(57)【要約】      （修正有）【課題】高い抗酸化作用を発揮する新規フラバノン化合物及びその製造方法の提供。【解決手段】下記一般式（１）に示される構造を有するフラバノン化合物など。2014125485.tif 000012これらのフラバノン化合物は、好ましくは抗酸化剤として用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）に示される構造を有するフラバノン化合物。
【化１】
2014125485.tif 000010
【請求項２】
下記一般式（２）に示される構造を有するフラバノン化合物。
【化２】
2014125485.tif 000011
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載されるフラバノン化合物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項４】
脂質の酸化防止剤として用いられることを特徴とする請求項３に記載の抗酸化剤。
【請求項５】
原料としてエリオディクティオール及びプレニル基供与体としてプレニル臭素を触媒存在下で反応させる工程を備えることを特徴とする請求項１に記載のフラバノン化合物の製造方法。
【請求項６】
原料としてエリオディクティオール及びゲラニル基供与体としてリナロールを触媒存在下で反応させる工程を備えることを特徴とする請求項２に記載のフラバノン化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フラバノン化合物、該フラバノン化合物を含有する抗酸化剤、及び該フラバノン化合物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より、この種のフラバノン化合物としては、ニムフェオール（nymphaeol）−Ａ，Ｂ，Ｃが知られている（非特許文献１参照）。これらの化合物は、ハスノハギリの他、特許文献１に記載されるように、オオバギから抽出することができる。また、これらの化合物は、抗酸化作用、抗菌作用等の有用な作用効果を発揮することが知られている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２７２３７４号公報
【特許文献２】特開２００５−２９７７８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】K.Yakushijin, K.Shibayama, H.Murata and H.Furukawa、ハスノハギリ由来の新規プレニルフラバノン（New prenylflavanones from Hernandia nymphaefolia(presl) Kubitzki）、Heterocycles, 14, 397-402, 1980.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、新規なフラバノン化合物を合成し、かつ有用な生理活性を見出したことによりなされたものである。その目的とするところは、医薬品等の様々な用途に利用することが可能な新規フラバノン化合物及びその製造方法を提供することにある。別の目的とするところは、高い抗酸化作用を発揮する抗酸化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の目的を達成するために本発明のフラバノン化合物は、下記一般式（１）に示される構造を有する。
【０００７】
【化１】
2014125485.tif 000002
また、上記の目的を達成するために本発明のフラバノン化合物は、下記一般式（２）に示される構造を有する。
【０００８】
【化２】
2014125485.tif 000003
本発明の抗酸化剤は、上記一般式（１）又は（２）に記載のフラバノン化合物を含有することを特徴とする。
【０００９】
好ましくは、抗酸化剤は、脂質の酸化防止剤として用いられる。
本発明のフラバノン化合物の製造方法は、上記一般式（１）に示される構造を有するフラバノン化合物の製造方法であって、原料としてエリオディクティオール及びプレニル基供与体としてプレニル臭素を触媒存在下で反応させる工程を備えることを特徴とする。
【００１０】
本発明のフラバノン化合物の製造方法は、上記一般式（２）に示される構造を有するフラバノン化合物の製造方法であって、原料としてエリオディクティオール及びプレニル基供与体としてリナロールを触媒存在下で反応させる工程を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の新規フラバノン化合物によれば、医薬品等の様々な用途に利用することができる。別の目的とするところは、本発明の新規フラバノン化合物によれば、高い抗酸化作用を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、この発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
本実施形態の第１のフラバノン化合物は、下記一般式（１）に示される構造を有する。
【００１３】
【化３】
2014125485.tif 000004
前記一般式（１）に示されるフラバノン化合物は、６'−プレニルエリオディクティオールであり、分子式Ｃ20Ｈ20Ｏ6、分子量３５６である。このフラバノン化合物は、エリオディクティオール（Eriodictyol）と類似した構造的特徴を有しているが、６’位にＣ−プレニル基を備えていることからエリオディクティオールよりも疎水性が高いものと思われる。
【００１４】
このフラバノン化合物は、エリオディクティオールやα−トコフェロール（α-Tocopherol）よりも高い抗酸化作用を有している。
本実施形態の第２のフラバノン化合物は、下記一般式（２）に示される構造を有する。
【００１５】
【化４】
2014125485.tif 000005
前記一般式（２）に示されるフラバノン化合物は、６'−ゲラニルエリオディクティオールであり、分子式Ｃ25Ｈ28Ｏ6、分子量４２４である。このフラバノン化合物は、エリオディクティオール（Eriodictyol）と類似した構造的特徴を有しているが、６’位にＣ−ゲラニル基を備えていることからエリオディクティオールよりも疎水性が高いものと思われる。
【００１６】
このフラバノン化合物は、エリオディクティオールやα−トコフェロール（α-Tocopherol）よりも高い抗酸化作用を有している。
本実施形態の第１又は第２の各フラバノン化合物を抗酸化剤として使用する場合、それらのフラバノン化合物を抗酸化剤の有効成分（抗酸化素材）として使用する。抗酸化剤は、油脂の酸化劣化、香料の劣化、色素の分解、色素の退色等の様々な製品の劣化（主に酸化劣化）を効果的に抑えるための劣化防止剤として飲食品（飲料品又は食品）中に添加して利用され得る。また、抗酸化剤は、健康食品等の飲食品中に含有させて利用することにより、経口摂取した生体内で活性酸素を消去して、肝機能の増強作用、アセトアルデヒドの毒性の低減、並びに脂質の酸化抑制、例えば不飽和脂肪酸の酸化抑制及び低密度コレステロール（ＬＤＬ）の抗酸化作用等により、健康増進作用を発揮する。さらに、抗酸化剤は、化粧品、医薬品又は医薬部外品中に含有させて利用することも可能であり、皮膚や口腔等の美白効果や老化の防止等に役立つ。
【００１７】
飲食品において、前記各フラバノン化合物の１日当たりの摂取量は、成人１日当たり好ましくは０．００１〜１０ｇ、より好ましくは０．０１〜１ｇである。前記各フラバノン化合物の１日当たりの摂取量が０．００１ｇ以上の場合、抗酸化作用をより効果的に発揮させることができる。逆に１０ｇ以下場合、経済的に摂取することができる。また、小人の場合は、前記成人の場合の半量が目安となる。前記飲食品としては、その他の成分として、例えばゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。
【００１８】
抗酸化剤を化粧料に適用する場合、化粧料基材に配合することにより適用することができる。化粧料の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状等のいずれであってもよい。化粧料基剤は、一般に化粧料に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、その他酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。
【００１９】
抗酸化剤を医薬品又は医薬部外品として使用する場合は、剤形としては、特に限定されないが、例えば、軟膏、液剤、スプレー剤、シート剤、散剤、粉剤が挙げられる。また、添加剤として、例えば賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。また、服用（経口摂取）により投与する場合の他、皮下注射、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として、例えば賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。
【００２０】
次に、上記のように構成された新規フラバノン化合物の作用を説明する。
本実施形態の新規フラバノン化合物は、上記一般式（１）の６’−プレニルエリオディクティオール及び上記一般式（２）の６’−ゲラニルエリオディクティオールである。これらのフラバノン化合物は、優れた抗酸化作用を有していることから、医薬品を始めとする様々な種類の用途に利用することができる。
【００２１】
次に、上記のように構成された新規フラバノン化合物の製造方法を説明する。
本実施形態の第１のフラバノン化合物は、例えば、原料としてエリオディクティオール、プレニル基供与体としてプレニル臭素を溶媒中に混合し、触媒存在下において反応させることにより合成することができる。
【００２２】
原料であるエリオディクティオールとしては、生合成品、化学合成品、天然素材から水・親水性有機溶媒を用いて抽出された粗抽出品又は精製品のいずれも使用することができる。触媒としては、例えばボロントリフルオリド−エチルエーテルコンプレックス（BF3-etherate）が挙げられる。溶媒としては、特に限定されないが、例えば、ジオキサンが挙げられる。反応温度・時間は、特に限定されないが、例えば室温（２５℃）で数時間行うことにより目的物を生成させることができる。尚、反応は窒素充填下で行われることが好ましい。プレニル基供与体として用いられるプレニル臭素は、例えば３，３−ジメチルアリルブロミドが挙げられる。
【００２３】
上記反応により得られた第１のフラバノン化合物は、公知の方法を用いてさらに精製処理を行ってもよい。精製方法としては、反応生成物を１又は２以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより単離される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ（順相・逆相クロマトグラフィ）、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。例えば、シリカゲルカラムクロマトグラフィを用いた方法では、移動相として水／アセトニトリルグラジエント系を使用することにより分離することができる。この精製工程は、既精製成分を指標として又は上述した抗酸化作用を指標として行うことができる。
【００２４】
本実施形態の第２のフラバノン化合物は、例えば、原料としてエリオディクティオール及びゲラニル基供与体としてリナロールを溶媒に溶解し、触媒存在下で反応させることにより合成することができる。原料、触媒、溶媒、及び反応条件は、第１のフラバノン化合物の製造方法と同様のものを採用することができる。
【００２５】
上記実施形態の新規フラバノン化合物によれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態の第１のフラバノン化合物は、上記一般式（１）の６’−プレニルエリオディクティオールである。このフラバノン化合物は、優れた抗酸化作用を有していることから、医薬品を始めとする様々な種類の用途に利用することができる。また、このフラバノン化合物は、エリオディクティオールと同様な用途に利用できる他、エリオディクティオールよりも疎水性が高いことを利用した様々な用途に利用することができる。
【００２６】
（２）本実施形態の第２のフラバノン化合物は、上記一般式（２）の６’−ゲラニルエリオディクティオールである。このフラバノン化合物は、特に優れた抗酸化作用を有していることから、医薬品を始めとする様々な種類の用途に利用することができる。また、このフラバノン化合物は、エリオディクティオールと同様な用途に利用できる他、エリオディクティオールよりも疎水性が高いことを利用した様々な用途に利用することができる。
【００２７】
（３）本実施形態のフラバノン化合物を含有する抗酸化剤は、高い抗酸化作用を有するフラバノン化合物を有効成分として含有していることから、飲食品、化粧品又は医薬部外品の劣化を防止して保存性を高めたり、経口摂取又は経皮投与することにより健康増進効果や老化防止効果を発揮することができる。
【００２８】
（４）本実施形態のフラバノン化合物を含有する抗酸化剤は、特に脂質の酸化を防止する効果に優れる。したがって、脂質を含有する飲食品、医薬品、化粧品等の素材の保存性を高めたり、脂質の酸化が原因とされる各種疾患等の治療又は予防に適用できることが期待される。
【００２９】
（５）本実施形態のフラバノン化合物は、飽和脂肪酸やＬＤＬの酸化を抑制する効果に優れる。したがって、過酸化脂質及び酸化ＬＤＬが原因とされる動脈硬化等の各種疾患の治療や予防に適用できることが期待される。
【００３０】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態の新規フラバノン化合物は、ヒト以外の動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタのような家畜（非ヒト哺乳動物）、ニワトリ等の家禽、或いは犬、猫、ラット及びマウス等のペット（各種飼養動物）に適用してもよい。
【００３１】
・上記実施形態のフラバノン化合物は、優れた抗酸化作用を有する。上記実施形態のフラバノン化合物を含有する抗酸化剤を実験用・研究用試薬として適用してもよい。抗酸化作用が関係する生理作用のメカニズムの解明等を目的として用いることができる。
【実施例】
【００３２】
次に、実施例及び比較例を挙げて前記実施形態を更に具体的に説明する。
＜新規フラバノン化合物の製造＞
（１）６'−プレニルエリオディクティオールの製造
まず、５０ｍＬ枝付きナスフラスコにエリオディクティオール（crude）（１．００ｇ、３．４７ｍｍｏｌ）を移し乾燥させ、ジオキサン（Dry Dioxane）（１０ｍＬ）に溶かした。氷冷下、撹拌しながら蒸留したＢＦ３ＯＥｔ２（１．２ｍＬ、９．５２ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ．）を滴下し、プレニル臭素（３，３−ジメチルアリルブロミド）（１．１ｍＬ、９．５４ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ．）をゆっくり滴下した。その後、３時間室温で撹拌した。反応物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶かし、ＲＯ水（３０ｍＬ）で３回洗浄した。その後Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を飛ばしてフラバノン化合物が含有される画分ＡＫ−３６−１を得た後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝２０：１）で精製し、画分ＡＫ−３６−５（crude）（１５４．３ｍｇ）及び画分ＡＫ−３６−６（２４２．９ｍｇ）（原料回収）を得た。画分ＡＫ−３６−５について逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用い、下記条件１で分析した。
【００３３】
＜ＨＰＬＣの条件１＞
Column: InertSustain C18 (4.6×150 mm)
Gradient: 0.1%TFA mQ:0.1% TFA CH3CN (0 min/99:1, 5 min/99:1, 35 min/0:100, 45 min/0:100, 55 min/99:1)
Detection: 214 nm
その後、分取して１Ｈ−ＮＭＲを用いて構造決定を行った。構造解析の結果を以下に示す。
【００３４】
1H NMR (400MHz, ACETN) δ7.06 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 5.95 (s, 2H), 5.62 (dd, 1H, J = 10.8, 2.7 Hz), 5.24-5.19(m, 1H), 3.41-3.27 (m, 2H), 3.13 (dd, 1H, J = 17.2, 13.2 Hz), 2.65 (dd, 1H, J = 14.4, 2.7 Hz), 1.70 (s, 3H), 1.65 (s, 3H)。
【００３５】
上記１Ｈ−ＮＭＲのデータより、一般式（１）の構造を有する６'−プレニルエリオディクティオールであることが確認された。
得られた構造解析のデータを元に、画分ＡＫ−３６−５より下記ＨＰＬＣ条件２にて６'−プレニルエリオディクティオールを精製した。
【００３６】
＜ＨＰＬＣの条件２＞
Column: Inertsil ODS-3 20×250 mm
Gradient: 0.1%TFA mQ:0.1% TFA CH3CN (0 min/40:60, 30 min/25:75)
Detection: 214 nm
リテンションタイム１０．４８３分のピークを分取し、画分ＡＫ−３８−２（１４．７ｍｇ、ｙ（収率）１．２％）（６'−プレニルエリオディクティオール）を得た。
【００３７】
（２）６'−ゲラニルエリオディクティオールの製造
まず、５０ｍＬ枝付きナスフラスコにエリオディクティオール（crude）（２．２ｇ、７．６３ｍｍｏｌ）を移し乾燥させ、ジオキサン（Dry Dioxane）（１０ｍＬ）に溶かした。氷冷下、撹拌しながら蒸留したＢＦ３ＯＥｔ２（２．６ｍＬ、２０．６ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ．）を滴下し、リナロール（Linalool）（４．４ｍＬ、２４．８ｍｍｏｌ、２．６ｅｑ．）をゆっくり滴下した。その後、３時間室温で撹拌した。反応物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に溶かし、ＲＯ水（３０ｍＬ）で３回洗浄した。その後Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を飛ばして画分ＲＴ−２−２７−１を得た後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝２０：１)で精製し、ＲＴ−２−２７−４（crude）（１．６２ｇ）、画分ＲＴ−２−２７−５（４４０ｍｇ）（原料回収）を得た。画分ＲＴ−２−２７−４を下記ＨＰＬＣ条件３にてＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。
【００３８】
＜ＨＰＬＣの条件３＞
Column: InertSustain C18 (4.6×150 mm)
Gradient: 0.1%TFA mQ:0.1% TFA CH3CN (0 min/99:1, 5 min/99:1, 35 min/0:100, 45 min/0:100, 55 min/99:1)
Detection: 214 nm
その後、同条件にて画分ＲＴ−２−２７−４とオオバギの９９．５％エタノール抽出物をＲＰ−ＨＰＬＣにて分析し、一致した３つのピーク（リテンションタイム：３３．８９２分、３４．８９３分、３５．４１７分）を確認後、それらを分取し、１Ｈ−ＮＭＲを用いて構造決定を行った。尚、オオバギの９９．５％エタノール抽出物は、まずオオバギの乾燥葉を細かく刻んだ後に乳鉢ですり潰し、すり潰された乾燥葉１００ｇに対して１０００ｍＬの９９．５％エタノールを加えた後、約１週間室温（２５℃）暗所で抽出を行った。続いて、活性炭等のろ過剤を用いて固液分離による精製を行った後、抽出液を乾固することにより、オオバギのエタノール抽出物を得た。
【００３９】
リテンションタイム３４．８９３分の成分： 1H NMR (400MHz, ACETN) δ6.91 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 5.95 (s, 2H), 5.40-5.33 (m, 1H), 5.12 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 3.37 (d, 2H, J = 7.7 Hz), 3.15-3.08 (m, 1H), 2.73-2.68 (m, 1H), 1.72 (s, 3H), 1.63 (s, 3H), 1.57 (s, 3H)。
【００４０】
上記１Ｈ−ＮＭＲのデータは、ニムフェオール−Ｂ（Nymphaeol-B）と一致した。
リテンションタイム３５．４１７分の成分： 1H NMR (400MHz, ACETN) δ7.02 (s, 1H), 6.87 (d, 2H, J = 1.0), 6.04 (s, 1H), 5.37 (dd, 1H, J = 3.2, J = 12.7), 5.26 (t, 1H, J = 7.1), 5.08 (t, 1H, J = 7.1), 3.26 (d, 2H, J = 7.1), 3.12 (dd, 1H, J = 13.0, J = 17.1), 2.66 (dd, 1H, J = 3.2, J = 17.1), 1.77 (s, 3H), 1.61 (s, 3H), 1.56 (s, 3H)。
【００４１】
上記１Ｈ−ＮＭＲのデータは、ニムフェオール−Ａ（Nymphaeol-A）と一致した。
一方、１Ｈ−ＮＭＲの結果より、３３．８９２分（ＲＴ−２−３３−３）は５’位又は６’位がゲラニル化された構造であり、おそらくイソニムフェオール−Ｂ（Isonymphaeol-B）であると推定された。しかし、完全に同定できなかったため、画分ＲＴ−２−２７−４を別の条件（下記ＨＰＬＣ条件４）にて精製を行った。
【００４２】
＜ＨＰＬＣの条件４＞
Column: Inertsil ODS-3 (20×250 mm)
Gradient: 0.1%TFA mQ:0.1% CH3CN (0 min/35:65, 30 min/20:80)
Detection: 214 nm
リテンションタイム２１．５６７分のピークを分取し、画分ＲＴ−２−３３−４（ニムフェオール−Ｂ）（１０．９ｍｇ、ｙ（収率）０．３％）を得た。次に、リテンションタイム２３．７５８分のピークを分取し画分ＲＴ−２−３３−５（ニムフェオール−Ａ）（５３．３ｍｇ、ｙ（収率）１．６％）を得た。
【００４３】
また、リテンションタイム１７．２４２分のピークは１Ｈ−ＮＭＲ解析の結果、２種類の化合物の混合物（画分ＲＴ−２−３３−３）であったため、さらに別条件（下記条件５）にて精製を試みた。
【００４４】
＜ＨＰＬＣの条件５＞
Column: Inertsil ODS-3 (20×250 mm)
Gradient: 0.1%TFA mQ:0.1% CH3CN (0 min/50:50, 60 min/40:60)
Detection: 214 nm
リテンションタイム５０．４６７分のピーク（画分ＲＴ−２−４３−１）及びリテンションタイム５３．７２５分のピーク（画分ＲＴ−２−４３−２）を分取し、１Ｈ−ＮＭＲを用いて構造決定を行った。
【００４５】
画分ＲＴ−２−４３−１の成分： 1H NMR (400MHz, ACETN) δ7.05(s, 1H), 6.73(s, 1H), 5.94(s, 2H), 5.62(dd, 1H, J =13.2, 2.8Hz), 5.23(t, 1H, J =7.8Hz), 5.09-5.05(m, 1H), 3.42-3.26(m, 2H), 3.12(dd, 1H, J =17.6, 13.6Hz), 2.64(dd, 1H, J =14.7,2.8 Hz), 1.65(s, 3H), 1.62(s, 3H), 1.56(s, 3H)。
【００４６】
上記１Ｈ−ＮＭＲのデータより、一般式（２）の構造を有する６'−ゲラニルエリオディクティオールであることが確認された。
画分ＲＴ−２−４３−２の成分： 1H NMR (400MHz, ACETN) δ6.96 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 5.96 (s, 2H), 5.61 (dd, 1H, J = 2.7, 13.4 Hz), 5.18 (t, 1H, J = 7.1), 5.07 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 3.54 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 3.17 (dd, 1H, J = 13.4, 17.1 Hz), 2.66 (dd, 1H, J = 2.7, 17.1 Hz), 1.69 (s, 3H), 1.61 (s, 3H), 1.55 (s, 3H)。
【００４７】
上記１Ｈ−ＮＭＲのデータは、イソニムフェオール−Ｂ（Isonymphaeol-B）と一致した。
尚、画分ＲＴ−２−４３−１（６'−ゲラニルエリオディクティオール）は、１７．４ｍｇ、ｙ（収率）０．５％であった。画分ＲＴ−２−４３−２（イソニムフェール−Ｂ）は、４．５ｍｇ、ｙ（収率）０．１％であった。
【００４８】
＜新規フラバノン化合物の抗酸化試験＞
（１）ラジカル捕捉能試験
新規フラバノン化合物の生理活性作用の一つである抗酸化作用を水系におけるラジカル捕捉能を評価するため、ＤＰＰＨラジカル消去活性の測定を行った。本試験では、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨ（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）が抗酸化物質により還元されて退色することを利用するものである。本試験で用いる試料として、実施例１の６'−プレニルエリオディクティオール、実施例２の６'−ゲラニルエリオディクティオール、並びに陽性対照として、エリオディクティオール、ニムフェオール−Ａ、ニムフェオール−Ｂ、及びイソニムフェオール−Ｂを使用した。
【００４９】
石英セル中にエタノール１．８ｍＬ、４０ｍＭのＭＥＳ（2-[N-Morpholino] ethanonesulfonic acid）buffer１．２ｍＬ（最終濃度１．６ｍＭ）を加えゼロ合わせを行う。コントロールとして石英セル中にエタノール１１７０μＬ、４０ｍＭのＭＥＳ buffer１２００μＬ（最終濃度１．６ｍＭ）、５００μＭのＤＰＰＨ６００μＬ（最終濃度１００ｍＭ）を加えゼロ合わせを行った。その後、エタノール３０μＬを加えて５分毎に吸光度を測定し３０分間のＤＰＰＨの吸光度変化を調べた。次に各試料を３０μＬ入れて同様の測定を行い３０分後の吸光度（５１７ｎｍ）が、５０％に減少した時の濃度ＥＣ５０を求めた。尚、測定は、２５℃にて３回行い、吸光度は、プレートリーダとしてHITACHI U-2000 Spectrophotometerを用いて行った。結果を表１に示す。データは平均±標準誤差で表した。
【００５０】
【表１】
2014125485.tif 000006
表１に示されるように、実施例１の６'−プレニルエリオディクティオール、及び実施例２の６'−ゲラニルエリオディクティオールは、優れた抗酸化活性を有することが確認された。
【００５１】
（２）リノール酸共役の生成阻害活性の試験
リノール酸の酸化変性の過程で生じる共役ジエンを測定することにより、抗酸化活性を比較した。あらかじめ４０℃にしておいた５０ｍＭのリン酸buffer（ｐＨ７．４）２．８１ｍＬを石英セルに入れた。その後調製した各試料を１０μＬ、次に１６ｍＭのリノール酸を含む溶液を３０μＬ（終濃度０．１６ｍＭ）、最後に４０ｍＭのＡＡＰＨ（2,2 ’-Azobis(2-methylpropionamidine)Dihydrochloride）１５０μＬ（終濃度２ｍＭ）を加えて全量を３ｍＬとした。ＡＡＰＨを加えた時間を０分として吸光度の測定を始めた。リノール酸酸化の過程で生じる共役ジエンの吸光度をピーク２３４ｎｍにおける吸光度の経時変化を３７℃で１８０分測定した。試料１μＭ当たりのリノール酸が酸化されるまでの時間（分）を求めた。尚、測定は、３回行い、吸光度は、プレートリーダとしてHITACHI U-3300 Spectrophotometerを用いて行った。結果を表２に示す。データは平均±標準誤差で表した。
【００５２】
【表２】
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表２に示されるように、実施例１の６'−プレニルエリオディクティオール、及び実施例２の６'−ゲラニルエリオディクティオールは、優れた抗酸化活性を有することが確認された。特に実施例２の６'−ゲラニルエリオディクティオールは、リノール酸の酸化変性を抑制する作用が著しく高いことが確認された。
【００５３】
（３）ＬＤＬ抗酸化活性の試験
血液中の主要なコレステロール輸送タンパク質であり、動脈硬化との相関があるとされているＬＤＬ（low density lipoprotein）に対する抗酸化作用を試験した。
【００５４】
（ａ）ＬＤＬの単離・精製
まず、ヒトの血液を採取後室温で約３０分間静置してから、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離を行った。遠心後、上清（血清）をピペットマンで採取し、１５ｍＬ遠心管に移した。これ以後の実験操作は全て低温下で行う。次に、０．３２５ｇ／ｍＬになるようにＫＢｒを血清に溶解させる。完全にＫＢｒが溶解したことを確認してから、ピペットマンを用いて血清を超遠心用遠心管に入れた。次に、濃度８．５ｇ／ＬのＮａＣｌ水溶液（ｄ＝１．００６）を体積比で、（ＮａＣｌ層）：（血清層）＝２：３になるように静かに注ぎ、２層にした。
【００５５】
次に、超遠心器で８００００ｒｐｍ、４℃の条件で６０分間遠心分離を行った。遠心後は慎重かつ速やかに遠心管を取り出し、濃度勾配によって分画されたＬＤＬ層をピペットマンで採取、チューブ（エッペンドルフ社製）に移した。
【００５６】
針を装着していない１ｍＬシリンジを用いて試料を採取した後、２２μｍのマイクロフィルタを装着し、別の新しいチューブ（エッペンドルフ社製）に濾出させた。次に、針を装着した１０ｍＬシリンジで試料を吸い取った後、針を透析膜に挿入し試料を注入する。透析膜に浮きを装着させ、スターラで攪拌させながら１×ＰＢＳ buffer中で遮光下、４℃で３０分間透析後、Buffer交換し、さらに３０分間透析した。最後にBuffer交換し、一晩透析した。３回の透析はすべて低温室で行った。なお、透析用の１×ＰＢＳ bufferは十分に窒素を通気し、冷却してから用いた。透析後の精製ＬＤＬは１０ｍＬシリンジで採取し、遮光下、４℃、窒素充填下でチューブ（エッペンドルフ社製）に保存した。
【００５７】
（ｂ）ＬＤＬの定量（ＢＣＡ法）
ＢＳＡ検量線を作成するため、終濃度がそれぞれ０、０．１２５、０．２５、０．５、１ｍｇ／ｍＬになるように標準ＢＳＡを調整した。ＬＤＬ試料は４倍、６倍、８倍の希釈で３点とった。試料の希釈は１×ＰＢＳ bufferで行った。マイクロプレートリーダ用９６穴プレートに希釈試料及び標準ＢＳＡを２５μＬずつアプライし、さらに（ＢＣＡ／Ａ液３０００μＬ）＋（ＢＣＡ／Ｂ液６０μＬ）の混合液を２００μＬずつアプライした。これを３７℃、３０分間インキュベーションした後マイクロプレートリーダを用いてＯＤ570測定を行い、検量線からＬＤＬ濃度及び単離したＬＤＬ量を算出した。
【００５８】
（ｃ）ＴＢＡＲＳアッセイ
チオバルビツール酸反応生成物（ＴＢＡＲＳ）アッセイは、脂質が酸化され生成する最終反応物（ＴＢＡＲＳ）の測定を行い、脂質酸化抑制効果を測定する方法で実験を行った。
【００５９】
まずＬＤＬ（５０μｇ／１００μｍ）となるように１×ＰＢＳ buffer、各例の試料１０μＬ、ＬＤＬ、５００μＭ硫酸銅（酸化剤）１０μＬ（終濃度５μＭ）の順に混合させ全量を１００μＬとした。３７℃、４時間インキュベーション後、１％リン酸水溶液１ｍＬずつ加えた１５ｍＬ遠心管に試料全量を１５ｍＬ遠心管に移した。さらに１０ｍＭのＢＨＴを５０μＬ加えて酸化を停止させ、最後に０．６７％のＴＢＡを１ｍＬ加えた後、約５秒ボルテックスし３０分間（１００℃）処理した。反応終了後、試料を氷中で冷やし常温に戻してからブタノールを２ｍＬ加え、約３０秒間ボルテックスした。十分に攪拌させることで、ＴＢＡＲＳはブタノールに溶け込む。遠心分離器（KUBOTA 5910）を用いて３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離を行い、２層に分ける。遠心後、ブタノール層（上層）を採取し、５３２ｎｍにおける吸光度をHITACHI U-2000 Spectrophotometerを用いて測定した。ＬＤＬの酸化を５０％抑制した時の濃度ＩＣ５０を求めた。結果を表３に示す。測定は、３回行い、データは平均±標準誤差で表した。
【００６０】
【表３】
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表３に示されるように、実施例１の６'−プレニルエリオディクティオール、及び実施例２の６'−ゲラニルエリオディクティオールは、優れたＬＤＬの酸化抑制作用を有することが確認された。
【００６１】
（ｄ）ＬＤＬ共役ジエン生成阻害活性
脂質が酸化された最終産物を測定する（ｃ）ＴＢＡＲＳアッセイに対して、ＬＤＬ共役ジエン生成阻害活性は、脂質の初期の酸化の程度を測定する方法として知られている。
【００６２】
測定は、石英セルに、表４に記載の各例の化合物３０μＬ（終濃度１μＭ）、ＬＤＬ(終濃度５０μｇ／ｍＬ)、５００μＭのＣｕＳＯ4を３０μＬ（終濃度５μＭ）を順に加え、ＰＢＳで全量を３ｍＬに調整した。その後、ＣｕＳＯ4を加えた時間を０分として、ＬＤＬの過酸化反応によって生じる共役ジエン構造に由来する２３４ｎｍの吸光度の経時変化を測定した。吸光度は、HITACHI U-2000 Spectrophotometerを用いて測定した。ＣｕＳＯ4を加えた時から酸化が開始されるまでの時間（タイムラグ（分））を求めた。結果を表４に示す。測定は、３回行い、データは平均±標準誤差で表した。
【００６３】
【表４】
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ラグタイムの値が大きい化合物ほど、初期酸化反応物である共役ジエンの生成を遅延させる効果が高く、強いＬＤＬ酸化抑制活性を有することを示す。表４に示されるように、実施例１の６'−プレニルエリオディクティオール、及び実施例２の６'−ゲラニルエリオディクティオールは、優れたＬＤＬの酸化抑制作用を有することが確認された。
【００６４】
ＬＤＬは上述したように血液中においてコレステロール輸送を担っている。生体内においてフリーラジカル等によりＬＤＬ中の脂質が酸化されると、酸化ＬＤＬが形成されることが知られている。通常、ＬＤＬはＬＤＬ受容体を通じて肝臓に取り込まれるが、酸化ＬＤＬは、ＬＤＬ受容体ではなく、スカベンジャ受容体を通してマクロファージに取り込まれる。この酸化ＬＤＬを多量に取り込んだマクロファージは泡沫化し、血管内皮細胞障害及びアテローム性動脈硬化症を引き起こす。したがって、ＬＤＬの酸化を抑制する効果に優れる本発明の新規フラバノン化合物は、酸化ＬＤＬが原因とされる動脈硬化を抑制することが期待される。
【００６５】
以上のように、本発明の新規フラバノン化合物は、公知のフラバノン化合物に対し、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。尚、本フラバノン化合物とは基本骨格が異なるフラバン−３−オールであるカテキンにおいて、Ｂ環の６’位に電子供与性のイソプロピル基が導入された平面型カテキンの構造により、ラジカル消去活性が高まることが知られている（K.Fukuhara et.al.; J. Am. Chem. Soc., 124, 5952-5953(2002)）。一方、フラバノン化合物は、Ｃ環の３位の位置に水酸基を有しておらず、平面型カテキンのような構造をとることはできない。つまり、フラバノン化合物においては、従来化合物よりも機能性の効果が向上することを予測して、炭素数５のイソプレン単位から構成されるプレニル基のＢ環６’位への付加により新規化合物を得ようとする動議付けはない。よって、上記のような本発明の新規フラバノン化合物が、公知のフラバノン化合物に対し、優れた抗酸化作用を有することは、意外性を有すると思料する。
【００６６】
次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について、以下に追記する。
（ａ）前記一般式（１）又は一般式（２）の新規フラバノン化合物を含有することを特徴とする飲食品、化粧品又は医薬品。
【００６７】
（ｂ）前記一般式（１）又は一般式（２）の新規フラバノン化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗動脈硬化剤。