(57)【要約】【課題】  脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体および脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤を提供する。【解決手段】  本発明者らは、鋭意研究の結果、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドが、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与することや増強すること、および、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体が、選択的かつ効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行することを見出した。【選択図】  図１
2014114267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体。
【請求項３】
ペプチドと結合した脂質が、ペプチドのＮ末端にグリシン残基、グリシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質がこの順で結合してなるペプチドと結合した脂質である、請求項２に記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項３に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
他の構成脂質総量に対して、ペプチドと結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である、請求項２から請求項４のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤に関し、より詳細には、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）またはＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、当該ペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに当該ペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチド（以下、「ＲＬＴＲペプチド」という。）は、ＡｐｏＢ−１００タンパク質の３３５９〜３３６７番目に相当する配列からなることが知られており、非特許文献１には、ＡｐｏＢ−１００タンパク質の３３５９〜３３６７番目のドメインが３１４７〜３１５７番目のドメインとヘテロダイマーを形成してＬＤＬレセプターに結合する領域であることが開示されている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、特定の細胞へ薬剤を送達する為に、薬剤の担体として様々な脂質膜構造体が開発されている。例えば、特許文献１には、血管内皮細胞へ核酸を送達する為の脂質膜構造体として、カチオン性脂質、中性ヘルパー脂質および核酸からなるリポプレックスが開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００９−５３４３４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｕｒｂａｎ Ｏら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１７巻、第１４９〜１５５頁、１９９７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１にはＲＬＴＲペプチドについて記載されているのにとどまり、ＲＬＴＲペプチドの逆配列である、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）であるペプチド（以下、「ＫＬＧＲペプチドという。）については記載や示唆がない。また、非特許文献１および特許文献１には、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドが脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するということ、あるいはＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体が選択的かつ効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行することについての記載はおろか、示唆もされていない。さらに、特許文献１に記載のリポプレックスは、肝臓の他に肺や膵臓、腎臓、小腸、胃など、身体全体の様々な器官の血管内皮細胞へ移行するものであり（特許文献１［０１６９］など）、肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行するものではない。
【０００７】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）またはＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびにＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドが、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与することや増強すること、および、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体が、選択的かつ効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行することを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００９】
（１）アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）である、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド。
【００１０】
（２）アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）であるペプチドと結合した脂質および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体。
【００１１】
（３）ペプチドと結合した脂質が、ペプチドのＮ末端にグリシン残基、グリシン残基、システイン残基、親水性ポリマーおよび脂質がこの順で結合してなるペプチドと結合した脂質である、（２）に記載の脂質膜構造体。
【００１２】
（４）親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、（３）に記載の脂質膜構造体。
【００１３】
（５）他の構成脂質総量に対して、ペプチドと結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である、（２）から（４）のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【００１４】
（６）アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）および／またはＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）であるペプチドを有効成分とする、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るペプチド、脂質膜構造体ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤によれば、脂質膜構造体を肝臓血管内皮細胞へ選択的かつ効率的に移行させることができ、さらにその細胞内で脂質膜構造体が内包していた薬剤の機能を発揮させることができる。これにより、薬剤の効果を適切に得ることができ、薬剤が肝臓血管内皮細胞以外で作用することに起因する副作用の低減や、薬剤の投与量の削減に貢献することができる。また、本発明に係るペプチド、脂質膜構造体ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤によれば、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドと脂質との結合にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介さずとも、脂質膜構造体を効率的に肝臓血管内皮細胞に移行させることができることから、脂質膜構造体におけるＰＥＧ修飾の低減ないし省略をすることができる。これにより、ＰＥＧ修飾によって脂質膜構造体の血中滞留性を向上させることができ、同時にＰＥＧ修飾によって脂質膜構造体の細胞内取り込みが抑制されてしまうという、いわゆるＰＥＧのジレンマの解決に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＫＬＧＲ付加ペプチド、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなる脂質（ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）、ならびにＲＬＴＲ付加ペプチド、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなる脂質（ＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）の構造を模式的に示す図である。図中、円で囲んだＳは、システインのチオール基を示す。
【図２】ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを投与したマウスの肝臓および肺における、血管内皮細胞およびリポソームの位置を示す図である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図３】ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを投与したマウスの肝臓における、血管内皮細胞およびリポソームの位置を示す図である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図４】空ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームを投与したマウスの肝臓における、血管内皮細胞およびリポソームの位置を示す図である。
【図５】標識ＫＬＧＲペプチドＬＰのみを投与したマウス（マウスａ）、非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを前投与した後に標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを投与したマウス（マウスｂ）および非標識コントロールＬＰを前投与した後に標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを投与したマウス（マウスｃ）の肝臓における、血管内皮細胞およびリポソームの位置を示す図である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図６】標識ＲＬＴＲペプチドＬＰのみを投与したマウス（マウスａ）、非標識ＲＬＴＲペプチドＬＰを前投与した後に標識ＲＬＴＲペプチドＬＰを投与したマウス（マウスｂ）および非標識コントロールＬＰを前投与した後に標識ＲＬＴＲペプチドＬＰを投与したマウス（マウスｃ）の肝臓における、血管内皮細胞およびリポソームの位置を示す図である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図７】３Ｈで標識したコントロールリポソームＡおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与したマウスの肝臓、肺、脾臓、腎臓および血液における３Ｈの放射線濃度を示す図である。
【図８】３Ｈで標識したコントロールリポソームＡおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与したマウスの肝臓、肺および脾臓における３Ｈの放射線濃度を示す図である。
【図９】ローダミンで標識したコントロールリポソームＡ、ＰＥＧ修飾リポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた肝臓血管内皮初代培養細胞における、蛍光強度を示す図である。
【図１０】ローダミンで標識したコントロールリポソームＡ、ＰＥＧ修飾リポソーム、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた肝臓血管内皮初代培養細胞における、蛍光強度を示す図である。
【図１１】ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームであってローダミンで標識しないもの（非標識）を肝臓血管内皮初代培養細胞に各量取り込ませた後、ローダミンで標識したもの（標識）を取り込ませた場合の蛍光強度を示す図（左図）、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームであってローダミンで標識しないもの（非標識）を肝臓血管内皮初代培養細胞に各量取り込ませた後、ローダミンで標識したもの（標識）を取り込ませた場合の蛍光強度を示す図（中央図）、およびコントロールリポソームＢであってローダミンで標識しないもの（非標識）を肝臓血管内皮初代培養細胞に各量取り込ませた後、ローダミンで標識したもの（標識）を取り込ませた場合の蛍光強度を示す図（右図）である。
【図１２】ＫＬＧＲペプチドを取り込ませずにローダミンで標識したＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた肝臓血管内皮初代培養細胞（添加しない）、ＫＬＧＲペプチドを１２５μｍｏｌ／Ｌ取り込ませた後にローダミンで標識したＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた肝臓血管内皮初代培養細胞（１２５μｍｏｌ／Ｌ）、ＫＬＧＲペプチドを６２５μｍｏｌ／Ｌ取り込ませた後にローダミンで標識したＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた肝臓血管内皮初代培養細胞（６２５μｍｏｌ／Ｌ）における、それぞれの蛍光強度を示す図である。
【図１３】リポソームを投与していない群（コントロール群）、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを投与した群およびＦ７内包ＹＳＫリポソームを投与した群における、それぞれのＦ７遺伝子発現量を示す図（左図）、ならびにコントロール群、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群およびＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群における、それぞれのＴｉｅ２遺伝子の発現量を示す図（右図）である。
【図１４】リポソームを投与していない群（コントロール群）、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群およびＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群における、それぞれのＴｉｅ２遺伝子の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤について詳細に説明する。
【００１８】
本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドは、リポソームに代表される脂質膜構造体に肝臓血管内皮細胞へ移行することができる機能（肝臓血管内皮細胞への移行能）を付与し、あるいはリポソームに代表される脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能を増強する。すなわち、本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドは、肝臓血管内皮細胞への移行能を有さない脂質膜構造体に対しては肝臓血管内皮細胞への移行能を付与し、あるいは肝臓血管内皮細胞への移行能を付与するとともにその移行能を増強し、肝臓血管内皮細胞への移行能を有する脂質膜構造体に対してはその移行能を増強する。
【００１９】
ここで、本発明において、「脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞へ移行する」とは、脂質膜構造体が、肝臓血管内皮細胞の周辺、細胞表面、細胞上あるいは細胞内に位置するようになることをいう。本発明において、脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞への移行能を有するか否か、あるいは、脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能が増強されたか否かは、常法に従い確認することができる。そのような方法としては、例えば、ローダミンなどの蛍光物質で標識した脂質膜構造体を生体に投与するとともに、肝臓血管内皮細胞をＩｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４などの蛍光物質で染色した後、肝臓を蛍光観察する方法を挙げることができる。この場合、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光が検出されれば、脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞への移行能を有すると判断することができる。また、黄色の蛍光強度が増加するあるいは黄色の蛍光を示す箇所数が増加すれば、脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能が増強されたと判断することができる。
【００２０】
その他の確認方法として、例えば、肝臓血管内皮細胞の培養細胞に蛍光物質で標識した脂質膜構造体を添加し、一定時間インキュベートした後、細胞を洗浄してから溶解し、蛍光強度を測定してもよい。この場合、脂質膜構造体に由来する蛍光が検出されれば、当該培養細胞に脂質膜構造体が取り込まれたと考えられるため、脂質膜構造体が肝臓血管内皮細胞への移行能を有すると判断することができる。また、脂質膜構造体に由来する蛍光の強度が増加すれば、脂質膜構造体の肝臓血管内皮細胞への移行能が増強されたと判断することができる。
【００２１】
本発明に係るペプチド、すなわち脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドは、アミノ酸配列がＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）のペプチド（ＫＬＧＲペプチド）および／またはアミノ酸配列がＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）のペプチド（ＲＬＴＲペプチド）である。なお、アミノ酸Ｋ，Ｌ，Ｇ，Ｒ，Ｔはそれぞれ、リシン残基、ロイシン残基、グリシン残基、アルギニン残基、トレオニン残基を示す。
【００２２】
本発明に係るペプチドは、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明に係るペプチドをコードするＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。なお、いずれの合成法も、当業者により広く知られている一般的な方法の他、あらゆる方法を利用することができる。
【００２３】
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。
【００２４】
次に、本発明は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体を提供する。本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体は、上述した本発明に係るペプチドと結合した脂質、すなわちＫＬＧＲペプチドと結合した脂質やＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含んでいる。なお、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体において、上述した本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチドと同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００２５】
本発明において、脂質膜構造体の好ましい形態は、脂質二重層膜構造を有する閉鎖小胞であり、そのような脂質膜構造体としては、例えば、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）の他、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）などの一枚膜リポソームを挙げることができる。
【００２６】
本発明における、脂質膜構造体を構成する脂質（「構成脂質」）の種類は特に限定されず、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、これらのうちのいずれであってもよい。また、カチオン性脂質、ｐＨ依存性カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質のいずれであってもよい。
【００２７】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）など）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロールなど）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、またはこれらの水素添加物、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなど）などを挙げることができ、これらのうちの１種または２種以上を用いることができる。
【００２８】
糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどのグリセロ糖脂質、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのスフィンゴ糖脂質などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００２９】
ステロールとしては、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。これらのステロールは、一般には脂質二重層を物理的または化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために用いることができる。
【００３０】
長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸またはそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸または長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、アラキジン酸、マルガリン酸、ツベルクロステアリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エレオステアリン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができ、具体的には、１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＭＧ）、１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＳＧ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３１】
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３２】
カチオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＣ−６−１４）などのジエタノールアミン塩酸塩、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロライド（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＤＯＤＡＣ）、Ｎ−（２，３−オレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（Ｎ−（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモールコレステロール（３β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ、ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ−Ｎ−［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、ＤＯＳＰＡ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３３】
ｐＨ依存性カチオン性脂質としては、１−ｍｅｔｈｙｌ−４，４−ｂｉｓ［（９Ｚ，１２Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１２−ｄｉｅｎ−１−ｙｌｏｘｙ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＹＳＫ０５）、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｒｏｐａｎｅ（ＤＯＤＡＰ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる
【００３４】
また、中性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（ＣＨＥ）などを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。また、アニオン性脂質としては、上述した脂質の他、例えば、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン（Ｎ−スクシニルＰＥ）、ホスファチジルエチレングリコールなどを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００３５】
本発明に係るペプチドと結合した脂質は、本発明に係るペプチドのＮ末端側に結合した脂質でもよく、Ｃ末端側に結合した脂質でもよい。また、本発明に係るペプチドと脂質とは直接結合していてもよく、アミノ酸やペプチド、親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。なお、本発明において、ペプチドと脂質との結合様式としては、例えば、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合などの非共有結合や、ジスルフィド結合、ペプチド結合などの共有結合を挙げることができる。
【００３６】
リンカーを介して結合したものである場合、リンカーとなるアミノ酸の種類、ペプチドの構成アミノ酸や長さ、親水性ポリマーの種類や重合数などは、ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドと脂質とが結合でき、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体を構成することができる限り特に限定されない。そのようなリンカーのアミノ酸としては、例えば、システイン（Ｃ）を挙げることができ、リンカーのペプチドとしては、例えば、Ｎ末端がＣで残りが中性アミノ酸残基であるものを挙げることができ、より具体的には、ＣＧＧ−（配列番号３）、ＣＡＡ−（配列番号４）、ＣＬＬ−（配列番号５）、ＣＶＶ−（配列番号６）、ＣＬＡ−（配列番号７）、ＣＧ−（配列番号８）、ＣＧＧＧ−（配列番号９）、ＣＧＧＧＧ−（配列番号１０）、ＣＧＧＧＧＧ−（配列番号１１）（Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリンをそれぞれ示す。）などを挙げることができる。また、リンカーの親水性ポリマーとしては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボキシレート基、ヒドロキシエチル基、ポリオキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ポリオキシプロピル基、アミノ基、アミノエチル基、アミノプロピル基、アンモニウム基、アミド基、カルボキシメチル基、スルホン酸基、リン酸基などの親水性基を有するものを挙げることができ、具体的には、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、デンプン誘導体、カルボキシメチルセルロースおよびそのナトリウム塩、セルロースアセテート、アルギン酸ナトリウム、酢酸ビニル−マレイン酸コポリマー類、スチレン−マレイン酸コポリマー類、ポリアクリル酸類およびそれらの塩、ポリメタクリル酸類およびそれらの塩、ヒドロキシエチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシエチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシピロピルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシプロピルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）類、ヒドロキシプロピレンポリマー類、ポリビニルアルコール類、加水分解度が６０モル％以上、好ましくは８０モル％以上である加水分解ポリビニルアセテート、ポリビニルホルマール、ポリビニルブチラール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、メタクリルアミドのホモポリマーおよびポリマー、Ｎ−メチロールアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、アルコール可溶性ナイロン、２，２−ビス−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパンとエピクロロヒドリンとのポリエーテルなどを挙げることができるが、ＰＥＧが好ましい。ＰＥＧの分子量は特に限定されず、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００などを用いることができる。
【００３７】
なお、後述する実施例においては、本発明に係るペプチドと結合した脂質として、図１に示すように、ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドのＮ末端に、グリシン残基（Ｇ）、グリシン残基（Ｇ）、システイン残基（Ｃ）および親水性ポリマーがこの順で結合してなる高分子化合物を介して結合した脂質を用いている。具体的には、ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドに付加したシステイン残基を介してマレイミド化された親水性ポリマーの一部に結合し、さらにこの親水性ポリマーが脂質と結合した構造を有するものである。
【００３８】
親水性ポリマーと本発明に係るペプチドとは、例えば、親水性ポリマーが有する官能基と、本発明に係るペプチドが有する官能基との間に共有結合を形成させて結合させることができる。一般的に、共有結合を形成できる官能基の組み合わせとしては、例えば、アミノ基／カルボキシル基、アミノ基／ハロゲン化アシル基、アミノ基／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、アミノ基／ベンゾトリアゾールカーボネート基、アミノ基／アルデヒド基、チオール基／マレイミド基、チオール基／ビニルスルホン基などを挙げることができ、本発明に係るペプチドの場合には、例えば、チオール基を有するシステイン残基を本発明に係るペプチドに付加し、このチオール基を用いて親水性ポリマーと結合させることができる。
【００３９】
システインなどのチオール基を有するアミノ酸残基を付加した本発明に係るペプチドを、チオール基を介して親水性ポリマーに結合させる方法、ならびにこの様な親水性ポリマーと脂質との結合は、Ｌｕら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ、２００６年、第１１０巻、第５０５−５１３頁）によって報告されており、本発明に係るペプチドと結合した脂質は、このＬｕらの方法を利用して調製することができるが、係る方法には限定されない。チオール基を有するアミノ酸残基の付加は、本発明に係るペプチドのＮ末端側、Ｃ末端側のいずれでもよい。
【００４０】
脂質は一般にカルボニル基、アミノ基または水酸基などの化学的に活性化可能な官能基を有しており、これらの適当な官能基と本発明に係るペプチドが有する官能基、本発明に係るペプチドに付加されたアミノ酸が有する官能基、あるいは前記親水性ポリマーの有する官能基との間の化学反応によって、上述した調製法の他、本発明に係る「ペプチドと結合した脂質」を調製することができる。例えば、脂質がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、これに前記高分子化合物を介してＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドを結合させる場合には、Ｍａｒｔｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９２年、第１１１３巻、第１７１−１９９頁）が知られている。すなわち、前記親水性ポリマーの水酸基をカルボン酸に変換し、そのカルボキシル基とＰＥのアミノ基との間で縮合反応を行うことで、本発明に係るペプチドと結合したＰＥを調製することができる。
【００４１】
上述した高分子化合物を介して本発明に係るペプチドと結合したステロール類を作製する方法としては、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａらの報告(Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００１年、第１７巻、第２０６７−２０７５頁) が知られている。すなわち、ステロール類が有する水酸基をトシル基などで活性化し、有機溶媒中で上述した親水性ポリマーの水酸基によるＳＮ２反応を用いることで、本発明に係るペプチドと結合したステロール類を調製することができる。
【００４２】
さらに、上述した高分子化合物を介して本発明に係るペプチドと結合した長鎖脂肪酸を調製する方法としては、上述した親水性ポリマーにアミノ基を導入し、このアミノ基と長鎖脂肪酸のカルボキシル基との間で縮合反応を行うことで、本発明に係るペプチドと結合した長鎖脂肪酸を調製することができる。
【００４３】
なお、本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体を構成する脂質膜は、本発明に係るペプチドと結合した脂質を複数種類含んでいてもよい。例えば、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＫＬＧＲペプチドと結合した別のリン脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＫＬＧＲペプチドと結合したステロール、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＫＬＧＲペプチドと結合した糖脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したステロールとＲＬＴＲペプチドと結合した糖脂質、ＫＬＧＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合した糖脂質、ＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合した別のリン脂質、ＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合したステロール、ＲＬＴＲペプチドと結合したリン脂質とＲＬＴＲペプチドと結合した糖脂質など、任意に選択することができる。
【００４４】
また、本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体における、本発明に係るペプチドと結合した脂質の割合Ｐは、本発明に係るペプチドと結合した脂質を除く構成脂質（他の構成脂質）の総量を１００ｍｏｌ％とした場合、当該総量に対して、１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％が好ましい。
【００４５】
本発明において、脂質膜構造体の脂質膜には、上述した脂質の他に、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの抗酸化剤、ステアリルアミン、オレイルアミンなどの正荷電を付与する荷電物質、ジセチルホスフェートなどの負電荷を付与する荷電物質、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質などの膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。
【００４６】
本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体は、あらかじめ本発明に係るペプチドと結合した脂質を調製し、これを用いて脂質膜構造体を調製することにより製造してもよく、脂質膜構造体を調製した後、当該脂質膜構造体に本発明に係るペプチドと結合した脂質を添加して、他の構成脂質の間隙に、本発明に係るペプチドと結合した脂質を挿入し、これを構成脂質とすることにより製造してもよい。あるいは、脂質膜構造体を調製した後、当該脂質膜構造体に本発明に係るペプチドや何らかのリンカーを結合した本発明に係るペプチドを添加して、本発明に係るペプチドや何らかのリンカーを結合した本発明に係るペプチドを構成脂質に結合させることにより製造してもよい。
【００４７】
なお、本発明において、脂質膜構造体は、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法などの公知の方法を用いて作製することができる。例えば水和法の場合、本発明に係るペプチドと結合した脂質、さらにはその他の脂質や先に記載した脂質膜に含まれる任意成分を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得た後、脂質膜を水和させ、攪拌または超音波処理することにより、本発明に係るペプチドと結合した脂質を膜の構成成分として含む脂質膜構造体を製造することができる。
【００４８】
上述した方法において、有機溶媒として、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの炭化水素類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、メタノール、エタノールなどの低級アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類などを、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００４９】
次に、本発明は、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤を提供する。本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤は、上述した本発明に係るペプチド、すなわちＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドを有効成分とする。なお、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤において、上述した本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／もしくは増強するペプチドまたは肝臓血管内皮細胞への移行能を有するもしくは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００５０】
最後に、本発明は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体の製造方法を提供する。本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体の製造方法は、下記（ａ）の工程を有する；
（ａ）ＫＬＧＲペプチドおよび／またはＲＬＴＲペプチドで脂質膜構造体を修飾する工程。
なお、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体の製造方法において、上述した本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／もしくは増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するもしくは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体または脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／もしくは増強する剤と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００５１】
工程（ａ）において、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチド、すなわち本発明に係るペプチドで脂質膜構造体を修飾する態様としては、脂質膜構造体の構成脂質に本発明に係るペプチドを結合する態様や、脂質膜構造体の構成脂質の間隙に本発明に係るペプチドを挿入する態様などを挙げることができる。
【００５２】
工程（ａ）において、本発明に係るペプチドで脂質膜構造体を修飾する方法は特に限定されず、当業者が適宜選択可能な手法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、下記（ｉ）〜（ｖ）を挙げることができる；
（ｉ）本発明に係るペプチドを先ず脂質に結合させた後、このペプチドと結合した脂質を構成脂質とする脂質膜構造体を調製する方法、
（ｉｉ）脂質膜構造体を調製した後に本発明に係るペプチドと結合した脂質を添加して、他の構成脂質の間隙に、本発明に係るペプチドと結合した脂質を挿入して、これを構成脂質とする方法、
（ｉｉｉ）脂質膜構造体を調製した後に本発明に係るペプチドを添加し、構成脂質に本発明に係るペプチドを結合させる方法、
（ｉｖ）脂質膜構造体を調製した後に本発明に係るペプチドを添加し、構成脂質の間隙に本発明に係るペプチドを挿入する方法、
（ｖ）脂質膜構造体の調製時に本発明に係るペプチドを添加し、構成脂質の間隙に本発明に係るペプチドを挿入する方法。
【００５３】
なお、工程（ａ）において、脂質膜構造体は、本発明に係る肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体に用いることのできる脂質膜構造体と同様のものを用いることができる。また、本発明に係るペプチドを脂質または構成脂質に結合させる場合は、直接結合させてもよく、上述したリンカーを介して結合させてもよい。また、本発明に係るペプチドを構成脂質の間隙に挿入する場合、本発明に係るペプチドを直接挿入してもよく、本発明に係るペプチドに上述した抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質などを結合した上で、これを挿入するなどしてもよい。なお、本発明に係るペプチドと脂質とを結合する方法、脂質膜構造体を調製する方法については、上述の通りである。
【００５４】
本発明の脂質膜構造体には、薬剤、核酸、ペプチド、タンパク質、糖またはこれらの複合体などの種々の生理活性物質を封入することができ、診断、治療などの目的に応じて適宜選択することができる。生理活性物質が水溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体内部の水相に生理活性物質を封入することができる。また、生理活性物質が脂溶性である場合には、脂質膜構造体の製造にあたり使用される有機溶剤に生理活性物質を添加することにより、脂質膜構造体の膜あるいは内部に生理活性物質を封入することができる。
【００５５】
本発明において、脂質膜構造体は、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液などの適当な水性溶媒に分散させて使用することができる。分散液には、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤などの添加剤を適宜添加してもよい。また、本発明において脂質膜構造体は、前記の分散液を乾燥させた状態で保存することができる。さらに、本発明において、脂質膜構造体は、経口投与することができる他、静脈、腹腔内、皮下、経鼻などへの非経口投与も可能である。
【００５６】
以下、本発明に係る脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強する剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞リポソームの調製
（１）構成脂質の調製
ＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＫＬＧＲペプチド」という。）のＮ末端に２残基のグリシン（Ｇ）およびシステイン残基（Ｃ）がこの順で付加したＣＧＧＫＬＧＲＫＲＴＬＲ（配列番号１２）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＫＬＧＲ付加ペプチド」とする。）をクラボウ社から購入した。マレイミド基が付加された分子量２０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ２０００）およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)の結合体であるＭａｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥとＫＬＧＲ付加ペプチドとを、ｍｏｌ比が１：１．２となるように混合して３７℃で２４時間振盪することにより、ＫＬＧＲ付加ペプチドのＮ末端のシステイン（Ｃ）のチオール基とマレイミド基とを結合して、ＫＬＧＲ付加ペプチド、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなる脂質（ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）を得た。
【００５８】
また、ＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号２）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＲＬＴＲペプチド」という。）のＮ末端に２残基のＧおよびＣがこの順で付加したＣＧＧＲＬＴＲＫＲＧＬＫ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＲＬＴＲ付加ペプチド」とする。）を東レ社から購入し、同様にして、ＲＬＴＲ付加ペプチドのＮ末端のシステイン（Ｃ）のチオール基とマレイミド基とを結合して、ＲＬＴＲ付加ペプチド、ＰＥＧ２０００およびＤＳＰＥがこの順で結合してなる脂質（ＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）を得た。ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥおよびＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥの構造の模式図を図１に示す。
【００５９】
また、リポソームの構成脂質として、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ｄｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＣ−６−１４）、ジオレオイルグリセロフォスフォエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＰＥＧ２０００が結合したＤＳＰＥ（ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）、１−ｍｅｔｈｙｌ−４，４−ｂｉｓ［（９Ｚ，１２Ｚ）−ｏｃｔａｄｅｃａ−９，１２−ｄｉｅｎ−１−ｙｌｏｘｙ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ（ＹＳＫ０５）、ＰＥＧ２０００が結合した１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）、ＰＥＧ２０００が結合した１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００）、ローダミンで標識したＤＯＰＥ（ローダミンＤＯＰＥ）および３Ｈで標識したＣｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｅｔｈｅｒ（３Ｈ−ＣＨＥ）を用意した。また、ＫＬＧＲペプチドがＰＥＧを介さずに結合した脂質として、ＫＬＧＲ付加ペプチドのＮ末端にステアリン酸が結合してなる脂質（ＫＬＧＲ−ＳＴＲ）を東レ社から購入した。
【００６０】
（２）リポソームの調製
［２−１］コントロールリポソームならびにＫＬＧＲペプチド、ＲＬＴＲペプチドおよびＰＥＧを修飾したリポソーム
クロロホルムおよびエタノールを混合した溶媒に、ｍｏｌ比が以下の割合１〜４となるよう各種の脂質を溶解して混合脂質溶液とし、ガラス管に入れて溶媒を減圧留去することにより脂質膜を得た。脂質膜に１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて１０分間インキュベートすることにより脂質膜を水和させた。続いて、バスタイプソニケーターを用いて約３０秒間超音波処理することによりリポソームを調製した。割合１〜４の混合脂質溶液から得られたリポソームを、それぞれコントロールリポソームＡ、コントロールリポソームＢ、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧ修飾リポソームとした。割合３においてＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが１、３、５、１０および１５の混合脂質溶液からは、他の構成脂質総量に対して、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質の割合（以下、「ＫＬＧＲペプチドの修飾割合」という。）がそれぞれ１、３、５、１０および１５ｍｏｌ％であるＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームが得られた。また、割合４においてＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが１、３、５および１０の混合脂質溶液からは、他の構成脂質総量に対して、ＲＬＴＲペプチドと結合した脂質の割合（以下、「ＲＬＴＲペプチドの修飾割合」という。）がそれぞれ１、３、５および１０ｍｏｌ％であるＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームが得られた。また、割合５においてＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが１、５、１０および１５の混合脂質溶液からは、他の構成脂質総量に対して、ＰＥＧと結合した脂質の割合（以下、「ＰＥＧの修飾割合」という。）がそれぞれ１、３、５、１０および１５ｍｏｌ％であるＰＥＧ修飾リポソームが得られた。
【００６１】
混合脂質溶液における各種の脂質の割合
割合１（コントロールリポソームＡ）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ＝７：３
割合２（コントロールリポソームＢ）ＤＣ−６−１４：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝４：３：３
割合３（ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ＝７０：３０：１、３、５、１０または１５
割合４（ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＲＬＴＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ＝７０：３０：１、３、５または１０
割合５（ＰＥＧ修飾リポソーム）ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ＝７０：３０：１、３、５、１０または１５
【００６２】
［２−２］ｓｉＲＮＡ内包ｐＨ依存性カチオン性リポソーム
〈２−２−１〉ｓｉＲＮＡ内包ｐＨ依存性カチオン性リポソームの調製
脂質膜構造体にｐＨ依存性カチオン性を付与する脂質であるＹＳＫ０５（特願２０１２−１１９５２１）を構成脂質として含むとともに、ｓｉＲＮＡを内包するｐＨ依存性カチオン性リポソームを調製した。具体的には、ＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００またはＤＳＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３となるよう９０％（ｖ／ｖ）ｔＢｕｔｙｌ水溶液に加えて、混合脂質溶液とした。肝実質細胞マーカー遺伝子であるＦ７遺伝子伝令ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−Ｆ７）、および肝血管内皮細胞マーカー遺伝子であるＴｉｅ２遺伝子伝令ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（ａｎｔｉ−Ｔｉｅ２）を、それぞれ２ｍｇ／ｍＬとなるようＤＤＷに溶解してｓｉＲＮＡ溶液とした。混合脂質溶液をボルテックスミキサーにより攪拌しながらｓｉＲＮＡ溶液８０μＬを滴下した後、１ｍＬシリンジおよび２７Ｇ針を用いて全量を回収した。２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）２ｍＬを攪拌しながら、回収した溶液を全量注入することにより、ｓｉＲＮＡを内包するリポソームを形成させた。適量のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）を加えて希釈した後、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）およびＰＢＳを用いて限外ろ過を行うことにより外液をＰＢＳに交換した。ａｎｔｉ−Ｆ７を内包するリポソームをＦ７内包ＹＳＫリポソーム、ａｎｔｉ−Ｔｉｅ２を内包するリポソームをＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームとした。なお、ａｎｔｉ−Ｆ７およびａｎｔｉ−Ｔｉｅ２の配列は下記のとおりである。
【００６３】
ａｎｔｉ−Ｆ７
センス鎖；５’−ＧＧＡＵＣＡＵＣＵＣＡＡＧＵＣＵＵＡＣＴＴ−３’（配列番号１４）
アンチセンス鎖；５’−ＧＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＣＴＴ−３’（配列番号１５）
ａｎｔｉ−Ｔｉｅ２
センス鎖；５’−ＡＵＡＵＣＵＧＧＧＣＡＡＡＵＧＡＵＧＧ−３’（配列番号１６）
アンチセンス鎖；５’−ＣＣＡＵＣＡＵＵＵＧＣＣＣＡＧＡＵＡＵ−３’（配列番号１７）
【００６４】
〈２−２−２〉ｓｉＲＮＡ内包率の確認
本実施例１（２）［２−２］〈２−２−１〉のＦ７内包ＹＳＫリポソームについて、２本鎖の核酸にインターカレートして蛍光を発するＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を用いて、ｓｉＲＮＡ内包率を測定した。具体的には、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを２５０倍、５００倍および１０００倍に希釈してリポソーム希釈液とした。リポソーム希釈液の半量にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．２％（ｗ／ｖ）となるよう添加して分解リポソーム希釈液とした。リポソーム希釈液および分解リポソーム希釈液各５０μＬに、２００倍に希釈したＲｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を５０μＬずつ加えた後、蛍光プレートリーダーを用いて、励起波長４９５ｎｍおよび蛍光波長５２５ｎｍで蛍光強度を測定した。リポソーム希釈液における蛍光強度を分解前蛍光強度とし、分解リポソーム希釈液における蛍光強度を分解後蛍光強度とした。続いて、希釈倍率ごとに、式１；ｓｉＲＮＡ内包率（％）＝｛（分解後蛍光強度−分解前蛍光強度）／分解後蛍光強度｝×１００によりｓｉＲＮＡ内包率を算出した。その後、２５０倍、５００倍および１０００倍のｓｉＲＮＡ内包率の平均値および標準偏差を求めたところ、９６±６％であった。この結果から、リポソームの調製に用いたｓｉＲＮＡの大部分がリポソームに内包されていることが確認された。
【００６５】
［２−３］空ｐＨ依存性カチオン性リポソーム
ｓｉＲＮＡ溶液に代えて２０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いて、本実施例１（２）［２−２］に記載の方法を行うことにより、ｓｉＲＮＡを内包しないｐＨ依存性カチオン性リポソームを得て、これを空ＹＳＫリポソームとした。
【００６６】
［２−４］ＫＬＧＲペプチドを修飾したｐＨ依存性カチオン性リポソーム
本実施例１（２）［２−２］のＦ７内包ＹＳＫリポソームおよびＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームならびに本実施例１（２）［２−３］の空ＹＳＫリポソームに、ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥまたはＫＬＧＲ−ＳＴＲを、他の構成脂質総量に対して、１、３、５または７ｍｏｌ％となるようそれぞれ添加して、室温にて３０分間インキュベートすることにより、ＫＬＧＲペプチドで各リポソームを修飾した。ここで、ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥまたはＫＬＧＲ−ＳＴＲを添加した割合は、ＫＬＧＲペプチドで修飾したリポソームにおいて「ＫＬＧＲペプチドの修飾割合」に相当する。ＫＬＧＲ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥを添加して得られたリポソームを、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソーム、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームとし、ＫＬＧＲ−ＳＴＲを添加して得られたリポソームを、ＫＬＧＲ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソーム、ＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ修飾空ＹＳＫリポソームとした。
【００６７】
［２−５］ローダミンで標識したリポソーム
他の構成脂質総量に対して１ｍｏｌ％となるようローダミンＤＯＰＥを混合脂質溶液に添加して、本実施例１（２）［２−１］〜［２−４］に記載の方法を行うことにより、ローダミンで標識したリポソームを調製した。
【００６８】
［２−６］３Ｈで標識したリポソーム
適量の３Ｈ−ＣＨＥを混合脂質溶液に添加して、本実施例１（２）［２−１］に記載の方法を行うことにより、３Ｈで標識したコントロールリポソームＡおよび５ｍｏｌ％ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを調製した。
【００６９】
（３）リポソームの物性
本実施例１（２）［２−１］のコントロールリポソームＡ、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧ修飾リポソーム、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％の本実施例１（２）［２−２］のＦ７内包ＹＳＫリポソームおよび本実施例１（２）［２−４］のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームについて、動的光散乱測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）によりＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で平均粒子径およびゼータ電位を測定した。その結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
2014114267.tif 000003
【００７１】
表１に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの粒子径は、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して、同等であった。一方、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームのゼータ電位は、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して大きく、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％以上では、正の値であった。これらの結果から、他の構成脂質がＥＰＣおよびＣｈｏｌの場合、他の構成脂質総量に対するＫＬＧＲペプチドと結合した脂質の割合が５ｍｏｌ％以上では、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームはカチオン性を呈することが明らかになった。
【００７２】
また、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームの平均粒子径は、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームと比較してやや大きかった。また、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームのいずれも、ゼータ電位はｐＨ７．４において僅かにカチオン性を呈しており、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームと比較してＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームの方がカチオン性はやや大きかった。
【００７３】
＜実施例２＞リポソームの分布
（１）カチオン性リポソームの肝臓および肺での分布
［１−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの分布
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意した。リポソームを１．６５ｎｍｏｌ／μＬの脂質濃度となるようＫｒｅｂｓ緩衝液に懸濁し、４〜５週齢のＩＣＲマウスに４００μＬずつ尾静脈内投与した。投与から２５分後に肝臓および肺を採取した。肝臓については、４０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含むＰＢＳを大静脈から流すことにより血管に残っている血液および血管内皮細胞表面のリポソームを除去した。肺については、生理食塩水で血液を洗い流した。肝臓および肺を、１０〜１５ｍｍ長さのブロックに刻んだ後、Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４を含むＨＥＰＥＳ緩衝液を添加して１時間インキュベートすることにより血管内皮細胞を染色した。その後、肝臓および肺を３．５ｃｍのガラスボトムディッシュに置いて、共焦点顕微鏡を用いてローダミンおよびＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光観察を行った。その結果を図２に示す。
【００７４】
［１−２］ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの分布
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意し、本実施例２（１）［１−１］に記載の方法によりマウスに投与して肺を観察した。その結果を図３に示す。
【００７５】
図２上図および図３に示すように、肝臓では、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合およびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合のいずれも、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）と同じ位置に観察され、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光が多数検出された。これに対し、コントロールリポソームＢを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）の周囲に斑点状に観察され、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光は少数であった。一方、図２下図に示すように、肺では、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）の周囲に細かい点状に観察された。また、コントロールリポソームＢを投与した場合、肝臓と同様に、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）の周囲に斑点状に観察された。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、肝臓血管皮細胞と同じ位置に検出され、かつ肺の血管内皮細胞と同じ位置に検出されなかったのに対し、コントロールリポソームＢは肝臓血管内皮細胞および肺の血管内皮細胞のいずれとも同じ位置にほとんど検出されなかった。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行することが明らかになった。
【００７６】
（２）ｐＨ依存性カチオン性リポソームの肝臓での分布
実施例１（２）［２−３］〜［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、空ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームを用意した。ただし、混合脂質溶液の組成はＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３とした。これらのリポソームを、本実施例２（１）に記載の方法によりマウスに投与して肝臓を採取し、蛍光観察を行った。ただし、肝臓の採取は投与から３０分後に行った。その結果を図４に示す。
【００７７】
図４に示すように、空ＹＳＫリポソームを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）はＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）と同じ位置のみならず、Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）から、比較的離れた位置にも観察された。これに対し、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームを投与した場合、ローダミンの蛍光（赤色）は専らＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）と同じ位置に観察された。すなわち、空ＹＳＫリポソームは肝臓血管内皮細胞と同じ位置のみならず肝実質細胞に相当する位置にも検出されたのに対し、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームは専ら肝臓血管皮細胞と同じ位置のみで検出された。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾空ＹＳＫリポソームは肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行することが明らかになった。
【００７８】
（３）競合阻害の効果
［３−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−１］に記載の方法により、ローダミンで標識していない、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意し、それぞれ非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰおよび非標識コントロールＬＰとした。また、実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意し、これを標識ＫＬＧＲペプチドＬＰとした。４〜５週齢のＩＣＲマウスを３匹用意し、マウスａ、ｂおよびｃとした。本実施例２（１）に記載の方法により、これらのマウスに標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを投与して肝臓を採取し、蛍光観察を行った。ただし、標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを投与する１５分前に、マウスｂには非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰを、マウスｃには非標識コントロールＬＰを、それぞれ８．２５ｎｍｏｌ／μＬの脂質濃度で含むＫｒｅｂｓ緩衝液を４００μＬずつ前投与した。その結果を図５に示す。
【００７９】
［３−２］ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−１］に記載の方法により、ローダミンで標識していない、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢを用意し、それぞれ非標識ＲＬＴＲペプチドＬＰおよび非標識コントロールＬＰとした。また、実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意し、これを標識ＲＬＴＲペプチドＬＰとした。これらのリポソームを、本実施例２（３）［３−１］に記載の方法によりマウスに投与して肝臓を観察した。その結果を図６に示す。
【００８０】
図５および図６に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームのいずれを投与した場合も、ローダミンの蛍光（赤色）とＩｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４の蛍光（緑色）との重複を示す黄色の蛍光は、マウスａと比較して、マウスｂでは顕著に減少したのに対し、マウスｃではほぼ同等であった。すなわち、肝臓血管内皮細胞と同じ位置に検出された標識ＫＬＧＲペプチドＬＰおよび標識ＲＬＴＲペプチドＬＰの量は、非標識コントロールＬＰの前投与によっては減少しなかったのに対し、非標識ＫＬＧＲペプチドＬＰおよび非標識ＲＬＴＲペプチドＬＰの前投与によって、顕著に減少した。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、肝臓血管内皮細胞へ選択的に移行することが明らかになった。
【００８１】
（４）各組織におけるリポソームの濃度
［４−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−６］に記載の方法により、３Ｈで標識したコントロールリポソームＡおよびＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意した。ＩＣＲマウスを４匹ずつ２群に分け、一方の群にはコントロールリポソームＡを、他方の群にはＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを、それぞれ本実施例２（１）に記載の方法により尾静脈内投与した。投与から２５分後に解剖して、肝臓、肺、脾臓、腎臓および血液を採取し、重量を測定した。その後、各サンプルをソルエン３５０（パーキンエルマージャパン社）中で５０℃にて５時間インキュベートすることにより溶解した。続いて、血液については、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理することにより脱色した。その後、各サンプルに１０ｍＬのＨｉｏｎｉｃ Ｆｌｏｕｒ（パーキンエルマージャパン社）を加え、液体シンチレーションカウンターを用いて３Ｈの放射線測定を行った。重量および放射線の測定結果に基づき、各サンプルの放射線濃度を算出し、投与量に対する百分率（％ＩＤ）で表して、群毎に平均値および標準偏差を算出した。その結果を図７に示す。
【００８２】
図７に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した群では、肝臓における％ＩＤが最も大きく、次いで、血液における％ＩＤが大きく、肺、脾臓および腎臓における％ＩＤは小さかった。これに対し、コントロールリポソームＡを投与した群では、血液における％ＩＤが最も大きく、次いで、肝臓における％ＩＤが大きく、肺、脾臓および腎臓における％ＩＤは小さかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、静脈内投与した後、投与量の大部分が速やかに肝臓に集積した。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは肝臓血管内皮細胞へ効率的に移行することが明らかになった。
【００８３】
［４−２］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した場合
実施例１（２）［２−６］に記載の方法により、３Ｈで標識したコントロールリポソームＡ、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意した。これらのリポソームを本実施例（４）［４−１］に記載の方法によりマウスに投与し、肝臓、肺および脾臓における３Ｈの放射線測定を行った。また、測定結果について、コントロールリポソームＡの場合に対して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った。その結果を図８に示す。
【００８４】
図８に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した群およびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを投与した群では、コントロールリポソームＡを投与した群と比較して、肝臓における％ＩＤが顕著に大きかった。これに対して、肺および脾臓における％ＩＤは、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＡを投与した群のいずれにおいても同等に小さかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、静脈内投与した後、投与量の大部分が速やかに肝臓に集積した。このことから、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは肝臓血管内皮細胞へ効率的かつ選択的に移行することが明らかになった。
【００８５】
以上の本実施例２（１）〜（４）の結果から、ＫＬＧＲペプチドおよびＲＬＴＲペプチドは、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強すること、ならびにＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体およびＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体であることが示された。
【００８６】
＜実施例３＞リポソームの細胞内取り込み
（１）肝臓血管内皮初代培養細胞の単離
肝臓血管内皮初代培養細胞を既報（Ｋ．Ｈｉｄａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第６４巻、第８２４９〜８２５５頁、２００４年；Ａｋｉｎｏ Ｔ.ら、ＡＭ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、第１７５巻、第６号、第２６５７〜２６６７頁、２００９年；Ｏｈｇａ Ｎ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．ら、第１００巻、第１０号、第１９６３〜１９７０頁、２００９年）に従い単離した。具体的には、まず、雌性ＫＳＮヌードマウスから肝臓を摘出して、ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）溶液に加え、その溶液中でハサミを用いて肝臓を細かく切断し、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液と同量のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ社）を用いて１段階のスクロース密度勾配遠心分離を行って血球細胞を除去し、得られた細胞懸濁液を濾過した。続いて、ＣＤ３１マイクロビーズキット（ＭＡＣＳ；ミルテニーバイオテック社）およびＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３１抗体を用いて、添付の使用書に従い、ＣＤ３１陽性の内皮細胞を回収した。回収した細胞は１．５％のゼラチン(ＳＩＧＭＡ社)を含有するＰＢＳでコーティングした培養皿に播き、これを肝臓血管内皮初代培養細胞とした。肝臓血管内皮初代培養細胞の培養は、１０％（ｖ／ｖ）となるよう仔ウシ血清を添加した、血管内皮細胞専用培地であるＥＧＭ−２ＭＶ(Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社)を用いて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で行った。
【００８７】
（２）リポソームの細胞内取り込み量
［２−１］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの細胞内取り込み量
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、コントロールリポソームＡ、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１〜１５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧの修飾割合が１〜１５ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾リポソームを用意した。本実施例３（１）の肝臓血管内皮初代培養細胞を２４ウェルプレートに４×１０４個／ウェルで播種して２４時間培養した後、ＰＢＳ（−）でウェルを洗浄した。次に、各リポソームをウェル２個ずつに添加した。添加量は２５ｎｍｏｌ（脂質量）／ウェルとした。３７℃で３時間インキュベートすることによりリポソームを細胞に取り込ませた後、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した。続いて、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１ウェルにつき７５ｕＬ添加して、−８０℃で２０分間以上静置した後、解凍することにより細胞を溶解した。セルスクレーパーを用いて溶解した細胞を回収し、４℃、１５００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離を行った。上清５０μＬを回収して、励起波長５５０ｎｍおよび蛍光波長５９０ｎｍでローダミンの蛍光強度を測定した。以上の実験を３回行い、取り込ませたリポソームの種類毎に、３回の実験の測定結果の平均値および標準偏差を算出した。また、平均値について、コントロールリポソームＡの場合に対して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った。その結果を図９に示す。
【００８８】
図９に示すように、蛍光強度は、ＰＥＧ修飾リポソームでは、コントロールリポソームＡと比較して、ＰＥＧの修飾割合に関わらずほぼ同等であった。これに対して、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームでは、コントロールリポソームＡと比較して、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１ｍｏｌ％の場合に大きい傾向であり、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５、１０および１５ｍｏｌ％の場合に有意に大きかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれる量が多かった。
【００８９】
また、蛍光強度を、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合の間で比較すると、５ｍｏｌ％＞１０ｍｏｌ％＞１５ｍｏｌ％＞１ｍｏｌ％の順であった。すなわち、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下の場合に、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれるＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの量が特に多かった。
【００９０】
［２−２］ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの細胞内取り込み量
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、コントロールリポソームＡ、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１〜１０ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が１〜１０ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＰＥＧの修飾割合が１〜１０ｍｏｌ％のＰＥＧ修飾リポソームを用意した。本実施例３（２）［２−１］に記載の方法により、これらのリポソームを肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込ませて蛍光強度を測定した。その結果を図１０に示す。
【００９１】
図１０に示すように、ＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた場合の蛍光強度は、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを取り込ませた場合と同様であった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、コントロールリポソームＡおよびＰＥＧ修飾リポソームと比較して、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれる量が多かった。また、蛍光強度を、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合の間で比較すると、３ｍｏｌ％＞５ｍｏｌ％＞１ｍｏｌ％≒１０ｍｏｌ％の順であったことから、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が１ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下の場合に、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれるＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの量が特に多かった。
【００９２】
（３）競合阻害の効果
［３−１］リポソームによる競合阻害
実施例１（２）［２−１］に記載の方法により、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢであって、それぞれローダミンで標識しないもの（以下、これらを「非標識リポソーム」という。）を用意した。また、実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソーム、ＲＬＴＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびコントロールリポソームＢであって、それぞれローダミンで標識したもの（以下、これらを「標識リポソーム」という。）を用意した。本実施例３（２）に記載の方法により、標識リポソームを肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込ませて蛍光強度を測定した。ただし、標識リポソームをウェルに添加するのに先立ち、非標識リポソームを添加して３７℃で１時間インキュベートし、その後標識リポソーム２５ｎｍｏｌ／ウェル添加してさらに３７℃で３時間インキュベートした。また、非標識リポソームの添加量は標識リポソームの０倍（添加しない）、２．５倍、５倍、１０倍、２０倍および５０倍量とした。以下、これらのサンプルを標識：非標識＝１：０、１：２．５、１：５、１：１０、１：２０および１：５０という。また、標識：非標識＝１：２．５、１：５、１：１０、１：２０および１：５０の蛍光強度の測定結果について、標識：非標識＝１：０の場合に対して、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定により有意差検定を行った。その結果を図１１に示す。
【００９３】
図１１に示すように、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームでは、標識：非標識＝１：０と比較して、標識：非標識＝１：２．５、１：５、１：１０、１：２０および１：５０において、蛍光強度が有意に小さかった。これに対し、コントロールリポソームＢでは、標識：非標識＝１：０と比較して、標識：非標識＝１：２．５、１：５および１：１０では蛍光強度がほぼ同等であり、標識：非標識＝１：２０および１：５０では有意に小さかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの場合、先行添加したリポソームの量に関わらず蛍光強度が顕著に減少したのに対し、コントロールリポソームＢの場合、先行添加したリポソームの量が一定以下では、蛍光強度が減少しなかった。このことから、コントロールリポソームＢはランダムに肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれるのに対し、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは選択的に肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれることが明らかになった。
【００９４】
さらに、標識：非標識＝１：０について、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームとコントロールリポソームＢとで蛍光強度を比較すると、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの方が顕著に大きかった。すなわち、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームおよびＲＬＴＲ／ＰＥＧ修飾リポソームは、コントロールリポソームＢと比較して、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込まれる量が多かった。
【００９５】
［３−２］ペプチドによる競合阻害
実施例１（２）［２−１］および［２−５］に記載の方法により、ローダミンで標識した、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームを用意し、本実施例３（２）に記載の方法により、肝臓血管内皮初代培養細胞に取り込ませて蛍光強度を測定した。ただし、リポソームをウェルに添加するのに先立ち、ＫＬＧＲペプチドを０（添加しない）、１２５μｍｏｌ／Ｌおよび６２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加して、３７℃で１時間インキュベートし、その後、リポソームを２５ｎｍｏｌ／ウェルとなるよう添加してさらに３７℃で３時間インキュベートした。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＫＬＧＲペプチドの添加量が１２５および６２５μｍｏｌ／Ｌのいずれの場合も、ＫＬＧＲペプチドを添加しない場合と比較して、蛍光強度はほぼ同等であった。すなわち、リポソームの構成脂質と結合していないＫＬＧＲペプチドは肝臓血管内皮初代培養細胞にほとんど取り込まれないため、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾リポソームの取り込み量に影響を与えないことが明らかになった。
【００９６】
以上の本実施例３（２）〜（３）［３−２］の結果から、ＫＬＧＲペプチドおよびＲＬＴＲペプチドは、脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および／または増強すること、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体およびＲＬＴＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体であること、ならびに、他の構成脂質総量に対して、ＫＬＧＲペプチドやＲＬＴＲペプチドと結合した脂質の割合Ｐが１ｍｏｌ％≦Ｐ≦１０ｍｏｌ％である場合、脂質膜構造体は、より効率的に肝臓血管内皮細胞に移行することが示された。
【００９７】
（４）内包物送達効率
［４−１］ＰＥＧを介してＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含むリポソーム
実施例１（２）［２−２］および［２−４］に記載の方法により、Ｆ７内包ＹＳＫリポソーム、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソーム、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が５ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを用意した。ただし、混合脂質溶液の組成はＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３とした。４週齢の雄性ＩＣＲマウスを２〜３匹ずつ６群に分け、そのうち２群は何も投与せず、コントロール（Ｆ７）群およびコントロール（Ｔｉｅ２）群とした。残りの４群に、各リポソームを１ｍｇ（ｓｉＲＮＡ量）／ｋｇの投与量で尾静脈内投与し、投与から２４時間後に肝臓を採取した。また、コントロール（Ｆ７）群およびコントロール（Ｔｉｅ２）群からも肝臓を採取した。採取した肝臓２０ｍｇをＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)１ｍＬに加えて、Ｍｉｃｒｏ Ｓｍａｓｈ ＭＳ−１００Ｒ（ＴＯＭＹ社）を用いて破砕した。続いて、クロロホルム２００μＬを加えてボルテックスした後、室温に３分間静置した。４℃、１２０００ｇの条件下で１５分間遠心分離を行って水層を回収し、５００μＬのイソプロパノールを加えた。次いで、同条件で遠心分離を行い、上清を除去した。ペレットに４℃の７０％（ｖ／ｖ）エタノール１ｍＬを加えてボルテックスした後、同条件で再度遠心分離を行って、上清を除去した。室温で２０分間風乾した後、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅの水を加えてペレットを溶解し、肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡを含む溶液とした。肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。次に、１μｇの肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを調製して、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。続いて、ｃＤＮＡを鋳型として下記条件によりリアルタイムＰＣＲを行って、Ｆ７遺伝子およびＴｉｅ２遺伝子の発現量を測定した。発現量は比較Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）法により、βアクチン（Ａｃｔｂ）遺伝子の発現量に対する相対値として表し、群ごとに平均値および標準偏差を求めた。続いて、Ｆ７遺伝子についてはコントロール（Ｆ７）群の、Ｔｉｅ２遺伝子についてはコントロール（Ｔｉｅ２）群の平均値をそれぞれ１として、各群の平均値を相対発現量として表した。その結果を図１３に示す。
【００９８】
リアルタイムＰＣＲの条件
反応液の組成；１０倍希釈したｃＤＮＡを含む溶液１２μＬ、ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＱＰＫ−２０１(ＴＯＹＯＢＯ社)１２．５μＬ、２０μｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマー（ＦＰ）溶液０．２５μＬ、２０μｍｏｌ／Ｌのリバースプライマー（ＲＰ）溶液０．２５μＬ（計２５μＬ）
ＰＣＲ反応システム；Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＱＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）
反応サイクル；９５℃１０分を１サイクル、続いて９５℃１５秒および６０℃１分を１サイクルとして４０サイクル
プライマー；Ｆ７遺伝子 ＦＰ：５’−ＴＣＧＡＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号１８）、Ｆ７遺伝子 ＲＰ：５’−ＣＣＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＣＴＡＧＧＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１９）、Ｔｉｅ２遺伝子 ＦＰ：５’−ＡＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＴＴＡＴＧＡ−３’（配列番号２０）、Ｔｉｅ２遺伝子 ＲＰ：５’−ＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴ−３’（配列番号２１）、Ａｃｔｂ遺伝子 ＦＰ：５’−ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号２２）、Ａｃｔｂ遺伝子 ＲＰ：５’−ＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＧＣＴＣＡ−３’（配列番号２３）
【００９９】
図１３に示すように、Ｆ７遺伝子の発現量は、コントロール群と比較して、Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを投与した群では小さかったのに対して、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｆ７内包ＹＳＫリポソームを投与した群では同等であった。これに対し、Ｔｉｅ２遺伝子の発現量は、コントロール群と比較して、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群およびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群のいずれにおいても小さかった。すなわち、リポソームがその内包物を細胞内へ送達して、細胞内で内包物の機能を発揮させる効率は、ＹＳＫリポソームでは、肝実質細胞および肝臓血管内皮細胞のいずれに対しても同等であったのに対し、ＫＬＧＲペプチドを修飾したＹＳＫリポソームでは、肝実質細胞に対しては小さく、肝臓血管内皮細胞に対しては大きかった。この結果から、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、選択的に肝臓血管内皮細胞へ移行して、内包物を送達できることが示された。
【０１００】
［４−２］ＰＥＧを介さずにＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含むリポソーム
実施例１（２）［２−２］および［２−４］に記載の方法により、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソーム、ならびにＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１〜７ｍｏｌ％のＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを用意した。ただし、混合脂質溶液の組成はＹＳＫ０５：Ｃｈｏｌ：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＝７０：３０：３とした。週齢の雄性ＩＣＲマウスを４匹ずつ１０群に分け、本実施例３（４）［４−１］に記載の方法により、これらのリポソームをマウスに投与して、肝臓におけるＴｉｅ２遺伝子の発現量を測定した。その結果を図１４に示す。
【０１０１】
図１４に示すように、発現量は、コントロール群と比較して、Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソーム、ＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群のいずれにおいても小さかった。この結果から、ＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、肝臓血管内皮細胞へ内包物を送達できることが示された。また、ＫＬＧＲペプチドの修飾割合が１、３および５ｍｏｌ％では、コントロール群ならびにＴｉｅ２内包ＹＳＫリポソームおよびＫＬＧＲ／ＰＥＧ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群と比較して、ＫＬＧＲ修飾Ｔｉｅ２内包ＹＳＫリポソームを投与した群の発現量が特に小さかった。この結果から、ＰＥＧを介さずにＫＬＧＲペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む脂質膜構造体は、より効率的に肝臓血管内皮細胞へ移行して内包物を送達できることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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