(57)【要約】      （修正有）【課題】治療薬担持ポリマーを利用し、疾病部位に対して多数の治療薬剤を選択的に標的化するための複合体の提供。【解決手段】（ａ）それぞれ異なるＭＷサイズのデキストラン、ポリグルタミン酸およびデンドリマーから成る群より選択され、かつ、１つ以上の治療薬部分の複製、または二官能性治療薬部分に化学選択的に連結可能であるか、もしくは治療薬部分と非共有的に複合化できる官能基を含む官能化ポリマーと、（ｂ）ソマトスタチン、ＶＩＰ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びドックアンドロック（ＤＮＬ）方法のＡＤペプチドから成る群より選択される認識構造部分とを含み、前記認識構造部分の数は、前記官能化ポリマー当たり１から１０である、複合体。該官能化ポリマーとしては、デキストランであることが好ましい。該官能基としては、１つ以上のアセチレンまたはアジド、ヒドラジド、シクロデキストリン等であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合体であって、
（ａ）１つ以上の治療薬部分の複製、または二官能性治療薬部分に化学選択的に連結可能であるか、もしくは治療薬部分と非共有的に複合化できる官能基を含む官能化ポリマーと、
（ｂ）ポリマー分子当たり１から１０部分の範囲の認識構造部分と、
を含む、複合体。
【請求項２】
前記ポリマーは、それぞれ異なるＭＷサイズのデキストラン、ポリグルタミン酸およびデンドリマーより選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ポリマーはデキストランである、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記認識部分は、例えば、ＨＳＧもしくはＤＴＰＡ等の１つまたは２つのハプテン分子を含有するペプチド、葉酸、ソマトスタチン、ＶＩＰ、ビオチン、アンチセンスオリゴヌクリド、およびドックアンドロック（ＤＮＬ）方法のＡＤペプチドから成る群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記治療薬部分は、化学療法薬、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗血管形成活性剤、アポトーシス促進剤、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、カンプトテシン、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位複合体、ホルモン、毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗菌タンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、緑膿菌外毒素および緑膿菌内毒素から成る群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記官能基は、１つ以上のアセチレン（またはアジド）、ヒドラジド、シクロデキストリン、ビニルスルホン、マレイミド、チオール、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、イソチオシアネートおよび活性カルボキシル基より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記官能基はアセチレンまたはアジドであり、連結は、アジドまたはアセチレンで誘導体化された薬剤を用いて行われる、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記官能基はシクロデキストリンであり、前記治療薬部分は、非共有ホストゲスト複合化によって連結される、請求項６に記載の複合体。
【請求項９】
前記化学療法部分は、単一または複数の薬剤型から生じ得る、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
前記認識部分は、ＤＮＬ方法のＡＤペプチドであり、ＤＮＬアセンブリは、前記ポリマーへの薬剤または治療薬部分の付着前または後のいずれかに行われる、請求項４に記載の複合体。
【請求項１１】
前記薬剤を前記ポリマーに連結するスペーサは、細胞内で開裂可能な結合を含有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記開裂可能結合はヒドラゾン、カテプシン−Ｂ−開裂可能ペプチド、ジスルフィド、またはエステラーゼによって開裂可能なエステル結合である、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記認識部分は、二重または多特異性抗体のアームのうちの１つに特異的であり、前記抗体の１つ以上の他のアームは、ムリン化、キメラ化、霊長類化、ヒト化またはヒト単クローン抗体に由来する疾病標的ＭＡｂであり、前記抗体は、無傷フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ′）２）またはサブフラグメント（一本鎖組成物）形態である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１４】
前記多特異性ＭＡｂは、ＬＬ１、ＬＬ２、ｈＡ２０、１Ｆ５、Ｌ２４３、ＲＳ７、ＰＡＭ−４、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５、Ｍｕ−９、Ｌ１９、Ｇ２５０、Ｊ５９１、ＣＣ４９およびＩｍｍｕ３１から成る群より選択される、１つ以上の抗体を含む、二重特異性および／または二価抗体組成物である、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＭＡｂは、癌細胞もしくは悪性細胞、感染性生物、自己免疫疾病、心血管疾病または神経疾病に関連する抗原または抗原のエピトープと反応する、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１６】
前記癌細胞は、造血性腫瘍、癌腫、肉腫、黒色腫またはグリア腫瘍に由来する細胞である、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１７】
前記ＭＡｂは、Ｂ−細胞系統抗原、Ｔ−細胞抗原、骨髄系統抗原またはＨＬＡ−ＤＲ抗原に結合する、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１８】
前記感染性生物は、バクテリア、ウィルス、真菌、微生物または寄生生物である、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１９】
前記感染性生物は、エイズを引き起こすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、結核菌、アガラクシア連鎖球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジオネラニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌ｓｐ．、血友病性Ｂ型インフルエンザ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、ウエストナイルウィルス、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルス、サイトメガロウィルス、単純ヘルペスウィルスＩ型、単純ヘルペスウィルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、麻疹ウィルス、アデノウィルス、ヒトＴ−細胞白血病ウィルス、エプスタイン−バーウィルス、マウス白血病ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、水疱性口内炎ウィルス、シンドビスウィルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス、いぼウィルス、ブルータングウィルス、センダイウィルス、ネコ白血病ウィルス、レオウィルス、ポリオウィルス、シミアンウィルス４０、マウス乳癌腫瘍ウィルス、デング熱ウィルス、風疹ウィルス、熱帯マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、ブルセイトリパノソーマ、マンソン住吸血虫、日本住吸血虫、ウシバベシア、エルメリア・テネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、羊条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソ条虫亜鋼コルチ、マイコプラズマ関節炎、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オラール、マイコプラズマ・アルギニーニ、アコレプラズマ・レイドロウィ、マイコプラズマ・サリバリウム、およびマイコプラズマ・ニューモニエから成る群より選択される、請求項１８に記載の複合体。
【請求項２０】
前記自己免疫疾病は、免疫媒介性血小板減少、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、関節リウマチ、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、レンサ球菌感染後の腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多型性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチュア症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺亢進、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、胆汁過多、尋常性天疱瘡、ヴェグナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨大細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、線維化性肺胞炎および若年性糖尿病から成る群より選択される、請求項１５に記載の複合体。
【請求項２１】
前記心血管疾病は、心筋梗塞、虚血性心疾患、動脈硬化性プラーク、フィブリン塊、塞栓またはそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の複合体。
【請求項２２】
前記抗体は、神経疾患と関連する抗原を特異的に結合し、前記抗原は、アミロイドまたはβ−アミロイドを含む、請求項１５に記載の複合体。
【請求項２３】
前記疾病標的抗体は、ＣＤ７４、ＣＤ２２、上皮糖タンパク質−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡまたはＣＤ６６ｅ）、大腸特異的抗原−ｐ、α−フェトプロテイン、ＣＣ４９、前立腺特異的膜抗原、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＩＬＧＦ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＰｌＧＦ、他の腫瘍血管形成抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−Ｉ、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、トーマス−フリードリッヒ抗原、腫瘍壊死抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、Ｌ２４３によって結合される抗原、ＰＡＭ４によって結合される抗原、ＣＤ６６ａ（ＢＧＰ）、ＣＤ６６ｂ（ＣＧＭ６）、６６ＣＤｃ（ＮＣＡ）、６６ＣＤｄ（ＣＧＭ１）、ＴＡＣおよびそれらの組み合わせから成る群より選択される抗原に結合する、請求項１５に記載の複合体。
【請求項２４】
前記抗体は、ＬＬ１、ＬＬ２、ＲＦＢ４、ｈＡ２０、１Ｆ５、Ｌ２４３、ＲＳ７、ＰＡＭ−４、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５、Ｍｕ−９、ＡＦＰ−３１、Ｌ１９、Ｇ２５０、Ｊ５９１、ＣＣ４９、Ｌ２４３、ＰＡＭ４およびＩｍｍｕ３１から成る群より選択される、請求項１３に記載の複合体。
【請求項２５】
認識部分の数は１である、請求項１に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく２００７年１月１７日出願の米国特許出願第６０／８８５，３２５号からの優先権を主張し、その文章全体は、それを参照することによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍選択的単クローン抗体（ＭＡｂ）を使用する、疾病部位に対する薬剤、毒素、および放射性核種の標的化は、生物薬剤学的研究の発展している分野であり、３つの認可された製品が、医療活動に影響を与えている（Ｓｈａｒｋｅｙ  ＲＭ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  ＪＣｌｉｎ．２００６；５６：２２６−２４３）。
【０００３】
典型的に、疾病部位上、例えば腫瘍細胞の表面上で発現した抗原に対するＭＡｂは、薬剤あるいは毒素または放射性核種で修飾されて免疫抱合体を形成し、後者は体内で標的化される。免疫抱合体の形成において、限られた数の修飾基のみしか、ＭＡｂの免疫反応性に影響することなく、抗体上に導入することができない。さらに、これらの修飾因子、例えば薬剤の多くは、概して疎水性であり、置換が閾値レベルを超えて増加すると溶解度問題を引き起こす。これらの問題は、薬剤または他の部分を水溶性ポリマー、例えばデキストラン上に担持し、その後、抗体に対して、薬剤−ポリマーをＦｃ領域炭水化物に部位特異的に共有結合することによって対応している。いずれもそれら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｈらの米国特許第４，６９９，７８４号および米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。ある適用においては、直接共役した抗体−ポリマー−薬剤組成物の大きさが問題になる可能性があり、直接免疫抱合体を使用する以外に、疾病部位における薬剤の濃度を増加させるための代替手法が望ましい。
【０００４】
「事前標的化」と呼ばれる直接免疫抱合体の使用の制限を回避する手法は、疾病抗原ならびに小分子量ハプテンに対する特異性を有する二重または多特異性抗体を利用する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４：８２３−８３４）。この方法において、疾病標的化ステップは、薬剤分子の標的化から時間的に分離される。簡潔に述べると、最初に二重特異性または多特異性抗体を患者に投与する。疾病関連の抗原に結合することによって、抗体が疾病部位に集中した後、小分子量ハプテンに付着した薬剤から成る第２の薬剤を投与する。この薬剤付着ハプテンは、疾病部位に事前標的化された二重特異性抗体の抗ハプテン成分に選択的に結合する。概して、第２のステップの薬剤は、ハプテン、および付着した薬剤を有するペプチドのような小分子であり、循環から急速にクリアし、物質が捕捉されなければならない腫瘍部位において、単一またはごく少数のパスのみが可能である。さらに、かかる第２のステップの薬剤の通常設計では、わずかな薬剤分子が付着するにすぎない。急速クリアランスと低薬剤置換の組み合わせによって、疾病部位における薬剤の比活性度が低くなる。
【０００５】
したがって、疾病部位に対して多数の治療薬剤を選択的に標的化するための新しい方法の開発が必要とされている。直接免疫抱合体、ならびに第２のステップの薬剤の事前標的化手法のいずれにも適用可能な一般的方法が極めて望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、低分子量ペプチドにも共有結合される治療薬担持ポリマーを提供することによって、抗体ベースの治療薬送達の直接または事前標的化形態に関する前述の問題を解決する。事前標的化に適用する場合、ペプチド部分は、１つまたは２つのハプテン単位、例えばＨＳＧ（ヒスタミン−スクシニル−グリシン）を含み得る。二重特異性の１つのアームとしての抗ＨＳＧ抗体で例示される、二重特異性抗体を診断および治療に使用することは十分に周知であり、当該技術分野において、ＨＳＧ含有ペプチドの調製方法も記載されている（米国特許第７，１３８，１０３号および第７，１７２，７５１号、いずれもそれら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【０００７】
直接免疫抱合体とともに使用する場合、ペプチドは、二価あるいは多価抗体、またはそれらのフラグメントへの共有結合のための官能基を、抗体の抗原結合特性に影響しない方法で含み得る。好ましい実施形態において、ペプチドは、「ドックアンドロック（ＤＮＬ）」方法を使用して、二価あるいは多価抗体、またはそれらのフラグメントに付着され得る（Ｒｏｓｓｉ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６；１０３：６８４１−６８４６、米国特許出願第２００６０２２８３００号、第２００７００８６９４２号、および第２００７０１４０９６６号、それぞれの文章は、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる）。本発明のこれらの態様および他の態様は、以下に詳細に記載する。
【課題を解決するための形態】
【０００８】
好ましい実施形態において、例えばデキストラン分子等のポリマーは、誘導体化されて複数のカルボン酸基を所有する。これらのカルボン酸基の画分は、ポリマーの分子当たり約１分子のマレイミド含有架橋剤が付着するように、エチレンジアミンを用いるアミド形成によって誘導体化される。残りのカルボン酸基は修飾され、薬剤に付着するために化学選択的である、規定レベル（置換）の官能基を所有する。この官能基の置換レベルは、ポリマーに付着した薬剤の置換レベルを決定する。
【０００９】
一実施形態において、ポリマー上の官能基はアセチレン部分である。ポリマー−（アルキン）ｘ−ペプチド誘導体は、「クリック化学」と呼ばれる銅（＋１）触媒付加環化反応において、アジド含有薬剤と連結される（Ｋｏｌｂ  ＨＣ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００３；８：１１２８−３７）。クリック化学は、水溶液において、中性ｐＨに近い状態で起こり、したがって、薬剤共役が起こりやすい。クリック化学の利点は、それが化学選択的であり、他の周知の共役化学反応、例えばチオール−マレイミド反応を補完することである。ポリマー−ペプチド追加物に対する薬剤の付着は、事前標的化のための材料調製における最終ステップとして行われる。ＤＮＬ手法の文脈における免疫抱合体形成において、薬剤は、ＤＮＬアセンブリの前にポリマーに付着することができる。ＤＮＬアセンブリ後の最終ステップとして、より有利に行うこともでき、このようにして、薬剤はＤＮＬプロセス中に関与しない。
【００１０】
別の実施形態において、ポリマー上の官能基はヒドラジドである。例えばドキソルビシン等のケト基を含有する薬剤は、ｐＨ５からｐＨ７の範囲でヒドラジド添付ポリマーに連結することができる。
【００１１】
第３の実施形態において、ポリマー上の官能基は、ホストゲスト複合化によって、薬物に非共有的に結合可能なシクロデキストリン分子である。
【００１２】
一部の実施形態において、ポリマーは、２つ以上の薬剤と置換することができる。これは、クリック化学手法に特に適し、それによって、複数のアルキン部分（通常一置換のアセチレン）を有する単一ポリマー追加物は、最初に１つのアジド含有薬剤と連結され得る。モル当量を限定することによって、アセチレン基の一定画分のみが、第１のアジド含有薬剤により誘導体化される。残りのアセチレン基が連結されるように、第２のアジド含有薬剤を用いてプロセスを反復する。例えば、第１の薬剤は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるドキソルビシンであり得、第２の薬剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるＳＮ−３８であり得る。
【００１３】
クリック化学方法によってポリマーに付着すると、結合は安定したトリアゾールを介する。開裂可能リンカーを、薬剤とアジドとの間の架橋剤に付加的に構築して、薬剤放出を可能にすることができる。
【００１４】
「認識部分」の性質に関する実施形態は以下のとおりである。（１）例えば、それぞれ抗ＨＳＧまたは抗体ＤＴＰＡ抗体に特異的に結合する、ＨＳＧまたはＤＴＰＡ等のハプテンの１つまたは２つの分子を含有するペプチドであり得る。次いで、疾病部位に特異的な少なくとも１つのアーム、およびハプテンに特異的な少なくとも１つのアームを所有する二重または多特異性抗体を用いて疾病部位を標的化した後、薬剤−ポリマー−ハプテンを事前標的化形態で使用することができる。代替として、事前複合化多特異性抗体−ポリマー−ハプテンは、本発明の範囲内で利用することができる。（２）ポリマー−薬剤−葉酸複合体を使用して、疾病部位上の葉酸受容体を標的化するような葉酸であり得、例えば癌において、葉酸受容体をできる限り標的化する際に、葉酸添付の診断的または治療薬部分を使用することは、周知の方法である。（３）疾病部位における受容体の標的化に有用なペプチド、例えばソマトスタチン（ＳＳ）またはＶＩＰペプチドであり得る。（４）アビジン／ストレプトアビジンベースの事前標的化プロトコルで使用するためのビオチンであり得る。（５）相補アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。（６）「ドックアンドロック」（ＤＮＬ）手法の固着ドメイン（ＡＤ）ペプチドであり得る（その全体を参照することによって、それぞれ本明細書に組み込まれる、例えば、２００６年３月２４日出願の米国特許出願番号第１１／３８９，３５８号、２００６年３月２８日出願の第１１／３９１，５８４号、２００６年６月２９日出願の第１１／４７８，０２１号、および２００６年１２月５日出願の第１１／６３３，７２９号を参照されたい）。この段落に記載される実施形態１から５を使用して、事前標的化プロトコルで使用される「認識部分」に特異的な成分、および二重または多特異性抗体の一部は、それぞれ抗ＨＳＧまたは抗ＤＴＰＡ抗体、抗葉酸抗体、抗ソマトスタチン抗体、アビジン／ストレプトアビジン、またはオリゴヌクレオチドである。第６の実施形態の対応成分は、ＤＮＬ手法の性質によって定義され、ＡＤ配列に対しては相補ＤＤＤ配列である。実施形態２および３において、ポリマー−薬剤−葉酸またはポリマー−薬剤−ＳＳは、疾病部位において事前標的化された二重または多特異性抗体上にラッチし、それぞれ葉酸またはＳＳ受容体を標的化することもでき、それによって、疾病部位における標的化機構を補強する。ポリマー上に導入される、かかる認識部分の数は、好ましくは１から１０であり、さらに好ましくは１から５であり、最も好ましくは１から２である。ポリマー当たりの認識部分の数は、ＤＮＬ複合体の文脈において使用する場合、好ましくは１であるが、事前標的化形式で使用する場合は１より多くてもよい。
【００１５】
薬剤−デキストランの実施例を以下に示す。スキーム１は、アセチレン−アジド連結化学反応を使用して、ポリマーを修飾するための一般的手法を示し、構造１から３によって例示される。
【００１６】
スキーム−１
【化１】
2014159441.tif 000002
【００１７】
代替として、ポリマーを誘導体化し、アセチレンの代わりにアジド基を含むことができ、薬剤は、アジドの代わりにアセチレン基を用いて誘導体化することができる。
【００１８】
構造４：これは、「クリック化学」による１種類の薬剤に対する連結の一例を表す。この場合、「Ｒｍ」は認識部分であり、ｎ＝０から１６、ｘ＝１０から１０００、および「（Ｚ）」は（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ部分から成る追加スペーサであって、式中、ｍは１から２０の値の整数であり、好ましくは１から５、最も好ましくは１である。
【化２】
2014159441.tif 000003
【００１９】
構造５：これは、「クリック化学」による２種類の薬剤に対する連結の一例を表す（「認識部分」は「Ｒｍ」によって示される）。薬剤−１は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるアントラサイクリン薬剤、例えばドキソルビシンであり得、第２の薬剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンプトセシン、例えばＳＮ−３８であり得る。この実施例において、「ｘ」はポリマーの大きさによって定義される反復デキストラン単位であり、「ｎ」は、薬剤１および薬剤２を用いて誘導体化された部分の数であって、薬剤担持レベルを定義し、「Ｚ」はスペーサである。この構造において、薬剤１および薬剤２に対して「ｎ」として示されるが、「ｎ」の値は、異なる薬剤担持のレベルを実現するため、薬剤１および薬剤２に対して異なり得る。アセチレン−アジド連結は、図示されるようなトリアゾール構造部分を生じる。スペーサ１およびスペーサ２は、開裂可能リンカー部分を含む。開裂可能リンカーは、アントラサイクリン、例えばドキソルビシンの場合において、酸−開裂可能ヒドラゾンまたはカテプシンＢ開裂可能ペプチドであり得、カンプトセシンの場合において、エステルまたは炭酸結合および／またはカテプシンＢ開裂可能ペプチドであり得る。薬剤は、表示されるもの以外であり得、薬剤種の数は２に限られない。［この構造において、「Ｒｍ」は認識部分であり、ｎ＝０から１６、ｘ＝１０から１０００、および「（Ｚ）」は（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ部分から成る追加スペースであって、式中、ｍは１から２０の値の整数であり、好ましくは１から５、最も好ましくは１である。］
【化３】
2014159441.tif 000004
【００２０】
構造６：これは、デキストランの化学選択的修飾の実施例である。７０ＫＤ  ＭＷデキストランのこの実施例において、４４のＣＯＯＨ基が、６−ブロモヘキサン酸と反応させることによって最初に導入され、モノマー単位の「１１％」（または４４部分）が修飾されたことを表す。これらのうち、２０の使用可能なＣＯＯＨ基（「モノマー単位の「５％」」は、ＢＯＣ−ＮＨＮＨ２および水溶性カルボジイミド、ＥＤＣを使用して、Ｂｏｃ保護ヒドラジドに変換される。残りのＣＯＯＨ基は、エチレンジアミンおよびＥＤＣ連結を使用して、アミンで終結するように部分的に変換され、ポリマー当たり８つのアミンが置換される。これらのアミノ基のうちの１つのみを、修飾因子、例えば構造７のピリジルジチオ基と置換し、後にペプチドに付着させるための条件が開発された。
【化４】
2014159441.tif 000005
【００２１】
構造７：この構造は、平均１つのＳＰＤＰ分子を７０ｋＤデキストラン上に置換できることを示す。ジスルフィド交換反応において、チオール含有ペプチドと最初に反応させることによって、平均１つのペプチドを導入することができる。代替として、構造７のジスルフィドは、ジチオスレイトールまたはＴＣＥＰで還元することができ、チオール含有デキストランは、マレイミド含有ペプチドと反応させることができる。さらに別の変型例は、デキストラン上のアミンは、チオール含有ペプチドとのさらなる反応のためのマレイミド含有架橋剤を用いて誘導体化される。ペプチド部分は、１つまたは２つのハプテン分子、例えばＨＳＧを含有するか、またはＤＮＬ手法の「ＤＤＤ」成分と融合するために適切な「ＡＤ」ペプチドである。次いで、酸性状態下でのＢＯＣ脱保護は、薬剤上でアデルヒドまたはケト基と反応させるために適切なヒドラジドを解放する。代替として、またＤＮＬ手法においてさらに好ましくは、後にアジド含有薬剤に連結可能なアセチレン基でヒドラジド部分を置換する。この手法における利益は、ＤＮＬアセンブリを最初に行うことができ、結果として生じるアセンブリは、実際にアセチレン（またはアジド）基である、薬剤シグニチャを含むことである。ＤＮＬ生成物は、アジド（またはアセチレン）添付薬剤と化学選択的に反応させることができる。ＤＮＬ生成物の事前アセンブリの利点は、薬剤をその後に定義できることである。定義した多価抗体成分を含有する各アセンブリに対して、対応するアジド誘導体化薬剤を使用することによって、異なる薬剤種を置換することができる。
【００２２】
「認識部分」の性質は、ＤＮＬ生成物において「ＡＤ」ペプチドとして定義されるが、前項で列挙されるように、他の実施例において異なり得る。
【化５】
2014159441.tif 000006
【００２３】
構造８：これは構造２の変型例であり、アセチレンの代わりにシクロデキストリンのデキストラン上の置換を示す。例えばドキソルビシンのような、シクロデキストリンとの非共有複合体を形成することがでる適切な薬剤が、その後添加される。シクロデキストリン置換は、薬剤置換を決定する。［この構造において、「Ｒｍ」は認識部分であり、ｎ＝０から１６、ｘ＝１０から１０００、および「（Ｚ）」は（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ部分から成る追加スペースであって、式中、ｍは１から２０の値の整数であり、好ましくは１から５、最も好ましくは１である。］
【化６】
2014159441.tif 000007
【００２４】
構造９：これは構造５の変型例であり、「クリック化学」を介する第１の薬剤のデキストラン上の置換、および第２の薬剤との複合化のためのシクロデキストリンの置換を示す。他の図解におけるように、「Ｒｍ」は認識部分であり、ｎ＝０から１６、ｘ＝１０から１０００、および「（Ｚ）」は（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ部分から成る追加スペースであって、式中、ｍは１から２０の値の整数であり、好ましくは１から５、最も好ましくは１である。
【化７】
2014159441.tif 000008
【００２５】
水溶性ポリマー、例えばデキストラン、ポリグルタミン酸、デンドリマー等は、本発明の範囲内である。デキストランで例示されるが、ポリマー成分は、デキストランに限られない。ポリグルタミン酸は、既にその中にカルボン酸基を含み、そのため本開示の観点から、カルボン酸−添加されたデキストランに相当する。ＣＯＯＨ添加されたデキストランについての、いかなる方法も、ポリグルタミン酸に対して等しく適用可能である。異なる世代のデンドリマーを用いて、官能基を連続的に誘導体化し、薬剤シグニチャ、例えばそれぞれアジド−薬剤あるいはアルキン薬剤との誘導体化が可能なアルキンまたはアジド、および二官能性薬剤誘導体に連結可能な他の誘導体を含有するようにする。
【００２６】
本発明で使用するための治療薬剤は、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、アンチメタボライト、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗血管由来剤、およびアポトーシス促進剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、カンプトセシン、これらのクラスおよび他のクラスの抗がん剤から生じる他の薬剤等の化学療法薬である。他の癌化学療法薬は、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位複合体、ホルモン等を含む。適切な化学療法薬は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ′Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、ならびにこれらの発行物の改訂版に記載されている。他の適切な化学療法薬、例えば実験薬は、当業者に知られている。本発明で使用される治療薬剤は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗菌タンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素を含む毒素でもあり得る（例えば、Ｐａｓｔａｎ．ｅｔ  ａｔ．，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１、およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（１９９４），４４：４３を参照されたい）。本明細書での使用に適切な追加の毒素は、当業者に既知であり、米国特許第６，０７７，４９９号において開示され、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００２７】
一実施形態において、標的部分は、多価および／または多特異性ＭＡｂであり得る。別の実施形態において、標的部分は、ＤＮＬ（ドックアンドロック）手法で形成される多価抗体フラグメントである。標的部分は、ムリン化、キメラ化、霊長類化、ヒト化、またはヒト単クローン抗体であり得、前記抗体は、無傷フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２）、またはサブフラグメント（一本鎖組成物）形態である。
【００２８】
好ましい実施形態において、標的部分は、抗原または癌または悪性細胞上で発現した抗原のエピトープと反応性がある。癌細胞は、好ましくは、造血性腫瘍、癌腫、肉腫、黒色腫、またはグリア腫瘍からの細胞である。
【００２９】
本発明に従って治療される好ましい悪性腫瘍は、悪性固形腫瘍または造血性腫瘍である。
【００３０】
好ましい実施形態において、「薬剤−ポリマー認識部分」に組み込まれる細胞内開裂可能部分は、事前標的化した多特異性抗体とのその共役体、または多特異性抗体とのその非共役の後に開裂され得るか、または共役ＤＮＬ組成物は、細胞に内在化され、特にエステラーゼおよびペプチダーゼによって、あるいはｐＨ依存性プロセスによって、またはジスルフィド還元によって開裂される。
【００３１】
標的部分は、好ましくは、抗体（完全ヒト、非ヒト、ヒト化、またはキメラ化抗体を含む）、または抗体フラグメント（酵素的または組み換えによって生成されるフラグメントを含む）、および抗体または抗体フラグメントからの配列を組み込む結合タンパク質である。抗体、フラグメント、および結合タンパク質は、上述のように、多価多特異性または多価単一特異性であり得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、マーカーを認識または結合する抗体、例えばＭＡｂ等、または標的細胞上に高レベルで発現し、正常組織に対して疾患細胞上で優位にまたは唯一発現する腫瘍関連の抗原、および急速に内在化する抗体を使用する。本発明の範囲内において有用な抗体は、上述のような特性を有する（および異なるレベルの細胞および微生物への内在化の特徴的な特性を示す）ＭＡｂを含み、癌においては、以下のＭＡｂの使用が考えられるが、これらに限定されない。ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２およびＲＦＢ４（抗体ＣＤ２２）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１）、ＰＡＭ−４およびＫＣ４（いずれも抗ＭＵＣ１）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅとしても知られる））、Ｍｕ−９（抗大腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗α−フェトプロテイン）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）およびＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）。これらの共役体を使用して、標的化され得る他の有用な抗原は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  ＭＡｂ）、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦＲ（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、フィブロネクチンスプライス変異体）、ＥＤ−Ｂ（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＦ受容体またはＥｒｂＢ１（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、胎盤成長因子（Ｐ１ＧＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＰＳＭＡ、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、テネイシン、葉酸受容体、トーマス−フリードリッヒ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管形成抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ−ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原、すなわち、ＣＤ６６ａ〜ｄ、またはそれらの組み合わせを含む。ＣＤ６６抗原は、同様の構造を有する５つの異なる糖タンパク質、それぞれ抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子家族、ＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１、およびＣＥＡによってコードされるＣＤ６６ａ〜ｅから成る。これらのＣＤ６６抗原は、主に顆粒球、消化管の正常上皮細胞、および様々な腫瘍細胞において発現する。多数の前述の抗原は、２００２年１１月１５日出願の米国暫定特許出願番号第６０／４２６，３７９号「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」において開示され、それを参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００３３】
ＤＮＬ手法によって事前複合または融合したポリマー治療認識部分を伴う本発明の別の好ましい実施形態において、急速に内在化する抗体を使用し、次いで細胞表面上で再発現、処理、および提示して、細胞による継続的な摂取および循環共役体の増大を可能にする。最も好ましい抗体／抗原対の実施例は、ＬＬ１、抗ＣＤ７４  Ｍａｂ（不変鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）である。ＣＤ７４抗原は、Ｂ−細胞リンパ腫、特定のＴ−細胞リンパ腫、黒色腫、および特定の他の癌（Ｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９８：２９６−３０２（１９９９））、ならびに特定の自己免疫疾患で高く発現する。この実施形態は、ポリマー治療認識部分を組み込む、事前複合化またはＤＮＬ組成物として特に好ましい。
【００３４】
抗ＣＤ７４抗体で好ましく治療される疾患は、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、黒色腫、肺癌、骨髄性白血病、および多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。標的細胞の表面上の短期間のＣＤ７４抗原の連続発現、それから抗原の内在化、および抗原の再発現は、標的ＬＬ１抗体を、それが担持する任意の化学療法部分とともに内在化することができる。これにより、高い治療濃度のＬＬ１化学療法薬剤共役体を、かかる細胞の内部に蓄積することができる。内在化ＬＬ１化学療法薬剤共役体は、リソソームおよびエンドソームを通して循環し、化学療法部分は、活性形態で標的細胞内に放出される。
【００３５】
別の実施形態は、対象を治療する方法に関連し、本発明の好ましい実施形態の治療有効量の治療薬共役体を対象に投与するステップを含む。好ましい実施形態の治療薬共役体で治療され得る疾患は、Ｂ−細胞悪性腫瘍（例えば、ＬＬ２  ＭＡｂを使用する非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病、米国特許第６，１８３，７４４号を参照されたい）、内胚葉的に生成された消化器系上皮の腺癌、例えば、乳癌および非小細胞肺癌等の癌、および他の癌腫、肉腫、グリア腫、骨髄性白血病等を含むが、これらに限定されない。特に、抗原に対する抗体、例えば、胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、精巣、脳、またはリンパ腫、肉腫、または黒色腫等の悪性固形腫瘍または造血性腫瘍によって生成される、または関連する腫瘍胎児抗原が有利に使用される。かかる治療薬は、疾病状態および共役体の忍容性に依存して、一度または繰り返し投与することができ、例えば手術、外部放射線、放射免疫治療、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子治療等の他の治療薬様式と組み合わせて、最適に使用することもできる。各組み合わせは、腫瘍の種類、段階、患者の状態および事前療法、ならびに担当医師によって考慮される他の因子に適合される。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「対象」という用語は、それに限定されないがが、ヒトを含む哺乳動物を含む任意の動物（すなわち、脊椎動物および無脊椎動物）を意味する。対象という用語は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）も含む。該用語は、特定の年齢または性別に限られるものではない。したがって、雄または雌にかかわらず、成人および新生児対象、ならびに胎児がその用語により包含される。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、Ｍｕ−９  ＭＡｂを含む治療薬共役体を使用して、２００２年４月５日出願のＧｏｌｄらによる米国出願番号第１０／１１６，１１６に開示されるように、結腸直腸、ならびに膵臓および卵巣癌を治療することができる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６４０５（１９９０）、およびそこで引用される参照文献）。さらに、ＰＡＭ−４  ＭＡｂを含む治療薬共役体を使用して、２００２年６月１４日出願の米国暫定特許出願番号第６０／３８８，３１４に開示されるように、膵臓癌を治療することができる。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、ＲＳ−７  ＭＡｂを含む治療薬共役体を使用して、２００２年３月１日出願のＳｔｅｉｎらによる米国暫定特許出願番号第６０／３６０，２２９に開示されるように、例えば肺、胃、膀胱、胸、卵巣、子宮、および前立腺の癌腫等の癌腫を治療することができる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０（１９９０）およびＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．４：７０３（１９９１））。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、抗ＡＦＰ  ＭＡｂを含む治療薬共役体を使用して、２００２年８月１日出願の米国暫定特許出願番号第６０／３９９，７０７に開示されるように、ヒト化、キメラ化、およびヒト抗体形態を使用して、肝細胞癌、細菌細胞腫瘍、および他のＡＦＰ生成腫瘍を治療することができる。
【００４０】
別の好ましい実施形態において、抗テネイシン抗体を含む治療薬共役体を使用して、造血性および固形腫瘍を治療することができ、Ｌｅ（ｙ）に対する抗体を含む共役体を使用して、固形腫瘍を治療することができる。
【００４１】
好ましい実施形態において、ヒト疾病の治療に使用される抗体は、ヒトまたはヒト化（ＣＤＲ移植）バージョンの抗体であるが、ムリン化およびキメラ化バージョンの抗体を使用することができる。送達剤としての同種ＩｇＧ分子は、免疫応答を最小化するために最も好ましい。これは、反復治療を考慮すると特に重要である。ヒトの場合、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体は、患者から抗ＩｇＧ免疫応答を引き起こす可能性が低い。ｈＬＬ１およびｈＬＬ２等の抗体は、標的細胞上の内在化抗原に結合した後に、急速に内在化し、これは、担持されている化学療法薬剤も同様に細胞内へ急速に内在化されることを意味する。しかしながら、内在化速度の遅い抗体を使用して、本発明を用いる選択的治療を達成することもできる。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、病原体に対する抗体が知られているため、病原体に対して治療薬共役体を使用することができる。例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原虫、菌類、およびウィルス等の病原菌、および抗原、およびかかる微生物に関連した生成物によって引き起こされる、例えばウィルス性、細菌性、真菌性、および寄生生物性感染を含む、感染性病変によって生成される、または関連するマーカーに特異的に結合する抗体および抗体フラグメントは、特に上で引用されるＨａｎｓｅｎらの米国特許第３，９２７，１９３号およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，８１８，７０９号、および第４，６２４，８４６号、ならびにＲｅｉｃｈｅｒｔおよびＤｅｗｉｔｚにおいて開示されている。好ましい実施形態において、病原体は、米国特許第６，４４０，４１６号に開示されるように、エイズを引き起こすヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、結核菌、アガラクシア連鎖球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジオネラニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、血友病性Ｂ型インフルエンザ、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ハンセン菌、ウシ流産菌、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルス、サイトメガロウィルス、単純ヘルペスウィルスＩ型、単純ヘルペスウィルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウィルス、呼吸器合胞体ウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、麻疹ウィルス、アデノウィルス、ヒトＴ−細胞白血病ウィルス、エプスタイン−バーウィルス、マウス白血病ウィルス、流行性耳下腺炎ウィルス、水疱性口内炎ウィルス、シンドビスウィルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス、いぼウィルス、ブルータングウィルス、センダイウィルス、ネコ白血病ウィルス、レオウィルス、ポリオウィルス、シミアンウィルス４０、マウス乳癌腫瘍ウィルス、デング熱ウィルス、風疹ウィルス、ウエストナイルウィルス、熱帯マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ランゲルトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、ブルセイトリパノソーマ、マンソン住吸血虫、日本住吸血虫、ウシバベシア、エルメリア・テネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、羊条虫、無鉤条虫、単包条虫、メソ条虫亜鋼コルチ、マイコプラズマ関節炎、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オラール、マイコプラズマ・アルギニーニ、アコレプラズマ・レイドロウィ、マイコプラズマ・サリバリウム、およびマイコプラズマ・ニューモニエから成る群より選択される。
【００４３】
さらに好ましい実施形態において、抗ｇｐ１２０および他のかかる抗ＨＩＶ抗体から成る薬剤共役体は、エイズ患者におけるＨＩＶの治療薬として使用することができ、ヒト結核菌に対する抗体の薬剤共役体は、薬剤屈折性結核の治療薬として適切である。抗ｇｐ１２０  ＭＡｂ（抗ＨＩＶ  ＭＡｂ）の融合タンパク質および毒素、例えばシュードモナス外毒素は、抗ウィルス特性について試験されている（Ｖａｎ  Ｏｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，５：７５−９１，１９９８））。エイズ患者においてＨＩＶ感染を治療する試みは、恐らく不十分な有効性または容認できない宿主毒性のために失敗した。本発明の薬剤共役体は、タンパク質毒性のかかる毒性副作用を有利に欠失し、したがって、エイズ患者においてＨＩＶ感染の治療に有利に使用される。これらの薬剤共役体は、単独で投与するか、または単独で投与された場合にかかる患者において有効な他の抗体または治療薬剤と組み合わせることができる。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、治療薬共役体を使用して治療され得る疾患は、これらに限定されないが、クラスＩＩＩ自己免疫疾患、例えば、急性特発性血小板減少性紫斑病および慢性特発性血小板減少性紫斑病等の免疫媒介性血小板減少、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、関節リウマチ、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、レンサ球菌感染後の腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多型性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチュア症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺亢進、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、胆汁過多、尋常性天疱瘡、ヴェグナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨大細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、線維化性肺胞炎、および若年性糖尿病を含む、免疫調節異常疾病および関連自己免疫疾患であり、２００２年３月１日出願の米国暫定特許出願番号第６０／３６０，２５９に開示されるとおりである。これらの疾患において有用な典型的抗体は、これらに限定されないが、ＨＬＡ−ＤＲ抗原またはＢ−細胞またはＴ−細胞抗原と反応するものである（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３，ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ０４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０，ＣＤ１２６、Ｂ７，ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、およびＨＬＡ−ＤＲ）である。これらの自己免疫疾患の多くは、異常なＢ−細胞集団によって形成される自己抗体の影響を受けるため、本明細書で使用される薬剤と結合した、かかる抗体を伴う治療薬共役体によるこれらのＢ−細胞の減少は、特にＢ−細胞抗体が、特定の状況において、ＨＬＡ−ＤＲ抗体および／またはＴ−細胞抗体（抗原としてＩＬ−２を標的化するもの、例えば抗ＴＡＣ抗体を含む）と組み合わされる場合、自己免疫疾病治療の好ましい方法である。好ましい実施形態において、抗Ｂ−細胞、抗Ｔ−細胞、あるいは抗マクロファージ、または自己免疫疾患のある患者の治療において使用する他のかかる抗体を共役して、前記自己免疫疾患に関与する宿主反応を制御するためのより有効な治療薬を生じ、単独で投与するか、または例えばＴＮＦ阻害剤またはＴＮＦ抗体、非共役Ｂ−またはＴ−細胞抗体等の他の治療薬剤との組み合わせで投与することができる。
【００４５】
好ましい実施形態において、治療薬共役体を使用して治療され得る疾患は、例えばフィブリン塊、アテローム性動脈硬化症、心筋虚血、および心筋梗塞等の心血管疾患を含む。フィブリンに対する抗体は、臨床試験において、前記塊および肺塞栓を明らかにするための造影剤として知られているが、抗顆粒球抗体、例えばＭＮ−３、ＭＮ−１５、ＮＣＡ９５、およびＣＤ１５抗体は、心筋梗塞および心筋虚血を標的化することができ、抗マクロファージ、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および抗ＣＤ７４（例えば、ｈＬＬ１）抗体を使用して、アテローム斑を標的化することができる。
【００４６】
さらに別の好ましい実施形態において、例えば、アルツハイマー病に関連するアミロイドまたはβ−アミロイド等の、抗体を位置特定するための標的として機能する、治療薬共役体を使用して治療され得る疾患は、標的部分を使用できる特定の病変によって特徴付けられる神経変性疾患を含む。
【００４７】
好ましい実施形態において、細胞および病原体へのより有効な組み込みは、多価多特異性または多価単一特異性抗体を使用することによって達成することができる。多価とは、細胞上で発現した同一または異なる抗原またはエピトープに対する、幾つかの結合アームの使用を意味するが、多特異性抗体は、複数結合アームを使用して、標的細胞または病原体上に含有される少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープを標的化することを伴う。かかる二価および二重特異性抗体の実施例は、２００２年８月１日出願の米国特許出願番号第６０／３９９，７０７号、２００２年３月１日出願の米国特許出願番号第６０／３６０，２２９号、２００２年６月１４日出願の第６０／３８８，３１４号、および２００２年４月５日出願の第１０／１１６，１１６号において見出され、すべてそれらを参照することによって本明細書に組み込まれる。これらの多価または多特異性抗体は、癌および感染性生物（病原体）の標的化において特に好ましく、複数の抗原標的、さらに同一抗原標的の複数のエピトープをも発現するが、細胞または病原体上の単一の抗原標的の発現または利用可能性が不十分であるため、免疫療法の抗体標的化および十分な結合を回避する場合が多い。複数の抗原またはエピトープを標的化することによって、前記抗体は、標的上のより高い結合および滞留時間を示し、したがって、本発明において標的化される薬剤とのより高い飽和を可能にする。
【００４８】
様々な実施形態において、本明細書に開示されるように、共役体は、複合、多特異的な抗体の一部であり得る。そのような抗体は、異なる特異性を有する２つ以上の異なる抗原結合部位を含み得る。多特異的な複合体は、同一の抗原の異なるエピトープに結合し得、または、あるいは、２つの異なる抗原に結合し得る。幾つかのさらに好ましい標的の組み合わせは、以下のものを含む。これは、好ましい組み合わせの例の一覧であるが、完全であることを意図しない。
【表１−１】
2014159441.tif 000009
【表１−２】
2014159441.tif 000010
【００４９】
例えば癌療法に対して好ましい、さらに他の組み合わせは、ＣＤ２０＋ＣＤ２２抗体、ＣＤ７４＋ＣＤ２０抗体、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）＋ＣＥＡＣＡＭ６抗体、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）＋ＣＥＡＣＡＭ５抗体、ＥＧＰ−１（例えば、ＲＳ−７）＋ＩＬＧＦ抗体、ＣＥＡＣＡＭ５＋ＥＧＦＲ抗体を含む。そのような抗体は、組み合わせて使用されるだけでなく、米国特許第６，０８３，４７７号、第６，１８３，７４４号、第６，９６２，７０２号、および米国特許出願公開第２００３０１２４０５８号、第２００３０２１９４３３号、第２００４０００１８２５号、第２００４０２０２６６６号、第２００４０２１９１５６号、第２００４０２１９２０３号、第２００４０２３５０６５号、第２００５０００２９４５号、第２００５００１４２０７号、第２００５００２５７０９号、第２００５００７９１８４号、第２００５０１６９９２６号、第２００５０１７５５８２号、第２００５０２４９７３８号、第２００６００１４２４５号、および第２００６００３４７５９号（それぞれは、その全体にそれを参照することによって本明細書に組み入れられる）に記載されるように、例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等の様々な形式の融合タンパク質として複合することができる。
【００５０】
ある実施形態において、本明細書に記載の結合部分は、１つ以上のアビマー配列を含み得る。アビマーは、様々な標的分子に対する親和性および特異性において、幾分抗体に似た、一種の結合タンパク質である。それらは、体外エキソンシャッフリングおよびファージ提示法によりヒト細胞外受容体ドメインから開発された。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：１４９３−９４、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２４：２２０）得られる多ドメインタンパク質は、多数の独立結合ドメインを含み得、それは、単一エピトープ結合タンパク質と比較して、改善した親和性（場合によっては、サブナノモル）および特異性を示し得る。（同文献）様々な実施形態において、それぞれは、それを参照することによって本明細書に組み入れられる、２００５年４月６日出願の米国暫定特許出願第６０／６６８，６０３号、および２００５年１２月１６日出願の第６０／７５１１９６号に記載されるように、アビマーは、特許請求される方法および組成物で使用するために、例えば、ＡＤおよび／またはＤＤＤ配列に結合し得る。アビマーの構造および使用に関する方法のさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号、および第２００５０２２１３８４号に開示され、それらのそれぞれの実施例の項は、それを参照することによって、本明細書に組み入れられる。
【００５１】
ＤＮＬ（ドックアンドロック）方法
異なるエフェクター部分を含有する複合体を形成するためのＤＮＬ方法の様々な実施形態は、周知である（例えば、米国特許出願公開第２００６０２２８３００号、第２００７００８６９４２号、第２００７０１４０９６６号を参照）。ＤＮＬ技法は、例えば、ｃＡＭＰ依存的タンパク質キナーゼの調節サブユニットの二量化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）領域と、多種多様のＡキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）から得られたアンカードメイン配列との間でなどの自然発生的な結合分子の複合体の形成に基づく。ＤＤＤドメインは、自然発生的に二量化し、その後、単一ＡＤ配列に連結する。したがって、様々なエフェクターが、定義された化学量論の複合体を形成するために、ＤＤＤおよびＡＤ配列に結合され得る。最も簡単な場合には、結果は、ＤＤＤ配列を抱合する２つの同一のサブユニットおよびＡＤ配列を抱合する１つのサブユニットを含有する三量体である。しかしながら、そのような集合において、ホモ二量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体、およびホモまたはヘテロ六量体を含む、多くの異なる形態が可能である（米国特許出願公開第２００６０２２８３５７号および第２００７０１４０９６６号を参照）。合成複合体を形成するためにＤＮＬ法に利用され得る典型的なＤＤＤおよびＡＤ配列を以下に開示する。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱ（配列番号３）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号４）
【００５２】
抗体フラグメントの生成
モノクローナル抗体生成の方法は、当技術分野で周知であり、任意のそのような既知の方法を使用して、特許請求に記載の方法および組成物において使用される抗体を生成し得る。幾つかの実施形態は、抗体フラグメントに関係し得る。そのような抗体フラグメントは、従来の方法により、全抗体のペプシンまたはパパイン分解により得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断により生成され、Ｆ（ａｂ’）２で示される５Ｓフラグメントを提供し得る。本フラグメントは、チオール還元剤、およびに、任意に、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対する遮断基を使用して、さらに切断され、３．５Ｆａｂ’一価フラグメントを生成し得る。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断は、２つの一価ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを生成する。抗体フラグメントを生成するための典型的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号、米国特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０、Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ，７３：１１９、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、およびＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に開示される。
【００５３】
抗体を切断する他の方法、例えば、一価軽−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的もしくは化学的もしくは遺伝子技術もまた、フラグメントが、無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。例えば、Ｆｖフラグメントは、ＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記載されるように、非共有であり得る。あるいは、可変鎖は、分子間のジスルフィド結合により結合、またはグルタルアルデヒド等の薬物により架橋し得る。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照。
【００５４】
好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーにより接続される、ＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、ＶＨおよびＶＬドメインを符号化するＤＮＡ配列を含有する構造遺伝子を構築することにより調製され、オリゴヌクレオチドリンカー配列により接続される。ｓＦｖｓを生成する方法は、当技術分野で周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、およびＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００５５】
抗体フラグメントの他の形態は、単一相補性決定領域（ＣＤＲ）のペプチドコーディングである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象となる抗体のＣＤＲを符号化する遺伝子を構築することにより得られる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６、Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，  ｐａｇｅｓ  １６６−１７９  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ  １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。
【００５６】
キメラおよびヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、マウス抗体の可変領域により置換される組み換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与される際、免疫原性の低下および安定性の増加を示す。キメラ抗体を構築する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９）。
【００５７】
キメラモノクローナル抗体は、ヒト抗体の対応する可変ドメインに、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からマウスＣＤＲを転移することによりヒト化され得る。キメラモノクローナル抗体におけるマウスフレームワーク領域（ＦＲ）はまた、ヒトＦＲ配列と置換される。ヒト化モノクローナルの安定性および抗原特異性を保存するために、１つ以上のヒトＦＲ残基は、マウスの対応する残基により置換され得る。ヒト化モノクローナル抗体は、対象の治療処置のために使用され得る。標的に対するヒト化抗体の親和性はまた、ＣＤＲ配列の選択修飾により増加し得る（国際公開第ＷＯ００２９５８４Ａ１号）。ヒト化モノクローナル抗体の生成技術は、当技術分野で周知である。（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：２６６、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照）
【００５８】
他の実施形態は、非ヒトの霊長類抗体に関係し得る。ヒヒにおける治療的に有用な抗体を上昇させるための一般的技術は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際公開第ＷＯ９１／１１４６５号（１９９１）、およびＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４６：３１０（１９９０）において、認められ得る。別の実施形態において、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり得る。そのような抗体は、抗原投与に対応して特異的なヒト抗体を生成するために操作されたトランスジェニックマウスから得られる。本技法において、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子座の構成要素は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む、胚幹細胞株から由来するマウス株に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成でき、マウスは、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを生成するために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，６：５７９（１９９４）により記載される。
【００５９】
ヒト抗体
組み合わせ法あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子座で変換されるトランスジェニック動物を使用して、完全ヒト抗体を生成する方法は、周知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２７：３１５−２８、Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ８：１１７−２６、Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ  ３：５４４−５０（それぞれは、それを参照することによって本明細書に組み入れられる））。そのような完全ヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体よりもさらに副作用が少なく、本来の、内因性ヒト抗体として、生体内で機能することが期待される。ある実施形態において、特許請求に記載の方法および手順は、このような技術により生成されるヒト抗体を利用し得る。
【００６０】
１つの別法においては、ファージ提示法を使用し、ヒト抗体を生成することができる（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｏｌ  Ｒｅｓ．  ４：１２６−４０、それを参照することによって本明細書に組み入れられる）。ヒト抗体は、正常ヒトまたは癌等の特定の病状を示すヒトから生成され得る（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）。罹患した個人からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが疾病関連の抗原に対する抗体に偏向し得ることである。本方法論の１つの限定されない実施例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａら（２００５）は、骨肉種患者からのヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージ提示ライブラリーを構築した。熟練した技術者は、本技法が、例示のみであり、ファージ提示法によりヒト抗体または抗体フラグメントを作製およびスクリーニングするための任意の既知の方法を利用し得ることを理解するであろう。
【００６１】
別の方法において、ヒト抗体を生成するように遺伝子操作されているトランスジェニック動物は、上で論じられるように、標準免疫プロトコルを使用して、実質上、いかなる免疫原性の標的に対しても抗体を生成するために使用され得る。このような手順の限定されない例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３、それを参照することによって本明細書に組み入れられる）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および類似動物において、マウス抗体遺伝子は、不活性化され、機能的なヒト抗体遺伝子により置換されるが、その一方、マウス免疫系の残りは、無傷のままである。
【００６２】
標的抗原の免疫があるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常免疫反応によりヒト抗体を生成し、それは、上で論じられる標準技術により収穫および／または生成され得る。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の様々な株が、利用可能であり、それらのそれぞれは、異なる種の抗体を生成することができる。そのようなヒト抗体は、化学的架橋または他の既知の手法により他の分子に結合され得る。遺伝子で生成されたヒト抗体は、治療に使用できる可能性があることを示す一方、正常ヒト抗体の薬物動態学的特性を保持する（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。熟練した技術者は、特許請求に記載の組成物および方法が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系の使用に限定されず、ヒト抗体を生成するために遺伝子組み換えが行われている任意のトランスジェニック動物を利用することができることを理解するであろう。
【００６３】
アビマー
ある実施形態において、本明細書に記載の前駆体、モノマー、および／または複合体は、１つ以上のアビマー配列を含み得る。アビマーは、様々な標的分子に対する親和性および特異性において、幾分抗体に似た、一種の結合タンパク質である。それらは、体外エキソンシャッフリングおよびファージ提示法によりヒト細胞外受容体ドメインから開発された。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２３：１４９３−９４、  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２４：２２０）得られる多ドメインタンパク質は、複数の独立結合ドメインを含み得、それは、単一エピトープ結合タンパク質と比較して、改善した親和性（場合によっては、サブナノモル）および特異性を示し得る。（同文献）様々な実施形態において、アビマーは、例えば、特許請求される方法および組成物に使用するためにＤＤＤ配列に結合され得る。アビマーの構造および使用に関する方法のさらなる詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、第２００５００４８５１２号、第２００５００５３９７３号、第２００５００８９９３２号、および第２００５０２２１３８４号に開示され、それらのそれぞれの実施例の項は、それを参照することによって、本明細書に組み入れられる。
【００６４】
ファージ提示法
特許請求される組成物および／または方法のある実施形態は、結合ペプチドおよび／または様々な標的分子、細胞、または組織のペプチド模倣薬に関係し得る。結合ペプチドは、ファージ提示法が挙げられるが、これに限定されない、任意の周知の方法により同定され得る。様々なファージ提示方法および種々の集団のペプチドを生成するための技術が、当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号、および第６，０６８，８２９号（それらのそれぞれは、それを参照することによって本明細書に組み入れられる）は、ファージライブラリーを調製するための方法を開示する。ファージ提示法は、少量のペプチドをそれらの表面上に発現することができるように、バクテリオファージを遺伝子操作することに関与する（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−１３１７、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１：２２８−２５７）。
【００６５】
所与の臓器、組織、細胞型、または標的分子に対して選択的な標的アミノ酸配列は、パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）により単離され得る（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８０：３６４−３６６、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ  Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４３：１５９−１６２）。手短に述べると、ファージ含有推定標的ペプチドのライブラリーは、無傷有機体、または単離された臓器、組織、細胞型もしくは標的分子に投与され、結合ファージを含む試料を回収する。標的に結合するファージを、標的臓器、組織、細胞型、もしくは標的分子から溶離し、その後、宿主細菌において、それらを成長させることにより増幅し得る。
【００６６】
複数回のパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を、選択的または特異的な結合剤の集団を得るまで行なうことができる。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノム内に挿入する標的ペプチドに対応するＤＮＡを配列することにより決定され得る。同定された標的ペプチドは、その後、標準タンパク質化学技法により、合成ペプチドとして生成され得る（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ，１９９８ａ，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）。
【００６７】
アプタマー
ある実施形態において、使用される標的部分は、アプタマーであり得る。アプタマーの結合特性を構築、および決定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、このような技術は、米国特許第５，５８２，９８１号、第５，５９５，８７７号、および第５，６３７，４５９号に記載され、それぞれは、それを参照することによって本明細書に組み入れられる。対象となる特定の標的に結合するアプタマーの調製およびスクリーニングの方法は、既知であり、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号および米国特許第５，２７０，１６３号であり、それぞれは、それを参照することによって組み入れられる。
【００６８】
アプタマーは、合成、組み換え、および精製方法を含む、任意の既知の方法により調製され得、単独で、または同一の標的に対して特異的な他のリガンドと組み合わせて使用され得る。一般に、最低約３つのヌクレオチド、好ましくは、少なくとも５つのヌクレオチドが特異結合をもたらすために必要である。１０塩基よりも短い配列のアプタマーも使用可能であるが、１０、２０、３０、または４０のヌクレオチドのアプタマーが好ましいとされ得る。
【００６９】
アプタマーは、結合特異性を与える配列を含む必要があるが、隣接領域を伴い拡張、または、他の形態で誘導体化され得る。好ましい実施形態において、アプタマーの結合配列は、プライマー結合配列により隣接され得、ＰＣＲまたは他の増幅技術によるアプタマーの増幅を促進する。
【００７０】
アプタマーを、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ分子として、単離する、配列を決定する、および／または増幅する、もしくは合成し得る。あるいは、対象となるアプタマーは、増幅したオリゴマーを含有し得る。通常、アプタマーに存在する任意のヒドロキシル基は、ホスホン酸基、リン酸基により置換され、標準保護基により保護される、または他のヌクレオチドに追加の結合を調製するために活性化される、または固体支持体に共役され得る。１つ以上のホスホジエステル結合は、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＮＲ２により置換されるＰ（Ｏ）Ｏ等の代替的な連結基により置換され得、式中、Ｒは、Ｈまたはアルキル（１−２０Ｃ）であり、Ｒ’は、アルキル（１−２０Ｃ）であり、さらに、本基は、ＯまたはＳを介して隣接ヌクレオチドに結合され得る。オリゴマー内のすべての結合が同一である必要はない。
【００７１】
共役プロトコル
好ましい共役プロトコルは、中性または弱酸性のｐＨで容易である、アルキン−アジド（好ましくは、一置換のアセチレン−アジド）、チオール−マレイミド、チオール−ビニルスルホン、チオール−ブロモアセトアミド、またはチオール−ヨードアセトアミド反応に基づく。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態の共役体の適切な投与経路は、経口、非経口、直腸、経粘膜的、腸管投与、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路は、非経口である。あるいは、全身的ではなく、局所的に、例えば、固形腫瘍に直接化合物を注入して、化合物を投与することができる。
【実施例】
【００７３】
本発明は、その範囲を限定することなく、下述の実施例を用いて説明される。
【００７４】
実施例１：デキストランにおけるＣＯＯＨ基の導入
デキストラン（７０ｋＤ  ＭＷ）を、８０℃で３時間、５−ブロモヘキサン酸および４Ｍ水酸化ナトリウムで誘導体化した。その後、この物質を、ｐＨ約４まで酸性化し、任意で、有機溶媒で抽出して未反応のブロモヘキサン酸を除去し、１０ｋＤ分画分子量（ＭＷＣＯ）透析カセットにおいて、水に対して透析し、３回水を取り替えた。水性生成物を凍結乾燥した。既知量の修飾デキストランを０．１Ｎ水酸化ナトリウムに対して滴定し、導入されたカルボン酸基の数を推定した。これにより、デキストラン当たり４４〜１００のＣＯＯＨ基が導入され、１１％〜２５％の修飾されたモノマー単位に対応することが示された。
【００７５】
実施例２：ＣＯＯＨ付加のデキストラン（７０ｋＤ  ＭＷ）の誘導体化
４４ＣＯＯＨ／７０ｋＤデキストランを有する実施例１の生成物を、水溶性カルボジイミド、ＥＤＣ、およびＢＯＣ−ヒドラジンで処理したが、それぞれは、ＣＯＯＨ量の約５０％に対応する同等物であった。簡潔に述べると、ＥＤＣ処理は、約６の酸性ｐＨで行われ、その後、一保護されたヒドラジンを添加し、ｐＨを７．４まで上げた。室温で２〜３時間培養した後、生成物を３０Ｋ  ＭＷＣＯの遠心フィルターを使用して、限外ろ過により精製した。回収した生成物を０．１Ｎ水酸化ナトリウムに対して滴定することにより測定したところ、２４ＣＯＯＨ／７０ｋＤデキストランを含んでいた。これは、２０のＣＯＯＨ部分がＢＯＣヒドラジドとして誘導体化されたことを示した。この工程は、新しい中間体が、ここで、デキストラン当たり、８アミノ基、２０ＢＯＣヒドラジド、および１６のＣＯＯＨを有するように、ＥＤＣおよびエチレンジアミンを使用して、さらに誘導体化とともに繰り返した。最終的に、デキストランポリマー当たり、約１つの反応部分を導入するために、最適化を行った。これは、様々なモル当量のＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロプリオネート）と、アミン、ＢＯＣ−ヒドラジド、およびＣＯＯＨ含有デキストランとを反応させることにより、かつ３４３ｎｍで、ジチオスレイトールとの反応により遊離された、２チオピリドンを分光光度法で分析することにより、そのように導入された活性ジスルフィド基の数を分析することにより行われた。本分析は、５．３倍のモル過剰のＳＰＤＰ試薬を使用した際、活性化したジスルフィド対デキストラン置換の１：１のレベルを得たことを示した。
【００７６】
実施例３：ドキソルビシン置換ポリマーに対するＣＯＯＨ付加のデキストラン（４０ｋＤ  ＭＷ）の連続誘導体化
デキストラン（４０ｋＤ）を、実施例１にあるように、ブロモヘキサン酸および水酸化ナトリウムで誘導体化し、デキストラン当たり約６０のＣＯＯＨを有するようにさせた。これを、ＢＯＣヒドラジンおよびＥＤＣで、約３０Ｂｏｃ−ヒドラジド基である、ＣＯＯＨ量の約５０％のレベルに、誘導体化した。脱保護を３Ｍ塩酸で行い、生成物を限外ろ過により精製した。ドキソルビシンとの共役を、ｐＨ５およびｐＨ６の条件下で検査したが、水性条件の誘導体化が、２０のＤｏｘ基が導入されたｐＨ５においての方が、１２のＤｏｘが導入されたｐＨ６においてより、さらに効率的であることを示した。ドキソルビシン量は、４９６ｎｍの吸光度、およびドキソルビシン標準曲線との相関から決定された。
【００７７】
実施例４：「クリック化学」手法によるドキソルビシン置換ポリマーに対するＣＯＯＨ付加のデキストラン（４０ｋＤ  ＭＷ）の逐次誘導体化
実施例３（０．００４７  ｍｍｏｌのデキストラン、ＣＯＯＨに対して０．２８２ｍｍｏｌ）からのカルボキシル誘導体化デキストラン（４０ｋＤ、約６０ＣＯＯＨ）を、２．６ｍｍｏｌのＥＤＣおよび２．１ｍｍｏｌのプロパルギルアミンで処理した。生成物である、アセチレン添加されたデキストランを、繰り返し限外ろ過膜分離法を行うことにより精製した。アセチレン量は、非誘導体化カルボン酸基の逆滴定に基づき、４０ｋｄ  ＭＷデキストラン当たり５０〜６０であると推定された。
【００７８】
アジド抱合されたドキソルビシンヒドラゾンを、メタノール中のドキソルビシン（０．４４ｍｍｏｌ）および６−アジドヘキサン酸ヒドラジド（ＴＦＡ塩として、１．５ｍｍｏｌ）から室温で一晩調製した。溶媒を蒸発により取り除き、過剰ヒドラジド試薬をアセトニトリルで粉砕することにより除去した。勾配溶離（３ｍＬ／分の流速で１０分間で１００％Ａを１００％Ｂ、次の５分間で１００％Ｂを維持、Ａ＝０．３％酢酸アンモニウム  ｐＨ４．４３、Ｂ＝９０％アセトニトリル、１０％Ａ、２５４ｎｍのインライン吸光度検出）を使用して、逆相ＨＰＬＣカラムにおいて分析した際、そのようにして得られた固体生成物は、９．９２分の保持時間を有し、７５％の純度であり、残留材料の大部分は未反応のドキソルビシンから構成されていた。生成物は、エレクトロスプレイ質量スペクトルにおいて、ｍ／ｅ  ６９６（Ｍ−Ｈ）、およびｍ／ｅ  ７３２（Ｍ＋Ｃｌ）でピークを示し、生成物の同一性を表した。［本明細書で使用されるヒドラジド試薬を、６−ブロモヘキサン酸（２ｇ）から、まず、ＤＭＳＯ中のアジ化ナトリウム（１ｇ）と、５０℃で２時間反応させ、次いで、抽出物を水および酢酸エチルで抽出することによる、３つのステップで、調製をした。酢酸エチル抽出物を、１Ｎ  ＨＣｌ溶液、塩水で順次洗浄し、乾燥させた。溶媒除去後、生成物を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中で再溶解し、２ｇのＥＤＣ（１０ｍｍｏｌ）および１．４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＢＯＣ−ヒドラジドと、室温で１時間反応させた。抽出処理を１Ｎ  ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液、および塩水で行い、次いで、乾燥させ、溶媒除去を１０ｍＬの１：１のＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ２を使用して、所要の生成物を得、これをＴＦＡ媒介ＢＯＣ脱保護した。本物質を誘導体化ドキソルビシンのために使用した。］
【００７９】
この部分的に精製された物質を、次のように、アセチレン含有デキストランに連結するために使用した。アセチレン添加されたデキストラン（３．３５ｍＭの０．１ｍＬ）を、酸開裂可能なヒドラゾン、０．０５モル当量の硫酸銅（ドキソルビシンアジドに対して）、および０．５モル当量のアスコルビン酸ナトリウム（ドキソルビシンアジドに対して）を組み込み、２ｍｇ（１．４４μｍｏｌ、デキストランに関して５７倍のモル過剰）のドキソルビシン−アジドと反応させ、室温で一晩撹拌した。反応ｐＨを約６．７で維持した。生成物を、１０Ｋ  ＭＷＣＯの遠心フィルターを使用して、３連続ＵＦ−ＤＦにより精製した。生成物を凍結乾燥し、１３．５ｍｇのドキソルビシン誘導体化されたデキストランを得た。ドキソルビシン置換は、デキストラン当たり８．２であることが判明した。
【００８０】
スキーム２は、その反応を説明する。
スキーム２
【化８】
2014159441.tif 000011
【００８１】
実施例５：ＳＮ３８−２０−Ｏ−グリシナト−ＰＥＧ−アジドの調製
０．５ｇ（０．９ｍｍｏｌ）の市販のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘプタエチレングリコールを、１．２当量のＤＣＣ（０．１８６ｇ）および１．２当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１０３ｇ）およびジクロロメタン（１０ｍＬ）中の触媒量のＤＭＡＰ（０．００３ｇ）により、周囲温度で３０分間、活性化した。これに、１０ｍＬのジクロロメタン中０．４２ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）のＳＮ３８−２０−Ｏ−グリシン酸塩およびＤＩＥＡ（０．１４５ｍＬ、１．１当量）の溶液を加えた。３０分間、撹拌した後、生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ勾配溶離を使用して、シリカゲル上（２３０−４００メッシュ）でフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。油状生成物（０．７４ｇ、収率９８％）は、実施例４に記載のＨＰＬＣ条件下で、９．８６分のＨＰＬＣ保持時間を有した。生成物をエレクトロスプレイ質量スペクトルにより特性化した。ｍ／ｅ  ９８６でＭ＋Ｈ、ｍ／ｅ  １００８でＭ＋Ｎａ、負イオン形態において、ｍ／ｅ  ９８５でＭ−Ｈ。Ｃ４５Ｈ６４Ｎ７Ｏ１７（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値：９８６．４３６０、実測値：９８６．４３６１。
【００８２】
スキーム３は、その合成を示す。
スキーム３
【化９】
2014159441.tif 000012
【００８３】
実施例６：Ｎ３−ＰＥＧ−ＰｈＣ−ＬｙＳ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−ＳＮ３８−１０−Ｏ−ＢＯＣの調製
０．５２７ｇ（０．９５ｍｍｏｌ）のＯ−（２−アジドエチル）−Ｏ’−（Ｎ−ジグリコリル−２−アミノエチル）ヘプタエチレングリコールを、周囲温度で３０分間、１．１当量のＤＣＣ（０．１８２ｇ）および１．２当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１１９ｇ）およびジクロロメタン（２０ｍＬ）中の触媒量のＤＭＡＰ（０．００５ｇ）で活性化した。本混合物に、既知のＰｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（０．５８ｇ、０．８６５ｍｍｏｌ）（ＭＭＴは、モノメトキシトリチルを表し、ＰＡＢＯＨは、ｐ−アミノベンジルアルコール部分である）、およびＤＩＥＡ（０．１５８ｍＬ、１．５当量）を加えた。さらに１時間撹拌し、生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率：８４％、質量スペクトル：Ｍ＋Ｈ：ｍ／ｅ  １２０７。本材料を１当量のＢＯＣ−ＳＮ３８−２０−Ｏ−クロロギ酸エステルに結合した。［後者は、それ自体は精製することなく、ＢＯＣ−ＳＮ３８、ジクロロメタン中のトリホスゲン（０．４当量）、およびＤＭＡＰ（３．２当量）から調製した。］。フラッシュクロマトグラフィーにより精製した後、表題生成物を収率６０〜８０％で得た。Ｍ＋Ｈ：計算値１７２５．７９８１、実測値：１７２５．７９５３。
【００８４】
スキーム４は、その調製を示す。
スキーム４
【化１０】
2014159441.tif 000013
【００８５】
実施例７：アジド−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−ＬｙｓＣ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＣＯ−２０−Ｏ−グリシナトＳＮ３８の調製
実施例１０からの中間体アジド−ＰＥＧ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（０．２７ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を、周囲温度で３日間、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のビス（ニトロフェニル）炭酸塩（０．２０４ｇ、３当量）およびＤＩＥＡ（１当量）で活性化した。フラッシュクロマトグラフィーにより、純粋な活性化した生成物（収率：６９％）、Ｃ７１Ｈ９０Ｎ９Ｏ１９に対するＭ＋Ｈ計算値：１３７２．６３４７、実測値：１３７２．６３４７を得た。活性化した炭酸塩生成物（０．０８ｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０２５ｍＬ、２．５当量）中のＳＮ３８−２０−Ｏ−グリシナト（０．０２８ｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）に結合した。４時間撹拌した後、溶媒を除去し、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率：０．０５２ｇ（５４％）。Ｃ８９Ｈ１０８Ｎ１１Ｏ２２に対するＭ＋Ｈ計算値：１６８２．７６６５、実測値：１６８２．７６８２。
【００８６】
スキーム５は、その反応を説明する。
スキーム５
【化１１】
2014159441.tif 000014
【００８７】
実施例８：Ｎ−ＢＯＣ−２，２’−（エチレンジオキシ）ジエチルアミン、次いで、ＢＯＣ脱保護を伴うスクシンイミジル４−マレイミドメチル−シクロヘキサンカルボン酸塩（ＳＭＣＣ）の誘導体化
ＳＭＣＣ（０．３３４ｇ）、一保護されたジアミン試薬（０．２４８ｇ）、およびＤＩＥＡ（０．１７ｍＬ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）中で溶解し、周囲温度で２０分間撹拌した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、ＴＦＡ（２ｍＬ）およびアニソール（０．５ｍＬ）と、さらに２時間反応させ、最終生成物を、ＴＦＡおよびアニソールを除去した後、単離した。対応する塩酸塩をＨＣｌ中に溶解し、ＨＣｌを蒸発によって取り除くことにより調製した。質量スペクトル：Ｍ＋Ｈ  ｍ／ｅ  ３６８。工程をスキーム６に図式で示す。
スキーム６
【化１２】
2014159441.tif 000015
【００８８】
実施例９：実施例８の生成物による実施例４のアセチレン含有デキストランの誘導体化
１０ｍＬの水中のアセチレン−デキストラン（４０ＫＤ  ＭＷ、０．４２５ｇ）の水溶液に、実施例８の生成物（０．０８５ｇ、デキストランに対して２０当量）およびＥＤＣ（０．０４０６ｇ、２０当量）を加え、１時間撹拌した。１０ｋｄ  ＭＷ  ＣＯろ過機を使用して、限外ろ過膜分離法により精製した。デキストランに対するアンスロン分析は、デキストラン濃度が２８．６ｍｇ／ｍＬであることを示した。過剰の２メルカプトエタノールを使用して、Ｅｌｌｍａｎ分析による過剰な未使用の２−ＭＥを測定する、逆Ｅｌｌｍａｎ分析により、５．４のマレイミドがデキストラン上で置換されたという値を得た。スキーム７は、その反応を表す。
スキーム７
【化１３】
2014159441.tif 000016
【００８９】
実施例１０：実施例５または実施例６または実施例７のＳＮ３８−２０−Ｏ−グリシナト−ＰＥＧ−アジドの生成物と、デキストラン−アセチレン（５０−６０）−マレイミド（５．４）のクリック化学連結
実施例９のデキストラン誘導体溶液の２８．６ｍｇ／ｍＬのうちの１０ｍＬを、１０倍過剰の硫酸銅における、硫酸銅およびアスコルビン酸ナトリウムの触媒量の存在下で、実施例５（７０当量）に特定されたＳＮ３８誘導体の０．４２Ｍ  ＤＭＳＯ溶液で反応した。ＤＭＳＯ濃度は、２０％ｖ／ｖであった。若干濁った溶液を４時間撹拌した。生成物を、０．２Ｍ水性のＥＤＴＡを使用して、限外ろ過膜分離法により精製し、次いで、ゲルろ過した。生成物をアンスロン分析（１０．７４ｍｇ／ｍＬ）により特性化し、ＳＮ３８濃度を、３６６ｎｍの吸光度および標準曲線との相関により決定した。ＳＮ３８モル置換が、３６．６であると計算された。未除去ＳＮ３８遊離濃度は、ＨＰＬＣにより５％であると推定された。実施例５のアジド−ＳＮ３８を使用する、反応生成物は、下のスキーム８に説明される。
スキーム８
【化１４】
2014159441.tif 000017
【００９０】
類似の方法において、実施例９のデキストラン誘導体は、実施例６または７のアジド−ＳＮ３８誘導体と反応し、対応するデキストラン共役体を得た。これらの場合において、ＢＯＣおよびＭＭＴ保護基は、その後、２Ｎ塩酸での処置により、またはトリフルオロ酢酸を伴う短期間の処置（＜５分）により除去された。また代替的に、保護基を、まず除去し、それから、実施例９のデキストラン誘導体に連結するクリック化学を行った。
【００９１】
実施例１１：実施例１０の任意のデキストラン誘導体の、認識部分を抱合するチオール含有材料との連結
反応は、７５ｍＭ酢酸ナトリウム−１ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて、ｐＨ６．５で、１時間、実施例１０のマレイミド付加のデキストランと、５．４当量の認識部分を抱合するチオール含有のペプチドとを連結することにより行われる。事前標的化のために、この点において、原型的ペプチドは、Ａｃ−Ｃｙｓ−（ＡＡ）ｎ−ＬｙＳ（ＨＳＧ）−ＮＨ２であり、ＡＡは、アミノ酸であり、ｎは、１〜２０、好ましくは、１〜３の整数である。「ＡＡ」で表されるアミノ酸のうちの１つは、リシン側鎖アミノ基に置換されるＨＳＧを有するリシンであり得、それにより、ペプチドがビス−ＨＳＧ含有ペプチドにされる。Ｎ末端システインの置換は、金属結合アッセイにより、ポリマーに付着するペプチドの数を決定するため、アシルの代わりに、ベンジル−ＤＴＰＡ等のキレート剤であり得る。ＤＮＬ連結のために、ペプチドは、例えば、第００５１段落に説明される、システイン含有のアンカードメイン（「ＡＤ」）ペプチドである。第００１４段落に記載の他の認識部分はまた、チオール基を所有する同一の適切な事前の誘導体化後の反応において有用である。生成物を、非ＥＤＴＡ緩衝液を使用して、限外ろ過膜分離法、それから、遠心サイズ排除カラムクロマトグラフィーにより精製する。金属キレート剤をさらに含有するＨＳＧ抱合ペプチドを使用して、金属結合分析により、デキストラン当たり２．５のキレート剤が含まれるという結果を得た。これは、デキストランの１モル当たり少なくとも２．５モルがチオール含有材料と反応するために接触可能であることを示唆する。Ｉｎ−１１１酢酸塩を有する試験標識化を行い、材料をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。放射性標識物質のＨＰＬＣ分析、ならびに、抗ＨＳＧ抗体（マウス６７９）と複合化された物質のＨＰＬＣ分析は、Ｉｎ−１１１−デキストランによるＳＥ  ＨＰＬＣピークから、より高いＭＷのデキストランによるピークへのシフトにより明らかであるように、完全複合化、すなわち、６７９抗体複合体を示す。非標識化材料もまた、デキストラン誘導体によって、広範なサイズ排除ＨＰＬＣピークが、比較的より急激かつ高速な溶離ピークに変化し、マウス６７９抗体と複合化することが示されるため、マウス６７９抗体との複合化を表す。ＨＳＧ含有ペプチドに対する共役をスキーム９に示す。
スキーム９
【化１５】
2014159441.tif 000018
【００９２】
実施例１２：ポリグルタミン酸の誘導体化
ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＧ）をＥＤＣおよびプロパルギルアミンと反応させる。生成物である、アセチレン添加されたＰＧをその後、限外ろ過膜分離法を反復することにより精製する。アセチレン量は、非誘導体化カルボン酸基の逆滴定により推定される。アセチレン付加のＰＧは、実施例８のマレイミド含有アミノ化合物を用いて、ＰＧのＣＯＯＨ基に対するＥＤＣ媒介連結、次いで、実施例３もしくは４のアジド誘導体化されたドキソルビシン、または実施例５、６、もしくは７のアジド誘導体化されたＳＮ−３８を使用して、アセチレンアジド連結で誘導体化することにより、順次誘導体化される。それぞれの生成物を限外ろ過膜分離法により精製する。アジド剤が実施例６または７から成る場合、ＢＯＣおよびＭＭＴ基のさらなる脱保護はまた、第００８４段落に記載されるように、塩酸またはトリフルオロ酢酸を用いて行われる。最終的に、当該物質は、実施例１１に記載されるように、チオール含有認識部分で誘導体化される。７５０〜５０００、３０００〜１５，０００、１５，０００〜５０，０００、および５０，０００〜１００，０００の範囲にある分子量を有するＰＧをこの状況で使用する。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月1日(2014.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合体であって、
（ａ）それぞれ異なるＭＷサイズのデキストラン、ポリグルタミン酸およびデンドリマーから成る群より選択され、かつ、１つ以上の治療薬部分の複製、または二官能性治療薬部分に化学選択的に連結可能であるか、もしくは治療薬部分と非共有的に複合化できる官能基を含む官能化ポリマーと、
（ｂ）ソマトスタチン、ＶＩＰ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びドックアンドロック（ＤＮＬ）方法のＡＤペプチドから成る群より選択される認識構造部分と、を含み、
前記認識構造部分の数は、前記官能化ポリマー当たり１から１０である、複合体。
【請求項２】
前記ポリマーはデキストランである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記治療薬部分は、化学療法薬、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗血管形成活性剤、アポトーシス促進剤、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、カンプトテシン、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位複合体、ホルモン、毒素、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗菌タンパク質、ゲロニン、ジフテリン毒素、緑膿菌外毒素および緑膿菌内毒素から成る群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記官能基は、１つ以上のアセチレンまたはアジド、ヒドラジド、シクロデキストリン、ビニルスルホン、マレイミド、チオール、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、イソチオシアネートおよび活性カルボキシル基より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記官能基はアセチレンまたはアジドであり、連結は、アジドまたはアセチレンで誘導体化された薬剤を用いて行われる、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記官能基はシクロデキストリンであり、前記治療薬部分は、非共有ホストゲスト複合化によって連結される、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
前記認識構造部分が、ＤＮＬ方法のＡＤペプチドであり、ＤＮＬ方法における前記ＡＤペプチドとＤＤＤ成分との融合は、前記ポリマーへの薬剤または治療薬部分の付着前または後のいずれかに行われる、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
前記薬剤を前記ポリマーに連結するスペーサは、細胞内で開裂可能な結合を含有し、前記開裂可能結合が、ヒドラゾン、カテプシン−Ｂ−開裂可能ペプチド、ジスルフィドまたはエステラーゼによって開裂可能なエステル結合である、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
前記認識構造部分は、二重または多特異性抗体のアームのうちの１つに特異的であり、前記抗体の１つ以上の他のアームは、ムリン化、キメラ化、霊長類化、ヒト化またはヒト単クローン抗体に由来する疾病標的抗体であり、前記疾病標的抗体は、無傷フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ′）２）またはサブフラグメント（一本鎖組成物）形態である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
前記多特異性抗体は、ＬＬ１、ＬＬ２、ｈＡ２０、１Ｆ５、Ｌ２４３、ＲＳ７、ＰＡＭ−４、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５、Ｍｕ−９、Ｌ１９、Ｇ２５０、Ｊ５９１、ＣＣ４９およびＩｍｍｕ３１から成る群より選択される、１つ以上の抗体を含む、二重特異性および／または二価抗体組成物である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記疾病標的抗体は、癌細胞もしくは悪性細胞、感染性生物、自己免疫疾病、心血管疾病または神経疾病に関連する抗原または抗原のエピトープと反応する、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
前記癌細胞は、造血性腫瘍、癌腫、肉腫、黒色腫またはグリア腫瘍に由来する細胞である、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記疾病標的抗体は、Ｂ−細胞系統抗原、Ｔ−細胞抗原、骨髄系統抗原またはＨＬＡ−ＤＲ抗原に結合する、請求項９に記載の複合体。
【請求項１４】
前記感染性生物は、バクテリア、ウィルス、真菌、微生物または寄生生物である、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１５】
前記自己免疫疾病は、免疫媒介性血小板減少、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、関節リウマチ、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、レンサ球菌感染後の腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多型性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチュア症候群、閉塞性血栓血管炎、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺亢進、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、胆汁過多、尋常性天疱瘡、ヴェグナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨大細胞動脈炎／多筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、線維化性肺胞炎および若年性糖尿病から成る群より選択される、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１６】
前記疾病標的抗体は、ＣＤ７４、ＣＤ２２、上皮糖タンパク質−１、癌胎児性抗原（ＣＥＡまたはＣＤ６６ｅ）、大腸特異的抗原−ｐ、α−フェトプロテイン、ＣＣ４９、前立腺特異的膜抗原、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＩＬＧＦ、ＢｒＥ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＰｌＧＦ、他の腫瘍血管形成抗原、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ガングリオシド、ＨＣＧ、ＥＧＰ−２、ＣＤ３７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３０、Ｉａ、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−Ｉ、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、トーマス−フリードリッヒ抗原、腫瘍壊死抗原、Ｇａ７３３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、遊走阻止因子（ＭＩＦ）、Ｌ２４３によって結合される抗原、ＰＡＭ４によって結合される抗原、ＣＤ６６ａ（ＢＧＰ）、ＣＤ６６ｂ（ＣＧＭ６）、６６ＣＤｃ（ＮＣＡ）、６６ＣＤｄ（ＣＧＭ１）、ＴＡＣおよびそれらの組み合わせから成る群より選択される抗原に結合する、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１７】
前記疾病標的抗体は、ＬＬ１、ＬＬ２、ＲＦＢ４、ｈＡ２０、１Ｆ５、Ｌ２４３、ＲＳ７、ＰＡＭ−４、ＭＮ−１４、ＭＮ−１５、Ｍｕ−９、ＡＦＰ−３１、Ｌ１９、Ｇ２５０、Ｊ５９１、ＣＣ４９、Ｌ２４３、ＰＡＭ４およびＩｍｍｕ３１から成る群より選択される、請求項９に記載の複合体。
【外国語明細書】
2014159441000001.pdf