(57)【要約】      （修正有）【課題】剤型中の抗体産物の分解を遅延させる製剤の提供。【解決手段】ヒスチジン−酢酸緩衝液中で処方されたモノクローナル抗体、ならびにＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体（例えばパーツズマブ）を含む製剤およびＤＲ５に結合する抗体（例えばＡｐｏｍａｂ）を含む製剤を含めた抗体製剤の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）中にモノクローナル抗体を含む安定な薬学的製剤。
【請求項２】
ｐＨが５．８から６．２である、請求項１記載の製剤。
【請求項３】
ヒスチジン−酢酸緩衝液の濃度が約１mMから約２００mMである、請求項１記載の製剤。
【請求項４】
ヒスチジン−酢酸緩衝液の濃度が約１０mMから約４０mMである、請求項３記載の製剤。
【請求項５】
抗体の濃度が約１０mg/mLから約２５０mg/mLである、請求項１記載の製剤。
【請求項６】
モノクローナル抗体の濃度が約２０mg/mLから約４０mg/mLである、請求項５記載の製剤。
【請求項７】
モノクローナル抗体の濃度が約８０mg/mLから約２５０mg/mLである、請求項５記載の製剤。
【請求項８】
糖類をさらに含む、請求項１記載の製剤。
【請求項９】
糖類が二糖類である、請求項８記載の製剤。
【請求項１０】
糖類がトレハロースである、請求項８記載の製剤。
【請求項１１】
糖類がスクロースである、請求項８記載の製剤。
【請求項１２】
糖類の濃度が約１０mMから約１Mである、請求項８記載の製剤。
【請求項１３】
糖類の濃度が約６０mMから約２５０mMである、請求項１２記載の製剤。
【請求項１４】
さらに界面活性剤を含む、請求項１記載の製剤。
【請求項１５】
界面活性剤がポリソルベートである、請求項１４記載の製剤。
【請求項１６】
界面活性剤がポリソルベート２０である、請求項１５記載の製剤。
【請求項１７】
界面活性剤の濃度が約０．０００１％から約１．０％である、請求項１４記載の製剤。
【請求項１８】
界面活性剤の濃度が約０．０１％から約０．１％である、請求項１７記載の製剤。
【請求項１９】
モノクローナル抗体が全長抗体である、請求項１記載の製剤。
【請求項２０】
モノクローナル抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１９記載の製剤。
【請求項２１】
モノクローナル抗体がヒト化抗体である、請求項１記載の製剤。
【請求項２２】
モノクローナル抗体が、抗原結合領域を含む抗体フラグメントである、請求項１記載の製剤。
【請求項２３】
抗体フラグメントがＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、請求項２２記載の製剤。
【請求項２４】
無菌である、請求項１記載の製剤。
【請求項２５】
モノクローナル抗体が、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＤＲ５、ＢＲ３、ＩｇＥ、およびＶＥＧＦからなる群より選択される抗原と結合する、請求項１記載の製剤。
【請求項２６】
抗原がＣＤ２０であり、モノクローナル抗体がヒト化２Ｈ７である、請求項２５記載の製剤。
【請求項２７】
抗原がＶＥＧＦであり、モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項２５記載の製剤。
【請求項２８】
モノクローナル抗体が脱アミドまたは凝集に感受性である、請求項１記載の製剤。
【請求項２９】
約４０℃で少なくとも４週間保存したときに安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項３０】
約５℃または約１５℃で少なくとも３か月間保存したときに安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項３１】
約−２０℃で少なくとも３か月間保存したときに安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項３２】
凍結時及び解凍時に安定である、請求項１記載の製剤。
【請求項３３】
水性である、請求項１記載の製剤。
【請求項３４】
凍結している、請求項１記載の製剤。
【請求項３５】
凍結乾燥されておらず、以前に凍結乾燥に供されたことのない、請求項１記載の製剤。
【請求項３６】
水性であり、対象に投与される、請求項３５記載の製剤。
【請求項３７】
静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）または筋肉内（ＩＭ）投与用である、請求項３６記載の製剤。
【請求項３８】
抗体の濃度が約２０mg/mLから約４０mg/mLである、ＩＶ投与用の請求項３７記載の製剤。
【請求項３９】
抗体の濃度が約８０mg/mLから約２５０mg/mLである、ＳＱ投与用の請求項３７記載の製剤。
【請求項４０】
注射器で刺通することができる栓を有し、内部に請求項１記載の製剤を含むバイアル。
【請求項４１】
約２〜８℃で保存される、請求項４０記載のバイアル。
【請求項４２】
２０ccまたは５０ccバイアルである、請求項４０記載のバイアル。
【請求項４３】
請求項１記載の製剤を中に含む、ステンレススチールタンク。
【請求項４４】
内部の製剤が凍結している、請求項４３記載のタンク。
【請求項４５】
対象における疾患または障害を処置する方法であって、該疾患または障害を処置するのに有効な量の請求項１記載の製剤を対象に投与する段階を含む方法。
【請求項４６】
（ａ）約１０mg/mLから約２５０mg/mLの量の、脱アミドまたは凝集に感受性の全長ＩｇＧ１抗体；
（ｂ）ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）；
（ｃ）約６０mMから約２５０mMの量の、トレハロースおよびスクロースからなる群より選択される糖類；ならびに
（ｄ）約０．０１％から約０．１％の量のポリソルベート２０
を含む薬学的製剤。
【請求項４７】
治療用モノクローナル抗体の脱アミドまたは凝集を低減するための方法であって、ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）中に該抗体を処方する段階を含む方法。
【請求項４８】
抗体が処方される前後に、該抗体の任意の脱アミドまたは凝集を評価する段階を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
ｐＨ約５．５から約６．５のヒスチジン緩衝液、糖類、および界面活性剤中に、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体を含む薬学的製剤。
【請求項５０】
緩衝液がヒスチジン−酢酸である、請求項４９記載の製剤。
【請求項５１】
ＨＥＲ２抗体が、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む、請求項４９記載の製剤。
【請求項５２】
ＨＥＲ２抗体が、配列番号１５および２３より選択される軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１６および２４より選択される重鎖アミノ酸配列とを含む、請求項５１記載の製剤。
【請求項５３】
製剤のｐＨが約５．８から約６．２である、請求項４９記載の製剤。
【請求項５４】
抗体がＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの間の結合部に結合する、請求項４９記載の製剤。
【請求項５５】
抗体が全長抗体である、請求項４９記載の製剤。
【請求項５６】
抗体の濃度が約２０mg/mLから約４０mg/mLである、請求項４９記載の製剤。
【請求項５７】
約２０mg/mLから約４０mg/mLの量のパーツズマブ、ヒスチジン−酢酸緩衝液、スクロース、およびポリソルベート２０を含み、ｐＨが約５．５から約６．５である薬学的製剤。
【請求項５８】
約３０mg/mLのパーツズマブ、約２０mMのヒスチジン−酢酸、約１２０mMのスクロース、および約０．０２％のポリソルベート２０を含み、ｐＨが約６．０である、請求項５７記載の製剤。
【請求項５９】
注射器で刺通することができる栓を有し、請求項４９記載の製剤を含むバイアル。
【請求項６０】
請求項４９記載の製剤を中に含むステンレススチールタンク。
【請求項６１】
対象におけるＨＥＲ２発現ガンを処置する方法であって、該ガンを処置するのに有効な量の請求項４９記載の薬学的製剤を該対象に投与する段階を含む方法。
【請求項６２】
製剤が対象に静脈内、皮下、または筋肉内投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）請求項１記載の製剤を調製する段階；および
（ｂ）該製剤中のモノクローナル抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価する段階
を含む、薬学的製剤を製造する方法。
【請求項６４】
ｐＨ約５．５から約６．５のヒスチジン緩衝液、糖類、および界面活性剤の中にＤＲ５抗体を含む薬学的製剤。
【請求項６５】
緩衝液がヒスチジン−酢酸である、請求項６４記載の製剤。
【請求項６６】
ＤＲ５抗体がアゴニスト抗体である、請求項６４記載の製剤。
【請求項６７】
ＤＲ５抗体がＡｐｏｍａｂである、請求項６４記載の製剤。
【請求項６８】
ＤＲ５抗体が、配列番号５１の重鎖アミノ酸配列および配列番号５２の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項６７記載の製剤。
【請求項６９】
製剤のｐＨが約５．８から約６．２である、請求項６４記載の製剤。
【請求項７０】
抗体が全長抗体である、請求項６４記載の製剤。
【請求項７１】
抗体濃度が約１０mg/mLから約３０mg/mLである、請求項６４記載の製剤。
【請求項７２】
約１０mg/mLから約３０mg/mLの量のＡｐｏｍａｂ、ヒスチジン−酢酸緩衝液、トレハロース、およびポリソルベート２０を含み、ｐＨが約５．５から約６．５である薬学的製剤。
【請求項７３】
約２０mg/mLのＡｐｏｍａｂ、約２０mMのヒスチジン酢酸塩、約２４０mMのトレハロース、および約０．０２％のポリソルベート２０を含み、ｐＨが約６．０である、請求項７２記載の製剤。
【請求項７４】
注射器で刺通することができる栓を有する、請求項６４記載の製剤を含むバイアル。
【請求項７５】
請求項６４記載の製剤を中に含むステンレススチールタンク。
【請求項７６】
対象におけるガンを処置する方法であって、該ガンを処置するのに有効な量の請求項６４記載の薬学的製剤を該対象に投与する段階を含む方法。
【請求項７７】
ガンが固形腫瘍である、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
ガンが非ホジキンリンパ腫である、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
製剤が対象に静脈内、皮下、または筋肉内投与される、請求項７６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
これは、２００４年１０月２０日に出願された仮出願６０／６２０，４１３の優先権を主張している米国特許法施行規則１．５３条（ｂ）項に基づく非仮出願であり、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒスチジン−酢酸緩衝液中で処方されたモノクローナル抗体、ならびにＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体（例えば、パーツズマブ）を含む製剤およびＤＲ５に結合する抗体（例えば、Ａｐｏｍａｂ）を含む製剤を含めた抗体製剤に関するものである。
【０００３】
発明の背景
過去１０年間に、バイオテクノロジーにおける進歩は、リコンビナントＤＮＡ技法を用いて薬学的応用のための多様なタンパク質を生産することを可能にした。タンパク質が伝統的な有機薬物および無機薬物よりも大型で複雑な（すなわち、複雑な三次元構造に加えて多数の官能基を有する）ことから、当該タンパク質の製剤は特別な問題を提起する。タンパク質が生物学的に活性のままであるためには、そのタンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列のコンフォメーション完全性がインタクトな状態を保つ一方で、同時にそのタンパク質の多数の官能基を分解から保護しなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち新しい化学的実体を生じる、結合形成または開裂によるタンパク質の改変を伴う任意の過程）または物理的不安定性（すなわちタンパク質の高次構造の変化）を伴うことがある。化学的不安定性は、脱アミド、ラセミ化、加水分解、酸化、β−脱離またはジスルフィド交換に起因することがある。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿または吸着に起因することがある。三つの最もよくみられるタンパク質分解経路は、タンパク質凝集、脱アミドおよび酸化である。Clelandら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)。
【０００４】
抗体製剤
薬学的応用に使用されるタンパク質には抗体が含まれる。治療に有用な抗体の例は、パーツズマブなどのＨＥＲ２抗原に結合する抗体である。
【０００５】
米国特許第６，３３９，１４２号は、抗ＨＥＲ２抗体とその一つまたは複数の酸性変異体との混合物を含むＨＥＲ２抗体組成物を記載しており、ここで、その酸性変異体の量は約２５％未満である。トラスツズマブはＨＥＲ２抗体の例である。
【０００６】
米国特許第６，２６７，９５８号および第６，６８５，９４０号（Andya et al.）は、ＨＥＲ２抗体製剤および抗ＩｇＥ抗体製剤を含めた凍結乾燥抗体製剤を記載している。ＷＯ９７／０４８０７およびＵＳ２００４／０１９７３２６Ａ１（Fick et al.）は、抗ＩｇＥ抗体を用いてアレルギー性喘息を処置するための方法を記載している。ＷＯ９９／０１５５６（Lowman et al.）は、異性化を起こしやすいアスパルチル残基を有する抗ＩｇＥ抗体およびその改良変異体に関するものである。ＵＳ２００２／００４５５７１（Liu et al.）は、ヒト化抗ＩｇＥ抗体製剤であるｒｈｕＭＡｂ  Ｅ２５およびＥ２６に例示される低粘度濃縮タンパク質製剤を提供している。ＷＯ０２／０９６４５７およびＵＳ２００４／０１７０６２３（Arvinte et al.）は、抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５を含む安定液体製剤を記載している。高濃度抗ＩｇＥ製剤に関するＵＳ２００４／０１９７３２４Ａ１（Liu and Shire）も参照されたい。
【０００７】
米国特許第６，１７１，５８６号（Lam et al.）は、安定水性抗体製剤を記載している。Ｆ（ａｂ’）２  ｒｈｕＭＡｂ  ＣＤ１８抗体が、酢酸ナトリウムおよびヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液中で処方された。ｒｈｕＭＡｂ  ＣＤ１８のための好ましい処方は、１０mM酢酸ナトリウム、８％トレハロース、０．０１％ＴＷＥＥＮ２０（商標）（ｐＨ５．０）であった。４０℃で１か月間保存されたｒｈｕＭＡｂ  ＣＤ２０の酢酸（ｐＨ５．０）製剤は、ヒスチジン（ｐＨ５．０またはｐＨ６．０）中で処方された試料よりも大きな安定性を示した。
【０００８】
ＵＳ２００３／０１９０３１６（Kakuta et al.）はヒト化ＩＬ−６レセプター抗体である処方された抗体ｈＰＭ−１に関するものである。単量体の損失は、クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）中で最大であり、降順でそれにリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、ヒスチジン−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）およびグリシン（ｐＨ７．６）が続いた。ｈＰＭ−１の安定性に及ぼすリン酸−Ｎａ（ｐＨ６．５）、リン酸−Ｈｉｓ（ｐＨ６．０または６．５）、Ｈｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、およびリン酸Ｎａ（ｐＨ６．０）の効果が標定された。
【０００９】
ＷＯ２００４／０７１４３９（Burke et al.）は、おそらく金属イオンおよびヒスチジンを伴う酸化反応により、ポリソルベート８０の分解からナタリズマブ（抗α４インテグリン−ヒト化モノクローナル抗体）製剤中に不純物が生じたと述べている。このように、リン酸緩衝液が選択された。
【００１０】
ＷＯ２０００／０６６１６０（英語での対応はＥＰ１１７４１４８Ａ１）（Okada et al.）は、リン酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液中の、ヒト血小板膜糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのフィブリノーゲンレセプターに結合するヒト化Ｃ４Ｇ１抗体製剤を参照している。
【００１１】
ＷＯ２００４／０１９８６１（Johnson et al.）は、５０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）および１２５mM塩化ナトリウム中に２００mg/mlで処方された抗ＴＮＦαのＰＥＧ化ＦａｂフラグメントであるＣＤＰ８７０に関するものである。
【００１２】
ＷＯ２００４／００４６３９（Nesta, P.）は、５０mMコハク酸緩衝液（ｐＨ６．０）およびスクロース（５％w/v）中の、腫瘍に活性化される免疫毒素であるｈｕＣ２４２−ＤＭ１についての製剤を参照している。
【００１３】
ＷＯ０３／０３９４８５（Kaisheva et al.）は、ダクリズマブ（ヒト化ＩＬ−２レセプター抗体）がｐＨ６．０のコハク酸ナトリウム緩衝液中で最高の安定性を有し、ヒスチジン中では緩衝液が酸化するにつれて効力を急速に失ったことを見出した。
【００１４】
ＷＯ２００４／００１００７は、ヒスチジンＨＣｌ緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液またはクエン酸ナトリウム緩衝液中のＣＤ８０モノクローナル抗体に関するものである。
【００１５】
米国特許第６，２５２，０５５号（Relton, J.）は、マレイン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝液中で処方された抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ２３抗体を参照しており、リン酸緩衝液が好ましい緩衝液と同定された。
【００１６】
米国特許第５，６０８，０３８号（Eibl et al.）は、免疫グロブリン、グルコースまたはスクロース、および塩化ナトリウムを中に有する高濃度ポリクローナル免疫グロブリン調製物を参照している。
【００１７】
ＷＯ０３／０１５８９４（Oliver et al.）は、１００mg/mL  ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、２５mMヒスチジン−ＨＣｌ、１．６mMグリシン（ｐＨ６．０）の水性製剤、ならびに処方されたとき（凍結乾燥前）に２５mMヒスチジン、１．６mMグリシンおよび３％w/vマンニトールをｐＨ６．０で含有する凍結乾燥ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）を参照している。
【００１８】
ＵＳ２００４／０１９１２４３Ａ１（Chen et al.）は、ヒトＩｇＧ２抗体であるＡＢＸ−ＩＬ８の製剤を報告している。
【００１９】
ＵＳ２００３／０１１３３１６Ａ１（Kaisheva et al.）は、凍結乾燥抗ＩＬ２レセプター抗体製剤を参照している。
【００２０】
ＨＥＲ抗体
ＨＥＲファミリーのレセプターチロシンキナーゼは、細胞の成長、分化、および生存の重要な仲介物質である。このレセプターファミリーには、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＢｒｂＢ１、またはＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含めた四つの異なるメンバーがある。
【００２１】
ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲは、ヒトの悪性腫瘍の原因となると関係づけられている。特に、ＥＧＦＲの発現増加が乳ガン、膀胱ガン、肺ガン、頭部ガン、頚部ガン、および胃ガン、ならびに神経膠芽腫で観察されている。レセプターＥＧＦＲの発現増加は、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドであるトランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）の産生増加としばしば関連し、その結果として自己分泌刺激経路によるレセプター活性化が生じる。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994)。ＥＧＦＲまたはそのリガンドであるＴＧＦ−αおよびＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の処置における治療薬として評価されてきた。例えば、Baselga and Mendelsohn、上記; Masui et al., Cancer Research 44:1002-1007 (1984);およびWu et al., J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995)を参照されたい。
【００２２】
ＨＥＲファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、化学処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子産物としてもともと同定された。ｎｅｕプロトオンコジーンの活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異に起因する。ｎｅｕのヒトホモログの増幅は、乳ガンおよび卵巣ガンで観察され、予後不良と相関する（Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); および米国特許第４，９６８，６０３号）。これまで、ｎｅｕプロトオンコジーンにおける点突然変異に類似した点突然変異は、ヒト腫瘍については報告されていない。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅が原因で頻繁であるが一様ではない）は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、および膀胱のガン腫を含めたその他のガン腫でも観察されている。数ある中で、King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al, Lancet 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res., 3:21- 31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364(1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al. Pathobiology 59:46-52 (1991);およびMcCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990)を参照されたい。ＨＥＲ２は前立腺ガンで過剰発現していることがある（Gu et al., Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol. 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79:2162-70 (1997);およびSadasivan et al., J. Urol. 150:126-31 (1993)）。
【００２３】
ラットｐ１８５ｎｅｕおよびヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が記載されている。Drebinおよび共同研究者らは、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin et al., Cell 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991);およびＷＯ９４／２２４７８を参照されたい。Drebin et al., Oncogene 2:273-277 (1988)は、ｐ１８５ｎｅｕの二つの異なる領域と反応する抗体の混合物が、ヌードマウスに移植した、ｎｅｕでトランスフォーメーションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を招くと報告している。１９９８年１０月２０日に発行された米国特許第５，８２４，３１１号も参照されたい。
【００２４】
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989)は、ヒト乳房腫瘍細胞系ＳＫ−ＢＲ−３を用いて特徴付けられたＨＥＲ２抗体の一団の発生を記載している。抗体を曝露した後に、７２時間後に単層をクリスタルバイオレットで染色することによって、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対的な細胞増殖を決定した。このアッセイを用いて、細胞増殖を５６％阻害した４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大阻害が得られた。この一団のその他の抗体は、このアッセイではより少ない程度に細胞増殖が低減した。この抗体４Ｄ５は、ＨＥＲ２を過剰発現している乳房腫瘍細胞系を、ＴＮＦ−αの細胞毒性作用に対して感作することがさらに見出された。１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号も参照されたい。Hudziakらに論じられたＨＥＲ２抗体は、Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Research 56:1457-1465 (1996);およびSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)にさらに特徴付けられている。
【００２５】
組換えヒト化バージョンのマウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツズマブ、またはHERCEPTIN（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、以前に大規模な抗ガン治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現転移性乳ガンを有する患者に臨床的に活性である（Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996））。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳ガン患者の処置に、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を受けた。
【００２６】
種々の特性を有するその他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue et al., Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res.51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al., Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer 53:401-408 (1993);ＷＯ９４／００１３６; Kasprzyk et al., Cancer Research 52:2771-2776 (1992);Hancock et al., Cancer Res.51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res.54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); 米国特許第５，７８３，１８６号;およびKlapper et al., Oncogene 14:2099-2109 (1997)に記載されている。
【００２７】
ホモロジースクリーニングの結果として、レセプターＨＥＲファミリーの２つの他のメンバー、すなわちＨＥＲ３（米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)）およびＨＥＲ４（ＥＰ特許出願第５９９，２７４号；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993);およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)）を同定した。これらのレセプターの両方は、少なくとも一部の乳ガン細胞系上で増加した発現を示す。
【００２８】
これらのレセプターＨＥＲは、一般に、細胞に様々な組み合わせで見い出され、ヘテロ二量体化は、多様なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)）。ＥＧＦＲは、六つの異なるリガンド、すなわち上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、およびエピレグリンによって結合される（Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングに起因するヘレグリンタンパク質ファミリーは、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するリガンドである。このヘレグリンファミリーには、アルファヘレグリン、ベータヘレグリン、およびガンマヘレグリン（Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); 米国特許第５，６４１，８６９号;およびSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）;ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；および感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）がある。総説については、Groenen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996)、およびLee et al., Pharm. Rev. 47:51-85 (1995)を参照されたい。最近、三つの追加のＨＥＲリガンドが同定された。それらは、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のいずれかと結合することが報告されているニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Chang et al., Nature 387 509-512 (1997);およびCarraway et al., Nature 387:512-516 (1997)）；ＨＥＲ４と結合するニューレグリン−３（Zhang et al., PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)）；およびＨＥＲ４と結合するニューレグリン−４（Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)）である。ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリン、およびエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【００２９】
ＥＧＦおよびＴＧＦαはＨＥＲ２と結合しないが、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成させ、このヘテロ二量体はＥＧＦＲを活性化して、その結果としてこのヘテロ二量体中のＨＥＲ２のリン酸基転移が生じる。二量体化および／またはリン酸基転移は、ＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化するようである。Earpら、上記を参照されたい。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と同時発現すると、活性なシグナル伝達複合体が形成し、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊できる（Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)）。追加的に、ＨＥＲ２と同時発現すると、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性はより高い親和性状態に増大する。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995);およびLewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996)もまた参照されたい。ＨＥＲ４は、ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994)）。
【００３０】
ＨＥＲシグナル伝達経路をターゲティングするために、ＨＥＲ２とその他のレセプターＨＥＲとの二量体化を阻害することによって、リガンドが駆動するリン酸化および活性化、ならびに下流のＲＡＳおよびＡＫＴ経路の活性化を阻害するヒト化抗体として、ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４（パーツズマブ、OMNITARG(商標)）が開発された。固形腫瘍を処置するための単剤としてのパーツズマブのフェーズＩ試験では、進行卵巣ガンを有する被験者３人がパーツズマブで処置された。１人が持続性の部分反応を有し、もう１人の被験者が１５週間安定した疾患を有した。Agusら、Proc Am Soc Clin Oncol 22: 192, Abstract 771 (2003)。
【００３１】
ＤＲ５抗体
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する様々なリガンドおよびレセプターが当技術分野で同定された。当該リガンドには、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」または「リンホトキシン−α」）、リンホトキシン−β（「ＬＴ−β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、ＬＩＧＨＴ、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、Ａｐｏ−２リガンド（Ａｐｏ２ＬまたはＴＲＡＩＬとも呼ばれる）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも呼ばれる）、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ、またはＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）、およびＴＡＬＬ−Ｉ（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも呼ばれる）がある（例えば、Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997); Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992)；１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ９７／０１６３３；１９９７年７月１７日に公開されたＷＯ９７／２５４２８; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); １９９８年７月２日に公開されたＷＯ９８／２８４２６；１９９８年１０月２２日に公開されたＷＯ９８／４６７５１；１９９８年５月７日に公開されたＷＯ／９８／１８９２１; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)を参照されたい）。
【００３２】
当該ＴＮＦファミリーリガンドによって仲介される多様な細胞応答の誘導は、典型的にはそれらのリガンドが特異的細胞レセプターに結合することによって開始する。全てではなく一部のＴＮＦファミリーリガンドは、細胞表面「デスレセプター」に結合し、そのレセプターを介して多様な生物学的活性を誘導して、カスパーゼ、または細胞死もしくはアポトーシス経路を実行する酵素を活性化する（Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)）。今までに同定されたＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーの中には、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＡＣＩ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＨＶＥＭ、Ｆａｓ（Ａｐｏ−１またはＣＤ９５とも呼ばれる）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１とも呼ばれる）、ＤＲ５（Ａｐｏ−２またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２とも呼ばれる）、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、オステオプロテグリン（ＯＰＧ）、ＲＡＮＫおよびＡｐｏ−３（ＤＲ３またはＴＲＡＭＰとも呼ばれる）が含まれる。
【００３３】
これらのＴＮＦレセプターファミリーのメンバーの大部分は、細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域を含めた細胞表面レセプターの典型的な構造を共有するが、その他のメンバーは、膜貫通および細胞内ドメインを欠く可溶性タンパク質として自然に見出される。典型的なＴＮＦＲの細胞外部分は、ＮＨ２末端から開始する多数のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）の繰り返しアミノ酸配列パターンを含む。
【００３４】
Ａｐｏ−２ＬまたはＴＲＡＩＬと呼ばれるリガンドが、ＴＮＦファミリーのサイトカインのメンバーとして数年前に同定された（例えば, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12697-12690 (1996)；ＷＯ９７／０１６３３；ＷＯ９７／２５４２８；１９９８年６月９日に発行された米国特許第５，７６３，２２３号；２００１年９月４日に発行された米国特許第６，２８４，２３６号を参照されたい）。ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドの完全長天然配列は、２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。一部の細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素的開裂によって天然可溶性形態のポリペプチドを産生することができる（Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)）。可溶性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結晶学的研究は、ＴＮＦおよび他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにしている（Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)）。しかし、他のＴＮＦファミリーのメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、（ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０にある）三つのシステイン残基が一緒に亜鉛原子に配位すること、およびその亜鉛の結合が三量体の安定性および生物学的活性に重要であることに独特の構造的特徴を有することが見出された（Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)）。
【００３５】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、リウマチ様関節炎などの自己免疫疾患を含めた免疫系のモデュレーションに役割を果たしうることが文献に報告されている（例えば、Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)を参照されたい）。
【００３６】
可溶性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬもまた、結腸腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、腎臓腫瘍、卵巣腫瘍および脳腫瘍、ならびに黒色腫、白血病、および多発性骨髄腫を含めた多様なガン細胞にアポトーシスを誘導すると報告されている（例えば、Wiley et al., supra; Pitti et al., supra;２０００年２月２９日に発行された米国特許第６，０３０，９４５号；２００４年６月８日に発行された米国特許第６，７４６，６６８号; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照されたい）。マウス腫瘍モデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、さらに、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが単独で、または化学療法もしくは放射線療法と組合せて、実質的な抗腫瘍効果を発揮できることを示唆している（例えば、Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)；ＰＣＴ出願ＵＳ／００／１５５１２；ＰＣＴ出願ＵＳ／０１／２３６９１を参照されたい）。多種類のガン細胞とは対照的に、大部分の正常ヒト細胞型は、あるリコンビナント形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘導に耐性であると思われる（Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra）。Joらは、ポリヒスチジンでタグ付けした可溶性形態のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、非ヒト肝細胞ではなく正常な単離されたヒト肝細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを誘導したと報告した（Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)も参照されたい）。ある種のリコンビナントＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の存在または不在、亜鉛含量、および３量体含有率（％）に依存して、疾患細胞対正常細胞に及ぼす生化学的性質および生物学的活性に関して変化しうると考えられている（Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)を参照されたい）。
【００３７】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、少なくとも５個の異なるレセプターと結合することが見出された。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと結合するレセプターのうち少なくとも二つは、機能的な細胞質デスドメインを含む。当該レセプターの一つは「ＤＲ４」（またはＴＲ４もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１）と呼ばれてきた（Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)；１９９８年７月３０日に公開されたＷＯ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日に公開されたＷＯ９９／３７６８４；２０００年１２月７日に公開されたＷＯ００／７３３４９；２００２年８月１３日に発行されたＵＳ６，４３３，１４７；２００２年１０月８日に発行されたＵＳ６，４６１，８２３および２００２年１月２９日に発行されたＵＳ６，３４２，３８３も参照されたい）。
【００３８】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するもう一つの当該レセプターは、ＤＲ５と呼ばれてきた（ＤＲ５は代わりにＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ−ＲもしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲとも呼ばれてきた）（例えば、Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)；１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ９８／５１７９３；１９９８年９月２４日に公開されたＷＯ９８／４１６２９; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997);１９９８年８月２０日に公開されたＷＯ９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日に公開されたＥＰ８７０，８２７；１９９８年１０月２２日に公開されたＷＯ９８／４６６４３；１９９９年１月２１日に公開されたＷＯ９９／０２６５３；１９９９年２月２５日に公開されたＷＯ９９／０９１６５；１９９９年３月１１日に公開されたＷＯ９９／１１７９１；２００２年８月１３日に公開されたＵＳ２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日に公開されたＵＳ２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日に発行されたＵＳ６，３１３，２６９；２００１年８月２日に発行されたＵＳ２００１／００１０９２４；２００３年７月３日に発行されたＵＳ２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日に公開されたＵＳ２００２／０１６０４４６；２００２年４月２５日に公開されたＵＳ２００２／００４８７８５；２００２年２月に発行されたＵＳ６，３４２，３６９；２００３年５月２７日に発行されたＵＳ６，５６９，６４２；２０００年６月６日に発行されたＵＳ６，０７２，０４７；２００３年１１月４日に発行されたＵＳ６，６４２，３５８；２００４年６月１日に発行されたＩＳ６，７４３，６２５を参照されたい）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、リガンドの結合の際に（またはリガンドの活性を模倣するアゴニスト抗体などの分子と結合する際に）アポトーシスをシグナル伝達できると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＤＲ５との間に形成した複合体の結晶構造は、Hymowitzら、Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【００３９】
リガンドの結合の際に、ＤＲ４およびＤＲ５の両方は、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と呼ばれるデスドメイン含有アダプター分子を介してアポトーシス開始因子であるカスパーゼ８をリクルートおよび活性化することによって、独立してアポトーシスをトリガーすることができる（Kischkel et al, Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12.:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)）。
【００４０】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２およびＯＰＧと呼ばれるレセプターと結合することも報告され、それらのレセプターは、シグナル伝達のトランスデューサーよりもむしろ阻害物質として機能すると考えられている（例えば、ＤｃＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ３とも呼ばれる）（Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997);およびMongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)）、ＤｃＲ２（ＴＲＵＮＤＤまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ４とも呼ばれる）（Marsters et al., Curr. Biol., 7: 1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)）、ならびにＯＰＧを参照されたい）。ＤＲ４およびＤＲ５と対照的に、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【００４１】
ＤＲ４レセプターおよび／またはＤＲ５レセプターに結合するある種の抗体が文献に報告された。例えば、ＤＲ４レセプターに対し、ある種の哺乳動物細胞でアゴニスト活性またはアポトーシス活性を有する抗ＤＲ４抗体が、例えば１９９９年７月２９日に公開されたＷＯ９９／３７６８４；２０００年７月１２日に公開されたＷＯ００／７３３４９；２００３年８月１４日に公開されたＷＯ０３／０６６６６１に記載されている。例えば、Griffithら、J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)；Chuntharapaiら、J. Immunol., 166:4891-4898 (2001)；２００２年１２月２日に公開されたＷＯ０２／０９７０３３；２００３年５月２２日に公開されたＷＯ０３／０４２３６７；２００３年５月８日に公開されたＷＯ０３／０３８０４３；２００３年５月８日に公開されたＷＯ０３／０３７９１３も参照されたい。ある種の抗ＤＲ５抗体も同様に記載された。例えば、１９９８年１１月８日に公開されたＷＯ９８／５１７９３；Griffithら、J. Immunol., 162:2597-2605 (1999)；Ichikawaら、Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylanderら、"An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug.29-Sept.1, 2002, Banff,  Alberta, Canada；２００３年５月８日に公開されたＷＯ０３／０３８０４３；２００３年５月８日に公開されたＷＯ０３／０３７９１３を参照されたい。さらに、ＤＲ４レセプターおよびＤＲ５レセプターの両方に交差反応性を有するある種の抗体が記載された（例えば、２００１年６月２６日に発行された米国特許第６，２５２，０５０号参照）。
【００４２】
発明の概要
本明細書における本発明は、少なくとも部分的に、モノクローナル抗体、特に脱アミドおよび／または凝集に感受性の全長ＩｇＧ１抗体を処方するために特に有用な緩衝液としてのヒスチジン−酢酸（ｐＨ５．５から６．５）の同定に関するものである。その製剤は、その中の抗体産物の分解を遅延させる。
【００４３】
このように第１の局面では、本発明は、ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）中にモノクローナル抗体を含む安定な薬学的製剤に関するものである。そのモノクローナル抗体は、好ましくは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＤＲ５、ＢＲ３、ＩｇＥ、およびＶＥＧＦからなる群より選択される抗原と結合する。
【００４４】
さらに、本発明は、疾患または障害を処置するのに有効な量で対象にその製剤を投与することを含む、その対象における疾患または障害を処置する方法に関するものである。
【００４５】
別の局面では、本発明は、（ａ）脱アミドまたは凝集に感受性の、約１０mg/mLから約２５０mg/mLの量の全長ＩｇＧ１抗体と；（ｂ）ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）と；（ｃ）トレハロースおよびスクロースからなる群より選択される、約６０mMから約２５０mMの量の糖類と；（ｄ）約０．０１％から約０．１％の量のポリソルベート２０とを含む薬学的製剤に関するものである。
【００４６】
本発明は、ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）中に治療用モノクローナル抗体を処方することを含む、その抗体の脱アミドまたは凝集を低減するための方法も提供するものである。
【００４７】
なおさらなる局面では、本発明は、約５．５から約６．５のｐＨのヒスチジン緩衝液中でＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体と、糖類と、界面活性剤とを含む薬学的製剤に関するものである。
【００４８】
本発明は、約２０mg/mLから約４０mg/mLの量のパーツズマブと、ヒスチジン−酢酸緩衝液と、スクロースと、ポリソルベート２０とを含む薬学的製剤にも関するものであり、ここで、その製剤のｐＨは約５．５から約６．５である。
【００４９】
本発明は、約５．５から約６．５のｐＨのヒスチジン緩衝液中のＤＲ５抗体と、糖類と、界面活性剤とを含む薬学的製剤にも関するものである。
【００５０】
別の局面では、本発明は、約１０mg/mLから約３０mg/mLの量のＡｐｏｍａｂと、ヒスチジン−酢酸緩衝液と、トレハロースと、ポリソルベート２０とを含む薬学的製剤に関するものであり、ここで、その製剤のｐＨは約５．５から約６．５である。
【００５１】
なお別の局面では、本発明は、ガンを処置するのに有効な量で対象に薬学的製剤を投与することを含む、その対象におけるそのガンを処置する方法を提供する。
【００５２】
本発明は、注射器で刺通することのできる栓を有するバイアルまたはステンレススチールタンクにも関するものであり、そのバイアルまたはタンクは、内部にその製剤を場合により凍結形態で含む。
【００５３】
さらに、本発明は、（ａ）モノクローナル抗体製剤を調製する段階、および（ｂ）その製剤中のモノクローナル抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価する段階を含む、薬学的製剤を製造する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ〜ＩＶ（それぞれ配列番号１９〜２２）を示す図である。
【図２Ａ】マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（図２Ａ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖カッパ亜群Ｉ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖亜群ＩＩＩ）（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。星印はヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の差を識別するものである。相補性決定部（ＣＤＲ）を括弧で囲む。
【図２Ｂ】マウスモノクローナル抗体２Ｃ４の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（図２Ａ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（図２Ｂ）（それぞれ配列番号１および２）、ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬおよびＶＨドメイン（それぞれ配列番号３および４）、ならびにヒトＶＬおよびＶＨコンセンサスフレームワーク（ｈｕｍκ１、軽鎖カッパ亜群Ｉ；ｈｕｍＩＩＩ、重鎖亜群ＩＩＩ）（それぞれ配列番号５および６）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。星印はヒト化２Ｃ４バージョン５７４とマウスモノクローナル抗体２Ｃ４との間、またはヒト化２Ｃ４バージョン５７４とヒトフレームワークとの間の差を識別するものである。相補性決定部（ＣＤＲ）を括弧で囲む。
【図３Ａ】パーツズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１５および１６）を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖および重鎖の計算された分子量は、２３，５２６．２２Daおよび４９，２１６．５６Daである（システインは還元形態）。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図３Ｂ】パーツズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１６および１６）を示す図である。ＣＤＲを太字で示す。軽鎖および重鎖の計算された分子量は、２３５２６．２２Daおよび４９２１６．５６Daである（システインは還元形態）。糖質部分は重鎖のＡｓｎ２９９に付着している。
【図４Ａ】それぞれインタクトなアミノ末端シグナルペプチド配列を含む、パーツズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１７および１８）を示す図である。
【図４Ｂ】それぞれインタクトなアミノ末端シグナルペプチド配列を含む、パーツズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１７および１８）を示す図である。
【図５】ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に２Ｃ４が結合することによって、活性化ＥＧＦＲまたはＨＥＲ３とのヘテロ二量体化が阻止されることを概略的に示す図である。
【図６】ＭＡＰＫ経路およびＡｋｔ経路へのＨＥＲ２／ＨＥＲ３の共役を示す図である。
【図７】トラスツズマブおよびパーツズマブの活性を比較する図である。
【図８】イオン交換（ＩＥＸ）分析によりパーツズマブ製剤の安定性を示す図である。
【図９】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によりパーツズマブ製剤の安定性を示す図である。
【図１０】異なる製剤中のパーツズマブの物理的安定性を表す図である。
【図１１】パーツズマブ液体製剤の撹拌実験からの図である。
【図１２】パーツズマブ液体製剤の別の撹拌研究からの図である。
【図１３】パーツズマブ製剤の凍結解凍研究からの図である。
【図１４Ａ】トラスツズマブの軽鎖（配列番号１３）および重鎖（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す図である。
【図１４Ｂ】トラスツズマブの軽鎖（配列番号１３）および重鎖（配列番号１４）のアミノ酸配列を示す図である。
【図１５Ａ】変異体パーツズマブの軽鎖配列（配列番号２３）および変異体パーツズマブの重鎖配列（配列番号２４）を示す図である。
【図１５Ｂ】変異体パーツズマブの軽鎖配列（配列番号２３）および変異体パーツズマブの重鎖配列（配列番号２４）を示す図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＩｇＧ抗体で共通して観察されるオリゴ糖構造を示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＩｇＧ抗体で共通して観察されるオリゴ糖構造を示す図である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、特異的抗ＩｇＥ抗体であるＥ２５、Ｅ２６、ＨＡＥ１およびＨｕ−９０１の軽鎖および重鎖の配列（配列番号３７〜４４）を示す図である。図１７Ａでは、可変軽鎖ドメインは１１１番残基の残基ＶＥＩＫで終止する。図１７Ｂでは、可変重鎖ドメインは、およそ１２０番残基の残基ＶＴＶＳＳで終止する。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、特異的抗ＩｇＥ抗体であるＥ２５、Ｅ２６、ＨＡＥ１およびＨｕ−９０１の軽鎖および重鎖の配列（配列番号３７〜４４）を示す図である。図１７Ａでは、可変軽鎖ドメインは１１１番残基の残基ＶＥＩＫで終止する。図１７Ｂでは、可変重鎖ドメインは、およそ１２０番残基の残基ＶＴＶＳＳで終止する。
【図１８Ａ】マウス２Ｈ７（配列番号２５）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号２６）、およびヒトκ軽鎖亜群Ｉ（配列番号２７）のそれぞれの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を比較する配列アライメントを示す図である。２Ｈ７およびｈｕ２Ｈ７ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号５７）、ＣＤＲ２（配列番号５８）、およびＣＤＲ３（配列番号５９）。
【図１８Ｂ】マウス２Ｈ７（配列番号２８）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号２９）、および重鎖亜群ＩＩＩのヒトコンセンサス配列（配列番号３０）のそれぞれの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）のアミノ酸配列を比較する配列アライメントを示す図である。２Ｈ７およびｈｕ２Ｈ７ｖ１６のＶＨのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号６０）、ＣＤＲ２（配列番号６１）、およびＣＤＲ３（配列番号６２）。図１８Ａおよび図１８Ｂにおいて、フレームワーク部ＦＲ１〜ＦＲ４が隣接する各鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を、表示したように括弧で囲む。２Ｈ７はマウス２Ｈ７抗体を指す。２列の配列の間の星印は、二つの配列の間で異なっている位置を示す。残基の付番は、Kabatら、Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)に従い、挿入部をａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｅとして示す。
【図１９】配列番号３１〜３６を有する三つの異なるＶＥＧＦ抗体の可変ドメイン配列を示す図である。
【図２０】以下のＡｐｏｍａｂ試料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）溶出プロファイルを示す図である：（ａ）対照、（ｂ）ｐＨ４．０、（ｃ）ｐＨ５．０、（ｄ）ｐＨ６．０および（ｅ）ｐＨ７．０で調製された製剤。処方された試料を４０℃で２か月間保存してから分析した。
【図２１】保存の間にＡｐｏｍａｂ抗体単量体における損失についてのｐＨ速度プロファイルを示す図である。ＳＥＣによる単量体動態を３０℃および４０℃で保存する間にモニターし、一次速度定数を計算した。
【図２２】以下のようなＡｐｏｍａｂ試料のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）溶出プロファイルを提供する図である：（ａ）対照、（ｂ）ｐＨ４．０、（ｃ）ｐＨ５．０、（ｄ）ｐＨ６．０および（ｅ）ｐＨ７．０で調製された製剤。処方された試料を４０℃で２か月間保存してから分析した。
【図２３】保存の間のＩＥＣ主ピークの損失についてのｐＨ速度プロファイルを示す図である。３０℃および４０℃での保存中にＩＥＣによる主ピーク動態をモニターし、一次速度定数を計算した。
【図２４】ヒトＡｐｏ−２リガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４５）およびそれから得られたアミノ酸配列（配列番号４６）を示す図である。（配列番号４５の）ヌクレオチド位置４４７の「Ｎ」を、そのヌクレオチド塩基が「Ｔ」または「Ｇ」でありうることを示すために使用する。
【図２５Ａ】１９９８年１１月１９日のＷＯ９８／５１７９３に公開されたヒトＤＲ５レセプターのアミノ酸４１１個の配列（配列番号４７）およびそれがコードするヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
【図２５Ｂ】１９９８年１１月１９日のＷＯ９８／５１７９３に公開されたヒトＤＲ５レセプターのアミノ酸４１１個の配列（配列番号４７）およびそれがコードするヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
【図２６Ａ】同様に１９９８年８月２０日のＷＯ９８／３５９８６に公開されたヒトＤＲ５レセプターのアミノ酸４４０個の配列（配列番号４９）およびそれがコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
【図２６Ｂ】同様に１９９８年８月２０日のＷＯ９８／３５９８６に公開されたヒトＤＲ５レセプターのアミノ酸４４０個の配列（配列番号４９）およびそれがコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
【図２７】Ａｐｏｍａｂ７．３の重鎖アミノ酸配列（配列番号５１）を示す図である。
【図２８】Ａｐｏｍａｂ７．３の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５２）を示す図である。
【図２９】１６Ｅ２の重鎖アミノ酸配列（配列番号５３）およびＡｐｏｍａｂ７．３の重鎖アミノ酸配列（配列番号５１）のアライメントを示す図である。
【図３０】１６Ｅ２の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５４）およびＡｐｏｍａｂ７．３の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５２）のアライメントを示す図である。
【図３１Ａ】Ａｐｏｍａｂ７．３の可変重鎖アミノ酸配列（図３１Ａ；配列番号５５）および可変軽鎖アミノ酸配列（図３１Ｂ；配列番号５６）を示す図である。ＣＤＲ残基を太字で識別する。
【図３１Ｂ】Ａｐｏｍａｂ７．３の可変重鎖アミノ酸配列（図３１Ａ；配列番号５５）および可変軽鎖アミノ酸配列（図３１Ｂ；配列番号５６）を示す図である。ＣＤＲ残基を太字で識別する。
【図３２】成熟２Ｈ７ｖ１６および２Ｈ７ｖ５１１の軽鎖（それぞれ配列番号６３および６４）のアライメントを示す図である。Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基の付番およびＥｕ定常ドメイン残基の付番と共に配列を示す。
【図３３】成熟２Ｈ７ｖ１６および２Ｈ７ｖ５１１の重鎖（それぞれ配列番号６５および６６）のアライメントを示す図である。Ｋａｂａｔの可変ドメイン残基の付番およびＥｕ定常ドメイン残基の付番と共に配列を示す。
【００５５】
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．定義
用語「薬学的製剤」は、活性成分の生物学的活性を有効にさせる形態の調製物であって、その製剤が投与されるであろう対象に許容されず有毒である追加の構成要素を含有しない調製物を指す。当該製剤は無菌である。
【００５６】
「無菌」製剤は、滅菌であるか、または全ての生きた微生物およびそれらの胞子を有さない。
【００５７】
本明細書において、「凍結」製剤は、０℃未満の温度の製剤である。一般に、凍結製剤は凍結乾燥されておらず、以前のまたはその後の凍結乾燥にも供されない。好ましくは、凍結製剤は、（ステンレススチールタンクに）保存するための凍結原薬または（最終バイアル形状の）凍結薬物産物を含む。
【００５８】
「安定」製剤は、保存時にその中のタンパク質が本質的にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持する製剤である。好ましくは、その製剤は、保存時に本質的にその物理的および化学的安定性、ならびにその生物学的活性を保持する。保存時間は一般にその製剤の予定された貯蔵期間に基づき選択される。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技法が当技術分野で利用でき、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991)およびJones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)に総説されている。選択された温度で選択された期間、安定性を測定することができる。好ましくは、その製剤は、約４０℃で少なくとも約２〜４週間安定であり、かつ／または約５℃および／もしくは１５℃で少なくとも３か月間安定であり、かつ／または約−２０℃で少なくとも約３か月間もしくは少なくとも１年間安定である。さらに、その製剤の（例えば、−７０℃への）凍結および解凍の後、例えば、１、２または３サイクルの凍結解凍後に、その製剤は好ましくは安定である。（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた、濁度を測定することによる、および／または肉眼検査による）凝集物形成の評価；陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷の不均一性を評定することによる；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分析；還元抗体およびインタクトな抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えばトリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物学的活性または抗原結合機能を評価することなどを含めた多様な異なる方法で安定性を定性的および／または定量的に評価することができる。不安定性は、凝集、脱アミド（例えばＡｓｎ脱アミド）、酸化（例えばＭｅｔ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／フラグメンテーション（例えば、ヒンジ部フラグメンテーション）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ末端伸長、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化の差などのうち一つまたは複数を伴うことがある。
【００５９】
本明細書における「脱アミド」モノクローナル抗体は、その一つまたは複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に誘導体化されたモノクローナル抗体である。
【００６０】
「脱アミドに感受性の」抗体は、脱アミド易発性であることが見出された一つまたは複数の残基を含む抗体である。
【００６１】
「凝集に感受性の」抗体は、特に凍結および／または撹拌時に他の抗体分子と共に凝集することが見出された抗体である。
【００６２】
「フラグメンテーションに感受性の」抗体は、例えばそのヒンジ部で二つ以上のフラグメントに開裂することが見出された抗体である。
【００６３】
「脱アミド、凝集、またはフラグメンテーションを減少すること」により、異なるｐＨで、または異なる緩衝液中で処方されたモノクローナル抗体に比較して脱アミド、凝集、またはフラグメンテーションを防止するか、またはその量を減少させることが意図される。
【００６４】
本明細書において、モノクローナル抗体の「生物学的活性」は、抗体が抗原に結合して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定できる測定可能な生物学的応答を生じる能力を指す。当該活性は、アンタゴニスト的（例えば、その抗体がＨＥＲ２抗体である場合）またはアゴニスト的（例えばその抗体がＤＲ５と結合する場合）でありうる。パーツズマブの場合、一態様ではその生物学的活性は、処方された抗体がヒト乳ガン細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩの増殖を阻害する能力を指す。その抗体がＡｐｏｍａｂである場合、その生物学的活性は、例えば、処方された抗体が結腸ガンＣｏｌｏ２０５細胞を殺滅する能力を指すことがある。
【００６５】
「等張」によって、対象となる製剤が本質的にヒト血液と同じ浸透圧を有することを意味する。等張製剤は、一般に約２５０から３５０mOsmの浸透圧を有するものである。例えば蒸気圧浸透圧計または製氷型浸透圧計を用いて、等張性を測定することができる。
【００６６】
本明細書に使用されるような「緩衝液」は、その酸塩基コンジュゲート構成要素の作用によってｐＨ変化に抵抗する緩衝溶液を指す。本発明の緩衝液は、約５．０から約７．０、好ましくは約５．５から約６．５、例えば約５．８から約６．２の範囲のｐＨを好ましくは有し、最も好ましくは約６．０のｐＨを好ましくは有する。この範囲にｐＨを調節するであろう緩衝液の例には、酢酸、コハク酸、コハク酸、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸、グリシルグリシン、および他の有機緩衝液がある。本明細書における好ましい緩衝液はヒスチジン緩衝液である。
【００６７】
「ヒスチジン緩衝液」は、ヒスチジンイオンを含む緩衝液である。ヒスチジン緩衝液の例には、塩化ヒスチジン、ヒスチジン酢酸塩、ヒスチジンリン酸塩、ヒスチジン硫酸塩がある。本明細書における実施例で同定された好ましいヒスチジン緩衝液は、ヒスチジン酢酸塩であることが見出された。好ましい態様では、ヒスチジン酢酸塩緩衝液は、Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基、固体）を酢酸（液体）で滴定することによって調製される。好ましくは、ヒスチジン緩衝液またはヒスチジン−酢酸緩衝液はｐＨ５．５から６．５、好ましくはｐＨ５．８から６．２である。
【００６８】
本明細書における「糖類」は、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含めた一般組成（ＣＨ２Ｏ）ｎおよびその誘導体を含む。本明細書における糖類の例には、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロースなどがある。本明細書における好ましい糖類は、トレハロースまたはスクロースなどの非還元二糖類である。
【００６９】
本明細書において「界面活性剤」は、界面活性な薬剤、好ましくは非イオン界面活性剤を指す。本明細書における界面活性剤の例には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トリトン；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えばラウロアミドプロピル）；ミリスタミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ココイルメチルタウリンナトリウムまたはオレイルメチルタウリン二ナトリウム；ならびにＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey）;ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、およびエチレンとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などがある。本明細書において好ましい界面活性剤はポリソルベート２０である。
【００７０】
「レセプターＨＥＲ」は、レセプターＨＥＲファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、レセプターＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４、ならびに将来同定されるべき本ファミリーのその他のメンバーを含む。レセプターＨＥＲは、ＨＥＲリガンドと結合できる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化されうるいくつかのチロシン残基を保有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般に含むものである。好ましくは、レセプターＨＥＲは天然配列のヒトレセプターＨＥＲである。
【００７１】
ＨＥＲ２の細胞外ドメインは、四つのドメイン、すなわちドメインＩ（約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（約１９６〜３２０のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（約３２１〜４８８のアミノ酸残基）、およびドメインＩＶ（約４８９〜６３２のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを除いた残基に番号付け）を含む。Garrett et al., Mol. Cell. 11:495-505 (2003), Cho et al., Nature 421:756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)、またはPlowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)を参照されたい。また、本明細書の図１も参照されたい。
【００７２】
用語「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮成長因子レセプター」、および「ΕＧＦＲ」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばCarpenter et al., Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)に開示されたようなＥＧＦＲを、その天然突然変異体（例えば、Humphrey et al., PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)におけるような欠失突然変異体ＥＧＦＲ)を含めて指す。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。
【００７３】
表現「ＥｒｂＢ２」および「ＨＥＲ２」は、本明細書において相互交換可能に使用され、例えばSemba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)およびYamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986)に記載されたヒトＨＥＲ２タンパク質（ＧｅｎｅｂａｎｋアクセッションナンバーＸ０３３６３）を指す。用語「ｅｒｂＢ２」は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を指し、「ｎｅｕ」は、ラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を指す。好ましいＨＥＲ２は天然配列のヒトＨＥＲ２である。
【００７４】
「ＥｒｂＢ３」および「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第５，１８３，８８４号および第５，４８０，９６８号、ならびにKraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されたようなレセプターポリペプチドを指す。
【００７５】
本明細書における用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、例えば、ＥＰ特許出願第５９９，２７４号; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993);およびPlowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)に開示されたようなレセプターポリペプチドを、例えば、１９９９年４月２２日に公表されたＷＯ９９／１９４８８に開示されたようなそのアイソフォームを含めて指す。
【００７６】
「ＨＥＲリガンド」により、レセプターＨＥＲに結合し、かつ／またはそれを活性化するポリペプチドを意味する。本明細書において特に関心対象であるＨＥＲリガンドは、上皮成長因子（ＥＧＦ）（Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）（Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)）；神経鞘腫またはケラチン細胞の自己分泌成長因子としても公知であるアンフィレグリン（Shoyab et al., Science 243: 1074-1076 (1989);Kimura et al., Nature 348:257-260 (1990);およびCook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)）；ベータセルリン（Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993);およびSasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)）；ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）（Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)）；エピレグリン（Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995);およびKomurasaki et al., Oncogene 15:2841-2848 (1997)）；ヘレグリン（下記参照）；ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）（Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)）；ニューレグリン−３（ＮＲＧ−３）（Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)）；ニューレグリン−４（ＮＲＧ−４）（Harari et al., Oncogene 18:2681-89 (1999)）またはクリプト（cripto）（ＣＲ−１）（Kannan et al., J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997））などの天然配列のヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲと結合するＨＥＲリガンドには、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ−ＥＧＦ、およびエピレグリンがある。ＨＥＲ３と結合するＨＥＲリガンドには、ヘレグリンがある。ＨＥＲ４と結合できるＨＥＲリガンドには、ベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、およびヘレグリンがある。
【００７７】
本明細書に使用する場合、「ヘレグリン」（ＨＲＧ）は、米国特許第５，６４１，８６９号またはMarchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)に開示されたようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドを指す。ヘレグリンの例には、ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、およびヘレグリン−β３（Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992);および米国特許第５，６４１，８６９号）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）（Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）（Falls et al., Cell 72:801-815 (1993)）；グリア細胞成長因子（ＧＧＦ）（Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)）；感覚および運動神経細胞由来因子（ＳＭＤＦ）（Ho et al., J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)）；γ−ヘレグリン（Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)）がある。本用語は、天然配列のＨＲＧポリペプチドのＥＧＦ様ドメインフラグメント（ＨＲＧβ１１７７−２４４）などの、そのＨＲＧポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントおよび／またはアミノ酸配列変異体を含む。
【００７８】
本明細書における「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも二つの異なるレセプターＨＥＲを含む非共有的に会合した二量体である。二つ以上のレセプターＨＥＲを発現している細胞がＨＥＲリガンドに曝露された場合にそのような複合体が形成することがあり、免疫沈降によりその複合体を単離して、例えばSliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。当該ＨＥＲ二量体の例には、ＥＧＦＲ−ＨＥＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、およびＨＥＲ３−ＨＥＲ４ヘテロ二量体がある。さらに、ＨＥＲ二量体は、二つ以上のレセプターＨＥＲ２を、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、またはＥＧＦＲのような異なるレセプターＨＥＲと組み合わせて含みうる。サイトカインレセプターサブユニット（例えばｇｐ１３０）などのその他のタンパク質がその二量体と会合していることがある。
【００７９】
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４と二量体を形成するときにそれらの細胞外ドメイン中の領域と接触または連結するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を指す。その領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見い出される。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328(2004)。
【００８０】
「ＨＥＲ活性化」または「ＨＥＲ２活性化」は、任意の一つもしくは複数のレセプターＨＥＲ、またはレセプターＨＥＲ２の活性化またはリン酸化を指す。一般に、ＨＥＲ活性化は（例えば、レセプターＨＥＲにおけるチロシン残基をリン酸化しているレセプターＨＥＲの細胞内キナーゼドメインまたは基質ポリペプチドによって起こる）シグナル伝達を招く。ＨＥＲ活性化は、関心対象のレセプターＨＥＲを含むＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって仲介されうる。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体における一つまたは複数のレセプターＨＥＲ中のキナーゼドメインを活性化することにより、一つもしくは複数のレセプターＨＥＲ中のチロシン残基のリン酸化および／またはＡｋｔもしくはＭＡＰＫ細胞内キナーゼなどの追加の基質ポリペプチド（類）中のチロシン残基のリン酸化を生じうる。
【００８１】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の生物学的活性を示す限りは全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つの全長抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体フラグメントにわたる。
【００８２】
本明細書に使用されるような用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、モノクローナル抗体の産生時に生じる可能性のある変異体を除いて、その集団を含む個別の抗体は同一であり、かつ／または同一のエピトープと結合する。当該変異体は一般に少量存在する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるようなその抗体の性質を表し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈してはならない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature, 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作製することができるし、また、リコンビナントＤＮＡ法によって作製することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」は、例えばClacksonら、Nature, 352:624-628 (1991)およびMarksら、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技法を用いたファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００８３】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、その鎖（類）の残りが、別の種由来または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに当該抗体のフラグメントが具体的には含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本明細書において関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常部配列を含む「霊長類化（primatized）」抗体がある。
【００８４】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の部分を含み、好ましくはその抗原結合部または可変部を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体（diabody）；線状抗体（linear antibody）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体がある。
【００８５】
「全長抗体」は、抗原結合可変部ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）ならびに重鎖定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む抗体である。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、全長抗体は一つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００８６】
本明細書における用語「主要種抗体」は、組成物中の量的に優勢な抗体分子である、その組成物中の抗体構造を指す。一態様では、主要種抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体、ＨＥＲの二量体化をトラスツズマブよりも効果的に阻害する抗体、および／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体性結合部位に結合する抗体などのＨＥＲ２抗体である。主要種ＨＥＲ２抗体の本明細書における好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（パーツズマブ）である。
【００８７】
本明細書における「アミノ酸配列変異体」抗体は、主要種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有するものであり、好ましくは、主要種抗体と少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％相同なものである。このアミノ酸配列変異体は、主要種抗体のアミノ酸配列内の、またはそれに隣接したある位置に置換、欠失、および／または付加を有する。本明細書におけるアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体（例えば、脱アミド抗体変異体）、塩基性変異体、一つまたは二つの軽鎖にアミノ末端リーダー伸長（例えば  ＶＨＳ−）を有する抗体、一つまたは二つの重鎖にＣ末端リシン残基を有する抗体などがあり、重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に対する変異の組合せが含まれる。本明細書において特に対象となる抗体変異体は、その一つまたは二つの軽鎖にアミノ末端リーダー伸長を含み、場合により主要種抗体と比較したその他のアミノ酸配列および／またはグリコシル化の相違をさらに含む抗体である。
【００８８】
「治療用モノクローナル抗体」は、ヒト対象の治療に使用される抗体である。本明細書に開示された治療用モノクローナル抗体には、ガンおよび様々な非悪性疾患または障害のためのＨＥＲ２抗体；Ｂ細胞悪性腫瘍、自己免疫疾患、移植片拒絶、または外来抗原に対する免疫応答の遮断の治療用ＣＤ２０抗体またはＢＲ３抗体；ＩｇＥ介在性障害を治療するための抗ＩｇＥ抗体；ガン治療用ＤＲ５抗体またはＶＥＧＦ抗体がある。
【００８９】
本明細書における「グリコシル化変異体」抗体は、一つまたは複数の糖質部分が付着した抗体であり、その糖質部分は、主要種抗体に付着した一つまたは複数の糖質部分とは異なる。本明細書におけるグリコシル化変異体の例には、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１またはＧ２オリゴ糖構造がＦｃ部に付着した抗体、一つまたは二つの糖質部分が一つまたは二つの軽鎖に付着した抗体、糖質が抗体の一つまたは二つの重鎖に付着していない抗体など、およびグリコシル化変更の組合せがある。
【００９０】
抗体がＦｃ部を有する場合、本明細書の図１６に示されたようなオリゴ糖構造を、その抗体の一つまたは二つの重鎖に、例えば残基２９９（残基のＥｕ付番では２９８）に付着させることができる。パーツズマブについては、Ｇ０は優勢なオリゴ糖構造であり、Ｇ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、Ｇ１（１−３）およびＧ２などのその他のオリゴ糖構造は、パーツズマブ組成物中により少量みられた。
【００９１】
特に表示しない限り、本明細書における「Ｇ１オリゴ糖構造」には、Ｇ１、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）およびＧ１（１−３）構造が含まれる。
【００９２】
本明細書における「アミノ末端リーダー伸長」は、抗体の任意の一つまたは複数の重鎖または軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一つまたは複数のアミノ酸残基を指す。アミノ末端リーダー伸長の例は、抗体変異体の一方もしくは両方の軽鎖に存在する三つのアミノ酸残基ＶＨＳを含むか、またはそれからなる。
【００９３】
「相同性」は、配列をアライメントして、必要ならばギャップを導入して最大の相同率を実現した後で同一な、アミノ酸配列変異体における残基の率として定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。当該コンピュータプログラムの一つは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．によって著作された「Ａｌｉｇｎ２」であり、このプログラムは１９９１年１２月１０日に米国著作権局、Washington, DC 20559にユーザー文書と共に提出された。
【００９４】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ部（天然配列Ｆｃ部またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ部）に起因しうる生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑとの結合；補体依存性細胞毒性作用；Ｆｃレセプターとの結合；抗体依存性細胞性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション（例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ）などがある。
【００９５】
重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、全長抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。全長抗体には五つの主要クラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
【００９６】
「抗体依存性細胞性細胞毒性作用」および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介するためのプライマリー細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現を要約したものは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３である。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されているようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。当該アッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。または、もしくは追加的に、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、例えばClynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されたような動物モデルでｉｎ  ｖｉｖｏ評価できる。
【００９７】
「ヒトエフェクター細胞」は、一つまたは複数のＦｃＲを発現してエフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、これらの細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、および好中球があり、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然起源から、例えば本明細書に記載されたように血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００９８】
用語「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ部に結合するレセプターを記述するために使用される。好ましいＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマレセプター）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターが、これらのレセプターのアレル変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて挙げられる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）があり、それらは、細胞質ドメインが主に異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにＩＴＩＭ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif）を含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234 (1997)の総説Ｍを参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説されている。将来同定されるものを含めたその他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」で包含される。この用語は、胎児への母体IgGの輸送を担う新生児レセプターＦｃＲｎも含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００９９】
「補体依存性細胞毒性作用」または「ＣＤＣ」は、分子が補体の存在下でターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、コグネイト抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始する。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを行うことができる。
【０１００】
「天然抗体」は、通常は２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する一方で、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で多様である。各重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、もう一方の末端に定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられる。
【０１０１】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が、抗体間で広範囲に配列が異なり、各特定の抗体の特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたり均等に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖および重鎖の可変ドメイン両方における超可変部と呼ばれる三つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク部（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインそれぞれは、４つのＦＲを含み、それらのＦＲは大部分がβシート立体配置を採り、三つの超可変部により連結され、これらの超可変部は、βシート構造と連結するループを形成して、場合によりこのβシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変部は、ＦＲによって相互に近接して保持されて、もう一方の鎖由来の超可変部と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接には関与しないが、抗体依存性細胞性細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）での抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【０１０２】
本明細書に使用する場合、用語「超可変部」は、抗原との結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変部は、一般に「相補性決定部」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、残基５０〜５６（Ｌ２）、および残基８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および残基９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、残基５３〜５５（Ｈ２）および残基９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク部」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義するような超可変部残基以外の、可変ドメインの残基である。
【０１０３】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる、それぞれ単一の抗原結合部位を有する二つの同一の抗原結合フラグメントと、名前が、容易に結晶化できる能力を反映する残りの「Ｆｃ」フラグメントとを産生する。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じ、このフラグメントは、依然として抗原を架橋できる。
【０１０４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、密接に非共有的に会合した、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するために、各可変ドメインの三つの超可変部が相互作用するのは、この立体配置である。まとめると、六つの超可変部は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（すなわち抗原に対して特異的な三つの超可変部のみを含む、Ｆｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１０５】
Ｆａｂフラグメントもまた、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ部由来の一つまたは複数のシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基が付加していることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においてＦａｂ’についての呼称であり、Ｆａｂ’−ＳＨでは、定常ドメインのシステイン残基（類）が少なくとも一つの遊離チオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメント対として本来産生された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
【０１０６】
任意の脊椎動物種由来である抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる二つの明らかに別個の型のうちの一つに割り当てることができる。
【０１０７】
「一本鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、このＦｖポリペプチドは、このｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。ＨＥＲ２抗体のｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。
【０１０８】
用語「二特異性抗体」は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結した可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対形成できるには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対形成することを強いて、二つの抗原結合部位を生み出す。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に、さらに完全に記載されている。
【０１０９】
「ヒト化」形態の非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、通例レシピエントの超可変部由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変部由来の残基に置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。時には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク部（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基に置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見い出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応する超可変ループのうちの全てまたは実質的に全てと、ＦＲの全てまたは実質的に全てとは、ヒト免疫グロブリン配列のものであろう。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部も場合により含むものである。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【０１１０】
ヒト化ＨＥＲ２抗体には、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、および参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されるｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）および本明細書に記載されているようなヒト化２Ｃ４抗体がある。
【０１１１】
本明細書の目的で、「トラスツズマブ」、「ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）」、および「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８」は、それぞれ配列番号１３および１４の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。
【０１１２】
本明細書において、「パーツズマブ」、「ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４」、および「ＯＭＮＩＴＡＲＧ（商標）」は、それぞれ配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体を指す。パーツズマブが全長抗体である場合、パーツズマブはそれぞれ配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を好ましくは含む。
【０１１３】
「ネイキッドな抗体」は、（本明細書に定義されるとおり）細胞毒性部分または放射性ラベルなどの異種分子とコンジュゲーションしていない抗体である。
【０１１４】
「親和性成熟した」抗体は、変更を有しない親抗体に比べて、抗原に対するその抗体の親和性に改善を生じる一つまたは複数の変更を、一つまたは複数の超可変部に有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、ターゲット抗原に対してナノモルでまたはピコモルでの親和性さえ有するであろう。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって産生される。Marksら、Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、ＶＨおよびＶＬドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbasら、Proc Nat. Acad. Sci, USA91:3809-3813 (1994)；Schierら、Gene 169:147-155 (1995)；Yeltonら、J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jacksonら、J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995);およびHawkinsら、J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に記載されている。
【０１１５】
「アゴニスト抗体」は、レセプターに結合してそれを活性化する抗体である。一般に、アゴニスト抗体のレセプター活性化能は、そのレセプターの天然アゴニストリガンドと少なくとも質的に同様であろう（し、本質的に量的に同様でありうる）。アゴニスト抗体の例は、ＤＲ５などのＴＮＦレセプタースーパーファミリーのレセプターに結合し、ＴＮＦレセプター（例えば、ＤＲ５）を発現している細胞のアポトーシスを誘導する抗体である。アポトーシスの誘導を決定するためのアッセイは、ＷＯ９８／５１７９３およびＷＯ９９／３７６８４に記載されており、これら両方は、参照により本明細書に特に組み入れられる。
【０１１６】
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定されて、分離および／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成要素は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害するであろう物質であり、それらには、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が含まれうる。好ましい態様では、抗体は、（１）ローリー法によって決定したときに、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで精製されるか、（２）スピニングカップ（spinning cup）シークエネーターの使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製されるか、または（３）クーマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を用いた、還元条件もしくは非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製されるであろう。抗体の天然環境の少なくとも一つの構成要素は存在しないものであることから、単離された抗体には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１回の精製段階によって調製されるものである。
【０１１７】
「トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害する」ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも約２倍効果的に）ＨＥＲ二量体を低減または除去する抗体である。好ましくは、当該抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４のＦａｂフラグメント、パーツズマブ、およびパーツズマブのＦａｂフラグメントからなる群より選択される抗体と少なくとも同じくらい効果的にＨＥＲ２の二量体化を阻害する。ＨＥＲ二量体を直接研究することにより、またはＨＥＲの二量体化を招くＨＥＲの活性化もしくは下流のシグナル伝達を評価することにより、および／または抗体のＨＥＲ２結合部位を評価することなどにより、ＨＥＲ二量体化の阻害を評価できる。トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲ２二量体化を阻害する能力を有する抗体をスクリーニングするためのアッセイは、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)ならびにWO01/00245（Adamsら）に記載されている。ほんの一例として、例えばＨＥＲ二量体の形成阻害（例えば、Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図１Ａ〜Ｂ；およびWO01/00245を参照されたい）；ＨＥＲリガンドによるＨＥＲ二量体を発現する細胞の活性化の低減（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)の図２Ａ〜Ｂ）；ＨＥＲ二量体を発現する細胞に対するＨＥＲリガンドの結合の遮断（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図2E）；ＨＥＲリガンドの存在下（または不在下）でＨＥＲ二量体を発現するガン細胞（例えばＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＤ−１３４、ＺＲ−７５−１、ＭＤ−ＭＢ−１７５、Ｔ−４７Ｄ細胞）の細胞成長阻害（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図３Ａ〜Ｄ）；下流のシグナル伝達の阻害（例えば、ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化の阻害またはＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性ＭＡＰＫリン酸化の阻害）（WO01/00245および例えばAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)の図２Ｃ〜Ｄを参照されたい）を評定することによってＨＥＲ二量体化の阻害をアッセイすることができる。抗体−ＨＥＲ２結合部位を研究することによって、例えばＨＥＲ２に結合した抗体の結晶構造などの構造またはモデルを評価することによっても、その抗体がＨＥＲ二量体化を阻害するかどうか評定することができる（例えば、Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)を参照されたい）。
【０１１８】
ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブよりも効果的に（例えば少なくとも２倍効果的に）「ＨＲＧ依存性ＡＫＴリン酸化を阻害」し、かつ／または「ＨＲＧもしくはＴＧＦα依存性のＭＡＰＫリン酸化」を阻害しうる（例としてAgus et al., Cancer Cell 2:127-137 (2002)およびWO01/00245を参照されたい）。
【０１１９】
ＨＥＲ２抗体は、「ＨＥＲ２エクトドメインの開裂を阻害しない」抗体でありうる（Molina et al., Cancer Res. 61:4744-4749(2001)）。
【０１２０】
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩ中の残基に結合して（場合によりドメインＩおよびＩＩＩなどのＨＥＲ２細胞外ドメインのドメインのうち他のものにおける残基にも結合して）、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、またはＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を少なくともある程度立体的に妨害することができる。Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、RCSB Protein Data Bank（ＩＤコードＩＳ７８）に寄託されたＨＥＲ２−パーツズマブの結晶構造を特徴づけ、その構造はＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体の例を例示している。
【０１２１】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩ中の残基と、場合によりドメインＩおよびドメインＩＩＩなどの、ＨＥＲ２のその他のドメイン（類）中の残基と結合する。好ましくは、ドメインＩＩに結合する抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの間の結合部に結合する。
【０１２２】
本明細書に使用する場合の「成長阻害剤」は、細胞、特にＨＥＲ発現性ガン細胞の成長をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで阻害する化合物または組成物を指す。このように、成長阻害剤は、Ｓ期のＨＥＲ発現細胞の率を有意に低減する薬剤でありうる。成長阻害剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）遮断する薬剤がある。古典的Ｍ期遮断薬には、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポＩＩ阻害剤がある。Ｇ１で停止させる薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−ＣなどのＤＮＡアルキル化剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、"Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)という標題のThe Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.、第１章、特に１３頁に見い出すことができる。
【０１２３】
「成長阻害」抗体の例は、ＨＥＲ２に結合し、そしてＨＥＲ２を過剰発現しているガン細胞の成長を阻害する抗体である。好ましい成長阻害ＨＥＲ２抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で、細胞培養でのＳＫ−ＢＲ−３乳房腫瘍細胞の成長を、２０％よりも高く、好ましくは５０％よりも高く（例えば、約５０％から約１００％）阻害する。ここで、抗体にＳＫ−ＢＲ−３細胞を曝露した６日間後に、この成長阻害を決定する（１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい）。このＳＫ−ＢＲ−３細胞成長阻害アッセイは、その特許および本明細書の下記にさらに詳細に記載されている。好ましい成長阻害抗体は、マウスモノクローナル抗体４Ｄ５のヒト化変異体、例えばトラスツズマブである。
【０１２４】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞のフラグメント化、および／または（アポトーシス小体と呼ばれる）膜小胞の形成によって決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体である。この細胞は、通常、その抗体が結合する抗原を発現する細胞である。好ましくは、この細胞は腫瘍細胞である。例えば、アネキシンの結合によって、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の移行を測定することができ；ＤＮＡラダー生成によってＤＮＡのフラグメント化を評価でき；そして低二倍体細胞の任意の増加によってＤＮＡのフラグメント化と同時の核／クロマチンの凝縮を評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、その抗体が結合する抗原を発現する細胞を用いたアネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２から５０倍、好ましくは約５から５０倍、最も好ましくは約１０から５０倍のアネキシンの結合誘導を生じる抗体である。アポトーシスを誘導する抗体の例は、ＨＥＲ２抗体である７Ｃ２および７Ｆ３、ならびにある種のＤＲ５抗体である。
【０１２５】
「エピトープ２Ｃ４」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体２Ｃ４が結合する領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。代替的には、 エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評定することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中のドメインＩＩ由来の残基を含む。２Ｃ４およびパーツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する。Franklinら、Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
【０１２６】
「エピトープ４Ｄ５」は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）およびトラスツズマブが結合する領域である。このエピトープはＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接しており、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内に存在する。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。代替的には、エピトープマッピングを行って、その抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、ＨＥＲ２の約５２９番残基から約６２５番残基まで、両端の残基を含めた領域における任意の一つまたは複数の残基）に結合するかどうかを評定することができる。
【０１２７】
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は、７Ｃ２抗体および／または７Ｆ３抗体（それぞれＡＴＣＣに寄託、下記参照）が結合する、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩ内のアミノ末端の領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane(1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを行うことができる。代替的には、その抗体がＨＥＲ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ(例えば、ＨＥＲ２の約２２番残基から約５３番残基までの領域中の任意の一つまたは複数の残基）に結合するかどうかを確認するために、エピトープマッピングを行うことができる。
【０１２８】
「処置」は、治療的処置および予防的方策の両方を指す。処置を必要とする者には、すでに疾患を有する者および疾患を予防されるべき者が含まれる。よって、本明細書において処置される患者は、疾患を有すると診断されたおそれもあるし、また、疾患の素因があるか、もしくは疾患に感受性なおそれがある。
【０１２９】
用語「ガン」および「ガン性」は、無秩序な細胞成長によって典型的には特徴づけられる、哺乳類における生理的状態を指すか、または記載する。ガンの例には、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫（髄芽腫および網膜芽腫を含む）、肉腫（脂肪肉腫および滑膜細胞肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍（カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、および膵島細胞ガンを含む）、中皮腫、神経鞘腫（聴神経腫を含む）、髄膜腫、腺ガン、黒色腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患があるが、それに限定されるわけではない。当該ガンのさらに特別な例には、扁平上皮ガン（例えば上皮扁平上皮ガン）；小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺腺ガンおよび肺扁平上皮ガンを含む肺ガン；腹膜ガン；肝細胞ガン；消化管ガンを含む胃ガン；膵臓ガン；神経膠芽腫；子宮頚がん；卵巣ガン；肝ガン；膀胱ガン；ヘパトーマ；乳ガン；結腸ガン；直腸ガン；直腸結腸ガン；子宮内膜ガンまたは子宮ガン；唾液腺ガン；腎ガン；前立腺がん；外陰部ガン；甲状腺ガン；肝ガン；肛門ガン；陰茎ガン；精巣ガン；食道ガン；胆道腫瘍；および頭頚部ガンがある。
【０１３０】
用語「有効量」は、患者における疾患を処置するのに有効な薬物の量を指す。その疾患がガンの場合、薬物の有効量はガン細胞数を減少させ、腫瘍の大きさを減少させ、末梢器官へのガン細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させ）、腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させ）、腫瘍の成長をある程度阻害し、かつ／またはガンに関連する一つもしくは複数の症状をある程度軽減することができる。薬物が成長を阻止し、かつ／または現存するガン細胞を殺滅しうる程度に、その薬物は細胞分裂抑制性および／または細胞毒性でありうる。有効量は、進行のない生存期間を延長し、客観的反応（部分反応（ＰＲ）もしくは完全反応（ＣＲ）を含む）を招き、全生存期間を増大させ、かつ／またはガンの一つもしくは複数の症状を改善することができる。
【０１３１】
「ＨＥＲ２発現性ガン」は、細胞表面にＨＥＲ２タンパク質が存在する細胞を含むガンである。
【０１３２】
レセプターＨＥＲを「過剰発現する」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して、その細胞表面にＨＥＲ２などのレセプターＨＥＲをかなり高レベル有するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。レセプターＨＥＲの過剰発現を、細胞表面に存在する増加したレベルのＨＥＲタンパク質を評価することによって、診断または予後アッセイで（例えば免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）により）決定することができる。または、もしくは追加的に、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公表されたＷＯ９８／４５４７９参照）、サザンブロット、またはリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって、細胞中のＨＥＲをコードしている核酸のレベルを測定することができる。血清などの生体液に分散した抗原（例えばＨＥＲ細胞外ドメイン）を測定することによって、レセプターＨＥＲの過剰発現を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公表されたＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号;およびSias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)を参照されたい）。当業者は、上記アッセイの他に様々なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを利用できる。例えば検出可能なラベル、例えば放射性同位体で場合によりラベルした抗体に、患者の体内の細胞を曝露して、例えば放射能を外部スキャンすることにより、または抗体に予め曝露された患者から採取した生検を分析することにより、その患者における細胞に対する抗体の結合を評価することができる。
【０１３３】
逆に、「レセプターＨＥＲ２を過剰発現しない」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して正常レベルよりも高いレセプターＨＥＲ２を発現しないガンである。
【０１３４】
ＨＥＲリガンドを「過剰発現する」ガンは、同じ組織型の非ガン細胞に比較して有意に高いレベルのそのリガンドを産生するガンである。当該過剰発現は、遺伝子増幅によって、または転写もしくは翻訳の増加によって起こることがある。ＨＥＲリガンドの過剰発現は、患者における、例えば腫瘍生検におけるリガンド（もしくはそれをコードする核酸）のレベルを評価することによって、または上記のＩＨＣ、ＦＩＳＨ、サザンブロット、ＰＣＲ、もしくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイなどの様々な診断アッセイによって、診断的に決定することができる。
【０１３５】
本明細書中において使用されるときの用語「細胞毒性薬」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、かつ／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性な毒素などの毒素を、そのフラグメントおよび／または変異体を含めて、を含むことを意味する。
【０１３６】
「化学療法剤」は、ガンの処置に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（CYTOXAN(登録商標)）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamine）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、MARINOL(登録商標)）；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログであるトポテカン（HYCAMTIN(登録商標)）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標)）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（scopolectin）、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)参照））；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；エスペラマイシン；ならびに、ネオカルチノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン（chromocycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射液（DOXIL(登録商標)）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（MYOCET(登録商標)）、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン（CAELYX(登録商標)）、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート、ゲムシタビン（GemZar(登録商標)）、テガフール（UFTORAL(登録商標)）、カペシタビン（XELODA(登録商標)）、エピチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジンアナログ；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；フロリニン酸（frolinic acid）などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（TAXOL(登録商標)）、パクリタキセルのアルブミン加工ナノ粒子製剤（ABRAXANE(商標)）、およびドセタキセル（TAXOTERE(登録商標)）；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどのプラチナ剤；ビンブラスチン（VELBAN(登録商標)）、ビンクリスチン（ONCOVIN(登録商標)）、ビンデシン（ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標)）、およびビノレルビン（NAVELBINE(登録商標)）を含めた、チューブリン重合により微小管が形成するのを阻止するビンカ；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン（leucovovin）；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（TARGRETIN(登録��標)）を含めたレチノイン酸などのレチノイド；クロドロネート（例えば、BONEFOS(登録商標)またはOSTAC(登録商標)）、エチドロネート（DIDROCAL(登録商標)）、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ZOMETA(登録商標)）、アレンドロネート（FOSAMAX(登録商標)）、パミドロネート（AREDIA(登録商標)）、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ(登録商標)）、またはリセドロネート（ACTONEL(登録商標)）などのビスホスフォネート；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係づけられているシグナル伝達経路における遺伝子発現、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）を阻害するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンならびに遺伝子療法ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、LURTOTECAN(登録商標)）；ｒｍＲＨ（例えば、ABARELIX(登録商標)）；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ;Bayer）；ＳＵ−１１２４８（Pfizer）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、PS341）；ボルテゾミブ（VELCADE(登録商標)）；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ（orafenib）、ＡＢＴ５１０；オブリマーセン（oblimersen）ナトリウム（GENASENSE(登録商標)）などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（下記定義参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（下記定義参照）；ならびに上記いずれかの薬学的に許容しうる塩、酸または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法についての略語）およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ELOXATIN(商標)）を用いた処置方式についての略語）などの、上記のうち二つ以上の組み合わせがある。
【０１３７】
本定義に同じく含まれるのは、腫瘍に及ぼすホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤であり、抗ホルモン剤の例は、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン剤（タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（FARESTON(登録商標)）、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(EVISTA(登録商標))、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、およびＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲンレセプターモデュレータ（ＳＥＲＭ）を含む）；アゴニスト性を有さない純粋な抗エストロゲン剤（フルベストラント(FASLODEX(登録商標))およびEM800（当該薬剤はエストロゲンレセプター（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲのターンオーバーを増加させ、かつ／またはＥＲレベルを抑制する）など）；アロマターゼ阻害剤（フォルメスタンおよびエキセメスタン（AROMASIN(登録商標)）などのステロイド系アロマターゼ阻害剤、アナストラゾール（ARIMIDEX(登録商標)）、レトロゾール（FEMARA(登録商標)）およびアミノグルテチミドなどの非ステロイド系アロマターゼ阻害剤、ならびにボロゾール(RIVISOR(登録商標))、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、ファドロゾール、イミダゾールを含むその他のアロマターゼ阻害剤を含む）；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ロイプロリド(LUPRON(登録商標)およびELIGARD(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリン（tripterelin）を含む）；性ステロイド剤（酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロールおよびプレマリンなどのエストロゲン、ならびにフルオキシメステロン、オールトランスレチノイン酸およびフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイドを含む）；オナプリストン；抗プロゲステロン剤；エストロゲンレセプターダウンレギュレータ（ＥＲＤ）；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン剤；テストラクトン；ならびに上記いずれかの薬学的に許容しうる塩、酸または誘導体；ならびに上記のうち二つ以上の組み合わせである。
【０１３８】
本明細書において使用されるような用語「ＥＧＦＲターゲット薬」は、ＥＧＦＲに結合して、場合によりＥＧＦＲの活性化を阻害する治療剤を指す。当該薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子がある。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号、Mendelsohn et al.参照）、ならびにキメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ;ERBUTIX（登録商標））および再形状化ヒト２２５（Ｈ２２５）（ＷＯ９６／４０２１０、Imclone Systems Inc.参照）などのその変異体；ＩＩ型突然変異ＥＧＦＲと結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号）；米国特許第５，８９１，９９６号に記載されているような、ＥＧＦＲと結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＡＢＸ−ＥＧＦなどの、ＥＧＦＲと結合するヒト抗体（ＷＯ９８／５０４３３、Abgenix参照）がある。抗ＥＧＦＲ抗体は細胞毒性薬とコンジュゲーションすることにより、免疫コンジュゲートを発生することができる（例えば、ＥＰ６５９，４３９Ａ２、Merck Patent GmbH参照）。ＥＧＦＲに結合する小分子の例には、ＺＤ１８３９またはゲフィチニブ（IRESSA（商標）;Astra Zeneca）、ＣＰ−３５８７７４、またはエルロチニブＨＣＬ（TARCEVA（商標）;Genentech/OSI)、およびＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１;Sugen）がある。
【０１３９】
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターＨＥＲなどの、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子である。当該阻害剤の例には、前項で言及されたＥＧＦＲターゲット薬；Takedaから入手できるＴＡＫ１６５などの小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；選好的にＥＧＦＲと結合するが、ＨＥＲ２過剰発現細胞およびＥＧＦＲ過剰発現細胞の両方を阻害するＥＫＢ−５６９（Wyethから入手できる）などの二重ＨＥＲ阻害剤；経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＧＷ５７２０１６（Glaxoから入手できる）およびＰＫＩ−１６６（Novartisから入手できる）；カネルチニブ（ＣＩ−１０３３；Pharmacia）などの汎ＨＥＲ阻害剤；Ｒａｆ−１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手できるアンチセンス剤ＩＳＩＳ−５１３２などのＲａｆ−１阻害剤；Ｇｌａｘｏから入手できるメシル酸イマチニブ（Gleevac（商標））などの非ＨＥＲターゲットＴＫ阻害剤；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼＩ阻害剤ＣＩ−１０４０（Pharmaciaから入手できる）；ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジン；４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチルホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lamber）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲをコードする核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（tryphostin）（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Astra Zeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）などの汎ＨＥＲ阻害剤；アフィニタック（ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly）；メシル酸イマチニブ（Gleevac; Novartis）；ＰＫＩ１６６（Novartis）；ＧＷ２０１６（Glaxo SmithKline）；ＣＩ−１０３３（Pfizer）；ＥＫＢ−５６９（Wyeth）；セマキシニブ（Sugen）；ＺＤ６４７４（AstraZeneca）；ＰＴＫ−７８７（Novartis/Schering AG）；ＩＮＣ−１Ｃ１１（Imclone）；または以下の特許公報のいずれかに記載されるもの：米国特許第５，８０４，３９６号；ＷＯ９９／０９０１６（American Cyanimid）；ＷＯ９８／４３９６０（American Cyanamid）；ＷＯ９７／３８９８３（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３７８（Warner Lambert）；ＷＯ９９／０６３９６（Warner Lambert）；ＷＯ９６／３０３４７（Pfizer, Inc）；ＷＯ９６／３３９７８（Zeneca）；ＷＯ９６／３３９７（Zeneca）；およびＷＯ９６／３３９８０（Zeneca）がある。
【０１４０】
「抗血管形成剤」は、血管の発生をある程度遮断または妨害する化合物を指す。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子レセプターに結合する、小分子または抗体でありうる。本明細書における好ましい抗血管形成因子は、ベバシズマブ（AVASTIN（登録商標））などの、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。
【０１４１】
用語「サイトカイン」は、細胞間仲介物質として別の細胞に作用する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質についての総称である。当該サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。これらのサイトカインの中に含まるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；ミュラー管抑制物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めたその他のポリペプチド因子である。本明細書に使用されるときの用語「サイトカイン」には、天然起源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的活性等価物が含まれる。
【０１４２】
処方された抗体は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均一である（すなわち、混入タンパク質などを有しない）。「本質的に純粋な」抗体は、組成物の総重量に基づき少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％の抗体を含む組成物を意味する。「本質的に均一な」抗体は、組成物の総重量に基づき少なくとも約９９重量％の抗体を含む組成物を意味する。
【０１４３】
本明細書における「Ｂ細胞表面マーカー」または「Ｂ細胞表面抗原」は、それに結合する抗体を用いてターゲティングすることができるＢ細胞表面に発現した抗原である。Ｂ細胞表面マーカーの例には、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５およびＣＤ８６白血球表面マーカー（説明については、The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New Yorkを参照されたい）。他のＢ細胞表面マーカーには、ＲＰ１０５、ＦｃＲＨ２、Ｂ細胞ＣＲ２、ＣＣＲ６、Ｐ２Ｘ５、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＣＸＣＲ５、ＦＣＥＲ２、ＢＲ３、Ｂｔｉｇ、ＮＡＧ１４、ＳＬＧＣ１６２７０、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＡＴＷＤ５７８、ＦｃＲＨ３、ＩＲＴＡ１、ＦｃＲＨ６、ＢＣＭＡ、および２３９２８７がある。本明細書において特に関心対象のＢ細胞表面マーカーは、他の哺乳動物非Ｂ細胞組織に比べてＢ細胞上に選好的に発現し、前駆Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞の両方に発現することができる。本明細書における好ましいＢ細胞表面マーカーは、ＣＤ２０またはＢＲ３である。
【０１４４】
「ＣＤ２０」抗原または「ＣＤ２０」は、末梢血またはリンパ系器官由来の９０％を超えるＢ細胞の表面で見出される約３５kDaの非グルコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞および悪性Ｂ細胞の両方に存在するが、幹細胞には発現しない。文献でのＣＤ２０についての他の名称には「Ｂリンパ球拘束性抗原」および「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、Clarkら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766 (1985)に記載されている。
【０１４５】
単に本明細書のために「ヒト化２Ｈ７」は、ＣＤＲ配列が米国特許第５，５００，３６２号（図５および６）に開示されている２Ｈ７抗体のヒト化変異体を指し、その特許は参照により本明細書に特に組み入れられる。本明細書におけるヒト化２Ｈ７抗体の例には、同様に参照により本明細書に特に組み入れられるＷＯ２００４／０５６３１２に記載されている変異体、および２Ｈ７ｖ１６、２Ｈ７ｖ３１、２Ｈ７ｖ７３、２Ｈ７ｖ７５、２Ｈ７ｖ９６、２Ｈ７ｖ１１４、２Ｈ７ｖ１１５、２Ｈ７ｖ１１６、２Ｈ７ｖ１３８、２Ｈ７ｖ４７７、２Ｈ７ｖ３７５などを含めた他の変異体があるが、それに限定されるわけではない。
【０１４６】
一態様では、ヒト化２Ｈ７抗体は、以下のＣＤＲ配列のうち１個、２個、３個、４個、５個または６個を含む：
ＣＤＲ  Ｌ１配列ＲＡＳＳＳＶＳＹＸＨ（配列中、ＸはＭまたはＬ（配列番号６７）、例えば配列番号５７（図１８Ａ））、
ＣＤＲ  Ｌ２配列（配列番号５８（図１８Ａ））、
ＣＤＲ  Ｌ３配列ＱＱＷＸＦＮＰＰＴ（配列中、ＸはＳまたはＡ（配列番号６８）、例えば配列番号５９（図１８Ａ））、
ＣＤＲ  Ｈ１配列（配列番号６０（図１８Ｂ））、
ＣＤＲ  Ｈ２配列ＡＩＹＰＧＮＧＸＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列中、ＸはＤまたはＡ（配列番号６９）、例えば配列番号６１（図１８Ｂ））、および
ＣＤＲ  Ｈ３配列ＶＶＹＹＳＸＸＹＷＹＦＤＶ（配列中、位置６のＸはＮ、Ａ、Ｙ、ＷまたはＤであり、位置７のＸはＳまたはＲである（配列番号７０）、例えば配列番号６２（図１８Ｂ））。
【０１４７】
上記ＣＤＲ配列は、実質的にヒト軽鎖カッパ亜群Ｉ（ＶＬκＩ）のヒトコンセンサスＦＲ残基および実質的にヒト重鎖亜群ＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のヒトコンセンサスＦＲ残基などのヒト可変軽鎖および可変重鎖のフレームワーク配列内に一般に存在する。ＷＯ２００４／０５６３１２も参照されたい（Lowman et al.）。
【０１４８】
その可変重鎖部をヒトＩｇＧ鎖定常部に連結することができ、ここで、その定常部は、例えば天然配列および変異定常部を含めたＩｇＧ１またはＩｇＧ３でありうる。
【０１４９】
好ましい態様では、当該抗体は、配列番号２９の可変重鎖ドメイン配列（図１８Ｂに示すｖ１６）を含み、場合により配列番号２６の可変軽鎖ドメイン配列（図１８Ａに示すｖ１６）もまた含む。その抗体は、場合により可変重鎖ドメインの位置５６、１００および／または１００ａに、例えばＤ５６Ａ、Ｎ１００ＡもしくはＮ１００Ｙ、および／またはＳ１００ａＲの一つまたは複数のアミノ酸置換と、可変軽鎖ドメインの位置３２および／または９２に、例えばＭ３２Ｌおよび／またはＳ９２Ａの一つまたは複数のアミノ酸置換とを含む。好ましくは、その抗体は、配列番号６３または６４の軽鎖アミノ酸配列および配列番号６５、６６、７１または７２の重鎖アミノ酸配列を含むインタクトな抗体である。
【０１５０】
好ましいヒト化２Ｈ７抗体はオクレリズマブ（ocrelizumab）（Genentech）である。
【０１５１】
本明細書における抗体は、アミノ酸置換が重鎖残基のＥｕ付番を用いて位置２９８、３３３、および３３４にあり、好ましくはＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、およびＫ３３４Ａである抗体のように、Ｆｃ部にＡＤＣＣ活性を改善する少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含むことがある。米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号、Prestaも参照されたい。
【０１５２】
これらの抗体のうち任意のものは、Ｆｃ部にＦｃＲｎ結合または血清半減期を改善する少なくとも一つの置換、例えば重鎖位置４３４にＮ４３４Ｗなどの置換を含むことがある。米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号、Prestaも参照されたい。
【０１５３】
これらの抗体のうち任意のものは、Ｆｃ部にＣＤＣ活性を増大させる少なくとも一つのアミノ酸置換をさらに含み、例えば位置３２６に好ましくはＫ３２６ＡまたはＫ３２６Ｗの少なくとも一つの置換を含むことがある。米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号も参照されたい（Idusogie et al.）。
【０１５４】
一部の好ましいヒト化２Ｈ７変異体は、Ｆｃ部（が存在するならば、そのＦｃ部）に置換を有するかまたは有さない変異体を含めた、配列番号２６の可変軽鎖ドメインおよび配列番号２９の可変重鎖ドメインを含む変異体、ならびに配列番号２９に変更Ｎ１００Ａ；またはＤ５６ＡおよびＮ１００Ａ；またはＤ５６Ａ、Ｎ１００Ｙ、およびＳ１００ａＲを有する可変重鎖ドメインと、配列番号２６に変更Ｍ３２Ｌ；またはＳ９２Ａ；またはＭ３２ＬおよびＳ９２Ａを有する可変軽鎖ドメインとを含む変異体である。
【０１５５】
２Ｈ７ｖ１６の可変重鎖におけるＭ３４は、抗体安定性の潜在的な供給源として同定されており、置換のための別の潜在的候補である。
【０１５６】
本発明のいくつかの様々な好ましい態様を要約すると、２Ｈ７ｖ１６に基づく変異体の可変部は、下表に示されたアミノ酸置換位置を除き、ｖ１６のアミノ酸配列を含む。特に表示しない限り、２Ｈ７変異体はｖ１６と同じ軽鎖を有するであろう。
【０１５７】
【表１】
2014159469.tif 000002
【０１５８】
好ましいヒト化２Ｈ７の一つは、２Ｈ７ｖ１６可変軽鎖ドメイン配列：
【０１５９】
【表２】
2014159469.tif 000003
【０１６０】
および２Ｈ７ｖ１６可変重鎖ドメイン配列：
【０１６１】
【表３】
2014159469.tif 000004
【０１６２】
を含む。
【０１６３】
ヒト化２Ｈ７ｖ１６抗体がインタクトな抗体である場合、その抗体は軽鎖アミノ酸配列：
【０１６４】
【表４】
2014159469.tif 000005
【０１６５】
および配列番号６５または:
【０１６６】
【表５】
2014159469.tif 000006
【０１６７】
の重鎖アミノ酸配列を含みうる。
【０１６８】
別の好ましいヒト化２Ｈ７抗体は、２Ｈ７ｖ５１１可変軽鎖ドメイン配列：
【０１６９】
【表６】
2014159469.tif 000007
【０１７０】
および２Ｈ７ｖ５１１可変重鎖ドメイン配列:
【０１７１】
【表７】
2014159469.tif 000008
【０１７２】
を含む。
【０１７３】
ヒト化２Ｈ７ｖ５１１抗体がインタクトな抗体である場合、その抗体は軽鎖アミノ酸配列：
【０１７４】
【表８】
2014159469.tif 000009
【０１７５】
および配列番号６６または:
【０１７６】
【表９】
2014159469.tif 000010
【０１７７】
の重鎖アミノ酸配列を含みうる。
【０１７８】
本明細書における「Ｂ細胞型悪性腫瘍」には、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫を含めた非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、およびワルデンストレームマクログロブリン血症；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病、および慢性骨髄芽球性白血病を含めた白血病；ならびにその他の血液悪性腫瘍がある。当該悪性腫瘍を、ＣＤ２０などのＢ細胞表面マーカーに対する抗体で処置することができる。
【０１７９】
本明細書に使用されるような用語「非ホジキンリンパ腫」または「ＮＨＬ」は、ホジキンリンパ腫以外のリンパ系のガンを指す。ホジキンリンパ腫は、一般にホジキンリンパ腫にリード・ステルンベルグ細胞が存在することおよび非ホジキンリンパ腫に前記細胞が不在であることによって非ホジキンリンパ腫と区別することができる。本明細書に使用されるような用語によって包含される非ホジキンリンパ腫の例には、Color Atlas of Clinical Hematology, Third Edition; A. Victor Hoffbrand and John E. Pettit (eds.)（Harcourt Publishers Limited 2000）（特に図１１．５７、１１．５８および／または１１．５９参照）に記載されているような改訂ヨーロッパ−アメリカリンパ腫（ＲＥＡＬ）スキームなどの、当該技術分野で公知の分類スキームに従って当業者（例えば、腫瘍学者または病理学者）によって非ホジキンリンパ腫として同定されるであろう任意のものがある。さらに具体的な例には、再発および不応性ＮＨＬ、フロントライン低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶ  ＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、前駆Ｂリンパ芽球性白血病および／またはリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病および／または前リンパ球性白血病および／または小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、免疫細胞腫および／またはリンパ形質細胞性リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、節外性辺縁帯−ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁帯リンパ腫、毛様細胞性白血病、形質細胞腫および／または形質細胞性骨髄腫、低悪性度／濾胞性リンパ腫、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）、中悪性度びまん性ＮＨＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、侵攻性ＮＨＬ（侵攻性フロントラインＮＨＬおよび侵攻性再発ＮＨＬを含む）、自己幹細胞移植後に再発しているか、または自己幹細胞移植に抗療性のＮＨＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、バーキットリンパ腫、前駆（末梢）Ｔ細胞リンパ芽球性白血病および／またはリンパ腫、成人型Ｔ細胞リンパ腫および／または白血病、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病および／または前リンパ球性白血病、大顆粒性リンパ球性白血病、菌状息肉症および／またはセザリー症候群、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫（鼻型）、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、皮膚リンパ腫、未分化大細胞型リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫（他に特定されない）および血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫があるが、それに限定されるわけではない。
【０１８０】
本明細書における「自己免疫疾患」は、個体自体の組織もしくは同時隔離物に起因し、それに対する疾患もしくは障害、またはその症状もしくはその結果として生じる状態である。自己免疫疾患または障害の例には、関節炎（リウマチ様関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹、多発筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、（全身性強皮症を含む）強皮症、進行性全身性硬化症などの硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性炎症性腸疾患）、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、アナフィラキシーおよびアレルギー性鼻炎およびアトピー性鼻炎などのＩｇＥ介在性疾患、ラスムッセン脳炎などの脳炎、ブドウ膜炎または自己免疫性ブドウ膜炎、顕微鏡的大腸炎および膠原性大腸炎などの大腸炎、糸球体腎炎（ＧＮ）（膜性ＧＮ（膜様ネフロパシー）、特発性膜性ＧＮ、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、および急速進行性ＧＮなど）、アレルギー状態、アレルギー反応、湿疹、喘息、Ｔ細胞浸潤および慢性炎症性応答を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（皮膚ＳＬＥ、亜急性皮膚エリテマトーデス、ループス（腎炎、脳炎、小児、非腎症、円板状、脱毛を含む）など）、小児インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年型（Ｉ型）糖尿病、成人発症型糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、多発性硬化症（ＭＳ）（脊髄視覚ＭＳなど）、サイトカインおよびＴリンパ球に仲介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（（リウマチ性多発性筋痛および巨細胞性（高安）動脈炎を含めた）大血管炎、中血管血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）、ＣＮＳ血管炎、全身性壊死性血管炎、およびチャーグ−ストラウス血管炎または症候群（ＣＳＳ）などのＡＮＣＡ関連血管炎を含む）、側頭動脈炎、再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド−ブラックファン（Diamond Blackfan）貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多臓器傷害症候群、抗原−抗体複合体介在性疾患、抗糸球体基底膜病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、カストルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス−ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性、落葉状、および天疱瘡粘膜性類天疱瘡を含む）、自己免疫性多発性内分泌障害、ライター病、免疫複合体性腎炎、ＩｇＭ多発性ニューロパシーまたはＩｇＭ介在性ニューロパシーなどの慢性ニューロパシー、（例えば心筋梗塞患者が発現する）血小板減少症（血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＰＰ）お��び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの慢性または急性ＩＴＰを含む自己免疫性または免疫性の血小板減少を含む）、自己免疫性睾丸炎および卵巣炎を含む睾丸および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、上皮小体機能低下症、自己免疫性内分泌疾患（自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性上皮小体機能低下症、アジソン病、グレーヴズ病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）などの多腺性症候群を含む）、ランバート−イートン筋無力症症候群またはイートン−ランバート症候群などの神経系腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、スティフマン症候群、アレルギー性脳脊髄炎などの脳脊髄炎、重症筋無力症、小脳変性、辺縁系脳炎および／または脳幹脳炎、神経ミオトニー、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパシー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺炎、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン−バレー症候群、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、不応性スプルー、疱疹状皮膚炎、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー−ゲーリック病）、冠状動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）または自己免疫性聴力損失、眼球クローヌスミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、不応性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、アミロイドーシス、巨細胞性肝炎、強膜炎、非ガン性リンパ球増加症、単クローン性Ｂ細胞性リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性高ガンマグロブリン血症および意味不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー、腫瘍随伴症候群、（てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、難聴、失明、周期性四肢麻痺、およびＣＮＳのチャネル病などの）チャネル病、自閉症、炎症性ミオパシー、巣状分節状糸球体硬化（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼症、ブドウ膜網膜炎、自己免疫性肝障害、線維筋痛、多発性内分泌腺不全症、シュミット症候群、副腎炎、胃の萎縮症、初老性痴呆、脱髄疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症、クレスト症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、手指硬化症、および毛細血管拡張症）、男性および女性自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発流産、農夫肺、多形性紅疹、心術後症候群、クッシング症候群、鳥飼育者肺、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、らい、マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、（慢性毛様体炎、異時性毛様体炎またはフックス毛様体炎などの）毛様体炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症��エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染症、ＥＢウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァンズ症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄ろう、ならびに巨細胞多発性筋痛があるが、それに限定されるわけではない。
【０１８１】
本明細書における「腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー」または「ＴＮＦレセプタースーパーファミリー」は、ＴＮＦファミリーのサイトカインによって結合されるレセプターポリペプチドを指す。一般に、これらのレセプターは、細胞外ドメインに一つまたは複数のシステインリッチ繰り返し配列を有するＩ型膜貫通レセプターである。ＴＮＦレセプタースーパーファミリーを、（１）デスレセプター、（２）デコイレセプター、および（３）デスドメインを欠くシグナル伝達レセプターにさらに細分することができる。「デスレセプター」は、細胞質領域または細胞内領域に「デスドメイン」、すなわちアポトーシスまたはある種の遺伝子の誘導を招きうるシグナルを細胞の中で伝達するように作用する領域または配列を含む。「デコイレセプター」は、機能的デスドメインを欠き、アポトーシスを生じるシグナルを伝達することができない。ＴＮＦ遺伝子ファミリーのサイトカインの例には、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−βまたはリンホトキシン）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（ＦａｓリガンドまたはＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬとも呼ばれる）、Ａｐｏ−３リガンド（ＴＷＥＡＫとも呼ばれる）、オステオプロテグリン（ＯＰＧ）、ＡＰＲＩＬ、ＲＡＮＫリガンド（ＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）、およびＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦまたはＴＨＡＮＫとも呼ばれる）がある。ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのレセプターの例には、１型腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ１）、２型腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ２）、ｐ７５神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｔ細胞抗原ＯＸ−４０、Ａｐｏ−１レセプター（ＦａｓまたはＣＤ９５とも呼ばれる）、Ａｐｏ−３レセプター（ＤＲ３、ｓｗ１−１、ＴＲＡＭＰおよびＬＡＲＤとも呼ばれる）、「膜貫通アクチベーターおよびＣＡＭＬ−相互作用因子」または「ＴＡＣＴ」と呼ばれるレセプター、ＢＣＭＡタンパク質、ＤＲ４、ＤＲ５（またはＡｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２、もしくはＫＩＬＬＥＲと呼ばれる）、ＤＲ６、ＤｃＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ３とも呼ばれる）、ＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４またはＴＲＵＮＤＤとも呼ばれる）、ＯＰＧ、ＤｃＲ３（ＴＲ６またはＭ６８とも呼ばれる）、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ（ＡＴＡＲまたはＴＲ２とも呼ばれる）、ＧＩＴＲ、ＺＴＮＦＲ−５、ＮＴＲ−１，ＴＮＦＬ１，ＣＤ３０、リンホトキシンβレセプター（ＬＴＢｒ）、４−１ＢＢレセプターおよびＴＲ９（ＥＰ９８８、３７１Ａ１）がある。
【０１８２】
用語「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ」および「ＴＲＡＩＬ」は、本明細書において相互交換可能に使用され、図２４（配列番号４６）に示したアミノ酸配列の両端の残基を含めたアミノ酸残基１１４〜２８１、両端の残基を含めた９５〜２８１、両端の残基を含めた残基９２〜２８１、両端の残基を含めた残基９１〜２８１、両端の残基を含めた残基４１〜２８１、両端の残基を含めた残基３９〜２８１、両端の残基を含めた残基１５〜２８１、または両端の残基を含めた残基１〜２８１を含むポリペプチド配列、ならびに前記配列の生物学的に活性なフラグメント、欠失、挿入、および／または置換変異体を指す。一態様において、そのポリペプチド配列は、図２４（配列番号４６）の残基１１４〜２８１を含む。場合により、そのポリペプチド配列は、図２４（配列番号４６）の残基９２〜２８１または残基９１〜２８１を含む。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは、図２４（配列番号４５）に示す天然ヌクレオチド配列によってコードされうる。場合により、残基Ｐｒｏ１１９（図２４、配列番号４５）をコードするコドンは、「ＣＣＴ」または「ＣＣＧ」でありうる。場合により、そのフラグメントまたは変異体は生物学的に活性であり、上記配列の任意の一つと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する。この定義は、その天然アミノ酸の少なくとも一つがアラニン残基などの別のアミノ酸に置換されている、Ａｐｏ−２リガンドの置換変異体を包含する。この定義は、Ａｐｏ−２リガンド起源から単離されたか、またはリコンビナント法および／もしくは合成法によって調製された天然配列Ａｐｏ−２リガンドも包含する。本発明のＡｐｏ−２リガンドには、１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ９７／０１６３３、１９９７年７月１７日に公開されたＷＯ９７／２５４２８、１９９９年７月２２日に公開されたＷＯ９９／３６５３５、２００１年１月４日に公開されたＷＯ０１／００８３２、２００２年２月７日に公開されたＷＯ０２／０９７５５、２０００年１２月１４日に公開されたＷＯ００／７５１９１、および２０００年２月２９日に発行された米国特許第６，０３０，９４５号に開示されたＡｐｏ−２リガンドまたはＴＲＡＩＬと呼ばれるポリペプチドが含まれる。これらの用語は、一般に単量体、二量体、三量体、六量体、またはそれよりも大きいオリゴマー形態のポリペプチドを含むＡｐｏ−２リガンドの形態を指すために使用される。Ａｐｏ−２Ｌ配列で参照されたアミノ酸残基の全ての付番は、特に述べない限り図２４（配列番号４６）による付番を使用する。
【０１８３】
「Ａｐｏ−２リガンドレセプター」には、当技術分野において「ＤＲ４」および「ＤＲ５」と呼ばれるレセプターが含まれる。Ｐａｎらは、「ＤＲ４」と呼ばれるＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを記載した（Pan et al, Science, 276: 111-113 (1997);１９９８年７月３０日に公開されたＷＯ９８／３２８５６；１９９９年７月２９日に公開されたＷＯ９９／３７６８４；２０００年１２月７日に公開されたＷＯ００／７３３４９；２００２年８月１３日に発行されたＵＳ６，４３３，１４７；２００２年１０月８日に発行されたＵＳ６，４６１，８２３、および２００２年１月２９日に発行されたＵＳ６，３４２，３８３も参照されたい）。Sheridanら、Science, 277:818-821 (1997)およびPanら、Science, 277:815-818 (1997)は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対する別のレセプターを記載した（１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ９８／５１７９３；１９９８年９月２４日に公開されたＷＯ９８／４１６２９も参照されたい）。このレセプターはＤＲ５と呼ばれる（代替的には、このレセプターは、Ａｐｏ−２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ−６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２またはＫＩＬＬＥＲとも呼ばれた；Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日に公開されたＷＯ９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日に公開されたＥＰ８７０，８２７；１９９８年１０月２２日に公開されたＷＯ９８／４６６４３；１９９９年１月２１日に公開されたＷＯ９９／０２６５３；１９９９年２月２５日に公開されたＷＯ９９／０９１６５；１９９９年３月１１日に公開されたＷＯ９９／１１７９１；２００２年８月１３日に公開されたＵＳ２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日に公開されたＵＳ２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日に発行されたＵＳ６，３１３，２６９；２００１年８月２日に公開されたＵＳ２００１／００１０９２４；２００３年７月３日に公開されたＵＳ２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日に公開されたＵＳ２００２／０１６０４４６；２００２年４月２５日に公開されたＵＳ２００２／００４８７８５；２００３年５月２７日に発行されたＵＳ６，５６９，６４２；２０００年６月６日に発行されたＵＳ６，０７２，０４７；２００３年１１月４日に発行されたＵＳ６，６４２，３５８）。上記のように、Ａｐｏ−２Ｌに対する別のレセプターには、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、およびＯＰＧがある。本明細書に使用されるような用語「Ａｐｏ−２Ｌレセプター」は、天然配列のレセプターおよびレセプター変異体を包含する。これらの用語は、ヒトを含めた様々な哺乳動物に発現したＡｐｏ−２Ｌレセプターを包含する。Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、様々なヒト組織系列で自然に生じるように内因性発現することもあるし、また、リコンビナント法もしくは合成法により発現することもある。「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」は、自然界由来のＡｐｏ−２Ｌレセプターと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このように、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターは、ヒトを含めた任意の哺乳動物由来天然Ａｐｏ−２Ｌレセプターのアミノ酸配列を有しうる。当該天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセ��ターを自然界から単離することができるし、また、リコンビナント手段もしくは合成手段によりそれを産生することができる。用語「天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプター」は、天然短縮形態または分泌形態のレセプター（例えば細胞外ドメイン配列を含む例えば可溶型）、天然変異体形態（例えば選択的スプライシングされた形態）および天然対立遺伝子変異体を具体的に包含する。レセプター変異体は、天然配列Ａｐｏ−２Ｌレセプターのフラグメントまたは欠失変異体を含みうる。図２５Ａ〜Ｃは、ヒトＤＲ５レセプターのアミノ酸４１１個の配列を、１９９８年１１月１９日のＷＯ９８／５１７９３に公開されたそのヌクレオチド配列（配列番号４７および４８）と共に示す。ヒトＤＲ５レセプターの転写スプライス変異体は当技術分野で公知である。このスプライス変異体は、ヒトＤＲ５レセプターのアミノ酸４４０個の配列をコードし、そのアミノ酸配列を、１９９８年８月２０日のＷＯ９８／３５９８６に公開されたそのヌクレオチド配列（配列番号４９および５０）と共に図２６Ａ〜Ｃに示す。
【０１８４】
本明細書において「デスレセプター抗体」は、一般に腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーのレセプターに対する抗体であって、アポトーシスをシグナル伝達できるデスドメインを含む抗体を指すために使用され、当該抗体にはＤＲ５抗体およびＤＲ４抗体がある。
【０１８５】
「ＤＲ５レセプター抗体」、「ＤＲ５抗体」、または「抗ＤＲ５抗体」は、広義で使用されて少なくとも一形態のＤＲ５レセプターまたはその細胞外ドメインに結合する抗体を指す。場合により、ＤＲ５抗体は異種配列または分子と融合または結合している。好ましくは、その異種配列はその抗体に高次複合体もしくはオリゴマー性複合体を形成させるか、またはそれを援助する。場合により、ＤＲ５抗体はＤＲ５レセプターに結合するが、任意の追加的なＡｐｏ−２Ｌレセプター（例えば、ＤＲ４、ＤｃＲ１、またはＤｃＲ２）と結合も交差反応もしない。場合により、その抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。
【０１８６】
場合により、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定された約０．１nMから約２０mMの濃度範囲でＤＲ５レセプターに結合する。場合により、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定された約０．６nMから約１８mMのＩＣ５０値を示す。
【０１８７】
純粋に本明細書のために、用語「Ａｐｏｍａｂ」は、ＤＲ５に結合するアゴニスト抗体を指し、配列番号５５および５６の可変重鎖および可変軽鎖アミノ酸配列を含む。好ましくは、Ａｐｏｍａｂはそれぞれ配列番号５１および５２の重鎖および軽鎖を含む。
【０１８８】
ＩＩ．抗体の産生
本発明により処方できる抗体を産生するための技法は、以下の通りである。
【０１８９】
（ｉ）抗原の選択と調製
好ましくは、その抗体が結合する抗原は、生物学的に重要な糖タンパク質であり、疾患または障害を患う哺乳動物へのその抗体の投与は、その哺乳動物に治療上の利益を生じることができる。しかし、非ポリペプチド抗原に対する抗体（腫瘍関連糖脂質抗原など、米国特許第５，０９１，１７８号参照）も考えられている。
【０１９０】
その抗原がポリペプチドである場合、その抗原は膜貫通分子（例えば、レセプター）または成長因子などのリガンドでありうる。抗原の例には、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含めた成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質；α１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンビルブラント因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼすなわちヒト尿プラスミノーゲンアクチベーターまたはヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよびβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミューラー阻害物質；レラクシンＡ鎖；レラクシンＢ鎖；プロレラクシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（ＣＴＬＡ−４など）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子に対するレセプター；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−ｂなどの神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなど、ＴＧＦ−ｂ１、ＴＧＦ−ｂ２、ＴＧＦ−ｂ３、ＴＧＦ−ｂ４、またはＴＧＦ−ｂ５を含む）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなど）；インスリン様成長因子−ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β、−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの部分などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなどのインテグリン；レセプターＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４などの腫瘍関連抗原；および上記ポリペプチドのうち任意のもののフラグメントなどの分子がある。
【０１９１】
本発明に包含される抗体についての分子ターゲットの例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３４およびＣＤ４０などのＣＤタンパク質；ＥＧＦレセプター、レセプターＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４などのＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー；ＣＤ２０またはＢＲ３などのＢ細胞表面抗原；ＤＲ５を含めた腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバー；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；ＬＦＡ−１，Ｍａｃ１，ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびαｖ／β３インテグリン（そのαまたはβサブユニットのいずれかを含む）（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８または抗ＣＤ１１ｂ抗体）などの細胞接着分子；ＶＥＧＦなどの成長因子およびそのレセプター；組織因子（ＴＦ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；αインターフェロン（α−ＩＦＮ）；ＩＬ−８などのインターロイキン；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなどがある。
【０１９２】
場合により他の分子にコンジュゲーションした可溶性抗原またはそのフラグメントを、抗体を発生させるための免疫原として使用することができる。レセプターなどの膜貫通分子については、これらのフラグメント（例えば、レセプターの細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。代替的には、膜貫通分子を発現している細胞を免疫原として使用することができる。当該細胞は、天然起源由来（例えば、ガン細胞系）のことがあるし、また、膜貫通分子を発現させるためのリコンビナント技法によってトランスフォーメーションされた細胞でもありうる。抗体の調製に有用な他の抗原およびその形態は、当業者に明らかであろう。
【０１９３】
ＨＥＲ２抗体の産生のために、その産生に使用されるＨＥＲ２抗原は、例えばＨＥＲ２の細胞外ドメインの可溶性形態または所望のエピトープを含有するその部分でありうる。代替的には、細胞表面にＨＥＲ２を発現している細胞（例えば、ＨＥＲ２を過剰発現するようにトランスフォーメーションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞；もしくはＳＫ−ＢＲ−３細胞などのガン細胞系、Stancovski et al. PNAS （USA） 88:8691-8695 (1991)参照）を使用して抗体を発生させることができる。
【０１９４】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られ、すなわち、その集団を含む個別の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じうる可能性のある変異体を除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープと結合する。このように、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではない抗体の性質を意味する。
【０１９５】
例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、また、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製できる。
【０１９６】
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターなどのその他の適切な宿主動物を、本明細書上記のように免疫処置して、免疫処置のために使用されたタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発させる。または、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫処置できる。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。
【０１９７】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する一つまたは複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如しているならば、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０１９８】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞により抗体の安定な高レベルの産生を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に感受性の細胞である。とりわけ好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞系、ならびにAmerican Type Culture Collection, Rockville, Maryland USAから入手できるＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
【０１９９】
抗原に対するモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が成長している培地をアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定される。
【０２００】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定できる。
【０２０１】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後で、限界希釈手順によりそのクローンをサブクローニングして、標準的な方法により成長させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地がある。さらに、このハイブリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍としてｉｎ  ｖｉｖｏで成長させることができる。
【０２０２】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の抗体精製手順によって培地、腹水、または血清から適切に分離する。
【０２０３】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、当該ＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すると、そのＤＮＡを発現ベクターの中に配置することができ、次にその発現ベクターを、E. coli細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の状況では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞にモノクローナル抗体の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡを細菌に組換え発現させることに関する総説論文には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)がある。
【０２０４】
さらなる態様では、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載されている技法を使用して発生した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用した、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。それに続く刊行物は、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）ならびに非常に大規模なファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによる高親和性（nM範囲）のヒト抗体の産生を記載している（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）。このように、これらの技法は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対する実行可能な代替法である。
【０２０５】
ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または免疫グロブリンのコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部を共有結合的に繋ぐことによって改変することもできる。
【０２０６】
典型的には、当該非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、または、抗体の一抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を生み出す。
【０２０７】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその抗体に導入された一つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入（import）」残基と称される。この残基は、典型的には「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、ヒト抗体の対応配列の代わりに超可変部配列に置換することによって、Winterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従って本質的に行うことができる。従って、当該「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さな配列が非ヒト種由来の対応する配列に置換されているキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変部残基と、可能性があることには一部のＦＲ残基とが、げっ歯動物抗体の類似部位に由来する残基に置換されているヒト抗体である。
【０２０８】
ヒト化抗体を作製する際に使用される、軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法により、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯動物の配列に最も類似しているヒト配列を、ヒト化抗体についてのヒトフレームワーク部（ＦＲ）として受け入れる（Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法は、特定亜群の軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク部を使用する。同フレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
【０２０９】
抗体が抗原に対する高い親和性および他の好都合な生物学的性質を保持してヒト化されることは、さらに重要である。この目標を実現するために、好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した、親配列および様々な概念上のヒト化産物の分析プロセスによりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の有望な三次元コンフォメーション構造を図解して表示するコンピュータプログラムを利用できる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能に、これらの残基が果たしそうな役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響する残基を分析することが可能になる。このように、ＦＲ残基を、レシピエント配列および輸入配列から選択して、組み合わせることができ、その結果、ターゲット抗原（類）に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が実現される。一般に、超可変部残基は、抗原結合に影響することに、直接的かつ最も実質的に関与している。
【０２１０】
ＷＯ０１／００２４５は、ＨＥＲ２と結合してリガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する例示的なヒト化ＨＥＲ２抗体の産生を記載している。本明細書において特に関心対象のヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４（またはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同様に効果的に、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよび／もしくはＨＲＧが介在するＭＡＰＫ活性化を遮断し、かつ／またはマウスモノクローナル抗体２Ｃ４（もしくはそのＦａｂフラグメント）と本質的に同様に効果的にＨＥＲ２と結合する。本明細書におけるヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに組み込まれた非ヒト超可変部残基を含むことがあり、さらにKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に述べられた可変ドメイン付番システムを利用して、６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈからなる群より選択される位置にフレームワーク部（ＦＲ）置換を含むことがある。一態様では、ヒト化抗体は、位置６９Ｈ、７１Ｈおよび７３Ｈの二つまたは全てにＦＲ置換を含む。
【０２１１】
本明細書において関心対象の例示的なヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定部残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（Ｘは好ましくはＤまたはＳ）（配列番号７）；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ（配列番号８）；および／またはＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ（配列番号９）を含み、場合により、それらのＣＤＲ残基にアミノ酸改変を含む（例えばその改変がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合）。例えば、関心対象の抗体変異体は、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を上記重鎖可変ＣＤＲ配列に有することがある。例えば下記のような親和性成熟によって、当該抗体変異体を調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号４の可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０２１２】
そのヒト化抗体は、例えば前節の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基に加えて、可変軽鎖ドメインの相補性決定残基ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ（配列番号１０）；ＳＡＳＹＸＸＸ（位置５のＸは好ましくはＲもしくはＬであり、位置６のＸは好ましくはＹもしくはＥであり、位置７のＸは好ましくはＴもしくはＳである）（配列番号１１）；および／またはＱＱＹＹＩＹＰＹＴ（配列番号１２）を含むことがある。当該ヒト化抗体は、場合により、例えば修飾がその抗体の親和性を本質的に維持または改善する場合に上記ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含む。例えば、対象となる抗体変異体は、上記可変軽鎖ＣＤＲ配列に、約１個から約７個または約５個のアミノ酸置換を有しうる。当該抗体変異体を、例えば下記のような親和性成熟により調製することができる。最も好ましいヒト化抗体は、配列番号３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
【０２１３】
本出願は、ＨＥＲ２と結合して、リガンドによるレセプターＨＥＲの活性化を遮断する、親和性成熟した抗体も考えている。親抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体、例えばそれぞれ配列番号３および４の軽鎖可変配列および／または重鎖可変配列をそれぞれ含むヒト化抗体（すなわち変異体５７４）でありうる。親和性成熟した抗体は、マウス２Ｃ４または変異体５７４よりも優れた親和性で（例えば、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ＥＬＩＳＡを用いて評定するとき、例えば約２または約４倍から約１００倍または約１０００倍向上した親和性で）レセプターＨＥＲ２に好ましくは結合する。置換のための例示的な重鎖可変部ＣＤＲ残基には、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、または７個）がある。変更のための軽鎖可変部ＣＤＲ残基の例には、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、または二つ以上の組み合わせ（例えば、これらの残基の２から３、４、５、または約１０個まで）がある。
【０２１４】
様々な形態のヒト化抗体または親和性成熟した抗体が考えられている。例えば、ヒト化抗体または親和性成熟した抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントでありうるが、このフラグメントは、免疫コンジュゲートを発生させるために、１つまたは複数の細胞毒性薬と場合によりコンジュゲーションしている。または、ヒト化抗体もしくは親和性成熟した抗体は、インタクトなＩｇＧ１抗体などのインタクトな抗体でありうる。
【０２１５】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化の代替として、ヒト抗体を発生させることができる。例えば、免疫処置した際に、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが今や可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体重鎖結合部（ＪＨ）遺伝子の同型接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を招くことが記載されている。当該生殖細胞系突然変異マウスにヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する結果として、抗原による攻撃の際にヒト抗体の産生が生じるものである。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号を参照されたい。
【０２１６】
代替的には、ファージディスプレイ技法（McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)）を使用して、免疫処置されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体および抗体フラグメントをｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。この技法によると、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの、糸状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子のいずれかにフレーム内にクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示させる。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、その抗体の機能的性質に基づく選択は、それらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択も招く。従って、そのファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイを、様々な形式で行うことができる；それらの総説については、例えばJohnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)を参照されたい。いくつかの起源のＶ遺伝子セグメントをファージディスプレイのために使用することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫処置したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模ランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫処置していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己抗原を含む）多様なアレイの抗原に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)によって記載されている技法に本質的に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０２１７】
上に論じたように、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性化されたＢ細胞によりヒト抗体を発生させることもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０２１８】
ヒトＨＥＲ２抗体は、１９９８年６月３０日に発行された米国特許第５，７７２，９９７号および１９９７年１月３日に公開されたＷＯ９７／００２７１に記載されている。
【０２１９】
（ｖ）抗体フラグメント
種々の技法が抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、全長抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、これらのフラグメントを、今や組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、その抗体フラグメントを、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。または、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、E.coliから直接回収して、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成させることができる（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体フラグメントの産生のためのその他の技法は、当業者に明白であろう。他の態様では、選択した抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。この抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に例えば記載される通り「線状抗体」（linear antibody）でもありうる。当該線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性でありうる。
【０２２０】
（ｖｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＥＲ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。その他の当該抗体は、ＨＥＲ２結合部位と、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３および／またはＨＥＲ４に対する結合部位とを組み合わせることができる。または、細胞防御メカニズムをＨＥＲ２発現細胞に集中させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）のような、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などの、ＩｇＧに対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）のような、白血球上のトリガー分子に結合するアームとＨＥＲ２アームを組み合わせることができる。ＨＥＲ２を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるために、二重特異性抗体を使用することもできる。これらの抗体は、ＨＥＲ２結合アームと、細胞毒性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシン（ricin）Ａ鎖、メトトレキサート、または放射性同位体ハプテン）と結合するアームとを有する。二重特異性抗体を、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０２２１】
ＷＯ９６／１６６７３は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載し、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩ抗体ＩＤＭ１（Osidem）を開示している。二重特異性ＨＥＲ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を教示している。ＭＤＸ−２１０は、二重特異性ＨＥＲ２−ＦｃγＲＩＩＩ Ａｂである。
【０２２２】
二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野において公知である。全長二重特異性抗体の従来の産生は、二つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づく。ここで、その２本の鎖は異なる特異性を有する（Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな取り合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち、一つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、普通はアフィニティークロマトグラフィー段階によってなされるが、その精製はかなり煩雑であり、その産物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０２２３】
異なるアプローチにより、所望の結合特異性（抗体−抗原の結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は、好ましくは、ヒンジ部の少なくとも部分、ＣＨ２部およびＣＨ３部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインを有する。これら融合体の少なくとも一つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第一重鎖定常部（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡと、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡとを、別々の発現ベクターに挿入して、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクションする。これは、等しくない比率の三つのポリペプチド鎖の構築に使用されるそれらのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互比率の調整に大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖が等しい比で発現することが高収率を招く場合、またはその比が特に重要ではない場合に、二つまたは三つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２２４】
このアプローチの好ましい態様では、その二重特異性抗体は、一方のアームに第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２結合特異性を提供する）とから構成される。この非対称構造は、望まれていない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。それは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することが、分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を発生させるさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０２２５】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の率を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。この方法では、第１抗体分子の界面由来の一つまたは複数の小型アミノ酸側鎖を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置換する。その大型側鎖（類）に同一または類似の大きさの代償的な「空洞」は、大型アミノ酸側鎖をより小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置換することによって、第２抗体分子の界面に生み出される。これは、ホモ二量体などのその他の望まれない最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加するためのメカニズムを提供する。
【０２２６】
二重特異性抗体は、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。当該抗体は、例えば、望まれていない細胞に免疫系細胞をターゲティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ ９１／００３６０、ＷＯ ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）提案された。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合の架橋方法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に、いくつかの架橋技法と共に開示されている。
【０２２７】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を発生させるための技法は、文献にも記載されている。例えば、化学的結合を用いて二重特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science, 229:81 (1985)は、全長抗体がタンパク質分解的に開裂されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを発生する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化して、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次に、発生したＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、メルカプトエチルアミンを用いた還元により、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをＦａｂ’−チオールへと再変換し、等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成させる。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０２２８】
最近の進歩により、E. coli由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。このＦａｂ’−ＳＨフラグメントを、化学的に結合して、二重特異性抗体を形成させることができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントが、E. coliから別個に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向化学的結合に供されて、二重特異性抗体を形成した。このように形成した二重特異性抗体は、レセプターＨＥＲ２を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、かつヒト乳房腫瘍ターゲットに対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性をトリガーできた。
【０２２９】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを直接作製して単離するための様々な技法も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。その抗体ホモ二量体は、ヒンジ部で還元されて単量体を形成し、次に、再び酸化されて抗体へテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体産生のためにも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)によって記載された「二特異性抗体」技法は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替メカニズムを提供した。このフラグメントは、同一鎖上の二つのドメイン間で対形成できるには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一フラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補性ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対形成することを強いられ、それによって、二つの抗原結合部位を形成する。二重特異性抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０２３０】
二つを超える結合価を有する抗体が考えられている。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０２３１】
（ｖｉｉ）その他のアミノ酸配列の改変
本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の改変が考えられている。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましいことがある。適切なヌクレオチド変化を抗体の核酸に導入することにより、またはペプチド合成により、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。当該改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換がある。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終構築物に達するように作製されるが、ただし、その最終構築物は所望の性質を有する。そのアミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるように、抗体の翻訳後プロセスを変更することもできる。
【０２３２】
突然変異誘発についての好ましい位置である、抗体のある残基または領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されているような「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。本明細書において、ターゲット残基の残基または基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電した残基）が同定され、中性または陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置換されて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響する。次に、置換に対する機能的感受性を実証しているアミノ酸位置を、置換部位に、または置換部位の代わりに、さらなる変異体またはその他の変異体を導入することによって精密化する。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているものの、その突然変異自体の性質は、予め決定されている必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム突然変異誘発が、ターゲットコドンまたはターゲット領域に施され、そして発現した抗体変異体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０２３３】
アミノ酸配列挿入には、一つの残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端の挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合したＨＥＲ２抗体がある。抗体分子のその他の挿入変異体には、抗体のＮ末端もしくはＣ末端と、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）との、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドとの融合体がある。
【０２３４】
別の型の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、ＨＥＲ２抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基に置換されている。置換突然変異誘発について最も関心対象の部位には、超可変部またはＣＤＲがあるが、ＦＲまたはＦｃ領域の変更も考えられている。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に表１に示す。当該置換が生物学的活性の変化を招くならば、表１に「例示的置換」と称するか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される、より実質的な変化を導入して、その産物をスクリーニングすることができる。
【０２３５】
【表１０】
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【０２３６】
抗体の生物学的性質における実質的な改変は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックスコンフォメーションのような、置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）ターゲット部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持することに及ぼすそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。アミノ酸を、側鎖の性質の類似性により以下のような群に分けることができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp.73-75, Worth Publishers, New York(1975)）：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２３７】
または、天然に存在する残基を、共通の側鎖の性質に基づいて以下の群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２３８】
非保存的置換は、これらのクラスのうち、一つのメンバーを別のクラスのものに交換することを必要とするものである。
【０２３９】
抗体の適切なコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般にセリンに置換して、その分子の酸化に対する安定性を改善して、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、（特に、その抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を改善することができる。
【０２４０】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変部残基を置換することを伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、結果として生じた変異体は、それらの発生が由来する親抗体と比較して、改善した生物学的性質を有するものである。当該置換変異体を発生させるための簡便法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変部部位（例えば、６から７個の部位）を突然変異させてすべての可能なアミノ置換を各部位に発生させる。このように発生した抗体変異体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として提示される。次に、ファージディスプレイされた変異体を、本明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための候補となる超可変部部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に重大に寄与する超可変部残基を同定することができる。代替的には、もしくは追加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とその抗原との間の接触点を同定することも有益でありうる。そのような接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳細に述べられた技法による置換のための候補である。当該変異体がいったん発生すると、一団の変異体を本明細書に記載されたスクリーニングに供し、一つまたは複数の関連するアッセイで優れた性質を有する抗体を、さらなる開発のために選択することができる。
【０２４１】
この抗体の別の型のアミノ酸変異体は、この抗体の本来のグリコシル化パターンを変更したものである。変更によって、抗体に見出される一つもしくは複数の糖質部分を欠失させること、および／またはその抗体には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０２４２】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分が付着していることを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に付着させるための認識配列である。このように、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチドに存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生み出される。Ｏ−結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つがヒドロキシアミノ酸に付着していることを指し、そのヒドロキシアミノ酸は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用されうるが、最も一般にはセリンまたはトレオニンである。
【０２４３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、アミノ酸配列を変更することにより、そのアミノ酸配列が（Ｎ−結合型グリコシル化部位のための）上記の一つまたは複数のトリペプチド配列を含ませることによって実現される。本来の抗体の配列に（Ｏ−結合型グリコシル化部位のための）一つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基を付加するか、またはこれらに置換することによっても、変更を行うことができる。
【０２４４】
その抗体がＦｃ部を含む場合、それに付着した糖質を変更することができる。例えば、抗体のＦｃ部に付着したフコース欠如成熟糖質構造を有する抗体は、米国特許出願ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１、Presta, L.に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１Ａ１（協和発酵工業株式会社）も参照されたい。抗体のＦｃ部に付着した糖質２等分性Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ０３／０１１８７８（Jean-Mairet et al.）および米国特許第６，６０２，６８４号（Umana et al.）に参照されている。抗体のＦｃ部に付着したオリゴ糖に少なくとも一つのガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ９７／３００８７（Patel et al.）に報告されている。抗体のＦｃ部に付着した変更糖質を有する抗体に関するＷＯ９８／５８９６４（Raju, S.）およびＷＯ９９／２２７６４（Raju, S.）も参照されたい。Ｆｃ部に付着した当該糖質構造を有する主要種抗体を含む抗体組成物も本明細書に考えられている。
【０２４５】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードしている核酸分子は、当技術分野で公知の多様な方法により調製される。これらの方法には、天然起源（天然アミノ酸配列変異体の場合）からの単離、または抗体の以前に調製された変異体もしくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド介在性（もしくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による調製があるが、それに限定されるわけではない。
【０２４６】
（ｖｉｉｉ）所望の性質を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を発生させる技法は上述されている。所望により、ある生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
【０２４７】
レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体を同定するために、その抗体が、（例えば、別のレセプターＨＥＲとコンジュゲーションして、それと共に関心対象のレセプターＨＥＲがＨＥＲヘテロオリゴマーを形成する）レセプターＨＥＲを発現している細胞に対するＨＥＲリガンドの結合を遮断する能力を決定することができる。例えば、ＨＥＲヘテロオリゴマーのレセプターＨＥＲを自然発現しているか、またはそれを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、その抗体と共にインキュベーションして、次にラベルしたＨＥＲリガンドに曝露することができる。ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマー中のレセプターＨＥＲに対するリガンドの結合を遮断する能力を、次に評価することができる。
【０２４８】
例えば、ＨＥＲ２抗体によるＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系へのＨＲＧ結合の阻害を、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載したように２４ウェルプレート形式での氷冷単層ＭＣＦ７培養物を用いて行うことができる。ＨＥＲ２モノクローナル抗体を各ウェルに加え、３０分間インキュベーションすることができる。１２５ＩラベルｒＨＲＧβ１１７７−２２４(２５pm)を次に加え、インキュベーションを４から１６時間続けることができる。用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてＩＣ５０値を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイで約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧの結合阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
【０２４９】
代替的には、もしくは追加的に、ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲヘテロオリゴマーに存在するレセプターＨＥＲのＨＥＲリガンド刺激性チロシンリン酸化を遮断する能力を評定することができる。例えば、レセプターＨＥＲを内因性発現しているか、またはそれらを発現するようにトランスフェクションされた細胞を、抗体と共にインキュベーションして、次に、ＨＥＲリガンド依存性チロシンリン酸化活性について抗ホスホチロシンモノクローナル(場合により検出可能なラベルとコンジュゲーションされたもの)を用いてアッセイすることができる。米国特許第５，７６６，８６３号に記載されているキナーゼレセプター活性化アッセイも、レセプターＨＥＲの活性化と抗体によるその活性の遮断とを測定するために利用できる。
【０２５０】
一態様では、本質的にＷＯ０１／００２４５に記載されたように、ＨＲＧによるＭＣＦ７細胞でのｐ１８０チロシンリン酸化の刺激を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４ウェルプレートに蒔き、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションし、次に最終濃度０．２nMまでｒＨＲＧβ１１７７−２４４を各ウェルに加えることができ、インキュベーションを８分間続けることができる。培地を各ウェルから吸引し、ＳＤＳ試料バッファー(５％ＳＤＳ、２５mM  ＤＴＴ、および２５mMトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)１００μlを加えることによって反応を停止させることができる。各試料（２５μl）を、４〜１２％の勾配ゲル（Novex）で電気泳動して、次にポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的に移行させることができる。抗ホスホチロシン（１μg/ml）免疫ブロットを展色させて、Ｍｒ〜１８００００での顕著な反応性バンドの強度を反射率デンシトメトリーにより定量することができる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイの対照の約０〜３５％まで、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激を有意に阻害するであろう。反射率デンシトメトリーによって決定された、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についての用量反応曲線を準備することができ、関心対象の抗体についてのＩＣ５０を算出することができる。一態様では、レセプターＨＥＲのリガンド活性化を遮断する抗体は、このアッセイにおいて約５０nM以下の、より好ましくは約１０nM以下の、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についてのＩＣ５０を有するであろう。抗体が、Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントである場合、このアッセイにおける、ＨＲＧによるｐ１８０チロシンリン酸化刺激の阻害についてのＩＣ５０は、例えば約１００nM以下、より好ましくは５０nM以下でありうる。
【０２５１】
例えば、本質的にSchaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞に及ぼす抗体の成長阻害効果を評定することもできる。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞を、ＨＥＲ２モノクローナル抗体（１０μg/mL）で４日間処理して、クリスタルバイオレットで染色することができる。ＨＥＲ２抗体とのインキュベーションにより、モノクローナル抗体２Ｃ４によって示される効果に類似した、本細胞系に及ぼす成長阻害効果が示されうる。さらなる態様では、外因性ＨＲＧはこの阻害を有意に逆転しないであろう。好ましくは、この抗体は、外因性ＨＲＧの存在下および不在下の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも高い程度（および場合によりモノクローナル抗体７Ｆ３よりも高い程度）、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を阻害することができるであろう。
【０２５２】
一態様では、関心対象のＨＥＲ２抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的に効果的に、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも実質的に効果的に、ＷＯ０１／００２４５に記載されたような共免疫沈降実験で決定されたように、ＭＣＦ７細胞およびＳＫ-ＢＲ-３細胞の両方においてＨＥＲ２とＨＥＲ３とのヘレグリン依存性会合を遮断することができる。
【０２５３】
増殖阻害ＨＥＲ２抗体を同定するために、ＨＥＲ２を過剰発現するガン細胞の成長を阻害する抗体についてスクリーニングすることができる。一態様では、えり抜きの成長阻害抗体は、細胞培養において約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０〜１００％だけ、好ましくは約５０〜１００％だけＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を阻害することができる。当該抗体を同定するために、米国特許第５，６７７，１７１号に記載されているＳＫ−ＢＲ−３アッセイを行うことができる。このアッセイによると、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、１０％ウシ胎仔血清、グルタミン、およびペニシリン、ストレプトマイシンを補充したＦ１２とＤＭＥＭ培地との１：１混合物中で成長させる。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、３５mmの細胞培養皿に細胞２００００個で（２ml／３５mmの皿）で蒔く。皿１枚あたり０．５から３０μg/mlのＨＥＲ２抗体を添加する。６日後に、未処理の細胞と比較した細胞数を、電子ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）細胞計数機を用いて計数する。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の成長を約２０〜１００％または約５０〜１００％だけ阻害する抗体を、成長阻害抗体として選択することができる。４Ｄ５および３Ｅ８などの成長阻害抗体についてスクリーニングするアッセイに関しては、米国特許第５，６７７，１７１号を参照されたい。
【０２５４】
アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体を選択するために、ＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合アッセイを利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養して、前項に論じたように皿に接種する。次に、培地を取り除き、新鮮培地培地単独または１０μg/mlのモノクローナル抗体を含有する培地に交換する。３日間のインキュベーション期間の後に、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により剥離する。次に、細胞を遠心分離して、Ｃａ２＋結合バッファーに再懸濁して、細胞死アッセイについて上に論じたように試験管に分取する。次に、試験管にラベル化アネキシン（例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ）（１μg/ml）を入れる。ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）フローサイトメータおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を使用して試料を分析できる。対照に比べて統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体を、アポトーシス誘導抗体として選択する。アネキシン結合アッセイに追加して、ＢＴ４７４細胞を用いたＤＮＡ染色アッセイを利用できる。このアッセイを行うために、前の二項に記載したように関心対象の抗体で処理したＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μg/mlのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２（商標）と共にインキュベーションし、次に、ＭＯＤＦＩＴＬＴ（商標）ソフトウェア（Verity Software House）を用いたＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ（商標）フローサイトメータ（Coulter Corporation）で分析する。本アッセイを使用して、未処理細胞(１００％までのアポトーシス細胞)よりも２倍以上（好ましくは３倍以上）というアポトーシス細胞率の変化を誘導する抗体を、アポトーシス促進性抗体として選択することができる。７Ｃ２および７Ｆ３などの、アポトーシスを誘導するＨＥＲ２抗体についてスクリーニングするためのアッセイに関してはＷＯ９８／１７７９７を参照されたい。
【０２５５】
関心対象の抗体によって結合されるＨＥＲ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような日常的な交差遮断アッセイを実施して、その抗体が２Ｃ４またはパーツズマブなどの抗体がＨＥＲ２に結合するのを交差遮断するするかどうかを評定することができる。または、もしくは追加的に、当技術分野で公知の方法によって、エピトープマッピングを行うことができ、かつ／または抗体−ＨＥＲ２構造を研究して（Franklin et al., Cancer Cell 5:317-328 (2004)）ＨＥＲ２のどのドメイン（類）がその抗体によって結合されるかを知ることができる。
【０２５６】
（ｉｘ）免疫コンジュゲート
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素であって、そのフラグメントおよび／または変異体を含む）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲーションした抗体を含む免疫コンジュゲートにも関するものである。
【０２５７】
当該免疫コンジュゲートの発生に有用な化学療法剤は上に記載されている。抗体と、カリチェアミシン、メイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、およびトリコテン（trichothene）、およびＣＣ１０６５などの一つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも本明細書に考えられている。
【０２５８】
本発明の好ましい一態様では、抗体は、一つまたは複数のメイタンシン分子（例えば、抗体１分子あたり約１から約１０個のメイタンシン分子）とコンジュゲーションしている。メイタンシンを、例えばＭａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換でき、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元して改変抗体と反応させ（Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992)）、メイタンシノイド−抗体免疫コンジュゲートを発生させることができる。
【０２５９】
関心対象の別の免疫コンジュゲートは、一つまたは複数のカリチェアミシン分子とコンジュゲーションしているＨＥＲ２抗体を含む。カリチェアミシンファミリーの抗生物質は、サブピコモル濃度で、２本鎖ＤＮＡ切断を産生することができる。使用されうるカリチェアミシンの構造アナログには、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１（Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342(1993)およびLode et al., Cancer Research 58:2925-2928(1998)）があるが、それに限定されるわけではない。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７１４，５８６号；第５，７１２，３７４号；第５，２６４，５８６号；および第５，７７３，００１号も参照されたい。
【０２６０】
使用できる酵素活性毒素およびそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ-Ｓ）、momordica charantia阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびびトリコテセンがある。例えば、１９９３年１０月２８日に公表されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０２６１】
本発明は、抗体と核分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考えている。
【０２６２】
放射性コンジュゲーションしたＨＥＲ２抗体の産生に種々の放射性同位体を利用できる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体がある。
【０２６３】
抗体と細胞毒性薬とのコンジュゲートを、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジポイミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン（tolyene）−２，６−ジイソシアネートなど）、および二活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）のような多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されているように、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素１４ラベル１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲーションするための例示的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬物の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al.，Cancer Research 52:127-131 (1992)）を使用することができる。
【０２６４】
代替的には、ＨＥＲ２抗体および細胞毒性薬を含む融合タンパク質を、例えば組換え技法またはペプチド合成によって作成することができる。
【０２６５】
なお別の態様では、腫瘍の予備ターゲティングに利用するために、「レセプター」(ストレプトアビジンなど)に抗体をコンジュゲーションすることができ、ここで、抗体 -レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて除去（clearing）剤を使用して循環から未結合のコンジュゲートを除去し、次に、細胞毒性薬（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲーションしている「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０２６６】
（ｘ）その他の抗体改変
抗体のその他の改変が本明細書において考えられている。例えば、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの一つに抗体を連結することができる。例えばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル)に、またはマクロエマルションに、抗体を捕捉することもできる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【０２６７】
例えば、抗体の抗原依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を高めるように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが理想的でありうる。抗体のＦｃ部に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって、これを実現することができる。または、もしくは追加的に、Ｆｃ部にシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。このように発生したホモ二量体抗体は、改善したインターナリゼーション能ならびに／または増加した補体介在性細胞殺滅および抗体依存性細胞性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caronら、J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。増大した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Wolffら、Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているようにヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。または、二つのＦｃ部を有することによって、増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有しうる抗体を加工することができる。Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照されたい。
【０２６８】
ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）は、ヒトエフェクター細胞の存在下で改善したＡＤＣＣ機能を有する抗体を記載しており、ここで、その抗体はそのＦｃ部にアミノ酸置換を含む。好ましくは、改善したＡＤＣＣを有する抗体は、Ｆｃ部の位置２９８、３３３、および／または３３４に置換を含む。好ましくは、変更されたＦｃ部は、これらの位置の一つ、二つもしくは三つに置換を含むか、または、それからなるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ部である。
【０２６９】
変更されたＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を有する抗体は、ＷＯ９９／５１６４２、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、米国特許第６，２４２，１９５Ｂ１号、米国特許第６，５２８，６２４Ｂ１号および米国特許第６，５３８，１２４号（Idusogie et al.）に記載されている。この抗体は、そのＦｃ部のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３および／または３３４のうち一つまたは複数にアミノ酸置換を含む。
【０２７０】
抗体の血清中半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載されたように抗体（特に抗体フラグメント）にサルベージレセプター結合エピトープを組み込むことができる。本明細書に使用されるように、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ血清中半減期を増加させることを担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ部のエピトープを指す。そのＦｃ部に置換を有し、増大した血清中半減期を有する抗体は、ＷＯ００／４２０７２（Presta, L.）にも記載されている。
【０２７１】
三つ以上（好ましくは四つ）の機能性抗原結合部位を有する加工された抗体もまた考慮されている（米国特許出願ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１、Miller et al.）。
【０２７２】
本明細書に開示されたＨＥＲ２抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームを、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開されたＷＯ９７／３８７３１に記載されているように、当技術分野において公知の方法により調製する。循環時間が増大したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２７３】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって発生させることができる。所定の孔径のフィルターを通過させてリポソームを押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。Martin et al. J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介して、本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントをリポソームにコンジュゲーションすることができる。場合により、化学療法剤がリポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)を参照されたい。
【０２７４】
（ｉｘ）抗体の例
本発明により処方できる抗体の例には以下のものがあるが、それに限定されるわけではない：
抗ＥｒｂＢ抗体、本明細書にさらに詳細に記載された抗体などの抗ＨＥＲ２抗体を含む；
Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））およびヒト化２Ｈ７）、ＣＤ２２、ＣＤ４０またはＢＲ３など；
ＩｇＥに結合する抗体、ジェネンテックから市販されているオマリズマブ（XOLAIR（登録商標））、Ｅ２６（本明細書の図１７Ａ〜Ｂ）、ＨＡＥ１（本明細書の図１７Ａ〜Ｂ）、Ｆｃ部の位置２６５にアミノ酸置換を有する抗ＩｇＥ抗体（ＵＳ２００４／０１９１２４４Ａ１）、Ｈｕ−９０１（本明細書の図１７Ａ〜Ｂ）、ＷＯ２００４／０７００１１におけるような抗ＩｇＥ抗体、またはこれら抗ＩｇＥ抗体のうち任意のものの可変ドメインを含む抗体（抗体フラグメントおよび全長抗体を含む）。Prestaら、J. Immunol. 151:2623-2632 (1993)；国際公開ＷＯ９５／１９１８１；１９９８年２月３日に発行された米国特許第５，７１４，３３８号；１９９２年２月２５日に発行された米国特許第５，０９１，３１３号；１９９３年３月４日に公開されたＷＯ９３／０４１７３；１９９９年１月１４日に公開されたＷＯ９９／０１５５６；および米国特許第５，７１４，３３８号も参照されたい；
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）またはそのレセプターに結合する抗体、ジェネンテックから市販されているベバシズマブ（AVASTIN（商標））およびラニビズマブ（LUCENTIS（商標））を含む；
抗ＩＬ−８抗体（St John et al., Chest, 103:932 (1993)および国際公開ＷＯ９５／２３８６５）；
抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ０１／４０３０９）；
抗ＣＤ４０抗体、Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変異体を含む（ＷＯ００／７５３４８）；
抗ＣＤ１１ａ抗体、エファリズマブ（RAPTIVA（登録商標））を含む（米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ９８／２３７６１、Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991)、およびHourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)）；
抗ＣＤ１８抗体（１９９７年４月２２日に発行された米国特許第５，６２２，７００号または１９９７年７月３１日に公開されたＷＯ９７／２６９１２の通り）；
抗Ａｐｏ−２レセプター抗体（１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ９８／５１７９３）；
抗ＴＮＦ−α抗体、ｃＡ２（REMICADE（登録商標））、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５を含む（１９９７年９月３０日に発行された米国特許第５，６７２，３４７号、Lorenz et al. J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)、およびDhainaut et al. Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995)参照）；
抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日に付与された欧州特許第０４２０９３７Ｂ１）；
抗ヒトα４β７インテグリン（１９９８年２月１９日に公開されたＷＯ９８／０６２４８）；
抗ＥＧＦＲ抗体、１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０２１０におけるようなキメラ化またはヒト化２２５抗体を含む；
抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３など（１９８５年５月７日に発行された米国特許第４，５１５，８９３号）；
抗ＣＤ２５抗体または抗ｔａｃ抗体、ＣＨＩ−６２１（SIMULECT（登録商標））および（ZENAPAX（登録商標））など（１９９７年１２月２日に発行された米国特許第５，６９３，７６２号参照）；
抗ＣＤ４抗体、ｃＭ−７４１２抗体など（Choy et al. Arthritis Rheum 39(1):52-56 (1996)）；
抗ＣＤ５２抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈなど（Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988)）; 
抗Ｆｃレセプター抗体、Grazianoら、J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)におけるようなＦｃγＲＩに対するＭ２２抗体など；
抗ガン胎児抗原（ＣＥＡ）抗体、ｈＭＮ−１４など（Sharkey et al. Cancer Res. 55(23 Suppl): 5935s-5945s (1995);
ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ３およびＣＨＬ６を含めた乳房上皮細胞に対する抗体（Ceriani et al. Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995)；およびRichman et al. Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)）；
Ｃ２４２などの結腸ガン細胞に結合する抗体（Litton et al. Eur J. Immunol. 26(1）: 1-9 (1996)）；
抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ１３／５（Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)）；
抗ＣＤ３３抗体、Ｈｕ  Ｍ１９５など（Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)およびＣＭＡ−６７６またはＣＤＰ７７１）；
抗ＣＤ２２抗体、ＬＬ２またはLymphoCideなど（Juweid et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)；
抗ＥｐＣＡＭ抗体、１７−１Ａ（PANOREX（登録商標））など；
抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、アブシキシマブすなわちｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（REOPRO（登録商標））など；
抗ＲＳＶ抗体、ＭＥＤＩ−４９３（SYNAGIS（登録商標））など；
抗ＣＭＶ抗体、ＰＲＯＴＯＶＩＲ（登録商標）など；
抗ＨＩＶ抗体、ＰＲＯ５４２など；
抗肝炎抗体、抗Ｈｅｐ  Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（登録商標）など；
抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；
抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；
抗αｖβ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標）；
抗ヒト腎細胞ガン抗体、ｃｈ−Ｇ２５０、ＩＮＧ−１など；
抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；
抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体（Ａ３３）；
ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；
抗ヒト扁平上皮細胞ガン（ＳＦ−２５）；ならびに
抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、Ｓｍａｒｔ  ＩＤ１０および抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）など。
【０２７５】
（ｘｉ）抗体変異体組成物
本発明は、少なくとも一局面では、主要種抗体とその一つまたは複数の変異体との混合物を含む組成物を含む製剤に関するものである。その主要種抗体がＨＥＲ２と結合する場合、好ましくはそのＨＥＲ２抗体（主要種ＨＥＲ２抗体およびその抗体変異体の一方または両方）は、ＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害し、かつ／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体である。その主要種抗体の本明細書における好ましい態様は、配列番号３および４の可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１５および２３より選択される軽鎖アミノ酸配列と、配列番号１６および２４より選択される重鎖アミノ酸配列とを含む抗体である。
【０２７６】
一態様において、処方されたＨＥＲ２抗体組成物は、主要種ＨＥＲ２抗体と、アミノ末端リーダー伸長部を含むそのアミノ酸配列変異体との混合物を含む。好ましくは、そのアミノ末端リーダー伸長部は、抗体変異体の軽鎖上（例えば、その抗体変異体の一つまたは二つの軽鎖上）に存在する。主要種ＨＥＲ２抗体または抗体変異体は、全長抗体または抗体フラグメントでありうる（例えばＦ（ａｂ’）２フラグメントのＦａｂ）が、好ましくは両方が全長抗体である。本明細書における抗体変異体は、その重鎖または軽鎖の任意の一つまたは複数にアミノ末端リーダー伸長部を含むことがある。好ましくは、そのアミノ末端リーダー伸長部は、その抗体の一つまたは二つの軽鎖上に存在する。そのアミノ末端リーダー伸長部は、好ましくはＶＨＳ−を含むか、またはそれからなる。その組成物中にアミノ末端リーダー伸長部が存在することを、Ｎ−末端配列分析、電荷の不均一性についてのアッセイ（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動）、質量分析などを非限定的に含めた様々な分析技法により検出することができる。組成物中の抗体変異体の量は、一般にその変異体を検出するために使用される任意のアッセイ（好ましくはＮ−末端配列分析）の検出限界を構成する量から、主要種抗体の量未満の量までの範囲である。一般に、組成物中の抗体分子の約２０％以下（例えば、約１％から約１５％、例えば５％から約１５％）は、アミノ末端リーダー伸長部を含む。そのようなパーセント量は、好ましくは定量Ｎ−末端配列分析または陽イオン交換分析を用いて（好ましくはPROPAC WCX-10（商標）陽イオン交換カラムなどの高分解能弱陽イオン交換カラムを用いて）決定される。アミノ末端リーダー伸長部変異体とは別に、一方または両方の重鎖上にＣ末端リシン残基を含む抗体、脱アミド抗体変異体などを非限定的に含めた、主要種抗体および／または変異体のさらなるアミノ酸配列変更が考えられている。
【０２７７】
さらに、主要種抗体または変異体は、さらにグリコシル化変異を含むことがあり、その非限定的な例には、Ｆｃ部に付着したＧ１またはＧ２オリゴ糖構造を含むＨＥＲ２抗体、軽鎖に付着した糖質部分（例えば、抗体の一つまたは二つの軽鎖に付着した一つまたは二つの糖質部分）を含むＨＥＲ２抗体、非グリコシル化重鎖を含むＨＥＲ２抗体がある。
【０２７８】
ＩＩＩ．製剤の調製
本発明は、第１の局面では、ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５、好ましくはｐＨ５．８から６．２）中にモノクローナル抗体、好ましくは全長ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体を含む安定な薬学的製剤を提供する。しかし、その製剤中の抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの、抗原結合領域を含む抗体フラグメントでありうる。
【０２７９】
別の態様では、本発明は、約１０mg/mLから約２５０mg/mLの量で脱アミドまたは凝集に感受性の全長ＩｇＧ１抗体；ヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）；約６０mMから約２５０mMの量のトレハロースおよびスクロースからなる群より選択される糖類；ならびに約０．０１％から約０．１％の量のポリソルベート２０を含むか、または本質的にそれからなる薬学的製剤に関するものである。
【０２８０】
なおさらなる態様では、本発明は、ｐＨ約５．５から約６．５のヒスチジン緩衝液中でＨＥＲ２のドメインＩＩに結合する抗体、糖類、および界面活性剤を含む薬学的製剤を提供する。例えば、その製剤は、約２０mg/mLから約４０mg/mLの量のパーツズマブ、ヒスチジン−酢酸緩衝液、スクロース、およびポリソルベート２０を含みうるものであり、ここで、この製剤のｐＨは約５．５から約６．５である。
【０２８１】
別の局面では、本発明は、ｐＨ約５．５から約６．５のヒスチジン緩衝液中のＤＲ５抗体、糖類、および界面活性剤を含む薬学的製剤を提供する。当該製剤は、例えば、約１０mg/mLから約３０mg/mLの量のＡｐｏｍａｂ、ヒスチジン−酢酸緩衝液、トレハロース、ぉよびポリソルベート２０を含みうるものであり、ここで、この製剤のｐＨは約５．５から約６．５である。
【０２８２】
この製剤は、緩衝液がその製剤中に処方された抗体の脱アミドおよび／または凝集および／またはフラグメント化を遅延させる点で、脱アミドおよび／または凝集および／またはフラグメント化に感受性の抗体に特に有用である。さらに、ＨＣｌを用いて調製された他のヒスチジン緩衝液とは異なり、このヒスチジン−酢酸緩衝液は塩化物イオンを欠如しており、このことは、この緩衝液を糖類と組合せたときポリソルベート２０と同じ保護効果を抗体に有し、安定で、ステンレススチールタンク中での保存に適合性であったという点で有益であることが本明細書において見出された。このように、脱アミド、凝集および／またはフラグメント化に感受性の抗体を含む製剤自体に加えて、本発明は、治療用モノクローナル抗体の脱アミド、凝集および／またはフラグメント化を（例えば異なるｐＨまたは異なる緩衝液中の組成物に比べて）低減するための方法を提供し、その方法はヒスチジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５から６．５）中でその抗体を処方することを含む。この態様では、その抗体が処方される前後に、脱アミド、凝集および／またはフラグメント化を決定または測定することができ、処方された抗体は、その製剤中およびその製剤の保存時に許容できる脱アミド、凝集および／またはフラグメント化を示す。
【０２８３】
その製剤中の抗体は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、ＩｇＥ、ＤＲ５、ＢＲ３およびＶＥＧＦを含むが、それに限定されるわけではない抗原と結合しうる。
【０２８４】
処方された抗体がＨＥＲ２と結合する場合、好ましくはその抗体はＨＥＲ２のドメインＩＩに結合し、トラスツズマブよりも効果的にＨＥＲの二量体化を阻害し、かつ／またはＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する抗体である。処方されたＨＥＲ２抗体の本明細書における好ましい態様は、配列番号３および４における可変軽鎖および可変重鎖アミノ酸配列を含む抗体であり、最も好ましくは配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む抗体（パーツズマブ）である。
【０２８５】
本明細書において処方されうるＣＤ２０抗体の例には、ジェネンテックから市販されている現在「リツキシマブ」（「RITUXAN（登録商標）」）と呼ばれる「Ｃ２Ｂ８」（参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，７３６，１３７号も参照されたい）；Ｂｉｏｇｅｎ−Ｉｄｅｃから市販されている「Ｙ２Ｂ８」または「イブリツモマブチウキセタン」であるＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）と呼ばれるイットリウム−９０ラベル２Ｂ８マウス抗体（参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，７３６，１３７号も参照）；場合により１３１Ｉでラベルされて「１３１Ｉ−Ｂ１」抗体（ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、BEXXAR（商標））を発生する「トシツモマブ」とも呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」（参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，５９５，７２１号）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」（Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)および「フレームワークが継ぎ合わされた」１Ｆ５またはヒト化１Ｆ５を含めたその変異体（ＷＯ０３／００２６０７、Leung, S.）；ＡＴＣＣ寄託ＨＢ−９６４５０）；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体（Clark et al. PNAS 82: 1766-1770 (1985)；参照により本明細書に特に組み入れられる米国特許第５，５００，３６２号）；ヒト化２Ｈ７；ｈｕＭａｘ−ＣＤ２０（ＷＯ０４／０３５６０７、Genmab, Denmark）；ＡＭＥ−１３３（Applied Molecular Evolution）；キメラまたはヒト化Ａ２０抗体（それぞれｃＡ２０、ｈＡ２０）などのＡ２０抗体またはその変異体（ＵＳ２００３／０２１９４３３、Immunomedics）；およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐから入手できるモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−ＣｌまたはＮＵ−Ｂ２（Valentine et al., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)）がある。
【０２８６】
処方されたＣＤ２０抗体の好ましい態様では、そのＣＤ２０抗体はヒト化２Ｈ７抗体である。本明細書における好ましいヒト化２Ｈ７抗体は、２Ｈ７ｖ１６および２Ｈ７ｖ５１１である。ヒト化２Ｈ７ｖ１６は、インタクトな抗体、または図１８Ａ〜Ｂの可変軽鎖および可変重鎖配列（配列番号２６および２９）を含む抗体フラグメントでありうる。そのヒト化２Ｈ７ｖ１６抗体が全長抗体の場合、その抗体は好ましくは配列番号６３および６５を有する軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む。
【０２８７】
その抗体がＶＥＧＦと結合する場合、その抗体は好ましくは図１９に示されるような可変ドメイン配列を含む。最も好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ジェネンテックから市販されている全長ヒト化ＩｇＧ１抗体、ベバシズマブ（AVASTIN（商標））である。
【０２８８】
処方された抗体がＩｇＥと結合する場合、その抗体は、好ましくはＥ２５、すなわちジェネンテックから市販されているオマリズマブ（XOLAIR（登録商標））（図１７Ａ〜Ｂも参照）、Ｅ２６（本明細書における図１７Ａ〜Ｂ）、ＨＡＥ１（本明細書における図１７Ａ〜Ｂ）、Ｆｃ部の位置２６５にアミノ酸置換を有するＩｇＥ抗体（ＵＳ２００４／０１９１２４４Ａ１）、Ｈｕ−９０１（本明細書における図１７Ａ〜Ｂ）、ＷＯ２００４／００７００１１におけるような抗ＩｇＥ抗体、またはこれらの抗ＩｇＥ抗体のうち任意のものの可変ドメインを含む抗体（抗体フラグメントおよび全長抗体を含む）からなる群より選択される。
【０２８９】
その抗体が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのレセプターまたはデスレセプターに結合する場合、その抗体は好ましくはＤＲ５に結合し、好ましくはアゴニスト抗体である。この分野における刊行物には、Sheridanら、Science, 277:818-821 (1997)、Panら、Science, 277:815-818 (1997)、１９９８年１１月１９日に公開されたＷＯ９８／５１７９３；１９９８年９月２４日に公開されたＷＯ９８／４１６２９；Screatonら、Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczakら、EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wuら、Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日に公開されたＷＯ９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日に公開されたＥＰ８７０，８２７；１９９８年１０月２２日に公開されたＷＯ９８／４６６４３；１９９９年１月２１日に公開されたＷＯ９９／０２６５３；１９９９年２月２５日に公開されたＷＯ９９／０９１６５；１９９９年３月１１日に公開されたＷＯ９９／１１７９１；２００２年８月１３日に公開されたＵＳ２００２／００７２０９１；２００１年１２月７日に公開されたＵＳ２００２／００９８５５０；２００１年１２月６日に発行されたＵＳ６，３１３，２６９；２００１年８月２日に公開されたＵＳ２００１／００１０９２４；２００３年７月３日に公開されたＵＳ２００３／０１２５５５４０；２００２年１０月３１日に公開されたＵＳ２００２／０１６０４４６；２００２年４月２５日に公開されたＵＳ２００２／００４８７８５；２００２年２月に発行されたＵＳ６，３４２，３６９；２００３年５月２７日に発行されたＵＳ６，５６９，６４２；２０００年６月６日に発行されたＵＳ６，０７２，０４７；２００３年１１月４日に発行されたＵＳ６，６４２，３５８；２００４年６月１日に発行されたＵＳ６，７４３，６２５がある。最も好ましいＤＲ５抗体はＡｐｏｍａｂである。
【０２９０】
上に言及された製剤のそれぞれは、ｐＨ５．５から６．５、好ましくは５．８から６．２、例えば約６．０を有する緩衝液、好ましくはヒスチジン緩衝液、最も好ましくはヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。その緩衝液の濃度は、少なくとも部分的には所望のｐＨによって指示される。その緩衝液についての濃度の例は、約１mMから約２００mM、好ましくは約１０mMから約４０mM、最も好ましくは約２０mMの範囲にある。
【０２９１】
その製剤中の抗体濃度は、好ましくは約１０mg/mLから約２５０mg/mLの範囲にある。その抗体濃度は、意図された使用およびその製剤の投与様式に基づき決定されうる。例えば、その製剤がＩＶ投与用（例えば、ＨＥＲ２抗体）である場合、その製剤中の抗体濃度は、好ましくは約２０mg/mLから約４０mg/mLである。静脈内（ＩＶ）投与を意図されたパーツズマブ製剤の例では、その抗体濃度は、約２０mg/mLから約４０mg/mL、最も好ましくは約３０mg/mLであった。
【０２９２】
その抗体がＳＱまたはＩＭ投与用の場合（例えば、抗ＩｇＥ抗体について）、高濃度の抗体が望まれることがある。そのような実質的な高抗体濃度は、約５０mg/mLから約２５０mg/mL、または約８０mg/mLから約２５０mg/mL、または約１００mg/mLから約２００mg/mLでありうる。
【０２９３】
その製剤がＡｐｏｍａｂなどのＤＲ５抗体を含む場合、抗体濃度の例は約１０mg/mLから約３０mg/mL、例えば約２０mg/mLのDR5抗体であり、当該製剤は静脈内投与に有用である。
【０２９４】
投与用の製剤は、好ましくは（凍結乾燥されていない）水性製剤であり、以前に凍結乾燥に供されていない。その製剤は凍結乾燥されうるが、好ましくは凍結乾燥されない。しかし、凍結乾燥中に起こる同時乾燥を行わずに、例えばステンレススチールタンク中で水性製剤を凍結することは、本明細書に具体的に考えられており、その製剤の長期保存を促進する。
【０２９５】
その製剤は、好ましくは糖類、最も好ましくはトレハロースまたはスクロースなどの二糖類をさらに含む。その糖類は、一般に凍結／解凍時に起こるような可溶性凝集物の形成を低減する量で一般に含まれる。糖類濃度の例は、約１０mMから約１M、例えば約６０mMから約２５０mMの範囲であり、最も好ましくはＨＥＲ２抗体製剤について約１２０mMおよびＤＲ５抗体製剤について約２４０mMである。
【０２９６】
本明細書において、ヒスチジン−酢酸緩衝液および糖類を含む製剤が安定であったことが見出されたが、その製剤は場合によりポリソルベート、最も好ましくはポリソルベート２０などの界面活性剤をさらに含む。その界面活性剤は、一般に（振盪または輸送時に生じる凝集物のような）不溶性凝集物の形成を低減する量で含まれる。界面活性剤濃度は、好ましくは約０．０００１％から約１．０％、最も好ましくは約０．０１％から約０．１％、例えば約０．０２％である。
【０２９７】
場合により、その製剤は塩化ナトリウムなどの張度を上げる量（tonicifying amount）の塩を含有しない。
【０２９８】
その製剤は、一般に無菌であり、これは、製剤の調製前または調製後に無菌濾過膜を通過させる濾過を含めた、ヒト対象に投与するのに適した無菌薬学的製剤を作製するための当業者に公知の手順により実現することができる。
【０２９９】
さらに、その製剤は、望ましくは保存時に安定であることが実証された製剤である。様々な安定性アッセイが、その製剤の安定性を確認するために当業者に利用できる。例えば、その製剤は、約４０℃で少なくとも４週間、約５℃または約１５℃で少なくとも３か月間または少なくとも１年間、および／または約−２０℃で少なくとも３か月間保存したときに安定であると見出されている製剤でありうる。処方した時点周辺で、および示された温度での保存後に、製剤中の抗体の物理的安定性、化学的安定性、および／または生物学的活性を評価することによって安定性を検査できる。物理的および／または安定性を、（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、濁度を測定することにより、および／または肉眼検査により）凝集物の形成を評価すること；陽イオン交換クロマトグラフィーまたはキャピラリーゾーン電気泳動を用いて電荷の不均一性を評定することにより;アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分析；還元された抗体とインタクトな抗体を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えばトリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物学的活性または抗原結合機能を評価することなどを含めた様々な異なる方法で定性的および／または定量的に評価することができる。不安定性の結果として、凝集、脱アミド（例えばＡｓｎ脱アミド）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えばＡｓｐ異性化）、クリッピング／加水分解／フラグメンテーション（例えばヒンジ部フラグメンテーション）、スクシンイミド形成、不対システイン、Ｎ−末端伸長、Ｃ−末端プロセシング、グリコシル化の差などが生じうる。生物学的活性または抗原結合機能を、当業者が利用できる様々な技法を用いて評価することができる。
【０３００】
上に示されたように、その製剤の凍結は本明細書に具体的に考えられている。よって、凍結時及び解凍時の安定性についてその製剤を検査することができる。
【０３０１】
したがって、本発明は、薬学的製剤を製造する方法も提供し、その方法は、本明細書に記載された製剤を調製する段階、およびその製剤中のモノクローナル抗体の物理的安定性、化学的安定性、または生物学的活性を評価する段階を含む。
【０３０２】
好ましい態様において、その製剤は注射器で刺通することができる栓を有するバイアル内部に、好ましくは水性形態で提供される。そのバイアルは、それを必要とする対象に投与されるまで約２〜８℃で望ましくは保存される。そのバイアルは、例えば２０ccバイアル（例えば４２０mg用量用）または５０ccバイアル（例えば１０５０mg用量用）でありうる。ＡｐｏｍａｂなどのＤＲ５抗体について、その製剤は５ccガラスバイアル（例えば満量５．５ml）中に提供されうる。
【０３０３】
別の態様では、その製剤はステンレススチールタンク中に提供される。ステンレススチールタンク中のその製剤は、場合により凍結されて、凍結乾燥されない。
【０３０４】
Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されているもののような、その製剤の所望の特徴に不利に影響しない一つまたは複数の他の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤が、提供された製剤中に含まれることがある。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、採用された投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、それらには、追加の緩衝剤、共溶媒、アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ポリエステルなどの生物分解性ポリマー、保存料、および／またはナトリウムなどの塩形成対イオンが含まれる。
【０３０５】
ＩＶ．抗体製剤を用いた処置
一態様において、本発明は対象における疾患または障害を処置する方法を提供し、その方法は、本明細書に記載された製剤を、その疾患または障害を処置するのに有効な量で対象に投与することを含む。
【０３０６】
その製剤中の抗体がＨＥＲ２に結合する場合、その製剤は好ましくはガンを処置するために使用される。そのガンは一般にＨＥＲ２発現細胞を含むであろう。その結果、本明細書におけるＨＥＲ２抗体はそのガン細胞に結合できる。このように、本態様における本発明は、対象におけるＨＥＲ２発現ガンを処置するための方法に関するものであり、その方法は、ＨＥＲ２抗体の薬学的製剤を、そのガンを処置するのに有効な量でその対象に投与することを含む。その組成物を用いて処置できる様々なガンが、上記定義の節に挙げられている。
【０３０７】
ＨＥＲ２抗体製剤を使用して、以下を含めた様々な非悪性疾患または障害を処置することができることも考えられている；自己免疫疾患（例えば乾癬）；子宮内膜症；強皮症；再狭窄；結腸ポリープ、鼻ポリープまたは胃腸管ポリープなどのポリープ；線維腺腫；呼吸器疾患（上記定義参照）；胆嚢炎；神経線維腫症；多発性嚢胞腎；炎症性疾患；乾癬および皮膚炎を含む皮膚障害；血管疾患（上記定義参照）；血管上皮細胞の異常増殖を伴う状態；胃腸潰瘍；メネトリエー病、分泌性腺腫またはタンパク喪失症候群；腎障害；血管形成障害；加齢黄斑変性、推定眼ヒストプラスマ症候群、増殖糖尿病網膜症による網膜血管新生、網膜血管形成、糖尿病性網膜症、または加齢黄斑変性などの眼疾患；骨関節炎、くる病および骨粗しょう症などの骨関連病態；脳虚血イベント後の損傷；肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、甲状腺炎、全身性過粘稠度症候群、オースラーウェーバー−ランデュ病、慢性閉塞性肺疾患、または熱傷、外傷、放射線、脳卒中、酸素欠乏症もしくは虚血後の浮腫などの線維疾患または浮腫疾患；皮膚過敏反応；糖尿病性網膜症および糖尿病性ネフロパシー；ギラン−バレー症候群；移植片対宿主疾患または移植拒絶反応；ページェット病；骨または関節の炎症；光老化（例えばヒト皮膚のＵＶ照射により起こる）；良性前立腺肥大；アデノウイルス、ハンタウイルス、Borrelia burgdorferi、Yersinia spp.およびBordetella pertussisから選択される微生物病原体を含めた、ある種の微生物感染；血小板凝集により起こる血栓；子宮内膜症、卵巣過剰刺激症候群、子癇前症、機能不全性子宮出血、または機能性子宮出血などの生殖器の状態；滑膜炎；アテローム；急性および慢性ネフロパシー（増殖性糸球体腎炎および糖尿病誘導腎疾患を含む）；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性ショックおよび真菌感染；家族性腺腫ポリポーシス；神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、エイズ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症および小脳変性）；骨髄異形成症候群；再生不良性貧血；虚血傷害；肺、腎臓または肝臓の線維症；Ｔ細胞媒介過敏性疾患；乳児肥大型幽門狭窄症；尿管閉塞症候群；乾癬性関節炎；ならびに橋本甲状腺炎など。本明細書における治療のための好ましい非悪性適応には、乾癬、子宮内膜症、強皮症、血管疾患（例えば、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、もしくは高血圧症）、結腸ポリープ、線維腺腫、または呼吸器疾患（例えば、喘息、慢性気管支炎、気管支拡張、もしくは嚢胞性線維症）がある。
【０３０８】
製剤中の抗体がＣＤ２０またはＢＲ３などのＢ細胞表面マーカーに結合する場合、その製剤を使用して、ＮＨＬもしくはＣＬＬ、自己免疫疾患、移植片拒絶などのＢ細胞悪性腫瘍を処置するか、または抗体、毒素、遺伝子治療用ウイルスベクター、移植片、感染因子、もしくはアロ抗原などの外来抗原に対する免疫応答を遮断することができる（ＷＯ０１／０３７３４、Grillo-Lopez et al.参照）。
【０３０９】
その製剤中の抗体がＩｇＥ抗体である場合、その製剤を使用して、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性胃腸障害、過敏症、湿疹、蕁麻疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫症、高ＩｇＥ症候群、毛細血管拡張性運動失調、ウィスコット−アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫、および移植片対宿主反応などのＩｇＥ介在性障害（ＵＳＳＮ２００４／０１９７３２４Ａ１、Liu and Shire）を処置することができる。
【０３１０】
ＴＮＦスーパーファミリーのレセプターに結合する抗体（例えば、ＤＲ５に結合する抗体）またはＶＥＧＦ（もしくはそのレセプター）に結合する抗体を使用して、ガンを処置することができ、その様々の形態が上記定義の節に記載されている。好ましくは、ＤＲ５抗体製剤を用いて処置されるガンは、固形腫瘍またはＮＨＬである。
【０３１１】
その適応がガンである場合、その患者を抗体製剤と化学療法剤との組合せで処置することができる。組合せ投与には、別々の製剤または単一の薬学的製剤を用いた同時投与または併行投与、およびいずれかの順序の連続投与があり、ここで、好ましくは両方の（または全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。このように、その組成物の投与前または投与後に化学療法剤を投与することができる。本態様では、化学療法剤の少なくとも１回の投与と、その組成物の少なくとも１回の投与との間のタイミングは、好ましくは約１か月以下であり、最も好ましくは約２週間以下である。代替的には、化学療法剤およびその組成物は、単一の製剤または別々の製剤の形で患者に同時投与される。
【０３１２】
その製剤を用いた処置の結果として、ガンまたは疾患の徴候または症状に改善が生じるであろう。例えば、処置される疾患がガンである場合、そのような治療の結果として、生存率（全生存率および／もしくは進行のない生存率）の改善を生じることができ、かつ／または客観的臨床（部分もしくは完全）反応を生じることができる。さらに、化学療法剤および抗体製剤の組合せを用いた処置により、患者に対して相乗的な、または相加的よりも大きい治療上の利益が生じうる。
【０３１３】
好ましくは、投与される製剤中の抗体はネイキッドな抗体である。しかし、投与される抗体を、細胞毒性薬とコンジュゲーションすることができる。好ましくは、その抗体が結合している免疫コンジュゲートおよび／または抗原は、細胞によってインターナリゼーションされる結果、それが結合するガン細胞の殺滅に果たす免疫コンジュゲートの治療有効性の増大を生じる。好ましい態様では、細胞毒性薬はガン細胞中の核酸をターゲティングまたは妨害する。当該細胞毒性薬の例には、メイタンシノイド、カリチェアミシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼがある。
【０３１４】
その製剤は、例えばボーラスとしての、もしくはある時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、鞘内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法により、ヒト患者に投与される。抗体組成物の静脈内、筋肉内または皮下投与が好ましく、静脈内投与が最も好ましい。
【０３１５】
皮下デリバリーのために、注射器、注射デバイス（例えばINJECT-EASE（商標）およびGENJECT（商標）デバイス）、ペン型注入器（GENPEN（商標）など）、針なしデバイス（例えばMEDIJECTOR（商標）およびBIOJECTOR（商標））、または皮下パッチデリバリーシステムを介してその製剤を投与することができる。
【０３１６】
疾患の予防または処置のために、抗体の適切な投薬量は、上に定義したような処置される疾患の種類、疾患の重症度および経過、予防目的、それとも治療目的でその抗体が投与されるか、以前の治療、患者の臨床歴およびその抗体に対する反応、ならびに担当の医師の判断力に依存するであろう。その抗体は一度にまたは一連の処置にわたり患者に適切に投与される。例えば、１回または複数回の別個の投与によるものであろうと、連続注入によるものであろうと、疾患の種類および重症度に応じて約１μg/kgから５０mg/kg（例えば０．１〜２０mg/kg）のＨＥＲ２抗体またはＤＲ５抗体が、患者に対する投与の候補となる初期投薬量である。その抗体の投薬量は、一般に約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲であろう。化学療法剤が投与されるならば、その化学療法剤は通常それに関して公知の投薬量で、または場合によりそれらの薬物の組合せ作用または化学療法剤の投与に起因しうる負の副作用が原因で低下された投薬量で投与される。当該化学療法剤の調製および投薬スケジュールを、製造業者の説明書通りに、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。当該化学療法の調製および投薬スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
【０３１７】
第２（第３、第４など）の化学療法剤（すなわち、異なる化学療法剤の「カクテル」）、別のモノクローナル抗体、成長阻害剤、細胞毒性薬、化学療法剤、ＥＧＦＲターゲット薬、チロシンキナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、および／またはサイトカインなどを非限定的に含めた他の治療方式をその抗体と組合せることができる。
【０３１８】
上記治療方式に加えて、ガン細胞の外科切除および／または放射線療法に患者を供することができる。
【０３１９】
Ｖ．製品
本発明の別の態様では、本発明の薬学的製剤を含有し、その使用説明書を提供する製品が提供される。その製品は容器を備える。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル（例えば２チャンバーバイアル）、注射器（２チャンバー注射器など）および試験管がある。その容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されうる。その容器はその製剤を収容し、その容器の上、またはその容器に付随するラベルは、使用方法を表示すことができる。その製剤を収容している容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば２〜６回の投与）を見込んだ多使用バイアルでありうる。その製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、および前節で言及したような使用説明書を有する添付文書を含めた、商業的観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含むことがある。
【０３２０】
以下の実施例を参照することにより、本発明はさらに完全に理解されるであろう。しかし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。全ての文献および特許の引用物は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３２１】
実施例
安定なパーツズマブ液体製剤
これらの実施例は、約１０mg/mL〜１８０mg/mLのタンパク質濃度範囲でパーツズマブを含む安定な液体製剤の開発および安定性検査について記載する。選択された製剤は低い濁度を有し、物理的および化学的に安定であった。腐食のリスクを減らすためにその製剤から塩化物イオンを除去した。その製剤は等張で、皮下または筋肉内デリバリーに適していた。撹拌ストレス時の不溶性凝集物の形成は、ポリソルベート２０を入れる必要なしにヒスチジン−酢酸およびスクロースの製剤を用いて防止された。
【０３２２】
分析法
色、外観および透明度（ＣＡＣ）
試料の色、外観、および透明度は、室温で蛍光灯下で白色および黒色背景に対してバイアルを肉眼検査することによって決定した。
【０３２３】
ＵＶ濃度測定
一定分量の液体製品を最初に製剤緩衝液で希釈して、２７８nm付近のＡｍａｘが０．５〜１．０吸光度単位に収まるようにした。光路長１cmの水晶セル中で、希釈した試料のＵＶ吸光度をＨＰ８４５３分光光度計で測定した。吸光度を２７８nmおよび３２０nmで測定した。３２０nmの吸光度を使用して、大きな凝集物、泡および粒子が原因のバックグラウンド光散乱を補正する。これらの測定値について製剤緩衝液をブランク試料として使用した。吸光率１．５０(mg/mL)-1cm-1を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０３２４】
ｐＨ測定
ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ  ＣＯＰＥＮＨＡＧＥＮ  ＰＨＭ８２（商標）ｐＨメータを用いて室温でｐＨを測定した。使用したプローブは、放射計コネクター（Sigma, Cat#E-5759）を有するガラス／参照複合電極であった。ｐＨメータのキャリブレーションにｐＨ４．０１およびｐＨ７．００の標準溶液（EM Science）を使用した。
【０３２５】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）
陽イオン交換クロマトグラフィーを採用して電荷変異体における変化を測定した。このアッセイは、ＨＰ１１００（商標）ＨＰＬＣシステムでＤＩＯＮＥＸ  ＰＲＯＰＡＣ  ＷＣＸ−１０（商標）カラムを利用する。ｐＨ６．０の２０mM  ＭＥＳを含有する移動相Ａで試料を１mg/mLに希釈した。次に、希釈された試料５０mLを、常温に保ったカラムにロードした。２０mM  MES、２５０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を含有する移動相Ｂを用いた緩いＮａＣｌ勾配でピークを溶出した。溶出液を２８０nmでモニターした。ＨＰ  ＣＨＥＭＳＴＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（Rev A08.03）を用いてデータを分析した。
【０３２６】
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの純度をＣＺＥによって決定した。このアッセイを、ＢＩＯＣＡＰ  ＸＬ（商標）キャピラリー、内径５０μm、全長４４．６cmおよび検出器まで４０cmのＢＩＯＲＡＤ  ＢＩＯＦＯＣＵＳ（商標）３０００（商標）キャピラリー電気泳動システムで行った。
【０３２７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除クロマトグラフィーを使用して凝集物およびフラグメントを定量した。このアッセイは、ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（商標）、７．８×３００mmカラムを利用し、ＨＰ１１００（商標）ＨＰＬＣシステムで行う。移動相で試料を１０mg/mLに希釈し、インジェクション容積は２０μLであった。その移動相は、ｐＨ６．８の１００mM  Ｋ２ＨＰＯ４であり、タンパク質を０．５mL/minのアイソクラチックな勾配で４５分間溶出した。溶出液の吸光度を２８０nmでモニターした。ＨＰ  ＣＨＥＭＳＴＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（Rev A08.03）を用いて積分を行った。
【０３２８】
生物学的活性
パーツズマブがヒト乳ガン細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩの増殖を阻害する能力を測定することによって、パーツズマブの生物学的活性を決定した。
【０３２９】
実施例１
パーツズマブのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを以下の緩衝液条件でタンパク質濃度１．０mg/mLで製剤した：
１０mMクエン酸、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；
１０mMコハク酸、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０；
１０mMコハク酸、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０；
１０mMヒスチジン、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０;および
１０mMグリシルグリシン、１４０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０。
【０３３０】
各製剤を濾過し、次に、ＴＥＦＬＯＮ（商標）でコーティングした灰色ブチル栓で密封された３cc ＷＨＥＡＴＯＮ（商標）ＵＳＰタイプＩガラスバイアルに一定分量ずつ入れた。試料を４０±２℃で保存した。薬物産物の安定性分析は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２がｐＨ５．０から６．０で最も安定であったことを示した。
【０３３１】
【表１１】
2014159469.tif 000012
【０３３２】
実施例２
パーツズマブを、１２０mMスクロースおよび０．０２％ポリソルベート２０を有する２０mMヒスチジン−酢酸緩衝液中で製剤した。酢酸を用いて５．０から７．０の間の最終ｐＨに製剤のｐＨを調整した。タンパク質濃度は３０mg/mLであった。各製剤を３ccＵＳＰタイプＩガラスバイアルに充填し、安定性分析のために４０℃で保存した。結果は、パーツズマブがｐＨ６．０付近で最も安定であったことを示した。
【０３３３】
【表１２】
2014159469.tif 000013
【０３３４】
実施例３
タンパク質濃度１００mg/mLのパーツズマブ製剤を以下の賦形剤中で調製した：
（１）１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、２４０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０；
（２）１０mMヒスチジン−酢酸、２４０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０；
（３）１０mMヒスチジン−リン酸、２４０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０；
（４）１０mMヒスチジン−硫酸、２４０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０。
【０３３５】
ＦＬＵＲＯＴＥＣ（商標）表面のブチルゴム栓で密封された３cc ＦＯＲＭＡ  ＶＩＴＲＵＭ（商標）ＵＳＰタイプＩガラスバイアルに各製剤を充填した。試料を３０℃および４０℃で保存し、質（ＣＡＣ）および純度（ＳＥＣ、ＩＥＣ）について安定性を評価した。安定性の結果は、４０℃で保存したときにヒスチジン−リン酸緩衝液中のパーツズマブが他のヒスチジン緩衝液よりもずっと急速に分解したことを示した（図８および図９）。
【０３３６】
実施例４
パーツズマブを、以下の緩衝液中で限外濾過／ダイアフィルトレーションにより様々な濃度に濃縮した：
（１）２０mMヒスチジン−酢酸、ｐＨ６．０；
（２）１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０、および
（３）１０mM ヒスチジン−硫酸、ｐＨ６．０．
【０３３７】
濾過前に各製剤の濁度を測定した。図１０に示すように、結果は、ヒスチジン−酢酸およびヒスチジン−ＨＣｌ中で処方されたパーツズマブ試料がヒスチジン−硫酸緩衝液よりも少ない量の不溶性凝集物を有したことを実証した。
【０３３８】
実施例５
パーツズマブを、２０mMヒスチジン−酢酸、１２０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中に３０mg/mLで処方した。パーツズマブを、３１６ＬおよびＨＡＳＴＥＬＬＯＹ（商標）のステンレススチールミニチュアタンクに充填した。全ての試料を−２０℃および５℃で保存し、質（ＣＡＣ）、純度（ＳＥＣ、ＩＥＣ）および強度（ＵＶ−Ｖｉｓ）について評価した。安定性分析は、パーツズマブが−２０℃および５℃で少なくとも３か月間保存時にこの製剤中で安定であったことを示した。無塩化物製剤は、３１６ＬおよびＨＡＳＴＥＬＬＯＹ（商標）のステンレススチールタンクと適合性である。
【０３３９】
【表１３】
2014159469.tif 000014
【０３４０】
実施例６
パーツズマブをタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を用いて処方した。最終製剤は、タンパク質濃度３０mg/mLで２０mMヒスチジン−酢酸、１２０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）を含有する。試料を、２０mm  ＦＬＵＲＯＴＥＣ（商標）表面のブチルゴム栓でキャップした２０Ｍｌ  ＦＯＲＭＡ  ＶＩＴＲＵＭ（商標）ＵＳＰタイプＩガラスバイアルに充填し、アルミニウム押し上げ式キャップで密封した。全ての試料を−７０℃、５℃、１５℃で保存し、質（ＣＡＣ）、純度（ＳＥＣ、ＩＥＣ）、強度（ＵＶ−Ｖｉｓ）、および効力（バイオアッセイ）について安定性を評価した。結果は、５℃および１５℃で少なくとも３か月間保存したときにこの製剤中のパーツズマブが安定であることを示した。
【０３４１】
【表１４】
2014159469.tif 000015
【０３４２】
実施例７
以下の緩衝液条件でパーツズマブを１００mg/mLで処方した：
（１）１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０；
（２）１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、２４０mMスクロース、ｐＨ６．０；
（３）２０mMコハク酸、ｐＨ６．０；および
（４）２０mMコハク酸、２４０mMスクロース、ｐＨ６．０。
【０３４３】
各製剤に異なる濃度のポリソルベート２０を添加した。全ての試料を３ccのＵＳＰタイプＩガラスバイアルに充填し、室温で最長７日間７０rpmで水平に撹拌した。濁度について各試料の安定性を７日目の時点で評価した。結果は、最終製剤へのポリソルベート２０の使用が不溶性凝集物の形成を効果的に防止したことを実証した。図１１を参照されたい。
【０３４４】
実施例８
以下の製剤中でパーツズマブを調製した：
（１）２５mg/mLパーツズマブ、１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、２４０mMスクロース、ｐＨ６．０；
（２）５０mg/mLパーツズマブ、１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、２４０mMスクロース、ｐＨ６．０；
（３）６０mg/mLパーツズマブ、２０mMヒスチジン−酢酸、１２０mMスクロース、ｐＨ６．０。
【０３４５】
様々な量のポリソルベート２０を各製剤に添加した。全ての試料を３ccのＵＳＰタイプＩガラスバイアルに充填し、室温で最長７日間７０ｒｐｍで水平に撹拌した。濁度について各試料の物理的安定性を７日目の時点で評価した。結果は、ヒスチジン−ＨＣｌおよびスクロースの製剤へのポリソルベート２０の使用が不溶性粒子の形成を効果的に防止したことを実証した。ヒスチジン−酢酸およびスクロースを含有する製剤は、タンパク質にポリソルベート２０と同じ保護作用を有すると思われた。図１２を参照されたい。
【０３４６】
実施例９
パーツズマブを以下のように処方した：
（１）１００mg/mLタンパク質、１０mMヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ６．０；
（２）１００mg/mLタンパク質、２０mMコハク酸、ｐＨ６．０；
（３）６０mg/mLタンパク質、２０mMヒスチジン−酢酸、ｐＨ６．０。
【０３４７】
各製剤を異なる量のスクロースと混合した。全ての試料を３ccのＵＳＰタイプＩガラスバイアルに無菌充填した。次に、それらの試料を３回−７０℃で凍結および５℃で解凍した。３サイクルの凍結解凍後に各試料の物理的安定性を決定した。結果は、スクロースが凍結解凍過程の間に可溶性凝集物の形成を防止することを実証した。図１３を参照されたい。
【０３４８】
実施例１０
治療的使用のための好ましいパーツズマブ製剤は、本質的に２０mMヒスチジン酢酸、１２０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０（ｐＨ６．０）中の３０mg/mLパーツズマブからなる。
【０３４９】
【表１５】
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【０３５０】
４２０mg用量バイアルの構成：
バイアル：２０cc公定ＶｉｔｒｕｍタイプＩガラス
栓：２０mm  ＤＡＩＫＹＯ  ＧＲＥＹ（商標）、フッ素樹脂ラミネート
キャップ：２０mm押し上げ式アルミニウム
充填体積：１４．５０mL
デリバリー：生理食塩水ＩＶバッグにパーツズマブ１４．０mL。
【０３５１】
１０５０mg用量バイアルの構成：
バイアル：５０cc公定ＶｉｔｒｕｍタイプＩガラス
栓：２０mm  ＤＡＩＫＹＯ  ＧＲＥＹ（商標）、フッ素樹脂ラミネート
キャップ：２０mm押し上げ式アルミニウム
充填体積：３６．０mL
デリバリー：生理食塩水ＩＶバッグにパーツズマブ３５．０mL。
【０３５２】
実施例１１
本実施例は、第Ｉ相および第ＩＩ相臨床試験で使用された別のパーツズマブ製剤に関するものである。この組成物は、２５mg/mlパーツズマブ、１０mMヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液、２４０mMスクロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０からなる。
【０３５３】
【表１６】
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【０３５４】
実施例１２
細胞のアポトーシスは、内因性および外因性経路に仲介される。化学療法は、細胞の損傷を引き起こすことがあり、細胞の損傷に応答して内因性経路によりアポトーシスを誘発しうる。しかし、ガン細胞はしばしばｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異により化学療法に対する耐性を発生する（Ashkenazi A. Targeting Death and Decoy Receptors of the Tumour-Necrosis Factor Superfamily. Nature Reviews 2:420-430 (2002)）。細胞表面に局在するＤＲ４およびＤＲ５などのデスレセプターは、ｐ５３を伴わない外因性経路を介してアポトーシスを誘発する。Ａｐｏ２Ｌなどのアゴニスト分子はＤＲ４およびＤＲ５レセプターに結合し、Ｆａｓ関連デスドメインを介してカスパーゼ８および１０を活性化する。次に、カスパーゼ８および１０は、カスパーゼ３、６および７を活性化してアポトーシスを誘導する。腫瘍細胞上のデスレセプターの分子シグナル伝達は、通常の治療に耐性のガン細胞の除去に治療的潜在性を有し、Ａｐｏ２Ｌのような分子は現在臨床的評価の途中である。
【０３５５】
「Ａｐｏｍａｂ」はλ軽鎖と共に構築されたＣＨＯ由来の全長ヒト化ＩｇＧ１である。Ａｐｏｍａｂは、様々なガン細胞系にアポトーシスを誘導することが示された、ＤＲ５に対するアゴニスト抗体である。マウス腫瘍移植片モデルを用いた前臨床研究は、ＡｐｏｍａｂがＡｐｏ２Ｌと比較して同様または改善された腫瘍低減を有することを示した。Ａｐｏｍａｂは進行固形腫瘍および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の適応における抗ガン剤として評価されている途中である。これらの実験で使用されたＡｐｏｍａｂの重鎖および軽鎖アミノ酸配列を図２７および２８に示す。
【０３５６】
抗体製剤の調製
リコンビナント産生されたＡｐｏｍａｂは、非常に希薄なタンパク質濃度および高ｐＨを有した。ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＰＥＬＬＩＣＯＮ（商標）ＸＬ、ＰＬＣＧＣ１０、５０ｃｍ膜を用いたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ実験室規模タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムを用いてその材料を約２０mg/mLまで濃縮し、交換して２０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）緩衝液中になるようにした。トレハロースおよびＴＷＥＥＮ２０（登録商標）を有しない酢酸ナトリウム、ヒスチジン酢酸塩、およびリン酸ナトリウムを用いて、１００００Da分子量カットオフ膜（Pierce, Inc）を用いた透析を使用して、４．０から７．０のｐＨ範囲にわたる様々な緩衝系中でＡｐｏｍａｂ試料を処方した。最終透析に２４０mMのトレハロースを添加した。透析後に、０．０２％ＴＷＥＥＮ２０（商標）をその製剤に添加して、試料を０．２２μmフィルター（Millipore, Inc.）で濾過した。Ａｐｏｍａｂの容積０．５mLを無菌３ccガラスバイアル（Forma Vitrum, Inc.）中に充填し、１３mm栓（Daikyo, Inc）で密封した。タンパク質の安定性を−７０℃、５℃、３０℃、および４０℃で最長３か月間保存して評価した。
【０３５７】
Ａｐｏｍａｂ製剤の安定性
薬物産物の安定性を検査するために、５cc  ＦＯＲＭＡ  ＶＩＴＲＵＭ（登録商標）ガラスバイアル中に充填されたＡｐｏｍａｂ処方原体を処方した。処方された抗体５．５mLをバイアルに充填し、２０mm  ＤＡＩＫＹＯ（登録商標）栓を取付け、−７０℃、５℃、３０℃、および４０℃で直立させて保存した。
【０３５８】
原薬の安定性検査のために、Ａｐｏｍａｂの処方原体を０．２２μmフィルターを通過させて除菌し、オートクレーブ処理した２０ccの３１６Ｌステンレススチールミニタンクに１０mLを充填した。このタンクを−２０℃および５℃で直立させて置いた。特定の時間間隔で１mLの分割量を無菌的にミニタンクから取り出してタンパク質の質を評定した。対照バイアルは−２０℃で保存された３ccガラスバイアル中の１mL分割量であった。
【０３５９】
色、外観、および透明度
試料の透明度、外観、および色を、黒および白色背景を有する光検査場所を使用して蛍光灯下で肉眼評定した。原薬の分析のために、ミニタンクの試料を検査用の３ccガラスバイアルに移した。
【０３６０】
ｐＨ
緩衝液の測定のためにＴＨＥＲＭＯ  ＯＲＩＯＮ  ＳＵＲＥ−ＦＬＯＷ  ＲＯＳＳ（商標）セミミクロｐＨ電極、またはタンパク質ｐＨスクリーニング試料の測定のためにＴＨＥＲＭＯ  ＯＲＩＯＮ  ＧＬＳ（商標）複合マイクロｐＨ電極、毒性学的安定性試料のためにＢｅｃｋｍａｎマイクロ電極プローブを用いて室温でｐＨを測定した。ＭＥＴＥＲＬＡＢ（商標）ｐＨＭ２４０ｐＨ／イオンメータ（Radiometer Analytical）をｐＨ７およびｐＨ４の標準緩衝液（EM Science）で毎日キャリブレーションした。
【０３６１】
濃度
ＡＧＩＬＥＮＴ８４５３（商標）分光光度計を用いた紫外吸収分光法によりタンパク質濃度を決定した。適切な製剤緩衝液ブランクで試料を希釈して０．５から１．０の吸光度にした。その装置について希釈溶液をブランクとして使用して、２４０から５００nmまでスペクトルをスキャンした。２７９nmでの吸光度から３２０nmでの吸光度の値を引いて、オフセットおよび光散乱について補正した。タンパク質濃度を次式により計算した：
【０３６２】
【数１】
2014159469.tif 000018
【０３６３】
配列に基づく吸光度係数を最初に１．３２cm-1(mg/mL)-1と決定し、この値をｐＨスクリーニング実験のために使用した。その後の値１．７cm-1(mg/mL)-1をアミノ酸分析法およびタンパク質分解法により決定し、この値を毒性学的研究に使用したＡｐｏｍａｂの安定性分析に使用した。
【０３６４】
イオン交換クロマトグラフィー
ダイオードアレイ検出器を備える１１００シリーズＨＰＬＣ（Agilent Technologies, Inc.）でイオン交換クロマトグラフィーを実施した。ＰＲＯＰＡＣ  ＷＣＸ−１Ｏ（商標）（Dionex）カラム（４×２５０mm）で流速０．５mL/minでカラム温度４０℃を用いてクロマトグラフィーを実施した。移動相Ａは、２５mMリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）であった。移動相Ｂは、移動相Ａと同じ緩衝液中の１００mM塩化ナトリウムであった。カラムを１００％移動相Ａで平衡化した。試料のｐＨスクリーニングのために、量２０mgのＡｐｏｍａｂをカラムにロードし、吸光度を２１４nmでモニターした。以下の勾配でカラムからタンパク質を溶出させた：
【０３６５】
【表１７】
2014159469.tif 000019
【０３６６】
毒性学的研究に使用した材料の安定性を分析するために、量３０mgのＡｐｏｍａｂをカラムにロードし、吸光度を２８０nmでモニターした。以下の勾配でタンパク質をカラムから溶出させた：
【０３６７】
【表１８】
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【０３６８】
サイズ排除クロマトグラフィー
ダイオードアレイ検出器を備える１１００シリーズＨＰＬＣ（Agilent Technologies, Inc.）でサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。量５０μgのＡｐｏｍａｂをＴＳＫ  Ｇｅｌ３０００ＳＷＸＬ（商標）（７．８×３００mm）カラムにロードし、ｐＨスクリーニング用試料について流速０．９mL/minで２０分間、毒性学的安定性試料について０．５mL/minで３０分間、移動相として０．２０Mリン酸カリウム、０．２５M塩化カリウム（ｐＨ６．２）を用いて運転した。吸光度を２８０nmでモニターした。
【０３６９】
効力
効力バイオアッセイの目的は、ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（商標）を用いてＡｐｏｍａｂがＣｏｌｏ２０５細胞を殺滅する能力を測定することであった。Ｃｏｌｏ２０５は結腸ガン細胞系であり、ＤＲ５およびＤＲ４両方のデスレセプターを発現する。このアッセイは、代謝活性の検出に基づく蛍光測定／比色測定用成長指示薬を組み込んでいる。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（商標）は、酸化状態で青色で非蛍光性の酸化還元色素である。細胞内代謝性還元は、その色素を蛍光性でもある赤色色素に変換する。色および蛍光の変化は代謝活性および生存細胞数と比例する。細胞が死滅するとシグナルは減少した。抗Ｆｃを有する媒質中でＡｐｏｍａｂを希釈し、次に、Ｃｏｌｏ２０５細胞をＡｐｏｍａｂ試料に添加して３７℃で４８時間インキュベートした。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ（商標）を最後の２〜３時間に添加する。平板を励起波長５３０nmおよび発光波長５９０nmで読み取り、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を得た。ＫＡＬＥＩＤＡＧＲＡＰＨ（商標）によってデータを分析した。殺滅の希釈曲線を作製した。
【０３７０】
結果
製剤ｐＨのスクリーニング研究
非増幅安定細胞系から産生されたＡｐｏｍａｂを用いて、抗体安定性に及ぼすｐＨの作用を検討した。この分析のために、ｐＨ４．０、４．５、５．０、５．５の２０mM酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ６．０および６．５の２０mMヒスチジン酢酸塩緩衝液；およびｐＨ７．０の２０mMリン酸ナトリウム緩衝液中に２０mg/mL抗体でＡｐｏｍａｂを処方した。これらの製剤の全ては、２４０mMトレハロースおよび０．０２％ＴＷＥＥＮ２０（登録商標）を含有した。これらの製剤を温度−７０℃、５℃、３０℃、および４０℃で最長３か月間保存し、タンパク質の安定性を、ＣＡＣ、ｐＨ、濃度、ＳＥＣおよびＩＥＣを含めた様々な分析アッセイにより決定した。試料の保存時にＣＡＣ、ｐＨまたはタンパク質濃度に有意な変化は観察されなかった。
【０３７１】
ＳＥＣによる試料の分析は、５℃および−７０℃で保存した間に有意な変化が起こらなかったことを示した。しかし、抗体フラグメントおよび可溶性凝集物の形成として観察された分解が、３０℃および４０℃での保存の間に起こった（図２０）。これらの製剤を比較するために、保存している間の抗体単量体の動態をモニターし、一次速度定数を計算した。抗体単量体の損失について得られたｐＨ速度プロファイルを図２１に示す。抗体単量体の安定性についての最適条件は、ｐＨ６．０のヒスチジン酢酸塩緩衝液中で処方することにより得られた。
【０３７２】
Ａｐｏｍａｂの電荷不均一性をＩＥＣによりモニターした。５℃および−７０℃で保存した間にＩＥＣプロファイルの有意な変化は起こらなかった。しかし、酸性または塩基性変異体の形成として観察された分解が製剤に依存して起こった（図２２）。一般に、増大した塩基性変異体が低製剤ｐＨで形成し、高製剤ｐＨでより多い酸性変異体が形成した。製剤を比較するために、保存中にＩＥＣの主ピーク動態をモニターし、一次速度定数を計算した。ＩＥＣ主ピークの損失についての得られたｐＨ速度プロファイルを図２３に示す。ＩＥＣにより観察された速度定数は、ＳＥＣからの定数よりも約１０倍高かった（図２１）。したがって、ＩＥＣ主ピークの損失は抗体の一次分解であったが、それは、製品の貯蔵寿命を最終的に制限するであろう。さらに、ＳＥＣにより観察されたようにＩＥＣ主ピークを安定化する至適抗体安定性は、ｐＨ６．０のヒスチジン酢酸塩緩衝液中で処方することにより得られた。
【０３７３】
上記ｐＨスクリーニングデータの分析に続いて、２０mMヒスチジン酢酸塩、２４０mMトレハロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０中に２０mg/mLの抗体を含むＡｐｏｍａｂ製剤を選択した。薬物製品については、バイアル構成は、２０mM  ＤＡＩＫＹＯ（商標）Ｗｅｓｔ栓を有する５cc  ＦＯＲＭＡ  ＶＩＴＲＵＭ（商標）バイアル中の５．５mL充填からなった。Ａｐｏｍａｂをステンレススチールタンク中で保存した。
【０３７４】
Ａｐｏｍａｂ薬物製品の安定性を上記５ccガラスバイアル構成で評価した。バイアルを−７０℃（対照）、５℃、３０℃、および４０℃で保存した。試料を特定の時間間隔で取り出し、以下のアッセイにより分析した：色、外観、透明度（ＣＡＣ）、ｐＨ、タンパク質濃度、ＳＥＣ、ＩＥＣ、および効力。−７０℃および５℃で保存された試料については表６に、３０℃および４０℃で保存された試料については表７に、これらのアッセイの結果を示す。
【０３７５】
【表１９】
2014159469.tif 000021
【０３７６】
【表２０】
2014159469.tif 000022
【０３７７】
−７０℃および５℃で１２か月保存後にタンパク質の質の変化は観察されなかった。例えば、ｐＨは６．０±０．３を維持し、Ａｐｏｍａｂは透明および無色の液体の外観であり、タンパク質濃度は２０．０±２．０gm/mLのままであり、単量体の率（％）は不変であった。さらに、ＩＥＣ主ピークの率（％）に有意な変化はなく、細胞殺滅効力アッセイによって決定された比活性（％）は６０％から１４０％比活性のアッセイ精度の範囲内であった。これらの結果は、５ccガラスバイアル中で保存されたＡｐｏｍａｂが５℃で少なくとも１２か月間安定であったことを示した。
【０３７８】
表７は、タンパク質の質の変化が３０℃および４０℃で起こったことを示す。ＳＥＣは単量体の率（％）の減少を示し、主にフラグメント種の増加を伴った。凝集物は高温度同様に増加するが、その速度はずっと低かった。しかし、凝集物は４０℃で６か月後に有意に増加する。ＩＥＣ主ピークの率（％）は減少し、酸性変異体の対応する増加を伴った。塩基性ピークは４０℃で２か月および３０℃で９か月後にわずかに減少した。４０℃で６か月保存後にＩＥＣ主ピークをもはや積分できない程度まで分解が起こった。細胞殺滅バイオアッセイは、高温で長期間の保存に伴い比活性の率（％）の損失を示した。タンパク質濃度およびｐＨは不変であった。溶液は、４０℃で３か月および３０℃で９か月後に微黄色になり、４０℃で９か月後に黄色になる。
【０３７９】
原薬の安定性
原薬についての凍結解凍安定性データを表８に示す。
【０３８０】
【表２１】
2014159469.tif 000023
【０３８１】
【表２２】
2014159469.tif 000024
【０３８２】
−２０℃で少なくとも１５時間凍結および常温で解凍を３回行った後にタンパク質の化学的特徴に有意な変化は観察されなかった。例えば、Ａｐｏｍａｂは透明無色液体の外観で、ｐＨは６．０±０．３のままであり、ＳＥＣ単量体ピークの率は不変であった。
【０３８３】
ステンレススチール容器中でのＡｐｏｍａｂの安定性を−２０℃および５℃で評価した（表９）。
【０３８４】
試料を特定の間隔でミニタンクから無菌的に取り出し、分析した。５℃で、Ａｐｏｍａｂは、ｐＨ、ＣＡＣ、タンパク質濃度およびＩＥＣによる主ピークの率（％）によるタンパク質の質に変化を示さなかったが、ＳＥＣによると３か月毎に０．１％の単量体を損失した。５℃で３か月間保存した間に効力の減少が観察された。しかし、試料の効力は、６か月および９か月の時点で再び増加した。したがって、３か月の時点で観察された効力の差はアッセイ変動に起因した。Ａｐｏｍａｂは、ｐＨ、ＣＡＣ、タンパク質濃度、ＳＥＣによる単量体の率（％）、ＩＥＣによる主ピークの率（％）により−２０℃でタンパク質の質の変化を示さず、効力に有意な変化も示さなかった。安定性データは、Ａｐｏｍａｂが−２０℃で少なくとも１年間、５℃で少なくとも３か月間安定であることを示している。
【０３８５】
結論
Ａｐｏｍａｂについての製剤を選択するために製剤スクリーニング研究を行った。２４０mMトレハロース二水和物および０．０２％ポリソルベート２０を有する酢酸ナトリウム、ヒスチジン酢酸塩、およびリン酸ナトリウムを緩衝液として用いたｐＨ範囲４．０から７．０にわたるｐＨスクリーニングは、ＡｐｏｍａｂがｐＨ６．０の溶液中で最も安定であることを示した。したがって、２０mMヒスチジン酢酸塩、２４０mMトレハロース、０．０２％ポリソルベート２（ｐＨ６．０）からなる製剤が開発され、実験的に安定であることが実証された。この製剤を用いて、Ａｐｏｍａｂは５℃で少なくとも１２か月間安定であることが示された。さらに、３１６Ｌステンレススチール容器中に保存されたときに、Ａｐｏｍａｂは−２０℃で少なくとも１２か月間および５℃で３か月間安定であることが示された。Ａｐｏｍａｂは３回の凍結／解凍サイクルに供されたときに安定であることも示された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
2014159469.tif 000033
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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