(57)【要約】【課題】１次・２次抗原抗体反応工程間やその前後の工程に存在する洗浄工程を迅速化及び自動化することができる電界洗浄方法、電界洗浄装置、それを用いた電界免疫組織染色方法、電界免疫組織染色装置を提案する。【解決手段】本発明の電界洗浄方法は、下部電極１０上に配置した、ガラスプレート１上に形成した液滴２の反応場に、貫通穴３を有する板状電極又は環状電極４を上方から臨ませ、印加電界強度の主電圧としてプラス側に０．４〜２．０ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜１．０ｋＶ／ｍｍを加え、更に周波数０．１〜８００Ｈｚの範囲の交流電圧を印加することで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、発生する電界による撹拌現象を用いながら電界洗浄を行う方法であって、板状電極又は環状電極４の貫通穴３から液滴反応場２へ排出管５を挿入して試薬溶液６を排出する工程と、貫通穴３から液滴反応場２へ注入管７を挿入して洗浄液８を注入する工程と、を行うことで、液滴に浮遊する非特異反応物質を排出することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と抗体とを反応させるために基板上に形成した反応場と、
前記反応場を挟むように上下に形成された上側電極と下側電極とを備え、
前記反応場で抗原に１次抗体を含む液滴を添加して抗原と１次抗体とを反応させる１次抗原抗体反応工程と、
前記１次抗原抗体反応工程の後に２次抗体を含む液滴を添加して２次抗体をさらに反応させる２次抗原抗体反応工程と、
前記上側電極と下側電極との間に所定の電界を与えることにより前記反応場に形成された液滴を撹拌する工程と、
前記１次抗原抗体反応工程と２次抗原抗体反応工程との後に、それぞれ未反応抗体を除去する未反応抗体洗浄工程と、
を有することを特徴とする電界洗浄方法。
【請求項２】
前記所定の電界は、周波数０．１〜８００Ｈｚの方形波を発生させ、電界強度をプラス側に０．４〜２．０ｋＶ／ｍｍとし、オフセット電界強度が０．１５〜１．０ｋＶ／ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の電界洗浄方法。
【請求項３】
前記上側電極は貫通穴を備える板状電極又は環状電極であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の電界洗浄方法。
【請求項４】
前記未反応抗体洗浄工程は、前記貫通穴から前記反応場へ排出管を挿入して未反応抗体を排出する工程と、前記貫通穴から前記反応場へ注入管を挿入して洗浄液を注入する工程と、
をさらに備えることを特徴とする請求項３に記載の電界洗浄方法。
【請求項５】
基板上に耐アセトン性を有し、ポリビニル系、ポリ塩化ビニル系、シリコーン系又はフッ素系から１つ選ばれる樹脂からなり、電界撹拌の良好な撹拌動作を生む反応場液滴形状並びに領域を確保する領域を形成するはっ水リングやはっ水枠を載置するか、はっ水処理剤塗布にて処理することにより液滴反応場を形成することを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の電界洗浄方法。
【請求項６】
はっ水リングの内径範囲５〜２５ｍｍ，また、長方形のはっ水枠を採用することによって、滴下する液滴は、５〜１０００μＬであることを特徴とする請求項５に記載の電界洗浄方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の電界洗浄方法を用いて、１次抗原抗体反応工程前に抗原に電界を与えて賦活化させ、反応を加速化させる電界賦活化工程を行うことを特徴とする電界免疫組織染色方法。
【請求項８】
抗原と抗体とを反応させるために基板上に形成した反応場と、
前記反応場を挟むように上下に形成された上側電極と下側電極とを備え、
前記反応場で抗原に１次抗体を含む液滴を添加して抗原と１次抗体とを反応させる１次抗原抗体反応機構と、
前記１次抗原抗体反応機構の後に２次抗体を含む液滴を添加して２次抗体をさらに反応させる２次抗原抗体反応機構と、
前記上側電極と下側電極との間に所定の電界を与えることにより前記反応場に形成された液滴を撹拌する機構と、
前記１次抗原抗体反応機構と２次抗原抗体反応機構との後に、それぞれ未反応抗体を除去する未反応抗体洗浄機構と、
を有することを特徴とする電界洗浄装置。
【請求項９】
前記上側電極は貫通穴を備える板状電極又は環状電極であることを特徴とする請求項１または請求項８に記載の電界洗浄装置。
【請求項１０】
前記未反応抗体洗浄機構は、前記貫通穴から前記反応場へ排出管を挿入して未反応抗体を排出する機構と、前記貫通穴から前記反応場へ注入管を挿入して洗浄液を注入する機構と、
をさらに備えることを特徴とする請求項８に記載の電界洗浄装置。
【請求項１１】
基板上に耐アセトン性を有し、ポリビニル系、ポリ塩化ビニル系、シリコーン系又はフッ素系から１つ選ばれる樹脂からなり、電界撹拌の良好な撹拌動作を生む反応場液滴形状並びに領域を確保する領域を形成するはっ水リングやはっ水枠を載置するか、はっ水処理剤塗布にて処理することにより液滴反応場を形成することを特徴とする請求項８〜１０の何れか一項に記載の電界洗浄装置。
【請求項１２】
請求項８〜１１の何れか一項に記載の電界洗浄装置を用いて、１次抗原抗体反応工程前に抗原に電界を与えて賦活化させ、反応を加速化させる電界賦活化を行う機構を有することを特徴とする電界免疫組織染色装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１次・２次抗原抗体反応工程間やその前後の工程に存在する洗浄工程を迅速化、自動化することができる電界洗浄方法、電界洗浄装置、それを用いた電界免疫組織染色方法、電界免疫組織染色装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、物理的な手段の１つである高電圧交流電界によって発生するクーロン力によって液滴が吸引される現象と与える高電圧の極性変化によって生じる液滴の振動現象によって、液滴内に存在する微細物が撹拌する現象と高圧電界を抗体液滴に与えることで、抗体はより分散する現象を示すことから、これらに着目して鋭意検討し、１ｍＬ以下、特に５０から数１００μＬオーダーの微少量の液滴を非接触に撹拌に適用し抗原定着工程、抗原抗体反応工程においても、著しく反応時間を短縮できる非接触撹拌方法として電界撹拌技術を特許文献１に提案した。
そして、この電界撹拌技術は、抗原抗体反応を約１０倍促進する技術であり、従来２時間を要していた１次・２次抗原抗体反応を合わせて１０分程度に完了する技術である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１１９３８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、術中迅速病理診断は時間の制約上、５分以内に染色可能なＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオジン染色）が用いられている。しかし、ＨＥ染色では小さながん遺残やリンパ節微小転移が見逃されていることが多い。このがん遺残やリンパ節転移を見逃さずに縮小手術を施行するには免疫染色が必要である。従来の免疫染色には２時間以上を要するため、術中病理診断には適さない。術中病理診断に用いるためには４０分以内に診断を完了する必要がある。現在、Sysmex社から約３０分で遺伝子増幅するＯＳＮＡ法によるリンパ節転移診断機器が販売されているが、同法による転移診断は形態学的情報が欠如するため、正確な転移診断とは言えず、信頼性を欠いている。また、数社から自動免疫染色装置が市販されているが、これらは大量の免疫染色を自動化するために開発されたもので、最短でも９０分を要するため術中病理診断には適用できなかった。即ち従来の免疫染色を実施するため、繁忙な医療スタッフが手動の装置操作を行うには限界があった。
この問題を解決するため、本発明の発明者等は、免疫染色を迅速に行うために電界を試料に非接触に与える新たな撹拌技術を開発し、免疫染色技術を開発し、試作機レベルにて診断に要する時間を１３６分から２０分に短縮する研究成果を上げている。これが前記特許文献１に提案した非接触撹拌方法である。
【０００５】
しかしながら、免疫組織診断をより迅速化して広く普及させるためには、診断に関わる試料作製処理技術をより簡便に、しかも高精度に行う必要がある。前記特許文献１に提案した非接触撹拌方法（電界撹拌技術）は、１次・２次抗原抗体反応そのものを高速化できる技術であり、１次・２次抗原抗体反応工程間に存在する洗浄工程によって、電界撹拌装置より試料が搭載されるガラス等で構成されるプレートを一度装置外へ取り出して洗浄を行う必要があるため、この洗浄操作に人手を要してしまい、煩雑な病理現場では問題となっている。したがって、この洗浄工程を迅速化及び自動化する技術が希求されている。
【０００６】
そこで、本発明は、１次・２次抗原抗体反応工程間やその前後の工程に存在する洗浄工程を迅速化、自動化することができる電界洗浄方法、電界洗浄装置、それを用いた電界免疫組織染色方法、電界免疫組織染色装置を提案することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記に鑑み提案されたもので、抗原と抗体とを反応させるために基板上に形成した反応場と、前記反応場を挟むように上下に形成された上側電極と下側電極とを備え、前記反応場で抗原に１次抗体を含む液滴を添加して抗原と１次抗体とを反応させる１次抗原抗体反応工程（機構）と、前記１次抗原抗体反応工程（機構）の後に２次抗体を含む液滴を添加して２次抗体をさらに反応させる２次抗原抗体反応工程（機構）と、前記上側電極と下側電極との間に所定の電界を与えることにより前記反応場に形成された液滴を撹拌する工程（機構）と、前記１次抗原抗体反応工程と２次抗原抗体反応工程との後に、それぞれ未反応抗体を除去する未反応抗体洗浄工程（機構）と、を有することを特徴とする電界洗浄方法又は装置に関するものである。
【０００８】
また、本発明は、前記電界洗浄方法又は装置において、前記所定の電界は、周波数０．１〜８００Ｈｚの方形波を発生させ、電界強度をプラス側に０．４〜２．０ｋＶ／ｍｍとし、オフセット電界強度が０．１５〜１．０ｋＶ／ｍｍであることを特徴とする電界洗浄方法又は装置をも提案する。
より望ましくは、周波数０．１〜３００Ｈｚの方形波を発生させ、電界強度をプラス側に０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍとし、オフセット電界強度が０．１５〜０．７ｋＶ／ｍｍである。
【０００９】
さらに、本発明は、前記上側電極は貫通穴を備える板状電極又は環状電極であることを特徴とする電界洗浄方法又は装置をも提案する。
【００１０】
また、本発明は、前記電界洗浄方法又は装置において、前記未反応抗体洗浄工程（機構）は、前記貫通穴から前記反応場へ排出管を挿入して未反応抗体を排出する工程（機構）と、前記貫通穴から前記反応場へ注入管を挿入して洗浄液を注入する工程（機構）と、をさらに備えることを特徴とする電界洗浄方法又は装置をも提案する。
さらに、基板上に複数の液滴の反応場を形成し、各反応場に対してそれぞれ液滴反応場の溶液を排出する排出管，洗浄液を注入する注入管を挿入可能な貫通穴を板状電極又は環状電極の上方から反応場となる液滴に臨ませるようにしてもよい。
【００１１】
また、本発明は、前記電界洗浄方法又は装置において、基板上に耐アセトン性を有し、ポリビニル系、ポリ塩化ビニル系、シリコーン系又はフッ素系から１つ選ばれる樹脂からなり、電界撹拌の良好な撹拌動作を生む反応場液滴形状並びに領域を確保し、領域を形成するはっ水リングやはっ水枠を載置するか、はっ水処理剤塗布にて処理することにより液滴反応場を形成することを特徴とする電界洗浄方法又は装置をも提案する。
はっ水リングの内径範囲５〜２５ｍｍ，また、長方形のはっ水枠を採用することによって、滴下する液滴は、５〜１０００μＬである。
【００１２】
さらに、本発明は、前記電界洗浄方法又は装置を用いて、１次抗原抗体反応工程（機構）前に抗原に電界を与えて賦活化させ、反応を加速化させる電界賦活化工程（機構）を行うことを特徴とする電界免疫組織染色方法又は装置をも提案するものである。
【００１３】
なお、本発明の前記未反応抗体洗浄工程（機構）に関して詳細に説明すると、貫通穴を有する板状電極又は環状電極を上部電極とし、板状電極を下部電極とする電極間において、下部電極上に配置したガラスプレート等の基板上に、液滴を形成させて反応場とし、液滴と上部電極とは非接触状態を維持した状態で、これらの上下電極間に電界を与え、液滴は上部電極方向に振動し、撹拌を生じさせ、与える電界条件は、周波数０．１〜８００（望ましくは０．１〜３００）Ｈｚの繰り返し方形波を発生し昇圧させ、電界強度はプラス側に０．４〜２．０（望ましくは０．４〜１．５）ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜１．０（望ましくは０．１５〜０．７）ｋＶ／ｍｍを加えてプラス側に偏らせて与える、電界条件によって液滴は非接触にそして活発に振動し、撹拌現象を生じ、この撹拌現象中に、前記貫通穴を有する板状電極又は環状電極の貫通穴から液滴反応場へ排出管を挿入して溶液を排出する工程（機構）と、貫通穴から液滴反応場へ注入管を挿入して洗浄液を注入する工程（機構）と、を行うことで、液滴に浮遊する未反応物等の非特異反応物質を排出することを特徴とする、となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の電界洗浄方法及び電界洗浄装置は、図１に示すとおりであるが、高電圧交流電界によるクーロン力を１ｍＬ以下、特に５０〜６００μLオーダーの微量の液滴に与えることにより、液滴の内部にて撹拌子等を用いずに撹拌することができる電界撹拌技術を、１次・２次抗原抗体反応工程間やその前後の工程に存在する洗浄に利用するものであって、ガラスプレート等の基板上に複数の液滴の反応場を形成しても、それぞれの反応場に対して貫通穴を有する板状電極又は環状電極を臨ませればよく、貫通穴から液滴反応場へ臨ませた排出管と注入管とを的確に液滴の反応場に配置させ、所定の電界撹拌工程完了後に引き続き電界撹拌を与えながら適宜に溶液を排出したり、洗浄液を注入したりすることにより、洗浄工程の迅速化及び自動化を達成することができる方法である。
【００１５】
また、ガラスプレート等の基板上に耐アセトン性を有し、ポリビニル系、ポリ塩化ビニル系、シリコーン系又はフッ素系から１つ選ばれる樹脂からなり、電界撹拌の良好な撹拌動作を生む反応場液滴形状並びに領域を確保する領域を形成するはっ水リングやはっ水枠を載置するか、はっ水処理剤塗布にて処理することにより液滴反応場を形成することにより、ばらつきの少ない一定の量の液滴を滴下可能にすることによって、液滴反応場の高さばらつきが抑制される。すなわち電極間と液滴頭頂部との距離長ばらつきが抑制され、これにより、電界撹拌性のばらつきが抑制される。この電界撹拌を継続しながら、液滴を排水し、さらに新規に注入されたばらつきの少ない一定の量の洗浄液を電界撹拌後に電界撹拌中に排出することで、不要な抗体を除去して洗浄不良による非特異発色を抑制し易くし、すぐれた洗浄性を得る極めて簡易な液滴の反応場を形成することができる。
【００１６】
さらに、前記電界洗浄を電界免疫組織染色に適用することにより、電界による１次・２次抗原抗体反応工程間やその前後の工程に存在する洗浄工程を迅速化、自動化することができる電界洗浄方法を実施することができる。また、凍結切片に対する術中迅速免疫染色診断として、パラフィン切片を用いた免疫染色確定診にも適用可能である。この時、抗体試薬を希釈し用いることができる。さらに、核酸におけるハイブリダイゼーション工程にも適用可能であり、加えて抗原抗体反応においても適用可能である。なお、１次抗原抗体反応工程前に抗原に電界を与えて賦活化させ、反応を加速化させる電界賦活化工程を行うことにより、脳腫瘍のような反応性の低い抗原に用いると有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の電界洗浄方法（装置）の概要を模式的に示す斜視図である。
【図２】印加電界波形と液滴内部の撹拌メカニズムとの関係を模式的に示す断面図である。
【図３】本発明における電界洗浄メカニズムを模式的に示す断面図である。
【図４】本発明における電界洗浄において、液滴反応場に１本の注入管、複数本の排出管を臨ませた例を模式的に示す断面図である。
【図５】印加電界強度と試料の液量との関係を示し、炭酸カルシウム−滅菌超純水液滴量と撹拌が生じた電界強度（ｋＶ／ｍｍ）の関係を示すグラフである。
【図６】印加周波数と試料の液量との関係を示し、炭酸カルシウム−滅菌超純水液滴量と撹拌が生じた印加周波数の関係を示すグラフである。
【図７】本発明の電界洗浄を用いた迅速免疫染色法を従来のＨＥ染色との比較対照表である。
【図８】実施例の免疫組織染色試験結果を示す顕微鏡写真の複写図である。
【図９】（ａ）本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色方法（装置）における電界非接触撹拌の反応場の抗体液滴をハイスピードカメラで側面から撮影した顕微鏡写真の複写図と、（ｂ）電界非接触撹拌技術を模式的に示す側面図である。
【図１０】本発明における電界非接触撹拌法によって生じる液温変化を示すグラフであり、一次抗体希釈液２１Ｈｚの場合と一次抗体希釈液９１Ｈｚの場合を並べて示している。
【図１１】電界賦活化効果による染色割合と印加電界時間との関係を示すグラフである。
【図１２】本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色装置における供給機構の一例を示し、供給カセット機構によるダイレクト滴下方式を採用した試薬格納カセット及びそれに収容された試薬用シリンジを示す斜視図である。
【図１３】本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色装置における試薬滴下部と電界撹拌部との連絡を模式的に示す側面図である。
【図１４】本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色装置における試薬滴下部と電界洗浄部との連絡を模式的に示す側面図である。
【図１５】本発明における電界ＰＢＳ洗浄を拡大して示す斜視図である。
【図１６】（ａ）本発明における電界洗浄工程に用いることが可能である環状電界集中型電極を示す斜視図、（ｂ）電界集中型電極を用いた際の反応場の抗体液滴内の挙動を模式的に示す断面図である。
【図１７】（ａ）本発明における環状電極（電界印加オンの状態）を用いた撹拌挙動を示す拡大写真の複写図、（ｂ）電界印加オフの状態を示す複写図である。
【図１８】（ａ）及び（ｂ）本発明における環状集中型電極（電界印加オンの状態）を用いた撹拌挙動を示す拡大写真の複写図、（ｃ）電界印加オフの状態を示す複写図である。
【図１９】ゼータ電位測定による分散性評価を示すグラフであり、欄外に電界（矩形波）を印加して機械的な撹拌を実施する装置が示されている。
【図２０】自動免疫組織染色装置の機構（電界洗浄工程）を示す斜視図である。
【図２１】（ａ）はっ水リングを用いた撹拌挙動を示す顕微鏡写真の複写図、（ｂ）２穴タイプはっ水リングを示す斜視図である。
【図２２】（ａ）従来法で得られる免疫組織染色を示す顕微鏡写真の複写図、（ｂ）本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色方法（実施例１）で得られる免疫組織染色を示す顕微鏡写真の複写図である。
【図２３】（ａ）本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色方法（実施例２）で得られる免疫組織染色を示す顕微鏡写真の複写図、（ｂ）従来法で得られる免疫組織染色を示す顕微鏡写真の複写図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記特許文献１に提案した電界撹拌の技術原理は図２に示すとおりであるが、これを、洗浄工程に適用しようとするものが本発明であり、電界を用いた撹拌現象を用いながら電界洗浄を行う方法（装置）であって、図３及び図４に示すとおりである。より具体的には、洗浄工程に電界洗浄工程を開発・導入し、電界撹拌装置に入った試料が洗浄工程のために装置より出入りする操作を無くし、医療スタッフの負担軽減を図る装置開発を行うものである。
【００１９】
本発明は、高電圧交流電界によるクーロン力を１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に与えることにより、液滴内部を非接触に撹拌することができる電界撹拌を洗浄に利用するものである。具体的には湿度６０±２０％の環境下で、印加電界強度の主電圧のとしてプラス側に０．４〜２．０（より望ましくは０．４〜１．５）ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜１．０（より望ましくは０．１５〜０．７）ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、周波数０．１〜８００（より望ましくは０．１〜３００）Ｈｚの範囲で液滴が活発に振動する周波数を与えることで発生する電界の波に変化をもたせた（＝バースト波形を構成させた）高電圧交流電界を１ｍＬ以下、特にμＬオーダーの微少量液滴に非接触に与えることで発生する電界を用いた撹拌現象を用いながら電界洗浄を行う方法（装置）である。
【００２０】
前記電界撹拌において、印加電界強度（ｋＶ／ｍｍ）は、プラス側に２．０ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．４ｋＶ／ｍｍ未満より低いと撹拌が生じない。
また、オフセット電圧は、１．０ｋＶ／ｍｍより強いと放電する可能性があり、０．１５ｋＶ／ｍｍより低いと撹拌が生じない。
【００２１】
さらに、撹拌作用に影響を与える電界強度・周波数は液滴量に依存するが、この電界強度と液量、周波数と液量の関係を以下に説明する。
印加電界強度（ｋＶ／ｍｍ）は、試料の液量により最適化される。
炭酸カルシウム（観察のために粒径５０ｎｍ  濃度０．０４％）を入れた滅菌超純水の液滴をプラスチック製基板に滴下し、平行平板電極間において電界下の動きを観察したところ、０．６μＬでは０．７５ｋＶ／ｍｍ（電極間距離４ｍｍ）、１〜２μＬでは０．６３ｋＶ／ｍｍ（電極間距離４ｍｍ）、５〜１５μＬでは０．４ｋＶ／ｍｍ（電極間距離４ｍｍ）、１００〜１０００μＬでは０．４２ｋＶ／ｍｍ（電極間距離７ｍｍ）で液滴内部の炭酸カルシウム粒子が活発に動く様子を確認した。この結果を図５のグラフにして示した。
炭酸カルシウム（観察のために粒径５０ｎｍ  濃度０．０．４％）を入れた滅菌超純水１０μＬの液滴をプラスチック製基板に滴下し、電界下の動きを観察したところ、液量０．６μＬでは３８０〜４２０Ｈｚ、１μＬでは２６０〜３１０Ｈｚ、２μＬでは１９５〜２２０Ｈｚ、５μＬでは１２５〜１４０Ｈｚ、１０μＬでは８５〜９５Ｈｚ、１５μＬでは７０〜８５Ｈｚ、１００μＬでは３０Ｈｚ、５００μＬでは１３〜１５Ｈｚ、１０００μＬでは１０Ｈｚで、液滴内部の炭酸カルシウムが活発に動く様子を確認した。この結果を図６のグラフにして示した。
【００２２】
本発明の電界洗浄では、ガラスプレート等の基板１上に形成した液滴反応場２に、貫通穴３を有する板状電極又は環状電極４を上方から臨ませ、貫通穴３から液滴反応場２へ排出管５を挿入して試薬溶液６を排出する工程と、貫通穴３から液滴反応場２へ注入管７を挿入して洗浄液８を注入する工程と、を行うと共に、必要に応じて上記工程を繰り返して行うようにしたものである。
【００２３】
既に概略的には説明したが、免疫組織診断をより迅速化して広く普及させるためには、診断に関わる試料作製処理技術をより簡便に、しかも高い精度で行う必要があった。本発明は、前記電界撹拌の技術を１次・２次抗原抗体反応自体に限らず、煩雑な病理診断における洗浄工程にも利用しようとするものである。
例えば１次・２次抗原抗体反応を行わせるための前記電界撹拌では、平板状の電極を用いればよいが、この洗浄方法（装置）においては、貫通穴を有する板状電極又は環状電極を用いる。前者の電極は、盤状電極の中央に貫通穴を形成したものであり、貫通穴としては貫通スリット穴を含むものであり、後者の電極は、電極自体を環状（ドーナツ状又はリング状）に成形したものである。
【００２４】
この電界洗浄における貫通穴を有する板状電極又は環状電極は、導体であればよく、アルミ又はステンレス等でもよく、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ，透明電極）でもよい。また、その配置は、液滴からの溶液の排出時に液滴の頂部と電極間距離を一定にすることで撹拌性の維持向上を図るようにしてもよい。
【００２５】
ガラスプレート表面に形成する液滴の反応場は、ガラスプレート表面を凸状に形成したものでも、平坦状の表面にはっ水リングやはっ水枠を載置（定着）したものでもよい。前者に比べて後者のはっ水リングやはっ水枠を用いた形成方法の方が極めて容易に作成でき、液滴の容量調整も容易に行うことができるという利点がある。さらに、はっ水機能を付与するはっ水ペンでガラスプレートに円や枠を描画して（＝はっ水処理剤塗布にて処理する）液滴を滴下する領域を形成するようにしてもよい。
【００２６】
前記はっ水リング等は、耐アセトン性を有し、電界印加環境に影響を与えない樹脂から形成されるものである。したがって、ガラスプレート上のはっ水リング等の内側部に滴下された液滴は、良好なドーム形状を形成し、その最大高さ（頂点位置）が一定となるため、液滴の底面の径寸法のばらつきを抑制することができ、液滴の頂点位置と電極との間の距離のばらつきも抑制することができる。
ここで、はっ水リング等は、その材質としての電界印加環境に影響を与えない樹脂の例示として、ポリビニル系、ポリ塩化ビニル系、シリコーン系又はフッ素系から１つ選ばれる樹脂を挙げることができる。また、はっ水リングのリング内側部に滴下された液滴に対してリング幅が０．５〜５ｍｍ、リング内径が５〜２５ｍｍであることを挙げることができる。また、長方形のはっ水枠を採用することが可能なため、その滴下する液滴は、５〜１０００μＬとなる。
【００２７】
また、反応場に臨ませる注入管７及び排出管５の本数及び配置は、特に限定するものではないが、図３に示すようにそれぞれ１本ずつ設けてもよいが、図４に示すように注入管７は中央部に１本設け、排出管５は１本、又は注入管７の周囲に複数本設けることが好ましい。
【００２８】
洗浄液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。このＰＢＳとしては、種々な組成のものがあり、カリウムを含む一例をあげると、ＮａＣｌ，ＫＣｌ、ＮａＨＰＯ4，ＫＨ2ＰＯ4を配合してなるものがあるが、カルシウムやマグネシウムを含む組成もある。
【００２９】
次に、本発明の電界洗浄を用いた迅速免疫染色法について図７に示す比較対照表を用いて説明する。
本発明の電界免疫組織染色技術の工程は、「５」と「７」が電界撹拌装置を用いて行う処理である。そのため、「６」のＰＢＳ洗浄の時に一度、試料が搭載されているスライドガラスを装置の外に出す必要がある。狙いは「５」〜「７」まで装置内で完了することである。
なお、工程「５」電界撹拌では上部に配置する電極形状は、平板電極、平板円盤電極、環状電極を採用し、電極形状が環状でも電界撹拌が成し得るかを確認した。これにより電界撹拌並びに洗浄にも同一の電極を用いることができ、装置を簡素化できることが確認された。
工程「６」〈電界洗浄技術〉電界撹拌印加中（０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、０．1〜３００Ｈｚ，２５０秒）に、環状電極の貫通穴より排出管をガラスプレート上の液滴に差し込み、溶液をポンプを用いて排出し、洗浄工程を完了する場合、ここで工程「７」の処理に移行してもよい。染色発色品位を高める場合には、貫通穴よりＰＢＳ洗浄液を注入管にて注入した後、電界撹拌（０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、０．1〜３００Ｈｚ，３０〜６０秒）し、その後、貫通穴から排出管をガラスプレート上の液滴に差し込み、溶液をポンプを用いて排出し、工程「７」へ移行する。（また、排出管１本、注入管２本を貫通穴から差し込み、排出と注入を同時に行うことによって、洗浄工程の時間を短縮化するようにしてもよい。）上記工程を１〜３回行うことで、非特異発色が発生しない免疫染色が得られる。即ち電界洗浄技術を導入することによって、免疫染色技術の迅速化及び自動化が可能になる。
なお、この電界洗浄技術は、免疫組織染色に限らず、核酸におけるハイブリダイゼーション工程にも適用可能であり、加えて抗原抗体反応においても適用可能である。
【００３０】
なお、本発明の電界洗浄方法を用いて、自動電界免疫組織染色方法を実施するには、以下に説明する電界賦活化工程、電界賦活化機構を実施することが望ましい。特にこの電界賦活化は脳腫瘍のような反応性の低い抗原に用いると有効である。
この電界賦活化工程（機構）は、１次・２次抗原抗体反応工程前に抗原に交流高電界を非接触に与えて、元来マイナスの電荷を有する抗原を賦活化（活性化）させ、抗原と抗体との接触頻度を向上させて染色の均一化と迅速化を図る工程（機構）である。
即ち本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色方法（装置）における電界非接触撹拌法による反応場の様子は図９に示すとおりであるが、その免疫染色メカニズムの特徴は、〔１〕撹拌により粒子速度が加速され、抗原と抗体の接触頻度が向上することで免疫染色反応が時短化される。〔２〕電界撹拌による溶液の温度上昇はない（図１０に示すように）ということである。そのため、室温で使用する限りタンパク質変性による非特異反応は生じ難い（タンパク質や組織の変性の恐れは無い）。
図２に示すように１次・２次抗原抗体反応工程前に抗原に交流高電界を非接触に与えて、マイナスの電荷を有する抗原を賦活化させる時間は３０秒〜３分とすることで反応性が１０〜３０％程度向上する。
印加電界強度の主電圧としてプラス側に０．４〜２ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜１ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、周波数０．１〜８００Ｈｚにて活発に応答する周波数の高電圧交流電界を与える。
【００３１】
前述の電界を反応場に与える電極としては、板状電極又は円板電極を用いることができる。前記電界洗浄で用いる環状電極の孔を塞いで板状とした状態で用いてもよい。
電極の厚さは４〜１０ｍｍ、材質は良導電材料の銅、アルミ合金などが用いられる。
なお、抗原を固定する基板の一例としては、通常の２６×７６×０．８ｍｍ大のスライドガラスを用い、はっ水フレームとしては、２穴型の内径形状が１０〜２０ｍｍ以下の貫通穴を有し、樹脂部の幅は０．５〜３ｍｍ以下、スライドガラスへ張りやすく、幅２〜３ｍｍを推奨する。また厚みは０．１５〜０．３ｍｍの２穴タイプはっ水リングを用いる。
【実施例】
【００３２】
〈現状工程（比較例）〉
（Ａ）一次抗体滴下後  手動電界撹拌装置に試料を投入
→（Ｂ）一次抗体を電界撹拌
→（Ｃ）装置よりスライドガラスに配置されている試料を搬出
→（Ｄ）ＰＢＳ洗浄（技師）
→（Ｅ）手動電界撹拌装置にスライドガラスに配置されている試料を搬入後、二次抗体を滴下
→（Ｆ）二次抗体を電界撹拌
→（Ｇ）装置より試料取り出し
→（Ｈ）ＰＢＳ洗浄（用手法洗浄）
【００３３】
〈実施例１の工程〉
前記の工程を下記に示す工程に変更し、殆どの工程を自動化し、装置より試料の取り出し投入工程を無くし、作業者の手間を省くと共に良好な染色を得ることを目標とした。
（Ａ）一次抗体を滴下後  電界撹拌装置に試料を設置
→（Ｂ）一次抗体を電界撹拌
→（Ｉ）ＰＢＳ洗浄（電界洗浄：電界撹拌中に抗体液を吸い上げ排出）
→（Ｅ）二次抗体を滴下  電界撹拌に試料を投入
→（Ｆ）二次抗体電界撹拌
→（Ｇ）試料は装置より自動搬出
→（Ｈ）ＰＢＳ洗浄（用手法洗浄）
このように、〈実施例１の工程〉と〈現状工程〉との相違は、現状工程における（Ｃ）装置よりスライドガラスに配置されている試料を搬出する工程、及び（Ｄ）ＰＢＳ洗浄（技師）の工程に代えて（Ｉ）ＰＢＳ洗浄（電界洗浄）を自動にて行った点である。
【００３４】
このように、〈現状工程（比較例）〉では、各工程毎に、一度装置外へ取り出して技師が洗浄作業を行う必要があり、人手を要してしまうため、煩雑な病理現場では極めて問題である。これに対して〈実施例１の工程〉では（Ｂ）から（Ｇ）までを装置内で電界洗浄を実施でき、洗浄工程の迅速化及び自動化を達成できることが確認した。
【００３５】
なお、前記工程における詳細な条件については、以下の通りである。
・一次抗体滴下後の電界撹拌条件：
はっ水リング φ２０ｍｍにて形成した液滴反応場に、一次抗体を滴下し、図１の電界洗浄装置を用いて４ｋＶ、オフセット２ｋＶ、１〜５０Ｈｚ、矩形波、４分３０秒、の条件で電界撹拌を行った。その後、同条件の電界撹拌中の液滴から排出管を用いて試験溶液を排出した。
・ＰＢＳ洗浄条件：
ＰＢＳ洗浄液４００〜６００μＬを注入管を用いて液滴反応場に注入し、電界撹拌４ｋＶ、オフセット２ｋＶ、１〜５０Ｈｚ、３０秒間後に排出した。電界洗浄時間〈回数〉については３０秒 ×１回でも ×２回でも、有為な差異は認められなかった。
・二次抗体滴下後の電界撹拌条件：
２次抗体を滴下し、４ｋＶ、オフセット２ｋＶ、１〜５０Ｈｚ、矩形波、５分の条件で電界撹拌を行った。その後、同条件の電界撹拌中の液滴から２次抗体液を排出管を用いて試験溶液を排出した。
その結果は、図８に示すように〈現状工程〉と同様の良好な染色性が得られた。
【００３６】
本発明の電界洗浄方法を用いて、自動電界免疫組織染色方法を実施する際の基本プロトコールを表１に示す。また、表２には、研究背景となった免疫染色プロトコールを示す。
【表１】
2014160061.tif 000003
【表２】
2014160061.tif 000004
【００３７】
上表１，２より明らかなように、従来法では、この免疫染色に合計１５１分を要していたが、本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色方法（装置）では、合計２４分でこの免疫染色処理が完了し、迅速化が確認された。
詳しい内訳は、従来法では、それぞれ６０分程度、或いはそれ以上の時間を要していた一次抗体（１次抗原抗体反応）、二次抗体（２次抗原抗体反応）のそれぞれの工程が、本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色装置における一次抗体、二次抗体の工程では、それぞれ５分に短縮できた。
また、１次・２次抗原抗体反応後の洗浄工程は、従来法では、それぞれ５分×３であったが、本発明の一次抗体（１次抗原抗体反応）の後の洗浄工程（電界ＰＢＳ洗浄）では３０〜６０秒であり、二次抗体（２次抗原抗体反応）の後の洗浄工程（電界ＰＢＳ洗浄）では１分であった。
【００３８】
図１１に示すように１次・２次抗原抗体反応工程前に抗原に交流高電界を非接触に与えて、マイナスの電荷を有する抗原を賦活化させる時間を３０秒〜３分にすることで反応性が１０〜３０％程度向上した。
印加電界強度の主電圧としてプラス側に０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、これにオフセット電界強度０．１５〜０．７ｋＶ／ｍｍを加えることで、プラス側に偏った繰り返し方形波を生成し、周波数０．１〜２０Ｈｚにて３０秒から３分間高電圧交流電界を与える。
なお、ここで用いる電極としては、円板電極や板状電極を用いてもよい。
【００３９】
次に、前記表１に示すプロトコールを用いて本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色方法における各工程について説明する。
本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色方法において、「４」と「８」が電界非接触撹拌装置を用いて行う１次・２次抗原抗体反応工程である。そのため、従来は「５」のＰＢＳ洗浄の時に一度、試料が搭載されているスライドガラスを装置の外に出す必要がある。
それに対し、本発明では、電界洗浄を導入することで、「４」〜「９」まで装置内にて実施することができる。「６」はカセットより内因性ペルオキシダーゼ除去液を投入する工程である。
【００４０】
図１２〜１５は、本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色装置の一例であるが、本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫染色方法は、このような装置により実施される。
工程「３」の電界賦活化では、１次・２次抗原抗体反応工程前に抗原に交流高電界を３０秒〜３分非接触に与えて、元来マイナスの電荷を有する抗原を賦活化（活性化）させるが、前述のように板状電極又は円板電極を用いることができる。
工程「４・８」の電界撹拌（１次・２次抗原抗体反応工程）では、上部に配置する電極形状として、中央部に穴３が開いている平板電極４、図１６に示す環状電極１３を採用し、電極形状が環状でも電界撹拌有効に作用する結果を得た。これは、環状電極によって、反応場に電界が集中する部位と電界が弱い（内径部洗浄ノズル挿入部位）とで液滴の挙動が変わり撹拌振動が生じやすいためと考えられる。これにより、電界撹拌にて実施される１次・２次抗原抗体反応工程及び洗浄工程に同一の電極を用いることができ、装置を簡素化できることが確認された。
上部に配置する電極形状は、電界を集中させる凸部１４を中心線に対称状に形成した環状集中型電極１３を用いる場合、中央部に貫通穴３が開いている平板電極、に電界を集中させる凸部１４をはっ水リング９内にたとえば２か所設けることで、液滴の動きを２か所に分けることができる。この効果により、吸引される液滴の高さが低くなり、より電極間距離を狭くすることが、可能となり、電界強度を高くすることができる。また、電界を集中させる凸部１４を２か所以上でもよい。
【００４１】
１次・２次抗原抗体反応における抗原と抗体との接触頻度を考慮すると、抗原は、スライドガラスの上に固定化されているため、抗体が抗原により多く接触させるためにも、液滴の高さを下げる必要がある。また、電界の作用によって、抗体液滴は電極面に引きつけられ、電界作用の無い時には、吸引力がなくなり、スライドガラス方向に液滴は落下する。この動作によって、液滴は撹拌作用を生じる。はっ水リングの機能として、内面は防波堤のように抗体液が外周方向に流れを食い止め、内周方向に跳ね返すことでも乱流が生じ、撹拌機能は発生する。即ち図１７（ａ）は電界が抗体液等に印加され、電極４近傍の液滴が吸引されている様子を示し、図１７（ｂ）は電界が切られ、吸引されていた抗体液等が落下し、はっ水リング９の壁面に液が衝突することで、電極４の中央部に液等が流れ込んでいく様子を示す。また、液滴の動きを２か所以上に分けることで、抗原の移動距離は半分以下になるため、抗原と抗体の出会う距離が半分になるため撹拌の均一性の面から好ましい。また設けることで、抗原抗体反応時間が短くなる。
【００４２】
工程「４・８」の電界撹拌（１次・２次抗原抗体反応工程）では印加中（０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、オフセット電界強度０．１５〜０．３０ｋＶ／ｍｍを加える、０．１〜３００Ｈｚ，３００秒）に２７０秒経過後に環状電極の貫通穴より排出管をガラスプレート上の液滴に差し込み、電界撹拌中に抗体液をポンプにて排出し、洗浄工程を完了する場合、この工程で洗浄工程が完了する場合には、工程「５・９」のＰＢＳ洗浄処理は不要となる。
さらに、抗原の種類によっては染色性が低いものもあるため、その場合には、貫通穴よりＰＢＳ洗浄液を注入管にて注入した後、工程「５・７・９」の電界ＰＢＳ洗浄工程を導入し、非特異発色が発生しない免疫染色が得られる。撹拌（０．４〜１．５ｋＶ／ｍｍ、オフセット電界強度０．１５〜０．７ｋＶ／ｍｍを加える、０．１〜５０Ｈｚ，３０秒）し、その後、貫通穴から排出管をガラスプレート上の液滴に差し込み、溶液をポンプにて排出し、工程「１０」へ移行し、装置からスライドガラスは排出される。このように免疫染色技術の迅速化及び自動化が可能になる。
【００４３】
本発明の電界洗浄を用いた自動電界免疫組織染色方法における、表１中の「５」と「７」が電界撹拌を用いて行う電界ＰＢＳ洗浄工程である。
なお、工程「５」の電界撹拌（電界ＰＢＳ洗浄）工程では、上部に配置する電極形状は、図１４及び図１５に示すように貫通穴３を有する板状電極又は環状電極４であるが、図１６（ａ）に示す電界を集中させる凸部１４を形成させた環状集中型電極１３を用いてもよい。この電界集中型電極１３では、電界を集中させる凸部１４をはっ水リング９に沿った形状にたとえば２か所設けることで、液滴の動きを凸部１４の数と同数の２か所に分けることができる。この効果により、図１６（ｂ）に示すように吸引される液滴の高さが低くなり、より電極間距離を狭くすることが、可能となり、電界強度を高くすることができる。また、電界を集中させる凸部１４を２か所以上６か所以下でもよい。凸部数の数をＮ個とすると６＞Ｎ＞１ここで、Ｎ＝１は環状電極を示す。内径はφ１０＞、外径は２２＜φＤ＜３０ｍｍ。
【００４４】
環状集中型電極の狙いは、１次・２次抗原抗体反応の反応物とＰＢＳとの接触頻度を考慮すると、反応物は、スライドガラスの上に固定化されているため、ＰＢＳが反応物により多く接触させるためにも、液滴の高さを下げる必要がある。また、電界の作用によって、液滴は電極面に引きつけられ、電界作用の無い時には、吸引力がなくなり、スライドガラス方向に液滴は落下する。この動作によって、液滴は撹拌作用を生じる。はっ水リングの機能として、内面は防波堤のように抗体液が外周方向に流れを食い止め、内周方向に跳ね返すことでも乱流が生じ、撹拌機能は発生する。また、液滴の動きを２か所以上に分けることで、ＰＢＳの移動距離は半分以下になるため、反応物とＰＢＳの出会う距離が半分になるため撹拌の均一性の面から好ましい。また設けることで、電界洗浄時間が短くなる。即ち図１８（ａ）は電界が抗体液等に印加され、環状電極１３近傍の液滴が吸引されている様子を示し、図１８（ｂ）は電界が抗体液等に印加され、凸型電極１３に液滴が吸引されている様子を示し、図１８（ｃ）電界が切られ、吸引されていた抗体液等が落下し、はっ水リング９の壁面に液が衝突することで、電極１３の中央部に液等が流れ込んでいく様子を示す。
【００４５】
さらに電極形状として、環状電極を採用すると、電極形状が環状でも電界撹拌が成し得た。これにより電界撹拌並びに洗浄にも同一の電極を用いることができ、装置を簡素化ができることが確認された。またより良い撹拌条件を環状電極に求めると環状電極にも凹凸部を設け電界が集中する箇所を設け電極間ギャップを狭め、電界強度を向上させることが可能となる。
なお、この電界洗浄技術は、免疫組織染色に限らず、核酸におけるハイブリダイゼーシ
ョン工程にも適用可能であり、加えて抗原抗体反応においても適用可能である。
【００４６】
〈実施例２の工程〉
前記の工程を下記に示す工程に変更し、殆どの工程を自動化し、試料の取り出し投入工程を無くし、作業者の手間を省くと共に良好な染色を得ることを目標とした。即ち前記図１２〜１５、図２０に示す自動電界免疫組織染色装置を用いて処理を行った。
（Ａ’）例えば図２１（ｂ）に示すようにスライドガラス上のはっ水リング内にそれぞれ試料と陽性コントロールを固定し、自動電界撹拌装置に設置後、たとえば脳腫瘍の組織のように反応性の低い抗原に対しては電界賦活化を施すと効果的である。
→（Ｃ’）電界ＰＢＳ洗浄（電界洗浄：電界撹拌中に抗体液を吸い上げ排出）
→（Ｄ’）二次抗体を滴下後  電界撹拌  後半より抗体液を排出
→（Ｅ’）電界ＰＢＳ洗浄
→（Ｆ’）試料は装置より自動搬出
このように、〈実施例２の工程〉と〈現状工程〉との相違は、現状工程における（Ｃ）装置よりスライドガラスに配置されている試料を搬出する工程、及び（Ｄ）ＰＢＳ洗浄（装置外に取り出し技師が洗浄）の工程に代えて（Ｃ’）ＰＢＳ洗浄（電界洗浄）を自動にて行った点である。さらに品位向上のために、（Ａ’）電界賦活化を加えた点である。
【００４７】
このように、〈現状工程（比較例）〉では、各工程毎に、一度装置外へ取り出して技師が洗浄作業を行う必要があり、人手を要してしまうため、煩雑な病理現場では極めて問題である。これに対して〈実施例２の工程〉では（Ｂ）から（Ｇ）までを装置が自動運転する。装置内に電界撹拌、電界洗浄を実施でき、洗浄工程の迅速化及び自動化を達成できることが確認した。また、図２１（ａ）に示すようにはっ水リングの内側面に撹拌液がぶつかり跳ね返り、内側に流体が流れることにで、スライドガラスに固定化されている抗原により抗体が接触する頻度が高まる。
【００４８】
なお、前記工程における詳細な条件については、以下の通りである。
・一次抗体滴下後の電界撹拌条件：
はっ水リング内径φ２０ｍｍにて形成した液滴反応場に、一次抗体を２００μＬ滴下し、図１５の電界洗浄装置を用いて４ｋＶ、オフセット２ｋＶ、1〜３０Ｈｚ、矩形波、４分３０秒、の条件で電界撹拌を行った。その後、同条件の電界撹拌中の液滴から排出管を用いて試験溶液を排出した。
・ＰＢＳ洗浄条件：
ＰＢＳ洗浄液４００μＬを注入管を用いて液滴反応場に注入し、電界撹拌４ｋＶ、オフセット２ｋＶ、1〜３０Ｈｚ、３０秒間後に排出した。電界洗浄時間〈回数〉については３０秒 ×１回で有為な差異は認められなかった。
・二次抗体滴下後の電界撹拌条件：
２次抗体を２００μＬ滴下し、４ｋＶ、オフセット２ｋＶ、１〜３０Ｈｚ、矩形波、５分の条件で電界撹拌を行った。その後、同条件の電界撹拌中の液滴から２次抗体液を排出管を用いて試験溶液を排出した。二次抗体の洗浄は２回以上行うことで良好な染色性が得られた。
その結果は、図２３に示すように〈現状工程（比較例）〉と同様の良好な染色性が得られた。即ち同図（ａ）は、従来法で得られた免疫組織染色（９０分）を示し、同図（ｂ）は、本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色方法で得られた免疫組織染色（１０分）を示すが、前述のように従来法では１５１分の処理時間に対し、本発明の電界洗浄方法を用いた自動電界免疫組織染色方法では２２．５分の短時間で処理できたにもかかわらず、むしろ本発明の方が免疫組織染色は明瞭であった。
【００４９】
図１９には、電界を非接触に抗体液に印加すると、発揮する現象についてゼータ電位を評価することで明らかにした。
即ち機械的な振動を生じるボルテックスミキサーにて抗体液を撹拌することにより分散が進行し、ゼータ電位はマイナス方向へシフトする。
一方、電界印加する周波数によっては、抗体液に撹拌振動が生じにくい状態がある。この場合において、抗体の運動は進行していないように観察されるが、通常の静置方法に比べると上記のような電界を印加した方が、染色性が加速することが明らかになっている。すなわち、電界印加によって抗体液が分散を生じるためと考えられる。この現象を明らかにするために、ゼータ電位を用いて評価した。
【００５０】
〈実施例３の工程〉
反応性が高い肺腺癌の組織にて、同様な自動電界免疫組織染色を行った際の条件を表６に示し、その結果を図２２（抗原抗体反応が一次・二次計１０分）に示した。
【表３】
2014160061.tif 000005
【符号の説明】
【００５１】
１  基板（ガラスプレート）
２  液滴（反応場）
３  貫通穴
４  環状電極（上部電極）
５  排出管
６  試薬溶液
７  注入管
８  洗浄液
９  はっ水リング
１０  下部電極
１１  試薬用シリンジ
１２  試薬格納カセット
１３  電界集中型電極
１４  洗浄液供給・排出ユニット
１５  電界撹拌スライドガラス搬送ステージ
１６  陽性コントロール
１７  検体試料；抗原
１８  取り外し用タグ
【図１】
2014160061.tif 000006
【図２】
2014160061.tif 000007
【図３】
2014160061.tif 000008
【図４】
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【図５】
2014160061.tif 000010
【図６】
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【図７】
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【図８】
2014160061.tif 000013
【図９】
2014160061.tif 000014
【図１０】
2014160061.tif 000015
【図１１】
2014160061.tif 000016
【図１２】
2014160061.tif 000017
【図１３】
2014160061.tif 000018
【図１４】
2014160061.tif 000019
【図１５】
2014160061.tif 000020
【図１６】
2014160061.tif 000021
【図１７】
2014160061.tif 000022
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2014160061.tif 000026
【図２２】
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【図２３】
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