(57)【要約】      （修正有）【課題】抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシンの検出法を用いて、ゲノムDNAにおける特定のシトシンのメチル化を選択的に検出し、その定量性および信頼性を向上させる手法を提供する。【解決手段】核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する方法であって、核酸を制限酵素により断片化する工程と、該断片化核酸と、該断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸との間で２本鎖核酸を形成させる工程と、該２本鎖核酸を該固相結合部を用いて固相上に結合させる工程と、該固相上で該２本鎖核酸への抗体の結合量を測定する工程、を有する方法。これにより、測定対象のシトシン以外はすべてグアニンと塩基対を形成し、抗体により検出されず、長大なゲノムから測定対象の塩基配列部分の特定のシトシンのメチル化の有無を選択的に検出する。【選択図】図１
2014176330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する方法であって、
核酸を制限酵素により断片化する工程と、
該断片化核酸と、該断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸との間で２本鎖核酸を形成させる工程と、
該２本鎖核酸を該固相結合部を用いて固相上に結合させる工程と、
該固相上で該２本鎖核酸への抗体の結合量を測定する工程、
を有する方法。
【請求項２】
抗体が抗メチルシトシン抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相結合部がビオチンであり、固相がアビジンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２本鎖核酸への抗体の結合量を、表面プラズモン共鳴法により抗体の結合を検出することによって、測定することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
２本鎖核酸への抗体の結合量を、抗体として西洋わさびペルオキシターゼを標識した抗体を用い、該抗体を結合させた後、該西洋わさびペルオキシターゼの基質を加え、該西洋わさびペルオキシターゼの反応生成物による吸光度変化を検出することによって、測定することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所が脱塩基部位となっている塩基配列を有する１本鎖核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、２本鎖核酸の形成時に、測定対象のシトシンがバルジ構造内に配置される塩基配列を有する１本鎖核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所がアデニン、シトシン、もしくはチミンとなっている塩基配列を有する１本鎖核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸を、測定対象の断片化核酸濃度の１倍以上１００倍以下の量、加えて、２本鎖形成させることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸の塩基配列が、制限酵素で断片化された測定対象の核酸と２本鎖を形成した際に、該２本鎖核酸が平滑末端を形成する塩基配列であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
制限酵素と、測定対象の断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及びビオチンを有する１本鎖核酸と、抗メチルシトシン抗体と、固相化したアビジンを組み合わせて構成される、核酸配列中のメチルシトシン検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する生体分子検出技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティックスの一例であるゲノムのメチル化修飾は、大腸菌から植物、脊椎動物まで広範囲にわたる生物種で見られ、様々な生命現象に関係していることが明らかになりつつある。特に哺乳類では、個体発生や細胞分化、がん化などの観点からも重要な研究領域になってきており、遺伝子のプロモーター領域にあるCpGアイランドのメチル化により、癌抑制遺伝子が不活性化されることがしられている。
【０００３】
ゲノムのメチル化は、具体的には核酸に含まれるシトシンがメチル化されることにより生じる。この核酸中に含まれるシトシンのメチル化状態を検出する方法として、現在、最も一般的に用いられているbisulfite法は、試料となる核酸にbisulfite処理を行なうとメチルシトシンは変換されず、シトシンのみがウラシルに変換されることを利用した方法である(特許文献１及び２)。Bisulfite処理後、PCRを行い、シーケンシングするとウラシルはチミンとして検出され、メチルシトシンはシトシンとして検出される。処理前後で生じるシトシンとチミン(ウラシル)の差異から、メチル化の有無や位置を決定することが出来る。しかしながら、bisulfite法の欠点は、シーケンスの操作が煩雑であることや、完全修飾に長時間の反応時間を要すこと(一般的には十数時間)、またその処理による脱プリン反応が起こったり、サンプルの断片化が進んだりすることが多く、手法の改善が求められている。
【０００４】
これとは別の方法として、抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシンの定量方法が報告されている(特許文献３)。しかしながら、この抗体を用いたメチルシトシンの定量方法では、目的核酸に含まれるメチルシトシンの総量を測定することは可能であるものの、塩基配列のどの位置のシトシンがメチル化されているのかを知ることができない。遺伝子の発現にはシトシンのメチル化頻度とともに、どのシトシンがメチル化されているかが極めて重要である。
【０００５】
近年、本発明者らは、抗メチルシトシン抗体を用いて塩基配列の特定の位置のシトシンのメチル化を選択的に定量する方法を、合成オリゴマーによる実験結果と共に報告した(特許文献４)。この方法は、核酸中の測定対象となる特定の位置のシトシンを、当該核酸が相補鎖とハイブリダイズする際に不対合により形成されるDNAバルジ内に配置させ、当該核酸への抗シトシンもしくは抗メチルシトシン抗体の結合量を測定するものであり、これにより、測定対象のシトシンがメチル化しているか否かを判別することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２３８７０１
【特許文献２】特開２００４−００８２１７
【特許文献３】特許３８５４９４３
【特許文献４】特開２０１２−２３００１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の、核酸中の測定対象となる特定のシトシンを当該核酸と相補鎖とのハイブリダイズの際に形成されるDNAバルジ内に配置させ、当該核酸への抗体の結合量を測定することにより、測定対象のシトシンがメチル化しているか否かを判別する方法は、合成したオリゴマーでの実験に於いては当該シトシンのメチル化を良好に検出できるものの、このままでは、実際の分析対象となるゲノムDNAを用いた場合には、特定のシトシンのメチル化を検出することは困難である。これは、ゲノム試料中には、目的とする塩基配列以外のDNAが多量に存在するため、相補鎖とハイブリダイズする領域以外にメチル化したシトシンが存在する可能性があり、このようなメチル化シトシンにも上記抗体が結合するため、特定部位のメチル化シトシンのみを選択的に検出することが困難なためである。
本発明は、上記発明が有するこの欠点を解消し、抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシンの検出法を用いて、ゲノムDNAにおける特定のシトシンのメチル化を選択的に検出し、その定量性および信頼性を向上させる手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、以下の様にして、ゲノムDNAにおける特定のシトシンのメチル化を選択的に検出することに成功した。
先ず、測定対象のゲノムDNA試料に制限酵素を加えることにより、DNAを断片化した。生成するそれぞれのDNA断片の核酸配列は、用いる制限酵素によって定まる。これにより、測定対象の特定の位置のシトシンを含む、特定の配列からなる測定対象核酸を、ゲノムからその断片として切り出すことができる。
なお、従来、DNAの断片化では、超音波などが用いられてきたが、このような方法では、不特定多数の断片が発生するため、後に特定の配列を増幅させるPCR法などでは特段問題にならないものの、以下に述べるとおり、測定対象核酸と相補性を有する核酸を検出試薬として用いる、本発明のメチルシトシン検出法には適していない。
その後、測定対象核酸と、測定対象のシトシンが塩基対を形成すべき塩基以外が当該測定対象核酸と相補的な配列を有する１本鎖核酸とを混合し、ハイブリダイズさせて、２本鎖DNAを形成させた。
当該１本鎖核酸の塩基配列は、測定対象核酸と２本鎖を形成出来る相補性と長さを有しつつ、測定対象シトシンとは塩基対を形成しない配列とする。また、形成する２本鎖DNAの末端に不対塩基が残らないように、制限酵素による切断によって生じる測定対象核酸の末端配列を考慮して設計する。
その後、形成された２本鎖DNAを、１本鎖核酸に設けた固相結合部を介して、固相に結合させることにより、固相上に回収した。残りのDNA断片は、洗浄により除去する。
その後、固相上に結合された２本鎖DNAを抗体と反応させた。
相補核酸と２本鎖を形成することにより、測定対象核酸の非測定対象位置にメチルシトシンが存在していたとしても、当該メチルシトシンはグアニンと塩基対を形成することで抗体に認識される可能性が大幅に減少する。一方、塩基対を形成していない測定対象位置のメチルシトシンは、高効率の抗原抗体反応により認識される。これによって、選択的にゲノムDNAにおける特定シトシンのメチル化状態を検出することができた。
【０００９】
本発明の各工程について、より詳細に説明すると、以下のとおりである。
（１）測定対象である核酸を、制限酵素で切断し断片化する。
特定の塩基配列を認識し、核酸を切断する制限酵素は様々なものが知られているが、測定対象となる塩基配列を挟むように切断される制限酵素を選択する。なお用いる制限酵素は１つでも良いし、２つの組み合わせでも良い。
（２）目的とする塩基配列と２本鎖を形成しつつ測定対象のシトシンが塩基対を形成しないように設計された塩基配列を有する１本鎖核酸を加えてハイブリダイゼーションを行う。
通常、ゲノムDNAは生体内では２本鎖を形成している。このため１本鎖核酸を加えた後、断片化された核酸の融解温度以上に一旦加熱し１本鎖とし、再度徐冷することで、１本鎖核酸とハイブリダイゼーションさせることが望ましい。さらに、１本鎖核酸と高効率にハイブリダイゼーションさせるために、１本鎖核酸を測定対象核酸に対し過剰に加えることが好ましい。さらに、１本鎖核酸の塩基配列は、形成される２本鎖DNAの末端に不対塩基が残らないように、制限酵素との組み合わせを考慮して設計する。なお、上記１本鎖核酸は、後ほど固相上に回収するために固相結合部も併せ持つようにする。
（３）測定対象とハイブリダイゼーションした固相結合部を有する２本鎖核酸を、固相結合部を利用して回収する。
回収する際には、その後の検出法に合わせた固相を用意しておくとよい。例えば、表面プラズモン共鳴法では、金や銀薄膜上へ回収することが望ましい。マイクロタイタープレートのウエルへ回収し、酵素免疫測定法として検出しても良い。基板のような平坦のものだけでなく、ポリスチレンや磁性を有する粒子上に回収しても良い。
（４）抗体を導入し、結合した抗体量を検出することにより、シトシンのメチル化率を測定する。
例えば抗メチルシトシン抗体を加えるのであれば、測定対象のシトシンがメチル化されていれば、２本鎖核酸へ抗メチルシトシン抗体が結合することになる。表面プラズモン共鳴法では、抗体を酵素や蛍光体で標識することなく、屈折率の変化から検出することが可能である。また、従来のイムノアッセイ法に用いられてきた一般的手法を幅広く用いることが可能である。当業者には自明であるが、例えば、抗体を酵素や蛍光体、放射性同位体、金属ナノ粒子で標識する方法がある。また、これら標識した２次抗体を導入しての検出も可能である。
【００１０】
すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
〈１〉核酸中に含まれる特定の位置のシトシンのメチル化状態を検出する方法であって、
核酸を制限酵素により断片化する工程と、
該断片化核酸と、該断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸との間で２本鎖核酸を形成させる工程と、
該２本鎖核酸を該固相結合部を用いて固相上に結合させる工程と、
該固相上で該２本鎖核酸への抗体の結合量を測定する工程、
を有する方法。
〈２〉抗体が抗メチルシトシン抗体であることを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈３〉固相結合部がビオチンであり、固相がアビジンであることを特徴とする、〈１〉または〈２〉に記載の方法。
〈４〉２本鎖核酸への抗体の結合量を、表面プラズモン共鳴法により抗体の結合を検出することによって、測定することを特徴とする、〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の方法。
〈５〉２本鎖核酸への抗体の結合量を、抗体として西洋わさびペルオキシターゼを標識した抗体を用い、該抗体を結合させた後、該西洋わさびペルオキシターゼの基質を加え、該西洋わさびペルオキシターゼの反応生成物による吸光度変化を検出することによって、測定することを特徴とする、〈１〉〜〈３〉に記載の方法。
〈６〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所が脱塩基部位となっている塩基配列を有する１本鎖核酸を用いることを特徴とする、〈１〉〜〈５〉に記載の方法。
〈７〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、２本鎖核酸の形成時に、測定対象のシトシンがバルジ構造内に配置される塩基配列を有する１本鎖核酸を用いることを特徴とする、〈１〉〜〈５〉に記載の方法。
〈８〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列として、測定対象のシトシンと塩基対を形成するべき箇所がアデニン、シトシン、もしくはチミンとなっている塩基配列を有する１本鎖核酸を用いることを特徴とする、〈１〉〜〈５〉に記載の方法。
〈９〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸を、測定対象の断片化核酸濃度の１倍以上１００倍以下の量、加えて、２本鎖形成させることを特徴とする、〈１〉〜〈８〉のいずれかに記載の方法。
〈１０〉断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及び固相結合部を有する１本鎖核酸の塩基配列が、制限酵素で断片化された測定対象核酸と２本鎖を形成した際に、該２本鎖核酸が平滑末端を形成する塩基配列であることを特徴とする、〈１〉〜〈９〉に記載の方法。
〈１１〉制限酵素と、測定対象の断片化核酸とハイブリダイズするが、該断片化核酸内の特定の位置のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列及びビオチンを有する１本鎖核酸と、抗メチルシトシン抗体と、固相化したアビジンを組み合わせて構成される、核酸配列中のメチルシトシン検出用キット。
【発明の効果】
【００１１】
従来の、核酸中の測定対象となる特定のシトシンを当該核酸と相補鎖とのハイブリダイズの際に形成されるDNAバルジ内に配置させ、当該核酸への抗体の結合量を測定することにより、測定対象のシトシンがメチル化しているか否かを判別する方法では、相補鎖と不対合のメチルシトシンはすべて抗メチルシトシン抗体により認識されてしまうため、実際の分析対象となるゲノムDNAなどのDNA試料での特定のシトシンのメチル化の選択的な検出は困難であり、産業上の利用価値に乏しかった。
本発明により、測定対象のシトシン以外はすべてグアニンと塩基対を形成することとなり、これによって非測定対象のメチルシトシンは検出されないこととなったため、長大なゲノムから測定対象の塩基配列部分の特定のシトシンのメチル化の有無を選択的に検出することが可能になった。これにより、従来の抗メチルシトシン抗体を用いたメチルシトシン検出技術に比べ、シトシンのメチル化の検出の選択性は大幅に向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明により、測定対象領域を含む核酸を制限酵素により断片化した後、測定対象領域の核酸断片をビオチン化された１本鎖核酸とハイブリダイズさせて回収し、測定対象の特定のシトシンを抗メチルシトシン抗体で検出する手順を示す模式図である。
【図２】本発明における抗原抗体反応の測定を、表面プラズモン共鳴法を用いて行う際の、センサの作製手順を示す模式図である。
【図３】本発明における抗原抗体反応の測定を、表面プラズモン共鳴法を用いて行う際の、測定手順を示す模式図である。
【図４】実施例１における、メチル化DNAおよび非メチル化DNAの表面プラズモン共鳴角度の測定結果を対比した図である。
【図５】実施例２における、各種相補核酸を用いた、メチルシトシンの表面プラズモン共鳴角度の測定結果を対比した図である。
【図６】実施例３における、DNAのメチル化率を酵素免疫測定法によって測定した結果を示す図である。
【図７】実施例４における、測定対象核酸に対する相補核酸の量を変化させた際の酵素免疫測定法による応答を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における、核酸配列中の特定の位置のシトシンのメチル化状態の測定手順を図１に示す。
本発明では、ゲノム中の測定対象となる塩基配列を有する核酸(図１-１)のみを選択的に測定するにあたり、先ず制限酵素によりゲノムDNAを任意の位置で切断する。用いる制限酵素は、測定対象領域の塩基配列に合わせて適宜選択することが可能である。例えば、AluI酵素では、5’-AGCT-3’のみを認識し、G-C間の核酸を切断することが知られている。制限酵素により、測定対象領域の塩基配列の断片を作製する(図１-２)。制限酵素の選択により、測定対象領域の塩基配列が定まる。
次にビオチン化した１本鎖核酸を加える(図１-３)。ビオチンは固相結合部として用いている。該ビオチン化核酸の塩基配列は、制限酵素により断片化された測定対象領域の核酸と２本鎖を形成できる相補性を有しつつ、測定対象のシトシンとは塩基対を形成しない塩基配列となっている。このような塩基配列としては、例えば、測定対象核酸の完全相補鎖である塩基配列から、測定対象のシトシンと塩基対を形成するグアニンのみを除去した塩基配列が挙げられる。この場合、形成される２本鎖DNAでは、測定対象シトシンは、DNAバルジ内に配置されることになる。また、同様のことは、完全相補鎖内の測定対象のシトシンと塩基対を形成するグアニンを、シトシンやアデニン、チミンと置き換えることでも可能である。この場合、形成される２本鎖DNAでは、測定対象シトシンは塩基対を形成できない状態となっている。また、完全相補鎖内の測定対象のシトシンと塩基対を形成するグアニンの塩基部位のみを除去してデオキシリボースを残し、脱塩基部位とすることも可能である。この場合も、形成される２本鎖DNAでは、測定対象シトシンは塩基対を形成できない状態となっている。
さらに、該ビオチン化核酸の塩基配列は、測定対象核酸と２本鎖を形成した際に、２本鎖核酸の末端を揃えることで不対塩基が存在しない平滑末端と呼ばれる状態にせしめることが好ましい。平滑末端にするには、制限酵素の切断箇所と、ビオチン化した１本鎖核酸の塩基配列を合わせることにより可能である。平滑末端が好ましい理由としては、２本鎖核酸の末端に飛び出した不対塩基中にメチルシトシンが存在すると、そのメチルシトシンに抗体が結合し、実際のメチル化率よりも高値になるためである。仮に２本鎖核酸の末端に不対塩基が存在したとても、その不対塩基がメチルシトシンでなければ抗メチルシトシン抗体に認識されないので直接問題とはならない。しかしながら、上述したように制限酵素と、ビオチン化した１本鎖核酸の塩基配列の組み合わせにより、平滑末端を形成することは比較的容易であり、２本鎖DNAの末端に不対塩基がないことが好ましい。
さらに、該ビオチン化核酸は、断片化された測定対象核酸の濃度と同じ、もしくは多くする方が好ましい。これは、測定対象核酸が、元々２本鎖を形成していた核酸と、再ハイブリダイゼーションする確率を減らすためである。しかしながら、大過剰に加えると、後に固相上での回収率が低下するため好ましくない。このため、加えるビオチン化核酸は、断片化された測定対象核酸の１〜１００倍程度が好ましい。
測定対象核酸とビオチン化した１本鎖核酸をハイブリダイゼーションさせる(図１-４)。ハイブリダイゼーションさせる方法としては、一旦、測定対象となる断片化核酸の融解温度(Tm値と呼ばれる)以上に加熱し、その後徐冷する。徐冷の際には、Tm値付近で30分程度保持することにより、ハイブリダイゼーションの特異性が向上する。
その後、ビオチン化した１本鎖核酸とハイブリダイゼーションした測定対象核酸をアビジン−ビオチン結合を用いて回収する(図１-５)。ビオチンとアビジン(およびストレプトアビジン)は強固に結合することが知られている。アビジンは、後の測定方法に合わせて、予め固相表面に固定化しておくと便利である。例えば表面プラズモン共鳴法では、金薄膜表面にアビジンを固定化する。酵素免疫測定法は、ポリスチレンやポリビニルクロライド製のマイクロタイタープレートのウエル内に固定化する。また、アビジンを固定化した磁性ビーズを用いる方法も広く知られている。なお、アビジンの固定化方法については従来知られている手法を幅広く用いることが出来る。
上記、アビジン固定化基板上に、測定対象核酸とハイブリダイズしたビオチン化核酸を含む核酸混合物を導入することにより、アビジン−ビオチン結合によって、測定対象核酸のみが選択的に基板上に固定化される。その後、基板を洗浄することにより、ビオチン化した核酸とハイブリダイゼーションしていない、非測定対象核酸は除去される。
その後、ビオチン化核酸とハイブリダイズし、基板上に固定化された測定対象核酸に、抗メチルシトシン抗体を結合させる(図１-６)。表面プラズモン共鳴法では、抗体の結合による屈折率変化を観測するので、抗メチルシトシン抗体は標識する必要はなく、そのままで検出可能である。酵素免疫測定法では、予め抗メチルシトシン抗体を西洋わさびペルオキシターゼなどの酵素で標識しておくか、２次抗体法により検出する。
【実施例】
【００１４】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
（実施例１）
本実施例では、本発明によってDNA中のメチルシトシンを、表面プラズモン共鳴法により測定可能であることを確認した実験結果を示す。
【００１６】
表面プラズモン共鳴に用いるセンサチップは、流路を形成したポリジメチルシロキサン基板と金薄膜を有するガラス基板を貼り合わせることにより、以下の様に作製した。
ポリジメチルシロキサン基板は、流路(幅3mm、長さ10mm、深さ20μm)の鋳型となる基板にポリジメチルシロキサン(PDMS)のオリゴマー(コーニング社製)と硬化剤を混合し、60℃で2時間放置することにより硬化させた。その後、鋳型からはずし、流路を有するPDMS基板を得た。
金薄膜を有するガラス基板は、以下の様に作製した。18mm角のBK7ガラス基板上に、直径3mmの穴を２つ開けたシールを貼った。その後、マグネトロンスパッタ装置(日本シード社製)を用いて、該ガラス基板上にチタンを3nm堆積させた後、さらに金薄膜を50nm堆積させた。マグネトロンスパッタ装置から取り出した後、シールを剥がすことにより、直径3mmの金薄膜を２つ有するガラス基板を作製した(図２-１)。
金薄膜表面へのアビジンの固定化は、以下の様に行った。まず、エタノールにカルボン酸デカンチオールを溶解させて1mM溶液を作製した。該溶液に金薄膜を有するガラス基板を一晩浸漬することにより、金―チオール結合により、金表面をカルボン酸デカンチオールで修飾した(図２-２)。その後、5mMのN-ヒドロキシスルフォスクシンイミドと40mMのN,N’-diisopropylcarbodiimideを含むMESバッファ(pH6.0)を5μL、金薄膜の一方にのみ滴下し、室温で30分反応させることで、カルボン酸デカンチオールのカルボキシル基を活性化した。その後、純水で金薄膜を洗浄し、0.1mg/mLのストレプトアビジン(リン酸緩衝液,pH7.4で希釈)を室温で二時間反応させた(図２-３)。純水で洗浄後、1Mエタノールアミン(リン酸緩衝生理食塩水,pH7.4で希釈)を室温で15min反応させ不活化後、純水で洗浄した。最後に、流路を形成したポリジメチルシロキサン基板と金薄膜を有するガラス基板を貼り合わせることにより、センサ化した。
【００１７】
メチル化したゲノムDNAの断片化試料は、以下の様に調製した。λDNA(タカラバイオ社、code No.3010、約48000bp)を用いた。λDNA(原液0.34μg/μL)440μLを採取し、制限酵素としてAluI(タカラバイオ社)を10μLと制限酵素に付属の10×bufferを50μL入れる。その後、37℃で4時間反応させることにより、λDNAを断片化した。その後、CpG領域にあるシトシンをメチル化する酵素(M.SssI、ニューイングランドバイオラボ社)を2μL(8unit)と、S-adenosylmethionine(原液32mM)を10μLいれて、一晩反応させる。本酵素処理したλDNAをCpG領域がメチル化したDNAとして扱った。当該DNAの配列は、5’-CTTTCCCGGAATTACGCCCAGATGAG-3’(5’末端から15塩基目のCはメチルシトシン)(配列番号１)である。なお、測定対象のCpG領域が99％以上メチル化していることを、従来法としてCombined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA法)を用いて確認した。
一方、CpGがメチル化されてないλDNAとしてUnmethylated λDNA(プロメガ社、カタログ番号D1521)を用い、同様に断片化試料を調製した。本λDNAはdamおよびdcmメチラーゼ活性が欠損しており、メチルシトシンを含んでいないものとして販売されているものである。
なお、本発明者らも、このλDNAを用いて調製した断片DNAにおいては、測定対象のCpG領域のメチル化が1％以下であることを、COBRA法で確認している。
【００１８】
測定は以下の様に行った。上記で作製したセンサチップを表面プラズモン共鳴センサ(NTTアドバンステクノロジ社)にマッチングオイルを介して取り付けた。その後、シリンジポンプ(CMA社)を用いてセンサに試料を導入した。なお本測定ではリン酸緩衝液(0.1％ウシ血清アルブミン,0.05％ Tween20を含む)を用いている。先ず、測定対象の断片化λDNAとビオチン化核酸の終濃度が935pMになるように混合した。なお、本実施例で用いたビオチン化核酸の塩基配列は、5’-CTCATCTGGGCTAATTCCGGGAA AG-3’(配列番号２)であり、測定対象のDNAの配列の5’末端から15塩基目のCに対応する塩基が欠如している以外は、測定対象のDNAの配列と完全に相補的な配列であり、5’末端にビオチンを有するものである。95℃で5分間加熱後、徐冷して室温にした(図３-１)。
リン酸緩衝液を用いて10倍希釈系列を作製し、希釈した試料を流速2μL/分で30分間導入することにより、ビオチン化核酸をセンサ内のストレプトアビジンで捕捉した(図３-２)。なお、センサの一方にのみストレプトアビジンを固定化しておくことで、ストレプトアビジン固定化金薄膜表面のみでビオチン化核酸を捕捉可能である。
ランニングバッファとして、リン酸緩衝液(0.1％ウシ血清アルブミン,0.05％ Tween20を含む)をセンサに15分間導入し、洗浄してセンサの応答を安定させた後、10μg/mLの抗メチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社)を導入し、センサ内に捕捉されたビオチン化核酸への抗体の結合量を表面プラズモン共鳴角度の変化として観測した。なお、センサの一方にのみストレプトアビジンを固定化してあるため、ストレプトアビジンが固定化されていない金薄膜表面での表面プラズモン共鳴角度の変化を、測定対象核酸以外による非特異吸着量として考えることができる。このストレプトアビジンを固定化していない表面は必須ではないが、これを用いることで、非特異吸着量を測定時に簡便に見積もることができる。
【００１９】
図４に測定結果を示す。CpG領域をメチル化したλDNAでは、試料濃度の増加に伴い表面プラズモン共鳴角度の変化量が増加していることがわかる。しかしながら、非メチル化DNAでは表面プラズモン共鳴角度の変化は小さい。これらは、抗メチルシトシン抗体の導入により、抗メチルシトシン抗体がビオチン化核酸とハイブリダイゼーションした測定対象核酸のメチル化シトシンに結合し、金薄膜表面の屈折率が上昇したためである。このように、本発明の方法ではゲノムDNA中のシトシンがメチル化しているか否かを計測可能である。
【００２０】
（実施例２）
本実施例では、本発明で用いるビオチン化核酸ついて、測定対象のシトシンと塩基対を形成しない塩基配列にすることが適していることを示す。
【００２１】
DNAの調製は以下の様に行った。測定対象核酸として5’-TTG CGC GGC GTC CGT CCT GTT
GAC TTC-3(5’末端から13塩基目のCはメチルシトシン)(配列番号３)を用いた。この測定対象核酸と以下の6種類のビオチン化核酸とを、実施例1と同様の手順で、おのおのハイブリダイゼーションさせた。
5’-GAA GTC AAC AGG AC  GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号４)では、測定対象シトシンはバルジ内に配置されるように設計されている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACA GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号５)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がAとなってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACT GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号６)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がTとなってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACC GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号７)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がCとなってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACd GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号８)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基が脱塩基部位(AP siteと呼ばれる)となってミスマッチになっている。
5’-GAA GTC AAC AGG ACG GAC GCC GCG CAA-3’(配列番号９)では、測定対象シトシンと塩基対を形成すべき塩基がGとなって、完全相補鎖になっている。
【００２２】
本実施例では、表面プラズモン共鳴測定器として、Biacore T100(GEヘルスケア社)とストレプトアビジンが固定化されたセンサチップ(Sensor chip SA,GEヘルスケア社)を用いた。
まず、２本鎖を形成させた1nMのDNAを30分間,10μL/分でセンサチップへ送液することでセンサ表面に捕捉した。その後、各種濃度(0.25，0.5，1，2.5，5，10，25，50nM)の抗メチルシトシン抗体を10分間，10μL/分で送液した。なお、ランニングバッファとして、GEヘルスケア社のHBS-EPバッファ(pH7.4，10mM HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.05％v/v Surfactant P20を含む)を用いた。その後、抗体を含まないバッファを5分間，10μL/分で送液した。その後、再生溶液として、50mM Gly-NaOH(pH10.6)を30秒，60μL/minで送液した。本再生溶液の条件では、DNAの２本鎖は維持しつつ、抗原抗体反応が解離することを確認してあり、繰り返し抗体の送液が可能である。
【００２３】
図５に測定結果を示す。メチルシトシンがバルジ内に配置されている場合に最も大きなレスポンスが得られた。また、メチルシトシンと塩基対を形成すべき箇所が脱塩基部位(AP siteと呼ばれる)である場合にも、大きなレスポンスが得られた。これらに対し、完全相補鎖の２本鎖に対しては、抗メチルシトシン抗体の結合は全く見られなかった。メチルシトシンと塩基対を形成すべき箇所が、アデニンやシトシン、チミンである場合に於いても若干のレスポンスを得ることが可能であり、これらも本発明に適用可能であることがわかった。
本実施例の結果は、本発明で用いるビオチン化核酸の塩基配列は、測定対象のシトシンと塩基対を形成しない塩基配列を有することが必要であることを明確に示している。
【００２４】
（実施例３）
本実施例では、本発明の方法によってDNA中のシトシンのメチル化率を、酵素免疫測定法により測定可能であることを確認した実験結果を示す。
【００２５】
測定対象DNAとしてλDNAを断片化して、用いた。すべてのCpG領域がメチル化されているDNA試料を、実施例１と同様に酵素によりメチル化を行うことにより調製した。また、すべてのCpG領域がメチル化されていないDNA試料として、実施例１と同様に、Unmethylated λDNA(プロメガ社、カタログ番号D1521)を断片化して、用いた。これらを混合することにより、メチル化率が、0，25，50，75，100％となるDNA試料サンプルを作製した。これらのDNAに実施例１と同じビオチン化核酸を混合し、95℃で5分間加熱後、徐冷して室温にした。
【００２６】
酵素免疫測定法は以下の様におこなった。ストレプトアビジンコート済みプレート(住友ベークライト)を準備し、各ウエルに200μLずつDNA試料を導入した。300μLのバッファ(リン酸緩衝生理食塩水，pH7.4、0.05％ tween20を含む)で3回洗浄し、1μg/mLの西洋わさびペルオキシターゼ標識の抗メチルシトシン抗体を50μLずつ加え、シールをして37度で30分反応させた。300μLのバッファで4回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液(Bethyl Laboratories社)を50μL加え、遮光して10分間反応させた。2N塩酸溶液を50μL加えて反応を停止させ、マイクロプレートリーダー(BioRad model 680)で450nmの吸光度を計測した。
【００２７】
図６に測定結果を示す。メチル化率の上昇に伴い、吸光度の増加が確認された。これにより、本発明によって、DNA中のシトシンのメチル化率を酵素免疫測定法により測定可能であることがわかった。
【００２８】
（実施例４）
本実施例では、本発明の方法においては、ビオチン化１本鎖核酸を、測定対象となる核酸断片濃度の１倍以上100倍以下の量、加えることが適当であることを示す。
【００２９】
測定対象DNAとして5’-CTTTCCCGGAATTACGCCCAGATGAG-3’(5’末端から15塩基目のCはメチルシトシン)(配列番号１)を用いた。本測定対象と完全相補鎖であるDNA(5’-CTCATCTGGGCGTAATTCCGGGAAAG-3’)(配列番号１０)を同濃度(1nM)で混合し、95℃で5分間加熱後、徐冷して室温にすることで、完全相補鎖の２本鎖を形成させた。上記２本鎖DNAに終濃度が0，0.5，1，5，10，50，100nMとなるようにビオチン化核酸(5’-(biotin)CTCATCTGGGCTAATTCCGGGAA AG-3’、測定対象DNAの5’末端から15塩基目のCに対応する相補塩基Gが欠如(配列番号２))を加え、再度95℃で5分間加熱後、徐冷して室温にすることで、メチルシトシンを有する測定対象DNAとビオチン化核酸とをハイブリダイゼーションさせた。その後、実施例３と同様に酵素免疫測定法により測定を行った。
【００３０】
測定結果を図７に示す。測定対象核酸に対するビオチン化核酸の量を増やすことにより、より大きなレスポンスが得られる。これはビオチン化核酸とハイブリダイゼーションする測定対象核酸の割合が増えるためである。しかしながら、あまり過剰すぎると、ビオチン化核酸の回収率が減少するためレスポンスが減少する。本条件では、測定対象核酸と同濃度から１００倍程度が良好であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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