(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法を提供する。【解決手段】検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原にＳ−エクオールを用いる測定方法、該標準抗原および該標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原にＳ−エクオールを含むキット、および、該標準抗原および該標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原にＳ−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する工程、該工程で得られたエクオールの測定値に基づいて被験者のエクオール産生能を判定する工程を含む、判定方法を提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のエクオール産生能を検査する方法であって、
（１）大豆イソフラボンを摂食させた被験者の尿又は血液を検体として採取する工程、
（２）検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原としてＳ−エクオールを用いた免疫法により、検体中のエクオールを測定する工程、および
（３）前記工程（２）で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する工程、を含む検査方法。
【請求項２】
Ｓ−エクオールに対する交差性を１００％とした場合、ダイゼインに対する交差性が１０％以下、ゲニステインに対する交差性が１０％以下、グリシテインに対する交差性が１０％以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が２０％以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が２０％以下である抗エクオール抗体を一次抗体として使用する、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
検体中のエクオール濃度が６５０ｎｇ／ｍＬ以上である場合に被験者はエクオール産生能を有すると判定する、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
カットオフ値が設定される、請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項５】
検体中のダイゼイン濃度とエクオールの測定値との対比を行わない、請求項１〜４に記載の検査方法。
【請求項６】
検体中のエクオールの測定時間が、３時間以下である、請求項１〜５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
前記標識化抗原の標識物が、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックスおよび金属コロイドからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜６のいずれかに記載の検査方法。
【請求項８】
前記免疫法が、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれかに記載の検査方法。
【請求項９】
前記生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法、その測定のためのキット、および被験者のエクオール産生能を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆中に含まれるイソフラボンが、乳癌、前立腺癌等に対する予防効果（抗エストロゲン効果）を有すること、および更年期障害、閉経後の骨粗鬆症・高脂血症・高血圧症等に対して改善効果（エストロゲン様効果）を有することは、広く知られている。
【０００３】
最近になって、大豆イソフラボンによる直接の臨床効果に加え、該大豆イソフラボンに代わって大豆イソフラボンの活性代謝物であるエクオールが、臨床応用における有効性の鍵を握ると報告されている。すなわち、乳癌、前立腺癌、更年期障害および閉経後の骨粗鬆症に対して、エクオールが有効である旨の報告が種々見られている。
【０００４】
また、エクオールは、腸内細菌によって生成されるため、腸内の菌叢によりその生成量に違いがあり、個人差が存在することが報告されている。それゆえ、大豆加工品を摂取しても所望の抗エストロゲン効果、エストロゲン様効果が期待できないヒトが存在することは否めない。
【０００５】
その後、エクオールを効率的に産生する乳酸菌が単離・同定され（特許文献１）、該乳酸菌製剤を経口摂取して乳酸菌を腸内に到達あるいは定着させることにより、エクオールの体内への効率的な取り込みが期待される。この時、例えば尿、血液、糞便等のエクオールを測定することにより、該乳酸菌の腸内への到達あるいは定着の有無を確認することが可能となる。
【０００６】
このエクオールの測定法としては、血液試料では液体クロマトグラフ質量分析装置あるいはガスクロマトグラフ質量分析計を用い、尿試料では高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法等の機器分析を用いる方法が知られているが、より簡便な測定法が期待されている。
【０００７】
また、イムノアッセイによるエクオールの測定法としては、時間分解蛍光イムノアッセイ法を用いたＬａｂｍａｓｔｅｒ  ＴＲ−ＦＩＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｑｕｏｌ（ＬＡＢＭＡＳＴＥＲ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ社）が市販されている（非特許文献１）。
【０００８】
一方、エクオールには、Ｓ−エクオールおよびＲ−エクオールの二種類の光学異性体の存在が知られている。この中、エクオールの前駆物質であるダイゼインの腸内細菌による代謝産物はＳ−エクオールに限られる。また、エストロゲン受容体との結合もＳ−エクオールの方がはるかに強い（非特許文献２）。
【０００９】
すなわち、生体内での存在の指標となる血液試料および尿試料に含まれるエクオールはＳ−エクオールであり、Ｓ−エクオールを特異的に測定することが有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００６−２９６４３４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅ.  Ｂｒｏｕｗｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年、８４巻、ｐ．５７７−５８８
【非特許文献２】Ｋ．  Ｄ．  Ｒ．  Ｓｅｔｃｈｅｌｌら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２００５年、８１巻、ｐ．１０７２−１０７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、免疫法、すなわちイムノアッセイを用いたエクオールの測定法において、Ｓ−エクオールを特異的に、かつ精確に測定する方法を構築することを目的とする。また、本発明は、免疫法を用いたエクオールの濃度の測定において、Ｓ−エクオールを特異的且つ精確に測定できるキットを構築することを目的とする。更に、本発明は、被験者のエクオール産生能を判定する方法を構築することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
イムノアッセイの性能を大きく左右するものとして、試料中の測定対象物とその結合対との反応から濃度を求める際の標準物質や競合反応を用いる際の競合物質と測定対象物との同一性もしくは類似性が挙げられる。
【００１４】
そこで、測定値を求めるための検量線を作成するための標準物質にＳ−エクオールを用いることにより、測定値の精確性が向上した。
【００１５】
また、競合免疫反応を用いたイムノアッセイにおいて、競合反応物に標識化したＳ−エクオールを用いることにより非特異反応を抑制し、Ｓ−エクオールおよびＲ−エクオールの混合物を用いたときに比べて精確に測定できる範囲が拡大した。
【００１６】
本発明は、この知見に基づき、さらに研究を重ねた結果完成されたものである。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法であって、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、Ｓ−エクオールを用いることを特徴とする方法。
項２．Ｓ−エクオールに対する交差性を１００％とした場合、ダイゼインに対する交差性が１０％以下、ゲニステインに対する交差性が１０％以下、グリシテインに対する交差性が１０％以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が２０％以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が２０％以下である抗エクオール抗体を一次抗体として使用する、項１に記載の方法。
項３．前記標識化抗原の標識物が、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックスおよび金属コロイドからなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
項４．前記免疫法が、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
項５．前記生体試料が、尿および血液からなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
項６．前記生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、項１に記載の方法。
項７．生体試料中のエクオールを免疫法により測定するためのキットであって、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、Ｓ−エクオールを含むことを特徴とする、キット。
項８．更に、Ｓ−エクオールに対する交差性を１００％とした場合、ダイゼインに対する交差性が１０％以下、ゲニステインに対する交差性が１０％以下、グリシテインに対する交差性が１０％以下、ジヒドロダイゼインに対する交差性が２０％以下、およびデヒドロエクオールに対する交差性が２０％以下である抗エクオール抗体を一次抗体として含む、項７に記載のキット。
項９．前記免疫法が、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法からなる群より選択される少なくとも１種である、項７に記載のキット。
項１０．前記生体試料が、尿および血液からなる群より選択される少なくとも１種である、項７に記載のキット。
項１１．被験者のエクオール産生能を判定する方法であって、
（１）検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原としてＳ−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する工程、および
（２）前記工程（１）で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する工程、
を含む判定方法。
項１２．前記工程（１）において、生体試料中のエクオールの抱合体が脱抱合処理されることなく測定されることを特徴とする、項１１に記載の判定方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の測定方法を実施することにより、生体試料中のエクオールをイムノアッセイによって測定する方法において、非特異反応を抑制し、精確な測定結果が得られる。また、本発明のキットによれば、該方法を、一層簡便に実施することができる。また、本発明の判定方法によれば、被験者がエクオール産生能を有するか否かを精確且つ簡便に判定することができる。
【００１９】
また、本発明により測定されるエクオール濃度は、ＨＰＬＣ法により測定されるエクオール濃度と高い相関性を示す。また、本発明によれば、その検出時間も３時間程度であり、７２時間、受託だと約２週間を要するＨＰＬＣ法と比較して、迅速にエクオール濃度を測定できる。また、本発明のキットは、ＨＰＬＣ法と比較して非常に安価であるにもかかわらず、ＨＰＬＣ法と同等の検出感度が得られる。
【００２０】
更に、本発明によれば、被験者のエクオール産生能の有無およびその程度を精確、簡便、迅速且つ特異性が高く把握できることから、該測定結果および判定結果に基づき、エクオール産生能の欠如に関連する疾患（例えば、乳癌、前立腺癌、更年期障害、閉経後の骨粗鬆症・高脂血症・高血圧症等）の発症可能性や症状の程度を把握することが可能になり、該疾患の予防や改善方策を適切に施すことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１はＨＰＬＣ法および実施例１で測定した結果の相関図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡ法により得られた値を示し、横軸はＨＰＬＣ法により得られた値を示し、単位はいずれもｎｇ／ｍｌである。
【図２】図２はＨＰＬＣ法および実施例２で測定した結果の相関図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡ法により得られた値を示し、横軸はＨＰＬＣ法により得られた値を示し、単位はいずれもｎｇ／ｍｌである。
【図３】図３はＨＰＬＣ法および実施例３で測定した結果の相関図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡ法により得られた値を示し、横軸はＨＰＬＣ法により得られた値を示し、単位はいずれもｎｇ／ｍｌである。
【図４】図４はＨＰＬＣ法および比較例で測定した結果の相関図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡ法により得られた値を示し、横軸はＨＰＬＣ法により得られた値を示し、単位はいずれもｎｇ／ｍｌである。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡ法における競合法のモデル図である。
【図６】図６はＬＣ／ＭＳ／ＭＳおよび試験例３に記載の本発明の免疫測定法でエクオール濃度を測定した結果の相関図である。
【図７】図７はＨＰＬＣ法を用いて測定した尿中のダイゼイン濃度を示す。
【図８】図８はＥＱＬ  ＥＬＩＳＡとＬｏｇ  Ｅ／Ｄ ｒａｔｉｏとのプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明について説明する。
１．生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法
本発明の、生体試料中のエクオールの濃度を免疫法により測定する方法（以下、これを免疫測定法と記載する場合がある）は、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原に、Ｓ−エクオールを用いることを特徴とする。本発明の免疫測定法について、以下、説明する。
【００２３】
Ｓ−エクオールに対する抗体作製のための免疫抗原
本発明の測定対象であるエクオールは低分子のハプテン抗原であるため、それ自体では免疫原性を有していない。そのため、免疫測定法に用いる抗体を得るためには、エクオールと抗原支持物質との結合体を合成し、免疫抗原を作製することが好ましい。
【００２４】
前記抗原支持物質としては、前記免疫抗原を作製できる限り制限されないが、高分子物質（分子量１万以上、好ましくは５万〜１００万）が好ましく、その中でもタンパク質が好ましい。好ましいタンパク質の例として、抗体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、フェリチン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００２５】
また、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させる方法は、これらが結合できる限り制限されないが、共有結合が好ましい。
【００２６】
共有結合の場合、例えば、抗原支持物質としてタンパク質を用いる場合は、Ｎ−ヒドロキシサクシイミド活性化エステル法により、ハプテン抗原に導入したサクシイミド基とタンパク質又は糖タンパク質のアミノ基とを反応させ、ハプテン抗原と抗原支持物質とを結合させることができる。また、この場合、他の方法として、グルタール法等が例示される。
【００２７】
さらに、ハプテン抗原と抗原支持物質との結合に際し、ハプテン抗原と抗原支持物質の間の距離を拡げるために、ハプテン抗原にスペーサー化合物を導入してから抗原支持物質と結合させることにより、抗体との親和性、抗体の特異性に変化を与えることができる。
【００２８】
スペーサー化合物の例としては、スペーサー化合物を介してハプテン抗原と抗原支持物質を結合できるものであれば制限されず、また、前記抗体との親和性、抗体の特異性に変化を与えることができるものであれば制限されないが、カルボキシメチルエーテル（ＣＭＥ）、カルボキシプロピルエーテル（ＣＰＥ）、カルボキシブチルエーテル（ＣＢＥ）、カルボキシフェニルエーテル（ＣＰｈＥ）等が例示され、好ましくはＣＭＥが挙げられる。
【００２９】
スペーサー化合物を介してハプテン抗原と抗原支持物質が結合された例としては、後述のエクオール−ＣＭＥ−タンパク質が例示でき、このほかにもエクオール−ＣＰＥ−タンパク質、エクオール−ＣＢＥ−タンパク質、エクオール−ＣＰｈＥ−タンパク質等が例示される。エクオール−ＣＭＥ−タンパク質は後述の実施例のようにしてようにして作製でき、このほかのスペーサー化合物を備えた免疫抗原は、使用するスペーサーの種類に応じて、当業者により適宜作製することができる。
【００３０】
標識化ハプテン抗原
抗体の存在を検出する標識化ハプテン抗原については、前記抗原支持物質の代わりに標識物を用いることにより、同様に作製することができ、ハプテン抗原と標識物の間にスペーサー化合物を導入することにより、検出する抗体との親和性を調整することができる。
【００３１】
標識物としては、抗原抗体反応を妨げないことを限度として、従来公知の標識物が使用できる。標識物として、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックス、金属コロイド、ユーロピウム、アクリジニウム等が例示され、好ましくは、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックスおよび金属コロイドからなる群から選択される。また、酵素としてはパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等；放射性同位体としては１２５Ｉ等；色素としてはシアニン系色素等；蛍光物質としてはＦＩＴＣ、ｃｙ３、ｃｙ５等；ラテックスとしてはポリスチレンラテックス、磁性ラテックス等；金属コロイドとしては金、銀、白金等が例示される。これらの標識物の中でも、高感度の検出を容易にできるという利点から、好ましくは酵素、更に好ましくはパーオキシダーゼ、特に好ましくは西洋ワサビパーオキシダーゼが例示される。
【００３２】
また、ハプテン抗原と標識物の結合に使用されるスペーサー化合物としては、カルボキシメチルエーテル（ＣＭＥ）、カルボキシプロピルエーテル（ＣＰＥ）、カルボキシブチルエーテル（ＣＢＥ）、カルボキシフェニルエーテル（ＣＰｈＥ）等が例示され、好ましくはＣＰＥが挙げられる。
【００３３】
抗体：一次抗体
本発明に用いる一次抗体は、エクオールに特異的に結合できる限り制限されず、ポリクローナル抗体を用いてもよく、モノクローナル抗体を用いてもよい。また、エクオールとの特異性を維持する限り、その抗体断片を一次抗体として使用してもよい。また、一次抗体として、抗血清を使用することもできる。
【００３４】
免疫測定法に用いる一次抗体は、公知の方法を実施することにより作製することができる。例えば、該一次抗体は、以下のようにして作製できるが、作製方法は以下の例に限定されない。
【００３５】
すなわち、ポリクローナル抗体は、エクオールと抗原支持物質を結合させた免疫抗原とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔを混和して免疫剤を調製し、調製した免疫剤を定期的にウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、ニワトリ等の皮下および／または皮内に複数回注射した後に得られる抗血清を精製または希釈等することで調製できる。免疫抗原としては前述のものが例示でき、アジュバントの使用は必須ではないが、アジュバントを使用しておくことが望ましい。抗血清は、従来公知の方法に従い採取することにより作製できる。本発明に用いる一次抗体として、好ましくは、ウサギ抗血清が使用される。
【００３６】
モノクローナル抗体は、エクオールと抗原支持物質を結合させた免疫抗原とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔを混和して免疫剤を調製し、調製した免疫剤を定期的にマウス、ラット等の皮下および／または皮内に複数回注射した後に前記免疫抗原を単独で静脈内または腹腔内注射し、数日後に摘出した脾臓より調製した脾細胞とミエローマ細胞を融合して融合細胞を選択培養する。
【００３７】
増殖した融合細胞をクローン化培養し、エクオールに特異的に結合するＩｇＧ抗体を産生する細胞株を選定する。選定した細胞株を培養して得られる培養上清を精製または希釈等することで測定に用いるモノクローナル抗体を調製できる。ポリクローナル抗体と同様に、免疫抗原としては前述のものが例示でき、アジュバントの使用は必須ではないが、アジュバントを使用しておくことが望ましい。
【００３８】
本発明で使用される一次抗体は、Ｓ−エクオールに対する特異性が高く、他の構造類似のイソフラボンに対しては交差性が低いことが望ましい。とりわけ、ダイゼイン、ジヒドロダイゼインおよびデヒドロエクオールは、生体試料中のエクオールの誤検出要因となるため、これらの化合物に対する交差性が低い一次抗体を使用することが望ましい。具体的には、本発明で使用される一次抗体として、Ｓ−エクオールに対する交差性を１００％とした場合、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ジヒドロダイゼイン、及びデヒドロエクオールに対する交差性が、下記範囲を充足していることが望ましい：
ダイゼインに対する交差性：１０％以下、好ましくは１％以下、更に好ましくは０．１％以下；
ゲニステインに対する交差性：１０％以下、好ましくは１％以下、更に好ましくは０．１％以下；
グリシテインに対する交差性：１０％以下、好ましくは１％以下、更に好ましくは０．１％以下；
ジヒドロダイゼインに対する交差性：２０％以下、好ましくは５％以下、更に好ましくは１．１％以下；及び
デヒドロエクオールに対する交差性：２０％以下、好ましくは５％以下、更に好ましくは１％以下。
【００３９】
上記交差性は、次のように説明できる。すなわち、上記交差性は、標識化されたＳ−エクオールの抗エクオール抗体への結合を２０％反応阻害できる各イソフラボン類等の濃度（ＩＣ２０）に対する、標識化されたＳ−エクオールの抗エクオール抗体への結合を２０％反応阻害できる標識化されていないＳ−エクオールの濃度（ＩＣ２０）の割合（％）を示す。より具体的には、標識化されたＳ−エクオール単独での抗体への結合を１００とした場合、該標識化されたＳ−エクオールと標識化されていないＳ−エクオールとの競合反応において、該標識化されたＳ−エクオールの抗体への結合が８０となったときの、該標識化されていないＳ−エクオールの濃度を求める。同様に、標識化されていない各々のイソフラボン類等について、該標識化されたＳ−エクオールとの競合反応を行い、該標識化されたＳ−エクオールの抗体への結合が８０となったときの、各々のイソフラボン類等の濃度を求める。
【００４０】
このようにして得られた、標識化されていないＳ−エクオールの濃度（ＩＣ２０）と、各々のイソフラボン類等の濃度（ＩＣ２０）の比をパーセント表示したものを交差性とする。これは、以下の式で表される。
交差性（％）＝（Ｓ−エクオールのＩＣ２０／各々のイソフラボン類等のＩＣ２０）×１００
【００４１】
ここで、該交差率は、ＥＬＩＳＡにおける競合法を用いて決定され、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原の抗原として、Ｓ−エクオールを用いて決定される。
【００４２】
また、該交差率の決定において使用される標識化されたＳ−エクオールの濃度は、競合法において、抗原を高感度に測定できる条件に適宜設定すればよい。標識物としては前述の酵素が例示できる。
【００４３】
より具体的には、例えば、該交差率は、後述の試験例２と同様の手順で決定される。
【００４４】
上記のような特異性を備えた一次抗体を使用し、且つ標準抗原および／または生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原としてＳ−エクオールを使用することによって、生体試料中のエクオールをより高精度に検出することが可能になる。
【００４５】
抗体：二次抗体
本発明に使用する二次抗体は、上記一次抗体に対して特異的に結合する抗体であり、該二次抗体は公知の方法に従い作製できる。
【００４６】
一次抗体としてウサギ抗体またはウサギ抗血清を使用する場合、二次抗体として好ましくはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体が使用される。
【００４７】
また、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジンの結合を利用してもよく、この場合には、例えばビオチン化一次抗体を作製して、該ビオチンと、固相に固定化したアビジン／ストレプトアビジンとを結合させればよい。
【００４８】
標準抗原、及び生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原
また、本発明において、前記した方法により作製した抗体を用いて生体試料中のエクオールを測定するときに、検量線の作成に使用する標準抗原および／または試料中のエクオールと競合する標識化抗原に、Ｓ−エクオールを用いることにより、精確なエクオールの測定値を得ることが可能となる。すなわち、本発明では、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原の少なくとも一方にＳ−エクオールが使用されるが、生体試料中のエクオールの測定精度を高めるという観点から、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原の双方にＳ−エクオールを使用することが望ましい。
【００４９】
上記標識化抗原の標識物としては、抗原抗体反応を妨げないことを限度として、従来公知の標識物が使用できる。標識物として、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックス、金属コロイド、ユーロピウム、アクリジニウム等が例示され、好ましくは、酵素、放射性同位体、色素、蛍光物質、ラテックスおよび金属コロイドからなる群から選択される。また、酵素としてはパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等；放射性同位体としては１２５Ｉ等；色素としてはシアニン系色素等；蛍光物質としてはＦＩＴＣ、ｃｙ３、ｃｙ５等；ラテックスとしてはポリスチレンラテックス、磁性ラテックス等；金属コロイドとしては金、銀、白金等が例示される。これらの標識物の中でも、高感度の検出を容易にできるという利点から、好ましくは酵素、更に好ましくはパーオキシダーゼ、特に好ましくは西洋ワサビパーオキシダーゼが例示される。
【００５０】
抗原と標識物との結合を目的として、また該抗原と抗体との親和性等の調整を目的として、該抗原と標識物の間にスペーサー化合物を導入してもよい。抗原（Ｓ−エクオール）と標識物の結合に使用されるスペーサー化合物としては、カルボキシメチルエーテル（ＣＭＥ）、カルボキシプロピルエーテル（ＣＰＥ）、カルボキシブチルエーテル（ＣＢＥ）、カルボキシフェニルエーテル（ＣＰｈＥ）等が例示され、好ましくはＣＰＥが挙げられる。
【００５１】
生体試料
エクオールを測定する生体試料としては、動植物を含む生体に由来する試料であってエクオールの測定が求められるものである限り特に制限されないが、例えば、尿、血液（例えば血清の他、血漿）、便、組織抽出物、細胞抽出物、食材等が挙げられる。生体試料として、好ましくはヒト由来の生体試料であり、さらに好ましくはヒト由来の尿および血液であり、特に好ましくはヒト由来の尿である。
【００５２】
また、エクオールの測定に供される生体試料は、必要に応じて、希釈されていてもよい。
【００５３】
生体試料を前処理（脱抱合）するための酵素
前記生体試料に含まれるエクオールは、通常、抱合体の形態で存在する。このため、該生体試料を抗原抗体反応に供する前に、エクオールを脱抱合させるための前処理に供してもよい。
【００５４】
該脱抱合処理は、β−グルファターゼ（グルクロニダーゼ、サルファターゼ含有）、グルクロニダーゼ、サルファターゼ等の酵素を使用して行うことができる。より具体的には、脱抱合処理に使用される酵素液の好適な一例として、６％β−グルファターゼ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を主成分とする組成が例示される。
【００５５】
また、該脱抱合処理は、抗原抗体反応に先だって実施してもよく、また抗原抗体反応と同時に実施してもよい。該脱抱合処理の反応条件は、使用する酵素の種類や生体試料の種類等に応じて適宜設定されるが、通常、２５〜５６℃で５分から一昼夜行われる。
【００５６】
生体試料および／または標準抗原の希釈液
生体試料および標準抗原の希釈に使用される希釈液は、測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、一般的な免疫法において使用されている希釈液を使用することができる。本発明において使用される希釈液の好適な一例として、塩化ナトリウム、ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有する混合溶液、１００％チャコール処理ヒト血清等が例示される。より具体的には、希釈液として、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ウシ血清アルブミン含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の混合溶液が例示される。
【００５７】
エクオールの濃度を測定するための免疫法
次に、エクオールを測定するための免疫法の具体例を以下に示すが、本発明の本質はこれらの例により限定されるものではない。
【００５８】
本発明において、エクオールを測定するための免疫法としては、前記抗原および抗体を利用した抗原抗体反応により、生体試料中のエクオールの濃度を測定できる限り制限されないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法およびイムノクロマト法等が例示される。
【００５９】
免疫法としてＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法を使用する場合、生体試料中のエクオールの測定は、従来公知のＥＬＩＳＡの手法に従い行えばよく、競合法、サンドイッチ法、直接法のいずれであってもよい。ＥＬＩＳＡ法として、好ましくは競合法である。参考として、ＥＬＩＳＡ法における競合法のモデルを、図５に示す。
【００６０】
例えば、競合法を採用する場合、ＥＬＩＳＡ法による生体試料中のエクオールの測定は、例えば、二次抗体を予め固相化しておいたマイクロプレートのウェルに、生体試料、酵素標識した抗原（標識化抗原）および一次抗体を添加して反応させ、二次抗体−一次抗体−エクオールの結合体を形成させる。また、一次抗体は、生体試料および標識化抗原と同時に添加してもよく、別々に添加してもよい。反応後、洗浄液にてウェルを洗浄し、前記酵素に対応する基質を加えて反応させた後、反応停止液等により反応を停止させて吸光度を測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００６１】
この場合、マイクロプレートは従来公知のものが使用でき、そのウェルの大きさや形状も、前記反応が実施される限り制限されない。また、二次抗体のウェルへの固相化は従来公知の方法により実施できる。また、基質も、該酵素に適した従来公知の基質を使用すればよい。
【００６２】
また、該競合法において、一次抗体、二次抗体、標識化抗原の添加量は、当該方法により生体試料中のエクオールが精確に測定できる限り制限されず、一般的なＥＬＩＳＡ法の条件に従って適宜設定される。また、ＥＬＩＳＡ法以外の免疫法においても、同様に、一次抗体、二次抗体、標識化抗原の添加量は、従来公知の条件に従えばよく、適宜設定される。
【００６３】
ＥＬＩＳＡ法における各反応は、従来公知の条件に従い行えばよく、生体試料の種類やＥＬＩＳＡ法の方法等に応じて適宜設定される。例えば、競合法の場合であれば、二次抗体−一次抗体−エクオールの結合体を形成させるための抗原抗体反応は、通常、４〜３７℃で５分から一昼夜行われる。
【００６４】
より具体的には、ＥＬＩＳＡ法（競合法）による尿中のエクオールの測定については、尿検体に検体希釈液を加えて希釈尿検体液を調製し、予めヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）を固相化しておいたマイクロプレートのウェルに調製した希釈尿検体液、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオールおよび希釈した抗エクオールウサギ抗血清（一次抗体）を加えて一定時間反応させる。反応後、ウェルを洗浄して発色基質液を加えて一定時間反応させ、一定時間後に反応を停止させて吸光度を測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００６５】
抗血清を希釈するための緩衝液（抗血清希釈緩衝液）は、抗血清を好適に希釈でき且つ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されない。本発明において使用される抗血清希釈緩衝液の好適な一例として、塩化ナトリウム、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ２０含有りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）等を含有する混合溶液が例示される。より具体的には、抗血清希釈緩衝液として、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）の混合溶液が例示される。該抗血清希釈緩衝液は競合法だけでなく、競合法以外のＥＬＩＳＡ法、更に種々の免疫法において使用できる。なお、Ｔｗｅｅｎは登録商標である。
【００６６】
ＲＩＡ（Radioimmunoassay）法による生体試料中のエクオールの測定についても従来公知の方法に従い行えばよく、標識物として放射性同位体を使用する以外は、前記ＥＬＩＳＡ法と同様にして実施できる。生体試料として尿を、放射性同位体として１２５Ｉを使用するＲＩＡ法として、以下が例示される。
【００６７】
尿検体に検体希釈液を加えて希釈尿検体液を調製し、予めヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を固相化しておいたマイクロプレートのウェルに調製した希釈尿検体液、１２５Ｉ標識Ｓ−エクオールおよび希釈した抗エクオール抗体産生細胞培養上清を加えて一定時間反応させる。反応後、ウェルを洗浄した後にマイクロプレートのウェルの放射線活性を測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００６８】
イムノクロマト（イムノクロマトグラフィー）法による生体試料中のエクオールの測定についても、従来公知の方法に従い行えばよい。生体試料として尿を、標識物として金コロイドを使用するイムノクロマト法として、以下の手法が例示される。即ち、尿検体に金コロイド標識抗エクオールマウスモノクローナル抗体を加えて希釈尿検体液を調製し、イムノクロマトストリップのサンプルパッド部に希釈尿検体液を滴下して一定時間反応させる。反応後、エクオールを固定化した捕捉部の金コロイド標識物による着色を測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００６９】
また、生体試料中のエクオールを標識化した抗体を用いて測定する方法としては、抗原支持物質と結合したエクオールまたはその類似物を固相化し、蛍光物質で標識化した抗エクオールウサギポリクローナル抗体と生体試料を混合することにより、生体試料中の測定対象物質と競合して固相に結合した蛍光物質を洗浄した後に測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００７０】
さらに、生体試料中のエクオールを標識化した抗体断片を用いて測定する方法として、オープンサンドイッチ法が知られている。この測定方法は、例えば、抗エクオールマウスモノクローナル抗体の軽鎖抗原結合部位断片と重鎖抗原結合部位断片を用いて生体中のエクオールを生体試料中のエクオールを挟み込んだ重合体を形成することによって測定できる。
【００７１】
具体的には、軽鎖抗原結合部位断片を固相化し、アルカリフォスファターゼで標識化した重鎖抗原結合部位断片と生体試料を混合することにより、生体試料中のエクオールを介して固相に結合したアルカリフォスファターゼ活性を洗浄した後に測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出する。
【００７２】
また、軽鎖抗原結合部位断片と重鎖抗原結合部位断片に異なった蛍光物質で標識化し、生体試料中のエクオールを介して複合物を形成することにより生じる蛍光共鳴エネルギー移動現象を測定し、同様に標準抗原を測定した検量線から、試料中のエクオール濃度を算出することも可能である。
【００７３】
本発明の好適な一態様としては、免疫法としてＥＬＩＳＡ法が挙げられ、さらに好ましくは、競合法によって行われるＥＬＩＳＡ法が挙げられ、特に好ましくは、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原の双方にＳ−エクオールを使用し、競合法によって行われるＥＬＩＳＡ法が挙げられる。
【００７４】
２．生体試料中のエクオールの濃度を免疫法により測定するためのキット
本発明の、生体試料中のエクオールの濃度を免疫法により測定するためのキットは、検量線の作成に使用する標準抗原および試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原として、Ｓ−エクオールを含むことを特徴とする。本発明のキットは、更に、Ｓ−エクオールに特異的に結合する一次抗体を含んでもよい。
【００７５】
また、本発明のキットは、更に必要に応じて、生体試料および／または標準抗原の希釈液、試料中のＳ−エクオールの抱合体を脱抱合するための酵素液、二次抗体を固相化させたプレート、及び洗浄液からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。
【００７６】
更に、本発明のキットは、採用する免疫法の種類に応じて、その他に必要とされる試薬が含まれていてもよい。例えば、競合法によって行われるＥＬＩＳＡ法に使用される場合には、更に標識化抗原の標識物に対する基質、標識物と基質の反応を停止させるための反応停止液、ならびに基質を溶解するための溶解液からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。
【００７７】
更に、本発明のキットにおいて抗血清が使用される場合、該抗血清の希釈に使用される抗血清希釈緩衝液を含んでいても良い。
【００７８】
以下、本発明のキットに備えさせ得る各試薬について説明する。
【００７９】
標準抗原
標準抗原としては、前述のものが同様に使用できる。該標準抗原は、溶液の形態でキットに含まれていてもよい。例えば、標準抗原としてＳ−エクオールを使用する場合、Ｓ−エクオール、塩化ナトリウム、ウシ血清アルブミン含有りん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を含有する標準エクオール溶液の形態にあってもよい。標準エクオール溶液として、例えば、８１０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ−エクオール、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％含有０．０１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）が例示される。また、別の標準エクオール溶液として、Ｓ−エクオール及び１００％チャコール処理ヒト血清の混合溶液等が例示される。
【００８０】
標識化抗原
標識化抗原としては、前述のものが同様に使用できる。好ましくはパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオールが、特に好ましくは西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオールが例示される。
【００８１】
標識物に対する基質
標識物に対する基質としては、従来公知の基質が使用でき、従来公知の標識物との組み合わせで使用される。例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、基質として過酸化水素が例示される。該基質は、後述する溶解液に溶解された後に使用されることが好ましい。
【００８２】
溶解液
溶解液は、必要に応じて溶解することを目的として使用される。該溶解液は、基質を好適に溶解でき、かつ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、従来公知の緩衝液が使用でき、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が例示される。該溶解液は、基質を予め含む形態で提供することができる。
【００８３】
基質が前述の過酸化水素である場合には、溶解液に、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）を溶解して基質液とする。好適な一態様としては、０．０５％過酸化水素水、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）含有５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）の基質液が挙げられる。
【００８４】
抗体：一次抗体
一次抗体としては、前述のものが同様に使用できる。好ましくは抗血清が使用され、更に好ましくはウサギ抗血清が使用される。該抗血清は、必要に応じて、後述する抗血清溶解緩衝液で希釈された後に使用される。該抗血清は、該抗血清希釈緩衝液で希釈された状態で、キットに含まれていてもよい。
【００８５】
抗体：二次抗体
二次抗体としては、前述のものが同様に使用できる。一次抗体としてウサギ抗体またはウサギ抗血清を使用する場合、二次抗体として、好ましくはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体が使用される。また、ＥＬＩＳＡ法における競合法を採用する場合には、二次抗体はマイクロプレートのウェルに固相化されていることが好ましい。該マイクロプレートは、従来公知のものが使用でき、固相化は従来公知の方法に従い実施すればよい。
【００８６】
抗血清希釈緩衝液
抗血清希釈緩衝液は、前述の抗血清を必要に応じて希釈することを目的として使用される。該抗血清希釈緩衝液は、抗血清を好適に希釈でき且つ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、前述のものが同様に使用できる。該抗血清希釈緩衝液は、抗血清を希釈した状態で、キットに含まれていてもよい。
【００８７】
生体試料を前処理（脱抱合）するための酵素液
生体試料を前処理（脱抱合）するための酵素液としては、前述のものが同様に使用できる。
【００８８】
生体試料および／または標準抗原の希釈液
生体試料（検体）および標準抗原の希釈液としては、前述のものが同様に使用できる。
【００８９】
標識物質と基質の反応を停止させるための反応停止液
標識物質と基質の反応を停止させるための反応停止液は、これらの反応を停止させることができ、測定結果に影響を与えない限り制限されず、従来公知の反応停止液が使用できる。反応停止液として、硫酸、塩酸、硝酸等が例示される。
【００９０】
洗浄液
洗浄液は、抗原抗体反応終了後、基質の分注前に、余分な生体試料および抗体等をウェル等から除去することを目的として使用される。該洗浄液は、好適に洗浄でき、かつ測定に悪影響を及ぼさない限り制限されず、従来公知の洗浄液が使用でき、そのままで使用されてもよく、精製水等で希釈して使用されてもよい。洗浄液として、精製水、界面活性剤を緩衝液で希釈した溶液等が例示される。
【００９１】
このほか、本発明のキットには、該キットを使用するプロトコールが記載された説明書、希釈用のプレート、プレートシールなども含むことができる。また、キットに含まれる前記溶液には、着色のため、更に色素が添加されていてもよい。
【００９２】
本発明のキットが対象とする生体試料は、前述のものが挙げられる。また、該キットを用いて実施される免疫法も前述の方法が例示され、好ましくはＥＬＩＳＡ法であり、好ましくはＥＬＩＳＡ法の中でも競合法である。
【００９３】
本キットにおける前記抗体、抗原、溶液等の含有量は、生体試料中のエクオール濃度が測定できる限り制限されず、前述の通り、ＥＬＩＳＡ法をはじめとする免疫法の一般的な条件に従って適宜設定される。
【００９４】
３．被験者のエクオール産生能を判定する方法
本発明の被験者のエクオール産生能を判定する方法（以下、判定方法と記載する場合がある）は、（１）検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原としてＳ−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する工程、ならびに（２）前記工程（１）で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する工程を含む。以下に、本発明の判定方法について、工程毎に説明する。
【００９５】
工程（１）
本工程（１）では、検量線の作成に使用する標準抗原および生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原からなる群より選択される少なくとも一方の抗原にＳ−エクオールを用いた免疫法により、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料中のエクオールを測定する。
【００９６】
本工程（１）に供される生体試料は、大豆イソフラボンを摂食させた被験者由来の生体試料である。エクオールは大豆イソフラボンの活性代謝物であるため、大豆イソフラボンを摂取していない被験者は、エクオール産生能を有している場合であっても、エクオールが検出されないか、その測定値が非常に低い傾向を示す。そのため、被験者には、予め大豆イソフラボンを摂取させることが必要とされる。被験者に大豆イソフラボンを摂取させる量については、特に制限されないが、例えば大豆イソフラボンの総量が２０〜７０ｍｇ、好ましくは２５〜５０ｍｇ程度が例示される。また、大豆イソフラボンを摂取させる時期についても、特に制限されるものではないが、例えば、生体試料採取前の３日間毎日あるいは生体試料採取前６〜２４時間、好ましくは生体試料採取前８〜１２時間が例示される。被験者に摂取させる大豆イソフラボンは、豆乳、大豆イソフラボン錠、大豆バー、納豆、豆腐、大豆煮豆、枝豆、黒豆、テンペ等の大豆製品の形態の物が使用できる。
【００９７】
本工程（１）に供される生体試料は、尿、血液（血清、血漿）、便等のいずれであってもよいが、好ましくは尿、血液であり、更に好ましくは尿である。
【００９８】
本工程（１）における免疫法によるエクオールの測定は、前述する「１．生体試料中のエクオールを免疫法により測定する方法」に従って行われる。
【００９９】
工程（２）
本第２工程では、前記工程（１）で得られたエクオールの測定値に基づいて、被験者のエクオール産生能を判定する。
【０１００】
本工程（２）では、前記工程（１）においてエクオールが検出された生体試料の被験者は、エクオール産生能を有していると判定され、また前記工程（１）においてエクオールが検出されなかった生体試料の被験者は、エクオール産生能を有していないと判定される。
【０１０１】
なお、本工程（２）では、エクオール産生能の有無の判定において誤判定を抑制するために、測定されたエクオールの濃度に対してカットオフ値未満であるか否かを判定することが望ましい。即ち、測定された生体試料のエクオールの濃度がカットオフ値未満であれば、該生体試料の被験者はエクオール産生能がないと判定され、測定された生体試料のエクオールの濃度がカットオフ値以上ならば、該生体試料の被験者はエクオール産生能があると判定される。カットオフ値は、次のようにして設定できる。
１．前記免疫法により生体試料中のエクオール濃度を測定する。
２．同一の生体試料中のダイゼイン濃度を測定する。該測定は、既存の測定法（ＨＰＬＣ法、ＧＣ−ＭＳ法など）を用いて測定する。
３．生体試料毎にダイゼイン濃度に対するエクオール濃度の対数比を算出する。
エクオールはダイゼインの代謝産物であるため、該対数値を算出することで、生体内でどの程度のエクオールが産生されているかを把握することができる。
４．ＨＰＬＣ法により、生体試料中のＳ−エクオール濃度及びダイゼインを測定する。
５．前記４の測定値に基づき、生体試料毎にダイゼイン濃度に対するエクオール濃度の対数比を算出する。
６．前記５で得られた対数比により設定される基準値と、前記３で得られた対数比とを比較し、前記３についてエクオール産生／非産生の結果に分類する。これに基づきエクオール非産生者／産生者の誤判定率が最も低くなるエクオール濃度を決定し、該濃度をカットオフ値とする。
【０１０２】
前記６について、具体的には、例えば、ＨＰＬＣ法から算出される対数比において−１．７５未満がエクオール非産生者、−１．７５以上ならばエクオール産生者と判断される場合には、該値（−１．７５）を基準値とする（例えば、Setchell and Co, 2006）。そして、該基準値と前記３で得られた対数比とを照らし合わせて、同様に、−１．７５未満であればエクオール非産生者、−１．７５以上ならばエクオール産生者と分類する。そして、当該分類と前記１で測定したエクオール濃度を照らし合わせ、前記分類を基準として、エクオール非産生者／産生者の誤判定率が最も低くなるようエクオール濃度を決定し、この濃度をカットオフ値として設定する。
【０１０３】
また、本工程（２）では、前記工程（１）において高濃度のエクオールが検出された生体試料の被験者については、エクオール産生能が高いと判定され、また前記第（１）工程において低濃度のエクオールが検出された生体試料の被験者は、エクオール産生能が低いと判定することもできる。
【実施例】
【０１０４】
エクオールには、Ｓ−エクオールおよびＲ−エクオールの二種類の光学異性体の存在が知られており、生体内での存在は、前者のＳ−エクオールに限られる。それゆえ、測定方法としては、Ｓ−エクオールを特異的に、精確に測定することが求められる。そこで、競合免疫法による測定に影響を及ぼす標準抗原および標識化抗原を検討した。
【０１０５】
以下に評価を行った測定法およびその結果について説明する。
＜試験例１＞
・実施例１
標識化抗原および標準抗原にＳ−エクオールを用いた測定キットによる測定
１．生体試料
生体試料として、尿を使用した。生体試料数は５である。
【０１０６】
２．抗エクオールウサギ抗血清溶液の作製（一次抗体）
免疫抗原の合成
１００ｍｇのエクオールを４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬのＭｅｔｈｙｌ  Ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【０１０７】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク  ジャパン社）上で展開分離し、１分子のエクオールに1分子のＣＭＥ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【０１０８】
回収した１分子ずつ結合したエクオール−ＣＭＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱した。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してエクオール−ＣＭＥ−ａｃｉｄを得た。
【０１０９】
得られたエクオール−ＣＭＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、エクオール−ＣＭＥ−ＮＨＳを得た。
【０１１０】
２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（ウシ血清アルブミン２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、エクオール−ＣＭＥ−ＮＨＳ（１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させた。反応終了後にゲル濾過により未反応物を除き、エクオール−ＣＭＥ−ＢＳＡ抗原の原液とした。
【０１１１】
抗血清の作製
合成した免疫抗原エクオール−ＣＭＥ−ＢＳＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ）とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔを等量混和し、免疫剤を作製した。該免疫剤を用い、３週間毎に１ｍＬ／回をウサギの背部の数箇所に皮下注射した。免疫開始１２週目から３週間毎に採血を開始し、５回の部分採血の後に全採血を実施した。採血した抗血清の抗体価を表１に示す。この全採血して得られた抗血清を抗血清希釈緩衝液で適宜希釈して以下の試験に使用した。
【０１１２】
なお、ここでは、従来公知の方法により抗体が検出できる抗血清の最大希釈倍率を抗体価とした。該希釈は、後述の抗血清希釈緩衝液を用いて行った。
【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
３．ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（二次抗体）および該抗体固相化プレートの作製
９６穴マイクロプレートの各ウェルに１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を１００μＬ加える。４℃で２晩静置した後にヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を吸引除去した。
【０１１５】
吸引除去した９６穴マイクロプレートの各ウェルに０．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン溶液を３００μＬ加えた。４℃で１８時間静置した後に、ウシ血清アルブミン溶液を吸引除去し、真空乾燥してヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートとした。
【０１１６】
４．西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオール（生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原）の作製
１００ｍｇのＳ−エクオール（Ｓ−ｅｑｕｏｌ）を４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬの４−Ｂｒｏｍｏ−ｎ−ｂｕｔｙｌｉｃ  Ａｃｉｄおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【０１１７】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク  ジャパン社）上で展開分離し、１分子のＳ−ｅｑｕｏｌに１分子のＣＰＥ（ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【０１１８】
回収した１分子ずつ結合したＳ−ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱する。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してＳ−ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄを得た。
【０１１９】
得られたＳ−ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、Ｓ−ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳを得た。
【０１２０】
２０ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ溶液（西洋ワサビパーオキシダーゼ２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、Ｓ−ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳ  （１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させた。反応終了後にゲルろ過により未反応物を除き、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオール溶液の原液（標識化抗原液）とした。
【０１２１】
５．標準抗原
標準抗原として、Ｓ−エクオールを用いた。なお、０、３０、９０、２７０または８１０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ−エクオール及び１００％チャコール処理ヒト血清の混合溶液の標準エクオール溶液を使用した。
【０１２２】
６．生体試料希釈液、標準抗原希釈液
生体試料（検体）および標準抗原の希釈液として、１００％チャコール処理ヒト血清（ＳＥＲＡＣＯＮ  ＩＩ：ＣＤ  ＩＮＴＥＲＧＥＮ社）を用いた。
【０１２３】
７．抗血清希釈緩衝液の組成
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を抗血清希釈緩衝液とした。なお、Ｔｗｅｅｎは登録商標である。
【０１２４】
８.洗浄液の組成
１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．３ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を洗浄液とした。
【０１２５】
９．酵素液の組成
６％β−グルファターゼ（株式会社日本バイオテスト研究所製）含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を酵素液とした。
【０１２６】
１０．基質
０．０５％過酸化水素水、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）含有５０ｍＭくえん酸緩衝液（ｐＨ５．５）を基質（基質液）とした。
【０１２７】
１１．反応停止液
３Ｎ硫酸を反応停止液とした。
【０１２８】
１２．生体試料を用いたエクオールの測定
尿検体２０μＬに検体希釈液２００μＬを加えて、１１倍希釈尿検体を調製した。抗ウサギＩｇＧヤギ抗体固相化プレートのウェルに、１１倍希釈尿検体２０μＬ、酵素及び標識化抗原の混合液５０μＬ（標識化抗原液１に対して、酵素液１０）を加え、攪拌後に２５℃で３０分間静置した。その後、抗エクオールウサギ抗血清溶液５０μＬを加え、攪拌後に２５℃で１時間静置した。
【０１２９】
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルから反応溶液を除去した後に洗浄液を用いて３回ウェルを洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルに基質を１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置した。その後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルに反応停止液を１００μＬ加え、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、同様に測定した標準希釈液を用いて作製した標準抗原の希釈系列から得られる検量線から、試料中のエクオール濃度を算出した。
【０１３０】
・実施例２
標識化抗原にＳ−エクオールを用いた測定キットによる測定
実施例１の中より、「標準抗原」をＳ−エクオールからエクオール（Ｓ−エクオールおよびＲ−エクオールの混合物）に変更した他は、実施例１と同様に実施した。
【０１３１】
・実施例３
標準抗原にＳ−エクオールを用いた測定キットによる測定
実施例１の中より、「西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオールの作製」を以下のようにＳ−エクオールからエクオール（Ｓ−エクオールおよびＲ−エクオールの混合物）に変更した他は、実施例１と同様に実施した。
【０１３２】
西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオールの作製
１００ｍｇのエクオール（Ｅｑｕｏｌ）を４００μＬのＤＭＳＯに溶解し、５８μＬの４−Ｂｒｏｍｏ−ｎ−ｂｕｔｙｌｉｃ  Ａｃｉｄおよび１４０ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えて、２５℃で４時間反応させる。反応終了後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、脱水後に蒸発乾固した。
【０１３３】
続いて、展開溶媒としてクロロホルムメタノール（１９：１）を用いて薄層クロマトグラフィー（１．０５７１７、メルク  ジャパン社）上で展開分離し、１分子のＥｑｕｏｌに１分子のＣＰＥ（ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｔｈｅｒ）−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒが導入された分画のみを回収した。
【０１３４】
回収した１分子ずつ結合したＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒに８Ｎの水酸化ナトリウムを加えて５０℃で２０分間加熱する。加熱後に塩酸を用いて酸性に調整した後、酢酸エチルを用いて抽出を行い、蒸発乾固してＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄを得た。
【０１３５】
得られたＥｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ａｃｉｄの２ｍｇに、１．５ｍｇのＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、１．５ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を加えて２０μＬのＤＭＳＯに溶解して２５℃で１時間反応させ、Ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳを得た。
【０１３６】
２０ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ溶液（西洋ワサビパーオキシダーゼ２０ｍｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）１ｍＬに溶解）２５０μＬに、Ｅｑｕｏｌ−ＣＰＥ−ＮＨＳ  （１０ｍｇ／ｍＬＤＭＦ溶液）１０μＬを添加して２５℃で３０分間反応させる。反応終了後にゲルろ過により未反応物を除き、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識エクオール溶液の原液とした。
【０１３７】
・比較例
標識化抗原および標準抗原にエクオールを用いた測定キットによる測定
実施例１の中より、「標準抗原」のＳ−エクオールを実施例２に記載のエクオールに、「西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオールの作製」のＳ−エクオールを実施例３に記載のエクオールに変更した他は、実施例１と同様に実施した。
【０１３８】
・実施例４
ＨＰＬＣ法との測定値の比較（パネル検体）
ＨＰＬＣ法によりエクオール濃度既知の尿試料５検体について、実施例１、実施例２、実施例３および比較例により測定した結果を表２に示し、ＨＰＬＣ法による測定値を１００％とした各測定値の比を表３に示す。
【０１３９】
【表２】
2014160088.tif 000003
【０１４０】
【表３】
2014160088.tif 000004
【０１４１】
比較例による測定結果とＨＰＬＣ法による測定結果の比が３９〜８２％であるのに比べ、実施例１、実施例２および実施例３では、各々、８９〜１０７％、１０６〜１３０％および９２〜１５９％と、標準抗原および／または標識化抗原にＳ−エクオールを用いることにより、ＨＰＬＣ法との測定値の乖離が収束した。
【０１４２】
・実施例５
ＨＰＬＣ法との相関（測定値）
ＨＰＬＣ法によりエクオール濃度既知の尿試料５０検体について、実施例１、実施例２、実施例３および比較例と同様にして測定した結果とＨＰＬＣ法による測定結果との相関図を、各々、図１、図２、図３および図４に示す。該尿試料は、前日に大豆イソフラボン摂取（イソフラボンアグリコンとして２６ｍｇ）させ、早朝第一尿を使用した
比較例による測定結果では、相関係数ｒ＝０．９７３と相関性が高いものの、回帰式の傾きが０．６６４とＨＰＬＣ法での測定値の半分近くになっている。
【０１４３】
一方、実施例１による測定結果では、相関係数ｒ＝０．９７４と相関性が高く、回帰式の傾きが１．０６７とＨＰＬＣ法と同等であった。それゆえ、実施例１は比較例に比べて精確性が高まったと判断された。
【０１４４】
なお、実施例２による測定結果では、相関係数ｒ＝０．９８７と相関性が高いものの、回帰式の傾きが１．５９４とＨＰＬＣ法での測定値より高くなっている。
【０１４５】
なお、実施例３による測定結果では、相関係数ｒ＝０．９７３と相関性が高いものの、回帰式の傾きが１．７１２とＨＰＬＣ法での測定値より高くなっている。グラフ（図３）を見ると、測定結果のばらつきが大きく、特に高値での測定値の乖離が認められた。
【０１４６】
＜試験例２＞
交差反応性
本試験例では、ＥＬＩＳＡ法における競合法を採用し、且つ、標準抗原および標識化抗原にＳ−エクオールを用いた場合の、一次抗体の交差反応性について調べた。具体的には、以下のようにして交差反応性について調べた。
【０１４７】
１．試料
後述の表４に示す各々のイソフラボン類等を１００％チャコール処理ヒト血清で溶解し、試料とした。
【０１４８】
２．一次抗体
一次抗体として、実施例１と同様に、抗エクオールウサギ抗血清を使用した。該抗血清は、後述の抗血清希釈緩衝液で適宜希釈して試験に使用した。
【０１４９】
３．二次抗体
二次抗体として、実施例１と同様に、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。該抗体は、実施例１と同様に固相化させて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートとした。
【０１５０】
４．生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原
標識化抗原として、実施例１と同様に、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオールを使用した。
【０１５１】
５．標準抗原
標準抗原として、実施例１と同様に、Ｓ−エクオールを用いた。なお、０、３０、９０、２７０および８１０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ−エクオール及び１００％チャコール処理ヒト血清の混合溶液の標準エクオール溶液を使用した。
【０１５２】
６．試料および標準抗原希釈液
試料および標準抗原の希釈液として、１００％チャコール処理ヒト血清を用いた。
【０１５３】
７．抗血清希釈緩衝液
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を抗血清希釈緩衝液とした。
【０１５４】
８．洗浄液
洗浄液として、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．３ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した。
【０１５５】
９．酵素液
酵素液として、６％β−グルファターゼ（株式会社日本バイオテスト研究所製）含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
【０１５６】
１０．基質
基質（基質液）として、０．０５％過酸化水素水、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）含有５０ｍＭくえん酸緩衝液（ｐＨ５．５）を使用した。
【０１５７】
１１．反応停止液
反応停止液として、３Ｎ硫酸を使用した。
【０１５８】
１２．交差反応性の検討手順
各々のイソフラボン類等及び標識化されていないＳ−エクオールの濃度希釈系列を調製し、各イソフラボン類等及び標識化されていないＳ−エクオールについて、それぞれ濃度０から過剰量を加えたときの競合反応おける吸光度を測定した。ここで得られた各測定値を、標準抗原（Ｓ−エクオール）の希釈系列から得られる検量線と照らし合わせ、算出された各値に基づき反応阻害を比較して、標識化されたＳ−エクオールの抗エクオール抗体への結合を２０％反応阻害する各イソフラボン類等の濃度及び標識化されていないＳ−エクオールの濃度（ＩＣ２０）を決定した。
【０１５９】
該競合反応は、実施例１同様の手順で、ＥＬＩＳＡにおける競合法を用いて行った。また、標識物として、西洋ワサビパーオキシダーゼを使用した。
【０１６０】
このようにして得られた、各々のイソフラボン類等の濃度と、標識化されていないＳ−エクオールの濃度の比をパーセント表示したものを交差性とした。これは、以下の式で表される。
交差性（％）＝（Ｓ−エクオールのＩＣ２０／各々のイソフラボン類等のＩＣ２０）×１００
【０１６１】
結果を表４に示す。
【０１６２】
【表４】
2014160088.tif 000005
【０１６３】
該結果から、この一次抗体の交差反応性は、Ｓ−エクオールとの交差性１００％に対し、Ｒ−エクオールとの交差性が１３．２４％、エクオールの代謝前のダイゼインとの交差性が０．０８％、ジヒドロダイゼインとの交差性が１．０３％、デヒドロエクオールとの交差性が０．３３％、ダイジンとの交差性が０．０６％であり、このほかの各種物質に対しても交差性が著しく低いことがわかる。これは、本発明の方法、更に本発明のキットによれば、Ｓ−エクオールを特異的に検出、測定できることを意味する。
【０１６４】
また、例えば従来公知のLABMASTER社のキットLabmaster Equol TR-FIAでは、ダイゼインとの交差率が０．８％であり（http://labmaster.fi/products/tr-fia-kits/equol-tr-fia.htm参照）、その交差性は本キットの１０倍である。また、Labmaster Equol TR-FIAにおけるデヒドロエクオールとの交差率は４２．３％、ジヒドロダイゼインとの交差率も４．０％であり、本キットは従来公知のキットより特異性が著しく高いといえる。
【０１６５】
また、これまでに、モノクローナル抗体を使った論文（Duncan C.S. Talbot, et al. Clinical Chemistry 53: 748-756, 2007）ではダイゼインに対する交差率が＜０．０４％という報告があり、本発明では、一次抗体として抗血清を使用しているにもかかわらず、モノクローナル抗体と同等の特異性を得ることができたことが分かる。
【０１６６】
＜試験例３＞
液体クロマトグラフ／タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）との相関性
本試験例では、ＥＬＩＳＡ法における競合法を採用し、且つ、標準抗原および標識化抗原にＳ−エクオールを用いた場合の、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法との相関性を調べた。具体的には以下のようにして相関性を調べた。
【０１６７】
１．生体試料
生体試料として、イソフラボン摂取前および摂取後の血清（男性１０名）を使用した。
【０１６８】
２．一次抗体
一次抗体として、実施例１と同様の、抗エクオールウサギ抗血清を使用した。該抗血清は、後述の抗血清希釈緩衝液で適宜希釈して試験に使用した。
【０１６９】
３．二次抗体
二次抗体として、実施例１と同様の、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を使用した。該抗体は、実施例１と同様に固相化させて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートとした。
【０１７０】
４．生体試料中のエクオールと競合する標識化抗原
標識化抗原として、実施例１と同様の、西洋ワサビパーオキシダーゼ標識Ｓ−エクオール及び標識化抗原液を使用した。
【０１７１】
５．標準抗原
標準抗原として、実施例１と同様に、Ｓ−エクオールを用いた。なお、８１０ｎｇ／ｍＬ  Ｓ−エクオールを標準抗原希釈液で適宜希釈して、標準エクオール溶液とした。
【０１７２】
６．標準抗原希釈液
標準抗原の希釈液として、１００％チャコール処理ヒト血清を用いた。
【０１７３】
７．抗血清希釈緩衝液
１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を抗血清希釈緩衝液とした。
【０１７４】
８．洗浄液
洗浄液として、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０含有０．３ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した。
【０１７５】
９．酵素液
酵素液として、６％β−グルファターゼ（株式会社日本バイオテスト研究所製）含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を酵素液とした。
【０１７６】
１０．基質
０．０５％過酸化水素水、２．２ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）含有５０ｍＭくえん酸緩衝液（ｐＨ５．５）を基質（基質液）とした。
【０１７７】
１１．反応停止液
３Ｎ硫酸を反応停止液とした。
【０１７８】
１２．エクオール濃度の測定手順
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルに、血清検体２０μＬ、酵素及び標識化抗原の混合液５０μＬ（標識化抗原液１に対して酵素液１０）を加え、攪拌後に２５℃で３０分静置する。その後、抗エクオールウサギ抗血清溶液５０μＬを加え、攪拌後に２５℃で１時間静置した。
【０１７９】
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルから反応溶液を除去した後に洗浄液を用いて３回ウェルを洗浄した。洗浄後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルに基質を１００μＬ加え、２５℃で３０分間静置した。その後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体固相化プレートのウェルに反応停止液を１００μＬ加え、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、同様に測定した標準希釈液を用いて作製した標準抗原の希釈系列から得られる検量線から、試料中のエクオール濃度を算出した。
【０１８０】
また、液体クロマトグラフ／タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて、同一の生体試料のエクオール濃度を測定した。得られた結果を比較した。これらの相関性を表５および図６に示す。
【０１８１】
【表５】
2014160088.tif 000006
【０１８２】
表５から、実施例４による血清検体の測定結果における絶対値は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの半分弱と低いが、表５から、これらの相関係数は０．９８４と高いことが分かる。
【０１８３】
＜試験例４＞
Ｓ−エクオール産生者／非産生者の判定１（カットオフ値の設定）
本試験例では、以下のようにしてカットオフ値を設定した。
【０１８４】
尿検体は、前日の夕食時に大豆イソフラボン摂取（イソフラボンアグリコンとして約２５ｍｇ）させ、摂取６時間以降の早朝第一尿を使用した。対象者数は、２４４名（男性：７６名、女性；１６８名）であり、生体試料数は４３２であった。
【０１８５】
ダイゼイン（ＤＺＮ）濃度の測定結果を図７に示した。ＤＺＮ濃度は、ＨＰＬＣ法を用いて測定した。イソフラボンを前日摂取することによって早朝第一尿で十分量のＤＺＮが尿中に検出されたことから、Ｓ−エクオール産生者／非産生者の判定が可能と判断した。
【０１８６】
次に、ＥＬＩＳＡ法にて、尿中エクオール（ＥＱＬ）濃度（ＥＱＬ ＥＬＩＳＡ）を測定した。検出限界は３３０ｎｇ／ｍｌであった。同時に、ＨＰＬＣ法での結果に基づき、ＤＺＮ濃度に対するＥＱＬ濃度の対数比（Ｌｏｇ  Ｅ／Ｄ ｒａｔｉｏ）を算出した。図８に、ＥＱＬ  ＥＬＩＳＡとＬｏｇ  Ｅ／Ｄ ｒａｔｉｏとのプロット図を示した。なお、Ｌｏｇ  Ｅ／Ｄ ｒａｔｉｏは、−１．７５（Kenneth D.R. Stechell and Sindey J. cole, J. Nutr. 136:2188-2193, August 2006)を基準値とし、−１．７５以上をＳ−エクオール産生者、−１．７５未満を非産生者と判断した。
【０１８７】
これに基づき、エクオール産生者／非産生者の誤判定率が最も低くなるエクオール濃度、すなわちカットオフ値を検討した。検討結果を表６に示す。なお、ＨＰＬＣ法において、産生者と判断された生体試料数は３７７、非産生者と判断された生体試料数は５５であった。
【０１８８】
【表６】
2014160088.tif 000007
【０１８９】
表６から、エクオール濃度が８００ｎｇ／ｍｌの場合に、エクオール産生者／非産生者の誤判定率が最も低くなった。従って、この場合、カットオフ値は８００ｎｇ／ｍｌと設定された。
【０１９０】
＜試験例５＞
Ｓ−エクオール産生者／非産生者の判定２（カットオフ値の設定）
試験例４と同様にして、Ｓ−エクオール産生者か非産生者かの判定基準となるカットオフ値を設定した。
【０１９１】
なお、免疫測定法における生体試料数は７１３である。また、検出限界以下の値を「０」とした。検討結果を表７に示す。
【０１９２】
【表７】
2014160088.tif 000008
【０１９３】
表７から、エクオール濃度が６５０ｎｇ／ｍｌの場合に、エクオール産生者／非産生者の誤判定率が最も低くなった。従って、この場合、カットオフ値は６５０ｎｇ／ｍｌと設定された。
【０１９４】
＜試験例６＞
Ｓ−エクオール産生者／非産生者の判定３
試験例４と同様にして、Ｓ−エクオール産生者か非産生者かの判定基準となるカットオフ値を設定した。
【０１９５】
なお、免疫測定法における生体試料数は１１８である。検討結果を表８に示す。
【０１９６】
【表８】
2014160088.tif 000009
【０１９７】
表８から、エクオール濃度が１０００ｎｇ／ｍｌの場合に、エクオール産生者／非産生者の誤判定率が最も低くなった。従って、この場合、カットオフ値は１０００ｎｇ／ｍｌと設定された。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
抗エストロゲン効果、エストロゲン様効果を期待して、大豆加工品を摂取する際に、尿中、血液中のエクオール濃度を測定することにより、その効果の有無が判断されるが、エクオールを精確に測定するためにＨＰＬＣ法等の機器分析を用いる方法では、多検体処理には時間と手間がかかり、日常の測定には適さない。
【０１９９】
しかし、本発明により、尿中、血液中のエクオールを短時間で、しかも精確に測定することが可能となり、エクオールを産生する安全な乳酸菌製剤の投与の効果の判断も含め、大豆加工品の摂取の効果を類推することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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