(57)【要約】【課題】Ｓ１００Ａ８の新規受容体を標的とする慢性炎症抑制剤又は癌転移抑制剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】本発明は、細胞増殖抑制剤の候補物質がＮＰＴＮとＳ１００Ａ８との結合を有意に阻害する場合に、当該候補物質が細胞増殖抑制剤として評価する、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法、を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖抑制剤をスクリーニングする方法であって、細胞増殖抑制剤の候補物質の存在下でニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）とＳ１００Ａ８とをインキュベートし、ＮＰＴＮとＳ１００Ａ８との結合を阻害する物質を細胞増殖抑制剤として選定することを含んで成る、方法。
【請求項２】
前記Ｓ１００Ａ８がＳ１００Ａ９と複合体を形成している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＰＴＮがＮＰＴＮβである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ニューロプラスチンβ（ＮＰＴＮβ）とＳ１００Ａ８又は１００Ａ８／Ａ９との結合を阻害する薬剤を含んで成る、細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
前記薬剤が、ヨモギ、カンゾウ、ニンジン、チャ、オウゴン及びローズマリーから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項４に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の細胞増殖抑制剤が配合されたアトピー性皮膚炎、癌及び乾癬から選択される疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓ１００ファミリーに属するタンパク質であるＳ１００Ａ８の新規受容体であるニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）、特にＮＰＴＮβを標的とする細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過剰増殖や乾癬においてアップレギュレーションされるタンパク質としてＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９が知られる。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、２０を超えるメンバーから構成されるＥＦ−ハンド型カルシウム結合ドメインを有するＳ１００タンパク質ファミリーに属する（非特許文献１：Marenholz I et al., Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122）。どちらのタンパク質も好中球、活性化単球、及びマクロファージによって分泌され、それらの細胞の化学走性分子として機能し、炎症性細胞の漸増に関する正のフィードバックループに関与する（非特許文献２：Roth J et al., Trends Immunol (2003) 24:155-158）。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９陽性骨髄細胞は、炎症領域内に浸潤する最初の細胞である（非特許文献３：Odink K et al., Nature (1987) 330:80-82）。慢性関節リウマチ（非特許文献４：Liao H et al., Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803）、多発性硬化症（非特許文献５：Bogumil T et al., Neurosci Lett (1998) 247:195-197）、クローン病（非特許文献６：Lugering N, et al., Digestion (1995) 56:406-414）、及び結合組織疾患（非特許文献７：Kuruto R, et al., J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653）を含む多数のヒト炎症性疾患で高いＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９血清レベルが観察されている。従って、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９は、炎症の誘導及び伝播に重要な役割を担うと考えられている。
【０００３】
上皮細胞中でＳ１００Ａ８と１００Ａ９が果たす生物学的機能について、本発明者は以前、外因性Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９が複合体（Ｓ１００Ａ８／Ａ９）（別名：カルプロテクチン）を形成することで正常表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を刺激して乾癬性病変などにおいて発現亢進される炎症性サイトカインを産生させ、さらにＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＥＫ中でのＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の産生及び分泌を刺激することを明らかにした（非特許文献８：J Cell Biochem. 2007 Nov 28, Epub ahead of print)。さらに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９自体がＮＨＥＫの増殖を増強することも見出した。これらの結果は、主要メディエーターとしてＳ１００Ａ８／Ａ９が関与するＮＨＥＫの増殖と炎症の正のフィードバック機構の存在を明らかにした。即ち、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が炎症性サイトカインの産生を誘導して炎症性疾患を惹起し、その炎症が細胞増殖を誘導し、さらには細胞増殖が炎症を誘導するといったスパイラルを形成し、増殖・炎症が連鎖する持続性皮膚炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬などの原因となることが示唆された。
【０００４】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９により引き起こされる慢性炎症の負のサイクル形成を阻止するためには、Ｓ１００Ａ８及びＡ９のレセプターの同定が必要と考えられる。これまでに、エンプリンがＳ１００Ａ９のレセプターであり、これらの結合を阻害することで、慢性炎症の抑制、更には癌の転移を抑制することが知られている（特許文献１）。しかしながら、Ｓ１００Ａ８のレセプターとして機能するタンパク質についてはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2011-47932号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
【非特許文献２】Trends Immunol (2003) 24:155-158
【非特許文献３】Nature (1987) 330:80-82
【非特許文献４】Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803
【非特許文献５】Neurosci Lett (1998) 247:195-197
【非特許文献６】Digestion (1995) 56:406-414
【非特許文献７】J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
【非特許文献８】J Cell Biochem. (2008) 104:453-464
【非特許文献９】Nature Cell Biol. (2006) 8(12): 1369-1375
【非特許文献１０】Hum Genet (2002) 111:310-313
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｓ１００Ａ８の新規受容体を標的とする細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、このたび、エンプリンとの相同性に基づくデータベースサーチにより、Ｓ１００Ａ８の新規レセプターの候補タンパク質としてニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）に着目した。ＮＰＴＮは、２個の免疫グロブリン様ドメインを有するＮＰＴＮαと、３個の免疫グロブリン様ドメインを有するＮＰＴＮβのイソ型が存在することが知られているが、メラノーマ及びケラチナサイトにおける発現を調べたところ、いずれにおいてもＮＰＴＮβが主に発現していることが判明した。また、ＲＡＧＥ、エンプリン又はＮＰＴＮβとＳ１００Ａ８との結合試験において、ＮＰＴＮβのみがＳ１００Ａ８と結合することが明らかとなった。Ｓ１００Ａ８によるケラチノサイト増殖促進には、ＮＰＴＮが関与していることが示された。さらに、免疫染色の結果は、Ｓ１００Ａ８及びＮＰＴＮがメラノーマやアトピー性皮膚炎の病変皮膚で強発現しており、これらが同様の局在性を示すことが明らかとなった。
【０００９】
このように、本発明者らは、ＮＰＴＮ（特にＮＰＴＮβ）がＳ１００Ａ８のレセプターであること、そして、これらの間の結合を阻害することで細胞増殖が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）  細胞増殖抑制剤をスクリーニングする方法であって、細胞増殖抑制剤の候補物質の存在下でニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）とＳ１００Ａ８とをインキュベートし、ＮＰＴＮとＳ１００Ａ８との結合を阻害する物質を細胞増殖抑制剤として選定することを含んで成る、方法。
（２）  前記Ｓ１００Ａ８がＳ１００Ａ９と複合体を形成している、（１）に記載の方法。
（３）  前記ＮＰＴＮがＮＰＴＮβである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  ニューロプラスチンβ（ＮＰＴＮβ）とＳ１００Ａ８又は１００Ａ８／Ａ９との結合を阻害する薬剤を含んで成る、細胞増殖抑制剤。
（５）  前記薬剤が、ヨモギ、カンゾウ、ニンジン、チャ、オウゴン及びローズマリーから成る群から選択される植物体又はその抽出物を一種又は二種以上含む、請求項４に記載の細胞増殖抑制剤。
（６）  （４）又は（５）に記載の細胞増殖抑制剤が配合されたアトピー性皮膚炎、癌及び乾癬から選択される疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
（７）  細胞の異常増殖に関連する症状又は疾患を改善するための美容的及び／又は治療的方法であって、細胞の異常増殖に関連する症状又は疾患の予防及び／又は治療が必要な対象に対して、（４）又は（５）に記載の細胞異常増殖抑制剤を適用することを含む方法。
（８）  アトピー性皮膚炎、癌及び乾癬から選択される疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、該疾患の治療が必要な対象に対して、（４）又は（５）のいずれか１項に記載の細胞異常増殖抑制剤を適用することを含む方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＮＰＴＮ（特にＮＰＴＮβ）とＳ１００Ａ８との結合の阻害を指標とすることで、細胞増殖抑制剤の探索が可能になる。また、本発明のスクリーニング方法によって得られた細胞増殖抑制剤は、細胞異常増殖に関連する疾患、例えばアトピー性皮膚炎、癌又は乾癬の予防又は治療に有用となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エンプリンとＮＰＴＮβの構造比較を示す。
【図２】メラノーマ及びケラチノサイトにおけるＮＰＴＮの相対発現を示す。
【図３】ＮＰＴＮｓｉＲＮＡによるケラチノサイト増殖抑制効果を示す。
【図４Ａ】ＲＡＧＥ及びエンプリンと各Ｓ１００タンパク質との結合を検出する、ウェスタンブロットによるバンドを示す。
【図４Ｂ】ＮＰＴＮβと各Ｓ１００タンパク質との結合を検出する、ウェスタンブロットによるバンドを示す。
【図５Ａ】メラノーマにおけるＳ１００Ａ８とＮＰＴＮの局在を示す免疫染色図。
【図５Ｂ】アトピー性皮膚炎患部表皮におけるＳ１００Ａ８とＮＰＴＮの局在を示す免疫染色図。
【図６】ＰＬＡ(Proximity Ligation Assay) 法によるアトピー性皮膚炎患部表皮におけるＳ１００Ａ８とＮＰＴＮの相互作用を示す。
【図７Ａ】ヨモギエキスのＮＰＴＮβ−Ｓ１００Ａ８結合阻害効果を示す。
【図７Ｂ】各植物エキスのＮＰＴＮβ−Ｓ１００Ａ８結合阻害効果の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ニューロプラスチン（ＮＰＴＮ）
ＮＰＴＮは、ストロマ細胞由来因子受容体１（ＳＤＦＲ１）又はストロマ細胞由来受容体１（ＳＤＲ１）とも称され、１回膜貫通型の細胞表面タンパク質であり、神経細胞の分化や細胞接着に関係すると考えられているが、その機能についてはあまり知られていない。ＮＰＴＮは、２個の免疫グロブリン様ドメインを有するＮＰＴＮαと、３個の免疫グロブリン様ドメインを有するＮＰＴＮβのイソ型が存在することが知られている。エンプリンと比較したＮＰＴＮβの構造を図１に示す。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、特に限定されるものではないが、候補物質の存在下ＮＰＴＮ（特にＮＰＴＮβ）とＳ１００Ａ８とをインキュベーションし、ＮＰＴＮとＳ１００Ａ８タンパク質との結合を有意に阻害する候補薬剤を細胞増殖抑制剤として選択することからなる。その評価基準として、例えばＮＰＴＮとＳ１００Ａ８タンパク質との結合がコントロールを作用させた場合と比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％阻害されていたなら慢性炎症又は癌転移を「有意に抑制する」、と判断してよい。
【００１５】
Ｓ１００Ａ８は、上述のとおりＳ１００Ａ９と複合体を形成していることがあり、この複合体がエンプリンと結合することもある。従って、Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体を本発明のスクリーニングに用いてもよい。
【００１６】
なお、本発明者らは、このたび、エンプリン、ＮＰＴＮα及びＮＰＴＮβがそれぞれ、ホモ及びヘテロダイマーを形成することを見出した。したがって、本発明のスクリーニングに用いられるＮＰＴＮは、ホモダイマーを形成していてもよく、あるいはエンプリン又はＮＰＴＮαもしくはＮＰＴＮβのいずれかとヘテロダイマーを形成していてもよい。
【００１７】
ＮＰＴＮ（特にＮＰＴＮβ）とＳ１００Ａ８との結合の阻害を検出する手段は特に限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡ法に基づきＮＰＴＮとＳ１００Ａ８（又はＳ１００Ａ８／Ａ９）との結合における検量線を作製し、この結合を阻害する分子、すなわち吸光度の低下する分子を細胞増殖抑制剤の候補薬剤として検出することができる。良好な検出感度を確保する観点から、固体支持体に吸着される分子は、分子量が大きいＮＰＴＮが好ましい。
【００１８】
Ｓ１００Ａ８及びＡ９
Ｓ１００Ａ８及びＡ９のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列は、例えばHum Genet (2002) 111:310-313（非特許文献１０）に公開されている。本発明において使用できるＳ１００Ａ８及びＡ９は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。Ｓ１００Ａ８及びＡ９の組換タンパク質は、当業界で周知の方法に従い、例えば単離したまたはＰＣＲにより合成したＳ１００Ａ８又はＡ９遺伝子 (cDNA) を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
【００１９】
Ｓ１００Ａ８は、水や培地、例えば表皮角化細胞の培養に適当な培地、例えば上記EpiLife（登録商標）培地に溶解し、本発明のスクリーニング系に添加する。添加量は、一概には規定できないが１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ程度の濃度とする。Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ８／Ａ９の添加は、好ましくは塩化カルシウムの存在下で行う。Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ８／Ａ９の存在下でのインキュベーション時間、インキュベーション温度といった培養条件は特に制限されることはなく、好ましくは３０〜３７℃で１〜１４時間、より好ましくは３４〜３７℃で２〜７時間、好ましくはＣＯ2５％の下でインキュベーションを行う。
【００２０】
本発明の細胞増殖抑制剤は、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ８／Ａ９に起因する細胞の異常増殖関連疾患、例えばアトピー性皮膚炎、癌、又は乾癬などの予防、治療といった改善等に有効な医薬品又は化粧品として利用できる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法により得られた細胞増殖抑制剤として、ヨモギ、カンゾウ、ニンジン、チャ、オウゴン及びローズマリーから成る群から選択される植物体又はその抽出物が挙げられる。
【００２２】
ヨモギ（学名：Artemisia indica var. maximowiczii）は、日本や朝鮮半島などに分布するキク科の多年草であり、ヨモギの葉は止血作用を有する生薬として知られている。
カンゾウ（学名：Glycyrrhiza）は、地中海地方、小アジア、ロシア南部、中央アジア、中国北部、北アメリカなどに自生するマメ科の多年草であり、根は乾燥させたものは抗炎症作用を有する生薬として知られている。
ニンジンは、原産地は中国及び朝鮮半島を原産とするウコギ科の多年草であるオタネニンジン（学名：Panax ginseng C.A.Meyer）が好ましい。疲労回復や神経細胞活性化、免疫力の増強などの作用を有する生薬として知られている。
チャ（学名：Camellia sinensis）は、日本、中国を原産とするツバキ科ツバキ属の常緑樹であり、チャエキスは、抗酸化作用や抗菌作用を有することが知られている。
オウゴンは、ロシア、中国を原産とするシソ科タツナミソウ属のコガネバナ（学名：Scutellaria baicalensis Georgi）の根であり、鎮痒作用を有する生薬として知られている。
ローズマリー（学名：Rosmarinus officinalis）は、地中海沿岸地方原産で、シソ科に属する常緑性低木であり、ローズマリーエキスは、血行促進作用や抗酸化作用を有することが知られている。
【００２３】
これらの植物体又は抽出物のうち、特に、ヨモギエキスはＮＰＴＮβとＳ１００Ａ８との結合を有意に阻害することが確認されているため（図８Ａ）、細胞増殖抑制剤の好ましい活性成分であることが予想される。ここで、本発明で使用する各植物の植物体又はその抽出物は、各々の植物体の各種部位（花、花穂、果皮、果実、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子又は全草など）をそのまま又は乾燥したものを粉砕して乾燥粉末としたもの、あるいはそのまま又は乾燥・粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【００２４】
抽出物の場合、抽出に用いられる抽出溶媒は通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特にメタノール、エタノールあるいは１，３−ブチレングリコール等のアルコール類、含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができ、このうち特に、アルコール類、含水アルコール類が好ましく、特にメタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、含水エタノールまたは含水１，３−ブチレングリコールが好ましい。また前記溶媒は、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
【００２５】
抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から、常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過又はイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。更に多くの場合は、そのままの状態で利用できるが、必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、脱臭・脱色等の精製処理手段としては、活性炭カラム等を用いれば良く、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えば良い。
【００２６】
植物体の抽出部位として、ヨモギ及びチャの場合には葉が、カンゾウの場合には根及び茎が、ニンジン及びオウゴンの場合には根が、ローズマリーの場合には葉及び花が考えられるが、抽出部位はこれらに限定されない。
【００２７】
上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。
【００２８】
本発明の細胞増殖抑制剤は、前記植物体又はその抽出物の一種または二種以上からなるものであることが好ましいが、本発明の効果を損なわない範囲において、他の種々の成分を含有することができる。また、本発明の細胞増殖抑制剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の細胞増殖抑制剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００２９】
本発明の細胞増殖抑制剤の上記エキス成分の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、一般には阻害剤全量中、乾燥物として0.0001〜20.0質量％、好ましくは0.0001〜10.0質量％である。ヨモギエキス、カンゾウエキス、ニンジンエキス、チャエキス、オウゴンエキス及びローズマリーエキスは濃度依存的に細胞異常増殖を抑制することが考えられる。
【００３０】
また、細胞増殖抑制剤中には、上記薬剤以外に、例えば、通常の食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００３１】
さらに、本発明の細胞増殖抑制剤を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸及びその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンＡ類なども適宜配合することができる。
【００３２】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
例１．メラノーマ及びケラチノサイトにおけるＮＰＴＮの相対発現
定量的ＰＣＲは、次のプライマー・セットを用いて行われた。
NPTN-panF: gtaagaatgccagcaacatggagt（配列番号１）
NPTN-panR: gccaactgacttgcaatacatagtgg（配列番号２）
NPTN-betaR: aggatgataatttcagccagaattccc（配列番号３）
ＮＰＴＮαの定量には、ＮＰＴＮ−ｐａｎＦとＮＰＴＮ−ｐａｎＲ、ＮＰＴＮβの定量には、ＮＰＴＮ−ｐａｎＦとＮＰＴＮ−ｂｅｔａＲを用いた。得られた値は、Ｇ３ＰＤＨ（G3-F: GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG（配列番号４）, G3-R: TATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG（配列番号５））の発現量をもとに補正して比較した。
用いたｃＤＮＡは、２種類のメラノーマ細胞株（SK-MEL-2, SK-MEL-5)、及び分化段階の異なるケラチノサイト（KC80%: 増殖期、KC100％： コンフルエント、KC-Ca: コンフルエント後、1.2 mM カルシウム添加し、さらに2日間培養、KC-Air: コンフルエント後空気暴露15分間、その後さらに2日間培養）から調製した。図２に示されるとおり、メラノーマ及びケラチノサイトのいずれにおいても、ＮＰＴＮβが主に発現した。
【００３４】
例２．ＮＰＴＮｓｉＲＮＡによるケラチナサイト増殖抑制
ＮＰＴＮの発現抑制のために、ＲＮＡｉＭａｘを用いて、ＮＰＴＮｓｉＲＮＡ（Santaq Cruz Biotechnology, Inc, Neuroplastin siRNA (h): sc-90193）を、終濃度 20 nMとなるように増殖期の培養ケラチノサイトにトランスフェクションした。コントロールとして、ヒト遺伝子のいずれの部分とも相同性を有していないcontrol siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-3707) を使用した。尚、トランスフェクションは、培養培地を増殖因子を含まない基礎培地に交換してから行った。トランスフェクションから２４時間後にＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ８＋Ａ９（10 μg/ml）で増殖ケラチノサイトを刺激し、さらに２４時間経過後にＲＮＡを採取した。その結果、図３に示すとおり、ＮＰＴＮｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合、上記コントロールを用いた場合と比較して、ケラチノサイト増殖が有意に抑制された。
【００３５】
例３．Ｓ１００タンパク質と受容体の結合
Ｍｙｃタグをつけた各Ｓ１００タンパク質（S100A4, S100A7, S100A8, S100A9, S100A11, S100B)ｃＤＮＡ、ＨＡタグをつけたＲＡＧＥｃＤＮＡ、ＮＰＴＮｃＤＮＡ、エンプリンｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを持つベクターに挿入して、発現コンストラクトを作製した。ＨＥＫ２９３細胞に、上記のようにトランスフェクトし、４８時間後、細胞抽出液を調製した。これらのサンプルをＭｙｃ抗体を用いて免疫沈降反応を行った。通常の方法により、ウェスタンブロットを行い、Ｍｙｃ抗体及びＨＡ抗体を用いて検出した。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
【００３６】
例４．表皮におけるＳ１００Ａ８とＮＰＴＮの局在
１）免疫染色
メラノーマの患者組織を、４％パラフォルムアルデヒドで固定後、パラフィンに包埋し、４μｍの切片を作製した。キシレンで脱パラフィン後、イムノブロック（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社、Cat. No. KN001A）を用いて非特異的抗体の結合をブロックした上で、一次抗体（anti-S100A8抗体：SC8112, Santaq Cruz Biotechnology, Inc, 及び、Anti-Neuroplastin/SDFR1 (N-term), ACRIS Antibodies [メーカー型番］AP31309PU-N）と１時間３７℃で反応させ、洗浄後、二次抗体（Molecular Probe社、Alexa Fluor 594 anti-rabbit, A-21207、Alexa Fluor 488、A-21467）と反応させ、蛍光顕微鏡（Olympus, BX51）で観察した。
同様に、アトピー性皮膚炎病変部からもバイオプシーを行い、上記と同様に染色し、Ｓ１００Ａ８とＮＰＴＮの局在を観察した。
その結果、Ｓ１００Ａ８及びＮＰＴＮは、メラノーマ組織及びアトピー性皮膚炎病変部組織上で同一局在を示した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
【００３７】
２）アトピー皮膚におけるＳ１００Ａ８とＮＰＴＮの相互作用の証明
Ｓ１００Ａ８とＮＰＴＮとが、単に結合しているだけでなく、実際に相互作用していることをＰＬＡ(Proximity Ligation Assay) 法により確認した。ＰＬＡ法によれば、ＤＮＡプローブで標識された２種類の抗体を用い、蛍光色素をラベルした相補的ＤＮＡをハイブリダイズさせることで、それらのタンパク質が相互作用しているか否かを明らかにすることができる。ＰＬＡ法は、通常の免疫染色と比較してはるかに高感度である。
Olink社のDuolink in situ PLAキットを用い、相互作用試験を行った。アトピー患者から得られた患部皮膚組織を、4％ パラホルムアルデヒドで固定後、通常の方法でパラフィンに包埋した。4 μmで細切後、キシレン処理、エタノール処理を経てＰＢＳにて洗浄し、ブロッキング後、一次抗体（抗S100A8  抗体：Calgranulin A [C-19、sc-8112][ Santa Cruz Biotechnology]、抗ニューロプラスチン抗体：AP31309PU-N [Acris Antibodies, Inc.]）と４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ＰＬＡプローブ（anti-goat PLUS, anti-rabbit MINUS [OLINK Bioscience]）と、３７℃で２時間反応させた。
洗浄後、ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションを行い、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、リガーゼを加えて３７℃で１５分インキュベートし、プローブを融合させた。ポリメラーゼを加え、３７℃で９０分インキュベートし、ライゲートしたＤＮＡプローブの増幅を行った。Detection kit 613 (Olink社) を用いて蛍光色素をラベルし、顕微鏡観察を行った。その結果、Ｓ１００Ａ８とＮＰＴＮはアトピー性皮膚炎患部表皮の上層及び顆粒層付近で強い相互作用を有することが確認された（図６）。
【００３８】
例５．ＥＰＴＮβ−Ｓ１００Ａ８  ＥＬＩＳＡ  スクリーニング
ｐｈＣＭＶ−ＦＳＲＴＭベクター(Genlantis, San Diego, CA) に、膜貫通ドメイン及び、細胞内ドメインを欠損させた、Ｈｉｓタグつき、ソリュブル・ニューロプラスチン（sol-NPTN, 1-338AA）を挿入し、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。４８時間後、細胞抽出液を調製し、ニッケルカラムにより、ｓｏｌ−ＮＰＴＮを精製した。ｓｏｌ−ＮＰＴＮ(PBS100 ml中2 μg/ml)を９６−ウェルプレートの各ウェルに分注し、４℃で一晩放置し、ｓｏｌ−ＮＰＴＮを固相化した。５％ＢＳＡでブロッキング後、２５０ｎｇ／ｍｌの１００Ａ８及び披見物質を添加し（全100 μl）、３７℃、１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄後、ウサギ抗Ｓ１００Ａ８抗体と３７℃、１時間反応させた。洗浄後、HRP-conjugated anti-Rabbit Fab (GE Healthcare)と３７℃、１時間反応させた後、TMB Peroxydase EIA substrate kit (Bio-Rad)を用いて発色させ、６３０ｎｍで測定した。結合阻害は、Ｓ１００Ａ８のみ添加した場合の吸光度を１００％として、これ以下の場合を阻害活性の持つと判定した。その結果、ヨモギエキス、カンゾウエキス、ニンジンエキス、チャエキス、オウゴンエキス及びローズマリーエキスに強い阻害活性が示された（図７Ａ及び図７Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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