(57)【要約】      （修正有）【課題】生存原核及び真核生物に関する核酸プローブに基づく診断アッセイの提供。【解決手段】原核又は真核生物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのｓｓｒＡ遺伝子又は少なくとも１０ヌクレオチドから成るその断片の使用。ＤＮＡ分子の５’端又は３’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が普遍的標的領域として用いられ、種間及び属特異的な核酸プローブアッセイにおける領域として用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核または真核生物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのｓｓｒＡ遺伝子または少なくとも１０ヌクレオチドから成るその断片の使用であって、標的領域は配列番号１〜２２７の配列またはそれらの断片から成る群より選択することができる、前記使用。
【請求項２】
標的配列が、配列番号１３〜１６、１９〜２２２、３５、３６、４９〜５２、６５〜７０、７３〜７４、８１〜８６、１５７〜１６２、１８４〜１８５、２００〜２０３、２１６〜２１７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、５５〜６２、１４９、１５０、１５１、１５２、３７、３８、１０１、１０２、１１５、１１６、またはそれらの断片から成る群より選択することができる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＤＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
【請求項４】
ＤＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
【請求項５】
低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
【請求項６】
低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片が、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いられる、請求項１記載の使用。
【請求項７】
原核または真核生物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出及び同定するための核酸プローブアッセイにおける標的領域としての、ｓｓｒＡ遺伝子のＲＮＡ転写物であるｔｍＲＮＡまたは少なくとも１０ヌクレオチドから成るその断片の使用であって、標的領域は配列番号１〜２２７の配列またはそれらの断片から成る群より選択することができる、前記使用。
【請求項８】
標的配列が、配列番号１３〜１６、１９〜２２２、３５、３６、４９〜５２、６５〜７０、７３〜７４、８１〜８６、１５７〜１６２、１８４〜１８５、２００〜２０３、２１６〜２１７、４９、５０、５１、５２、５３、５４、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、５５〜６２、１４９、１５０、１５１、１５２、３７、３８、１０１、１０２、１１５、１１６、またはそれらの断片から成る群より選択することができる、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ｔｍＲＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
【請求項１０】
ｔｍＲＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、普遍的標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
【請求項１１】
低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
【請求項１２】
低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片が、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いられる、請求項７記載の使用。
【請求項１３】
前記ｓｓｒＡ遺伝子断片または前記ｔｍＲＮＡ断片が、増幅法において用いようとするプライマーの基礎として用いられる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の使用。
【請求項１４】
増幅法の産物が、核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
ｔｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写物が、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いられる、請求項７〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
標的領域が、生存および死亡原核または真核生物間を区別するためのアッセイの基礎として用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
標的領域が、原核または真核生物の広規模検出および／または同定のための多プローブ形式で用いられる、請求項１〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
ｓｓｒＡ遺伝子プローブまたはｔｍＲＮＡ転写物プローブを、原核または真核生物の広規模ハイスループット検出および同定のためのマイクロアレイ遺伝子チップ系に関連させる、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
標的領域が、問題の試料中の原核または真核生物を検出するアッセイにおけるプローブとして用いられる、請求項１〜１８のいずれか１項記載の使用。
【請求項２０】
ｓｓｒＡ遺伝子またはｔｍＲＮＡ転写物が、原核または真核生物のＤＮＡプロフィールを得て、そしてそれにより、同種の株間を区別するアッセイにおいて用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２１】
ｓｓｒＡ遺伝子、ｔｍＲＮＡ転写物またはそれに相補的なＤＮＡ配列、あるいはそれら断片が、感染性原核または真核生物に対する治療剤を設計するのに用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２２】
標的領域が、感染性病原体に対する薬剤療法の有効性をモニターするのに用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２３】
標的領域が、胃腸管における健康促進生物の生存度およびレベルをモニターするのに用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２４】
アッセイが、原核または真核生物の定量化のために用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項２５】
ｓｓｒＡ遺伝子配列のデータベースが、原核または真核生物を同定するのに用いられる、請求項１〜６および１３〜１５のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原核および／または真核生物の検出および同定のための核酸アッセイにおける使用のための標的配列の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
小さい安定多コピー数ＲＮＡ転写物（ｔｍＲＮＡ）をコードするｓｓｒＡ遺伝子は、すべての細菌に見られ、そして最近、葉緑体および珪藻類で同定されてきている。ｔｍＲＮＡは、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子両方としての二重の機能を有し、そして、停止コドンが欠失した一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｍＲＮＡを救出し、プロテアーゼ分解前に一部切除ペプチドのトランス翻訳（ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を促進するのに関与する（Ｋｅｉｌｅｒ，  Ｋ．Ｃ．ら（１９９６），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７１，  ９９０−９９３）。ｔｍＲＮＡの特有の機能のため、研究者は、これらの分子の二次構造とその機能の関係を解析してきた。これらの研究は、異なる微生物由来のｔｍＲＮＡ二次構造の保存、並びにこうした構造的保存の進化的有意性および機能的関連性に焦点を置いてきた。Ｍａｔｖｅｅｖａ，  Ｏら（１９９８），  Ｖｏｌ．１６，  Ｎｏ．１３，  １３７４−１３７５により、ＲＮＡ含有二次構造のモデルとしてｔｍＲＮＡを用い、ＲＮＡ分子に結合するオリゴヌクレオチドを調べる研究が行われた。該研究は、ｔｍＲＮＡにおける部位の同定を目的とせず、療法目的のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を目的とした。
【０００３】
細菌診断法のための核酸標的／プローブの数は、現在限定されている。こうしたものとして、診断目的のための新規ＤＮＡおよびＲＮＡ標的を同定し、そして性質決定する必要性が、現在、優先事項とみなされている。プローブの開発のための標的核酸配列は、例えば、プラスミド、リボソームＲＮＡ遺伝子、遺伝子間領域、ビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）因子をコードする遺伝子またはランダムゲノムＤＮＡ断片であってもよい。さらに、ＲＮＡに基づく検出のための標的として用いられる、いくつかのＲＮＡ分子が記載されてきており、例えば、リボソームＲＮＡおよびＲＮアーゼＰがある。
【０００４】
いかなるものでもよい核酸に基づくプローブアッセイの基礎は、研究されている原核および真核生物すべてに存在するよく性質決定された核酸配列を必要とする。原核または真核生物の信頼できる検出のため、用いられる核酸プローブは、非常に特異的であり（すなわち、他の生物由来の核酸と交差反応せず）、そして非常に感受性でなければならない（すなわち、検出しようとする生物のほとんどまたはすべての株がプローブと反応しなければならない）。したがって、好ましい標的配列は、問題の生物のすべての株に存在するであろう。こうした配列は、他の密接に関連する種と問題の種の区別を可能にする有意な配列多様性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を有するが、一方、問題の種のすべての株の検出を可能にするのに十分な配列保存性を有するであろう。一般的に、特異的核酸プローブアッセイの基礎を形成することが可能な、核酸配列の正確な同定は、冗長で困難であり、そして不確実である。現在まで、非常に多様な微生物のための核酸プローブの開発を促進するであろう、一般的なアプローチはほとんどない。プローブ開発のための潜在的に有用な標的として同定されてきている核酸配列は、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子およびＲＮＡ、並びにｒＲＮＡ  １６Ｓ／２３Ｓ遺伝子間領域である。
【０００５】
大部分の核酸プローブ／標的アッセイは、検出および同定の目的のため、細菌細胞の高コピー数リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびｒＲＮＡ  １６Ｓ／２３Ｓスペーサー領域（欧州特許第０  ３９５  ２９２号）に焦点を置く。多様な微生物の検出のため、これら
のｒＲＮＡプローブ／標的に基づく、いくつかの成功した商業的細菌診断キットが、販売されている。これらには、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴが販売する、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づく商業的プローブキット、およびＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．、ベルギー・ヘントが販売する、１６Ｓ／２３Ｓスペーサー領域に基づくＤＮＡプローブの範囲が含まれる。しかし、これらの診断キットの多くには制限があり、多くの場合において、低コピー数標的配列のための感受性の欠如および密接に関連する生物間の配列同一性のための特異性の欠如が含まれる。
【０００６】
存在するいかなるものでもよい微生物の生存度の指標を提供するため、試料に直接適用することが可能な、核酸に基づく方法は、食品、産業、環境および医学的適用に、非常に重要であろう。
【０００７】
ＤＮＡに基づく方法の不都合な点は、これらが生存および死亡生物間を区別しないことである。いくつかの研究は、細胞生存度の指標としてｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを用いることに、焦点を置いている（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，  Ｇ．Ｅ．Ｃ．ら（１９９８）Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ６４，  １３１３−１３１８）。しかし、これらの配列は、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡが細胞死後４８時間まで細菌細胞に存在する可能性があるため、満足できる標的ではない。
【０００８】
多核酸標的の同時モニターを取り込んだ、核酸に基づくマイクロアレイ様形式の出現により、現在、生存原核および真核細胞を検出し、そして同定する、プローブおよび／または標的領域として使用するための新規核酸配列を同定し、そして性質決定する、明らかな必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
発明の開示
本発明は、原核または真核生物に関する核酸プローブアッセイにおける標的領域としてのｓｓｒＡ遺伝子またはその断片の使用を提供する。
【００１０】
したがって、本発明は、ウイルス以外のすべての生物に関する適用を有する。
原核および真核生物の種を検出し、そして同定する標的領域として、ｓｓｒＡ遺伝子の領域を用いる、付随する利点を有する、他のいかなる核酸プローブアッセイも報告されてきていない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の１つの態様にしたがい、ＤＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
本発明の別の態様において、ＤＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
【００１２】
本発明のさらなる態様において、低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いてもよい。
【００１３】
本発明のさらなる態様において、低相同性領域に対応するｓｓｒＡ遺伝子分子の断片を、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いてもよい。
本明細書において、以後記載されるように、異なる生物由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のヌクレオチド配列並列は、これらの分子の５’および３’領域が、高い度合いの相同性を示し、そしてしたがって、普遍的標的領域として有用であることを示す。ｓｓｒＡ遺伝子はまた、いかなる他の細菌高コピー数ＲＮＡより、密接に関連した生物間の、より有意な度合いのヌクレオチド配列多様性も示す。これらの可変領域は、種間を区別する核酸アッ
セイの、理想的な標的である。
【００１４】
本発明はまた、原核または真核生物に関する核酸プローブアッセイにおける標的領域としての、ｓｓｒＡ遺伝子のＲＮＡ転写物であるｔｍＲＮＡまたはその断片の使用も提供する。
【００１５】
本発明の本側面の１つの態様にしたがい、ｔｍＲＮＡ分子の５’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
【００１６】
あるいは、ｔｍＲＮＡ分子の３’端由来の高相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、普遍的標的領域として用いてもよい。
本発明の本側面のさらなる態様にしたがい、低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、種間を区別する核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いてもよい。
【００１７】
さらなる態様にしたがい、低相同性領域に対応するｔｍＲＮＡ分子の断片を、属特異的プローブの生成のための標的領域として用いてもよい。
本発明にしたがった核酸プローブ（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、典型的には、ｓｓｒＡ遺伝子および／またはｔｍＲＮＡ転写物あるいはその相補的配列の少なくとも１０ヌクレオチドからなり、そして原核または真核生物に関する核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイで用いられる。その相補的配列へのプローブハイブリダイゼーションは、典型的には、放射性または非放射性（例えば、比色または蛍光）標識で核酸プローブを標識することにより、明らかにされる。
【００１８】
好ましい態様において、前記ｓｓｒＡ遺伝子断片または前記ｔｍＲＮＡ断片は、増幅法において用いようとするプライマーの基礎として用いてもよい。
ｓｓｒＡ遺伝子またはｔｍＲＮＡ配列いずれかの５’および３’領域に向けられる普遍的オリゴヌクレオチドプライマーを用い、本発明にしたがい、非常に多様な細菌からｓｓｒＡ遺伝子またはそのコードｔｍＲＮＡを増幅し、同時に広い範囲の生物の増幅を促進する一方、また、特異的な核酸プローブハイブリダイゼーションおよび検出を可能にしてもよい。
【００１９】
好ましくは、増幅法の産物は、核酸プローブアッセイにおける標的領域として用いられる。
さらに好ましくは、ｔｍＲＮＡ分子のｃＤＮＡ転写物は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして用いられる。
【００２０】
こうしたアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで行ってもよい。
本明細書に定義されるような標的領域は、生存および死亡原核または真核生物間を区別するためのアッセイの基礎として用いてもよい。
【００２１】
細胞死後に細菌細胞に存在する可能性があるｒＲＮＡおよびｍＲＮＡと対照的に、ｔｍＲＮＡは死んだ生物において、迅速に分解される。したがって、ｔｍＲＮＡは、単離細菌ＲＮＡへの核酸プローブハイブリダイゼーションにより直接、またはＲＮＡ増幅および増幅産物への核酸プローブハイブリダイゼーションの組み合わせにより、生存および死亡原核または真核生物間を区別するのに、有用な標的である可能性がある。
【００２２】
好ましくは、標的領域は、原核または真核生物の広規模検出および／または同定のための多プローブ形式で用いられる。
ｓｓｒＡ遺伝子プローブまたはｔｍＲＮＡ転写物プローブを、本発明にしたがい、原核または真核生物の広規模ハイスループット検出および同定のためのマイクロアレイ遺伝子
チップ系に関連させてもよい。
【００２３】
本発明にしたがった標的領域はまた、問題の試料中の原核または真核生物を検出するアッセイにおけるプローブとして用いてもよい。
こうした問題の試料には、呼吸管、泌尿生殖管または胃腸管由来の組織の試料、あるいは血液および血液分画、痰または脳脊髄液などの体液試料のような生物学的試料を含んでもよい。
【００２４】
本発明にしたがったアッセイはまた、食品試料、空気、水、海洋および土壌試料を含む環境試料、並びに植物および動物由来試料に対して行ってもよい。
本発明にしたがい、ｓｓｒＡ遺伝子またはｔｍＲＮＡ転写物の断片はまた、原核または真核生物のＤＮＡプロフィールを得て、そしてそれにより、同種の株間を区別するアッセイにおいて用いてもよい。
【００２５】
核酸配列並列は、個々の種内で、ｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ転写物において、配列変動が起こることを示している。この種内配列変動を用い、疫学のため、同一種の株間を区別し、例えば、病気の突発（ｏｕｔｂｒｅａｋ）において、または集団研究のため、感染性病原体を追跡することが可能である。
【００２６】
本発明の他の適用には、療法目的のため、感染性原核または真核生物に対して向けられる剤を設計するためのｓｓｒＡ遺伝子、ｔｍＲＮＡ転写物またはそれに相補的なＤＮＡ配列、あるいはその断片の使用が含まれる。
【００２７】
こうした剤には、アンチセンスｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド、リボザイム、および拮抗性ペプチドが含まれてもよく、そしていかなる種類の医学的状態における使用にも適している。
【００２８】
したがって、本発明は、ｔｍＲＮＡ標的を用い、生物学的試料においてのみ多様な生物の検出に用いることが可能である。したがって、いかなる抗感染性病原体薬剤治療中および該治療後に、ｔｍＲＮＡ標的を用い、これらの特定の感染性病原体に対する療法（例えば、抗微生物および／または抗寄生虫治療）の有効性をモニターしてもよい。
【００２９】
１つの態様において、標的領域を用い、感染性病原体に対する薬剤療法の有効性をモニターする。
別の態様において、標的領域を用い、胃腸管における健康促進生物の生存度およびレベルをモニターする。
【００３０】
本発明の本側面は、例えばヨーグルトまたは健康状態を改善する他の食品に含まれる、例えば健康促進（生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ））生物の腸フロラへの導入に関する。これらの生物の存在およびレベルを連続してモニターし、健康促進におけるこれらの連続した機能を確実にする目的および必要性がある。ｔｍＲＮＡ領域は、健康促進生物の存在をモニターするため、例えば糞便中の、生存生物を検出する標的として用いることが可能である。
【００３１】
さらなる態様において、アッセイは、原核または真核生物の定量化のために用いられる。
試料において生物を検出するプローブハイブリダイゼーションおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅を用いる際、シグナル強度に基づき、存在する生物の数を決定することが可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅のリアルタイム法もまた、試料中の生物の定量を可能にするのに用いてもよい。したがって、試料中の生物の数を定量化する能力は、治療目的の
ため、例えば、抗生物質または他の治療のため、あるいは治療有効性をモニターするため、臨床状況において、重要である可能性がある。
【００３２】
本発明のさらなる適用は、原核または真核生物を同定するためのｓｓｒＡ遺伝子配列データベースの使用である。
本発明は、ｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ配列の５’および３’相同領域、並びに可変領域のための多様なプローブを提供し、該プローブは、これらの配列またはそれに相補的な配列に由来する。代表的な配列は以下のとおりである：
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）ｓｓｒＡ
【００３３】
【化１】
2014195456.tif 000002
【００３４】
アクチノバチルス・アクチノマイセテムコミタンスｔｍＲＮＡ
【００３５】
【化２】
2014195456.tif 000003
【００３６】
エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【００３７】
【化３】
2014195456.tif 000004
【００３８】
エロモナス・サルモニシダｔｍＲＮＡ、内部部分的
【００３９】
【化４】
2014195456.tif 000005
【００４０】
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）ｓｓｒＡ
【００４１】
【化５】
2014195456.tif 000006
【００４２】
アルカリゲネス・ユートロファスｔｍＲＮＡ
【００４３】
【化６】
2014195456.tif 000007
【００４４】
アクイフェクス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ｓｓｒＡ
【００４５】
【化７】
2014195456.tif 000008
【００４６】
アクイフェクス・エオリクスｔｍＲＮＡ
【００４７】
【化８】
2014195456.tif 000009
【００４８】
巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【００４９】
【化９】
2014195456.tif 000010
【００５０】
巨大菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【００５１】
【化１０】
2014195456.tif 000011
【００５２】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｓｒＡ
【００５３】
【化１１】
2014195456.tif 000012
【００５４】
枯草菌ｔｍＲＮＡ
【００５５】
【化１２】
2014195456.tif 000013
【００５６】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ｓｓｒＡ
【００５７】
【化１３】
2014195456.tif 000014
【００５８】
百日咳菌ｔｍＲＮＡ
【００５９】
【化１４】
2014195456.tif 000015
【００６０】
ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓｓｒＡ
【００６１】
【化１５】
2014195456.tif 000016
【００６２】
ライム病ボレリアｔｍＲＮＡ
【００６３】
【化１６】
2014195456.tif 000017
【００６４】
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）ｓｓｒＡ
【００６５】
【化１７】
2014195456.tif 000018
【００６６】
カンピロバクター・ジェジュニｔｍＲＮＡ
【００６７】
【化１８】
2014195456.tif 000019
【００６８】
トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ）ｓｓｒＡ
【００６９】
【化１９】
2014195456.tif 000020
【００７０】
トラコーマクラミジア（Ｄ／ＵＷ−３／ＣＸ）ｔｍＲＮＡ
【００７１】
【化２０】
2014195456.tif 000021
【００７２】
トラコーマクラミジア（マウス肺炎）ｓｓｒＡ
【００７３】
【化２１】
2014195456.tif 000022
【００７４】
トラコーマクラミジア（マウス肺炎）ｔｍＲＮＡ
【００７５】
【化２２】
2014195456.tif 000023
【００７６】
クロロビウム・テピドゥム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ）ｓｓｒＡ
【００７７】
【化２３】
2014195456.tif 000024
【００７８】
クロロビウム・テピドゥムｔｍＲＮＡ
【００７９】
【化２４】
2014195456.tif 000025
【００８０】
シアノフォラ・パラドキサ（Ｃｙａｎｏｐｈｏｒａ  ｐａｒａｄｏｘａ）（藻類）シアネラ（ｃｙａｎｅｌｌｅ）ｓｓｒＡ
【００８１】
【化２５】
2014195456.tif 000026
【００８２】
シアノフォラ・パラドキサ（藻類）シアネラｔｍＲＮＡ
【００８３】
【化２６】
2014195456.tif 000027
【００８４】
アセトン・ブタノール生産菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ｓｓｒＡ、３’部分的
【００８５】
【化２７】
2014195456.tif 000028
【００８６】
アセトン・ブタノール生産菌ｔｍＲＮＡ、３’部分的
【００８７】
【化２８】
2014195456.tif 000029
【００８８】
デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）ｓｓｒＡ
【００８９】
【化２９】
2014195456.tif 000030
【００９０】
デイノコッカス・ラディオデュランスｔｍＲＮＡ
【００９１】
【化３０】
2014195456.tif 000031
【００９２】
デサルフォビブリオ・デサルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【００９３】
【化３１】
2014195456.tif 000032
【００９４】
デサルフォビブリオ・デサルフリカンスｔｍＲＮＡ、内部部分的
【００９５】
【化３２】
2014195456.tif 000033
【００９６】
ディケロバクター・ノドスス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｄｏｓｕｓ）ｓｓｒＡ、３’部分的
【００９７】
【化３３】
2014195456.tif 000034
【００９８】
ディケロバクター・ノドススｔｍＲＮＡ、３’部分的
【００９９】
【化３４】
2014195456.tif 000035
【０１００】
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ｓｓｒＡ
【０１０１】
【化３５】
2014195456.tif 000036
【０１０２】
エンテロコッカス・フェカリスｔｍＲＮＡ
【０１０３】
【化３６】
2014195456.tif 000037
【０１０４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｓｓｒＡ
【０１０５】
【化３７】
2014195456.tif 000038
【０１０６】
大腸菌ｔｍＲＮＡ
【０１０７】
【化３８】
2014195456.tif 000039
【０１０８】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｓｓｒＡ
【０１０９】
【化３９】
2014195456.tif 000040
【０１１０】
インフルエンザ菌ｔｍＲＮＡ
【０１１１】
【化４０】
2014195456.tif 000041
【０１１２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）（ＡＴＣＣ  ４３５０４）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１１３】
【化４１】
2014195456.tif 000042
【０１１４】
ヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ  ４３５０４）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１１５】
【化４２】
2014195456.tif 000043
【０１１６】
ヘリコバクター・ピロリ（株２６６９５）ｓｓｒＡ
【０１１７】
【化４３】
2014195456.tif 000044
【０１１８】
ヘリコバクター・ピロリ（株２６６９５）ｔｍＲＮＡ
【０１１９】
【化４４】
2014195456.tif 000045
【０１２０】
クレブシエラ・エロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（ＮＣＴＣ
９５２８）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１２１】
【化４５】
2014195456.tif 000046
【０１２２】
クレブシエラ・エロゲネス（ＮＣＴＣ  ９５２８）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１２３】
【化４６】
2014195456.tif 000047
【０１２４】
乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＮＣＴＣ  ６６２）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１２５】
【化４７】
2014195456.tif 000048
【０１２６】
乳酸杆菌（ＮＣＴＣ  ６６２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１２７】
【化４８】
2014195456.tif 000049
【０１２８】
レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１２９】
【化４９】
2014195456.tif 000050
【０１３０】
レジオネラ・ニューモフィラｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１３１】
【化５０】
2014195456.tif 000051
【０１３２】
リステリア・グライ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１３３】
【化５１】
2014195456.tif 000052
【０１３４】
リステリア・グライｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１３５】
【化５２】
2014195456.tif 000053
【０１３６】
リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１３７】
【化５３】
2014195456.tif 000054
【０１３８】
リステリア・イノキュアｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１３９】
【化５４】
2014195456.tif 000055
【０１４０】
リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＮＣＴＣ
７９７３）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１４１】
【化５５】
2014195456.tif 000056
【０１４２】
リステリア菌（ＮＣＴＣ  ７９７３）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１４３】
【化５６】
2014195456.tif 000057
【０１４４】
リステリア菌（ＮＣＴＣ  １１９９４）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１４５】
【化５７】
2014195456.tif 000058
【０１４６】
リステリア菌（ＮＣＴＣ  １１９９４）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１４７】
【化５８】
2014195456.tif 000059
【０１４８】
リステリア・ムライ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１４９】
【化５９】
2014195456.tif 000060
【０１５０】
リステリア・ムライｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１５１】
【化６０】
2014195456.tif 000061
【０１５２】
リステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１５３】
【化６１】
2014195456.tif 000062
【０１５４】
リステリア・ウェルシメリｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１５５】
【化６２】
2014195456.tif 000063
【０１５６】
マリノバクター・ヒドロカーボノクラスティクス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ
ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１５７】
【化６３】
2014195456.tif 000064
【０１５８】
マリノバクター・ヒドロカーボノクラスティクスｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１５９】
【化６４】
2014195456.tif 000065
【０１６０】
鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１６１】
【化６５】
2014195456.tif 000066
【０１６２】
鳥型結核菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１６３】
【化６６】
2014195456.tif 000067
【０１６４】
ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１６５】
【化６７】
2014195456.tif 000068
【０１６６】
ウシ型結核菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１６７】
【化６８】
2014195456.tif 000069
【０１６８】
らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）ｓｓｒＡ
【０１６９】
【化６９】
2014195456.tif 000070
【０１７０】
らい菌ｔｍＲＮＡ
【０１７１】
【化７０】
2014195456.tif 000071
【０１７２】
パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１７３】
【化７１】
2014195456.tif 000072
【０１７４】
パラ結核菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１７５】
【化７２】
2014195456.tif 000073
【０１７６】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓｓｒＡ
【０１７７】
【化７３】
2014195456.tif 000074
【０１７８】
ヒト型結核菌ｔｍＲＮＡ
【０１７９】
【化７４】
2014195456.tif 000075
【０１８０】
ヤギ伝染性胸膜肺炎菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）ｓｓｒＡ
【０１８１】
【化７５】
2014195456.tif 000076
【０１８２】
ヤギ伝染性胸膜肺炎菌ｔｍＲＮＡ
【０１８３】
【化７６】
2014195456.tif 000077
【０１８４】
性器マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３３５３０、＃１）ｓｓｒＡ
【０１８５】
【化７７】
2014195456.tif 000078
【０１８６】
性器マイコプラズマ（ＡＴＣＣ  ３３５３０、＃１）ｔｍＲＮＡ
【０１８７】
【化７８】
2014195456.tif 000079
【０１８８】
性器マイコプラズマ（ＡＴＣＣ  ３３５３０、＃２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１８９】
【化７９】
2014195456.tif 000080
【０１９０】
性器マイコプラズマ（ＡＴＣＣ  ３３５３０、＃２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１９１】
【化８０】
2014195456.tif 000081
【０１９２】
肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ｓｓｒＡ
【０１９３】
【化８１】
2014195456.tif 000082
【０１９４】
肺炎マイコプラズマｔｍＲＮＡ
【０１９５】
【化８２】
2014195456.tif 000083
【０１９６】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＡＴＣＣ  １９４２４）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０１９７】
【化８３】
2014195456.tif 000084
【０１９８】
淋菌（ＡＴＣＣ  １９４２４）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０１９９】
【化８４】
2014195456.tif 000085
【０２００】
淋菌（ＦＡ  １０９０）ｓｓｒＡ
【０２０１】
【化８５】
2014195456.tif 000086
【０２０２】
淋菌（ＦＡ  １０９０）ｔｍＲＮＡ
【０２０３】
【化８６】
2014195456.tif 000087
【０２０４】
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｓｓｒＡ
【０２０５】
【化８７】
2014195456.tif 000088
【０２０６】
髄膜炎菌ｔｍＲＮＡ
【０２０７】
【化８８】
2014195456.tif 000089
【０２０８】
ノストック・ムスコルム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）ＰＣＣ７１２０
ｓｓｒＡ
【０２０９】
【化８９】
2014195456.tif 000090
【０２１０】
ノストック・ムスコルムＰＣＣ７１２０  ｔｍＲＮＡ
【０２１１】
【化９０】
2014195456.tif 000091
【０２１２】
オドンテラ・シネンシス（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（珪藻）葉緑体ｓｓｒＡ
【０２１３】
【化９１】
2014195456.tif 000092
【０２１４】
オドンテラ・シネンシス（珪藻）葉緑体ｔｍＲＮＡ
【０２１５】
【化９２】
2014195456.tif 000093
【０２１６】
ポルフィラ・プルプレウム（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（紅藻）葉緑体ｓｓｒＡ
【０２１７】
【化９３】
2014195456.tif 000094
【０２１８】
ポルフィラ・プルプレウム（紅藻）葉緑体ｔｍＲＮＡ
【０２１９】
【化９４】
2014195456.tif 000095
【０２２０】
ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ｓｓｒＡ
【０２２１】
【化９５】
2014195456.tif 000096
【０２２２】
ポルフィロモナス・ギンギバリスｔｍＲＮＡ
【０２２３】
【化９６】
2014195456.tif 000097
【０２２４】
プロテウス・レットゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ｓｓｒＡ（ＮＣＴＣ  １０９７５）、内部部分的
【０２２５】
【化９７】
2014195456.tif 000098
【０２２６】
プロテウス・レットゲリｔｍＲＮＡ（ＮＣＴＣ  １０９７５）、内部部分的
【０２２７】
【化９８】
2014195456.tif 000099
【０２２８】
シュードアルテロモナス・ハロプランクトニ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｏｎｉ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０２２９】
【化９９】
2014195456.tif 000100
【０２３０】
シュードアルテロモナス・ハロプランクトニｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０２３１】
【化１００】
2014195456.tif 000101
【０２３２】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｓｓｒＡ
【０２３３】
【化１０１】
2014195456.tif 000102
【０２３４】
緑膿菌ｔｍＲＮＡ
【０２３５】
【化１０２】
2014195456.tif 000103
【０２３６】
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｓｓｒＡ
【０２３７】
【化１０３】
2014195456.tif 000104
【０２３８】
ネズミチフス菌ｔｍＲＮＡ
【０２３９】
【化１０４】
2014195456.tif 000105
【０２４０】
シーワネラ・ピュートリファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ｓｓｒＡ
【０２４１】
【化１０５】
2014195456.tif 000106
【０２４２】
シーワネラ・ピュートリファシエンスｔｍＲＮＡ
【０２４３】
【化１０６】
2014195456.tif 000107
【０２４４】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ｓｓｒＡ
【０２４５】
【化１０７】
2014195456.tif 000108
【０２４６】
黄色ブドウ球菌ｔｍＲＮＡ
【０２４７】
【化１０８】
2014195456.tif 000109
【０２４８】
ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）ｓｓｒＡ
【０２４９】
【化１０９】
2014195456.tif 000110
【０２５０】
ストレプトコッカス・ゴルドニｔｍＲＮＡ
【０２５１】
【化１１０】
2014195456.tif 000111
【０２５２】
ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ｓｓｒＡ
【０２５３】
【化１１１】
2014195456.tif 000112
【０２５４】
ミュータンス連鎖球菌ｔｍＲＮＡ
【０２５５】
【化１１２】
2014195456.tif 000113
【０２５６】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ｓｓｒＡ
【０２５７】
【化１１３】
2014195456.tif 000114
【０２５８】
肺炎連鎖球菌ｔｍＲＮＡ
【０２５９】
【化１１４】
2014195456.tif 000115
【０２６０】
化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｓｓｒＡ
【０２６１】
【化１１５】
2014195456.tif 000116
【０２６２】
化膿連鎖球菌ｔｍＲＮＡ
【０２６３】
【化１１６】
2014195456.tif 000117
【０２６４】
シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．  ＰＣＣ６３０１  ｓｓｒＡ
【０２６５】
【化１１７】
2014195456.tif 000118
【０２６６】
シネココッカスｓｐ．  ＰＣＣ６３０１  ｔｍＲＮＡ
【０２６７】
【化１１８】
2014195456.tif 000119
【０２６８】
ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）ｓｐ．  ＰＣＣ６８０３  ｓｓｒＡ
【０２６９】
【化１１９】
2014195456.tif 000120
【０２７０】
ラン藻ｓｐ．  ＰＣＣ６８０３  ｔｍＲＮＡ
【０２７１】
【化１２０】
2014195456.tif 000121
【０２７２】
テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ｓｓｒＡ
【０２７３】
【化１２１】
2014195456.tif 000122
【０２７４】
テルモトガ・マリティマｔｍＲＮＡ
【０２７５】
【化１２２】
2014195456.tif 000123
【０２７６】
サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｓｓｒＡ
【０２７７】
【化１２３】
2014195456.tif 000124
【０２７８】
サーマス・サーモフィルスｔｍＲＮＡ
【０２７９】
【化１２４】
2014195456.tif 000125
【０２８０】
梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）ｓｓｒＡ
【０２８１】
【化１２５】
2014195456.tif 000126
【０２８２】
梅毒トレポネーマｔｍＲＮＡ
【０２８３】
【化１２６】
2014195456.tif 000127
【０２８４】
コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）ｓｓｒＡ
【０２８５】
【化１２７】
2014195456.tif 000128
【０２８６】
コレラ菌ｔｍＲＮＡ
【０２８７】
【化１２８】
2014195456.tif 000129
【０２８８】
ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ｓｓｒＡ
【０２８９】
【化１２９】
2014195456.tif 000130
【０２９０】
ペスト菌ｔｍＲＮＡ
【０２９１】
【化１３０】
2014195456.tif 000131
【０２９２】
カンピロバクター・フィタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０２９３】
【化１３１】
2014195456.tif 000132
【０２９４】
カンピロバクター・フィタスｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０２９５】
【化１３２】
2014195456.tif 000133
【０２９６】
カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）（ＢＭ２５０９）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０２９７】
【化１３３】
2014195456.tif 000134
【０２９８】
カンピロバクター・コリ（ＢＭ２５０９）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０２９９】
【化１３４】
2014195456.tif 000135
【０３００】
カンピロバクター、ニワトリ単離体ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３０１】
【化１３５】
2014195456.tif 000136
【０３０２】
カンピロバクター、ニワトリ単離体ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３０３】
【化１３６】
2014195456.tif 000137
【０３０４】
ウェルチ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３０５】
【化１３７】
2014195456.tif 000138
【０３０６】
ウェルチ菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３０７】
【化１３８】
2014195456.tif 000139
【０３０８】
デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）（ＮＣＴＣ  １０９４５）
ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３０９】
【化１３９】
2014195456.tif 000140
【０３１０】
デュクレー菌（ＮＣＴＣ  １０９４５）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３１１】
【化１４０】
2014195456.tif 000141
【０３１２】
リステリア・イノキュア（食品単離体＃１）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３１３】
【化１４１】
2014195456.tif 000142
【０３１４】
リステリア・イノキュア（食品単離体＃１）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３１５】
【化１４２】
2014195456.tif 000143
【０３１６】
リステリア・イノキュア（食品単離体＃２）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３１７】
【化１４３】
2014195456.tif 000144
【０３１８】
リステリア・イノキュア（食品単離体＃２）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３１９】
【化１４４】
2014195456.tif 000145
【０３２０】
リステリア・イノキュア（食品単離体＃３）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３２１】
【化１４５】
2014195456.tif 000146
【０３２２】
リステリア・イノキュア（食品単離体＃３）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３２３】
【化１４６】
2014195456.tif 000147
【０３２４】
リステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ  １２２１０）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３２５】
【化１４７】
2014195456.tif 000148
【０３２６】
リステリア・イノキュア（ＡＴＣＣ  １２２１０）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３２７】
【化１４８】
2014195456.tif 000149
【０３２８】
リステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）（ＮＣＴＣ  １１８４６）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３２９】
【化１４９】
2014195456.tif 000150
【０３３０】
リステリア・イバノビ（ＮＣＴＣ  １１８４６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３３１】
【化１５０】
2014195456.tif 000151
【０３３２】
リステリア・シーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（ＮＣＴＣ  １１８５６）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３３３】
【化１５１】
2014195456.tif 000152
【０３３４】
リステリア・シーリゲリ（ＮＣＴＣ  １１８５６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３３５】
【化１５２】
2014195456.tif 000153
【０３３６】
腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３３７】
【化１５３】
2014195456.tif 000154
【０３３８】
腸炎菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３３９】
【化１５４】
2014195456.tif 000155
【０３４０】
表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＮＣＴＣ  １１０４７）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３４１】
【化１５５】
2014195456.tif 000156
【０３４２】
表皮ブドウ球菌（ＮＣＴＣ  １１０４７）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３４３】
【化１５６】
2014195456.tif 000157
【０３４４】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＮＣＴＣ  ８１８１）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３４５】
【化１５７】
2014195456.tif 000158
【０３４６】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＮＣＴＣ  ８１８１）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３４７】
【化１５８】
2014195456.tif 000159
【０３４８】
気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）ｓｓｒＡ
【０３４９】
【化１５９】
2014195456.tif 000160
【０３５０】
気管支敗血症菌ｔｍＲＮＡ
【０３５１】
【化１６０】
2014195456.tif 000161
【０３５２】
肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＣＷＬ０２９）、ｓｓｒＡ
【０３５３】
【化１６１】
2014195456.tif 000162
【０３５４】
肺炎クラミジア（ＣＷＬ０２９）ｔｍＲＮＡ
【０３５５】
【化１６２】
2014195456.tif 000163
【０３５６】
野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）ｓｓｒＡ
【０３５７】
【化１６３】
2014195456.tif 000164
【０３５８】
野兎病菌ｔｍＲＮＡ
【０３５９】
【化１６４】
2014195456.tif 000165
【０３６０】
グイラルディア・テタ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ  ｔｈｅｔａ）（プラスチド）ｓｓｒＡ
【０３６１】
【化１６５】
2014195456.tif 000166
【０３６２】
グイラルディア・テタ（プラスチド）ｔｍＲＮＡ
【０３６３】
【化１６６】
2014195456.tif 000167
【０３６４】
タラシオシラ・ワイスフロッギ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  Ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉ）（プラスチド）ｓｓｒＡ
【０３６５】
【化１６７】
2014195456.tif 000168
【０３６６】
タラシオシラ・ワイスフロッギ（プラスチド）ｔｍＲＮＡ
【０３６７】
【化１６８】
2014195456.tif 000169
【０３６８】
ヘリコバクター・ピロリｓｓｒＡ、（臨床的単離体１）、内部部分的
【０３６９】
【化１６９】
2014195456.tif 000170
【０３７０】
ヘリコバクター・ピロリｔｍＲＮＡ、（臨床的単離体１）、内部部分的
【０３７１】
【化１７０】
2014195456.tif 000171
【０３７２】
ヘリコバクター・ピロリｓｓｒＡ、（臨床的単離体２）、内部部分的
【０３７３】
【化１７１】
2014195456.tif 000172
【０３７４】
ヘリコバクター・ピロリｔｍＲＮＡ、（臨床的単離体２）、内部部分的
【０３７５】
【化１７２】
2014195456.tif 000173
【０３７６】
リステリア・シーリゲリ（ＮＣＴＣ  １１８５６）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３７７】
【化１７３】
2014195456.tif 000174
【０３７８】
リステリア・シーリゲリ（ＮＣＴＣ  １１８５６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３７９】
【化１７４】
2014195456.tif 000175
【０３８０】
リステリア・イバノビ（ＮＣＴＣ  １１８４６）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３８１】
【化１７５】
2014195456.tif 000176
【０３８２】
リステリア・イバノビ（ＮＣＴＣ  １１８４６）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３８３】
【化１７６】
2014195456.tif 000177
【０３８４】
アフリカ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３８５】
【化１７７】
2014195456.tif 000178
【０３８６】
アフリカ菌（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３８７】
【化１７８】
2014195456.tif 000179
【０３８８】
マイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３８９】
【化１７９】
2014195456.tif 000180
【０３９０】
マイコバクテリウム・ゴルドネ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３９１】
【化１８０】
2014195456.tif 000181
【０３９２】
マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３９３】
【化１８１】
2014195456.tif 000182
【０３９４】
マイコバクテリウム・カンサシ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３９５】
【化１８２】
2014195456.tif 000183
【０３９６】
マイコバクテリウム・ケロネ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｅｌｏｎａｅ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０３９７】
【化１８３】
2014195456.tif 000184
【０３９８】
マイコバクテリウム・ケロネｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０３９９】
【化１８４】
2014195456.tif 000185
【０４００】
マイコバクテリウム・スズルガイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｚｕｌｇａｉ）（ＡＴＣＣ  ３５７９９）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４０１】
【化１８５】
2014195456.tif 000186
【０４０２】
マイコバクテリウム・スズルガイ（ＡＴＣＣ  ３５７９９）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４０３】
【化１８６】
2014195456.tif 000187
【０４０４】
マイコバクテリウム・マルモエンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４０５】
【化１８７】
2014195456.tif 000188
【０４０６】
マイコバクテリウム・マルモエンセ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４０７】
【化１８８】
2014195456.tif 000189
【０４０８】
マイコバクテリウム・フラベセンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４０９】
【化１８９】
2014195456.tif 000190
【０４１０】
マイコバクテリウム・フラベセンスｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４１１】
【化１９０】
2014195456.tif 000191
【０４１２】
マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４１３】
【化１９１】
2014195456.tif 000192
【０４１４】
マイコバクテリウム・マリヌムｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４１５】
【化１９２】
2014195456.tif 000193
【０４１６】
ネズミ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）（環境単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４１７】
【化１９３】
2014195456.tif 000194
【０４１８】
ネズミ型結核菌（環境単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４１９】
【化１９４】
2014195456.tif 000195
【０４２０】
スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＡＴＣＣ
１０１４３）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４２１】
【化１９５】
2014195456.tif 000196
【０４２２】
スメグマ菌（ＡＴＣＣ  １０１４３）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４２３】
【化１９６】
2014195456.tif 000197
【０４２４】
マイコバクテリウム・キセノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｎｏｐｉ）（臨床的単離体）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４２５】
【化１９７】
2014195456.tif 000198
【０４２６】
マイコバクテリウム・キセノピ（臨床的単離体）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４２７】
【化１９８】
2014195456.tif 000199
【０４２８】
マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＮＣＴＣ  １０４２５）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４２９】
【化１９９】
2014195456.tif 000200
【０４３０】
マイコバクテリウム・イントラセルラレ（ＮＣＴＣ  １０４２５）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４３１】
【化２００】
2014195456.tif 000201
【０４３２】
マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）（ＮＣＴＣ  １０８０３）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４３３】
【化２０１】
2014195456.tif 000202
【０４３４】
マイコバクテリウム・スクロフラセウム（ＮＣＴＣ  １０８０３）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４３５】
【化２０２】
2014195456.tif 000203
【０４３６】
ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４３７】
【化２０３】
2014195456.tif 000204
【０４３８】
ノカルジア・アステロイデスｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４３９】
【化２０４】
2014195456.tif 000205
【０４４０】
腸炎菌ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４４１】
【化２０５】
2014195456.tif 000206
【０４４２】
腸炎菌ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４４３】
【化２０６】
2014195456.tif 000207
【０４４４】
表皮ブドウ球菌（ＮＣＴＣ  １１０４７）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４４５】
【化２０７】
2014195456.tif 000208
【０４４６】
表皮ブドウ球菌（ＮＣＴＣ  １１０４７）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４４７】
【化２０８】
2014195456.tif 000209
【０４４８】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＮＣＴＣ  ８１８１）ｓｓｒＡ、内部部分的
【０４４９】
【化２０９】
2014195456.tif 000210
【０４５０】
ストレプトコッカス・アガラクティエ（ＮＣＴＣ  ８１８１）ｔｍＲＮＡ、内部部分的
【０４５１】
【化２１０】
2014195456.tif 000211
【０４５２】
上記配列のうち、配列番号４７から６２、６５から６８、７１および７２、９８および９９、１５９から１６８並びに１７６−２１７は、新規配列である。
上述の配列を用い、細菌種を同定するのに用いることが可能な、または核酸診断アッセイの生成のためのｓｓｒＡ遺伝子配列のデータベースを形成してもよい。
【０４５３】
本発明にしたがって同定される代表的なプローブは以下のとおりである：
サルモネラ属：
１）属特異的プローブ：
【０４５４】
（化２１１）
５’−ＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＧ−３’  配列番号２１８
マイコバクテリア：
２）結核複合体検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ
【０４５５】
（化２１２）
ＴＢ０１  ５’−ＡＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＡ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＣＡＧＣＧＡ−３’  配列番号２１９
３）鳥型結核菌およびパラ結核菌配列検出のためのオリゴヌクレオチドプローブ
【０４５６】
（化２１３）
プローブ１：  ＰＡＶ１−５’−ＧＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＴＡＡＧＣＧＣＣ−３’  配列番号２２０
プローブ２：  ＰＡＶ２−５’−ＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＣ−３’  配列番号２２１
リステリア属：
４）細胞の熱殺処理後のｔｍＲＮＡ完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）決定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ：
【０４５７】
（化２１４）
ＬＶｔｍ：  ５’−ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡ−３’  配列番号２２２
大腸菌：
５）細胞の熱殺処理後のｔｍＲＮＡ完全性決定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ：
【０４５８】
（化２１５）
Ｅｖｔｍ：  ５’−ＡＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＣＧＡ−３’  配列番号２２３
本発明にしたがって同定されるさらなる代表的なプライマーは以下のとおりである：
マイコバクテリア：
１）すべてのマイコバクテリア配列増幅のための縮重オリゴヌクレオチドプライマー
【０４５９】
（化２１６）
５’プライマー
１０ＳＡＡＭ３−５’−ＣＡＧＧＣＡＡ（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＡＣＣＡＣＣＧＴＡＡ−３’  配列番号２２４
３’プライマー
１０ＳＡＡＭ４−５’ＧＧＡＴＣＴＣＣ（Ｃ／Ｔ）Ｇ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｔ）Ｃ（Ａ／Ｇ）ＣＧ（Ａ／Ｇ）ＡＣ（Ａ／Ｔ）Ａ−３’  配列番号２２５
２）鳥型結核菌およびパラ結核菌増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー
【０４６０】
（化２１７）
５’プライマー：  ＡＰ１ｆｏｒ−５’−ＴＧＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＡＣＴＧ−３’
配列番号２２６
３’プライマー：  ＡＰ２ｒｅｖ−５’−ＣＡＣＧＣＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡ−３’
配列番号２２７
本発明は、以下の実施例により、さらに例示されるであろう。
【実施例】
【０４６１】
実施例１
入手可能ｔｍＲＮＡ配列の一次ヌクレオチド配列の検査
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ核酸並列プログラムを用いた入手可能ｔｍＲＮＡ配列の比較一次ヌクレオチド配列並列により、表１に示されるように、原核生物由来のｔｍＲＮＡが、他の細菌高コピー数ＲＮＡより、より有意な度合いのヌクレオチド配列多様性および非相同性を示すことが立証された。
【０４６２】
表１
異なる細菌由来のＲＮＡ分子間のヌクレオチド配列相同性パーセント
【０４６３】
【表１】
2014195456.tif 000212
【０４６４】
異なる細菌由来のｔｍＲＮＡ配列間のこれらの非相同性領域は、分子の中央に位置し、そしてｔｍＲＮＡ分子内の非相同なヌクレオチド配列の度合いにより、属特異的と共に種特異的プローブを生成し、細菌間の区別をし、および／または細菌を検出することが可能であることが示された。
【０４６５】
ヌクレオチド配列並列により、先に、ｔｍＲＮＡ分子の５’および３’隣接領域が種内および属内で、高い度合いの相同性を共有することが示されてきている。本観察により、普遍的オリゴヌクレオチドプライマーを生成し、多様な細菌からｓｓｒＡ遺伝子またはそのコードｔｍＲＮＡを増幅すること可能であることが示された。
【０４６６】
我々は現在、異なる生物由来のｔｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列内のこれらの相同性および非相同性領域を、分子レベルで生物を同定し、そして検出する基礎として用いることが可能であることを立証した。
【０４６７】
実施例２
コレラ菌ｔｍＲＮＡ特異的プローブの開発
図１に示されるような、大腸菌（配列番号３７）およびコレラ菌（配列番号１２７）ｓｓｒＡ配列のヌクレオチド配列並列は、これらの２つの細菌種が、系統発生的に密接に関連していることを示す。しかし、アステリスクマークの非存在により明示されるように、配列間に非相同性領域がある。図１に下線で示した、コレラ菌ｓｓｒＡヌクレオチド配列の可変領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを合成した。
【０４６８】
コレラ菌ｔｍＲＮＡ特異的プローブの配列は
【０４６９】
（化２１８）
５’−ＡＡＣＧＡＡＴＧＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡ−３’  配列番号１６９
である。
【０４７０】
増殖の対数中期および定常期で、大腸菌およびコレラ菌の液体培養から総ＲＮＡを単離した。図２に示すように、同等の量の単離総ＲＮＡを、変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動し、そしてＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロン膜上にブロッティングした。レーン１−４は以下に相当する：
レーン１：総大腸菌ＲＮＡ対数中期
レーン２：総コレラ菌ＲＮＡ対数中期
レーン３：総大腸菌ＲＮＡ定常期
レーン４：総コレラ菌ＲＮＡ定常期
その後、生じたノーザンブロットを、γＰ32で末端標識したコレラ菌ｔｍＲＮＡ特異的プローブとハイブリダイズさせた。図３に示されるハイブリダイゼーション実験結果は、コレラ菌ｔｍＲＮＡのみが検出されたため、プローブの特異性を立証する。さらに、増殖の定常期中の培養から単離されたコレラ菌ｔｍＲＮＡで、より高い度合いのハイブリダイゼーションシグナル強度が観察され、この期間中、より高いコピー数のｔｍＲＮＡ分子がコレラ菌細胞に存在することが示された。
【０４７１】
実施例３
未知のｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ配列の性質決定のための普遍的ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡオリゴヌクレオチド増幅プライマーの生成
すべての入手可能なｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡ配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ並列により、縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、多様な生物に関し、ｓｓｒＡ遺伝子およびｔｍＲＮＡヌクレオチド配列を増幅することが可能であることが示された。
【０４７２】
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、広い範囲の細菌由来の総ゲノムＤＮＡ調製から、ｓｓｒＡ遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。
合成縮重オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：
【０４７３】
（化２１９）
（ａ）ｔｍＵ５’：  ５’  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＣＲ増幅プライマー
５’−ＧＧＧ（Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ）ＴＡＣＧＧ（Ａ／Ｔ）ＴＴＣＧＡＣ−３’  配列番号１７０
（ｂ）ｔｍＵ３’：  ３’  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＣＲ増幅プライマー
５’−ＧＧＧＡ（Ａ／Ｇ）ＴＣＧＡＡＣＣ（Ａ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）ＧＴＣＣ−３’
配列番号１７１
縮重塩基位は、括弧内である。
【０４７４】
ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル上で電気泳動し、そして図４に示されるように、すべての場合で３５０塩基対（およそ）のＰＣＲ産物が増幅され、縮重ｔｍＲＮＡプライマーの「普遍性」が立証された。
【０４７５】
図４において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：サルモネラ・プーナ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐｏｏｎａ）
レーン３：クレブシエラ・エロゲネス
レーン４：プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）
レーン５：プロテウス・レットゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）
レーン６：エロモナス・ヒドロフィリア（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：エンテロコッカス・フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌
レーン１２：リステリア・イノキュア
レーン１３：リステリア・ムライ
レーン１４：リステリア・ウェルシメリ
レーン１５：リステリア・グライ
レーン１６：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
表２に示されるように、普遍的プライマーは、グラム陽性およびグラム陰性細菌両方から、ｓｓｒＡ遺伝子を増幅した。
【０４７６】
表２
普遍的増幅プライマーで試験した細菌種
【０４７７】
【表２】
2014195456.tif 000213
【０４７８】
実施例４
以前未知であった細菌ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡヌクレオチド配列の単離および性質決定
実施例２由来の、細菌のリステリア種およびウシ型結核菌細菌由来のゲノムＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定の目的のためのＴ−テール化プラスミドベクターにサブクローニングした。各種に関し、３つの組換えクローンを選択し、そしてジデオキシ配列決定法により、配列決定した。各サブクローンに関し、両ＤＮＡ鎖の配列を決定した。
【０４７９】
ウシ型結核菌ｓｓｒＡ遺伝子に関し決定したヌクレオチド配列は、ヒト型結核菌ｓｓｒＡ遺伝子配列と、１００％相同性を共有した。
リステリア種に関し得られた新規ｓｓｒＡ遺伝子配列（配列番号５１、５３、５５、５９および６１）のｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ並列を図５に示す。本解析により、リステリア細菌に関し、属特異的プローブおよびオリゴヌクレオチド増幅プライマーを生成することが可能であることが示された。さらに、該並列により、他のリステリア種からリステリア菌を区別するであろう、種特異的オリゴヌクレオチドプローブを生成することが可能であることもまた、示された。
【０４８０】
図５において、提唱される属特異的オリゴヌクレオチドプライマー、Ｌｔｍ  １およびＬｔｍ  ２は、囲みで示され、属特異的リステリア・オリゴヌクレオチドプローブＬＧｔｍも同様である。提唱されるリステリア菌種特異的オリゴヌクレオチドプローブ配列、ＬＳｔｍは、下線および斜字で示される。
【０４８１】
ｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡ核酸標的が、細菌診断法に適した標的であることをさらに例示するため、リステリア菌ｓｓｒＡ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号５５）と、入手可能な枯草菌ｓｓｒＡ遺伝子ヌクレオチド配列（配列番号１１）（リステリアに系統発生的に密接に関連する細菌）の比較並列を、図６に示すように行った。配列並列の解析は、４１％のヌクレオチド配列相同性パーセントを示し、一方、対応する１６Ｓ  ｒＲＮＡ並列は、８７％のヌクレオチド配列相同性パーセントを示す（データ未提示）。
【０４８２】
実施例５
リステリア細菌種に関するｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡ属特異的増幅プライマー、属特
異的および種特異的プローブの生成および適用
実施例４のリステリア属ｓｓＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡヌクレオチド配列並列を用い、ｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡヌクレオチド配列の領域を解析し、属特異的増幅プライマー、並びに属特異的および種特異的オリゴヌクレオチドプローブの生成の適切性を決定した。本解析中、これらの増幅プライマーおよびプローブの設計において、枯草菌に対し、最大配列相違を示す領域を選択した。
【０４８３】
合成オリゴヌクレオチドの配列は以下のとおりである：
【０４８４】
（化２２０）
（ａ）Ｌｔｍｌ：  ５’リステリア属特異的増幅プライマー
５’−ＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＧＧ−３’  配列番号１７２
（ｂ）Ｌｔｍ２：  ３’リステリア属特異的増幅プライマー
５’−ＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＴ−３’  配列番号１７３
（ｃ）ＬＧｔｍ：リステリア属特異的ハイブリダイゼーションプローブ
５’−ＧＴＧＡＧＡＣＣＣＴＴＡＣＣＧＴＡＧ−３’  配列番号１７４
（ｄ）ＬＳｔｍ：リステリア菌種特異的ハイブリダイゼーションプローブ
５’−ＴＣＴＡＴＴＴＡＡＣＣＣＣＡＧＡＣＧ−３’  配列番号１７５
属特異的増幅プライマーＬｔｍ１およびＬｔｍ２を、各場合で、テンプレートとして２０の異なる株由来の総ゲノムＤＮＡを用いた、一連のＰＣＲ反応で用いた。これらのプライマーを用い、リステリア種由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のみが増幅され（２６０塩基対産物）（図７および表３）、ｓｓｒＡ遺伝子／ｔｍＲＮＡが、細菌属の特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅に適した標的であることが立証された。試験したいかなる他の細菌種に関しても、増幅産物は観察されなかったが、実施例２に記載される普遍的プライマー（ｔｍＵ５’およびｔｍＵ３’）を用いると、これらの細菌種由来のＤＮＡからＰＣＲ産物が得られた。
【０４８５】
図７において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：Ｓ．プーナ
レーン３：Ｋ．エロゲネス
レーン４：Ｐ．ミラビリス
レーン５：Ｐ．レットゲリ
レーン６：Ａ．ヒドロフィリア
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：Ｅ．フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌株１
レーン１２：リステリア菌株２
レーン１３：リステリア菌株３
レーン１４：リステリア菌株４
レーン１５：リステリア菌、臨床的単離体
レーン１６：Ｌ．イノキュア
レーン１７：Ｌ．ムライ
レーン１８：Ｌ．ウェルシメリ
レーン１９：Ｌ．グライ
レーン２０：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
表３
リステリア特異的増幅プライマーで試験した細菌種
【０４８６】
【表３】
2014195456.tif 000214
【０４８７】
リステリア属特異的オリゴヌクレオチドプローブ、ＬＧｔｍを、図4に示されるサザン
ブロットにハイブリダイズさせた。陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、図８および表４に示されるように、リステリア種のみで観察され、特定の属を検出する際の標的としてのｔｍＲＮＡ配列の有用性が立証された。
【０４８８】
図８において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：サルモネラ・プーナ
レーン３：クレブシエラ・エロゲネス
レーン４：プロテウス・ミラビリス
レーン５：プロテウス・レットゲリ
レーン６：エロモナス・ヒドロフィリア
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：エンテロコッカス・フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌
レーン１２：リステリア・イノキュア
レーン１３：リステリア・ムライ
レーン１４：リステリア・ウェルシメリ
レーン１５：リステリア・グライ
レーン１６：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
本実施例に記載され、そして図７に示される、属特異的増幅を用いて生成されたＰＣＲ産物をサザンブロッティングし、そしてリステリア菌種特異的オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせた。図９および表４に示されるように、リステリア菌の４つの型決定株のうち３つおよび臨床単離体で、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが観察された。
【０４８９】
図９において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ
レーン１：大腸菌
レーン２：Ｓ．プーナ
レーン３：Ｋ．エロゲネス
レーン４：Ｐ．ミラビリス
レーン５：Ｐ．レットゲリ
レーン６：Ａ．ヒドロフィリア
レーン７：黄色ブドウ球菌
レーン８：Ｅ．フェカリス
レーン９：乳酸杆菌
レーン１０：枯草菌
レーン１１：リステリア菌株１
レーン１２：リステリア菌株２
レーン１３：リステリア菌株３
レーン１４：リステリア菌株４
レーン１５：リステリア菌、臨床的単離体
レーン１６：Ｌ．イノキュア
レーン１７：Ｌ．ムライ
レーン１８：Ｌ．ウェルシメリ
レーン１９：Ｌ．グライ
レーン２０：ウシ型結核菌
レーンＢ：分子量マーカーＶ
表４
リステリア属特異的プローブおよびリステリア菌種特異的プローブの特異性
【０４９０】
【表４】
2014195456.tif 000215
【０４９１】
型決定されたリステリア株の１つ、株４は、本プローブで陽性シグナルを生成するのに失敗した。本株由来のＰＣＲ増幅ｓｓｒＡ遺伝子のＤＮＡ配列決定は、本株が、Ｌ．イノキュアと同一のプローブ標的領域を含むことを立証した。しかし、本株由来のｓｓｒＡ遺伝子は、先に性質決定されたリステリア菌株と同一の配列の他の領域を含み、そしてこれらの配列は、図１５に示されるように、Ｌ．イノキュアの配列とは異なる。したがって、種、例えばリステリア菌内の各株種（単離体）を認識するであろう、これらの可変領域の１つに向けられる種特異的オリゴヌクレオチドを合成してもよい。
【０４９２】
実施例６
リステリアｓｓｒＡ遺伝子配列の多比色プローブ検出
ＬＧＴｍ（Ａ）、ＬＳｔｍ（Ｂ）およびカンピロバクター・ウプサリエンシス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ）１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＲＮＡスペーサー（Ｃ−５’ＣＡＴＴＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧ
３’）配列番号２２８オリゴヌクレオチドプローブを、ナイロン膜片に不可逆的に結合させ、そして属特異的プライマーＬｔｍ１およびＬｔｍ２（Ｌｔｍ１は５’端でビオチン標識した）を用いた、リステリア菌（１−６）、Ｌ．イノキュア（７−１０）、Ｌ．イバノビ（１１）、Ｌ．ムライ（１２）、Ｌ．シーリゲリ（１３）、Ｌ．ウェルシメリ（１４）およびＬ．グライ（１５）由来の増幅ｓｓｒＡ  ＰＣＲ産物と、ハイブリダイズさせた。ｔｍＵ５’およびｔｍＵ３’（ｔｍＵ５’は５’端でビオチン標識した）を用いた、グラム陽性細菌、枯草菌、乳酸杆菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、Ｅ．フェカリス、Ｃ．ペルフリンジンズ（Ｃ．  ｐｅｒｆｒｉｎｇｉｎｓ）（１６−２１）およびグラム陰性細菌、大腸菌、腸炎菌、Ｐ．レットゲリ、Ｋ．エロゲネス（２２−２５）由来のｓｓｒ
Ａ増幅ＰＣＲ産物もまた、ナイロン膜片にハイブリダイズさせた。図１０に示されるように、ハイブリダイゼーション後、ビオチンに対する比色アッセイの現像により、以下が明らかになった：片１−６は、リステリア菌に由来するｓｓｒＡ増幅ＰＣＲ産物と合わせ、増幅ＰＣＲ産物が属リステリア由来のものであることの確認を示し−ＡおよびＢは色検出を提供し；片７−１５は、これらのＰＣＲ産物が属リステリアに由来することを示し−Ａのみが色検出を提供し；そして片１６−２５は、ＰＣＲ産物が属リステリア由来でないことを示す−色検出はない。Ｃは陰性オリゴヌクレオチドコントロールプローブであり、そしてＤはすべての試料に関する陽性コントロール比色検出アッセイである。
【０４９３】
実施例７
生物の種間を区別するｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ配列の使用
図１１（配列番号１９および２１）、１２（配列番号４１および４３）、１３（配列番号７７および７９）、１４（配列番号８３および８５）、１５および１６（配列番号５３、５５および５７）に示されるようなＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ並列は、同一細菌の異なる株のｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ配列内にヌクレオチド相違があることを示す。これは、ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ配列を用い、細菌種内の個々の株および／または株群間を区別することが潜在的に可能であることを示唆する。これは、疫学および細菌集団解析に有用な適用を有する可能性がある。
【０４９４】
実施例８
細菌細胞の中程度のおよび極端な熱処理後のｔｍＲＮＡ完全性解析
大腸菌およびリステリア菌培養を、一晩培養後、大腸菌の場合、８０℃で２０分間、そしてリステリア菌の場合、４０分間、そして両方の菌を１２０℃で１５分間（オートクレーブ）熱処理し、そして生存度に関し、熱処理の０時間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間および４８時間後に試験した。試験した各時点で、いかなる生存度も観察されなかった。これらの時点で、また、総ＲＮＡを単離し、そして変性１．２％  アガロースゲル上で電気泳動し、そしてノーザンブロッティングした。各ブロットを、大腸菌の場合（図１７および１８）、放射能標識オリゴヌクレオチドプローブＥｖｔｍで、そしてリステリア菌の場合（図１９および２０）、放射標識ＬＶｔｍにハイブリダイズさせた。試験した各試料で、いかなるｔｍＲＮＡ転写物も検出されず、ｔｍＲＮＡ転写物が熱処理後、分解されたことが立証された。表記＋ｖｅに相当するレーンは、陽性コントロール総ＲＮＡ試料である。
【０４９５】
実施例９
生存および非生存細菌間を区別する際のｔｍＲＮＡ転写物の使用
リステリア菌の１００  ｍｌ培養を、液体培養中で一晩増殖させた。増殖後、細胞の連続希釈を行い、そして栄養寒天プレート上にスプレッドプレーティングすることにより、生存度を決定した。同時に、これらの細胞の１  ｍｌアリコットから総ＲＮＡを単離した。細胞の残りを、６５℃で２０分間加熱した。その後、生存度解析および総ＲＮＡ単離のため、細胞を除去した。生存度およびＲＮＡ単離のための試料は、処理後、０時間、２時間、６時間および２４時間後の時点で採取した。
【０４９６】
栄養寒天プレート上のスプレッドプレーティングにより、生存コロニー形成単位はまったく観察されず、熱処理がリステリア菌細胞を殺したことが示された。単離された各ＲＮＡ試料をその後、ＤＮアーゼで処理し、いかなる混入ＤＮＡも除去し、そして総ＲＮＡ試料（１００  ｎｇ）を、リステリア属特異的ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡオリゴヌクレオチドプライマー、Ｌｔｍ１およびＬｔｍ２を用いた逆転写酵素−ＰＣＲ増幅に供した。陰性コントロール増幅反応には、プライマー、標的、およびＴａｑポリメラーゼが含まれたが、逆転写酵素は含まれなかった。増幅反応の結果を図１２に示す。
【０４９７】
増幅ｔｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ産物は、熱処理されないＲＮＡ試料のみで観察された。すべての他の試料は、いかなるＲＴ−ＰＣＲ産物も提供せず、これらの試料中のｔｍＲＮＡ分子は、非生存熱処理細胞中で分解していた可能性があることを示す。
【０４９８】
図２１において、レーンは以下に相当する：
レーンＡ：分子量マーカーＶ；
レーン１：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（細胞の熱処理なし）、−逆転写酵素（ＲＴ）、＋Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＰ）；
レーン２：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（細胞の熱処理なし）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン３：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後０時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン４：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後０時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン５：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後１時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン６：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後１時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン７：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後２時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン８：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後２時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン９：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後６時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン１０：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後６時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン１１：ＲＮＡのＰＣＲ増幅（熱処理後２４時間）、−ＲＴ、＋ＴＰ；
レーン１２：ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（熱処理後２４時間）、＋ＲＴ、＋ＴＰ；
レーンＢ：分子量マーカーＶ。
【図面の簡単な説明】
【０４９９】
【図１】図１は、大腸菌およびコレラ菌ｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図２】図２は、大腸菌およびコレラ菌細胞から調製した総細胞ＲＮＡのアガロースゲル写真である。
【図３】図３は、大腸菌およびコレラ菌のｔｍＲＮＡ転写物に対するコレラ菌オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションのオートラジオグラム写真である。
【図４】図４は、一団の生物由来の普遍的ｓｓｒＡ遺伝子増幅プライマーの増幅産物のアガロースゲル写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、リステリア種由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、リステリア種由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図６】図６は、リステリア菌および枯草菌ｓｓｒＡ／ｔｍＲＮＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図７】図７は、一団の生物由来のリステリア属特異的ＰＣＲ増幅プライマーの増幅産物のアガロースゲル写真である。
【図８】図８は、実施例４で調製されるような、一団の生物に対し、ハイブリダイズしたリステリア属特異的オリゴヌクレオチドプローブのオートラジオグラム写真である。
【図９】図９は、実施例７で調製されるような、一団の生物に対し、ハイブリダイズしたリステリア菌種特異的プローブのオートラジオグラム写真である。
【図１０】図１０は、実施例６に記載されるような、リステリアｓｓｒＡ遺伝子配列の多比色プローブ検出で用いられるナイロン膜片のコンピュータースキャン画像である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、トラコーマクラミジア株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、トラコーマクラミジア株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１２】図１２は、Ｈ．ピロリ株由来のｓｓｒＡ配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１３】図１３は、性器マイコプラズマ株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１４】図１４は、淋菌株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１５】図１５は、リステリア菌株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１６】図１６は、リステリア菌株およびＬ．イノキュア株由来のｓｓｒＡ遺伝子配列のｃｌｕｓｔａｌ並列である。
【図１７】図１７は、大腸菌細胞の中程度の熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｅｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。
【図１８】図１８は、大腸菌細胞の極端な熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｅｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。
【図１９】図１９は、リステリア菌細胞の中程度の熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｌｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。
【図２０】図２０は、リステリア菌細胞の極端な熱処理後に単離した総ＲＮＡ試料に対し、ハイブリダイズしたリステリア・オリゴヌクレオチドプローブ（Ｌｖｔｍ）のオートラジオグラム写真である。
【図２１】図２１は、熱処理後の多様な時点の、ＲＴ−ＰＣＲ生成ｔｍＲＮＡ産物のアガロースゲル写真である。
【図１】
2014195456.tif 000216
【図２】
2014195456.tif 000217
【図３】
2014195456.tif 000218
【図４】
2014195456.tif 000219
【図５Ａ】
2014195456.tif 000220
【図５Ｂ】
2014195456.tif 000221
【図６】
2014195456.tif 000222
【図７】
2014195456.tif 000223
【図８】
2014195456.tif 000224
【図９】
2014195456.tif 000225
【図１０】
2014195456.tif 000226
【図１１Ａ】
2014195456.tif 000227
【図１１Ｂ】
2014195456.tif 000228
【図１２】
2014195456.tif 000229
【図１３】
2014195456.tif 000230
【図１４】
2014195456.tif 000231
【図１５】
2014195456.tif 000232
【図１６】
2014195456.tif 000233
【図１７】
2014195456.tif 000234
【図１８】
2014195456.tif 000235
【図１９】
2014195456.tif 000236
【図２０】
2014195456.tif 000237
【図２１】
2014195456.tif 000238
【配列表】
2014195456000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年6月5日(2014.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１６９、１７４、１７５、２１８〜２２３、及び２２８から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
配列番号１７０〜１７３及び２２４〜２２７から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー。