(57)【要約】【課題】糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とすることを特徴とする骨密度増加剤を提供する。又、前記化合物Ａ、Ｅユニットの発現量を増加させる化合物Ｅの一方又は両方を有効成分としても良い。又、被験物質がＣＳ鎖のＡユニットの発現量又は前記化合物Ａをコードする遺伝子Ａの発現量を増加させるか否かを指標とする骨密度増加剤のスクリーニング方法を提供する。又、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量又は前記化合物Ｅをコードする遺伝子Ｅの発現量を指標としても良い。これにより、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法を提供することが出来る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨密度増加剤であって、
骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とすることを特徴とする骨密度増加剤。
【請求項２】
前記化合物Ａは、骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して１．２０倍以上増加させる
請求項１に記載の骨密度増加剤。
【請求項３】
前記化合物Ａは、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＡユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＡユニットの割合と比較して１．０２倍以上増加させる
請求項１又は２に記載の骨密度増加剤。
【請求項４】
更に、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖のＥユニットの発現量を増加させる化合物Ｅを含有する
請求項１−３のいずれか一項に記載の骨密度増加剤。
【請求項５】
前記化合物Ｅは、骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量と比較して１．３０倍以上増加させる
請求項４に記載の骨密度増加剤。
【請求項６】
前記化合物Ｅは、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合と比較して１．１０倍以上増加させる
請求項４又は５に記載の骨密度増加剤。
【請求項７】
更に、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＣユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＣユニットの割合と比較して同等倍とする化合物Ｃを含有する
請求項１−６のいずれか一項に記載の骨密度増加剤。
【請求項８】
本骨密度増加剤を、女性ホルモンの減少により発症する骨疾患の治療用又は予防用の薬剤とする
請求項１−７のいずれか一項に記載の骨密度増加剤。
【請求項９】
骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、
被検物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットを発現可能な細胞とを接触させるステップと、
前記細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量を測定するステップと、
前記被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して、ＣＳ鎖のＡユニットの発現量を増加させる被験物質を選択するステップと
を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１０】
骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、
被験物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａをコードする遺伝子Ａを発現可能な細胞とを接触させるステップと、
前記細胞における遺伝子Ａの発現量を測定するステップと、
前記被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子Ａの発現量と比較して、遺伝子Ａの発現量を増加させる被験物質を選択するステップと
を備えることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法に関し、詳しくは、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、閉経後の女性に多くみられる病気であり、日本では約１２００万人の患者がいると考えられている。この骨粗鬆症は、骨芽細胞による骨形成の低下、又は破骨細胞による骨吸収の亢進によって生じる骨疾患であり、この骨粗鬆症の患者には、大腿骨頸部等の骨折が非常に起こり易く、当該骨折が原因で寝たきりに移行する可能性があり、早期治療が求められる骨疾患である。
【０００３】
ここで、骨粗鬆症の主な原因として、女性ホルモン（エストロゲン）の量の低下が挙げられる。例えば、閉経後の女性では、女性ホルモンの量が低下することで、骨形成の低下及び骨吸収が促進されることが知られている（非特許文献１）。又、高齢の男性でも、男性ホルモンの量の低下によって、エストロゲンの量が減少し、骨密度が低下することが知られている（非特許文献２）。そのため、エストラジオ−ル等のエストロゲンを外部から補って骨密度の低下を防止するエストロゲン補充療法が、従来において、閉経後の女性に用いられていた。
【０００４】
このエストロゲン補充療法には、子宮出血、子宮頸癌又は乳癌等の腫瘍を発生させる副作用が伴う場合があり、この副作用を軽減するために、現在では、ビスホスホネート製剤（ビスホスホネート）、ホルモン剤（エストロゲン）、カルシウム製剤（カルシトニン）、ビタミンＤやその誘導体等を、骨粗鬆症の患者に投与し、骨代謝の改善を試みる治療方法が普及している。しかしながら、各種の製剤を併用した併用治療方法は、必ずしも満足の行く効果が得られておらず、従って、現在、骨粗鬆症等の骨疾患の治療用又は予防用の骨密度増加剤、治療薬の開発が盛んに行われている。
【０００５】
例えば、エストロゲンの刺激を受けた骨芽細胞が産生する骨吸収抑制因子を有効成分として含有する代謝性骨疾患の治療剤（特許文献１）、黄体ホルモン及び抗エストロゲン作用物質を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤（特許文献２）、エストロゲンとアロマターゼ非代謝性アンドロゲンとを含有する医薬組成物（特許文献３）、治療を低用量のエストロゲン様化合物により開始し、開始期間ののちエストロゲン様化合物の用量を増加させるという点で特徴付けられる、閉経後骨粗鬆症の予防又は治療用医薬の製造におけるエストロゲン様化合物の用途（特許文献４）、炭素数が１０の直鎖脂肪酸又はその塩からなることを特徴とするエストロゲン様作用剤（特許文献５）等が存在する。
【０００６】
ここで、女性ホルモンのエストロゲンは、間質細胞又は骨芽細胞によるＯＰＧ（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）及びＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）の分泌を促進することで、破骨細胞分化を抑制し、破骨細胞のアポトーシスを促すことが知られている（非特許文献３）。又、エストロゲンは、パラトルモンの分泌抑制及びカルシトニンの分泌を促進することで、破骨細胞の機能を抑制し、更に、骨粗鬆症モデルマウス、例えば、卵巣摘出（ＯＶＸ：Ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ）マウスでは、エストロゲンが減少することで、骨密度の減少や破骨細胞数の増加を促すことが知られている（非特許文献４）。このように、エストロゲンによる破骨細胞の抑制機構が明らかになりつつある。一方、エストロゲンは、骨芽細胞分化を亢進させることも知られているが、その詳しいメカニズム（作用機序）は未だ不明である（非特許文献５）。
【０００７】
ところで、近年、ヒトの遺伝子の解析が完了し、タンパク質の翻訳後修飾が生体内で重要であることが判明し、従来からの研究アプローチ、即ち、核酸（ＤＮＡ）とタンパク質に着目した研究アプローチが限界に来ている。そこで、ポストゲノム、ポストプロテオミクスの流れで、次の研究アプローチとして、核酸、タンパク質に次ぐ第三の生命鎖と呼ばれる糖鎖が注目され始めている。
【０００８】
糖鎖とは、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカン（ＰＧ）等の複合糖質として生体内に存在し、様々な生物学的機能を担っている。この糖鎖の合成は、主として糖転移酵素によって行われ、糖転移酵素をコードする糖鎖遺伝子を細胞に導入したり、糖鎖遺伝子を人工的に破壊するノックアウトマウスを解析したりすることにより、糖鎖の機能が明らかになりつつある。
【０００９】
糖鎖の一種であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ、ＧＡＧ鎖）は、細胞表面や細胞外マトリックスに存在する直鎖状の糖鎖であり、コアタンパク質と共有結合して、ＰＧとして存在している。このＧＡＧ鎖は、ウロン酸とアミノ糖が二糖単位（又は、単に、二糖）で繰り返し結合した構造を持ち、この二糖単位の種類により、コンドロイチン硫酸（ＣＳ、ＣＳ鎖）、デルマタン硫酸（ＤＳ）、ヘパリン（Ｈｅｐ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）に分類される。ＣＳ又はＤＳは、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ)との二糖が交互に繰り返し重合されて構成されており、Ｈｅｐ又はＨＳは、ＧｌｃＡとＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との二糖が交互に繰り返し重合されて構成されている。ＧＡＧ鎖の各種の二糖単位が、生体内の各種の異性化酵素により一部異性化されたり、各種の硫酸基転移酵素により一部の水酸基が硫酸基に転移されたりすることで、生体内の様々なシグナルを発信し、その生物学的機能を発揮することになる。
【００１０】
このような糖鎖において硫酸基転移酵素に着目した発明として、例えば、ＧａｌＮＡｃの４位又は６位の硫酸化インヒビター（阻害剤）を成分とする組織線維形成抑制剤が存在する（特許文献６）。この組織線維形成抑制剤は、前記インヒビターがＧａｌＮＡｃの４位又は６位の硫酸基転移酵素の機能を阻害する活性を有する薬剤であったり、前記インヒビターがＧａｌＮＡｃの４位又は６位の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を抑えるｓｉＲＮＡである薬剤であったりする。これにより、前記インヒビターが、組織の線維形成に起因する疾患（組織線維形成性疾患）に対して治療効果を有することを実証したとしている。
【００１１】
又、近年の研究により、糖鎖のＣＳ鎖がコアタンパク質と共有結合したプロテオグリカン（ＣＳＰＧ）が、形態形成、骨格形成（非特許文献６−８）の生命現象に関与することが知られてきており、本発明者は、近年、ＣＳ鎖の特定の硫酸化パターンが骨芽細胞の分化を亢進することを明らかにした（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Atkins, D., Zanelli, J.M., Peacock, M., and Nordin, B. E. (1972) J. Endocrinol. 54, 107-117.
【非特許文献２】Vandenput, L., andOhlsson, C. (2009) Nat. Rev. Endocrinol. 5, 437-443.
【非特許文献３】Riggs, B. L. (2000) J.Clin. Invest. 106, 1203-1204
【非特許文献４】Funck-Brentano, T., Lin,H., Hay, E., Ah, Kioon, M. D., Schiltz, C., Hannouche, D., Nizard, R., Liote,F., Orcel, P., de, Vernejoul, M. C., and Cohen-Solal, M. E. (2012) PLoS One 7,e33543.
【非特許文献５】Kanno, S., Hirano, S., andKayama, F. (2004) Toxicology 196, 137-145.
【非特許文献６】Sugahara, K., Mikami, T.,Uyama, T., Mizuguchi, S., Nomura, K., and Kitagawa, H.(2003)Curr. Opin. Struct.Biol.,13,612-620
【非特許文献７】Thiele, H., Sakano, M.,Kitagawa, H., Sugahara, K., Rajab, A.,Hohne, W., Ritter, H., Leschik, G., Nurnberg,P., & Mundlos,S.(2004)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,101,10155-10160.
【非特許文献８】Kluppel, M.(2010)Prog.Mol. Biol. Transl. Sci.,93,113-132.
【非特許文献９】Koike, T., Izumikawa, T.,Tamura, J., Kitagawa. H., (2012) Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 420, 523-529
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平５−５８９０１号公報
【特許文献２】特開平６−３１２９３０号公報
【特許文献３】特開平１０−２７９４８３号公報
【特許文献４】特表２００３−５１１４０９号公報
【特許文献５】特開２００６−６２９８６号公報
【特許文献６】特開２０１１−３７８４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところで、非特許文献１−９に記載の技術、特許文献１−６に記載の発明であっても、未だに効果的な骨密度増加剤、治療薬が存在しないという問題がある。更に、次世代の研究アプローチの対象である糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤、治療薬は全く存在しない。
【００１５】
一方、本発明者は、非特許文献９においてＣＳ鎖の特定の硫酸化パターンが骨芽細胞の分化を亢進することを明らかにしたものの、現実に、外来性の化合物、又は生合成される内在性の化合物を添加（投与、導入）することで、ＣＳ鎖の硫酸化パターンを人工的に変化させ、骨密度を増加させるか否かが不明であった。
【００１６】
そこで、本発明は、前記問題を解決するためになされたものであり、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、鋭意研究の結果、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とすることで、前記骨芽細胞の分化による骨基質の産生と石灰化を亢進し、骨密度を確実に増加させることを初めて見出した。
【００１８】
即ち、本発明は、骨密度増加剤であって、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とすることを特徴とする。
【００１９】
又、前記化合物Ａは、骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して１．２０倍以上増加させる。
【００２０】
又、前記化合物Ａは、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＡユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合と比較して１．０２倍以上増加させる。
【００２１】
又、本発明は、更に、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖のＥユニットの発現量を増加させる化合物Ｅを含有する。
【００２２】
又、前記化合物Ｅは、骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量と比較して１．３０倍以上増加させる。
【００２３】
又、前記化合物Ｅは、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合と比較して１．１０倍以上増加させる。
【００２４】
又、本発明は、更に、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＣユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＣユニットの割合と比較して同等倍とする化合物Ｃを含有する。
【００２５】
又、本発明は、本骨密度増加剤を、女性ホルモンの減少により発症する骨疾患の治療用又は予防用の薬剤とする。
【００２６】
又、本発明は、被験物質がＣＳ鎖のＡユニットの発現量又は前記化合物Ａをコードする遺伝子Ａの発現量を増加させるか否かを指標とする骨密度増加剤のスクリーニング方法として提供することが出来る。
【００２７】
即ち、本発明は、骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、被検物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットを発現可能な細胞とを接触させるステップと、前記細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量を測定するステップと、前記被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して、ＣＳ鎖のＡユニットの発現量を増加させる被験物質を選択するステップとを備えることを特徴とする。
【００２８】
又、本発明は、骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、被験物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａをコードする遺伝子Ａを発現可能な細胞とを接触させるステップと、前記細胞における遺伝子Ａの発現量を測定するステップと、前記被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子Ａの発現量と比較して、遺伝子Ａの発現量を増加させる被験物質を選択するステップとを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法によれば、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＣＳ鎖を構成する二糖単位の種類を示す図（図１（Ａ））と、ＣＳ鎖の硫酸化経路を示す図（図１（Ｂ））とである。
【図２】Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＣＳ鎖二糖組成解析の結果を示す図である。
【図３】Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を示す図である。
【図４】Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＣｈＧｎの発現量を示す図である。
【図５】Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＡＬＰの発現量を示す図である。
【図６】Ｅ２を添加した骨髄由来間葉系幹細胞における硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を示す図である。
【図７】ＯＶＸマウス及びＳｈａｍ由来骨髄間葉系幹細胞におけるＣＳ鎖の二糖組成を示す図である。
【図８】ＯＶＸマウス及びＳｈａｍ由来骨髄間葉系幹細胞における硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を示す図である。
【図９】ＯＶＸマウス及びＳｈａｍ由来骨髄間葉系幹細胞におけるＣｈＧｎの発現量を示す図である。
【図１０】ＯＶＸマウス及びＳｈａｍの脛骨における骨密度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下に、添付図面を参照して、本発明の骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法の実施形態について説明し、本発明の理解に供する。尚、以下の実施形態は、本発明を具体化した一例であって、本発明の技術的範囲を限定する性格のものではない。
【００３２】
＜骨密度増加剤＞
先ず、本発明で着目する糖鎖について詳細に説明する。図１（Ａ）は、ＣＳ鎖を構成する二糖単位の種類を示す図である。糖鎖の一種であるＣＳ（コンドロイチン硫酸）鎖は、図１（Ａ）に示すように、ＧｌｃＡ（グルクロン酸）とＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）との二糖（単位）を繰り返し単位とした直鎖状の糖鎖構造を基本骨格としている。ＣＳ鎖は、生体内の生合成の過程で、基質特異性の異なる複数の硫酸基転移酵素（ＣＳＳＴ：ＣＳ  ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）により、主として、ＧｌｃＡの残基２位の水酸基、ＧａｌＮＡｃの残基４位の水酸基、残基６位の水酸基のいずれか、又はこれらの組み合わせが硫酸化修飾（硫酸化反応）を受ける。その結果、ＣＳ鎖は、生体内では、硫酸化修飾の種類により、特徴的な二糖単位（Ｏユニット、Ａユニット、Ｃユニット、Ｄユニット、Ｅユニット）の組み合わせで存在する。
【００３３】
図１（Ｂ）は、ＣＳ鎖の硫酸化経路を示す図である。ここで、ＣＳ鎖は、全く硫酸化修飾を受けていないＧｌｃＡとＧａｌＮＡｃの二糖単位であるＯユニットを基本の二糖単位として、図１（Ｂ）に示すように、最初に作用する硫酸基転移酵素の種類により、ＧａｌＮＡｃの残基４位の水酸基が硫酸基に移転された二糖単位であるＡユニットと、ＧａｌＮＡｃの残基６位の水酸基が硫酸基に移転された二糖単位であるＣユニットとの二つに区分される。
【００３４】
Ａユニットは、コンドロイチン４−Ｏ−硫酸基転移酵素（Ｃ４ＳＴ）により、ＯユニットにおけるＧａｌＮＡｃの残基４位の水酸基が硫酸基に移転されることで合成（形成）される。又、当該Ａユニットは、更に、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ）により、ＡユニットにおけるＧａｌＮＡｃの残基６位の水酸基が硫酸基に移転されることで、Ｅユニットとなる。
【００３５】
一方、Ｃユニットは、コンドロイチン６−Ｏ−硫酸基転移酵素（Ｃ６ＳＴ）により、ＯユニットにおけるＧａｌＮＡｃの残基６位の水酸基が硫酸基に移転されることで合成（形成）される。又、当該Ｃユニットは、更に、ウロノシル２−Ｏ−硫酸基転移酵素（ＵＳＴ）により、ＣユニットにおけるＧａｌＮＡｃと隣接する非還元末端側のＧｌｃＡの残基２位の水酸基が硫酸基に移転されることで、Ｄユニットとなる。
【００３６】
特に、ＣＳ鎖のＡユニットとＣユニットは、Ｃ４ＳＴとＣ６ＳＴの競合により、その発現量が変動し、ＣＳ鎖のＯユニットがＡユニットかＣユニットのいずれかに移行し、ＡユニットかＣユニットに留まるか、更に、ＥユニットかＤユニットのいずれかに移行する。
【００３７】
このように、ＣＳ鎖は、生体内で様々な硫酸基転移酵素の作用により、Ａユニット、Ｅユニット、Ｃユニット、Ｄユニットの発現量や割合が変動し、上述した特徴的な二糖単位（二糖繰り返し単位）の組み合わせが生じ、特有の硫酸化パターンが形成される。
【００３８】
これまで、ＣＳ鎖の量や硫酸化パターンの異常によって骨格形成の異常が生じることが多数報告されている（例えば、Li, Y., Laue, K., Temtamy, S., Aglan, M., Kotan, L. D., Yigit, G., Canan,
H., Pawlik, B., Nurnberg, G., Wakeling, E. L., Quarrell, O. W., Baessmann, I.,
Lanktree, M. B., Yilmaz, M., Hegele, R. A., Amr, K., May, K. W., Nurnberg, P.,
Topaloglu, A. K. , Hammerschmidt, M., and Wollnik, B. (2010) Am. J. Hum. Genet.
87, 757-767.、Dundar, M., Muller, T., Zhang, Q., Pan,
J., Steinmann, B., Vodopiutz, J., Gruber, R., Sonoda, T., Krabichler, B.,
Utermann, G., Baenziger, J. U., Zhang, L., and Janecke, A. R. (2009) Am. J.
Hum. Genet. 85, 873-882.等）。
【００３９】
又、脊椎動物の骨格形成に関わる骨の大部分は、未分化間葉系幹細胞が軟骨細胞へ分化した後に、当該軟骨細胞が骨芽細胞に置き換わり、更に、当該骨芽細胞の分化により骨が造られるが、前記軟骨細胞には、ＣＳ鎖が多く含まれるため、軟骨細胞の形成におけるＣＳ鎖の機能が広く明らかになっている（例えば、Klupple, M., Wight, T. N., Chan, C., Hinek, A., and Wrana, L. (2005)
Development. 132, 3989-4003.、Schwartz, N. B., and
Domowicz, M. (2002) Glycobiology 12, 57R-68R.等）。
【００４０】
一方、頭骨や下顎の一部は、軟骨細胞を介さずに骨芽細胞が直接分化することによって骨が造られる。この骨芽細胞の分化を膜内骨化と称する。この頭骨や下顎の一部の骨基質中にもＣＳ鎖が含まれていることから、本発明者は、軟骨細胞の形成だけでなく、骨芽細胞の分化においてもＣＳ鎖が重要な機能を有していると考え、後述する実施例に基づいて、骨芽細胞におけるＣＳ鎖の機能を解明し、本発明を完成させたのである。
【００４１】
即ち、本発明では、骨密度増加剤であって、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物（化合物Ａとする）を有効成分とすることを特徴とする。
【００４２】
これにより、前記骨芽細胞の分化による骨基質の産生と石灰化を亢進し、骨密度を確実に増加させることが可能となる。つまり、現実に、骨密度の増加は、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量の増加が重要であるものの、当該Ｅユニットの発現量は、Ａユニットの発現量に大きく依存しており、更に、前記骨芽細胞内では、通常、Ｅユニットの発現量を増加させる酵素（ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ）が十分に機能していないという現状がある。そこで、本発明では、ＣＳ鎖のＯユニットをＡユニットに優先的に移行させる化合物Ａを有効成分とすることで、Ａユニットの発現量を増加させ、その結果、Ｅユニットの発現量を間接的に増加させるのである。これにより、前記骨芽細胞の分化を亢進し、骨密度を確実に増加させることが可能となるのである。
【００４３】
ここで、本発明の化合物Ａは、本発明の目的を阻害しない限り、特に限定は無いが、例えば、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、天然若しくは合成化学的に調製された有機化合物、無機化合物等が挙げられる。
【００４４】
又、本発明の化合物Ａは、ＣＳ鎖のＡユニットの発現量を特異的に増加させる化合物であると特に好ましく、例えば、硫酸基転移酵素のＣ４ＳＴ（Ｃ４ＳＴ−１、Ｃ４ＳＴ−２等）、Ｃ４ＳＴ様酵素、Ｃ４ＳＴ様化合物、Ｃ４ＳＴ誘導体、通常のＣＳ鎖のＡユニットよりもＡユニットの発現量が高い糖鎖のＣＳ鎖−Ａ多糖（糖鎖そのもの）、ＣＳ鎖−Ａ多糖様化合物、ＣＳ鎖−Ａ多糖誘導体、エストラジオール等のエストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロゲン誘導体等が挙げられる。尚、本発明の化合物Ａは、当該化合物Ａの製薬学的に許容される塩も含まれ、又、当該化合物Ａを異常発現する細胞であっても構わない。
【００４５】
又、本発明の化合物Ａは、骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量を、（前記化応物Ａが未添加の）通常の骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して１．２０倍以上、好ましくは１．３５倍以上、更に好ましくは２．００倍以上であると良い。
【００４６】
又、本発明の化合物Ａは、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＡユニットの割合を増加させると好ましく、例えば、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＡユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＡユニットの割合と比較して１．０２倍以上、好ましくは１．１０倍以上、更に好ましくは１．９８倍以上であると良い。
【００４７】
又、本発明の化合物Ａは、前記化合物Ａをコードする遺伝子（遺伝子Ａとする）であっても良く、例えば、Ｃ４ＳＴをコードする遺伝子Ａ、ＣＳ鎖−Ａ多糖をコードする遺伝子Ａ、エストロゲンをコードする遺伝子Ａ等が挙げられ、更に、当該遺伝子Ａの発現量を増加させる化合物であっても当該遺伝子Ａを含有する細胞であっても構わない。
【００４８】
又、本発明の化合物Ａが、Ｃ４ＳＴ−１をコードする遺伝子Ａの発現量を増加させる化合物である場合、骨芽細胞における前記遺伝子Ａの発現量を、通常の骨芽細胞における前記遺伝子Ａの発現量と比較して１．４２倍以上、好ましくは１．６０倍以上、更に好ましくは２．００倍以上としても良い。
【００４９】
又、本発明は、更に、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ｅユニットの発現量を増加させる化合物（化合物Ｅとする）を含有（添加）しても構わない。ここで、本発明の化合物Ｅは、化合物Ａと同等の化合物であっても異種の化合物であっても構わない。
【００５０】
これにより、ＡユニットをＥユニットに優先的に移行させることが可能となり、Ｅユニットの発現量を直接的に増加させ、更に骨密度の増加を亢進させることが可能となる。尚、上述のように、骨密度の確実な増加には、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量の増加が重要であるため、本発明は、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量にも着目し、前記化合物Ａ、化合物Ｅのいずれか一方又は両方を有効成分としても構わない。
【００５１】
又、本発明の化合物Ｅは、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量を特異的に増加させる化合物であると特に好ましく、例えば、硫酸基転移酵素のＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ様化合物、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ誘導体、通常のＣＳ鎖のＥユニットよりもＥユニットの発現量が高い糖鎖のＣＳ鎖−Ｅ多糖、ＣＳ鎖−Ｅ多糖様化合物、ＣＳ鎖−Ｅ多糖誘導体、エストラジオール等のエストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロゲン誘導体等が挙げられる。尚、本発明の化合物Ｅは、当該化合物Ｅの製薬学的に許容される塩も含まれ、前記化合物Ｅを異常発現する細胞であっても構わない。
【００５２】
又、本発明の化合物Ｅは、骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量と比較して１．３０倍以上、好ましくは１．４４倍以上、更に好ましくは２．００倍以上であると良い。
【００５３】
又、本発明の化合物Ｅは、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合を増加させると好ましく、例えば、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＥユニットの割合と比較して１．１０倍以上、好ましくは１．４４倍以上、更に好ましくは２．００倍以上であると良い。
【００５４】
又、本発明の化合物Ｅは、前記化合物Ｅをコードする遺伝子（遺伝子Ｅとする）であっても良く、例えば、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴをコードする遺伝子Ｅ、ＣＳ鎖−Ｅ多糖をコードする遺伝子Ｅ等が挙げられ、更に、当該遺伝子Ｅの発現量を増加させる化合物であっても当該遺伝子Ｅを含有する細胞であっても構わない。
【００５５】
ここで、本発明の化合物Ｅが、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴをコードする遺伝子Ｅの発現量を増加させる化合物である場合、骨芽細胞における当該遺伝子Ｅの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴをコードする遺伝子の発現量と比較して１．６０倍以上、好ましくは１．８０倍以上、更に好ましくは２．００倍以上としても良い。
【００５６】
又、本発明は、更に、骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＣユニットの割合を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖に対するＣユニットの割合と比較して同等倍とする化合物（化合物Ｃとする）を含有しても構わない。これにより、骨密度増加のみ亢進することが可能となる。
【００５７】
ここで、本発明の化合物Ｃは、化合物Ａ又は化合物Ｅと同等の化合物であっても異種の化合物であっても構わない。尚、同等倍とは、厳密に同一を意味せず、同一又は近似倍を意味する。本発明の化合物Ｃは、具体的には、硫酸基転移酵素のＣ６ＳＴ（Ｃ６ＳＴ−１等）、Ｃ６ＳＴ様化合物、Ｃ６ＳＴ誘導体等が挙げられ、当該化合物Ｃの製薬学的に許容される塩も含まれる。
【００５８】
又、本発明は、更に、骨芽細胞における、ＣＳ鎖の本数又は鎖長を制御するＣｈＧｎ（ＣｈＧｎ−１、ＣｈＧｎ−２等）の発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣｈＧｎの発現量と比較して同等倍とする化合物（化合物Ｓとする）を含有しても構わない。これにより、骨密度増加のみ亢進することが可能となる。ここで、本発明の化合物Ｓは、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｃと同等の化合物であっても異種の化合物であっても構わない。又、本発明の化合物Ｓは、ＣｈＧｎ、ＣｈＧｎ様化合物、ＣｈＧｎ誘導体、エストラジオール等のエストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロゲン誘導体等が挙げられ、当該化合物Ｓの製薬学的に許容される塩も含まれる。更に、本発明の化合物Ｓは、骨芽細胞におけるＣｈＧｎをコードする遺伝子の発現量を、通常の骨芽細胞におけるＣｈＧｎをコードする遺伝子の発現量と比較して同等倍としても良い。
【００５９】
又、本発明は、更に、骨芽細胞における、骨芽細胞分化マーカーであるＡＬＰの発現量を、通常の骨芽細胞におけるＡＬＰの発現量と比較して同等倍とする化合物（化合物Ｌとする）を含有しても構わない。これにより、骨密度増加のみ亢進することが可能となる。ここで、本発明の化合物Ｌは、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｃ、化合物Ｓと同等の化合物であっても異種の化合物であっても構わない。又、本発明の化合物Ｌは、ＡＬＰ、ＡＬＰ様化合物、ＡＬＰ誘導体、エストラジオール等のエストロゲン、エストロゲン様化合物、エストロゲン誘導体等が挙げられ、当該化合物Ｌの製薬学的に許容される塩も含まれる。更に、本発明の化合物Ｌは、骨芽細胞におけるＡＬＰをコードする遺伝子の発現量を、通常の骨芽細胞におけるＡＬＰをコードする遺伝子の発現量と比較して同等倍としても良い。
【００６０】
又、本発明は、更に、骨芽細胞における総ＣＳ鎖の発現量を増加させる化合物（化合物Ｄ）を含有しても構わない。これにより、骨密度増加のみ亢進することが可能となる。ここで、本発明の化合物Ｄは、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｃ、化合物Ｓ、化合物Ｌと同等の化合物であっても異種の化合物であっても構わない。又、本発明の化合物Ｄは、更に、骨芽細胞における総ＣＳ鎖の発現量を、通常の骨芽細胞における総ＣＳ鎖の量と比較して１．２０倍以上、好ましくは１．５０倍以上、更に好ましくは２．００倍以上であると良い。
【００６１】
＜薬剤＞
本発明は、上述した本骨密度増加剤を、女性ホルモンの減少により発症する骨疾患の治療用又は予防用の薬剤としても良い。本発明の薬剤は、そのまま若しくは公知の薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、結合剤、滑沢剤、流動助剤、崩壊剤、界面活性剤、慣用の添加剤等と混合して医薬組成物（医薬品、治療剤、治療薬、治療用医薬、予防用医薬等）として調製することが出来る。
【００６２】
又、本発明の薬剤は、調製する形態に応じて、全身的に又は局所的に、経口投与又は非経口投与することが出来る。調整する形態は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液等の経口投与剤や注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤等の非経口投与剤が挙げられる。又、非経口投与する場合には、静脈投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。
【００６３】
又、本発明の薬剤は、経口投与剤として用いる場合、例えば、許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分の化合物を配合することにより製造することが出来る。又、本発明の薬剤は、非経口投与剤として用いる場合、例えば、許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することが出来る。
【００６４】
又、本発明の薬剤の投与量は、有効成分の化合物Ａの種類、投与経路、投与対象又は患者の年齢、体重、症状等によって異なり、一概に規定できないが、通常、経口の場合には、成人で１日あたり有効成分量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは５ｍｇ〜数十ｍｇ程度を、１日１回〜数回に分けて投与することが出来る。非経口（注射）の場合には、成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよく、１日の投与量を１回〜数回に分けて投与することが出来る。尚、化合物Ｅ、化合物Ｃ、化合物Ｓ、化合物Ｌも同様である。
【００６５】
又、本発明の薬剤は、遺伝子治療剤として使用する場合、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより、効率よく投与することが出来る。
【００６６】
又、本発明の薬剤は、リポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。例えば、本発明の薬剤を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、導入された細胞を、例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。骨芽細胞を含む組織等に局所的に投与することも出来る。
【００６７】
又、本発明の薬剤の対象となる、骨密度（骨量）減少を伴う骨疾患は、骨代謝の不全や、骨破壊の亢進等に関連して発症する疾患であればよく、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチ、変形性関節症による骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、グルココルチコイド処置、転移性の骨疾患、歯周病、歯槽膿漏、歯根膜炎、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、及び加齢による骨の喪失等を挙げることが出来る。
【００６８】
又、本発明の薬剤（骨密度増加剤）の対象となる骨は、本発明の目的を阻害しない限り、特に限定は無く、例えば、長骨、短骨、扁平骨、含気骨、混合骨等が挙げられ、具体的には、頭蓋骨、脊椎骨、頸椎、胸椎、腰椎、仙骨、尾骨、肋骨、胸骨、肩の骨、腕の骨、手の骨、骨盤、脚の骨、足の骨等が挙げられる。
【００６９】
又、本発明の薬剤における治療は、骨疾患において骨密度を増加させる効果の他に、骨疾患の発生を抑制する予防的な効果も含まれる。又、本発明は、骨疾患の完全な治療効果を有する必要は無く、部分的な治療効果を有する場合であっても構わない。
【００７０】
又、本発明の薬剤における治療又は予防は、骨代謝の不全や骨破壊の亢進等に関連した症状の発生を抑制する又は進行を維持又は抑止出来ればよく、更に、予防と治療とを明確に区別されなくてもよい。
【００７１】
＜骨密度増加剤用化合物＞
本発明は、骨密度増加剤用の化合物であって、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とすることを特徴とする。このような構成であっても、同様の作用効果を得ることが可能となる。尚、本発明は、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量にも着目し、前記化合物Ａ、化合物Ｅのいずれか一方又は両方を有効成分とすることを特徴とする骨密度増加剤用の化合物としても構わない。ここで、本発明に係る骨密度増加用の化合物Ａ及びこれに関連する化合物の設計事項は、上述した骨密度増加剤と同様であるため、省略する。
【００７２】
＜骨疾患の治療方法＞
本発明は、骨疾患の治療方法であって、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とする骨密度増加剤を骨疾患の患者に投与することを特徴とする。このような構成であっても、同様の作用効果を得ることが可能となる。尚、本発明は、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量にも着目し、前記化合物Ａ、化合物Ｅのいずれか一方又は両方を有効成分とする骨密度増加剤を骨疾患の患者に投与することを特徴とする骨疾患の治療方法としても構わない。ここで、本発明に係る骨疾患の治療方法の化合物Ａ及びこれに関連する化合物の設計事項は、上述した骨密度増加剤と同様であるため、省略する。
【００７３】
＜骨密度増加剤のスクリーニング方法＞
本発明は、被験物質がＣＳ鎖のＡユニットの発現量又は前記化合物Ａをコードする遺伝子Ａの発現量を増加させるか否かを指標とする、骨密度増加剤のスクリーニング方法として採用することが出来る。
【００７４】
即ち、本発明は、ＣＳ鎖のＡユニットの発現量を指標として、骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、被検物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットを発現可能な細胞とを接触させるステップと、前記細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量を測定するステップと、前記被験物質を接触させない対照細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して、ＣＳ鎖のＡユニットの発現量を増加させる被験物質を選択するステップとを備えることを特徴とする。これにより、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤を効率よくスクリーニングすることが可能となる。
【００７５】
ここで、被験物質は、本発明の目的を阻害しない限り、特に限定は無く、例えば、酵素、タンパク質、ペプチド、核酸、天然若しくは合成化学的に調製された有機化合物、無機化合物等が挙げられる。
【００７６】
又、対照細胞は、ＣＳ鎖のＡユニットを発現可能な細胞において、被検物質を接触させない場合の当該細胞を示し、例えば、被験物質の代わりに被験物質と同量の溶媒（ブランク）を添加した細胞やＣＳ鎖のＡユニットの発現に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加した細胞等が挙げられる。又、被験物質と細胞とを接触させる条件は、本発明の目的を阻害しない限り、特に限定は無く、当該細胞が死なないように、その培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を大きく変化させない条件を採用すればよい。
【００７７】
又、ＣＳ鎖のＡユニットを発現可能な細胞と接触させる被験物質の濃度としては、本発明の目的を阻害しない限り、特に限定は無く、通常、約０．１μＭ〜約１００μＭであればよく、好ましくは、１μＭ〜５０μＭであればよい。又、被験物質は、適宜、水、リン酸バッファー若しくはトリスバッファー等のバッファー、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド若しくはこれらの混合物等の溶媒に溶解又は懸濁して用いることが出来る。
【００７８】
又、ＣＳ鎖のＡユニットの発現レベルの検出及び定量は、被験物質の種類に応じて公知の方法に従って実施出来る。被験物質（化合物Ａ）がタンパク質であれば、例えば、当該タンパク質を認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知の方法に従って定量出来る。
【００７９】
又、被験物質を添加した細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量が、被験物質を添加しない対照細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量と比較して１．３倍以上、好ましくは１．５倍以上、更に好ましくは２．０倍以上であれば、該被験物質を、本化合物Ａの発現誘導物質として選択することが出来る。
【００８０】
又、本発明は、遺伝子Ａの発現量を指標として、骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、被験物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａをコードする遺伝子Ａを発現可能な細胞とを接触させるステップと、前記細胞における遺伝子Ａの発現量を測定するステップと、前記被験物質を接触させない対照細胞における遺伝子Ａの発現量と比較して、遺伝子Ａの発現量を増加させる被験物質を選択するステップとを備えることを特徴とする。このように構成しても、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤を効率よくスクリーニングすることが可能となる。
【００８１】
ここで、遺伝子Ａは、本発明の目的を阻害しない限り、特に限定は無く、例えば、使用する細胞の内在性の遺伝子Ａ、外来遺伝子として細胞に導入された遺伝子Ａのいずれか、又はこれらの組み合わせでも良い。又、外来遺伝子として導入する場合、例えば、遺伝子Ａは、用いられる細胞の由来動物種の遺伝子Ａであることが好ましい。例えば、脂肪組織由来細胞、本遺伝子発現ベクターを導入されてなる形質転換細胞等が挙げられる。由来動物種としては、ラット、マウス、モルモット等のげっ歯類哺乳動物、イヌ、サル、ヒト等が挙げられる。又、前記細胞としては、動物の組織や臓器から分離された細胞や、同一の機能・形態を持つ集団を形成している細胞（組織）等も含まれ、いかなる分化過程にある細胞であってもよい。
【００８２】
又、遺伝子Ａの発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したＲＮＡ又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法等の公知の方法で実施すれば良い。例えば、遺伝子Ａの塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド又はその相補的なポリヌクレオチド、又はこれらの組み合わせをプライマー（又はプローブ）として用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子Ａの発現の有無やその発現レベルを検出、測定することが出来る。そのようなプライマーは、遺伝子Ａの塩基配列に基づいて、例えば、ｐｒｉｍｅｒ３（ＨＹＰＥＲＬ  ＩＮＫ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することが出来る。
【００８３】
又、ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、細胞由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の遺伝子Ａの領域が増幅出来るように、遺伝子Ａの塩基配列に基づき調製した一対のプライマー（前記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を挙げることが出来る。尚、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、前記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法等を用いることが出来る。
【００８４】
又、被験物質を添加した細胞における遺伝子Ａの発現量が、被験物質を添加しない対照細胞における遺伝子Ａの発現量と比較して１．６倍以上、好ましくは１．８倍以上、更に好ましくは２．０倍以上であれば、該被験物質を、本遺伝子Ａの発現誘導物質として選択することが出来る。
【００８５】
又、本発明は、他の観点から、遺伝子Ａの発現制御領域を用いたレポーター遺伝子アッセイを用いるスクリーニング方法として採用することが出来る。即ち、本発明は、骨密度増加剤のスクリーニング方法であって、被験物質と、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａをコードする遺伝子Ａの発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子Ａを含有する細胞とを接触させるステップと、当該細胞における前記レポーター遺伝子Ａの発現量を測定するステップと、前記被験物質を接触させない対照細胞における前記レポーター遺伝子Ａの発現量と比較して、前記レポーター遺伝子Ａの発現量を増加させる被験物質を選択するステップとを備えることを特徴とする。このように構成しても、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤を効率よくスクリーニングすることが可能となる。
【００８６】
ここで、遺伝子Ａの発現制御用域とは、通常、当該染色体遺伝子の上流数ｋｂから数十ｋｂの範囲を示し、例えば、５’−レース法（５’−ＲＡＣＥ法）、オリゴキャップ法、Ｓ１プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定する第一のステップと、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ（クローンテック社製）等を用いて５’−上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定する第二のステップとを備える手法等により同定することが出来る。
【００８７】
又、レポーター遺伝子Ａは、当業者に公知の方法で調製すればよい。例えば、通常の遺伝子工学的手法に従って切り出された遺伝子Ａの発現調節領域を、レポーター遺伝子Ａを含むプラスミド上に組み込むことが出来る。
【００８８】
又、レポーター遺伝子Ａとしては、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ及びグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等が挙げられる。例えば、レポーター遺伝子Ａを、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子Ａを導入する細胞において使用可能なベクターに挿入し、プラスミドを作製し、適当な宿主細胞へ導入することが出来る。レポーター遺伝子Ａに応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質転換細胞を得ることが出来る。
【００８９】
又、レポーター遺伝子Ａの発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子Ａとしてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、前記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得て、次いで当該抽出物をルシフェリン及びＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することが出来る。この際、市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることが出来る。
【００９０】
又、本発明は、上述のように、ＣＳ鎖のＥユニットの発現量を指標にしても良く、例えば、被験物質がＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットのいずれか一方又は両方の発現量を増加させるか否かを指標とする、骨密度増加剤のスクリーニング方法としても構わない。更に、本発明は、前記化合物Ａをコードする遺伝子Ａ、前記化合物Ｅをコードする遺伝子Ｅのいずれか一方又は両方の発現量を増加させるか否かを指標とする、骨密度増加剤のスクリーニング方法としても構わない。レポーター遺伝子であっても同様である。
【実施例】
【００９１】
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の適用が本実施例に限定されるものでない。
【００９２】
実施例１：エストラジオール（Ｅ２）を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＣＳ鎖二糖組成解析
＜手順＞
先ず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、膜内骨化をシミュレート出来るマウス頭蓋骨由来骨芽細胞様細胞株であるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（前骨芽細胞）を用いて、女性ホルモンのエストロゲン（化合物Ａ）の一種であるＥ２の添加によるＣＳ鎖の二糖組成解析を行った。先ず、細胞同士が未接着の状態のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に、未添加（コントロール：Ｃｏｎｔ）又は最終濃度として１０ｎＭのＥ２を添加し（Ｅ２）、２４時間培養した。ここで、試料を最終濃度とする方法は、例えば、最終濃度よりも高濃度の溶液を予め用意しておき、細胞の体積又は重量を考慮して最終濃度となる高濃度の溶液の体積又は重量を細胞に添加することで、試料を最終濃度とする。以下、同様である。その後、各細胞から抽出・精製したＧＡＧ鎖を、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣＨａｓｅ）を用いて消化し、得られた不飽和二糖を２−ＡＢ標識後、陰イオン交換カラム（ＰＡ−０３カラム）を用いて陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。得られた二糖のピーク面積から二糖組成を算出し、各細胞の乾燥重量１ｍｇ当たりのＣＳ二糖の物質量を求めた。又、総物質量に対する各二糖の割合（％）を求めた。
【００９３】
具体的には、先ず、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を５×１０４個になるように６穴プレートに播種し、α−ＭＥＭ／１０％(ｖ／ｖ)ＦＢＳ培地で３７度／５％ＣＯ２の条件で２４時間培養を行った。又、細胞未接着の状態で、最終濃度として１０ｎＭのＥ２を添加し、２４時間反応させた後に、当該細胞を回収した。
【００９４】
次に、回収した細胞の重量を測定後、当該重量の５倍量のアセトンを加え、ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。その後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清のアセトンを取り除くことで脱水及び脱脂した。さらに、アセトンを加え、遠心分離し、脱水及び脱脂する同様の操作を２回繰り返した後、回収した沈殿物を風乾し、アセトンパウダーを得て、当該アセトンパウダーの重量を測定した。
【００９５】
そして、予め活性化させたアクチナーゼＥ及び１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、５５度で２日間反応させて、試料中のタンパク質を分解した（例えば、Sugahara, K., Ohi, Y., Harada, T., de waard, P., and Vliegenthart, J.
F. (1992) J. Biol. Chem. 267, 6027-6035.等）。
【００９６】
ここで、アクチナーゼＥの活性化は、アセトンパウダー重量の１／１０量のアクチナーゼＥを１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む１００ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、５５度で３０分間反応させることによって行った。更に、アクチナーゼＥで消化した試料に、最終濃度として５％(ｗ／ｖ)のトリクロロ酢酸を加え、氷上で１時間静置することで、変性したタンパク質を沈殿させ、３，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を回収した。その後、沈殿物の試料と等量のジエチルエーテルを加えて撹拌し、２，０００ｒｐｍで１分間遠心後、上層のエーテル層を除去するという操作を３回繰り返すことで、トリクロロ酢酸を除いた。そして、エアーコンプレッサーを用いて試料に空気を吹きつけ、残ったジエチルエーテルを完全に揮発させた（例えば、Yamada, S., Okada, Y., Ueno, M., Iwata, S., Deepa, S., Nishimura,
S., Fujita, M., Van Die, I., Hirabayashi, Y., and Sugahara, K. (2002) J. Biol.
Chem. 277, 31877-31886.等）。
【００９７】
続いて、最終濃度として５％(ｗ／ｖ)の酢酸ナトリウムを、最終濃度として８０％(ｗ／ｖ)のエタノールを、それぞれ試料に加え、氷上で３時間放置した。その後、遠心分離により上清を除去して、ＧＡＧ画分を回収した。風乾後、ＧＡＧ鎖を１ｍＬの５０ｍＭピリジン−酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)で溶解し、ＰＤ−１０カラムでゲルろ過を行い、脱塩処理した。これにより、ＧＡＧ鎖の抽出と精製を行った。
【００９８】
次に、ＣＳ鎖二糖組成を解析するために、ＧＡＧ鎖の精製物にＣＨａｓｅ消化を行った（例えば、Yamagata, T., Saito, H., Habuchi, O., and Suzuki, S. (1968) J. Biol.
Chem. 243, 1523-1535.等）。先ず、精製物に、最終濃度として５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、最終濃度として６０ｍＭのＣＨ３ＣＯＯＮａの溶液を調整し、１０ｍＩＵのＣＨａｓｅ（生化学工業株式会社製）を用い、全量２０μｌで３７度、２時間反応させた後、消化物を乾固させた。これにより、ＧＡＧ鎖の酵素消化を行った。
【００９９】
更に、酵素消化後の試料に、最終濃度として３５０ｍＭの２−ＡＢと１．０ＭのＮａＣＮＢＨ４を含むＤＭＳＯ：氷酢酸＝７:３の混液５μｌを加え、６５度で２時間反応させ、ＬｉＯＨにより切り出されたＧＡＧ鎖を２−ＡＢで蛍光標識した（例えば、Yamada, S., and Sugahara, K. (2003) Methods Mol. Biol. 213, pp.
71-78.等）。未反応の２−ＡＢ試薬を除くために、２−ＡＢ化後の反応生成物を５００μＬの蒸留水に溶解し、さらに、等量のクロロホルムを加えてからよく撹拌し、２，０００ｒｐｍで５秒間遠心し、下層のクロロホルム層に２−ＡＢ試薬を移行させ除去した（例えば、Kawashima, H., Atarashi, K., Hirose, M., Hirose, J., Yamada, S.,
Sugahara, K., and Miyasaka, M. (2002) J. Biol. Chem. 277, 12921-12930.等）。この操作を１０回繰り返した後、その試料を乾固した。これにより、酵素消化後の試料に対して２−ＡＢ化及び２−ＡＢ試薬の除去を行った。
【０１００】
そして、２−ＡＢ標識された試料を４００μＬの蒸留水に溶かし、コスモスピンフィルターＨでろ過後、ポリアミン結合シリカカラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＡ−０３を用いた陰イオン交換ＨＰＬＣで不飽和二糖の組成を分析した。ＨＰＬＣは、室温下、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、ＮａＨ２ＰＯ４の濃度を６０分間で１６ｍＭから５３０ｍＭまで直線勾配をかける条件で行った。検出は、２−ＡＢ由来の蛍光を指標に励起波長３２０ｎｍ／蛍光波長４２０ｎｍで行なった（例えば、Kinoshita, A., and Sugahara, K. (1999) Anal. Biochem. 269, 367-378.、Sugahara, K., Okumura, Y., and Yamashina, I. (1989) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 162, 189-197.等)。検出されたピークを２−ＡＢ化ＣＳ二糖標準品の溶出位置と比較して、同定・定量した。これにより、乾固後の試料に対してＨＰＬＣによる分析を行った。
【０１０１】
＜結果＞
図２には、Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＣＳ鎖二糖組成解析の結果を示す。図２に示すように、細胞同士が未接着な状態でＥ２を添加することで、未添加のもの（Ｃｏｎｔ）と比較してＣＳ総量が増加し、特に、Ｅ２を添加した細胞におけるＣＳ鎖の二糖単位のうち、Ａユニットの発現量（４２８．６ｐｍｏｌ／ｍｇ）が、未添加の細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの発現量（３４７．８ｐｍｏｌ／ｍｇ）と比較して、約１．２３倍増加していた。又、Ｅ２を添加した細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量（１４．９ｐｍｏｌ／ｍｇ）が、未添加の細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの発現量（１１．２ｐｍｏｌ／ｍｇ）と比較して、約１．３３倍増加していた。
【０１０２】
これに対応して、Ｅ２を添加した細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの割合（９１．９ｍｏｌ％）が、未添加の細胞におけるＣＳ鎖のＡユニットの割合（９０．０ｍｏｌ％）と比較して、約１．０２倍増加し、Ｅ２を添加した細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの割合（３．２ｍｏｌ％）が、未添加の細胞におけるＣＳ鎖のＥユニットの割合（２．９ｍｏｌ％）と比較して、約１．１０倍増加していた。一方、Ｅ２を添加した細胞におけるＣＳ鎖のＣユニットの発現量（７．０ｐｍｏｌ／ｍｇ）は、未添加の細胞におけるＣＳ鎖のＣユニットの発現量（６．２ｐｍｏｌ／ｍｇ）と比較して、約１．１３倍増加しているものの、Ｅ２を添加した細胞におけるＣＳ鎖のＣユニットの割合（１．５ｍｏｌ％）が、未添加の細胞におけるＣＳ鎖のＣユニットの割合（１．５ｍｏｌ％）と比較して変化していなかった。従って、Ｅ２の添加により、ＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットの発現量が増加することが判明した。
【０１０３】
実施例２：Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞又は骨髄由来間葉系幹細胞における遺伝子発現量の解析
＜手順＞
細胞同士が未接着な状態のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞又はメスの野生型マウスから採取した骨髄由来未分化間葉系幹細胞に、最終濃度として１０ｎＭのＥ２を添加し、２４時間培養を行った。その後、細胞からＲＮＡ抽出し、ｃＤＮＡを合成した後、ＲＴ−ＰＣＲ法により、各硫酸基転移酵素の遺伝子の発現量を解析した。遺伝子は、Ｃ４ＳＴ−１、Ｃ４ＳＴ−２、Ｃ６ＳＴ−１、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、ＣｈＧｎ−１、ＣｈＧｎ−２、ＡＬＰの遺伝子である。
【０１０４】
具体的には、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞又はメスの野生型マウスから採取した骨髄由来未分化間葉系幹細胞を、１×１０５個になるように６ｃｍｄｉｓｈに播種し、α−ＭＥＭ／１０％(ｖ／ｖ)ＦＢＳ培地で３７度／５％ＣＯ２の条件で１日間培養した後、最終濃度として１０ｎＭのＥ２を添加した。２４時間後、細胞を回収し、当該細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。
【０１０５】
各ｔｏｔａｌＲＮＡの１μｇを鋳型として、Ｍ−ＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅとｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒとを用いて３７度／１時間、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを５０倍希釈したものを鋳型として、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅや緩衝液を含む混合試薬であるＦａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ｐｌｕｓ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用い、ライトサイクラーＳＴ３００でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行った。
【０１０６】
各遺伝子のｐｒｉｍｅｒは、それぞれの塩基配列に基づき、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｏｌｔｗａｒｅ  ２．０で設計したものを使用した。
Ｃ４ＳＴ−１
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＴＧＴＡＧＡＧ−３’（配列番号２）
Ｃ４ＳＴ−２
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡ−３’（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号４）
Ｃ６ＳＴ−１
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧＴＴＴ−３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＧＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＴＣＴＣＣＧＡＴＡＡＧ−３’（配列番号６）
ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＧＧ−３’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＧＡＡ−３’（配列番号８）
ＣｈＧｎ−１
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＡＡＣＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＣＧＡＡＡＴＡＧＧＡＣＡＡＧＴＣＧＣ−３’（配列番号１０）
ＣｈＧｎ−２
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＴＧＣＣＡＣＴＴＧＣＧ−３’（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＧＡＡＴＡＧＡＣＴＴＧＡＣＴＴＴＡＧＡＴＡＧＴＣＣ−３’（配列番号１２）
ＡＬＰ
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＣＧＣ−３’（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＴＧＧＧＡ−３’（配列番号１４）
【０１０７】
ターゲット遺伝子の発現量を定量するための検量線を作製するため、ハウスキーピング遺伝子であるヒトｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ(ＧＡＰＤＨ)を組み込んだベクター（ｐＧＡＰＤＨ：配列番号１５）を、１０６コピーから１０３コピーまで段階希釈して、ＰＣＲ反応を行った。
【０１０８】
ＰＣＲ反応により得られた結果のｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ(サイクル数で表示)を縦軸に、濃度(ｌｏｇ値表示)を横軸にプロットすることにより検量線を作製した。ＰＣＲ反応は、９５度で５ｓｅｃ、６０度で５ｓｅｃ、７２度で１０ｓｅｃを５０ｃｙｃｌｅそれぞれ行った。１×１０−４  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／μＬのＧＡＰＤＨを濃度既知の外標準物質として、ＰＣＲ反応により各遺伝子の増幅を行い、その立ち上がりのサイクル数(ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ、Ｃｔ値)と検量線から各遺伝子の発現量を求めた。得られた各遺伝子の発現量をＧＡＰＤＨの発現量で割り、この定量結果をもとに、サンプル間の各遺伝子の発現量を求めた。
【０１０９】
＜結果＞
図３には、Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞における硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を示す。図３に示すように、細胞同士が未接着な状態でＥ２を添加した細胞における硫酸基転移酵素のうち、Ｃ４ＳＴ−１の遺伝子の発現量が、未添加のものと比較して約１．８倍増加していた。又、Ｅ２を添加した細胞におけるＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴの遺伝子の発現量が、未添加のものと比較して約１．８倍増加していた。これらは、図２の結果におけるＥ２を添加した際の二糖組成変化と一致している。
【０１１０】
図４には、Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＣｈＧｎの遺伝子の発現量を示す。図４に示すように、細胞同士が未接着な状態でＥ２を添加した細胞におけるＣｈＧｎ−１、ＣｈＧｎ−２の遺伝子の発現量は、未添加のものと比較して変化していなかった。
【０１１１】
図５には、Ｅ２を添加したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＡＬＰの遺伝子の発現量を示す。図５に示すように、細胞同士が未接着な状態でＥ２を添加した細胞におけるＡＬＰの遺伝子の発現量は、未添加のものと比較して変化していなかった。
【０１１２】
又、図６には、Ｅ２を添加した骨髄由来間葉系幹細胞における硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を示す。図６に示すように、より未分化な状態である骨髄由来間葉系幹細胞にＥ２を添加した結果、当該細胞におけるＣ４ＳＴ−１の遺伝子の発現量が、未添加のものと比較して約１．９倍増加していた。又、Ｅ２を添加した細胞のＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴの遺伝子の発現量が、未添加のものと比較して約１．６倍増加していた。
【０１１３】
従って、図２〜図６の結果により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、骨芽細胞でも間葉系幹細胞でも、Ｅ２の添加により、ＣＳ鎖の硫酸化パターンを変化させ、ＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットの発現量を増加させることが判明した。
【０１１４】
実施例３：卵巣摘出マウス由来骨髄間葉系幹細胞におけるＣＳ鎖二糖組成及び遺伝子発現量の解析
＜手順＞
次に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、エストロゲン（化合物Ａ）がＣＳ鎖の生合成に関与しているかを調べた。マウスから、女性ホルモンのエストロゲンが産生される卵巣を摘出することで（ＯＶＸマウス)、エストロゲンが産生されない状態にし、６週間飼育した後の骨髄由来間葉系幹細胞におけるＣＳ鎖の二糖組成及び各遺伝子の発現量を解析した。
【０１１５】
具体的には、生後８週齡のマウスの卵巣を摘出又は偽手術を行い、ＯＶＸマウスと偽手術のマウス（Ｓｈａｍ）を作製し、それぞれ６週間飼育した。その後、両大腿骨から骨髄細胞を採取し、ＤＭＥＭ／１０％(ｖ／ｖ)ＦＢＳ培地で３７度／５％ＣＯ２の条件で３日間培養した後、回収し、実施例１、実施例２に記載した方法を用いて、ＣＳ鎖の二糖組成及び各遺伝子の発現量を解析した。
【０１１６】
＜結果＞
図７には、ＯＶＸマウス及びＳｈａｍ由来骨髄間葉系幹細胞におけるＣＳ鎖の二糖組成を示す。図７に示すように、ＯＶＸマウスの細胞におけるＣＳ鎖の量が、Ｓｈａｍと比較して半分程度まで減少していた。特に、ＯＶＸマウスの細胞におけるＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットの発現量が減少し、当該Ａユニットが顕著に減少していた。一方、ＯＶＸマウスの細胞におけるＣＳ鎖のＣユニットの発現量は、Ｓｈａｍと比較して変化していなかった。
【０１１７】
図８には、ＯＶＸマウス及びＳｈａｍ由来骨髄間葉系幹細胞における硫酸基転移酵素遺伝子の発現量を示す。図８に示すように、ＯＶＸマウスの細胞におけるＣ４ＳＴ−１、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴの遺伝子の発現量は、Ｓｈａｍと比較して半分程度にまで減少していた。
【０１１８】
図９には、ＯＶＸマウス及びＳｈａｍ由来骨髄間葉系幹細胞におけるＣｈＧｎの発現量を示す。図９に示すように、ＯＶＸマウスの細胞におけるＣｈＧｎ−１、ＣｈＧｎ−２の遺伝子の発現量は、Ｓｈａｍと比較して変化していなかった。
【０１１９】
実施例４：卵巣摘出マウスの脛骨における骨密度の解析
＜手順＞
生後８週齡のマウスの卵巣を摘出又は偽手術を行い、ＯＶＸマウスとＳｈａｍを作製し、６週間飼育した。その後、脛骨を摘出し、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴ［ラシータ(ＬＣＴ−２００)]を用いて骨密度を測定した。骨密度は、皮質骨、海綿骨、全骨の骨密度とした。
【０１２０】
＜結果＞
図１０には、ＯＶＸマウス及びＳｈａｍの脛骨における骨密度を示す。図１０に示すように、ＯＶＸマウスの脛骨をＭｉｃｒｏ  ＣＴを用いて解析した結果、ＯＶＸマウスの各種の骨密度は、Ｓｈａｍと比較していずれも減少していた。ここで、ＯＶＸマウスは、女性ホルモンのエストロゲンを投与していないマウスとみなし、Ｓｈａｍは、エストロゲンを投与したマウスとみなすことが出来る。従って、図７〜図１０の結果により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、エストロゲンの投与により、ＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットの発現量を増加させ、その結果、各種の骨密度を増加させることが判明した。
【０１２１】
＜考察＞
図２〜図１０の結果により、例えば、Ｅ２のエストロゲンの添加によって、ＣＳ鎖の硫酸化パターンを変化させ、ＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットの発現量を増加させ、その結果、各種の骨密度を増加させることが明らかになった。
【０１２２】
更に、本発明者は、非特許文献９において、ＣＳ鎖のＥユニットが特に骨芽細胞の分化を制御していることを明らかにしているため、図２〜図１０の結果を考慮すれば、エストロゲンを含む外来性の化合物又は生合成される内在性の化合物（化合物Ａ）の添加によって、ＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットのいずれか一方又は両方の発現量が増加し、これに伴い、骨密度が増加することが示唆される。
【０１２３】
現在、ＯＶＸマウスに、破骨細胞の分化を抑制する骨吸収抑制薬を用いたとしても、骨密度の低下を完全に抑えることはできない（非特許文献４）。そのため、エストロゲンの低下による骨粗鬆症を治療するためには、骨形成の促進と骨吸収の抑制の両方が必要であると考えられる。
【０１２４】
そこで、本発明では、図２〜図１０の結果に基づいて、特に、発現量が顕著であったＡユニットに着目し、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａを有効成分とすることを特徴とする。これにより、前記骨芽細胞の分化による骨基質の産生と石灰化を亢進し、骨密度を確実に増加させることが可能となる。尚、本発明は、図２〜図１０の結果に基づいて、骨芽細胞内の糖鎖のＣＳ鎖における二糖単位のうち、Ａユニットの発現量を増加させる化合物Ａ、Ｅユニットの発現量を増加させる化合物Ｅのいずれか一方又は両方を有効成分とすることを特徴としても良い。
【０１２５】
又、このような骨密度増加剤を用いた治療方法は、従来から存在するエストロゲン補充療法やビスホスホネート製剤、ホルモン剤、カルシウム製剤等との併用治療方法とは全く異なる。従って、本発明では、従来の治療方法で生じていた副作用を回避することが出来る、より良い骨密度増加剤、薬剤、これを用いた治療方法の開発につなげることが出来る可能性がある。
【０１２６】
又、本発明は、被験物質がＣＳ鎖のＡユニットの発現量又は前記化合物Ａをコードする遺伝子Ａの発現量を増加させるか否かを指標とする骨密度増加剤のスクリーニング方法である。これにより、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤を効率よくスクリーニングすることが可能となる。尚、本発明は、被験物質がＣＳ鎖のＡユニット、Ｅユニットのいずれか一方又は両方の発現量を増加させるか否かを指標とする、骨密度増加剤のスクリーニング方法としても良い。更に、本発明は、前記化合物Ａをコードする遺伝子Ａ、前記化合物Ｅをコードする遺伝子Ｅのいずれか一方又は両方の発現量を増加させるか否かを指標とする、骨密度増加剤のスクリーニング方法としても構わない。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
以上のように、本発明に係る骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法は、通常の骨疾患はもちろん、骨粗鬆症等の骨疾患のための骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法に有用であり、糖鎖に着目した新規な骨密度増加剤及び骨密度増加剤のスクリーニング方法として有効である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１５：ｐＧＡＰＤＨ
【図１】
2014159392.tif 000003
【図２】
2014159392.tif 000004
【図３】
2014159392.tif 000005
【図４】
2014159392.tif 000006
【図５】
2014159392.tif 000007
【図６】
2014159392.tif 000008
【図７】
2014159392.tif 000009
【図８】
2014159392.tif 000010
【図９】
2014159392.tif 000011
【図１０】
2014159392.tif 000012
【配列表】
2014159392000001.app