(57)【要約】      （修正有）【課題】２．５μｍ以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用バイオマーカー及びそれを用いた確認方法を提供する。【解決手段】具体的に２．５μｍ以下の微小粒子状物質によって特異的に遺伝子発現が増加または減少するバイオマーカー及びそれを用いた２．５μｍ以下の微小粒子状物質に特異的曝露有無を確認する方法に関するもので、本発明のバイオマーカーはＤＮＡマイクロアレイチップを通じて選別された反応遺伝子をバイオマーカーに用いて環境試料で２．５μｍ以下の微小粒子状物質の汚染をモニタリング及び判定するのに有用に用いることができ、２．５μｍ以下の微小粒子状物質によって特異的に誘発される毒性作用機序を解明する道具として有用に用いることができる。２．５μｍに曝露されたと疑われる群と正常対照群の細胞から各々のＲＮＡをｃＤＮＡで合成し、蛍光物質で標識し、比較する方法。【選択図】図４
2014212787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子の核酸配列またはその相補鎖分子が集積された、２．５マイクロメートル（μｍ）以下の微小粒子状物質への特異的曝露の有無を確認するためのＤＮＡマイクロアレイチップ：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号（Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【請求項２】
１）２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質への曝露が疑われる実験群及び正常対照群の体細胞から各々のＲＮＡを分離する工程と、
２）前記工程１）の実験群及び対照群のＲＮＡをｃＤＮＡで合成しながら実験群と対照群を各々異なる蛍光物質で標識する工程と、
３）前記工程２）の各々異なる蛍光物質で標識されたｃＤＮＡを請求項１のＤＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイゼーションする工程と、
４）前記工程３）の反応したＤＮＡマイクロアレイチップの結果を分析する工程、及び
５）前記工程４）の分析したデータで請求項１のＤＮＡマイクロアレイチップに集積された遺伝子の発現程度を対照群と比較して分析する工程とを含む、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法。
【請求項３】
工程１）の体細胞が、ヒト肺細胞またはヒト肺癌組織由来細胞であることを特徴とする請求項２に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法。
【請求項４】
前記ヒト肺癌組織由来細胞が、Ａ５４９であることを特徴とする請求項３に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法。
【請求項５】
工程３）の蛍光物質が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ポリ−Ｌ−リジン−フルオロセインイソチオシアネート（poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate;FITC）、ＲＩＴＣ（rhodamine-B-isothiocyanate)及びローダミン（rhodamine）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法。
【請求項６】
１）２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質曝露が疑われる実験群及び正常対照群の体細胞で各々のＲＮＡを分離する工程と、
２）前記工程１）のＲＮＡを下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）を遂行する工程と：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)、及び
３）前記工程２）の増幅された遺伝子産物の量を対照群と比較して発現程度を分析する工程とを含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法。
【請求項７】
工程２）のプライマー対が、下記のプライマー対１〜８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法：
プライマー対１：配列番号１で表される正方向プライマー及び配列番号２で表される逆方向プライマー；
プライマー対２：配列番号３で表される正方向プライマー及び配列番号４で表される逆方向プライマー；
プライマー対３：配列番号５で表される正方向プライマー及び配列番号６で表される逆方向プライマー；
プライマー対４：配列番号７で表される正方向プライマー及び配列番号８で表される逆方向プライマー；
プライマー対５：配列番号９で表される正方向プライマー及び配列番号１０で表される逆方向プライマー；
プライマー対６：配列番号１１で表される正方向プライマー及び配列番号１２で表される逆方向プライマー；
プライマー対７：配列番号１３で表される正方向プライマー及び配列番号１４で表される逆方向プライマー；及び
プライマー対８：配列番号１５で表される正方向プライマー及び配列番号１６で表される逆方向プライマー。
【請求項８】
請求項１に記載のＤＮＡマイクロアレイチップを含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キット（kit）。
【請求項９】
ヒト体細胞を追加的に含むことを特徴とする、請求項８に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キット。
【請求項１０】
ヒト体細胞が、ヒト肺細胞またはヒト肺癌組織由来細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キット。
【請求項１１】
下記の各々の遺伝子に相補的で、下記の各々の遺伝子を増幅することができるプライマー対を含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キット：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)及び遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【請求項１２】
前記プライマー対が、下記のプライマー対１〜８からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キット：
プライマー対１：配列番号１で表される正方向プライマー及び配列番号２で表される逆方向プライマー；
プライマー対２：配列番号３で表される正方向プライマー及び配列番号４で表される逆方向プライマー；
プライマー対３：配列番号５で表される正方向プライマー及び配列番号６で表される逆方向プライマー；
プライマー対４：配列番号７で表される正方向プライマー及び配列番号８で表される逆方向プライマー；
プライマー対５：配列番号９で表される正方向プライマー及び配列番号１０で表される逆方向プライマー；
プライマー対６：配列番号１１で表される正方向プライマー及び配列番号１２で表される逆方向プライマー；
プライマー対７：配列番号１３で表される正方向プライマー及び配列番号１４で表される逆方向プライマー；及び
プライマー対８：配列番号１５で表される正方向プライマー及び配列番号１６で表される逆方向プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２．５マイクロメートル（μｍ）以下の微小粒子状物質特異的曝露(露出)有無確認用バイオマーカー及びそれを用いた確認方法に関するもので、より詳細には２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質によって特異的に遺伝子発現量が増加または減少するバイオマーカー、及び、それを用いた２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の特異的曝露有無を確認する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
粒子状物質は、その大きさによって大きく３種種類に分類される。具体的に、１０マイクロメートル（μｍ）以下の粒子状物質（particulate matter 10,PM10）、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質（particulate matter 2.5,PM2.5）、及び超微小粒子（ultra fine particle,UFP）に分けられる（非特許文献１）。このように区分される主な原因は、大きさによって粒子状物質の物理化学的性質が変わり、特に２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の場合は、主に自動車、発電所、工場などのヒトの人工的な活動によって発生するものであると知られている。また、１０マイクロメートル以下の粒子状物質の中で２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の占める割合は、８０％前後と報告されていて（非特許文献２）、実際にヒトの喉頭と気管支でろ過されないで肺胞まで到達し得る大きさの粒子状物質は、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質であると知られている。また、粒子状物質の不溶性物質は肺の粘液を通じて排出されるので、実際に人体の血管に浸透してヒトに危害性を及ぼす要因は２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の溶解性化学物質である（非特許文献３、非特許文献４）。前記２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質は、塩素、硝酸塩、硫酸塩、アンモニウム、及び反応性が高い金属等を含む水溶性溶解物質、主に多核芳香族炭化水素（Polynuclear aromatic hydrocarbons,PAHs）からなる有機性溶解物質、その他微量のタンパク質、及び微生物などが含まれた混合物の形態で大気中に存在している。
【０００３】
一方、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する先行技術として、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の肺疾患との連関性を明らかにした疫学的研究結果、その相関性がかなり前から認められてきている（非特許文献５）。呼吸器、気管支、及び肺胞に影響を及ぼす微小粒子状物質は、人体の免疫機能を低下させて、喘息、呼吸困難、及び慢性閉塞性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）などを含む疾患を誘発する。このような疫学的な相関性を証明した多くの研究において、試験管内（インビトロ）及び生体内（インビボ）実験が行なわれていて、特に２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質による遺伝子指標を用いた研究が進行中である。２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に特異的なバイオマーカーの発掘は、肺疾患及び２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の環境中への露出（曝露）をスクリーニングすることに活用することができる。しかし、前記で明示したように２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質のヒトに対する危害性が明らかであるにもかかわらず、人体における危害度評価データが十分ではなく、微小粒子状物質の曝露程度を早くかつ簡便に知ることができる方法は開発されていないのが実情である。したがって、より早くより簡便にスクリーニングする方法、例えば特定遺伝子に対するプライマーを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）または、ＤＮＡマイクロアレイチップなどを用いて、迅速な危害性評価を通じて人体での毒性作用及び遺伝子発現の有無を探索することができるバイオマーカーを発掘して、それを活用した２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の曝露に対する適切な対策及び能率的な管理を行なうことが重要な課題であると言える。
【０００４】
哺乳類６種、微生物２９２種などを含んだ多くの種の遺伝体塩基配列プロジェクトが完成し、そのデータはすべてＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）に公開して報告されている。このように得られた莫大な量のデータを基に遺伝子の機能を明らかにするために、遺伝体全般の発現（genome-wide expression）に対する研究が行なわれている。一般的に、一回の実験結果で数千個の遺伝子発現を分析することができるＤＮＡマイクロアレイ実験が行なわれている（非特許文献６）。マイクロアレイは、ｃＤＮＡ（complementary DNA）や２０ないし２５ｂｐ長のオリゴヌクレオチドのセットをガラスに集積化したものである。ｃＤＮＡマイクロアレイは、学内研究室またはAgilent、Genomic Solutionsなどの企業で、チップ上にｃＤＮＡ収集物を機械的に固定化したりインクジェット方法を用いたりして生産している（非特許文献７）。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、Affymetrix社で写真蝕刻工程（photolithography）を用いてチップ上で直接合成する方法によって作られていて、Agillent社などでは合成したオリゴヌクレオチドを固定化する方法で生産している（非特許文献７）。
【０００５】
遺伝子の発現分析のために組織、細胞などの試料からＲＮＡを抽出して、ＤＮＡマイクロアレイにあるオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション（混成化）反応を行なう。オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、主にＣｙ３及びＣｙ５のような二つの異なる蛍光物質で対照群と実験群を各々異なるように標識化して、同じチップ上で同時にハイブリダイゼーションした後、光学的イメージをスキャンして蛍光の強さを分析する。二つの蛍光強さの比率によって、遺伝子の発現有無を決定する（非特許文献８）。最近では、ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた先端技法であるトキシコゲノミクス（Toxicogenomics）研究の結果、ハイスループットに医薬品及び新薬候補物質のみならず、代表的な環境汚染物質を含めたすべての化学物質による遺伝子の発現パターン及び量的分析が可能になった。それによって、特定細胞内で特定遺伝子の発現頻度を分析することで、薬物の副作用及び環境汚染物質の有害作用と係わる遺伝子の発掘が可能で、それを通じて環境汚染物質の有害性と薬物の作用及び副作用による分子的機序（メカニズム）を理解できるようになり、ひいては毒性及び副作用を誘発する物質の検索及び確認する方法を開発することができるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Toxicology,2003年,第183巻,p.243-254
【非特許文献２】Atmospheric Environment,2001年,第35巻,p.6407-6419
【非特許文献３】Nature Reviews Drug Discovery,2007年,第6巻,p.67-74
【非特許文献４】Molecular and cellular biochemistry,2004年,第255巻,p.257-265
【非特許文献５】Chemosphere,2010年,第78巻,p.1368-1377
【非特許文献６】Proc. Natl. Acad. Sci.USA,1996年,第93巻,p.10614-10619
【非特許文献７】J. Am. Acad. Dermatol.,2004年,第51巻,p.681-692
【非特許文献８】Genomics Proteomics,2002年,第I巻,p.1-10
【発明の概要】
【０００７】
そこで、本発明者らはヒト遺伝子４万２千余個が集積されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ研究を基に、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質による遺伝子発現様相変化をヒトの肺癌組織由来細胞であるＡ５４９細胞株で観察及び分析した結果、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質によってのみ特異的に過発現または低発現する遺伝子を発掘して、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質のみを特異的に検出することができるバイオマーカー及びそれを用いた曝露有無を確認する方法を確立することによって本発明を完成した。
【０００８】
本発明の目的は、２．５マイクロメートル（μm）以下の微小粒子状物質への曝露によって特異的に過発現または低発現するバイオマーカー及び前記バイオマーカーを用いて２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無を確認する方法を提供することである。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質への曝露によって特異的に発現変化を起こす２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用バイオマーカーを提供する。
【００１０】
また、本発明は下記の群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子の核酸配列またはその相補鎖分子が集積された２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用ＤＮＡマイクロアレイチップを提供する：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2,Homo sapiens mucin 2,oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6,Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11,Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2,Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP,Homo sapiens interleukin 8 receptor,beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI,Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4,Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1,Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【００１１】
また、本発明は、１）２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質曝露が疑われる実験群及び正常対照群の体細胞から各々のＲＮＡを分離する工程と、
２）前記工程１）の実験群及び対照群のＲＮＡをｃＤＮＡで合成しながら実験群と対照群を各々異なる蛍光物質で標識する工程と、
３）前記工程２）の各々異なる蛍光物質で標識されたｃＤＮＡを本発明のＤＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイゼーションする工程と、
４）前記工程３）の反応したＤＮＡマイクロアレイチップの結果を分析する工程、及び
５）前記工程４）の分析したデータで本発明のＤＮＡマイクロアレイチップに集積された遺伝子の発現程度を対照群と比較して分析する工程とを含む、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無を確認方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、１）２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質曝露が疑われる実験群及び正常対照群の体細胞から各々のＲＮＡを分離する工程と、
２）前記工程１）のＲＮＡを下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）を遂行する工程：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI、Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4、Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)、及び
３）前記工程２）の増幅された遺伝子産物の量を対照群と比較して発現程度を分析する工程とを含む、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は本発明のＤＮＡマイクロアレイチップを含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キット（kit）を提供する。
【００１４】
同時に、本発明は下記の各々の遺伝子に相補的で、下記の各々の遺伝子を増幅することができるプライマー対を含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キットを提供する：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)及び遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の２．５マイクロメートル（μm）以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用バイオマーカー及びそれを用いた確認方法は、ＤＮＡマイクロアレイチップを通じて選別された反応遺伝子をバイオマーカーに用いて、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質のモニタリング及びその危害性を判定するのに有用であり、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質によって惹起される特異的な毒性作用機序を解明する道具として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】２．５マイクロメートル（μm）以下の微小粒子状物質処理群でその水溶性抽出液及び有機性抽出液の抽出工程経路に関する図である。
【図２】２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の水溶性抽出液及び有機性抽出液処理によるヒト肺癌組織由来細胞株での細胞毒性実験結果を各々示した図である。
【図３】マイクロアレイチップを用いて２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質を処理したヒト肺癌組織由来細胞株の遺伝子発現様相を分析した結果を、有機性抽出液及び水溶性抽出液を比較して示した図である。
【図４】２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質を処理した条件で、共通的に増加または減少した遺伝子８種に対して各遺伝子別マイクロアレイチップ結果とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）の結果を対照群と対比して発現の増減を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１８】
本発明は、２．５マイクロメートル（μm）以下の微小粒子状物質への曝露によって特異的に発現変化を起こす遺伝子を用いて、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用バイオマーカーを提供する。
【００１９】
前記粒子状物質は、超微小粒子（UFP）を含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質（PM2.5）であることが好ましくて、０．１ないし２．５マイクロメートルの粒子状物質であることが最も好ましいがそれに限定されない。
【００２０】
前記バイオマーカーは、１．５倍以上発現が増加または減少した遺伝子であって、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的に発現量が変化する８種の遺伝子で構成されている（表３参照）。
【００２１】
前記２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質への曝露の程度によって特異的に発現量の変化を伴うバイオマーカーは、下記のように構成された群から選択することが好ましいが、これに限定されない：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)及び遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【００２２】
本発明の具体的な実施例で、本発明者らは２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用バイオマーカーを発掘するために、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質を１個のテフロン（登録商標）コーティンググラスファイバーフィルターを２４時間±３０分間捕集した。捕集した１０個のフィルターは、各々半分の大きさに分けて水溶性抽出液及び有機性抽出液に分けて各々１５０ｍｌ精製水とジクロロメタンを用いて３０分間超音波粉砕機に入れて抽出工程を行なった。このような実験を５０個のフィルターを用いて５回実施し、各々の水溶性抽出液及び有機性抽出液を製作した（図１参照）。前記水溶性抽出液及び有機性抽出液をヒト肺癌組織由来細胞であるＡ５４９細胞株に処理して細胞毒性を確認した（ENVIRON. MOL. MUTAGEN.2006年,第47巻,P.199-211）。その結果、前記２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質は、ヒト肺癌組織由来細胞株に毒性を有していることを確認することができ（図２参照）、前記実験を基に２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の濃度を決定した。
【００２３】
本発明では前記決定した濃度で２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液をヒト肺癌組織由来細胞株に処理して、前記物質を処理した細胞株からｍＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成しながら蛍光物質であるＣｙ５で標識し、前記物質を処理しない対照群の場合はＣｙ３で標識した。前記蛍光標識されたｃＤＮＡをAgilent Human GE V2 4X44K（Agilent,米国）を用いてハイブリダイゼーション反応を実施し、そのマイクロアレイチップ実験結果である蛍光イメージをスキャンして遺伝子発現様相の差を分析した（図３参照）。分析した結果、Ｃｙ５／Ｃｙ３の比率が１．５倍以上の場合を発現増加した遺伝子に分類し、０．６６倍以下の場合は発現減少した遺伝子に分類した。分析の結果、共通的に発現量が増加した遺伝子は０．３３％（４２，４０５個の遺伝子中で１４４個）で、共通的に発現量が減少した遺伝子は０．２４％（４２，４０５個の遺伝子中で１０２個）であることを確認した。それらの中でリアルタイム定量ＰＣＲを用いて２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液で共通的に特異的に発現が変化した遺伝子８種を選別した（図４及び表３参照）。前記遺伝子は、既存の発明において他の化学物質等による肺毒性と係わる疾病を誘発させることに関与するという報告があるが、本発明で使用した２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液を処理した時、ヒト肺癌組織由来細胞において毒性と関連があるという報告は存在しない。
【００２４】
また、本発明は下記の群から選択されるいずれか一つ以上の遺伝子の核酸配列またはその相補鎖分子が集積された２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用ＤＮＡマイクロアレイチップを提供する：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【００２５】
本発明の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質曝露有無確認用ＤＮＡマイクロアレイチップは、当業者に公知の方法で製作することができる。前記マイクロアレイチップを製作する方法は、下記のとおりである。前記探索されたバイオマーカーを探針ＤＮＡ分子に用いてＤＮＡチップの基板上に固定化させるため、ピエゾエレクトリック（piezoelectric）方式を用いたマイクロピペット（micropipetting）法またはピン（pin）形態のスポッター（spotter）を用いた方法などを用いることが好ましいが、それに限定されるのではなくて、本発明の好ましい実施例では、ピン形態のスポッターを用いてＤＮＡ分子を固定したマイクロアレイを使用した。前記ＤＮＡマイクロアレイチップの基板は、アミノシラン、ポリ−Ｌ−リジン及びアルデヒドからなる群から選択される一つの活性基がコーティングされたものが好ましいが、それに限定されるのではない。また、前記基板は、スライドガラス、プラスチック、金属、シリコン、ナイロン膜、及びニトロセルロース膜からなる群から選択することができるが、それに制限されるのではなく、本発明の好ましい実施例ではアミノシランがコーティングされたスライドガラスを用いた。
【００２６】
また、本発明は前記バイオマーカーを用いた２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認方法を提供する。
【００２７】
本発明は、下記ののような過程を含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認方法を提供する：
１）２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質曝露が疑われる実験群及び正常対照群の体細胞から各々のＲＮＡを分離する工程と、
２）前記工程１）の実験群及び対照群のＲＮＡをｃＤＮＡで合成しながら実験群と対照群を各々異なる蛍光物質で標識する工程と、
３）前記工程２）の各々異なる蛍光物質で標識されたｃＤＮＡを本発明のＤＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイゼーションする工程と、
４）前記工程３）の反応したＤＮＡマイクロアレイチップの結果を分析する工程、及び
５）前記工程４）の分析したデータで本発明のＤＮＡマイクロアレイチップに集積された遺伝子の発現程度を対照群と比較して分析する工程。
【００２８】
前記曝露有無確認方法において、工程１）の体細胞はヒト肺癌組織由来細胞であるＡ５４９細胞株を用いることが好ましいがそれに限定されるのではなく、ヒト肺細胞またはヒト肺癌組織に由来した細胞ならすべて使用可能である。
【００２９】
前記曝露有無確認方法において、工程３）の蛍光物質は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ポリ−Ｌ−リジン−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＲＩＴＣ（rhodamine-B-isothiocyanate）及びローダミン（rhodamine）からなる群から選択されられることが好ましいがそれに限定されるのではなく、当業者に公知の蛍光物質はすべて使用可能である。
【００３０】
本発明は前記曝露有無確認方法において、工程４）のＤＮＡマイクロアレイチップは、Whole Human Genome Oligo Microarray（Agilent, 米国）などを使用することが好ましいがそれに限定されるのではなく、ヒト遺伝体の中で本発明において前記過発現あるいは低発現した遺伝子（表３参照）が搭載されたマイクロアレイチップなら使用可能であり、前記本発明者が製作したＤＮＡマイクロアレイチップを用いることが最も好ましい。また、工程４）の分析方法は、Agilent Feature Extraction 10.7.3.1（Agilent technologies, 米国）、及びAgilent GeneSpring GX 11.5.1（Agilent technologies, 米国）を用いることが好ましいがそれに限定されるのではなく、当業者に公知の分析ソフトウェアを使用しても構わない。
【００３１】
また、本発明は、
１）２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質曝露が疑われる実験群及び正常対照群の体細胞から各々のＲＮＡを分離する工程と、
２）前記工程１）のＲＮＡを下記の遺伝子に相補的で下記の遺伝子を増幅することができるプライマー対を使用してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Real-time reverse transcript polymerase chain reaction）を遂行する工程：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)、及び
３）前記工程２）の増幅された遺伝子産物の量を対照群と比較して発現程度を分析する工程とを含む、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認方法を提供する。
【００３２】
前記工程２）のプライマー対は、工程２）の遺伝子を増幅することができる、１８ないし３０ｂｐ長の正方向（フォワード）及び逆方向（リバース）プライマー対であることが好ましく、下記のプライマー対１ないし８からなる群から選択されることがより好ましいがそれに限定されない：
プライマー対１：配列番号１で表される正方向プライマー及び配列番号２で表される逆方向プライマー、
プライマー対２：配列番号３で表される正方向プライマー及び配列番号４で表される逆方向プライマー、
プライマー対３：配列番号５で表される正方向プライマー及び配列番号６で表される逆方向プライマー、
プライマー対４：配列番号７で表される正方向プライマー及び配列番号８で表される逆方向プライマー、
プライマー対５：配列番号９で表される正方向プライマー及び配列番号１０で表される逆方向プライマー、
プライマー対６：配列番号１１で表される正方向プライマー及び配列番号１２で表される逆方向プライマー、
プライマー対７：配列番号１３で表される正方向プライマー及び配列番号１４で表される逆方向プライマー、及び
プライマー対８：配列番号１５で表される正方向プライマー及び配列番号１６で表される逆方向プライマー。
【００３３】
したがって、本発明のバイオマーカーは、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に特異的に遺伝子発現が増加または減少するので、環境試料において２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の汚染をモニタリング及び判定するのに有用に用いることができる。
【００３４】
また、本発明は本発明で製作した前記ＤＮＡマイクロアレイチップを含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質特異的曝露有無確認用キット（kit）を提供する。
【００３５】
前記キットは、ヒト体細胞を追加的に含むことが好ましいがそれに限定されない。
【００３６】
前記ヒト体細胞は、Ａ５４９であることが好ましいがそれに限定されるのではなく、ヒト肺細胞またはヒト肺癌細胞及び組織に由来した細胞ならすべて使用可能である。
【００３７】
前記キットに追加的に蛍光物質を含むことができ、その蛍光物質はストレプトアビジンアルカリフォスファターゼコンジュゲート（streptavidin-alkaline phosphatase conjugate）、化学蛍光物質（chemiflurorensce）及び化学発光物質（chemiluminescent）からなる群から選択されることが好ましいがそれに限定されるのではなくて、本発明の好ましい実施例ではＣｙ３とＣｙ５を使用した。
【００３８】
前記キットに追加的に反応試薬を含ませることができ、前記反応試薬はハイブリダイゼーションに使用される緩衝溶液、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、ｃＮＴＰｓ及びｒＮＴＰ（事前混合型または分離供給型）、蛍光染色剤の化学的誘導剤のような標識試薬、洗浄緩衝溶液などで構成することができるがそれに限定されるのではなく、当業者に公知のＤＮＡマイクロアレイチップのハイブリダイゼーション反応に必要な反応試薬はすべて含ませることができる。
【００３９】
本発明のバイオマーカーは、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に特異的に遺伝子発現が増加または減少するので、環境試料で２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の汚染をモニタリング及び判定するのに有用に用いることができ、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質によって特異的に誘発される毒性作用機序を解明する道具として用いることができる。
【００４０】
また、本発明は、
下記の各々の遺伝子に相補的で、下記の各々の遺伝子を増幅することができるプライマー対を含む２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用キットを提供する：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)及び遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)。
【００４１】
前記確認用キットのプライマー対は、下記のプライマー対１ないし８で構成された群から選択して用いることが好ましいがそれに限定されるのではなく、前記バイオマーカー遺伝子の増幅産物が１００ないし３００ｂｐになるように設計された１５ないし５０ｂｐ長さの、好ましくは１５ないし３０ｂｐ長さの、さらに好ましくは１８ないし２５ｂｐ長さの正方向及び逆方向プライマー対はすべて使用可能である。
【００４２】
プライマー対１：配列番号１で表される正方向プライマー及び配列番号２で表される逆方向プライマー、
プライマー対２：配列番号３で表される正方向プライマー及び配列番号４で表される逆方向プライマー、
プライマー対３：配列番号５で表される正方向プライマー及び配列番号６で表される逆方向プライマー、
プライマー対４：配列番号７で表される正方向プライマー及び配列番号８で表される逆方向プライマー、
プライマー対５：配列番号９で表される正方向プライマー及び配列番号１０で表される逆方向プライマー、
プライマー対６：配列番号１１で表される正方向プライマー及び配列番号１２で表される逆方向プライマー、
プライマー対７：配列番号１３で表される正方向プライマー及び配列番号１４で表される逆方向プライマー、及び
プライマー対８：配列番号１５で表される正方向プライマー及び配列番号１６で表される逆方向プライマー。
【００４３】
前記確認用キットに追加的にヒト体細胞を含むことが好ましいが、それに限定されない。
【００４４】
前記ヒト体細胞は、ヒト肺癌組織由来細胞であるＡ５４９細胞株を用いることが好ましいがそれに限定されるのではなく、ヒト肺細胞またはヒト肺癌細胞及び組織に由来した細胞ならすべて使用可能である。
【００４５】
併せて、前記キットに追加的に反応試薬を含むことができ、前記反応試薬はＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、ｃＮＴＰｓ及びｒＮＴＰ（事前混合型または分離供給型）、蛍光染色剤の化学的誘導剤のような標識試薬、及び洗浄緩衝溶液などで構成することができるがそれに限定されるのではなく、当業者に公知のＲＴ−ＰＣＲ反応に必要な反応試薬はすべて含むことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４７】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるのではない。
【００４８】
＜実施例１＞２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質捕集及び抽出
＜１−１＞捕集場所選定
一日平均７万台余の車が通るソウル特別市内部循環道路から直線距離で２４０メートル離れている韓国科学技術研究院の体育館屋上で２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質を捕集した。また、重量濃度測定法の中で米国ＥＰＡが２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質測定方法として唯一公認した方法であるハイボリュームエアーサンプラー（High Volume Air Sampler）を使用して２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質を捕集した。２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の試験管内（インビトロ）検査を実施するためには、多量の２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質が必要である。ローボリュームエアーサンプラー（Low Volume Air Sampler）は、２４時間稼動時に得ることができる２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の量が数ミリグラムに過ぎず、実験試験管内検査のための２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質捕集に相応しくないので、一日に多量を捕集することができるハイボリュームエアーサンプラーを選択して実験を行なった。２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質専用Inlet（Tisch Instrument Company）は、流体力学的大きさ（Aerodynamic Size）が２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質よりそれ以上のものは、その重さの慣性に勝つことができずに油膜（oil）にぶつかって停止し、この過程を経った２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質はテフロン（登録商標）コーティンググラスファイバーフィルターを用いて捕集される。
【００４９】
＜１−２＞捕集フィルター
ハイボリュームエアーサンプラー使用時、ろ過工程で８×１０インチの大きさの成分が抽出される可能性がない長所を有したテフロン（登録商標）コーティンググラスファイバーフィルターを採択し、抽出溶媒には精製水（１８．２ＭΩ）とジクロロメタンを用いた。水分による誤差を最小化するために乾燥器で４８時間フィルターの水分を完全に除去した後、０．１ｍｇまで測定することができる超精密秤（Mettler Toledo Company）を用いてフィルターの重さを秤量した。フィルターの内側面が互いに合うように折った後、暗室及び密閉効果がいるジッパーパック（Zipper bag）に入れて試料を使用する前まで−８０℃で保管して、捕集場所まで移動時にはアイスボックスを用いて移動した。２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質捕集のためには適正流量速度（１．１３ｍ３／分±１０％）を維持した。
【００５０】
＜１−３＞捕集期間
２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質は、５ヶ月にわたってハイボリュームエアーサンプラーを用いて捕集した。２０１１年１１月１日に最初の捕集を皮切りに、２０１３年３月２８日に最後の３０回目の捕集を終了した。雨が降った場合の測定値が基準値２０μｇ／ｍ３以下の低い粒子状物質大気濃度を示すフィルター値は除外し、各１０枚のフィルターにグループ化して総５個グループを構成した。
【００５１】
＜１−４＞粒子状物質捕集試料抽出工程
捕集した２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質の成分分析のために一枚のフィルターを１／２に分けて使用し、各々のフィルターは互いに異なる二つの抽出溶媒として水溶性成分抽出のための超純粋精製水及び有機性成分抽出のためのジクロロメタンを用いた。図１の抽出工程経路によって２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性及び２．５有機性抽出液を各々製作した（図１）。
【００５２】
＜実施例２＞細胞培養及び化学物質処理
＜２−１＞細胞培養
１００ミリメートルディッシュに１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ培地（Gibro-BRL、米国）条件下で、ヒト肺癌細胞株であるＡ５４９細胞（韓国細胞株銀行）を８０％程度成長するまで培養した。
【００５３】
＜２−２＞細胞毒性実験（MTT assay）及び化学物質処理
Mossman等（J. Immunol. Methods,1983年,第65巻,P.55-63）の方法にしたがってＡ５４９細胞株を用いたＭＴＴ実験を行なった。具体的に、２４ウェルプレートを使用してＲＰＭＩ培地（Gibro-BRL, 米国）で２．５×１０５／ウェル細胞数の条件で、前記＜実施例１＞の方法によって製造した、精製水に溶解した２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及びＤＭＳＯに溶解した２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質有機性抽出液を処理して４８時間培養した後、ＭＴＴ（3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide）５ｍｇ／ｍｌを混合して３７℃で３時間追加培養した。その後、培地を除去して形成されたホルマザンクリスタル（formazan crystal）をＤＭＳＯ  ５００μｌに溶解した。その溶解物を９６ウェルプレートに移して分注（aliquot）して吸光度５４０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【００５４】
その結果、図２に示したようにＡ５４９細胞株で２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質抽出液による細胞毒性に対して８０％生存率を示す濃度（ＩＣ２０）値は、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液４２６．９１μｇ／ｍｌ及び２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質有機性抽出液１９６２．８０μｇ／ｍｌであり、前記結果を基にして下記のマイクロアレイ実験を行なった（図２）。
【００５５】
＜実施例３＞マイクロアレイ実験
＜３−１＞標的ＲＮＡ分離及び蛍光物質標識
６−ウェルプレートにＡ５４９細胞を２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ濃度で分注した後、前記＜実施例１＞によって製造した２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液を４８時間処理した。以後、前記粒子状物質が処理された細胞でトリゾール（trizol, Invitrogen life technologies，米国）を使用して製造社の方法にしたがって全体ＲＮＡを抽出して、RNeasy mini kit（Qiagen,米国）を使用して精製した。ＲＮＡを精製する間にRNase-free DNase set（Qiagen, 米国）を使用してＤＮＡ遺伝体を完全に除去した。全体ＲＮＡ試料の量は、分光光度計で測定し、その濃度はND-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.,米国）とAgilent 2100バイオアナライザー（Agilent Technologies,米国）で確認した。
【００５６】
＜３−２＞蛍光物質で標識されたｃＤＮＡ製造
ＤＮＡマイクロアレイ分析のために、前記＜実施例１＞で得た２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液処理群の全体ＲＮＡをｃＤＮＡで製造した。前記得た全体ＲＮＡ３０μｇとオリゴ（ｄＴ）プライマー２μｇ（1μg/μl）を混合して、６５℃で１０分間反応後、直ちに氷に入れてアニーリングさせた。前記アニーリングされたＲＮＡの逆転写酵素反応のために、下記の［表１］のように試薬を混合して準備した。無処理の対照群は、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（緑）で標識し、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液で処理した実験群はＣｙ５−ｄＵＴＰ（赤色）で標識した。ここで、前記二つの試料は、Microcon ＹＭ−３０カラム（Millipore,米国）を使用して混合及び精製した。
【００５７】
【表１】
2014212787.tif 000003
【００５８】
＜３−３＞ハイブリダイゼーション反応
ハイブリダイゼーション反応及び洗浄過程は、（株）イバイオゼンの指示方法によって行なった。具体的に、下記の［表２］のような転写用試薬（Transcription Master Mix）を製造して混合した後、４０℃で２時間反応させた後、標識されたｃＤＮＡを精製して、前記Ｃｙ３またはＣｙ５で標識されたｃＤＮＡ  ６００ｎｇを６０℃で３０分間反応させて断片化（fragmentation）過程を遂行した。前記ｃＤＮＡを2x GEx Hybridization Buffer HI-RPMと混合した後、マイクロアレイチップ（chip）に位置させて６５℃で１７時間オーブンでハイブリダイゼーション反応を進行した。以後、マイクロアレイチップを２回洗浄（GE Wash Buffer 1で１分、GE Wash Buffer 2で１分）した後、３分間８００ｒｐｍで遠心分離して乾燥した。
【００５９】
【表２】
2014212787.tif 000004
【００６０】
＜３−４＞蛍光イメージの獲得
マイクロアレイチップスライド上のハイブリダイゼーション結果である蛍光イメージは、Agilent Cスキャナー（Agilent technologies, 米国）でスキャンした。ここで、緑蛍光イメージは対照群で、赤色蛍光イメージは実験群で特異的に発現する遺伝子の活性程度を意味し、黄色い蛍光イメージは緑色と赤色の補色であり、前記二つの群で遺伝子の発現量に大きな差がないことを意味する。スキャンしたイメージから遺伝子発現の割合に対する数値を得るためにAgilent Feature Extraction 10.7.3.1（Agilent technologies, 米国）で分析した。抽出されたデータは、Agilent GeneSpring GX 11.5.1（Agilent technologies, 米国）を用いて正規化（normalization）工程を経て各遺伝子の発現様相を分析した。このデータから２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対する曝露有無確認用バイオマーカーに使用する遺伝子を選別した。
【００６１】
その結果、図３に示したように表示されたオリゴチップ上に存在する約４万２千個余りの遺伝子の中で、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質水溶性抽出液及び有機性抽出液によってＣｙ５／Ｃｙ３値の比率が１．５倍以上で、共通的に発現量の増加した遺伝子は０．３３％（４２，４０５個の遺伝子の中で１４４個）、共通的に発現が減少した遺伝子は０．２４％（４２，４０５個の遺伝子の中で１０２個）であることを確認した（表３及び図３）。
【００６２】
【表３】
2014212787.tif 000005
【００６３】
＜実施例４＞リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量
前記＜実施例３＞のマイクロアレイ実験結果から２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質によって特異的に発現が変化した遺伝子の中で２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質によって共通的に特異的に発現する下記の８種の遺伝子：
遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)、遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)の発現量変化程度を調査及び定量するために、My IQリアルタイムPCR(My IQ Real-time PCR, Bio-rad, 米国)機械を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量を実施した。
【００６４】
具体的に、オリゴｄＴプライマーとSuperscript kit（OmnisciptTM kit, Qiagen, Co., 米国）を用いて逆転写反応を遂行してｃＤＮＡを合成した。前記合成したｃＤＮＡ０．２μｌと蒸溜水３．８μｌ、正方向プライマー０．５μｌ、逆方向プライマー０．５μｌ、及びサイバーグリーン（SYBR Green）Ｉ染色スーパーミックス（Bio-rad, 米国）５μｌをＰＣＲチューブ内で混合して、下記のようにリアルタイムＰＣＲ反応を進行した。工程１：９５℃、３分；工程２（４５回反復）：工程２−１：９５℃で１０秒；工程２−２：遺伝子ＫＩＦ１Ａに対する反応は５７℃で４５秒、及び遺伝子Ｂ３ＧＡＬＴ４、遺伝子ＤＨＲＳ９、遺伝子ＥＭＲ２、及び遺伝子ＫＩＡＡ１１９９に対する反応は６５℃で４５秒；工程３：９５℃で１分；工程４：５５℃で１分；工程５（８０回反復）：５５℃で１０秒間Ｍｙ  ＩＱリアルタイムＰＣＲ機械で反応させた。ＰＣＲ産物を定量するために、サイバーグリーンＩ染色（Bio-rad, 米国）で染色した。サイバーグリーンＩ染色は、二重螺旋ＤＮＡに結合する染色法であり、ＰＣＲ過程間で二重螺旋ＤＮＡが生成されるほど蛍光強度（fluroscense intensity）が増加するようになる。まず、ＰＣＲに用いた標的遺伝子と内在性（endogenous）対照群（ＲＰＬＰＯ）に対するプライマーをサイバーグリーンマスターミックス（Master mix）に添加して、ＰＣＲ反応を実施した後、適切な濃度を選択するプライマー適合化（primer optimization）過程を遂行した。合成されたｃＤＮＡと下記の［表４］に記載した各々のプライマーを混合して、サイバーグリーンマスターミックスを添加した後、ＰＣＲ反応を遂行し、定量ソフトウェアを使用して分析した。
【００６５】
その結果、図４に示したように前記遺伝子登録番号(Genebank)NM_002457(MUC2, Homo sapiens mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000065(C6, Homo sapiens complement component 6)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002986(CCL11, Homo sapiens chemokine (C-C motif)ligand 11)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002006(FGF2, Homo sapiens fibroblast growth factor 2)及び遺伝子登録番号(Genebank)NR_002712(IL8RBP, Homo sapiens interleukin 8 receptor, beta pseudogene)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_000204(CFI, Homo sapiens complement factor I)、遺伝子登録番号(Genebank)NM_002747(MAPK4, Homo sapiens mitogen-activated protein kinase 4)及び遺伝子登録番号(Genebank)NM_013955(NOX1, Homo sapiens NADPH oxidase 1)の８種遺伝子からなる群の発現様相は、前記＜実施例３＞のマイクロアレイチップ実験結果と類似の様相を示すことを確認及び証明した。
【００６６】
【表４】
2014212787.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００６７】
２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質に対して特異的な発現変化をバイオマーカーを含むマイクロアレイチップまたはキットを、２．５マイクロメートル以下の微小粒子状物質のモニタリング及び危害性を判定するのに有用に用いることができる。
【図１】
2014212787.tif 000007
【図２】
2014212787.tif 000008
【図３】
2014212787.tif 000009
【図４】
2014212787.tif 000010
【配列表】
2014212787000001.app