(57)【要約】      （修正有）【課題】遊離塩基及び遊離塩基をその場で可溶化するために必要な有機溶剤を使用せずとも可能な塩を含有する新生物疾患及び状態を治療するための非経口投与に有用なエルサミトルシン製剤の提供。【解決手段】トシル酸エルサミトルシンで代表される、安定な形態のエルサミトルシン塩を含有する製剤であり、浸透圧調整剤としてマンニトールを含有し、ｐＨが約４．０に設定された水溶液製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの安定な固体のエルサミトルシン塩、及び
製薬学的に許容しうる担体
の溶液を含む製剤。
【請求項２】
前記製剤が溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を含有しない、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記製剤が安定化抗酸化剤を必要としない、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
浸透圧調整剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記浸透圧調整剤がマンニトールである、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
ｐＨを約３．５〜４．５に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
ｐＨを約３．０〜約４．０に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
ｐＨを約４．０に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記安定な固体のエルサミトルシン塩が、乳酸エルサミトルシン、フマル酸エルサミトルシン、マレイン酸エルサミトルシン、コハク酸エルサミトルシン、酒石酸エルサミトルシン、トシル酸エルサミトルシン、メタンスルホン酸エルサミトルシン、安息香酸エルサミトルシン、サリチル酸エルサミトルシン、塩酸エルサミトルシン、硫酸エルサミトルシン、及びリン酸エルサミトルシンからなる群から選ばれる、請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
前記エルサミトルシン塩がトシル酸エルサミトルシンである、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記製薬学的に許容しうる担体が水又は生理食塩水である、請求項１に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年１２月１９日出願の米国仮特許出願第６１／０１５，１８３号に基づく優先権を主張する。この出願の内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の分野
本開示は、新生物疾患及び状態を治療するための非経口投与に有用なエルサミトルシン製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
エルサミトルシンは、グラム陽性菌の放線菌株Ｊ９０７−２１から分離された複素環式の抗新生物性抗生物質である。これについては、米国特許番号（ＵＳＰＮ）４，５１８，５８９及び４，５７２，８９５に記載されており、前記特許がエルサミトルシンの自然史、化学組成、製造法及び生物活性に関して開示している全内容は、引用によって本明細書に援用する。エルサミトルシンは、ＤＮＡのグアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）リッチ配列部分にインターカレートしてトポイソメラーゼＩ及びIIを阻害し、一本鎖切断及びＤＮＡの複製の阻害をもたらす。エルサミトルシンは、転移性の乳がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん及び卵巣がんに対して、及び再発性又は難治性の非ホジキンリンパ腫患者において、著しい腫瘍崩壊活性を有している。
【０００４】
エルサミトルシンは、化学的には、ベンゾ（ｈ）（１）ベンゾピラノ（５，４，３−ｃｄｅ）（１）ベンゾピラン−５，１２−ジオン，１０（（２−Ｏ−（２−アミノ−２，６−ジデオキシ−３−Ｏ−メチル−アルファ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル）オキシ）−６−ヒドロキシ−１−メチルとして知られ、一般的に式Ｉに描かれた構造を有する。エルサミトルシン(elsamitrucin)は、１０−Ｏ−エルサミノシルエルサロシルカルタリン(10-O-elsaminosylelsarosylchartarin)、ＢＢＭ  ２４７８Ａ、ＢＭＹ−２８０９０、ＳＰＩ−２８０９０、ＢＲＮ  ５２１４８１３、エルサマイシンＡ、エルサミトルシナ(elsamitrucina)、及びエルサミ
トルシン(elsamitrucine)としても知られている。
【０００５】
【化１】
2014114313.tif 000002
【０００６】
先行技術の凍結乾燥エルサミトルシン粉末に、滅菌水を添加されたコハク酸を供給する。これによりエルサミトルシン塩がその場で(in situ)形成される。すなわち、エルサミ
トルシン塩基を有機溶媒に溶解した後、十分なコハク酸水溶液を加えることにより、可溶化遊離塩基：酸の１：１溶液が形成される。次に、得られたエルサミトルシン−コハク酸溶液は、ｐＨを３．５〜４．５に調整され、安定性増大のためにマンニトールのような増量剤と混合された後、凍結乾燥される（例えば、米国特許第５，５０８，２６８号参照）。粉末形（結晶又はアモルファス）の安定なエルサミトルシン塩は現在のところ入手できないので、すべての高可溶性エルサミトルシン医薬組成物は、遊離塩基を用いてその場で製造されなければならない。エルサミトルシンは、典型的にはヒトを含む動物に非経口（一般的に静脈内）投与されるが、先行技術のその場で形成される塩に固有の不安定性のために、凍結乾燥粉末として供給され、使用直前に注射用の滅菌水で再構成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，５１８，５８９号
【特許文献２】米国特許第４，５７２，８９５号
【特許文献３】米国特許第５，５０８，２６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、安定なエルサミトルシン塩を含有する製剤が求められている。これらの製剤は、遊離塩基及び該遊離塩基をその場で可溶化するために必要な相応の有機溶媒を使用せずとも製造可能な塩を含有すべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示は、新生物疾患及び状態を治療するための非経口投与に有用な、水溶性の固体エルサミトルシン塩を含有する製剤に関する。
本開示の一態様において、前記製剤は、少なくとも一つの安定な固体のエルサミトルシン塩及び製薬学的に許容しうる担体の溶液を含む。
【００１０】
本開示の別の態様において、前記製剤は、溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を必要と
しない。
本開示の別の態様において、前記製剤は安定化抗酸化剤を必要としない。
【００１１】
本開示の別の態様において、前記製剤はさらに浸透圧調整剤を含む。
本開示の別の態様において、前記製剤はさらにｐＨを約３．５〜約４．５に設定するための薬剤を含む。
【００１２】
本開示の別の態様において、前記製剤のｐＨは約４．０である。
本開示の別の態様において、前記製剤の固体エルサミトルシン塩は、乳酸エルサミトルシン、フマル酸エルサミトルシン、マレイン酸エルサミトルシン、コハク酸エルサミトルシン、酒石酸エルサミトルシン、トシル酸エルサミトルシン、メタンスルホン酸エルサミトルシン、安息香酸エルサミトルシン、サリチル酸エルサミトルシン、塩酸エルサミトルシン、硫酸エルサミトルシン、及びリン酸エルサミトルシンからなる群から選ばれる。
【００１３】
本開示の別の態様において、前記製剤の固体エルサミトルシン塩は、トシル酸エルサミトルシンである。
本開示の別の態様において、前記製薬学的に許容しうる担体は、水又は生理食塩水である。
【００１４】
本開示のこれら及びその他の目的、利点及び特徴は、書面の明細書を参照することにより、より十分に理解及び評価されるであろう。
［図面の簡単な説明］
［図１］  本開示の教示に従って製造された、アセトニトリル：水の１：１混合物から再結晶化されたトシル酸エルサミトルシンを示す図である。
［図２Ａ］  ５℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図２Ｂ］  ５℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図３Ａ］  ２５℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図３Ｂ］  ２５℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図４Ａ］  ４０℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図４Ｂ］  ４０℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図５Ａ］  ６０℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図５Ｂ］  ６０℃における２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の、時間に対する効力を示す図である。
［図６］  逆位のエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形のアレニウスプロットを示す図である。
［図７］  立位のエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形のアレニウスプロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語の定義
開示の説明に先立ち、本明細書中で以後使用される一定の用語の理解を提供するのが有用であろう。
【００１６】
類似体：本明細書における“類似体”とは、別の化合物に構造的類似性を有する化合物を含む。例えば、抗ウィルス化合物のアシクロビルは、ヌクレオシド類似体で、塩基のグアニンから誘導されるヌクレオシドのグアノシンに構造的に類似している。従って、アシクロビルは、グアノシンを模倣し（生物学的に“類似”し）、ウィルスの核酸のグアノシン残基を置換する（残基と競合する）ことによってＤＮＡ合成を妨害し、翻訳／転写を防止する。このように、別の化合物（親化合物）との構造類似性を有し、親化合物の生物活性又は化学活性を模倣する化合物は類似体である。類似体が親化合物の生物学的又は化学的性質を、同一的、補足的又は競合的のいずれかの何らかの関連様式で模倣できるならば、本明細書で言う類似体として資格認定されるのに必要な元素又は官能基置換の最小又は最大数というものはない。類似体は親化合物の誘導体であり得、また、そうであることが多い（下記の“誘導体”参照）。本明細書中に開示されている化合物の類似体は、それらの親化合物と等しい、それより小さい又は大きい活性を有しうる。
【００１７】
誘導体：本明細書における“誘導体”とは、親化合物から自然に又は合成的に製造される（誘導される）化合物である。誘導体は類似体でありうるので（上記の“類似体”参照）、類似の化学活性又は生物活性を有しうる。しかしながら、本明細書においては、誘導体は必ずしも親化合物の活性を模倣する必要はない。誘導体として資格認定されるのに必要な元素又は官能基置換の最小又は最大数というものはない。一例として、抗ウィルス化合物のガンクロビル(ganclovir)はアシクロビルの誘導体である。ガンクロビル(ganclovir)は、アシクロビルとは異なる抗ウィルス活性のスペクトル並びに異なる毒性を有している。本明細書中に開示されている化合物の誘導体は、それらの親化合物と等しい、それより小さい、大きい又はそれらと類似しない活性を有しうる。
【００１８】
エルサミトルシン：本明細書において、“エルサミトルシン”という用語は、約８２５．８３Ｄａの分子量を有する抗新生物組成物を意味し、化学的には、ベンゾ（ｈ）（１）ベンゾピラノ（５，４，３−ｃｄｅ）（１）ベンゾピラン−５，１２−ジオン，１０（（２−Ｏ−（２−アミノ−２，６−ジデオキシ−３−Ｏ−メチル−アルファ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシル）オキシ）−６−ヒドロキシ−１−メチルとして知られ、一般的に式Ｉに描かれた構造を有している。エルサミトルシン(elsamitrucin)は、１０−Ｏ−エルサミノシルエルサロシルカルタリン(10-O-elsaminosylelsarosylchartarin)、ＢＢＭ  ２４７８Ａ、ＢＭＹ−２８０９０、ＳＰＩ−２８０９０、ＢＲＮ  ５２１４８１３、エルサマイシンＡ、エルサミトルシナ(elsamitrucina)、及びエルサミトルシン(elsamitrucine)としても知られている。天然源からのエルサミトルシンの単離及び特徴付けの方法については米国特許第４，５１８，５８９号及び４，５７２，８９５号参照。Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｍ，Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｋ，Ｋｏｆｕ  Ｆ，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｙ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｋ，Ｍｉｙａｋｉ  Ｔ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｈ．１９８６．Ｅｌｓａｍｉｃｉｎｓ，ｎｅｗ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ  Ｉ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）Ｊｕｎ；３９（６）：７８４−９１も参照。
【００１９】
製剤：本明細書において、製剤という用語は、本開示のエルサミトルシン塩の一つ又は複数及び少なくとも一つの製薬学的に許容しうる担体、例えばこれらに限定されないが注射用水又は生理食塩水を含む製薬学的に許容しうる調剤品を意味する。さらに、本開示の製剤は、安定剤、保存剤、又は追加の治療薬も含みうる。本開示の医薬製剤は、当業者に公知の任意の手段によって投与でき、理想的には、静脈内投与又は皮膚、筋肉もしくは身体のその他の組織への注射に適している。該医薬製剤は経口投与を意図されてもよい。
【００２０】
塩：本明細書において、“塩”とは、酸の酸水素の一部又はすべてが金属又は金属のよ
うに働く基によって置換されて得られる化合物、すなわちイオン性結晶化合物を含む。この場合、塩は遊離塩基と有機酸の生成物で、安定な固体として存在でき、溶液中でのみ存在する擬似塩(pseudo salts)又はその場で製造された塩は含まない。
【００２１】
適切な塩形：本明細書において、“適切な塩形”という用語は、アモルファス又は結晶形のいずれかの安定な固体状態で製造されたエルサミトルシン塩を意味する。
固体又は固体塩：本明細書において、固体又は固体塩という用語は、固体状態で存在し、３０％未満の残留湿分、好ましくは１０％未満の残留湿分、さらに好ましくは５％未満の残留湿分しか有さないエルサミトルシン塩のことを言う。本明細書において“湿分”とは水又は有機溶媒のことである。“固体”という用語は、本明細書中では、本開示のエルサミトルシン塩を、その場で形成され主として水性相中で存在する塩と区別するためにも使用される。さらに、この固体塩は凍結乾燥品ではない。
【００２２】
安定な：本明細書において、“安定な”とは、エルサミトルシン塩が７５℃の高温で９時間又はさらに好ましくは９８℃で一晩乾燥中にほぼ完全な１：１の塩比を示す（すなわち固体状態における分解がないことを示す）ＮＭＲデータを保持するエルサミトルシン塩又は非経口のエルサミトルシン塩含有製剤（その場での塩形成以外の方法で製造された）のことを言う。さらに、本明細書で言う安定なとは、インビトロ増殖阻害試験（実施例４参照）による測定でその抗新生物活性の少なくとも９０％を、適切な保管温度において固体形で少なくとも２４ヶ月間及び液体形で１８ヶ月間保持している非経口製剤に含有されたエルサミトルシン塩のことを言う。
【００２３】
発明の詳細な説明
エルサミトルシン及び構造的に関連した抗生物質は、ＤＮＡのＧＣリッチトラクト(tract)に結合する。その場合、Ｚ−ＤＮＡよりＢ−ＤＮＡに対し、明白な選択性を有する。
それらはＲＮＡ合成を阻害し、フリーラジカルの形成によってＤＮＡの一本鎖切断を起こす。エルサミトルシンはまた、これまでに報告された中で最も強力なトポイソメラーゼIIの阻害薬とみなすこともでき、いくつかのＤＮＡ−タンパク質複合体の形成を阻害できる。エルサミトルシンは、ｃ−ｍｙｃがん遺伝子のＰ１及びＰ２プロモーター領域に結合し、Ｓｐ１転写因子の結合を阻害することによって転写を阻害する。
【００２４】
エルサミトルシンは、再発性又は難治性の非ホジキンリンパ腫患者における活性及び広範囲のマウス新生物、例えば白血病Ｐ３８８、白血病Ｌ１２１０、及び黒色腫Ｂ１６及びＭ５０７６、並びにＭＸ１及びＨＣＴ１１６異種移植片に対するインビボ活性を示している（例えばＲａｂｅｒ  ＭＮ，Ｎｅｗｍａｎ  ＲＡ，Ｎｅｗｍａｎ  ＢＭ，Ｇａｖｅｒ  ＲＣ，Ｓｃｈａｃｔｅｒ  ＬＰ１９９２  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｍａｒ  １５；５２（６）：１４０６−１０参照）。
【００２５】
さらに、難治性／再発性非ホジキンリンパ腫の実験的治療から、エルサミトルシン関連毒性は比較的軽度で、主に無力、吐き気及び嘔吐からなり、骨髄抑制は含まれないことが示された。エルサミトルシンの活性とその骨髄抑制の欠如は、特に他の実証済み薬剤と併用した場合に、この疾患における有用性を示唆している（Ａｌｌｅｎ  ＳＬ，Ｓｃｈａｃｔｅｒ  ＬＰ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ  ＳＭ，Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  Ｒ，Ｆｕｓｃｏ  Ｄ，Ｈｅｎｓｌｅｙ  Ｍ，Ｏ’Ｄｗｙｅｒ  Ｐ，Ｍｉｔｔｅｌｍａｎ  Ａ，Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ
Ｂ，Ｈｕｙｂｅｎｓｚ  Ｓ．１９９６．  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ  （ＢＭＹ−２８０９０）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ／ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ．１４（２）：２１３−７参照）。
【００２６】
エルサミトルシンのドキソルビシン（ＤＸ）と比較したインビトロ活性も、二つの感受性乳がん細胞株、すなわち一つはエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋、ＭＣＦ７）及び一つはエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）株、並びにＤＸ抵抗性の副次株（サブライン）（ＭＣＦ７ＤＸ）に対して調べた。この二つの薬物の活性は、未治療患者からの１９の臨床乳がん標本に対しても調べた。薬物は、マウスにおいて１０％の死亡率を引き起こす致死量（ＬＤ１０）に３時間暴露した場合の曲線下面積から算出された薬理学的関連濃度、並びに１０倍及び１００倍の濃度で試験された。ＤＸ感受性株では、エルサミトルシンによってＤＸよりも大きいＲＮＡ及びＤＮＡ前駆体組み込みの阻害並びに細胞増殖の阻害が引き起こされた。さらに、抗増殖効果は、ＥＲ＋のＭＣＦ７の方がＥＲ−のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株よりも１０倍高かった（ＩＣ５０：０．２５対０．２１マイクログラム／ｍｌ）。エルサミトルシンは、ＭＣＦ７ＤＸ副次株ではＤＸに対する交差耐性を示した。臨床標本では、ＤＮＡ前駆体組み込みに対する効果は、同じ薬物濃度でエルサミトルシンの方がＤＸよりも多く観察された。エルサミトルシンに対するインビトロ感受性はＥＲ＋腫瘍の方がＥＲ−腫瘍よりも顕著であった。二つの群で薬物の最小阻害濃度はそれぞれ０．１及び３．５マイクログラム／ｍｌであった。これらのインビトロの結果から、主にＥＲ＋乳がん患者の臨床治療におけるエルサミトルシンの有望な役割が示されるであろう（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｎｉ  Ｒ，Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ  Ｏ，Ｚａｆｆａｒｏｎｉ  Ｎ，Ｄｅ  Ｍａｒｃｏ  Ｃ，Ｃａｔａｎｉａ  Ｓ．１９９２．Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｈａｒｔｒｅｕｓｉｎ  ａｎａｌｏｇ，ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ，ｏｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．Ｄｅｃ；３（６）：６７７−８１参照）。
【００２７】
Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂに譲渡された、Ｎａｓｓａｒらによる１９９６年４月１６日発行の米国特許第５，５０８，２６８号（以後‘２６８特許）には、エルサミトルシン塩基、有機溶媒、安定剤及び緩衝剤を含む非経口製剤が開示されている。前記特許において開示されているエルサミトルシン組成物は、各種の有機酸、例えば塩酸、Ｌ（＋）−乳酸、Ｌ−酒石酸、Ｄ−グルクロン酸、メタンスルホン酸、アジピン酸及びコハク酸を用いて製造され、コハク酸が好適であった。エルサミトルシン組成物は、（公報の）カラム４の５〜３０行にある実施例の教示に従って製造される。この実施例ではコハク酸塩のみが記載されている。具体的には、‘２６８特許は、その開示によれば、エルサミトルシン塩は、少なくとも一つの還元剤（保存剤）と組み合わせた有機酸を使用してその場で形成され、ｐＨはおよそ４に調整されている。得られた溶液はろ過され、安定性試験のために液体の状態で保持された。‘２６８特許に開示されているその他の態様では、有機酸、エルサミトルシン塩基、還元剤及びその他の適切な製薬学的賦形剤、例えば、これに限定されないが、糖が溶液中で混合され、得られた組成物が凍結乾燥されている。
【００２８】
しかしながら、‘２６８特許は、安定な固体のエルサミトルシン塩について、開示も検討も教示もしていない。‘２６８特許の教示とは際立って対照的に、本発明者らは、エルサミトルシン塩基と選択された有機酸を用いて製造された安定な固体のエルサミトルシン塩を提供する方法を見出した。本開示の教示に従って製造された結果の組成物は、‘２６８特許に記載されている凍結乾燥物とは対照的に、固体の乾燥又は部分乾燥されたエルサミトルシン塩粉末である。従って、本開示のエルサミトルシン塩組成物は、可溶化された塩基及び有機酸の混合物を含有するその場の溶液ではなく、固体状態の真の塩である。
【００２９】
本開示は、‘２６８特許に記載されているようなその場で形成された混合物に優る多数の利益を提供する。第一に、本開示の教示に従って製造されたエルサミトルシン塩は、不純物について注意深く分析でき、極めて高い政府規則に適合するように必要に応じて精製することができる。さらに、本開示の真の塩は、正確に秤量でき、注射用水のような適切な製薬学的担体に溶解させることができる。選択された塩自体は、固体状態で貯蔵された
場合に極めて安定で、長い貯蔵寿命を有する。それらの対応する可溶化溶液も同様である。従って、本開示のエルサミトルシン塩を用いて非経口溶液が製造でき、長期間貯蔵できる。
【００３０】
本開示の一態様において、製剤は、少なくとも一つの安定な固体エルサミトルシン塩及び製薬学的に許容しうる担体を含む。
本開示の別の態様において、製剤は、溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を必要としない。
【００３１】
本開示の別の態様において、製剤は安定化抗酸化剤を必要としない。
本開示の別の態様において、製剤はさらに浸透圧調整剤を含む。
本開示の別の態様において、製剤はさらにｐＨを約３．５〜約４．５に設定するための薬剤を含む。
【００３２】
本開示の別の態様において、製剤のｐＨは約４．０である。
本開示の別の態様において、製剤の固体エルサミトルシン塩は、乳酸エルサミトルシン、フマル酸エルサミトルシン、マレイン酸エルサミトルシン、コハク酸エルサミトルシン、酒石酸エルサミトルシン、トシル酸エルサミトルシン、メタンスルホン酸エルサミトルシン、安息香酸エルサミトルシン、サリチル酸エルサミトルシン、塩酸エルサミトルシン、硫酸エルサミトルシン、及びリン酸エルサミトルシンからなる群から選ばれる。
【００３３】
本開示の別の態様において、製剤の固体エルサミトルシン塩は、トシル酸エルサミトルシンである。
本開示の別の態様において、製薬学的に許容しうる担体は、水又は生理食塩水である。
【００３４】
本開示の製剤はｐＨを維持するための緩衝剤が不要でありうる。緩衝剤は、通常、弱酸又は弱塩基のいずれかであり、これらが緩衝液を構成する。緩衝剤は通常水に添加され、緩衝液が形成される。緩衝剤はこれらの緩衝液中で見られる緩衝を担う物質である。これらの薬剤は、酸性又は塩基性条件下に置かれねばならない物質に加えられ、該物質を安定化させる。例えば、緩衝化アスピリンは、アスピリンが患者の胃を通過する際のアスピリンのｐＨを維持するＭｇＯなどの緩衝剤を有している。緩衝剤の別の使用は、胃の酸性度を低下させるのが主目的の制酸錠においてである。緩衝剤の例は、リン酸二水素カリウム、コハク酸、Ｌ（＋）−乳酸、及びＬ−酒石酸であるが、これらに限定されない。
【００３５】
本製剤を製造する場合、所望ｐＨを設定する薬剤を使用するだけでよく、必ずしもその所望ｐＨを維持する必要はない。この目的のために酸及び塩基が使用できる。一つのそのような薬剤の例はＮａＯＨのような強塩基である。強塩基は、酸塩基反応で非常に弱い酸を脱プロトン化できる塩基性の化合物である。約１３より大きいｐＫａを有する化合物は強塩基と呼ばれる。強塩基の一般例は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、例えばＮａＯＨ及びＣａ（ＯＨ）２である。
【００３６】
当業者は、エルサミトルシン製剤の所望ｐＨ又はｐＨ範囲を決定することができ、必要であればこのｐＨ又はｐＨ範囲をｐＨ調整剤で設定することができる。本開示の目的のために、ｐＨ範囲は、約３．５〜約４．５及び約２．０〜約４．０でありうるが、これらに限定されない。別の態様において、ｐＨは約４でありうる。
【００３７】
また、本製剤は安定化抗酸化剤を必要としない。安定化抗酸化剤は、他の分子の酸化を緩徐化又は防止できる分子である。酸化は、電子を物質から酸化剤に移動させる化学反応である。酸化反応はフリーラジカルを生成でき、これが細胞を損傷する連鎖反応を開始させる。抗酸化剤は、フリーラジカル中間体を除去することによってこれらの連鎖反応を終
結させ、それら自体が酸化されることによってその他の酸化反応を阻害する。結果的に、抗酸化剤は、チオール又はポリフェノールなどの還元剤であることが多い。抗酸化剤の更なる例は、硫黄−及びアルカリ金属−含有抗酸化剤などであるが、これらに限定されない。硫黄−及びアルカリ金属−含有抗酸化剤は、メタ重亜硫酸ナトリウム、アセトン亜硫酸水素ナトリウム及びホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムなどであるが、これらに限定されない。
【００３８】
一つ又は複数の浸透圧調整剤を本開示の製剤に含めてもよい。浸透圧調整剤は、溶液の浸透圧を設定できる化学物質である。浸透圧は、半透膜によって仕切られたスペースで、溶質濃度の差のために溶液によって生み出される静水圧である。浸透圧調整剤の包含は、患者の浸透圧に適合させるために必要でありうる。そのような浸透圧調整剤の例は、マンニトール及び塩化ナトリウムなどであるが、これらに限定されない。
【００３９】
本開示の製剤は、すぐに使える溶液として製造できる。これまでに報告されたエルサミトルシンの溶液は、米国特許第５，５０８，６２８号に記載されているように、固体形を得るために凍結乾燥されており、これを投与直前に水のような製薬学的担体で再構成するというものであったが、本開示の製剤は液体形で安定であり、以下の実施例に記載のように長期貯蔵寿命を有している。従って、本開示の溶液は貯蔵でき、使用前に再構成することなく投与できる。米国特許第５，５０８，６２８号の可用製剤は、その場で形成されたエルサミトルシン塩溶液がメタノール、エタノール、クロロホルム、ｎ−ブタノール及びｔ−ブタノールのような残留溶媒を含有しているため、凍結乾燥を必要とする。凍結乾燥(freeze-drying, lyophilization, cryodesiccation)は、典型的には、傷みやすい材料を保存するため又は材料を輸送により好都合にするために使用される脱水プロセスである。凍結乾燥は、材料を凍結した後、周囲圧を減じ、そして十分な熱を加えて材料中の凍結水を固体状態から気体に直接昇華させることによって行われる。
【００４０】
残留溶媒が存在したままであることは患者への投与には許されないことであろう。米国特許第５，５０８，６２８号ではこれらの不純物を除去するために凍結乾燥が必要であった。一態様において、本開示の製剤は、そのような不純物、例えばメタノール、エタノール、クロロホルム、ｎ−ブタノール及びｔ−ブタノールを含有していない。
【００４１】
以下の実施例は、本発明の例示的態様として提供される。当然のことながら、本発明の安定で乾燥した、又はほぼ乾燥したエルサミトルシン塩は以下の実施例によって制限されない。以下の実施例の教示は、通常技能の製薬化学者がここに開示されているのと同じ組成物をもたらすその他の変形を為す際のガイダンスとして使用することができる。
【実施例】
【００４２】
実施例１
本開示の安定なエルサミトルシン塩の初期製造
エルサミトルシン塩の少量バッチを、最適化及びスケールアップに先立って製造した。有機酸に基づく８種類の対イオンを選択した。これらは、乳酸、マレイン酸、コハク酸、Ｌ−酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸（本明細書中ではｐ−ＴＳＡ又はトシル酸とも呼ばれる）、安息香酸、サリチル酸、及び硫酸であった。製薬化学の分野の専門家に公知の、以前のスクリーン法に基づいて３種類の溶媒を選択した。選択された溶媒は、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、及び酢酸（ＡｃＯＨ）であった。ｐ−ＴＳＡ／ＭｅＯＨの追加の組合せも含めて、合計２５種類の反応を実施した。
【００４３】
各反応バイアルに３．０×１０−５ｍｏｌのエルサミトルシン塩基を加えた。エルサミトルシン塩基は、０．２５ｍＬのＤＭＦ又はＡｃＯＨに５５℃で、１．５ｍＬのジオキサンに８０℃で、又は１２ｍＬのＭｅＯＨに７０℃で溶解し、溶解を確実にするために５分
間撹拌した。次に、各バイアルに、上記有機酸の一つの０．１２６Ｍジオキサン溶液２４５〜２７０μＬを加えた（表１参照）。これは、８種類の各酸の１．０５当量に相当する（酒石酸はジオキサンに不溶性のため、１：１のメタノール／水混合物に調合した）。
【００４４】
【表１】
2014114313.tif 000003
【００４５】
初期温度を１０分間保持し、その後ＤＭＦ及びＡｃＯＨは２０℃／時間、ジオキサンは３０℃／時間及びＭｅＯＨは２５℃／時間の速度で室温にまで下げた。ジオキサン／Ｌ−酒石酸、ジオキサン／ｐ−ＴＳＡ、ジオキサン／硫酸、及びＡｃＯＨ／硫酸のバイアルに固体が形成された。固体をろ過によって回収し、真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させた。固体が形成されなかったバイアルは、窒素ストリームを用いて濃縮乾固し、真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させた。真空下でメタノールを除去し、得られた残渣を高真空下室温で乾燥させた。全サンプルとも、ｘ線回折（ＸＲＰＤ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、及び熱重量分析（ＴＧＡ）によって分析し、塩の結晶度を測定した。結晶固体は、ジオキサン／硫酸及びＡｃＯＨ／硫酸から得られ、半結晶固体は、ジオキサン／Ｌ−酒石酸、ジオキサン／ｐ−ＴＳＡ、ＤＭＦ／乳酸、ＤＭＦ／マレイン酸、ＤＭＦ／Ｌ−酒石酸、ＤＭＦ／安息香酸、ＤＭＦ／硫酸、ＡｃＯＨ／乳酸、ＡｃＯＨ／ｐ−ＴＳＡ、及びＡｃＯＨ／安息香酸から得られた。すべてのその他の固体はＸＲＰＤによりアモルファスであることが分かった。
【００４６】
実施例２
エルサミトルシン塩製造の最適化
実施例１の教示に従って製造された次の三つのエルサミトルシン塩がスケールアップ開発のために選ばれた。選ばれた塩は、酒石酸エルサミトルシン、硫酸エルサミトルシン及びトシル酸エルサミトルシンであった。これらが選ばれた理由は、それぞれが冷却プロセス中に沈殿する結晶又は半結晶固体を提供したからであった。このことは、塩のより良好な単離及び精製（必要であれば）を可能にするので、より大規模な製造技術にとってそれらはより適切である。しかしながら、実施例２の目的のためのそれらの選択は制限とみなされるべきではない。
【００４７】
Ｌ−酒石酸、硫酸及びｐ−ＴＳＡをジオキサンに溶解した。適切な反応容器のそれぞれに１．７×１０−４ｍｏｌのエルサミトルシン塩基を入れた。該塩基を７．５ｍＬのジオキサンに８０℃で溶解し、溶解を確実にするために５分間撹拌した。次に、各バイアルに、これら三つの各酸約１．０５当量に相当する有機酸のジオキサン中０．５Ｍ溶液３５０〜３８０μＬを入れた（表２）。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
初期温度を１０分間保持し、その後ジオキサンの場合、３０℃／時間の速度で室温にまで下げた。固体は、ジオキサン／Ｌ−酒石酸及びジオキサン／硫酸及びジオキサン／ｐ−ＴＳＡを用いて酸をバイアルに添加すると形成され、沈殿は冷却プロセス中に発生した。ろ過後、固体を真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させた。サンプルは、結晶度（表３）及びその他の物理的性質を測定するためにＸＲＰＤ、ＤＳＣ、及びＴＧＡによって分析した。
【００５０】
表３に示されているとおり、実施例２のすべての固体は半結晶性で、約５％までの残留溶媒を含有し、迅速な沈殿のために固体中に多量の溶媒が保持されていたため、一貫してペースト状であった。
【００５１】
本開示のエルサミトルシン塩は、上記より遅い沈殿法を用いても製造された。反応容器に７．６×１０−５ｍｏｌのエルサミトルシン塩基及び５ｍＬのジオキサンを８０℃で入れた。塩基の溶解を確実にするために混合物を５分間撹拌した後、１．０５当量に相当する酒石酸の０．２Ｍ水溶液４００μＬを溶解エルサミトルシン塩基に加えた。温度を１０分間８０℃に保持した後、バイアルを３０℃／時間の速度で室温に冷却した。冷却段階にある間、沈殿が生じた。この固体をろ過により回収し、真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させた。サンプルをＸＲＰＤ、ＤＳＣ、及びＴＧＡによって分析し、物理的性質を測定した［表３、ＯＶＬ−Ａ−５５（１）及びＯＶＬ−Ａ−５５（２）］。第一のサンプル［ジオキサン／硫酸、ＯＶＬ−Ａ−５５（１）］はＸＲＰＤにより結晶性であったが、ＴＧＡ分析及びＤＳＣ曲線上での三つの吸熱ピークにより３．６％の残留溶媒を含有していた。第二のサンプル［ジオキサン／Ｌ−酒石酸、ＯＶＬ−Ａ−５５（２）］は半結晶性であった。
【００５２】
次に、エルサミトルシン塩を次のように水性環境中で製造した。反応バイアルに、１００ｍｇのエルサミトルシン塩基、１．０５当量の対応酸（ｐ−ＴＳＡ、コハク酸、及びＬ−酒石酸は固体として添加；硫酸は０．５ｍＬの水に溶解した）及び水（ｐ−ＴＳＡ、コハク酸、及びＬ−酒石酸は１０ｍＬ、硫酸は９．５ｍＬ）を入れた。懸濁液を１０分間撹拌しながら８０℃に加熱し、透明溶液を形成させた後、３０℃／時間の速度で室温に下げた。室温で一晩撹拌後、沈殿物はどの実験でも形成されなかった。穏やかな窒素流下、３５℃で水を除去した。３分の１の水を除去した後、ｐ−ＴＳＡの実験で沈殿が観察された。この固体をろ過し、真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させた。ろ液も分析した。他の三つのバイアルは蒸発乾固して真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させた。結果は、生成した固体は半結晶性で、アモルファス含有量が高いことを示していた［表３、ＯＶＬ−Ａ−４７（１）、ＯＶＬ−Ａ−４７（２−１）、ＯＶＬ−Ａ−４７（３）、及びＯＶＬ−Ａ−６５］。
【００５３】
【表３】
2014114313.tif 000005
【００５４】
実施例３
顕微鏡法を用いるトシル酸エルサミトルシン塩の結晶化
顕微鏡スライド上に１〜２ｍｇのアモルファス性のトシル酸エルサミトルシンをスパチュラを使って蒔き、カバースリップを載せた。溶媒滴をカバースリップの横に置き、溶媒をカバースリップの下から滲み込ませて薬物を溶解させるようにした。溶媒と接触した薬物は室温で保管し、顕微鏡下１００倍又は４００倍の倍率で検査した。使用した溶媒は、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、プロピレングリコール、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン及びイソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンと水との１：１混合物であった。針状又は棒状の結晶が、顕微鏡下、エタノール、メタノール、プロピレングリコール、イソプ
ロピルアルコール、アセトン、及びすべての水：溶媒混合物の溶媒で観察された。サンプルの顕微鏡検査で、トシル酸エルサミトルシン塩は少なくとも一つの溶媒で結晶化することが示された。
【００５５】
実施例４
エルサミトルシンのＭＳＡ、ｐ−ＴＳＡ及びＨＣｌ塩の微結晶化
少量の塩（１〜２ｍｇ）を顕微鏡スライドに載せ、カバースリップでカバーした。数滴の溶媒をカバースリップの縁に加え、毛管現象で溶媒がスライドとカバースリップの間に吸い込まれるようにした。物質が部分溶解されるようであれば、スライドをホットプレート上でほとんどの固体が溶解されるまで徐々に加熱した。各スライドを室温に冷却し、ゆっくり結晶化させた。水中メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びアセトニトリルの１：１混合物を結晶化に使用した。全４種類の異なる溶媒系中のどの塩もエルサミトルシンの結晶を生成した。トシル酸エルサミトルシン塩の結晶は、図１に示すように、平面偏光下で複屈折を示した。
【００５６】
実施例５
ｐ−ＴＳＡ塩の再結晶化のスケールアップ
ｐ−ＴＳＡの再結晶化はクレイグ(Craig)管での緩やかな蒸発を用いて実施した。ｐ−
ＴＳＡ塩をアセトニトリルと水の１：１混合物に高温で溶解した。クレイグ管に熱ろ過した後、反応から溶媒を緩やかに蒸発させ、沈殿物を得た。顕微鏡下で晶癖を観察したところ針状であった。該結晶をろ過により単離し、真空下で乾燥させた。この物質はＸＲＤに対して透過性であることが観察され、顕微鏡検査によって結晶性であることが確認された。示差走査熱量測定分析では、該物質は、溶融と、その後の分解又は結晶化を、それぞれ１８３℃及び１８６℃で示した。１Ｈ  ＮＭＲ分析で、該サンプルはＡＰＩ：対イオン（ｐ−ＴＳＡ）が１：１の比率であることが示された。
【００５７】
ｐ−ＴＳＡ塩の水中溶解度を、室温でスラリーを６時間撹拌後、ＨＰＬＣでチェックした。ｐ−ＴＳＡ塩の水中溶解度は１５．６ｍｇ／ｍＬであることが分かった（表５、ロット番号ＯＶＬ−Ａ−１３７）。ｐＨ４（安息香酸塩緩衝液）でのｐ−ＴＳＡ塩の溶解度は１４．７ｍｇ／ｍＬである（表５、ＯＶＬ−Ａ−１４３）。
【００５８】
【表４】
2014114313.tif 000006
【００５９】
本開示の教示に従って製造されたエルサミトルシン塩を安定性について試験した。単離されたｐ−ＴＳＡ塩の二つのサンプル（それぞれ４０ｍｇ）を７５℃の真空オーブンに９時間入れた。この暴露後、サンプル＃１を取り出し、温度を９８℃に上げた。第二のサンプルは一晩乾燥させた。ＮＭＲデータは、完全な１：１の塩比を示しており、高温での乾燥中に固体状態での分解はなかった。ＴＧＡによる重量減は両サンプルともほぼ２．５％であった。カール・フィッシャー分析から、二つのロットとも依然として水分を有していることが示された。サンプル＃１は４．０％の水分含有量で、＃２は４．６％であった。エルサミトルシンのｐ−ＴＳＡ塩（１６ｍｇ）を１．６ｍＬの安息香酸塩緩衝液（ｐＨ４）中に溶解し、５０℃で１０日間撹拌した。ＨＰＬＣ及びＭＳのためのサンプルを３、５
、及び１０日目に取り出した。ＭＳ（ピーク２８２）でもＨＰＬＣでも分解生成物の証拠は見つからなかった。
【００６０】
実施例６
ＨＣｌ塩形成のスケールアップ
エルサミトルシン（２００ｍｇ）を１ｍＬのアセトニトリル／水（１：１）中でスラリー化し、７５℃に加熱して、非常に濃厚なスラリーとした。１ＭのＨＣｌ水溶液（０．３２１ｍＬ、１．０５当量）を該スラリーに加え、透明溶液を形成させた。次に、その混合物を非常に穏やかに撹拌しながら２５℃／ｈの速度で室温にゆっくり冷却した。室温で約６時間撹拌後、得られた固体をろ過により単離し、真空下５０℃及び３０インチＨｇで乾燥させ、１８７．５ｍｇ（収率８８．８６％）のＨＣｌ塩を得た。ＤＳＣ及びＸＲＤ分析から、該塩の結晶性を確認した。
【００６１】
実施例７
エルサミトルシン及びトシル酸エルサミトルシン塩のインビトロ増殖阻害活性
以下の実験で、本開示の教示に従って製造されたエルサミトルシン塩は、エルサミトルシン塩基と比較した場合、それらのインビトロ抗新生物活性を保持していることが確認される。エルサミトルシン及びトシル酸エルサミトルシンをインビトロでＢ１６Ｆ１０（マウス肺）、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸）、ＨＴ２９（ヒト結腸）及びＳＫ−ＭＥＳ−１（ヒト非小細胞肺がん）を用いて試験した。細胞増殖の阻害は、９６ウェルマイクロカルチャープレート中で半自動化ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを用いて評価した。
【００６２】
ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト非小細胞肺がん、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９ヒト結腸がん（まとめて“試験細胞培養物”）を、ウシ胎仔血清、抗生物質及びグルタミンのようなその他の適当な増殖因子を補給した緩衝化ＲＰＭＩ１６４０中に維持した。試験細胞（１，５００〜２，０００細胞／ウェル）を９６ウェルマイクロカルチャープレートに総体積１００μＬ／ウェルで播種した。３７℃、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿インキュベーター中で一晩インキュベーション後、エルサミトルシン溶液をＲＰＭＩ１６４０で様々な濃度に希釈し、１００μＬの体積で各ウェルに加えた。エルサミトルシン塩基及びトシル酸エルサミトルシンの溶液（エルサミトルシン溶液）を調製し、−２０℃のフリーザーに保管した。当該溶液を全実験のために１０回以内解凍した。
【００６３】
試験細胞及び様々な濃度のエルサミトルシン溶液を蒔いた細胞培養プレートを、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％空気の加湿インキュベーター中に５〜１０日間置いた。次に、プレートを短時間遠心分離し、１００μＬの増殖培地を除去した。細胞培養物を５０μＬのＭＴＴ試薬（ダルベッコ（登録商標）リン酸緩衝化生理食塩水中１ｍｇ／ｍｌ）とともに４時間３７℃でインキュベートした。得られた紫色のホルマザン沈殿物を２００μＬのイソプロパノール中０．０４ＮのＨＣｌで可溶化した。ＴＥＣＡＮ（登録商標）ＧＥＮｉｏｓマイクロプレートリーダーを用いて、波長５９５ｎｍ及び参照波長６５０ｎｍで吸光度をモニターした。全実験で吸光度データは各薬剤につき二つのオーバーラップする濃度範囲で取得した。大部分の場合、研究はより広い濃度範囲を用いて反復された。
【００６４】
各試験の結果を保存し、グラフ分析及びＩＣ５０値の決定のためにＰＲＩＳＭ（登録商標）３．０３にインポートした。全結果を薬物濃度に対する対照吸光度のパーセンテージとしてグラフ化した。ＩＣ５０値は、ＰＲＩＳＭ（登録商標）３．０３で、非線形回帰分析を用い、下記の４−ロジスティック方程式：
【００６５】
【数１】
2014114313.tif 000007
【００６６】
によって記載されるＳ字型用量反応曲線にデータを適合させて推定した。
Ｔｏｐは最高薬剤濃度における対照吸光度の最大パーセンテージ、Ｂｏｔｔｏｍは対照吸光度の最小パーセンテージ、Ｙは観察された吸光度、Ｘは薬剤濃度、ＩＣ５０は対照細胞と比べて５０％細胞増殖を阻害する薬剤の濃度、そしてｎは曲線の傾きである。表４は、エルサミトルシン及びトシル酸エルサミトルシン塩が試験した細胞株に対して本質的に同じ抗増殖効果を有していることを示している。従って、表４に示されているように、本開示の教示に従って製造されたエルサミトルシン塩は、エルサミトルシン塩基のみを用いて製造された治療用組成物と等価又は優れたインビボ抗新生物活性を有することが期待できる。トシル酸エルサミトルシンは、類似量のエルサミトルシン塩基の好ましくは約２０％、さらに好ましくは約１５％及び最も好ましくは約１０％以内のＩＣ５０を含む。
【００６７】
【表５】
2014114313.tif 000008
【００６８】
実施例８
エルサミトルシン製剤の安定性
２．５ｍＬ剤形のエルサミトルシンＦ２製剤（１０ｍｇ／ｍＬのエルサミトルシン遊離塩基と４．７７％マンニトール、ｐＨ４．０）を安定性試験のために使用した。該製剤は５及び２５℃で１２週間、立位でも逆位でも安定であり、これらのサンプルのｐＨは４．０〜４．３の範囲でかなり安定に維持されていた。しかしながら、高温で保管されたこれらのサンプルについては分解の進行につれてｐＨの低下が観察された。アレニウス法を用いると、立位サンプルの５及び２５℃におけるゼロ次分解速度定数（ｋＴ）は、概算でそれぞれ１日５．７９×１０−５及び９．８４×１０−４ｍｇ／ｍＬであった。逆位サンプルでは、対応するゼロ次分解速度定数は５℃及び２５℃でそれぞれ１日２．４９×１０−５及び６．２８×１０−４ｍｇ／ｍＬであった。従って、このエルサミトルシンＦ２剤形は、２５℃で２．５年より長期間、９０％を超える効力を維持可能であると予測された（この剤形は５℃では効力の同レベルの低下に達するのに４７年かかるのと比べて）。
【００６９】
使用されたエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ製剤は、トシル酸エルサミトルシン：３．２９０３ｇ（最終溶液中で１０ｍｇ／ｍＬの遊離塩基に相当）、マンニトール：１１．９２５１ｇ、注射用水：２５０ｍＬからなる。ｐＨはＮａＯＨを用いて４．０に設定された。
【００７０】
安定性試験の設計：２５０ｍＬのトシル酸エルサミトルシンストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬの遊離塩基、４．７７％マンニトール、ｐＨ４．０）を調製した。８０×５ｍＬのアンバーセラムバイアル(amber serum vial)に２．５ｍＬのトシル酸エルサミトルシンストック溶液を充填し、窒素でフラッシュして栓で密閉した。これらの密閉バイアルを立位及び逆位で４、２５、４０及び６０℃の温度キャビネットにそれぞれ保管した。ストック溶液の毒性をゼロ時に記録した。ｐＨ測定及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析のために様々な時点でサンプルを取り出した。６０℃の場合、測定は０、２、７、１０、１４日に実施した。４０℃の場合、測定は０、７、１４、２８、３８、６４、７７、８４日に実施した。２５℃の場合、測定は０、７、１４、２８、６４、８４日に実施した。４℃の場合、測定は０、７、１４、２８、６４、８４日に実施した。
【００７１】
安定性試験に使用された装置及び材料は次の通りである。バイアル：５ｍＬのＷｈｅａｔｏｎアンバーセラムバイアル（口の内径×外径−１３×２０ｍｍ、部品番号２２３６９５、ロット番号１３９４６８９）、栓：２０−ｍｍ  Ｓｔｅｌｍｉセラムストッパー（ブロモブチル、グレイ、部品番号６７２０ＧＣ、ロット番号 Ｂ６０３／１８０４７）、ア
ルミニウムシール：２０−ｍｍ  Ｗｈｅａｔｏｎライニングなしアルミニウムシール（部品番号２２４１９３−０１）、トシル酸エルサミトルシン：Ａｌｂａｎｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，ロット番号ＤＫＫ−Ｍ−２７、注射用水（ＷＦＩ）：Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ロット番号 ７０３０９７Ｆ、
マンニトール：Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，ロット番号 Ｃ３９６４５、０．２Ｎ水酸化ナトリ
ウム溶液：ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ロット番号７０５０、０．２２ミクロン酢酸セルロース膜フィルター：Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，部品番号４３０６２４、ディフューザー：Ｗａｔｅｒｓ，部品番号ＷＡＴ００７２７２、ｐＨメーター：Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｃｃｕｍｅｔ  Ｂａｓｉｃ，ＶＷＲ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ａｇ／ＡｇＣｌ  ｐＨ電極を備えている（ｐＨ＝４．０１、７．０及び１０．０のＶＷＲ
ｐＨ標準液で校正）、浸透圧計：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３３２０。
【００７２】
トシル酸エルサミトルシンストック溶液の調製：３．２９０３ｇのトシル酸エルサミトルシン及び１１．９２５１ｇのマンニトールを２５０ｍＬの容量フラスコに正確に量り入れる。約２００ｍＬの注射用水を使用前にＷａｔｅｒｓのディフューザーで１時間窒素の通気によって脱ガスし、これを前記フラスコに加えた。混合物を４５〜５０℃の水浴中で全固体が溶解するまで撹拌した。周囲温度に冷却後、溶液のｐＨを０．２ＮのＮａＯＨで４．０に調整した。次に、注射用水をマークまで加え、溶液のｐＨを再チェックした。次に、該溶液を０．２２ミクロンの酢酸セルロース膜フィルターを通してろ過し、Ｗａｔｅｒｓのディフューザーで５分間窒素を通気した。２．５ｍＬのストック溶液を５ｍＬのアンバーセラムバイアルに移した（８０個）。各バイアルのヘッドスペースを窒素でパージし、Ｓｔｅｌｍｉのセラムストッパー及びＷｈｅａｔｏｎのライニングなしアルミニウムシールで密閉した。
【００７３】
本安定性試験の場合、エルサミトルシンのＨＰＬＣ重量／重量アッセイも、関連不純物の測定のほかに実施した。ＨＰＬＣアッセイのための試薬は次の通りである。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル及びトリフルオロ酢酸（ロット番号４４０９３４１８）をＥＭＤ
Ｓｃｉｅｎｃｅから入手した。水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステムを用いて精製した。装置は、カラムヒーター、オートサンプラー及びＷａｔｅｒｓ  ２９９６フォトダイオードアレイ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５分離モジュールからなるクロマトグラフィーシステムであった。データ取得は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏ ２ソフトウェアによって制御された。カラムとして、Ｃａ
ｄｅｎｚａ  Ｃｄ−Ｃ１８，３μｍ，４．６×１５０ｍｍ（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。検出は２６７ｎｍで行った。移動相Ａは０．１％トリフル
オロ酢酸入りの水を含有していた。２ｍＬのトリフルオロ酢酸を２０００ｍＬの水にピペットで加えた。移動相Ｂは０．０８％トリフルオロ酢酸入りのアセトニトリルを含有していた。１ｍＬのトリフルオロ酢酸を１２５０ｍＬのアセトニトリルにピペットで加えた。１Ｌの水を１Ｌのアセトニトリルと完全に混合した。
【００７４】
以下に示すように、ＨＰＬＣ分析を様々な時点で実施した。
【００７５】
【表６】
2014114313.tif 000009
【００７６】
以下の表にグラジエント条件を示す。
【００７７】
【表７】
2014114313.tif 000010
【００７８】
ＨＰＬＣ分析は、１．０ｍＬ／分に等しい流速のグラジエントで実施した。オーブン温度は４０℃に設定された。オートサンプラー温度は２５℃であった。注入体積は１０μＬであった。サンプル希釈液−アセトニトリル／水（５０／５０，ｖ／ｖ）：１Ｌの水を１Ｌのアセトニトリルと完全に混合した。サンプルブランク−アセトニトリル／水（５０／５０，ｖ／ｖ）：サンプル希釈液をサンプルブランクとして使用した。標準溶液−〜０．１ｍｇ／ｍＬのエルサミトルシン：２６．３２ｍｇのトシル酸エルサミトルシンを正確に秤量し、２００ｍＬの容量フラスコ中で２００ｍＬのサンプル希釈液に溶解した。サンプル溶液の調製（１時点につき１個のバイアル）：２ｍＬのエルサミトルシンＲＴＵ溶液を２０ｍＬの容量フラスコにピペットで入れ、１８ｍＬのサンプル希釈液で希釈した。２ｍＬの希釈溶液を２０ｍＬの容量フラスコ中でさらに１８ｍＬのサンプル希釈液で希釈して
最終分析サンプルを得た（約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度）。エルサミトルシンのリテンションタイムは約１１．７分であった。
【００７９】
使用直後、カラムを溶媒Ｂで３０分間、次いでサンプル希釈液で４５分間フラッシュ洗浄した。カラムは各使用終了時、サンプル希釈液中に保管された。ゼロ時におけるストック溶液中のエルサミトルシン遊離塩基の平均濃度は１０．０３５ｍｇ／ｍＬで、平均浸透圧は３０１．６ｍＯｓｍ／ｋｇに等しいことが分かった。
【００８０】
エルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ−２．５ｍＬ剤形の効力を以下の表８に示す。表８には立位及び逆位の２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の１２週間の間の効力がまとめてある。この剤形は、図２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに示されているように、４及び２５℃で、どちらの保管位置でも安定であった。高温では異なる分解程度を示した。３１３及び３３３Ｋにおけるゼロ次分解速度定数（ｋＴ）を表９に示す。
【００８１】
【表８】
2014114313.tif 000011
【００８２】
【表９】
2014114313.tif 000012
【００８３】
２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の推定分解速度定数の測定（ｋ２７８Ｋ
＆  ｋ２９３Ｋ）：表９中の限定的データに対してアレニウス法を用いると、エルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の立位での５℃（又は２７８Ｋ）及び２５℃（又は２９３Ｋ）における分解速度定数は、それぞれ１日５．７９×１０−６及び９．８４×１０−４ｍｇ／ｍＬに等しいと概算された。立位のエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の効力の１０％低下（すなわち１０ｍｇ／ｍＬから９ｍｇ／ｍＬへ）を得るには、５℃で保管した場合約１７２８２日、２５℃では１０１６日を要することになる。
【００８４】
同様に、逆位の場合、エルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の概算分解速度定数は、５℃及び２５℃でそれぞれ１日２．４９×１０−５及び６．２８×１０−４ｍｇ／ｍＬであった。このことは、エルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の効力は、４０２３６日間逆位で５℃で保管された場合に１０％低下し、２５℃で保管された場合は（１０％低下するのに）１５９３日かかることを意味している。
【００８５】
一般に、逆位で保管されたエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形のサンプルの方が立位のものより安定である。二つの保管位置間の安定性の相違の理由は不明であるが、Ｓｔｅｌｍｉセラムストッパーの組成が関係していると考えるのが妥当である。該セラムストッパーは、製剤と接触している間、分解機構をどういうわけか緩徐化する。
【００８６】
不純物プロフィール：表３〜６に２．５ｍＬエルサミトルシンＦ２  ＲＴＵ剤形の不純物プロフィールのリストを示す。５及び２５℃で保管されたバイアルの場合、製剤のｐＨは試験期間中かなり安定であった（４．０〜４．３の範囲）。しかしながら、高温で保管されたこれらのサンプルには、分解の進行とともにｐＨの低下が観察された。主要な分解不純物（６０℃のストレス条件下で誘導された）は、以下のリテンションタイムを有するものであった。すなわち、０．５９、０．６２、１．４１、１．６５、１．８２及び１．８４。
【００８７】
【表１０】
2014114313.tif 000013
【００８８】
【表１１】
2014114313.tif 000014
【００８９】
【表１２】
2014114313.tif 000015
【００９０】
【表１３】
2014114313.tif 000016
【００９１】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されている、成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表すすべての数字は、特に断りのない限り、すべての場合において“約”という用語で修飾されていると理解されるべきである。従って、それとは反対の指示がない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に示されている数値パラメーターは、本開示によって得ようとしている所望の性質に応じて変動しうる近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限しようとする試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効数字の数を考慮し、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。開示の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示されている数値はなるべく正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も元来、それらの各試験測定に見出される標準偏差に必然的に由来する一定の誤差を含有している。開示を記載する文脈において（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）使用されている“ａ”及び“ａｎ”及び“ｔｈｅ”という用語及び類似の参照は、本明細書において特に断りのない限り又は文脈によって明らかに否定されない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるものとする。本明細書において、値の範囲の記述は、単に、その範囲内に入るそれぞれの別個の値を個別に言及することの簡略化法としての役割を果たすことを目的としたものに過ぎない。本明細書においては特に断りのない限り、各個別の値は、あたかもそれが本明細書中で個別に記述
されたかのように本明細書に取り込まれる。本明細書中に記載されているすべての方法は、本明細書において特に断りのない限り又は文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。いずれか及びすべての例の使用、又は本明細書中に提供されている例示的言語（例えば“のような”）は、単に本発明をよりよく照らし出すことを目的としたものであり、別途特許請求されている本発明の範囲に制限を課しているのではない。本明細書中のどの言語も、本発明の実施に必須の、特許請求の範囲に記載されていない何らかの要素を示していると解釈されるべきではない。
【００９２】
本明細書中に開示された発明の代替の構成要素又は態様のグループ分けを制限と解釈すべきでない。各グループのメンバーは、個別に又はグループの他のメンバーもしくは本明細書中に見出される他の構成要素と任意に組み合わせて言及及び特許請求されうる。グループの一つ又は複数のメンバーは、便宜上及び／又は特許性の理由から、グループに包含されうる又はグループから削除されうることが予想される。何らかのそのような包含又は削除が発生する場合、本明細書においては、本明細書は修正されたグループを含有するものとみなされるので、添付の特許請求の範囲で使用されるありとあらゆるマーカッシュグループの記載要件を満たす。
【００９３】
発明を実施するために発明者に公知の最善の様式を含む本発明の好適な態様が本明細書中に記載されている。当然のことながら、前述の記載を読むと、それらの好適な態様に対する変形が当業者には明らかであろう。発明者らは、熟練技術者が必要に応じてそのような変形を使用することを想定し、また発明者らは本発明が本明細書中に具体的に記載された以外の方法で実施されることも意図している。従って、本発明は、関係法によって許される限り、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載されている主題のあらゆる変更及び均等物を含む。さらに、上記構成要素の、そのすべての可能な変形における任意の組合せも、本明細書において特に断りのない限り又は文脈によって明らかに否定されない限り、本発明に包含される。
【００９４】
さらに、本明細書全体にわたって、特許及び印刷出版物への参照がなされている。上記引用文献及び印刷出版物のそれぞれは、引用によってそれらの全文を個別に本明細書に援用する。
【００９５】
終わりに、本明細書中に開示された本発明の態様は、本発明の原理の例示であることは理解されるべきである。使用されうるその他の変更も本発明の範囲に含まれる。従って、例として、しかし制限としてではなく、本発明の代替の構成が本明細書での教示に従って利用できる。ゆえに、本発明は、精密に示し記載されたものに限定されない。
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月12日(2014.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの、単離された、安定で、水溶性で、固体のエルサミトルシン塩であって、凍結乾燥品でないエルサミトルシン塩、及び
製薬学的に許容しうる担体
の溶液を含む製剤であって、
当該固体エルサミトルシン塩が、その抗新生物活性の少なくとも９０％を、固体形で少なくとも２４ヶ月間保持し、当該製剤は安定化抗酸化剤を含まない、製剤。
【請求項２】
前記製剤が溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を含有しない、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
浸透圧調整剤をさらに含む、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
前記浸透圧調整剤がマンニトールである、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
ｐＨを約３．５〜４．５に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤であって、当該薬剤が少なくとも一つの酸又は塩基を含む、製剤。
【請求項６】
ｐＨを約３．０〜約４．０に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤であって、当該薬剤が少なくとも一つの酸又は塩基を含む、製剤。
【請求項７】
ｐＨを約４．０に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤であって、当該薬剤が少なくとも一つの酸又は塩基を含む、製剤。
【請求項８】
前記単離された安定な固体のエルサミトルシン塩が、乳酸エルサミトルシン、フマル酸エルサミトルシン、マレイン酸エルサミトルシン、コハク酸エルサミトルシン、酒石酸エルサミトルシン、トシル酸エルサミトルシン、メタンスルホン酸エルサミトルシン、安息香酸エルサミトルシン、サリチル酸エルサミトルシン、塩酸エルサミトルシン、硫酸エルサミトルシン、及びリン酸エルサミトルシンからなる群から選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
前記エルサミトルシン塩がトシル酸エルサミトルシンである、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記製薬学的に許容しうる担体が水又は生理食塩水である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
終わりに、本明細書中に開示された本発明の態様は、本発明の原理の例示であることは理解されるべきである。使用されうるその他の変更も本発明の範囲に含まれる。従って、例として、しかし制限としてではなく、本発明の代替の構成が本明細書での教示に従って利用できる。ゆえに、本発明は、精密に示し記載されたものに限定されない。
以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
少なくとも一つの安定な固体のエルサミトルシン塩、及び
製薬学的に許容しうる担体
の溶液を含む製剤。
［請求項２］
前記製剤が溶液のｐＨを維持するための緩衝剤を含有しない、請求項１に記載の製剤。
［請求項３］
前記製剤が安定化抗酸化剤を必要としない、請求項１に記載の製剤。
［請求項４］
浸透圧調整剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
［請求項５］
前記浸透圧調整剤がマンニトールである、請求項４に記載の製剤。
［請求項６］
ｐＨを約３．５〜４．５に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
［請求項７］
ｐＨを約３．０〜約４．０に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
［請求項８］
ｐＨを約４．０に設定するための薬剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
［請求項９］
前記安定な固体のエルサミトルシン塩が、乳酸エルサミトルシン、フマル酸エルサミトルシン、マレイン酸エルサミトルシン、コハク酸エルサミトルシン、酒石酸エルサミトルシン、トシル酸エルサミトルシン、メタンスルホン酸エルサミトルシン、安息香酸エルサミトルシン、サリチル酸エルサミトルシン、塩酸エルサミトルシン、硫酸エルサミトルシン、及びリン酸エルサミトルシンからなる群から選ばれる、請求項１に記載の製剤。
［請求項１０］
前記エルサミトルシン塩がトシル酸エルサミトルシンである、請求項９に記載の製剤。
［請求項１１］
前記製薬学的に許容しうる担体が水又は生理食塩水である、請求項１に記載の製剤。
【外国語明細書】
2014114313000001.pdf