(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ迅速に実施することができ、精度の良い、腸内環境改善候補物質の評価方法を提供する。【解決手段】少なくとも以下の工程Ａ〜Ｅを有する。腸内の酸化還元電位を上昇させる処置を非ヒト動物に施す工程Ａ、非ヒト動物に被験物質を投与する工程Ｂ、工程Ａ及び工程Ｂより後に、非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する工程Ｃ、工程Ｃで測定した酸化還元電位の値を基準値と比較する工程Ｄ、工程Ｄにおける比較の結果、被験物質が工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を抑制している場合に、被験物質を腸内環境改善候補物質と評価する工程Ｅ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の工程Ａ〜Ｅを有することを特徴とする腸内環境改善候補物質の評価方法：
（Ａ）腸内の酸化還元電位を上昇させる処置を非ヒト動物に施す工程Ａ：
（Ｂ）非ヒト動物に被験物質を投与する工程Ｂ：
（Ｃ）前記工程Ａ及び工程Ｂより後に、前記非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する工程Ｃ：
（Ｄ）前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値を、基準値と比較する工程Ｄ：
（Ｅ）前記工程Ｄにおける比較の結果、前記被験物質が工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を抑制している場合に、前記被験物質を腸内環境改善候補物質と評価する工程Ｅ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸内環境改善候補物質の評価方法に関し、より詳細には、非ヒト動物の糞便の酸化還元電位を測定する工程を含む、腸内環境改善候補物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内には細菌が常在し、腸内細菌叢を構成している。近年、この腸内細菌叢が人間の健康と重要な係わりをもっていることが認識され、腸内細菌に対する関心が高まっている。ヒトの腸内細菌叢の構成は、環境及び食餌内容が安定であり、かつ宿主が健康である限りほとんど一定している。しかし、この腸内細菌叢の生態系は、宿主の年齢、疾病、微生物感染、ストレス、栄養成分、薬物投与等種々の要因により変動し、腸内細菌叢が悪化して、いわゆる悪玉菌である有害菌がいわゆる善玉菌である有用菌よりも優勢となると、宿主の健康に悪い影響を及ぼす原因となる。
【０００３】
善玉菌としては、ビフィズス菌などのビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌や、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌などがよく知られており、悪玉菌としては、クロストリジウム（Clostridium）属細菌や大腸菌などがよく知られている。悪玉菌は悪臭のもととなる腐敗物質を産生するものが多く、中には病原性物質を産生するものもいる。善玉菌が宿主の腸内で優勢となり、腸内細菌叢が改善すると、悪玉菌の生育や働きが抑制され、宿主の健康に良い影響を及ぼす。また、善玉菌の中には、宿主に有用な生理活性を有する有機酸を産生することによって宿主の健康に良い影響を及ぼすものもある。そのため、腸内環境改善作用や腸内細菌叢改善作用を有する様々な物質がこれまでに探索されている（特許文献１〜４参照）。
【０００４】
従来、ある食品素材などのある物質が腸内環境改善作用を示すかどうかを評価するためには、その物質を対象に長期間（一般的には４週間ほど）継続投与し、その糞便中の菌叢や菌叢由来の代謝産物などの各種パラメータを測定する必要があった。しかし、かかる従来の評価方法は、長期間を要し、また、操作も煩雑であった。したがって、より簡便かつ迅速に腸内環境改善候補物質を評価し得る方法が求められていた。
【０００５】
なお、潰瘍性大腸炎の患者では、糞便中の細菌叢において、好気性菌の菌数に対する嫌気性菌の菌数が減少し、腸内細菌叢が悪化していることが知られている（非特許文献１参照）。また、微生物を用いた下排水の処理装置において、ろ床の嫌気度合の指標として酸化還元電位を用いることは知られていた（特許文献５参照）。しかし、宿主の糞便の酸化還元電位の上昇を抑制する物質を、腸内細菌叢改善候補物質等の腸内環境改善候補物質と評価し得ることは全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−０３１３４５号公報
【特許文献２】特開２００７−２０４４２３号公報
【特許文献３】特開２００８−２３７１６２号公報
【特許文献４】特開２００９−１６１５０２号公報
【特許文献５】特開平０９−１４１２９２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】日本消化器病学会雑誌（１９８７），８４（１２），２６６９−２６８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、より簡便かつ迅速に実施することができ、加えて、より精度の良い、腸内環境改善候補物質の評価方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討する中で、脂質投与による非ヒト動物の糞便の酸化還元電位の上昇をプロピルガレートが抑制すること、脂質投与による非ヒト動物の糞便中の大腸菌数の増加をプロピルガレートが抑制すること、及び、脂質投与による非ヒト動物の盲腸内糞便中の有機酸濃度の低下をプロピルガレートが抑制することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）少なくとも以下の工程Ａ〜Ｅを有することを特徴とする腸内環境改善候補物質の評価方法：
（Ａ）腸内の酸化還元電位を上昇させる処置を非ヒト動物に施す工程Ａ：
（Ｂ）非ヒト動物に被験物質を投与する工程Ｂ：
（Ｃ）前記工程Ａ及び工程Ｂより後に、前記非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する工程Ｃ：
（Ｄ）前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値を、基準値と比較する工程Ｄ：
（Ｅ）前記工程Ｄにおける比較の結果、前記被験物質が工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を抑制している場合に、前記被験物質を腸内環境改善候補物質と評価する工程Ｅ：
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、より簡便かつ迅速に実施することができ、加えて、より精度の良い、腸内環境改善候補物質の評価方法を提供する。本発明によれば、腸内環境改善候補物質をより簡便、迅速かつ精度良く評価し得るので、一定期間内により多くの被験物質をより低コストで効率良く評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例において、５つの群（control群、oil群、tBHQ群、PG群、AX群）のマウスの盲腸内糞便の酸化還元電位（ｍＶ）を測定した結果を示す図である。縦軸の酸化還元電位は負の値であるため、酸化還元電位が上昇するにつれて絶対値が小さくなる。なお、群間の有意差検定はStudent-Newman-Keuls法を用いた。各群の棒グラフに付記されたａ又はｂの記号は、記号の異なる群間に有意な差があることを表している。また、各群の内容は以下の通りである。「control群：２００μＬの水を経口投与。」「oil群（被験物質非投与群）：２００μＬのコーン油を経口投与。」「tBHQ群：ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（２ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。」「PG群：プロピルガレート（２ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。」「AX群：アスタキサンチン（１ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。」
【図２】本発明の実施例において、３つの群（control群、oil群、PG群）のマウスの糞便中の大腸菌数を測定した結果を示す図である。縦軸は糞便１ｇ中の大腸菌数を常用対数で示しているため、縦軸の数値が１増えると大腸菌数は１０倍となる。
【図３】本発明の実施例において、３つの群（control群、oil群、PG群）のマウスの盲腸内糞便中の有機酸濃度を測定した結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、３つの群（control群、oil群、PG群）のマウスの盲腸内糞便中の酢酸濃度（左パネル）及び酪酸濃度（右パネル）を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、少なくとも以下の工程Ａ〜Ｅを有することを特徴とする腸内環境改善候補物質の評価方法（以下、単に「本発明の評価方法」とも表示する。）からなる。
（Ａ）腸内の酸化還元電位を上昇させる処置を非ヒト動物に施す工程Ａ：
（Ｂ）非ヒト動物に被験物質を投与する工程Ｂ：
（Ｃ）前記工程Ａ及び工程Ｂより後に、前記非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する工程Ｃ：
（Ｄ）前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値を、基準値と比較する工程Ｄ：
（Ｅ）前記工程Ｄにおける比較の結果、前記被験物質が工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を抑制している場合に、前記被験物質を腸内環境改善候補物質と評価する工程Ｅ： 
【００１４】
また、本発明の評価方法は前述の工程Ａ〜Ｅに加えて、以下の工程Ｘをさらに有していてもよい。
（Ｘ）工程Ａ又はＢより前に、非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する工程Ｘ：
【００１５】
本発明の評価方法では、非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位の値を利用することにより、被験物質が腸内環境改善候補物質であるかどうかをより簡便、迅速かつ精度良く評価することができる。なお、本発明の腸内環境改善候補物質の評価方法には、腸内環境改善候補物質のスクリーニング方法も含まれる。
【００１６】
上記工程Ａとしては、腸内の酸化還元電位を上昇させる処置を非ヒト動物に施す工程である限り特に制限されず、腸内の酸化還元電位を上昇させる作用を有する物質を非ヒト動物に投与する処置を好適に例示することができる。該「腸内の酸化還元電位を上昇させる作用を有する物質」としては、非ヒト動物に投与することによって、その腸内の酸化還元電位を上昇させ得る物質である限り特に制限されないが、油脂；デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）等の腸炎惹起物質；過酸化水素、過酸化カルシウム、過マンガン酸カリウム、塩素酸カリウム、臭素酸ナトリウム、臭素酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、クロラミン、過酢酸、メタクロロ過安息香酸等の酸化剤；などを好適に例示することができる。上記の油脂としては、コーン油、大豆油、米油、ナタネ油、オリーブ油、ごま油、ヤシ油、パーム油、べにばな油等の植物油；魚油、肝油、鯨油等の海産動物油；さなぎ油、牛脚油、骨油などの陸産動物油；などの油や、ヘット、ラード、馬脂、骨脂、乳酪脂などの脂を好適に例示することができ、中でも、所定量を投与しやすい点で油をさらに好適に例示することができ、中でも、植物油をより好適に例示することができ、中でも、入手が容易で比較的安価である点でコーン油、べにばな油、大豆油などをさらに好適に例示することができる。
【００１７】
前述の「腸内の酸化還元電位を上昇させる作用を有する物質を非ヒト動物に投与する」方法としては、非ヒト動物に投与された該物質がその腸内の酸化還元電位を上昇させる作用を発揮し得る投与方法である限り特に制限されず、経口投与、経腸投与などを例示することができる。なお、工程Ａには、腸内の酸化還元電位を上昇させる処置があらかじめ施された非ヒト動物を用意することも便宜上含まれる。該非ヒト動物として例えば腸炎モデル非ヒト動物、大腸癌モデル非ヒト動物、老齢モデル非ヒト動物などを例示することができる。かかるモデル非ヒト動物としては、公知のものなどを用いることができる。また、老齢の非ヒト動物も用いることができる。
【００１８】
本願明細書における非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類等に属する動物を例示することができ、中でも、哺乳動物を好適に例示することができ、中でも、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、サル等をより好適に例示することができ、比較的安価で、サイズも小さく扱いやすい点で、マウス、ラット、モルモットなどをさらに好適に例示することができる。
【００１９】
上記工程Ｂとしては、非ヒト動物に被験物質を投与する工程である限り特に制限されず、かかる投与方法としては、経口投与、経腸投与、腹腔内投与などを例示することができ、簡便性の観点から経口投与を好適に例示することができる。なお、本明細書における「経口投与」には、混餌投与や飲水投与を好適に例示することができる。
【００２０】
上記工程Ａは、本発明の効果が達成され得る限り、工程Ｂより先に行ってもよいし、工程Ｂより後に行ってもよいし、工程Ｂと同時に行ってもよいが、簡便性の観点から、工程Ｂと同時に行うことが好ましく、中でも、腸内の酸化還元電位を上昇させる作用を有する物質と被験物質を非ヒト動物に同時に投与することによって、工程Ａと工程Ｂを同時に行うことがより好ましい。ここで両物質を非ヒト動物に同時に投与することには、非ヒト動物に両物質を別々に同時に投与することや、両物質を混合した上で同時に投与することが含まれる。
【００２１】
上記工程Ｃとしては、前記工程Ａ及び工程Ｂより後に、前記非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する工程である限り特に制限されない。かかる「非ヒト動物の腸内又は体外の糞便の酸化還元電位を測定する」方法としては、特に制限されないが、酸化還元電位計のセンサー部を非ヒト動物の腸内又は体外の糞便に接触させる方法を好適に例示することができる。非ヒト動物の腸内の糞便の酸化還元電位を計測する方法としては、酸化還元電位計のセンサー部を非ヒト動物の肛門から挿入して計測する方法や、非ヒト動物を開腹、開腸して酸化還元電位計のセンサー部を腸内に挿入して計測する方法を例示することができる。ここで「腸内」としては、大腸内、盲腸内、結腸内、直腸内を例示することができるが、酸化還元電位計のセンサー部を糞便に接触させやすい点で盲腸内を好適に例示することができる。また、体外の糞便の酸化還元電位を計測する方が、腸内の糞便の酸化還元電位を計測するよりも簡便であるが、体外の糞便のサイズは、用いる非ヒト動物の種類などによっては、酸化還元電位を測定するのに十分な大きさを備えていない場合もある。当業者は、これら諸条件を考慮して、いずれの糞便の酸化還元電位を計測するか適宜決定することができる。なお、上記工程Ｘは、酸化還元電位の測定を工程Ａ又はＢより前に行うこと以外は、工程Ｃと同様に行うことができる。
【００２２】
上記工程Ｃにおける「前記工程Ａ及び工程Ｂより後に」が具体的にどの程度の時間かは、本発明の効果が達成され得る限り特に制限されず、上記工程Ａの「腸内の酸化還元電位を上昇させる処置」の種類や、被験物質の投与方法などに応じて適宜調整することができるが、「腸内の酸化還元電位を上昇させる処置」として例えば油脂を非ヒト動物に経口投与した場合は、腸内環境改善候補物質の評価の精度と、評価に要する時間のバランスの観点から、工程Ｂを行った時から３時間以上、好ましくは５時間以上１５時間以内、より好ましくは６時間以上１０時間以内を好適に例示することができ、臭素酸カリウムを非ヒト動物に経口投与した場合は、工程Ｂを行った時から５時間以上、好ましくは８時間以上２０時間以内、より好ましくは１０時間以上１６時間以内を好適に例示することができる。
【００２３】
上記工程Ｄとしては、前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値を、基準値と比較する工程である限り特に制限されない。ここで、「基準値」には、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」や、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」が含まれ、本発明の評価方法が工程Ｘを有さない場合は、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を基準値とすることができ、本発明の評価方法が工程Ｘをさらに有する場合は、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」のいずれも基準値とすることができるが、より簡便であることから、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」を基準値とすることが好ましい。
【００２４】
上記の「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」とは、被験物質を投与しなかったこと以外は工程Ｃにおける非ヒト動物と同様の非ヒト動物について、工程Ｃと同様の条件下で計測した酸化還元電位の値を意味する。なお、本発明の評価方法についてより高い精度を求める観点からは、工程Ｃの酸化還元電位を測定する際に、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」についても測定することが好ましいが、本発明の評価方法を実施する度に「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を行う必要は必ずしもなく、同様の実験条件で以前に測定した「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を用いることもできる。
【００２５】
上記工程Ｅとしては、前記工程Ｄにおける比較の結果、前記被験物質が工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を抑制している場合に、前記被験物質を腸内環境改善候補物質と評価する工程である限り特に制限されない。ここで、「工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を抑制している場合」とは、工程Ａにおける処置による酸化還元電位の上昇を完全に抑制している場合だけでなく、その上昇の一部を抑制している場合も含まれる。以下、工程Ｅを、本発明の評価方法の態様ごとに説明する。
【００２６】
態様１：本発明の評価方法が工程Ｘを有さない場合。
かかる態様１の場合は、前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値が、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」（基準値）よりも低い場合に、該被験物質を腸内環境改善候補物質と評価することができるが、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」の絶対値に対して、割合として好ましくは１％以上、より好ましくは２％以上、さらに好ましくは４％以上、より好ましくは６％以上に相当する値の分、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」よりも低い場合に、被験物質を腸内環境改善候補物質と好適に評価することができる。なお、前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値が、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」の絶対値に対して、割合としてＹ％に相当する値の分、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」よりも低い場合とは、例えば、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」が−４００ｍＶであれば、割合としてＹ％に相当する値の分は、４００×（Ｙ／１００）＝４Ｙとなるので、工程Ｃで測定した酸化還元電位の値が（−４００−４Ｙ）の場合ということになる。
【００２７】
態様２：本発明の評価方法が工程Ｘを有し、該工程Ｘが工程Ａ及びＢよりも前である場合。
かかる態様２の場合であっても、基準値として「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を用いる場合は、前述の態様１と同様に評価することができる。かかる態様２において、基準値として「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を用いる場合には、例えば、工程Ｘで酸化還元電位を測定した非ヒト動物を例えば２群に分けて、一方の群（工程Ａのみ実施群）には工程Ａのみを施し、他方の群（工程Ａ、Ｂ実施群）には工程Ａ及び工程Ｂを施すことを含む方法において、工程Ａのみ実施群の酸化還元電位の値を「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」として用いる場合なども含まれる。一方、態様２で基準値として、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」を用いる場合は、前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値が、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」とほぼ同程度である場合などに、該被験物質を腸内環境改善候補物質と評価することができる。「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」とほぼ同程度である場合としては、例えば、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」の絶対値に対して、割合として好ましくは５％以内、より好ましくは３％以内、さらに好ましくは１％以内に相当する分、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」よりも高い又は低い場合を挙げることができる。
【００２８】
態様３：本発明の評価方法が工程Ｘを有し、該工程Ｘが工程ＡとＢとの間であり、かつ、工程Ａが先の場合。すなわち、工程Ａ、工程Ｘ、工程Ｂの順序である場合。
かかる態様３の場合は、「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」と「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」が同じ値を表すことになるので、以下では単に基準値と表す。態様３の場合は、前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値が、基準値よりも低い場合に該被験物質を腸内環境改善候補物質と評価することができる。かかる低下の好ましい程度としては、前述の態様１で記載したのと同様のものを挙げることができる。なお、本態様３において、工程Ｘにおける酸化還元電位の測定の時点で、工程Ａの作用がまだ発揮されていない場合、すなわち、腸内の酸化還元電位の上昇が見られないような場合は、前述の態様２の場合と同様に評価することができる。
【００２９】
態様４：本発明の評価方法が工程Ｘを有し、該工程Ｘが工程ＡとＢとの間であり、かつ、工程Ｂが先の場合。すなわち、工程Ｂ、工程Ｘ、工程Ａの順序である場合。
かかる態様４の場合であっても、基準値として「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を用いる場合は、前述の態様１と同様に評価することができる。かかる態様４において、基準値として「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」を用いる場合には、例えば、工程Ｂを施す前に非ヒト動物を例えば２群に分けて、一方の群（工程Ｂ、Ａ実施群）には工程Ｂ、Ａを施し、他方の群（工程Ａのみ実施群）には工程Ａのみを施すことを含む方法において、工程Ａのみ実施群の酸化還元電位の値を「被験物質非投与の場合の酸化還元電位の値」として用いる場合なども含まれる。一方、態様４で基準値として、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」を用いる場合は、前記工程Ｃで測定した酸化還元電位の値が、「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」とほぼ同程度である場合などに、該被験物質を腸内環境改善候補物質と評価することができる。「工程Ｘで測定した酸化還元電位の値」とほぼ同程度である場合としては、前述の態様２で記載したのと同様のものを挙げることができる。
【００３０】
なお、工程Ｘにおける非ヒト動物などの、基準値の算出に用いる非ヒト動物は、工程Ｃにおける非ヒト動物と同一個体であってもよいし、同種の別個体であってもよいが、より高い評価精度を得る観点から、同一個体である場合を好適に例示することができる。
【００３１】
本明細書における「値」は、１個体の非ヒト動物の測定値であってもよいが、より高い評価精度を得る観点から、複数個体の非ヒト動物の測定値の平均値であることが好ましい。
【００３２】
本明細書における「腸内環境改善候補物質」とは、腸内環境改善作用を有する物質の候補となる物質を意味し、好適には、腸内環境改善作用を有する物質を含む。ここで「腸内環境改善作用」とは、腸内細菌叢や、腸内細菌により産生される有機酸（好ましくは酢酸や酪酸）等の代謝産物及びｐＨや水分といった理化学的指標を、宿主にとって都合の良い方向に改善する作用や、腸内の炎症を予防、改善する作用を意味し、好適には、「腸内細菌叢改善作用」を含む。「腸内細菌叢改善作用」とは、善玉菌の増殖により、腸内細菌叢を宿主にとって都合のよい方向に変動させる作用を意味する。腸内環境改善作用を有する物質は、投与された動物の便通改善や下痢抑制、あるいは、炎症性腸疾患等の腸内の炎症を予防、改善し得る。
【００３３】
本発明の評価方法によって、腸内環境改善候補物質と評価された被験物質については、腸内環境や腸内細菌叢に与える影響等についてさらに詳細に解析すること等によって、該被験物質が腸内環境改善物質であるかどうか、さらには、どのような効用を発揮することによって腸内環境を改善するかなどを解析することができる。
【００３４】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
［盲腸内の糞便の酸化還元電位の測定］
脂質投与による糞便の酸化還元電位の上昇を抑制し得る物質を探索するために、以下のような方法で、マウス盲腸内の糞便の酸化還元電位を測定した。
【００３６】
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入後１週間順化させた。順化させたマウス２０匹を、１群につき４匹ずつ、５群に分け、各群のマウスには以下のような強制経口投与を行った。
・control群：２００μＬの水を経口投与。
・oil群（被験物質非投与群）：２００μＬのコーン油を経口投与。
【００３７】
・tBHQ群：ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン（２ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。
・PG群：プロピルガレート（２ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。
・AX群：アスタキサンチン（１ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。
なお、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、プロピルガレート、アスタキサンチンを被験物質として用いたのは、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン及びプロピルガレートは、食品添加物として使用されている強力な抗酸化剤であることが知られており、アスタキサンチンは強い抗酸化力を有することが知られていたからである。
【００３８】
投与終了６時間後に各マウスを麻酔下で開腹し、酸化還元電位（ＯＲＰ）計（Liquisys M、Endress+Hauser社製）の測定プローブを盲腸内に挿入することにより、各マウスの盲腸内の糞便のＯＲＰ値（ｍＶ）を測定した。各群におけるＯＲＰ値の平均±ＳＤ（標準偏差）を図１に示す。なお、各群のＯＲＰ値の平均値（以下、単に「ＯＲＰ値」と表示する。）は、control群が−４２１ｍＶ、oil群が−４００ｍＶ、tBHQ群が−３９４ｍＶ、PG群が−４２４ｍＶ、AX群が−３９８ｍＶであった。
【００３９】
図１から分かるように、コーン油を投与したoil群では、水を投与したcontrol群に対して、ＯＲＰ値が有意に上昇した。これは、コーン油の投与によりマウスの腸内がより酸化的な環境になったことを表す。また、コーン油とtBHQを同時投与したtBHQ群や、コーン油とアスタキサンチンを同時投与したAX群では、コーン油単独投与のoil群のＯＲＰ値とほとんど変わらず、平均値はむしろ若干上昇した。それに対して、コーン油とプロピルガレートを同時投与したPG群では、oil群に対してＯＲＰ値が有意に低下し、コントロール群と同程度の値を示した。これらの結果から、プロピルガレート投与が、コーン油の投与によるＯＲＰ値の上昇を抑制することが明らかとなった。なお、PG群のＯＲＰ値（−４２４ｍＶ）は、oil群のＯＲＰ値（−４００ｍＶ）の絶対値に対して、割合として６％に相当する値（２４ｍＶ）の分、oil群のＯＲＰ値よりも低下していた。また、前述したようにｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノンやアスタキサンチンも、プロピルガレートと同様に抗酸化作用を有しているが、糞便のＯＲＰ値の上昇抑制は確認されなかったことから、単に抗酸化剤であるからといって、糞便のＯＲＰ値の上昇抑制作用が得られるわけではないことも分かった。
【実施例２】
【００４０】
［盲腸内の糞便中の大腸菌数の測定］
糞便中の大腸菌数の増加や、有機酸濃度の低下は、腸内細菌叢等の腸内環境の悪化の指標として知られている。プロピルガレート投与によるＯＲＰ値の上昇抑制が、腸内環境の悪化抑制あるいは改善を示すかどうかを調べるために、以下のような、糞便中の大腸菌数の解析、及び、盲腸内糞便中の有機酸濃度の分析を行った。
６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入後１週間順化させた。順化させたマウス１５匹を、１群につき５匹ずつ、３群に分け、各群のマウスには以下のような強制経口投与を行った。
・control群：２００μＬの水を経口投与。
・oil群（被験物質非投与群）：２００μＬのコーン油を経口投与。
・PG群：プロピルガレート（２ｍｇ）を２００μＬのコーン油に懸濁し経口投与。
【００４１】
各群とも１日１回の投与を３週間継続し、投与終了後の各マウスの糞便中の大腸菌数の解析及び盲腸内糞便中の有機酸濃度の分析を行った。大腸菌数の解析には定量ＰＣＲ法を用いた。糞便中の菌体からのＤＮＡ抽出は松木等の方法（Appl Environ Microbiol(2004) 70, 7220-8.）に準じて実施した。得られたＤＮＡ中の大腸菌由来ＤＮＡの定量には大腸菌特異的なプライマーセット（配列番号１のヌクレオチド配列からなるＦｗプライマー、及び、配列番号２のヌクレオチド配列からなるＲｖプライマー）及び市販のリアルタイムＰＣＲキットであるSYBR（登録商標） Premix Ex TaqTM (タカラバイオ社)を用いて実施した。ＰＣＲ反応はロシュ社のLight Cycler480を使用し、９５℃５分間→（９５℃１０秒間、６０℃３０秒間）×４５サイクルで反応を行った。定量のためのスタンダードにはEscherichia coli W3110培養菌体より抽出したＤＮＡを使用し、糞便中の大腸菌数を算出した。各群における大腸菌数の平均±ＳＤ（標準偏差）を図２に示す。以下、各群の大腸菌数の平均値を単に「大腸菌数」と表示する。図２から分かるように、コーン油を投与したoil群では、水を投与したcontrol群と比較して大腸菌数が約３５倍に増加した（p < 0.01）。それに対して、コーン油とプロピルガレートを同時投与したPG群では、oil群と比較して大腸菌数が少なかった。この結果から、プロピルガレート投与が、コーン油投与による大腸菌数の増加を抑制することが明らかとなった。
【００４２】
前述の有機酸濃度の分析はＨＰＬＣを用いて行った。盲腸内糞便を０．７規定の水酸化ナトリウム溶液に１０％（ｗ／ｖ）となるように懸濁し、遠心後の上清を回収した。孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜を通して浮遊物を除去し、サンプル中の有機酸濃度を、ＨＰＬＣ（ＬＣ−２０ＡＤ；株式会社島津製作所製）を用いて分析した。カラムはShim-pack SPR-102H column (7.8 mm i.d. × 250 mm long; 株式会社島津製作所製)を使用した。各群における有機酸濃度の平均±ＳＤ（標準偏差）を図３に示す。以下、各群の有機酸濃度の平均値を単に「有機酸濃度」と表示する。図３から分かるように、コーン油を投与したoil群では、水を投与したcontrol群と比較して有機酸濃度が低下傾向を示したのに対して、コーン油とプロピルガレートを同時投与したPG投与群ではその低下は緩やかであった。この結果から、プロピルガレート投与が、コーン油投与による有機酸濃度の低下を抑制する傾向が示された。
【００４３】
また、腸内の有機酸の中で特に有用かつ重要であると考えられている酢酸及び酪酸の濃度について、各群の平均±ＳＤ（標準偏差）を図４に示す。以下、各群の酢酸濃度の平均値、酪酸濃度の平均値をそれぞれ、単に「酢酸濃度」、「酪酸濃度」と表示する。図４から分かるように、コーン油を投与したoil群では、水を投与したcontrol群と比較して酢酸濃度（図４左）及び酪酸濃度（図４右）はいずれも有意に減少した。それに対して、コーン油とプロピルガレートを同時投与したPG群では、oil群と比較して酢酸濃度及び酪酸濃度のいずれも高かった。この結果から、プロピルガレート投与が、コーン油投与による酢酸濃度及び酪酸濃度の低下を抑制する傾向が示された。
【００４４】
以上の実施例１及び実施例２の実験の結果を総合すると、糞便のＯＲＰ値の上昇抑制作用を有するプロピルガレートが、腸内細菌叢等の腸内環境の悪化を抑制あるいは改善する作用を有することが示された。また、これらの結果から、ある被験物質が、糞便のＯＲＰ値の上昇抑制作用を有するかどうかを調べることによって、その被験物質が腸内環境改善候補物質であるかどうかを簡便かつ迅速に精度良く評価できることが示された。
【００４５】
なお、以上の実施例では、腸内の酸化還元電位を上昇させ得る物質としてコーン油を使用したが、腸炎惹起物質デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）や、酸化剤である臭素酸カリウムを投与しても、腸内の酸化還元電位が実際に上昇することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、より簡便かつ迅速に実施することができ、加えて、より精度の良い、腸内環境改善候補物質の評価方法を提供する。本発明によれば、腸内環境改善候補物質をより簡便、迅速かつ精度良く評価し得るので、一定期間内により多くの被験物質をより低コストで効率良く評価することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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