(57)【要約】【課題】肺炎球菌の複数の血清型の同時検出を可能にするプライマーセット、該プライマーセットを含有する、肺炎球菌の複数の血清型の同時検出用キット、および該プライマーセットを用いた、肺炎球菌の複数の血清型の同時検出方法の提供。【解決手段】広範な血清型をカバーする、DNA結合蛍光色素法によるリアルタイムPCR法を適用可能なPCRプライマーを複数セット設計し、包括的血清型一括診断を可能とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）からなる群から選択される、いずれかのプライマーセット：
（４）配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（５）配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（６）配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（８）配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（９）配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１１）配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１３）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１４）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１５）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２６）配列番号５１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２８）配列番号５５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２９）配列番号５７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；および
（３０）配列番号５９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
【請求項２】
以下の（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセット、ならびに以下の（２）、（３）、（７）、（１０）、（１２）、（１６）〜（２５）および（２７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、プライマーセットの組み合わせ：
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（３）配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（４）配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（５）配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（６）配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（７）配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（８）配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（９）配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１０）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１１）配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１２）配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１３）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１４）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１５）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１６）配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１７）配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１８）配列番号３５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１９）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２０）配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２１）配列番号４１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２２）配列番号４３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２３）配列番号４５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２４）配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２５）配列番号４９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２６）配列番号５１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２７）配列番号５３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２８）配列番号５５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２９）配列番号５７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；および
（３０）配列番号５９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
【請求項３】
（２）〜（３０）のプライマーセットを含む、請求項２に記載のプライマーセットの組み合わせ。
【請求項４】
以下のプライマーセット（１）を更に含む、請求項２または３に記載のプライマーセットの組み合わせ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーセット、または請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットの組み合わせを用いて、被験対象から採取した試料から肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、肺炎球菌の検出方法。
【請求項６】
請求項１に記載のプライマーセット、または請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットの組み合わせを用いて、被験対象から採取した試料から肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、肺炎球菌の血清型の判別方法。
【請求項７】
肺炎球菌遺伝子またはその転写産物の検出が、用いられる全てのプライマーセットについて、同一温度条件下で、同時にＰＣＲを実施することにより行われる、請求項６に記載の判別方法。
【請求項８】
温度条件が、５９℃のアニーリング温度により特定される、請求項７に記載の判別方法。
【請求項９】
請求項１に記載のプライマーセット、または請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットの組み合わせを含有する、肺炎球菌遺伝子またはその転写産物の検出用キット。
【請求項１０】
請求項１に記載のプライマーセット、または請求項２〜４のいずれか１項に記載のプライマーセットの組み合わせを含有する、肺炎球菌の血清型の判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる血清型の肺炎球菌を同時に検出し、その血清型を判別することを可能にするプライマーセットの組み合わせ、肺炎球菌の検出方法、肺炎球菌の血清型の判別方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎球菌は、免疫機能が弱い乳幼児や高齢者に肺炎、気管支炎等の呼吸器感染症並びに髄膜炎、中耳炎、副鼻腔炎および菌血症等を引き起こす。また、抗生物質が効かない薬剤耐性菌の増加が認められるため、治療が困難となる傾向がある。従ってワクチンにより感染を予防することが有効であるが、感染する肺炎球菌の血清型によっては、汎用されているワクチンの効果が低い場合もあり得る。ある地域全体でワクチンの接種を開始する前に、当該地域で患者に感染している肺炎球菌の血清型を迅速に知ることができれば、ワクチンの効果を予測することができるし、効果が高いワクチンを新たに製造することもできる。
【０００３】
肺炎球菌の血清型は莢膜の多糖類の分子構造で決定され、古典的には実験室で培養した菌体に対して型判定用抗血清セットを用いてその形態変化を検鏡する方法が取られるが、活発に生育する生菌を要すること、比較的純化した菌を要すること、手順が煩雑、判定に熟練を要するなどの理由で結果を得るまでに相当の作業と時間・費用を要する。
【０００４】
また、一旦分離した菌株を対象とするため咽頭ぬぐい液・痰・髄液・血液などの臨床検体をそのまま使用できず、そのため、複数の血液型の混合感染などの感染実体の把握は不可能である。莢膜抗原を規定する遺伝子の存在を検出する分子診断はPCR法を適用することで上記問題点を克服できる（特許文献１〜２）が、これまでに開発された方法は同時一括分析・定量的分析に適さず、また、人為的エラーの危険も相当に高いと想定される。
【０００５】
肺炎球菌の多くの血清型を一度で同時に検出・判別でき、特異性が高く、且つ定量性のある方法はこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kong, F., Brown, M., Sabananthan, A., Zeng, X., & Gilbert, G. L. (2006). Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes. J Clin Microbiol 44(5), 1887-1891
【非特許文献２】List of oligonucleotide primers used for pneumococcal serotype deduction, updated 2011 June (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/files/pcr-oligonucleotide-primers.pdf)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、肺炎球菌の複数の血清型を同時に検出可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、広範な血清型をカバーする、リアルタイムＰＣＲ法を適用可能なＰＣＲプライマーセットを複数設計し、その組み合わせを工夫することにより、同一反応条件下で広範な血清型を一括して検出することを可能とし、本発明を完成するに到った。
【０００９】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］  以下の（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）からなる群から選択される、いずれかのプライマーセット：
（４）配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（５）配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（６）配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（８）配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（９）配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１１）配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１３）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１４）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１５）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２６）配列番号５１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２８）配列番号５５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２９）配列番号５７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；および
（３０）配列番号５９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
［２］  以下の（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセット、ならびに以下の（２）、（３）、（７）、（１０）、（１２）、（１６）〜（２５）および（２７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、プライマーセットの組み合わせ：
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（３）配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（４）配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（５）配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（６）配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（７）配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（８）配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（９）配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１０）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１１）配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１２）配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１３）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１４）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１５）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１６）配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１７）配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１８）配列番号３５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（１９）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２０）配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２１）配列番号４１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２２）配列番号４３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２３）配列番号４５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２４）配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２５）配列番号４９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２６）配列番号５１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２７）配列番号５３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２８）配列番号５５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（２９）配列番号５７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５８に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；および
（３０）配列番号５９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号６０に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
［３］  （２）〜（３０）のプライマーセットを含む、［２］に記載のプライマーセットの組み合わせ。
［４］  以下のプライマーセット（１）を更に含む、［２］または［３］に記載のプライマーセットの組み合わせ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
［５］  ［１］に記載のプライマーセット、または［２］〜［４］のいずれかに記載のプライマーセットの組み合わせを用いて、被験対象から採取した試料から肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、肺炎球菌の検出方法。
［６］  ［１］に記載のプライマーセット、または［２］〜［４］のいずれかに記載のプライマーセットの組み合わせを用いて、被験対象から採取した試料から肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、肺炎球菌の血清型の判別方法。
［７］  肺炎球菌遺伝子またはその転写産物の検出が、用いられる全てのプライマーセットについて、同一温度条件下で、同時にＰＣＲを実施することにより行われる、［６］に記載の判別方法。
［８］  温度条件が、５９℃のアニーリング温度により特定される、［７］に記載の判別方法。
［９］  ［１］に記載のプライマーセット、または［２］〜［４］のいずれかに記載のプライマーセットの組み合わせを含有する、肺炎球菌遺伝子またはその転写産物の検出用キット。
［１０］  ［１］に記載のプライマーセット、または［２］〜［４］のいずれかに記載のプライマーセットの組み合わせを含有する、肺炎球菌の血清型の判別用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、肺炎球菌の広範な血清型を、同一反応条件下で一括して検出することができるので、複数のＰＣＲのセットアップおよびそれに続く検出系での手作業に際しての人為的エラーを回避できる。また、同時一括反応により、異なるＰＣＲのセットアップ間でのばらつきを回避するとともに、時間効率を改善できる。更に、既存技術で頻用されるマルチプレックス法に伴う共存反応間の競合阻害による偽陰性反応を回避できる。加えて、感染現象の生物学的有意性の判定に重要な定量性を持ったデータの取得が可能となる。更には、本発明のプライマーセットの組み合わせは、広く用いられている定量リアルタイムPCR測定機に加え、ナノ流路技術を適用した高集積度定量リアルタイムPCR測定機への適用が可能である。そして、分離培養後の菌株だけでなく、咽頭ぬぐい液・痰・髄液・血液など臨床検体からそのまま調製した核酸試料に適用可能となる。
従来法によれば、1000件の臨床検体の血清型を明らかにするために要する特殊試薬、消耗品の費用としては、例えば、単価1,100,000円のLatex kitは1箱で75検体分のため13キット分と1/3を要するため、Latex kitだけで総額14,500,000円要するが、本発明により、当該費用を相当額低減することができる（図１０）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、プライマーの特異性テスト例を示す図である。
【図２】図２は、リアルタイムPCRにおいて、同一条件での反応によりすべての血清型を一括して同時検出することを示す図である。
【図３】図３は、段階希釈DNAを用いたリアルタイムPCRにおいて、時間に対する蛍光強度の増加を示すグラフの直線性によって検出の感度と定量性が担保されることを示す図である。
【図４】図４は、リアルタイムPCRの、喀痰検体中の肺炎球菌検出能を示す図である。
【図５】図５は、リアルタイムPCRにおいて、融点分析により肺炎球菌共通PCR産物の反応特異性を検証した図である。
【図６】図６は、リアルタイムPCRにおいて、融点分析により血清型特異的PCR産物の反応特異性を検証した図である。
【図７】図７は、リアルタイムPCRにおける、検量線を用いた定量的検出の例を示した図である。
【図８】図８は、多項目並列PCRにおける、陽性反応の例を示した図である。
【図９】図９は、多項目並列PCRにおいて、血清型特異的PCR産物の融点分析を示した図である。
【図１０】図１０は、肺炎球菌の血清型を決定するための常法と本発明の方法とを、効率性の面から比較した図である。
【図１１】図１１は、ベトナム中部ニャチャン市の小児の肺炎患者と健常対照群肺炎球菌保菌者におけるbacterial load（細菌負荷）を示す図である。
【図１２】図１２は、ニャチャン市の小児の肺炎患者と健常対照群における肺炎球菌血清型分布を示す図である。
【図１３】図１３は、ニャチャン市の小児の肺炎患者と健常対照群における年齢階層別の肺炎球菌血清型分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本明細書中、「肺炎球菌」とは、肺炎などの呼吸器の感染症や全身性感染症を引き起こすグラム陽性の双球菌であって、Streptococcus属の細菌を指す。好ましくは、Streptococcus pneumoniaeである。
【００１４】
本明細書中、「肺炎球菌の血清型」とは、肺炎球菌莢膜の、抗原としての多糖類の分子構造で決定される型のことをいう。該血清型は、抗血清セットに対する菌体の形態変化を顕微鏡観察して決定され得る他、抗原の決定に関わる遺伝子の配列の差異を検出することによっても、決定することができる。肺炎球菌の該遺伝子としては、wzy、galU、wci Nbeta、wcrG、wzx、wcrO、wcrHの各遺伝子が挙げられる。
【００１５】
本発明は、肺炎球菌を検出し得るプライマーセット、および肺炎球菌の多種類の血清型を同時に検出し得るプライマーセットを提供する。本発明においてプライマーセットとは、各血清型の肺炎球菌の遺伝子を増幅する為のPCRプライマーのセットである。遺伝子増幅のためにPCRは、通常１回行えばよいが、精度を上げるためにnested-PCRあるいはhemi-nested PCRを行ってもよい。各PCRの手法自体は公知であるので、プライマー以外の材料は容易に入手可能であり、種々の反応条件も適宜設定することができる。本発明のプライマーセットは、1遺伝子を増幅するために設計された1組のプライマーの各セットから構成される。具体的には、該各セットは、
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１のプライマーともいう）と、配列番号２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３のプライマーともいう）と、配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（３）配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５のプライマーともいう）と、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（４）配列番号７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号７のプライマーともいう）と、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号８のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（５）配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号９のプライマーともいう）と、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１０のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（６）配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１１のプライマーともいう）と、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１２のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（７）配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１３のプライマーともいう）と、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１４のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（８）配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１５のプライマーともいう）と、配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（９）配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１７のプライマーともいう）と、配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１８のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１０）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１９のプライマーともいう）と、配列番号２０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２０のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１１）配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２１のプライマーともいう）と、配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２２のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１２）配列番号２３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２３のプライマーともいう）と、配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２４のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１３）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２５のプライマーともいう）と、配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１４）配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２７のプライマーともいう）と、配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２８のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１５）配列番号２９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２９のプライマーともいう）と、配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３０のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１６）配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３１のプライマーともいう）と、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３２のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１７）配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３３のプライマーともいう）と、配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３４のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１８）配列番号３５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３５のプライマーともいう）と、配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（１９）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３７のプライマーともいう）と、配列番号３８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３８のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２０）配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３９のプライマーともいう）と、配列番号４０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４０のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２１）配列番号４１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４１のプライマーともいう）と、配列番号４２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４２のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２２）配列番号４３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４３のプライマーともいう）と、配列番号４４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４４のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２３）配列番号４５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４５のプライマーともいう）と、配列番号４６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２４）配列番号４７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４７のプライマーともいう）と、配列番号４８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４８のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２５）配列番号４９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４９のプライマーともいう）と、配列番号５０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５０のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２６）配列番号５１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５１のプライマーともいう）と、配列番号５２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５２のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２７）配列番号５３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５３のプライマーともいう）と、配列番号５４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５４のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２８）配列番号５５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５５のプライマーともいう）と、配列番号５６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（２９）配列番号５７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５７のプライマーともいう）と、配列番号５８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５８のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；および
（３０）配列番号５９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号５９のプライマーともいう）と、配列番号６０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号６０のプライマーともいう）とからなるプライマーセットである。
【００１６】
配列番号１および２に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.AE005672）中、第1840961番目から第1840980番目の塩基配列、および第1841047番目から第1841066番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はすべての血清型の肺炎球菌に共通するlytA遺伝子の断片（106bp）を増幅するために設計されている。後述する実施例の如くPCRを配列番号１のプライマー（フォワード）と配列番号２のプライマー（リバース）で行うことにより、血清型に係わらず肺炎球菌の検出が可能となる。
【００１７】
配列番号３および４に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.Z83335）の第10307番目から第10328番目の塩基配列、および第10554番目から第10576番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（270bp）を増幅するために設計されている。血清型1を検出するためには、PCRを配列番号３のプライマー（フォワード）と配列番号４のプライマー（リバース）で行う。
【００１８】
配列番号５および６に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931633）の第10271番目から第10301番目の塩基配列、および第10531番目から第10560番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（290bp）を増幅するために設計されている。血清型2を検出するためには、PCRを配列番号５のプライマー（フォワード）と配列番号６のプライマー（リバース）で行う。
【００１９】
配列番号７および８に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931634.2）の第9251番目から第9269番目の塩基配列、および第9360番目から第9382番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はgalU遺伝子の断片（132bp）を増幅するために設計されている。血清型3を検出するためには、PCRを配列番号７のプライマー（フォワード）と配列番号８のプライマー（リバース）で行う。
【００２０】
配列番号９および１０に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931635.1）の第9999番目から第10019番目の塩基配列、および第10099番目から第10118番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（120bp）を増幅するために設計されている。血清型4を検出するためには、PCRを配列番号９のプライマー（フォワード）と配列番号１０のプライマー（リバース）で行う。
【００２１】
配列番号１１および１２に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931637.1）の第6132番目から第6154番目の塩基配列、および第6232番目から第6257番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（126bp）を増幅するために設計されている。血清型5を検出するためには、PCRを配列番号１１のプライマー（フォワード）と配列番号１２のプライマー（リバース）で行う。
【００２２】
配列番号１３および１４に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.AF316640）の第9263番目から第9284番目の塩基配列および第9528番目から第9555番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（293bp）を増幅するために設計されている。血清型6A/6B/6C/6Dを検出するためには、PCRを配列番号１３のプライマー（フォワード）と配列番号１４のプライマー（リバース）で行う。
【００２３】
配列番号１５および１６に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.EF538714.1）の第7223番目から第7242番目の塩基配列、および第7322番目から第7341番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwci Nbeta遺伝子の断片（119bp）を増幅するために設計されている。血清型6C/6Dを検出するためには、PCRを配列番号１５のプライマー（フォワード）と配列番号１６のプライマー（リバース）で行う。
【００２４】
配列番号１７および１８に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931643.1）の第14685番目から第14709番目の塩基配列、および第14794番目から第14814番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（130bp）を増幅するために設計されている。血清型7F/7Aを検出するためには、PCRを配列番号１７のプライマー（フォワード）と配列番号１８のプライマー（リバース）で行う。
【００２５】
配列番号１９および２０に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931644）の第11193番目から第11223番目の塩基配列、および第11364番目から第11393番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（201bp）を増幅するために設計されている。血清型8を検出するためには、PCRを配列番号１９のプライマー（フォワード）と配列番号２０のプライマー（リバース）で行う。
【００２６】
配列番号２１および２２に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931648.1）の第9967番目から第9990番目の塩基配列、および第10066番目から第10088番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（122bp）を増幅するために設計されている。血清型9V/9Aを検出するためには、PCRを配列番号２１のプライマー（フォワード）と配列番号２２のプライマー（リバース）で行う。
【００２７】
配列番号２３および２４に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931647）の第9818番目から第9837番目の塩基配列、および第10156番目から第10179番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（362bp）を増幅するために設計されている。血清型9N/9Lを検出するためには、PCRを配列番号２３のプライマー（フォワード）と配列番号２４のプライマー（リバース）で行う。
【００２８】
配列番号２５および２６に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931649.1）の第11565番目から第11584番目の塩基配列、および第11666番目から第11685番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwcrG遺伝子の断片（121bp）を増幅するために設計されている。血清型10Aを検出するためには、PCRを配列番号２５のプライマー（フォワード）と配列番号２６のプライマー（リバース）で行う。
【００２９】
配列番号２７および２８に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931652.1）の第12556番目から第12580番目の塩基配列、および第12656番目から第12675番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzx遺伝子の断片（120bp）を増幅するために設計されている。血清型10F/10Cを検出するためには、PCRを配列番号２７のプライマー（フォワード）と配列番号２８のプライマー（リバース）で行う。
【００３０】
配列番号２９および３０に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931653.1）の第11646番目から第11670番目の塩基配列、および第11733番目から第11754番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzx遺伝子の断片（109bp）を増幅するために設計されている。血清型11A/11D/11E/11Fを検出するためには、PCRを配列番号２９のプライマー（フォワード）と配列番号３０のプライマー（リバース）で行う。
【００３１】
配列番号３１および３２に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931660.1）の第8914番目から第8931番目の塩基配列、および第9138番目から第9155番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（242bp）を増幅するために設計されている。血清型12F/12A/12B/44/46を検出するためには、PCRを配列番号３１のプライマー（フォワード）と配列番号３２のプライマー（リバース）で行う。
【００３２】
配列番号３３および３４に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.X85787）の第7376番目から第7398番目の塩基配列、および第7481番目から第7504番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（129bp）を増幅するために設計されている。血清型14を検出するためには、PCRを配列番号３３のプライマー（フォワード）と配列番号３４のプライマー（リバース）で行う。
【００３３】
配列番号３５および３６に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931664）の第7797番目から第7818番目の塩基配列、および第8124番目から第8148番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（352bp）を増幅するために設計されている。血清型15B/15Cを検出するためには、PCRを配列番号３５のプライマー（フォワード）と配列番号３６のプライマー（リバース）で行う。
【００３４】
配列番号３７および３８に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931670）の第13988番目から第14009番目の塩基配列、および第14272番目から第14295番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（308bp）を増幅するために設計されている。血清型17Fを検出するためには、PCRを配列番号３７のプライマー（フォワード）と配列番号３８のプライマー（リバース）で行う。
【００３５】
配列番号３９および４０に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.AF316642）の第12208番目から第12232番目の塩基配列および第12456番目から第12478番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（271bp）を増幅するために設計されている。血清型18F/18A/18B/18Cを検出するためには、PCRを配列番号３９のプライマー（フォワード）と配列番号４０のプライマー（リバース）で行う。
【００３６】
配列番号４１および４２に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.U09239）の第7693番目から第7715番目の塩基配列および第7917番目から第7941番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（249bp）を増幅するために設計されている。血清型19Fを検出するためには、PCRを配列番号４１のプライマー（フォワード）と配列番号４２のプライマー（リバース）で行う。
【００３７】
配列番号４３および４４に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.AF094575）の第9260番目から第9282番目の塩基配列、および第9482番目から第9506番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（247bp）を増幅するために設計されている。血清型19Aを検出するためには、PCRを配列番号４３のプライマー（フォワード）と配列番号４４のプライマー（リバース）で行う。
【００３８】
配列番号４５および４６に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931679）の第7711番目から第7732番目の塩基配列、および第7988番目から第8010番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（300bp）を増幅するために設計されている。血清型20を検出するためには、PCRを配列番号４５のプライマー（フォワード）と配列番号４６のプライマー（リバース）で行う。
【００３９】
配列番号４７および４８に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931682）の第13190番目から第13211番目の塩基配列、および第13523番目から第13543番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（354bp）を増幅するために設計されている。血清型22F/22Aを検出するためには、PCRを配列番号４７のプライマー（フォワード）と配列番号４８のプライマー（リバース）で行う。
【００４０】
配列番号４９および５０に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.AF057294）の第8583番目から第8604番目の塩基配列、および第8806番目から第8827番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（245bp）を増幅するために設計されている。血清型23Fを検出するためには、PCRを配列番号４９のプライマー（フォワード）と配列番号５０のプライマー（リバース）で行う。
【００４１】
配列番号５１および５２に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931683.1）の第8257番目から第8276番目の塩基配列、および第8341番目から第8359番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（103bp）を増幅するために設計されている。血清型23Aを検出するためには、PCRを配列番号５１のプライマー（フォワード）と配列番号５２のプライマー（リバース）で行う。
【００４２】
配列番号５３および５４に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931702）の第11129番目から第11156番目の塩基配列、および第11436番目から第11466番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（338bp）を増幅するために設計されている。血清型33F/33A/37を検出するためには、PCRを配列番号５３のプライマー（フォワード）と配列番号５４のプライマー（リバース）で行う。
【００４３】
配列番号５５および５６に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931703.1）の第7915番目から第7937番目の塩基配列および第8042番目から第8061番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwzy遺伝子の断片（147bp）を増幅するために設計されている。血清型34を検出するためには、PCRを配列番号５５のプライマー（フォワード）と配列番号５６のプライマー（リバース）で行う。
【００４４】
配列番号５７および５８に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931707.1）の第8258番目から第8288番目の塩基配列および第8343番目から第8364番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwcr0遺伝子の断片（107bp）を増幅するために設計されている。血清型34/35Fを検出するためには、PCRを配列番号５７のプライマー（フォワード）と配列番号５８のプライマー（リバース）で行う。
【００４５】
配列番号５９および６０に示される塩基配列はそれぞれ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)ゲノム（GenBank Accession No.CR931705.1）の第10477番目から第10496番目の塩基配列および第10601番目から第10620番目の塩基配列に相補的な塩基配列に相当する。該配列はwcrH遺伝子の断片（144bp）を増幅するために設計されている。血清型35Bを検出するためには、PCRを配列番号５９のプライマー（フォワード）と配列番号６０のプライマー（リバース）で行う。
【００４６】
本発明のプライマーセットを構成するプライマーとしては、前記の各配列番号に示される塩基配列からなる核酸以外にも、各配列番号で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体もまた含まれる。
【００４７】
「各配列番号で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、上記した各配列番号で示される塩基配列にそれぞれ相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。例えば、「配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによって肺炎球菌遺伝子の特定の領域をPCR増幅させることのできる機能を有する。同様に「配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによって肺炎球菌遺伝子の特定の領域をPCR増幅させることのできる機能を有する。かかる変異体は、プライマーとしての機能が維持される範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドから１個または複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入または付加されている。
【００４８】
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのヌクレオチド配列のGC含量およびハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring HarborLaboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。
【００４９】
本発明のプライマーセットを構成する各プライマーは、核酸からなる。本発明において、核酸とはヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子のことを指す。例えば、DNA、RNA、RNAおよびDNAが混合した重合体が挙げられる。これら本発明のプライマーセットを構成するプライマーは一本鎖核酸であることが好ましい。また、該核酸はビオチン化、ジゴキシゲニン化等の修飾を施した分子、フルオレセイン、ローダミン等の蛍光色素で修飾を施した分子、または放射性同位体を取り込ませた分子であってもよい。
【００５０】
本発明のプライマーセットを構成するプライマーは、天然物のDNA/RNAをヌクレアーゼ等の酵素を用いて調製することもできるし、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて合成することにより調製することもできる。
【００５１】
本発明のプライマーセットを構成するプライマーは単離または精製されていることが好ましい。「単離または精製」とは、天然にある状態から目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離または精製されたプライマーの純度（全核酸中に含まれる目的とするプライマーの割合（ｗ／ｗ）％））は、通常50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上（例えば100％）である。
【００５２】
本発明のプライマーセットのうち上記（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）の各プライマーセットは、各血清型を高い特異性で検出可能とするべく、新たに設計されたものである。
【００５３】
上記本発明のプライマーセットを複数組み合わせ、ＰＣＲを行うことにより、肺炎球菌の複数の血清型を、一括して検出することが可能となる。従って、本発明は、上記本発明のプライマーセットの中から選択される２以上のプライマーセットを含む、プライマーセットの組み合わせを提供する。
【００５４】
一態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、上記（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）からなる群から選択される、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のプライマーセットを含む。本態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、最も好ましくは、上記（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）の全てのプライマーセットを含む（態様１）。
【００５５】
他の態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、上記（４）〜（６）、（８）、（９）、（１１）、（１３）〜（１５）、（２６）、および（２８）〜（３０）からなる群から選択される少なくとも１（好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２、最も好ましくは１３（全て））のプライマーセット、および上記（２）、（３）、（７）、（１０）、（１２）、（１６）〜（２５）および（２７）からなる群から選択される少なくとも１（好ましくは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５、最も好ましくは１６（全て））のプライマーセットを含む（態様２）。本態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、最も好ましくは、上記（２）〜（３０）の全てのプライマーセットを含む。
【００５６】
上記の態様１および２において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、プライマーセット（１）を更に含むことができる（態様３）。プライマーセット（１）を更に含むことにより、血清型に係わらず肺炎球菌の有無を判別した上で、血清型の判別を実施することが可能となる。
【００５７】
更なる他の態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、少なくとも上記（５）、（７）、（８）、（１１）、（１７）、（２０）、（２１）および（２５）のプライマーセットを含む（態様４）。（５）、（７）、（８）、（１１）、（１７）、（２０）、（２１）および（２５）は、肺炎球菌の７価肺炎球菌結合型ワクチン（ファイザー株式会社；プレベナー（登録商標））が対応する血清型の菌を検出し得るプライマーセットである。
【００５８】
更なる他の態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、少なくとも上記（２）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１１）、（１７）、（２０）、（２１）、（２２）および（２５）のプライマーセットを含む（態様５）。（２）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１１）、（１７）、（２０）、（２１）、（２２）および（２５）は、肺炎球菌の13価肺炎球菌結合型ワクチン（ファイザー株式会社；プレベナー13（登録商標））が対応する血清型の菌を検出し得るプライマーセットである。
【００５９】
更なる他の態様において、本発明のプライマーセットの組み合わせは、少なくとも上記（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）および（２７）を含む（態様６）。（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１５）、（１６）、（１７）、（１８）、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）および（２７）は、肺炎球菌の23価肺炎球菌多糖体ワクチン（MERCK&CO.,INC；ニューモバックス（登録商標）NP）が対応する血清型の菌を検出し得るプライマーセットである。
【００６０】
本発明はまた、上記本発明のプライマーセット、または本発明のプライマーセットの組み合わせを用いて、被験対象から採取した試料から肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、肺炎球菌の検出方法および肺炎球菌の血清型の判別方法を提供する。
【００６１】
本発明の検出方法および判別方法が適用できる対象は特に制限されないが、例えば、肺炎球菌に感染しているおそれがあるか、もしくは感染していることが疑われる哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。好ましくはヒトである。
【００６２】
本発明の検出方法および判別方法に用いられる試料としては、被験対象である上記哺乳動物から採取されるものであって、検出対象である肺炎球菌遺伝子またはその産物（例、DNA、RNA、それらの分解産物など）を含有するものであれば特に制限されない。例えば、全血、血球成分、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、汗、唾液、咽頭ぬぐい液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、粘膜（例えば、鼻咽頭など）、生検により得られる細胞もしくは組織標本などが挙げられる。迅速且つ簡便に採取することができ、動物への侵襲が少ないなどの点から、咽頭ぬぐい液が好ましいが、それらに限定されない。
【００６３】
本発明の検出方法および判別方法は、上記した哺乳動物から採取した試料における、肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする。本発明の検出方法で検出される肺炎球菌の血清型および本発明の判別方法で判別される肺炎球菌の血清型としては、血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6A/6B/6C/6D、血清型6C/6D、血清型7F/7A、血清型8、血清型9V/9A、血清型9N/9L、血清型10A、血清型10F/10C、血清型11A/11D/11E/11F、血清型12F/12A/12B/44/46、血清型14、血清型15B/15C、血清型17F、血清型18F/18A/18B/18C、血清型19F、血清型19A、血清型20、血清型22F/22A、血清型23F、血清型23A、血清型33F/33A/37、血清型34、血清型34/35Fおよび血清型35Bが挙げられる。
【００６４】
肺炎球菌疾患にかかるリスクがあるヒトを対象として、７価肺炎球菌結合型ワクチン、13価肺炎球菌結合型ワクチンまたは23価肺炎球菌多糖体ワクチンが調製／使用されているが、これは異なる7種、13種または23種の血清型の肺炎球菌に対応するためのワクチンである。該7種の血清型は血清型4、血清型6B、血清型9V、血清型14、血清型18C、血清型19Fおよび血清型23Fであり、本発明の方法によって検出可能な血清型にすべて含まれる。該13種の血清型は血清型1、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6A、血清型6B、血清型7F、血清型9V、血清型14、血清型18C、血清型19A、血清型19Fおよび血清型23Fであり、本発明の方法によって検出可能な血清型にすべて含まれる。該23種の血清型は血清型1、血清型2、血清型3、血清型4、血清型5、血清型6A/6B、血清型7F、血清型8、血清型9V、血清型9N、血清型10A、血清型11A、血清型12F、血清型14、血清型15B、血清型17F、血清型18C、血清型19F、血清型19A、血清型20、血清型22F、血清型23Fおよび血清型33Fであり、本発明の方法によって検出可能な血清型にすべて含まれる。
【００６５】
被験対象から採取した試料における肺炎球菌遺伝子または肺炎球菌血清型の検出は、該試料からDNA（例：肺炎球菌ゲノムDNA）画分またはRNA（例：肺炎球菌RNA、mRNA）画分を調製し、該画分中に含まれる肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することにより調べることができる。DNA画分の調製は、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法など、RNA画分の調製は、グアニジン-CsCl超遠心法、AGPC法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のDNA／RNA抽出用キット（例：QIAamp Viral DNA Mini Kit, QIAamp Viral RNA Mini Kit; QIAGEN製、等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の肺炎球菌のDNAまたはRNAを調製することができる。DNAまたはRNA画分中の肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、DNAチップ解析等）を用いる方法、あるいはPCR（RT-PCR、競合PCR、リアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、多項目並列PCR、等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よく肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出できる点で競合PCRやリアルタイムPCRなどの定量的PCR法が、また、複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得るなどの点でDNAチップ解析が好ましいが、迅速性・定量性・複数遺伝子を同時に検出可能であるという点で、リアルタイムPCRや多項目並列PCRが特に好ましい。
【００６６】
DNAチップ解析による場合、例えば、上記のようにして調製したRNA画分から、逆転写反応によりＴ７プロモーター等の適当なプロモーターを導入したｃDNAを合成し、さらにRNAポリメラーゼを用いてcRNAを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたcRNAが得られる）。この標識cRNAを、プローブを固相化したチップと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、肺炎球菌遺伝子を検出することができる。
【００６７】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。
【００６８】
別の好ましい実施態様によれば、肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出する方法として定量的PCR法が用いられる。定量的PCRとしては、例えば、競合PCRやリアルタイムPCR、マルチプレックスPCR、多項目並列PCRなどがある。本発明の検出方法および判別方法においては、特に同時に多種類の肺炎球菌血清型を検出可能であることから、リアルタイムPCRおよび多項目並列PCRが好適に用いられる。
【００６９】
PCRにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、例えば、検出対象の肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を特異的に検出し得る核酸プライマーを挙げることができる。１つの好ましい態様においては、本発明の検出方法および判別方法に用いられる核酸プライマーとしては、例えば、上記した本発明のプライマーセットが挙げられる。
【００７０】
マルチプレックスPCRとは、一または複数の標的核酸の複数の標的配列を一の反応容器内で同時に増幅する方法である。各標的配列を増幅し得るプライマーセットを一反応容器に入れて単一のPCR操作により、標的配列を増幅させる。通常、PCR反応は一の標的配列を増幅することを目的として一回のPCR操作につき、一種類プライマーセットを用いるが、マルチプレックスPCRでは複数の標的配列を増幅し得るプライマーセットを利用することにより、単一PCRに比べて標的DNAの増幅に要する時間、労働力および試薬コストを大きく低減させることが可能となる。また、微量試料をも対象とすることができる。また、マルチプレックスPCRでは、２回以上のPCRを反復して行ってもよい。その際、２回目以降のPCRはnested PCRまたはhemi-nested PCRであることが好ましい。Nested PCRは、直前のPCRで用いたプライマーセットより内側に設計したプライマーセットを用いて、２段階のPCRを行う方法であり、目的とする領域からの直前のPCR産物を鋳型にして、直前に使用したプライマー位置より、５’および３’側ともに内側に新たにプライマーを設計して行う方法をnested PCR、５’または３’側のいずれかのみの内側に新たにプライマーを設計して行う方法をhemi-nested PCRという。PCRは、二つのプライマーセットの標的配列に対する特異性に基づいて特定の断片を増幅する手法であるが、プライマーの類似配列によってミススプライシングがときどき起こり、標的配列の増幅とともに非特異的な増幅が生じうる。この非特異的断片を含むPCR生成物を鋳型にしてnested PCRまたはhemi-nested PCRを行うことにより、非特異的な断片のなかにnested PCRプライマーに類似した配列が存在する確率が極めて低くなるため、特異的配列のみを増幅することができる。
【００７１】
マルチプレックスPCRによって、複数の病原体を増幅対象として、同時に検出を試みた場合であっても、プライマーセット同士の相互作用等の要因により、検出されない場合もある。そこで、各プライマーセットによる増幅を、他のプライマーセットとは独立した反応系で行う、リアルタイムPCRまたは多項目並列PCRが好適に使用される。
【００７２】
リアルタイムPCRでは、1反応系において本発明のプライマーセットの一組のフォワードおよびリバースプライマーによって反応を行う。該反応系には、被験対象から採取した試料または該試料から調製した核酸等、塩基の混合物（dNTP mix）、DNAポリメラーゼ等の酵素などの他、生成されるPCR産物の量を定量するため、DNAの塩基対にインターカレートして蛍光を発する蛍光色素（例、SYBR（登録商標）GREEN）等が添加され得る。該蛍光色素の蛍光強度が生成したDNA量を反映するので、反応時間中にこの蛍光量をモニターしていくことで、DNA合成量をリアルタイムで追跡することができる。該反応を本発明のプライマーセットの組み合わせに含まれる、複数のプライマーセット（フォワードおよびリバースプライマー）について複数の反応系でそれぞれ別々に、同時に行うことにより、肺炎球菌の複数の血清型を同時に決定することができる。生成されるPCR産物の特異性は、融点分析（熱解離曲線分析）により確認することができる。例えば、上記プライマーセット（２）のフォワードおよびリバースプライマーを用いたリアルタイムPCRにおいて、時間軸に対して直線的な蛍光量の上昇、即ちPCR産物の特異的な増幅が確認され、融点分析によって該PCR産物の特異性が確認されれば、被験対象から採取した試料中に血清型1の肺炎球菌が含まれていると判定することができる。
【００７３】
定量的な測定に関しては、各血清型の肺炎球菌のDNAを調製して標準試料とし、該標準試料を段階希釈して調製した検体にリアルタイムPCRを適用し、ベースラインからの立ち上がりサイクル（Cp）を決定して試料中の遺伝子のコピー数を示す検量線を作成することができる。この検量線を用いて、任意の検体中について行ったリアルタイムPCRデータについてのCpから該検体中の遺伝子コピー数を求めることができる。逆に、特異的なPCR産物の増幅が観察されなければ、被験対象から採取した試料中に血清型1の肺炎球菌が含まれていないと判定することができる。
【００７４】
（３）〜（３０）のプライマーセットにおいても、上記と同様にして、被験対象から採取した試料中に各血清型の肺炎球菌が含まれているか、含まれていないのかを判定することができる。また、検体中の遺伝子コピー数を定量することができる。
【００７５】
肺炎球菌の血清型をより効率よく同時に決定するため、Fluidigm社BiomarkTM HD Dynamic ArrayTM System等を用いて、多項目並列PCRを用いることができる。当該システムは、マイクロフルーディクス技術により1サンプル当たり48または96のアッセイ解析、つまり48サンプル&試薬では2,304反応、96サンプル&試薬では9,216反応を一度に解析できる集積流体回路(IFC: Integrated Fluidic Circuit)による遺伝子解析システムである。当該システムを用いて、上記と同様に融点分析、最小検出DNAコピー数の定量を行うことができる。
【００７６】
本発明のプライマーセット（１）〜（３０）は、特にアニーリング温度について、増幅特異性を損なうことなく、ＰＣＲにおける増幅効率がほぼ等しくなるように設計されている。プライマーセット（１）〜（３０）の好適なアニーリング温度は、５９℃である。従って、本発明のプライマーセットの組み合わせ（例えば、プライマーセット（２）〜（３０）を含む組み合わせ、プライマーセット（１）〜（３０）を含む組み合わせ）によるＰＣＲ反応を、使用される全てのプライマーセットについて、同一温度条件下で、同時に実施して、被験対象から採取した試料から肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出することにより、肺炎球菌の複数の血清型を、一括して判別することができる。当該ＰＣＲにおける好適な温度条件としては、アニーリング温度が５９℃であり、その他の温度条件（変性温度、エクステンション温度）は、ＰＣＲ増幅が適切に進行可能なように、設定することが可能である。例えば、変性温度：９８℃、アニーリング及びエクステンション温度：５９℃の２段階温度変化のサイクルを繰り返す。当該ＰＣＲ反応は、好適には、プライマーセットごとに別々の反応系で実施される。
【００７７】
本発明はまた、上記本発明の検出方法および判別方法において好ましく使用され得る、肺炎球菌遺伝子またはその転写産物の検出用キットを提供する。該キットは、上記本発明のプライマーセット、又は上記本発明のプライマーセットの組み合わせを含む。
【００７８】
本発明のキットによって検出され得る肺炎球菌またはその血清型は、上記に記載した検出方法および判別方法で検出される肺炎球菌またはその血清型と同様である。
【００７９】
各プライマーは、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。
【００８０】
本発明のキットに含まれる、各プライマーセットは、同一の方法（例：サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、DNAアレイ技術、定量RT-PCR、マルチプレックスPCR等）により肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出し得るように構築されていることが特に好ましい。
【００８１】
本発明のキットの構成として、上記の各プライマーセットがそれぞれ別個に提供されるもの［例：プライマーセットがリアルタイム定量PCR用プライマーとして機能する場合等］、異なる複数のプライマーセットが同一の試薬中に混合して含有されて提供されるもの［例：プライマーセットがマルチプレックスPCR用プライマーとして機能する場合等］などが例示されるが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明のキットは、上記本発明のプライマーセット、または上記本発明のプライマーセットの組み合わせに加えて、該プライマーセットにより肺炎球菌遺伝子またはその転写産物を検出するための反応において必要な他の物質を含んでいてもよい。該物質が、プライマーセットと共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質である場合には、プライマーセットと混合してキットに含めることができる。あるいは、当該他の物質はプライマーセットとは混合せずに別個に提供されてもよい。当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ等が挙げられる。競合PCRやリアルタイムPCRを用いる場合は、competitor核酸や蛍光試薬（上記インターカレーターや蛍光プローブ等）などをさらに含むことができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００８４】
［実施例１］
１．血清型既知臨床分離株からの肺炎球菌標準DNAの調製
長崎大学熱帯医学研究所臨床感染症分野にて収集した肺炎球菌臨床分離株のうちタイピング血清を用いた血清学的診断で血清型を再確認したもの22株（血清型 1、3、4、6B、6C、7F、9V、10F、10A、11A、14、15B、18C、19F、19A、22F、23F、23A、33F、34、35F、35B）を選択した。保有しない血清型（2、5、8、9N、12F、17F、20）7種については公的リソースであるAmerican Type Culture Collection (ATCC)より入手した。これら併せて29種の菌を5％ヒツジ血添加trypticase soy agar (TSA)培地にて一晩培養したのち、Qiamp DNA mini kit (Qiagen)を用いてDNAを調製した。DNA濃度をNano-Drop 分光光度計(Thermo scientific)により測定した波長260nmの紫外線の吸収から算出し、肺炎球菌平均ゲノムサイズ（GenBankに登録された数株の情報を用いた）とAvogadro数から単位体積中のcopy数に換算し、copy数を揃えた標準DNAとして用いた。また、肺炎球菌以外にStreptococcus oralis, Haemophillus influenzea, Moraxiella catarrhalis, Staphylococcus aureusのDNAを調製し、肺炎球菌特異的反応の陰性対照とした。
【００８５】
２．PCRプライマーの設計
異なる血清型の肺炎球菌について(i)SYBR Green等の2重鎖DNA結合蛍光色素による定量リアルタイムPCR法において十分な反応効率を得られるように増幅されるDNA断片長を100bpから400bpの範囲とし、(ii)BiomarkTM HD Dynamic ArrayTM System（ナノ流路技術を応用した同時多項目並列PCRプラットホーム）に適用可能とするため、PCRサイクルの条件、特にアニーリング温度について、以下のすべての反応がほぼ等しい増幅効率を得るように、PCRプライマーの塩基配列を設計した。
【００８６】
設計した反応は
(1) 肺炎球菌特異的（すべての血清型の肺炎球菌を同定する）反応、
(2) 血清型 1特異的反応、
(3) 血清型 2特異的反応、
(4) 血清型 3特異的反応、
(5) 血清型 4特異的反応、
(6) 血清型 5特異的反応、
(7) 血清型 6A/6B/6C/6D特異的反応、
(8) 血清型 6C/6D特異的反応、
(9) 血清型 7F/7A特異的反応、
(10) 血清型 8特異的反応、
(11) 血清型 9V/9A特異的反応、
(12) 血清型 9N/9L特異的反応、
(13) 血清型 10A特異的反応、
(14) 血清型 10F/10C特異的反応、
(15) 血清型 11A/11D/11E/11F特異的反応、
(16) 血清型 12F/12A/12B/44/46特異的反応、
(17) 血清型 14特異的反応、
(18) 血清型 15B/15C特異的反応、
(19) 血清型 17F特異的反応、
(20) 血清型 18F/18A/18B/18C特異的反応、
(21) 血清型 19F特異的反応、
(22) 血清型 19A特異的反応、
(23) 血清型 20特異的反応、
(24) 血清型 22F/22A特異的反応、
(25) 血清型 23F特異的反応、
(26) 血清型 23A特異的反応、
(27) 血清型 33F/33A/37特異的反応、
(28) 血清型 34特異的反応、
(29) 血清型 34/35F特異的反応、
(30) 血清型 35B特異的反応、
の30種であり、そのそれぞれが以下ようなGenBank登録配列の、同じく以下に示された位置のセンス鎖配列に相当するFオリゴヌクレオチドプライマーと、それに向かい合って位置するアンチセンス鎖配列に相当するRオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで示された長さのDNA断片を増幅産物として生成するように設計した。
【００８７】
(1) 肺炎球菌特異的（すべての血清型の肺炎球菌を同定する）反応： GenBank登録番号AE005672 （lytA遺伝子）、Fプライマー（1840961から1840980まで）TCGTGCGTTTTAATTCCAGC（配列番号１）、Rプライマー（1841066から1841047まで）TGACGGACTACCGCCTTTAT（配列番号２）、増幅DNA断片長106bp（新規設計）。
(2) 血清型 1特異的反応： GenBank登録番号Z83335（wzy遺伝子）、Fプライマー（10307から10328まで）GGGACTTTAATTTTATGCAGTG（配列番号３）、Rプライマー（10576から10554まで）CACAATGGCTTTAGAAGGTAGAG（配列番号４）、増幅DNA断片長270bp（F. Kongらによる）。
(3) 血清型 2特異的反応： GenBank登録番号CR931633（wzy遺伝子）、Fプライマー（10271から10301まで）TATCCCAGTTCAATATTTCTCCACTACACC（配列番号５）、Rプライマー（10560から10531まで）ACACAAAATATAGGCAGAGAGAGACTACT（配列番号６）、増幅DNA断片長290bp（CDCによる）。
(4) 血清型 3特異的反応： GenBank登録番号CR931634.2（galU遺伝子）、Fプライマー（9251から9269まで）GTGAATTTGTGGGCAAACG（配列番号７）、Rプライマー（9382から9360まで）ATTGCTTACCAAGTGCAATAACG（配列番号８）、増幅DNA断片長132bp（新規設計）。
(5) 血清型 4特異的反応： GenBank登録番号CR931635.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（9999から10019まで）GCGGGTAGGATTTTAACAGG（配列番号９）、Rプライマー（10118から10099まで）TCCTGAACTAGCTGCCTCTG（配列番号１０）、増幅DNA断片長120bp（新規設計）。
(6) 血清型 5特異的反応： GenBank登録番号CR931637.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（6132から6154まで）CAACTTCTGATTATGCCTTTGTG（配列番号１１）、Rプライマー（6257から6232まで）CAAAGCAATAGTGCTAATTAAACAAC（配列番号１２）、増幅DNA断片長126bp（新規設計）。
(7) 血清型 6A/6B/6C/6D特異的反応： GenBank登録番号AF316640 （wzy遺伝子）、Fプライマー（9263から9284まで）TCAACCTGCAGTAATTTTAACA（配列番号１３）、Rプライマー（9555から9528まで）CTACTTTCTGAATTTCACGGATATAAAG（配列番号１４）、増幅DNA断片長293bp（F. Kongらによる）。
(8) 血清型 6C/6D特異的反応：GenBank登録番号EF538714.1（wci Nbeta遺伝子）、Fプライマー（7223から7242まで）TGGGCGAACTGAAGAACTAA（配列番号１５）、Rプライマー（7341から7322まで）TCGAGAAAAGAACTGCCTGA（配列番号１６）、増幅DNA断片長119bp（新規設計）。
(9) 血清型 7F/7A特異的反応：GenBank登録番号CR931643.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（14685から14709まで）CAAACTATTACAGTGGGAATTACGG（配列番号１７）、Rプライマー（14814から14794まで）GGACCATACAATAAGCGCAAT（配列番号１８）、増幅DNA断片長130bp（新規設計）。
(10) 血清型 8特異的反応： GenBank登録番号CR931644 （wzy遺伝子）、Fプライマー（11193から11223まで）GAAGAAACGAAACTGTCAGAGCATTTACAT（配列番号１９）、Rプライマー（11393から11364まで）CTATAGATACTAGTAGAGCTGTTCTAGTCT（配列番号２０）、増幅DNA断片長201bp（CDCによる）。
(11) 血清型 9V/9A特異的反応：GenBank登録番号CR931648.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（9967から9990まで）GGTTCAAAGTCAGACAGTGAATCT（配列番号２１）、Rプライマー（10088から10066まで）AAAAGAGGCTTTCAATTGTTGTT（配列番号２２）、増幅DNA断片長122bp（新規設計）。
(12) 血清型 9N/9L特異的反応：GenBank登録番号CR931647 （wzy遺伝子）、Fプライマー（9818から9837まで）TCAATGGCGACTTTATTTGC（配列番号２３）、Rプライマー（10179から10156まで）AGTCTATTATCTCCTGTAGGGTGC（配列番号２４）、増幅DNA断片長362bp（F. Kongらによる）。
(13) 血清型 10A特異的反応：GenBank登録番号CR931649.1（wcrG遺伝子）、Fプライマー（11565から11584まで）AGACGACAAGATTGCGACAG（配列番号２５）、Rプライマー（11685から11666まで）AAGGTGATCCGCTACCACAT（配列番号２６）、増幅DNA断片長121bp（新規設計）。
(14) 血清型 10F/10C特異的反応：GenBank登録番号CR931652.1（wzx遺伝子）、Fプライマー（12556から12580まで）GATCTATGATCAGGCACTTAAGTTG（配列番号２７）、Rプライマー（12675から12656まで）TTAACCGCTTTGTGTTCACC（配列番号２８）、増幅DNA断片長120bp（新規設計）。
(15) 血清型 11A/11D/11E/11F特異的反応： GenBank登録番号CR931653.1（wzx遺伝子）、Fプライマー（11646から11670まで）GTTCAGGTGATTTCCCAATATAGTG（配列番号２９）、Rプライマー（11754から11733まで）TCGTTAAAATCAACAGCAACTG（配列番号３０）、増幅DNA断片長109bp（新規設計）。
(16) 血清型 12F/12A/12B/44/46特異的反応： GenBank登録番号CR931660.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（8914から8931まで）TGAATATGGACGGTGGAG（配列番号３１）、Rプライマー（9155から9138まで）AGCAAAGAAAGCCGAAAG（配列番号３２）、増幅DNA断片長242bp（F. Kongらによる）。
(17) 血清型 14特異的反応： GenBank登録番号X85787 （wzy遺伝子）、Fプライマー（7376から7398まで）CCTACTTCCAAAACAGTTTATGC（配列番号３３）、Rプライマー（7504から7481まで）GTCCATAGCACCATACAAAAAGAC（配列番号３４）、増幅DNA断片長129bp（F. Kongらによる）。
(18) 血清型 15B/15C特異的反応：GenBank登録番号CR931664 （wzy遺伝子）、Fプライマー（7797から7818まで）TAATAAGCGGATGATTGTAGCG（配列番号３５）、Rプライマー（8148から8124まで）TATACTGATTAACTTTCCAGATGGG（配列番号３６）、増幅DNA断片長352bp（F. Kongらによる）。
(19) 血清型 17F特異的反応：GenBank登録番号CR931670 （wzy遺伝子）、Fプライマー（13988から14009まで）AGAGGGATTGTTGAAGGTATTC（配列番号３７）、Rプライマー（14295から14272まで）AGTAGTCTCGCATTTCTATCATCC（配列番号３８）、増幅DNA断片長308bp（F. Kongらによる）。
(20) 血清型 18F/18A/18B/18C特異的反応： GenBank登録番号AF316642 （wzy遺伝子）、Fプライマー（12208から12232まで）AATTGTTCTTTTCCTGTACTCAGTC（配列番号３９）、Rプライマー（12478から12456まで）CGAACCATTGAAACTATCATCTG（配列番号４０）、増幅DNA断片長271bp（F. Kongらによる）。
(21) 血清型 19F特異的反応：GenBank登録番号U09239 （wzy遺伝子）、Fプライマー（7693から7715まで）TCAGTATTTGCACTGGTTAATTC（配列番号４１）、Rプライマー（7941から7917まで）AAGAACAAGGTTGTATATTTCCTTC（配列番号４２）、増幅DNA断片長249bp（F. Kongらによる）。
(22) 血清型 19A特異的反応：GenBank登録番号AF094575 （wzy遺伝子）、Fプライマー（9260から9282まで）TGTATTTGCCCTTATTAATGTGC（配列番号４３）、Rプライマー（9506から9482まで）AAGTGCAAGATTATGAATCTCTCTC（配列番号４４）、増幅DNA断片長247bp（F. Kongらによる）。
(23) 血清型 20特異的反応： GenBank登録番号CR931679 （wzy遺伝子）、Fプライマー（7711から7732まで）CTTTATCAGGAATACGCCAATC（配列番号４５）、Rプライマー（8010から7988まで）CTGTATAATAACGAGAACCAACG（配列番号４６）、増幅DNA断片長300bp（F. Kongらによる）。
(24) 血清型 22F/22A特異的反応：GenBank登録番号CR931682 （wzy遺伝子）、Fプライマー（13190から13211まで）AGGATGCAGTAGATACCAGTGG（配列番号４７）、Rプライマー（13543から13523まで）TATAAACGGAGGTTGTTGTCC（配列番号４８）、増幅DNA断片長354bp（F. Kongらによる）。
(25) 血清型 23F特異的反応：GenBank登録番号AF057294 （wzy遺伝子）、Fプライマー（8583から8604まで）TGATAGTGAACTTGGGATTGTC（配列番号４９）、Rプライマー（8827から8806まで）CTTTATCGGTAAGGTGGATAAG（配列番号５０）、増幅DNA断片長245bp（F. Kongらによる）。
(26) 血清型 23A特異的反応：GenBank登録番号CR931683.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（8257から8276まで）CTGGGAATTGGCACTCTTCT（配列番号５１）、Rプライマー（8359から8341まで）GCCGCAAAGAGATACGAAC（配列番号５２）、増幅DNA断片長103bp（新規設計）。
(27) 血清型 33F/33A/37特異的反応：GenBank登録番号CR931702 （wzy遺伝子）、Fプライマー（11129から11156まで）GAAGGCAATCAATGTGATTGTGTCGCG（配列番号５３）、Rプライマー（11466から11436まで）CTTCAAAATGAAGATTATAGTACCCTTCTAC（配列番号５４）、増幅DNA断片長338bp（CDCによる）。
(28) 血清型 34特異的反応： GenBank登録番号CR931703.1（wzy遺伝子）、Fプライマー（7915から7937まで）TGACTGGTAGTAGAGGGTCCTTG（配列番号５５）、Rプライマー（8061から8042まで）GAGGAGCAACTGCCACTACA（配列番号５６）、増幅DNA断片長147bp（新規設計）。
(29) 血清型 34/35F特異的反応：GenBank登録番号CR931707.1（wcrO遺伝子）、Fプライマー（8258から8288まで）TATTAGTATTTGTGAAGAAAATAACCTGACC（配列番号５７）、Rプライマー（8364から8343まで）TATCAATATCGTCATCCCAAGG（配列番号５８）、増幅DNA断片長107bp（新規設計）。
(30) 血清型 35B特異的反応：GenBank登録番号CR931705.1（wcrH遺伝子）、Fプライマー（10477から10496まで）TACGCTTTCCCAAGTTTCCT（配列番号５９）、Rプライマー（10620から10601まで）CTCCGTACATTGGATGTTGG（配列番号６０）、増幅DNA断片長144bp（新規設計）。
F. Kongらによる：非特許文献１
CDCによる：非特許文献２
【００８８】
３．PCRの実施
上記30種の反応を標準DNAの段階希釈検体について適用する（図２）ことで、それぞれの反応の反応特異性（図１）、PCRサイクル1回あたりの増幅効率、最小検出DNAコピー数（検出感度）、定量性の直線域（図３）を評価した。段階希釈検体の作製に当たっては、低濃度でのDNAの非特異的吸着による損失を防ぐ目的で標的配列を有しない配列既知のDNAとしてラムダファージDNAを一定濃度（1ng/μl）で含むように、1反応（2μl）の3x106コピーから3コピーの7段階10倍希釈系列を、再現性検証のために作成日を変えて3回作製した。リアルタイムPCR測定機はRoche社Light cycler 480を用い、試薬はBioRad社 Sso FAST EvaGreenリアルタイムPCRキットを標準プロトコールに従って用いた。機器設定は、98℃、3分(ramp rate 4.8℃/sec)ののち、 98℃、30秒 (ramp rate 4.8℃/sec)と59℃、30秒 (ramp rate 2.5℃/sec)の2段階のサイクルを45回繰り返し、各サイクルの59℃、30秒の終了時に蛍光強度を測定した（図４）。非特異的反応の偽陽性を除外する目的で、PCR終了後にDNAの融点分析（熱解離曲線分析）を65℃から98℃の範囲で実施した(continuously at the ramp rate of 0.11℃/sec)（図５および図６）。異常な熱解離曲線を示す反応を偽陽性として除外したのち、各反応でのサイクル毎の蛍光強度時系列データから、ベースラインからの立ち上がりサイクル（Cp）を決定し、標準段階希釈検体のCpをプロットした検量線を用いて検体中の標的配列コピー数を算定した（図７）。
【００８９】
４．多項目並列PCRの実施
Fluidigm社BiomarkTM HD Dynamic ArrayTM Systemの推奨標準プロトコールに従い、ナノ流路技術を応用した同時多項目並列PCRプラットホームにのせる前段階として、30種の標的配列すべてを一括して全般的に増幅させるSTA (Specific Target Amplification)反応を適用した。STAはApplied Biosystem社TaqMan PreAmp Master Mixを用い、標準プロトコールに従って30種の標的配列に対応する60種のプライマーを各々最終濃度50nMとなるように調製し、14サイクルのPCR（98℃、10分ののち、98℃、15秒と59℃、4分の2段階のサイクルを14回繰り返し）を行なった。ナノ流路技術を応用した同時多項目並列PCRは、48.48 Dynamic Array IFC chipの検体注入ウェルにSTA産物の5倍希釈液を注入し、アッセイウェルには各プライマーの組とBioRad社 Sso FAST EvaGreenリアルタイムPCRキットの増幅試薬を注入して、（検体注入ウェル）ｘ（アッセイウェル）の総当たりの組み合わせでのリアルタイムPCRをBiomarkTM HD Dynamic ArrayTMSystemの測定機を用いて実施した（図８）。機器設定は98℃、3分ののち、98℃、30秒と59℃、30秒(ramp rate 2℃/sec)の2段階のサイクルを40回繰り返し、非特異的反応の偽陽性を除外する目的で、PCR終了後DNAの融点分析（熱解離曲線分析）を65℃から98℃の範囲で実施した (continuously at the ramp rate of 0.11℃/sec)（図９）。異常な熱解離曲線を示す反応を偽陽性として除外したのち、各反応でのサイクル毎の蛍光強度時系列データから、ベースラインからの立ち上がりサイクル（Cp）を決定し、標準段階希釈検体のCpをプロットした検量線を用いて検体中の標的配列コピー数を算定した。従来法と本発明の方法との効率の比較を図１０に示す。
【００９０】
［実施例２］
実施例にて最適化した実験条件下で以下の試験を実施した。
【００９１】
ベトナム中部ニャチャン市で、5歳未満小児の肺炎患者と健常対照群における肺炎球菌保菌率およびその血清型分布を比較した。
【００９２】
現在、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)には莢膜を構成する多糖の構造による94の血清型(serotype)が存在し、ワクチンによって血清型特異的防御免疫を賦与可能である。また、肺炎球菌はある頻度で健康なヒトの上気道に定着しているが、いくつかの血清型の菌は肺炎、中耳炎、髄膜炎、敗血症等の感染症(侵襲性肺炎球菌感染症 invasive pneumococcal diseases)を、より起こしやすいことから、それらに向けたワクチンが開発されている。
【００９３】
ベトナムでは小児の肺炎球菌ワクチンが普及し始めているが、未接種集団における保菌・感染の実態は十分にわかっていないので、それを明らかにする目的で、以下の試験を実施した。
【００９４】
ベトナム中部の都市ニャチャンにおいて、地域の中核的医療施設であるカンホワ総合病院に入院した5歳未満の肺炎(radiology confirmed pneumonia)患者226例と同地域の健常小児350名の鼻咽頭ぬぐい液(nasopharyngeal swab)を収集し、DNAを調製した。肺炎球菌の存在をlytA遺伝子DNAを標的とするリアルタイムPCR法で検出した（プライマーセット（１））。肺炎球菌陽性検体については50血清型・血清型群を弁別可能な29種のプライマーセット（プライマーセット（２）〜（３０））を用いた多項目並列リアルタイムPCR法により、血清型判別と血清型別の感染負荷(bacterial load)の定量測定を行なった。
【００９５】
カンホワ総合病院に入院した5歳未満の肺炎(radiology confirmed pneumonia)患者226例と同地域の健常小児350名の鼻咽頭ぬぐい液(nasopharyngeal swab)中の肺炎球菌lytA遺伝子DNAをリアルタイムPCR法で検出した。(増幅産物のmelting curve analysisによって陽性/陰性を判別した（検出感度： 15 copies in 2ul of sample)）。結果を表１に示す。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
lytA遺伝子DNAをリアルタイムPCR法で検出した肺炎(radiology confirmed pneumonia)患者194例と健常対照群164名のlytA遺伝子DNAコピー数の定量結果を図１１に示す。対数変換後のｔ検定により有意な差を認めた(p < 0.001)。
【００９８】
5歳未満の肺炎患者226例と健常対照群350名を4つの年齢(月齢)階層に分けて、年齢階層別の肺炎球菌保菌状態を比較した（表２）。いずれの階層においても患者群は有意に肺炎球菌保菌率が高かった。
【００９９】
【表２】
2014212711.tif 000003
【０１００】
lytA遺伝子DNAをリアルタイムPCR法で検出した肺炎患者194例と健常対照群164名に関して、実施例１で使用したプライマーセットを用いた高集積並列リアルタイムPCR法を適用して血清型を判別した。結果を図１２に示す。小児に用いられる7価結合型ワクチン(PCV7)抗原に含まれる血清型が患者群の70％、対照群の50％を占めていた。
【０１０１】
侵襲性肺炎球菌感染症（invasive pneumococcal diseases）をより起こしやすいとされる血清型が、対照群に比べ肺炎患者に高頻度に検出された（表３）。また健常対照群には血清型を特定できない肺炎球菌の定着がより高頻度に見られた（表３）。表中、19F、6A/6Bおよび23Fは、7価結合型ワクチン（PCV7）抗原に含まれる血清型である。
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
次に、小児の肺炎患者と健常対照群における年齢階層別の肺炎球菌血清型分布を調査した（図１３）。検出される血清型は特に肺炎患者群で月齢とともに、より侵襲性肺炎球菌感染症（IPD）を来しやすい血清型の検出率が増加していた。その多くは７価肺炎球菌結合型ワクチン（PCV7）でカバーされており、PCV7導入の効果は十分期待できると思われる。
【０１０４】
以上の結果をまとめると、以下のとおりである。
【０１０５】
カンホワ総合病院に入院した5歳未満の肺炎(radiology confirmed pneumonia)患者226例と同地域の健常小児350名の鼻咽頭ぬぐい液(nasopharyngeal swab)中の肺炎球菌lytA遺伝子DNAを検出感度： 15 copies in 2μl of sampleのリアルタイムPCR法で検出した。患者群で85％、対照群では46％の保菌率で両者に有意な差を認めた(OR = 6.88, p = 3.0 x 10-22)。また、肺炎球菌陽性者それぞれ194名：164名の感染負荷にも有意差を認めた。
【０１０６】
肺炎球菌陽性者について、高集積並列リアルタイムPCR法を適用した血清型判別により血清型の分布を明らかにした。検出された血清型は小児に用いられる7価結合型ワクチン(PCV7)抗原に含まれる血清型が患者群の70％、対照群の50％を占めていた。侵襲性肺炎球菌感染症(invasive pneumococcal diseases)を、より起こしやすいとされる血清型が、対照群に比べ肺炎患者に高頻度に検出された。また、肺炎患者群では年齢とともに、よりIPDを来しやすい血清型の検出率が増加していた。これらの結果から、PCV7導入の効果は十分期待できると思われた。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明によって大規模な肺炎球菌血清型疫学調査を迅速且つ廉価に実施することが可能になる。このような調査を肺炎球菌ワクチンの導入前後に実施することにより、同ワクチンの有用性を公衆衛生学的に議論する際の客観的なデータを提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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