(57)【要約】【課題】腫瘍の種類、及び患者の主要組織適合抗原の型を問わずに、腫瘍の再発防止、転移阻害、及び再発した腫瘍の治療に適用できる、優れた抗腫瘍免疫誘導効果を有する腫瘍ワクチン組成物を提供する。【解決手段】手術により摘出した腫瘍組織、あるいは確立された腫瘍細胞株からなる群から選ばれる腫瘍材料から調製された腫瘍抗原と、野生型バキュロウイルスとを含む腫瘍ワクチン組成物を使用することにより、優れた抗腫瘍免疫誘導効果が達成できた。これにより、腫瘍の再発防止、転移阻害、及び再発した腫瘍の治療に適用可能な腫瘍ワクチン組成物を提供できることとなった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型バキュロウイルス１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕと腫瘍抗原を含有することを特徴とする、哺乳動物における細胞性免疫応答を誘導する医薬組成物。
【請求項２】
上記野生型バキュロウイルスが１×１０８〜１×１０１０ｐｆｕであることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
上記腫瘍抗原が、１×１０６〜１×１０１０個の腫瘍細胞を凍結融解することによって得られた腫瘍細胞断片であることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
上記腫瘍抗原が、１×１０６〜１×１０１０個の腫瘍細胞をホルマリンで固定して調製された腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
上記腫瘍細胞が、当該哺乳動物の自己腫瘍組織の腫瘍細胞であるか、または確立された腫瘍細胞株であることを特徴とする、請求項３または４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
上記腫瘍抗原が、消化器系腫瘍又は皮膚腫瘍由来のものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
上記消化器系腫瘍が、大腸がんであることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
上記皮膚腫瘍が、悪性黒色腫であることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
上記野生型バキュロウイルスが、核多角体病ウイルスであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
上記核多角体病ウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスであることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
上記細胞性免疫応答を誘導する医薬組成物が、がんの再発予防剤又は再発したがんの治療剤として使用されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
上記請求項１〜１０に記載の医薬組成物と共に、抗がん剤を併用することを特徴とする、がんの再発・転移予防又は治療用の医薬組成物。
【請求項１３】
上記抗がん剤が、術後補助化学療法において標準的に用いられている抗がん剤であり、免疫抑制作用を減弱する投与方法を行なうことを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
上記請求項１〜１３に記載の医薬組成物を１週間に１回の皮下あるいは皮内投与を複数回行うことによって、がんの再発・転移予防又は治療を行なう方法。
【請求項１５】
野生型バキュロウイルス１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕと共に、１×１０６〜１×１０１０個の腫瘍細胞由来の腫瘍抗原を含有することを特徴とする、腫瘍ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、野生型バキュロウイルスを含有する、腫瘍の再発予防、転移阻害、及び再発した腫瘍の治療用ワクチン製剤に関するものであり、該方法は腫瘍特異的細胞障害性Ｔリンパ球の誘導に効果的な腫瘍ワクチンである。
【背景技術】
【０００２】  腫瘍を手術によって摘出して生還した患者の、その後の恐怖は再発である。現在、再発した腫瘍に対しての有効な治療法はなく、再発の告知はそのまま余命宣告へ直結することが少なくない。そのため、術後の患者には術後補助化学療法が実施されるケースがある。これは、再発予防を目的とした抗がん剤治療である。現在、手術後、抗がん剤ＴＳ−１の服用およびシスプラチンの点滴により、術後の５年生存率が１０％程度増加することが確認されており、例えば、胃がんの術後にＴＳ−１を服用することは標準治療となっている。しかしながら、術後補助化学療法は、その有効性が明確には実証されていないものが多いのが現状である。その理由として、術後補助化学療法の有効性を証明することが困難であることが挙げられる。すなわち、手術後、補助化学療法を受けた患者に腫瘍の再発が見られなかった場合、それが抗がん剤によって再発が抑制されたものなのか、もともと手術が成功していて、抗がん剤の治療を受けなくとも再発していなかったのか、判断が困難なのである。しかしながら、このような現状に鑑みても、がん再発のリスクを下げる治療方法の開発は、術後の患者の精神的負担の軽減、あるいはその後の社会生活の維持・継続にとって、極めて大きな意義がある。【０００３】  現在、外科手術、放射線療法、および抗がん剤治療に続く第４の治療方法として、免疫療法が注目されている。これは、患者体内における免疫担当細胞、なかでも樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（以下、「ＮＫ細胞」と略す。）、あるいは細胞障害性Ｔリンパ球（以下、「ＣＴＬ」と略す。）を活性化して、腫瘍容積の増大の抑制および治癒、あるいは腫瘍の転移・再発の防止を目的とした治療方法である。【０００４】  免疫療法には、自然免疫を活性化する方法と獲得免疫を活性化する方法がある。なかでも、獲得免疫は腫瘍細胞を特異的に攻撃する免疫反応であり、液性免疫および細胞性免疫に分けることができる。特に、細胞性免疫はＣＴＬを媒介する免疫反応であり、腫瘍における免疫療法では、この細胞性免疫をいかに効果的に誘導させるかが大きな鍵となる。【０００５】  腫瘍特異的ＣＴＬを誘導するためには、まず、樹状細胞によって腫瘍抗原が取り込まれ、Ｔ細胞に抗原提示される必要がある。従って、獲得免疫を誘導する方法においては、この抗原提示の工程をいかにうまく人工的に再現させるかが成功を大きく左右すると考えられる。【０００６】  腫瘍に対する獲得免疫を誘導させるためには、まず、腫瘍抗原が必要となる。そこで、腫瘍細胞に特異的なＣＴＬエピトープを同定する研究が、多くの研究室において実施されている。その中には、ＷＴ１抗原に見られるように、研究成果の一部が腫瘍ペプチドワクチンとして臨床試験に進んでいるものもある。【０００７】  しかし、有効なＣＴＬエピトープが同定されていない腫瘍も多く、また、ＣＴＬエピトープが同定されている腫瘍においても、その患者の主要組織適合抗原の型と適合しなければ、腫瘍ワクチンとして適用できない。ヒトの主要組織適合抗原の種類は膨大であり、該腫瘍抗原ペプチドがその腫瘍のすべての患者に適用できるわけではなく、それどころか、腫瘍ワクチンとして利用できる症例の方が極めて限定的である。そこで、患者本人から外科手術により摘出した自己腫瘍組織を腫瘍抗原として利用する方法は、その患者の腫瘍の再発を予防するワクチンの材料としては極めて適していると考えられる。現在までに、凍結融解した腫瘍組織や、ホルマリン液で固定した腫瘍細胞をワクチン抗原として利用する試みが検討されている（特許文献１及び２）。しかしながら、摘出した腫瘍をワクチン抗原の組成物として用いた場合、樹状細胞の機能を低下させてしまうなど、腫瘍に対する免疫反応を効果的に誘導させることが困難であった（非特許文献１及び２）。【０００８】  また、腫瘍細胞の溶解物をワクチン抗原の組成物として用いる場合において、その溶解物を樹状細胞と混合培養しても、通常、樹状細胞により処理された抗原ペプチドは主要組織適合抗原のＣｌａｓｓ  ＩＩに結合し、液性免疫反応を優位に誘導するようにシグナルが伝達され、ＣＴＬを主とする細胞性免疫反応を誘導する効果は低い。【０００９】  さらに、腫瘍抗原から調製した腫瘍抗原ペプチドをワクチンとして用いる場合においても、それだけでは抗腫瘍免疫の誘導能は極めて不十分である。そのため、例えば、腫瘍抗原としてＷＴ１ペプチドを使用する場合には、アジュバントとしてモンタナイドが用いられており、さらに、ＢＣＧ菌の細胞骨格成分であるＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ  ｓｋｅｌｅｔｏｎ）をアジュバントとして用いる方法も検討されるなど（特許文献３）、効果的に抗腫瘍免疫、特に細胞性免疫を誘導するアジュバントの研究開発が盛んに行なわれている。【００１０】  従来から知られる免疫アジュバントの中で、ヒト腫瘍の免疫療法に使用し得る、安全で、かつ、安価な免疫アジュバントは少ない。例えば、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）は、スカシ貝から抽出されたヘモシアニンタンパク質であるが、強いヘルパーＴ細胞活性化能を有し、樹状細胞を成熟させる効果を持ち、免疫増強効果が期待できるアジュバントとして知られている（特許文献２）。また、ＢＣＧ菌やその細胞骨格成分であるＢＣＧ−ＣＷＳは、未熟樹状細胞のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒに作用することにより、樹状細胞の成熟を促進し、Ｔ細胞を活性化する。【００１１】  しかしながら、ＫＬＨは非常に高価であるという欠点がある。また、ＢＣＧ菌については、アジュバントとして用いる場合、ＢＣＧ菌を２回以上接種するとその接種箇所に潰瘍など重篤な副作用が生じ、腫瘍ワクチンのように複数回接種が必要なワクチンのアジュバントとしては不都合が多い。同様に、ＢＣＧ−ＣＷＳの場合は、ＢＣＧ菌からの水溶性膜分画の抽出、酵素処理によるタンパク質の除去、及び有機溶媒処理など精製手順の煩雑さに加え、精製物の構成成分の含有量が不均一であることもアジュバント製剤としての欠点として考えられる。このように、安全で、安価で、抗腫瘍免疫誘導能の高いアジュバントの開発、及びそれを用いた腫瘍ワクチンの開発が急がれるところである。【００１２】  バキュロウイルス  オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＡｃＮＰＶ）は、鱗翅目、膜翅目、および双翅目昆虫の幼虫に感染し、死に至らしめる昆虫病原ウイルスであり、その特徴から、特定の害虫を駆除する生物農薬として利用されている（非特許文献３及び４）。また、バキュロウイルスは、感染すると全タンパク質の３０〜４０％が多角体タンパク質になるほどの強力な多角体プロモーターを有しており、この性質を利用して、昆虫細胞を用いたタンパク質発現系としても広く利用されている（非特許文献５及び６）。さらにバキュロウイルスは、昆虫細胞だけでなく、広範な哺乳動物細胞にも複製することなく感染することが確認され、遺伝子導入ベクターとしての研究も進められている（非特許文献７〜１１）。【００１３】  野生型バキュロウイルスは、哺乳動物に対して自然免疫を活性化し、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン１等のサイトカインを産生させることが確認されている（非特許文献１２〜１４）。また、マウスに野生型バキュロウイルスを静脈内投与すると、ＮＫ細胞が活性化されることで抗腫瘍効果が誘導されることも報告されている（非特許文献１５）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、マウス樹状細胞に野生型バキュロウイルスを感染させると、樹状細胞が活性化し、その活性化樹状細胞をマウス腫瘍内に移注すると、腫瘍に対する免疫反応が誘導されることも確認されている（非特許文献１６及び１７）。このように、近年、野生型バキュロウイルスは自然免疫を効果的に活性化するという性質について明らかにされつつある。今後は、その自然免疫をいかに効果的に抗原特異的な獲得免疫に繋げていくかが重要な課題であると考えられる。【００１４】  バキュロウイルスを抗腫瘍ワクチンベクターとして利用する場合、ＣＴＬエピトープが同定されている腫瘍については、組換えバキュロウイルスの構築が考えられるが、該述したように、患者の主要組織適合抗原の型との一致の問題があり、やはり腫瘍ワクチンとしての適用が極めて限定的なものになる。【００１５】  また、組換えバキュロウイルスを利用する試みにおいては、哺乳類動物のサイトカイン遺伝子を挿入した組換えバキュロウイルスの構築及び、腫瘍に対する医薬組生物としての利用が検討されている（特許文献４及び５）。【００１６】  腫瘍ワクチンを開発する場合、腫瘍抗原をどのような方法で調製するのか、その抗原に組み合わせるアジュバントはどのようなものが適しているのか、さらには、そのワクチン組成物の投与方法はどのようにするのか等、検討する課題は多い。すなわち、これらの要素によりワクチンの免疫誘導能は大きく変化し、該腫瘍ワクチンを用いた免疫療法の成否に大きな影響を及ぼす。したがって、腫瘍抗原の調製方法やアジュバントとの組み合わせについて様々な検討が試みられている。【００１７】  しかしながら、野生型バキュロウイルスにおいては、そのままアジュバントとして使用して腫瘍ワクチンとする試み、野生型バキュロウイルスと組み合わせる有効な腫瘍抗原、あるいは、野生型バキュロウイルスを含有した腫瘍ワクチンの投与方法及び、抗腫瘍免疫誘導能の解析については、充分な解明がなされていない状況であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００７−２３０９５６号公報
【特許文献２】特開２０１１−０４６７４２号公報
【特許文献３】国際公開２００３／０２８７５８号パンフレット
【特許文献４】特表２００６−５１７１８４号公報
【特許文献５】特表２００６−５０７３６２号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｌｉｚｅｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１２，ｐｐ．２３５９ｓ−２３６５ｓ，２００６
【非特許文献２】Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２３，ｐｐ．６２３−６３２，２００８
【非特許文献３】Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，ｐｐ．８５−８８，１９９１
【非特許文献４】Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，ｐｐ．１３８−１４０，１９９４
【非特許文献５】Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，ｐｐ．１２３３−１２５０，１９８７
【非特許文献６】Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，ｐｐ．４７−５５，１９８８
【非特許文献７】Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，ｐｐ．１００９９−１０１０３，１９９５
【非特許文献８】Ｂｏｙｃｅ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，ｐｐ．２３４８−２３５２，１９９６
【非特許文献９】Ｓａｎｄｉｇ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７４，ｐｐ．２０５−２１２，１９９６
【非特許文献１０】Ｐｉｅｒｏｎｉ，Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，ｐｐ．４６５−４６７
【非特許文献１１】Ｋｏｓｔ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０，ｐｐ．１７３−１８０，２００２
【非特許文献１２】Ｇｒｏｎｏｗｓｋｉ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，ｐｐ．９９４４−９９５１，１９９９
【非特許文献１３】Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，ｐｐ．１３８−１４０，１９９４
【非特許文献１４】Ｂｅｃｋ，Ｎ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７，ｐｐ．１２７４−１２８３，２０００
【非特許文献１５】Ｋｉｔａｊｉｍａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６，ｐｐ．２６１−２６８，２００８
【非特許文献１６】Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６２，ｐｐ．３５−４３，２０１０
【非特許文献１７】Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，ｐｐ．４４０−４４６，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】  本発明の目的は、腫瘍抗原と共に、野生型バキュロウイルスを含有する、安全で、安価で、簡便に製造することができる腫瘍ワクチンを提供することである。更には、本発明の腫瘍ワクチンを用いて、腫瘍の種類を問わずに腫瘍の再発・転移防止及び／又は再発後の腫瘍の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】  本発明者らは、野生型バキュロウイルスの自然免疫賦活化作用、アジュバント作用の検討を進める中で、野生型バキュロウイルスを用いた新たな腫瘍ワクチンの組成物を見出すことができた。すなわち、本発明者らは、腫瘍抗原と野生型バキュロウイルスを組み合わせてワクチンとして用いると、顕著な抗腫瘍活性が誘導されることを見出した。またさらに、本発明者らは、腫瘍抗原についても、野生型バキュロウイルスとの組み合わせに適した調製方法を提供する。これらの知見を基に、手術により摘出した自己腫瘍あるいは確立された腫瘍細胞株から抗原タンパクを調製し、野生型バキュロウイルスと混合して、ワクチン製剤を簡便に製造することができる。本発明腫瘍ワクチンの接種を受けた動物では、その後に移植される同系統の腫瘍に対して、抵抗性の獲得、あるいは腫瘍容積の増加が顕著に抑制されることを見出した。またさらには、本腫瘍ワクチンの接種を受けた動物では、その後に移植された腫瘍による腫瘍形成が見られた場合においても、本腫瘍ワクチンの追加接種により、該腫瘍の完全退縮が確認された。本発明の腫瘍ワクチンは、腫瘍細胞より調製したワクチンの単独投与及び、野生型バキュロウイルスの単独投与と比較し、より顕著な抗腫瘍免疫を誘導可能であることを確認し、本発明を完成するに至った。【００２２】  本発明の要旨は、以下に示す通りである。
〔１〕野生型バキュロウイルス１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕと腫瘍抗原を含有することを特徴とする、哺乳動物における細胞性免疫応答を誘導する医薬組成物。
〔２〕上記野生型バキュロウイルスが１×１０８〜１×１０１０ｐｆｕであることを特徴とする、上記〔１〕記載の医薬組成物。
〔３〕上記腫瘍抗原が、１×１０６〜１×１０１０個の腫瘍細胞を凍結融解することによって得られた腫瘍細胞断片であることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の医薬組成物。
〔４〕上記腫瘍抗原が、１×１０６〜１×１０１０個の腫瘍細胞をホルマリンで固定して調製された腫瘍細胞であることを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の医薬組成物。
〔５〕上記腫瘍細胞が、当該哺乳動物の自己腫瘍組織の腫瘍細胞であるか、または確立された腫瘍細胞株であることを特徴とする、上記〔３〕または〔４〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔６〕上記腫瘍抗原が、消化器系腫瘍又は皮膚腫瘍由来のものであることを特徴とする、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔７〕上記消化器系腫瘍が、大腸がんであることを特徴とする、上記〔６〕に記載の医薬組成物。
〔８〕上記皮膚腫瘍が、悪性黒色腫であることを特徴とする、上記〔６〕に記載の医薬組成物。
〔９〕上記野生型バキュロウイルスが、核多角体病ウイルスであることを特徴とする、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の医薬組成物。
〔１０〕上記核多角体病ウイルスが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスであることを特徴とする、上記〔９〕に記載の医薬組成物。
〔１１〕上記細胞性免疫応答を誘導する医薬組成物が、がんの再発予防剤又は再発したがんの治療剤として使用されるものである、上記〔１〕に記載の医薬組成物。
〔１２〕上記〔１〕〜〔１０〕に記載の医薬組成物と共に、抗がん剤を併用することを特徴とする、がんの再発・転移予防又は治療用の医薬組成物。
〔１３〕上記抗がん剤が、術後補助化学療法において標準的に用いられている抗がん剤であり、免疫抑制作用を減弱する投与方法を行なうことを特徴とする、上記〔１２〕に記載の医薬組成物。
〔１４〕上記〔１〕〜〔１３〕に記載の医薬組成物を１週間に１回の皮下あるいは皮内投与を複数回行うことによって、がんの再発・転移予防又は治療を行なう方法。
〔１５〕野生型バキュロウイルス１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕと共に、１×１０６〜１×１０１０個の腫瘍細胞由来の腫瘍抗原を含有することを特徴とする、腫瘍ワクチン組成物。
【発明の効果】
【００２３】  本発明の医薬組成物は、腫瘍抗原と野生型バキュロウイルスを含有する、安全で、安価で、簡便に製造することができる腫瘍ワクチンであり、がんの再発／転移の予防及び、再発したがんの治療において、優れた抗腫瘍免疫誘導効果を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の腫瘍ワクチンの３回の皮内投与がマウスの成育に及ぼす影響について示した図である。図中、縦軸はマウスの体重を示し、横軸はワクチン投与後の日数を示す。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。図中矢印は、ワクチン投与日を示す。
【図２】本発明の腫瘍ワクチンの３回の皮内投与がマウスの成育に及ぼす影響について示した図である。図中、縦軸はマウスの体重を示し、横軸はワクチン投与後の日数を示す。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。図中矢印は、ワクチン投与日を示す。
【図３】本発明の腫瘍ワクチンの皮内投与による抗腫瘍免疫誘導能について解析した結果を示した図である。図中、縦軸Ｔｕｍｏｒ  ｆｒｅｅ  ｒａｔｅとは、腫瘍形成が認められないマウスの割合を示す。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図４】本発明の腫瘍ワクチンの皮内投与による腫瘍容積増大の抑制について解析した結果を示した図である。図中各折れ線グラフは、各マウス固体の腫瘍容積の変化を示す。また、ＡはＰＢＳ投与コントロール群；ＢはＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原単独投与群；Ｃは野生型バキュロウイルス単独投与群；ＤはＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図５】本発明の腫瘍ワクチンを皮内投与したマウスの腫瘍移植後の生存率を示した図である。カプラン・マイヤー検定およびログランク検定により統計学的有意性を解析した。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図６】本発明の腫瘍ワクチンの皮内投与による抗腫瘍免疫誘導能について解析した結果を示した図である。図中、縦軸Ｔｕｍｏｒ  ｆｒｅｅ  ｒａｔｅとは、腫瘍形成が認められないマウスの割合を示す。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図７】本発明の腫瘍ワクチンの皮内投与による腫瘍容積増大の抑制について解析した結果を示した図である。図中各折れ線グラフは、各マウス固体の腫瘍容積の変化を示す。また、ＡはＰＢＳ投与コントロール群；ＢはＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原単独投与群；Ｃは野生型バキュロウイルス単独投与群；ＤはＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図８】本発明の腫瘍ワクチンを皮内投与したマウスの腫瘍移植後の生存率を示した図である。カプラン・マイヤー検定およびログランク検定により統計学的有意性を解析した。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＢ１６Ｆ１０細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図９】凍結融解処理あるいは超音波処理により調製したワクチン抗原による抗腫瘍免疫誘導能の差異について示した図である。図中各折れ線グラフは、各マウス固体の腫瘍容積の変化を示す。また、ＡはＰＢＳ投与コントロール群；Ｂは超音波処理ＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群；Ｃは凍結融解処理ＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群；ＤはグラフＣの縦軸をスケールアップしたものを示す。
【図１０】本発明の腫瘍ワクチンを皮内投与したマウスの腫瘍移植後の生存率を示した図である。カプラン・マイヤー検定およびログランク検定により統計学的有意性を解析した。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；○は超音波処理ＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群；●は凍結融解処理ＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【図１１】実施例６において実施した抗体処理および本発明腫瘍ワクチンによる抗腫瘍効果について示した図である。また図中、ＣｏｎｔｒｏｌはＰＢＳ投与コントロール群；ＣＤ４（−）はＣＤ４陽性Ｔ細胞除去＋ワクチン投与群；ＣＤ８（−）はＣＤ８陽性Ｔ細胞除去＋ワクチン投与群；ＶａｃｃｉｎｅはＴ細胞除去処理なし＋ワクチン投与群を示す。
【図１２】本発明腫瘍ワクチンの皮内投与により腫瘍細胞特異的ＣＴＬが誘導されることを示した図である。図中、縦軸の％  ＣｙｔｏｔｏｘｉｔｙはＣＴＬによる標的細胞の殺傷活性を示し、横軸はエフェクター細胞数とターゲット細胞数の比を示す。また、◇はＰＢＳ投与コントロール群；△はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原単独投与群；□は野生型バキュロウイルス単独投与群；●はＣＴ２６細胞由来腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチン投与群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】  本明細書において「バキュロウイルス」とは、バキュロウイルス科に属し、核多角体病ウイルス（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＮＰＶ）属および顆粒病ウイルス（Ｇｒａｎｕｌｏ  ｖｉｒｕｓ：ＧＶ）属に大別されるものである。本発明で用いられ得るＮＰＶとしては、例えば、ウワバの一種より分離されたＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、カイコ由来のＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）、ドクガ由来のＯｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ  ＮＰＶ（ＯｐＮＰＶ）、マイマイガ由来のＬｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ  ＮＰＶ（ＬｄＮＰＶ）、シロイチモジヨトウ由来のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ  ＮＰＶ（ＳｅＮＰＶ）が挙げられるが、なかでもＡｃＮＰＶが好ましい。
【００２６】  本明細書において「腫瘍抗原」とは、腫瘍細胞の表面あるいは内部に存在する抗原のことを言い、例えば、腫瘍にのみ特異的に発現し、免疫系に認識され得るエピトープペプチドを含有する抗原タンパク質等のことを言う。
【００２７】  腫瘍抗原を調製する腫瘍細胞又は腫瘍組織としては、ヒトを含む動物体内から摘出した腫瘍組織又は、それを培養して得られた腫瘍細胞、あるいは標的とする腫瘍に関し確立された腫瘍細胞株を用いることができる。腫瘍組織は、腫瘍細胞を含む組織であれば特にその種類は限定されない。更に、用いる腫瘍細胞又は腫瘍組織は、ヒト由来のものに限定されるものではなく、腫瘍の予防及び治療の対象となる、いかなる哺乳類動物由来のものを用いることができる。例えば、愛玩用のイヌにおける、腫瘍の再発予防及び治療にも適用することができる。
【００２８】  腫瘍抗原を調製するための第一の方法は、ヒトを含む動物体内から摘出した腫瘍組織又は、それを培養して得られた腫瘍細胞１×１０６〜１×１０１０個、あるいは標的とする腫瘍に関し確立された腫瘍細胞株１×１０６〜１×１０１０個を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略す。）あるいは生理食塩水を用いて洗浄後、一定量のＰＢＳあるいは生理食塩水に懸濁したものに凍結融解処理を施し、細胞を破砕する。この細胞片を含むＰＢＳあるいは生理食塩水を、ワクチンの腫瘍抗原として用いる。すなわち、凍結融解後、遠心分離により細胞片と上清とを分離し、その細胞片あるいは上清のどちらか一方のみをワクチン抗原の材料として用いるものではない。
【００２９】  腫瘍抗原を調製するための凍結融解の方法は、特に限定されず、当業者に利用可能ないかなる手段を採用しても良い。例えば、−８０℃の冷凍庫および３７℃のウォーターバスを用いて、凍結融解を５回繰り返したものを、腫瘍抗原として用いることができる。
【００３０】  腫瘍抗原を調製するための第二の方法は、ヒトを含む動物体内から摘出した腫瘍組織又は、それを培養して得られた腫瘍細胞１×１０６〜１×１０１０個、あるいは標的とする腫瘍に関し確立された腫瘍細胞株１×１０６〜１×１０１０個を、ＰＢＳあるいは生理食塩水を用いて洗浄後、ホルマリンを用いて固定する。この固定した腫瘍細胞をＰＢＳあるいは生理食塩水を用いて洗浄後、一定量のＰＢＳあるいは生理食塩水に懸濁したものを、ワクチンの腫瘍抗原として用いる。
【００３１】  腫瘍細胞をホルマリン液を用いて固定する方法は、特に限定されず、当業者に利用可能ないかなる手段を採用しても良い。例えば、腫瘍細胞を、ＰＢＳで４％に調製したパラホルムアルデヒドに懸濁し、４℃にて保存することで、固定化腫瘍細胞を調製することができる。
【００３２】  本腫瘍ワクチンに用いる腫瘍抗原量は、腫瘍細胞数で１×１０６〜１×１０１０個を用いる。投与対象となる動物種、体の大きさ、体重等によって異なり得るため、該範囲内で適宜設定され得る。例えば、マウスに投与する場合、腫瘍細胞１×１０６個を凍結融解して得られた細胞片を含むＰＢＳあるいは生理食塩水、あるいは、ホルマリンで固定した１×１０６個の腫瘍細胞を、腫瘍抗原として用いることで、効果的な抗腫瘍免疫を誘導することができる。
【００３３】  上記の方法により調製した腫瘍抗原と混合させる野生型バキュロウイルスの量は、１×１０７〜１×１０１０ｐｆｕを用いる。投与対象となる動物種、体の大きさ、体重等によって異なり得るため、該範囲内で適宜設定され得る。例えば、マウスに投与する場合、１×１０６個の腫瘍細胞より調製した腫瘍抗原に、１×１０８ｐｆｕの野生型バキュロウイルスを混合することで、効果的な抗腫瘍免疫を誘導することができる。従って、１×１０８〜１×１０１０ｐｆｕのバキュロウイルスの利用が好ましい。
【００３４】  本発明の腫瘍ワクチン組成物とは、腫瘍ワクチンを含有する組成物のことを言う。一般的にワクチンとは、病原体の感染を予防するためにあらかじめ宿主に投与される免疫原のことであり、病原性を弱めるかまたは不活化した病原体、あるいはその病原体の有効成分を宿主に投与し、病原体に対する免疫を誘導させるものである。また、腫瘍ワクチンとは、がん細胞に存在する成分のうち宿主免疫系が標的抗原として認識し得る構成成分（がん抗原）を同定し、このがん抗原を宿主に人為的に投与することで、がんに対する特異的な抗腫瘍免疫を誘導するためのがん抗原を腫瘍ワクチンと言う。本願発明の腫瘍ワクチンとしては、病原性のないウイルスである野生型バキュロウイルスと共に、宿主の腫瘍抗原あるいは確立された腫瘍細胞株から得られる腫瘍抗原であることが好ましい。
本腫瘍ワクチンの再発・転移防止及び／又は再発後の治療の対象となる「がん（腫瘍）」としては、外科手術により摘出可能な腫瘍、あるいは、確立された腫瘍細胞株が存在する腫瘍であれば、特に制限されないが、例えば膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、胃がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん等の消化器系腫瘍、例えば悪性黒色腫等の皮膚腫瘍、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、腎がん等を挙げることができる。
【００３５】  本発明の腫瘍ワクチンの投与方法は、特に限定されないが、投与動物の樹状細胞などの抗原提示細胞に効果的に取り込まれるように、皮下投与あるいは皮内投与されることが望ましい。皮下投与あるいは皮内投与は、墨汁をマウスに投与すれば明らかであるように、投与後速やかに体内に拡散することはなく、長時間投与局所に留まることが知られている。従って、抗原提示細胞が集合し抗原を貪食しやすいと考えられ、例えば、結核予防のためのＢＣＧ菌接種においても用いられている。
【００３６】  本発明の腫瘍ワクチンの接種場所に関しては、特に限定されない。例えば、外科手術後、その腫瘍が存在した場所に位置する皮内、あるいは、腫瘍が存在した場所の近傍のリンパ節に位置する皮内、などが挙げられる。
【００３７】  本発明の腫瘍ワクチンの投与回数に関しても、特に限定されないが、ワクチンの追加接種によるブースター効果を発揮させるために、２回以上の投与が好ましい。例えば、外科手術後、本腫瘍ワクチンを週１回３週連続皮内投与し、数週間間隔をあけた後、再度、本腫瘍ワクチンを週１回３週連続皮内投与するサイクルを繰り返すなどのワクチン投与方法が挙げられる。ワクチン療法の効果を確認しながら、適宜ワクチンの投与回数及び投与期間を決定することが望ましい。
【００３８】  本発明の腫瘍ワクチンは、非特異的免疫反応を惹起するアジュバントを含んでいてもよい。アジュバントは一種又は二種以上を組み合わせて用いることができる。アジュバントとして、例えば、ＢＣＧ菌、ＢＣＧ−ＣＷＳあるいはＰＰＤ等のＢＣＧ菌体成分製剤、Ａｌｕｍあるいはモンタナイド等合成アジュバント製剤等を挙げることができるが、これらの具体例に制限されることはなく、アジュバントとしての効果を有する物質であればいかなるものを用いてもよい。
【００３９】  本発明の腫瘍ワクチンは、抗がん剤と併用することができる。抗がん剤は一種又は二種以上を組み合わせて用いることができる。特に、現在、術後補助化学療法の標準治療として用いられているような抗がん剤、例えば、ＴＳ−１、シスプラチン、オキサリプラチン、フルオロウラシル、ゲムシタビンなどとの併用が考えられる。投与方法は、本腫瘍ワクチンと抗がん剤を同時期に投与することができる。あるいは、本腫瘍ワクチンと抗がん剤とを交互に投与することもできる。抗がん剤には、腫瘍細胞のみならず、免疫担当細胞を含め正常な細胞にもダメージを与えるものが少なくない。この場合、抗がん剤によって免疫担当細胞の活動が抑制された状態にあると、本腫瘍ワクチンによる免疫療法の効果が十分に発揮されないことも考えられるため、併用する抗がん剤は、免疫抑制作用を減弱する投与方法を行なうことが望ましい。免疫抑制作用の減弱投与方法としては、投与間隔、投与量を調整し、パルス的な投与等の公知の工夫を行なうことが好ましい。
【実施例】
【００４０】  以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。【００４１】実施例１：野生型バキュロウイルスの調製
（１）バキュロウイルスの増殖
バキュロウイルスとして、核多角体病ウイルスであるＡｃＮＰＶを、昆虫培養細胞株Ｓｆ−９細胞を用いて増殖させた。Ｓｆ−９細胞が培養フラスコ内で８０％コンフルエントの状態になった時点で、ウイルス液を滴下した。その後、２８℃で４〜５日間培養し、ウイルスを増殖させた。
（２）バキュロウイルスの回収および濃縮
培養上清を回収し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して細胞とウイルス液に分離した。得られたウイルス液を１９０００ｒｐｍ、４℃、９０分間遠心して、ウイルスをペレット状にした。このウイルスペレットをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略す。）に懸濁後、ショ糖密度勾配によりウイルスを精製した。
（３）バキュロウイルスの力価測定
バキュロウイルスの力価は、プラークアッセイ法により測定した。培養皿（直径６０ｍｍ）にＳｆ−９細胞を１×１０６個播いた。２４時間後、１０倍段階希釈したウイルス液を一定量滴下し、２８℃で２時間感染させた。感染後、ウイルス液を除去し、寒天培地を重層した。２８℃で７日前後培養しプラークを形成させた。ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍＬ）は、各希釈倍率のウイルス液から形成されたプラーク数を測定し、それを基に、ウイルス原液中のウイルス数を算出することで決定した。【００４２】実施例２：本発明腫瘍ワクチンのマウスの成育に及ぼす作用
本発明腫瘍ワクチンのマウス固体の成育に与える影響を、本腫瘍ワクチンを接種したマウスの体重を指標として評価した。
［方法］
１．腫瘍ワクチンの調製
１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地にて培養したＢＡＬＢ／ｃマウス大腸がん由来細胞株ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣより入手）を、ＰＢＳで無菌的に３回洗浄後、１×１０６個／５０μＬになるようにＰＢＳにて調製し、エッペンドルフチューブに分注した。その後、−８０℃の冷凍庫および３７℃のウォーターバスを用いて凍結融解を５回繰り返したものを、腫瘍抗原として用いた。この腫瘍抗原に１×１０８ｐｆｕの野生型バキュロウイルスを混合することで本発明腫瘍ワクチン（以下、「腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン」と表す。）とした。また、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ最小必須培地（以下、「ＤＭＥＭ」と略す。）で培養したマウス悪性黒色腫メラノーマＢ１６Ｆ１０（理化学研究所細胞開発銀行より入手）についても、同様の方法により、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンを調製した。【００４３】  比較対照のワクチンとして、上記と同様に調製した腫瘍抗原のみのもの（腫瘍抗原単独ワクチン）、および１×１０８ｐｆｕの野生型バキュロウイルスのみのもの（バキュロウイルス単独ワクチン）を調製した。また、ＰＢＳ接種群をワクチン非投与コントロール群として用いた。なお、マウスは１群５匹を用いた。【００４４】２．マウスへのワクチン投与およびマウスの体重の測定
腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン、および比較対照のワクチンを、４週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの右脇腹皮内に接種した。各ワクチンは、週１回３週連続で皮内接種した。マウスの体重は、１回目のワクチン接種前より、週１回測定した。【００４５】［結果］
図１に示すように、ＣＴ２６細胞由来の腫瘍抗原については、ＰＢＳ投与群、腫瘍抗原単独ワクチン投与群、バキュロウイルス単独ワクチン投与群、および腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与群の各ＢＡＬＢ／ｃマウスの体重に差異は認められず、３回目のワクチン投与から１４日目の重量はそれぞれ１７．９±１．６、１８．０±１．５、１８．８±０．６、および１７．７±０．８ｇであった。また、図２に示すように、Ｂ１６Ｆ１０細胞由来の腫瘍抗原についても、ＰＢＳ投与群、腫瘍抗原単独ワクチン投与群、バキュロウイルス単独ワクチン投与群、および腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与群の各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重についても差異は認められず、３回目のワクチン投与から７日目の重量はそれぞれ１９．２±１．０、１８．４±０．８、２０．１±１．５、および１９．２±１．６ｇであった。これらの結果から、野生型バキュロウイルス、あるいは野生型バキュロウイルスと腫瘍細胞より調製した抗原を混合したワクチンを皮内接種しても、摂食阻害等成育の変化は認められないことが明らかとなった。【００４６】実施例３：大腸がん細胞を移植したマウスにおける本腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果
実施例２でＣＴ２６腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンを皮内投与したマウスに、抗腫瘍免疫が誘導されているか否かを解析した。
［方法］
実施例２と同様の方法で培養したＣＴ２６細胞をＰＢＳで３回洗浄後、５×１０４個／５０μＬになるようにＰＢＳにて調製し、３回目のワクチン接種より１週間後に、マウスの右脇腹皮下に移植した。ＣＴ２６細胞移植部位は、ワクチン接種部位と重ならないように位置をずらして調整した。腫瘍サイズの測定は、ノギスを用い、腫瘍の長径および短径を計測することにより腫瘍容積を算出した。【００４７】［結果］
図３に腫瘍形成が認められたマウスの割合を示す。図中縦軸Ｔｕｍｏｒ  ｆｒｅｅとは、腫瘍形成が認められないことを表す。ＰＢＳ投与群、腫瘍抗原単独ワクチン投与群、およびバキュロウイルス単独ワクチン投与群では全てのマウスにおいて腫瘍形成が観察された。これに対し、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与群では５匹中２匹に全く腫瘍は認められなかった。また、図４に示すように、腫瘍容積の変化については、各群マウス間で個体差が見られるものの、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与群では他の群と比較して、腫瘍容積の増大が緩やかである傾向が見られた。腫瘍移植後３８日目の腫瘍サイズを表１に示す。【００４８】
【表１】
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【００４９】  次に、これらの動物の生存率を解析した。図５にその結果を示す。腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与マウスは、他のＰＢＳ投与群、腫瘍抗原単独投与群、およびバキュロウイルス単独投与群のいずれの群よりも統計学的に有意
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これらの結果より、本発明腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンの抗腫瘍効果は明白である。【００５０】実施例４：悪性黒色腫を移植したマウスにおける本腫瘍ワクチンの抗腫瘍効果
実施例２でＢ１６Ｆ１０腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンを皮内投与したＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０細胞に対する抗腫瘍免疫が誘導されているか否かを解析した。
［方法］
実施例２と同様の方法で培養したＢ１６Ｆ１０細胞をＰＢＳで３回洗浄後、２×１０５個／５０μＬになるようにＰＢＳにて調製し、３回目のワクチン接種より１週間後に、マウスの右脇腹皮下に移植した。Ｂ１６Ｆ１０細胞移植部位は、ワクチン接種部位と重ならないように位置をずらして調整した。腫瘍サイズの測定は、ノギスを用い、腫瘍の長径および短径を計測することにより腫瘍容積を算出した。【００５１】［結果］
図６に腫瘍形成が認められたマウスの割合を示す。ＰＢＳ投与群、腫瘍抗原単独投与群、およびバキュロウイルス単独投与群では全てのマウスにおいて腫瘍形成が観察された。これに対し、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与群では５匹中４匹に腫瘍形成が認められたものの、その腫瘍出現の時期は、他の３
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投与群では５匹中１匹で腫瘍形成が認められなかった。【００５２】  また、図７に示すように、腫瘍容積の変化については、各群マウス間で個体差が見られるものの、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与群では、腫瘍抗原単独投与群、およびバキュロウイルス単独投与群と比較して、腫瘍容積の増大の速度が緩やかである傾向が見られた。【００５３】  次に、これらの動物の生存率を解析した。図８にその結果を示す。腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン投与マウスは、ＰＢＳ投与群と比較し統計学的に
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ロウイルス単独投与群の固体の生存率は、ＰＢＳ投与群の固体の生存率と比較して若干高い傾向にあったが、統計学的に有意な差ではなかった。これらの結果より、本発明腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンの抗腫瘍効果は明白である。【００５４】実施例５：本腫瘍ワクチンに用いる腫瘍抗原調製法の違いによる抗腫瘍免疫誘導能の比較
本腫瘍ワクチンの特徴の一つは、がん患者から摘出した腫瘍をワクチンの抗原として用いることである。そこで、腫瘍から調製する抗原の調製方法の違いにより、ワクチンが誘導する抗腫瘍効果に違いが認められるか検討した。
［方法］
１．腫瘍ワクチンの調製
ＣＴ２６細胞を、ＰＢＳで３回洗浄後、１×１０６個／５０μＬになるようにＰＢＳにて調製し、エッペンドルフチューブに分注した。その後、−８０℃の冷凍庫および３７℃のウォーターバスを用いて凍結融解を５回繰り返したもの、あるいは、超音波処理装置を用いて細胞を破砕したものを腫瘍抗原として用いた。これらの腫瘍抗原にそれぞれ１×１０８ｐｆｕの野生型バキュロウイルスを混合することで２種類の腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン、すなわち、凍結融解処理腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン、および超音波処理腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンを調製した。【００５５】２．マウスへのワクチン投与および腫瘍細胞の移植
上記１で調製した２種類のワクチンを、４週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの右脇腹皮内に週１回３週連続で投与した。ＰＢＳ投与群をワクチン非投与コントロール群とした。マウスは１群５匹を用いた。【００５６】  実施例２と同様の方法で培養したＣＴ２６細胞を、ＰＢＳで３回洗浄後、５×１０４個／５０μＬになるようにＰＢＳにて調製し、３回目のワクチン接種より１週間後に、マウスの右脇腹皮下に移植した。ＣＴ２６細胞移植部位は、ワクチン接種部位と重ならないように位置をずらして調整した。腫瘍サイズの測定は、ノギスを用い、腫瘍の長径および短径を計測することにより腫瘍容積を算出した。
［結果］
図９に各ワクチン投与群における腫瘍容積の変化について示す。凍結融解により腫瘍抗原を調製したワクチン投与群においては、５匹中３匹で腫瘍が認められなかった。腫瘍が認められた２匹には、腫瘍移植後２１日目および３１日目に同じワクチンを皮内接種した。これらワクチンの追加接種は、直接腫瘍内には接種せず、腫瘍から１〜２ｍｍ離して接種した。その結果、これら２固体の腫瘍はワクチンの追加接種後徐々に縮小していき、やがて完全に消失し治癒したことが確認された。これらの固体は観察期間の１年以上腫瘍は再発することなく良好であった。【００５７】  一方、超音波処理により腫瘍抗原を調製したワクチン投与群においては、５匹全固体で腫瘍が観察され、その腫瘍増大の経過は、ＰＢＳ投与群と同様のものであった。これら５固体にも、腫瘍移植後２１日目および３１日目にｐｒｉｍｉｎｇと同じワクチンを皮内へ追加接種したが、治療効果は見られなかった。【００５８】  次に、これらのマウスの生存率を解析した。図１０に示すように、凍結融解により腫瘍抗原を調製したワクチン投与群においては、腫瘍が治癒した２個体を含め、５匹全固体が観察期間の１年以上死亡する固体はなかった。一方、超音波処理により腫瘍抗原を調製したワクチン投与群では、ＰＢＳ投与群と同様の生存曲線を示した。【００５９】  以上の結果より、超音波処理により腫瘍抗原を調製すると、野生型バキュロウイルスを混合しても、その抗腫瘍効果はほぼ消失することが明らかとなった。また、凍結融解により腫瘍抗原を調製後に野生型バキュロウイルスを混合すると、抗腫瘍効果は高く、腫瘍が出現しても、ワクチンの追加接種により治療できる可能性が示された。これらの結果より、凍結融解腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン療法の効果は明白である。【００６０】実施例６：本発明腫瘍ワクチンの皮内投与によるＴ細胞免疫の誘導
腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンの皮内接種によって、抗腫瘍免疫が誘導されることは明らかとなった。では、その誘導された免疫反応は、Ｔ細胞を介した免疫反応であるのか否か確認するため、動物実験を実施した。
［方法］
１．抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体および抗マウスＣＤ８モノクローナ抗体の調製
抗マウスＣＤ４モノクローナ抗体、および抗マウスＣＤ８モノクローナ抗体を産生するハイブリドーマ（ｃｌｏｎｅ  ＧＫ１．５およびｃｌｏｎｅ  ２．４３）をヌードマウスにそれぞれ移植した。一定期間経過後、ヌードマウス腹腔内より腹水を採取後、遠心分離して上清を回収した。これら抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体、あるいは抗マウスＣＤ８モノクローナ抗体を含む腹水をそれぞれＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに腹腔内投与し、マウス体内のＣＤ４陽性Ｔ細胞あるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去した。Ｔ細胞除去の確認は、マウス脾臓細胞を用いて、フローサイトメトリー解析により確認した。【００６１】２．マウスへのワクチン投与および腫瘍細胞の移植
腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンは、実施例２と同様の方法で調製した。実施例２と同様の方法を用いて、４週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンを週１回３週連続皮内接種した。マウスは１群５匹を用いた。【００６２】  この腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン接種群を３群作成し、ひとつの群には抗マウスＣＤ４モノクローナル抗体を、もうひとつの群には抗マウスＣＤ８モノクローナル抗体を週２回４週連続腹腔内投与した。残りのひとつの群には、これら抗体による処置は実施しなかった。【００６３】  実施例２と同様の方法で培養したＣＴ２６細胞を、ＰＢＳで３回洗浄後、５×１０４個／５０μＬになるようにＰＢＳにて調製し、３回目のワクチン接種より１週間後に、マウスの右脇腹皮下に移植した。ＣＴ２６細胞移植部位は、ワクチン接種部位と重ならないように位置をずらして調整した。腫瘍サイズの測定は、ノギスを用い、腫瘍の長径および短径を計測することにより腫瘍容積を算出した。
［結果］
図１１に示すように、腫瘍移植後２３日目における腫瘍容積は、抗体によるＴ細胞除去処理を施していないワクチン投与群が最も小さい傾向にあった（図中では「ｖａｃｃｉｎｅ」と表記）。また、この群では、５匹中１匹で腫瘍が認められなかった。同様に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞除去群においても、５匹中４匹で腫瘍は小さく抑えられていた（図中では「ＣＤ４（−）」と表記）。一方、ＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群（図中では「ＣＤ８（−）」と表記）では、腫瘍容積がＰＢＳ投与群と同等、あるいはそれ以上になる固体が観察された。これらの結果から、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンを接種しても、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を除去すると、そのワクチンの効果は減少することが明らかとなった。これはすなわち、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンの皮内接種によって、腫瘍抗原特異的なＣＤ８陽性キラーＴ細胞（ＣＴＬ）を誘導できる可能性を示唆している。【００６４】  また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞除去群では、腫瘍サイズが小さく抑えられている固体もあり、本ワクチン接種によって、ＣＴＬに頼らない、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞およびナチュラルキラー細胞の抗腫瘍効果の誘導の可能性も考えられる。【００６５】実施例７：本発明腫瘍ワクチン投与による腫瘍抗原特異的ＣＴＬの誘導
腫瘍細胞を攻撃し死滅させる中心となる細胞は、ＣＴＬである。したがって、腫瘍ワクチンにとって最も重要なことは、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを誘導することができるか否かである。これまで示してきたように、本発明の腫瘍ワクチンには明確な抗腫瘍効果が確認され、さらにその効果には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が深く関与している可能性が示された。【００６６】  そこで次に、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンの皮内接種によって、腫瘍抗原特異的なＣＴＬが誘導できているのか否か、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＴＬ  ａｓｓａｙを実施することにより直接確認した。
［方法］
腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチンの調製は、ＣＴ２６細胞を用いて、実施例２と同様の方法で行なった。比較対照として、同様に調製した腫瘍抗原単独ワクチン、および１×１０８ｐｆｕの野生型バキュロウイルス単独ワクチンを調製した。また、ＰＢＳ投与群をワクチン非投与コントロール群として用いた。各ワクチンおよびＰＢＳは、４週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの右脇腹皮内に、週１回３週連続で投与した。なお、マウスは１群５匹を用いた。【００６７】  ３回目のワクチン接種から１週間後にマウスを解剖し、脾臓細胞を調製しｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞とした。また、ｔａｒｇｅｔ細胞はＣＴ２６細胞を用いた。９６穴プレートに、ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞およびｔａｒｇｅｔ細胞を５０：１、２５：１、および１２．５：１になるように混合し、３７℃で４〜８時間培養した。細胞障害活性はｌａｃｔｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを測定することにより、ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ（％）を算出した。
［結果］
図１２に示すように、腫瘍抗原＋バキュロウイルス混合ワクチン皮内投与マウスの脾臓細胞に、腫瘍細胞に対する顕著な細胞障害活性が確認された（図中では「Ｍｉｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ」と表記）。さらにその活性は、腫瘍抗原単独投与群、およびバキュロウイルス単独投与群と比較し、顕著に高いものであった。【００６８】  以上の結果から、本発明である腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチンの皮内投与により、腫瘍抗原単独皮内投与、あるいは野生型バキュロウイルス単独皮内投与よりも、極めて明確に腫瘍容積の増大を抑制することが可能であり、その抗腫瘍効果は、本腫瘍抗原＋野生型バキュロウイルス混合ワクチンの皮内投与により、腫瘍抗原特異的ＣＴＬが効果的に誘導されることにあると結論された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】  本発明の野生型バキュロウイルスの含有ワクチン製剤は、効果的な抗腫瘍免疫誘導能を有し、標的とする腫瘍から調製した腫瘍抗原と混合することで、腫瘍の種類または、患者個人の主要組織適合抗原のタイプに関係なく、腫瘍の再発予防あるいは、再発した腫瘍の治療に対し、優れた抗腫瘍免疫誘導効果を有する腫瘍ワクチンを、安価に提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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