(57)【要約】      （修正有）【課題】とくに口腔分野への適用に優れた新たな抗カンジグ活性組成物の開発。【解決手段】植物由来成分であるショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒド、低分子プロアントシアニジン、およびショウガオールをそれらの成分として含むジンジャー精油、ジンジャーオレオレジン、およびシトラールをその成分として含むレモングラス油、シンナムアルデヒドをその成分として含む桂皮油、低分子プロアントシアニジンをその成分として含むオリゴノール、それらはいずれも中鎖脂肪酸低級アルコールエステルと合わせて使用することによって、相乗的かつ実用レベルの抗カンジダ活性を発揮する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の中鎖脂肪酸低級アルコールエステルと、植物成分であるショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒド、および低分子プロアントシアニジンからなる群の中から選ばれた少なくとも１種類が、使用時、共に同一物中に含まれていることを特徴とする抗カンジダ活性組成物
【請求項２】
ショウガオールをそれぞれの成分として含むジンジャー精油、ジンジャーオレオレジン、またはシトラール、シンナムアルデヒドをそれぞれの成分として含むレモングラス油、桂皮油、または低分子プロアントシアニジンを主成分として含むオリゴノールを加えることによって、それらの成分を含ませることを特徴とする請求項１記載の抗カンジダ活性組成物
【請求項３】
中鎖脂肪酸低級アルコールエステルがデカン酸エチルであり、使用時、それと同一物中に含まれるショウガオール、シトラール、またはシンナムアルデヒドの各濃度が、それぞれ１．５６μｇ／ｇ以上、１．５６μｇ／ｇ以上、３．１３μｇ／ｇ以上、およびそれらの植物成分と組み合わせるデカン酸エチルの各濃度が、それぞれ１２．５μｇ／ｇ以上、２５．０μｇ／ｇ以上、１２．５μｇ／ｇ以上であることを特徴とする請求項１記載の抗カンジダ活性組成物
【請求項４】
中鎖脂肪酸低級アルコールエステルがデカン酸エチルであり、使用時、その濃度が２５μｇ／ｇ以上、および同一物中に含まれるオリゴノールの濃度が２００μｇ／ｇ以上であることを特徴とする請求項２記載の抗カンジダ活性組成物
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗カンジダ活性は弱いが香りのよい中鎖脂肪酸エステルの中から少なくとも１種類と、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒド、低分子プロアントシアニジンといった植物由来成分そのもの、または、それらの成分を含むジンジャー精油、ジンジャーオレオレジン、レモングラス油、桂皮油、およびオリゴノールから成る群の中から少なくとも１種類を選び、それらを併せて使用することによって抗カンジダ活性を高めた組成物およびその用途に関する。本発明の組成物は、発症頻度が高く、かつ再発しやすい皮膚、粘膜のカンジダ症、とくに口腔カンジダ症に対し、効果的かつ簡便で、副作用や耐性菌出現の危険がない治療法および予防法を提供するものであり、同時に、特異な臭いをもつ非結合型の脂肪酸の使用を避けることによって、口腔分野、とくに異臭を嫌う食品分野への応用を容易ならしめるものである。
【背景技術】
【０００２】  オクタン酸（別称カプリル酸。炭素数８）やデカン酸（別称カプリン酸。炭素数１０）といった中鎖脂肪酸は、それらの非結合型が抗真菌作用を発揮し、さらにゲラニオールやシトラール、ショウガオールといった精油成分との併用によって相乗作用を発揮することが知られている。またオクタン酸やデカン酸は、香料、染料、医薬品などの各種化学工業において有機合成の原料として用いられる一方、食品添加物としての使用も認可されている。しかしながら非結合型のオクタン酸やデカン酸は、それぞれ不快な腐敗臭、羊肉の特異臭があるといった特性のために食品分野への応用は好まれない。オクタン酸やデカン酸は、ココナッツ油などの植物油に多く含まれるが、ほとんどはトリグリセリド分子の構成脂肪酸として結合型で存在する。結合型に不快臭はない。
中鎖脂肪酸低級アルコールエステルは、それぞれの酸と、エタノール、アミルアルコールといった低級アルコール（炭素数６以下）との脱水反応によって人工的にも合成される。中鎖脂肪酸低級アルコールエステルの仲間は一般的に香りが好く、その多くは食品添加物（香料）として認可されている。たとえばオクタン酸エチルはアプリコットやパイナップルを想起させるフルーティな香り、デカン酸エチルはオイリーなナッツやワイン粕を想起させる甘い香りをもち、いずれも食品添加物（香料）として使用可能である。嗜好性が重視される食品分野においては、不快な異臭を放つ非結合型の脂肪酸よりも、香りのよいこれらのエステル類の方が、応用性が著しく高い。しかしながら、これらエステル類の抗真菌作用は、本発明者の研究によると、原料である非結合型のオクタン酸やデカン酸に比較して著しく低かった。また、これらエステル類の抗真菌作用は公知ではなく、これらを用いて実用的な抗真菌作用を発揮させるためには、新たな発明が必要であった。
ショウガオールの化学構造は、フェニルプロパノイド骨格にポリケチド由来のアルキル鎖が付加したものであり、ショウガの辛みの主成分である。ショウガを乾燥したり加熱したりすると、前駆体であるジンゲロールから脱水反応により生成する。本発明者の研究によれば、ショウガオールは単独で比較的強い抗カンジダ活性を示す。ショウガオールを含む材料には、ジンジャー精油やジンジャーオレオレジンがある。ジンジャーオレオレジンは、ショウガをエタノールなどの有機溶剤によって抽出・濃縮して得られる粘稠な樹脂状の物質である。
シトラールの化学構造はモノテルペン系のアルデヒドで、強いレモン臭をもち、精油成分の中では比較的強い抗カンジダ活性を示す。シトラールを主成分として含む精油の代表例がレモングラス油である。また本発明者の研究により、ジンジャー精油にも主成分の一つとしてシトラールが含まれることが分かった。
シンナムアルデヒドの化学構造は、フェニルプロパノイド骨格をもつ芳香族アルデヒドであり、化学合成によって産業的に生産することも行われている。シンナムアルデヒドはシナモンの香り成分であり、強い抗カンジダ活性、抗真菌活性をもつことが知られている。桂皮油はシンナムアルデヒドを主成分として含む。
オリゴノール（商品名。販売：株式会社アミノアップ化学、北海道札幌市）とはオリゴマー・ポリフェノールの略称で、果実であるライチに含まれるポリフェノールの一種である高分子プロアントシアニジンを化学的に低分子化したものである。モノマー、ダイマー、トリマーを主成分として含み、その味は苦い。オリゴノールも抗カンジダ活性を示すが、強いものではない。
以上述べてきたように、オクタン酸やデカン酸といった中鎖脂肪酸、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒド、低分子プロアントシアニジンといった植物由来成分、およびそれらを成分として含むジンジャー精油、ジンジャーオレオレジン、レモングラス油、桂皮油、オリゴノールといった植物精油または植物由来材料、以上がそれぞれ抗真菌作用をもつことは公知である。さらに中鎖脂肪酸とショウガオール、シトラールといった精油成分を併用すると、抗カンジダ作用が相乗的に高まるという知見も公知である。
しかしながら非結合型の中鎖脂肪酸は不快な異臭を放ち、味や香りが重視される口腔分野においては使用が好まれる材料ではない。一方、中鎖脂肪酸のエステル類は香りが好く、口腔分野への応用性は著しく高いものの、他方、これらの抗真菌作用は、本発明者の研究によると、非結合型に比較して著しく低くかった。また、それらのエステル類の抗真菌作用は公知ではなく、これらを用いて実用的な抗真菌作用を発揮させるためには、新たな発明が必要であった。
カンジダは、健常人にも見出せる常在性真菌であるが、ときによって病原性を示し、口腔や腟、皮膚のカンジダ症の原因となる。口腔カンジダ症は、舌の疼痛や味覚異常などの症状を呈してＱＯＬの低下をもたらす感染症で、とくに高齢者に発症頻度が高く、老人ホームにおいてはその治療や予防が重要な課題となっている。口腔カンジダ症の原因菌は、その大半がカンジダ・アルビカンスＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓである。女性の腟カンジダ症も発症頻度が大変高く、局所の痒み、発赤、帯下がみられ、ＱＯＬが低下する。膣カンジダ症の原因菌は、主にカンジダ・アルビカンスであるが、カンジダ・トロピカリスＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、カンジダ・グラブラタＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａなどの菌種も比較的高い頻度で検出される。後の２菌種は通常の抗真菌剤には抵抗性で、難治性かつ再発を繰り返しやすいとされている。
カンジダは、酵母形と菌糸形の２形性を示し、このうち菌糸形が病原性に直接関わっている。したがって菌糸形発育の阻害は、カンジダ感染症の予防に結びつくとされている。カンジダの酵母形および菌糸形発育それぞれに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害試験の方法は確立されており、それによって、様々な材料のＭＩＣ（最少発育阻止濃度）を測定することができる。菌糸形発育に対するデカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールの各ＩＣ８０（８０％発育阻止濃度）は、それぞれ１００、６．２５、６．２５、１２．５、１，６００μｇ／ｍＬであった。
一般に、微生物に対して抗菌物質を併用した場合の相乗的効果の定義は、２剤の個別的効果の和よりも有意に大きい効果を示した場合を指す。また相乗効果に対する評価は、以下の通り、チェッカーボード法によって２剤のＭＩＣの値から求めたＦＩＣ係数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）によっておこなうことができる。すなわちＦＩＣ係数が０．５未満の場合、相乗効果があると判定される。本発明のデカン酸エチルとショウガオールを併用した場合、カンジダの菌糸形発育に対するＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。同様にデカン酸エチルと、シトラール、シンナムアルデヒド、またはオリゴノールそれぞれを併用した場合、各ＦＩＣ係数は、それぞれ０．４９９、０．３７５、０．３７５となり、いずれも相乗効果があると判定された。
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  皮膚や粘膜におけるカンジダ症、とくに高齢者における口腔カンジダ症や女性における腟カンジダ症は、それぞれ発症頻度が大変高く、かつ再発を繰り返しやすい。これらのカンジダ症の治療には、アゾール系やキャンディン系といった抗真菌剤が用いられるが、使用終了後の再発を抑えることは困難である。再発を抑えるために薬剤を長期間使用した場合、肝機能障害などの副作用や耐性菌の出現といったリスクが高まる危険がある。
植物由来成分や脂肪酸を活用した方法は、長期間連用しても副作用や耐性菌出現の危険がほとんどなく、かつ効果的な治療法であり、さらに患者自身が手軽に実行できるという特長がある。
しかしながら、とくに口腔カンジダ症の場合は、長期間口腔に適用することになるため、組成物の味や香りが大きな問題となる。とくにオクタン酸やデカン酸などの中鎖脂肪酸類は不快な異臭をもち、応用が好まれる材料ではない。一方、オクタン酸やデカン酸などのエステルは香りが好く、口腔分野への応用には適しているものの、他方、その抗カンジダ活性は低く実用的なレベルではなかった。
本発明の目的は、実用的なレベルの抗カンジダ活性を発揮し、かつ香りが好く、とくに口腔カンジダ症の患者によりよく適用できる組成物を開発することにある。具体的には、異臭がある非結合型の中鎖脂肪酸に代えて、香りのよいそれらのエステルの使用に置き換え、かつ植物由来成分との相乗効果によって抗カンジダ活性を実用的なレベルにまで高めた組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  カンジダの菌糸形発育に対する阻害試験は、帝京大学医真菌研究センター保存の菌株Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＴＩＭＭ１７６８株を用いておこなった。カンジダは、子牛血清を含む培地では専ら菌糸形をとり、培養器の表面に付着して発育する。２％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に、カンジダを菌数５×１０２、および予め各濃度を設定してＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド。培地中の最終濃度０．２５％）に溶解したデカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドまたはオリゴノールを加えて最終液量を２００μＬとした。それを９６穴マイクロプレートのウェルの中で、５％炭酸ガス存在下、３７℃、１６時間培養した。培養終了後、各ウェルの培養物を吸引除去し、生理食塩水１８０μＬを入れて洗浄回収し、７０％エタノール２００μＬを入れて残存しているカンジダを殺菌した。エタノールを除去して水道水で洗浄した後、染色液（０．１Ｍリン酸バッファーに溶解した０．０１％クリスタルバイオレット液）１００μＬを入れてウェルの表面に付着したカンジダ菌を染色した。水道水で洗浄して余分な染色液を除去した後、０．０４ＮＨＣｌを含む３−イソプロパノール１５０μＬおよび０．２５％ＳＤＳ溶液５０μＬを入れて菌体に付着した色素を遊離させた。色素を遊離させた後、プレートをマルチスキャンフォトメーターにかけて、各ウェルのＯＤ６２０ｎｍを測定した。増殖阻害率は、以下の式により求めた。
増殖阻害率（％）＝（１−サンプルＯＤ／対照ＯＤ）×１００
デカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールの各ＩＣ８０（８０％増殖阻害濃度）は、それぞれ１００、６．２５、６．２５、１２．５、１，６００μｇ／ｍＬであった。
デカン酸エチルと、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールとの併用による抗カンジダ活性の相乗効果については、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、デカン酸エチルおよび各植物由来の成分または材料とそれぞれの濃度系列を各ウェルに交差させた。実験条件および測定方法などは、菌糸形発育に対する試験と同様とした。
デカン酸エチルとショウガオールを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、６．２５μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１２．５、１．５６μｇ／ｍＬであった。それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝１２．５／１００＋１．５６／６．２５＝０．３７５＜０．５
デカン酸エチルとシトラールを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、６．２５μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ２５．０、１．５６μｇ／ｍＬ、それらの数値を用いて計算したＦＩＣ係数は０．４９９となり、相乗効果があると判定された。
デカン酸エチルとシンナムアルデヒドを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、１２．５μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１２．５、３．１３μｇ／ｍＬ、それらの数値を用いて計算したＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。
デカン酸エチルとオリゴノールを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、１，６００μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ２５、２００μｇ／ｍＬ、それらの数値を用いて計算したＦＩＣ係数は０．３７５となり、相乗効果があると判定された。
【発明の効果】
【０００５】  本発明の抗カンジダ活性組成物は、皮膚や粘膜におけるカンジダの感染を抑える効果を発揮する。したがって発明の効果としては、皮膚や粘膜のカンジダ症、とくに患者数の多い口腔カンジダ症や膣カンジダ症への適用と、それによる症状の改善、病気の治癒、感染の予防が第一にあげられる。
また植物由来成分そのものや植物由来の精油または材料、および中鎖脂肪酸低級アルコールエステルは、高純度の製品を得ることが容易であり、かつ食品への利用も認められている。したがって医薬品から食品まで幅広い製品に応用することが可能であり、実用化されれば入手しやすく使用が簡便で、患者にとってメリットが大きい。
口腔カンジダ症や膣カンジダ症は再発を繰り返しやすく、しかも副作用や耐性菌出現リスクのために抗真菌剤の連用には限界がある。中鎖脂肪酸低級アルコールエステルと、植物由来成分または植物由来の精油や材料を併用した組成物は、このようなリスクを考慮する必要がなく、患者は安心して利用することができる。
オクタン酸やデカン酸といった非結合型の中鎖脂肪酸類は異臭を放つため、口腔分野への適用は好まれないが、それらのエチルエステルは香りが好く、応用は容易である。とくに口腔カンジダ症の場合、患者への適用はしばしば長期間にわたり、その場合、組成物の味や香りは大きな問題になる。本発明の目的は、その問題を解決し、それによって実用化を容易にするための優れた組成物を提供するところにある。
【発明を実施するための形態】
【０００６】  本発明の抗カンジダ活性組成物の必須材料である中鎖脂肪酸低級アルコールエステルおよび植物由来成分やそれらを含む精油または材料は、高純度の製品を得ることが容易であり、かつ食品への利用も可能である。したがって、医薬品から食品まで幅広い範囲の製品に応用することができる。医薬品的な形態としては、例えば液剤や軟膏として、口腔や膣などの患部に直接塗布または噴霧することがあげられる。食品的な形態としては、例えばキャンディやグミ、ガムといった製品や、精油成分の保存性がよい容器を使用した飲料などがあげられる。いずれの製品であっても、使用に際して、効果を発揮するための必要量の植物由来成分や中鎖脂肪酸低級アルコールエステルの投与を可能とする形態であり、かつ保証期間内にそれらの保存に問題を生じないことが肝要である。
【実施例】
【０００７】  本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．デカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールのカンジダ菌糸形発育に対する阻害活性【０００８】  カンジダは帝京大学医真菌研究センター保存の臨床分離株、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＴＩＭＭ１７６８を用い、サブロー・デキストロース寒天培地平板で３７℃、２０時間培養した。増殖した菌体を回収して２％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、菌数５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整してカンジダ菌液とした。デカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールは、予め最終濃度に合わせて、それぞれＤＭＳＯに溶解し、この溶液を２％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に加えてサンプル液とした（培地中のＤＭＳＯ濃度０．５％）。サンプル液およびカンジダ菌液各１００μＬを、それぞれ９６穴マイクロプレート（Ｍｕｌｔｉ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ、住友ベークライト、東京）各ウェルに入れて、５％炭酸ガス存在下、３７℃、１６時間培養した。培養終了後、各ウェル中の培養物を吸引除去し、生理食塩水１８０μＬを入れて洗浄回収し、７０％エタノール２００μＬを入れてカンジダを殺菌した。エタノールを除去して水道水で洗浄した後、染色液（０．１Ｍリン酸バッファーに溶解した０．０１％クリスタルバイオレット液）１００μＬを入れて１５分間静置し、ウェルの表面に付着したカンジダ菌を染色した。水道水で洗浄して余分な染色液を除去した後、０．０４ＮＨＣｌを含む３−イソプロパノール１５０μＬおよび０．２５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液５０μＬを入れて菌体に付着した色素を遊離させた。色素を遊離させた後、プレートをマルチスキャンフォトメーター（Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、大日本製薬、大阪）にかけて、各ウェルのＯＤ６２０ｎｍを測定した。増殖阻害率は、以下の式により求めた。
増殖阻害率（％）＝（１−サンプルＯＤ／対照ＯＤ）×１００
デカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールの各ＩＣ８０（８０％増殖阻害濃度）は、それぞれ１００、６．２５、６．２５、１２．５、１，６００μｇ／ｍＬであった。
実施例２．カンジダ菌糸形発育に対するデカン酸エチルと、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドまたはオリゴノールとの併用による抗カンジダ活性の相乗効果【０００９】  併用による抗カンジダ活性の相乗効果については、チェッカーボード法により評価した。９６穴マイクロプレート上にチェッカーボードを想定し、各ウェルに、デカン酸エチル、ショウガオール、シトラール、シンナムアルデヒドおよびオリゴノールそれぞれの濃度系列を交差させた。実験条件および測定方法などは菌糸形発育に対する試験と同様とした。
デカン酸エチルとショウガオールとを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、６．２５μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１２．５、１．５６μｇ／ｍＬであった。それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．３７５となり相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝１２．５／１００＋１．５６／６．２５＝０．３７５＜０．５
デカン酸エチルとシトラールとを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、６．２５μｇ／ｍＬ、併用時のＩＣ８０は、それぞれ２５．０、１．５６μｇ／ｍＬ、それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．４９９となり相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝２５．０／１００＋１．５６／６．２５＝０．４９９＜０．５
デカン酸エチルとシンナムアルデヒドとを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１００、１２．５μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１２．５、３．１３μｇ／ｍＬ、それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．３７５となり相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝１２．５／１００＋３．１３／１２．５＝０．３７５＜０．５
デカン酸エチルとオリゴノールとを併用した場合、単独使用時の各ＩＣ８０は、それぞれ１，６００μｇ／ｍＬ、併用時の各ＩＣ８０は、それぞれ２５．０、２００μｇ／ｍＬ、それらの数値を用いて以下の計算により求めたＦＩＣ係数は０．３７５となり相乗効果があると判定された。
ＦＩＣ係数＝２５．０／１００＋２００／１，６００＝０．３７５＜０．５