(57)【要約】【課題】細胞透過のための過剰に荷電されたタンパク質の提供。【解決手段】本発明は、過剰に荷電されたタンパク質または過剰に荷電されたタンパク質と作用物質（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、小分子）の複合体を細胞に送達するための組成物、調製物、システムおよび関連方法を提供する。そのようなシステムおよび方法は、過剰に荷電されたタンパク質の使用を含む。例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質を（典型的には正味負電荷を有する）核酸と静電相互作用によって会合させることができる。いくつかの実施形態において、そのようなシステムおよび方法は、そのタンパク質を「過剰に荷電させる」（例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質を生じさせる）ためにタンパク質の一次配列を改変することを含む。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき１つ以上の作用物質とを含む複合体は、治療薬として有用である。【選択図】図６
2014159484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／０４８，３７０号および２００８年１０月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／１０５，２８７号（これらの各々は、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
政府の支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ／ＮＩＧＭＳによって授与された契約番号Ｒ０１  ＧＭ  ０６５４００の下、米国政府の支援によっ
てなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
治療、診断または他の用途に応じて使用するためのものである作用物質の有効性は、多くの場合、生物学的な活性の所望の変化を誘導するために細胞膜または組織を透過するその能力に大いに依存する。タンパク質であろうと、核酸であろうと、有機小分子であろうと、無機小分子あろうと、多くの治療薬、診断または他の製品候補が、インビトロで有望な生物学的な活性を示すが、多くの場合、不適当なインビボ生体内分布を生じさせる結果となる生理化学的特性のため、多くのものは、ターゲット細胞に到達してまたはそれらを透過して所望の効果を達成することができない。
【０００４】
特に、核酸は、有効な治療薬としておよび研究ツールとして大きな潜在能力を有する。ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子調節の一般性および配列特異性は、遺伝子特異的治療薬としてのｓｉＲＮＡの使用の可能性を提起した（非特許文献１；参考として本明細書に援用されている）。短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による遺伝子発現の抑制も、遺伝子およびタンパク質機能を研究するための価値のあるツールとして浮上してきた（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。しかし、ｓｉＲＮＡなどの核酸の細胞への送達は、予想できないことが判明しており、典型的には役に立たない。細胞への核酸の有効な送達の一つの障害は、核酸を取り込むように細胞を誘導することである。細胞への核酸の送達を助長することができる作用物質を特定するために多くの研究がなされてきた。細胞培養物にｓｉＲＮＡをトランスフェクトするために、市販のカチオン性脂質試薬が典型的には使用されている。しかし、カチオン性脂質ベースのｓｉＲＮＡ送達の有効性は、細胞タイプによって大きく異なる。また、一部の一次ニューロン、Ｔ細胞、線維芽細胞および上皮細胞系をはじめとする多数の細胞系は、一般的なカチオン性脂質トランスフェクション技術に対して耐性であることを明示した（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。エレクトロポレーション（非特許文献９；参考として本明細書に援用されている）およびウイルス媒介ｓｉＲＮＡ送達（非特許文献１０；非特許文献１１；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）をはじめとする代替トランスフェクションアプローチも用いられているが；これらの方法は、細胞毒性である場合があり、または予想できない様式で細胞機能を乱す場合があり、および被験体における治療薬としての核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の送達にはあまり価値がない。
【０００５】
核酸送達の挑戦に取り組む最近の努力は、様々な新たな核酸送達の足掛かりをもたらした。これらの方法としては、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄｓ）（Ａｋｉｎｃら、２００８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６：５６１−６９；参考として本明細書に援用されている）、カチオンポリマー（ＳｅｇｕｒａおよびＨｕｂｂｅｌｌ、２００７、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１８：７３６−４５；参考として本明細書に援用されている）、無機ナノ粒子（ＳｏｋｏｌｏｖａおよびＥｐｐｌｅ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、４７：１３８２−９５；参考として本明細書に援用されている）、カーボンナノチューブ（Ｌｉｕら、２００７、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、４６：２０２３−２７；参考として本明細書に援用されている）、細胞透過性ペプチド（Ｄｅｓｈａｙｅｓら、２００５、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、６２：１８３９−４９；およびＭｅａｄｅおよびＤｏｗｄｙ、２００８、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、６０：５３０−３６；これらの両方が参考として本明細書に援用されている）、および化学修飾ｓｉＲＮＡ（Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：６８５−８９；参考として本明細書に援用されている）が挙げられる。これらの送達システムのそれぞれが、特定の用途には恩恵をもたらすが、殆どの場合、細胞毒性、調製の容易さ、安定性または一般性については疑問が残る。従って、有意な細胞毒性を伴わずに様々な細胞系に核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を有効に送達することが
できる、容易に調製される試薬には依然として相当な関心が寄せられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｍｃｒｏｔら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００６）２：７１１−１９
【非特許文献２】Ｄｏｒｓｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００４）３：３１８−２９
【非特許文献３】Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３）４：４５７−６７
【非特許文献４】Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４−９８
【非特許文献５】Ｃａｒｌｏｔｔｉら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００４）９：２０９−１７
【非特許文献６】Ｍａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）１１２：１−５
【非特許文献７】ＭｃＭａｎｕｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６９：５７５４−６０
【非特許文献８】Ｓｔｒａｉｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００７）２９３：Ｆ６０１−０６
【非特許文献９】Ｊａｎｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００８）３３７：７１−７７
【非特許文献１０】Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００２）２：２４３−４７
【非特許文献１１】Ｓｔｅｗａｒｔら、ＲＮＡ（２００３）９：４９３−５０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＮＡｉ療法および他の核酸ベースの療法に関する現在の関心を考えると、核酸ならびに他の作用物質（例えば、ペプチド、タンパク質、小分子）を様々な細胞タイプに予測どおりにおよび効率的に送達するために用いることができる試薬およびシステムが当該技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タンパク質上の総表面電荷の増加または減少を生じさせる（今後、「過剰に荷電させる」と言う）ように修飾されたタンパク質を使用する、核酸および他の作用物質（例えば、ペプチド、タンパク質、小分子）を細胞に送達するための新規システム、組成物、調製物および関連方法を提供する。従って、過剰に荷電させることを用いて、過剰に荷電されたタンパク質、または一緒に複合体を形成する過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質（単数もしくは複数）のインビボまたはインビトロでの細胞への侵入を促進することができる。そのようなシステムおよび方法は、過剰に荷電されるように作られた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）タンパク質の使用を含む場合があり、これらに限定されないが、荷電部分の該タンパク質への取り付けばかりでなくアミノ酸配列の変更を含むものを含めて、すべてのそのような修飾を包含し得る。作られた過剰に荷電されたタンパク質の例は、国際ＰＣＴ特許出願、２００７年１２月１３日にＷＯ  ２００７／１４３５７４として発行された２００７年６月１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／７０２５４；ならびに米国特許仮出願、２００６年６月２日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８１０，３６４および２００６年８月９日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８３６，６０７（これらのそれぞれが、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ」と題し、およびこれらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）に記載されている。薬物送達に有用な過剰に荷電されたタンパク質のさらなる例は、本明細書にも記載する。本発明は、天然
に存在する過剰に荷電されたタンパク質を使用して、一緒に複合体を形成する会合している作用物質の細胞透過を増進させる、または天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質それ自体の細胞透過を増進させることも考えている。典型的には、作られたまたは天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質は、正電荷を有する。ある実施形態では、過剰に正に荷電されたタンパク質を、静電相互作用によって（一般には正味負電荷を有する）核酸と会合させ、それによってその核酸の細胞への送達を助長することができる。別の方法で、過剰に正に荷電されたタンパク質と送達すべき核酸とを、共有結合的にまたは非共有結合的に会合させることもできる。ペプチドまたは小分子などの他の作用物質を、送達すべきその作用物質と共有結合するまたは別様に会合する（例えば、静電相互作用）過剰に荷電されたタンパク質を使用して、細胞に送達することもできる。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を第二のタンパク質配列と融合する。例えば、ある実施形態では、送達すべき作用物質および過剰に荷電されたタンパク質を一緒に、単一ポリペプチド鎖内で融合タンパク質として発現させる。ある実施形態において、融合タンパク質は、過剰に荷電されたタンパク質と他のタンパク質成分の間にリンカー、例えば切断可能なリンカーを有する。ある実施形態では、送達すべき作用物質と、過剰に荷電されたタンパク質、例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質とを、切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼまたはエステラーゼによって切断することができるリンカー、ジスルフィド結合）によって互いに会合させる。本発明において有用な過剰に荷電されたタンパク質、例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質は、典型的には、非抗原性、生体分解性、および／または生体適合性である。ある実施形態において、過剰に正に荷電されたタンパク質は、生物学的な活性を有さず、またはいずれの有害な生物学的な活性も有さない。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、過剰に荷電させる前のそのタンパク質によって示される生物学的な活性を減少させるまたは完全に破壊する変異または他の改変（例えば、翻訳後修飾、例えば切断または他の共有結合性修飾）を有する。これは、その過剰に荷電されたタンパク質が、それ自体の生物学的な活性のためではなく作用物質の細胞への送達での使用のために興味深いものであるとき、特に興味深い。特定の理論により拘束されることを望まないが、アニオン性細胞表面プロテオグリカンは、そのペイロードに結合した過剰に正に荷電されたタンパク質のアクチン依存性エンドサイトーシスのための受容体としての役割を果たすと考えられる。本発明の過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電された、例えば過剰に正に荷電された、タンパク質を使用する送達システムは、他の医薬的に許容され得る賦形剤、例えば、ポリマー、脂質、炭水化物、小分子、ターゲッティング部分、エンドソーム溶解剤、タンパク質、ペプチドなどの使用を含む場合がある。例えば、過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質、例えば過剰に正に荷電されたタンパク質、と送達すべき作用物質との複合体を、マイクロ粒子、ナノ粒子、ピコ粒子、ミセル、リポソーム、または他の薬物送達システムの中に収容するまたはそれらと会合させることができる。他の実施形態では、送達すべき作用物質および過剰に荷電されたタンパク質だけを使用して、その作用物質を細胞に送達する。ある実施形態において、前記過剰に荷電されたタンパク質は、それ自体をまたは会合している作用物質を特定の細胞または組織タイプに送達するために選択される。ある実施形態では、前記過剰に荷電された、例えば過剰に正に荷電された、タンパク質、または送達すべき作用物質および過剰に荷電されたタンパク質を、エンドソーム溶解性小胞を破壊するまたはエンドソームの分解を増進させる作用物質（例えば、クロロキン、ピレン酪酸、融合性ペプチド、ポリエチレンイミン、血球凝集素２（ＨＡ２）ペプチド、メリチンペプチド）と併用する。このようにして、送達すべき作用物質のエンドソームからサイトゾルへの脱出を増進させる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、タンパク質の一次配列を改変して、そのタンパク質を「過剰に荷電させる」ことを含む。他の実施形態において、本発明のシステムおよび方法は、荷電部分をタンパク質に取り付けて、そのタンパク質を「過剰に荷電させる」ことを含む。すなわち、修飾されたタンパク質の全体の正味電荷
は、未修飾タンパク質と比較して増加される（より大きな正電荷またはより大きな負電荷のいずれか）。ある実施形態では、タンパク質を過剰に荷電させて、例えば過剰に正に荷電させる、核酸または他の作用物質の細胞への送達を可能にする。任意のタンパク質を「過剰に荷電させる」ことができる。典型的には、タンパク質は、非免疫原性であり、および自然に、または過剰に荷電させることによって、それ自体をまたは会合している作用物質を細胞にトランスフェクトまたは送達する能力を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質の活性は、修飾を伴わないタンパク質とほぼ同じまたは実質的に同じである。他の実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質の活性は、修飾を伴わないタンパク質と比較して実質的に減少される。そのような活性は、それ自体のまたは会合している作用物質、例えば核酸、の本明細書に記載するような細胞への送達に密接に関連していない場合がある。いくつかの実施形態において、タンパク質を過剰に荷電させることは、それ自体をまたは会合している作用物質、例えば核酸、を細胞に送達するそのタンパク質の能力を増加させるばかりでなく、タンパク質の耐凝集性、溶解度、リフォールディング能力、および／または広範な条件下での一般的な安定性を増加させる結果となる。ある実施形態において、前記過剰に荷電されたタンパク質は、それ自体または会合している送達すべき作用物質を特定の細胞タイプ、組織または器官にターゲッティングするのに役立つ。ある実施形態において、タンパク質を過剰に荷電させることは、（ａ）対象となるタンパク質の表面残基を特定する工程；（ｂ）場合により、対象となるタンパク質に関連した他のタンパク質の間で高度に保存されない特定の表面残基を特定する（すなわち、どのアミノ酸が、そのタンパク質の活性または機能にとって必須でないかを決定する）工程；（ｃ）特定された表面残基の親水性を決定する工程；および（ｄ）特定された荷電または極性、溶媒露出残基の少なくとも１つ以上を、生理的なｐＨで電荷を有するアミノ酸で置換する工程を含む。国際公開ＰＣＴ特許出願、２００７年１２月１３日にＷＯ  ２００７／１４３５７４として発行された２００７年６月１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／７０２５４；ならびに米国特許仮出願、２００６年６月２日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８１０，３６４および２００６年８月９日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８３６，６０７を参照のこと（これらのそれぞれが、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ」と題し、およびこれらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。過剰に荷電されたタンパク質の例示的調製方法および方法の使用を説明する例示的タンパク質配列を本明細書に記載する。ある実施形態では、正電荷を有する「過剰に荷電された」タンパク質を作るために、修飾用に特定された残基をリシン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）残基のいずれか（すなわち、生理的なｐＨで正電荷を有するアミノ酸）に変異させる。ある実施形態では、負電荷を有する「過剰に荷電された」タンパク質を作るために、修飾用に特定された残基をアスパラテート（Ａｓｐ）またはグルタメート（Ｇｌｕ）残基のいずれか（すなわち、生理的なｐＨで負電荷を有するアミノ酸）に変異させる。上記工程のそれぞれは、当該技術分野において公知の任意の技術、コンピュータソフトウェア、アルゴリズム、方法論、パラダイムなどを用いて行うことができる。修飾タンパク質を作製した後、その活性および／または求められている望ましい特性（例えば、核酸または他の作用物質を細胞に送達する能力）についてそれを試験することができる。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、凝集しにくい。ある実施形態において、正電荷を有する「過剰に荷電された」タンパク質（例えば、過剰に正に荷電された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、例えば＋３６ＧＦＰ）は、核酸（例えばｓｉＲＮＡ剤）の細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞）への送達に有用である。ある実施形態において、本発明のシステムは、通常はトランスフェクションに耐性の細胞（例えば、ニューロン細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、および上皮細胞）への核酸の送達を可能にする。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質を作るのではなく、天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質を特定し、本発明の薬物送達システムにおいて使用する。天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質の例としては、サイクロン（番号（ＩＤ  Ｎｏ．）：Ｑ９Ｈ６Ｆ５）、ＰＮＲＣ１（番号：Ｑ１２７９６）、ＲＮＰＳ１（番号：Ｑ１５２８７）、ＳＵＲＦ６（番号：Ｏ７５６８３）、ＡＲ６Ｐ（番号：Ｑ６６ＰＪ３）、ＮＫＡＰ（番号：
Ｑ８Ｎ５Ｆ７）、ＥＢＰ２（番号：Ｑ９９８４８）、ＬＳＭ１１（番号：Ｐ８３３６９）、ＲＬ４（番号：Ｐ３６５７８）、ＫＲＲ１（番号：Ｑ１３６０１）、ＲＹ−１（番号：Ｑ８ＷＶＫ２）、ＢｒｉＸ（番号：Ｑ８ＴＤＮ６）、ＭＮＤＡ（番号：Ｐ４１２１８）、Ｈ１ｂ（番号：Ｐ１６４０１）、サイクリン（番号：Ｑ９ＵＫ５８）、ＭＤＫ（番号：Ｐ２１７４１）、ミッドカイン（番号：Ｐ２１７４１）、ＰＲＯＫ（番号：Ｑ９ＨＣ２３）、ＦＧＦ５（番号：Ｐ１２０３４）、ＳＦＲＳ（番号：Ｑ８Ｎ９Ｑ２）、ＡＫＩＰ（番号：Ｑ９ＮＷＴ８）、ＣＤＫ（番号：Ｑ８Ｎ７２６）、ベータ−ディフェンシン（番号：Ｐ８１５３４）、ディフェンシン３（番号：Ｐ８１５３４）；ＰＡＶＡＣ（番号：Ｐ１８５０９）、ＰＡＣＡＰ（番号：Ｐ１８５０９）、エオタキシン−３（番号：Ｑ９Ｙ２５８）、ヒストンＨ２Ａ（番号：Ｑ７Ｌ７Ｌ０）、ＨＭＧＢ１（番号：Ｐ０９４２９）、Ｃ−Ｊｕｎ（番号：Ｐ０５４１２）、ＴＥＲＦ  １（番号：Ｐ５４２７４）、Ｎ−ＤＥＫ（番号：Ｐ３５６５９）、ＰＩＡＳ  １（番号：Ｏ７５９２５）、Ｋｕ７０（番号：Ｐ１２９５６）、ＨＢＥＧＦ（番号：Ｑ９９０７５）、およびＨＧＦ（番号：Ｐ１４２１０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質が得られたら、本発明によるシステムおよび方法は、１つ以上の核酸または他の作用物質とその過剰に荷電されたタンパク質を会合させる工程、および結果として得られた複合体と細胞を、その細胞がペイロードを取り込むために適する条件下で接触させる工程を含む。核酸は、ＤＮＡである場合もあり、ＲＮＡである場合もあり、および／またはそれらのハイブリッドもしくは誘導体である場合もある。ある実施形態において、核酸は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ誘導剤、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター、プラスミド、ウイルスゲノム、人工染色体などである。いくつかの実施形態において、核酸は、一本鎖である。他の実施形態において、核酸は、二本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の検出可能な標識（例えば、蛍光タグおよび／または放射性原子）を含む場合がある。ある実施形態では、核酸を（例えば、分解しにくくなるように、またはトランスフェクション効率を向上させるように）修飾または誘導体化する。ある実施形態において、核酸の修飾は、その核酸の分解を防止する。ある実施形態において、核酸の修飾は、その核酸の細胞への送達を助長する。過剰に荷電されたタンパク質を用いて送達することができる他の作用物質としては、小分子、ペプチドおよびタンパク質が挙げられる。その後、結果として得られた複合体を他の医薬的に許容され得る賦形剤（単数または複数）と併せてまたは会合させて、細胞、組織、器官または被験体へのその作用物質の送達に適する組成物を形成することができる。
【００１１】
過剰に荷電されたタンパク質を非共有結合性相互作用によって核酸（または他の作用物質）と会合させて複合体を形成することができる。過剰に荷電されたタンパク質と核酸の共有結合性会合は可能であるが、典型的には核酸の送達には必要ではない。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を静電相互作用によって核酸と会合させる。他の非共有結合性相互作用または共有結合性相互作用によって過剰に荷電されたタンパク質を核酸と会合させることもできる。過剰に荷電されたタンパク質は、少なくとも＋５、＋１０、＋１５、＋２０、＋２５、＋３０、＋３５、＋４０または＋５０の正味正電荷を有する場合がある。いくつかの実施形態では、過剰に正に荷電されたタンパク質を、全体の正味負電荷を有する核酸と会合させる。結果として得られる複合体は、正味負電荷を有する場合もあり、正味正電荷を有する場合もある。ある実施形態において、複合体は、正味正電荷を有する。例えば、＋３６ＧＦＰを、負の電荷を有するｓｉＲＮＡと会合させることができる。
【００１２】
核酸に加えて他の作用物質と過剰に荷電されたタンパク質を非共有結合性または共有結合性相互作用によって会合させることができる。例えば、負の電荷を有するタンパク質と
過剰に正に荷電されたタンパク質とを静電相互作用によって会合させることができる。電荷を有さないまたは十分な電荷を有さない作用物質については、その作用物質と過剰に荷電されたタンパク質とを共有結合的に会合させて、その作用物質の細胞への送達を果たすことができる。例えば、ペプチド治療薬を過剰に荷電されたタンパク質と融合させて、そのペプチド治療薬を細胞に送達することができる。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質とペプチドを、切断可能なリンカーによって連結させることができる。しかし別の例を挙げると、細胞への送達のために小分子を過剰に荷電されたタンパク質に結合体化させることができる。非共有結合性相互作用（例えば、リガンド−受容体相互作用、双極子−双極子相互作用など）によって、作用物質を過剰に荷電されたタンパク質と会合させることもできる。
【００１３】
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき作用物質の１つ以上の分子とを含む複合体を提供する。いくつかの実施形態において、そのような複合体は、過剰に荷電されたタンパク質１分子につき多数の作用物質分子を含む。いくつかの実施形態において、そのような複合体は、過剰に荷電されたタンパク質１分子につき１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０またはそれより多い作用物質（例えば、核酸）分子を含む。ある特定の実施形態において、複合体は、おおよそ１個の過剰に荷電されたタンパク質に対しておおよそ１〜２個の核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。他の実施形態において、そのような複合体は、作用物質１分子につき多数のタンパク質分子を含む。いくつかの実施形態において、そのような複合体は、作用物質１分子につき１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０またはそれより多いタンパク質分子を含む。ある実施形態において、そのような複合体は、作用物質おおよそ１分子と過剰に荷電されたタンパク質おおよそ１分子を含む。ある実施形態において、作用物質／過剰に荷電されたタンパク質複合体の全体の正味電荷は、負である。ある実施形態において、作用物質／過剰に荷電されたタンパク質複合体の全体の正味電荷は、正である。ある実施形態において、作用物質／過剰に荷電されたタンパク質複合体の全体の正味電荷は、中性である。ある特定の実施形態において、核酸／過剰に荷電されたタンパク質複合体の全体の正味電荷は、正である。
【００１４】
もう一つの態様において、本発明は、本発明によるａ）１つ以上の過剰に荷電されたタンパク質；ｂ）過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき作用物質との１つ以上の複合体；またはｃ）ａ）の１つ以上もしくはｂ）の１つ以上と、少なくとも１つの医薬的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。組成物中の複合体の量は、細胞において所望の生物学的な応答を誘導するために、例えば、細胞における特定の遺伝子の発現を増加させるまたは減少させるために有用な量であり得る。ある実施形態では、特定の細胞、細胞タイプ、組織または器官に作用物質の送達を方向づけるために使用されるターゲッティング部分（例えば、小分子、タンパク質、ペプチド、炭水化物など）と複合体を会合させる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、作られたまたは天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質と１つ以上の核酸とを含む複合体（および／またはそれらの医薬組成物）は、治療薬として有用である。いくつかの実施形態において、核酸および／または過剰に荷電されたタンパク質は、治療上活性であり得る。ある実施形態において、核酸は、治療上活性である。例えば、一部の状態（例えば、癌、炎症性疾患）は、一定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現と関係づけられる。発現されるｍＲＮＡをターゲットにするＲＮＡｉ剤と会合している過剰に荷電されたタンパク質は、そのような状態の治療に有用であり得る。あるいは、一部の状態（例えば、癌、先天性代謝異常）は、一定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現不良と関係づけられる。欠損したｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を誘導するベクターと会合している過剰に荷電されたタンパク質は、そのような状態の処置に有用であり得る。
【００１６】
本発明は、本発明の過剰に荷電されたタンパク質もしくは過剰に荷電されたタンパク質／作用物質複合体もしくはそれらの組成物の生産、および／または過剰に荷電されたタンパク質もしくは作用物質を細胞にトランスフェクトもしくは送達するためのそのような複合体の使用に有用なキットも提供する。本発明のキットは、本発明の過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体またはそれらの医薬組成物の投与または使用についての指示書も含む場合がある。例えば、キットは、医薬組成物を被験体に処方するための指示書を含む場合がある。キットは、作用物質の複数の単位用量に十分な材料を含む場合がある。キットを治療または研究のために設計することができる。キットは、送達すべき作用物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、薬物）を場合によっては含むことがあり、もしくは使用者がその作用物質を供給できる。
【００１７】
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質もしくは過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質またはその両方を細胞に導入する方法も提供する。本発明の方法は、過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質およびその過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質を細胞と、例えば、前記過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質の細胞への透過を可能にするのに十分な条件下で、接触させる工程、それによって過剰に荷電されたタンパク質、もしくは過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質、またはその両方を細胞に導入する工程を含む。ある実施形態では、十分な過剰に荷電されたタンパク質または作用物質が細胞に進入して、次のうちの１つ以上の検出が可能となる：細胞中の過剰に荷電されたタンパク質もしくは作用物質；細胞の生物学的特性、例えば細胞の増殖速度、遺伝子発現パターンもしくは生存率、の変化；または過剰に荷電されたタンパク質もしくは作用物質の生物学的作用の検出。ある実施形態において、接触は、インビトロで行われる。ある実施形態において、接触は、インビボで、例えば、被験体、例えばヒトまたは他の動物、の体内で行われる。一つのインビボ実施形態では、被験体において検出可能な効果、例えば治療効果、を生じさせるために十分な過剰に荷電されたタンパク質、作用物質、またはその両方が、細胞内に存在する。一つのインビボ実施形態では、透過された１つ以上の細胞または組織のイメージングを可能にするために十分な過剰に荷電されたタンパク質、作用物質またはその両方が、細胞内に存在する。ある実施形態では、観察されるまたは検出可能な効果が、細胞透過から生ずる。
【００１８】
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する方法であって、過剰に荷電されたタンパク質を場合によっては選択する工程；前記過剰に荷電されたタンパク質を提供する工程；および前記過剰に荷電されたタンパク質と細胞とを接触させ、その過剰に荷電されたタンパク質が細胞を透過するかどうかを決定し、それによって過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する工程を含む、方法も提供する。
【００１９】
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する方法であって、過剰に荷電させるべきタンパク質を選択する工程；変更すべき１つまたは複数の残基のセットを得て、過剰に荷電されたタンパク質を生成する工程であって、本明細書に記載する方法によって生成されたものであるセットを得る工程（この得る工程は、そのセットを生成すること、またはそのセットの１つ以上のメンバーの正体を他の関係者から受け取ることを含む）；前記変更される残基のセットを有する過剰に荷電されたタンパク質を（例えば、それを作ることまたは別の関係者から受け取ることによって）提供する工程；および前記過剰に荷電されたタンパク質と細胞とを接触させ、その過剰に荷電されたタンパク質が細胞を透過するかどうかを決定し、それによって過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する工程を含む、方法も提供する。この方法によって、関係者は、過剰に荷電されたタンパク質を開発することまたはそうするために他の者と共同研究することができる。
【００２０】
定義
送達すべき作用物質：本明細書において用いる場合、「送達すべき作用物質」というフレーズは、被験体、器官、組織、細胞、細胞内現場、および／または細胞外マトリックス現場に送達することができる任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、送達すべき作用物質は、生物学的に活性な作用物質であり、すなわち、生体系および／または生物において活性を有する。例えば、生物に投与されたとき、その生物に対して生物学的作用を及ぼす物質を生物学的に活性であると考える。特定の実施形態において、送達すべき作用物質が生物学的に活性な作用物質である場合、作用物質の少なくとも１つの生物学的な活性を全体として共有するその作用物質の一部分を、典型的に、「生物学的に活性な」部分と呼ぶ。いくつかの実施形態において、送達すべき作用物質は、治療薬である。本明細書において用いる場合、用語「治療薬」は、被験体に投与されたとき、有益な効果を及ぼす任意の作用物質を指す。用語「治療薬」は、被験体に投与されたとき、治療、診断および／もしくは予防効果を及ぼす、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的作用を惹起する、任意の作用物質を指す。本明細書において用いる場合、用語「治療薬」は、過剰に荷電されたタンパク質とのその会合によって細胞に送達される核酸である場合がある。ある実施形態において、送達すべき作用物質は、核酸である。ある実施形態において、送達すべき作用物質は、ＤＮＡである。ある実施形態において、送達すべき作用物質は、ＲＮＡである。ある実施形態において、送達すべき作用物質は、ペプチドまたはタンパク質である。ある実施形態において、送達すべき作用物質は、小分子である。いくつかの実施形態において、送達すべき作用物質は、インビボまたはインビトロイメージング剤として有用である。これらの実施形態の一部においてそれは生物学的に活性であり、他においてそれは生物学的に活性ではない。
【００２１】
動物：本明細書において用いる場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発生段階のヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発生段階の非ヒト動物を指す。ある実施形態において、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯動物、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、またはクローンである。
【００２２】
おおよそ：本明細書において用いる場合、対象となる１つ以上の値に適用されるときの用語「おおよそ」または「約」は、述べられている参照値に類似している値を指す。ある実施形態において、用語「おおよそ」または「約」は、別様に述べられていないまたはその文脈から別様に明らかでない限り、述べられている参照値のどちらの方向にでも２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下（大きいまたは小さい）の範囲内に入る値の範囲を（そのような数が、可能な値の１００％を超える場合を除き）指す。
【００２３】
と会合している：本明細書において用いる場合、２つ以上の部分に関して用いられるときの用語「と会合している」、「結合体化している」、「連結している」、「付いている」および「係留されている」は、その部分が、その構造が用いられる条件、例えば生理条件下で物理的に会合したままであるために十分安定な構造を形成するように、それらの部分が、互いに直接、または連結剤としての役割を果たす１つ以上の追加の部分によって、物理的に会合または連結していることを意味する。典型的には、過剰に荷電されたタンパク質は、非共有結合（例えば、静電相互作用）を含むメカニズムによって核酸と会合している。ある実施形態では、正電荷を有する過剰に荷電されたタンパク質と核酸が静電相互作用によって会合して、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、十分な数のより弱
い相互作用によって、部分は、様々な異なる条件下で物理的に会合したままであるために十分な安定性を得ることができる。ある実施形態において、送達すべき作用物質は、過剰に荷電されたタンパク質に共有結合している。
【００２４】
生体適合性：本明細書において用いる場合、用語「生体適合性」は、細胞に対して毒性でない物質を指す。いくつかの実施形態において、物質は、インビボでの細胞へのその添加が、インビボで炎症および／または他の有害作用を誘導しない場合、「生体適合性」と考えられる。いくつかの実施形態において、物質は、インビボまたはインビトロでの細胞へのその添加が、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、または約５％未満の細胞死を生じさせる結果となる場合、「生体適合性」と考えられる。
【００２５】
生体分解性：本明細書において用いる場合、用語「生体分解性」は、生理条件下で分解する物質を指す。いくつかの実施形態において、生体分解性物質は、細胞機械によって破壊される物質である。いくつかの実施形態において、生体分解性物質は、化学的プロセスによって破壊される物質である。
【００２６】
生物学的に活性な：本明細書において用いる場合、「生物学的に活性な」というフレーズは、生物学的な系および／または生物において活性を有する任意の物質の特性を指す。例えば、生物に投与されたとき、その生物に対して生物学的作用を及ぼす物質を、生物学的に活性であると考える。特定の実施形態では、核酸が生物学的に活性である場合、全核酸の少なくとも１つの生物学的な活性を共有する核酸の一部を、典型的に、「生物学的に活性な」部分と呼ぶ。
【００２７】
炭水化物：用語「炭水化物」は、糖または糖のポリマーを指す。用語「糖類」、「多糖類」、「炭水化物」および「オリゴ糖類」を交換可能に用いることがある。大部分の炭水化物は、多くのヒドロキシル基、通常はその分子のそれぞれの炭素原子上に１個のヒドロキシル基、を有するアルデヒドまたはケトンである。炭水化物は、一般に、分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、または多糖類である場合がある。最も基本的な炭化水素は、単糖類、例えば、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロースおよびフルクトースである。二糖類は、２つの連結された単糖類である。例示的二糖類としては、スクロース、マルトース、セロビノースおよびラクトースが挙げられる。典型的にはオリゴ糖類は、３個と６個の間の単糖類単位（例えば、ラフィノース、スタキオース）を含み、および多糖類は、６個以上の単糖類単位を含む。例示的多糖類としては、デンプン、グリコーゲンおよびセルロースが挙げられる。炭水化物は、修飾された糖類単位、例えば、ヒドロキシル基が除去されている２’−デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素で置換されている２’−フルオロリボース、またはＮ−アセチルグルコサミン、グルコース（例えば、２’−フルオロリボース、デオキシリボースおよびヘキソース）の窒素含有形態を含有する場合がある。炭水化物は、多数の異なる形態、例えば、配座異性体、環式形態、非環式形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、および異性体で存在することがある。
【００２８】
特性部分：本明細書において用いる場合、物質の「特性部分」という用語は、最も広義で、ある程度の配列および／もしくは構造同一性ならびに／または少なくとも１つの機能的特性を関連無損傷物質と共有するものである。例えば、タンパク質またはポリペプチドの「特性部分」は、ともにタンパク質またはポリペプチドの特徴である、アミノ酸の連続伸長部、またはアミノ酸の連続伸長部の集まりを含有するものである。いくつかの実施形態において、それぞれのそのような連続伸長部は、一般に、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、またはそれより多いアミノ酸を含有するであろう。核酸の「特性部分」は、ともに核酸の特徴である、ヌ
クレオチドの連続伸長部、またはヌクレオチドの連続伸長部の集まりを含有するものである。いくつかの実施形態において、それぞれのそのような連続伸長部は、一般に、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも５０、またはそれより多いヌクレオチドを含有するであろう。いくつかの実施形態において、特性部分は、生物学的に活性である。
【００２９】
保存される：本明細書において用いる場合、用語「保存される」は、比較される２つ以上の関連配列の同じ部分に変わることなく存在する、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基をそれぞれ指す。相対的に保存されるヌクレオチドまたはアミノ酸は、より関係性の高い配列間で、それらの配列内の他の場所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸より保存されるものである。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、２つ以上の配列は、それらが、互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存される」と言われる。
【００３０】
発現：本明細書において用いる場合、核酸配列の「発現」は、次の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの（例えば、転写による）生産；（２）ＲＮＡ転写産物の（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセッシングによる）プロセッシング；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【００３１】
機能性：本明細書において用いる場合、「機能性」生体分子は、生体分子であって、それを特徴づける特性および／または活性を示す形態でのものを指す。
【００３２】
融合タンパク質：本明細書において用いる場合、「融合タンパク質」は、第二のタンパク質部分とのペプチド結合を有する第一のタンパク質部分、例えば過剰に荷電されたタンパク質、を含む。ある実施形態において、融合タンパク質は、単一融合遺伝子によってコードされる。
【００３３】
遺伝子：本明細書において用いる場合、用語「遺伝子」は、当該技術分野において理解されているとおりのその意味を有する。用語「遺伝子」が、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列を包含し得ることは、通常の当業者には理解されるであろう。遺伝子の定義が、タンパク質をコードするのではなく、むしろ機能性ＲＮＡ分子、例えばＲＮＡｉ剤、リボザイム、ｔＲＮＡなど、をコードする核酸への言及を含むことは、さらに理解されるであろう。明瞭さのために、本発明者らは、本出願において用いる場合の用語「遺伝子」が、タンパク質をコードする核酸の部分を一般には指すことを注記する。通常の当業者には文脈から明らかであろうが、この用語は、調節配列を場合によっては包含し得る。この定義は、用語「遺伝子」の非タンパク質コーディング配列単位への適用を排除するためのものではなく、むしろ、本書類におい
て用いるときのこの用語が、殆どの場合、タンパク質コーディング核酸を指すことを明らかにするためのものである。
【００３４】
遺伝子産物または発現産物：本明細書において用いる場合、用語「遺伝子産物」または「発現産物」は、一般に、遺伝子（プロセッシング前および／または後）から転写されたＲＮＡまたは遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされたポリペプチド（修飾前および／または後）を指す。
【００３５】
緑色蛍光タンパク質：本明細書において用いる場合、用語「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）は、青色光線に暴露されたときに緑色蛍光を発するくらげＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａからそもそも単離されたタンパク質またはそのようなタンパク質の誘導体（例えば、そのタンパク質の過剰に荷電されたバージョン）を指す。野生型ＧＦＰのアミノ酸配列は、次の通りである：
【００３６】
【化１】
2014159484.tif 000003
少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同であるタンパク質も緑色蛍光タンパク質と考えられる。ある実施形態では、緑色蛍光タンパク質を過剰に荷電させる。ある実施形態において、緑色蛍光タンパク質を過剰に正に荷電させる（例えば、本明細書に記載するような＋１５ＧＦＰ、＋２５ＧＦＰ、および＋３６ＧＦＰ）。ある実施形態では、そのタンパク質の精製を容易にするためにポリヒスチジンタグを含むようにＧＦＰを修飾することができる。ある実施形態では、ＧＦＰを別のタンパク質またはペプチド（例えば、血球凝集素２（ＨＡ２）ペプチド）と融合させることができる。ある実施形態では、ＧＦＰを生物学的にまたは化学的にさらに修飾すること（例えば、翻訳後修飾、タンパク質分解など）ができる。
【００３７】
相同性：本明細書において用いる場合、用語「相同性」は、ポリマー分子間、例えば核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の総体的関係性を指す。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である場合、互いに「相同」であると考えられる。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％類似している場合、互いに「相同」であると考えられる。必然的に、用語「相同の」は、少なくとも２つの配列（ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列）間の比較を指す。本発明によると、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長部について少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、
少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約９０％同一である場合、相同であると考えられる。いくつかの実施形態において、相同ヌクレオチド配列は、一意的に指定される少なくとも４〜５アミノ酸の伸長部をコードする能力を特徴とする。相同と考えられる核酸配列については、互いに対するこれらのアミノ酸の同一性および近似的間隔の両方を考えなければならない。長さが６０ヌクレオチド未満のヌクレオチド配列については、一意的に指定された少なくとも４〜５アミノ酸の伸長部をコードする能力によって相同性を決定する。本発明によると、２つのタンパク質配列は、それらのタンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長部について少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約９０％同一である場合、相同であると考えられる。
【００３８】
親水性：本明細書において用いる場合、「親水性」物質は、極性分散媒に可溶性であり得る物質である。いくつかの実施形態において、親水性物質は、極性分散媒と一時的に結合することができる。いくつかの実施形態において、親水性物質は、水素結合によって極性分散媒と一時的に結合することができる。いくつかの実施形態において、前記極性分散媒は水である。いくつかの実施形態において、親水性物質は、イオン性である場合がある。いくつかの実施形態において、親水性物質は、非イオン性である場合がある。いくつかの実施形態において、ある物質は、別の物質に比べて、それが他の物質より水、極性分散媒または親水性分散媒に溶けるので、親水性である。いくつかの実施形態において、ある物質は、別の物質に比べて、それが他の物質より油、非極性分散媒または疎水性分散媒に溶けないので、親水性である。
【００３９】
疎水性：本明細書において用いる場合、「疎水性」物質は、非極性分散媒に可溶性であり得る物質である。いくつかの実施形態において、疎水性物質は、極性分散媒からはじかれる。いくつかの実施形態において、前記極性分散媒は水である。いくつかの実施形態において、疎水性物質は、非極性である。いくつかの実施形態において、ある物質は、別の物質と比べて、それが他の物質より油、非極性分散媒または疎水性分散媒に溶けるので、疎水性である。いくつかの実施形態において、ある物質は、別の物質に比べて、それが他の物質より水、極性分散媒または親水性分散媒に溶けないので、疎水性である。
【００４０】
同一性：本明細書において用いる場合、用語「同一性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の総体的関係性を指す。２つの核酸配列間の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較のために２つの配列をアラインすることによって行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために第一の核酸配列および第二の核酸配列の一方またはもしくは両方にギャップを導入することができ、ならびに比較のために非同一配列を無視することができる）。ある実施形態において、比較のためにアラインする配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。その後、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第一の配列におけるある位置が、第二の配列における対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているときには、それらの分子は、その位置では同一である。２配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れて、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である。２配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。例えば、２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者：Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、編者：Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、編者：Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、編者：Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１（これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）に記載されているものなどの方法を用いて決定することができる。例えば、２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表と１２のギャップ長ペナルティーと４のギャップペナルティーを用いるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１−１７）を用いて決定することができる。あるいは、２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いるＧＣＧソフトウェアパッケージの中のＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般に利用されている方法としては、参考として本明細書に援用されているＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８−１０７３（１９９８）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技術は、一般に利用できるコンピュータプログラムに体系的にまとめられている。２配列間の相同性を決定するための例示的コンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１）、３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、２１５，４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
遺伝子の発現を阻害する：本明細書において用いる場合、「遺伝子の発現を阻害する」というフレーズは、遺伝子の発現産物の量の減少を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である場合もあり、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドである場合もある。典型的には、ｍＲＮＡレベルの低下は、それらから翻訳されるポリペプチドレベルを低下させる結果となる。発現レベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技術を用いて決定することができる。
【００４２】
インビトロ：本明細書において用いる場合、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内部でではなく、人工的環境において、例えば、試験管または反応器内、細胞培養中、ペトリ皿の中、などで発生する事象を指す。
【００４３】
インビボ：本明細書において用いる場合、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内部で発生する事象を指す。
【００４４】
単離された：本明細書において用いる場合、用語「単離された」は、（１）（自然界においてであろうと、実験設定においてであろうと）最初に生産されたときにそれが会合していた成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人間の手で生産、調製および／もしくは製造された、物質または実体を指す。単離される物質および／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれを超えるものから分離することができる。いくつかの実施形態において、単離された作用物質は、約８０％より高い、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％より高く純粋である。本明細書において用いる場合、ある物質は、それに他の成分が実質的にない場合、
「純粋」である。
【００４５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：本明細書において用いる場合、用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、長さがおおよそ２１ヌクレオチド（ｎｔ）〜２３ｎｔであるＲＮＡｉ剤を指す。ｍｉＲＮＡは、長さが１８ｎｔ〜２６ｎｔの間にわたることがある。典型的には、ｍｉＲＮＡは、一本鎖である。しかし、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、少なくとも部分的に二本鎖である場合がある。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡデュプレックス（本明細書では「デュプレックス領域」と呼ぶ）を含むことがあり、場合によっては、１つから３つの一本鎖オーバーハングをさらに含むことがある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、長さが１５ｂｐから２９ｂｐにわたり、場合によっては１つまた２つの一本鎖オーバーハングをさらに含むものである、デュプレックス領域を含む。ｍｉＲＮＡは、ともにハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成されることがあり、または代替的に、自己ハイブリダイズ部分を含む単一ＲＮＡ分子から産生されることがある。一般に、ｍｉＲＮＡ分子の遊離５’末端は、リン酸基を有し、遊離３’末端は、ヒドロキシル基を有する。ｍｉＲＮＡのデュプレックス部分は、必ずではないが通常は、１つ以上の非対合ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを含む。ｍｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲットＲＮＡとハイブリダイズする部分を含む。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲットＲＮＡの一領域に正確に相補的でなく、これは、そのｍｉＲＮＡが１つ以上のミスマッチを伴うターゲットＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲットＲＮＡの一領域に正確に相補的であり、これは、そのｍｉＲＮＡがミスマッチを伴わないターゲットＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。典型的には、ｍｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の翻訳を阻害することによって遺伝子発現の阻害を媒介すると考えられる。しかし、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介することがある。
【００４６】
核酸：本明細書において用いる場合、用語「核酸」は、最も広義で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込むことができる化合物および／または物質である。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。本明細書において用いる場合、ヌクレオチドのポリマー（少なくとも２ヌクレオチドの一続きになったもの）を指すために「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を交換可能に用いることがある。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」および／または類似の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外の主鎖を有する類似体を含む。例えば、当該技術分野において公知であり、その主鎖にホスホジエステル結合ではなくペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であると考えられる。用語「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの変性バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含むことがある。核酸を天然源から精製すること、組換え発現系を使用して生産して場合によっては精製すること、化学的に合成することなどができる。適切な場合、例えば、化学合成分子の場合、核酸は、ヌクレオシド類似体、例えば、化学的に修飾された塩基または糖、主鎖修飾などを有する類似体を含むことがある。別の指示がなければ、核酸配列を５’から３’への方向で提示する。用語「核酸セグメント」は、より長い核酸配列の一部分である核酸配列を指すために本明細書では用いる。多くの実施形態において、核酸セグメントは少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なく
とも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれより多い残基を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態において、本発明は、「未修飾核酸」に特に関し、「未修飾核酸」は、送達を助長または達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ポリヌクレオチド、ならびにヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドをはじめとする残基）を意味する。
【００４７】
ポリマー：本明細書において用いる場合、用語「ポリマー」は、互いに会合している少なくとも２つの反復構造単位（すなわち、「モノマー」）を含む任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、モノマーは、互いに共有結合的に会合している。いくつかの実施形態において、モノマーは、互いに非共有結合的に会合している。ポリマーは、ホモポリマーである場合もあり、または２種類以上のモノマーを含むコポリマーである場合もある。配列の点から、コポリマーは、ランダム、ブロック、グラフトである場合があり、またはランダム配列、ブロック配列および／もしくはグラフト配列の組み合わせを含む場合がある。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、ジブロックコポリマーである。いくつかの実施形態において、ブロックコポリマーは、トリブロックコポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、線状ポリマーまたは分岐ポリマーである場合がある。いくつかの実施形態において、本発明によるポリマーは、本明細書に記載する任意のポリマーのブレンド、混合物、および／または付加物を含む。典型的には、本発明によるポリマーは、有機ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、親水性である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、疎水性である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、１つ以上の部分および／または官能基で修飾されている。
【００４８】
タンパク質：本明細書において用いる場合、用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つアミノ酸の一続きになったもの）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含む場合があり（例えば、糖タンパク質である場合があり）および／または別様にプロセッシングまたは修飾されている場合がある。「タンパク質」が、（シグナル配列を用いてまたは用いずに）細胞によって生産されるような完全ポリペプチド鎖である場合もあり、またはその機能性部分である場合もあることは、通常の当業者には理解されるであろう。タンパク質が、例えば１つ以上のジスルフィド結合によって連結されているまたは他の手段によって会合している、１つより多くのポリペプチド鎖を時として含む場合があることは、当業者にはさらに理解されるであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその両方を含有する場合があり、および当該技術分野において公知の任意の様々なアミノ酸修飾または類似体を含有する場合がある。有用な修飾は、例えば、結合体化、官能化、または他の修飾（例えば、アルファアミド化）などのための、化学的実体、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、アミド基、末端アセチル基、リンカーの付加を含む。好ましい実施形態において、ペプチドの修飾は、より安定なペプチド（例え
ば、より長いインビボ半減期）をもたらす。これらの修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込みなども挙げることができる。いずれの修飾もペプチドの所望の生物学的な活性に実質的に干渉してはならない。ある実施形態において、ペプチドの修飾は、より生物学的に活性なペプチドをもたらす。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、アミノ酸類似体、およびこれらの組み合わせを含む場合がある。用語「ペプチド」は、約１００未満のアミノ酸長を有するポリペプチドを指すために典型的に用いる。
【００４９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：本明細書において用いる場合、用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ＲＮＡ（このＲＮＡは、ターゲットＲＮＡに実質的に相補的である部分を含む）によって媒介される遺伝子発現の配列特異的阻害および／またはターゲットＲＮＡレベルの低下を指す。典型的には、この実質的に相補的な部分の少なくとも一部は、ＲＮＡの二本鎖領域内にある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、ＲＮＡの選択的細胞内分解によって起こる場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、翻訳抑制によって起こる場合がある。
【００５０】
ＲＮＡｉ剤：本明細書において用いる場合、「ＲＮＡｉ剤」または「ＲＮＡｉ」は、ＲＮＡｉメカニズムによって遺伝子発現の阻害を媒介することができる分子に特有の構造を有するＲＮＡであって、場合によっては１つ以上のヌクレオチド類似体または修飾形を含むものを指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ターゲット転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ターゲット転写産物の翻訳を阻害することによって遺伝子発現の阻害を媒介する。一般に、ＲＮＡｉ剤は、ターゲットＲＮＡに実質的に相補的である部分を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも部分的に二本鎖である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、一本鎖である。いくつかの実施形態において、例示的ＲＮＡｉ剤としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡを挙げることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、天然ＲＮＡヌクレオチド（すなわち、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル）で完全に構成される場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１つ以上の非天然ＲＮＡヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド類似体、ＤＮＡヌクレオチドなど）を含む場合がある。非天然ＲＮＡ核酸残基を含めることを利用して、ＲＮＡｉ剤をＲＮＡよりも細胞分解に対して耐性にすることができる。いくつかの実施形態において、用語「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡｉ作用（例えば、ターゲットＲＮＡの分解および／または翻訳の阻害）を誘導する任意のＲＮＡ、ＲＮＡ誘導体、および／またはＲＮＡをコードする核酸を指す場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ダイサー基質として作用することができる、平滑末端を有する（すなわち、オーバーハングを伴わない）ｄｓＲＮＡを含む場合がある。例えば、そのようなＲＮＡｉ剤は、免疫応答を廃止するように場合によっては化学的に修飾されていることがある、２５塩基対以上の長さである、平滑末端を有するｄｓＲＮＡを含む場合がある。
【００５１】
ＲＮＡｉ誘導剤：本明細書において用いる場合、用語「ＲＮＡｉ誘導剤」は、ＲＮＡｉ剤の活性を送達する、調節するおよび／または修飾する任意の実体を包含する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、ベクター（人間の手によって修飾されていない天然に存在する分子以外）であって、細胞内のその存在が、ＲＮＡｉを生じさせる結果となり、そのＲＮＡｉ誘導剤のターゲットになる転写産物の発現低減をもたらすものであるベクターを含む場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、ＲＮＡｉ誘導ベクターである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、ＲＮＡｉ剤と１つ以上に医薬的に許容され得る賦形剤および／または担体とを含む組成物である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、「ＲＮＡｉ誘導ベクター」であり、「ＲＮＡｉ誘導ベクター」は、細胞内のその存在が、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮ
Ａ、および／またはｍｉＲＮＡ）を形成するように自己ハイブリダイズするまたは互いにハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡの生産を生じさせる結果となるベクターを指す。様々な実施形態において、この用語は、細胞内のその存在が、ＲＮＡｉ剤を形成するように自己ハイブリダイズするまたは互いにハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡの生産を生じさせる結果となるプラスミド、例えば、ＤＮＡベクター（この配列は、ウイルスに由来する配列要素を含む場合がある）、またはウイルス（人間の手によって修飾されていない天然に存在するウイルスまたはプラスミド以外）を包含する。一般に、ベクターは、発現シグナル（単数または複数）に作動可能に連結されている核酸を含むので、そのベクターが細胞内に存在するときにＲＮＡｉ剤を形成するようにハイブリダイズするまたは自己ハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡが転写される。従って、ベクターは、ＲＮＡ（単数もしくは複数）またはその（それらの）前駆体の細胞内合成のためのテンプレートを提供する。ＲＮＡｉを誘導するために、（例えば、ウイルスエンベロープと細胞膜融合の後の）細胞内のウイルスゲノムの存在は、細胞内のウイルスの存在を構成するために十分なものであると考えられる。加えて、ＲＮＡｉを誘導するために、ベクターは、それが細胞に導入された場合、細胞に進入した場合、または親細胞から遺伝された場合、それが後にその細胞内で修飾またはプロセッシングされるかどうかに関係なく、その細胞内に存在すると考えられる。ＲＮＡｉ誘導性ベクターは、細胞内のそのベクターの存在が、転写産物をターゲットにするＲＮＡｉ剤を形成するように互いにハイブリダイズするまたは自己ハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡの生産を生じさせる結果となる場合、すなわち、細胞内のそのベクターの存在が、転写産物をターゲットにする１つ以上のＲＮＡｉ剤の生産を生じさせる結果となる場合、転写産物をターゲットにすると考えられる。
【００５２】
短鎖、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）：本明細書において用いる場合、用語「短鎖、干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、長さがおおよそ１９塩基対（ｂｐ）であるＲＮＡデュプレックス（本明細書では「デュプレックス領域」と呼ぶ）を含み、場合によっては１つから３つの一本鎖オーバーハングをさらに含む、ＲＮＡｉ剤を指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、長さが１５ｂｐから２９ｂｐにわたるデュプレックス領域を含み、場合によっては１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含む。ｓｉＲＮＡは、ともにハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成される場合があり、あるいは、自己ハイブリダイズする部分を含む単一のＲＮＡ分子から生成される場合もある。一般に、ｓｉＲＮＡ分子の遊離５’末端は、リン酸基を有し、遊離３’末端は、ヒドロキシル基を有する。ｓｉＲＮＡのデュプレックス部分は、１つ以上の非対合ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを含む場合があるが、典型的には含まない。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲット転写産物とハイブリダイズする部分を含む。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲット転写産物の領域と正確に相補的であり、これは、そのｓｉＲＮＡが１つのミスマッチも伴わずにターゲット転写産物にハイブリダイズすることを意味する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡとターゲット転写産物のターゲットとなる部分との間に１つ以上のミスマッチが存在する場合がある。完全相補性が達成されないいくつかの実施形態では、一般に、任意のミスマッチがｓｉＲＮＡ末端にまたは付近に位置する。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。
【００５３】
短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）：本明細書において用いる場合、用語「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを媒介するために十分な長さ（典型的には、少なくともおおよそ１９ｂｐの長さ）の二本鎖（デュプレックス）構造を形成するようにハイブリダイズしているまたはハイブリダイズすることができる少なくとも２つの相補部分と、ループを形成する、典型的にはおおよそ１ヌクレオチド（ｎｔ）とおおよそ１０ｎｔの間にわたる長さの、少なくとも１つの一本鎖部分とを有するＲＮＡを含むＲＮＡｉ剤を指す。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、１５ｂｐから２９ｂｐにわたる長さのデュプレックス部分と、ループを形成する、典型的にはおおよそ１ｎｔとおおよそ
１０ｎｔの間にわたる長さの、少なくとも１つの一本鎖部分とを含む。デュプレックス部分は、１つ以上の非対合ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを含む場合があるが、典型的には含まない。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。ｓｈＲＮＡは、保存された細胞ＲＮＡｉ機械によってｓｉＲＮＡにプロセッシングされると考えられる。従って、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体であり得る。それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡは、一般に、ｓｉＲＮＡに似て、ターゲットＲＮＡの発現を阻害することができる。
【００５４】
小分子：一般に、「小分子」は、実験室において調製される、または自然界において見つけられる、実質的にペプチドでなく、オリゴマーでない有機化合物を指す。本明細書において用いる場合、「天然産物様」である化合物を指す場合があるが、用語「小分子」は、「天然産物様」化合物に限定されない。どちらかというと、小分子は、いくつかの炭素−炭素結合を含有し、１５００ｇ／ｍｏｌ未満、１２５０ｇ／ｍｏｌ未満、１０００ｇ／ｍｏｌ未満、７５０ｇ／ｍｏｌ未満、５００ｇ／ｍｏｌ未満、または２５０ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有することを典型的には特徴とするが、本発明のために、この特徴づけは、限定的であると解釈されない。ある他の実施形態では、天然産物様小分子を利用する。
【００５５】
類似性：本明細書において用いる場合、用語「類似性」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いとの類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が、当該技術分野において理解されているような保存的置換を考慮にいれることを除き、同一性パーセントの計算と同様に行うことができる。
【００５６】
安定な：本明細書において用いる場合、タンパク質に適用されるときの「安定な」は、タンパク質安定性の任意の態様を指す。元々の未修飾タンパク質と比較して安定な修飾タンパク質は、次の特徴のうちのいずれか１つ以上を有する：より大きな可溶性、凝集に対してより耐性、変性に対してより耐性、アンフォールディングに対してより耐性、不適当なまたは望ましくないフォールディングに対してより耐性、より高い復元能力、熱安定性増加、様々な環境（例えば、ｐＨ、塩濃度、洗剤の存在、変性剤の存在など）における安定性増加、および非水性環境における安定性増加。ある実施形態において、安定な修飾タンパク質は、上の特徴のうちの少なくとも２つを示す。ある実施形態において、安定な修飾タンパク質は、上の特徴のうちの少なくとも３つを示す。そのような特徴は、活性タンパク質の高レベルでの生産を可能にすることができる。例えば、修飾タンパク質は、そのタンパク質の未修飾バージョンより凝集を伴わずに高レベルで発現され得る。そのような特徴は、そのタンパク質の治療薬または研究ツールとしての使用も可能にすることができる。
【００５７】
被験体：本明細書において用いる場合、用語「被験体」または「患者」は、本発明による組成物を例えば実験、診断、予防および／または治療のために投与することができる任意の生物を指す。典型的な被験体としては、動物（例えば、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト）ならびに／または植物が挙げられる。
【００５８】
実質的に：本明細書において用いる場合、用語「実質的に」は、対象となる特徴または特性についての完全なまたはほぼ完全な程度または度合を示す定性条件を指す。生物学的または化学的現象が、まずめったに、完了まで行かないおよび／もしくは完全へと進まないまたは絶対的な結果に達しないもしくは絶対的な結果を避けられないことは、生物学技術分野の通常の技術者には理解されるであろう。従って、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を表現するために用語「実質的に」を用いる。
【００５９】
に罹患している：疾患、障害および／または状態「に罹患している」個体は、疾患、障害および／もしくは状態を有すると診断された、または疾患、障害および／もしくは状態の１つ以上の症状を示す。
【００６０】
過剰に荷電させる：本明細書において用いる場合、用語「過剰に荷電させる」は、タンパク質の全体の正味電荷の増加または減少を生じさせる結果となるタンパク質の任意の修飾を指す。修飾としては、アミノ酸配列の改変または荷電部分（例えば、カルボン酸基、リン酸基、硫酸基、アミノ基）の付加が挙げられるが、これらに限定されない。過剰に荷電させることは、作用物質と、天然に存在するまたは修飾された荷電タンパク質とが会合して、その作用物質単独と比較して増加したまたは減少した電荷を有する複合体を形成することも指す。
【００６１】
過剰に荷電された複合体：本明細書において用いる場合、「過剰に荷電された複合体」は、作られたまたは天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質と会合している１つ以上の作用物質の組み合わせであって、その作用物質単独と比較して増加したまたは減少した電荷を集合的に有するものを指す。
【００６２】
罹患しやすい：疾患、障害および／または状態に「罹患しやすい」個体は、疾患、障害および／もしくは状態を有すると診断されておらず、ならびに／または疾患、障害および／もしくは状態の症状を示さない場合がある。いくつかの実施形態において、疾患、障害および／または状態（例えば、癌）に「罹患しやすい」個体は、次のうちの１つ以上によって特徴づけることができる：（１）疾患、障害および／または状態の発現と関係づけられる遺伝子変異；（２）疾患、障害および／または状態の発現と関係づけられる遺伝子多型；（３）疾患、障害および／または状態と関係づけられるタンパク質および／または核酸の発現および／または活性増加および／または減少；（４）疾患、障害および／または状態の発現に関係づけられる習慣および／または生活習慣；（５）疾患、障害および／または状態の家族歴；ならびに（６）疾患、障害および／または状態の発現に関係づけられる微生物への暴露および／または感染。いくつかの実施形態において、疾患、障害および／または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害および／または状態を発現するであろう。いくつかの実施形態において、疾患、障害および／または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害および／または状態を発現しないであろう。
【００６３】
ターゲッティング剤またはターゲッティング部分：本明細書において用いる場合、用語「ターゲッティング剤」または「ターゲッティング部分」は、細胞、組織および／または器官に随伴する成分に結合する任意の物質を指す。そのような成分を「ターゲット」または「マーカー」と呼ぶ。ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸、小分子、炭水化物、脂質などであり得る。いくつかの実施形態において、ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、抗体またはその特性部分である。いくつかの実施形態において、ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、受容体またはその特性部分である。いくつかの実施形態において、ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、リガンドまたはその特性部分である。いくつかの実施形態において、ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、細胞タイプ特異的マーカーに結合する核酸ターゲッティング剤（例えば、アプタマー）である。いくつかの実施形態において、ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、有機小分子である。いくつかの実施形態において、ターゲッティング剤またはターゲッティング部分は、無機小分子である。
【００６４】
ターゲット遺伝子：本明細書において用いる場合、用語「ターゲット遺伝子」は、ＲＮＡｉまたは他の作用物質によってその発現が改変される任意の遺伝子を指す。
【００６５】
ターゲット転写産物：本明細書において用いる場合、用語「ターゲット転写産物」は、ターゲット遺伝子から転写された任意のｍＲＮＡを指す。
【００６６】
治療有効量：本明細書において用いる場合、用語「治療有効量」は、疾患、障害および／または状態に罹患しているまたは罹患しやすい被験体に投与されたとき、その疾患、障害および／または状態の処置、症状改善、診断、予防、および／または発症遅延に十分である、送達すべき作用物質（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。
【００６７】
処置：本明細書において用いる場合、用語「治療」は、特定の疾患、障害および／または状態の１つ以上の症状または特徴の部分的もしくは完全な軽減、改善、向上、寛解、発症遅延、進行阻害、重症度低下、および／または発生率低下を指す。例えば、癌の「処置」は、腫瘍の生存、増殖および／または拡散の阻害を指す場合がある。処置は、疾患、障害および／もしくは状態の症候を示さない被験体に、および／または疾患、障害および／もしくは状態の初期症候しか示さない被験体に、その疾患、障害および／または状態に関連した病状を発現するリスクを低下させるために施与される場合がある。いくつかの実施形態において、処置は、その必要がある被験体への、治療上活性な核酸と会合している過剰に荷電されたタンパク質の送達を含む。
【００６８】
未修飾の：本明細書において用いる場合、「未修飾の」は、過剰に荷電させる前の、または作られたまたは天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質と複合体の形態で会合する前の、タンパク質または作用物質を指す。
【００６９】
ベクター：本明細書において用いる場合、「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、ベクターは、それらに連結されている核酸の染色体外複製および／または発現を宿主細胞、例えば真核および／または原核細胞において達成することができる。作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができるベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
過剰に荷電されたタンパク質の調製物であって、該過剰に荷電されたタンパク質は、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味負電荷または正電荷を有し、かつ細胞への透過のために十分な量で存在し、かつそのために調合されるものである、調製物。
（項目２）
医薬的に許容され得る調製物である、項目１に記載の調製物。
（項目３）
過剰に荷電されたタンパク質、もしくは過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質、またはその両方を細胞に導入する方法であって、
該過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質および該過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質を、該細胞と、該過剰に荷電されたタンパク質、または該過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質の該細胞への透過を可能にするために十分な条件下で接触させ、それによって過剰に荷電されたタンパク質、もしくは該過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質、またはその両方を細胞に導入する工程、
を含む、方法。
（項目４）
上記過剰に荷電されたタンパク質または上記過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質が上記細胞を透過したことを、標識の検出、該細胞における生物学的変化の検出、または該過剰に荷電されたタンパク質もしくは過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質を投与した被験体における応答、例えば障害の処置、の検出のうちの１つ以
上によってさらに確認する、項目３に記載の方法。
（項目５）
過剰に荷電されたタンパク質であって、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味電荷を有する、過剰に荷電されたタンパク質と、
１つ以上の核の作用物質（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｇｅｎｔ）と、
を含む、複合体。
（項目６）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、全体の正味正電荷を有する、項目５に記載の複合体。
（項目７）
上記全体の正味正電荷が、約＋５である、項目６に記載の複合体。
（項目８）
上記全体の正味正電荷が、約＋１０である、項目６に記載の複合体。
（項目９）
上記全体の正味正電荷が、約＋１５である、項目６に記載の複合体。
（項目１０）
上記全体の正味正電荷が、約＋２０である、項目６に記載の複合体。
（項目１１）
上記全体の正味正電荷が、約＋２５である、項目６に記載の複合体。
（項目１２）
上記全体の正味正電荷が、約＋３０である、項目６に記載の複合体。
（項目１３）
上記全体の正味正電荷が、約＋３５である、項目６に記載の複合体。
（項目１４）
上記全体の正味正電荷が、約＋４０である、項目６に記載の複合体。
（項目１５）
対象となる上記過剰に荷電されたタンパク質が、生理的なｐＨで、その対応する未修飾タンパク質よりもより正に荷電される、項目６に記載の複合体。
（項目１６）
対象となる上記過剰に荷電されたタンパク質が、生理的なｐＨで、その対応する未修飾タンパク質より少なくとも＋５より正に荷電される、項目６に記載の複合体。
（項目１７）
対象となる上記過剰に荷電されたタンパク質が、生理的なｐＨで、その対応する未修飾タンパク質より少なくとも＋１０より正に荷電される、項目６に記載の複合体。
（項目１８）
対象となる上記過剰に荷電されたタンパク質が、生理的なｐＨで、その対応する未修飾タンパク質より少なくとも＋５より正に荷電される、項目６に記載の複合体。
（項目１９）
対象となる上記過剰に荷電されたタンパク質が、生理的なｐＨで、その対応する未修飾タンパク質より少なくとも＋５より正に荷電される、項目６に記載の複合体。
（項目２０）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、蛍光タンパク質である、項目５に記載の複合体。
（項目２１）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、項目５に記載の複合体。
（項目２２）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、過剰に正に荷電されたＧＦＰである、項目５に記載の複合体。
（項目２３）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列：
【化１０】
2014159484.tif 000004
の過剰に正に荷電されたＧＦＰ（＋３６  ＧＦＰ）である、項目５に記載の複合体。
（項目２４）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目２５）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の約２０アミノ酸の伸長部を含む、項目５に記載の複合体。
（項目２６）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の約３０アミノ酸の伸長部を含む、項目５に記載の複合体。
（項目２７）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の約４０アミノ酸の伸長部を含む、項目５に記載の複合体。
（項目２８）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の約５０アミノ酸の伸長部を含む、項目５に記載の複合体。
（項目２９）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列の約１００アミノ酸の伸長部を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３０）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約４０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３１）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約５０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３２）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３３）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３４）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３５）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３６）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目５に記載の複合体。
（項目３７）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、緑色蛍光タンパク質と血球凝集素２（ＨＡ２）ペプチドの融合タンパク質である、項目５に記載の複合体。
（項目３８）
上記過剰に荷電されたタンパク質が、配列：
【化１１】
2014159484.tif 000005
の、緑色蛍光タンパク質と血球凝集素２（ＨＡ２）ペプチドの融合タンパク質である、項目５に記載の複合体。
（項目３９）
上記核酸が、ＲＮＡを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４０）
上記核酸が、ＤＮＡを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４１）
上記核酸が、ＲＮＡｉ剤を含む、項目５に記載の複合体。
（項目４２）
上記ＲＮＡｉ剤が、短い干渉性ＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目４１に記載の複合体。
（項目４３）
上記核酸が、ＲＮＡｉを誘導する実体を含む、項目５に記載の複合体。
（項目４４）
上記核酸が、アンチセンスＲＮＡを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４５）
上記核酸が、リボザイムまたはデオキシリボザイムを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４６）
上記核酸が、三重らせん形成を誘導するＲＮＡを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４７）
上記核酸が、ＲＮＡアプタマーを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４８）
上記核酸が、ベクターを含む、項目５に記載の複合体。
（項目４９）
上記核酸が、ｍＲＮＡの発現を駆動するベクターを含む、項目５に記載の複合体。
（項目５０）
上記核酸が、タンパク質の発現を駆動するベクターを含む、項目５に記載の複合体。
（項目５１）
過剰に荷電されたタンパク質の核酸に対する比率が、約１：１である、項目５に記載の複合体。
（項目５２）
過剰に荷電されたタンパク質の核酸に対する比率が、約１：２である、項目５に記載の複合体。
（項目５３）
過剰に荷電されたタンパク質の核酸に対する比率が、約１：３である、項目５に記載の複合体。
（項目５４）
過剰に荷電されたタンパク質の核酸に対する比率が、約１：４である、項目５に記載の複合体。
（項目５５）
過剰に荷電されたタンパク質の核酸に対する比率が、約１：５である、項目５に記載の複合体。
（項目５６）
過剰に荷電されたタンパク質であって、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味電荷を有する、過剰に荷電されたタンパク質と、
１つ以上のペプチドまたはタンパク質と、
を含む、複合体。
（項目５７）
過剰に荷電されたタンパク質であって、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味電荷を有する、過剰に荷電されたタンパク質と、
１つ以上の小分子と、
を含む、複合体。
（項目５８）
サイクロン（番号：Ｑ９Ｈ６Ｆ５）、ＰＮＲＣ１（番号：Ｑ１２７９６）、ＲＮＰＳ１（番号：Ｑ１５２８７）、ＳＵＲＦ６（番号：Ｏ７５６８３）、ＡＲ６Ｐ（番号：Ｑ６６ＰＪ３）、ＮＫＡＰ（番号：Ｑ８Ｎ５Ｆ７）、ＥＢＰ２（番号：Ｑ９９８４８）、ＬＳＭ１１（番号：Ｐ８３３６９）、ＲＬ４（番号：Ｐ３６５７８）、ＫＲＲ１（番号：Ｑ１３６０１）、ＲＹ−１（番号：Ｑ８ＷＶＫ２）、ＢｒｉＸ（番号：Ｑ８ＴＤＮ６）、ＭＮＤＡ（番号：Ｐ４１２１８）、Ｈ１ｂ（番号：Ｐ１６４０１）、サイクリン（番号：Ｑ９ＵＫ５８）、ＭＤＫ（番号：Ｐ２１７４１）、ＰＲＯＫ（番号：Ｑ９ＨＣ２３）、ＦＧＦ５（番号：Ｐ１２０３４）、ＳＦＲＳ（番号：Ｑ８Ｎ９Ｑ２）、ＡＫＩＰ（番号：Ｑ９ＮＷＴ８）、ＣＤＫ（番号：Ｑ８Ｎ７２６）、ベータ−ディフェンシン（番号：Ｐ８１５３４）、ＰＡＶＡＣ（番号：Ｐ１８５０９）、エオタキシン−３（番号：Ｑ９Ｙ２５８）、ヒストンＨ２Ａ（番号：Ｑ７Ｌ７Ｌ０）、およびＨＭＧＢ１（番号：Ｐ０９４２９）からなる群より選択されるタンパク質と；１つ以上のポリヌクレオチドとを含む複合体。
（項目５９）
サイクロン（番号：Ｑ９Ｈ６Ｆ５）、ＰＮＲＣ１（番号：Ｑ１２７９６）、ＲＮＰＳ１（番号：Ｑ１５２８７）、ＳＵＲＦ６（番号：Ｏ７５６８３）、ＡＲ６Ｐ（番号：Ｑ６６ＰＪ３）、ＮＫＡＰ（番号：Ｑ８Ｎ５Ｆ７）、ＥＢＰ２（番号：Ｑ９９８４８）、ＬＳＭ１１（番号：Ｐ８３３６９）、ＲＬ４（番号：Ｐ３６５７８）、ＫＲＲ１（番号：Ｑ１３６０１）、ＲＹ−１（番号：Ｑ８ＷＶＫ２）、ＢｒｉＸ（番号：Ｑ８ＴＤＮ６）、ＭＮＤＡ（番号：Ｐ４１２１８）、Ｈ１ｂ（番号：Ｐ１６４０１）、サイクリン（番号：Ｑ９ＵＫ５８）、ＭＤＫ（番号：Ｐ２１７４１）、ＰＲＯＫ（番号：Ｑ９ＨＣ２３）、ＦＧＦ５（番号：Ｐ１２０３４）、ＳＦＲＳ（番号：Ｑ８Ｎ９Ｑ２）、ＡＫＩＰ（番号：Ｑ９ＮＷＴ８）、ＣＤＫ（番号：Ｑ８Ｎ７２６）、ベータ−ディフェンシン（番号：Ｐ８１５３４）、ＰＡＶＡＣ（番号：Ｐ１８５０９）、エオタキシン−３（番号：Ｑ９Ｙ２５８）、ヒストンＨ２Ａ（番号：Ｑ７Ｌ７Ｌ０）、およびＨＭＧＢ１（番号：Ｐ０９４２９）からなる群より選択されるタンパク質と；１つ以上のペプチドまたはタンパク質とを含む複合体。（項目６０）
サイクロン（番号：Ｑ９Ｈ６Ｆ５）、ＰＮＲＣ１（番号：Ｑ１２７９６）、ＲＮＰＳ１（番号：Ｑ１５２８７）、ＳＵＲＦ６（番号：Ｏ７５６８３）、ＡＲ６Ｐ（番号：Ｑ６６ＰＪ３）、ＮＫＡＰ（番号：Ｑ８Ｎ５Ｆ７）、ＥＢＰ２（番号：Ｑ９９８４８）、ＬＳＭ１１（番号：Ｐ８３３６９）、ＲＬ４（番号：Ｐ３６５７８）、ＫＲＲ１（番号：Ｑ１３６０１）、ＲＹ−１（番号：Ｑ８ＷＶＫ２）、ＢｒｉＸ（番号：Ｑ８ＴＤＮ６）、ＭＮＤＡ（番号：Ｐ４１２１８）、Ｈ１ｂ（番号：Ｐ１６４０１）、サイクリン（番号：Ｑ９ＵＫ５８）、ＭＤＫ（番号：Ｐ２１７４１）、ＰＲＯＫ（番号：Ｑ９ＨＣ２３）、ＦＧＦ５（
番号：Ｐ１２０３４）、ＳＦＲＳ（番号：Ｑ８Ｎ９Ｑ２）、ＡＫＩＰ（番号：Ｑ９ＮＷＴ８）、ＣＤＫ（番号：Ｑ８Ｎ７２６）、ベータ−ディフェンシン（番号：Ｐ８１５３４）、ＰＡＶＡＣ（番号：Ｐ１８５０９）、エオタキシン−３（番号：Ｑ９Ｙ２５８）、ヒストンＨ２Ａ（番号：Ｑ７Ｌ７Ｌ０）、およびＨＭＧＢ１（番号：Ｐ０９４２９）からなる群より選択されるタンパク質と；１つ以上の小分子とを含む複合体。
（項目６１）
過剰に荷電されたタンパク質であって、該過剰に荷電されたタンパク質は、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味電荷を有し；該過剰に荷電されたタンパク質は、該対応する未修飾タンパク質では正に荷電されない、少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基を含み；および該正に荷電されたアミノ酸残基のそれぞれが少なくとも１つのアミノ酸残基によって隔てられている、過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６２）
上記対応する未修飾タンパク質では正に荷電されない、少なくとも１０個の正に荷電されたアミノ酸残基を含む、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６３）
上記対応する未修飾タンパク質では正に荷電されない、少なくとも１５個の正に荷電されたアミノ酸残基を含む、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６４）
上記対応する未修飾タンパク質では正に荷電されない、少なくとも２０個の正に荷電されたアミノ酸残基を含む、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６５）
上記対応する未修飾タンパク質では正に荷電されない、少なくとも２５個の正に荷電されたアミノ酸残基を含む、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６６）
正に荷電されたアミノ酸残基のそれぞれが少なくとも２つのアミノ酸残基によって隔てられている、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６７）
正に荷電されたアミノ酸残基のそれぞれが少なくとも３つのアミノ酸残基によって隔てられている、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６８）
正に荷電されたアミノ酸残基のそれぞれが少なくとも５つのアミノ酸残基によって隔てられている、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目６９）
正に荷電されたアミノ酸残基のそれぞれが少なくとも１０のアミノ酸残基によって隔てられている、項目６１に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７０）
過剰に荷電されたタンパク質であって、該過剰に荷電されたタンパク質は、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味電荷を有し；該過剰に荷電されたタンパク質は、少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基を含み；該少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基が、該対応する未修飾タンパク質中に存在する対応するアミノ酸残基とは異なり；および該正に荷電されたアミノ酸残基のそれぞれが、少なくとも１つのアミノ酸残基によって隔てられている、過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７１）
上記少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基のアミノ最末端とカルボキシ最末端の間の距離が、約１０アミノ酸である、項目６１または７０に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７２）
過剰に荷電されたタンパク質であって、該過剰に荷電されたタンパク質は、その対応する未修飾タンパク質より大きい全体の正味電荷を有し；該過剰に荷電されたタンパク質は、少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基を含み；該少なくとも５つの正に荷電され
たアミノ酸残基が、該対応する未修飾タンパク質中に存在する対応するアミノ酸残基とは異なり；および該少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基の少なくとも６０％が、該タンパク質の表面に位置する、過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７３）
上記少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基の少なくとも７０％が、上記タンパク質の表面に位置する、項目７２に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７４）
上記少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基の少なくとも８０％が、上記タンパク質の表面に位置する、項目７２に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７５）
上記少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基の少なくとも９０％が、上記タンパク質の表面に位置する、項目７２に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７６）
上記少なくとも５つの正に荷電されたアミノ酸残基の少なくとも９５％が、上記タンパク質の表面に位置する、項目７２に記載の過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７７）
過剰に荷電されたタンパク質であって、少なくとも５つのアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンアミノ酸残基が、対応する未修飾タンパク質の対応するアミノ酸残基と異なり；最高ＡｖＮＡＰＳＡスコアを有する該対応する未修飾タンパク質の少なくとも５つのアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンアミノ酸残基がリシンに変異され；および該少なくとも５つのアミノ酸残基が正に荷電される、過剰に荷電されたタンパク質。
（項目７８）
項目５〜６０のいずれか一項に記載の複合体と、
医薬的に許容され得る賦形剤と、
を含む、医薬組成物。
（項目７９）
疾患、障害もしくは状態に罹患しやすいか、疾患、障害もしくは状態に罹患しているか、または疾患、障害もしくは状態の１つ以上の症状を示す被験体を提供する工程；および
項目１〜７７のいずれか一項に記載の過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体または項目７８に記載の医薬組成物を、該被験体に、少なくとも１つの症状が改善されるように投与する工程、
を含む、方法。
（項目８０）
上記投与する工程が、上記過剰に荷電されたタンパク質または複合体が上記被験体の細胞を透過するために十分な条件下で行われる、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
上記疾患、障害または状態が、ｍＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの組み合わせの異常に上昇したレベルに関連している、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
上記複合体が、異常に上昇したｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを低下させる核酸を含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
上記疾患、障害または状態が、ｍＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの組み合わせの発現に関連している、項目７９に記載の方法。
（項目８４）
上記複合体が、発現した上記ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを低下させる核酸を含む、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
上記核酸が、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉを誘導する実体、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、
およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
上記疾患、障害または状態が、異常に低いｍＲＮＡまたはタンパク質レベルに関連している、項目７９に記載の方法。
（項目８７）
上記複合体が、異常に上昇したｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを上昇させる核酸を含む、項目７９に記載の方法。
（項目８８）
上記核酸が、発現ベクターを構成する、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
上記投与する工程が、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、心室内、局所、吸入および粘膜送達からなる群より選択される投与経路を含む、項目７９に記載の方法。
（項目９０）
項目７９〜８９のいずれか一項に記載の方法を行うためのキット。
（項目９１）
項目５〜６０のいずれか一項に記載の複合体または項目７８に記載の医薬組成物を含むキット。
（項目９２）
過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する方法であって、
過剰に荷電されたタンパク質を場合によっては選択する工程；
該過剰に荷電されたタンパク質を提供する工程；
該過剰に荷電されたタンパク質と細胞とを接触させる工程；および
該過剰に荷電されたタンパク質が該細胞を透過するかどうかを決定し、それによって過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する工程、
を含む、方法。
（項目９３）
過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する方法であって、
過剰に荷電させるべきタンパク質を選択する工程；
変更すべき１つまたは複数の残基のセットを得て、過剰に荷電されたタンパク質を生成する工程；
該変更された残基のセットを有する過剰に荷電されたタンパク質を提供する工程；
該過剰に荷電されたタンパク質と細胞とを接触させる工程；および
該過剰に荷電されたタンパク質が該細胞を透過するかどうかを決定し、それによって過剰に荷電されたタンパク質を細胞透過について評価する工程、
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】図１は、過剰に荷電された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を示す図である。（Ａ）蛍光体形成残基を緑色で強調し、負電荷を有する残基を赤色で強調し、および正電荷を有する残基を青色で強調した、ＧＦＰ変異体のタンパク質配列。（Ｂ〜Ｄ）−２５ｋＴ／ｅ（赤色）から＋２５ｋＴ／ｅ（青色）までを着色した、ｓｆＧＦＰ（Ｂ）、ＧＦＰ（＋３６）（Ｃ）、およびＧＦＰ（−３０）（Ｄ）の静電表面電位。
【図１Ｂ】図１は、過剰に荷電された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を示す図である。（Ａ）蛍光体形成残基を緑色で強調し、負電荷を有する残基を赤色で強調し、および正電荷を有する残基を青色で強調した、ＧＦＰ変異体のタンパク質配列。（Ｂ〜Ｄ）−２５ｋＴ／ｅ（赤色）から＋２５ｋＴ／ｅ（青色）までを着色した、ｓｆＧＦＰ（Ｂ）、ＧＦＰ（＋３６）（Ｃ）、およびＧＦＰ（−３０）（Ｄ）の静電表面電位。
【図１Ｃ】図１は、過剰に荷電された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を示す図である。（Ａ）蛍光体形成残基を緑色で強調し、負電荷を有する残基を赤色で強調し、および正電荷を有する残基を青色で強調した、ＧＦＰ変異体のタンパク質配列。（Ｂ〜Ｄ）−２５ｋＴ／ｅ（赤色）から＋２５ｋＴ／ｅ（青色）までを着色した、ｓｆＧＦＰ（Ｂ）、ＧＦＰ（＋３６）（Ｃ）、およびＧＦＰ（−３０）（Ｄ）の静電表面電位。
【図１Ｄ】図１は、過剰に荷電された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を示す図である。（Ａ）蛍光体形成残基を緑色で強調し、負電荷を有する残基を赤色で強調し、および正電荷を有する残基を青色で強調した、ＧＦＰ変異体のタンパク質配列。（Ｂ〜Ｄ）−２５ｋＴ／ｅ（赤色）から＋２５ｋＴ／ｅ（青色）までを着色した、ｓｆＧＦＰ（Ｂ）、ＧＦＰ（＋３６）（Ｃ）、およびＧＦＰ（−３０）（Ｄ）の静電表面電位。
【図２Ａ】図２は、ＧＦＰ変異体の細胞内特性を示す図である。（Ａ）精製ＧＦＰ変異体の染色およびＵＶ蛍光。それぞれのレーンおよびチューブが０．２μｇのタンパク質を含有する。（Ｂ）ＧＰＦ変異体の円偏光二色性スペクトル。（Ｃ）グアニジニウム誘導アンフォールディングによって測定した、ＧＦＰ変異体の熱力学的安定性。
【図２Ｂ】図２は、ＧＦＰ変異体の細胞内特性を示す図である。（Ａ）精製ＧＦＰ変異体の染色およびＵＶ蛍光。それぞれのレーンおよびチューブが０．２μｇのタンパク質を含有する。（Ｂ）ＧＰＦ変異体の円偏光二色性スペクトル。（Ｃ）グアニジニウム誘導アンフォールディングによって測定した、ＧＦＰ変異体の熱力学的安定性。
【図２Ｃ】図２は、ＧＦＰ変異体の細胞内特性を示す図である。（Ａ）精製ＧＦＰ変異体の染色およびＵＶ蛍光。それぞれのレーンおよびチューブが０．２μｇのタンパク質を含有する。（Ｂ）ＧＰＦ変異体の円偏光二色性スペクトル。（Ｃ）グアニジニウム誘導アンフォールディングによって測定した、ＧＦＰ変異体の熱力学的安定性。
【図３Ａ】図３は、過剰に荷電されたタンパク質の分子間特性を示す図である。（Ａ）精製ＧＦＰ変異体（「自然状態」）のＵＶ照明サンプル、１分間、１００℃で加熱したそれらのサンプル（「煮沸」）、およびその後、２時間、２５℃に冷却したそれらのサンプル（「冷却」）。（Ｂ）４０％ＴＦＥを用いて２５℃でＧＦＰ変異体の凝集を誘導し、直角の光散乱によってモニターした。（Ｃ）過剰に荷電されたＧＦＰは、逆の電荷を有する高分子に可逆的に接着する。サンプル１：３０μＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の６μｇのＧＦＰ（＋３６）。サンプル２：サンプル１に添加した６μｇのＧＦＰ（−３０）。サンプル３：サンプル１に添加した３０μｇのサケ精子ＤＮＡ。サンプル４：サンプル１に添加した２０μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ。サンプル５：サンプル４への１Ｍ  ＮａＣｌの添加。サンプル６〜８：ＧＦＰ（＋３６）の代わりにｓｆＧＦＰを使用したことを除き、それぞれ、サンプル１、２および４と同じ。すべてのサンプルを微量遠心分離機で短時間回転させ、ＵＶ光のもとで可視化した。
【図３Ｂ】図３は、過剰に荷電されたタンパク質の分子間特性を示す図である。（Ａ）精製ＧＦＰ変異体（「自然状態」）のＵＶ照明サンプル、１分間、１００℃で加熱したそれらのサンプル（「煮沸」）、およびその後、２時間、２５℃に冷却したそれらのサンプル（「冷却」）。（Ｂ）４０％ＴＦＥを用いて２５℃でＧＦＰ変異体の凝集を誘導し、直角の光散乱によってモニターした。（Ｃ）過剰に荷電されたＧＦＰは、逆の電荷を有する高分子に可逆的に接着する。サンプル１：３０μＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の６μｇのＧＦＰ（＋３６）。サンプル２：サンプル１に添加した６μｇのＧＦＰ（−３０）。サンプル３：サンプル１に添加した３０μｇのサケ精子ＤＮＡ。サンプル４：サンプル１に添加した２０μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ。サンプル５：サンプル４への１Ｍ  ＮａＣｌの添加。サンプル６〜８：ＧＦＰ（＋３６）の代わりにｓｆＧＦＰを使用したことを除き、それぞれ、サンプル１、２および４と同じ。すべてのサンプルを微量遠心分離機で短時間回転させ、ＵＶ光のもとで可視化した。
【図３Ｃ】図３は、過剰に荷電されたタンパク質の分子間特性を示す図である。（Ａ）精製ＧＦＰ変異体（「自然状態」）のＵＶ照明サンプル、１分間、１００℃で加熱したそれらのサンプル（「煮沸」）、およびその後、２時間、２５℃に冷却したそれらのサンプル（「冷却」）。（Ｂ）４０％ＴＦＥを用いて２５℃でＧＦＰ変異体の凝集を誘導し、直角の光散乱によってモニターした。（Ｃ）過剰に荷電されたＧＦＰは、逆の電荷を有する高分子に可逆的に接着する。サンプル１：３０μＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の６μｇのＧＦＰ（＋３６）。サンプル２：サンプル１に添加した６μｇのＧＦＰ（−３０）。サンプル３：サンプル１に添加した３０μｇのサケ精子ＤＮＡ。サンプル４：サンプル１に添加した２０μｇのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ。サンプル５：サンプル４への１Ｍ  ＮａＣｌの添加。サンプル６〜８：ＧＦＰ（＋３６）の代わりにｓｆＧＦＰを使用したことを除き、それぞれ、サンプル１、２および４と同じ。すべてのサンプルを微量遠心分離機で短時間回転させ、ＵＶ光のもとで可視化した。
【図４】図４は、ＧＦＰ変異体の（Ａ）励起および（Ｂ）発光スペクトルを示す図である。４９０ｎｍでの発色団吸収によって定量したところ、それぞれのサンプルが等量のタンパク質を含有した。
【図５】図５は、過剰に荷電された表面が分子間相互作用を支配することを示す図である。過剰に荷電されたＧＦＰは、逆の電荷を有する高分子（「タンパク質ベルクロ（Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標））」）と非特異的におよび可逆的に付着する。そのような相互作用は、沈殿の形成を生じさせる場合がある。変性タンパク質の凝集体とは異なり、これらの沈殿は、フォールディングされた蛍光ＧＦＰを含有し、１Ｍの塩に溶解する。＋３６ＧＦＰのみ；−３０ＧＦＰと混合した＋３６ＧＦＰ：ｔＲＮＡと混合した＋３６ＧＦＰ；１Ｍ  ＮａＣｌ中のｔＲＮＡと混合した＋３６ＧＦＰ；ｓｆＧＦＰ（−７）；および−３０ＧＦＰと混合したｓｆＧＦＰをここに示す。
【図６】図６は、過剰に正に荷電されたＧＦＰがｓｉＲＮＡに結合することを示す図である。ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ複合体は、アガロースゲルの中でｓｉＲＮＡと共に移動しない−＋３６ＧＦＰをｓｉＲＮＡと共にインキュベートし、結果として得られた複合体をアガロースゲル電気泳動に付した。様々な＋３６ＧＦＰ：ｓｉＲＮＡ比をこのアッセイで試験した：０：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５および１：１０。＋３６ＧＦＰは、約１：３の化学量論比でｓｉＲＮＡと安定な複合体を形成することが明らかになった。過剰に正に荷電されていないタンパク質は、ｓｉＲＮＡに結合しないことが明らかになった。５０：１のｓｆＧＦＰ：ｓｉＲＮＡ比を試験したが、そのような高い過剰レベルでさえ、ｓｆＧＦＰは、ｓｉＲＮＡと会合しなかった。
【図７】図７は、過剰に正に荷電されたＧＦＰが細胞を透過することを示す図である。ＨｅＬａ細胞をＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ（−７）、−３０ＧＦＰ、または＋３６ＧＦＰのいずれか）と共にインキュベートし、洗浄し、固定し、染色した。＋３６ＧＦＰは、ＨｅＬａ細胞を強力に透過したが、ｓｆＧＦＰおよび−３０ＧＦＰはしなかった。左：細胞をはっきり示すためのＤＮＡのＤＡＰＩ染色。中央：ＧＦＰの細胞内取り込みがどこで発生したのかをはっきり示すためのＧＦＰ染色。右：それが発生したときの＋３６ＧＦＰ局在を示す動画。
【図８】図８は、過剰に正に荷電されたＧＦＰがｓｉＲＮＡをヒト細胞に送達することを示す図である。＋３６ＧＦＰは、ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に強力に送達することが明らかになった。左：リポフェクタミン２０００およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ；右：＋３６ＧＦＰおよびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ。＋３６ＧＦＰは、ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に強力に送達することが明らかになった。Ｈｏｅｓｃｈｔチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきり示した；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化した；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した；黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。
【図９】図９は、従来のトランスフェクションに対して耐性の細胞系：ネズミ３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞前駆細胞（「３Ｔ３Ｌ細胞」）へのｓｉＲＮＡの送達を示す図である。３Ｔ３Ｌ細胞をリポフェクタミン２０００およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または＋３６ＧＦＰおよびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。３Ｔ３Ｌ細胞は、リポフェクタミンによってあまりトランスフェクトされなかったが、＋３６ＧＦＰによって効率的にトランスフェクトされた。Ｈｏｅｓｃｈｔチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきり示した；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化した；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。
【図１０】図１０は、従来のトランスフェクションに対して耐性の細胞系：ラットＩＭＣＤ細胞へのｓｉＲＮＡの送達を示す図である。ラットＩＭＣＤ細胞をリポフェクタミン２０００およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または＋３６ＧＦＰおよびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。ラットＩＭＣＤ細胞は、リポフェクタミンによってあまりトランスフェクトされなかったが、＋３６ＧＦＰによって効率的にトランスフェクトされた。Ｈｏｅｓｃｈｔチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきり示した；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化した；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。
【図１１】図１１は、従来のトランスフェクションに対して耐性の細胞系：ヒトＳＴ１４ＡニューロンへのｓｉＲＮＡの送達を示す図である。ヒトＳＴ１４Ａニューロンをリポフェクタミン２０００およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または＋３６ＧＦＰおよびＣｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。ヒトＳＴ１４Ａニューロンは、リポフェクタミンによってあまりトランスフェクトされなかったが、＋３６ＧＦＰによって効率的にトランスフェクトされた。ＤＡＰＩチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきり示した；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化した；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。
【図１２】図１２は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションのフローサイトメトリー分析を示す図である。左：リポフェクタミン。それぞれのカラムは異なるトランスフェクション方法で行った実験：リポフェクタミン（青色）；および２０ｎＭ＋３６ＧＦＰ（赤色）、に対応する。それぞれのチャートは、異なる細胞タイプ：ＩＭＣＤ細胞、ＰＣ１２細胞、ＨｅＬａ細胞、３Ｔ３Ｌ細胞およびジャーカット細胞、で行った実験に対応する。Ｘ軸は、ｓｉＲＮＡ蛍光の読み取り値である、Ｃｙ３チャンネルから得られた測定値を表す。Ｙ軸は、フローサイトメトリー実験における細胞数を表す。フロー・サイトメトリー・データは、細胞が、リポフェクタミンより＋３６ＧＦＰを使用するほうが効率的にｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたことを示している。
【図１３】図１３は、＋３６ＧＦＰで送達されたｓｉＲＮＡが遺伝子ノックアウトを誘導できることを示す図である。約２μＭのリポフェクタミン２０００（黒色バー）または２０ｎＭの＋３６ＧＦＰ（緑色バー）のいずれかを使用して、５０ｎＭ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを５つの異なる細胞タイプ（ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３Ｌ、ＰＣ１２、およびジャーカット細胞系）にトランスフェクトした。Ｙ軸は、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルをチューブリンタンパク質レベルの割合として表す。
【図１４Ａ】図１４は、細胞透過のメカニズムプローブを示す図である。ＨｅＬａ細胞を様々なプローブでのうちの１つで３０分間処理し、その後、５ｎＭの＋３６ＧＦＰで処理した。サンプルは、次のものを含んだ：（Ａ）プローブなし；（Ｂ）４℃プレインキュベーション（エネルギー依存性プロセスを阻害する）；（Ｃ）１００ｍＭのスクロース（クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害する）、左、および２５μｇ／ｍＬのナイスタチン（カベオラ機能を破壊する）、右；（Ｄ）２５μＭのサイトカラシンＢ（マクロピノサイトーシスを阻害する）、左、および５μＭモネンシン（エンドソーム受容体再循環を阻害する）、右。
【図１４Ｂ】図１４は、細胞透過のメカニズムプローブを示す図である。ＨｅＬａ細胞を様々なプローブでのうちの１つで３０分間処理し、その後、５ｎＭの＋３６ＧＦＰで処理した。サンプルは、次のものを含んだ：（Ａ）プローブなし；（Ｂ）４℃プレインキュベーション（エネルギー依存性プロセスを阻害する）；（Ｃ）１００ｍＭのスクロース（クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害する）、左、および２５μｇ／ｍＬのナイスタチン（カベオラ機能を破壊する）、右；（Ｄ）２５μＭのサイトカラシンＢ（マクロピノサイトーシスを阻害する）、左、および５μＭモネンシン（エンドソーム受容体再循環を阻害する）、右。
【図１４Ｃ】図１４は、細胞透過のメカニズムプローブを示す図である。ＨｅＬａ細胞を様々なプローブでのうちの１つで３０分間処理し、その後、５ｎＭの＋３６ＧＦＰで処理した。サンプルは、次のものを含んだ：（Ａ）プローブなし；（Ｂ）４℃プレインキュベーション（エネルギー依存性プロセスを阻害する）；（Ｃ）１００ｍＭのスクロース（クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害する）、左、および２５μｇ／ｍＬのナイスタチン（カベオラ機能を破壊する）、右；（Ｄ）２５μＭのサイトカラシンＢ（マクロピノサイトーシスを阻害する）、左、および５μＭモネンシン（エンドソーム受容体再循環を阻害する）、右。
【図１４Ｄ】図１４は、細胞透過のメカニズムプローブを示す図である。ＨｅＬａ細胞を様々なプローブでのうちの１つで３０分間処理し、その後、５ｎＭの＋３６ＧＦＰで処理した。サンプルは、次のものを含んだ：（Ａ）プローブなし；（Ｂ）４℃プレインキュベーション（エネルギー依存性プロセスを阻害する）；（Ｃ）１００ｍＭのスクロース（クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害する）、左、および２５μｇ／ｍＬのナイスタチン（カベオラ機能を破壊する）、右；（Ｄ）２５μＭのサイトカラシンＢ（マクロピノサイトーシスを阻害する）、左、および５μＭモネンシン（エンドソーム受容体再循環を阻害する）、右。
【図１５】図１５は、細胞透過活性の一因となる要因を示す図である。電荷の大きさが細胞透過活性の一因となることが明らかになった。詳細には、＋１５ＧＦＰまたはＬｙｓ２０〜５０は、細胞を透過しないことが明らかになった。左：２０ｍＭの＋１５ＧＦＰおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３。中央：２０ｎＭの＋３６ＧＦＰ。右：６０ｎＭのＬｙｓ２０〜５０および５０ｎＭのｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３。Ｈｏｅｓｃｈｔチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきり示した；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。
【図１６】図１６は、過剰に荷電されたＧＦＰ変異体および細胞を透過するそれらの能力を示す図である。（Ａ）−２５ｋＴ／ｅ（濃赤色）から＋２５ｋＴ／ｅ（濃青色）までを着色した、ＧＦＰ変異体の算出静電表面電位。（Ｂ）２００ｎＭのそれぞれのＧＦＰ変異体で独立して処理し、ヘパリンを含有するＰＢＳで３回洗浄して細胞表面に結合したＧＦＰを除去したＨｅＬａ細胞における内在（ｉｎｔｅｒｎａｔｌｉｚｅｄ）ＧＦＰの量を示すフローサイトメトリー分析。（Ｃ）未処理細胞におけるバックグラウンド蛍光（黒色）と比較してＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞における内在＋３６ＧＦＰ（緑色）の量を示すフローサイトメトリー分析。
【図１７】図１７は、以下のことを示す図である。（Ａ）３７℃で１時間のコ・インキュベーション後のＨｅＬａ細胞における＋３６ＧＦＰの内在化。（Ｂ）４℃で１時間インキュベートしたＨｅＬａ細胞における＋３６ＧＦＰ細胞透過の阻害。＋３６ＧＦＰが一部は細胞表面に結合したままであることができるように、細胞を部分的にしか洗浄しなかった。（Ｃ）および（Ｄ）（Ａ）における条件下、しかし、それぞれ、カベオリン依存性エンドサイトーシス阻害剤フィリピンおよびナイスタチンの存在下での＋３６ＧＦＰの内在化。（Ｅ）（Ａ）における条件下、しかし、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤クロルプロマジンの存在下での＋３６ＧＦＰの内在化。（Ｆ）エンドサイトーシスの２０分後のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識トランスフェリン（赤色）および＋３６ＧＦＰ（緑色）の細胞局所化。（Ｇ）アクチン重合阻害剤サイトカラシンＤの存在下でのＨｅＬａ細胞における＋３６ＧＦＰ内在化の阻害。（Ｈ）８０ｍＭの塩素酸ナトリウムで処理したＨｅＬａ細胞における＋３６ＧＦＰ内在化の阻害。（Ｉ）３７℃で１時間インキュベートしたＣＨＯ細胞における＋３６ＧＦＰの内在化。（Ｊ）ＰＤＧ−ＣＨＯ細胞における＋３６ＧＦＰ内在化の欠如。（Ｉ）および（Ｊ）では、細胞核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。
【図１８】図１８は、以下のことを示す図である。（Ａ）過剰に正に荷電されたＧＦＰ：ｓｉＲＮＡの結合の化学量論比を決定するために、臭化エチジウムによって染色した未結合ｓｉＲＮＡ（３３）を示すゲルシフトアッセイ。１０ピコモルのｓｉＲＮＡを１０分間、２５℃で様々なモル比のそれぞれのＧＦＰと混合し、その後、非変性ＰＡＧＥによって分析した。それぞれの列の最も右のレーンは、ｓｆＧＦＰとｓｉＲＮＡの１００：１混合物を示す。（Ｂ）５０ｎＭのＣｙ３−ｓｉＲＮＡと２００ｎＭの＋１５、＋２５または＋３６ＧＦＰとの混合物で処理し、その後、ヘパリンで３回洗浄して非内在タンパク質を除去したＨｅＬａ細胞における内在ｓｉＲＮＡレベルを示すフローサイトメトリー分析（図２２参照）。ｓｉＤＮＡで処理したが、トランスフェクション試薬ではしていないＨｅＬａ細胞のデータを黒で示す。（Ｃ）トランスフェクション試薬を用いずにｓｉＲＮＡで処理した細胞（黒色）と比較して、５０ｎＭのＣｙ３−ｓｉＲＮＡと２００ｎＭの＋３６ＧＦＰ（緑色）または約２μＭのリポフェクタミン２０００（青色）いずれかとの混合物とのインキュベーション後のＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞に送達されたＣｙ３標識ｓｉＲＮＡレベルを示す、フローサイトメトリー分析。上で説明したようにフローサイトメトリーの前に細胞を洗浄した。（Ｄ）２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭのＣｙ３−ｓｉＲＮＡでの４時間処理の２４時間後の安定な付着細胞系（ＨｅＬａ、ＩＭＣＤおよび３Ｔ３−Ｌ）の蛍光顕微鏡画像。それぞれの画像は、３つのチャンネル：青色（ＤＡＰＩ染色）、赤色（Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ）および緑色（＋３６ＧＦＰ）のオーバーレイであり；黄色は、赤色と緑色の共局在を示す。３つの画像すべてについて倍率は４０倍であった。
【図１９】図１９は、ｓｉＲＮＡ送達の結果として生ずるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの抑制を示す図である。（Ａ）ＲＴ−ＱＰＣＲによって測定したときの、５０ｎＭのｓｉＲＮＡおよび約２μＭのリポフェクタミン２０００での、または５０ｎＭのｓｉＲＮＡおよび２００ｎＭの＋３６ＧＦＰでの処理の４８、７２および９６時間後のＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルの抑制。示す抑制レベルは、β−アクチン  ｍＲＮＡレベルに正規化したものであり；０％抑制は、約２μＭのリポフェクタミン２０００および５０ｎＭのスクランブル陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞におけるｍＲＮＡレベルと定義する。（Ｂ）ｓｉＲＮＡおよび約２μＭのリポフェクタミン２０００での、またはｓｉＲＮＡおよび２００ｎＭの＋３６ＧＦＰでの処理の４８、７２および９６時間後のＨｅＬａ細胞におけるＧＡＰＤＨタンパク質レベルの抑制。（Ｃ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡおよび約２μＭのリポフェクタミン２０００、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰ、または２００ｎＭの＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２での処理の９６時間後のＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞におけるＧＡＰＤＨタンパク質レベルの抑制。（Ｂ）および（Ｃ）について、示す抑制レベルは、ウエスタンブロットによって測定し、β−チューブリンタンパク質レベルに正規化したものであり；０％抑制は、約２μＭのリポフェクタミン２０００およびスクランブル陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞におけるタンパク質レベルと定義する。値およびエラーバーは、（Ａ）および（Ｂ）の場合は３回の独立した実験、ならびに（Ｃ）の場合は５回の独立した実験の平均値および標準偏差を表す。
【図２０】図２０は、＋１５および＋３６ＧＦＰのものと比較した様々なカチオン性合成ペプチドのｓｉＲＮＡトランスフェクション活性を示す図である。５０ｎＭのＣｙ３−ｓｉＲＮＡと２００ｎＭまたは２μＭいずれかの示すペプチドまたはタンパク質との混合物で４時間処理したＨｅＬａ細胞における内在Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡレベルを測定するために、フローサイトメトリーを用いた。
【図２１】図２１は、リポフェクタミン２０００、＋３６ＧＦＰ、または＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２によるＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞へのプラスミドＤＮＡトランスフェクションを示す図である。細胞を８００ｎｇのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドおよび２００ｎＭまたは２μＭの＋３６ＧＦＰまたは＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２で４時間処理した。２４時間後、β−Ｆｌｕｏｒキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。値およびエラーバーは、３回の独立した実験の平均値および標準偏差を表す。
【図２２】図２２は、細胞表面に結合した過剰に荷電されたＧＦＰを除去するために用いた洗浄プロトコルの有効性を示す図である。４℃で（ＧＦＰの細胞取り込みを阻止するため、本文参照）１時間、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰでＨｅＬａ細胞を処理した。その後、細胞を４℃のＰＢＳでまたは４℃のＰＢＳ中の２０Ｕ／ｍＬ硫酸ヘパリンで３回（各洗浄について１分）洗浄し、その後、フローサイトメトリーで分析した。ＰＢＳで洗浄した細胞は、おそらく細胞表面結合ＧＦＰから生ずる有意なＧＦＰ蛍光を示す。対照的に、ＰＢＳ中の２０Ｕ／ｍＬヘパリンで洗浄した細胞は、未処理細胞と同等のＧＦＰ蛍光レベルを示す。
【図２３】図２３は、ＨｅＬａ細胞における＋３６ＧＦＰ細胞透過の濃度依存性を示す図である。ＨｅＬａ細胞を無血清培地において４時間、＋３６ＧＦＰで処理した。細胞をトリプシン処理し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をコーティングしたスライドガラス上のＤＭＥＭ中の１０％ＦＢＳの中に置いた。３７℃で２４時間後、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＤＡＰＩで染色し、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ倒立顕微鏡を使用してイメージングした。すべての画像について倍率は２０倍である。
【図２４】図２４は、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション剤を使用すると蛍光顕微鏡検査がＩＭＣＤおよび３Ｔ３−Ｌ細胞においてＣｙ３−ｓｉＲＮＡが内在化しないことを示さないことを示す図である。細胞を無血清培地において４時間、Ｆｕｇｅｎｅ  ６でその製造業者のプロトコルに従って処理した。細胞をトリプシン処理し、ペレット化した。トリプシン含有培地を吸引によって除去し、細胞をＤＭＥＭ中の１０％ＦＢＳに再び懸濁させ、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を事前にコーティングしておいたスライドガラスで平板培養した。細胞を２４時間放置して付着させ、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色し、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ倒立顕微鏡を使用してイメージングした。すべての画像について倍率は２０倍である。Ｃｙ３蛍光は観察されなかった（図１８Ｄと比較）。
【図２５Ａ】図２５は、以下のことを示す図である。（Ａ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡと約２μＭのリポフェクタミン２０００、＋３６ＧＦＰ、または＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２とで処理した５つの哺乳動物細胞系についてのＭＴＴ細胞毒性アッセイ。処理の２４時間後にデータを取った。値およびエラーバーは、３つの独立した実験の平均値および標準偏差を表す。ＭＴＴ試薬では処理せず＋３６ＧＦＰまたは＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２で処理した細胞は、これらの条件下で有意な蛍光を示さなかった。（Ｂ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡと２００ｎＭまたは２μＭいずれかのカチオン性ポリマーとで処理したＨｅＬａ細胞のＭＴＴ細胞毒性アッセイ。クロロキンまたは酪酸ピレンでの処理は、細胞毒性であることが判明した（それぞれ、レーン９および１０）。
【図２５Ｂ】図２５は、以下のことを示す図である。（Ａ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡと約２μＭのリポフェクタミン２０００、＋３６ＧＦＰ、または＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２とで処理した５つの哺乳動物細胞系についてのＭＴＴ細胞毒性アッセイ。処理の２４時間後にデータを取った。値およびエラーバーは、３つの独立した実験の平均値および標準偏差を表す。ＭＴＴ試薬では処理せず＋３６ＧＦＰまたは＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２で処理した細胞は、これらの条件下で有意な蛍光を示さなかった。（Ｂ）５０ｎＭのｓｉＲＮＡと２００ｎＭまたは２μＭいずれかのカチオン性ポリマーとで処理したＨｅＬａ細胞のＭＴＴ細胞毒性アッセイ。クロロキンまたは酪酸ピレンでの処理は、細胞毒性であることが判明した（それぞれ、レーン９および１０）。
【図２６】図２６は、＋３６ＧＦＰ：プラスミドＤＮＡの結合の化学量論比を決定するための未結合線形化ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を示すゲルシフトアッセイ。それぞれのレーンにおいて、ＥｃｏＲＩ消化によって線形化した２２ｆｍｏｌのｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼを様々なモル比の＋３６ＧＦＰと併せ、２５℃で１０分間インキュベートした。臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルを用いる５０分間、１４０Ｖでの電気泳動によって、サンプルを分析した。
【図２７】図２７は、この研究において使用した精製ＧＦＰ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。クマシーブルーでの染色によって、タンパク質を可視化した。分子量マーカーの移動点を左側に記載する。過剰に荷電されたＧＦＰが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に、実際の分子量のみに依存せず、理論正味電荷の大きさにも一部依存する様式で、移動することに注目。
【図２８】図２８は、この研究において使用したすべてのＧＦＰ類似体（１０ｎＭの各タンパク質、４８８ｎｍで励起）の蛍光スペクトルを示す図である。
【図２９】図２９は、以下のことを示す図である。（Ａ）約２μＭのリポフェクタミン２０００および５０ｎＭの陰性対照ｓｉＲＮＡとで処理した４日後の代表ウエスタンブロットデータ。（Ｂ）２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭの陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した４日後の代表ウエスタンブロットデータ。（Ｃ）５０ｎＭのＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡと約２μＭのリポフェクタミン２０００または２００ｎＭの＋３６ＧＦＰのいずれかとで処理した４８、７２および９６時間後のＧＡＰＤＨおよびβ−チューブリンレベルを示す代表な代表ウエスタンブロットデータ。（Ｄ）約２μＭのリポフェクタミン２０００と５０ｎＭのＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡとで処理した４日後の代表ウエスタンブロットデータ。（Ｅ）２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭのＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡとで処理した４日後の代表ウエスタンブロットデータ。（Ｆ）２００ｎＭの＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２および５０ｎＭのＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡとで処理した４日後の代表ウエスタンブロットデータ。（Ｇ）約２μＭのリポフェクタミン２０００および５０ｎＭの陰性対照ｓｉＲＮＡ、約２μＭのリポフェクタミン２０００および５０ｎＭのβ−アクチンターゲッティングｓｉＲＮＡ、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭのβ−アクチンターゲッティングｓｉＲＮＡ、または２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭの陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した４日後のＨｅＬａ細胞からの代表ウエスタンブロットデータ。
【図３０】図３０は、蛍光顕微鏡検査が、いずれも４℃で処理したＨｅＬａ細胞において、またはサイトカラシンＤ（１０μｇ／ｍＬ）で前処理したＨｅＬａ細胞において、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡもＧＦＰも内在化しないことを示す図である。画像は、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰと５０ｎＭのｓｉＲＮＡとを含有する溶液で処理した１時間後の細胞のものである。ＧＦＰ発光を検出するためのフィルターを装備したスピニングディスク型共焦点倒立顕微鏡を用いて画像を撮影した。可視化を助長するために、細胞をＰＢＳ中の２０Ｕ／ｍＬのへパリンで２回（それぞれ１分）洗浄して（すべてではないが）大部分の表面結合ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを除去した。
【図３１】図３１は、以下のことを示す図である。（Ａ）２０μＭの＋３６ＧＦＰと５μＭの二本鎖ＲＮＡ２０マーとの混合から形成された粒子の流体力学的半径（Ｈｒ）を示す動的光散乱（ＤＬＳ）データ。（Ｂ）上記サンプルの蛍光顕微鏡画像。示す画像は、明視野画像およびＧＦＰチャンネル画像のオーバーレイである。乾燥したサンプルの場合、像が大きいほど、共に会合している粒子が実際には小さいことに注意。スケールバー＝１０μｍ。
【図３２】図３２は、以下のことを示す図である。（Ａ）プロテイナーゼＫによる＋３６ＧＦＰおよびウシ血清アルブミンの消化。１００ｐｍｏｌの＋３６ＧＦＰまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．６単位のプロテイナーゼＫで、３７℃で処理した。サンプルをＳＤＳタンパク質ローディングバッファーと混合し、１０分間、９０℃に加熱し、クマシーブルーでの４〜１２％アクリルアミドゲル染色でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。（Ｂ）ネズミ血清中での＋３６ＧＦＰおよびＢＳＡの安定性。ＰＢＳ中のそれぞれのタンパク質１００ｐｍｏｌを５μＬのネズミ血清と混合して合計１０μＬの量にし、３７℃でインキュベートした。サンプルをＳＤＳタンパク質ローディングバッファーと混合し、１０分間、９０℃に加熱した。得られた混合物を４〜１２％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、＋３６ＧＦＰおよびＢＳＡタンパク質バンドをウエスタンブロットによって明らかにした。一番下の画像は、＋３６ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ複合体（Ｃで論じる）の５μＬのサンプルであり、ＧＦＰについてウエスタンブロットにより分析したものである。（Ｃ）＋３６ＧＦＰと複合体を形成したｓｉＲＮＡのネズミ血清中での安定性。ｓｉＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ）をｓｆＧＦＰ（４０ｐｍｏｌ）または＋３６ＧＦＰ（４０ｐｍｏｌ）と混合し、４μＬのＰＢＳ中で１０分間、２５℃でインキュベートした。得られた溶液を４倍量のマウス血清（合計２０μＬ）に添加し、示されている時間、３７℃でインキュベートし、エタノールで沈殿させ、１５％アクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって分析した。（Ｄ）＋３６ＧＦＰまたはｓｆＧＦＰと複合体を形成したプラスミドＤＮＡのネズミ血清中での安定性。プラスミドＤＮＡ（０．０２６ｐｍｏｌ）を４μＬのＰＢＳ中の１２．８ｐｍｏｌの＋３６ＧＦＰまたはｓｆＧＦＰのいずれかと１０分間混合した。この溶液に１６μＬのマウス血清を添加した（合計２０μＬ）。サンプルを示されている時間、３７℃でインキュベートした。フェノール−クロロホルムでの抽出によってＤＮＡを単離し、エタノールで沈殿させ、１％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって分析した。
【図３３】図３３は、（１）ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＴ；（２）ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｒｇ９；（３）ｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＬＡＬ−＋３６ＧＦＰを使用してＨｅＬａ、ＰＣ１２およびＩＭＣＤ細胞系におけるｍＣｈｅｒｒｙの内在化を示す図である。
【図３４】図３４は、５０ｎＭのｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＬＡＬ−＋３６ＧＦＰでの処理の４時間後のＨｅＬａ、ＰＣ１２およびＩＭＣＤ細胞の蛍光顕微鏡画像を示す図である。それぞれの画像は、３つのチャンネル：青色（ＤＮＡについてのＤＡＰＩ染色）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）および緑色（＋３６ＧＦＰ）のオーバーレイである。黄色は、赤色と緑色の共局在を示す。
【図３５】図３５は、ヒトタンパク質がｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達することを示す図である。（Ａ）ヒトタンパク質をｓｉＲＮＡと漸増質量比で混合し、ＰＡＧＥおよび臭化エチジウム染色によって未結合ｓｉＲＮＡについてアッセイした。漸減するバンド強度は、ヒトタンパク質によるｓｉＲＮＡ結合を明示している。（Ｂ）ヒトタンパク質をＣｙ３標識ｓｉＲＮＡと混合し、４時間、ＨｅＬａ細胞に適用した。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってＣｙ３蛍光についてアッセイした。右へのピークのシフトは、ｓｉＲＮＡ内在化を明示している。（Ｃ）ヒトタンパク質を使用してＨｅＬａ細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、３日間インキュベートし、ターゲットとなるｍＲＮＡの分解についてアッセイした。ターゲットとなるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルをβ−アクチン  ｍＲＮＡレベルに対して比較した。「対照」は、非ターゲッティングｓｉＲＮＡの使用を示す。リポフェクタミン２０００を陽性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質それ自体の過剰に荷電させることによるまたはタンパク質もしくは他の作用物質（例えば、ペプチド、タンパク質、小分子）と過剰に荷電されたタンパク質を会合させることによるタンパク質または他の作用物質の細胞への送達を増進させるための組成物、調製物、システムおよび関連方法を提供する。そのようなシステムおよび方法は、一般に、過剰に荷電されたタンパク質の使用を含む。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質それ自体を細胞の内部に送達して、例えば、それが透過する細胞に対する生物学的作用を治療的恩恵のために生じさせる。過剰に荷電されたタンパク質を使用して他の作用物質を送達することもできる。例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質を、負電荷を有する作用物質、例えば、核酸（典型的に、正味負電荷を有する）または負の電荷を有するペプチドもしくはタンパク質と静電相互作用によって会合させて、複合体を形成することができる。過剰に負に荷電されたタンパク質を、正電荷を有する作用物質と会合させることもできる。送達すべき作用物質を、共有結合性連結または他の非共有結合性相互作用によって、過剰に負に荷電されたタンパク質と会合させることもできる。いくつかの実施形態において、そのような組成物、調製物、システムおよび方法は、タンパク質の一次配列を改変して、そのタンパク質を「過剰に荷電させる」（例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質を生じさせる）ことを含む。ある実施形態において、本発明のシステムは、自然に存在するタンパク質を使用して複合体を形成する。ある実施形態において、本発明の複合体は、過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき１つ以上の作用物質（例えば、核酸、タンパク質、小分子）とを含む。細胞取り込みの一例では、過剰に荷電されたタンパク質が細胞によるエンドサイトーシスを受けることが判明した。過剰に荷電されたタンパク質、またはタンパク質／作用物質複合体を形成するために送達すべき作用物質と混合された過剰に荷電されたタンパク質は、細胞に有効にトランスフェクトされる。メカニズムの研究は、これらの複合体のエンドサイトーシスが、硫酸化された細胞表面プロテオグリカンを必要とするが、クラスリンおよびカベオリンを必
要としないことを示す。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき１つ以上の作用物質とを含む複合体は、治療薬、診断薬、または研究ツールとして有用である。いくつかの実施形態において、作用物質および／または過剰に荷電されたタンパク質は、治療上活性であり得る。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質または複合体を使用して、細胞における遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質または複合体を使用して、細胞内の生体経路（例えば、シグナリング経路、代謝経路）を調節する。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質または複合体を使用して、細胞における酵素の活性を阻害する。いくつかの実施形態では、本発明の過剰に荷電されたタンパク質またはそれらの複合体および／もしくは医薬組成物をその必要がある被験体に投与する。いくつかの実施形態では、本発明の過剰に荷電されたタンパク質またはそれらの複合体および／もしくは組成物を、細胞（例えば、ヒト細胞、哺乳動物細胞、Ｔ細胞、ニューロン、幹細胞、前駆細胞、血球、線維芽細胞、上皮細胞など）に作用物質をトランスフェクトするために有効な条件下で、細胞と接触させる。いくつかの実施形態において、細胞への過剰に荷電されたタンパク質または複合体の送達は、過剰に荷電されたタンパク質、または治療薬と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体をその必要がある被験体に投与することを含む。
【００７２】
過剰に荷電されたタンパク質
過剰に荷電されたタンパク質は、タンパク質の表面の非保存アミノ酸をより極性の高いアミノ酸残基または荷電アミノ酸残基に変更することによって生成することができる。修飾すべきアミノ酸残基は、疎水性である場合もあり、親水性である場合もあり、電荷を有する場合もあり、またはそれらの組み合わせである場合もある。過剰に荷電されたタンパク質は、タンパク質に荷電部分を付けてそのタンパク質を過剰に荷電させることによって生成することもできる。過剰に荷電されたタンパク質は、多くの場合、耐凝集性であり、増加されたリフォールディング能力を有し、不適切にフォールディングしにくく、向上された溶解度を有し、および熱または洗剤の存在などの変性条件をはじめとする広範な条件下で一般により安定である。
【００７３】
本発明のシステムを使用して任意のタンパク質を修飾して、過剰に荷電されたタンパク質を生成することができる。天然ならびに非天然タンパク質（例えば、作られたタンパク質）を修飾することができる。修飾することができるタンパク質の例としては、受容体、膜結合タンパク質、膜貫通タンパク質、酵素、転写因子、細胞外タンパク質、治療用タンパク質、サイトカイン、メッセンジャータンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、シグナル伝達に関与するタンパク質、構造タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、疎水性タンパク質、親水性タンパク質などが挙げられる。修飾すべきタンパク質は、植物、動物、および／または微生物の任意の種に由来するものであり得る。ある実施形態において、タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。ある実施形態において、タンパク質は、ヒトタンパク質である。ある実施形態において、タンパク質は、研究において典型的に使用されている生物に由来する。例えば、修飾すべきタンパク質は、霊長類（例えば、類人猿、サル）、齧歯動物（例えば、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ）、ブタ、イヌ、ネコ、魚（例えば、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、または細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。ある実施形態において、タンパク質は、非免疫原性である。ある実施形態において、タンパク質は、非抗原性である。ある実施形態において、タンパク質は、固有の生物学的な活性を有さず、または生物学的な活性を有さないように修飾されている。ある実施形態において、タンパク質は、そのターゲッティング能力に基づいて選択される。ある実施形態において、タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、その構造が、例えばＮＭＲまたはＸ線結晶学によって、特性づけされているものである。いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、その構造と生化学的活性（例えば、酵素活性、タンパク質−タンパク質相互作用など）との相関関係および／または関係が示されているものである。いくつかの実施形態において、そのような情報は、（例えば、生体機能を維持するために、または生物学的な活性を低下させるもしくは除去することができるように）修飾すべきアミノ酸残基または修飾することとならないアミノ酸残基の選択のためのガイドラインとなる。ある実施形態では、タンパク質の固有の生物学的な活性は、有害なおよび／または望ましくない作用のリスクを低下させるために、低下または除去される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、細胞への核酸または他の作用物質の送達に有用なものである。いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、イメージング剤、標識剤、診断薬、予防薬または治療薬である。いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、特定の細胞に作用物質、例えば核酸、を送達するために有用であるものである。いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、望ましい生物学的な活性を有するものである。いくつかの実施形態において、修飾すべきタンパク質は、望ましいターゲッティング活性を有するものである。いくつかの実施形態では、対象となるタンパク質の非保存表面残基を特定し、それらの少なくとも一部を、親水性である、極性である、および／または生理的なｐＨで電荷を有する残基で置換する。いくつかの実施形態において、対象となるタンパク質の非保存表面残基を特定し、それらの少なくとも一部を、生理的なｐＨで正電荷を有する残基で置換する。
【００７６】
修飾すべきタンパク質の表面残基は、当該技術分野において公知の任意の方法（単数または複数）を用いて特定される。ある実施形態では、タンパク質のコンピューターモデリングによって表面残基を特定する。ある実施形態において、タンパク質の三次元構造は、公知であり、および／または決定されており、ならびにタンパク質の表面を可視化することによって表面残基を特定する。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアを使用して表面残基を予測する。ある特定の実施形態では、側鎖原子あたりの平均隣接原子（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ａｔｏｍｓ  ｐｅｒ  Ｓｉｄｅｃｈａｉｎ  Ａｔｏｍ：ＡｖＮＡＰＳＡ）値を用いて表面露出を予測する。ＡｖＮＡＰＳＡは、コンピュータプログラムとして実装されている表面露出の自動測定単位である。低いＡｖＮＡＰＳＡ値は、表面露出残基を示し、これに対して高い値は、そのタンパク質の内部の残基を示す。ある実施形態では、ソフトウェアを用いて、タンパク質の二次構造および／または三次構造を予測し、この予測に基づいて表面残基を特定する。いくつかの実施形態において、表面残基の予測は、残基の疎水性および親水性、ならびにそのタンパク質の一次配列内でのそれらのクラスター化に基づく。インシリコ法に加えて、様々な生化学的技法、例えばプロテアーゼ切断、表面修飾など、を用いてタンパク質の表面残基を特定することもできる。
【００７７】
場合によっては、その後、表面残基のうち、どれが保存されているのか、またはどれがタンパク質の機能化にとって重要であるのか決定する。タンパク質の根底にある生物学的な活性を保存する必要がない場合、どの残基が保存されるかを決定する段階は、任意である。保存残基の特定は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて決定することができる。ある実施形態では、対象となるタンパク質の一次配列を関連タンパク質とアラインすることによって保存残基を決定することができる。これらの関連タンパク質は、同じタンパク質ファミリーからのものである場合もある。例えば、そのタンパク質が免疫グロブリンである場合、他の免疫グロブリン配列を使用することができる。関連タンパク質は、異なる種からの同じタンパク質である場合もある。例えば、異なる種からの同じタンパク質の配列をアラインすることによって、保存残基を特定することができる。しかし、別の例を挙げると、類似した機能または生物学的な活性のタンパク質をアラインする場合が
ある。好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の異なる配列を使用して、タンパク質内の保存アミノ酸を決定する。ある実施形態において、配列の５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、９０％より多く、または９５％より多くが、特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、残基は保存されていると考えられる。他の実施形態において、配列の５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、７５％より多く、８０％より多く、９０％より多く、または９５％より多くが、特定の位置に同じまたは類似した（例えば、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；グリシンおよびアラニン；グルタミンおよびアスパラギン；またはアスパラギン酸およびグルタミン酸）アミノ酸を有する場合、残基は保存されていると考えられる。本明細書に記載するようなタンパク質配列のアラインメントおよび比較に、多くのソフトウェアパッケージを利用することができる。当業者には理解されるように、最初に保存残基を決定してもよいし、最初に表面残基を決定してもよい。順序は問題ではない。ある実施形態において、コンピュータ・ソフトウェア・パッケージは、表面残基と保存残基を同時に決定することができる。そのタンパク質中の重要な残基をタンパク質の変異誘発によって特定することもできる。例えば、タンパク質のアラニンスキャンを用いて、そのタンパク質中の重要なアミノ酸残基を決定することができる。いくつかの実施形態では、部位特異的変異誘発を用いる場合がある。ある実施形態において、タンパク質の元々の生物学的な活性の保存は重要でなく、従って、保存残基を特定する段階および過剰に荷電されたタンパク質においてそれらを保護する段階を行わない。
【００７８】
表面残基のそれぞれを疎水性または親水性として識別する。ある実施形態では、残基に疎水性スコアを割り当てる。例えば、それぞれの表面残基にオクタノール／水ｌｏｇＰ値を割り当てることができる。他の疎水性パラメータを用いてもよい。アミノ酸のそのような尺度は、Ｊａｎｉｎ、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ、２７７：４９１；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎら、１９８１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０：８４９；Ｋｙｔｅら、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５；Ｒｏｓｅら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８３４；Ｃｏｒｎｅｔｔｅら、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９５：６５９；ＣｈａｒｔｏｎおよびＣｈａｒｔｏｎ、１９８２、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、９９：６２９において論じられており、これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている。これらの疎水性パラメータのいずれかを本発明の方法において用いて、どの残基を修飾するかを決定することができる。ある実施形態では、親水性または荷電残基を修飾のために特定する。
【００７９】
その後、特定された少なくとも１つの表面残基を修飾のために選択する。ある実施形態では、疎水性残基（単数または複数）を修飾のために選択する。他の実施形態では、親水性および／または荷電残基（単数または複数）を修飾のために選択する。ある実施形態では、１つより多くの残基を修飾のために選択する。ある実施形態では、特定された残基の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を修飾のために選択する。ある実施形態では、１０より多くの、１５より多くの、２０より多くの、または２５より多くの残基を修飾のために選択する。当業者には理解されるように、タンパク質が大きいほど、修飾を必要とする残基は多い。また、タンパク質が疎水性であるほど、または凝集もしくは沈殿しやすいほど、多くの残基を修飾する必要があるだろう。ある実施形態では、異なる修飾をそれぞれが伴う、タンパク質の多くの変異体を生成し、細胞への核酸の送達、安定性、生体適合性および／または生物学的な活性に関して試験して最良の変異体を決定する。
【００８０】
ある実施形態では、修飾のために選択された残基をより親水性の高い残基（荷電残基を含む）に変異させる。典型的には、残基をより親水性の高い天然アミノ酸に変異させる。ある実施形態では、生理的なｐＨで電荷を有するアミノ酸に残基を変異させる。例えば、残基をアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンまたはリシンに変更することができる。ある実施形態では、修飾すべきすべての残基を同一の異なる残基に変更す
る。例えば、選択された残基のすべてをリシン残基に変更する。他の実施形態では、選択された残基を異なる残基に変更するが、すべての最終残基は、生理的なｐＨで正電荷または負電荷を有し得る。ある実施形態では、負電荷を有するタンパク質を作るために、変異させるすべての残基をグルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基に転化させる。ある実施形態では、正電荷を有するタンパク質を作るために、変異させるすべての残基をリシン残基に転化させる。例えば、修飾のために選択されるすべての残基は、アスパラギン、グルタミン、リシンおよび／またはアルギニンであり、これらの残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸残基に変異させる。しかし、別の例を挙げると、修飾のために選択されるすべての残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、および／またはグルタミンであり、これらの残基をリシンに変異させる。このアプローチは、タンパク質の正味電荷を最大限まで修飾することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、未修飾タンパク質のものと同じ正味電荷を修飾されたタンパク質が保持するようにタンパク質を修飾することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質の全体の正味電荷を減少させ、その上、表面の荷電残基の総数を増加させるように、タンパク質を修飾することができる。ある実施形態では、理論正味電荷を少なくとも＋１、少なくとも＋２、少なくとも＋３、少なくとも＋４、少なくとも＋５、少なくとも＋１０、少なくとも＋１５、少なくとも＋２０、少なくとも＋２５、少なくとも＋３０、少なくとも＋３５、または少なくとも＋４０増加させる。ある実施形態では、理論正味電荷を少なくとも−１、少なくとも−２、少なくとも−３、少なくとも−４、少なくとも−５、少なくとも−１０、少なくとも−１５、少なくとも−２０、少なくとも−２５、少なくとも−３０、少なくとも−３５、または少なくとも−４０減少させる。ある実施形態では、選択されたアミノ酸を非イオン性極性残基（例えば、システイン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン）に変更する。
【００８２】
ある実施形態において、荷電アミノ酸残基に変異させるアミノ酸残基は、互いに少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５アミノ酸残基、離れている。ある実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リシン）に変異させるアミノ酸残基は、互いに少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５アミノ酸残基、離れている。典型的に、これらの介在配列は、荷電化されるタンパク質の主アミノ酸に基づく。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質において２つの荷電アミノ酸しか連続して存在させない。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質において３つの荷電アミノ酸しか連続して存在させない。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質において４つ以下の荷電アミノ酸しか連続して存在させない。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質において５つ以下の荷電アミノ酸しか連続して存在させない。
【００８３】
ある実施形態において、表面露出ループ、らせん、ターン、または他の二次構造は、荷電残基を１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個しか含有できない。タンパク質にわたって荷電残基を分布させることが、タンパク質をより安定にさせると典型的には考えられる。ある実施形態では、一次配列のアミノ酸１５〜２０個あたり１、２、３、４または５個の残基しか荷電アミノ酸（例えば、リシン）に変異させない。ある実施形態では、一次配列のアミノ酸１０個あたり平均で１、２、３、４または５個の残基しか荷電アミノ酸（例えば、リシン）に変異させない。ある実施形態では、一次配列のアミノ酸１５個あたり平均で１、２、３、４または５個の残基しか荷電アミノ酸（例えば、リシン）に変異させない。ある実施形態では、一次配列のアミノ酸２０個あたり平均で１、２、３、４または５個の残基しか荷電アミノ酸（例えば、リシン）に変異させない。ある実施形態
では、一次配列のアミノ酸２５個あたり平均で１、２、３、４または５個の残基しか荷電アミノ酸（例えば、リシン）に変異させない。ある実施形態では、一次配列のアミノ酸３０個あたり平均で１、２、３、４または５個の残基しか荷電アミノ酸（例えば、リシン）に変異させない。
【００８４】
ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質の変異荷電アミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、溶媒に露出される。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質の変異荷電アミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は、タンパク質の表面に存在する。ある実施形態において、変異荷電アミノ酸残基の５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満は、溶媒に露出されない。ある実施形態において、変異荷電アミノ酸残基の５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満は、内部アミノ酸残基である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、１つ以上の所定の基準を用いて、修飾するためのアミノ酸残基を選択する。例えば、過剰に正に荷電されたタンパク質を生成するために、ＡｖＮＡＰＳＡ値を用いて、一定の閾値より下のＡｖＮＡＰＳＡ値を有するアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよび／またはグルタミン残基を特定することができ、これらの残基の１つ以上（例えば、すべて）をリシンに変更することができる。いくつかの実施形態において、過剰に正に荷電されたタンパク質を生成するために、ＡｖＮＡＰＳＡ値を用いて、一定の閾値より下のＡｖＮＡＰＳＡ値を有するアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよび／またはグルタミン残基を特定することができ、これらの１つ以上（例えば、すべて）をアルギニンに変更することができる。いくつかの実施形態において、過剰に負に荷電されたタンパク質を生成するために、ＡｖＮＡＰＳＡ値を用いて、一定の閾値より下のＡｖＮＡＰＳＡ値を有するアスパラギン、グルタミン、リシンおよび／またはアルギニン残基を特定することができ、これらの１つ以上（例えば、すべて）をアスパラギン酸残基に変更することができる。いくつかの実施形態において、過剰に負に荷電されたタンパク質を生成するために、ＡｖＮＡＰＳＡ値を用いて、一定の閾値より下のＡｖＮＡＰＳＡ値を有するアスパラギン、グルタミン、リシンおよび／またはアルギニン残基を特定することができ、これらの１つ以上（例えば、すべて）をグルタミン酸残基に変更することができる。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、４０以下である。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、３５以下である。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、３０以下である。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、２５以下である。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、２０以下である。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下である。いくつかの実施形態において、一定の閾値は、０である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、隣接するものの数によって溶媒露出残基を特定する。一般に、隣接するものをより多く有する残基は、隣接するものをより少く有する残基より溶媒露出が少ない。いくつかの実施形態では、溶媒露出残基を、アミノ酸側鎖の方向の原因となる半球露出（Ｈａｍｅｌｒｙｃｋ、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、５９：８−４８；参考として本明細書に援用されている）によって特定する。いくつかの実施形態では、溶媒露出表面積、接触可能表面積、および／またはそれぞれの残基の溶媒排除表面を算出することによって溶媒露出残基を特定する。例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５（３）：３７９−４００、１９７１；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９、１９８４参照（これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。
【００８７】
当該技術分野において公知の任意の技術を用いて、タンパク質における所望の修飾または変異を果たすことができる。タンパク質配列にそのような変更を導入するための組み換えＤＮＡ技術は、当該技術分野において周知である。ある実施形態では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって修飾を行う。変異を導入するための他の技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、編者：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）において論じられており、これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている。修飾されたタンパク質を発現させ、試験する。ある実施形態では、一連の変異体を調製し、それぞれの変異体を試験してその生物学的な活性およびその安定性を決定する。後の使用のために選択される変異体は、最も安定なものである場合もあり、最も活性の高いものである場合もあり、または活性および安定性が総合的に最も高い組み合わせである場合もある。第一の変異体セットを調製した後、第一のセットから学んだことに基づいて、追加の変異体セットを調製することができる。典型的には、当該技術分野において公知の組み換え技術を用いて変異体を作り、過剰発現させる。
【００８８】
過剰に荷電されたタンパク質をさらに修飾することができる。当業者に公知の技術を用いて、過剰に荷電されたタンパク質を含むタンパク質を修飾することができる。例えば、過剰に荷電されたタンパク質を化学的にまたは生物学的に修飾することができる。１つ以上のアミノ酸残基をその一次配列に付加させることができ、その一次配列から欠失させるまたは変更することができる。例えば、ポリヒスチジンタグまたは他のタグを過剰に荷電されたタンパク質に付加させて、そのタンパク質の精製を助長することができる。他のペプチドまたはタンパク質を過剰に荷電されたタンパク質に付加させて、そのタンパク質の生物学的、生化学的、および／または生理的特性を改変することができる。例えば、エンドソーム溶解性ペプチドを過剰に荷電されたタンパク質の一次配列に付加させることができ、またはターゲッティングペプチドを過剰に荷電されたタンパク質の一次配列に付加させることができる。過剰に荷電されたタンパク質の他の修飾としては、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、脂質化、ファルネシル化、アセチル化、タンパク質分解など）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を、その免疫原性を低下させるように修飾することができる。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を、細胞に核酸を送達するその能力を強化するように修飾することができる。ある実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を、ポリマーに結合体化させることができる。例えば、タンパク質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーに結合体化させることによって、そのタンパク質をＰＥＧ化することができる。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、過剰に荷電されたタンパク質を修飾する多数の方法を思い描くことができる。本明細書に記載する方法は、過剰に荷電させるべきタンパク質のタンパク質配列に変更を課すことによって、タンパク質を荷電化することができる。他の方法を用いて、タンパク質配列を修飾せずに過剰に荷電されたタンパク質を生成することができる。例えば、電荷を変える部分を、タンパク質に（例えば、化学または酵素反応によって）付けて、表面電荷を与えて、過剰に荷電させることを達成することができる。ある実施形態では、Ｓｈａｗら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７：１４４６、２００８に記載されているタンパク質修飾方法を用いて、タンパク質を過剰に荷電させることができる。
【００８９】
国際ＰＣＴ特許出願（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ」と
題する２００７年１２月１３日にＷＯ  ２００７／１４３５７４として発行された、２００７年６月１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／７０２５４；参考として本明細書に援用されている）および米国特許仮出願（２００６年６月２日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８１０，３６４、および２００６年８月９日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８３６，６０７；両方とも「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ」と題するものであり、および両方とも参考として本明細書に援用されている）には、いくつかの異なるタンパク質の変異体の設計および生成が記載されている。これらの変異体が、より安定であることおよびそれらの蛍光を保持することが証明されている。例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４２２１２に記載されており、これは、参考として本明細書に援用されている。この野生型ＧＦＰのアミノ酸配列は、次のとおりである：
【００９０】
【化２】
2014159484.tif 000006
野生型ＧＦＰは、−７の理論正味電荷を有する。−２９、−３０、−２５、＋１５、＋２５、＋３６、＋４８、および＋４９の理論正味電荷を有する変異体が生成された。＋３６ＧＦＰは、９５℃に加熱した後でさえ、変異タンパク質の１００％が可溶性であり、タンパク質は、その蛍光の７０％以上を保持する。＋１５、＋２５および＋３６ＧＦＰは、細胞への核酸のトランスフェクションに特に有用であることが判明した。詳細には、＋３６ＧＦＰは、高細胞透過性であること、および他のトランスフェクション法を用いるとトランスフェクションに対して耐性の細胞系を含む様々な哺乳動物細胞に核酸を効率的に送達できることが判明した。従って、少なくとも＋２５、少なくとも＋３０、少なくとも＋３５、または少なくとも＋４０の正味電荷を有するＧＦＰまた他のタンパク質は、細胞への核酸のトランスフェクションに特に有用であると考えられる。
【００９１】
生成されたＧＦＰの変異体のアミノ酸配列としては、次のものが挙げられる：
【００９２】
【化３】
2014159484.tif 000007
【００９３】
【化４】
2014159484.tif 000008
【００９４】
【化５】
2014159484.tif 000009
エンドソームからの過剰に荷電されたタンパク質、または送達された作用物質、例えば核酸、の脱出を促進するために、エンドソーム分解またはエンドソームの溶解を増進することが公知であるタンパク質、ペプチドまたは他の実体と過剰に荷電されたタンパク質を融合させるまたは会合させることができる。ある実施形態において、ペプチドは、エンドソーム分解を増進することが公知である、血球凝集素２（ＨＡ２）ペプチドである。ある特定の実施形態では、ＨＡ２ペプチドを過剰に荷電されたＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰ）と融合させる。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、次の配列のものである：
【００９５】
【化６】
2014159484.tif 000010
ある実施形態において、エンドソーム溶解性ペプチドは、メリチンペプチド（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ、配列番号：ＸＸ）（Ｍｅｙｅｒら、ＪＡＣＳ  １３０（１１）：３２７２−３２７３、２００８；これは参考として本明細書に援用されている）である。ある実施形態では、メリチンペプチドを１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失、および／または付加によって修飾する。ある実施形態において、メリチンペプチドは、配列：ＣＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号：ＸＸ）のものである。ある特定の実施形態では、メリチンペプチドを過剰に荷電されたＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰ）と融合させる。
【００９６】
ある実施形態において、エンドソーム溶解性ペプチドは、ペネトラチンペプチド（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−アミド、配列番号：ＸＸ）、ウシＰｒＰ（１−３０）ペプチド（ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ−アミド、配列番号：ＸＸ）、ＭＰＧΔＮＬＳペプチド（これは、Ｋ−＞Ｓ置換のため機能性核酸局在配列を欠く）（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＳＫＲＫＶ、配列番号：ＸＸ）、ＴＰ−１０ペプチド（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−アミド、配列番号：ＸＸ）、および／またはＥＢ１ペプチド（ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫ−アミド、配列番号：ＸＸ）（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００７、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２１：２６６４；参考として本明細書に援用されている）である。ある実施形態では、ペネトラチン、ＰｒＰ（１−３０）、ＭＰＧ、ＴＰ−１０、および／またはＥＢ１ペプチドを、１、２、３、４または５アミノ酸置換、欠失、および／または付加によって修飾する。ある特定の実施形態では、ＰｒＰ（１−３０）、ＭＰＧ、ＴＰ−１０、および／またはＥＢ１ペプチドを、過剰に荷電されたＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰ）に融合させる。
【００９７】
他のペプチドまたはタンパク質も過剰に荷電されたタンパク質に融合させることができる。例えば、ターゲッティングペプチドを過剰に荷電されたタンパク質に融合させて、過剰に荷電されたタンパク質、または会合している作用物質、例えば核酸、を特定の細胞タイプに選択的に送達することができる。核酸のトランスフェクションを増進するペプチドまたはタンパク質も使用することができる。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質に融合させるペプチドは、ペプチドホルモンである。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質に融合させるペプチドは、ペプチドリガンドである。
【００９８】
当業者には理解されるように、相同タンパク質も本発明の範囲内であると考えられる。例えば、上記配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸の伸長部を含む任意のタンパク質を本発明に従って利用することができる。あるいは、または加えて、本発明に従って付加および欠失変異体を利用することができる。ある実施形態では、上記配列のいずれかに示したような変異残基を有する任意のＧＦＰを本発明に従って利用することができる。ある実施形態において、本発明に従って利用するためのタンパク質配列は、上記配列のいずれかに示したような変異を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上含む。
【００９９】
過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができる他のタンパク質は、他のＧＦＰ型蛍光タンパク質を含む。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、青色蛍光タンパク質の過剰に荷電されたバージョンである。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、シアン蛍光タンパク質の過剰に荷電されたバージョンである。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、黄色蛍光タンパク質の過剰に荷電されたバージョンである。例示的蛍光タンパク質としては、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥＢＦＰ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、ｍＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、およびＡＱ１４３が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができるさらに他のタンパク質としては、ヒストン成分またはヒストン様タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、ヒストン成分は、ヒストンリンカーＨ１である。ある実施形態において、ヒストン成分は、コアヒストンＨ２Ａである。ある実施形態において、ヒストン成分は、コアヒストンＨ２Ｂである。ある実施形態において、ヒストン成分は、コアヒストンＨ３である。ある実施形態において、ヒストン成分は、コアヒストンＨ４である。ある実施形態において、タンパク質は、古細菌ヒストン様タンパク質（ａｒｃｈａｅｌ  ｈｉｓｔｏｎｅ−ｌｉｎｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＨＰｈＡである。ある実施形態において、タンパク質は、細菌ヒストン様タンパク質、ＴｍＨＵである。
【０１０１】
過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができる他のタンパク質としては、高速移動群タンパク質（ＨＭＧ）が挙げられる。ある実施形態において、タンパク質は、ＨＭＧ１である。ある実施形態において、タンパク質は、ＨＭＧ１７である。ある実施形態において、タンパク質は、ＨＭＧ１−２である
。
【０１０２】
過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができる他のタンパク質としては、抗癌剤、例えば、抗アポトーシス剤、細胞周期調節剤などが挙げられる。
【０１０３】
過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができる他のタンパク質は、アミラーゼ、ペクチナーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、グルコースイソメラーゼ、リパーゼ、フィターゼなどを含む（しかし、これらに限定されない）酵素である。いくつかの実施形態において、過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができるタンパク質は、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼベータ、α−１−イズロニダーゼ、酸性α−グルコシダーゼ、イズロン酸−２−スルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼなどを含む（しかし、これらに限定されない）リソソーム酵素（Ｗａｎｇら、２００８、ＮＢＴ、２６：９０１−０８；参考として本明細書に援用されている）である。
【０１０４】
過剰に荷電させることができ、および例えば、作用物質、例えば核酸、の送達に用いることができる他のタンパク質を表１に提示する。表１に列挙するタンパク質の一部は、それらのタンパク質を過剰に荷電させるように修飾することができる残基のリストを含む。残基の正体は、対象となるタンパク質のＰＤＢファイルをダウンロードすることによってコンピュータで特定した。ａｖＮａｐｓａ値を上昇させることによってｐｄｂファイルの残基がソートされ、最初の１５のＡＳＰ、ＧＬＵ、ＡＳＮまたはＧＬＮ残基がＬＹＳへの変異のために提案された。
【０１０５】
ＰＤＢファイルは、規定により、アミノ酸に野生型タンパク質におけるそれらの順序によって番号を付与する。しかし、ＰＤＢファイルは、完全長野生型タンパク質を含有しない場合がある。インプットタンパク質配列は、ＰＤＢに含まれているアミノ酸の配列である。提案変異によって、完全長野生型タンパク質中およびまたインプットタンパク質配列中のアミノ酸の数が規定される。提案変異を次の形式で提供する：野生型残基＿鎖：野生型タンパク質鎖中の残基番号（インプット鎖中の残基番号）＿提案残基。野生型残基は、野生型タンパク質中のアミノ酸の正体を指す。鎖は、明記する変異のペプチド鎖の呼称を指す。野生型タンパク質中の残基番号は、完全長野生型タンパク質における明記する変異の指定タンパク質鎖中のアミノ酸の数を指す。インプット鎖中の残基番号は、分析したＰＤＢに含まれていた指定タンパク質鎖中のアミノ酸の数を指す。
【０１０６】
【表１−１】
2014159484.tif 000011
【０１０７】
【表１−２】
2014159484.tif 000012
【０１０８】
【表１−３】
2014159484.tif 000013
【０１０９】
【表１−４】
2014159484.tif 000014
【０１１０】
【表１−５】
2014159484.tif 000015
【０１１１】
【表１−６】
2014159484.tif 000016
【０１１２】
【表１−７】
2014159484.tif 000017
【０１１３】
【表１−８】
2014159484.tif 000018
【０１１４】
【表１−９】
2014159484.tif 000019
【０１１５】
【表１−１０】
2014159484.tif 000020
【０１１６】
【表１−１１】
2014159484.tif 000021
【０１１７】
【表１−１２】
2014159484.tif 000022
【０１１８】
【表１−１３】
2014159484.tif 000023
【０１１９】
【表１−１４】
2014159484.tif 000024
【０１２０】
【表１−１５】
2014159484.tif 000025
【０１２１】
【表１−１６】
2014159484.tif 000026
【０１２２】
【表１−１７】
2014159484.tif 000027
表２．過剰に荷電され得る例示的転写因子
それらの調節機能による分類：
Ｉ．構成的に活性  −  すべての細胞に常に存在  −  一般的な転写因子、Ｓｐ１、ＮＦ１、ＣＣＡＡＴ
ＩＩ．  条件付きで活性−活性化を必要とする
ＩＩ．Ａ  発生的（細胞特異的）−  発現はしっかりと制御されるが、一旦発現されると、さらなる活性化を一切必要としない−ＧＡＴＡ、ＨＮＦ、ＰＩＴ−１、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｈｏｘ、翼状らせん
ＩＩ．Ｂ  シグナル依存性  −  活性化に外部シグナルを必要とする
ＩＩ．Ｂ．１  細胞外リガンド依存性  −  核受容体
ＩＩ．Ｂ．２  細胞内リガンド依存性  −  細胞内小分子によって活性化される  −  ＳＲＥＢＰ、ｐ５３、オーファン核受容体
ＩＩ．Ｂ．３  細胞膜受容体依存性  −  転写因子のリン酸化を生じさせる二次メッセン
ジャー・シグナリング・カスケード
ＩＩ．Ｂ．３．定住核性因子  −  活性化の状態にかかわらず核内に定住する  −  ＣＲＥＢ、ＡＰ−１、Ｍｅｆ２
ＩＩ．Ｂ．３．ｂ  潜在細胞質因子  −  不活性形が細胞質中に定住しているが、活性化されると、核内に転座する  −  ＳＴＡＴ、Ｒ−ＳＭＡＤ、ＮＦ−ｋＢ、Ｎｏｔｃｈ、ＴＵＢＢＹ、ＮＦＡＴ
配列類似性および従ってそれらのＤＮＡ結合ドメインの三次構想に基づく分類：
１  スーパークラス：  塩基性ドメイン（塩基性らせん−ループ−らせん）
１．１  クラス：  ロイシンジッパー因子（ｂＺＩＰ）
１．１．１  ファミリー：ＡＰ−１（様）成分；（ｃ−Ｆｏｓ／ｃ−Ｊｕｎ）を含む
１．１．２  ファミリー：ＣＲＥＢ
１．１．３  ファミリー：Ｃ／ＥＢＰ様因子
１．１．４  ファミリー：ｂＺＩＰ  ／  ＰＡＲ
１．１．５  ファミリー：Ｐｌａｎｔ  Ｇ−ｂｏｘ阻害因子
１．１．６  ファミリー：ＺＩＰのみ
１．２  クラス：らせん−ループ−らせん因子（ｂＨＬＨ）
１．２．１  ファミリー：ユビキタス（クラスＡ）因子
１．２．２  ファミリー：筋原性転写因子（ＭｙｏＤ）
１．２．３  ファミリー：Ａｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ
１．２．４  ファミリー：Ｔａｌ／Ｔｗｉｓｔ／Ａｔｏｎａｌ／Ｈｅｎ
１．３  クラス：  らせん−ループ−らせん  ／ロイシンジッパー因子（ｂＨＬＨ−ＺＩＰ）
１．３．１  ファミリー：ユビキタスｂＨＬＨ−ＺＩＰ因子；ＵＳＦ（ＵＳＦ１、ＵＳＦ２）；ＳＲＥＢＰ（ＳＲＥＢＰ）を含む
１．３．２  ファミリー：細胞周期制御因子；ｃ−Ｍｙｃを含む
１．４  クラス：ＮＦ−１
１．４．１  ファミリー：ＮＦ−１（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ）
１．５  クラス：ＲＦ−Ｘ
１．５．１  ファミリー：ＲＦ−Ｘ（１、２、３、４、５、ＡＮＫ）
１．６  クラス：ｂＨＳＨ
２  スーパークラス：亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメイン
２．１  クラス：核受容体タイプのＣｙｓ４ジンクフィンガー
２．１．１  ファミリー：ステロイドホルモン受容体
２．１．２  ファミリー：甲状腺ホルモン受容体様因子
２．２  クラス：  多様なＣｙｓ４ジンクフィンガー
２．２．１  ファミリー：ＧＡＴＡ因子
２．３  クラス：Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンク・フィンガー・ドメイン
２．３．１  ファミリー：ユビキタス因子；ＴＦＩＩＩＡ、Ｓｐ１を含む、
２．３．２  ファミリー：発生／細胞周期調節因子；Ｋｒｕｅｐｐｅｌを含む
２．３．４  ファミリー：ＮＦ−６Ｂ様結合特性を有する大きな因子
２．４  クラス：Ｃｙｓ６システイン−亜鉛クラスター
２．５  クラス：交互組成のジンクフィンガー
３  スーパークラス：らせん−ターン−らせん
３．１  クラス：ホメオドメイン
３．１．１  ファミリー：ホメオドメインのみ；Ｕｂｘを含む
３．１．２  ファミリー：ＰＯＵドメイン因子；Ｏｃｔを含む
３．１．３  ファミリー：ＬＩＭ領域を有するホメオドメイン
３．１．４  ファミリー：ホメオドメインとジンク・フィンガー・モチーフ
３．２  クラス：  対合ボックス
３．２．１  ファミリー：対合ドメインとホメオドメイン
３．２．２  ファミリー：対合ドメインのみ
３．３  クラス：フォークヘッド／翼状らせん
３．３．１  ファミリー：発生調節因子；フォークヘッドを含む
３．３．２  ファミリー：組織特異的調節因子
３．３．３  ファミリー：細胞周期制御因子
３．３．０  ファミリー：他の調節因子
３．４  クラス：  熱ショック因子
３．４．１  ファミリー：ＨＳＦ
３．５  クラス：トリプトファンクラスター
３．５．１  ファミリー：Ｍｙｂ
３．５．２  ファミリー：Ｅｔｓタイプ
３．５．３  ファミリー：インターフェロン調節因子
３．６  クラス：  ＴＥＡ（転写エンハンサー因子）ドメイン
３．６．１  ファミリー：ＴＥＡ（ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ２、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４）
４  スーパークラス：  副溝接点を有するベータ−足場因子
４．１  クラス：  ＲＨＲ（Ｒｅｌ相同領域）
４．１．１  ファミリー：Ｒｅｌ／アンキリン；ＮＦ−カッパＢ
４．１．２  ファミリー：アンキリンのみ
４．１．３  ファミリー：ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核性因子）（ＮＦＡＴＣ１、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＡＴＣ３）
４．２  クラス：ＳＴＡＴ
４．２．１  ファミリー：ＳＴＡＴ
４．３  クラス：ｐ５３
４．３．１  ファミリー：ｐ５３
４．４  クラス：ＭＡＤＳボックス
４．４．１  ファミリー：分化の調節因子；（Ｍｅｆ２）を含む
４．４．２  ファミリー：外部シグナルに対する応答因子、ＳＲＦ（血清応答因子）（ＳＲＦ）
４．５  クラス：ベータ−バレル・アルファらせん転写因子
４．６  クラス：ＴＡＴＡ結合タンパク質
４．６．１  ファミリー：ＴＢＰ
４．７．１  ファミリー：ＳＯＸ遺伝子、ＳＲＹ
４．７．２  ファミリー：ＴＣＦ−１（ＴＣＦ１）
４．７．３  ファミリー：ＨＭＧ２関連、ＳＳＲＰ１
４．７．５  ファミリー：ＭＡＴＡ
４．８  クラス：ヘテロメリックＣＣＡＡＴ因子
４．８．１  ファミリー：ヘテロメリックＣＣＡＡＴ因子
４．９  クラス：グレイニーヘッド
４．９．１  ファミリー：グレイニーヘッド
４．１０  クラス：低温ショックドメイン因子
４．１０．１  ファミリー：ｃｓｄ
４．１１  クラス：Ｒｕｎｔ
４．１１．１  ファミリー：Ｒｕｎｔ
０  スーパークラス：他の転写因子
０．１  クラス：銅フィストタンパク質
０．２  クラス：ＨＭＧＩ（Ｙ）（ＨＭＧＡ１）
０．２．１  ファミリー：ＨＭＧＩ（Ｙ）
０．３  クラス：ポケットドメイン
０．４  クラス：Ｅ１Ａ様因子
０．５  クラス：ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ関連因子
０．５．１  ファミリー：ＡＰ２
０．５．２  ファミリー：ＥＲＥＢＰ
０．５．３  スーパーファミリー：ＡＰ２／Ｂ３
０．５．３．１  ファミリー：ＡＲＦ
０．５．３．２  ファミリー：ＡＢＩ
０．５．３．３  ファミリー：ＲＡＶ
ある実施形態では、特定のタンパク質について表１において提案した変異のサブセットを生じさせて、過剰に荷電されたタンパク質を生成する。ある実施形態では、少なくとも２つの変異を生じさせる。ある実施形態では、少なくとも３つの変異を生じさせる。ある実施形態では、少なくとも４つの変異を生じさせる。ある実施形態では、少なくとも５つの変異を生じさせる。ある実施形態では、少なくとも１０個の変異を生じさせる。ある実施形態では、少なくとも１５個の変異を生じさせる。ある実施形態では、少なくとも２０個の変異を生じさせる。ある実施形態では、提案変異すべてを生じさせて、過剰に正に荷電されたタンパク質を生成する。ある実施形態では、提案変異を生じさるのではなく、むしろ１つ以上の荷電部分をタンパク質に付加させて過剰に正に荷電されたタンパク質を作る。
【０１２３】
ある実施形態において、前記過剰に荷電されたタンパク質は、天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質である。ある実施形態において、前記天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質の理論正味電荷は、少なくとも＋１、少なくとも＋２、少なくとも＋３、少なくとも＋４、少なくとも＋５、少なくとも＋１０、少なくとも＋１５、少なくとも＋２０、少なくとも＋２５、少なくとも＋３０、少なくとも＋３５、または少なくとも＋４０である。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ０．８の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．０の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．２の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．４の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、前記過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．５の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、前記過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．６の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．７の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．８の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ１．９の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ２．０の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ２．５の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、少なくともおおよそ３．０の電荷：分子量比を有する。ある実施形態において、タンパク質の分子量は、おおよそ４ｋＤａからおおよそ１００ｋＤａにわたる。ある実施形態において、タンパク質の分子量は、おおよそ１０ｋＤａからおおよそ４５ｋＤａにわたる。ある実施形態において、タンパク質の分子量は、おおよそ５ｋＤａからおおよそ５０ｋＤａにわたる。ある実施形態において、タンパク質の分子量は、おおよそ１０ｋＤａからおおよそ６０ｋＤａにわたる。ある実施形態において、天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質は、ヒストンに関連するものである。ある実施形態において、天然に存在する過剰に荷電され
たタンパク質は、リボソームに関連するものである。天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質の例としては、サイクロン（番号：Ｑ９Ｈ６Ｆ５）；ＰＮＲＣ１（番号：Ｑ１２７９６）；ＲＮＰＳ１（番号：Ｑ１５２８７）；ＳＵＲＦ６（番号：Ｏ７５６８３）；ＡＲ６Ｐ（番号：Ｑ６６ＰＪ３）；ＮＫＡＰ（番号：Ｑ８Ｎ５Ｆ７）；ＥＢＰ２（番号：Ｑ９９８４８）；ＬＳＭ１１（番号：Ｐ８３３６９）；ＲＬ４（番号：Ｐ３６５７８）；ＫＲＲ１（番号：Ｑ１３６０１）；ＲＹ−１（番号：Ｑ８ＷＶＫ２）；ＢｒｉＸ（番号：Ｑ８ＴＤＮ６）；ＭＮＤＡ（番号：Ｐ４１２１８）；Ｈ１ｂ（番号：Ｐ１６４０１）；サイクリン（番号：Ｑ９ＵＫ５８）；ＭＤＫ（番号：Ｐ２１７４１）；ミッドカイン（番号：Ｐ２１７４１）；ＰＲＯＫ（番号：Ｑ９ＨＣ２３）；ＦＧＦ５（番号：Ｐ１２０３４）；ＳＦＲＳ（番号：Ｑ８Ｎ９Ｑ２）；ＡＫＩＰ（番号：Ｑ９ＮＷＴ８）；ＣＤＫ（番号：Ｑ８Ｎ７２６）；ベータ−ディフェンシン（番号：Ｐ８１５３４）；ディフェンシン３（番号：Ｐ８１５３４）；ＰＡＶＡＣ（番号：Ｐ１８５０９）；ＰＡＣＡＰ（番号：Ｐ１８５０９）；エオタキシン−３（番号：Ｑ９Ｙ２５８）；ヒストンＨ２Ａ（番号：Ｑ７Ｌ７Ｌ０）；ＨＭＧＢ１（番号：Ｐ０９４２９）；Ｃ−Ｊｕｎ（番号：Ｐ０５４１２）；ＴＥＲＦ  １（番号：Ｐ５４２７４）；Ｎ−ＤＥＫ（番号：Ｐ３５６５９）；ＰＩＡＳ  １（番号：Ｏ７５９２５）；Ｋｕ７０（番号：Ｐ１２９５６）；ＨＢＥＧＦ（番号：Ｑ９９０７５）；およびＨＧＦ（番号：Ｐ１４２１０）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明において利用する過剰に荷電されたタンパク質は、Ｕ４／Ｕ６．Ｕ５トリ−ｓｎＲＮＰ関連タンパク質３（番号：Ｑ８ＷＶＫ２）；ベータ−ディフェンシン（番号：Ｐ８１５３４）；タンパク質ＳＦＲＳ１２ｌＰ１（番号：Ｑ８Ｎ９Ｑ２）；ミッドカイン（番号：Ｐ２１７４１）；Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２６（番号：Ｑ９Ｙ２５８）；遺伝子座過剰タンパク質（ｓｕｒｆｅｉｔ  ｌｏｃｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）６（番号：Ｏ７５６８３）；オーロラキナーゼＡ相互作用タンパク質（番号：Ｑ９ＮＷＴ８）；ＮＦ−カッパ−Ｂ−活性化タンパク質（番号：Ｑ８Ｎ５Ｆ７）；ヒストンＨ１．５（番号：Ｐ１６４０１）；ヒストンＨ２Ａタイプ３（番号：Ｑ７Ｌ７Ｌ０）；６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ４（番号：Ｐ３６５７８）；高セリンドメイン１を有するＲＮＡ結合タンパク質のアイソフォーム１（番号：Ｑ１５２８７−１）；サイクリン依存性キナーゼ阻害剤２Ａのアイソフォーム４（番号：Ｑ８Ｎ７２６−１）；プロキネチシン−２のアイソフォーム１（番号：Ｑ９ＨＣ２３−１）；ＡＤＰリボシル化因子様タンパク質６相互作用タンパク質４のアイソフォーム１（番号：Ｑ６６ＰＪ３−１）；線維芽細増殖長因子５のアイソフォームｌｏｎｇ（番号：Ｐ１２０３４−１）；またはサイクリン−Ｌ１のアイソフォーム１（番号：Ｑ９ＵＫ５８−１）である。本発明に利用することができるヒトプロテオームからの他の可能な天然に存在する過剰に荷電されたタンパク質を下のリストに含める。列挙するタンパク質は、０．８より大きい電荷：分子量比を有する。
【０１２４】
【数１】
2014159484.tif 000028
【０１２５】
【数２】
2014159484.tif 000029
【０１２６】
【数３】
2014159484.tif 000030
【０１２７】
【数４】
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【０１２８】
【数５】
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【０１２９】
【数６】
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【０１３０】
【数７】
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【０１３１】
【数８】
2014159484.tif 000035
【０１３２】
【数９】
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【０１３３】
【数１０】
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【０１３４】
【数１１】
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【０１３５】
【数１２】
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【０１３６】
【数１３】
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【０１３７】
【数１４】
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【０１３８】
【数１５】
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【０１３９】
【数１６】
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【０１４０】
【数１７】
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【０１４１】
【数１８】
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【０１４２】
【数１９】
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【０１４３】
【数２０】
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【０１４４】
【数２１】
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【０１４５】
【数２２】
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核酸
本発明は、細胞への核酸のインビボまたはインビトロ送達のためのシステムおよび方法を提供する。そのようなシステムおよび方法は、典型的には、複合体を形成するための過剰に荷電されたタンパク質と１つ以上の核酸の会合、および１つ以上の細胞へのその複合体の送達を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、治療活性を有することがある。
いくつかの実施形態において、複合体の細胞への送達は、核酸と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を、その必要がある被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、独力で細胞に進入できない場合があるが、過剰に荷電されたタンパク質と複合体を形成すると細胞の内部に進入することができる。いくつかの実施形態では、核酸を細胞に進入させるために過剰に荷電されたタンパク質を利用する。本発明による核酸は、それら自体、治療活性を有することができ、または治療活性を有するＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現を指示することができる。核酸の治療活性は、下でさらに詳細に論じる。
【０１４６】
用語「核酸」は、その最も広義で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているまたは組み込むことができる任意の化合物および／または物質を包含する。本発明に従って使用するための例示的核酸としては、下でさらに詳細に説明する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒性ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１４７】
本発明に従って使用するための核酸は、化学合成、酵素的合成、より長い前駆体の酵素的または化学的切断などをはじめとする（しかし、これらに限定されない）任意の利用可能な技術に従って調製することができる。ＲＮＡの合成方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ［Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ］，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４；およびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖ．２８８  （Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００５参照；これらの両方が参考として本明細書に援用されている）。
【０１４８】
核酸は、天然に存在するヌクレオシド；修飾ヌクレオシド；１つ以上のヌクレオシドの間に挿入された炭化水素リンカー（例えば、アルキレン）もしくはポリエーテルリンカー（例えば、ＰＥＧリンカー）を伴う天然に存在するヌクレオシド；１つ以上のヌクレオシドの間に挿入された炭化水素もしくはＰＥＧリンカーを伴う修飾ヌクレオシド；またはこれらの組み合わせを含む場合がある。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを炭化水素リンカーまたポリエーテルリンカーで置換することができるが、但し、核酸の機能がその置換によって実質的に低下されないことを条件とする。
【０１４９】
本発明による核酸が、天然に存在する核酸中でもっぱら見つけられるタイプのヌクレオチドを含むこともあり、または、その代わりに１つ以上のヌクレオチド類似体を含む、もしくは天然に存在する核酸のものとは別様に異なる構造を有することもあることは、通常の当業者には理解されるであろう。米国特許第６，４０３，７７９号；同第６，３９９，７５４号；同第６，２２５，４６０号；同第６，１２７，５３３号；同第６，０３１，０８６号；同第６，００５，０８７号；同第５，９７７，０８９号（これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）；およびそれらの中に開示されている参考文献には、用いることができる多種多様な具体的なヌクレオチド類似体および修飾が開示されている。Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（ｅｄ．）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１ｓｔｅｄ），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ＩＳＢＮ：０８２４７０５６６１；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１；参考として本明細書に援用されている）およびその中の参考文献を参照のこと。例えば、２’修飾は、ハロ、アルコキシおよびアリルオキシ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、Ｎ
Ｒ２またはＣＮから選択される基によって２’−ＯＨ基を置換し、この場合のＲは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、およびハロは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。修飾結合の例としては、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合が挙げられる。
【０１５０】
様々な異なるヌクレオチド類似体、修飾された主鎖、または天然に存在しないヌクレオシド間結合を含む核酸を本発明に従って利用することができる。本発明の核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）を場合もあり、または修飾ヌクレオシドを含む場合もある。修飾ヌクレオチドの例としては、塩基修飾ヌクレオシド（例えば、アラシチジン、イノシン、イソグアノシン、ネブラリン、プソイドウリジン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、２−チオチミジン、３−デアザ−５−アザシチジン、２’−デオキシウリジン、３−ニトロピロール、４−メチルインドール、４−チオウリジン、４−チオチミジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、２−チオウリジン、５−ブロモシチジン、５−ヨードウリジン、イノシン、６−アザウリジン、６−クロロプリン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−アザアデノシン、８−アジドアデノシン、ベンズイミダゾール、Ｍ１−メチルアデノシン、ピロロ−ピリミジン、２−アミノ−６−クロロプリン、３−メチルアデノシン、５−プロピニルシチジン、５−プロピニルウリジン、５−ブロモウリジン、５−フルオロウリジン、５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアノシン、および２−チオシチジン）、化学的にまたは生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、修飾糖（例えば、２’フルオロリボース、２’−アミノリボース、２’−アジドリボース、２’−Ｏ−メチルリボース、Ｌ−エナンチオマーヌクレオシドアラビノース、およびヘキソース）、修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。核酸の化学的合成のための天然および修飾ヌクレオチドモノマーは、容易に入手することができる。場合により、そのような修飾を含む核酸は、天然に存在するヌクレオチドのみからなる核酸に比べて改善された特性を提示する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸修飾を利用して、ヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼなど）による消化を減少および／または防止する。例えば、消化を減少させるために一方またはその両方の鎖の３’末端にヌクレオチド類似体を含めることによって、核酸の構造を安定させることができる。
【０１５１】
修飾核酸を分子の全長に沿って均一に修飾する必要はない。異なるヌクレオチド修飾および／または主鎖構造が核酸内の様々な位置に存在する場合がある。ヌクレオチド類似体または他の修飾（単数または複数）が、その核酸の機能に実質的に影響を及ぼさないような核酸のいずれの位置（単数または複数）にあってもよいことは、通常の当業者には理解されるであろう。１つだが例を挙げると、修飾は、ターゲットに特異的に結合する核酸ターゲッティング部分の能力に実質的に影響を及ぼさないような核酸ターゲット部分のいずれの位置にあってもよい。修飾領域は、一方またはその両方の鎖の５’末端にある場合もあり、および／または３’末端にある場合もある。例えば、両方の鎖のいずれかの５’および／または３’末端のおおよそ１個からおおよそ５個の残基がヌクレオチド類似体である、および／または主鎖修飾を有する、修飾核酸ターゲッティング部分を利用した。修飾は、５’末端修飾である場合もあり、または３’末端修飾である場合もある。一方またはその両方の核酸鎖が、少なくとも５０％未修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％未修飾ヌクレオチド、少なくとも９０％未修飾ヌクレオチド、または１００％未修飾ヌクレオチドを含む場合がある。
【０１５２】
本発明による核酸は、例えば、米国特許公開第２００３／０１７５９５０号、同第２０
０４／０１９２６２６号、同第２００４／００９２４７０号、同第２００５／００２０５２５号、および同第２００５／００３２７３３号（これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）に記載されているものなどの、糖、ヌクレオシド、またはヌクレオシド間結合への修飾を含む場合がある。本発明は、それらの中に記載されている修飾のいずれか１つ以上を有する任意の核酸の使用を包含する。例えば、多数の末端結合体、例えば、脂質、例えばコレステロール、リトコール酸、アルル酸または長いアルキル分岐鎖が、細胞の取り込みを向上させると報告されている。例えば、当該技術分野において公知の任意の適するアッセイを用いて類似体および修飾を試験して、例えば、ＲＮＡｉ剤によってターゲット遺伝子サイレンシング向上をもたらすものなどを選択することができる。いくつかの実施形態において、本発明による核酸は、１つ以上の非天然ヌクレオシド結合を含む場合がある。いくつかの実施形態では、核酸ターゲッティング部分の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方における１つ以上の内部核酸を転化させて、３’−３’結合または５’−５’結合などの結合を生じさせる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、本発明による核酸は、合成実体ではなく、それらの自然環境から単離された天然に存在する実体である。
【０１５４】
ＲＮＡｉ剤
ＲＮＡ干渉
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する作用物質を含む。ＲＮＡｉは、特定の遺伝子の発現を阻害するメカニズムである。ＲＮＡｉは、典型的には、翻訳レベルで遺伝子発現を阻害するが、転写レベルで遺伝子発現を阻害することによって機能する場合もある。ＲＮＡｉターゲットは、細胞転写産物、病原体転写産物（例えば、ウイルス、細菌、真菌などからのもの）、トランスポゾン、ベクターなどをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、細胞内に存在し得る任意のＲＮＡを含む。
【０１５５】
ＲＮＡｉ経路は、一方またはその両方の末端に少数の非対合オーバーハング塩基を場合によっては有する２０〜２５塩基対の短いフラグメントに、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を切断する、酵素ダイサーによって開始される。その後、ガイド鎖として公知の、それぞれのフラグメントの２本の鎖のうちの一方が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、相補配列と対合する。他方の鎖は、ＲＩＳＣ活性化中に分解される。この認識事象の最もよく研究された結果は、転写後遺伝子サイレンシングである。これは、ガイド鎖がターゲット転写産物と特異的に対合し、アルゴノート（ａｒｇｏｎａｕｔｅ）、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分、によるターゲット転写産物の分解を誘導すると、発生する。もう１つの結果は、遺伝子が転写される程度に影響を及ぼす、遺伝子に対する後成的変更（例えば、ヒストン修飾およびＤＮＡメチル化）である。
【０１５６】
長い二本鎖ＲＮＡ（例えば、３０ｂｐより大きいもの）の哺乳動物細胞への導入は、インターフェロン応答の活性化に起因して、翻訳の系統的非特異的阻害を生じさせる結果となる。外因的に送達することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４；参考として本明細書に援用されている）またはＲＮＡポリメラーゼＩＩもしくはＩＩＩプロモーターから内因的に発現させることができる合成短鎖ＲＮＡ（例えば、１９〜２５ｂｐ）の使用によってこの障害を克服できることが判明したとき、飛躍的な進歩が生じた。
【０１５７】
ＲＮＡｉの現象は、例えば、以下の参考文献（これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）の中でより詳細に論じされている：Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８；Ｆｉｒｅら，、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６；Ｔａｂａｒａら、１９９９，Ｃｅｌｌ，９９：１２３；Ｈａｍｍｏｎｄら，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２０００，４０４：２９３；Ｚａｍｏｒｅら，、２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：２５；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，８：４６９；およびＭｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，２００６，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１３：５５３。
【０１５８】
本明細書において用いる場合、用語「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡｉメカニズムによって遺伝子発現の阻害を媒介することができる分子に特有の構造を有する、１つ以上のヌクレオチド類似体または修飾を場合によっては含む、ＲＮＡを指す。一般に、ＲＮＡｉ剤は、ターゲットＲＮＡに実質的に相補的である部分を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも部分的に二本鎖である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、一本鎖である。いくつかの実施形態において、例示的ＲＮＡｉとしては、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、用語「ＲＮＡｉ剤」は、ＲＮＡｉ効果（例えば、ターゲットＲＮＡの分解、および／または翻訳の阻害）を誘導する任意のＲＮＡ、ＲＮＡ誘導体、および／またはＲＮＡをコードする核酸を指すだろう。
【０１５９】
本明細書において用いる場合、用語「ＲＮＡｉ誘導剤」は、ＲＮＡｉ剤の活性を送達する、調節する、および／または修飾する任意の実体を包含する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、ベクター（人間の手によって修飾されていない天然に存在する分子以外）であって、細胞内のその存在が、ＲＮＡｉを生じさせる結果となり、およびそのＲＮＡｉ誘導体のターゲットになる転写産物の発現減少をもたらすものであるベクターを含む場合がある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、「ＲＮＡｉ誘導ベクター」であり、「ＲＮＡｉ誘導ベクター」は、細胞内のその存在が、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはｍｉＲＮＡ）を形成するように自己ハイブリダイズするまたは互いにハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡの生産を生じさせる結果となるベクターを指す。様々な実施形態において、この用語は、細胞内のその存在が、ＲＮＡｉ剤を形成するように自己ハイブリダイズするまたは互いにハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡの生産を生じさせる結果となるプラスミド、例えば、ＤＮＡベクター（この配列は、ウイルスに由来する配列要素を含む場合がある）、またはウイルス（人間の手によって修飾されていない天然に存在するウイルスまたはプラスミド以外）を包含する。一般に、ベクターは、発現シグナル（単数または複数）に作動可能に連結されている核酸を含むので、そのベクターが細胞内に存在するときにＲＮＡｉ剤を形成するようにハイブリダイズするまたは自己ハイブリダイズする１つ以上のＲＮＡが転写される。従って、ベクターは、ＲＮＡ（単数もしくは複数）またはその（それらの）前駆体の細胞内合成のためのテンプレートとなる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤と１つ以上の医薬的に許容され得る賦形剤および／または担体とを含む組成物である。本発明のために、本明細書に記載するような任意の部分的または完全二本鎖短鎖ＲＮＡ、またはターゲット転写産物に結合してその発現を減少させる（すなわち、転写レベルを減少させる、および／または転写産物によってコードされたポリペプチドの合成を減少させる）一方の鎖を、それが分解を誘発することによって作用するのか、転写を阻害することによって作用するのか、または他の手段によって作用するのかにかかわらず、ＲＮＡｉ誘導剤であると考える。加えて、インビボで（すなわち、細胞または生物体内で）プロセッシングされてそのようなＲＮＡｉ誘導剤を生じさせることができる任意の前駆ＲＮＡ構造が、本発明において有用である。
【０１６０】
本発明によるＲＮＡｉ剤は、転写産物の任意の部分をターゲットにすることができる。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、遺伝子のコーディング配列内に位置する。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、非コーディング配列内に位置する。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、エキソン内に位置する
。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、イントロン内に位置する。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ内に位置する。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、エンハンサー領域内に位置する。いくつかの実施形態において、ターゲット転写産物は、プロモーター内に位置する。
【０１６１】
任意の特定の遺伝子ターゲットのための、ＲＮＡｉ剤および／またはＲＮＡｉ誘導剤の設計は、一定のガイダンスに典型的には従う。一般に、分解が望ましくない他の転写産物と共有され得るターゲット転写産物の区画を避けることが望ましい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤および／またはＲＮＡｉを誘導する実体は、高度に保存される転写産物および／またはそれらの部分をターゲットにする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤および／またはＲＮＡｉを誘導する実体は、高度に保存されない転写産物および／またはそれらの部分をターゲットにする。
【０１６２】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
本明細書において用いる場合、「ｓｉＲＮＡ」は、おおよそ１９塩基対（ｂｐ）の長さであり、場合によっては１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含むＲＮＡデュプレックス（本明細書では「デュプレックス領域」とも呼ぶ）を含む、ＲＮＡｉ剤を指す。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、長さが１５ｂｐから２９ｂｐにわたり、場合によっては１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含む、デュプレックスを含む。ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子（すなわち、２本の鎖）から典型的には成る。ｓｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲット転写産物とハイブリダイズする部分を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。
【０１６３】
本明細書において用いる場合、「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを媒介するために十分な長さ（典型的には、少なくともおおよそ１９ｂｐの長さ）の二本鎖（デュプレックス）構造を形成するようにハイブリダイズしたまたはハイブリダイズすることができる少なくとも２つの相補部分と、ループを形成する典型的にはおおよそ１ヌクレオチド（ｎｔ）とおおよそ１０ｎｔの間にわたる長さの少なくとも１つの一本鎖部分とを有するＲＮＡを含むＲＮＡｉ剤を指す。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、１５ｂｐから２９ｂｐにわたる長さのデュプレックス部分と、ループを形成する典型的にはおおよそ１ｎｔとおおよそ１０ｎｔの間にわたる長さの少なくとも１つの一本鎖部分とを含む。いくつかの実施形態において、一本鎖部分は、おおよそ１ｎｔ、おおよそ２ｎｔ、おおよそ３ｎｔ、おおよそ４ｎｔ、おおよそ５ｎｔ、おおよそ６ｎｔ、おおよそ７ｎｔ、おおよそ８ｎｔ、おおよそ９ｎｔ、またはおおよそ１０ｎｔの長さである。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、細胞ＲＮＡｉ機械によって（例えば、ダイサーによって）ｓｉＲＮＡにプロセッシングされる。従って、いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの前駆体である場合がある。それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡは、一般に、ｓｉＲＮＡに似てターゲットＲＮＡの発現を阻害することができる。本明細書において用いる場合、用語「短鎖ＲＮＡｉ剤」は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを一括して指すために用いる。
【０１６４】
上で述べたように、短鎖ＲＮＡｉ剤は、おおよそ１５ｎｔとおおよそ２９ｎｔの間の長さ、例えば、おおよそ１９ｎｔの長さの塩基対合領域（「デュプレックス領域」）を典型的には含み、場合によっては１つ以上の遊離またはループ状末端を有することがある。いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤は、約１５ｎｔ、約１６ｎｔ、約１７ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔの長さのデュプレックス領域を有する。しかし、投与する薬剤がこの構造を有する必要はない。例えば、ＲＮＡｉ誘導剤は、短鎖ＲＮＡｉ剤の構造にインビボでプロセッシングされ得る任意の構造を
含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ誘導剤は、細胞に送達され、そこで、１つ以上のプロセッシング工程を受けた後、機能性短鎖ＲＮＡｉ剤になる。そのような場合、ＲＮＡｉ誘導剤が、そのプロセッシングに必要および／または有用であり得る配列を含むことが望ましいことは、通常の当業者には理解されるであろう。
【０１６５】
ＲＮＡｉ誘導剤および／または短鎖ＲＮＡｉ剤を説明する場合、作用物質を二本の鎖を有するものと言うのが適便である。一般に、ＲＮＡｉ誘導剤および／または短鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖のデュプレックス部分の配列は、この領域ではターゲット転写産物に実施的に相補的である。ＲＮＡｉ誘導剤および／または短鎖ＲＮＡｉ剤の他方の鎖のデュプレックス部分の配列は、典型的には、ターゲット転写産物のターゲットとなる部分と実質的に同一である。ターゲットに相補的な部分を含む鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれ、その一方で、他方の鎖は、多くの場合、「センス鎖」と呼ばれる。ターゲットに相補的であるアンチセンス鎖の部分は、「阻害領域」と呼ばれる場合がある。
【０１６６】
ＲＮＡｉ誘導剤および／または短鎖ＲＮＡｉ剤は、典型的には、１つの領域（「デュプレックス領域」）を含み、この一方の鎖が、ターゲット転写産物の一部分（「ターゲット部分」）に十分に相補的である１５ｎｔから２９ｎｔの長さの阻害領域を含有し、そのためインビボでこの鎖とターゲット転写産物とでハイブリッド（「コア領域」）が形成し得る。コア領域がオーバーハングを含まないことは理解される。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤は、約１５ｎｔ、約１６ｎｔ、約１７ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔの長さの阻害領域を有する。いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ領域は、約１９ｎｔの長さの阻害領域を有する。いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖のそのターゲット転写産物へのハイブリダイゼーションは、約１５ｎｔ、約１６ｎｔ、約１７ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔの長さのコア領域を生じさせる。いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖のその転写産物へのハイブリダイゼーションは、約１９ｎｔの長さのコア領域を生じさせる。
【０１６８】
ターゲット転写産物は、多くの場合、デュプレックス領域の中央付近で切断される。いくつかの実施形態において、転写産物は、ｓｉＲＮＡとターゲット転写産物とで形成するデュプレックスの第一の塩基対の下流１１ｎｔまたは１２ｎｔで切断される（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５：１８８参照；これは、参考として本明細書に援用されている）。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、デュプレックス領域の一方またはその両方の末端に３’−オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、その遊離末端に３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド３’−オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２ｎｔの３’−オーバーハングを含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１ｎｔの３’−オーバーハングを含む。オーバーハングは、存在する場合、ターゲット転写産物に相補的である場合があるが、ある必要はない。３’末端上の２ｎｔ〜３ｎｔオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するｓｉＲＮＡよりターゲット転写産物レベルを減少させる点で有効である場合が多い。
【０１７０】
任意の所望の配列（例えば、ＵＵ）をアンチセンスおよび／またはセンスコア領域の３’末端に単に追加して、３’−オーバーハングを生成することができる。一般に、１つ以上のピリミジンを含有するオーバーハング、通常はＵ、ＴまたはｄＴ、が利用される。Ｒ
ＮＡｉ誘導剤を合成するとき、オーバーハング（単数または複数）にＵではなくＴを用いるほうが適便である場合がある。ＴではなくｄＴを使用したほうが安定性増加をもたらす場合がある。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤の阻害領域は、ターゲット転写産物の一領域に１００％相補的である。しかし、いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤の阻害領域は、ターゲット転写産物の一領域に１００％までは相補的でない。阻害領域は、例えば、細胞において生理条件下でおよび／またはＲＮＡｉを支持するインビトロ系（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａエキス系）において、ハイブリダイゼーションが発生できるために十分なターゲット転写産物に対する相補性しか必要としない。
【０１７２】
短鎖ＲＮＡｉ剤デュプレックスが、ミスマッチおよび／またはバルジ、特に、そのデュプレックス中の中央領域内のミスマッチを許容でき、その上、尚、有効なサイレンシングをもたらすことができることは、通常の当業者には理解されるであろう。短鎖ＲＮＡｉ剤／ターゲット転写産物コア領域の中央部分でのミスマッチを避けることが望ましい場合があることも、当量者には理解されるであろう（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７，２００１参照）。例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’ヌクレオチドは、多くの場合、ターゲット識別の特異性に有意に寄与せず、ターゲット切断にとってあまり重要でない場合がある。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、１つ以上のミスマッチを示すデュプレックス領域を有する短鎖ＲＮＡｉ剤は、典型的には、６以下の全ミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤は、それらのデュプレックス領域に１、２、３、４、５または６の全ミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域は、少なくとも５ｎｔ（例えば、６、７、またはそれ以上のｎｔ）の長さである完全相補性の伸長部を有する。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの２０％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの１５％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの１０％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの５％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のいずれのヌクレオチドもミスマッチしていない。デュプレックス領域は、ミスマッチの領域によって隔てられた完全相補性の２つの伸長部を含むことがある。いくつかの実施形態では、多数のミスマッチエリアが存在する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、典型的には、１つ以上のミスマッチを示すコア領域（例えば、短鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖とターゲット転写産物のハイブリダイゼーションによって形成されたもの）は、６以下の全ミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、コア領域は、１、２、３、４、５または６の全ミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、コア領域は、少なくとも５ｎｔ（例えば、６、７、またはそれ以上のｎｔ）の長さである完全相補性の伸長部を含む。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの２０％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの１５％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの１０％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの５％以下がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のいずれのヌクレオチドもミスマッチしていない。コア領域は、ミスマッチの領域によって隔てられた完全相補性の２つの伸長部を含むことがある。いくつかの実施形態では、多数のミスマッチエリアが存在する。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、短鎖ＲＮＡｉ剤の一方またはその両方の鎖は、「バルジ
」を形成する１つ以上の「余分な」ヌクレオチドを含む場合がある。１つ以上のバルジ（例えば、５ｎｔ〜１０ｎｔの長さ）が存在する場合がある。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、多数の利用可能なアルゴリズムのうちの１つ以上を用いて、短鎖ＲＮＡｉ剤を設計および／または予測することができる。少数だが例を挙げると、以下の資源を利用して、ＲＮＡｉ剤を設計および／または予測することができる：Ａｌｎｙｌｕｍ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｏｎｌｉｎｅ、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ａｍｂｉｏｎ  Ｏｎｌｉｎｅ、ＢｉｏＰｒｅｄｓｉ  Ｏｎｌｉｎｅ、ＲＮＡｉ  Ｗｅｂ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｏｎｌｉｎｅ、ＬｅｎｔｉＷｅｂ
Ｏｎｌｉｎｅ  ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｏｎｌｉｎｅ；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：３２６；Ｎａｉｔｏら，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４：Ｗ４４８；Ｌｉら，２００７，ＲＮＡ，１３：１７６５；Ｙｉｕら，２００５，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１：１４４；およびＪｉａら、２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：２７１（これらのそれぞれが、参考として本明細書に援用されている）で見つけられるアルゴリズム。
【０１７７】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特に発生中の遺伝子発現の調節に役立つ、約２１〜２３ヌクレオチドの長さの、ゲノムにコードされた非コーディングＲＮＡである（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６：２８１；Ｎｏｖｉｎａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３０：１６１；および米国特許公開第２００５／００５９００５号参照；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉ，２００７，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１２：３９７５；およびＺｈａｏ，２００７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，３２：１８９に概説されているものも参照；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。広く定義すると、ＲＮＡ干渉の現象は、ｍｉＲＮＡの内因的に誘導される遺伝子サイレンシング作用、ならびに外来ｄｓＲＮＡによって誘発されるサイレンシングを含む。成熟ｍｉＲＮＡは、外因性ｄｓＲＮＡから生産されるｓｉＲＮＡに構造的に類似しているが、成熟に達する前に、ｍｉＲＮＡは、先ず、転写後修飾を受ける。ｍｉＲＮＡは、はるかに長いＲＮＡコーディング遺伝子から、プリｍｉＲＮＡとして公知の一次転写産物として典型的には発現され、それが、細胞核において、マイクロプロセッサー複合体により、プレｍｉＲＮＡと呼ばれる７０ヌクレオチドステム−ループ構造にプロセッシングされる。この複合体は、Ｄｒｏｓｈａと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ酵素と、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質Ｐａｓｈａとからなる。このプレｍｉＲＮＡのｄｓＲＮＡ部分は、ダイサーにより結合および分解されて成熟ｍｉＲＮＡ分子を生成し、その成熟ｍｉＲＮＡ分子がＲＩＳＣ複合体に組み込まれ得る；従って、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、それらの初期プロセッシングの下流で同じ細胞機械を共有する（Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００６，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３４２：３３；参考として本明細書に援用されている）。一般に、ｍｉＲＮＡは、それらのターゲット転写産物と完全には相補的でない。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、１８ｎｔ〜２６ｎｔにわたる長さであり得る。典型的には、ｍｉＲＮＡは、一本鎖である。しかし、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、少なくとも部分的に二本鎖であることがある。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡデュプレックス（本明細書では、「デュプレックス領域」と呼ぶ）を含むことがあり、場合によっては、１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含むことがある。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、長さが１５ｂｐから２９ｂｐにわたり、場合によっては１つから３つの一本鎖オーバーハングをさらに含む、デュプレックス領域を含む。互いにハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子からｍｉＲＮＡを形成することができ、または代替的に、自己ハイブリダイズ部分を含む単一ＲＮＡ分子からｍ
ｉＲＮＡを生じさせることができる。ｍｉＲＮＡのデュプレックス部分は、１つ以上の非対合ヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを、必ずではないが、通常は含む。ｍｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲットＲＮＡとハイブリダイズする部分を含む。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲットＲＮＡの一領域に正確には相補的でなく、これは、ｍｉＲＮＡが１つ以上のミスマッチを伴うターゲットＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの一方の鎖は、ターゲットＲＮＡの一領域に正確に相補的であり、これは、そのｍｉＲＮＡがミスマッチを伴わないターゲットＲＮＡにハイブリダイズすることを意味する。典型的には、ｍｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の翻訳を阻害することによって遺伝子発現の阻害を媒介すると考えられる。しかし、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ターゲット転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する場合がある。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、約１５ｎｔ、約１６ｎｔ、約１７ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔの長さのデュプレックス領域を有する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ領域は、約１５ｎｔ、約１６ｎｔ、約１７ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２１ｎｔ、約２２ｎｔ、約２３ｎｔ、約２４ｎｔ、約２５ｎｔ、約２６ｎｔ、約２７ｎｔ、約２８ｎｔ、約２９ｎｔの長さの阻害領域を有する。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、それらのデュプレックス領域において１つ以上のミスマッチを示す、デュプレックス領域を有する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、それらのデュプレックス領域において１、２、３、４、５、６、７、８または９の全ミスマッチを示す、デュプレックス領域を有する。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域は、１、２、３、４、５、６、７、８または９ｎｔの長さである完全相補性の伸長部を有する。デュプレックス領域は、ミスマッチの領域によって隔てられた完全相補性の２つの伸長部を含む場合がある。いくつかの実施形態では、多数のミスマッチエリアが存在する。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの約５０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの約４０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの約３０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの約２０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの約１０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、デュプレックス領域内のヌクレオチドの約５％がミスマッチしている。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、コア領域（例えば、ｍｉＲＮＡの一方の鎖とターゲット転写産物のハイブリダイゼーションによって形成されたもの）は、１、２、３、４、５、６、７、８または９の全ミスマッチを有する。いくつかの実施形態において、コア領域は、１、２、３、４、５、６、７、８または９ｎｔの長さである完全相補性の伸長部を含む。コア領域は、ミスマッチの領域によって隔てられた完全相補性の２つの伸長部を含む場合がある。いくつかの実施形態では、多数のミスマッチエリアが存在する。いくつかの実施形態では、多数のミスマッチエリアが存在する。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの約５０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの約４０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの約３０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの約２０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの約１０％がミスマッチしている。いくつかの実施形態において、コア領域内のヌクレオチドの約５％がミスマッチしている。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡの一方またはその両方の鎖は、「バルジ」を形成する１つ以上の「余分な」ヌクレオチドを含む場合がある。１つ以上のバルジ（例えば、５ｎｔ〜１０ｎｔの長さ）が存在する場合がある。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、多数の利用可能なアルゴリズムのうちの１つ以上を用いて、短鎖ＲＮＡｉ剤を設計および／または予測することができる。少数だが例を挙げると、以下の資源を利用して、ＲＮＡｉ剤を設計および／または予測することができる：ＰｉｃＴａｒ  Ｏｎｌｉｎｅ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｏｎｌｉｎｅ、ＥＭＢＬ  Ｏｎｌｉｎｅ；Ｒｅｈｍｓｍｅｉｅｒら、２００４，ＲＮＡ，１０：１５０７；Ｋｉｍら、２００６，ＢＭＣ
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，７：４１１；Ｌｅｗｉｓら、２００３，Ｃｅｌｌ，１１５：７８７；およびＫｒｅｋら、２００５，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３７：４９５（これらのそれぞれが、参考として本明細書に援用されている）において見つけられるアルゴリズム。
【０１８４】
アンチセンスＲＮＡ
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸としては、アンチセンスＲＮＡが挙げられる。典型的には、アンチセンスＲＮＡは、ターゲット転写産物に結合して（例えば、ｍＲＮＡの分解によって、および／または翻訳プロセスの重大な工程を立体的にブロックすることによって）それらの翻訳を阻止する、様々な長さのＲＮＡ鎖である。
【０１８５】
アンチセンスＲＮＡは、上で説明したＲＮＡｉ剤と同じ特徴の多くを示す。例えば、アンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡのターゲット転写産物へのハイブリダイゼーションを可能にするために十分なターゲット転写産物への相補性を示す。ターゲットへのハイブリダイゼーションが依然として発生し得るのであれば、ＲＮＡｉ剤について上で説明したように、ミスマッチが許容される。一般に、アンチセンスＲＮＡは、短鎖ＲＮＡｉ剤より長く、ハイブリダイゼーションが依然として発生し得るのであればいずれの長さのものであってもよい。いくつかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡは、約２０ｎｔ、約３０ｎｔ、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約７５ｎｔ、約１００ｎｔ、約１５０ｎｔ、約２００ｎｔ、約２５０ｎｔ、約５００ｎｔであるか、それより長い。いくつかの実施形態において、アンチセンスＲＮＡは、約２０ｎｔ、約３０ｎｔ、約４０ｎｔ、約５０ｎｔ、約７５ｎｔ、約１００ｎｔ、約１５０ｎｔ、約２００ｎｔ、約２５０ｎｔ、約５００ｎｔの、またはそれより長いターゲット転写産物とハイブリダイズする阻害領域を含む。
【０１８６】
リボザイム
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸としては、リボザイムが挙げられる。リボザイム（リボ核酸酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｎｚｙｍｅ）から；ＲＮＡ酵素または触媒性ＲＮＡとも呼ばれる）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解、または他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらがリボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも判明した。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、遺伝子ノックダウン用途に使用されるリボザイムは、ターゲット転写産物に相補的な配列に隣接している触媒ドメインを有する。遺伝子サイレンシングのメカニズムは、ワトソン・クリック塩基対合によるターゲット転写産物へのリボザイムの結合、続いて、エステル交換反応によるそのターゲット転写産物のホスホジエステル主鎖の切断を含む（Ｋｕｒｒｅｃｋ，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１６２８；Ｓｕｎら、２０００，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，５２：３２５；Ｄｏｕｄｎａ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２２２；Ｇｏｏｄ
ｃｈｉｌｄ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２：２７２；Ｍｉｃｈｉｅｎｚｉ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３４１：５８１；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。ターゲット転写産物が破壊されると、リボザイムは解離し、その後、追加の基質に対する切断を繰り返すことができる。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させるためのリボザイムは、ハンマーヘッドリボザイムである。最初、ハンマーヘッドリボザイムは、部位特異的自己切断を被るウイロイドＲＮＡからそれらの転写プロセスの一部として単離された。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、リボザイムは、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ＲＮアーゼＰ、グループＩおよびグループＩＩイントロン、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、哺乳動物ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、およびＣｏＴＣリボザイムをはじめとする（しかし、これらに限定されない）、天然に存在するリボザイムである。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、リボザイムは、人工リボザイムである。例えば、良好な酵素活性を有する人工生産自己切断性ＲＮＡが生産された。ＴａｎｇおよびＢｒｅａｋｅｒ（１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：５７８４；参考として本明細書に援用されている）は、ランダム配列ＲＮＡ起源のＲＮＡのインビトロ選択によって自己切断性ＲＮＡを単離した。生産された合成リボザイムの幾つかは、新規構造を有したが、幾つかは、天然に存在するハンマーヘッドリボザイムに類似していた。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、人工リボザイムを見つけるために用いる技術は、ダーウィン進化を含む。このアプローチは、触媒と情報ポリマーの両方としてＲＮＡの二重性を利用し、それによって研究者は、ポリメラーゼ酵素を使用してＲＮＡ触媒を大量生産することができる。リボザイムを、逆転写酵素でそれらを様々なｃＤＮＡに逆転写し、変異誘発ＰＣＲで増幅させることによって、変異させる。これらの実験における選択パラメータは、多くの場合、異なる。１つだが例を挙げると、リガーゼリボザイムを選択するためのアプローチは、基質に共有結合的に連結されているビオチンタグの使用を含む。候補リボザイムが所望のリガーゼ活性を有する場合には、ストレプトアビジンマトリックスを使用して、それらの活性分子を回収することができる。
【０１９１】
デオキシリボザイム
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸としては、触媒性ＤＮＡ（「デオキシリボザイム」）が挙げられる。デオキシリボザイムは、リボザイムと同様に、典型的にはワトソン・クリック塩基対合によってＲＮＡ基質に結合し、ターゲット転写産物を部位特異的に切断する。ＤＮＡ酵素の天然例は知られていないので、デオキシリボザイム分子は、インビトロ進化によって生産されている。異なる切断部位特異性を有する２つの異なる触媒モチーフが特定されている。研究者がすべての可能なジヌクレオチド配列をターゲットにできるように、様々な切断特異性を有するデオキシリボザイムが生産されている。
【０１９２】
アプタマー
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸としては、アプタマーが挙げられる。アプタマーは、ターゲット分子を特異的に結合するオリゴ核酸分子である。アプタマーは、様々な分子ターゲット、例えば小分子、タンパク質、核酸、細胞、組織および／または生物、に結合するように、インビトロ選択ラウンドの反復によって（例えば、指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａ
ｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、「ＳＥＬＥＸ」によって）作られる。アプタマーは、典型的には、そのアプタマーの三次元構造に起因してそれらのターゲットに結合する。一般に、アプタマーは、それらのターゲットに、従来のワトソン・クリック塩基対合によって結合しない。
【０１９３】
米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）によって加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の処置に認可された最初のアプタマーは、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と呼ばれるものであった。加えて、ＡＲＣ１７７９（マサチューセッツ州、ケンブリッジのＡｒｃｈｅｍｉｘ）は、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の強力で選択的なファースト・イン・クラスのアンタゴニストであり、経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）を受けている急性冠症候群（ＡＣＳ）と診断された患者において評価中である。
【０１９４】
一般に、未修飾アプタマーは、通常、血流から急速に除去され、数分から数時間の半減期を有する。おそらく、これは、ヌクレアーゼ分解、およびアプタマーに低分子量を有する傾向があるために起こる腎臓による身体からのクリアランスに起因する。未修飾アプタマーは、一過性の状態（例えば、血液凝固）の処置に、および／または局所送達が可能である器官（例えば、目、皮膚など）の処置に特に適するであろう。急速なクリアランスは、インビボ画像診断などの用途に望ましいであろう。例えば、テネイシン結合アプタマー（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）を癌のイメージングに利用することができる。いくつかの実施形態では、半減期が増加されたアプタマーが望ましい。一定の修飾（例えば、２’−フッ素置換ピリミジン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）結合など）は、アプタマーの半減期を増加させることができる。
【０１９５】
三重らせん形成を誘導するＲＮＡ
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸としては、三重らせん形成を誘導するＲＮＡが挙げられる。いくつかの実施形態では、ターゲット遺伝子の調節領域（すなわち、ターゲット遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をターゲッティングすることにより内因性ターゲット遺伝子発現を低減して、体内のターゲット筋肉細胞におけるターゲット遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することができる（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６：５６９；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２，Ａｎｎ，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７；およびＭａｈｅｒ，１９９２，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４：８０７参照）。
【０１９６】
ベクター
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と会合させることができる核酸としては、ベクターが挙げられる。本明細書において用いる場合、「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核および／または原核細胞などの宿主においてそれらが連結している核酸の染色体外複製および／または発現を達成することができる。例示的ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス、ウイルスゲノム、人工染色体、細菌人工染色体、および／または酵母人工染色体が挙げられる。ある実施形態において、ベクターは、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位などの要素を含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる（「発現ベクター」）。いくつかの実施形態において、その作動可能に連結された遺伝子の発現は、機能性核酸（例えば、ＲＮＡｉ剤、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、リボザイムなど）の生産を生じさせる結果となる場合がある。いくつかの実施形態において、その作動可能に連結された遺伝子の発現は、タンパク質（例えば、治療用
、診断用、および／または予防用タンパク質）の生産を生じさせる結果となる場合がある。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、タンパク質ベースの薬物（例えば、抗体ベースの薬物、ペプチドベースの薬物など）である。いくつかの実施形態において、予防用タンパク質は、タンパク質抗原および／または抗体であり得る。いくつかの実施形態において、診断用タンパク質は、過剰に荷電されたタンパク質によって細胞に送達される前に一定の特性を示すが、送達後は検出可能に異なる特性を示すものであり得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌起源のものである。いくつかの実施形態において、ベクターは、真菌起源のものである。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核生物起源のものである。いくつかの実施形態において、ベクターは、原核生物起源のものである。いくつかの実施形態では、ベクターを過剰に荷電されたタンパク質によって細胞に送達することができ、そこでそれは後にインビボ複製する。いくつかの実施形態では、ベクターを過剰に荷電されたタンパク質によって細胞に送達することができ、そこでそれは後にインビボ転写される。
【０１９９】
標識核酸
いくつかの実施形態では、本発明による核酸に検出可能なタグを付ける。本発明に従って使用することができる適切な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、および／または放射性標識が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、シアニン−３、シアニン−５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、およびＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒなど）に付いている少なくとも１つのヌクレオチドを含む。核酸と会合させることができる任意の蛍光部分を、本発明に従って利用することができる。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１つの放射性ヌクレオチド（例えば、３２Ｐまたは３５Ｓを含有するヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも１つの放射性部分に付いている少なくとも１つのヌクレオチドを含む。
【０２００】
送達される核酸によってターゲッティングされる細胞核酸
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質を使用して細胞に送達すべき核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなど）は、細胞核酸を分解のターゲットにするために有用である。任意の細胞核酸を分解のターゲットにすることができる。分解のターゲットにすることができる例示的細胞核酸としては、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β−チューブリンおよびｃ−ｍｙｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
ペプチドおよびタンパク質
本発明は、インビボまたはインビトロで細胞にタンパク質またはペプチドを送達するためのシステムおよび方法を提供する。そのようなシステムおよび方法は、１つ以上のペプチドまたはタンパク質と過剰に荷電されたタンパク質とを会合させて複合体を形成すること、およびその複合体を１つ以上の細胞に送達することを典型的には含む。いくつかの実施形態において、タンパク質またはペプチドは、治療活性を有する場合がある。いくつかの実施形態において、複合体の細胞への送達は、ペプチドまたはタンパク質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を、その必要がある被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質は、独力で細胞の内部に進入できない場合があるが、過剰に荷電されたタンパク質と複合体を形成すると細胞の内部に進入することができる。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を利用して、ペプチドまたはタンパク質を細胞に進入させる。本発明によるペプチドまたはタンパク質は、それら自体、治療活性を有する場合がある。
【０２０２】
小分子
本発明は、インビボまたはインビトロで細胞に小分子を送達するためのシステムおよび方法を提供する。そのようなシステムおよび方法は、１つ以上の小分子と過剰に荷電されたタンパク質とを会合させて複合体を形成すること、およびその複合体を１つ以上の細胞に送達することを典型的には含む。いくつかの実施形態において、小分子は、治療活性を有する場合がある。必ずではないが、好ましくは、薬物は、適切な政府機関または規制団体によって人間または動物での使用について安全であり有効であるとすでに考えられているものである。ある実施形態において、小分子は、米国食品医薬品局によって人間または他の動物での使用が認可されている薬物である。例えば、人間での使用が認可されている薬物は、ＦＤＡにより２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§３３０．５、３３１から３６１、および４４０から４６０（参考として本明細書に援用されている）のもとに記載されており、獣医学用の薬物は、ＦＤＡによって２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§５００から５８９（参考として本明細書に援用されている）のもとに記載されている。記載されているすべての薬物が本発明による使用に許容され得ると考えられる。いくつかの実施形態において、複合体の細胞への送達は、小分子と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を、その必要がある被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、小分子は、独力で細胞の内部に進入できない場合があるが、過剰に荷電されたタンパク質と複合体を形成すると細胞の内部に進入することができる。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を利用して、小分子を細胞に進入させる。
【０２０３】
複合体の形成
本発明は、送達すべき１つ以上の作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を提供する。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、送達すべき１つ以上の作用物質と非共有結合性相互作用によって会合している。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、１つ以上の核酸と静電相互作用によって会合している。ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、全体の正味正電荷を有し、および核酸などの送達すべき作用物質は、全体の正味負電荷を有する。
【０２０４】
ある実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、送達すべき１つ以上の作用物質と共有結合性相互作用によって会合している。例えば、過剰に荷電されたタンパク質を、送達すべきペプチドまたはタンパク質に融合させることができる。共有結合性相互作用は、直接的である場合もあり、または間接的である場合もある。いくつかの実施形態において、そのような共有結合性相互作用は、１つ以上のリンカーによって媒介される。いくつかの実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーである。ある実施形態において、切断可能なリンカーは、アミド、エステル、またはジスルフィド結合である。例えば、リンカーは、細胞の酵素によって切断され得るアミノ酸配列である場合がある。ある実施形態において、酵素は、プロテアーゼである。他の実施形態において、酵素は、エステラーゼである。いくつかの実施形態において、酵素は、一定の細胞タイプにおいて、他の細胞タイプにおけるより高度に発現されるものである。例えば、酵素は、非腫瘍細胞におけるより腫瘍細胞におけるほうが高度に発現される。例示的リンカーおよびそれらのリンカーを切断する例示的酵素を表３に提示する。
【０２０５】
【表３】
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１つだが特定の例を挙げると、＋３６ＧＦＰを送達すべき作用物質と切断可能なリンカー、例えばＡＬＡＬ（配列番号：ＸＸ）によって会合させて、＋３６ＧＦＰ−（ＧＧＳ）４−ＡＬＡＬ−（ＧＧＳ）４−Ｘ（この場合、Ｘは、送達すべき作用物質である）を生成することができる。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、送達すべき作用物質は、核酸である。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質と核酸をインキュベートすることによって複合体を形成する。いくつかの実施形態では、複合体の形成を緩衝溶液中で行う。いくつかの実施形態では、複合体の形成をｐＨ７でまたはｐＨ７付近で行う。いくつかの実施形態では、複合体の形成を約ｐＨ５、約ｐＨ６、約ｐＨ７、約ｐＨ８、または約ｐＨ９で行う。複合体の形成は、過剰に荷電されたタンパク質および／または核酸の機能に負の影響を及ぼさないｐＨで典型的には行われる。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、複合体の形成を室温で行う。いくつかの実施形態では、複合体の形成を３７℃でまたは３７℃付近で行う。いくつかの実施形態では、複合体の形成を
４℃未満で、約４℃で、約１０℃で、約１５℃で、約２０℃で、約２５℃で、約３０℃で、約３５℃で、約３７℃で、約４０℃で、または約４０℃より高温で行う。複合体の形成は、過剰に荷電されたタンパク質および／または核酸の機能に負の影響を及ぼさない温度で典型的には行われる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、複合体の形成を無血清培地において行う。いくつかの実施形態では、複合体の形成をＣＯ２（例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、またはそれ以上）の存在下で行う。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、約１００ｎｍの核酸の濃度を用いて、複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、約２５ｎＭ、約５０ｎＭ、約７５ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２５ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１７５ｎＭ、または約２００ｎＭの核酸の濃度を用いて、複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、約４０ｎＭの過剰に荷電されたタンパク質の濃度を用いて、複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、または約１００ｎＭの過剰に荷電されたタンパク質の濃度を用いて、複合体の形成を行う。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、核酸過剰条件下で複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、約２０：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の核酸：過剰に荷電されたタンパク質の比率で複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、約３：１の核酸：過剰に荷電されたタンパク質の比率で複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、約２０：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の過剰に荷電されたタンパク質：核酸の比率で複合体の形成を行う。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質と核酸を混合し、その混合物を（例えば、反転により）攪拌することによって、複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質と核酸を混合し、その混合物を静置しておくことによって、複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、医薬的に許容され得る担体または賦形剤の存在下で複合体の形成を行う。いくつかの実施形態では、その複合体を医薬的に許容され得る担体または賦形剤とさらに併せる。例示的賦形剤または担体としては、水、溶媒、脂質、タンパク質、ペプチド、エンドソーム溶解剤（例えば、クロロキン、ピレン酪酸など）、小分子、炭水化物、緩衝剤、天然ポリマー、合成ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン）、医薬調製物などが挙げられる。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質と核酸とを含む複合体は、ゲル電気泳動アッセイにおいて、過剰に荷電されたタンパク質のみまたは核酸のみよりゆっくりと移動する。
【０２１３】
用途
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質、または送達すべき作用物質と会合している、天然に存在するまたは作られた、過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体、ならびにそのような複合体の使用方法を提供する。本発明のシステムを用いて、任意の作用物質を送達することができる。核酸を送達する場合、核酸は、一般に負電荷を有するので、核酸と会合する過剰に荷電されたタンパク質は、典型的には過剰に正に荷電されたタンパク質である。本発明の過剰に荷電されたタンパク質または複合体は、例えば細胞への作用物質の送達の恩恵を受けることができる任意の疾患を処置または予防するために使用することが
できる。本発明の過剰に荷電されたタンパク質または複合体を使用して、研究のために細胞を移入するまたは処理することもできる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明による過剰に荷電されたタンパク質または複合体を、研究のために、例えば研究に関連して核酸を細胞に効率的に送達するために、使用することができる。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を研究ツールとして使用して、核酸で細胞を効率的に形質転換することができる。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を研究ツールとして使用して、ＲＮＡｉメカニズムを研究するためにＲＮＡｉ剤を細胞に効率的に導入することができる。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を研究ツールとして使用して、細胞において遺伝子をサイレンシングすることができる。ある実施形態では、ペプチドまたはタンパク質の生物学的な活性を研究するために、過剰に荷電されたタンパク質を使用して、ペプチドまたはタンパク質を細胞に送達することができる。ある実施形態では、ペプチドまたはタンパク質の生物学的な活性を研究するために、過剰に荷電されたタンパク質を細胞に導入することができる。ある実施形態では、小分子の生物学的な活性を研究するために、過剰に荷電されたタンパク質を使用して小分子を細胞に送達することができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明による過剰に荷電されたタンパク質または複合体を、治療のために使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明による過剰に荷電されたタンパク質または複合体を使用して、次のものの１つ以上を含む（しかし、これらに限定されない）様々な疾患、障害および／または状態のいずれかの処置することができる：自己免疫疾患（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性疾患（例えば、関節炎、骨盤腹膜炎）；感染症（例えば、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）；神経疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、血管新生性疾患、例えば黄斑変性）；増殖性疾患（例えば、癌、良性新生物）；呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消火器疾患（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；骨格筋疾患（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗しょう症）；泌尿性器疾患（例えば、腎臓病）；精神障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚疾患（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ系疾患（例えば、貧血、血友病）など。
【０２１６】
本発明の過剰に荷電されたタンパク質またはタンパク質を臨床現場で使用することができる。例えば、治療用途に用いることができる核酸と過剰に荷電されたタンパク質を会合させることができる。そのような核酸としては、１つ以上のターゲット転写産物のレベルを低下させるために使用される機能性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなど）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、疾患、障害および／または状態は、１つ以上の特定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の異常に高いレベルと関連している場合がある。１つだが特定の例を挙げると、乳癌の多くの形態は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現増加と関連している。過剰に荷電されたタンパク質は、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡをターゲットにするＲＮＡｉ剤を細胞（例えば、乳癌腫瘍細胞）に送達するために利用することができる。過剰に荷電されたタンパク質は、腫瘍細胞に効率的に取り込まれ、その結果、ＲＮＡｉ剤を送達することができる。送達されると、ＲＮＡｉ剤は、ＥＧＦＲ  ｍＲＮＡのレベル低下、それによりＥＧＦＲタンパク質のレベル低下に有効であり得る。そのような方法は、乳癌（例えば、ＥＧＦＲのレベル上昇と関連している乳癌）の有効な処置であり得る。類似の方法を用いて、１つ以上の特定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベル上昇と関連している任意の疾患、障害および／または状態を処置できることは、通常の当業者には理解されるであろう。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、疾患、障害および／または状態は、１つ以上の特定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の異常に低いレベルと関連している。１つだが特定の例を挙げると、チロシン血症は、身体がアミノ酸チロシンを有効に分解できない障害である。３つのタイプのチロシン血症があり、それぞれ異なる酵素の欠乏によって引き起こされる。過剰に荷電されたタンパク質を使用して、その欠乏酵素を発現させるベクターを送達することによりチロシン血症を処置することができる。ベクターが細胞に送達されると、細胞機械は、欠乏酵素の発現を命令し、それによって患者のチロシン血症を処置することができる。類似の方法を用いて、１つ以上の特定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の異常に低いレベルと関連している任意の疾患、障害および／または状態を処置できることは、通常の当業者には理解されるであろう。
【０２１８】
実施例２および３において実証するように、細胞への過剰に荷電されたタンパク質ベースの核酸送達は、従来のカチオン性脂質ベースのトランスフェクション法を用いる核酸トランスフェクションに対して耐性の細胞系を用いても成功する。従って、いくつかの実施形態では、他の核酸送達法（例えば、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション法、例えばリポフェクタミンの使用）に対して耐性の細胞に核酸を送達するために過剰に荷電されたタンパク質を利用する。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、過剰に正に荷電されたタンパク質を低ナノモル（ｎＭ）濃度（例えば、１ｎｍから１００ｎｍ）で使用して、細胞に核酸を有効に送達できることを実証した。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質を約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２５ｎｍ、約５０ｎｍ、約７５ｎｍ、約１００ｎｍ、または約１００ｎｍより上で使用して、細胞に核酸を有効に送達することができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、治療薬である場合がある。例えば、過剰に荷電されたタンパク質は、タンパク質薬（例えば、アバタセプト、アダリムマブ、アレファセプト、エリスロポエチン、エタネルセプト、ヒト成長ホルモン、インフリキシマブ、インスリン、トラスツズマブ、インターフェロンなど）の過剰に荷電された変異体である場合がある。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、治療薬である場合があり、および会合している核酸は、ターゲット部位へのその治療用タンパク質のターゲッティング送達に有用であり得る。例えば、過剰に荷電されたタンパク質は、タンパク質薬（例えば、アバタセプト、アダリムマブ、アレファセプト、エリスロポエチン、エタネルセプト、ヒト成長ホルモン、インフリキシマブ、インスリン、トラスツズマブ、インターフェロンなど）の過剰に荷電された変異体である場合があり、および会合している核酸は、ターゲット器官、組織および／または細胞にその治療用タンパク質を効率的にターゲッティングするアプタマーである場合がある。過剰に荷電されたタンパク質は、イメージング剤、診断薬、または他の検出薬である場合もある。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質および（存在する場合には）送達すべき作用物質の一方またはその両方が、検出可能な特質を有することがある。例えば、過剰に荷電されたタンパク質および作用物質の一方またはその両方が、少なくとも１つの蛍光部分を含む場合がある。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質は、固有蛍光性（例えば、ＧＦＰ）を有する。いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質および送達すべき作用物質の一方またはその両方が、少なくとも１つの蛍光部分と会合している（例えば、蛍光体、蛍光色素などに結合体化している）場合がある。あるいは、または加えて、過剰に荷電されたタンパク質および送達すべき作用物質の一方またはその両方が、少なくとも１つの放射性部分を含む場合がある（例えば、タンパク質が３５Ｓを含む場合がある；核酸は、３２Ｐを含む場合がある；など）。そのような検出可能な部分は、ターゲット部位への過剰に荷電されたタンパク質または複合体の送達の検出および／またはモニタリングに有用であろう。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、過剰に荷電されたタンパク質および過剰に荷電されたタンパク質と会合している作用物質は、検出可能な標識を含む。これらの分子は、検出、イメージング、疾病病期分類、診断、または患者選択の際に使用することができる。適切な標識としては、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、比色標識、リン光標識、密度に基づく標識、例えば電子密度に基づく標識、ならびに一般に造影剤、および／または放射性標識が挙げられる。
【０２２２】
医薬組成物
本発明は、過剰に荷電されたタンパク質、および送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を提供する。従って、本発明は、１つ以上の過剰に荷電されたタンパク質または１つ以上のそのような複合体と、１つ以上の医薬的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、１つ以上の追加の治療上活性な物質を場合によっては含むことがある。いくつかの実施形態に従って、１つ以上の過剰に荷電されたタンパク質を含む医薬組成物、または送達すべき１つ以上の作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む１つ以上の複合体を含む医薬組成物を、その必要がある被験体に投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物をヒトに投与する。本開示のために、「活性成分」というフレーズは、本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき少なくとも１つの作用物質とを含む複合体を一般に指す。
【０２２３】
本明細書に提供する医薬組成物の説明は、ヒトへの投与に適する医薬組成物に主として関するが、そのような組成物がすべての種類の動物への投与に一般に適することは当業者には理解されるであろう。ヒトへの投与に適する医薬組成物に対する、その組成物を様々な動物への投与に適するようにするための修飾は、十分に理解されており、通常技能の獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験だけで、そのような修飾を計画および／または実施することができる。医薬組成物の投与が考えられる被験体としては、ヒトおよび／または他の霊長類；商業関連哺乳動物を含む哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／もしくはラット；ならびに／または；商業関連鳥類を含む鳥類、例えば、ニワトリ、カモ、ガチョウおよび／もしくはシチメンチョウが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
本明細書に記載する医薬組成物の調合薬は、薬理学技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と会合させる工程、そしてその後、必要なおよび／または望ましい場合には、その生成物を所望の単回または多回用量単位に成形および／または包装する工程を含む。
【０２２５】
本発明による医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および／または多数の単回単位用量として、調製、包装および／または販売することができる。本明細書において用いる場合、「単位用量」は、活性成分の所定量を含む医薬組成物の個別量である。活性成分の量は、被験体に投与されることとなる活性成分の投薬量および／またはそのような投薬量の、例えばそのような用量の二分の一もしくは三分の一などの、適便な小部分に一般に等しい。
【０２２６】
本発明による医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容され得る賦形剤および／または任意の追加の成分の相対量は、処置する被験体の正体、サイズおよび／または状態に依存して、ならびにその組成物を投与することとなる経路にさらに依存して、変わるであろう。例として、組成物は、０．１％と１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含む場合がある。
【０２２７】
医薬調合物は、医薬的に許容され得る賦形剤をさらに含む場合があり、前記賦形剤としては、ここで用いる場合、所望される特定の剤形に適するような任意のおよびすべての溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存薬、固体結合剤、滑沢剤およびこれらに類するものが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；参考として本明細書に援用されている）には、医薬組成物の調合に使用される様々な賦形剤、およびその調製のための公知技術が開示されている。いずれの従来の賦形剤媒質も、物質またはその誘導体と非相溶性である場合、例えば、何らかの望ましくない生物学的作用を生じさせるまたは別様にその医薬組成物の任意の他の成分（単数または複数）と有害に相互作用することで非相溶性である場合を除き、その使用は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、医薬的に許容され得る賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、人間での使用または獣医学的使用に認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局によって認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品グレードである。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たしている。
【０２２９】
医薬組成物の製造に使用される医薬的に許容され得る賦形剤としては、不活性な希釈剤、分散および／または造粒剤、界面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存薬、緩衝剤、滑沢剤、および／または油が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤を場合によっては医薬調合物に含めることがある。調合者の判断に従って、カカオ脂および坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、着香剤および／または香料などの賦形剤が、組成物中に存在する場合がある。
【０２３０】
例示的希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉砂糖など、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３１】
例示的造粒および／または分散剤としては、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クレー、アルギン酸、グアガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、α化−デンプン（デンプン１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、ラウリル硫酸ナトリウム、第四アンモニウム化合物など、ならびに／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３２】
例示的界面活性剤および／または乳化剤としては、天然乳化剤（例えば、アラビアゴム、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカントゴム、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、
羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイドクレー（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶｅｅｇｕｍ（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラゲナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［Ｓｐａｎ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［Ｍｙｒｊ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ  ６８、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンズアルコニウム、ドキュセートナトリウムなど、ならびに／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３３】
例示的結合剤としては、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ゴム（例えば、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アイルランドゴケ抽出物、パンワールゴム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガッチゴム、イサポール外皮（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋｓ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメチルアクリレート；ワックス；水；アルコールなど；ならびに／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３４】
例示的保存薬としては、抗酸化物質、キレート剤、抗菌性保存薬、抗真菌性保存薬、アルコール保存薬、酸性保存薬および／または他の保存薬が挙げられるが、これらに限定されない。例示的抗酸化物質としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。例示的キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸・一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、およ
び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的抗菌性保存薬としては、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的抗真菌性保存薬としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。例示的アルコール保存薬としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的酸性保存薬としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の保存薬としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ｂｕｔｙｌａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅｄ）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ亜硫酸カリウム、Ｇｌｙｄａｎｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ（登録商標）、メチルパラベン、Ｇｅｒｍａｌｌ（登録商標）１１５、Ｇｅｒｍａｂｅｎ（登録商標）ＩＩ、Ｎｅｏｌｏｎｅ（商標）、Ｋａｔｈｏｎ（商標）、および／またはＥｕｘｙｌ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
例示的緩衝剤としては、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化カルシウムリン酸塩、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質不含水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコールなど、および／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３６】
例示的滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、レシチン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３７】
例示的油としては、扁桃油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ種子油、ルチジサ油、カデ油、カミツレ油、カノーラ油、カラウェー油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、カカオ脂、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、マツヨイグサ油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ハーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、リツェア
クベバ油、マカデミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ニクズク油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラッフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ種子油、カボチャ種子油、菜種油、米ぬか油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サザンカ油、セイバリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバル油、クルミ油、および小麦胚芽油挙げられるが、これらに限定されない。例示的油としては、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコーン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイルおよび／またはこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２３８】
経口および非経口投与のための液体剤形としては、医薬的に許容され得るエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般に用いられている不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒など、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、プロピレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含む場合がある。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、着香剤、および／または香料を含む場合がある。非経口投与のためのある実施形態では、組成物を可溶化剤、例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせと混合する。
【０２３９】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適する分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従って調合することができる。滅菌注射用調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性で非経口的に許容され得る希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液および／またはエマルジョンである場合がある。利用することができる許容され得るビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液などがある。滅菌、固定油は、溶媒または懸濁媒質として従来用いられている。このために、合成モノまたはジグリセリドをはじめとする任意の無刺激の固定油を用いることができる。オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製の際に用いることができる。
【０２４０】
注射用調合物は、例えば、細菌保留フィルターによる濾過によって、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒質に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【０２４１】
活性成分の作用を持続させるために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが望ましい場合が多い。これは、水溶解度が小さい結晶質または非晶質材料の液体懸濁物の使用によって果たすことができる。このときの薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、そしてまたその溶解速度は、結晶のサイズおよび結晶形に依存するだろう。あるいは、非経口投与薬物形態の吸収遅延は、油性ビヒクルに薬物を溶解または懸濁させることによって果たすことができる。注射用デポー形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中の薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られる。薬物のポリマーに対する比率、および利用する特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出速度を制御することができる。他の生体分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用調合物は、
体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を捕捉することによって調製される。
【０２４２】
直腸内または膣内投与のための組成物は、典型的には坐剤であり、坐剤は、周囲温度では個体であるが体温で液体であり、従って直腸または膣腔内で溶融し、活性成分を放出する適切な無刺激性賦形剤、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックス、と組成物を混合することによって調製することができる。
【０２４３】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、ピル、粉末、および顆粒が挙げられる。そのような固体剤形では、少なくとも１つの不活性で医薬的に許容され得る賦形剤、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、および／または充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアラビアゴム）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯またはタピオカデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解抑制剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレー）、および滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、ならびにこれらの混合物と、活性成分を混合する。カプセル、錠剤およびピルの場合、その剤形は、緩衝剤を含むことがある。
【０２４４】
同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールおよびこれらに類するもののような賦形剤を使用する軟および硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として利用することができる。錠剤、糖衣丸、カプセル、ピルおよび顆粒の固体剤形は、医薬調合分野において周知のコーティングおよび外皮、例えば腸溶コーティングおよび他のコーティング、を用いて調製することができる。それらは、場合によっては不透明剤を含むことがあり、および活性成分（単数もしくは複数）を腸管の一定の部分においてのみまたは優先的に、場合によっては遅延様式で放出する組成のものである場合がある。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールおよびこれらに類するもののような賦形剤を使用する軟および硬ゼラチンカプセルにおける充填剤として利用することができる。
【０２４５】
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー剤、吸入剤および／またはパッチを挙げることができる。一般に、活性成分は、滅菌条件下で医薬的に許容され得る賦形剤ならびに／または必要とされる場合には任意の必要とされる保存薬および／もしくは緩衝剤と混合される。加えて、本発明は、経皮パッチの使用を考えており、これらは、化合物の身体への制御送達をもたらす付加的利点を有することが多い。そのような剤形は、例えば、化合物を適切な媒質に溶解および／または分散させることによって調製することができる。あるいは、または加えて、速度制御膜を設けることによって、ならびに／またはポリマーマトリックスおよび／もしくはゲルに化合物を分散させることによって、速度を制御することができる。
【０２４６】
本明細書に記載する皮内医薬組成物の送達に使用するために適する器具としては、短針器具、例えば、米国特許第４，８８６，４９９号；同第５，１９０，５２１号；同第５，３２８，４８３号；同第５，５２７，２８８号；同第４，２７０，５３７号；同第５，０１５，２３５号；同第５，１４１，４９６号；および同第５，４１７，６６２号に記載さ
れているものが挙げられる。皮内組成物は、皮膚への有効針穿通長を制限する器具、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ  ９９／３４８５０に記載されているものおよびそれらの機能等価物によって投与することができる。液体ジェット式注射器によっておよび／または角質層に刺し入れ、真皮に達するジェットを生じさせる針によって真皮に液体組成物を送達するジェット式注射器具が適する。ジェット式注射器具は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；同第５，５９９，３０２号；同第５，３３４，１４４号；同第５，９９３，４１２号；同第５，６４９，９１２号；同第５，５６９，１８９号；同第５，７０４，９１１号；同第５，３８３，８５１号；同第５，８９３，３９７号；同第５，４６６，２２０号；同第５，３３９，１６３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，５０３，６２７号；同第５，０６４，４１３号；同第５，５２０，６３９号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第４，９４０，４６０号；ならびにＰＣＴ公報ＷＯ  ９７／３７７０５およびＷＯ  ９７／１３５３７に記載されている。圧縮ガスを使用して粉末形態のワクチンを皮膚の外層を通して真皮に加速する弾道粉末／粒子送達器具が適する。あるいは、または加えて、皮内投与の古典的マントー法で従来の注射器を使用してもよい。
【０２４７】
局所投与に適する調合物としては、液体および／または半液体調製物、例えば、糊膏、ローション、水中油型および／もしくは油中水型エマルジョン、例えばクリーム、軟膏、ならびに／またはペースト、溶液および／もしくは懸濁液が挙げられるが、これらに限定されない。局所投与可能な調合物は、例えば、約１％から約１０％（ｗ／ｗ）活性成分を含むが、活性成分の濃度は、溶媒中のその活性成分の溶解度の限界ほども高い場合がある。局所投与用の調製物は、本明細書に記載する追加の成分の１つ以上をさらに含む場合がある。
【０２４８】
医薬組成物を、口腔経由での肺投与に適する調合物で、調製、包装、および／または販売することができる。そのような調合物は、活性成分を含み約０．５ｎｍから約７ｎｍまたは約１ｎｍから約６ｎｍの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含む場合がある。適便には、そのような組成物は、噴射剤の流れによって粉末を分散させる乾燥粉末レザバーを含む装置を使用する投与、ならびに／または自己噴射性溶媒／粉末分散容器、例えば低沸点噴射剤に溶解および／もしくは懸濁された活性成分を密閉容器内に含む装置、を使用する投与のための乾燥粉末形態である。そのような粉末は、粒子を含み、この場合、それらの粒子の重量で少なくとも９８％は、０．５ｎｍより大きい直径を有し、およびそれらの粒子の数で少なくとも９５％は、７ｎｍ未満の直径を有する。あるいは、それらの粒子の重量で少なくとも９５％は、１ｎｍより大きい直径を有し、およびそれらの粒子の数で少なくとも９０％は、６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉希釈剤を含む場合があり、単位用量形態で適便に提供される。
【０２４９】
低沸点噴射剤としては、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤が一般に挙げられる。一般に、噴射剤は、組成物の５０％から９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することがあり、および活性成分は、組成物の０．１％から２０％（ｗ／ｗ）を構成することがある。噴射剤は、追加の成分、例えば液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同じオーダーの粒径を有するだろう）をさらに含むことがある。
【０２５０】
肺送達のために調合される医薬組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を供給することができる。そのような調合物は、活性成分を含む、場合によっては滅菌された、水性および／または希アルコール溶液および／または懸濁液として調製、包装および／または販売することができ、ならびに任意の噴霧および／または霧化装置を使用して適便に投与することができる。そのような調合物は、着香剤、例えばサッカリンナトリウム、揮発油、緩衝剤、界面活性剤、および／または保存薬、例えばヒドロキシ安息
香酸メチルをはじめとする（しかし、これらに限定されない）１つ以上の追加の成分をさらに含む場合がある。この投与経路によって供給される液滴は、約０．１ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均直径を有するだろう。
【０２５１】
肺送達に有用であると本明細書に記載する調合物は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に適するもう１つの調合物は、活性成分を含み約０．２μｍから５００μｍの平均粒子を有する、粗い粉末である。そのような調合物は、かぎタバコを吸う仕方で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻孔を通した急速吸入により、投与される。
【０２５２】
鼻投与に適する調合物は、例えば、約０．１％（ｗ／ｗ）ほどもの少ない活性成分から１００％（ｗ／ｗ）ほどもの多い活性成分までを含むことがあり、および本明細書に記載する追加の成分の１つ以上を含むことがある。口内投与に適する調合物で医薬組成物を調製、包装および／または販売することができる。そのような調合物は、例えば、従来の方法を用いて作られた錠剤および／またはロゼンジの形態である場合があり、例えば、０．１％から２０％（ｗ／ｗ）活性成分と、経口溶解性および／または分解性組成物を構成するその残余と、場合によっては、本明細書に記載する追加の成分の１つ以上とを含むことがある。あるいは、口内投与に適する調合物は、活性成分を含む粉末ならびに／またはエーロゾル化および／もしくは霧化溶液および／もしくは懸濁液を含む場合がある。そのような粉末、エーロゾル化、および／または霧化調合物は、分散させたとき、約０．１ｎｍから約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有することがあり、および本明細書に記載する追加の成分の１つ以上を含むことがある。
【０２５３】
眼科投与に適する調合物で医薬組成物を調製、包装および／または販売することができる。そのような調合物は、例えば、水性または油性液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／または懸濁液を例えば含む点眼剤の形態である場合がある。そのようなドロップは、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載する他の任意の追加の成分をさらに含む場合がある。有用である他の眼科投与可能な調合物としては、微結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物で活性成分を含むものが挙げられる。点耳剤および／または点眼剤は、本発明の範囲内であると考えられる。
【０２５４】
医薬調製物の調合および／または製造の際の一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参考として本明細書に援用されている）において見つけることができる。
【０２５５】
投与
本発明は、本発明による過剰に荷電されたタンパク質または複合体を、それを必要とする被験体に投与することを含む。疾患、障害および／または状態（例えば、記憶欠損に関連した疾患、障害および／または状態）の予防、処置、診断またはイメージングに有効な任意の量および任意の投与経路を用いて、過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体、または医薬組成物、イメージング用組成物、診断用組成物もしくは予防用組成物を被験体に投与することができる。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢および全般的な健康状態、その疾病の重症度、特定の組成物、その投与方式、その活性様式およびこれらに類するものに依存して、被験体毎に異なるであろう。本発明による組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のため投薬単位で典型的には調合される。しかし、本発明の組成物の１日の合計使用量が、堅実な医学的判断の範囲内で担当医によって決められることは理解されるであろう。任意の個々の患者についての特定の治療有効、予防有効、または適切なイメージング用量レベルは、処置する障害およびその障害の重症度；利用する特定の化合物の活性；利用する特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別およ
び食事；利用する特定の化合物の投与回数、投与経路および排泄率；処置期間；利用する特定の化合物と併用するまたは同時に使用する薬物；ならびに医学分野において周知のこれらに類する要因をはじめとする様々な要因に依存するであろう。
【０２５６】
過剰に荷電されたタンパク質、もしくは送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体、および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物を、動物、例えば哺乳動物（例えば、ヒト、家畜、ネコ、イヌ、マウス、ラットなど）に投与することができる。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物をヒトに投与する。
【０２５７】
本発明による過剰に荷電されたタンパク質、もしくは送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体、および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物を任意の経路によって投与することができる。いくつかの実施形態では、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、骨髄内経路、クモ膜下経路、皮下経路、脳室内経路、経皮経路、皮内経路、直腸内経路、膣内経路、腹腔内経路、局所経路（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローションおよび／もしくはドロップにより）、粘膜経路、鼻経路、口内経路、経腸経路、硝子体経路、腫瘍内経路、舌下経路をはじめとする様々な経路の１つ以上によって；気管内点滴注入、気管支点滴注入、および／もしくは吸入により；経口スプレー、鼻スプレー、および／もしくはエーロゾルとして；ならびに／または門脈カテーテルによって、過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物を投与する。いくつかの実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物を全身性静脈注射によって投与する。特定の実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物を静脈内投与することができ、および／または経口投与することができる。特定の実施形態では、過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物を、その過剰に荷電されたタンパク質または複合体が血液脳関門、血管関門または他の上皮関門を横断することができるように投与することができる。
【０２５８】
しかし、本発明は、薬物送達の科学研究に関する可能性の高い進歩を考慮に入れて任意の適切な経路による過剰に荷電されたタンパク質もしくは複合体および／またはそれらの医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物もしくはイメージング用組成物の送達を包含する。
【０２５９】
一般に、最も適切な投与経路は、過剰に荷電されたタンパク質、または送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体の性質（例えば、胃腸管、血流などの環境でのその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路を許容できるかどうか）などをはじめとする様々な要因に依存するであろう。本発明は、薬物送達の科学研究に関する可能性の高い進歩を考慮に入れて任意の適切な経路による医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物またはイメージング用組成物の送達を包含する。
【０２６０】
ある実施形態では、本発明による組成物を、１日に１回以上、１日あたり被験体体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍ
ｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇを送達するために十分な投薬レベルで投与して、所望の治療、診断、予防またはイメージング効果を得ることができる。所望の投薬量を１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、３日毎に、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、送達することができる。ある実施形態では、多回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて所望の投薬量を送達することができる。
【０２６１】
過剰に荷電されたタンパク質、または送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を、１つ以上の他の治療薬、予防薬、診断薬またはイメージング剤と併用することができる。「併用で」とは、作用物質を同時に投与および／または送達のために合わせて調合しなければならないという意味するためのものではないが、これらの送達方法は、本発明の範囲内である。組成物を、１つ以上の他の所望の治療薬もしくは医療手順と同時に施与することもあり、それらの前に施与することもあり、またはそれらの後に施与することもある。一般に、それぞれの作用物質は、その作用物質について決められた用量でおよび／またはタイムスケジュールで投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物またはイメージング組成物を、それらのバイオアベイラビリティーを向上することができる、それらの代謝を減少および／もしくは調節することができる、それらの排泄を抑制することができる、ならびに／またはそれらの体内分布を調節することができる作用物質と併用で送達することを包含する。
【０２６２】
併用される治療、予防、診断またはイメージング活性作用物質が、単一組成物で一緒に投与されることもあり、または異なる組成物で別々に投与される場合もあることは、さらに理解されるであろう。一般に、併用される作用物質は、それらが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されると予想される。いくつかの実施形態において、併用されるレベルは、個々に利用されるレベルより低いであろう。
【０２６３】
併用レジメンで用いられる療法（治療薬または手順）の個々の組み合わせは、所望の治療薬および／または手順と達成すべき所望の治療効果の適合性を考慮にいれることとなる。用いられる療法が同じ障害について所望の効果を達成する場合があり（例えば、本発明による癌の処置に有用な組成物を化学療法薬と同時に投与することができる）、またはそれらが異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成する場合があることも理解されるであろう。
【０２６４】
キット
本発明は、本発明の方法を適便におよび／または有効に行うための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が被験体（単数もしくは複数）の多数の処置を行うことができるおよび／または多数の実験を行うことができる十分な量および／または数の成分を含むであろう。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質；（ｉｉ）送達すべき作用物質；（ｉｉｉ）少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を形成するための指示書、のうちの１つ以上を含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質；（ｉｉ）核酸；（ｉｉｉ）少なくとも１つの核酸と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を形成するための指示書、のうちの１つ以上を含
む。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質；（ｉｉ）ペプチドまたはタンパク質；（ｉｉｉ）送達すべき少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を形成するための指示書、のうちの１つ以上を含む。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質；（ｉｉ）小分子；（ｉｉｉ）少なくとも１つの小分子と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を形成するための指示書、のうちの１つ以上を含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質、または送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体；（ｉｉ）少なくとも１つの医薬的に許容され得る賦形剤；（ｉｉｉ）医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物またはイメージング用組成物の被験体への投与のための注射器、針、アプリケーターなど；ならびに（ｉｖ）医薬組成物を調製するための、およびその組成物の被験体への投与のための指示書、のうちの１つ以上を含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、キットは、（ｉ）本明細書に記載するような、過剰に荷電されたタンパク質を含む医薬組成物、または送達すべき少なくとも１つの作用物質と会合している過剰に荷電されたタンパク質を含む複合体を含む医薬組成物；（ｉｉ）医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物またはイメージング用組成物の被験体への投与のための注射器、針、アプリケーターなど；および（ｉｉｉ）医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物またはイメージング用組成物の被験体への投与のための指示書、のうちの１つ以上を含む。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、キットは、過剰に荷電されたタンパク質を生成するように対象となるタンパク質を修飾するために有用な１つ以上の成分を含む。これらのキットは、過剰に荷電されたタンパク質を作るために必要な試薬のすべてまたは大部分を典型的には含む。ある実施形態において、そのようなキットは、研究者が本発明による過剰に荷電されたタンパク質を設計するのに役立つコンピュータソフトウェアを含む。ある実施形態において、そのようなキットは、部位特異的変異誘発を行うために必要な試薬を含む。
【０２７２】
いくつかの実施形態において、キットは、追加の成分または試薬を含むことがある。例えば、キットは、緩衝剤、試薬、プライマー、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、酵素、緩衝剤、細胞、媒質、プレート、チューブ、指示書、ベクターなどを含むことがある。いくつかの実施形態において、キットは、使用のための指示書を含むことがある。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、キットは、過剰に荷電されたタンパク質、または過剰に荷電されたタンパク質と送達すべき少なくとも１つの作用物質とを含む複合体を含む、医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物、またはイメージング組成物の多数の単位投薬量を含む。記憶を助けるものが、例えば、投薬量を投与することができる処置スケジュールにおける日／時を示す、番号、文字および／もしくは他の標示の形態で、ならびに／またはカレンダー挿入物と共に、供給される場合もある。医薬組成物、予防用組成物、診断用組成物またはイメージング組成物の投薬量と同様のまたは異なる形態いずれかでプラセボ投薬量および／またはカルシウム栄養補助食品を含めて、投薬量を毎日摂取するキットを提供する場合もある。
【０２７４】
キットは、個々の成分または試薬の幾つかを別々に収容することができるように１つ以上の器または容器を含むことがある。キットは、商業販売のために比較的密閉状態で個々の容器を密封する手段（例えば、指示書、包装材料、例えばスタイロフォームなどを密封することができるプラスチックボックス）を含むことがある。キットは、実験室での適便な使用のために典型的には包装される。
【０２７５】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の実施形態の考慮によってさらに理解されるであろう。これらの実施形態は、本発明のある特定の実施形態を例証するためのものであり、請求項によって定義するとおりの本発明の範囲を制限するためのものではない。
【実施例】
【０２７６】
実施例１：過剰に荷電されたタンパク質は並はずれたレジリエンスを付与することができる
方法および材料
設計手順および過剰に荷電されたタンパク質配列
公表されている構造データ（Ｗｅｂｅｒら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：８５；Ｄｉｒｒら、１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４３：７２；Ｐｅｄｅｌａｃｑら、２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：７９；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）から溶媒露出残基（下にグレーで示す）をＡｖＮＡＰＳＡ＜１５０（ＡｖＮＡＰＳＡは、側鎖原子あたりの平均隣接（１０Å以内）原子数である）を有するものと特定した。荷電または高極性溶媒露出残基（ＤＥＲＫＮＱ）を、過剰な負電荷を持たせるためにＡｓｐもしくはＧｌｕに；または過剰な正電荷を持たせるためにＬｙｓもしくはＡｒｇに変異させた。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体における変異させる追加の表面露出位置を、ＧＦＰホモログの間のこれらの位置での配列変異性に基づいて選択した。
【０２７７】
タンパク質発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用量について最適化された合成遺伝子をＤＮＡ  ２．０から購入し、ｐＥＴ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳにおいて５〜１０時間、１５℃で過剰発現させた。遠心分離によって細胞を回収し、音波処理によって溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって、タンパク質を精製し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸カリウムｐＨ７．５に緩衝液を交換し、限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮した。すべてのＧＦＰ変異体を自然状態下で精製した。
【０２７８】
静電表面電位計算（図１Ｂ〜Ｄ）
−３０および＋４８の過剰に荷電されたＧＦＰ変異体のモデルは、スーパーフォルダーＧＦＰ（Ｐｅｄｅｌａｃｑら、２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：７９；参考として本明細書に援用されている）の結晶構造に基づくものであった。ＡＰＢＳ（Ｂａｋｅｒら、２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９８：１００３７；参考として本明細書に援用されている）を用いて静電位を計算し、−２５ｋＴ／ｅ（赤色）から＋２５ｋＴ／ｅ（青色）のスケールを用いてＰｙＭｏｌ（Ｄｅｌａｎｏ，２００２，Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ；参考として本明細書に援用されている）で描画した。
【０２７９】
タンパク質染色およびＵＶ誘導蛍光（図２Ａ）
０．２μｇのそれぞれのＧＦＰ変異体を１０％変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析し、クマシー・ブリリアント・ブルー色素で染色した。１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中の０．２μｇの同じタンパク質を０．２ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、ＵＶ線（３６０ｎｍ）のもとで撮影した。
【０２８０】
熱変性および凝集（図３Ａ）
精製ＧＦＰ変異体を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）中、２ｍｇ／ｍＬに希釈し、その後、ＵＶ照明下で撮影した（自然状態）。それらのサンプルを１分間、１００℃に加熱し、その後、ＵＶ照明下で再び撮影した（「煮沸」）。最後に、それらのサンプルを２時間、室温に冷却し、ＵＶ照明下で再び撮影した（「冷却」）。
【０２８１】
化学的に誘導した凝集（図３Ｂ）
２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を添加して、１．５ｍｇ／ｍＬ  タンパク質、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＢＭＥ、および４０％ＴＦＥを有する溶液を生成した。２５℃で凝集を直角の光散乱によってモニターした。
【０２８２】
サイズ排除クロマトグラフィー（表４）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラムで２０〜５０μｇのタンパク質を分析することによって、ＧＦＰ変異体の多量体状態を決定した。緩衝剤は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸カリウム  ｐＨ７．５であった。同じ条件下で別に分析した既知分子量の１セットの単量体タンパク質標準物質との比較により、分子量を決定した。
【０２８３】
【表４】
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過剰に荷電されたタンパク質ＧＦＰ
「スーパーフォルダーＧＦＰ」（ｓｆＧＦＰ）と呼ばれる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の変異体は、フォールディング効率および変性耐性について高度に最適化されている（Ｐｅｄｅｌａｃｑら、２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：７９；参考として本明細書に援用されている）。スーパーフォルダーＧＦＰは、野生型ＧＦＰのものに類似した、−７の正味電荷を有する。アミノ酸の溶媒露出を計算するための簡単なアルゴリズム（材料および方法参照）に導かれて、ＧＦＰの過剰に荷電された変異体を設計した。過剰に荷電されたＧＦＰは、＋３６の理論正味電荷を有するものであり、およびその最
も溶媒に露出された２９の残基を、正電荷を有するアミノ酸に変異させることによって作った（図１）。ｓｆＧＦＰまたは過剰に荷電されたＧＦＰ（「ＧＦＰ（＋３６））」）のいずれかをコードする遺伝子の発現は、強緑色蛍光細菌を生じさせた。タンパク質精製後、ＧＦＰ（＋３６）の蛍光特性を測定し、ｓｆＧＦＰのものに非常に類似していることが判明した。
【０２８４】
＋４８、−２５および−３０の正味電荷を有する追加の過剰に荷電されたＧＦＰを設計し、精製し、それらのすべてもｓｆＧＦＰ様蛍光を示すことが判明した（図２Ａ）。すべての過剰に荷電されたＧＦＰ変異体は、ｓｆＧＦＰのものに類似した円偏光二色性スペクトルを示した。これは、それらのタンパク質が、類似した二次構造含量を有することを示している（図２Ｂ）。過剰に荷電されたＧＦＰ変異体の熱力学的安定性は、３６ほどもの多さの変異の存在にもかかわらず、ｓｆＧＦＰのものよりほんのわずかに低かった（１．０〜４．１ｋｃａ／ｍｏｌ、図２Ｃおよび表４参照）。
【０２８５】
ｓｆＧＦＰは、ＧＦＰ最適化の長い歴史の産物である（Ｇｉｅｐｍａｎｓら、２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１２：２１７；参考として本明細書に援用されている）が、熱的または化学的アンフォールディングによって誘導される凝集を依然として受けやすい。１００℃へのｓｆＧＦＰの加熱は、その定量的沈殿および蛍光の不可逆的喪失を誘導した（図３Ａ）。対照的に、過剰に荷電されたＧＦＰ（＋３６）およびＧＦＰ（−３０）は、１００℃に加熱しても可溶性のままであり、冷却すると有意な蛍光が回復した（図３Ａ）。４０％  ２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）は、２５℃で数分以内にｓｆＧＦＰの完全凝集を誘導したが、＋３６および−３０の過剰に荷電されたＧＦＰ変異体は、数時間、同じ条件下で有意な凝集および蛍光喪失を被らなかった（図３Ｂ）。
【０２８６】
過剰に荷電されたＧＦＰ変異体は、反対の電荷の高荷電高分子に対して強い可逆的アビディティを示す（図３Ｃ）。１：１の化学量論比で互いに混合すると、ＧＦＰ（＋３６）およびＧＦＰ（−３０）は、直ちに緑色蛍光共沈物を形成した。これは、フォールディングしたタンパク質の会合を示している。ＧＦＰ（＋３６）は、高濃度のＲＮＡまたはＤＮＡと同様に共沈した。ＮａＣｌの添加は、これらの複合体を溶解させるために十分であった。これは、それらの形成の静電学的論拠と一致する。対照的に、ｓｆＧＦＰは、ＧＦＰ（−３０）、ＲＮＡ、またはＤＮＡの添加による影響を受けなかった（図３Ｃ）。
【０２８７】
結論
まとめると、様々な構造および機能の単量体および多量体タンパク質を、それらの最も溶媒に露出した残基を、同様の電荷を有するアミノ酸で単に置換することによって、「過剰に荷電」させることができる。過剰に荷電させることは、タンパク質の分子間特性を大いに改変して、顕著な耐凝集性、および「分子ベルクロ」のような反対の電荷を有する高分子とフォールディングした形態で会合する能力を付与する。
【０２８８】
これらの劇的な分子間作用とは対照的に、フォールディング、蛍光、リガンド結合および酵素触媒作用を含む、ここで研究した７つの過剰に荷電されたタンパク質についての分子内特性は、大半は手つかずのままであった。従って、過剰に荷電させることは、タンパク質凝集傾向を低下させるために、およびタンパク質の可溶性を、それらの機能を損なうことなく向上させるために有用なアプローチと言える。これらの原理は、凝集を含む予測できないタンパク質取扱特性が依然として有意な難題であるデノボのタンパク質設計努力に特に有用であり得る。
【０２８９】
これらの観察によって、天然タンパク質のわずかな正味電荷分布（Ｋｎｉｇｈｔら、２００４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１：８３９０；Ｇｉｔｌｉｎら、２００６，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，４５：３０２２
；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）も説明することができる：例えば、Ｐｒｏｔｅｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）ポリペプチドの８４％の正味電荷は、±１０以内に入る。上の結果は、高い正味電荷がアンフォールディングを強いるために十分な静電反発力を作るという仮説と相反する。実際、ＧＦＰ（＋４８）は、現在、ＰＤＢにおけるいずれのポリペプチドより高い正の正味電荷を有するが、フォールディングするおよび蛍光を発する能力を保持する。それよりも、これらの知見は、非特異的分子間付着が、多すぎる高荷電天然タンパク質の発生を嫌ったのかもしれないことを示唆している。ＲＮＡに結合するリポソームタンパク質Ｌ３（＋３６）およびＬ１５（＋４４）またはカルシウムカチオンに結合するカルセクエストリン（−８０）などの、非常に高い正味電荷を有するほぼすべての天然タンパク質が、それらの本質的な細胞機能の一部として正電荷を有する化学種と会合する。
【０２９０】
実施例２：過剰に荷電されたタンパク質を使用して核酸を細胞に効率的に送達することができる。
【０２９１】
図５は、過剰に荷電されたＧＦＰが、反対の電荷を有する高分子（「タンパク質ベルクロ」）と非特異的におよび可逆的に会合することを明示している。そのような相互作用は、沈殿の形成を生じさせる場合がある。変性タンパク質の凝集とは異なり、これらの沈殿は、フォールディングした蛍光ＧＦＰを含有し、１Ｍの塩に溶解する。＋３６ＧＦＰのみ；−３０ＧＦＰと混合した＋３６ＧＦＰ；ｔＲＮＡと混合した＋３６ＧＦＰ；１ＭのＮａＣｌ中のｔＲＮＡと混合した＋３６ＧＦＰ；スーパーフォルダーＧＦＰ（「ｓｆＧＦＰ」；−７ＧＦＰ）；および−３０ＧＦＰと混合したｓｆＧＦＰをここに示す。
【０２９２】
図６は、過剰に正に荷電されたＧＦＰがｓｉＲＮＡを結合することを明示している。＋３６ＧＦＰとｓｉＲＮＡとの結合化学量論比を、様々な比率のこれら２成分を（２５℃で３０分）混合し、３％アガロースゲル上でその混合物を泳動させること（Ｋｕｍａｒら、２００７，Ｎａｔｕｒｅ，４４９：３９；参考として本明細書に援用されている）によって決定した。試験した＋３６ＧＦＰ：ｓｉＲＮＡの比率は、０：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５および１：１０であった。＋３６ＧＦＰ／ｓｉＲＮＡ複合体は、アガロースゲル中でｓｉＲＮＡと共に移動しなかった。＋３６ＧＦＰは、約１：３の化学量論比でｓｉＲＮＡと安定な複合体を形成することが明らかになった。これは、１個の過剰に荷電されたＧＦＰがおおよそ３個のｓｉＲＮＡ分子を結合することを示している。この特性により、過剰に正に荷電されたＧＦＰの少ない量の適用で細胞に有効にｓｉＲＮＡを送達することができる。さらに、送達試薬が蛍光性であるため、および従って、送達試薬を蛍光顕微鏡検査によって観察できるため、この顕微鏡技術を用いてｓｉＲＮＡ送達を評価することができる。対照的に、過剰に正に荷電されていないタンパク質は、ｓｉＲＮＡを結合しなかった。５０：１比のｓｆＧＦＰ：ｓｉＲＮＡも試験したが、そのように高い過剰レベルででさえ、ｓｆＧＦＰはｓｉＲＮＡと会合しなかった。
【０２９３】
図７は、過剰に正に荷電されたＧＦＰが、細胞を透過することを明示している。ＨｅＬａ細胞を１ｎＭ  ＧＦＰと共に３時間インキュベートし、洗浄し、固定し、染色した。この実験では３つのＧＦＰ変異体を試験した：ｓｆＧＦＰ（−７）、−３０ＧＦＰおよび＋３６ＧＦＰ。＋３６ＧＦＰは、数分以内に強力にＨｅＬａ細胞を透過するが、ｓｆＧＦＰおよび−３０ＧＦＰはしないことが明らかになった。細胞膜で始まり、点状になり、そしてその後、細胞内への局在が明らかになった。＋３６ＧＦＰは、ＨｅＬａ細胞において５日以上の間、安定であることが明らかになった。結果を図７に示す。細胞の位置をはっきりと示すためのＤＮＡのＤＡＰＩ染色が左側にある。どこでＧＦＰの細胞取り込みが発生するのかを示すためのＧＦＰ染色が中央にある。局在を発生につれて示す動画が右側にある。
【０２９４】
ｓｉＲＮＡ送達のための過剰に正に荷電されたＧＦＰの利用を実証するために、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞において、リポフェクタミン２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、一般に使用されている市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬、を使用して、ｓｉＲＮＡトランスフェクション効率を、過剰に正に荷電されたＧＦＰベースのｓｉＲＮＡトランスフェクションと比較した。
【０２９５】
一般に、１ｍＬの総体積での細胞培養条件については、細胞を１０％血清／培地中、約８０％集密まで平板培養する。血清／培地溶液を除去し、細胞をＰＢＳおよび５００μＬの無血清培地で２回洗浄する。別の器に５００μＬの無血清培地を添加し、それに１μＬの５０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液（総濃度１００ｎＭ）および１．６６μＬの１５μＭ  ｓｃ（＋３６）ＧＦＰ（総濃度４０ｎＭ）を添加する。反転によって内容物を混合し、５分間、インキュベートさせておく。そのような時間の後、その混合物を、５００μＬの無血清培地が入っているウエルに添加して、５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡおよび２０ｎＭ  ｓｃＧＦＰの最終濃度を得る。この溶液を３７℃のインキュベーター（５％ＣＯ２）の中に４時間置き、取り出し、ＰＢＳで２回洗浄する。その後、１ｍＬ  １０％ＦＢＳ／培地で細胞を処理する。細胞を４日間インキュベートさせておき、その後、回収して遺伝子ノックダウンを測定した。
【０２９６】
図８は、過剰に正に荷電されたＧＦＰがｓｉＲＮＡをヒト細胞に送達できることを明示している。詳細には、＋３６ＧＦＰはｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達することが明らかになった。＋３６ＧＦＰは、リポフェクタミンより大量のｓｉＲＮＡをはるかに高いトランスフェクション効率で送達した。ＨｅＬａ細胞を、約２μＭ  リポフェクタミン２０００および５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または３０ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。リポフェクタミンとは異なり、＋３６ＧＦＰは、特に、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質の添加により、細胞毒性を誘導しなかった。
【０２９７】
核酸送達のための過剰に荷電されたタンパク質の幅広い使用効果を実証するために、カチオン性脂質ベースのｓｉＲＮＡトランスフェクションに対して耐性である細胞を含む様々な細胞でこの実験を繰り返した。図９〜１１は、過剰に正に荷電されたＧＦＰが、従来のトランスフェクション法に対して耐性である細胞系にｓｉＲＮＡを送達できることを明示している。図９は、過剰に正に荷電されたＧＦＰが、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞前駆細胞（「３Ｔ３Ｌ細胞」）にｓｉＲＮＡを送達できることを明示している。３Ｔ３Ｌ細胞を、約２μＭ  リポフェクタミン２０００および５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または３０ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞前駆細胞は、リポフェクタミンによって然程トランスフェクトされなかったが、＋３６ＧＦＰによって効率的にトランスフェクトされた。Ｈｏｅｓｃｈｔチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきりと示し；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化し；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。リポフェクタミンとは異なり、＋３６ＧＦＰは、特に、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質の添加により、細胞毒性を誘導しなかった。
【０２９８】
図１０は、過剰に正に荷電されたＧＦＰが、ラットＩＭＣＤ細胞にｓｉＲＮＡを送達できることを明示している。ラットＩＭＣＤ細胞を、約２μＭ  リポフェクタミン２０００および５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または２０ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。ラットＩＭＣＤ細胞は、リポフェクタミンによって然程トランスフェクトされなかったが、＋３６ＧＦＰでは効率的にトランスフェクトされた。Ｈｏｅｓｃｈｔチャンネル、
青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきりと示し；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化し；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。リポフェクタミンとは異なり、＋３６ＧＦＰは、特に、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質の添加により、細胞毒性を誘導しなかった。
【０２９９】
図１１は、過剰に正に荷電されたＧＦＰがヒトＳＴ１４ＡニューロンにｓｉＲＮＡを送達できることを明示している。ヒトＳＴ１４Ａニューロンを、約２μＭ  リポフェクタミン２０００および５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（左）；または５０ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭ（１２５ｐｍｏｌ）Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ（右）のいずれかで処理した。ヒトＳＴ１４Ａニューロンは、リポフェクタミンによって弱くトランスフェクトされたが、＋３６ＧＦＰによって効率的にトランスフェクトされた。ＤＡＰＩチャンネル、青色、を用いてＤＮＡを可視化し、それによって細胞の位置をはっきりと示し；Ｃｙ３チャンネル、赤色、を用いてＣｙ３タグ付きｓｉＲＮＡを可視化し；ＧＦＰチャンネル、緑色、を用いてＧＦＰを可視化した。黄色は、ｓｉＲＮＡとＧＦＰの間の共局在部位を示す。図９〜１１に提示したものに類似した結果が、従来のトランスフェクション法に対して耐性である２つの他の細胞タイプ（すなわち、ジャーカット細胞およびＰＣ１２細胞）において観察された。リポフェクタミンとは異なり、＋３６ＧＦＰは、特に、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質の添加により、細胞毒性を誘導しなかった。
【０３００】
図１３は、ｓｉＲＮＡトランスフェクション実験のフローサイトメトリー分析を提示するものである。それぞれのカラムは、異なるトランスフェクション法：リポフェクタミン（青色）；および２０ｎＭの＋３６ＧＦＰ（赤色）、で行った実験に対応する。それぞれのチャートは、異なる細胞タイプ：ＩＭＣＤ細胞、ＰＣ１２細胞、ＨｅＬａ細胞、３Ｔ３Ｌ細胞、およびジャーカット細胞、で行った実験に対応する。Ｘ軸は、ｓｉＲＮＡ蛍光の読み取り値である、Ｃｙ３チャンネルから得られた測定値を表す。Ｙ軸は、フローサイトメトリー実験における細胞数を表す。フロー・サイトメトリー・データは、リポフェクタミンより＋３６ＧＦＰを使用したほうが細胞がｓｉＲＮＡで効率的にトランスフェクトされたことを示している。
【０３０１】
遺伝子発現を抑制する＋３６ＧＦＰ送達ｓｉＲＮＡの有効性を実証するために、ＧＡＰＤＨの細胞レベルをウエスタンブロットによって調査した。図１３に示すように、＋３６ＧＦＰは、ｓｉＲＮＡを細胞に有効に送達し、リポフェクタミンのものに匹敵するレベルでＧＡＰＤＨを抑制した。約２μＭ  リポフェクタミン２０００（黒色棒）または２０ｎＭの＋３６ＧＦＰ（緑色棒）のいずれかを使用して、５０ｎＭ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを５つの異なる細胞タイプ（ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３Ｌ、ＰＣ１２、およびジャーカット細胞系）にトランスフェクトした。Ｙ軸は、チューブリンタンパク質レベルの関数としてＧＡＰＤＨタンパク質レベルを表す。
【０３０２】
図１４は、過剰に正に荷電されたＧＦＰによって媒介されるｓｉＲＮＡトランスフェクションに対する細胞透過性の様々なメカニズムプローブの効果を実証するものである。ＨｅＬａ細胞を様々なプローブのうちの１つで３０分間処理し、その後、５ｎＭの＋３６ＧＦＰで処理した。その後、細胞をヘパリン＋プローブで洗浄し、ＰＢＳ＋プローブ中でイメージングした。サンプルは、次のものを含んだ：プローブなし；４℃プレインキュベーション（エネルギー依存性プロセスを阻害する）；１００ｍＭ  スクロース（クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害する）；２５μｇ／ｍＬ  ナイスタチン（カベオラ機能を破壊する）；２５μＭ  サイトカラシンＢ（マクロピノサイトーシスを阻害する）；および５μＭ  モネンシン（エンドソーム受容体再循環を阻害する）。４℃での実験は、＋３６ＧＦＰの細胞透過がエネルギー消費を必要とすることを明示している。スクロースおよ
びナイスタチンでの実験は、＋３６ＧＦＰの細胞取り込みがクラスリン媒介エンドサイトーシスおよびカベオラエンドサイトーシスを必要としないことを明示している。サイトカラシンＢおよびモネンシンでの実験は、＋３６ＧＦＰの細胞取り込みがマクロピノサイトーシスを必要としないが、初期エンドソームを必要とする可能性が高いことを明示している。
【０３０３】
図１５は、細胞透過活性に寄与する要因を実証するものである。電荷密度が細胞透過活性の一因となることが明らかになった。例えば、６０ｎＭ  Ａｒｇ６はｓｉＲＮＡをトランスフェクトしないことが明らかになった。電荷の大きさが細胞透過活性の一因となることが明らかになった。例えば、＋１５ＧＦＰは、細胞を透過せず、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしないことが明らかになった。「タンパク質様」特性も細胞透過活性の一因となることが明らかになった。例えば、６０ｎＭのＬｙｓ２０〜５０は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしないことが明らかになった。本発明は、いくつかの実施形態において、電荷密度がタンパク質を細胞に透過させるために十分なものではないことを実証する。本発明は、いくつかの状況において、電荷の大きさがタンパク質を細胞に透過させるために十分なものではないが必要である場合があることを実証する。本発明は、さらに、一部のタンパク質様特徴が細胞透過の一因となる場合があることをさらに証明する。
【０３０４】
実施例３：過剰に荷電された緑色蛍光タンパク質による哺乳動物細胞透過、ｓｉＲＮＡトランスフェクション、およびＤＮＡトランスフェクション
最近、本発明者らは、タンパク質を、非保存、溶媒露出残基の広範囲の変異誘発による、それらの構造または機能を損なわない、タンパク質の表面置換（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を記載した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＫＪ，Ｌｉｕ  ＤＲ（２００７）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃａｎ  ｉｍｐａｒｔ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１０１１０−１０１１２；国際ＰＣＴ特許出願、２００７年１２月１３日にＷＯ  ２００７／１４３５７４として発行された、２００７年６月１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０７／７０２５４；米国特許仮出願、２００６年６月２日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８１０，３６４および２００６年８月９日出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８３６，６０７；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。置換残基がすべて正電荷またはすべて負電荷を有する場合、結果として生ずる「過剰に荷電された」タンパク質は、それらの活性を維持しながら、強い耐凝集性、および反対の電荷を有する高分子に結合する能力などの、並はずれた特性を得ることができる。例えば、本発明者らは、＋３６正味理論電荷を有する緑色蛍光タンパク質（＋３６ＧＦＰ）が高耐凝集性であり、煮沸および冷却された後でさえ蛍光を保持することができ、ならびに静電相互作用によってＤＮＡおよびＲＮＡと可逆的に複合体を形成することを報告した。
【０３０５】
ＨＩＶ  Ｔａｔに由来するペプチド（Ｆｒａｎｋｅｌ  ＡＤ，Ｐａｂｏ  ＣＯ（１９８８）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ．Ｃｅｌｌ  ５５：１１８９−１１９３；Ｇｒｅｅｎ  Ｍ，Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  ＰＭ（１９８８）Ａｕｔｏｍｏｎｏｕｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔａｔ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ  ５５：１１７９−１１８８；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）およびアンテナペディアホメオドメインからのペネトラチン（Ｔｈｏｒｅｎ  ＰＥ，Ｐｅｒｓｓｏｎ
Ｄ，Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｍ，Ｎｏｒｄｅｎ  Ｂ（２０００）Ｔｈｅ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ−ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４８２：２６５−２６８；参考として本明細書に
援用されている）をはじめとする、哺乳動物細胞を透過する能力を有する様々なカチオン性ペプチドが、以前に記載されている。Ｓｃｈｅｐａｒｔｚおよび共同研究者は、タイプＩＩポリプロリンらせん内に包埋された最小カチオン性モチーフを含有する小さな、フォールディングしたタンパク質が、真核細胞を効率的に透過することを、最近、明らかにした（Ｄａｎｉｅｌｓ  ＤＳ，Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ  Ａ（２００７）Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＰＰＩＩ  ｍｏｔｉｆ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９：１４５７８−１４５７９；Ｓｍｉｔｈ  ＢＡ，Ｄａｎｉｅｌｓ  ＤＳ，Ｃｏｐｌｉｎ  ＡＥ，Ｊｏｒｄａｎ  ＧＥ，ＭｃＧｒｅｇｏｒ  ＬＭら，（２００８）Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｖｉａ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０：２９４８−２９４９；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。Ｒａｉｎｅｓおよび共同研究者は、細胞を透過する能力を付与する表面露出ポリアルギニンパッチを有するタンパク質を、最近作った（Ｆｕｃｈｓ  ＳＭ，Ｒａｉｎｅｓ  ＲＴ（２００７）Ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｔｏ  ｅｎｄｏｗ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２：１６７−１７０；Ｆｕｃｈｓ  ＳＭ，  Ｒｕｔｋｏｓｋｉ  ＴＪ，Ｋｕｎｇ  ＶＭ，Ｇｒｏｅｓｃｈｌ  ＲＴ，Ｒａｉｎｅｓ  ＲＴ（２００７）Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｇｒａｆｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２０：５０５−５０９；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。これらの研究にかんがみて、本発明者らは、＋３６ＧＦＰなどの過剰に正に荷電されたタンパク質が、細胞膜の負電荷を有する成分と、細胞透過を生じさせるように会合し得るという仮説を立てた。
【０３０６】
本実施例において、本発明者らは、＋１５、＋２５および＋３６の正味電荷を有する過剰に正に荷電されたＧＦＰ変異体の細胞透過特性を説明する。本発明者らは、＋３６ＧＦＰが、硫酸化ペプチドグリカン媒介、アクチン依存性エンドサイトーシスによって細胞に強力に進入することを発見した。ｓｉＲＮＡと予備混合したとき、＋３６ＧＦＰは、カチオン性脂質媒介トランスフェクションに対して耐性であることが知られている幾つかのものを含む様々な細胞系に、有効におよび細胞毒性を伴わずに、ｓｉＲＮＡを送達する。＋３６ＧＦＰを使用して細胞に送達されたｓｉＲＮＡは、試験した５つの哺乳動物細胞のうち４つで遺伝子サイレンシングを果たすことができた。＋３６ＧＦＰのｓｉＲＮＡトランスフェクション能力と、匹敵するまたはより大きい電荷の大きさおよび電荷密度の幾つかの合成ペプチドのものとの比較は、観察されたｓｉＲＮＡ送達方式が、カチオン性ペプチドには存在しない＋３６ＧＦＰのタンパク質様特性を必要とし得ることを示唆している。血球凝集素に由来するエンドソーム溶解性ペプチドに融合すると、＋３６ＧＦＰは、カチオン性脂質媒介トランスフェクションを受けにくい幾つかの細胞系にプラスミドＤＮＡを、プラスミドベースの遺伝子発現を可能にするように、トランスフェクトすることもできる。
【０３０７】
結果
過剰に荷電されたＧＦＰによる哺乳動物細胞透過
本発明者らは、蛍光を保持する−３０から＋４８にわたる理論正味電荷を有する「スーパーフォルダーＧＦＰ」（ｓｆＧＦＰ）（Ｐｅｄｅｌａｃｑ  ＪＤ，Ｃａｂａｎｔｏｕｓ
Ｓ，Ｔｒａｎ  Ｔ，Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ＴＣ，Ｗａｌｄｏ  ＧＳ（２００６）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：７９−８８；参考として本明細書に援用されている）の一連の表面置換変異体を以前に生成し、特性付けした（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ，Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓ  ＫＪ，Ｌｉｕ  ＤＲ（２００７）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃａｎ  ｉｍｐａｒｔ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９：１０１１０−１０１１２；参考として本明細書に援用されている）。哺乳動物細胞を透過するこれらの過剰に荷電されたＧＦＰの能力の評価には、表面に結合した非内在化ＧＦＰを除去する方法が必要である。従って、本発明者らは、細胞から表面に結合したカチオン性タンパク質を除去することが知られている洗浄条件（Ｐｅｄｅｌａｃｑ  ＪＤ，Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  Ｓ，Ｔｒａｎ  Ｔ，Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ＴＣ，Ｗａｌｄｏ  ＧＳ（２００６）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：７９−８８）が、細胞表面に結合した、過剰に正に荷電されたＧＦＰも有効に除去することを確認した。本発明者らは、細胞の外側に＋３６ＧＦＰを結合させるが内在化を阻止する温度である４℃（下記参照）で、＋３６ＧＦＰでＨｅＬａ細胞を処理した。細胞を４℃で、ＰＢＳでまたはヘパリンを含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＧＦＰ蛍光についてのフローサイトメトリーによって分析した。ＰＢＳで洗浄した細胞は、（おそらく表面に結合した）ＧＦＰの有意なレベルを有することが判明したが、ヘパリンを含有するＰＢＳで洗浄した細胞は、未処理細胞のものに非常に類似したＧＦＰ蛍光強度を示した（図２２）。表面に結合した、過剰に正に荷電されたＧＦＰの除去に対するヘパリンでの３回の洗浄の有効性が、これらの観察によって裏付けられた。
【０３０８】
次に、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞を１０〜５００ｎＭ  ｓｆＧＦＰ（−７の理論正味電荷）、−３０ＧＦＰ、＋１５ＧＦＰ、＋２５ＧＦＰ、または＋３６ＧＦＰと共に４時間、３７℃でインキュベートした（図１６Ａ）。インキュベーション後、ヘパリンを含有するＰＢＳで細胞を３回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。ｓｆＧＦＰまたは−３０ＧＦＰで処理した細胞では、検出可能な内在化タンパク質が観察されなかった。しかし、＋２５ＧＦＰまたは＋３６ＧＦＰで処理したＨｅＬａ細胞は、高レベルの内在化ＧＦＰを含有することが判明した。対照的に、＋１５ＧＦＰで処理した細胞は、１０分の１の内在化ＧＦＰを含有した。これは、正電荷の大きさが有効な細胞透過の重要な決定要素であることを示している（図１６Ｂ）。本発明者らは、＋３６ＧＦＰが、１０ｎＭほども低い濃度でさえ、ＨｅＬａ細胞を容易に透過することを発見した（図２３）。
【０３０９】
＋３６ＧＦＰによる細胞透過の一般性を試験するために、本発明者らは、４つの追加の哺乳動物細胞タイプ：髄質内層集合管（ＩＭＣＤ）細胞、３Ｔ３−Ｌ脂肪細胞前駆体、ラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞、およびジャーカットＴ細胞、を使用してこれらの実験を繰り返した。フローサイトメトリー分析は、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰが、試験した５つすべての細胞タイプを有効に透過したことを示した（図１６Ｃ）。安定付着ＨｅＬａ、ＩＭＣＤおよび３Ｔ３−Ｌ細胞系における＋３６ＧＦＰの内在化を蛍光顕微鏡検査によって確認した（下記参照）。実時間イメージングは、真核細胞による取り込みと一致して、＋３６ＧＦＰがＨｅＬａ細胞の細胞膜に迅速に結合し、細胞の内部に移動する点状巣として数分以内に内在化し、大きな巣へと統合することを示した。
【０３１０】
＋３６ＧＦＰ細胞透過のメカニズムプローブ
＋３６ＧＦＰが細胞に入るメカニズムを例証するために、本発明者らは、それぞれがエンドサイトーシス経路の異なる成分を阻止する様々な条件下で、ＨｅＬａ細胞において細胞透過実験を繰り返した（Ｐａｙｎｅ  ＣＫ，Ｊｏｎｅｓ  ＳＡ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，Ｚｈｕａｎｇ  Ｘ（２００７）Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ８：３８９−４０１；Ｖｅｌｄｈｏｅｎ  Ｓ，Ｌａｕｆｅｒ  ＳＤ，Ｔｒａｍｐｅ  Ａ，Ｒｅｓｔｌｅ
Ｔ（２００６）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：６５６１−６５７３；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）。＋３６ＧＦＰ処理前および中にＨｅＬａ細胞を４℃に冷却したとき、＋３６ＧＦＰの細胞透過は、観察されなかった（図１７Ｂ）。この結果は、＋３６ＧＦＰの取り込みが、エンドサイトーシスと一致して、エネルギー依存性プロセスを必要とすることを示唆している（Ｄｅｓｈａｙｅｓ  Ｓ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＭＣ，Ｄｉｖｉｔａ  Ｇ，Ｈｅｉｔｚ  Ｆ（２００５）Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６２：１８３９−１８４９；参考として本明細書に援用されている）。次に、本発明者らは、５μｇ／ｍＬのフィリピンまたは２５μｇ／ｍＬのナイスタチン（カベオリン依存性エンドサイトーシスを阻害することが知られている小分子）の効果を評価した。いずれの阻害剤も、＋３６ＧＦＰ内在化を有意に改変しなかった（それぞれ、図１７Ｃおよび１７Ｄ）。クロルプロマジン（クラスリン媒介エンドサイトーシスの公知阻害剤）での処理は、同様に、＋３６ＧＦＰ細胞透過に対して殆ど効果がなかった（図１７Ｅ）。加えて、５０ｎＭの＋３６ＧＦＰと１０μｇ／ｍＬの蛍光標識トランスフェリン（クラスリン依存的様式で内在化されることが知られているタンパク質（Ｈｏｐｋｉｎｓ  ＣＲ，Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ
ＩＳ（１９８３）Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ａ４３１  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ  ９７：５０８−５２１；参考として本明細書に援用されている））でのＨｅＬａ細胞の同時処理は、ＧＦＰ／トランスフェリン共局在を殆ど生じさせなかった（図１７Ｆ）。しかし、サイトカラシンＤ（アクチン重合阻害剤）での処理は、＋３６ＧＦＰ細胞透過を有意に減少させた（図１７Ｇ）。考え合わせると、これらの結果は、＋３６ＧＦＰ取り込みが、エネルギー依存性であるエンドサイトーシス経路によって進行し、アクチン重合を必要とし、クラスリンまたはカベオリンを必要としないモデルと一致する。
【０３１１】
カチオン性ペプチドの細胞取り込みのメカニズムに関する以前の研究（Ｐａｙｎｅ  ＣＫ，Ｊｏｎｅｓ  ＳＡ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，Ｚｈｕａｎｇ  Ｘ（２００７）Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ  ８：３８９−４０１；Ｆｕｃｈｓ  ＳＭ，Ｒａｉｎｅｓ
ＲＴ（２００４）Ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ  ｅｎｔｒｙ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：２４３８−２４４４；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）に基づいて、本発明者らは、アニオン性細胞表面プロテオグリカンが、＋３６ＧＦＰ内在化を媒介するために受容体としての役割を果たし得るという仮説を立てた。この仮説を調査するために、本発明者らは、８０ｍＭ  塩素酸ナトリウム（硫酸化プロテオグリカンの生合成に必要な酵素であるＡＴＰスルフリラーゼの阻害剤（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ，Ｈｕｔｔｎｅｒ
ＷＢ（１９８６）Ｃｈｌｏｒａｔｅ−ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １４１：８７０−８７７；参考として本明細書に援用されている））でＨｅＬａ細胞を前処理した。これらの条件は、＋３６ＧＦＰ透過を完全に阻止した（図１７Ｈ）。＋３６ＧＦＰ取り込みにおいてプロテオグリカンが果たす役割のさらなる調査として、本発明者らは、野生型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における内在化を、キシロシルトランスフェラーゼ（グリコサミノグリカン合成に必要な酵素）を欠くプロテオグリカン欠失ＣＨＯ細胞（ＰＧＤ−ＣＨＯ）と比較した。野生型ＣＨＯ細胞（図１７Ｉ）は、＋３６ＧＦＰを効率的に内在化したが、ＰＤＧ−
ＣＨＯ細胞（図１７Ｊ）はしなかった。これらの知見は、哺乳動物細胞の＋３６ＧＦＰ透過が硫酸化細胞表面ペプチドグリカンへの結合を必要とすることを示唆している。
【０３１２】
＋３６ＧＦＰはｓｉＲＮＡに結合し、様々な哺乳動物細胞系にｓｉＲＮＡを送達する
本発明者らは、ＤＮＡおよびｔＲＮＡと複合体を形成する、過剰に正に荷電されたタンパク質の能力を観察した（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、（２００７）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃａｎ  ｉｍｐａｒｔ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９：１０１１０−１０１１２；参考として本明細書に援用されている）。これらの結果にかんがみて、本発明者らは、ｓｉＲＮＡにインビトロで結合する＋１５、＋２５および＋３６ＧＦＰの能力を様々な化学量論比で評価した。ゲルシフトアッセイ（Ｋｕｍａｒ  Ｐ，Ｗｕ  Ｈ，ＭｃＢｒｉｄｅ  ＪＬ，Ｊｕｎｇ  ＫＥ，Ｋｉｍ  ＭＨら、（２００７）Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３９−４３；参考として本明細書に援用されている）を用いて、本発明者らは、＋２５および＋３６ＧＦＰのｓｉＲＮＡへの結合を約２：１の化学量論比で観察したが、単一のｓｉＲＮＡ分子と複合体を形成するために平均して５個より多くの＋１５ＧＦＰタンパク質を必要とした（図１８Ａ）。対照的に、１００当量のｓｆＧＦＰは、このアッセイ条件下でｓｉＲＮＡに検出可能に結合しなかった。
【０３１３】
次に、本発明者らは、結合したｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達する＋１５、＋２５および＋３６ＧＦＰの能力を調査した。Ｃｙ３に結合体化しているＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）を２００ｎＭの＋３６ＧＦＰと短時間、混合し、結果として得られた混合物を無血清培地中の細胞に４時間にわたって添加した。それらの細胞を、ヘパリンを含有するＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ取り込みについてフローサイトメトリーによって分析した。本発明者らは、＋２５および＋３６ＧＦＰが、ｓｉＲＮＡのみでの処理よりそれぞれ１００および１０００倍多くｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達すること（図３Ｂ）、および一般的なカチオン性脂質トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００での送達より約２０倍多くｓｉＲＮＡを送達すること（図１８Ｃ）を観察した。対照的に、＋１５ＧＦＰは、ＨｅＬａ細胞にｓｉＲＮＡを効率的にトランスフェクトしなかった（図１８Ｂ）。
【０３１４】
ＨｅＬａ細胞に加えて、＋３６ＧＦＰは、ＩＭＣＤ細胞、３Ｔ３−Ｌ脂肪細胞前駆体、ラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞、およびジャーカットＴ細胞（リポフェクタミン２０００を使用するｓｉＲＮＡトランスフェクションに対して耐性である４つの細胞系統）（Ｃａｒｌｏｔｔｉ  Ｆ，Ｂａｚｕｉｎｅ  Ｍ，Ｋｅｋａｒａｉｎｅｎ  Ｔ，Ｓｅｐｐｅｎ  Ｊ，Ｐｏｇｎｏｎｅｃら、（２００４）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  ｍａｔｕｒｅ  ３ＴＬ−Ｌ１  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９：２０９−２１７；Ｍａ  Ｈ，Ｚｈｕ
Ｊ，Ｍａｒｏｎｓｋｉ  Ｍ，Ｋｏｔｚｂａｕｅｒ  ＰＴ，Ｌｅｅ  ＶＭ，Ｄｉｃｈｔｅｒ  ＭＡら、（２００２）Ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１２：１−５；ＭｃＭａｎｕｓ  ＭＴ，Ｈａｉｎｅｓ  ＢＢ，Ｄｉｌｌｏｎ  ＣＰ，Ｗｈｉｔｅｈｕｒｓｔ
ＣＥ，ｖａｎ  Ｐａｒｉｊｓ  Ｌら、（２００２）Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５７５４−５７６０；Ｓｔｒａｉｔ  ＫＡ，Ｓｔｒｉｃｋｌｅｔｔ  ＰＫ，Ｋｏｈａｎ  ＪＬ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＢ，Ｋｏｈａｎ  ＤＥ（２００７）Ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ
−１  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｎｎｅｒ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  ｄｕｃｔ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３：Ｆ６０１−６０６；これらのそれぞれが参考として本明細書に援用されている）内にｓｉＲＮＡを効率的に送達することができた。リポフェクタミン２０００およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡでの処理は、ＨｅＬａ細胞内への効率的なｓｉＲＮＡ送達を生じさせたが、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞へのｓｉＲＮＡの有意な送達は生じさせなかった（図１８Ｃ）。Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）（別のカチオン性脂質トランスフェクション剤）およびＣｙ３−ｓｉＲＮＡでのＩＭＣＤまたは３Ｔ３−Ｌ細胞の処理も、これらの細胞への有意なｓｉＲＮＡ送達を生じさせなかった（図２４）。対照的に、＋３６ＧＦＰおよびＣｙ３−ｓｉＲＮＡでの処理は、試験した５つすべての細胞系において有意なｓｉＲＮＡレベルを生じさせた（図１８Ｃ）。リポフェクタミン２０００と比較して、＋３６ＧＦＰは、すべての場合、２０から２００倍高いＣｙ３シグナルレベルを生じさせた。非内在化＋３６ＧＦＰの除去に対する３回のヘパリン洗浄の有効性に基づき（図２２）、本発明者らは、これらのより高いＣｙ３レベルの原因が、細胞表面に結合した＋３６ＧＦＰ／Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ複合体にではなくより高い内在化Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡレベルにあるとした。この解釈と一致して、この研究において使用した付着細胞系（ＨｅＬａ、ＩＭＣＤおよび３Ｔ３−Ｌ）の蛍光顕微鏡検査は、本発明者らがエンドソームであると考える点状巣に内在化したＣｙ３−ｓｉＲＮＡおよび＋３６ＧＦＰを示した（図１８Ｄ）。ひとまとめにして、これらの結果は、＋３６ＧＦＰが、一般に用いられているカチオン性脂質トランスフェクション試薬によってあまりトランスフェクトされない幾つかのものを含む様々な哺乳動物細胞系にｓｉＲＮＡを有効に送達できることを示している。
【０３１５】
サイトカラシンＤの存在下で、または４℃で、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰと５０ｎＭのＣｙ３−ｓｉＲＮＡを含有する予め混合した溶液でＨｅＬａ細胞を処理したとき、内在化したＧＦＰおよびＣｙ３  ｓｉＲＮＡは、一切、観察されなかった（図３０）。これらのデータは、ｓｉＲＮＡ不在下での＋３６ＧＦＰの本発明者らのメカニズムの研究と一致して、エンドサイトーシスおよびアクチン重合に依存するｓｉＲＮＡ送達のメカニズムを裏付ける。
【０３１６】
＋３６ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ複合体のサイズおよび細胞毒性
トランスフェクションのための用いたものと同一の化学量論比を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）により、＋３６ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ複合体を分析した。２０μＭの＋３６ＧＦＰおよび５μＭのｓｉＲＮＡを含有する混合物から、本発明者らは、顕微鏡検査データ（図３１Ｂ）と一致して、８８０．６±６２．２ｎｍの流体力学的半径（Ｈｒ）を有する粒子の完全単分散集団を観察した（図３１Ａ）。これらの観察は、＋３６ＧＦＰが、ｓｉＲＮＡと混合すると大きな粒子を形成する（カチオン性送達試薬を使用する以前の研究者によって観察された現象；Ｄｅｓｈａｙｅｓら、２００５，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６２：１８３９−４９；およびＭｅａｄｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，２００８，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，６０：５３０−３６；これらの両方が参考として本明細書に援用されている）可能性を実証している。
【０３１７】
＋３６ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ複合体の細胞毒性を評価するために、本発明者らは、０．２から２μＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡでの処理の２４時間後に５つすべての細胞系に関してＭＴＴアッセイを行った。これらのアッセイは、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２またはジャーカット細胞に対して有意で明白な細胞毒性を示さなかった（図２５Ａ）。
【０３１８】
＋３６ＧＦＰ送達ｓｉＲＮＡでの遺伝子サイレンシング
上の結果は、様々な哺乳動物細胞にｓｉＲＮＡを送達する＋３６ＧＦＰの能力を実証し
ているが、それらは、遺伝子サイレンシングについてのこのｓｉＲＮＡの利用可能性を確立していない。細胞内＋３６ＧＦＰの点状局在（図１８Ｄ）に基づいて、本発明者らは、遺伝子サイレンシングが、エンドソームから＋３６ＧＦＰによってトランスフェクトされたｓｉＲＮＡの少なくとも部分的な脱出を必要とすると予想した。＋３６ＧＦＰで送達されたｓｉＲＮＡの遺伝子抑制活性を評価するために、本発明者らは、５０ｎＭのＧＡＰＤＨターゲッティングｓｉＲＮＡと、約２μＭのリポフェクタミン２０００または２００ｎＭの＋３６ＧＦＰのいずれかとを含有する溶液で、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞を処理した。細胞を４時間、そのｓｉＲＮＡトランスフェクション溶液に暴露し、その後、４日までの間、増殖させた。
【０３１９】
ＨｅＬａ細胞において観察されたＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの低下は、リポフェクタミン２０００と＋３６ＧＦＰの両方が、同様の動態でＧＡＰＤＨ発現の効率的なｓｉＲＮＡ誘導抑制を媒介することを示している。リポフェクタミン２０００または＋３６ＧＦＰで送達されたＧＡＰＤＨターゲッティングｓｉＲＮＡは、７２時間後にＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルの約８５％低下を生じさせた（図１９Ａ）。類似して、約７５％のＧＡＰＤＨタンパク質レベル低下が、リポフェクタミン２０００または＋３６ＧＦＰでのｓｉＲＮＡ送達の９６時間後にＨｅＬａ細胞において観察された（図１９Ｂ）。類似して、約２μＭのリポフェクタミン２０００または２００ｎＭの＋３６ＧＦＰいずれかでのβ−アクチンターゲッティングｓｉＲＮＡの送達は、両方のトランスフェクション剤について７０〜７８％のβ−アクチンタンパク質レベル低下をＨｅＬａ細胞において生じさせた（図１９Ｂ）。
【０３２０】
ＨｅＬａ細胞における遺伝子抑制の効率とは対照的に、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２およびジャーカット細胞におけるリポフェクタミン２０００および５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡでの処理は、これらの細胞系のカチオン性脂質媒介トランスフェクションに対する耐性（図１８Ｃ）と一致して、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルの有意な低下をもたらさなかった（図１９Ｃ）。しかし、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡでの処理は、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−ＬおよびＰＣ１２細胞においてＧＡＰＤＨタンパク質レベルの４４〜６０％抑制を生じさせた（図１９Ｃ）。＋３６ＧＦＰによる効率的なｓｉＲＮＡ送達（図１８Ｃ）にもかかわらず、本発明者らは、ジャーカット細胞においてＧＡＰＤＨ発現の有意なｓｉＲＮＡ媒介抑制を観察しなかった（図１９Ｃ）。
【０３２１】
本発明者らは、エンドソームからの＋３６ＧＦＰ送達ｓｉＲＮＡの脱出の増進は遺伝子サイレンシングの有効性を増大させるだろうと推測した。エンドサイトーシス性小胞を化学的に破壊しようとして、クロロキン、エンドソーム溶解活性を有することが知られている小分子（Ｅｒｂａｃｈｅｒ  Ｐ，Ｒｏｃｈｅ  ＡＣ，Ｍｏｎｓｉｇｎｙ  Ｍ，Ｍｉｄｏｕｘ  Ｐ（１９９６）Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｂｙ  ＤＮＡ／ｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２２５，１８６−１９４；参考として本明細書に援用されている）または内在化ポリアルギニンのサイトゾル分布を増加させることが証明されているピレン酪酸（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ，Ｋｏｓｕｇｅ  Ｍ，Ｔａｄｏｋｏｒｏ  Ａ，Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｙ，Ｎｉｓｈｉ  Ｍら、（２００６）Ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｐｙｒｅｎｅｂｕｔｙｒａｔｅ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １：２９９−３０３；参考として本明細書に援用されている）と共に、２００ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡで細胞を処理した。＋３６ＧＦＰおよびｓｉＲＮＡを含有する混合物へのこれらの試薬の添加は、試験した細胞系において細胞毒性であることが判明した。加えて、本発明者らは、＋３６ＧＦＰと、エンドソーム分解を増進することが報告されている血球凝集素２（ＨＡ２）
ペプチド（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  Ｐ，Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  Ｓ，Ｓｕｔｌｕ  Ｔ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈ，Ｌａｎｇｅｌ  Ｕ（２００７）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２１：２６６４−２６７１；参考として本明細書に援用されている）とのＣ末端融合体を生成して精製した。＋３６ＧＦＰでの場合と同様に、ＨＡ２融合変異体は、試験した５つの細胞系で低い細胞毒性を示した（図２５Ａ）。＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２融合体でのｓｉＲＮＡの送達は、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、およびＰＣ１２細胞においてＧＡＰＤＨタンパク質レベル低下を生じさせたが、抑制の程度は、＋３６ＧＦＰの使用から生じるものに匹敵していた（図１９Ｃ）。
【０３２２】
併せて、これらの結果は、＋３６ＧＦＰおよび＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２が、ｓｉＲＮＡおよびカチオン性脂質ベースのトランスフェクション剤で処理したときには遺伝子サイレンシングを示さなかった幾つかの細胞系を含む様々な哺乳動物細胞においてｓｉＲＮＡを送達することができ、遺伝子サイレンシングを果たすことができることを示している。
【０３２３】
＋３６ＧＦＰの安定性ならびに＋３６ＧＦＰと複合体を形成しているＲＮＡおよびＤＮＡの安定性
様々な哺乳動物細胞タイプにわたる一般性および低い細胞毒性に加えて、ｓｉＲＮＡ送達剤は、急速分解に対して耐性であり得る。プロテイナーゼＫ（強い、広域スペクトルのプロテアーゼ）での＋３６ＧＦＰの処理は、ウシ血清アルブミンと比較して＋３６ＧＦＰが有意にプロテアーゼ耐性であることを示す。プロテイナーゼＫ消化の１時間後に未切断のＢＳＡは残存しなかったが、１時間後、＋３６ＧＦＰの６８％は未切断のままであり、６時間後、４８％が未切断のままであった（図３２Ａ）。本発明者らは、３７℃で、マウス血清で＋３６ＧＦＰを処理した（図３２Ｂ）。６時間後、有意な分解は観察されなかった。これは、その潜在的インビボ血清安定性を示唆している。対照的に、ウシ血清アルブミンをマウス血清中で同じ期間、インキュベートしたとき、３時間後に７１％分解、そして４時間までに完全な分解が観察された。
【０３２４】
ｓｉＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡを分解から保護する＋３６ＧＦＰの能力を評価した。ｓｉＲＮＡ、または＋３６ＧＦＰと予め複合体を形成していたｓｉＲＮＡを、３７℃で、マウス血清で処理した。３時間後、＋３６ＧＦＰを欠くサンプルではｓｉＲＮＡの５．９％しか無損傷のままでなく、＋３６ＧＦＰと予め複合体を形成していたサンプルではｓｉＲＮＡの３４％が無損傷のままであった（図３２Ｃ）。類似して、プラスミドＤＮＡは、３７℃で３０分後、マウス血清によってほぼ完全に分解されたが、＋３６ＧＦＰと予め複合体を形成していた事実上すべてのプラスミドＤＮＡは、３０分後に無損傷のままであり、プラスミドＤＮＡの８４％は、１時間後に無損傷のままであった（図３２Ｄ）。これらの結果は、併せて、＋３６ＧＦＰが血清媒介ｓｉＲＮＡおよびプラスミドＤＮＡ分解を有意に阻害できることを示している。
【０３２５】
＋３６ＧＦＰと合成カチオン性ペプチドの比較
ｓｉＲＮＡを細胞に送達するそれらの能力を付与する、過剰に正に荷電されたＧＦＰの特徴を調査するために、本発明者らは、２００ｎＭでの＋３６ＧＦＰのｓｉＲＮＡトランスフェクション能力と、２００ｎＭまたは２μＭでの合成カチオン性ペプチドのパネルのものとを比較した。このパネルは、ポリ−（Ｌ）−Ｌｙｓ（ポリペプチドあたり平均約３０のＬｙｓ残基を含有する混合物）、ポリ−（Ｄ）−Ｌｙｓ、Ａｒｇ９、および＋３６ＧＦＰと同じ理論正味電荷およびＬｙｓ：Ａｒｇ比を有する合成＋３６ペプチド（（ＫＫＲ）１１ＲＲＫ）から成った。これらの合成ポリカチオンで処理したＨｅＬａ細胞でのＭＴＴアッセイは、過剰に正に荷電されたＧＦＰのものと一致して、用いた濃度で低い毒性を示した（図２５Ｂ）。フローサイトメトリーによってアッセイすると、＋３６ＧＦＰが効
率的なｓｉＲＮＡ送達を果たすためにまたは＋１５ＧＦＰが検出可能なｓｉＲＮＡ送達を果たすために必要とされるものより１０倍高い濃度で使用したときでさえ、試験した４つの合成ペプチドはいずれも、検出可能な量のＣｙ３−ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に送達しなかった（図２０）。
【０３２６】
＋１５ＧＦＰが、＋２５および＋３６ＧＦＰと比較して低い細胞透過性およびｓｉＲＮＡ結合活性を示すという本発明者らの観察（図１８Ａおよび１８Ｂ）と併せて、これらの結果は、細胞に進入してｓｉＲＮＡを効率的にトランスフェクトする能力を獲得するために十分な正電荷をＧＦＰは有さねばならないが、正電荷の大きさおよび電荷密度はトランスフェクション活性を付与するために十分なものでないことを示している。その代わり、本発明者らの知見は、本発明者らが観察した細胞透過およびｓｉＲＮＡトランスフェクション活性のフルセットを達成するには、サイズ、球形状、または安定性などの＋３６ＧＦＰのタンパク質様特徴が必要とされるであろうということを示唆している。
【０３２７】
プラスミドＤＮＡの＋３６ＧＦＰ媒介トランスフェクション
ｓｉＲＮＡでの場合に類似して、本発明者らは、＋３６ＧＦＰがプラスミドＤＮＡと複合体を形成することをゲルシフトアッセイによって観察した（図２６）。＋３６ＧＦＰが、プラスミドＤＮＡを、プラスミドベースの遺伝子発現を支持するように細胞に送達できるかどうかを試験するために、本発明者らは、リポフェクタミン２０００、＋３６ＧＦＰ、または＋３６ＧＦＰとエンドソーム分解を増進すると報告されている血球凝集素２（ＨＡ２）ペプチド（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら，２００７，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．，２１：２６６４−７１；参考として本明細書に援用されている）とのＣ末端融合体と予備混合したβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドで、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−Ｌ、ＰＣ１２、およびジャーカット細胞を処理した。２４時間後、蛍光原基質ベースのアッセイを用いて細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。
【０３２８】
本発明者らの以前の結果（図１８および１９）と一致して、リポフェクタミン２０００処理は、ＨｅＬａ細胞において有意なβ−ガラクトシダーゼ活性を生じさせたが、ＰＣ１２細胞ではほんのわずかなβ−ガラクトシダーゼ活性しか生じさせず、試験した他の３つの細胞系のいずれにおいても検出可能か活性を生じさせなかった（図２１）。対照的に、２μＭの＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２によって媒介されるプラスミドトランスフェクションは、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤおよび３Ｔ３−Ｌ細胞において有意なβ−ガラクトシダーゼ活性を、およびＰＣ１２細胞においてわずかな活性を生じさせた（図２１）。興味深いことに、プラスミドＤＮＡおよび２μＭの＋３６ＧＦＰでの処理は、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性を生じさせなかった（図２１）。これは、血球凝集素由来のペプチドが、ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングに対するその効果がないことにもかかわらず、ＤＮＡトランスフェクションまたはプラスミドベースの発現効率を増進することを示唆している（図１９Ｃ）。
【０３２９】
これらの結果は、＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２が、カチオン系脂質媒介トランスフェクションに対して耐性の幾つかの細胞系を含む哺乳動物細胞に、プラスミドＤＮＡを、プラスミドベースの遺伝子発現を可能にするように送達できることを示唆している。十分なｓｉＲＮＡトランスフェクションを誘導するために必要とされる＋３６ＧＦＰまたは＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２の量より高濃度の＋３６ＧＦＰ−ＨＡ２が、プラスミドＤＮＡトランスフェクションを媒介するために必要とされる。
【０３３０】
結論
本発明者らは、＋１５、＋２５および＋３６の正味電荷を有する３つの過剰に正に荷電されたＧＦＰ変異体の細胞透過、ｓｉＲＮＡ送達、ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングおよびプラスミドＤＮＡトランスフェクション特定を特性づけした。本発明者らは、＋３
６ＧＦＰが、高細胞透過性であること、およびカチオン性脂質ベースのトランスフェクションに対して耐性のものを含む様々な哺乳動物細胞系に低い細胞毒性でｓｉＲＮＡを効率的に送達できることを発見した。
【０３３１】
メカニズムの研究により、＋３６ＧＦＰが、硫酸化細胞表面プロテオグリカンおよびアクチン重合を必要とするクラスリンおよびカベオリン非依存性エンドサイトーシス経路によって細胞に進入することが明らかになった。この送達経路は、それらの核酸カーゴを局在させる細胞特異的ターゲッティングに依存する真核細胞への核酸送達のための以前に記載された戦略（Ｓｏｎｇら、２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：７０９−１７；Ｋｕｍａｒら、２００７，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：３９−４３；およびＣａｒｄｏｓｏら、２００７，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，９：１７０−８３；これらのすべてが参考として本明細書に援用されている）とは異なる。細胞培養における使用には、および一定のインビボ用途における使用でさえ、核酸送達のための一般的な非細胞タイプ特異的アプローチが望ましいであろう。
【０３３２】
試験した５つの細胞系のうちの４つにおいて、＋３６ＧＦＰ媒介ｓｉＲＮＡ送達は、遺伝子発現の有意な抑制を誘導した。さらに、＋３６ＧＦＰ−血球凝集素ペプチド融合体は、同４細胞系において、プラスミドベースの遺伝子発現を可能にするようにプラスミドＤＮＡトランスフェクションを媒介することができる。２１塩基対の長さのＲＮＡならびに５，０００ｂｐを超える長さのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトする今般実証した能力は、＋３６ＧＦＰおよびその誘導体が一般的な核酸送達ベクターとしての役割を果たし得ることを示唆している。
【０３３３】
多くの従来の送達法は、共有結合的に連結されたトランスフェクション剤−核酸結合体、例えば、カーボンナノチューブ−ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｕら，２００７，Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４６：２０２３−２７；参考として本明細書に援用されている）、ナノ粒子−ｓｉＲＮＡ（Ｒｏｓｉら、２００６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１２：１０２７−３０；参考として本明細書に援用されている）、ＴＡＴペプチド−ｓｉＲＮＡ（Ｆｉｓｈｅｒら、２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２２９８０−８４；参考として本明細書に援用されている）、コレステロール−ｓｉＲＮＡ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１７３−７８；参考として本明細書に援用されている）、および動的ポリコンジュゲート−ｓｉＲＮＡ（Ｒｏｚｅｍａら，２００７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０４：１２９８２−８７；参考として本明細書に援用されている）の合成に依存する。＋３６ＧＦＰの使用は、タンパク質と核酸を互いに混合することしか必要としない。さらに、ここに記載する試薬は、細菌細胞から直接精製し、外因性カルシウムまたはクロロキンなどの化学的コ・トランスフェクタントなしで用いる。
【０３３４】
本発明者らは、＋３６ＧＦＰが、熱力学的にｓｆＧＦＰとほぼ同様に安定であるが、ｓｆＧＦＰとは異なり煮沸および冷却後にリフォールディングできることを以前に報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９：１０１１０−１２；参考として本明細書に援用されている）。本発明者らは、＋３６ＧＦＰが、耐タンパク質分解性を示し、マウス血清中での安定性を示し、および複合体を形成しているｓｉＲＮＡのマウス血清中での有意な保護を示すことを今般実証した。従って、本発明は、これらのシステムが（例えば、ヒト、哺乳動物、非ヒト、または非哺乳動物細胞への）インビボ核酸送達に有用であり得るという認識を包含する。
【０３３５】
従って、本発明は、哺乳動物細胞への核酸の効力ある送達のためのタンパク質表面置換法の使用を初めて記載するものである。この驚くべきおよび有意な効力（Ｄｅｓｈａｙｅｓら、２００７，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８６：２９９−３０８；およびＬｕ
ｎｄｂｅｒｇら、２００７，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．，２１：２６６４−７１；これらの両方が参考として本明細書に援用されている）を、低い細胞毒性、哺乳動物血清中での安定性、従来のトランスフェクションを受けにくい幾つかのものを含む様々な哺乳動物細胞タイプにわたっての一般性、小さなＲＮＡと大きなＤＮＡプラスミドの両方をトランスフェクトする能力、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からの直接調製、および対象となる未修飾核酸との混合による簡単な使用によって補足される。従って、本発明は、過剰に荷電されたタンパク質が、哺乳細胞における一般的核酸送達問題に対する解決策の新たな種類を代表するものであるとうい認識を包含する。
【０３３６】
材料および方法
細胞培養
ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、ＰＣ１２および３Ｔ３−Ｌ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａから購入）と２ｍＭのグルタミンと５Ｉ．Ｕ．のペニシリンと５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを伴うダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａから購入）において培養した。ジャーカット細胞は、１０％ＦＢＳと２ｍＭのグルタミンと５Ｉ．Ｕ．のペニシリンと５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンとを伴うＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ）において培養した。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＰＣ１２細胞は、ＡＴＣＣから購入した。
【０３３７】
過剰に荷電されたＧＦＰタンパク質の発現および精製
本発明者らが以前に報告した方法の変形を用いて、過剰に荷電されたＧＦＰ変異体（タンパク質配列を下に列挙する）を精製した。簡単に言うと、ＧＦＰをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉにおいて過剰発現させた。単離されたＧＦＰの全収率を増加させることが判明したＰＢＳ中の２Ｍ  ＮａＣｌ中での音波処理によって細胞を溶解し、以前に記載したように精製した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＫＪ，Ｌｉｕ  ＤＲ（２００７）Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃａｎ  ｉｍｐａｒｔ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９：１０１１０−１０１１２；参考として本明細書に援用されている）。精製したＧＦＰを、８．３３×１０４Ｍ−１ｃｍ−１の吸光率を仮定して４８８ｎｍでの吸光度により定量した（Ｐｅｄｅｌａｃｑ  ＪＤ，Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  Ｓ，Ｔｒａｎ  Ｔ，Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ＴＣ，Ｗａｌｄｏ  ＧＳ（２００６）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２４：７９−８８；参考として本明細書に援用されている）。ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によってタンパク質純度を評価した（図２７）。この作業で用いたＧＦＰ変異体の蛍光発光スペクトルは、類似している（図２８）。
【０３３８】
過剰に荷電されたＧＦＰ変異体のタンパク質配列
【０３３９】
【化７】
2014159484.tif 000052
【０３４０】
【化８】
2014159484.tif 000053
ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイは、Ｋｕｍａｒらの方法（Ｋｕｍａｒ  Ｐ，Ｗｕ  Ｈ，ＭｃＢｒｉ
ｄｅ  ＪＬ，Ｊｕｎｇ  ＫＥ，Ｋｉｍ  ＭＨら、（２００７）Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３９−４３；参考として本明細書に援用されている）に基づくものであった。ｓｉＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ）またはプラスミドＤＮＡ（２２ｆｍｏｌ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の指定量のＧＦＰ変異体と１０分間、２５℃で混合した。得られた溶液を、ｓｉＲＮＡについては１５％アクリルアミドゲルをまたはプラスミドＤＮＡについては１％アガロースゲルを使用する非変性電気泳動によって分析し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ線で可視化した。
【０３４１】
カチオン性脂質ベースのおよびＧＦＰベースのトランスフェクション
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＦｕｇｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用するトランスフェクションを、製造業者のプロトコルに従って行った。これらの試薬の分子量は、製造業者によって提供されていないが、トランスフェクション中のリポフェクタミン２０００の作業濃度は、２μｇ／ｍＬであり、本発明者らは、このカチオン性脂質の分子量が≦１，０００Ｄａであるという仮説に基づいて、この濃度を≧約２μＭに相当すると推定した。
【０３４２】
１２ウエル組織培養プレートにおいてウエルあたり細胞８０，０００の密度で細胞を平板培養した。３７℃で１２時間後、細胞を４℃（ＰＢＳ）で洗浄し、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−ＬおよびＰＣ１２細胞については培地を４℃で５００μＬの無血清ＤＭＥＭで置換した。
【０３４３】
ジャーカット細胞を組織培養プレートのウエルから個々の１．５ｍＬチューブに移し、遠心分離によってペレット化し、４℃で５００μＬの無血清ＲＰＭＩ  １６４０に再び懸濁させた。
【０３４４】
ＧＦＰとｓｉＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡいずれかとの溶液を、５００μＬの４℃  ＤＭＥＭ（ＨｅＬａ、ＩＭＣＤ、３Ｔ３−ＬおよびＰＣ１２細胞について）または４℃  ＲＰＭＩ  １６４０（ジャーカット細胞について）に混合した。２５℃で５分後、この溶液を細胞に添加し、軽く攪拌して混合した。３７℃で４時間後、その溶液を細胞から除去し、１０％ＦＢＳを含有する３７℃の培地で置換した。ＧＡＰＤＨターゲッティングＣｙ３標識ｓｉＲＮＡおよび未標識ｓｉＲＮＡをＡｍｂｉｏｎから購入した。ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、プラスミドトランスフェクションを行った。β−蛍光体アッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【０３４５】
固定細胞イメージング
ＧＦＰおよびＣｙ３−ｓｉＲＮＡでの処理の４時間後、細胞をトリプシン処理し、Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングしたスライドガラス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の１０％ＦＢＳを含有する培地において再び平板培養した。３７℃で２４時間後、細胞をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで固定し、指示されている場合にはＤＡＰＩで染色し、ＧＦＰおよびＣｙ３発光のためのフィルターを装備したＬｅｉｃａ  ＤＭＲＢ倒立顕微鏡でイメージングした。ＯｐｅｎＬａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して画像を作製した。ＧＦＰおよびＣｙ３に対する露光時間をそれぞれ３５０ミリ秒および５００ミリ秒に固定した。
【０３４６】
生細胞イメージング
小分子阻害剤を使用する実験については、ガラス底の組織培養プレート（ＭａｔＴｅｋ；＃１．５ガラス厚および１４ｍｍガラス径を有する５０ｍｍの未コーティングプラスチ
ック皿）上で細胞を平板培養し、１時間、３７℃で阻害剤と共にインキュベートし、その後、５０ｎＭの＋３６ＧＦＰおよび阻害剤でさらに１時間、３７℃で処理した。得られた細胞を、阻害剤と２０Ｕ／ｍＬのヘパリンとを含有するＰＢＳで３回洗浄して、表面会合ＧＦＰを除去したが、例外として、４℃で５０ｎＭの＋３６ＧＦＰで処理した細胞は、スライドガラスに結合しているＧＦＰを除去するが多少の細胞表面結合ＧＦＰの境界面をまだ見ることができるようにするために、２０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含有するＰＢＳで１回しか洗浄しなかった。
【０３４７】
油浸対物レンズ（開口数１．４５、６０Ｘ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を有する落射蛍光構成の倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０）を使用して細胞をイメージングした。４８８ｎｍラインのアルゴンイオンレーザー（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ）でＧＦＰを励起させ、６３３ｎｍのヘリウム−ネオンレーザー（Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏｔ）でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を励起させた。短および長波長発光を６５０ｎｍロングパス・ダイクロイック・ミラー（Ｃｈｒｏｍａ）によってスペクトル分離し、ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳｎａｐ  ＨＱ）でイメージングした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７検出には６６５ｎｍロングパスフィルターを、およびＧＦＰには５３５／２０ｎｍ帯域フィルターを使用した。イメージングは３７℃で行った。
【０３４８】
ＲＴ−ＱＰＣＲ
トランスフェクションの４８、７２または９６時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｒｉｂｏｐｕｒｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して全ＲＮＡを抽出した。サンプルを１ｕＬのＤＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、３０分間、３７℃でインキュベートした。ＤＮアーゼＩ不活性化試薬（Ａｍｂｉｏｎ）をその製造業者のプロトコルに従って用いて、ＤＮアーゼＩを不活性化した。Ｒｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、８００ｎｇのＲＮＡから相補ＤＮＡを生成した。ＱＰＣＲ反応は、１×  ＩＱ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）、３ｎＭ  ＲＯＸリファレンス色素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２．５μＬの逆転写反応混合物、ならびに２００ｎＭのフォワードおよびリバース、両方のプライマー：
【０３４９】
【化９】
2014159484.tif 000054
を含有した。
【０３５０】
ＱＰＣＲ反応をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３０００ｐ  ＱＰＣＲシステムで以下のプログラムに付した：９５℃で１５分、その後、４０サイクルの（９５℃で３０秒、５５℃で１分、そして７２℃で３０秒）。７２℃工程の間に増幅を定量した。９５℃で１分、５５℃で３０秒、そして９５℃で３０秒にサンプルを付し、５５℃から９５℃への加熱中の蛍光をモニターすることによって、解離曲線を得た。ＭｘＰｒｏ  ｖ３．０ソフトウェア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してサイクル閾値を決定し、ΔΔＣｔ法によって分析した。
【０３５１】
ウエスタンブロッティング
トランスフェクションの９６時間後に細胞を４℃のＰＢＳで１回洗浄した。プロテアー
ゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する２００μＬのＲＩＰＡバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）で細胞を５分間溶解した。得られた細胞溶解産物を、４〜１２％アクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３５２】
ゲル上のタンパク質を、メタノールに予め浸漬しておいたＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、エレクトロブロッティングによって移した。膜を５％ミルクで１時間ブロックし、５％ミルク中の一次抗体中で、一晩、４℃でインキュベートした。すべての抗体は、Ａｂｃａｍから購入した。膜をＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキングバッファ（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ８００ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ））で３０分間処理した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０とを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４でその膜を３回洗浄し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外イメージングシステム（Ｌｉ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してイメージングした。Ｏｄｙｓｓｅｙイメージング・ソフトウェア・バージョン２．０を使用して画像を分析した。代表データを図２９に示す。示すＧＡＰＤＨ抑制レベルは、β−チューブリンタンパク質レベルに対して正規化したものであり；０％抑制を、約２μＭ  リポフェクタミン２０００および５０ｎＭ  陰性対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞中のタンパク質レベルと定義する。
【０３５３】
フローサイトメトリー
ＰＢＳ中の２０Ｕ／ｍＬ  ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）で細胞を３回洗浄して、非内在化ＧＦＰを除去した。付着細胞をトリプシン処理し、１％ＦＢＳと７５Ｕ／ｍＬ  ＤＮアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とを伴う１ｍＬのＰＢＳに再び懸濁させた。２５℃でＢＤ  ＬＳＲＩＩ装置を用いてフローサイトメトリーを行った。ＧＦＲ（ＦＩＴＣ）およびＣｙ３発光用のフィルターを使用して、ＰＢＳ中で細胞を分析した。少なくとも１０４個の細胞をそれぞれのサンプルについて分析した。
【０３５４】
合成カチオン性ペプチド
（Ａｒｇ）９および（ＫＫＲ）１１（ＲＲＫ）をＣｈｉ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、≧９５％の純度で使用した。ポリ−（Ｌ）−Ｌｙｓおよびポリ−（Ｄ）−Ｌｙｓは、Ｓｉｇｍａから購入した。ポリ−（Ｌ）−Ｌｙｓは、１，０００〜５，０００Ｄａの分子量領域および３，０００Ｄａのメジアン分子量を有する混合物である。ポリ−（Ｄ）−Ｌｙｓは、１，０００〜５，０００Ｄａの分子量領域および２，５００Ｄａのメジアン分子量を有する混合物である。すべての合成ペプチドの保存溶液をＰＢＳ中２０μＭの濃度で調製した。
【０３５５】
＋３６ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ粒径特性づけ
ＰＢＳ中の２０μＭの＋３６ＧＦＰおよび５μＭのｓｉＲＮＡを使用して、２５℃でＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤｙｎａＰｒｏ装置を使用して動的光散乱を行った。これらの実験では、精製された２０ｂｐ  ＲＮＡデュプレックス（ＩＤＴからの、５’ＧＣＡＵＧＣＣＡＵＵＡＣＣＵＧＧＣＣＡＵ  ３’；配列番号：ＸＸ）を使用した。等方球形に合うようにデータをモデリングした。ＤＬＳによって分析した５μＬの溶液（ＰＢＳ中の２０μＭの＋３６ＧＦＰおよび５μＭのｓｉＲＮＡ）を、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＢ倒立顕微鏡を使用してイメージングした。
【０３５６】
安定性分析
マウス血清中でのｓｉＲＮＡ安定性を評価するために、ｓｉＲＮＡ（１０ｐｍｏｌ）をｓｆＧＦＰ（４０ｐｍｏｌ）と混合し、＋３６ＧＦＰ（４０ｐｍｏｌ）と混合し、またはＰＢＳ中、単独で、１０分間、２５℃でインキュベートした。得られた溶液を４倍量のマ
ウス血清（合計２０μＬ）に添加し、指示した時間、３７℃でインキュベートした。得られた溶液の１５μＬを水で希釈して１００μＬの合計量にした。１００μＬのＴＲＩ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）および３０μＬのクロロホルムを添加した。激しく攪拌し、１５分間１，０００Ｇで遠心分離した後、水性層を回収した。１５μＬの３Ｍ  酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５および２倍量の９５％エタノールの添加によって、ｓｉＲＮＡを沈殿させた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５にｓｉＲＮＡを再び懸濁させ、１５％アクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって分析した。ｓｉＲＮＡと複合体を形成したときの＋３６ＧＦＰの血清安定性を、抗ＧＦＰウエスタンブロットによって５μＬのインキュベーションと同時に測定した。
【０３５７】
＋３６ＧＦＰと複合体を形成しているプラスミドＤＮＡのマウス血清中での安定性を評価するために、プラスミドＤＮＡ（０．０２５７ｐｍｏｌ）を、１０分間、４μＬのＰＢＳ中の、２．５７ｐｍｏｌ、１００当量、または１２．８４ｐｍｏｌ、５００当量のいずれかの、ｓｆＧＦＰまたは＋３６ＧＦＰのいずれかと混合した。この溶液に、１６μＬのマウス血清（合計２０μＬ）を添加し、指示した時間、３７℃でインキュベートした。フェノールクロロホルム抽出によってＤＮＡを単離し、１％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって分析し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光で可視化した。
【０３５８】
マウス血清中でのタンパク質の安定性を評価するために、２μＬのＰＢＳ中のそれぞれのタンパク質１００ｐｍｏｌを８μＬのマウス血清（Ｓｉｇｍａ）と混合し、３７℃でインキュベートした。それらのサンプルをＳＤＳタンパク質ローディングバッファーと混合し、１０分間、９０℃に加熱した。得られた混合物を、４〜１２％アクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ウエスタンブロットによってイメージングした。
【０３５９】
プロテイナーゼＫの存在下での安定性を評価するために、１００ｐｍｏｌの＋３６ＧＦＰまたはＢＳＡを３７℃で、０．６単位のプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した。それらのサンプルをＳＤＳタンパク質ローディングバッファーと混合し、１０分間、９０℃に加熱し、４〜１２％アクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３６０】
実施例４：過剰に荷電されたタンパク質は有効なタンパク質送達試薬である
ｍＣｈｅｒｒｙ、蛍光タンパク質、を、＋３６ＧＦＰ（アミノ酸配列ＡＬＡＬ、配列番号：ＸＸを有する切断可能なリンカーにより）、ＴＡＴ、およびＡｒｇ９のそれぞれに融合させて、３つのｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質を生成した。これらの融合体を、ＨｅＬａ、ＩＭＣＤおよびＰＣ１２細胞にｍＣｈｅｒｒｙを送達するそれらの能力について試験した。
【０３６１】
＋３６ＧＦＰがタンパク質を細胞にどれ程よく送達するかを評価するために、ＨｅＬａ、ＰＣ１２および３Ｔ３−Ｌ細胞を（１）ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＴ、（２）ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｒ９、または（３）ｍＣｈｅｒｒｙ−＋３６ＧＦＰのいずれかで処理した。ＤＭＥＭ中で４時間、５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、または２μＭの材料で細胞を処理し、その後、ヘパリンで洗浄し、ＦＡＣＳを行った。
【０３６２】
ｍＣｈｅｒｒｙ−ＡＬＡＬ−＋３６ＧＦＰは、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＡＴまたはｍＣｈｅｒｒｙ  Ａｒｇ９よりはるかに強く細胞を透過した（図３３）。図３４は、蛍光顕微鏡検査によりこれら３つの融合体の内在化を示すものである。データは、＋３６ＧＦＰが非常に強力で一般的なタンパク質送達試薬であることを示している（図３４）。
【０３６３】
実施例５：天然の過剰に荷電されたタンパク質についてのゲノムの調査
本発明は、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）を調べて、作用物質（例えば、核酸、タンパク質など）の送達に有用であるかもしれない天然の過剰に荷電されたタンパク質を特定することできるという認識を包含する。１０のヒトタンパク質（すなわち、Ｃ−Ｊｕｎ（タンパク質アクセッション番号（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｐ０５４１２）；ＴＥＲＦ  １（Ｐ５４２７４）；ディフェンシン３（Ｐ８１５３４）；エオタキシン（Ｑ９Ｙ２５８）；Ｎ−ＤＥＫ（Ｐ３５６５９）；ＰＩＡＳ１（Ｏ７５９２５）；Ｋｕ７０（Ｐ１２９５６）；ミッドカイン（Ｐ２１７４１）；ＨＢＥＧＦ（Ｑ９９０７５）；ＨＧＦ（Ｐ１４２１０）；ＳＦＲＳ１２−ＩＰ１（Ｑ８Ｎ９Ｑ２）；サイクロン（Ｑ９Ｈ６Ｆ５））を発現させ、精製した。これらのうちの４つ（すなわち、ＨＢＥＧＦ、Ｎ−ＤＥＫ、Ｃ−ｊｕｎおよび２ＨＧＦ）は、ｓｉＲＮＡに結合してｓｉＲＮＡを細胞（すなわち、培養ＨｅＬａ細胞）に送達する能力を示した。
【０３６４】
ヒトタンパク質をゲルシフトアッセイによってｓｉＲＮＡへの結合についてアッセイした。ゲルシフトアッセイは、Ｋｕｍａｒらの方法（Ｋｕｍａｒ  Ｐ，Ｗｕ  Ｈ，ＭｃＢｒｉｄｅ  ＪＬ，Ｊｕｎｇ  ＫＥ，Ｋｉｍ  ＭＨら、（２００７）Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８：３９−４３；参考として本明細書に援用されている）に基づくものであった。Ａｍｂｉｏｎ陰性対照ｓｉＲＮＡ（約１５０ｎｇ）を１０分間、２５℃でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の指定量のヒトタンパク質と混合した。得られた溶液を、ｓｉＲＮＡのための１５％アクリルアミドゲルを使用して非変性電気泳動により未結合ｓｉＲＮＡについて分析し、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ線で可視化した（図３５Ａ）。
【０３６５】
ヒトタンパク質を、ＨｅＬａ細胞へのｓｉＲＮＡの送達についてアッセイした。細胞を１２ウエル組織培養プレートにおいてウエルあたり細胞８０，０００の密度で平板培養した。３７℃で１２時間後、細胞を４℃（ＰＢＳ）で洗浄し、４℃で５００μＬの無血清ＤＭＥＭで置換した。ヒトタンパク質およびＡｍｂｉｏｎ陰性対照Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡの溶液を５００μＬの４℃のＤＭＥＭと混合した。２５℃で５分後、この溶液を細胞に添加し、軽く攪拌して混合した。ヒトタンパク質の最終濃度は、１マイクロモル濃度であり、ｓｉＲＮＡは、５０マイクロモル濃度であった。３７℃で４時間後、その溶液を細胞から除去し、１０％ＦＢＳを含有する３７℃の培地で置換した。その後、細胞を、固定細胞イメージングおよびフローサイトメトリーによって、ｓｉＲＮＡ送達について分析した。タンパク質−ｓｉＲＮＡ複合体の内在化を図３５Ｂに示す。
【０３６６】
ヒトタンパク質を使用して、ＨｅＬａ細胞をＡｍｂｉｏｎ  Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、３日間インキュベートし、その後、ターゲットとなるｍＲＮＡの分解についてアッセイした（図３５Ｃ）。ターゲットとなるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルをβ−アクチン  ｍＲＮＡレベルと比較した。「対照」は、非ターゲッティングｓｉＲＮＡの使用を示す。リポフェクタミン２０００を陽性対照として使用した。
【０３６７】
実施例６：ピレン酪酸は遺伝子サイレンシングの一貫性を向上させる
発明者らは、酪酸ピレン、エンドソーム溶解剤（Ｆｕｔａｋｉら，２００６，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１：２９９；参考として本明細書に援用されている）が、遺伝子サイレンシング効果を増加させ、バッチごとの変動性を減少させることを発見した。いずれか１つの特定の理論により拘束されることを望まないが、そのような変動性は、可変的なイオンエンドソーム脱出効率によって引き起こされるであろう。従って、本発明者らは、遺伝子サイレンシングの効率、一貫性および再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃａｂｉｌｉｔｙ）を向上させる方法を開発した。
【０３６８】
下のプロトコルは、＋３６ＧＦＰおよびピレン酪酸（ＰＢＡ）を利用するが、任意の過
剰に荷電されたタンパク質および任意のエンドソーム溶解剤（例えば、クロロキン、ＨＡ２、メリチン）に容易に一般化することができる。
【０３６９】
ＨｅＬａ細胞を１２ウエルプレートにおいて集密度約８０％まで増殖させた。ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。それぞれのウエルにＰＢＳ中の５０μＭ  ＰＢＡを含有する溶液１ｍＬを添加した。細胞をこの溶液中で５分間、３７℃でインキュベートした。小型プラスチックチューブにおいて、２００ｆｍｏｌのＧＡＰＤＨ抑制ｓｉＲＮＡ（２μＬの１００μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液）および８００ｆｍｏｌの＋３６ＧＦＰを予め混合し、５分間、２５℃でインキュベートさせておいた。ｓｉＲＮＡ／＋３６ＧＦＰ複合体の全量の四分の一（１／４）を、ＰＢＳ中の５０μＭ  ＰＢＡが１ｍＬ入っているそれぞれのウエルに添加した。その組織培養トレーを弱く攪拌してそれぞれのウエル内の溶液を均質にし、その結果、５０μＭのｓｉＲＮＡと２００μＭの＋３６ＧＦＰとを含有する溶液を得た。細胞をこれらの条件下で３時間、３７℃でインキュベートした。５０μＭ  ＰＢＡ／ＰＢＳ溶液を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、その後、１０％ＦＢＳ中の１ｍＬのＤＭＥＭを添加した。細胞をこれらの条件下で４日間インキュベートし、ＧＡＰＤＨ発現のノックダウンをウエスタンブロットによって定量した。
【０３７０】
５０μＭ  ＰＢＡ／ＰＢＳ中での３時間のインキュベーションの後、約２０％細胞毒性が観察された。ＨｅＬａ細胞を５０μＭ  ＰＢＡ／ＰＢＳ中で４時間以上インキュベートしたとき、はるかに高い細胞毒性（約８０％）が観察された。ＰＢＡの細胞毒性は、細胞タイプによって変わり得る。
【０３７１】
等価物および範囲
当業者には、本明細書に記載する特定の実施形態の多くの等価物がわかるであろうし、または常例的な実験以上のものを用いることなくそれらを突き止めることができるであろう。本発明は、上の説明に限定されると解釈されず、むしろ添付の請求項に記載するとおりである。
【０３７２】
当業者には、本明細書に記載する本発明による特定の実施形態の多くの等価物がわかるであろうし、または常例的な実験以上のものを用いることなくそれらを突き止めることができるであろう。本発明は、上の説明に限定されると解釈されず、むしろ添付の請求項に記載するとおりである。
【０３７３】
請求項における「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」などの冠詞は、相反する指示がないまたはその文脈から別様に明らかでない限り、１つを意味する場合もあり、または１つより多くを意味する場合もある。１つの群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項および説明は、相反する指示がないまたはその文脈から別様に明らかでない限り、その群のメンバーの１つ、１つより多く、またはすべてが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに利用されている、またはそれらと別様に関連している場合を満たすと考える。本発明は、その群のまさに１つのメンバーが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに利用されている、またはそれらと別様に関連している実施形態を含む。本発明は、その群のメンバーの１つ以上またはすべてが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それらに利用されている、またはそれらと別様に関連している実施形態を含む。さらに、本発明が、列挙する請求項１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、記載用語などが別の請求項に導入されているすべての変形、組み合わせおよび順列を包含することは、理解されるはずである。例えば、別の請求項に依存する任意の請求項を、同じ基本請求項に依存する任意の他の請求項において見つけられる１つ以上の制限を含むように修飾することができる。さらに、請求項が組成物を説明している場合、別様に示されていない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが通常の当業者に明らかでない限り、本明細書に開示する目的のいずれかのためのその組成物
の使用方法が含まれること、および本明細書に開示する製造方法もしくは当該技術分野において公知の他の方法のいずれかによるその組成物の製造方法が含まれることは、理解されるはずである。
【０３７４】
要素を、例えばマーカッシュ群形式で、リストとして提示している場合、それらの要素のそれぞれの部分群も開示していること、および任意の要素（単数または複数）をその群から除去できることは、理解されるはずである。一般に、本発明または本発明の態様を、特定の要素、特徴などを含むと言う場合、本発明または本発明の態様のある実施形態が、そのような要素、特徴などからなるまたは本質的に成ることは、理解されるであろう。簡略化のために、そのような実施形態を、本明細書にこのとおりの言葉で具体的に述べていない。用語「含む」は、開放的であると解釈し、追加の要素または工程を含めることを許容する。
【０３７５】
範囲を与えている場合には、終点を含む。さらに、別の指示がない、またはその文脈および通常の当業者の知識から別様に明らかでない限り、範囲として表示する値は、その文脈が明確に別様に命じていない限り、本発明の様々な実施形態において述べている範囲内の任意の特定の値またはサブ範囲を、その範囲の下限の単位の十分の一まで、とることができることは理解されるはずである。
【０３７６】
加えて、先行技術の範囲内に入る本発明の任意の特定の実施形態は、本請求項のいずれか１つ以上から明確に除外されるだろうということは、理解されるはずである。そのような実施形態は、通常の当業者には公知であると思われるので、それらは、ここに明確に除外が述べられていない場合でも除外されるだろう。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の過剰に荷電されたタンパク質；任意の核酸；任意の生産方法；任意の使用方法など）は、先行技術の存在に関係あろうと、なかろうと、何らかの理由で、いずれか１つ以上の請求項から除外される場合がある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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