(57)【要約】【課題】in vivoでも十分な細胞増殖抑制作用を示し、抗がん剤として用いられうる新規な手段を提供する。【解決手段】本発明のいくつかの形態により、以下のものが提供される：明細書に記載の化学式１または化学式２で表されるｍｉＲ−２０５類似体；前記類似体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤；前記類似体を有効成分として含有する医薬（例えば、悪性黒色腫等のがんの予防および／または治療剤）。【選択図】図４
2014195438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１または化学式２で表されるｍｉＲ−２０５類似体：
【化１】
2014195438.tif 000009
化学式１および化学式２において、ＢＰは、ベンゼンピリジン骨格を表す。
【請求項２】
前記ベンゼンピリジン骨格が、下記化学式３で表される、請求項１に記載のｍｉＲ−２０５類似体：
【化２】
2014195438.tif 000010
【請求項３】
請求項１または２に記載のｍｉＲ−２０５類似体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載のｍｉＲ−２０５類似体を有効成分として含有する医薬。
【請求項５】
請求項１または２に記載のｍｉＲ−２０５類似体を有効成分として含有する、がんの予防および／または治療剤。
【請求項６】
前記がんが、悪性黒色腫である、請求項５に記載の予防および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖抑制剤およびがんの予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省の「人口動態統計」における日本人の主要死因別年齢調整死亡率において、昭和５６年から現在に至るまで悪性新生物（がん）が第一位となっており、がんによる死亡率は近年まで低下傾向を示さず、横ばいか、微増を示している。このため、がんの治療および症状の軽減に適した治療方法を開発するために多くの研究が行われており、化学治療の分野においては、抗生物質、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン剤などががん細胞に有効な抗腫瘍剤として見いだされているが、これらの抗腫瘍剤は、がん細胞を攻撃するだけでなく正常細胞にも作用することから、嘔吐、悪心、食欲不振、脱毛などの副作用を引き起こす問題が発生しており、これらの副作用が少ない新規な治療薬の開発が望まれている。
【０００３】
ところで、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）が、種々の生理活性を有することが知られている。ｍｉＲＮＡは、細胞内在性の、２０〜２５塩基程度の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写される。次いで、プロセシングを受けて約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとなる。その後、核から細胞質内に移り、さらにプロセシングを受けて２０〜２５塩基程度の二量体（ガイド鎖およびパッセンジャー鎖）からなる成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちのガイド鎖（アンチセンス鎖）がＲＩＳＣ（RNA-Induced Silencing Complex）と呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。
【０００４】
ここで、従来、ｍｉＲＮＡの１種であるｍｉＲ−２０５が細胞増殖抑制作用を示し、がんの治療薬となりうる可能性が報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hanna JA et al., In situ measurement of miR-205 in malignant melanoma tissue supports its role as a tumor suppressor microRNA, Lab Invest., 2012 Oct;92(10):1390-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らの検討によれば、従来報告されているｍｉＲ−２０５をin vivoで投与した場合には、その活性が十分に発揮されないことが判明した。
【０００７】
そこで本発明は、in vivoでも十分な細胞増殖抑制作用を示し、抗がん剤として用いられうる新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った。その結果、ｍｉＲＮＡ−２０５のパッセンジャー鎖（センス鎖）の塩基配列を一部改変し、かつ、二本鎖の双方の３’末端に所定の修飾基を導入することで上記課題が解決されうることを見出した。具体的には、野生型ｍｉＲ−２０５には６箇所のミスマッチ部位が存在するが、これらのうちいくつかをマッチさせるようにパッセンジャー鎖（センス鎖）の塩基配列を改変し、さらに、二本鎖の双方の３’末端にベンゼンピリジン骨格を導入したものがin vivoでも優れた細胞増殖抑制作用を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の一形態によれば、下記化学式１または化学式２で表されるｍｉＲ−２０５類似体が提供される。
【００１０】
【化１】
2014195438.tif 000003
【００１１】
ここで、化学式１および化学式２において、ＢＰは、ベンゼンピリジン骨格（以下、「ＢＰ骨格」とも称する）を表す。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、in vivoでも十分な細胞増殖抑制作用を示し、抗がん剤として用いられうる新規なｍｉＲ−２０５類似体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例において、ｍｉＲＮＡ類似体をトランスフェクションし、７２時間培養した後に生細胞（Ａ２０５８細胞）の数を計測した結果を示すグラフである。
【図２】実施例において、ｍｉＲＮＡ類似体をトランスフェクションし、７２時間培養した後に生細胞（Ｍｅｗｏ細胞）の数を計測した結果を示すグラフである。
【図３】実施例において、ｍｉＲＮＡ類似体をＦＢＳ中でインキュベートした際の残存率をリアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。
【図４】実施例において、ｍｉＲＮＡ類似体をＦＢＳ中でインキュベートした際の残存率をリアルタイムＰＣＲにより測定した結果を示すグラフである。
【図５】実施例において、BALB/cSlc-nu/nu（ヌード）マウスにA2058細胞を皮下投与し、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐまたはコントロールｍｉＲＮＡを投与し、腫瘍細胞の移植後２１日目にマウスを解剖して腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。
【図６】実施例において、BALB/cSlc-nu/nu（ヌード）マウスにA2058細胞を皮下投与し、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐまたはコントロールｍｉＲＮＡを投与し、腫瘍細胞の移植後２１日目にマウスを解剖して腫瘍重量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。なお、本明細書では、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにおいて、最終的に標的となる遺伝子のｍＲＮＡと対合する、当該ｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖（または当該アンチセンス鎖を含むＲＮＡ領域）を「ガイド鎖」と表現する。一方、前記アンチセンス鎖に対するセンス鎖（または当該センス鎖を含むＲＮＡ領域）を「パッセンジャー鎖」と表現する。また、化学式としての塩基配列の表現においては、上列がガイド鎖の塩基配列を示し、下列がパッセンジャー鎖の塩基配列を示す。
【００１５】
≪ｍｉＲ−２０５類似体≫
（化学構造）
本明細書に開示のｍｉＲ−２０５類似体は、下記化学式１または化学式２で表されるものである。
【００１６】
【化２】
2014195438.tif 000004
【００１７】
ここで、ヒトの野生型ｍｉＲ−２０５は、以下のような塩基配列を有している。
【００１８】
【化３】
2014195438.tif 000005
【００１９】
このように、野生型ｍｉＲ−２０５は、６箇所のミスマッチ部位を有しているが、これらのミスマッチ部位をガイド鎖の５’末端の側からミスマッチ１〜６としたときに、本発明に係るｍｉＲ−２０５類似体のうち、化学式１で表されるもの（以下、「類似体１」とも称する）では、ミスマッチ４〜６がマッチするようにパッセンジャー鎖の塩基配列が改変されている。また、本発明に係るｍｉＲ−２０５類似体のうち、化学式２で表されるもの（以下、「類似体２」とも称する）では、ミスマッチ１およびミスマッチ２がマッチするようにパッセンジャー鎖の塩基配列が改変されている。
【００２０】
（ベンゼンピリジン骨格（ＢＰ骨格））
化学式１および化学式２において、ＢＰは、ベンゼンピリジン骨格（ＢＰ骨格）を表す。ＢＰ骨格はベンゼン環およびピリジン環を有する骨格であれば特に制限されないが、例えば、下記化学式３で表されるものであることが好ましい。
【００２１】
【化４】
2014195438.tif 000006
【００２２】
ただし、上記化学式３で表されるもののほかにも、例えば国際公開第２００７／０９４１３５号パンフレットに開示されているようなＢＰ骨格が同様に用いられうる。
【００２３】
（製造方法）
上述した本発明に係るｍｉＲＮＡ−２０５類似体は、その塩基配列に基づき、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することができる。また、このようにして製造されたｍｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖の双方の３’末端にＢＰ骨格を導入する手法についても、従来公知の知見（例えば、国際公開第２００７／０９４１３５号パンフレットや特開２０１１−２５１９１２号公報など）が適宜参照されうる。
【００２４】
発明の一形態によれば、上述したｍｉＲ−２０５類似体（すなわち、類似体１および／または類似体２）を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤が提供される。ここで、「細胞増殖抑制剤」とは、例えばがん細胞等の細胞の増殖を抑制することによって種々の用途に用いられうる剤をいう。そして、細胞増殖抑制剤の用途としては、例えば、がんの予防および／または治療剤が挙げられる。ここで、本形態に係る細胞増殖抑制剤によって増殖が抑制されるがん細胞について特に制限はないが、例えば、大腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、膵臓がん、脳腫瘍、造血器腫瘍、悪性黒色腫などが挙げられ、好ましくは悪性黒色腫が挙げられる。つまり、本形態に係る細胞増殖抑制剤は、これらのがんの予防・治療剤として用いられうる。
【００２５】
本発明に係る細胞増殖抑制剤による細胞増殖の抑制効果は、例えば、各種のがん細胞を、被験対象となる試料の存在下に培養し、生細胞の数の経時的な変化を観察することにより評価され、ここで、生細胞の数が経時的に減少する場合、該試料が、細胞増殖抑制効果を有することの指標となる。
【００２６】
本発明の一形態による細胞増殖抑制剤は、上述した類似体１または類似体２を有効成分として含む。これらの双方を有効成分として含んでももちろんよい。ただし、類似体１の方がin vivoにおいてより強い細胞増殖抑制活性を示すことから、本発明に係る細胞増殖抑制剤は、少なくとも類似体１を有効成分として含むことが好ましい。ここで、「有効成分として含む」とは、本発明に係る細胞増殖抑制剤が、所望の細胞増殖抑制活性を発揮するのに充分な量（すなわち、有効量）で、類似体１および／または類似体２を含有することを意味する。
【００２７】
したがって、類似体１および／または類似体２を、そのまま細胞増殖抑制剤として用いてもよいが、このような有効量で有効成分を含み、かつ細胞増殖抑制活性を損なわない限りにおいて、本発明に係る細胞増殖抑制剤は、所望の製品形態に応じた製薬上許容されうる担体や、他の添加剤などとともに組成物を構成してもよい。また、本発明に係る細胞増殖抑制剤は、賦形剤などの添加剤と混合して非経口投与、経口投与または外部投与に適した、医薬品、医薬部外品などの薬剤組成物のほか、飲食品などの形で使用することができる。
【００２８】
医薬品に使用する場合、治療的有効量の上記類似体が、１つまたは複数の製薬上許容されうる担体（添加剤）および／または希釈剤とともに処方される。以下で詳細に説明するように、本発明に係る薬剤組成物は固体または液体での投与のために具体的に処方することができる。経口投与として、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末薬、顆粒剤、舌に塗布するためのペーストが例示される。非経口投与としては、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液として例えば皮下、筋内もしくは静脈内注射のための製剤、あるいは、局所用として、または、膣内または直腸内へ投与するための剤形へと製剤化されうる。なかでも、本発明に係る類似体は、ＲＮＡ医薬である点を考慮して、好ましくは注射剤の形態として製剤化される。
【００２９】
「治療的有効量」とは、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、何らかの所望の治療効果を生じるために有効な作用物質または組成物の量を意味する。例えば、本発明に係る細胞増殖抑制剤の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、用量は対象となる者の体重等の条件によって容易に変動しうるため、当業者によって適宜選択されうる。
【００３０】
「製薬上許容されうる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために使用される。
【００３１】
「製薬上許容されうる担体」とは、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明に係る細胞増殖抑制剤を運搬または輸送することに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤またはカプセル化材料のような、製薬上許容されうる材料、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、剤形の他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で「許容されうる」ものでなければならない。製薬上許容されうる担体として機能しうる材料のいくつかを以下に例示すると、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような補形薬；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油脂；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬物処方で使用される他の非毒性の適合物質を含む。いくつかの実施形態では、薬物製剤は非発熱性である。すなわち、患者の体温を上昇させないものが好ましい。
【００３２】
その他、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた組成物中に存在してもよい。
【００３３】
製薬上許容されうる酸化防止剤の例には以下のものがある：アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤も必要に応じて含有させることができる。
【００３４】
非経口投与に好適な本発明に係る細胞増殖抑制剤を含有する薬剤組成物は、本発明に係る類似体とともに、１つまたは複数の製薬上許容されうる滅菌等張水溶液または非水溶液、分散剤、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散剤中で戻すことが可能な滅菌粉末を含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、調剤を目的レシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは濃縮剤を含みうる。
【００３５】
本発明に係る細胞増殖抑制剤を有する薬剤組成物において使用可能な好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルがある。固有の流動性は、例えば、レシチンのような被覆材料の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【００３６】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬を含んでもよい。微生物の活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有によって確保し得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めると好ましい。さらに、注射可能薬物形態の持続性吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質の含有により引き起こされうる。
【００３７】
本発明に係る薬剤組成物を投与する場合、本発明に係る有効成分の投与量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定されうる。本発明においては、少なくとも細胞増殖抑制効果を得るために必要な１日あたりの有効成分の量を投与できるように、１日あたりの組成物の投与量を考慮し、組成物中の含有量を適宜設定することが好ましい。なお、本発明による薬剤組成物は、好ましくは、有効成分である類似体１および／または類似体２を、当該有効成分換算で成人一人に１日あたり好ましくは１ｎｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは１０ｎｇ〜１０ｍｇ、さらに好ましくは１００ｎｇ〜１００ｍｇの範囲で提供される量含む。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３９】
統計解析
生細胞数、mRNAの発現量およびルシフェラーゼ活性はそれぞれ３サンプル測定し、その平均値±標準偏差（Mean±SD）を求め、コントロールを100%あるいは1.0としたときの相対値を示した。実験に用いた各miRNAあるいはsiRNAをトランスフェクションした場合の結果をスチューデントのt検定（有意水準5%）にて有意差検定を行った。
【００４０】
細胞培養および細胞の生育性
ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ２０５８およびＭｅｗｏをヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入し、製造者のプロトコールに従って維持した。
【００４１】
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡによる細胞のトランスフェクション
Ａ２０５８細胞またはＭｅｗｏ細胞を、トランスフェクションの前日に、６穴プレートに０．５×１０５細胞／ウェルの濃度で播種した。ｍｉＲ−２０５の代表的な模倣体としては、野生型ｍｉＲ−２０５と同一の配列を有し、一般に入手可能なＰｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ（アプライドバイオシステムズ）を用いた。細胞のトランスフェクションには、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐのほか、３’オーバーハング領域に上記化学式３で表される芳香族ベンゼンピリジン類似体が付加され、かつミスマッチ部位のパッセンジャー鎖の少なくとも１つをマッチさせた合成ｍｉＲ−２０５類似体（北海道システム・サイエンス株式会社）を用いた。また、トランスフェクションは、カチオン性リポソームであるリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）を１０ｎＭの濃度で用い、製造者のリポフェクションのプロトコールに従って行った。なお、各ｍｉＲＮＡについては、最終濃度が２０ｎＭとなるように調整し、培地に添加した。また、コントロール（陰性対照）としては、Dharmacon社製のコントロールＲＮＡを培地に添加した。
【００４２】
本実施例で用いた合成ｍｉＲ−２０５類似体の配列を、類似体１および類似体２のものも含めて下記に示す。
【００４３】
【化５】
2014195438.tif 000007
【００４４】
【化６】
2014195438.tif 000008
【００４５】
生細胞数の算定
上述したように各ｍｉＲＮＡ類似体をトランスフェクションし、７２時間培養した後に0.5%トリプシン-EDTA（ethlenediaminetetraacetic acid、SIGMA、St. Louis、MO、USA）を用いて、細胞を回収し、トリパンブルーを用いた色素排除法にて、改良Neubauer型血球計算盤（ERMA、東京）を用いて生細胞数を計測した。結果を図１および図２に示す。これらの図に示すように、上述したＳ１〜Ｓ８のいくつかは、コントロール（陰性対照）に対して有意に高い細胞増殖抑制作用を示した。
【００４６】
ｍｉＲＮＡのin vitroでの安定性の評価
ｍｉＲＮＡのin vitroでの安定性を評価するために、ＢＰ修飾されていない合成ｍｉＲ−２０５類似体であるｍｉＲ−２０５／Ｓ１およびｍｉＲＮＡ−２０５／Ｓ３を北海道システム・サイエンス株式会社から入手した。
【００４７】
Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ１、ｍｉＲ−２０５／Ｓ１、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３およびｍｉＲ−２０５／Ｓ３のそれぞれを20 pmolの濃度で、３７℃にてリポフェクトアミンＲＮＡｉＭＡＸを用いずに、100μlのFBS（Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT, USA）中で０、２、１０、２０または３０分間インキュベートした。次いでtotal RNAを抽出し、TaqMan microRNA assay（hsa-miR-205; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いた定量ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を行い、ΔΔＣｔ法により各ｍｉＲ−２０５類似体のレベルを定量した。なお、リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ−２０５類似体のレベルの定量は以下のようにして行った。
【００４８】
まず、DNase I処理を用いたフェノール／グアニジウムチオシアネート法により細胞からtotal RNAを抽出した。次いで、ｍｉＲＮＡの定量レベルを測定するために、TaqMan microRNA assayを用いて成熟miRNAの配列を対応するcDNAへと逆転写して、リアルタイムＰＣＲを行った。具体的には、total RNA 25ngを逆転写した後にcDNAを得た。ＰＣＲ条件は、初期変性ステップ（95℃10秒間）に続いて40サイクル（95℃5秒間、60℃30秒間）であった。蛍光発光が所定の閾値に達したサイクル数としてサイクル閾値（Ｃｔ）を決定した。各サンプルにおけるｍｉＲ−２０５類似体の定量レベルをＣｔ値として測定した。ΔΔＣｔ法により各ｍｉＲ−２０５類似体の相対的な定量レベルを算出し、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐまたはｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３の標準曲線から各各ｍｉＲ−２０５類似体の定量レベルの絶対値を算出した。
【００４９】
結果を図３に示す。図３に示す値は、各ｍｉＲ−２０５類似体の０分における定量レベルを１００％としたときの相対値である。図３に示すように、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３のみが高い残存率を示した。このことから、本実験で用いたｍｉＲ−２０５類似体の中ではｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３のみがＲＮａｓｅに対して抵抗性を示すことがわかる。
【００５０】
また、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ４、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ７およびｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ８を用い、上記と同様の手法により各ｍｉＲ−２０５類似体の定量レベルを定量した。結果を図４に示す。図４に示す値は、各ｍｉＲ−２０５類似体の０分における定量レベルを１００％としたときの相対値である。図４に示すように、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３が高い残存率を示し、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ７も３０分後で約１０％の残存率を示した。このことから、本実験で用いたｍｉＲ−２０５類似体の中ではｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３およびｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ７がＲＮａｓｅに対して抵抗性を示し、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３が特に高い抵抗性を示すことがわかる。
【００５１】
in vivoにおける腫瘍モデルとｍｉＲ−２０５／リポソーム複合体の投与
BALB/cSlc-nu/nu（ヌード）マウスを日本エスエルシー株式会社から入手した。A2058細胞を１００μｌあたり１×１０６個まで濃縮し、各マウスの背中に皮下投与した。腫瘍体積は式：0.5236L1(L2)2（ここで、L1は腫瘍の長径であり、L2は腫瘍の短径である）に従って算出した。まず、miRNA投与の頻度を決定するために、腫瘍細胞の接種７日目にＰｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐまたはｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３（０．１ｎｍｏｌ）のOpti-MEM（Invitrogen）溶液（50μl）を2μlのカチオン性リポソーム（リポフェクトアミンRNAiMAX）と混合し、得られた混合物を腫瘍に一度に注射した。注射後０、２４、４８、７２または９６時間後にマウスを解剖し、移植した腫瘍の全組織を摘出してtotal RNAを抽出し、次いでｍｉＲ−２０５類似体の発現レベルを評価した。
【００５２】
in vivoでのｍｉＲ−２０５類似体の抗腫瘍効果を評価すべく、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐまたはコントロールｍｉＲＮＡ（１投与あたり0.1 nmol）のOpti-MEM溶液（50μl）を2μlのリポフェクトアミンRNAiMAXと混合し、得られた混合物を腫瘍部位に週に２回投与した。なお、各群のマウスは５匹ずつであった。また、腫瘍の評価は腫瘍細胞の移植後２１日目にマウスを解剖して行った。具体的には、腫瘍体積および腫瘍重量を測定した。結果をそれぞれ図５（腫瘍体積）および図６（腫瘍重量）に示す。これらの図に示す結果から、ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３は、従来公知のｍｉＲ−２０５類似体であるＰｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐに比べて、きわめて優れた抗腫瘍効果を示すことがわかる。これは、上述したようにｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３が高いＲＮａｓｅ抵抗性を示すことに起因するものと推測される。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
〔配列番号：１〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３（類似体１）のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：２〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ３（類似体１）のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：３〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ７（類似体２）のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：４〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ７（類似体２）のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：５〕
Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ（ヒトの野生型ｍｉＲ−２０５）のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：６〕
Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ（ヒトの野生型ｍｉＲ−２０５）のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：７〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ１のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：８〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ１のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：９〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ２のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１０〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ２のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１１〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ４のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１２〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ４のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１３〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ５のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１４〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ５のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１５〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ６のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１６〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ６のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１７〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ８のガイド鎖のＲＮＡ配列である。
〔配列番号：１８〕
ｍｉＲ−２０５ＢＰ／Ｓ８のパッセンジャー鎖のＲＮＡ配列である。
【図１】
2014195438.tif 000011
【図２】
2014195438.tif 000012
【図３】
2014195438.tif 000013
【図４】
2014195438.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【配列表】
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