(57)【要約】【課題】  血液検体から血液除去処理を行うことができる血球除去デバイス、及び細菌検査装置を提供する。【解決手段】  流路にくびれ部を持つデバイス21内部の複数のサンプル保持部に設けた一対の電極27に電圧を印加し流路に検体を流すことで、くびれ部23に電界強度をフォーカスさせ、そこに滞在している細胞に電気パルスを与えることによって血球成分を破壊する構成とし、血液検体から血球成分を簡便に除去できる血球除去デバイスや、血球成分除去処理を自動的に行う細菌検査装置を提供できる。【選択図】図２
2014176371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球除去デバイスであって、
サンプルを導入するための吸引・吐出口と、
前記吸引・吐出口に接続された流路と、
前記流路に接続された複数のサンプル保持部と、
前記サンプル保持部間に接続され、前記サンプル保持部よりも幅の小さいくびれ部と、
前記サンプルに電圧を印加するための、前記サンプル保持部内に設置された電極とを備える、
ことを特徴とする血球除去デバイス。
【請求項２】
請求項１に記載の血球除去デバイスであって、
前記吸引・吐出口は、少なくとも一対である、
ことを特徴とする血球除去デバイス。
【請求項３】
請求項2に記載の血球除去デバイスであって、
前記サンプル保持部は、内容積が1mL以上のサンプルを保持可能である、
ことを特徴とする血球除去デバイス。
【請求項４】
請求項3に記載の血球除去デバイスであって、
前記サンプル保持部は、前記内容積の高さ0.2〜4mm、好ましくは0.5〜2mmの範囲内である、
ことを特徴とする血球除去デバイス。
【請求項５】
請求項4に記載の血球除去デバイスであって、
前記電極は白金であり、少なくともその一部が前記サンプル保持部に露出している、
ことを特徴とする血球除去デバイス。
【請求項６】
細胞検査装置であって、
少なくとも一対の吸引・吐出口を有し、印加される電圧により吸引されたサンプルの血球を破壊する血球除去デバイスと、
前記サンプルを前記血球除去デバイスの前記吸引・吐出口に吸引・吐出を行うノズル機構と、
前記ノズル機構の移動及び位置決め、及び前記血球除去デバイスの電圧印加を制御する制御部とを備える、
ことを特徴とする細菌検査装置。
【請求項７】
請求項6に記載の細胞検査装置であって、
前記サンプルを入れる複数の検体容器を収容できる検体ラックと、
複数のディスポーザブルチップを収容したチップラックとを更に備え、
前記ノズル機構は、前記検体容器の前記サンプルを、前記ディスポーザルチップを用いて、前記サンプルの吸引・吐出を行う、
ことを特徴とする細菌検査装置。
【請求項８】
請求項7に記載の細胞検査装置であって、
チューブを設置するチューブラックを更に備え、
前記ノズル機構は、前記検体容器の前記サンプルを、前記ディスポーザルチップを用いて、前記チューブに導入する、
ことを特徴とする細胞検査装置。
【請求項９】
請求項8に記載の細胞検査装置であって、
前記チューブは、接続チューブを介して、前記血球除去デバイスの前記吸引・吐出口と接続可能である、
ことを特徴とする細菌検査装置。
【請求項１０】
請求項9に記載の細胞検査装置であって、
前記制御部は、
前記サンプルを含む前記チューブから、前記血球除去デバイスに前記サンプルを吸引し、
前記血球除去デバイスに吸引した前記サンプルに対して前記電圧を印加し、
前記電圧の印加が終了した、前記サンプルを吐出するよう制御する、
ことを特徴とする細菌検査装置。
【請求項１１】
請求項10に記載の細胞検査装置であって、
前記制御部は、
前記電圧の印加と、前記サンプルの流速を同期させる、
ことを特徴とする細菌検査装置。
【請求項１２】
請求項11に記載の細胞検査装置であって、
前記血球除去デバイスは、
前記吸引・吐出口に接続された流路と、
前記流路に接続された複数のサンプル保持部と、
前記サンプル保持部間に接続され、前記サンプル保持部よりも幅の小さいくびれ部と、
前記サンプルに電圧を印加するための、前記サンプル保持部内に設置された一対の電極とを備える、
ことを特徴とする細胞検査装置。
【請求項１３】
請求項12に記載の細胞検査装置であって、
前記制御部は、
前記電圧を周期的なパルスとして印加し、
前記くびれ部を通過する前記サンプルに少なくとも一回前記パルスが印加されるよう制御する、
ことを特徴とする細胞検査装置。
【請求項１４】
請求項13に記載の細胞検査装置であって、
前記サンプルの流速は前記くびれ部における前記サンプルの流速である、
ことを特徴とする細胞検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液等の検体を採取して、検体内に含まれる細菌を識別するための血球除去に用いるデバイス、及び細菌検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症・菌血症の診断において、本来無菌である血液から細菌(細菌あるいは真菌)などを迅速に検出することは重要性が高い。敗血症・菌血症は、診断や適切な治療が遅れることで患者が重篤な状態になるリスクのある感染症であるためである。検体である患者の血液で検出される細菌の種を同定し、その細菌の抗生物質に対する感受性を測定することで、効果のある抗生物質の種類およびその濃度を決定できる。つまり治療方針をたてることが可能となり、しいては適正な治療につながる。
【０００３】
このように、敗血症・菌血症においては患者が重篤な状態になることを防ぐために、細菌の種の同定や、抗生剤に対する感受性を迅速に測定することが求められている。そこで、血液培養検査において、時間がかかるコロニー育成の培養工程を省略するための研究が盛んに行われている。例えば、血液培養を行わずに、検体から直接核酸抽出を行って、その後、ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase chain reaction :PCR)を行い、細菌の種の同定を行なう方法などが開発されている。しかし、この場合は核酸抽出の段階で細菌を破壊するため、顕微鏡で細菌の形状を観察することができない。従って、同定結果が得られるまでは、細菌が球菌であるかまたは桿菌であるかや、グラム陽性菌であるかまたはグラム陰性菌であるかを知ることはできない。つまり、血液検体において、細菌の形状を観察したり、グラム判定を行なうには、血液培養を行うしか方法がないことが現状である。
【０００４】
血液検体において血液培養の工程が必要な理由は、血液は、細菌が元々存在しない無菌検体であり、重篤な敗血症患者でもその菌濃度は10CFU/mL程度と小さいためである。また、血液中に存在する赤血球や白血球の濃度はそれぞれ10^9個/mL、10^7個/mL程度であって細菌の濃度よりも高く、血液培養によって細菌を増殖させないと赤血球や白血球が邪魔となって細菌を顕微鏡で観察できないことも血液培養が必要な理由である。
【０００５】
一方、血液検体中の細菌の観察において邪魔となる赤血球や白血球を破壊する方法、更には、この細胞破壊の方法としてエレクトロポレーションを応用することが検討されている。なお、エレクトロポレーション技術に関する先行技術文献として、特許文献１がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国公開特許ＵＳ２００７／０１０５２０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したエレクトロポレーションとは、外部からの電圧印加によって、電気伝導度を増加させ、細胞の膜透過性を変化させる方法である。主に分子生物学の分野で、薬剤や分子プローブやデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid：DNA）を細胞内に導入し、細胞の機能を変化させる手段として用いられている。電界の強さと、電気パルスの持続時間によって規定される電気パルスを与えるが、一般的に電気パルスは細胞膜に小さな孔を開ける程度の大きさである。もし、適切な電気パルスの大きさ、つまり適切な電界強度が適切な時間だけ与えられ、その後電界強度がなくなるのであれば細胞膜は一時的に透過性が上がり、電界強度がなくなれば元の性質に戻る。一方で、電界強度が大きすぎたり、時間が長かったりすると細胞は破壊され、細胞の内容物は流出する。
【０００８】
上述した特許文献１では、流路デバイスに検体を導入し、一定の電圧を印加して細胞を破壊することなくエレクトロポレーションを起こすものである。流路デバイスの流路幅が変化しており、幅が狭い箇所では電界強度がフォーカスされる。その結果、閾値を超えた場合にのみ細胞にエレクトロポレーションが起こる仕組みになっている。しかし、流路幅の狭い領域を通過するスピードで強電界印加時間の幅が決まってしまうため、一般的なエレクトロポレーションのように、msオーダーという時間幅を安定して実現することが難しいという課題がある。
【０００９】
本発明の目的は、上記の課題を解決し、エレクトロポレーションを用いて血液検体から血球除去処理を簡便に、安定に行うことができる血球除去デバイス、及び細菌検査装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するため、本発明においては、血球除去デバイスであって、サンプルを導入するための吸引・吐出口と、吸引・吐出口に接続された流路と、流路に接続された複数のサンプル保持部と、サンプル保持部間に接続され、サンプル保持部よりも幅の小さいくびれ部と、サンプルに電圧を印加するための、サンプル保持部内に設置された電極とを備える構成の血球除去デバイスを提供する。
【００１１】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、細胞検査装置であって、少なくとも一対の吸引・吐出口を有し、印加される電圧により吸引されたサンプルの血球を破壊する血球除去デバイスと、サンプルを血球除去デバイスの吸引・吐出口に吸引・吐出を行うノズル機構と、ノズル機構の移動及び位置決め、及び血球除去デバイスの電圧印加を制御する制御部とを備える構成の細菌検査装置を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血球除去デバイスを用いると、デバイスのくびれ部に電界強度をフォーカスすることができ、外部からパルスを与えることで、くびれ部に存在する細胞のみを破壊することができ、検体を吸引・吐出口からフローさせることで検体の一部だけでなく、全ての検体を処理することが可能となる。また、血球成分の除去処理を自動的に実施できる細菌検査装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１の実施例に係る、細菌検査装置の構成例を示す概略図である。
【図２】第１の実施例に係る、血球除去に用いるデバイスの一例の概略図である。
【図３】第１の実施例に係る、血球除去に用いるデバイスの一例の上面模式図である。
【図４】第１の実施例に係る、血球除去に用いるデバイスの一例の側面模式図である。
【図５】第１の実施例に係る、血球除去のフローを示す図である。
【図６】第１の実施例に係る、血球除去のフローにおける一工程を示す図である。
【図７】第１の実施例に係る、血球除去のフローにおける一工程を示す図である。
【図８】第１の実施例に係る、血球除去のフローにおける一工程を示す図である。
【図９】第１の実施例に係る、血球除去に用いるデバイスに電圧を印加した場合の電界強度の分布を示す図である。
【図１０】第１の実施例に係る、血球除去に用いる電気パルスパターンを示す図である。
【図１１】第１の実施例に係る、血球除去操作を行う前に、顕微鏡にて観察した例を示す図である。
【図１２】第１の実施例に係る、血球除去操作を行った後、顕微鏡にて観察した例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明するが、それに先立ち、本発明の血球除去デバイス、及び細菌検査装置について概説する。
本発明の血球除去デバイスでは、流路の一部の幅が狭くなっているマイクロフルイディクスデバイスを用いる。マイクロフルイディクスデバイスは、縦、横がそれぞれ数十mm程度、深さが数百um程度の検体（サンプル）を保持するサンプル保持部が複数存在し、それらサンプル保持部同士を接続する縦(つまり流路の幅に相当する)数百um程度、横数〜数十mm程度のくびれ部が少なくとも１つ存在し、サンプル保持部にはサンプル導入やサンプル吐出用の接続部分がある。
【００１５】
そして、このマイクロフルイディクスデバイスのサンプル保持部に電圧を印加するための電極を設ける。このサンプル保持部に設けた電極により、検体に電圧を印加すると、検体中に含まれる細胞の細胞膜は高電圧に曝されて、細胞膜の透過性は変化する。エレクトロポレーションとして知られるこの方法は、細胞内に分子プローブや薬剤やDNAを導入するための方法として用いられるが、この場合には電気パルス印加後に細胞が元の形状に戻るように、印加する電気パルスの大きさ、即ち電界強度や電気パルスの持続時間や数をうまく調節している。これは印加する電気パルスがある閾値を超えると細胞膜が元に戻らず、細胞が破壊してしまうためである。このエレクトロポレーションを応用して電気パルス印加条件を適切に調節することにより、検査対象である検体中の細菌を破壊せずに、血球だけを選択的に破壊することができ、血球除去処理を実施できる。
【００１６】
一般的に細胞が受ける膜透過電圧Vは以下の式で表される。
【００１７】
【数１】
2014176371.tif 000003
ここで、Eは電界強度、kは細胞の形状に依存する係数、aは細胞の半径、θは電界に対する細胞の角度である。
【００１８】
つまり細胞の半径が大きいほど細胞が受ける膜透過電圧が大きくなり、エレクトロポレーションが起こりやすく、また細胞の破壊も起こりやすくなる。つまり、幅の広いサンプル保持部に設けた電極により、電界強度を適切に調節することで選択的にある大きさの細胞を破壊することが可能になる。
【００１９】
デバイスに電圧を印加し、この電圧の印加に同期してシリンジポンプなどを用いてサンプル導入部からサンプル吐出部に向かって検体をデバイス中に導入する速度を制御する。検体はサンプル導入用の接続部からサンプル保持部へ導入され、くびれ部を通って、別のサンプル保持部へ導かれ、サンプル吐出用の接続部からデバイス外部へ吐出される。電界強度はサンプル保持部を結ぶくびれ部でフォーカスされるため、検体中の血球や細菌はくびれ部を通過する際に、同期され閾値を超えた電気パルスを、サンプル保持部に設けた電極から受けることになる。
【００２０】
サンプル保持部に設けた電極を用いて発生する電界強度は以下の式で表わされる。
【００２１】
【数２】
2014176371.tif 000004
ここで、Eは電界強度、Uは電極間に印加する電圧、Lsはサンプル保持部中の電極からくびれ部の開始点までの距離、Wsはサンプル保持部の幅、Lcはくびれ部の距離、Wcはくびれ部の幅である。
【００２２】
くびれ部の幅はサンプル保持部より小さいため抵抗が大きくなり、結果としてくびれ部で電界強度がフォーカスされることになる。電界強度は、外部から電極に印加する電圧によって調節できるが、サンプル保持部とくびれ部の幅や長さによっても調節が可能となる。電気パルスの数はシリンジポンプによる検体の導入・吐出速度を調節することによって当然調節できるが、くびれ部の長さによっても調節が可能となる。つまり、電気パルスの大きさと数を外部からの印加電圧やシリンジポンプによる流速だけでなくデバイス形状によっても調節することで、細菌を破壊せずに血球だけを破壊する条件を設定することができる。
【００２３】
細菌検査では検体ごとのコンタミネーションを避けるために検査に使用する器具はディスポーザブルにすることが望ましいが、デバイスを樹脂で作製する事で安価に出来るためディスポーザブルとすることができる。さらに、電極をサンプル保持部に設けて、デバイスと一体化することで検体と接触する電極もディスポーザブルとすることができる。
【実施例１】
【００２４】
以下、第1の実施例の細菌検査装置、及びこれに使用する血球除去に用いる血球除去デバイスの実施例を詳細に説明する。
図１に示すように、実施例1の細菌検査装置は、載置台11と、血球除去デバイス21と、検体ラック12と、チップラック13と、デバイスに電圧を印加する電源14と、チューブラック15と、廃棄物を捨てるための廃棄物用容器16と、ノズル機構18と、ノズル機構18等を制御するコンピュータ20を備えている。
【００２５】
載置台11上の検体ラック12は、複数の検体容器42を収容できる。また、チップラック13は、複数のディスポーザブルピペットチップ43を収容し、チップラックは、複数の試験管（チューブ）45を収容できる。ノズル機構18は、載置台11の一面に対向する位置において移動自在に配置される。そして、コンピュータ20は、ノズル機構18の移動及び位置決め、電源14の電気パルスの強度や幅、周期などの装置全体を制御したり、処理条件や生物学的試料に関する情報、その他の各種情報を入力するための制御部として機能する。
【００２６】
なお、検体ラック12は従来よく用いられている外径10mm程度、長さ100mm程度の採血管42を複数配置できるもの、チップラック13は一般的に用いられている外形3〜7mm程度、長さ25〜80mm程度のディスポーザブルピペットチップ43が上向きに複数本配置できるもの、チューブラック15は一般的に用いられている外形10mm程度、長さ50〜100mm程度のチューブ45を上向きの状態で複数本配置できるものである。後で説明するように、数番47は接続チューブ、数番52は補助具を示している。
【００２７】
同図に見るように、デバイス21に電圧を印加するための電源ケーブル17が電源14に接続されており、予めコンピュータ20で設定された電気パルスをデバイス内に導入した検体に印加できる。ノズル機構18はXYZステージによって、図１に示したX、Y、Z方向に移動が可能であり、ノズル機構18の先端はディスポーザブルピペットチップ43が装着できる形状をしている。また、ノズル機構18には図示を省略したポンプが接続されており、デバイス21内部に血液検体などの液体を吸引したり、吐出したりすることが可能である。
【００２８】
図２、図３、及び図４は、本実施例の細菌検査装置において血球除去に用いられるデバイス21の一例を示す概略図である。デバイス21を構成する材料は、特に限定されるものではないが、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、アクリル系樹脂などの樹脂等を用いることができる。またデバイス21中に組み込まれる電極としては、例えば白金などを用いることが出来る。
【００２９】
図２は本実施例の血球除去デバイス21の一具体例の鳥瞰図、図３はその正面摸式図、図４はその側面摸式図である。デバイス21は、縦、横がそれぞれ数十ミリメートル程度、高さが数ミリメートル程度の薄板の形状をしており、その内部に検体を保持するための貯留部としての空洞のサンプル保持部22を複数備えている。また、サンプル保持部22は幅がサンプル保持部22より幅が小さいくびれ部23で、別のサンプル保持部22と連結されており、複数のサンプル保持部22にはそれぞれ電極27が埋め込まれている。
【００３０】
またサンプル保持部22には、外部から検体をサンプル保持部22へ導入したり、吐出したりするための吸引・吐出口25a、25bが設けられている。サンプル保持部22と吸引・吐出口25a、25bの間は細い流路26a、26bによって接続されている。なお、吸引・吐出口25a、25b、更に流路26a、26bは一対に限定されるものでなく、複数対であっても良い。
【００３１】
この吸引・吐出口25a、25bの寸法や形状は、ピペットチップ43の上端や接続チューブ47にフィットするように設計されている。サンプル保持部22の寸法は幅5〜30mm、深さ0.2〜1ｍｍであり、くびれ部23の寸法は幅0.05〜0.5mm、深さ0.2〜1mmである。サンプル保持部とくびれ部の深さは同じになるように設計されている。
【００３２】
一対の電極27はサンプル保持部22で検体と接することができるようにその一部がサンプル保持部22に露出し、また電源14から電圧を印加できるようにその一部が外部に突き出るように設計される。サンプル保持部22の形状は特に限定されないが、サンプル保持部22に検体を導入し、電気的処理を行いながら排出をする際に液残りのない形状とする。角に丸みを持たせた形状であってもよい。
【００３３】
図５に本実施例の細菌検査装置において血球除去処理を行う際のフローを示す。まず、ノズル機構18がXYステージ動作によりディスポーザブルピペットチップラック13の上方に移動し、その後Zステージ動作によって下降してディスポーザブルピペットチップ43がノズル機構18の先端に装着される(S11)。ノズル機構18の先端はディスポーザブルピペットチップ43の内径よりもわずかにノズル機構18の外径が大きくなるように設計されており、上からノズル機構18をディスポーザブルピペットチップ43に押し込むことによって接続を行う。次にノズル機構18がXYZステージ動作によって上昇した後、検体ラック12の上方に移動し、その後下降してディスポーザブルピペットチップ43の先端を検体に浸しノズル機構18に接続されているポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ43内部に検体を吸引する(S12)。
【００３４】
デバイス21には接続チューブ47を接続して、デバイス21からチューブラック15に収容しているチューブ45のうちの一つに検体を回収できるようにしておき、所定の電圧を印加して電気パルスを与える(S13)。次にノズル機構18をXYZステージの動作によってデバイス21の位置に移動させ、ポンプを動作させてディスポーザブルピペットチップ43内部に吸引した検体をデバイス21に導入する。デバイス21に導入された検体は、くびれ部23を通過する際にフォーカスされた電界強度によって強められた電気パルスによって血球が破壊され、流路26bとデバイス21の吸引・吐出口25b、さらに接続チューブ47を通ってチューブラック15に収容しているチューブ45に回収される(S14)。なお、細菌がこの電気パルスによって破壊されないように電界強度の大きさは調節されている。次にXYZステージ動作によりノズル機構18を移動させてノズル機構18の先端からディスポーザブルピペットチップ43をはずす(S15)。
【００３５】
図６、図７、及び図８は、本実施例において、ノズル機構18からディスポーザブルピペットチップ43をはずす動作を説明する模式図である。最初に、図６に示すように、ノズル機構18とディスポーザブルピペットチップ43の接続部よりわずかに広く、かつディスポーザブルピペットチップ43の外径よりも狭い隙間51を有する補助具52にノズル機構18を近接させる。次に、図７に示すように、ディスポーザブルピペットチップ43が接続されたノズル機構18の先端を補助具52の隙間51に挿入する。次に、図８に示すように、ノズル機構18をZ方向に上昇させることで、ノズル機構18の先端からディスポーザブルピペットチップ43を外すことができる。この後さらに別の検体を処理する場合には図５のフローの最初に戻り、ノズル機構18の先端に新たなディスポーザブルピペットチップ43を装着する。
【００３６】
血液検体をチューブに吐出した後の工程は、従来の細菌検査の工程と同じである。つまり、血液検体から血球成分を除去した後に細菌の同定を行ったり、細菌の形状を顕微鏡観察するなど様々な処理を実施することができる。具体的には、チューブに吐出された血液検体から核酸を抽出してPCR検査を行ってもよいし、スライドグラス上に検体を塗布してグラム染色などを実施して顕微鏡観察を行ってもよい。
【００３７】
以下では、血液検体から血球成分を除去する処理を実施する形態を例として細菌検査装置を説明する。
まず、図１を用いて細菌検査装置のセットアップについて説明する。患者から採取した血液が10mLの入った採血管42を検体ラック12にセットし、チップラック13にディスポーザブルピペットチップ43をセットする。また、血球除去に使用するデバイス21に接続チューブ47を接続し、接続チューブ47のもう一端をチューブラック15に収納されたチューブ45に接続する。さらに、デバイス21と電源14を電源ケーブル17で接続する。
【００３８】
セットアップの完了した細菌検査装置では、ノズル機構18が移動し、ディスポーザブルピペットチップ43をノズル先端に装着する。次にノズル機構18が移動して、検体ラック12の採血管42の上に移動し、ディスポーザブルピペットチップ43の先端が、採血管42中の検体につかるようにノズル機構18を下降させる。その後、図示を省略したポンプを作動させて、検体をディスポーザブルピペットチップ43に吸引する。再びノズル機構18が移動して、血球除去デバイス21の上に移動し、ディスポーザブルピペットチップ43に吸引した検体は、吸引・吐出口25aを通ってデバイス21に導入される。
【００３９】
更に、デバイス21に導入された検体はデバイス21の図２他に示したサンプル保持部22から、くびれ部23を通って別のサンプル保持部22へ移動する際に、一対の電極27により電気パルスを受け、検体中に含まれる血球成分が破壊される。その後、検体は別の吸引・吐出口25aと接続チューブ47を通ってチューブラック15にセットされたチューブ45に回収される。
【００４０】
図９に、本実施例における装置の電源14から1kVの電圧をデバイス21の電極27に印加した場合の電界強度の分布状態を表すグラフを示す。電極27からサンプル保持部22の端まで、つまりくびれ部の開始端の距離は1.5mm、くびれ部22の距離、つまりサンプル保持部22の端から別のサンプル保持部22の端までの距離は2mm、くびれ部23の終端からもう片方の電極までの距離は2mmであるため、グラフの横軸で0〜1.5mmがサンプル保持部、1.5mm〜3.5mmがくびれ部、3.5〜5.0mmがもう片方のサンプル保持部に相当する。また、サンプル保持部の幅は6mm、くびれ部の幅は0.2mm、サンプル保持部とくびれ部の深さはともに0.3mmである。
【００４１】
図９のグラフ中の2.0〜3.0mmで示すくびれ部分の中央部付近で電界強度が4.5kV/cm以上にフォーカスされ、グラフ中の1.5〜2.0mmや3.0〜3.5mmで示すくびれ部分の両端部では急激に電界強度が小さくなり、グラフ中の0〜1.5mmや3.5〜5.0mmで示すサンプル保持部分ではほぼ1kV/cm以下になっていることがわかる。この図９からデバイス21中の特定の領域でのみ電界強度を高く設定でき、設定した電気パルスによって所望の細胞だけを選択的に破壊することができる。電界強度はサンプル保持部22とくびれ部23の幅によってどの程度フォーカスされるかが決まるため、外部からの電気パルスのパターンの調節以外に、くびれ部分の長さや幅を調節することによって細胞に与える電気パルスの強度や数を変化させることができる。もちろん検体をデバイス21に導入する速度を変化させ、くびれ部23のフロー速度を変えて、細胞が受ける電気パルスの数を調節することもできる。
【００４２】
図１０に本実施例の装置の破壊処理に用いた電気パルスパターンの一例を示す。20ms周期で0.3msのパルスを電圧1kVで周期的に与え、細胞破壊処理を行った。検体を導入・吐出する速度によって細胞が受けるパルス数は変化する。くびれ部23を通過する際の線速度を1.0mm/s以下に設定することで細胞は4.5kV/cm以上の電界強度の領域(およそ距離1.0mm)を通過する際に少なくとも1回は電気パルスを受けることになる。このくびれ部23を通過する検体の流速を変化させることで細胞に与える電気パルスの数を調節できる。
【００４３】
すなわち、細胞に与える電気パルスの数を調整するため、コンピュータ20の制御部は、電気パルスパターンと検体の導入・吐出する速度の同期を取るよう、電源１４、及びノズル機構18の図示を省略したポンプを制御する。このように、外部からの電気パルスのパターンの調節以外にも細胞に与える電気パルスの強度や数を変化させることが出来る。なお、処理に用いる電気パルスは図１０に示すように一定の周期でパルスを与えても良いが、一定の電圧を印加してくびれ部分でだけ細胞が破壊されるように設定しても良い。
【００４４】
この後、本実施例の装置と直接的には関係しないので詳述しないが、検体をチューブから回収して、フィルタ処理を行う、顕微鏡による観察を行う、PCR (Polymerase chain reaction: ポリメラーゼ連鎖反応)を行って細菌の同定を行う、といった解析を行う。電気処理を行いながら本実施例のデバイス21を上方から顕微鏡とカメラを組み合わせるなどして観察することで、リアルタイムで細胞の破壊状況をモニタしながら電気パルスの条件の設定を変更することも可能である。
【００４５】
図１２に本実施例の細菌検査装置を用いて血球除去処理を行った結果を示す。図１１は、処理を行う前の血液を、生理食塩水で100000倍に希釈して、倍率40倍対物レンズと倍率10倍の接眼レンズを用いて光学顕微鏡で観察した結果で、図１２は本実施例のデバイスで血球破壊処理を行った血液を、生理食塩水で1000倍に希釈して、同じ顕微鏡で観察した結果である。図１１で観察される球状の赤血球が、図１２では9割以上破壊されて内容物が流出してコントラストの薄い細胞に変化していることが確認できる。図１２には血球除去を行った後に顕微鏡観察を実施した例を示したが、本実施例による細菌検査装置の処理はこれに限定されるものではなく、培養を行っても良いし、血球除去後に細菌を破壊して、得られた核酸をPCRなどで解析しても良いし、特に限定されるものではない。
【００４６】
以上詳述した、本発明の血球除去デバイスを用いると、デバイスのくびれ部に電界強度をフォーカスすることができ、外部からパルスを与えることで、くびれ部に存在する細胞のみを破壊することができ、検体を吸引・吐出口からフローさせることで検体の一部だけでなく、全ての検体を処理することが可能となる。つまり、電極の位置するサンプル保持部では電界強度がフォーカスされないために電気分解などが発生しにくく、検体の不必要な劣化を防ぐことができ、くびれ部とサンプル保持部の幅を調節して設計し、さらに印加するパルス強度やパルスの長さを調節することで選択的に特定の細胞を破壊することができ、電極をデバイスと一体化してサンプル保持部に設けることで、デバイスをディスポーザブルとすることができる。
【００４７】
この結果、1mL以上の血液検体から血球成分を簡便に除去できるようになり、細菌の顕微鏡観察を実施することが可能となる。また、血球成分の除去処理を自動的に実施できる細菌検査装置を提供できる。
【００４８】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されものではない。また、実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることも可能である。
【００４９】
更に、上述した各構成、機能、制御部等は、それらの一部又は全部を処理するプログラムを実行するコンピュータによる実現を説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。
【符号の説明】
【００５０】
11  載置台
12  検体ラック
13  チップラック
14  電源
15  チューブラック
16  廃棄物用容器
17  電気ケーブル
18  ノズル機構
20  コンピュータ
21  デバイス
22  サンプル保持部
23  くびれ部
25a、25b  吸引・吐出口
26a、26b  流路
27  電極
42  採血管
43  ディスポーザブルピペットチップ
45  チューブ
47  接続チューブ
51  隙間
52  補助具
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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