(57)【要約】【課題】  ヒト由来成分を含まない条件でビタミンＤ類の安定性を確保可能な標準液を提供すること。【解決手段】  ヒト以外に由来したタンパク質をさらに含み、かつそのｐＨを７．５以上とすることで、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定濃度のビタミンＤ類を含むビタミンＤ類標準液であって、ヒト以外に由来したタンパク質をさらに含み、かつそのｐＨが７．５以上である、前記標準液。
【請求項２】
ビタミンＤ類が２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項１に記載の標準液。
【請求項３】
ヒト以外に由来したタンパク質がウシ血清アルブミンである、請求項１または２に記載の標準液。
【請求項４】
請求項１から３に記載の標準液を凍結乾燥して得られる、凍結乾燥体。
【請求項５】
請求項１から３に記載の標準液を用いて、抗原抗体反応を利用した免疫測定によりビタミンＤ類を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のビタミンＤ類を測定する際使用する、ビタミンＤ類標準液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤは脂溶性ビタミンの１つであり、さらにコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）にわかれる。ビタミンＤは食事やサプリメント等による直接摂取や、日光による皮膚中での合成により、ヒト体内に吸収される。
【０００３】
ヒト体内に吸収されたビタミンＤは、肝臓に存在する酵素によりその２５位が水酸化されて２５−ヒドロキシビタミンＤとなり、さらに腎臓に存在する酵素により１位が水酸化されることで、生物学的活性を有する１，２５−ジヒドロキシビタミンＤとなる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、体内のカルシウムやリンの血中濃度をコントロールする役割を有している。一方２５−ヒドロキシビタミンＤは、ビタミンＤ欠乏の最もよい指標として近年、臨床検査の分野で注目されている。ビタミンＤの欠乏は骨粗鬆症、癌や心疾患と関連があるとされ、欧米を中心に検査数が年々増加している。
【０００４】
臨床検査で２５−ヒドロキシビタミンＤ等のビタミンＤ類を測定する際、検量線の作成や精度管理のためにビタミンＤ類の標準品（標準液）が必要である。当該標準品は、測定の信頼性に影響を与えないよう、測定時や保存時における一定条件下での安定性を保証する必要がある。
【０００５】
ビタミンＤ類の保存安定性に関しては、非特許文献１において、ヒト血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３の保存安定性について報告されており、室温条件下で約２４時間の安定性を有していることが報告されている。しかしながら、非特許文献１において２５−ヒドロキシビタミンＤ３に添加するヒト血清は、供給安定性やヒトへの感染性の点で問題を有していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５５（８），  １５８４−１５９５（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
臨床検査でビタミンＤ類を測定する際使用するビタミンＤ類標準品（標準液）は、測定時や保存時における一定条件下での安定性を保証する必要がある一方、ビタミンＤ類を安定化させるために当該標準品に添加する添加剤として、ヒト血清等のヒト由来成分を用いるのは、供給安定性やヒトへの感染性から問題があった。
【０００８】
そこで本発明の目的は、ヒト由来成分を含まない条件でビタミンＤ類の安定性を確保可能な標準液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヒト以外に由来したタンパク質を添加し、かつｐＨを７．５以上とすることで、測定時におけるビタミンＤ類の安定性が向上することを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）から（５）に記載の態様を包含する。
【００１１】
（１）一定濃度のビタミンＤ類を含むビタミンＤ類標準液であって、ヒト以外に由来したタンパク質をさらに含み、かつそのｐＨが７．５以上である、前記標準液。
【００１２】
（２）ビタミンＤ類が２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３である、（１）に記載の標準液。
【００１３】
（３）ヒト以外に由来したタンパク質がウシ血清アルブミンである、（１）または（２）に記載の標準液。
【００１４】
（４）（１）から（３）に記載の標準液を凍結乾燥して得られる、凍結乾燥体。
【００１５】
（５）（１）から（３）に記載の標準液を用いて、抗原抗体反応を利用した免疫測定によりビタミンＤ類を測定する方法。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明において、ビタミンＤ類とは、ビタミンＤそのもの、またはその代謝産物のことをいい、具体的には、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２が例示できる。中でも、臨床検査の測定項目として注目されている、２５−ヒドロキシビタミンＤ３および２５−ヒドロキシビタミンＤ２に対して、本発明を適用すると好ましい。
【００１８】
本発明の標準液で添加する、ヒト以外に由来したタンパク質としては、抗原抗体反応を利用した免疫測定の分野で試薬等に通常添加するタンパク質が例示でき、具体的には、ウシ血清アルブミン、ヒト以外に由来したコラーゲンペプチド、カゼイン等があげられる。中でも、ウシ血清アルブミンが、本発明の標準液で添加するタンパク質として、好ましい。ヒト以外に由来したタンパク質の添加量は、免疫測定の分野で試薬等に通常添加する量の範囲で適宜決定すればよく、ヒト以外に由来したタンパク質としてウシ血清アルブミンを用いる場合は、１％（ｗ／ｖ）から１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは４％（ｗ／ｖ）から６％（ｗ／ｖ）添加すればよい。
【００１９】
本発明において、標準液のｐＨは７．５以上にする必要がある。そのため、標準液を調製する際は、ｐＨ７．５以上の緩衝液に対してビタミンＤ類およびヒト以外に由来したタンパク質を添加するとよい。緩衝液の種類については、ｐＨ７．５以上の領域で緩衝能を有するものであれば特に限定はなく、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液が例示できる。なお、標準液のｐＨを８．０以上とすると好ましく、ｐＨを８．５以上とすると、より好ましい。
【００２０】
本発明の標準液は、少なくともビタミンＤ類とヒト以外に由来したタンパク質とを含んでいればよいが、測定用途に応じてさらに他の成分を含んでもよい。他の成分の例としては、抗酸化剤（アスコルビン酸、ビタミンＥ等）、結合剤（カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（セルロース、ポリエチレングリコール等）、着色剤（合成食用色素等）、懸濁化剤（ポリビニルピロリドン等）、乳化剤（アルキルスルホン酸等）、溶解補助剤（グリセリン等）、等張化剤（Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム等）、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）等）があげられる。
【００２１】
本発明の標準液は、使用時は液状にする必要があるが、保存時においては必ずしも液状にする必要はなく、液状の標準液を凍結乾燥して得られる、凍結乾燥体の形で保存してもよい。本発明の標準液の凍結乾燥体を製造する際は、凍結乾燥−再溶解操作によるｐＨの変動を防ぐため、あらかじめ緩衝液を構成する成分を、ビタミンＤ類とヒト以外に由来したタンパク質とを含んだ溶液に添加するとよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、一定濃度のビタミンＤ類を含むビタミンＤ類標準液であって、ヒト以外に由来したタンパク質をさらに含み、かつそのｐＨが７．５以上であることを特徴としている。本発明により、供給安定性やヒトへの感染性の問題を有したヒト由来成分を使用しなくとも、ビタミンＤ類を安定に保存することができ、例えば抗原抗体反応を利用したビタミンＤ類の免疫測定時において、試料中に含まれるビタミンＤ類を精度高く定量することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
（１）以下に示す各溶液に、２５−ヒドロキシビタミンＤ３を終濃度２０ｎｇ／ｍＬまたは８０ｎｇ／ｍＬとなるよう添加することで、ビタミンＤ類標準液を調製した。
【００２５】
試薬Ａ：５％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
試薬Ｂ：５％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
試薬Ｃ：５％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
試薬Ｄ：５％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
試薬Ｅ：５％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
（２）（１）で調製したビタミンＤ類標準品各１ｍＬをガラス製容器に分注し、凍結乾燥した。
（３）各凍結乾燥体に蒸留水１ｍＬを加えて再溶解し、４℃（保存時を想定）または３５℃（測定時を想定）で１６時間保存した後、全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−２０００、東ソー社製）と当該装置用２５−ヒドロキシビタミンＤ免疫測定試薬とを用いて各標準品を測定し、当該試薬に含まれる基質（４−メチルウンベリフェロン）からの蛍光強度増加速度［ｎＭ／ｓ］を求めた。
【００２６】
結果を表１に示す。なお表１に示す蛍光強度増加速度［ｎＭ／ｓ］は、各標準品に対し、２回ずつ測定した値の平均値である。また測定値百分率は、以下の式に基づき算出している。
【００２７】
測定値百分率［％］＝
（３５℃で保存した標準液の蛍光強度増加速度）÷（４℃で保存した標準液の蛍
光強度増加速度）×１００
【００２８】
【表１】
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標準液のｐＨが７．０以下の場合、特にビタミンＤ類の添加量が低い（２０ｎｇ／ｍＬ）標準液において、４℃で保存した標準液と比較し、２０％以上測定値が減少していた。一方、標準液のｐＨを７．５以上とすると、４℃で保存した標準液に対する測定値の減少を１５％以下に抑えることができ、標準液のｐＨが８．０以上とすると、測定値の減少が約５％以下まで抑えることができた。つまり、ビタミンＤ類標準液を作成する際、ウシ血清アルブミンのようなヒト以外に由来したタンパク質を添加し、かつそのｐＨをアルカリ側（具体的にはｐＨ７．５以上、好ましくはｐＨ８．０以上、より好ましくはｐＨ８．５以上）とすることで、測定時（例えば、３５℃で１６時間）においても、ビタミンＤ類を安定に保存することができ、例えば抗原抗体反応を利用した免疫測定において、試料中に含まれるビタミンＤ類を精度高く測定することができる。