(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト胚性幹(hES)細胞およびそれらの誘導体の調製物を含む薬学的組成物、ならびにヒト身体へのそれらの移植のための方法の提供。【解決手段】動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子(steel factor)、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞および/またはそれらの誘導体が薬学的に許容される生体適合性溶液に懸濁されている、薬学的組成物であって、あらかじめ注射器に充填された薬学的組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のヒト胚性幹(hES)細胞および/またはそれらの誘導体を含む、疾患、障害、または状態の処置のための薬学的組成物であって、該hES細胞および/またはそれらの誘導体が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子(steel factor)もしくは可溶性スチール因子、または条件培地を伴わず、該hES細胞および/またはそれらの誘導体が薬学的に許容される生体適合性溶液に懸濁されている、薬学的組成物。
【請求項２】
すぐに使用できる形である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
すぐに使用できる形があらかじめ充填された注射器である、請求項2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
幹細胞が、治療的に有効であるための十分な生存度を有する、請求項2記載の薬学的組成物。
【請求項５】
幹細胞の生存度が40%より高い、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項６】
生体適合性溶液が生理食塩水である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
生体適合性溶液が抗微生物剤、抗細菌剤、または他の薬学的剤をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
治療的有効量の造血幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項９】
治療的有効量のニューロン幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
治療的有効量の造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
治療的有効量の間葉系幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
治療的有効量のインスリン産生幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
治療的有効量の肝幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
治療的有効量の心臓幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
治療的有効量の上皮幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
組成物における治療的有効量の造血幹細胞前駆体が約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
組成物における治療的有効量のニューロン幹細胞が約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、約0.25ml〜約100mlの生体適合性溶液における約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、約0.25ml〜約10mlの生体適合性溶液における750,000個〜約8千万個の細胞である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
疾患、障害、または状態が、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、発達障害、変性障害、神経系の家族性障害または外傷性障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、ならびに関節炎および血液障害からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
疾患、障害、または状態が、急性骨髄性白血病、腺癌、関節炎、星状細胞腫、聴覚神経萎縮症、自閉症、自己免疫障害、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、ベッカー型筋ジストロフィー、脳損傷、火傷、脳血管発作、脳性麻痺、昏睡、角膜潰瘍、角膜移植片拒絶、神経系の大脳皮質基底核変性症、冠動脈疾患、糖尿病、認知症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、末期腎疾患、エルブ麻痺、顔面肩甲筋ジストロフィー、受精能障害、フリートライヒ運動失調症、心不全、肝細胞癌、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、肢帯ジストロフィー、肝硬変、黄斑変性症、精神遅滞、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、ニーマン・ピック病、非治癒性皮膚潰瘍、オリーブ橋小脳萎縮症、視神経萎縮症、パーキンソン病、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、褥瘡、進行性核上麻痺、乾癬、眼球癆、拘束型心筋症、網膜色素変性症、右脚ブロック、サルコイドーシス、洞性徐脈、脊髄腫瘍、脊髄性筋ジストロフィー、脊髄小脳失調、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、血小板減少症、サラセミア、潰瘍性大腸炎、植物状態、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、無精子症、原発性卵巣障害、アフタ性潰瘍、ホルモンの不均衡、変形性関節症、ホルネル症候群および骨形成不全症、イオンチャネル疾患、ならびに低ガンマグロブリン血症からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
hES細胞および/またはそれらの誘導体を含む組成物であって、該hES細胞および/またはそれらの誘導体が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子および/もしくは可溶性スチール因子、または条件培地を伴わず、該hES細胞および/またはそれらの誘導体を生体適合性で選択透過性の構造またはマトリックスに捕捉することにより得られる、組成物。
【請求項２３】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が造血幹細胞前駆体を含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
hES細胞および/またはそれらの誘導体がニューロン幹細胞前駆体を含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２５】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が造血幹細胞およびニューロン幹細胞前駆体の組み合わせを含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２６】
生体適合性で選択透過性の構造またはマトリックスが、生体高分子、ポリペプチド、タンパク質、多糖、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース、およびゼラチンからなる群より選択される、請求項22記載の組成物。
【請求項２７】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が、アガロースおよびコラーゲンの混合物、またはアガロースおよびゼラチンの混合物に捕捉されている、請求項22記載の組成物。
【請求項２８】
以下の段階を含む、hES細胞を単離するための方法：
(a)最少必須培地からなる培地における2〜7日齢の胚を収集する段階、
(b)胚からhES細胞を機械的手段により単離する段階。
【請求項２９】
胚が2日齢の胚である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
機械的手段が振盪である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
以下の段階を含む、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞を増殖させる方法：
(a)最少必須培地、プロゲスチン、およびβ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン(βhCG)アゴニストからなる細胞培養培地にhES細胞を導入する段階；ならびに
(b)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、幹細胞をインキュベートする段階。
【請求項３２】
細胞培養培地がRPMIである、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項３３】
以下の段階をさらに含む、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法：
(c)段階(b)のインキュベートされた幹細胞のアリコートを採取する段階であって、該アリコートが少なくとも1個の幹細胞を含む、段階、
(d)細胞培養培地における細胞をプロゲステロンおよびβhCGと共にアリコートへ再懸濁する段階、
(e)プロゲスチンおよびβhCGアゴニストを含まない細胞培養培地に細胞を希釈する段階、ならびに
(f)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、細胞をインキュベートする段階。
【請求項３４】
インキュベーションがウォータージャケット型細胞培養インキュベーターにおいて行われる、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項３５】
培地における幹細胞が実質的に嫌気性の条件下で生体適合性容器においてインキュベートされる、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項３６】
幹細胞が増殖時に分化しない、請求項35記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項３７】
用いられるhES細胞が3日齢の胚から機械的手段により単離される、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項３８】
増殖した幹細胞を任意の汚染について検査する段階をさらに含む、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項３９】
培養過程が生体適合性容器において行われる、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項４０】
インキュベートされた幹細胞のアリコート対細胞培地の比が約1:3.5〜約1:35である、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項４１】
インキュベーションが実質的に嫌気性の環境で行われる、請求項31記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項４２】
インキュベーションが、生体適合性容器において行われ、その容量が培地によってほとんど完全に占有され、かつ容器が垂直位に保たれる、請求項41記載のhES細胞を増殖させる方法。
【請求項４３】
以下の段階を含む、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞を部分的に分化させる方法：
(a)最少必須培地からなる細胞培養培地にhES細胞を導入する段階；および
(b)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、幹細胞をインキュベートする段階。
【請求項４４】
細胞培養培地がRPMIまたはDMEMである、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項４５】
インキュベーションがウォータージャケット型細胞培養インキュベーターにおいて行われる、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項４６】
培地における幹細胞が実質的に好気性の条件下で生体適合性容器においてインキュベートされる、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項４７】
幹細胞が増殖時に分化する、請求項46記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項４８】
増殖した幹細胞を任意の汚染について検査する段階をさらに含む、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項４９】
培養過程が生体適合性容器において行われる、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項５０】
インキュベートされた幹細胞のアリコート対細胞培地の比が約1:3.5〜約1:35である、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項５１】
インキュベーションが実質的に好気性の環境で行われる、請求項43記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項５２】
インキュベーションが生体適合性容器において行われ、かつ容器が水平位に保たれる、請求項51記載のhES細胞を部分的に分化させる方法。
【請求項５３】
以下の段階を含む、ヒト移植のためのhES細胞および/またはそれらの誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法：
(a)動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞を得る段階、
(b)該幹細胞を遠心分離してペレットを得る段階、ならびに
(c)ペレットを生体適合性溶液に懸濁する段階。
【請求項５４】
以下の段階をさらに含む、請求項53記載のヒト移植のためのhES細胞および/またはそれらの誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法：
(d)調製物を約-15℃〜約-72℃で貯蔵する段階、および
(e)移植前に、貯蔵された調製物を自然に解凍する段階であって、細胞の生存度が解凍時に少なくとも40%である、段階。
【請求項５５】
調製物を移植前に任意の汚染について検査する段階をさらに含む、請求項53または54記載のヒト移植のためのhES細胞および/またはそれらの誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法。
【請求項５６】
(a)で得られたhES細胞および/またはそれらの誘導体が請求項31または45記載の方法により産生される、請求項53記載のヒト移植のためのhES細胞および/またはそれらの誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法。
【請求項５７】
以下の段階を含む、生存可能な状態でhES細胞および/またはそれらの誘導体の調製物を貯蔵する方法：
(a)請求項31または45記載の方法により調製されたhES細胞および/またはそれらの誘導体の調製物を採取する段階、
(b)凍結保存剤を加える段階、および
(c)細胞を約-15〜約-72℃で凍結させる段階。
【請求項５８】
凍結保存剤の量対培地の量の比が約1:500から約16:1000までである、請求項57記載のhES細胞および/またはそれらの誘導体の調製物を貯蔵する方法。
【請求項５９】
貯蔵が生体適合性容器においてである、請求項57記載のhES細胞および/またはそれらの誘導体の調製物を貯蔵する方法。
【請求項６０】
細胞が約-18〜約-20℃で凍結される、請求項57記載のhES細胞および/またはそれらの誘導体の調製物を貯蔵する方法。
【請求項６１】
被験体における疾患、障害、または状態の処置のための医薬を調製するための、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用であって、該細胞が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、または条件培地を伴わない、使用。
【請求項６２】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が請求項31または45記載の方法により産生される、請求項61記載の使用。
【請求項６３】
疾患、障害、または状態が、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、発達障害、変性障害、神経系の家族性障害または外傷性障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、関節炎、ならびに血液障害からなる群より選択される、請求項61記載の使用。
【請求項６４】
神経系障害が、自閉症、脳性麻痺、エルブ麻痺、精神遅滞、および進行性核上麻痺からなる群より選択される発達性神経系障害である、請求項63記載の使用。
【請求項６５】
神経系障害が、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、難聴(聴覚神経萎縮症)、認知症、フリートライヒ運動失調症、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、および脊髄小脳失調からなる群より選択される変性神経系障害である、請求項63記載の使用。
【請求項６６】
神経系障害が、脳損傷、昏睡、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、脊髄損傷または傷害、および植物状態からなる群より選択される神経系の外傷である、請求項63記載の使用。
【請求項６７】
神経系障害が脳血管発作または卒中である、請求項63記載の使用。
【請求項６８】
神経系障害が、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患およびハンチントン舞踏病からなる群より選択される家族性状態である、請求項63記載の使用。
【請求項６９】
肝臓および腎臓障害が、肝硬変、末期腎疾患、ネフローゼ症候群、およびニーマン・ピック病からなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７０】
皮膚障害が、関節炎、関節硬化症、火傷、非治癒性潰瘍、褥瘡、乾癬、全身性エリテマトーデス、およびサルコイドーシスからなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７１】
自己免疫障害が、血小板減少症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７２】
遺伝的障害が、ダウン症候群、強直性脊椎炎、サラセミア、およびハンチントン舞踏病からなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７３】
眼障害が、視神経萎縮症、眼球癆、黄斑変性症、網膜色素変性症、角膜の擦過傷、角膜移植片拒絶、および角膜潰瘍からなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７４】
筋骨格障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲筋ジストロフィー、肢帯ジストロフィー、脊髄性筋ジストロフィー、およびベッカー型筋ジストロフィーからなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７５】
心臓障害が、心筋梗塞、右脚ブロック、拘束型心筋症、心不全、洞性徐脈、および冠動脈疾患からなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７６】
腫瘍学的状態が、急性骨髄性白血病、副腎の腺癌、星状細胞腫、肝細胞癌、および脊髄腫瘍からなる群より選択される、請求項63記載の使用。
【請求項７７】
疾患が糖尿病である、請求項63記載の使用。
【請求項７８】
動物性産物、フィーダー細胞、条件培地、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、または可溶性スチール因子を含まない培地で培養された治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体の、筋内注射もしくは静脈内注射もしくは硬膜外注射もしくは硬膜外カテーテルもしくは球後注射もしくは皮下注射もしくは心腔内注射もしくは嚢内注射もしくは髄腔内注射による、または局所適用もしくは病巣内適用もしくは静脈内注入による、または噴霧器による、またはスプレーによる、または腟内経路による、または局部点眼薬および点耳薬による投与のための医薬の調製のための使用。
【請求項７９】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が請求項31または45記載の方法により産生される、請求項78記載の使用。
【請求項８０】
治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体が約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項78記載の使用。
【請求項８１】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が、造血幹細胞前駆体、ニューロン幹細胞前駆体、間葉系幹細胞前駆体、上皮幹細胞前駆体、腎臓幹細胞前駆体、心臓幹細胞前駆体、もしくは肝臓幹細胞前駆体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項78記載の使用。
【請求項８２】
疾患が、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、発達障害、変性障害、神経系の家族性障害または外傷性障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、関節炎、ならびに血液障害からなる群より選択される、請求項78記載の使用。
【請求項８３】
疾患、障害、または状態が、急性骨髄性白血病、腺癌、関節炎、星状細胞腫、聴覚神経萎縮症、自閉症、自己免疫障害、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、ベッカー型筋ジストロフィー、脳損傷、火傷、脳血管発作、脳性麻痺、昏睡、角膜潰瘍、角膜移植片拒絶、神経系の大脳皮質基底核変性症、冠動脈疾患、糖尿病、認知症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、末期腎疾患、エルブ麻痺、顔面肩甲筋ジストロフィー、受精能障害、フリートライヒ運動失調症、心不全、肝細胞癌、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、肢帯ジストロフィー、肝硬変、黄斑変性症、精神遅滞、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、ニーマン・ピック病、非治癒性皮膚潰瘍、オリーブ橋小脳萎縮症、視神経萎縮症、パーキンソン病、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、褥瘡、進行性核上麻痺、乾癬、眼球癆、拘束型心筋症、網膜色素変性症、右脚ブロック、サルコイドーシス、洞性徐脈、脊髄腫瘍、脊髄性筋ジストロフィー、脊髄小脳失調、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、血小板減少症、サラセミア、潰瘍性大腸炎、植物状態、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、無精子症、原発性卵巣障害、アフタ性潰瘍、ホルモンの不均衡、変形性関節症、ホルネル症候群および骨形成不全症、イオンチャネル疾患、ならびに低ガンマグロブリン血症からなる群より選択される、請求項78記載の使用。
【請求項８４】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が腫瘍、奇形腫、または染色体変化を引き起こさない、請求項78記載の使用。
【請求項８５】
以下の段階を含む方法による、被験体の脊髄傷害(SCI)の処置の医薬の調製のための、hES細胞および/またはそれらの誘導体の使用：
(a)約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体を皮下注射によって投与する段階；
(b)所定の期間後、段階(a)を繰り返し、その後、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を筋内注射によって投与する段階；
(c)ニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を、静脈内注射または注入によって投与する段階；
(d)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を、硬膜外注射によって投与し、臨床的および/または神経学的検査により評価される被験体の状態に依存して、所定の期間後、投薬を繰り返す段階；
(e)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を、仙骨(caudal)注射によって投与する段階；
(f)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を、髄腔内注射またはくも膜下ブロックカテーテルによって投与する段階；
(g)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を、硬膜外注射または硬膜外カテーテルによって投与する段階；
(h)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を脊椎の両側の深部脊椎注射によって投与する段階；ならびに
(i)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を静脈内注入によって投与する段階；
(j)段階(a)および(b)は最初に行われ、残りの段階は任意の順序で行われてもよい。
【請求項８６】
被験体がSCIからの回復の臨床的徴候を示すまで、段階(f)、続いて段階(g)を繰り返す段階をさらに含む、請求項85記載の使用。
【請求項８７】
hES細胞および/またはそれらの誘導体が請求項31または45記載の方法により産生される、請求項85記載の使用。
【請求項８８】
造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、段階(a)および段階(b)において0.25〜1.0mlの生体適合性溶液に懸濁される、請求項85記載の使用。
【請求項８９】
造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1100万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、段階(f)において2.0〜4.0mlの生体適合性溶液に懸濁される、請求項85記載の使用。
【請求項９０】
造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、段階(g)において15〜40mlの生体適合性溶液に懸濁される、請求項85記載の使用。
【請求項９１】
SCIを有する被験体の処置が結果として、床ずれの改善を生じる、請求項85記載の使用。
【請求項９２】
発達性、変性、家族性、および外傷性神経系障害ならびに脳血管発作の処置のための静脈内注射、皮下注射、筋内注射、髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、またはくも膜下ブロックカテーテル注入による投与のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項９３】
皮下または静脈内注射による皮膚障害の処置のための医薬の調製のための、造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項９４】
hES細胞および/または前駆体が損傷した皮膚に適用されるように生体適合性担体に混合される、請求項93記載の使用。
【請求項９５】
生体適合性担体が、ゲル、軟膏、ペースト、またはエアロゾルスプレーである、請求項94記載の使用。
【請求項９６】
局部または局所適用によるおよび筋内注射による床ずれの処置のための医薬の調製のための、約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項９７】
筋内注射、静脈内注射、皮下注射、関節内注射、もしくは静脈内注入、またはそれらの組み合わせによる自己免疫障害の処置のための医薬の調製のための、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項９８】
静脈内注射、皮下注射、筋内注射、髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、もしくはくも膜下ブロックカテーテル注入、またはそれらの組み合わせによる遺伝的障害の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項９９】
静脈内注射、筋内注射、もしくは生存可能組織と死んだ組織の接合部での局部適用、またはそれらの組み合わせによる壊疽の処置のための医薬の調製のための、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１００】
静脈内注射、皮下注射、筋内注射、浮遊状態または生体適合性担体に混合された局部適用による、老化に関連した状態の処置のための医薬の調製のための、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１０１】
生体適合性担体がゲル、軟膏、ペースト、またはエアロゾルスプレーである、請求項100記載の使用。
【請求項１０２】
静脈内もしくは筋内注射または両方による糖尿病の処置のための医薬の調製のための、約750,000個〜約1億6千万個のヒト胚性インスリン産生前駆細胞の使用。
【請求項１０３】
静脈内注射、皮下注射、筋内注射、心腔内注射、血管造影法、もしくは直接注射、またはそれらの組み合わせによる、心臓血管障害を処置するための医薬の調製のための、造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１０４】
投与が血管造影法中である、請求項102記載の使用。
【請求項１０５】
静脈内注射、皮下注射、筋内注射、静脈内注入、もしくは局部注射、またはそれらの組み合わせによる、肝臓および腎臓障害の処置のための医薬の調製のための、造血幹細胞前駆体、アルブミン産生幹細胞前駆体、およびビリルビン産生幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１０６】
局部筋内注射、精巣内注射によるか、もしくは副睾丸近くの皮下皮膚注射を通してか、またはそれらの組み合わせによる、受精能および生殖障害の処置のための医薬の調製のための、造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１０７】
静脈内注射、皮下注射、筋内注射、もしくは静脈内カテーテル注入、またはそれらの組み合わせによる、筋骨格障害の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１０８】
局部静脈内注射、皮下注射、筋内注射、球後注射、硝子体内注射、もしくは局所適用、またはそれらの組み合わせによる、眼障害の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体、造血幹細胞前駆体、および/または間葉系幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１０９】
ニューロン幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、球後注射により投与される、請求項108記載の使用。
【請求項１１０】
ニューロン幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、硝子体内注射により投与される、請求項108記載の使用。
【請求項１１１】
間葉系幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、角膜の擦過傷の処置のためにコンタクトレンズに適用される、請求項108記載の使用。
【請求項１１２】
筋内注射、静脈内注射、スプレー、もしくは噴霧器、またはそれらの組み合わせによる、肺障害の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１１３】
筋内注射もしくは静脈内注射、またはそれらの組み合わせによる、ホルモン障害の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１１４】
筋内注射もしくは静脈内注射、またはそれらの組み合わせによる、アフタ性潰瘍の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１１５】
筋内注射、静脈内注射、もしくは関節内注射、またはそれらの組み合わせによる、膝関節および股関節の変形性関節症の処置のための医薬の調製のための、ニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用。
【請求項１１６】
hES細胞および/またはそれらの誘導体への化合物の効果を試験するための方法であって、請求項31または45記載の方法により得られたhES細胞および/またはそれらの誘導体を化合物の存在下で培養する段階、ならびに化合物の細胞への効果を決定する段階を含む、方法。
【請求項１１７】
被験体への薬物の送達のための、医薬の調製における、請求項31または45記載の方法により得られたhES細胞および/またはそれらの誘導体の使用であって、細胞が薬物の存在下で薬物を取り込み、かつ細胞が被験体における薬物が送達される部位に投与される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、現在不治、末期、および内科の疾患、状態、または障害の処置に用いるヒト胚性幹(hES)細胞またはそれらの誘導体を含む薬学的組成物に関し、該幹細胞が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子(steel factor)、可溶性スチール因子、および条件培地を含まない。より具体的には、本発明は、移植プロトコールによってhES細胞を用いる、臨床的障害、および末期または現在不治の状態の処置の方法に関する。本発明はさらに、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わない新規な幹細胞系を調製する新規な方法に関する。本発明はさらに、そのような幹細胞の単離、培養、維持、増殖、分化、貯蔵、および保存に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
多数のヒト内科的障害、状態、および疾患が、既存の薬物治療、手術、もしくは移植方法では現在不治であるか、またはそれらは末期であるかのいずれかである。
【０００３】
幹細胞は、分裂して、幹細胞の性質を保持する「娘」細胞を生成する能力、またはより特定化された細胞型へ分化し始める娘を生じる能力、または各型の1つの娘細胞を生じる能力を有する。このように、幹細胞は、正常なヒト成長および発生の中心であり、それらの内因性特徴により、罹患または損傷した組織の再生のための新しい細胞の潜在的源でもある。幹細胞は、すべての発達段階に、および多数の(おそらく、たいていの)成体の組織に存在する。異なる組織由来、および異なる発達段階由来の幹細胞は、それらが通常、生じる細胞の数および型に関して異なる。この分類による幹細胞の主要なクラスは、胚性幹細胞、体性幹細胞、および胚性生殖細胞である。
【０００４】
受精後の最初期において(8細胞期まで)、胚の全細胞は、全能性である(すなわち、それらは、胎盤および臍帯などの胚外組織を含む完全な発生に必要とされる細胞のあらゆる型へ発達する能力を有する)。約2〜5日後、胚盤胞期に達する。50〜100細胞のこの球の内に、内部細胞塊があり、胚本体へと発達する。内部細胞塊は、この発達段階における全細胞の約4分の1、および固有のクラスの幹細胞；胚性幹細胞を含む。胚性幹細胞は、それぞれの200個ほどの細胞型へ分化する生得的な能力または可能性を有し、多能性として記載される。hESの発達においてすべての組織型に寄与する能力は、まだ完全には確立されていないが、それらは、培養で長い期間に渡って成長し、それらの細胞遺伝子型または表現型を変化させることなく数を増加し、これらの条件下でそれらの多能性状態を維持することができる。
【０００５】
胚盤胞期を過ぎて、幹細胞は、胚、胎児、成体の身体において細胞の割合の減少を含む。胎児および成体における、大部分ではないにしても、多くの組織は、幹細胞を含み、それらは、それらの正常な位置において、それらが通常存在する組織を再生するために限られた数の特定の細胞型へ分化する可能性を有する。これらの幹細胞(体性幹細胞)は多分化能性であり、それらが通常、ヒト身体の細胞型の全部ではないが、一部を生じるという点において、胚性幹細胞より制限された可能性を有しうる。体性幹細胞の主要な源は、胎児および成体の骨髄ならびに臍帯血である。
【０００６】
胚性幹細胞は、細胞分化事象、薬物スクリーニングを研究するための優れたインビトロ系として、および将来的な再生治療適用のための特定化された分化型細胞の主要な源としての役割を果たす。
【０００７】
胚性幹細胞は、多能性であり、いかなる分化した細胞型をも生じる発展可能性を有する。従って、特定の細胞型の遺伝的かまたは後天性かのいずれかの不全または調節解除に起因する疾患は、hES細胞またはそれらの誘導体の移植により、欠陥細胞の置換および罹患器官または組織の再生によって、ならびにまた休眠および瀕死の組織を刺激することによって、処置可能である可能性がある。
【０００８】
hES細胞またはそれらの誘導体のヒト身体への移植は、満たされていない医学的ニーズに取り組むための手段としての可能性を有することを示唆されている。
【０００９】
hES細胞の移植は、幅広い種類の疾患、状態、および障害の処置に革命を起こすだろうと広く考えられているが、今まで、研究は、マウスおよび霊長類における前臨床試験に限定されていた。動物モデルで観察された結果が、そのような細胞のヒトへの移植で起こるであろう事象を本当に表しているかどうかは疑問である。さらに、概念の臨床的使用なしに、幹細胞の投与についての薬学的組成物、プロトコール、投与経路、および用量は、定義も試験もされないままである。さらに、胚以外の源由来のヒト幹細胞、または他の種からの細胞、組織、および器官の異種移植が診療室で用いられているが、これらの試みは、大部分、不成功であった、または様々な衰弱させる副作用を示す。
【００１０】
本発明は、様々な、現在不治の、もしくは末期の状態、疾患、または障害を患っているヒトへの、hES細胞および/またはそれらの誘導体を含む薬学的組成物の移植を提供する。
【００１１】
米国特許第5,453,457号は、始原生殖細胞由来で、かつ塩基性線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および白血病抑制因子を含む非マウス哺乳動物多能性細胞を含む組成物を開示する。
【００１２】
米国特許第6,800,480号は、細胞外マトリックス上で増殖する未分化のhES細胞を含む組成物を主張する。
【００１３】
米国特許出願第2003/0017587号は、フィーダー細胞を必要としない培地を用いる、中絶された胎児、または新鮮もしくは凍結した卵割期胚盤胞から得られた未分化の胚性幹細胞インビトロ増殖を開示する。いったん単離されると、胚性幹細胞は、患者への移植での可能性のある副作用を考慮すれば望ましくない、成長因子、ウシ胎児血清、神経細胞成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、または条件培地を追加した細胞培養培地へ導入される。また、該特許出願は、患者が各型の細胞の1つの用量を必要とすることを除いて、遺伝的または臨床的障害の処置に用いられうるプロトコールについて沈黙している。
【００１４】
米国特許出願第2004/0071665号は、心臓病の処置に哺乳動物幹細胞を用いる治療方法を提供する。例は、フィーダー細胞上で培養され、その後、心筋梗塞を有するマウスの心臓の3つの部位に注射される、分化して心筋細胞クラスターを形成する胚性幹細胞を提供する。
【００１５】
米国特許出願第2004/0107453号は、成体幹細胞を得る、維持する、および分化させる方法、ならびに治療的処置でのそれらの使用を開示する。
【００１６】
米国特許出願第2005/0124003号は、胎児幹細胞を得る、維持する、および分化させる方法、ならびに治療的処置でのそれらの使用を開示する。
【００１７】
特に、および本発明に特に関連のあることには、脊髄損傷(SCI)のマウスモデルにおける胚性幹細胞の移植は、明らかに、急性SCIの処置の第一選択としてのそれらの将来的な可能性を示している(McDonald et al., (1999) Nature Med. 5:1410; Kerr et al., (2003) J. Neurosci. 23:5131; Roy et al., (2004) Nature Biotechnology, 22:297; Hori et al., (2003) Stem Cells, 21:405; Harper, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7123)。動物モデルにおける実証された効力にもかかわらず、移植片対宿主拒絶問題、免疫抑制剤の一生涯の投与の必要の可能性、ならびに腫瘍および奇形腫形成に関する疑念は、実験的人体試験において前臨床安全性および効力を再現する許可の遅延を生じている。臨床研究の設計に直面し、かつ本発明に特に関連のある、さらなる問題は、今までのところ、確立された投与プロコールまたはスケジュールがない、治療的有効量もしくは活性薬学的組成物は何か、またはどの細胞型もしくは細胞組み合わせが用いられるべきかについての研究がないことである。
【００１８】
それゆえに、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わずに、生体適合性溶液、担体、またはマトリックスに懸濁しており、それに従って、ヒト使用に適している、hES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物を開発することが本発明の目的である。
【００１９】
本発明のさらにもう一つの目的は、現在不治の、または末期の障害の処置のためのプロトコールを開発することである。
【００２０】
本発明のなおさらなる目的は、SCI(Spinal Cord Injury)の処置のためのプロトコールを開発することである。
【００２１】
本発明の組成物は、調製が簡単、安全、費用効果が高い、効率的、容易な可搬型、拡張可能、良い貯蔵寿命をもつ、ならびに抗体-抗原反応、異常な神経支配、腫瘍原性、奇形腫形成、または移植片宿主拒絶などの副作用を含まない。また、本発明は、たった1つの胚を必要とし、このゆえに、ヒト胚の連続的供給は必要とされない。また、本発明による処置についてのプロトコールは、免疫抑制剤の使用を必要としない、および疾患、状態、または障害の効果的な処置のために処置される被験体の、HLAタイピングに依存しない、人種、性別、または年齢に依存しない、回帰しない、および投与の分野における予備トレーニングの必要性がない。本発明の実施による薬学的組成物での被験体の処置は、それゆえに、世界中の任意の適切に備えられた臨床施設において可能である。
【００２２】
治療を目的としてヒト胚性幹細胞をヒトへ移植するために、そのような細胞は、細菌、ウイルス、プリオン、またはウイロイドなどの汚染を含まないことが重要である。良い製造および良い臨床業務などの標準作業実験室業務の採用がそのような汚染のリスクを許容レベルまで低下させる。
【００２３】
しかしながら、既存の細胞培養方法を通して、患者へのリスクは存在する。
【００２４】
主なリスクは、ヒト被験体への投与のための薬学的産物に保持される細胞培養培地の成分が投与されることであり、それゆえに、動物試験において「安全性」研究によって予想されえなかった、まだ予期しない副作用による患者へのリスクを表す。
【００２５】
そのようなリスクの排除はそれゆえに、望ましい。
【００２６】
ヒト被験体への投与のための胚性幹細胞培養源の特徴は、以下の設計をもつと同定されている：分化無しに長期間の増殖が可能である、ドナーの特徴のすべてが培養中、忠実に保持される核型を維持する、培養間中を通じて、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の誘導体へ分化する可能性を維持する、外因性因子の非存在下で培養される場合分化しない、奇形腫を生じない、免疫原性ではない、異常な結合および異所性組織を形成しない、損傷組織上で働く、ならびにインビボで連続的に分裂せずに、それらが自然の生活環において行うのをプログラムされているように分裂する。本発明に開示された培養方法および細胞系に存在する汚染はないはずである。
【００２７】
これまで研究の主要な主眼は、これらの必要条件を満たす培養条件を開発することであったが、今まで、そのような条件は、現れようとしたことはない、または臨床試験を通して確証されたことがない。特に、今までの研究は、成長のためのマトリックスとしてのマウスフィーダー細胞の要求の排除に焦点を合わせていた。フィーダー細胞の除去および「条件培地」の補充を通して未知の成長因子を供給する部分的療法もまた、理想的な培地において許容できないリスクを露呈している。フィーダー細胞条件培地の存在下で培養されたヒト胚性幹細胞は、汚染の固有のリスク、およびそれゆえに、ヒトへの移植中に許容できないリスクをなお保持する。
【００２８】
ヒトへ投与する予定になっているヒト胚性幹細胞の培養条件の設計における追加の因子は、細胞増殖相の間で必須ではないとすれば、投与される薬学的組成物に存在しうる培地における残留する外因性補充物の問題である。
【００２９】
これらには、塩基性線維芽細胞成長因子、白血病抑制因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、血清、アルブミンまたはアルブミン補充物、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、トランスフェリンまたはトランスフェリン補充物、抗酸化剤、インスリンまたはインスリン代用物、コラーゲン前駆体またはコラーゲン前駆体代用物、微量元素、「条件培地」の残留物、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、およびビタミン補充物が挙げられる。
【００３０】
そのような追加の補充物の残留物は、ヒト胚性幹細胞のそのような被験体への移植中での患者の安全性に対する不必要なリスクと見なされる。加えて、そのような因子の培地への補充は、環境からの汚染のリスクを増加させ、かつ幹細胞治療の将来的費用を増加させ、それゆえに、幅広い範囲の内科的疾患、状態、または障害におけるその適用性を制限する。
【００３１】
以下を含むいくつかのアプローチが、これらのリスクを低減するために採用されている：米国特許および出願第5,843,780号；第5,690,926号；第6,642,048号；第6,800,480号；第5,166,065号；第6,200,806号；第5,453,357号；第6,090,622号；第6,562,619号；第6,921,632号；第2006/0073587号および第2002/076747号。
【００３２】
しかしながら、これらのアプローチのいずれも、ヒトへの投与の際にヒト胚性幹細胞およびそれらの誘導体の効力ならびに安全性を冒しうる汚染する可能性のある因子を含まない、ヒト胚性幹細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的産物の産生のための系を提供していない。
【００３３】
それゆえに、幅広い種類の内科的障害にすぐに用いることができる薬学的産物を産生するために実質的に未分化の状態でhES細胞およびそれらの誘導体の増殖のための単純化された細胞培養系を開発することが、本発明のもう一つの目的である。
【００３４】
より具体的には、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わない幹細胞系を産生する培養技術を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【００３５】
発明の概要
本発明は、hES細胞および/またはそれらの誘導体を含む薬学的組成物、ならびに幅広い種類の状態、疾患、および障害の処置における、hES細胞およびそれらの誘導体の使用であって、幹細胞が様々な投与経路、局所適用、または病巣内挿入によりヒト身体へ導入される、使用を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、筋肉内、静脈内、仙骨(caudal)、硝子体内、線条体内、実質内、髄腔内、硬膜外、球後、皮下、心腔内、嚢内、関節内、もしくは髄腔内注射による、硬膜外カテーテル注入、くも膜下ブロックカテーテル注入、静脈内注入による、噴霧器による、スプレーによる、腟内経路による、局部点眼薬および点耳薬による、治療的有効量のhES細胞またはそれらの誘導体の投与のスケジュール、ならびにhES細胞およびそれらの誘導体の局所的または病巣内での投与のためのスケジュールを含む、末期の、もしくは現在不治の疾患、障害、または状態を患っている被験体を処置するための方法を提供する。
【００３７】
任意の汚染の機会および負の副作用の可能性を避けるために、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、ビタミン補充物、アミノ酸補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞またはそれらの誘導体を用いることが好ましい。hES細胞およびそれらの誘導体は、フィーダー細胞を含まず、かつ任意の源由来の汚染を含まず、かつヒト移植にとって安全である、任意の公知かつ認可された細胞培養方法を通して得られうる。hES誘導体はさらに、ヒト身体由来の分化した細胞を含む。
【００３８】
本発明はさらに、治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を含む、末期の、もしくは現在不治の疾患、障害、または状態の処置のための薬学的組成物であって、該hES細胞またはそれらの誘導体が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わずに、薬学的に許容される生体適合性溶液または任意の他の担体媒体に懸濁している、薬学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明はまた、生体適合性物質またはマトリックスに捕捉された、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞ならびに/またはそれらの誘導体を含む。生体適合性物質またはマトリックスは、フィブロネクチン、様々な型のコラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース、もしくはゼラチンを含む、ポリペプチドまたはタンパク質、多糖を含む生体高分子から選択されうる。
【００４０】
本発明の組成物は、幹細胞が十分な生存度を有する、すなわちそれらが本発明の1つまたは複数の方法に有用であるのに十分高い生存度を有する、すぐ使用できる薬物の形をとりうる。一つの態様において、幹細胞は、約40%より高い、例えば、約50%、60%、70%、または80%より高い、生存度を有する。組成物はさらに、抗微生物剤、抗細菌剤、ホルモン産物、または他の薬学的剤を含みうる。
【００４１】
組成物を調製するために、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/または造血幹細胞前駆体、ニューロン幹細胞前駆体、間葉系幹細胞前駆体、インスリン産生幹細胞前駆体、肝細胞の幹細胞前駆体、心臓幹細胞前駆体、上皮幹細胞前駆体、もしくはそれらの混合物などのそれらの誘導体の1つまたは複数が、約0.25ml〜約100mlの担体媒体に懸濁される。一つの態様において、約750,000個〜約8千万個のhES細胞が、約0.25ml〜約10mlの担体媒体に懸濁されている。集団における特定の分化した幹細胞前駆体型の濃縮は優先事項であるが、未分化の幹細胞の割合は組成物において保持される。一つの態様において、未分化の幹細胞の部分は、全細胞集団の約80%以下である。もう一つの態様において、未分化の幹細胞の部分は、全細胞集団の約40%以下である。
【００４２】
本発明により処置されうる、または改善されうる末期疾患および他の障害または状態は、非限定的に、癌、肝臓および腎臓障害、神経系障害、皮膚障害、自己免疫障害、遺伝的障害、眼障害、筋骨格障害、受精能および生殖障害、ならびに心臓血管障害を含み、かつ非限定的に、急性骨髄性白血病、腺癌、関節炎、星状細胞腫、聴覚神経萎縮症、自閉症、自己免疫障害、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、ベッカー型筋ジストロフィー、脳損傷、火傷、脳血管発作、脳性麻痺、昏睡、角膜潰瘍、角膜移植片拒絶、神経系の大脳皮質基底核変性症、冠動脈疾患、糖尿病、認知症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、末期腎疾患、エルブ麻痺、顔面肩甲筋ジストロフィー、受精能障害、フリートライヒ運動失調症、心不全、肝細胞癌、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、肢帯ジストロフィー、肝硬変、黄斑変性症、精神遅滞、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、ニーマン・ピック病、非治癒性皮膚潰瘍、オリーブ橋小脳萎縮症、視神経萎縮症、パーキンソン病、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、褥瘡、進行性核上麻痺、乾癬、眼球癆、拘束型心筋症、網膜色素変性症、右脚ブロック、サルコイドーシス、洞性徐脈、脊髄性筋ジストロフィー、脊髄小脳失調、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、血小板減少症、サラセミア、潰瘍性大腸炎、植物状態、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、無精子症、原発性卵巣障害、アフタ性潰瘍、ホルモンの不均衡、変形性関節症、ホルネル症候群および骨形成不全症を、イオンチャネル疾患および低ガンマグロブリン血症と共に、含む。
【００４３】
より具体的には、本発明は、以下の段階を含む被験体のSCIの処置の方法を提供する：
a)約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体を皮下注射によって投与する段階；
b)所定の期間後、段階(a)を繰り返し、その後、hES細胞および/またはそれらの誘導体を筋内注射によって投与する段階；
c)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、細胞を静脈内注射または注入によって投与する段階；
d)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を硬膜外注射によって投与し、臨床的および/または神経学的検査により評価される被験体の状態に依存して所定の期間後、該投薬を繰り返す段階；
e)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を仙骨注射によって投与する段階；
f)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を髄腔内注射またはくも膜下ブロックカテーテルによって投与する段階；
g)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を硬膜外注射または硬膜外カテーテルによって投与する段階；
h)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を脊椎の両側の深部脊椎注射によって投与する段階；ならびに
i)治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を静脈内注入によって投与する段階；
段階(a)および(b)は最初に行われ、残りの段階は任意の順序で行われてもよい。一つの態様において、段階(f)、続けて、段階(g)が、被験体が該SCIからの回復の臨床的徴候を示すまで、少なくとも1回、繰り返される。
【００４４】
本発明はまた、動物性産物、フィーダー細胞、条件培地、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、または可溶性スチール因子を含まない培地で培養されたhES細胞および/またはそれらの誘導体の治療的有効量を筋内注射もしくは静脈内注射もしくは硬膜外注射もしくは硬膜外カテーテルもしくは球後注射もしくは皮下注射もしくは心腔内注射もしくは嚢内注射もしくは髄腔内注射により、または局所適用もしくは病巣内適用により、投与する段階を含む、疾患、障害、または状態をもつ被験体を処置するための方法を提供する。一つの態様において、疾患、障害、または状態は、末期の、もしくは現在不治の疾患、障害、または状態である。
【００４５】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を単独でまたは組み合わせて含む、細胞の静脈内注射、皮下注射、筋内注射、髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、およびくも膜下ブロックカテーテル注入による投与を含む、発達性、変性、家族性、および外傷性神経系障害ならびに脳血管発作の処置のための方法を提供する。
【００４６】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体を含む、細胞の皮下または静脈内注射による投与を含む、皮膚障害の処置のための方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の、局部または局所適用による、および筋内注射による投与を含む、床ずれの処置のための方法を提供する。
【００４８】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体を含む、細胞の筋内注射もしくは静脈内注射もしくは皮下注射もしくは関節内注射もしくは静脈内注入、またはそれらの組み合わせによる投与を含む、自己免疫障害の処置のための方法を提供する。
【００４９】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を単独でまたは組み合わせて含む、細胞の静脈内注射、皮下注射、筋内注射、髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、もしくはくも膜下ブロックカテーテル注入、またはそれらの組み合わせによる投与を含む、遺伝的障害の処置のための方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の、静脈内注射、筋内注射、もしくは生存可能な組織と死んだ組織の接合部での局部適用、またはそれらの組み合わせによる投与を含む、壊疽の処置のための方法を提供する。
【００５１】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、またはゲル、軟膏、マトリックス、ペースト、もしくはエアロゾルスプレーなどの生体適合性担体に浮遊状態での、もしくは混合されての局部適用による投与を含む、老化に関連した状態の処置のための方法を提供する。
【００５２】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がインスリン産生前駆細胞を含む、細胞の静脈内もしくは筋内注射、またはそれらの組み合わせによる投与を含む、糖尿病の処置のための方法を提供する。
【００５３】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体を含む、細胞の静脈内注射、皮下注射、筋内注射、心腔内注射、血管造影法、または手術中の直接注射による投与を含む、心血管障害の処置のための方法を提供する。
【００５４】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体、アルブミン産生幹細胞前駆体、およびビリルビン産生幹細胞前駆体を含む、細胞の静脈内注射、皮下注射、筋内注射、静脈内注入、または局部注射よる投与を含む、肝臓および腎臓障害の処置のための方法を提供する。
【００５５】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体を含む、細胞の局部的筋内注射、精巣内注射による、または副睾丸近くの皮下の皮膚注射による投与を含む、受精能および生殖障害の処置のための方法を提供する。
【００５６】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を単独でまたは組み合わせて含む、細胞の静脈内注射、皮下注射、筋内注射、または静脈内カテーテル注入による投与を含む、筋骨格障害の処置のための方法を提供する。
【００５７】
本発明はまた、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体、造血幹細胞前駆体、および間葉系幹細胞前駆体を単独でまたは組み合わせて含む、細胞の局部的静脈内注射、皮下注射、筋内注射、球後注射、硝子体内注射、または局所適用よる投与を含む、眼障害の処置のための方法を提供する。一つの態様において、ニューロン幹細胞前駆体を含む約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、球後注射により投与される。もう一つの態様において、ニューロン幹細胞前駆体を含む約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、硝子体内注射により投与される。もう一つの態様において、間葉系幹細胞前駆体を含む約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体が、角膜の擦過傷の処置のために眼の上に留置するためにコンタクトレンズに適用される(例えば、コンタクトレンズは、コンタクトレンズを細胞で被覆するためにhES細胞および/またはそれらの誘導体と培養され、レンズはその後、約24時間、眼の上に留置される)。
【００５８】
本発明はまた、750,000個〜1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体を単独で、またはニューロン幹細胞前駆体と組み合わせて含む、細胞の筋内注射、静脈内注射、スプレー、または噴霧器よる投与を含む、肺障害の処置のための方法を提供する。一つの態様において、750,000個〜1億6千万個の造血幹細胞前駆体が、2mlの生理食塩水が加えられている噴霧器により投与される。もう一つの態様において、750,000個〜1億6千万個の造血幹細胞前駆体が、スプレー(ひと吹き)により投与される。
【００５９】
本発明はまた、750,000個〜1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血およびニューロン幹細胞を含む、細胞の筋肉内および静脈内経路による投与を含む、ホルモン障害の処置のための方法を提供する。
【００６０】
本発明はまた、750,000個〜1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血およびニューロン幹細胞を組み合わせてまたは単独で含む、細胞の筋肉内および静脈内経路による投与を含む、アフタ性潰瘍および他の潰瘍の処置のための方法を提供する。
【００６１】
本発明はまた、750,000個〜1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体の、筋内、静脈内、または関節内注射による投与を含む、膝関節および股関節の変形性関節症の処置のための方法を提供する。一つの態様において、750,000個〜1億6千万個の造血幹細胞前駆体が関節内に投与される。
【００６２】
本発明は、奇形腫形成、腫瘍形成、抗原性問題、または移植片対宿主拒絶などのいかなる副作用もなくヒトにおける移植に用いられうるhES細胞およびそれらの誘導体の培養に適用できる細胞培養方法を提供する。
【００６３】
培養方法の設計は、特に、十分な生存度、およびヒトにおける移植後の治療的に最適な活性のための適切な特徴を有するhES細胞およびそれらの誘導体の産生についてである。
【００６４】
好ましい態様において、細胞培養方法は、hES細胞の成長、増殖、分化、および貯蔵のために用いられる。加えて、本発明は、解凍時の直接的移植に適している貯蔵の条件で貯蔵されるhES細胞および/またはそれらの誘導体を含むすぐに注射できる組成物に関する。
【００６５】
実質的に未分化の状態でのhES細胞の維持のための現行の細胞培養方法と対照的に、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子、白血病抑制因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、血清、アルブミンまたはアルブミン補充物、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、トランスフェリンまたはトランスフェリン補充物、抗酸化剤、インスリンまたはインスリン代用物、コラーゲン前駆体またはコラーゲン前駆体代用物、微量元素、「条件培地」の残留物、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、およびビタミン補充物などの補充物を含まない。
【００６６】
hES細胞の増殖のための他の細胞培養方法とさらに対照的には、本発明の実施は、胚様体の形成をもたらさず、それにより外科的切開の必要性を回避する。本発明の産物が完全にヒト産物であるため、異種移植(例えば、動物試験)が必要ではない可能性があることは、この時点で注目に値する。最初のの体外受精(IVF)妊娠期間の事例は、結果として生じる例である。
【００６７】
他の細胞培養方法と違って、本発明の細胞培養技術は、有意な分化無しにhES細胞のほとんど無制限の増殖を可能にする。本発明の主要な利点は、単一の胚が多数の患者を処置するための治療的有効量のhES細胞および/またはそれらの誘導体を供給するのに十分であることである。従って、ヒト胚の繰り返される獲得の必要性がなく、ヒト胚の使用に関する倫理的問題の多くが回避されうる。
【００６８】
本発明の方法のさらなる利点は、hES細胞およびそれらの誘導体が免疫学的観点において普遍的に許容される産物であり、それゆえに、患者と細胞の交差マッチングが要求されず、かつ免疫抑制が必要とされないことである。
【００６９】
本発明の一つの局面は、以下の段階を含む、hES細胞を単離するための方法に関する：
(a)最少必須培地における2〜7日齢の胚を収集する段階、
(b)機械的手段により胚からhES細胞を単離する段階。
【００７０】
本発明の一つの局面は、以下の段階を含む、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないヒト胚性幹細胞を増殖させる方法に関する：
(a)最少必須培地、プロゲスチン、およびβ-ヒト絨毛性コナドトロピン(βhCG)アゴニストからなる細胞培養培地にヒト胚性幹細胞を導入する段階；ならびに
(b)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、幹細胞をインキュベートする段階。
【００７１】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、hES細胞が部分的に分化した期の前の期にあり、かつ動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わずにhES細胞を成長させる方法に関する：
(a)最少必須培地からなる細胞培養培地にhES細胞を導入する段階；および
(b)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、幹細胞をインキュベートする段階。
【００７２】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、ヒト移植のためのすぐに使用できるヒト胚性幹細胞調製物を調製する方法に関する：
(a)動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないヒト胚性幹細胞を得る段階、
(b)該幹細胞を遠心分離してペレットを得る段階、ならびに
(c)ペレットを生体適合性溶液に懸濁する段階。
【００７３】
本発明のもう一つの局面は、以下の段階を含む、生存可能な状態でヒト胚性幹細胞を貯蔵する方法に関する：
(a)本発明の方法により調製された幹細胞を採取する段階、
(b)凍結保存剤を加える段階、および
(c)細胞を-4〜-80℃で凍結させる段階。
【００７４】
そのような補充物の非存在下で本発明の実施に従ってhES細胞を成長させる目的は、培養物に細菌、真菌、ウイルス、または他の汚染を取り込むリスクを低減することである。これは、感染および細胞の特徴についての変異性のリスクを低減する。
【００７５】
本発明のさらなる目的は、いかなる汚染残留物を含まず、かつヒトに用いるのに安全である形をとるhES細胞およびそれらの誘導体の産生および増殖のための、単純な、費用効果の高い、拡大縮小可能な方法を提供することである。
【００７６】
本発明の目的は、それゆえに、すべての同時汚染物の投与のリスクが低減されている、および補充因子の残留汚染が排除されている薬学的産物を提供することである。
【００７７】
本発明のさらなる目的は、染色体異常または遺伝的不安定性のリスクを低減する細胞培養方法を提供することである。
【００７８】
本発明のさらなる目的は、該培養物が移植される患者における奇形腫形成のリスクを低減する細胞培養方法を提供することである。
【００７９】
本発明のさらなる目的は、該培養物が移植される患者における腫瘍形成のリスクを低減する細胞培養方法を提供することである。
【００８０】
本発明のさらなる目的は、該培養物が移植される患者における抗原性問題または移植片対宿主拒絶問題のリスクを低減する細胞培養方法を提供することである。
【００８１】
本発明は特に、安全および品質の国際規制基準に従う形をとり、かつそれゆえに、治療を目的としてすぐにヒト患者へ注射可能である形をとる、hES細胞およびそれらの誘導体ならびに生体適合性媒体を含む組成物を提供する。
【００８２】
本発明はまた、生体適合性溶液に懸濁したhES細胞および/またはそれらの誘導体の懸濁液を含み、かつ貯蔵、輸送、またはヒトへの直接的な移植のための容器に含まれる製造産物を提供する。
【００８３】
本発明はまた、hES細胞およびそれらの誘導体の増殖のための方法を提供する。
【００８４】
本発明はまた、hES細胞およびそれらの誘導体の増殖ならびにそれらの分化の抑制のための方法を提供する。
【００８５】
本発明はまた、hES細胞およびそれらの誘導体の成長のための方法であって、それらを疾患、状態、または障害を患っているヒトへの移植において治療的に有効にする方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
発明の詳細な説明
定義
以下の説明および実施例において、いくつかの用語が本明細書に用いられている。本明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ一貫した理解を提供するために、そのような用語が与えられるべき範囲を含め、以下の定義が提供される。
【００８７】
本発明を一般的に記載するために用いられる用語は、当業者により理解されているそれらの一般的な意味に沿う形で用いられることを言及しておく。
【００８８】
「胚性幹細胞」は、ヒトの多能性細胞を指す(すなわち、hES細胞)。一つの態様において、hES細胞は、前胚盤胞期(pre-blastocyst stage)胚から単離される。もう一つの態様において、hES細胞は、少なくとも部分的に分化した細胞(例えば、多分化能性細胞)の脱分化により調製され、実際には全能性である。hES細胞を調製する方法は、周知であり、例えば、米国特許第5,843,780号、第6,200,806号、第7,029,913号、第5,453,357号、第5,690,926号、第6,642,048号、第6,800,480号、第5,166,065号、第6,090,622号、第6,562,619号、第6,921,632号、および第5,914,268号、米国特許出願第2005/0176707号、ならびに国際特許出願第WO2001085917号に教示されている。
【００８９】
「胎児幹細胞」は、胎児組織、すなわち、子宮における胚の着床後の発育中のヒトの組織、由来の幹細胞を指す。
【００９０】
「多分化能の」は、密接に関連した細胞のファミリーの細胞のみを生じうる幹細胞を指す。
【００９１】
「多能性の」は、全能性細胞の子孫であり、かつ全能性幹細胞を除く任意の細胞型へ成長できる幹細胞を指す。
【００９２】
「全能性の」は、卵細胞と精子細胞の融合から生じる幹細胞を指す。受精卵細胞の最初の数回の分裂により生じた細胞もまた全能性である。これらの細胞は例外なしに任意の細胞型へ成長できる。
【００９３】
「治療的有効量」は、胚性幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、造血幹細胞前駆体、心臓幹細胞前駆体、もしくは任意の他の幹細胞の誘導体、または本発明の1つもしくは複数の局面を実施する関連内において意図された結果を生じるために有効である他の作用物質およびそれらの混合物などの成分の濃度または量を記載するために本明細書に用いられる。
【００９４】
「移植すること」および「移植」という用語は、本発明による胚性幹細胞および/またはそれらの誘導体が、ヒト身体内の部位へ送達される過程を記載するために同意語として本明細書を通じて用いられるが、ヒト身体内で、細胞は、非限定的に、被験体の中枢神経系の損傷を修復する、神経変性疾患を処置する、または卒中、心血管疾患、心臓発作、または身体的傷害もしくは外傷により引き起こされた神経損傷、または遺伝的損傷、または例えば、事故もしくは他の活動により引き起こされた脳および/もしくは脊髄もしくは他の器官への環境的傷害、肝臓損傷、自己免疫障害、性的もしくは生殖機能不全、眼の様々な部分の変性、腎臓損傷などの作用を処置するためを含む、本明細書に記載された疾患、障害、もしくは状態の処置または改善に関連した好ましい効果を示すことを意図される。
【００９５】
「生体適合性溶液」は、移植のプロトコールにおける使用のために、または任意のその後の他の使用のために、hES細胞および/またはそれらの誘導体を懸濁する溶液を指すように本明細書で用いられる。そのような生体適合性溶液には、生理食塩水を含み、保存剤、抗微生物剤などの他の成分、および他の薬学的剤をさらに含みうる。
【００９６】
「生体適合性担体」は、局所的処置、移植のプロトコールにおける使用のために、または任意の他のその後の使用のために、hES細胞および/またはそれらの誘導体を懸濁する固体担体、溶液、および混合物を指す。そのような生体適合性担体には、ゲル、軟膏、ペースト、およびエアロゾルスプレーが挙げられる。
【００９７】
「生体適合性容器」は、hES細胞および/またはそれらの誘導体が入れられ、かつ細胞が移植に用いられるのを妨げない、すなわち、被験体に投与されることができない化合物を細胞に混入させない、容器(例えば、細胞培養または貯蔵容器)を指すように本明細書で用いられる。生体適合性容器材料の例には、非限定的に、ガラス、ステンレススチール、およびポリスチレンが挙げられる。
【００９８】
「プロゲスチン」は、プロゲステロン様活性を有する、すなわち、生物活性の任意の公知のアッセイの1つにおいてプロゲステロンの活性の少なくとも25%を有する、任意の天然または合成ホルモンである。例には、非限定的に、プロゲステロン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ノルエチステロン、レボノルゲストレル、ノルゲストレル、ゲストデン、およびドロスピレノンが挙げられる。他のプロゲスチンの例は、米国特許第7,091,234号、第7,084,151号、第7,081,457号、第7,071,205号、第6,562,857号、第6,319,911号、第6,245,757号、第6,043,235号、および第6,028,064号に開示されている。
【００９９】
「β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン(βhCG)アゴニスト」は、生物活性の任意の公知のアッセイの1つにおいて天然βhCGの活性の少なくとも25%を有する任意の天然もしくは合成のβhCGまたはその断片もしくは誘導体として定義される。βhCGアゴニストの例には、非限定的に、βhCG、ならびに米国特許第6,635,445号、第6,585,982号、第6,583,109号、第6,469,139号、および第5,997,871号に開示されたものが挙げられる。
【０１００】
「最少必須培地」は、アミノ酸、塩、グルコース、およびビタミンを含む細胞培養培地を指すように本明細書で用いられる。例には、RPMI、DMEM、EMEM、およびGMEMが挙げられる。
【０１０１】
「噴霧」は、薬物または物質の噴霧器による肺への投与を意味する。
【０１０２】
関節内とは、関節内腔への投与を意味する。
【０１０３】
球後とは、球後腔への投与を意味する。
【０１０４】
静脈内注入とは、産物または薬物を含む静脈内輸液を用いることによる静脈への投与を意味する。
【０１０５】
「硬膜外」注射またはカテーテル注入とは、髄膜の硬膜の外側の領域への投与を意味する。
【０１０６】
「髄腔内」注射またはカテーテル注入とは、脳と連続している髄膜の最内層、すなわち脳脊髄液中の脊髄くも膜(arachnoid matter)への投与を意味する。
【０１０７】
「仙骨」注射とは、硬膜外腔と連続している尾骨の先端より約3センチメートル上にある仙骨膜を通しての投与を意味する。
【０１０８】
「深部脊椎注射」とは、脊椎の両側の脊柱起立筋への注射を意味する。
【０１０９】
「筋内」注射とは、筋肉シートの間への投与を意味する。
【０１１０】
「静脈内」注射とは、静脈の内側への投与を意味する。
【０１１１】
「急性SCI」とは、SCIの日付後3ヶ月までを意味する。
【０１１２】
「亜急性SCI」とは、SCIの日付後3ヶ月から傷害の日付後9ヶ月までを意味する。
【０１１３】
「慢性SCI」とは、SCIの日付後9ヶ月より以降を意味する。
【０１１４】
hES細胞の「誘導体」は、多分化能幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、および組織特異的幹細胞を含み、完全に分化した細胞を含まない。組織特異的幹細胞の例は、以下の表に見出されうる。
2014159455.tif 000002
2014159455.tif 000003
2014159455.tif 000004
【０１１５】
本発明は、hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該幹細胞が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わない、幹細胞を含む、現在不治の、もしくは末期の疾患、状態、または障害の臨床的処置に用いる薬学的組成物に関する。もう一つの態様において、本発明は、移植プロトコールによりhES細胞および/またはそれらの誘導体を用いる現在不治の、または末期の状態の処置の方法に関する。
【０１１６】
「動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わない」という句は、本発明の培養方法の結果として薬学的組成物に存在する可能性がある微量のプロゲスチンおよびβhCGアゴニストを除外しない。「動物性産物」という用語は、任意の非ヒト産物に関する。
【０１１７】
もう一つの態様において、本発明の方法は、すぐに使用できる形で、かつフィーダー細胞およびいかなる他の汚染をも含まない、hES細胞および/またはそれらの誘導体を含む薬学的組成物の移植のための、単純な、安全な、広範囲に適用可能な、再現性のある、および効率的な方法を提供する。これらの細胞は、任意の培養方法から得られ、患者の遺伝的背景、年齢、人種、および性別に関わりなく、かつ抗体抗原反応または移植片宿主拒絶無しに、奇形腫もしくは腫瘍の形成または他の衰弱させる副作用無しに、異常な神経支配無しに、および免疫抑制剤の投与の必要性無しに、様々な疾患、状態、および障害の処置のために、移植されうる。
【０１１８】
他の公知の方法と対照的に、本発明の薬学的組成物の調製に用いられるhES細胞は、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を含まない培地で成長し、それゆえに、意図された臨床用途の安全性または有効性に干渉しうるいかなる種類の汚染をももたない。
【０１１９】
本発明の実施に従って、hES細胞および/またはそれらの誘導体は、筋肉内、静脈内、仙骨、硝子体内、線条体内、実質内、髄腔内、硬膜外、球後、皮下、口腔、心腔内、嚢内、関節内、もしくは髄腔内注射により、または硬膜外カテーテル、くも膜下ブロックカテーテル、静脈内注入により、噴霧器により、スプレーにより、腟内経路により、および/または局部点眼薬および点耳薬により、ヒト身体へ導入される。もう一つの態様において、hES細胞および/またはそれらの誘導体は、局所的にまたは病巣内に投与される。
【０１２０】
各投与経路は、表1に示されているように、hES細胞および/またはそれらの誘導体の保存液からの特定の注射用容量、およびそれゆえに、特定の範囲の細胞を用いる。細胞型が示されている場合(例えば、下記の注射スケジュール表において)、示された細胞型は、細胞集団に主に存在する型である。
【０１２１】
（表１）
2014159455.tif 000005
【０１２２】
実験室と最終的な使用場所の間で、それが診療所であろうと他の場所であろうと、薬学的組成物は、低温貯蔵で保たれなければならない。一つの態様において、薬学的組成物は、約+4〜約-160℃で貯蔵される。もう一つの態様において、薬学的組成物は、約-15〜約-72℃、例えば、約-20〜約-40℃、で貯蔵される。
【０１２３】
一つの態様において、本発明に用いられるhES細胞は、自然の体外受精周期サイクルから捨てられ、インフォームドコンセントを通して提供された、予備の胚から単離される。代替の態様において、絨毛膜、羊水、および/または胎盤から単離された米国特許公開出願第2005/0124003号に記載されたものなどの、多能性胎児幹細胞が本発明に用いられる。
【０１２４】
本発明は、限定されるわけではないが、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、神経系障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、ならびに関節炎を含む様々な疾患、状態、および障害のhES細胞および/またはそれらの誘導体を用いる処置のための方法を提供する。
【０１２５】
本発明により処置されうる癌の非限定的例には、脊髄腫瘍、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵臓癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌腫、頭頸部癌、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部癌、乳房癌腫、卵巣癌腫、子宮頚癌、転移病巣、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌腫、精巣癌腫、膀胱癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、結腸癌腫、前立腺癌腫、泌尿生殖器癌腫、甲状腺癌腫、食道癌腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌腫、腎細胞癌腫、子宮内膜癌腫、副腎皮質癌腫、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、悪性高カルシウム血症、頸部過形成、白血病、急性リンパ球白血病、慢性リンパ球白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリー細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０１２６】
一つの態様において、hES細胞は、胚性であるので、細胞はプログラムされているため、分化誘導剤で処理せず、いったん被験体に投与されたならば、細胞は病変部位へ移動する。その部位において、細胞はインビボの分化シグナルに応答して分化する。病変部位において、hES細胞およびそれらの誘導体は、無制限に増殖せず、それにより、繰り返し注射のスケジュールを必要とする。hES細胞およびそれらの誘導体が無制限に増殖しないという事実は、腫瘍原性および奇形腫形成の可能性を排除する。
【０１２７】
本発明の実施によるhES細胞および/またはそれらの誘導体での処置後、患者は、休養をとり、そして、細胞機能を損ないかつhES細胞およびそれらの誘導体の病変部位への移動により誘発される再生過程を妨害しうる、アルコールまたはタバコなどの任意の物質の摂取を断つ厳しい療法を採用すべきである。患者はまた、妊娠中に有害であることが知られている任意の薬剤の服用も避けるべきであり、それは薬剤が移植された細胞に有害効果を生じる可能性があるためである。
【０１２８】
SCIの処置におけるhES細胞およびそれらの誘導体の使用
現在、しばしば、結果として対麻痺、四肢麻痺(tetraplegia)、および四肢麻痺(quadriplegia)を生じる、急性脊髄損傷、亜急性脊髄損傷、または慢性脊髄損傷を含むSCIの処置についての効果的な治療はない。SCIの処置のためのhES細胞の移植は、満たされていない医学的要求に取り組み、かつSCIの結果に苦しんでいる何百万人という世界中の人々の生活を劇的に向上させるためのまたとない機会を提供する。実質的に前駆体状態のhES細胞およびそれらの誘導体の移植を通して中枢および自律神経系の失われた機能を取り戻すことは、失われた細胞機能の置き換え、失われた神経細胞の再生、瘢痕組織などの物理的障壁の除去、抑制性シグナル伝達経路の遮断、ならびに移植されたhES細胞前駆体からの神経栄養因子の放出を通して、副交感神経性、交感神経性、運動性、自律神経性、および知覚性経路の回復を可能にする。
【０１２９】
本発明の実施によるhES細胞の移植を通しての神経学的機能の回復の利点の中には、以下がある：運動性および知覚性機能、一般的な生活の質の向上、一般的には身内により提供されるサポートシステムの低減、他の薬学的組成物ならびに他の医療装置および扶助への依存の減少、精神的および心理的状態ならびにまた経済的自立における向上。処置のための年あたり限られた数の診療所通院だけで、副交感神経性、交感神経性、知覚性、および運動性機能の回復を通して医療機器および身体障害扶助の費用ならびに薬剤依存における低減がある。自給自足の増強、社会的地位、配偶者の有無、および性と生殖に関する権利を行使する能力の向上がある。本発明に従うhES細胞およびそれらの誘導体の投与による処置は、抗原性、腫瘍形成、奇形腫形成、または異常な神経連絡の問題へ導かない。
【０１３０】
また、hES細胞およびそれらの誘導体の、特にSCI被験体への投与は、結果として、床ずれの治癒、昇圧剤または抗欝剤の彼らの必要性の低減、膀胱感覚および制御の回復、腸感覚ならびに痛覚および触知覚の回復；失われた反射神経の回復；冷や汗の症状の低減；目眩の感覚の低減；血圧の正常化、および全横隔膜病変を伴う呼吸の正常化を生じる。
【０１３１】
亜急性脊髄損傷または慢性脊髄損傷を患っており、かつ自然回復機構が機能しなかった患者へのhES細胞の投与についての手順は、下記で詳細に示されている。本発明の実施による、傷害の3ヶ月以内での処置の第一選択としての急性SCIの処置についての異なる手順もまた下記で詳細に提供されている。
【０１３２】
最初に投与されるべきhES細胞の、治療的有効量、投与のスケジュール、および投与経路は、3つの因子、すなわち、障害の型、患者の臨床的状態、および存在する症状の重症度に依存する。本発明の実施中、治療的有効量およびスケジュールは、年齢、性別、体重、または人種に依存しないことが見出されている。各患者についてのプロトコールは、患者の評価の進行中の過程に基づいて個々に確立される。
【０１３３】
本発明の実施の一つの態様において、hES細胞および/またはそれらの誘導体を含む薬学的組成物は、現在不治の障害または末期状態、または上記で言及されている他の臨床障害を患っている被験体に、障害を処置するために一連の注射を通して投与される。
【０１３４】
本発明による臨床障害および末期状態の処置についての様々な態様を、以下の例を参照して、ここに記載する。
【０１３５】
SCIを患っている患者の処置、投与用量、スケジュール、投与経路、評価、およびフォローアップ
一つの態様において、hES細胞および/またはそれらの誘導体は、障害を処置するために一連の注射を通して、3ヶ月より多くSCIを患っている被験体(亜急性および慢性SCI)へ投与される。もう一つの態様において、hES誘導体は造血前駆幹細胞である。もう一つの態様において、hES誘導体はニューロン前駆幹細胞である。
【０１３６】
試験投薬
一つの態様において、滅菌生理食塩水に約0.25〜約1.0mlの最終容量まで希釈された約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血前駆幹細胞およびニューロン前駆幹細胞を含む、細胞を標準プロトコールを用いて汚染および生存度について、ならびに計数について試験し、その後、試験投薬として前腕における皮下注射により投与する。アナフィラキーショック、注射の部位における疼痛または炎症、全身性そう痒、5分、10分、15分、30分、1時間、および24時間後のフラッシングまたは発熱について調べるために観察を行う。一つの態様において、hES細胞対造血前駆幹細胞およびニューロン前駆幹細胞の比率は、約4:1から約1:4までの範囲である。もう一つの態様において、比率は約1:1である。
【０１３７】
プライミング投薬
プロトコールは、約0.25ml〜約1.0mlの容量の滅菌生理食塩水に再懸濁された、約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血前駆幹細胞およびニューロン前駆幹細胞を含む、細胞を含む薬学的組成物の皮下、筋肉内、および/または静脈内プライミング注射の投与を含む。プライミング注射は、同数のhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の、1週間〜10日間、毎日の注射を通して投与される。
【０１３８】
硬膜外注射および硬膜外カテーテル
2mlの容量の滅菌生理食塩水に懸濁され、さらに5ml〜40mlの滅菌生理食塩水へ希釈された約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン前駆幹細胞を含む、細胞を、病変部位より上または下への硬膜外注射または硬膜外カテーテルにより、最初のプライミング注射から7〜10日後、連続3日間に渡って毎日2回、投与する。硬膜外注射/硬膜外カテーテルによる投与は、患者により示された症状の改善における臨床的進展および医師の意見に従って、病変部位より上または下へ繰り返される。患者を硬膜外注射後、仰向けに寝させる場合には、知覚性向上が大きく、彼/彼女をうつぶせで寝させる場合には、運動性向上が大きいこともまた観察されている。両方の場合とも、患者は脚を高い位置に保つようにしなければならない。
【０１３９】
髄腔内
2mlの滅菌生理食塩水に懸濁され、さらに2mlの滅菌生理食塩水により4mlの総容量へ希釈された約750,000個〜約1100万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン前駆幹細胞を含む、細胞を、病変部位より上または下への髄腔内注射により、プライミング注射の開始後2ヶ月目、5ヶ月目、8ヶ月目、12ヶ月目、17ヶ月目、および22ヶ月目の時期に投与する。
【０１４０】
一つの態様において、SCI処置は、病変部位より上または下へカテーテルを介する硬膜外注射により細胞を投与することにより、例えば、傷害後15日間、継続される。一つの態様において、2mlの容量の滅菌生理食塩水中に、その後さらに15ml〜40mlの滅菌生理食塩水へ希釈された約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン前駆幹細胞を含む、細胞の懸濁液を注射する。この処置は、その後、１ヶ月半、繰り返されうる。
【０１４１】
深部脊椎注射
症状好転の進展の観察に従って、0.25ml〜1.0mlの容量の滅菌生理食塩水に懸濁された、約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞およびニューロン前駆幹細胞の両方を含む、細胞を含む薬学的組成物の追加のブースター注射を投与しうる。一つの態様において、薬学的組成物は、脊椎の奥の深部脊椎注射により毎週または隔週に投与される。この処置は、背部筋肉を強くし、患者が運動性を取り戻したならば、身体のリハビリテーションを増強する。
【０１４２】
仙骨注射
本発明の実施により、2mlの生理食塩水に再懸濁され、単独で10mlへまたは最高20mlまでのDEPOMEDROL(酢酸メチルプレドニゾロン)と組み合わせて希釈された約750,000個〜約8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞の薬学的組成物を、仙骨注射により投与する。この処置は、腰部の筋肉を強くし、腰部および仙骨領域において知覚力および運動力の回復を可能にする。
【０１４３】
hES細胞の進行中の移植に加えて、患者の回復は、細胞機能および細胞再生過程を促進する、毎日の理学療法、および失われた運動機能を用いることの再教育、および健康的な生活様式の維持に関する指示により助けられる。
【０１４４】
局部投与
本発明の実施によるhES細胞および/またはそれらの誘導体を用いるSCIの直接的処置に加えて、患者の長期間不動化の結果として生じる床ずれは、hES細胞および/またはそれらの誘導体を含む薬学的組成物の局所適用を通して迅速かつ効果的に処置されうる。
【０１４５】
床ずれの処置は、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血前駆細胞を含む、細胞を含む薬学的組成物の局所適用により達成されうる。負荷投薬またはプライミング投薬は、内部治癒、加えて新血管形成を促進するのを可能にするために静脈内および筋肉内注射により与えられる。または、hES細胞およびそれらの誘導体を、2ml生理食塩水に再懸濁し、2〜4mlの生理食塩水で希釈し、病巣内に適用する。
【０１４６】
静脈内注入
本発明の実施により、750,000個〜8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血前駆細胞およびニューロン前駆細胞を含む、細胞を含む薬学的組成物を、100mlの生理食塩水に再懸濁し、静脈内経路により投与する。この処置は、幹細胞の身体への連続的な流入を保証し、他の直接経路が何かの理由、例えば、その部位での床ずれ、衰弱しすぎた患者などにより利用できない場合には、特に有用でありうる。
【０１４７】
急性SCIの処置についてのプロトコール
急性SCIの処置における迅速な介入は、患者の生存の可能性を大いに増強する。さらに、本発明の実施を通しての任意の不治の疾患、状態、または障害の処置における迅速な介入は、回復の可能性を増加させる。本発明のさらなる態様において、脊髄傷害後3ヶ月未満の間、急性SCIを患っている患者もまた、下で詳細に記載されているように成功裡に処置されうる。本発明の実施による効果的な理学療法、リハビリテーション、および再教育プログラムを伴うhES細胞および/またはそれらの誘導体の薬学的組成物は、急性SCIの処置の効果的な第一選択である。
【０１４８】
急性SCIの処置は、亜急性および慢性SCIの処置に用いられる全段階に加えて追加の2段階を含む。傷害後すぐのSCIについての最初の介入(例えば、手術)中、hES細胞および/またはそれらの誘導体を、傷害部位へ直接投与する。フォローアップ処置は、傷害の3ヶ月以内での2回の髄腔内注射および1回の硬膜外注射を含む。
【０１４９】
臨床評価および観察
長期間、脚の運動機能を失っていた患者について、本発明に従って処置されると同時に、歩行の再教育および他の理学療法についてのプログラムが、運動機能が彼らの脚に戻るように実施されるべきである。そのようなプログラムにおける第一段階として、歩行器およびカリパス副木の使用は、再教育に効果的であることが証明されている。腕および上半身の筋肉化の追加のプログラムは、患者が歩行において助けを受けずに体重を支えることができるために実施されるべきである。再教育プログラムは、処置が継続し、患者の状態が改善するにつれて減らしてもよい。
【０１５０】
本発明の実施による処置を通しての患者の交感神経性および副交感神経性症状の改善の理由による医療装置のサポートおよび理学療法の必要性の低減に加えて、血圧変動薬、鬱病薬、床ずれ薬、腸および膀胱合併症の薬剤および医療装置、抗痙攣薬物およびポンプを含む薬剤の必要性の低減がある。
【０１５１】
SCIに直接的または間接的に関連した症状の処置のための薬剤の必要性の低減に加えて、SCIを伴い、かつ本発明により処置された糖尿病は、抗糖尿病薬物の必要性の低減を示すことが観察されている。
【０１５２】
SCIを患っており、かつ本発明により処置された患者により示される症状の改善における進行の臨床評価は、処置の経過中および寛解後定期的にモニターされる。いくつかの生理的、交感神経的、副交感神経的、運動的、自律的、および心理学的パラメーターが、SCIの症状を好転させる技術の効力を判断するために評価され、これらは下で詳細に記載されている。
【０１５３】
症状記載、病変部位分類、症状進行、臨床的介入、処置、および一般的な傷害歴を含む委託臨床医の記録が審査される。この審査、ならびに磁気共鳴映像法(MRI)、筋電図検査法(EMG)、神経伝達速度(NCV)スキャン法、および損傷の程度を評価するための、および処置前の病変の記録を得るための神経学的検査を含む他の神経学的検査および調査を含む患者の徹底的な検査に基づいて、本発明の実施による移植後の改善の半定量的記載のための方法が作成され、下で詳細に記載されている。
【０１５４】
心理学的評価の一部として、患者の精神状態、鬱状態かそうでないか、行動特性、脳神経機能、および一般的な態度を含む交感神経的パラメーターならびに神経学的幸福度が記載される。
【０１５５】
病変部位における神経学的損傷および自律神経系の機能に結びつけられる徴候および症状の評価がなされる。これは、神経学的検査、強い圧力を感じる能力、触覚、感覚、バランス、疼痛を感じる能力、温度の変化を感じる能力、不随運動、冷や汗の存在、目眩、血圧、呼吸困難、横たわる時の異常な姿勢、および助けを受けないで座る能力の試験を含む。
【０１５６】
膀胱および腸機能の評価がなされる。これは、膀胱制御、膀胱の流れ、および膀胱における満杯の感覚、腸制御、腸の排出の時間、および腸における感覚を含む。
【０１５７】
上半身の運動機能の評価は、中枢神経系への損傷の程度を評価するためになされる。これは、肩の運動、手首および指の運動、腱反射、肢運動の強さ、筋肉萎縮、ならびに把握反射を含む。
【０１５８】
下半身の運動機能の評価は、中枢神経系への損傷の程度を評価するためになされる。これは、股関節の運動、膝運動、足指の運動、腱反射、肢の強さ、筋肉萎縮、ならびに足底反応を含む。詳細な神経学的検査もまた、肢神経支配の進行をモニターするために処置中の定期的に行われる。
【０１５９】
通院の過程において患者の回復を助けるために、標準理学療法技術が、運動機能が戻るにつれて患者の調子を整えて、彼らの四肢および関節の使用を取り戻し、より動きやすくなるように用いられる。
【０１６０】
神経再生の証拠は、神経学的機能および神経学的評価の回復により実証される。SCIについての処置の例は、本出願における症例研究として提供されている。
【０１６１】
神経系の発達障害の処置
本発明の実施によるhES細胞および/またはそれらの誘導体は、自閉症および精神遅滞などの発達障害の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与される。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞が、試験投薬後、筋肉内または静脈内経路を経由して投与される。髄腔内経路もまた用いられうる。さらなる態様において、頭蓋内移植もまた用いられうる。hES細胞および/またはそれらの誘導体は、主にニューロン前駆細胞である。もう一つの態様において、造血およびニューロン前駆細胞が筋肉内または静脈内経路を経由して投与される。この処置は、3ヶ月間の筋肉内または静脈内経路の毎日の注射から始まって1年間に渡って継続する。その後、同じ注射が、次の3〜6ヶ月間、週に1回、その後、次の3ヶ月間、2週間に1回、およびその後、月に1回、医師の観察に従って、継続する。髄腔内注射は、処置の開始後6〜8ヶ月間のみ、およびその後また、患者が筋肉内および静脈内注射に対して応答を示していない場合のみ、プロトコールに含まれる。本発明のもう一つの態様において、750,000個〜8千万個のhES細胞および/またはそれらの誘導体は、100mlの生理食塩水に再懸濁され、静脈内注入により投与される。
【実施例】
【０１６２】
実施例1：
羽ばたき振戦、過活動状態、社会的技能をもたない、アイコンタクトがない、ピンローリング運動、指示に従うことができない、学ぶ意思がないことを示す、自閉症と診断された患者は、ニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含むhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与後、改善を示した。
【０１６３】
この患者についての注射のスケジュールは表2に示されている。この表および注射スケジュールに関する次の表のすべてについて、細胞型表示「ニューロン」とは神経前駆幹細胞への分化を促進する培地(例えば、DMEM)において部分的に分化しているhES細胞の細胞集団を指す。細胞集団は、主にニューロン前駆幹細胞であるhES細胞および幹細胞を含む。「非ニューロン」という表示は、ニューロン前駆幹細胞以外の前駆幹細胞への分化を促進する培地(例えば、RPMI)において部分的に分化しているhES細胞の細胞集団を指す。細胞集団は、大部分はニューロン前駆幹細胞ではないhES細胞および様々な幹細胞を含む。
【０１６４】
（表２）
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【０１６５】
変性神経系障害の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施によりニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、限定されるわけではないが、大脳皮質基底核変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、認知症、聴覚神経萎縮症、および運動ニューロン疾患を含む変性神経系障害の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与する。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞を投与する。
【０１６６】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、子どもにおける変性神経系障害の処置のための典型的なプロトコールは、最初の1ヶ月において毎日、筋内および静脈内注射、2ヶ月目〜4ヶ月目の間、週に3回注射、5ヶ月目および6ヶ月目において毎週注射、および9ヶ月目〜12ヶ月目において毎週ブースター注射を含む。成人について、典型的なプロトコールは、毎日、硬膜外カテーテル、腰椎穿刺、髄腔内または仙骨経路による投与と共に筋内および静脈内注射を含む。これに続いて、少なくとも7日間の最小限の隔たりで2回の静脈内注入を行う。最後に、ブースター注射を、6ヶ月間、月に1回、およびその後、少なくとも6ヶ月間、2ヶ月ごとに1回、投与する。処置は、より長い期間、継続される場合があり、疾患が進行性である場合、生涯に渡ることさえありうる。
【０１６７】
進行性かつ変性障害の場合、本発明の実施による迅速な介入を通して疾患進行を止めるまたは安定させることは、患者の自己依存の増加を可能にする。いくつかの改善が見られうるのは、安定効果後のみである。
【０１６８】
実施例2：
SOLUMEDROL(メチルプレドニゾロン)を毎日服用する反復性進行性多発性硬化症の2年間の病歴に苦しんでいる患者は、歩くことができなかった、膀胱または腸の制御をもたなかった、およびしばしば、呼吸器障害に苦しんだ。
【０１６９】
本発明による処置に従って、被験体の状態は改善され、患者は、歩くことができ、膀胱および腸の制御の回復があり、かつSOLUMEDROLの使用が低減した。MRIは50%改善を示している。
【０１７０】
この患者についての注射のスケジュールは表3に示されている。
【０１７１】
（表３）
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【０１７２】
実施例3：
60歳の男性は、2年前、腕および手に急速な衰退があるALS(運動ニューロン疾患)を示した。腕、手、および舌に持続性単収縮および線維束収縮があった。彼は、左腕を回外および回内させることができなかった、またはそれを頭より上へ上げることができなかった。彼の右腕を、グイッと持ち上げることができたが、骸骨のような手であった。
【０１７３】
処置から1年半後、彼の手は、骸骨のような骨組から回復し、両手の小指球筋および母指球筋が再生した。回外および回内は両腕で可能である。彼は嚥下に同じ困難を見出したが、その後ずっと、悪化していない。脚、呼吸、および発語に衰退はない。
【０１７４】
この患者についての注射のスケジュールは表4に示されている。
【０１７５】
（表４）
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【０１７６】
実施例4：
患者はパーキンソン病に罹っていると診断された。患者は標準的処置に応答せず、彼の状態は時間が進むにつれて悪化した。彼は典型的な引きずり歩行をした。片側性振戦が右腕に存在し、彼は生理学的に非常に落ち込んでいた。彼は眼を開くことができなかった。処置が開始されてから、患者は徐々に改善を示し、1年間のhES細胞処置後、患者は著しく改善されている。歩行は正常であり、手における振戦は最小であり、心理的に彼は陽気である。彼は眼を完全に開く。彼は、処置の開始時点では不可能であった、サインすること、および書くことが現在可能である。彼は、現在、他人への依存が低下した。
【０１７７】
この患者についての注射のスケジュールは表5に示されている。
【０１７８】
（表５）
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【０１７９】
脳性麻痺の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施によりニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、脳性麻痺の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与する。プロトコールおよび用量は神経変性障害の処置についてのものと同じである。
【０１８０】
実施例5：
生まれた時にCP(脳性麻痺)とAIIMSで診断された48歳の男性は、不明瞭な言語、引きずり歩行、嚥下困難、および左側の片側不全麻痺を有した。筋緊張、反射神経、および力のチャート作成は、それらを確認するために行われた。
【０１８１】
処置から6ヶ月後、彼は、より明瞭な言語を発する、嚥下困難がない、身体の左側を用いることができる、および彼の歩行は改善している。彼は、左手でひげを剃ることができる、また左手を用いてコップを持ち上げることができる。彼のバランスはより良くなり、彼は長く歩き続けることができる。
【０１８２】
この患者についての注射のスケジュールは表6に示されている。
【０１８３】
（表６）
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【０１８４】
実施例6：
3歳の女の子がCPで診療所へ連れてこられ、生後1ヶ月の赤ちゃんのように見え、かつふるまい、首のすわりがない、弱い泣き声、応答なし、瓶を通して吸うことができなかった。彼女は全くへなへなであった。
【０１８５】
1年半の処置後、彼女は成長し、2歳の幼児のように見えた。彼女は首のすわりがある、彼女の両親を認識する、ベッドの上をはう、通常の食べ物を食べる、認識して微笑む、およびサポートを受けて座る、そして、彼女の母親が彼女を支えて、2、3歩、歩いた。彼女の歩行ははさみ歩行であり、彼女はまた、両親へ呼びかけし始めた。
【０１８６】
この患者についての注射のスケジュールは表7に示されている。
【０１８７】
（表７）
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【０１８８】
実施例8：
8歳の子どもが脳性麻痺と診断され、重度の精神遅滞をもち、自力で歩くことができなかった。彼女は物体を識別することができず、注意持続時間が非常に低かった。よだれを垂らすことが多く、口を開けたままであった。
【０１８９】
処置後、彼女はよだれを垂らさない、彼女の注意持続時間は向上し、より機敏に見ている。彼女は最小のサポートで歩いている。
【０１９０】
この患者についての注射のスケジュールは表8に示されている。
【０１９１】
（表８）
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【０１９２】
神経系外傷の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施によりニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、限定されるわけではないが、脳損傷、昏睡、および植物状態を含む神経系外傷の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与する。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞が投与される。
【０１９３】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、神経系外傷の処置のための典型的なプロトコールは、最初の2ヶ月間、毎日、筋内および静脈内注射を髄腔内および硬膜外注射と共に含む。
【０１９４】
脳血管発作または卒中の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施によりニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、脳血管発作または卒中の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与する。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞が投与される。
【０１９５】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、脳血管発作の処置のための典型的なプロトコールは、2週間、毎日、筋内および静脈内注射、および最初の1ヶ月の間、その後、3日間、静脈内注入、2ヶ月目および3ヶ月目の間、15日ごとに2日間、静脈内注入、5ヶ月目の間、2日間の静脈内注入および髄腔内注射、8ヶ月目、10ヶ月目、および12ヶ月目の間、4日間の静脈内注入、続いて4日間の筋内注射を含む。
【０１９６】
実施例9：
脳血管発作または卒中と診断された患者は、右側の片側不全麻痺に苦しみ、流涎、嚥下困難、会話不能、または歩行不能があった。加えて、患者は結腸の癌を有した。本発明による処置後、患者は、発語および運動活動の改善、まっすぐになった脊柱、および片側不全麻痺の治癒などの、改善の兆しを示した。
【０１９７】
この患者についての注射のスケジュールは表9に示されている。
【０１９８】
（表９）
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【０１９９】
実施例9：
82歳の男性は5年前、脳卒中を患い、右側の片側不全麻痺を示し、顔面非対称および不明瞭な発語を伴った。彼は杖をもって、大きく足を引きずって歩き、協調困難のせいで右手で食べることができなかった。彼は自力で座る、または起き上がることができず、歩行の際、足をひきずった。流涎があり、彼はまたうまく嚥下することができなかった。
【０２００】
処置から2ヶ月後、彼はサポート無しで歩くことができる、自力で座ったり立ったりする、右手で食べる、不明瞭言語および顔面非対称をもたない。彼は椅子から立ち上がることができる。彼は、バランスを維持しながら、歩行の際、罹患した膝を曲げている。
【０２０１】
この患者についての注射のスケジュールは表10に示されている。
【０２０２】
（表１０）
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2014159455.tif 000035
【０２０３】
家族性神経系障害の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施によりニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、限定されるわけではないが、オリーブ橋小脳萎縮症およびハンチントン舞踏病を含む家族性神経系障害の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で被験体に投与する。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞が投与される。投与経路は、髄腔内、硬膜外カテーテル、および静脈内注入と共に筋内および静脈内である。これは、その人の一生涯、継続する可能性が最も高いが、最初の1年は、以下のような集中的なプログラムである - 少なくとも3ヶ月間、毎日、筋内および静脈内注射、その期間中、髄腔内、硬膜外カテーテル、および静脈内注入もまた投与される。注射の同じセットが、1ヶ月半の隔たりの後、21日間に渡って投与される。毎日の筋内および静脈内注射は継続され、その後、患者の状態に依存して、週に3回、週に2回、週に1回、2週間に1回、およびその後、毎月へ低減される。髄腔内注射は、4〜6ヶ月の隔たりで繰り返されることができ、硬膜外カテーテルも同様である。静脈内注入は、2週間ごとに、1ヶ月ごとに、または2ヶ月ごとに与えられうる。
【０２０４】
実施例10：
患者は、孤発性脊髄小脳性運動失調症と診断され、寝返りをうつことができなかった、歩くことができなかった、または座りながら位置を変えることができなかった、発語困難を有した、振戦を有した、および首を持ち上げることができなかった。
【０２０５】
本発明の実施による幹細胞処置後、すべての症状における改善が観察され、患者は、バランスをとって、2、3歩、歩くことができた。言語は明瞭になった。
【０２０６】
この患者についての注射のスケジュールは表11に示されている。
【０２０７】
（表１１）
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2014159455.tif 000037
【０２０８】
実施例11：
家族性オリーブ橋小脳萎縮症をもつ患者は、John Hopkins Universityで診断された。彼女の父親、双子の姉妹、および兄は同じ疾患に冒されていた。彼女は、呼気音でのみ話すことができた、持続性尿滴下をもち車椅子に束縛されていた、および用手排便を行わなければならなかった。彼女は身体中に振戦をもち、座る時でさえもバランスをとることができなかった。重度の立ちくらみがあるように考えられた。
【０２０９】
2年間の処置後、患者は、自分の排泄行為のためにトイレへ行く、よく話す、振戦がない、およびサポートを受けて歩くことができる。彼女の双子の姉妹が同じ疾患で寝込んでいるにもかかわらず、それ以来、悪化はしていない。立ちくらみはなく、彼女は確かに悪化していない。
【０２１０】
皮膚障害の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施により造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、限定されるわけではないが、非治癒性潰瘍、乾癬、褥瘡、およびサルコイドーシスを含む皮膚障害の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で皮下もしくは静脈内注射により、または局部もしくは局所適用により投与する。皮膚障害の場合、hES細胞はまたは、皮膚障害または損傷を処置するために局所的に用いられうる。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞が投与される。
【０２１１】
一つの態様において、hES細胞または分化した皮膚細胞および胚性抽出物を、ゲル、軟膏、またはペーストなどの生体適合性担体と混合し、治癒を促進するために、および糖尿病性または褥瘡性潰瘍などの治癒抵抗性創傷を治癒するために、損傷した皮膚または粘膜組織へ適用しうる。または、細胞を、懸濁液または乳濁液で供給しうる。一つの態様において、担体はまた、抗微生物剤、鎮痛薬、または他の薬学的剤を含む。
【０２１２】
または、異なる態様において、hES細胞をモスリンなどの滅菌人工多孔質基体上で成長させ、創傷へ直接適用する。12〜24時間後、モスリンを除去し、幹細胞は成長し続けて、創傷を治癒する。病巣内に適用すると、hES細胞は分化し、最終的には損傷した細胞に取って代わる。
【０２１３】
実施例12：
70歳の女性は、左足首に通常の治療にもかかわらず治癒しない火傷を負っていた。火傷部位上へのhES細胞の適用後、彼女の創傷は治癒し始め、3年後、皮膚は完全に大丈夫である。
【０２１４】
自己免疫障害の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が本発明の実施により造血幹細胞前駆体を含む、細胞を、限定されるわけではないが、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、心筋症、サルコイドーシス、関節炎、および潰瘍性大腸炎を含む自己免疫障害の処置のために約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で筋内注射、静脈内注射、皮下注射、関節内注射、もしくは静脈内注入、またはそれらの組み合わせにより投与する。もう一つの態様において、約750,000個〜約8千万個の細胞が投与される。hES細胞の投与は、自己免疫障害の処置においてだけでなく、抑制された免疫系の回復においても高度に効果的である。免疫抑制剤での処置の代替として、または臓器移植もしくは他の医学的介入のために患者を「プライミング」する方法として、hES細胞およびそれらの誘導体は、宿主移植片拒絶過程の低減を通して臓器の許容を可能にするために用いられうる。
【０２１５】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、自己免疫障害の処置のための典型的なプロトコールは、最初の2ヶ月間、毎日の注射、3ヶ月目の間、静脈内注入と共に隔日注射、5〜7ヶ月目および10〜12ヶ月目の間、15日ごとに2日間の連続静脈内注入と共に毎週の注射、ならびに1年間、3ヶ月ごとの、およびその後、1年間、6ヶ月ごとのブースター注射を含む。
【０２１６】
実施例13：
過去26年間、乾癬を患っている患者は、車椅子に束縛され、高血圧、糖尿病、および乾癬性関節炎を有し、彼女の脚の巨大な潰瘍は、治癒せず、皮膚移植に適さなかった。
【０２１７】
6ヶ月間、治療を受けた後、彼女は潰瘍および関節炎を有さなかった。彼女の糖尿病及び高血圧は制御されていた。彼女は自力で歩き始め、あらゆる活動を開始しており、この1年間、ブースター注射を受けている。彼女は、過去26年間で初めて歩いたと主張し、自力ですべての家事を行うことができる。
【０２１８】
幹細胞処置は傷へ局部的に行われ、傷は治癒した。また、処置後、さらなる傷は検出されなかった。皮膚の鱗屑性およびそう痒性ならびに脚の腫れもまた低減した。糖尿病性状態もまた治癒し、血圧が制御され、薬物療法が低減した。
【０２１９】
この患者についての注射のスケジュールは表12に示されている。
【０２２０】
（表１２）
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【０２２１】
血液障害の処置
本発明の実施による方法のさらにもう一つの態様は、hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆細胞を含む、細胞の静脈内注射による、血小板減少症、サラセミア、急性骨髄性白血病などの血液障害の処置においてである。良性状態について、細胞を、10日間〜14日間、投与し、その後、毎週の注射として繰り返す。悪性状態について、注射を毎日、40日間、与え、その後、再発がある場合には、繰り返す。
【０２２２】
遺伝的障害の処置
本発明の実施によるhES細胞移植方法のもう一つの態様は、限定されるわけではないが、ダウン症候群、フリートライヒ運動失調症、ハンチントン舞踏病、アスペルガー症候群、および脊髄筋萎縮症を含む遺伝的障害の処置においてである。
【０２２３】
遺伝的障害の症状は、精神遅滞、筋骨格機能障害、および臓器不全の組み合わせで、または単独で現れ、結果として、重篤な不治の衰弱および推定寿命の減少を生じる。遺伝的障害を患っている患者の場合、hES細胞は、本発明の実施により患者へ投与され、いったん投与されたならば、分化して、患者に、欠損したまたは損なわれた遺伝子産物を発現する細胞の集団を供給し、その後、細胞内恒常性を回復させる。
【０２２４】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、遺伝的障害の処置のための典型的なプロトコールは、最初の1ヶ月間、毎日の筋内および静脈内注射、2ヶ月目の間、隔日の注射、3ヶ月目の間、週に2回の注射、5、7、9、11、および12ヶ月目の間、週に1回の注射、ならびに1年間、3ヶ月ごとのブースター注射を含む。静脈内注入もまた15日ごとに与えられる。
【０２２５】
実施例14：
ダウン症候群をもつ患者は、言葉による指示へ応答を示さなかった、階段を昇降することができなかった、摂食困難の結果として低体重であった。患者は、食べることができなかった、典型的に足幅を広くとり、および頻繁に咳および風邪を患った。眼は蒙古症であった。
【０２２６】
本発明による処置に従って、患者は、言葉による指示を理解し、実行することができる、話始めた、および階段を上がったり下がったり歩き始めた。DQ検査は、精神年齢が、1年未満内に、2年6ヶ月遅れていることに対して、彼女の暦年齢より1年遅れていることを示した。社会的に、彼女は学校へ行き、他の子ども達と遊ぶ。彼女はまた自力で食べる。
【０２２７】
この患者についての注射のスケジュールは表13に示されている。
【０２２８】
（表１３）
2014159455.tif 000039
2014159455.tif 000040
2014159455.tif 000041
【０２２９】
実施例15：
3歳の少女が、ダウン症候群と診断された。彼女は、話すこと、理解すること、または階段を上がったり下がったり歩くことができなかった。彼女は自力で食べず、彼女の一単語に限られた発話は非常に不明瞭であった。
【０２３０】
8ヶ月間の処置後、彼女はすべてを理解し、3語の文を話し、ならびに色、形、および大きさを認識する。彼女は自力で階段を昇降することができ、自力で食べ始めた。
【０２３１】
この患者についての注射のスケジュールは表14に示されている。
【０２３２】
（表１４）
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【０２３３】
実施例16：
13歳の少年は、集中力の欠如、頻繁な発作、および視覚障害をもつ遺伝的欠陥を患っていた。彼は全視野狭窄を有した。彼は、授業中に座っているのが困難であり、最前列に座っていたとしても黒板を見るのが困難であった。彼は目標達成が遅く、もし彼が何かを読んでいたら、彼は、彼が読んでいるものを記憶するのにそれを3回、読まなければならないだろう。彼はまた、部屋で物を捜し当てることが困難であった。
【０２３４】
hES細胞を開始してから、彼の視覚は改善し、彼は教室で後ろへ2列目に座っており、黒板をずっと良く見ることができる。彼はずっと多くを記憶することができ、言葉による指示に対する応答時間は改善した。彼は以前ほど発作を起こさず、彼の薬物療法は減少した。眼科医からの報告は、失われていた周辺視野が回復したことを示している。
【０２３５】
この患者についての注射のスケジュールは表15に示されている。
【０２３６】
（表１５）
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【０２３７】
実施例17：
患者は、フリートライヒ運動失調症を患っている32歳の男性であり、彼の姉妹はその疾患で亡くなった。彼は、立つことができなかった、発語が次第に消えていった、嚥下困難があった、車椅子に束縛されていた、およびトイレへ行くのに助けが必要であった。彼は以前、ドイツおよび米国で処置されたが、効果はなかった。彼の心臓は膨張しており、15〜20%で機能していた。
【０２３８】
hES細胞を開始してから、彼は改善を示した。彼はよりずっと明瞭に話し、嚥下困難はなかった。彼の心臓は改善し、すべての寸法は正常に戻り、機能している能力は58〜60%へ上昇した。悪化はしていない。
【０２３９】
この患者についての注射のスケジュールは表16に示されている。
【０２４０】
（表１６）
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【０２４１】
眼障害の処置
本発明の実施によるhES細胞移植のもう一つの使用は、本発明の実施によるニューロン前駆体およびhES細胞の、眼球後部分、眼の表面領域、および内部眼房への直接的注射を通しての、限定されるわけではないが、視神経萎縮症、黄斑変性症、眼損傷、角膜移植片拒絶、および網膜色素変性症を含む眼障害の処置においてである。
【０２４２】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、眼障害の処置のための典型的なプロトコールは、筋内および静脈内注射の10日間、続いて球後または硝子体内注射、筋内および静脈内注射の15日間、続いて球後注射、2回の静脈内注入、ならびに2ヶ月後の球後注射を含む。合計4回の球後注射は、結果が見られる前の8ヶ月間〜1年間の期間に渡って与えられるが、場合によっては、結果がより早く見られる。硝子体経路が用いられうる。また角膜が、幹細胞が成長しているコンタクトレンズの使用によって修復されうる。また幹細胞を含む点眼薬も用いられうる。
【０２４３】
実施例18：
視神経萎縮症と診断された患者は、小さい文字の読み取り困難を含む状態であり、かつ遠く離れて置かれた物体をみることができなかった。また紺色および紫色は見えなかった。視力はゼロで光覚はあり、現在6/24である。
【０２４４】
本発明による幹細胞治療、すなわち、ニューロン幹細胞前駆体を含むhES細胞およびそれらの誘導体が球後注射により投与される、ならびに本発明の実施によるニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含むhES細胞およびそれらの誘導体が局部静脈内注射または皮下注射または筋内注射、硝子体内注射、または局所適用により約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与される、治療に従って、患者はかなりの改善を示した。彼は時間を読み取ることができ、広告掲示板を見ることができ、加えて遠くからテレビを見ることができる。
【０２４５】
この患者についての注射のスケジュールは表17に示されている。
【０２４６】
（表１７）
2014159455.tif 000054
【０２４７】
肝臓および腎臓障害の処置
本発明の実施によるhES細胞移植のさらにもう一つの使用は、限定されるわけではないが、末期腎臓ネフローゼおよびネフローゼ症候群を含む肝臓障害および腎臓障害の、本発明の実施による移植を通しての処置においてである。投与経路は、静脈内、筋肉内、および静脈内注入による。
【０２４８】
実施例19：
ネフローゼ症候群と診断された患者は、尿素、クレアチン、およびPタンパク質レベルの上昇を示した。皮髄分化は維持されず、身体はむくんだ。本発明の実施による造血幹細胞前駆体、アルブミン産生幹細胞前駆体、およびビリルビン産生幹細胞前駆体を含むhES細胞およびそれらの誘導体を、静脈内注射、または皮下注射、または筋内注射、または静脈内注入により、約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与した。幹細胞での処置後、身体のむくみはより少なく、皮髄分化は回復した。尿素、クレアチン、およびPタンパク質レベルもまた正常化した。
【０２４９】
この患者についての注射のスケジュールは表18に示されている。
【０２５０】
（表１８）
2014159455.tif 000055
【０２５１】
筋骨格障害の処置
本発明の実施によるhES細胞移植のもう一つの使用は、限定されるわけではないが、関節炎、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、およびベッカー型筋萎縮症を含む筋骨格障害の処置においてである。
【０２５２】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、筋骨格障害の処置のための典型的プロトコールは、最初の1ヶ月中、毎日、筋内または静脈内注射、3、5、6、および7ヶ月目中、週に2回の注射、9〜12ヶ月目中、毎週の注射、ならびに3ヶ月ごとのブースター注射を含む。静脈内注入は、10〜15日ごとに与えられ、深部脊椎筋注射は15〜30日間ごとに与えられる。
【０２５３】
実施例20：
デュシェンヌ型筋ジストロフィーと診断された患者の既往歴は、だるさ、腫れた大腿部および顔、ならびに陽性ガウアーズ徴候、10,000ユニットの高レベルのクレアチンホスホキナーゼ(CPK)をもつなどの症状を示した。
【０２５４】
ニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を単独または組み合わせて含むhES細胞およびそれらの誘導体での静脈内注射、または皮下注射、または筋内注射、または静脈内カテーテル注入、または硬膜外カテーテル注入、またはくも膜下ブロックカテーテル注入による所定の期間での処置後、CPKレベルは1198ユニットへと大幅に下がり、ガウアーズ徴候は陰性であった。
【０２５５】
この患者についての注射のスケジュールは表19に示されている。
【０２５６】
（表１９）
2014159455.tif 000056
2014159455.tif 000057
2014159455.tif 000058
【０２５７】
実施例21：
DMDの症例と診断された14歳の少年は、手足両方の力がなく、筋萎縮症をもち、寝たきりであった。彼はまた脊柱側弯症を患っていた。
【０２５８】
8ヶ月の治療後、彼は、二頭筋、三頭筋、および腕橈骨筋における筋肉の発達をもち、腕を肘レベルまで持ち上げることができる。彼は体重が増加し、いかなる関連した脊柱側弯症も発症することなく、より高く成長している。筋破壊率を示す、彼のCPKレベルは低下している。
【０２５９】
この患者についての注射のスケジュールは表20に示されている。
【０２６０】
（表２０）
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【０２６１】
実施例22：
DMDによって車椅子に束縛された8歳の少年は、歩いたり立ったりできなかった。6ヶ月の処置後、彼のCPKレベルは低下した。彼は悪化することはなく、腕を動かすことができる。彼は最小のサポートで歩き始めた。
【０２６２】
この患者についての注射のスケジュールは表21に示されている。
【０２６３】
（表２１）
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【０２６４】
実施例23：
サポートを受けて2、3歩、歩くことができたDMDと診断された10歳の少年は、治療を受けた。彼は、自力で寝返りを打つまたは自力で座ることができなかった。彼は腕を肘レベルの30°前まで持ち上げることができた。2、3ヶ月の処置後、彼のCPKレベルは下がり始め、彼は、自力で向きを変えることができ、水のマグカップを彼の頭より上へ持ち上げて、水浴びすることができる。彼は体重が減少していない。
【０２６５】
この患者についての注射のスケジュールは表22に示されている。
【０２６６】
（表２２）
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【０２６７】
心臓疾患および障害の処置
本発明の実施によるhES細胞移植のもう一つの使用は、限定されるわけではないが、拘束型心筋症、心不全、洞性徐脈、および冠動脈疾患を含む心臓疾患および障害の処置においてである。分化した細胞のいくらかを患者の心臓組織へ組み入れ、損傷した筋肉を再生および修復する。
【０２６８】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、心臓疾患および障害の処置のための典型的なプロトコールは、2週間、隔日に、およびその後、次の2週間、3日間ごとに、筋内および静脈内注射、ならびに3、6、10、および12ヶ月目中、静脈内注入と共に1ヶ月に1回、筋内注射を含む。損傷領域周囲の心腔内注射は、バイパス手術中に与えられうる。
【０２６９】
実施例23：
洞性徐脈をもつ洞性心症候群(Sinus Corda Syndrome)と診断された患者は、ペースメーカーの移植を受けるように勧められた。患者は、静脈内注射、または皮下注射、または筋内注射、または心腔内注射による、または血管造影法中の造血幹細胞前駆体を含むhES細胞およびそれらの誘導体が約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で投与される、本発明の実施により処置された。患者は、hES細胞での処置を受けた後、改善の兆しを示し、ペースメーカーの必要が排除された。
【０２７０】
この患者についての注射のスケジュールは表22に示されている。
【０２７１】
（表２２）
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【０２７２】
癌性細胞および発癌性組織の処置
または、hES細胞は、癌患者の通常の化学療法処置を補うために本発明の実施により投与される。通常の化学療法において、細胞毒性剤が、癌細胞を破壊するために投与される。しかしながら、細胞毒性剤は、正常細胞と癌細胞を区別せず、患者の免疫系の細胞を含む患者の非癌細胞を破壊する可能性がある。結果として、化学療法を受けている間、および化学療法停止後のいくらかの期間、癌患者は彼らの損なわれた免疫系のせいで感染に対して感受性が高い。造血幹細胞、ニューロン幹細胞、およびhES細胞を化学療法を受けている患者へ投与することにより、注射された細胞のいくらかの部分は、新しい免疫系へ分化し、化学療法で破壊された白血球、赤血球、血小板、および他の細胞に取って代わる。また、有糸分裂の機構の制御を通しての放射線療法および化学療法の結果としての形成不全性骨髄の再生、および正常細胞情報伝達経路の回復が、免疫系をブーストし、さらなる調節解除有糸分裂を停止させる。hES細胞および/またはそれらの誘導体は、静脈内もしくは筋内注射または腫瘤への直接投与により投与されうる。これらの細胞はまた、異常なヘッジホッグ経路上で働き、過度の増加の停止を可能にするようにそれを制御する。
【０２７３】
実施例24：
悪性度III腺癌と報告する患者は、化学療法処置および手術を受けたが、成功しなかった。結節性外観ならびに腹腔および膵臓後の結節を有する多発性肝転移の発症のため、患者は支持療法の必要があった。
【０２７４】
本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体は、約750,000個〜約1億6千万個の細胞の量で患者へ投与され、患者は、結果として、以前は結節性であった一様に不均質な肝臓の回復、およびリンパ節におけるエコー発生性領域の増加を含む顕著な改善を生じた。
【０２７５】
この患者についての注射のスケジュールは表23に示されている。
【０２７６】
（表２３）
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【０２７７】
アフタ性潰瘍/扁平苔癬の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体のさらにもう一つの使用は、口のアフタ性潰瘍などの身体の粘膜領域における任意の潰瘍の処置においてである。細胞は、静脈内に、筋肉内に、および局部的に投与される。毎日の注射は、最初の4ヶ月間、筋肉内に、または静脈内に与えられ、静脈内注入は15〜30日ごとに与えられる。直接的またはゲルとの混合による局部適用もまた行われる。
【０２７８】
実施例25：
壊死組織および疼痛を伴うアフタ性潰瘍で満ちている舌をもつ65歳の女性がやって来た。彼女は飲食および嚥下困難、ならびに発語困難を有した。hES細胞を受けると、彼女は良くなり、嚥下および発語がより容易になって、口をよりうまく開ける。彼女はまた、潰瘍および壊死組織に関して回復を示している。
【０２７９】
変形性関節症、関節炎、強直性関節の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体のさらにもう一つの使用は、変形性関節症、関節炎、および強直性関節の処置においてである。毎日の筋内注射は、プライミング×10日間、与えられる。サルメドロール(salumedrol)と混合された750,000個〜8千万個のhES細胞の関節内注射が与えられ、1ヶ月半〜3ヶ月後に繰り返される。
【０２８０】
腕神経叢損傷の処置
hES細胞および/またはそれらの誘導体のさらにもう一つの使用は、冒された腕が麻痺する腕神経叢損傷の処置においてである。細胞は、筋肉内に、静脈内に、および腕神経叢へ投与され、1年間または腕が良くなるまで、1ヶ月半ごとに繰り返される。静脈内注入もまた用いられる。
【０２８１】
実施例26：
患者は、腕神経叢損傷(左)手を患って、この7〜8年間、その機能を喪失していた26歳の男性である。幹細胞処置で、彼の左手はずっと良くなり、肘および手首までのより大きい運動力をもつ。彼は、手首を動かすことができ、手は以前ほど弛緩していない。彼はまた腕を上へ動かすことができる。
【０２８２】
生殖性障害の処置
本発明の実施によるhES細胞移植のもう一つの使用は、精巣萎縮、卵巣不全、および無精子症を患っている患者の受精能力の回復を通しての生殖性障害の処置である。
【０２８３】
実施例27：
無精子症患者の、本発明の実施による局部筋内注射を介しての造血幹細胞前駆体を含むhESおよびそれらの誘導体での処置は、結果として、精子の産生を生じた。また、静脈内および筋内注射、加えて、精巣への直接注射が用いられ、精巣上体近くの皮下注射もまた用いられた。
【０２８４】
この患者についての注射のスケジュールは表24に示されている。
【０２８５】
（表２４）
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【０２８６】
組織再生
hES細胞は、限定されるわけではないが、筋肉再生を含む組織再生の誘導、肝硬変の処置のために、ならびに変性疾患の処置および非治癒性潰瘍の処置において効果的である新しい血管の形成(新血管形成)において、本発明の実施によって投与されうる。
【０２８７】
糖尿病の処置
本発明のもう一つの態様は、hES細胞および/またはそれらの誘導体であって、該細胞がインスリン産生前駆細胞を含む、細胞の糖尿病の処置における使用である。糖尿病患者は、心臓麻痺または発作を患うリスクが4倍高く、また、腎臓、眼、神経系、および全身免疫を含む多臓器変性および不全のリスクの増加をもつ。インスリン産生hES細胞の移植および身体におけるインスリン産生の回復を通しての糖尿病の処置により、インスリンの必要性の低減、および衰弱させる副作用の低減がある。
【０２８８】
投与プロトコールは特定の患者に合うように変化しうるが、糖尿病の処置のための典型的なプロトコールは、最初の1ヶ月中、週2回、筋内および静脈内注射、ならびに3、6、11、および12ヶ月目中、週1回の注射を含む。静脈内注入もまた6ヶ月目中に与えられうる。
【０２８９】
実施例28：
患者は、糖尿病をもつ70歳の男性であり、高ケトアシドーシスを患って、52ユニットのインスリンおよび経口血糖降下薬を常用していた。治療の6ヶ月以内に、彼は、すべての薬物およびインスリンから離れ、今や現在、この1年半の間、通常の食事で血糖を維持することができる。彼はブースター注射を受けている。
【０２９０】
この患者についての注射のスケジュールは表25に示されている。
【０２９１】
（表２５）
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【０２９２】
実施例29：
54歳の男性はこの3年間、コントロール不良の糖尿病を示し、インスリン42ユニットを経口血糖降下剤と共に服用していた。すべての薬物療法を以て、彼の空腹時血糖は200mg/dlであり、食後血糖は280mg/dlであった。
【０２９３】
3週間、hES細胞を摂取後、彼は、インスリンの摂取を停止し、低減した用量の血糖降下剤を服用している。彼は気分が前よりずっと良くなり、より機敏である。
【０２９４】
この患者についての注射のスケジュールは表26に示されている。
【０２９５】
（表２６）
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【０２９６】
実施例30：
45歳の男性はアンギナを有し、糖尿病であった。彼はインスリンおよび経口血糖降下剤を常用しており、血管形成術を受けていた。
【０２９７】
hES細胞処置を受けてから3ヶ月後、彼はインスリンを停止し、低減した用量の経口血糖降下剤を服用している。彼の血糖および薬物の記録は、良くコントロールされた血糖値を示している。
【０２９８】
この患者についての注射のスケジュールは表27に示されている。
【０２９９】
（表２７）
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【０３００】
間質性肺疾患の処置
実施例31：
ILD(interstitial lung disease)を患っている中年女性が診療所へやって来た。彼女は、末期にあり、安静時にSPO2 69%であった。現在のところ、hES細胞処置で、彼女の疾患は進行を停止している。患者は、全体的に気分が前よりずっと良くなり、彼女の呼吸までも改善している。処置は継続中である。聴診で聞こえうる呼吸音があり、彼女の全体的な肺機能はかなりの改善を示している。
【０３０１】
この患者についての注射のスケジュールは表28に示されている。
【０３０２】
（表２８）
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【０３０３】
新しい薬物開発
hES細胞についてのなおもう一つの使用は、新しい薬物の開発および試験のためである。例えば、hES細胞を、本発明の実施により培養し、新しい化学物質、薬物候補、ならびに薬学的研究および開発中の新しい薬剤の標的、作用様式、取り込み、代謝、排出、毒性、および安全性を試験するための基質として用いうる。一つの態様において、本発明は、化合物のhES細胞および/またはそれらの誘導体への効果を試験するための方法であって、その化合物の存在下で本発明の方法により得られたhES細胞および/またはそれらの誘導体を培養する段階、ならびにその化合物の細胞への効果を測定する段階を含む、方法に関する。
【０３０４】
実施例32：
抗生物質テトラサイクリンおよびセフトリアキソンの培養hES細胞への効果を患者の血清と共に分析した。これらの薬物を別々に、および異なる濃度で合わせて、導入し、効果を幹細胞に関して研究した。最後に、薬物療法の用量および薬物の効力を測定した。
【０３０５】
薬物送達
hES細胞および/またはそれらの誘導体についてのもう一つの使用は、局部的送達として傷害または疾患の部位へ薬物を輸送することである。hES細胞および/またはそれらの誘導体を、細胞が薬物を取り込むように、薬物の存在下でインキュベートしうる。負荷された細胞をその後、処置部位へ局部的に送達し、そこで、薬物は細胞から外へ拡散し、傷害または疾患の処置が結果として起こる。もう一つの態様において、損傷または罹患領域が薬物の直接適用には適さない場合(例えば、領域が、薬物の直接注射としてはあまりにも損傷しすぎている)には、負荷された細胞を、損傷または罹患領域以外の部位へ送達することができる。この薬物送達方法は、被験体へ系統的に投与される場合には毒性であるだろう薬物の使用を可能にする。方法はまた、より高い濃度の薬物を、他の投与経路により可能でありうる部位に投与することを可能にする。さらなる態様において、hES細胞および/またはそれらの誘導体は、細胞自身の移植により引き起こされる処置を増強するだろう1つまたは複数の薬物と負荷されうる。非限定的例には、心臓疾患の処置のための血圧降下剤と共の細胞の負荷、癌患者の処置のための化学療法剤と共の細胞の負荷、およびSCIの処置のための神経栄養因子と共の細胞の負荷が挙げられる。一つの態様において、本発明は、本発明の方法により得られたhES細胞および/またはそれらの誘導体を薬物の存在下で培養する段階であって、細胞が薬物を取り込む段階、ならびに細胞を被験体における部位へ投与する段階であって、薬物が送達される段階を含む被験体に薬物を送達するための方法に関する。
【０３０６】
本発明の一つの局面において、本発明の培養方法は、薬物または活性作用物質を患者へ直接、投与することと比較して、移植前にインビトロでhES細胞および/またはそれらの誘導体の薬物および他の活性作用物質の曝露を可能にする。インビトロでの細胞の曝露は、有利には、薬物の全身性投与の毒性を回避すると同時に、薬物の正の効果を提供する。
【０３０７】
脊髄傷害処置：症例研究
SCIについてhES細胞およびそれらの誘導体を用いる臨床的処置は、顕著な結果を示している。本発明の実施の性質、および患者が不治のボランティアであること、および彼らの状態がASIA A慢性SCIである、およびそれゆえに、自然の神経再生過程が可能である時期を過ぎていることを考慮すれば、二重盲検またはプラセボ対照試験は医師宣誓については実行されていない。プロトコールの結果は、下記の症例研究として提供された詳細な例を通して実証されている。
【０３０８】
症例研究1
本発明の実施は、本明細書に記載されたプロトコールによるhES細胞の移植によりSCIを患っている被験体におけるSCIの症状の好転を生じた。
【０３０９】
ReRo 1.3.4/000/220905/α、C6-C7骨折および脱臼を有する29歳の被験体は、種々の医療行為によって処置不可能と宣告された。被験体は、乳房間領域から下方へ感覚がなく、自力で座ることができなかった、膀胱または腸制御がなかった、腕および指を動かすことができなかった、ならびに脚に力または緊張がなかった。被験体は、3年間中、非治癒性両側床ずれを発症していた。本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体の投与は、以下のとおりこれらの条件下で開始された。
【０３１０】
造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む約750,000個〜約8千万個のhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物を、0.25〜1.0mlの最終容量へと滅菌生理食塩水に希釈し、核型を決定し、標準プロトコールを用いて汚染、生存度、および計数について検査し、その後、前腕における皮下注射により投与した。被験体を、5分後、10分後、15分後、30分後、1時間後、および24時間後、アナフィラキーショック、注射部位における疼痛もしくは炎症、全身性そう痒、フラッシング、または発熱について観察した。
【０３１１】
被験体の処置は、0.25ml〜1.0mlの容量の滅菌生理食塩水に再懸濁された、750,000個〜8千万個のhES細胞およびそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を含む薬学的組成物の皮下プライミング注射の投与によるものである。0.25ml〜1.0mlの滅菌生理食塩水に再懸濁された同数の造血幹細胞およびニューロン幹細胞を有するさらなるプライミング注射を、筋内注射により投与した。0.25ml〜1.0mlの容量の滅菌生理食塩水に再懸濁された750,000個〜8千万個のニューロン幹細胞前駆体の最終プライミング注射を、静脈内注射により投与した。
【０３１２】
本発明の実施によるSCIの直接処置は、2mlの容量の滅菌生理食塩水に再懸濁され、さらに、15ml〜40mlの滅菌生理食塩水へ希釈され、そして、最初のプライミング注射から7日後、該部位に、部位より下に、および部位より上に硬膜外注射により投与される、750,000個〜8千万個のhES細胞およびそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を含む薬学的組成物の再懸濁液により行われた。硬膜外注射の投与による処置は、1ヶ月半のプライミング後、プライミングから4ヶ月後、およびプライミングから6ヶ月後、繰り返された。
【０３１３】
硬膜外投与に加えて、被験体を、2mlの滅菌生理食塩水に再懸濁された、750,000個〜1100万個のhES細胞およびそれらの誘導体であって、該細胞が造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を含む薬学的組成物の髄腔内注射により処置の開始から2ヶ月後および5ヶ月後に処置した。
【０３１４】
加えて、2mlの滅菌生理食塩水に再懸濁され、さらに4mlの最終容量へ希釈された、750,000個〜8千万個のhES細胞およびそれらの誘導体であって、該細胞がニューロン幹細胞前駆体を含む、細胞を含む薬学的組成物の、連続した3日間、毎日2回の硬膜外注射で被験体を処置した。
【０３１５】
この患者についての注射のスケジュールは表29に示されている。
【０３１６】
（表２９）
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【０３１７】
被験体の神経学的幸福度は、処置の開始後定期的に評価され、被験体の精神状態および一般的な衛生状態の顕著な改善が表30に示されているように2週間後、観察された。
【０３１８】
（表３０）
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【０３１９】
C6-C7骨折の結果としての自律神経系への損傷に典型的な徴候および症状は、処置の経過中に評価された。強い圧力を感じる能力、触覚、感覚、バランス、疼痛を感じる能力、温度の変化を感じる能力、不随運動、冷や汗の存在、目眩、血圧、呼吸困難、横たわる時の異常な姿勢、および助けを受けないで座る能力を含む、検査された全パラメーターにおける顕著かつ漸進的改善が表31に示されているように観察された。
【０３２０】
（表３１）
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【０３２１】
（表３１）(続き)
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【０３２２】
膀胱および腸機能障害は、一般的に、SCIの結果としての神経学的損傷に関連している。この損傷は、結果として、膀胱制御、膀胱の流れ、および膀胱における満杯の感覚、腸制御、腸の排出の時間、および腸における感覚の障害を生じる。処置の経過中、検査された全パラメーターにおける顕著かつ漸進的な改善が表32に示されているように処置の結果として観察された。
【０３２３】
（表３２）
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【０３２４】
C6-C7病変の部位における神経再生の証拠として、上半身の運動機能における変化が、処置の経過中に評価された。肩の運動、手首および指の運動、指の力、腱反射、四肢運動の強さ、筋萎縮、および把握反射における顕著かつ漸進的な改善が、表33に示されているように観察された。
【０３２５】
（表３３）
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S＝肩；FA＝前腕；W＝手首；F＝指；L＝左；R＝右
力：0は弱い、4は強い
萎縮：0は良い、4は悪い
【０３２６】
C6-C7病変の部位における神経再生の証拠として、下半身の運動機能における変化が、処置の経過中に評価され、それには、股関節の運動、膝運動、足指の運動、四肢の腱反射および強さ、筋肉萎縮、ならびに足底反応を含む。3ヶ月の処置後、研究の経過中に検査されたパラメーターのいずれにおいても改善はなかったが、被験体は、表34に示されているように歩行器の助けを借りて立つことができた。
【０３２７】
（表３４）
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【０３２８】
症例研究2
ReRo 1.3.4./001/051004/α001、22歳の被験体は、二階屋根頂上からの落下後、D6-D7骨折の結果として外傷後対麻痺SCIで苦しんでいた。被験体は、落下後2日間、昏睡状態になり、意識を回復したが、両側性麻痺を発症して、乳房間領域から足までの身体の下半分の完全な知覚および運動喪失があり、彼の足または脚を持ち上げることができず、助けを受けずに座るまたは座位へと起きあがることができなかった。被験体は、永久に寝込んでいた、膀胱および腸制御を喪失していた、および彼の上肢は冒されていなかったが全体的に彼の家族のサポートに依存していた。
【０３２９】
本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与は、傷害から5ヶ月後、開始された。5ヶ月間の期間のうちに、被験体は、膀胱および腸制御、ならびにサポートなしに座る、および股関節を持ち上げることにより上下に滑らかに動く能力を取り戻した。知覚は会陰レベルまで回復した。被験体は、助けを受けないで歩行器へ乗ることができ、膝サポートを必要とせず、歩行器で容易に立つことができる。処置は、結果として、被験体が膝ブレースのサポートを受けて歩行器を用いて歩き、職場に復帰する能力を生じた、すなわち、彼は規則正しい生活様式を取り戻した。
【０３３０】
この患者についての注射のスケジュールは表35に示されている。
【０３３１】
（表３５）
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【０３３２】
症例研究3
ReRo 1.3.4./002/040205/α、40歳の被験体は、C5-C6傷害の結果としての四肢麻痺SCI、ならびに首の凝りおよび疼痛に苦しんでいた。被験体は6ヶ月後、手術を受け、それ以来、四肢麻痺だった。被験体は、虚脱感、およびサポートを受けて座らされた場合の目眩に悩まされ、肩甲骨上縁から上に感覚があり、手術後すぐに、すべての四肢の力の完全な喪失ならびに腸および膀胱機能の喪失があった。
【０３３３】
本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与は、手術から9ヶ月後に開始された。hES細胞処置の結果として、被験体は、サポートの必要なしに、楽々と座ることができ、脚を楽々と降ろして椅子に座ると同時に、横へ動かしたり曲げたりできる。被験体は、上半身の制御の顕著な改善を取り戻した。被験体は、運動性および独立および活動の増加を通して一般心理学的幸福の実質的向上を享受した。彼は、サポートを受けて立つことができ、下肢の力、足指の運動の制御をもち、下垂手はない。処置は、被験体の状態の改善に従って継続している。
【０３３４】
症例研究4
ReRo 1.3.4./003/260902/β、17年前の道路交通事故後、脳損傷を有する脊髄傷害を患い、車椅子生活を余儀なくされていた37歳の被験体。被験体はまた、右側の片麻痺、話すことができない、顔面筋麻痺、記憶の完全喪失、および膀胱制御がないことに苦しんでいた。
【０３３５】
被験体は、本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物を1年2ヶ月間、投与され、その結果として、歩行器の助けを借りて歩く能力、数語の会話、まっすぐになった首、顔面筋麻痺の除去、および記憶の改善を生じた。
【０３３６】
症例研究5
ReRo 1.3.4./004/030505/α、脊髄挫傷および付随した前硬膜外出血を引き起こす脊椎骨破砕の後方化を有するC5-C8における外傷後骨折を患っており、対麻痺であった56歳の被験体。被験体は、両方の下肢を動かすことができず、背中の急性疼痛に悩まされていた。
【０３３７】
本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与は、1年間、行われ、その結果として、両脚のかなりの力、脚における振動などの知覚、および背痛なしに歩行器の助けを借りて立つ能力の回復を生じた。被験体は、歩行器の助けを借りて歩くことができる、膀胱制御および感覚を取り戻した、ならびにの冷や汗および目眩の発作を克服した。
【０３３８】
この患者についての注射のスケジュールは表36に示されている。
【０３３９】
（表３６）
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【０３４０】
症例研究6
ReRo 1.3.4./005/130705/β、下肢対麻痺をもつD6レベルのポット脊椎障害(Potts Spine disorder)と診断され、脊髄の前方除圧固定術で、3回手術を受けた、25歳の被験体。被験体は車椅子に束縛された、サポートなしで座ることができなかった、脚の弛緩性麻痺を有した、腸制御がなく、寝ながら排泄した、および膀胱感覚がなかった。
【０３４１】
被験体は、本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物を傷害から11年6ヶ月後、投与された。最初の1年間中に従った処置プロトコールは、結果として、背中の強化、サポートなしで座る能力、脚における重みの感覚を生じた。被験体はまた、生理中の背痛および生理痛を取り戻した。大腿部、脚における感覚、ならびに膀胱感覚および制御の回復が観察された。被験体は歩行器の助けを借りて歩くことができ、両脚の運動の良好な回復がある。処置は継続している。
【０３４２】
この患者についての注射のスケジュールは表37に示されている。
【０３４３】
（表３７）
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【０３４４】
症例研究7
ReRo 1.3.4./006/220805/α、C6-C7対麻痺を患っている30歳の被験体は、下肢を動かすことができず、腸制御または腸感覚がなかった。被験体は、乳房間領域から上へのみ繊細および強い圧覚があった。従って、被験体は座るのが困難であった。被験体の手はほんの少ししか力はなく、指の運動は非常に弱く、被験体は呼吸困難であった。
【０３４５】
被験体は、傷害から約3ヶ月後、hES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与により本発明の実施に従って処置された。被験体は、サポートなしで座る能力を取り戻した、目眩に悩まされていない、鼠径部において圧力を知覚できる、肘の内側に感覚がある、および患者が動かそうと試みた場合には、脚に痛みを感じる。被験体は容易に呼吸する、膀胱および腸に感覚がある、脚に感覚がある、ならびに今や、サポートを受けて2、3分、立つことができる。被験体はまた、指における力および運動が増加した。処置は継続している。
【０３４６】
この患者についての注射のスケジュールは表38に示されている。
【０３４７】
（表３８）
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【０３４８】
症例研究8
ReRo 1.3.4./007/221005/β、D6におけるSCIの結果として対麻痺の26歳の被験体は、サポートなしで座ることはできたが、両方の下肢を動かすことができなかった。被験体は膀胱または腸制御をもたず、乳房間領域から上へのみ感覚があった。
【０３４９】
被験体は、傷害から約10ヶ月後、本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物を投与された。被験体は、身体の側面、および腋窩領域から寛骨までの両側の臍領域まで、感覚を取り戻した。被験体は、脚の運動力で歩行器およびカリパス副木の助けを借りて歩くことができる。
【０３５０】
この患者についての注射のスケジュールは表39に示されている。
【０３５１】
（表３９）
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【０３５２】
症例研究9
ReRo 1.3.4./008/151005/β、27歳の被験体は、外傷性四肢麻痺を患っており、話すことおよび呼吸することに大きな困難があり、首が硬直していた。被験体の脚は麻痺しており、被験体は指運動がなく、身体の他の部位においては感覚がなかった。
【０３５３】
本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与による処置は、傷害から約2年後に始まった。被験体は、首運動の改善、発語の容易さ、および発声音の調節の改善を経験した。被験体は、呼吸の厄介さがより少なくなったことを見出し、運動機能がいくつかの指の運動に戻った。脚は痙攣性は少なくなり、被験体は助けを受けずに座ることができた。足指の運動もまた回復し、被験体は肩を動かすことができる。
【０３５４】
この患者についての注射のスケジュールは表40に示されている。
【０３５５】
（表４０）
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【０３５６】
症例研究10
ReRo 1.3.4./009/300106/α、25歳の被験体は、道路事故に遭い、サポートなしで座る能力を失った、脊椎はバックリングしやすかった、被験体は膀胱および腸制御を失った、ならびに被験体は脚の力の完全な喪失に苦しんだ。
【０３５７】
被験体は、傷害から約2年後、本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与により処置された。被験体は急速な改善を示し、サポートなしで座ることができる。被験体は、目眩に悩まされない、両足の運動を有する、指先に感覚を取り戻した、および脊椎中を流れる冷気を経験することができる。
【０３５８】
症例研究11
ReRo 1.3.4./010/020206/β、道路交通事故の結果としてD12-L1におけるSCIをもつ26歳の被験体は、立つことができず、膝が攣縮していた。被験体は、サポートなしで座ることができ、四肢には正常な感覚があった。被験体は、膀胱または腸制御をもたず、痙縮の増加があった。
【０３５９】
被験体は、本発明の実施によるhES細胞およびそれらの誘導体を含む薬学的組成物の投与により傷害から約12年後、処置された。被験体は、痙縮が減少して、脚運動機能において目覚ましい回復を経験した、右脚を完全に伸ばすことができること、および左脚への力の復帰を示した。被験体は、カリパス副木および歩行器の助けを借りて立つおよび歩く能力を取り戻した。膀胱および腸感覚もまた被験体に戻った。
【０３６０】
この患者についての注射のスケジュールは表41に示されている。
【０３６１】
（表４１）
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【０３６２】
症例研究12
患者は、D6-D8間の傷害後、対麻痺をもつ26歳の男性であった。彼は、2004年9月に外傷性道路事故に遭った。彼は全く寝たきりであり、胸より下の感触、膀胱または腸制御、および胸から下への感覚または運動力がなかった。彼は、腰背部に非常に深い床ずれを有し、彼の仙骨を見ることができた。
【０３６３】
患者は2006年4月27日にhES細胞を始めた。床ずれのために、彼はいかなるO/T手順も受けることができず、静脈内および筋内へ毎日、細胞の投与を与えられ、最終的には、hES細胞を彼の床ずれへ直接適用された。彼はまた静脈内注入を与えられた。
【０３６４】
処置の11日目において、彼は、完全カリパス副木(ウエストから足首まで)および歩行器を用いて立つことができ、2歩、進んだ。時間が進むにつれて、彼の筋力は増加し、4ヶ月後、彼は100歩まで進むことができ、最高20分間、立つことができた。彼は脚を感じてそれらを動かすこともできる。彼はまた膀胱および腸満杯を感じることができ、サポートとして膝ブレースおよび歩行器だけで今や歩くことができる。彼の床ずれは治癒し、彼は彼の研究を再開している。
【０３６５】
この患者についての注射のスケジュールは表42に示されている。
【０３６６】
（表４２）
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【０３６７】
症例研究13
患者は、2006年6月に乗馬中の事故に遭った22歳の男性であり、T-12、L-1において対麻痺がある。彼は、ウエストより下の力、腸または膀胱制御、およびウエストより下の感覚がなかった。
【０３６８】
患者は、6週間、入院した2006年9月に処置を開始した。彼はhES細胞に応答し、1週間以内に、彼は、完全カリパス副木(ウエストから足首まで)および歩行器を用いて、立って、歩くことができた。彼は進歩し、膝ブレースを身につけ、彼は、歩行器を用いて最高30分間、立つことができる。彼は今や、完全な感覚ならびに腸および膀胱制御をもつ。彼はまた、杖およびまた松葉杖で良いバランスを保った。彼は、カリパス副木および松葉杖で階段を昇降することができる。
【０３６９】
この患者についての注射のスケジュールは表43に示されている。
【０３７０】
（表４３）
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【０３７１】
症例研究14
患者は、2004年9月に道路交通事故に遭ったT-12、L-1における外傷性対麻痺の26歳の女性である。彼女は胸より下の感触がなく、腸または膀胱制御がなかった。両脚に運動力はなく、彼女は車椅子に束縛されていた。
【０３７２】
患者は2006年3月にhES細胞を開始した。彼女は、9日後、完全カリパス副木(ウエストから足首まで)および歩行器を用いて、立って、2、3歩、歩くことができ、進歩し続けた。彼女の現在の状態は、彼女はカリパス副木および歩行器を用いて継続的に歩くことができ、また膝ブレースを用いて立つことができることである。腸および膀胱感覚は、制御と共に、かついかなるカテーテル法または座薬の使用もなしに、回復している。感覚は足首レベルまで向上している。
【０３７３】
この患者についての注射のスケジュールは表44に示されている。
【０３７４】
（表４４）
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2014159455.tif 000117
【０３７５】
ヒト胚性幹細胞培養方法
本発明下で開発された細胞系のための出発材料として用いられるhES細胞は、子宮へのその着床前の2〜7日齢の胚、例えば、2〜4日齢の胚、例えば、3日齢の胚、由来である。
【０３７６】
胚単離のために、卵子を、定期的なIVFサイクルを受けているヒトドナーから同意をもって収集する。卵子を精子により受精させ、通常の方法により培養し、胚を得る。余分の胚を、細胞系の発達について可変性期間、インキュベートする。
【０３７７】
胚を、少量の最少必須培地(例えば、RPMI、例えば、2.2g/L重炭酸ナトリウムを含むRPMI 1640)に懸濁し、hES細胞を機械的手段(例えば、振盪)により胚から単離する。追加の培地を、プロゲスチンおよびβhCGアゴニストと共に単離された細胞へ加える。一つの態様において、プロゲステロン(250mg/mlの16〜64μl)およびβhCG(5000 iu/mlの16〜64μl)を加える。単離された細胞を12〜48時間、例えば、24時間、34〜38℃の温度で、3.5〜6%二酸化炭素の環境において、培養する。
【０３７８】
一つの態様において、hES細胞を、分化を防ぎながら細胞を増殖させるために嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で培養する。「実質的に嫌気性」とは、約10%未満O2、例えば、8%、6%、4%、2%、または1%未満O2、と定義される。低酸素状態は、マルチガス(CO2、O2、N2)細胞インキュベーターを用いて生じることができ、その中で、酸素レベルは、周囲空気を窒素ガスで置換することにより0%と20%の間に設定されうる。マルチガスインキュベーターの例には、Fisher 11-730シリーズ、Napco 7000シリーズ、Sanyo MCOシリーズ、Jouan IG750、およびHeraeus Heracell 150が挙げられる。もう一つの態様において、細胞をCO2インキュベーター内で培養し、酸素レベルを、細胞が含まれるフラスコの形および位置によって制御する。例えば、細胞培養フラスコが垂直位に維持される場合、フラスコ中の培地の大部分は実質的に嫌気性である。対照的に、細胞培養フラスコが水平位に維持される場合、培地は実質的に好気性である。培地における酸素レベルは、インキュベーター内の細胞培養フラスコの形および/もしくは位置、またはフラスコ中の培地の量(例えば、ヘッドスペースの量)を変えることにより実質的嫌気性と実質的好気性の間を変動しうる。
【０３７９】
増殖段階中、フラスコは、水平よりむしろ垂直位に維持されうる。一つの態様において、インキュベーションは、容量がほとんど完全に培地によって占有され、かつ容器が垂直位に保たれている、培養容器中で行われる。結果として、細胞の実質的割合は、培養フラスコの壁に付着しておらず、培地は実質的に嫌気性である。
【０３８０】
そのような成長条件下で、細胞倍加または複製周期はそれらの最大であり、細胞分化過程は実質的に抑制される。増殖中の細胞複製周期は、12〜48時間、例えば、24時間、進行する。
【０３８１】
hES細胞の継代または再培養について、細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを、プロゲステロンおよびβhCGを含む少量の新鮮な培地に再懸濁し、細胞を等分し、プロゲステロンおよびβhCGを含まない追加の新鮮な培地を加える。一つの態様において、インキュベートされた幹細胞のアリコート対新鮮な細胞培地の比は、約1:3.5対約1:35体積/体積である。細胞を、実質的嫌気性条件下で3.5〜6%二酸化炭素の雰囲気を追加したウォーター・ジャケット型インキュベーターにおいて34〜38℃で、12〜48時間、例えば、24時間、再インキュベートする。この時点で、細胞を、連続的増殖として継代しうる、または将来的使用のために貯蔵しうる。
【０３８２】
そのような条件下で培養されたhES細胞は、アルカリホスファターゼ活性および細胞特殊化または分化の特徴を示す任意のマーカーの非存在により測定されるように、大部分は未分化型のままである。しかしながら、完全に分化している、または完全に未分化である細胞集団は得られないことは言及しておく。細胞集団は、分化型および未分化型の細胞系の混合物であり、約4:1から約10:1までの範囲の比の未分化型対分化型の細胞である。
【０３８３】
例えば、超低温フリーザー中、または液体窒素中における増殖したhES細胞の貯蔵について、限定されるわけではないが、0.2〜2%(w/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む凍結保存剤を培地に加えてもよい。用いられるDMSOのレベルは、分化または細胞への損傷を誘導することを避けるために、凍結保存用に典型的に用いられるものより低い(例えば、2〜84μl/0.5mlチューブ)。凍結保存剤の量対幹細胞を含む培地の量の比は、約1:500から約16:1000まで変動しうる。他の凍結保存剤には、非限定的に、グリセロール、プロパンジオール、ブタンジオール、エタノール、グルコース、D-グルコース、スクロース、トレハロース、マンニトール、パパラビン(paparavine)、ホルムアミド、プロブコール、クルクミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、コンドロイチン硫酸、グリコサミノグリカンジメチルスルホキシド、グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムが挙げられる。細胞懸濁液の凍結温度は、約-15℃から約-80℃まで、例えば、約-15℃〜約-40℃、変動しうる。ヒト胚性幹細胞およびそれらの誘導体の貯蔵のための他の技術と対照的に、瞬間冷凍または「ストロー(straws)」の中での貯蔵の必要がない。貯蔵後、細胞を、連続的増殖のために、または分化のために、遠心分離により細胞を収集し、細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁することにより、調製しうる。
【０３８４】
増殖したhES細胞(例えば、新鮮に単離されたhES細胞の増殖後、または以前に増殖した細胞の貯蔵後の)の部分的分化は、細胞懸濁液を遠心分離器において(例えば、700〜1400rpmで5〜12分間)沈殿させ、上清を除去および廃棄し、プロゲスチンおよびβhCGアゴニストを含む少量の新鮮な培地(例えば、RPMI)に細胞を再懸濁することにより、行われる。細胞をその後、等分し、プロゲスチンまたはβhCGを含まない追加の培地(例えば、RPMIまたはDMEM、例えば、1×グルタミン酸を含まないDMEM、または4.5g/Lグルコースおよび3.7g/L重炭酸ナトリウムを含むDMEM、などの最少必須培地)を加える。細胞を、実質的好気性条件下で(例えば、フラスコ中、水平位で)、12〜48時間、例えば、24時間、培養する。「実質的好気性」は、少なくとも約15%O2、例えば、少なくとも約18%または20%O2、と定義される。実質的好気性条件下で、hES細胞は分化し始める。hES細胞についての分化経路は、分化段階中に用いられる培地に依存する。ニューロン前駆細胞を産生するために、hES細胞をDMEMまたはその等価物中で培養する。ニューロン前駆体以外の前駆細胞を産生するために、hES細胞をRPMIまたはその等価物中で培養する。12〜48時間複製周期後、細胞を収集し、分化を継続するために新鮮培地に再懸濁しうる。一般的に、この時点を超えるさらなる分化は本発明の方法を用いる移植に適していない細胞を産生するため、分化段階は、48〜72時間より長く続けるべきではない。
【０３８５】
いったん細胞が部分的に分化したならば、細胞は、上記のように凍結保存剤を加えて、-15〜約-80℃で細胞を貯蔵することによるか、または本発明の方法に用いるために細胞を調製することによるかのいずれかにより、将来的使用のために貯蔵されうる。使用のために細胞を調製するために、細胞を等分し、新鮮培地を加え(必要に応じて、DMEMまたはRPMI)、細胞を、さらなる分化を防ぐために実質的嫌気性条件下で12〜48時間、例えば、24時間、培養する。細胞を、その後、連続的増殖のために新鮮培地へ分注する、または移植のための調製において、遠心分離により収集し、生体適合性溶液(例えば、生理食塩水)に再懸濁する。この時点で、細胞は患者へ移植されうる、またはさらなる移植のために+4℃〜-80℃で貯蔵されうる。貯蔵は、輸送または臨床的使用を容易にしうる、限定されるわけではないが、試験管、バイアル、注射器などを含む任意の適切な容器内でありうる。一つの態様において、生体適合性溶液中の懸濁した細胞は、すぐ使用できる形で(例えば、事前充填型注射器に)貯蔵される。必要とされる時、細胞のアリコートを、水浴またはインキュベーターを必要とすることなく自然に解凍する。
【０３８６】
生体適合性溶液中の記載された貯蔵条件下で、6ヶ月間の貯蔵後でさえも再解凍後、>40%の細胞生存度が観察され、検出可能な異数性(aneuploidy)または異数性(heteroploidy)などの遺伝子型的(遺伝的不安定性)または表現型的変化をもたない。
【０３８７】
増殖、分化、および貯蔵の各段階において、細胞のアリコートを、トリパンブルー排除および顕微鏡検査により生存度について検査する。細胞培養物のアリコートをまた、微生物汚染について検査する。細胞懸濁液のさらなるアリコートをまた、細胞密度を測定するために、血球計数器上に置き、顕微鏡的に検査する。さらなるアリコートをまた、細胞培養物の分化の状態のマーカーとしてアルカリホスファターゼ活性を検査するために採取する。
【０３８８】
貯蔵中、細胞を、培養法の結果として起こる遺伝的不安定性について検査するために、それらの核型について月に1回、検査しうる。
【０３８９】
実施例
実施例1
胚単離のために、8個の卵胞を生じた、定期的IVFサイクルを受けているヒトドナーからの同意を以て卵子を収集した。卵子を精子により受精させ、通常の方法により培養し、胚を得た。胚のうちの3個をドナーへ移植した。余分の胚を、hES細胞系の発達について可変性期間、インキュベートした。
【０３９０】
無傷かまたは破損状態のいずれかの胚を、培地に懸濁した。さらに、84μlのプロテステロン(250mg/ml)および84μlのβhCG(5000iu/ml)を加えた。胚性細胞を含む培地を、いかなる汚染についても検査し、いかなる感染した胚も廃棄した。この形での胚の細胞を増殖および貯蔵に用いた。
【０３９１】
1日のインキュベーション後、1mlの培地含有胚性細胞を、50ml容器における40ml細胞培養培地(DMEMまたはRPMI)にプロゲステロンおよびβhCGと共に導入した。幹細胞を伴う培地を、二酸化炭素を含む環境において周辺温度で水平位でインキュベートした。表45は、この方法について従った実験条件の一部を示す。
【０３９２】
（表４５）
2014159455.tif 000118
【０３９３】
（表４６）
2014159455.tif 000119
【０３９４】
24時間のインキュベーション後、等しい数の有核(部分的に分化した)細胞およびブランク(未分化の)細胞を観察した。約0.5mlのアリコートをこの段階での貯蔵として採取した。48時間のインキュベーション後、ほとんどストランドがない楕円形細胞が、DMEM培地で観察された。しかしながら、RPMI培地を用いた場合、様々な形をもつ多数の有核細胞が観察された。容器の容量は、48時間のインキュベーション後、37mlマークまで満たされていることが見出された。0.5mlのアリコートをこの段階の貯蔵として採取した。DMEMにおける72時間のインキュベーション後、神経組織のように架橋結合した細胞の長いストランドが観察された。RPMI培地インキュベーションは、少数の小さなサイズの細胞、および中心細胞の周りに集積する少数の細胞を生じた。0.5mlのアリコートをこの段階での貯蔵として採取した。
【０３９５】
培地を含む培養物中で成長した胚性細胞のアリコートを、滅菌容器(Tarsons steriflask)内で他の試験要素に関してより多くの培地(RPMIまたはDMEM)へ導入した。幹細胞を、18時間から5日間までの範囲の様々な期間、水平位で二酸化炭素の環境において周囲温度でインキュベートした。24時間のインキュベーション後、約0.5mlのアリコートを再び、より多くの培地へ導入し、再インキュベートした。すぐに使用できる組成物を調製するために、加えて、異なるインキュベーション段階後の貯蔵として、アリコートを採取した。表46は、hES細胞の増殖について従ったいくつかの実験条件を記載する。
【０３９６】
実施例2
無傷かまたは破損状態のいずれかの胚を、培地に懸濁した。さらに、84μlのプロテステロンおよび84μlのβhCGを加えた。胚性細胞を含む培地を、いかなる汚染についても検査し、いかなる感染した胚も廃棄した。この形での胚の細胞を増殖および貯蔵に用いた。
【０３９７】
1日のインキュベーション後、1mlの培地含有胚性細胞を、50ml容器における46ml細胞培養培地(DMEMまたはRPMI)にプロゲステロンおよびβhCGと共に導入した。幹細胞を、二酸化炭素の環境において周辺温度で垂直位でインキュベートした。表47は、この方法について用いられた実施例変数の一部を示す。
【０３９８】
（表４７）
2014159455.tif 000120
【０３９９】
（表４８）
2014159455.tif 000121
【０４００】
24時間のインキュベーション後、有核細胞(部分的に分化した)およびブランク細胞(未分化の)が、約1:4の比で観察された。48時間のインキュベーション後、比1:2の有核細胞およびブランク細胞が観察された。0.5mlのアリコートを24時間および48時間の段階での貯蔵として採取した。
【０４０１】
0.5mlの、培地を含む培養物中で成長した胚性細胞を、50ml滅菌容器(Tarsons steriflask)内で他の試験要素に関して46mlの培地(RPMIまたはDMEM)に導入した。幹細胞を、二酸化炭素を含む環境において周囲温度、水平位でインキュベートした。24時間のインキュベーション後、0.5mlのアリコートを再び、46mlの培地へ導入し、再インキュベートした。表48は、hES細胞の増殖について従ったいくつかの実験条件を記載する。
【０４０２】
すぐに使用できる組成物を調製するために、加えて、24時間のインキュベーション段階後の貯蔵として、アリコートを採取した。
【０４０３】
実施例3：貯蔵
貯蔵のために、hES細胞を0.5ml貯蔵チューブに採取し、16μlの量の0.2%DMSOなどの凍結保存剤を加え、穏やかな振盪後、-20℃で貯蔵した。細胞を、すぐに使用できる組成物を作製するために、またはさらなる増殖のために、自然に解凍した。解凍された細胞の生存度を検査し、細胞の64%〜84%が生存可能であることが見出された。貯蔵された細胞を、定期的な間隔後、汚染および生存度について検査した。表49は、5つの異なる実験における貯蔵について従った実際のパラメーター、および解凍後の細胞の生存度を示す。
【０４０４】
（表４９）
2014159455.tif 000122
【０４０５】
実施例4
増殖および貯蔵段階の様々な間隔で胚性細胞におけるいかなる汚染または感染または異常をもチェックするために、ならびに各培養物に存在するhES誘導体を同定するために、様々な検査を行った。異なる検査には、HIV、HbSAg(肝炎について)についての検査、Kochs検査についての通常のPCR(結核について)、ギムザバンドのCG方法による染色体分析、ヤンドラシック・グロフ法によるビリルビンおよびBCG色素結合方法を用いるアルブミン(肝臓前駆細胞について)、CLIA方法によるインスリン(膵臓前駆細胞について)、免疫組織化学法によるニューロフィラメント(ニューロン前駆細胞について)、免疫組織化学法によるCD34試験(造血前駆細胞について)、PNPP方法によるアルカリホスファターゼ(未分化型細胞について)、組織病理学的検査(形態による細胞同定について)などが挙げられる。培養条件は、手作業の培養プレート方法および手作業の感度により試験され、versatrek/AP1での同定は、真菌感染について行われた。すべての検査が行われ、細胞計数および細胞の生存度が、各段階でチェックされた。表50は検査の一部の結果を提供する。
【０４０６】
実施例5：移植のためのhES細胞の調製
15mlの幹細胞懸濁液を採取し、1000r.p.m.で7分間、遠心分離した。上清を廃棄した。2〜15mlの生理食塩水をペレットに加え、それに従って、幹細胞は懸濁した。懸濁液を微生物汚染についてチェックした。生存度検査もまた行った。
【０４０７】
実施例6：すぐに使用できる形でのhES細胞の貯蔵
移植可能なhES細胞懸濁液で満たされた容器(注射器、試験管、フラスコ、バイアル)にラベルを貼り、-20℃で貯蔵した。懸濁液を移植直前に自然に解凍した。
【０４０８】
（表５０）
2014159455.tif 000123
-ve＝陰性試験結果
-＝実施せず
【０４０９】
細胞系
本発明のhES細胞を樹立するために、継代培養を100回より多く繰り返した。さらに、継代培養を、さらなる増殖または貯蔵の各段階でいかなる汚染/感染についても検査した。hES細胞系は、5年間を超える継代培養サイクルの間、安定で、かついかなる異常もないことが見出された。
【０４１０】
本発明は、特定の態様および例によって範囲が限定されるべきではなく、その特定の態様および例は、本発明のいくつかの局面の例証として意図され、機能的に等価であるいかなる態様も本発明の範囲内である。当業者は、本明細書に記載された発明の特定の態様に対する多くの等価物をわかっている、または日常的に過ぎない実験を用いて確かめることができると考えられる。これらおよびすべての他の等価物は、特許請求の範囲により含まれることが意図される。本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照により完全に組み入れられている。
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月21日(2014.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のヒト胚性幹(hES)細胞誘導体を含む、疾患、障害、または状態の処置のための薬学的組成物であって、該誘導体が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、ビタミン補充物、膜結合性スチール因子(steel factor)、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わず、該誘導体が薬学的に許容される生体適合性溶液に懸濁されており、さらにここで、該誘導体は、最少必須培地、βhCGアゴニスト、およびプロゲスチンを含む細胞培養培地によって培養され、約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間インキュベートされた、薬学的組成物。
【請求項２】
すぐに使用できる形である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
すぐに使用できる形があらかじめ充填された注射器である、請求項2記載の薬学的組成物。
【請求項４】
幹細胞誘導体が、治療的に有効であるための十分な生存度を有する、請求項2記載の薬学的組成物。
【請求項５】
幹細胞誘導体の生存度が40%より高い、請求項4記載の薬学的組成物。
【請求項６】
生体適合性溶液が生理食塩水である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
生体適合性溶液が抗微生物剤、抗細菌剤、または他の薬学的剤をさらに含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
治療的有効量の造血幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項９】
治療的有効量のニューロン幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
治療的有効量の造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
治療的有効量の間葉系幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
治療的有効量のインスリン産生幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
治療的有効量の肝幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
治療的有効量の心臓幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
治療的有効量の上皮幹細胞前駆体を含む、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
組成物における治療的有効量の造血幹細胞前駆体が約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
組成物における治療的有効量のニューロン幹細胞が約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項9記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
治療的有効量のhES細胞誘導体が、約0.25ml〜約100mlの生体適合性溶液における約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
治療的有効量のhES細胞誘導体が、約0.25ml〜約10mlの生体適合性溶液における750,000個〜約8千万個の細胞である、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
疾患、障害、または状態が、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、発達障害、変性障害、神経系の家族性障害または外傷性障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、ならびに関節炎および血液障害からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
疾患、障害、または状態が、急性骨髄性白血病、腺癌、関節炎、星状細胞腫、聴覚神経萎縮症、自閉症、自己免疫障害、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、ベッカー型筋ジストロフィー、脳損傷、火傷、脳血管発作、脳性麻痺、昏睡、角膜潰瘍、角膜移植片拒絶、神経系の大脳皮質基底核変性症、冠動脈疾患、糖尿病、認知症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、末期腎疾患、エルブ麻痺、顔面肩甲筋ジストロフィー、受精能障害、フリートライヒ運動失調症、心不全、肝細胞癌、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、肢帯ジストロフィー、肝硬変、黄斑変性症、精神遅滞、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、ニーマン・ピック病、非治癒性皮膚潰瘍、オリーブ橋小脳萎縮症、視神経萎縮症、パーキンソン病、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、褥瘡、進行性核上麻痺、乾癬、眼球癆、拘束型心筋症、網膜色素変性症、右脚ブロック、サルコイドーシス、洞性徐脈、脊髄腫瘍、脊髄性筋ジストロフィー、脊髄小脳失調、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、血小板減少症、サラセミア、潰瘍性大腸炎、植物状態、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、無精子症、原発性卵巣障害、アフタ性潰瘍、ホルモンの不均衡、変形性関節症、ホルネル症候群、骨形成不全症、イオンチャネル疾患、ならびに低ガンマグロブリン血症からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
hES細胞誘導体を含む組成物であって、該hES細胞誘導体が、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、線維芽細胞成長因子、ビタミン補充物、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わず、ここで、該誘導体は生体適合性の構造またはマトリックスに捕捉され、さらにここで、マトリックスの生体適合性の構造は選択透過性であり、さらにここで、該誘導体は、最少必須培地、βhCGアゴニスト、およびプロゲスチンを含む細胞培養培地によって培養され、約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間インキュベートされた、組成物。
【請求項２３】
誘導体が造血幹細胞前駆体を含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
誘導体がニューロン幹細胞前駆体を含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２５】
誘導体が造血幹細胞およびニューロン幹細胞前駆体の組み合わせを含む、請求項22記載の組成物。
【請求項２６】
生体適合性で選択透過性の構造またはマトリックスが、生体高分子、ポリペプチド、タンパク質、多糖、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース、およびゼラチンからなる群より選択される、請求項22記載の組成物。
【請求項２７】
誘導体が、アガロースおよびコラーゲンの混合物、またはアガロースおよびゼラチンの混合物に捕捉されている、請求項22記載の組成物。
【請求項２８】
以下の段階を含む、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わないhES細胞誘導体を増殖させる方法：
(a)最少必須培地、プロゲスチン、およびβ-ヒト絨毛性ゴナドトロピン(βhCG)アゴニストからなる細胞培養培地に該誘導体を導入する段階；ならびに
(b)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、該誘導体をインキュベートする段階。
【請求項２９】
細胞培養培地がRPMIである、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３０】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法：
(c)段階(b)のインキュベートされた誘導体のアリコートを採取する段階であって、該アリコートが少なくとも1個の細胞を含む、段階、
(d)細胞培養培地における細胞をプロゲステロンおよびβhCGと共にアリコートへ再懸濁する段階、
(e)プロゲスチンおよびβhCGアゴニストを含まない細胞培養培地に細胞を希釈する段階、ならびに
(f)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、細胞をインキュベートする段階。
【請求項３１】
インキュベーションがウォータージャケット型細胞培養インキュベーターにおいて行われる、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３２】
培地における細胞が実質的に嫌気性の条件下で生体適合性容器においてインキュベートされる、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３３】
細胞が増殖時に分化しない、請求項32記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３４】
増殖した細胞を任意の汚染について検査する段階をさらに含む、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３５】
培養過程が生体適合性容器において行われる、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３６】
インキュベートされた細胞のアリコート対細胞培地の比が約1:3.5〜約1:35である、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３７】
インキュベーションが実質的に嫌気性の環境で行われる、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３８】
インキュベーションが、生体適合性容器において行われ、その容量が培地によってほとんど完全に占有され、かつ容器が垂直位に保たれる、請求項28記載の誘導体を増殖させる方法。
【請求項３９】
以下の段階を含む、動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わない誘導体を部分的に分化させる方法：
(a)最少必須培地からなる細胞培養培地に誘導体を導入する段階；および
(b)約34℃〜約38℃の温度で約3.5%〜約6%二酸化炭素の環境において約12時間〜約48時間、誘導体をインキュベートする段階。
【請求項４０】
細胞培養培地がRPMIまたはDMEMである、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４１】
インキュベーションがウォータージャケット型細胞培養インキュベーターにおいて行われる、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４２】
培地における細胞が実質的に好気性の条件下で生体適合性容器においてインキュベートされる、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４３】
細胞が増殖時に分化する、請求項42記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４４】
増殖した細胞を任意の汚染について検査する段階をさらに含む、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４５】
培養過程が生体適合性容器において行われる、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４６】
インキュベートされた細胞のアリコート対細胞培地の比が約1:3.5〜約1:35である、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４７】
インキュベーションが実質的に好気性の環境で行われる、請求項39記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４８】
インキュベーションが生体適合性容器において行われ、かつ容器が水平位に保たれる、請求項47記載の誘導体を部分的に分化させる方法。
【請求項４９】
以下の段階を含む、ヒト移植のためのhES細胞誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法：
(a)動物性産物、フィーダー細胞、成長因子、白血病抑制因子、補充性ミネラル組み合わせ、アミノ酸補充物、ビタミン補充物、線維芽細胞成長因子、膜結合性スチール因子、可溶性スチール因子、および条件培地を伴わない誘導体を得る段階、
(b)該細胞を遠心分離してペレットを得る段階、ならびに
(c)ペレットを生体適合性溶液に懸濁する段階。
【請求項５０】
以下の段階をさらに含む、請求項49記載のヒト移植のための誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法：
(d)調製物を約-15℃〜約-72℃で貯蔵する段階、および
(e)移植前に、貯蔵された調製物を自然に解凍する段階であって、細胞の生存度が解凍時に少なくとも40%である、段階。
【請求項５１】
調製物を移植前に任意の汚染について検査する段階をさらに含む、請求項49または50記載のヒト移植のための誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法。
【請求項５２】
(a)で得られた誘導体が請求項28または39記載の方法により産生される、請求項49記載のヒト移植のための誘導体のすぐに使用できる調製物を調製する方法。
【請求項５３】
以下の段階を含む、生存可能な状態でhES細胞誘導体の調製物を貯蔵する方法：
(a)請求項28または39記載の方法により調製された誘導体の調製物を採取する段階、
(b)凍結保存剤を加える段階、および
(c)細胞を約-15〜約-72℃で凍結させる段階。
【請求項５４】
凍結保存剤の量対培地の量の比が約1:500から約16:1000までである、請求項53記載の誘導体の調製物を貯蔵する方法。
【請求項５５】
貯蔵が生体適合性容器においてである、請求項53記載の誘導体の調製物を貯蔵する方法。
【請求項５６】
細胞が約-18〜約-20℃で凍結される、請求項53記載の誘導体の調製物を貯蔵する方法。
【請求項５７】
被験体における疾患、障害、または状態の処置のための医薬を調製するための、治療的有効量の請求項1の薬学的組成物もしくは請求項22の組成物の使用。
【請求項５８】
hES細胞誘導体が請求項28または39記載の方法により産生される、請求項57記載の使用。
【請求項５９】
疾患、障害、または状態が、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、発達障害、変性障害、神経系の家族性障害または外傷性障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、関節炎、ならびに血液障害からなる群より選択される、請求項57記載の使用。
【請求項６０】
神経系障害が、自閉症、脳性麻痺、エルブ麻痺、精神遅滞、および進行性核上麻痺からなる群より選択される発達性神経系障害である、請求項59記載の使用。
【請求項６１】
神経系障害が、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、難聴(聴覚神経萎縮症)、認知症、フリートライヒ運動失調症、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、および脊髄小脳失調からなる群より選択される変性神経系障害である、請求項59記載の使用。
【請求項６２】
神経系障害が、脳損傷、昏睡、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、脊髄損傷または傷害、および植物状態からなる群より選択される神経系の外傷である、請求項59記載の使用。
【請求項６３】
神経系障害が脳血管発作または卒中である、請求項59記載の使用。
【請求項６４】
神経系障害が、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患およびハンチントン舞踏病からなる群より選択される家族性状態である、請求項59記載の使用。
【請求項６５】
肝臓および腎臓障害が、肝硬変、末期腎疾患、ネフローゼ症候群、およびニーマン・ピック病からなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項６６】
皮膚障害が、関節炎、関節硬化症、火傷、非治癒性潰瘍、褥瘡、乾癬、全身性エリテマトーデス、およびサルコイドーシスからなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項６７】
自己免疫障害が、血小板減少症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項６８】
遺伝的障害が、ダウン症候群、強直性脊椎炎、サラセミア、およびハンチントン舞踏病からなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項６９】
眼障害が、視神経萎縮症、眼球癆、黄斑変性症、網膜色素変性症、角膜の擦過傷、角膜移植片拒絶、および角膜潰瘍からなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項７０】
筋骨格障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、顔面肩甲筋ジストロフィー、肢帯ジストロフィー、脊髄性筋ジストロフィー、およびベッカー型筋ジストロフィーからなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項７１】
心臓障害が、心筋梗塞、右脚ブロック、拘束型心筋症、心不全、洞性徐脈、および冠動脈疾患からなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項７２】
腫瘍学的状態が、急性骨髄性白血病、副腎の腺癌、星状細胞腫、肝細胞癌、および脊髄腫瘍からなる群より選択される、請求項59記載の使用。
【請求項７３】
疾患が糖尿病である、請求項57記載の使用。
【請求項７４】
治療的有効量の請求項1記載の薬学的組成物もしくは請求項22記載の組成物の、筋内注射もしくは静脈内注射もしくは硬膜外注射もしくは硬膜外カテーテルもしくは球後注射もしくは皮下注射もしくは心腔内注射もしくは嚢内注射もしくは髄腔内注射による、または局所適用もしくは病巣内適用もしくは静脈内注入による、または噴霧器による、またはスプレーによる、または腟内経路による、または局部点眼薬および点耳薬による投与のための医薬の調製のための使用。
【請求項７５】
誘導体が請求項28または39記載の方法により産生される、請求項74記載の使用。
【請求項７６】
治療的有効量の誘導体が約750,000個〜約1億6千万個の細胞である、請求項74記載の使用。
【請求項７７】
誘導体が、造血幹細胞前駆体、ニューロン幹細胞前駆体、間葉系幹細胞前駆体、上皮幹細胞前駆体、腎臓幹細胞前駆体、心臓幹細胞前駆体、もしくは肝臓幹細胞前駆体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項74記載の使用。
【請求項７８】
疾患が、癌、卒中、遺伝的障害、肝臓障害、発達障害、変性障害、神経系の家族性障害または外傷性障害、血管障害、皮膚疾患および障害、自己免疫障害、眼障害、腎臓障害、心臓障害、筋骨格障害、生殖および受精能障害、関節炎、ならびに血液障害からなる群より選択される、請求項74記載の使用。
【請求項７９】
疾患、障害、または状態が、急性骨髄性白血病、腺癌、関節炎、星状細胞腫、聴覚神経萎縮症、自閉症、自己免疫障害、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、ベッカー型筋ジストロフィー、脳損傷、火傷、脳血管発作、脳性麻痺、昏睡、角膜潰瘍、角膜移植片拒絶、神経系の大脳皮質基底核変性症、冠動脈疾患、糖尿病、認知症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、末期腎疾患、エルブ麻痺、顔面肩甲筋ジストロフィー、受精能障害、フリートライヒ運動失調症、心不全、肝細胞癌、遺伝性脊髄運動ニューロン疾患、ハンチントン舞踏病、クラッベ病、肢帯ジストロフィー、肝硬変、黄斑変性症、精神遅滞、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、心筋梗塞、ネフローゼ症候群、ニーマン・ピック病、非治癒性皮膚潰瘍、オリーブ橋小脳萎縮症、視神経萎縮症、パーキンソン病、電気ショック後脳障害、狂犬病ワクチン後脳障害、褥瘡、進行性核上麻痺、乾癬、眼球癆、拘束型心筋症、網膜色素変性症、右脚ブロック、サルコイドーシス、洞性徐脈、脊髄腫瘍、脊髄性筋ジストロフィー、脊髄小脳失調、スティーブンス・ジョンソン症候群、全身性エリテマトーデス、血小板減少症、サラセミア、潰瘍性大腸炎、植物状態、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、無精子症、原発性卵巣障害、アフタ性潰瘍、ホルモンの不均衡、変形性関節症、ホルネル症候群および骨形成不全症、イオンチャネル疾患、ならびに低ガンマグロブリン血症からなる群より選択される、請求項74記載の使用。
【請求項８０】
誘導体が腫瘍、奇形腫、または染色体変化を引き起こさない、請求項74記載の使用。
【請求項８１】
以下の段階を含む、疾患、障害、または状態が脊髄傷害(SCI) である、請求項74記載の使用：
(a)約750,000個〜約8千万個の該誘導体を皮下注射によって投与する段階；
(b)所定の期間後、段階(a)を繰り返し、その後、治療的有効量の該誘導体を筋内注射によって投与する段階；
(c)ニューロン幹細胞前駆体および造血幹細胞前駆体を含む、治療的有効量の該誘導体を、静脈内注射または注入によって投与する段階；
(d)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量の該誘導体を、硬膜外注射によって投与し、臨床的および/または神経学的検査により評価される被験体の状態に依存して、所定の期間後、投薬を繰り返す段階；
(e)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量の該誘導体を、仙骨(caudal)注射によって投与する段階；
(f)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量の該誘導体を、髄腔内注射またはくも膜下ブロックカテーテルによって投与する段階；
(g)ニューロン幹細胞前駆体を含む、治療的有効量の該誘導体を、硬膜外注射または硬膜外カテーテルによって投与する段階；
(h)治療的有効量の該誘導体を脊椎の両側の深部脊椎注射によって投与する段階；ならびに
(i)治療的有効量の該誘導体を静脈内注入によって投与する段階；
ここで、段階(a)および(b)は最初に行われ、残りの段階は任意の順序で行われてもよい。
【請求項８２】
被験体がSCIからの回復の臨床的徴候を示すまで、段階(f)、続いて段階(g)を繰り返す段階をさらに含む、請求項81記載の使用。
【請求項８３】
誘導体が請求項28または39記載の方法により産生される、請求項81記載の使用。
【請求項８４】
段階(a)および段階(b)における該細胞が造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含み、さらに、0.25〜1.0mlの生体適合性溶液に懸濁される、請求項81記載の使用。
【請求項８５】
段階(f)における該治療的有効量が約750,000個〜約1100万個のhES細胞誘導体であり、ここで、該細胞は造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含み、さらにここで、該細胞は2.0〜4.0mlの生体適合性溶液に懸濁される、請求項81記載の使用。
【請求項８６】
段階(g)における該治療的有効量が約750,000個〜約8千万個の誘導体であり、ここで、該細胞は造血幹細胞前駆体およびニューロン幹細胞前駆体を含み、さらにここで、該細胞は15〜40mlの生体適合性溶液に懸濁される、請求項81記載の使用。
【請求項８７】
SCIを有する被験体の処置が結果として、床ずれの改善を生じる、請求項81記載の使用。
【請求項８８】
疾患、障害、または状態が、発達性、変性、家族性、および外傷性神経系障害ならびに脳血管発作からなる群より選択され、該処置は約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を静脈内注射、皮下注射、筋内注射、髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、またはくも膜下ブロックカテーテル注入により投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項８９】
疾患、障害、または状態が皮膚障害であり、該処置は約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を局部または局所適用により投与する段階を含み、ここで、該細胞は造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９０】
hES細胞誘導体および/または前駆体が損傷した皮膚に適用されるように生体適合性担体に混合される、請求項89記載の使用。
【請求項９１】
生体適合性担体が、ゲル、軟膏、ペースト、またはエアロゾルスプレーである、請求項90記載の使用。
【請求項９２】
疾患、障害、または状態が床ずれであり、該処置は約750,000個〜約8千万個のhES細胞誘導体を局部もしくは局所適用または筋内注射により投与する段階を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９３】
疾患、障害、または状態が自己免疫障害であり、該処置は約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、筋内注射、静脈内注射、皮下注射、関節内注射、もしくは静脈内注入、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９４】
疾患、障害、または状態が遺伝的障害であり、該処置は約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、髄腔内注射、硬膜外カテーテル注入、もしくはくも膜下ブロックカテーテル注入、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９５】
疾患、障害、または状態が壊疽であり、該処置は約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、静脈内注射、筋内注射、もしくは生存可能組織と死んだ組織の接合部での局部適用、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９６】
疾患、障害、または状態が老化に関連した状態であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、浮遊状態または生体適合性担体に混合された局部適用により投与する段階を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９７】
生体適合性担体がゲル、軟膏、ペースト、またはエアロゾルスプレーである、請求項96記載の使用。
【請求項９８】
疾患、障害、または状態が糖尿病であり、約750,000個〜約1億6千万個のヒト胚性インスリン産生前駆細胞を、静脈内もしくは筋内注射または両方により投与する段階を含む、請求項74記載の使用。
【請求項９９】
疾患、障害、または状態が心臓血管障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、心腔内注射、血管造影法、もしくは直接注射、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞は造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１００】
投与が血管造影法中である、請求項99記載の使用。
【請求項１０１】
疾患、障害、または状態が肝臓および腎臓障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、静脈内注入、もしくは局部注射、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞は造血幹細胞前駆体、アルブミン産生幹細胞前駆体、およびビリルビン産生幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１０２】
疾患、障害、または状態が受精能および生殖障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、局部筋内注射、精巣内注射によるか、もしくは副睾丸近くの皮下皮膚注射を通してか、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞は造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１０３】
疾患、障害、または状態が筋骨格障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、静脈内注射、皮下注射、筋内注射、もしくは静脈内カテーテル注入、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１０４】
疾患、障害、または状態が眼障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、局部静脈内注射、皮下注射、筋内注射、球後注射、硝子体内注射、もしくは局所適用、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体、造血幹細胞前駆体、および/または間葉系幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１０５】
該細胞はニューロン幹細胞前駆体を含み、球後注射により投与される、請求項104記載の使用。
【請求項１０６】
該細胞はニューロン幹細胞前駆体を含み、硝子体内注射により投与される、請求項104記載の使用。
【請求項１０７】
該細胞は間葉系幹細胞前駆体を含み、角膜の擦過傷の処置のためにコンタクトレンズに適用される、請求項104記載の使用。
【請求項１０８】
疾患、障害、または状態が肺障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、筋内注射、静脈内注射、スプレー、もしくは噴霧器、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１０９】
疾患、障害、または状態がホルモン障害であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、筋内注射もしくは静脈内注射、スプレー、もしくは噴霧器、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１１０】
疾患、障害、または状態がアフタ性潰瘍であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、筋内注射もしくは静脈内注射、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１１１】
疾患、障害、または状態が膝関節および股関節であり、約750,000個〜約1億6千万個のhES細胞誘導体を、筋内注射、静脈内注射、もしくは関節内注射、またはそれらの組み合わせにより投与する段階を含み、ここで、該細胞はニューロン幹細胞前駆体および/または造血幹細胞前駆体を含む、請求項74記載の使用。
【請求項１１２】
hES細胞誘導体への化合物の効果を試験するための方法であって、請求項28または39記載の方法により得られた該誘導体を化合物の存在下で培養する段階、ならびに化合物の細胞への効果を決定する段階を含む、方法。
【請求項１１３】
被験体への薬物の送達のための、医薬の調製における、請求項28または39記載の方法により得られたhES細胞誘導体の使用であって、細胞が薬物の存在下で薬物を取り込み、かつ細胞が被験体における薬物が送達される部位に投与される、使用。