(57)【要約】      （修正有）【課題】胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞、及び様々な他の細胞型の表面上に存在するＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）と結合するヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ６抗体（Ｔ１ｈ）の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを含む抗ＣＤ６モノクローナル抗体であって、多発性硬化症、移植拒絶反応、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫障害を含む群から選択される自己免疫障害の治療に使用される、抗ＣＤ６モノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される重鎖ポリペプチドと配列番号２に示される軽鎖ポリペプチドとを含む抗ＣＤ６モノクローナル抗体であって、
多発性硬化症、移植拒絶反応、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫障害を含む群から選択される自己免疫障害の治療に使用され、かつ、以下の特徴：
ｉ）連結抗ＣＤ３により誘導されるナイーブＰＢＭＣの増殖を阻害すること；
ｉｉ）ラージ細胞が抗原提示細胞でありＰＢＭＣが増殖する一方向ＭＬＲを特異的に阻害すること；
ｉｉｉ）ＰＢＭＣにより媒介される一方向自己ＭＬＲを特異的に阻害すること；
ｉｖ）ＩＬ２の抑制を媒介することによりＴ細胞増殖を阻害すること；及び
ｖ）ＣＤ２５カウント数及びＣＤ４カウント数の低減によりナイーブＴ細胞増殖の阻害を引き起こすこと；のうち１つ又は複数を有する、抗ＣＤ６モノクローナル抗体。
【請求項２】
免疫抑制剤と組み合わせて０．１ｍｇ／Ｋｇ／週〜２５ｍｇ／Ｋｇ／週の薬学的有効用量でそれを必要とする被験体に前記抗体を投与することにより、多発性硬化症、移植拒絶反応、１型糖尿病、関節リウマチ、乾癬、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫障害を含む群から選択される自己免疫障害の治療において使用される、請求項１に記載の抗ＣＤ６モノクローナル抗体。
【請求項３】
連結抗ＣＤ３；連結抗ＣＤ３及び抗ＣＤ６の組合せ、又は連結抗ＣＤ３及びＡＬＣＡＭの組合せにより誘導されるナイーブＰＢＭＣの増殖を阻害する、請求項１または２に記載の抗ＣＤ６モノクローナル抗体。
【請求項４】
炎症促進性サイトカインＩＬ６及びＩＮＦγの下方調節に関与する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗ＣＤ６モノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号１に示される重鎖ポリペプチドと配列番号２に示される軽鎖ポリペプチドとを含み、それを必要とする被験体に対して０．１ｍｇ／ｋｇ／週〜２５ｍｇ／ｋｇ／週の薬学的有効用量で治療のために使用される、抗ＣＤ６モノクローナル抗体。
【請求項６】
インスリン、ＧＡＤ、ＭＯＧ、ＭＢＰ及びＨＳＰ６０を含む群から選択される抗炎症性免疫応答を誘発することができる抗原と組み合わせて投与される、請求項５に記載の抗ＣＤ６モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞、及び様々な他の細胞型の表面上に存在するＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）と結合するヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ６抗体（Ｔ１ｈ）に関する。本発明はさらに、ＣＤ６と、天然のＣＤ６リガンド、例えば活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）との相互作用を遮断することなくＴ細胞の増殖を阻害する方法に関する。本発明はまた、ＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）と結合する抗ＣＤ６抗体を使用して様々な適応疾患（disease indications）を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ６は、ヒトＴ細胞、及びＢ細胞のサブセットにより、並びに、幾つかのＢ細胞慢性リンパ球性白血病及びニューロンにより主に発現される重要な細胞表面タンパク質である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ＣＤ６は、１型マクロファージのスカベンジャー受容体システインリッチドメイン（ＳＲＣＲ）に相同な少なくとも１つのドメインを有することを特徴とするタンパク質の大きなファミリーのメンバーである（非特許文献４及び非特許文献５）。このファミリーの他のメンバーは、ＣＤ５（非特許文献６）；シクロフィリンＣ（非特許文献７）；活性化補体タンパク質Ｃ３ｂ及びＣ４ｂを結合する補体因子Ｉ（非特許文献８）；τ／δ（.tau./.delta.）Ｔ細胞により発現されるウシＷＣ−１（非特許文献９）、及びマクロファージ活性化マーカーであるＭ１３０（非特許文献１０）を含む。
【０００３】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する遮断研究により、ＣＤ６は、胸腺上皮（ＴＥ）細胞とのＴ細胞接着相互作用を調節することによって、Ｔ細胞発生において重要な役割を果たすことが示唆されている（非特許文献１１）。さらなる研究により、ＣＤ６がＴ細胞活性化において重要なアクセサリー分子として機能することができることが示されている。例えば、或る特定の抗ＣＤ６ｍＡｂは、Ｔ細胞に対して直接的に分裂促進性を有している（非特許文献１２及び非特許文献１３）が、他の抗ＣＤ６ｍＡｂは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２又はホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）と併せてＴ細胞増殖を同時刺激することができる（非特許文献１２；非特許文献１４及び非特許文献１５）。Ｔ細胞活性化におけるＣＤ６の役割のまたさらなる証拠が複数の研究から得られており、これらの研究では、Ｔ細胞活性化後にＣＤ６がＳｅｒ及びＴｈｒ残基で高リン酸化型となり（非特許文献１６及び非特許文献１７；非特許文献１８）、Ｔｙｒ残基でリン酸化型となる（非特許文献１９）ことが示されている。これらの研究及び他の研究により、ＣＤ６は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での未熟及び成熟Ｔ細胞機能の両方の重要な修飾因子であり、Ｔ細胞活性化及びシグナル伝達の両方に影響を及ぼすと意味づけられている。
【０００４】
成熟ＣＤ６タンパク質の細胞外ドメインは、３つのＳＲＣＲドメイン（本明細書では以下でＤ１、Ｄ２及びＤ３と称される）から構成されている。Ｄ３は、短い３３個のアミノ酸のストーク（stalk）領域に続く膜近位ＳＲＣＲドメインに対応する。これらの細胞外ドメインは、可変長の細胞質ドメインの前の短い膜貫通ドメインを介して細胞膜に固定されている（非特許文献１）。
【０００５】
ヒトＩｇＧ１定常ドメインと融合したＣＤ６の選択された細胞外ドメインを含有するＣＤ６−免疫グロブリン融合タンパク質（ＣＤ６−Ｒｇｓ）を使用する研究により、「活性化白血球細胞接着分子」（ＡＬＣＡＭ）と称されるＣＤ６リガンドの同定及びクローニングがなされた（非特許文献２０；非特許文献１１；非特許文献２１）。ＡＬＣＡＭは、膜近位ＳＲＣＲドメインに対応するＣＤ６のドメイン３と結合する（非特許文献２２）。
【０００６】
Ｔ細胞調節におけるＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用の役割の研究により、この受容体−リガンド対が、ＣＤ６を発現する細胞の胸腺上皮細胞への接着を媒介することができることが示されている（非特許文献２３）。この証拠及び他の証拠により、ＣＤ６／ＡＬＣＡＭ相互作用が、Ｔ細胞の発生及び活性化を変調させるのに重要であることが示唆されている。
【０００７】
ＣＤ６の機能的特徴づけは不完全なままであるが、臨床現場では、骨髄からＴ細胞及びＴ細胞前駆体を一掃するために抗ＣＤ６ｍＡｂを適用することに成功している。抗ＣＤ６処理した同種骨髄の投与を受けた患者が移植片対宿主病の発症率が低く、高レベルの生着を伴っていたという知見（非特許文献２４）により、ＣＤ６陰性の末梢血Ｔ細胞（５％〜６％）の小さなサブセットの発見が導かれた（非特許文献２５）。ＣＤ６陰性Ｔ細胞の亜集団は、通常のＣＤ６＋Ｔ細胞と比較して、ＭＬＲにおけるより低い同種反応性を示した（非特許文献２５）。これらのＣＤ６陰性Ｔ細胞の機能的特徴づけにより、ＣＤ６陰性Ｔ細胞は同種刺激に対して非応答性であるが、フィトヘマグルチニン（phytohemagglutin）（ＰＨＡ）で刺激したときには増殖することができることも示されている。これらの知見は、ＣＤ６が、インビボでＴ細胞の機能を変調させる上で重要な役割を果たすという仮説をさらに支持している。ＣＤ６は、初期及び後期Ｔ細胞−ＡＰＣ相互作用を媒介する免疫学的シナプスの一部分であることも報告されている（非特許文献２６）。
【０００８】
ＣＤ６分子は、プロテアーゼ感受性部位でＮ−グリコシル化されており、鎖内ジスルフィド結合を保有している。以前の報告により、ＣＤ６は、２分子形態（休止Ｔ細胞では１０５ｋＤａのリン酸化形態であり、腫瘍プロモータであるホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）によるタンパク質キナーゼＣ活性化後の細胞では１３０ｋＤａの高リン酸化形態）で存在することが示されている（非特許文献２７）。
【０００９】
特許文献１は、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメイン３（Ｄ３）、又はヒトＣＤ６ストークドメイン（ＣＤ６Ｓ）と特異的に結合し、ＣＤ６と結合する活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）を阻害する抗体及び他の結合因子を開示しており、この内容は参照により本明細書に援用される。
【００１０】
「関節リウマチの診断及び治療に有用な抗ＣＤ６モノクローナル抗体を含む医薬組成物」と題する２００６年１２月２６日付けの特許文献２は、Ｔ１ｈがＣＤ６とＡＬＣＡＭリガンドとの結合を阻害することなくＣＤ６と結合することを開示しており、この出願の内容は参照により本明細書に援用される。
【００１１】
本発明のＣＤ６抗体は、既知のＣＤ６に対するリガンド、すなわちＡＬＣＡＭと相互作用するドメインとは別個のドメインと結合することによりＴ細胞増殖を阻害することによって、Ｔ細胞の活性化を妨げる。
【００１２】
以前の刊行物及び特許は、マウス抗ＣＤ６（ＩＯＲ−Ｔ１）モノクローナル抗体の配列、及びＩＯＲ−Ｔ１をヒト化してＴ１ｈ（ヒト化ＩＯＲ−Ｔ１）とするために実施されたアミノ酸改変を開示している。特許文献３及びそれに相当する（its equivalent）特許文献４は、マウスモノクローナル抗体をヒト化する具体的な方法、並びにＩＯＲ−Ｔ１及びＴ１ｈの配列を開示している。特許文献５及びそれに相当する特許文献６は、ＩＯＲ−Ｔ１及びＴ１ｈ（ヒト化ＩＯＲ−Ｔ１）の配列を開示している。刊行物（非特許文献２８）では、マウスモノクローナル抗体をヒト化する具体的な方法、並びにＩＯＲ−Ｔ１及びＴ１ｈの配列について論じている。
【００１３】
本発明の態様は、Ｔ１ｈの重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に関する。これにより、Ｔ１ｈを製造するために使用される細胞株により発現されるＴ１ｈのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が確立される。本発明のモノクローナル抗体は、ＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）と結合することができ、ＡＬＣＡＭ結合を妨害することなくＴ細胞増殖を阻害する。本発明のモノクローナル抗体は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性（dependant）細胞毒性（ＡＤＣＣ）及びアポトーシスを誘導しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，３７２，２１５号明細書
【特許文献２】キューバ国特許出願第２５０／２００６号明細書
【特許文献３】米国特許第５７１２１２０号明細書
【特許文献４】欧州特許第０６９９７５５号明細書
【特許文献５】米国特許第６５７２８５７号明細書
【特許文献６】欧州特許第０８０７１２５号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Aruffo et al., J. Exp. Med. 1991, 174:949
【非特許文献２】Kamoun et al., J. Immunol. 1981, 127:987
【非特許文献３】Mayer et al.,  J. Neuroimmunol. 1990. 29:193
【非特許文献４】Matsumoto, et al., J. Exp. Med. 1991, 173:55
【非特許文献５】Resnick et al., Trends Biochem. Sci.1994, 19:5
【非特許文献６】Jones et al., Nature. 1986, 323:346
【非特許文献７】Friedman et al. 1993, PNAS 90:6815
【非特許文献８】Goldberger, et al., J. Biol. Chem. 1987, 262:10065
【非特許文献９】Wijingaard et al., J. Immunol. 1992, 149:3273
【非特許文献１０】Law et al., Eur J. Immunol. 1993, 23:2320
【非特許文献１１】Patel et al., J. Exp. Med. 1995 181:1563-1568
【非特許文献１２】Gangemi et al., J. Immunol. 1989, 143:2439
【非特許文献１３】Bott et al.,1993 Int. Immunol. 7:783
【非特許文献１４】Morimoto et al., J. Immunol. 1988, 140:2165-2170
【非特許文献１５】Osorio et al., Cell. Immunol. 1994, 154:23
【非特許文献１６】Swack et al., Mol. Immunol. 1989 26:1037-1049
【非特許文献１７】J. Biol. Chem. 1991, 266:7137
【非特許文献１８】Cardenas et al., J. Immunol. 1990, 145:1450-1455
【非特許文献１９】Wee et al., J. Exp. Med. 1993, 177:219-223
【非特許文献２０】Wee, et al., Cell. Immunol. 1994, 158:353-364
【非特許文献２１】Bowen et al., J. Exp. Med. 1995, 181:2213-2220
【非特許文献２２】Whitney, et.al., J. Biol. Chem. 1995, 270: 18187-18190
【非特許文献２３】Bowen et al., J. Exp. Med. 1995, 181:2213
【非特許文献２４】Soiffer R J, 1993, Bone Marrow Transplant.;12 Suppl 3:S7-10
【非特許文献２５】Rasmussen. J Immunol 1994. 152: 527-536
【非特許文献２６】Gimferrer  I. J Immunol 2004. 173: 2262-2270
【非特許文献２７】Osorio M, Cellular Immunology,1994154:123-133,
【非特許文献２８】Roque-Navarro, L., et.al., Hybridoma and Hybridomics 2003.22:245-257
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的
本発明の主目的は、ＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）と結合することができ、かつ、ＡＬＣＡＭ結合を妨害することなくＴ細胞増殖を阻害するモノクローナル抗体を得ることである。
【００１７】
本発明の別の主目的は、前記モノクローナル抗体を使用して炎症状態を変調させる方法を得ることである。
【００１８】
本発明のさらに別の主目的は、免疫抑制剤と組み合わせて前記モノクローナル抗体を使用して炎症状態を変調させる方法を得ることである。
【００１９】
本発明のまた別の主目的は、抗炎症性免疫応答を誘発することができる抗原、例えばインスリン、ＧＡＤ、ＭＯＧ、ＭＢＰ及びＨＳＰ６０と組み合わせて前記モノクローナル抗体を使用して炎症状態を変調させる方法を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の説明
したがって、本発明は、ＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）と結合することができ、ＡＬＣＡＭ結合を妨害することなくＴ細胞増殖を阻害するモノクローナル抗体；モノクローナル抗体を使用して、炎症状態、例えば乾癬、関節リウマチ、又は患者における自己免疫応答、例えば多発性硬化症又は移植拒絶反応と関連する有害応答（adverse responses）、移植片対宿主病、１型糖尿病、乾癬、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎（thyroiditis）、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫疾患を変調させる方法；免疫抑制剤と組み合わせてモノクローナル抗体を使用して、炎症状態、例えば乾癬、関節リウマチ、又は患者における自己免疫応答、例えば多発性硬化症又は移植拒絶反応と関連する有害応答、移植片対宿主病、１型糖尿病、乾癬、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫疾患を変調させる方法；並びに抗炎症性免疫応答を誘発することができる抗原、例えばインスリン、ＧＡＤ、ＭＯＧ、ＭＢＰ及びＨＳＰ６０と組み合わせてモノクローナル抗体を使用して、炎症状態、例えば、多発性硬化症又は移植拒絶反応、移植片対宿主病、１型糖尿病を変調させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】プラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから得られたＴ１ｈのＶＨ及びＶｋのヌクレオチド配列である。
【図１ｂ】ＶＨ及びＶｋのアミノ酸配列である。
【図１ｃ】配列の差異を強調するために本特許で開示されている配列と比較した、以前の刊行物で開示されているＶｋアミノ酸配列の比較である。
【図２】Ｔ１ｈ及びＡＬＣＡＭの存在下での、又はＴ１ｈ単独存在下でのＣＤ６−Ｆｃを連結した（tethered）プレートのＥＬＩＳＡの読取り値である。
【図３】ドメイン１と結合する抗体であるＭＥＭ９８（Castro AA M et al, J of Immunol, 178 (2007) 4351-4361.）をＴ１ｈと競合させると、用量依存的な競合が観察され、両方が同じドメイン（すなわちドメイン１）と結合することを示唆している。
【図４】Ｔ１ｈ抗体（５ｕｇ／ｍｌ）、ｈＲ３抗体（５ｕｇ／ｍｌ）及びラパマイシン（１．２ｕｇ／ｍｌ）を用いて又は抗体を用いず（対照として）処理し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートしたＨＵＴ７８細胞である。その後細胞をアネキシンＶ標識溶液で処理した後、フローサイトメトリー分析を行った。アネキシンＶ  ＦＩＴＣ対数値を横軸に、ＰＩ／ＰＥテキサスレッドを縦軸に示す。
【図５】ＦＩＴＣチャネルに関するＳｐｈｅｒｏ検量線図である。
【図６】様々な健常個体のＴリンパ球及びＢリンパ球上のＣＤ６受容体の密度。Ｔ細胞は、ＣＤ６に関して陽性のＢ細胞よりも１０倍多いＣＤ６受容体である。
【図７】ダウジ（Daudi）細胞に対して陽性対照としてリツキサンを使用して、ＡＤＣＣアッセイを行った。ダウジ細胞をＣＦＳＥで標識して、リツキサン（２．５ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ及び１０ｕｇ／ｍｌ）、非特異的対照として使用したｈＲ３（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下でインキュベートし、ＰＢＭＣを１：２５、１：５０、１：１００の比でエフェクター細胞として使用した。細胞を６時間インキュベートした。７ＡＡＤを使用して細胞毒性細胞を検出した。細胞をＣＹＡＮ  ＡＤＰフローサイトメトリーで分析した。
【図８】リツキサンによるダウジ細胞に対する、２次元ドットプロットでのＡＤＣＣアッセイ結果。
【図９】５μｇ／ｍｌのＴ１ｈによるＨＵＴ７８に対する、２次元ドットプロットでのＡＤＣＣアッセイ結果。
【図１０】ＡＤＣＣアッセイにおけるＴ１ｈの役割。ＨＵＴ７８をＣＦＳＥで標識して、Ｔ１ｈ抗体及び非特異的対照として使用したｈＲ３の存在下及び非存在下でインキュベートし、ＰＢＭＣを１：１、１：２５、１：５０の比でエフェクター細胞として使用した。標的：エフェクター細胞を終夜インキュベートした。７ＡＡＤを使用して細胞毒性細胞を検出した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【図１１】ＡＤＣＣアッセイにおけるＴ１ｈの役割。ＨＵＴ７８をＣＦＳＥで標識して、Ｔ１ｈ抗体（５ｕｇ／ｍｌ及び１０ｕｇ／ｍｌ）及び非特異的対照として使用したｈＲ３（１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下でインキュベートし、ＰＢＭＣを１：１、１：２５、１：５０の比でエフェクター細胞として使用した。標的：エフェクター細胞を終夜インキュベートした。７ＡＡＤを使用して細胞毒性細胞を検出した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。
【図１２】ａ、ｂ及びｃ、ｄがそれぞれＴ１ｈ及びｈＲ３（非特異的抗体）のそれぞれ５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌでの２つの独立した実験を表す。グラフは、種々の標的：エフェクター比での死細胞の百分率を表す。
【図１３】アラマーブルーを使用するＣＤＣアッセイにおけるリツキサンとＴ１ｈとの間の細胞毒性の倍率差（fold difference）。
【図１４】非刺激の細胞、及びフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｍ）で刺激した細胞の蛍光強度を示すＣＦＳＥのヒストグラムプロット。ＦＩＴＣ対数値を横軸に、細胞数を縦軸に示す。ピークの上の領域（Ｒ１４）を使用して、増殖等の（as proliferation）事象を計数した。
【図１５】棒グラフとしてリンパ球に対するＴ１ｈの用量依存性阻害。図は、様々な濃度（５０ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｇ／ｍｌ、１２．５ｕｇ／ｍｌ、６．２５ｕｇ／ｍｌ）での、ＰＨＡで活性化した（activate）リンパ球に対するＴ１ｈの阻害の％を表す。ｈＲ３（非特異的抗体）を同じ濃度で使用した。
【図１６】独立の実験として過去の実験の繰り返しである。リンパ球に対するＴ１ｈの用量依存性阻害である。図は、様々な濃度（５０ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｇ／ｍｌ、１２．５ｕｇ／ｍｌ及び６．２５ｕｇ／ｍｌ）での、ＰＨＡで活性化したリンパ球に対するＴ１ｈの阻害の％を表す。ｈＲ３（非特異的抗体）を同じ濃度で使用した。
【図１７】１０μｇ／ｍｌの濃度での可溶性Ｔ１ｈの存在により、９６ウェルプレートベースのアラマーブルーアッセイにおいてリンパ球のＰＨＡ媒介性増殖が有意に阻害された。
【図１８】抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋Ｔ１ｈ及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭ−Ｆｃの連結実験のためのプレート設定。
【図１９】連結抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋Ｔ１ｈ及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭ−Ｆｃの存在下における、ｓＴ１ｈ及びｓｈＲ３（１０μｇ／ｍｌ）のそれぞれによるリンパ球増殖に対する効果の間の比較。プロトコルで述べるように、種々の量の連結抗ＣＤ３を、固定濃度のＴ１ｈ又はＡＬＣＡＭと共に使用した。
【図２０】ＢＬＩＳＳでの過去のデータの分析。ここで、下側の線は、種々の濃度の抗ＣＤ３抗体、及びＡＬＣＡＭ−Ｆｃ又は抗ＣＤ６抗体それぞれにより得られた実験曲線である。点線は、組合せが相加的である場合の予測曲線である。上側の線は実験的に得られた曲線であり、両方の場合において理論予測曲線より上に存在することから、組合せが相乗的であることを示唆している。
【図２１】種々の濃度のＩＬ２により誘導されるナイーブＴ細胞の増殖。可溶性Ｔ１ｈ及び可溶性ｈＲ３は、いかなる効果も示さなかった。ＰＨＡを陽性対照として加えている。
【図２２】連結ＣＤ３及びＣＤ３＋ＡＬＣＡＭ−Ｆｃにより、可溶性Ｔ１ｈにより阻害されるリンパ球増殖が引き起こされた。可溶性Ｔ１ｈを伴うＩＬ２により、両方の条件において阻害の部分的な回復が示された。
【図２３】抗ＣＤ３をつなぎ留めたウェル及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭをつなぎ留めたウェルの両方において、ＩＬ１０、ＩＮＦγ、ＩＬ６及びＴＮＦａの発現が、対照（可溶性ｈＲ３非特異的抗体）と比較して、可溶性Ｔ１ｈによって低減される。可溶性Ｔ１ｈと共に添加した外来のＩＬ２は、阻害の部分的な回復を示し、可溶性Ｔ１ｈの阻害がＩＬ２の下方調節により媒介されることを示唆している。実験は、２回の独立の実験から得られたデータの平均を示す。
【図２４】可溶性Ｔ１ｈ（ｓＴ１ｈ）及び外来のＩＬ２の両方の添加により回復する、ｓＴ１ｈの存在下におけるＣＤ４及びＣＤ２５を発現する細胞の絶対数の部分的な低減が存在する。しかし、受容体の絶対数と相関し得る平均蛍光強度においては、ＣＤ４カウント数における、及びより飛躍的にはＣＤ２５カウント数におけるＭＦＩの有意な低減が存在する。これらの低減の両方が、外来のＩＬ２（１．２ｎｇ／ｍｌ）の添加によりそれぞれ完全に又は部分的に回復し得る。この現象は、連結抗ＣＤ３のウェル、並びに連結抗ＣＤ３及びＡＬＣＡＭ−Ｆｃのウェルの両方において観察される。
【図２５】可溶性Ｔ１ｈによる増殖の阻害がアポトーシスの増大により媒介されない。ＰＩ陽性の細胞はネクローシス細胞であり、アネキシンＶ  ＦＩＴＣ陽性の細胞はアポトーシス細胞であり、両方が陽性の細胞は後期アポトーシス細胞である。データから、対照と比較して、種々のどの組合せにおいても細胞死パラメータの各々で有意な増大又は減少が存在しないことが明らかである。
【図２６】Ｔ１ｈ抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）、ｈＲ３（アイソタイプ対照）を用いて又は抗体を用いず（対照として）ＰＢＭＣを処理し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション前に、破傷風トキソイドで細胞を刺激した。増殖をアラマーブルー色素で測定した。Ｔ１ｈの存在下で増殖の阻害は観察されなかった。
【図２７】前述した免疫蛍光（手順ＩＩ）により、ラージ（Raji）細胞が真のＢ細胞であり、またＭＨＣ  ＩＩ抗原を発現することをここで示す図である。
【図２８】マイトマイシン処理したラージ細胞の存在下でのＰＢＭＣの増殖性である。陽性対照は、ＰＢＭＣがＰＨＡの存在下で成長することを示している。ｓＴ１ｈは、抗体なし又はｈＲ３対照と比較して、Ｔ細胞増殖を阻害する（ｔ検定により有意に）。各実験結果は、６つの異なるウェルから得られた平均及び標準偏差である。
【図２９】−同種樹状細胞混合リンパ球反応−  プレート設定。
【図３０】同種樹状細胞混合リンパ球反応  Ｔ１ｈはＰＢＭＣ増殖の用量依存性阻害を示す。ＩＬ２の既知の阻害剤である陽性対照ピメクロリムスは、試験した全濃度で阻害した。陰性対照ｈＲ３は、対照実験と同様であった。Ｙ軸は相対蛍光単位（ＲＦＵ）である。
【図３１】同種樹状細胞混合リンパ球反応  サイトカインレベルの評価。ＩＬ６及びＩＮＦγは、Ｔ１ｈ及び既知のＩＬ２阻害剤であるピメクロリムスにより用量依存的に阻害される。
【００２２】
添付した配列リストの簡単な説明
配列番号１：ＶＨ配列のアミノ酸配列
配列番号２：ＶＫ配列のアミノ酸配列
配列番号３：ＶＨ配列のヌクレオチド（ＤＮＡ）配列
配列番号４：ＶＫ配列のヌクレオチド（ＤＮＡ）配列
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）と結合することができ、かつ、ＡＬＣＡＭ結合を妨害することなくＴ細胞増殖を阻害するモノクローナル抗体に関する。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、前記モノクローナル抗体は、配列番号１又は配列番号２に示したようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態では、前記モノクローナル抗体は、配列番号３又は配列番号４に示したようなヌクレオチド配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、インビトロで補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導しない。
【００２７】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、インビトロで抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導しない。
【００２８】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、インビトロでアポトーシスを誘導しない。
【００２９】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、連結抗ＣＤ３；連結抗ＣＤ３及び抗ＣＤ６の組合せ、又は連結抗ＣＤ３及びＡＬＣＡＭの組合せにより誘導されるナイーブＰＢＭＣの増殖を阻害する。
【００３０】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、ラージ細胞が抗原提示細胞でありＰＢＭＣが増殖する一方向ＭＬＲを特異的に阻害する。
【００３１】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、ＰＢＭＣにより媒介される一方向自己ＭＬＲを特異的に阻害する。
【００３２】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、炎症促進性サイトカインを実質的に減少させることによりナイーブＴ細胞増殖の阻害を引き起こす。
【００３３】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、ＣＤ２５カウント数及びＣＤ４カウント数の低減によりナイーブＴ細胞増殖の阻害を引き起こす。
【００３４】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、ＩＬ２の抑制を媒介することによりＴ細胞増殖を阻害する。
【００３５】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、外来のＩＬ２の添加により機能獲得を示す。
【００３６】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、炎症促進性サイトカインＩＬ６及びＩＮＦγの下方調節に関与する。
【００３７】
本発明のまた別の実施形態では、前記抗体は、記憶Ｔ細胞集団を阻害しない。
【００３８】
本発明は、前記モノクローナル抗体を使用して、乾癬、関節リウマチ、又は患者における自己免疫応答（例えば多発性硬化症もしくは移植拒絶反応に関連する有害応答）、移植片対宿主病、１型糖尿病、乾癬、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫疾患等の炎症状態を変調させる方法に関する。
【００３９】
本発明は、免疫抑制剤と組み合わせてモノクローナル抗体を使用して、乾癬、関節リウマチ、又は患者における自己免疫応答（例えば多発性硬化症もしくは移植拒絶反応に関連する有害応答）、移植片対宿主病、１型糖尿病、乾癬、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、甲状腺炎、及び他のＴ細胞媒介性自己免疫疾患等の炎症状態を変調させる方法に関する。
【００４０】
本発明は、抗炎症性免疫応答を誘発することができる抗原（インスリン、ＧＡＤ、ＭＯＧ、ＭＢＰ及びＨＳＰ６０等）と組み合わせてモノクローナル抗体を使用して、多発性硬化症又は移植拒絶反応、移植片対宿主病、１型糖尿病等の炎症状態を変調させる方法に関する。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、方法は、治療的有効量又は薬学的有効量の、ヒトＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合し、ＡＬＣＡＭとｈＣＤ６との結合を阻害しない抗ＣＤ６結合抗体の患者への投与を含む。
【００４２】
本発明のさらに別の実施形態では、薬学的有効用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／週〜２５ｍｇ／ｋｇ／週である。
【００４３】
本発明のまた別の実施形態では、モノクローナル抗体は、配列番号１又は配列番号２に示したようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列により表される。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、モノクローナル抗体は、配列番号３又は配列番号４に示したようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するヌクレオチド配列により表される。
【００４５】
ここで、以下の実施例と共に本発明の原理を説明するのに役に立つであろう、現時点で好ましい本発明の実施形態を詳細に参照する。
【００４６】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示されるものであるが、本発明の範囲を限定することは決して意図しておらず、また、本発明の範囲を限定するものであると決して解釈するべきではない。実施例は、アッセイ手順において利用した従来の方法に関しては詳細な説明を含んでいない。かかる方法は当業者に既知であり、例示目的で含まれる多数の刊行物で説明されている。
【００４７】
本明細書中で他に規定のない限り、本発明の関連で使用される科学用語及び技術用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。さらに、文脈が他に要求しない場合は、単数形の用語が複数形の意味を含むことがあり、複数形の用語が単数形の意味を含むことがあるものとする。
【００４８】
本発明を説明及び特許請求する際には、本明細書中に示した定義に従い、以下の専門用語を使用する。
【００４９】
「抗ＣＤ６抗体」は、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合する抗体である。本発明の好ましい態様では、ヒトのＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１と特異的に結合し、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）とＣＤ６との結合を妨害しない、天然の及び人工的に改変した抗体並びに抗体断片を含む抗体及び他の免疫グロブリンが提供される。
【００５０】
本発明のＴ１ｈモノクローナル抗体は、１つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は添加により抗体を構成する重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列から得られたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖を含む抗体も包含する。上述の部分的なアミノ酸の改変（欠失、置換、挿入又は付加）は、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を部分的に改変することにより、本発明の抗体のアミノ酸配列にもたらすことができる。かかるヌクレオチド配列の部分的改変は、既知の形式の部位特異的突然変異誘発を使用する標準的な方法によりもたらすことができる（Proc Natl Acad Sci U.S.A., 1984 Vol 81: 5662）。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態は、配列番号１及び配列番号２に示したようなアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、ＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合するモノクローナル抗体を表す。
【００５２】
本発明の別の好ましい実施形態は、配列番号３に示したヌクレオチド配列又はその相補体を含む重鎖及び軽鎖可変領域；及び（ｂ）配列番号４に示したヌクレオチド配列又はその相補体を含む核酸分子を含む、ＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合する、モノクローナル抗体を表す。
【００５３】
一実施形態によれば、ＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合する本発明の抗ＣＤ６抗体変異体Ｔ１ｈは、配列番号１及び配列番号２により表されるアミノ酸残基に対応する部分において、少なくとも約６５％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約７０％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約７５％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約８５％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性、少なくとも約９８％のアミノ酸配列の同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列の同一性若しくは相同性を有する。
【００５４】
本発明の抗体は、インビトロで補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘導しない。
【００５５】
本発明の抗体は、インビトロで抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導しない。
【００５６】
本発明の抗体は、インビトロでアポトーシスを誘導しない。
【００５７】
別の態様では、本発明は、本発明の主題たる抗体又はその機能的断片を活性成分として含有する、自己免疫障害を含む多様な疾患のための予防薬、治療薬又は診断薬をさらに提供する。
【００５８】
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、マクロファージ、ＮＫ細胞、好中球等の活性化により誘導される細胞毒性の一種を指し、上記活性化は、上記細胞の表面上に発現されるＦｃ受容体と抗体定常領域との結合を介して認識される。対照的に、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）は、抗体と抗原との結合を介して生じる補体系の活性化により誘導される細胞毒性の一種を指す。これらの活性の強度は抗体のサブクラスに応じて変動することが知られている。かかる差異が抗体定常領域の間の構造上の差異によるものであることも知られている（Charles A. Janeway et al., Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.）。
【００５９】
本発明の他の実施形態では、Ｔ１ｈの重鎖及び軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が開示されている。これにより、Ｔ１ｈを製造するために使用される細胞株により発現されるＴ１ｈのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が確立されている。
【００６０】
ｈＣＤ６に特異的に結合するさらなる結合因子を同定するためのスクリーニング方法が提供される。これらの方法は、ヒトＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合し、ＡＬＣＡＭとｈＣＤ６との結合を阻害しない基準（reference）抗ｈＣＤ６モノクローナル抗体を接触させることを伴う。
【００６１】
ＣＤ６−ＦｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートにおいて種々の濃度のＡＬＣＡＭ−Ｆｃを固定濃度のＴ１ｈと共にインキュベートすると、Ｔ１ｈは全濃度のＡＬＣＡＭ−Ｆｃで検出された。この実験により、Ｔ１ｈがＡＬＣＡＭ結合ドメイン（ドメイン３）とは異なるドメインと結合することが示唆された。
【００６２】
ドメイン１と結合する抗体であるＭＥＭ９８（Castro AA M et al, J of Immunol, 178
(2007) 4351-4361.）をＴ１ｈと競合させると、用量依存的な競合が観察され、両方が同じドメイン、すなわちドメイン１と結合することが示唆されている。
【００６３】
本発明の他の態様では、多発性硬化症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、及び１型糖尿病等の炎症状態を変調させる方法が提供される。Ｔ１ｈモノクローナル抗体は、混合リンパ球反応、ＰＨＡ媒介性ＰＢＭＣ増殖アッセイ、並びに連結抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ３抗体＋ＡＬＣＡＭ−Ｆｃの存在下での最終的なＰＢＭＣ増殖において観察されたように、ナイーブＴ細胞増殖を阻害することができる。Ｔ１ｈモノクローナル抗体は、炎症促進性サイトカインを低減し、細胞上でのＩＬ２受容体（ＣＤ２５）及びＣＤ４の発現を低減する。
【００６４】
１型糖尿病はインスリン依存性であり、Ｔ細胞により媒介される自己免疫疾患と考えられる。このことは、Ｔ１ｈ抗体が自己反応性Ｔ細胞の増殖を妨害することにより膵島β細胞枯渇を防ぐ機能を有することを示唆している。これらの細胞の塊が無傷である場合、インスリンへの依存の低減がもたらされよう。したがって、Ｔ１ｈ抗体の作用プロファイルとの調和を保つ上で、Ｔ１ｈ抗体は、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）及び熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）と組み合わせて抗炎症性応答を促進することにより１型糖尿病において効果的であり得ることが考えられ得る。同じ論理を拡張することにより、分子が、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ１）又はその関連模倣体エキセンディン−４と共に、おそらく相加的に又はさらには相乗的に、より効果的に働き得ると仮定することが合理的であろう。ＧＬＰ−１及びエキセンディン−４は、グルコース媒介性インスリン放出を増強し、グルカゴンのレベルを減少させ、β細胞のアポトーシスを阻害すること及びβ細胞の新生を促進することによりβ細胞を増加させる。
【００６５】
Ｔ１ｈは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）との組合せで、多発性硬化症に効果的であり得る。
【００６６】
また、シロリムス、タクロリムス及びミコフェノール酸モフェチル等の抗炎症性及び免疫抑制性の役割を果たす他の小分子との組合せでのＴ１ｈは、自己免疫障害、移植拒絶反応及びＧｖＨＤにおいて特定の治療上の利益を有し得る。
【００６７】
これらの方法は、治療的有効量又は薬学的有効量の、ヒトＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合し、かつＡＬＣＡＭとｈＣＤ６との結合を阻害しない抗ＣＤ６結合因子の患者への投与を含む。これらの方法における使用のための好ましい抗ＣＤ６結合因子はモノクローナル抗体であり、ヒト化モノクローナル抗体及びヒトモノクローナル抗体、並びに改変免疫グロブリン（例えば、抗体断片、及び対応する天然抗体との実質的なアミノ酸配列同一性を有しそれと実質的に同じ結合特異性を共有する天然抗体の突然変異誘発形態）を含む。
【００６８】
またさらなる本発明の態様では、インビトロ及びインビボのアッセイでＣＤ６、ＣＤ６＋細胞、及び／又はＣＤ６に媒介される活性、例えばＴ細胞活性化に関連するＣＤ６活性を検出する、診断用組成物及び診断方法が提供される。これらの方法は同様に、ヒトＣＤ６のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）と特異的に結合し、かつＡＬＣＡＭとｈＣＤ６との結合を阻害しない抗ＣＤ６結合因子を利用する。
【００６９】
本発明の主題たる抗体の様々な機能的特徴は、インビトロのアッセイ、インビボ及び細胞ベースのアッセイを使用する方法、並びに選択技術を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用してスクリーニングすることができる。複数の特性を同時に又は個別にスクリーニングすることができる。タンパク質は、アッセイの要求に応じて、精製されていても又は精製されていなくてもよい。一実施形態では、スクリーニング基準（screen）は、抗ＣＤ６抗体と結合することが知られている又は結合すると考えられているタンパク質分子と抗ＣＤ６抗体との結合に関する定性的又は定量的な結合アッセイである。かかるアッセイは多くの場合、細胞の抗ＣＤ６抗体に対する応答、例えば細胞生残性、細胞死、細胞の食作用、細胞溶解、細胞の形態の変化、又は天然遺伝子若しくはレポーター遺伝子の細胞発現等の転写活性化をモニタリングすることを伴う。例えばかかるアッセイにより、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘発する抗ＣＤ６抗体の能力を測定することができる。幾つかのアッセイのために、標的細胞に加えてさらなる細胞又は成分、例えば血清補体、又はエフェクター細胞（例えば末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージ等）を添加する必要があることがある。
【００７０】
投与のための最適な投与量及び投与計画は、当業者により容易に確定することができ、特定の薬剤の薬力学的特徴、その投与時期及び投与様式、調製物の強度、並びに疾患の病態の進行（疾患の症状の性質及び程度を含む）に応じて変化しうる。加えて、患者の性別、年齢、体重、食事、身体活動性及び併発疾患を含む治療される特定の患者と関連する因子により、投与量及び／又は計画を調整する必要性が生じるだろう。薬学的有効用量は０．１ｍｇ／ｋｇ／週〜２５ｍｇ／ｋｇ／週である。
【００７１】
本発明の抗ＣＤ６抗体の生物学的特性は、細胞、組織及び全生物の実験で特徴づけることができる。当該技術分野において既知であるように、疾患若しくは疾患モデルに対する治療のための薬剤の有効性を測定するために、又は薬剤の薬物動態、毒性、及び他の特性を測定するために、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ及びサルを含むがこれらに限定されない動物において、薬剤を試験することが多い。
【００７２】
前述の本発明の説明により、本発明を例示及び説明している。また、本開示により、本発明の代表的な好ましい実施形態を示し説明しているが、上述のように本発明は、様々な他の組合せ、修正形態及び状況で使用することができ、また上記教示及び／又は関連技術分野の技能若しくは知識に応じた、本明細書中に表したような本発明の概念の範囲内で変更又は修正することができることを理解するべきである。本明細書の以下で説明する実施形態は、本発明の実施の既知の最良の形態を説明すること、並びにかかる又は他の実施形態で及び本発明の特定の用途又は使用により必要とされる様々な修正を行って当業者が本発明を利用することを可能にすることをさらに意図している。したがってこの説明は、本明細書中に開示されている形態に本発明を限定することを意図するものではない。また、添付した特許請求の範囲は代替的な実施形態を含むと解釈されることを意図している。
【００７３】
１．Ｔ１ｈのヌクレオチド（ゲノム及びプラスミドの両方）配列並びにアミノ酸配列。
ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを鋳型として使用する多重ＰＣＲ反応を使用して、Ｔ１ｈのヌクレオチド配列を決定した。ゲノムＤＮＡを、Ｔ１ｈを発現するＮＳＯ細胞から調製した。アミノ酸配列を、ＥＳＩ−ＴＯＦ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用して決定した。トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ及びＧｌｕ−Ｃを含む種々の酵素を使用したペプチドマッピングを使用して、最終的なアミノ酸配列を設定した（evolve）。図１に開示されている配列は、特許文献３及びそれに相当する特許文献４、並びに特許文献５及びそれに相当する特許文献６で既に公表されたＴ１ｈの配列とわずかに異なっている。下記の多数の実施例において述べるように、本特許で開示した配列がその標的ＣＤ６に対して完全な機能的活性を有することは、立証されている。
【００７４】
２．Ｔ１ｈは、ＣＤ６受容体のドメイン１（Ｄ１）と結合する。
ＥＬＩＳＡ実験により、種々の濃度のＡＬＣＡＭの存在は、Ｔ１ｈがＣＤ６−Ｆｃと結合するのを妨げないことが明らかに示された。ＡＬＣＡＭとＴ１ｈとの間の競合が存在しないことは、これらの２つに関する結合ドメインが異なることを示唆している。
【００７５】
ドメイン１（Ｄ１）と結合する抗体であるＭＥＭ９８（Castro AA M et al, J of Immunol, 178 (2007) 4351-4361.）をＴ１ｈと競合させると、用量依存的な競合が観察され、両方が同じドメイン、すなわちドメイン１と結合することが示唆されている。
【００７６】
３．Ｔ１ｈは、ＨＵＴ７８細胞においてアポトーシスを誘導しない。
アポトーシスの特質の１つは、細胞膜の内部から外側へのホスファチジルセリン（phosphatidylserine）（ＰＳ）の転位である（J Biol Chem 1990. 265: 4923-4928）。アポトーシス細胞の膜の外葉上のホスファチジルセリンの分析を、アポトーシス細胞及びネクローシス細胞の識別のためにアネキシン−Ｖ−フルオレセイン及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用することにより行った。アネキシンＶは、ホスファチジルセリンに対して高い親和性を有するＣａ２＋依存性リン脂質結合タンパク質である（J Immunol Methods 1995. 184: 39-51）。ＰＩが明らかな（distinct）ネクローシス細胞と結合するのに対して、アネキシン−Ｖ−フルオレセインはアポトーシス細胞と結合する。この方法は、アポトーシス細胞及びネクローシス細胞の集団を区別する上で役立つ。初期アポトーシス集団はアネキシンＶ陽性であるのみであるが、後期アポトーシス集団はアネキシンＶ及びＰＩの両方について陽性である。
【００７７】
この実験で本発明者らは、Ｔ１ｈが、ＣＤ６を発現するＴリンパ腫細胞株であるＨＵＴ７８細胞における限定的なアポトーシス能（apoptotic potential）を有することを観察している。Ｔ１ｈで処理したＨＵＴ７８細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣチャネルにおいて、非処理対照とほぼ等しい４０％のアポトーシスを示した。非処理細胞及び非特異的アイソタイプ対照であるｈＲ３（ＥＧＦＲと結合するモノクローナル抗体）処理細胞が、それぞれ３５．３％及び３６．５％のアポトーシスを示したのに対して、陽性対照ラパマイシンは５４．３％のアポトーシスを示した。このデータは、Ｔ１ｈがＨＵＴ７８細胞株におけるアポトーシスを媒介しないことを示唆している。
【００７８】
４．ＣＤ６に関して陽性のＴ細胞及びＢ細胞は、ＣＤ６受容体の発現の差異を示す。
胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、Ｂ−１サブタイプと呼ばれるＢ細胞のサブセット、及び幾つかの脳細胞は、ＣＤ６を発現する（J Exp Med 1991. 174: 949-952; J Immunol 1997. 158:
1149-1156）。実験のねらいは、Ｔ細胞及びＢ細胞のそれぞれにおいて受容体密度、及びＣＤ６の発現の差異を定量化することである。
【００７９】
実験結果は、ＣＤ６受容体密度が、Ｂ細胞と比較してＴ細胞上において１０倍高いことを示唆している。飽和量の抗体を使用しなかったので、この方法は受容体の絶対密度を定量化することを主張するものではない。しかしＴ細胞及びＢ細胞における発現パターンの倍率差は明確に識別可能である。
【００８０】
５．Ｔ１ｈは穏やかなＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）を誘導する。
抗体が標的細胞又は感染細胞と結合する際には、抗体のＦｃ部分が細胞（特にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）の表面上に存在するＦｃ受容体と結合する。これは引き続きこれらの細胞の活性化を引き起こす。これらの活性化細胞は、サイトカイン及び細胞毒性顆粒を放出し、アポトーシスを誘発することにより細胞死を促進する。これは、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）として知られている。
【００８１】
本発明では、標的細胞集団（ＨＵＴ７８／ダウジ）を、細胞追跡用色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジル（succinimidyl）エステル）で標識する。フルオレセインベースの色素ＣＦＳＥは、自身を生細胞標識に特に十分に適したものにする生化学的特性を有する（J Immunol Methods 2000. 243: 147-154）。ＣＦＳＥは、２つのアセテート部分及び１つのサクシニミジルエステル官能基を含有するフルオレセイン分子から成る。この形態では、ＣＦＳＥは膜透過性且つ非蛍光性である。細胞内環境への拡散後、内在性エステラーゼがアセテート基を除去し、分子を極めて蛍光性且つ細胞膜に対して非透過性にする（J Immunol Methods 2000. 243: 147-154）。標的細胞であるＨＵＴ７８細胞を、抗体であるＴ１ｈの存在下又は非存在下でインキュベートする。エフェクター細胞（フィコールパック法により回収したＰＢＭＣである）を種々の比（標的：エフェクター；１：１、１：２５、１：５０、１：１００）で添加し、３７℃で最適な時間インキュベートする。７ＡＡＤを使用して細胞死を測定する。７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）は死細胞に進入し、ＤＮＡと結合する。ＣＦＳＥ標識細胞を、標的細胞の抗体媒介性細胞毒性を評価するためにゲーティングする（gated）。ダウジ細胞を使用して、強力なＡＤＣＣ活性を有することが知られているリツキサンを使用するアッセイを適格化した（qualify）。リツキサンは、６時間で５０％より大きい細胞毒性を示した。同様の条件下での４回の独立の実験により、エフェクター細胞の存在下での終夜のインキュベーションによりＴ１ｈがＨＵＴ７８細胞において穏やかなＡＤＣＣを誘導することが示唆された。
【００８２】
６．Ｔ１ｈは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介しない。
アラマーブルー（レサズリン）ベースのアッセイを使用して、細胞死滅を促進する抗体の能力を測定する。これは、抗体と細胞表面抗原との結合により、標的細胞溶解をもたらす補体を固定及び活性化することによって誘導される。レサズリンは、還元されると色が青色からピンク色へ変化する酸化還元活性色素である。最近のデータにより、レサズリンは細胞の細胞質に進入し、細胞質において蛍光生成物へと還元され、その後再び培地へ排出されることが示唆されている（Eur J Biochem 2000. 267: 5421-5426）。
【００８３】
これらの実験からの結果は、抗体が、ＣＤ６を発現する細胞株、すなわちＨＵＴ７８においてＣＤＣを誘導しないことを結論として（conclusive）証明している。
【００８４】
７．Ｔ１ｈは、ＰＨＡに媒介されるリンパ球増殖を阻害する。
リンパ球培養物における細胞分裂の刺激のためにフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｍ）を使用する。アカインゲンマメ（ファセオラス・ブルガリス（Phaseolus vulgaris））からのレクチン抽出物であるＰＨＡは、強力な細胞凝集活性及び分裂促進活性を含有する（Proc Natl Acad Sci U S A 1982. 79: 1611-1615）。ＰＨＡは、各々が非共有的な力により共に保持される四量体である５種類のイソレクチン（Ｌ４Ｅ０、Ｌ３Ｅ１、Ｌ２Ｅ２、Ｌ１Ｅ３、Ｌ０Ｅ４）のファミリーを含有する。サブユニットは、白血球反応性（Ｌ）及び赤血球反応性（Ｅ）と称される、２つの異なる種類のものである。Ｌはリンパ球表面受容体に対して高い親和性を有するが赤血球表面受容体に対しては親和性をほとんど有さず、イソレクチンの分裂促進特性に関与する。Ｅは赤血球凝集特性に関与する。ＰＨＡ−Ｐはタンパク質形態であり、ＰＨＡ−Ｍはこれらのイソレクチンのムコタンパク質形態（form）である（J Biol Chem 1977. 252: 9018-9023）。
【００８５】
ＰＢＭＣを、細胞追跡用色素ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジルエステル）で標識する。それから細胞を、様々な濃度の抗体の存在下又は非存在下でインキュベートする。細胞を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により刺激して３７℃で３日間増殖させる。細胞が増殖するにつれて、ＣＦＳＥは娘細胞に等しく分配され、各々の次の世代は、半分の細胞蛍光強度を有する（J Immunol Methods 1994. 171: 131-137）。増殖の阻害の百分率を、抗体の効果とみなす。増殖の阻害の％を、以下の式：［｛ＰＨＡ−（Ｔ１ｈ＋ＰＨＡ）｝／ＰＨＡ］×１００（式中、ＰＨＡはＰＨＡにより誘導される増殖であり、Ｔ１ｈ＋ＰＨＡはＴ１ｈ及びＰＨＡの存在下で誘導される増殖である）により評価する。
【００８６】
これらのデータは、Ｔ１ｈ抗体がＰＨＡで刺激したリンパ球の増殖の阻害を用量依存的に媒介することを示唆している。阻害の百分率は、正常個体間の固有の変化により個体間で変動し得る。しかし全体としては、ＰＨＡで刺激したリンパ球の用量依存性阻害がＴ１ｈで観察されたが、非特異的ＩｇＧ１アイソタイプ抗体ｈＲ３では観察されなかった。
【００８７】
８．Ｔ１ｈは、９６ウェルプレートベースのアラマーブルーアッセイにおいても、ＰＨＡに媒介されるリンパ球増殖を阻害する。
以前の実験をハイスループットプレートベースのアッセイに変更した。該アッセイではＴ１ｈ又は非特異的ＩｇＧ１アイソタイプ抗体ｈＲ３を含む又は含まない９６ウェルディッシュ中で新たに回収したＰＢＭＣをインキュベートする。その後ＰＨＡを添加してリンパ球の増殖を３日間刺激する。アラマーブルーを使用することにより増殖を測定する。有意性の試験はＴ検定により行う。
【００８８】
このアッセイは、リンパ球のＰＨＡ媒介性増殖が可溶性Ｔ１ｈの存在下で有意に阻害されるが非特異的ＩｇＧ１アイソタイプ抗体ｈＲ３の存在下では有意に阻害されないという事実を繰り返し示している。以前の実験と併せたこの実験の結果により、ナイーブＴ細胞増殖の阻害におけるＴ１ｈの役割が示唆されている。
【００８９】
９．Ｔ１ｈは、連結抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋Ｔ１ｈ、及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭ−Ｆｃにより誘導されるリンパ球の増殖を低減する。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び同時刺激受容体による刺激が、急速な成長及び増殖の速度、並びにエフェクター機能の獲得を特徴とする静止（休止）状態から活性化状態へのＴ細胞分化のスイッチをトリガすることが知られている（Immunity 2007. 27: 173-178）。ヒトＣＤ６受容体は、未熟胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、及びＢ１ａサブセットと呼ばれるＢリンパ球のサブセット、慢性Ｂ細胞リンパ球性白血病、並びに脳の様々な領域で発現される１０５ｋＤａ〜１３０ｋＤａの１型糖タンパク質である（J Immunol 2006. 177: 1152-1159）。ＣＤ６は、このファミリーに特徴的な３つの１００個〜１１０個のアミノ酸長のシステインリッチドメインの細胞外領域の（of in）存在に基づくタンパク質受容体のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのグループＢのメンバーである（J Exp Med 1991. 174: 949-952）。入手可能な証拠により、ＣＤ６がリンパ球活性化及び分化プロセスの変調に関与するアクセサリー分子であることが示されている（J Immunol 2006. 177: 1152-1159）。胸腺細胞及び休止成熟Ｔ細胞上で、ＣＤ６は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（J Immunol 2004. 173: 2262-2270）、及びＳＲＣＲスーパーファミリーの近縁なメンバーであるＣＤ５（J Biol Chem 2003. 278: 8564-8571）と、部分的に会合する。さらに、ＣＤ６は成熟免疫シナプス（ＩＳ）の中心部で蓄積し、そこでＣＤ６はＴＣＲ／ＣＤ３及びＣＤ５と共存する。ＣＤ６は、ＩＳ成熟に影響を与える初期Ｔ細胞−ＡＰＣ接触、またＴ細胞の増殖応答にも関与している（J Immunol 2006. 177: 1152-1159, Eur J Immunol 2004. 34: 930-940）。
【００９０】
細胞増殖をもたらす最適なＴ細胞活性化には、少なくとも２つの刺激シグナルが必要とされることが、十分に確立されている。１つのシグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ分子と結合するペプチド断片を認識するＴＣＲ−ＣＤ３複合体に関連しており、抗原特異的でない第２のシグナルは同時刺激シグナル又はアクセサリーシグナルと称されているが、これは必須ではあるがそれ自体はＴ細胞増殖を引き起こさないためである（Immunology 1998. 93: 358-365）。幾つかの潜在的な同時刺激シグナル受容体及びそのリガンドが同定されており、これらは、ＣＤ４とクラスＩＩ  ＭＨＣとの間、ＣＤ８とクラスＩ  ＭＨＣとの間、ＣＤ２とリンパ球機能関連抗原−３との間、ＣＤ５とＣＤ７２との間、ＣＤ２８とＢ７−１／Ｂ７−２との間、及びまたＣＤ６とＣＤ６リガンド（Ｄ１６６又はＡＬＣＡＭ）との間の相互作用を含む（Immunology 1998. 93: 358-365；Curr Opin Immunol 1995. 7: 389-395）。
【００９１】
リンパ球増殖を引き起こす、抗同時刺激分子抗体の存在下又は非存在下での連結抗ＣＤ３抗体の効果に関して、過去の文献が存在する。ＣＤ３の単独での刺激により、又はＣＤ３とＣＤ２若しくはＣＤ４との共架橋結合により、ＣＤ６は、２つのほとんどのＣ末端チロシン残基（Ｙ６２９及びＹ６６２）で、一時的にリン酸化型となる（J Exp Med 1993. 177: 219-223）。したがって、Ｔ細胞増殖に対するＣＤ６に媒介される効果が、ＰＫＣ活性化に依存するチロシンキナーゼ活性に関与することが示されて（show）いる（Cell Immunol 1995. 166: 44-52）。ＣＤ６のシグナル伝達経路は、別の同時刺激分子であるＣＤ２８のシグナル伝達経路と比較して十分に特徴づけられてはいないが、これらの２つの細胞表面抗原の効果の間には或る程度の類似性が存在する。例えば、２つの受容体のうちのいずれか１つの連結は、ＴＣＲ複合体を介するシグナルと協働して、Ｔ細胞増殖を増強する（J Immunol 1989. 143: 2439-2447）。それらは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の存在下でＴ細胞増殖を誘発することもでき、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）及びＩＬ−２  ｍＲＮＡの上方調節をもたらす（Cell Immunol 1995. 166: 44-52、Proc Natl Acad Sci U S A 1989. 86: 1333-1337）。連結（tethering）抗ＣＤ６及び抗ＣＤ２８抗体が、抗ＣＤ３抗体による刺激と独立して休止リンパ球の増殖を引き起こしたことも示されている（Immunology 1998. 93: 358-365）。
【００９２】
本発明では、本発明者らは、可溶性Ｔ１ｈ抗体が、連結抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋Ｔ１ｈ、及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭ−Ｆｃにより媒介されるＴ細胞増殖を阻害することを示している。実際に本発明者らは、データのＢｌｉｓｓ分析において観察されたように、抗ＣＤ３＋Ｔ１ｈ及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭの組合せが実際に抗ＣＤ３単独に対して相乗的であることを観察している。本発明者らはさらに、外（extraneous）からのＩＬ２（１．２５ｎｇ／ｍｌ）の添加が、可溶性Ｔ１ｈに媒介されるＴ細胞増殖阻害からの部分的な回復を引き起こすことを示している。サイトカイン分析により、本発明者らは、Ｔ１ｈがＩＦＮγ、ＩＬ１０及びＴＮＦを主に阻害すること、並びに外からのＩＬ２の添加によりこれらの炎症促進性サイトカインの部分的な回復が誘導されることを示している。増殖しているリンパ球におけるＣＤ２５及びＣＤ４の受容体密度の評価により、可溶性Ｔ１ｈがこれらのマーカーの両方の下方調節を引き起こすが、外からのＩＬ２がこれらのマーカーの発現を部分的に回復させることが示唆された。まとめると、このデータにより、Ｔ１ｈは、ＩＦＮγ等の炎症促進性サイトカインの阻害、及びＩＬ２受容体発現の減少により、Ｔ細胞増殖を阻害することが示唆されている。外からのＩＬ２の添加が部分的な「機能獲得」を示すため、本発明者らの結果は、Ｔ１ｈが、連結抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋連結Ｔ１ｈ、及び抗ＣＤ３＋連結ＡＬＣＡＭ−Ｆｃにより媒介されるＩＬ２合成を阻害している可能性があることを示唆しているように見える。
【００９３】
９ａ．ナイーブＰＢＭＣ（末梢血単核球（Peripheral Blood Mononucleated Cells））におけるＩＬ２の用量設定。
ＩＬ２は、Ｔ細胞活性化に必要且つ十分なサイトカインである。ＩＬ２は、ＩＬ２により上方調節されるＩＬ２受容体を介してシグナル伝達を行う。ＩＬ２は、Ｔ細胞発生、Ｔ細胞の免疫学的記憶、及び調節性Ｔ細胞の発生において重要な役割を有する（J Immunol 1995. 155: 1151-1164）。この実験から、ＩＬ２の最適濃度１．２５ｎｇ／ｍｌを、さらなる実験で使用した。
【００９４】
９ｂ．Ｔ１ｈは、アポトーシスを誘導することなく炎症促進性サイトカイン、ＣＤ４及びＣＤ２５受容体発現の低減を引き起こし、この阻害は外からのＩＬ２の存在下で部分的に除去される。
フローサイトメトリーは、大きさ及び色に基づき種々の粒子の識別を可能にする分析ツールである。ＢＤ（商標）ＣＢＡは、別個の蛍光強度を有する一連の粒子を利用して、複数の可溶性の分析対象を同時に検出する。ＢＤＡ（商標）ＣＢＡは、フローサイトメトリーと組み合わせて、強力な多重アッセイを創出する。ＢＤＡ  ＣＢＡヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインＩＩを使用して、単一試料中のインターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、ＴＮＦ及びインターフェロンγのレベルを定量的に測定する（J Immunol Methods 2001. 254: 109-118）。
【００９５】
相異なる蛍光強度を有する６種類のビーズ集団が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ１０、ＴＮＦ及びＩＦＮ−γタンパク質に特異的な捕捉用抗体でコーティングされている。６種類のビーズ集団を共に混合して、DAKO社のＣｙａｎ  ＡＤＰブランドのフローサイトメーターのＦＬ３チャネルで分離されるＢＤ（商標）ＣＢＡを形成する。サイトカイン捕捉用ビーズをＰＥ結合型検出抗体と混合し、その後組換え標準（recombinant standards）又は試験試料と共にインキュベートして、サンドイッチ複合体を形成する。フローサイトメーターを使用する試料データの取得後、グラフ及び表の形式で試料の結果を生成する。
【００９６】
これらの実験から、Ｔ１ｈがナイーブＴ細胞増殖の阻害を引き起こすこと、並びにこれが炎症促進性サイトカインの実質的な減少、及びまたＣＤ２５カウント数及びＣＤ４カウント数の低減により媒介されることが明らかである。外来のＩＬ２の添加により、阻害を回復させることができ、炎症促進性サイトカインの発現を増大させることができ、またＣＤ４及びＣＤ２５の両方の受容体絶対数を増大させることができる。これらの結果は、Ｔ１ｈによるＴ細胞増殖の阻害がＩＬ２の抑制により媒介されること、及び外来のＩＬ２の添加により「機能獲得」が引き起こされることを示唆している。本発明者らは、Ｔ細胞増殖の低減がアポトーシスの誘導によって媒介されるのではないことも観察している。
【００９７】
１０．Ｔ１ｈは、記憶Ｔ細胞増殖を阻害しない。
抗原提示細胞上の外来性抗原を認識した後、Ｔ細胞は増殖し、免疫応答を開始する。これらのＴ細胞のうち幾つかは系で循環中の記憶Ｔ細胞に変化し、同じ抗原で再負荷されると、これらの細胞は増殖し免疫応答を開始する。たいていのヒトは破傷風トキソイドに対して免疫化されており、そのヒト由来のＴ細胞を同じ抗原で負荷すると、集団中の記憶Ｔ細胞が増殖する。実験結果により、破傷風トキソイドがＴ細胞の増殖を用量依存的に刺激するが、ｓＴ１ｈはこれらの細胞の増殖の阻害を示さないことが示されている。このことは、Ｔ１ｈが記憶Ｔ細胞増殖を阻害しないことを強力に示唆している。循環記憶Ｔ細胞増殖が影響されずＴ１ｈ療法の患者が感染し易くならないため、このことはＴ１ｈ療法にとって好ましい。
【００９８】
１１．Ｔ１ｈは、ＰＢＭＣ及びラージ細胞により媒介される混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を阻害する。
遺伝的に異なる個体由来のリンパ系細胞の混合物をインビトロで培養すると、該細胞は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）と称されている特徴的な応答を受ける（Proc Natl Acad Sci
U S A 1973.70: 2707-2710）。この反応は、初期増殖期、及び元の反応を刺激するのに使用した抗原を生じる標的細胞に対して特異的な細胞毒性を示すエフェクターリンパ球のその後の出現により典型的に表される。
【００９９】
同種Ｔリンパ球の両方の集団は、一方の集団がマイトマイシンＣ又は致死性Ｘ線照射での処理により非応答性とならなければ、ＭＬＲにおいて増殖する。一方向ＭＬＲと呼ばれる後者（一方の集団が非応答性となった場合）の系では、非応答性の集団は、刺激細胞の同種抗原を発現する刺激細胞をもたらす。一方向ＭＬＲでは、レスポンダーＴＨ細胞は、刺激細胞上の同種クラスＩＩ  ＭＨＣ分子を認識し、これらの差異に応答して増殖する。抗ＣＤ４＋補体を有するレスポンダー集団からのＣＤ４＋ＴＨ細胞の除去は、ＭＬＲを消失させ、ＣＴＬの発生を防止する。マクロファージ等のアクセサリー細胞も、ＭＬＲに対して重要であることが示されている。ここで、マクロファージの役割が、ＭＬＲにおいて増殖が測定されるクラスＩＩ−ＭＨＣ制限ＴＨ細胞を活性化することであることが理解される。
【０１００】
本発明では、マイトマイシンで処理したラージ細胞を用いて一方向ＭＬＲを行うため、該ラージ細胞が抗原提示細胞であり、増殖はＰＢＭＣに関して測定する。以前の文献により、ラージ細胞がＡＬＣＡＭを発現することが示されている（J Immunol 2004. 173: 2262-2270）。
【０１０１】
この実験から、Ｔ１ｈは、ラージ細胞が抗原提示細胞でありＰＢＭＣが増殖する一方向ＭＬＲを特異的に阻害することが結論づけられる。
【０１０２】
１２．Ｔ１ｈは、ＰＢＭＣ及び成熟樹状細胞により媒介される混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を阻害する。
成熟樹状細胞（抗原提示細胞）がナイーブＰＢＭＣの増殖を引き起こす同種（或る個体から採取された抗原提示細胞、及び別の個体から採取されたＰＢＭＣによる）混合リンパ球反応では、Ｔ１ｈは、この増殖を用量依存的に阻害する。データにより、作用様式は少なくとも２種類の主要な炎症促進性サイトカイン、すなわちＩＬ６及びＩＦＮγの下方調節を伴っていることが示された。
【０１０３】
材料及び方法。
細胞株及び細胞培養：
ＨＵＴ７８（ＡＴＣＣから入手したＴ細胞リンパ腫ヒト細胞株）を、標的細胞として使用する。細胞を補足イスコブＤＭＥＭで培養し、該培地は２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び２０％  ＦＢＳ（Invitrogen）を含有する。
【０１０４】
ダウジ細胞（Ｂ細胞リンパ腫、ＡＴＣＣ）：細胞をＲＰＭＩ１６４０中で培養する；該培地は、２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１０％  ＦＢＳ（Invitrogen）を含有する。
【０１０５】
ＷＩＬ２Ｓ細胞（Ｂ細胞リンパ腫）：細胞を、ＤＭＥＭ中で培養する；該培地は、２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１０％
ＦＢＳ（Invitrogen）を含有する。
【０１０６】
ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を、エフェクター細胞として使用する：ＰＢＭＣを、フィコールパック（Amersham、カタログ番号：１７−１４４０３−０３）を用いた（mediated）密度遠心分離により単離する。バフィーコートを健常ドナーから取得し、常に新たな状態で採取する（harvested fresh）。細胞をＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）中で培養し、該培地は、２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び５％  ＦＢＳ（Invitrogen）を含有する。
【０１０７】
抗体：以下の抗ＣＤ６ＭＡｂを、インビトロで使用した：リツキサン（Genentech）、ｈＲ３抗体（CIM, Havana, Cuba）。
１×ＰＢＳ（Invitrogen、カタログ番号：１００１０）。コーティング緩衝液（Ｈ２Ｏ
１０００ｍｌ中におけるＮａＨＣＯ３−８．４ｇ、Ｎａ２ＣＯ３−３．５６ｇ、ｐＨ９．５）。
ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（１０００ｍｌのＰＢＳ中における０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０（SIGMA））。
ブロッキング溶液（ＰＢＳ中における１％  ＢＳＡ）。
ＲＰＭＩ１６４０（カタログ番号：１１８７５（Invitrogen））。
イスコブＤＭＥＭ（Invitrogen、カタログ番号：１２２００−０３６）。
アラマーブルー（Invitrogen  ＤＡＬ−１１００）。
Biotek  プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴ）。
プールしたヒト血清
ＥＤＴＡバキュテナー（ＢＤバキュテナー  カタログ番号：３６８４５７）に回収した健常個体由来の（from）末梢血。
１％  ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を添加したイスコブＤＭＥＭ培地（Invitrogen）。
アポトーシスキット  −  カタログ番号：１９８８５４９（Roche）。
フローサイトメーター：Dako  Ｃｙａｎ  ＡＤＰ。
フィコールパック（Amersham、カタログ番号：１７−１４４０３−０３）、ＲＰＭＩ１６４０（カタログ番号：１１８７５（Invitrogen））。
ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（Gibco、カタログ番号：１００８２−１４７）。
抗ＣＤ６−ＰＥ、抗ＣＤ６−ＦＩＴＣ、抗Ｄ１９−ＰＥＣｙ５、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、及び抗ＣＤ４−Ａｌｅｘａ（AbD Serotec, UK）。
ＳＰＨＥＲＯ（商標）Ｒａｉｎｂｏｗ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（カタログ番号：ＲＣＰ−３０−５Ａ）。
ＣＦＳＥ（Sigma、カタログ番号：２１８８８）、７ＡＡＤ（Invitrogen、カタログ番号：Ｖ３５１２４）。
ＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）（２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び５％  ＦＢＳ（Invitrogen）を含有する）。
９６ウェルＦｌｕｏｔｒａｃ  ６００プレート  −  カタログ番号：６５５０７７（Greiner Bio）。
【０１０８】
以下の実施例は例示のために提供されるものであり、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１ａ
Ｔ１ｈ及びＡＬＣＡＭは、同じドメインと結合しない（ＥＬＩＳＡによる）。
ｒｈＣＤ６ＦＣ／キメラ（R and D systems）（１００μｇ／ｍｌ）をコーティング緩衝液で希釈し、１００μｌを９６ウェルＮｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウェルに添加した。その後プレートを４℃で終夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。その後２００μｌのブロッキング溶液（１×ＰＢＳ中における２％  ＢＳＡ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを再びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄して、その後Ｔ１ｈモノクローナル抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びｒｈＡＬＣＡＭＦｃ（R and D systems）を種々の濃度で添加した。その後これを３７℃で１時間インキュベートした。その後プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ウェルに、ブロッキング緩衝液で希釈した（１：２００００）２００μｌの抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２ＡＬＰを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。２００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）基質を各ウェルに添加し、発色するまで３７℃でおよそ１５分間インキュベートした。読取り値を、BIOTEK社のマイクロプレートリーダーを使用して４０５ｎｍで取得した。実験により、種々の濃度のＡＬＣＡＭの存在は、Ｔ１ｈがＣＤ６受容体と結合するのを妨げないことが示されている。ＡＬＣＡＭとＴ１ｈとの間の競合が存在しないことは、これらの２つに関する結合ドメインが異なることを示唆している（図２）。
【０１１０】
実施例１ｂ
Ｔ１ｈは、ＣＤ６のドメイン１（Ｄ１）と結合する。
ドメイン１と結合する抗体であるＭＥＭ９８（Castro AA M et al, J of Immunol, 178
(2007) 4351-4361.）をＴ１ｈと競合させると、用量依存的な競合が観察され、両方が同じドメイン、すなわちドメイン１と結合することが示唆されている（図３）。
【０１１１】
実施例２
Ｔ１ｈは、ＨＵＴ７８細胞においてアポトーシスを誘導しない。
細胞を採取し、各３５ｍｍディッシュに１．５ｍｌの３．３×１０５細胞／ｍｌの菌液（最終細胞数：５×１０５個）を播種した。所要量の抗体をそれぞれのディッシュに添加して、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。対照ディッシュには、抗体を添加しなかった。陽性対照として細胞を濃度１．２μｇ／ｍｌのラパマイシンと共にインキュベートした。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートした。その後細胞をＦＡＣＳチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号：３５２０５４）に移し、１２００ＲＰＭで５分間室温（ＲＴ）で遠心分離した。上清を廃棄し、２ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、１２００ＲＰＭ、ＲＴで５分（minutes）間遠心分離した。上清を廃棄し、１００μｌのアネキシン−Ｖ−フルオレセイン標識溶液を添加し、ＲＴで１０分間〜１５分間インキュベートした。細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、１２００ＲＰＭで５分間遠心分離した。その後上清を廃棄した。細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁し、励起波長４８８ｎｍでフローサイトメーター（３０００個の細胞をゲーティングした）によりデータ取得した（acquired）。試料は、アネキシンＶに関してＦＩＴＣチャネルで、ＰＩに関してＰＥテキサスレッドチャネルで、読み取った。ラパマイシン処理アームにおいてアネキシンＶ単独及びＰＩ単独の試料を、補償が可能となるように分析した（run）。
【０１１２】
Ｔ１ｈで処理したＨＵＴ７８細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣチャネルにおいて、非処理対照とほぼ等しい４０％のアポトーシスを示した。非処理細胞及び非特異的抗体（ｈＲ３抗体）処理細胞が、それぞれ３５．３％及び３６．５％のアポトーシスを示したのに対して、陽性対照ラパマイシンは５４．３％のアポトーシスを示した。このデータは、Ｔ１ｈがＨＵＴ７８細胞におけるアポトーシスを媒介しないことを示唆している（図４）。
【０１１３】
実施例３
正常個体由来のＴリンパ球及びＢリンパ球上におけるＣＤ６受容体の発現の差異。
ＰＢＭＣを、フィコールパック（Amersham、カタログ番号：１７−１４４０３−０３）を用いた密度遠心分離により単離した。バフィーコートを健常ドナーから取得し、常に新たな状態で採取した。その後ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄した。その後ＰＢＭＣを５ｍｌの１×ＰＢＳ中に１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で再懸濁し、１００ｕｌを各ｆａｌｃｏｎチューブに添加した。１０μＬの結合抗体（１：１０希釈）をそれぞれのチューブに添加し、ボルテックス処理し、その後４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍｌの１×ＰＢＳを各チューブに添加し、その後１２００ＲＰＭ、ＲＴで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を０．５ｍＬの１×ＰＢＳ中に再懸濁して、フローサイトメーターで細胞についてデータ取得した。ＦＳＣ及びＳＳＣで所要の集団（細胞数３０００）に関して細胞（リンパ球）をゲーティングした。ＳＰＨＥＲＯ（商標）（カタログ番号：ＲＣＰ−３０−５Ａ）Ｒａｉｎｂｏｗ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓについても、同じ電位設定で上記チューブと共にデータ取得する。各ピークに関する蛍光平均チャネル数（すなわち相対輝度）を記録した。平均チャネル数を、以下の式を使用して相対チャネル数に変換した。
ｉ．    相対チャネル数♯＝（Ｒ／４）ｌｏｇ（平均チャネル数♯×１０）
ｉｉ．  式中、Ｒ＝解像度（すなわち２５６）
【０１１４】
各ピークに関するＭＥＦ設定値対相対チャネル数により、グラフをエクセルシート上にプロットして、図５に示すような検量線図を取得した。Ｔ細胞及びＢ細胞上のＣＤ６抗体に関するＲＣＮを取得し、Ｓｐｈｅｒｏ検量線図に対してプロットして、リンパ球の様々なサブセットの個々の細胞に関するＣＤ６受容体密度を定量化した。
【０１１５】
リンパ球上の受容体の数を算出するための、グラフから得られる式は、以下であった。
ａ．  ＦＩＴＣチャネル  ：  ｙ＝１３４．９５ｅ０．０３６６ｘ
ｂ．  ＰＥチャネル      ：  ｙ＝２３．６ｅ０．０３７３６ｘ
【０１１６】
ＣＤ６受容体密度は、Ｂ細胞と比較して、Ｔ細胞上において１０倍高い。Ｔ細胞及びＢ細胞における発現パターンの差異は、識別可能であることが見出された（図６）。
【０１１７】
実施例４
Ｔ１ｈは、穏やかなＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性）を引き起こす。
標的細胞株（ＨＵＴ７８／ダウジ）を採取し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞（２×１０５）を、１ｍｌの濃度０．２５μＭのＣＦＳＥ溶液（ＰＥ  Ｃｙ５チャネル中に漏れないＣＦＳＥの濃度を選択するために、各細胞型に関してＣＦＳＥの用量設定が必要である）に再懸濁した。３７℃で１０分間正確に、細胞をインキュベートした。２ｍｌのＲＰＭＩ、５％  ＦＢＳを添加して反応を停止した。２ｍｌ  ＲＰＭＩ  ５％  ＦＢＳ各々で細胞を２回洗浄して、ＣＦＳＥを除去した。その後標的細胞調製物を１×１０５細胞／ｍｌの細胞密度でＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、各ｆａｌｃｏｎチューブに１００ｕｌ（細胞数１０４）を添加した。５０ｕｌの抗体（５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ）をそれぞれのチューブに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。その後ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）を、１：１、１：２５、１：５０及び１：１００のＴ／Ｅ比でそれぞれのチューブに添加した。最終容積は、各チューブ中で培地により２５０ｕｌとした。各チューブを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離して細胞間相互作用を促進し、ＡＤＣＣが起こるように３７℃でインキュベートした。ダウジ細胞をリツキサンと共に６時間インキュベートし、陽性対照として試料と共に試験した（run）。その後細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。１００ｕｌの７ＡＡＤ（６．２５ｕｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、１２００ＲＰＭ、４℃で５分間スピンダウンした。上清を廃棄し、細胞を５００ｕｌの１×ＰＢＳ中で再懸濁した。およそ２００事象／秒で細胞についてデータ取得し、フローサイトメーターのＦＩＴＣチャネル及びＰＥ  Ｃｙ５チャネルで観察した。ＣＦＳＥ陽性細胞は、対数目盛の１０２及び１０３（the second and third decade）の間で蛍光を発し、ＰＥ  Ｃｙ５チャネルへの漏出はなかった。計３０００個のＦＩＴＣ陽性細胞をゲーティングし、この集団において、７ＡＡＤ（ＰＥ  Ｃｙ５陽性）を示す細胞の百分率を評価した（図７及び図８）。非特異的抗体対照の他に、１：１、１：２５、１：５０及び１：１００の比のエフェクター／標的細胞（単独）もアッセイに含まれるものとした。アポトーシスの％は、ＦＩＴＣ／ＰＥｃｙ５ドットプロット散布図（scatter）における右上の区分の細胞の％とした（図９）。
【０１１８】
実施例５
ＨＵＴ７８に対するＴ１ｈによるＡＤＣＣ。
実施例４に基づき、同じアッセイ手順でＡＤＣＣアッセイを行って、ＨＵＴ７８に対するＴ１ｈの効果を検証した。細胞を４時間〜終夜インキュベートした。終夜のインキュベーションにより、最適且つ一貫性のある結果が得られた。
【０１１９】
４回の異なる個々の実験から得られたインビトロでの結果により、エフェクター細胞の存在下で、終夜のインキュベーションにより、Ｔ１ｈがＨＵＴ７８細胞における穏やかなＡＤＣＣを誘導することが示唆されている（図１０、図１１及び図１２）。
【０１２０】
実施例６
Ｔ１ｈは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介しない。
プールした全血由来ヒト血清（最小３（minimum three））を無菌チューブに回収し、血液を室温で少なくとも４時間凝固させた。該血液を９００ｇで２０分間遠心分離する。血清を採取し、分注し、−８０℃で保存した。標的細胞（Ｗｉｌ−２Ｓ／ＨＵＴ−７８）を希釈緩衝液で洗浄し、２×１０５細胞／ｍＬに再懸濁した。抗体を希釈緩衝液で希釈し、所望の最終濃度の４×とした。補体を希釈し、所望の最終濃度の４×とした（すなわち、最終濃度が１：１０である場合、１：２．５希釈）。各５０μＬの希釈した抗体、希釈した補体、及び５０μＬの細胞懸濁液（１００００細胞／ウェル）を、９６ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。以下の対照ウェルを含むものとした：標的細胞＋Ａｂ単独（自発的細胞死）、標的細胞＋血清のみ（バックグラウンドの溶解）、及び標的細胞＋１０％  ＳＤＳ（最大の細胞死に関する）。陽性対照は、種々の濃度のリツキサンで処理したＷｉｌ−２Ｓ細胞であった。９６ウェルプレートを３７℃で２時間インキュベートした。５０ｕＬ／ウェルのアラマーブルーを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ及び感度＝３５で、Biotek社の分光光度計Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴにより蛍光を測定する。結果は、リツキサンと比較してＴ１ｈがＣＤＣを誘導しないことを示唆している（図１３）。
【０１２１】
実施例７
Ｔ１ｈは、ＰＨＡに媒介されるリンパ球増殖を阻害する。
細胞株及び細胞培養：
同意を得た後で、標準的な静脈切開手順に従って全血を正常個体から抽出した。フィコールパック（Amersham、カタログ番号：１７−１４４０３−０３）を用いた密度遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。バフィーコートを健常ドナーから取得し、常に新たな状態で採取した。ＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）中で細胞を培養した。該培地は２ｍｇ／ｍｌのＮａＨＣＯ３、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１０％  ＦＢＳ（Invitrogen）を含有する。
【０１２２】
リンパ球増殖阻害（ＣＦＳＥを使用するフローサイトメトリーによる）。
ＰＢＭＣを採取し、ＰＢＳで洗浄した。細胞（７．５×１０６）を、１ｍｌの、濃度２μＭのＣＦＳＥを含むＰＢＳに再懸濁した。３７℃で１０分間正確に細胞をインキュベートした。１０ｍｌのＲＰＭＩ、１０％  ＦＢＳを添加して反応を停止した。１０ｍｌのＰＢＳで細胞を２回洗浄した。その後細胞調製物を１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、各ＢＤ  ＦＡＣＳチューブに２００ｕｌを添加した。２００ｕｌの所要の抗体及び非特異的抗体を様々な濃度（それぞれ、５０ｕｇ／ｍｌ、２５ｕｇ／ｍｌ、１２．５ｕｇ／ｍｌ、及び６．２５ｕｇ／ｍｌ）で添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。２ｍｌのＰＢＳを各チューブに添加し、１２００ＲＰＭ、ＲＴで５分間遠心分離して、未結合の抗体を洗い流した。１ｍｌのＲＰＭＩ、１０％  ＦＢＳを各チューブ中のペレットに添加した。１ｍｌのＰＨＡ（２０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １０％  ＦＢＳをそれぞれのチューブに添加して、増殖を刺激した。チューブ中の総容積は２ｍｌである。ＰＨＡの最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。チューブをボルテックス処理し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１２００ＲＰＭ、４℃で５分間スピンダウンした。上清を破棄し、５００ｕｌの１×ＰＢＳに再懸濁した。計２００００事象についておよそ２００事象／秒でデータ取得し、ＦＩＴＣチャネルで観察した。
【０１２３】
阻害の％＝｛［ＰＨＡ−（Ｔ１ｈ＋ＰＨＡ）］／ＰＨＡ｝×１００
（式中、ＰＨＡ＝ＰＨＡ−細胞単独
ＰＨＡ＋Ｔ１ｈ＝（ＰＨＡ＋Ｔ１ｈ）−細胞単独
ＰＨＡ＋ｈＲ３＝（ＰＨＡ＋ｈＲ３）−細胞単独）
細胞単独とは、ＣＦＳＥ＋細胞である。
【０１２４】
これらのデータは、Ｔ１ｈ抗体が、ＰＨＡで刺激されたリンパ球の増殖の阻害を用量依存的に媒介することを示唆している。阻害の百分率は、正常個体間の固有の変化により個体間で変動し得る。しかし全体としては、ＰＨＡで刺激したリンパ球の用量依存性阻害がＴ１ｈで観察されたが、非特異的抗体ｈＲ３では観察されなかった（図１４、図１５及び図１６）。
【０１２５】
実施例８
Ｔ１ｈは、９６ウェルプレートベースのアラマーブルーアッセイにおいても、ＰＨＡに媒介されるリンパ球増殖を阻害する。
ＰＢＭＣを新たに回収し、４×１０５細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ  ５％  ＦＢＳに再懸濁した。５０μｌの細胞を各ウェルに添加した。１００μｌの２×濃度（２０μｇ／ｍｌ）の抗体（Ｔ１ｈ又はｈＲ３）をそれぞれのウェルに添加した。１００μｌの培地を単独で非抗体ウェルに添加した。その後プレートを、３７℃で３０分間インキュベートした。５０μｌの４×濃度（２０μｇ／ｍｌ）のＰＨＡをそれぞれのウェルに添加して、リンパ球の増殖を刺激した。残りのウェルには、５０μｌの培地を添加して、全てのウェルの最終容積を２００μｌ／ウェルとした。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルーを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートした。励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ及び感度＝３５で、Biotek社の分光光度計Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴにより蛍光を測定した。
【０１２６】
このアッセイは、リンパ球のＰＨＡ媒介性増殖が可溶性Ｔ１ｈの存在下で有意に阻害されるが非特異的抗体ｈＲ３の存在下では有意に阻害されないという事実を繰り返し示している。以前の実験と併せたこの結果により、ナイーブＴ細胞増殖の阻害におけるＴ１ｈの役割が示唆されている。この実験により、ＰＨＡ媒介性Ｔ細胞増殖の阻害を、フローサイトメトリーベースの以前の実験と比較して簡便なプレートベースのアッセイ形式に変換することができることも示されている（図１７）。
【０１２７】
実施例９
Ｔ１ｈは、連結抗ＣＤ３、抗ＣＤ３＋連結Ｔ１ｈ、及び抗ＣＤ３＋連結ＡＬＣＡＭ−Ｆｃにより誘導されるリンパ球の増殖を低減する。
５０μｌのコーティング緩衝液を９６ウェルプレートに添加し、図１８に示すように５０ｕｌの２×濃度（１ｕｇ／ｍｌ）の抗ＣＤ３抗体を行Ａに添加した。第１の行Ａから５０μｌの抗体希釈物を採取し、１２チャネル電動ピペットを使用してプレートの下方へ行Ｅまで段階希釈した。５０μｌのコーティング緩衝液を、行Ａ〜行Ｅの列１〜列４に添加し、５０μｌの２×（２μｇ／ｍｌ）濃度の抗体（Ｔ１ｈ（列５〜列８）又はＡＬＣＡＭ−Ｆｃ（列９〜列１２））をそれぞれのウェルに添加して、ウェルの最終濃度を、抗体は一定濃度（１μｇ／ｍｌ）、及び抗ＣＤ３抗体は種々の濃度（行Ａ〜行Ｅにおいて、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ）とした（図１８）。１００μｌのＴ１ｈ又はｈＲ３又はＡＬＣＡＭ（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに対照として添加した（テンプレートに示したように）。培地対照、ｓＴ１ｈ及びｓｈＲ３に関して、３つのプレートで上記セットを行った。抗体がプレートと結合するように、プレートを４℃で終夜インキュベートした。
【０１２８】
プレートのブロッキング。
プレート温度を室温とし、コーティング緩衝液中の抗体をｖａｃｃｕｓａｆｅ（IBS Integra BioSciences）を使用して吸引し、２００μｌのブロッキング溶液を各ウェルに添加することにより非特異的結合部位をブロッキングした。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した。第３の洗浄は、ＲＰＭＩ培地で行った。残留量の培地を慎重に除去した。
【０１２９】
細胞懸濁液の添加：
１００μｌのＰＢＭＣ（細胞数３０，０００）を各ウェルに添加した。１００μｌの２×濃度の所要の抗体（Ｔ１ｈ又はｈＲ３）をそれぞれのプレートに添加した。１００μｌの培地を培地プレートに添加した。９６ウェルプレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルー溶液を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートした。９６ウェル蛍光光度計（Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いるＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ）を使用して、励起波長５３０ｎｍ及び発光波長５９０ｎｍ（感度＝３５）で、蛍光を読み取った（図１９）。
【０１３０】
連結抗ＣＤ３＋Ｔ１ｈ及び抗ＣＤ３＋ＡＬＣＡＭの組合せは、Ｂｌｉｓｓ分析との関係では、連結抗ＣＤ３単独に対して相乗的である（図２０）。
【０１３１】
実施例９ａ
ナイーブＰＢＭＣにおけるＩＬ２の用量設定。
１００μｌの培地を、全てのウェルに添加した。１００μｌの２×濃度のＩＬ２（２０ｎｇ／ｍｌ）を、第１の行のＡ２〜Ａ１０に添加した。第１の行から１００μｌを採取し、プレートの下方へ行Ｈまで段階希釈を行った。５０μｌのＰＢＭＣ懸濁液（６×１０５細胞／ｍｌ）を全てのウェルに添加した。５０ｕｌの培地又は抗体（Ｔ１ｈ又はｈＲ３、１０μｇ／ｍｌ）又はＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに添加して、最終容積を２００μｌとした。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５日間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルー溶液を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートした。９６ウェル蛍光光度計（Ｇｅｎ５ソフトウェアを用いるＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ）を使用して、励起波長５３０ｎｍ及び発光波長５９０ｎｍ（感度＝３５）で、蛍光を読み取った。この実験に基づき、その後の実験において１．２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ２濃度を選択することを決定した（図２１）。
【０１３２】
実施例９ｂ
Ｔ１ｈは炎症促進性サイトカインの低減を引き起こし、この阻害は外来のＩＬ２の存在下で部分的に除去される。
サイトカイン分析。
ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準の調製。
バイアル１本の凍結乾燥ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準を、０．２ｍｌのアッセイ希釈液を用いて再構成して１０×バルク標準を調製し、希釈する前に少なくとも１５分間平衡化した。１２ｍｍ×７５ｍｍのチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２００８）にラベルを付し、以下の順序で配置した：１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８及び１：２５６。
【０１３３】
９００μｌのアッセイ希釈液を最高濃度標準チューブにピペッティングした。３００μｌのアッセイ希釈液を残りのチューブの各々にピペッティングした。最高濃度標準チューブから１：２希釈チューブに３００μｌを移すことにより段階希釈を行い、完全に混合した。１：２希釈チューブから１：４希釈チューブ等を経て１：２５６希釈チューブに３００μｌを移すことにより、さらなる段階希釈を行い、完全に混合した。アッセイ希釈液を含有する１本のチューブを調製して、０ｐｇ／ｍｌの陰性対照として用いた。
【０１３４】
混合ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインビーズの調製。
捕捉用ビーズを個別にボトル充填した。ＰＥ検出試薬、標準及び試料と混合する直前にビーズ試薬（Ａ１〜Ａ６）をプールすることが必要である。実験に必要なアッセイチューブ（標準及び対照を含む）の数を決定した。各捕捉用ビーズ懸濁液を、混合前に数秒間ボルテックス処理した。分析対象の各アッセイチューブに関して、「混合捕捉用ビーズ」とラベルを付した単一チューブに各捕捉用ビーズの１０μｌの一定分量を添加した（例えば、１０μｌのＩＬ−２捕捉用ビーズ×１８本のアッセイチューブ＝１８０μｌのＩＬ−２捕捉用ビーズが必要とされる）。
【０１３５】
試料の調製：
適当な容積のアッセイ希釈液を使用して、所望の希釈倍率（すなわち、１：２、１：１０又は１：１００）により試験試料を希釈した。混合捕捉用ビーズ及びＰＥ検出試薬を含有する適当なアッセイチューブに試料を移す前に、試料希釈物を完全に混合した。
【０１３６】
培養上清アッセイ手順。
５０μｌの混合捕捉用ビーズ（混合ヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン捕捉用ビーズの調製において記載された手順を使用して調製された）を、適当なアッセイチューブに添加した。アッセイチューブに添加する前に、混合捕捉用ビーズをボルテックス処理した。５０μｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２−ＩＩ  ＰＥ検出試薬をアッセイチューブに添加した。５０μｌのヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカイン標準希釈物を対照アッセイチューブに添加した。５０μｌの各試験試料を、試験アッセイチューブに添加した。アッセイチューブを、ＲＴで３時間インキュベートし、光への直接的曝露から保護した。１ｍｌの洗浄緩衝液を各アッセイチューブに添加し、２００×ｇで５分間遠心分離した。上清を慎重に吸引し、各アッセイチューブから廃棄した。３００μｌの洗浄緩衝液を各アッセイチューブに添加し、ビーズペレットを再懸濁した。試料をフローサイトメーターで解析した（図２２及び図２３）。
【０１３７】
可溶性Ｔ１ｈは、増殖しているＴ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ２５受容体発現を阻害する。
連結アッセイの手順、すなわち図１８で言及されたプレートのコーティング及びＰＢＭＣの培養において記載されているようにアッセイを設定した。細胞を９６ウェルプレートから採取しＢＤ  ｆａｌｃｏｎチューブに移した。２ｍｌの１×ＰＢＳを各チューブに添加し、１２００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、１００ｕｌの１×ＰＢＳを細胞ペレットに添加した。１００ｕｌの細胞を各チューブ中で採取し、１０μｌの蛍光色素（Fluorochrome）、結合型抗ＣＤ４  Ａｌｅｘａ又は抗ＣＤ２５  ＰＥを添加し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍｌの１×ＰＢＳを各チューブに添加し、その後１２００ＲＰＭ、ＲＴで５分間遠心分離した。上清を廃棄した。細胞を０．５ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁し、細胞についてフローサイトメーターでデータ取得する。ＦＳＣ及びＳＳＣで所要の集団（細胞数３０００）に関して細胞（リンパ球）をゲーティングした。細胞の百分率と平均蛍光強度との両方を評価した。この実験は３回行った。１回の代表的な図を示す。結果は、各独立の実験で再現性を有していた（図２４）。
【０１３８】
上述のアッセイではアポトーシスは増大しない。
実施例９の連結アッセイの手順において説明されたアッセイ設定では、９６ウェルプレートからＢＤ  ｆａｌｃｏｎチューブに細胞を採取し、アポトーシスアッセイのために標識した。２ｍｌの１×ＰＢＳを各チューブに添加し、１２００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、１００ｕｌの１×ＰＢＳを細胞ペレットに添加した。１００ｕｌのＰＩ／アネキシンＶ標識溶液を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍｌの１×ＰＢＳを各チューブに添加し、その後１２００ＲＰＭ、室温で５分間遠心分離した。上清を廃棄した。細胞を０．５ｍＬの１×ＰＢＳに再懸濁した。細胞についてフローサイトメーターでデータ取得する。ＦＳＣ及びＳＳＣで所要の集団（細胞数３０００）に関して細胞（リンパ球）をゲーティングする（図２５）。
【０１３９】
これらの実験から、Ｔ１ｈがナイーブＴ細胞増殖の阻害を引き起こすこと、並びにこれが炎症促進性サイトカインの実質的な減少、及びまたＣＤ２５カウント数及びＣＤ４カウント数の低減により媒介されることが明らかである。外来のＩＬ２の添加により、阻害を回復させることができ、炎症促進性サイトカインの発現を増大させることができ、またＣＤ４及びＣＤ２５の両方の受容体絶対数を増大させることができる。これらの結果は、Ｔ１ｈによるＴ細胞増殖の阻害がＩＬ２の抑制により媒介されること、及び外来のＩＬ２の添加により「機能獲得」が引き起こされることを示唆している。本発明者らは、Ｔ細胞増殖の低減がアポトーシスの誘導によって媒介されるのではないことも観察している。
【０１４０】
実施例１０
破傷風トキソイド媒介性Ｔ細胞増殖アッセイにおいては、Ｔ１ｈにより記憶Ｔ細胞は阻害されない。
ＰＢＭＣを、フィコールパック（Amersham、カタログ番号：１７−１４４０３−０３）、密度勾配遠心分離により単離した。バフィーコートを健常ドナーから取得し、常に新たな状態で採取した。その後ＰＢＭＣをＰＢＳ（Invitrogen）で洗浄した。その後ＰＢＭＣを、０．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、５％ＦＢＳを添加した２ｍｌのＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。その後細胞を、無菌ＢＤ  ＦＡＣＳ  ５ｍｌチューブ中で、Ｔ１ｈ（１０ｕｇ／ｍｌ）及び非特異的対照として使用するｈＲ３の存在下又は非存在下で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をボルテックス処理し、１００μｌの細胞懸濁液をそれぞれのウェルに添加した。１００ｕｌの破傷風トキソイド（カタログ番号５８２２３１、CALBIOCHEM）（１０ｕｇ／ｍｌ）希釈標準溶液（５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地）をそれぞれのウェルに添加して、記憶Ｔ細胞増殖を刺激した。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５日間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルーを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートした。励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ及び感度＝３５で、Biotek社の分光光度計Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴにより蛍光を測定した（図２６）。
【０１４１】
実験結果により、破傷風トキソイドがＴ細胞の増殖を用量依存的に刺激するが、ｓＴ１ｈはこれらの細胞の増殖の阻害を示さないことが示されている。このことは、Ｔ１ｈが記憶Ｔ細胞増殖を阻害しないことを強力に示唆している。循環記憶Ｔ細胞増殖が影響されずＴ１ｈ療法の患者が感染し易くならないため、このことはＴ１ｈ療法にとって好ましい。
【０１４２】
実施例１１
Ｔ１ｈは、ＰＢＭＣ及びラージ細胞により媒介される混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を阻害する。
ラージ細胞／ＰＢＭＣ細胞を採取し、１×ＰＢＳに再懸濁した。８×１０５細胞／ｍｌのラージ細胞／ＰＢＭＣを、１ｍｌのマイトマイシン（２５ｕｇ／ｍｌ）に再懸濁した。細胞を、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、５％  ＦＢＳを含む２ｍｌのＲＰＭＩを各チューブに添加し、１２００ＲＰＭ、ＲＴで５分間遠心分離して、マイトマイシンを除去した。上清を廃棄し、再び５％  ＦＢＳを含む２ｍｌのＲＰＭＩを添加し、遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。
【０１４３】
５０ｕｌのＰＢＭＣ（４×１０５細胞／ｍｌ）を９６ウェル丸底プレートのそれぞれのウェルに添加した。１００μｌの抗体（Ｔ１ｈ又はｈＲ３）希釈物（１０ｕｇ／ｍｌ）をそれぞれのウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３０分間インキュベートした。５０ｕｌのマイトマイシン処理されたラージ細胞（４×１０５細胞／ｍｌ）をそれぞれのウェルに添加した。アッセイに伴い、含めることとした対照は、マイトマイシン処理されたラージ細胞単独、ＰＢＭＣ単独、マイトマイシン処理されたラージ細胞＋ＰＨＡ、ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ、マイトマイシン処理されたラージ細胞及びＰＢＭＣであった。プレートを、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５日間インキュベートした。６５μｌのアラマーブルーを各ウェルに添加し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で終夜インキュベートした。励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ及び感度＝３５で、Biotek社の分光光度計Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴにより蛍光を測定した。
【０１４４】
結論として、Ｔ１ｈは、ラージ細胞が抗原提示細胞でありＰＢＭＣが増殖する一方向ＭＬＲを特異的に阻害することができることが観察された（図２７及び図２８）。
【０１４５】
実施例１２：
混合リンパ球反応（樹状細胞及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）：
ＭＬＲアッセイ：
ＭＬＲアッセイをＤＣ：ＰＢＬ＝１：２比として行った。実験テンプレートを、陽性対照ピメクロリムス及び陰性対照ｈＲ３を含む３種類の濃度のＴ１ｈで設計した。テンプレートを示す（図２９）。それに従い、プレート全体にわたり（across）段階希釈を行った。
【０１４６】
ＰＢＬ及び／又はＤＣをプレートレイアウト通りに添加した。マイトマイシンＣ処理されたＰＢＬを、プレート内の対応するウェルに添加した。全てのウェルにおいて最終容積は２００ｕｌであった。
【０１４７】
ＭＬＲは二連で（in duplicates）行った。一方のプレートは増殖アッセイに関するものであり、他方はサイトカインアッセイに関するものである。最終的に両方のプレートを軽くスピンダウンし、ＣＯ２インキュベーター中で６日間維持した。
【０１４８】
増殖アッセイ：
インキュベーション後、プレートを、顕微鏡によりコンタミネーションに関して確認し、２０ｕｌ（１ウェル当たりの総容積の１０％）のアラマーブルーを各ウェルに添加した。読取り値を、４時間目に開始して終夜、種々の時間フレームで、感度３５で取得した（図３０）。
【０１４９】
サイトカインアッセイ：
上清を各ウェルから回収し、各群について上清をプールした。サイトカインを、ＢＤ  ＣＢＡ  Ｔｈ１／Ｔｈ２キットＩＩを使用してフローサイトメトリーで分析した（図３１）。
【０１５０】
成熟樹状細胞（抗原提示細胞）がナイーブＰＢＭＣの増殖を引き起こす同種（或る個体から採取された抗原提示細胞、及び別の個体から採取されたＰＢＭＣによる）混合リンパ球反応では、Ｔ１ｈは、この増殖を用量依存的に阻害する。データにより、作用様式は少なくとも２種類の主要な炎症促進性サイトカイン、すなわちＩＬ６及びＩＦＮγの下方調節を伴っていることが示された。
【０１５１】
実施例１３：
１型糖尿病動物モデル。
ＮＯＤ（非肥満糖尿病）雌マウスは、経時的なグルコースの増大により測定される、自発性自己免疫性Ｔ細胞媒介性糖尿病を発症することが知られている。このインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）モデルは、薬剤の治療効果及び予防効果を研究するための優れたモデルである。このマウスを、ＣＤ６に対する代替抗体（Ｔ１ｈがヒトＣＤ６と結合する場合と同様の様式でマウスＣＤ６と結合するラットモノクローナル抗体）の治療上及び予防上の利益を研究するために使用した。
【０１５２】
パイロット実験では、Harlan社から供給を受けた動物が８週〜１０週で疾患を発症したことが示された。これらのマウスは、実験開始時には６週齢〜７週齢である。２．４６ｍｇ／ｋｇ／週〜１９．６８ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の用量によりグルコースレベルが有意に低減し、実際には最高用量ではグルコースレベルは正常まで低減した。
【０１５３】
治療的状況での１０匹のマウスでの同様の実験により、疾患の開始が用量依存的に遅延化された。遅延は、最高用量で３週ほどであった。
【０１５４】
実施例１４：
コラーゲン誘導性関節炎モデル。
コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）に関するマウスモデルは、動物モデルにおける関節リウマチを研究するのに特に有利である。モデルは、抗体を含む抗関節リウマチ分子の効果を研究するのにも歴史的に使用されている。
【０１５５】
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、研究に使用した。簡潔に述べると、Sigma社から供給を受けたニワトリコラーゲン（ＣＩＩ）を１０ｍＭ酢酸に溶解させ、０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌した。５０μｌの注入容積を、研究で使用した。ＣＩＩを、１００μｌの容積に対して４ｍｇ／ｍｌで溶解させた。全ての手順を２Ｃ〜８Ｃで行った。
【０１５６】
加熱殺菌したマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）を、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と組み合わせて乳鉢及び乳棒で微粉砕する。その後２つを混合することにより、ＣＩＩをこの溶液中に乳化した。全ての手順は２Ｃ〜８Ｃで行った。
【０１５７】
尾の付け根に最初の投与を行い、２週後に注射によりブースター投与する。その後、関節炎の発症をモニタリングする。
【０１５８】
疾患を発症した１０匹のマウスにおいて、Ｔ１ｈと同様のドメインでマウスＣＤ６を特異的に検出する代替抗ＣＤ６抗体を使用した。２．４６ｍｇ／ｋｇ／週〜１９．６８ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の用量により、非処理対照と比較してこれらのマウスにおいて用量依存的に関節リウマチが有意に低減した。これらの実験結果により、Ｔ１ｈに対する代替抗体により関節リウマチを制御することができるという事実が確立される。
【０１５９】
実施例１５：
自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、脳炎症の動物モデルである。ＥＡＥは中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄性疾患であり、多発性硬化症の疾患を含むヒトＣＮＳ脱髄性疾患のモデルとして研究されている。
【０１６０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ラットミエリン塩基性タンパク質を注射するとこの疾患に罹患し易いことが知られている。０日目及び１７日目にＣＦＡ中の２００μｇラットＭＢＰでマウスを免疫化する追加免疫プロトコルの後、標準的な百日咳毒素を投与した。このプロトコルにより、炎症の組織学的特質、及び軸索損傷を有するが有意な脱髄を有しない、２０日目に開始する単相性の中等度の疾患経過が引き起こされた。
【０１６１】
処理群の１０匹のマウスを、種々の濃度の、Ｔ１ｈに対する代替抗体（Ｔ１ｈがヒトＣＤ６と結合する場合と同様の、マウスＣＤ６のドメインと結合する）に曝露した。用量の範囲は２．４６ｍｇ／ｋｇ／週〜１９．６８ｍｇ／ｋｇ／週であった。処理により、用量依存的に、特に最高用量で、プラセボ集団と比較して疾患が有意に制御された。
【０１６２】
実施例１６：
同種移植片。
皮膚移植片は、Ａ系の近交系マウス由来の皮膚をマウスＢに移植すると特異的に拒絶されることがあり、皮膚は３日目と７日目との間に最初に血管新生する。その後血管新生された皮膚はリンパ球、単球、好中球及び他の炎症性細胞で浸潤される。７日目〜１０日目までに、移植された組織の血管新生の減少が生じ、１０日後には目に見えるネクローシスが生じる。
【０１６３】
Ｃ５７ＢＬ６／ＷＴマウス由来の皮膚移植片の移植を受けた２０匹のマウス（ＢＡＬＢｃ−ＷＴ）に対して、この実験を試みた。標準的な外科的手順を使用して皮膚を切除し、異なるＢＡＬＢｃマウスに移植した。処理群の１０匹のマウスを、種々の濃度の、Ｔ１ｈに対する代替抗体（Ｔ１ｈがヒトＣＤ６と結合する場合と同様の、マウスＣＤ６のドメインと結合する）に曝露した。用量の範囲は、２．４６ｍｇ／ｋｇ／週〜１９．６８ｍｇ／ｋｇ／週であった。最初の注射はＢＡＬＢｃマウスが移植片の移植を受ける１週間前に行い、その後６週間継続した。
【０１６４】
データは、非処理動物と比較して薬剤の投与を受けたマウスでは、皮膚移植片が耐容性を示すことがより多いことを示唆しているように見える。全ての非処理動物において、移植片は３週間以内にネクローシス性となった。移植片に対する耐容性も用量依存的であり、最高用量の投与を受けた動物はより良く移植片を維持していた。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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