(57)【要約】【課題】キチン系生体接着剤の接着強度及び接着速度を明らかにし、接着強度及び接着速度が制御されたキチン系生体接着剤を提供する。【解決手段】（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む生体接着剤の接着強度及び接着速度を、二枚のコラーゲンフィルムを接着して接着面に平行な引っ張りせん断荷重を加えることで、測定して評価することができた。本発明の生体接着剤は、（Ａ）キチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含むので、キチン系誘導体の種類、置換度、分子量及びキチン系ナノファイバーの種類等を制御することで、種々の接着強度を有する生体接着剤を、簡単、かつ容易に得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び
（Ｂ）キチン系ナノファイバー
を含む生体接着剤。
【請求項２】
（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバー
を含む水性組成物と、ラジカル重合開始剤を組み合わせた、請求項１に記載の二成分型生体接着剤。
【請求項３】
ラジカル重合開始剤は、過酸化水素を含む請求項２に記載の生体接着剤。
【請求項４】
生体接着剤を製造するための、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーの組み合わせ。
【請求項５】
（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体を準備する工程；及び
（Ｂ）キチン系ナノファイバーを準備する工程
を有する生体接着剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチン系ナノファイバーを含む生体接着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷及び外科手術部位を処置するために、縫合糸を使用することなく、生体の部位と生体の部位を結合するために、生体接着剤が使用されることがある。そのような生体接着剤として、キチン系接着剤が検討されている。キチン系接着剤は、カニ殻及びエビ殻由来のキチン及び／又はキトサンを原料とするので、ウィルス感染などの危険性が無いこと、及びキチン及びキトサンは創傷治癒剤や生体内充填剤として有用であること（特許文献１及び特許文献２参照）から、生体適合性の高い材料と考えられている。
【０００３】
キチンは、Ｎ−アセチルグルコサミンを繰り返し単位とする天然由来のムコ多糖の一種である（下記式（１）参照）。一方、キトサンも天然由来のムコ多糖の一種であるが、工業的にはキチンの脱アセチル化により製造されている。キチンとキトサンの相違点は、Ｎ−アセチル化の有無であり、Ｎ−アセチル化及び脱Ｎ−アセチル化は任意の割合で行うことが可能なので、キチンとキトサンは相互に変換可能であり、かつ、Ｎ−アセチル化の程度に応じて、キチンとキトサンの間に種々の化合物を製造し得る。従って、本明細書では、キチン、キトサン及びそれらの間の化合物（Ｎ−アセチル化の程度のみ異なる）を合わせてキチン系化合物という。このようなキチン系化合物の生体適合性及び含水性は、分子量分布、Ｎ−アセチル基の置換度、及び導入した官能基により制御可能であることが知られている。尚、本明細書では、キチン、キトサン及びそれらの間の化合物の誘導体を合わせて、キチン系誘導体という。
【０００４】
【化１】
2014176605.tif 000002
【０００５】
例えば、種々の位置に光反応性官能基等が導入されたキチン系誘導体は、紫外線照射により自己架橋して、生体組織の接合等に使用できることが報告されている。更に、他の官能基を導入することで、細胞接着性、遺伝子導入性及び水溶性の向上が可能なことも報告されている（特許文献３〜７及び非特許文献１〜３参照）。
【０００６】
しかし、これらのキチン系誘導体を含む生体接着剤（「キチン系生体接着剤」ともいう）の接着強度及び接着速度等を制御すること、特に、簡単かつ容易に制御することは、学術的のみならず、実際の医療の観点からも興味深い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第２７１４６２１号公報
【特許文献２】特許第２５７９６１０号公報
【特許文献３】特許第４６０６５８６号公報
【特許文献４】特開２００５−１５４４７７号公報
【特許文献５】特許第４９５５００７号公報
【特許文献６】特開２０１０−１８０３７７号公報
【特許文献７】特開２０１１−１６０９５９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Biomacromol., 6, 2385-2388, 2005.
【非特許文献２】Trends Glycosci. Glycotechnol., 14, 331-341, 2002.
【非特許文献３】Bioconjug. Chem. 17, 2, 309-316, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、かかる課題を解決するためになされたもので、その課題は、キチン系生体接着剤の接着強度及び接着速度を明らかにすることで、接着強度及び接着速度が制御されたキチン系生体接着剤、その製造方法、及びその接着強度及び接着速度を制御する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、キチン系ナノファイバーを使用することで、キチン系生体接着剤の接着強度及び接着速度を制御することができることを見い出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、一の要旨において、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む生体接着剤を提供する。
本発明は、一の態様において、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む水性組成物と、ラジカル重合開始剤を組み合わせた、上述の二成分型生体接着剤を提供する。
本発明は他の態様において、ラジカル重合開始剤は、過酸化水素を含む上述の生体接着剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る生体接着剤は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含むので、接着強度及び接着速度を制御することができる。
【００１３】
本発明に係る生体接着剤は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む水性組成物と、ラジカル重合開始剤を組み合わせた、二成分型である場合、より容易で簡単に使用することができる。
【００１４】
本発明に係る生体接着剤は、ラジカル重合開始剤が、過酸化水素を含む場合、更により容易で簡単に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、試料作製方法及び測定方法を模式的に示す。
【図２】図２（ａ）は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体を含むが、（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含まない生体接着剤を、ラットの肝臓に適用した後、１週間後の患部を示す。図２（ｂ）は、本発明の生体接着剤を、ラットの肝臓に適用した後、１週間後の患部を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る生体接着剤は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体（以下「（Ａ）キチン系誘導体」ともいう）；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む。
本発明に係る「（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体」とは、キチン、キトサン及びそれらの間の化合物（Ｎ−アセチル化の程度のみ異なる）の誘導体であって、ラジカル重合性基を有する化合物をいう。「ラジカル重合性基」とは、炭素原子間二重結合を有しラジカル重合可能な官能基をいう。より具体的には、可視光線、紫外線等の光線、Ｘ線等の電磁波、及びラジカル重合開始剤によって硬化する性質を有する官能基をいう。
【００１７】
本発明に係る（Ａ）キチン系誘導体は、本発明が目的とする生体接着剤を得ることができる限り、特に制限されることはないが、例えば、下記式（Ｉ）で示されるキチン系誘導体を例示することができる。
【００１８】
式（Ｉ）：
【化２】
2014176605.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、親水性基、ラジカル重合性基、又はラジカル重合性基を有する親水性基を示し、ｍ及びｎは、ｍ＋ｎ＝１を満たし、かつ、０≦ｍ≦１、０≦ｎ≦１である：但し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つはラジカル重合性基又はラジカル重合性基を有する親水性基であり、かつ
ｎ個のＲ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、ｍ個のＲ４及びＲ５はそれぞれ同一でも異なっていてもよい）
で表わされるキチン系誘導体、及び
上述の式（Ｉ）で表されるユニットがＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つに導入された分岐型のキチン系誘導体である。
【００１９】
式（Ｉ）のキチン誘導体は、Ｎ−アセチルグルコサミンのユニット(以下、キチンユニットともいう)及びグルコサミンのユニット(以下、キトサンユニットともいう)を構成単位として含む。これらのユニットの３位及び６位の水酸基と、キトサンユニットの２位のアミノ基の少なくともいずれか１つに、ラジカル重合性基、又はラジカル重合性を有する親水基を含むことが好ましい。
【００２０】
式（Ｉ）で示されるキチン系誘導体は、好ましくは、
（１） Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つは親水性基であり、残りの基の少なくともいずれか１つはラジカル重合性基であり；
（２） Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つは親水性基であり、残りの基の少なくともいずれか１つはラジカル重合性基を有する親水性基であり；又は
（３） Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つはラジカル重合性基を有する親水性基である
上述のキチン系誘導体、及び
式（Ｉ）で表されるユニットがＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つに導入された分岐型のキチン系誘導体である。
【００２１】
式（Ｉ）のキチン系誘導体は、ラジカル重合性を有し、更に、水溶性も有することが好ましい。「水溶性」とは、水、生理食塩水、希ＤＭＳＯ水溶液等の生体に適した溶媒への溶解性を意味する。式（Ｉ）のキチン系誘導体は、例えば、２５℃の水に対して、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ以上の溶解性を有する。
【００２２】
前記式（Ｉ）で表されるキチン系誘導体において、キトサンユニット及びキチンユニットは、ユニット比率の合計が１となる割合であれば、それぞれ独立した構成単位として存在することができる。ユニットの配列は限定されず、末端単位となるユニットも特に限定されるものではない。従って、式（Ｉ）のキチン系誘導体には、キトサンユニットを含む誘導体も含まれる。なお、末端単位になりうるユニットのうち、グルコサミンの１位にヒドロキシ基が結合する残基は、６員環状態と開環した状態の平衡状態をとることから、還元末端残基として、キトサンユニットのアミノ基と反応することができる。
【００２３】
式（Ｉ）の「アルキル基」は、分子全体の親水性を損なわないという観点から、炭素数１〜４のアルキル基が好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ジヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、及びジエチルアミノエチル基等を例示できる。
【００２４】
式（Ｉ）の「親水性基」として、糖類、ポリエチレングリコール、ポリグリセロール等を有する官能基及び極性基（カルボキシアルキル基等）を有する官能基が例示できる。優れた水溶性を付与する観点から、カルボキシアルキル基が好ましい。
【００２５】
「カルボキシアルキル基」として、例えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、及びそれらの塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩）等を例示できる。優れた水溶性を付与する観点から、カルボキシメチル基が好ましい。
【００２６】
なお、式（Ｉ）のキチン系誘導体では、アミノ糖を構成成分とする多糖類のキチン及びキトサン自身も糖類として用いることができる。式（Ｉ）のキチン系誘導体が、式（Ｉ）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つに導入されることによって、式（Ｉ）で表わされるキチン系誘導体は、前記位置で分岐した構造を有する。なお、導入されるキチン系誘導体自身も、前記のキチンユニットとキトサンユニットを構成単位とするため、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の少なくともいずれか１つに別のキチン系誘導体が導入される等によって、式（Ｉ）で表わされるキチン系誘導体が網目状の構造を有し得る。このような構造のキチン系誘導体を、分岐型キチン系誘導体ともいう。
【００２７】
式（Ｉ）の「ラジカル重合性基」として、例えば、（メタ）アクリロイル基、ビニルエーテル基、アリルエーテル基、シンナモイル基、アジド基、及びマレイミド基等を有する官能基を例示できる。キチンユニット及びキトサンユニットとの反応性の観点から、（メタ）アクリロイル基を有する官能基が好ましい。なお、「（メタ）アクリロイル基」とは、メタクリロイル基とアクリロイル基を意味する。
【００２８】
そのような「ラジカル重合性基」として、具体的に、例えば、式（ＩＩ）：
【化３】
2014176605.tif 000004
で表わされる２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル基、及び３−アクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロピル基を例示できる。
【００２９】
更に、例えば、式（ＩＩＩ）：
【化４】
2014176605.tif 000005
で表わされる２−メタクリロイルオキシエチル基、（２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロポキシ）カルボニルメチル基、（３−アクリロイルオキシ−２−ヒドロキシプロポキシ）カルボニルメチル基、（２−メタクリロイルオキシエトキシ）カルボニルメチル基等を例示できる。なかでも、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）で表わされる官能基は、前記キチン及びキトサンの３位及び６位の水酸基に導入可能であり、かつ、重合反応することにより硬化性を示す。更に、反応原料が市販されているので、大量合成が容易であり、好ましい。
【００３０】
また、他のラジカル重合性基として、例えば、３，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロポキシ）ベンジル基、３，５−ビス（２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロポキシ）ベンジル基、３−メトキシ−４−メタクリロイルオキシベンジル基、４−（２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロポキシ）−３−メトキシベンジル基、３，４−ジメタクリロイルオキシベンジル基、３，５−ジメタクリロイルオキシベンジル基等が例示できる。
【００３１】
「ラジカル重合性基を有する親水性基」として、例えば、前記親水性基に、前記ラジカル重合性基が結合した官能基を例示できる。例えば、後述の式（ＩＶ）の右端のＣ６位の置換基を例示できる。
【００３２】
また、式（Ｉ）のキチン系誘導体の一つの態様として、上記の親水性基とラジカル重合性基を有するユニットを含有する形態を例示できる。前記２位のアミノ基がアセチル基に置換されたキチンユニットは取り扱い性を良好にすることから、キチンユニットがキトサンユニットと等量又はより多く含有される場合には水溶性を増大することができる。
【００３３】
式（Ｉ）中のｍ及びｎは、各々、式（Ｉ）中の全繰り返し単位数（即ち、キチンユニットとキトサンユニットの総数）におけるキチンユニットの割合とキトサンユニットの割合を示し、同時に、ｍはキチン誘導体のアセチル基置換度〔Ｎ−アセチル化度（ＤＳＡＣ）〕を意味する。ｍは、０．６０≦ｍ≦１であることが好ましく、０．８０≦ｍ≦１であることがより好ましく、０．９０≦ｍ≦１であることが特に好ましい。ｎは、０≦ｎ≦０．４０であることが好ましく、０≦ｎ≦０．２０であることがより好ましく、０≦ｎ≦０．１０であることが特に好ましい。ｍとｎの値は、キチン系誘導体のアセチル化反応及び脱アセチル化反応を行うことにより変えることができる。なお、ｍ及びｎそれぞれの値は、プロトン核磁気共鳴分析及び元素分析を利用して、例えば、特許文献７の実施例等に記載の方法を参照して、算出することができる。
【００３４】
式（Ｉ）で示されるキチン系誘導体の例として、例えば、親水性基としてカルボキシメチル基、ラジカル重合性基として２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル基が導入されたキチン系誘導体を好ましく例示できる。
【００３５】
そのようなキチン系誘導体として、
例えば、式（ＩＶ）：
【化５】
2014176605.tif 000006
で示される化合物、及び
式（Ｖ）：
【化６】
2014176605.tif 000007
で示される化合物、及び
式（ＶＩ）：
【化７】
2014176605.tif 000008
で示される化合物（Ｋはカリウムであり、式（ＶＩ）中のｘ、ｙ及びｚは、０．５≦ｘ≦０．６、０≦ｙ≦０．４、０．１≦ｚ≦０．４、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１）及び
式（ＶＩＩ）：
【化８】
2014176605.tif 000009
で示される化合物（式（ＶＩＩ）中のｘ、ｙ及びｚは、０．５≦ｘ≦０．６、０．４≦ｙ≦０．２、０．１≦ｚ≦０．２、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１）を例示できる。
【００３６】
キチン系誘導体の親水性基の置換度（ＤＳＣＭ）は、５０％〜９０％であることが好ましく、５０％〜８０％であることがより好ましく、６０％〜７０％であることが特に好ましい。
キチン系誘導体のラジカル重合性基置換度（ＤＳＰＳ）は、１０％〜４０％であることが好ましく、２０％〜４０％であることがより好ましく、２５％〜３０％であることが特に好ましい。
キチン系誘導体は、そのキチン系主鎖部分（より具体的には、キチン系出発原料）の重量平均分子量（Ｍｗ）が、１００，０００〜１，０００，０００であることが好ましく、２７０，０００〜７３０，０００であることがより好ましく、５７０，０００〜７３０，０００であることが特に好ましい。
【００３７】
このようなキチン系誘導体の製造方法は、目的とするキチン系誘導体を得られる限り特に制限されることはないが、例えば、キチン、キトサン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される１種以上の化合物と、親水性基を有する化合物及びラジカル重合性基を有する化合物を反応させて得ることができる。反応は、公知の方法を使用することができる。キチン系誘導体の製造方法として、特許文献３及び７等を参照することができる。キチン系誘導体は、赤外吸収スペクトル及びプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定することによって同定することができる。
【００３８】
本発明に係る「（Ｂ）キチン系ナノファイバー」とは、キチン、キトサン及びそれらの間の化合物（Ｎ−アセチル化の程度のみ異なる）に基づくナノファイバーであって、ナノオーダーの繊維の幅（または径）を有するファイバーをいい、本発明が目的とする生体接着剤を得られる限り特に制限されることはない。
【００３９】
キチン系ナノファイバーの幅（または径）は、約１ｎｍ〜約７００ｎｍであることが好ましく、約１ｎｍ〜約３００ｎｍであることがより好ましく、約１ｎｍ〜約１００ｎｍであることが更に好ましく、約１ｎｍ〜約６０ｎｍであることが更により好ましく、約２ｎｍ〜約３０ｎｍであることが特に好ましく、約２ｎｍ〜約２０ｎｍであることが特により好ましく、５ｎｍ〜２０ｎｍであることが特に更に好ましい。ここで、例えば、「キチンナノファイバーの幅（または径）は約１ｎｍ〜約３００ｎｍ」とは、電子顕微鏡観察にて観察した場合に，幅（または径）が約１ｎｍ〜約３００ｎｍのファイバーが全体の約５０％以上を占める状態をいう。好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上を占める状態をいう。
【００４０】
キチン系ナノファイバーは、細くて均質であることが好ましく、長いことが好ましく、分子が伸びきり鎖結晶であることが好ましく、強度が高いことが好ましい。「伸びきり鎖結晶」とは、剛直性の高分子が伸びきった状態で規則正しく配列し、束になった繊維状の結晶のことであり、欠陥が少ないため強靭な物性を発揮することが可能である。さらに、水性媒体において高い分散安定性を有する。
【００４１】
このようなキチン系ナノファイバーの製造方法は、目的とするキチン系ナノファイバーを得られる限り特に制限されることはないが、一般的には、キチン含有生物由来の材料から製造することができる。キチン含有生物として、甲殻類、昆虫類またはオキアミなどが例示される。キチン系ナノファイバーの原料となるキチン含有生物由来の材料は、例えば、昆虫類の外皮、オキアミなどの殻、甲殻類の殻および外皮などが挙げられる。キチン含有生物由来の材料としては、キチン含量の多い生物、例えば、エビ、カニなどの甲殻類の殻および外皮が好ましい。
【００４２】
キチン系ナノファイバーは、公知の製造方法を用いて製造することができる。そのような製造方法として、ＷＯ２０１０／０７３７５８パンフレット及びそれに引用された特許文献等に記載された方法を参照することができる。
キチン含有生物由来の材料を、少なくとも１回の脱蛋白工程および少なくとも１回の脱灰工程に付し、および少なくとも１回の脱アセチル化工程に付してよく、次に、解繊工程に付すことを特徴とする、キチン系ナノファイバーの製造方法が好ましい。
【００４３】
本発明の生体接着剤は、上述の「（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体」；及び「（Ｂ）キチン系ナノファイバー」を含む。かかる生体接着剤は、適宜、適切な形態で保存し、使用することができる。例えば、粉末の形態で保存してよく、水性組成物の形態で使用することが好ましい。本発明の生体接着剤は、チューブに入れて保存し、使用してもよい。本発明の医療用接着剤は、ラジカル重合性であるため、遮光性の密封容器に入れて保存し、使用することが好ましい。
【００４４】
（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体と（Ｂ）キチン系ナノファイバーの重量比（（Ａ）／（Ｂ））は、０．５／１〜５０／１であることが好ましく、１／１〜３０／１であることがより好ましく、５／１〜２５／１であることが特に好ましく、１０／１〜２０／１であることが最も好ましい。
【００４５】
本発明の生体接着剤が水性組成物の場合、（Ａ）及び（Ｂ）を含む水性組成物（ラジカル重合開始剤と未混合）中の（Ａ）の濃度は、０．１〜２５重量％であることが好ましく、０．５〜２２重量％であることが更に好ましく、１〜２０重量％であることがより好ましく、２．５〜１５重量％であることが特に好ましく、５〜１０重量％であることが最も好ましい。
本発明の生体接着剤が水性組成物の場合、（Ａ）及び（Ｂ）を含む水性組成物（ラジカル重合開始剤と未混合）中の（Ｂ）の濃度は、０．１〜１０重量％であることが好ましく、０．２〜５重量％であることがより好ましく、０．３〜３重量％であることが特に好ましく、０．４〜１重量％であることが最も好ましい。
【００４６】
「水性組成物」とは、「（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体」及び「（Ｂ）キチン系ナノファイバー」が、水性媒体中に存在することを意味し、溶解していても、溶解していなくてもよい。本発明の生体接着剤では、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体は、水性媒体に溶解することが好ましい。（Ｂ）キチン系ナノファイバーは、一般的に、水性媒体中に、分散することが好ましい。従って、本発明の生体接着剤は、水性分散物の形態を有することが好ましい。
【００４７】
「水性媒体」とは、例えば、イオン交換水、純水、蒸留水等の水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液、及び生理食塩水等をいう。生体と本発明の生体接着剤に悪影響を与えない限り、ジメチルスルホキシド、アルコール等の他の溶媒等を含んでよい。更に、水性媒体は、ｐＨ調整剤、塩等を含んでも良い。
【００４８】
本発明の生体接着剤は、光及び電磁波等を照射することで、硬化させることができる。更に、ラジカル重合開始剤と混合することで、硬化させることもできる。従って、本発明の生体接着剤は、（１）（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体と（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む成分と、（２）ラジカル重合開始剤を含む成分の、２成分型接着剤として、使用することができる。
【００４９】
ラジカル重合開始剤とは、一般的にラジカル種を発生して、重合性化合物のラジカル重合を開始させることができる化合物をいい、例えば、光、電磁波及び熱等によってラジカル種が発生してもよい。ラジカル重合開始剤とは、そのような化合物であれば特に制限されるものではない。例えば、ヒドロキシケトン系、アミノケトン系、ビスアシルホスフィンオキシド系及び過酸化物等を例示できる。具体的には、ベンゾフェノン、ベンゾインエチルエーテル、アセトフェノン、ベンゾインメチルエーテル、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２−ヒドロキシ−２−メチルフェニルプロパノン、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］２−ヒドロキシ−２−メチルプロパノン、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキサイド、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン等を例示できる。また、例えば、エオジンＹ、クマリン、ローズベンガル、エリスロシン、カンファーキノン、９−フルオレノン、メタロセン系化合物、チタノセン化合物〔例えば、ビスシクロペンタジエニル−ビス（ジフルオロ−ピリル−フェニル）チタニウム〕等の可視光線による重合開始剤を例示できる。更に、過酸化水素、過硫酸
塩、ヒドロペルオキシドと塩化鉄、アスコルビン酸等の酸化還元開始剤を例示できる。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。ラジカル重合開始剤の含有量は、適宜決定されるが、生体接着剤中、０．０１〜１０重量％であることが好ましく、０．５〜１０重量％であることがより好ましく、１〜１０重量％であることが更に好ましく、１〜３重量％であることが特に好ましい。
【００５０】
また、本発明の生体接着剤に悪影響を与えない限り、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体以外の他のラジカル重合性化合物（例えば、ラジカル重合性樹脂等）を、本発明の生体接着剤は含むことができる。他のラジカル重合性化合物の種類及び添加量等は、目的及び用途に応じて適宜選択することができる。本発明のキチン系誘導体の含有量は、接着剤中、特に限定はない。
【００５１】
本発明の生体接着剤は、水性組成物の形態で、注射器等を用いて使用部位に注入して使用することができる。その後、注入された接着剤に可視光線や紫外線等を照射してラジカル重合反応を開始させることができる。ラジカル重合反応開始の条件は公知の方法によることができる。
【００５２】
本発明の生体接着剤は、外科手術の際の組織接着に使用しても良く、例えば、皮膚、血管及び臓器等の組織を接合するための接着剤として使用することもできる。
【００５３】
更に本発明は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体を準備する工程；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを準備する工程を有する生体接着剤の製造方法を提供する。本発明は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを準備する工程、及びラジカル重合開始剤を組み合わせる工程を含む、二成分型生体接着剤の製造方法を提供する。
【００５４】
また本発明は、生体接着剤を製造するための、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーの組み合わせを提供する。本発明は、生体接着剤を製造するための、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体；（Ｂ）キチン系ナノファイバー；及びラジカル重合開始剤の組み合わせを提供する。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いて説明するが、これらの例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を何ら限定するものではない。
実施例及び比較例で使用した生体接着剤を以下説明する。
【００５６】
実施例及び比較例の生体接着剤を製造するために使用した成分を説明する。
（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体
（Ａ１）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、ＤＳＰＳ：１４％、Ｍｗ：５７０，０００、下記式（ＶＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．６１、ｙ＝０．２５、ｚ＝０．１４）後述する方法で合成した。（Ａ１）キチン系誘導体ともいう。
（Ａ２）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９７％、ＤＳＰＳ：２２％、Ｍｗ：５７０，０００、下記式（ＶＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．６１、ｙ＝０．１７、ｚ＝０．２２）後述する方法で合成した。（Ａ２）キチン系誘導体ともいう。
（Ａ３）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、ＤＳＰＳ：３９％、Ｍｗ：５７０，０００、下記式（ＶＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．６１、ｙ＝０．０、ｚ＝０．３９）後述する方法で合成した。（Ａ３）キチン系誘導体ともいう。
（Ａ４）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：９５％、ＤＳＰＳ：２５％、Ｍｗ：２７０，０００、下記式（ＶＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．６８、ｙ＝０．０７、ｚ＝０．２５）後述する方法で合成した。（Ａ４）キチン系誘導体ともいう。
（Ａ５）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ： ５５％、ＤＳＡＣ：９３％、ＤＳＰＳ：２２％、Ｍｗ：７３０，０００、下記式（ＶＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．５５、ｙ＝０．２３、ｚ＝０．２２）後述する方法で合成した。（Ａ５）キチン系誘導体ともいう。
【００５７】
【化９】
2014176605.tif 000010
【００５８】
（Ａ６）３−メトキシ−４−（２−ヒドロキシ−３−メタクリルオキシプロポキシ）ベンジル  カルボキシメチル  キチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：７８％、ＤＳＰＳ：１４％、Ｍｗ：５７０，０００、下記式（ＶＩＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．６１、ｙ＝０．２５、ｚ＝０．１４）後述する方法で合成した。（Ａ６）キチン系誘導体ともいう。
【００５９】
【化１０】
2014176605.tif 000011
【００６０】
（Ａ７）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ： ６１％、ＤＳＡＣ：１００％、ＤＳＰＳ：２６％、Ｍｗ：５７０，０００、上記式（ＶＩ）において、ｘ＋ｙ＋ｚ＝１とすると、ｘ＝０．６１、ｙ＝０．１３、ｚ＝０．２６）後述する方法で合成した。（Ａ７）キチン系誘導体ともいう。
【００６１】
（Ｂ）キチン系ナノファイバー
（Ｂ１）キチン系ナノファイバー  後述する方法で合成した。
（Ｂ２）表面脱アセチル化キチン系ナノファイバー（又は表面キトサン化キチンナノファイバーともいう）後述する方法で合成した。
（Ｘ）添加剤
（ｘ１）Ｌ（＋）−アスコルビン酸（ナカライテスク製）
水：純水
【００６２】
（Ａ）ラジカル重合性キチン誘導体の合成
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９７％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
１００ｍLの純水に脱アセチル化カルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル製  Ｌｏｔ．Ｎｏ．３０１２３ＲＹ、カルボキシメチル化度（ＤＳＣＭ）：６１％、アセチル化度（ＤＳＡＣ）：６７％、重量平均分子量（Ｍｗ）：５７０，０００、数平均分子量（Ｍｎ）：１９０，０００）５．０２ｇを加え、室温で溶解するまで撹拌した。反応溶液に１０５ｍＬのメタノールを加え、室温で一晩撹拌し、さらに０．９９ｇ（９．６９ｍｍｏｌ、アミノ基（ＮＨ２）に対して１．３当量）の無水酢酸を滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を３００ｍＬのアセトンに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）して、沈殿物を得た。沈殿物を１５０ｍＬの純水に溶解させ、４．２１ｇの０．５Ｍ水酸化カリウム水溶液を加えて、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を４００ｍＬのメタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を水に溶解させた後、凍結乾燥を行うことで白色綿状のＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（４.３２ｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９７％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
【００６３】
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
９０ｍLの純水に脱アセチル化カルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル製  Ｌｏｔ．Ｎｏ．３０１２３ＲＹ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：６７％、Ｍｗ：５７０，０００、Ｍｎ：１９０，０００）４．０７ｇを加え、室温で溶解するまで撹拌した。反応溶液に１３０ｍＬのメタノールを加え、室温で一晩撹拌し、さらに０．８ｇ（７．８４ｍｍｏｌ、アミノ基（ＮＨ２）に対して１．３当量）の無水酢酸を滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を３００ｍＬのアセトンに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）して、沈殿物を得た。沈殿物を２００ｍＬの純水に溶解させ、６．０５ｇの０．５Ｍ水酸化カリウム水溶液を加えて、室温で１９時間撹拌した。反応溶液を８００ｍＬのメタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を水に溶解させた後、凍結乾燥を行うことで白色綿状のＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（３．７９ｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
【００６４】
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：５５％、ＤＳＡＣ：９３％、Ｍｗ：７３０，０００）の合成
５０ｍLの純水に脱アセチル化カルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル製  Ｌｏｔ．Ｎｏ．３０２０３AS、ＤＳＣＭ：５５％、ＤＳＡＣ：７０％、Ｍｗ：７３０，０００、Ｍｎ：１９２，０００）３．０８ｇを加え、室温で溶解するまで撹拌した。反応溶液に１４０ｍＬのメタノールを加え、室温で一晩撹拌し、さらに０．８７ｇ（８．５４ｍｍｏｌ、アミノ基（ＮＨ２）に対して２．１当量）の無水酢酸を滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を３００ｍＬのアセトンに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）して、沈殿物を得た。沈殿物を１５０ｍＬの純水に溶解させ、４．４６ｇの０．５Ｍ水酸化カリウム水溶液を加えて、室温で１９時間撹拌した。反応溶液を６００ｍＬのメタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を水に溶解させた後、凍結乾燥を行うことで白色綿状のＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（２．９５ｇ、ＤＳＣＭ：５５％、ＤＳＡＣ：９３％、Ｍｗ：７３０，０００）を得た。
【００６５】
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：９５％、Ｍｗ：２７０，０００）の合成
６０ｍLの純水に脱アセチル化カルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル製  Ｌｏｔ．Ｎｏ．０５２２−１５、ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：５８％、Ｍｗ：２７０，０００、Ｍｎ：８９，０００）２．００ｇを加え、室温で溶解するまで撹拌した。反応溶液に１２０ｍＬのメタノールを加え、室温で一晩撹拌し、さらに０．７６ｇ（７．４５ｍｍｏｌ、アミノ基（ＮＨ２）に対して２．０当量）の無水酢酸を滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を３００ｍＬのアセトンに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）して、沈殿物を得た。沈殿物を２００ｍＬの純水に溶解させ、５．６ｇの０．５Ｍ水酸化カリウム水溶液を加えて、室温で１９時間撹拌した。反応溶液を８００ｍＬのメタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を水に溶解させた後、凍結乾燥を行うことで白色綿状のＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（１．７９ｇ、ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：９５％、Ｍｗ：２７０，０００）を得た。
【００６６】
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：７８％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
６０ｍLの純水に脱アセチル化カルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル製  Ｌｏｔ．Ｎｏ．３０１２３ＲＹ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：６７％、Ｍｗ：５７０，０００、Ｍｎ：１９０，０００）３．０３ｇを加え、室温で溶解するまで撹拌した。反応溶液に６０ｍＬのメタノールを加え、室温で一晩撹拌し、さらに０．５９ｇ（５．７８ｍｍｏｌ、アミノ基（ＮＨ２）に対して１．３当量）の無水酢酸を滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を４００ｍＬのアセトンに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）して、沈殿物を得た。沈殿物を１００ｍＬの純水に溶解させ、２．９ｇの０．５Ｍ水酸化カリウム水溶液を加えて、室温で２８時間撹拌した。反応溶液を６００ｍＬのメタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を水に溶解させた後、凍結乾燥を行うことで白色綿状のＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（２．７１ｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：７８％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
尚、Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチンの合成は、文献１１：Carbohydr. Res., 47, 315-320, 1976. を参照することができる。
【００６７】
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：１００％、Ｍｗ：５７０、０００）の合成
６０ｍLの純水に脱アセチル化カルボキシメチルキチン（甲陽ケミカル製  Ｌｏｔ．Ｎｏ．３０１２３ＲＹ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：６７％、Ｍｗ：５７０、０００、Ｍｎ：１９０、０００）４．０８ｇを加え、室温で一晩撹拌し、さらに０．７９ｇ（７．５０ｍｍｏｌ、アミノ基（ＮＨ２）に対して２．０当量）の無水酢酸を滴下し、室温で撹拌した。反応溶液を６００ｍＬのアセトンに加えることで沈殿させ、遠心分離（３、５００ｒｐｍ、５分）して、沈殿物を得た。沈殿物を２００ｍＬの純水に溶解させ、６．０５ｇの０．５Ｍ水酸化カリウム水溶液を加えて、室温で１２時間撹拌した。反応溶液を４００ｍＬのメタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３、５００ｒｐｍ、５分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を水に溶解させた後、凍結乾燥を行うことで白色綿状のＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（３．０４ｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：８８％、Ｍｗ：５７０、０００）を得た。
得られたＮ−アセチル化カルボキシメチルキチンを、同様の操作を用いて、更に再アセチル化した（第１ロット）。
また、同じ脱アセチル化カルボキシメチルキチンを使用して、同様の操作を用いて、アセチル化後、更に再アセチル化した（第２ロット）
第１ロットと第２ロットを併せて、更に再々アセチル化を行った。
Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：１００％、Ｍｗ：５７０、０００）を得た。
【００６８】
（Ａ１）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、ＤＳＰＳ：１４％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
２０ｍＬの純水に合成したＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、Ｍｗ：５７０，０００、５６３．２ｍｇ）を加え、室温で溶解するまで撹拌した。その後、１３５．２ｍｇ（０．９５１ｍｍｏｌ、６位の水酸基（ＯＨ基）に対して１．０当量）のグリシジルメタクリレートを加え、４０℃で２４時間撹拌した。反応溶液をエタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を真空下で１０時間乾燥させた。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、粉末状にした後、ジエチルエーテルで洗浄を行い、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）を行い、沈殿物を得た。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、白色粉末の（Ａ１）キチン誘導体（５６３．０ｍｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、ＤＳＰＳ：１４％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
【００６９】
（Ａ２）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９７％、ＤＳＰＳ：２２％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
６０ｍＬの純水に合成したＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９７％、Ｍｗ：５７０，０００、２．０２ｇ）を加え、室温で溶解するまで撹拌した。その後、０．９４ｇ（６．６２ｍｍｏｌ、６位の水酸基（ＯＨ基）に対して２．０当量）のグリシジルメタクリレートを加え、室温で２４時間撹拌した。反応溶液を５００ｍＬのエタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を真空下で一晩乾燥させた。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、粉末状にした後、ジエチルエーテルで洗浄を行い、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、白色粉末の（Ａ２）キチン誘導体（１．１ｇ、ＤＳＣＭ：０．６１％、ＤＳＡＣ：９７％、ＤＳＰＳ：２２％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
【００７０】
（Ａ３）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、ＤＳＰＳ：３９％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
１５ｍＬの純水に合成したＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、Ｍｗ：５７０，０００、５９２．４ｍｇ）を加え、室温で溶解するまで撹拌した。その後、４２４．７ｍｇ（２．９９ｍｍｏｌ、６位の水酸基（ＯＨ基）に対して３．０当量）のグリシジルメタクリレートを加え、４０℃で９６時間撹拌した。反応溶液をエタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を真空下で１０時間乾燥させた。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、粉末状にした後、ジエチルエーテルで洗浄を行い、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０分）を行い、沈殿物を得た。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、白色粉末の（Ａ３）キチン誘導体（４６１ｍｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：９２％、ＤＳＰＳ：３９％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
【００７１】
（Ａ４）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：９５％、ＤＳＰＳ：２５％、Ｍｗ：２７０，０００）の合成
２０ｍＬの純水に合成したＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：９５％、Ｍｗ：２７０，０００、７５３．３ｍｇ）を加え、室温で溶解するまで撹拌した。その後、３０２．０ｍｇ（１．７５ｍｍｏｌ、６位の水酸基（ＯＨ基）に対して２．１当量）のグリシジルメタクリレートを加え、６０℃で２５時間撹拌した。反応溶液をエタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、２分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を真空下で３時間乾燥させた。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、粉末状にした後、ジエチルエーテルで洗浄を行い、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、２分）を行い、沈殿物を得た。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、白色粉末の（Ａ４）キチン誘導体（３３３．９ｍｇ、ＤＳＣＭ：６８％、ＤＳＡＣ：９５％、ＤＳＰＳ：２５％、Ｍｗ：２７０，０００）を得た。
【００７２】
（Ａ５）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：５５％、ＤＳＡＣ：９３％、ＤＳＰＳ：２２％、Ｍｗ：７３０，０００）の合成
２０ｍＬの純水に合成したＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：５５％、ＤＳＡＣ：９３％、Ｍｗ：７３０，０００、５３５ｍｇ）を加え、室温で溶解するまで撹拌した。その後、２９５ｍｇ（２．０６ｍｍｏｌ、６位の水酸基（ＯＨ基）に対して２．０当量）のグリシジルメタクリレートを加え、室温で２４時間撹拌した。反応溶液をエタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、５分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を真空下で１０時間乾燥させた。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、粉末状にした後、ジエチルエーテルで洗浄を行い、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、５分）を行い、沈殿物を得た。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、白色粉末の（Ａ５）キチン誘導体（４０７ｍｇ、ＤＳＣＭ：５５％、ＤＳＡＣ：９３％、ＤＳＰＳ：２２％、Ｍｗ：７３０，０００）を得た。
【００７３】
（Ａ６）３−メトキシ−４−（２−ヒドロキシ−３−メタクリルオキシプロポキシ）ベンジルカルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：７８％、ＤＳＰＳ：１４％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
５０ｍＬのＤＭＦに１６．７２ｇ（０．１１ｍｏｌ）のバニリン、１３．１mＬ（０．１０ｍｏｌ）のグリシジルメタクリレート、および０．３７ｇ（１．００ｍｍｏｌ）の塩化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを加え、８５℃で一晩撹拌した。室温まで冷却した後、３００ｍＬの酢酸エチルを加え、有機層を冷１０％水酸化カリウム（５０ｍｌ）で３回洗浄し、さらに冷蒸留水（５０ｍＬ）で３回洗浄した。その後、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄した有機層を減圧下で濃縮し、１ｍＬのＴＨＦを加えて冷蔵庫で一晩放置し再結晶し、バニリン誘導体を得た（１０．３８ｇ）。
１３０ｍＬの０．２M酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）に、Ｎ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：７８％、Ｍｗ：５７０，０００）２．７１ｇを溶解するまで撹拌した。同時に４０ｍLのＴＨＦに上記で合成したバニリン誘導体０．７７ｇ（２位のアミノ基に対して２当量）を溶解するまで撹拌した。これらの溶液を混ぜ合わせ、さらに６時間撹拌した。そこに、０．３３ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（バニリン誘導体に対して２当量）を１０ｍLの純水に溶解させた溶液を０℃で滴下した。その溶液のｐＨを１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液で７．０に調整した。さらに、４時間撹拌した後、６００ｍＬのエタノールを加え、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、５分）により沈殿物を回収した。沈殿物は、１週間透析した後、凍結乾燥することで白色綿状生成物を得た。生成物を５０ｍＬの２−プロパノール中で一晩撹拌洗浄した後、さらに５０ｍＬのジエチルエーテル中で一晩撹拌洗浄し、乾燥することで（Ａ６）キチン誘導体（０．８６ｍｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：７８％、ＤＳＰＳ：１４％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。尚、（Ａ６）キチン誘導体の合成は、文献１２：Carbohydr Polym. 69, 697-706, 2007 を参照することができる。
【００７４】
（Ａ７）２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：１００％、ＤＳＰＳ：２６％、Ｍｗ：５７０，０００）の合成
８０ｍＬの純水に合成したＮ−アセチル化カルボキシメチルキチン（ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：１００％、Ｍｗ：５７０，０００、１．９６ｇ）を加え、室温で溶解するまで撹拌した。その後、１．２７ｇ（７．９６ｍｍｏｌ、６位の水酸基（ＯＨ基）に対して２．５当量）のグリシジルメタクリレートを加え、４０℃で２４時間撹拌した。反応溶液をエタノールに加えることで沈殿させ、遠心分離（３、５００ｒｐｍ、３分）を行い、沈殿物を得た。沈殿物を真空下で５時間乾燥させた。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、粉末状にした後、ジエチルエーテルで洗浄を行い、遠心分離（３、５００ｒｐｍ、１０分）を行い、沈殿物を得た。乾燥した沈殿物を乳鉢ですり潰し、白色粉末の（Ａ７）キチン誘導体（５６３ｍｇ、ＤＳＣＭ：６１％、ＤＳＡＣ：１００％、ＤＳＰＳ：２６％、Ｍｗ：５７０，０００）を得た。
【００７５】
カルボキシメチル化度（ＤＳＣＭ）は、滴定法により算出した。
アセチル化度（ＤＳＡＣ）は、元素分析法による炭素／窒素比より算出した。
ラジカル重合性基置換度（ＤＳＰＳ）は、プロトン核磁気共鳴スペクトルの積分値より算出した。
【００７６】
重量平均分子量（Ｍｗ）は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＦＣ：Gel Filtration Chromatography）を用いて測定して、単分散分子量のプルラン（昭和電工製  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２）を用いて換算した重量平均分子量をいう。より具体的には、高速液体クロマトグラフ用送液ユニット（島津社製  ＬＣ−１０ＡＴ）、カラムオーブン（島津製  ＣＴＯ−６Ａ）、ＲＩ検出器（島津社製  ＲＩＤ−６Ａ）を用い、カラムは、東ソー製のＡｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−５２０ＨＱ（φ７．６ｍｍ×３０ｃｍ）、ＧＳ−３２０ＨＱ（φ７．６ｍｍ×３０ｃｍ）、ＧＳ−２２０ＨＱ（φ７．６ｍｍ×３０ｃｍ）を３本連結して用いた。溶離液は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  酢酸ナトリウム水溶液を用いた。２ｍｇの試料に１ｍｌの溶離液を加えて、室温で２４時間緩やかに撹拌後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した試料を用いた。カラム温度は、４０℃で、同様の溶媒を用いた。流量は、０．５ｍｌ／分であった。試料の秤量から繰り返し２回測定を行い、得られた数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）の平均値を、Ｍｎ及びＭｗとした。
尚、本明細書において、Ｍｎ及びＭｗとは、キチン系主鎖部分（より具体的には、キチン系出発原料）のＭｎ及びＭｗをいう。
【００７７】
（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体の水溶液の調製
８０ｍｇの合成した（Ａ１）キチン系誘導体を、１０ｍＬサンプル管にとり、６８８ｍｇの水、及び３２ｍｇのＬ（＋）−アスコルビン酸の１０ｗｔ％水溶液（メタクリル基に対し１／４当量）を加え、室温で３０分撹拌して、（Ａ１）キチン系誘導体濃度が１０ｗｔ％の（１）比較水溶液を得た。
（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに、（Ａ２）〜（Ａ７）キチン系誘導体の各々を用いて、同様の方法を使用して、（Ａ２）〜（Ａ７）キチン系誘導体の各々の濃度が、１０ｗｔ％の（２）〜（７）比較水溶液を得た。（後述する［００８７］［表３］参照）
【００７８】
（Ｂ）キチン系ナノファイバーの製造
（Ｂ１）キチン系ナノファイバーの製造
カニ殻由来乾燥キチン粉末（ナカライテスク）２０ｇを２，０００ｍＬの純水中に分散させ、そこに２０ｍＬの酢酸を加え、よく撹拌した後、濾過した。回収した沈殿物に１％酢酸を加え全量を２，０００ｍＬとし、よく撹拌した。キチン分散液を石臼式摩砕機（スーパーマスコロイダー（ＭＫＣＡ  ６−２））を用いて、繊維に解離させて、（Ｂ１）キチン系ナノファイバー（収率：９３％、ＤＳＡＣ：９５％）を得た。
【００７９】
（Ｂ２）表面脱アセチル化キチン系ナノファイバーの製造
カニ殻由来乾燥キチン粉末（ナカライテスク）２０ｇを２，０００ｍＬの２０％水酸化ナトリウム中、アルゴン雰囲気下、１００℃で６時間撹拌を行うことによって繊維表面を脱アセチル化した。その後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分）を６回行うことで分散液を中性に戻した後、ろ過した。沈殿物を１，５００ｍＬの１％酢酸中に入れ、１晩室温で撹拌した。表面脱アセチル化キチン分散液を石臼式摩砕機（スーパーマスコロイダー（ＭＫＣＡ  ６−２））を用いて、繊維に解離させて、（Ｂ２）表面脱アセチル化キチン系ナノファイバー（又は表面キトサン化キチンナノファイバー）を得た（収率：５３％、ＤＳＡＣ：７２％）。
【００８０】
（Ｂ３）脱アセチル化キチン系ナノファイバー（キトサンナノファイバー）の製造
カニ殻由来乾燥キトサン（東京化成）２３ｇを１、８００ｍＬの純水中に分散させた後、石臼式摩砕機（スーパーマスコロイダー（ＭＫＣＡ  ６−２））を用いて粗破砕した。その後、スターバースト（スギノマシン製）により３０回解繊処理を行うことで、１ｗｔ％の（Ｂ３）脱アセチル化キチン系ナノファイバー（又はキトサンナノファイバー）を得た（ＤＳＡＣ：２２％）。
【００８１】
（Ａ）キチン系誘導体及び（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む水性組成物の製造
（Ａ１）キチン系誘導体と（Ｂ１）キチン系ナノファイバーを含む（１）水性組成物の製造
８０ｍｇの上述の（Ａ１）キチン系誘導体を１０ｍＬサンプル管に量りとった。６８８ｍｇの０．６０重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液（（Ｂ１）キチン系ナノファイバーの含有量：４．１ｍｇ）、及び３２ｍｇの１０重量％Ｌ（＋）−アスコルビン酸水溶液（メタクリル基に対し１／４当量）を加え、室温で３０分撹拌して、（１）水性組成物（（Ａ１）キチン系誘導体濃度：１０重量％）を得た。（Ａ１）キチン系誘導体は、水に溶解したが、（Ｂ１）キチン系ナノファイバーは、水に懸濁したので、（１）水性組成物は、全体は水性懸濁物であった。
【００８２】
（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに、（Ａ２）キチン系誘導体〜（Ａ５）キチン系誘導体を用いた以外は、（１）水性組成物の製造と同様の方法を用いて、（２）水性組成物〜（６）水性組成物を得た。いずれの水性組成物も、キチン系誘導体濃度は、１０重量％であった。
引き続いて、（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに、（Ａ６）キチン系誘導体を用い、０．６０重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液の代わりに、０．９３重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液（（Ｂ１）キチン系ナノファイバーの含有量：６．４ｍｇ）を用いた以外は、（１）水性組成物の製造と同様の方法を用いて水性組成物を得た。
更に、８０ｍｇの（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに、８ｍｇ、４０ｍｇ及び１６０ｍｇの（Ａ２）キチン系誘導体を用い、０．６０重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液の代わりに、０．９３重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液の量を、７６０ｍｇ、７２８ｍｇ及び６０８ｍｇに各々変えた以外は、（１）水性組成物の製造と同様の方法を用いて、（９）〜（１１）水性組成物を得た。これらの各水性組成物の（Ａ２）キチン系誘導体の濃度は、１重量％、５重量％及び２０重量％であった。
【００８３】
更に、（Ａ１）キチン系誘導体、又は（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに（Ａ２）キチン系誘導体〜（Ａ６）キチン系誘導体を用い、０．６０重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液の代わりに、０．６０重量％の（Ｂ２）キチン系ナノファイバー水懸濁液（（Ｂ２）キチン系ナノファイバーの含有量：４．１ｍｇ）を用いた以外は、（１）水性組成物の製造と同様の方法を用いて、（１２）〜（１７）水性組成物（キチン系誘導体濃度：１０ｗｔ％）を得た。
尚、（２）〜（１７）水性組成物は、いずれも水分散物の形態であった。
【００８４】
さらに引き続いて、（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに、（Ａ７）キチン系誘導体を用い、０．６０重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液、０．６０重量％の（Ｂ２）キチン系ナノファイバー水懸濁液及び１重量％の（Ｂ３）キチン系ナノファイバー水懸濁液を用いた以外は、（１）水性組成物の製造と同様の方法を用いて、（１８）〜（２０）水性組成物を得た。
【００８５】
更にまた、（Ａ１）キチン系誘導体の代わりに、（Ａ２）キチン系誘導体を用い、０．６０重量％の（Ｂ１）キチン系ナノファイバー水懸濁液の代わりに、０．６重量％の（Ｂ３）キチン系ナノファイバー水懸濁液（（Ｂ３）キトサンナノファイバーの含有量：４．１ｍｇ）を用いた以外は、（１）水性組成物の製造と同様の方法を用いて、（２１）水性組成物（キチン系誘導体濃度：１０重量％）を得た。
尚、（１８）〜（２１）水性組成物は、いずれも水分散物の形態であった。
【００８６】
接着強度測定
試料作製方法及び測定方法を、図１を参照しながら説明する。４０〜４３ｍｇの上述の（１）〜（２１）水性組成物及び（１）〜（７）比較水溶液の各々１を、薬さじで、コラーゲンフィルム２（日東電工製）に薄く塗布した。コラーゲンフィルム２を、生体組織モデルとして用いた。
（１）〜（１７）及び（２１）水性組成物及び（１）〜（６）比較水溶液の各々１に、０．０１ｗｔ％の過酸化水素水３を一滴（３２〜３９ｍｇ）滴下し、直ちにもう一枚のコラーゲンフィルム２を被せた。（１８）〜（２０）水性組成物及び（７）比較水溶液を用いた場合、０．０１ｗｔ％の過酸化水素水の代わりに、３ｗｔ％の過酸化水素水を使用した。
【００８７】
（１）〜（１７）及び（２１）水性組成物及び（１）〜（６）比較水溶液を使用した場合、２枚のコラーゲンフィルム２の接着部分４の上に２０ｇの錘５を乗せ、１時間圧着させた。錘５を取り除き、室温で１２時間風乾した。（１８）〜（２０）水性組成物及び（７）比較水溶液を用いた場合、２枚のコラーゲンフィルム２の接着部分４の上に２０ｇの錘５を乗せ、５分間圧着させた。錘５を取り除き、室温で５分間風乾した。
接着したコラーゲンフィルム２を４０℃の温水に１分間浸漬した後、水気をキムタオルにより取り除き、コラーゲンフィルムにダンプロンテープ（ＯＰＰテープ）６を張り付けることで補強した。
【００８８】
接着強度試験は、精密万能試験機（島津製、ＡＧＳ−１０ＫＮＸ）を用いて、接着面に平行な引っ張りせん断荷重により測定する方法（ＪＩＳ  Ｋ  ６８５０−１９９９）を参考にして行った。接着強度は、５回測定して平均値（試験力（Ｎ）及び試験力（Ｎ）をキチン誘導体溶液の乾燥塗布量（ｍｇ）で除した値）で示した。
使用した（１）〜（２１）水性組成物及び（１）〜（７）比較水溶液の組成（成分は、水性組成物全体を１００重量％とする重量％で示す）と、それらを０．０１ｗｔ％又は３ｗｔ％の過酸化水素水を用いて硬化させた場合の接着強度の測定結果を表１〜３に示した。
【００８９】
【表１】
2014176605.tif 000012
【００９０】
【表２】
2014176605.tif 000013
【００９１】
【表３】
2014176605.tif 000014
【００９２】
表１〜３に示すように、実施例の生体接着剤は、（Ｂ）を含まない対応する比較例の生体接着剤より接着強度に優れる。例えば、実施例１〜６、１０〜１５及び１９を、（Ｂ）を含まない対応する比較例１〜６と比べると、接着強度に優れる。更に、実施例１６〜１８を、比較例７と比べると、接着強度に優れる。従って、キチン系ナノファイバーを含むことで接着強度が増加する。接着強度及び接着強度の増加量は、キチン系誘導体の種類、置換度、分子量及びキチン系ナノファイバーの種類等に依存するので、本発明の生体接着剤は、これらを制御することで、種々の接着強度を有する生体接着剤を、簡単、かつ容易に得ることができる。
【００９３】
ラット肝臓への適用
（２）比較水溶液、及び（１１）水性組成物をオートクレーブにより滅菌（１２０℃、５分）した。
２匹のラットの各々を開腹し、各々の肝臓にデルマパンチを用いて直径３ｍｍの穴を開けた。一方に、（１１）水性組成物を塗布した後、３ｗｔ％過酸化水素水を２滴滴下し、開腹部を縫合した。他方に、（２）比較水溶液を塗布した後、同様に、３ｗｔ％過酸化水素水を２滴滴下し、開腹部を縫合した。１週間後、両方を再度開腹し、各々の患部を観察した。それらを図２に示す。
【００９４】
図２（ａ）は、（２）比較水溶液を塗布した肝臓である。患部は塞がり、白色になっていた。図２（ｂ）は、（１１）水性組成物を塗布した肝臓である。患部は塞がり、更に、患部と大網膜がしっかりと接着していた。患部と大網膜のしっかりとした接着が認められたことから、（１１）水性組成物の方が、（２）比較水溶液より、接着力が強いと考えられる。即ち、キチン系ナノファイバーを含むことで、接着力が向上したと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、（Ａ）ラジカル重合性基を有するキチン系誘導体と、（Ｂ）キチン系ナノファイバーを含む生体接着剤を提供する。本発明に係る生体接着剤は、接着強度及び接着速度を、簡単かつ容易に制御することができる。
【符号の説明】
【００９６】
１  水性組成物、２  コラーゲンフィルム、３  ０．０１重量％過酸化水素水、４  塗布部分（又は接着部分）、５  錘、６  テープ
【図１】
2014176605.tif 000015
【図２】
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