(57)【要約】【課題】真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体座を改変するために、大きな相同性領域を含む標的化ベクターの使用を可能にする迅速かつ便利な方法を提供すること。【解決手段】真核生物細胞において内因性遺伝子または染色体座を遺伝子改変する方法。この方法は、ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌相同組み換えを使用して（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、真核生物において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、この細胞中の内因性遺伝子または染色体座を改変する工程；ならびにｄ）（ｃ）の真核生物細胞において対立遺伝子の改変を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変された真核生物細胞を同定する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年２月１６日に出願された米国特許実用出願番号０９／７８４，８５９に対する優先権を主張する。この出願は、本明細書中に参考として援用される。本願を通じて、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物のそれらの全体における開示は、本明細書によって本願に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の分野は、真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体座を、相同組み換えを通じて標的化し、任意の望ましい様式で改変するための大きなＤＮＡベクターを操作および利用するための方法である。真核生物細胞に対するこれらの大きなＤＮＡ標的化ベクター（ＬＴＶＥＣと呼ばれる）は、真核生物細胞において相同性標的化を実施することを意図する他のアプローチにより代表的に使用されるフラグメントよりも大きなクローン化されたゲノムＤＮＡのフラグメントから獲得される。本発明の分野はさらに、ＬＴＶＥＣが所望の内因性遺伝子または染色体座を正確に標的化および改変した真核生物細胞を検出する迅速かつ便利な方法を提供する。この分野はまた、遺伝子改変を有する生物を作製するためのこれらの細胞の使用、その生物自体、およびそれらの使用方法を包含する。
【０００３】
（導入）
ＬＴＶＥＣの使用は、現在の方法を上回る実質的な利点を提供する。例えば、これらは標的化ベクターを作製するために現在使用されているＤＮＡフラグメントよりも大きなＤＮＡフラグメントから獲得されるので、ＬＴＶＥＣは、現在の技術を用いて作製される標的化ベクターよりも大きなゲノムＤＮＡフラグメントの利用可能なライブラリー（例えば、ＢＡＣおよびＰＡＣライブラリー）からより迅速かつ便利に作製され得る。さらに、より大きな改変およびより大きなゲノム領域にまたがる改変は、現在の技術を使用するよりも便利に作製され得る。さらに、本発明は、「標的化の困難な」座の標的化頻度を増大するための長い相同領域を利用し、また、これらの標的化ベクターにおいて同系ＤＮＡ（存在する場合）を使用する利益を減らす。
【０００４】
従って、本発明は、所定の生物の実質的に全ての内因性遺伝子および染色体座を体系的に改変するための迅速、便利、かつ効率的な方法を提供する。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
相同な外因性ＤＮＡと内因性染色体配列との間の相同組み換えによる遺伝子標的化は、マウスにおいて、欠失、挿入を作製するため、変異を設計するため、遺伝子変異を修正するため、導入遺伝子を導入するため、または他の遺伝子改変を作製するために極めて価値のある方法であることが証明されている。現在の方法は、代表的に、合計１０〜２０ｋｂ未満の内因性ＤＮＡに対する相同領域を有する標準的な標的化ベクターを使用してマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に所望の遺伝子改変を導入し、その後変更されたＥＳ細胞をマウス胚に注入してこれらの操作された遺伝子改変をマウス生殖系統に移す工程を包含する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；特許文献１（ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの名の下で１９９８年８月４日発行））。これらの現在の方法において、標準的な標的化ベクターが所望の内因性遺伝子または染色体座を正確に標的化および改変している希なＥＳ細胞を検出することは、標的化ベクターに含まれる相同標的化配列の外側の配列情報を必要とする。首尾良い標的化のためのアッセイは、標的化ベクターの外側であり相同性アーム（定義を参照のこと）全体にまたがる配列からの標準的なサザンブロッティングまたは長いＰＣＲを伴う（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に対して発行された特許文献２）。従って、これらの方法を制限する大きさの考慮から、相同性アームの大きさは、合計１０〜２０ｋｂ未満に制限される（非特許文献１３）。
【０００６】
現在の方法において使用されている相同性アームよりも長い相同性アームを有する標的化ベクターを使用する能力は、極めて価値が高い。例えば、このような標的化ベクターは、大きなゲノムインサートが広範に特徴付けられ、使用前にトリミングされる必要のある現在の技術を用いて作製される標的化ベクターよりも、このような大きなゲノムインサートを含む利用可能なライブラリー（例えば、ＢＡＣまたはＰＡＣライブラリー）からより迅速かつ便利に作製され得る。さらに、より大きな改変およびより大きなゲノム領域にまたがる改変は、現在の技術を使用するよりもより便利にかつより少ない工程で作製され得る。さらに、長い相同性領域の使用は、真核生物細胞における「標的化の困難な」座の標的化頻度を増大し得る。なぜならば、真核生物細胞における相同組み換えの標的化は、その標的化ベクターに含まれる総相同性に関連するようであるからである（非特許文献１４）。さらに、長い相同性アームを用いて獲得された増加した標的化頻度は、これらの標的化ベクターにおいて同系ＤＮＡを使用することから得られ得る任意の潜在的な利益を減らし得る。
【０００７】
非常に大きなゲノムフラグメント（例えば、ＢＡＣライブラリーにおいてクローン化されたフラグメント）への正確な改変を操作する上での問題は、真核生物の内因性遺伝子または染色体座に対する大きな相同性領域を含むベクターの構築を可能にする、細菌における相同組み換えの使用を通して大部分が解決された（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。しかし、一旦作製されると、これらのベクターは、一般的に、相同組み換えを通じて内因性遺伝子または染色体座を改変するのに有用ではない。なぜならば相同性アームが１０〜２０ｋｂよりも長い場合、希な正確な標的化事象を検出することが困難であるからである（非特許文献２０）。結果として、ＢＡＣゲノムフラグメントから細菌相同組み換えを使用して作製されたベクターは、標的化ベクターとして使用する前になおも広範にトリミングされなければならない（非特許文献２１）。従って、真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体座を改変するために、大きな相同性領域を含む標的化ベクターの使用を可能にする迅速かつ便利な方法論に対する必要性がなおも存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７８９，２１５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４３６，１４９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３１７：２３０−２３４、１９８５
【非特許文献２】Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ、５１：５０３−５１２、１９８７
【非特許文献３】Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６；８９２７−８９３１、１９８９
【非特許文献４】Ｋｕｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：７０７−７１０、１９９１
【非特許文献５】Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：８４７−８５０、１９９０
【非特許文献６】Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：７９９−８０３、１９８９
【非特許文献７】Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：５７６−５７８、１９８７
【非特許文献８】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、５：３１３−３２１、１９８９
【非特許文献９】ＤｅＣｈｉａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５：７８−８０、１９９０
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３６９：６８４−５、１９９４
【非特許文献１１】ＦｏｏｒｄおよびＲｏｓｅ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ、３：Ｓ１４９−６１、１９９４
【非特許文献１２】ＰｏｎｃｅおよびＭｉｃｏｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２０：６２３，１９９２
【非特許文献１３】Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９
【非特許文献１４】ＤｅｎｇおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１２：３３６５−７１、１９９２
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０：１２３−８、１９９８
【非特許文献１６】Ｙａｎｇら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１５：８５９−６５、１９９７
【非特許文献１７】Ａｎｇｒａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２７：ｅ１６、１９９９
【非特許文献１８】Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、２７：１５５５−７、１９９９
【非特許文献１９】Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、６：４４２−７、１９９９
【非特許文献２０】Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９
【非特許文献２１】Ｈｉｌｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６４：１１１−３、２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明に従って、本出願人らは、相同組み換えを通じて真核生物細胞における内因性遺伝子および染色体座を改変するために、大きな相同性領域を含む標的化ベクターの使用を可能にする新規の方法を提供する。このような方法は、上記の現在の技術の制限を克服する。さらに、当業者は、本発明の方法が、任意の真核生物（動物（例えば、マウス、ラット、他の齧歯類、またはヒト）および植物（例えば、ダイズ、トウモロコシ、およびコムギ）が挙げられるがこれらに限定されない）の任意のゲノムＤＮＡを用いた使用に容易に適合されることを容易に認識する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明に従って、本出願人らは、改変された内因性遺伝子または染色体座を含む真核生物細胞を作製およびスクリーニングするための新規、迅速、効率的、かつ効果的な方法を開発した。この新規の方法は、初めて、以下を組み合わせる：
１．大きなクローン化されたゲノムフラグメント中での所望の遺伝子改変を正確に操作し、それによって真核生物細胞において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製するための細菌相同組み換え；
２．これらの真核生物細胞における目的の内因性染色体座を改変するための、これらの細胞へのこれらのＬＴＶＥＣの直接的な導入；および
３．標的化配列の外側の配列情報を必要としない親対立遺伝子の対立遺伝子改変（ＭＯＡ）のためのアッセイ（例えば、定量ＰＣＲ）を含む、標的化された対立遺伝子が所望するように改変された希な真核生物細胞を決定するための分析。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態は、以下の工程を包含する、真核生物細胞において内因性遺伝子または染色体座を遺伝子改変する方法である：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌相同組み換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、真核生物において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、この細胞中の内因性遺伝子または染色体座を改変する工程；ならびにｄ）（ｃ）の真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変された真核生物細胞を同定する工程。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、内因性遺伝子または染色体座に対するこの遺伝子改変が、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更；新たなコード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入；条件付き対立遺伝子の作製；または１つの種由来のコード配列または遺伝子セグメントと、異なる種由来の相同またはオルソロガスな（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）コード配列との置換を含む方法である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更が、置換、付加、または融合を含み、その融合体がエピトープタグまたは二官能性タンパク質を含む方法である。
【００１５】
本発明のなお別の実施形態は、定量アッセイが、定量ＰＣＲ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、または固定化されたプローブに対する定量ハイブリダイゼーションを含み、定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術または分子ビーコンを用いる定量ＰＣＲを含む方法である。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施形態は、真核生物細胞が、哺乳動物胚性幹細胞であり、特に、この胚性幹細胞がマウス、ラット、または他の齧歯類の胚性幹細胞である方法である。
【００１７】
本発明の別の好ましい実施形態は、内因性遺伝子または染色体座が、哺乳動物の遺伝子または染色体座、好ましくは、ヒトの遺伝子または染色体座、あるいはマウス、ラット、または他の齧歯類の遺伝子または染色体座である方法である。
【００１８】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、ＬＴＶＥＣが２０ｋｂよりも大きなＤＮＡフラグメント、特に１００ｋｂより大きなＤＮＡフラグメントを収容し得る方法である。
【００１９】
別の好ましい実施形態は、本発明の方法により産生される遺伝子改変された内因性遺伝子または染色体座である。
【００２０】
なお別の好ましい実施形態は、本発明の方法により産生される遺伝子改変された真核生物細胞である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明の方法により産生される遺伝子改変された内因性遺伝子または染色体座を含む非ヒト生物である。
【００２２】
本発明の方法により産生される遺伝子改変された真核生物細胞または胚性幹細胞から産生される非ヒト生物もまた好ましい。
【００２３】
好ましい実施形態は、以下の工程を含む方法により産生される、遺伝子改変された内因性遺伝子または染色体座を含む、非ヒト生物である：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌相同組み換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、胚性幹細胞において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを胚性幹細胞に導入して、細胞中の内因性遺伝子または染色体座を改変する工程；ｄ）（ｃ）の胚性幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変された胚性幹細胞を同定する工程；ｅ）（ｄ）の胚性幹細胞を胚盤胞に導入する工程；ならびにｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠のために代理母に導入する工程。
【００２４】
本発明のさらなる好ましい実施形態は、以下の工程を含む方法により産生される、遺伝子改変された内因性遺伝子または染色体座を含む、非ヒト生物である：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌相同組み換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、真核生物において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、この細胞中の内因性遺伝子または染色体座を遺伝子改変する工程；ｄ）（ｃ）の真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変された真核生物細胞を同定する工程；ｅ）（ｄ）の真核生物細胞から核を取り除く工程；ｆ）（ｅ）の核を卵母細胞に導入する工程；ならびにｇ）（ｆ）の卵母細胞を妊娠のための代理母に導入する工程。
【００２５】
なお別の好ましい実施形態は、以下の工程を含む方法により産生される、遺伝子改変された内因性遺伝子または染色体座を含む、非ヒト生物である：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；ｂ）細菌相同組み換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、真核生物において使用するための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、この細胞中で内因性遺伝子または染色体座を遺伝子改変する工程；ｄ）（ｃ）の真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変された真核生物細胞を同定する工程；ｅ）（ｄ）の真核生物細胞と別の真核生物細胞とを融合させる工程；ならびにｆ）（ｅ）の融合された真核生物細胞を妊娠のための代理母に導入する工程。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、非ヒト生物はマウス、ラット、または他の齧歯類であり；胚盤胞は、マウス、ラット、または他の齧歯類の胚盤胞であり；卵母細胞は、マウス、ラット、または他の齧歯類の卵母細胞であり；そして代理母は、マウス、ラット、または他の齧歯類である。
【００２７】
別の好ましい実施形態は、胚性幹細胞が哺乳動物胚性幹細胞、好ましくは、マウス、ラット、または他の齧歯類の胚性幹細胞である方法である。
【００２８】
さらなる好ましい実施形態は、非ヒト生物の産生のための、本発明の遺伝子改変された真核生物細胞の使用、特に、非ヒト生物の産生のための、本発明の遺伝子改変された胚性幹細胞の使用である。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態は、マウス胚性幹細胞において目的の内因性遺伝子または染色体座を遺伝子改変する方法である。この方法は、ａ）目的のＤＮＡ配列を含む２０ｋｂよりも大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程（この大きなクローン化されたＤＮＡフラグメントは内因性遺伝子または染色体座に相同である）；ｂ）細菌相同組み換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、マウス胚性幹細胞において使用するための大きな標的化ベクターを作製する工程（遺伝子改変は、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である）；ｃ）（ｂ）の大きな標的化ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して、この細胞中の内因性遺伝子または染色体座を改変する工程；およびｄ）（ｃ）のマウス胚性幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変されたマウス胚性幹細胞を同定する工程（定量アッセイは定量ＰＣＲである）を包含する。この方法により産生される遺伝子改変されたマウス胚性幹細胞；この方法により産生される遺伝子改変された内因性遺伝子または染色体座を含むマウス；および遺伝子改変されたマウス胚性幹細胞から産生されるマウスもまた好ましい。
【００３０】
別の好ましい実施形態は、以下の工程を包含する方法により産生される、遺伝子改変された目的の内因性遺伝子または染色体座を含むマウスである：ａ）目的のＤＮＡ配列を含む２０ｋｂよりも大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程（この大きなクローン化されたＤＮＡフラグメントは内因性遺伝子または染色体座に相同である）；ｂ）細菌相同組み換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、マウス胚性幹細胞において使用するための大きな標的化ベクターを作製する工程（遺伝子改変は、コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失である）；ｃ）（ｂ）の大きな標的化ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して、この細胞中の内因性遺伝子または染色体座を改変する工程；ｄ）（ｃ）のマウス胚性幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性遺伝子または染色体座が遺伝子改変されたマウス胚性幹細胞を同定する工程（定量アッセイは定量ＰＣＲである）；ｅ）（ｄ）のマウス胚性幹細胞を胚盤胞に導入する工程；ならびにｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠のために代理母に導入する工程。
【００３１】
マウスの産生のための、上記遺伝子改変されたマウス胚性幹細胞の使用もまた好ましい。
【００３２】
本発明の１つの実施形態は、以下の工程を包含する、非ヒト真核生物細胞において、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座を相同ヒト遺伝子座またはオルソログなヒト遺伝子座と、全部または一部置換する方法である：
ａ）ホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座を、全部または一部含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）のクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、真核生物細胞における使用のための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；
ｃ）（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入して、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、ホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換された真核生物細胞を同定する工程。
【００３３】
別の実施形態は、以下の工程をさらに包含する、非ヒト真核生物細胞において、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換する方法である：
ｅ）（ａ）のフラグメントと異なるホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座の一部を含む、大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｆ）細菌相同組換えを使用して、（ｅ）のクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、第２のＬＴＶＥＣを作製する工程；
ｇ）（ｆ）の第２のＬＴＶＥＣを工程（ｄ）で同定された真核生物細胞に導入して、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｈ）（ｇ）の真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、ホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換された真核生物生物を同定する工程。
【００３４】
上記方法の別の実施形態は、工程（ｅ）〜（ｈ）が、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座がホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と全部置換されるまで繰り返される方法である。
【００３５】
この方法の別の実施形態は、免疫グロブリン可変遺伝子座が、以下：
ａ）κ軽鎖の可変遺伝子座；
ｂ）λ軽鎖の可変遺伝子座；および
ｃ）重鎖の可変遺伝子座、
からなる群より選択される座である方法である。
【００３６】
好ましい実施形態は、定量アッセイが、定量ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、または固定されたプローブに対する定量ハイブリダイゼーションを含み、特に、定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術または分子ビーコンを用いる定量ＰＣＲを含む方法である。
【００３７】
なお別の好ましい実施形態は、以下の工程を包含する、マウス胚性幹細胞において、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換する方法である：
ａ）ホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座を、全部または一部含む大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、胚性幹細胞における使用のための大きな標的化ベクターを作製する工程；
ｃ）（ｂ）の大きな標的化ベクターをマウス胚性幹細胞に導入して、細胞中の内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｄ）（ｄ）のマウス胚性幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量ＰＣＲアッセイを使用して、内因性可変遺伝子座が、ホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換されたマウス胚性幹細胞を同定する工程。
【００３８】
別の実施形態において、この方法はさらに、以下の工程を包含する：
ｅ）（ａ）のフラグメントと異なるホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座の一部を含む、大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｆ）細菌相同組換えを使用して、（ｅ）のクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、胚性幹細胞における使用のための大きな標的化ベクターを作製する工程；
ｇ）（ｆ）の大きな標的化ベクターを工程（ｄ）で同定されたマウス胚性幹細胞に導入して、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｈ）（ｇ）のマウス胚性幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、ホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換されたマウス胚性幹細胞を同定する工程。
【００３９】
さらに別の好ましい実施形態は、上記工程（ｅ）〜（ｈ）が、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座がホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と全部置換されるまで、繰り返される、方法である。
【００４０】
好ましいのはまた、上記免疫グロブリン可変遺伝子座は、以下：
ａ）κ軽鎖の可変遺伝子座；
ｂ）λ軽鎖の可変遺伝子座；および
ｃ）重鎖の可変遺伝子座、
からなる群より選択される座を含む、方法である。
【００４１】
別の好ましい実施形態は、上記の方法によって産生される遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座；上記の方法によって産生される遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む遺伝子改変された真核生物細胞；上記の方法により遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む非ヒト生物；および上記の方法により遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含むマウス胚幹細胞である。
【００４２】
好ましいのはまた、マウス重鎖可変遺伝子座が、ヒト重鎖可変遺伝子座と、全部または一部置換された胚幹細胞；マウスκ軽鎖可変領域遺伝子座が、ヒトκ軽鎖可変領域遺伝子座と、全部または一部置換された胚幹細胞；マウスλ軽鎖可変領域遺伝子座が、ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子座と、全部または一部置換された胚幹細胞；および重鎖可変領域遺伝子座および軽鎖可変領域遺伝子座が、それらのヒトホモログまたはオルソログと、全部置換された胚幹細胞である。
【００４３】
別の好ましい実施形態は、上記の胚幹細胞から作製されたマウスである。
【００４４】
なお別の好ましい実施形態は、上記の遺伝子改変された可変領域遺伝子座によりコードされるヒト可変領域を含む抗体；非ヒト定常領域をさらに含む抗体；およびヒト定常領域をさらに含む抗体である。
【００４５】
また好ましいのは、トランスジェニックマウスであって、このマウスは、内因性マウス定常領域座を完全に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域座およびヒト軽鎖可変領域座を完全に含むゲノムを有し、その結果、このマウスが、抗原性刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を含有する血清を産生する、トランスジェニックマウス；トランスジェニックマウスであって、このマウスは、内因性マウス定常領域座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域座および／またはヒト軽鎖可変領域座を含むゲノムを有し、その結果、このマウスは、抗原性刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を含有する血清を産生する、トランスジェニックマウス；トランスジェニックマウスであって、このマウスは、ホモログヒト可変座またはオルソログヒト可変座で置換された内因性免疫グロブリン可変領域座を含み、このマウスは、以下：
ａ）ホモログヒト可変領域座全体またはオルソログヒト可変領域座全体を含む、１つ以上の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）のクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、マウス胚幹細胞における使用のための大きな標的化ベクターを作製する工程；
ｃ）（ｂ）の大きな標的化ベクターをマウス胚幹細胞に導入して、この細胞において内因性可変領域座全体を置換する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）のマウス胚幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量ＰＣＲアッセイを使用して、内因性可変領域座全体が、ホモログヒト可変領域座またはオルソログヒト可変領域座と置換されたマウス胚幹細胞を同定する、工程、
ｅ）（ｄ）のマウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の胚盤胞を妊娠のために代理母に導入する工程、
を包含する、方法によって作製される、
トランスジェニックマウスである。
【００４６】
別の好ましい実施形態は、上記のトランスジェニックマウスであって、免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、以下：
ａ）κ軽鎖の可変遺伝子座；
ｂ）λ軽鎖の可変遺伝子座；および
ｃ）重鎖の可変遺伝子座、
からなる群より選択される１つ以上の座を含む、トランスジェニックマウスである。
【００４７】
また好ましいのは、マウス胚幹細胞が、上記の方法により作製されたトランスジェニックマウスに由来する、上記の方法である。
【００４８】
本発明のなおさらに別の好ましい実施形態は、ヒト抗体を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）上記のマウスを抗原性刺激に曝す工程であって、その結果、このマウスは抗原に対する抗体を産生する、工程；
ｂ）抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを単離する工程；
ｃ）活性な抗体を発現し得る細胞中で、（ｂ）の可変領域をコードするＤＮＡをヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結する工程；
ｄ）この細胞を、ヒト抗体を発現するような条件下で増殖させる工程；ならびに
ｅ）抗体を回収する工程、
を包含する、方法である。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、上記の細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００５０】
また好ましいのは、上記の工程（ｂ）のＤＮＡが、上記工程（ａ）中の抗原性刺激に曝されたマウスの脾臓から作製されたハイブリドーマから単離される方法である。
【００５１】
また好ましいのは、ＤＮＡがＰＣＲによって単離される、上記方法である。
【００５２】
別の好ましい実施形態は、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をホモログ遺伝子座（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ）またはオルソログ遺伝子座（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｌｏｃｕｓ）と、全部または一部置換する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、その可変遺伝子座内の下流相同性アーム、およびその可変遺伝子座内の上流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この下流相同性アームは、この免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、このＪセグメントを含まない、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位、その可変遺伝子座内の上流相同性アーム、およびその可変遺伝子座内の下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この上流相同性アームは、この免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入する工程；
ｄ）この可変遺伝子座中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、この部位特異的組換え部位がこの内因性可変領域遺伝子座に隣接する工程（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程；
ｅ）このオルソログ遺伝子座またはこのホモログ遺伝子座の全部または一部に隣接する部位特異的組換え配列を含むベクターを作製する工程；ならびに
ｆ）組換えを介して、この内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座がこのホモログ遺伝子座またはこのオルソログ遺伝子座と、全部または一部置換されるように、工程（ｄ）において同定された真核生物中に（ｅ）のベクターを導入する工程、
を包含する、方法である。
【００５３】
また好ましいのは、トランスジェニックマウスであって、このマウスは、ホモログヒト免疫グロブリン可変領域座またはオルソログヒト免疫グロブリン可変領域座で置換された内因性免疫グロブリン可変領域座を含み、このマウスは、以下：
ａ）部位特異的組換え部位および下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この下流相同性アームは、このマウス免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、このＪセグメントを含まない、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位および上流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この上流相同性アームは、このマウス免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のマウスＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）のＬＴＶＥＣをその真核生物細胞に導入する工程；この可変遺伝子座中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、この部位特異的組換え部位がこの内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に隣接する工程（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程；
ｄ）このオルソログ遺伝子座またはホモログ遺伝子座の全部または一部に隣接する部位特異的組換え配列を含むベクターを作製する工程；
ｅ）組換えを介して、この内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座がこのホモログ遺伝子座またはオルソログ遺伝子座と、全部または一部置換されるように、工程（ｄ）において同定されたこの真核生物細胞中に（ｄ）のベクターを導入する工程；
ｆ）（ｅ）のマウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する工程；ならびに
（ｆ）の胚盤胞を妊娠のために代理母に導入する工程、
を包含する、方法によって作製される、トランスジェニックマウスである。
【００５４】
なお別の好ましい実施形態は、真核生物細胞において、下流が部位特異的組換え部位と隣接した内因性遺伝子座を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、この座内の下流相同性アーム、この座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この下流相同性アームは、この内因性遺伝子座領域の３’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＬＴＶＥＣをこの真核生物細胞内に導入する工程；ならびに
ｃ）この内因性遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、この内因性遺伝子座の下流がこの部位特異的組換え部位と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法である。
【００５５】
なお別の好ましい実施形態は、真核生物細胞において、上流が部位特異的組換え部位と隣接した内因性遺伝子座を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、その座内の上流相同性アーム、その座内の下流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この上流相同性アームは、この内因性遺伝子座領域の５’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｂ）（ａ）のＬＴＶＥＣをこの真核生物に導入する工程；ならびに
ｃ）この内因性遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、この内因性遺伝子座の上流がこの部位特異的組換え部位と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、を包含する、方法である。
【００５６】
また好ましいのは、真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性遺伝子座を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、この座内の下流相同性アーム、この座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この下流相同性アームは、この内因性遺伝子座領域の３’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位、その座内の上流相同性アーム、その座内の下流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この上流相同性アームは、この内因性遺伝子座領域の５’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）のＬＴＶＥＣをこの真核生物細胞内に導入する工程；ならびに
ｄ）この内因性遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、この部位特異的組換え部位がこの内因性遺伝子座と隣接する（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法である。
【００５７】
なお別の好ましい実施形態は、真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、その可変遺伝子座内の下流相同性アーム、その可変遺伝子座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この下流相同性アームは、この免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、このＪセグメントを含まない、工程；
ｂ）（ａ）のＬＴＶＥＣをこの真核生物細胞内に導入する工程；ならびに
ｃ）この可変遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、この部位特異的組換え部位がこの内因性免疫グロブリン可変遺伝子座の下流末端と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法である。
【００５８】
また好ましいのは、真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、この座内の上流相同性アーム、この座内の下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この上流相同性アームは、この免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｂ）（ａ）のＬＴＶＥＣをこの真核生物細胞内に導入する工程；ならびに
ｃ）この可変遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、この部位特異的組換え部位がこの内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上流末端と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法である。
【００５９】
なお別の実施形態は、真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を作製する方法であって、この方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、この座内の下流相同性アーム、この座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この下流相同性アームは、この免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、このＪセグメントを含まない、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位、この座内の上流相同性アーム、この座内の下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、この上流相同性アームは、この免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）のＬＴＶＥＣをこの真核生物細胞内に導入する工程；ならびに
ｄ）この可変遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、この部位特異的組換え部位がこの内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と隣接する（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法である。
本発明の好適な実施形態によれば、例えば以下の方法などが提供される：
（項目１）
非ヒト真核生物細胞において、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換する方法であって、該方法は、以下：
ａ）改変改変該ホモログヒト遺伝子座または該オルソログヒト遺伝子座を全部または一部含む、大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）の該クローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、真核生物細胞における使用のための大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を作製する工程；
ｃ）（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入して、該内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の該真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、該ホモログヒト遺伝子座または該オルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換された真核生物細胞を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、該方法はさらに、以下：
ｅ）（ａ）の前記フラグメントと異なるホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座の一部を含む、大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｆ）細菌相同組換えを使用して、（ｅ）の該クローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、第２のＬＴＶＥＣを作製する工程；
ｇ）（ｆ）の該第２のＬＴＶＥＣを工程（ｄ）で同定された前記真核生物細胞に導入して、前記内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｈ）（ｇ）の該真核生物細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、該ホモログヒト遺伝子座または該オルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換された真核生物細胞を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目３）
項目２に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）〜（ｈ）は、前記内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座がホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と全部置換されるまで、繰り返される、方法。
（項目４）
項目１に記載の方法であって、ここで、前記免疫グロブリン可変遺伝子座は、以下：
ａ）κ軽鎖の可変遺伝子座；
ｂ）λ軽鎖の可変遺伝子座；および
ｃ）重鎖の可変遺伝子座、
からなる群より選択される座である、方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、ここで、前記定量アッセイが、定量ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、または固定されたプローブに対する定量ハイブリダイゼーションを含む、方法。
（項目６）
前記定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術または分子ビーコンを用いる定量ＰＣＲを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
マウス胚幹細胞において、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換する方法であって、該方法は、以下：
ａ）改変該ホモログヒト遺伝子座または該オルソログヒト遺伝子座を全部または一部含む、大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）の該大きなクローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、該胚幹細胞における使用のための大きな標的化ベクターを作製する工程；
ｃ）（ｂ）の該大きな標的化ベクターを胚幹細胞に導入して、該細胞中の該内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｄ）（ｃ）の該胚幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量ＰＣＲアッセイを使用して、該内因性可変遺伝子座が、該ホモログヒト遺伝子座または該オルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換された胚幹細胞を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目８）
項目７に記載の方法であって、該方法はさらに、以下：
ｅ）（ａ）の前記フラグメントと異なるホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座の一部を含む、大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｆ）細菌相同組換えを使用して、（ｅ）の該クローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、前記胚幹細胞における使用のための大きな標的化ベクターを作製する工程；
ｇ）（ｆ）の該大きな標的化ベクターを工程（ｄ）で同定された該胚幹細胞に導入して、前記内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を、全部または一部置換する工程；ならびに
ｈ）（ｇ）の該マウス胚幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が、該ホモログヒト遺伝子座または該オルソログヒト遺伝子座と、全部または一部置換された胚幹細胞を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目９）
項目８に記載の方法であって、ここで、工程（ｅ）〜（ｈ）は、前記内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座がホモログヒト遺伝子座またはオルソログヒト遺伝子座と全部置換されるまで、繰り返される、方法。
（項目１０）
項目７に記載の方法であって、ここで、前記免疫グロブリン可変遺伝子座は、以下：
ａ）κ軽鎖の可変遺伝子座；
ｂ）λ軽鎖の可変遺伝子座；および
ｃ）重鎖の可変遺伝子座、
からなる群より選択される座を含む、方法。
（項目１１）
内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座をホモログ遺伝子座またはオルソログ遺伝子座と、全部または一部置換する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該可変遺伝子座内の下流相同性アーム、該可変遺伝子座内の上流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該下流相同性アームは、該免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、該Ｊセグメントを含まない、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位、該可変遺伝子座内の上流相同性アーム、該可変遺伝子座内の下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該上流相同性アームは、該免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）のＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入する工程；
ｄ）該可変遺伝子座中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、該部位特異的組換え部位が該内因性可変領域遺伝子座に隣接する工程（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程；
ｅ）該オルソログ遺伝子座または該ホモログ遺伝子座の全部または一部に隣接する部位特異的組換え配列を含むベクターを作製する工程；ならびに
ｆ）組換えを介して、該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が該ホモログ遺伝子座または該オルソログ遺伝子座と、全部または一部置換されるように、工程（ｄ）において同定された真核生物細胞中に（ｅ）のベクターを導入する工程、
を包含する、方法。
（項目１２）
前記真核生物細胞が胚幹細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
項目１、４、７、８、１０、１１、または１２に記載の方法によって産生される、遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座。
（項目１４）
項目１、４、７、８、１１、または１２に記載の方法によって産生される遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む、遺伝子改変された真核生物細胞。
（項目１５）
項目１、４、７、８、１０、または１１に記載の方法によって産生される遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む、非ヒト生物。
（項目１６）
項目７、８、１０、または１２に記載の方法によって作製される遺伝子改変された免疫グロブリン可変領域遺伝子座を含む、マウス胚幹細胞。
（項目１７）
前記マウス重鎖可変領域座が、ヒト重鎖可変遺伝子座で全部または一部置換された、項目１６に記載の胚幹細胞。
（項目１８）
前記マウスκ軽鎖可変領域座が、ヒトκ軽鎖可変領域座で全部または一部置換された、項目１６に記載の胚幹細胞。
（項目１９）
前記マウスλ軽鎖可変領域座が、ヒトλ軽鎖可変領域座で全部または一部置換された、項目１６に記載の胚幹細胞。
（項目２０）
前記重鎖可変領域遺伝子座および前記軽鎖可変領域遺伝子座が、そのヒトホモログまたはヒトオルソログで全部置換された、項目１６に記載の胚幹細胞。
（項目２１）
項目１６に記載の胚幹細胞から作製される、マウス。
（項目２２）
項目１７に記載の胚幹細胞から作製される、マウス。
（項目２３）
項目１８に記載の胚幹細胞から作製される、マウス。
（項目２４）
項目１９に記載の胚幹細胞から作製される、マウス。
（項目２５）
項目２０に記載の胚幹細胞から作製される、マウス。
（項目２６）
項目１１に記載の遺伝子改変された改変遺伝子座によってコードされるヒト可変領域を含む、抗体。
（項目２７）
非ヒト定常領域をさらに含む、項目２６に記載の抗体。
（項目２８）
ヒト定常領域をさらに含む、項目２６に記載の抗体。
（項目２９）
トランスジェニックマウスであって、該マウスは、内因性マウス定常領域座に完全に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域座およびヒト軽鎖可変領域座を完全に含むゲノムを有し、その結果、該マウスは、抗原性刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を含有する血清を産生する、トランスジェニックマウス。
（項目３０）
トランスジェニックマウスであって、該マウスは、内因性マウス定常領域座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域座および／またはヒト軽鎖可変領域座を含むゲノムを有し、その結果、該マウスは、抗原性刺激に応答してヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を含有する血清を産生する、トランスジェニックマウス。
（項目３１）
トランスジェニックマウスであって、該マウスは、ホモログヒト可変領域座またはオルソログヒト可変領域座で置換された内因性免疫グロブリン可変領域座を含み、該マウスは、以下：
ａ）結合された場合に該ホモログヒト可変領域座または該オルソログヒト可変領域座に広がる、１つ以上の大きなクローン化されたゲノムフラグメントを得る工程；
ｂ）細菌相同組換えを使用して、（ａ）の該クローン化されたゲノムフラグメントを遺伝子改変し、マウス胚幹細胞における使用のための大きな標的化ベクターを作製する工程；
ｃ）（ｂ）の該大きな標的化ベクターをマウス胚幹細胞に導入して、該細胞において該内因性可変領域座を置換する工程；
ｄ）（ｃ）の該マウス胚幹細胞において対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量ＰＣＲアッセイを使用して、該内因性可変領域座が、該ホモログヒト可変領域座または該オルソログヒト可変領域座と置換されたマウス胚幹細胞を同定する、工程、
ｅ）（ｄ）の該マウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する工程；ならびに
ｆ）（ｅ）の該胚盤胞を妊娠のために代理母に導入する工程、
を包含する、方法
によって作製される、トランスジェニックマウス。
（項目３２）
トランスジェニックマウスであって、該マウスは、ホモログヒト免疫グロブリン可変領域座またはオルソログヒト免疫グロブリン可変領域座で置換された内因性免疫グロブリン可変領域座を含み、該マウスは、以下：
ａ）部位特異的組換え部位および下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該下流相同性アームは、該マウス免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、該Ｊセグメントを含まない、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位および上流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該上流相同性アームは、該マウス免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のマウスＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）のＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入する工程；
ｄ）該可変遺伝子座中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するために定量アッセイを使用して、該部位特異的組換え部位が該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に隣接する工程（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程；
ｅ）該オルソログ遺伝子座または該ホモログ遺伝子座の全部または一部に隣接する部位特異的組換え配列を含むベクターを作製する工程；
ｆ）組換えを介して、該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座が該ホモログ遺伝子座または該オルソログ遺伝子座と、全部または一部置換されるように、工程（ｄ）において同定された該真核生物中に（ｅ）の該ベクターを導入する工程；
ｇ）（ｄ）の該マウス胚幹細胞を胚盤胞に導入する工程；ならびに
ｈ）（ｅ）の該胚盤胞を妊娠のために代理母に導入する工程、
を包含する、方法
によって作製される、トランスジェニックマウス。
（項目３３）
項目３０、３１、または３２に記載のトランスジェニックマウスであって、ここで、前記免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、以下：
ａ）κ軽鎖の可変遺伝子座；
ｂ）λ軽鎖の可変遺伝子座；および
ｃ）重鎖の可変遺伝子座、
からなる群より選択される１つ以上の座を含む、トランスジェニックマウス。
（項目３４）
前記マウス胚幹細胞が、項目３１に記載の方法によって作製されたトランスジェニックマウスに由来する、項目７、８、９、１０または１２に記載の方法。
（項目３５）
前記マウス胚幹細胞が、項目３２に記載の方法によって作製されたトランスジェニックマウスに由来する、項目７、８、９、１０または１２に記載の方法。
（項目３６）
ヒト抗体を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）項目２６に記載のマウスを抗原性刺激に曝す工程であって、その結果、該マウスは該抗原に対する抗体を産生する、工程；
ｂ）該抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを単離する工程；
ｃ）活性な抗体を発現し得る細胞中で、（ｂ）の該可変領域をコードするＤＮＡをヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結する工程；
ｄ）該細胞を、該ヒト抗体を発現するような条件下で増殖させる工程；ならびに
ｅ）抗体を回収する工程、
を包含する、方法。
（項目３７）
前記細胞がＣＨＯ細胞である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
工程（ｂ）の前記ＤＮＡが、工程（ａ）中の抗原性刺激に曝された前記マウスの脾臓から作製されたハイブリドーマから単離される、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記ＤＮＡがＰＣＲによって単離される、項目３１に記載の方法。
（項目４０）
真核生物細胞において、下流が部位特異的組換え部位と隣接した内因性遺伝子座を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該座内の下流相同性アーム、該座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該下流相同性アームは、該内因性遺伝子座領域の３’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｂ）（ａ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入する工程；ならびに
ｃ）該内因性遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該内因性遺伝子座の下流が該部位特異的組換え部位と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４１）
真核生物細胞において、上流が部位特異的組換え部位と隣接した内因性遺伝子座を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該座内の上流相同性アーム、該座内の下流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該上流相同性アームは、該内因性遺伝子座領域の５’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｂ）（ａ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入する工程；ならびに
ｃ）該内因性遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該内因性遺伝子座の上流が該部位特異的組換え部位と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４２）
真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性遺伝子座を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該座内の下流相同性アーム、該座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該下流相同性アームは、該内因性遺伝子座領域の３’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位、該座内の上流相同性アーム、該座内の下流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該上流相同性アームは、該内因性遺伝子座領域の５’末端に隣接する領域を含む、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物細胞に導入する工程；ならびに
ｄ）該内因性遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該部位特異的組換え部位が該内因性遺伝子座と隣接する（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４３）
真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該可変遺伝子座内の下流相同性アーム、該可変遺伝子座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該下流相同性アームは、該免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、該Ｊセグメントを含まない、工程；
ｂ）（ａ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物に導入する工程；ならびに
ｃ）該可変遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該部位特異的組換え部位が該内因性免疫グロブリン可変遺伝子座の下流末端と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４４）
真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該座内の上流相同性アーム、該座内の下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該上流相同性アームは、該免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｂ）（ａ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物に導入する工程；ならびに
ｃ）該可変遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該部位特異的組換え部位が該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座の上流末端と隣接する（ｂ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４５）
真核生物細胞において、部位特異的組換え部位が隣接した内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を作製する方法であって、該方法は、以下：
ａ）部位特異的組換え部位、該座内の下流相同性アーム、該座内の上流相同性アームを含むＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該下流相同性アームは、該免疫グロブリン可変遺伝子座領域のＪセグメントにすぐ隣接する領域を含むが、該Ｊセグメントを含まない、工程；
ｂ）部位特異的組換え部位、該座内の上流相同性アーム、該座内の下流相同性アームを含む、ＬＴＶＥＣを作製する工程であって、
ここで、該上流相同性アームは、該免疫グロブリン可変遺伝子座領域の最も遠位のＶ遺伝子セグメントに隣接する領域を含むが、いかなるＶ遺伝子セグメントも含まない、工程；
ｃ）（ａ）および（ｂ）の該ＬＴＶＥＣを該真核生物に導入する工程；ならびに
ｄ）該可変遺伝子座における対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出するための定量アッセイを使用して、該部位特異的組換え部位が該内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と隣接する（ｃ）の真核生物細胞を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目４６）
１つの部位特異的組換え部位が隣接する、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座。
（項目４７）
部位特異的組換え部位が隣接する、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座。
（項目４８）
１つの部位特異的組換え部位が隣接する内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を含む、ＥＳ細胞。
（項目４９）
部位特異的組換え部位が隣接する内因性免疫グロブリン可変遺伝子座を含む、ＥＳ細胞。（項目５０）
項目４８または４９の細胞によって作製される、マウス。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】細菌相同組換えを使用する代表的なＬＴＶＥＣの生成の模式図である（ｈｂ１＝相同性ボックス１；ｈｂ２＝相同性ボックス２；ＲＥ＝制限酵素部位）。
【図２】マウス  ＯＣＲ１０についてのドナーフラグメントおよびＬＴＶＥＣの模式図である（ｈｂ１＝相同性ボックス１；ｌａｃＺ＝β−ガラクトシダーゼＯＲＦ；ＳＶ４０ポリＡ＝シミアンウイルス４０由来のＤＮＡフラグメント（ポリアデニル化部位およびシグナルを含む）；ＰＧＫｐ＝マウスホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）。プロモーター、ＥＭ７＝細菌プロモーター；ｎｅｏ＝ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；ＰＧＫ  ｐｏｌｙＡ＝ＰＧＫ遺伝子に由来し、ポリアデニル化部位およびシグナルを含む３’非翻訳領域；ｈｂ２＝相同性ボックス２）。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、マウスＯＣＲ１０  ｃＤＮＡ、相同性ボックス１（ｈｂ１）、相同性ボックス２（ｈｂ２）の配列であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーを定量ＰＣＲアッセイで使用して、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出した。  ｈｂ１：塩基対１〜２１１  ｈｂ２：塩基対１５８６〜１８０１  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン３に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド４１３〜４３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−５’：ヌクレオチド３９０〜４１０（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−３’：ヌクレオチド４４５〜４６１（下の鎖）  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン４に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド６０８〜６３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−５’：ヌクレオチド５８６〜６０５（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−３’：ヌクレオチド６４２〜６６２（下の鎖）
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、マウスＯＣＲ１０  ｃＤＮＡ、相同性ボックス１（ｈｂ１）、相同性ボックス２（ｈｂ２）の配列であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーを定量ＰＣＲアッセイで使用して、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出した。  ｈｂ１：塩基対１〜２１１  ｈｂ２：塩基対１５８６〜１８０１  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン３に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド４１３〜４３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−５’：ヌクレオチド３９０〜４１０（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−３’：ヌクレオチド４４５〜４６１（下の鎖）  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン４に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド６０８〜６３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−５’：ヌクレオチド５８６〜６０５（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−３’：ヌクレオチド６４２〜６６２（下の鎖）
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、マウスＯＣＲ１０  ｃＤＮＡ、相同性ボックス１（ｈｂ１）、相同性ボックス２（ｈｂ２）の配列であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーを定量ＰＣＲアッセイで使用して、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出した。  ｈｂ１：塩基対１〜２１１  ｈｂ２：塩基対１５８６〜１８０１  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン３に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド４１３〜４３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−５’：ヌクレオチド３９０〜４１０（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−３’：ヌクレオチド４４５〜４６１（下の鎖）  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン４に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド６０８〜６３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−５’：ヌクレオチド５８６〜６０５（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−３’：ヌクレオチド６４２〜６６２（下の鎖）
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、マウスＯＣＲ１０  ｃＤＮＡ、相同性ボックス１（ｈｂ１）、相同性ボックス２（ｈｂ２）の配列であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびプライマーを定量ＰＣＲアッセイで使用して、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣを使用して標的化されたＥＳ細胞中の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を検出した。  ｈｂ１：塩基対１〜２１１  ｈｂ２：塩基対１５８６〜１８０１  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン３に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド４１３〜４３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−５’：ヌクレオチド３９０〜４１０（上の鎖）    プライマー  ｅｘ３−３’：ヌクレオチド４４５〜４６１（下の鎖）  ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび対応するＰＣＲプライマーセットは、ｍＯＣＲ１０エキソン４に由来している：    ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：ヌクレオチド６０８〜６３９（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−５’：ヌクレオチド５８６〜６０５（上の鎖）    プライマー  ｅｘ４−３’：ヌクレオチド６４２〜６６２（下の鎖）
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、マウスＶＤＪ領域をヒトＶＤＪ領域で置き換えて構築した２つのＬＴＶＥＣの模式図である。  図４Ａ：ヒト重鎖遺伝子座のＶＤＪ領域全体にまたがる大きなインサート（ＢＡＣ）クローンを単離した。  図４Ｂ：この例において、相同性アームの供給源として、大きなインサート（ＢＡＣ）クローンをマウスＶＤＪ領域の末端から単離する。この相同性アームを使用して、２工程プロセスにおいてヒトＶＤＪ配列の相同組換えを介して組み込んだ。  図４Ｃ〜４Ｄ：第１の工程において、ＬＴＶＥＣ１（図４Ｄ）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細菌相同組換えにより構築する。ＬＴＶＥＣ１は、順番に以下を含む：マウスＤＪ領域から上流の領域に由来する大きなマウス相同性アーム（しかし、その絶対エンドポイントは、重要ではない）；ＥＳ細胞において機能的な選択マーカーをコードするカセット（この例では、ＰＧＫ−ネオマイシンＲ）；ｌｏｘＰ部位；いくつかのＶ遺伝子セグメントからＤＪ領域全体にまたがる大きなヒトインサート；およびマウスＪセグメントにすぐ隣接するが、このＪセグメントを含まない領域を含むマウス相同性アーム。第２の工程において、ＬＴＶＥＣ２（図４Ｃ）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細菌相同組換えにより構築する。ＬＴＶＥＣ２は、順番に以下を含む：最も遠位のマウスＶ遺伝子セグメントに隣接するが、いかなるマウスＶ遺伝子セグメントも含まない領域を含む大きなマウス相同性アーム；多数の遠位ヒトＶ遺伝子セグメントを含む大きなインサート；変異ｌｏｘＰ部位（ＬＴＶＥＣ２およびＬＴＶＥＣ１における野生型ｌｏｘＰ部位とは反対の配向にてｌｏｘＰ５１１といわれる）（この部位は、野生型ｌｏｘＰと組換わらないが、他のｌｏｘＰ５１１とは容易に組換わる）；野生型ｌｏｘＰ部位；第２の選択マーカー（この例では、ＰＧＫ−ハイグロマイシンＲ）；およびＶ領域に由来するマウス相同性アーム（しかし、その絶対エンドポイントは重要ではない）。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
（定義）
「標的化ベクター」は、所望の遺伝子改変に隣接する内因性染色体核酸配列に「相同（ホモログ）（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」な配列を含むＤＮＡ構築物である。隣接相同性配列（「相同性アーム」と称する）は、標的化ベクターを、相同性アームと対応する内因性配列との間に存在する相同性によってゲノム内の特定の染色体位置に方向付け、「相同組換え」と称されるプロセスにより、所望の遺伝子改変を導入する。
【００６２】
「相同（ホモログ）（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、２以上の核酸配列が、互いにハイブリダイズし得るかまたは分子間交換を受け得るに十分、同一または類似のいずれかである、２以上の核酸配列を意味する。
【００６３】
「遺伝子標的化」は、標的化ベクターを使用して、相同組換えを介した内因性配列への挿入、内因性配列の欠失または内因性配列の置換による、内因性染色体座の改変である。
【００６４】
「遺伝子ノックアウト」は、染色体座においてコードされた遺伝情報の破壊から生じた遺伝子改変である。
【００６５】
「遺伝子ノックイン」は、染色体座においてコードされた遺伝情報を、異なるＤＮＡ配列と置換することから生じる遺伝子改変である。
【００６６】
「ノックアウト生物」は、その生物の細胞の大部分が、遺伝子ノックアウトを有する生物である。
【００６７】
「ノックイン生物」は、その生物の細胞の大部分が、遺伝子ノックインを有する生物である。
【００６８】
「マーカー」または「選択マーカー」は、集団中の処理細胞の大部分から、選択マーカーを発現する稀なトランスフェクト細胞を単離することを可能にする選択マーカーである。このようなマーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、または蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
「ＥＳ細胞」は、胚幹細胞である。この細胞は、通常、胚盤胞期の胚の内部細胞塊に由来する。
【００７０】
「ＥＳ細胞クローン」は、ＤＮＡの導入、引き続く選択の後の、ＥＳ細胞集団の単一細胞由来の細胞の亜集団である。
【００７１】
「隣接ＤＮＡ」は、参照の特定の点と同一線上でありそして隣接する、ＤＮＡのセグメントである。
【００７２】
「ＬＴＶＥＣ」は、真核生物細胞において相同標的化を行うことを目的とされた他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きな、クローニングされたゲノムＤＮＡのフラグメント由来の、真核生物細胞についての大きな標的ベクターである。
【００７３】
「非ヒト生物」は、通常ヒトであることが公的に受容されない生物である。
【００７４】
「対立遺伝子の改変」（ＭＯＡ）は、遺伝子、またはゲノム中の染色体遺伝子座の対立遺伝子の正確なＤＮＡ配列の改変をいう。この対立遺伝子改変（ＭＯＡ）としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：単一ヌクレオチド程度の小さなヌクレオチドのわずかな欠失、置換または挿入、または多くのキロベースにわたる目的の遺伝子または染色体遺伝子座の欠失、ならびにこれらの２つの極値の間で可能な改変のいずれかおよび全て。
【００７５】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）」配列は、別の種中のその配列の機能的等価物である種由来の配列をいう。
【００７６】
とりわけ示される記載または実施例は、本発明に例証されることで提供される。当業者は、これらの実施例が本発明の例示の目的のみに提供され、限定の目的には含まれないことを、理解する。
【００７７】
（発明の詳細な説明）
本出願人らは、改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座を含む真核生物細胞を作製およびスクリーニングするための、新規で、迅速で、能率的で、そして効率的な方法を開発した。これらの細胞において、改変は、遺伝子ノックアウト、ノックイン、点変異または大きなゲノム挿入もしくは欠失、あるいは他の改変であり得る。非限定的な例示の目的で、これらの細胞は、変更、欠失および／または挿入された遺伝子の機能を決定する目的のためのノックアウト生物またはノックイン生物（特に、ノックアウトマウスまたはノックインマウス）に有用である胚性幹細胞であり得る。
【００７８】
本明細書中に記載される新規な方法は、最初に以下を組合わせる：
１．大きなクローニングされたゲノムＤＮＡフラグメント内に所望の遺伝子改変を正確に操作し、これにより真核生物細胞（ＬＴＶＥＣ）における使用のための大きな標的化ベクターを作製するための細菌性相同組換え；
２．これらのＬＴＶＥＣ細胞において対応する目的の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を改変するための、真核生物細胞へのこれらの細胞の直接導入；および
３．標的化対立遺伝子が所望されるように改変されている、まれな真核生物細胞を決定するための分析（親対立遺伝子の対立遺伝子改変（ＭＯＡ）のための定量的アッセイを含む）。
【００７９】
真核生物細胞における相同組換えを首尾よく検出するための以前の方法が、ＬＴＶＥＣ中に存在する長い相同性アームのために、本出願人らの発明のＬＴＶＥＣと組合わせて利用され得ないことは、強調されるべきである。真核生物細胞中の内因性遺伝子または染色体遺伝子座を、相同組換えを介して故意に改変するためにＬＴＶＥＣを利用することによって、まれな真核生物細胞を決定するためのアッセイの新規適用によっておそらくなされる。ここで、標的化された対立遺伝子は所望されるように改変されており、このようなアッセイとしては、親対立遺伝子の対立遺伝子改変（ＭＯＡ）のための定量的アッセイ（例えば、定量的ＰＣＲまたはＭＯＡについての他の適切な定量的アッセイを使用することによる）が挙げられる。
【００８０】
現在の方法において使用されるものより長い相同性アームを有する標的化ベクターを利用する能力は、以下の理由について極めて有益である：
１．標的化ベクターは、大きなゲノム挿入物を含む利用可能なライブラリー（例えば、ＢＡＣライブラリーまたはＰＡＣライブラリー）から、以前の技術を使用して作製される標的化ベクターより迅速かつ簡便に作製される。ここで、ゲノム挿入物は、広範に特徴付けられており、使用前に「整えられる（ｔｒｉｍ）」（以下に詳細に説明される）。さらに、最小配列情報が、目的の遺伝子座について知られていることが必要である。すなわち、相同性ボックス（以下に詳細に記載される）を作成するため、およびＭＯＡについての定量的アッセイ（以下に詳細に記載される）に使用され得るプローブを作成するために必要とされる約８０〜１００ヌクレオチドが知られていることのみが必要である。
２．より大きな改変、ならびにより長いゲノム領域にわたる改変が、以前の技術を使用するより簡便に、そしてよりわずかな工程において作製される。例えば、本発明の方法は、そのサイズ制限のために伝統的プラスミドベースの標的化ベクターによっては収容され得ない大きな遺伝子座の正確な改変を可能にする。これはまた、１工程における複数の点での任意の所定の遺伝子座の改変（例えば、複数のエキソン遺伝子の異なるエキソンでの特定の変異の導入）を可能にして、複数の標的化ベクターを操作する必要性、およびＥＳ細胞での相同組換えのための複数回の標的化およびスクリーニングを行う必要性を緩和する。
３．相同性の長い領域（長い相同性アーム）の使用は、真核生物細胞における相同組換えの標的化が標的化ベクター内に含まれる総相同性に関連するようであるという以前の知見と一致して、真核生物細胞における「標的化しにくい（ｈａｒｄ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ）」遺伝子座の標的化頻度を増加させる。
４．長い相同性アームを使用して得られた増加した標的化頻度は、これらの標的化ベクターにおいて同系のＤＮＡを使用することから、たとえあったとしても、その利点を明らかに減少させる。
５．真核生物細胞を相同組換えについてスクリーニングするための定量的ＭＯＡアッセイの適用は、標的化ベクターとしてのＬＴＶＥＣの使用を可能にするだけでなく（利点は上記に概説した）、正確に改変された真核生物細胞を同定するための時間を代表的な７日から数時間までに減少させる。さらに、定量的ＭＯＡの適用は、改変されている、内因性遺伝子または染色体遺伝子座の外側に位置されるプローブの使用を必要としない。よって、改変された遺伝子または遺伝子座に隣接する配列を知る必要性を除去する。これは、過去に行われたスクリーニングを、真核生物細胞における相同組換え事象についてスクリーニングするためにほとんど労力を要さず、そしてかなり高い費用効果的なアプローチとなさしめる、有意な改善である。
【００８１】
（方法）
本明細書中に記載されるＤＮＡベクターを構築するために使用される技術の多くは、当業者に周知である標準的な分子生物学的技術である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １，２，ａｎｄ  ３，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。全てのＤＮＡ配列決定を、ＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定機およびＴａｑ  Ｄｉｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用する標準的な技術によって行った。
【００８２】
（工程１．目的の遺伝子または染色体遺伝子座を含有する大きなゲノムＤＮＡクローンを得る）
目的の遺伝子または遺伝子座を、特定の基準（例えば、詳細な構造的データまたは機能的データ）に基づいて選択し得るか、または種々のゲノム配列決定プロジェクトの努力を介して潜在的な遺伝子フラグメントが予想されるようになるような詳細な情報の非存在下で選択し得る。重要なことは、ＬＴＶＥＣを産生させるために、目的の遺伝子の完全な配列および遺伝子構造を知って本発明の方法に適用する必要がないことを、注意するべきである。実際に、目的のゲノムクローンを得、そしてＬＴＶＥＣを作製する際に使用される相同性ボックス（以下に詳細に記載される）を作製し、そして定量性ＭＯＡアッセイにおける使用のためのプローブを作製するために必要とされる唯一の情報は、約８０〜１００ヌクレオチドである
一旦、目的の遺伝子または遺伝子座が選択されると、この遺伝子または遺伝子座を含有する大きなゲノムクローンが得られる。このクローンを、適切なＤＮＡライブラリー（例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣまたはコスミド）を標準的なハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術、あるいは当業者が精通する任意の他の方法によるスクリーニングが挙げられるがこれに限定されないいくつかの方法のいずれか１つにおいて取得し得る。
【００８３】
（工程２．改変カセットへの相同性ボックス１および２の付加ならびにＬＴＶＥＣの作製）
相同性ボックスは、クローニングされた大きなゲノムフラグメントからＬＴＶＥＣを作成するために使用される細菌性相同組換えの部位を印す（図１）。相同性ボックスは、一般には、二本鎖であり、そして少なくとも４０ヌクレオチド長であるＤＮＡの短いセグメントであり、このセグメントは、「改変されるべき領域」に隣接する、このクローニングされた大きなゲノムフラグメント内の領域に相同である。相同性ボックスは、改変されたカセットに付加され、その結果、細菌中での相同組換えに続いて、この改変カセットは、改変されるべき領域に置換する（図１）。細菌性相同組換えを使用する標的化ベクターの作製技術は、種々の系において行われ得る（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５：８５９−６５，１９９７；Ｍｕｙｒｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２７：１５５５−７，１９９９；Ａｎｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２７：ｅ１６，１９９９；Ｎａｒａｙａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９；Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：５９７８−８３，２０００）。現在使用に好ましい技術の１つの例は、ＥＴクローニング（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２０：１２３−８，１９９８；Ｎａｒａｙａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９）およびこの技術の改変（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：５９７８−８３，２０００）である。ＥＴは、相同組換え反応を実施するｒｅｃＥ（Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：３２０５−９，１９９４）およびｒｅｃＴタンパク質（Ｋｕｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８：１７−２５，１９９４）をいう。ＲｅｃＥは、線状二本鎖ＤＮＡ（実質的にはとりわけ記載されるドナーＤＮＡフラグメント）の一方の鎖を５’から３’に整え、よって３’一本鎖オーバーハングを有する線状二本鎖フラグメントの後ろに残すエクソヌクレアーゼである。この一本鎖オーバーハングは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合活性を有するｒｅｃＴタンパク質によってコートされる（Ｋｏｖａｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１８２４−７，１９９７）。ＥＴクローニングは、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴのＥ．ｃｏｌｉ遺伝子産物（Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：３２０５−９，１９９４；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ，４９：４５３−６２，１９８４；Ｎｏｉｒｏｔ  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１２２７４−８０，１９９８；Ｔｈｒｅｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２５４：３６４−７１，１９９５；Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１１：２３−３０，１９９４；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７５：２７７−８７，１９９３）、およびバクテリオファージ（λ）タンパク質λｇａｍ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７３：５８０８−２１，１９９１；  Ｐｏｔｅｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０：２０１２−２１，１９８８）を一過性に発現するＥ．ｃｏｌｉを使用して行われる。λｇａｍタンパク質は、ｒｅｃＢＣエクソヌクレアーゼ系による分解からドナーＤＮＡフラグメントを保護するために必要とされ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｈｌ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２８：４９−７０，１９９４）、そしてｒｅｃＢＣ＋宿主（例えば、しばしば使用されるＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０ｂ）における効率的なＥＴクローニングのために必要とされる。
【００８４】
細菌性相同組換えを使用して改変および置換されるべき領域は、０ヌクレオチド（もともとの遺伝子座に挿入を作製する）〜数十キロベース（もともとの遺伝子座の欠失および／または置換を作製する）の長さにわたり得る。改変カセットに基づくと、改変は以下を生じ得る：
（ａ）コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの欠失；
（ｂ）コード配列、遺伝子セグメント、または調節エレメントの変更（置換、付加、および融合（例えば、エピトープタグまたは二官能性タンパク質（例えば、ＧＦＰとの融合）の作製を含む）；
（ｃ）新たなコード領域、遺伝子セグメント、または調節エレメントの挿入（例えば、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子についてのもの）あるいは内因性転写調節下での新たな遺伝子の配置；
（ｄ）条件付き対立遺伝子の作製（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼによって切除されるべき領域に隣接するｌｏｘＰ部位（Ａｂｒｅｍｓｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｅｓｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ，２５９：１５０９−１４，１９８４）、またはＦｌｐリコンビナーゼによって切除されるべき領域に隣接するＦＲＴ部位（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４０：７９５−８０３，１９８５；Ｍｅｙｅｒ−Ｌｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ，４９：７９７−８０４，１９８４；Ｃｏｘ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８０：４２２３−７，１９８３）の導入による）；あるいは
（ｅ）異なる種由来のオルソログコード配列での、ある種からのコード配列または遺伝子セグメントの置換（例えば、マウス遺伝子座をオルソログヒト遺伝子座と置換して、ここでこれらの特定の遺伝子座が「ヒト化」される）。
【００８５】
これらの改変のいずれかまたは全てが、ＬＴＶＥＣに組み込まれ得る。特定の、非限定的な例示（ここで、内因性コード配列が完全に欠失され、そして、同時にレポーター遺伝子および選択マーカーの両方と置換されている）が、以下の実施例１に提供され、以前の技術と比較して本発明の方法の利点である。
【００８６】
（工程３（任意）．各ＬＴＶＥＣが正確に操作されていることの検証）
各ＬＴＶＥＣが正確に操作されていることの検証は、以下による：
ａ．ドナーフラグメントを、目的の遺伝子または染色体遺伝子座へ導入することによって作製された新規な連結を検証するための診断的ＰＣＲ。よって、この得られたＰＣＲフラグメントを配列決定し、ドナーフラグメントを、目的の遺伝子または染色体遺伝子座へ導入することによって作製された新規な連結をさらに検証し得る。
ｂ．細菌性相同組換えプロセスの間に所望の改変のみがＬＴＶＥＣに導入されたことを確認するための、診断的制限酵素消化。
ｃ．ドナーフラグメントを、目的の遺伝子または染色体遺伝子座へ導入することによって作製された新規な連結を検証するための、ＬＴＶＥＣ（特に、改変の部位にわたる領域）の直接配列決定。
【００８７】
（工程４．真核生物細胞への導入のための、ＬＴＶＥＣ  ＤＮＡの精製、調製および線状化）
（ａ．ＬＴＶＥＣ  ＤＮＡの調製）
選択したＬＴＶＥＣのｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ
１，２，ａｎｄ３，１９８９；Ｔｉｌｌｅｔｔ  ａｎｄ  Ｎｅｉｌａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４：５６８−７０，５７２，１９９８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／ｈａｎｄｂｏｏｋｓ／ｐｌｋｍｉｎｉ／ｐｌｍ＿３９９．ｐｄｆ）を調製し、そしてこのｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＬＴＶＥＣ  ＤＮＡを、エレクトロポレーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １，２，ａｎｄ  ３，１９８９）を使用してＥ．ｃｏｌｉに再度形質転換した。この工程は、細菌性相同組換え工程に利用される組み換えタンパク質をコードするプラスミドを除くために必要である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２０：１２３−８，１９９８；Ｎａｒａｙａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，６：４４２−７，１９９９）。（ａ）なぜならこれは、コピー数の多いプラスミドであって、大規模ＬＴＶＥＣ  ｐｒｅｐにおいて得られる収量を減少し得、（ｂ）組換えタンパク質の発現を誘導する可能性を排除するためであり；そして（ｃ）なぜなら、これは、ＬＴＶＥＣの物理的マッピングをあいまいにし得るからである。ＬＴＶＥＣを真核生物細胞に導入する前に、より多量のＬＴＶＥＣ  ＤＮＡを、標準的な方法論（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ／ｈａｎｄｂｏｏｋｓ／ｐｌｋ／ｐｌｋｌｏｗ．ｐｄｆ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １，２，ａｎｄ  ３，１９８９；Ｔｉｌｌｅｔｔ  ａｎｄ  Ｎｅｉｌａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：５６８−７０，５７２，１９９８）によって調製した。しかし、この工程は、組換えプロファージを利用する細菌性相同組換え法が使用される（すなわち、組換えタンパク質をコードする遺伝子が細菌染色体中に組み込まれる）場合、回避され得る（Ｙｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７：５９７８−８３，２０００）。
【００８８】
（ｂ．ＬＴＶＥＣ  ＤＮＡの線状化）  
真核生物細胞への導入のためにＬＴＶＥＣを調製するために、ＬＴＶＥＣを、好ましくは、長い相同性アームに隣接する、改変された内因性遺伝子または染色体遺伝子座ＤＮＡを残す様式で線状化する。これは、めったに消化しない適切な制限酵素のいずれかを用いて、ＬＴＶＥＣ、好ましくは、ベクターバックボーン中のを線状化することによって達成され得る。適切な制限酵素の例としては、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｒｆＩ、ＳｗａＩ、ＦｓｅＩなどが挙げられる。制限酵素の選択は、実験的に（すなわち、いくつかの異なる候補レアカッター（ｒａｒｅ  ｃｕｔｔｅｒ）を試験することによって）、またはＬＴＶＥＣの配列が公知である場合は、配列を分析し、そして分析に基づいて適切な制限酵素を選択することによって）決定され得る。ＬＴＶＥＣがまれな部位（例えば、ＣｏｓＮ部位）を含むベクターバックボーンを有する状況では、次いで、このような部位を認識する酵素（例えば、λターミナーゼ（Ｓｈｉｚｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：８７９４−７，１９９２；Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７５：４１９９−２０３，１９７８；Ｒａｃｋｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４０：２５９−６６，１９８５））で切断し得る。
【００８９】
（工程５．真核生物細胞へのＬＴＶＥＣの導入、およびＬＴＶＥＣの導入が首尾よく生じた場合の細胞の選択）
ＬＴＶＥＣ  ＤＮＡを、標準的な方法論（例えば、リン酸カルシウム、脂質を介するトランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １，２，ａｎｄ  ３，１９８９））を使用して真核生物細胞に導入し得る。ＬＴＶＥＣが首尾よく導入された細胞を、選択因子に曝露することによって、ＬＴＶＥＣ中に操作されている選択マーカー遺伝子に依存して選択し得る。非限定的な例として、選択マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子（Ｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９：３２７−３６，１９８２）である場合、次いで、ＬＴＶＥＣを取り込んだ細胞を、Ｇ４１８含有培地中で選択し得る：ＬＴＶＥＣを有さない細胞は死ぬが、ＬＴＶＥＣを取り込んだ細胞は、生存する（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７−５６，１９８４）。他の適切な選択マーカーとしては、真核生物細胞中で活性を有する任意の薬物（例えば、ハイグロマイシンＢ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７−５６，１９８４；Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ
Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，１５８：２３７−４３，１９８５；Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ａｎｄ  ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，Ｇｅｎｅ，８８：２８５−８，１９９０）、ブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）Ｓ（Ｉｚｕｍｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，１９７：２２９−３３，１９９１）、および当業者の精通した他のもの）が挙げられる。
【００９０】
（工程６．対立遺伝子改変（ＭＯＡ）についての定量的アッセイを使用する、真核生物細胞における相同組換え事象のスクリーニング）
目的の遺伝子座にＬＴＶＥＣを標的化することにより首尾よく改変された真核生物細胞を、目的の遺伝子座内の対立遺伝子改変を指向し得、そして相同性アーム全体にわたるアッセイに依存しない種々のアプローチを使用して同定し得る。このようなアプローチとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
（ａ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９：４３−８，１９９８）を使用する定量的ＰＣＲ；
（ｂ）分子ビーコンを使用する定量的ＭＯＡアッセイ（Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：１１０７−１１，２０００）；
（ｃ）インサイチュハイブリダイゼーションＦＩＳＨでの蛍光（Ｌａａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，９６：２７５−８０，１９９５）または比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（Ｆｏｒｏｚａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ，１３：４０５−９，１９９７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒａｙ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ，１３９−４３，１９９３；Ｈｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｃｈａｇａｎｔｉ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１４５：１２５３−６０，１９９４）；
（ｄ）等温ＤＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，１９：２２５−３２，１９９８；Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２７：ｅ３４，１９９９）；および
（ｅ）固定化プローブへの定量的ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３，１９７５；Ｋａｆａｔｏｓ  ＦＣ；Ｊｏｎｅｓ  ＣＷ；Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ  Ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ７（６）：１５４１−５２，１９７９）。
【００９１】
出願人は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲを使用して、標的化真核生物細胞を首尾よくスクリーニングする例示を、本明細書中に提供する。この非限定的例示において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用して、相同組換えを受けた真核生物を同定し、ここで、二倍体ゲノム中の２つの内因性対立遺伝子のうちの１つの部分は、別の配列に置換されている。相同性アーム全体にわたる制限フラグメントの長さにおける差異が、２つの対立遺伝子のうちの１つの改変を示す伝統的な方法とは対照的に、定量的ＴａｑＭａｎ（登録商標）法は、改変されていない対立遺伝子のコピー数の（半分だけの）減少を測定することによって一方の対立遺伝子の改変を検出する。詳細には、プローブは、改変されていない対立遺伝子を検出し、改変されている対立遺伝子を検出しない。よって、この方法は、改変の正確な特徴に依存せず、本実施例に記載される配列置換に限定されない。ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用して、ゲノムＤＮＡサンプル中のＤＮＡテンプレートのコピー数を、特に、参照遺伝子と比較することによって定量する（Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９：４３−８，１９９８）。参照遺伝子は、標的遺伝子または遺伝子座として同一のゲノムＤＮＡにおいて定量される。よって、２つのＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅（各々それぞれのプローブを有する）が行われる。一方のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、参照遺伝子の「Ｃｔ」（閾値サイクル）を決定し、他方のプローブは、首尾よく標的化することによって置換されている、標的化された遺伝子または遺伝子座の領域のＣｔを決定する。Ｃｔは、各ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブについての開始ＤＮＡの量を反映する量である（すなわち、ほとんどの配列が、閾値サイクルに達するためにＰＣＲのより多いサイクルを必要としない）。ＴａｑＭａｎ（登録商標）についてのテンプレート配列のコピー数を半分に減少することによって、約１Ｃｔ単位の増加を生じる。標的化遺伝子または遺伝子座の一方が相同組換えによって置換されている細胞でのＴａｑＭａｎ（登録商標）反応は、標的化されていない細胞由来のＤＮＡと比較する場合、参照遺伝子についてのＣｔの増加することなく標的ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応について１Ｃｔの増加を生じる。このことによって、ＬＴＶＥＣを使用して真核生物細胞に目的の遺伝子の一方の対立遺伝子の改変を容易に検出し得る。
【００９２】
上記の状態において、対立遺伝子改変（ＭＯＡ）スクリーニングは、相同組換えを受けた細胞を同定するための、一方の対立遺伝子の改変の検出する任意の方法の使用である。標的化対立遺伝子が互いに同一（相同）であることは必要とされず、マウスの異なる２つの系統を交配することによって生じる子孫の場合のように、実際に、多型を含み得る。さらに、ＭＯＡスクリーニングによってまたカバーされる、ある特定の状況は、遺伝子（例えば、性染色体、特にＹ染色体上に位置するいくつか）の標的化であり、これは、細胞中に単一のコピーとして正常に存在する。この場合において、単一の標的化対立遺伝子の改変を検出する方法（例えば、定量的ＰＣＲ、サザンブロッティングなど）を使用して、標的化事象を検出し得る。対立遺伝子が多型であるかまたは標的化細胞中の単一コピー中に存在する場合でさえ、本発明の方法を使用して、改変された真核生物細胞を作製し得る。
【００９３】
（工程８．遺伝子改変された真核生物細胞の使用）
（ａ）細胞の表現型の変化が所望される場合、工程１〜７に記載された方法によって作製された、遺伝子改変された真核生物細胞を、任意のインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて使用し得る。
【００９４】
（ｂ）工程１〜７に記載された方法によって作製された、遺伝子改変された真核生物細胞をまた、遺伝子改変を保有する生物を作製するために使用し得る。遺伝子改変された生物を、以下の異なる種々の技術（しかし、これらに限定されない）を使用することによって作製し得る：
１．改変された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）（例えば、ラットＥＳ細胞およびマウスＥＳ細胞がしばしば使用される）。ＥＳ細胞を使用して、遺伝子改変されたラットまたはマウスを、標準的な胚盤胞注入技術または凝集技術（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２５４，１９８７；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：８７−９，１９９３；Ｊｏｙｎｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２９３，１９９９）、テトラプロイド胚盤胞注入（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ，６２：１３７−４５，１９９７）または核移入およびクローニング（Ｗａｋａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６：１４９８４−９，１９９９）によって作製し得る。他の生物（例えば、ウサギ（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ，６２：１３７−４５，１９９７；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｄｅｖ，４５：４３９−４３，１９９６）またはニワトリ（Ｐａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：２３３９−４８，１９９６）あるいは他の種）由来のＥＳ細胞はまた、本発明の方法を使用する遺伝子改変に従うべきである。
【００９５】
２．改変されたプロトプラストは、遺伝的に改変された植物を作製するために用いられ得る（例えば、米国特許第５，３５０，６８９号「プロトプラストまたはプロトプラスト由来細胞から再生されるトウモロコシ植物およびトランスジェニックトウモロコシ植物」、米国特許第５，５０８，１８９号「培養された孔片細胞プロトプラストからの植物の再生」、およびこれらの参考文献を参照のこと）。
【００９６】
３．改変された対立遺伝子を有するクローン化生物体を作製するための、改変された真核生物細胞から卵母細胞への核移入（Ｗａｋａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６：１４９８４−９，１９９９；Ｂａｇｕｉｓｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７：４５６−６１，１９９９；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ，１０：６３９−４３，１９９８；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３８５：８１０−３，１９９７；Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２４：１０８−９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，３９４：３６９−７４，１９９８；Ｒｉｄｅｏｕｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２４：１０９−１０，２０００；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３８０：６４−６，１９９６）。
【００９７】
４．操作された染色体の移動を含む、改変された対立遺伝子を別の細胞に移入させるための細胞融合、および改変された対立遺伝子または操作された染色体を有する生物体を産生するためのこのような細胞の使用（Ｋｕｒｏｉｗａら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：１０８６−１０９０，２０００）。
【００９８】
５．本発明の方法はまた、用いられているか、または、まだ発見されていない、他の任意のアプローチに受け入れられる。
【００９９】
本発明の方法の個々の工程を実行する際に使用される多くの技術は、当業者によく知られているが、本出願人は、本発明の方法の新規性が、真核生物細胞にＬＴＶＥＣを直接導入して、染色体座を改変する、以前に記載されたことのない方法と、適切に改変された真核生物細胞を同定するための定量的ＭＯＡアッセイの使用とを組み合わせた、工程および技術の独自の組み合わせにあることを主張する。この新規組み合わせは、内因性の遺伝子または染色体遺伝子座の改変を有する生物を作製するための、先行技術を上回る有意な改善を示す。
【実施例】
【０１００】
（実施例１：ＯＣＲ１０遺伝子の欠失を有するマウスＥＳ細胞の操作）
（ａ．ｍＯＣＲ１０を含む大きなゲノムＤＮＡクローンの選択）
マウスＯＣＲ１０（ｍＯＣＲ１０）遺伝子のコード配列を含んだ大きなゲノムＤＮＡフラグメントを保有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを、ＰＣＲを使用して、整列されたマウスゲノムＤＮＡのＢＡＣライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）をスクリーニングすることによって獲得した。このライブラリーをスクリーニングするために使用したプライマーは、ｍＯＣＲ１０遺伝子のｃＤＮＡ配列に由来した。
【０１０１】
使用した２つのプライマー対は、以下であった：
（ａ）ＯＣＲ１０．ＲＡＡ（５’−ＡＧＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＧＧＧＣＡＧ−３’）およびＯＣＲ１０．ＰＶＩｒｃ（５’−ＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧ−３’）、これらは、１０２ｂｐのＤＮＡを増幅する；ならびに
（ｂ）ＯＣＲ１０．ＴＤＹ（５’−ＧＡＣＣＴＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡＣＴＡＣ−３’）およびＯＣＲ１０．ＱＥＴｒｃ（５’−ＡＣＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＧ−３’）、これらは、１５００ｂｐのＤＮＡを増幅する。
【０１０２】
このｍＯＣＲ１０  ＢＡＣは、完全なｍＯＣＲ１０コード配列を含む、約１８０ｋｂのゲノムＤＮＡを含んだ。このＢＡＣクローンを使用して、ＬＴＶＥＣを作製し、続いて、これを使用して、開始コドンがＯＣＲ１０の開始コドンで正確に置換されたレポーター遺伝子を導入し、同時にこのレポーター遺伝子の後ろに、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞の両方において選択するのに有用な選択マーカー遺伝子を挿入しながら、ｍＯＣＲ１０のコード領域の一部を欠失させた（図２）。レポーター遺伝子（この非限定的な例において、ＬａｃＺ、この配列は、当業者に容易に入手可能である）は、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードする。ＬａｃＺ（その開始コドンは、ｍＯＣＲ１０の開始コドンと同じ位置である）の挿入位置に起因して、ＬａｃＺでの類似の置換が先行技術を使用して実行された他の例において観察されたように（「Ｇｅｎｅ  ｔｒａｐ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ」、Ｗ  ＷｕｒｓｔおよびＡ．Ｇｏｓｓｌｅｒ、Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９を参照のこと）、ｌａｃＺの発現は、ｍＯＣＲ１０の発現を模倣するはずである。ＬａｃＺ遺伝子は、その発現パターンをインサイチュで明らかにし得る、単純かつ標準的な酵素アッセイが実行されるのを可能にし、従って、置換された遺伝子または染色体遺伝子座の正常な発現パターンを反映する代理アッセイを提供する。
【０１０３】
（ｂ．ドナーフラグメントの構築およびＬＴＶＥＣの作製）
ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣの構築において使用される改変カセットは、ｌａｃＺ−ＳＶ４０ポリＡ−ＰＧＫｐ−ＥＭ７−ｎｅｏ−ＰＧＫポリＡカセットであり、ここでｌａｃＺは、上記のようなマーカー遺伝子であり、ＳＶ４０ポリＡは、シミアンウイルス４０由来のフラグメントであり（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９：１５７−６４、１９７６；Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２５３：１６１３−８、１９７８；Ｄｈａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、７１：３７１−５、１９７４；Ｒｅｄｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００：４９４−５０２、１９７８）、そしてポリアデニル化部位およびシグナルを含み（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、Ｐｒｏｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９：１５７−６４、１９７６；Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２５３：１６１３−８、１９７８；Ｄｈａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、７１：３７１−５、１９７４；Ｒｅｄｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００：４９４−５０２、１９７８）、ＰＧＫｐは、マウスホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターであり（Ａｄｒａら、Ｇｅｎｅ、６０：６５−７４、１９８７）（これは、哺乳動物細胞における薬物耐性遺伝子の発現を駆動するために広く使用されてきた）、ＥＭ７は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子の発現を駆動することによって、細菌中の、完成したＬＴＶＥＣ構築物のポジティブ選択を可能にする利点を有する、強力な細菌プロモーターであり、ｎｅｏは、原核生物細胞におけるカナマイシン耐性および真核生物細胞におけるＧ４１８耐性を付与する選択マーカーであり（Ｂｅｃｋら、Ｇｅｎｅ、１９：３２７−３６、１９８２）、そしてＰＧＫポリＡは、ＰＧＫ遺伝子由来の３’非翻訳領域であり、ポリアデニル化部位およびシグナルを含む（Ｂｏｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｔ、２８：２９９−３０８、１９９０）。
【０１０４】
ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣを構築するために、改変カセット中のＬａｃＺ遺伝子の上流に結合したｍＯＣＲ１０相同性ボックス１（ｈｂ１）、および改変カセット中のｎｅｏ−ＰＧＫポリＡ配列の下流に結合したｍＯＣＲ１０相同性ボックス２（ｈｂ２）からなる第一のドナーフラグメント（図２）を、標準的な組換え遺伝子操作技術を使用して作製した。相同性ボックス１（ｈｂ１）は、ｍＯＣＲ１０のオープンリーディングフレーム（ｍＯＣＲ１０  ＯＲＦ）の開始メチオニンの直ぐ上流の、２１１ｂｐの非翻訳配列からなる（図３Ａ〜３Ｄ）。相同性ボックス２（ｈｂ２）は、終止コドンで終わる、ｍＯＣＲ１０  ＯＲＦの最後の２１６ｂｐからなる（図３Ａ〜３Ｄ）。
【０１０５】
続いて、細菌相同組換えを用いて（Ｚｈａｎｇら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、２０：１２３−８、１９９８；Ａｎｇｒａｎｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、２７：ｅ１６、１９９９；Ｍｕｙｒｅｒｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２７：１５５５−７、１９９９；Ｎａｒａｙａｎａｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、６：４４２−７、１９９９；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄｓ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９７：５９７８−８３、２０００）、このドナーフラグメントを使用して、ｍＯＣＲ１０コード領域（開始メチオニンから終止コドンまで）を挿入カセットで正確に置換し、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣの構築を生じた（図２）。従って、このｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣにおいて、ｍＯＣＲ１０コード配列を、挿入カセットによって置換して、ｍＯＣＲ１０遺伝子座における約２０ｋｂの欠失を作製し、一方で約１３０ｋｂの上流相同性（上流相同性アーム）および３２ｋｂの下流相同性（下流相同性アーム）を残した。
【０１０６】
ＬＴＶＥＣが、先行技術を使用して作製された標的化ベクターよりも、入手可能なＢＡＣライブラリーからより迅速かつ簡便に作製され得る（なぜなら、単一の細菌相同組換え工程のみが必要であり、必要な配列情報は、相同性ボックスを作製するために必要な配列情報のみであるからである）ことに注意することが重要である。対照的に、細菌相同組換えを使用して標的化ベクターを作製するための先行技術のアプローチは、ＥＳ細胞への導入の前に、大きな標的化ベクターが「トリミング」される必要がある（Ｈｉｌｌら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６４：１１１−３、２０００）。先行技術のアプローチによって利用されるスクリーニング方法に対応するために、十分短い相同性アームを作製することが必要なので、このトリミングは必要とされる。Ｈｉｌｌらの方法の１つの主な欠点は、２つのさらなる相同組換え工程が、単にトリミングのために必要とされることである（１つの工程は、改変された遺伝子座の上流領域をトリミングし、１つの工程は、改変された遺伝子座の下流領域をトリミングする）。これを行うために、実質的により多くの配列情報（トリミング部位にわたる配列情報を含む）が必要とされる。
【０１０７】
さらに、上記の実施例によって例示される別の明らかな利点は、ｍＯＣＲ１０遺伝子にわたる非常に大きな欠失（約２０ｋｂ）が、単一工程において容易に作製され得ることである。対照的に、先行技術を使用して同じ作業を達成することは、いくつかの工程を必要とし得、そしてＣｒｅリコンビナーゼを使用して、真核生物細胞において改変された遺伝子座の導入後にｌｏｘＰ部位が隣接する配列を除去するために、ｌｏｘＰ部位を有するコード配列の上流および下流の領域を作製する工程を含み得る。このことは、１工程では達成不能であり得、従って、異なる選択マーカーを使用する２つの標的化ベクターの構築、およびＥＳ細胞における２つの連続する標的化事象（１つの事象は、コード配列の上流領域にｌｏｘＰ部位を導入すること、そして他方の事象は、コード配列の下流領域にｌｏｘＰ部位を導入すること）を必要とし得る。相同組換えの達成頻度は、比較的短い相同性アームが隣接する大きな欠失を含む標的化ベクターを使用する場合、低い可能性があるので、大きな欠失の作製は、しばしば、真核生物細胞における先行の標的化技術を使用すると、低い効率で生じることもさらに注意されるべきである。本発明の方法（以下を参照のこと）を使用して得られる高い効率は、真核生物細胞における相同組換えの割合を増大させる、ＬＴＶＥＣ中に存在する非常に長い相同性アームに起因する。
【０１０８】
（ｃ．ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣ  ＤＮＡの確認、調製およびＥＳ細胞への導入）
挿入カセットおよび相同性配列の連結部の周辺の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣのサイズを、制限分析、その後のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によって確認した（Ｃａｎｔｏｒら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ、１７：２８７−３０４、１９８８；ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＣａｎｔｏｒ、Ｃｅｌｌ、３７：６７−７５、１９８４）。ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣの標準的なラージスケールのプラスミド調製を行って、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩ（これは、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣのベクター骨格を切断する）で消化して、直鎖状ＤＮＡを作製した。続いて、線状化されたＤＮＡを、エレクトロポレーションによって、マウスＥＳ細胞に導入した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２５４、１９８７；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、１巻、２巻および３巻、１９８９）。ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣで首尾よくトランスフェクトされたＥＳ細胞を、標準的な選択方法を使用して、Ｇ４１８含有培地中で選択した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２５４、１９８７；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９）。
【０１０９】
（ｄ．対立遺伝子の定量的改変（ＭＯＡ）アッセイを使用する、標的化ＥＳ細胞クローンの同定）
２つの内因性ｍＯＣＲ１０遺伝子のうち１つが改変カセット配列によって置換されたＥＳ細胞を同定するため、個々のＥＳ細胞クローン由来のＤＮＡを、標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）方法論を、記載されたように使用する定量的ＰＣＲによって分析した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、カタログ番号Ｐ／Ｎ４３０４４３７；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３０４４４９．ｐｄｆもまた参照のこと）。使用したプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、図３Ａ〜３Ｄに記載の通りである。合計６９個の個々のＥＳ細胞クローンをスクリーニングし、そして３個のクローンが陽性として、すなわち、内因性ｍＯＣＲ１０コード配列の１つが、上記の改変カセットによって置換されたクローンとして、同定された。
【０１１０】
ＭＯＡアプローチのいくつかの利点が明らかである：
（ｉ）改変されている遺伝子座の外側のプローブの使用を必要としない。従って、改変された遺伝子座に隣接する配列を知る必要を排除する。
【０１１１】
（ｉｉ）以前の選り抜きの方法であった従来のサザンブロット方法論（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２５４、１９８７；Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９）と比較して、実行するために必要な時間が非常に短い。従って、正確に改変された細胞を同定するための時間を、代表的には数日間からほんの数時間に減少させる。
【０１１２】
これは、過去にスクリーニングが実行された方法における有意な改善であり、この方法を、真核生物細胞における相同組換え事象についてスクリーニングするための、労力集約がかなり少なく、かつコスト効率のよいアプローチにしている。
【０１１３】
本発明の方法のなお別の利点は、難しい遺伝子座を標的化する能力に起因してもまた、先行技術より優れていることである。先行技術を使用すると、特定の遺伝子座についての首尾よい標的化頻度は、２０００の組み込み事象のうち１、おそらくそれより低い頻度でさえあり得ることが示された。本発明の方法を使用して、本出願人は、このような難しい遺伝子座が、長い相同性アーム（すなわち、先行技術によって可能な長さよりも長い）を含むＬＴＶＥＣを使用して、より効率的に標的化され得ることを実証した。上記の非限定的な実施例が実証するように、本出願人は、ＯＣＲ１０遺伝子座（この遺伝子座は、従来技術を使用する標的化が困難であることが以前に証明された）を標的化した。本発明の方法を使用して、本出願人は、ｍＯＣＲ１０  ＬＴＶＥＣ（１６０ｋｂより長い相同性アームを含み、２０ｋｂの欠失を導入する）が組み込まれた６９個のＥＳ細胞クローンのうち３個において、首尾よい標的化を得たが、一方、ＥＳ細胞標的化の先行技術（Ｊｏｙｎｅｒ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、２９３、１９９９）を使用すると、１０〜２０ｋｂより短い相同性アームを有し、一方でまた１５ｋｂ未満の欠失を導入する、プラスミドベースのベクターを使用して、ベクターの６００を超える構成要素のうち、標的化事象は同定されなかったことを示した。これらのデータは明らかに、本発明の方法が、先行技術よりも優れていることを実証する。
【０１１４】
（実施例２：ＬＴＶＥＣが標的化ベクターとして使用される場合の、増大した標的化頻度および同質遺伝子ＤＮＡを使用する必要性の撤廃）
上記のように、長い相同性アームを使用して得られた増大した標的化頻度は、存在する場合、ＬＴＶＥＣを構築する際の、標的化される真核生物細胞のＤＮＡと同質遺伝子の（すなわち、このＤＮＡの配列と同一の）ゲノムＤＮＡを使用することに由来する利点を低減するはずである。この仮説を試験するため、本出願人は、標的化されるべき真核生物細胞と同じマウス副系統に由来するゲノムＤＮＡ（おそらく同質遺伝子）を使用して、多数のＬＴＶＥＣを構築し、そして標的化されるべき真核生物細胞と異なるマウス副系統に由来するゲノムＤＮＡ（おそらく非同質遺伝子）を使用して、多数の他のＬＴＶＥＣを構築した。ＬＴＶＥＣの２つの組は、１〜１３％の範囲の類似の標的化頻度を示した（表１）。このことは、ＬＴＶＥＣを使用した首尾よい標的化の割合が、遺伝子同質性に依存しないことを示す。
【０１１５】
（表１）
（ＢＡＣクローンベクターを用いる遺伝子標的化の概要）
【０１１６】
【表１】
2014176391.tif 000002
要約すると、ＥＳ細胞における相同組換え事象についてのＭＯＡスクリーニングと組合わせた、ＬＴＶＥＣを作製し、これらを標的ベクターとして直接使用するアプローチは、遺伝子改変した遺伝子座を操作するための新規の方法を作成する。この方法は、迅速で、安価であり、そして使用の際に、以前の冗長な、時間のかかる方法よりも有意な改善を示す。従って、以前の方法論により必要とされる時間および費用のほんの少しで、生物体のゲノム中の本質的に任意のおよび全ての遺伝子の、迅速な大スケールのインビボでの機能的ゲノム分析の可能性を開く。
【０１１７】
（実施例３：キメラ抗体およびヒト抗体を産生するためのＬＴＶＥＣの使用）
（ａ．導入）
抗体は、２つの鎖（軽鎖および重鎖）から構成され、これらの鎖の各々は、２つのドメイン（可変ドメインおよび定常ドメイン）から構成される。抗体タンパク質の可変領域は、抗体のＮ末端部分であり、この部分は抗原に結合する。重鎖可変ドメインは、重鎖可変遺伝子の遺伝子座のＤＮＡによりコードされ、この遺伝子座は、可変（Ｖ）遺伝子セグメント、多様性（Ｄ）遺伝子セグメント、および連結（Ｊ）遺伝子セグメントから構成される。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変遺伝子の遺伝子座（κおよびλ）のＤＮＡによりコードされ、この遺伝子座は、可変（Ｖ）遺伝子セグメントおよび連結（Ｊ）遺伝子セグメントから構成される。
【０１１８】
Ｂ細胞の初期の発達の間の可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）遺伝子の再構成は、最初の機構であり、これにより、免疫系は、遭遇し得る莫大な数の抗原を認識し得る抗体を産生する。本質的に、Ｂ細胞発達の間のＤＮＡ再構成を通じて、莫大なレパートリーの可変（ＶＤＪ／ＶＪ）領域の配列をアセンブルし、次いで、これを、定常（Ｃ）領域に連結して、完全な重鎖および軽鎖を作製し、この重鎖および軽鎖をアセンブルして抗体を形成する。機能的抗体をアセンブルした後、第２のリンパ器官を生じる体細胞過剰変異は、生物体が抗体のアフィニティーを選択および最適化し得るさらなる多様性を導入する。
【０１１９】
非ヒト種における種々の抗原に対する抗体の産生は、ヒト治療剤として用いられ得る抗体の大規模産生についての大きな見込みを最初に提供した。しかし、種の違いは、外来の抗体を不活化し、そしてアレルギー反応を引き起こすヒトによる抗体の産生を導く。抗体を「ヒト化」し、それにより、ヒトにおいて外来物として認識される可能性が低い抗体を作製する試みが、引き続いてなされた。初めに、この手順は、マウス由来の抗体の抗原結合部位を、ヒト抗体の定常領域と組合わせ、それにより、ヒトにおいて免疫原性が低い組換え抗体を作製することに関した。開発された第２のアプローチは、ファージディスプレーであり、これにより、ヒトＶ領域は、ファージディスプレーライブラリーへとクローン化され、そして適切な結合特性を有する領域が、ヒト定常領域に連結され、ヒト抗体を作製する。しかし、この技術は、Ｂ細胞において天然で生じる、抗体発達およびアフィニティーの成熟の不足により、制限される。
【０１２０】
より最近では、内因性遺伝子をマウスでノックアウトし、そして遺伝子を、ヒト対応物と交換して、完全にヒト抗体を産生している。残念なことに、これらの構築物の使用は、Ｂ細胞における抗体の発達および最適化における、内因性定常領域の重要性が強調されている。完全なヒト抗体を産生するマウスは、免疫応答が低下されている。このことは、マウスの対応物と比べてアフィニティーが低下されている、完全なヒト構築物を有するトランスジェニックマウスにより産生されるヒト抗体に起因し得る。低下したアフィニティーは、Ｂ細胞成熟および生存をもたらし得る。従って、マウスまたは他の生物体においてヒト化抗体を産生するより称賛される方法（この方法において、マウスの内因性の可変領域および定常領域をノックアウトし、そしてヒト対応物と交換する）は、最適な抗体を生じ得ない。
【０１２１】
キメラ抗体（ヒト可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）とマウス定常領域とをＢ細胞成熟の間に利用し、その後、この抗体は、そのマウス定常領域をそのヒト対応物で置換されるよう操作される）の使用が、示唆されている（１９９８年６月２３日発行の米国特許第５，７７０，４２９号）。しかし、このようなキメラを作製するために現在まで存在している唯一の方法論は、トランススイッチであり、この方法論において、そのキメラの形成は、重鎖においてのみ生じるほんの稀な事象である。従来、トランスジェニック動物において、セグメント群をコードする可変遺伝子全体をヒト遺伝子で大規模に置換し、それにより重鎖および軽鎖の両方でキメラを作製する機構は、存在しない。本明細書中に開示される本出願人の方法論を使用すると、キメラ抗体が作製され、その後、このキメラ抗体は、標準的方法論を介して、高親和性ヒト抗体を作製するように変化され得る。
【０１２２】
（ｂ．簡単な説明）
ヒト可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）およびマウス定常領域を含むハイブリッド抗体を産生する、トランスジェニックマウスが、作製される。これは、そのマウス可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）遺伝子群をそれらのヒト対応物で直接インサイチュにて置換することによって、達成される。生じるハイブリッド免疫グロブリン座は、そのハイブリッド抗体を産生するように、Ｂ細胞発生の間に天然の再配列プロセスを受ける。
【０１２３】
その後、完全にヒト化した抗体が、そのマウス定常領域を所望のヒト対応物で置換することによって、作製される。このアプローチは、以前の方法（例えば、マウスモノクローナル抗体の「ヒト化」またはＨｕＭａｂマウスにおける完全にヒト化した抗体の産生）よりもかなり効率良く、治療抗体を生じる。さらに、この方法は、以前の方法が失敗してきた多くの抗原に対する治療抗体の産生に成功する。このマウスは、ヒト（ＶＤＪ／ＶＪ）−マウス定常領域である抗体を産生し、このことは、完全にヒト化した抗体を産生する以前に利用可能であったＨｕＭＡｂマウスを越える、以下の利点を有する。この新規なマウスにより産生される抗体は、そのマウスのＢ細胞レセプター複合体の他の成分（適切なＢ細胞分化に必要なシグナル伝達成分（例えば、ＩｇａおよびＩｇｂ）を含む）と、より効率良く相互作用するマウスＦｃ領域を保持する。さらに、このマウスＦｃ領域は、マウス細胞、補体分子などの上のＦｃレセプターとそのマウスＦｃ領域との相互作用において、ヒトＦｃ領域よりも特異的である。これらの相互作用は、強力かつ特異的な免疫応答のため、Ｂ細胞の増殖および成熟のため、ならびに抗体の親和性成熟のために、重要である。
【０１２４】
ヒトＶ−Ｄ−Ｊ／Ｖ−Ｊ領域によるそのマウス座の等価な領域の直接置換が存在するので、適切な転写、組換え、および／またはクラススイッチに必要な配列のすべてが、インタクトなままである。例えば、そのマウス免疫グロブリン重鎖イントロンエンハンサー（Ｅｍ）は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびＢ細胞発生の初期段階の間の重鎖遺伝子発現に重要であることが示されているが［Ｒｏｎｉａ，Ｄ．，Ｂｅｒｒｕ，Ｍ．およびＳｈｕｌｍａｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９：７０３１〜７０４０（１９９９）］、その免疫グロブリン重鎖３’エンハンサー領域は、クラススイッチ［Ｐａｎ，Ｑ．，Ｐｅｔｉｔ−Ｆｒｅｒｅ，Ｃ．，Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ，Ｊ．およびＨａｍｍａｒｓｔｒｏｍ，Ｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：１０１９−１０２９（２０００）］ならびにＢ細胞分化の後期段階での重鎖遺伝子発現のために重要であるようである［Ｏｎｇ，Ｊ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｓ．Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．，およびＥｃｋｈａｒｄｔ，Ｌ．Ａ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：４８９６−４９０３（１９９８）］。その転写制御エレメントのこれらの様々であるが重要な機能を考慮すると、これらの配列をインタクトなまま維持することが、望ましい。
【０１２５】
正常なＢ細胞分化過程の間に免疫グロブリン座で生じる必要な組換え事象は、これらの座が不適切な染色体に挿入されるかまたは現在利用可能なマウスにおけるように多コピーで挿入される場合に、異常で非生産的な免疫グロブリン再配列の頻度を増加し得る。生産的免疫グロブリン再配列の減少により、従って、特定のＢ細胞発生段階での適切なシグナル伝達により、異常な細胞が排除される。初期発生段階でのＢ細胞数の減少は、全体的最終Ｂ細胞集団を減少させ、そのマウスの免疫応答を非常に制限する。（現在利用可能なマウスにおける、変異免疫グロブリン座と対照的に、ヒトトランスジェニック座が、重鎖および軽鎖について異なる染色体位置に組み込まれている）唯一のキメラの重鎖座または軽鎖座のみが存在するので、非生産的再配列または治療上不適切なキメラ抗体を生じ得る座のトランススプライシングもトランス再配列も存在しない（Ｗｉｌｌｅｒｓ，Ｊ．，Ｋｏｌｂ，Ｃ．およびＷｅｉｌｅｒ，Ｅ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００：１５０−１６４（２０００）；Ｆｕｊｉｅｄａ，Ｓ．，Ｌｉｎ，Ｙ．Ｑ．，Ｓａｘｏｎ，Ａ．およびＺｈａｎｇ，Ｋ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：３４５０−３４５９（１９９６））。
【０１２６】
真のマウス染色体免疫グロブリン座中へのヒトＶ−Ｄ−Ｊ領域またはＶ−Ｊ領域の置換は、実質的により安定であり、現在利用可能なマウスと比較して、子孫への伝達率が増加し、そしてＢ細胞遺伝子型のモザイク現象が減少する（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．，Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．，Ｕｅｊｉｍａ，Ｈ．，Ｏｈｇｕｍａ，Ａ．，Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．，Ｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．およびＩｓｈｉｄａ，Ｉ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９７：７２２−７２７（２０００））。さらに、インビボでの真のマウス座へのヒト可変領域（ＶＤＪ／ＶＪ）の導入は、適切な時期の組換え事象に重要であることが以前に示されている、染色体接近性の適切な全体調節を維持する（Ｈａｉｎｅｓ，Ｂ．Ｂ．およびＢｒｏｄｅｕｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８：４２２８−４２３５（１９９８））。
【０１２７】
ヒト抗体のうちの約１／３は、λ軽鎖を含み、対して、マウス抗体のうちの１／２０のみがλ軽鎖を含む。従って、マウスλ軽鎖Ｖ−Ｊ配列を、ヒト座由来のλ軽鎖Ｖ−Ｊ配列で置換することは、抗体のレパートリーを増加し、そして真のヒト免疫応答とより密接に一致するために役立ち、従って、治療上有用な抗体を含む可能性を増加させる。
【０１２８】
ヒト配列を真マウス免疫グロブリン座中に組み込むさらなる利点は、その挿入部位に変異原性破壊を生じ得、そして生存するホモ接合体マウスの単離を阻止し得る、新規な組み込み部位に導入されないことである。これは、繁殖中のマウス群の作製および維持を非常に簡単にする。
【０１２９】
以下は、上記の利点のすべてを備える抗体を作製するための新規な方法を提供する。当業者は、本明細書中に記載される一般的方法が、等価な結果を生じるように改変され得ることを、認識する。
【０１３０】
（Ｃ．材料および方法）
マウス重鎖可変領域（ＶＤＪ）をヒト対応物で正確に置換することは、以下の例における相同組換えと部位特異的組換えの組み合わせを使用して例証され、この例は、２段階プロセスを使用する。当業者は、マウス座を、ヒトホモログ座またはオルソログヒト座で置換することが、１つ以上の工程で達成され得ることを、認識する。従って、本発明は、マウス座の全体または一部を、相同組換えを介して、各組み込みにより置換することを企図する。
【０１３１】
ヒト重鎖座のＶＤＪ領域全体に広がる大インサート（ＢＡＣ）クローンを、単離する（図４Ａ）。この領域全体の配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋファイル（ＡＢ０１９４３７、ＡＢ０１９４３８、ＡＢ０１９４３９、ＡＢ０１９４４０、ＡＢ０１９４４１、Ｘ９７０５１、およびＸ５４７１３）にて入手可能である。この例において、大インサート（ＢＡＣ）クローンは、相同性アームの供給源として、マウスＶＤＪ領域の末端から単離し（図４Ｂ）、この末端を、２段階プロセスにおけるヒトＶＤＪ配列の相同組換えを介して直接組み込みに使用する。
【０１３２】
第１段階において、ＬＴＶＥＣ１（図４Ｄ）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細菌相同組換えにより構築する。ＬＴＶＥＣ１は、順番に、マウスＤＪ領域から上流にある領域に由来する大マウス相同性アーム（しかし、その絶対的端部は重要ではない）；ＥＳ細胞において機能する選択マーカー（この例においてはＰＧＫ−ネオマイシンＲ）をコードするカセット；ｌｏｘＰ部位；いくつかのＶ遺伝子セグメントからＤＪ領域全体にまで広がる、大ヒトインサート；およびマウスＪセグメントとすぐ近接するがこのセグメントは含まない領域を含む、マウス相同性アーム；を含む。この下流アームの５’末端およびｌｏｘＰ部位の配置は、置換されるべき領域の３’末端を、この座中に規定する。マウスＥＳ細胞を、標準的技術（例えば、エレクトロポレーション）によって、線状化ＬＴＶＥＣ１で形質転換する。ＬＴＶＥＣ１の直接導入は、内因性可変遺伝子座の改変を生じるので、ネオマイシン耐性コロニーを、ＭＯＡアッセイを使用して正確な標的化についてスクリーニングし得る。これらの標的化ＥＳ細胞は、ハイブリッド重鎖を含む抗体を産生するマウスを生じ得る。しかし、このマウス可変セグメントの残りを排除するその後の段階を続行することが、好ましい。
【０１３３】
第２段階において、ＬＴＶＥＣ２（図４Ｃ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中にて、細菌相同組換えによって構築する。ＬＴＶＥＣ２は、順番に、最も遠位のマウスＶ遺伝子セグメントと近接するがいかなるマウスＶ遺伝子セグメントも含まない、領域を含む大マウス相同性アーム；多数の遠位ヒトＶ遺伝子セグメントを含む大インサート；（ＬＴＶＥＣ２およびＬＴＶＥＣ１中の野生型ｌｏｘＰ部位と反対の方向にある）ｌｏｘ５１１と呼ばれる変異体ｌｏｘＰ部位［Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．，Ｗｉｅｒｚｂｉｃｋｉ，Ａ．およびＡｂｒｅｍｓｋｉ，Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：２２８７−２３００（１９８６）］（この部位は、野生型ｌｏｘＰ部位と組換わらないが、他のｌｏｘ５１１部位と容易に組み換わる）；野生型ｌｏｘＰ部位；第２選択マーカー（この例においてはＰＧＫ−ピューロマイシンＲ）およびＶ領域に由来する、マウス相同性アーム（しかし、その絶対的端部は重要ではない）；を含む。この上流相同性アームの３’末端およびｌｏｘＰ部位の配置は、置換されるべき領域の５’末端を、この座中に規定する。その後、ＬＴＶＥＣ１で正確に標的化されたマウスＥＳ細胞を、標準的技術によって、線状化ＬＴＶＥＣ２で形質転換し、そしてハイグロマイシン耐性コロニーを、内因性可変遺伝子座における改変について、ＭＯＡアッセイを使用して正確な標的化についてスクリーニングする。この形質転換から生じる正確に標的化されたＥＳ細胞を、本明細書中で、以後、「二重標的化ＥＳ細胞」と呼ぶ。
【０１３４】
その後の、この二重標的化ＥＳ細胞におけるＣＲＥリコンビナーゼの一過性発現は、マウスＶ領域の残りの欠如を生じる。あるいは、この二重標的化ＥＳ細胞を、キメラマウスの作製のために、宿主胚盤胞中に注入し得る。生じたキメラマウスを、発生初期にＣＲＥリコンビナーゼを発現するマウスと交配させると、子孫Ｆ１において、マウスＶ領域の残りの欠如を生じる。この後者の選択肢は、ハイブリッド重鎖座が、生殖細胞系を通過する可能性を増加させる。なぜなら、これは、より少ない世代の間ＥＳ細胞を培養する工程を包含するからである。
【０１３５】
ＬＴＶＥＣ２中にｌｏｘ５１１を含めると、ハイブリッド座中へのさらなるヒトＶ遺伝子セグメントの挿入が可能である。１つのアプローチは、多くのさらなるヒトＶ遺伝子セグメントを含む大ゲノムＤＮＡクローンをｌｏｘ５１１部位およびｌｏｘＰ部位と隣接するように、細菌相同組換えを使用することである。このような改変大ゲノムＤＮＡクローンを、ＣＲＥリコンビナーゼを一過性発現するプラスミドとともに、二重標的化ＥＳ細胞中に同時形質転換すると、カセット交換によって、このさらなるＶ遺伝子セグメントの導入を生じる（Ｂｅｔｈｋｅ，Ｂ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：２８２８−２８３４（１９９７））。
【０１３６】
さらなるＶ遺伝子セグメントを組み込むための第２のアプローチは、多くのさらなるヒトＶ遺伝子セグメントを含む大ゲノムＤＮＡクローンを、例えば、ＬＴＶＥＣ２中に含まれる同じマウス相同性アームを使用して、マウス座中に独立して標的化することである。この場合、このさらなるヒトＶ遺伝子セグメントは、ｌｏｘ５１１部位およびｌｏｘＰ部位と隣接しており、その標的化ＥＳ細胞を、マウスを作製するために使用する。二重標的化ＥＳ細胞由来のマウスおよびこのさらなるＶ遺伝子セグメントを含むＥＳ細胞由来のマウスを、減数分裂の間にＣＲＥリコンビナーゼの発現を指向する第３のマウスと交配する。減数分裂対合の間のその２つの組換え座の近接性によって、他の系（Ｈｅｒａｕｌｔ，Ｙ．，Ｒａｓｓｏｕｌｚａｄｅｇａｎ，Ｍ．，Ｃｕｚｉｎ．Ｆ．およびＤｕｂｏｕｌｅ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：３８１−３８４（１９９８））において観察されたような、高頻度のＣＲＥ誘導性染色体内組換えが生じる。
【０１３７】
別のアプローチは、上記に概略したものと類似するが、ヒトＬＴＶＥＣ１およびＬＴＶＥＣ２とともにｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位を導入するのではなく、ｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位を、マウスＬＴＶＥＣ上に導入し、その後、ＣＲＥを使用して、隣接するｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位を介するカセット交換によって、そのヒトｘ座中に特異的に標的化する。下記に概略する方法論は、このＬＴＶＥＣ技術をどのように使用して、任意の非ヒト動物において目的の任意の内因性遺伝子の末端に、隣接部位特異的組換え部位を配置し得るかを、示す。
【０１３８】
マウスＬＴＶＥＣ１は、Ｊ領域の下流かつそのＪ領域に近接して、細菌組換えにより挿入されたカセットを含む。このカセットは、ｌｏｘＰ部位および細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性）を含む。ＬＴＶＥＣ１は、順番に、マウスＤＪ領域から上流にある（が、この可変遺伝子座内にある）領域由来の大相同性アーム（しかし、その絶対的末端は、重要ではない）；ＥＳ細胞において機能する選択マーカー（この例においてはＰＧＫ−ハイグロマイシンＲ）をコードするカセット；ｌｏｘＰ部位；およびマウスＪセグメントとすぐ近接するがこのＪセグメントを含まない、相同性アーム；を含む。この下流相同性アームの５’末端およびｌｏｘＰ部位の配置は、置換されるべき領域の３’末端を、この座中に規定する。カセット挿入部位にある内因性可変遺伝子の３’末端の改変は、ＭＯＡアッセイにより、ＥＳ細胞中での正確に挿入されたＬＴＶＥＣ１の欠失を可能にする。薬物耐性マーカーに、ＦＲＴ部位が隣接する。ＦＲＴ部位の導入は、ＥＳ細胞中においてＦＬＰによるか、または生殖細胞系能力を有する細胞においてＦＬＰを発現するマウスと生じるマウスとの交配のいずれかによる、残りすべての薬物耐性マーカーの除去を可能にする。
【０１３９】
ＬＴＶＥＣ２を、その座の最も遠位のＶ領域の上流にカセットを挿入するような細菌組換えによって、構築する。このカセットは、ｌｏｘ５１１部位および細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性）を含む。ＬＴＶＥＣ２は、順番に、最も遠位にあるマウスＶ遺伝子セグメントと近接する領域を含むがいかなるマウスＶ遺伝子セグメントも含まない、大相同性アーム；ＬＴＶＥＣ２およびＬＴＶＥＣ１中の野生型ｌｏｘＰ部位とは反対の方向にあるｌｏｘ５１１部位；野生型ｌｏｘＰ部位；第２選択マーカー（この例においてはＰＧＫ−ネオマイシンＲ）；およびＶ領域に由来する（従って、その可変遺伝子座内にある）マウス相同性アーム（しかし、その絶対的端部は重要ではない）；を含む。この上流相同性アームの３’末端およびｌｏｘＰ部位の配置は、置換されるべき領域の５’末端を、この座中に規定する。カセット挿入部位にある内因性可変遺伝子の５’末端の改変は、ＭＯＡアッセイにより、ＥＳ細胞中での正確に挿入されたＬＴＶＥＣ２の欠失を可能にする。これらのＬＴＶＥＣを、一緒にか連続して、標準的技術を使用してＥＳ細胞中に導入し、ＭＯＡアッセイを使用して、正確な標的化についてスクリーニングする。
【０１４０】
ＶＤＪ／ＶＪ領域の一部または全体を含むヒトＢＡＣを、細菌組換えにより、そのヒト配列とｌｏｘ５１１部位およびｌｏｘＰ部位が隣接するカセット群を挿入するように改変する。その上流カセットを、マウス改変領域を置換する領域のすぐ上流に挿入する。この上流カセットは、順番に、ｌｏｘ５１１部位、その後、細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性）を含む。その下流カセットを、Ｊ領域の下流に近接して挿入する。この下流カセットは、順番に、ｌｏｘＰ部位、その後、細菌選択マーカー（例えば、スペクチノマイシン耐性）を含む。
【０１４１】
ライブラリーから単離される単一ＢＡＣ上に存在するよりも大きなヒト可変領域を挿入するために、いくつかの方法を使用し得る。これらのうちのいくつかを、以下に記載する。
【０１４２】
ｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位を、細菌組換えによって、重複するＢＡＣ上に別個に挿入し得、これらのＢＡＣは、ＥＳ細胞中に形質転換した場合、互いに組み換わる。この場合、上流ＢＡＣは、１つのカセットを有し、このカセットは、マウス可変領域を置換する領域のすぐ上流で組み換わり、ｌｏｘ５１１部位、その後ろに細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性）を有する。下流ＢＡＣは、１つのカセットを有し、このカセットは、Ｊ領域のすぐ下流でこのＪ領域と近接して組み換わり、細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性）の後ろに、ｌｏｘＰ部位を含む。これらの２つのＢＡＣが重複していない場合、重複するホモロジーによりこの上流ＢＡＣおよび下流ＢＡＣと関連するさらなるＢＡＣを、このスキーム中に組み込む。これらを、細菌組換えによって、細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性）を含むように改変する。これらの上流ＢＡＣおよび下流ＢＡＣを、ネオマイシン耐性マーカーおよびハイグロマイシン耐性マーカーを保有する、ｌｏｘＰカセットおよびｌｏｘ５１１カセットを含むように改変する。
【０１４３】
ヒトＢＡＣを、可変領域と隣接するｌｏｘ５１１組換え部位および可変領域と隣接するｌｏｘＰ組換え部位を含むＥＳ細胞株中に、ＣＲＥリコンビナーゼとともに同時形質転換する。重複するＢＡＣを使用する場合、それらのＢＡＣの間で相同組換えが生じて、より大きなＤＮＡフラグメントが生じ、そして隣接するｌｏｘＰ部位およびｌｏｘ５１１部位が、この大フラグメントを、マウス座中に標的化する。細胞を、ピューロマイシン耐性について選択し、そしてそのマウス可変領域の置換についてスクリーニングする。あるいは、このマウス配列を、まず、その２つのｌｏｘＰ部位を介して欠失させ得、その後、そのヒト配列を、残りのｌｏｘ５１１部位およびｌｏｘＰ部位を介して導入し得る。
【０１４４】
ＬＴＶＥＣ１が、第３の部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘ２２７２（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００１  Ｍａｒ１５；２９０（２）：２６０−７１））を、細菌耐性遺伝子／哺乳動物耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン耐性）のすぐ下流に含む場合、第４のＢＡＣを挿入し得、ＬＴＶＥＣを作製し得る。このＬＴＶＥＣは、順番に、ピューロマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘＰ遺伝子、およびｌｏｘ２２７２遺伝子、その後ろに、ヒト配列、を含む。このＢＡＣを、マウス免疫グロブリン座中に組み込んだ後、ｌｏｘ５１１部位／ｌｏｘ２２７２部位は、第２回目のカセット交換におけるレシピンエトとして役立ち得、この第２回目のカセット交換において、ピューロマイシン耐性遺伝子が、ヒト免疫グロブリン座可変領域のさらなる上流部分、およびｌｏｘ５１１部位およびｌｏｘ２２７２部位が隣接する異なる細菌耐性遺伝子／哺乳動物耐性遺伝子によって、置換される。
【０１４５】
このヒト可変領域のより大きなストレッチを導入するための別の方法は、稀な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を使用して、複数のＢＡＣに由来する配列をインビトロで合わせることである。これは、細菌相同組換えを使用して、最も下流のＢＡＣの最後のＪのすぐ下流にｌｏｘＰおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子を挿入すること、そして下流のＢＡＣのヒト配列の上流に、第２の細菌選択マーカーおよび稀なＩ−Ｃｅｕ１部位を挿入することによって、達成する。ｌｏｘ５１１部位および細菌選択マーカー／哺乳動物選択マーカー（例えば、ピューロマイシン耐性）を、第１のＢＡＣ中の配列から上流の、ヒト可変領域の領域を含む第２のＢＡＣの上流末端に、挿入する。Ｉ−Ｃｅｕ１部位を、第２のＢＡＣの下流末端に挿入する。両方のＢＡＣをＩ−Ｃｅｕ１およびＮｏｔ１（これは、両方の改変ＢＡＣのベクター部分中で独特である）で消化した後、この２つのＢＡＣを連結し、そして組換え体を、ピューロマイシン耐性およびスペクチノマイシン耐性について細菌中で選択する。生じるより大きなＢＡＣは、順番に、ｌｏｘ５１１部位、上流ヒト配列、Ｉ−Ｃｅｕ１部位、下流ヒト配列、ｌｏｘＰ部位、およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む。ｌｏｘ５１１部位とｌｏｘＰ部位との間の領域を、上記のようなカセット交換およびピューロマイシン選択によって、マウス免疫グロブリン座中に挿入する。
【０１４６】
ヒト可変領域のより大きなストレッチを挿入するための第３の方法は、上記のように複数のＢＡＣに由来する配列を合わせることであるが、制限消化／連結の代わりに、細菌相同組換えを使用する。組換え体ＢＡＣについての同じ選択を、細菌において適用するが、但し、２つのＢＡＣのうちの１つを消化し、消化後にその末端を、他の「レシピンエト」ＢＡＣと相同であるように設計し、そしてそのレシピエントＢＡＣを、細菌株中で、細菌相同組換えを許容するように改変する。
【０１４７】
ヒト可変／マウス定常モノクローナル抗体産生マウスを作製する際の最後の段階は、軽鎖λ座および軽鎖κ座上での等価な可変領域置換を実施し、そして同じマウスにおいてともにホモ接合性であるように３つすべてのハイブリッド座を交配することである。生じるトランスジェニックマウスは、完全に内因性マウス定常領域に作動可能に連結した完全にヒトの重鎖および軽鎖の可変遺伝子座を含むゲノムを有し、そのマウスは、抗原性刺激に応答して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を含む血清を産生するようになっている。その後、そのようなマウスを、ヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡの供給源として使用し得る。標準的組換え技術を使用して、この抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡと、細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で作動可能に連結し、この細胞は、活性な抗体を発現可能である。この細胞を、完全なヒト抗体を発現するに適切な条件下で増殖させ、その後、この完全なヒト抗体を回収する。可変領域をコードする配列を、例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニングによって単離し得る。好ましい実施形態において、ヒト可変領域免疫グロブリン座のいくつかまたはすべてを含むトランスジェニックマウスから作製したハイブリドーマ（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９（１９７６））を、ヒト可変領域をコードするＤＮＡの供給源として使用する。
【０１４８】
要約すると、ＬＴＶＥＣを作製し、そのＬＴＶＥＣを、ＥＳ細胞における相同組換え事象についてＭＯＡスクリーニングと組み合わせて、標的化ベクターとして直接使用するアプローチは、遺伝子改変された座を操作するための新規な方法を生じる。この方法は、迅速かつ安価である。そしてこの方法は、以前に使用された冗漫で時間がかかる方法を超える有意な改善を示す。従って、この方法は、以前の方法論により必要とされた時間および価格の何分の１かで、生物のゲノム中の本質的に任意かつすべての遺伝子の迅速な、大規模の、インビボでの機能的なゲノム分析の可能性を開く。
【０１４９】
上記の発明は、説明および例としていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなく、本発明の教示に対して特定の変化および改変がなされ得ることが、当業者にとって容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【配列表】
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