(57)【要約】【課題】リゾビスト（登録商標）を構成する酸化鉄粒子では近赤外領域における光吸収量が低く、光音響信号が弱い。【解決手段】カテコール類と鉄原子とを有する粒子であって、前記カテコール類のモル数/前記鉄原子のモル数が270/10000以上であることを特徴とする粒子によれば、近赤外領域における光吸収が増加し、強い光音響信号を発信することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテコール類と鉄原子とを有する粒子であって、
前記カテコール類のモル数/前記鉄原子のモル数が270/10000以上であることを特徴とする粒子。
【請求項２】
前記カテコール類はドーパミンであることを特徴とする請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記鉄原子の少なくとも一部は前記カテコール類と錯体を形成していることを特徴とする請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
さらに酸素原子を含み、前記鉄原子の少なくとも一部は該酸素原子と結合していることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項５】
アモルファスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項６】
近赤外領域の光を吸収することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項７】
平均粒径が1nm以上5000nm以下であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項８】
さらに分散安定化剤を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項９】
分散安定化剤は糖および糖の誘導体から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１０】
前記分散安定化剤は、デキストラン、カルボキシデキストラン、アミノ化デキストラン、プルラン、ポリエチレングルコールのうち少なくとも一種を有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項１１】
カテコール類と鉄原子とを有する粒子であって、
鉄量あたりのモル吸光係数は580以上であることを特徴とする粒子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の粒子と分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の粒子を生体内に投与する工程、及び
生体に光を照射し、前記粒子から発せられる光音響信号を検出する工程、
を含む、光音響イメージング方法。
【請求項１４】
前記光は近赤外波長の光である、請求項１３に記載の光音響イメージング方法。
【請求項１５】
鉄イオンとカテコール類と塩基とを含む水溶液を撹拌する粒子の製造方法であって、
窒素雰囲気下、pH7以下、温度は0℃以上60℃未満の条件で行われることを特徴とする方法。
【請求項１６】
さらに水溶液に分散安定化剤を含むことを特徴とする請求項１５に記載の粒子の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の粒子と分散剤とを有することを特徴とする血管の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は粒子及び前記粒子を用いた光音響イメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する光音響イメージング法が知られている。光音響イメージング法とは、検体に光を照射することで検体から発せられる光音響信号の強度と発生位置を測定することにより、検体内部の物質分布の画像を得る方法である。
検体に照射する光として、生体を透過しやすい700〜900 nmの波長の光である近赤外光が好ましい。
【０００３】
リゾビスト（登録商標）（酸化鉄粒子を含むMRI用の造影剤）に光を照射すると、音響波を発生することが知られている（非特許文献1）。したがって、リゾビスト（登録商標）は光音響イメージング用造影剤として用いることができる可能性がある。
【０００４】
ここで、光音響イメージング用造影剤とは、光音響イメージング法で用いられる造影剤である。光音響イメージング法は、生体などの検体に光を照射することで検体から発せられる音響波の強度と発生位置を測定することにより、検体内部の物質分布の画像を得る方法である。光音響イメージング用造影剤が検体内の特定のターゲット部位に蓄積しやすい場合、光音響イメージング用造影剤を検体に付与した後に、光音響イメージング法によって画像を得ると、その画像における、その特定のターゲット部位とそれ以外の部位とのコントラストが上がる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】2006 IEEE Ultrasonics Symposium p.393-396
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、リゾビスト（登録商標）を構成する酸化鉄粒子では近赤外領域における光吸収量が低く、光音響信号が弱い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
カテコール類と鉄原子とを有する粒子であって、前記カテコール類のモル数/前記鉄原子のモル数が270/10000以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、近赤外領域における光吸収が増加し、強い光音響信号を発信する粒子が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】粒子の透過型顕微鏡写真。
【図２】X線回折の測定結果。
【図３】光音響信号強度の測定結果。
【図４】ドーパミンを含有していない粒子B-2、ドーパミンを吸着させた粒子B-4、およびドーパミンを含有する粒子A-1の血清中での安定性を示すグラフ。
【図５】ドーパミンと光音響信号との関係を示すグラフ。
【図６】光音響イメージング像（A）と輝度値（B）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に係る粒子は、カテコール類と鉄原子とを有する粒子であって、前記カテコール類のモル数/前記鉄原子のモル数が270/10000以上であることを特徴とする。
【００１１】
粒子を造影剤として用いて光音響イメージングする場合、生体から出る光音響信号に対して十分に大きい光音響信号が粒子から出る必要がある。一方で、生体内に投与できる粒子には限界がある。さらに、投与した粒子の全てを造影したい部位に集積させることは難しい。そこで、粒子あたりの光吸収量を増やして、少ない投与量でより強い光音響信号を得ることが望ましい。
【００１２】
マウスのリンパ節をイメージングした実績から、以下のように計算した。生体組織の光吸収量は0.05 cm-1であるのに対し、十分なコントラストを出すためには光吸収量に換算して0.1 cm-1の上乗せが必要である。投与できる粒子の量は、リゾビスト（登録商標）のFe量としての投与量である0.45 mg/kgと、マウスの平均的な体重20 g、および鉄の原子量55.85から、マウス1匹に投与できるFe量として1.6×10-7 molとなる。投与した粒子のうち、リンパ節への集積割合は平均1 ID%だった。つまりリンパ節に集積する粒子はFe量として1.6×10-9 molとなる。マウスのリンパ節の平均体積は9.4×10-6 lであることから、リンパ節での粒子濃度はFe濃度として、1.7×10-4 mol/lとなる。この濃度で粒子が集積して光吸収量にして0.1 cm-1の上乗せを得るためには、粒子の鉄量あたりのモル吸光係数ε（Fe）が580以上であることが求められる。このε（Fe）=580以上を達成するには、カテコール類の分子のモル数／Feのモル数が270／10000以上であることが必要であると見積もられた。ヒトにおいては体積が増えると同時に体重も増えるので、粒子の求められる性能は同じであると考えられる。
【００１３】
本発明の粒子において、鉄原子はFe2+またはFe3+の鉄イオンとして粒子内に存在してもよい。本明細書で鉄原子と表記された場合、原子状の鉄と鉄イオンとを包含する概念を表す。
【００１４】
（FeとO）
本発明の粒子は鉄原子（Fe）と酸素原子（O）を含む粒子であってもよい。このような粒子の例として、鉄原子と酸素原子とが結合しているFe3O4、γ−Fe2O3、またはこれらの混合物などを含む粒子が挙げられる。
【００１５】
（カテコール類）
本明細書におけるカテコール類とは、ベンゼン環を有する化合物であり、ベンゼン環の６つ炭素原子のうち一つの炭素原子が水酸基で置換され、前記水酸基からみてオルト位の炭素原子も水酸基で置換されたもののことである（下記式（１））。なお、本明細書におけるカテコール類は、上記水酸基を有する２つの炭素原子以外の炭素原子が水酸基やその他の官能基で置換されていてもよい。
【化１】
2014031363.tif 000002
（Ｘは置換または無置換の炭素数１乃至１０のアルキル基であり、前記置換基は炭素数１乃至５のアルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基等である。）
【００１６】
本実施形態に係るカテコール類としては、例えば、ドーパミン（ドパミン）（下記式（２））、ベンセラジド（下記式（３））、アドレナリン（下記式（４））、イソプレナリン（下記式（５））、ドブタミン（下記式（６））、ノルアドレナリン（下記式（７））、レボドパ（下記式（８））、トリメトキノール（下記式（９））、エンタカポン（下記式（１０））、ドロキシドパ（下記式（１１））、メチルドパ（下記式（１２））、カルビドパ（下記式（１３））、ルチン（下記式（１４））、タンニン酸（下記式（１５））等のカテコール類を挙げることができる。
【００１７】
なお、下記に示す化合物について鏡像異性体が存在する場合は、下記に示す化合物とその鏡像異性体のどちらも本実施形態に係るカテコール類に含まれる。
【化２】
2014031363.tif 000003
【化３】
2014031363.tif 000004
【化４】
2014031363.tif 000005
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
2014031363.tif 000016
【００１８】
本発明では、鉄イオンとカテコール類とが錯体を形成していると考えられる。鉄イオンとカテコール類との錯体は、カテコールから鉄イオンへの電荷移動遷移に伴う吸収ピークを近赤外波長領域に有する。そのため、生体を透過しやすい700〜900 nmの波長の光である近赤外領域の光をより多く吸収して光音響信号を発信することが可能となる。
【００１９】
（アモルファス）
一般的に、鉄系の粒子は結晶性の粒子とアモルファスの粒子とに分けることができる。これらは、Ｘ線回折法で分析したときに結晶性を示す回折強度のピークが特定の解析角に見られるかどうかで区別することができる。本明細書におけるアモルファスとは、Ｘ線回折法で分析したときに、結晶性を示すピークが認められない粒子の状態のことを指す。
【００２０】
本発明の粒子は、カテコール類の分子のモル数／Feのモル数が上記要件を満たしていれば、結晶性でもアモルファスでもかまわない。一般に、粒子の鉄量あたりの規格化光音響信号PA（Fe）を鉄量あたりのモル吸光係数ε（Fe）で割った値（以下、信号変換効率と呼ぶ。）を比較した場合、結晶性の粒子に比べて、アモルファスの粒子は信号変換効率が高い。つまり、同じ量の光を吸収した場合、アモルファスの粒子のほうが結晶性の粒子よりも強い光音響信号を出すことができる。また、カテコール類の含有量が高まると粒子の結晶状態が崩れてアモルファスになる可能性が高い。そのため、本発明の粒子はアモルファスであることが好ましい。
【００２１】
（粒径）
本明細書において粒径とは、動的光散乱解析装置を用いて、動的光散乱法によって測定される粒子の流体力学的直径を意味する。本実施形態に係る粒子の平均粒径は、1nm以上5000nm以下であることが好ましい。平均粒径は、腎臓で排泄されにくい8nm以上であることが好ましく、EPR（Enhanced Permeability and Retention）が期待できる1000nm以下であることがさらに好ましい。
製造条件を変えることにより、所望の平均粒径の粒子を製造することができる。
【００２２】
（製造方法）
本発明の粒子は、たとえば下記の共沈法によって製造することができる。以下に、共沈法について説明するが、これは非限定的な例示に過ぎず、本発明に係る粒子を製造する方法はこれに限定されるものではない。
【００２３】
共沈法を用いる場合、具体的には、以下の（1）から（3）の工程をこの順に行うことにより本発明の粒子を得ることができる。
（1）鉄イオンを含む水溶液とカテコール類を含む水溶液とを混合し、鉄イオンとカテコール類とを含む水溶液を得る工程。
（2）前記の鉄イオンとカテコール類とを含む水溶液に、塩基を加え、粒子化する工程。
（3）前記水溶液から、粒子化していない鉄イオンとカテコール類を除去する工程。
【００２４】
（脱酸素）
Fe2＋イオンなどの酸化を防止するため、製造に用いる水はあらかじめ窒素バブリングし、水中の溶存酸素を除去しておいてもよい。または、窒素雰囲気下において、工程（1）〜（3）を行ってもよい。
【００２５】
（Feを含む水溶液）
鉄イオンを含む水溶液には、カテコール類を含む水溶液とを混合する前の段階で、Fe2+:Fe3+=0:100〜100:0の割合で鉄イオンが含まれている。Fe2+とFe3+との比率は、Fe2+:Fe3+=36:64〜0:100がより好ましいが、これに限定されない。なお、この比率は水溶液中のFe2+:Fe3+の比であって、得られる粒子中のFe2+:Fe3+の比がこの範囲内である必要はない。Fe2+はFeCl2などを水に溶解したり、Fe3+とカテコール類を共存させたりすることで得られる。Fe3+はFeCl3などを水に溶解したり、Fe2+を酸素などで酸化させたりすることで得られる。
【００２６】
（塩基）
工程（2）では、塩基として、アンモニア、メチルアミン、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等を加えることができる。塩基を加えることによって粒子化にいたる核を生成することができれば、塩基の種類は上記に限定されない。
【００２７】
一般に、酸化鉄粒子を作製する際の最適なpHは8〜14であることが知られている。ここで、カテコール類と錯体を形成する鉄イオンの量が、酸化鉄を形成する鉄イオンの量よりも多い場合の方がより多くのカテコール類を含ませることができるため、粒子を調製する際に用いる水溶液のpHは、上記のpHよりも低い、pH7以下であることが好ましく、pH5以下であることがさらに好ましい。
【００２８】
（粒子化する工程における温度）
一般に、酸化鉄粒子を作製する際は粒子作製に用いる水溶液が、60〜80℃に加温されることが多い。ここで、カテコール類と錯体を形成する鉄イオンの量が、酸化鉄を形成する鉄イオンの量よりも多い場合の方がより多くのカテコール類を含ませることができるため、粒子を調製する際に用いる水溶液の温度は、上記の温度よりも低い、60℃未満であることが好ましく、25℃以下であることがさらに好ましい。また、水溶液中で粒子化する場合、水が凍らないようにするために、水溶液の温度は0℃以上であることが好ましい。
【００２９】
（酸）
粒子の光吸収量や光音響信号を上げることを目的として、工程（2）と（3）との間で、水溶液に酸を加えてもよい。本実施形態においては、塩酸、硝酸等を加えてもよいが、粒子の光吸収量や光音響信号が上がるのであれば、上記の酸に限定されない。
【００３０】
（除去）
工程（3）で水溶液から粒子化していない鉄イオンとカテコール類を除去する方法としては、透析、限外濾過、遠心精製が挙げられる。
【００３１】
（分散安定化剤）
本発明における粒子の水中における分散安定性を高めるために、粒子に分散安定化剤が含まれていてもよい。
【００３２】
本実施形態に係る分散安定化剤として、多糖類、四糖類、三糖類、二糖類、単糖類等の糖や、糖アルコール、糖酸等の糖の誘導体、あるいはポリエチレングルコール（PEG）や、アミノ化PEGなどのPEGの誘導体を用いることができる。
【００３３】
例えば多糖類として、デキストラン、カルボキシデキストラン、アミノ化デキストラン、デキストリン、ヒアルロン酸ナトリウム、プルラン、アルギン酸、ペクチン、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、アガロース、アミロース、カラギーナン、へパリンナトリウム、キシログルカン、キサンタンガム、ヒドロキシプロピルセルロースを用いることができる。
【００３４】
四糖類として、アカルボース、スタキオースを用いることができる。
【００３５】
三糖類として、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオースを用いることができる。
【００３６】
二糖類として、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース、ツラノース、セロビオースを用いることができる。
【００３７】
単糖類として、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、エリトロース、エリトルロース、トレオース、リブロース、キシルロース、キシロース、リキソース、デオキシリボース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、グルコース、マンノース、グロース、ガラクトース、タロース、フコース、ラムノース、セドヘプツロースを用いることができる。
【００３８】
糖アルコールや糖酸等の糖誘導体として、キシリトール、イノシトール、グルコン酸カルシウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、ソルビトール、糖酸カルシウム、マンニトール、メグルミンを用いることができる。
【００３９】
本発明の粒子は、分散安定化剤として、これらのうちデキストラン、カルボキシデキストラン、アミノ化デキストラン、プルラン、PEG（ポリエチレングリコール）のうち少なくとも一種を有することが好ましい。
【００４０】
分散安定化剤は、製造方法（1）と（2）の工程の間、あるいは製造方法（2）と（3）の工程の間で、水溶液中に添加してもよい。
【００４１】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態おける光音響用造影剤について説明する。本実施形態において光音響イメージングとは、光を照射された対象が発する音響波（光音響信号）を検出してイメージング（画像化）することを意味する。本実施形態に係る粒子は、光を多く吸収してより強い音響波を発するため、これを造影剤（光音響用造影剤）として用いることで、対象からの音響波を増強し、よりコントラストの強い光音響イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。
【００４２】
本実施形態に係る光音響用造影剤は、さらに、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水などの分散媒を有していてもよい。また本実施形態に係る光音響用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物を有していても良い。本実施形態に係る光音響用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
【００４３】
本実施形態に係る光音響用造影剤は、EPR効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位よりも腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。従って、本実施形態に係る粒子は腫瘍部位を特異的に検出する光音響用造影剤として用いることができる。
【００４４】
（造影方法）
生体内に投与された本実施形態に係る粒子を造影剤として用いて、粒子からの光音響信号を光音響イメージング装置を用いて検出する方法は以下の工程を有する。但し、本実施形態に係る造影方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係る粒子を生体内に投与する工程。
（ｂ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る粒子から発せられる光音響信号を検出する工程。
【００４５】
（ａ）について
本実施形態に係る粒子を生体内に投与する方法は特に限定されず、経口投与、静脈注射あるいは皮下注射等の方法によることができる。本実施形態に係る粒子は、EPR効果によって腫瘍に集積させることができるため、効率よく腫瘍を検出することができる。
【００４６】
（ｂ）について
生体に照射する光としては、生体に照射したときに安全で、かつ高い生体透過性を示す600nmから900nmの近赤外波長であることが好ましい。また、光を発生させる装置、音響信号を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。
本実施形態に係る粒子を用いた造影方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍などの部位を造影することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する粒子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００４８】
実施例として作製した本発明の粒子をA-1、A-2、A-3・・・、比較例として作製した粒子をB-1、B-2、B-3・・・と、以下呼ぶことにする。
【００４９】
後述するが、実施例として作製した粒子は光音響イメージングが可能なカテコール/Fe=270/10000以上という条件を満たすが、比較例として作製した粒子はその条件を満たさなかった。
【００５０】
（実施例1）（比較例1）
カテコール類として上記式２で示されるドーパミン、分散安定化剤としてプルランを含有するアモルファス粒子（以下、粒子A-1と呼ぶ）を以下の方法で作製した。さらに、ドーパミンを含有しない結晶性粒子（B-1）及び、ドーパミンを含有しないアモルファス粒子（B-2）と比較した。
【００５１】
用いる水をあらかじめ30分間窒素バブルし、溶存酸素を除去しておいた。41 mg/mlのFeCl2・4H2O水溶液1.5 ml（Fe2+として3.1×10-4 mol）と、100 mg/mlのFeCl3・6H2O水溶液1.5 ml（Fe3+として5.6×10-4 mol）とを11.6 mlの水が入った3つ口フラスコに加えた。このFe2+とFe3+とを含む水溶液を、窒素雰囲気下で、オイルバスを用いて80℃で加温しながら、200 rpmの速度で撹拌した。このFe2+とFe3+とを含む水溶液に、100 mg/mlのドーパミン水溶液を1.14 ml（3-ヒドロキシチラミン塩酸塩、ドーパミンとして6.0×10-4 mol）加え、窒素雰囲気下で、15分間撹拌と加温を続けた。加温をやめ、窒素雰囲気下で5分間撹拌を続けた。次に、0.5 mol/lのNaOH水溶液を2.4 ml、20 mg/mlのプルラン水溶液を12.7ml加え、窒素雰囲気下で2時間撹拌を続けて、粒子化させた。
【００５２】
1 mol/lのHCl水溶液500μlを加えて撹拌した後、50kDaのポアサイズの透析膜を用いた透析と、100kDaのポアサイズをもつアミコンウルトラ-4（日本ミリポア）を用いた限外濾過を行うことにより、粒子化させた水溶液から粒子化していないFe、ドーパミン、及びプルランを除去した。1.2μmのポアサイズをもつフィルター濾過により凝集物を除去し、粒子A-1を得た。
【００５３】
比較のために、ドーパミンを含まない結晶性の粒子（B-1）として、市販の酸化鉄（リゾビスト（登録商標））を用いた。ドーパミンを含有しないアモルファスの粒子（B-2）はドーパミンを加えない点以外は粒子A-1と同様の条件で作製した。
【００５４】
透過型電子顕微鏡（日立、H800）を用いて粒子の形状を、X線回折装置（パナリティカル、X'Pert PRO）を用いて粒子の結晶構造を、それぞれ観察した。結晶構造を観察するときには、観察する粒子を乾燥させた後、約1gを観察に用いた。X線回折装置による測定結果にピークが認められなかったとき、粒子はアモルファスであると判断した。
【００５５】
図1は透過型原子顕微鏡で粒子A-1を観察した写真である。粒子A-1はお米状の形をしていた。図2は粒子A-1とB-2のX線回折を測定した結果である。粒子A-1には特異的なピークが認められず、アモルファス粒子であった。
【００５６】
粒子の吸光度とFe濃度とを測定することにより、鉄量あたりのモル吸光係数ε（Fe）（cm-1M-1）を求めた。まず、分光光度計（Perkin Elmer、Lambda Bio40）を用いて、吸光度を測定した。一方、粒子を濃硝酸で溶解した後、発光分光装置（SPECTRO、CIROS CCD）を用いて、Feの濃度を定量した。吸光度をFeのモル濃度およびセル幅で除算し、モル吸光係数ε（Fe）（cm-1M-1）を求めた。
【００５７】
光音響信号の計測は、パルスレーザー光を水に分散した粒子に照射し、圧電素子を用いて粒子からの光音響信号を検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで波形を取得して行った。具体的な条件は以下の通りである。パルスレーザー光源として、チタンサファイアレーザー（Lotis、LT-2211-PC）を用いた。波長は710、750、800、及び850 nm、エネルギー密度は20乃至50 mJ/cm2（選択した波長に依存する）、パルス幅は約20ナノ秒、パルス繰返周波数は10 Hzとした。水に分散した粒子をおさめる測定容器には、幅1 cm、光路長0.1 cmのポリスチレン製キュベットを用いた。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径1.27 cm、中心帯域1 MHzの非収束型超音波トランスデューサ（Panametrics-NDT、V303）を用いた。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を2.5 cmとした。光音響信号を増幅する高速プリアンプは増幅度+30 dBの超音波プリアンプ（オリンパス、Model 5682）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（テクトロニクス、DPO4104）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを32回平均表示モードとし、レーザーパルス照射32回平均の光音響信号取得を行った。図3は、典型的な光音響信号の波形である。図中の矢印で示すように、波形から光音響信号強度（V）を求めた。得られた光音響信号強度を照射パルスレーザーのエネルギー（J）で割った値を規格化光音響信号（VJ-1）と定義した。さらに、Fe濃度で割り、鉄量あたりの規格化光音響信号PA（Fe）（VJ-1M-1）とした。 
【００５８】
鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を鉄量あたりのモル吸光係数ε(Fe)で割った値を信号変換効率とした。
【００５９】
表1に、粒子A-1、B-1、及びB-2の作製条件と測定結果をまとめた。表中では波長710nmにおける鉄量あたりのモル吸光係数ε(Fe)、及び鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を示している（以下の表でも断りがないかぎり、波長710nmにおける結果を示す）。結晶性の粒子に比べて、アモルファス粒子では高い信号変換効率を示した。さらに、ドーパミンを含有する粒子では、光吸収量が上がるとともに、高い信号変換効率を維持し、強い光音響信号が出た。
【００６０】
【表１】
2014031363.tif 000017
【００６１】
（実施例2）（比較例2）
カテコール類としてドーパミン、分散安定化剤としてデキストランを含有するアモルファス粒子A-2〜A-5を以下の方法で作製した。比較のために、ドーパミンを含有しない粒子B-3も作製した。
【００６２】
41 mg/mlのFeCl2・4H2O水溶液240μl（Fe2+として5.0×10-5 mol）と、100 mg/mlのFeCl3・6H2O水溶液240μl（Fe3+として8.9×10-5 mol）とを2.32mlの水が入った30mlのガラス瓶に加え、Fe2+とFe3+とを含む水溶液を得た。このFe2+とFe3+とを含む水溶液を100 rpmの速度で撹拌しながら、100 mg/mlのドーパミン水溶液を加え（ドーパミンとして9.5×10-5、4.7×10-4、9.5×10-4、1.9×10-3 molとなるように量を調節した）、Feとドーパミンとを含む水溶液を得た。このFeとドーパミンとの水溶液に、0.5 mol/lのNaOH水溶液を384μl（1.9×10-4 mol）、20 mg/mlのデキストラン（デキストラン40、分子量約40,000）水溶液を2 ml加えた。2時間撹拌を続け、粒子化させた（A-2〜A-5）。ドーパミンを含有しない粒子B-3はドーパミンを加える以外は粒子A-2〜A-5と同じ方法で作製した。
【００６３】
動的光散乱解析装置（大塚電子、ELS-Z）を用いて、粒子の粒径を測定した。１００回の積算を５回行い、算出された５つのデータの平均の粒径を求めた。実施例1と同様に、鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を測定した。
【００６４】
表2に、粒子A-2〜A-5、及びB-3の作製条件と測定結果をまとめた。分散剤としてデキストランを用いても、粒子を作製することができた。作製時に用いるドーパミンの量を変えると、鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を変えることができた。作製時のドーパミン量4.7×10-4 molは作製時のFe2+とFe3+とを合わせたFe量の3.4倍等量にあたる。Feとドーパミンとは最大1:3で錯体を形成できることから、4.7×10-4 mol （つまり3.4倍等量）以上で作製したとき、十分にFeとドーパミンの錯体が形成され、その結果、得られた粒子のPA（Fe）がほぼ同じ値になったと思われる。
【００６５】
【表２】
2014031363.tif 000018
【００６６】
（実施例3）
鉄としてFe3+のみを用いて、カテコール類としてドーパミン、分散安定化剤としてデキストランを含有するアモルファス粒子A-6を以下の方法で作製した。
【００６７】
100 mg/mlのFeCl3・6H2O水溶液2.35 ml（Fe3+として8.7×10-4 mol）を12.1mlの水が入った3つ口フラスコに加えた。Fe3+を含む水溶液を窒素雰囲気下で、200 rpmの速度で撹拌した。このFe3+水溶液に、100 mg/mlのドーパミン水溶液5.7 ml（ドーパミンとして3.0×10-3mol）加えた。次に、0.5 mol/lのNaOH水溶液を2.4 ml、40 mg/mlのデキストラン水溶液を6.4 ml加えた。窒素雰囲気下で、2時間撹拌を続け、粒子化させた。
【００６８】
実施例1及び2と同様に、粒径、鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を測定した。
【００６９】
表3に、粒子A-6の測定結果をまとめた。鉄としてFe3+のみを用いても、粒子ができた。
【００７０】
【表３】
2014031363.tif 000019
【００７１】
（実施例4）
カテコール類としてドーパミン、分散安定化剤としてデキストランを含有するアモルファス粒子A-7を以下の方法で作製し、リンパ節への集積性を確認した。
【００７２】
41 mg/mlのFeCl2・4H2O水溶液240μl（Fe2+として5.0×10-5 mol）と、100 mg/mlのFeCl3・6H2O水溶液240μl（Fe3+として8.9×10-5 mol）とを2.32mlの水が入った30mlのガラス瓶に加え、Fe2+とFe3+とを含む水溶液を得た。このFe2+とFe3+とを含む水溶液を100 rpmの速度で撹拌しながら、100 mg/mlのドーパミン水溶液を180μl加え（ドーパミンとして9.5×10-5 mol）、25分間撹拌し、Feとドーパミンとを含む水溶液を得た。このFeとドーパミンとの水溶液に、0.5 mol/lのNaOH水溶液を384μl（1.9×10-4 mol）、20 mg/mlのデキストラン水溶液を2 ml加えた。2時間撹拌を続け、粒子化させた。
【００７３】
得られた粒子A-7をマウスのリンパ節への集積性を調べた。Fe濃度として3.1 mg/mlの濃度で粒子を分散させた水溶液10 μlをマウスの足底部に皮下注射した。24時間後、下肢のリンパ節を取りだした。リンパ節は1%トライトンX100水溶液中でホモジネートした。塩酸を加えて、遠心分離し、Feイオンを抽出した上澄みを得た。2-Nitroso-5-[N-n-propyl-N-(3-sulfopropyl)amino]phenolを用いて比色定量することにより、Fe濃度を求めた。投与した粒子の内、平均1.3 ID%がリンパ節に集積していた。
【００７４】
（比較例3）
ドーパミンを含有しない粒子にドーパミンを吸着させ、粒子作製時にドーパミンを用いたドーパミン含有粒子との比較を行った。
【００７５】
ドーパミンを含有しない粒子として、粒子B-2を用いた。この粒子B-2に、ドーパミンを吸着させ、ドーパミンを吸着した粒子B-4とした。作製時にドーパミンを用いたドーパミン含有粒子として、粒子A-1を用いた。
【００７６】
ドーパミンを吸着させる方法は次のように行った。粒子B-2の分散水溶液に、ドーパミン水溶液を加えた。このときのドーパミン量は、粒子中のFeと水溶液中のドーパミンの比率が1.5:1（mol:mol）となるように調整した（粒子A-1作製時に、Feとドーパミンの比率1.5:1であったため）。粒子に吸着していないドーパミンを除去するために透析をおこなった。
【００７７】
実施例1と同様に、鉄量あたりの光吸収量ε(Fe)、及び鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を測定した。また、粒子を生体内に投与し造影することを想定し、ウシ胎児血清と混合し、37℃でインキュベーションし、一定時間ごとに吸光度を測定した。吸光度変化率とは、インキュベーションを始める前の吸光度を1としたときの、各測定時間における吸光度の値を表す。
【００７８】
表4はドーパミンを含有しない粒子B-2、ドーパミンを吸着させた粒子B-4、およびドーパミンを含有する粒子A-1を評価した結果である。ドーパミンを含有しない粒子B-2とドーパミンを吸着させた粒子B-4の結果から、粒子を作製した後にドーパミンを吸着させても、光の吸収量や光音響信号は向上した。しかし、ドーパミンを含有する粒子A-1のように、作製時にドーパミンを用いた粒子の方が、ドーパミンを吸着させた粒子よりも、はるかに光の吸収量や光音響信号は向上した。
【００７９】
【表４】
2014031363.tif 000020
【００８０】
図4はドーパミンを含有しない粒子B-2（白三角）、ドーパミンを吸着させた粒子B-4（白丸）、およびドーパミンを含有する粒子A-1（黒丸）の吸光度変化率を測定した結果である。ドーパミンを含有しない粒子B-2に比べて、ドーパミンを吸着させた粒子B-4およびドーパミンを含有する粒子A-1では吸光度変化率が減少した。37℃の血清中でインキュベーションしたことで、ドーパミンが変化し、ドーパミンとFeの配位が変化したと思われる。ドーパミンを含有した粒子A-1に比べて、ドーパミンを吸着させた粒子B-4では、吸光度変化率の変化が大きかった。ドーパミンを吸着させた粒子B-4では、ドーパミンが粒子の表面に存在することから、血清中の成分によるドーパミンの変性が起こりやすかったと考えられる。
【００８１】
ドーパミンを吸着させた粒子に比べて、ドーパミンを含有させた粒子では、光の吸収量が多く、強い光音響信号が出た。また生体内に投与し造影するときの信号変化が少なかった。ドーパミンを吸着させた粒子より、本件の粒子では、より強くより安定的に光音響信号を発する粒子ができた。
【００８２】
（比較例4）
粒子化の工程におけるpHが得られる粒子のPA（Fe）に与える影響を調べるために以下の方法で粒子（B-5）を作製した。
【００８３】
粒子A-7同様に、Fe2+、Fe3+、水、及びドーパミンを加えた後、0.5 mol/lのNaOH水溶液を600μl加え（NaOHとして3.0×10-4 mol）、粒子B-5を作製した。
【００８４】
pHメーター（堀場製作所、B-212）を用いて、NaOH添加直後のpHを測定した。実施例1と同様に鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を測定した。またFe濃度と液量から、得られた粒子のFe量を計算し、作製に用いたFe量から、Fe収率を計算した。
【００８５】
表5に粒子の作製条件と測定結果をまとめた。比較のために粒子A-7の結果も載せた。 NaOH添加直後のpH、すなわち粒子化の工程におけるpHが高いほど、得られる粒子のPA（Fe）は弱くなり、Fe収率は高くなった。
【００８６】
【表５】
2014031363.tif 000021
【００８７】
PA（Fe）が強くなったのはFeイオンがドーパミンと十分に錯体を形成したまま粒子化したと考えられる。一方、Fe収率が高くなったのはFeイオンが酸化鉄の成長に使われ粒子化したからと考えられる。Feイオンがドーパミンとの錯体形成に使われるか、あるいはFeイオンが酸化鉄の成長に使われるかは粒子化のときのpHに関係していると思われる結果となった。
【００８８】
一般に、酸化鉄粒子を作製するとき、粒子化する工程における最適なpHは8〜14であることが知られている。ここで、ドーパミンと錯体を形成する鉄イオンの量が酸化鉄を形成する鉄イオンの量よりも多い場合の方が、より多くのドーパミンを含ませることができ、ドーパミンが多い方がよりPA（Fe）が大きいと思われる。pH7.2では鉄錯体形成よりも酸化鉄の形成が優位となりPA（Fe）が小さく、pH4.7では酸化鉄形成より鉄錯体形成が優位になりPA（Fe）が大きくなったと考えられる。
【００８９】
より強いPA（Fe）の出る粒子を得るためには、粒子化のpHは7.2よりも酸性にする必要がある。
【００９０】
(実施例5)（比較例5）
粒子化の工程における温度が得られる粒子のPA（Fe）に与える影響を調べるために以下の方法で粒子（A-8及びB-6）を作製した。
【００９１】
粒子A-2と同様に、Fe2+、Fe3+、及びドーパミンを加えてから、NaOHを加えた。さらに、デキストランを加えた後、0又は60℃に加熱しながら2時間撹拌を続け、粒子A-8又はB-6を作製した。
【００９２】
実施例1と同様に鉄量あたりの規格化光音響信号PA(Fe)を測定した。またFe濃度と液量から、得られた粒子のFe量を計算し、作製に用いたFe量から、Fe収率を計算した。
【００９３】
表6は測定した結果である。比較のために粒子A-2の結果も載せた。粒子化の工程において加熱するとPA（Fe）は下がり、Fe収率は向上した。加熱が酸化鉄の成長を促進したと考えられる。
【００９４】
一般に、酸化鉄粒子を作製するとき、粒子化する工程では粒子作製に用いる水溶液が60〜80℃に加温されることが多い。ここで、ドーパミンと錯体を形成する鉄イオンの量が、酸化鉄を形成する鉄イオンの量よりも多い場合の方がより多くのドーパミンを含ませることができる、ドーパミンが多い方がよりPA（Fe）が大きいと思われる。0℃及び25℃（室温）で粒子化させたA-8及びA-2では酸化鉄形成よりも錯体形成が優位となりPA（Fe）が強く、60℃で粒子化させたB-6では錯体形成よりも酸化鉄形成が優位となりPA（Fe）が弱くなったと考えられる。
【００９５】
粒子化の工程において、加熱すると、強いPA（Fe）の出る粒子を得ることができない。
【００９６】
【表６】
2014031363.tif 000022
【００９７】
（実施例6）（比較例6）
粒子に含まれるドーパミンの量と、光音響信号とを比較した。
【００９８】
本件の粒子（A-2〜A-7）、ドーパミンを含有しない粒子（B-3）、Journal of the American Chemical Society 2007;129:pp.2582-2487を参考に調製した、ドーパミンを吸着させた粒子（B-4）、および、米国特許第6146615号明細書を参考に調製した、加熱して粒子化した粒子（B-6）に含まれるドーパミン量を定量した。
【００９９】
窒素原子を定量することにより、粒子に含まれるドーパミン量を求めた。まず、粒子を凍結乾燥させた。その後、微量窒素分析装置（三菱化学、ND-100）を用いて、酸化分解―減圧発光法にて、窒素原子を定量し、ドーパミン量とした。
【０１００】
図5は粒子に含まれるドーパミンの量と、光音響信号との関係を示したグラフである。図5(a)にグラフ全体を、図5(b)に一部分の拡大図を示す。横軸はFe 10000 molあたりのドーパミンのモル数を示している。縦軸はFe原子あたりの光音響信号を示している。黒丸は粒子A-2〜A-7の測定結果である。粒子に含まれるドーパミン量に比例して、光音響信号は強くなった。白丸は粒子B-3、B-4、及びB-6の測定結果である。粒子B-3、B-4、及びB-6のいずれの粒子においても光音響信号が弱かった。
【０１０１】
生体組織の光吸収量は0.05 cm-1であるのに対し、十分なコントラストを出すためには光吸収量に換算して0.1 cm-1の上乗せが必要である。投与できる粒子はリゾビスト（登録商標）の投与量であるFe量として0.45 mg/kgと、マウスの平均的な体重20 g、また鉄の原子量は55.85であることから、マウス1匹に投与できる粒子はFe量として1.6×10-7 molとなる。実施例4より投与した粒子のうち、リンパ節への集積割合は約1 ID%だった。つまりリンパ節に集積する粒子はFe量として1.6×10-9 molとなる。マウスのリンパ節の平均体積は9.4×10-6 lであることから、リンパ節での粒子濃度はFe濃度として、1.7×10-4 mol/lとなる。この濃度で粒子が集積して十分なコントラストを出すために粒子に求められる性能はε（Fe）=580以上である。また、モル吸光係数εと光音響信号強度とは線形関係にあるため、必要な光音響信号強度を得るためにはε（Fe）=580以上であることが必要になる。このε（Fe）=580以上を達成するには、図5のグラフより、カテコール類のモル数／Feのモル数が270／10000以上であることが必要であると見積もられた。
【０１０２】
粒子B-3、B-4、及びB-6のいずれの粒子においても、光音響イメージングが可能なカテコール/Fe=270/10000以上という条件を満たさなかった。
【０１０３】
（実施例7）
カテコール類としてドーパミン、分散安定化剤としてカルボキシデキストランを含有するアモルファス粒子A-9を以下の方法で作製した。
【０１０４】
実施例2と同様に、Fe2+とFe3+を含む水溶液に、ドーパミン水溶液（ドーパミンとして9.5×10-4 mol）、及びNaOH水溶液を加えた。20 mg/mlのカルボキシデキストラン（名糖産業）水溶液を2 ml加えた。2時間撹拌を続け、粒子化させた。
【０１０５】
実施例1及び2と同様に、粒径と鉄量あたりの規格化光音響信号PA（Fe）を測定した。
粒子A-9の粒径は12 nm、鉄量あたりの規格化光音響信号PA（Fe）=2.2×104 （VJ-1M-1）だった。分散安定化剤として、カルボキシデキストランを用いても粒子を粒子ができた。分散安定化剤としてデキストランを用いて作製した粒子A-2と、分散安定化剤としてカルボキシデキストランを用いた粒子A-9と比較して、粒径及び鉄量あたりの規格化光音響信号は大きく変化しなかった。
【０１０６】
（実施例8）
カテコール類としてドーパミン、分散安定化剤としてアミノ化PEGを含有するアモルファス粒子A-10を以下の方法で作製した。
【０１０７】
実施例３と同様に、Fe3+を含む水溶液に、ドーパミン、及びNaOHを加えた。20 mg/mlのアミノ化PEG（日油、ME-200EA）水溶液6.4 ml加えた。2時間撹拌を続けて、粒子化させた。
【０１０８】
実施例1及び2と同様に、粒径と鉄量あたりの規格化光音響信号PA（Fe）を測定した。
【０１０９】
粒子A-10の粒径は72 nm、鉄量あたりの規格化光音響信号PA（Fe）=2.9×105 （VJ-1M-1）だった。分散安定化剤として、アミノ化PEGを用いても粒子を粒子ができた。分散安定化剤としてデキストランを用いて作製した粒子A-６と、分散安定化剤としてアミノ化PEGを用いた粒子A-10と比較して、粒径はやや変わるものの、鉄量あたりの規格化光音響信号は大きく変化しなかった。
【０１１０】
（実施例9）
粒子A-10を用いて、血管造影を想定して、以下の方法でin vitroで光音響イメージングを行った。
【０１１１】
粒子A-10を含む溶液を、溶液中のFe濃度が608 μg/mlとなるように調整した。この粒子A-10と、マウスから採取した血液とを体積比で1:10の割合で混合し、「血液＋粒子A-10」とした。この混合割合は、血液量が2 mlのマウスに200 μlの溶液を静脈注射すると仮定して見積った。比較として、PBSと血液とを体積比で1:10の割合で混合した液を「血液のみ」、粒子A-10とPBSとを体積比で1:10の割合で混合した液を「粒子A-10」とした。
【０１１２】
血管造影を想定して、それぞれの液をポリエチレンチューブ（イマムラ、外径0.965 mm、内径0.580 mm）に移し、光音響イメージング装置（Endra、Nexus 128）を用いて撮影した。撮影は波長680 nmで行った。画像を得るとともに、画像から輝度値を求めた。
【０１１３】
図６(A)は得られた画像である。血液のみと比べて、血液＋粒子A-10では鮮明な管状の像が得られた。図６(B)は輝度値のグラフである。血液のみと比べて、血液＋粒子A-10では輝度値は7.1倍、粒子A-1では輝度値は6.1倍高くなった。
【０１１４】
粒子A-10をマウスに200μl静脈注射した場合、粒子A-10のFe濃度が608μg/mlなので、マウスの体重が20gとした仮定すると、マウスの体重あたりの投与Fe投与量は6.08mg/kgとなる。リゾビスト（登録商標）を造影剤として用いる場合、Fe量として0.45 mg/kg投与できる。6.08mg/kgは0.45mg/kgの約13.5倍多い量である。
【０１１５】
しかし、粒子A-10を0.45mg/kgだけ投与した場合でも、
｛（粒子A-10の輝度値）÷13.5＋（血液のみの輝度値）｝÷（血液のみの輝度値）
の計算式から、輝度値は1.5倍高くなることが見積もられた。
【０１１６】
論文（Chemical Reviews 2756-2782 (2010)）では、血液に対して輝度値が1.65倍高くなるだけでも、画像上ではぼやけた血管像からはっきりした血管像に変化している。
【０１１７】
これらのことから、光音響イメージング装置で血管造影をするときの造影剤として、本件の粒子が有用であることが示された。
【図２】
2014031363.tif 000023
【図３】
2014031363.tif 000024
【図４】
2014031363.tif 000025
【図５】
2014031363.tif 000026
【図１】
2014031363.tif 000027
【図６】
2014031363.tif 000028