(57)【要約】【課題】より実用的な標的ポリヌクレオチドの検出方法を提供する。【解決手段】標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を固相担体上に備えるアレイを準備、このアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とにつき、ハイブリダイゼーションを実施し、ハイブリダイゼーションで得られた二重鎖ハイブリダイズ産物に肉眼で視認可能な検出シグナルを付与し、検出シグナルに基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する。ハイブリダイゼーションは、アレイ毎に１ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドの検出方法であって、
標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を固相担体上に備えるアレイ上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とにつき、ハイブリダイゼーションを実施する工程と、
前記ハイブリダイゼーションで得られた二重鎖ハイブリダイズ産物に肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程と、
前記固定化領域から得られる検出シグナルに基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、
を備え、
前記ハイブリダイゼーション工程は、前記アレイを用いて、前記アレイ毎に１ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する工程とする、検出方法。
【請求項２】
前記ハイブリダイゼーション工程は、前記固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であり、前記固相担体が、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上のシート状体である前記アレイを用いて、ハイブリダイゼーションを実施する工程とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記ハイブリダイゼーション工程は、前記固相担体が、平面積が５０ｍｍ2以下のシート状体である前記アレイを用いて、前記アレイ毎に０．３ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する工程とする、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記アスペクト比が２０以下である、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記アレイは、前記固相担体上に前記検出シグナルによる発色見本領域を別途備える、請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記発色見本領域は、顔料系インクにより形成されている、請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
前記アレイは、検出シグナルの色調又は濃淡につき程度の異なる２種以上の前記発色見本領域を備える、請求項５又は６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記アレイは、検出シグナルの色調又は濃淡の上限及び下限に相当する２つの前記発色見本領域を少なくとも備えており、
前記検出工程は、前記上限及び下限を指標として、前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項９】
前記固相担体は、液体の浸透性又は透過性を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記固相担体は、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン及びろ紙から選択される、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
前記固相担体の厚みは、０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下である、請求項１〜１０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
前記アレイは、前記複数個の固定化領域の外縁の所定の一部にハンドリング部位を備える、請求項１〜１１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイゼーション工程及び前記シグナル付与工程を、前記アレイを所定の方向性で同一のチューブ状容器に投入した状態を維持して実施する、請求項１〜１２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１４】
さらに、前記検出工程を、前記アレイを所定の方向性で前記容器に投入した状態を維持して実施する、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、前記容器内で遺伝子増幅反応により被験試料を調製する工程を備える、請求項１３又は１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記検出工程は、所定の複数の前記固定化領域から得られる検出シグナルの組み合わせに基づいて複数の前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程である、請求項１〜１５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１７】
前記検出工程は、前記組み合わせを、前記アレイ上において得られた前記固定化領域の発色パターンと、前記組み合わせに対応する前記オリゴヌクレオチドプローブの発色パターン見本と対比して検出する工程である、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記固定化領域は、２個以上２００個以下である、請求項１〜１７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、正規直交配列である塩基配列を有するプローブである、請求項１〜１８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の検出方法に用いるアレイであって、
標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域と、肉眼で視認可能な検出シグナルによる発色を提示する発色見本領域と、を固相担体上に備え、
前記固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であり、前記固相担体が、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上２０以下のシート状体である、アレイ。
【請求項２１】
標的ポリヌクレオチドを検出するためのアレイのシートであって、
標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域と、肉眼で視認可能な検出シグナルによる発色を提示する発色見本領域と、有するアレイ領域を複数個固相担体上に備えており、
前記固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であり、前記アレイ領域が、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上２０以下であり、
前記固相担体は、前記アレイ領域毎に分離可能である、シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ポリヌクレオチドの検出方法、そのためのアレイ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、結核菌の型別に必要な遺伝子領域をＰＣＲ法にて増幅し、メンブレン上へ固相化されたオリゴヌクレオチドプローブへこの増幅産物をハイブリダイズすることによって菌株の型別を行うなどの、生体試料の遺伝子情報中の特定のヌクレオチドや塩基配列を標的として、生体を同定するなどの検査が行われている。
【０００３】
この種の方法としては、例えば、検出しようとする菌の型別に必要な特異的プローブを数十種類を準備し、メンブレン上にこのプローブを平行線状に固定化しておき、ブロッターを用いてプローブのラインパターンと垂直になるように供給し試料から調製したＰＣＲ産物をハイブリダイズさせる方法があり、市販キットとしても提供されている。この方法では、ＰＣＲ用プライマーの一方の端がビオチン標識されているため、ハイブリダイゼーション後のメンブレンをペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンでインキュベートする。これにより、ハイブリダイズしたＰＣＲ産物をペルオキシダーゼで標識し、ＥＣＬ試薬による化学発光シグナルをＸ線フィルムへ感光させる。生体試料に含まれている菌の型に応じて表出される特異的プローブの配列パターンに基づき型判別が可能となる。
【０００４】
標的ポリヌクレオチドの検出を容易にするため、試験紙などに、２種類以上の生理活性物質を固定しておき、生理活性物質同士が隣接することにより、目視で容易に生理的複合反応の検出を行うことも検討されている（特許文献１）。また、核酸プローブがスポットされた周囲に蛍光標識された試薬などをスポッティングすることで、標的物質と結合した核酸プローブの位置を特定するのを容易にすることも試みられている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−６４９２７号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記した従来の方法では、いずれも、検体毎の検査や、小数検体での検査は困難であった。すなわち、上記した典型的な市販キットでは、ブロッターを用いてハイブリダイゼーションを行う手法であるため、大きな（１４ｃｍ四方）メンブレン上に数十種のプローブが固相化されており、サンプルも１度に数十検体までハイブリダイゼーションできるが、検体数が少ない場合でも同量の試薬を使用し、同様の処理を行わなければならなかった。また、こうした事情によって、検体ごとに検査することは困難であった。
【０００７】
さらに、上記市販キットでは、ハイブリダイゼーションや洗浄工程の間は温度を特定の一定温度に保たねばならないが、気相で加温するインキュベーターを使用するため温度の厳密な制御が難しく、非特異的結合による誤判定に繋がりやすい。更に、気相によるインキュベートはメンブレンが大きいことも影響して定温に達するまで時間が掛かっていた。加えて、検出工程については、プライマーが標識されているためPCR増幅断片１つについて得られるシグナルが１つであり、この検出感度の低さを補うため化学発光試薬とＸ線フィルムへの感光を採用しており、コストと作業時間の増加に繋がっている。
【０００８】
特許文献１には、比較的小面積の試験片（６０〜３００ｍｍ2）が開示されているが、検体毎の個別のかつ迅速な要請に応えるものではない。さらに、特許文献２には、Ｃｙ５をはじめとした蛍光物質を大量に必要とすること及び専用のスキャナを必要とすることから、コスト増となる。
【０００９】
そこで、本発明は、より実用的な標的ポリヌクレオチドの検出方法やそのためのアレイを提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、より実用的な標的ポリヌクレオチドの検出方法、すなわち、検体数の低減化、最も好ましくは検体毎の検査実施を可能にすることができるような、迅速性、簡易性及び低コスト性等を実現できる、検出方法及びそのためのアレイの提供につき、検討した。その結果、反応系サイズのコンパクト化と検出の肉眼による可視化とを、実現できることを見出した。本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１１】
（１）標的ポリヌクレオチドの検出方法であって、
標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を固相担体上に備えるアレイ上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とにつき、ハイブリダイゼーションを実施する工程と、
前記ハイブリダイゼーションで得られた二重鎖ハイブリダイズ産物に肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程と、
前記検出シグナルに基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程と、
を備え、
前記ハイブリダイゼーション工程は、前記アレイを用いて、前記アレイ毎に１ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する工程とする、検出方法。
（２）  前記ハイブリダイゼーション工程は、前記固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であり、前記固相担体が、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上のシート状体である前記アレイを用いて、ハイブリダイゼーションを実施する工程とする、（１）に記載の検出方法。
（３）前記ハイブリダイゼーション工程は、前記固相担体が、平面積が５０ｍｍ2以下のシート状体である前記アレイを用いて、前記アレイ毎に０．３ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する工程とする、（１）又は（２）に記載の検出方法。
（４）前記アスペクト比が２０以下である、（１）〜（３）のいずれかに記載の検出方法。
（５）前記アレイは、前記固相担体上に前記検出シグナルによる発色見本領域を別途備える、（１）〜（４）のいずれかに記載の検出方法。
（６）前記発色見本領域は、顔料系インクにより形成されている、（５）に記載の検出方法。
（７）前記アレイは、検出シグナルの色調又は濃淡につき程度の異なる２種以上の前記発色見本領域を備える、（５）又は（６）に記載の検出方法。
（８）前記アレイは、検出シグナルの色調又は濃淡の上限及び下限に相当する２つの前記発色見本領域を少なくとも備えており、
前記検出工程は、前記上限及び下限を指標として、前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程とする、（７）に記載の検出方法。
（９）前記固相担体は、液体の浸透性又は透過性を有する、（１）〜（８）のいずれかに記載の検出方法。
（１０）前記固相担体は、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン及びろ紙から選択される、（９）に記載の検出方法。
（１１）前記固相担体の厚みは、０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下である、（１）〜（１０）のいずれかに記載の検出方法。
（１２）前記アレイは、前記複数個の固定化領域の外縁の所定の一部にハンドリング部位を備える、（１）〜（１１）のいずれかに記載の検出方法。
（１３）前記ハイブリダイゼーション工程及び前記シグナル付与工程を、前記アレイを所定の方向性で同一のチューブ状容器に投入した状態を維持して実施する、（１）〜（１２）のいずれかに記載の検出方法。
（１４）さらに、前記検出工程を、前記アレイを所定の方向性で前記容器に投入した状態を維持して実施する、（１３）に記載の検出方法。
（１５）前記ハイブリダイゼーション工程に先立って、前記容器内で遺伝子増幅反応により被験試料を作製する工程を備える、（１３）又は（１４）に記載の検出方法。
（１６）前記検出工程は、所定の複数の前記固定化領域から得られる検出シグナルの組み合わせに基づいて複数の前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程である、（１）〜（１５）のいずれかに記載の検出方法。
（１７）前記検出工程は、前記組み合わせを、前記アレイ上において得られた前記固定化領域の発色パターンと、前記組み合わせに対応する前記オリゴヌクレオチドプローブの発色パターン見本と対比して検出する工程である、（１６）に記載の検出方法。
（１８）前記固定化領域は、２個以上２００個以下である、（１）〜（１７）のいずれかに記載の検出方法。
（１９）前記オリゴヌクレオチドプローブは、正規直交配列である塩基配列を有するプローブである、（１）〜（１８）のいずれかに記載の検出方法。
（２０）（１）〜（１９）のいずれかに記載の検出方法に用いるアレイであって、
標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域と、肉眼で視認可能な検出シグナルによる発色を提示する発色見本領域と、を固相担体上に備え、
前記固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であり、前記固相担体が、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上２０以下のシート状体である、アレイ。
（２１）標的ポリヌクレオチドを検出するためのアレイのシートであって、
標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域と、肉眼で視認可能な検出シグナルによる発色を提示する発色見本領域と、有するアレイ領域を複数個固相担体上に備えており、
前記固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下であり、前記アレイ領域が、平面積が１５０ｍｍ2以下、アスペクト比が１．５以上２０以下であり、
前記固相担体は、前記アレイ領域毎に分離可能である、シート。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のアレイ及びアレイシートの一例を示す図である。
【図２】本発明の検出方法の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、標的ポリヌクレオチドの検出方法及びそのためのアレイ等に関する。本発明の検出方法は、小スケールで、迅速かつ簡易に標的ポリヌクレオチドを検出することができる。反応系の小スケール化は、試薬量の低減による低コスト化のほか、アレイの小スケール化によって、精度がよく迅速な温度制御が可能となる。さらに、可視光による検出は、装置コストを低減できるほか、リアルタイムに発色を観察できる点が検査の迅速性に寄与している。
【００１４】
本発明のアレイ及びシートによれば、こうした小スケール反応に適したものとなっており、特に、０．５ｍｌ以下のチューブ状容器への適用性に優れたものとなっている。
【００１５】
本明細書において、標的ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合体を意味しており、その数は特に限定しない。したがって、標的ポリヌクレオチドには、数十程度のヌクレオチドが連結したオリゴヌクレオチドが包含される。標的ポリヌクレオチドは、例えば、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒト、非ヒト動物などの生物における遺伝子上の指標となる塩基あるいは塩基配列を含んでいる。典型的には、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の塩基配列も標的ポリヌクレオチドが有する塩基配列として挙げられる。
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１７】
（標的ポリヌクレオチドの検出方法）
本発明の検出方法は、ハイブリダイゼーション工程と、シグナルを付与する工程と、標的ポリヌクレオチドの検出工程と、を備えている。
【００１８】
（ハイブリダイゼーション工程）
ハイブリダイゼーション工程は、標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を固相担体上に備えるアレイを準備し、このアレイ上の前記オリゴヌクレオチドプローブと、被験試料とにつき、前記アレイ毎に１ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施するハイブリダイゼーションを実施する工程とすることができる。以下、まず本発明方法において用いる本発明のアレイについて説明する。
【００１９】
（アレイ）
本発明のアレイは、標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を固相担体上に備えている。本アレイは、上記のとおり、アレイ一つにつき１ｍｌ以下の液中ハイブリダイゼーション可能な程度の形態を有している。すなわち、当該形態（サイズ及び形状）の固相担体を備えている。
【００２０】
アレイに１ｍｌ以下の液中ハイブリダイゼーションを可能とする形態は、ハイブリダイゼーション容器の大きさによっても異なるが、本発明では、当該容器として、例えば、先細りのあるいは寸胴状のチューブ状容器が意図されることが好ましい。すなわち、こうした容器を用いて本検出方法を実施することが好ましい。先細り状の容器の例としては、典型的には、エッペンドルフチューブ（商品名）が挙げられ、寸胴状の容器の例としては、典型的には一般的な試験管等が挙げられる。チューブ状容器は、例えば、１ｍｌ以下、０．５ｍｌ以下、０．３ｍｌ以下のハイブリダイゼーション液を充填できる容積を有することが好ましい。こうしたチューブ状容器としては、それぞれ、内径７〜９ｍｍ、典型的には８ｍｍ、深さ３７〜３９ｍｍ、典型的には３８ｍｍ、内径５〜７ｍｍ、典型的には６ｍｍ、深さ２９〜３１ｍｍ、典型的には３０ｍｍ及び内径４〜６ｍｍ、典型的には５ｍｍ、深さ１９〜２１ｍｍ、典型的には２０ｍｍのサイズを有するものが挙げられる。
【００２１】
容器は、また、透明性であることが好ましい。内部のアレイの状態、ひいては検出シグナルを肉眼で視認するのに都合がよいからである。また、容器は、その開口部（通常は上部）を開閉するために脱着可能な蓋を備えていてもよい。こうした蓋を備えることで、少ない液量の蒸発等を防ぐとともに、温度制御を迅速かつ容易化できる。
【００２２】
より具体的には、アレイの形態は、平面積が１５０ｍｍ2以下であることが好ましい。この平面積以下であると、十分に１ｍｌ以下の液中においても固定化領域においてハイブリダイゼーションが可能である。より好ましくは、１００ｍｍ2以下であり、さらに好ましくは５０ｍｍ2以下である。５０ｍｍ2以下であると、０．３ｍｌ以下の液中でのハイブリダイゼーションにも有効である。
【００２３】
また、好ましくは、アスペクト比が１．５以上の方形状である。こうした方形状であると、チューブ状容器に収まりやすく、ハンドリングも容易である。また、チューブ状容器内で反転したりせずに、容器内において投入時の形態が保持され、予め定めた一定の方向性が確保される。さらに、方形状であると、アレイの方向性を目視で簡易に判別することができ、ハイブリダイゼーション工程ほか、シグナル付与工程及び検出工程に都合がよい。より好ましくはアスペクト比は２０以下である。アスペクト比が２０を超えると固定化領域の検出パターンを把握しにくくなるからであり、２０以下であると複数個の固定化領域におけるシグナルを目視でパターンとして把握しやすいため、検出精度を維持ないし向上させることができる。アスペクト比は好ましくは１５以下であり、より好ましくは１０以下であり、さらに好ましくは５以下であり、一層好ましくは３以下である。
【００２４】
アレイは、シート状であることが好ましい。シート状であると、ハンドリング性が良く、検査データとしての保存にも有利である。さらに、シート状であると、一定の可撓性も付与しやすく、小スケールの容器への充填性、収納性及び反応性に有利に寄与することができる。アレイの厚みは、固相担体の厚みとして、０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下であることが好ましい。
【００２５】
（オリゴヌクレオチドプローブの固定化領域）
アレイは、固相担体上に標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を備えている。オリゴヌクレオチドプローブは、検出する対象や検出手法、あるいは標的ポリヌクレオチドの検出システムに応じて適宜選択される。例えば、感染症等の感染原因菌の菌種（型）判定には、複数のオリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリダイゼーションによって検出する。変異の検出にあたっては、一つの変異に対して１又は複数のオリゴヌクレオチドプローブの固定化領域を対応させてもよい。
【００２６】
オリゴヌクレオチドプローブとしては、標的ポリヌクレオチドの塩基配列にかかわらず、常に所定の塩基配列を有するプローブである、ユニバーサルプローブを用いてもよい。ユニバーサルプローブは、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される塩基配列である正規直交配列を有することができる。正規直交配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味しうる。１つの正規直交配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交配列は、ＰＣＲ等において増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイズのような問題に影響されずに、当該正規直交配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有しうる。上記のような正規直交配列は、H.Yoshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)に詳細が記載されている。こうした文献に基づいて正規直交配列を設計することができる。
【００２７】
こうしたユニバーサルプローブを用いた場合、予め標的ポリヌクレオチドに対して特定のユニバーサルプローブを関連付けておく。そして、標的ポリヌクレオチドに対して、プライマーとのハイブリダイゼーション反応とリガーゼ反応とを実施して、関連付けられたユニバーサルプローブの塩基配列と同一又は相補的な塩基配列を有する標的ポリヌクレオチドに特異的なリガーゼ産物を取得し、このリガーゼ産物と、アレイ上のユニバーサルプローブとのハイブリダイゼーションを実施することとなる。リガーゼ産物は、予め関連付けられたプローブとハイブリダイズし二重鎖ハイブリダイズ産物を生成する。なお、ＳＮＰなど変異の検出には、一つの標的ポリヌクレオチドに対して、複数のユニバーサルプローブが割り付けられることもある。この種の方法は、特開２００８−３０６９４１号公報、Analytical Biochemistry, 364, 1, 2007, 78-85の他、特開２００９−２３２７７８号公報、特開２００９−２４号公報等を参照して実施することができる。
【００２８】
一つの固定化領域は、好ましくは一種類のオリゴヌクレオチドプローブが固定化されている。なお、オリゴヌクレオチドプローブの固相担体への固定化手法については、当業者であれば、公知の各種手法に必要に応じて適宜採用することができる。
【００２９】
個々の固定化領域の大きさは、０．２ｍｍ2以上１５０ｍｍ2以下である。０．２ｍｍ2未満であると目視による視認性が低下しすぎ、１５０ｍｍ2を超えてはアレイのサイズ上問題がある。
【００３０】
固定化領域の形状は特に限定しないで、円形状、方形状等、アレイにおいて適用される公知の各種の形態とすることができる。固定化領域の充填密度や視認性を考慮すると方形状であることが好ましく、より好ましくは正方形状である。
【００３１】
固定化領域の個数は、固定化領域の個数は、検出意図や検出方法の用途に応じて適宜設定される。アレイのサイズ等を考慮すると、特に限定しないが、２個以上２００個以下であることが好ましい。２００個を超えると、アレイのサイズ上の観点及び目視による検出判定が困難になる可能性があるからである。１又は複数の固定化領域における目視によるシグナル検出を考慮すると、好ましくは１５０個以下であり、より好ましくは１００個以下である。また、固定化領域の個数は、好ましくは２０個以上であり、より好ましくは４０個以上である。２０個以上であると、例えば、各種診断等において汎用性が高い。
【００３２】
複数個の固定化領域は、固相担体上に一つの区画を形成していることが好ましい。区画は、アレイの形状に応じた、たて列及びよこ列の組み合わせによる整列形態を備えていることが好ましい。典型的には、こうした区画は、方形状となっている。
【００３３】
（発色見本領域）
アレイは、固相担体上に、複数の固定化領域の他に検出シグナルによる発色見本領域を別途備えることができる。こうした発色見本領域を備えることで、アレイが小スケール化されていても、また、目視によるシグナル判別によっても、検出精度及び正確性を確保することができる。発色見本領域は、後述するシグナル付与工程で付与するシグナルの発色見本であり、シグナルに応じた色調、明度や彩度をもって、予め付与されている。すなわち、検出方法を通じて維持できるように付与されている。発色見本領域は、インクによって、付与されており、好ましくは、固相担体への定着性や反応性を考慮して顔料インクが用いられる。こうしたインク類は、典型的には、オリゴヌクレオチドプローブを固相担体に付与して固定化領域を形成するときと同様の手法（例えば、ピエゾ素子によるインクジェット手法）で、固相担体に付与されている。そして、発色見本領域は、対比観察上の要請から、固定化領域と同様のサイズと形状で、固相担体上に付与されていることが好ましい。さらに、発色見本領域は、固定化領域におけるシグナルと対比観察がしやすいように、固定化領域に隣接して形成されていることが好ましい。
【００３４】
発色見本領域は、検出シグナルの色調又は濃淡につき程度の異なる２種以上の領域から構成されていることが好ましい。こうした構成とすることで、目視によるシグナル検出をより容易にかつ確実に行うことができる。好ましくは、検出シグナルの色調又は濃淡の上限及び下限に相当する少なくとも２つの発色見本領域を備える。こうした発色見本領域を備えることで、上記上限及び下限を指標としてシグナルの検出を判断できるようになり、試験者の熟練程度や反応誤差に関わらず一層容易かつ確実な検出が可能となる。
【００３５】
（ハンドリング部位）
アレイは、複数個の固定化領域からなる区画の外部にハンドリング部位を備えることができる。ハンドリング部位を有することで、小さいアレイであってもハンドリングを確実にするとともに、一定の方向性でアレイを取り扱うことが可能となり、実験精度ないし検出精度を高め、シグナル検出も容易化することができる。ハンドリング部位としては、典型的には、固相担体上の固定化領域や発色見本領域が形成されていないマージン領域を適用することができる。また、ハンドリング部位をアレイの一部、例えば、方形状シートの一端部（特に一方の短縁部）に設けることで、アレイの取り扱いに便利であるほか、アレイを容易に一定の方向性を維持して各種操作を実施できる。ハンドリング部位には、アレイを個別に識別するための検体識別情報を付与することが可能であり、予めこうした検体識別情報を、インク等に付与されていてもよい。検体識別情報は、数字、記号、文字又は図形、これらの組み合わせであってよい。
【００３６】
そのほか、アレイは、操作及び識別に有用な情報を備えることができる。例えば、操作や検出時におけるアレイの方向性を定める方向識別情報を付与することができる。なお、上記したマージン領域（ハンドリング部位）や発色見本領域、検体識別情報を、方向識別情報として用いることもできる。
【００３７】
（固相担体）
アレイを構成する固相担体は、特に限定しないが、ダウンサイジング性、小スケールでの取り扱い性、反応性、検出シグナルの視認性等を考慮すると、液体の浸透性又は透過性を有することが好ましい。こうした材料としては、例えば、ポリエーテルスルホン、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデンなどのポリマーを主体としたいわゆる多孔性のメンブランフィルターのほか、セルロースなどのろ紙を好ましく用いることができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーション工程は、こうしたアレイを用いて、一つのアレイにつき１ｍｌ以下、好ましくは、０．５ｍｌ以下、より好ましくは０．３ｍｌ以下の液中でハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーション工程において、被験試料中に、プローブと塩基対を形成する標的ポリヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを含んでいるとき、二重鎖ハイブリダイズ産物が形成される。
【００３９】
ハイブリダイゼーション工程は、アレイを所定の方向でチューブ状容器に投入し、その状態を維持して実施することが好ましい。具体的には、チューブ状容器の内部形態に合わせて、アレイの長辺が容器の深さ方向に沿う状態を維持して実施することが好ましい。上記したアスペクト比の方形状シートのアレイを用いることで、市販で入手できる１〜０．３ｍｌ程度の各種形態のチューブ状容器内に安定して保持される。
【００４０】
ハイブリダイゼーション工程では、チューブ状容器を用いる場合、既存のＰＣＲのための温度制御装置に適用することができる。こうした温度制御を実施することで、精度よくかつ迅速に温度制御が可能となる。ハイブリダイゼーション工程の条件は特に限定しない。通常のハイブリダイズ媒体を用いることができる。また、適度な温度に設定することができる。
【００４１】
なお、後段の検出工程に先立って、過剰の被験試料を洗浄除去する洗浄工程を実施することが好ましい。洗浄工程は、ハイブリダイゼーション工程を実施した容器からハイブリダイゼーション液を除去してアレイのみを残留させた状態で、所定の温度条件で洗浄に適した液を供給して適当な時間接触させることを適数回繰り返すことによって実施できる。こうした洗浄工程を同一容器で実施することで、操作を簡略化し容器数を減らしてしかも、温度制御を迅速かつ精度よく行うことができる。
【００４２】
ハイブリダイゼーション工程に供する被験試料は、特に限定しないで、ハイブリダイゼーションの対象となる可能性のある標的ポリヌクレオチドを含んでいればよい。被験試料としては、プローブハイブリダイゼーションが適用される公知の遺伝子情報、ＤＮＡを用いた検出、検査、診断方法における被験試料を本方法に用いることができる。
【００４３】
被験試料には、各種の生体由来の試料（血液、尿、痰、組織、細胞（各種の動物由来の培養動物細胞、培養植物細胞、培養微生物細胞を含む））あるいは、こうした生体試料からＤＮＡを抽出したＤＮＡ抽出試料、こうした生体試料の有するＤＮＡやＲＮＡから各種の遺伝子増幅手法による増幅試料等が含まれる。また、後述するシグナル付与工程を考慮すると、被験試料中のオリゴヌクレオチドが予め標識されていることが好ましい。当業者であれば、こうした被験試料を周知の技術に基づいて容易に調製することができるが、例えば、以下の被験試料調製工程を実施してもよい。
【００４４】
（被験試料調製工程）
本発明方法は、ハイブリダイゼーション工程に先立って、ハイブリダイゼーション工程に用いる容器と同一容器を用いて、遺伝子増幅反応によって被験試料を調製する工程を備えていてもよい。同一容器を用いることで、増幅に用いた容器に対してアレイを投入することでハイブリダイゼーション工程を実施できる。また、こうすることで、用いる容器数を減少させ、操作を簡略化することができる。
【００４５】
遺伝子増幅反応としては、公知の各種の反応が利用でき、例えば、各種手法によるＰＣＲのほか、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＩＣＡＮ等が挙げられる。また、被験試料中のポリヌクレオチドを標識するのにあたっては、所定の標識結合性物質が連結されたｄＮＴＰを取り込ませる方法によることができる。標識結合性物質とは、ジゴキニゲニン（ＤＩＧ）などのハプテン（一次シグナル）などが挙げられる。この場合には、当該ハプテン特異的認識抗体を用い、さらに当該認識抗体に付与した例えば、ペルオキシダーゼ等の発色性物質（二次シグナル）を検出シグナルとして用いることができる。
【００４６】
遺伝子増幅反応実施後、同一容器内の遺伝子増幅反応液又はハイブリダイゼーション用の液を供給することが好ましい。そして、さらに、ハイブリダイゼーションに先立つ高温による変性工程も同一容器内でそのまま実施することがより好ましい。こうすることで、操作を簡略化し、さらに操作の迅速化、温度制御の迅速化及び高精度化も実現できる。
【００４７】
（シグナル付与工程）
シグナル付与工程は、ハイブリダイゼーション工程で得られた二重鎖ハイブリダイズ産物に肉眼で視認可能な検出シグナルを付与する工程とすることができる。肉眼で視認可能なシグナルを付与することで、特別な検出装置を要することなく、しかもリアルタイムに発色を肉眼で観察し判定することができる。二重鎖ハイブリダイズ産物にシグナル付与するには、例えば、既に記載のとおり、予め被験試料中のポリヌクレオチドに対してハプテンなどのほか、ビオチンなどの一次シグナルを付与しておくことが挙げられる。そして、本工程において、当該一次シグナルに特異的な二次シグナルを付与することで、当該二次シグナルを利用して肉眼で視認可能な検出シグナルを付与することができる。すなわち、検出系としては、抗原抗体反応やビオチン−アビジン反応を利用できる。
【００４８】
二次シグナルを利用して肉眼で視認可能な検出シグナルを得るには、二次シグナルが発色性の生成物を生成する酵素であることが好ましい。こうすることで、酵素反応を利用して発色性生成物を速やかにかつリアルタイムに検出することができる。この場合、二次シグナルは、ハプテンに特異手的に結合する抗体とこうした酵素とを備えた複合体とすることができる。
【００４９】
二次シグナルは、こうした酵素を必ずしも備えておらず、単にハプテンなどの一次シグナルに結合する抗体としてもよい。この場合、二次シグナルたる抗体に特異的に結合する二次抗体と酵素との複合体を三次シグナルとして用いればよい。こうした複数シグナルによる検出には、ＥＬＩＳＡやビオチン−アビジンシステムにおける周知の手法を用いることができる。
【００５０】
シグナル付与工程は、ハイブリダイゼーション工程で用いたのと同一容器内で実施することが好ましい。こうすることで、操作を簡略化して迅速性を向上させることができる。また、アレイを、同一容器に残しておくことで、アレイの容器への投入時（ハイブリダイゼーション工程時）の一定の方向性を容易に維持できる。例えば、過剰試料除去後のアレイが残留した同一容器に、二次シグナルを含む溶液を投入して標識反応を実施することができる。過剰の二次シグナルを除去洗浄後、二次シグナルをそのまま肉眼で視認できる場合以外は、さらに、二次シグナルを発色させる発色反応を実施する。例えば、二次シグナルとしてペルオキシダーゼなどの酵素を用いた場合には、過剰なペルオキシダーゼ除去後に、基質を供給して酵素反応を生じさせる。三次シグナルを要する場合には、洗浄及び反応工程をさらに実施する。
【００５１】
（検出工程）
検出工程は、シグナル付与工程で二重鎖ハイブリダイズ産物に付与した検出シグナルに基づいて標的ポリヌクレオチドを検出する工程とすることができる。上記のとおり、二重鎖ハイブリダイズ産物は、検出シグナルが付与されているので、これを肉眼にて観察し、標的ポリヌクレオチドの有無を検出する。
【００５２】
検出にあたっては、アレイが充填されたままの容器内で行ってもよいし、アレイを容器から取り出して容器外で行ってもよい。また、シグナル付与のための液が投入されたままの状態で行っても良い。シグナル付与工程において、ハイブリダイゼーション工程に用いたのと同一容器でアレイの方向性が維持された状態とすることで、アレイにおける検出シグナルの検出の際に、投入時と同様である、所定の方向性でシグナルを検出できるため、標的ポリヌクレオチドの検出が容易であり確度も高いものとなる。
【００５３】
アレイが、発色見本領域を備えるとき、この色調や濃淡と対比観察することで、迅速かつ確度の高い検出が可能となる。また、アレイが、検出シグナルの色調又は濃淡の上限及び下限に相当する２つの発色見本領域を少なくとも備える場合には、上限及び下限を指標として、前記標的ポリヌクレオチドを検出する工程とすることができる。こうすることで、熟練程度や反応誤差によらないで確度の高い検出が可能となる。
【００５４】
検出工程は、検出対象や用途に応じて、被験試料中の複数の標的ポリヌクレオチドの組み合わせを検出する工程であってもよい。例えば、肺炎の原因菌の型判別のように、複数の遺伝子の複数の配列を検出する場合には、複数の標的ポリヌクレオチドに対応する複数の固定化領域の組み合わせが検出される。この場合、こうした組み合わせを、アレイ上において得られた記固定化領域の発色パターンと、その組み合わせに対応するオリゴヌクレオチドプローブの発色パターン見本と対比して検出するとしてもよい。こうした発色パターン見本は予め準備しておく。例えば、検出しようとするパターン毎に準備しておくことで、迅速かつ容易に確度の高い判別が可能となる。
【００５５】
なお、ハイブリダイゼーション工程及びシグナル付与工程を、同一容器内で行うことが好ましいとしたが、これに限定するものではなく、異なる容器で実施してもよい。また、被験試料調製工程も同様である。例えば、工程毎あるいはさらに細かいステップ毎に、異なる容器に予め適切な液を準備して配置しておき、アレイがこうした容器を反応工程に応じて移動する構成としてもよい。
【００５６】
（アレイ及びアレイシート）
本発明によれば、また、本発明方法に用いるアレイが提供される。上記した各種態様のアレイも本発明に含まれる。さらに、本発明によれば、こうしたアレイをアレイ領域として複数個備えるアレイシートも提供される。すなわち、標的ポリヌクレオチドを検出するためのアレイのシートであって、標的ポリヌクレオチドと予め関連付けられたオリゴヌクレオチドプローブの複数個の固定化領域を含むアレイ領域を、このアレイ領域毎に分離可能に複数個備えたアレイシートが提供される。このシートによれば、本発明方法に用いられるアレイを簡単に製造、供給できる。アレイ領域毎に分離可能とするには、例えば、上記した好ましい固相担体を用いれば、一般的に使用されるカッターやはさみ等で切断が可能である。あるいは、切断可能に脆弱な部位をアレイ領域間に設けることで、容易に手操作によって、アレイ領域を分離可能である。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５８】
（アレイの作製）
アルデヒド基で表面修飾したポリエーテルスルホン製であって、サイズが２８５ｍｍ×５０ｍｍ、孔径が０．５μｍ、厚さが０．１５μｍのシートに、以下の表に示す塩基配列からなるＤＮＡプローブ溶液を、特開２００３−７５３０５号公報に記載されている吐出ユニット（インクジェット法）を用いた日本ガイシ株式会社ＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標）スポッターを用いて、スポットし、以下の手順で固定化した。
【００５９】
（ＤＮＡプローブ溶液）
オリゴＤＮＡを４４種類合成し、Tris-EDTA bufferで溶解した水溶液を、ＳＳＣ緩衝液、ブロモフェノールブルーと混合してＤＮＡプローブ濃度が２μＭ〜６０μＭのＤＮＡプローブ溶液を調製した。
【００６０】
【表１】
2014176296.tif 000002
【００６１】
（手順１）
吐出ユニット内に配置した液体注入部に、ＤＮＡプローブ溶液を注入し、シートにスポットする前に、検査用のシート上に検査スポットを行った。品質の検査は、検査スポットに対し、スポットが形成されないことはないか、スポットがいびつな形状ではないか、スポット径が設計値から１０％ 以上ずれていないか、サテライトと呼ばれる本スポット以外の不要なスポットが発生していないか、スポット位置がスポット径の３分の１以上ずれていないかという項目を実施した。シートの色は白色で、ＤＮＡプローブ溶液はブロモフェノールブルーによって青色に着色されているため、目視で検査を実施した。ブロモフェノールブルーは、ハイブリダイゼーション〜酵素付抗体免疫反応〜酵素発色色素沈着において、溶出し、除去される。
【００６２】
（手順２）
検査スポットで不良が検出されたときは、吐出ユニット内に配置された圧電/電歪素子の駆動信号を調整して検査スポットを再度行う。駆動信号の調整は電圧値、所定電圧までの上昇時間、所定電圧値のキープ時間、電圧立ち下げ時間の変更で行った。それでも不良が検出されるときは、真空吸引することで吐出ユニットからＤＮＡプローブ溶液を抜き取り、液体注入部にＤＮＡプローブを再度注入して、検査スポットを行う。不良スポットが検出されなくなるまで、この操作を繰り返した。
【００６３】
（手順３）
不良スポットが検出されなくなったことを確認したのち、以下の方法でオリゴヌクレオチドプローブを図１に示すようにシートにプロットした。すなわち、１種類のＤＮＡプローブにつき、スポットのピッチを横方向（Ｘ方向）、縦方向（Ｙ方向）ともに０．０５ｍｍで、横方向、縦方向ともに９箇所スポットを行い、横方向０．５ｍｍ、縦方向０．５ｍｍのスクエア形状の一つの固定化領域を形成した。固定化領域のコーナーはＲ＝０．０５ｍｍとなった。さらに、シート上を吐出ユニットが、シート長手方向（Ｘ方向）に移動しながら、シートがシート短手方向（Ｙ方向）に移動して、非接触でスポットを行った。スクエアのピッチを縦方向、横方向ともに０．６ｍｍで５列×１０行の格子エリア内に４７種類のＤＮＡプローブ溶液から４７個の固定化領域を形成・配置して、複数の固定化領域からなる１つの区画（５．９ｍｍ×２．９ｍｍ）を形成した。
さらにこの区画を、縦方向１３．５ｍｍピッチ、横方向６．８ｍｍピッチで、１シートに１２０個形成した。
【００６４】
（手順４）
複数の顔料系インクを混合して、検出シグナルの発色と同じ色調になるように、発色見本のスポットに使用する溶液を得た。さらに濃淡も検出シグナルの発色と同じになるように、先に得た溶液の２倍希釈、３倍希釈、４倍希釈を行った。これら３種類の溶液を、それぞれ、（手順１）〜（手順３）の方法で、各区画の上部の中央に３個隣接してスポットを行い、シート上に各区画毎に発色見本領域を形成した。
【００６５】
（手順５）
各アレイの固体識別を可能にするために、発色見本領域の上部に、顔料系マゼンダインクを用いて、ＩＤ番号として、“Ａ０１・・・・Ａ１２、Ｂ０１・・・・Ｊ１２”のスポットを行った。
【００６６】
（手順６）
ＤＮＡプローブ溶液、発色見本、ＩＤ番号のスポットが完了したのち、風乾することで、
ＤＮＡプローブ溶液の固定、発色見本及びＩＤ番号の固着を行った。
【００６７】
（手順７）
（手順１）で行う検査と同様の項目で検査を行った。
【００６８】
（手順８）
不良が検出されなかったシートについて、１アレイを４ｍｍ×９ｍｍサイズ（アスペクト比：２．２５）に、ローラーカッターで切断することで、１シートから１２０個のアレイを得た。
【実施例２】
【００６９】
本実施例では、結核菌の４つの型（ＢＧＣワクチン株、北京ファミリー、ＬＡＭ９、ＥＡＩ２）を判別への本アレイの適用を評価した。これらの４つの菌型に予め他の方法で判別されている検体から常法に従い、ゲノム抽出サンプルを調製し、このサンプルを、以下の工程で、実施例１で作製したアレイに適用した。図２に工程の概要を示す。
【００７０】
（遺伝子増幅工程）
４種類のゲノム抽出サンプルを、エッペンドルフチューブにとり、ＤＲ配列認識プライマーを用いるとともに、ＤＩＧラベルＮＴＰ（ＰＣＲ ＤＩＧラベリングミックス、ロッシュ製）を用いて常法によりＰＣＲを実施して増幅産物溶液を得た。
【００７１】
（変性工程）
各チューブに、ハイブリダイゼーション液として、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液２００μｌを加えて、良く混合し、９５℃に加熱したヒートブロックに５分配置後、氷水中に移して急冷した。
【００７２】
（ハイブリダイゼーション工程）
各チューブに、実施例１で作製したアレイを一個づつ、発色見本領域が上方となるように投入して、６０℃に制御したヒートブロックに挿入して１５分ハイブリダイゼーションを実施した。
【００７３】
（洗浄工程）
ハイブリダイゼーション工程に用いた溶液を一旦除去し、チューブ内のアレイに対して新たにハイブリダイゼーション溶液２００μｌを添加し、６０℃のヒートブロックで１分間静置状態で加熱してハイブリダイゼーション液を除去した後、さらに同様にしてハイブリダイゼーション液を交換してそれぞれ１０分及び１分の洗浄を繰り返した。
【００７４】
（シグナル付与工程）
抗ＤＩＧ抗体酵素（ペルオキシダーゼ）含有試薬（ＤＩＧ−ＰＯＤ、ロッシュ製）の１０００倍希釈液２００μｌを各チューブ内のアレイに供給して、抗原抗体反応により酵素を結合させた。
【００７５】
（洗浄工程）
シグナル付与工程に用いた溶液を除去し、チューブ内のアレイに対して新たにハイブリダイゼーション溶液２５０μｌを添加し、６０℃のヒートブロックで１分間静置状態で加熱してハイブリダイゼーション液を除去した後、さらに同様にしてハイブリダイゼーション液を交換してそれぞれ１０分及び１分の洗浄を繰り返した。
【００７６】
（基質反応工程）
洗浄後のチューブに対してペルオキシダーゼの基質溶液（Ｖｅｃ．Ｌａｂ製、ＴＭＢキット）２００μｌを供給して、室温で酵素反応を行い、青色の反応生成物を生成させた。
【００７７】
（検出工程）
各チューブ内の反応液中で固定化領域の発色パターンを確認したところ、それぞれのチューブのアレイから、結核菌の４種の型、ＢＧＣワクチン株、北京ファミリー、ＬＡＭ９、ＥＡＩ２をそれぞれ確認できた。これらの４種の型を確認するにあたって、発色見本領域を参照することで容易に個々の固定化領域の検出シグナルが標的ポリヌクレオチドの存在を肯定できるかどうかを簡易にかつ迅速に判断することができた。また、アレイのアスペクト比が約２であり、幅４ｍｍ×長さ９ｍｍであったため、チューブ内に収まりやすくかつ方向性を維持して各操作を行うことができた。さらに、複数個の固定化領域がスクエア状であり、かつ、よこ５列×たて１０列で整列されて、アスペクト比が約２であったので、複数個の固定化領域の検出シグナルを組み合わせて得られるパターンの判別が容易であり、結核菌の４つの型を迅速に判断することができた。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１〜４４：プローブ
【図１】
2014176296.tif 000003
【図２】
2014176296.tif 000004
【配列表】
2014176296000001.app