(57)【要約】【課題】ポリイソプレノイドの製造効率を改善する方法を提供する。【解決手段】防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を阻害する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項２】
ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を阻害する
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項３】
Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項４】
ミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害する
１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項５】
増産剤が、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものである、
請求項１〜４のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項６】
イソプレノイド産生細胞が真核生物の細胞である、
請求項１〜５のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項７】
真核生物が、ノゲシ、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、グアユール、及びロシアンタンポポから選択される、
請求項６に記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項８】
真核生物が、酵母である
請求項６に記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項９】
イソプレノイド産生細胞が細菌の細胞である、
請求項１〜５のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項１０】
細菌が遺伝子組換大腸菌である、
請求項９に記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリイソプレノイドの製造方法の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で生合成された天然ゴム（イソプレノイド）を、植物から採取することにより得られる。しかしながら、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴム（イソプレノイド）を採取できる期間は２０〜３０年に限られている。
【０００３】
ゴム産生植物によるイソプレノイド製造の効率を向上させるために、例えば、ゴム産生植物の幹にエチレンやｅｔｈｅｐｈｏｎ（２−クロロエチルホスホン酸）を塗布し、乳管から流出してくるラテックスが傷口で凝固することを防ぎ、ラテックスの採取効率を向上させる方法が知られている。また、ジャスモン酸やその前駆体であるリノレン酸等を配合したラノリンをゴム産生植物の幹に塗布することにより、乳管分化を促進し、乳管密度を増大する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながら、これらの方法はポリイソプレノイド生成のメカニズムに直接的に作用するものではなく、増産効果は限定的であった。
【０００４】
一方、ゴム産生植物から得られるイソプレノイド以外に、遺伝子組換微生物により製造されるイソプレノイドを利用する方法が知られている。しかしながら、収量、力価、及び純度の点で、商業プロセスの要求を充分に満たすものとはいえない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｏ  他、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ、２０００年、第８５巻、３７〜４３ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前述の問題を解決し、ポリイソプレノイドの製造効率を改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤をイソプレノイド産生植物に添加することにより、イソプレノイドの製造効率を改善できること、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤をイソプレノイド産生植物に添加することにより、イソプレノイドの製造効率を改善できること、ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性を有する１種類以上の増産剤をイソプレノイド産生植物に添加すること、及びミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害する１種類以上の増産剤をイソプレノイド産生植物に添加することにより、イソプレノイドの製造効率を改善できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を阻害する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【００１２】
増産剤が、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものであることが好ましい。
【００１３】
イソプレノイド産生細胞が真核生物の細胞であることが好ましい。
【００１４】
真核生物が、ノゲシ、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、グアユール、及びロシアンタンポポから選択されることが好ましい。
【００１５】
真核生物が、酵母であることが好ましい。
【００１６】
イソプレノイド産生細胞が細菌の細胞であることが好ましい。
【００１７】
細菌が遺伝子組換大腸菌であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法により、イソプレノイド産生植物によるポリイソプレノイド生産効率を向上させることができる。ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素はメバロン酸経路における主要酵素であり、この酵素を阻害することにより非メバロン酸経路が活性化され、ポリイソプレノイド生産効率を向上させられると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を阻害する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害する１種類以上の増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【００２０】
電子伝達複合体に対する電子伝達阻害剤の共存下で培養することにより、組織中のイソプレノイドの含有量が向上する理由は必ずしも明らかではないが、これら阻害剤がいずれもイソプレノイド以後の電子伝達を阻害するので、呼吸鎖に分岐が発生し、この結果分岐点以前の成分が増量したと考えられる。
【００２１】
ポリイソプレノイドは、イソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。ポリイソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。
【００２２】
イソプレノイド産生細胞は、培養してイソプレノイドを製造できる生物の細胞であれば特に限定されず、例えば真核細胞、細菌、古細菌などが挙げられる。真核細胞としては、酵母や、植物の細胞などが挙げられる。
【００２３】
酵母としては、培養してイソプレノイドを製造できる酵母であれば特に限定されず、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロマイセス属、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロマイセス属が挙げられる。出芽酵母の具体例として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ  ０２６２や、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ  ０５６５が挙げられる。なかでも、サッカロマイセス属が好ましい。
【００２４】
植物は、培養してイソプレノイドを製造できる植物であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｋｏｉｄｚ．）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｆｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、グアユー��、ロシアンタンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール、及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、パラゴムノキ、ノゲシが更に好ましい。また、培養される細胞は、植物の組織に由来するカルスであってもよい。
【００２５】
細菌は、培養してイソプレノイドを製造できる細菌であれば特に限定されず、例えば、エシェリキア属、枯草菌、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、緑膿菌、シュードモナス・メバロニ、シュードモナス・プディカ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラータ、ロドスピリルム・ルブルム等が挙げられる。エシェリキア属に属する細菌の具体例として大腸菌が挙げられる。
【００２６】
また、細胞は形質転換体であってもよい。形質転換体は、宿主となる細胞に、外来遺伝子を導入して得られる。外来遺伝子としては、特に限定されないが、イソプレノイドの製造効率をより改善できるという理由から、イソプレノイド産生に関与する外来遺伝子が好ましい。
【００２７】
イソプレノイド産生に関与する外来遺伝子としては、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素等のトランス−イソプレニル二リン酸合成酵素及び／又はネリル二リン酸合成酵素、ウンデカプレニルリン酸合成酵素等のシス−イソプレニル二リン酸合成酵素などの直鎖プレニル二リン酸合成酵素が挙げられる。宿主細胞としては、真核細胞、細菌が挙げられる。細菌の中でも、遺伝子組換大腸菌は安価であり、遺伝子組換え操作や培養による増殖が容易であることから特に好ましい。真核細胞としては、酵母の細胞や、植物の細胞が挙げられる。
【００２８】
増産剤は、防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬、或いは／及び、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素を阻害する物質、或いは／及び、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害、から選択される活性を有する物質、或いは／及び、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害する物質から選択される。イソプレノイドはメバロン酸経路と非メバロン酸経路の２種の経路により合成されることが一般に良く知られている。これらの経路は、ミトコンドリアにある呼吸鎖複合体の調節により制御を受けるという理由で、増産剤としては、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害活性、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、又は電子伝達阻害から選択される１つ以上の活性を有することがより好ましい。或いは、メバロン酸経路における主要酵素を制御するという理由で、ＨＭＧＲ遺伝子を阻害する１種類以上の物質から選択されることがより好ましい。
【００２９】
防腐剤とは、微生物の進入や増殖を防ぎ、腐敗や発酵を抑制する物質のことをいう。防腐剤の具体例としては、アジ化ナトリウム、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステルなどが挙げられる。この中でも呼吸鎖呼吸鎖関連酵素の機能阻害を起こす理由で、アジ化ナトリウムが好ましい。
【００３０】
抗生物質とは、微生物が産生し、ほかの微生物の増殖を抑制する物質のことをいう。抗生物質の具体例としては、アンチマイシン、アンホテリシン、フォスミドマイシンが挙げられる。この中でも、呼吸鎖複合体阻害剤であるという理由でアンチマイシンが好ましい。アンチマイシンとしては、アンチマイシンＡが好ましく、アンチマイシンＡのタイプはＡ１であってもよく、Ａ３であってもよい。
【００３１】
副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤は、メバロン酸経路におけるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のはたらきを阻害するという理由で増産剤として好ましい。副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤としては、ハイドロコルチゾン、グルココルチコイド、フルドロコチゾン、プロドニゾロン、デキサメタゾン等が挙げられる。
【００３２】
抗コレステロール剤とは、血中のコレステロールを低下させる薬剤として使用される総称であり、スタチン系薬剤、例えばロバスタチン、メバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンが挙げられる。またスタチン系薬剤は、メバロン酸からコレステロールを作る上流にあたるＨＭＧ−ＣｏＡからメバロン酸に変化させるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することが知られている。
【００３３】
高血圧薬としては、ロテニン等が挙げられる。
【００３４】
増産剤として、防腐剤、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬のなかでは、抗コレステロール剤が好ましい。
【００３５】
上記の増産剤に加えて、抗真菌剤としてロダニン−３−酢酸、呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤としてアラキドン酸、呼吸鎖ＩＶ阻害剤としてシアン酸塩、起炎物質としてカプサイシン、呼吸阻害剤としてアジ化合物（アジ化ナトリウム等）、呼吸鎖複合体Ｉ阻害剤としてアミタール、電子伝達阻害剤として硫化ナトリウム、呼吸鎖複合体ＩＩＩ阻害剤としてｎ−ヘプチルヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド、電子伝達阻害剤として２，３−ジメルカプトプロパノールが挙げられる。これらは、単独で用いても、２つ以上を併用しても構わない。
【００３６】
本発明では、増産剤の存在条件下でイソプレノイド産生細胞を培養する。増産剤の存在条件下で細胞を培養する方法としては、イソプレノイドの製造効率を向上できる方法であれば特に限定されないが、例えば、細胞に増産剤を付着させ該細胞を培養する方法、増産剤を含む培養液で細胞を培養する方法等が挙げられる。
【００３７】
イソプレノイド産生細胞としてパラゴムノキ等の木本類の細胞（特に、木本類の植物個体）を使用する場合、細胞に増産剤を付着させ該細胞を培養する方法を採用することが好ましく、イソプレノイド産生細胞としてノゲシ等の草本類や酵母、細菌、古細菌等の細胞を使用する場合、増産剤を含む培養液で細胞を培養する方法を採用することが好ましい。
【００３８】
なお、増産剤は、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させて使用されることが好ましい。水又は水溶性媒体に溶解又は分散させることにより、増産剤を細胞に対して効果的に作用させることができる。具体的には、増産剤は、少量の水溶性媒体に溶かし、さらに水で希釈してから使用されることが好ましい。増産剤を溶解又は分散させるための水溶性媒体としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００３９】
まず、以下において、増産剤を含む培養液を用いて細胞を培養する方法について説明する。増産剤を含む培養液を用いて細胞を培養することにより、イソプレノイドの製造効率を向上させることができる。
【００４０】
培養条件は、細胞がイソプレノイドを製造できる条件であれば特に限定されない。細胞を培養する際に使用される培地としては、細胞の培養に通常使用される培地であればよい。具体的には、細菌の場合にはＫＢ培地、ＬＢ培地が挙げられる。酵母の場合には、ＹＭ培地、ＫＹ培地、Ｆ１０１培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＡＤ培地が挙げられる。植物の場合には、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地が挙げられる。
【００４１】
水溶性媒体／（水溶性媒体＋水）の希釈率は、１／１００〜１／１０００であることが好ましく、１／２００〜１／８００であることがより好ましく、１／３５０〜１／６５０であることがさらに好ましい。これより水の量が多いと、必要な増産剤の濃度が得られない傾向がある。他方、これより水の量が少ないと、水溶性媒体が、イソプレノイドを製造する細胞に対し悪影響を及ぼす可能性がある。
【００４２】
培養液中の増産剤の濃度は、イソプレノイドの製造効率を向上させる濃度であって、かつ、細胞の培養を阻害しない濃度であることが好ましい。
【００４３】
培養液中の増産剤の濃度は、イソプレノイドの合成効率を向上させると共に、不必要に高濃度としてコストを増大させてしまうことを防ぐために、１０〜１０００ｎＭであることが好ましく、５０〜８００ｎＭであることがより好ましく、１００ｎＭ〜５００ｎＭであることが最も好ましい。
【００４４】
なお、イソプレノイド産生細胞として植物の細胞を使用する場合、細胞の培養工程では、増産剤と共に、１種類以上の植物生長ホルモンを用いることが好ましい。植物生長ホルモンとしては、オーキシン系植物ホルモン、サイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００４５】
炭素源としては、イソプレノイド産生細胞が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。このような炭素源として、例えば、糖類及び／又は油脂類等が挙げられる。
【００４６】
糖類としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、例えばスクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、グルコース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、フルクトース、イドース、ガラクトース及びキシロース等或いは転化糖（例えば、酵素的に処理されたショ糖シロップ）等を用いることができる。
【００４７】
油脂類としては、例えば大豆油、ひまし油、綿実油、あまに油、なたね油、パーム油、やし油、落花生湯、ロジン、パインオイル、パインタール、トール油、コーン油、こめ油、べに花油、ごま油、オリーブ油、ひまわり油、パーム核油、椿油、ホホバ油、マカデミアナッツ油、桐油、またそれらを分解して生成したグリセロール、グリセリン、脂肪酸等を用いることができる。炭素源の添加量は、糖類や油脂類を合わせて、培地に対して５〜４００ｇ／Ｌであることが好ましく、２０〜１００ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００４８】
窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００４９】
培養温度は、細胞の種類によって異なるが、０〜５０℃であることが好ましく、１０〜４０℃であることがより好ましく、２０〜３５℃であることが更に好ましい。ｐＨは、ｐＨ３〜１１であることが好ましく、４〜１０であることがより好ましく、５〜９であることが更に好ましい。また、培養は、細胞の種類に応じて嫌気的条件下、或いは好気的条件下のいずれにおいても行うことができる。
【００５０】
細胞の培養は、バッチ式培養でも可能であり、また、バイオリアクターを用いた連続式培養でも可能である。具体的な培養方法として、振とう培養、回転培養などが挙げられる。イソプレノイドは、細胞内に蓄積させることができ、また、培養上清中に生成蓄積させることもできる。
【００５１】
培養後の細胞からイソプレノイドを取得する場合、遠心分離により細胞を回収した後、細胞を破砕し、破砕液から１−ブタノール等の溶剤を使用して抽出することができる。また、溶剤抽出法に、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することもできる。ここで、細胞の破砕は、イソプレノイドの変性・崩壊を防ぐために、例えば４℃等の低温で行うことが好ましい。細胞は、例えば、ガラスビーズを使用した物理的破砕等により破砕することができる。
【００５２】
培養上清からイソプレノイドを取得するには、遠心分離にて菌体を除去した後、得られた上清から、１−ブタノール等の溶剤にて抽出する。
【００５３】
次に、細胞に増産剤を付着させ該細胞を培養する方法について説明する。この方法は、植物細胞、特に、植物個体に対して好適に適用できる。例えば、パラゴムノキの成体に増産剤を付着させることにより、該パラゴムノキにおいて、イソプレノイドの製造量を増大できる。
【００５４】
植物に付着させる増産剤の濃度としては、１０〜１０００ｎＭであることが好ましく、５０〜８００ｎＭであることがより好ましく、１００〜５００ｎＭであることがさらにより好ましい。この様に設定することで、ポリイソプレノイド合成効率を上げさせると共に、不必要に高濃度としてコストを増大させてしまうことを防ぐことができる。
【００５５】
また、植物に付着させる増産剤の植物あたりの量は、１０〜５０００００ｎＭであることが好ましく、１００〜２０００００ｎＭであることがより好ましく、１０〜１０００μｍｏｌであることがさらに好ましく、２００〜１０００００ｎＭであることが特に好ましい。
【００５６】
増産剤のイソプレノイド産生植物への付着工程の前に、イソプレノイド産生植物のコルク層を剥離し、剥離した部分に増産剤を付着させることが好ましい。イソプレノイド産生植物の表面は堅いコルク層で覆われているため、コルク層を剥離して、コルク層の内側にある組織に増産剤が到達しやすくすることにより、増産効果を高めることができる。
【００５７】
コルク層とは、イソプレノイド産生植物の外樹皮に位置し、乳管細胞および乳管細胞形成組織よりも外側に存在する層をいう。剥離される幹又は茎の一部分としては、該部分に増産剤を付着させることによりイソプレノイドの増産効果が得られる部分であれば特に限定されるものではないが、タッピングによりラテックスを回収する部分の近傍部分であることが好ましい。また、剥離する部分の厚さは、乳管細胞および乳管細胞形成組織を傷つけずにコルク層を剥離する厚さであれば、特に限定されるものではないが、例えば、０．１〜１０ｍｍ、好ましくは０．５〜８ｍｍ、更に好ましくは、３〜６ｍｍであることが好ましい。
【００５８】
コルク層を剥離する方法は、特に限定されるものではなく、樹皮等の剥離に通常用いられる方法を用いて行うことができる。例えば、ナイフ等を用いて幹又は茎の一部分に傷をつけてコルク層を剥離する方法が挙げられる。また、剥離を行う時期、剥離を行う部分の数は、イソプレノイドの増産効果が得られれば特に限定されるものではなく、ラテックス増産剤の有効成分の種類や濃度、付着方法、植物の樹齢や種類等を考慮して適宜決定することができる。
【００５９】
コルク層を剥離した後、植物への増産剤の付着時期は、コルク層を剥離した部分を介して増産剤が植物に作用できる時期であれば、特に限定されるものではないが、コルク層の剥離の後、５年以内であることが好ましく、１年以内であることがより好ましく、半年以内であることがさらに好ましく、１ヶ月以内であることが特に好ましい。コルク層の剥離の後、上記期間内に増産剤の付着を行えば、コルク層が再生する前に増産剤を作用させられるので、再生したコルク層により増産剤の組織への到達が妨げられるという事態を回避することができる。
【００６０】
増産剤の付着部位としては、イソプレノイド産生植物の幹、茎、根が挙げられる。このなかでも、イソプレノイドを産生する乳管組織が多いという理由で、茎や幹に付着することが好ましい。付着方法は、イソプレノイド産生植物の幹、茎、根に直接付着させることができる方法であれば特に限定されないが、例えば、上述のように水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものを、刷毛等を用いて直接幹、茎、根に塗布してもよく、スプレーなどを用いて噴霧してもよい。
【００６１】
上記の増産剤と共に、植物生長ホルモンを併用することも可能である。植物生長ホルモンとしては、エチレン、ジャスモン酸又はその誘導体などが挙げられる。
【００６２】
エチレンに代えて、エチレン発生剤であるエテホン（Ｅｔｈｅｐｈｏｎ、２−クロロエチルホスホン酸）を使用することもできる。エテホンとしては、１０％Ｅｔｈｒｅｌ溶液が挙げられる。
【００６３】
ジャスモン酸又はその誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物であることが好ましい。
【００６４】
【化１】
2014212706.tif 000002
（式中、Ｒ１は炭化水素基であり、Ｒ２は水素原子又は炭化水素基である）
【００６５】
植物に付着させる植物生長ホルモンの濃度としては、例えば、有効成分としてプロヒドロジャスモンを用いた場合には、０．０５％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましく、０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）であることがより好ましい。
【００６６】
植物生長ホルモンの、イソプレノイド産生植物への付着時期は、植物生長ホルモンが植物に作用できる時期であれば、特に限定されるものではない。
【００６７】
イソプレノイドは、イソプレノイド産生植物にナイフ等を用いて溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管からの流出物として回収することができる。
【００６８】
本発明の方法で製造されるポリイソプレノイドの重量平均分子量（Ｍｗ）は、１０００以上であることが好ましく、１００００以上であることがより好ましく、１０００００以上であることがさらに好ましく、２０００００以上であることが最も好ましい。１０００未満では、ゴムとして利用しにくい傾向がある。上記重量平均分子量の上限は、特に限定されない。重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）による測定値をもとに標準ポリスチレン換算等の値により求めることができる。
【００６９】
本発明の方法で製造されるポリイソプレノイドに含まれるイソプレンユニット中の１，４−シス構造の含有量は、１０モル％以上であることが好ましく、３０モル％以上であることがより好ましく、６０モル％以上であることがさらに好ましく、９０モル％以上であることがさらにより好ましい。１，４−シス構造の含有量の上限は特に限定されない。１，４−シス構造の含有量は、ＮＭＲにより測定することができる。
【００７０】
製造されたイソプレノイドの生成量は、薄層クロマトグラフィーによるヨウ素呈色法、及びＧＣ／ＭＳ方法により測定することができる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７２】
（調製例１）増産剤の調製
抗コレステロール剤であり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することによりミトコンドリアのエネルギー産生に影響を及ぼし、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能を阻害し、呼吸鎖関連酵素の機能を阻害し、カリウムチャネルを開口し、電子伝達を阻害し、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体を阻害するロバスタチン１０ｍｇを水２４．７ｃｃに溶解し１ｍｍｏｌ／Ｌとした。更に、これを水で１００倍〜１０００倍に希釈した。
【００７３】
（実施例１〜３）増産剤のパラゴムノキ幹表面への塗布
樹齢１０年目のパラゴムノキを、１つの増産剤につき１５本選択し、ナイフを用いて、幹の一部分の、表面から５ｍｍの厚さのコルク層を剥離した。その後、１ヶ月に１回剥離を繰り返し行った。コルク層の剥離を最初に行ってから２週間後に、調製例１で調製した３種類の濃度の増産剤を、１５本のパラゴムノキに付着させた。付着は、幹表面に、０．１ｍｌ／ｃｍ２の濃度で、１つの植物あたりの増産剤の付着量が１００μｍｏｌとなるように、刷毛を用いて塗布により行った。その後、２週間に１回塗布を繰り返し行った。
【００７４】
各１５本中の５本について、増産剤の塗布を最初に行ってから２日後に、タッピングを行い、ラテックスから回収されたゴム量を測定した。なお、タッピングは２日おきに３ヶ月間実施し、増産剤の塗布は、回収を行った３ヶ月間継続した。各パラゴムノキの３ヶ月間のゴム量の合計量を測定し、５本のパラゴムノキの平均値を、回収されたゴム量とした。
【００７５】
（比較例１）
増産剤の代わりに、ロバスタチンを含まないエタノール２０ｃｃに水を加え５００倍に希釈して１Ｌとしたものを、コントロール増産剤として樹齢１０年目のパラゴムノキ５本に塗布した以外は、実施例１〜３と同様の操作を行い、生産されたゴムの合計量を測定した。
【００７６】
（実施例４〜６）エチレン発生剤の、増産剤との併用
実施例１〜３と同様の方法でパラゴムノキに増産剤を塗布した。増産剤の塗布を最初に行ってから４週間後に、増産剤を塗布したパラゴムノキから５本を選択し、エチレン発生剤として、エテホン（１０％Ｅｔｈｒｅｌ溶液）を付着させた。エテホンの付着は、タッピングされた組織に、０．０１ｇ／木となるよう塗布により行った。その後、３０日に１回、塗布を繰り返し行った。
【００７７】
パラゴムノキ５本について、増産剤の塗布を最初に行ってから２日後に、タッピングを行い、ラテックスから回収されたゴム量を測定した。なお、タッピングは２日おきに３ヶ月間実施し、上記増産剤の塗布は、回収を行った３ヶ月間継続した。各パラゴムノキの３ヶ月間のゴム量の合計量を測定し、５本のパラゴムノキの平均値を、回収されたゴム量とした。
【００７８】
（比較例２）
増産剤の代わりに、ロバスタチンを含まないエタノール２０ｃｃに水を加え５００倍に希釈して１Ｌとしたものを、コントロール増産剤として樹齢１０年目のパラゴムノキ５本に塗布した以外は、実施例４〜６と同様の操作を行い、生産されたゴムの合計量を測定した。
【００７９】
（調製例２）ジャスモン酸類溶液の調製
プロヒドロジャスモンを有効成分とするジャスモン酸類溶液を調製した。具体的には、ジャスモメート液剤（明治製菓株式会社製）を、１％のカルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ。以下、「ＣＭＣ」という。）の溶液を用いて希釈し、５０倍希釈溶液（０．１％プロヒドロジャスモン溶液）を調製した。なお、ジャスモメート液剤の組成は、以下の通りである；５％プロヒドロジャスモン、３３％１−プロパノール、３０％界面活性剤、及び３２％水。
【００８０】
（実施例７〜９）ジャスモン酸類溶液及びエチレン発生剤の、増産剤との併用
増産剤と同時に、上記ジャスモン酸類溶液を０．１ｍｌ／ｃｍ２となるように併せて塗布した以外は、実施例４〜６と同様の方法で、増産剤の塗布、及びエテホンの付着を行った。
【００８１】
各５本について、増産剤の塗布を最初に行ってから２日後に、タッピングを行い、ラテックスから回収されたゴム量を測定した。なお、タッピングは２日おきに３ヶ月間実施し、上記増産剤の塗布は、回収を行った３ヶ月間継続した。各パラゴムノキの３ヶ月間のゴム量の合計量を測定し、５本のパラゴムノキの平均値を、回収されたゴム量とした。
【００８２】
（比較例３）
増産剤を塗布しない以外は、実施例７〜９と同様の方法で、ジャスモン酸類溶液を塗布し、エテホンの付着を行い、生産されたゴムの合計量を測定した。
【００８３】
実施例１〜９及び比較例２〜３で得られたゴムの合計量を、比較例１で得られた合計量を１００とした指数に換算した。その結果を表１に示す。
【００８４】
実施例１〜９及び比較例１〜３で得られたゴムの重量平均分子量（Ｍｗ、ポリスチレン換算）を、下記（１）〜（７）の条件で、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリスチレン
測定結果を表１に示す。
【００８５】
【表１】
2014212706.tif 000003
【００８６】
表１の結果より、ポリイソプレノイド増産剤により、効率的にポリイソプレノイドを増産できることが確認できた。また、増産剤を使用しない場合とほぼ同様の分子量のポリイソプレノイドを得られることが確認できた。
【００８７】
（実施例１０〜１２）増産剤の存在下での、酵母によるファルネシル二リン酸の製造
ＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）１０Ｌを２Ｌ三角フラスコ１０個に小分けして、１２１℃、１．２気圧で２０分間オートクレーブ滅菌を行った。この培地に、調製例１の増産剤１０ｍｌ、５％グルコース、及び１％大豆油を無菌的に添加した。培地中の増産剤の最終濃度は、それぞれ１５０ｎＭ（実施例１０）、３００ｎＭ（実施例１１）、及び４５０ｎＭ（実施例１２）となるようにした。独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲購入したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＢＲＣ  ０２６２）を植菌した。３０℃、１３０ｒｐｍの回転培養で７２時間培養した。
【００８８】
培養終了後、培養液中の菌体をプラスチックチューブに移し、ガラスビーズ（シグマ社製）を加え、安井器械社製マルチビーズショッカーを使用し、４℃で冷却破砕した。菌体の破砕は、２５００ｒｐｍで３０秒間破砕し、３０秒間停止する工程を２０サイクル繰り返すことにより行った。
【００８９】
菌体の冷却破砕液を１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後の上清に１−ブタノール２５０ｍＬを数回に分けて加える事でファルネシル二リン酸を抽出し、エバポレーターを用いて濃縮を行った。ファルネシル二リン酸の生成量を、薄層クロマトグラフィーによるヨウ素呈色法、及びＧＣ／ＭＳにより測定した。
【００９０】
（比較例４）ファルネシル二リン酸の製造
ロバスタチンを含まないエタノール２０ｃｃに水を加えて５００倍に希釈し、１Ｌとしたものをコントロール増産剤として使用した以外は、実施例１０〜１２と同様の操作を行い、ファルネシル二リン酸の生成量を測定した。
【００９１】
実施例１０〜１２で得られたファルネシル二リン酸の収量を、比較例４の収量を１００とした指数に換算した。その結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
2014212706.tif 000004
【００９３】
表２の結果から、増産剤を使用することにより、従来技術と比較して効率的にポリイソプレノイドを製造できることが確認できた。
【００９４】
更に、上記実施例１０〜１２及び比較例４に記載の培地から、菌体を取り出し、その菌体における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により解析して比較した。その結果より、増産剤が、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させ、またＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させていることがわかった。なお、ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量は増加するものの、増産剤がＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅを阻害する結果、その活性は低下すると考えられる。
【００９５】
（実施例１３〜１５）増産剤の存在下での、酵母によるゲラニル二リン酸の製造
独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲購入したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＢＲＣ  ０５６５）を使用した以外は実施例１０〜１２と同様の条件で培養・抽出を行い、ゲラニル二リン酸を回収した。ゲラニル二リン酸の生成量を、薄層クロマトグラフィーによるヨウ素呈色法、及びＧＣ／ＭＳにより測定した。
【００９６】
（比較例５）ゲラニル二リン酸の製造
ロバスタチンを含まないエタノール２０ｃｃに水を加えて５００倍に希釈し、１Ｌとしたものをコントロール増産剤として使用した以外は、実施例１３〜１５と同様の操作を行い、ゲラニル二リン酸の生成量を測定した。
【００９７】
実施例１３〜１５で得られたゲラニル二リン酸の収量を、比較例５の収量を１００とした指数に換算した。その結果を表３に示す。
【００９８】
【表３】
2014212706.tif 000005
【００９９】
表３の結果から、増産剤を使用することにより、従来技術と比較して効率的にポリイソプレノイドを製造できることが確認できた。
【０１００】
更に、上記実施例１３〜１５及び比較例５に記載の培地から、菌体を取り出し、その菌体における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により解析して比較した。その結果より、増産剤が、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させ、またＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させていることがわかった。なお、ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量は増加するものの、増産剤がＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅを阻害する結果、その活性は低下すると考えられる。
【０１０１】
（調製例３）無菌培養用培養培地の調製
無菌培養用の培地は、ハイポネックスを基に、２０００倍に希釈した溶液に、固形化剤の濃度を１質量％とし調製した。オートクレーブ（１２１℃、２０分）を行った後、調製例１の増産剤を添加して固形化した。ハイポネックスとして、ハイポネックス原液（ハイポネックスジャパン製）を使用した。固形化剤として、寒天、アガロース、ゼラチンを使用した。培地中の増産剤の最終濃度は、それぞれ１５０ｎＭ（実施例１６）、３００ｎＭ（実施例１７）、及び４５０ｎＭ（実施例１８）となるようにした。
【０１０２】
（実施例１６〜１８）増産剤のノゲシへの添加
草丈が２０ｃｍ程度の無菌培養ノゲシを１つの増産剤につき５本選択し、調製例３で調製した無菌培養用の培地へ移植した。移植は、ノゲシの根が培地中で伸長するように植え、増産剤が根から吸収されるようにした。
【０１０３】
各９本中の３本について、増産剤を含む培地へ移植してから５日後に、ノゲシ植物体からとれる乳液を茎から回収し、ポリイソプレン量を測定した。なお、茎からの乳液の回収は、５日おきに３回行った。各濃度、各生育期間のポリイソプレン量から各３本のノゲシの平均値を、回収されたポリイソプレン量とした。
【０１０４】
（比較例６）
増産剤、水、及びエタノールのいずれも添加しない以外は、実施例１６〜１８に記載された操作によりノゲシを培養し、回収したポリイソプレン量を測定した。
【０１０５】
（比較例７）
増産剤の代わりに、ロバスタチンを含まないエタノール２０ｃｃに水を加え、５００倍に希釈して１Ｌとしたものを、コントロール増産剤としてノゲシの無菌培養用培地に添加した。エタノールを添加した以外は、実施例１６〜１８と同様の操作を行い、回収したポリイソプレン量を測定した。
【０１０６】
実施例１６〜１８及び比較例７で得られたイソプレンの合計量を、比較例６で得られた合計量を１００とした指数に換算した。その結果を表４に示す。
【０１０７】
実施例１６〜１８及び比較例６〜７で得られたポリイソプレンの重量平均分子量（Ｍｗ、ポリスチレン換算）を、下記（１）〜（７）の条件で、ゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ）法により測定した。
（１）装置：東ソー社製ＨＬＣ−８０２０
（２）分離カラム：東ソー社製ＧＭＨ−ＸＬ
（３）測定温度：４０℃
（４）キャリア：テトラヒドロフラン
（５）流量：０．６ｍＬ／分
（６）検出器：示差屈折、ＵＶ（２１５ｎｍ）
（７）分子量標準：標準ポリスチレン
測定結果を表４に示す。
【０１０８】
【表４】
2014212706.tif 000006
【０１０９】
表４の結果より、ポリイソプレノイド増産剤により、効率的にポリイソプレノイドを増産できることが確認できた。また、増産剤を使用しない場合とほぼ同様の分子量のポリイソプレノイドを得られることが確認できた。