(57)【要約】      （修正有）【課題】リムルステストにおける試薬の使用量を削減し、操作時間を短縮し、測定操作を簡易にするエンドトキシンの測定方法及びそれに用いる測定基板を提供する。【解決手段】プラズモン金属量子結晶とリムルステスト用のリムルス試薬（ＬＡＬ試薬）により測定用器具を構成し、その器具を用いてラマン分光法によりエンドトキシンを測定するものである。金属表面にプラズモン金属錯体量子結晶はＬＡＬ試薬を吸着して形成され、これを用いると、微量のエンドトキシンとの反応がラマン分光法により検出できるので、従来実施されているゲル化法、比濁法、比色分析法によるエンドトキシン測定に比して簡易な操作で、試薬の使用量は１／１０００以下で、測定時間は１／１０以下の数分と迅速に測定結果が得られる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＬＡＬ試薬をプラズモン金属錯体水溶液中に添加し、プラズモン金属錯体にＬＡＬ試薬を結合させる工程と、
b）ＬＡＬ試薬が結合したプラズモン金属錯体溶液を金属基板上に滴下してＬＡＬ試薬が結合したプラズモン金属錯体量子結晶を凝集させて作成した基板を用意する工程と、
c）該基板上でエンドトキシンと接触させて、前記エンドトキシンと前記ＬＡＬ試薬の結合させる工程と、
d）前記エンドトキシンと前記ＬＡＬ試薬を結合させた量子結晶にレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得る工程、を含むことを特徴とするエンドトキシンの測定方法。
【請求項２】
上記ａ）工程ではプラズモン金属錯塩を１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で含有する水溶液を用いる請求項１記載のエンドトキシンの測定方法。
【請求項３】
上記ｂ）工程では上記混合水溶液をプラズモン金属錯塩の酸化還元電位より卑なる電極電位を有する金属基板上に滴下してＬＡＬ試薬と共にプラズモン金属量子結晶を金属基板上に凝集させる請求項１記載のエンドトキシンの測定方法。
【請求項４】
上記ｃ）及びｄ）工程では金属基板上にＬＡＬ試薬とともにプラズモン金属量子結晶を凝集した領域にエンドトキシンを含有する水溶液を滴下してＬＡＬ試薬とエンドトキシンとを水溶液中で反応させつつ、又は反応させた後反応領域にレーザービームを照射して表面増強ラマン光を得、それによりエンドトキシンを検出する請求項１記載のエンドトキシンの測定方法。
【請求項５】
プラズモン金属がパラジウム、プラチナ、白金、銀及び銅からなる群から選ばれる一種である請求項１記載の測定方法。
【請求項６】
ＬＡＬ試薬と結合したプラズモン金属量子結晶の凝集域を金属表面上に形成したことを特徴とするエンドトキシンのラマン分光用測定基板。
【請求項７】
プラズモン金属量子結晶がチオ硫酸銀錯体量子結晶であって、粒径１０〜５００nmの六角板状結晶である請求項６記載の測定基板。
【請求項８】
前記金属基板が銅合金である請求項６に記載の測定基板。
【請求項９】
前記銅合金が、銅、リン、錫を主要構成成分とする請求項５に記載の測定基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンのラマン分光を利用する新規測定方法に関するものであり、詳しくはエンドトキシンをカブトガニ血球由来の成分により測定する方法であるリムルステストにラマン分光法を適用した測定方法に関するものである。さらに詳しくはリムルステストに用いられるリムルス試薬（以下ＬＡＬ試薬と略す）の使用量が少なく、簡素化された操作により検体中のエンドトキシンを迅速に測定する方法及びそれに用いる測定基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性細菌の細胞外膜に存在するリポ多糖で内毒素とも言われている。グラム陰性細菌は水溶液を初めとして動物の腸内や皮膚表面、植物表面等に定常的に存在するに留まらず、ホコリ等に付着し空気中を浮遊している。同菌の死滅による溶解や菌体の分裂に際してエンドトキシンが溶液中に放出され、異物として溶液中に存在することとなる。エンドトキシンは各種動物に対して免疫反応の誘導、サイトカイン生産の誘導など多彩な生物活性を示すことから、人の血液中に侵入したときには発熱、炎症さらにはショック死などを引き起こす弊害がある。
【０００３】
したがって、エンドトキシンは直接的または間接的に注射液、輸液などの医薬品とその中間製品やこれらの原料中に含まれるとか、混入があると上記の弊害が生じる可能性がある。このためにエンドトキシンの測定は製造中、または貯蔵中の医薬品、およびその中間製品、またはこれらの原料の一部となる物質の品質管理の重要項目となっており、また、エンドトキシンの測定は細菌の増殖を早期に検出する手段としても有効である。しかしながら、測定に時間を要することが問題であった。
【０００４】
現在、エンドトキシン検査の必要な代表的な対象として、血液の人工透析治療における透析用液がある。同水溶液にエンドトキシンが存在すると、生きた細菌による汚染が示唆されるのに加えて、細菌から遊離したエンドトキシンが血液透析膜を通過し、患者の血液中に混入することにより、エンドトキシンに固有の生体反応を引き起こす。例えば、患者の発熱や低血圧などがある。そのため、透析液の清浄化は人工透析治療においては重要事項であり、同水溶液中のエンドトキシン濃度を可能な限り低減することが望まれている。
【０００５】
エンドトキシンを測定する方法としては、ウサギ発熱性試験、鶏胚致死試験、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ等がある。それらに比して鋭敏で操作が簡易かつ迅速な測定方法としてカブトガニ血球由来成分を利用したリムルステストがある（日本細菌学会教育委員会編、細菌学技術叢書１１、エンドトキシンの試験法、１２７〜１４７頁（１９９０）、（株）菜根出版）。
【０００６】
リムルステストとはＬＡＬ試薬にエンドトキシンを含む水溶液を加えると同溶液が凝固する性質を応用した試験法で、１９８８年には日本薬局方にエンドトキシン試験法として収載されている。また、２０１１年には日米欧の３薬局方の国際調和合意に基づいた改正がなされている。リムルステストには、ゲル化法（ゲル化転倒法、非特許文献１）、比濁法（比濁時間分析法、非特許文献２）、合成基質法（比色法、非特許文献３）の３方式が現在広く実施されている。
【０００７】
上記のそれぞれの手法に対し、各種試薬（例えば、ゲル化法-比濁分析法には和光純薬製リムルス−Ｊ−テストワコー等が、合成基質法用の試薬は生化学工業製エンドスペシー「登録商標」）が市販されており、一般的に使用されている。
【０００８】
ゲル化法はＬＡＬ試薬と検体溶液を混合し、３７℃で６０分反応させた後１８０°転倒させ、流下の有無によりゲル化を判定し、存在量を推測する半定量的分析法である。比濁法はＬＡＬ試薬と試料を混合し、３７℃ において反応中の透過光量変化により計算したゲル化時間からエンドトキシンを定量分析する方法である。合成基質法はＬＡＬ試薬に含まれる酵素がエンドトキシンとの反応によって活性化され、色素を遊離する合成基質を用いるもので、遊離色素量からエンドトキシンを定量分析する方法である。いずれの先行技術の測定法も、大腸菌から調製された標準エンドトキシンとの比較により算出される。これらのリムルステストに基づく測定は、用手法であるために測定者により測定値のバラツキが生じ、信頼性のある結果の取得には測定者が操作に習熟する必要があるなど、改善の必要な問題点があった。
【０００９】
また、現状では上記の３方法は測定時間が３０〜９０分程度と長く、開放系でマイクロピペット等を用いた分注や液体の移動操作が必要で、器具や測定環境からの汚染を防止するために、エンドトキシンフリーの器具、及び２５０℃で滅菌した専用の器具などが必要であった。加えて、ＬＡＬ試薬は生きたカブトガニを唯一の原料とすることから高価であり、測定の制限要因となっていた。試薬使用量の少ない測定方法は重要であるが、これまでに現行の３方式による測定で必要な試薬使用量を桁違いに少なくすると共に、測定時間を桁違いに短縮する測定法はなかった。
【００１０】
さらに、光透過率を検出する光散乱法ではいずれも混和液からの透過光の強度あるいは、散乱光における強度またはピーク数から求められる粒子数が閾値を超えるまでの時間を計測する閾値法を判定の基礎にしている（特許文献１〜３）が、かかる方法では測定開始直後から、リムルス反応の状態とは関係なく透過光強度が減少し、光散乱法では散乱光強度またはピーク数が上昇する現象が観察される。この漸次減少／上昇の現象は、上記粒子数が閾値を超えるまでの時間に影響を及ぼすので、上記の測定法の測定精度を低下させるおそれがある。また、測定対象物質の濃度が低くなるほど記粒子数が閾値を超えるまでの測定時間は長くなるため、所定物質の濃度が低いほど漸次減少／上昇の影響を受けやすく、ゲル化あるいは凝集が始まったとされる反応開始時刻が正しく評価できない場合があるなど低濃度測定に問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献２】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７８：１３８−１４８（１９７１）
【非特許文献２】薬学雑誌，１０５：３００−３０３（１９８５）
【非特許文献３】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：５５０−５５５（１９８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、前述した従来のリムルステストの問題点を改善し、少ないＬＡＬ試薬で、微量のエンドトキシンの迅速な測定を可能とする方法を提供するためには測定方法を抜本的変更する必要があることに着目して鋭意研究の結果、ラマン分光法の利用が適切と見込まれるが、表面プラズモン増強作用を利用してＬＡＬ試薬によるエンドトキシンとの反応を検出するにはプラズモン増強効果を発揮する金属微粒子上に如何にしてＬＡＬ試薬を結合させるか、ＬＡＬ試薬が金属微粒子に結合または吸着してもＬＡＬ試薬とエンドトキシンとの反応がラマン分光で検出できるかが問題であった。ところが、銀錯塩を代表とするプラズモン金属錯体の水溶液にＬＡＬ試薬を溶解し、金属表面で金属微粒子（量子結晶）を形成させると、該微粒子の表面にはＬＡＬ試薬のゲル化反応に関わるタンパク質が集積しており、微量エンドトキシンの検出がラマンスペクトル測定により可能なことを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
本発明はａ）ＬＡＬ試薬をプラズモン金属錯体水溶液中に添加し、プラズモン金属錯体にＬＡＬ試薬を結合させる工程と、
b）ＬＡＬ試薬が結合したプラズモン金属錯体溶液を金属基板上に滴下してＬＡＬ試薬が結合したプラズモン金属錯体量子結晶を凝集させて作成した基板を用意する工程と、
c）該基板上でエンドトキシンと接触させて、前記エンドトキシンと前記ＬＡＬ試薬の結合させる工程と、
d）前記エンドトキシンと前記ＬＡＬ試薬を結合させた量子結晶にレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得る工程、を含むことを特徴とする。
【００１５】
上記ａ）工程はプラズモン金属錯塩を含有する水溶液は１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で、好ましくは試薬の使用法に記された容積、をＬＡＬ試薬に混合し、ＬＡＬ試薬のプラズモン金属錯塩水溶液をプラズモン金属錯塩水溶液で希釈することによって行なわれるのが好ましい。
上記ｂ）工程は上記混合水溶液をプラズモン金属錯塩の酸化還元電位より卑なる電極電位を有する金属基板上に滴下してＬＡＬ試薬と共にプラズモン金属量子結晶を金属基板上に凝集させることにより行なわれるのが好ましい。
上記ｃ）及びｄ）工程は金属基板上にＬＡＬ試薬とともにプラズモン金属量子結晶を凝集した領域にエンドトキシンを含有する水溶液を滴下してＬＡＬ試薬とエンドトキシンとを水溶液中で反応させつつ、又は反応させた後反応領域にレーザービームを照射して表面増強ラマン光を得、それによりエンドトキシンを検出することにより行なわれるのが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、従来法に比して簡易かつ安価に微量のエンドトキシンが測定できる。すなわち、従来実施されているゲル化法、比濁法、比色分析法によるエンドトキシン測定に比して簡易なラマン分光操作で、エンドトキシンを測定することができ、試薬の使用量は１／１０００以下で、測定時間は１／１０以下の数分と迅速に測定結果が得られる。なお、本発明において、プラズモン金属はパラジウム、プラチナ、金、銀、及び銅からなる群から選ばれる一種である。また、本発明によれば、本発明方法を容易に実施できるラマン分光用測定基板が提供され、ＬＡＬ試薬と結合したプラズモン金属量子結晶の凝集域を金属表面上に形成したことを特徴とする。本発明において、プラズモン金属量子結晶はチオ硫酸銀錯体量子結晶であって、粒径１０〜５００ｎｍの六角板状結晶であるのが好ましい。また、前記金属基板は銅合金であるのが好ましく、特に銅、リン、錫を主要構成成分とするリン青銅板が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】金属板表面に作製されたエンドトキシン測定用器具の電子顕微鏡写真である。
【図２】ＬＡＬ試薬と組み合わせて作製した測定器具に標準エンドトキシン水溶液を滴下したときのラマン散乱スペクトルの経時変化を示す。
【図３】ＬＡＬ試薬を減じて作製した測定器具に標準エンドトキシンの水溶液を滴下して測定したラマン散乱スペクトルの９００ｃｍ-1付近のピークの高さを示す。
【図４】ＬＡＬ試薬を１／１０００に減じて作製した測定器具に標準エンドトキシンの濃度の異なる水溶液を滴下して測定したラマン散乱スペクトルの９００ｃｍ-1付近のピークの高さを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、重要な技術はプラズモン金属錯体水溶液が好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭという希薄な領域であって、錯体の安定度定数と相関するその酸化還元電位の近傍で選ばれた担体金属が平衡電位より卑なる電極電位を有する場合に、その希薄なプラズモン金属錯体水溶液から析出する結晶がプラズモン金属錯体であって、プラズモン増強効果のあるナノ金属的性質を有する一方、水中でＬＡＬ試薬が吸着しやすい電荷を有するため、被検体がプラズモン増強を受けるに必要な電荷移動錯体を容易に形成することにある。
【００１９】
本発明では、プラズモン金属錯体溶液から担体金属上に析出させた金属錯体量子結晶にＬＡＬ試薬を固定し、これにエンドトキシンを結合させ、形成された多数個のホットスポットより、表面増強ラマン散乱スペクトルを利用してエンドトキシンを検出することを特徴する。特に、ａ）ＬＡＬ試薬をプラズモン金属錯体水溶液中に添加し、プラズモン金属錯体にＬＡＬ試薬を結合させる工程と、
b）ＬＡＬ試薬が結合したプラズモン金属錯体溶液を金属基板上に滴下してＬＡＬ試薬が結合したプラズモン金属錯体量子結晶を作成した基板を用意する工程と、
c）該基板上でエンドトキシンと接触させて、前記エンドトキシンと前記ＬＡＬ試薬の結合させる工程と、
d）前記エンドトキシンと前記ＬＡＬ試薬を結合させた量子結晶にレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得る工程、とを含んで行われるのが好ましい。
【００２０】
量子結晶は銀イオン濃度が９．１ｍＭのチオ硫酸銀錯体水溶液の場合、リン青銅板上に滴下して３分間放置すると１００ｎｍ前後の六角柱状に形成され、各六角柱状の量子結晶は数ｎｍオーダの凹凸を持つことがＳＥＭ像から確認された。金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できず、ＥＤＳ元素分析で銀及び錯体配位子由来の元素を検出されたため、全体は銀錯体のナノ結晶であって、その表面に現れる凹凸は錯体中の銀がクラスタとして量子ドットを形成して広がっていると推測される。
本発明の銀錯体量子結晶がリン青銅板上に形成される一方、銅基板上には銀のみのナノ粒子が析出する現象を見ると、チオ硫酸銀錯体の酸化還元電位が０．３３ボルトで銅の電極電位（０．３４ボルト）と同等であるため、銅基板上には銀（０．８０ボルト）のみが析出し、リン青銅の場合は０．２２と電極電位がわずかに卑であるため、銀錯体の結晶が析出したものと思われる。したがって、量子結晶を作成するためには１）錯体水溶液が１ｍＭ〜１００ｍＭという希薄な領域であること、２）金属錯体水溶液の平衡電位に対し担持金属の電極電位がわずかに卑であること、３）電極電位差で金属錯体が凝集させることが重要であると思われる。
【００２１】
本発明におけるプラズモン金属は、特に金、銀、プラチナまたはパラジウムから選ばれるのが好ましい。
【００２２】
本発明で言う検体液とは、エンドトキシン測定の対象となる溶液であれば、特に限定されるものではなく、医薬品を溶解させた溶液や、医療用具からの抽出液、人工透析における透析液、血液や尿など医療検査、健康診断用の検体液などが挙げられる。検体液は無菌的且つエンドトキシンフリー下で採取する。
【００２３】
微粒子の作製に用いるＬＡＬ試薬は和光純薬製「リムルス−Ｊ−テストワコー」など市販のものを使うことができる。金属を設置する器具は板状、毛細管状など形状は任意であるが、エンドトキシンフリーのガラスを用いることが好ましい。
【００２４】
採取した検体液を金属表面の微粒子に所定量接触させ速やかにラマンスペクトル測定を開始することにより、エンドトキシンを測定することが出来る。
【実施例】
【００２５】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
１．標準エンドトキシンの水溶液調製
和光純薬工業製リムルス−Ｊ−テストワコーに添付される標準エンドトキシンをパイロジェンフリーの注射用水（日本薬局方注射用水：大塚製薬、以下同じ）に溶解したものを順次パイロジェンフリーの注射用水で希釈し、０．１〜５ＥＵ／ｍｌの濃度に調整した。
２．エンドトキシン測定器具の作製
リムルステスト用チューブ（透析液用ＬＡＬ試薬０．２ｍｌ用：和光純薬）に塩化銀に対しとチオ硫酸ナトリウムが２以上５倍迄の混合溶液０．０６ｍｌをリン青銅合金板に滴下し、室温で３分間静置したのちに水溶液を除去し、エンドトキシン測定器具を作製した。
３．エンドトキシンの測定
測定器具に標準エンドトキシン溶液０．０６ｍｌを滴下し、７８５ｎｍのレーザ光を照射してラマンスペクトルを測定しスペクトル強度の経時的変化を追跡した。また、ＬＡＬ試薬量を変化させた測定器具を作製し、標準エンドトキシン濃度の異なる検体液でスペクトル強度の変化を測定した。
【実施例１】
【００２６】
測定用器具の作製
塩化銀試薬の濃度が９．１ｍＭ、チオ硫酸ナトリウム試薬の濃度が塩化銀濃度の2以上3倍以下となる割合で蒸留水に投入し、完全に溶解するまで攪拌混合した。該水溶液は孔径０．２μｍのセルロースアセテートメンブランフィルターでろ過し、細菌や微少な不溶解物質を除去した。該硝酸銀-チオ硫酸水溶液０．２ｍｌをオートクレーブ滅菌したマイクロピペット（以下、マイクロピペット）で和光純薬工業製ＬＡＬ試薬リムルス−Ｊ−シングルテストワコーが入っているガラス容器に投入し、ボルテックスミキサーで攪拌した。該溶液０．０６ｍｌを直径が７ｍｍで円盤状の銅合金板の表面にマイクロピペットで滴下し、室温下で静置した。３分後に防塵スプレーの気化ガスを用いて溶液を除去し、エンドトキシン測定用器具を作製した。図１に銅合金基板で作製した測定用器具の電子顕微鏡画像を示す。銅合金板には認められない六角形の結晶状微粒子が、該溶液の滴下と除去により形成されている。
【実施例２】
【００２７】
光純薬工業製の標準エンドトキシン１７００ＥＵのバイアルビンに注射用蒸留水（大塚製薬製）３．４ｍｌをマイクロピペットで加えて溶解した後に、注射用蒸留水で希釈して０．５ＥＵ／ｍｌのエンドトキシン水溶液を調製した。室温で該水溶液０．０６ｍｌをマイクロピペットで測定器具に滴下し、ラマン分光計に取り付けて７８５ｎｍのレーザ光を照射しラマン散乱スペクトルを測定した。続いて、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後にラマン散乱スペクトルを測定した。図２に示したラマン散乱スペクトルから明らかなように、測定器具のスペクトルピーク７８０ｃｍ-1と１０４５ｃｍ-1の主要ピークに加えて９００ｃｍ-1付近に新しいピークが出現した。ピークの強度は時間の経過と共に高くなっていることから、該ピークがエンドトキシンによるＬＡＬ試薬の反応によることは明らかである。
【実施例３】
【００２８】
使用するＬＡＬ試薬を１／１０，１／１００，１／１０００と減じて作製した測定器具に、標準エンドトキシン５ＥＵ／ｍｌの水溶液を滴下して数分後に実施例２と同様にラマン散乱スペクトルを測定した。スペクトルピークの中で９００ｃｍ-1付近のピークの高さを図３に示した。ＬＡＬ試薬が１／１０と１／１００のどちらとも減じる前の測定器具により測定される結果と同等である。１／１０００に減じた測定器具では該ピークの高さは低くなるが減じる前の５割くらいであり、エンドトキシンは１／１０００の試薬量で作製される該測定器具により測定される。
【実施例４】
【００２９】
ＬＡＬ試薬を１／１０００に減じて作製した測定器具を用いて標準エンドトキシンの濃度が０．１，０．５，５ＥＵ／ｍｌと異なる水溶液を個別に測定器具に滴下して、実施例２と同様にラマン散乱スペクトルを測定したときの、９００ｃｍ-1付近のピークの高さを図４に示した。標準エンドトキシン濃度が０．１ＥＵ／ｍｌ水溶液の場合、５ＥＵ／ｍｌと比較して高さは約８割であり、該測定器具により０．１ＥＵ／ｍｌが測定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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