(57)【要約】      （修正有）【課題】液体または液体試料中のアナライト濃度を決定する方法、装置およびシステムを提供する。【解決手段】競合分子に結合可能な受容体分子を備えたＳＥＲＳ基板を準備し２０１、アナライトと競合分子を含む液体（試料）にＳＥＲＳ基板を接触させ２０２、ＳＥＲＳ基板に光源の光を照射しつつ２０３、光照射中に競合分子に関連するＳＥＲＳ信号を測定し２０４、測定したＳＥＲＳ信号レベルを基に液体中のアナライト濃度を決定する２０５。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体または液体試料中の所定のアナライト（１０８）濃度を決定する方法（２００）であって、
ａ）所定の競合分子（１０６）を結合させることができる所定の受容体分子（１０７）を備えたＳＥＲＳ基板（１０２）を準備する工程（２０１）、
ｂ）決定対象の濃度の前記アナライト（１０８）と所定量の前記競合分子（１０６）とを含む液体または液体試料に、ＳＥＲＳ基板（１０２）を接触させる工程（２０２）、
ｃ）ＳＥＲＳ基板（１０２）に単色光源（１０１）の光を照射することにより、ＳＥＲＳ基板（１０２）の受容体分子（１０７）に結合した競合分子（１０６）の量を示すレベルを有するＳＥＲＳ信号を発生させる工程（２０３）、
ｄ）ＳＥＲＳ基板（１０２）に単色光源（１０１）の光を照射しつつＳＥＲＳ信号のレベルを決定する工程（２０４）、
ｅ）測定されたＳＥＲＳ信号のレベルを基に、液体または液体試料中のアナライト（１０８）濃度を決定する工程（２０５）
を含む方法。
【請求項２】
受容体分子（１０７）は、ＳＥＲＳ基板（１０２）の上に固定されている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
受容体分子（１０７）は、表面結合した、競合分子（１０６）に対する可逆的結合ジオール受容体である、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
競合分子（１０６）は、アナライト分子（１０８）と受容体分子（１０７）のいずれか一方に結合可能な分子である、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
競合分子（１０６）はボロン酸誘導体である、
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
競合分子（１０６）は、フェニル環を含むボロン酸誘導体である、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＥＲＳ信号のレベルを測定する工程（２０４）は、
ラマン分光計を用いて、受容体分子（１０７）に結合した競合分子（１０６）から生じるＳＥＲＳ信号のレベルを測定することを含む、
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＳＥＲＳ基板（１０２）に単色光源（１０１）の光を照射する工程（２０３）は、
ＳＥＲＳ基板（１０２）からの表面増強ラマン散乱光を発生させるように、皮膚組織の真皮を通じてＳＥＲＳ基板（１０２）を照明することを含む、
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＲＳ基板（１０２）は、基板表面の上に金属ナノ構造を有するＳｉＯ２基板である、
請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＥＲＳ基板（１０２）を事前に埋め込み、かつ、
工程ｂ）から工程ｅ）を体内で実施する、
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アナライト（１０８）はグルコースである、
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
液体または液体試料中でアナライト（１０８）濃度を決定する工程（２０５）は、
測定されたＳＥＲＳ信号と競合分子の量とを関連づけることを含む、
請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
液体または液体試料中で所定のアナライト濃度を測定する装置であって、
競合分子（１０６）を結合させる受容体分子（１０７）を備えた検出面を有するＳＥＲＳ基板（１０２）、
ＳＥＲＳ基板（１０２）の上のコンテナ（１０９）、ここでコンテナ（１０９）は競合分子（１０６）を備え、競合分子（１０６）は所定のアナライト分子（１０８）と受容体分子（１０７）のいずれか一方に結合可能な分子であり、
アナライト分子（１０８）を通過させ、競合分子（１０６）を通過させないように構成された薄膜（１０５）を備えた生体適合性パッケージ内に検出面が封入された
装置。
【請求項１４】
液体または液体試料中で所定のアナライト濃度を測定するシステム（１００）であって、
請求項１３に記載のＳＥＲＳ基板（１０２）を備えた装置、
ＳＥＲＳ基板（１０２）に光を照射する単色光源（１０１）、
装置のＳＥＲＳ基板（１０２）の受容体分子（１０７）に結合した競合分子（１０６）から発せられるＳＥＲＳ信号のレベルを決定する（２０４）検出器（１０３）、
検出されたＳＥＲＳ信号のレベルを基にアナライト（１０８）濃度を決定する（２０５）計算ユニット（１０４）を備えた
システム。
【請求項１５】
グルコース濃度を測定する、請求項１３に記載の装置または請求項１４に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、具体的には表面増強ラマンバイオセンサに関する。特に本発明は、液体または液体試料中のアナライト(analyte)濃度を間接的に決定するための方法、装置、システムおよび使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中の何百万もの人々が糖尿病を患っているが、この数は増加の一途をたどり、糖尿病は世界的な健康問題として認識されている。この慢性疾患は、長期の健康障害（主に循環器疾患や失明など）につながる。現在、糖尿病の利用可能な治療法は依然として存在しない。合併症を防ぐためには、健康的なライフスタイルと併せて、治療介入（すなわちインスリンデリバリ(insulin delivery)）を行うことによる正常な血中グルコース濃度の維持が重要である。このとき、グルコース観察技術が使用される。血中グルコース濃度を注意深く制御することにより、生活の質と寿命は明らかに向上することになる。
【０００３】
今日、多くの糖尿病患者は手持ち式のグルコースメータに頼っているが、これはフィンガプリック(finger pricking)により血中のグルコースレベルを記録するものである。この方法では、痛みが伴ううえに、患者の就寝中の観察が容易でない。それゆえ研究者は、経皮的に、すなわち皮膚の上から実装または使用可能な「ユーザ非依存型連続グルコースモニタ(user-independent continuous glucose monitor)」について研究を行っている。皮膚と接触する経皮モニタは非侵襲に分類されるが、浸透がゆっくりであることと、その結果、血中グルコースレベルと、皮膚に浸透するグルコースの測定値との間にタイムラグがあることとに悩まされている（例えば皮膚疱疹が起こる）。さらに、この種のセンサは、試料液体中に存在する他の分子と相互作用する際に疑似信号を発生させる可能性があり、さらに温度のような環境因子の影響を受けやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、完全な埋め込み式装置は、侵襲に分類されるところ、長期間にわたって動作可能であれば患者にとっての快適さと適合の容易さを増すので非常に有望である。また、埋め込み型モニタは、環境因子にあまり影響を受けず、体液中に存在する「グルコースライクな(glucose-like)」分子（マンノースを除く）の影響も受けない。すでに、商業的に利用可能な連続的インビボ(continuous-in-vivo)グルコースモニタが幾つか存在する。例えば、米国を拠点とする企業であるMedtronic and Abbottにより、そのような装置が提供されている。これらのセンサは、皮下に埋め込み可能なニードル式電極を利用する。当該ニードル式電極は、酵素反応を使用した間質液中のグルコースを測定する。これらのニードル式インプラント(implant)の寿命は、使用する酵素の不安定性に起因して限られており、数日で置き換える必要がある。さらに、多くのニードル式インプラントは、内部の読出部（ニードル）と外部パーツ（電極）を有しており、真皮を貫く開口部のために感染や炎症が生じるリスクを抱えている。外部パーツがなく、長い埋め込み可能時間(implantation times)を有する低侵襲インプラントを発展させる必要がある。
【０００５】
本発明の実施形態の目的は、アナライト濃度を（間接的に）決定するための良好な方法を提供することである。
【０００６】
また、本発明の実施形態の目的は、当該方法の実施に適した装置とシステムを提供することである。
【０００７】
また、本発明の実施形態の目的は、血液または血液試料中のグルコース濃度を測定するための、当該装置またはシステムの使用を提供することである。
【０００８】
本発明の実施形態の目的は、液体または液体試料（例えば血液試料）中のアナライト濃度を（間接的に）決定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの目的と他の目的は、本発明の実施形態に係る方法、装置、システムおよび／または使用により達成される。
【００１０】
第１の態様で、本発明は、液体または液体試料中の所定のアナライト濃度を決定または測定する方法を提供する。この方法は、ａ）所定の競合分子を結合させることができる所定の受容体分子を備えたＳＥＲＳ基板を準備する工程、ｂ）決定対象の濃度の前記アナライトと所定量の前記競合分子とを含む液体または液体試料に、ＳＥＲＳ基板を接触させる工程、ｃ）ＳＥＲＳ基板に単色光源の光を照射することにより、ＳＥＲＳ基板の受容体分子に結合した競合分子の量を示すレベルを有するＳＥＲＳ信号を発生させる工程、ｄ）ＳＥＲＳ基板に単色光源の光を照射しつつＳＥＲＳ信号のレベルを決定する工程、ｅ）測定されたＳＥＲＳ信号のレベルを基に、液体または液体試料中のアナライト濃度を決定する工程を含む。
【００１１】
本発明の実施形態の利点は、液体中のアナライト濃度を（間接的に）決定する改善した技術が提供されることであり、この技術はこの分野で知られた技術よりも高感度である。
【００１２】
光照射時に競合分子のＳＥＲＳ信号を測定することによって、液体（試料）中のアナライト濃度が決定されることは利点である。ＳＥＲＳ信号は、液体（試料）中に存在するアナライト分子の濃度に間接的に関連する。競合分子の濃度を非常に高い感度で測定できることから、間接測定技術は感度の点で改善した方法と装置につながる。このようにして、間接的に、アナライト分子の濃度を非常に高い感度で決定できる。また、競合分子は、特に、光照射時に高強度の(high)ＳＥＲＳ信号を発生させるように設計されている。
【００１３】
一実施形態では、この方法を体内で(in vivo)実施してもよい
【００１４】
一実施形態では、ＳＥＲＳ基板を事前に埋め込み、工程ｂ）から工程ｅ）のみを体内で実施する。デバイスが既に体内に埋め込まれているので、濃度を決定する方法が手術工程を必要としない。
【００１５】
本発明の実施形態の利点は、少なくとも部分的に皮下で実施でき、体内で比較的長い時間（例えば４か月以上、好ましくは６か月以上）持続可能な方法が提供されることである。
【００１６】
あるいは、ＳＥＲＳ基板は身体に埋め込まれず、すべての工程は身体の外側で実施されてもよい。手術も身体への侵入も必要とされない。この場合の人体との相互作用は、血液試料の採取、例えば血液試料を採取するために行う肌への針の挿入（例えばフィンガプリック）時にあるのみである。
【００１７】
本発明の実施形態の利点は、この方法を体内で実施しても体外で(in vitro)実施しても、液体中のアナライト濃度を決定する改善した技術が実施されることであり、当該技術はこの分野で知られた技術よりも非侵襲的である。先行技術はプリックによる血液採取を使用しており、毎日行う必要があるが、本発明の実施形態による基板は、６か月に１度埋め込む必要があるのみである。
【００１８】
本発明の実施形態の利点は、液体中のアナライト濃度を決定または測定する改善した技術が提供されることであり、当該技術はこの分野で知られた技術よりも安定的である（例えば温度変化に対して）。幾つかの実施形態では、アナライト以外の分子が試料液体中に存在する場合にも、開示された技術を使用可能である。
【００１９】
本発明の実施形態の利点は、液体中のアナライト濃度を決定または測定する改善した技術が提供され、当該技術はこの分野で知られた技術よりも信頼性が高いことである。
【００２０】
本発明の実施形態の利点は、液体中のアナライト濃度（例えば血液試料中のグルコース濃度）を決定または測定する無標識技術が提供されることである。
【００２１】
本発明の実施形態の利点は、液体中のアナライト濃度（例えば血液試料中のグルコース濃度）を決定または測定する生体適合性技術が提供されることである。
【００２２】
本発明の実施形態の利点は、液体または１つ以上の液体試料中のアナライト濃度を連続的に観察または測定する技術が提供され、アナライト濃度をリアルタイムで検出または観察できることである。
【００２３】
特定の実施形態で、受容体分子はＳＥＲＳ基板の上に固定される。
【００２４】
これにより、生体適合性材料との親和性反応(affinity reaction)が可能となる。受容体分子が競合分子に対する親和性結合(affinity binding)を可能とすることは利点である。競合分子の濃度とアナライト濃度とは相互に関連していることから、液体（試料）中のアナライト濃度を決定する非常に感度の高い技術が得られる。競合分子は、受容体分子またはアナライトに結合可能であるがその両方に同時に結合することはできないことから、表面で検出される競合分子の濃度が低い場合、アナライト濃度はより高くなることになる。
【００２５】
一実施形態で、受容体分子は、表面結合した、競合分子に対する可逆的結合ジオール受容体(reversibly-binding diol-receptor)である。
【００２６】
好都合なことに、ジオール受容体は、光照射時に高強度のＳＥＲＳ信号を発生させる特定の競合分子に結合可能である。また、可逆的に結合可能なジオール受容体により、連続的な観察が可能となる。ジオール受容体分子は、可能な限り小さく（例えば２ｎｍ以下である）、ＳＥＲＳ基板の活性領域内で競合分子の大きい信号増強を可能にする。ＳＥＲＳ基板へのジオール受容体の化学的付着は、例えば共有結合スキームを介して安定であるべきである。
【００２７】
一実施形態で、競合分子は、アナライト分子と受容体分子のいずれか一方に結合可能な分子である。
【００２８】
好都合なことに、競合分子は受容体とアナライト分子に連続的に競合している。この競合は、受容体分子に結合する競合分子の数の連続的な増加または減少につながり、これにより液体（試料）中のアナライト濃度の連続的観察が可能となる。
【００２９】
一実施形態で、 競合分子はボロン酸誘導体である。
【００３０】
好都合なことに、ボロン酸誘導体は、他種の競合分子と比較して高強度のＳＥＲＳ信号を発生させる。
【００３１】
一実施形態で、ボロン酸誘導体はフェニル環を含む。
【００３２】
好都合なことに、ボロン酸誘導体はフェニル環を含み、環がないボロン酸誘導体と比較して、光照射時により大きいＳＥＲＳ信号を発生させる。
【００３３】
一実施形態で、ＳＥＲＳ信号のレベルを決定（測定）する工程は、ラマン分光計を用いて、受容体分子に結合した競合分子から生じるＳＥＲＳ信号のレベルを決定（測定）することを含む。
【００３４】
一実施形態で、ＳＥＲＳ基板に単色光源の光を照射する工程は、ＳＥＲＳ基板からの表面増強ラマン散乱光を発生させるように、皮膚組織の真皮を通じて（例えばヒトの皮膚の真皮を通じて）ＳＥＲＳ基板を照明することを含む。
【００３５】
好都合なことに、患者の皮膚下に埋め込まれる装置を用いてこの方法を使用できる。
【００３６】
一実施形態で、ＳＥＲＳ基板に単色光源の光を照射する工程は、皮膚組織の真皮を通じて（例えばヒトの皮膚の真皮を通じて）ＳＥＲＳ基板を照明すること、検出領域と基準領域の両方を照明してＳＥＲＳ基板からの表面増強ラマン散乱光を同時に発生させること、センサ値の較正のために基準領域を使用することを含む。
【００３７】
検出領域と、既知の濃度の競合分子を有する基準領域とを同時に照明することは、信号をより容易に較正できる点で利点である。検出領域と基準領域の両方を同時に照明することにより、基準領域からのＳＥＲＳ信号を使用して、検出領域から発せられるＳＥＲＳ信号を較正できる。基準領域からのＳＥＲＳ信号を、検出領域からのＳＥＲＳ信号と関連づけることができる基準信号として使用して、競合分子の濃度を決定できる。その後、決定した競合分子の濃度を用いて、液体または液体試料中のアナライト濃度を決定できる。
【００３８】
一実施形態で、ＳＥＲＳ基板は、基板表面の上に金属ナノ構造を有する二酸化ケイ素基板である。
【００３９】
好都合なことに、金属ナノ構造は高強度のＳＥＲＳ信号／応答を発生させる。
【００４０】
一実施形態で、アナライトはグルコースである。
【００４１】
第２の態様により、本発明は、液体または液体試料中で所定のアナライト濃度を測定する装置を提供する。この装置は、競合分子を結合させる受容体分子を備えた検出面を有するＳＥＲＳ基板と、ＳＥＲＳ基板の上のコンテナ(container)と（コンテナは競合分子を備え、競合分子は所定のアナライト分子と受容体分子のいずれか一方に結合可能な分子である）とを備える。アナライト分子を通過させ、競合分子を通過させないように構成された薄膜を備えた生体適合性パッケージ内に検出面が封入されている。この構成は、薄膜の細孔の大きさを選択してアナライト分子の大きさに適合させることを含んでもよい。細孔の大きさは、アナライト分子がコンテナにコンテナ内に入ることができる一方、競合分子が内部に捕捉されるように選択される。
【００４２】
デバイスを使用して、本発明の第１の態様に記載された方法を実行できる。コンテナは、受容体分子を備えた表面に接していてもよい。コンテナは、ゲル、空洞、マトリクス(matrix)、液体、または、受容体分子を含有可能な他の任意の物質または材料であってもよい。
【００４３】
検出面が生体適合性パッケージ内に封入されることは利点である。これにより、例えば人体に装置を埋め込むことができる。受容体分子に結合した競合分子の量を決定することによって液体（液体試料）中のアナライト濃度を決定するために、コンテナ中に存在する競合分子の数が固定される。薄膜が分子を通過させないことでコンテナ中の競合分子の数が一定に維持されることは利点である。
【００４４】
薄膜はアナライト分子を通過させ且つ競合分子を通過させないことから、装置を使用して、受容体分子に結合した競合分子の数を基に（ＳＥＲＳ測定中に検出面で発生したＳＥＲＳ信号を測定することにより）アナライト分子の濃度を連続的に観察できることは利点である。
【００４５】
一実施形態で、受容体分子はジオール分子である。
【００４６】
一実施形態で、競合分子はボロン酸誘導体である。
【００４７】
一実施形態で、受容体分子はＳＥＲＳ基板の上に固定されている。
【００４８】
一実施形態で、受容体分子は、表面結合した、競合分子に対する可逆的結合ジオール受容体である。
【００４９】
一実施形態で、ＳＥＲＳ基板は、基板表面の上に金属ナノ構造を有するＳｉＯ２基板である。
【００５０】
一実施形態で、アナライト分子はグルコース分子である。
【００５１】
これらの装置の特徴の利点は、対応する方法の実施形態の特徴の利点と同一である。
【００５２】
第３の態様により、本発明は、液体または液体試料中で所定のアナライト濃度を測定するシステムを提供する。このシステムは、第２の態様の実施形態によるＳＥＲＳ基板を備えた装置と、ＳＥＲＳ基板に光を照射する単色光源と、装置のＳＥＲＳ基板の受容体分子に結合した競合分子から発せられるＳＥＲＳ信号のレベルを決定する検出器と、検出されたＳＥＲＳ信号のレベルを基にアナライト濃度を決定する計算ユニット（１０４）とを備える。
【００５３】
一実施形態で、競合分子は、アナライト分子と受容体分子のいずれか一方に結合可能な分子である。
【００５４】
一実施形態で、競合分子はボロン酸誘導体である。
【００５５】
一実施形態で、ボロン酸誘導体はフェニル環を含む。
【００５６】
一実施形態で、検出器は、ラマン分光計を用いて、受容体分子に結合した競合分子のＳＥＲＳ信号を検出する手段を備える。
【００５７】
一実施形態で、単色光源は、皮膚組織の真皮を通じて（例えばヒトの皮膚の真皮を通じて）ＳＥＲＳ基板を照明し、ＳＥＲＳ基板からの表面増強ラマン散乱光を発生させるように構成されている。
【００５８】
これらのシステムの特徴の利点は、対応する方法または装置の実施形態の特徴の利点と同一である。
【００５９】
第４の態様により、本発明は、グルコース濃度、特に血液または血液試料中のグルコース濃度を測定する、第２の態様に係るデバイスまたは第３の態様に係るシステムの使用を提供する。
【００６０】
本発明の特定かつ好ましい態様が、添付した独立および従属の請求項に記述されている。従属請求項からの特徴は、独立請求項の特徴および他の従属請求項と適切に組み合わせてもよく、請求項に明記されたものだけに限らない。
【００６１】
本発明のこれらの態様と他の態様が、以下に記載した実施形態を参照して明らかになり解明されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の一実施形態による間接測定技術を使用したアナライトの検出原理を示す。
【図２】本発明の実施形態で使用可能な間接競合分析を実行するためのセットアップを示す。
【図３】（ａ）本発明の実施形態で使用可能な基板、（ｂ）本発明の実施形態で使用可能であり、パターン化ナノ構造を表面に有する基板、（ｃ）本発明の実施形態で使用可能であり、パターン化ナノ構造を表面に有するジオール修飾基板を示す。
【図４】一般的なボロン酸誘導体を示しており、「Ｒ」は本発明の実施形態で使用可能な種々の官能基であってよい。
【図５】パターン化ナノ構造を有する基板の上に固定された受容体分子（ＳＨグルコース）に対する競合分子（ＰＢＡ）の親和性を示す。
【図６】本発明の実施形態で使用可能な種々のボロン酸誘導体を示す。種々のＢＡ誘導体はすべてグルコースに対して異なる親和性を有し、「＊」で示す分子はＨ２Ｏベースの溶液中で難溶解性（例えば２ｍＭから１ｍＭ）である。
【図７】本発明の一実施形態による、血清アルブミンの存在下でのＰＢＡセンシングを示す。
【図８】競合分子（ＰＢＡ）と、ナノパターン化基板の上に固定された受容体分子（ＳＨグルコース）との間の結合の動力学(kinetics)を示す。
【図９】本発明の実施形態による、液体中のアナライト濃度を決定する方法のフローチャートである。
【図１０】グルコース濃度を低下させながら測定した、ＳＥＲＳ信号強度の時間変化の一例を示す。
【図１１】グルコース濃度を低下させながら測定した、ＳＥＲＳ信号強度の時間変化の別の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
図面は、概略的であって非限定的である。図面において、幾つか要素のサイズは、説明目的のために誇張することがあり、また縮尺どおり描写していないことがある。
【００６４】
請求項での参照符号は、いずれも範囲を限定するものとして解釈すべきでない。異なる図面において、同一の参照符号は、同一または類似の要素を参照している。
【００６５】
特定の実施形態に関して図面を参照して本発明を説明するが、本発明はこれに限定されず、請求項によってのみ限定される。記載した図面は、概略的であって非限定的である。図面において、幾つかの要素のサイズは、説明目的のために誇張していることがあり、また縮尺どおり描写していないことがある。寸法と相対寸法は、本発明を実施するための実際の縮尺に対応していない。
【００６６】
説明および請求項での用語「第１」、「第２」などは、類似の要素を区別するために使用しており、必ずしも時間的、空間的、順序でまたは他の方法でシーケンスを記述するために使用しているわけではない。使用する用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書で説明する本発明の実施形態は、本明細書で説明し、あるいは図示したものとは別のシーケンスで動作可能であると理解すべきである。
【００６７】
説明と請求項での用語「上(top)」、「下に(under)」等は、説明目的で使用しており、必ずしも相対的な位置を記述するために使用しているわけではない。使用する用語は、適切な状況下で交換可能であって、本明細書で説明する本発明の実施形態は、本明細書で説明または図示した以外の他の向きで動作可能であると理解すべきである。
【００６８】
請求項で使用する用語「備える、含む、有する(comprising)」は、それ以降に列挙された手段に限定されるものと解釈すべきでなく、他の要素または工程を除外していないことに留意されたい。記述した特徴、整数、工程またはコンポーネントの存在を、参照したように特定するよう解釈する必要があるが、１つ又はそれ以上の他の特徴、整数、工程またはコンポーネント、あるいはこれらのグループの存在または追加は除外されない。したがって、「手段ＡとＢとを備える装置」という表現の範囲は、コンポーネントＡとＢのみから成る装置に限定されるべきでない。それは、本発明に関して、装置の関連コンポーネントのみがＡとＢであることを意味する。
【００６９】
本明細書を通じて「一実施形態(one embodiment, an embodiment)」は、実施形態との関連で記載した特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じていろいろな場所で現れるフレーズ「一実施形態」は、必ずしもすべて同一の実施形態を参照しているわけではないが、参照してもよい。さらに、１つまたは複数の実施形態で、本発明から当業者にとって明らかなように、特定の特徴、構造または特性を、いずれかの適切な方法で組み合わせることができる。
【００７０】
同様に、本発明の例示的な実施形態の説明において、本開示を合理化し、本発明の１つまたは複数の種々の態様の理解を支援する目的で、単一の実施形態、図、またはその説明において、本発明の種々の特徴が一緒にグループされることがあると理解すべきである。しかし、この開示の方法は、請求項に係る発明が、各請求項で明示的に記載された特徴より多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈すべきでない。むしろ、請求項が反映しているように、発明の態様は、それまでに開示した単一の実施形態の全特徴より少ない。このように、詳細な説明に続く請求項は、この詳細な説明の中に明示的に組み込まれており、各請求項は、本発明の別々の実施形態としてそれ自体で成立している。
【００７１】
さらに、本明細書で説明する幾つかの実施形態は、他の実施形態の特徴の幾つかを含むが、含まない特徴もある。当業者によって理解されるように、種々の実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内にあるとともに種々の実施形態を構成することを意味する。例えば、請求項において、請求項に係る実施形態のいずれもが、いずれもの組合せで使用可能である。
【００７２】
本明細書の説明では、多数の具体的な詳細について説明している。しかし、本発明の実施形態は、これらの具体的な詳細なしで実施してもよいことが理解されよう。別の例では、本説明の理解を曖昧にしないために、周知の方法、構造、および技術について詳細には示していない。
【００７３】
本発明において、「液体（試料）」という表記は、「液体または液体試料」を意味する。同様に、「血液（試料）」という表記は、「血液または血液試料」を意味する。
【００７４】
本発明に照らして、アナライトは、分析手順において関心対象となる物質または化学成分である。
【００７５】
本発明に照らして、受容体分子は、基板表面に現れる分子であるとともに、基板が他の特定の分子と自由に相互作用するのを助勢する化学的構造または物理的構造を有する分子である。
【００７６】
本発明に照らして、競合分子は、アナライトとの結合と受容体分子との結合との間で競合するような分子種である。
【００７７】
図９は、本発明の実施形態による方法２００を示しており、液体（試料）中のアナライト分子１０８の量を測定するものである。この技術は、表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ）を利用する。ＳＥＲＳは非常に感度の高い技術であって、少量の分子を単一分子レベルで測定できる。金属表面の上で（接触して／近接して）吸収されまたは結合する分子によるラマン散乱の増強を生じさせるのが、表面センシティブ(surface sensitive)技術である。好ましくは、これらの分子は金属表面で吸収されまたは結合する。
【００７８】
本発明の実施形態の方法は間接分析(indirect assay) 法を利用するが、この方法では、ＳＥＲＳ基板表面１０２の上に固定された（固定されている(immobilized)ことを「結合している(bound)」と定義する）受容体分子１０７に結合した競合分子１０６の量を測定し、液体（試料）中のアナライト分子１０８の量を測定する。提示している方法は、溶液中のアナライト１０８を検出する改善した方法を提供するものであり、この方法２００は従来技術よりも安定性が高い。方法２００の実行には、単色光源１０１、ＳＥＲＳ修飾基板１０２および検出器１０３を伴う。ＳＥＲＳ修飾基板１０２はＳＥＲＳ基板であって、そのＳＥＲＳ基板の表面の上に受容体分子１０７を固定するために界面化学が利用されているような基板である。基板表面１０２の上に固定された受容体分子１０７は、競合分子１０６に結合できる。
【００７９】
競合分子１０６は、アナライト分子１０８または受容体分子１０７に選択的に結合できる（基板の上に固定される）が、それらに同時に結合することはできない。
【００８０】
図２に示すように、アナライト１０８を検出するために、競合分子１０６とアナライト分子１０８を含む液体（試料）をＳＥＲＳ修飾基板の上に供給する。競合分子１０６は、液相での受容体分子１０７とアナライト１０８への結合特性に基づいて選択される。競合分子１０６は、受容体分子１０７とアナライト分子１０８に選択的に結合可能である。このようにＳＥＲＳ基板表面の上に供給する場合、競合分子１０６はアナライト分子１０８と競合する。幾つかの競合分子１０６がＳＥＲＳ修飾基板１０２に結合することになり、別の幾つかの競合分子１０６は溶液中でアナライト分子１０８に結合することになる。平衡状態では、ＳＥＲＳ基板表面１０２に結合している競合分子１０６の数は、液体（試料）中のアナライト分子１０８の数に関連している。
【００８１】
単色光源１０１を使用して、ＳＥＲＳ修飾基板１０２（例えばＳＥＲＳジオール修飾基板）に光を照射する（照明する）。ＳＥＲＳ修飾基板表面１０２に結合した競合分子１０６の量は、当該基板１０２への光照射中に、ラマン検出器１０３を用いて、ＳＥＲＳ修飾基板表面１０２から戻るラマン散乱光１１２（「ＳＥＲＳ信号」または「表面増強ラマン散乱光」と呼ばれる）を記録することで測定できる。これにより、ＳＥＲＳ修飾基板表面１０２の上での競合分子１０６の存在に関係するＳＥＲＳ信号が生じる。アナライト分子１０８の量は、ＳＥＲＳ修飾基板表面１０２に結合した競合分子１０６の数と関連づけられる。ＳＥＲＳ信号は、液体（試料）中に存在するアナライト１０８の量に不可逆的に(irreversibly)関連する。液体（試料）中に存在するアナライト分子１０８の数が多いほど、ＳＥＲＳ基板表面１０２に結合する競合分子１０６の数は少なくなり、すなわち記録されるＳＥＲＳ信号強度は低下することになる。逆も同様である。これを図１に示している。また、ＳＥＲＳ信号は、表面にごく近接している分子に対してのみ感度が高い。アナライト試料中に存在可能な他のマトリクスタンパク質は検出に影響を与えないことになる。これは利点である。
【００８２】
提示している技術は、例えば、体内または血液試料中のグルコース濃度測定に適している。ＳＥＲＳ修飾基板１０２（例えばＳＥＲＳ修飾基板１０２の上のコンテナ１０９内に包含される競合分子１０６を有する）は、身体の中に埋め込むことができる。単色光源１０１と検出器１０３は、身体の外側にある。単色光源１０１（例えばレーザ）は、皮膚を介してＳＥＲＳ修飾基板に達することができる。検出器１０３は、ＳＥＲＳ修飾基板１０２にごく近接した分子からのＳＥＲＳ信号１１２を、皮膚を介して記録できる。単に照明および散乱用の単色光源を提供するためにレーザ光を使用していることが指摘される。レーザ光のパラメータは、レーザ光の使用がヒト組織にまったく無害であって、人間を治療、治癒せず、細胞や組織を損傷しないように選択される。
【００８３】
図１は、本発明の実施形態による方法２００を示す。
第１段階（グラフの左部分）で、表面１０２の上に固定された受容体分子１０７を有するＳＥＲＳ基板が準備される。ＳＥＲＳ基板１０２の上に、液体（試料）（例えばコンテナ１０９）が存在している。液体（試料）は、受容体分子１０７に結合可能な競合分子１０６を含む。競合分子１０６は、光照射時にＳＥＲＳ信号を発生させる。第２段階（グラフ中央部分）で、アナライト分子１０８が液体（試料）に供給される。幾つかの競合分子１０６がアナライト分子１０８に結合して、光照射時に弱いＳＥＲＳ信号を発生させることになる。第３段階（グラフの右部分）で、より多くのアナライト分子１０８が液体（試料）に追加されてより多くの競合分子１０６と結合し、ＳＥＲＳ信号が低下する。ある段階（グラフのずっと右の部分）では、液体（試料）はアナライト分子１０８に対して飽和する。
【００８４】
このように、ＳＥＲＳ信号の測定は、液体（試料）中に存在するアナライト分子１０８の数に間接的に関連する。光照射時に高強度のＳＥＲＳ信号を発生させる好適な競合分子１０６を選択することにより、液体（試料）中のアナライト１０８の濃度決定をより高い感度で行うことができる。
【００８５】
本発明の一実施形態によれば、競合分子１０６の選択は、高強度のＳＥＲＳ信号を発生させる間に、生理的ｐＨ（７）でのアナライト分子１０８に対する親和性応答に基づいて行われる。
【００８６】
グルコースを高感度で検出するために、ＳＥＲＳ基板（受容体分子１０７）について好適な界面化学を選択する必要がある。本発明の一実施形態によれば、チオール化グルコースが基板に結合する。ＳＥＲＳ基板に対して親和性を有する任意のジオール分子を使用できる。ＳＥＲＳ信号は、事象(event)と基板との間の距離に大きく依存するので、競合分子の数は少ないほどよい。一実施形態で、この距離は数ナノメートル、典型的には５ナノメートル以下である。
【００８７】
図３は、ＳＥＲＳ修飾基板１０２を製造するプロセスを示す。図３ａ）は、基板、例えばシリコン酸化物表面１１０（例えばシリコノイド(siliconoide)）を有するキャリア基板を示す。図３ｂ）は、基板の上でパターン化した金属ナノ構造１１１を示す。図３ｃ）は、ＳＥＲＳジオール修飾基板１０２を示しており、ジオール分子１０７が基板１０２の金属ナノ構造１１１の上に存在している。
【００８８】
一実施形態で、アナライト１０８はグルコースである。
【００８９】
一実施形態で、競合分子１０６はボロン酸分子である。
【００９０】
競合分子１０６は、大きいラマン断面(Raman cross section)を有するように、さらに生理的ｐＨ（７）において、設計された親和性比(affinity ratio)で、受容体分子１０７とアナライト１０８のいずれかに結合できるように設計できる。
【００９１】
一実施形態では、図４に示すように、ボロン酸分子はボロン酸誘導体である。ボロン酸誘導体は、二糖類に対する親和性を有することが知られており、間接競合分析内で理想的な競合分子として機能することができる。ボロン酸誘導体は、光照射時にＳＥＲＳ信号を発生させる。これもまた、競合分子１０６を選択するうえでの選択基準である。競合分子１０６は、受容体分子、アナライト分子１０８に結合可能であり、光照射時にＳＥＲＳ信号を発生させる。
【００９２】
一実施形態で、受容体分子１０７はジオール分子である。一実施形態で、ボロン酸誘導体１０６はＳＥＲＳ基板表面１０２の上に固定されたジオール分子（受容体分子１０７）またはグルコース分子１０８に結合する。一実施形態で、ボロン酸誘導体１０６は、図６
に示す一覧の、ＰＢＡ、４ＦＦＰＢＡ、３ＡＰＢＡ、５ＦＭＰＢＡ、３ＴＢＡから選択されるが、これに限定されない。
【００９３】
一実施形態で、競合分子１０６として使用するボロン酸誘導体は、その構造においてフェニル環を含む。フェニル環を含むボロン酸誘導体は、ＳＥＲＳにより大きく増強可能である。ＳＥＲＳ基板の上に固定された受容体分子１０７に対して、フェニル環を含むボロン酸誘導体が結合する場合、光照射中に非常に高強度のＳＥＲＳ信号が発生することになる。
【００９４】
一実施形態では、大きい散乱断面積を有するボロン酸誘導体が選択される。
【００９５】
一実施形態で、単色光源１０１はレーザである。特定の実施形態で、単色光源は赤外光源または近赤外光源である。単色光源１０１は、連続型単色光源であってもよいしパルス型単色光源であってもよい。一実施形態で、単色光源は、組織を損傷することなく何の治療効果もなく組織（例えばヒトの皮膚の真皮）に侵入できる光源である。特定の実施形態で、単色光源の波長は５００ｎｍから９００ｎｍ、例えば５３２ｎｍ、６３３ｎｍまたは７８５ｎｍである。放射線源から出射する単色光の波長は、その皮膚を貫通する能力に基づいて選択できる。単色光源１０１は、皮膚を通じてＳＥＲＳ修飾基板に光を照射可能な任意の光源であってよい。光源により発生する光は、皮膚を通じた侵入を可能にする波長を有し、かつ、基板表面の上の受容体分子に結合した競合分子を励起させてＳＥＲＳ信号を測定するのに充分な、できるだけ低い出力を有する。特定の実施形態によれば、単色光源のパワーは、医療的用途に適した値であって、数十ｍＷ以下、例えば集束モード(focused mode)において１．２ｍＷである。
【００９６】
一実施形態で、基板１０２の光照射は、ＳＥＲＳ修飾基板１０２の種々の位置で連続的に行われる。例えば、光源から照射される光線が、ＳＥＲＳ修飾基板１０２の種々の位置を照明し、これにより、液体（試料）中のアナライト１０８の濃度を連続的に観察できる。
【００９７】
一実施形態では、基板表面に固定される受容体分子１０７の存在により、ＳＥＲＳ基板１０２の表面に競合分子１０６を付着させることが可能となる。受容体分子１０７がＳＥＲＳ基板の上に固定されることにより、競合分子１０６との親和性反応が可能となる。受容体分子１０７は分子に可逆的に結合しており、これにより、競合分子１０６を受容体分子１０７に結合させることができるとともに、アナライト分子に結合するときには競合分子を受容体分子１０７から取り除くことができる。一実施形態で、 ＳＥＲＳ基板はＳＥＲＳジオール修飾基板１０２である。 
【００９８】
一実施形態で、ＳＥＲＳ基板はナノ構造１１１を有する。一実施形態で、ＳＥＲＳ修飾基板１０２は金属ナノ構造を有する。一実施形態で、ＳＥＲＳ修飾基板１０２は、基板表面の上にパターン化金属ナノ構造を有する。基板表面の上に存在するナノ構造は、表面の上で、または表面にごく近接した位置で吸収される分子のラマン散乱を増強する。特定の実施形態で、基板はシリコン基板であり、選択的には表面の上がシリコン酸化物層で覆われている。特定の実施形態で、ナノ構造は金（Ａｕ）、銀（Ｓｉ）もしくは銅（Ｃｕ）のナノ構造または他の金属構造であって、ラマン散乱の増強を可能とするものである。一実施形態では、ＳＥＲＳ修飾基板１０２の上に、競合分子１０６を含むコンテナ１０９が存在する。例えば人体に埋め込むことを見越して、ＳＥＲＳ修飾基板１０２とコンテナ１０９を生体適合性パッケージ内に封入してもよい。生体適合性パッケージ内では、所定の数の競合分子１０６がコンテナ１０９内に存在している。競合分子１０６は、ＳＥＲＳ修飾基板１０２または生体適合性パッケージを通って侵入するアナライト分子１０８に結合可能である。
【００９９】
一実施形態で、生体適合性パッケージは、薄膜１０５を備える（図２参照）。薄膜により、アナライト１０８は当該薄膜を通ってコンテナ１０９内に入ることができる。競合分子１０６の濃度を固定する（液体（試料）中のアナライト１０８濃度を決定するために）必要があるところ、薄膜は競合分子１０６を通過させない。このようにして、競合分子１０６は生体適合性パッケージの内側、コンテナ１０９の内側に閉じ込められる。薄膜とコンテナ１０９により、光が侵入して、ＳＥＲＳ修飾基板１０２に結合した競合分子１０６に光を照射することができる。
【０１００】
一実施形態で、生体適合性パッケージは、カプセルを例えば容易に体内に移すことができる形状、例えば楕円形を有するが、本発明はこれに限定されない。好都合な実施形態では、生体適合性パッケージは鋭利なエッジを有しない。
【０１０１】
一実施形態で、生体適合性パッケージの面積は１．０ｍｍ２以下である。
【０１０２】
生体適合性パッケージは、切開により、またはパッケージを体内に挿入するよう構成された特別なツールにより体内に導入されてもよい。また、生体適合性パッケージの形状は特別な挿入ツールに収まるように適合してもよい。あるいは、パッケージを体外で使用してもよい。
【０１０３】
一実施形態で、薄膜は、この分野で知られたセルロースまたはセロファンからなる薄膜（例えば透析膜）である。
【０１０４】
一実施形態で、液体（試料）中の競合分子１０６の濃度は予め決定されている。実際の競合分子の量はトレードオフである。液相中の競合分子の量は多すぎるべきでない。なぜなら、液相中ですべてのアナライト分子が結合してどのアナライト分子も基板の上に結合しないことになるからである。
【０１０５】
一実施形態で、検出器１０３は、ＳＥＲＳ信号を検出または記録可能なラマン分光計である。特定の実施形態で、検出器１０３はホログラフィック分散格子(holographic dispersive gratings)またはＣＣＤマルチチャネル検出器である。
【０１０６】
第２の態様では、アナライトを検出し、または液体（試料）中の特定のアナライト濃度を測定する装置が提供される。この装置により、本発明の第１の態様で説明した方法を実施できる。装置は、生体適合性パッケージ内に封入されたＳＥＲＳ修飾基板１０２を備えており、基板１０２はその表面の上にコンテナ１０９（例えばゲル、液体（試料））を有する。生体適合性パッケージにより、装置を例えば体内に埋め込むことができるが、これは必須ではなく、装置を体外で使用してもよい。生体適合性パッケージ内では、所定数の競合分子１０６がコンテナ１０９内に存在する。競合分子１０６は、上記ＳＥＲＳ基板１０２に結合可能であり、生体適合性パッケージ内に侵入するアナライト分子１０８にも結合可能である。
【０１０７】
一実施形態で、コンテナ１０９は、ゲル、空洞、マトリクス、液体（試料）、または、受容体分子１０７を含有可能な他の任意の物質または材料である。
【０１０８】
一実施形態で、ＳＥＲＳ修飾基板１０２はＳＥＲＳジオール修飾基板である。ＳＥＲＳジオール修飾基板により、競合分子１０６を結合させることができる。一実施形態で、競合分子１０６はボロン酸誘導体である。図３（ｃ）は、金属ナノ構造１１１を備えた基板を示しており、各金属ナノ構造は少なくとも１つのジオール分子を含んでいる。
【０１０９】
一実施形態で、修飾基板１０２はナノ構造を有する。一実施形態で、基板１０２はパターン化金属ナノ構造を基板１０２表面の上に有する。表面の上のナノ構造は、表面で吸収される分子によるラマン散乱を増強する。特定の実施形態で、基板１０２はケイ素化合物(silicium)（例えばＳｉＯ２）支持部である。特定の実施形態で、ナノ構造は金（Ａｕ）、銀（Ｓｉ）または銅（Ｃｕ）のナノ構造である。ラマン散乱増強を可能にする他の任意の金属を使用できる。金属ナノ構造は、より高強度のＳＥＲＳ信号を発生させるように成形または設計されてもよい。例えばピラミッド型、柱型、星型でもよく、鋭利なエッジを有する他の任意の形状を有していてもよい。
【０１１０】
一実施形態で、生体適合性パッケージは薄膜１０５を備える。薄膜１０５は、生体適合性パッケージの一部であってもよい。当該薄膜を通じて、アナライト１０８をコンテナ１０９内に移動させることができる。競合分子１０６の濃度を固定する（液体（試料）中のアナライト１０８の濃度を決定するために）必要があるところ、薄膜は競合分子１０６を通過させない。薄膜とコンテナ１０９により、競合分子に照射する光を通過させることができる。
【０１１１】
一実施形態で、薄膜は、この分野で知られたセルロースまたはセロファンからなる薄膜（例えば透析膜）である。
【０１１２】
一実施形態で、競合分子１０６はボロン酸誘導体であり、受容体分子はジオール分子であり、アナライト１０８はグルコースである。一実施形態によれば、ジオール分子はＳＨグルコース分子である。
【０１１３】
生体適合性パッケージは、切開により、または体内に挿入するよう構成された特別なツールにより体内に導入されてもよい。また、生体適合性パッケージの形状は特別な挿入ツールに収まるように適合してもよい。あるいは、パッケージを体外で使用してもよい。生体適合性パッケージは、例えば体内へ容易にカプセルを移すことができるような形状を有していてもよい。
【０１１４】
一実施形態で、生体適合性カプセルの大きさは、数ｍｍ２、例えば１０ｍｍ２以下、５ｍｍ２以下、１ｍｍ２以下である。
【０１１５】
本発明の第３の態様では、本発明の第１の態様のいずれかの実施形態で説明した方法を実行するシステムが提供される。当該システムは本発明の第２の態様のいずれかの実施形態で説明した装置を使用する。システムは、本発明の第１の態様で説明した単色光源１０１と、本発明の第２の態様で説明した装置と、ＳＥＲＳ信号を測定する検出器１０３とを備える。当該システムを１０３に示している。
【０１１６】
一実施形態で、検出器１０３はラマン分光計である。
【０１１７】
単色光源１０１は、駆動されてＳＥＲＳ修飾基板１０２の特定の位置に光を照射する。ラマン分光計１０３を使用して、ＳＥＲＳ修飾基板１０２表面に結合した競合分子１０６の量に関連するＳＥＲＳ信号（ＳＥＲＳデータ）を観察および記録することができる。
【０１１８】
また、例えばＳＥＲＳ信号の連続的観察を行う場合には、計算ユニット１０４を使用してＳＥＲＳデータを収集し、これを液体（試料）中のアナライト１０８の濃度と関連づけることができる。この相互関係は、ＳＥＲＳ信号に基づいて液体（試料）中のアナライト濃度を決定するものである。一実施形態で、計算ユニット１０４は、ＳＥＲＳデータを処理する処理装置を備える。検出器から計算ユニット１０４へのＳＥＲＳデータの移動は、ワイヤレスで、またはケーブルを介して行うことができる。
【０１１９】
一実施形態で、計算ユニット１０４は検出器内に統合されており、さらに検出器１０３は、アナライト濃度をユーザに示すためのディスプレイを備える。
【０１２０】
別の実施形態で、単色光源１０１、計算ユニット１０４および検出器１０３は、単一の内蔵型システム１００内に統合される。このシステムにより、ユーザはアナライト１０８（例えば自分の血流中のグルコース）の濃度を測定できる。システム１００は、ユーザの体内に埋め込むことも体外で使用することもできるＳＥＲＳ修飾基板１０２を備えた生体適合性パッケージに、光を照射する。システム１００は、競合分子１０６の濃度に関連するＳＥＲＳデータを収集し、このＳＥＲＳデータを血液（試料）中のグルコース（アナライト１０８）濃度と関連づける。さらに、システム１００は測定情報をレビューして利用可能とするためのディスプレイとインタフェースを備えてもよい。
【０１２１】
また、本発明の実施形態では、例えば血流中や血液試料中のグルコース濃度を測定するための、上記装置または上記システムの使用についても考慮する。
【０１２２】
（実験結果）
Ａ．ＳＥＲＳ基板の製造
実験では、１種類の金のナノ構造を有するＳＥＲＳ基板を用いた。裸のＳｉＯ２基板を洗浄した後に、直径１００ｎｍのポリスチレンビーズ(Thermo Fisher Scientificから得られる)を堆積させた。静電気力に起因して、ナノ粒子がＳｉＯ２基板の上に密充填層を形成する。次に、基板をＨ２Ｏで慎重にリンスした。次に、ポリスチレンコーティングされたＳｉＯ２基板の上に、スパッタ堆積を使用して薄いＡｕの層（約５０ｎｍ）を堆積させた。このようにして得られたＳＥＲＳ基板をアセトン−Ｈ２Ｏ混合物で洗浄し、窒素気流で乾燥させた。さらに、実験前に１５分間のＵＶ−Ｏ３処理を行うことにより、試料を洗浄した。
【０１２３】
Ｂ．受容体分子を用いたＳＥＲＳ基板の官能基化
１ｍＭのチオール化グルコース（すなわち１−チオ−β−Ｄ−グルコースナトリウム塩二水和物（Toronto Research Chemicalsから得られる））を含有する溶液に、ＳＥＲＳ基板を、暗室中、室温で３日間浸漬させた。チオール官能基の存在に起因して、分子は自己組織化により、ＳＥＲＳ基板の金部分(feature)の上に化学的に吸着する。チオール化グルコースは、ボロン酸誘導体に可逆的に結合する受容体分子として機能する。使用前に、ジオール官能基化ＳＥＲＳ基板をカーボネート緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ１０）に浸漬させた(emerge)。
【０１２４】
Ｃ．ＳＥＲＳジオール修飾基板とボロン酸誘導体との間の相互作用の観察
まず、グルコースに対する親和性に基づいて、ボロン酸誘導体を大まかに選択した（図６に示している）。提示している実験では、フェニルボロン酸を選択した。ボロン酸誘導体は、BoroChemまたはSigma-Aldrichから得たものを精製せずに用いた。
【０１２５】
チオール化グルコース分子を用いて官能基化されたＳＥＲＳ基板を、蠕動ポンプシステムに接続された自作のフローセルの上に載せた。カーボネート緩衝液のフローを連続的に供給した（図７（Ａ））。LabRAMのラマンセットアップを使用して、対応するラマン信号を観察した。測定中、積分時間２５秒、０．５ｍＷのＩＲレーザ（７８５ｎｍ）を使用した。図７では、生のＳＥＲＳ信号をプロットしている。図７Ａ）では、カーボネート緩衝液の供給時に信号は観察されない。
次に、カーボネート中の１ｍＭのフェニルボロン酸（ＰＢＡ）溶液を、官能基化ＳＥＲＳ基板に対して一定の流速で送り、図７Ｂ）に示す指紋スペクトルを得た。図５は、２５秒の時間間隔を用いて、１０７５±１ｃｍ−１で観察したＳＥＲＳ強度を示す。明らかに、時間とともに信号強度が大きくなる。これは、ＳＥＲＳ基板の上に固定されたチオール化グルコース部分に結合するＰＢＡの量に関連する。種々のボロン酸誘導体（ＳＥＲＳ基板の上に固定されたグルコースに対して高い親和性を示すもの、低い親和性を示すもの）を使用して、同様の観察を行った（データについては示していない）。
さらに、マトリクス分子の生理的バックグラウンドを使用して、同様の実験を繰り返した（図７Ｃ））。このとき、カーボネート溶液にヒトの血清アルブミン（２０００ｍｇ／ｄｌ）を溶解させ、カーボネート中の１ｍＭ ＰＢＡと１／１の比で混合した。マトリクスタンパク質の高いバックグラウンドにもかかわらず、体内条件を模倣して、固定されたチオール化グルコースと相互作用するＰＢＡの明確なＳＥＲＳ応答を観察できる。また、図８に示すように、応答はリアルタイムで測定した。ＰＢＡは、バックグラウンドが高いマトリクスタンパク質を利用する場合であっても、ＳＥＲＳ基板の上に固定されたグルコース分子（ＳＨグルコース）と相互作用することができる。このように、常に大量のタンパク質が存在する「体内」条件で使用することができることから、提示した方法は有望である。
【０１２６】
Ｄ．グルコース検出のために競合分子としてＰＢＡを使用する間接分析
上記実験と同様に、チオール化グルコースで官能基化されたＳＥＲＳ基板を、蠕動ポンプに接続された自作のフローセルの上に載せた。ＰＢＡ（２ｍＭ）とＤ−グルコース（さまざまな濃度：２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ）の１／１の混合物を、ＳＥＲＳ基板の上に連続的に送った。１０７５±１ｃｍ−１でのＳＥＲＳ強度を、５０ｓごとに観察した。図１０で、２．５ｍＭグルコース／１ｍＭ ＰＢＡの混合物を導入した後、ＳＥＲＳ信号強度が明らかに増加した。グルコース濃度を低下させ、ＰＢＡ濃度を維持することにより、ＳＥＲＳ強度が増加した。溶液中に存在するアナライト（すなわちグルコース）分子が少ないと、競合分子（ＰＢＡ）はＳＥＲＳ基板の上の受容体分子（固定されたグルコース分子）に結合し、ＳＥＲＳ応答を発生させることができる。グルコース分子の濃度が大きすぎる（＞２．５ｍＭ）と、全ＰＢＡ分子が溶液中のグルコース分子に結合し、ＳＥＲＳ基板の上に固定されたグルコース分子に結合可能なＰＢＡ分子がなくなる。このように、ＳＥＲＳ信号を観察できない（図１に概略的に示したものと同様）。
【０１２７】
ヒトの血液のグルコースレベルは３ｍＭから１０ｍＭの間で変動する。提示している間接分析は特にこの濃度範囲で感度が高い必要がある。高感度なグルコース検出を得るために、グルコースに対する親和性が高いボロン酸誘導体を利用できる。また、競合分子の濃度を最適化できる。ボロン酸誘導体の濃度が高すぎる場合、低濃度のグルコースを見分けるのは難しい。一方、ボロン酸誘導体の濃度が低すぎる場合、高濃度のグルコースを検出できない。
【０１２８】
他の方法は、反応速度を増加させることである。このとき、与えられるレーザ出力を０．５ｍＷから１．２ｍＷへ増加させた。こうすることにより、ＰＢＡ分子についてのＳＥＲＳ信号を２０ｍＭのグルコースで観察でき、グルコース濃度を低下させることで信号強度は増加し続ける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【外国語明細書】
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