(57)【要約】【課題】流路内の核酸を超高速に増幅するための装置及び方法を提供する。【解決手段】ＰＣＲ反応を行うことができる蛇行流路、前記蛇行流路の片側のループ部に対応する熱変性温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング温度帯、アニーリング温度帯と熱変性温度帯との間の伸長温度帯、さらに前記熱変性温度帯、伸長温度帯及びアニーリング温度帯を形成できるヒーターを備えた核酸増幅装置であって、前記蛇行流路は伸長部、熱変性部、冷却部及びアニーリング部から構成され、流路断面積は、伸長部＜冷却部＜熱変性部≦アニーリング部であり、熱変性部は熱変性温度帯に配置され、伸長部と冷却部は伸長温度帯に配置され、アニーリング部はアニーリング温度帯に配置されている核酸増幅装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ反応を行うことができる蛇行流路、前記蛇行流路の片側のループ部に対応する熱変性温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング温度帯、アニーリング温度帯と熱変性温度帯との間の伸長温度帯、さらに前記熱変性温度帯、伸長温度帯及びアニーリング温度帯を形成できるヒーターを備えた核酸増幅装置であって、前記蛇行流路は伸長部、熱変性部、冷却部及びアニーリング部から構成され、流路断面積は、伸長部＜冷却部＜熱変性部≦アニーリング部であり、熱変性部は熱変性温度帯に配置され、伸長部と冷却部は伸長温度帯に配置され、アニーリング部はアニーリング温度帯に配置されている核酸増幅装置。
【請求項２】
熱変性温度帯に配置された熱変性部の伸長部側の端部が、伸長部と同じ流路断面積を有する、請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
蛇行流路の入口にＰＣＲ反応液の吐出用ポンプを接続し、蛇行流路の出口にＰＣＲ反応液の吸引用ポンプを接続してなる、請求項１又は２に記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
ヒーターがステンレス製の平板状ヒーターであり、蛇行流路を有する平板状PCR用マイクロ流体基板を平板状ヒーターとマグネットにより挟持し、ヒーターと基板の安定な接触を磁力により確保する、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅装置の蛇行流路にＰＣＲ試料液を供給してＰＣＲ反応を行う核酸増幅方法において、ＰＣＲ試料液は気体に挟まれた試料プラグの形状でポンプにより蛇行流路内に送液され、気体によりＰＣＲの１サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。
【請求項６】
複数の試料プラグは、伸長部、熱変性部、冷却部及びアニーリング部からなる群から選ばれる同じ流路に位置するように蛇行流路内に送液される、請求項５に記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛇行流路内の核酸を超高速に増幅するための方法に関する。より具体的には、本発明は、連続流マイクロ流体システムを用いて、温度及び残留時間を正確にコントロールするための送液条件と流路デザインを提供し、超高速なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体微細加工技術などを用いて作製されたマイクロ流路チップで、微量のDNAサンプルから目的とする遺伝子配列領域を高速・簡便に増幅させるポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase chain Reaction, PCR)が注目されている。
【０００３】
従来技術として、例えば、蛇行マイクロ流路を備えた核酸増幅装置であって、熱変性温度帯(94℃程度)、アニーリング温度帯（60℃程度）、伸長温度帯（72℃程度）を有し、かつ、PCR試料液が気体に挟まれた試料プラグの形状でポンプにより蛇行流路内に送液される核酸増幅装置（特許文献１,２）や、PCR試料液の還流を最適化する事によって高速な遺伝子増幅を達成した方法（特許文献３）が公開されている。
【０００４】
特許文献１,２では、平板型マイクロ流体装置内を流れているPCR試料プラグ液の前後の気体との界面に生じる蒸気圧差を利用することで、高速な温度制御を達成しているが、
(i)入口からの気体吐出によって試料プラグ液を送液させる場合、連続蛇行状のマイクロ流路は高い内圧上昇が発生するため、蛇行状流路の入口付近、中央付近、出口付近は流速が著しく異なる。そのため、蒸気圧差による流体制御を効果的に作用させるには、煩雑な流体制御法が必要になること。
(ii)出口からの気体吸引によって試料プラグ液を送液させる場合、マイクロ流路内の高い蒸気圧は、出口からの吸引による減圧によって解放されるため、マイクロ流路内の蒸気圧差は薄れること。
(iii)蒸気圧差の効果は、装置に接しているヒーターブロックのPID制御のバラつきと、装置とヒーター接触面の熱伝導の不均一さによる影響を大きく受けること。
(iv)1サイクル分或はそれ以上隔てられた状態で、セグメントフロー方式により複数の試料プラグ液を送液する場合、蒸気圧差が発生しているマイクロ流路内を、其々の試料プラグ液の流体制御を実現しながら送液し続けることは、技術的に極めて困難であること、の問題があった。
【０００５】
特許文献３では、試料液自身の還流を活用することで、正確な温度制御と迅速な昇降操作を可能にしているが、煩雑な制御系が必要であることと、他の生化学反応部との接続を考えた場合、構造上自由度が低く扱い難いという問題がある。
【０００６】
これまでの技術では、現場で処理可能な、迅速かつ簡便なPCRを行うことが不可能であり、超高速に増幅を行える方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2011-200193
【特許文献２】特開2013-055921
【特許文献３】特開2011-250800
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、流路内の核酸を超高速に増幅するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで上記課題を解決するために、本発明者は、流体の粘性を活用できるように流路の構造を工夫して、PCRの伸長部で十分な反応時間が確保され、冷却部の反応液の通過を短時間で行い、簡便な制御で満足のいく核酸伸長反応が行えるようにした。
【００１０】
本発明は、以下の核酸増幅方法及び核酸増幅装置を提供するものである。
項１．  ＰＣＲ反応を行うことができる蛇行流路、前記蛇行流路の片側のループ部に対応する熱変性温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング温度帯、アニーリング温度帯と熱変性温度帯との間の伸長温度帯、さらに前記熱変性温度帯、伸長温度帯及びアニーリング温度帯を形成できるヒーターを備えた核酸増幅装置であって、前記蛇行流路は伸長部、熱変性部、冷却部及びアニーリング部から構成され、流路断面積は、伸長部＜冷却部＜熱変性部≦アニーリング部であり、熱変性部は熱変性温度帯に配置され、伸長部と冷却部は伸長温度帯に配置され、アニーリング部はアニーリング温度帯に配置されている核酸増幅装置。
項２．  熱変性温度帯に配置された熱変性部の伸長部側の端部が、伸長部と同じ流路断面積を有する、項１に記載の核酸増幅装置。
項３．  蛇行流路の入口にＰＣＲ反応液の吐出用ポンプを接続し、蛇行流路の出口にＰＣＲ反応液の吸引用ポンプを接続してなる、請求項１又は２に記載の核酸増幅装置。
項４．  ヒーターがステンレス製の平板状ヒーターであり、蛇行流路を有する平板状PCR用マイクロ流体基板を平板状ヒーターとマグネットにより挟持し、ヒーターと基板の安定な接触を磁力により確保する、項１〜３のいずれかに記載の核酸増幅装置。
項５．  項１〜４のいずれかに記載の核酸増幅装置の蛇行流路にＰＣＲ試料液を供給してＰＣＲ反応を行う核酸増幅方法において、ＰＣＲ試料液は気体に挟まれた試料プラグの形状でポンプにより蛇行流路内に送液され、気体によりＰＣＲの１サイクル分或いはそれ以上隔てられた状態で前記蛇行流路内に供給されることを特徴とする、核酸増幅方法。
項６．  複数の試料プラグは、伸長部、熱変性部、冷却部及びアニーリング部からなる群から選ばれる同じ流路に位置するように蛇行流路内に送液される、項５に記載の核酸増幅方法。
【発明の効果】
【００１１】
遺伝子検査のように、医療現場において微量に採取した生体試料から、高感度に遺伝子の有無を検査可能なシステムの実現が求められる。本発明では、遺伝子増幅技術であるPCRにおいて、空気に挟まれた試料プラグの形態（形状）を利用し、かつ、蛇行流路の断面積を伸長部＜冷却部＜熱変性部≦アニーリング部とすることで、これまでの平板型マイクロ流体装置を用いた連続流ＰＣＲにおいて課題であった高速と高効率の両立を、試料プラグの前後の空気との界面に生じた試料液自身の蒸気圧と流体の粘度を活用することで実現することができる。これにより、新たに特別な外部装置を必要とせず、マイクロ流体装置の長所を最大限に生かした連続流ＰＣＲシステムの微量化ならびに高速化に資する特徴を備える。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マイクロ流路の形状を試料プラグ液の流体制御に活用した２種類のPCR用マイクロ流体装置を示す図である。ヒーターはマイクロ流路がデザインされた面に接触させる。
【図２】図１に示す２種類のPCR用マイクロ流体装置において、サーマルサイクルのため、蛇行流路の領域毎に温度を制御する方法を示す図である。図２中、温調１（約９５℃）はＤＮＡ熱変性用ヒーターブロックであり、温調２（約７２℃）は伸長反応用ヒーターブロックであり、温調３（約30-60℃）はアニーリング用ヒーターブロックである。
【図３】ヒーターブロックにステンレス製ヒーターを用いて、図１に示す平板状PCR用マイクロ流体装置をマグネットによる挟み込みで接触させたときの、熱伝導の均一さを示す図である。
【図４】ヒーターブロックに接触しているPCR用マイクロ流体装置内を、PCR試料プラグ液が流動してサーマルサイクルを行う工程を説明する図である。
【図５】室温下でPCR用マイクロ流体装置内を流動する試料プラグ液の流動原理を説明する図である。
【図６】室温（約20℃）・吐出下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動している試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図７】室温（約20℃）・吐出下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動している試料プラグ液の残留時間分布を比較した表と図である。
【図８】サーマルサイクル下で、PCR用マイクロ流体装置内を流動するPCR試料プラグ液の流動原理を説明する図である。
【図９】サーマルサイクル・吐出下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動しているＰＣＲ試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図１０】サーマルサイクル・吐出下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動しているＰＣＲ試料プラグ液の残留時間分布を比較した表と図である。
【図１１】サーマルサイクル・吐出下で、マイクロ流路の冷却部の断面積と伸長部の断面積を変えたときのＰＣＲ試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図１２】室温（約20℃）・吸引下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動している試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図１３】室温（約20℃）・吸引下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動している試料プラグ液の残留時間分布を比較した表と図である。
【図１４】サーマルサイクル・吸引下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動しているＰＣＲ試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図１５】サーマルサイクル・吸引下で、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置の、流動しているＰＣＲ試料プラグ液の残留時間分布を比較した表と図である。
【図１６】サーマルサイクル・吸引下で、マイクロ流路の冷却部の断面積と伸長部の断面積を変えたときのＰＣＲ試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図１７】流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流路の形状を流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置を用いて、PCR試料プラグ液の液量を変化させて入口からの吐出によりPCRを行った結果、リアルタイムPCRキットのDNA断片の増幅に伴って得られた蛍光強度の比較を示す図である。
【図１８】流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流路の形状を流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置を用いて、PCR試料プラグ液の液量を変化させて出口からの吸引によりPCRを行った結果、リアルタイムPCRキットのDNA断片の増幅に伴って得られた蛍光強度の比較を示す図である。
【図１９】流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と、流路の形状を流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置を用いて、セグメントフローにより流動させた試料プラグ液の残留時間分布を比較した図である。
【図２０】流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と、流路の形状を流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置を用いて、図19で示されたセグメントフローによりPCRを行った結果、リアルタイムPCRキットのDNA断片の増幅に伴って得られた蛍光強度と電気泳動による結果の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、複数の温度帯を蛇行しながら繰り返し通過する微小流路内において極めて高速にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により核酸を増幅するための方法及び装置に関する。より具体的には、本発明は、連続流ＰＣＲのための平板型マイクロ流体システムにおいて、蛇行流路を用いて、気体に挟まれ試料プラグとして流れるPCR試料液に対して、熱変性部、伸長部、冷却部、アニーリング部の各反応部における温度と滞留時間を正確に制御するための流路デザインと、送液条件を適切に設定し、流路内の核酸を超高速に増幅するための装置及び方法に関する。
【００１４】
特に断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が関係している技術分野の当業者に通常理解される意味と同じ意味を有する。次に実施の形態を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施の形態のみに限定されるものではなく、本明細書で説明されているものと類似のまたは同等の多数の方法および材料についてどれも本発明を実施する際に使用することができる。好ましい材料および方法について以下に説明する。
【００１５】
本明細書において、複数の温度帯とは、熱変性温度帯、アニーリング温度帯、伸長温度帯の３つの温度帯が挙げられる。これらの３つの温度帯は加熱装置（ヒーター）或いは冷却装置などにより明確に区別されていてもよく、隣接する温度帯（熱変性温度帯と伸長温度帯、或いは、伸長温度帯とアニーリング温度帯）の境界は明確でなくてもよい。図面で示される具体的な実施形態では、熱変性温度帯は９５℃、伸長温度帯は７２℃、アニーリング温度帯は３０℃に設定されているが、核酸増幅反応（PCR）が進行する限り多少温度を上下させることができる。伸長温度帯とアニーリング温度帯は、見かけ上一体的になった１つの温度帯に見える場合もあるが、本明細書ではこのような場合であっても、より温度の高い部分を伸長温度帯と表現し、より温度の低い部分をアニーリング温度帯と表現する。
【００１６】
本発明の蛇行流路は、PCR用マイクロ流体基板に形成される。この基板は平板状であるのが好ましい。本発明の核酸増幅基板は、PCR用マイクロ流体基板とヒーター（好ましくは平板状ヒーター）を備え、好ましい実施形態では、PCR用マイクロ流体基板はヒーターとマグネットにより挟持され、熱変性温度帯と反対側のループ部に対応するアニーリング温度帯、熱変性温度帯伸長温度帯の温度を所定の温度に安定して保持する。
【００１７】
図３ａに示される実施形態では、平板状ステンレス製ヒーター上の平板状PCR用マイクロ流体基板の上にマグネットを設けている。このマグネットにより基板とヒーターが密着し、均一な温度を実現できる。
【００１８】
本発明を実施するための核酸増幅装置の模式図を図１に示す。この装置は、ＰＣＲ試薬の入口、蛇行流路、ＰＣＲ反応後の液(試料プラグ液)の出口を備える。ＰＣＲの１サイクルは、両側の１対のループ部分（高温の熱変性部と低温のアニーリング部）、ループ部分を結ぶ２つの直線部分（伸長部と冷却部）からなる１つのユニットにより行うことができる。
【００１９】
図４に示すように、熱変性部は「熱変性温度帯(９５℃のヒーターブロック)」に対応し、アニーリング部は、「アニーリング温度帯(３０℃のヒーターブロック)」に対応し、ループ部分を結ぶ２つの直線部分(伸長部と冷却部)は、「伸長温度帯(７２℃のヒーターブロック)」に対応する。本発明で使用する核酸増幅装置は、このユニットが多数連結された蛇行流路において核酸増幅反応を行う。１つのＰＣＲ試料液が蛇行流路を進んでいくと、蛇行流路のユニット数に応じて多数のサイクルのＰＣＲ反応が行われ、必要な数のＰＣＲ産物が形成されて蛇行流路の出口から放出される。
【００２０】
本発明の蛇行流路の伸長部は流路断面積が最も小さく、空間に余裕があるので、伸長部のデザインを例えば図２ｂに示すように蛇行させることで、伸長部の体積を増加させることができる。伸長部の流路断面積は小さいので、粘性の力によって試料プラグ液は伸長部を遅く流動する。大量の試料プラグ液を熱変性部（95℃）に流動させると、長い時間（例えば１分間以上）熱変性部（95℃）に残留し、気泡が発生するおそれがあるが、熱変性部を流動する時間が気泡が発生しない程度の時間(通常30秒以下、好ましくは20秒以下、より好ましくは10秒以下)であれば、試料プラグ液の液量が増大しても核酸増幅反応を問題なく行うことができる。
【００２１】
なお、試料プラグ液の液量が増加すれば、核酸増幅に時間がかかり、アニーリング部における残留時間も長くなるため、アニーリング部の温度は30℃（図2）から55℃程度の温度に上昇させればよい。アニーリング部から伸長部に供給される試料プラグ液の温度は５５〜６０℃程度が望ましく、このような温度になるようにアニーリング部の温度を適宜設定できる。例えば、試料プラグ液の液量に応じてアニーリング部の温度を３０℃〜６０℃程度の温度範囲で設定すればよい。
【００２２】
本発明の核酸増幅装置の蛇行流路は伸長部、熱変性部、冷却部及びアニーリング部から構成され、流路断面積は、伸長部＜冷却部＜熱変性部≦アニーリング部となっている。特に流路断面積が伸長部＜冷却部であることが重要である。このような構成とすることで、伸長部を移動する時間が長くなり、冷却部を移動する時間は短くなり、伸長部における核酸の伸長反応に十分な時間が確保し、冷却部における送液の時間短縮が行われる。プラグ状の試料液の量が少ないときには図２ａに示されるように伸長部は直線状の流路でも十分であるが、プラグ状の試料液の量が多くなった場合、伸長部の流路は図２ｂに示されるように蛇行させてもよい。本発明ではプラグ状の試料液は各部(熱変性部、伸長部、冷却部、アニーリング部)に単独で存在し得ることが重要であり、最も流路断面積の小さい伸長部の流路内体積は各プラグ状の試料液の体積よりも大きくする必要がある。伸長部は最も流路断面積が小さく流路内の体積が小さいので、図２ｂに示されるように流路を蛇行させて流路内の体積を増加させることができる。
【００２３】
図４ａに示されるように、９５℃のヒーターブロック内の熱変性部の伸長部側端部は流路断面積を伸長部と同様に細くしている。これは、この９５℃の細い流路部分を試料液がゆっくり通過することで熱変性を行うのに十分な時間を確保するためである。伸長部と冷却部の流路断面積が熱変性部、アニーリング部の流路断面積よりも小さいことは、図１ａ，ｂの断面図にも示されている。
【００２４】
図５に本発明の装置における送液原理の概略を示す。アニーリング部ではＰＣＲ試料プラグ液はポンプの陽圧により流動されて移動し(i)、流路断面積が大きいアニーリング部から流路断面積の小さい伸長部への送液は毛管力により素早く移動する(ii)。伸長部では流路断面積が小さいのでプラグ液は粘性によりゆっくり移動し、十分な伸長時間が確保されるようになっている(iii)。伸長部と熱変性部の境界を熱変性温度域に設定すると、この領域での送液が非常にゆっくり行われるために熱変性に必要な時間がこの部分で十分に確保される(iv)。プラグ液が流路断面積の大きな熱変性部に送液されると、その前のゆっくりした移動時に高められたポンプの陽圧によりプラグ液は素早く移動する(v)。熱変性部から冷却部への移動及び冷却部内の移動は高い陽圧と毛管力により素早く行われる(vi)、(vii)。アニーリング部は流路断面積が大きくなっているので、試料プラグ液は冷却部よりもゆっくり移動し、アニーリングに必要な時間が確保される。図６ａ、図９ａに示すように、本発明の核酸増幅装置の蛇行流路は、流路断面積を、伸長部＜冷却部＜熱変性部≦アニーリング部とすることで、試料プラグ液の移動時間は伸長部＞アニーリング部＞熱変性部＞冷却部となり、核酸増幅反応を行うのに理想的な反応時間の配分となるため、高速化を実現しつつ核酸増幅反応を確実に行うことができる。
【００２５】
本発明で使用するポンプは通常のポンプが使用でき、特に限定されないが、例えば小型のダイヤフラム式ポンプ(mp6 piezoelectric diaphragm micropump)を好ましく使用できる。このダイヤフラム式ポンプは、気体・液体の吐出・吸引の両方が可能なポンプであり、蛇行流路の入口での吐出と出口での吸引の両方に使用できる。
【００２６】
図６は室温における試料プラグ液の残留時間分布であり、図９ａはサーマルサイクル時の残留時間分布である。流路の形状を活用しなかったとき、すなわち流路断面積が伸長部＝冷却部＝熱変性部＝アニーリング部の場合、室温(図６ａ)では残留時間は全て同一であるが、サーマルサイクル時には残留時間は大きく変化する(図９ａ)。流路形状を活用したとき、プラグ液の蒸気圧の寄与がない室温条件で伸長部と熱変性部の残留時間は長くなり、冷却部、アニーリング部の残留時間は短くなる。この残留時間パターンの変化は、核酸増幅反応を確実に行いながら高速化を実現するために理想的である。図９ａに示されるように、サーマルサイクル時には本発明の流路形状を活用しなくても室温(図６ａ)と比較して伸長部とアニーリング部の残留時間は大きく延長され、熱変性部の残留時間はやや減少し、冷却部の残留時間は大きく低下する。これは蛇行流路内の蒸気圧による効果である。これに流路形状の効果を重ね合わせることで、伸長部、熱変性部、冷却部、アニーリング部における試料プラグ液の残留時間をさらに理想的なものにすることができる。
【００２７】
図２０に示すように、本発明の核酸増幅装置を用いたＰＣＲでは、増幅された核酸が得られているが、流路断面積を一定にした図１９ｂの装置を用いた場合増幅された核酸は得られなかった。これは、各サイクルにおける残留時間が一定である本発明の効果である。
なお、ＰＣＲの試料液としては、ＰＣＲの標準的なキットを利用することができる。核酸の増幅反応（ＰＣＲ）は、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ-ＰＣＲ法などを利用することができる。
【００２８】
次に、４０サイクルの蛇行流路を有する本発明の核酸増幅装置、及び流路断面積が一定の比較対象の核酸増幅装置を用い、室温で試料プラグ液を送液したときの各サイクルにおける残留時間分布を図７に示す。図７ａと図７ｂに示されるように、本発明の核酸増幅装置は、入口から出口にかけて１サイクルの合計の残留時間と冷却部、アニーリング部、伸長部、熱変性部の各々の残留時間はほとんど変わらないが、流路断面積が一定の装置(図７ｂ)では、サイクル数が２０前後のときに残留時間が最も長くなり、出口(４０サイクル)に近づくと残留時間は急速に短くなっている。この残留時間の変化は、サーマルサイクル下での送液の場合にも同様に生じ(図１０)、本発明の装置はサーマルサイクル下の方が残留時間の変動がさらに小さくなり(図７ａ、図１０ａの比較)。流路断面積が一定の比較例の装置ではサーマルサイクル下の方が残留時間の変動がさらに大きくなっている(図７ｂ、図１０ｂの比較)。このように本発明の装置及び方法は、多数のＰＣＲサイクルを行った場合、確実に核酸の増幅を行うことができるが、流路断面積が一定であると特に出口付近で必要な残留時間が確保されなくなり増幅不良になるだけでなく、蛇行流路の中央付近では必要以上に長い残留時間になり、高速化の妨げになる。
【００２９】
伸長部と冷却部の流路断面積が残留時間に及ぼす影響を図１１、図１６に示す。伸長部と冷却部の流路断面積が同一(0.25mm2)であってもサーマルサイクル下では冷却部の残留時間は十分短くなっているが、反応の高速化の観点では伸長部と冷却部の流路断面積が同一では不十分であり、冷却部の断面積を伸長部よりも大きくして冷却部の残留時間を伸長部よりも十分短くすることが反応の高速化に重要である。
【００３０】
図１２には、室温・吸引下での残留時間を示す。図６（室温吐出下）と比較すると、吸引及び吐出により残留時間は同様に変化すること、図６の吐出下の方が残留時間の変化の程度がやや大きいことを示す。
【００３１】
さらに、図１４、１５には、サーマルサイクル・吸引下での残留時間の変化を示す。図１４から、本発明の流路形状を活用すると冷却部の残留時間が大幅に短縮されることがわかる。まら、図１５と図１０を比較すると、サーマルサイクル吸引下（図１５）の方がサーマルサイクル吐出下（図１０）よりもサイクル数による残留時間の変化率は小さいことがわかる。
【００３２】
図１７、１８は、流路の形状を流体制御に活用したPCR用マイクロ流体装置と流路の形状を流体制御に活用しないPCR用マイクロ流体装置を用いて、PCR試料プラグ液の液量を変化させて入口からの吐出によりPCRを行った結果、リアルタイムPCRキットのDNA断片の増幅に伴って得られた蛍光強度の比較を示す。伸長部の流路体積は、２〜３μLである。１μLまたは２μLの試料プラグ液の場合、十分な蛍光強度が得られるが、試料プラグ液の量が３μL以上になると伸長部での残留時間が短くなることで蛍光強度が徐々に減少する。したがって、試料プラグ液の液量によって、図２ａ、図２ｂに示されるような流路形状の装置を使い分けることができる。
【００３３】
図１７は入口にシリンジでPCR用試料プラグ液を入れて、入口からポンプで吐出したとき。図１８は入口にシリンジでPCR用試料プラグ液を入れて、出口からポンプで吸引したときの結果を示す。入口からのポンプでの吐出と出口からのポンプでの吸引のいずれでも核酸増幅産物が得られることが確認された。
【００３４】
図１９は、セグメントフローにより流動させた試料プラグ液の残留時間分布を比較したものであり、本発明の流路構造(図１９ａ)が比較対象の流路構造(図１９ｂ)よりも残留時間の変動の少なさにおいて優れていることと、セグメントフローによる複数の試料プラグ液は、同じ間隔(位相)で送液することが重要であることを示す。図２０は、図１９ａによる試料液１,２では核酸増幅産物である蛍光物質が十分な量で得られるが、図１９ｂによる試料液３，４では核酸増幅産物である蛍光物質が十分な量で得られないことを示す。この結果は、蛇行流路の構造(特に流路断面積)と試料プラグ液間の間隔の制御が非常に重要であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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