(57)【要約】【課題】生体分子測定用チップがより容易に作製できるようにする。【解決手段】検出部形成用基板に形成した流路形成用溝を用いて基体の主表面に形成した短冊状の複数の分子パタンに対し、分子パタンの延在方向に交差する状態で測定流路溝が配置されるように、測定流路形成用基板を基体の主表面に貼り付け、測定流路溝による測定流路が形成された生体分子測定チップを作製する。【選択図】  図１
2014157064.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々平行に設けられた複数の流路形成用溝を備える検出部形成用基板を基体の主表面に貼り付けて、前記基体の主表面上の測定領域に各々平行な複数の検出部形成用流路を形成する第１工程と、
複数の前記検出部形成用流路に各々異なる生体分子検出用分子を含む溶液を輸送して、前記測定領域における複数の前記検出部形成用流路内の前記基体の主表面に、各々異なる前記生体分子検出用分子を配置し、前記測定領域に各々異なる前記生体分子検出用分子からなる短冊状の複数の分子パタンを形成する第２工程と、
前記基体より前記検出部形成用基板を分離する第３工程と、
測定流路溝を備える測定流路形成用基板を、前記測定領域において前記測定流路溝が複数の前記分子パタンの延在方向に交差する状態で前記基体の主表面に貼り付けて、前記基体の主表面上に測定流路を形成する第４工程と
を少なくとも備えることを特徴とする生体分子測定用チップの製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の生体分子測定用チップの製造方法において、
前記検出部形成用基板は、樹脂から構成することを特徴とする生体分子測定用チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とする生体分子を測定するための生体分子測定用チップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
極微量の試料から同時に複数の化学成分を検出し、また、類似の化学反応を精度よく比較測定するための技術として、分子認識機能を有する核酸分子や抗体や酵素といったタンパク質などの生体分子検出用分子を微小な測定領域に配置した生体分子測定用チップを用いた分析技術が注目されている。この生体分子測定用チップでは、測定領域に各々異なる複数の生体分子検出用分子を配置し、迅速な測定が行えるようにしている。
【０００３】
各々異なる生体分子検出用分子の微細な領域（パタン）を、チップ（基板）表面の異なる所望の位置に配置（固定）する代表的な技術として、インクジェットプリンティング法，マイクロコンタクトプリンティング法などの生体分子検出用分子を微小液滴として固定する技術や、基板自体を予めパタン化処理しておく方法がある（非特許文献１、２）。これらは、生体分子測定用チップ作製技術として、比較的簡便な手法である。
【０００４】
例えば、インクジェットプリンティング法によるチップの作製では、プリンターのインクのかわりに生体分子検出用分子の溶液を用い、サブミクロンオーダの微細なパタンで生体分子検出用分子をチップ上に配置することが可能である。また、インクジェットプリンティング法は、大面積のパタン形成にも対応できる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】益田  直樹  他、「マイクロコンタクトプリンティングを用いたタンパク質のマイクロパターニング技術の開発，応用」、生産研究、５８巻、２号、２００６年。
【非特許文献２】Irena Barbulovic-Nad et al. , "Bio-Microarray Fabrication Techniques.A Review", Critical Reviews in Biotechnology, vol.26, pp.237-259, 2006.
【非特許文献３】DAN LI et al. , "Processable aqueous dispersions of graphene nanosheets", nature nanotechnology,vol.3, pp.101-105, 2008.
【非特許文献４】K. Furukawa, Y. Ueno, E. Tamechika, H. Hibino, "Protein Recognition on Single Graphene Oxide Surface Fixed on Solid Support", Journal of Materials Chemistry B,vol.1, no.8, pp.1119-1124, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、生体分子検出用分子は、一般的に貴重であり、微小量単位で扱う場合が多いが、上述した技術では、装置にある程度まとまった量を導入する必要があり、生体分子測定用チップの作製に利用されないデッドボリュームが発生してしまうという問題がある。また、対象とする生体分子検出用分子に合わせ、ノズル形状や噴霧条件を最適化する必要があり、作業が煩雑である。このように、インクジェットプリンティング法は、産業利用などで大量な処理が必要な場合は良いが、基礎研究用などの小規模のチップ作製においては、効率が悪い。
【０００７】
一方、マイクロコンタクトプリンティング法は、高分子で作製したスタンプに、生体分子検出用分子溶液を塗布して、これを基板に押し付けて転写する技術であり、大型装置を必要とせず、簡便で溶液の必要量も少なくてすむ。しかし、転写の際の接触や押し付けにより、生体分子検出用分子に機械的な負荷が加わる上、転写プロセスにおいて溶液が乾燥しやすいという問題があるため、生体分子検出用分子の活性が失活する恐れがある。
【０００８】
また、基板自体を予めパタン化処理しておく方法は、部分的に親水、疎水処理をしたり、金属などの薄膜を付けたりすることによって表面の性質を場所ごとに異なる性質に区切るものである。生体分子検出用分子の配置は、パタン化した基板表面に溶液を接触させれば良いので、簡単な操作で、かつ生体分子に機械的な負荷が加わる心配がなく、プロセス中に溶液が乾燥することもない。
【０００９】
しかし、位置制御性よく、かつ微細な領域（パタン）で生体分子検出用分子を配置するためには、例えば、ＬＳＩ製造に用いられるリソグラフィ用の製造装置を用いて基板のパタン化処理が必要となる。このため、基礎研究用などの小規模のチップ作製においては、装置が高価で大がかりになるなどの問題がある。
【００１０】
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、生体分子測定用チップがより容易に作製できるようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る生体分子測定用チップの製造方法は、各々平行に設けられた複数の流路形成用溝を備える検出部形成用基板を基体の主表面に貼り付けて、基体の主表面上の測定領域に各々平行な複数の検出部形成用流路を形成する第１工程と、複数の検出部形成用流路に各々異なる生体分子検出用分子を含む溶液を輸送して、測定領域における複数の検出部形成用流路内の基体の主表面に、各々異なる生体分子検出用分子を配置し、測定領域に各々異なる生体分子検出用分子からなる短冊状の複数の分子パタンを形成する第２工程と、基体より検出部形成用基板を分離する第３工程と、測定流路溝を備える測定流路形成用基板を、測定領域において測定流路溝が複数の分子パタンの延在方向に交差する状態で基体の主表面に貼り付けて、基体の主表面上に測定流路を形成する第４工程とを備える。
【００１２】
上記生体分子測定用チップの製造方法において、検出部形成用基板は、樹脂から構成するとよい。
【発明の効果】
【００１３】
以上説明したことにより、本発明によれば、生体分子測定用チップがより容易に作製できるようになるという優れた効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法を説明するフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する斜視図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する平面図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する斜視図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する斜視図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する平面図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する斜視図である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法における工程途中状態を説明する平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における生体分子測定用チップの製造方法を説明するフローチャートである。まず、ステップＳ１０１で、各々平行に設けられた複数の流路形成用溝を備える検出部形成用基板を基体の主表面に貼り付けて、基体の主表面上の測定領域に各々平行な複数の検出部形成用流路を形成する（第１工程）。
【００１６】
例えば、基体は、ガラス，シリコンなどから構成できる。生体分子測定用チップが、例えば、蛍光検出または表面プラズモン共鳴測定法に用いられる場合、基体はガラスから構成すればよい。また、表面プラズモン共鳴測定法に用いられる場合、少なくとも基体の測定領域には、Ａｕの薄膜を形成しておけばよい。また、生体分子検出のための化学修飾が、基体の主表面に施されていてもよい。また、基体の主表面に、光学材料の薄膜，電極などが形成されていてもよい。
【００１７】
これらの、基体主表面の機能化は、表面の親水化処理もしくは疎水化処理、蒸着による金属薄膜の形成、ドライエッチングやミリング法による機械加工、スピンコート法やディップ法による有機薄膜形成、自己組織化膜の形成、化学反応による分子の結合などにより実施すればよい。また、これらの複数の処理を組み合わせてもよい。
【００１８】
なお、基体の材料は、シリコンやガラスが一般的であるがこれに限るものではない。基体の主表面と、これに吸着もしくは化学結合を形成する生体分子検出用分子を含む溶液の組み合わせにおいても、特に制約はない。基体と、これに吸着もしくは化学結合を形成する分子またはこの分子を含む溶液の組み合わせの例としては、末端をカルボキシル基置換したアルカンチオールを用いて自己組織化単分子膜を形成した金表面に、抗体や酵素を含む溶液を反応させ、ペプチド結合を形成させて固定する方法がある。また、カチオン性シランカップリング剤で表面を修飾したガラス基板に、核酸分子溶液を導入し、静電相互作用による吸着により固定する方法などがある。また、親水性を有するＳｉＯ2表面に、ベシクルを含む溶液を導入し、ベシクル融合法により脂質二分子膜を作製する、自己組織化を用いた方法が挙げられる。
【００１９】
これらの機能化の目的には、生体分子検出用分子の固定密度を制御する、または生体分子検出用分子を用いた検出に必要な機能の付与（例えば薄膜電極や光学材料の形成）、などが挙げられる。なお、貼り付ける検出部形成用基板との位置合わせのための合わせマークを基体の主表面に形成しておいてもよい。
【００２０】
次に、検出部形成用基板は、例えば、高分子材料などの樹脂から構成すればよい。例えば、高分子材料としては、ＰＤＭＳ（poly dimethylsiloxane）を基本骨格に有する材料を用いることができる。ＰＤＭＳは、合成が簡単であるほか、ガラスやシリコン上の酸化膜に対して良好な密着が得られるという理由から好ましい。
【００２１】
検出部形成用基板を基体の主表面に貼り付けることで、検出部形成用基板に形成している流路形成用溝により管状の検出部形成用流路が形成できる。この場合、検出部形成用流路の一端および他端に、検出部形成用基板を貫通する孔部を設け、基体に貼り付けて検出部形成用流路を形成した後で、導入口および排出口とする。なお、検出部形成用基板を貫通する流路形成用溝とした場合、検出部形成用基板を基体の主表面に貼り付けると、上部が開放した溝状の流路となる。この場合、上述したような導入口およぶ排出口を設ける必要はない。
【００２２】
ここで、検出部形成用基板の貼り付けは、後の工程で分離する（剥がす）ことを考慮し、化学結合を形成せずに物理吸着により行うことが好ましいが、化学的に結合を形成して貼り合わせてもよい。例えば、ガラスやシリコンによる基体に対しては、エタノールで表面を洗浄したのちに酸素プラズマ処理をしたＰＤＭＳによる検出部形成用基板を搭載して密着し、３０分〜１時間以上静置することで、化学結合による良好な貼り合わせが可能である。
【００２３】
この化学結合による貼り合わせでは、基体の主表面に対して酸素プラズマ処理をしてもよい。ただし、基体表面が、機能化してある場合には、機能の失活の恐れがあるので、酸素プラズマ処理をしないほうがよい。酸素プラズマ処理はしなくても、ある程度の良好な貼り合わせが可能である。
【００２４】
また、検出部形成用基板に形成する流路形成用溝は、幅を１μｍ〜３ｍｍ程度とすればよい。また、溝の深さは、１０μｍ〜５００μｍ程度とすればよい。また、検出部形成用流路の全長は、１ｍｍ〜１０ｍｍ程度とすればよい。上述した幅および溝の深さとすることで、流路形成用溝により形成される検出部形成用流路においては、毛管現象が発現されるようになり、ポンプなどの外部の駆動力を使うことなく、ピペットなどにより供給した溶液を送液できるようになる。生体分子検出用分子を含む溶液の使用量は、検出部形成用流路の体積と同程度のμＬオーダーで十分である。また、ポンプによる圧力の高い送液の場合は、化学結合を形成せずに物理吸着させて形成した検出部形成用流路においては、溶液が漏れる場合があるが、上述したような毛管現象を用いる場合、液漏れの問題が発生しない。
【００２５】
次に、ステップＳ１０２で、複数の検出部形成用流路に各々異なる生体分子検出用分子を含む溶液を輸送し、測定領域における複数の検出部形成用流路内の基体の主表面に、各々異なる生体分子検出用分子を配置し、測定領域に各々異なる生体分子検出用分子からなる短冊状の複数の分子パタンを形成する（第２工程）。例えば、検出部形成用流路に、生体分子検出用分子を含む溶液を導入する。例えば、検出部形成用流路の一端に設けた検出部形成用基板を貫通する孔部による導入口に、ピペットなどを用いて溶液を供給すればよい。これにより、毛管現象により検出部形成用流路を溶液が流れていく。また、異なる検出部形成用流路に、各々異なる種類や濃度の生体分子検出用分子を導入する。
【００２６】
生体分子検出用分子としては、標的物質に特異的に結合する核酸またはペプチドから構成されるリガンド（アプタマー）や、標的物質に特異的に結合する抗体または標的物質と特異的な化学反応を行う酵素を用いることができる。アプタマー，抗体，または酵素の化学構造の中の予め設計した部位に、基体表面によく吸着する性質を有するリンカー分子または結合部位、検出可能な信号変化を引き起こすシグナル材料、特異的結合機能を持たないスペーサの配列などが結合されていてもよい。
【００２７】
検出部形成用流路に生体分子検出用分子を含む溶液を導入した後、導入した生体分子検出用分子を含む溶液と基体表面が接している状態を保ち、例えば、室温（２３℃程度）〜３７℃の恒温状態で、３０分〜６０分程度の時間静置する。このとき、検出部形成用流路内の溶液が乾燥しないように、検出部形成用流路の導入口および排出口を塞いでおくとよい。例えば、ＰＤＭＳから構成した小片で導入口および排出口を塞いでおけばよい。また、溶液に用いた溶媒の飽和蒸気圧下で静置しておいてもよい。
【００２８】
また、所定の時間静置した後、検出部形成用流路より溶液を除去する。また、検出部形成用流路の内部で、基体表面に固定されなかった余剰の生体分子検出用分子を除去する。例えば、洗浄などにより除去すればよい。例えば、生体分子検出用分子を含む溶液に用いた溶媒を検出部形成用流路に導入して溶媒を除去する洗浄を、数回繰り返せばよい。これらのことにより、測定領域において、各々異なる生体分子検出用分子からなる短冊状の複数の分子パタンが形成できる。
【００２９】
次に、ステップＳ１０３で、基体より検出部形成用基板を分離する（第３工程）。例えば、この分離を、水中で行うことで、上述した洗浄を行うようにしてもよい。この結果、基体の主表面には、検出部形成用基板の流路形成用溝の形成箇所に対応し、各々生体分子検出用分子による短冊状の分子パタンが配置（固定）された状態が得られる。ここで、前述したように、ＰＤＭＳなどの樹脂から検出部形成用基板を構成しておくことで、基体からの分離が容易に行える。
【００３０】
次に、ステップＳ１０４で、測定流路溝を備える測定流路形成用基板を、測定領域において測定流路溝が複数の分子パタンの延在方向に交差する状態で基体の主表面に貼り付けて、基体の主表面上に測定流路を形成する（第４工程）。測定流路溝は、１つに限らず、複数の測定流路溝を設けてもよい。
【００３１】
測定流路形成用基板は、検出部形成用基板と同様に、ＰＤＭＳなどの高分子材料から構成し、検出部形成用基板と同様に貼り付ければよい。前述したように、複数の生体分子検出用分子が配置されている基体の主表面に測定流路形成用基板を貼り付けることで、測定流路形成用基板に形成している測定流路溝により管状の測定流路が形成できる。
【００３２】
ここで、測定領域において測定流路溝が複数の分子パタンの延在方向に交差する状態としているので、測定流路は、基体主表面に形成されている生体分子検出用分子による短冊状の分子パタンに交差する状態となる。また、基体主表面には、各々異なる複数の生体分子検出用分子による短冊状の複数の分子パタンが形成されているため、測定流路には、各々異なる複数の生体分子検出用分子の領域（分子パタン）が、各々離間して配置された状態となる。このように、実施の形態によれば、流路内に、複数の生体分子検出用分子が各々離間して配置されている生体分子測定用チップがより容易に作製できるようになる。
【００３３】
以下、実施例を用いてより詳細に説明する。
【００３４】
［実施例１］
はじめに、実施例１について説明する。まず、図２Ａの斜視図に示すように、基体２０１を用意する。基体２０１の主表面の中央部に測定領域２０２を設ける。基体２０１は、ガラス（カバーガラス）から構成する。また、図示していないが、貼り合わせ字の位置合わせのための位置合わせマークを基体２０１の主表面に形成する。この後、基体２０１の主表面に酸素プラズマを照射して親水化処理を行った。次いで、酸化グラフェンが分散した水溶液を、スピンコート法を用いて塗布することで光学材料薄膜を形成した。酸化グラフェン分散溶液は、よく知られた合成法により作製することができる（非特許文献３参照）。
【００３５】
また、分散溶液を超音波処理することにより、酸化グラフェンの大きさは、数１００ｎｍ程度の小片に調整可能である。この塗布により、単層〜３層程度の酸化グラフェンの小片からなる層が均一に形成できる。また、分散溶液における酸化グラフェンの濃度は、０．０１〜１ｗｔ％程度とすればよい。酸化グラフェンは、良好な蛍光クエンチャーとして作用するため、蛍光消光および回復をシグナルに用いた蛍光センサの構築が可能である。また、酸化グラフェンは、１本鎖ＤＮＡからなるアプタマーを表面に比較的強く物理吸着する。よって、アプタマーを用いたセンサ素子の構築の良好なプラットホームとなりえる。
【００３６】
次に、ピレン酪酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレン酪酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を、酸化グラフェンを固定した基体２０１の表面に滴下し、室温で１時間静置し、酸化グラフェン表面に吸着させる。次いで、これらをジメチルホルムアミドで洗浄し、風乾する。ピレンは、酸化グラフェンと、後の工程で用いる生体分子検出用分子であるアプタマーを強固に固定するためのリンカー（接着分子）として機能する（非特許文献４参照）。
【００３７】
次に、ＰＤＭＳから検出部形成用基板２０３を形成する。検出部形成用基板２０３は、図２Ｂの平面図にも示すように、例えば、３つの流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６を備える。流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６は、測定領域２０２において、並列に配列されている。流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６は、例えば、幅８０μｍに形成し、深さ５００μｍに形成する。また、測定領域２０２を通る並列な箇所の長さは、１ｍｍとする。また、測定領域２０２を通る並列な箇所における流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６の配置間隔は、７０μｍとする。
【００３８】
また、流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６は、一端に検出部形成用基板２０３を貫通する孔部からなる導入口２０４ａ，２０５ａ，２０６ａを形成し、他端に検出部形成用基板２０３を貫通する孔部からなる排出口２０４ｂ，２０５ｂ，２０６ｂを形成する。導入口２０４ａ，２０５ａ，２０６ａおよび排出口２０４ｂ，２０５ｂ，２０６ｂは、各々流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６に連続して形成する。
【００３９】
また、流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６による検出部形成用流路において毛管現象を利用した送液がしやすいように、ＰＤＭＳに界面活性剤を導入して検出部形成用基板２０３を成型し、流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６における表面の親水性を向上させるようにしてもよい。
【００４０】
上述したように、基体２０１および検出部形成用基板２０３を用意したら、図２Ｃの斜視図に示すように、検出部形成用基板２０３を基体２０１に貼り付ける。検出部形成用基板２０３の流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６を形成した面に、基体２０１の主表面を当接させて密着すればよい。このとき、基体２０１の主表面に形成してある。位置合わせマークを基準とすることで、流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６の互いに平行に配列された領域が、測定領域２０２に配置されるように、両者を位置合わせする。
【００４１】
次に、貼り合わせることで形成される流路形成用溝２０４，流路形成用溝２０５，流路形成用溝２０６からなる各検出部形成用流路の各々に、生体分子検出用分子としてアプタマー構造を有する分子の水溶液を導入する。
【００４２】
ここで、アプタマー構造を有する生体分子検出用分子について説明する。アプタマー配列には、例えば、トロンビンに特異的に結合するものとして、５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’を用いることができる。アプタマーには、検出可能な信号変化を引き起こすシグナル材料として、３末端に色素分子（例えば６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＦＡＭ）を、５末端に結合部位としてアミノ基を導入しておく。５末端のアミノ基は、基体２０１の主表面に設けた酸化グラフェンに吸着させたピレン酪酸のＣＯＯＨ基と反応してペプチド結合を形成し、これを介してアプタマー構造を含む分子を酸化グラフェン表面に固定することができる。
【００４３】
アプタマー構造のＤＮＡ鎖は、酸化グラフェン表面に比較的強く物理吸着するため、３末端に結合した色素は、酸化グラフェン表面の近傍に配置されることになり、色素から蛍光が発生された場合、クエンチ（消光，減光）される。ところが、アプタマーが標的物質（トロンビン）に特異的に結合すると、酸化グラフェン表面との親和性を失い、酸化グラフェン表面から乖離する。このことにより、アプタマーの３末端に結合した色素も酸化グラフェン表面から遠ざかるため、消光されていた蛍光が距離に応じて回復する。この蛍光回復を標的物質検出のシグナルとして用いることが可能である。
【００４４】
ところで、アプタマーには、特異的結合機能を持たないスペーサを導入し、吸着した酸化グラフェンの表面と色素との距離を調節することができる。蛍光回復の度合いは、色素と酸化グラフェンの距離に依存するため、スペーサの導入により、標的物質検出の感度を向上させることが可能となる。例えば、導入するスペーサの状態が各々異なる複数のアプタマーを用い、これらスペーサ状態の違いによって異なる応答の、色素分子の劣化や経時変化の影響が除去された正味の差を、精度よく同時に比較測定できれば、様々な分析に応用可能となる。
【００４５】
実施例１では、スペーサを導入していない生体分子検出用分子Ａ、チミン１０塩基（Ｔ１０）をスペーサとして３末端と色素分子の間に導入した生体分子検出用分子Ｂ、および２０塩基（Ｔ２０）をスペーサとして３末端と色素分子の間に導入した生体分子検出用分子Ｃの３種類を合成し、用いた。
【００４６】
まず、生体分子検出用分子Ａの水溶液を導入口２０４ａから流路形成用溝２０４による検出部形成用流路に導入し、生体分子検出用分子Ｂの水溶液を導入口２０５ａから流路形成用溝２０５による検出部形成用流路に導入し、生体分子検出用分子Ｃの各々の水溶液を導入口２０６ａから流路形成用溝２０６による検出部形成用流路に導入した。各水溶液は、１００μＭの濃度に調整した。各溶液の導入には、マイクロピペットを用い、各検出部形成用流路における毛管現象を利用して約２μＬを使用した。
【００４７】
上述したように各溶液を各検出部形成用流路に導入した後、導入した溶液が各検出部形成用流路の内部で、基体２０１の主表面に固定されている酸化グラフェンに接触している状態を室温状態で６０分間維持した。このとき、検出部形成用流路内の溶液が乾燥しないように、導入口２０４ａ，２０５ａ，２０６ａおよび排出口２０４ｂ，２０５ｂ，２０６ｂを、ＰＤＭＳによる小片で塞いでおく。
【００４８】
以上のことにより、基体２０１の主表面に固定した酸化グラフェンの表面に、リンカー分子であるピレンとシグナル材料である色素分子の両者が結合されているアプタマーが固定される。
【００４９】
次いで、超純水を各検出部形成用流路に導入して排出することによる、超純水と各溶液との置換を数回繰り返す洗浄により、固定されなかった余剰の生体分子検出用分子を、基体２０１の表面から除去した。
【００５０】
次に、図２Ｄの斜視図に示すように、基体２０１より検出部形成用基板２０３を分離する。この分離は、ビーカー内に収容した超純水の中で洗浄しながら行った。これらの結果、図２Ｅの平面図にも示すように、基体２０１の主表面の測定領域２０２においては、各々が平行に配列された短冊状の分子パタン２１４，分子パタン２１５，分子パタン２１６が形成される。分子パタン２１４は、生体分子検出用分子Ａから構成され、分子パタン２１５は、生体分子検出用分子Ｂから構成され、分子パタン２１６は、生体分子検出用分子Ｃから構成されている。
【００５１】
次に、図２Ｆの斜視図に示すように、測定流路形成用基板２２１を、基体２０１の主表面に貼り付ける。測定流路形成用基板２２１には、測定流路溝２２２，２２３が形成されている。ここで、測定領域２０２において、測定流路溝２２２および測定流路溝２２３が、短冊状の分子パタン２１４，分子パタン２１５，分子パタン２１６が延在する方向に交差する状態で、測定流路形成用基板２２１を基体２０１の主表面に貼り合わせる。この貼り合わせにより、基体２０１の主表面上には、測定流路溝２２２，２２３からなる測定流路が形成される。
【００５２】
測定流路形成用基板２２１は、検出部形成用基板２０３と同様に、ＰＤＭＳから形成すればよい。測定流路溝２２２，２２３は、各々、幅３００μｍ、深さ５００μｍに形成する。また、測定領域２０２を通過する並列に配列された箇所の長さは、５ｍｍとする。また、測定流路溝２２２と測定流路溝２２３との間隔は７０μｍとする。
【００５３】
また、測定流路溝２２２，２２３は、一端に測定流路形成用基板２２１を貫通する孔部からなる導入口２２２ａ，２２３ａを形成し、他端に測定流路形成用基板２２１を貫通する孔部からなる排出口２２２ｂ，２２３ｂを形成する。導入口２２２ａ，２２３ａおよび排出口２２２ｂ，２２３ｂは、各々測定流路溝２２２，２２３に連続して形成する。
【００５４】
また、測定流路溝２２２，２２３による測定流路において毛管現象を利用した送液がしやすいように、ＰＤＭＳに界面活性剤を導入して測定流路形成用基板２２１を成型し、測定流路溝２２２，２２３における表面の親水性を向上させるようにしてもよい。なお、測定流路形成用基板２２１と基体２０１とは、エタノールで表面を洗浄したのちに酸素プラズマ処理をして密着させ、３０分室温で静置して、化学結合により貼り合わせた。
【００５５】
以上のことにより、３種類の生体分子検出用分子Ａ，生体分子検出用分子Ｂ，生体分子検出用分子Ｃによる異なる試料の比較測定が可能な生体分子検出用チップが得られる。この生体分子検出用チップでは、図２Ｇの平面図にも示すように、測定領域２０２において並列配置されている２つの測定流路溝２２２，２２３からなる各々の測定流路内で、流れの方向に、分子パタン２１４，分子パタン２１５，分子パタン２１６が、各々離間して配列された状態となる。
【００５６】
次に、上述した実施例１の生体分子測定用チップを用いた生体分子測定について説明する。以下では、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いる。まず、１００μｇ／ｍｌのトロンビン水溶液を導入口２２２ａに滴下し、超純水を導入口２２３ａに滴下し、毛管現象により、各々の測定流路に導入する。これらの２つの測定流路が並列配置された測定領域２０２が、共焦点レーザー蛍光顕微鏡の同一視野内に観測される位置において、酸化グラフェン表面の蛍光像を測定した。
【００５７】
トロンビン溶液を導入した測定流路溝２２２による測定流路の内部では、アプタマーを固定した分子パタン部分のみで蛍光強度の増加が観測された。これは、アプタマーとトロンビンが選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに修飾されているＦＡＭが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に遠い距離に移動して発光したためである。また、この蛍光回復強度は、導入されているスペーサによって異なり、より長いスペーサ分子を導入したアプタマーによる分子パタンの部分（分子パタン２１６）ほど、強い蛍光が観測された。
【００５８】
一般的に、レーザーを照射したことにより発生する色素分子からの蛍光強度の絶対値は、色素分子の劣化や経時変化の影響が含まれるため、定量的比較が困難である。しかしながら、上述した実施例１による生体分子測定用チップでは、スペーサの状態が各々異なる複数の生体分子検出用分子のパタンが、同じ流路内に配置されて同時に測定できるので、上述したような様々な影響を抑制し、各々の応答の差を精度よく比較することが可能となる。
【００５９】
ところで、超純水を導入した測定流路溝２２３による測定流路の内部では、アプタマーを固定した分子パタンの部分も、これ以外の部分（バックグラウンド）も、蛍光はほとんど観測されなかった。これは、アプタマーの立体構造が変化せずに色素分子と酸化グラフェンの距離が近いため、色素分子の蛍光が酸化グラフェンによって消光されていることを示している。このように、同じ生体分子検出用分子に対する２つの応答信号の差を精度よく比較することも可能となる。上述した実施例１の場合、超純水を導入した測定流路からの応答信号を、参照信号とすることができる。
【００６０】
以上に説明したように、実施例１によれば、基板表面の異なる所望の位置に生体分子検出用分子を固定した生体分子検出用チップが、生体分子に機械的な負荷をかけず、貴重な生体分子検出用分子の使用溶液の必要量も少なく、大型装置を必要とせず、簡便に製造できるようになる。また、この生体分子検出用チップを用いれば、極微量の試料から、異なる化学反応を、色素分子の劣化や経時変化の影響を抑制し、正味の応答の差を精度よく同時に比較測定することができる。
【００６１】
［実施例２］
次に、実施例２について、説明する。実施例２においても、実施例１と同様にすることで、生体分子測定用チップを製造する。ただし、実施例２では、生体分子検出用分子として、トロンビンに特異的に結合するアプタマー配列を有する核酸（５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’）、前立腺特異抗原に結合するアプタマー配列を有する核酸（５’−ｔｔｔＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣｔｔｔ−３’）、および特異的に結合する分子がない核酸の３種類を用いる。また、これらは、リン酸緩衝液溶液として各検出部形成用流路に導入した。
【００６２】
上述した核酸分子には、検出可能な信号変化を引き起こすシグナル材料として、３末端に色素分子（例えば６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＦＡＭ）を導入し、５末端には結合部位としてアミノ基を導入しておく。
【００６３】
実施例２では、上述した生体分子検出用分子を用い、トロンビンおよび前立腺特異抗原に対するアプタマーによる反応の比較測定が可能な生体分子検出用チップを得た。
【００６４】
次に、上述した実施例２の生体分子測定用チップを用いた生体分子測定について説明する。以下でも、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いる。まず、１００μｇ／ｍｌのトロンビン水溶液を導入口２２２ａに滴下し、１００μｇ／ｍｌの前立腺特異抗原水溶液を導入口２２３ａに滴下し、毛管現象により、各々の測定流路に導入する。これらの２つの測定流路が並列配置された測定領域２０２が、共焦点レーザー蛍光顕微鏡の同一視野内に観測される位置において、酸化グラフェン表面の蛍光像を測定した。
【００６５】
トロンビン水溶液を導入した測定流路溝２２２による測定流路の内部では、トロンビンアプタマーを固定した分子パタン部分のみで蛍光強度の増加が観測された。一方、前立腺特異抗原水溶液を導入した測定流路溝２２３による測定流路の内部では、前立腺特異抗原アプタマーを固定した分子パタン部分のみで蛍光強度の増加が観測された。
【００６６】
これらに対し、特異的に結合する分子がない核酸を固定した分子パタン部分では、測定流路溝２２２による測定流路および測定流路溝２２３による測定流路の両者で、蛍光はほとんど観測されなかった。
以上の結果は、それぞれトロンビンおよび前立腺特異抗原に対するアプタマーと標的のタンパク質が選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに修飾されているＦＡＭが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に遠い距離に移動して発光したためである。
【００６７】
一方、特異的に結合する分子がない核酸を固定した分子パタン部分および、特異的に結合するタンパク質とアプタマーの組み合わせが異なる分子パタン部分では、２つの測定流路ともに蛍光はほとんど観測されなかった。これは、各核酸に対してはトロンビンも前立腺特異抗原も結合しないため、アプタマーの立体構造変化が起こらず、色素分子の蛍光が酸化グラフェンによって消光されたままであることを示している。  
【００６８】
上述したように、実施例２によれば、異なる２種類の試料溶液における、同じ生体分子検出用分子に対する応答信号を、精度よく比較することができることが分かる。
【００６９】
以上に説明したように、本発明によれば、流路形成用溝を用いて基体の主表面に形成した短冊状の複数の分子パタンに対し、分子パタンの延在方向に交差する状態で測定流路溝が配置されるように、測定流路形成用基板を基体の主表面に貼り付けるようにしたので、生体分子測定用チップがより容易に作製できるようになる。
【００７０】
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、シグナル分子や接着分子が結合しているアプタマーの端部に、更に、核酸やペプチドが配列した分子が結合していてもよい。
【００７１】
また、接着分子としては、ピレン酪酸やピレンブタジエン酸などピレンが骨格に含まれているもや、ベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）などを用いることができる。また、接着分子をアプタマーと結合させる官能基（分子）は、ブタジエン酸や、「−ＣＯＯＨ」および「−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ」がある。なお、ｎは、好ましくは２〜１０の範囲がよい。
【符号の説明】
【００７２】
２０１…基体、２０２…測定領域、２０３…検出部形成用基板、２０４，２０５，２０６…流路形成用溝、２０４ａ，２０５ａ，２０６ａ…導入口、２０４ｂ，２０５ｂ，２０６ｂ…排出口、２１４，２１５，２１６…分子パタン。
【図１】
2014157064.tif 000003
【図２Ａ】
2014157064.tif 000004
【図２Ｂ】
2014157064.tif 000005
【図２Ｃ】
2014157064.tif 000006
【図２Ｅ】
2014157064.tif 000007
【図２Ｇ】
2014157064.tif 000008
【図２Ｄ】
2014157064.tif 000009
【図２Ｆ】
2014157064.tif 000010