(57)【要約】【課題】細胞周辺の明るさが様々な状態において、一細胞中における細胞内のカルシウム濃度を測定できる光受容体の光応答解析方法を提供する。【解決手段】ステップＳ１において、光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む細胞を作製する。ステップＳ２において、細胞からの発光を促して発光画像を撮像する。ステップＳ３において、細胞からの蛍光を促して蛍光画像を撮像する。ステップＳ４において、光照射のタイミングであると判定されたとき、ステップＳ５において、細胞に照射光を照射する。ステップＳ６において、撮像終了でないと判定されたとき、繰り返し発光画像と蛍光画像との撮像を行う。撮像終了後、ステップＳ７において、発光画像及び蛍光画像に基づいて、光照射に対する細胞におけるカルシウム濃度の変化を解析する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む対象細胞を作製することと、
前記対象細胞からの発光を促して前記対象細胞の発光画像を繰り返し撮像することと、
前記対象細胞からの蛍光を促して前記対象細胞の蛍光画像を繰り返し撮像することと、
少なくとも１回の前記対象細胞に照射光を照射することと、
繰り返し取得した前記発光画像及び前記蛍光画像に基づいて、前記対象細胞におけるカルシウムの濃度を解析することと、
を具備する光受容体の光応答解析方法。
【請求項２】
前記光受容体遺伝子は、ヒトのオプシン５遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発光レポーターは、発光タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発光レポーターは、円順列置換したルシフェラーゼ、カルモジュリン、及びＭ１３ペプチドを含む改変タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発光を促すことは、発光基質を添加することである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光レポーターは、蛍光物質である、請求項１乃至５のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光画像の撮像において、５００乃至７００ｎｍの波長を含む励起光を照射することにより前記蛍光を促す請求項１乃至６のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光画像の撮像において、５４０乃至６００ｎｍの波長を含む励起光を照射することにより前記蛍光を促す請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発光画像の撮像及び前記蛍光画像の撮像には、発光顕微鏡が用いられる請求項１乃至８のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光画像の撮像及び前記蛍光画像の撮像は連続的に行われる、請求項１乃至９のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記照射光の波長は、３４０乃至６００ｎｍである、請求項１乃至１０のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記照射光の波長は、３６０乃至４００ｎｍである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記照射光の強度は、
前記発光画像の取得時には、０．１乃至１０００μＷ／ｍｍ２であり、
前記蛍光画像の取得時には、１乃至１００ｍＷ／ｍｍ２である、
請求項１乃至１２のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記照射光の強度は、
前記発光画像の取得時には、０．３乃至３．０μＷ／ｍｍ２であり、
前記蛍光画像の取得時には、３乃至３０ｍＷ／ｍｍ２である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カルシウムの濃度の解析は、前記発光画像の輝度及び前記蛍光画像の輝度に基づいて行われる、請求項１乃至１４のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象細胞の明視野画像を撮像することをさらに具備し、
カルシウムの濃度の解析において、前記発光画像及び／又は前記蛍光画像を前記明視野画像に重ね合わせることで、前記発光及び／又は前記蛍光を発している前記対象細胞を同定する、
請求項１乃至１５のうち何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光受容体の光応答解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化に伴って中高年の視力障害によるＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）の低下が社会問題となっている。視力低下の一因として「加齢黄斑変性症」と呼ばれる網膜変性症や、「糖尿病性網膜症」、「網膜色素性変性症」等の視力に影響する網膜疾患が挙げられる。網膜には、明るいところで働く錐体視細胞や暗いところで働く桿体視細胞といった光受容細胞が多く分布している。これらの光受容細胞が機能的に障害を受けると、視力の低下や視野の欠損等の疾患が引き起こされる。これらのことから、網膜の機能を客観的に正しく評価することは、網膜疾患の早期発見や失明予防に重要であると考えられている。
【０００３】
眼科診療では、視力検査や視野検査等によって自覚的な視機能が測定されている。また、光刺激に対して生じる電気的な反応を捉える網膜電図等により網膜の機能が客観的に測定されている。さらに近年、網膜の機能的分布を客観的かつ非侵襲的にイメージングする網膜内因性信号計測法が開発され、臨床応用に向けた研究が進められている。このイメージング法の測定原理は以下である。すなわち、網膜をＣＣＤカメラ又は光干渉断層計（ＯＣＴ）で一定時間観察する。この観察の間に網膜に光刺激を与える。光刺激を与える前後における網膜の画像を比較して、明るさが変化している部分を神経活動の起きた領域とする。
【０００４】
しかしながら、この測定法には、視細胞に由来するとされる信号の起源が全て理解されていないという課題がある。現在のところ、この信号の起源は、神経活動にともなう細胞構造の微小変化や神経活動にともなう局所ヘモグロビン濃度変化などであると考えられているが不明な点も多い。この信号の起源を詳細に解析するために、光受容に関する神経活動を細胞レベルで捉える技術が必要とされている。
【０００５】
視細胞などの光受容細胞において、光刺激を細胞内に伝達する際に「オプシン」と呼ばれる光受容体タンパク質を介して行われる分子機構が知られている。オプシンについては、様々な生物でホモログが見つかっている。細胞内における情報伝達機構も種によって異なることが知られている。哺乳類のオプシンに係る分子機構では、Ｇタンパク質を介して細胞内の情報伝達が行われることが知られている。すなわち、光受容細胞への光刺激により細胞内のｃＡＭＰやｃＧＭＰやカルシウムイオン等のセカンドメッセンジャーの濃度が変化することが知られている。哺乳類オプシンのこれらの性質を利用して、これまでに光受容細胞の光応答を解析する技術が開示されている。
【０００６】
例えば非特許文献１は、オプシン５タンパク質とＧタンパク質とを混合し、光を当てたときのＧタンパク質とＧＴＰγＳとの結合量の測定について開示している。この測定は、オプシン５タンパク質の活性化を測定するものである。
【０００７】
例えば非特許文献２は、オプシン５タンパク質及びＣａ２＋−Ｃｌ−チャネルタンパク質を有するアフリカツメガエルの卵母細胞を利用して、光を照射したときの細胞膜電位の変化の測定について開示している。この測定は、個々の卵母細胞においてオプシン５タンパク質の活性化を測定するものである。
【０００８】
例えば非特許文献３は、オプシン４タンパク質を有する細胞及び蛍光カルシウムセンサーを利用して、光を照射したときの細胞内カルシウム濃度変化の測定について開示している。この測定は、組織又は個々の細胞においてオプシン４タンパク質の活性化を測定するものである。
【０００９】
例えば特許文献１は、オプシン５タンパク質及びカルシウム発光レポーターを発現させた細胞を利用して、紫外光を照射したときの細胞内カルシウム濃度の変化の測定について開示している。この測定は、組織又は細胞において紫外光の照射量を細胞レベルで測定するものである。
【００１０】
上述のようにオプシンについては様々な解析が行われている。しかしながら、例えば非特許文献１においては、生体組織や生細胞においてＧタンパク質とＧＴＰγＳとの結合量を測定することについて考慮されていない。すなわち、生きている組織や細胞におけるＧタンパク質とＧＴＰγＳとの結合量の測定には対応されていない。
【００１１】
非特許文献２においては、生体組織等の多数・多種類の細胞について光を照射したときの細胞膜電位の変化の測定について考慮されていない。すなわち、卵母細胞以外の多数・多種類の細胞についての測定には対応されていない。
【００１２】
非特許文献３においては、青色光を吸収するオプシンが用いられている。このため、青色以外の波長域に吸収を持つオプシンを用いた細胞内カルシウム濃度変化の測定については考慮されていない。すなわち、多様な波長域での光刺激を用いたオプシン活性化の測定には対応されていない。
【００１３】
特許文献１においては、微弱光を撮像する方法が用いられている。このため、明るい環境において細胞内のカルシウム濃度の変化を測定することについて考慮されていない。すなわち、明るい環境下において光刺激を用いたカルシウム測定には対応されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２０１２−１９６１８３号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，"Ｏｐｎ５  ｉｓ  ａ  ＵＶ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｂｉｓｔａｂｌｅ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｉ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．"，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  ｖｏｌ．１０７，  Ｎｏ．５１，  ｐｐ．２２０８４−２２０８９．
【非特許文献２】Ｎａｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，"Ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｐｓｉｎ  （Ｏｐｓｉｎ５）  ｉｓ  ａ  ｄｅｅｐ  ｂｒａｉｎ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｂｉｒｄｓ．"，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，  ｖｏｌ．１０７，  Ｎｏ．３４，  ｐｐ．１５２６４−１５２６８．
【非特許文献３】Ｈａｒｔｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，"Ｌｉｇｈｔ−ｅｖｏｋｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｅｌａｎｏｐｓｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ．"，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．４９，ｐｐ．１３４６８−１３４８０．
【非特許文献４】Ｋａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，"Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃａ２＋  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｐｒｉｔ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．"  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ１４０５−１４０８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述のように、多数・多種類の生きている組織・細胞において、様々な波長域及び光強度を有する光による刺激を行ったときの、一細胞中における細胞内のカルシウム濃度を、細胞周辺の明るさが様々な状態において測定する光受容体の光応答解析方法が求められている。
【００１７】
本発明は、細胞周辺の明るさが様々な状態において、一細胞中における細胞内のカルシウム濃度を測定できる光受容体の光応答解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、光受容体の光応答解析方法は、光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む対象細胞を作製することと、前記対象細胞からの発光を促して前記対象細胞の発光画像を繰り返し撮像することと、前記対象細胞からの蛍光を促して前記対象細胞の蛍光画像を繰り返し撮像することと、少なくとも１回の前記対象細胞に照射光を照射することと、繰り返し取得した前記発光画像及び前記蛍光画像に基づいて、前記対象細胞におけるカルシウムの濃度を解析することと、を具備する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞周辺の明るさが様々な状態において、一細胞中における細胞内のカルシウム濃度を測定できる光受容体の光応答解析方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】一実施形態に係る光受容体の光応答解析方法の概略を示すフローチャート。
【図２】発光レポーターとしてのカルシウム感受性発光タンパク質の一例の概略を示す図。
【図３】光受容体遺伝子と発光レポーターの遺伝子とが導入された細胞の模式図。
【図４】イメージングシステムの構成例の概略を示す図。
【図５】光刺激前の細胞の発光画像の一例を示す図。
【図６】光刺激後の細胞の発光画像の一例を示す図。
【図７】細胞の発光輝度の継時変化の一例を示す図。
【図８】光刺激前のＦｌｕｏ−４を添加した細胞の蛍光画像の一例を示す図。
【図９】光刺激後のＦｌｕｏ−４を添加した細胞の蛍光画像の一例を示す図。
【図１０】Ｆｌｕｏ−４を添加した細胞の蛍光輝度の継時変化の一例を示す図。
【図１１】光刺激前のＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅを添加した細胞の蛍光画像の一例を示す図。
【図１２】光刺激後のＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅを添加した細胞の蛍光画像の一例を示す図。
【図１３】Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅを添加した細胞の蛍光輝度の継時変化の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［第１の実施形態］
本発明の第１の実施形態について図面を参照して説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。本実施形態に係る光受容体の光応答解析方法の概略を図１に示す。ステップＳ１において、光を感知する光受容体遺伝子と、カルシウムを感知する発光レポーターと、カルシウムを感知する蛍光レポーターとを含む細胞が調製される。
【００２２】
光受容体の一例として、例えば視細胞等の光受容細胞に存在する光受容タンパク質であるオプシンが挙げられる。オプシンには、例えばヒトのオプシン５が含まれる。また、オプシンにはオプシン４が含まれる。また、オプシンには、これらの例えばヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、微生物といった任意の動物種の対応物も含まれる。したがって、光受容体遺伝子の一例として、オプシン５といったオプシンの遺伝子が挙げられる。
【００２３】
例えばヒトのオプシン５は、光を吸収して細胞内カルシウム濃度を上昇させる。このため、オプシン５が発現している細胞に光が照射されたとき、細胞内カルシウム濃度は上昇する。本実施形態では、このカルシウム濃度の変化をカルシウム感受性発光タンパク質の発光強度、又はカルシウム感受性蛍光色素の蛍光強度の変化を検出することで、光照射による細胞応答を測定する。
【００２４】
発光レポーターの一例として、ホタルルシフェラーゼやレニラルシフェラーゼ等のルシフェラーゼが挙げられる。また、発光レポーターには、イクオリン、オベリン等の発光タンパク質も含まれる。
【００２５】
カルシウムを感知する発光レポーターとしてのカルシウム感受性発光タンパク質は、カルシウムイオンと相互作用を起こして発光強度を強めたり、弱めたりするタンパク質である。カルシウム感受性発光タンパク質の一例として、円順列置換したホタルルシフェラーゼ、カルモジュリン、及びＭ１３ペプチドを含む改変タンパク質が挙げられる。このカルシウム感受性発光タンパク質を用いたスプリットルシフェラーゼアッセイ法を用いたカルシウムの検出原理の一例について説明する。このスプリットルシフェラーゼアッセイ法については、例えば特表２００９−５３２０６３号公報に開示されている。スプリットルシフェラーゼアッセイ法は、例えば、タンパク質間相互作用の検出や、タンパク質の細胞内小器官移行の検出等に用いられている。
【００２６】
スプリットルシフェラーゼアッセイ法を用いたカルシウムの検出原理について図２を参照して簡単に説明する。スプリットルシフェラーゼアッセイ法では、ホタルルシフェラーゼやレニラルシフェラーゼ等のルシフェラーゼを特定の位置で分割して発光酵素活性（生物発光能）を失活させたフラグメント（断片）であるＮ末端側断片（ＮＬｕｃ）とＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）とが用いられる。
【００２７】
Ｎ末端側断片（ＮＬｕｃ）とＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）とを再構成させて発光酵素活性を回復させるために、例えばカルシウム結合タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）１０３、及びカルモジュリンと可逆的に結合又は解離できるＭ１３ペプチド１０４が用いられる。例えば図２に示されるように、Ｎ末端側断片（ＮＬｕｃ）１０１と、Ｍ１３ペプチド１０４と、カルモジュリン（ＣａＭ）１０３と、Ｃ末端側断片（ＣＬｕｃ）１０２とが接続された融合タンパク質が細胞内で発現した場合を考える。細胞内のカルシウムイオンがカルモジュリン（ＣａＭ）１０３に結合していないとき、発光酵素であるルシフェラーゼのＮ末端側断片（ＮＬｕｃ）１０１とＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）１０２とは再構成して発光酵素活性が回復する。一方、細胞内のカルシウムイオンがカルモジュリン（ＣａＭ）１０３と結合すると、カルモジュリン（ＣａＭ）１０３の立体構造が変化する。このとき、ルシフェラーゼのＮ末端側断片（ＮＬｕｃ）１０１とＣ末端側断片（ＣＬｕｃ）１０２とは解離し、発光酵素活性が消失する。したがって、この融合タンパク質が発現している細胞についてルシフェリン存在下で発光強度を測定すると、細胞内でのカルシウム濃度に応じた発光シグナルの増減が検出され得る。この発光強度に基づいて、細胞内のカルシウム濃度が解析され得る。
【００２８】
上述のようなカルシウムを感知する発光レポーターを細胞に導入するため、例えばＮＬｕｃと、Ｍ１３と、ＣａＭと、ＣＬｕｃとが接続された融合タンパク質の遺伝子が、細胞に導入される。
【００２９】
なお、上述の説明では、カルシウムイオンの濃度が低いとき、ルシフェラーゼの活性が回復し、カルシウムイオンの濃度が高いとき、ルシフェラーゼの活性が消失する例を示した。しかしながらこれに限らず、発光レポーターは、カルシウムイオンの濃度が高いとき、ルシフェラーゼの活性が回復し、カルシウムイオンの濃度が低いとき、ルシフェラーゼの活性が消失するように構成されていてもよい。
【００３０】
光受容体遺伝子や発光レポーターの遺伝子のコドンは、対象とする細胞における発現に最適化されていてもよい。また、Ｋｏｚａｋ配列等、発現量を上昇させるための配列を含んでよいし、付与されていてもよい。ベクターは、対象とする細胞における発現のための発現ベクターであってもよい。発現ベクターである場合、光受容体遺伝子や発光レポーターの遺伝子の配列のほかに、発現を制御するための配列、マーカー遺伝子の配列等、一般的な発現ベクターに含まれる配列を含んでいてもよい。
【００３１】
光受容体遺伝子や発光レポーターの遺伝子を細胞へ導入する方法として、塩化カルシウム法若しくは塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法等が用いられ得る。本実施形態で使用される遺伝子が導入された細胞は、一過性発現細胞と安定発現細胞との何れでもよい。
【００３２】
光受容体遺伝子と、発光レポーターの遺伝子とが導入された細胞の模式図を図３に示す。この図に示されるように、遺伝子が導入された細胞２０３において、光受容体２０１と発光レポーター２０２とが発現する。本実施形態では、このような細胞２０３が用いられる。
【００３３】
別の方法は、細胞外で精製したタンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によってタンパク質を細胞内に直接注入することができる。あるいは、タンパク質を含む培養液を用いて細胞をインキュベートし、エンドサイトーシスによってタンパク質を細胞に取り込ませることもできる。
【００３４】
カルシウムを感知する蛍光レポーターは、カルシウムイオンと相互作用を起こして蛍光強度を強めたり、弱めたりする色素である。このような蛍光カルシウム感受性色素の一例として、Ｆｌｕｏ−４、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｆｕｒａ−ｒｅｄ等が挙げられる。
【００３５】
対象となる細胞の種類に限定はなく、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞及び動物細胞等が使用され得る。動物細胞が使用される場合、特に哺乳細胞が使用され、例えばマウスの細胞、サルの細胞及びヒトの細胞が使用される。細胞は、生きた状態で用いられ得る。細胞の由来が多細胞生物である場合、細胞は、組織から単離した細胞でもよいし、株化した単一の細胞でもよいし、複数の細胞の集合体でもよい。細胞の集合体とは、例えば、組織、個体等である。細胞の集合体を測定対象とする場合、その集合体全体を測定対象としてもよいし、その集合体に含まれる特定の細胞のみを測定対象としてもよい。
【００３６】
ステップＳ２において、ステップＳ１で調整された細胞の発光画像の取得が行われる。この撮像のため、発光が促される。すなわち、例えば発光レポーターとしてホタルルシフェラーゼが用いられている場合、発光基質であるルシフェリンが添加される。勿論この発光基質の添加は撮像の度に行われる必要はなく、一連の複数回の撮像を開始する前に一度添加されるだけでもよい。また、レニラルシフェラーゼが用いられるとき、発光基質としてセレンテラジンが用いられ得る。細胞において発光が生じる状態において、例えば発光顕微鏡を用いて、細胞の発光状態の撮像が行われる。
【００３７】
発光基質を添加する方法には特別な限定はなく、適宜に選択され得る。例えば、細胞を含む培養液に添加することで、培養液を介して細胞に発光基質を取り込ませることができる。また、マイクロインジェクション法等を利用して、発光基質を細胞内に直接注入することもできる。さらには、測定する細胞が組織又は個体に含まれる細胞である場合には、血液又は体液に発光基質を添加し、血液循環又は体液循環を利用して、対象とする細胞に対して送達させることもできる。
【００３８】
オプシンはレチナールと結合した状態で応答特性を有する波長範囲に当てはまる光を受けると活性化する。したがって、レチナールの産生が少ない細胞を用いる場合、レチナール添加工程を設けることが好ましい。特に、紫外光感受性タンパク質としてオプシン５を用いる場合、１１−ｃｉｓ−レチナールを添加することが好ましい。ここにいう添加とは、細胞を含む培養液に添加すること、マイクロインジェクション法等を利用して細胞内に直接注入すること、血液又は体液に添加して、血液循環又は体液循環を介して細胞に送達すること等を含む。また、添加のタイミングも適宜に選択され得る。
【００３９】
ステップＳ３において、ステップＳ１で調整された細胞の蛍光画像の取得が行われる。この撮像のため、蛍光が促されるように、細胞への励起光の照射が行われる。例えば顕微鏡を用いて、励起光が照射された状態で細胞から発せられる蛍光の状態が撮像される。励起光の波長は、例えば５００乃至７００ｎｍである。また、励起光の波長は、好ましくは５４０乃至６００ｎｍである。
【００４０】
ステップＳ４において、細胞に光刺激を与えるために、細胞に光を照射するタイミングであるか否かを判定する。光を照射するタイミングであるとき、ステップＳ５において細胞への光照射が行われる。この光照射で照射される光の波長は、例えば３４０乃至６００ｎｍである。また、この照射光の波長は、好ましくは３６０乃至４００ｎｍである。また、発光画像に対して照射光が影響しないように、発光画像の取得時には照射光の強度は、例えば０．１乃至１０００μＷ／ｍｍ２とする。この照射光強度は、好ましくは０．３乃至３．０μＷ／ｍｍ２とする。一方、蛍光画像に対して照射光が影響しないように、蛍光画像の取得時には照射光の強度は、例えば１乃至１００ｍＷ／ｍｍ２とする。この照射光強度は、好ましくは３乃至３０ｍＷ／ｍｍ２とする。光照射の長さ、回数及びタイミングは任意に設定され得る。
【００４１】
一方、ステップＳ５の判定で光を照射するタイミングでないと判定されたとき、光照射が行われずに処理はステップＳ６に進む。ステップＳ６において、撮像終了であるか否かが判定される。撮影終了でないとき、処理はステップＳ２に戻り、発光画像及び蛍光画像の取得が行われる。すなわち、発光画像の撮像及び蛍光画像の撮像は連続的に行われる。一方、撮像終了であると判定されたとき、ステップＳ７において、取得された発光画像及び蛍光画像に基づいて、解析が行われる。この解析においては、取得された発光画像の輝度及び蛍光画像の輝度に基づいてカルシウムイオンの濃度が算出される。
【００４２】
さらに、細胞の明視野画像が取得されてもよい。発光画像及び／又は蛍光画像を取得した明視野画像に重畳することで、発光及び／又は蛍光を発している細胞を明視野画像において同定することができる。
【００４３】
図４は、本実施形態で用いられるイメージングシステム３００の構成の概略を示す。このイメージングシステム３００は、上述のステップＳ２乃至ステップＳ６における発光画像及び蛍光画像の取得に用いられる。また、イメージングシステム３００は、明視野画像を取得してもよい。この図に示されるように、イメージングシステム３００は、細胞３０１を収容するための容器３０３と、光刺激を与えるための照明３０２と、光学系３０４と、撮像装置３０５とが、図示せぬハウジング内に遮光状態で収容されていると共に、解析装置３０６と電気的に接続した構成となっている。容器３０３は、例えばシャーレやマルチプレート等である。容器３０３として、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体等も用いられ得る。容器３０３は、細胞が臓器又はマウス等の非ヒト個体のような生体関連の検体である場合には、検体自身を任意の保持手段で保持する支持部材であってもよい。光学系３０４には、例えば顕微鏡が用いられる。光学系３０４は、細胞３０１の拡大画像を撮像装置３０５の撮像面に結像させる。また、光学系３０４は、蛍光画像を取得するために、励起光を細胞３０１に照射する。また、撮像装置３０５は、励起光と蛍光とを分離するフィルタやダイクロイックミラー等を含み得る。撮像装置３０５は、例えば顕微鏡に設けられたデジタルカメラである。撮像装置３０５は、光学系３０４の対物レンズを介して、細胞３０１の蛍光イメージや発光イメージを撮像し記録することができる。容器解析装置３０６は、撮像装置３０５と有線又は無線で通信可能に接続されている。解析装置３０６は、撮像装置３０５で取得された画像の解析を行う。解析装置３０６は、例えばパーソナルコンピュータである。図４においては、撮像装置３０５は、細胞の下に配置されているが、細胞の上に配置されてもよいことは勿論である。また、照明３０２は、明視野画像を取得する際の照明光を兼ねてもよく、光刺激専用のレーザ光であってよい。なお、イメージングシステム３００は、発光画像及び蛍光画像を取得し、各発光・蛍光画像を繰り返し撮像し、かつこれら複合的な画像を解析するための構成要素を具備していればよく、本出願人による国際公開特許２００６／１０６８８２号を参照して種々変更等することが可能である。
【００４４】
細胞３０１の発光又は蛍光は、光学系３０４で拡大されるので、個々の細胞３０１における発光又は蛍光が観察され得る。本実施形態に係るイメージングシステム３００では、撮像装置３０５が発光画像及び蛍光画像を繰り返し撮像し、その画像を解析装置３０６が繰り返し取り込む。したがって、イメージングシステム３００によれば、同一視野において撮像を繰り返し撮像できる。すなわち、同一視野において、連続的に細胞が観察される。その結果、複数の発光画像及び蛍光画像による同一細胞における時空間的な解析ができる。また、明視野画像も同一視野で撮像することにより、細胞内外における発光及び／又は蛍光の分布をより正確に把握することができる。また、複数の異なる細胞について同時に撮像を行い、複数の細胞に係る発光画像及び蛍光画像を細胞ごとに照合しながら解析を行うので、個々の細胞におけるカルシウム濃度変化を時空間的に解析できる。
【００４５】
本実施形態では、１１−ｃｉｓ−レチナールと結合したオプシン５遺伝子を有する細胞に光が当たると、オプシン５の活性化がおこり、細胞内のカルシウムストアからのカルシウム動員がおこる。細胞質のカルシウム濃度が変化すると、細胞内に存在するカルシウム感受性発光タンパク質の発光酵素活性が回復又は消失して検出可能なシグナルが発生又は消失する。したがって、ルシフェリン存在下で発光強度を測定すれば、光の照射による細胞内でのカルシウム濃度を解析できる。また、細胞質のカルシウム濃度が変化すると、細胞内に存在するカルシウム感受性蛍光物質による蛍光の強度が変化する。したがって、この蛍光の強度を測定すれば、光の照射による細胞内でのカルシウム濃度を解析できる。
【００４６】
本実施形態によれば、細胞周囲が暗い状態において撮像される発光画像と、周囲が明るい状態で撮像される蛍光画像とを組み合わせることによって、周囲の明るさが様々な状態で光受容体による光応答に基づくカルシウムイオン濃度の変化を継時的にかつ定量的に解析することができる。解析はイメージングに基づくため、個別の細胞ごとの変化を解析できる。
【実施例】
【００４７】
本発明の実施例においては、ヒトのオプシン５と、特開２０１２−０５１８２４号公報に記載のカルシウム感受性発光タンパク質と、蛍光カルシウム感受性色素とを有する細胞を用いた実施例について説明する。
【００４８】
［ヒトのオプシン５遺伝子の動物細胞発現用プラスミドの作製］
ヒト由来のオプシン５遺伝子の全長を合成し、その端部にＢａｍＨＩ制限酵素サイトとＥｃｏＲＩ制限酵素サイトとを設けた。このオプシン５遺伝子を、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に挿入し、動物細胞発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ＯＰＮ５を作製した。
【００４９】
［カルシウム感受性発光タンパク質発現用プラスミドの作製］
特開２０１２−０５１８２４号公報に記載された方法で、カルシウム感受性発光タンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを作製した。ｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎの作製方法を簡単に説明する。
【００５０】
前準備として、ホタルルシフェラーゼのＮ末端側断片遺伝子及びＣ末端側断片遺伝子のクローニングを行った。また、カルモジュリン（ＣａＭ）遺伝子及びＭ１３遺伝子のクローニングを行った。これら遺伝子に基づいて、カルシウムセンサータンパク質発現プラスミドの作製を行った。
【００５１】
ホタルルシフェラーゼの各断片のクローニングのための、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いる合成オリゴＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を以下に示す配列で調製した。調製したオリゴＤＮＡは、円順列置換してセンサータンパク質内に配置するためのＮ末側断片（ｃｐＮＬｕｃ）遺伝子及びＣ末側断片（ｃｐＣＬｕｃ）遺伝子である。
［ｃｐＮＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号１）：５´−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＡＧ−３´
ｃｐＮＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号２）：５´−ＣＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＣ−３´
［ｃｐＣＬｕｃ遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｆｗ（配列番号３）：５´−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＴＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣ−３´
ｃｐＣＬｕｃ＿Ｒｖ（配列番号４）：５´−ＣＡＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴ−３´
また、カルモジュリン（ＣａＭ）及びＭ１３のクローニングのための、ＰＣＲに用いる合成オリゴＤＮＡを以下に示す配列で調製した。
［ＣａＭ−Ｍ１３遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列］
ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｆｗ（配列番号５）：５´−ＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧ−３´
ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｒｖ（配列番号６）：５´−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴ−３´
鋳型としてｐＧＬ４．１０（プロメガ（株）製）を用いて、ホタルルシフェラーゼの各断片をＰＣＲによりクローニングした。配列番号１及び配列番号２のオリゴＤＮＡを用いて円順列置換センサータンパク質用のＮ末端側断片遺伝子（ｃｐＮＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の１番目から４１６番目のアミノ酸を含む）を増幅した。また、配列番号３及び配列番号４のオリゴＤＮＡを用いて円順列置換センサータンパク質用のＣ末端側断片遺伝子（ｃｐＣＬｕｃ：ＧＬ４．１０遺伝子の３９９番目から５５０番目のアミノ酸を含む）を増幅した。
【００５２】
また、鋳型として、非特許文献１に記載のカメレオン遺伝子（ＹＣ２．１）のｃＤＮＡを用いて、カルモジュリン（ＣａＭ）及びＭ１３をＰＣＲによりクローニングした。配列番号５及び配列番号６のオリゴＤＮＡをプライマーとして用いてＣａＭ−Ｍ１３遺伝子（カメレオン遺伝子の２３０番目から４０６番目のアミノ酸配列に対応する領域を含む）を増幅した。
【００５３】
上記の通り増幅した各遺伝子を発現用プラスミドに挿入することで、カルシウムセンサータンパク質発現用プラスミドを作製した。具体的には、動物細胞発現用プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に、発光酵素の断片としてｃｐＮＬｕｃ遺伝子及びｃｐＣＬｕｃ遺伝子を、カルシウム結合領域及び相互作用領域としてＣａＭ−Ｍ１３遺伝子をそれぞれ挿入し、プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを作製した。
【００５４】
［測定１：光照射によるカルシウム濃度変動の発光イメージング］
ＨＥＫ２９３細胞における光照射によるカルシウム濃度変動の発光イメージングについて説明する。
【００５５】
（手順１：ＨＥＫ２９３細胞の培養）
ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣ社より入手した。ＨＥＫ２９３を、５％  ＣＯ２インキュベーター内で、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、及び１ｘ  Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓが添加されたＥａｒｌｅ'ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて培養した。
【００５６】
（手順２：融合タンパク質発現プラスミドの導入）
ＨＥＫ２９３細胞を直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。ヒトのオプシン５発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ＯＰＮ５、及び記載のカルシウム感受性発光タンパク質発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションした。その後トランスフェクションされた細胞を、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００５７】
（手順３：発光画像の撮像）
一晩培養後の細胞の培地中にルシフェリン（プロメガ社製）を終濃度２ｍＭとなるように、また、１１−ｃｉｓ−レチナールを終濃度１０μＭとなるようにそれぞれ添加した。ルシフェリン及び１１−ｃｉｓ−レチナールの添加の後、細胞を１時間静置した。その後、細胞を発光顕微鏡ＬＶ（ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ）−２００（オリンパス社製）にセットした。撮像装置３０５として、ＥＭ−ＣＣＤカメラｉＸｏｎ（アンドール社製）を用いた。対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は５乃至１０秒間、ビニングは１×１とし、５秒間隔で発光画像のタイムラプス撮影を行った。撮像した画像を、解析装置３０６としてのパーソナルコンピュータに取り込んだ。
【００５８】
（手順４：光照射による発光画像のタイムラプス撮像）
タイムラプス撮影開始から５分後にＣＣＤカメラのシャッターを閉じ、ハロゲンランプ光源から光照射（０．１５乃至１．０μＷ、１０乃至１５秒間）を行った。照射後に再びＣＣＤカメラのシャッターを開き、引き続き発光画像のタイムラプス撮影を行った。
【００５９】
（手順５：画像解析）
手順３で撮影した各々の発光画像に対して、複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定した。また、手順４で撮影した各々の発光画像に対して、複数のＲＯＩを指定した。指定した各ＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定した。発光画像の解析には、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いた。
【００６０】
［測定２：光照射によるカルシウム濃度変動の蛍光イメージング］
ＨＥＫ２９３細胞における光照射によるカルシウム濃度変動の蛍光イメージングについて説明する。
【００６１】
（手順１：ＯＰＮ５タンパク質発現プラスミドの導入）
ＨＥＫ２９３細胞を直径３５ｍｍガラスボトムディッシュに２×１０５／ｄｉｓｈの細胞密度で播種し、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。ヒトのオプシン５発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／ＯＰＮ５を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションした。その後トランスフェクションされた細胞を、５％  ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
（手順２：蛍光画像の撮像）
一晩培養後の細胞の培地中にＦｌｕｏ−４（インビトロジェン）又はＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン）を終濃度５μＭとなるように、また、１１−ｃｉｓ−レチナールを終濃度１０μＭとなるようにそれぞれ添加した。蛍光色素と１１−ｃｉｓ−レチナールとの添加の後、細胞を１時間静置した。その後、細胞を蛍光顕微鏡ＩＸ−８１（オリンパス社製）にセットした。撮像装置３０５として、ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡＩＩ；浜松ホトニクス社製）を用いた。対物レンズの倍率は４０倍、露出時間は５００ミリ秒間、ビニングは１×１とし、１０秒間隔で蛍光画像のタイムラプス撮影を行った。撮像した画像を、解析装置３０６としてのパーソナルコンピュータに取り込んだ。
【００６２】
（手順３：光照射による蛍光画像のタイムラプス撮像）
タイムラプス撮影開始から５分後以降に、ハロゲンランプ光源から光照射（０．１５乃至１．０μＷ、１０乃至１５秒間）を行った。照射後に引き続き蛍光画像のタイムラプス撮影を行った。
【００６３】
（手順４：画像解析）
手順２で撮影した各々の蛍光画像に対して、複数のＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：関心領域）を指定した。また、手順３で撮影した各々の蛍光画像に対して、複数のＲＯＩを指定した。指定した各ＲＯＩの蛍光強度を各々の蛍光画像に基づいて測定した。蛍光画像の解析には、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（ユニバーサルイメージング社製）を用いた。
【００６４】
［実験結果］
測定１の光照射によるカルシウム濃度変動の発光イメージングの結果を示す。図５に、光照射前の発光画像の一例を示す。また、図６に、光照射後の発光画像の一例を示す。図５及び図６において、四角形は、ＲＯＩを示す。また、これら発光画像から得られた発光輝度の継時変化を図７に示す。
【００６５】
図５乃至図７に示されるように、ヒトのオプシン５タンパク質及びカルシウム感受性発光タンパク質ｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＣａＭ−Ｍ１３＿Ｎを利用することによって、光刺激に対するカルシウム応答を発光強度の減少としてシングルセル（単一細胞）レベルで検出することができた。
【００６６】
測定２の光照射によるカルシウム濃度変動の蛍光イメージングの結果を示す。図８は、光照射前におけるＦｌｕｏ−４を添加した細胞の蛍光画像の一例を示す。図９は、光照射後におけるＦｌｕｏ−４を添加した細胞の蛍光画像の一例を示す。これら蛍光画像から得られたＦｌｕｏ−４を添加した細胞における蛍光強度の継時変化を図１０に示す。
【００６７】
また、図１１は、光照射前におけるＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅを添加した細胞の蛍光画像の一例を示す。図１２は、光照射後におけるＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅを添加した細胞の蛍光画像の一例を示す。これら蛍光画像から得られたＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅを添加した細胞における蛍光強度の継時変化を図１３に示す。
【００６８】
図８乃至図１３に示されるように、蛍光カルシウム感受性色素（Ｆｌｕｏ−４又はＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ）を利用することによって、光刺激に対するカルシウム応答を蛍光強度の増強としてシングルセル（単一細胞）レベルで検出することができた。
【００６９】
カルシウム感受性発光タンパク質を用いたイメージングでは、図５乃至図７に示されるように、細胞は光刺激に対して一過性のカルシウム応答を示すことが明らかになった。また、刺激光の強度が０．７乃至１．０μＷ／ｍｍ２で１０秒間の照射でカルシウム応答が起こることが示された。
【００７０】
図８乃至図１０に示されるように、蛍光カルシウム指示薬Ｆｌｕｏ−４を用いたイメージングでは、一回目の励起により一過性のカルシウム動員が見られ、その後は蛍光強度が変化しなくなった。蛍光強度が一定になったところで、３０秒間の励起を行ったが、Ｆｌｕｏ−４の蛍光強度に変化は見られなかった。発光イメージングの結果と蛍光イメージングの結果より、励起光を照射しているとＯＰＮ５遺伝子の光刺激によるシグナル伝達系に影響を及ぼすことが明らかになった。
【００７１】
Ｆｌｕｏ−４の励起波長はＯＰＮ５の吸収波長に近い。このため、Ｆｌｕｏ−４を用いた実験では、励起を行うたびにオプシン５に刺激が入り、図８乃至図１０に示されるような現象が起こってしまう可能性が考えられた。そこで、励起波長がＦｌｕｏ−４よりも赤色にシフトしている蛍光色素であるＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（吸収波長：５４９ｎｍ）を用いて、光刺激による細胞のカルシウム応答を観察した。その結果、図１１乃至図１３に示されるように、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅの励起によるカルシウム動員は見られなかったが、発光カルシウムイメージングで行った光強度（０．７乃至１．０μＷ）では、光刺激によるカルシウム応答も観察できなかった。一方で、刺激光の強度を上げて光刺激を行ったところ、１ｍＷ／ｍｍ２以上の光強度で照射したときにＣａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度が上昇していくことが認められた。しかしながら、図１３に示されるように、蛍光強度が高い状態は一過性のものではなく、１０分以上続いていた。これらの結果より、オプシン５の吸収波長と異なる励起波長の照射があっても、励起光により細胞内シグナル伝達系に影響が及ぶことが示された。
【００７２】
カルシウム感受性発光タンパク質を用いた発光イメージングは、レポーターの発光が微弱であるため、明るい環境下で計測には不向きである。このため、蛍光イメージングで得られたような光受容体のシグナル伝達を観察することはできなかった。一方で、蛍光色素を用いた蛍光イメージングからは、励起光の刺激が細胞の挙動に影響を与えることが明らかになった。
【００７３】
以上のことから、発光イメージングと蛍光イメージングとを組み合わせることにより、光受容体活性化において、周囲が明るい環境におけるシグナル伝達と暗い環境におけるシグナル伝達とを比較することが可能であることが示された。この研究手法はこれまでに無かった新しい手法であり、光受容シグナル研究領域を含む多様なシグナル伝達研究領域に詳細なデータを提供できるものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上詳述に説明したように、本発明にかかる光受容体の光応答解析ツール及び解析方法は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００７５】
１０１…Ｎ末端側断片、１０２…Ｃ末端側断片、１０３…カルモジュリン、１０４…ペプチド、２０１…光受容体、２０２…発光レポーター、２０３…細胞、３００…イメージングシステム、３０１…細胞、３０２…照明、３０３…容器、３０４…光学系、３０５…撮像装置、３０６…解析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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