(57)【要約】【課題】蛍光計測を通して距離を評価していたFRET法に比べ、長距離情報を導出する。【解決手段】（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システム、（２）該電磁石システムが発生する静磁場の印加角度を変えながら蛍光体で標識された常磁性ナノ粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する蛍光検出磁気共鳴測定部、（３）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性ナノ粒子の間の距離を求める演算部、を備えた。【選択図】図１０
2014059192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システム、
（２）該電磁石システムが発生する静磁場の印加方向を変えながら蛍光体で標識された常磁性微粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する蛍光検出磁気共鳴測定部、
（３）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性微粒子の間の距離を求める演算部、
を備えたことを特徴とする蛍光顕微装置。
【請求項２】
前記蛍光体は、ＮＶセンターを有するダイヤモンド微粒子であることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微装置。
【請求項３】
前記常磁性微粒子は、酸化鉄微粒子であることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微装置。
【請求項４】
（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システムを用いて、該電磁石システムが発生する静磁場の印加方向を変えながら蛍光体で標識された常磁性微粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する工程、
（２）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性微粒子の間の距離を求める工程、
から成ることを特徴とする蛍光顕微方法。
【請求項５】
前記蛍光体は、ＮＶセンターを有するダイヤモンドであることを特徴とする請求項４記載の蛍光顕微方法。
【請求項６】
前記常磁性微粒子は、酸化鉄微粒子であることを特徴とする請求項４記載の蛍光顕微方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた細胞内で生理機能をその場で可視化する蛍光顕微鏡を使った観察において、細胞内に存在する生体分子の長距離構造変化情報を評価する技術に属する。特に、注目する生体分子を修飾しているエネルギー供与を担う蛍光分子（ドナー）とそのエネルギー受容を担う蛍光分子（アクセプター）の２つの特定部位が構造上どのくらいの距離を経て存在しているかを蛍光強度測定によって評価する技術、いわゆる、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer：FRET）の原理を使って距離情報を導出する従来技術に属する。
【背景技術】
【０００２】
FRETの解説書としては「Principles of Fluorescence Spectroscopy」（Springer）、「バイオイメージングがわかる−細胞内分子を観察する多様な技術とその原理」（羊土社）が挙げられる、またFRETを使った蛍光計測の手法種別は「FRET imaging」（Nature biotechnology 21, 187 (2003)）に紹介されている。
【０００３】
最も単純な蛍光顕微鏡の装置構成を図１に示す。励起用光源(1-1)から出力された光はダイクロイックミラー(1-2)を通して顕微鏡対物レンズ(1-3)へ導入され、適当なビーム径に収束されて試料（1−4）内に存在する蛍光体（1−5）に照射される。蛍光体（1−5）からの蛍光は同じ光路を通り、ダイクロイックミラー(1-2)、更にバンドパスフィルター(1-6)などを通して希望の波長だけを選別し蛍光検出器(1-7)で計測される。蛍光検出器(1-7)で測定された蛍光強度データは、コンピュータ(1-8)に取り込まれ解析・表示される。必要に応じて、顕微鏡ステージ（1−10）の位置を制御するために制御信号が顕微鏡ステージ制御回路（1−9）へと送信され、試料（1−4）が設置される顕微鏡ステージ（1−10）が制御される。
【０００４】
蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer：FRET）を使った蛍光計測の一般手法は、エネルギー供与体（ドナー:D）とエネルギー受容体（アクセプター：A）が近距離に存在したときに生じるドナーからアクセプターへのエネルギー移動に帰する。エネルギー移動効率は（１）ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの重なり、（２）ドナーの量子効率、（３）ドナーとアクセプターの遷移モーメント対称性、（４）ドナーとアクセプターの距離：Rのマイナス６乗（R-6）、の４項目に依存する。観測手法の代表的例を図２に示す。左図では、２つの異なる生体分子にドナーとアクセプターをそれぞれ化学修飾しておき試料に導入する（１分子間FRET）。励起光を照射してドナーの蛍光を観測すると、それらの生体分子間相互作用前ではドナーは励起光により蛍光を発し、アクセプターからの蛍光強度は極小である。生体分子相互作用後では、ドナーからの蛍光エネルギーFRET現象によってアクセプターに移動しアクセプターの蛍光強度が増す。一方右図では、１つの生体分子内の２か所にドナーとアクセプターを修飾し、試料内に導入する（１分子内FRET）。試料内にある他の分子との相互作用によって分子構造が変化し、ドナーとアクセプターが近接するとFRET現象によってその相互作用をモニターすることができる。このような実施例は、抗原抗体反応を利用した病理部位への特異的結合性質を有する蛍光分子計測などが挙げられ、創薬や生理活性の研究・開発に大いに役立っている。
【０００５】
一方、磁場との相互作用を通じて蛍光スペクトルが変化する蛍光体の例は、ダイヤモンド内に不純物として存在する窒素原子（N）と格子空隙（V）が近接した時に形成される量子状態ＮＶセンター（NVCenter。以下、ＮＶＣと呼ぶ）が挙げられる。これは、２個の電子スピンが隣接して存在することにより-１価の価数を持つS=1のスピン量子状態である。このＮＶＣは静磁場を印加していない状態でも2.87GHzに相当するエネルギーギャップを持つ特異なエネルギー準位を持ち、電子スピン共鳴が可能であることが知られている。さらに、電子スピン共鳴に寄与する電子がＮＶＣから発する蛍光現象にも影響を与え、磁気共鳴現象の有無やＮＶＣ位置の磁場強度に応じてその蛍光スペクトルに変化が生じる。
【０００６】
Nature 455,648 (2008)に掲載された論文では、電子スピン共鳴と蛍光スペクトル計測の両技術を走査型プローブ顕微鏡に導入し、蛍光スペクトル計測を通して単一ＮＶＣの存在位置やナノ磁性体が周囲に発生する静磁場の分布状態を常温・常圧下で観測した。さらに、静磁場を検出する原子サイズの磁気センサーとして単一ＮＶＣを持つナノダイヤモンドを探針に利用し、ナノメートルの空間分解能を有する顕微鏡の可能性を示した。また、同号644ページにも単一ＮＶＣを使った同種の論文が掲載された。後者の論文では、磁気センサーとしてＮＶＣ中心を利用した場合の磁場検出感度を検証するために、磁気共鳴手法で用いられている汎用的なスピンエコー法を導入し、サブマイクロテスラの磁場感度を実証した。
【０００７】
ナノダイヤモンドを使った生体観察の実施例がいくつか存在する。特に、ナノダイヤモンドは細胞内部において毒性が低いと考えられ、化学修飾が容易であることから、生体内部に導入可能な蛍光体として注目されている。PNAS 104, 727 (2007)に報告された例では、ＮＶＣが存在する35nmのナノダイヤモンドをHela細胞に導入し、共焦点レーザ顕微鏡や蛍光顕微鏡を使った蛍光強度の走査画像観測を実施した。その結果について、著者らは「従来から問題となっている蛍光体の褪色や不規則な発光（ブリンキング）などに影響されることの無い理想的な蛍光プローブである」と結論付けている。
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−１８０５７０号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
FRETは短距離相互作用に基づくエネルギー移動現象であり、1〜10nmの範囲に限定される。また、２つの蛍光体の距離だけでなく、２つの蛍光体のスペクトルが適切に重なる必要がある他、細胞内でのそれら蛍光体の生体分子への結合形態に由来する遷移モーメントの対称性（配向因子：κ）に大いに依存してFRET効率が変化するなど、試験管内における化学合成時の校正データでは対処しきれない事由もある。したがって現状では、配向因子：κの二乗に対し、ドナーとアクセプターが蛍光寿命の時間内に高速且つランダムな回転運動を実施しているという仮定の下、常にκ2＝2/3として距離に関して議論する。
【００１０】
しかしながら、この仮定が成り立つ状況は稀であり、実際、細胞内に導入された生体分子に標識されている蛍光体はそういった運動性は束縛されていることは明らかである。また、細胞培地のpH値によってドナー蛍光体の量子効率が変化することもあるので、FRETに関連するアクセプター蛍光強度の評価には注意を要する。このように、FRET現象を使った蛍光計測によって分子間相互作用発生の有無はモニターできるが、距離情報を始め定量的な分子構造の解析には困難を極める。
【００１１】
本発明の目的は、磁化された常磁性微粒子が周囲に作る双極子磁場と外部磁場との合成磁場ベクトルとの相互作用を通じて光検出磁気共鳴スペクトルが変化する蛍光物質を使ったスペクトル解析を実施することにより、蛍光計測を通して距離を評価していたFRET法に比べ、更に長距離情報、更には距離の絶対値を導出できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的を達成するため、本発明の蛍光顕微装置は、
（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システム、
（２）該電磁石システムが発生する静磁場の印加方向を変えながら蛍光体で標識された常磁性微粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する蛍光検出磁気共鳴測定部、
（３）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性微粒子の間の距離を求める演算部、
を備えたことを特徴としている。
【００１３】
また、前記蛍光体は、ＮＶＣを有するダイヤモンドであることを特徴としている。
【００１４】
また、前記常磁性微粒子は、酸化鉄微粒子であることを特徴としている。
【００１５】
また本発明の蛍光顕微方法は、
（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システムを用いて、該電磁石システムが発生する静磁場の印加方向を変えながら蛍光体で標識された常磁性微粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する工程、
（２）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性微粒子の間の距離を求める工程、
から成ることを特徴としている。
【００１６】
また、前記蛍光体は、ＮＶＣを有するダイヤモンドであることを特徴としている。
【００１７】
また、前記常磁性微粒子は、酸化鉄微粒子であることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１８】
本発明にかかる蛍光顕微装置によれば、
（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システム、
（２）該電磁石システムが発生する静磁場の印加方向を変えながら蛍光体で標識された常磁性微粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する蛍光検出磁気共鳴測定部、
（３）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性微粒子の間の距離を求める演算部、
を備えたので、
蛍光計測を通して距離を評価していたFRET法に比べ、長距離情報を導出することが可能になった。
【００１９】
また、本発明にかかる蛍光顕微方法によれば、
（１）互いに直交した３軸方向から静磁場を合成印加できる電磁石システムを用いて、該電磁石システムが発生する静磁場の印加方向を変えながら蛍光体で標識された常磁性微粒子の蛍光検出磁気共鳴スペクトルを測定する工程、
（２）蛍光検出磁気共鳴スペクトルの蛍光強度の静磁場方向に対する角度依存性から蛍光体と常磁性微粒子の間の距離を求める工程、
から成るので、
蛍光計測を通して距離を評価していたFRET法に比べ、長距離情報を導出することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】従来の蛍光顕微装置の一例を示す図である。
【図２】FRET現象の一例を示す図である。
【図３】蛍光体で標識された常磁性ナノ粒子の一例を示す図である。
【図４】蛍光検出磁気共鳴スペクトルの一例を示す図である。
【図５】蛍光検出磁気共鳴法の理論的説明図である。
【図６】磁場方向を変えたときに蛍光検出磁気共鳴スペクトルに現れた信号の共鳴周波数の一例を示す図である。
【図７】磁場方向を変えたときに蛍光検出磁気共鳴スペクトルに現れた信号の共鳴周波数の一例を示す図である。
【図８】３軸制御電磁石システムを示す斜視図である。
【図９】３軸制御電磁石システムを示すブロック図である。
【図１０】本発明にかかる蛍光顕微装置の一実施例を示す図である。
【図１１】本発明を用いた測定結果の例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本実施の形態では、磁場を感じて光検出磁気共鳴スペクトルが変化する蛍光物質のスペクトルを、任意の方位に静磁場を発生させることができる電磁石システムを使って、同スペクトルの角度依存性を測定する。信号位置は静磁場と双極子磁場の影響を受けて特異な角度依存性を示すので、ＮＶＣと常磁性物質との距離をパラメータとしてフィッティング処理を施し、残差が最小となる距離を導出することについて述べる。
［理論的説明］
ナノメートルのサイズを持つ常磁性物質と磁場との相互作用を通じて光検出磁気共鳴スペクトルが変化する蛍光物質を、化学合成技術を使って図３に示したように分子複合体に化学修飾する。これらは前出２分子FRETの場合では２つの分子にそれぞれ結合させておきその後に結合した分子複合体でも良く、前出１分子FRETのように一つの分子に結合した複合体であっても良い。
【００２２】
一例である前出のＮＶＣでは、磁気共鳴に付随する光検出磁気共鳴スペクトルを測定すると、ゼロ磁場環境下では2.87GHzの周波数をもつ高周波電磁波を照射したときに蛍光強度減少が観測される。一方、磁場の存在によって、その減少を示す高周波周波数位置は２つに分裂し、磁場強度と共に広がっていく様子が観測できる（図４、Nature 455,648 (2008)から抜粋）。この現象を利用すれば、蛍光スペクトルの測定を通して磁場強度が計測できることになる。
【００２３】
常磁性物質とＮＶＣから構成される分子複合体においては、外部から静磁場を供給されて分極した常磁性物質が周囲に作る磁場は双極子磁場と呼ばれるベクトル量である。例えば、MRI造影剤に使われている超常磁性の特徴を持つ酸化鉄ナノ粒子のような材料は、磁場印加時に大きな磁化が誘起されるため、その周囲に双極子磁場と呼ばれるベクトル磁場が発生する。
【００２４】
磁性粒子が原点（0,0,0）に置かれており、外部静磁場：ベクトルＨ0によって分極磁化：ベクトルＭ＝χ・ベクトルＨが距離ベクトル：ベクトルＲだけ離れた位置に作る双極子磁場は、（式１）で表される。
【００２５】
【数１】
2014059192.tif 000003
（式１）
（式１）を見ると明らかなように、双極子磁場は外部磁場ベクトルと距離ベクトルの内積を含む項や、２つの項のベクトル和で与えられる複雑な方向性を持ち、外部磁場の方位とその磁場強度に応じて、磁性粒子の双極子磁場の大きさ・方向・向きが変化する。
【００２６】
一方で、実験室座標系内で外部磁場の方位とＮＶＣの位置が同じ実験室座標系内で定義できれば、ＮＶＣ位置の合成磁場ベクトルを計算するのは容易である。図５では、原点に置かれた磁性体に外部から磁場を印加した時の分極磁化を黒い矢印で示し（左図）、その磁化がＮＶＣの置かれている場所に発生する双極子磁場の様子を拡大表示している（中央図、右図、眺める角度が異なるが、同じ磁化方位時の状況）。ＮＶＣの位置では外部磁場も存在するために、ＮＶＣが感じる有効磁場はその両者の合成ベクトルとなる。
【００２７】
双極子磁場の計算は、磁性粒子が原点（0,0,0）に置かれているので、ＮＶＣの位置（ｘ、ｙ、ｚ）が与えられ、磁場の強度：Ｈとその方位単位ベクトル（e1,e2,e3）が判れば、（式１）を使って双極子磁場ベクトル：ベクトルＨdipが求まる。ＮＶＣ位置の合成ベクトル：ベクトルＨtotal＝ベクトルＨ0＋ベクトルＨdipは、外部磁場：ベクトルＨ0とベクトルＨdipの各成分の加算で計算される。
【００２８】
ＮＶＣの光検出磁気共鳴スペクトルはＮＶＣ主軸とＮＶＣが感じる磁場方位と磁場強度に依存する。以下に要点を記述する。
【００２９】
ＮＶＣは、S=1のスピン三重項状態を形成し、D=2.87ＧＨｚのゼロ磁場分裂を持つ。有限の磁場：ベクトルＨtotalが存在する時には、（式２）の第二項に示されるゼーマンハミルトニアンが追加される。
【００３０】
【数２】
2014059192.tif 000004
（式２）
第一項のＤ＝2.87ＧＨｚに相当する磁場強度（約0.1テスラ相当）に比べてベクトルＨtotalの強度が弱い場合には、ＮＶＣ主軸に沿ったゼロ磁場分裂による基本状態が第二項目のゼーマンハミルトニアンにより若干摂動を受けるが、その量はＮＶＣ主軸方位とベクトルＨtotalとの成す角度に依存する（第二項目が内積であることに注意）。
【００３１】
ＮＶＣ主軸に沿った基本状態、即ち、Ｓｚ＝0と縮退したＳｚ＝+１と-１で表される純粋なスピン状態は、磁場の存在によって他の状態と混ざり合い、Ｓｚ＝±１の状態の縮退が解かれることになる。結果として、３つのスピン状態（Ｓｚ＝0、+1、-1）のエネルギー準位は以下に示す３×３の行列の対角化を経て決定され、Ｓｚ＝0⇔Ｓｚ＝+1と、Ｓｚ＝0⇔Ｓｚ＝-１の準位間遷移に相当するエネルギー差（これを、磁気共鳴分野では共鳴周波数と呼ぶ）が光検出磁気共鳴スペクトルに信号として現れる。
【００３２】
【数３】
2014059192.tif 000005
（式３）
ＮＶＣが一個の場合には、Ｓｚ＝0⇔Ｓｚ＝+1と、Ｓｚ＝0⇔Ｓｚ＝-1の順位間遷移に相当する２つの共鳴周波数が出現するが、その周波数位置は上記の式２、式３からも明らかなようにベクトルＨtotalの強度とＮＶＣ主軸との成す角度によって変化する。
【００３３】
整理すると、光検出磁気共鳴スペクトルの信号周波数位置は、
（１）ＮＶＣ主軸方位と合成磁場ベクトル方位、ならびに、合成磁場の強度に依存する。
（２）ＮＶＣ位置の合成磁場は、方向が既知の外部磁場と前節で説明した双極子磁場とのベクトル和で与えられる。
【００３４】
一方、双極子磁場は
（１）原点にある磁性粒子とＮＶＣとをつなぐ距離ベクトルと外部磁場方位（分極磁化方位）との成す角度に依存し、
（２）双極子強度は外部磁場の強度にも依存する。
【００３５】
つまり、ＯＤＭＲスペクトルに現れる信号位置（周波数）は、
（１）Ｄの値
（２）実験室座標系で定義される 外部磁場方位（θh、φh）と強度Ｈ0
（３）実験室座標系で定義される 距離：Ｒ、距離方位角度（Ｒθ、Ｒφ）
（４）実験室座標系で定義される ＮＶＣ主軸方位角度（ＮＶＣθ、ＮＶＣφ）、
（５）双極子磁場の変数である、磁化―これは外部磁場（強度Ｈ0と方位（Ｈθ、Ｈφ））と粒子当たりの帯磁率：χの掛け算に等しい、
の計１０個の変数に依存する。
【００３６】
ただし、実際の実験では、
（１）昨今磁性ナノ粒子の物性評価や合成方法は確立されており、極めて均一な球形磁性ナノ粒子を作ることが可能になってきているので、磁性粒子の帯磁率：χは実測値（本文末の付録参照）を与えられると考えても良い、
（２）Ｄの値はゼロ磁場下での光検出磁気共鳴スペクトルから実測可能、
（３）印加する磁場強度と方位は実験室座標系では既知である。
【００３７】
従って、実験者が制御することのできないＮＶＣ主軸方位角度と、磁性粒子とＮＶＣをつなぐ距離ベクトルに関する全５つの変数で、光検出磁気共鳴スペクトルをフィットすることになる。
【００３８】
そこで、任意の方位に外部磁場の回転軸を定義し、その軸面内で外部磁場を０〜１８０°回転させる方法を採用した。
【００３９】
例えば、鉛直上向きのＺ軸を回転軸（極座標の角度表示を用いれば（０°、０°））とし、Ｚ軸面内のＸ軸方向に外部磁場を印加する。この状態で光検出磁気共鳴スペクトルを測定し、信号位置を（ピークフィットか何かで）取得する。ＮＶＣが一つしか存在しない場合には、２つの信号位置が得られるはずである。
【００４０】
次に、Ｚ軸面内でＸ軸からある角度回転した方向に外部磁場を印加し、同様に信号位置を取得する。この操作を繰り返すと、ＮＶＣが感じる合成磁場ベクトルの方向と強度が双極子磁場の影響を受けて変化し、図６のような角度依存性を示すことが期待される。
【００４１】
上記ではZ軸面内で磁場を回転させたが、Ｘ軸（９０°、０°）、ならびにＹ軸（９０°、９０°）を回転軸として外部磁場を回転させれば、ＮＶＣの主軸方位と距離ベクトルの方位を反映して、図７のような３種類の異なる角度依存性を持つ測定データが得られる。
【００４２】
以上のように、外部磁場方位を変化させながら光検出磁気共鳴スペクトルを逐次測定し、蛍光強度の減少として出現する信号周波数位置を磁場方位を変数として表示すると、磁性ナノ粒子が作る双極子磁場に影響された角度依存性データを得ることができる。
［実施例］
図８は、直交した３つの電磁石の模式図を示している。
【００４３】
図９は、当該電磁石に磁場を発生させるためのハードウエアブロックダイアグラムを示している。
３つの電磁石に電流を供給するために、電流電源と制御信号源から成る電気回路を用意する。コンピュータからの指令により、３つの独立した制御信号発生部で制御信号を発生させ、それぞれ対応する電流電源に供給する。
【００４４】
以下では、任意方向に磁場を生成するために、各電磁石が担当する磁場成分の導出方法について述べる。
【００４５】
まず、電磁石の位置ベクトルを求める。実験室系において、電磁石方位を以下の単位ベクトルで表す。
【００４６】
【数４】
2014059192.tif 000006
（式４）
ここで、θは試料面から垂直方向に伸びたＺ軸からの開角、φは電磁石１を基準に取ったときのＺ面内での電磁石１から電磁石２への角度であり、φ＝120°である。Mag1vectorとMag2vectorが直交する条件を考慮すると、両者の内積がゼロである必要があるので、
【００４７】
【数５】
2014059192.tif 000007
これによりθ≒54.7°と求まる。したがって、各電磁石の方位ベクトルは以下定数となる。
【００４８】
【数６】
2014059192.tif 000008
次に、希望する静磁場の方向を、以下の実験室系単位ベクトルで定義する。
【００４９】
【数７】
2014059192.tif 000009
（式５）
静磁場強度Ｈ0を上記方向に発生させたい場合には、Ｈ0の各電磁石方向への射影成分を各電磁石によって発生させれば良い。
【００５０】
【数８】
2014059192.tif 000010
（式６）
以下に、実験室系で定義される（θh、φh）の組み合わせとして代表的な例、（0,0）、（90,0）、（90,90）、（90,180）、（90,270）、（180,0）時の各電磁石の供給磁場強度成分を示す。
【００５１】
【数９】
2014059192.tif 000011
【００５２】
【数１０】
2014059192.tif 000012
【００５３】
【数１１】
2014059192.tif 000013
任意の方向に回転軸を設定し、その周りを回転する磁場を発生したい場合には、以下の行列演算を実施することで、磁場方位ベクトル：ベクトルＨを求めることができる。
【００５４】
まず、通常の座標変換行列を以下のように定義する。
【００５５】
【数１２】
2014059192.tif 000014
（式７）
それぞれの式は行列で書くと以下と同じである。
【００５６】
【数１３】
2014059192.tif 000015
上記行列式を使って、Ｘ軸上にあった単位ベクトルv＝｛1,0,0｝をＺ軸周りに任意の角度：αを回転させ、実験室系鉛直Ｚ軸方向からの角度をθとしてＹ軸周りにθ、再度実験室系鉛直Ｚ軸周りに角度φを回転させると、
【００５７】
【数１４】
2014059192.tif 000016
（式８）
となる。即ち、実験室系で定義された｛θ、φ｝方向を方位軸としてその面内で回転する磁場方位ベクトル：ベクトルＨは、上記式に代入することで得られる。各電磁石が担当する磁場強度は、前出の計算に習って、磁場強度：Ｈ0を乗じたベクトルＨの各電磁石への射影成分を計算すればよい。
【００５８】
直交した三軸電磁石システムを使って、光検出磁気共鳴スペクトルの角度依存性を計測・収集する手順について、図９を説明する。
【００５９】
（１）磁場を回転させる方位｛θ、φ｝を設定する。また、回転軸面内での回転角：αを定義し、０°とする。
【００６０】
（２）式（８）を使って、直交した３つの電磁石が担う磁場を供給するように、図９ないしは図１０のコンピュータ(１０-８)から制御信号部に指令を送る。
【００６１】
（３）制御信号部は通常デジタルーアナログ回路になっており、次の電源部（図１０内の１０−１７）への参照信号を発生させる。
【００６２】
（４）電源部（図１０内の１０−１７）は入力された参照電圧値に対し、電源部内部で定義されたゲインに従って電流を電磁石部（図１０内の１０−１６）へ供給する。
【００６３】
（５）与えられた電流によって、各電磁石（図１０内の１０−１６）は担当する磁場を発生する。
【００６４】
光検出磁気共鳴スペクトルを測定するための装置について説明する。
【００６５】
図１０は装置構成の一例であり、図１で示された一般的な蛍光顕微鏡装置の構成を発展させたものである。励起用光源(１０-１)から出力された光はダイクロイックミラー(１０-２)を通して顕微鏡対物レンズ(１０-３)へ導入され、適当なビーム径に収束されて試料(１０-４)に照射される。試料には既にユーザーが調製した磁性ナノ粒子（１０-１１）と磁場を感じて蛍光スペクトルが変化する蛍光体（ＮＶＣ）（１０-５）が分子間相互作用によって分子複合体を形成しており、両者間距離が近接しているものとする。ＮＶＣ（１０-５）からの蛍光は励起光と同じ光路を通り、ダイクロイックミラー(１０-２)、更にバンドパスフィルター(１０-６)などを通して希望の波長だけを選別し、高感度冷却CCD(１０-７)などを使って二次元画像として蛍光強度を計測し、コンピュータ(１０-８)に取り込まれる。顕微鏡ステージの位置を正確に制御するために、顕微鏡ステージ制御回路（１０-９）を介したフィードバック回路を用意しても良い。
【００６６】
一方、試料内ＮＶＣ（１０-５）に対して電子スピン磁気共鳴現象を発生させるために、高周波磁場照射を実施する。磁気共鳴を発生させるための高周波は高周波発信器(１０-１２)から出力される。高周波出力信号は高周波アンプ(１０-１３)によって増幅されて、試料に近接して設置されている高周波コイル(１０-１４)へと導入され、高周波磁場が試料内蛍光体（１０-５）に照射される。磁気共鳴に付随する蛍光強度減少量を測定するために、高周波磁場の周波数を更新しながら蛍光強度の二次元画像取得を繰り返す。高周波周波数の更新や蛍光強度画像取得は装置を制御するコンピュータ（１０−８）でそのタイムスケジュールを実施しても良く、または、マスタークロックならびに各装置の作業開始指示を与えるパルス回路（１０-１５）を用意しても良い。
【００６７】
高周波磁場の周波数を設定しその環境で測定された蛍光強度画像データは、コンピュータ（１０−８）に取り込まれる。コンピュータ内部では、強度計測のために事前に選択しておいた蛍光輝点の最大値または輝点を囲む領域に渡った積分値または平均値を計測し、メモリに格納しておく。この作業を高周波磁場の周波数をパラメータとして繰り返し、磁気共鳴に付随する蛍光強度スペクトルを計測する。これらはコンピュータ（１０−８）の測定制御部で実施される。
【００６８】
（６）与えられた磁場下で計測された光検出磁気共鳴スペクトルに対し、最小二乗法などを使った自動フィッティングツールを使って信号位置を算出する。
【００６９】
（７）コンピュータ(１０-８)の磁場角度を更新し、手順２から同じ作業を繰り返す。
【００７０】
（８）設定した回転角度範囲内で光検出磁気共鳴スペクトル、更には信号位置の算出が終了したら、次の回転軸に対する同様な磁場回転を実施し、信号算出を実施する。
【００７１】
例えば、｛０、０｝、｛９０、０｝、｛９０、９０｝を回転軸と定義した場合、一例として、図１１左図のような角度依存性を取得するかもしれない。これは、常磁性微粒子とＮＶＣを含むダイヤモンドが結合した分子複合体を配向させることはできないため、実験室座標系で定義される磁場方位に対するＮＶＣからの信号の角度依存性は常に任意の位相差を持って観測されることによる。
【００７２】
図１１右図は、式（１）、式（２）を使って非線形最小二乗法アルゴリズムを使って距離を算出した例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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