(57)【要約】【課題】複雑な試料調製、特に追加の遠心分離および洗浄ステップを必要とせず、臨床検査室におけるルーチン処理に適した方法、特に自動アッセイシステムでの処理に適した方法を提供する。【解決手段】ａ）個体からの多血小板血漿と洗浄剤とを含有する第１アッセイ体積を用意するステップ、ｂ）個体からの多血小板血漿を含有し、洗浄剤を含有しない第２アッセイ体積、または、個体からの乏血小板血漿を含有し、洗浄剤を含有しない第２アッセイ体積、または、個体からの乏血小板血漿と洗浄剤とを含有する第２アッセイ体積を用意するステップ、ｃ）第１アッセイ体積中および第２アッセイ体積中のアナライトの量または活性を測定するステップ、およびｄ）測定結果を比較するステップを含み、測定結果の差が血小板関連アナライトの量または活性に相当する。【選択図】図１
2014059304.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体からの試料中の血小板関連アナライトの量または活性の決定方法であって、
ａ）個体からの多血小板血漿と洗浄剤とを含有する第１アッセイ体積を用意するステップ、
ｂ）ｉ）個体からの多血小板血漿を含有し、洗浄剤を含有しない第２アッセイ体積、または
ｉｉ）個体からの乏血小板血漿を含有し、洗浄剤を含有しない第２アッセイ体積、または
ｉｉｉ）個体からの乏血小板血漿と洗浄剤とを含有する第２アッセイ体積
を用意するステップ、
ｃ）第１アッセイ体積中および第２アッセイ体積中のアナライトの量または活性を測定するステップ、および
ｄ）測定結果を比較するステップ
を含み、測定結果の差が血小板関連アナライトの量または活性に相当する血小板関連アナライトの決定方法。
【請求項２】
洗浄剤が非イオン性界面活性剤、好ましくはポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０）およびポリドカノール（ＴＨＥＳＩＴ）からなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
洗浄剤がアッセイ体積中に体積比０．１〜１．６％の最終濃度、好ましくは体積比０．２〜０．８％の最終濃度で存在する請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
第１アッセイ体積中および第２アッセイ体積中のアナライトの量または活性が、各アッセイ体積を、少なくとも１つのアナライト特異的結合パートナーと結合している粒子状固相、好ましくはラテックス粒子と混合することによって測定され、粒子状固相の凝集が測定される請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ヴォン・ヴィレブランド因子、第ＸＩＩＩ因子、Ｄ−ダイマー、フィブリノゲンおよびポリリン酸からなる群より選択される血小板関連アナライトの量または活性を決定する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固診断薬の分野に属し、試料中の血小板関連アナライトを決定するインビトロ（in vitro）方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
まず血管系における血液の流動性を確保し、次に血管外失血が血餅の形成によって確実に回避されるようにする生理的過程は、止血という用語で扱われる。止血の調節には、数多くのタンパク質因子が関与すると共に、細胞コンポーネント、例えば血小板（同義語：栓球）も関与する。血管傷害が起こると、まず最初に内皮下コラーゲンへの血小板の付着が起こる。この接着は、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）などの接着性タンパク質によって媒介される。接着過程中に、血小板は活性化され、その顆粒からメディエーターを放出して、さらなる血小板の集合と活性化の強化とを誘導する。これによって一次血管壁閉塞（一次止血）が達成されるが、それは、血漿凝固系のさらなる反応によって初めて安定化される（二次止血）。これらの過程の調節不全は、血栓形成傾向または出血傾向につながり、重症度によっては、命を脅かす結果を招きうる。
【０００３】
血小板は、生理的に重要な機能を有する細胞内成分を数多く含有している。さまざまな物質、例えば血小板因子４（ＰＦ４）、フィブリノゲン、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、フィブロネクチン、カルシウムイオン、さらには血小板増殖因子、例えばＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）の、最も重要な貯蔵部位は、血小板の細胞質中のアルファ顆粒および密顆粒である。血小板が例えば血管傷害の結果として活性化されると、それらの成分が顆粒から分泌され、それが次に、凝固反応の継続にとって重要な過程を開始させる。
【０００４】
他の物質、例えば第ＸＩＩＩ因子は、血小板のサイトゾルに見いだされる。さらなる他の物質、特にＡＤＰ受容体、トロンボキサン受容体、トロンビン受容体または糖タンパク質Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩｂおよびＩＩＩａなどの受容体タンパク質は、血小板の細胞膜中または細胞膜上に結合している。さらにまた、第Ｘ因子、第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子など、多くのタンパク質は、血小板活性化の結果として血小板の細胞膜に結合する。ＶＷＦは、ずれ応力の結果として、または分子欠陥ゆえに、血小板のＧＰＩｂ受容体に自発的に結合する。ＶＷＦ切断プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ−１３については、血小板関連部分が同様に知られている。
【０００５】
これらの血小板関連物質およびそれらの調節された放出の多くは、止血において果たすべき、重要な役割を有している。このことは、血小板における顆粒機能の破壊に原因があると考えることのできる一連の症状が知られているという事実からも明白である。既知の状態の一つは、アルファ顆粒の減少または欠如が引き起こす遺伝性出血性障害、いわゆる灰色血小板症候群（ＧＰＳ）である。もう一つの既知の状態は、やはり遺伝性の出血性障害、いわゆるケベック血小板障害（ＱＰＤ）であり、これは、アルファ顆粒成分の過剰な分解によって引き起こされる。それゆえに、血小板関連物質の欠乏または機能不全を同定すること、および血小板顆粒からの前記物質の放出における欠陥を同定することは、診断上極めて重要である。
【０００６】
さらにもう一つの既知の状態は、遺伝性または後天性の出血性障害、いわゆるヴォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）である。これはさまざまなＶＷＦ障害によって引き起こされうるため、タイプの異なるヴォン・ヴィレブランド病が識別されている。３型ＶＷＤでは、血漿にも血小板のアルファ顆粒にも、ＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）が全く存在しない。低下した血漿ＶＷＦ抗原濃度が特徴的な１型ＶＷＤでは、２つのサブタイプが識別されていて、それらは、一方のサブタイプでは血小板中のアルファ顆粒ＶＷＦ抗原濃度がやはり低下しているのに対し、他方のサブタイプでは血小板中のアルファ顆粒ＶＷＦ抗原濃度が正常である点で異なっている。
【０００７】
さまざまな治療がタイプの異なるヴォン・ヴィレブランド病に使用されるので、個々の症例は、極めて正確な分類を必要とする。それゆえに、患者の血漿におけるＶＷＦ抗原の濃度または活性を決定するだけでなく、患者の血小板におけるＶＷＦ抗原の濃度または活性も決定することが望ましい。
【０００８】
血小板関連物質を決定するための既知の方法は技術的に複雑であり、臨床検査室におけるルーチン処理には適さない。根本的問題は、多くの診断上重要な血小板関連物質、例えばＶＷＦが、血小板中に存在するだけでなく、血漿中にも存在することである。細胞内血小板アナライトを分析するために、通常は、新鮮洗浄血小板から血小板溶解物が調製される。この目的のために、多血小板血漿を洗浄溶液に繰り返し懸濁して血漿構成要素を除去し、遠心分離し、次に、洗浄剤含有バッファーを添加することによって血小板を溶解する。次に、こうして得た血漿フリー血小板溶解物において、所望のアナライトの量または活性が決定される。
【０００９】
Ｄｅ  ＲｏｍｅｕｆとＭａｚｕｒｉｅｒは、少なくとも洗浄ステップが不要になる、簡易な血小板ＶＷＦ決定方法を記載している。この簡易法では、多血小板血漿を１回だけ遠心分離し、上清を注意深く除去し、細胞ペレットを洗浄剤含有バッファーに再懸濁する。次に、こうして得られた血小板溶解物において、血小板ＶＷＦの量または活性が決定される（非特許文献１）。
【００１０】
この簡易法は、臨床検査室におけるルーチン処理には適さず、特に自動アッセイ手法には適していない。というのも、試料調製には、試料材料（多血小板血漿）を遠心分離し、上清を注意深く除去することが、依然として必要だからである。試料を遠心分離して、上清を細胞ペレットから精密に除去することができるシステムは、少なくとも自動凝固分析装置の分野では知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｒｏｍｅｕｆ，Ｃ．およびＭａｚｕｒｉｅｒ，Ｃ．「Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｆａｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（血小板ヴォン・ヴィレブランド因子キャラクタリゼーションのための簡易かつ迅速な方法の利点）」Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９６，８３（４）：２８７−２９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえに、本発明の課題は、試料中の血小板関連アナライトの量または活性を決定する方法であって、複雑な試料調製、特に追加の遠心分離および洗浄ステップを必要とせず、臨床検査室におけるルーチン処理に適した方法、特に自動アッセイシステムでの処理に適した方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題は、
ａ）個体からの多血小板血漿と洗浄剤とを含有する第１アッセイ体積を用意するステップ、
ｂ）ｉ）個体からの多血小板血漿を含有し、洗浄剤を含有しない第２アッセイ体積、または
ｉｉ）個体からの乏血小板血漿を含有し、洗浄剤を含有しない第２アッセイ体積、または
ｉｉｉ）個体からの乏血小板血漿と洗浄剤とを含有する第２アッセイ体積
を用意するステップ、
ｃ）第１アッセイ体積中および第２アッセイ体積中のアナライトの量または活性を測定するステップ、および
ｄ）測定結果を比較するステップ
を含み、測定結果の差が血小板関連アナライトの量または活性に相当する方法によって解決される。
【００１４】
用語「血小板関連アナライト」は広義に理解すべきであり、血小板の細胞内成分、例えば血小板顆粒の成分またはサイトゾルの成分、血小板外表面に接着する細胞外物質、例えばＶＷＦまたはフィブリノゲン、および血小板の細胞膜に固定されている膜構成要素、例えば膜貫通受容体を包含する。用語「血小板関連アナライト」は、単離された（好ましくはヒト）血小板中に存在する、あらゆるタイプの物質、例えばペプチド、タンパク質（例えば第ＸＩＩＩ因子、ＶＷＦ、ＧＰＩｂ受容体、フィブリノゲン、Ｄ−ダイマー）、脂質、イオン（例えばカルシウムイオン）、ヌクレオチド（例えばＡＤＰおよびＡＴＰ）、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）および長鎖ポリリン酸（ｎ＞５０）を包含する。
【００１５】
用語「多血小板血漿」（ＰＲＰ）は、試料１マイクロリットル［μＬ］あたり少なくとも１０，０００個の血小板を含有する、個体からの血漿試料、好ましくはヒト個体からの血漿試料を包含する。全血試料から多血小板血漿を得るためのさまざまな方法が当業者に知られている。従来の方法は次のように作用する：抗凝固処理した全血試料を、１７０ｇで１５分間、または１８０ｇで１０分間、遠心分離する。これにより、白血球および赤血球から構成される下層と、多血小板血漿の上層との形成が達成される。後者が、下層と混合させずに、注意深く取り出される。
【００１６】
対照的に、乏血小板血漿（ＰＰＰ）（「血漿」という用語を使用する場合、通常は、これを意味する）は、理想的には血小板不含であるが、いずれにせよ、含有される血小板は試料１マイクロリットル［μＬ］あたり１０，００００個未満でなければならない。全血試料から乏血小板血漿を得るためのさまざまな方法が当業者には知られている。従来の方法は次のように作用する：抗凝固処理した全血試料を１５００ｇで少なくとも１５分間遠心分離する。これにより、赤血球、白血球および血小板から構成される下層と、乏血小板血漿の上層との形成が達成される。後者が、下層と混合させずに、注意深く取り出される。
【００１７】
用語「洗浄剤」は、水性媒質における細胞脂質膜の溶解度を増加させる能力を有する表面活性物質、特に非イオン性界面活性剤を包含する。洗浄剤は、細胞膜を透過性にするので、細胞内構成要素または膜貫通構成要素が、周囲の媒質へと放出されるか、または細胞構成要素を検出するために使用される結合パートナーにとって、より容易にアクセスできるようになることが知られている。細胞脂質膜を透過性にするのに適した洗浄剤または血小板を含む細胞を溶解するのに適した洗浄剤の例は、例えばポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（商品名：ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名：ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリドカノール（商品名：ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）；同義語：ポリエチレングリコールドデシルエーテル、ポリエチレングリコール４００ドデシルエーテル）、グリセロール、サポニン、ジギトニン、フィリピン、オクチルグルコシド、ドデシル硫酸、Ｚｏｎｙｌ（登録商標）１７およびデオキシコレートである。
【００１８】
個体からの試料中の血小板関連アナライトの量または活性を決定するための本発明の方法は、個体からの多血小板血漿と洗浄剤とを含有する第１アッセイ体積を用意することを含む。洗浄剤は、好ましくは、洗浄剤が０．１〜１．６％、特に好ましくは０．２〜０．８％の体積比でアッセイ体積中に存在することになるような量で、多血小板血漿に添加される。アナライト特異的検出試薬、例えば検出すべきアナライトに特異的な標識結合パートナーを添加することによって、アッセイ体積中のアナライトの量または活性を決定することが可能である。第１アッセイ体積において決定されるアナライトの量または活性は、血漿中に存在するアナライトの量または活性（血漿部分）と、血小板中または血小板上に存在する同じアナライトの量または活性（血小板部分）との和に相当する。
【００１９】
本発明の方法はさらに、
ｉ）個体からの多血小板血漿を含み、洗浄剤を含まない第２アッセイ体積、
または
ｉｉ）個体からの乏血小板血漿を含み、洗浄剤を含まない第２アッセイ体積、
または
ｉｉｉ）個体からの乏血小板血漿と洗浄剤とを含む第２アッセイ体積
を用意することを含む。
【００２０】
選択肢ｉｉｉ）では、好ましくは、洗浄剤が、体積比０．１〜１．６％の最終濃度で、特に好ましくは０．２〜０．８％の体積比でアッセイ体積中に存在することになるような量で、洗浄剤を乏血小板血漿に添加する。特に好ましくは、選択肢ｉｉｉ）では、洗浄剤が第１アッセイ体積の場合と同じ最終濃度で存在することになるような量で、洗浄剤を乏血小板血漿に添加する。第１アッセイ体積の場合と同じアナライト特異的検出試薬、例えば検出すべきアナライトに特異的な標識結合パートナーを添加することによって、第２アッセイ体積におけるアナライトの量または活性を決定することが可能である。第２アッセイ体積において決定されたアナライトの量または活性は、血漿中に存在するアナライト（血漿性アナライト）の量または活性に相当する。血小板中に存在する同じアナライト（血小板関連アナライト）の量または活性は決定されない。なぜなら、アナライトの血小板部分をアクセス可能にするであろう洗浄剤を使用していないか（選択肢ｉ）、または血小板の含有量が不十分な乏血小板血漿しか使用していない（選択肢ｉｉおよびｉｉｉ）からである。
【００２１】
本発明の方法はさらに、測定結果を比較すること、すなわち、第１アッセイ体積に関する測定結果（血漿性アナライトおよび血小板関連アナライトの量または活性）を、第２アッセイ体積に関する測定結果（血漿性アナライトの量または活性）と比較することを含む。測定結果の差は、血小板関連アナライトの量または活性に相当する。例えば、第２アッセイ体積に関する測定結果を、第１アッセイ体積に関する測定結果から差し引くことによって、血小板関連アナライトの量または活性を決定することが可能である。
【００２２】
第１アッセイ体積および第２アッセイ体積におけるアナライトの量または活性は、そのアナライトを検出するのに適した任意の検出方法を使って測定することができる。
【００２３】
アナライトの量または活性は、例えば、不均一結合アッセイにおいて測定することができる。不均一結合アッセイは、１つ又は複数の分離ステップおよび／または洗浄ステップを特徴とする。分離は、例えば免疫沈降、ポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウムなどの物質による沈殿、濾過、磁気分離、または固相への結合によって達成することができる。そのような固相は、多孔性および／または非多孔性の、一般的には水不溶性の材料からなる。これは、例えば、容器、チューブ、マイクロタイタープレート、ビーズ、微粒子、棒、ストリップ、フィルターまたはクロマトグラフィー紙など、極めて広範囲にわたる多種多様な形態を示しうる。サンドイッチフォーマットの不均一結合アッセイの場合、一般的には、第１アナライト特異的結合パートナー、例えばモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはアナライト結合性抗体フラグメント、またはオリゴヌクレオチドを、固相に結合し、それを使って、液相からアナライト／アナライト特異的結合パートナーの結合複合体を取り除き、一方、結合複合体を検出するための第２アナライト特異的結合パートナーは、検出可能なラベル（例えば酵素、蛍光ラベルまたは化学発光ラベルなど）を保持している。これらのアッセイ方法はさらに、２つの特異的結合パートナーが同時に試料と共にインキュベートされる、いわゆる１段階サンドイッチアッセイと、試料をまず固相試薬と共にインキュベートし、アナライトおよびアナライト特異的結合パートナーから構成される固相結合型結合複合体が関わる分離および洗浄ステップ後に、検出試薬と共にインキュベートする、２段階サンドイッチアッセイとに分けられる。不均一結合アッセイの標準的な一例は、ＥＬＳＩＡアッセイである。
【００２４】
アナライトの量または活性は、均一結合アッセイにおいて測定することもできる。均一結合アッセイでは、遊離のアナライト特異的結合パートナーと結合したアナライト特異的結合パートナーとの分離が行われない。アナライト特異的結合パートナー、信号発生システムの構成要素および試料を含有するアッセイ体積が、さらなる分離または洗浄ステップを伴わずに、結合反応後に、または結合反応中にさえ測定され、対応する測定信号が決定される。均一イムノアッセイの例は、検出に使用されるアナライト特異的結合パートナーをラテックス粒子と結合させることができる、多くの濁度測定法または比濁法である。均一アッセイフォーマットの例は、ＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ、ＣＥＤＩＡ（登録商標）アッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ、ルミネセントオキシジェンチャネリングイムノアッセイ（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；「ＬＯＣＩ」；ＥＰ−Ａ２−５１５１９４参照）、Ｔ２ＭＲ（Ｔ２  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；ＵＳ−Ａ１−２０１２０１６４６４４参照）などである。均一サンドイッチイムノアッセイ、例えば比濁ラテックスアッセイでは、結合パートナー、例えばモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはアナライト結合性抗体フラグメント、またはオリゴヌクレオチドを、試料と共にインキュベートし、測定前に分離または洗浄ステップを行うことなく、インキュベーション中および／またはインキュベーション後に、信号を測定する。
【００２５】
本発明による方法の好ましい一実施形態では、第１アッセイ体積および第２アッセイ体積におけるアナライトの量または活性が、ラテックス凝集試験を使って測定される。このために、各アッセイ体積を、少なくとも１つのアナライト特異的結合パートナーと結合している粒子状固相、好ましくはラテックス粒子と混合し、粒子状固相の凝集を光学的に測定する。あるいは、各アッセイ体積を、アナライトの存在下で粒子の凝集を変化させる結合パートナーを表面上に有する磁気粒子と混合する。反応体積を磁場に曝し、粒子状固相の凝集を、反応体積のＴ２緩和速度に基づいて決定する。
【００２６】
アナライトの量または活性は、競合結合アッセイにおいて測定することもできる。競合結合アッセイでは、試料アナライトと試薬アナライト、例えば標識アナライトとが、限られた数のアナライト特異的結合パートナーへの結合に関して競合する。原理を説明するための例：（ｉ）試料アナライトは、固相結合型アナライト特異的結合パートナーへの結合に関して、信号発生システムの構成要素と結合している試薬アナライトと競合するか、または（ｉｉ）試料アナライトは、信号発生システムの構成要素と結合しているアナライト特異的結合パートナーへの結合に関して、固相結合型試薬アナライトと競合する。
【００２７】
本発明による方法の好ましい一実施形態では、血小板関連ＶＷＦの量または活性が測定される。アッセイ体積におけるＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の量は、少なくとも１つのＶＷＦ特異的結合パートナー、好ましくはモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはＶＷＦ結合性抗体フラグメントを使用する、不均一結合アッセイまたは均一結合アッセイを使って測定することができる。アッセイ体積中のＶＷＦ活性（ＶＷＦ  Ａｃ）は、標準的なリストセチン補因子アッセイ（ＶＷＦ：Ｒｃｏ）を使って測定することができる。この目的のためには、アッセイ体積をリストセチンおよび固定血小板と混合し、血小板の凝集を決定する。あるいは、ＧＰＩｂに結合するＶＷＦの能力に基づいて、ＶＷＦ活性を決定することもできる。この目的のためには、アッセイ体積を、リストセチンおよび固相に結合した野生型の（典型的には組換え）ＧＰＩｂタンパク質またはＧＰＩｂタンパク質フラグメントと混合するか（ＷＯ−Ａ２−０１／０２８５３）、リストセチンなしで、ただし固相に結合した変異型の（典型的には組換え）ＧＰＩｂタンパク質またはＧＰＩｂタンパク質フラグメントと混合し（ＷＯ−Ａ２−２００９／００７０５１、ＷＯ−Ａ１−２００９／０２６５５１）、ＧＰＩｂタンパク質へのＶＷＦの結合を定量する。あるいは、コラーゲンに結合するＶＷＦの能力に基づいて、ＶＷＦ活性を決定することもできる。
【００２８】
本発明による方法のもう一つの好ましい実施形態では、血小板関連第ＸＩＩＩ因子の量または活性が測定される。アッセイ体積における第ＸＩＩＩ因子の量は、少なくとも１つの第ＸＩＩＩ因子特異的結合パートナー、好ましくはモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または第ＸＩＩＩ因子結合性抗体フラグメントを使用する、不均一結合アッセイまたは均一結合アッセイを使って測定することができる。アッセイ体積中の第ＸＩＩＩ因子活性は、アッセイ体積中の第ＸＩＩＩ因子を、Ｃａ2+イオンの存在下、トロンビンで活性化することで第ＸＩＩＩａ因子を形成させるアッセイを使って、測定することができる。次にアッセイ体積を、第ＸＩＩＩａ因子による分子間アミド結合の形成のための基質として役立つ合成グルタミン含有ペプチドおよびグリシンエチルエステルと混合する。この反応において放出されるアンモニアを定量的に検出するために、試料をさらに、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドハイドライド）、ＮＡＤＰＨまたはチオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ならびにＮＡＤＨ依存性指示反応のコンポーネント、すなわちグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）およびα−ケトグルタル酸と混合する。ＧＬＤＨは、アンモニアの存在下で、α−ケトグルタル酸をグルタミン酸に転化する。この反応はさらにＮＡＤＨを消費して、ＮＡＤＨの酸化型であるＮＡＤ＋を形成する。ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＨとは異なる吸収スペクトルを有するので、アッセイ体積の吸収は、ＮＡＤＨ消費に比例して、したがってアンモニア量に比例して、したがって第ＸＩＩＩ因子の量または活性に比例して変化する（ＥＰ−Ａ２−３３６３５３；ＷＯ−Ａ１−２０１１／０４２０７１）。
【００２９】
本発明による方法のもう一つの好ましい実施形態では、血小板関連Ｄ−ダイマーの量が測定される。アッセイ体積中のＤ−ダイマーの量は、少なくとも１つのＤ−ダイマー特異的結合パートナー、好ましくはモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはＤ−ダイマー結合性抗体フラグメントを使用する、不均一結合アッセイまたは均一結合アッセイを使って測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】例示的実施形態２のとおり、３人の健常ドナー（ドナー１、２および３）からの乏血小板血漿および多血小板血漿の試料における第ＸＩＩＩ因子活性（標準値（ｎｏｒｍ）の％として）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
図１において、バー１〜４は、それぞれ、乏血小板血漿の試料（ＰＰＰ試料）に関するアッセイ結果を示す。バー５〜８は、多血小板血漿の試料（ＰＲＰ試料）に関するアッセイ結果を示す。バー１および５は、洗浄剤が完全に存在しない状態で決定されたアッセイ結果を表す。残りのバーは、アッセイ体積中に洗浄剤（Ｔｈｅｓｉｔ）が存在する状態で決定されたアッセイ結果を表す（２および６：Ｔｈｅｓｉｔによる試料の前処理／アッセイ試薬中はＴｈｅｓｉｔなし；３および７：Ｔｈｅｓｉｔによる前処理なし／アッセイ試薬中にＴｈｅｓｉｔ；４および８：Ｔｈｅｓｉｔによる試料の前処理かつアッセイ試料中にＴｈｅｓｉｔ）。バー５（ＰＲＰを試料とし、洗浄剤が存在しない状態でのアッセイ結果の決定）をバー６〜８（ＰＲＰを試料とし、洗浄剤が存在する状態でのアッセイ結果の決定）と比較すると、有意に高い第ＸＩＩＩ因子活性が測定されることがわかり、これは血小板関連第ＸＩＩＩ因子の活性に起因すると考えることができる。
【実施例】
【００３２】
実施例１：血小板関連ＶＷＦの活性の決定
【００３３】
多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製：
４人の見かけ上健常なドナーのそれぞれからの新鮮クエン酸加全血１０ｍＬを、元の採血管内において１８０ｇで１０分間遠心分離した。ピペットを使って上清中の多血小板血漿を注意深く取り出し、室温に保った。
【００３４】
乏血小板血漿（ＰＰＰ）の調製：
多血小板血漿の調製から、採血管の中に残っていて、赤血球、白血球、栓球の残りおよび血漿を含有する下層を、２０００ｇで２０分間遠心分離した。ピペットを使って、透明な上清、すなわち乏血小板血漿を注意深く取り出し、室温に保った。
【００３５】
実施例１．１：血小板関連ＶＷＦのＶＷＦ活性を決定するためのリストセチン補因子アッセイ
【００３６】
４人のドナーからの上記多血小板血漿および乏血小板血漿を試料として使用した。第１アッセイ体積を調製するために、１０μＬの試料を、いずれの場合も、２０μＬのＮａＣｌ溶液（０．９％）ならびに１μＬあたり約１２０万個の固定栓球、リストセチン（１．２５ｍｇ／ｍＬ）および０．７５体積パーセントのＴｈｅｓｉｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ・ミュンヘン）を含有する試薬１５０μＬと混合して、アッセイ体積中のＴｈｅｓｉｔの体積比を０．６３％にした。洗浄剤を含まない第２アッセイ体積を調製するために、１０μＬの試料を、２０μＬのＮａＣｌ溶液（０．９％）ならびに１μＬあたり約１２０万個の固定栓球およびリストセチン（１．２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する試薬１５０μＬと混合した。各アッセイ体積における血小板凝集を、吸光度測定に基づいて決定した。凝集反応は試料のＶＷＦ活性に比例する。
【００３７】
４つの多血小板血漿試料と４つの乏血小板血漿試料との決定されたＶＷＦ活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ、標準値の％として）を、いずれの場合も平均した。平均ＶＷＦ活性（［％］、標準値の％）を表１に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
血小板関連ＶＷＦの活性を決定するために、次に、以下のうちの１つを行うことができる。
ａ）洗浄剤の存在下で多血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性と、洗浄剤の非存在下で多血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性との間の差を計算すること。すなわちこの具体例では、
１２１．８％−９５．５％＝２６．３％、または
ｂ）洗浄剤の存在下で多血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性と、洗浄剤の非存在下で乏血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性との間の差を計算すること。すなわちこの具体例では、
１２１．８％−８９．８％＝３２．０％、または
ｃ）洗浄剤の存在下で多血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性と、洗浄剤の存在下で乏血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性との間の差を計算すること。すなわちこの具体例では、
１２１．８％−９５．６％＝２６．２％。
【００４０】
こうして決定された２６．２〜３２．０％（絶対値）の範囲にある血小板関連ＶＷＦに関するＶＷＦ活性は、健常ドナーについては正しそうに思われる。というのも、血小板ＶＷＦについては全ＶＷＦの１０〜２５％という値が文献に報告されているからである（ＭｃＧｒａｔｈ，Ｒ．Ｔ．ら「Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（血小板ヴォン・ヴィレブランド因子−構造、機能および生物学的重要性）」Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０１０，１４８，８３４−８４３）。Ｔｈｅｓｉｔの非存在下での測定と比較してＴｈｅｓｉｔの存在下で乏血小板血漿において測定される５．８％増加したＶＷＦ活性はごくわずかであり、これは、アッセイの不正確さ、または洗浄剤がアッセイ系に及ぼす無視できる程度の影響に、原因があると考えることができる。
【００４１】
実施例１．２：血小板関連ＶＷＦのＶＷＦ活性を決定するためのラテックス凝集試験
【００４２】
ＩＮＮＯＶＡＮＣＥ（登録商標）ＶＷＦ  Ａｃアッセイ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ国マールブルク）は、血漿試料中のＶＷＦ活性を決定するためのラテックス凝集試験である。４人のドナーからの上記多血小板血漿および乏血小板血漿を試料として使用した。ＶＷＦ活性を決定するために、いずれの場合も、１５μＬの試料、３０μＬのオーレン・ベロナールバッファー、７０μＬの反応バッファー（これは、なかんずく、体積比０．９０％の洗浄剤Ｔｈｅｓｉｔを含有した）、１３μＬのＧＰＩｂα試薬（リストセチンの非存在下でＶＷＦに結合する単離されたＧＰＩｂαタンパク質を含有するバッファー溶液）および４０μＬのラテックス試薬（モノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体でコーティングされたラテックス粒子を含有するバッファー溶液）を混合し、粒子凝集を濁度測定法で決定した。それゆえに、アッセイ体積には、体積比０．３８％のＴｈｅｓｉｔが存在した。４つの多血小板血漿試料と４つの乏血小板血漿試料の、決定されたＶＷＦ活性（標準値の％として）を、いずれの場合も、平均した。平均ＶＷＦ活性（［％］、標準値の％）を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2014059304.tif 000004
【００４４】
洗浄剤の存在下で多血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性と、洗浄剤の存在下で乏血小板血漿において決定されたＶＷＦ活性との間の差、すなわちこの具体例では、
１２１．８％−１０２．９％＝１８．９％
が、血小板関連ＶＷＦに関連する。
【００４５】
実施例２：血小板関連第ＸＩＩＩ因子の活性の決定
【００４６】
Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ（登録商標）ＦＸＩＩＩアッセイ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ国マールブルク）を使ってＦ  ＸＩＩＩ活性を決定した。Ｆ  ＸＩＩＩａを形成させるために、試料にトロンビンを添加することによって、試料中に存在するＦ  ＸＩＩＩを活性化した。トロンビンによって形成されるフィブリンも、この反応を速める。フィブリノゲンは測定前に除去しない。というのも、それはＦ  ＸＩＩＩの喪失と関連するからである。その代わりに、トロンビン作用によって形成されるフィブリンは、集合阻害ペプチドによって凝塊を形成するのを妨げられ、溶解状態に保たれる。Ｆ  ＸＩＩＩａは、特異的ペプチド基質をグリシンエチルエステルと結びつけて、アンモニアを放出する。これが、並行して行われる酵素反応で決定される。ＮＡＤＨの減少は３４０ｎｍでの吸光度によって測定される。結果が初期測定範囲を上回った場合は、試料の１：２事前希釈をリン酸バッファーで行い、再測定を行った。
【００４７】
３人の健常ドナーからの上記多血小板血漿および乏血小板血漿を試料として使用した。１５μＬの試料を、いずれの場合も、７５μＬのＢｅｒｉｃｈｒｏｍ  ＦＸＩＩＩ活性化試薬（なかんずく、トロンビンを含有し、Ｔｈｅｓｉｔ（１．４９体積パーセント）を含むか、Ｔｈｅｓｉｔを含まない）と混合し、インキュベートした。その後、７５μＬのＢｅｒｉｃｈｒｏｍ  ＦＸＩＩＩ検出試薬（なかんずく、ＧＬＤＨ（２０ＩＵ／ｍＬ）、合成Ｆ  ＸＩＩＩペプチド基質（２．４ｇ／Ｌ）、ＡＤＰ、グリシンエチルエステル（１．４ｇ／Ｌ）およびα−ケトグルタル酸（２．７ｇ／Ｌ）を含有する）を加えて、呈色反応を開始させた。これにより、アッセイ体積において、Ｔｈｅｓｉｔの体積比は０．６８％になった。
【００４８】
さらにもう一つの実験では、試料を洗浄剤で前処理した。この目的のために、試料を体積比０．６３％のＴｈｅｓｉｔの存在下、３７℃で３０分間インキュベートしてから、それらを、第ＸＩＩＩ因子活性を決定するための試薬類と混合した。
【００４９】
３人のドナーからの多血小板血漿試料および乏血小板血漿試料の、決定された第ＸＩＩＩ因子活性（標準値の％として）を、図１に示す。
【００５０】
あるドナーからのＰＰＰ試料の第ＸＩＩＩ因子活性（どのアッセイ体積を使って活性を決定したかとはかかわりなく）と、あるドナーからのＰＲＰ試料の洗浄剤非存在下での第ＸＩＩＩ因子活性とは、いずれの場合も非常に似ていた。これは、アッセイ体積における洗浄剤の存在、洗浄剤による前処理、および栓球の存在が、第ＸＩＩＩ因子アッセイを妨害しないことの証拠になる。洗浄剤によるＰＲＰ試料の前処理とアッセイ試薬における洗浄剤の使用のどちらにおいても、要するに、アッセイ方法が洗浄剤の存在下で行われる場合は常に、多量の血小板関連第ＸＩＩＩ因子が、多血小板血漿中に放出される。これは、本発明の方法が、血漿性第ＸＩＩＩ因子に加えて、放出されうる血小板関連第ＸＩＩＩ因子の全量を捕捉することを示している。
【００５１】
第ＸＩＩＩ因子の血小板関連部分は、全量と血漿部分との間の差を計算することによって決定することができる。これにより、測定した３つの試料について、血小板関連第ＸＩＩＩ因子部分に関する表３の値が得られる。
【００５２】
【表３】
2014059304.tif 000005
【００５３】
血小板関連第ＸＩＩＩ因子の含量は、ドナー番号３の方が、ドナー番号１および２より、かなり高い。
【図１】
2014059304.tif 000006