(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なコレステロール産生抑制剤、高コレステロール血症予防・治療剤並びに動脈硬化予防剤の提供。【解決手段】トランス−レスベラトロール等のヒドロキシスチルベン類とシナピン酸との反応生成物、又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とするコレステロール産生抑制剤、高コレステロール血症予防・治療剤並びに動脈硬化予防剤。レスベラトロールより優れたコレステロール産生抑制作用を有している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2014125464.tif 000006
（但し、式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とするコレステロール産生抑制剤。
【請求項２】
式（１）：
【化２】
2014125464.tif 000007
（但し、式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする高コレステロール血症予防・治療剤。
【請求項３】
式（１）：
【化３】
2014125464.tif 000008
（但し、式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする動脈硬化予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に簡便な方法かつ食品でも応用可能な合成方法によって得られるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を有効成分とするコレステロール産生抑制剤、高コレステロール血症予防・治療剤、動脈硬化予防剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在の社会生活においては、過剰なストレスや食物摂取、運動不足が蔓延している。これらが原因となるメタボリックシンドロームが大きな社会問題になっている。メタボリックシンドロームとは、内蔵脂肪型肥満に加えて高血糖、高血圧、脂質異常のうち二つ以上を併せ持った状態であり、脳梗塞・動脈硬化・心筋梗塞などの循環器系疾患のリスクが高くなった状態である。
【０００３】
また、脂質異常症は、血液中に含まれる脂質が過剰もくしは不足している状態を指し、これまで高脂血症と呼ばれていた疾患である。脂質異常症が発症すると、血中のＬＤＬコレステロール濃度の増加（高コレステロール血症）、ＨＤＬコレステロール濃度の低下（低コレステロール血症）、中性脂肪などの脂質の増加（高トリグリセリド血症）により、動脈硬化のリスクが高くなることが知られている。
【０００４】
そこで、高コレステロール血症の治療薬として用いられている薬剤としてはヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）阻害剤であるスタチン系薬剤、コレステロールから胆汁酸への異化を促進するプロブコール、小腸にて胆汁酸の再吸収を抑制するコレスチラミン、小腸のコレステロールトランスポーターを阻害するエゼチミブなどが知られている。
【０００５】
これらの薬剤においては、その有効性から医療機関において高コレステロール血症及び脂質異常症患者に広く処方されている。しかし、これらの薬剤は有効性が高いと同時に副作用の発生も懸念されており、多くの症状が報告されている。たとえば、スタチン系薬剤では横紋筋融解症やそれに伴う腎不全、肝機能障害などがある。また、薬剤の組み合わせによりこのような副作用のリスクが増大することも知られており、商品回収などの事態にも発展しているケースがある。プロブコールやコレスチラミン、エゼチミブなどの薬剤に関しても同様である。
【０００６】
高コレステロール血症や脂質異常症などの治療のうちで安全な方法は食事療法である。しかし食事療法は患者の負担が大きく、患者にとって実施困難である場合が多い。また高コレステロール血症や脂質異常症ではないが、それに近い状況にある予備群も多く存在する。これらの予備群には前述のような薬剤を処方されることはなく、実質食事制限や運動による自然回復に依存している。しかし、その実施が困難な人が多く、高コレステロール血症や脂質異常症の発症に繋がっている。
【０００７】
このような現状から現在注目されているのが予防医学である。予防医学とは、疾患に罹っていない人が、疾患の発症を予防する効果を有する成分を日常的に摂取することで発症の予防を行うことをいう。社会保険料の増大、高齢化社会の現在において非常に有効な手段であるとされ研究が進められている。
【０００８】
予防医学において重要視されるものが有効性と安全性の両立である。予防医学では有効性を有するものを長期間摂取するため安全性の高い素材が求められている。したがって、食品由来の機能性成分を用いたものの開発が進められており、その先行技術も報告されている。たとえば、サトイモ抽出物を有効成分とするコレステロール合成阻害剤（特許文献１）、小豆煮汁抽出物を有効成分とする脂質代謝改善剤（特許文献２）、バチルス属に属する細菌の培養液を有効成分とする脂質代謝改善剤（特許文献３）、また安全性が高い漢方を用いた先行技術として、細辛の根又は根茎のエタノール抽出物を有効成分とする脂質代謝改善剤（特許文献４）などが報告されている。
【０００９】
一方、様々な植物種に含まれるヒドロキシスチルベン類は様々な生理活性を有することが報告されている。例えば、赤ワインに含まれていることで有名なレスベラトロールはブドウ果皮などに含まれるヒドロキシスチルベン類である。植物では病原菌から自己を守るファイトアレキシンとしてやＵＶ保護を目的として存在するといわれている。１９９７年、レスベラトロールに高い抗ガン作用があることが報告された（非特許文献１）。この報告によりレスベラトロールを含むヒドロキシスチルベン類の生理活性に注目が集まり、多くの疾病に効果があることが明らかにされつつある（非特許文献２）。フランスにおいて循環器系疾患の発症率が著しく低い「フレンチパラドックス」とよばれる現象は赤ワインの摂取量と相関があることが知られており、レスベラトロールの抗酸化作用・抗炎症作用などによる心血管保護作用が要因であるといわれている。このことからレスベラトロールを初めとするヒドロキシスチルベン類は有効性と安全性を兼ね備えた機能性成分として注目されている。
【００１０】
レスベラトロールはまた、高コレステロール血症モデル動物において粥状効果プラークの縮小効果が報告されており、動脈硬化の予防効果が示唆されている（非特許文献３）。またヒト投与試験においても肝臓内脂質濃度の減少や肝機能の改善など肝臓における有効性が示唆されている（非特許文献４）。これらの報告からレスベラトロールの有効性が検討されているが、日常的に摂取するには投与量が非現実的な量であることもあり、現実性に乏しい。
【００１１】
これらの現状から有効性と安全性を兼ね備えた新たな循環器系疾患の予防・治療効果を有する薬剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００３−７３２９２号公報
【特許文献２】特開２０１２−２２４６０１号公報
【特許文献３】国際公開第２００８／０２３６０８号
【特許文献４】特許第４９２９５７６号公報
【特許文献５】特開２０１２−２４６２４３号公報
【特許文献６】国際公開第２０１２／０７０６５６号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５（１０），ｐ２１８−２２０（１９９７）
【非特許文献２】Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５，ｐ４９３−５０６（２００６）
【非特許文献３】Ｉｎｔｅｒ．Ｊｏｕｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｅ．，１６，ｐ５３３−５４０（２０１１）
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ．Ｍｅｔａｂ．，１４（５），６１２−６２２（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところで、本発明者らはこれまでヒドロキシスチルベン類を始めとする機能性素材の高機能化について様々に検討しており、その一例として、ヒドロキシスチルベン類と桂皮酸類を高温あるいは高圧下で加熱処理することにより、多数の新規なヒドロキシスチルベン誘導体の合成に成功している（特許文献５、特許文献６）。これらの新規なヒドロキシスチルベン誘導体の合成方法はいずれも簡便であることのみならず、食品にも応用可能な合成方法である点で優れたものであるが、新規なヒドロキシスチルベン誘導体についての機能性についてはまだ十分に検討できていなかった。そこで、本発明者らは、これらの新規なヒドロキシスチルベン誘導体の機能性について検討したところ、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物がコレステロール産生抑制作用を有していることを見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
したがって、本発明はヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を有効成分とする新たなコレステロール産生促進剤、高コレステロール血症予防・治療剤及び動脈硬化予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の要旨は、
［１］式（１）：
【００１７】
【化１】
2014125464.tif 000002
【００１８】
（但し、式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とするコレステロール産生抑制剤、
［２］前記式（１）で示されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする高コレステロール血症予防・治療剤、
［３］前記式（１）で示されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする動脈硬化予防剤
に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の薬剤は、レスベラトロールより優れたコレステロール産生抑制作用を有していることから、新規のコレステロール産生抑制剤、さらには新規の高コレステロール血症予防・治療剤、動脈硬化予防剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は実施例２で行った肝細胞培養上清のコレステロール濃度定量結果を示す。レスベラトロール、ＵＨＡ１０２８で処理した脂肪細胞培養液中のコレステロール濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のコレステロール産生抑制剤、高コレステロール血症予防・治療剤及び動脈硬化予防剤（以下、本発明のコレステロール産生抑制剤等と略す）は、式（１）：
【００２２】
【化２】
2014125464.tif 000003
【００２３】
（但し、式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で表されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物又はその薬学的に許容可能な塩を含有することを特徴とする。
【００２４】
前記式（１）において、Ｒ1〜Ｒ4で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基である。その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基などが挙げられる。
また、Ｒ1〜Ｒ4で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基などが挙げられる。
中でも、前記Ｒ1〜Ｒ4のうち１つ以上が水素原子であることが好ましく、Ｒ1〜Ｒ4が全て水素原子であることがより好ましい。
【００２５】
本発明において、「コレステロール産生抑制剤」、「高コレステロール血症予防・治療剤」又は「動脈硬化予防剤」は、いずれもヒト又は非ヒト動物の肝臓でのコレステロールの産生を抑制できる薬剤をいう。
ヒト又は非ヒト動物の肝臓でのコレステロールの産生抑制効果は、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することで確認することができる。
【００２６】
前記式（１）で表されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物において、炭素−炭素２重結合は、トランス又はシスであってよく、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物としてはシス体とトランス体の混合物でもよい。
【００２７】
前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２８】
前記式（１）で表されるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物及びその薬学的に許容可能な塩（以下、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物と略する。）は、当該分野で周知の方法に従って化学合成することも可能ではあるが、反応工程が複雑であり、有害な試薬や工程を必要とするために安全性や回収率に課題がある。
【００２９】
そこで、本発明者らは、鋭意検討した結果、前記特許文献５、６に記載のように、ヒドロキシスチルベン類とシナピン酸を金属塩存在下で加熱処理することで、前記の化学合成法のように有害な試薬や工程を必要とせずに、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を効率的で安全に製造することができることを見出した。以下に、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の製造方法について具体的に説明する。
【００３０】
前記製造方法では、前駆体としてヒドロキシスチルベン類を用いる。
ヒドロキシスチルベン類とは、式（２）：
【００３１】
【化３】
2014125464.tif 000004
【００３２】
（但し、式（２）中、Ｒ1〜Ｒ4は、水素原子、ヒドロキシ基、炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基、あるいは炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）
で示されるヒドロキシスチルベン誘導体及びその薬学的に許容可能な塩である。
【００３３】
前記式（２）において、Ｒ1〜Ｒ4で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルコキシ基である。その具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基などが挙げられる。
また、Ｒ1〜Ｒ4で表される炭素数１〜１０の飽和又は不飽和の、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基などが挙げられる。
【００３４】
また、前記式（２）で表される化合物にはトランス体とシス体の構造異性体が存在するが、加熱や紫外線によってトランス体とシス体の変換が一部生じる。したがって、本発明では、ヒドロキシスチルベン類としては、トランス体でもシス体でも、あるいはトランス体とシス体の混合物であってもよい。
【００３５】
前記式（２）で表される化合物の薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩又はそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３６】
前記ヒドロキシスチルベン類は、ブドウ果皮から抽出・精製した天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のヒドロキシスチルベン類を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明で用いるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物が得られることから、ヒドロキシスチルベン類以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の回収率の観点からは、ヒドロキシスチルベン類換算で１重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。
前記ヒドロキシスチルベン類の具体例としては、レスベラトロール、ピセアタンノールのような化合物や、ブドウ果皮、ピーナッツ、イタドリ根もしくは根茎、パッションフルーツ種子等の原料からの抽出物、これらの抽出物の凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００３７】
また、前記製造方法では、前駆体としてシナピン酸も必要である。シナピン酸は、天然由来のものであっても、化学合成された純度の高い化成品であっても良い。天然由来のシナピン酸を用いる場合は、完全に精製されたものである必要はなく、後述のように所望の生成反応が進み最終的に本発明で用いるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物が得られるのであれば、シナピン酸以外の成分を含む混合物も使用できる。
ただし、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の回収量の観点からは、シナピン酸換算で５重量％以上含有された混合物が原料として望ましい。このような原料としては、例えば、リンゴ果実、ナタネ種子、ブロッコリー、穀物等の原料からの抽出物、凍結乾燥品等を使用してもよい。
【００３８】
前記製造方法では、ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸、又はヒドロキシスチルベン類とシナピン酸との混合物を適切な溶媒に溶解させる。この際、溶媒が水のみであれば、ヒドロキシスチルベン類やシナピン酸の水への溶解度が著しく低いために、水と有機溶媒の混合液や、有機溶媒のみに溶解させればよい。水と有機溶媒の配合比や、有機溶媒の種類については特に制限はなく、ヒドロキシスチルベン類やシナピン酸が十分に溶解すれば良い。中でも、メタノールやエタノールのみの溶媒や、水とメタノール、水とエタノール等の混合液を使用することが、安全性やコスト面から好ましい。ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を含む反応後組成物に対して最終的な精製を十分に適用せずにその組成物を食品に使用する場合には、安全性や法規面から溶媒としてエタノールや含水エタノールを使用することが望ましい。
得られるヒドロキシスチルベン類、シナピン酸、又はヒドロキシスチルベン類とシナピン酸との混合物を含有する溶液中のヒドロキシスチルベン類及びシナピン酸の濃度について特に制限はないが、それぞれの濃度が高いほど、溶媒使用量が少ない等のメリットもあるため、ヒドロキシスチルベン類及びシナピン酸の濃度は各々の溶媒に対しヒドロキシスチルベン類及びシナピン酸がそれぞれ飽和する濃度近くが好ましい。
また、ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸は前記溶液中において生成反応前に完全に溶解していなくともよい。例えば、ヒドロキシスチルベン類含有溶液とシナピン酸含有溶液とを混合する場合、それぞれの溶液中のヒドロキシスチルベン類濃度、シナピン酸濃度がともに飽和濃度以上であっても、混合液とした場合には、飽和濃度近くになるように調整しておけばよい。
【００３９】
次に、前記ヒドロキシスチルベン類及びシナピン酸を含有する溶液（以下、ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液）のｐＨを８未満に調整することが好ましい。調整方法として、例えば、ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液を調製した後にｐＨ調整剤を添加してｐＨを調整しても良いし、前記溶液の調製時に前もって溶媒のｐＨを調整しておいても良い。ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液の反応開始時のｐＨは８．０以上であれば、他の反応や目的化合物の分解も一方で生じるために最終的なヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の回収量が低下する。したがって、反応開始時のｐＨは３以上８未満が望ましい。
【００４０】
前記製造方法では、前記ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液中に金属塩を添加する。前記金属塩としては、酸性塩、塩基性塩、正塩のいずれでもよく、また、単塩、複塩、錯塩のいずれでもよい。さらに、金属塩は１種類であっても、複数種類の混合物であってもよい。金属塩の例としては、食品添加物として認可されているものが安全性の面で好ましい。例えば、食品に添加することが認められているマグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、銅塩等が挙げられる。
また、前記金属塩の混合物としては、例えば、ミネラルプレミックス（田辺製薬株式会社、グルコン酸亜鉛、クエン酸鉄アンモニウム、乳酸カルシウム、グルコン酸銅、リン酸マグネシウムを主成分としたミネラル混合物）のように金属塩を数種類含む物質が挙げられる。また、複数の金属塩を含む混合物として、ミネラルウォーターも挙げることができる。
なお、前記金属塩の含有量としては、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を生成可能な量であればよく、特に限定はない。
【００４１】
次に、金属塩存在下で、ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液を加熱処理する。この加熱処理により、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の生成反応を行う。生成反応を効率的に進ませるために、ヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液の加熱温度は１１０℃以上に調整することが好ましい。また、使用する溶媒の沸点から考え、加圧加温が望ましい。例えば、開放容器にヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液を入れ、溶媒の沸点を超える高温で前記容器を加温する、密閉容器にヒドロキシスチルベン類、シナピン酸含有溶液を入れて前記容器を加温する、レトルト装置やオートクレーブを用いて加圧加温する等、少なくとも部分的に溶液温度が１１０℃以上に達するように加熱することが好ましい。回収効率面から、溶液温度が均一に１１０℃〜１５０℃になることが、さらに好ましい。加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではなく、効率的に目的の反応が進行する時間条件とすればよい。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜１２０分の加熱時間が望ましい。また、加熱は、一度でも良いし、複数回に分けて繰り返し加熱しても良い。複数回に分けて加熱する場合、蒸発した溶媒を補うために溶媒を新たに追加して行うことが好ましい。
【００４２】
前記加熱処理によるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の生成反応の終了は、例えば、ＨＰＬＣによる成分分析によりヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の生成量を確認して判断すればよい。
【００４３】
得られる反応液中には、本発明で用いるヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物が含有されている。
また、安全な原料のみを用いた工程でヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を製造した場合には、前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を含む混合物の状態で食品、医薬品又は医薬部外品に使用することが可能である。例えば、天然由来のヒドロキシスチルベン類、シナピン酸を含水エタノール溶媒に溶解し、ミネラルウォーターやミネラルプレミックスを添加して加熱処理した場合には、得られる反応液を食品原料の一つとして使用することが可能である。
【００４４】
また、風味面での改良やさらなる高機能化を望む場合は、前記反応液を濃縮してヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の濃度を高めたり、前記反応液を精製しヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を得ることができる。濃縮、精製は、公知の方法で実施可能である。例えば、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノール等を用いた溶媒抽出法や炭酸ガスによる超臨界抽出法等で抽出してヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を濃縮できる。また、カラムクロマトグラフィーを利用して濃縮や精製を施すことも可能である。再結晶法や限外ろ過膜等の膜処理法も適用可能である。
【００４５】
また、前記反応液からヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を分離して回収する場合には、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等を用いてもよい。
【００４６】
前記濃縮物や精製物を、必要に応じて、減圧乾燥や凍結乾燥して溶媒除去することで、粉末状のヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を得ることができる。
【００４７】
また、得られたヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物は、必要に応じて、当該分野で公知の方法により、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の塩としてもよい。
【００４８】
前記のヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物は、レスベラトロールよりも優れたコレステロール産生抑制作用を有する。
したがって、本発明は、前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を有効成分として含有することで、優れたコレステロール産生抑制剤等を提供することができる。
【００４９】
本発明のコレステロール産生抑制剤等は、有効成分として前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物のみからなるものであってもよいが、前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物をエタノール又はエタノール含有水溶液等の溶媒に溶解した液剤としたり、公知の方法で乳剤、懸濁剤としたりしてもよい。本発明のコレステロール産生抑制剤等中の前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の含有量は、０．００１重量％以上であればよい。
【００５０】
本発明のコレステロール産生抑制剤等は、医薬品として製剤化してもよい。この製剤形態としては特に限定されず、例えば、注射剤、坐剤、点眼剤、軟膏剤、エアゾール剤等の非経口剤、錠剤、被覆錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、トローチ剤、チュアブル錠、シロップ剤等の経口剤等が挙げられる。製剤化の際には、薬学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤等が用いられる。
【００５１】
担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００５２】
滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。
結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００５３】
崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００５４】
希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。
安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００５５】
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。
ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００５６】
さらに本発明のコレステロール産生抑制剤等は、増量剤、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、抗酸化剤、細菌抑制剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を含んでいてもよい。
【００５７】
また、錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。また、胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。
【００５８】
本発明のコレステロール産生抑制剤等を使用する場合、例えば、前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物の摂取量は、所望の効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。前記ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物換算で、１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００５９】
また、前記新規ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
【００６０】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。ここでは、ヒドロキシスチルベン類としてトランス−レスベラトロールを用いた反応を示すが他のヒドロキシスチルベン類でも同様の反応で化合物が得られる。
【実施例】
【００６１】
（実施例１：ＵＨＡ１０２８の生成及び単離・精製）
前記特許文献６の実施例７に記載の方法に準じて、トランス−レスベラトロール、シナピン酸をエタノールに溶解し、ミネラルウォーターを加えて、レスベラトロール、シナピン酸含有溶液（ｐＨ＝４．９）を得、これをオートクレーブで１３０℃、９０分間加熱して、ヒドロキシスチルベン類・シナピン酸反応生成物を作製した。次いで、前記特許文献６の実施例８に記載の方法に準じて式（３）：
【００６２】
【化４】
2014125464.tif 000005
【００６３】
で表されるＵＨＡ１０２８を単離した。
【００６４】
（実施例２：コレステロール産生抑制作用の検証）
コレステロール産生抑制作用を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト由来肝臓ガン細胞株）を用いて評価を行った。
【００６５】
試料にはレスベラトロール、ＵＨＡ１０２８の２種類を用いた。各試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）社製）に６ｍＭ、２ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。
【００６６】
培養は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、１％アンチバイオティック−アンチマイコティック（「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ」、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含む「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ」（ＤＭＥＭ、商品名、Ｓｉｇｍａ社製）を用いていった。試験に使用するＨｅｐＧ２細胞は定法に従って調整した。つまり、細胞培養用２４ｗｅｌｌプレート（ＩＷＡＫＩ社製）にＨｅｐＧ２細胞を１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで５００μＬ播種して３７℃、５％ＣＯ2条件下で４８時間培養し、１００％コンフルエントしたものを使用した。
【００６７】
試験は以下のように行った。各試料を２．５μＬ（終濃度３０μＭ、１０μＭ）添加したＤＭＥＭ（維持培地）に交換して７２時間培養した。
【００６８】
培養終了後、培地を回収してコレステロールの定量に使用した。コレステロールの定量には「Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）を使用した。
測定は付属の取扱説明書に準じて行った。培養上清とキット付属の試薬を反応させ、５７０ｎｍの吸光度を測定し、検量線からコレステロール濃度を算出した。結果を図２に示す。
【００６９】
図１に示す結果より、ＵＨＡ１０２８は、同じ濃度のレスベラトロールよりコレステロール濃度が低かったことから、レスベラトロールよりも優れたコレステロール産生抑制作用が確認された。
したがって、ＵＨＡ１０２８を有効成分として含有する薬剤は、ヒト又は非ヒト動物の肝臓にてコレステロールの産生を抑制するコレステロール産生抑制剤として使用できることがわかる。また、前記薬剤は、優れたコレステロール産生抑制作用を有することから、公知の高コレステロール血症の治療薬と同様に、ヒト又は非ヒト動物の血中コレステロール濃度を低減させる高コレステロール血症予防・治療剤また動脈硬化予防剤として使用できることがわかる。
【００７０】
なお、ＵＨＡ１０２８について、本発明者らは、これまでに抗癌作用（特願２０１１−１１８３８２）、ヒト血管内皮細胞におけるサーチュイン発現促進作用（特願２０１１−１１８３６７）、成熟脂肪細胞におけるアディポネクチン産生促進作用（特願２０１１−１４５３３１）、成熟脂肪細胞におけるリポプロテインリパーゼ促進作用（特願２０１１−１８６０５４）、前駆脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化抑制作用（特願２０１２−２４０３６４）等を有することを確認しているが、コレステロール産生抑制に対する効果については確認しておらず、一般的にも未だ知られていない。
【図１】
2014125464.tif 000009