(57)【要約】【課題】補酵素を単純な方法で再生し、且つ目的物質を容易に精製できる酵素修飾電極を提供することを目的とする。より高感度で対象物質の定量測定ができる新たな物質測定センサーを提供することを目的とする。【解決手段】導電体に、酵素、補酵素、および前記導電体と前記補酵素との間の電子伝達を仲介する電子伝達メディエーターが、アミノ基を有する高分子化合物およびカルボキシ基を有する高分子化合物を介してそれぞれ共有結合により固定されてなる酵素修飾電極であって、前記電子伝達メディエーターの単位面積当たりの含有量が、１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上である酵素修飾電極とする。前記酵素修飾電極を用いて、化学物質を酸化還元反応させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１、酵素２および導電体を含む酵素修飾電極であって、
前記酵素１は前記電子伝達メディエーターと前記補酵素の間の電子伝達を触媒する酵素であり、
前記酵素２は、目的の反応を触媒する酵素または酵素群であり、
前記補酵素は、前記酵素２に対する補酵素であり、
前記電子伝達メディエーターが共有結合により固定された前記アミノ基を有する高分子化合物が、前記導電体の表面の少なくとも一部を被覆して、第１の被覆層を形成しており、
前記カルボキシ基を有する高分子化合物が、前記第１の被覆層の表面の少なくとも一部を被覆して、第２の被覆層を形成しており、
前記カルボキシ基を有する高分子化合物に、前記酵素１、前記補酵素および前記酵素２が共有結合により固定されており、
前記電子伝達メディエーターの単位面積当たりの含有量が、１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上である、
酵素修飾電極。
【請求項２】
前記酵素１および前記酵素２のうちの少なくとも１つの酵素が、前記第１の被覆層の表面または前記第２の被覆層の層内に共有結合により固定されている、請求項１に記載の酵素修飾電極。
【請求項３】
前記酵素２が酸化還元反応を触媒する酵素である請求項１または請求項２に記載の酵素修飾電極。
【請求項４】
前記アミノ基を有する高分子化合物が、ポリアリルアミンであり、
前記カルボキシ基を有する高分子化合物が、ポリアクリル酸であり、
前記電子伝達メディエーターが、ピロロキノリンキノンであり、
前記補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、
前記酵素１が、ジアホラーゼであり、
前記酵素２が、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼのうち少なくとも一種を含む酵素であり、
前記導電体が、グラファイトフェルトである請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素修飾電極。
【請求項５】
導電体に、アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１および酵素２を固定してなる酵素修飾電極の製造方法であって、
前記酵素１は前記電子伝達メディエーターと前記補酵素の間の電子伝達を触媒する酵素であり、
前記酵素２は、目的の反応を触媒する酵素または酵素群であり、
前記補酵素は、前記酵素２に対する補酵素であり、
前記電子伝達メディエーターと縮合剤との反応液に前記アミノ基を有する高分子化合物を混合させた溶液に前記導電体を浸漬して、前記導電体の表面の少なくとも一部に第１の被覆層を形成する工程、
次いで、前記カルボキシ基を有する高分子化合物を含有する溶液に浸漬して、前記第１の被覆層の表面の少なくとも一部に第２の被覆層を形成する工程、
前記第２の被覆層に、前記酵素１、前記補酵素および前記酵素２を順次固定する工程を含む、
酵素修飾電極の製造方法。
【請求項６】
導電体に、アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１および酵素２を固定してなる酵素修飾電極の製造方法であって、
前記酵素１は前記電子伝達メディエーターと前記補酵素の間の電子伝達を触媒する酵素であり、
前記酵素２は、目的の反応を触媒する酵素または酵素群であり、
前記補酵素は、前記酵素２に対する補酵素であり、
前記電子伝達メディエーターと縮合剤との反応液に前記アミノ基を有する高分子化合物を混合させた溶液に前記導電体を浸漬して、前記導電体の表面の少なくとも一部に第１の被覆層を形成する工程、
前記第１の被覆層に前記酵素１を固定する工程、
前記カルボキシ基を有する高分子化合物を含有する溶液に、前記酵素１が固定した前記第１の被覆層が形成された導電体を浸漬して、前記第１の被覆層の表面の少なくとも一部に第２の被覆層を形成する工程、
前記第２の被覆層に、前記補酵素および前記酵素２を順次固定する工程を含む、
酵素修飾電極の製造方法。
【請求項７】
前記補酵素で修飾された前記酵素２を、前記第２の被覆層に固定する、請求項５または請求項６に記載の酵素修飾電極の製造方法。
【請求項８】
酸化還元酵素を触媒とする電気的酵素反応を連続的または非連続的に行うための電気化学反応装置であり、反応槽内に、少なくとも一方が請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素修飾電極である一対の電極と、電解質を含む溶媒と、基質とを含む電気化学反応装置。
【請求項９】
請求項８に記載の電気化学反応装置を用いて、酸化反応または還元反応によって化学物質を製造する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素修飾電極、該酵素修飾電極の製造方法、およびこれを用いた電気化学反応装置、並びに該電気化学反応装置を使用した化学物質の製造方法に関し、特に前記酵素修飾電極を用いた電気化学反応装置によって光学活性を有する化学物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の光学活性を有する化学物質が医薬品や農薬などの原料として使用されている。酵素は立体特異的に酸化還元反応を触媒することから光学活性を有する化学物質の合成には非常に適した生体触媒である。いくつかの重要な光学活性医薬中間体が酵素反応を利用して製造されている。酵素により触媒される酸化還元反応には基質との間で直接電子や水素イオンの授受を行う補酵素と呼ばれる化学物質が必要である。反応を持続させるためには基質量に見合った量の補酵素が必要であるが、一般的に補酵素は高価であるため目的物質を大量に製造する際にはコスト的に不利である。この課題を解決するために、目的の反応と同時に補酵素の再生反応が進行するように全体の反応が設計される（例えば、特許文献１、特許文献２参照。）。
【０００３】
すなわち、目的物質の還元（酸化）によって酸化（還元）された補酵素は、同じ反応系中に組み込まれた別の酸化還元酵素によって酸化（還元）反応に使用されることにより元の状態に再生される。酵素による還元反応の場合、補酵素再生反応にはグルコースオキシダーゼによりグルコースを酸化してグルクロン酸を生成する反応、またはギ酸デヒドロゲナーゼによりギ酸を酸化してホルムアルデヒドを生成する反応が利用される。これらの反応の際、酸化型補酵素は、グルコース、またはギ酸から電子とプロトンを受け取り還元型補酵素に還元される。しかしながらこの方法では目的の反応に必要とされる酵素の他に補酵素再生に必要とされる酵素および基質を投入する必要があるため反応系が複雑になる、コストが嵩むという欠点がある。また、酵素活性の不安定性や再利用ができないためにコストが嵩むという課題も残る。さらに反応終了後の系内には目的物質の他に目的の反応に使用された酵素、補酵素、補酵素再生に使用された酵素、基質、補酵素再生反応によって生成した生成物が混在するため目的物質の精製の点からも不利である。
【０００４】
一方、目的の反応を触媒する酵素遺伝子と補酵素再生反応に必要とされる酵素遺伝子とを菌体に組み込み、その菌体を用いた反応により目的物質を製造する方法がある（例えば特許文献３参照。）。この方法では目的物質の精製の点からは上記酵素反応よりも有利であるが補酵素再生系の基質と生成物が反応系中に目的物質と混在する点は変わらない。また、菌体反応全般の課題であるが、反応基質および目的生成物の菌体膜透過性の問題や菌体内にもともと存在する酵素による好ましくない反応で生じる副生物の生成を抑制する必要が生じるという問題がある。
【０００５】
また、酵素を用いた酸化還元反応による化合物製造において、電極と補酵素間での電子の授受を触媒する化学物質を用いて間接的電気化学反応により補酵素の再生を行う方法も開示されている（例えば特許文献４参照。）。この場合、目的の反応によって生成した酸化型補酵素は触媒を介して電極から電子を受け取ることによって元の還元状態の補酵素に再生される。そのためこの方法によれば補酵素再生に必要とされる酵素と基質が必要ないので反応系が単純化される。しかしながらここで開示された方法では目的の反応に使用された酵素、補酵素および補酵素再生のための触媒が反応溶液中に混在するため生成物の精製の点について課題が残る。
【０００６】
特許文献５では補酵素再生を目的として、電解重合によりアミノ基を有する重合物層を炭素板上に形成し、そのアミノ基を介して電子伝達メディエーターを固定した電極、および前記電子伝達メディエーターが固定された電極にさらに補酵素および／または補酵素を再生するための酸化還元酵素を固定した電極が開示されている。これらの電極はもっぱら補酵素再生反応に特化した電極であるため、光学活性を有する化学物質を合成する場合には別途反応系中に目的の反応を触媒する酵素を添加しなければならない。そのためこの手法では目的酵素の再利用、活性の安定性、目的物質の精製について課題が残る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４４２６４３７号公報
【特許文献２】特開２００２−２３３３９５号公報
【特許文献３】特開２００４−１５９５８７号公報
【特許文献４】特表２００３−５３３２０８号公報
【特許文献５】特開平０６−１５３９０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
酵素を用いた化学物質の合成反応は基質特異的、部位特異的、立体特異的であるため非常に有用であるものの補酵素が高価であるため、化学物質を大量に生産する場合にはコスト的に不利である。この問題を解決するために、目的の反応と補酵素再生反応とを組み合わせる方法や、目的酵素遺伝子と、補酵素再生反応を触媒する遺伝子を組み込んだ微生物を用いる方法が開発されている。これらの方法は補酵素を再生しながら目的の反応を行うことができるため経済的であるが、補酵素再生反応に必要な基質が必要である、目的物質の精製が煩雑になる、副生物が生成するなどの問題がある。そのため補酵素を単純な方法で再生し、且つ目的物質を容易に精製できる方法の確立が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、目的の化学物質の製造に必要な酵素、前記酵素に対応する補酵素、補酵素再生に必要となる酵素、および電子伝達メディエーターがそれぞれ導電体に固定された酵素修飾電極であって、電子伝達メディエーターが一定量以上含有された酵素修飾電極とすることで、低過電圧で高選択性の反応を触媒可能な電極が作製可能となり、さらに酵素、補酵素、電子伝達メディエーターの有効利用、電極外への漏出防止、および電極の連続使用・長期使用が可能になることを見出し、本願発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明は下記の構成を有する。
［１］アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１、酵素２および導電体を含む酵素修飾電極であって、前記酵素１は前記電子伝達メディエーターと前記補酵素の間の電子伝達を触媒する酵素であり、前記酵素２は、目的の反応を触媒する酵素または酵素群であり、前記補酵素は、前記酵素２に対する補酵素であり、前記電子伝達メディエーターが共有結合により固定された前記アミノ基を有する高分子化合物が、前記導電体の表面の少なくとも一部を被覆して、第１の被覆層を形成しており、前記カルボキシ基を有する高分子化合物が、前記第１の被覆層の表面の少なくとも一部を被覆して、第２の被覆層を形成しており、前記カルボキシ基を有する高分子化合物に、前記酵素１、前記補酵素および前記酵素２が共有結合により固定されており、前記電子伝達メディエーターの単位面積当たりの含有量が、１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上である、酵素修飾電極。
［２］前記酵素１および前記酵素２のうちの少なくとも１つの酵素が、前記第１の被覆層の表面または前記第２の被覆層の層内に共有結合により固定されている、前記［１］に記載の酵素修飾電極。
［３］前記酵素２が酸化還元反応を触媒する酵素である前記［１］または［２］に記載の酵素修飾電極。
［４］前記アミノ基を有する高分子化合物が、ポリアリルアミンであり、前記カルボキシ基を有する高分子化合物が、ポリアクリル酸であり、前記電子伝達メディエーターが、ピロロキノリンキノンであり、前記補酵素が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、前記酵素１が、ジアホラーゼであり、前記酵素２が、ギ酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼのうち少なくとも一種を含む酵素であり、前記導電体が、グラファイトフェルトである前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の酵素修飾電極。
［５］導電体に、アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１および酵素２を固定してなる酵素修飾電極の製造方法であって、前記酵素１は前記電子伝達メディエーターと前記補酵素の間の電子伝達を触媒する酵素であり、前記酵素２は、目的の反応を触媒する酵素または酵素群であり、前記補酵素は、前記酵素２に対する補酵素であり、前記電子伝達メディエーターと縮合剤との反応液に前記アミノ基を有する高分子化合物を混合させた溶液に前記導電体を浸漬して、前記導電体の表面の少なくとも一部に第１の被覆層を形成する工程、次いで、前記カルボキシ基を有する高分子化合物を含有する溶液に浸漬して、前記第１の被覆層の表面の少なくとも一部に第２の被覆層を形成する工程、前記第２の被覆層に、前記酵素１、前記補酵素および前記酵素２を順次固定する工程を含む、酵素修飾電極の製造方法。
［６］導電体に、アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１および酵素２を固定してなる酵素修飾電極の製造方法であって、前記酵素１は前記電子伝達メディエーターと前記補酵素の間の電子伝達を触媒する酵素であり、前記酵素２は、目的の反応を触媒する酵素または酵素群であり、前記補酵素は、前記酵素２に対する補酵素であり、前記電子伝達メディエーターと縮合剤との反応液に前記アミノ基を有する高分子化合物を混合させた溶液に前記導電体を浸漬して、前記導電体の表面の少なくとも一部に第１の被覆層を形成する工程、前記第１の被覆層に前記酵素１を固定する工程、前記カルボキシ基を有する高分子化合物を含有する溶液に、前記酵素１が固定した前記第１の被覆層が形成された導電体を浸漬して、前記第１の被覆層の表面の少なくとも一部に第２の被覆層を形成する工程、前記第２の被覆層に、前記補酵素および前記酵素２を順次固定する工程を含む、酵素修飾電極の製造方法。
［７］前記補酵素で修飾された前記酵素２を、前記第２の被覆層に固定する、前記［５］または［６］に記載の酵素修飾電極の製造方法。
［８］酸化還元酵素を触媒とする電気的酵素反応を連続的または非連続的に行うための電気化学反応装置であり、反応槽内に、少なくとも一方が前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の酵素修飾電極である一対の電極と、電解質を含む溶媒と、基質とを含む電気化学反応装置。
［９］前記［８］に記載の電気化学反応装置を用いて、酸化反応または還元反応によって化学物質を製造する製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の酵素修飾電極を用いることで、従来の酵素的手法を用いて化学物質を製造する場合に比べて、単純な反応系で、かつ低コストで反応させることができ、さらに、その反応速度をより速め、かつより高い電流効率で反応させることができる。また、反応に係る成分がすべて電極に固定されているため反応系からの目的物質の精製が容易となる。特に、生体触媒を用いたケトン類の不斉還元反応が単純な反応系で、かつ低コストで行うことができる。
【００１２】
本発明の酵素修飾電極によれば、酵素による触媒作用と電源から供給される電子によって化学物質が酸化または還元される。この反応は酵素反応であるため穏和な条件で進行し、目的反応、および補酵素再生反応に必要な全ての物質が電極に固定されているため電流効率が高い。すなわち投入された電子のほとんどが、補酵素の再生を介して化学物質を酸化又は還元して生成物を生成する反応に消費される。
【００１３】
本発明の酵素修飾電極と、それを用いた電気化学反応装置によれば、カルボン酸類から対応するアルデヒド類またはアルコール類を、アルデヒド類および／またはケトン類から対応するアルコール類を穏和な条件で効率的に製造することができる。また、アルコール類からは対応するアルデヒド類またはカルボン酸類を、アルデヒド類からは対応するカルボン酸類を穏和な条件で効率的に製造することができる。さらに、この方法で製造されるアルコール類および／またはアルデヒド類は、酵素を触媒としているため、立体特異性を有した状態で製造することができる。同様に本発明の酵素修飾電極と、それを用いた電気化学反応装置によれば、二酸化炭素を還元してメタノールのみならず、ホルムアルデヒド、またはギ酸の製造が、メタノールを酸化してホルムアミド、またはギ酸、または二酸化炭素を、ホルムアルデヒドを酸化してギ酸、または二酸化炭素を、ギ酸を酸化して二酸化炭素を製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】比較例１のピロロキノリンキノン修飾グラファイトフェルト電極１のサイクリックボルタンメトリーによる測定結果を示す図である。
【図２】実施例１のピロロキノリンキノン修飾グラファイトフェルト電極２のサイクリックボルタンメトリーによる測定結果を示す図である。
【図３】実施例２、３および比較例２の電極を用いたメタノール生産におけるガスクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す図である。
【図４】種々の基質濃度における実施例３の電極のサイクリックボルタンメトリーによる測定結果を示す図である。
【図５】実施例３、４の電極を用いたメタノール生産におけるガスクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す図である。
【図６】比較例３の電極を用いたメタノール生産におけるガスクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す図である。
【図７】実施例５の電極を用いたメタノール生産におけるガスクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す図である。
【図８】実施例６の電極を用いたメタノール生産におけるガスクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（酵素修飾電極）
本発明の酵素修飾電極は、アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物、電子伝達メディエーター、補酵素、酵素１、酵素２が、導電体に固定されている。アミノ基を有する高分子化合物およびカルボキシ基を有する高分子化合物は、電荷を有する高分子化合物である。電子伝達メディエーターは、導電体と補酵素との間の電子伝達を仲介する機能を有する化合物である。酵素１は電子伝達メディエーターと補酵素との電子伝達を触媒する酵素である。酵素２は目的の反応を触媒する酵素、または酵素群である。導電体は、繊維状の導電性物質からなるフェルトであり、アミノ基を有する高分子化合物が、導電体の表面の少なくとも一部を被覆して、第１の被覆層を形成しており、第１の被覆層上に電子伝達メディエーターが、共有結合により固定されており、さらにカルボキシ基を有する高分子化合物が、電子伝達メディエーターおよび第１の被覆層の表面の少なくとも一部を被覆して、第２の被覆層を形成しており、第２の被覆層上に補酵素および酵素が、共有結合により固定されてなる。
【００１６】
本発明の酵素修飾電極は、電子伝達メディエーターの単位面積当たりの含有量が、１０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上である。酵素修飾電極における電子伝達メディエーターの単位面積当たりの含有量は、１０〜５０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であることが好ましく、１５〜３０ｎｍｏｌ／ｃｍ２であることがより好ましい。電子伝達メディエーターの含有量が２０ｎｍｏｌ／ｃｍ２以上であれば、電子の移動が可逆的に進行するため好ましい。
【００１７】
また、本発明の酵素修飾電極は、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）で測定した際の電極反応挙動について、還元電位と、還元反応を起こした後に再度酸化させた際の電位（以下、「再酸化電位」という。）との差が０．０４〜０．２Ｖであることが好ましい。還元電位と再酸化電位との差は酵素修飾電極の抵抗の大きさを表し、その差が小さければ小さいほど電子移動速度が速いということがわかる。還元電位と再酸化電位との差が０．２Ｖ以下であれば、準可逆的に電子移動が進行するため好ましく、０．０５９Ｖ以下であれば、可逆的に電子移動が進行するためより好ましい。そして、還元電位と再酸化電位との差が０．０４Ｖ以上であると、多層構造的な固定様式であることが示されることとなるため好ましい。また、還元電位と再酸化電位との差は、０．０４〜０．１Ｖがより好ましく、０．０５〜０．０７Ｖがさらに好ましく、０．０５〜０．０５９Ｖが最も好ましい。
【００１８】
（導電体）
本発明で用いられる導電体は、導電性物質からなるフェルトである。導電体は、酵素修飾電極の使用に際して、外部回路と電気的に接続されることにより、電子の授受をするものであればいずれの材料でもよく、例えば、グラッシーカーボン等が挙げられる。特に、比表面積の大きさの観点から、グラファイトからなるフェルト（以下、グラファイトフェルトということがある。）が好ましい。
【００１９】
（酵素および補酵素）
本発明で用いられる酵素１は電子伝達メディエーターと補酵素の間の酸化還元反応を触媒する酵素であり、酵素２は、酸化還元反応を触媒する酵素であり、補酵素は、前記酸化還元反応を触媒する酵素２に対応するものであればよく、製造を目的とする化学物質の反応系により、適宜選択することができる。例えば、酵素１としてジアホラーゼ等を挙げることができ、酵素２としてギ酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の酵素番号（ＥＣ）第１群に分類される酵素を挙げることができ、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、チアミン二リン酸、ビタミンＢ６類、パントテン酸、ビオチン、葉酸、ビタミンＢ１２類、ピロロキノリンキノン、トパキノン、トリプトファン−トリプトフィルキノン、リシンチロシルキノン、システニル−トリプトファンキノン等の補酵素を挙げることができ、製造する目的の化合物に応じてこれらを適宜組み合わせて用いることができる。
【００２０】
（電子伝達メディエーター）
本発明で用いられる電子伝達メディエーターは、導電体と補酵素との間の電子伝達を仲介するものであればいずれでもよく、例えば、フェロセン、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン、ピロロキノリンキノン等を挙げることができる。
【００２１】
（アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物）
アミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物としては、それぞれポリアリルアミン、ポリアクリル酸等が挙げられる。高分子化合物として電荷を有しない高分子化合物を使用した場合、アミノ基を有する高分子化合物およびカルボキシ基を有する高分子化合物に、電子伝達メディエーター、酵素、補酵素を共有結合で固定することができない。そのため、アミノ基を有する高分子化合物およびカルボキシ基を有する高分子化合物は、電荷を有する高分子化合物を用いる必要がある。この場合、カルボキシ基を有する高分子化合物として、水中においてアミノ基を有する高分子化合物と同じ電荷を有する高分子化合物、または水中においてアミノ基を有する高分子化合物と対の電荷を有する高分子化合物を使用することができる。カルボキシ基を有する高分子化合物として、水中においてアミノ基を有する高分子化合物と同じ電荷を有する高分子化合物を使用する場合に比べ、水中においてアミノ基を有する高分子化合物と対の電荷を有する高分子化合物を使用する方が、両高分子化合物間に働く静電相互作用により、カルボキシ基を有する高分子化合物がアミノ基を有する高分子化合物の表面により安定的に被覆されるため好ましい。
【００２２】
酵素、補酵素及び電子伝達メディエーターと、これらのアミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物が有する反応性官能基とを共有結合させるには、例えば、アミノ基とカルボキシ基を脱水縮合するための縮合剤（例えば、水溶性カルボジイミド等）等を用いることが好ましい。
【００２３】
酵素、補酵素及び電子伝達メディエーターをそれぞれ共有結合によりアミノ基を有する高分子化合物、カルボキシ基を有する高分子化合物を介して導電体に固定させる方法としては、特に限定的ではないが、例えば、導電体を、酵素、補酵素、電子伝達メディエーター、上記官能基を有する高分子化合物及び縮合剤を含有する溶液に浸漬させて、あるいは、該溶液を導電体に塗布、スプレー等した後、乾燥させることにより、酵素、補酵素及び導電体が共有結合した高分子化合物により被覆された導電体を得ることができる。上記の酵素、補酵素及び電子伝達メディエーターの固定は、一段階で行ってもよいし、二段階以上に分けて、例えば、アミノ基を有する高分子化合物を介して、導電体に電子伝達メディエーターを固定した後、該被覆したアミノ基を有する高分子化合物上に酵素１及び補酵素、酵素２を固定させてもよいが、アミノ基を有する高分子化合物を介して電子伝達メディエーターと酵素１を固定した後、カルボキシ基を有する高分子化合物で前記電子伝達メディエーターおよび酵素１を固定した電極を被覆し、その後に補酵素及び酵素２を、それぞれ逐次的に、または同時に固定させることがより好ましい。
【００２４】
（酵素修飾電極の作製）
酵素修飾電極の作製は特に限定されないが、例えば次のように行うことができる。例えばピロロキノリンキノン（電子伝達メディエーター）と、該ピロロキノリンキノンとアミノ基とカルボキシル基とを脱水縮合するための縮合剤（例えば水溶性カルボジイミド）とを反応させたメタノール水溶液に、アミノ基を有する高分子化合物（例えばポリアリルアミン）を混合したメタノール水溶液にグラファイトフェルトを浸漬後、減圧乾燥することで前記ピロロキノリンキノンが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを得ることができる。次に例えばジアホラーゼ（酵素１）と、アミノ基とカルボキシル基とを脱水縮合するための縮合剤（例えば水溶性カルボジイミド）とを含むメタノール水溶液に、前記ピロロキノリンキノンが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを浸漬後、減圧乾燥することで前記ピロロキノリンキノンと前記ジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを得ることができる。さらに、カルボキシ基を有する高分子化合物（例えばポリアクリル酸）を含むメタノール水溶液に前記ピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを浸漬後、減圧乾燥することでポリアクリル酸で被覆されたピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを得ることができる。さらに、アルコールデヒドロゲナーゼ（酵素２）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（補酵素）と、水溶性カルボジイミドとを含むメタノール水溶液に前記ポリアクリル酸で被覆されたピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを浸漬後、減圧乾燥することで、ピロロキノリンキノンと、ジアホラーゼと、アルコールデヒドロゲナーゼと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとが共有結合で固定された高分子化合物で被覆されたグラファイトフェルトからなる酵素修飾電極が作製できる。
【００２５】
本発明において、上記作製方法では、ピロロキノリンキノンが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトのピロロキノリンキノンと未反応であったポリアリルアミンのアミノ基にジアホラーゼを共有結合させた後にポリアクリル酸で被覆したが、カルボキシ基を有する高分子化合物（例えばポリアクリル酸）を含むメタノール水溶液にピロロキノリンキノンが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを浸漬し、減圧乾燥することでポリアクリル酸で被覆されたピロロキノリンキノンが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを得た後で、ジアホラーゼと、アミノ基とカルボキシル基とを脱水縮合するための縮合剤（例えば水溶性カルボジイミド）とを含むメタノール水溶液に浸漬、減圧乾燥して、ポリアクリル酸で被覆されたピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを得てもよい。
【００２６】
また、上記作製方法では、アルコールデヒドロゲナーゼと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドと、水溶性カルボジイミドとを含むメタノール水溶液、すなわち酵素２と補酵素を先に縮合剤で活性化させた水溶液に、ポリアクリル酸で被覆されたピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを浸漬したが、まず先に、補酵素と縮合剤を含む水溶液にポリアクリル酸で被覆されたピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンにより被覆されたグラファイトフェルトを浸漬した後、酵素２と縮合剤を含む水溶液に浸漬してもよい。
【００２７】
（電気化学反応装置）
前記酵素修飾電極を用いた化学物質の製造は、下記の構成の電気化学反応装置で行うことができる。電気化学反応装置は少なくとも、電力源に接続された安定化電源、前記安定化電源にそれぞれ接続された前記酵素修飾電極、対となる電極、参照電極、窒素ガス等を通気するための管、排気のための管および温調用のウォータージャケットを有する蓋付の水槽から構成される。ここで前記３つの電極は、溶液を入れた際に溶液中に浸るように設置され、さらに窒素ガス等が排出される側の管の先端が、溶液を入れた際に溶液の表面下になるように水槽に設置されている。また、水槽内は蓋を閉じることによって外気から遮断される。安定化電源が接続される電力源は一般的な家庭用のコンセントでよいが、燃料電池、太陽光発電、水力発電、風力発電、地熱発電などの自然エネルギー由来の電力源でもよい。
【００２８】
上記構成の電気化学反応装置で化学物質の還元反応を行う場合、水槽に基質となる化学物質と電解液、例えばリン酸緩衝液を満たした後、安定化電源で参照電極と酵素修飾電極間との電位を−０．６±０．１Ｖに保てばよい。また、ウォータージャケットに温度制御した溶媒を流すことで、水槽内の電解質の温度を適当な温度に保つことができる。通電中、溶液と電極の界面において、基質となる化学物質は酵素の作用により、補酵素から電子と水素イオンを受け取り還元される。基質となる化学物質に電子と水素イオンを渡すことで酸化型となった補酵素はジアホラーゼの作用によってピロロキノリンキノンから電子と水素イオンを受け取り、再び還元型の補酵素となる。さらに、酸化型の補酵素に電子と水素イオンを渡すことで酸化型となったピロロキノリンキノンは酵素修飾電極を構成する導電体を介して電源由来の電子と、電解液中に存在する水素イオンを受け取り、再び還元型ピロロキノリンキノンとなる。以上の一連の反応により、基質となる化学物質は酵素の触媒作用によって還元され、この反応で消費された電子、および水素イオンはそれぞれ、電力源、および電解液から供給される。酸化反応の場合は上記一連の反応が逆方向に進行する。
【００２９】
（Ｌ−フェニルアラニノール製造用の酵素修飾電極）
以下、ラセミ体のフェニルアラニンを還元してＬ−フェニルアラニノールを生成する場合を例にして説明する。
その場合には、第１の被覆層として、電子伝達メディエーターであるピロロキノリンキノンとジアホラーゼが共有結合したポリアリルアミンで被覆され、次いで、第２の被覆層として、アルコールデヒドロゲナーゼ、前記アルコールデヒドロゲナーゼの補酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとが共有結合したポリアクリル酸で被覆されたグラファイトフェルトである酵素修飾電極を用いることができる。
【００３０】
ここで使用されるアルコールデヒドロゲナーゼはその由来によらず、ＥＣ１．１．１．１、またはＥＣ１．１．１．２、またはＥＣ１．１．１．７１で規定される活性を有するものであればよく、ジアホラーゼはその由来によらず、ＥＣ１．８．１．４で規定される活性を有する酵素であればよい。
【００３１】
また、ここで使用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、その由来によらず、酸化型でも還元型でもよく、その遊離酸でも塩でもよく、どの状態のものを固定してもよいが、還元型のナトリウム塩がより好ましい。さらに、ここで使用されるピロロキノリンキノンは、その由来によらず、酸化型でも還元型でもよく、その遊離酸でも塩でもよく、どの状態のものを固定してもよいが、還元型の遊離酸がより好ましい。
【００３２】
（Ｌ−フェニルアラニノールの製造法）
前記酵素修飾電極を用いたラセミ体のフェニルアラニンの還元によるＬ−フェニルアラニノールの製造は下記の構成の電気化学反応装置で行うことができる。電気化学反応装置は、電力源に接続された安定化電源、前記安定化電源にそれぞれ接続された前記酵素修飾電極、対となる電極、参照電極および温調用のウォータージャケットを有する蓋付の水槽から構成される。ここで前記３つの電極は、溶液を入れた際に溶液中に浸るように設置されている。また、水槽内は蓋を閉じることによって外気から遮断される。安定化電源が接続される電力源は一般的な家庭用のコンセントでよいが、燃料電池、太陽光発電、水力発電、風力発電、地熱発電などの自然エネルギー由来の電力源でもよい。
【００３３】
ラセミ体のフェニルアラニンの還元によるＬ−フェニルアラニノール生産を行う場合は、前記水槽に電解液、例えばリン酸緩衝液を含むラセミ体のフェニルアラニンを満たし、前記電解液を含むラセミ体のフェニルアラニンに窒素ガスを通気することで、溶液中に存在する酸素を除去した後、安定化電源で参照電極と酵素修飾電極間との電位を−０．５±０．１Ｖに保つことが好ましい。また、ウォータージャケットに温度制御した溶媒を流すことで、水槽内の電解質の温度を適当な温度に保つことができる。通電中、溶液と電極の界面において、Ｌ−フェニルアラニンのみがアルコールデヒドロゲナーゼの作用により、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドから電子と水素イオンを受け取りＬ−フェニルアラニノールに還元される。ところで、Ｌ−フェニルアラニンに電子と水素イオンを渡すことで酸化型となったニコチンアミドアデニンジヌクレオチドはジアホラーゼの作用によってピロロキノリンキノンから電子と水素イオンを受け取り、再び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとなる。さらに、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに電子と水素イオンを渡すことで酸化型となったピロロキノリンキノンは酵素修飾電極を構成する導電体を介して電源由来の電子と、電解液中に存在する水素イオンを受け取り、再び還元型ピロロキノリンキノンとなる。
【００３４】
以上の一連の反応により、Ｌ−フェニルアラニンは酵素の触媒作用によってＬ−フェニルアラニノールに還元され、この反応で消費された電子および水素イオンは、それぞれ電力源および電解液から供給される。この還元反応は、電力源からの電子の供給が遮断されない限り、または電解液中のＬ−フェニルアラニンがなくなるまで進行し、電解液中にＬ−フェニルアラニノールが蓄積する。また、Ｌ−フェニルアラニンを供給し続けることで連続的にＬ−フェニルアラニノールを生成することが可能である。
【実施例】
【００３５】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
本発明の略号の定義は次のとおりである。
【００３７】
ＧＦ：グラファイトフェルト（比表面積：０．７ｍ２／ｇ）、ＰＡＡ：ポリアリルアミン、ＰＡＡｃ：ポリアクリル酸、ＰＱＱ：ピロロキノリンキノン、ＮＡＤＨ：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＦＤＨ：ギ酸デヒドロゲナーゼ、ＡＤＨ：アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｄｐ：ジアホラーゼ、ＷＳＣ：水溶性カルボジイミド、ＳＣＥ：飽和カロメロ電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ：銀／塩化銀電極
・ポリアクリル酸（和光純薬工業社製  重量平均分子量１，４００，０００）
・ポリアリルアミン（日東紡績社製  重量平均分子量７０，０００）
【００３８】
〔サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）による測定〕
ビー・ビー・エス社製「電気化学ＱＣＭアナライザー（ＡＬＳモデル４２０Ａ）」を用いた。
測定条件は、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに作用極として評価対象の電極、対極として白金線、参照電極としてＳＣＥ、またはＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。酸素を除去するため１０分間窒素ガスを通気した後、５０ｍＶ／秒の掃引速度で参照電極に対してある範囲の内で電圧を連続的に変化させ、その際に流れる電流をグラフテック社製のＸ−Ｙレコーダー（ＷＸ１２００）を用いて記録した。
【００３９】
〔ガスクロマトグラフィーによる測定〕
日本電子製「質量分析計ＪＭＳ−ＭＳ７００Ｖ」を用いた。
測定条件はＩｎｅｒｔＣａｐ １内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍのガラスキャピラリーカラムにジメチルポリシロキサンを充填し、カラム温度、１００℃、試料入口温度３００℃、検出器温度２５０℃、アルゴンガス３．０ｋｇ／ｃｍ２（２９４．２ＫＰａ）とした。メタノール、ギ酸、ホルムアルデヒド、アミノ酸類、２−アミノアルコール類のいずれも標準物質との保持時間により定性、既知濃度の標準物質試料を作製し、検量線を引き定量を行った。
【００４０】
〔高速液体クロマトグラフィーによる測定〕
日本分光製「ＵＶ−２０７５」、「ＰＵ−２０８０」、「ＣＯ−２０６５」を用いた。
測定条件は、ギ酸、ホルムアルデヒドについては内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのＯＤＳ−１２０ステンレスカラム（東ソー社製）、移動相は０．９質量％リン酸水溶液（水を２回蒸留したものを使用）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ。カラム温度３０℃。アミノ酸類、および２−アミノアルコール類については内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍのＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ  Ｔステンレスカラム（シグマ−アルドリッチ社製）、移動相は１５ｍＭのギ酸アンモニウムを含むメタノール、流速１ｍＬ／ｍｉｎ。ギ酸、ホルムアルデヒド、アミノ酸類、２−アミノアルコール類のいずれも標準物質との保持時間により定性、既知濃度の標準物質試料を作製し、検量線を引き定量を行った。
【００４１】
本発明で使用した水は、日本ミリポア社製純水製造装置（Ｅｌｉｘ−ＵＶ３、６０Ｌタンク、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＡＳＭ）で作られた導電率１８ＭΩｃｍの精製水である。
【００４２】
比較例１
（ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製１）
６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌにＰＡＡ（日東紡績社製  重量平均分子量７０，０００）１００μｌと、ＰＱＱ５μｍｏｌとＷＳＣ６μｍｏｌを溶解した。この溶液にＧＦ（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。このようにして得られた電極をＰＱＱ修飾ＧＦ電極１とした。
【００４３】
実施例１
（ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製２）
ＰＱＱ５μｍｏｌを６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに溶解し、ＷＳＣ６μｍｏｌを加えて２分間混合した後、ＰＡＡ１００μｌを添加した。この溶液にＧＦ（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。このようにして得られた電極をＰＱＱ修飾ＧＦ電極２とした。
【００４４】
試験例１
（製法の異なるＰＱＱ修飾ＧＦ電極のＣＶによる評価）
ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１とＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の電極反応挙動をＣＶによって評価した。０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに作用極としてＰＱＱ修飾ＧＦ電極１（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、またはＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金線、参照電極として、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１の場合はＳＣＥを、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の場合はＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。酸素を除去するため１０分間窒素ガスを通気した後、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１の場合はＳＣＥに対して−１．０Ｖから０．４Ｖの間を、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の場合はＡｇ／ＡｇＣｌに対して−１．０Ｖから０．６Ｖの間を５０ｍＶ／秒の掃引速度で電圧を連続的に変化させた。ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１の結果を図１に、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の結果を図２に示した。
【００４５】
ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２においてＰＱＱ修飾ＧＦ電極１よりも大幅なピーク電流の増加が確認された。また、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１の還元電位はＳＣＥに対して−０．３Ｖであり、再酸化電位はＳＣＥに対して−０．１Ｖであり、それらの差は０．２Ｖであった。一方、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の還元電位はＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．１５Ｖであり、再酸化電位はＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．０９Ｖであり、それらの差は０．０６Ｖであった。ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の還元電位と再酸化電位の差がＰＱＱ修飾ＧＦ電極１の還元電位と再酸化電位の差よりも小さいことから、電子移動速度はＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の方がＰＱＱ修飾ＧＦ電極１よりも速いということが明らかとなった。更に、可逆的な電子移動が行われている場合における還元電位と再酸化電位の差は一般的に０．０５９Ｖと言われており、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２では可逆的に電子移動が行われていることが明らかとなった。還元波の面積よりＰＱＱの固定量はＰＱＱ修飾ＧＦ電極１で０．２ｎｍｏｌ／ｃｍ２、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２で２０ｎｍｏｌ／ｃｍ２と算出された。以上の結果から、ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２はＰＱＱ修飾ＧＦ電極１に比べてＰＱＱの固定量が１００倍増えており、その結果として性能が著しく向上していた。ここにおいて実施例１で作成したＰＱＱ修飾ＧＦ電極の有用性が示された。
【００４６】
比較例２
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製１）
０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに比較例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極１（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で２時間浸し放置した後、減圧乾燥することでＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を作製した。この電極を５ｍＭＮＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を、２０μＭのＤｐとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＤｐとＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を、２．５酵素単位のＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。このようにして得られた電極を酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１とした。
【００４７】
実施例２
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製２）
０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに実施例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で２時間浸し放置した後、減圧乾燥することでＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を作製した。この電極を２０μＭのＤｐとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記Ｄｐが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、５ｍＭＮＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＮＡＤＨとＤｐが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、２．５酵素単位のＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。このようにして得られた電極を酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２とした。
【００４８】
実施例３
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製３）
Ｄｐ２０μＭとＷＳＣ６μｍｏｌを６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに溶解し２分間混合した後、実施例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌにＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いでＮＡＤＨ５ｍＭ、ＷＳＣ６μｍｏｌを６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに溶解した後、ＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで２．５酵素単位のＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに溶解し２分間混合した後、ＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。このようにして得られた電極を酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３とした。
【００４９】
試験例２
（電位が酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極を用いた電解反応へ及ぼす影響）
１０ｍＭのＤ，Ｌ−フェニルアラニンを含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例２で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．５０Ｖ、または−０．５５Ｖ、または−０．６０Ｖ、または−０．６５Ｖ、または−０．７０Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物（Ｌ−フェニルアラニノール）の定性、および定量を行った。表１に結果を示した。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
表１の結果より、設定したいずれの電位を印加した場合でもＬ−フェニルアラニンが選択的に還元されＬ−フェニルアラニノールが生成することがわかった。またＤ−フェニルアラニンは未反応のまま回収された。設定電位を高くするに従い、電解時間は短くなるものの、Ｄ−フェニルアラニンの回収率が悪くなるとともに電流効率が低下するが、Ｌ−フェニルアラニノールはほぼ１００％ｅｅに近い収率で生成することができた。
【００５２】
試験例３
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１〜３を用いたギ酸の電解還元によるメタノール生産性の比較）
１０ｍＭのギ酸を含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例２、３または比較例２で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物（メタノール）の定性、および定量を行った。図３に結果を示した。
【００５３】
反応開始後、酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１（比較例２）では７時間で、酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（実施例２）では４５分で、酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３（実施例３）では４０分で反応が終了した。また、単位時間、単位容量当たりの生産量はそれぞれ０．０５、０．４、０．５ｇ／Ｌ／ｈであり、比較した中では酵素固定ＰＱＱ修飾電極３が最も高い生産性を示した。
【００５４】
試験例４
（基質濃度が酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の電子移動に及ぼす影響）
１０ｍＭ、または２０ｍＭ、または３０ｍＭ、または４０ｍＭのギ酸を含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例３で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−１．０Ｖから０．６Ｖの間を５０ｍＶ／秒の掃引速度で電圧を連続的に変化させた。結果を図４に示した。
【００５５】
ギ酸濃度が高くなるにつれて大きな還元電流が流れたが、４０ｍＭギ酸では３０ｍＭギ酸の場合と比べて還元電流の大きな増加は起こらなかった。還元電流が増加するということは反応速度が増加することを示しており、ここで用いた電解条件では３０ｍＭのギ酸濃度で反応速度が最も早くなることが明らかとなった。
【００５６】
実施例４
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製４）
Ｄｐ２０μＭとＷＳＣ６μｍｏｌを６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに溶解し２分間混合した後、実施例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌにＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで前記ＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）をＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに５分間浸した後、２５μｍｏｌのＮＡＤＨを添加し、室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで２．５酵素単位のＡＤＨを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌにＷＳＣ６μｍｏｌを添加して２分間撹拌した。この溶液に前記ＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を浸し、室温で７２時間反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。このようにして得られた電極を酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極４とした。
【００５７】
試験例５
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３および４を用いたギ酸の電解還元によるメタノール生産性の比較）
３０ｍＭのギ酸を含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例３または４で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物（メタノール）の定性、および定量を行った。図５に結果を示した。
【００５８】
反応開始後、酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３（実施例３）では約２．５時間で、酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極４（実施例４）では約１時間で反応が終了した。また、単位時間、単位容量当たりの生産量はそれぞれ０．７２、１．８ｇ／Ｌ／ｈであり酵素固定ＰＱＱ修飾電極４の方が酵素固定ＰＱＱ修飾電極３よりも高い生産性を示した。
【００５９】
試験例３と試験例５の結果から実施例４で示した酵素固定ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製法が最も優れていることが示された。
【００６０】
試験例６
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３の再利用性）
１０ｍＭのギ酸を含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例３で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物（メタノール）の定性、および定量を行った。同じ電極を用いて同様の操作を５回繰り返した。表２に結果を示した。
【００６１】
【表２】
2014160024.tif 000003
【００６２】
表２の結果より、電極を繰り返し使用するにつれて、電解時間、および通電量が増加し、電流効率が低下するため、ＧＦに固定した酵素、補酵素、電子伝達メディエーターが脱落していく可能性、または酵素が失活していく可能性があるが、酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３を繰り返し使用してもメタノールを１００％の収率で得ることができることがわかった。
【００６３】
試験例７
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極４の再利用性）
３０ｍＭのギ酸を含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例４で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物（メタノール）の定性、および定量を行った。同じ電極を用いて同様の操作を５回繰り返した。表３に結果を示した。
【００６４】
【表３】
2014160024.tif 000004
【００６５】
表３の結果より、５回の繰り返し操作において電解時間、通電量、電流効率に変化はほとんど見られなかった。このことから酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極４では、繰り返し使用しても１００％の収率でメタノールを得ることができるとともに、ＧＦに固定した酵素、補酵素、電子伝達メディエーターが安定に保持されていることがわかった。
【００６６】
試験例８
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極を用いた、Ｄ，Ｌ−アミノ酸からのＬ−２−アミノアルコール、およびＤ−アミノ酸の製造）
１０ｍＭのアミノ酸を含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例２で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、高速液体クロマトグラフィーで生成物の定性、および定量を行った。フェニルアラニン、アラニン、バリンについて上記操作を行い、Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニノールとＤ−フェニルアラニンを、Ｄ，Ｌ−アラニンからＬ−アラニノールとＤ−アラニンを、Ｄ，Ｌ−バリンからＬ−バリノールとＤ−バリンを、それぞれ製造した。結果を表４に示した。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
表４の結果より、使用したいずれのアミノ酸からも対応する２−アミノアルコール、およびＤ−アミノ酸が９９％ｅｅ以上の鏡像体過剰率で得られた。このことからＡＤＨを用いた酵素固定ＰＱＱ修飾ＧＦ電極はギ酸を電解還元してメタノールを製造するために使用できるだけでなく、Ｌ−アミノ酸から２−アミノアルコールを製造するためにも使用可能であることが示された。更に当該電極は反応基質としてＬ体特異的であることが示された。
【００６９】
試験例９
（酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１〜４を用いたＤ，Ｌ‐フェニルアラニンの電解触媒還元反応の比較）
１０ｍＭのＤ，Ｌ‐フェニルアラニンを含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として比較例２、実施例２、実施例３または実施例４で作製した電極（１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板（２ｃｍ×２ｃｍ×０．１ｃｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。溶液中の溶存酸素を除去するために窒素ガスを１０分間通気した後、窒素ガス雰囲気下でＡｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加して通電した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、高速液体クロマトグラフィーで生成物の定性、および定量を行った。Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンからＬ−フェニルアラニノールとＤ−フェニルアラニンをそれぞれ製造した。結果を表５に示した。
【００７０】
【表５】
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【００７１】
表５の結果より、収率はいずれも９８％以上、また鏡像体過剰率はいずれも９９％ｅｅ以上であった。使用した４種類の電極では実施例４で作製した電極で最も早く反応が進行した。ここで示された各電極と電解時間の関係は試験例３および試験例５で示されたギ酸の電解反応の結果と矛盾せず、酵素修飾電極の性能の向上には、ＰＱＱ固定量を上げることとＤｐをＰＡＡ層に固定すること、ＰＡＡｃをＷＳＣで活性化した後ＮＡＤＨを添加することとが重要であることが確認された。
【００７２】
比較例３
（二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製１）
０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに比較例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極１（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で２時間浸し放置した後、減圧乾燥することでＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を作製した。この電極を５ｍＭＮＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を、２０μＭのＤｐとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＤｐとＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を、２．５酵素単位のＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＡＤＨとＤｐとＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極１を、２．５酵素単位のＦＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。このようにして得られた電極を二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１とした。
【００７３】
実施例５
（二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製２）
０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに実施例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で２時間浸し放置した後、減圧乾燥することでＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を作製した。この電極を２０μＭのＤｐとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記Ｄｐが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、５ｍＭＮＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＮＡＤＨとＤｐが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、２．５酵素単位のＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＡＤＨとＮＡＤＨとＤｐが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、２．５酵素単位のＦＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。このようにして得られた電極を二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２とした。
【００７４】
実施例６
（二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製３）
Ｄｐ２０μＭとＷＳＣ６μｍｏｌを６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに溶解し２分間混合した後、実施例１で作製したＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、ＧＦを減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで０．１（ｗ／ｖ）％ＰＡＡｃ（和光純薬工業社製、重量平均分子量１，４００，０００）を含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌにＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２（５ｃｍ×２ｃｍ×０．５ｃｍ）を室温で２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、続いて３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液１００ｍｌで３回濯いだ後、減圧乾燥した。次いで前記ＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、５ｍＭＮＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、２．５酵素単位のＡＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。次いで前記ＡＤＨとＮＡＤＨが固定されたＰＡＡｃで被覆されたＤｐが固定されたＰＱＱ修飾ＧＦ電極２を、２．５酵素単位のＦＤＨとＷＳＣ６μｍｏｌを含む６０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液５ｍｌに室温で７２時間浸し反応させた。反応終了後、減圧乾燥し、３０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液で３回濯ぎ減圧乾燥した。このようにして得られた電極を二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３とした。
【００７５】
試験例１０
（二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１〜３を用いた、二酸化炭素からのメタノールの製造比較）
０．３Ｍの炭酸水素ナトリウムを含む、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに、作用極として実施例５、実施例６または比較例３で作製した電極（２ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ）、対極として白金板、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを浸した。前記リン酸緩衝液に二酸化炭素ガスを５分間通気した後、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．６５Ｖとなるように電位を印加した。一定時間ごとに反応液を一部抜き取り、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物（メタノール）の定性、および定量を行った。図６〜図８に結果を示す。
【００７６】
反応開始後、二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１では、図６に示したように、１２時間で反応が終了し、二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２では、図７に示したように、８時間で反応が終了し、二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３では、図８に示したように、６時間で反応が終了した。また、単位時間、単位容量当たりの生産量はそれぞれ０．００７、０．０１１、０．０１５ｇ／Ｌ／ｈであり二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２が二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１よりも１．６倍高い生産性を示し、さらに二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３は二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２よりも１．４倍高い生産性を示した。この結果から実施例６で示した二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極の作製法が最も優れていることが示された。なお、二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極１と二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２の違いはＰＱＱの固定量のみが異なり、二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極２と二酸化炭素還元用酵素固定化ＰＱＱ修飾ＧＦ電極３の違いはＤｐ固定の順番が異なるのみである。以上のようにＰＱＱ固定量と、Ｄｐ固定の順番が酵素修飾電極の性能に影響を与えるという結果は試験例３で示された結果を支持するものである。
【００７７】
試験例１１
（フロー型電解層によるギ酸からのメタノール製造）
フロー型電解層は北斗電工株式会社製ＨＸ−２０１を用いた。作用極として円筒状に加工した実施例２で作製した電極（直径０．８ｃｍ×５ｃｍ）、対極として白金線（直径０．３ｍｍ×３００ｍｍ）、参照電極としてＡｇ／ＡｇＣｌを用いた。１０ｍＭギ酸と０．３Ｍ炭酸水素ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）５０ｍｌに窒素ガスを１０分間通気して溶存酸素を除去した後、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して−０．５Ｖとなるように電位を印加したフロー型電解層に一定の流速で通液した。流出液を回収し、ガスクロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィーで生成物の定性、および定量を行った。ギ酸のメタノールへの変換率は、フロー型電解層に投入されたギ酸がメタノールに変換された割合であり、流出液中のギ酸の量／投入前のギ酸の量×１００の計算式から算出される。結果を表６に示した。
【００７８】
【表６】
2014160024.tif 000007
【００７９】
表６の結果より、流速０．０５〜０．２０ｍＬ／分ではギ酸のメタノールへの変換率は１００％であった。しかしながら、流速が上がるにつれて電流効率は低下し、流速１．０ｍＬ／分では変換率が４０％であった。なお、フロー型電解層による電解反応は電極の性能やサイズ、流速によって大きく影響を受ける。また、循環型にすることにより高流速でも変換率を１００％にすることが可能である。
【図１】
2014160024.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014160024.tif 000013
【図７】
2014160024.tif 000014
【図８】
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