(57)【要約】【課題】キシロースイソメラーゼによるキシロースからキシルロースへの変換と組み合わせてキシロースからエタノールの製造に使用できる、キシルロースからエタノールへの生産能に優れた酵母を提供する。【解決手段】RKI1遺伝子(リボース5リン酸異性化酵素をコードする遺伝子）、RPE1遺伝子(リブロースリン酸3異性化酵素をコードする遺伝子）、TAL2遺伝子(トランスアルドラーゼをコードする遺伝子)及びTKL2遺伝子(トランスケトラーゼをコードする遺伝子）の4つの遺伝子を同時に過剰発現させた形質転換酵母。【選択図】図３
2014195442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主酵母に、以下の(a)〜(c)のいずれか1つのリボース5リン酸異性化酵素をコードする遺伝子、以下の(d)〜(f)のいずれか1つのリブロースリン酸3異性化酵素をコードする遺伝子、以下の(g)〜(i)のいずれか1つのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子、及び以下の(j)〜(l)のいずれか1つのトランスケトラーゼをコードする遺伝子の4つの遺伝子が発現可能に導入された形質転換酵母。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(b) 配列番号２に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(c) 配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(d) 配列番号４に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(e) 配列番号４に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(f) 配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(g) 配列番号６に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(h) 配列番号６に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(i) 配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(j) 配列番号８に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(k) 配列番号８に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(l) 配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
前記4つの遺伝子が、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されたものである、請求項１記載の形質転換酵母。
【請求項３】
宿主酵母が、サッカロマイセス属(Saccharomyces)に属する酵母である、請求項１又は２記載の形質転換酵母。
【請求項４】
サッカロマイセス属に属する酵母が、サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項３記載の形質転換酵母。
【請求項５】
キシルロースからエタノールを生産する能力を有するものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の形質転換酵母。
【請求項６】
キシルロース含有培地中において、請求項１〜５のいずれか１項記載の形質転換酵母を培養し、キシルロース資化によりエタノールを産生せしめるキシルロース発酵工程を含む、エタノールの製造方法。
【請求項７】
キシロースをキシロースイソメラーゼにより異性化してキシルロースを得る異性化工程を更に含み、該異性化工程により得られるキシルロースを前記キシルロース発酵工程に供する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
キシロース含有培地中でキシロースイソメラーゼの存在下に前記異性化工程を行い、且つ該培地中に生成するキシルロースを前記キシルロース発酵工程によりエタノールに転換する、異性化工程とキシルロース発酵工程とを同時に行う、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばキシルロースからエタノールを生産する酵母に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、CO2排出削減の観点から、輸送用燃料へのバイオエタノールの利用が注目されている。中でも、バイオエタノール生産方法として、セルロース系バイオマスからの生産が検討されている。セルロース系バイオマスから得られる糖の約三分の一はキシロースが占めることから、バイオマス資源の有効利用のためには、キシロースからエタノールを効率よく生産する微生物の開発が必要である。
【０００３】
従来において、エタノールの生産には、サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)に代表される酵母が醸造用酵母として主に使用されている。サッカロマイセス・セレビシアは、グルコースやマンノース等の六炭糖からのエタノール生産能が高く、エタノールに対する高い耐性を有している。しかしながら、サッカロマイセス・セレビシアは、キシロース等の五炭糖を利用することができない。
【０００４】
一方、サッカロマイセス・セレビシアは、キシロースを利用することはできないものの、異性体であるキシルロースをわずかながら利用することができる(非特許文献１)。キシルロースはキシロースイソメラーゼによりキシロースを異性化することで容易に入手することができる。従って、キシロースイソメラーゼによるキシロースからキシルロースへの変換と、サッカロマイセス・セレビシアとを組み合わせることにより、キシロースからエタノールを製造することが可能となる。しかしながら、サッカロマイセス・セレビシアのキシルロースからのエタノール生産能は非常に低い。
【０００５】
非特許文献２は、サッカロマイセス・セレビシアにおいて、それぞれリブロース5リン酸エピメラーゼ(RPE1)、リボース5リン酸ケトールイソメラーゼ(RKI1)、トランスアルドラーゼ(TAL1)及びトランスケトラーゼ(TKL1)をコードする4つの遺伝子を過剰発現させることで、サッカロマイセス・セレビシアのキシルロース消費速度が増加したことを開示する。しかしながら、非特許文献２においては、当該4つの遺伝子を過剰発現させることで、サッカロマイセス・セレビシアのキシルロースからのエタノール生産能は有意に向上しなかった。
依然としてキシルロースからのエタノール生産能をさらに向上させた酵母の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. Yu et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1995年, Vol. 44, pp. 314-320
【非特許文献２】B. Johansson et al., FEMS Yeast Research, 2002年, Vol. 2, pp. 277-282
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、エタノール製造におけるキシロースイソメラーゼによるキシロースのキシルロースへの変換と酵母のアルコール発酵との組み合わせにおいて、キシルロースからのエタノール生産能をさらに向上させた酵母の開発が望まれている。
そこで、本発明は、酵母を改良し、キシルロースからエタノールへの生産能に優れた酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、酵母染色体上にRKI1遺伝子(リボース5リン酸異性化酵素をコードする遺伝子）、RPE1遺伝子(リブロースリン酸3異性化酵素をコードする遺伝子）、TAL2遺伝子(トランスアルドラーゼをコードする遺伝子)及びTKL2遺伝子(トランスケトラーゼをコードする遺伝子）の4つの遺伝子を導入し、同時に過剰発現させると、キシルロースからのエタノール生産性の高い酵母が得られ、且つ得られた当該形質転換酵母は、キシロースイソメラーゼによるキシロースからキシルロースへの変換と組み合わせることで、キシロースからエタノールを製造するのに使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[１]  宿主酵母に、以下の(a)〜(c)のいずれか1つのリボース5リン酸異性化酵素をコードする遺伝子、以下の(d)〜(f)のいずれか1つのリブロースリン酸3異性化酵素をコードする遺伝子、以下の(g)〜(i)のいずれか1つのトランスアルドラーゼをコードする遺伝子、及び以下の(j)〜(l)のいずれか1つのトランスケトラーゼをコードする遺伝子の4つの遺伝子が発現可能に導入された形質転換酵母。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(b) 配列番号２に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(c) 配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(d) 配列番号４に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(e) 配列番号４に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(f) 配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(g) 配列番号６に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(h) 配列番号６に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(i) 配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(j) 配列番号８に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードする遺伝子；
(k) 配列番号８に示すアミノ酸配列において1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列から成り、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
(l) 配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
[２]  前記4つの遺伝子が、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入されたものである、[１]記載の形質転換酵母。
[３]  宿主酵母が、サッカロマイセス属(Saccharomyces)に属する酵母である、[１]又は[２]記載の形質転換酵母。
[４]  サッカロマイセス属に属する酵母が、サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)である、[３]記載の形質転換酵母。
[５]  キシルロースからエタノールを生産する能力を有するものである、[１]〜[４]のいずれか１記載の形質転換酵母。
[６]  キシルロース含有培地中において、[１]〜[５]のいずれか１記載の形質転換酵母を培養し、キシルロース資化によりエタノールを産生せしめるキシルロース発酵工程を含む、エタノールの製造方法。
[７]  キシロースをキシロースイソメラーゼにより異性化してキシルロースを得る異性化工程を更に含み、該異性化工程により得られるキシルロースを前記キシルロース発酵工程に供する、[６]記載の方法。
[８]  キシロース含有培地中でキシロースイソメラーゼの存在下に前記異性化工程を行い、且つ該培地中に生成するキシルロースを前記キシルロース発酵工程によりエタノールに転換する、異性化工程とキシルロース発酵工程とを同時に行う、[７]記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、キシルロースからエタノールを生産可能な形質転換酵母が提供される。
また、本発明に係る形質転換酵母は、キシルロースからのエタノールへの優れた生産能を有するため、キシロースイソメラーゼによるキシロースのキシルロースへの変換と組み合わせることで、キシロースからエタノールを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】サッカロマイセス・セレビシア由来のTAL1遺伝子(塩基配列：配列番号９)とサッカロマイセス・セレビシア由来のTAL2遺伝子(塩基配列：配列番号５)との塩基配列レベルでのアライメントを示す。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２−１】サッカロマイセス・セレビシア由来のTKL1遺伝子(塩基配列：配列番号１０)とサッカロマイセス・セレビシア由来のTKL2遺伝子(塩基配列：配列番号７)との塩基配列レベルでのアライメントを示す。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図２−３】図２−２の続きである。
【図２−４】図２−３の続きである。
【図３】本発明に係る形質転換酵母による(A)キシルロース消費速度及び(B)エタノール生産を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に限定されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で当業者であれば適宜変更し実施することができる。
【００１３】
また、本明細書において引用された全ての刊行物(例えば、先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献)は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１４】
１．本発明の概要
本発明は、宿主酵母にRKI1遺伝子(リボース5リン酸異性化酵素(又は「リボース5リン酸ケトールイソメラーゼ」とも称する)をコードする遺伝子)、RPE1遺伝子(リブロースリン酸3異性化酵素(又は「リブロース5リン酸エピメラーゼ」とも称する)をコードする遺伝子）、TAL2遺伝子(トランスアルドラーゼをコードする遺伝子）及びTKL2遺伝子(トランスケトラーゼをコードする遺伝子)の4つの遺伝子を同時に過剰発現させた形質転換酵母が、優れたキシルロースからのエタノール生産能を有するという知見に基づくものである。
【００１５】
上述のように、非特許文献２は、サッカロマイセス・セレビシアにおいて、RPE1遺伝子、RKI1遺伝子、TAL1遺伝子及びTKL1遺伝子を過剰発現させることで、サッカロマイセス・セレビシアのキシルロース消費速度が増加したことを開示する。しかしながら、非特許文献２においては、当該4つの遺伝子を過剰発現させることで、サッカロマイセス・セレビシアのキシルロースからのエタノール生産能は有意に向上しなかった。
【００１６】
図１は、サッカロマイセス・セレビシア由来のTAL1遺伝子(塩基配列：配列番号９)とサッカロマイセス・セレビシア由来のTAL2遺伝子(塩基配列：配列番号５)との塩基配列レベルでのアライメントを示す。また、図２は、サッカロマイセス・セレビシア由来のTKL1遺伝子(塩基配列：配列番号１０)とサッカロマイセス・セレビシア由来のTKL2遺伝子(塩基配列：配列番号７)との塩基配列レベルでのアライメントを示す。図１及び２に示すように、TAL1遺伝子とTAL2遺伝子との相同性及びTKL1遺伝子とTKL2遺伝子との相同性は、それぞれ54％及び71％であり、各遺伝子間で構造(配列)上有意に異なる。
【００１７】
また、サッカロマイセス・セレビシアにおいて、内在するTAL1遺伝子とTAL2遺伝子の発現強度(リアルタイムPCRによる遺伝子発現量測定に基づく)は、それぞれ0.20及び2.54である。同様に、サッカロマイセス・セレビシアにおいて、内在するTKL1遺伝子とTKL2遺伝子の発現強度は、それぞれ0.92及び2.41である。このように、TAL2遺伝子はTAL1遺伝子に比べて12.7倍遺伝子発現量が高く、また、TKL2遺伝子はTKL1遺伝子に比べて2.6倍遺伝子発現量が高い。酵母においては、TAL2遺伝子はTAL1遺伝子に比べて、またTKL2遺伝子はTKL1遺伝子に比べてメインの遺伝子として機能していると考えられる。
【００１８】
このように、本発明に係る形質転換酵母は、RKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子を宿主酵母に導入して作製されることを特徴の一つとするものである。
【００１９】
酵母の中には、キシロース資化酵素群が実質的に機能していない、いわゆる休眠状態にあるために、キシロース等の五炭糖資化能を有さない酵母が存在する。例えば、サッカロマイセス属に属する酵母は、キシロース資化酵素群をコードする遺伝子群を有しているにもかかわらず、キシロースを利用してエタノールを生産することができない。しかしながら、サッカロマイセス属に属する酵母はキシロースの異性体であるキシルロースからはエタノールを生産することができる。
【００２０】
このようなキシロースからのエタノール生産能を有さないとされる酵母を、キシロースを異性化するキシルロースイソメラーゼを含むキシロース含有培地中で培養することで、キシロースからエタノールを製造することができる。そして、この酵母にRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子を同時に過剰発現させた形質転換酵母は、驚くべきことに対照株(例えば、これら4つの遺伝子を過剰発現させていない酵母)と比較して、キシルロースからのエタノール生産能が向上する。
【００２１】
２．本発明に係る形質転換酵母
本発明に係る形質転換酵母は、宿主酵母に、RKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子をさらに発現可能に導入された(同時に過剰発現させた)酵母である。
【００２２】
２−１．宿主酵母
本発明において、遺伝子導入又は形質転換の対象となる宿主酵母は、キシロース等の五炭糖の資化能を有していない酵母であることが好ましい。当該酵母は遺伝子導入又は形質転換の前に五炭糖資化能を有していないものであればよく、グルコース等の六炭糖の資化能を有していてもよい。
【００２３】
ここで、「五炭糖資化能」とは、キシロース等の五炭糖を炭素源として生育する能力をいう。五炭糖資化能を有する酵母は、炭素源として五炭糖のみを添加した培地中で生育可能であるため、五炭糖資化能は、炭素源として五炭糖のみを添加した培地中における酵母の生育程度を600 nm又は660 nm等の波長での濁度を測定することで確認することができる。
【００２４】
本発明において、五炭糖資化能を有していない酵母は、特に限定されるわけではないが、例えば、サッカロマイセス属に属する酵母等を挙げることができる。サッカロマイセス属に属する酵母としては、例えばCEN.PK2-1C株(Microbiology, 148, p.2783-2788, 2002)等のサッカロマイセス・セレビシアを挙げることができる。また、本発明において、遺伝子導入又は形質転換の対象となる酵母として、1倍体だけでなく2倍体の酵母を使用することができる。2倍体の酵母は実用酵母として優れており、例えば協会7号(DNA Research, 18, p.423-434, 2011)等の協会系酵母、ワイン酵母、Red star株(Biotechnol. And Bioeng., 100, p.1122-1131, 2008)、Taiken No.396株(J. Biosci. Bioeng., 114, 476-478, 2012)等を挙げることができる。
【００２５】
また、本発明において、遺伝子導入又は形質転換の対象となる酵母は、エタノールへの耐性を備えた醸造用酵母であることが好ましく、そのような酵母としては、特に限定されるわけではないが、上述のサッカロマイセス属に属する酵母(例えば、サッカロマイセス・セレビシア）等を挙げることができる。
【００２６】
従って、本発明において遺伝子導入又は形質転換の対象となる酵母は、好ましくはサッカロマイセス属に属する酵母、より好ましくはサッカロマイセス・セレビシアである。
【００２７】
２−２．本発明に係る形質転換酵母
本発明に係る形質転換酵母は、前述の宿主酵母にRKI1遺伝子(リボース5リン酸異性化酵素遺伝子)、RPE1遺伝子(リブロースリン酸3異性化酵素遺伝子）、TAL2遺伝子(トランスアルドラーゼ遺伝子)及びTKL2遺伝子(トランスケトラーゼ遺伝子)の4つの遺伝子が発現可能に導入された酵母である。
【００２８】
酵母のリボース5リン酸異性化酵素をコードする遺伝子として、RKI1遺伝子が知られている。従って、本発明においてリボース5リン酸異性化酵素をコードする遺伝子として、RKI1遺伝子を使用することができる。
【００２９】
RKI1遺伝子の塩基配列情報は、当業者であれば、Genbank等の公知のデータベースから入手することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来のRKI1遺伝子の配列情報は、アクセッション番号：NM_001183514を参照することにより入手することができる。
【００３０】
本発明において、RKI1遺伝子は、リボース5リン酸異性化酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号１に示す塩基配列から成るDNA(遺伝子)、又は配列番号２に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA(遺伝子)である。本発明において、RKI1遺伝子は、例えば、配列番号１に示す塩基配列を基にプライマーを設計し、酵母ライブラリー又はゲノムライブラリーから遺伝子増幅技術により得ることができる。
【００３１】
本発明で使用されるRKI1遺伝子は、RKI1タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。RKI1タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。
【００３２】
RKI1タンパク質の変異体をコードするDNAは、配列番号１に示す塩基配列から成るDNA又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー又はゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed.」(Cold Spring Harbor Press(2012))等を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００３３】
ここで、「ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として、例えば「1×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)）、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons(1987-1997))等を参照することができる。
【００３５】
また、本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAには、例えば、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは99％以上、さらに一層好ましくは99.7％以上、特に好ましくは99.9％の同一性（相同性）を有する塩基配列を含むDNAが含まれる。同一性を示す値は、BLAST等の公知のプログラムを利用することにより算出することができる。
【００３６】
また、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、例えば配列番号１に示す塩基配列において1個又は数個の核酸に欠失、置換、付加又は挿入等の変異の生じた塩基配列を含むDNAが挙げられる。このようなDNAとしては、例えば、(i)配列番号１に示す塩基配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）の塩基が欠失したDNA、(ii)配列番号１に示す塩基配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個)の塩基が他の塩基に置換したDNA、(iii)配列番号１に示す塩基配列中に１〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）の塩基が付加したか又は挿入されたDNA及び(iv)それらの変異が組み合わされたDNAであって、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができ、例えばジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al.（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００３８】
本発明において、RKI1遺伝子は、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号２に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするものも含まれる。本発明では、サッカロマイセス・セレビシア由来のRKI1タンパク質又はそれらの変異体をコード遺伝子も、RKI1遺伝子に含まれる。
【００３９】
RKI1タンパク質の変異体は、(i)配列番号２に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii)配列番号２に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii)配列番号２に示すアミノ酸配列中に1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が付加したか又は挿入されたタンパク質及び(iv)それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質等が挙げられる。
【００４０】
また、RKI1タンパク質の変異体としては、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列から成り、且つリボース5リン酸異性化酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４１】
ここで、「リボース5リン酸異性化酵素活性」は、リボース5リン酸をリブロース5リン酸に変換する活性を意味する。本発明において、RKI1タンパク質の変異体は、リボース5リン酸異性化酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列から成るタンパク質の約10％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するリボース5リン酸異性化酵素活性は、公知の方法で測定することができる。
【００４２】
一方、酵母は、リブロースリン酸3異性化酵素をコードする遺伝子として、RPE1遺伝子を有することが知られている。従って、本発明において、リブロースリン酸3異性化酵素をコードする遺伝子として、RPE1遺伝子を使用することができる。
【００４３】
RPE1遺伝子の塩基配列情報は、当業者であれば、Genbank等の公知のデータベースから入手することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来のRPE1遺伝子の配列情報は、アクセッション番号：NM_001181554を参照することにより入手することができる。
【００４４】
本発明において、RPE1遺伝子は、リブロースリン酸3異性化酵素をコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号３に示す塩基配列から成るDNA(遺伝子)、又は配列番号４に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA(遺伝子)である。
【００４５】
本発明で使用されるRPE1遺伝子は、RPE1タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。RPE1タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、配列番号３に示す塩基配列からなるDNAに相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。
【００４６】
また、本発明で使用されるRPE1遺伝子は、以下のRPE1タンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい：(i)配列番号４に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii)配列番号４に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個)のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii)配列番号４に示すアミノ酸配列中に1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が付加したか又は挿入されたタンパク質及び(iv)それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質。
【００４７】
さらに、RPE1タンパク質の変異体としては、配列番号４に示すアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列から成り、且つリブロースリン酸3異性化酵素活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４８】
ここで、「リブロースリン酸3異性化酵素活性」は、キシルロース5リン酸をリブロース5リン酸に変換する活性を意味する。本発明においてRPE1タンパク質の変異体は、リブロースリン酸3異性化酵素活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号４に示すアミノ酸配列から成るタンパク質の約10％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するリブロースリン酸3異性化酵素活性は、公知の方法で測定することができる。
【００４９】
上記ハイブリダイズするDNAに含まれるDNA、及びハイブリダイズの条件等は、前述の説明が同様に適用できる。また、本発明において、RPE1遺伝子は、RKI1遺伝子に対して記載された方法と同様の方法により取得又は製造することができる。
【００５０】
酵母は、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子として、TAL2遺伝子を有することが知られている。従って、本発明において、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子として、TAL2遺伝子を使用することができる。
【００５１】
TAL2遺伝子の塩基配列情報は、当業者であれば、Genbank等の公知のデータベースから入手することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来のTAL2遺伝子の配列情報は、アクセッション番号：NM_001178753を参照することにより入手することができる。
【００５２】
本発明において、TAL2遺伝子は、トランスアルドラーゼをコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号５に示す塩基配列から成るDNA(遺伝子)、又は配列番号６に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA(遺伝子)である。
【００５３】
本発明で使用されるTAL2遺伝子は、TAL2タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。TAL2タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、配列番号５に示す塩基配列から成るDNAに相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。
【００５４】
また、本発明で使用されるTAL2遺伝子は、以下のTAL2タンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい：(i)配列番号６に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii)配列番号６に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii)配列番号６に示すアミノ酸配列中に1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個）のアミノ酸が付加したか又は挿入されたタンパク質及び(iv)それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【００５５】
さらに、TAL2タンパク質の変異体としては、配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列から成り、且つトランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００５６】
ここで、「トランスアルドラーゼ活性」は、グリセルアルデヒド3リン酸とセドヘプツロース7リン酸をフルクトース6リン酸とエリトロース4リン酸に変換する活性を意味する。本発明においてTAL2タンパク質の変異体は、トランスアルドラーゼ活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号６に示すアミノ酸配列から成るタンパク質の約10％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するトランスアルドラーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。
【００５７】
上記ハイブリダイズするDNAに含まれるDNA、及びハイブリダイズの条件等は、前述の説明が同様に適用できる。また、本発明において、TAL2遺伝子は、RKI1遺伝子に対して記載された方法と同様の方法により取得又は製造することができる。
【００５８】
酵母は、トランスケトラーゼをコードする遺伝子として、TKL2遺伝子を有することが知られている。従って、本発明において、トランスケトラーゼをコードする遺伝子として、TKL2遺伝子を使用することができる。
【００５９】
TKL2遺伝子の塩基配列情報は、当業者であれば、Genbank等の公知のデータベースから入手することができる。例えば、サッカロマイセス・セレビシア由来のTKL2遺伝子の配列情報は、アクセッション番号：NM_001178465を参照することにより入手することができる。
【００６０】
本発明において、TKL2遺伝子は、トランスケトラーゼをコードする塩基配列を含む遺伝子であり、例えばサッカロマイセス・セレビシア由来の配列番号７に示す塩基配列から成るDNA(遺伝子)、又は配列番号８に示すアミノ酸配列から成るタンパク質をコードするDNA(遺伝子)である。
【００６１】
本発明で使用されるTKL2遺伝子は、TKL2タンパク質の変異体をコードする遺伝子を含む。TKL2タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、例えば、配列番号７に示す塩基配列から成るDNAに相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。
【００６２】
また、本発明で使用されるTKL2遺伝子は、以下のTKL2タンパク質の変異体をコードする遺伝子であってもよい：(i)配列番号８に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個)のアミノ酸が欠失したタンパク質、(ii)配列番号８に示すアミノ酸配列中の1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個)のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したタンパク質、(iii)配列番号８に示すアミノ酸配列中に1〜数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、さらに好ましくは1〜2個)のアミノ酸が付加したか又は挿入されたタンパク質及び(iv)それらの変異が組み合わされたタンパク質であって、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質。
【００６３】
さらに、TKL2タンパク質の変異体としては、配列番号８に示すアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、特に好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％の配列同一性(相同性)を有するアミノ酸配列から成り、且つトランスケトラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００６４】
ここで、「トランスケトラーゼ活性」は、キシルロース5リン酸とリボース5リン酸をグリセルアルデヒド3リン酸とセドヘプツロース7リン酸に変換する活性、又はエリトロース4リン酸とキシルロース5リン酸をフルクトース6リン酸とグリセルアルデヒド3リン酸に変換する活性を意味する。本発明においてTKL2タンパク質の変異体は、トランスケトラーゼ活性を有する限り、その活性の程度に特に限定されないが、例えば配列番号８に示すアミノ酸配列から成るタンパク質の約10％以上の活性を有していればよい。タンパク質の有するトランスケトラーゼ活性は、公知の方法で測定することができる。
【００６５】
上記ハイブリダイズするDNAに含まれるDNA、及びハイブリダイズの条件等は、前述の説明が同様に適用できる。また、本発明において、TKL2遺伝子は、RKI1遺伝子に対して記載された方法と同様の方法により取得又は製造することができる。
【００６６】
本発明において、以上に説明したRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子を、宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入することにより、本発明に係る形質転換酵母を得ることができる。上記遺伝子を酵母の染色体上に挿入することにより、宿主酵母自身のリボース5リン酸異性化酵素、リブロースリン酸3異性化酵素、トランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼの活性が遺伝子導入前よりも向上し、当該酵母のキシルロースからのエタノールの生産性が向上する。
【００６７】
本発明において、RKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子を宿主酵母の染色体上に挿入する。これらの遺伝子は、それぞれの遺伝子を個別に染色体上に挿入しても良いし、又はプロモーターの支配(制御)下にタンデムに連結した発現カセットを作製して染色体上に挿入してもよい。タンデムに連結する場合、4つの遺伝子の配置の順番は特に限定されず、考えられる組合せのいずれでも良い。また、RKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子を含むプラスミドを用いて、酵母の染色体上に遺伝子を導入しても良い。上記4つの遺伝子は、一つのプラスミドに含まれても良いし、それぞれ別のプラスミドに含まれても良い。また、挿入されるそれぞれの遺伝子の個数は限定されず、1個又は複数であるが1個が好ましい。
【００６８】
遺伝子を染色体上に挿入するためのカセット又はプラスミドの作製、染色体上での挿入位置の選択、あるいは染色体への挿入は、当業者であれば、公知の方法に基づき適宜実施することができる。本発明は、RKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の4つの遺伝子をプロモーターの支配下にタンデムに連結した発現カセット又はプラスミドを含む。
【００６９】
本発明で使用されるプラスミドは、酵母発現用のベクターに上記遺伝子を発現可能に挿入することで作製することができる。ベクターへの遺伝子の挿入は、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応等を利用することができる。例えば、精製したDNAを適当な制限酵素で切断し、得られたDNA断片を、ベクター中の適当な制限酵素部位又はマルチクローニングサイト等に挿入することでベクターに連結する方法等を採用することができる。
【００７０】
本発明で使用されるプラスミドは、その基本となるベクターの由来には特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を使用することができる。例えば、pGADT7、pAUR135等の市販のベクターを使用することもできる。
【００７１】
本発明で使用されるプラスミドは、目的遺伝子を発現させ得る限り、マルチクローニングサイト、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選択マーカーカセット等を含んでもよい。また、DNAを挿入する際に必要であれば、適宜リンカーや制限酵素部位を付加してもよい。これらの操作は、当分野でよく知られている慣用の遺伝子操作技術を用いて行うことができる。
【００７２】
プロモーターは、目的遺伝子の上流に組み込むことができる。プロモーターは、形質転換体において目的タンパク質を適切に発現できるものであれば、特に限定されないが、PGKプロモーター、ADHプロモーター、TDHプロモーター、ENOプロモーター等を使用することができる。
【００７３】
ターミネーターは、目的遺伝子の下流に組み込むことができる。
本発明において、酵母で目的遺伝子を効率よく発現させるために、PGKプロモーター及び／又はPGKターミネーターを用いることが好ましい。
【００７４】
選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ロイシン合成酵素遺伝子、ウラシル合成酵素遺伝子等を挙げることができる。ベクターにロイシン、ヒスチジン、トリプトファン等のアミノ酸合成遺伝子カセット又はウラシル合成遺伝子カセットが含まれる場合は、当該アミノ酸又はウラシルを含まない培地で酵母を培養することにより、形質転換酵母を選択することができる。
【００７５】
以上に説明する上記遺伝子を含有するプラスミドを、遺伝子導入対象の宿主酵母に導入することで、形質転換酵母を作製することができる。
【００７６】
宿主酵母にプラスミドを導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法等の公知の方法が挙げられる。これらの方法により、本発明に係る形質転換酵母が提供される。
【００７７】
また、本発明は、相同組換えによりRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子が宿主酵母の染色体上に組み込まれた形質転換体酵母もその範囲に含む。宿主酵母の染色体上に遺伝子が挿入される場合、挿入部位は特に限定はされない。また、RKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子を宿主酵母の染色体上に発現可能に挿入する方法としては、特に限定されず、公知の遺伝子組換え技術を利用した方法等を用いることができる。
【００７８】
さらに、本発明に係る形質転換酵母としては、宿主細胞の有するRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の発現が活性化されたものであってもよい。すなわち、本発明は、宿主酵母の染色体上に内在するRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子の発現量が増大した酵母も含むものである。内在するRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子は、外部からプロモーターを導入すること、又は当該遺伝子自身の持つプロモーターをより強力なプロモーターに置換すること等によって、発現可能な形で活性化され、目的タンパク質を適切に発現し得る。
【００７９】
このように宿主酵母の染色体上に内在する遺伝子の発現を活性化させる方法としては、特に限定されないが、目的タンパク質を適切に発現できるプロモーターを、公知の遺伝子組換え技術を用いて、染色体上に遺伝子置換により組み込む方法等が挙げられる。遺伝子置換の方法としては、Akada et al. Yeast 23: 399-405 (2006)の方法を用いることができる。置換するプロモーターとしては、PGKプロモーター、ADHプロモーター、TDHプロモーター、ENOプロモーター等の公知のプロモーターを使用することができる。
【００８０】
３．エタノールの製造方法
本発明に係る形質転換酵母は、宿主酵母にRKI1遺伝子、RPE1遺伝子、TAL2遺伝子及びTKL2遺伝子を導入し、これら遺伝子が過剰発現される酵母であり、キシルロースからのエタノール生産能が高い。また、本発明に係る形質転換酵母は、キシロースイソメラーゼによるキシロースからのキシルロースへの変換と組み合わせることでキシロースからエタノールを製造することが可能である。
【００８１】
従って、本発明に係るエタノール製造方法は、キシルロース含有培地において、本発明に係る形質転換酵母を培養し、キシルロース資化によりエタノールを産生せしめるキシルロース発酵工程を含むものである。
【００８２】
本発明に係る形質転換酵母は、酵母の培養に用いられる通常の方法に準じて培養することができる。当業者であれば、SD培地、SCX培地、YPD培地、YPX培地等の公知の培地から適切な培地を選択し、好ましい培養条件の下で酵母を培養することができる。液体培地で酵母を培養する場合は、振盪培養が好ましい。
【００８３】
培地中のキシルロースは、キシロースをキシロースイソメラーゼによる異性化反応(異性化工程)に供することで得られたキシルロースであってよい。ここで、キシロースイソメラーゼは、キシロースからキシルロースへの異性化反応を触媒する酵素を意味する。キシロースイソメラーゼは、市販のものであってよく、例えばXylose isomerase  A（株式会社耐熱性酵素研究所）が挙げられる。また、キシロースに対するキシロースイソメラーゼの酵素量としては、例えばキシロース100 mMに対して、0.05〜10.0 mg、好ましくは0.5〜1.0 mgが挙げられる。
【００８４】
当該異性化反応により得られたキシルロースを培地に添加して、本発明に係る形質転換酵母を培養してもよいが、キシロースとキシロースイソメラーゼを培地に添加し、当該培地中で本発明に係る形質転換酵母を培養し、異性化反応によるキシルロース生成と、生成したキシルロースを用いた本発明に係る形質転換酵母によるキシルロース発酵とを同時に行うことが好ましい。
【００８５】
このように、本発明に係る形質転換酵母を培養し、得られる培養物からエタノールを採取することにより、エタノールを製造することができる。
【００８６】
キシロースイソメラーゼ存在下で、エタノールを製造する場合、10〜150 g/L、好ましくは70 g/Lのキシロース存在下に本発明に係る形質転換酵母を培養する。本培養の前に、形質転換酵母を前培養しても良い。前培養は、例えば、本発明に係る形質転換酵母を少量の培地に接種し、12〜24時間培養すればよい。本培養の培養量の0.1〜10％、好ましくは1％の前培養液を本培養の培地に加え、本培養を開始する。本培養は、キシロース含有培地で、0.5〜200時間(好ましくは10〜150時間、より好ましくは24〜137時間)の期間、20〜40℃(好ましくは30℃)の温度下で振盪培養により行われる。
【００８７】
また、本発明において、培地に添加するキシロースは、バイオマス糖化液又はバイオマス糖化液から分離されたキシロースであってよい。バイオマスを高温高圧水、酸又はアルカリで処理し、前処理バイオマスを得る。当該前処理バイオマスを酸又は酵素により糖化し、バイオマス糖化液を得る。得られたバイオマス糖化液は主にグルコースから成るヘキソースと、主にキシロースから成るペントースとが約2：1の割合で含まれている。
【００８８】
酵母は、グルコース等のヘキソースからアルコール発酵によりエタノールを製造することができる。従って、キシロースとしてバイオマス糖化液を添加した培地中で、キシロースイソメラーゼ存在下で本発明に係る形質転換酵母を培養することで、キシルロース資化によりエタノールを製造できると同時に、グルコース等のヘキソース資化によりエタノールを製造することができる。
【００８９】
製造されたエタノールは、上記のように本発明に係る形質転換酵母を培養して得られる培養物から採取することができる。培養物とは、培養液(培養上清)、培養酵母又は培養酵母の破砕物等を意味する。エタノールは公知の精製方法により培養物から精製し、採取することができる。本発明において、エタノールは形質転換酵母から主に培養上清中に分泌されるため、培養上清から採取することが好ましい。
【００９０】
エタノールの製造量は、培地に含まれるエタノールを液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、市販のエタノール測定キットで分析することで測定できる。
【００９１】
４．配列情報
配列番号１：サッカロマイセス・セレビシア由来のRKI1遺伝子の塩基配列。
配列番号２：サッカロマイセス・セレビシア由来のRKI1タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号３：サッカロマイセス・セレビシア由来のRPE1遺伝子の塩基配列。
配列番号４：サッカロマイセス・セレビシア由来のRPE1タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号５：サッカロマイセス・セレビシア由来のTAL2遺伝子の塩基配列。
配列番号６：サッカロマイセス・セレビシア由来のTAL2タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号７：サッカロマイセス・セレビシア由来のTKL2遺伝子の塩基配列。
配列番号８：サッカロマイセス・セレビシア由来のTKL2タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号９：サッカロマイセス・セレビシア由来のTAL1遺伝子の塩基配列。
配列番号１０：サッカロマイセス・セレビシア由来のTKL1遺伝子の塩基配列。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９３】
〔実施例１〕
１．キシルロースの作製
市販のキシロースイソメラーゼ(カタログ番号：XYI-75-01(株式会社耐熱性酵素研究所製))を用いて、キシロースをキシルロースに変換した。100mMキシロース、50mM Tris-HCL緩衝液(pH7.0)及び1mM塩化コバルト(II)を含む溶液に、0.1、0.5又は1.0mgの酵素を加え、85℃で10、30又は60分反応させた。生成したキシルロースを、Shodex SUGAR SC1011カラムを用いたHPLCにより定量した。
【００９４】
結果を下記の表１に示す。キシロースは、酵素量0.5mg、反応時間60分で完全にキシルロースに変換された。
【００９５】
【表１】
2014195442.tif 000003
【００９６】
２．形質転換株の作製
市販の発現ベクターYip5に、PGK1プロモーター支配下に置いたRKI1遺伝子(リボース5リン酸異性化酵素遺伝子、塩基配列：配列番号１及び対応するアミノ酸配列：配列番号２）、RPE1遺伝子(リブロースリン酸3異性化酵素遺伝子、塩基配列：配列番号３及び対応するアミノ酸配列：配列番号４)及びTAL2遺伝子(トランスアルドラーゼ遺伝子、塩基配列：配列番号５及び対応するアミノ酸配列：配列番号６)を組み込んだ。
【００９７】
また、市販の発現ベクターpAUR135(タカラバイオ株式会社）に、PGK1プロモーター支配下に置いたTKL2遺伝子(トランスケトラーゼ遺伝子、塩基配列：配列番号７及び対応するアミノ酸配列：配列番号８)を組み込んだ。
【００９８】
得られた当該2つの組換えベクターを用いて、キシロース資化能付与醸造用酵母(サッカロマイセス・セレビシア協会7号株(DNA Research, 18, p.423-434, 2011))の染色体上URA3遺伝子部位にRKI1遺伝子、RPE1遺伝子及びTAL2遺伝子を導入し、且つ当該染色体上AUR1遺伝子部位にTKL2遺伝子を導入した。得られた株をペントースリン酸経路(PPP)強化株とした。また、導入遺伝子を含まないベクターのみを組み込んだ株を同様に作製し、以下の実験で対照株として用いた。
【００９９】
３．発酵性評価
上記第２節で作製したPPP強化株又は対照株を、YPD(グルコース2％含有)で前培養した後、上記第１節で作製した5％キシルロースを含む改変CBS培地(H. B. Klinke et al., Biotechnol. Bioeng., 2003年, Vol. 81, pp. 738-747：pH 5.0)15 mlを含む50 ml容三角フラスコで、初期植菌量OD600＝ 20、30℃及び140 rpm下で旋回培養し、経時的にサンプリングを行い、発酵性を評価した。発酵代謝物を、Shodex SUGAR SP0810カラムを用いてHPLCにより定量した。菌体濃度は、分光光度計(λ＝600nm)で測定した。
【０１００】
４．発酵性評価結果
結果を図３に示す。PPP強化株は、対照株に比べキシルロース消費速度が増加し、エタノール生産量に向上が認められた。
【図１−１】
2014195442.tif 000004
【図１−２】
2014195442.tif 000005
【図２−１】
2014195442.tif 000006
【図２−２】
2014195442.tif 000007
【図２−３】
2014195442.tif 000008
【図２−４】
2014195442.tif 000009
【図３】
2014195442.tif 000010
【配列表】
2014195442000001.app