(57)【要約】【課題】簡便な操作で製造でき、簡便に投与可能であり、かつ優れた抗腫瘍効果を有するワクチン組成物及びその製造方法の提供。【解決手段】（Ａ）自己腫瘍抗原と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを含有するワクチン組成物。一般式（１）2014125457.tif 000007（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）自己腫瘍抗原と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを含有するワクチン組成物。
一般式（１）
【化１】
2014125457.tif 000005
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【請求項２】
前記（Ｂ）成分が、Ｎ−メチルピロリドン又はＮ−エチルピロリドンである請求項１のワクチン組成物。
【請求項３】
経皮投与剤である、請求項１又は２記載のワクチン組成物。
【請求項４】
（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類に自己腫瘍細胞を溶解することを特徴とする、（Ａ）自己腫瘍抗原と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを含有するワクチン組成物の製造方法。
【化２】
2014125457.tif 000006
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんワクチン組成物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、元来生体が有している外来抗原排除という免疫応答を利用する療法であり、免疫系を賦活させることで治療するものである。免疫療法には、皮下、皮内、経皮投与法などがあり、免疫賦活剤と抗原とを順次に或いは同時に投与することで自然免疫系を活性化し、投与抗原に対する高い免疫応答を期待している。
【０００３】
自家ワクチンは手術などで得られた自己のがん組織抽出物をアジュバントと共に投与し、免疫系に認識、がんに対して攻撃性のあるＣＴＬs（細胞障害性Ｔ細胞）を生体内で誘導し、がんを治療する方法である。同様にがんに対するＣＴＬsを誘導する方法として、ペプチドワクチンがあり多くの検討がなされている。しかし、ペプチドワクチンはＨＬＡ拘束性があるため、ＨＬＡの型が合う一部の人しか対象とならない。それに対し、自家ワクチン療法では自己の癌細胞に含まれる様々なタンパク、ペプチドの情報を一度に与えることができるので、高い治療効果が期待できる。また自己組織由来であるため、ＨＬＡの型に依らず治療が行えるのが大きな利点である（特許文献１、２）。
また、自家ワクチン療法は効果、また対象となる患者という点でがん免疫療法の中でも優れた特徴を持っている。しかし、自家ワクチンは、もともと自己組織由来の成分を投与するため、免疫系が異物として認識しにくいという欠点がある。これに対し、腫瘍細胞をハプテン化して投与する方法（特許文献３、４）や抗原を無機微粒子に担持させて徐放する方法（特許文献５）といった手段が採られている。しかしこれらの方法は、腫瘍細胞に対してさまざまな添加物を加えて培養するなど設備や時間の面で煩雑な操作が必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００１−５２６６２２号公報
【特許文献２】特表２００６−５０７２１４号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１６５５１８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０２３２９５号明細書
【特許文献５】特表２００８−５４０４９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、簡便な操作で製造でき、簡便に投与可能であり、かつ優れた抗腫瘍効果を有するワクチン組成物及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、自己腫瘍細胞を簡便に無毒化する手段及び経皮投与により優れた抗腫瘍効果を得る手段を開発すべく種々検討した結果、ピロリドン類が経皮投与により優れた免疫賦活剤として作用すること、さらにピロリドン類が腫瘍細胞の溶解剤及び不活化剤としても作用することから、自己腫瘍細胞をピロリドン類に溶解させるだけで腫瘍細胞が不活化（死滅）し、得られた組成物が経皮投与により優れたワクチン効果を奏することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、（Ａ）自己腫瘍抗原と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを含有するワクチン組成物を提供するものである。
【０００８】
【化１】
2014125457.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【００１０】
また、本発明は、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類に自己腫瘍細胞を溶解することを特徴とする、（Ａ）自己腫瘍抗原と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを含有するワクチン組成物の製造方法を提供するものである。
【００１１】
【化２】
2014125457.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明ではピロリドン類（１）が腫瘍細胞の不活化剤、細胞の溶解剤、さらには免疫賦活剤として働くため、腫瘍細胞をピロリドン類（１）に溶解させるだけで、十分な効果を有するワクチン組成物が作成可能である。また、このワクチン組成物を経皮投与することで、皮膚に存在する抗原提示細胞によって効率的に免疫反応を誘導でき、腫瘍に対して十分な治療効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】試験例２、３及び４による腫瘍径の経時変化を示す図である。ここで、試験例４は本発明ワクチン組成物非投与群である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のワクチン組成物は、（Ａ）自己腫瘍抗原と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを含有する。
【００１６】
【化３】
2014125457.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【００１８】
（Ａ）自己腫瘍抗原は、自己腫瘍細胞由来の抗原であり、本発明においては、自己腫瘍細胞をピロリドン類（１）に溶解するだけで、自己腫瘍細胞が死滅し、自己腫瘍細胞由来の抗原が生成する。用いられる自己腫瘍細胞としては、自己が罹患しているがん組織であるのが望ましい。すなわち、肺がん患者であれば、当該患者の肺がん組織を用いるのが望ましい。がんの種類は、特に限定されず、例えば頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。
【００１９】
（Ｂ）ピロリドン類（１）を示す一般式（１）中、Ｒとしては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、メチル基、エチル基が特に好ましい。すなわち、ピロリドン類（１）としては、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドンが特に好ましい。
【００２０】
本発明のワクチン組成物において、ピロリドン類（１）は、自己腫瘍細胞の溶解剤として、また不活化剤として作用する。また、ピロリドン類（１）は、単独で免疫賦活作用を有する。従って、本発明のワクチン組成物は、優れたワクチン効果、すなわち抗腫瘍効果が得られる。
【００２１】
本発明のワクチン組成物中のピロリドン類（１）の含有量は、０．１質量％以上が好ましく、１〜２０質量％がより好ましく、２〜１５質量％がさらに好ましく、３〜１０質量％が特に好ましい。また、本発明のワクチン組成物中の（Ａ）自己腫瘍抗原の含有量は、特に限定されないが、ピロリドン類（１）１００μｌに対して、好ましくは１０2〜１０10個、より好ましくは１０3〜１０8個の自己腫瘍細胞を死滅させて得られる自己腫瘍抗原を含むことが好ましい。
【００２２】
本発明のワクチン組成物は、他の腫瘍抗原、他の免疫賦活剤、免疫調節剤、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＴＬＲ賦活剤（クレスチン、リポポリサッカロイド、フラジェリン、ＣｐＧヌクレオチド）等と併用してもよい。
【００２３】
また、本発明のワクチン組成物には、希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤；水等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２４】
本発明のワクチン組成物の剤形は、経皮投与剤であることが好ましい。経皮投与剤は、注射用剤と比較して、非侵襲的であること、また操作が塗る、貼るなどの単純な作業になるため、医療従事者である必要がなく、患者自身によっても作業可能である点で優れている。このような経皮投与剤の具体的な剤形としては、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、スプレー剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤などが挙げられる。これらの中でも貼付剤であることがより好ましい。
【００２５】
また、本発明のワクチン組成物を経皮投与する場合には、さらに角質剥離用粘着シートを備えていてもよい。角質剥離用粘着シートは、例えば特開２００７−２８９６７２、特開２００８−２０１６９８、特開２０１１−１６８５４２、特開２０１１−１７７２７４に記載のものが使用できる。
【００２６】
角質剥離用粘着シートの剥離により、皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、ワクチン組成物の経皮吸収性を向上させることが出来るうえ、角質剥離用粘着シートの剥離による皮膚表皮角質層の破壊により皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。
【００２７】
また、角質剥離用粘着シートの粘着層に上記（Ｂ）成分等の免疫賦活剤を含有させることが好ましい。免疫賦活剤を含有する角質剥離用粘着シートの貼付により、免疫賦活剤による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮内樹状細胞等）の活性化を行うことができる。
【００２８】
角質剥離用粘着シートの粘着層中の免疫賦活剤の含有量は、０．００００１〜２５質量％が好ましく、０．００１〜２０質量％がより好ましく、０．１〜１５質量％がさらに好ましく、３〜１０質量％が特に好ましい。
【００２９】
本発明のワクチン組成物は、基本的に、ピロリドン類（１）に自己腫瘍細胞を溶解することにより簡便に製造できる。当該溶液を用い常法に従い、さらに必要に応じて種々の添加物を添加して、経皮投与剤とするのが好ましい。
具体的には、ピロリドン類（１）１００μｌに対して、特に限定されないが、好ましくは細胞数１０2〜１０10個、より好ましくは１０3〜１０8個の自己腫瘍細胞を溶解させ、必要に応じて、上述した希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等を添加し、所望の剤形のワクチン組成物を製造できる。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００３１】
１.ワクチン組成物の調製
〔実施例１〕
マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株２×１０6個を、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）１００μｌに溶解し、ワクチン組成物１を調製した。
【００３２】
〔実施例２〕
マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０7個を、ＮＭＰ１００μｌに溶解し、そこから５μｌ採取し９５μｌオレイン酸で希釈することで、ワクチン組成物２を調製した。
【００３３】
２.角質剥離用粘着シートの作製
アクリル系ポリマー溶液（アクリル酸−２−エチルヘキシル；２ＥＨＡ／Ｎ−ビニルピロリドン；ＶＰ／ヘキサンジオールジメタクリレート；ＨＤＤＭ  共重合体＝７８／２２／０．０３［ｍｏｌ％］、Ｍｗ＝約８５万、固形分３５質量％）１００質量部に対して、ＮＭＰ１０質量部を溶解して粘着剤組成物（非水系、溶剤型）を調製した後、剥離シートとしての剥離処理ポリエステルフィルム（商品名「ＳＰ−ＰＥＴ３８１０３１」、リンテック社製）上に、粘着剤組成物をアプリケーターで塗布し、８０℃で乾燥して坪量２５ｇ／ｍ2の粘着層を形成した後、支持基材としての厚さ５０μｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを粘着層面にラミネートして、支持基材／粘着層（非水系）／剥離シートの構成からなる角質剥離用粘着シート１（粘着層中にＮＭＰ８質量％含有）を得た。
【００３４】
〔比較例１〕
マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株２×１０6個を、リン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに溶解し、比較用製剤１を調製した。
【００３５】
〔試験例１〕
ワクチン組成物１及び比較用製剤１にそれぞれ７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）を添加後、フローサイトメータによる細胞の生死を判定した。７−ＡＡＤは細胞膜形成が崩壊した死細胞核内に進入し、ＤＮＡのグアニン-シトシン塩基対間に結合する。よって、７−ＡＡＤ陽性細胞は死細胞として、７−ＡＡＤ陰性細胞は生細胞として判定される。
その結果、ワクチン組成物１中のマウス腫瘍細胞の生細胞率は０％、比較用製剤１では８９％となった。
【００３６】
〔試験例２〕
８〜１０週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束）背部をバリカンで除毛後、角質剥離用粘着シート１を貼付した。貼付から２４時間後にテープを剥離し、１００μｌのワクチン組成物２を塗布した。上記操作を再度２週間後に実施した。最終処理から１０日後に、マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０5個をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに懸濁した液を皮内注射した。
次いで、マウス腫瘍細胞の移植から１２、１５、２０、２５日目に腫瘍径を測定し、球体として体積換算した。
なお、試験はｎ＝３で実施し、腫瘍体積の平均値を測定値とした。
結果を図１に示す。
【００３７】
〔試験例３〕
８〜１０週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束）背部をバリカンで除毛後、角質剥離用粘着シート１を貼付した。貼付から２４時間後にテープを剥離し、１００μｌのワクチン組成物２を塗布した。上記操作を再度２週間後に実施した。最終処理から１０日後に、マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０5個をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに懸濁した液を皮内注射した。
次いで、マウス腫瘍細胞の移植から１２、１５、２０、２５日目に腫瘍径を測定し、球体として体積換算した。
また、マウス腫瘍細胞の移植から７、１４、２１日目に角質剥離用粘着シート１を貼付した。貼付から２４時間後にテープを剥離し、１００μｌのワクチン組成物２を塗布した。
なお、試験はｎ＝３で実施し、腫瘍体積の平均値を測定値とした。
結果を図１に示す。
【００３８】
〔試験例４〕（本発明ワクチン組成物非投与群）
８〜１０週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束）背部をバリカンで除毛後、マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０5個をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに懸濁した液を皮内注射した。
次いで、マウス腫瘍細胞の移植から１２、１５、２０、２５日目に腫瘍径を測定し、球体として体積換算した。
なお、試験はｎ＝３で実施し、測定した腫瘍体積の平均値を測定値とした。
結果を図１に示す。
【００３９】
試験例１の結果より、ワクチン組成物１によって腫瘍細胞は完全に死滅していることが示された。
図１より、ワクチン組成物非投与群である試験例４に比べて、試験例２及び試験例３は優れた腫瘍細胞の増殖抑制効果が認められた。特に、定期的にワクチン組成物２を投与した試験例３では、移植した腫瘍細胞の増殖の抑制効果が顕著に認められた（図１）。
【００４０】
以上の結果より、（Ｂ）成分に自己腫瘍細胞を溶解させて、自己腫瘍細胞を死滅させることにより、無毒化された（Ａ）自己腫瘍抗原が含まれたワクチン組成物が得られることが確認された。
また、本発明のワクチン組成物を用いることで、腫瘍細胞の増殖が抑制できるため、腫瘍に直接適用することや、腫瘍切除手術後の再発を防止するために適用することが期待される。
【図１】
2014125457.tif 000008