(57)【要約】      （修正有）【課題】ヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅなどに対して安定性を有し、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を介した免疫調節活性を有するオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の提供。【解決手段】ＴＬＲ８、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、またはＴＬＲ７に対するアゴニストである安定化免疫調節ＲＮＡ（ＳＩＭＲＡ）化合物で、該ＳＩＭＲＡが３’若しくは５’付着またはこれらの組み合わせを介して結合するＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの少なくとも２つを含むもの、又はＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドが、３’末端若しくは５’末端で互いに直接結合するものである。又はＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドが、３’末端又は５’末端が非ヌクレオチドリンカーと結合し、該非ヌクレオチドリンカーがアルキルリンカー又は、アミノリンカーである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化免疫調節ＲＮＡ（ＳＩＭＲＡ）化合物を含む、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、またはＴＬＲ７に対するアゴニスト。
【請求項２】
ＳＩＭＲＡが、３’または５’付着またはこれらの組み合わせを介して結合するＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの少なくとも２つを含む、請求項１に記載のアゴニスト。
【請求項３】
ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドが、３’末端または５’末端で互いに直接結合する、請求項２に記載のアゴニスト。
【請求項４】
ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端が、非ヌクレオチドリンカーと結合する、請求項２に記載のアゴニスト。
【請求項５】
非ヌクレオチドリンカーが、アルキルリンカーまたはアミノリンカーであり、ここでアルキルまたはアミノシンカーは、選択的に、分枝または非分枝、環状または非環状、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってもよい、請求項４に記載のアゴニスト。
【請求項６】
アルキルリンカーが、約２〜約１８個の炭素原子を有し得る、請求項５に記載のアゴニスト。
【請求項７】
アルキルリンカーが、約３〜約９個の炭素原子を有し得る、請求項５に記載のアゴニスト。
【請求項８】
アルキルリンカーが、１，２，３−プロパントリオール、グリセロール、１，２，４−ブタントリオール、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオール、トリス（ヒドロキシメチル）ニトロメタン、１，１，１−トリ（ヒドロキシメチル）プロパン、１，２，６−ヘキサントリオール、１，３，５−ヘキサントリオール、１，３，５−ペンタントリオール、３−メチル−１，３，５−ペンタントリオール、１，２，３−ヘプタントリオール、２−（ヒドロキシメチル）１，４−ブタンジオール、１，３−ジ（ヒドロキシメチル）フェノール、１，３，５−トリ（ヒドロキシメチル）ベンゼン、１，３−ジ（ヒドロキシエトキシ）−２−ヒドロキシ−プロパン、１，３−ジ（ヒドロキシプロポキシ）−２−ヒドロキシ−プロパン、Ｄ−ガラクタール、１，３，５−トリス（２−ヒドロキシエチル）シアヌル酸または１，３，５−トリス（４−ヒドロキシフェニル）ベンゼンから選択される、請求項５に記載のアゴニスト。
【請求項９】
ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、修飾オリゴリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアゴニスト。
【請求項１０】
修飾オリゴリボヌクレオチドが、７−デアザ−Ｇ、アラ−Ｇ、６−チオ−Ｇ、イノシン、イソ−Ｇ、ロキソリビン、ＴＯＧ（７−チオ−８−オキソ）−Ｇ、８−ブロモ−Ｇ、８−ヒドロキシ−Ｇ、５−アミノホルマイシンＢ、オキソホルマイシン、７−メチル−Ｇ、９−ｐ−クロロフェニル−８−アザ−Ｇ、９−フェニル−Ｇ、９−ヘキシル−グアニン、７−デアザ−９−ベンジル−Ｇ、６−クロロ−７−デアザグアニン、６−メトキシ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ−Ｇ（ＰＰＧ）、２−（ジメチルアミノ）グアノシン、７−メチル−６−チオグアノシン、８−ベンジルオキシグアノシン、９−デアザグアノシン、９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）アデニン、２−アミノ−Ｎ２−Ｏ−、メチルアデノシン、８−アザ−７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ａ、ビダラビン、２−アミノアデノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、５−ヨードツベルサイジン、１−（Ｂ−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンおよび４−チオ−Ｕまたはこれらの組み合わせを含む、請求項９に記載のアゴニスト。
【請求項１１】
ＲＮＡベースの化合物が、さらに５’キャップを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のアゴニスト。
【請求項１２】
５’キャップが、非ヌクレオチドリンカーである、請求項１１に記載のアゴニスト。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載のアゴニストおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
脊椎動物において免疫応答を惹起する方法であって、該脊椎動物に薬学的に有効な量の請求項１〜１０のいずれかに記載のＳＩＭＲＡ化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息または病原によって引き起こされた疾病を有する脊椎動物を治療的に処置する方法であって、かかる方法が、薬学的に有効な量の請求項１〜１０のいずれかに記載のＳＩＭＲＡ化合物を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
さらに、１または２以上の化学療法化合物を投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、標的治療剤を投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、抗体を投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、ＤＮＡワクチンを投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、ワクチンを投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、抗原を投与することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
脊椎動物における癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性障害、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息または病原によって引き起こされた疾病を予防する方法であって、かかる方法が、薬学的に有効な量の請求項１〜１０のいずれかに記載のＳＩＭＲＡ化合物を脊椎動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
さらに、１または２以上の化学療法化合物を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、標的治療剤を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
さらに、抗体を投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、オリゴリボヌクレオチドを免疫調節剤として用いる免疫学および免疫治療の適用の分野に関する。とくに本発明は、安定化免疫調節ＲＮＡ（ＳＩＭＲＡ）組成物およびその使用方法に関する。かかる組成物および方法は、Ｔｏｌｌ様レセプター８（ＴＬＲ８）、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、並びにＴＬＲ７（ＴＬＲ７）を介した免疫反応を調節するのに効果的である。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の概要
免疫応答には、該応答に係わる細胞のサブセットに基づく生得的応答および順応的応答の両方が含まれる。例えば、遅延型過敏性および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化などの古典的な細胞媒介機能に係わるＴヘルパー（Ｔｈ）細胞はＴｈ１細胞であり、一方、Ｂ細胞の活性化に対してヘルパー細胞として係わる細胞はＴｈ２細胞である。免疫応答のタイプは、抗原への暴露に対する応答において産生されるサイトカインおよびケモカインによって影響を受ける。サイトカインは、生じる免疫応答のタイプに直接的に影響するＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞とＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞とのバランスに影響することによって、免疫応答を制御する手段を提供する。バランスがＴｈ１の数がより高い方へ向くと、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含む細胞媒介免疫応答が生じる。バランスがＴｈ２の数がより高い方へ向くと、体液性または抗体免疫反応が生じる。これらの免疫応答のそれぞれは、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞から分泌されるサイトカインの異なる組み合わせをもたらす。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞によって分泌されるサイトカインの差異は、これら２つのサブセットの異なる生体機能の結果であるかもしれない。
【０００３】
Ｔｈ１細胞は、抗原への身体の先天性応答に関与する（例えばウィルス感染、細胞内病原体、および腫瘍細胞）。抗原に対する最初の応答は、抗原提示細胞（例えば、活性化マクロファージおよび樹状細胞）からのＩＬ−１２の分泌およびＴｈ１細胞の同時活性化である可能性がある。Ｔｈ１細胞の活性化の結果は、あるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマおよび他のサイトカイン）の分泌および抗原特異的ＣＴＬの同時活性化である。Ｔｈ２細胞は、細菌、寄生動物、抗原およびアレルゲンに応答して活性化されることが知られており、あるサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３および他のサイトカイン）およびケモカインの分泌を介して、身体の順応免疫応答（例えば、ＩｇＥ産生および好酸球の活性化）を媒介し得る。これらのあるサイトカインの分泌によって、Ｂ細胞増殖および抗体産生の増加をもたらし得る。さらに、これらのあるサイトカインは、他のサイトカインの遊離を惹起するか、阻害し得る（例えば、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γおよび樹状細胞からのＩＬ−１２の分泌を阻害する）。最終的に、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の間のバランス並びに選択された刺激に応じて遊離したサイトカインおよびケモカインは、身体の免疫系が疾病にどのように応答するかにおける重要な役割を有する可能性がある。例えば、ＩＦＮ−αはＣ型肝炎を阻害し、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β（夫々、ＣＣＬ３およびＣＣＬ４としても知られる）は、ＨＩＶ−１の感染を阻害し得る。Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の最適なバランスは、種々の疾病を処置および予防するために免疫系を用いる機会を提示する。
【０００４】
Ｔｈ１免疫応答は、例えば、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む細菌のまたは合成ＤＮＡの導入によって、哺乳動物において誘導されることができ、免疫応答は、パターン認識レセプター（pattern recognition receptors；ＰＲＲ）として知られるある免疫細胞のレセプターに対する特異的なオリゴヌクレオチド配列（例えば、非メチル化ＣｐＧ）の提示をもたらす。これらのうち、あるＰＲＲは、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）である。
【０００５】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、微生物感染に対する応答における先天性免疫応答の誘導に密接に関与する。脊椎動物において、Ｔｏｌｌ様受容体と呼ばれる１０種のタンパク質のファミリー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）が、病原体関連分子パターンを認識することが知られている。１０種のうち、ＴＬＲ３、７、８および９は、細胞内のエンドソーム内に限局化し、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにヌクレオシドおよび核酸代謝産物などの小分子を認識することが知られている。ＴＬＲ３およびＴＬＲ９は、それぞれウィルスおよび細菌ならびに合成ＤＮＡに存在するｄｓＲＮＡおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドなどの核酸を認識することが知られている。細菌ＤＮＡは、免疫システムおよび抗腫瘍活性を活性化することが示されている(Tokunaga T et al., J. Natl. Cancer Inst. (1984) 72:955-962; Shimada S, et al., Jpn. H cancer Res, 1986, 77, 808-816; Yamamoto S, et al., Jpn. J. Cancer Res., 1986, 79, 866-73; Messina, J, et al., J. Immunolo. (1991) 147:1759-1764)。ＣｐＧジヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する他の研究では、免疫応答の刺激が示された(Zhao Q, et al., Biochem.Pharmacol. 1996, 26, 173-82)。続く研究により、ＴＬＲ９が細菌および合成ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが示された(Hemmi H, et al., Nature. (2000) 408:740-5)。ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修飾はまた、ＴＬＲ９を介する免疫応答のモジュレータとして作用するその能力に影響を及ぼすことができる(例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182;  Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544;  Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502;  Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054;  Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; and Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813参照)。加えて、構造活性相関研究により、合成モチーフおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドから生じるものとは明白に異なる、特異的免疫応答プロフィールを誘発する新規のＤＮＡに基づく化合物の同定を可能にしてきた(Kandimalla ER, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2005) 102:6925-30. Kandimalla ER, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2003) 100:14303-8. Cong YP, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 310:1133-9. Kandimalla ER, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 306:948-53. Kandimalla ER, et al., Nucleic Acids Res. (2003) 31:2393-400. Yu D, et al., Bioorg Med Chem. (2003) 11:459-64. Bhagat L, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2003) 300:853-61. Yu D, et al., Nucleic Acids Res. (2002) 30:4460-9. Yu D, et al., J Med Chem. (2002) 45:4540-8. Yu D, et al., Biochem Biophys Res Commun. (2002) 297:83-90. Kandimalla ER, et al., Bioconjug Chem. (2002) 13:966-74. Yu D, K et al., Nucleic Acids Res. (2002) 30:1613-9. Yu D, et al., Bioorg Med Chem. (2001) 9:2803-8. Yu D, et al., Bioorg Med Chem Lett. (2001) 11:2263-7. Kandimalla ER, et al., Bioorg Med Chem.( 2001) 9:807-13. Yu D, et al., Bioorg Med Chem Lett. (2000) 10:2585-8, Putta MR, et al., Nucleic Acids Res. (2006) 34:3231-8)。しかしながら、最近まで、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然のリガンドは知られていなかった。
【０００６】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が、ウイルスおよび合成の一本鎖ＲＮＡ、および多くのヌクレオシドを含む、小さな分子を認識することが示されてきた(Diebold, S.S., et al., Science v: 303, 1529-1531 (2004))。Diebold et al. (Science, v303: 1529-1531 (2004))には、インフルエンザウイルスに対するＩＦＮ−α応答が、インフルエンザのゲノムＲＮＡのエンドソーム認識およびＴＬＲ７およびＭｙＤ８８によるシグナリングを要求することが示されていて、ｓｓＲＮＡをＴＬＲ７に対するリガンドであると同定している。ヒトの場合、ｓｓＲＮＡはＴＬＲ７ではなくＴＬＲ８によって認識され、一方で、マウスのＴＬＲ７はｓｓＲＮＡを認識することができる(Lund JM, et al.  Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Apr 13; 101(15):5598-603;  Heil F, et al.  Science. 2004 ;303:1526-9; Diebold SS, et al., Science. 2004; 30:1529-31; Triantafilou K, et al.,  Eur J Immunol. 2005 Aug; 35(8):2416-23)。ある合成化合物、イミダゾキノロンイミキモド（Ｒ−８３７）およびレシキモド（Ｒ−８４８）は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドである(Hemmi H et al., (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499)。加えて、７−デアザ−Ｇ、７−チア−８−オキソ−Ｇ（ＴＯＧ）および７−アリル−８−オキソ−Ｇ（ロキソリビン）などのグアノシン類縁体は、高濃度において、ＴＬＲ７を活性化することが示されている[Lee J et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100:6646-51]。しかしながら、例えば、イミキモドなどのこれら小分子はまた、他のレセプターを介して作用することが知られている(Schon MP, et al., J. Invest Dermatol., 2006, 126, 1338-47)。
【０００７】
ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の認識のための既知の特異的ｓｓＲＮＡモチーフの欠損並びに潜在的に広い範囲の刺激性ｓｓＲＮＡによって、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が自己のおよびウイルスのＲＮＡの両方を認識し得ることが示唆されている。近年、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）または他の脂質剤と複合された場合、あるＧＵ−リッチなオリゴリボヌクレオチドが、免疫刺激性であり、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を介して作用することが示されてきた(Heil et al. Science, 303: 1526-1529 (2004); Lipford et al. WO03/086280; Wagner et al. WO98/32462)。しかしながら、ＲＮＡ分子は長年、例えば、リボザイムおよびｓｉＲＮＡとして使用され、リボザイムおよびｓｉＲＮＡとして用いられたＲＮＡは、ＧＵジヌクレオチドを含む。さらに、多くのこれらＲＮＡ分子は、脂質の存在下で、ＴＬＲの刺激を介して免疫応答を誘発することが示されてきた[Kariko et al., Immunity (2005) 23:165-75; Ma Z et al., Biochem Biophys Res Commun., (2005) 330, 755-9]。しかしながら、これらのＲＮＡ分子の不安定さによって、多くの領域（例えば、ヒトの疾病の予防や処置など）において、これらの分子を用いることおよび適用することの発展が妨げられた。
【０００８】
リボースまたはデオキシリボースの糖を含むオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドは、様々な分野で使用されており、診断精査、ＰＣＲプライミング、遺伝子発現のアンチセンス阻害、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、およびトール様受容体（ＴＬＲ）をベースとした免疫療法剤が含まれるがこれらに限定されない。より最近では、多くの刊行物は、オリゴデオキシヌクレオチドの免疫調節剤としての使用や、アレルギー、喘息、自己免疫、癌、および感染症などの多くの疾病への免疫療法用途におけるそれらの単独でのまたはアジュバントとしての使用を実証している。
【０００９】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＴＬＲ９によって認識され、一方でＲＮＡオリゴヌクレオチドがＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８によって認識されているという事実は、ＤＮＡおよびＲＮＡの間の構造的な配座の差によるものであろう。しかしながら、ＤＮＡおよびＲＮＡの間の化学的な差にもよって、ＤＮＡは化学的および酵素的にＲＮＡよりもはるかに安定である。
【００１０】
ＲＮＡは、遍在する細胞外リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によって急速に分解し、このことが、殆どの（あったとしても）自己のｓｓＲＮＡが抗原提示細胞に辿り着かないことを保証する。核酸のエキソヌクレアーゼ分解は、圧倒的に３’−ヌクレアーゼの消化であり、よりわずかな割合で５’−エキソヌクレアーゼ作用を介する。エキソヌクレアーゼの消化に加えて、ＲＮＡはＲＮａｓｅのエンドヌクレアーゼ作用によっても分解し得る。ＲＮＡをベースとする分子は、ヌクレアーゼ安定性を提供するために、脂質と複合化しなければならなかった。
【００１１】
しかしながら、自己免疫反応を防ぐ本質的な機能を提供している間、これらのリボヌクレアーゼはまた、合成および天然の両方のｓｓＲＮＡを急速に分解するから、免疫療法のために開発されるべく意図された任意の合成ｓｓＲＮＡ分子の本質的な問題を示す。このハードルを克服するため、ｓｓＲＮＡ分子の分解からの保護は、ｓｓＲＮＡのリポソームでのカプセル化、ポリエチレンイミンでの凝集、または、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）などの分子との複合化が試みられてきた。しかしながら、これらの保護手段は、まだ不安定なｓｓＲＮＡに適用された二次的な手段であり、ｓｓＲＮＡ（天然または合成）のインビボでのこれらの保護手段の効能および免疫調節作用の影響は、不明なままである。
【００１２】
したがって、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８に対するリガンドとして認識され続けるように、一方で、インビボで有用な分子となり得るように安定性を改善されるように、裸のＲＮＡをそのままにしておくことが挑戦されている。理想的には、新しい免疫治療剤として作用することができる本質的に安定なＲＮＡをベースとした分子の設計を介して、この挑戦に対峙するかもしれず、かかる剤は、併用時のワクチンの効果を改善すること、または、免疫応答を引き起こすことや増強することが有益である場合に、例えば、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息または病原体による疾病などの疾患を処置および／または予防することのように、多くの臨床的に関連ある適用における使用を見出すであろう。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の概要
第一の面において、本発明は、
新規なクラスの安定化免疫調節ＲＮＡ（ＳＩＭＲＡ）化合物、さらに以下に定義するもの、およびそれらの免疫応答の誘導および／または増強への使用を提供することにより、前記の要求を満たす。本発明による新規な化学物質は、免疫応答を誘導することに実質的により効果的であり、分解に対して実質的により感受性が低い免疫反応誘導および／または増強化合物を提供する。本発明による方法は、免疫治療の適用に対し、ＳＩＭＲＡによって産生するサイトカインプロフィールを改変することができる。
【００１４】
第一の面の１つの態様において、本発明は、ＴＬＲ８に対するアゴニストとしてのＳＩＭＲＡ化合物を提供する。
【００１５】
第一の面の他の態様において、本発明は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対するアゴニストとしてのＳＩＭＲＡ化合物を提供する。
【００１６】
第一の面のさらなる態様において、本発明は、ＴＬＲ７に対するアゴニストとしてのＳＩＭＲＡ化合物を提供する。
【００１７】
第一の面のさらなる態様において、本発明は、アジュバントとしてのＳＩＭＲＡ化合物を提供する。
【００１８】
第二の面において、本発明は医薬組成物を提供する。これらの組成物は、本発明の第一の最初の３つの面に開示した組成物の任意のものおよび薬学的に許容し得る担体を含む。
【００１９】
第三の面において、本発明は、脊椎動物において免疫応答を惹起する方法を提供し、該方法は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物を薬学的に有効な量で脊椎動物に投与することを含む。
【００２０】
第四の面において、本発明は、例えば、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息または病原体による疾病などの免疫応答を誘導することおよび／または増強することが有益である疾病または障害を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、このような疾病または障害を有する患者に、薬学的に有効な量で本発明のＳＩＭＲＡ化合物を投与することを含む。
【００２１】
第五の面において、本発明は、例えば、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、皮膚病、アレルギー、喘息または病原体による疾病などの免疫応答を誘導することおよび／または増強することが有益である脊椎動物における疾病または障害を予防する方法を提供し、かかる方法は、このような障害または疾病に感受性である脊椎動物に本発明のＳＩＭＲＡ化合物を薬学的に有効な量を投与することを含む。
【００２２】
第六の面において、本発明は、サイトカインまたはケモカインを産生することができる細胞（例えば、免疫細胞、ＰＢＭＣ）を単離する方法、かかる細胞を標準の細胞培養条件下で培養する方法、かかる細胞を、単離細胞が増大したレベルのサイトカインまたはケモカインを産生または分泌するようにＳＩＭＲＡとエクスビボで処置する方法、および疾病の予防または処置のため、処置した細胞をサイトカインまたはケモカイン治療の必要な患者に投与または再投与する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物のリニア合成の合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【図２】図２は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物のパラレル合成の合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【図３】図３は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物のリニア合成に好適な代表的なアルキルリンカーのグループを図示する。
【図４】図４は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物のパラレル合成に好適な代表的な小分子リンカーのグループを図示する。
【図５】図５Ａは、天然のホスホジエステルＲＮＡ２０マーが１％ヒト血清で１０分以内に完全に分解されたことを示す。  図５Ｂは、同一の配列のホスホロチオエート骨格修飾ＲＮＡが、同じ条件下で相対的に安定しており、完全なオリゴの約５０％が１０分の終わりに存在していることを示す。  図５Ｃは、３’末端を介して付着する２つのホスホロチオエート骨格修飾ＲＮＡは、もっと安定しており、完全なＲＮＡの約７８％またはそれ以上が１０分後に残っており、ヌクレアーゼ分解に対する該分子の増大した安定性を示している。  図５Ｄは、３’−３’結合ホスホロチオエート骨格修飾ＲＮＡの５’末端でリンカーまたはキャップを付着していることが、５’結合またはキャップのないＲＮＡのものと比較して、安定性を適度に増大し、大部分の分解が３’末端から生じていることを示している。
【図５Ｅ】図５Ｅは、付加的なホスホロチオエート骨格を修飾した本発明の免疫調節化合物の安定性を示す。
【００２４】
【図６】図６は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物の皮下投与の２時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスからの血清においてＥＬＩＳＡで測定したＩＬ−１２のレベルを図示し、ＳＩＭＲＡ化合物（例えば、配列番号１１）がインビボでＩＬ−１２の分泌を誘導できることを示している。
【図７】図７は、１００ｍｇ／ｋｇの用量の本発明のＳＩＭＲＡ化合物を投与したマウスからの血清におけるサイトカインプロフィールを図示し、ＳＩＭＲＡ化合物（例えば、配列番号１１）がインビボ投与に続くサイトカインの産生を誘導することを示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび図８Ｂは、本発明のＳＩＭＲＡ化合物で処置したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン／ケモカインプロフィールを図示し、ＳＩＭＲＡ化合物（例えば、配列番号１１）がヒトＰＢＭＣにおいてサイトカインの分泌を誘導することを示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂは、本発明のＳＩＭＲＡ化合物で処置したヒトＰＢＭＣからのサイトカイン／ケモカインプロフィールを図示し、ＳＩＭＲＡ化合物（例えば、配列番号１１）がヒトＰＢＭＣにおいてサイトカインの分泌を誘導することを示す。
【図９】図９は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物の投与４時間後の注射したマウスの腫瘍細胞におけるＥＬＩＳＡで測定した血清ＩＬ−１２濃度を図示し、ＳＩＭＲＡ化合物の腫瘍保持哺乳動物への投与に続くＩＬ−１２の増大した量を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物の投与後のマウス腫瘍モデルにおける腫瘍小塊の数を図示し、ＳＩＭＲＡ化合物が、インビボでの投与に続いて、腫瘍小塊の数を低減したことを示す。
【００２５】
【図１１Ａ】図１１Ａから図１１Ｄは、本発明のＳＩＭＲＡ化合物で処理したヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣからのサイトカイン／ケモカインプロフィールを図示する。図１１Ａから図１１Ｄは、ＳＩＭＲＡ化合物が、ロキソリビンまたは７−デアザ−Ｇより強くはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することを示す。図１１Ａから図１１Ｄは、さらに、ＳＩＭＲＡ化合物の骨格、リンカー、結合および／またはキャップに対する修飾が、ＳＩＭＲＡが独特およびはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することをもたらすことを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａから図１１Ｄは、本発明のＳＩＭＲＡ化合物で処理したヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣからのサイトカイン／ケモカインプロフィールを図示する。図１１Ａから図１１Ｄは、ＳＩＭＲＡ化合物が、ロキソリビンまたは７−デアザ−Ｇより強くはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することを示す。図１１Ａから図１１Ｄは、さらに、ＳＩＭＲＡ化合物の骨格、リンカー、結合および／またはキャップに対する修飾が、ＳＩＭＲＡが独特およびはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することをもたらすことを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａから図１１Ｄは、本発明のＳＩＭＲＡ化合物で処理したヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣからのサイトカイン／ケモカインプロフィールを図示する。図１１Ａから図１１Ｄは、ＳＩＭＲＡ化合物が、ロキソリビンまたは７−デアザ−Ｇより強くはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することを示す。図１１Ａから図１１Ｄは、さらに、ＳＩＭＲＡ化合物の骨格、リンカー、結合および／またはキャップに対する修飾が、ＳＩＭＲＡが独特およびはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することをもたらすことを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａから図１１Ｄは、本発明のＳＩＭＲＡ化合物で処理したヒトＰＢＭＣおよびｐＤＣからのサイトカイン／ケモカインプロフィールを図示する。図１１Ａから図１１Ｄは、ＳＩＭＲＡ化合物が、ロキソリビンまたは７−デアザ−Ｇより強くはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することを示す。図１１Ａから図１１Ｄは、さらに、ＳＩＭＲＡ化合物の骨格、リンカー、結合および／またはキャップに対する修飾が、ＳＩＭＲＡが独特およびはっきりしたサイトカイン／ケモカインプロフィールを産生することをもたらすことを示す。
【００２６】
【図１２】図１２は、ＳＩＭＲＡ化合物の投与２４時間後、カニクイザルの血液プロフィールにおける変化を図示し、ＳＩＭＲＡ化合物が選択した免疫剤棒の効果を誘導できることを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＳＩＭＲＡ化合物の投与２４時間後のＥＬＩＳＡで測定したカニクイザルの血漿サイトカイン／ケモカイン濃度を図示し、ＳＩＭＲＡ化合物（例えば、配列番号１１および配列番号３０）が、インビボでサイトカイン／ケモカインプロフィールに影響を与えることができることを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＳＩＭＲＡ化合物の投与２４時間後のＥＬＩＳＡで測定したカニクイザルの血漿サイトカイン／ケモカイン濃度を図示し、ＳＩＭＲＡ化合物（例えば、配列番号１１および配列番号３０）が、インビボでサイトカイン／ケモカインプロフィールに影響を与えることができることを示す。
【図１４】図１４は、０時間と比較した投与後２４時間のカニクイザルのフローサイトメトリーで計測した制御性Ｔ細胞数、総Ｔ細胞数、単球数、ＮＫ細胞数およびＢ細胞数の変化を図示し、ＳＩＭＲＡ化合物はインビボでの免疫応答を調節することにおいて効果的であることを示す。より具体的には、これらのデータは、ＳＩＭＲＡ化合物が免疫細胞を選択する効果を誘導できることを示す。
【図１５】図１５は、０時間と比較した投与後２４時間のカニクイザルのフローサイトメトリーで計測した免疫細胞の活性化マーカーＣＤ６９の変化を図示する。図１５は、ＳＩＭＲＡ化合物はインビボで種々の免疫細胞のポピュレーションを活性化するのに効果的であることを示す。より具体的には、これらのデータは、ＳＩＭＲＡ化合物が免疫細胞を選択する効果を誘導できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、免疫治療の適用のための免疫調節剤としてのオリゴヌクレオチドの治療的使用に関する。とくに、本発明は、ＴＬＲ７のみ、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、またはＴＬＲ８のみを介した免疫応答を調節する改善されたインビボでの安定性を有するＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチド（ＳＩＭＲＡ化合物）を提供する。例えば、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８の安定したアゴニスト、またはＳＩＭＲＡ化合物による樹状細胞および他の抗原提示細胞の活性化を介し、様々な先天性および獲得免疫応答メカニズムを始めることによって、もたらされるサイトカインプロフィールは、病原体、感染細胞または腫瘍細胞の破壊、および抗原特異的抗体およびＣＴＬ応答の発生を導き得る。各々が参照として組み込まれるべく詳細かつ個別に示されているように、ここに言及する発行された特許、特許出願および文献は、同じ範囲で参照によってここに組み込まれる。ここに言及された任意の参照の任意の教示および本明細書との間に矛盾がある場合、後者が本発明の目的のために優先する。
【００２８】
本発明は、限定されないが、成人および小児科のヒトおよび獣医の適用における癌、自己免疫疾患、喘息、呼吸アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギーおよび細菌、寄生生物およびウイルスの感染の処置などの免疫治療の適用のために用いるＳＩＭＲＡ化合物によって引き起こされた免疫を増強する方法を提供する。したがって、本発明はさらに、免疫治療ための免疫調節効果の最適なレベルを有するＳＩＭＲＡ化合物およびかかる化合物を製造および使用する方法を提供する。さらに、本発明のＳＩＭＲＡ化合物は、疾病の予防および処置のためのＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を減らさない疾病または症状を処置するのに有用な剤と組み合わせるアジュバントとして有用である。
【００２９】
定義
用語「２’−置換リボヌクレオシド」または「２’−置換アラビノシド」は、一般に、ペントース部位の２’位の水酸基が置換して２’−置換または２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドであるリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。ある態様において、かかる置換は、１〜６個の飽和または不飽和の炭素原子を含む低級ヒドロカルビル基、ハロゲン原子、または、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基によるものであり、ここでかかるヒドロカルビル基またはアリール基は、置換していなくても、あるいは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシまたはアミノ基で置換していてもよい。２’−Ｏ−置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−置換アラビノシドの例には、限定されないが、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシドまたはアラビノシド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエトキシリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエトキシアラビノシドがある。
【００３０】
用語「３’」は、方向性に用いる場合、一般に、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの他の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’（糖の３’位の方へ）の領域または位置を意味する。
【００３１】
用語「５’」は、方向性に用いる場合、一般に、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの他の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’（糖の５’位の方へ）の領域または位置を意味する。
【００３２】
用語「約」は、一般に、正確な数字が臨界的でないことを意味する。したがって、オリゴリボヌクレオチドのリボヌクレオシド残基の数が臨界的であり、１つまたは２つのより少数のリボヌクレオシド残基を有するオリゴリボヌクレオチド、または１つから数個の付加的なリボヌクレオシド残基は、上記の各態様の相当物として考慮される。
【００３３】
用語「アジュバント」は、一般に、ワクチンまたは抗原などの免疫原の剤に加えられた場合、混合物にさらすと受け手のホストにおける剤の免疫応答を増強または強化する物質をいう。
【００３４】
用語「気道炎症」は、一般に、限定されず、喘息を含む感染性アレルゲンによって引き起こされた呼吸管の炎症を含む。
【００３５】
用語「アレルゲン」は、一般に、対象にさらすとアレルギー反応を誘発する分子（通常、タンパク質）の抗原または抗原部分をいう。典型的な対象は、例えば、ホイール・アンド・フレイア試験（wheal and flare test）または当該分野で知られる任意の方法によって示されるように抗原に対しアレルギー性である。分子は、分子にさらすと対象の小さな小集団だけがアレルギーの（例えば、ＩｇＥ）免疫反応を示しても、アレルゲンであるといわれる。
【００３６】
用語「アレルギー」は、一般に、限定されないが、食品アレルギー、呼吸アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００３７】
用語「抗原」は、一般に、抗体によって、または、Ｔ細胞抗原レセプターによって、認識され、選択的に結合する物質をいう。抗原は、限定されないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、天然または合成であってよく、一般に、当該抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【００３８】
用語「自己免疫疾患」は、一般に、「自己」の抗原が免疫系によって攻撃を受ける疾患をいう。
【００３９】
３’または５’分解を阻止することまたは「キャップ（cap）」または「キャッピング（capping）」は、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端が、ヌクレアーゼの分解（例えば、３’エキソヌクレアーゼの分解）を十分に阻害する他の分子（例えば、リンカーまたは他の非ＲＮＡヌクレオチド）と付着することを意味する。
【００４０】
用語「担体」は、一般に、任意の賦形剤、希釈剤、増量剤、塩、バッファー、安定化剤、可溶化剤、オイル、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソームカプセル剤または医薬の処方において用いるための当該分野でよく知られた他の材料を包含する。担体、賦形剤または希釈剤の特性が特定の適用に対する投与ルートに依存するであろうことは理解されるであろう。これらの材料を含む薬学的に許容し得る処方の製剤は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００４１】
用語「共投与（co-administration）」は、一般に、免疫応答を調節するために十分に時間的に近接した少なくとも２つの異なる物質の投与をいう。好ましくは、共投与は、少なくとも２つの異なる物質の同時の投与をいう。
【００４２】
用語「相補的」は、一般に、核酸とハイブリダイズする能力を有することを意味する。かかるハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖の間の水素結合の結果であり、他のモードの水素結合ならびに塩基のスタッキングもまたハイブリダイゼーションを導き得るが、好ましくは、ワトソン−クリック（Watson-Crick）またはフーグスティーン（Hoogsteen）塩基対を形成する。
【００４３】
用語「有効な量」または「十分な量」は、一般に、有益な結果などの所望の生体効果に影響するのに十分な量をいう。したがって、「有効な量」または「十分な量」は、投与される状況に依存するであろう。有効な量は、１回または２回以上の投与において投与され得る。
【００４４】
用語「免疫調節オリゴリボヌクレオチド」は、一般に、魚、家禽または哺乳動物などの脊椎動物に投与したとき、免疫応答を誘導または抑制するオリゴリボヌクレオチドをいう。
【００４５】
用語「組み合わせて」は、一般に、同じ患者における同じ疾病を処置する過程を意味し、ＳＩＭＲＡ化合物およびＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を減らさない疾病または症状を処置するのに有用な剤を、同時投与ならびに数秒から数日間隔の時間的に間隔の開いた手順を含む任意の手順で投与すること含む。かかる組み合わせ処置は、さらにＳＩＭＲＡ化合物（および／または独立した剤）の単独を超えた投与を含み得る。ＳＩＭＲＡ化合物および剤の投与は、同一または異なるルートによってもよい。
【００４６】
用語「個体」または「対象」は、一般に、ヒトなどの哺乳動物をいう。哺乳動物は、一般に、限定されないが、ヒト、ヒトでない霊長動物、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００４７】
用語「リニア合成」は、一般に、免疫調節オリゴリボヌクレオチドの一端から始まり、他端まで直線的に進行する合成をいう。リニア合成は、同一または非同一（長さ、塩基組成および／または組み込まれた化学修飾の点で）のモノマー単位を免疫調節オリゴリボヌクレオチドへの組み込みを許容する。
【００４８】
用語「修飾されたヌクレオシド」は、一般に、修飾された複素環塩基、修飾された糖部分またはそれらの任意の組み合わせを含むヌクレオシドである。ある態様において、修飾されたヌクレオシドは、ここに記載されているように、非天然のピリミジンまたはプリンのヌクレオシドである。本発明の目的のため、修飾されたヌクレオシド、ピリミジンまたはプリン類縁体または非天然に生じたピリミジンまたはプリンは、交換可能に用いることができ、非天然に生じた塩基および／または非天然に生じた糖部分を含むヌクレオシドをいう。本発明の目的のため、塩基は、グアニン、シトシン、アデニンまたはウラシルでない場合、非天然であるとみなされる。ある態様において、修飾されたヌクレオシドは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８の活性を妨害することのない安定性を改善したオリゴリボヌクレオチドの選択された位置が置換され得る２’−置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’−置換アラビノシドである。
【００４９】
用語「調節」または「刺激」は、一般に、応答の誘発および／または増強から生じ得る、応答の増加または応答の質の差などの変化をいう。
【００５０】
用語「リンカー」は、一般に、糖、塩基または骨格（back bone）を介して共有結合または非共有結合によって、オリゴリボヌクレオチドに付着させることができる任意の部分をいう。リンカーは、２つまたは３つ以上のヌクレオシドに付着するように用いられるか、または、オリゴリボヌクレオチドの５’および／または３’末端のヌクレオチドに付着され得る。かかるリンカーは、非ヌクレオチドリンカーまたはヌクレオチドリンカーであり得る。
【００５１】
用語「非ヌクレオチドリンカー」は、一般に、共有結合または非共有結合によってオリゴリボヌクレオチドに付着することができるヌクレオチド結合以外の化学部分をいう。好ましくは、かかる非ヌクレオチドリンカーは、約２オングストロームから約２００オングストロームの長さであり、シスまたはトランス配置であり得る。
【００５２】
用語「ヌクレオチド結合」は、一般に、隣接するヌクレオシドの間のホスフェート、非ホスフェート、荷電したまたは中和した基（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートなど）からなるそれらの糖を介して（例えば、３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’）、２つのヌクレオシドを合わせる化学結合をいう。
【００５３】
用語「パリンドローム配列」は、一般に、自己相補的または反転した繰り返し（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列で、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’など）が、通常のワトソン−クリック塩基対を形成することができる塩基であることを意味する。インビボでは、かかる配列は、分子内または分子間の二本鎖構造を形成し得る。
【００５４】
用語「ペプチド」は、一般に、十分な長さのポリペプチドおよび例えば、ペプチドがハプテンであってもなくても、抗体産生またはサイトカイン活性などの生体反応に影響を与える組成物をいう。用語「ぺプチド」は、修飾したアミノ酸（天然または非天然に生じたのであってもなくても）を含んでもよく、かかる修飾には、限定されないが、リン酸化、糖鎖化、ペグ化、脂質化およびメチル化が含まれる。
【００５５】
用語「ＰＢＭＣ」は、一般に、末梢血単核細胞をいう。
【００５６】
用語「生理学的に許容し得る」は、一般に、ＳＩＭＲＡ化合物の有効性を妨害することなく、細胞、細胞培養物、組織または器官などの生体システムと適合的である物質をいう。好ましくは、生体システムは、脊椎動物などの生物である。
【００５７】
用語「ＳＩＭＲＡ」は、一般に、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８によってリガンドとして認識される安定化免疫調節ＲＮＡ化合物をいい、該化合物は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および／または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むことができ、その３’末端を保護（安定化）するための修飾によって（例えば、３’分解を阻止することによって、または、３’末端をキャッピングすることによって、または、２つまたは３つ以上のオリゴリボヌクレオチドの３’末端を結合することによって）、ＳＩＭＲＡが、修飾していないオリゴリボヌクレオチドよりもインビボでより安定であることを提供し、したがって、その免疫調節能力に影響する。ＳＩＭＲＡは、修飾オリゴリボヌクレオチドを含み得る。ＳＩＭＲＡ化合物は、オリゴリボヌクレオチドの安定性をさらに改善するために、その５’末端を保護するための修飾（例えば、５’分解を阻止することによって、または５’末端をキャッピングすることによって）を含んでいてもよい。ＳＩＭＲＡは、直鎖状または分枝状であってよく、例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたは代替の結合などを介して結合するリボヌクレオシドのポリマーである核酸を有し得る。ＳＩＭＲＡは、リボース糖残基に共有結合するプリン（アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）またはそれらの誘導体（例えば、７−デアザ−Ｇおよびアラ−Ｇ）またはピリミジン（シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）またはそれらの誘導体）塩基またはそれらの誘導体からなり得る。
【００５８】
用語「処置」は、一般に、症状の緩和、または疾病の進行を遅らせることまたは改善することを含み得る、有益さまたは所望の結果を得ようとするアプローチをいう。
【００５９】
用語「ウイルス性疾患」は、一般に、その病原としてウイルスを有する疾患をいい、限定されないが、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および帯状疱疹を含む。
【００６０】
第一の面において、本発明はＳＩＭＲＡ化合物を提供する。本発明者らは、その３’末端を保護するための免疫調節オリゴリボヌクレオチドの修飾によって（例えば、３’分解を阻止することによって、または３’末端をキャッピングすることによって、または２つまたは３つ以上のオリゴリボヌクレオチドの３’末端を結合することによって）、驚くべきことに、その免疫調節能力に影響を与えることを発見した。加えて、この保護によって、驚くべきことに、脂質集合または他の保護手段の必要性をなくし、オリゴリボヌクレオチドの安定化を改善することを決定した。さらに、５’分解または５’末端のキャッピングによって、さらにオリゴリボヌクレオチドの安定性を改善することができる。
【００６１】
本発明において、新規ＳＩＭＲＡ化合物によるＴＬＲ８の活性化および免疫応答（例えば、サイトカインプロフィールの変化）が示されている。さらに、ヒトＴＬＲ８活性ＲＮＡにある化学修飾を組み込むことによって、ＴＬＲ７を活性化することもでき、免疫応答およびサイトカイン／ケモカインプロフィールにおける変化をもたらす。したがって、本発明者らは、驚くべきことに、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ７の活性化を介して、それに関連するサイトカイン／ケモカインプロフィールは、免疫調節オリゴリボヌクレオチドの一部として、修飾した塩基、修飾した糖、骨格、リンカー、結合および／またはキャップを含む修飾した化学構造を用いることによって調節することができる。
【００６２】
１つの態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーに、３’末端で結合された少なくとも２つのＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチドまたはヌクレオシド間結合または官能化した核酸塩基または糖を含む免疫調節化合物を提供する。本発明のかかる態様は、少なくとも１つの利用可能な５’末端を有し得る。この構造は、脂質集合または他の保護の必要なしに、ＳＩＭＲＡ化合物に対するさらなる安定性（例えば、エキソヌクレアーゼ活性の阻害）を提供することを決定した。ＳＩＭＲＡの５’末端は、ＳＩＭＲＡ化合物がＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を介して免疫応答を調節することを防ぐようには修飾されない。
【００６３】
この面の他の態様において、本発明は、少なくとも２つのオリゴリボヌクレオチドを含み、免疫調節化合物は、限定されないが、表１の式Ｉ−Ｘに示すものを含む構造を有する。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
ドメインＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、独立して、長さ約２個〜約３５個のリボヌクレオチドであってもよく、いくつかの態様において、約２個〜約２０個、または約２個〜約１２個、または約２個〜約１１個、または約２個〜約８個のリボヌクレオチドである。ドメインＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤは同一であっても、同一でなくてもよい。ドメインＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、独立して、自己相補的ドメイン、ホモまたはヘテロリボヌクレオチド配列またはリンカーを有していてるかまたは有していない５’−３’または２’−５’ＲＮＡであってもよい。「ｎ」は、１から無制限の数であり得る。
【００６６】
「Ｘ」は、３’または５’結合、リン酸基、非ＲＮＡヌクレオチドを介し得るドメインＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤを連結またはキャッピングするリンカー、または脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、モノ−、トリ−またはヘキサポリエチレングリコール、または複素環部分、またはこれらの組み合わせであり得る非ヌクレオチドリンカーである。
【００６７】
さらなる態様において、本発明は、非ヌクレオチドリンカーによって結合した少なくとも２つのオリゴリボヌクレオチドを含むＳＩＭＲＡ化合物を提供し、ここで免疫調節オリゴリボヌクレオチドの配列は、少なくとも部分的に自己相補的であり得る。当業者に認識されるであろうように、オリゴリボヌクレオチドの相補的な配列は、オリゴリボヌクレオチドの二次構造を与える分子間の水素結合を許容する。付加的なオリゴリボヌクレオチドは、互いに結合することができ、それにより本発明のオリゴリボヌクレオチドの鎖またはマルチマーが作られる。
【００６８】
同様の考察は、異なる塩基配列の免疫調節オリゴリボヌクレオチドの間で対になる分子間の塩基に適用される。したがって、複数の免疫調節オリゴリボヌクレオチドがともに使用される場合、複数の免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、必要ではないが、互いに少なくとも部分的に相補的な配列を含み得る。１つの態様において、複数の免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、第一の配列を有する免疫調節オリゴリボヌクレオチドおよび第二の配列を有する免疫調節オリゴリボヌクレオチドを含み、ここで第一の配列および第二の配列は少なくとも５０％相補的である。例えば、少なくとも５０％の相補性である２つの８マーの間で、それらが４、５、６、７または８つのＧ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはＧ−Ｕの揺らぎの塩基対を形成し得る。かかる塩基対は、必要ではないが、相補的な免疫調節オリゴリボヌクレオチドの一端に位置する塩基を含む。相補性の程度は、免疫調節オリゴリボヌクレオチドの間のアライメントに依存する可能性があり、かかるアライメントは、単一または複数のヌクレオシド突出を含んでいても、含んでいなくてもよい。他の態様において、相補性の程度は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％でさえある。
【００６９】
当業者が認識するであろうとおり、示した免疫調節化合物は、ドメインの配列が分子間水素結合を許容するような相補的であるから、二次構造を有し得る。さらに、式Ｉから式Ｘに描かれるように、付加的に結合したＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチドは、分子間水素結合を介して結合することができ、これにより鎖またはマルチマーが作られ、ここで任意の数の結合したＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチドが組み込まれ得る。
【００７０】
他の態様において、本発明は、３’または５’末端で、またはヌクレオシド間結合または官能化された核酸塩基または糖を介して、非ヌクレオチドリンカーに結合した少なくとも２つのＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチドを提供し、ここでリンカー（例えば、キャップ）は少なくとも１つの５’末端で付着している。この構造がＳＩＭＲＡ化合物にさらなる安定性（例えば、エキソヌクレアーゼ活性の阻害）を供給することが決定される。ＳＩＭＲＡの５’末端は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を介して免疫応答を調節することからＳＩＭＲＡ化合物を阻害するようには修飾されない。
【００７１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは夫々独立して、約２個〜約３５個のリボヌクレオシド残基を有する。したがって、ある態様において、オリゴリボヌクレオチドは、独立して、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個または３５個のヌクレオチド長である。好ましくは、オリゴリボヌクレオチドは、約４個〜約３０個のリボヌクレオシド残基であり、より好ましくは、約４個〜約２０個のリボヌクレオシド残基または約４個〜約１１個のリボヌクレオシド残基である。いくつかの態様において、免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、約１個〜約１８個、または約１個〜約１１個、または約５個〜約１４個のリボヌクレオシド残基を有するオリゴリボヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴリボヌクレオチドの１つまたは２つ以上は、１１個のヌクレオチドを有する。免疫調節オリゴリボヌクレオチドとの関連で、好ましい態様は、約１個〜約３５個のリボヌクレオチド、好ましくは、約５個〜約２６個のヌクレオチド、より好ましくは、約１３個〜約２６個のリボヌクレオチドを有する。好ましくは、免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート、リボヌクレオシド間結合を含む。
【００７２】
好ましい態様において、それぞれのリボヌクレオシドユニットは、複素環の塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。リボヌクレオシド残基は、多数の既知のリボヌクレオシド間結合の任意のものによって互いに結合できる。かかるリボヌクレオシド間結合は、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、シロキサン、カルボネート、カルボアルコキシ、アセトアミダイト、カーバメイト、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、ホスホルアミダイト、架橋ホスホルアミダイト、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンリボヌクレオシド間結合を含む。リボヌクレオチドに対する結合の可能な部位は、以下の式ＸＩに示され、式中、Ｂは複素環の塩基を示す。
【００７３】
【化１】
2014031373.tif 000003
【００７４】
本発明のＳＩＭＲＡ化合物は、自然に生じるリボヌクレオシド、修飾したリボヌクレオシドまたはそれらの混合物を含み得る。
【００７５】
本発明において、新規のＳＩＭＲＡ化合物は、ヒトＴＬＲ８によって認識され、かかるヒトＴＬＲ８活性化ＲＮＡにおけるある化学修飾の組み込みによって、ヒトＴＬＲ７により認識されるようになり、免疫応答を誘導する。かかる化学修飾には、限定されないが、７−デアザ−Ｇ、アラ−Ｇ、６−チオ−Ｇ、イノシン、イソ−Ｇ、ロキソリビン、ＴＯＧ（７−チオ−８−オキソ）−Ｇ、８−ブロモ−Ｇ、８−ヒドロキシ−Ｇ、５−アミノホルマイシンＢ、オキソホルマイシン、７−メチル−Ｇ、９−ｐ−クロロフェニル−８−アザ−Ｇ、９−フェニル−Ｇ、９−ヘキシル−グアニン、７−デアザ−９−ベンジル−Ｇ、６−クロロ−７−デアザグアニン、６−メトキシ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザ−Ｇ（ＰＰＧ）、２−（ジメチルアミノ）グアノシン、７−メチル−６−チオグアノシン、８−ベンジルオキシグアノシン、９−デアザグアノシンおよび１−（Ｂ−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンなどのグアニン誘導体が含まれる。化学修飾にはまた、限定されないが、９−ベンジル−８−ヒドロキシ−２−（２−メトキシエトキシ）アデニン、２−アミノ−Ｎ２−Ｏ−、メチルアデノシン、８−アザ−７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ａ、ビダラビン、２−アミノアデノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、８−アザアデノシン、５−ヨードツベルサイジンなどのアデニン誘導体が含まれる。化学修飾にはまた、限定されないが、シトシン誘導体が含まれる。化学修飾にはまた、限定されないが、４−チオ−Ｕなどのウラシル誘導体が含まれる。
【００７６】
本発明の「免疫調節オリゴリボヌクレオチド」は、非ヌクレオチドまたはヌクレオチドリンカーを介して、３’−または２’−末端または官能化されたリボースまたは官能化されたリボ核酸塩基で結合する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むＳＩＭＲＡ化合物である。リンカーのいくつかの例を以下に示す。非共有結合は、限定されないが、静電的相互作用、疎水的相互作用、π−スタッキング相互作用および水素結合を含む。
【００７７】
さらに他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴリボヌクレオチドの付着を可能にする官能基を有する有機部分である。かかる付着は、好ましくは、安定した共有結合による。非限定的な例として、リンカーは、ヌクレオチドの任意の好適な位置で付着され得る。いくつかの好ましい態様において、リンカーは、３’−ヒドロキシルで付着している。かかる態様において、リンカーは、好ましくは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネートなどのホスフェートに基づく結合または非ホスフェートに基づく結合によって、好ましくは３’−ヒドロキシルと付着するヒドロキシル官能基を含む。
【００７８】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されないが、ポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖を含む小分子、マクロ分子または生体分子である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは小分子である。本発明の目的のため、小分子は、１０００Ｄａよりも小さな分子量を有する有機部分である。いくつかの態様において、小分子は、７５０Ｄａよりも小さな分子量を有する。
【００７９】
いくつかの態様において、小分子は、脂肪族または芳香族の炭化水素であり、オリゴリボヌクレオチドに接続する直鎖か、それに追加される、限定されないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアまたはチオウレアを含む１つまたは２つ以上の官能基を任意に含み得る。小分子は、環状または非環状であり得る。小分子リンカーの例は、限定されないが、アミノ酸、炭化水素、シクロデキストラン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質を含む。しかしながら、非ヌクレオチドリンカーを記載する目的のため、用語「小分子」はヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００８０】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、アルキルリンカーまたはアミノリンカーである。アルキルリンカーは、分枝状または非分枝状、環状または非環状、置換または非置換、飽和または不飽和、キラル、アキラルまたはラセミ混合物であってもよい。アルキルリンカーは、約２個〜約１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、約３個〜約９個の炭素原子を有する。いくつかのアルキルリンカーは、限定されないが、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、ウレアおよびチオウレアを含む１つまたは２つ以上の官能基を含む。かかるアルキルリンカーは、限定されないが、１−プロパノール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２，３−プロパントリオール、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、ポリエチレングリコールリンカー（例えば、［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ（ｎ＝１〜９））、メチルリンカー、エチルリンカー、プロピルリンカー、ブチルリンカーまたはヘキシルリンカーを含み得る。いくつかの態様において、かかるアルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸を含み得る。
【００８１】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されないが、表２にリストされているものを含み得る。
【００８２】
【表２】
2014031373.tif 000004
【００８３】
【表３】
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【００８４】
【表４】
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【００８５】
【表５】
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【００８６】
【表６】
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【００８７】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、グリセロールまたは式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨのグリセロール類似体であり、式中、ｏおよびｐは、独立して、１〜約６、１〜約４、または１〜約３の整数である。いくつかの態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのかかる誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中、ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６、または２〜約４である。
【００８８】
本発明のいくつかの非ヌクレオチドリンカーは、表１に記載したように２つを超えるオリゴヌクレオチドの付着を許容する。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴリボヌクレオチドが共有結合し得る３つの水酸基を有する。したがって、本発明のいくつかの免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、３’末端で非ヌクレオチドリンカーと結合する２つを超えるオリゴリボヌクレオチド（例えば、ドメインＣなど、付加的なドメインがドメインＡ、Ｂ、ＣおよびＤについて前記に定義したようなオリゴリボヌクレオチドを含む）を含む。
【００８９】
本発明のこの面のさらなる態様において、ＳＩＭＲＡは、３’または５’末端で、または、ヌクレオシド間結合または官能化核酸塩基または糖を介して、表１に示した２つまたは３つ以上のリンカーと結合した３つまたは４つ以上のオリゴリボヌクレオチドを含み得る。本発明のこの面のオリゴリボヌクレオチドは、同一または異なる配列を有し得る。本発明のこの面のリンカーは、同一または異なっていてもよい。
【００９０】
本発明の免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、自動合成および図１および２に概略的に示し、さらに例を示すようなホスホルアミダイトアプローチを用いて簡便に合成され得る。いくつかの態様において、免疫調節オリゴリボヌクレオチドはリニア合成アプローチによって合成される（図１参照）。
【００９１】
合成の代替的方法は、「パラレル合成」であり、該合成は、中央のリンカー部分から外側へ進行する（図２参照）。リンカーが付着した固体支持体は、米国特許第5,912,332号に記載されているようなパラレル合成のために用いることができる。代替的に、汎用固体支持体（ホスフェート付着制御多孔ガラス支持体など）を用いることができる。
【００９２】
免疫調節オリゴリボヌクレオチドのパラレル合成は、リニア合成に対していくつかの利点を有する：（１）パラレル合成は、同一のモノマーユニットの組み込みを許容する；（２）リニア合成と異なり、両方（または全て）のモノマーユニットは、同時に合成され、それにより合成工程の数および合成に必要な時間がモノマーユニットのそれと同じである；および（３）合成工程の低減は、最終的な免疫調節オリゴリボヌクレオチド産物の純度および収率を改善する。
【００９３】
リニア合成またはパラレル合成プロトコルのいずれかによる合成の終わりに、免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドが組み込まれる場合、濃縮アンモニア溶液により、またはホスホルアミダイト供給者が推奨するとおりに、簡便に脱保護され得る。免疫調節オリゴリボヌクレオチド産物は、好ましくは、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化（detritylated）、脱塩および透析によって精製される。
【００９４】
表３ａは、非限定的な、本発明の代表的なＲＮＡをベースとした免疫調節オリゴリボヌクレオチドを示す。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
【表８】
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【００９７】
【表９】
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【００９８】
【表１０】
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【００９９】
【表１１】
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Ｉ＝イノシン；Ｕ１＝ｄＵ；Ｔ１＝リボＴ；Ｇ１＝７−デアザ−Ｇ；Ｇ２＝アラ−Ｇ；Ｇ３＝６−チオ−Ｇ；Ｇ４＝１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリン；Ｏ＝ロキソリビン；Ｘ＝グリセロール；Ｘ１＝１，３，５−ペンタントリオール；Ｘ２＝Ｘ３＝Ｃ３リンカーまたはプロパンジオール；Ｘ４＝トリ（エチレングリコール）；Ｘ５＝１，５−ペンタンジオール；Ｘ６＝２’−デオキシ−アビシック；Ｘ７＝Ｃ３アミノリンカー；Ｘ８＝シス，シス−シクロヘキサントリオール；Ｘ９＝シス，トランス−シクロヘキサントリオール；下線付き＝２’−Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオチド；Ｐ＝ホスホロチオエート；小文字＝ホスホジエステル骨格。
【０１００】
表３ｂは、限定されないが、本発明のオリゴリボヌクレオチドのいくつかが形成し得る代表的な二次構造を示す。
【０１０１】
【表１２】
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【０１０２】
第二の面において、本発明は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物および生理学的に許容し得る担体を含む薬学的処方を提供する。
【０１０３】
第三の面において、本発明は、脊椎動物の免疫応答を調節するＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を発生する方法を提供し、かかる方法は、脊椎動物に本発明のＳＩＭＲＡ化合物を投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は哺乳動物である。好ましい態様において、ＳＩＭＲＡ化合物は、免疫刺激の必要な脊椎動物に投与される。
【０１０４】
第四の面において、本発明は、疾病または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、かかる方法は、患者に本発明のＳＩＭＲＡ化合物を投与することを含む。種々の態様において、処置すべき疾病または障害は、癌、自己免疫疾患、感染症、気道炎症、炎症性障害、アレルギー、喘息または病原によって引き起こされた疾病である。病原は、細菌、寄生生物、糸状菌、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンを含む。
【０１０５】
第五の面において、本発明は、疾病または障害を予防する方法を提供し、かかる方法は、本発明のＳＩＭＲＡ化合物を患者へ投与することを含む。種々の態様において、予防すべき疾病または障害は、癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性障害、感染症、アレルギー、喘息または病原によって引き起こされた疾病である。病原は、細菌、寄生生物、糸状菌、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンを含む。
【０１０６】
第六の面において、本発明は、障害を予防または処置する方法を提供し、かかる方法は、限定されないが、免疫細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、ｐＤＣおよびリンパ球様細胞を含む、サイトカインまたはケモカインを産生できる細胞を単離すること、かかる細胞を標準の細胞培養条件下で培養すること、単離細胞がサイトカインまたはケモカインの増大したレベルを産生または分泌するために、かかる細胞をエクスビボでＳＩＭＲＡで処置すること、および、障害を予防または処置するためにサイトカインまたはケモカイン治療の必要な患者に処置した細胞を投与または再投与することを含む。本発明のこの面は、活性化された免疫細胞を産生するための標準の養子細胞免疫治療法である。
【０１０７】
本発明のこの面のいくつかの態様において、サイトカインまたはケモカインを産生することができる細胞は、疾病または障害を有するまたは有しない対象から単離され得る。かかる単離は、同定および選択を含んでもよく、以下の具体例に記載のものを含む標準の細胞単離方法を用いることを行うことができる。かかる単離された細胞は、以下の具体例に記載の培養方法および条件を含んでもよい標準の細胞培養方法に従い、標準の細胞培養条件を用いて培養される。本発明のこの態様のさらなる面において、単離細胞は、少なくとも１つのＳＩＭＲＡの存在下で、かかる１つまたは２つ以上のＳＩＭＲＡが存在せずに培養された単離細胞と比較して、サイトカインおよび／またはケモカインの産生および／または分泌を誘導、増大または増強に十分な量および時間で培養される。かかる時間は、数分から数時間、数日であってもよい。かかる単離されたＳＩＭＲＡ処置細胞は、ドナーへの再投与または第二の患者への投与に続く使用を見出すことができ、ここでかかるドナーまたは第二の患者はサイトカインおよび／またはケモカインの産生および／または分泌を誘導、増大または増強する必要がある。例えば、ドナーへの再投与または癌、自己免疫疾患、気道炎症、炎症性疾患、感染症、アレルギー、喘息または病原による疾病を有する第二の患者への投与である。かかる再投与または投与は、カテーテルまたは注射投与または任意の他の効果的なルートを含む種々の方法を用いて遂行され得る。本発明のこの面は、免疫反応を高める制限または不完全な能力を有し得るまたは免疫が弱化している患者（例えば、ＨＩＶに感染した患者および骨髄移植患者）における使用をも見出し得る。
【０１０８】
本発明による任意の方法において、ＳＩＭＲＡ化合物は、直接の免疫調節効果を単独でおよび／または疾病またはＳＩＭＲＡ化合物の免疫調節効果を減じない疾病または症状を処置または予防するのに有益な任意の他の剤との組み合わせにおいて作用する。本発明の任意の方法において、疾病または症状を処置または予防するのに有用な剤は、限定されないが、ワクチン、抗原、抗体、好ましくはモノクローナル抗体、細胞傷害性の剤、アレルゲン、抗生物質、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ９のアゴニストおよび／またはＴＬＲ３のアゴニスト）、化学療法剤（伝統的な化学療法および現代の標的治療の両方）、標的治療剤、活性化細胞、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン、アジュバントおよび共刺激分子（例えば、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、転写活性因子、ペプチドまたは修飾アミノ酸を含むペプチド）、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、癌の処置において、ＳＩＭＲＡ化合物は、１つまたは２つ以上の化学療法化合物、標的治療剤および／またはモノクローナル抗体との組み合わせで投与され得ることが意図される。代替的に、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含むことができる。代替的に、ＳＩＭＲＡ化合物は、ＳＩＭＲＡ化合物への免疫応答の特異性または大きさを増強するために他のアジュバントと組み合わせて投与できる。
【０１０９】
本発明による任意の方法において、単独または他の任意の剤との組み合わせでのＳＩＭＲＡ化合物の投与は、限定されないが、非経口的、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、経鼻、エアゾール、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃によって、経皮パッチまたは点眼または口腔洗浄の形態を含む任意の好適なルートによって可能である。ＳＩＭＲＡ化合物の治療組成物の投与は、疾病の病徴または代理マーカーの低減に効果的な有効量および期間で、既知の手法を用いて行うことができる。例えば、疾病および／または障害の処置のためのＳＩＭＲＡ化合物の有効量は、病徴を緩和または低減するか、または、腫瘍、癌または細菌、ウイルスまたは糸状菌の感染を遅らせるか改善するために必要な量であることができる。ワクチンアジュバントとして使用する有効な量は、ワクチンまたは抗原に対する対象の免疫応答を強化することに有益な量であり得る。抗原の共投与に対する免疫応答を調節する組成物の投与の状況において、ＳＩＭＲＡ化合物および抗原の有効な量は、抗原を単独で投与した場合に得られる免疫応答に比較して所望の調節を達成するのに十分な量である。任意の特定の適用のための有効な量は、標的の疾病または症状、投与する特定のオリゴヌクレオチド、対象のサイズ、または疾病または症状の重篤さなどの因子に依存して変化する可能性がある。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定のオリゴヌクレオチドの有効な量を経験的に決定することができる。
【０１１０】
全身に投与する場合、治療組成物は、好ましくは、ＳＩＭＲＡ化合物の血中レベルが、約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルになるような十分な投与量で投与される。局所投与のためには、これよりもより低い濃度で効果がある可能性があり、より高い濃度で耐性となり得る。好ましくは、ＳＩＭＲＡ化合物の総投与量は、患者１日あたり約０．００１ｍｇから、体重１ｋｇ１日あたり２００ｍｇである。単一の処置エピソードとして、個体へ本発明の１つまたは２つ以上の治療組成物の治療的に有効な量を同時または連続して投与することが望まれ得る。
【０１１１】
ＳＩＭＲＡ化合物は、任意に、１つまたは２つ以上のアレルゲンおよび／または抗原（自己または外来）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの免疫原性タンパク質、または任意の他の免疫原性担体タンパク質と結合し得る。ＳＩＭＲＡはまた、限定されないが、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ２アゴニストおよびＴＬＲ９アゴニスト）、フロイント不完全アジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバンおよび、ＱＳ−２１を含むサポニン、イミキモドまたはそれらの組み合わせを含む他の化合物との組み合わせで用いることができる。
【０１１２】
本発明のこの面による方法は、免疫系のモデル研究に有用である。該方法はまた、ヒトまたは動物の疾病の予防または治療的処置に有用である。例えば、該方法は、小児および獣医のワクチンの適用に有用である。
【０１１３】
以下の例は、本発明の好ましい実施例をさらに示すことを意図し、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０１１４】
例
免疫調節オリゴリボヌクレオチド合成
免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成でホスホルアミダイト化学を用いて化学的に合成される。ＴＡＣ保護された（Ｕ以外の）２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡモノマー、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵは、Sigma-Aldrichから購入した。７−デアザ−Ｇ、イノシンおよびロキソリビンモノマーは、ChemGenes Corporationから購入した。０．２５Ｍの５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ＰＡＣ−無水物Ｃａｐ ＡおよびＣａｐ Ｂは、Glen Researchから購入した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中３％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）および５％の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Beaucage試薬）は自社製であった。
【０１１５】
免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、標準のＲＮＡ合成プロトコールを用いて、１〜２μＭのスケールで合成した。
【０１１６】
開裂および塩基脱保護
免疫調節オリゴリボヌクレオチドを固体支持体から開裂し、溶液をさらに６５℃に加熱し、エキソ環状アミンの保護基を除去した。得られた溶液をSpeedVacで完全に乾燥した。
【０１１７】
ＩＥ  ＨＰＬＣ  精製
免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、イオン交換ＨＰＬＣで精製した。
カラム：Dionex DNAPac 100 カラム(22X250)
カラムヒーター：ChromTech TL-105 HPLC カラムヒーター、温度は８０℃に設定した。
バッファーＡ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリル
バッファーＢ：３．０Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２０％アセトニトリル
流速：１０ｍｌ／ｍｉｎ
勾配：
０−２ｍｉｎ：０％Ｂ
２−１１ｍｉｎ：０％Ｂから３５％Ｂ
１１−４１ｍｉｎ：３５％Ｂから９０％Ｂ
４１−４５ｍｉｎ：１００％Ｂ
【０１１８】
粗製免疫調節オリゴリボヌクレオチド溶液をＨＰＬＣに注入した。上記の勾配を行い、フラクションを集めた。９０％を超える所望の産物を含有する全てのフラクションを混合し、次いで、溶液をRotoVapによってほとんど乾燥し濃縮した。ＲＮａｓｅフリーの水を加え、終体積を１０ｍｌにした。
【０１１９】
Ｃ−１８逆相脱塩
Watersから購入したCC-18 Sep-Pakカートリッジを最初に１０ｍｌのアセトニトリル、続いて１０ｍｌの０．５Ｍ酢酸ナトリウムで調整した。１０ｍｌの免疫調節オリゴリボヌクレオチド溶液を装填した。次いで、１５ｍｌの水を塩の洗浄に用いた。免疫調節オリゴリボヌクレオチドは、最終的に、１ｍｌの水中５０％アセトニトリルによって溶出した。
【０１２０】
溶液は、３０分間SpeedVacに入れた。残りの溶液を０．２マイクロフィルターを介してろ過し、次いで凍結乾燥して乾燥した。次いで、溶液を水に再溶解し、所望の濃度にした。
最終溶液を０℃以下で貯蔵した。
【０１２１】
キャピラリー電気泳動
装置：Beckman 5010
キャピラリー：６２ｃｍ ｓｓＤＮＡキャピラリー
サンプル調製：０．２ＯＤのＳＩＭＲＡ化合物を２００μｌのＲＮａｓｅフリーの水に溶解した。
注入：５ＫＶで５秒間の動電注入
実行条件：３０℃、１４ＫＶで５０分間
イオン交換ＨＰＬＣ分析
カラム：Dionex DNAPacガードカラム(22X250)
カラムヒーター：ChromTech TL-105 HPLCカラムヒーター、温度は８０℃に設定した。
バッファーＡ：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル
バッファーＢ：２．０Ｍ ＬｉＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０％アセトニトリル
流速：２ｍｌ／ｍｉｎ    勾配：
０−２ｍｉｎ：０％Ｂ
２−１０ｍｉｎ：０％Ｂから１００％Ｂ
１０−１５ｍｉｎ：１００％Ｂ
【０１２２】
ＰＡＧＥ分析
０．３ＯＤの免疫調節オリゴリボヌクレオチドを２０％ポリアクリルアミドゲルにロードし、４ワットの定電力でおよそ５時間で実行した。ゲルを短波長のＵＶ光下で見た。
【０１２３】
ヒト細胞培養プロトコール
ヒトＰＢＭＣの単離
新鮮に取られた健康なボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)によって単離した。
【０１２４】
ヒトｐＤＣ単離
新鮮に取られた健康なボランティアの血液(CBR Laboratories, Boston, MA)由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)によって単離した。ｐＤＣは、製造者の指示に従い、BDCA4細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いてポジティブ選択によってＰＢＭＣから単離した。
【０１２５】
サイトカインＥＬＩＳＡ
ヒトＰＢＭＣを５ｘ１０６細胞／ｍｌを用いて４８ウェルプレートに静置した。ｐＤＣを１Ｘ１０６細胞／ｍｌを用いて９６ウェルディッシュに静置した。ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４；Mediatech）に溶解したＳＩＭＲＡを細胞培養物に終濃度１００．０μｇ／ｍｌで添加した。次いで、細胞を３７℃、２４時間インキュベートし、懸濁液をluminex multiplexまたはＥＬＩＳＡアッセイのために集めた。実験は三連のウェルで行った。ＩＦＮ−α、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αのレベルは、サンドウィッチＥＬＩＳＡで測定した。サイトカイン抗体および標品を含む必要な試薬は、PharMingenから購入した。
【０１２６】
Luminexマルチプレックスアッセイを、Luminex 100装置上でBiosourceヒトマルチプレックスサイトカイン分析キットを使って行い、データを、Applied Cytometry Systems（Sacramento, CA）によって供給されたStarStationソフトウェアを使用して分析した。
【０１２７】
ＴＬＲ発現ＨＥＫ２９３細胞でのアッセイのためのプロトコール
ＨＥＫ２９３／ヒトＴＬＲ７またはＨＥＫ２９３／ヒトＴＬＲ８細胞(Invivogen, San Diego, CA)を５％ＣＯ２インキュベーター中、２５０μｌ／ウェルの１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで４８ウェルプレートで培養した。
【０１２８】
レポーター遺伝子の形質転換
マウスＴＬＲ９またはヒトＴＬＲ３、７または８を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞(Invivogen, San Diego, CA)を５％ＣＯ２インキュベーター中、２５０μｌ／ウェルの１０％熱不活性化ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで４８ウェルプレートで培養した。８０％のコンフルエンスで、培養物は、培養培地中、４μｌ／ｍｌのlipofectamine(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下、４００ｎｇ／ｍｌのＳＥＡＰ(ヒト胚性アルカリホスファターゼの分泌型)レポータープラスミド(pNifty2-Seap)(Invivogen)で一過性にトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡおよびlipofectamineを無血清培地で分けて希釈して、５分間室温でインキュベートした。インキュベーションの後、希釈したＤＮＡおよびlipofectamineを混合し、混合物を２０分間室温でインキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｌのlipofectamineを含むＤＮＡ／lipofectamine混合物の２５μｌのアリコートを細胞培養プレートの各ウェルに添加し、培養を４時間継続した。
【０１２９】
ＩＭＯ−処置
トランスフェクションの後、培地をフレッシュな培養培地に置き換え、ＳＩＭＲＡを培養物に添加し、そして培養を１８時間継続した。ＳＩＭＲＡ処置の終わりに、３０μｌの培養上清を各処置から取り、製造者のプロトコール(Invivogen)に従ってＳＥＡＰアッセイに用いた。
【０１３０】
ＳＥＡＰアッセイ
簡単に、培養上清をｐ−ニトロフィニルホスフェート基材でインキュベートし、発生した黄色の色を４０５ｎｍでプレートリーダーで測定した。データをＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の倍数増加として示す。(Putta MR et al, Nucleic Acids Res., 2006, 34:3231-8)
【０１３１】
【表１３】
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【０１３２】
【表１４】
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【０１３３】
【表１５】
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【０１３４】
【表１６】
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【０１３５】
【表１７】
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【０１３６】
【表１８】
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【０１３７】
【表１９】
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【０１３８】
【表２０】
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【０１３９】
【表２１】
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【０１４０】
【表２２】
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【０１４１】
【表２３】
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【０１４２】
【表２４】
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【０１４３】
【表２５】
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【０１４４】
マウスモデルにおけるインビボでのＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの抗癌活性
ＢＡＬＢ／ｃマウスを３つのマウスのグループに分けた。培養したＣＴ２６．ＣＬ２５細胞を静注（ｉ．ｖ．）した（４ｘ１０５細胞／マウス）。次いで、本発明によるＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチド（ＳＩＭＲＡ化合物）または対照を５０ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに皮下投与（ｓ．ｃ．）した。最初の用量の投与から４時間後、血清はマウスから得られ、ＩＬ−１２レベルをＥＬＩＳＡで測定した。結果を図９に示す。マウスは、ＣＴ２６．ＣＬ２５細胞の静注後、２４時間、７２時間および１４４時間に皮下投与を受けた。１４日目にマウスを屠し、肺を採取した。図１０は、多数の腫瘍小塊が肺に見られた。
【０１４５】
非ヒト霊長動物におけるインビボでのＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドの免疫応答
カニクイザルを、１グループあたり４匹のサルで３グループに分けた（２つは生理食塩水のグループ）。次いで、本発明によるＲＮＡをベースとしたオリゴヌクレオチド（ＳＩＭＲＡ化合物）または対照を５ｍｇ／ｋｇの投与量でサルに皮下投与（ｓ．ｃ．）した。他の用量（例えば、１ｍｇ／ｋｇ）もまた所望の効果を有し得る。投与の８、１６および２４時間後、サルから血清を採取し、免疫応答におけるサイトカインおよびケモカインのレベルおよび変化を測定した。結果を図１２〜１５に示す。
【０１４６】
同等物
前述の発明が、明確化および理解を目的として詳細に記載されている一方、当然のことながら、当業者であれば、本発明の開示を読むことにより、形態および詳細のさまざまな変形を、本発明の真の範囲および特許請求の範囲から逸脱することなく想到することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月2日(2013.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化免疫調節ＲＮＡ（ＳＩＭＲＡ）化合物を含む、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、またはＴＬＲ７に対するアゴニスト。
【外国語明細書】
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