(57)【要約】【課題】医薬物質と複合体を作らせ、当該複合体を封入したD-MENDが真核細胞に取り込まれた際に、エンドソーム内では医薬物質を保持し、細胞質及び／又は核内では医薬物質を解離することが可能な結合剤、及びその結合剤と医薬物質との複合体、及びその複合体を封入したD-MEND、及びそのD-MENDを含有するリポソーム製剤などを提供すること。【解決手段】疎水性基修飾ポリヒスチジンは、核酸等と相互作用により結合して複合体を形成することができ、酸性条件下では核酸等を保持し、中性条件下では結合した核酸等を解離することができることから、疎水性基修飾ポリヒスチジンは、結合剤などとして有用である。また、疎水性基修飾ポリヒスチジンと核酸等との複合体及びそれを封入したD-MENDは、核酸等を細胞内へ輸送するのに有用であり、複合体を封入したD-MENDを含むリポソーム製剤は、次世代型の医薬として有用である。【選択図】図４
2014031349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸、ペプチド、又は糖と静電的相互作用により結合して複合体を形成し、酸性の条件下で前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を保持し、中性の条件下で結合した前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤であって、
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドを含有することを特徴とする結合剤。
【請求項２】
核酸、ペプチド、又は糖と静電的相互作用により結合して複合体を形成することができ、細胞質及び／又は核内では、結合した前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤であって、
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドを含有することを特徴とする結合剤。
【請求項３】
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドと、核酸、ペプチド、又は糖とを静電的相互作用により結合した複合体。
【請求項４】
請求項３に記載の複合体を封入した脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体。
【請求項５】
前記構造体の表面に膜透過性ペプチド及びｐＨ応答性膜融合性ペプチドが結合していることを特徴とする請求項４に記載の構造体。
【請求項６】
前記膜透過性ペプチドが、オクタアルギニン又はオクタリジンである請求項５に記載の構造体。
【請求項７】
前記ｐＨ応答性膜融合性ペプチドが、ＧＡＬＡペプチド又はその一部であることを特徴とする請求項５又は６に記載の構造体。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載の構造体を有効成分として含有するリポソーム製剤。
【請求項９】
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドと、脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体とを含むキット。
【請求項１０】
核酸、ペプチド、又は糖と静電的相互作用により結合して複合体を形成し、酸性の条件下で、前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を保持し、中性の条件下で、結合した前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤のスクリーニング方法であって、
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドに対してアミノ酸変異を導入し、疎水性基修飾変異ペプチドを作製する工程と、
酸性の条件下で前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖と、前記疎水性基修飾変異ペプチドとを結合させる工程と、
中性の条件下で前記疎水性基修飾変異ペプチドが、前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖と解離するかどうかを調べる工程と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１１】
核酸、ペプチド、又は糖との複合体を封入した脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体を真核細胞内に導入した場合に、細胞質及び／又は核内に放出された前記複合体から前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤のスクリーニング方法であって、
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドに対してアミノ酸変異を導入し、疎水性基修飾変異ペプチドを作製する工程と、
前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖と、前記疎水性基修飾変異ペプチドとの複合体を作製する工程と、
前記複合体を封入した多機能性エンベロープ型ナノ構造体を作製する工程と、
前記構造体を真核細胞に導入する工程と、
前記真核細胞の細胞質及び／又は核内に前記複合体から解離した、前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖が存在するかどうかを調べる工程と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬物質と複合体を作らせることによって、当該複合体を封入した脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体（a lipid Double-lamellar Multifunctional Envelope-type Nano Device；以下、単に「D-MEND」と称する場合がある。）が真核細胞に取り込まれた際に、エンドソーム内（酸性条件下）では医薬物質を保持し、細胞質及び／又は核内（中性条件下）では医薬物質を解離する結合剤、及びその結合剤と医薬物質との複合体、及びその複合体を封入したD-MEND、及びそのD-MENDを含有する医薬又はキット、及び結合剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸デリバリーシステムは、次世代型の医薬品（核酸医薬）として非常に注目されている。デリバリーシステムによって運ばれる核酸として、特定の遺伝子の機能発現を抑制可能なsiRNA、特定の遺伝子の機能を追加可能なプラスミドDNAなどはその代表例である。効率の高い核酸デリバリーシステムは、目的の疾患組織を標的にできる能力、核酸を細胞内作用部位（細胞質、核等）まで効率よく送達できる能力、核酸分子の活性を高度に機能させる能力、の３点が求められる。従来、これらの能力を発揮可能な多機能性エンベロープ型ナノ構造体（Multifunctional Envelope-type Nano Device；MEND）の開発が行われてきた（例えば、特許文献１などを参照）。また、このMENDにおいて脂質膜の枚数を制御することにより、細胞内における脂質膜からの核酸の放出、すなわち脱被覆化を効率的に行うことが可能なD-MENDが開発されている（例えば、特許文献２及び非特許文献１などを参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５−３２５９３号公報
【特許文献２】特開２００８−２１４３２４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Akita H et al., J Control Release. 143(3):311-317(2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記D-MENDにおいては、封入するコア粒子、すなわち医薬として有用な核酸、ペプチド、糖等の医薬物質と、該医薬物質を凝縮化するポリカチオンとの複合体が真核細胞の細胞内で解離しないため、効果が減弱している可能性があるという問題があった。
そこで、本発明は、医薬物質と複合体を作らせることによって、当該複合体を封入したD-MENDが真核細胞に取り込まれた際に、エンドソーム内（酸性条件下）では医薬物質を保持し、細胞質及び／又は核内（中性条件下）では医薬物質を解離することが可能な結合剤、及びその結合剤と医薬物質との複合体、及びその複合体を封入したD-MEND、及びそのD-MENDを含有する医薬又はキット、及び結合剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、疎水性基修飾ポリヒスチジンと核酸との複合体を封入したD-MENDを、真核細胞に導入した際に、エンドソーム内（酸性の条件下）では疎水性基修飾ポリヒスチジンは核酸を保持し、細胞質及び／又は核内（中性の条件下）において疎水性基修飾ポリヒスチジンは核酸を解離することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
(1) 核酸、ペプチド、又は糖と静電的相互作用により結合して複合体を形成し、酸性の条件下で前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を保持し、中性の条件下で結合した前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤であって、５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドを含有する結合剤；
(2) 核酸、ペプチド、又は糖と静電的相互作用により結合して複合体を形成することができ、細胞質及び／又は核内では、結合した前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤であって、５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドを含有することを特徴とする結合剤；
(3) ５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドと、核酸、ペプチド、又は糖とを静電的相互作用により結合した複合体；
(4) 上記(3)の複合体を封入した脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体；
(5) 前記構造体の表面に膜透過性ペプチド及びｐＨ応答性膜融合性ペプチドが結合している上記(4)に記載の構造体；
(6) 前記膜透過性ペプチドが、オクタアルギニン又はオクタリジンである上記(5)に記載の構造体;
(7) 前記ｐＨ応答性膜融合性ペプチドが、ＧＡＬＡペプチド又はその一部である上記(5)又は(6)に記載の構造体;
(8) 上記(4)-(7)のいずれかに記載の構造体を有効成分として含有するリポソーム製剤；
(9) ５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドと、脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体とを含むキット；
(10) 核酸、ペプチド、又は糖と静電的相互作用により結合して複合体を形成し、酸性の条件下で、前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を保持し、中性の条件下で、結合した前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤のスクリーニング方法であって、
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドに対してアミノ酸変異を導入し、疎水性基修飾変異ペプチドを作製する工程と、
酸性の条件下で前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖と、前記疎水性基修飾変異ペプチドとを結合させる工程と、
中性の条件下で前記疎水性基修飾変異ペプチドが、前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖と解離するかどうかを調べる工程と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法；
(11) 核酸、ペプチド、又は糖との複合体を封入した脂質二重層の多機能性エンベロープ型ナノ構造体を細胞内に導入した場合に、細胞質及び／又は核内に放出された前記複合体から前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖を解離する結合剤のスクリーニング方法であって、
５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドに対してアミノ酸変異を導入し、疎水性基修飾変異ペプチドを作製する工程と、
前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖と、前記疎水性基修飾変異ペプチドとの複合体を作製する工程と、
前記複合体を封入した多機能性エンベロープ型ナノ構造体を作製する工程と、
前記構造体を真核細胞に導入する工程と、
前記真核細胞の細胞質及び／又は核内で前記複合体から解離した、前記核酸、前記ペプチド、又は前記糖が存在するかどうかを調べる工程と、
を含むことを特徴とするスクリーニング方法；
(12) 前記構造体の表面に膜透過性ペプチド及びｐＨ応答性膜融合性ペプチドが結合していることを特徴とする上記(11)に記載のスクリーニング方法；
(13) 前記膜透過ペプチドが、オクタアルギニンであることを特徴とする上記(12)に記載のスクリーニング方法;
(14) 前記ｐＨ応答性膜融合性ペプチドが、ＧＡＬＡペプチド又はその一部であることを特徴とする上記(12)又は(13)に記載のスクリーニング方法などである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、医薬物質と複合体を作らせることによって、当該複合体を封入したD-MENDが真核細胞に取り込まれた際に、エンドソーム内（酸性条件下）では医薬物質を保持し、細胞質及び／又は核内（中性条件下）では医薬物質を解離することが可能な結合剤、及びその結合剤と医薬物質との複合体、及びその複合体を封入したD-MEND、及びそのD-MENDを含有する医薬又はキット、及び結合剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施例において、複合体封入D-MENDの短時間におけるルシフェラーゼのノックダウン効果を評価した結果を示す図である。図１中の「＊＊」は、Student’s t-testによるp値が0.01未満であることを意味する。
【図２】本発明の一実施例において、複合体封入D-MENDの用量依存性及び血清に対する影響を調べた結果を示す図である。図２中の「＊＊」は、Student’s t-testによるp値が0.01未満であることを意味する。
【図３】本発明の一実施例において、エンドソーム内でポリカチオンがsiRNAを保持し、細胞内に放出された際にポリカチオンがsiRNAと解離するかどうかを調べた結果を示す図である。図３中の「＊＊」は、SNK testを用いたone-way ANOVAによるp値が0.01未満であることを意味する。
【図４】本発明の一実施例において、ポリカチオンとsiRNAが実際に細胞内において解離するかどうかを共焦点レーザー顕微鏡により調べた結果を示す図である。
【図５】本発明の一実施例において、図４の画像を用いて、各種ポリカチオンからのsiRNA解離効率を調べた結果を示す図である。図５中の「＊＊」は、Student’s t-testによるp値が0.01未満であることを意味する。
【図６】本発明の一実施例において、複合体におけるポリヒスチジンの長さによる、複合体封入D-MENDのルシフェラーゼノックダウン効果を調べた結果を示す図である。図６中の「＊＊」は、Student’s t-testによるp値が0.01未満であることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施例において特に説明がない場合には、市販の試薬キットや測定装置はそれらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１１】
本発明の、疎水性基修飾ポリヒスチジン、すなわち、５〜２０個のヒスチジンからなり、疎水性基で修飾されているペプチドは、医薬として有用な、核酸（遺伝子、アンチセンスDNAなどのDNA、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNAなどのRNAなど）、ペプチド（オリゴペプチド、ポリペプチドなど）、糖（単糖、二糖、オリゴ糖など）などの医薬物質と静電的相互作用により結合して複合体を形成し、酸性条件下では医薬物質を保持し、中性条件下では医薬物質を解離することから、結合剤として有用である。
【００１２】
前記ポリヒスチジンとしては、５〜２０個のヒスチジンからなるものであれば特に制限されるものではないが、好ましくは６〜１８個のヒスチジンからなるペプチド、より好ましくは７〜１６個のヒスチジンからなるペプチド、最も好ましくは８〜１２個のヒスチジンからなるペプチド［(His)8；配列番号１]である。
【００１３】
前記疎水性基としては、例えば、直鎖状又は分岐状のアルキルカルボニル基（好ましくはC12-C24のアルキルカルボニル基、より好ましくはC14-C22のアルキルカルボニル基、特に好ましくはC16-C20のアルキルカルボニル基）、直鎖状又は分岐状のアルケニルカルボニル基（好ましくはC12-C24のアルケニルカルボニル基、より好ましくはC14-C22のアルケニルカルボニル基、特に好ましくはC16-C20のアルケニルカルボニル基）、コレステロール基などを挙げることができるが、これらに制限されるものではない。
【００１４】
なお、本願明細書において、酸性とは、pH1以上pH7.0未満、好ましくはpH4.0以上pH7.0未満、より好ましくはpH5.0-6.5、特に好ましくはエンドソーム内のｐＨ（pH5.0-6.0）を意味し、中性とは、pH7.0以上pH7.6未満、好ましくは細胞質及び／又は核内のｐＨ（例えばpH7.0）を意味する。
【００１５】
上記疎水性基修飾ポリヒスチジンと上記医薬物質との複合体を、真核細胞の細胞内に導入すると、複合体はエンドソーム内では解離しないが、細胞質内において疎水性基修飾ポリヒスチジンと医薬物質に解離することから、当該複合体は、それに含まれる医薬物質の細胞質及び／又は核内への輸送に有用である。
また、上記複合体を封入したD-MENDは、上記医薬物質を真核細胞の細胞質及び／又は核内に効率よく輸送できることから、効率の高い医薬物質のデリバリーシステムとして有用であり、次世代型の医薬（リポソーム製剤）として有用である。
さらに、上記疎水性基修飾ポリヒスチジンとD-MENDとを含むキットは、核酸、ペプチド、糖などの物質を効率的に細胞内に導入するのに有用である。
＝＝疎水性基修飾ポリヒスチジンの作製＝＝
本発明の疎水性基修飾ポリヒスチジンは、５〜２０個のヒスチジンからなるペプチドを、例えば、有機化学的に合成した後、あるいは、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチドを挿入し、この組換えベクターを大腸菌、サルモネラ菌等の細菌や、イースト、動物細胞などに導入し、発現させることにより作製した後、得られたペプチドを、上記直鎖状又は分岐状のアルキルカルボニル基を有する飽和脂肪酸又はその塩、上記直鎖状又は分岐状のアルケニルカルボニル基を有する飽和脂肪酸又はその塩、あるいはコレステロール、ジヒドロコレステロール、ヒドロキシコレステロール、シトステロール、エルゴステロール、スチグマステロールなどのコレステロール類又はその誘導体と反応させ、疎水性基で修飾させることにより得ることができる。
【００１６】
＝＝複合体を封入したD-MENDの作製＝＝
本発明の複合体を封入したD-MENDは、まず、上記酸性の溶液中で、上記疎水性基修飾ポリヒスチジンと、細胞質及び／又は核内に導入したい、核酸、ペプチド、糖等の物質とを混合し、静電的相互作用によって結合させて複合体を形成させ、それから、この複合体の溶液を、SUV（Small Unilameller Vesicles）、LUV（Large Unilameller Vesicles）などの脂質二重膜から成るベシクルに加えて攪拌又は超音波処理することにより、作製することができる。
なお、上記D-MENDの膜表面に、ポリアルギニンペプチド（例えば、オクタアルギニン；(Arg)8；配列番号２）、オクタリジン（(Lys)8；配列番号３）などの細胞膜透過性ペプチド、血中滞留性ポリアルキレングリコール、GALAペプチド（WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA；配列番号４）又はその一部（sGALA： WEAALAEALAEALAEHLAEALA；配列番号５）を有するペプチドなどのｐＨ応答性膜融合性ペプチド、トランスサイトーシス誘導性ペプチド、特異抗体、標的化リガンド、ヒアルロン酸などの機能性物質を結合させてもよい。これらの機能性物質は、公知の方法に従ってD-MENDの膜表面に結合させることができる。
【００１７】
＝＝本発明に係るリポソーム製剤又はキット等＝＝
上記疎水性基修飾ポリヒスチジンと、D-MENDとを含むキットは、細胞質及び／又は核内に導入させたい、核酸、ペプチド、糖等の物質を封入したD-MENDを製造するのに有用である。本発明に係るキットは、疎水性基修飾ポリヒスチジン及びD-MEND以外に、例えば、物質の封入に用いるバッファー、物質の細胞内の存在箇所を確認するための標識物質や試薬などをさらに含ませてもよい。
また、細胞内に導入することにより疾患の予防、治療、進行抑制、改善などを行うことができる、核酸、ペプチド、糖などの医薬物質と、上記疎水性基修飾ポリヒスチジンとの複合体を封入したD-MENDの懸濁液は、液剤としてのリポソーム製剤として有用であり、前記複合体を封入したD-MENDの懸濁液を凍結乾燥した乾燥物は、錠剤、顆粒剤などの固形剤としてのリポソーム製剤として有用である。リポソームの製剤化は、従来使用されている製剤添加物を用いて常法で行うことができる。
リポソーム製剤の投与方法としては、疾患の予防、治療、進行抑制、改善などに有用な、核酸、ペプチド、糖などの医薬物質の細胞質及び／又は核内への導入が必要な動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコなど）に、経口投与してもよいし、腹腔内や静脈内への注射や点滴により非経口投与してもよいし、イオンフォレシスにより皮膚を通じて体内に投与してもよい。
【００１８】
＝＝スクリーニング方法＝＝
本発明のスクリーニング方法によって、上記疎水性基修飾ポリヒスチジンを基礎として、核酸、ペプチド、糖などの物質と静電的相互作用により結合して複合体を形成し、酸性条件下では物質を保持し、中性条件下では物質を解離することができる新たな結合剤や、前記物質との複合体を封入したD-MENDを真核細胞に導入した場合に、細胞質内及び／又は核内に放出された複合体から前記物質を解離する結合剤をスクリーニングすることができる。
まず、５〜２０個のヒスチジンからなるペプチドに対し、１〜数個のアミノ酸変異を導入した配列を設計する。アミノ酸変異の種類は特に限定されず、欠失、置換、挿入、付加、及びそれらの組み合わせのいずれであっても構わない。アミノ酸変異の数は、特に限定されず、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個のいずれであっても良いが、設計した変異ペプチドは、５〜２０個のアミノ酸からなることが好ましく、６〜１８個のアミノ酸からなることがより好ましく、７〜１６個のアミノ酸からなることが特に好ましく、８〜１２個のアミノ酸からなることが最も好ましい。すなわち、最終的にそのような数個のアミノ酸からなる配列になるように、導入する変異を決め、変異ペプチドを設計する。
そして、その様に設計した変異ペプチドを、実際に合成する。合成方法は、５〜２０個のヒスチジンからなるペプチドについて上述したものと、同様の方法を用いることができる。
それから、変異ペプチドを、上記直鎖状又は分岐状のアルキルカルボニル基を有する飽和脂肪酸又はその塩、上記直鎖状又は分岐状のアルケニルカルボニル基を有する飽和脂肪酸又はその塩、あるいはコレステロール、ジヒドロコレステロール、ヒドロキシコレステロール、シトステロール、エルゴステロール、スチグマステロールなどのコレステロール類又はその誘導体と反応させることにより、疎水性基で修飾させた変異ペプチド（疎水性基修飾変異ペプチド）を得ることができる。
次に、疎水性基修飾変異ペプチドと、核酸、ペプチド、糖等の物質を酸性の条件下で結合させ、中性の条件下で疎水性基修飾変異ペプチドと、前記物質とが解離するかどうかを調べることで新規結合剤のスクリーニングを行うことができる。また、疎水性基修飾変異ペプチドと、核酸、ペプチド、糖等の物質との複合体を作製した後、上述した方法により、複合体を封入したD-MENDを作製して真核細胞に導入し、真核細胞の細胞質及び／又は核内に複合体から解離した前記物質が存在するかどうかを調べることで新規結合剤のスクリーニングを行うことができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例及び図を用いてより具体的に説明する。
＜実施例１＞複合体封入D-MENDの調製
（１）リポソーム（SUV）の調製
ガラス試験管に、DOPE（Avanti Polar Lipids）/PA（Sigma社）/cholesteryl-sGALA（Sigma社）＝70/20/1となるように混合して脂質薄膜を調製し、10 ｍM HEPES buffer（pH=4.0）で脂質濃度が0.55 mMになるように希釈した後、室温で10分間水和させた。それから、バス型ソニケーターで超音波処理を行った後、プローブ型のソニケーターで10分間超音波処理を行った。これをマイクロチューブに移して遠心分離（15000rpm×5分，25℃）を行った後、上清を分取するという操作を3回繰り返し、リポソーム（SUV）溶液を得た。
【００２０】
（２）コア粒子の調製
10 ｍM HEPES buffer（pH=4.0）で濃度を調製した、Anti-luciferase siRNA [Hokkaido System Science社；21-mer：5’-GCGCUGCUGGUGCCAACCCTT-3’(配列番号６)，5’-GGGUUGGCACCAGCAGCGCTT-3’(配列番号７)] 溶液 (0.1 mg/ml) 及びポリカチオン溶液 [ステアリル化オクタアルギニン（STR-R8；NeoMPS Industries社）：0.17 mg/ml、及びステアリル化オクタヒスチジン（STR-H8；Toray research center, Inc社）：0.15 mg／ml]を準備した。ポリカチオン溶液 60 μlを撹拌しながら、Anti-luciferase siRNA溶液 30 μlを滴下し、ポリカチオンとsiRNAとの複合体（コア；STR-R8/siRNA及びSTR-H8/siRNA）の溶液(N（nitrogen）/P（phosphate）＝5.5)を調製した。各コアの粒子径、多分散指数（PdI）、及びζ−電位をZetasizer Nano ZS instrument（Worchestershire社）で測定した。その結果、STR-R8/siRNAの方が、STR-H8/siRNAに比べて粒子径が小さいものの、PdIやζ−電位には違いがみられなかった。
【表１】
2014031349.tif 000003
【００２１】
（３）複合体封入D-MENDの調製
SUV溶液：コア溶液＝2:1になるように混合し、10分放置することでD-MENDに複合体を封入した。その後、最終濃度で0.055 mMとなるようにSTR-R8溶液を添加し、室温で30分間以上放置することにより、表面にオクタアルギニンを有する複合体封入D-MEND（MENDSTR-R8/siRNA及びMENDSTR-H8/siRNA）を作製した。この複合体封入D-MENDのpH4.0の溶液における粒子径、PdI、ζ−電位を測定した。また、PBS(-)を用いて、溶液のｐＨを細胞質のｐＨ７．４に変化させたときの、粒子径、PdI及びζ−電位と、D-MENDに封入されたsiRNAの封入率を測定した。封入率は、複合体封入D-MENDの溶液を同量のPBS(-)と混合し、HEPESバッファー (pH7.4) で100倍に希釈した希釈液（複合体封入D-MENDの最終濃度55.5μg/L）50 μLと、デキストラン硫酸 (80μg/mL) 及びRiboGreen試薬 (200倍希釈, Probes社；membrane impermeable dye RiboGreen Molecular) を含むHEPESバッファー (pH7.4) 50 μLとを攪拌混合したＡ液と、希釈液 50 μLと、デキストラン硫酸 (80μg/mL) 、TritonX-100 (0.25%) 、及びRiboGreen試薬 (200倍希釈) を含むHEPESバッファー (pH7.4) 50 μLとを攪拌混合したＢ液とを準備し、それぞれの溶液の蛍光強度を吸光光度計（励起波長495 nm、蛍光波長525 nm）で測定し、式：(１−Ａ液の蛍光強度／Ｂ液の蛍光強度)×100%により算出した。その結果、MENDSTR-R8/siRNA及びMENDSTR-H8/siRNAの両者で、粒子径、PdI及びζ−電位に違いはみられず、pH7.4では、両者とも高い効率でsiRNAを封入していることが認められた。
【表２】
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【表３】
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【００２２】
＜実施例２＞短時間におけるルシフェラーゼのノックダウン評価
実施例１で作製した複合体封入D-MENDの短時間におけるルシフェラーゼのノックダウン効果を評価した。96 well plateにルシフェラーゼを恒常的に発現させたHela-GL3細胞（5×103 cells/100 μl）を播種し、DMEM培地 (FBS+, Penicillin/Streptomycin+)にて37℃・5% CO2で培養した。24時間後、培地を除去して細胞をPBS(-)で洗浄した。続いて、50 nMのsiRNA濃度の複合体封入D-MEND (MENDSTR-R8/siRNA又はMENDSTR-H8/siRNA) 溶液 (100 μL) を各ウェルに注入し、37℃・5% CO2で培養することにより複合体封入D-MENDを細胞に投与した。3時間後、培地を除去し、DMEM培地で3、9又は21時間さらに培養した。その後、培地を除去してPBS(-)で洗浄し、reporter lysis buffer (promega社) 100 μLを各ウェルに注入し、-80℃で凍結して30分間以上放置した。その後溶解し、luciferase 1000 assay System (promega社, E4550) の溶液を100 μL加え、ルシフェラーゼ活性を吸光光度計(検出波長 556 nm)で測定し、複合体封入D-MEND投与後、6、12又は24時間後のルシフェラーゼのノックダウン効果を評価した。
図１に示すように、6、12、24時間のどの時間においても、MENDSTR-H8/siRNAの方がMENDSTR-R8/siRNAよりもノックダウン効果が有意に高かった。このことから、STR-H8の方がSTR-R8に比べ、siRNAとの解離が早い段階から行われ、短時間で高い活性が得られることが示唆された。
【００２３】
＜実施例３＞ルシフェラーゼのノックダウン効果による用量依存性の評価
実施例１で作製した複合体封入D-MEND (MENDSTR-R8/siRNA又はMENDSTR-H8/siRNA) の用量依存性及び血清に対する影響をそれぞれ調べるため、血清 (10％) の存在下又は非存在下において複合体封入D-MENDを細胞に投与し、24時間後のルシフェラーゼに対するノックダウン効果を実施例２に記載の方法に準じて評価した。
図２に示すように、MENDSTR-R8/siRNA及びMENDSTR-H8/siRNAの両者とも用量依存性がみられ、血清の存在下において効果が若干減弱するものの、どの条件下においてもSTR-H8の方がSTR-R8より活性が高かった（血清(+)のMENDSTR-R8/siRNA及びMENDSTR-H8/siRNAのED50は、siRNAの濃度がそれぞれ32.15 nM及び14.17 nMであり、血清(-)のMENDSTR-R8/siRNA及びMENDSTR-H8/siRNAのED50は、siRNAの濃度がそれぞれ24.12 nM及び6.50 nMであった。）。
【００２４】
＜実施例４＞ポリカチオンとsiRNAの解離評価
次に、酸性条件下でポリカチオンがsiRNAを保持し、中性条件下でポリカチオンがsiRNAと解離するかどうかを確認した。実施例１（２）で調製した、ポリカチオンとsiRNAとの複合体溶液 (コア溶液) を、各ｐＨのHEPESバッファー (pH5.0, pH7.4) で100倍に希釈し（最終濃度999 ng/mL）、RiboGreen試薬を各ｐＨのHEPESバッファー (pH5.0, pH7.4) で200倍に希釈した溶液と攪拌混合した。その後、それぞれの溶液の蛍光強度を吸光光度計（励起波長495 nm、蛍光波長525 nm）で測定し、各溶液中のtotal siRNAに対するfree siRNAの割合を算出した。
図３に示すように、酸性バッファー (pH5.0) 中では、どちらのコアも1％しかsiRNAを放出しなかった (図３(a)参照)。このことから、ポリカチオンとsiRNAが複合体を形成していることが示された。また、中性バッファー (pH7.4) 中では、STR-R8は酸性バッファー (pH5.0) と同様に1％しかsiRNAを放出しなかったのに対し、STR-H8では42％まで上昇した (図３(b)参照)。このことから、中性バッファーでSTR-H8とsiRNAとの結合が低下し、中性条件下ではsiRNAの解離が進むことが示された。
【００２５】
＜実施例５＞細胞内でのsiRNAの解離評価
ポリカチオンとsiRNAが実際に細胞内において解離するかどうかを共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）により確認した。
Anti-luciferase siRNAの代わりにCy3でラベルしたAnti-luciferase siRNAを用いる他は、実施例１に記載の方法と同様に、Cy3-複合体封入D-MEND（MENDSTR-R8/siRNA又はMENDSTR-H8/siRNA）を作製した。また、3.5cm dishにHela-GL3細胞 (1x105 cells / dish) を播種し、DMEM培地にて37oC・5% CO2で培養した。
24時間のHela-GL3細胞培養後、100nMになるようにCy3-複合体封入D-MENDを培地に添加して1時間さらに培養した。それから、培地を除去してヘパリンPBS(-)で洗浄し、ヘキスト33342とlysotracker greenを添加した。30分後に培地を除去してPBS(-)で洗浄し、DMEM培地を加えた。こうして、Cy3-複合体封入D-MEND添加から3時間後に顕微鏡観察を行った。その結果を図４に示す。
図４に示すように、ポリカチオンがSTR-H8の場合、siRNAは細胞質内全体に分布している様子が観察されたが、ポリカチオンがSTR-R8の場合は、siRNAはSTR-R8と細胞質内で凝縮体を形成している様子が観察された。
この取得した画像（図４）における、各細胞（MENDSTR-R8/siRNA：n=139、MENDSTR-H8/siRNA：n=125）内のCy3-siRNAの面積及び各細胞の総面積をImage Pro Plus ver7.0 (Media Cybernetics社) を用いて定量化し、各細胞内のCy3-siRNAの総面積を各細胞の総面積で除することでポリカチオンからのsiRNA解離効率を算出した。ポリカチオンがSTR-H8の場合、STR-R8と比べて有意なsiRNAの解離効率の上昇が確認できた（図５）。このことは、STR-H8が、細胞質内で効率的にsiRNAを解離しやすいポリカチオンであることを示唆している。
【００２６】
＜実施例６＞複合体におけるポリヒスチジンの長さによる効果
実施例１に記載の方法に準じてMENDSTR-H12/siRNAを作製し、複合体におけるポリヒスチジンの長さによる、複合体封入D-MENDのルシフェラーゼに対するノックダウン効果を実施例２に記載の方法に準じて評価した。
図６に示すように、MENDSTR-H12/siRNAの方がMENDSTR-H8/siRNAよりもノックダウン効果が有意に高かった。このことから、ポリヒスチジンの長さが長い方がsiRNAを効率よく放出することができ、高い活性が得られることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図４】
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【配列表】
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