(57)【要約】【課題】セルロース系バイオマス等からの効率的なエタノール生産方法の提供。【解決手段】カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いてエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、エタノール生産に用いる発酵用液として該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、かつ全ての糖類の合計含有量に占めるセロビオースの含有割合が１５〜８５％質量％である発酵用液を用いることを特徴とするエタノールの生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いてエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、エタノール生産に用いる発酵用液として該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、かつ全ての糖類の合計含有量に占めるセロビオースの含有割合が１５〜８５％質量％である発酵用液を用いることを特徴とするエタノールの生産方法。
【請求項２】
カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が、４−６−４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母である請求項１に記載のエタノールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセルロース系バイオマス等からの効率的なエタノール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、環境面から微生物の発酵によるエタノール生産原料として注目されている。特に、最近では未利用バイオマスの有効活用という観点から、木材、紙類、あるいはバガス（サトウキビの搾りかす）及びワラ類のような農業廃棄物といったようなセルロース系のバイオマス原料の利用が検討されている。
【０００３】
セルロース系バイオマスを用いて微生物の発酵によってエタノールを生産するためには、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースやヘミセルロースやこれらの一部分解物である多糖類を酵素法や希硫酸などを用いる加水分解法により分解し、六炭糖であるグルコース、マンノース及びガラクトースや五炭糖であるキシロースを主成分とする糖化液を得、この糖化液中の糖を微生物の発酵に供する必要がある。この糖化液中にはしばしばグルコース同士がβ−１，４結合した２糖類であるセロビオースが含まれる場合がある。しかし、５単糖のキシロースや２糖類のセロビオースはエタノール発酵しづらいことが知られている。実際、グルコース等から効率よくエタノールを生産可能な酵母として知られているサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はキシロースやセロビオースからはエタノールを生産することができない。一方、キシロースやセロビオースからエタノールを生産できる酵母としては、クルイベロマイセス・セロビオボラス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｖｏｒｕｓ、現在ではカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に分類）が報告されているが（非特許文献１、特許文献１等）、そのエタノール生産効率は十分とはいえない。
【０００４】
ところで、微生物によるグルコース等の糖から発酵によりエタノールを生産するにあたっては、理論上はエタノールの原料である糖濃度を高くすればするほど、生産性があがるように思われる。しかし、一般に、グルコース濃度が高すぎるとエタノールの生産速度が速くなりすぎ、発酵に用いている菌体内に急速にエタノールが蓄積し、菌体のエタノール耐性の問題から却って発酵が阻害されてしまう（非特許文献２，３）。この現象はグルコース阻害（グルコースリプレッション）として知られている。このグルコース阻害の影響から、発酵液中のエタノール濃度の上限値は、組み換え体のような特殊な微生物を用いない限り、通常４．５質量％程度が上限となる場合が多い（非特許文献４）。
このグルコース阻害は、前述したセルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いたエタノール発酵においても生じるが、これによってセルロース系バイオマス糖化液中に含まれるグルコース以外の糖であるキシロースやセロビオースは一層消費されづらくなってしまう。そして、通常、セルロース系バイオマス糖化液中に含まれる糖類の消費では、グルコースを完全に消費した後でなければキシロースを消費できず、さらにはキシロースを消費した後でなければセロビオースを消費できないという序列があるため、グルコースの消費がグルコース阻害により停止してしまうと、キシロースやセロビオースの発酵が進行しなくなってしまう（例えば、非特許文献３等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−０２８２８９号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ「Ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄ−ｘｙｌｏｓｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ｂｙ  Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｖｏｒｕｓ」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８５年、第２７巻、第４号、ｐ．５０９−５１３
【非特許文献２】Ｋ．−Ｄ．  Ｅｎｔｉａｎ  「Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ」  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  第３巻、ｐ．３６６−３７１
【非特許文献３】ＴＷ．Ｊｅｆｆｒｉｅｓ、ＹＳ．Ｊｉｎ  「Ｅｔｈａｎｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｔｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｘｙｌｏｓｅ  ｂｙ  ｙｅａｓｔｓ」、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００年、第４７巻、ｐ．２２１−２６８．
【非特許文献４】Ｓ−Ｊ．Ｈａら「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ  ａｎｄ  ｘｙｌｏｓｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」  ＰＮＡＳ．２０１１年、１０８巻、ｐ．５０４−５０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、グルコース阻害は、セルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いるエタノール生産に及ぼす影響が大きい。
そのため、セルロース系バイオマスから得られる糖化液を用いたエタノール発酵では、主な糖源としてグルコースを用いた場合と比較して、エタノール生産濃度の上限はさらに低くなり、また発酵速度も低くなってしまい、エタノールの生産効率が図りづらいという課題があった。
従って、本発明の課題は、セルロース系バイオマスから得られる糖化液等のキシロースやセロビオースを含有する発酵用液から、エタノールを効率良く生産するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、カンジダ・インターメディアに属する酵母を用いて、該酵母をエタノール生産に供する前にキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、エタノール生産に用いる発酵用液として、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が特定量であり、かつ全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量が特定量である発酵用液を用いることにより、エタノール生産効率が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕及び〔２〕を提供するものである。
〔１〕カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母を用いてエタノールを生産する方法であって、該酵母をエタノール生産に供する前にキシロースを０．５〜５質量％含有する培地で培養した後に、エタノール生産に用いる発酵用液として、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、かつ全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量が１５〜８５質量％である発酵用液を用いることを特徴とするエタノールの生産方法。
〔２〕カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が、４−６−４Ｔ２と命名されＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９として寄託された酵母である〔１〕に記載のエタノールの生産方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、キシロースやセロビオースを含有するセルロース系バイオマスから効率的にエタノールを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】カンジダ・インターメディア  ＮＢＲＣ１０６０１を用い、キシロース２質量％含有培地で前培養後、全糖類を１０質量％含有し、かつセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液を用いて発酵した結果を示す。
【図２】カンジダ・インターメディア  ＮＢＲＣ１０６０１を用い、グルコース２質量％含有培地で前培養後、全糖類を１０質量％含有し、かつセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液を用いて発酵した結果を示す。
【図３】カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２を用い、キシロース２質量％含有培地で前培養後、全糖類を１０質量％含有し、かつセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液を用いて発酵した結果を示す。
【図４】カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２を用い、グルコース２質量％含有培地で前培養後、全糖類を１０質量％含有し、かつセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液を用いて発酵した結果を示す。
【図５】カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２を用い、キシロース２質量％含有培地で前培養後、発酵用液中の全糖類濃度及びセロビオース濃度を変化させて発酵した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、セルロース系バイオマスの糖化液からのエタノール生産に最適に用いられるものであるが、通常のエタノール生産に用いるセルロース系バイオマスの糖化処理よりもセロビオース含有量をあえて高い濃度となるように調整したものを発酵用液として用いる点に特徴がある。また、それと共に、特定の酵母を用いる点、及びエタノール生産に用いる酵母の前培養をキシロース存在下で行う点にも特徴がある。これらの特徴により、エタノール生産において必ずしも有利とはいえないセルロース系バイオマスからエタノールの生産効率を高め、エタノールを高濃度で生産することが可能となる。本発明においてこのような効果が得られるメカニズムについて定かではないが、以下のようなメカニズムと推定される。
通常であれば高いセロビオース含有量ではエタノール発酵は進みづらい。しかし、本発明ではエタノール発酵に供する前にキシロースの存在下で前培養を行うことで酵母の細胞内のβ−グルコシダーゼ活性を十分に高めることができると推定される。酵母自らが有するこのβ−グルコシダーゼによってエタノール生産で用いる発酵用液中に多量に含まれるセロビオースのβ−１，４結合を分解し、エタノール発酵の直接の発酵原料であるグルコースを供給することができる。このように、発酵原料のグルコースを、エタノール発酵を行う酵母自身の有するβ−グルコシダーゼによって発酵用液内のセロビオースから調達するために、グルコース濃度とエタノール生産のバランスが良好に保たれ易いと考えられる。その結果、グルコース阻害がかかりづらく、エタノールを高濃度で生産でき、生産効率が高まるものと考えられる。また、かかるメカニズムから、キシロース資化性とグルコース資化性を共に有し、これらの糖からエタノールを生産可能な特定の酵母を用いた点も効果を奏しているものと考えられる。
【００１３】
（１）酵母
本発明のエタノールの生産方法では、カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に属する酵母が用いられる。該酵母としてはカンジダ・インターメディアに属する酵母であれば特に限定されず、例えば、独立行政法人  製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）から入手可能なカンジダ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」等であってもよいし、カンジダ・インターメディアの突然変異株であってもよい。その中でも、本発明者がカンジダ・インターメディア「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として常法に従い自然変異させ、親株よりもエタノール生産能が高い株を選抜することにより取得したカンジダ・インターメディア「４−６−４Ｔ２」と命名し、「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９」として独立行政法人  製品評価基盤機構（ＮＩＴＥ）に寄託した酵母を用いることが特に好ましい。
【００１４】
前記４−６−４Ｔ２は、グルコース及びキシロースとの共存下で、グルコース及びキシロースから短時間で効率良くエタノールを生産する能力を有する。ここで、グルコース及びキシロースとの共存下とは、少なくともグルコースとキシロースを含む原料液体（発酵用液）中に４−６−４Ｔ２が共存することを意味する。従来の酵母は、前述のようにキシロースの消費効率が十分でないもの、或いはグルコース又はキシロースのうちいずれか一方からのエタノール生産能を有するものの、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合は、カタボライトリプレッションによりグルコースが完全に消費されるまでキシロースがほとんど消費されないものであったが、４−６−４Ｔ２は、グルコース及びキシロースの両方が存在する場合であっても、その両方から短時間で効率よくエタノールを生産する能力を有する。
また、４−６−４Ｔ２は、グルコース及びキシロースを含有する原料液体から短時間で効率良くエタノールを生産するが、このとき副生成物としてのキシリトールがほとんど生成されない。また、４−６−４Ｔ２は、このような糖からのエタノールの生産能力以外については親株と同等の性質を有する。
【００１５】
（２）エタノール生産に供する前に実施する酵母の前培養
本発明においては、エタノール生産に供する前に、キシロースを０．５〜５質量％含有する培地で前培養を行う必要があり、培地中にキシロースを１〜３質量％含有することがより好ましい。キシロース含有量がこの範囲を外れた場合には、本発明のエタノール生産用の発酵用液中で効率のよいエタノール生産を行うことができない。
【００１６】
キシロースとしては、キシロースそのものを含有させてもよいし、キシロースを含有するセルロース系バイオマスを酵素法または希硫酸法等の加水分解法によって糖化した糖化液を用いることもでき、培地中のキシロース濃度が前記範囲になるように、セルロース系バイオマス糖化液を前培養の培地中に添加すればよい。なお、セルロース系バイオマスの糖化液には、キシロース以外にもグルコースやマンノースやガラクトース等のセルロースやヘミセルロース由来の糖が含まれ、これらの濃度が高いと生育阻害を起こす場合がある。そのため、キシロースおよび他の糖を含んだ培地中の全糖濃度は１０質量％以下とすることが好ましい。前培養の培地に含まれるキシロース以外の成分は特に限定されるものではないが、生育に適したアミノ酸、尿素、無機窒素塩、有機窒素塩、ポリペプトン、酵母アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源；酵母エキス等があげられる。
【００１７】
前培養の温度は、好ましくは１０℃〜３７℃であり、より好ましくは２５℃〜３２℃である。ｐＨは、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５である。
また、前培養は好気条件で行うことが好ましい。
【００１８】
（３）エタノール生産用発酵用液
本発明のエタノールの生産方法に用いられる発酵用液では、発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％であり、かつ全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量が１５〜８５％質量である発酵用液が用いられる。この糖類としては、セルロース系バイオマスの糖化液を用いることができる。
【００１９】
本発明で用いることができるセルロース系バイオマス糖化液とは、農業残渣（稲ワラ、麦ワラ、バガス（サトウキビの搾りかす）等）、林業残渣（材木等）等から得られるセルロース系バイオマス、すなわちセルロースとヘミセルロースを含むバイオマスを酵素法や希硫酸法等の加水分解法により糖類に分解して得られる液を指す。なお、セルロースはグルコースを構造単位とし、ヘミセルロースはグルコース、キシロース、マンノース及びガラクトース等を構造単位とする多糖類である。
【００２０】
本発明で用いられる発酵用液は、該発酵用液全量に対する全ての糖類の合計の含有量が８〜２０質量％である必要があり、８〜１５質量％であることが好ましく、１０〜１５質量％であることがより好ましい。本発明のエタノール生産法によれば、従来よりも高いエタノール濃度まで発酵させることが可能となり、後の蒸留、濃縮工程にかかるエネルギーを削減することが可能となるが、糖濃度８質量％未満の場合、理論上、生産可能なエタノール濃度は４質量％未満と低く抑えられてしまい、本発明の効果を十分に発揮できない。そのため、糖濃度は８質量％以上とすることが好ましい。一方、糖類の濃度が高すぎる場合には酵母自身のエタノール耐性が十分でないため、糖類の濃度は２０質量％以下とする必要がある。
【００２１】
含有する糖類としては、本発明の発酵用液の必須成分であるセロビオースの他、セルロース系バイオマス糖化液に含まれるグルコース、キシロース、マンノース及びガラクトース等が挙げられる。例えば、バガスやコーンストーバーや広葉樹等のセルロース系バイオマスの糖化液は、通常、含有する糖の単位としては（なお、グルコースを構造単位とするセルロースやセロビオースはグルコースとして換算）、グルコースとキシロースの質量比が７：３〜５：５程度であり、本発明ではこのような比率でグルコースとキシロースを含有するセルロース系バイオマス糖化液も用いることができる。また、さらに本発明に用いられる発酵用液中の各成分の含有量の範囲内であれば、必要に応じて、別途糖類を添加してもよい。
【００２２】
本発明で用いられる発酵用液に含まれるセロビオースは、グルコース同士がβ−１，４結合した２糖類であり、一般的にセルロース系バイオマスを分解、糖化することで得られる。本発明においては、全ての糖類の合計含有量に対するこのセロビオースの含有量が１５〜８５質量％である必要があり、２０〜７０質量％であることが好ましく、３０〜６０質量％であることがより好ましい。かかる濃度範囲とするためには、セルロース系バイオマスの糖化条件を、適宜、完全に単糖になる前のマイルドな条件とすることで調整することができる。また、通常の条件で得られたセルロース系バイオマス糖化液に、セロビオースを添加して調整してもよい。
【００２３】
本発明で用いることのできるセルロース系バイオマスの糖化液は、酵素法であっても、希硫酸法等の加水分解法であっても得ることができる。ただし、後者の加水分解法では分解後のｐＨがエタノール発酵には適さないため、揮発性の発酵阻害物質である酢酸やフルフラール等を軽減する目的および糖を濃縮する目的で蒸留工程等を行ったり、ｐＨを調整したりするなどして、本発明の発酵用液に用いるのに適した濃度やｐＨに調整する必要がある。また、加水分解法では、酵素法とは異なり、分解の過程で選択的にβ−１，４結合を残してセロビオースを本発明で必要とされる所定濃度に調整することが難しい。よって、本発明の発酵用液に用いる糖化液を得る手段としては、酵素法を用いることが好ましい。
【００２４】
酵素法としては、セルロース分解酵素であるセルラーゼが用いられる。セルラーゼは種々の酵素から構成されており、通常、非結晶性セルロースに作用してセルロース鎖を切断するエンドグルカナーゼ、結晶性及び非結晶性セルロース鎖の末端からセロビオースで糖を切り出すセロビオヒドラーゼ、及びこれらの酵素により生成したセロビオースをグルコースに分解するβ−グルコシダーゼなどが含まれている。そのため、このセルラーゼ中のβ−グルコシダーゼの含有量を適宜調整することにより、セルロース系バイオマスがセロビオースを経てグルコースにまで十分に分解されるのを防ぎ、セロビオースを残すことができる。このように、酵素法によれば糖化液中の全ての糖類の合計含有量に対するセロビオースの含有量を所定量に調整しやすい、よって、本発明の発酵用液に含有させる糖類としてセルロース系バイオマス糖化液を用いる場合には、この糖化液は酵素法によって製造することが好ましい。
なお、セルロース系バイオマスからのエタノール生産方法において糖化法として酵素法を用いる場合には、酵素反応と発酵反応を同時に行う並行複発酵を採用することが効率的であるが、本発明のエタノール生産方法もこの並行複発酵を採用することができる。その場合、セロビオース濃度の調整は並行複発酵における酵素反応の調整により行うことができる。そして、本発明に適合するように並行複発酵の酵素反応を調整することは、並行複発酵の効率を高める効果も期待できる。理由は以下の通りである。並行複発酵において酵素反応が進み過ぎてグルコース濃度が高くなり過ぎると、グルコースがセロビオヒドラーゼに結合して活性低下し糖化効率が低下したり、グルコース阻害によりエタノール生産効率が低下したりする場合がある。しかし、本発明に適合するように、酵素反応を調整してセロビオース濃度を調整すれば、生成するグルコース量を調整することができる。その結果、並行複発酵におけるエタノール生産の効率性を高めることができる。
また、β−グルコシダーゼは、セルロースからグルコースを生産するために必要な他の酵素（エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼ）に比べ、酵素活性が低く、グルコースを生産するためには多量必要であり、酵素法によるバイオエタノール製造のコストアップにつながっている。よって、本発明で用いるセロビオースを所定量含有させる上記の糖化液の製造方法では、このβ−グルコシダーゼ使用量を低減しつつもエタノール効率も高めることができるので、コスト面でも有利である。
【００２５】
本発明のエタノール生産に用いる発酵用液には、上記糖類の他にも適宜必要な成分を含有していてもよい。例えば、アミノ酸、尿素、ポリペプトン、アミノ酸不含ニトロゲンベース等の窒素源や、酵母エキス等を添加してもよい。なお、発酵方式として連続発酵法を用いた場合には、培養槽中のエタノールを含有する発酵液の抜き出し時に酵母も抜き出され、発酵槽内での酵母の増殖が必要となる場合が多いため、長期にわたる連続発酵を行う際には、このような成分を酵母の増殖に適するように適宜含有させることが好ましい。
【００２６】
（３）発酵条件
上記以外の発酵条件については、適宜、選択すればよいが、好ましい条件を挙げると以下の通りである。
【００２７】
本発明のエタノール生産方法は、エア供給速度を０．００１〜５００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量とすることが好ましい。この範囲とすることでエタノール生産効率をより向上させることができる。エア供給速度は０．０５〜１００Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．５０〜１０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．１０〜１．０Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。
【００２８】
本発明のエタノール生産方法は、回分発酵法で行ってもよいし連続発酵法で行ってもよいが、本発明のエタノール生産方法ではセルロース系バイオマスに含まれる通常は発酵しづらいセロビオースやキシロースからも効率的にエタノール生産を行うことができるため、これらを含有する発酵用液を連続投入しても効率的に消費出来る点で、連続発酵にも適している。本発明を連続発酵法で行う場合、発酵用液を０．０００２〜２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量の供給速度で発酵槽内に供給することが好ましく、０．００５〜０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がより好ましく、０．０１〜０．５Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量がさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量が特に好ましい。
【００２９】
エタノール生産中の酵母濃度は、乾燥菌体重量で０．５〜５質量％に調整することが好ましい。回分発酵法においては、エタノール発酵工程前の増殖工程においてこの濃度に調整すればよい。連続発酵法においては、培養開始前に前培養した酵母をこの濃度の範囲となるように植菌するか、植菌後、酵母濃度を２倍程度の増殖をともなってもよく、エタノール生産中は発酵用液の供給速度（すなわち発酵液抜き出し速度）や酸素濃度等の培養条件を調整しこの濃度の範囲となるように調整すればよい。
エタノール生産中の温度は、２０〜３５℃とすることが好ましい。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
（参考例１）
以下の手順に従い、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に保存されている酵母カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）「ＮＢＲＣ１０６０１」を親株として、馴養及び自然変異により４−６−４Ｔ２株を取得した。
【００３２】
まず、グルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液のｐＨを水酸化マグネシウムにて５．０に調整し、この溶液２０％と液体培地（酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％）８０％を混合した。この混合溶液１０ｍＬにキシロースを１％添加し、酵母カンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）「ＮＢＲＣ１０６０１」を１白金耳植菌し、３０℃で３日間培養し培養液を得た。
次いで、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液と液体培地を５０％ずつ混合し、この混合液１０ｍＬに上記３日間培養した培養液を１００μＬ添加し、更に７日間培養した。更に、上記と同様にしてｐＨを５．０に調整したグルコース及びキシロースをそれぞれ１質量％含有する酢酸水溶液８０％と培地２０％を混合し、この混合液１０ｍＬに上記７日間培養した培養液を１００μＬ加え３０日間更に培養し、馴養株液とした。
上記馴養株液を１０００倍希釈し、ＹＮＢ寒天培地（グルコース：５％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で４日間培養した後、コロニーを形成した株を取得した。
【００３３】
上記取得した株をＹＮＢ寒天培地（トレハロース：２％、酵母エキス：１％、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース：２％、寒天：２％）の培地に塗布し、２５℃で３日間培養した後、コロニーが形成されたのを確認し、４℃で保管した。４℃において拡大したコロニーを選抜し、リン酸緩衝液（キシロース：２．５％、ＫＨ2ＰＯ4：０．１Ｍ、ｐＨ＝５．０、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．００６Ｍ）でエタノール生産試験を実施し、親株よりもエタノール生産能の高い株を選抜した。
【００３４】
このようにして目的とする酵母を選抜し、これをカンジダ・インターメディア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）４−６−４Ｔ２株と命名した。本菌株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ）に寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９である。
【００３５】
（実施例１）
カンジダ・インターメディア  ＮＢＲＣ１０６０１をＹＮＢ培地（キシロース２質量％、２％酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１％酵母エキス）に添加し、４８時間、温度３０℃で前培養を行った。この前培養液を、発酵用液（グルコース５質量％、セロビオース５質量％、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．５））に２重量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加し、温度３０℃、エア供給量は０．２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量で、発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、エタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
なお、参考として上記発酵用液で糖類としてはグルコース１０質量％のみとした発酵用液を用いて、それ以外の条件は上記と同条件としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図１に示す。
【００３６】
比較のために、前培養のＹＮＢ培地中の糖類としてキシロースに代えてグルコースを２質量％含有した培地を用いる以外は、上記と同条件としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図２に示す。
【００３７】
図１からは、キシロースを２質量％含有する培地で前培養した場合、全糖類を１０質量％含有しかつセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液を用いてエタノール生産を行ったものは、グルコース阻害がかかりづらく、比較的直線的にエタノールの生産をし続け、高濃度のエタノールを生産できることがわかる。一方、グルコースのみを１０質量％含有する発酵用液は初期の発酵速度は速いが、その後発酵速度が遅くなり、発酵後７２時間時後点でのエタノール濃度はセロビオースを全糖類中に５０質量％含有する発酵用液と比べ低くなっていることがわかる。すなわち、前者の発酵用液中のセロビオースをグルコース単位で換算した場合にほぼ同等量のグルコースを含有しているにもかかわらず、グルコース阻害の影響を受け、含有するグルコースが有効活用されていないことがわかる。
【００３８】
また、図２からは、前培養で糖類としてグルコースのみを含有する培地で培養した酵母をエタノール生産に供した場合には、グルコースからエタノール生産を行うことができるが、セロビオースからのエタノール量が極めて低いことがわかる。
【００３９】
（実施例２）
酵母としてカンジダ・インターメディア  ＮＢＲＣ１０６０１に代えてカンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９）を用いた以外は、前培養、エタノール生産とも全て実施例１と同様に行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図３に示す。
【００４０】
また、比較のために、前培養のＹＮＢ培地中の糖類としてキシロースに代えてグルコースを２質量％含有した培地を用いる以外は、上記と同条件としてエタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
以上の結果を図４に示す。
【００４１】
図３、図４によれば、実施例で用いたＮＢＲＣ１０６０１株と同じく、カンジダ・インターメディアに属する４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９）を用いた場合でも、同様の傾向を示し、キシロースの全培養と全糖類合計量当たりセロビオースを５０質量％含有する発酵液を用いることで、効率的なエタノール生産ができることがわかる。
【００４２】
（実施例３）
カンジダ・インターメディア  ４−６−４Ｔ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５０９）をＹＮＢ培地（キシロース２質量％、グルコース１質量％、２％酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）、１％酵母エキス）に添加し、４８時間、温度３０℃で前培養を行った。この前培養液を、発酵用液（全糖類合計量１３質量％（糖類の種類と含有量は表１の通り）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ４．５））に２質量％（乾燥菌体重量相当）となるように菌を添加し、温度３０℃、エア供給量は０．２Ｌ／時／ｇ乾燥菌体重量で、発酵用液の供給、発酵液の抜き出しは行わずに、エタノール生産を行い、エタノール濃度の経時変化を測定した。
結果を図５に示す。
【００４３】
図５によれば、全糖類の合計量に占めるセロビオースの含有率が本発明の範囲内である（２）〜（５）の発酵用液は、セロビオースを含有せずグルコースを多く含む（１）の発酵用液よりもエタノール生産効率が高いことがわかる。
また、セロビオースによるエタノール生産効率向上効果は、セルロース系バイオマス糖化液に含まれるキシロースの共存下においても発揮できることがわかる。なお、セルロース系バイオマス（バガス、コーンストーバー、広葉樹）の場合、通常、含有する糖の単位としては（なお、グルコースを構造単位とするセルロースやセロビオースはグルコースとして換算）、グルコースとキシロースの質量比が７：３〜５：５の範囲であるため、（１）〜（５）の発酵液はセルロース系バイオマス糖化液を模擬したものといえる。
したがって、本発明はセルロース系バイオマス糖化液からの効率的なエタノール生産方法として極めて有用であることがわかる。
【００４４】
【表１】
2014176351.tif 000002
【図１】
2014176351.tif 000003
【図２】
2014176351.tif 000004
【図３】
2014176351.tif 000005
【図４】
2014176351.tif 000006
【図５】
2014176351.tif 000007