(57)【要約】【課題】プローブの走査により細胞を水溶液中で良好に観察し得る走査型プローブ顕微鏡の観察方法を提供する。【解決手段】観察方法は、光の照射を受けて硬くなる細胞を溶液中で保持する細胞保持工程Ｓ１と、溶液中で保持された細胞に光を照射して細胞の硬さを調整する光照射工程Ｓ２と、硬さが調整された細胞をプローブの走査により溶液中で観察する観察工程Ｓ３を有している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光の照射を受けて硬くなる細胞を溶液中で保持する細胞保持工程と、
溶液中で保持された前記細胞に光を照射して前記細胞の硬さを調整する光照射工程と、
硬さが調整された前記細胞をプローブの走査により溶液中で観察する観察工程を有している、走査型プローブ顕微鏡の観察方法。
【請求項２】
前記細胞はヘモグロビンを含んでいる、請求項１に記載の観察方法。
【請求項３】
前記光照射工程は、光学顕微鏡を用いて前記光の照射をおこなう、請求項１に記載の観察方法。
【請求項４】
前記光は、５０５ｎｍよりも短い波長の光である、請求項１に記載の観察方法。
【請求項５】
前記光照射工程は、前記光学顕微鏡の照明視野によって前記光の照射領域を規定する、請求項３に記載の観察方法。
【請求項６】
前記光照射工程は、前記光学顕微鏡の照明時間によって前記光の照射時間を規定する、請求項３に記載の観察方法。
【請求項７】
前記光学顕微鏡はレーザ顕微鏡であり、前記光照射工程は、前記レーザ顕微鏡のレーザ光の走査範囲によって前記光の照射領域を規定する、請求項３に記載の観察方法。
【請求項８】
前記光学顕微鏡はレーザ顕微鏡であり、前記光照射工程は、前記レーザ顕微鏡のレーザ光の走査速度および走査回数によって前記光の照射時間を規定する、請求項３に記載の観察方法。
【請求項９】
前記細胞保持工程は、細胞の吸着性を高めるための物質をあらかじめ透明部材の表面に吸着させておくことを含む、請求項１ないし８のいずれかひとつに記載の観察方法。
【請求項１０】
前記吸着性を高めるための物質は、細胞が吸着すべき表面にアミノ基が出るようになっている、請求項９に記載の観察方法。
【請求項１１】
前記観察工程は、前記細胞保持工程によって保持された細胞の保持部の反対側から細胞をプローブで走査する、請求項１に記載の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型プローブ顕微鏡の観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命現象を解明するために生体を構成する個々の細胞を研究することは重要である。
【０００３】
細胞は、細胞膜に覆われた細胞質、細胞内小器官および核によって構成されている。
【０００４】
細胞を外界と分かつ細胞膜上には外界との情報のやり取りを行う受容体を形成する膜タンパクや糖鎖またはこれらの複合体であるラフトが存在している。また、細胞膜の内側には細胞の形状や機能性分子の配置を支える細胞骨格が存在している。さらに細胞膜の外には細胞外マトリックスが存在している。これらの組織が協同して細胞外界とのやり取りを制御し、生体として活動できるように、維持している。
【０００５】
したがって、細胞の研究の中で細胞膜上の生体分子の形状、配置、動態を知ることは重要なことである。
【０００６】
このため、生体分子の配置や形状を知るために、細胞を化学的にまたは液体窒素によって固め、その表面を電子顕微鏡により形状観察することがおこなわれている。
【０００７】
また、生体分子の動態を知るために、細胞を構成している分子を蛍光修飾したり、タンパク分子の設計図である遺伝子に蛍光タンパクが発現するように遺伝子修飾することで目的タンパク分子が蛍光を発するように変更したりして、分子の動きや分布を蛍光顕微鏡により観察することもおこなわれている。
【０００８】
また、その大きさが数ｎｍないし数１０ｎｍであることから、生体分子を走査型プローブ顕微鏡により観察することもおこなわれている。たとえば、単離精製された膜タンパクを脂質二重膜に融合したものをマイカやガラスのような硬い基板上に展開したり、同様の基板上に自己組織化膜を形成したりして、生理食塩水や緩衝溶液や培養液などの水溶液中で形状および構造変化を原子間力顕微鏡により観察することもおこなわれている。
【０００９】
その高い分解能と溶液中測定に対応できることから、原子間力顕微鏡を用いて生細胞上の生体分子を観察する試みが続けられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、電子顕微鏡は真空中で使用されるため、細胞の生理活性は完全に失われる。
【００１１】
また、蛍光顕微鏡は、蛍光修飾が前提として本来の分子そのものの動きを反映しているとは言えず、光学的な分解能を超えることはできない。
【００１２】
非特許文献１(Cytoskeleton, February 2012 69:101−112; Forced Extension of Delipidated Red Blood Cell Cytoskeleton with Little Indication of Spectrin Unfolding)では、原子間力顕微鏡を用いて、細胞上の膜タンパクと相互作用する分子との相互作用力を測定している。引力測定のために、前記非特許文献１の１０３ページにおいて、赤血球をガラス上に固定するためにガラス基板をアミノ化する手法が示されている。赤血球の内部の細胞質は流体であるため、カンチレバーの先端が接触したときに容易に変形してしまうため斥力に基づく画像化は困難で、前記非特許文献１においても原子間力顕微鏡は、カンチレバーの先端が観察対象物に接触した際に吸着した分子と、カンチレバーの先端に働く引力に基づく解析のみを行い、原子間力顕微鏡像の詳細は開示していない。
【００１３】
本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、プローブの走査により細胞を水溶液中で良好に観察し得る観察方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による観察方法は、光の照射を受けて硬くなる細胞を溶液中で保持する細胞保持工程と、溶液中で保持された細胞に光を照射して細胞の硬さを調整する光照射工程と、硬さが調整された細胞をプローブの走査により溶液中で観察する観察工程を有している。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、プローブの走査により細胞を水溶液中で良好に観察し得る観察方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施形態による観察方法のフローチャートを示している。
【図２】図１に示された光照射工程をおこなうための装置を示している。
【図３】４０倍の対物レンズを通して得られた図１に示された光照射工程後のスライドガラスの光学顕微鏡像である。
【図４】４倍の対物レンズを通して得られた図１に示された光照射工程後のスライドガラスの光学顕微鏡像である。ものである。
【図５】図１に示された光照射工程と観察工程をおこなうための装置を示している。
【図６】図１に示された光照射工程後のスライドガラスの原子間力顕微鏡像である。
【図７】特開２００４−６９４２８号公報に開示された原子間力顕微鏡を示している。
【図８】赤血球の構造を模式的に示している。
【図９】これまでの手法に従って原子間力顕微鏡により赤血球を観察する際の様子を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【００１８】
本実施形態において、観察に供される細胞は、光の照射を受けて細胞質が、光の照射を受ける前と比べて硬くなる細胞である。細胞の代表的な例として赤血球の場合を示す。
【００１９】
図８に示すように、赤血球は、通常の細胞と同様に、ヘモグロビンを多く含む細胞質４１が細胞膜４２（脂質二重膜）で覆われた形態をしている。細胞膜４２上には、脂質二重膜に埋め込まれた形で膜タンパク４３（例えばバンド３タンパク等）が存在しており、これらは、細胞内外の物質の出入りや情報の伝達を行っている。
【００２０】
これまで、赤血球の細胞膜表面の膜タンパク４３の配置や形状を生体中とほぼ同じ水溶液中で原子間力顕微鏡により良好に観察することはできていなかった。それは、赤血球の細胞膜４２は非常に柔らかいため、図９に示すように、カンチレバー４４の先端の探針４５が膜タンパク４３に接触して膜タンパク４３が探針４５から力を受けたときに、液体状の細胞質４１が変形して細胞膜４２が動いてしまうためである。
【００２１】
本発明者らは、このような原子間力顕微鏡を用いた細胞の観察の研究を進めるなか、細胞に光を適当な条件で照射すると、細胞が硬くなって変形しにくくなり、細胞膜上の生体分子を良好に観察できるようになるという新規な知見を得た。細胞が硬くなる理由は、明確ではないが、細胞質に含まれる分子の光変性がかかわっていると考えられる。たとえば、つぎのように推測される。
【００２２】
光の照射によって細胞質に含まれる生体分子の３次構造が壊れて粒子状から直鎖状の分子構造に変性する。これにより分子同士の絡み合いが進み細胞質がゲル化する。これにより、細胞質の弾性率が高まり、細胞骨格の動きが減衰され、細胞膜の支えができる。その結果、細胞膜上に存在する膜タンパクや細胞外マトリックスの動きが少なくなる。
【００２３】
細胞質が光の照射を受けて変性する分子を含んでいる細胞であれば、細胞に光を照射することによって細胞自体の硬さを調整することができるものと予想される。
【００２４】
本実施形態の観察方法は、このような知見に基づいたものであり、図１に示すように、光の照射を受けて硬くなる細胞を溶液中で保持する細胞保持工程Ｓ１と、溶液中で保持された細胞に光を照射して細胞の硬さを調整する光照射工程Ｓ２と、硬さが調整された細胞をプローブの走査により溶液中で観察する観察工程Ｓ３を有している。
【００２５】
細胞は、たとえば、ヘモグロビンを含んでいる。より具体的には、細胞は赤血球であってよい。細胞保持工程Ｓ１は、たとえば、細胞の吸着性を高めるための物質をあらかじめ透明部材たとえばガラス基板の表面に吸着させておくことを含む。細胞の吸着性を高めるための物質は、たとえば、細胞が吸着すべき表面にアミノ基が出るようになっている。
【００２６】
照射する光は、たとえば、５０５ｎｍよりも短い波長の光である。より具体的には、照射する光は、３６０ｎｍ〜３７０ｎｍの波長帯域の光や、４００〜４４０ｎｍの波長帯域の光であってよい。光照射工程Ｓ２は、たとえば、光学顕微鏡を用いて光の照射をおこなう。光照射工程Ｓ２は、光学顕微鏡の照明視野によって光の照射領域を規定する。また光照射工程Ｓ２は、光学顕微鏡の照明時間によって光の照射時間を規定する。光学顕微鏡は、たとえば、レーザ顕微鏡であってよい。この場合、光照射工程Ｓ２は、レーザ顕微鏡のレーザ光の走査範囲によって光の照射領域を規定する。また光照射工程Ｓ２は、レーザ顕微鏡のレーザ光の走査速度および走査回数によって光の照射時間を規定する。
【００２７】
観察工程Ｓ３は、細胞保持工程Ｓ１によって保持された細胞の保持部の反対側から細胞をプローブで走査する。
【００２８】
この観察方法によれば、細胞に光を照射することにより細胞が硬くなるため、走査型プローブ顕微鏡のプローブ（探針）が接触しても容易に変形しなくなるので、走査型プローブ顕微鏡により細胞を水溶液中で良好に観察できるようになる。たとえば、これまで測定できなかった細胞膜上の生体分子の形状や配置を良好に観察できるようになる。
【００２９】
図２は、光照射工程Ｓ２をおこなうための装置を示している。この装置は、倒立型の光学顕微鏡１０で構成されている。
【００３０】
光学顕微鏡１０は、水銀ランプ１１と、コリメートレンズ１３と、減衰フィルタ１４と、ダイクロイックミラー１５と、対物レンズ１７、観察ステージ１８を備えている。対物レンズ１７は、倍率を切り替えられるようになっている。すなわち、倍率の異なる複数の対物レンズの一つが光路上に選択的に配置されるようになっている。
【００３１】
光学顕微鏡１０はまた、光学顕微鏡像を取得するために、水銀ランプ１１と代替的に使用されるハロゲンランプ１２と、ダイクロイックミラー１５と代替的に使用されるハーフミラー１６と、光学像を取得するためのカメラ１９を備えている。
【００３２】
観察ステージ１８の上には、緩衝溶液２３中で赤血球２２を保持したスライドガラス２１が乗せられる。このようなスライドガラス２１は次のようにして作成される。まず、緩衝溶液２３で適当な濃度に希釈した赤血球２２を、アミノ化したスライドガラス２１上に展開する。アミノ化したスライドガラス２１には、ある比率で赤血球２２が吸着する。次に、緩衝溶液２３を入れ替える。これにより、アミノ化したスライドガラス２１上に吸着しなかった赤血球が取り除かれる。
【００３３】
赤血球２２を保持するための基板は、アミノ化したスライドガラス２１に限らず、赤血球２２の物理吸着を妨げないものであればどのようなものが適用されてもよい。
【００３４】
光照射工程Ｓ２をおこなう場合、光学顕微鏡１０の光路上に、水銀ランプ１１と減衰フィルタ１４とダイクロイックミラー１５を配置する。水銀ランプ１１で発せられた光は、コリメートレンズ１３で平行化され、減衰フィルタ１４で減衰され、ダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１７によって集束されて、スライドガラス２１上の一部の領域に照射される。たとえば、水銀ランプ１１の出力は１００Ｗ、減衰フィルタ１４の透過率は６％、対物レンズ１７の倍率は６０倍、照射時間は３０分である。ダイクロイックミラー１５は、５０５ｎｍ以下の波長の光を反射する特性を有している。したがって、水銀ランプ１１から発生された光のうち、５０５ｎｍ以下の波長の光が赤血球２２に照射される。
【００３５】
光照射工程Ｓ２の終了後、必要に応じて、水銀ランプ１１をハロゲンランプに切り替え、減衰フィルタ１４をはずし、ダイクロイックミラー１５をハーフミラー１６に切り替える。これにより、カメラ１９によって赤血球２２の状態を光学顕微鏡像として観察することができる。
【００３６】
光照射工程Ｓ２の終了後のスライドガラス２１は、その後、走査型プローブ顕微鏡たとえば原子間力顕微鏡による観察に供される。
【００３７】
ヘモグロビンを構成するヘムタンパク質の光吸収のピークは４００ｎｍから４５０ｎｍにあり、５０５ｎｍ以下の波長の光を受けることにより、赤血球の細胞質の主成分であるヘモグロビンが、照射光のエネルギーを吸収し、３次構造が壊れ粒子状から直鎖状の分子構造に変性する。これにより分子同士の絡み合いが進み細胞質がゲル化する。
【００３８】
一方、光照射を受けていない赤血球は、緩衝溶液を滅菌水に入れ替えると、細胞膜を通して塩濃度の濃い細胞内に水分が入ることで、形状を維持できなくなり、最後には破裂してしまう。
【００３９】
図３は、６０倍の対物レンズを用いて５０５ｎｍ以下波長の光を照射した赤血球の緩衝溶液を滅菌水と入れ替えた後の赤血球を４０倍の対物レンズを用いて観察した光学顕微鏡像である。図３の光学顕微鏡像は、スライドガラス２１が載置された観察ステージ１８を移動させて６０倍の対物レンズを通して光が照射された領域と光が照射されなかった領域の境界を視野の中心に位置合わせして、４０倍の対物レンズを通して観察したものである。図３の破線の左側には、光照射によって細胞質がゲル化した赤血球が見てとれる。一方、図３の破線の右側には、光が照射されなかった赤血球が緩衝溶液と滅菌水の入れ替えによって破裂した赤血球の痕跡が見てとれる。
【００４０】
図４の光学顕微鏡像は、６０倍の対物レンズを通して光を照射した領域の中心を視野の中心に合わせて、４倍の対物レンズを通して観察したものである。１点鎖線の円で囲まれた領域内に、ゲル化して細胞質の形状を維持した赤血球が見てとれる。
【００４１】
前述したように、光学顕微鏡１０を用いて光照射工程Ｓ２をおこなうため、高い自由度で光の選択をおこなうことができる。
【００４２】
赤血球２２の光変性を促すための光の波長は、水銀ランプ１１の後段に色選択フィルタを設置することで、さらには、色選択フィルタを光学特性の異なるものに取り換えることで変更することができる。
【００４３】
赤血球２２の光変性を促すための光の光量は、水銀ランプ１１の後段の減衰フィルタを透過率の異なるものに取り換えることで変更することができる。
【００４４】
赤血球２２の光変性を促すための光の照射個所は、観察ステージ１８によりスライドガラス２１を移動させることで変更することができる。
【００４５】
赤血球２２の光変性を促すための光の照射領域は、光学顕微鏡１０の照明視野によって規定される。光学顕微鏡１０の照明視野は、照明光路上に照明絞りを設置することで、また、照明絞りの大きさと形状を変えることで変更することができる。また、対物レンズ１７を倍率の異なるものに切り換えることによっても変更することができる。
【００４６】
また、光学顕微鏡には、多種の観察をおこなうために多種の光源が搭載されていることもあり、赤血球２２の光変性を促す光を発するものであれば、それらの光源のいずれもが赤血球２２の光変性を促すための光照射に適用されてよい。たとえば、紫外光を発する光源が赤血球２２の光変性を促すための光照射に適用されてよい。
【００４７】
図５は、光照射工程Ｓ２と観察工程Ｓ３をおこなうための装置を示している。この装置は、光学顕微鏡１０と原子間力顕微鏡３０を組み合わせた構成となっている。光学顕微鏡１０は、倒立型の光学顕微鏡であり、図２に示したものと同様である。言い換えれば、この装置は、図２の光学顕微鏡１０に、原子間力顕微鏡３０が追加された構成となっている。
【００４８】
原子間力顕微鏡３０は、観察ステージ１８の上方に配置されるカンチレバー３１と、カンチレバー３１を走査する走査機構３２と、カンチレバー３１の変位を光学的に検出する変位検出部３３と、走査機構３２を駆動するとともに変位検出部３３で検出される情報に基づいて原子間力顕微鏡像を形成する制御部３４から構成される。
【００４９】
このような構成により、上方からの原子間力顕微鏡観察と、下方からの光照射および光学顕微鏡観察の共存が実現されている。
【００５０】
つまり、この装置では、緩衝溶液２３と共に赤血球２２を保持したスライドガラス２１に、水銀ランプ１１と減衰フィルタ１４とダイクロイックミラー１５を用いて下方から赤血球２２の光変性を促す光の照射をおこない、その後、必要に応じて、ハロゲンランプ１２とハーフミラー１６を用いて下方から光学顕微鏡観察をおこない、さらに、上方から原子間力顕微鏡観察を行なうことができる。光学顕微鏡観察と原子間力顕微鏡観察は、別々におこなっても、同時におこなってもよい。
【００５１】
光照射により赤血球２２の細胞質４１がゲル化することにより、細胞膜４２が細胞質ゲルに支えられるようになり容易に変形しなくなるため、赤血球２２の細胞膜４２上に存在する膜タンパク４３を原子間力顕微鏡３０により溶液中で良好に観察できるようになる。
【００５２】
図６は、ゲル化したことで表面が観察された赤血球の原子間力顕微鏡像である。観察環境は緩衝溶液中である。観察された白い粒のそれぞれの距離は約１００ｎｍであり、電子顕微鏡等で観察されるバンド３タンパクの間隔と同等の間隔が観察されている。
【００５３】
観察には、図２と図５に示した装置のほか、レーザ顕微鏡と組み合われた原子間力顕微鏡が適用されてもよい。そのような原子間力顕微鏡の一例が特許文献１（特開２００４−６９４２８号公報）に開示されている。この原子間力顕微鏡について図７を参照しながら説明する。
【００５４】
原子間力顕微鏡は、倒立型顕微鏡２７０と一体化されており、倒立型顕微鏡２７０は、試料２１１が載せられるステージ２７１と、ステージ２７１の下方に配置された対物レンズ２７２と、対物レンズ２７２を上下に移動させるレボルバーＺ移動機構２７６と、対物レンズ２７２と共働して試料２１１の光学像を得る接眼レンズ２７３と、照明光を発する照明光源１０８と、試料２１１を上方から照明する透過照明装置２７４と、透過照明装置２７４を支持するアーム２７５を備えている。
【００５５】
原子間力顕微鏡は更に、下方に突出する探針２０９を先端部下面に備えるカンチレバー２０７と、カンチレバー２０７を支持すると共にカンチレバー２０７の変位を検出する変位検出ユニット２３０と、カンチレバー２０７を試料面上に対して水平方向（Ｘ方向とＹ方向）と垂直方向（Ｚ方向）にカンチレバー２０７を走査する走査機構である円筒形ＸＹＺスキャナー２１３とを有している。
【００５６】
円筒形ＸＹＺスキャナー２１３は、通常、ピエゾアクチュエータで構成され、顕微鏡２７０のアーム２７５に固定されている。カンチレバー２０７は、測定時に、試料２１１に近づけられ、その先端の探針２０９が試料２１１の表面に当てられる。
【００５７】
変位検出ユニット２３０は、カンチレバーの背面に光ビーム２３１を照射する変位測定用光源であるレーザ発振器２２１と、カンチレバーの背面からの反射光ビーム２３２の位置を検出する検出器２３５とを備えている。レーザ発振器２２１からの光ビーム２３１は、カンチレバー２０７の背面に焦点が合った状態で照射される。
【００５８】
検出器２３５は、例えば上下二分割型のフォトディテクタ（ＰＤ）で構成され、受けた光量に対応する信号を出力する上側センサと下側センサとを有する。反射光ビーム２３２の入射位置は、二分割ＰＤ２３５の上側センサと下側センサの受ける光量の差、すなわちそれらの出力信号の差に基づいて求めることができる。
【００５９】
原子間力顕微鏡は更に、検出器２３５から出力されるアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器２６１と、Ａ／Ｄ変換器２６１からのデジタル信号を処理するデータ処理部２６２と、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３を駆動するＺ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４と、システム全体を制御するＣＰＵ２５７と、ＣＰＵ２５７に外部から情報を与えるための入力部１０９と、データを表示する表示部２５５とを有している。
【００６０】
データ処理部２６２は、二分割ＰＤ２３５の上側センサと下側センサの出力の差信号と和信号を算出し、制御情報としてこれをＣＰＵ２５７に送る。ＣＰＵ２５７は、データ処理部２６２からの情報に従ってＺ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４を制御すると共に、Ｚ走査駆動制御部２６３とＸＹ走査駆動制御部２６４から探針２０９の位置情報を取得して試料２１１のデータを取得し、得られたデータに基づいて所望のデータを表示部２５５に表示させる。
【００６１】
また、原子間力顕微鏡は、励起光ビームを発する光源であるレーザ１０５と、励起光ビーム照射の位置と領域と光量と時間を指定する光強度・時間指定部１０３と照射位置・領域指定部１０４と、励起光ビーム照射の位置と領域と光量と時間を制御する照射位置・領域制御部１００と照射時間制御部１０１と照射光量制御部１０２と、試料２１１の全体の蛍光像を得るための撮像部１０６と、試料２１１からの蛍光を撮像部１０６に方向付けるミラー例えばダイクロイックミラー１０７を有している。
【００６２】
この原子間力顕微鏡では、照明光源１０８からの光が、透過照明装置２７４によって、円筒形ＸＹＺスキャナー２１３の中を通って試料に照射される。この照明光により試料の蛍光色素が励起され蛍光を発する。この蛍光像を撮像部１０６において撮像し試料全体の観察像を得る。
【００６３】
また、レーザ１０５からのレーザ光が、光強度・時間指定部１０３、照射位置・領域指定部１０４を経由した後、試料に照射される。照射位置や領域を光学的に制御する照射位置・領域指定部１０４は、例えばガルバノミラーやＡＯＭ素子で構成され、照射位置・領域制御部１００からの信号に応答し、それに対応した位置にレーザ光を移動させる。これを用いれば、レーザ光を観察範囲全体にラスター走査することができる。さらに領域を指定することにより、走査範囲が限定される。
【００６４】
時間と光量の制御は、光強度・時間指定部１０３によって行われ、指定された強度と時間だけ、レーザ光が透過される。光強度・時間指定部１０３は、例えばＡＯＴＦ素子で構成される。ＡＯＴＦ素子は、高速シャッター機能により光の透過／遮断を高速で切り換えることができ、これにより高精度な領域指定と時間指定が実現される。
【００６５】
この原子間力顕微鏡は、レーザ１０５が発する励起光ビームを走査することによって特定領域の蛍光画像を得るものであるが、レーザ１０５が、細胞たとえば赤血球２２の光変性を促す光を発するものであればそのまま、そうでないならば細胞たとえば赤血球２２の光変性を促す光を発するレーザに変更することにより、本実施形態の観察方法に適用できる。
【００６６】
この場合、赤血球２２の光変性を促すための光の照射領域は、レーザ顕微鏡のレーザ光の走査範囲によって規定される。レーザ光の走査範囲は、照射位置・領域指定部１０４によって任意に変更可能であり、また、通常の光学顕微鏡の照明視野に比べて非常に微小である。したがって、任意な形状の微小な領域内の赤血球２２だけを選択的に光変性させて、原子間力顕微鏡観察することが可能である。
【００６７】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【００６８】
実施形態は、原子間力顕微鏡による観察を例にあげて説明したが、それ以外の走査型プローブ顕微鏡に適用されてもよい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００６９】
【非特許文献１】Cytoskeleton, February 2012 69:101−112；Forced Extension of Delipidated Red Blood Cell Cytoskeleton with Little Indication of Spectrin Unfolding
【特許文献】
【００７０】
【特許文献１】特開２００４−６９４２８号公報
【符号の説明】
【００７１】
１０…光学顕微鏡、１１…水銀ランプ、１２…ハロゲンランプ、１３…コリメートレンズ、１４…減衰フィルタ、１５…ダイクロイックミラー、１６…ハーフミラー、１７…対物レンズ、１８…観察ステージ、１９…カメラ、２１…スライドガラス、２２…赤血球、２３…緩衝溶液、３０…原子間力顕微鏡、３１…カンチレバー、３２…走査機構、３３…変位検出部、３４…制御部、４１…細胞質、４２…細胞膜、４３…膜タンパク、４４…カンチレバー、４５…探針、１００…照射位置・領域制御部、１０１…照射時間制御部、１０２…照射光量制御部、１０３…光強度・時間指定部、１０４…照射位置・領域指定部、１０５…レーザ、１０６…撮像部、１０７…ダイクロイックミラー、１０８…照明光源、１０９…入力部、２０７…カンチレバー、２０９…探針、２１１…試料、２１３…円筒形ＸＹＺスキャナー、２２１…レーザ発振器、２３０…変位検出ユニット、２３１…光ビーム、２３２…反射光ビーム、２３５…検出器、２５５…表示部、２５７…ＣＰＵ、２６１…Ａ／Ｄ変換器、２６２…データ処理部、２６３…Ｚ走査駆動制御部、２６４…ＸＹ走査駆動制御部、２７０…顕微鏡、２７１…ステージ、２７２…対物レンズ、２７３…接眼レンズ、２７４…透過照明装置、２７５…アーム、２７６…レボルバーＺ移動機構。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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