(57)【要約】【課題】幹細胞株の集団の中で個々の幹細胞の分化状態の均質性を評価すること。【解決手段】幹細胞の解析方法は、幹細胞の状態を検出するためのマーカー遺伝子の転写因子結合領域と、前記領域の下流に位置する発光レポーター遺伝子とを含む核酸を有する幹細胞又は幹細胞由来の分化細胞を培養することと、前記発光レポーター遺伝子の発現に起因する発光を経時的に撮像して、複数の発光画像を含む経時的プロファイルを得ることと、前記経時的プロファイルから、複数の前記発光レポーター遺伝子の発現に起因する特徴量の均質性を解析することとを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の状態を検出するためのマーカー遺伝子の転写因子結合領域と、前記領域の下流に位置する発光レポーター遺伝子とを含む核酸を有する幹細胞又は幹細胞由来の分化細胞を培養することと、
前記発光レポーター遺伝子の発現に起因する発光を経時的に撮像して、複数の発光画像を含む経時的プロファイルを得ることと、
前記経時的プロファイルから、複数の前記発光レポーター遺伝子の発現に起因する特徴量の均質性を解析することと、
を含む幹細胞の解析方法。
【請求項２】
前記幹細胞を培養する際に前記幹細胞の分化を促進又は抑制する因子を添加することと、
前記撮像する際に前記因子を除去することと、
を含む請求項１に記載の幹細胞の解析方法。
【請求項３】
前記均質性の評価の結果に基づいて、前記因子を評価することを含む請求項２に記載の幹細胞の解析方法。
【請求項４】
前記因子は、前記幹細胞の分化に関わる低分子化合物又は薬剤に含まれる因子である請求項２又は３に記載の幹細胞の解析方法。
【請求項５】
前記解析は、ヒストグラム解析である請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記特徴量は、前記発光の強度及び／又は変動を含む請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記特徴量は、前記幹細胞の形態に基づく量を含む請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記形態に基づく量は、前記幹細胞のコロニーの厚さ、前記幹細胞の円形度、前記幹細胞の大きさ及び前記幹細胞のコロニーの大きさからなる群から選択される少なくとも１つである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞は、ＥＳ細胞、体性幹細胞、ｉＰＳ細胞又はがん幹細胞である請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野では、幹細胞を使った細胞移植、臓器再生による難病治療が期待されている。心疾患等の臨床応用が先行しているが、実際に移植した幹細胞がどのように機能しているか、不明な点が多い。安全な移植を行うためには、幹細胞の分化誘導（ある特定の機能を持つ細胞へ誘導すること）のメカニズム解明に加えて、細胞内動態や機能を制御する因子の同定、適切な分化を促進する低分子化合物及び薬剤の評価及びスクリーニングが必要である。
【０００３】
これまでに、幹細胞は、未分化細胞に高度に特異的ないくつかの転写因子を発現していることが分かっている。これらには、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ、Ｎａｎｏｇ、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦ−Ｒ）が含まれる。Ｏｃｔ−４は原腸未形成胚、卵割初期胚、胚盤胞の内細胞塊の細胞、及び胚性癌（ＥＣ）細胞で発現している。成体動物では、Ｏｃｔ−４は生殖細胞だけに見られる。
【０００４】
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体性幹細胞等の幹細胞実験では、フィーダー細胞との共培養、分化抑制因子であるＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）の添加により多能性を維持しているが、環境や細胞のコンディションが原因で多分化能を失い容易に分化してしまうことがある。分化誘導プロセスの理解を図るうえで、未分化状態（多能性を持つ状態）、分化状態を正確に知ることは重要であるが、分化状態は幹細胞の形態だけで判断することは難しい。
【０００５】
特許文献１は、ＬＩＦが存在している状態で培養する場合にＥＳ細胞の表面で発現し、ＬＩＦが存在していない状態では発現しない特定の配列番号のタンパク質を同定し、このタンパク質を未分化マーカータンパク質として用いることを開示している。また、特許文献１は、未分化マーカータンパク質を認識するための抗体を蛍光色素で標識して観察できるようにしている。さらに、特許文献１は、経時的プロファイルを利用して細胞状態を判定することも開示している。
【０００６】
特許文献２は、幹細胞コロニーとフィーダー細胞とを含む画像から、フィーダー細胞が占める領域を抽出し、その領域に存在するフィーダー細胞の形態的特徴を示す特徴量を算出し、その特徴量と幹細胞コロニーの状態との対応関係に基づいて、幹細胞コロニーの状態を評価することを含む細胞評価装置を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１０−１０４３５０号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２９４０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ここで、特許文献１及び２の何れも幹細胞の観察に蛍光を利用している。蛍光観察の場合、細胞に対して励起光を照射する必要があるので、特に長期に及ぶ観察の場合、励起光が細胞に与える影響を考慮することが必要である。
【０００９】
また、幹細胞は、環境や細胞のコンディションにより、容易に性質が変わることが知られている。さらに、長期間にわたる培養を行うことで、幹細胞集団の中で多分化能を失い分化する幹細胞が混在してくる場合があり、分化多能性にばらつきが生じる。ここで、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を目的の細胞に分化させて細胞治療に用いる場合には、移植する細胞の中に未分化な細胞が含まれると移植後に腫瘍化する危険性があり、完全に分化した細胞を細胞治療に用いる必要がある。このように幹細胞株の細胞集団の中で個々の幹細胞の分化状態の均質性を評価することは重要である。
【００１０】
本発明の目的は、幹細胞株の集団の中で個々の幹細胞の分化状態の均質性を評価することが可能な幹細胞の解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態に係る幹細胞の解析方法は、幹細胞の状態を検出するためのマーカー遺伝子の転写因子結合領域と、前記領域の下流に位置する発光レポーター遺伝子とを含む核酸を有する幹細胞又は幹細胞由来の分化細胞を培養することと、前記発光レポーター遺伝子の発現に起因する発光を経時的に撮像して、複数の発光画像を含む経時的プロファイルを得ることと、前記経時的プロファイルから、複数の前記発光レポーター遺伝子の発現に起因する特徴量の均質性を解析することとを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、幹細胞株の集団の中で個々の幹細胞の分化状態の均質性を評価することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る幹細胞の解析方法の主な処理の流れを示した図である。
【図２】図２（ａ）は未分化細胞から生じる発光の経時的変化を示すグラフであり、図２（ｂ）は分化細胞から生じる発光の経時的変化を示すグラフである。
【図３】図３は、形態に基づく特徴量の経時的変化を示した図である。
【図４】図４は、分化の程度のスコアリングの例を説明するための図である。
【図５】図５は、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後１０時間後のＲＯＩ情報付きの発光画像を示す図である。
【図６】図６は、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後６０時間後のＲＯＩ情報付きの発光画像を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後１０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析の結果を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後２０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析の結果を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後３０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析の結果を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後４０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析の結果を示す図である。
【図７Ｅ】図７Ｅは、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後５０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析の結果を示す図である。
【図７Ｆ】図７Ｆは、実施例にて取得されたＬＩＦ除去後６０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析の結果を示す図である。
【図８】図８は、分化マーカー遺伝子と未分化マーカー遺伝子とを組み合わせた場合のそれぞれの発現量の時間変化を示すグラフである。
【図９Ａ】低分子化合物及び薬剤の作用後、短時間の経過後のマーカー遺伝子の発現量のヒストグラムを示す図である。
【図９Ｂ】低分子化合物及び薬剤の作用後、長時間の経過後のマーカー遺伝子の発現量のヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１は、本発明の一実施形態に係る幹細胞の解析方法の主な処理の流れを示した図である。本発明の一実施形態に係る方法は、幹細胞の状態を検出するためのマーカー遺伝子の転写因子結合領域とこの領域の下流に位置する発光レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）とを含む核酸を有する幹細胞を培養することと、発光レポーター遺伝子の発現に起因する発光を経時的に撮像して複数の発光画像を含む経時的プロファイルを得ることと、経時的プロファイルから、複数の発光レポーター遺伝子の発現に起因する特徴量の均質性を解析することとを含む。具体的には、図１に示されるように、幹細胞の作製（Ｓ１）、幹細胞の培養（Ｓ２）、発光画像の撮像（Ｓ３）、特徴量の均質性の評価（Ｓ４）の手順で処理が行われる。
【００１５】
Ｓ１の幹細胞の作製の処理は、幹細胞の状態を検出するためのマーカー遺伝子の転写因子結合領域とこの領域の下流に位置する発光レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ遺伝子）とを含む核酸を有する幹細胞を作製する処理である。
【００１６】
ここで、幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体性幹細胞、人口多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はがん幹細胞である。さらに、本実施形態による「幹細胞」は、幹細胞のコロニー、さらには幹細胞由来の分化細胞も含むものである。また、幹細胞は、種々の生物に由来するものであってよく、例えばヒト、マウスといった哺乳類の幹細胞である。幹細胞は、市販される細胞であってよく、公知の方法によって製造された細胞であってもよい。
【００１７】
また、幹細胞の状態を検出するためのマーカー遺伝子は、例えば、その遺伝子が発現すること及び／又は発現しないことに基づいて細胞の状態の判別を可能とする遺伝子である。未分化の程度を同定する際に使用できるマーカー遺伝子は、例えば、細胞が未分化であるときに特異的に発現する遺伝子であり、その具体例は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ、Ｓｏｘ等である。分化の程度を同定する際に使用できるマーカー遺伝子は、例えば、細胞が分化する過程において特定的に発現する遺伝子であり、その具体例は、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍａｓｈ１といった神経分化マーカー遺伝子、及びＧＡＴＡ４、Ｎｋｘ２．５といった心筋分化メーカー遺伝子である。
【００１８】
転写因子結合領域は、転写因子と呼ばれるタンパク質が特異的に結合できる、核酸に存在する領域である。転写因子が転写因子結合領域に結合することにより、核酸上の遺伝情報の転写が制御される。転写因子結合領域は、例えば、プロモーター、エンハンサー又はサイレンサーである。転写因子結合領域は、公知のものを使用してよく、あるいは、マーカー遺伝子の上流に位置する塩基配列からクローニングしてもよい。
【００１９】
転写因子結合領域としてプロモーターを使用する場合、Ｎａｎｏｇのプロモーター領域は、例えばT Kuroda et al., Molecular and Cellular Biology (2005 vol.25, No.6 p2475-2485)に記載されるものを使用でき、Ｏｃｔ−４のプロモーター領域は、例えばS Okumura-Nakanishi et al., The journal of Biological Chemistry (2005 vol. 280, No7 p5307-5317)に記載されるものを使用でき、Ｎｅｓｔｉｎのプロモーター領域は、例えばL Cheng et al., FEBS Letters 2004 565 p195-202に記載されるものを使用できる。
【００２０】
発光レポーター遺伝子の一例としてのルシフェラーゼ遺伝子は、発光が生じる化学反応を触媒する酵素であるルシフェラーゼをコードする遺伝子である。ルシフェラーゼは、ＡＴＰが存在する場合に、基質であるルシフェリンの酸化反応を触媒する。その反応の際、ルシフェリンが発光する。
【００２１】
ルシフェラーゼ遺伝子は、ホタルやバクテリアといった種々の生物に由来するものであってよい。ルシフェラーゼ遺伝子は、例えば、緑色の発光を生じさせるＥｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光を生じさせるＣＲＢルシフェラーゼ、青色の発光を生じさせるウミシイタケルシフェラーゼといった市販されるものをコードする遺伝子であってよい。ルシフェラーゼ遺伝子を予め含有する市販のベクターの例は、Ｅｌｕｃ  ｖｅｃｔｏｒ（東洋紡）、ＣＲＢ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＲｅｎｉｌｌａ  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）である。
【００２２】
核酸は、例えば、幹細胞の核内に含まれるＤＮＡである又は細胞質中にベクターとして存在するＤＮＡである。核酸の塩基配列の一部は、転写因子結合領域及びルシフェラーゼ遺伝子となっている。転写因子結合領域とルシフェラーゼ遺伝子と位置関係は、転写因子結合領域に対して特異的に転写因子が結合することでルシフェラーゼ遺伝子の発現が促進される位置関係となっている。
【００２３】
一対の転写因子結合領域及びルシフェラーゼ遺伝子は、核酸に１つのみ存在してよい。または１種類の転写因子結合領域及びルシフェラーゼ遺伝子の対が、核酸に複数存在してよい。あるいは、複数種の転写因子結合領域及びルシフェラーゼ遺伝子の対が、核酸に１つずつ又は複数ずつ存在してよい。複数種の転写因子結合領域及びルシフェラーゼ遺伝子の対を使用する場合、それぞれの対の転写因子結合領域は互いに異なるマーカー遺伝子に対するものであり、かつそれぞれの対のルシフェラーゼ遺伝子は異なる色の発光をもたらすルシフェラーゼの遺伝子とすることができる。
【００２４】
Ｓ２の幹細胞の培養の処理は、Ｓ１の処理に従って作成された幹細胞を培養する処理である。ここで、幹細胞の培養は、既知の方法により行うことができる。幹細胞をフィーダー細胞と同時に培養してよい。培養するための培地には、分化を促進又は抑制するための物質を添加してもよい。例えば、分化抑制因子であるＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を培地に添加することができる。また、培地には、幹細胞に対して特定の刺激を与えるための外来因子を添加してもよい。幹細胞は、例えば、３７．０℃で１〜３日間培養される。必要に応じて、継代培養を行うことができる。また、培地には、公知の方法に基づいて、任意の時期に任意の量で、ルシフェリン、ＡＴＰ、マグネシウム等の発光のために必要な物質を添加することができる。
【００２５】
ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、転写因子結合領域と転写因子との結合に応じて制御される。本来、転写因子結合領域はマーカー遺伝子の転写を制御するためのものであるため、ルシフェラーゼ遺伝子の発現のタイミング及び発現量等は、マーカー遺伝子のそれらに一致しているとみなすことができる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって細胞内に生じたルシフェラーゼタンパク質は、細胞に対して提供されたルシフェリンの酸化を触媒し、その結果ルシフェリンが発光する。したがって、発光に基づいて、マーカー遺伝子のタイミング及び発現量等を推定することができる。
【００２６】
Ｓ３の発光画像の取得の処理は、発光レポーター遺伝子に起因する発光を、発光イメージング装置によって撮像して発光画像を含む経時的プロファイルを取得する処理である。ここで、本実施形態における発光画像は、発光を撮像することにより得られた画像のことを言うものとする。この発光画像は、発光する細胞に由来する発光シグナルが検出された領域と、発光しない細胞及び細胞が存在しない部分に由来する発光シグナルが検出されない領域とを含む。このため、細胞毎又はコロニー毎の発光を推定することができる。
【００２７】
発光イメージング装置は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光を主に透過させるフィルターと、フィルターを通した光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す処理部とを含む。発光イメージング装置の具体例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）である。
【００２８】
ここで、Ｓ３の撮像は、継時的に行われる。すなわち、撮像は、任意の間隔で連続的に行われる。例えば、撮像は、５分から１時間の間隔で行われる。また、１回の撮像の時間は任意に設定される。１回の撮像時間は、十分な発光シグナルを検出できるように調整することができる。
【００２９】
また、本実施形態における経時的プロファイルは、幹細胞を経時的に測定することで得られた幹細胞に関する情報の集合を意味する。経時的プロファイルは、経時的に取得された複数の発光画像を含む。また、経時的プロファイルは、１つ以上の明視野画像を含んでよい。さらに、経時的プロファイルは、画像以外の情報を含んでよく、例えば、培養時間、培養温度、培養液の組成といった培養時の条件を含んでよい。
【００３０】
発光画像の取得と並行して、幹細胞に対して照射された照明光が幹細胞を反射及び／又は透過して生じる光に基づく明視野画像を取得するようにしてもよい。明視野画像とは、発光に基づくことなく、幹細胞の位置及び形態等を観察することができる画像である。明視野画像は、位相差画像やＤＩＣ観察画像を含む。明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得することができ又は発光画像の取得からは独立して任意のタイミングで取得することができる。
【００３１】
Ｓ４の特徴量の均質性の評価の処理は、経時的プロファイルから抽出される特徴量の均質性を評価することによって、幹細胞の分化状態の均質性を評価する処理である。ここで、特徴量とは、経時的プロファイルに含まれる幹細胞に関する情報の一部を数値化した情報、ある特徴の有無及び符号変化などの変動情報等である。
【００３２】
特徴量の例は、発光画像から抽出される発光に基づく量である。発光に基づく量の例は、発光の強度及び発光の変動である。
【００３３】
発光の強度は、例えば、特定の時間における発光の絶対的もしくは相対的な強度、又は特定の期間における積算又は平均化された発光の強度である。図２（ａ）及び図２（ｂ）に、発光画像から抽出される発光（相対値）の経時的変化を示すグラフである。図２（ａ）は未分化細胞の経時的プロファイルの例を示し、図２（ｂ）は分化細胞の経時的プロファイルの例を示す。図２（ａ）及び図２（ｂ）に示す発光強度は、ある測定時点とその前後の複数時点（計７点）の発光強度の測定値を平均化した数値を時間に沿ってプロットすることで得られる。
【００３４】
また、発光の変動は、例えば、発光強度の測定値を、発光強度−測定時間の平面にプロットし、各プロットを繋いでできる曲線から見出すことができる。例えば、発光の変動は、そのような曲線の形状、そのような曲線における発光強度のピークの位置等である。また、そのような曲線の少なくとも一部が振動する場合には、その振動に関する情報であり、例えば、その振動の波長もしくは周期、振幅又は波高等である。振動は、発光量の増減の繰り返しを意味する。振動は、連続する２時点の間の発光強度の増減の符号が逆転したときに１回の振動があったとカウントする。ここで、図２（ａ）と図２（ｂ）を比較して分かるように、分化細胞の場合と未分化細胞とでは、未分化細胞の方が発光の振幅の回数が多い。このため、ある一定時間後に細胞が分化しているか否かを発光強度の振幅から判断することができる。このような判断が後で詳しく説明する特徴量の解析で行われる。
【００３５】
特徴量の別の例は、幹細胞の形態に基づく量、すなわち、幹細胞の形態を、任意の判断基準に基づいて数値化したものである。幹細胞の形態に基づく量は、発光画像及び／又は明視野画像から抽出することができる。幹細胞の形態に基づく量の例は、幹細胞のコロニーの厚さ、幹細胞のコロニーの円形度、幹細胞の大きさ及び幹細胞のコロニーの大きさである。
【００３６】
形態に基づく特徴量の一例を図３に示す。この経時的プロファイルは、例えば発光画像の取得と同時に継時的に取得される明視野画像において観察されるコロニーの形状から分化の程度を判断することにより得られるものである。
【００３７】
分化の程度は、例えば図４に示される３つの段階に分類される。図３の形状スコアは、最も未分化な段階であるコンパクトな球形で辺縁がクリアである状態のコロニーをスコア２とし、中程度の分化の段階である厚さが減少し球形が少し崩れ始めた段階のコロニーをスコア１と、最も分化した段階であるまとまりのある形状が崩れ、平坦になったコロニーをスコア０としている。これらの判別は、目視によって行うことができる。勿論、判別のための数値上の指標が設定されることにより、判別が画像解析プログラム等を用いて行われるようにしてもよい。
【００３８】
例えば、ＬＩＦが添加された培地で幹細胞を培養した後でＬＩＦを除去して分化誘導を開始した場合、幹細胞の形態の変化が一方向である。このとき、形状スコアは、図３に示されるように、時間の経過に伴ってスコア２からスコア０まで順次変化する。一方、分化誘導を開始した後でさらに分化阻害剤を添加した場合、形態スコアがスコア０にあった後で再びスコア１に戻る時点が表れる。このように、幹細胞の形態の変化からも、一定時間後の分化状態を同定できる。
【００３９】
抽出された特徴量は解析される。解析の前に、特徴量を数理的に処理することもできる。この処理により、特徴量は解析に適したものに変換される。そのような数理的な処理の例は、特徴量の各々を、その前後に取得された少なくとも１つの特徴量との間の相加平均に変換することである。あるいは、特徴量の各々を、その分散の値に変換することである。
【００４０】
解析は、例えば、幹細胞の状態を判断するために行われる。この判断は、現在の幹細胞の状態を評価することであり、あるいは幹細胞の将来の状態を予測することである。
【００４１】
解析は、公知の手法に基づいて行うことができる。例えば、複数種の特徴量を抽出した場合、解析として、それらの特徴量を多変量解析することができる。多変量解析の例は、判別分析、ロジスティック回帰分析、主成分分析又は因子分析である。判別分析又はロジスティック回帰分析は、線形モデル又は非線形モデルに基づいて行うことができる。あるいは、自己相関係数を変数として行ってもよい。種々の解析を同時に行うこともできる。
【００４２】
また、特徴量の均質性の評価の一例は、マーカー遺伝子の発現量の経時的プロファイルデータを取得し、この発現量の均質性を評価することを含む。この評価に用いる幹細胞又はコロニーは、数十から数百程度個であることが望ましい。また、均質性の評価には、比較対象となる異なる細胞群の経時的プロファイルデータを用いても良い。例えば、幹細胞の継代回数による分化状態への影響について評価を行うために、継代回数の少ない幹細胞株と継代回数の多い幹細胞株においてＮａｎｏｇ遺伝子等の未分化マーカー発現の経時的プロファイルを比較した場合、継代数の少ない細胞ではＮａｎｏｇ発現プロファイルの均質性が高く、継代回数が多くなると均質性が低下する。
【００４３】
また、均質性解析の別として、マーカー遺伝子の発現量以外の、各種の特徴量を用いることができる。さらに、分化マーカー遺伝子の発現量と未分化マーカー遺伝子の発現量との比等、複数のマーカー遺伝子を組み合わせてもよい。
【００４４】
均質性の解析方法は、一例として、データの有意性の解析、等分散の検定、平均値の分散、正規分布のずれの解析、外れ値検定、カイ２乗検定、クラスター分析等の手法を用いることができる。
【００４５】
本実施形態に係る方法によれば、経時的プロファイルから抽出された特徴量に基づいて解析することにより、幹細胞の状態を高い精度で同定することができる。特に、ルシフェラーゼに起因する発光を利用し、励起光の照射が不要であるため、細胞に対するダメージを最小限に抑えられ、数日から数週間にわたる長期的な観察が可能となる。また、発光画像を取得するため、幹細胞ごと及びコロニーごとに状態を同定することができる。したがって、従来の手法と比較して、幹細胞の状態をより高い精度で同定することが可能となる。その結果、分化させた幹細胞の再生医療等への応用を促進することが可能となり、また幹細胞の多能性維持機構、分化機構等の解明を促進することができる。個々の幹細胞又は幹細胞コロニーにおける幹細胞の分化状態が同定できれば、分化させた幹細胞を細胞治療や研究等に用いる場合に、目的に合った幹細胞又は幹細胞コロニー又は分化させた幹細胞を選定、回収し、適宜使用することができる。
【００４６】
さらに、幹細胞又はコロニーの経時的プロファイルから得られる特徴量の均質性の評価をすることで分化状態の均質性を評価することができる。これにより、不均一性の高い幹細胞に対して、従来の各幹細胞、コロニーに着目した解析を行うよりもより精度の高い解析を行うことができる。
【実施例】
【００４７】
＜実施例：未分化マーカーＮａｎｏｇ遺伝子を用いた幹細胞の均質性評価＞
実施形態で説明した方法に基づいて、幹細胞の状態を評価した。転写因子結合領域として、未分化マーカーであるＮａｎｏｇ遺伝子の転写を制御するための転写因子結合領域を使用した。コロニーの均質性評価を行うために、発光画像から、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量の経時的変化を解析した。
【００４８】
（１−１）細胞の作製
未分化マーカーであるＮａｎｏｇ遺伝子のためのプロモーターとその下流に位置するルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸を核内に有する細胞を作製した。その概要としては、転写因子結合領域及びルシフェラーゼ遺伝子並びに薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子導入ベクターを幹細胞に導入し、薬剤耐性遺伝子が安定的に発現するようになった細胞（安定発現細胞）を選択した。詳細を以下に述べる。
【００４９】
Ｎａｎｏｇ遺伝子のためのプロモーターは、既知の文献（T Kuroda et al., Molecular and Cellular Biology 2005 vol.25, No.6, p2475-2485）を参考にクローニングした。具体的には、マウス由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーを使用した。
【００５０】
ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ：  ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡ（配列番号１）  
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ＣＴＡＣＴＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡ（配列番号２）  
一方、ネオマイシン耐性ｐＧＬ４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）におけるルシフェラーゼ遺伝子に対応する核酸断片を、Ｅｌｕｃルシフェラーゼ遺伝子の断片に置き換えた。このベクターに対し、上述のようにクローニングしたＮａｎｏｇ遺伝子のプロモーターに対応する断片を挿入した。このようにして得られた遺伝子導入ベクターを、Ｎａｎｏｇ遺伝子発現特異的発光ベクターｐＮａｎｏｇ−Ｅｌｕｃと称する。
【００５１】
ｐＮａｎｏｇ−Ｅｌｕｃを、マウスＥＳ細胞にトランスフェクションするために、まず、ＥＳ細胞をフィーダー細胞とともに培養した。具体的には、３５ｍｍ径のプラスティックディッシュを０．１％ゼラチンでコーティングし、ＰＢＳにて３回洗浄した。ゼラチンコートを行ったディッシュに、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたＭＥＦ細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏ−ｂｌａｓｔ  マウス胎児線維芽細胞）をフィーダー細胞として撒き、一晩培養を行った。培地には、ＤＭＥＭ（フェノールレッド、１０％ＦＣＳ入り）を用いた。翌日、マウスＥＳ細胞（ＢＲＣ６株、理研ＢＲＣ）を３５ｍｍディッシュ内のフィーダー細胞上に撒き、一晩培養した。
【００５２】
その後、ｐＮａｎｏｇ−Ｅｌｕｃを、マウスＥＳ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬株）を用いて、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ法により行った。培地にＧ４１８を適量添加して、安定的に遺伝子が導入された細胞のみを選択した。
【００５３】
（１−２）細胞の培養
Ｎａｎｏｇ−Ｅｌｕｃを恒常的に発現したマウスＥＳ細胞を、１５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ））及びＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）が添加されたＤＭＥＭ培地にて一晩培養した。その後、細胞を２つに分け、それぞれＬＩＦ及びＨＥＰＥＳが添加されたＤＭＥＭ培地（１５％ＫＳＲ、フェノールレッド抜き）並びにＨＥＰＥＳが添加されたＤＭＥＭ培地（１５％ＫＳＲ、フェノールレッド抜き、ＬＩＦ非添加）に移した。ＬＩＦとしては、製品名ＬＩＦ  Ｈｕｍａｎ，  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ（和光純薬製）を規定濃度で使用した。
【００５４】
（１−３）発光画像の取得
培地に対して、最終濃度５００μＭのＤ−ルシフェリン（プロメガ社製：）を添加した後、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）に設置した。マウスＥＳ細胞を１５分間隔で１２分間ずつ撮像し、対物レンズは×２０の倍率のものを使用し、ｂｉｎｎｉｎｇは１×１とし、ＣＣＤカメラはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社製）を用いた。
【００５５】
Ｎａｎｏｇ発現量を定量するため、ＥＳ細胞コロニーを複数箇所選択し、発光量の数値化を行った。取得された発光画像に対しては、画像解析システムＡＱＵＡＣＯＳＭＯＳ（浜松ホトニクス株式会社製）を用いて数値データを解析し、解析した結果をグラフ化した。ＬＩＦ非存在下で培養した細胞の発光画像から、それぞれ１つのコロニーを含むＲｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ）1〜８１を指定した。図５はＬＩＦ除去後１０時間後のＲＯＩ情報付きの発光画像を、図６はＬＩＦ除去後６０時間後のＲＯＩ情報付きの発光画像を示す。
【００５６】
コロニーの均質性の解析を行うために、ＬＩＦ除去後１０時間後、２０時間後、３０時間後、４０時間後、５０時間後、６０時間後のＮａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム解析を行った。ヒストグラムの解析結果を、図７Ａ〜図７Ｆに示す。図７Ａ〜図７Ｆに示されるように、未分化性を保つ目的で添加されているＬＩＦの除去により、幹細胞が分化しはじめることにより、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量のヒストグラム分布が変化していることが分かる。図７Ａに示すＬＩＦ除去後１０時間後は、ピーク発現量に対する分散の小さい正規分布に近い分布である。したがって、分化状態の均質性は高いと言える。一方、図７Ｅに示すＬＩＦ除去後５０時間後及び図７Ｆに示すＬＩＦ除去後６０時間後では、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量が低下したコロニーが増え、正規分布と異なる分布に変化していく様子が分かる。
【００５７】
ＬＩＦ除去後１０時間後のヒストグラムデータを元に、各時点でのＮａｎｏｇ遺伝子発現量の分布との有意性を検討するために、カイ２乗検定を行った。なお、カイ２乗検定の期待値は、Ｎａｎｏｇ遺伝子発現量の頻度の平均値である。その結果は、ＬＩＦ除去後２０時間後（P＝0.0026）、ＬＩＦ除去後３０時間後（P＝0.1012）、ＬＩＦ除去後４０時間後（P＝0.0204）、ＬＩＦ除去後５０時間後（P＝1.16E-08）、ＬＩＦ除去後６０時間後（P＝1.35E-05）であった。なお、カイ２乗検定の期待値として周辺頻度から計算される各種の期待値を利用することができる。
【００５８】
カイ２乗検定の結果から、ＬＩＦ除去後の経時変化により、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量の分布が変化していることが分かる。ここで、実施例ではコロニーの均質性の評価として各データの有意性解析を行った。これに加えて、等分散の検定、平均値の分散、正規分布のずれの解析を行うことでも検定できる。
【００５９】
また、実施例では、特徴量としてＮａｎｏｇ遺伝子発現量を用いたが、前述の実施形態で説明したような、発光画像、明視野画像の経時的プロファイルから抽出される各種の特徴量を用いることができる。また、均質性の有無については、検定した結果を元に、解析目的に応じて任意に判定基準を設定してよい。さらに、幹細胞の未分化及び分化を評価するためのマーカー遺伝子を複数組み合わせて得られる図８に示されるような解析データから、分化マーカー遺伝子と未分化マーカー遺伝子との特徴量の比のグラフを作成し、この比の均質性を評価することもできる。
【００６０】
この幹細胞又はコロニーの特徴量の均質性の評価は、幹細胞の分化に関わる低分子化合物及び薬剤の評価にも応用できる。細胞の分化に又は未分化に影響する低分子化合物及び薬剤のコントロールとこれらの非添加のコントロールに関し、複数のウェル又はディッシュを同時に観察及び比較する。前述した実施例では、ＬＩＦ除去後の経時的プロファイルを取得するようにしているが、幹細胞の分化に関わる低分子化合物及び薬剤の評価の際には、低分子化合物及び薬剤を添加してからの経時的プロファイルを取得する。低分子化合物及び薬剤の作用時には幹細胞の応答性が異なるので、図９Ａに示されるように分化状態（特徴量）が不均一な分布を示すことが考えられる。しかしながら、時間経過により十分な薬剤応答が見られれば、図９Ｂに示されるように分化状態の均質性が回復すると考えられる。したがって、均質性評価を行うことで、薬剤応答までの作用時間を含めた化合物の特性及び作用機序に関する評価が可能である。また、より有効な低分子化合物及び薬剤であれば、多数のコロニーに対して作用開始から早期の段階で均質に作用することが考えられる。したがって、複数の低分子化合物及び薬剤の作用効果の程度を均質性という指標で比較することで、適切な低分子化合物及び薬剤を選定できる。
【００６１】
また、実施形態で示した手法を用いて幹細胞又はコロニーの特徴量の均質性の評価を行うことで、不均一性の高い幹細胞に対して、従来の各幹細胞、コロニーに着目した解析を行うよりもより精度の高い解析を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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