(57)【要約】【課題】アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬およびＦＳＨ分泌を低減または阻害するための使用の提供。【解決手段】ある態様において、本発明は、患者におけるＦＳＨレベルを低下させるための組成物および方法を提供する。患者は、例えば、ＦＳＨ関連障害と診断され得る、または生殖細胞の成熟の遅延または阻害を所望し得る。ある態様において、本開示は、アクチビンに結合する溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含むポリペプチドを使用してＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。別の態様において、本開示は、ＦＳＨ関連障害を有するヒト対象でのＦＳＨレベルを低下させる方法を提供する。【選択図】図３１
2014031380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／９９４，３９９号の利益を主張し、この米国仮特許出願のすべての教示は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、下垂体によって放出され、生殖腺の機能ならびに配偶子の産生および成熟を調節する。ＦＳＨは、性腺刺激ホルモン放出ホルモンなどの誘発ホルモンの事前放出時に、下垂体によって一般に放出される。
【０００３】
ＦＳＨ放出は、女性の排卵および男性の精子成熟に必要である。女性において、ＦＳＨは、卵巣での卵胞顆粒膜細胞の増殖を刺激して、卵胞の成熟および排卵に不可欠なホルモンであるエストロゲンの合成に影響を及ぼす。男性においては、ＦＳＨは精子細胞の成熟に関与する。さらに詳細には、男性におけるＦＳＨ作用は、ホルモンの認識された標的であり、精子の成熟プロセス（精子形成）を補助するセルトリ細胞に向けられている。ＦＳＨは前立腺においても産生され、前立腺ではＦＳＨが細胞増殖の重要な介在物質である。
【０００４】
したがって、ＦＳＨ放出の阻害薬は男性および女性の両方で避妊薬として有用である。
【０００５】
受胎機能に加えて、ＦＳＨは複数の疾患状態でも役割を果たす。ＦＳＨ受容体のレベルの上昇は前立腺癌と関連しており、最高レベルはホルモン抵抗性前立腺癌と関連している。前立腺癌は米国の男性で最も一般的な癌であり、２３０，０００名を超える新患が毎年診断される。２００４年には、約３０，０００件の死亡が前立腺癌に起因するであろう（非特許文献１）。手術または放射線で治療された個人の約４０％が、再発性前立腺癌を発症するであろう（非特許文献２）。再発性前立腺癌の最も一般的な処置は、睾丸摘出術による睾丸テストステロン産生の抑制、エストロゲン治療、抗アンドロゲン投与、および／またはＧｎＲＨ作用薬／拮抗薬処置である。このことは通常、２〜３年間の寛解を生じるが、その期間の後、前立腺癌は、血中アンドロゲン濃度の去勢レベルまでの低下にもかかわらず前立腺癌が増殖する能力を生じることを意味する、「ホルモン抵抗性」となる。したがって、前立腺癌、特にホルモン抵抗性前立腺癌を治療するための改良された組成物および方法が必要である。
【０００６】
下垂体腫瘍（腺腫）は、腫瘍の詳細な位置に応じて各種のホルモン産生領域に通例影響を及ぼす、非癌性増殖である。下垂体腫瘍は、頭蓋内腫瘍の約１５％を占め、局所圧迫効果、ホルモン過分泌、または処置関連内分泌欠陥による著しい罹患率と関連している（非特許文献３）。下垂体腺腫の大部分は良性であり、比較的進行が遅い。しかし、下垂体腫瘍は、１つ以上の下垂体ホルモンの過剰産生を引き起こすことがある。ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍は、多嚢胞性卵巣の発症およびエストラジオールレベルの上昇を引き起こすことが多い。結果として、エストラジオールレベルの上昇は、子宮内膜癌および前立腺癌を含む健康上のリスクの一因となる。したがって、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍に関連する症状を治療するための改良された組成物および方法が必要である。
【０００７】
したがって、ＦＳＨ分泌を阻害する化合物は多様な処置において有用である。
【０００８】
本開示の目的は、ＦＳＨレベルを低下させるために使用され得る組成物および方法を提供することであり、このような組成物および方法は、例えば、避妊において、および多様なＦＳＨ関連障害の処置に使用され得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ  Ａ、Ｔｉｗａｒｉ  Ｒ  Ｃ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｔ．Ｇｈａｆｏｏｒ  Ａ、Ｓａｍｕｅｌｓ  Ａ、Ｗａｒｄ  Ｅ、Ｆｅｕｅｒ  Ｅ  Ｊ、Ｔｈｕｎ  Ｍ  Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００４。ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．５４：８−２９、２００４
【非特許文献２】Ｗａｌｓｈ  Ｐ  Ｃ、Ｒｅｔｉｋ  Ａ  Ｂ、Ｖａｕｇｈａｎ  Ｅ  Ｄ、編。Ｃａｍｐｂｅｌｌ’ｓ  Ｕｒｏｌｏｇｙ、第７版、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．：ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；１９９８
【非特許文献３】Ｈｅａｎｅｙ  Ａ．Ｐ．ら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、編者：Ｗａｓｓ  Ｊ．Ａ．Ｈ．およびＳｈａｌｅｔ  Ｓ．Ｍ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００２（近刊）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、一部は、ＦＳＨ分泌を低減または阻害するための、アクチビン拮抗薬はもちろんのこと、ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の使用に関する。特に、本開示は、アクチビンの阻害薬として作用するＡｃｔＲＩＩａの溶解形を使用してＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。溶解性ＡｃｔＲＩＩａは、アクチビン拮抗作用以外の機序によってＦＳＨ分泌に影響を及ぼし得るが、所望の治療剤はそれにもかかわらず、アクチビン拮抗作用もしくはＡｃｔＲＩＩａ拮抗作用または両方に基づいて選択され得る。このような薬剤は集合的に、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬と呼ばれる。したがって、ある実施形態において、本開示は、たとえばアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、抗アクチビン抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、アクチビン−またはＡｃｔＲＩＩａ−標的小型細胞およびアパタマー、ならびにアクチビンおよびＡｃｔＲＩＩａの発現を低下させる核酸を含むアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を使用して、その必要がある患者におけるＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。参照により本明細書に組み込まれている米国特許公報番号：２００７／０２４９０２２に記載されているように、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を使用して骨増殖を促進し、骨密度を上昇させることができる。本明細書に記載するように、このような拮抗薬を使用してＦＳＨ分泌を低減または阻害することもできる。
【００１１】
ある態様において、本開示は、アクチビンに結合する溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含むポリペプチドを使用してＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよび製薬的に許容される担体を含む製薬調製物として製剤され得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、アクチビンに１マイクロモル未満または１００、１０または１ナノモル未満のＫＤで結合し得る。場合により、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対してアクチビンを、場合によりＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対してよりもアクチビンに対して少なくとも１０倍、２０倍、または５０倍低いＫＤで選択的に結合する。特定の作用機序に縛られたくはないが、ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８阻害を超えるアクチビン阻害に対するこの程度の選択性は、筋肉に対する一貫して測定可能な効果を伴わないＦＳＨ分泌に対する効果の原因であることが予想される。多くの実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＦＳＨ分泌に対する所望の効果を達成する用量にて、１５％未満の、１０％未満の、または５％未満の筋肉の増加を引き起こすために選択されるであろう。組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによって評価されるように、他のポリペプチド成分に関して、少なくとも９５％純粋であり得、場合により、組成物は少なくとも９８％純粋である。このような調製で使用するためのアクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、配列番号２、３、７もしくは１２から選択されるアミノ酸配列を有する、または配列番号２、３、７、１２または１３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの、本明細書で開示されるポリペプチドのいずれであってもよい。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、配列番号１〜３から選択される配列またはＣ末端１０〜１５アミノ酸（「尾部」）が欠失した配列番号２の配列の少なくとも１０、２０または３０アミノ酸を含む断片などの、天然ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能性断片を含み得る。
【００１２】
ある態様において、本開示は、ＦＳＨ関連障害を有するヒト対象でのＦＳＨレベルを低下させる方法を提供する。このような方法は、対象におけるＦＳＨ活性を低下させるのに有効な量のＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質を対象に投与するステップを含み得る。ある態様において、本開示は、その生殖細胞の成熟を遅延または阻害したい患者でのＦＳＨレベルを低下させる方法を提供する。このような方法は、対象におけるＦＳＨ活性を低下させるのに有効な量のＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質を投与するステップを含み得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３または配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３または配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列をそれぞれ含む２個のポリペプチドで形成されたダイマーであり得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、３個以上のシアル酸部分、特に３個、４個または５個のシアル酸部分を含み得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質はＣＨＯ細胞中で産生され得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有し得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇの患者における血清濃度に達するように、好ましくは０．３〜３ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ血清濃度に達するように投与され得る。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、１５〜３０日の血清半減期を有することがあり、例えば、週１回、月１回、または年１回を超えない頻度で対象に投与され得る。ある実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、静脈内または皮下投与したときに、正常で健常なヒトで平均２５〜３２日の血清半減期と、同等の生物学的利用能を有する。ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、静脈内または皮下投与され得る。
【００１３】
溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、天然型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと比較してアミノ酸配列に（例えば、リガンド結合ドメインに）１つ以上の改変を含み得る。改変ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの例は、本明細書に組み込まれているＷＯ  ２００６／０１２６２７、ｐｐ．５９−６０に記載されている。アミノ酸配列の改変は例えば、哺乳動物、昆虫もしくは他の真核細胞で産生されたときにポリペプチドのグリコシル化を変化させ、または天然型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと比較してポリペプチドのタンパク質分解的切断を変化させ得る。
【００１４】
アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、１つのドメインとしてのＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩａのリガンド結合部分）と、改良された薬物動態、より容易な精製、特定の組織への標的化などの所望の特性を与える１つ以上のさらなるドメインとを有する、融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、インビボ安定性、インビボ半減期、摂取／投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質のマルチマー化、および／または精製の１つ以上を向上させ得る。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型またはミュータント）または血清アルブミンまたは改良された薬物動態、改良された溶解性もしくは改良された安定性などの所望の特性を与える他のポリペプチド部分を含み得る。好ましい実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合は、Ｆｃドメインと細胞外ＡｃｔＲＩＩａドメインとの間に位置する比較的構造化されていないリンカーを含む。この非構造化リンカーは、ＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインのＣ末端（「尾部」）におけるおおよそ１５アミノ酸の非構造化領域に対応し得るか、または１、２、３、４、または５アミノ酸の人工配列もしくは２次構造を比較的含まない５〜１５、２０、３０、５０またはそれ以上のアミノ酸長、もしくはその両方の混合物であり得る。リンカーはグリシンおよびプロリン残基が豊富な場合があり、ならびに、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの単一配列またはトレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列（例えば、ＴＧ４（配列番号１５）またはＳＧ４（配列番号１６）単一または反復）を含有し得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合などの精製サブ配列を含み得る。場合により、溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは：グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合したアミノ酸、および有機誘導体化剤に結合したアミノ酸から選択される１つ以上の修飾アミノ酸残基を含む。好ましくは、製薬調製物は発熱物質を実質的に含まない。一般に、患者における好ましくない免疫応答の可能性を低減するためにＡｃｔＲＩＩａタンパク質の好適な天然グリコシル化を仲介する哺乳動物細胞株にて、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質が発現されることが好ましい。ヒトおよびＣＨＯ細胞株は良好に使用されており、他の一般的な哺乳動物発現系も有用であろうことが予想される。
【００１５】
本明細書に記載するように、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃと呼ばれるＡｃｔＲＩＩａタンパク質（ＡｃｔＲＩＩａ部分とＦｃ部分との間に最小リンカーを持つ形）は、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１と比較したアクチビンに対する選択的結合、高親和性リガンド結合ならびに動物モデルにおける２週間を超える血清半減期を含む、所望の特性を有する。ある実施形態において、本発明は、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃポリペプチドを使用してＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法ならびにかかるポリペプチドおよび製薬的に許容される賦形剤を含む製薬調製物を提供する。
【００１６】
ある態様において、本開示は、溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする核酸を使用してＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。単離ポリヌクレオチドは、上述のような、溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのコード配列を含み得る。例えば、単離核酸は、ＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）をコードする配列と、ＡｃｔＲＩＩａの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインの一部または全部をコードするが、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメイン内に位置する、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間に位置する停止コドンはコードしない配列とを含み得る。例えば、単離ポリヌクレオチドは、配列番号４もしくは５などの全長ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチド配列、または部分切断形を含むことがあり、前記単離ポリヌクレオチドは、３’末端の少なくとも６００ヌクレオチド前に、またはそうでなければポリヌクレオチドの翻訳によって全長ＡｃｔＲＩＩａの切断部分に場合により融合した細胞外ドメインが生じるように位置した、転写終止コドンをさらに含む。好ましい核酸配列は、配列番号１４である。本明細書に記載する方法に従って有用な核酸は、発現のためにプロモーターに操作可能に連結されることがあり、本開示はこのような組換えポリヌクレオチドによって形質転換された細胞を提供する。好ましくは、細胞はＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。
【００１７】
本開示は、ＦＳＨ分泌を低減または阻害するために使用できる溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを作製する方法も提供する。このような方法は、本明細書で開示する核酸（例えば、配列番号４、５または１４）のいずれかを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの好適な細胞で発現させることを含み得る。このような方法は：ａ）溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの発現に好適な条件下で細胞を培養するステップであって、前記細胞は溶解性ＡｃｔＲＩＩａ発現構築物によって形質転換される、ステップ；およびｂ）このように発現された溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを回収するステップ；を含み得る。溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、粗、部分精製または高度精製画分として回収され得る。精製は、例えば、以下：タンパク質Ａクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑセファロース）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース）、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの１個、２個もしくは３個またはそれ以上を任意の順序で含む、一連の精製ステップによって達成され得る。
【００１８】
ある態様において、溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドなどの、本明細書で開示するアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、例えば、前立腺癌の発症を遅延させる方法、前立腺の進行を阻害する方法、腫瘍サイズを縮小する方法、腫瘍増殖を予防する方法、転移の発症を遅延させる方法または転移を予防する方法を含む、対象におけるＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法で使用され得る。ある実施形態において、開示は、その必要がある患者における前立腺癌細胞の増殖または生存を低減または阻害する方法を提供する。方法は、有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬をその必要がある対象に投与するステップを含み得る。ある態様において、本開示は、本明細書で開示するような前立腺癌の処置または予防用の薬剤を作製するための、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の使用を提供する。本開示は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬ならびに放射線療法、化学療法（例えば、細胞毒性剤）、および／または内分泌療法を含む併用療法にも関する。拮抗薬はＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質であってもよく、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号３、６、７、または１３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、１つ以上の前立腺癌リスク因子を持つ患者において前立腺癌の発症を予防または遅延する方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、原発性前立腺腫瘍または前立腺の増殖性病変とすでに診断された患者において、転移性疾患の発症を予防または遅延する方法に関する。ヒト患者において前立腺癌の発症を予防または遅延する方法は、その必要があるヒト患者に：ａ）配列番号２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｂ）配列番号３に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｃ）配列番号２から選択される少なくとも５０の連続アミノ酸を含むポリペプチド；から成る群より選択されるポリペプチドの有効量を投与するステップを含み得る。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、ヒト前立腺癌患者において、アクチビン仲介シグナル伝達を阻害する方法に関する。ある実施形態において、該方法は、ヒト患者に有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を投与するステップを含む。さらなる実施形態において、拮抗薬は：ａ）配列番号２に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ｂ）配列番号３に少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｃ）配列番号２から選択される少なくとも５０の連続アミノ酸を含むポリペプチド；から成る群より選択されるポリペプチドである。
【００２１】
ある実施形態において、ＦＳＨ分泌の低減または阻害によって、受精能力の低下を引き起こす。女性において、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩ拮抗薬の投与は、卵胞顆粒膜細胞の増殖を制限する。男性において、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩ拮抗薬の投与は、精子成熟を阻害する。ある態様において、本開示は、避妊のための方法および組成物を提供する。ある実施形態において、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩ拮抗薬およびプロゲスチン、プロゲステロン、およびエストロゲンなどの１つ以上の経口避妊剤を含む組成物が提供される。
【００２２】
ある実施形態において、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍に罹患した患者において、ＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法が提供される；該方法は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩ拮抗薬を投与するステップを含む。
【００２３】
ある態様において、本開示は、癌細胞（例えば、前立腺癌細胞）の増殖または生存を阻害する薬剤を同定する方法を提供する。該方法は：ａ）アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合する試験薬剤を同定するステップ；およびｂ）癌細胞の増殖、生存、またはアポトーシスに対する効果を評価するステップ；を含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＦＳＨ関連障害を有するヒト対象におけるＦＳＨレベルを低下させる方法であって、該対象におけるＦＳＨ活性を低下させるのに有効な量のＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質を該対象に投与するステップを含み、該ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質の投与が、前記障害の少なくとも１つの症状を軽減または低減する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、それぞれ配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む２個のポリペプチドで形成されたダイマーである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が３個以上のシアル酸部分を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質がＣＨＯ細胞での発現によって産生される、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が３〜５個のシアル酸部分を含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、前記患者において少なくとも０．３ｍｇ／ｋｇの血清濃度に達するように投与される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が１５〜３０日の血清半減期を有する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が週１回を超えない頻度で前記対象に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が月１回を超えない頻度で前記対象に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、静脈内投与または皮下投与された場合に、正常で健常なヒトでの平均２５〜３２日の血清半減期と、同等の生物学的利用能とを有する、項目６に記載の方法。
（項目１６）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、ダイマー当り４個のシアル酸部分を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が皮下投与される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記方法が前記対象の骨格筋量の１０％未満の増加を引き起こす、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
放射線療法、内分泌療法または細胞毒性剤を前記ヒト対象に投与するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記ＦＳＨ関連疾患が前立腺癌であり、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の投与が前立腺癌の発症を遅延させ、前立腺癌の進行を阻害し、転移の発症を遅延させ、または腫瘍サイズを縮小させる、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記前立腺癌がホルモン抵抗性前立腺癌である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記ＦＳＨ関連疾患がＦＳＨ分泌下垂体腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記対象が１つ以上の卵巣嚢腫に罹患した女性であり、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の投与が嚢腫サイズを縮小させ、嚢腫の成長を阻害し、または新しい嚢腫の形成を阻害する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
生殖細胞の成熟を遅延または阻害を所望する患者においてＦＳＨ産生を阻害する方法であって、該対象においてＦＳＨ活性を低下させるのに有効な量のＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質を該対象に投与するステップを含み、該ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２５）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、それぞれ配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む２つのポリペプチドで形成されたダイマーである、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記ダイマーの各ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が３個以上のシアル酸部分を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質がＣＨＯ細胞での発現によって産生される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が３〜５個のシアル酸部分を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を有する、項目２４に記載の方法。
（項目３４）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、静脈内投与または皮下投与したときに、正常で健常なヒトでの平均２５〜３２日の血清半減期と、同等の生物学的利用能とを有する、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質が、ダイマー当り４個のシアル酸部分を有する、項目３４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＣＨＯ細胞で発現したＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの精製を示す。タンパク質は、単一の明確なピークとして精製する。
【図２】ＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）アッセイによって測定したような、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃのアクチビンおよびＧＤＦ−１１への結合を示す。
【図３】Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイの概略図を示す。該図は、レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を示す（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８、ＥＭＢＯ  １７：３０９１−３１００に記載されている）。該ＣＡＧＡ１２モチーフはＴＧＦ−β応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在するため、このベクターは一般に、Ｓｍａｄ  ２および３を通じてシグナル伝達する因子にとって有用である。
【図４】Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおけるＧＤＦ−８シグナル伝達に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ（ひし形）およびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（正方形）の効果を示す。どちらのタンパク質も、ピコモル濃度でＧＤＦ−８仲介シグナル伝達の実質的な阻害を示した。
【図５】Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイにおけるＧＤＦ−１１シグナル伝達に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの３つの異なる調製物の効果を示す。
【図６】１２週間処置期間の前（上パネル）および後（下パネル）の、対照およびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置ＢＡＬＢ／ｃマウスのＤＥＸＡ画像の例を示す。より薄い陰影が骨密度の上昇を示す。
【図７】１２週期間に及ぶ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける骨ミネラル密度に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの効果の定量化を示す。処置は、対照（ひし形）、２ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ投薬（正方形）、６ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ投薬（三角形）および１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ投薬（丸）であった。
【図８】１２週期間に及ぶ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける骨ミネラル含有量に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの効果の定量化を示す。処置は、対照（ひし形）、２ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ投薬（正方形）、６ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦの投薬（三角形）および１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ投薬（丸）であった。
【図９】６週期間後の卵巣切除（ＯＶＸ）または偽手術（ＳＨＡＭ）Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける骨梁の骨ミネラル密度に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの効果の定量化を示す。処置は、対照（ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＡｃｔＲＩＩａ）投薬であった。
【図１０】１２週期間に及ぶ卵巣切除（ＯＶＸ）Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける骨梁に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの効果の定量化を示す。処置は、対照（ＰＢＳ；淡色棒）または１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＡｃｔＲＩＩａ；暗色棒）投薬であった。
【図１１】６週または１２週の処置期間後の偽手術Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける骨梁に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの効果の定量化を示す。処置は、対照（ＰＢＳ；淡色棒）または１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＡｃｔＲＩＩａ；暗色棒）投薬であった。
【図１２】１２週間の処置での卵巣切除マウスにおける骨密度のｐＱＣＴ解析の結果を示す。処置は、対照（ＰＢＳ；淡色棒）またはＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（暗色棒）。ｙ軸：ｍｇ／ｃｃｍ
【図１３】１２週間の処置での偽手術マウスにおける骨密度のｐＱＣＴ解析の結果を表す。処置は、対照（ＰＢＳ；淡色棒）またはＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（暗色棒）。ｙ軸；ｍｇ／ｃｃｍ
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、１２週間の処置後の全身ＤＥＸＡ解析（Ａ）および大腿骨のエクスビボ解析（Ｂ）を示す。淡色範囲は高骨密度範囲を表す。
【図１５】１２週の処置後の大腿骨中間骨幹のエクスビボｐＱＣＴ解析を示す。処置は、ビヒクル対照（ＰＢＳ、暗色棒）およびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（淡色棒）であった。左側の４本の棒は総骨密度を示すが、右側の４本の棒は皮質骨密度を示す。４本の棒の各組で、最初の組は卵巣切除マウスからのデータを表すが、２つ目の組は偽手術マウスからのデータを表す。
【図１６】１２週の処置後の大腿骨中間骨幹のエクスビボｐＱＣＴ解析および骨幹骨含有量を示す。処置は、ビヒクル対照（ＰＢＳ、暗色棒）またはＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（淡色棒）であった。左側の４本の棒は総骨含有量を示すが、右側の４本の棒は皮質骨含有量を示す。４本の棒の各組で、最初の組は卵巣切除マウスからのデータを表すが、２つ目の組は偽手術マウスからのデータを表す。
【図１７】大腿骨中間骨幹および大腿骨皮質幅のエクスビボｐＱＣＴ解析を示す。処置は、対照（ＰＢＳ、暗色棒）およびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（淡色棒）であった。左側の４本の棒は骨内膜周囲を示すが、右側の４本の棒は骨膜周囲を示す。４本の棒の各組で、最初の組は卵巣切除マウスからのデータを表すが、２つ目の組は偽手術マウスからのデータを表す。
【図１８】処置１２週間後の大腿骨の機械的試験の結果を表す。処置は、対照（ＰＢＳ、暗色棒）およびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（淡色棒）であった。左側の２本の棒は卵巣切除マウスからのデータを表すが、最後の２本の棒は偽手術マウスからのデータを表す。
【図１９】骨梁量に対するＡｃｔｒＩＩａ−ｍＦｃの効果を示す。
【図２０】大腿遠位の骨梁構造に対するＡｃｔｒＩＩａ−ｍＦｃの効果を示す。
【図２１】皮質骨に対するＡｃｔｒＩＩａ−ｍＦｃの効果を示す。
【図２２】骨の機械的強度に対するＡｃｔｒＩＩａ−ｍＦｃの効果を示す。
【図２３】３つの異なる投薬量での骨特徴に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの３つの異なる用量の効果を示す。
【図２４】ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃが二元的な同化および再吸収抑制活性を有することを示す骨組織形態計測を示す。
【図２５】さらなる組織形態計測データを示す。
【図２６】未処置および腫瘍保持マウスのマウス大腿骨の画像、および多発性骨髄腫モデルにおける骨形態に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置の効果を示す。多発性骨髄腫腫瘍を保持するマウス（５Ｔ２）は、正常マウス（未処置）と比較して骨に顕著な孔や分解を示す。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによる処置は、この影響を排除する。
【図２７】ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃが静脈内（ＩＶ）投与あるいは皮下（ＳＣ）投与されるかにかかわらず、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの曲線下面積（ＡＵＣ）および投与用量が直線相関を有する、実施例６に記載したヒト臨床試験による結果を示す。
【図２８】ＩＶまたはＳＣ投与された患者におけるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの血清レベルの比較を示す。
【図２９】ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの異なる用量レベルに応じた骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）レベルを示す。ＢＡＰは、同化骨増殖のマーカーである。
【図３０】マウスにおけるＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＲＡＰ−０１１）およびビスホスホネート剤（ゾレドロナート）の共同効果を示す。
【図３１】ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃが時間および用量依存的方式でＦＳＨレベルを低下させることを示す、実施例６に記載したヒト臨床試験による結果を示す。
【図３２】ＦＳＨレベルに各種の程度の効果を及ぼすＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの用量についてのＡＵＣ解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．概要
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通の配列要素および構造モチーフを共有する各種の成長因子を含有する。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方で非常に多様な細胞タイプに対して生物学的効果を及ぼすことが公知である。スーパーファミリーのメンバーは、胚発生中にパターン形成および組織特異化において重要な機能を果たし、脂肪生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生、および上皮細胞分化を含む各種の分化プロセスに影響を及ぼすことができる。ファミリーは、２つの一般的な種類：ＢＭＰ／ＧＤＦおよびＴＧＦ−β／アクチビンという種類に分けられ、そのメンバーは多様で、しばしば相補的な効果を有する。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、生物に著しい生理学的変化を引き起こせることが多い。例えばピエモンテおよびベルジアンブルーウシ種は、筋肉量に著しい増加を生じる、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子における機能喪失突然変異を持つ。Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９７、１７（１）：７１−４。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性型対立遺伝子が筋肉量の増加、および報告によれば、並外れた力に関連している。Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４、３５０：２６８２−８。
【００２６】
アクチビンは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するダイマーポリペプチド成長因子である。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ／ヘテロダイマー（それぞれβＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である３つの主要なアクチビン形（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）がある。ヒトゲノムは、主に肝臓で発現されるアクチビンＣおよびアクチビンＥもコードして、βＣまたはβＥを含有するヘテロダイマー形も公知である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤細胞でのホルモン産生を刺激して、神経細胞の生存を補助し、細胞タイプに応じて細胞周期の進行にプラスまたはマイナスの影響を及ぼし、少なくとも両生類胚で中胚葉分化を誘発することができる、独自で多機能性の因子である（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８：５００−５１２；Ｄｙｓｏｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７：８１−８４；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：９５３−９６３）。複数の組織において、アクチビンシグナル伝達は、その関連するヘテロダイマーのインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出中に、アクチビンはＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンはＦＳＨの分泌および合成を予防する。アクチビンの生物活性を調節および／またはアクチビンに結合し得る他のタンパク質は、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）およびα２−マクログロブリンを含む。
【００２７】
ＴＧＦ−βシグナルは、リガンド刺激時に下流のＳｍａｄタンパク質をホスホリル化および活性化する、Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって仲介される（Ｍａｓｓａｇｕe、２０００、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ  Ｂｉｏｌ．１：１６９−１７８）。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチ領域を備えたリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／トレオニン特異性を備えた細胞質ドメインで構成された、膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に不可欠である；ならびにＩＩ型受容体は、リガンドを結合するのに、およびＩ型受容体の発現に必要である。ＩおよびＩＩ型アクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のホスホリル化を引き起こす。
【００２８】
２つの関連するＩＩ型受容体、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂは、アクチビンのＩＩ型受容体として同定されている（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ、１９９１、Ｃｅｌｌ  ６５：９７３−９８２；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２、Ｃｅｌｌ  ６８：９７−１０８）。アクチビンに加えて、ＡｃｔＲＩＩａおよびＡｃｔＲＩＩｂは、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を含む、複数の他のＴＧＦ−βファミリータンパク質と生化学的に相互作用する（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３０：２１７−２２６；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：９３０６−９３１１；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ、２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ７：９４９−９５７；Ｏｈら、２００２、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２７４９−５４）。ＡＬＫ４は、アクチビン、特にアクチビンＡの主なＩ型受容体であり、ＡＬＫ−７は、同様にアクチビン、特にアクチビンＢの受容体として作用し得る。
【００２９】
本明細書に記載するように、溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（ｓＡｃｔＲＩＩａ）は、ＧＤＦ８またはＧＤＦ１１などの他のＴＧＦ−βファミリーメンバーとは対照的に、アクチビンＡに対して実質的に優先的な結合を示し、ＦＳＨ分泌を低減または阻害するために使用され得る。いずれの特定の機序にも縛られたくはないが、これらの研究で使用した特定のｓＡｃｔＲＩＩａ構築物によって示された非常に強力なアクチビン結合（ピコモルの解離定数）を考えると、ｓＡｃｔＲＩＩａの効果は、主にアクチビン阻害薬の効果によって引き起こされることが予想される。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は例えば、アクチビン結合溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、アクチビン（特にアクチビンＡまたはＢサブユニット、βＡまたはβＢとも呼ばれる）に結合して、ＡｃｔＲＩＩａ結合を破壊する抗体、ＡｃｔＲＩＩａに結合して、アクチビン結合を破壊する抗体、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａ結合のために選択された非抗体タンパク質（このようなタンパク質の例ならびにその設計および選択の方法については、例えば、ＷＯ／２００２／０８８１７１、ＷＯ／２００６／０５５６８９、およびＷＯ／２００２／０３２９２５を参照）、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａ結合のために選択された、しばしばＦｃドメインに結合したランダム化ペプチドを含む。アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａ結合活性を備えた２つの異なるタンパク質（または他の部分）、特に、Ｉ型（例えば、溶解性Ｉ型アクチビン受容体）およびＩＩ型（例えば、溶解性ＩＩ型アクチビン受容体）結合部位をそれぞれ遮断するアクチビンバインダーは、共に結合されて２官能性結合分子を生成し得る。核酸アプタマー、小型分子および他の薬剤は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａシグナル伝達軸を阻害する。インヒビンはすべての組織でアクチビンを普遍的に拮抗するわけではないが、インヒビン（例えば、インヒビンαサブユニット）、フォリスタチン（例えば、フォリスタチン−２８８およびフォリスタチン−３１５）、ＦＳＲＰ、アクチビンＣ、α（２）−マクログロブリン、およびＭ１０８Ａ（１０８位でのメチオニン→アラニン変化）ミュータントアクチビンＡを含む、各種のタンパク質がアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬活性を有する。一般に、別の形のアクチビン、特にＩ型受容体結合ドメインに改変のあるアクチビンは、ＩＩ型受容体に結合可能であり、活性三元複合体を形成できないため、拮抗薬として作用する。さらに、アクチビンＡ、Ｂ、ＣもしくはＥ、または特にＡｃｔＲＩＩａの発現を阻害するアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡまたはリボザイムなどの核酸は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬として使用できる。使用されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、ＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーと比較して、特にＧＤＦ８およびＧＤＦ１１に関して、アクチビン仲介シグナル伝達を阻害するための選択性を示し得る。溶解性ＡｃｔＲＩＩｂタンパク質はアクチビンに結合するが、野生型タンパク質は、ＧＤＦ８／１１と比較したアクチビンへの結合において著しい選択性を示していない。それにもかかわらず、このようなＡｃｔＲＩＩｂポリペプチドは、異なる結合特性を備えたＡｃｔＲＩＩｂの改変形（参照により本明細書に組み込まれている、例えば、ＷＯ  ２００６／０１２６２７、ｐｐ．５５−５９を参照）と同様に、癌細胞に所望の効果を達成し得る。未処置または改変ＡｃｔＲＩＩｂは、第２のアクチビン選択性結合剤と結合することによって、アクチビンに対するさらなる特異性を与えることができる。
【００３０】
本明細書で使用する用語は一般に、当分野における、本発明の文脈内での、および各用語が使用される特定の文脈におけるその通常の意味を有する。ある用語は、本発明の組成物および方法ならびにそれらの作製および使用方法を説明する際に実施者に対してさらなる指導を与えるために、明細書の以下または別の箇所で述べられる。用語のいずれの使用の範囲または意味も、用語が使用される特定の文脈から明らかとなるであろう。
【００３１】
「約（Ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、測定値の性質および精確度を考えて、測定した量について許容される誤差の程度を一般に意味する。通例、例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、およびさらに好ましくは５％以内である。
【００３２】
または、および特に生物系において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、所与の値の１桁以内の、好ましくは５倍以内の、およびさらに好ましくは２倍以内の平均値であり得る。本明細書で与える数量は別途示さない限りおおよそであり、明示的に示されないときには、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語が推測できる。
【００３３】
本発明の方法は、１つ以上のミュータント（配列変異体）に対する野生型配列を含めて、配列を相互に比較するステップを含み得る。このような比較は通例、例えば当分野で周知である配列アラインメントプログラムおよび／またはアルゴリズム（例えば２、３例を挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用した、ポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、このような配列アラインメントにおいて、突然変異が残基の挿入または欠失を含有する場合に、配列アライメントによって、挿入または欠失残基を含有していないポリマー配列に「ギャップ」（通例、ダッシュ、または「Ａ」によって表される）が導入されることをただちに認識できる。
【００３４】
「相同の」は、その文法形およびスペル別形のすべてにおいて、異なる生物種の相同タンパク質と同様に、同じ生物種のスーパーファミリーによるタンパク質も含む「共通の進化上の起源」を所有する、２つのタンパク質間の関係を指す。このようなタンパク質（およびそのコード核酸）は、同一性パーセントによるか、または特異的残基もしくはモチーフおよび保存位置の存在によるかにはかかわらず、その配列類似性によって反映されるような配列相同性を有する。
【００３５】
「配列類似性」という用語は、そのすべての文法形において、共通の進化上の起源を共有し得るまたは共有し得ない核酸またはアミノ酸配列間での同一性または一致の程度を指す。
【００３６】
しかし、一般的な用法および本出願において、「相同の」という用語は、「高度に」などの副詞で修飾されるときに、配列類似性を指すことがあり、共通の進化上の起源に関連することもまたはしないこともある。
【００３７】
「前立腺癌」という用語は、例えば良性病変、前悪性および悪性病変、固形腫瘍、ならびに転移性疾患（局所転移性、例えばＩＩＩ期、およびより広範な転移性、例えばＩＶ期の両方）を含む、前立腺の任意の増殖性病変または増殖性異常を指す。前立腺癌は、ホルモン感受性癌およびホルモン非依存性癌の両方を含む。ホルモン抵抗性前立腺癌は、抗ホルモン（特に抗エストロゲン）療法による処置に対して不応性である。
【００３８】
２．ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド
ある態様において、本発明は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに関する。本明細書で使用するように、「ＡｃｔＲＩＩａ」という用語は、突然変異誘発または他の修飾による、このようなＡｃｔＲＩＩａタンパク質に由来する任意の種および変異体からのアクチビン受容体ＩＩａ型（ＡｃｔＲＩＩａ）タンパク質のファミリーを指す。本明細書でのＡｃｔＲＩＩａへの言及は、現在同定されている形のいずれか１つへの言及と理解される。ＡｃｔＲＩＩａファミリーのメンバーは一般に、システインリッチ領域を備えたリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されたセリン／トレオニンキナーゼ活性を備えた細胞質ドメインで構成された、膜貫通タンパク質である。
【００３９】
「ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩａファミリーメンバーの任意の天然型ポリペプチドはもちろんのこと、有用な活性を有するその任意の変異体（ミュータント、断片、融合、およびペプチドミメティック形を含む）を含むポリペプチドを含む。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの配列に少なくとも８０％同一である配列、および好ましくは８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上の同一性を有する任意の公知のＡｃｔＲＩＩａの配列に由来するポリペプチドを含む。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質もしく／またはアクチビンに結合し得る、またはその機能を阻害し得る。好ましくは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、下垂体細胞を使用して実施されるインビボまたはインビトロアッセイでＦＳＨレベルを低下させる。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの例は、ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体、ポリペプチド（配列番号１）および溶解性ヒトＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（例えば配列番号２、３、７および１２）を含む。
【００４０】
ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質配列は、次の通りである：
【００４１】
【化１】
2014031380.tif 000003
シグナルペプチドには１本下線が付いている；細胞外ドメインは太字であり、潜在的なＮ結合グリコシル化部位は２本下線が付いている。
【００４２】
ヒトＡｃｔＲＩＩａ溶解性（細胞外）、処理ペプチド配列は、次の通りである：
【００４３】
【化２】
2014031380.tif 000004
細胞外ドメインのＣ末端「尾部」には下線が付いている。「尾部」が欠失した配列（Δ１５配列）は、次の通りである：
【００４４】
【化３】
2014031380.tif 000005
ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、次の通りである（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ  ＮＭ＿００１６１６のヌクレオチド１６４−１７０５）：
【００４５】
【化４】
2014031380.tif 000006
【００４６】
【化５】
2014031380.tif 000007
ヒトＡｃｔＲＩＩａ溶解性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列は、次の通りである：
【００４７】
【化６】
2014031380.tif 000008
詳細な実施形態において、本発明は、溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよびＦＳＨレベルを低下させることでのその使用に関する。本明細書に記載するように、「溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド」という用語は、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを一般に指す。「溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド」という用語は、本明細書で使用するように、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質の任意の天然型細胞外ドメインはもちろんのこと、その任意の変異体（ミュータント、断片およびペプチドミメティック形を含む）も含む。アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、アクチビン、特にアクチビンＡＡ、ＡＢまたはＢＢに結合する能力を保持するポリペプチドである。好ましくは、アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、１ｎＭ以下の解離定数でアクチビンＡＡに結合するであろう。ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を下に示す。ＡｃｔＲＩＩａタンパク質の細胞外ドメインは、アクチビンに結合して、一般に溶解性であり、それゆえ溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと呼ぶことができる。溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの例は、配列番号２、３、７、１２および１３で示す溶解性ポリペプチドを含む。配列番号７は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃと呼ばれ、実施例でさらに説明する。溶解性アクチビン結合ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質の細胞外ドメインに加えてシグナル配列、例えば、ミツバチメリチンリーダー配列（配列番号８）、組織プラミノゲンアクチベータ（ＴＰＡ）リーダー（配列番号９）または未処置ＡｃｔＲＩＩａリーダー（配列番号１０）を含む。配列番号１３で示されるＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃポリペプチドは、ＴＰＡリーダーを使用する。
【００４８】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能活性断片は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え産生されたポリペプチドをスクリーニングすることによって得られる。さらに、断片は、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学反応などの当分野で公知の技法を使用して化学的に合成できる。断片を（組換えまたは化学合成による）産生して、ＡｃｔＲＩＩタンパク質またはアクチビンが仲介するシグナル伝達の拮抗薬（阻害薬）として機能することができるこれらのペプチジル断片を同定するために試験を行うことができる。
【００４９】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能活性変異体は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする核酸の対応する突然変異誘発された断片から組換え産生された修飾ポリペプチドのライブラリをスクリーニングすることによって得られる。変異体を産生して、ＡｃｔＲＩＩタンパク質またはアクチビンが仲介するシグナル伝達の拮抗薬（阻害薬）として機能できるものを同定するために試験を行うことができる。ある実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能性変異体は、配列番号２または３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある場合において、機能性変異体は、配列番号２または３から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５０】
機能性変異体は、治療有効性、または安定性（例えばエクスビボ貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する耐性）の向上などの目的で、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの構造を修飾することによって生成され得る。このような修飾ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、アクチビン結合を保持するように選択されたときに、天然型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能性同等物と見なされる。修飾ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によっても産生できる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンによる、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による、トレオニンのセリンによる単独置換、あるいはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸（例えば、保存的突然変異）による同様の置換が、得られた分子の生物活性に大きな影響を持たないことを予測するのは合理的である。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能性ホモログで発生するか否かは、変異体ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドが野生型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと同様の方法で細胞中にて応答を発生する能力を評価することによって、ただちに判定できる。
【００５１】
ある実施形態において、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を改変するためにＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの特異的突然変異を検討する。このような突然変異は、Ｏ結合またはＮ結合グリコシル部位などの１つ以上のグリコシル部位を導入または除去するために選択され得る。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、トリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−トレオニン（またはアスパラギン−Ｘ−セリン）（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を一般に含み、これは適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識される。改変は、（Ｏ連結グリコシル化部位について）野生型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、あるいは置換によっても実施されうる。グリコシル化認識部位の第１または第３アミノ酸位置の一方または両方における多様なアミノ酸置換または欠失（および／または第２位置におけるアミノ酸欠失）によって、修飾トリペプチド配列において非グリコシル化が生じる。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの炭化水素部分の数を増加する別の手段は、グリコシドのＡｃｔＲＩＩａポリペプチドへの化学的または酵素的結合による。使用する結合方式に応じて、糖は（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）システインの遊離スルフヒドリル基などの、遊離スルフヒドリル基；（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基などの、遊離ヒドロキシル基（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基などの芳香族残基；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ  ８７／０５３３０、１９８７年９月１１日公開、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに存在する１つ以上の炭化水素部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学脱グリコシル化は例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等の化合物への曝露を含み得る。この処置は、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大半またはすべての糖の切断を引き起こすが、アミノ酸はそのまま残す。化学脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によってさらに説明されている。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの炭水化物部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されているように、各種のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成できる。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの配列は、必要に応じて、哺乳動物、酵母、昆虫および植物細胞などの使用される発現系の種類によって調整され、ペプチドのアミノ酸配列によって影響される可能性がある各種のグリコシル化パターンすべてを導入し得る。一般に、ヒトに使用するＡｃｔＲＩＩａタンパク質は、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ株化細胞などの適正なグリコシル化をもたらす哺乳動物株化細胞で発現されるであろうが、他の哺乳動物発現株化細胞、改変グリコシル化酵素を持つ酵母株化細胞および昆虫細胞も同様に使用されることが予想される。
【００５２】
本開示は、ミュータント、特にＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのコンビナトリアルミュータントのセットはもちろんのこと、切断ミュータントを生成する方法をさらに検討する；コンビナトリアルミュータントのプールは、機能性変異体配列を同定するのに特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする目的は例えば、作用薬もしくは拮抗薬として作用できる、または新規活性をまとめて所有するＡｃｔＲＩＩａポリペプチド変異体を生成することであり得る。多様なスクリーニングアッセイを下に示し、このようなアッセイを使用して変異体が評価され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド変異体は、ＡｃｔＲＩＩａリガンドに結合する、ＡｃｔＲＩＩａリガンドのＡｃｔＲＩＩａポリペプチドへの結合を防止する、またはＡｃｔＲＩＩａリガンドによって引き起こされるシグナル伝達を妨害する能力についてスクリーニングされ得る。
【００５３】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはその変異体の活性も、細胞ベースまたはインビトロアッセイで試験され得る。例えば、遺伝子の発現に対するＡｃｔＲＩＩａポリペプチド変異体の効果は、ＦＳＨ産生に関与していた。これは必要に応じて、１つ以上の組換えＡｃｔＲＩＩａリガンドタンパク質（例えば、アクチビン）の存在下で実施されることがあり、細胞はＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよび／またはその変異体、ならびに場合によりＡｃｔＲＩＩａリガンドを産生するためにトランスフェクトされ得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをマウスまたは他の動物に投与して、ＦＳＨレベルが評価され得る。ＦＳＨを産生する下垂体株化細胞は周知であり、ＡｃｔＲＩＩａタンパク質は、特に外因的に供給されたアクチビンの存在下でＦＳＨ産生を低減する効果について試験され得る。別の例として、癌細胞の増殖または生存に対するＡｃｔＲＩＩａポリペプチド変異体の効果が評価され得る。癌細胞は、固形腫瘍を形成する生体対象中の細胞または腫瘍から生じて、生体対象内の別の部位に広がった細胞（すなわち転移性細胞）を指し得る。さらに、癌細胞は、腫瘍または癌性増殖より得たまたは由来する、およびインビトロで培養される細胞を指し得る。癌細胞は、例えば、インビトロで培養され得るまたは動物異種移植研究で使用され得る、株化細胞も含む。癌細胞は、転移後の細胞分裂による転移性細胞より得た細胞も指す。細胞は、ホルモン感受性またはホルモン非依存性であり得る。癌細胞の増殖または生存は、１つ以上の組換えＡｃｔＲＩＩａリガンドタンパク質（例えば、アクチビン）の存在下で評価されることがあり、細胞はＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよび／またはその変異体、ならびに場合によりＡｃｔＲＩＩａリガンドを産生するためにトランスフェクトされ得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、マウスまたは他の動物に投与されることがあり、腫瘍サイズ、または細胞増殖もしくはアポトーシスの速度などの１つ以上の測定値が対照と比較して評価され得る。
【００５４】
天然型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと比較して選択的なまたは一般に向上した効力を有する、コンビナトリアル由来変異体を生成することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じることができる。例えば、改変タンパク質は、タンパク質分解または未処置ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの破壊、もしくはそうでなければ不活性化を引き起こす他の細胞プロセスに対する安定度の上昇または低下のどちらかを行うことができる。このような変異体、およびそれらをコードする遺伝子は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの半減期を調節することによってＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのレベルを変化させるために使用できる。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的効果を引き起こすことが可能であり、患者において組換えＡｃｔＲＩＩａポリペプチドレベルのより厳密な制御を可能にする。Ｆｃ融合タンパク質では、突然変異は、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分で行われてタンパク質の半減期が変化され得る。
【００５５】
コンビナトリアルライブラリは、潜在的なＡｃｔＲＩＩａポリペプチド配列の少なくとも一部をそれぞれ含むポリペプチドのライブラリをコードする遺伝子の縮重ライブラリによって産生され得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、潜在的なＡｃｔＲＩＩａポリペプチドヌクレオチド配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、またはより大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージ提示のために）発現できるように、遺伝子配列中に酵素的に結合できる。
【００５６】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なホモログのライブラリを生成できる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成装置で実施可能であり、次に発現のために、合成遺伝子を適切なベクター中に結合できる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当分野で周知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｅｄ．ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照）。このような技法は、他のタンパク質の定方向進化で利用されてきた（例えば、Ｓｃｏｔｔら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；同様に米国特許番号：５，２２３，４０９、５，１９８，３４６および５，０９６，８１５を参照）。
【００５７】
または、突然変異誘発の他の形を利用してコンビナトリアルライブラリを生成できる。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド変異体は、例えば、アラニン走査突然変異誘発などを使用するスクリーニングによって（Ｒｕｆら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１５６５−１５７２；Ｗａｎｇら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２８８８−２８９２；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）、リンカー走査突然変異誘発によって（Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３１６）；飽和突然変異誘発によって（Ｍｅｙｅｒｓら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１３）；ＰＣＲ突然変異誘発によって（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：１１−１９）；または化学突然変異誘発を含むランダム突然変異誘発によって（Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２）Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３２−３４）、ライブラリから生成および単離できる。リンカー走査突然変異誘発は、特にコンビナトリアル状況において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの切断（生物活性）形を同定するのに魅力的な方法である。
【００５８】
点突然変異および切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、ならびにそれに関して、ある特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための広範囲の技法が当分野で公知である。このような技法は一般に、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適用できる。大規模な遺伝子ライブラリをスクリーニングするために最も幅広く使用されている技法は通例、遺伝子ライブラリの複製可能な発現ベクター中へのクローニング、得られたベクターのライブラリを用いた適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検知により生成物が検出される遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離が促進される条件下での、コンビナトリアル遺伝子の発現を含む。好ましいアッセイは、アクチビン結合アッセイおよびアクチビン仲介細胞シグナル伝達アッセイを含む。
【００５９】
ある実施形態において、本発明のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに本来存在する修飾に加えて、翻訳後修飾をさらに含み得る。このような修飾は、これに限定されるわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、ホスホリル化、脂質化、およびアシル化を含む。結果として、修飾ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、ポリまたはモノサッカライド、およびホスフェートなどの非アミノ酸要素を含有し得る。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸要素の効果は、他のＡｃｔＲＩＩａポリペプチド変異体について本明細書に記載されるように試験され得る。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの新生形を切断することによってＡｃｔＲＩＩａポリペプチドが産生されるとき、タンパク質の正確な折畳みおよび／または機能にとって翻訳後処理も重要であり得る。各種の細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３など）は、このような翻訳後活性に対する特異的細胞機構および特徴的機序を有し、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの正確な修飾および処理を確実にするように選択され得る。
【００６０】
ある態様において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの機能性変異体または修飾形は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの少なくとも一部および１つ以上の融合ドメインを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例は、これに限定されるわけではないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンを含む。融合ドメインは、所望の特性を与えるために選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のためには、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−またはコバルト−結合樹脂などのアフィニティクロマトグラフィー用の関連マトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーによって有用なＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」形で入手できる。別の例として、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの検出を容易にするために融合ドメインが選択され得る。このような検出ドメインの例は、各種の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）はもちろんのこと、通常は、特異的抗体が利用可能である短ペプチド配列である「エピトープタグ」も含む。特異的モノクローナル抗体がただちに入手できる周知のエピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグを含む。いくつかの場合で、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのためのプロテアーゼ切断部位を有し、この部位は関連するプロテアーゼに融合タンパク質を部分的に消化させて、それにより組換えタンパク質をそこから遊離させる。遊離されたタンパク質は次に、続いてのクロマトグラフィーによる分離によって融合ドメインから単離することができる。ある好ましい実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、インビボでＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを安定化するドメイン（「安定化」ドメイン）と融合される。「安定化すること」とは、これが破壊の減少、腎臓によるクリアランスの低下、または他の薬物動態効果のいずれによるかに関わらず、血清半減期を延長する何らかのことを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に所望の薬物動態特性を与えることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は所望の特性を与えることができる。選択され得る他の種類の融合タンパク質は、マルチマー化（例えば、ダイマー化、テトラマー化）ドメインおよび機能性ドメイン（骨増加または筋肉増加のさらなる刺激などの、要望に応じたさらなる生物機能を与える）を含む。
【００６１】
詳細な例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合したＡｃｔＲＩＩａの溶解性細胞外ドメイン（例えば、配列番号６）を含む融合タンパク質を提供する。
【００６２】
【化７】
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場合により、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２、およびＡｓｎ−４３４などの残基に１つ以上の突然変異を有する。ある場合において、これらの突然変異の１つ以上（例えば、Ａｓｐ−２６５突然変異）を有するミュータントＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃγ受容体に対する結合能力の低下を有する。他の場合において、これらの突然変異の１つ以上（例えば、Ａｓｎ−４３４突然変異）を有するミュータントＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）に対する結合能力の上昇を有する。
【００６３】
融合タンパク質の各種の要素が所望の機能性と一致する任意の方法で配置され得ることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドが異種ドメインのＣ末端側に配置され得るか、または異種ドメインがＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのＣ末端側に配置され得る。ＡｃＲＩＩａポリペプチドドメインおよび異種ドメインは融合タンパク質内で隣接する必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列はドメインのＣまたはＮ末端側のどちらかに、またはドメイン間に含まれ得る。
【００６４】
ある実施形態において、本発明のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを安定化させることができる１つ以上の修飾を含有する。例えば、このような修飾は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのインビトロ半減期を延長するか、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの循環半減期を延長するか、またはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾は、これに限定されるわけではないが、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドおよび安定化ドメインを含む融合タンパク質を含む）、グリコシル化部位の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を含む）および炭水化物部分の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドからの炭水化物部分の除去）を含む。融合タンパク質の場合では、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＩｇＧ分子などの安定化ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）に融合される。本明細書で使用するように、「安定化ドメイン」という用語は、融合タンパク質の場合のような融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）を指すだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性修飾、またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含む。
【００６５】
ある実施形態において、本発明は、他のタンパク質からの単離形である、またはそうでなければ他のタンパク質を実質的に含まない、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの単離形および／または精製形を使用できるようにする。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは一般に、組換え核酸からの発現によって産生されるであろう。
【００６６】
３．ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする核酸
ある態様において、本発明は、本明細書で開示する断片、機能性変異体および融合タンパク質を含む、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのいずれも（例えば、溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）コードする単離および／または組換え核酸、ならびにＦＳＨレベルの低下に使用するタンパク質を産生するための核酸の使用を提供する。例えば、配列番号４は、天然型ヒトＡｃｔＲＩＩａ前駆体ポリペプチドをコードするが、配列番号５は、ＡｃｔＲＩＩａの処理された細胞外ドメインをコードする。主題の核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸は例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを作製する方法で、または直接、治療剤として（例えば、遺伝子療法手法において）使用され得る。
【００６７】
ある態様において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする主題の核酸は、配列番号４または５の変異体である核酸を含むことがさらに理解される。変異体ヌクレオチド配列は、対立変異体などの、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失によって異なる配列を含む。
【００６８】
ある実施形態において、本発明は、配列番号４または５に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である単離または組換え核酸配列の使用を提供する。当業者は、配列番号４または５に相補的な核酸配列、および配列番号４または５の変異体も本発明の範囲内であることを認識するであろう。さらなる態様において、本発明の核酸配列は、異種ヌクレオチド配列によって、またはＤＮＡライブラリ内において単離、組換え、および／または融合することができる。
【００６９】
他の実施形態において、ＦＳＨレベルを低下させるのに使用されるタンパク質は、高い厳密性条件下で配列番号４もしくは５で示されるヌクレオチド配列、配列番号４もしくは５の相補配列、またはその断片にハイブリダイズする核酸によってコードされる。上述のように、当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性条件が多様であり得ることを理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性条件が多様であり得ることを理解するであろう。例えば、約４５℃にて６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションと、続いて５０℃での２．０×ＳＣＣの洗浄を実施できる。例えば、洗浄ステップの塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＣＣの低厳密性から５０℃における約０．２×ＳＣＣの高厳密性まで選択できる。さらに、洗浄ステップの温度は、室温、約２２℃における低厳密性条件から、約６５℃の高厳密性条件まで上昇させることができる。温度および塩のどちらも変更してもよく、または他の変数を変更して、温度もしくは塩濃度を一定に維持してもよい。一実施形態において、本発明によって、室温における６×ＳＳＣの低厳密性条件下でハイブリダイズし、続いて室温における２×ＳＣＣで洗浄される、核酸が提供される。
【００７０】
遺伝暗号の縮重のために配列番号４または５で示される核酸とは異なる単離核酸も、本発明の範囲内である。例えば、アミノ酸の数は、２つ以上のトリプレットによって示される。同じアミノ酸を指定するコドン、すなわちシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンのシノニムである）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異を引き起こし得る。しかし、主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化を引き起こすＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞に存在するであろうことが予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の１つ以上のヌクレオチドにおけるこれらの変異（ヌクレオチドの約３〜５％まで）が、天然の対立遺伝子変異のために所与の種の個体に存在し得ることを認識するであろう。ありとあらゆるこのようなヌクレオチド変異および生じたアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
【００７１】
ある実施形態において、本発明の組換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に操作可能に連結され得る。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適切であろう。多様な宿主細胞についての多くの種類の適切な発現ベクターおよび好適な調節配列は、当分野で公知である。通例、前記１つ以上の調節ヌクレオチド配列は、これに限定されるわけではないが、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含み得る。当分野で公知の構成的プロモーターまたは誘導プロモーターも本発明によって検討される。プロモーターは、天然型プロモーター、または２つ以上のプロモーターの要素を組合せるハイブリッドプロモーターのどちらかであり得る。発現構築物はプラスミドなどのエピソームの細胞中に存在することがあり、または発現構築物は染色体に挿入されることがある。好ましい実施形態において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択可能なマーカー遺伝子は、当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変化するであろう。
【００７２】
本発明のある態様において、主題の核酸は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードして、少なくとも１つの調節配列に操作可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に与えられる。調節配列は、当分野で認識されており、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの発現を指示するために選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素を含む。例示的な調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に説明されている。例えば、ＤＮＡ配列に操作可能に連結されているときにＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様の発現制御配列は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現するためにこれらのベクター中で使用され得る。このように有用な発現制御配列は例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、発現がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモーター、ファージλの主オペレータおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼ、例えば、Ｐｈｏ５のプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、原核または真核細胞の遺伝子の発現を制御することが公知のバキュロウイルス系および他の配列またはそのウイルスの多角体プロモーター、ならびにその各種の組合せを含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が所望されるタンパク質の種類などの因子によって変化し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、そのコピー数および抗体マーカーなどのベクターにコードされるその他のタンパク質の発現を制御する能力も考慮されるべきである。
【００７３】
本発明の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子、またはその一部を原核細胞、真核細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）、または両方のいずれかでの発現に好適なベクター中に結合することによって産生され得る。組換えＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの産生のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、好適なベクターは：ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞中での発現のためのｐＢＴａｃ由来プラスミドおよびｐＵＣ由来プラスミドの種類のプラスミドを含む。
【００７４】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌でのベクターの増殖を促進するための原核配列と、真核細胞で発現される１つ以上の真核転写単位との両方を含有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来ベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核および真核細胞の両方で複製および薬物耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドからの配列によって修飾される。または、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体は、真核細胞でのタンパク質の一過性発現に使用できる。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、下の遺伝子治療送達系の説明で見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において利用される各種の方法は、当分野で周知である。一般的な組換え手順と同様に、原核および真核細胞の両方に好適な他の発現系については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）を参照されたい。いくつかの例において、バキュロウイルス発現系の使用によって、組換えポリペプチドを発現することが所望であり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（ｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩを含有するβ−ｇａｌなど）を含む。
【００７５】
好ましい実施形態において、ベクターは、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．）などのＣＨＯ細胞中における主題のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの産生のために設計されるであろう。明らかとなるように、主題の遺伝子構築物を使用して培養物中で増殖した細胞において主題のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの発現を引き起こして、精製のための融合タンパク質または変異体タンパク質を含むタンパク質を産生することができる。
【００７６】
本開示は、主題のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの１つ以上のためのコード配列（例えば、配列番号４または５）を含む組換え遺伝子がトランスフェクトされた宿主細胞にも関する。宿主細胞は、いずれの原核または真核細胞でもよい。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用して）、酵母、または哺乳動物細胞で発現され得る。他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００７７】
したがって本発明は、主題のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを産生する方法にさらに関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養して、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの発現を起こすことができる。ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。または、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、細胞質によって、または膜画分ならびに収集、溶解した細胞、および単離したタンパク質の中に保持され得る。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養に好適な培地は、当分野で周知である。主題のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの特定のエピトープに特異性の抗体を用いた免疫アフィニティおよびＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに融合したドメインに結合する薬剤を用いたアフィニティ精製（ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合物を精製するために、例えば、タンパク質Ａカラムが使用され得る）を含む、タンパク質精製の分野で公知の技法を使用して、細胞培地、宿主細胞、または両方から単離することができる。好ましい実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、その精製を促進するドメインを含有する融合タンパク質である。好ましい実施形態において、精製は、例えば、以下：タンパク質Ａクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つ以上を任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーのステップによって達成される。精製はウイルス濾過および緩衝液交換によって完了できる。本明細書に示すように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定されたように＞９８％の、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されたように＞９５％の純度まで精製した。このレベルの純度は、マウスの骨に対して、ならびにマウス、ラットおよび非ヒト霊長類の許容される安全プロフィールに対して所望の効果を達成するのに十分であった。
【００７８】
別の態様において、組換えＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの所望の部分のＮ末端におけるポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの、精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって発現された融合タンパク質の精製を可能にする。そこで続いて精製リーダー配列をエンテロキナーゼによる処理によって除去して、精製ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを得られる（例えばＨｏｃｈｕｌｉら、（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照されたい）。
【００７９】
融合遺伝子を作製する技法は周知である。本質的に、異なるペプチド配列をコードする各種のＤＮＡ断片の連結は、連結のための平滑またはねじれ形末端、適切な末端を与えるための制限酵素消化、必要に応じた付着端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結を利用して、従来の技法に従って実施される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技法によって合成することができる。または、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２個の連続遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じさせて、次にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成できるアンカープライマーを使用して実施できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者：Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。
【００８０】
４．別のアクチビンおよびＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬
本明細書で扱うデータは、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａシグナル伝達の拮抗薬を使用してＦＳＨレベルを低下できることを示す。溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド、および特にＡｃｔｒＩＩａ−Ｆｃは好ましい拮抗薬であるが、ならびにこのような拮抗薬はアクチビン拮抗作用以外の機序によってＦＳＨに影響を及ぼし得るが、抗アクチビン（例えば、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ）抗体、抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体、ＡｃｔＲＩＩａの産生を阻害するアンチセンス、ＲＮＡｉまたはリボザイム核酸、ならびにアクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａの他の阻害薬、特にアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ結合を破壊する阻害薬を含む、他の種類のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬が有用であることが予想される。
【００８１】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（例えば、溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）と特異的に反応性であり、リガンドに対して競合的にＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと結合するか、またはそうでなければＡｃｔＲＩＩａ仲介シグナル伝達を阻害する抗体は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド活性の拮抗薬として使用され得る。同様に、アクチビンＡポリペプチドと特異的に反応性であり、ＡｃｔＲＩＩａ結合を破壊する抗体は拮抗薬として使用され得る。
【００８２】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはアクチビンポリペプチドに由来する免疫原を使用することによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を標準プロトコルによって作製できる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、編者：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照されたい）。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物は、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの免疫原性形、抗体反応を誘発できる抗原断片、または融合タンパク質によって免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える技法は、担体への結合または当分野で周知の他の技法を含む。ＡｃｔＲＩＩａまたはアクチビンポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与できる。免疫化の進行は、血漿または血清における抗体力価の検出によって監視できる。標準ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを抗原としての免疫原と共に使用して、抗体のレベルを評価できる。
【００８３】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの免疫原性調製物による動物の免疫化の後に、抗血清が得られ、所望であれば、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化された動物から収集して、ハイブリドーマ細胞を得るための骨髄腫細胞などの不死化細胞を用いた標準体細胞融合手順によって融合できる。このような技法は当分野で公知であり、例えば、ハイブリドーマ技法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）を含む。ハイブリドーマ細胞は、ＡｃｔＲＩＩａペプチドと特異的に反応性である抗体およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の産生のために、免疫化学的にスクリーニングできる。
【００８４】
本明細書で使用するように「抗体」という用語は、主題のポリペプチドとまた特異的に反応性であるその断片を含むことを意図する。抗体は、抗体全体について上述と同じ方法で利用するために、従来の技法およびスクリーニングされた断片を使用して断片化できる。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体をペプシンによって処理することによって生成できる。得られたＦ（ａｂ）２断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ断片を産生することができる。本発明の抗体はさらに、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって与えられたＡｃｔＲＩＩａまたはアクチビンポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性、単鎖、キメラ、ヒト化および完全ヒト分子を含むことを意図する。抗体は、それに結合され、検出できる標識をさらに含み得る（例えば、標識は放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。
【００８５】
ある実施形態において、抗体は組換え抗体であり、組換え抗体という用語は、ＣＤＲグラフトまたはキメラ抗体、ライブラリ選択抗体ドメインから構築したヒトまたは他の抗体、単鎖抗体および単一ドメイン抗体（例えばヒトＶＨタンパク質またはラクダ科ＶＨＨタンパク質）を含む、一部は分子生物学の技法によって生成された任意の抗体を含む。ある実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、ある実施形態において、本発明は、新規抗体を生成する方法を利用できるようにする。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはアクチビンポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な量の抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物をマウスに投与するステップと、マウスから抗原産生細胞（例えば、脾臓からの細胞）を得て、抗原産生細胞を骨髄腫細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得るステップと、抗原産生ハイブリドーマを試験して、抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するステップとを含み得る。ハイブリドーマは一度得られると、細胞培養物中で、場合により、ハイブリドーマ由来細胞が抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件下で増殖させることができる。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製され得る。
【００８６】
抗体に関して使用されるような「と特異的に反応性の」という形容詞は、当分野で一般に理解されるように、抗体が興味のある抗原（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）および興味のない他の抗原との間で十分に選択的であり、抗体が少なくとも、ある種類の生体サンプル中に興味のある抗原の存在を検出するのに有用であるということを意味することを意図する。治療的利用などの、抗体を利用する、ある方法において、より高度の結合特異性が所望であり得る。モノクローナル抗体は一般に、所望の抗原と交差反応ポリペプチドとを効果的に識別する傾向がより高い（ポリクローナル抗体と比較して）。抗体：抗原相互作用の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性は一連の各種の親和性によって到達可能であり得るが、一般に好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９またはそれ以下の親和性（解離定数）を有するであろう。アクチビンとＡｃｔＲＩＩａとの間の非常に強い結合を考えると、中和抗アクチビンまたは抗ＡｃｔＲＩＩａ抗体は一般に、１０−１０またはそれ以下の解離定数を有するであろう。
【００８７】
さらに、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られた抗体の特性に影響し得る。例えば、抗体が溶液中の抗体を結合するために使用されることになっている場合、溶液結合を試験することが所望であり得る。特定の所望の抗体を同定するために抗体と抗原との間の相互作用を試験するための、多種多様の異なる技法が利用できる。このような技法は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学を含む。
【００８８】
アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬である核酸化合物の種類の例は、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ構築物および触媒核酸構築物を含む。核酸化合物は１本鎖または２本鎖であり得る。２本鎖化合物は、鎖の一方または他方が１本鎖である、オーバーハングまたは非相補的領域も含み得る。１本鎖化合物は、化合物がいわゆる「ヘアピン」または「ステムループ」構造を形成することを意味する自己相補的領域を、二重らせん構造の領域と共に含む。核酸化合物は、全長ＡｃｔＲＩＩａ核酸配列あるいはアクチビンβＡまたはアクチビンβＢ配列の、１０００以下の、５００以下の、２５０以下の、１００以下のまたは５０、３５、３０、２５、２２、２０もしくは１８以下のヌクレオチドから成る領域に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。相補的領域は好ましくは、少なくとも８ヌクレオチド、ならびに場合により少なくとも１０または少なくとも１５ヌクレオチド、場合により１５〜２５ヌクレオチドであるだろう。相補的領域は、コード配列部分などの、標的転写物のイントロン、コード配列または非コード配列に含まれ得る。一般に、核酸化合物は、長さが約８〜約５００ヌクレオチドまたは塩基対の長さを有し、場合により、長さは約１４〜約５０ヌクレオチドであろう。核酸は、（特に、アンチセンスとしての使用のための）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドであり得る。いずれの１本鎖もＤＮＡおよびＲＮＡの混合物はもちろんのこと、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかに容易に分類できない修飾形も含み得る。同様に、２本鎖化合物はＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡであり、いずれの１本鎖もＤＮＡおよびＲＮＡの混合物はもちろんのこと、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかに容易に分類できない修飾形も含み得る。核酸化合物は、主鎖（ヌクレオチド間結合を含む、天然核酸の糖−リン酸部分）または塩基部分（天然核酸のプリンまたはピリミジン部分）に対する１つ以上の修飾を含む、各種の修飾のいずれかを含み得る。アンチセンス核酸化合物は好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、血清中、細胞中、または経口送達化合物の場合には胃および吸入化合物には肺などの、化合物が送達されやすい場所での安定性などの特性を改良する１つ以上の修飾を含有することが多いだろう。ＲＮＡｉ構築物の場合には、標的転写物に相補的な鎖は一般に、ＲＮＡまたはその修飾物であろう。他の鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその他の変形であり得る。２本鎖または１本鎖「ヘアピン」ＲＮＡｉ構築物の２本鎖部分は、それがダイサー基質として作用する限り、好ましくは長さが１８〜４０ヌクレオチドの、長さが場合により約２１〜２３ヌクレオチドの長さを有するであろう。触媒または酵素核酸はリボザイムまたはＤＮＡ酵素であり、修飾形も含有し得る。核酸化合物は、生理学的条件下で、およびナンセンスまたはセンス対照がほとんどまたは全く効果を持たない濃度で細胞と接触したときに、標的の発現を約５０％、７５％、９０％またはそれ以上阻害し得る。核酸化合物の効果を試験するための好ましい濃度は、１、５および１０  μｍｏｌである。核酸化合物は、例えば、インビボでのＦＳＨレベル、インビトロでの株化細胞によるＦＳ���産生、またはＦＳＨ関連障害に対する効果についても試験され得る。
【００８９】
５．スクリーニングアッセイ
ある態様において、本発明は、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａシグナル伝達経路の作用薬または拮抗薬である化合物（薬剤）を同定するための、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド（例えば、溶解性ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）およびアクチビンポリペプチドの使用に関する。このスクリーニングによって同定された化合物は、インビボまたはインビトロでの癌細胞、特に前立腺癌細胞の増殖または生存を調節するその能力を評価するために試験できる。これらの化合物は例えば、マウス異種移植モデルなどの動物モデルで試験できる。１つの有用な動物モデルは、マウスＬＡＰＣ−４前立腺癌モデル（米国特許番号：７，１２２，７１４に記載）。前立腺癌の他の動物モデルは、例えば、ＬＮＣａＰ細胞を移植することによって生成できる。ＬＮＣａＰ株化細胞は、前立腺癌患者のリンパ節転移から得た樹立アンドロゲン応答性前立腺癌株化細胞である。
【００９０】
アクチビンおよびＡｃｔＲＩＩａシグナル伝達を標的化することによってＦＳＨ分泌を低減または阻害する治療剤をスクリーニングするための多くの手法がある。ある実施形態において、化合物の高スループットスクリーニングを実施して、選択した株化細胞に対するアクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａ仲介効果を混乱させる薬剤を同定することができる。ある実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのアクチビンへの結合を特異的に阻害または低減する化合物をスクリーニングおよび同定するアッセイが実施される。または、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドのアクチビンへの結合を向上させる化合物を同定するアッセイを使用できる。さらなる実施形態において、化合物はアクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと相互作用するその能力によって同定できる。
【００９１】
多様なアッセイ形式が十分であり、本開示を考慮すると、本明細書に明示的に記載されていないアッセイはそれにもかかわらず、当業者によって理解されるであろう。本明細書に記載するように、試験化合物（薬剤）は、任意のコンビナトリアル化学方法によって作製され得る。または、主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然型生体分子であり得る。組織増殖のモジュレータとして作用するその能力について試験される化合物（薬剤）は、例えば、細菌、酵母、植物もしくは他の生物によって産生する（例えば、天然生成物）、化学的に産生する（例えば、ペプチドミメティックを含む小型分子）、または組換えにより産生することができる。本明細書で検討する試験化合物は、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティック、糖、ホルモン、および核酸分子を含む。詳細な実施形態において、試験薬剤は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する小型有機分子である。
【００９２】
試験化合物は、単一の別個の実体として供給することが、またはコンビナトリアル化学によって作製されるような、より複雑なライブラリで供給することができる。これらのライブラリは例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験化合物の試験系への提示は、特に初期スクリーニングステップにおいては、単離形でも、または化合物の混合物としてでもよい。場合により、化合物は他の化合物によって場合によって誘導体化され得るか、または化合物の単離を促進する誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非制限的な例は、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化架橋剤またはその任意の組合せを含む。
【００９３】
化合物および天然抽出物の試験ライブラリを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査される化合物の数を最大限にするために、高スループットアッセイが所望である。精製または半精製タンパク質に由来し得るような無細胞系で実施されるアッセイは、系が生成されて試験化合物が仲介する分子標的中での変化を迅速に発生させ、比較的容易に検出させられるという点で、「１次」スクリーンとして好ましいことが多い。さらに、試験化合物の細胞毒性または生物学的利用能の効果はインビトロ系では一般に無視できるので、代わりにアッセイは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとアクチビンとの間の結合親和性の変化で明らかであり得るように、主に分子標的に対する薬物の効果に注目している。
【００９４】
単に例証するために、例示的なスクリーニングアッセイにおいて、興味のある化合物は、アクチビンに通例は結合可能である単離および精製ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドと接触させる。化合物およびＡｃｔＲＩＩａポリペプチドの化合物に、次にＡｃｔＲＩＩａリガンドを含有する組成物を添加する。ＡｃｔＲＩＩａ／アクチビン複合体の検出および定量によって、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとアクチビンとの間での複合体の形成を阻害する（または増強する）化合物の効力を決定する手段が得られる。化合物の効力は、試験化合物の各種の濃度を使用して得たデータから用量依存曲線を生成することによって評価できる。さらに、比較の基線を得るために、対照アッセイも実施できる。例えば、対照アッセイにおいて、単離および精製アクチビンは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含有する組成物に添加され、ＡｃｔＲＩＩａ／アクチビン複合体の形成は試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物質が混合される順序は変更することができ、同時に混合できることが理解されるであろう。さらに、精製タンパク質の代わりに、好適な無細胞アッセイ系を得るために、細胞抽出物および溶解産物が使用され得る。
【００９５】
ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとアクチビンとの間の複合体形成は、各種の技法によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素標識ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドまたはアクチビンなどの検出可能に標識されたタンパク質を使用して、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量することができる。
【００９６】
ある実施形態において、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイは、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を直接的または間接的のいずれかで測定するために使用され得る。他の好適な検出方式は、例えば光導波路（ＰＣＴ公開特許公報：ＷＯ  ９６／２６４３２および米国特許番号：５，６７７，１９６）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくものを含む。
【００９７】
「ツー・ハイブリッド・アッセイ」としても公知の相互作用トラップアッセイも、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を破壊または増強する薬剤を同定するために使用され得る。例えば、米国特許番号：５，２８３，３１７；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６）を参照されたい。詳細な実施形態において、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、小型分子またはペプチド）を同定するために、逆ツーハイブリッド系が使用され得る。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：９１９−２９；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：３７４−８１；および米国特許番号：５，５２５，４９０；５，９５５，２８０；および５，９６５，３６８を参照されたい。
【００９８】
ある実施形態において、化合物は、本明細書に記載したＡｃｔＲＩＩａまたはアクチビンポリペプチドと相互作用するその能力によって同定される。化合物とＡｃｔＲＩＩａまたはアクチビンポリペプチドとの間の相互作用は、共有または非共有であり得る。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含む、インビトロ生化学方法を使用してタンパク質レベルで同定できる（Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら、１９７４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６：１）。ある場合において、化合物は、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドに結合する化合物を検出するアッセイなどの、機序ベースアッセイでスクリーニングされ得る。これは固相または液相結合イベントを含み得る。または、アクチビンまたはＡｃｔＲＩＩａポリペプチドをコードする遺伝子は、レポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）を用いて細胞中にトランスフェクトして、場合により高スループットスクリーニングによって、またはライブラリの個々のメンバーを用いて、ライブラリに対してスクリーニングすることができる。他の機序ベース結合アッセイ、例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイが使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定された、または固定化抗体によって捕捉された、またはキャピラリー電気泳動によって分離された標的を用いて実施できる。結合された化合物は通常、比色もしくは蛍光または表面プラズモン共鳴を使用して検出され得る。
【００９９】
６．例示的な治療用途
ある実施形態において、本発明は、個人に例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドなどの有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を投与することによって、その必要のある個人においてＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。ＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法は、例えば、ＦＳＨ転写、翻訳、翻訳後処理、および分泌を低減することを含む、前記効果を引き起こす全ての方法を含む。血漿ＦＳＨレベルを試験するための、ＭＥＮＯＣＨＥＣＫ（登録商標）を含む各種のキットが利用できる。男性のＦＳＨの正常値は、２〜１８ｍＩＵ／ｍｌ血液の範囲に及ぶ。女性の正常値は５〜２５ｍＩＵ／ｍＬの範囲に及ぶ。健常女性での５０ｍＩＵ／ｍＬより高いレベルは、更年期に関連している。ＦＳＨの組織濃度は、唾液を試験することによって決定できる（ｅＭＨＰ（登録商標））。
【０１００】
ある実施形態において、本発明は、ＦＳＨ分泌を低減または阻害するために個人に例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドなどの有効量アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を投与することによって、その必要がある個人において前立腺癌を治療または予防する方法を提供する。これらの方法は、前立腺癌を発症する高いリスクを有するヒト、特に男性の治療的処置にはもちろんのこと、予防的処置にも使用され得る。いずれの男性も前立腺癌を発症するリスクに瀕しているため、前立腺癌を発症するリスクが高い男性は、一般集団またはある年齢群の男性集団と比べて、そのリスク因子によってその疾患を発症する確率がより高くなった男性である。例示的なリスク因子は、年齢、家族暦または遺伝子構造、運動および食事などの生活習慣、ならびに放射線または他の発癌因子を含む。
【０１０１】
本明細書で使用するように、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的サンプルにおいて、未処置対照サンプルと比較して処置サンプルの障害もしくは状態の発生を低減する、または未処置対照サンプルと比較して１つ以上の症状の発症または障害もしくは状態の特徴を遅延させる、化合物を指す。例えば、前立腺癌を予防することは、処置後に新たな病変がないこと、または転移性疾患がないこともしくは遅延することを指し得る。
【０１０２】
「前立腺癌を処置する」という用語は、未処置対照と比較した、または処置前の疾患の重症度と比較した疾患の１つ以上の症状または特徴の改良を指す。この用語は、処置を受けている患者が治癒されること、または疾患が患者から完全に根絶されることを必ずしも要求していない。前立腺癌を処置する薬剤は、その疾患の１つ以上の症状または特徴の重症度を低下させる薬剤であり得る。腫瘍の増殖および進行は、細胞周期進行および細胞分裂の介在物質ならびに細胞死、すなわちアポトーシスの調節因子を含む、多様な因子によって影響されることに注目すべきである。したがって、前立腺癌を治療することは、癌細胞増殖の低下または細胞分裂速度の低下を含み得る。代わりにまたはさらに、前立腺癌を処置することは、癌細胞生存の減少またはアポトーシスの増加を含み得る。したがって、ある実施形態において、前立腺癌を処置することは、細胞分裂の減少および細胞死の増加の両方を含み得る。機序とは無関係に、前立腺癌を処置する薬剤の有効性は、対照と比較した癌細胞数の減少（増殖減少、アポトーシス増加、またはその両方のいずれかによる）、または対照と比較した腫瘍サイズの縮小などの、観察可能な測定基準によって決定され得る。したがって前立腺癌を処置することまたは腫瘍もしくは癌細胞増殖を阻害することは、このような変化が発生する機序に関して中立であることが意図されるものとする。予防および処置はどちらも、医師または他の医療提供者によって下された診断および治療剤の投与の所期の結果の解析で識別され得る。
【０１０３】
ヒトにおける前立腺癌進行に対する主題の拮抗薬の効果を観察するとき、効果は、測定可能な疾患の減少もしくは消失、および／または新たな病変の非存在または転移の予防によって評価され得る。例えば、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、非侵襲性および侵襲性前立腺癌の両方を持つ患者における前立腺癌進行を著しく低減または遅延させ得る。さらに拮抗薬は、その疾患のリスク因子を持つ健常男性における前立腺癌を発症するリスクを予防または低減し得る。拮抗薬は、その疾患の履歴を持つ患者における前立腺癌の再発リスクも低減し得る。
【０１０４】
したがって、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を使用して、疾患を発症するリスクに瀕していると見なされる個人における前立腺癌の発症を予防または遅延することができ、このような拮抗薬は選択した患者集団に使用され得る。適切な患者集団の例は、父または兄弟が前立腺癌と診断されている男性患者などの、前立腺癌の家族暦を持つ患者を含む。一実施形態において、前立腺癌を発症する高いリスクに瀕していると見なされるが、その疾患と診断されていない患者をアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬で処置する。このような処置は、患者が３０歳、４０歳、５０歳、６０歳、または７０歳の年齢に達したときに開始し得る。
【０１０５】
本明細書で開示されるアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬、および特にＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃタンパク質を使用して、固形腫瘍を持つ患者はもちろんのこと、転移性癌を持つ患者も含む患者における前立腺癌が処置または予防され得る。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、前立腺の前癌または良性病変を持つまたは定型過形成、異型過形成、および非侵襲性もしくは上皮内癌を含む任意の異常増殖病変を持つヒト対象にも投与され得る。本開示の拮抗薬は、ホルモン依存性またはホルモン感受性癌およびホルモン非依存性癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌）の両方の処置または予防でも有用である。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、上昇した（正常な前立腺組織由来細胞と比較して）レベルのアクチビン（例えば、Ａ、ＡＢまたはＢ）または上昇したレベルのＡｃｔＲＩＩａもしくはＡｃｔＲＩＩｂを発現する腫瘍において特に有用であることが判明し得る。
【０１０６】
ある実施形態において、本発明は、個人に例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドなどの有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を投与することによって、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍に罹患した個人においてＦＳＨ分泌を低減または阻害する方法を提供する。これらの下垂体腫瘍でのＦＳＨの分泌過多を阻害することは、エストロゲンレベルの上昇および卵巣嚢腫の発症などの腫瘍症状を減少させるための処置として有用である。本方法は手術などの従来の癌治療と併せて好ましくは使用されるが、ＦＳＨ分泌の阻害は単独で、特に手術や放射線が否定される症例では有効な処置であり得る。
【０１０７】
本発明は、従来の癌療法（例えば、化学療法、放射線療法、光線療法、免疫療法、および手術、特に前立腺切除術）の有効性が、主題の拮抗薬の使用によって向上できることを認識している。したがって、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、前立腺癌の処置、予防、または管理のために併用療法で使用され得る。拮抗薬は、放射線および／または外科処置とはもちろんのこと、細胞障害性化学療法および／または内分泌療法とも併せて患者に投与され得る。このような併用処置は、相乗的に作用して、個々の処置それぞれの投薬量を減少させ、それによってより多い投薬量で各処置によって及ぼされる有害な副作用を低減する可能性がある。他の例において、処置に対して難治性である悪性腫瘍は、２つ以上の異なる処置の併用療法に応答し得る。したがって、本開示は、抗悪性腫瘍剤の治療効果を向上させるまたはこのような抗悪性腫瘍剤に対する細胞抵抗性を克服するために、別の従来の抗悪性腫瘍剤と同時にまたは連続的に組合せたアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の投与に関する。本開示は、ホルモン療法と組合せたアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の投与にも関する。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は、ＦＳＨ分泌下垂体腫瘍から生じる症状を低減するために併用療法にも使用され得る。併用腫瘍療法に使用され得る製薬化合物は、単に例証するために：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトセシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含む。
【０１０８】
これらの化学療法抗腫瘍化合物は、その作用機序によって例えば、次の群に分類され得る：ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸拮抗薬および関連阻害薬（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの、代謝拮抗物質／抗癌剤；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然生成物を含む、抗増殖／有糸分裂阻害剤、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロンおよびナベルビンなどの微小管撹乱物質、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトセシン、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソ尿素、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホラミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身的に代謝して、その独自のアスパラギナーゼを合成する能力を持たない細胞を除去する、Ｌ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロランブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホナート−ブスルファン、ニトロソ尿素（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、テトラゼン−ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）などの抗増殖／有糸分裂阻害アルキル化剤；葉酸類似体（メトトレキセート）などの抗増殖／有糸分裂阻害代謝拮抗物質；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩およびトロンビンの他の阻害薬）；線維素溶解剤（組織プラスミノゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジプリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害薬（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害薬、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害薬）；アンギオテンシン受容体遮断薬；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害薬および分化誘導薬（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトセシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルペドニゾロン、プレドニゾン、およびプレニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害薬；ミトコンドリア機能障害誘導薬およびカスパーゼアクチベータ；ならびにクロマチン撹乱物質。
【０１０９】
ある実施形態において、併用療法に使用され得る製薬化合物は、（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）などの、「血管新生分子」の放出の阻害薬；（２）抗βｂＦＧＦ抗体などの、血管新生分子の中和薬；および（３）コラゲナーゼ阻害薬、基底膜代謝回転阻害薬、抗血管新生ステロイド、真菌由来血管新生阻害薬、血小板因子４、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミンおよび金チオマレートなどの関節炎薬、ビタミンＤ３類似体、アルファ−インターフェロンなどを含む血管新生刺激に対する内皮細胞の阻害薬などの、抗血管新生剤を含む。さらに提案される血管新生の阻害薬については、Ｂｌｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１０３２：８９−１１８（１９９０）、Ｍｏｓｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８：１４０８−１４１０（１９９０）、Ｉｎｇｂｅｒら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５９：４４−５１（１９８８）、および米国特許番号：５，０９２，８８５、５，１１２，９４６、５，１９２，７４４、５，２０２，３５２、および６５７３２５６を参照されたい。さらに、血管新生を阻害するために使用できる多様な化合物、例えば、ＶＥＧＦ仲介血管新生経路を遮断するペプチドまたは薬剤、エンドスタチンタンパク質または誘導体、アンギオスタチンのリジン結合断片、メラニンまたはメラニン促進化合物、プラスミノゲン断片（例えば、プラスミノゲンのクリングル１−３）、トロポインサブユニット、ビトロネクチンαｖβ３の拮抗薬、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質または類似体（例えば、テトラサイクリン、またはネオマイシン）、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドに結合したＭｅｔＡＰ−２阻害阻害性コアを含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコンおよびその類似体、ならびにｎａａｌａｄアーゼ阻害薬がある。例えば、米国特許番号：６，３９５，７１８、６，４６２，０７５、６，４６５，４３１、６，４７５，７８４、６，４８２，８０２、６，４８２，８１０、６，５００，４３１、６，５００，９２４、６，５１８，２９８、６，５２１，４３９、６，５２５，０１９、６，５３８，１０３、６，５４４，７５８、６，５４４，９４７、６，５４８，４７７、６，５５９，１２６、および６，５６９，８４５．を参照されたい。
【０１１０】
併用療法の性質に応じて、本発明の治療用拮抗薬の投与は、他方の療法が投与されている間におよび／またはその後に、継続され得る。本明細書に記載する拮抗薬の投与は、単回用量または複数回用量で行われ得る。いくつかの例において、拮抗薬の投与は、従来の療法の少なくとも数日前に開始されるが、他の例では投与は従来の療法の投与の直前または投与時のどちらかに開始される。
【０１１１】
出願の一態様は、受胎能力に有用な方法および組成物を提供する。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の投与によってＦＳＨ分泌を低減または阻害することは、精子成熟を阻害する有用な方法である。女性では、ＦＳＨの減少は、卵巣における卵胞顆粒膜細胞の増殖を制限するように作用する。アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬の投与によってＦＳＨ分泌を低減または阻害することは、避妊の有用な方法である。減少したＦＳＨは、卵巣での卵胞の成熟も遅延させることがあり、それにより女性において限られた数の卵胞の成熟を延期する。このような処置は、後年、自然な受精および妊娠の可能性を上昇させる潜在性を有する。ＦＳＨ分泌の低減によって卵巣内での卵胞の成熟を遅延させることは、迅速に分裂する細胞を処置するように設計された化学療法または同様の処置の一般的な副作用である、卵母細胞の枯渇を防止するのにも有用である。
【０１１２】
本出願は、１つ以上の避妊剤と組合せた１つ以上のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を含む新規組成物も提供する。例示的な避妊剤は、エストロゲン、プロゲストゲン、プロゲスチン（例えば、ノルエチノドレル、ノルエチンドロン、ノルゲスチメート、ノルゲストレル、レボノルゲストレル、メドロキシプロゲステロンおよびデソゲストレル）、オルメロキシフェン（セントクロマン）を含む。
【０１１３】
ある実施形態において、本発明は、ＦＳＨ分泌を低減または阻害するために個人に例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドなどの有効量のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬を投与することによって、その必要がある個人におけるエストロゲン関連障害を治療または予防する方法を提供する。エストロゲン合成に対するＦＳＨの制御機能のために、ＦＳＨ分泌の低減は、子宮筋腫、子宮内膜症、多嚢胞卵巣疾患、機能不全性子宮出血および卵巣癌などのエストロゲン関連障害の処置にも有効である。
【０１１４】
７．製薬組成物
ある実施形態において、本発明のアクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）は、製薬的に許容される担体を用いて製剤される。例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチドは、単独でまたは製薬製剤（治療用組成物）の成分として投与できる。主題の化合物は、ヒトまたは動物用薬剤で使用するために任意の好都合な方法での投与のために製剤され得る。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明の治療方法は、組成物を全身にまたは局所的に、インプラントまたはデバイスとして投与するステップを含む。本発明で使用するための治療用組成物は投与するときに、発熱物質を含まない、生理学的に許容される形である。上述のように組成物にも場合により含まれ得るＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬以外の治療的に有用な薬剤は、本発明の方法で主題の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）と同時にまたはレン蔵して投与され得る。
【０１１６】
通例、ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬は非経口的に、および特に静脈内または皮下に投与されるであろう。非経口投与に適切な製薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、調合物を対象とするレシピエントの血液と等張性にする溶質または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る、１つ以上の製薬的に許容される滅菌等張性水性または非水性液剤、分散剤、懸濁剤もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用液剤または分散剤に再構成されうる滅菌粉剤と組合された１つ以上のＡｃｔＲＩＩａポリペプチドを含み得る。本発明の製薬組成物で利用され得る適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適正な流動性は例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用により、分散剤の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。
【０１１７】
ある実施形態において、本発明の方法は、経口的に、例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、口内錠（フレーバーベース、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用）、粉剤、顆粒剤の形で、または水性もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤として（不活性ベース、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムを使用）および／またはマウスウォッシュなどとして投与することができ、それぞれ薬剤の所定の量を活性成分として含有する。薬剤は、巨丸剤、舐剤またはパスタ剤としても投与され得る。
【０１１８】
経口投与用の固体投薬形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、粉剤、顆粒剤など）において、本発明の１つ以上の治療用化合物は、１つ以上の製薬的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸ジカルシウム、および／または次のもの：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、および／またはアラビアゴムなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物などの潤滑剤；ならびに（１０）着色料のいずれかと混合され得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、製薬組成物は緩衝剤も含み得る。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤はもちろんのこと、高分子量ポリエチレングリコールなども使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤の充填剤としても利用され得る。
【０１１９】
経口投与用の液体投薬形は、製薬的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体投薬形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物などの当分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有しうる。不活性希釈剤以外に、経口組成物は湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味料、着香料、着色料、香料および保存料などのアジュバントも含み得る。
【０１２０】
懸濁剤は活性成分に加えて、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントなどの懸濁化剤、ならびにその混合物を含有し得る。
【０１２１】
本発明の組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散化剤などのアジュバントも含有し得る。微生物の作用の予防は、各種の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含によって確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成剤中に含めることも所望であり得る。さらに、注射用製薬形の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延する薬剤の包含によって引き起こされ得る。
【０１２２】
投薬計画は、本発明の主題の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩａポリペプチド）の作用を修飾する各種の因子を考慮して、担当医師によって決定されるであろうことが理解される。各種の因子は、これに限定されるわけではないが、所望のＦＳＨレベルの低下の程度、疾患の重症度、患者の年齢、性別および食事、骨減少に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、および他の臨床因子を含む。最終組成物への他の公知の成長因子の添加も、投薬量に影響を及ぼし得る。進行は、ＦＳＨレベルまたは処置されるＦＳＨ関連障害に関連する他の症状の定期的評価によって監視することができる。
【０１２３】
霊長類およびヒトを用いた実験によって、約１０００ｎｇ／ｍｌの血清濃度を達成するのに十分な間隔および量で化合物を投薬するときに、ＦＳＨに対するＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃの効果が検出可能であり、０．３ｍｇ／ｋｇまたは同等の投薬量において曲線下面積の点からＦＳＨに対する著しい効果が発生することが示されている。ヒトでは、０．３ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の単回用量によって１０００ｎｇ／ｍｌの血清レベルが達成され得る。分子の観察された血清半減期は約２５〜３５日であり、大半のＦｃ融合タンパク質よりは実質的に長く、それゆえ例えば、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇを週１回または２週に１回投薬することによって持続した有効血清レベルを維持するか、または投薬間隔をより長くしてより高い用量を使用してもよい。例えば、０．１、０．３、０．５、０．７、１、２もしくは３ｍｇ／ｋｇの用量、またはその間の値が月１回または２ヶ月に１回使用されることがあり、骨に対する効果は十分に続くので、投薬は３、４、５、６、９、１２またはそれ以上の月ごとに１回だけ必要である。投薬の間のより長い間隔は、血清中での薬物の持続よりも長い、薬力学的効果の持続によってさらに補助される。薬力学的効果はヒト患者において、少なくとも１２０日間観察される。
【０１２４】
ある実施形態において、本発明は、ＡｃＲＩＩａポリペプチドのインビボ産生のための遺伝子療法も提供する。このような療法は、上記のような障害を有する細胞または組織中へのＡｃＲＩＩａポリヌクレオチド配列の導入によって、その治療効果を達成するであろう。ＡｃＲＩＩａポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して達成できる。ＡｃＲＩＩａポリヌクレオチド配列の治療的送達には、標的リポソームの使用が好ましい。
【０１２５】
本明細書で教示するような遺伝子療法に利用できる各種のウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来性遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例は、これに限定されるわけではないが：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含む。いくつかのさらなるレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を含むことができる。これらのベクターはすべて、選択可能なマーカーの遺伝子を伝達および包含できるので、形質導入された遺伝子細胞を同定および生成することができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を結合することによって標的特異性にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。当業者は、ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために特異的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノム中に挿入できること、またはウイルスエンベロープに結合できることを認識するであろう。好ましい実施形態において、ベクターは骨または軟骨に標的化される。
【０１２６】
または、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを直接トランスフェクトできる。次にこれらの細胞に、興味のある遺伝子を含有するベクタープラスミドをトランスフェクトする。得られた細胞は、培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０１２７】
ＡｃｔＲＩＩａポリヌクレオチドの別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベース系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび未処置ビリオンは水性内部にカプセル化して、生物活性形で細胞に送達することができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６：７７、１９８１）を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用する効率的な遺伝子移入の方法は、当分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２、１９８８を参照されたい。リポソームの組成は通常、ステロイド、特にコレステロールと通常組合された、リン脂質の組合せである。他のリン脂質または他の脂質も使用され得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および２価カチオンの存在によって代わる。
【０１２８】
リポソーム産生で有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物を含む。例示的なリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。リポソームの標的化は、例えば、臓器特異性、細胞特異性、および小器官特異性に基づいても可能であり、当分野で公知である。
【実施例】
【０１２９】
本発明はここで概して説明されており、本発明のある実施形態および実施形態の例証の目的のためだけに含まれており、本発明を制限するものではない次の実施例への参照により、本発明がより容易に理解されるであろう。
【０１３０】
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
出願人は、間の最小リンカーによってヒトまたはマウスＦｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを有する溶解性ＡｃｔＲＩＩａ融合タンパク質を構築した。構築物はそれぞれ、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃと呼ばれる。
【０１３１】
ＣＨＯ株化細胞から精製されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃを下に示す（配列番号７）：
【０１３２】
【化８】
2014031380.tif 000010
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ株化細胞中で発現された。３個の異なるリーダー配列が考慮される：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ  （配列番号８）
（ｉｉ）組織プラスミノゲンアクチベータ（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号９）
（ｉｉｉ）未処置：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号１０）。
【０１３３】
選択された形は、ＴＰＡリーダー配列を利用し、次の未処理アミノ酸配列を有する：
【０１３４】
【化９】
2014031380.tif 000011
【０１３５】
【化１０】
2014031380.tif 000012
このポリペプチドは、次の核酸配列によってコードされる：
【０１３６】
【化１１】
2014031380.tif 000013
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃはどちらも、組換え発現を著しく受けやすい。図１に示すように、タンパク質は、タンパク質の単一の明確なピークとして精製された。Ｎ末端配列決定によって、-ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号１１）の単一配列が明らかになった。精製は、例えば、次のもの：タンパク質Ａクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３個以上を任意の順序で含む、一連のカラムクロマトグラフィーステップによって達成できる。精製はウイルス濾過および緩衝液交換によって完了できる。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定されたように＞９８％の、およびＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されたように９５％の純度まで精製した。
【０１３７】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、リガンド、特にアクチビンＡに対して高い親和性を示した。ＧＤＦ−１１またはアクチビンＡ（「ＡｃｔＡ」）は、標準アミンカップリング手順を用いてＢｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップに固定化した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃタンパク質を系に添加して、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃはアクチビンに５ｘ１０−１２の解離定数（ＫＤ）で結合し、タンパク質はＧＤＦ１１に９．９６×１０−９のＫＤで結合した。図２を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは同様に作用した。
【０１３８】
Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの効果を評価した。株化細胞：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８、ＥＭＢＯ  １７：３０９１−３１００に記載されている）。図３を参照されたい。ＣＡＧＡ１２モチーフはＴＧＦ−ベータ応答性遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在するため、このベクターは一般に、Ｓｍａｄ  ２および３を通じてシグナル伝達する因子にとって有用である。
【０１３９】
第１日：Ａ−２０４細胞を４８ウェルプレートに分けた。
【０１４０】
第２日：Ａ−２０４細胞に１０μｇ  ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０μｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトした。
【０１４１】
第３日：因子を添加する（培地＋０．１％  ＢＳＡ中へ希釈）。阻害薬は、細胞への添加前に因子によって１時間プレインキュベートする必要がある。６時間後、細胞をＰＢＳですすいで、細胞を溶解させる。
【０１４２】
この後にルシフェラーゼアッセイを続けた。通例このアッセイでは、いずれの阻害薬も存在せずに、アクチビンＡは、レポーター遺伝子発現のほぼ１０倍の刺激およびＥＤ５０〜２ｎｇ／ｍｌを示す。ＧＤＦ−１１：１６倍の刺激、ＥＤ５０：〜１．５ｎｇ／ｍｌ。ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−１１と同様の効果を示す。
【０１４３】
図４に示すように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、ピコモル濃度でＧＤＦ−８仲介シグナル伝達を阻害する。図５に示すように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの３つの異なる調製物は、約２００ｐＭのＩＣ５０でＧＤＦ−１１シグナル伝達を阻害した。
【０１４４】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、薬物動態試験で非常に安定であった。ラットに１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質を投与して、タンパク質の血漿レベルを２４、４８、７２、１４４および１６８時間に測定した。別の試験では、ラットに１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇで投与した。ラットにおいて、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは１１〜１４日の血清半減期を有し、薬物の循環レベルは２週間後にかなり高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初期投与でそれぞれ、１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌまたは３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿半減期は１４日よりも実質的に長く、薬物の循環レベルは１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの初期投与でそれぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌまたは１４４０μｇ／ｍｌであった。ヒトでの予備結果は、血清半減期が約２０〜３０日であることを示唆している。
【０１４５】
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃがインビボで骨増殖を促進する
正常メスマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）にＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃを１ｍｇ／ｋｇ／用量、３ｍｇ／ｋｇ／用量または１０ｍｇ／ｋｇ／用量のレベルで投薬し、用量は週２回与えた。骨ミネラル密度および骨ミネラル含有量はＤＥＸＡで決定した、図６を参照されたい。
【０１４６】
ＢＡＬＢ／ｃメスマウスにおいて、ＤＥＸＡスキャンは、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置の結果として骨ミネラル密度および含有量の著しい上昇（＞２０％）を示した。図７および８を参照されたい。
【０１４７】
それゆえ、ＡｃｔＲＩＩａの拮抗作用によって、正常メスマウスでの骨密度および含有量の上昇が引き起こされた。次のステップとして、骨粗鬆症マウスモデルにおける骨に対するＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの効果を試験した。
【０１４８】
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（２００１）は、卵巣切除マウスが実質的な骨減少を被ること（術後６週で骨梁のほぼ５０％の減少）、およびこれらのマウスでの骨減少が副甲状腺ホルモンなどの候補治療剤によって修正できることが証明された。
【０１４９】
出願人は、４〜５週齢で卵巣切除した（ＯＶＸ）または偽手術したＣ５７ＢＬ６メスマウスを使用した。術後８週に、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）または対照（ＰＢＳ）を用いた処置を開始した。骨密度はＣＴスキャナによって測定した。
【０１５０】
図９に示すように、未処置の卵巣切除マウスは６週後に、偽対照と比較して骨梁の実質的な減少を示した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置は、骨密度を偽手術マウスのレベルまで回復させた。処置６および１２週において、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによって、卵巣切除マウスの骨梁の実質的な増加が引き起こされた。図１０を参照されたい。処置６週後に、骨密度はＰＢＳ対照と比較して、２４％上昇した。１２週後には、増加は２７％であった。
【０１５１】
偽手術マウスにおいても、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは骨梁の実質的な増加を引き起こした。図１１を参照されたい。６および１２週後に、処置によって対照と比較して３５％の増加が生じた。
【０１５２】
実験の別のセットでは、上述のような卵巣切除（ＯＶＸ）または偽手術マウスを、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ、週２回）または対照（ＰＢＳ）によって１２週にわたって処置した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃについて上述した結果と同様に、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃを投与されたＯＶＸマウスは、早くも４週で１５％の、処置１２週後には２５％の骨梁密度の上昇を示した（図１２）。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃを投与された偽手術マウスも同様に、早くも４週に２２％の、処置１２週後には３２％の骨梁密度の上昇を示した（図１３）。
【０１５３】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによる処置１２週の後に、全身およびエクスビボ大腿骨ＤＥＸＡ解析は、処置が卵巣切除マウスと偽手術マウスの両方で骨密度の上昇を誘発することを示した（それぞれ図１４Ａおよび１４Ｂ）。これらの結果も、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによる処置１２週後に全体および皮質骨密度の両方の著しい上昇を示した、大腿骨中間骨幹のエクスビボｐＱＣＴ解析によって裏付けられる。ビヒクル処置対照卵巣切除マウスは、ビヒクル処置対照偽手術マウスに匹敵する骨密度を示した（図１５）。骨密度に加え、骨含有量もＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置後に上昇した。大腿骨中間骨幹のエクスビボｐＱＣＴ解析は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃを用いた処置の１２週後に全体および皮質骨含有量の両方の著しい増加を示したが、卵巣切除および偽手術ビヒクル対照処置マウスは同程度の骨含有量を示した（図１６）。大腿骨中間骨幹のエクスビボｐＱＣＴ解析は、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置マウスが骨膜周囲の変化を示さなかったことも示した；しかしＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ処置によって、骨内膜周囲の減少が生じて、大腿骨内面での増殖による皮質幅の増加が示された（図１７）。
【０１５４】
大腿骨の機械的試験によって、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃが、骨の内因性特性（極限強さ）の著しい向上に寄与した骨の外因性の特徴（最大負荷、剛性および破断エネルギー）を向上できることが判定された。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによって処置した卵巣切除マウスは、偽手術ビヒクル処置対照を超えるレベルまで向上した骨強度を示し、骨粗鬆症表現型の完全な回復が示された（図１８）。
【０１５５】
これらのデータは、アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬が正常メスマウスでの骨密度を上昇させて、さらに骨粗鬆症マウスモデルにおいて骨密度、骨含有量、および最終的に骨強度の欠陥を修正することを証明する。
【０１５６】
実験のさらなるセットにおいて、マウスは４週に卵巣切除または偽手術を行い、１２週から開始して、プラセボまたはＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（２回／週、１０ｍｇ／ｋｇ）（図１９〜２４ではＲＡＰ−１１とも呼ばれる）のどちらかをさらに１２週の期間にわたって投与した。各種の骨パラメータを評価した。図１９に示すように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによって、椎骨骨梁量がＯＶＸおよび偽手術マウスの両方で総量比（ＢＶ／ＴＶ）まで増加した。ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃはまた、骨梁構造を改良し（図２０）、皮質幅を増大させ（図２１）、および骨強度を改良した（図２２）。図２３に示すように、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃによって、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で所望の効果が生じた。
【０１５７】
骨組織形態計測は、偽手術マウスで２週の時点で実施した。図２４に示すこれらのデータは、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃが、骨吸収の阻害および骨増殖の促進の両方の、二重効果を有することを示している。それゆえＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、骨増殖（同化効果）を刺激して、骨吸収（異化抑制効果）を阻害する。ＢＶ＝骨量；ＴＶ＝総組織量。ＢＶ／ＴＶは、石灰化された骨量のパーセンテージの尺度である。ＥＳ＝吸収面；ＢＳ＝骨表面。ＥＳ／ＢＳは骨侵食の尺度であり、ＲＡＰ−０１１によって引き起こされた低下は、再吸収抑制または異化抑制効果を示す。Ｍｓ／Ｂｓは、骨増殖、すなわち同化効果の指標である、石灰化表面／骨表面比である。同様に、骨石灰化速度（ＭＡＲ）および１日当りの骨表面当りの骨形成速度（ＢＦＲ／ＢＳｄ）は、骨増殖を示す。作用機序を証明するために、骨芽細胞（Ｎｏｂ／ＢＰｍ）および破骨細胞（Ｎｏｃ／ＢＰｍ）の測定を行った。
【０１５８】
第２の骨組織形態計測実験はメスＣ５７ＢＬ／６マウスで実施し、１２週齢に開始した。マウスには週２回、１０ｍｇ／ｋｇ  ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃを２週間、４週間、８週間または１２週間にわたって腹腔内投薬した。各群は最終投薬の５日後に殺処分して、解析のために骨を採取した。マウスは、安楽死の９日前および２日前にカルセイン標識した。図２５に示すように、測定基準により、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃが骨増殖および石灰化を促進し、同化効果および異化抑制効果を有することが示されている。例えば、ＢＶ／ＴＶ比、ＥＳ／ＢＳ比およびＭＳ／ＢＳ比を参照されたい。同化効果は投薬計画を通じて持続するように思われるが、再吸収抑制効果はマウスにおいて長続きしないように思われる。
【０１５９】
（実施例３）
ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、多発性骨髄腫マウスモデルにおける骨損傷を改善または予防する。
【０１６０】
多発性骨髄腫患者は、破骨細胞活性の上昇と骨芽細胞による骨形成の低下を特徴とする骨減少障害を示す。マウスの骨髄腫の５Ｔ２ＭＭモデルは、老齢マウスで発症し、ヒト多発性骨髄腫患者に見られるのと同様の効果をマウスにて引き起こす自然腫瘍の一種による腫瘍細胞（５Ｔ２ＭＭ細胞）に基づいている。例えば、Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｋｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００５；１１３：１９１−２０５を参照されたい。このモデルでの効果についてＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃを試験した。
【０１６１】
Ｃ５７Ｂｌ／ＫａＬｗＲｉｊマウスに注射した５Ｔ２ＭＭ細胞は、破骨細胞面の増加、溶骨性病変の形成を促進して、骨面積の縮小を引き起こした。骨疾患は、骨芽細胞数の減少、骨芽細胞面、および石灰化の低下に関連していた。
【０１６２】
５Ｔ２ＭＭ細胞を持つマウスを、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＲＡＰ−０１１）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週２回）、またはビヒクルによって、２ＭＭ注射の時点から合計１２週間にわたって処置した。脛骨近位端および腰椎のＭｉｃｒｏＣＴ解析は、未処置マウスと比較して、５Ｔ２ＭＭ保持マウスでは海綿骨量の３９％および２１％の減少（ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）ならびに骨梁数の３７％および１５％の減少（ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）を示した。ＲＡＰ−０１１は、ビヒクル処置マウスと比較したときに、骨梁量ならびに脛骨（ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５）および椎骨（ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）の数の、５Ｔ２ＭＭによって誘発された減少を完全に予防した。骨量は、未処置マウスと比較したときに、ＲＡＰ−０１１処置マウスの脛骨では１９％高く（ｐ＝１６８）、椎骨では１２％高かった（ｐ＜０．０５）ＲＡＰ−０１１は、溶骨型骨病変の発症を防止した（ｐ＜０．０５）。この効果を図２６に示す。データの予備評価では本試験での血清パラプロテイン（多発性骨髄腫腫瘍細胞のバイオマーカー）または骨髄腫負荷に対する著しい効果を同定できなかったが、さらなる解析により、血清パラプロテインが１匹を除くすべての処置動物で実質的に低下したことと、健常骨髄の量が実質的に増加したことが示され、骨髄腫腫瘍細胞負荷が低下したことが示された。
【０１６３】
したがって、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃは、多発性骨髄腫から生じる骨疾患の効果を低下させるために、および腫瘍細胞自体を処置するために使用され得る。
【０１６４】
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃタンパク質のキャラクタリゼーション
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質は、配列番号９の組織プラスミノゲンリーダー配列を使用して、ｐＡＩＤ４ベクター（ＳＶ４０  ｏｒｉ／エンハンサー、ＣＭＶプロモーター）からの安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞で発現された。実施例で上述したように精製したタンパク質は、配列番号７の配列を有していた。Ｆｃ部分は、配列番号７に示すように、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列である。シアル酸解析によって、タンパク質が平均して、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質１分子当り約１．５〜２．５モルのシアル酸を含有することが示された。
【０１６５】
この精製されたタンパク質は、ヒト患者での２５〜３２日の半減期を含めて（下の実施例６を参照されたい）、試験したすべての動物で著しく長い血清半減期を示した。さらに、ＣＨＯ細胞発現物質は、ヒト２８３細胞で発現されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質に対して報告されたよりも、アクチビンＢリガンドに対して高い親和性を有する（ｄｅｌ  Ｒｅら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  Ｄｅｃ  １７；２７９（５１）：５３１２６−３５）。さらにｔＰａリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりも高い産生をもたらし、未処置リーダーによって発現されたＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃとは異なり、高度に純粋なＮ末端配列を与えた。未処置リーダー配列の使用によって、それぞれ異なるＮ末端配列を持つ、２つの主要な種類のＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃが生じた。
【０１６６】
（実施例５）
ヒト臨床試験
実施例５に記載したタンパク質を、健常な閉経後女性におけるタンパク質の安全性を主に評価するために実施された無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験でヒト患者に投与した。対象４８名を６名のコホートに無作為に割付けて、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃまたはプラセボのどちらかの単回用量を投与した（有効１：プラセボ１）。用量レベルは、静脈内（ＩＶ）で０．０１〜３．０ｍｇ／ｋｇおよび皮下（ＳＣ）で０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲であった。全対象を１２０日間追跡した。対象が試験開始の６ヶ月以内に骨代謝に影響を及ぼす薬剤を摂取した場合には、その対象を試験参加から除外した。用量増加を判定するために、各コホートを追跡した安全性評価を実施した。薬物動態（ＰＫ）解析に加えて、骨形成および吸収の生化学マーカーの測定、およびＦＳＨレベルにより、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの生物活性も評価した。
【０１６７】
本試験では重篤有害事象は報告されなかった。有害事象（ＡＥ）は一般に軽度で一時的であった。ＡＥの予備解析には、頭痛、臨床検査値の上昇、風邪症状、吐気または嘔吐、静脈内浸潤、および注射部位における血腫が含まれていた。
【０１６８】
ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃのＰＫ解析によって、用量との直線プロフィールと、約２５〜３２日の平均半減期が示された。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの曲線下面積（ＡＵＣ）は、用量と直線関係にあり、ＳＣ投薬後の吸収は本質的に完全であった（図２７および２８を参照）。これらのデータは、ＳＣはＩＶ投薬の最初の２、３日に伴う薬物の血清濃度の急上昇を回避しながら、薬物の同等の生物学的利用能および血清半減期を与えるため、ＳＣが投薬への所望の手法であることを示している（図２８を参照されたい）。ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃは、同化骨増殖のマーカーである骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の血清レベルの迅速で持続的な用量依存的な上昇と、骨吸収のマーカーであるＣ末端１型コラーゲンテロペプチドおよび酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂのレベルの用量依存的な低下を引き起こした。Ｐ１ＮＰなどの他のマーカーは、決定的でない結果を示した。ＢＡＰレベルは、薬物の最高投薬量にて近飽和効果を示し、この同化骨バイオマーカーに対する最大半量効果が０．３ｍｇ／ｋｇの投薬量にて達成され、増量は３ｍｇ／ｋｇまでの範囲に及ぶことが示された。薬物のＡＵＣに対する薬力学的効果の関係として、ＥＣ５０は５１，４６５（日＊ｎｇ／ｍｌ）として計算される。図２９を参照されたい。この骨バイオマーカーの変化は、試験した最高用量レベルでは約１２０日間持続された。アクチビンの阻害に一致する血清ＦＳＨレベルの用量依存的低下もあった。ＦＳＨレベルの実質的な低下は、０．１０ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの用量で見られた。３０〜４０％の平均ＦＳＨレベルの低下は１および３ｍｇ／ｋｇの投薬によって、ならびに３ｍｇ／ｋｇ用量にて個々の患者で見られ、基線に対してＦＳＨの最大５０％の低下が見られた。閉経後女性が比較的一貫して高いＦＳＨレベルを示し、ＦＳＨに対する薬物の効果の観察が比較的容易になることに注目すべきである。男性および生殖能力のある女性では、基線ＦＳＨレベルは広範に変化することがあり、特異的な阻害度を評価することが困難になるが、それにもかかわらず、アクチビン−ＦＳＨシグナル伝達軸はこれらの個人においてそのままであり、これらの集団でのＦＳＨに対する効果を定量することが困難であっても、ＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃがＦＳＨ産生をかなりの程度まで阻害することが予想される。ＦＳＨに対する効果に関する薬物のＡＵＣに対する薬力学的効果の関係として、ＥＣ５０は約２５０，０００（日＊ｎｇ／ｍｌ）として計算される。図３２を参照されたい。
【０１６９】
健常な閉経後女性に投与されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃの単回用量は安全であり、試験した用量レベルの範囲で耐容性良好であった。長期の薬物動態および薬力学的効果は、将来の試験には間欠的な投薬が適切であろうことを示唆している。例えば、血清半減期に基づく投薬は、毎月、または２、３、４、５もしくは６週間ごとにほぼ１回で実施できる。さらに、薬力学的効果は、薬物の血清滞留時間をはるかに超えて及ぶため、投薬は薬力学的効果に基づいて実施可能であり、３ヵ月後とまたは２、３、４、５、６もしくは２ヶ月ごとの投薬でさえ患者において所望の効果を産生するのに有効であり得ることを意味している。この臨床試験は、ヒトにおいてＡｃｔＲＩａ−ｈＦｃが骨形成の増加および骨吸収の減少の両方の生物学的証拠を持つ骨同化剤であることを示している。
【０１７０】
（実施例６）
ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃおよびビスホスホネートとの同時投与
ビスホスホネートは、骨粗鬆症および癌関連骨減少を含む低い骨ミネラル密度に関連する障害を処置するために広範に使用されている薬物のクラスである。ビスホスホネートは、破骨細胞を阻害する、強力な再吸収抑制活性を有するおそらく破骨細胞は骨破壊および骨増殖の両方に必要であるため、ビスホスホネートは、唯一公知の同化骨増殖剤の１つである副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の効果を低下させるように思われる（Ｂｌａｃｋら、Ｎ
Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００３  Ｓｅｐ  ２５；３４９（１３）：１２０７−１５；Ｓａｍａｄｆａｍら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００７  Ｊｕｎ；１４８（６）：２７７８−８７）。
【０１７１】
ビスホスホネートまたは他の再吸収抑制療法を以前に受けた、または同時に投与されていた患者におけるＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ処置の有用性を試験するために、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍｃとビスホスホネート化合物であるゾレドロネートを組合せてマウスで試験を行った。１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを次のように処置した：
１群  ＰＢＳ
２群  ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＲＡＰ−０１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）週２回（３および４群と共に）
３群  ゾレドロン酸（ＺＯＬ）単回用量（２０ｍｇ／ｋｇ）
４群  ＺＯＬ（１用量）、３日後、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＲＡＰ−０１１）（１ｍｇ／ｋｇ）週２回
５群  ＺＯＬ（１用量）、３日後、ＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃ（ＲＡＰ−０１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）週２回
総ＢＭＤは、ＤＥＸＡスキャン（ＰＩＸＩ）によって投薬前ならびに処置３週および８週に決定した。
【０１７２】
図３０に示すように、総ＢＭＤはすべての処置群で顕著に上昇し、ＺＯＬおよびＡｃｔＲＩＩａ−ｍＦｃの組合せは最大の効果を産生した。これらの結果は、ビスホスホネート療法を受けた患者でも、ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃタンパク質を使用して骨密度を上昇させられることを示す。
【０１７３】
（実施例７）
別のＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃタンパク質
本明細書に記載する方法に従って使用され得る各種のＡｃｔＲＩＩａ変異体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開された国際特許出願所に記載されている（例えば、ｐｐ．５５−５８を参照されたい）。別の構築物は、Ｃ末端尾部（ＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインの最後の１５アミノ酸の欠失を有し得る。このような構築物の配列を下に示す（Ｆｃ部分に下線）（配列番号１２）：
【０１７４】
【化１２】
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参照による組み込み
本明細書で現有したすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許それぞれが参照により組み込まれることが詳細および個別に指示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
本発明の詳細な実施形態が議論されたが、上の明細書は例示的であり、制限的ではない。多くの変形は、本明細書および下の請求項の検討時に当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、等価物の全範囲と共に請求項への、そしてこのような変形と共に明細書への参照によって決定すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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