(57)【要約】【課題】本発明は、抗菌剤に対する耐性変異株に抗菌作用を示す物質の候補を選択する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、第１の抗菌剤に対する第１の耐性変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を選択する方法であって、第１の抗菌剤と異なる第２の抗菌剤に対する第２の耐性変異株が、ある物質に対して抵抗性を示す場合に、前記物質を前記候補として選択することを特徴とする方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗菌剤に対する第１の耐性変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を選択する方法であって、第１の抗菌剤と異なる第２の抗菌剤に対する第２の耐性変異株が、ある物質に対して抵抗性を示す場合に、前記物質を前記候補として選択することを特徴とする、方法。
【請求項２】
第１の耐性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の耐性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の抗菌剤に対する第１の感受性変異株が、ある物質に対して感受性を示す場合に、前記物質を前記候補から除外することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１の感受性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子に変異を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第２の抗菌剤に対する第２の感受性変異株が、ある物質に対して感受性を示す場合に、前記物質を前記候補として選択することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第２の感受性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子に変異を有する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌作用を有する物質の候補を選択する方法に関する。より具体的には、本発明は、抗菌剤に対して耐性を示す変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
菌類が原因となる疾患は、数多く知られている。たとえば、アスペルギルス、カンジダ、クリプトコックスなどの真菌は、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコックス症、白癬（水虫、たむし、およびしらくも）などの疾患の原因となることが知られている（非特許文献１参照）。このような疾患の治療には、抗菌剤が用いられている。
【０００３】
抗菌剤による治療を行うと、その抗菌剤に対して耐性を有する耐性菌が出現し、その抗菌剤を用いても治療を継続することができなくなる場合があることが知られている（非特許文献２〜３参照）。このような疾患を治療するために、抗菌剤に対する耐性菌に対して抗菌作用を有する物質を取得することが求められている。
【０００４】
真菌類は、ウイルスや細菌と異なり、進化学的にヒトなどの高等真核生物と近縁であり、真菌が備える生命機構やそれに関与する蛋白質がかなり共通するため、新規薬剤の開発は困難を極める。現在上市される薬剤も、細胞壁や細胞膜のごく限られた違いをターゲットとして、限られた数があるにすぎない。これまでの真菌症治療において、個々の薬剤に対する耐性菌出現の報告は頻繁にあるが、現在のところ重大な多剤耐性真菌出現の報告はない。しかし、近年、糖尿病、エイズ、臓器移植、抗癌剤治療に係る免疫低下した患者が増加したことにより、真菌症に罹患する患者が増加の一途をたどっている。したがって、抗真菌薬の使用が増加することにより、病原性真菌が薬剤耐性を獲得する確率も飛躍的に高まっている。今後出現が予測される多剤耐性真菌は、限られた抗真菌薬しかない現状で、人類にとって大変な脅威となる。したがって、今後も新薬を開発する事が求められるだけでなく、多剤耐性真菌にも対応することができる新薬を開発する必要がある。
【０００５】
菌類が薬剤耐性を獲得する原因となる現象として、薬剤排出ポンプと呼ばれるタンパク質が変異導入によって菌類内で過剰に発現し、抗菌剤が菌類内部から外部に排出される現象が知られている。薬剤排出ポンプは、生物において高度に保存された膜輸送体であり、その発現量を制御する一連の転写因子が存在することが知られている（非特許文献４〜５参照）。
【０００６】
抗菌剤耐性菌に対して抗菌作用を有する物質を探索する方法として、薬剤排出ポンプの機能に異常がある変異株を用いる方法が知られている（特許文献１〜３参照）。これらの方法は、薬剤排出ポンプの排出を阻害する物質を探索することなどを目的としており、変異株が感受性を示す化合物を抗菌剤の候補として選択している。なお、抗真菌剤の感受性の試験方法は、各種の方法が開発されている（非特許文献６〜８）。
【０００７】
しかしながら、現実に抗菌作用を有する物質は、単一の探索方法のみによって即座に得られるものではなく、効率的に取得するためには、様々な観点からの選別基準を適切に組み合せることが必要であり、候補物質についての様々な選別基準が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００１−５０３８５７号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１８５１号公報
【特許文献３】特表平９−５０４７１６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】化学と生物  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１２，２００４
【非特許文献２】モダンメディア  ５６巻６号２０１０［真菌］１１９
【非特許文献３】医学のあゆみ  Ｖｏｌ．２０９，Ｎｏ．９，２００４．５．２９
【非特許文献４】ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｓｅｐｔ．２００６，ｐ．５８３-６０４
【非特許文献５】ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．４００  ｐｈａｓｅ  ｉｉ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ
【非特許文献６】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．Ｖｏｌ．５１，１５３−１６３，２０１０
【非特許文献７】日本臨床微生物学雑誌  Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３，２００４
【非特許文献８】モダンメディア  ５５巻１２号２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、抗菌剤に対する耐性変異株に抗菌作用を示す物質の候補を選択する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、遺伝学的手法を用いて、薬剤排出ポンプとこれを制御する転写因子について、薬剤排出機序を研究していたところ、全く意外なことに、ある抗菌剤に対する耐性変異株が特定の物質に対して抵抗性を示すことは、その物質が、その抗菌剤とは別異の抗菌剤に対する耐性変異株に抗菌作用を示す指標として有用であり、そのような物質を選択することによって、抗菌剤の耐性変異株に対する抗菌剤の候補を絞り込むことができることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、第１の抗菌剤に対する第１の耐性変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を選択する方法であって、第１の抗菌剤と異なる第２の抗菌剤に対する第２の耐性変異株が、ある物質に対して抵抗性を示す場合に、前記物質を前記候補として選択することを特徴とする方法を提供するものである。
【００１３】
また、本発明は、第１の耐性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する、上記の方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、第２の耐性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する、上記の方法を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、第１の抗菌剤に対する第１の感受性変異株が、ある物質に対して感受性を示す場合に、前記物質を前記候補から除外することを含む、上記の方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、第１の感受性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子に変異を有する、上記の方法を提供するものである。
【００１７】
さらに、本発明は、第２の抗菌剤に対する第２の感受性変異株が、ある物質に対して感受性を示す場合に、前記物質を前記候補として選択することを含む、上記の方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、第２の感受性変異株が、薬剤排出ポンプ遺伝子に変異を有する、上記の方法を提供するものである。
【００１９】
抗菌剤に耐性を示す変異株に被験物質を投与して、その変異株を殺傷した被験物質を抗菌剤の候補として選択する方法は、従来行われてきたことが推測される。この方法は、変異株が特定の物質に対して感受性を示した場合に、その物質を候補として選択する。したがって、その変異株が抵抗性を示す化合物は、抗菌剤の候補化合物から除外されることとなる。本発明の方法は、薬剤耐性を示す変異株に対する抗菌剤をスクリーニングするに際して、本来ならば候補物質から除外されるこのような化合物を候補物質として選択することによって、別の薬剤に対する耐性変異株に抗菌作用を示す物質を取得する確率を向上させるという斬新な方法である。また、本発明の方法は、従来の候補物質をスクリーニングする過程で蓄積した情報を解析する指標を工夫することによって、目的とする物質を取得する確率を高めることができ、特段の設備投資なしに簡便に実施することができる点で、画期的である。
【００２０】
本発明の選択方法の原理は、後述するように、ある薬剤に対する耐性変異株に抗菌作用を示す化合物が、その薬剤を排出する薬剤排出ポンプとは異なる薬剤排出ポンプによって排出されるという、本発明者らの実験結果をもとに得た薬剤排出機序のモデルと整合的である。このことと、薬剤排出ポンプとそれを制御する転写因子が高度に保存されていることを考え合わせると、この選択方法は、多くの菌類において有用であることが期待でき、抗菌剤の候補を選択する方法として十分な効果を有するといえる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法は、以前に行われた探索方法によって得られた解析結果を活用することによって実施することができる。したがって、本発明の方法によれば、特段の設備投資を要することなく、簡便に、目的とする抗菌剤の候補を選択することができ、これにより、抗菌剤に対して耐性を示す変異株に対して抗菌作用を有する抗菌剤の開発を容易に行うことができる。本発明の方法は、医学、畜産、農業、その他の産業（医療器具、食品、建材、生活用品）での抗菌剤開発において活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例１の薬剤感受性試験(スポット・アッセイ法)の結果を示す写真である。
【図２】図２は、実施例１の薬剤感受性試験の結果を整合的に説明するモデル図である。
【図３−１】図３は、実施例２の薬剤感受性試験(スポット・アッセイ法)の結果を示す写真である。薬剤名の下の数値は濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図３−２】図３は、実施例２の薬剤感受性試験(スポット・アッセイ法)の結果を示す写真である。薬剤名の下の数値は濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図３−３】図３は、実施例２の薬剤感受性試験(スポット・アッセイ法)の結果を示す写真である。薬剤名の下の数値は濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図４】図４は、実施例１および実施例２の薬剤感受性試験の結果を整合的に説明するモデル図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、第１の抗菌剤に対する第１の耐性変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を選択する方法を提供する。
【００２４】
第１の抗菌剤は、菌の増殖を抑制する作用を有する薬剤である。菌としては、真核生物、真正細菌、および古細菌などが挙げられる。真核生物としては、真菌、メソミセトゾア（偽粘菌・中動菌）などのオピストコンタ；動菌、変形菌・粘菌、原生粘菌（プロトステリウム類）、タマホコリカビ類、およびアクラシス類などのアメーボゾア；卵菌、ラビリンチュラ類、およびネコブカビ類などのストラメノパイル、などが挙げられる。真菌としては、ツボカビ門；クモノスカビなどのケカビ属(ムコール症)などの接合菌門；子嚢菌門；クリプトコッカスなどの担子菌門；白癬、スポロトリックス、黒色真菌などの不完全菌などが挙げられる。子嚢菌門としては、アスペルギルス、カンジダ、ニューモシスチス；出芽酵母、分裂酵母などの酵母；アオカビ、コウジカビ、アカパンカビなどのカビ；アミガサタケ、トリュフなどのキノコなどが挙げられる。また、菌としては、病原性菌が挙げられる。
【００２５】
真菌の増殖を抑制する作用を有する薬剤は、抗真菌剤と呼ばれる。抗真菌剤としては、アムホテリシンＢ（ＡＭＰＨ−Ｂ）、オリゴマイシンなどのポリエンマクロライド系の抗真菌剤；フルシトシン（５−ＦＣ）などのピリミジン誘導体の抗真菌剤；ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、イソコナゾール、スルコナゾール、オキシコナゾール、クロコナゾール、ビホナゾール、ネチコナゾール、ラノコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾールなどのアゾール系の抗真菌剤；ミカファンギン、カスポファンギン、アニデュラファンギンなどのキャンディン系の抗真菌剤；テルビナフィンなどのアリルアミン系の抗真菌剤；ブテナフィンなどのベンジルアミン系の抗真菌剤；サリチル酸、ヨードチンキ、エキサラミドなどのサリチル酸系の抗真菌剤などが挙げられる。また、抗真菌剤としては、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）などの化学発癌剤なども挙げられる。またさらに、抗真菌剤としては、マンコゼブ、ベノミルなどの農薬や、リベロマイシンＡ、セルレニン、アルテスナート、シクロヘキシミドなども挙げられる。このうち、アムホテリシンＢ、フルシトシン、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、ボリコナゾール、およびミカファンギンは、日本で深在性真菌症治療薬として使用されている。なお、ポリエンマクロライド系、アゾール系、アリルアミン系、およびベンジルアミン系の抗真菌剤は、細胞膜構成成分であるエルゴステロールを創薬のターゲットとする。また、キャンディン系の抗真菌剤は、細胞壁を創薬のターゲットとする。
【００２６】
第１の抗菌剤に対する第１の耐性変異株は、第１の抗菌剤に対して耐性を有する変異株である。ある変異株およびその変異株の野生株に対して抗菌剤を投与したとき、その変異株の増殖度が野生株に比して高い場合には、その変異株は、その抗菌剤に対して耐性を有するといえる。
【００２７】
第１の抗菌剤に対する第１の耐性変異株は、自然発生的な突然変異によって生じたものであってもよい。また、第１の耐性変異株は、公知の方法によって野生株にランダムに突然変異を導入し、その導入された変異株の中から、第１の抗菌剤に対して耐性を示す変異株を選択することによって取得したものであってもよい。
【００２８】
第１の耐性変異株は、第１の抗菌剤に対して耐性を有するだけでなく、他の抗菌剤に対して耐性を有するものであってもよい。複数の抗菌剤に対して耐性を有する耐性変異株は、多剤耐性変異株と呼ばれることがある。後述するように、本発明の方法の原理は、第１の薬剤耐性変異株において、特定の薬剤排出ポンプを含む薬剤排出経路が活性化していることを前提としている。そして、特定の薬剤排出経路が活性化した場合、その変異株は、複数の薬剤に対して耐性を示すことが通常である。単剤耐性の薬剤耐性は、標的部位の構造的変化によるものであり、薬剤排出ポンプ群の強発現によるものでない場合がある。したがって、本発明の方法は、第１の薬剤耐性変異株が多剤耐性変異株である場合において、より確実に高い効果を実現することができる。第１の耐性変異株の菌の種類としては、前述したものが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法は、第１の抗菌剤と異なる第２の抗菌剤に対する第２の耐性変異株が、ある物質に対して抵抗性を示す場合に、その物質を選択することを特徴とする。ある物質は、第２の抗菌剤自体であってもよい。
【００３０】
第２の耐性変異株は、第２の抗菌剤に対して耐性を有する変異株である。第２の抗菌剤は、第１の抗菌剤と異なる。第１の抗菌剤と第２の抗菌剤の組み合わせとしては、両者が、それぞれ、ポリエンマクロライド系、アゾール系、ピリミジン誘導体、キャンディン系、アリルアミン系、ベンジルアミン系、サリチル酸系、または化学発癌剤などからなる群から選ばれる特定の系統に属し、かつ、両者が異なる系統に属する場合などが挙げられる。たとえば、第１の抗菌剤と第２の抗菌剤の組み合わせとしては、第１の抗菌剤が、ポリエンマクロライド系の抗菌剤、アゾール系の抗菌剤、または化学発癌剤であり、かつ、第２の抗菌剤が、サリチル酸系の抗菌剤である組み合わせが挙げられる。
【００３１】
第２の耐性変異株は、第１の抗菌剤に対して耐性であってもよいし、感受性であってもよい。第２の耐性変異株が第１の抗菌剤に対して感受性である場合には、後述のモデルによれば、第１の抗菌剤と第２の抗菌剤は、異なる薬剤排出経路によって排出されるといえる。後述のように、本発明の方法の原理は、第１の抗菌剤と第２の抗菌剤が異なる薬剤排出経路によって排出されることを利用する。したがって、この場合、より確実に本発明における所望の効果が得られる。
【００３２】
第２の耐性変異株が、第１の抗菌剤に対しても耐性である場合には、第１の抗菌剤と第２の抗菌剤の薬剤排出経路が異ならない可能性がある。この場合には、第１の耐性変異株として、第２の抗菌剤に対して感受性を示す変異株を用いることが好ましい。この組み合わせの場合、第１の抗菌剤と第２の抗菌剤の排出経路が異なるといえるため、本発明の方法の原理に基づき、より確実に本発明における所望の効果を得ることができる。
【００３３】
第２の耐性変異株は、第１の耐性変異株と同様に、自然発生的な突然変異によって生じたものであってもよく、また、ランダムに突然変異を導入して得た変異株の中から選択して取得したものであってもよい。
【００３４】
また、本発明の方法は、第１の耐性変異株の場合と同一の理由により、第２の耐性変異株が多剤耐性変異株である場合において、より高い効果を実現することができる。
【００３５】
第２の耐性変異株の菌の種類としては、先に菌として列挙したものが挙げられる。後述のように、本発明の方法が依拠する原理は、第１の耐性変異株の野生株と第２の耐性変異株の野生株が共通の薬剤耐性排出経路を有することを前提とする。したがって、本発明の方法の原理に基づく高い効果を得る観点から、第１の耐性変異株と第２の耐性変異株は、同一の野生株に由来することが好ましい。
【００３６】
本発明の方法が選択する物質は、第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質である。第２の耐性変異株およびその野生株に対して特定の物質を投与した場合において、その野生株の増殖が低下し、かつ、第２の耐性変異株が野生株よりも高い増殖度を示す場合には、投与したその物質は、第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質であるということができる。野生株または第２の耐性変異株の増殖度の測定は、後述の実施例において行われたスポット・アッセイによって行ってもよいし、日本医真菌学会の「酵母の抗真菌薬感受性試験法」（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．，Ｖｏｌ．５１，１５３−１６３，２０１０）に基づいて行ってもよい。なお、抗菌剤の開発にあたって、スクリーニングが行われる場合、抗菌作用を有する物質の膨大なストックが蓄積される。これらのストックの中には、上市された抗菌剤よりも薬効が劣るために、実用化されていないものもあると考えられる。このストックについては、スクリーニングの結果として、どの薬剤耐性の変異株に対してどの物質が感受性を示すか否かについての情報が存在する。したがって、新たな実験を行うことなく、抗菌剤に対する耐性変異株が抵抗性を示す物質を選択することができる。しかも、これらのストックは、重篤な副作用を引き起こすかどうかなど、医薬品としての臨床に必要な複数の項目が既に検査されていることが多い。したがって、検討する物質としてこのストックを用いれば、迅速に臨床化することができる有効な抗菌剤を低価格で開発できる。耐性変異株が抵抗性を示す物質は、従来のスクリーニング方法では無用なものとして活用されていなかったものであり、これを活用する点でも、本発明の方法は画期的である。
【００３７】
本発明の方法が行う選択は、単独の物質を用いる方法として行ってもよいが、複数の物質を用いるハイコンテンツスクリーニング方法として行ってもよい。ある物質に対して第２の耐性変異株が抵抗性を示すかどうかは、その物質を第２の耐性変異株およびその野生株に投与した後の増殖度に基づき判断することができるが、増殖度は、視覚的に容易に把握することが可能である。したがって、本発明の方法は、ハイコンテンツスクリーニング方法に適している。
【００３８】
本発明の方法は、第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質を選択することを特徴とする。後述の実施例において示すモデルによっても明らかなように、ある物質に対して第２の耐性変異株が抵抗性を示すことは、その物質が第１の抗菌剤とは異なる薬剤排出経路によって排出されることの指標としての意義を有する。そして、後述の実施例において明らかになったモデルによれば、ある物質が目的とする抗菌剤と異なる薬剤排出経路によって排出される場合には、その物質は、目的とする抗菌剤に対する耐性変異株に対して抗菌作用を有する可能性が高い。したがって、複数の候補物質の中から、その物質を選択することによって、第１の抗菌剤に対する耐性変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を選択することができる。なお、ここで、物質の候補の選択とは、複数の物質の中から、最適な物質を選択するための絞り込みの手段として、候補物質の数を減らすことの意味を包含する。したがって、選択した化合物の全てが所望の抗菌作用を有しない場合であっても、候補物質の数を減らすことができれば、本発明の目的の効果は得られたといえる。
【００３９】
以下、好ましい態様の本発明の方法について説明する。好ましい態様の本発明の方法において、第１の耐性変異株は、薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する。
【００４０】
薬剤排出ポンプは、細胞内に侵入した生体外物質を細胞外へ排出する膜輸送体である。多くの生物が、様々な薬剤排出ポンプを有することが知られている。薬剤排出ポンプとしては、ＡＢＣトランスポーター、主要促進因子スーパーファミリー（Ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒ  ｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ））などが挙げられる。これらの薬剤排出ポンプは基質特異性がゆるく、同一ポンプにおいても複数の薬剤が排出される。出芽酵母の薬剤排出ポンプとしては、Ａｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ１０ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐ、Ｐｄｒ１２ｐ、Ｔｐｏ１ｐなどが挙げられる。薬剤排出ポンプ遺伝子は、薬剤排出ポンプをコードする遺伝子である。
【００４１】
薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子は、薬剤排出ポンプ遺伝子の発現を制御する転写因子である。この転写因子に機能獲得性突然変異（優性の形質）が生じると、発現制御している薬剤排出ポンプ群を恒常的に強発現する。薬剤排出ポンプ群が強発現することで、細胞内に侵入した多種類の薬剤が速やかに細胞外へ排出されて多剤耐性形質を示すこととなる。出芽酵母の場合、この転写因子としては、たとえば、Ｙｒｍ１ｐ、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐなどが挙げられる。Ｙｒｍ１ｐは、たとえば、Ａｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐの発現を制御する。Ｙｒｒ１ｐは、たとえば、Ａｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐの発現を制御する。Ｐｄｒ１ｐは、たとえば、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐ、Ｔｐｏ１ｐの発現を制御する。Ｐｄｒ３ｐは、たとえば、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐの発現を制御する。
【００４２】
個々の詳細な遺伝子情報、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ＧＥＮＯＭＥ  ＤＡＴＡＢＡＳＥ（ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）などの公知のデータベースにより得ることができる。
【００４３】
薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する第１の耐性変異株は、たとえば、公知の方法によって野生株にランダムに突然変異を導入し、その導入された変異株のゲノムの塩基配列を解読し、所望の遺伝子に変異が導入されていた変異株を選択することによって取得することができる。
【００４４】
第１の耐性変異株が出芽酵母である場合には、第１の耐性変異株としては、たとえば、以下の表１〜３に示すＰｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐ、Ｙｒｒ１ｐの変異株が挙げられる。Ｐｄｒ１ｐは、１０６８アミノ酸残基からなる１２１．８ｋＤａである。Ｐｄｒ３ｐは、９７６アミノ酸残基からなる１１２．６ｋＤａである。Ｙｒｒ１ｐは、８１０アミノ酸残基からなる９２．５ｋＤａである。Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐ、Ｙｒｒ１ｐは、いずれも、ＤＮＡ結合ドメインであるジンク・フィンガー・モチーフを有する。
【表１】
2014195452.tif 000002
【表２】
2014195452.tif 000003
【表３】
2014195452.tif 000004
【００４５】
これらの変異株は、複数の抗真菌剤に対して耐性を示す。関連する文献を以下に示す。
Reid, R. J., et al., J. Biol. Chem., 272, 12091-12099, 1997
Kean, L. S., et al., J. Cell Biol., 138, 255-270, 1997
Wendler, F., et al., J. Biol. Chem., 272, 27091-27098, 1997
Carvajal, E., et al., Mol. Gen. Genet., 256, 406-415, 1997
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Mizoguchi, H., et al., J. Biosci. Bioeng., 88, 20-25, 1999
Mizoguchi, H., et al., J. Biosci. Bioeng., 93, 221-227, 2002
Cui, Z., et al., Mol. Microbiol., 29, 1307-1315, 1998
Zhang, X., et al., J. Biol. Chem., 276, 8812-8819, 2001
Keeven, J., et al., Curr. Genet., 41, 11-19, 2002
【００４６】
ポリエンマクロライド系、アゾール系、キャンディン系、または化学発癌剤に属する多くの抗真菌剤に対する耐性変異株としては、たとえば、Ｐｄｒ１ｐの変異株、およびＰｄｒ３ｐの変異株が挙げられる。また、サリチル酸系の抗真菌剤に対する耐性変異株としては、たとえば、Ｙｒｒ１ｐの変異株、およびＹｒｍ１ｐの変異株が挙げられる。第１の耐性変異株として、Ｐｄｒ１ｐの変異株、またはＰｄｒ３ｐの変異株を用いる場合には、多剤耐性菌として臨床上問題となる多くの突然変異株に有効な抗真菌剤を開発することができ、実用性が高い。
【００４７】
薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する第１の耐性変異株は、当該転写因子によって制御される薬剤排出ポンプの発現量が向上している変異株、特に、その発現量が常時向上している変異株が好ましい。その場合、本発明の方法が依拠する後述の原理との整合性が高く、より確実に本発明の所望の効果が得られる。薬剤排出ポンプの発現量が向上している変異株は、ランダムに突然変異を導入し、その導入された変異株における薬剤排出ポンプの発現量を公知の方法によって測定し、野生株に比して発現量が向上している変異株を選択することによって取得することができる。
【００４８】
別の好ましい態様の本発明の方法において、第２の耐性変異株は、薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子の遺伝子に変異を有する。第２の耐性変異株の例としては、第１の耐性変異株について説明したものが挙げられる。好ましくは、第２の耐性変異株において変異を有する薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子は、第１の耐性変異株において変異を有する薬剤排出ポンプ遺伝子を制御する転写因子と異なる。第１の耐性変異株と第２の耐性変異株の組み合わせとしては、たとえば、第１の耐性変異株としてＰｄｒ１ｐの変異株、またはＰｄｒ３ｐの変異株を用いて、かつ、第２の耐性変異株としてＹｒｒ１ｐの変異株、またはＹｒｍ１ｐの変異株を用いる組み合わせが挙げられる。第２の耐性変異株が、Ｙｒｒ１ｐの変異株、またはＹｒｍ１ｐの変異株である場合には、多剤耐性菌として臨床上問題となる多くの突然変異株に有効な抗真菌剤を開発することができ、実用性が高い。
【００４９】
別の好ましい態様の本発明の方法は、第１の抗菌剤に対する第１の感受性変異株が、ある物質に対して感受性を示す場合に、前記物質を前記候補から除外することを含む。
【００５０】
第１の感受性変異株は、第１の抗菌剤に対して感受性を示す変異株である。ある変異株およびその変異株の野生株に対して抗菌剤を投与したとき、その変異株の増殖度が野生株に比して低い場合には、その変異株は、その抗菌剤に対して感受性を示すといえる。
【００５１】
第１の抗菌剤に対する第１の感受性変異株は、自然発生的な突然変異によって生じたものであってもよい。また、第１の感受性変異株は、公知の方法によって野生株にランダムに突然変異を導入し、その導入された変異株の中から、第１の抗菌剤に対して感受性を示す変異株を選択することによって取得したものであってもよい。
【００５２】
第１の感受性変異株の菌の種類としては、前述したものなどが挙げられる。後述のように、本発明の方法が依拠する原理は、第１の耐性変異株の野生株と第１の感受性変異株の野生株が共通の薬剤耐性排出経路を有することを前提とする。したがって、本発明の方法の原理に基づく高い効果を得る観点から、第１の耐性変異株と第１の感受性変異株は、同一の野生株に由来することが好ましい。
【００５３】
この好ましい態様の本発明の方法は、第１の感受性変異株が感受性を示す物質を候補から除外することを含む。第１の感受性変異株およびその野生株に対してある物質を投与した場合において、第１の感受性変異株が野生株よりも低い増殖度を示す場合には、投与したその物質は、第１の耐性変異株が感受性を示す物質であるということができる。
【００５４】
後述のモデルによれば、薬剤排出ポンプを制御する転写因子は、複数の薬剤排出ポンプを制御し、かつ、薬剤排出ポンプを制御する転写因子には重複がありうるため、第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質であっても、第１の耐性変異株において活性化している薬剤排出ポンプによって排出されることがありうる。このような転写因子の重複のために、本発明の方法によって第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質を取得しても、所望の効果が得られない場合がある。第１の感受性変異株が感受性を示す物質を除外することによって、薬剤排出経路の活性化の重複に伴う偽陽性の物質を除外することができ、より高い精度で候補を絞り込むことができる。
【００５５】
第１の感受性変異株が、薬剤排出ポンプに変異を有する場合には、後述するモデルに一層合致し、本発明の方法の原理に一層適合するため、候補を絞り込む精度が一層高い。第１の感受性変異株における薬剤排出ポンプの変異としては、たとえば、薬剤排出ポンプの機能低下型変異が挙げられる。機能低下型変異は、野生型に比して遺伝子の機能が低下している変異である。機能低下型変異としては、機能を欠損した変異である機能欠損変異などが挙げられる。遺伝子全体を欠失した変異は、機能欠損変異の一例である。
【００５６】
たとえば、第１の感受性変異株は、１又は複数の株であってもよく、各々の株が１又は複数の種類の薬剤排出ポンプに変異を有していてもよい。たとえば、各第１の感受性変異株において変異を有する薬剤排出ポンプは、第１の耐性変異株において変異を有する薬剤排出ポンプを制御する転写因子と同じ転写因子によって制御されるものであってもよい。第１の耐性変異株、第２の耐性変異株、および第１の感受性変異株の組み合わせとしては、たとえば、第１の耐性変異株が、Ｐｄｒ１ｐの変異株、またはＰｄｒ３ｐの変異株であり、第２の耐性変異株が、Ｙｒｒ１ｐの変異株、またはＹｒｍ１ｐの変異株であり、第１の感受性変異株が、Ｐｄｒ５ｐの変異株、Ｓｎｑ２ｐの変異株、Ｙｏｒ１ｐの変異株、および／またはＰｄｒ１５ｐの変異株である場合が挙げられる。
【００５７】
別の好ましい態様の本発明の方法は、第２の抗菌剤に対する第２の感受性変異株が、ある物質に対して感受性を示す場合に、前記物質を前記候補として選択することを含む。
【００５８】
第２の感受性変異株は、第２の抗菌剤に対して感受性を示す変異株である。ある変異株およびその変異株の野生株に対して抗菌剤を投与したとき、その変異株の増殖度が野生株に比して低い場合には、その変異株は、その抗菌剤に対して感受性を示す変異株ということができる。
【００５９】
第２の感受性変異株は、自然発生的な突然変異によって生じたものであってもよい。また、第２の感受性変異株は、公知の方法によって野生株にランダムに突然変異を導入し、その導入された変異株の中から、第２の抗菌剤に対して感受性を示す変異株を選択することによって取得したものであってもよい。
【００６０】
第２の感受性変異株の菌の種類としては、前述のものなどが挙げられる。後述のモデルから明らかなように、本発明の方法が依拠する原理は、第１の耐性変異株の野生株と第２の感受性変異株の野生株が共通の薬剤耐性排出経路を有することを前提とする。したがって、本発明の方法の原理に基づく高い効果を得る観点から、第１の耐性変異株と第２の感受性変異株は、同一の野生株に由来することが好ましい。
【００６１】
第２の感受性変異株が感受性を示す物質の選択は、第２の感受性変異株およびその野生株に対してある物質を投与した結果、第２の感受性変異株が野生株よりも低い増殖度を示す場合に、投与したその物質を選択することによって行うことができる。
【００６２】
後述のモデルによれば、薬剤排出ポンプを制御する転写因子は、複数の薬剤排出ポンプを制御し、かつ、薬剤排出ポンプを制御する転写因子には重複がありうるため、第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質であっても、第１の耐性変異株において活性化している薬剤排出ポンプによって排出されることがありうる。このような転写因子の重複のために、本発明の方法によって第２の耐性変異株が抵抗性を示す物質を取得しても、所望の効果が得られない場合がある。第２の感受性変異株が感受性を示す物質を選択することによって、薬剤排出経路の活性化の重複に伴う偽陽性の物質を除外することができ、より高い精度で候補を絞り込むことができる。
【００６３】
別の好ましい態様の本発明の方法において、第２の感受性変異株は、薬剤排出ポンプ遺伝子に変異を有する。第２の感受性変異株が、薬剤排出ポンプに変異を有する場合には、後述するモデルに一層合致し、本発明の方法の原理に整合するため、候補を絞り込む精度が高い。第２の感受性変異株における薬剤排出ポンプの変異としては、たとえば、薬剤排出ポンプの機能低下型変異が挙げられる。機能低下型変異とは、野生型に比して、遺伝子の機能が低下している変異をいう。機能低下型変異は、機能を欠損した変異である機能欠損変異を含む。遺伝子全体を欠失した変異は、機能欠損変異の一例である。
【００６４】
たとえば、第２の感受性変異株は、１又は複数の株であってもよく、各々の株が１又は複数の種類の薬剤排出ポンプに変異を有していてもよい。たとえば、各第２の感受性変異株において変異を有する薬剤排出ポンプは、第２の耐性変異株において変異を有する薬剤排出ポンプを制御する転写因子と同じ転写因子によって制御されるものであってもよい。たとえば、第１の耐性変異株、第２の耐性変異株、および第２の感受性変異株の組み合わせとしては、第１の耐性変異株が、Ｐｄｒ１ｐの変異株、またはＰｄｒ３ｐの変異株であり、第２の耐性変異株が、Ｙｒｒ１ｐの変異株、またはＹｒｍ１ｐの変異株であり、第２の感受性変異株が、Ｓｎｇ１ｐの変異株、Ａｚｒ１ｐの変異株、および／またはＦｌｒ１ｐの変異株である場合などが挙げられる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００６６】
実験手法：
以下の実施例において、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の分子遺伝学的実験手法は、以下の実験書に基づいて行った。
・Ｄ．Ｃ．Ａｍｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．Ｂｕｒｋｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｎ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００５．
・水野貴之、バイオ実験イラストレイテッド７  使おう酵母  できるＴｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ、秀潤社．
また、分子生物学実験の各種方法は、以下のマニュアルを用いて行った。
・Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９．
【００６７】
試験例１．出芽酵母変異株の入手：
ｙｒｒ１−５２株（ＹＲＲ１突然変異による多剤耐性株）、ｐｄｒ１−３株（ＰＤＲ１突然変異による多剤耐性株）、ｐｄｒ３−１１株（ＰＤＲ３突然変異による多剤耐性株）、ｓｎｇ１欠損株（薬剤排出ポンプ欠損株）、ｐｄｒ５欠損株（薬剤排出ポンプ欠損株）、ｓｎｑ２欠損株（薬剤排出ポンプ欠損株）、およびｙｏｒ１欠損株（薬剤排出ポンプ欠損株）を以下のようにして入手した。これらは、いずれも、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＢＹ４７４２株の派生株である。
【００６８】
（１）ＢＹ４７４２株：
ＢＹ４７４２株は、文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＢＲＰ）］「酵母」より購入した。
【００６９】
（２）ｓｎｇ１欠損株、ｐｄｒ５欠損株、ｓｎｑ２欠損株、ｙｏｒ１欠損株：
ｓｎｇ１欠損株、ｐｄｒ５欠損株、ｓｎｑ２欠損株、ｙｏｒ１欠損株は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）より購入した。
【００７０】
（３）ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、ｐｄｒ３−１１株：
ＹＣｐｌａｃ１１１（ＮＢＲＰより購入）プラスミドに各々の突然変異型遺伝子を連結した各構築物を、各遺伝子欠損酵母株（ｙｒｒ１欠損株、ｐｄｒ１欠損株、ｐｄｒ３欠損株）に導入して、上記の突然変異株を得た。なお、ｙｒｒ１欠損株、ｐｄｒ１欠損株、ｐｄｒ３欠損株は、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）より購入した（これらは全てＢＹ４７４２派生株である）。変異導入用の各構築物の構築方法を以下に記す。
【００７１】
ａ．ＹＣｐｌａｃ１１１にｙｒｒ１−５２突然変異遺伝子を連結した構築物（ＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２）：
「バイオ実験イラストレイテッド  ７  使おう酵母できる  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ」に記すガラス・ビーズを用いたゲノムＤＮＡ抽出法により、突然変異を有するＫｉｎＳａｌ０５２株（論文未発表）からゲノムＤＮＡを抽出した。なお、ＫｉｎＳａｌ０５２株は、Ｙｒｒ１ｐの６１６番目のＳｅｒがＰｈｅに置換する変異有する。このＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲを行うことにより、突然変異ｙｒｒ１コード領域とその上流・下流を含むＤＮＡを増幅した。使用したプライマーは、５’−ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号１）と５’−ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴ−３’（配列番号２）である。これらのプライマーの５’末端側には制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を付加した。東洋紡のＫＯＤ−ＦＸ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、その添付文書に記す通りにＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズのＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用いた。ＰＣＲプログラムは、９５℃２分に続き、９５℃３０秒と５５℃３０秒と６８℃３分を３０サイクル行った。反応終了後、反応溶液をキアゲン社の「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を用いて増幅断片の精製を行った。増幅断片とベクターは制限酵素ＢａｍＨＩで消化を行い、実験マニュアルに記すようにライゲーションと大腸菌に形質転換を行うことにより、構築物（ＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２）を得た。本構築物のｙｒｒ１欠損株への導入は、実験書に記す酢酸リチウム法により行った。そして、ＹＣｐｌａｃ１１１プラスミドのロイシン要求性マーカーを指標にして組換え体を選択し、ｙｒｒ１−５２株を取得した。
【００７２】
ｂ．ＹＣｐｌａｃ１１１にｐｄｒ１−３突然変異遺伝子を連結した構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ１−３）：
本構築物もＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２の場合と同様の方法によって取得した。ｐｄｒ１−３株は、Ｐｄｒ１ｐの８１５番目のアミノ酸がＰｈｅからＳｅｒに置換した変異株である。以下、ＹＣｐ−ｙｒｒ１−５２の場合との変更点を記す。ＰＣＲに使用したゲノムＤＮＡは、ＢＹ４７４２株から取得した。このＤＮＡを鋳型にして、まず野生型ＰＤＲ１遺伝子を増幅した。使用したプライマーは、フォワード・プライマーが５’−ＡＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣ−３’（配列番号３）であり、この５’末端側には制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を新たに付加した。そして、リバース・プライマーは５’−ＡＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＣＧＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＴＴＣＴ−３’（配列番号４）であり、これも５’末端側に制限酵素ＳａｌＩの認識配列を新たに付加した。ＰＣＲ反応は上記と同様に行い精製を行った。プラスミドへの連結も使用した制限酵素以外は同様に行い、大腸菌に形質転換を行うことにより、野生型ＰＤＲ１構築物を作製した（ＹＣｐ−ｐｄｒ１）。つづいて突然変異型ｐｄｒ１遺伝子を作製するために、上記構築物ＹＣｐ−ＰＤＲ１を鋳型にしてＰＣＲを行った。それに用いたリン酸基を付加したプライマーは、フォワード・プライマーが５’−ＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＡＣＴＣＧＴＡ−３’（配列番号５）であり、リバース・プライマーが５’−ＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＴＡＴＡ−３’（配列番号６）である。ＰＣＲ条件も上記と基本的に同様であるが、プログラムを以下の通りとした。すなわち、９４℃で２分のあと、９４℃３０秒と５５℃３０秒と６８℃１１分を３０サイクル行った。反応溶液を精製後、増幅産物のみを用いてセルフ・ライゲーション（自己環状化）を行って、大腸菌に形質転換を行うことで、構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ１−３）を得た。
【００７３】
ｃ．ＹＣｐｌａｃ１１１にｐｄｒ３−１１突然変異遺伝子を連結した構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ３−１１）：
本構築物はＹＣｐ−ｐｄｒ１−３と同様に、２段階のＰＣＲにより作製した。ｐｄｒ３−１１株は、Ｐｄｒ３ｐの９５７番目のアミノ酸がＧｌｙからＡｓｐに置換した変異株である。一回目のＰＣＲは、ＢＹ４７４２株のゲノムＤＮＡを鋳型にして、フォワード・プライマー（５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＴＡＡＣＴＧ−３’［配列番号７］）とリバース・プライマー（５’−ＡＡＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴ−３’［配列番号８］）を用いて増幅を行った。これらのプライマーにも制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩの認識配列を新たに付加した。二回目のＰＣＲには、一回目のＰＣＲに基づき構築されたＹＣｐ−ｐｄｒ３を鋳型に、フォワード・プライマー（５’−ＴＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＣ−３’［配列番号９］）とリバース・プライマー（５’−ＴＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣ−３’［配列番号１０］）を用いて増幅を行った。この増幅産物をセルフ・ライゲーションし、大腸菌に形質転換することにより、構築物（ＹＣｐ−ｐｄｒ３−１１）を得た。
【００７４】
実施例１．出芽酵母の薬剤感受性試験（スポット・アッセイ法）１：
試験例１によって入手した酵母を用いて、以下のようにして薬剤感受性試験を行った。
（１）酵母終夜培養希釈液の調製：
ａ．  出芽酵母ＢＹ４７４２野生株と試験例１で得たその派生変異株を、クリーンベンチ内でＹＰＤ固形培地に植菌した。培地を３０℃に設定した培養器内で３日程度保温して、コロニーを形成させた。次に、クリーンベンチ内で、各々の株のコロニーを一つ滅菌した竹串でかきとり、試験管内の１ｍｌのＹＰＤ液体培地に移植した。その試験管を同様に３０℃の培養器内で２４時間以上振とう培養を行った。
ｂ．  培養が終了した試験管を用いて、クリーンベンチ内で以下の操作を行った。まず、滅菌したサンプルチューブに０．９ｍｌのＹＰＤ液体培地を加え、それを一株につき５本用意した。良く撹拌した液体培養から０．１ｍｌをマイクロピペットで取り出し、用意した一本のチューブに加えて混合した。この操作により、１０倍希釈液を作製した。さらに、この希釈液から０．１ｍｌ取り出し、新しいチューブへ移し混合することで、さらに原液の１００倍希釈液を作製した。この操作を繰り返して、最終的に５本の希釈系列（１０倍、１００倍、・・・）を各株で作製した。
【００７５】
（２）薬剤を含有するＹＰＤ固形培地の作製：
目的の薬剤を含有する試験用固形培地は、以下のようにして作製した。サリチル酸および４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）は和光純薬より、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびフルコナゾールは東京化成工業より購入した。各々の抗真菌剤をＤＭＳＯで溶解したストック溶液を作製した。メディウム瓶にＹＰＤと最終濃度２％になるように寒天末を加えて、オートクレーブ滅菌を行った。終了後、培地はウォーター・バスで６５℃に保温した。クリーンベンチ内で、３０ｍｌの培地を滅菌ピペットで取り出し、滅菌済のカップへ移した。そこへ、目的の最終濃度となるように、薬剤のストック溶液をマイクロピペットを用いて加えて、十分に混合を行った。そして、滅菌シャーレに本液体を注ぎ、クリーンベンチ内で固化させると共に十分に乾燥を行った。
【００７６】
（３）スポット・アッセイの実施：
各種薬剤を含む固形培地をクリーンベンチ内に並べて、各株の液体培養の希釈系列をスポットした。スポットする際は、液体培養の入ったチューブを十分に攪拌したのち、マイクロピペットで１０μｌずつ固形培地の数ミリ上方から培地上に滴下を行った。全ての培養希釈系列を滴下して乾燥を行い、シャーレのふたをして、３０℃の培養器で２日間培養を行った。コロニー形成したシャーレは、野生株、多剤耐性株、排出ポンプ遺伝子欠損株の生育状況を観察するとともに、写真撮影を行った。なお、対照実験としては、薬剤を含まないＹＰＤ固形培地を用いた。
【００７７】
結果を図１に示す。図１Ｃ〜Ｆに示すように、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株は、４−ＮＱＯ、ケトコナゾール、ミコナゾール、およびフルコナゾールを含む培地において、出芽酵母ＢＹ４７４２野生株よりも、高い増殖度を示した。このことから、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株は、４−ＮＱＯ、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾールなどの多数の薬剤に対して耐性を示す多剤耐性真菌であることがわかる。
【００７８】
図１Ｂと図１Ａとの比較から、サリチル酸は、出芽酵母ＢＹ４７４２野生株の増殖を低下させる作用を有することがわかる。図１Ｂに示すように、多剤耐性菌であるｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株は、サリチル酸を含む培地上において、出芽酵母ＢＹ４７４２野生株と同程度にしか増殖しなかった。このことから、サリチル酸は、多剤耐性真菌であるｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株を、野生株と同程度に殺傷する抗真菌作用を有し、多剤耐性真菌に対して有効であることがわかる。
【００７９】
試験例２．Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ａｚｒ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、およびＰｄｒ１５ｐの作用機序の解析：
Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、Ｐｄｒ３ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ａｚｒ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、およびＰｄｒ１５ｐの作用機序を検討すべく、ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株におけるＳｎｇ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ａｚｒ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、およびＰｄｒ１５ｐの各種の薬剤排出ポンプの遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲの方法によって定量的に調べた。各酵母株をＹＰＤ液体培地中で対数増殖期まで培養を行い、得られた菌体からニッポンジーン社のＩＳＯＧＥＮを用いて全ＲＮＡ抽出を行い、東洋紡社のＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅを用いて逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、遺伝子特異的プライマーと東洋紡社のＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘを用いてＰＣＲ反応を行い、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ７７００遺伝子解析装置により、アクチン遺伝子を内部標準にして定量を行った。測定結果を表４に示す。
【表４】
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【００８０】
表４に示すように、ｙｒｒ１−５２株においては、ＡＺＲ１（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝２３．３８／０．７８）、ＳＮＧ１（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝１０．５４／１．１７）、ＦＬＲ１（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝３．４７／０．８２）、ＳＮＱ２（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝３．９５／１．０２）、およびＹＯＲ１（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝２．５７／０．７４）の発現量が、野生株に比して亢進していた。一方で、ｙｒｒ１−５２株において、ＰＤＲ５（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝１．２３／１．１８）とＰＤＲ１５（ｙｒｒ１−５２株／野生株＝１．１８／０．９９）の発現量の変化は観察されなかった。ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株においては、ＳＮＱ２（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝５．７９／２．７３／１．０２）、ＹＯＲ１（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝１４．３９／１．９３／０．７４）、ＰＤＲ５（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝１８．９８／１２．９７／１．１８）、およびＰＤＲ１５（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝２．８１／１６．０４／０．９９）の発現量が、野生株に比して亢進していた。しかし、両株では、ＡＺＲ１（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝１．４０／１．２６／０．７８）、ＳＮＧ１（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝１．２０／１．０１／１．１７）、およびＦＬＲ１（ｐｄｒ１−３株／ｐｄｒ３−１１株／野生株＝１．５７／１．１５／０．８２）の発現量の亢進は観察されなかった。
【００８１】
この結果と図１Ａ〜Ｆの結果を合わせると、以下のように考察することができる。
まず、サリチル酸に関しては、図１Ｂの結果に基づき以下のように考察することができる。
（１）サリチル酸の排出ポンプはＳｎｇ１ｐであるので、ｓｎｇ１欠損株ではサリチル酸に対して感受性を示す（図１Ｂのｓｎｇ１Δ参照）。
（２）Ｙｒｒ１ｐは、ＳＮＧ１の発現制御を行うので、その突然変異株であるｙｒｒ１−５２株はＳｎｇ１ｐを強発現することで、サリチル酸に対して抵抗性を示す（図１Ｂのｙｒｒ１−５２参照）。
（３）Ｐｄｒ１ｐとＰｄｒ３ｐはＳＮＧ１の発現制御を行わないので、それらの突然変異株であるｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株はＳｎｇ１ｐが強発現しない。そのため、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株は、サリチル酸に対して野生株と同等の感受性を示す（図１Ｂのｐｄｒ１−３およびｐｄｒ３−１１参照）。
【００８２】
アゾール系の代表的な抗真菌剤であるケトコナゾール、ミコナゾール、およびフルコナゾールに関しては、図１Ｄ〜Ｆの結果に基づき以下のように考察することができる。
（１）これらはＰｄｒ５ｐによって排出されるので、ｐｄｒ５欠損株は、これらの抗真菌剤に高い感受性を示す（図１Ｄ〜Ｆのｐｄｒ５Δ参照）。
（２）Ｐｄｒ５ｐは、Ｐｄｒ１ｐとＰｄｒ３ｐにより発現制御されるので、それらの突然変異株であるｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株では、Ｐｄｒ５ｐが強発現する。したがって、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株は、これらの抗真菌剤に抵抗性を示す（図１Ｄ〜Ｆのｐｄｒ１−３およびｐｄｒ３−１１参照）。
（３）Ｙｒｒ１ｐはＰｄｒ５ｐの発現制御を行わないので、その突然変異株であるｙｒｒ１−５２株は、これらの抗真菌剤に対して野生株と同等の感受性を示す（図１Ｄ〜Ｆのｙｒｒ１−５２参照）。
【００８３】
化学発癌剤である４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）に関しては、図１Ｃの結果に基づき以下のように考察することができる。
（１）４−ＮＱＯは排出ポンプＳｎｑ２ｐにより排出されるので、ｓｎｑ２欠損株は、４−ＮＱＯに対して強感受性を示す（図１Ｃのｓｎｑ２Δ参照）。
（２）Ｓｎｑ２ｐは、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、およびＰｄｒ３ｐのいずれによっても発現制御されるので、これらの突然変異株であるｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株の全てにおいて、Ｓｎｑ２ｐが強発現する。そのため、ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株の全てが、４−ＮＱＯに対して抵抗性を示す（図１Ｃのｙｒｒ１−５２、ｐｄｒ１−３、およびｐｄｒ３−１１参照）。
【００８４】
以上の実験結果の考察を整合的に説明するモデルを図２に提示する。図２のモデルを以下に説明する。図２のモデルにおいて、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、およびＰｄｒ３ｐは、転写因子である。Ａｚｒ１ｐ、Ｓｎｇ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、およびＰｄｒ１５ｐは、薬剤排出ポンプである。薬剤排出ポンプと転写因子を結ぶ矢印は、その薬剤排出ポンプの発現量が、その転写因子によって制御されていることを示している。図２のモデルにおいては、薬剤排出ポンプと排出薬剤とが矢印によって結ばれている。これは、その排出薬剤が、その薬剤排出ポンプによって特異的に排出されることを示している。なお、転写因子Ｙｒｍ１ｐとその制御ポンプについて（J Biol Chem. 2003 Dec 26;278(52):52641-50）、および薬剤排出ポンプＹｏｒ１ｐとその排出薬剤オリゴマイシンについて（Mol Cell Biol. 1995 Dec;15(12):6875-83）は、すでに知られている情報に基づく。
【００８５】
以上のモデルと実験結果をもとにして、以下のように考察することができる。
（１）排出ポンプ遺伝子群は、上流の転写因子により厳密に発現制御を受けている。
（２）各々の転写因子は、転写調節する下流遺伝子群が決まっているが、それらは他の転写因子の制御遺伝子群とかなり共通している。
（３）各転写因子に優性の突然変異が生じると、恒常的に下流の排出ポンプ群の遺伝子が強発現する。
（４）その結果、それらの変異株では、恒常的に強発現された排出ポンプ群により、多剤耐性が引き起こされる。
（５）薬剤耐性といっても、突然変異が生じる転写因子により、抵抗性が高まる薬剤は異なる。たとえば、ケトコナゾールなどのアゾール系抗真菌剤やその他の抗真菌剤（キャンディン系）は、転写因子Ｐｄｒ１ｐやＰｄｒ３ｐの制御下で、排出ポンプＰｄｒ５ｐにより排出される。サリチル酸は、転写因子Ｙｒｒ１ｐやＹｒｍ１ｐの制御下で、排出ポンプＳｎｇ１ｐにより排出される。４−ＮＱＯおよびオリゴマイシンは、転写因子Ｙｒｒ１ｐ、Ｙｒｍ１ｐ、Ｐｄｒ１およびＰｄｒ３ｐの制御下で、それぞれ排出ポンプＳｎｑ２ｐおよびＹｏｒ１ｐにより排出される。
（６）薬剤排出ポンプと、その薬剤排出ポンプによって排出される薬剤との間には、特異的な関係がある。ある薬剤を排出する薬剤排出ポンプの種類は、その薬剤の種類に応じて異なる。
【００８６】
以上をもとにすれば、図１Ｂにおいて、ｙｒｒ１−５２株がサリチル酸に対して抵抗性を示し、サリチル酸がｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株などの多剤耐性変異株に対して抗菌作用を示したことの原因は、サリチル酸がｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株において活性化している薬剤排出経路（特に、薬剤排出ポンプ）とは異なる経路によって排出されることにあると説明することができる。これを敷衍すると、目的とする抗菌剤に対して耐性を示す変異株に対して抗菌作用を有する化合物を取得するためには、目的とする抗菌剤とは異なる薬剤排出経路によって排出される薬剤を選択すればよいことがわかる。また、以上のモデルおよび実験結果から、目的とする抗菌剤と異なる抗菌剤に対する耐性変異株が特定の物質に対して抵抗性を示すことは、その物質が目的とする抗菌剤とは異なる薬剤排出経路によって排出されることの指標となりうることもわかる。
【００８７】
実施例２．出芽酵母の薬剤感受性試験（スポット・アッセイ法）２：
試験例１によって入手した酵母を用いて、実施例１と同様にして薬剤感受性試験を行った。但し、薬剤を含有するＹＰＤ固形培地の作製には、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）（和光純薬）、ケトコナゾール（東京化成工業）、ミコナゾール（東京化成工業）、フルコナゾール（東京化成工業）、５−フルシトシン（和光純薬）、カスポファンギン（シグマアルドリッチ）、アムホテリシンＢ（和光純薬）、イトラコナゾール（和光純薬）、クロトリマゾール（和光純薬）、イソコナゾール（東京化成工業）、ボリコナゾール（東京化成工業）、ブテナフィン（東京化成工業）、テルビナフィン（東京化成工業）、マンコゼブ（和光純薬）、ベノミル（和光純薬）、リベロマイシンＡ（和光純薬）、セルレニン（東京化成工業）、アルテスナート（東京化成工業）、およびシクロヘキシミド（和光純薬）を用いた。
【００８８】
結果を図３に示す。図３に示すように、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株は、４−ＮＱＯ、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、アムホテリシンＢ、イトラコナゾール、クロトリマゾール、イソコナゾール、ボリコナゾール、ブテナフィン、テルビナフィン、ベノミル、リベロマイシンＡ、セルレニン、アルテスナート、およびシクロヘキシミドを含む培地において、出芽酵母ＢＹ４７４２野生株よりも、高い増殖度を示した。このことから、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株は、４−ＮＱＯ、ケトコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、アムホテリシンＢ、イトラコナゾール、クロトリマゾール、イソコナゾール、ボリコナゾール、ブテナフィン、テルビナフィン、ベノミル、リベロマイシンＡ、セルレニン、アルテスナート、シクロヘキシミドなどの多数の薬剤に対して耐性を示す多剤耐性真菌であることがわかる。
【００８９】
アゾール系の抗真菌剤であるケトコナゾール、ミコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、クロトリマゾール、イソコナゾール、およびボリコナゾール、アゾール系抗真菌剤と同様にエルゴステロールの生合成を阻害するブテナフィンおよびテルビナフィン、ならびにセルレニン、アルテスナート、およびシクロヘキシミドに関しては、図３の結果に基づき以下のように考察することができる。
（１）これらの抗真菌剤はＰｄｒ５ｐによって排出されるので、ｐｄｒ５欠損株はこれらの抗真菌剤に対して高い感受性を示した（図３のｐｄｒ５Δ参照）。
（２）Ｐｄｒ５ｐは、Ｐｄｒ１ｐとＰｄｒ３ｐにより発現制御されるので、突然変異株ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株では、Ｐｄｒ５ｐが強発現する。したがって、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株は、これらの抗真菌剤に対して抵抗性を示した（図３のｐｄｒ１−３およびｐｄｒ３−１１参照）。
（３）Ｙｒｒ１ｐはＰｄｒ５ｐの発現制御を行わないので、その突然変異株であるｙｒｒ１−５２株は、これらの抗真菌剤に対して野生株と同等の感受性を示した（図３のｙｒｒ１−５２参照）。
【００９０】
４−ＮＱＯおよびベノミルに関しては、図３の結果に基づき以下のように考察することができる。
（１）これらの薬剤は、排出ポンプＳｎｑ２ｐにより排出されるので、ｓｎｑ２欠損株は、これらの薬剤に対して強感受性を示した（図３のｓｎｑ２Δ参照）。
（２）Ｓｎｑ２ｐは、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、およびＰｄｒ３ｐのいずれによっても発現制御されるので、これらの突然変異株であるｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株の全てにおいて、Ｓｎｑ２ｐが強発現する。そのため、ｙｒｒ１−５２株、ｐｄｒ１−３株、およびｐｄｒ３−１１株の全てが、これらの薬剤に対して抵抗性を示した（図３のｙｒｒ１−５２、ｐｄｒ１−３、およびｐｄｒ３−１１参照）。
【００９１】
リベロマイシンＡに関しては、Ｙｏｒ１ｐにより排出されるので、Ｙｏｒ１ｐを強発現するｙｒｒ１−５２株およびｐｄｒ１−３株がこれら薬剤に対して耐性を示した（図３参照）。
【００９２】
アムホテリシンＢに対しては、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株が耐性を示し、ｙｒｒ１−５２株は野生株と同等の感受性を示した。しかし、供試した薬剤排出ポンプ欠損株群も野生株と同等の感受性を示した。したがって、アムホテリシンＢは、ｐｄｒ１−３株およびｐｄｒ３−１１株において発現が亢進された未同定の薬剤排出ポンプにより排出がされていると考えられる。
【００９３】
５−フルシトシン、カスポファンギン、マンコゼブに関しては、ｐｄｒ１−３株、ｐｄｒ３−１１株、およびｙｒｒ１−５２株のいずれにおいても、野生株と同等の感受性が示された。したがって、これらの多剤耐性変異株では、これらの薬剤を排出するポンプが亢進していないか、またはこれらの薬剤を排出できるポンプが存在していないと考えられる。
【００９４】
実施例１および実施例２の実験結果の考察を整合的に説明するモデルを図４に提示する。図４のモデルにおいて、転写因子Ｙｒｍ１ｐ、Ｙｒｒ１ｐ、Ｐｄｒ１ｐ、およびＰｄｒ３ｐの下流に、Ｓｎｇ１ｐ、Ａｚｒ１ｐ、Ｆｌｒ１ｐ、Ｓｎｑ２ｐ、Ｙｏｒ１ｐ、Ｐｄｒ５ｐ、Ｐｄｒ１５ｐ、および２つの未同定の薬剤排出ポンプが示され、その下に排出薬剤が例示される。薬剤排出ポンプと転写因子を結ぶ矢印は、その薬剤排出ポンプの発現量が、その転写因子によって制御されていることを示している。薬剤排出ポンプと排出薬剤とを結ぶ矢印は、その排出薬剤が、その薬剤排出ポンプによって特異的に排出されることを示している。
【００９５】
以上の実験結果から、現在使用されている抗真菌剤、特に深在性真菌症治療の治療に使用されている抗真菌剤の多くがＰｄｒ１ｐおよび／またはＰｄｒ３ｐによって制御される薬剤排出ポンプで排出されることが分かった。したがって、本発明の方法によれば、このような主要な抗真菌剤に対する耐性変異株に対して抗菌作用を有する物質の候補を得るには、Ｐｄｒ１ｐおよび／またはＰｄｒ３ｐによって制御されない薬剤排出経路（特に、薬剤排出ポンプ）によって排出される薬剤を選択すればよい。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【配列表】
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