(57)【要約】【課題】本発明は、新規な線維芽細胞増殖促進剤を提供することを主な目的とする。【解決手段】本発明は、ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドを有効成分として含有する、線維芽細胞増殖促進剤に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドを含有する線維芽細胞増殖促進剤。
【請求項２】
ヒアルロン酸の平均分子量が２０００以上７．５万以下である、請求項１記載の線維芽細胞増殖促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドを含有する線維芽細胞増殖促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞は、皮膚の真皮層に存在し、皮膚中のコラーゲンやヒアルロン酸を産生し、皮膚の張りや弾力を支持する役割を担う。したがって、線維芽細胞の増殖を促進することは、コラーゲンやヒアルロン酸の産生増加を誘導し、健康な皮膚の維持や、内的、外的刺激によりダメージを受けた皮膚の改善に有効である。
【０００３】
コラーゲンは、分子量約３０万のタンパク質で、生体では細胞外マトリックスとして存在する。また、コラーゲン由来のジペプチドには、線維芽細胞増殖促進作用が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
ヒアルロン酸は、分子量数十万から数百万の高分子化合物で、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が直鎖状に連なった構造を有している。ヒアルロン酸はその優れた保水性と粘弾性から、関節症状の改善や肌症状の改善効果を期待して、医薬品や化粧品として利用されている（非特許文献２および３）。また、近年では、経口摂取による肌症状の改善作用に関する報告もされ、食品分野においても注目される素材となっている（非特許文献４）。分子量約１００万の高分子ヒアルロン酸は、線維芽細胞の活性化効果が報告されている（非特許文献５）。また、４糖からなるヒアルロン酸（分子量約８００）は、熱ショックタンパクの誘導を介した細胞保護作用が報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ. Ａｇｒｉｃ. Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．  ５７ ４４４−４４９（２００９）
【非特許文献２】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．  ５  ５４−６７（２００３）
【非特許文献３】ＳＯＦＷ−Ｊｏｕｒｎａｌ  １３１  ３  ２２−３０（２００５）
【非特許文献４】Ｊ．Ｎｅｗ．Ｒｅｍ．  ５０  ５４８−５５０（２００１）
【非特許文献５】Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ.   ９０  ２６５−７３（１９８８）
【非特許文献６】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ.  １０  ２７７（１９）  １７３０８−１４（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な線維芽細胞増殖促進剤を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討した結果、ヒアルロン酸とコラーゲンペプチドを含有する組成物が優れた線維芽細胞増殖促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
本発明として、下記のものを挙げることができる。
（１）ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドを含有する線維芽細胞増殖促進剤。
（２）ヒアルロン酸の平均分子量が２０００以上７．５万以下である、上記（１）に記載の線維芽細胞増殖促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る線維芽細胞増殖促進剤（以下、「本発明増殖促進剤」という。）は、線維芽細胞の増殖を促進してコラーゲンやヒアルロン酸の産生を促進することから、コラーゲンやヒアルロン酸の減少により生じる皮膚のしわやたるみ、肌のくすみや老化、肌の乾燥を抑制し、有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は、ヒアルロン酸およびコラーゲン無添加時を１００としたときの細胞増殖活性を表す。また、白いカラムはコラーゲン無添加を、黒いカラムはコラーゲン添加を表す。
【図２】ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を示す図である。横軸は、ヒアルロン酸およびコラーゲン無添加時を１００としたときの細胞増殖活性を表す。また、白いカラムはヒアルロン酸無添加を、黒いカラムはヒアルロン酸添加を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明増殖促進剤は、ヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドを有効成分として含有するものである。
本発明にかかるヒアルロン酸としては、例えば、市販のもの（ヒアルロン酸ＬＭ、ヒアルロン酸ＳＴ、ヒアルロン３０００（全て日本新薬社製）等）を用いることができるし、通常の方法で鶏冠から抽出したものや微生物の培養液から精製したものを適宜、酵素や加水分解により低分子化して用いることもできる。かかるヒアルロン酸の平均分子量としては、１０万以下が好ましく、１０００−７．５万の範囲内がより好ましい。１５００−５０００の範囲内が特に好ましい。平均分子量の調整方法としては、酵素、酸あるいはアルカリの濃度及び処理時間等を適宜選択することで、目的の平均分子量に調整することができる。
本発明にかかるヒアルロン酸の平均分子量は、ヒアルロン酸の極限粘度から算出された粘度平均分子量を示す。まず、適当な複数のヒアルロン酸溶液を調製し、粘度計により測定したヒアルロン酸溶液の粘度をもとに比粘度および還元粘度を算出する。次に、各ヒアルロン酸溶液について、得られた還元粘度を縦軸に、乾燥物換算のヒアルロン酸濃度を横軸にプロットして検量線を作成し、ヒアルロン酸濃度を０に外挿したときの還元粘度を求めることにより、ヒアルロン酸の極限粘度を得る。得られた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、 ４２、４７６−４８５、１９６０）に代入することで、ヒアルロン酸の極限粘度から平均分子量を求める。
本発明にかかるコラーゲンペプチドは、例えば、市販のもの（NSCPアクア（日本新薬社製）等）を用いることができるし、通常の方法により動物から抽出したコラーゲンや市販のコラーゲンを酵素により分解したものを用いることができる。かかるコラーゲンペプチドの平均分子量としては、１０００−５０００が好ましく、１５００−４２００がより好ましい。２２００−３２００が特に好ましい。
コラーゲンペプチドの平均分子量は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用い、サイズ排除クロマトグラフィーにより算出する。使用するカラムは適宜選択することができ、例えば、市販されているＳｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋＳＢ−８０５ＨＱ、ＯＨｐａｋＳＢ−８０４ＨＱ、ＴＳＫ−ｇｅｌＧ２５００ＰＷ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ、などを単独または複数組合せて使用することができる。標準物質としては、分子量既知のプルラン（ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２、昭和電工製）又は分子量既知の市販のタンパク質Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｃ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙを使用する。
本発明増殖促進剤は、上記のヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドを、そのまま又は担体として使用することのできる素材と混合し、次いで、常法により粉末状、塊状、液状などの各種形態に加工することにより製造することができる。
本発明増殖促進剤におけるヒアルロン酸及びコラーゲンペプチドの含有量は、特に限定されないが、例えば、それぞれ０．００１重量％（以下、単に「％」という）以上が適当であり、好ましくは、０．００５〜５０％の範囲内である。本発明増殖促進剤におけるヒアルロン酸とコラーゲンペプチドとの配合比は、特に限定されないが、重量比として１：１〜１：２００００（ヒアルロン酸：コラーゲンペプチド、以下同じ）の範囲内が好ましく、１：１０〜１：１０００の範囲内がより好ましい。
本発明増殖促進剤には、医薬上又は食品上許容される添加物を任意に配合することができる。かかる添加剤としては、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、酸化防止剤、賦形剤、界面活性剤、紫外線防止剤、金属イオン封鎖剤、増粘剤、防腐剤、抗菌剤、保湿剤、色素を挙げることができ、これらを１種又は２種以上使用することができる。
本発明増殖促進剤は、常法により、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、ドロップ錠、トニック、ローション、軟膏、クリーム等の剤型に適宜調製することができる。
本発明増殖促進剤の摂取量は、症状、剤型、投与対象者の年齢、体重等により異なるが、通常、成人１日当り、ヒアルロン酸又はコラーゲンペプチドの重量として、０．００１〜１００ｇの範囲内とするのが適当であり、０．００３ｇ〜６０ｇの範囲内とするのが好ましいが、必ずしもこの範囲に限られるものではない。かかる１日当りの摂取量は、１回で摂取してもよく、また、２〜４回に分割して摂取してもよい。
【実施例】
【００１１】
以下に、試験例を掲げて本発明をさらに詳述する。但し、本発明が下記実施例に限定されないことは言うまでもない。
試験例１  本発明増殖促進剤の線維芽細胞増殖促進活性測定
細胞は正常ヒト皮膚線維芽細胞（タカラバイオ社製；以下、ＮＨＤＦ細胞）を用いた。ＮＨＤＦ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−１００ｍｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎおよび０．１ｍＭ  ＮＥＡＡを含む）に分散し，接着系細胞用培養フラスコ（日本バイオサイエンス社製；底面積：２５ｃｍ2）  に終濃度１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように７ｍｌ播種し，ＣＯ2インキュベーター（三洋電機バイオメディカ社製；ＣＯ2濃度５％，湿度９０％）を用いて３７(Ｃで４−５日間培養した。７０−９０％コンフルエントになったことを検鏡により確認した後，順次実験に使用した。
検体として、平均分子量２千、３千、１５千、７５千のヒアルロン酸を用いた。ストレプトコッカス属の培養液より抽出・精製して得られた高分子ヒアルロン酸を原料とし、高分子ヒアルロン酸を溶解後、塩酸を加え、ｐＨを調整したのち、酸加水分解を行うことにより適宜目的の分子量まで低分子化した。続いて、水酸化ナトリウムを加えて中和した後、エタノールを加えて、ヒアルロン酸を抽出・精製した。
検体のコラーゲンペプチドはＮＳＣＰアクア（日本新薬株式会社製）を用いた。
各検体はＰＢＳに溶解させた。検体溶液は０．２μｍフィルターに供して滅菌し、実験に使用した。細胞増殖作用はＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。
まず、７０−９０％コンフルエントになったＮＨＤＦ細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて剥がし、回収した。このＮＨＤＦ細胞を１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００mｌ）で９６ｗｅｌｌプレートに播種した後、２４時間インキュベートした。インキュベート後、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と検体（ヒアルロン酸；終濃度０．１mｇ／ｍｌ、コラーゲンペプチド；終濃度１０mｇ／ｍｌ）を単独または複数種添加し、４８時間培養した。培養後、各ｗｅｌｌにＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を５mｌ加え、３０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍの吸光値をマイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡ  ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製，ＭＴＰ−３００）で測定した。
検体無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作をおこない、ここに得られた吸光値に対する各検体添加時の吸光値の相対値を求め、細胞増殖活性とした。結果を図１および表１に示す。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
図１に示すように、ヒアルロン酸とコラーゲンペプチドを併用することにより、線維芽細胞増殖促進活性は相乗的に増加した。また、表１に示すように、ヒアルロン酸とコラーゲンペプチドを併用した場合の細胞増殖促進活性は、ヒアルロン酸およびコラーゲンペプチドを各々単独で添加した際の増殖作用から予想される相加効果をはるかに上回った。また、当該増加作用は、平均分子量２０００−３０００のヒアルロン酸において特に顕著であった。
試験例２  本発明増殖促進剤の線維芽細胞増殖促進活性測定
細胞は正常ヒト皮膚線維芽細胞（タカラバイオ社製；以下、ＮＨＤＦ細胞）を用いた。ＮＨＤＦ細胞は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（１００ｕｎｉｔ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−１００ｍｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎおよび０．１ｍＭ  ＮＥＡＡを含む）に分散し，接着系細胞用培養フラスコ（日本バイオサイエンス社製；底面積：２５ｃｍ2）に終濃度１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように７ｍｌ播種し，ＣＯ2インキュベーター  （三洋電機バイオメディカ社製；ＣＯ2濃度５％，湿度９０％）を用いて３７(Ｃで４−５日間培養した。７０−９０％コンフルエントになったことを検鏡により確認した後，順次実験に使用した。
検体として、平均分子量３千のヒアルロン酸（ヒアルロン３０００、日本新薬社製）を用いた。また、コラーゲンペプチドは、市販の平均分子量１．６千、３千、４．３千のコラーゲンペプチドを用いた。各検体はＰＢＳに溶解させた。なお、検体溶液は０．２μｍフィルターに供して滅菌し、実験に使用した。細胞増殖作用はＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。
まず、７０−９０％コンフルエントになったＮＨＤＦ細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて剥がし、回収した。このＮＨＤＦ細胞を１．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（１００mｌ）で９６ｗｅｌｌプレートに播種した後、２４時間インキュベートした。インキュベート後、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地と検体（ヒアルロン酸；終濃度０．１mｇ／ｍｌ、コラーゲンペプチド；終濃度１０mｇ／ｍｌ）を単独または複数種添加し、４８時間培養した。培養後、各ｗｅｌｌにＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を５mｌ加え、３０分間インキュベートした。その後、４５０ｎｍの吸光値をマイクロプレートリーダー（ＣＯＲＯＮＡ  ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製，ＭＴＰ−３００）で測定した。
検体無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作をおこない、ここに得られた吸光値に対する各検体添加時の吸光値の相対値を求め、細胞増殖活性とした。結果を図２および表２に示す。
【００１４】
図２に示すように、ヒアルロン酸は、コラーゲンペプチドの線維芽細胞増殖促進作用を相乗的に増加した。この増加作用は、表２に示すように、ヒアルロン酸およびコラーゲンペプチドを各々単独で添加した際の増殖作用から予想される相加効果を大きく上回った。また、当該増加作用は、平均分子量３千のコラーゲンペプチドにおいて特に顕著であった。
【００１５】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明増殖促進剤は、優れた線維芽細胞増殖促進作用を有するため、例えば、コラーゲンの減少や変質を原因とする症状である皮膚の老化（皮膚の弾力低下、しわやたるみの原因となるコラーゲンの架橋形成、肌のくすみの原因となる色素沈着等）の抑制に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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