(57)【要約】      （修正有）【課題】植物体の生育後に、外来遺伝子を発現させることができるシステムを提供する。【解決手段】以下に記載のポリヌクレオチドを含む、目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト；（ａ）光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）、（ｂ）前記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの制御下に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列であって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド配列を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に記載のポリヌクレオチドを含む、目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト；
（ａ）光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）、
（ｂ）前記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの制御下に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列であって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記コンストラクトが一過性遺伝子発現用コンストラクトである、請求項１または２に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記ＤＮＡ組み換えタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド配列が、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、あるいはリプレッサーによって、目的遺伝子の発現を阻害する、請求項１〜３に記載のコンストラクト。
【請求項５】
更に、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４に記載のコンストラクト。
【請求項６】
請求項１〜５に記載のコンストラクトを含有するベクター。
【請求項７】
前記請求項６に記載のベクターが導入された植物由来の形質転換体。
【請求項８】
近赤外光照射により、目的遺伝子の発現量を変化させる方法であって、請求項６に記載のコンストラクトを導入した形質転換体に、４４０ｎｍ〜４５０ｎｍまたは、６９０ｎｍ〜７１０ｎｍの波長領域内の波長成分を含む光を照射する方法。
【請求項９】
前記波長領域内の波長成分の光量子束密度が、７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１〜３００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の範囲内である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記近赤外光照射を１日間〜２日間行うことを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物物質生産のための光化学系スイッチに関するものであり、その遺伝子の光化学系スイッチを導入した形質転換植物、目的遺伝子のみの発現を光により制御し、さらに目的遺伝子を葉緑体に蓄積させる方法に関する。なお、本技術は、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｖｉａ  ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ（ｉＧＰＳ）と呼ぶことにする。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞には、核、葉緑体、およびミトコンドリアに遺伝情報（ＤＮＡ）が存在する。これらのうち、核ゲノムへの外来遺伝子導入技術が先行し、現在日本に輸入が認可されているすべての遺伝子組換え農作物は、核ゲノムの遺伝子操作により作出されたものである（非特許文献１）。
【０００３】
遺伝子組換えにおいては、植物に新たな形質あるいはタンパク質生産能を付与する「目的遺伝子」に加えて、遺伝子導入植物体（形質転換体）の選抜に「選択マーカー遺伝子」が不可欠となる。これには、土壌細菌や腸内細菌由来の抗生物質耐性や除草剤耐性遺伝子が用いられて来た（非特許文献２）。これらに代わり、消費者の遺伝子組換え農作物への忌避意識回避には、「植物由来選択マーカー遺伝子」の開発が望まれる（非特許文献２）。
【０００４】
葉緑体は、通常の栽培植物では花粉に取り込まれないため、外来遺伝子の花粉を介しての飛散が防止できる。さらに葉緑体には、植物の可溶性タンパク質の半分にも及ぶ含量のタンパク質［ｆｒａｃｔｉｏｎ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ：  後にｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  （Ｒｕｂｉｓｃｏ）と判明］が存在するため、外来タンパク質の蓄積にも適すると考えられてきた。このように、葉緑体ゲノムの遺伝子操作は、核ゲノムのそれよりも利点を有するが、技術的には核ゲノムの遺伝子操作ほど容易ではない。なお、ミトコンドリア・ゲノム遺伝子操作の成功例は未だ報告されていない。葉緑体形質転換および外来遺伝子維持の技術が研究されている（非特許文献３）。
【０００５】
これまでの葉緑体ゲノム遺伝子操作では、以下の文献に述べられている通り、有用タンパク質の葉緑体での生産が植物の生育を阻害する場合が多い。具体的には、破傷風毒素（用途：ワクチン）（非特許文献４）、バクテリオファージ溶原化タンパク質（用途：タンパク質性抗生物質）（非特許文献５）、マルトース結合タンパク質（用途：融合タンパク質として発現させた外来タンパク質の回収）（非特許文献６）、プラスチド／プラストキノール末端酸化酵素（用途：光合成機能の向上）（非特許文献７）等が挙げられる。したがって、植物が生育した後、「光化学系スイッチ」により外来タンパク質の生産を始め蓄積させることが望ましい。
【０００６】
従来の植物の遺伝子発現誘導系としては、（１）ヒートショックタンパク質誘導系（非特許文献８）、（２）光受容体（フィトクロムあるいはクリプトクロム）を介した誘導系（非特許文献９）、あるいは（３）動物ステロイドホルモン誘導系（非特許文献１０）の導入が知られている。
【０００７】
（１）と（２）は、目的遺伝子以外の多くの内在遺伝子の発現が影響を受ける。したがって、処理中に植物体の受けるダメージが大きい。一方、（３）において圃場におけるステロイドホルモンの散布は、そのコストが高くまた環境汚染が懸念される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】厚生労働省：  安全性審査が終了し公表された遺伝子組換え食品及び添加物リスト  （平成２５年１月３１日現在版）．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｔｏｐｉｃｓ／ｉｄｅｎｓｈｉ／ｄｌ／ｌｉｓｔ．ｐｄｆ
【非特許文献２】Ahmad A, Kaji I, Murakami Y, Funato N, Ogawa T, Shimizu M, Niwa Y, Kobayashi H: Transformation of Arabidopsis with plant-derived DNA sequences necessary for selecting transformants and driving an objective gene. Biosci. Biotechnol. Biochem., 73, 936-938, 2009
【非特許文献３】Shimizu M, Goto M, Hanai M, Shimizu T, Izawa N, Kanamoto H, Tomizawa K, Yokota A, Kobayashi H.: Selectable tolerance to herbicides by mutated acetolactate synthase genes integrated into the chloroplast genome of tobacco. Plant Physiol., 147, 1976-1983, 2008
【非特許文献４】Tregoning JS, Nixon P, Kuroda H, Svab Z, Clare S, Bowe F, Fairweather N, Ytterberg J, van Wijk KJ, Dougan G, Maliga P: Expression of tetanus toxin fragment C in tobacco chloroplasts. Nucleic Acids Res., 31, 1174-1179, 2003
【非特許文献５】Oey M, Lohse M, Kreikemeyer B, Bock R: Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic. Plant J., 57, 436-445, 2009
【非特許文献６】Ahmad N, Michoux F, McCarthy J, Nixon PJ: Expression of the affinity tags, glutathione-S-transferase and maltose-binding protein, in tobacco chloroplasts. Planta, 235, 863-871, 2012
【非特許文献７】Ahmad N, Michoux F, Nixon PJ: Investigating the production of foreign membrane proteins in tobacco chloroplasts: expression of an algal plastid terminal oxidase. PLoS One, 7, e41722, 2012
【非特許文献８】Saidi Y, Finka A, Goloubinoff P: Heat perception and signalling in plants: a tortuous path to thermotolerance. New Phytol. 190, 556-565, 2011
【非特許文献９】Gyula P, Schafer E, Nagy F: Light perception and signalling in higher plants. Curr Opin Plant Biol., 6, 446-452, 2003
【非特許文献１０】Aoyama T, Chua NH: A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant J., 11, 605-612, 1997
【非特許文献１１】Shimizu M, Kato H, Ogawa T, Kurachi A, Nakagawa Y, Kobayashi H.: Sigma factor phosphorylation in the photosynthetic control of photosystem stoichiometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 10760-10764, 2010
【非特許文献１２】Boichenko VA: Action spectra and functional antenna sizes of photosystems I and II in relation to the thylakoid membrane organization and pigment composition. Photosynth. Res., 58, 163-174, 1998
【非特許文献１３】Kanamoto H, Yamashita A, Asao H, Okumura S, Takase H, Hattori M, Yokota A, Tomizawa K: Efficient and stable transformation of Lactuca sativa L. cv. Cisco (lettuce) plastids. Transgenic Res. 15, 205-217, 2006
【非特許文献１４】Brixey PJ, Guda C,  Daniell H: The chloroplast psbA promoter is more efficient in Escherichia coli than the T7 promoter for hyperexpression of a foreign protein. Biotechnology Letter., 19, 395-399, 1997
【非特許文献１５】Hirise T, Sugiura M: Functional Shine-Dalgarno-like sequences for translational initiation of chloroplast mRNAs. Plant Cell Physiol., 45, 114-117, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
植物細胞内における外来タンパク質の生産・蓄積は、植物の生育を阻害し、植物体としては生育できなくなることが想定される。しかしながら、植物体の生育後に、外来遺伝子の発現を開始すれば、植物体の枯死を回避し、多量の外来タンパク質の蓄積が期待される。したがって、植物体の生育後に、外来遺伝子を発現させることができるシステムが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、葉緑体ゲノム遺伝子操作において、有用物質を高蓄積するために「光化学系スイッチ」技術を導入するものである。「光化学系スイッチ」の概念図を図１に示す。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ね、以下の葉緑体発現用コンストラクトを用いた上記課題の解決法を提供する。
[１]以下に記載のポリヌクレオチドを含む、目的遺伝子を発現させるための光学スイッチ用コンストラクト；
（ａ）光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）、
（ｂ）前記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの制御下に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列であって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド配列。
[２]前記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターが、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する、前記[１]に記載のコンストラクト。
[３]前記コンストラクトが一過性遺伝子発現用コンストラクトである、前記[１]または[２]に記載のコンストラクト。
[４]前記ＤＮＡ組み換えタンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチド配列が、
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）、あるいはリプレッサーによって、目的遺伝子の発現を阻害する、前記［１］〜［３］に記載のコンストラクト。
［５］更に、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）をコードするポリヌクレオチドを含む、前記［１］〜［４］に記載のコンストラクト。
［６］  前記［１］〜［５］に記載のコンストラクトを含有するベクター。
［７］前記［６］に記載のベクターが導入された植物由来の形質転換体。
［８］近赤外光照射により、目的遺伝子の発現量を変化させる方法であって、前記［６］に記載のコンストラクトを導入した形質転換体に、４４０ｎｍ〜４５０ｎｍ、または６９０ｎｍ〜７１０ｎｍの波長領域内の波長成分を含む光を照射する方法。
［９］前記波長領域内の波長成分の光量子束密度が、７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１〜３００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の範囲内である、前記［８］に記載の方法。
［１０］前記近赤外光照射を１日間〜２日間行うことを特徴とする前記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］  以下に記載のポリヌクレオチドを含むコンストラクトの、目的遺伝子を発現させる光学スイッチとしての使用；
（ａ）光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）、
（ｂ）前記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの制御下に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列であって、前記目的遺伝子の発現を阻害する転写産物をコードするポリヌクレオチド配列。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】遺伝子発現「光スイッチ」の働きを示す図である。
【図２Ａ】近赤外光による葉緑体ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子  （ｐｓａＡ）  の選択的発現制御機構を示す図である。  葉緑体において光化学系Ｉ（ＰＳ  Ｉ）はＰＳ  ＩＩよりも長波長（近赤外光：６９０〜７００ｎｍ）により励起される。この際、プラストキノン（ＰＱ）は酸化型になる。これをシグナルとして、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化され、選択的にＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子（ｐｓａＡ）の発現が抑制される。  ＰＳ  ＩＩ，光化学系  ＩＩ；ＰＳ  Ｉ，光化学系Ｉ；ＰＱ，酸化型プラストキノン；ＰＱＨ２，還元型プラストキノン；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ＰｐｓａＡ，ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(Shimizu et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,107, 10760-10764, 2010)
【図２Ｂ】近赤外光によるｒｂｃＬの選択的発現制御機構を示す図である。  葉緑体において光化学系Ｉ（ＰＳ  Ｉ）はＰＳ  ＩＩよりも長波長（近赤外光：６９０〜７００ｎｍ）により励起される。この際、プラストキノン（ＰＱ）は酸化型になる。これをシグナルとして、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化され、選択的にｒｂｃＬの発現が抑制される。  ＰＳ  ＩＩ，光化学系  ＩＩ；ＰＳ  Ｉ，光化学系Ｉ；ＰＱ，酸化型プラストキノン；ＰＱＨ２，還元型プラストキノン；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ｒｂｃＬ，Ｒｕｂｉｓｃｏ  Ｌサブユニット遺伝子
【図３Ａ】植物における有用物質生産のための葉緑体遺伝子発現「光化学系スイッチ」の模式図（方法１）である。   ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）の制御下に目的遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）コンストラクトを置く。また、目的遺伝子は光波長非依存的発現プロモーター［ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）］の制御下に置く。昼光色ではＲＮＡｉが発現して、目的タンパク質は産生されない。一方、近赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）の照射により、プラストキノン（ＰＱ）が酸化型になり、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化する。Ｐ−σ１により、ＰｐｓａＡの活性が抑制され、その制御下に置いたＲＮＡｉが発現せず、目的タンパク質が産生される。なお、葉緑体の形質転換維持には、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）を用いる。   Ｐ，リン酸基；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ＰｐｓａＡ，ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター  （Ｐ−σ１で特異的に転写が抑制される）；ＲＮＡｉ，目的遺伝子のＲＮＡｉコンストラクト；目的遺伝子，光波長非依存的発現プロモーター  ［ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター  （ＰｐｓｂＡ）  ］  の制御下に置かれた目的遺伝子；ｍＡＬＳ，変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（形質転換維持マーカー）
【図３Ｂ】植物における有用物質生産のための葉緑体遺伝子発現「光化学系スイッチ」の別の態様を示す図である。  ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）の制御下に大腸菌ｌａｃリプレッサー遺伝子（Ｉ）を置く。また、目的遺伝子は光波長非依存的発現プロモーター［ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）］と大腸菌ｌａｃオペレーター（Ｏ）の制御下に置く。昼光色ではＩが発現して、ｌａｃリプレッサーが目的遺伝子の発現を押さえていて、目的タンパク質は産生されない。一方、近赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）の照射により、プラストキノン（ＰＱ）が酸化型になり、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化する。Ｐ−σ１により、ＰｐｓａＡの活性が抑制され、その制御下に置いたＩが発現せず、目的タンパク質が産生される。なお、葉緑体の形質転換維持には、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）を用いる。   Ｐ，リン酸基；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ＰｐｓａＡ，ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（Ｐ−σ１で特異的に転写が抑制される）；Ｉ，大腸菌ｌａｃリプレッサー遺伝子；Ｏ，光波長非依存的発現プロモーターＰｐｓｂＡと連結された大腸菌ｌａｃオペレーター（Ｏ１）配列；目的遺伝子，目的遺伝子タンパク質コード領域；ｍＡＬＳ，変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（形質転換維持マーカー） 大腸菌ｌａｃリプレッサー遺伝子（Ｉ）：ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＣ＿００７７７９．１大腸菌ｌａｃオペレーター（Ｏ１）配列：５’−ＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡ−３’
【図４】ｐｓａＡプロモーターの光制御およびｐｓａＡプロモーターの光波長非依存性。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる各波長光照射時のｐｓａＡおよびｐｓｂＡ発現量の変化を示す図である。
【図５】ｐｓｂＡプロモーター活性測定のための葉緑体一過性発現用ｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＲｌｕｃおよびｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＧ６８ｌｕｃコンストラクト作製の流れを示す図である。  ｐＬＤ２６をＳｐｈＩ、ｐＣＢＲおよびｐＣＢＧ６８をそれぞれＮｃｏＩ／ＸｂａＩでそれぞれ処理し、平滑末端化した後ライゲーション（連結）した。
【図６】平滑末端連結の正否を確認した実験例を示す図である。  （Ａ）ｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＲｌｕｃの連結産物（レーン１）あるいはｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＧ６８ｌｕｃの連結産物（レーン２）を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマー：レーン１，ｐＬＤ６  ｆｄ／ＣＢＲｌｕｃ  ｒｖ（産物サイズ１．１ｋｂｐ）；レーン２，ｐＬＤ６  ｆｄ／ＣＢＧ６８ｌｕｃ  ｒｖ  （産物サイズ１．１ｋｂｐ）  （Ｂ）コロニーＰＣＲにてポジティブな結果が出たものから、少量調製法にてプラスミドを抽出し、制限酵素処理を行った結果。レーン１，ｐＬＤ２６プラスミド；レーン２，ｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＧ６８ｌｕｃをそれぞれＮｓｐＶにて消化した結果。レーン２に目的のバンドが確認できる。
【図７】世界の大型医薬品売り上げランキングを示す図である。
【図８】高価な医薬品のランキングを示す図である。
【図９】タンパク質製剤（免疫グロブリンＡ）の生産コストを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．１．  葉緑体発現用コンストラクト
本発明のコンストラクトは、目的遺伝子を葉緑体中で発現させるスイッチとして用いることができる。
【００１４】
１．２．  光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子
本発明は、近赤外光が選択的に光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子（ｐｓａＡ）の発現を抑制するという知見に基づいている（図２Ａ：文献１１）。
また、同様の機構により、近赤外光は選択的に、ｒｂｃＬプロモーターの制御にも関与することが知られている（図２Ｂ）。
【００１５】
図２Ａは、葉緑体において光化学系Ｉ（ＰＳ  Ｉ）はＰＳ  ＩＩよりも長波長（近赤外光：６９０〜７００ｎｍ）により励起されることを示す。この際、プラストキノン（ＰＱ）は酸化型になる。これをシグナルとして、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化され、選択的にＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子（ｐｓａＡ）の発現が抑制される。
【００１６】
また、図２Ａ中の略号は以下のとおりである。
ＰＳ  ＩＩ，光化学系ＩＩ；ＰＳ  Ｉ，光化学系Ｉ；ＰＱ，酸化型プラストキノン；ＰＱＨ２，還元型プラストキノン；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ＰｐｓａＡ，ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター(Kobayashi et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 10760-10764, 2010)
【００１７】
また、図２Ｂは、葉緑体において、長波長（近赤外光：６９０〜７００ｎｍ）により、選択的にｒｂｃＬの発現も抑制されることを示す。
【００１８】
１．３．  光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター配列
本発明は、上記に記載されるような、ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子（ｐｓａＡ）のプロモーター（光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター）を光学スイッチとして利用するものである。
光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター配列（ＰｐｓａＡ）は、配列番号：１において示される。
配列番号１：
5’-AAGCATTTATTGAAATAGGATAATATTATCTATAAAAAAAATAGGCTACATTTCGGAACTTAATAATTGAAATATGAATACACTCGATTAGGTTATAAAAAAAGCTCTTTGTGTACCAATGTAAAGGCGCTAAAACTTTTTTTAATTATAAAAAAGGGTCCGTTGAGCACCCTATGGATATGTCATAATAGATCCG-3’
ここで、3’側の最後のGが転写開始点である。
ｐｓａＡプロモーターとしては、上記のシロイヌナズナｐｓａＡプロモーター配列およびそれと相同性の高い配列を用いることができる。
【００１９】
また、本願において、ｒｂｃＬプロモーターとは、以下のシロイヌナズナｒｂｃＬプロモーター配列（配列番号２）およびそれと相同性の高い配列である。
配列番号２：
5’-TTGTTTTTCATTTTCATGGATGAATTCCGCATATTGTCATATCTAGGATTTACATATACAACAGATATTACTGTCAAGAGTGATTTTATTAATATTTTAATTTTAATATTAAATATTTGGATTTATAAAAAGTCAAAGATTCAAAACTTGAAAAAGAAGTATTAGGTTGCGCTATACATATGAAAGAATATACAATAATGA-3’
ここで、3’側の最後のAが転写開始点である。
しかし、用いる配列は、配列番号１や配列番号２に示される配列を有するものに限定されるものではなく、これらの配列と同等な機能（プロモーターの下流に位置する光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子またはＲｕｂｉｓｃｏ  Ｌサブユニット遺伝子を転写させる機能）を有する他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１または２の塩基配列と約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記プロモーター活性を有する配列が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２０】
本発明に関係するポリヌクレオチドおよびその等価物について
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得る。
【００２１】
また、本発明は、配列番号１または２の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ近赤外光によりプロモーター活性が低下するポリヌクレオチドも包含する。
【００２２】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。
【００２３】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２４】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％  （ｗ／ｖ）  ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を検出することができる。
【００２５】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：１のポリヌクレオチドと80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２６】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２７】
本発明において、葉緑体発現用コンストラクトは一過性遺伝子発現用コンストラクトであってもよい。
本発明において「一過性遺伝子発現」とは、葉緑体に導入されたＤＮＡが葉緑体内で分解されるまでの間、遺伝子が発現されることを意味する。
【００２８】
１．４．  目的遺伝子
本発明のＤＮＡ組み換えタンパク質（目的遺伝子）としては、例えば、リツキシマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、エポエチン  アルファ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、ソリリス（Ｓｏｌｉｒｉｓ）（登録商標）、エラプラーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ）（登録商標）、ナグラザイム（Ｎａｇｌａｚｙｍｅ）（登録商標）、シンライズ（Ｃｉｎｒｙｚｅ）、ミオザイム（Ｍｙｏｚｙｍｅ）、アーカリスト（Ａｒｃａｌｙｓｔ）、ファブラザイム（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）、セレザイム（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）、アウドラザイム（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ）等の医療製剤用タンパク質、および免疫グロブリンＡ等の抗体タンパク質が挙げられるがこれらに限定されるものではない。これらのタンパク質製剤は、大型医薬品として世界での売り上げが多額であり（図７、図８）、これらの組み換えタンパク質を植物体内で生産する手法は、大幅な生産コストの削減に貢献し、医薬品生産の増大にも貢献するものと考えられる（図９）。また更に、特に、植物体の成長が著しく困難となる目的遺伝子を選択した場合には、本発明のコンストラクトが非常に有用になると考えられる。
【００２９】
また、本発明のコンストラクトは、目的遺伝子のための独立したプロモーターを含んでもよい。このようなプロモーターとしては、葉緑体内で活性を有し、光波長非依存的発現プロモーターである必要がある。ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）やリボゾーマルＲＮＡ遺伝子プロモーター、さらに細菌由来のプロモーターであってもよい。
【００３０】
光波長非依存的発現プロモーターＰｐｓｂＡの配列は、以下のシロイヌナズナｐｓｂＡプロモーター配列およびそれと相同性の高い配列である。
配列番号３：
5’-AAAAAATATTCCTAGAGCAATTCTATTTCTATGTATGTGGATTCGCTTCTAATTTATTTCATCGATTACAAAAAATTTTTTATGAATCTAAACTAAAAGGATCTTATCCATTTTACATTGGTTGACATGGCTATATAAGTCATGTTATACTGTTTC-3’
ここで、3’側の最後のCが転写開始点となる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現」とは、ゲノム遺伝子を鋳型として、プロモーター配列の制御下でｍＲＮＡを発現する過程（転写）、および／またはこのｍＲＮＡを鋳型としてタンパク質を合成する過程（翻訳）を含む。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」はそれぞれと交換可能に使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号：１の塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号：１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００３２】
１．５．  ＤＮＡ組み換えタンパク質の発現を阻害する機構
さらに、本発明の「目的遺伝子の発現を阻害する転写因子をコードするポリヌクレオチド」は、（ｉ）目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｖ）目的遺伝子をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を共抑制効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、葉緑体発現用コンストラクトと共にベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記（ｉ）〜（ｉｖ）のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を抑制することができる。したがって、上記ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。
【００３３】
本明細書中、「ＤＮＡの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスＤＮＡのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上：新生化学実験講座２  核酸ＩＶ  遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７，１９９３などを参照）。アンチセンスＤＮＡの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、また１００塩基以上であり、さらに５００塩基以上であってもよい。
【００３４】
本明細書中、「ＤＮＡの発現をＲＮＡｉ効果により抑制するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「ＲＮＡｉ」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、２１〜２５塩基長のＲＮＡ干渉を生ずる二重鎖ＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖ＲＮＡが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００３５】
本明細書中、「ＤＮＡの転写産物を特異的に切断する活性を有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいい、ターゲットとするＤＮＡの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。
本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。
【００３６】
ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）によって目的遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドは、目的遺伝子の配列に基づいて設計することができる（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。
【００３７】
例えば、目的遺伝子とその発現を抑制するＲＮＡiの組合せとしては、次のようなものが例示される。
緑色発光ルシフェラーゼをコードするＣＢＧ６８ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使った場合、このコード領域を以下のようなｓｉＲＮＡ最適配列予測サイト（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／Ｓｃｉｔｏｏｌｓ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＲＮＡｉ／ＲＮＡｉ．ａｓｐｘや、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ／ｓｉｒｎａＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｓｉｇｎＩｎｉｔ．ｄｏ）で配列を予測させると，以下のＣＢＧ６８ｌｕｃのタンパク質コード領域の８３〜１０９の２７塩基のアンチセンスがベストとして上がる。
配列４：５’−ＴＣＣＧＡＧＣＡＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＡＴＡＧＴＣＡＣＣ−３’
したがって、ＣＢＧ６８ｌｕｃのタンパク質コード領域の８３〜１０９の２７塩基（以下）を含むＣＢＧ６８ｌｕｃのＤＮＡ塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２５８５９３．１）のアンチセンスを好適に用いることができる。
【００３８】
また、本願発明では、大腸菌の「lacリプレッサー」のような遺伝子発現抑制系を用いることもできる。さらに「lacオペレーター」を併用することもできる。
本発明において、リプレッサーとは、特異的なオペレーターを認識し、これに結合することによって、そのオペレーターを含むプロモーターに連なる遺伝子群、すなわちオペロンの発現を抑制し、負の調節を行うタンパク質を意味する。また、オペレーターとは、リプレッサーの結合部位を意味する。オペレーターは、プロモーターとオペロンの構造遺伝子との中間、又はプロモーターと一部重なり合ってオペロンの上流に存在する。すなわち、オペレーターは、プロモーターと存在位置が重複する場合がある。本発明において使用できるリプレッサー遺伝子/プロモーター(オペレーターを含む)としては、既知のものを用いることが出来る。
【００３９】
２．光化学系スイッチ
「光化学系スイッチ」として、図３Ａに示すような系があげられる。
ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）の制御下に目的遺伝子のＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）コンストラクトを置く。また、目的遺伝子は光波長非依存的発現プロモーター［ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）］の制御下に置く。昼光色ではＲＮＡｉが発現して、目的タンパク質は産生されない。一方、近赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）の照射により、プラストキノン（ＰＱ）が酸化型になり、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化する。Ｐ−σ１により、ＰｐｓａＡの活性が抑制され、その制御下に置いたＲＮＡｉが発現せず、目的タンパク質が産生される。なお、葉緑体の形質転換維持には、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）を用いる。
【００４０】
なお、図３Ａ中における略号は以下のとおりである。
Ｐ，リン酸基；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ＰｐｓａＡ，ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（Ｐ−σ１で特異的に転写が抑制される）；ＲＮＡｉ，目的遺伝子のＲＮＡｉコンストラクト；目的遺伝子，光波長非依存的発現プロモーター［ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）］の制御下に置かれた目的遺伝子；ｍＡＬＳ，変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（形質転換維持マーカー）
【００４１】
なお、この態様においては、以下のような３つのパターンのコンストラクトであればPpsaA、ＲＮＡｉ、ＴｐｓｂＡ、目的遺伝子、およびｍＡＬＳの各配置の順番は変わっても問題なく実施が可能である。なお、以下で「Ｔ」は「ターミナーター」を表わす。
ＰｐｓａＡ−ＲＮＡｉ−ＴｐｓｂＡ
ＰｐｓｂＡ−目的遺伝子−ＴｐｓｂＡ
ＰｐｓｂＡ−ｍＡＬＳ−ＴｐｓｂＡ
【００４２】
また、別の態様の光工学系スイッチとして、図３Ｂに示す系が挙げられる。
図３Ｂの系において、「近赤外光」（６９０〜７１０ｎｍ）では、ｐｓａＡの発現が抑制されるため、大腸菌の「ｌａｃ  レプレッサー」のような遺伝子発現抑制系をｐｓａＡプロモーター（ＰｐｓａＡ）の制御下に置き，「近赤外光」で目的遺伝子の発現抑制が解除される。
ここで、ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓａＡ）の制御下に大腸菌ｌａｃリプレッサー遺伝子（Ｉ）が置かれる。また、目的遺伝子は光波長非依存的発現プロモーター［ＰＳ  ＩＩ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター（ＰｐｓｂＡ）］と大腸菌ｌａｃオペレーター（Ｏ）の制御下に置かれる。
【００４３】
昼光色ではＩが発現して、ｌａｃリプレッサーが目的遺伝子の発現を押さえていて、目的タンパク質は産生されない。
【００４４】
一方、近赤外発光ダイオード（ＬＥＤ）の照射により、プラストキノン（ＰＱ）が酸化型になり、σ因子ＳＩＧ１（σ１）がリン酸化する。Ｐ−σ１により、ＰｐｓａＡの活性が抑制され、その制御下に置いたＩが発現せず、目的タンパク質が産生される。なお、葉緑体の形質転換維持には、植物由来の変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子（ｍＡＬＳ）用いる。
【００４５】
なお、図３Ｂ中における略号は以下のとおりである。
Ｐ，リン酸基；σ１，ＲＮＡポリメラーゼσ因子ＳＩＧ１；ＰｐｓａＡ，ＰＳ  Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーター  （Ｐ−σ１で特異的に転写が抑制される）；Ｉ，大腸菌ｌａｃリプレッサー遺伝子；Ｏ，光波長非依存的発現プロモーターＰｐｓｂＡと連結された大腸菌ｌａｃオペレーター（Ｏ１）配列；目的遺伝子，目的遺伝子タンパク質コード領域；ｍＡＬＳ，変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子  （形質転換維持マーカー）
大腸菌lacリプレッサー遺伝子 (I)：NCBI Reference Sequence NC_007779.1
大腸菌lacオペレーター(O1)配列：5’-TGTTGTGTGGAATTGAGAGCGGATAACAATTTCACACA-3’
【００４６】
なお、この態様においては、以下のような３つのコンストラクトのパターンであればＰｐｓａＡ、Ｉ、ＴｐｓｂＡ、Ｏ、目的遺伝子、およびｍＡＬＳの各配置の順番は変わっても問題なく実施が可能である。なお、以下で「Ｔ」は「ターミナーター」を表わし、Ｉは大腸菌ｌａｃリプレッサーを、Ｏは大腸菌ｌａｃオペレーターを表わす。
ＰｐｓａＡ−Ｉ−ＴｐｓｂＡ
ＰｐｓｂＡ−Ｏ−目的遺伝子−ＴｐｓｂＡ
ＰｐｓｂＡ−ｍＡＬＳ−ＴｐｓｂＡ
【００４７】
従来技術に対し、本発明は、目的遺伝子のみの発現を光により制御し、さらに外来タンパク質を葉緑体に蓄積させるものである。したがって、植物体にダメージを与えず、外来タンパク質が生産・蓄積し得る。
【００４８】
２．１．  照射波長
本発明の葉緑体発現用コンストラクトを導入した植物において、目的遺伝子を葉緑体に蓄積させる場合に用いる波長は、光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制できるものであればよく、特に制限はない。例えば、青色帯（４３５ｎｍ〜４８０ｎｍ）および近赤色帯（６１０ｎｍ〜７５０ｎｍ）において効率的である。また、上記光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性抑制の観点からは、好ましくは、約４４０ｎｍ〜約４５０ｎｍ、または約６９０ｎｍ〜約７１０ｎｍの波長領域内の波長成分を含む光が挙げられる。
【００４９】
２．２．  本発明で使用される光の光量子束密度について
光量子束密度としては、光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制できるものであればよく、特に制限はない。これら遺伝子の発現促進効率の観点からは、上記波長領域または波長の波長成分の光量子束密度は、好ましくは７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１〜３００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の範囲内である。
【００５０】
２．３．  本発明で使用される光の照射時間
光照射時間は、照射する光の光量子束密度によっても異なるが、光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制できるものであればよく、特に制限はないが、連続照射であるのが好ましい。これら遺伝子の発現促進効率の観点からは、光量子束密度が７０μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１〜３００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の範囲内である場合には、光照射時間は、好ましくは１日間〜２日間程度である。
【００５１】
２．４．  光源
本発明で用いられる光源としては、人工光源を用いる場合には、なるべく光化学系（ＰＳ）Ｉ反応中心タンパク質遺伝子プロモーターの活性を抑制する効率の高い波長成分の光のみを用いるのが、エネルギー効率の観点からは好ましい。好ましくは、上記に示される特定の波長を発する光源が挙げられる。
【００５２】
本発明で用いられる光源としては、上記の例示的な条件の光照射に用いることができるものであればよく、特に制限はない。例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、白色蛍光灯、放電ランプ（例、水銀灯、キセノンランプなど）、さらに、回折格子、プリズムなどとの組み合わせにより取り出された特定の波長の光などを適宜用いることができる。過剰な光による植物の障害（光合成能の低下、組織傷害など）を抑制するために目的以外の波長成分、例えば７５５ｎｍ〜３０００ｎｍの波長領域内の波長成分を減少させるためには、所望の波長選択性を有するフィルター（例、色ガラスフィルター、ゼラチンフィルター、干渉フィルターなど）を使用することができる。また、ＬＥＤやレーザーは、不要な波長領域の波長成分を含まず、かつ、好ましい光量子束密度を有する光を得るために好ましく用いることができる。
【００５３】
また、安価な発光ダイオード（ＬＥＤ）が光源として利用できるため、費用対効果も高い。また、ＬＥＤは一般に、従来の他の照明器具と比較して、
（１）  発熱がほとんど無い
（２）  発光ダイオード単体が小さいため、光源としての発光機器はその形状を自由に変化させることできる
（３）  発光ダイオードはそれぞれの種類によって光の波長域が狭く（スペクトル幅が小さく）、その組み合わせによって自由に目的の波長域を得ることができるので、植物の栽培に適した波長域を容易に設定して照射を行なうことができる、
などの特徴および効果を有している。すなわち、ＬＥＤは、スペクトル幅の小さな単色光／低電圧で駆動可能／コンパクト／発熱が少ないという特性を有しており、植物に必要な波長の光を組み合わせて照射を行なうことにより、小さなエネルギーで効率よく特定の植物生理機能や形態形成を促すことが可能になるとともに、植物の要部に対する近接照射を容易に行なうことが可能である。さらに、高輝度ＬＥＤを利用することによって、より強い光量子束密度を提供することが可能であり、このことによって、より強い生合成を植物に誘導させることが可能である。
【００５４】
したがって、好ましくは本発明において使用される光源は、青色ＬＥＤ（４４０〜４５０ｎｍ）または赤色ＬＥＤ（６１０〜７５０ｎｍ）が望ましい。高輝度ＬＥＤを使用して比較的強い光量子束密度を提供することがさらに好ましい。高輝度ＬＥＤは各種波長のものが入手可能であり、それらを用いることが出来る。
【００５５】
３．ベクター
本発明の組換えベクターは、本発明の上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって作成することができる。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクターなどが使用できる。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクター、ｐＢＩ系のベクターなどのバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的のＤＮＡを導入できるという点で好ましい。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）などがあげられる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などがあげられる。
ｐＵＣ系のベクターは、植物にＤＮＡを直接導入することができるという点で好ましい。
ベクターは、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激（例えば、乾燥、紫外線の照射、塩ストレス）により誘導的に活性化されるプロモーターを有していてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1406 (1990)）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al., EMBO J. 8, 651 (1989)）、塩ストレスによって誘導されるプロモーターなどがあげられる（Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223 (2000))。
【００５６】
さらに、本発明のベクターには、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡ付加シグナルなどを連結してもよい。
プロモーターとしては、植物細胞において機能することができれば植物由来のものでなくてもよい。具体的には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のＰＲタンパク質プロモーターなどがあげられる。さらに、前述の外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターもあげられる。
エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。
ターミネーターとしては、前述のプロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、ＣａＭＶポリＡターミネーターなどがあげられる。
【００５７】
本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる。
【００５８】
４．本発明の非ヒト形質転換体（形質転換植物細胞、形質転換植物体など）
本発明の形質転換植物細胞は、本発明の組換えベクターを植物細胞に導入することによって得ることができる。組換えベクターの植物細胞への導入は、従来公知の方法、例えば、植物に感染するウイルスや細菌を介して導入する方法（I. Potrylkus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991)）、外来ＤＮＡを直接導入する方法などがあげられる。具体的には、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。これらの方法は、例えば、形質転換する宿主植物の種類などに応じて適宜決定できる。
【００５９】
植物に感染するウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、プロムモザイクウイルスなどが使用できる。細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾジェネスなどが使用できる。
【００６０】
アグロバクテリウムへのベクターの移行は、エレクトロポレーション法によって行うことができる。
【００６１】
植物細胞に外来ＤＮＡを直接導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックペネトレーション法等の従来公知の方法があげられる（I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991)参照）。エレクトロポレーション法は、例えば、プロトプラストの培養が安定かつ容易であり、再生が容易な植物細胞に適用することが好ましい。また、パーティクルガン法は、宿主の限定を受けないため、例えば、アグロバクテリウムに感染し難い植物細胞や、プロトプラストの調製が困難な植物細胞に適用することが好ましい。なお、このようにエレクトロポレーション法を行う場合、前記組換えベクターを構成するベクターとしては、例えば、pUC18、pUC19、pBR322、pBR325、pBluescript 等が好ましい。単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染しにくい双子葉植物に対しては、ＤＮＡ導入法として汎用されているアグロバクテリウムを用いた間接導入法が使用できないため、これらの直接導入法が有効である。
【００６２】
次に、本発明のベククーを導入したアグロバクテリウム等から植物へＴ−ＤＮＡを導入して、植物の形質転換を行う。例えば、上述のようにしてベクターを導入したアグロバクテリウム株を植物細胞のカルスまたは組織片と数分間程度共存させた後、２Ｎ６−ＡＳまたはＮ６ＣＯなどの培地中で、２５〜２８℃で３日間程度共存培養する。ここで共存培養する植物としては、共存培養の難易度に差があるものの種子植物が用いられる。特に、これまで形質転換の困難であった単子葉作物、すなわち、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シバなど、さらに樹木（ポプラやユーカリなど）なども対象となり得る。
【００６３】
上記のアグロバクテリウムとの共存培養の後、カルスまたは組織片は、適当な抗生物質を含む培地で選択培養を行う。例えば、ベクターに選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を導入した場合には、ハイグロマイシン（１０〜１００μｇ／ｍＬ）とアグロバクテリウム除去のためのセフォタキシム（２５μｇ／ｍＬ）またはカルベニシリン（５００μｇ／ｍＬ）とを含む２Ｎ６−ＣＨまたはＮ６Ｓｅ培地を用いて、１〜３週間選択培養を行うことにより、形質転換したカルス体を選択的に得ることができる。選択的に得たカルス体を、Ｎ６Ｓ３−ＣＨ、ＭＳｒｅなどの適当な再分化培地を用いて再分化を誘導し、再分化個体を得る。以上のようにして、本発明のベクターを用いてＤＮＡ断片を植物に導入し形質転換することができる。
【００６４】
組換え個体の選抜は、マーカー遺伝子で抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン遺伝子）の発現を調べることによって行うことができる。また、得られた形質転換植物細胞および形質転換植物体の染色体ＤＮＡをそれぞれ調製し、例えば、目的ＤＮＡ配列に特異的なプライマーやプローブを用いたＰＣＲやサザンブロッティング法等により、前記目的ＤＮＡの発現が確認されれば、所望の形質転換植物細胞および形質転換植物体が得られたこととなる。
【００６５】
なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド（例えば、DNA）の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。
【００６６】
形質転換植物体が得られれば、その植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができ、公知の方法によりクローンを得ることもできる。また、その植物体、その子孫もしくはクローンから、さらに子孫もしくはクローンを得ることもできる。
【００６７】
植物体
本発明のベクターまたはポリヌクレオチドが導入されることで形質転換される植物としては、特に制限はなく、下等植物から高等植物まで全て含む。本発明で形質転換される植物としては、例えば、種子植物、シダ植物、コケ植物、地衣植物、多細胞の植物、作物植物、蔬菜植物、花卉植物、木本植物、観賞用植物、樹木植物（例えば、針葉樹、落葉樹など）などを挙げることができる。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であってよい。農作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ダイズ、(インゲン)マメ、エンドウ、チコリー、トマト、ミカン、イチゴ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、チャ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、ゴムノキ、カンショ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ソルガム、クローバー、ニンジン、アルファルファ、ナス、キュウリ、アラビドプシスなどが挙げられる。観賞用植物としては、例えば、キク、カーネーション、バラ、キンギョソウ、ラン、トルコギキョウ、フリージア、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、シクラメン、カトレア、ペチュニア、トレニア、チューリップ、ガーベラ、アヤメ、ヤシ、スゲなどが挙げられる。樹木植物としては、例えば、例えば、マツ、トウヒ、モミ、ツガ、イチイ、イチョウが挙げられる。コケ植物としては、例えば、ヒメツリガネゴケが挙げられる。
【００６８】
なお、本発明において、詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第３版、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法などの公知の方法により、または市販のキットの取扱い説明書に記載の方法により行うことができる。
【００６９】
５．本発明のコンストラクトを導入した形質転換体を用いて目的物質を生産する方法
本発明のコンストラクトを導入した形質転換体を用いて目的物質を生産する方法は、例えば以下の手順が示されるが、本発明の範囲はこの手順に限定されるものではない。
【００７０】
葉緑体の「一過性発現」については、公知の文献をもとに実施が可能であり、例えば、Yoshimoto K, Sakaiya M, Isono K, Kobayashi H: Comparison of strength of endogenous and exogenous gene promoters in Arabidopsis chloroplasts. Plant Biotech., 18, 135-142, 2001等の文献をもとにして実施が可能である。
【００７１】
また、葉緑体の「形質転換」については、出願人らの論文（3. Shimizu M, Goto M, Hanai M, Shimizu T, Izawa N, Kanamoto H, Tomizawa K, Yokota A, Kobayashi H.: Selectable tolerance to herbicides by mutated acetolactate synthase genes integrated into the chloroplast genome of tobacco. Plant Physiol., 147, 1976-1983, 2008）の記載をもとに手順を組み立て、実施をすることができる。
【実施例】
【００７２】
材料および方法
１．  種子の滅菌、播種
１．５ｍＬチューブにシロイヌナズナ種子（ｅｃｏｔｙｐｅ：  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を分注し、７０％エタノール１ｍＬを加え、１分間振とう後、遠心し上清を捨てた。滅菌溶液を１ｍＬ加えて、１０分間振とうした。以後の操作は、無菌的に行うため、クリーンベンチを使用した。軽く遠心し、上清を捨て、１ｍＬ滅菌水で洗浄した。洗浄を５回繰り返し、０．１％アガロース溶液１ｍＬを加え、アルミホイルに包み、４℃で２〜３日春化処理を行った。その後、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地に播種した。
【００７３】
【表１】
2014176309.tif 000002
【００７４】
【表２】
2014176309.tif 000003
【００７５】
２．  植物の育成条件
人工気象機（ＲＩＯＴＲＯＮ  ＮＣ２２０，  日本医化器械製作所）を用い、温度２０℃、湿度４０−６０％、照度２，０００−３，０００ｌｕｘの白色蛍光灯下、１６時間−明、８時間−暗で育成させた。
【００７６】
３．  各波長の光照射時のｐｓａＡおよびｐｓｂＡの発現量測定
３−１．  近赤外光の照射
３週間育成させたシロイヌナズナを３日間アルミホイルにて遮光し、各波長の光を２日間から２週間照射した。
【００７７】
３−２．  シロイヌナズナからＲＮＡ抽出
約１００ｍｇシロイヌナズナ葉を採取し（近赤外光照射のものは遮光条件下で行った）、液体窒素にて氷結粉砕した。その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、操作はその取扱説明書に従った。
【００７８】
３−３．  ＤＮａｓｅＩ処理
抽出したＲＮＡからＤＮＡを取り除くためＤＮａｓｅ処理を行った。１０  Ｘ  ＤＮａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、７μｇ分のＲＮＡが含まれた抽出液、ＤＮａｓｅ  ３μＬ加え、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で５０μＬにメスアップした後、３７℃で３０分反応させた。反応後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１００μＬにメスアップした。そこに等量のクロロホルムを加えて５分間ボルテックスし、室温で１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上層を回収した。１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５倍量の１００％エタノールを加え、１分間ボルテックスし、−８０℃で１時間放置した。その後、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し上清を取り除いた。７０％エタノールを１５０μＬ加え、４℃、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を完全に取り除いた。得られたペレットを風乾させ、１０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶かした。
【００７９】
３−４．  ｃＤＮＡの合成
逆転写反応は、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
【００８０】
３−５．  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ
忠実性の高いＰＣＲを行う際は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。１０  Ｘ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５  μＬ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  ２μＬ、プライマー（各１０μＭ）  １．５μＬ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １μＬ、鋳型  ＤＮＡ  ５０ｎｇを混合し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で５０  μＬに調製した。基本反応条件は、９４℃  ２分間→（９４℃  ３０秒、５８℃  ３０秒、６８℃  １分／ｋｂ）Ｘ  ３０ｃｙｃｌｅ→６８℃  ５分間とした。
【００８１】
３−６．  リアルタイムＰＣＲ
リアルタイム  ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）  を使用した。ＳＹＢＥＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥｘＴａｑ  （ＴａＫａＲａ）  １０μＬ、プライマー（各１０  ｐｍｏｌ）０．４μＬ、鋳型ｃＤＮＡ  ２μＬを混合、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２０μＬにメスアップしたものをキャピラリーに入れ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒに供した。プライマーは２０〜２５−ｍｅｒの長さで、測定する遺伝子に対して特異性が高く、かつゲノムＤＮＡの混入を確認するために、イントロンを挟むように設計し、産物が１５０〜２５０ｂｐ程度のサイズになるように作製した。発現量を内部標準遺伝子ＡＣＴ２によって補正し、３日間暗処理したものとの相対値で表した。
【００８２】
４．  タバコ葉緑体におけるルシフェラーゼアッセイのためのコンストラクト作製
４−１．  使用培地組成
【表３】
2014176309.tif 000004
【００８３】
４−２．  プラスミドＤＮＡの少量調製法
抗生物質  （アンピシリン５０μｇ／ｍＬ）を含む２ｍＬの液体ＬＢ培地中で、大腸菌を３７℃で１２−１６時間振とう培養した。２ｍＬチューブに移し入れ、１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心し菌体を集め、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＯＲＩＧＥＮＥ）により調製した。
【００８４】
４−３．  制限酵素処理
回収したプラスミドは目的に応じた制限酵素で消化した。処理後、アガロース電気泳動を行い、目的のものとして正しいか確認、ゲルからのＤＮＡ回収を行った。
【００８５】
４−４．  アガロースゲルからのＤＮＡ回収
Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ  （ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）  を使用した。アガロース電気泳動後、目的のＤＮＡ断片をメスで切り出して回収した。切り出したゲルにＮＴ  Ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加え、５０℃、１５分間インキュベートし、ゲルを溶かす。溶かした溶液を付属カラムに移し入れ、１０，０００ｒｐｍ、１分間遠心した。ＮＴ３  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  ６００μＬ加えて１０，０００ｒｐｍ、１分間遠心し、液は捨てた。１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、カラムを乾燥させた。新しいチューブにカラムを移し、ＮＴ  Ｅｌｕｓｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬを加えて、室温で１分間放置後、１０，０００ｒｐｍ、１分間遠心した。
【００８６】
４−５．  クローニング
ａ．  ＤＮＡ末端の平滑化
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼで、鋳型ＤＮＡおよびｄＮＴＰｓ存在下で３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持ち、５→３’にはエキソヌクレアーゼ活性は持たずポリメラーゼ活性を有するＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ）  から構成されるＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）  を用いた。反応液は１０  μＬ  ［鋳型ＤＮＡ  ０．１−１０  ｐｍｏｌ、１０  Ｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ｄＮＴＰ含む）］  １  μＬをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で９  μＬにメスアップし７０℃、５分間処理後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １  μＬを加え、３７℃で５分間反応させた。ボルテックスにて激しく撹拌し、氷中に置き反応を停止させた。
【００８７】
ｂ．  ライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ：ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ２．１：ＴａＫａＲａ  ）
ベクター：インサート＝１：５〜１：１０  （モル比）、平滑末端の場合は１：１０〜１：２０となるようにそれぞれのＤＮＡ溶液を調製し、２  Ｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  （ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）  もしくはＥｎｚｙｍｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＴａＫａＲａ）  をＤＮＡ溶液と等量加え、１６℃、３０分間反応させた。平滑末端のライゲーションの場合、１４℃、一晩反応させた。
【００８８】
ｃ．  形質転換
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  ＪＭ１０９およびＤＨ５α  （ＴＯＹＯＢＯ）  を使用した。コンピテントセルを氷上で融解して、ライゲーションした溶液を加え穏やかに混ぜ  （ライゲーション溶液は、コンピテントセル溶液の１／１０量より少なくする）、氷上で３０分放置した。４２℃のヒートショックを３０秒間行い、氷上で２分間冷却した。ＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１時間振とう培養した後、ＬＢプレート上に適量播いた。
【００８９】
ｄ．  コロニーＰＣＲ  （９６穴プレート使用）
鋳型となるＤＮＡを大腸菌のコロニーのまま爪楊枝を用いて、ＰＣＲ反応液に入れ、９４℃で１０分間の熱処理により大腸菌を破壊し、鋳型ＤＮＡを溶出させ、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴａＫａＲａ）  を用い増幅させた。反応液の組成は、１０  Ｘ  ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５０μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  １８０μＬ、プライマー（各５  ｐｍｏｌ）１００μＬ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１，４４０μＬを調製し、２１μＬずつ分注した。そこに鋳型ＤＮＡを加え、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを４μＬ（０．１２５  Ｕ）づつ分注し、穏やかにピペッティングした。ＰＣＲ反応条件は、通常のものと同様に行った。
【００９０】
ｅ．  ＤＮＡ塩基配列決定
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。反応液の組成は、鋳型ＤＮＡ  ２００−１，０００ｎｇ、５  Ｘ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、プライマー  （３．２  ｐｍｏｌ）  ０．５μＬを滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で８μＬにメスアップした。最後に２  μＬのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｑを加え全体で１０μＬとした。反応条件を９６℃  １分間→  （９６℃  １０秒→５０℃  ５秒→６０℃  ４分間  Ｘ  ２５  サイクル→４℃）  とし、Ｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）を用いて反応を行った。反応の終わったサンプルをエタノール沈殿により精製し、ＰＲＩＳＭ３１００／３１００−Ａｖａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００９１】
結果と考察
１．各種波長光照射によるｐｓａＡおよびｐｓｂＡ発現量の変化
ＰＳＩとＰＳＩＩの吸収スペクトルの差が大きく見られる波長は４５０ｎｍと７００ｎｍ付近である（文献１２）。したがって、これら波長のうちｐｓａＡとｐｓｂＡの発現量の差が最も大きく見られる、つまりｐｓａＡの発現が最も抑制される波長とその照射時間の特定を目的とした。各種波長の光を照射し、ｐｓａＡおよびｐｓｂＡの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した。ＲＴ−ＰＣＲにおいては転写産物量が測定されるが、内在性のｐｓａＡおよびｐｓｂＡ転写産物量が高いと各種波長照射による増大が評価しにくいことが想定される。したがって、３週間育成させたシロイヌナズナを３日間暗処理することにより、ｐｓａＡおよびｐｓｂＡの転写産物量を一旦減少させた。その後、白昼光、４５０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７０５ｎｍ、７１０ｎｍ、７３０ｎｍの各波長光を一定期間照射し、シロイヌナズナからＲＮＡ抽出を行った。また、３日間暗処理直後のものをコントロールとして使用した。転写産物量は、ＤＮａｓｅＩ処理、ｃＤＮＡ合成を経て、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した（図４）。
【００９２】
近赤外光を照射した時、どの照射期間でも、ｐｓｂＡおよびｐｓａＡの発現量がともにコントロール（３日間暗処理直後のもの）よりも低下している結果となった。６９０ｎｍの光を１日、３日、２週間に分けて照射した際には、長期間光を照射するにつれｐｓｂＡの発現量は低下し、ｐｓａＡの発現量は増加傾向にあった。つまりｐｓｂＡ／ｐｓａＡ値をみると、短期間照射の方がその値が大きいことから、ｐｓａＡの発現は短期間の６９０ｎｍ光の照射で最も抑制されることが明らかになった。７００〜７１０ｎｍの近赤外光を２日間照射した際には、長波長になるにつれｐｓｂＡの発現量は徐々に増大し、ｐｓａＡの発現量にはあまり変化が見られなかった。ｐｓｂＡ／ｐｓａＡの値をみると、長波長になるにつれ、その値は増大し、７１０ｎｍにて今回照射した全波長の中で最大の値を示した。７３０ｎｍ照射の際は、どちらの照射期間でもｐｓｂＡの発現はあまり差が見られないが、ｐｓａＡの発現量は日数を経るにつれ増大していった。これらの結果から、７１０ｎｍ、２日間の近赤外光照射でｐｓａＡとｐｓｂＡの発現の差が最も大きくなり、これが、本光制御に最適な波長および照射時間であることが判明した。
【００９３】
２．葉緑体における遺伝子発現を評価するコンストラクトの作製
遺伝子発現をモニターするには、レポーター遺伝子が有効である。本実験においては、葉緑体形質転換（葉緑体ゲノムへの遺伝子導入）に先立ち、一過性遺伝子発現（パーティクルガンにより葉緑体に打ち込まれたＤＮＡが葉緑体内で分解されるまでの間の遺伝子発現）により評価する。一過性遺伝子発現は感度が要求され、また目的の遺伝子発現の評価には打ち込み効率の補正が必要となる。したがって、同時に測定可能な複数の高感度レポーター遺伝子が不可欠となる。Ｃｈｒｏｍａ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が本目的を満たすと考えた。Ｃｈｒｏｍａ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅのうち、赤に発光するＣＢＲｌｕｃと緑に発光するＣＢＧ６８ｌｕｃを実験供した。これらのコドン使用（ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ）は、葉緑体のそれから大きく外れていなかったため、利用可能と判断した。しかしながら、ＣＢＲｌｕｃおよびＣＢＧ６８ｌｕｃの葉緑体での発現について報告がないため、まずは、これらをｐｓｂＡプロモーターの制御下で発現させることとした。
【００９４】
ベクターとして、葉緑体形質転換に用いられるｐＬＤ６（文献１３）の改良版であるｐＬＤ２６を用いた（図５）。ＳｐｈＩで切断し、電気泳動で確認後、アガロースゲルから目的のバンドのみを切り出して精製、平滑化した。また、同様にインサートであるｐＣＢＲｌｕｃあるいはｐＣＢＧ６８ｌｕｃをＮｃｏＩ／ＸｂａＩで切断し、目的のＤＮＡ断片のみを切り出し精製、平滑化した。これらを連結し、大腸菌ＪＭ１０に形質転換した。スクリーニングは、ベクターとインサートを挟むように設計したプライマー（ｐＬＤ６ｆｄ、ＣＢＲｌｕｃｒｖとｐＬＤ６ｆｄ、ＣＢＧ６８ｌｕｃｒｖ）を用い、コロニーＰＣＲを行い、約１，１００ｂｐの目的産物を確認した（図６）。また、コロニーＰＣＲにてスクリーニングされた大腸菌から少量調製法にてプラスミドを回収し、ｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＲｌｕｃはＫｐｎＩ／ＮｓｐＶで切断し４．２ｋｂｐ／２．１ｋｂｐ付近の、ｐＬＤ２６−ＰｐｓｂＡ−ＣＢＧ６８ｌｕｃはＮｓｐＶで切断し６．０ｋｂｐ／３００ｂｐ付近の目的ＤＮＡ断片を確認した。その後、制限酵素処理で確認されたものにプライマー（ｐＬＤ６ｆｄ、ｐＬＤ６ｒｖ）によってＤＮＡ塩基配列決定を行った。
【００９５】
今回用いたＣＢＲｌｕｃあるいはＣＢＧ６８ｌｕｃを発現させるｐｓｂＡプロモーターは、大腸菌内でも発現することが知られており、大腸菌でよく用いられているＴ７プロモーターに対して１８倍発現が高いと報告されている（文献１４）。さらにこのコンストラクトにはＳＤ配列  （文献１５）が組み込まれており、タンパク質の発現効率が高いことが想定される。したがって、組み込んだＣＢＲｌｕｃあるいはＣＢＧ６８ｌｕｃがｐｓｂＡプロモーターによって強力に発現され、それが大腸菌の生育に何らかの悪影響を及ぼし、形質転換体の取得を難しくしていた。一方、葉緑体の一過性発現は線状ＤＮＡ  （ｌｉｎｅａｒ  ＤＮＡ）でも可能なことが知られている。
【００９６】
CBRlucおよびCBG68lucからの発光は、IVIS Lumina (Caliper LifeSciences) あるいはルミノメーターARVOsx (パーキンエルマー社) を使用した。この際、赤色検出レインジにCBG68lucの発光の一部が入る。これは別途実施した実測値に基づいて補正した。
【００９７】
これらの発光が葉緑体における遺伝子発現に起因することを葉緑体遺伝子転写阻害剤rifampicin、葉緑体転写阻害剤翻訳阻害剤lincomycin、核遺伝子転写阻害剤α-amanitin、細胞質基質の翻訳阻害剤cycloheximideを用いた実験系で確認することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、植物体の生育後に、所定の波長の光を照射するだけで外来遺伝子の発現を開始させることができるので、植物体の枯死を回避し、多量の外来タンパク質を植物体内（例えば、葉緑体内）に蓄積させることができる。本発明を利用すれば、植物を用いて目的タンパク質を生産できるので、製造コストの大幅な削減が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号１  ：  ＰｓａＡ  Ｐｒｏｍｔｅｒ
配列番号２  ：  Ｒｕｂｉｓｃｏ  Ｌ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ
配列番号３  ：  ＰｓｂＡ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ
配列番号４  ：  ＣＢＧ６８ｌｕｃ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
配列番号５  ：  ｌａｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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