(57)【要約】【課題】新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供すること。【解決手段】（Ａ）クレスチンと、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類及び下記一般式（２）で表されるスルホキシド類から選ばれる１種以上とを組み合わせてなる免疫賦活剤。2014031344.tif 000006（式中、Ｒ1は、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）2014031344.tif 000007（式中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）クレスチンと、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類及び下記一般式（２）で表されるスルホキシド類から選ばれる１種以上とを組み合わせてなる免疫賦活剤。
【化１】
2014031344.tif 000004
（式中、Ｒ1は、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【化２】
2014031344.tif 000005
（式中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【請求項２】
成分（Ａ）と成分（Ｂ）とが一の製剤中に含まれるものである請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
成分（Ｂ）が前記ピロリドン類であり、当該ピロリドン類が、Ｎ−メチルピロリドン又はＮ−エチルピロリドンである請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
成分（Ｂ）が前記スルホキシド類であり、当該スルホキシド類が、ジメチルスルホキシドである請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を含有する免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活剤及び免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、元来生体が有している外来抗原排除という免疫応答を利用する療法であり、免疫系を賦活させることで治療するものである。免疫療法には、皮下、皮内、経皮投与法などがあり、免疫賦活剤と抗原とを順次に或いは同時に投与することで自然免疫系を活性化し、投与抗原に対する高い免疫応答を期待している。
【０００３】
クレスチンは、かわらたけ菌糸体より抽出された多糖類であり、効能・効果として、胃癌患者及び結腸・直腸癌患者における化学療法との併用による生存期間の延長（非特許文献１、２）、小細胞肺癌に対する化学療法等との併用による奏功期間の延長（非特許文献３）が挙げられる。これらの作用は、クレスチンによる自然免疫系の活性化によるものと考えられる（特許文献１）。また、クレスチンを利用してＴｈ１サイトカインを誘導することで癌抗原非特異的ワクチン療法開発の検討も行われている（特許文献２）。上記のクレスチンによる免疫賦活作用機序は長年不明であった。その後、遺伝子欠損マウスの解析から、クレスチンはトールライクレセプター２（ＴＬＲ２）に特異的に結合することが示された。この遺伝子欠損マウスの解析から、クレスチンはＴＬＲ２に選択的に結合し、キラーＴ細胞やＮＫ細胞を活性化することで抗腫瘍免疫を亢進させていることが判明した。更に、樹状細胞の成熟にも関与していることが分かった。これらの事象はヒトでも観察され、クレスチンは直接的にヒトＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞死（ＡＤＣＣ）活性を亢進させることも示されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８９８１５号公報
【特許文献２】特開２０１０−２６５３２７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】新本ら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ  １９８５；１４：１７１−１８０
【非特許文献２】三富ら、日本癌治療学会誌  １９９３；２８（１）：７１−８３
【非特許文献３】今野ら、肺癌  １９８８；２８（１）：１９−２８
【非特許文献４】Ｌｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；１７（１）６７−７６
【非特許文献５】Ｌｕら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７（２１）６７４２−５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の免疫賦活剤の効果は十分でなく、さらに優れた免疫賦活剤及びそれを用いた免疫療法剤が望まれていた。
従って、本発明の課題は、新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者は、種々の成分を用いて脾臓細胞から産生される液性因子の産生誘導能を指標として免疫賦活作用を検討してきたところ、クレスチンと特定のピロリドン類又はスルホキシド類との組み合わせが強い免疫賦活能を有し、免疫療法剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、（Ａ）クレスチンと、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類及び下記一般式（２）で表されるスルホキシド類から選ばれる１種以上とを組み合わせてなる免疫賦活剤を提供するものである。
一般式（１）
【０００９】
【化１】
2014031344.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒ1は、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
一般式（２）
【００１１】
【化２】
2014031344.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【００１３】
また、本発明は、上記免疫賦活剤を含有する免疫療法剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、脾臓細胞から放出される液性因子の割合が顕著に増大されるので、優れた免疫賦活剤が提供できるとともに、その免疫賦活剤を含む免疫療法剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】脾臓細胞の増殖に対するクレスチン単独（比較例１）の効果及びクレスチンとピロリドン類又はスルホキシド類との組み合わせ（実施例１〜５）の効果を示す図である。
【図２】ＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの産生に対するクレスチン単独（比較例１）及びクレスチンとピロリドン類又はスルホキシド類との組み合わせ（実施例１〜５）の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の免疫賦活剤は、（Ａ）クレスチンと、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類及び下記一般式（２）で表されるスルホキシド類から選ばれる１種以上とを組み合わせてなる。
【００１７】
クレスチンとは、かわらたけの菌糸体より得られる多糖類−タンパク質複合体であり、褐色又は褐色を帯びた細粒で、わずかに特異な匂いがあり、味はない。また、水に溶けやすく、エタノールには殆ど溶解しない性質を持つ。当該クレスチンは、医薬品として製造販売されており、それと同様にして製造することができる。
【００１８】
ピロリドン類を示す一般式（１）中、Ｒ1としては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒ1の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、メチル基、エチル基が特に好ましい。すなわち、ピロリドン類（１）としては、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドンが特に好ましい。
【００１９】
スルホキシド類を示す一般式（２）中、Ｒ2及びＲ3としては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒ2及びＲ3の具体例としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基が挙げられ、メチル基が特に好ましい。すなわち、スルホキシド類（２）としては、ジメチルスルホキシドが特に好ましい。
【００２０】
成分（Ｂ）は、１種を用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
（Ａ）クレスチンと、（Ｂ）ピロリドン類（１）及びスルホキシド類（２）から選ばれる１種以上とを組み合わせて用いれば、後記実施例に示すように、クレスチン単独投与の場合に比べて、免疫担当細胞（Ｂリンパ球等）の産生、成熟臓器である脾臓細胞の増殖を促進し、また脾臓細胞から産生される液性因子であるＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの産生量を増大させる作用、特にＩＦＮ−γの産生量を増大させる作用を有することから、これらの組み合わせは、ヒトを含む哺乳動物の免疫賦活剤として有用であり、免疫療法剤として有用である。また、ピロリドン類（１）又はスルホキシド類（２）は単独で免疫賦活作用を有するので、クレスチンの投与量を少なく抑制することができるため、安全性上特に好ましい。
【００２２】
本発明の免疫賦活剤は、（Ａ）クレスチンと（Ｂ）ピロリドン類（１）又はスルホキシド類（２）とを組み合わせて投与できればよく、同時投与であっても、互いに逐次投与であってもよい。また、（Ａ）クレスチンと（Ｂ）ピロリドン類（１）又はスルホキシド類（２）とは、投与経路が同一でも、互いに異なっていてもよいし、一の製剤であっても、別個の製剤であってもよい。
【００２３】
本発明の免疫療法剤は、上記の免疫賦活剤を含むものであり、好ましくはさらに抗原を含むものである。本発明の免疫療法剤は、免疫賦活剤および抗原を含む１つの製剤としてもよいし、免疫賦活剤および抗原を別体の製剤として含むキットであってもよい。また、他の免疫賦活剤、免疫調節剤、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＴＬＲ賦活剤（イミキモド、ＣｐＧヌクレオチド）等と併用してもよい。
【００２４】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤の投与方法としては、経皮投与、経粘膜投与、経口投与、皮下注射、皮内注射等が挙げられるが、経皮投与がより好ましい。本発明の免疫賦活剤と抗原を併用して投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。抗原の投与は、本発明の免疫賦活剤と抗原とを同時に投与してもよく、また本発明の免疫賦活剤を投与した後に抗原を投与してもよい。
上記抗原としては、免疫応答を引き起こすことができる分子であれば、特に制限はないが、例えばペプチドまたはタンパク質が挙げられる。ペプチドとしては、天然由来のペプチドまたは合成ペプチドのいずれでもよく、３〜２５のアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。タンパク質としては、天然由来のタンパク質または合成タンパク質のいずれでもよい。具体的には、癌抗原（腫瘍抗原）、種々のウイルス由来抗原、感染原因菌由来抗原、種々のアレルギー原因抗原等が挙げられる。
【００２５】
本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤中の成分（Ａ）の含有量は、０．００００１質量％以上が好ましく、０．００１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。なお、本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤の剤形が、後述する貼付剤である場合には、貼付剤の粘着層中に粘着剤を含むことが必要であるため、貼付剤の粘着層中の成分（Ａ）の含有量は、０．００００１〜２５質量％が好ましく、０．００１〜２０質量％がより好ましく、０．１〜１５質量％がさらに好ましい。
また、本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤中の成分（Ｂ）の含有量は、０．００００１質量％以上が好ましく、０．００１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。なお、本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤の剤形が、後述する貼付剤である場合には、貼付剤の粘着層中の成分（Ｂ）の含有量は、０．００００１〜２５質量％が好ましく、０．００１〜２０質量％がより好ましく、０．１〜１５質量％がさらに好ましい。
また、成分（Ａ）と成分（Ｂ）との含有質量比（成分（Ａ）：成分（Ｂ））は、１：１００〜１００：１が好ましく、１：５０〜５０：１がより好ましい。
【００２６】
また、本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤には、希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤；水等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２７】
本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤の剤形は、注射用剤または経皮投与剤であることが好ましく、経皮投与剤であることがより好ましい。経皮投与剤は、注射用剤と比較して、非侵襲的であること、また操作が塗る、貼るなどの単純な作業になるため、医療従事者である必要がなく、患者自身によっても作業可能である点で優れている。このような経皮投与剤の具体的な剤形としては、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、スプレー剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤などが挙げられる。これらの中でも貼付剤であることがより好ましく、角質剥離機能を有する貼付剤であることが特に好ましい。
角質剥離機能を有する貼付剤は、その粘着力をＪＩＳ  Ｚ０２３７に準拠した測定方法（対ベークライト板）で、好ましくは３〜２０Ｎ／２５ｍｍ程度に調整することにより得ることができる。
角質剥離機能を有する貼付剤の剥離により、皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、通常免疫賦活剤の適用後に適用される抗原の経皮吸収性を向上させることが出来るうえ、角質剥離機能を有する貼付剤の剥離による皮膚表皮角質層の破壊により皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。すなわち、免疫賦活成分による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮樹状細胞など）の活性化と、皮膚表皮角質層の破壊による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化の両方を一つの貼付剤で行うことができる。
【００２８】
免疫療法剤として、免疫賦活剤と併用して抗原を投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
抗原を投与する場合には、上記免疫賦活剤の投与と同時または約９６時間以内に、好ましくは約７２時間以内に、特に好ましくは約４８時間以内に、抗原を投与する。
抗原は、そのまま投与してもよいが、抗原投与剤の形態にするのが好ましく、抗原投与剤の剤形は、注射用剤または経皮投与剤であることが好ましく、経皮投与剤であることがより好ましい。この理由は、皮下注射された抗原は投与された局所から拡散するのに時間がかかり、皮膚下層中に点在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮内樹状細胞等）に捕獲される効率が低くなるためである。これに対して、経皮投与の場合には、表皮角質層が皮膚透過のバリアとなってしまい、抗原の経皮吸収性が低いことが問題となるが、上記のように、皮膚表皮角質層を破壊することで劇的に抗原の経皮吸収性が高まるうえ、皮下注射に比べて皮膚表皮の比較的広い範囲に抗原が投与されるため、皮膚下層中に点在する抗原提示細胞に捕獲される効率が高くなるという利点を有する。
【実施例】
【００２９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００３０】
実施例１
クレスチン粉末（クレハ社製）とＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）とをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）に溶解し、クレスチン濃度：１００μｇ／ｍｌ、ＮＭＰ濃度：０．１ｍＭである免疫賦活剤１を調製した。
【００３１】
実施例２
クレスチン粉末（クレハ社製）とＮＭＰとをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）に溶解し、クレスチン濃度：１００μｇ／ｍｌ、ＮＭＰ濃度：１ｍＭである免疫賦活剤２を調製した。
【００３２】
実施例３
クレスチン粉末（クレハ社製）とジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）に溶解し、クレスチン濃度：１００μｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ濃度：０．１ｍＭである免疫賦活剤３を調製した。
【００３３】
実施例４
クレスチン粉末（クレハ社製）とＤＭＳＯとをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）に溶解し、クレスチン濃度：１００μｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ濃度：１ｍＭである免疫賦活剤４を調製した。
【００３４】
実施例５
クレスチン粉末（クレハ社製）とＤＭＳＯとをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）に溶解し、クレスチン濃度：１００μｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ濃度：１０ｍＭである免疫賦活剤５を調製した。
【００３５】
比較例１
クレスチン粉末（クレハ社製）をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）に溶解し、クレスチン濃度：１００μｇ／ｍｌである比較用製剤１を調製した。
【００３６】
試験例
８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を取り出し、ピンセットで単一細胞化した。これらの細胞を０．９％塩化アンモニウム溶液で処理１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）に懸濁した。これらの脾臓細胞を使用して、以下の評価を行った。
【００３７】
（１）細胞増殖活性評価
１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した２×１０5個の脾臓細胞を９６ウェルプレートに播種し、免疫賦活剤１〜５、又は比較用製剤１で処理した（最終液量２００μｌ）。３７℃、５％ＣＯ2存在下で７２時間培養後、各ウェルに２０μｌのＷＳＴ−１（タカラバイオ製）を添加し、４時間後にマイクロプレートリーダ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用してＯＤ４５０を測定することで脾臓細胞増殖活性を判定した。結果を図１に示す。図１はＯＤ４５０の吸光度を示す。
上記ＷＳＴ−１は、ミトコンドリアの呼吸鎖に存在し、生細胞にだけ活性のある「succinate-tetrazolium reductase（コハク酸塩テトラゾリウム還元酵素)」（EC1.3.99.1)によりテトラゾリウム塩からホルマザン色素に変換される。すなわち、ホルマザン色素と生細胞の数とは直線的な相関を示し、ホルマザン色素の吸光度は生細胞の数に比例する。
【００３８】
図１の結果から、免疫賦活剤１〜５（クレスチンとピロリドン類又はスルホキシド類の組み合わせ：実施例１〜５）は、比較用製剤１（クレスチン単独：比較例１）と比較して、脾臓細胞の増殖を亢進させていることが分かる。
【００３９】
（２）サイトカイン産生評価
１０％ＦＢＳ  ＲＰＭＩ１６４０に懸濁した２×１０6個の脾臓細胞を２４ウェルプレートに播種し、免疫賦活剤１〜５、又は比較用製剤１で処理した（最終液量１ｍｌ）。３７℃、５％ＣＯ2存在下で７２時間培養後、細胞上清を回収した。ＩＬ−１α、ＩＦＮ−γに対する特異的抗体を使用することで、回収した上記の細胞上清中に含まれるＩＬ−１α、ＩＦＮ−γの量を測定した。検出方法はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を採用した。以下にその手法を記載する。９６ウェルプレート（ヌンク製）に、１μｇ／ｍｌの抗マウスＩＬ−１α抗体（バイオレジェンド製、クローンＢＬ１ａ−７２）、又は抗マウスＩＦＮ−γ抗体（バイオレジェンド製、クローンＡＮ−１８）を、ＴＢＳ[２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ]で希釈して播種し４℃で反応させた。１６時間後にプレートを室温に戻し、ＴＢＳ−ｔ[２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０]で３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳでブロッキングを行った。その１時間後にＴＢＳ−ｔで３回洗浄し、脾臓細胞由来細胞上清液を添加して室温で反応させた。その４時間後にＴＢＳ−ｔで３回洗浄し、１μｇ／ｍｌのビオチン標識抗マウスＩＬ−１α抗体（バイオレジェンド製、クローンＢＬ１ａ−８９）、又はビオチン標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体（バイオレジェンド製、クローンＸＭＧ１．２）をＴＢＳで希釈して播種し室温で反応させた。その１時間後にＴＢＳ−ｔで３回洗浄し、ストレプトアビジンーアルカリフォスファターゼ（バイオレジェンド製）をＴＢＳで希釈して室温で反応させた。その３０分後にＴＢＳ−ｔで５回洗浄し、パラニトロフェニルフォスフェート（インビトロジェン製）を播種して３７℃で反応させた。その３０分後にマイクロプレートリーダ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用してＯＤ４０５の吸光度を測定して、ＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの量を算出した。
比較用製剤１によるＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの産生量を１とした場合の免疫賦活剤１〜５によるＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの産生量の比率を図２に示す。
【００４０】
図２の結果から、免疫賦活剤１〜５（クレスチンとピロリドン類又はスルホキシド類との組み合わせ：実施例１〜５）は、比較用製剤１（クレスチン単独：比較例１）と比較して、ＩＬ−１αおよびＩＦＮ−γの産生を亢進していることが分かる。
【図１】
2014031344.tif 000008
【図２】
2014031344.tif 000009