(57)【要約】      （修正有）【課題】プロテインキナーゼ阻害作用を有する化合物を提供するとともに、これを有効成分とする研究用試薬及び癌治療等に有効な医薬の提供。【解決手段】藍藻（シアノバクテリア）の一種であるＬｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．から単離・構造決定された環状ペプチドであるリングビアシクラミドを有効成分とする研究用試薬及び癌治療等に有効な医薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１）、
【化１】
2014031353.tif 000010
（式中、Ｒは水素原子または水酸基を表す。）で表されるリングビアシクラミドを有効成分とする試薬。
【請求項２】
プロテインキナーゼ阻害性を有する、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
プロテインキナーゼが細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ）であることを特徴とする請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
次の式（１）、
【化２】
2014031353.tif 000011
（式中、Ｒは水素原子または水酸基を表す。）で表されるリングビアシクラミドを有効成分とする医薬。
【請求項５】
プロテインキナーゼ阻害性を有する、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
プロテインキナーゼが細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ）であることを特徴とする請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
抗がん性を有する、請求項４に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リングビアシクラミド（１、Ｌｙｎｇｂｙａｃｙｃｌａｍｉｄｅ  Ａ（Ｒ＝Ｈ）  またはＬｙｎｇｂｙａｃｙｃｌａｍｉｄｅ  Ｂ（Ｒ＝ＯＨ））を有効成分とする試薬と医薬、及びリングビアシクラミド（１）を有効成分とするプロテインキナーゼ阻害剤、リングビアシクラミド（１）を有効成分としてプロテインキナーゼの活性を阻害することを特徴とする試薬、並びにリングビアシクラミドを有効成分としてプロテインキナーゼの活性を阻害することを特徴とする医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】  プロテインキナーゼ（タンパク質リン酸化酵素）は全身の細胞に広く発現しており、タンパク質分子のセリン、スレオニン、あるいはチロシンにリン酸基を付加する。タンパク質はリン酸化されることにより構造が変化してその酵素活性や細胞内での局在、他のタンパク質との会合状態の変化等を引き起こす。従って、プロテインキナーゼの機能異常は種々の疾病の原因となる。特に細胞の分化増殖や細胞情報伝達機能に重要な役割を担うものであることから、がん細胞の発生、増殖、治療等、様々な観点から広く研究の対象となっている。【０００３】従来より、種々のプロテインキナーゼ阻害剤が報告されており、研究用試薬や抗がん剤として既に使用されているものもあるが、その作用機構や、必ずしも満足のいかない治療成績、重篤な副作用の点で問題が残っているばかりか多剤耐性の問題などもあるため、更により優れた阻害剤の出現が常に求められている。また、これまでにない新規な構造を有する化合物は新たな作用機構を示し、より有効で、より副作用の少ない薬剤となる可能性が高い。またその新たな作用機構により、抗癌剤以外の医薬としての効果も期待できる。【０００４】  本発明のリングビアシクラミド（１）は、本発明者らにより藍藻（シアノバクテリア）の一種であるＬｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．から単離・構造決定された環状ペプチドであり、マウス由来のＢ１６メラノーマ細胞に対して増殖阻害作用を示す一方、小型甲殻類であるブラインシュリンプに対しては毒性を示さないことが報告されている（非特許文献１）。しかし、リングビアシクラミドがプロテインキナーゼを阻害することはこれまでに報告されていない。また、種々のがん細胞に対する増殖阻害活性の現れ方が従来の抗がん剤と異なっていることはこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５１（２０１０）６３８４−６３８７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、プロテインキナーゼ阻害作用を有するリングビアシクラミドを提供するとともに、これを有効成分とする研究用試薬及びがん治療等に有効な医薬を提供することを目的とする。また、従来にない新規な作用機構を有する研究用試薬及びがん治療等に有効な医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を重ね本発明に想到したものであり、沖縄県で採集した藍藻（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）を抽出、分離精製して得たリングビアシクラミドが、プロテインキナーゼに対して阻害活性を有すること、種々のがん細胞に対する増殖阻害活性の現れ方が従来の抗がん剤と異なっておりその作用機構が未知のものである可能性が高いことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の式（１）【０００８】
【化１】
2014031353.tif 000002
（式中、Ｒは水素原子または水酸基を表す。）で表されるリングビアシクラミドを有効成分とする試薬に関する（請求項１）。また、請求項１の試薬が、特にプロテインキナーゼ阻害剤である試薬に関する（請求項２）。さらに、プロテインキナーゼが細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ）であることを特徴とする請求項２に記載の試薬に関する（請求項３）。【０００９】  また、次の式（１）【００１０】
【化２】
2014031353.tif 000003
（式中、Ｒは水素原子または水酸基を表す。）で表されるリングビアシクラミドを有効成分とする医薬に関する（請求項４）。また、請求項４の医薬が、特にプロテインキナーゼ阻害性を有する医薬（請求項５）および、プロテインキナーゼが細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ）であることを特徴とする請求項５に記載の医薬（請求項６）に関する。さらに、請求項４の医薬が、特に抗がん剤である医薬（請求項７）に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明の効果】
【００１１】  本発明は以下の効果を奏する。本発明のリングビアシクラミドは、プロテインキナーゼ阻害活性を有し研究用試薬、抗がん剤、医薬として有用である。リングビアシクラミドはこれまでのプロテインキナーゼ阻害剤にない新規な構造を有するため新たな作用機構を示し、より有効で、より副作用の少ない薬剤となる可能性が高い。リングビアシクラミドは種々のがん細胞に対する増殖阻害活性の現れ方が従来の抗がん剤と異なっており、その作用機構が未知のものである可能性が高い。またその作用機構により、抗がん剤以外の医薬としての効果も期待できる。さらに、化学修飾が容易で誘導体を合成しやすいので更に優れた活性を有する抗がん剤を含む医薬の開発が期待できる。【００１２】
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のリングビアシクラミド（１）によるヒト単球性白血病由来細胞株（Ｕ９３７）に対する細胞生存率を表した図である。
【図２】本発明のリングビアシクラミド（１）によるヒト乳がん由来細胞株（ＭＣＦ−７）に対する細胞生存率を表した図である。
【図３】本発明のリングビアシクラミド（１）によるヒト子宮頸がん由来細胞株（ＨｅＬａ）に対する細胞生存率を表した図である。
【図４】本発明のリングビアシクラミドＡ（１ａ）のヒト培養がん細胞パネル試験結果をフィンガープリントとして表示したものである。
【図５】本発明のリングビアシクラミドＢ（１ｂ）のヒト培養がん細胞パネル試験結果をフィンガープリントとして表示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】  本発明の上記式（１）で表されるリングビアシクラミドは、例えば沖縄県で採集した藍藻（Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．）を有機溶媒で抽出後、分離精製することにより得られる。また、市販されている試薬を用いて公知の方法により合成して得ることもできる。
【００１５】  本発明における上記式（１）に含まれる化合物としては具体的には、
【化３】
2014031353.tif 000004
で表されるリングビアシクラミドＡ（１ａ）、及び、
【化４】
2014031353.tif 000005
で表されるリングビアシクラミドＢ（１ｂ）を挙げることができる。
【００１６】  リングビアシクラミドが阻害作用をしめすプロテインキナーゼとしては、例えば、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、チロシンキナーゼを挙げることができる。
【００１７】  本発明の化合物を試薬として用いるとは、リングビアシクラミドがプロテインキナーゼ活性を阻害することを利用するものであって、例えばＥＲＫが関与する生体内反応の研究時にその作用を効果的に抑制するための試薬を挙げることができる。
【００１８】  本発明の化合物を医薬として用いる場合には治療のために経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、直腸投与剤、皮膚外用剤、吸入剤とすることができる。これらの製剤は有効成分に薬学的に認容である製造助剤を加えることにより常法に従って製造される。更に公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
【００１９】  経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤例えば乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳糖カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水ケイ酸などとを混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するにはこれらの散剤及び顆粒剤をそのままあるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタアクリル酸、メタアクリル酸メチルコポリマーなどの腸溶性基剤で被覆して腸溶性製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆し軟カプセル剤とすることができる。
【００２０】  経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００２１】  注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じ塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射用乳剤とすることもできる。
【００２２】  直腸投与剤を製造するには、有効成分及びカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの坐剤用基剤とを加湿して溶融し型に流しこんで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２３】  皮膚外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合したのちポリエチレンなどの不織布に展延してテープ剤とする。
吸入剤を製造するには、有効成分をフロンガスなどの噴射剤に溶解又は分散して耐圧容器に充填しエアゾール剤とする。
【００２４】  上記構成を有する本発明の薬剤は、公知の製造法、例えば第１６改正日本薬局方製剤総則記載の方法ないし適当な改良を加えた方法によって製造することができる。
【００２５】  本発明の有効成分の投与量は患者の年齢、体重及び病態によって異なるが、通常１日約１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、１乃至数回に分けて投与することが望ましい。
【００２６】
【実施例】
【００２７】  試験例１（リングビアシクラミドのプロテインキナーゼ阻害性試験）
化学療法基盤支援活動の化合物評価（抗がん剤のシードとなる分子標的阻害物質の探索と評価）においてプロテインキナーゼ阻害性試験を行った。ＮＲＫ細胞を９６ウェルプレートにまき込み、３日間培養後、リングビアシクラミドＡまたはリングビアシクラミドＢを所定濃度になるように添加、３時間処理した後に血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）で刺激した。電気泳動用サンプルを調製し、リン酸化されたシグナル伝達分子（ＡＫＴ、ＥＲＫ、ＰＫＤ、ＰＬＣγ１、Ｓ６  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ６Ｒ））及びホスホチロシン（ＰＹ）に対する抗体によるウェスタンブロットを行い、ＰＤＧＦレセプターからの細胞内シグナル伝達に対する影響を評価した。結果を表１、２に示す。特にリングビアシクラミドＡはＰＤＧＦレセプターチロシンキナーゼ（ＰＹ欄参照）を阻害しない濃度（１μＭ）においても細胞外シグナル調節キナーゼに対して５０〜８０％の阻害（＋）が観測された（ＥＲＫ欄）。
【表１】
2014031353.tif 000006
【表２】
2014031353.tif 000007
【００２８】  試験例２（リングビシクラミドのがん細胞増殖阻害活性試験（Ｕ９３７））
ヒト単球性白血病由来細胞株（Ｕ９３７）を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した１０％ウシ胎児血清含有のＲＰＭＩ−１６４０培地に加え、Ｕ９３７細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２４時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。２４時間培養後にリングビアシクラミドＡまたはリングビアシクラミドＢをそれぞれＤＭＳＯに溶解し、所定の濃度（１０、５、２．５、１μＭ）になるように細胞に添加し、追加培養した。４８時間後にＭＴＴ試薬を加え、４時間培養して形成されるホルマザンを０．０４Ｍ  ＨＣｌ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液に溶解し、５７０ｎｍの吸光度で測定することで、細胞増殖抑制活性を求めた。結果のグラフを図１に示す。リングビアシクラミドＡ及びリングビアシクラミドＢは、グラフに示す濃度でＵ９３７細胞の増殖を完全に抑制し、死滅させた。【００２９】  試験例３（リングビアシクラミドのがん細胞増殖抑制活性試験（ＭＣＦ−７））
ヒト乳がん由来細胞株（ＭＣＦ−７）を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した１０％ウシ胎児血清含有のＭＤＥＭ培地に加え、ＭＣＦ−７細胞を８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２４時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。２４時間培養後にリングビアシクラミドＡまたはリングビアシクラミドＢをそれぞれＤＭＳＯに溶解し、所定の濃度（１０、５、２．５、１μＭ）になるように細胞に添加し、追加培養した。４８時間後にＭＴＴ試薬を加え、４時間培養して形成されるホルマザンを０．０４Ｍ  ＨＣｌ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液に溶解し、５７０ｎｍの吸光度で測定することで、細胞増殖抑制活性を求めた。結果のグラフを図２に示す。リングビアシクラミドＡ及びリングビアシクラミドＢは、グラフに示す濃度でＭＣＦ−７細胞の増殖を完全に抑制し、死滅させた。【００３０】  試験例４（リングビアシクラミドのがん細胞増殖抑制活性試験（ＨｅＬａ））
ヒト子宮頸がん由来細胞株（ＨｅＬａ）を１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した１０％ウシ胎児血清含有のＭＤＥＭ培地に加え、ＨｅＬａ細胞を８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２４時間培養した（５％ＣＯ２、３７℃）。２４時間培養後にリングビアシクラミドＡまたはリングビアシクラミドＢをそれぞれＤＭＳＯに溶解し、所定の濃度（１０、５、２．５、１μＭ）になるように細胞に添加し、追加培養した。４８時間後にＭＴＴ試薬を加え、４時間培養して形成されるホルマザンを０．０４Ｍ  ＨＣｌ／ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液に溶解し、５７０ｎｍの吸光度で測定することで、細胞増殖抑制活性を求めた。結果のグラフを図３に示す。リングビアシクラミド及びリングビアシクラミドＢは、グラフに示す濃度でＨｅＬａ細胞の増殖を完全に抑制し、死滅させた。【００３１】  試験例５（リングビアシクラミドのヒト培養がん細胞パネル試験）
化学療法基盤支援活動の化合物評価（抗がん剤のシードとなる分子標的阻害物質の探索と評価）においてがん細胞パネルを用いた新規抗がん剤スクリーニングを行った。ヒトがん細胞パネルとは、ヒトがん細胞株３９系（肺がん７系、胃がん６系、大腸がん５系、卵巣がん５系、脳腫瘍６系、乳がん５系、腎がん２系、前立腺がん２系およびメラノーマ１系）を用いた薬剤感受性試験によって、新規化合物のがん細胞増殖阻害活性を評価すると同時に、インフォーマティクスによってその化合物の作用メカニズムないし分子標的の予測を行う化合物評価系である。既知の抗がん剤とは異なるユニークな分子標的を持つ化合物を選別する方法として優れている。（癌と化学療法３１，４８５−９０（２００４）参照）
各がん細胞を９６ウェルプレートにまき込み、翌日サンプルの溶液を添加、２日間培養後、細胞増殖をスルホローダミンＢによる比色定量で測定した。測定したがん細胞株３９系の平均薬剤有効濃度に対する個々のがん細胞株の有効濃度偏差を計算し、フィンガープリントとして表示した（図４、５）。これまで測定しデータベース化した約７０種類の標準抗がん剤のフィンガープリントと比較することにより、サンプルの作用機作の推定あるいは作用機作の新規性の評価を行った。結果を表３、４に示す。
【表３】
2014031353.tif 000008
【表４】
2014031353.tif 000009
特にリングビアシクラミドＢは有効濃度が十分に低く（ＭＧ  ＭＩＤ＜−５）、かつ特定のがん種またはいくつかのがん細胞株に対し顕著な有効性が見られた（Ｄｅｌｔａ≧０．５かつＲａｎｇｅ≧１）ので、有効と評価された。さらに、Ｃｏｍｐａｒｅ  Ｒｅｓｕｌｔで作用機構が最も似ていたＣｉｓｐｌａｔｉｎ（Ｒａｎｋ１）との相関係数（ｒ値）が０．５６１で、新規な作用機構を持つ可能性があるとの評価（０．５≦ｒ＜０．７５）に相当した。
【産業上の利用可能性】
【００３２】  本発明は、プロテインキナーゼ阻害作用を有するリングビアシクラミドを提供するとともに、これを有効成分とする研究用試薬及びがん治療に有効な医薬を提供することを目的とする。
本発明のリングビアシクラミドは、プロテインキナーゼ阻害活性を有し研究用試薬、医薬、抗がん剤として有用である。プロテインキナーゼは生体内に広く分布し、様々な役割を果たすので、生化学、生物学、または医学上重要な研究対象であり、その阻害剤は研究用試薬として有用である。また、プロテインキナーゼ阻害剤はがん治療に有効であることが知られており、ゲフィチニブやイマチニブ等既に臨床に用いられているものもあるが、リングビアシクラミドはこれまでにない新規な構造を有するため新たな作用機構を示し、より有効で、より副作用の少ない薬剤となる可能性が高い。またその作用機構により、抗癌剤以外の医薬としての効果も期待できる。さらに、化学修飾が容易で誘導体を合成しやすいので更に優れた活性を有する抗がん剤を含む医薬の開発が期待できる。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2014031353.tif 000012
【図２】
2014031353.tif 000013
【図３】
2014031353.tif 000014
【図４】
2014031353.tif 000015
【図５】
2014031353.tif 000016