(57)【要約】【課題】リシノール酸をより高産生することが可能なリシノール酸産生酵母、および該リシノール酸産生酵母を用いたリシノール酸の製造方法を提供する。【解決手段】酵母を宿主とし、ＦＡＨ１２遺伝子と、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体であることを特徴とする、リシノール酸産生酵母、並びに前記いずれかのリシノール酸産生酵母を培養した後、培養された該リシノール酸産生酵母または培養上清からリシノール酸を取得することを特徴とするリシノール酸の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を宿主とし、ＦＡＨ１２遺伝子と、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体であることを特徴とする、リシノール酸産生酵母。
【請求項２】
前記加水分解酵素が、フォスフォリパーゼＡ２活性またはトリアシルグリセロールリパーゼ活性を有する、請求項１に記載のリシノール酸産生酵母。
【請求項３】
前記酵母がシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母である請求項１または２に記載のリシノール酸産生酵母。
【請求項４】
前記ＦＡＨ１２遺伝子が、トウゴマ（Ricinus communis）、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）または麦角菌（Claviceps purpurea）由来である請求項１〜３のいずれか一項に記載のリシノール酸産生酵母。
【請求項５】
前記加水分解酵素をコードする遺伝子が、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のｐｌｇ７遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリシノール酸産生酵母。
【請求項６】
酵母を宿主とし、遺伝子工学的方法により、ＦＡＨ１２遺伝子と、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子とを、同時にまたは順次組み込むことを特徴とする、リシノール酸産生酵母の製造方法。
【請求項７】
ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体に、前記加水分解酵素をコードする遺伝子を導入する、請求項６に記載のリシノール酸産生酵母の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のリシノール酸産生酵母を培養した後、培養された該リシノール酸産生酵母または培養上清からリシノール酸を取得することを特徴とするリシノール酸の製造方法。
【請求項９】
前記リシノール酸産生酵母の培養を、１０〜３５℃で行う、請求項８に記載のリシノール酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リシノール酸を高産生し得る酵母の形質転換体、および該酵母を培養してリシノール酸を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ウレタン製品等の化成品の原料は、専ら石油資源に頼っている。地球温暖化対策により、石油資源に代わる代替材料が模索されており、リシノール酸が注目されている。リシノール酸は、トウゴマ（Ricinus communis）を絞ったひまし油の８０〜９０％を占めており、ひまし油から精製したものが使用されている。しかし、トウゴマにはリシンという猛毒の蛋白質が含まれており、取り扱いに注意を要する上、植物資源であるため、安定供給には不安がある。そこで、ひまし油以外からリシノール酸を安全かつ安定して製造する方法の開発が望まれている。
【０００３】
リシノール酸は、鎖長が炭素数１８であり、不飽和結合が１つと１２位に水酸基を持つ脂肪酸であり、Δ１２−ヒドロキシラーゼにより、オレイン酸の１２位に水酸基を導入することによって生産できる。野生型の酵母はΔ１２−ヒドロキシラーゼを有していないため、リシノール酸を産生することはできない。そこで、本発明者らは、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe、以下、Ｓ．ポンベ）が、脂肪酸組成としてオレイン酸の含有量が８割程度と高いことに着目して、Ｓ．ポンベに異種生物由来のΔ１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入し、リシノール酸の生産を試みた。この結果、Ｓ．ポンベの形質転換体においてリシノール酸が生産されることが確認されたが、リシノール酸の生産量が多くなるほど宿主の増殖が遅くなることも分かった（非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】石川大輔、他８名、日本分子生物学会年会講演要旨集、２００９年、第３２巻、第２号、第７０ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明の目的は、リシノール酸をより高産生することが可能なリシノール酸産生酵母、該リシノール酸産生酵母の製造方法、および該リシノール酸産生酵母を用いたリシノール酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＦＡＨ１２(Fatty acid hydroxylase）遺伝子が導入された酵母の形質転換体に、さらに脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子を導入することにより、ＦＡＨ１２遺伝子の導入により引き起こされた増殖阻害が抑制し得ること、および、該形質転換体を培養すると、産生されたリシノール酸の少なくない量が培地中に分泌されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明に係るリシノール酸産生酵母、リシノール酸産生酵母の製造方法、およびリシノール酸の製造方法は前記［１］〜［９］である。
［１］酵母を宿主とし、ＦＡＨ１２遺伝子と、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体であることを特徴とする、リシノール酸産生酵母。
［２］前記加水分解酵素が、フォスフォリパーゼＡ２活性またはトリアシルグリセロールリパーゼ活性を有する前記［１］のリシノール酸産生酵母。
［３］前記酵母がシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母である前記［１］または［２］のリシノール酸産生酵母。
［４］前記ＦＡＨ１２遺伝子が、トウゴマ（Ricinus communis）、レスクェレラ・フェンドレリ（Lesquerella fendleri）または麦角菌（Claviceps purpurea）由来である前記［１］〜［３］のいずれかのリシノール酸産生酵母。
［５］前記加水分解酵素をコードする遺伝子が、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）のｐｌｇ７遺伝子である前記［１］〜［４］のいずれかのリシノール酸産生酵母。
［６］酵母を宿主とし、遺伝子工学的方法により、ＦＡＨ１２遺伝子と、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子とを、同時にまたは順次組み込むことを特徴とする、リシノール酸産生酵母の製造方法。
［７］ＦＡＨ１２遺伝子が導入された酵母の形質転換体に、前記加水分解酵素をコードする遺伝子を導入する前記［６］のリシノール酸産生酵母の製造方法。
［８］前記［１］〜［５］のいずれかのリシノール酸産生酵母を培養した後、培養された該リシノール酸産生酵母または培養上清からリシノール酸を取得することを特徴とするリシノール酸の製造方法。
［９］前記リシノール酸産生酵母の培養を、１０〜３５℃で行う前記［８］のリシノール酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、ＦＡＨ１２の発現によりリシノール酸を産生し得るにもかかわらず、ＦＡＨ１２遺伝子のみが導入された形質転換体よりも増殖能が高い。さらに、該リシノール酸産生酵母により産生されたリシノール酸のうちの少なくない量が培地中に分泌される。このため、該リシノール酸産生酵母を培養する本発明に係るリシノール酸の製造方法により、より大量のリシノール酸を簡便に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した図である。
【図２】参考例１において、ＣｐＦＡＨ１２株をスポットしたプレートを各温度でインキュベートした後の各プレートの写真図である。
【図３】Ｓ．ポンベのｃＤＮＡライブラリーを作製するために用いたベクターの構造を模式的に示した図である。
【図４】実施例１において、各形質転換体をスポットしたプレートを培養した後の各プレートの写真図である。
【図５】実施例１において、各形質転換体を、３０℃で培養した場合の増殖曲線を示した図である。
【図６】実施例２において、各形質転換体を培養した場合の培養液のＯＤ６００、グルコース濃度、および培養上清の濁度を経時的に測定した結果を示した図である。
【図７】実施例２において、各形質転換体の培養上清の脂肪酸の含有量と組成を測定した結果を示した図である。
【図８】実施例２において、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子とｐｌｇ７遺伝子を導入した株）とＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子と空ベクターを導入した株） について、リン脂質（ＰＬ）以外の脂質（遊離脂肪酸を含む。）中、およびリン脂質中のリシノール酸含有割合（％）を、ガスクロマトグラフ分析によって測定した結果を示して図である。
【図９】実施例３において、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養上清中の脂質画分を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した結果を示した図である。
【図１０】実施例４において、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株とＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株について、培養上清中および細胞内の脂肪酸含量およびリシノール酸含量を測定した結果を示した図である。
【図１１】実施例５において、各形質転換体を、２０℃、２５℃および３０℃で培養した場合の増殖曲線を示した図である。
【図１２】実施例６において、各形質転換体を培養した場合の培養上清の濁度の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［リシノール酸産生酵母］
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、酵母を宿主とし、ＦＡＨ１２遺伝子と、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ＦＡＨ１２遺伝子の導入により、酵母にリシノール産生能を付与できる。また、ＦＡＨ１２の発現により増殖阻害が引き起こされるが、ＦＡＨ１２遺伝子と共に特定の活性を有する加水分解酵素遺伝子を導入することにより、ＦＡＨ１２による増殖阻害が緩和され、ＦＡＨ１２遺伝子を単独で導入した形質転換体よりも、増殖能を高められる。
【００１１】
（ＦＡＨ１２遺伝子）
酵母に導入するＦＡＨ１２遺伝子は、オレイン酸の１２位の炭素原子に水酸基を導入し得るΔ１２−ヒドロキシラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子であれば、特に限定されず、微生物由来であってもよく、植物由来であってもよい。具体的には、たとえば、トウゴマのＦＡＨ１２（ＲｃＦＡＨ１２）（GenBank ID.No.： AAC49010.1）をコードする遺伝子（ＲｃＦＡＨ１２遺伝子）、レスクェレラ・フェンドレリのＦＡＨ１２（ＬｆＦＡＨ１２）（GenBank ID.No.： AAC32755.1）をコードする遺伝子（ＬｆＦＡＨ１２遺伝子）、麦角菌のＦＡＨ１２（ＣｐＦＡＨ１２）（GenBank ID.No.： ACF37070.1）をコードする遺伝子（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子）、フィサリア・リンドヘイメリ（Physaria lindheimeri）のｏｌｅａｔｅ  １２−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（GenBank ID.No.：ABQ01458.1）をコードする遺伝子、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のｕｎｎａｍｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ（GenBank ID.No.：CAK37451.1）をコードする遺伝子、が挙げられる。なお、GenBankはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースである。本発明では、ＲｃＦＡＨ１２遺伝子、ＬｆＦＡＨ１２遺伝子またはＣｐＦＡＨ１２遺伝子が好ましく、Δ１２−ヒドロキシラーゼ活性がより高いため、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子がより好ましい。
【００１２】
（加水分解酵素およびこれをコードする遺伝子）
酵母に導入する加水分解酵素をコードする遺伝子は、脂質のエステル結合の切断活性を有する加水分解酵素をコードする遺伝子である。より詳細には、該加水分解酵素は、脂質のエステル結合を加水分解し、アシル基を遊離させる酵素活性を有する。該加水分解酵素としては、たとえば、グリセロリン脂質やトリアシルグリセリドを基質とするリパーゼ等が挙げられる。本発明に係るリシノール酸産生酵母を製造するために酵母に遺伝子を導入する加水分解酵素としては、フォスフォリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性、フォスフォリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）活性、またはトリアシルグリセロールリパーゼ（ＴＧリパーゼ）活性を少なくとも有する加水分解酵素が好ましく、ＰＬＡ２活性またはＴＧリパーゼ活性を有する加水分解酵素がより好ましい。なお、以降、該加水分解酵素を「加水分解酵素Ａ」、該加水分解酵素をコードする遺伝子を「加水分解酵素Ａ遺伝子」ということがある。
【００１３】
酵母に導入する加水分解酵素Ａ遺伝子の由来は特に限定されず、微生物由来であってもよく、植物由来であってもよく、動物由来であってもよい。酵母内における発現のしやすさの点から、微生物由来の遺伝子が好ましく、酵母由来の遺伝子がより好ましい。本発明に係るリシノール酸産生酵母としては、酵母由来であって、ＰＬＡ２活性、ＰＬＡ１活性、またはＴＧリパーゼ活性を少なくとも有する加水分解酵素をコードする遺伝子が導入されていることが好ましく、Ｓ．ポンベ由来のＰＬＡ２活性、ＰＬＡ１活性、またはＴＧリパーゼ活性を少なくとも有する加水分解酵素をコードする遺伝子が導入されていることがより好ましい。Ｓ．ポンベ由来の該遺伝子としては、たとえば、ｐｌｇ７遺伝子（ＳＰＢＣ１０６．１１ｃ）、ｐｔｌ２遺伝子（ＳＰＡＣ１７８６．０１ｃ）、およびＳＰＡＣ４Ａ８．１０遺伝子が挙げられる。ｐｌｇ７はＰＬＡ２活性を有する酵素であり、ｐｔｌ２はＴＧリパーゼ活性を有する酵素である。また、ＳＰＡＣ４Ａ８．１０遺伝子がコードする蛋白質ＦＹＧ１３０＿ｆ０は、そのアミノ酸配列からリパーゼであると推定されていた。
【００１４】
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、サンガー研究所のデータベース「ＧｅｎｅＤＢ」に「Schizosaccharomyces pombe Gene DB（http://www.genedb.org/genedb/pombe/）」として、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名または系統名で検索して、入手できる。
【００１５】
（酵母）
ＦＡＨ１２遺伝子等が導入される宿主は、酵母であれば特に限定されず、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae、以下、Ｓ．セレビシエ)をはじめとするサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属酵母、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）属酵母、ピキア（Pichia）属酵母、カンジダ（Candida）属酵母が挙げられる。オレイン酸含有量が高いことから、シゾサッカロミセス属酵母であることが好ましい。シゾサッカロミセス属酵母としては、たとえば、Ｓ．ポンベ、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Schizosaccharomyces octosporus）が挙げられ、Ｓ．ポンベが好ましい。
【００１６】
また、宿主とする酵母は、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Latour法（Nucleic  Acids  Research誌、第34巻、e11ページ、2006年；国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（PCR  Methods  Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
【００１７】
さらに宿主となる酵母には、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターに該欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得られる。
たとえば、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっている酵母を宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得られる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
【００１８】
（発現カセット）
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、ＦＡＨ１２遺伝子の発現カセットと加水分解酵素Ａ遺伝子の発現カセットとを、酵母に導入することにより作製できる。ＦＡＨ１２遺伝子の発現カセットは、ＦＡＨ１２遺伝子をコードする領域を含む構造遺伝子配列（ＦＡＨ１２遺伝子配列）、並びに該遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含む。加水分解酵素Ａ遺伝子の発現カセットは、加水分解酵素Ａ遺伝子をコードする領域を含む構造遺伝子配列（加水分解酵素Ａ遺伝子配列）、並びに該遺伝子を発現させるためのプロモーター配列およびターミネーター配列を含む。ＦＡＨ１２遺伝子配列としては、麦角菌等由来のＦＡＨ１２をコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いる酵母内での発現量を増大させるために、前記遺伝子配列を、宿主での高発現遺伝子において使用頻度の高いコドンに改変することが好ましい。加水分解酵素Ａ遺伝子として、宿主とは別種の生物由来の遺伝子を用いる場合にも同様である。
【００１９】
発現カセットとは、蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、該蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主である酵母内で機能するプロモーターとターミネーターとを含む。
前記発現カセットには、さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ＦＡＨ１２遺伝子配列または加水分解酵素Ａ遺伝子配列、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域を全て含む発現カセットである。さらに、栄養要求性相補マーカー等の遺伝子を有していてもよい。
【００２０】
プロモーターとターミネーターは、宿主である酵母内で機能してＦＡＨ１２等を発現できるものであればよい。酵母内で機能するプロモーターとしては、酵母が本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい。）や酵母が本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど。）を使用できる。プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号参照。）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号参照。）などが挙げられる。
シゾサッカロミセス属酵母が本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
シゾサッカロミセス属酵母内で機能するターミネーターとしては、シゾサッカロミセス属酵母が本来有するターミネーターやシゾサッカロミセス属酵母が本来有しないターミネーターを使用できる。ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
【００２１】
（ベクター）
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、具体的には、前記発現カセットを含むベクターにより宿主である酵母を形質転換することにより得られる。形質転換に用いるベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence: ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素部位を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
【００２２】
該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
【００２３】
リシノール酸産生酵母の製造に用いられる前記発現カセットを含むベクターは、たとえば、外来構造遺伝子を導入するためのクローニングサイトを備える公知の発現ベクター中の該クローニングサイトに、ＦＡＨ１２遺伝子配列等を挿入することによって製造できる。また、公知の発現ベクターに、ＦＡＨ１２遺伝子配列等を含む発現カセットを組み込むことによっても製造できる。また、ＦＡＨ１２遺伝子の発現カセットと加水分解酵素Ａ遺伝子の発現カセットは、それぞれ別個のベクターに組み込んでもよく、両者を１のベクターに組み込んでもよい。
【００２４】
（リシノール酸産生酵母の製造方法）
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、前記発現カセットを、染色体中に有するか、または、染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１カ所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有するということである。形質転換体の継代培養が容易であることから、該発現カセットを染色体中に有することが好ましい。
【００２５】
形質転換方法は、公知の形質転換方法をいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法や、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
【００２６】
形質転換を行った後、通常は得られた形質転換体を選抜する。選抜方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。選抜した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
【００２７】
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、宿主となる酵母に、ＦＡＨ１２遺伝子の発現カセットと加水分解酵素Ａ遺伝子の発現カセットを同時に導入して、両遺伝子を同時に組み込むことにより製造してもよく、両発現カセットを順次導入して製造してもよい。たとえば、まず、酵母にＦＡＨ１２遺伝子の発現カセットを導入し、ＦＡＨ１２遺伝子が組み込まれた形質転換体を得、これに加水分解酵素Ａ遺伝子の発現カセットを導入することによって、加水分解酵素Ａ遺伝子がさらに組み込まれた形質転換体を製造できる。
【００２８】
（リシノール酸産生酵母の培養方法）
本発明に係るリシノール酸産生酵母は、一般的な酵母の培養方法と同様にして培養できる。たとえば、培養液には、宿主とした酵母の培養に用いられる公知の培養培地を用いることができ、宿主が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率よく行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
【００２９】
炭素源としては、たとえばグルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、たとえばアンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえばリン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００３０】
培養には公知の細胞培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養、撹拌培養により行える。
培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。また、培養時間は適宜決定できる。
【００３１】
［リシノール酸の製造方法］
本発明に係るリシノール酸産生酵母では、産生されたリシノール酸のうちの少なくない量が培地中に分泌される。このため、該リシノール酸産生酵母の培養上清（培養後の液体培地）から、リシノール酸を容易に回収できる。該リシノール酸産生酵母では、菌体外へ分泌される脂肪酸の大部分がリシノール酸であるため、培養上清から回収することにより、菌体から回収するよりも純度の高いリシノール酸を容易に得られる。また、産生された全てのリシノール酸が菌体外に分泌されるわけではなく、培養後のリシノール酸産生酵母からもリシノール酸は回収できる。
【００３２】
該リシノール酸産生酵母は、ＦＡＨ１２遺伝子導入による増殖阻害が抑制されており、１０〜３５℃の範囲内でリシノール酸を分泌しつつ良好に増殖できる。特に、増殖とリシノール酸の産生効率とのバランスがよいことから、リシノール酸回収のための培養温度は、１５〜３０℃が好ましく、１８〜２８℃がより好ましく、２０〜２５℃がさらに好ましい。
【００３３】
培養上清や菌体からのリシノール酸の回収は、溶剤抽出法等の一般的に脂肪酸の抽出・精製に使用される公知の手法により実施できる。たとえば、リシノール酸産生酵母を培養した後、得られた培養液を遠心分離して菌体を除去し、得られた培養上清にクロロホルム／メタノール（１：２）を加えて抽出し、その後精製することにより、リシノール酸を精製できる。また、該遠心分離により回収された菌体をメタノール中でグラスビーズ等を用いて破砕しながら、クロロホルム／メタノール（１：２）を加えて抽出し、その後精製することにより、リシノール酸を精製できる。
リシノール酸は、ガスクロマトグラフィ法等の公知の手法で検出および定量できる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例等を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
なお、以下の実施例等において、酵母の培養液および該希釈液のＯＤ値は、分光光度計ＵＶ１６００（島津製作所製）を用いて測定した。
【００３５】
（脂肪酸含有量の測定）
以下の実施例等において、リシノール酸をはじめとする脂肪酸含有量は、ガスクロマトグラフ分析によるKainouらの方法（Kainou et al., Yeast, 2006, vol.23, pp.605-612）に準じて行った。具体的には、以下に示す通りである。まず、脂肪酸分析は、温度制御環境下（１６０〜２３４℃、昇温速度：４．５℃／ｍｉｎ）で、ＴＣ−７０キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ２０１０、島津製作所製）に０．２μＬの測定試料を投与して実施した。脂肪酸組成は、各ピークの面積に基づいて算出され、含有量は、標準としたヘプタデカン酸メチル（Ｃ１７：０)と比較することによって決定した。
なお、菌体中のリシノール酸量を測定する場合には、遠心分離により回収された菌体をメタノール中でグラスビーズ等を用いて破砕しながら、クロロホルム／メタノール（１：２）を加えて抽出したクロロホルム層を測定試料とする。また、培養上清中のリシノール酸量を測定する場合には、遠心分離により回収された培養上清にクロロホルム／メタノール（１：２）を加えて抽出したクロロホルム層を測定試料とする。
【００３６】
［参考例１］
まず、ＣｐＦＡＨ１２株（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子を染色体中に組み込んだＳ．ポンベの形質転換体）を製造した。
【００３７】
（酵母）
Ｓ．ポンベは、ロイシンおよびウラシル要求株ＡＲＣ０１０（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）を用いた。
Ｓ．ポンベは、プラスミドを維持するために必要な選択圧に依存して、ＥＭＭＳまたはＥＭＭＳドロップアウト培地中で培養した（Alfa et al., “A laboratory course manual.”, 1993, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。ＥＭＭＳは通常の培養時に使用され、窒素が制限された最小培地（ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３）がリシノール酸産生には使用された。発明者らによる従前の実験結果から、ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中で培養したほうが脂肪酸含有量が高くなることが示唆されていたためである。ＥＭＭ培地は、０．５％（ｗ／ｖ）の塩化アンモニウム、２％（ｗ／ｖ）のグルコースを含有していた。一方、ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３は、塩化アンモニウムの濃度は０．１％にまで低減されており、グルコース濃度が１０％にまで増大していた。ｎｍｔ１プロモーターの下、遺伝子発現を抑制するために、１５μＭ（５μｇ／ｍＬ）のチアミンを使用した。
【００３８】
（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子導入のためのプラスミド構築）
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子のコード領域を含む酵母の形質転換用プラスミドを構築した。ＤＮＡ操作の標準的な技術は、SambrookおよびRussellの方法（“Molecular cloning: A laboratory manual.  3rd ed.”, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に準じて行った。また、プラスミド構築は、大腸菌ＤＨ５α〔Ｆ−ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃＺ）Ｕ１６９、Φ８０、Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５〕株を用いて行った。該ＤＨ５α株は、アンピシリンまたはカナマイシンを添加したＬＢ培地（Luria−Bertani broth）中で培養した。
【００３９】
ＣｐＦＡＨ１２遺伝子のＤＮＡ配列（Meesapyodsuk and Qiu, Plant Physiology, 2008, vol.147, pp.1325−1333）は、Ｓ．ポンベにおいて好ましい使用頻度のコドンに改変した後、ＧＥＮＥＡＲＴ社（Regensburg, Germany）に依頼して化学合成した。合成されたＣｐＦＡＨ１２のＯＲＦは、５’末端と３’末端にそれぞれ人工的に付加されていた制限酵素部位を使用して、大腸菌のプラスミドｐＭＫ−ＣｐＦＡＨ１２から、制限酵素NcoIおよびSalIで二重消化したフラグメントとして切り出し、ｐＬ２４２８−９（略してｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２）を構築するために、マルチクローニングサイトの制限酵素AarIおよびSalIで二重消化したプラスミドｐＳＬ１０に組み込んだ。合成されたプラスミドをｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２とした。ｐＳＬ１０は、ｌｅｕ１マーカーを有する、染色体へ組み込まれるタイプのプラスミドであり、ｐＳＬ６プラスミド（Alimjan et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, vol.85, pp.667−677）のｈＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ−ｐ）をｎｍｔ１プロモーターに置換し、ＬＰＩターミネーター（ＬＰＩ−ｔｅｒ．）をｉｎｖ１ターミネーターに置換したプラスミドである。ｐＳＬ１０の塩基配列を配列番号１に示す。Ｓ．ポンベにｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２を導入した形質転換体では、チアミン非存在時には、ｎｍｔ１プロモーターの制御下でＣｐＦＡＨ１２が発現したが、チアミン存在時には発現は抑制された。
図１に、ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２のベクターの構築手順を模式的に示した。
【００４０】
（ＣｐＦＡＨ１２株の作製）
酵母細胞は、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ ｋｉｔ (Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ＣＡ， ＵＳＡ)を用いて、製造者により推奨されるプロトコールに従って形質転換した。
すなわち、酵母の第２染色体のｌｅｕ１座にｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２を組み込むため、ｐＳＬ１０−ＣｐＦＡＨ１２は制限酵素BsiWIによって消化し、得られた線状プラスミドをＳ．ポンベＡＲＣ０１０−１株に導入し、ｌｅｕ１＋の形質転換体（ＣｐＦＡＨ１２遺伝子が染色体中に組み込まれた形質転換体）を選抜し、これをＣｐＦＡＨ１２株とした。
【００４１】
（ＣｐＦＡＨ１２株の増殖能）
ＣｐＦＡＨ１２株の各培養温度における増殖能を調べた。
具体的には、ＣｐＦＡＨ１２株と、Ｓ．ポンベにｐＳＬ１０およびｐＲＥＰ２を導入した形質転換体（コントロール株）を、それぞれチアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵ中、３７℃で一晩、培養液のＯＤ６００が約４になるまで前培養した。該前培養液を同種の新しい培地で希釈し、さらに、１０倍希釈系列を調整し、各１０μＬずつを、１５μＭのチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵプレート（発現抑制条件）またはチアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３−ＵＲＡ，ＬＥＵプレート（発現誘導条件）上にスポットした。該プレートを３７℃、３５℃、３０℃、２５℃、または２０℃で４〜９日間インキュベートした。
インキュベート後の各プレート表面の写真図を図２に示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロール株の結果であり、「ＣｐＦＡＨ１２」はＣｐＦＡＨ１２株の結果を示す。また、図中、白い部分がコロニーである。チアミン含有プレート（図中、「＋Ｔｈｉａｍｉｎｅ」）では、２０℃、９日間培養した場合のみ、ＣｐＦＡＨ１２株がコントロール株よりもやや増殖能が低かったものの、その他の培養条件では両形質転換体の増殖能に特段の差はなかった。一方、チアミン不含有プレート（図中、「Ｎｏ  Ｔｈｉａｍｉｎｅ」）では、３７℃、４日間培養した場合を除き、ＣｐＦＡＨ１２株のほうがコントロール株よりも明らかに増殖能が低かった。すなわち、Ｓ．ポンベにＣｐＦＡＨ１２を発現させることにより、３５℃以下では増殖能が低下することが確認された。
【００４２】
［実施例１］
ＦＡＨ１２遺伝子が導入された形質転換体における増殖阻害を解除し得る遺伝子を探索するために、Ｓ．ポンベのｃＤＮＡライブラリーを導入し、リシノール酸産生能を保持しつつ増殖阻害が抑制される遺伝子を調べた。なお、本実施例ではＳ．ポンベのｃＤＮＡライブラリーを用いたが、その他の酵母のｃＤＮＡライブラリーや酵母以外の生物種のｃＤＮＡライブラリーを用いてもよい。
【００４３】
（ｃＤＮＡライブラリーの導入）
Ｓ．ポンベのｃＤＮＡライブラリーは、ｃＤＮＡライブラリーの構築のための標準的な技術であるSambrookおよびRussellの方法（“Molecular cloning: A laboratory manual.  3rd ed.”，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.）に準じて行った。Ｓ．ポンベのｃＤＮＡは、図３に示すプラスミドｐＲＥＰ４２のｎｍｔ４１プロモーターの下流のクローニングサイトに挿入した。
具体的には、まず、Ｓ．ポンベから定法によりｍＲＮＡを調製し、ｏｌｉｇｏｄＴにNotI部位を付加したプライマーを用いてｃＤＮＡを作成し、得られた２本鎖ＤＮＡの５’末端にSalIアダプターを付加した。これにより、一方の端にNotI部位を有し、他端にSalI部位を有するｃＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡを制限酵素SalIとNotIで二重消化して得たフラグメントを、ｐＲＥＰ４２のXhoIとNotI 部分に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００４４】
（ＣｐＦＡＨ１２株へのＳ．ポンベのｃＤＮＡライブラリーの導入）
ＣｐＦＡＨ１２株のコンピテントセルに、該ｃＤＮＡライブラリーの各クローンをそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体群を、チアミンを含まないＥＭＭＳ−ＬｅｕＵｒａプレート（アガー平板培地）上に播き、３０℃で培養した。該培養条件下では、形質転換体内でＣｐＦＡＨ１２が発現するため、ＣｐＦＡＨ１２株の増殖は阻害されるが、約２０万個の形質転換体が培養可能であった。該形質転換体の中から、増殖能が回復しており、普通サイズのコロニーを形成した形質転換体を６０株得た。この６０株をそれぞれ培養し、前記のガスクロマトグラフ分析によりリシノール酸の産生量を測定したところ、２株のみがｃＤＮＡ導入前のＣｐＦＡＨ１２株と同程度のリシノール酸を生産し、他の株ではリシノール酸の生産は見られなかった。
該２株からプラスミドを回収し、挿入されているｃＤＮＡの塩基配列を解読したところ、２株共にｐｌｇ７遺伝子配列と相同であることが確認された。
【００４５】
（ＣｐＦＡＨ１２株にｐｌｇ７遺伝子を導入した形質転換体の作製）
ＣｐＦＡＨ１２株における増殖能の回復が、ｐｌｇ７遺伝子によることを再確認するため、該２株から回収されたプラスミド（ｐＲＥＰ４２−ｐｌｇ７）を再度ＣｐＦＡＨ１２株に形質転換して、ｐｌｇ７遺伝子を導入したＣｐＦＡＨ１２株の形質転換体（ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株）を得た。
【００４６】
（ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の増殖能）
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株をチアミン存在下および非存在下で培養し、増殖能を調べた。ＣｐＦＡＨ１２株に空ベクターｐＡＬ−ＫＳ（Tanaka et al., Mol Cell Biol, 2000,  vol.20, pp.3459-3469）を導入した形質転換株（ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株）を、比較対照とした。
まず、チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３７℃で一晩前培養し、該前培養液の原液および１０倍希釈系列を、チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３のプレート（アガー平板培地）またはチアミン含有ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３のプレートに塗布し、３０℃で４日間培養した。
培養後の各プレート表面の写真図を図４に示す。図中、「＋Ｖｅｃｔｏｒ」はＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果であり、「＋ｐｌｇ７」はＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の結果を示す。また、図中、白い部分がコロニーである。チアミン含有プレート（図中、「＋Ｔｈｉａｍｉｎｅ」）では、ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株とＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株は共に、前培養液の１００００倍希釈液をスポットした場合でもコロニーが形成された。一方で、チアミン不含有プレート（図中、「Ｎｏ  Ｔｈｉａｍｉｎｅ」）では、ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株では前培養液の原液と１０倍希釈液をスポットした場合にのみコロニーが形成されたのに対して、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株では前培養液の１０００倍希釈液をスポットした場合でもコロニーが形成された。すなわち、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株では、ＣｐＦＡＨ１２発現による増殖阻害が抑制されていた。
【００４７】
また、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株のチアミン非存在下における液体培地中の増殖能を調べた。ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株と、ＣｐＦＡＨ１２遺伝子導入前のＡＲＣ０１０株にｐＲＥＰ２（空ベクター）を導入した形質転換株（Ｎｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株）、およびＡＲＣ０１０株に（ｐＲＥＰ４２−ｐｌｇ７）を導入した形質転換株（Ｎｏ＿ＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株）を、比較対照とした。
具体的には、チアミンを含むＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３０℃で一晩前培養した後、チアミンを枯渇させた前培養液を、チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３の新しい培地で、ＯＤ６００が０．０５になるように希釈した後、３０℃で７２時間、撹拌培養した。６３０ｎｍの濁度（ＯＤ６３０）を自動検出器（Ｂｉｏ−Ｐｌｏｔｔｅｒ、東洋測器製）でモニターすることにより、液体培地中の増殖曲線を描いた。図５に増殖曲線を示す。図中、「Ｎｏ  ＦＡＨ１２＋Ｖｅｃｔ」がＮｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果を、「Ｎｏ  ＦＡＨ１２＋ｐｌｇ７」がＮｏ＿ＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の結果を、「ＣｐＦＡＨ１２＋Ｖｅｃｔ」がＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果を、「ＣｐＦＡＨ１２＋ｐｌｇ７」がＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の結果を、それぞれ示す。図中、ＯＤ６３０が培養時間経過により頭打ちになっているのは、検出限界値を超えたためである。酵母にｐｌｇ７遺伝子を導入しただけでは増殖能には影響しないが、ＣｐＦＡＨ１２株にｐｌｇ７遺伝子を導入することにより増殖能が顕著に改善された。つまり、ＣｐＦＡＨ１２による増殖抑制を解除するためには、ＰＬＡ２活性が重要であることが示された。
また、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株を培養した培養液のみ白濁していた。該培養液を顕微鏡により検鏡したところ、油滴様のものが確認された。
【００４８】
［実施例２］
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株のリシノール産生能を調べた。
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株、ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株、およびＮｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株を、チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３７℃で一晩前培養した前培養液を、グルコース濃度２質量％または１０質量％のチアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３でＯＤ６００が２．０になるように希釈した後、２０℃で５日間、撹拌培養した。ＯＤ６００を手動でモニターすることにより、液体培地中の増殖曲線を描いた。また、本培養開始後１日経過ごとに、培養液の一部をサンプリングし、培養液のグルコース濃度と、酵母を除去した培養上清の濁度を、Ｋｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎフォトメトリックカロリメーターを使用してＫｌｅｔｔ法により測定した。測定結果を図６に示す。ｔＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株を培養した場合には、培養時間が経過しても培養液のＯＤ６００はほとんど上昇せず、グルコース濃度の低下も少なく、培養上清の濁度は、Ｎｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株よりは高かったものの、視認できるほどの白濁はなかった〔図６（Ｂ）および（Ｅ）〕。ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株を培養した場合には、Ｎｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株よりはやや緩やかであるものの、培養時間の経過と共に培養液のＯＤ６００は上昇し、グルコース濃度は低下し、さらに、Ｎｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株とは異なり、培養上清の濁度は経時的に顕著な上昇が確認され、これは油滴様構造の量に依存することも確認された〔図６（Ａ）および（Ｃ）〕。この傾向は、グルコース濃度２質量％の培地よりも、グルコース濃度１０質量％の培地のほうが顕著であった。
【００４９】
５日間の培養終了後の培養上清を回収し、脂肪酸（ＦＡ）の含有量と組成を測定した。測定結果を図７に示す。図７中、「Ｃ１８：１−ＯＨ」はリシノール酸を、「Ｃ１８：２ｎ−６」はリノレン酸を、「Ｏｔｈｅｒｓ」はその他の脂肪酸の総和を、それぞれ示す。また、「ＣｐＦＡＨ１２＋ｐｌｇ７  １０％Ｇｌｃ」はＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株をグルコース濃度１０質量％の培地で培養した結果を、「ＣｐＦＡＨ１２＋ｐｌｇ７  ２％Ｇｌｃ」はＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株をグルコース濃度２質量％の培地で培養した結果を、「ＣｐＦＡＨ１２＋Ｖｅｃｔｏｒ  １０％Ｇｌｃ」はＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株をグルコース濃度１０質量％の培地で培養した結果を、それぞれ示す。ｐｌｇ７を発現させたＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株では、ＣｐＦＡＨ１２のみを発現させたＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株よりも培養上清に分泌される脂肪酸の量が顕著に増大しており、かつ、分泌された脂肪酸全量の大部分がリシノール酸であることが確認された。特に、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株をグルコース濃度１０質量％の培地で培養した場合には、培養上清中に７４．５ｍｇ／Ｌ以上の脂肪酸が分泌されており、その７０％程度がリシノール酸であった。
【００５０】
さらに、１日間培養して得た菌体を回収し、細胞内のリシノール酸含有量を調べた。
具体的には、まず、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の菌体とＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の菌体について、それぞれメタノールを添加して菌体を破砕した後、クロロホルム／メタノール（１：２）を加えて脂質を抽出し、クロロホルム層を脂質画分として回収した。次いで、該脂質画分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離し、リン脂質（ＰＬ）以外の脂質（遊離脂肪酸（ＦＡＡ）を含む。）中、およびリン脂質中のリシノール酸含有割合（％）を、ガスクロマトグラフ分析によって測定した。ＴＬＣは、具体的には、該脂質画分の１／３量を、ＴＬＣガラスプレート（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  ｐｌａｔｅ、Ｍｅｒｃｋ社製）にスポットし、クロロホルム混合溶媒［クロロホルム：アセトン：メタノール：酢酸：水＝５０：２０：１０：１０：５（容量比）］で展開させた。次いで、同じＴＬＣガラスプレートに、該脂質画分の全残量をスポットし、ヘキサン混合溶媒［ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：４０：１（容量比）］で展開させた。次いで、該ＴＬＣプレートをプリムリンで染色し、各バンドをプレートより掻き取り、ガスクロマトグラフ分析にかけた。
【００５１】
測定結果を図８に示す。図中、「Ｖｅｃｔｏｒ」はＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果を、「ｐｌｇ７」はＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の結果をそれぞれ示す。ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株では、リン脂質中におけるリシノール酸含有割合（図中、「ＰＬ」）が、ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株よりも顕著に減少していることが示された。該結果から、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株では、リシノール酸がリン脂質として蓄積された後、ｐｌｇ７によって切り出され、細胞外に排出されることを示唆しており、リシノール酸が排出されることで細胞増殖抑制が解除されたものと推測された。
【００５２】
［実施例３］
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養上清の脂肪酸組成分析を、ＴＬＣにより調べた。
チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３７℃で一晩前培養した前培養液を、前培養と同種の新しい培地で、ＯＤ６００が２．０になるように希釈した後、２０℃で５日間、撹拌培養した。培養後の培養液を遠心分離して培養上清を回収し、クロロホルム／メタノール（１：２）を加えて脂質を抽出し、クロロホルム層を脂質画分として回収した。回収した脂質画分を、実施例２と同様にしてＴＬＣで展開した。ＴＬＣの展開結果を図９に示す。レーン１には各脂質［トリアシルグリセリド（ＴＧ）、オレイン酸（ＯＡ）、ジアシルグリセロール（ＤＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）］の標準品を、レーン２にはＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養上清の脂質画分を、レーン３にはひまし油を、レーン４にはリシノール酸の標準品を、それぞれ展開した。その結果、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養上清中の脂肪酸の大部分がリシノール酸であった。また、ひまし油は、その大部分がリシノール酸であるが、標準品のリシノール酸とは異なる移動度の位置に展開していたのに対して、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養上清の脂質画分中のリシノール酸は、標準品と同じ移動度であった。すなわち、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養上清から、純度の高いリシノール酸が回収できることが示唆された。
【００５３】
［実施例４］
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養時間に伴うリシノール酸の蓄積状況を調べた。
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株とＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株について、チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３７℃で一晩前培養した前培養液を、グルコース濃度１０質量％のチアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３でＯＤ６００が２になるように希釈した後、２０℃で１１日間、撹拌培養した。本培養開始から３、５、７、１１日後に培養液の一部をサンプリングし、培養上清中および細胞内の脂肪酸の含有量と組成を測定した。測定結果を図１０に示す。図中、「Ｖｅｃｔｏｒ」はＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果を、「ｐｌｇ７」はＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の結果をそれぞれ示す。「Ｃ１８：１−ＯＨ」、「Ｃ１８：２ｎ−６」、および「Ｏｔｈｅｒｓ」は図７と同様である。両株とも、リシノール酸の含有割合は、細胞内で５０〜６０％であり、培養上清で７０％以上であった。特にＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株では、培養上清中には細胞内と同程度の量のリシノール酸が排出されており、培養上清から大量のリシノール酸を容易に取得できた。本実施例は試験管レベルの実験であるが、本発明に係るリシノール酸の製造方法をジャー培養槽等を用いて行うことにより、より大量のリシノール酸の製造が可能になることが示された。
【００５４】
［実施例５］
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の増殖能に対する培養温度の影響を調べた。
Ｎｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株とＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株とＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株について、チアミンを含むＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３０℃で一晩前培養した後、チアミンを枯渇させた前培養液を、グルコース濃度１０質量％のチアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３でＯＤ６００が０．２になるように希釈した後、２０℃、２５℃または３０℃で１００時間撹拌培養した。実施例２と同様にして、ＯＤ６００をモニターした。描いた増殖曲線を図１１に示す。図中、「Ｎｏ  ＦＡＨ１２＋Ｖｅｃｔ」がＮｏ＿ＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果を、「ＣｐＦＡＨ１２＋Ｖｅｃｔ」がＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の結果を、「ＣｐＦＡＨ１２＋ｐｌｇ７」がＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の結果を、それぞれ示す。２０℃、２５℃および３０℃のいずれにおいても、ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株よりもＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株のほうが培養液のＯＤ６００が高く、増殖能が高いことがわかった。すなわち、培養温度にかかわらず、ＣｐＦＡＨ１２発現による増殖抑制に対するｐｌｇ７による解除効果が観察された。
また、ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株を培養した培養液のみ白濁していた。該培養液を顕微鏡により検鏡したところ、油滴様のものが確認された。
【００５５】
［実施例６］
ＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株のリシノール酸産生能に対する培養温度の影響を調べた。
ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株とＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株について、チアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３中、３７℃で一晩前培養した前培養液を、グルコース濃度１０質量％のチアミン不含ＥＭＭ−Ｃ／Ｎ３でＯＤ６００が２．０になるように希釈した後、２０℃、２５℃または３０℃で撹拌培養した。４日間培養後の培養液の培養上清の濁度（Ｋｌｅｔｔ値）を、実施例２と同様にして測定した。測定結果を図１２に示す。図中、「ｐｌｇ７」はＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株の培養結果を、「Ｖｅｃｔ」はＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株の培養結果を、それぞれ示す。いずれの温度においても、ＣｐＦＡＨ１２／ｖｅｃｔ株よりもＣｐＦＡＨ１２／ｐｌｇ７株のほうが培養上清の濁度が明らかに高く、リシノール酸の分泌量が高かった。特に、３０℃で培養した場合よりも、２０〜２５℃で培養した場合のほうがＫｌｅｔｔ値が高く、より大量のリシノール酸が分泌されていた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係るリシノール酸産生酵母およびこれを用いたリシノール酸の製造方法により、リシノール酸を、酵母の形質転換体を用いて効率よく生産できるため、特に、リシノール酸またはひまし油が原料として使用されている化成品、塗料・印刷インキ、化粧品、医薬品、潤滑油等の製造分野において好適に用いられる。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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