(57)【要約】【課題】新生児慢性肺疾患、閉塞性慢性肺疾患などの重篤な肺障害を対症療法ではなく、肺組織を修復することで積極的に治療し、かつ、従来と比較して副作用が少ない肺障害治療剤を提供する。【解決手段】硝酸塩を有効成分として含有する、肺障害治療剤。本発明において肺障害は、新生児慢性肺疾患または閉塞性慢性肺疾患であることが好ましい。また、本発明の肺障害治療剤は、体重１ｋｇあたり１５〜２０００μｍｏｌ／ｋｇの範囲で投与されることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
硝酸塩を有効成分として含有する、肺障害治療剤。
【請求項２】
肺障害が、新生児慢性肺疾患または閉塞性慢性肺疾患である、請求項１に記載の肺障害治療剤。
【請求項３】
体重１ｋｇあたり１５〜２０００μｍｏｌの範囲で投与される、請求項１または２に記載の肺障害治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硝酸塩を有効成分として含有する肺障害治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生児慢性肺疾患（Chronic Lung Disease：ＣＬＤ）は、１９９６年の厚生省心身障害研究班により、「先天性奇形を除く肺の異常により酸素投与を必要とするような呼吸窮迫症状が新生児に始まり日齢２８を超えて続くもの」と定義されている、重篤な肺障害として知られている。ＣＬＤは、肺の未熟性や、酸素の毒性、人工換気、感染、動脈管開存症などがリスクファクターとして知られ、肺胞や血管系の発達が抑制された状態と考えられている（たとえば、Christian P. Speer., 「Inflammation and bronchopulmonary dysplasia」, Seminars in Neonatology (2003) 8, 29-38（非特許文献１）を参照）。
【０００３】
この疾患の治療法は、対症療法として投与酸素濃度の制限や、水分の制限、利尿薬による肺循環への水分負荷軽減、気管支拡張剤や呼吸刺激剤の投与、抗炎症作用や抗浮腫作用を期待してのステロイド投与などが行なわれている。たとえば特開２００７−２６２０６４号公報（特許文献１）では、呼吸窮迫症候群患者が新生児慢性肺疾患に陥るリスクを低減させるために、ステロイド剤および肺表面活性剤を組み合わせた、気管内投与に適用される医薬組成物が提案されている。
【０００４】
しかしながら、ステロイドについては、成長期の中枢神経系への副作用が危惧され、Canadian Paediatric Societyは、American Academy of Pediatricsと連名で、早産児のＣＬＤに対する予防・治療目的のルーチン的なステロイド投与は勧められず、重症例に対してのみレスキュー的な短期少量投与を行うことを勧告している（たとえば、「Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants」, Paediatr Child Health, 2002 Jan ;7(1):20-28（非特許文献２）を参照）。また、ＣＬＤの治療に用いられる気管支拡張剤であるテオフィリンには、悪心、吐き気、頭痛、痙攣、意識障害、黄紋筋融解症など多くの副作用がある。
【０００５】
また、ＣＬＤ以外の重篤な肺障害として、閉塞性慢性肺疾患（Chronic Obstructive Pulmonary Disease：ＣＯＰＤ）も知られている。ＣＯＰＤは、煙草などの外的因子である有毒な粒子やガスの吸入によって生じた肺の炎症反応と、年齢や免疫因子など生体の内的な因子が複合的に関与し合い発症する進行性の気流制限を呈する、閉塞性呼吸器疾患である。ＣＯＰＤでは、終末細気管支より末梢の気腔がそれを構成する壁の破壊を伴いながら、非可逆的に拡大していく。
【０００６】
ＣＯＰＤの治療法は、対症療法と進行を遅らせる保存療法が主である。薬物治療としては、気管支拡張薬として抗コリン薬やβ刺激薬などの併用や、重症例に対しては増悪回数を減少させるためのステロイド吸入が行われている。また、喫煙がＣＯＰＤの主要危険因子とされていることから喫煙患者に対する禁煙指導や、酸素療法も行われる。
【０００７】
しかしながら、ＣＯＰＤの治療に用いられる抗コリン剤には、口渇、心不全、イレウス、発疹、便秘、消化不良などの副作用が知られている。また、ＣＯＰＤの治療に用いられるβ刺激薬には、動悸、振戦、頭痛、嘔吐などの副作用がある。また、ステロイドの副作用としては、嗄声、咳嗽、悪心、口腔カンジダ症、咽喉頭疼痛などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２６２０６４号公報
【特許文献２】特開２０１１−３７８３０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Christian P. Speer., 「Inflammation and bronchopulmonary dysplasia」, Seminars in Neonatology (2003) 8, 29-38
【非特許文献２】「Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants」, Paediatr Child Health, 2002 Jan ;7(1):20-28
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、ＣＬＤ、ＣＯＰＤのいずれの疾患においても、積極的に疾患を治療することができずに基本的には対症療法を施すしかなく、また、使用する薬剤に副作用があるという問題があった。
【００１１】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ＣＬＤ、ＣＯＰＤなどの重篤な肺障害を、対症療法ではなく、肺組織を修復することで積極的に治療することができ、かつ、従来と比較して副作用が少ない肺障害治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の肺障害治療剤は、硝酸塩を有効成分として含有する。
本発明における肺障害は、新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）または閉塞性慢性肺疾患（ＣＯＰＤ）であることが好ましい。
【００１３】
本発明の肺障害治療剤は、体重１ｋｇあたり１５〜２０００μｍｏｌの範囲で投与されることが、好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来と比較して、副作用が少なく、肺組織を修復することで積極的に重篤な肺障害を治療できる肺障害治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】被験化合物１を投与した場合（実施例１）の結果を示す肺後葉の標本の写真であり、図１（ａ）は全体写真、図１（ｂ）は図１（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大して示す図である。
【図２】比較例１の結果を示す肺後葉の標本の写真であり、図２（ａ）は全体写真、図２（ｂ）は図２（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大して示す図である。
【図３】比較例２の結果を示す肺後葉の標本の写真であり、図３（ａ）は全体写真、図３（ｂ）は図３（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大して示す図である。
【図４】被験化合物２を投与した場合（実施例２）の結果を示す肺中葉の標本の写真であり、図４（ａ）は全体写真、図４（ｂ）は図４（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大して示す図である。
【図５】比較例３の結果を示す肺中葉の標本の写真であり、図５（ａ）は全体写真、図５（ｂ）は図５（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大して示す図である。
【図６】比較例４の結果を示す肺中葉の標本の写真であり、図６（ａ）は全体写真、図６（ｂ）は図６（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、後述する実験例において実証するように、硝酸塩が、損傷した肺組織を積極的に修復する作用を示し、従来、対症療法が主であった重篤な肺障害の治療に有効であることを見出した。硝酸塩が、損傷を受けた肺組織を積極的に修復するメカニズムの詳細は不明であるが、後述する実験例２に示すように、硝酸ナトリウム投与群で肺胞壁割合が増加していることから、硝酸ナトリウムは肺胞組織の修復を促進する働きを有するものと考えられた。
【００１７】
また、本発明の肺障害治療剤は、従来の肺障害治療に用いられていた薬剤とは異なり、副作用が少ないという特徴も有する。これは、硝酸ナトリウムを含む硝酸塩は、硝酸イオンとしてホウレンソウなどの野菜中にも０．２ｇ／１００ｇ程度（ホウレンソウ生葉の場合。文部科学省作成「五訂増補日本食品標準成分表  本表：野菜類」より）含まれており、ヒトが日常的に摂取しても問題のない安全性の高い化合物であることは経験的に知られているためである。後述する実験例３では、硝酸ナトリウムは、亜硝酸ナトリウムとは異なり２０００μｍｏｌ／ｋｇまで投与しても血中メトヘモグロビンの増加は見られなかった。このように、本発明の肺障害治療剤を用いた治療は、従来と比較して副作用が少なく、安全性の高いものである。
【００１８】
本発明の肺障害治療剤の治療対象となる「肺障害」としては、たとえば、新生児慢性肺疾患（ＣＬＤ）、閉塞性慢性肺疾患（ＣＯＰＤ）などを挙げることができる。
【００１９】
本発明における硝酸塩は、無機アニオン（硝酸イオン：ＮＯ３−）とカチオンから形成される医薬的に許容される塩であればよく、たとえば、カチオンとしてアルカリ金属、アルカリ土類金属、あるいは有機塩基を用いることができる。たとえば、アルカリ金属として、ナトリウム、カリウムが好ましく、アルカリ土類金属として、カルシウム、マグネシウムが好ましく、有機塩基として、アルギニン、リジンが好ましい。
【００２０】
本発明の肺障害治療剤は、硝酸塩が水に溶け易く、消化管からの吸収性が良好なことから、非経口、経口を問わず多様な投与形態を使用することができる。非経口の投与経路としては、たとえば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、肺内、鼻腔内、外用局所を含む多様な経路によって投与することができ、剤型としては注射剤、吸入剤などが挙げられる。一方、経口投与剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、内用液剤などが挙げられるが、これらの製剤を胃崩壊剤、腸溶剤に調製することにより、消化管の所望する部位で硝酸塩を放出させることができる。これらの製剤は、汎用されている製剤技術を用いて、配合変化に注意し、医薬的に許容される医薬品添加物を使用して製剤化することができる。
【００２１】
本発明の肺障害治療剤の投与量は、年齢、体重、疾患の進行度、投与形態または投与経路によって異なるが、上記薬理作用が発揮でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定されないが、体重１ｋｇあたり１５〜２０００μｍｏｌ（μｍｏｌ／ｋｇ）の範囲で投与されることが好ましく、また、１日１回程度の単回投与が望ましい。
【００２２】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
＜実験例１＞
実験例１では、７５％の酸素を曝露させ作製した肺障害モデルマウスに、硝酸ナトリウム（被験化合物１）または生理食塩水（比較例１）を投与し、肺における障害の程度を標本の画像解析により評価した。
【００２４】
（被験化合物注射液の調製）
被験化合物１として硝酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試験特級）を注射用生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）の注射量で投与量が１００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）となるよう、２０ｍｍｏｌ／Ｌの被験化合物注射液を調製した。
【００２５】
（実験方法）
実験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本エルエスシー株式会社より提供）を使用した。新生仔マウスを生後１日目から１２日目まで親マウスと共に酸素制御装置（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ．  Ｌｔｄ製、型番ＰＲＯ−ＯＸ  １１０）によって高酸素（７５±１％  Ｏ２）状態に制御されたケージ内で飼育した。生後１２日目以降は大気圧条件下（２１％  Ｏ２）に戻し、生後１７日目まで飼育し、その６日間に１日１回、被験化合物１００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）を頚部皮下注射した（被験化合物１：実施例１）。
【００２６】
また、比較例１として、被験化合物の代わりに注射用生理食塩水を５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）頚部皮下注射した。
【００２７】
比較例２として、出生直後から生後１７日目まで大気圧条件下（２１％  Ｏ２）で飼育したマウスを作製した。
【００２８】
生後１７日目の注射終了後にマウスを安楽死させ、肺を摘出し、４％  パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液中で４８時間固定してから各肺葉に切り分けた。なお、用いたパラホルムアルデヒドリン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試験特級）０．１ｍｏｌ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試験特級）０．１ｍｏｌ／Ｌからなるリン酸緩衝液によって、パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）を溶解したものである。肺葉をエタノール水溶液で脱水し、パラフィン包埋後、肺葉を厚さ４μｍの切片とし、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）して標本を作製した。
【００２９】
（評価法）
作製した標本を倒立顕微鏡（オリンパス株式会社製、型番ＩＸ７１）下、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス株式会社製、型番ＤＰ７１）で撮影した。撮影画像を画像ソフト（アドビシステムズ株式会社製、商品名Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４  ｅｘｔｅｎｄｅｄ）を用いて解析した。
【００３０】
図１は、被験化合物１を投与した場合（実施例１）の結果を示す肺後葉の標本の写真であり、図１（ａ）は全体写真（４０倍）、図１（ｂ）は図１（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大（全体写真を２．５倍に拡大）して示す図である。図２は、比較例１の結果を示す肺後葉の標本の写真であり、図２（ａ）は全体写真（４０倍）、図２（ｂ）は図２（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大（全体写真を２．５倍に拡大）して示す図である。また図３は、比較例２の結果を示す肺後葉の標本の写真であり、図３（ａ）は全体写真（４０倍）、図３（ｂ）は図３（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大（全体写真を２．５倍に拡大）して示す図である。正常な状態である比較例２の標本（図３）と比較して、肺胞がつぶれた箇所（たとえば図２（ｂ）を参照）を障害部位とした。実施例１および比較例１の肺中葉（図示せず）、肺後葉の撮影画像から肺胞総面積および障害部位の面積を算出し、さらに次式（１）によって障害部位割合を算出した。
【００３１】
障害部位割合（％）＝障害部位の面積÷肺胞総面積×１００…式（１）
（結果）
正常な結果である比較例２（図３）と比べ、肺障害モデルマウスである比較例１（図２）および実施例１（図１）で肺胞が正常に形成されていない障害部位が出現したが、実施例１ではその程度が軽度であった。
【００３２】
画像解析結果を表１に示す。表１中、数値は、障害部位の割合（％（平均））を示している。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
表１から、実施例１は、比較例１と比較して障害部位割合が低く、酸素曝露による障害の治癒が促進されていたことが分かる。
【００３５】
＜実験例２＞
実験例２では、従来治療法である吸入ステロイド剤ブデソニドとの比較において、硝酸ナトリウムの投与により肺胞組織の修復が促進される効果について、検討を行なった。
【００３６】
（被験化合物注射液の調製）
被験化合物２として硝酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試薬特級）を注射用生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）の注射量で投与量が３０μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）となるよう、６ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の被験化合物注射液を調製した。
【００３７】
（比較薬物の調製）
比較薬物として、ブデソニド（和光純薬工業株式会社製）を精製水（吉田製薬株式会社製）に溶解し、コンプレッサー式ネブライザー（パリ・ジャパン株式会社製、商品名パリボーイモバイルＳ）で霧状にした。マウスの呼吸量を９ｍＬ／ｍｉｎと想定し、投与量がブデソニドとして５ｎｇ／ｇ（マウス体重あたり）となるまでマウス口元に持続的に噴霧し吸入投与した。
【００３８】
（実験方法）
実験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本エルエスシー株式会社より提供）を使用した。新生仔マウスを生後１日目から７日目まで親マウスと共に酸素制御装置（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ．  Ｌｔｄ製、型番ＰＲＯ−ＯＸ  １１０）によって高酸素（７５±１％  Ｏ２）状態に制御されたケージ内で飼育した。生後７日目以降は大気圧条件下（２１％  Ｏ２）に戻し生後１７日目まで飼育し、その１０日間に１日１回、被験化合物３０μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）を頚部皮下注射した（被験化合物２：実施例２）。
【００３９】
また、比較例３として、被験化合物２の代わりに比較薬物（ブデソニド）を吸入投与した。
【００４０】
また、比較例４として、被験化合物２の代わりに注射用生理食塩水を５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）頚部皮下注射した。
【００４１】
生後１７日目の投与終了後にマウスを安楽死させ、肺を摘出し、４％  パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液中で４８時間固定してから各肺葉に切り分けた。なお、用いたパラホルムアルデヒドリン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試験特級）０．１ｍｏｌ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試験特級）０．１ｍｏｌ／Ｌからなるリン酸緩衝液によって、パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）を溶解したものである。肺葉をエタノール水溶液で脱水、パラフィン包埋後、肺葉を厚さ４μｍの切片とし、ヘマトキシリン−エオジン染色（ＨＥ染色）して標本を作製した。
【００４２】
（評価法）
作製した標本を倒立顕微鏡（オリンパス株式会社製、型番ＩＸ７１）、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス株式会社製、型番ＤＰ７１）で撮影した。撮影画像を画像ソフト（アドビシステムズ株式会社製、商品名Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４  ｅｘｔｅｎｄｅｄ）を用いて解析した。
【００４３】
標本切片全体の面積から気管、血管および障害部位の面積を除いて肺胞の面積とし、そのうち、肺胞壁が占める面積の割合（肺胞壁割合）を下記式（２）によって算出した。
【００４４】
肺胞壁割合（％）＝肺胞壁面積÷（肺標本全体面積−（気管部位面積＋血管部位面積＋障害部位面積））×１００…式（２）
この肺胞壁割合が高いほど、肺胞壁が密に形成され肺組織が修復されていることを表わす。標本は肺中葉を用いた。試験は３回以上繰り返し実施した。
【００４５】
（結果）
図４は、被験化合物２を投与した場合（実施例２）の結果を示す肺中葉の標本の写真であり、図４（ａ）は全体写真（４０倍）、図４（ｂ）は図４（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大（全体写真を２．５倍に拡大）して示す図である。図５は、比較例３の結果を示す肺中葉の標本の写真であり、図５（ａ）は全体写真（４０倍）、図５（ｂ）は図５（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大（全体写真を２．５倍に拡大）して示す図である。また図６は、比較例４の結果を示す肺中葉の標本の写真であり、図６（ａ）は全体写真（４０倍）、図６（ｂ）は図６（ａ）中、矢印で示す丸く囲った部分を拡大（全体写真を２．５倍に拡大）して示す図である。実施例２（図４）では、比較例３（図５）および比較例４（図６）と比較して、肺胞壁がより形成されていたことが分かる。
【００４６】
画像解析結果を表２に示す。表２中、数値は、肺胞壁の割合（％（平均））を示している。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
表２から、実施例２では、比較例３、４と比較して肺胞壁割合が高く、肺組織の修復がより促されていることが示された。
【００４９】
＜実験例３＞
実験例３では、幾つかの濃度で硝酸ナトリウムを投与したときの血中メトヘモグロビン濃度を測定し、硝酸ナトリウムの投与可能濃度上限について検討を行なった。
【００５０】
（被験化合物注射液の調製）
被験化合物として硝酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試薬特級）を注射用生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）の注射量で、投与量が５００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）（被験化合物３）、１０００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）（被験化合物４）および２０００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）（被験化合物５）となる濃度の各被験化合物注射液を調製した。
【００５１】
（比較薬物の調製）
比較薬物として、亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、試薬特級）を注射用生理食塩水（大塚製薬株式会社製）に溶解し、５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）の注射量で、投与量が５００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）となるよう、１００ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の比較薬物注射液を調製した。
【００５２】
（実験方法）
実験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本エルエスシー株式会社より提供）を使用した。３週齢のマウスに硝酸ナトリウム５００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）（被験化合物３：実施例３）、１０００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）（被験化合物４：実施例４）あるいは２０００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）（被験化合物５：実施例５）で頚部皮下注射した。
【００５３】
また、比較薬物として調製した亜硝酸ナトリウム５００μｍｏｌ／ｋｇ（マウス体重あたり）を頚部皮下注射した（比較例５）。
【００５４】
また、比較例６として、被験化合物の代わりに注射用生理食塩水を５μＬ／ｇ（マウス体重あたり）頚部皮下注射した。
【００５５】
それぞれ注射１時間後に採血し、以下の方法によりメトヘモグロビン濃度（％）を算出した。試験は３回繰り返し実施した。
【００５６】
（メトヘモグロビン濃度測定法）
採血した全血２００μＬに対し蒸留水を１６ｍＬ加えて希釈し、Ｍ／１０  リン酸緩衝液（（Ａ）ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬工業株式会社製）水溶液１３．６２ｇ／Ｌと（Ｂ）Ｎａ２ＨＰＯ４（和光純薬工業株式会社製）を（Ａ）：（Ｂ）＝６２．５：３７．５で混合し、（Ａ）の溶液あるいは（Ｂ）の溶液を用いてｐＨ６．６に調整）４ｍＬを加え、転倒混和した。遠心分離機（エッペンドルフ株式会社製、型番５４３０−Ｒ）で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を５ｍＬずつ４つに分けた（上清（ａ）、上清（ｂ）、上清（ｃ）、上清（ｄ）とした）。
【００５７】
上清（ａ）について、紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製、型番Ｖ−６７０）で６３０ｎｍおよび６８０ｎｍの吸光度を測定し、６３０ｎｍの吸光度から６８０ｎｍの吸光度を引いた値を算出し、Ｌ（ａ）とした。
【００５８】
上清（ｂ）について、５％  シアン化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液を５０μＬ加え、６３０ｎｍおよび６８０ｎｍの吸光度を同様に測定し、６３０ｎｍの吸光度から６８０ｎｍの吸光度を引いた値を算出し、Ｌ（ｂ）とした。
【００５９】
上清（ｃ）について、２０％フェリシアン化カリウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液を５０μＬ加え、３０分間静置した。６３０ｎｍおよび６８０ｎｍの吸光度を同様に測定し、６３０ｎｍの吸光度から６８０ｎｍの吸光度を引いた値を算出し、Ｌ（ｃ）とした。
【００６０】
上清（ｄ）について、２０％フェリシアン化カリウム水溶液を５０μＬ加え、３０分間静置した後、５％シアン化ナトリウム水溶液を５０μＬ加えた。６３０ｎｍおよび６８０ｎｍの吸光度を同様に測定し、６３０ｎｍの吸光度から６８０ｎｍの吸光度を引いた値を算出し、Ｌ（ｄ）とした。
【００６１】
Ｌ（ａ）、Ｌ（ｂ）、Ｌ（ｃ）、Ｌ（ｄ）と次式とを用いて、メトヘモグロビン濃度を算出した。
【００６２】
メトヘモグロビン濃度（％）＝（Ｌ（ａ）−Ｌ（ｂ））／（Ｌ（ｃ）−Ｌ（ｄ））×１００  …式（３）
（結果）
結果を表３に示す。表３中、数値は、血中メトヘモグロビン濃度（％（平均））を示している。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
表３から分かるように、比較例６と比べ、比較例５ではメトヘモグロビン濃度の上昇がみられたが、被験化合物３、４、５（実施例３、４、５）では比較例６と同等であった（表３）。このことから、被験化合物は体重１ｋｇあたり２０００μｍｏｌまでメトヘモグロビン濃度の上昇を起こさず、安全に投与可能であることが示された。
【００６５】
今回開示された実施の形態および実験例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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