(57)【要約】      （修正有）【課題】２００３年以降、動物およびヒトから単離されたＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスは、血球凝集素アミノ酸配列に基づいて異なるクレードに分かれているが、これら多数のクレードのインフルエンザ免疫処置への利用。【解決手段】被験体がＨ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードのプライミング投与およびＨ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードのブースティング投与を受ける、プライム−ブーストスケジュール。さらに、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの１つより多くのクレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物。【選択図】図１
2014159454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１１月２６日に出願された米国仮出願第６１／００４，３３４号、および２００８年６月５日に出願された英国特許出願第０８１０３０５．３号（これらの両方は、全てが本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する防御のための、および特にインフルエンザパンデミックに対する防御のための、ワクチンの分野に存する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節ごとに変わる。数年にわたって、ワクチンは、２つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）と１つのインフルエンザＢ株を概して含んでいる。「抗原連続変異」に対処するために、予防接種に使用される正確な株は、年ごとに変わる。
【０００４】
抗原連続変異より懸念されるのは、流行するインフルエンザＡウイルスのサブタイプがＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２から変わる「抗原不連続変異」である。特に、インフルエンザＡウイルスのＨ５サブタイプは、近い将来、流行することになると予想される。ヒト集団は、この新しい血球凝集素サブタイプに対して免疫がないので、この抗原不連続変異は、インフルエンザ感染のパンデミック勃発を引き起こすであろう。パンデミック勃発を引き起こす可能性をもたらすインフルエンザ株の特徴は、（ａ）それが、現在流行しているヒト株における血球凝集素に比べて新しい血球凝集素、すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性になっていないものまたはヒト集団において以前に見られたことがまったくないもの、を含有すること；（ｂ）それが、ヒト集団において水平伝播され得ること；および（ｃ）それが、ヒトにとって病原性であることである。
【０００５】
Ｈ５株によって引き起こされるインフルエンザパンデミックに備えて、プレパンデミック予防接種戦略を用いることが提案された［１（非特許文献１）］。患者は、結果として得られる免疫がパンデミック発生時に有益であることを期待して、とかくするうちに発生し得る一切の抗原連続変異にもかかわらず、（トリからの）現行のＨ５株での免疫処置を受ける。
【０００６】
２００６年１０月に、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒは、アジュバント添加およびアジュバント非添加形態で様々な抗原用量で試験したその候補プレパンデミックワクチンに関する結果を公表した。２００６年１１月に、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓは、アジュバント添加プレパンデミックワクチンについて欧州規制当局の認可のために書類を提出したことを公表した。２００７年６月に、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅは、５０，０００，０００回分のＨ５Ｎ１アジュバント添加プレパンデミックワクチンをＷＨＯに寄付するその意向を公表し、２００８年２月に、そのＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品は、ＥＭＥＡ’ｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅから肯定的意見を受けた。３つの製品すべてが、Ｈ５Ｎ１／Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４株に基づくものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｉｌｅｙら、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．（２００７）４（６）：ｅ２１８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
２００３年以来、動物およびヒトから単離されたＨ５Ｎ１ウイルスは、血球凝集素アミノ酸配列に基づいて近縁ウイルスの多数の異なるクレードに分かれている。Ｈ５Ｎ１／Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４株は、クレード１に分類される。
【０００９】
本発明に従って、多数のクレードをインフルエンザ免疫処置に利用する。
【００１０】
本発明の第１の態様では、被験体がＨ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードのプライミング量およびＨ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードのブースティング量を受ける、プライム−ブースト免疫処置スケジュールを用いる。例えば、患者をクレード１抗原でプライミングし、クレード２でブースティングすることができ、またはその逆もできる。
【００１１】
同様に、第１クレード（例えば、クレード１）からのＨ５ワクチンを既に受けている患者に、異なるクレード（例えば、クレード２）からのＨ５ワクチンを使用することによってブースター免疫処置を施すことができる。この患者は、第１クレードワクチンの全主要コース（例えば、２用量）を受けていることになる。
【００１２】
第２の態様において、免疫原性組成物は、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの多数のクレードからの血球凝集素抗原を含むことができ、それによって多数のＨ５クレードに対する同時免疫が可能になる。
【００１３】
従って、本発明は、インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、（ｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程、およびその後（ｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物をその被験体に投与する工程を含み、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる方法を提供する。
【００１４】
本発明は、インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程を含み、患者が、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を以前に受けており、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる方法を提供する。
【００１５】
本発明は、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの１つより多くのクレード（例えば、２、３、４、５または６つの異なるクレード）からの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物も提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、（ｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程、およびその後（ｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を該被験体に投与する工程を含み、該第１クレードと該第２クレードとが互いに異なり、該免疫原性組成物の一方または両方が、アジュバントを添加したものである、方法。
（項目２）
インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、（ｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程、およびその後（ｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を該被験体に投与する工程を含み、第１クレードと第２クレードとが互いに異なり、該免疫原性組成物の一方または両方が、インフルエンザＡウイルスノイラミニダーゼ抗原を含む、方法。
（項目３）
インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程を含み、該患者は、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を以前に受けており、該第１クレードと該第２クレードとが互いに異なり、ならびに、該第２クレードの抗原を含む組成物が、アジュバントを添加したものであり、および／またはインフルエンザＡウイルスノイラミニダーゼ抗原を含む、方法。
（項目４）
インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、（ｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程、およびその後（ｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を該被験体に投与する工程を含み、該第１クレードと該第２クレードとが互いに異なり、該第１クレードが、クレード０ではない、方法。
（項目５）
インフルエンザウイルスに対して患者を免疫するための方法であって、（ｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を被験体に投与する工程、およびその後（ｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物を該被験体に投与する工程を含み、該第１クレードと該第２クレードとが互いに異なり、ならびに該組成物の一方または両方が、１用量につき≦１５μｇのＨ５の血球凝集素を含有する、方法。
（項目６）
前記第１クレードが、クレード１であり、前記第２クレードが、クレード２である、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記第１クレードが、クレード２であり、前記第２クレードが、クレード１である、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記第１クレードが、クレード１であり、前記第２クレードが、クレード２ではない、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記第１クレードが、クレード２であり、前記第２クレードが、クレード１ではない、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記免疫原性組成物の少なくとも１つが、スプリットビリオンウイルスである、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記免疫原性組成物の少なくとも１つが、インフルエンザＡウイルスノイラミニダーゼを含む、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記第１クレードの抗原を含む組成物が、アジュバントを添加したものである、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記第２クレードの抗原を含む組成物が、アジュバントを添加したものである、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記第１クレードの抗原を含む組成物が、アジュバントを添加したものであり、かつ前記第２クレードの抗原を含む組成物が、アジュバントを添加したものである、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
Ｈ５インフルエンザＡウイルスの１つより多くのクレードからの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物。
（項目１６）
Ｈ５インフルエンザＡウイルスのクレード１および２からの血球凝集素を含む、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）
アジュバントを添加した（例えば、サブミクロン水中油型エマルジョンを伴う）ものである、項目１５または項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
１クレードにつき４５μｇ未満のＨ５血球凝集素を含有する、項目１５から１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
１クレードにつき１５μｇ未満、例えば１クレードにつき７．５μｇまたは１クレードにつき３．７５μｇのＨ５血球凝集素を含有する、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
全ビリオン抗原およびアルミニウム塩アジュバント（例えば、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム）を含有する、項目１７から１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
前記抗原の供給源として使用されるウイルスが細胞培養（例えば、Ｖｅｒｏ細胞）上で増殖され、かつオボアルブミンおよびオボムコイドが含まれていない、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
スプリットビリオン抗原または精製表面抗原、およびサブミクロン水中油型エマルジョンアジュバントを含有する、項目１７から１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記エマルジョンが、スクアレンを含む、項目１７または項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
１つのＨ５クレードにつき７．５μｇのＨＡを含有する、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
１つのＨ５クレードにつき３．７５μｇのＨＡを含有する、項目２３に記載の組成物。
（項目２６）
２価ワクチン組成物である、項目１５〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【００１６】
本発明は、第１Ｈ５株および第２Ｈ５株が異なるクレードのものである、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの少なくとも２つの株（例えば、２、３、４、５または６つの異なる株）からの血球凝集素抗原を含む免疫原性組成物も提供する。
【００１７】
Ｈ５クレード
本発明に伴って使用するウイルスの血球凝集素抗原は、Ｈ５サブタイプに分類されるが、Ｈ５サブタイプの中でそれらは異なるクレードに分類される。
【００１８】
２００３年以降、鳥類に流行する大部分のＨ５Ｎ１ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）配列は、異なる系統発生的クレードに分かれている。カンボジア、タイおよびベトナムにおいて流行するクレード１ウイルスは、２００４年および２００５年におけるこれらの国での、ならびに２００６年におけるタイでのヒト感染の原因である。クレード２ウイルスは、２００３年以来、中国およびインドネシアにおいて鳥に流行しており；２００５年および２００６年には西方に、中東、欧州およびアフリカへと広がった。２００５年後半から、クレード２ウイルスが、主としてヒト感染の原因になっている。クレード２については多数のサブクレードが区別されており；これらのうちの３つ−サブクレード１、２および３（図１）−は、地理的分布の点で異なり、今のところ主としてそれらがヒト症例の原因になっている。
【００１９】
２００６年８月から２００７年３月の間、アフリカ、アジアおよび欧州における鳥類において流行し続けてまたは再び出現して散在的なヒト感染を伴ったＨ５Ｎ１ウイルスの大部分のＨＡ配列は、前に指摘した系統発生的クレードおよびサブクレードに分類される。クレード１ウイルスは、タイおよびベトナムにおける鳥でのならびにタイにおけるヒトに対する大発生の原因であった。クレード２．１ウイルスは、インドネシアにおいて家禽に流行し続け、ヒト感染を引き起こしている。クレード２．２ウイルスは、アフリカ、アジアおよび欧州における幾つかの国の鳥において大発生を引き起こし、エジプト、イラクおよびナイジェリアではヒト感染を伴っている。クレード２．３ウイルスは、アジアにおいて散発的に単離されており、中国およびラオスではヒト感染の原因となっている。
【００２０】
加えて、これらの分類以外に分類される二、三のウイルスが、アジアにおける局地的発生中に家禽から単離された。これらは、新生クレードに分類され、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６（クレード４）およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｘｉ／２／２００６（クレード７）によって表される。０から９の番号が付与された、合計１０のクレードが、現在、定義されている（図２）。
【００２１】
本明細書における参照のために、それぞれのクレードについての原型株は、それらの血球凝集素遺伝子のコーディング配列と共に、次のとおりである：
【００２２】
【表２】
2014159454.tif 000003
本明細書において、クレード１  Ｈ５ウイルスは、Ｐｈｙｌｉｐパッケージに実装されているようなＤＮＡＤＩＳＴアルゴリズム［２］を使用して（例えば、２パラメータ距離および正方行列を使用して）評価すると、系統発生の点から、クレード０および２から９（配列番号２から１０）のいずれかからのいずれのコーディング配列とよりＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３株（配列番号１）からのコーディング配列とのほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有するインフルエンザＡウイルスと定義することができる。同様に、クレード２ウイルスは、クレード０、１および３から９（配列番号１および３から１０）のいずれかからのいずれのコーディング配列とよりＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号２）からのコーディング配列とのほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有する。他のクレードは、系統発生的に、同様に、配列番号１から１０における他の配列とより配列番号１から１０からのその該当コーディング配列とほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有する−と定義することができる。
【００２３】
本明細書において、クレード１ウイルスは、核酸配列の点から、配列番号２から１０のいずれのものとよりＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３株（配列番号１）との配列同一性のほうが大きい血球凝集素コーディング配列を有するインフルエンザＡウイルスと定義することができる。他のクレードは、同様に、配列番号１から１０における他の配列とより配列番号１から１０からのその該当コーディング配列とのほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有する−と定義される。
【００２４】
本明細書において、Ｈ５ウイルスは、特徴的なＨＡ突然変異［３］を参照することによりアミノ酸配列の点から特定のクレードに存するものと定義することができる。例えば、クレード３ウイルスは、クレード１および２とは異なる、次のアミノ酸残基のうちの１つ以上を有することができる：Ａｓｎ−４５；Ｓｅｒ−８４；Ａｓｎ−９４；Ａｓｎ−１２４；Ｌｅｕ−１３８；Ｓｅｒ−１４４；Ｇｌｕ−２１２；Ｓｅｒ−２２３；および／またはＡｒｇ−３２５。クレード２ウイルスは、クレード１および３では見られないＡｓｐ−１２４を有することができる。クレード１ウイルスは、クレード２および３とは異なる、次のアミノ酸残基のうちの１つ以上を有することができる：Ｓｅｒ−１２４；Ｌｅｕ−１２９。
【００２５】
クレード２の中で、少なくとも３つのサブクレードが認知されている：２．１、２．２および２．３（図１）。本明細書において、クレード２．１  Ｈ５ウイルスは、系統発生の点から、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株（配列番号１１）またはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（配列番号１２）のいずれかとよりＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号２）とのほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有すると定義することができる。同様に、本明細書において、クレード２．２  Ｈ５ウイルスは、系統発生の点から、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５株（配列番号１１）またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号２）のいずれかとよりＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（配列番号１２）とのほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有すると定義することができる。最後に、クレード２．３  Ｈ５株は、本明細書において、系統発生の点から、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（配列番号１２）またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５株（配列番号２）のいずれかとよりＡ／Ａｎｈｕｉ／１／０５株（配列番号１１）とのほうが近縁である血球凝集素コーディング配列を有すると定義することができる。
【００２６】
一部の実施形態において、サブクレード２．２における株は、次の配列：Ｉｌｅ−２２３；Ｉｌｅ−２３０；Ｓｅｒ−２９４；Ｉｌｅ−５１７；ΔＳｅｒ−１３３のうちの１つ以上と、配列ＲＥＧＲＲＲＫＲ（配列番号１３）を有する開裂部位と、配列ＧＥＲＲＲＲＫＲ（配列番号１６）を有する開裂部位とを含むＨＡを有することがある。前記ＨＡ遺伝子は、ヌクレオチド：Ａ−４１；Ａ−１４２；Ａ−２０９；Ａ−２９５；Ｇ−４３３；Ａ−４６７；Ａ−４９６；Ｃ−６１０；Ａ−６２７；Ａ−６４３；Ｃ−６５８；Ｔ−６６１；Ｔ−６８９；Ｔ−７２７；Ａ−７５４；Ｇ−８８０；Ｃ−９３７；Ｇ−１００６；Ｔ−１０１２；Ａ−１０１９；Ｔ−１１７７；Ａ−１２３５；Ｔ−１４０２；Ｃ−１４１５；Ｔ−１４８０；Ｃ−１５１０；Ｔ−１６１４；Ｃ−１６１５；Ａ−１６７２；Ｇ−１７０８（これらはいずれも、該当コドンについてのコード化アミノ酸を変えることがない）のうちの１つ以上を含むことがある。前記ＮＡ遺伝子は、該当コドンについてのコード化アミノ酸を変えないであろう、ヌクレオチドＡ−７４３を含むことがある。
【００２７】
本発明の一部の実施形態において、プライミング抗原および／またはブースティング抗原は、クレード０からのものではなく、例えば、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７からのものではない。例えば、前記第２抗原がクレード１（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）からのものである場合には、前記第１抗原は、好ましくは、クレード０（例えば、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１５６／９７）からのものではない。
【００２８】
クレードの組み合わせ
本発明は、免疫処置のために１つより多くのＨ５クレードに由来する抗原を使用する。
【００２９】
例えば、患者を第１クレードにおけるＨ５ウイルスからの抗原でプライミングし、しかしその後、第２クレードにおけるＨ５ウイルスからの抗原でブースティングすることができる。このプライム／ブースト戦略において有用なクレードの組み合わせとしては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【００３０】
【表３】
2014159454.tif 000004
本発明は、第１クレードにおけるＨ５ウイルスからの抗原で予めプライミングした患者に対するブースター免疫処置も提供し、この場合のブースターは、第２（異なる）クレードからのものである。上の組み合わせは、このプライム／ブーストアプローチにも用いることができる。
【００３１】
本発明は、少なくとも２つの異なるクレードにおけるＨ５ウイルスからの抗原を含む免疫原性組成物も提供する。２つのクレードの有用な組み合わせとしては、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：
【００３２】
【表４】
2014159454.tif 000005
インフルエンザウイルス抗原
本発明に伴って使用するワクチンは、Ｈ５血球凝集素サブタイプを有するインフルエンザＡウイルスからの抗原を含む。前記ワクチンは、少なくとも１つのＨ５血球凝集素エピトープを含むタンパク質を含むであろう。例えば、前記ワクチンは、Ｈ５ウイルスからのウイルス性血球凝集素を含むであろう。
【００３３】
本発明の好ましいワクチンは、少なくとも１つのインフルエンザウイルスノイラミニダーゼエピトープを含むタンパク質も含む。例えば、前記ワクチンは、Ｈ５ウイルスからのウイルスノイラミニダーゼを含むであろう。本発明は、インフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９のうちの１つ以上に対して防御することができるが、通常、それは、Ｎ１（すなわち、Ｈ５Ｎ１ウイルス）またはＮ３（すなわち、Ｈ５Ｎ３ウイルス）に対してであろう。前記第１クレードおよび第２クレードは、同じＮＡサブタイプを有することがあり（例えば、両方ともＮ１もしくは両方ともＮ３）、または異なるＮＡサブタイプを有することがある（例えば、Ｎ１それからＮ３、もしくはＮ３それからＮ１、など）。前記プライミングおよびブースティング量の少なくとも一方がノイラミニダーゼを含む場合、それは、プライミング量であろう。
【００３４】
抗原は、概してインフルエンザウイルスから調製されるであろうが、代案として、血球凝集素およびノイラミニダーゼなどの抗原を組換え宿主において（例えば、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞系において）発現させ、精製された形態で［４、５、６］またはウイルス様粒子（ＶＬＰ；例えば、参考文献７および８を参照のこと）の形態で使用することができる。しかし、一般に、抗原はビリオンからのものであろう。
【００３５】
抗原は、生ウイルスまたは、さらに好ましくは、不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、次の作用因子のうちの１つ以上の有効量での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−ピロピオラクトン、またはＵＶ線。不活化のための追加の化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）またはこれらのいずれかのものの組み合わせでの処理が挙げられる。他のウイルス不活化方法は、例えば二成分系エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはガンマ線など、当該技術分野では公知である。
【００３６】
不活化ウイルスを使用する場合、そのワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン、または精製表面抗原（血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む）を含むことがある。ＤＡＲＯＮＲＩＸ（商標）Ｈ５Ｎ１製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）Ｈ５Ｎ１製品は、スプリットビリオン不活化ワクチンである。スプリットビリオンおよび精製表面抗原（すなわち、サブビリオンワクチン）は、本発明にとって特に有用である。
【００３７】
様々な方法によってウイルス含有流体からウイルスを回収することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを分解するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心法を含むことがある。その後、抗原を、最適に希釈した後、ダイアフィルトレーションによって精製してもよい。
【００３８】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割プロセスを含めて、洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスファート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９、など）でビリオンを処理してサブビリオン製剤を生成することにより、得られる。インフルエンザウイルスの分割方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、参考文献９−１４などを参照のこと。概して、ウイルスの分割は、感染性であろうとまたは非感染性であろうと完全ウイルスを分解濃度の分割剤で分解または分画することによって行われる。この分解は、ウイルスタンパク質の完全または部分可溶化を生じさせる結果となり、それによってそのウイルスの完全性が改変される。好ましい分割剤は、非イオン性およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤、例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスファート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル、などである。１つの有用な分割手順は、デオキシコール酸ナトリウムとホルムアルデヒドの逐次作用を利用し、最初のビリオン精製中に（例えば、スクロース密度勾配溶液中で）分割を行うことができる。従って、分割プロセスは、（非ビリオン材料を除去するための）ビリオン含有材料の浄化、（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を使用する）回収したビリオンの濃縮、全ビリオンの非ビリオン材料からの分離、密度勾配遠心工程における分割剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分割剤を含有するスクロース勾配を使用する）ビリオンの分割、そしてその後、望まない材料を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含むだろう。スプリットビリオンは、リン酸ナトリウム緩衝等張塩化ナトリウム溶液に有効に再懸濁することができる。ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品は、スプリットワクチンである。
【００３９】
精製表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原血球凝集素および概してノイラミニダーゼも含む。精製形態のこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該技術分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）、ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品は、サブユニットワクチンである。
【００４０】
インフルエンザ抗原は、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  Ｖ（商標）およびＩＮＶＡＶＡＣ（商標）製品の場合のように、ビロソーム［１５］（核酸不含ウイルス様リポソーム粒子）の形態で提供することもできるが、本発明に関してはビロソームを使用しないほうが好ましい。従って、一部の実施形態において、前記インフルエンザ抗原は、ビロソームの形態ではない。
【００４１】
ウイルスを調製する株は、概して、トリインフルエンザウイルスまたはヒトインフルエンザウイルスであろう。通常、それはヒトを感染させることができるであろうが、場合によっては、ヒトを感染させることができない株、例えばヒトを感染させる能力を後に獲得し得るトリ株、を使用することもある。この株は、ＨＰＡＩ（抗病原性トリインフルエンザ）株［１６］であり得る。
【００４２】
インフルエンザウイルスを弱毒化することができる。インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。前記インフルエンザウイルスを、低温馴化させることができる。これら３つの特徴は、生ウイルスを抗原として使用するとき、特に有用である。
【００４３】
インフルエンザウイルスは、抗ウイルス療法に対して耐性（例えば、オセルタビル［１７］および／またはザナミビルに対して耐性）である場合がある。
【００４４】
本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含めて、１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）のインフルエンザウイルス株からの抗原を含むことがあるが、但し、少なくとも１つのＨ５株からの抗原を含むことを条件とする。従って、組成物は、通常の季節型ワクチンに加えて少なくとも１つのＨ５株を特徴とする１つ以上の株からの抗原、例えば、３つのインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に加えて、Ｈ５株、例えばＨ５Ｎ１）と１つのインフルエンザＢ株とを有する４価ワクチンを含むことがある。他の実施形態において、それは、少なくとも２つのＨ５株と、場合によりＨ１株および／またはＨ３株および／またはインフルエンザＢウイルス株からの抗原とを含むことがある。ワクチンが、１つより多くのインフルエンザの株を含む場合、それらの異なる株は、一般に、別々に増殖させ、ウイルスを回収して抗原を調製した後に混合する。従って、本発明のプロセスは、１つより多くのインフルエンザ株からの抗原を混合する工程を含むことがある。
【００４５】
インフルエンザウイルスは、リアソータント株である場合もあり、逆遺伝学的技法によって得られたものである場合もある。逆遺伝学技術［例えば、１８−２２］は、プラスミドを使用して所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスのインビトロで調製を可能にする。概して、それは、（ａ）例えばｐｏｌＩプロモーターからの、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子、および（ｂ）例えばｐｏｌＩＩプロモーターからの、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現させることを含むので、細胞における両方のタイプのＤＮＡの発現が、完全無傷の感染性ビリオンのアセンブリをもたらす。前記ＤＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質のすべてを生じさせるが、ヘルパーウイルスを使用して該ＲＮＡおよびタンパク質の一部を生じさせることもできる。それぞれのウイルスＲＮＡを生産するために別々のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が好ましく［２３−２５］、これらの方法は、プラスミドを使用して、一部の方法では１２以下のプラスミドを用いて、ウイルスタンパク質のすべてまたは一部（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＰタンパク質のみ）を発現させることも含むであろう。イヌ細胞を用いる場合には、イヌｐｏｌＩプロモーターを使用することができる［２６］。
【００４６】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、１つのアプローチ［２７］は、同じプレスミド上の（ウイルスＲＮＡ合成のための）多数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザＡ  ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する多数のタンパク質コーディング領域（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つすべてのインフルエンザＡ  ｍＲＮＡ転写産物をコードする配列）を併用する。参考文献２７の方法の好ましい態様は、（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ  ｍＲＮＡをコードする領域；ならびに（ｂ）単一プラスミド上の８つすべてのｖＲＮＡをコードするセグメントを必要とする。１つのプラスミド上のＮＡおよびＨＡセグメントと別のプラスミド上の６つの他のセグメントとを含めることによっても問題を容易にすることができる。
【００４７】
ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためのｐｏｌＩプロモーターの使用の代案として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーター［２８］を使用することもできる。例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターを至便に使用することができる。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性のため、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞タイプ（例えば、ＭＤＣＫ）に、より至便であり得るが、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドで細胞をさらにトランスフェクトしなければならない。
【００４８】
他の技法では、二重ｐｏｌＩおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用して、ウイルスＲＮＡと単一テンプレートからの発現可能なｍＲＮＡとを同時にコードすることができる［２９、３０］。
【００４９】
インフルエンザＡウイルスは、特にウイルスを卵の中で増殖させるとき、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスからの１つ以上のＲＮＡセグメント（典型的には、Ａ／ＰＲ／８／３４からの６つのセグメントと、ワクチン株からのものであるＨＡおよびＮセグメント、すなわち、６：２リアソータント）を含むことがある。Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスからの、またはワクチン製剤のためのリアソータントウイルスの産生に有用な任意の他のウイルス株からの、１つ以上のＲＮＡセグメントを含むこともある。概して、本発明は、ヒト対ヒト伝播が可能である株に対して防御するものであり、そのため、その株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含むであろう。それは、トリインフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含むこともある。
【００５０】
抗原源として使用するウイルスは、卵または細胞培養のいずれか上で増殖させることができる。インフルエンザウイルス増殖のための現行の標準的方法は、特定病原体不在（ＳＰＦ）孵化鶏卵を使用し、それらの卵の内容物（尿膜腔液）からウイルスを精製する。しかし、さらに最近では、ウイルスは動物細胞培養で増殖されており、速度および患者アレルギーの理由で、この増殖方法が好まれる。卵ベースのウイルス増殖を用いる場合には、１つ以上のアミノ酸をその卵の尿膜腔液にウイルスと共に導入することができる［１４］。
【００５１】
細胞培養を用いるとき、ウイルス増殖基質は、概して、哺乳動物由来の細胞系であろう。元になる適する哺乳動物細胞としては、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。様々な細胞タイプ、例えば、腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などを使用することができる。適するハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣを有する細胞系である。適するサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞、例えばＶｅｒｏ細胞系におけるような腎細胞である。適するイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞系におけるような、腎細胞である。従って、適する細胞系としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞系としては、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来する、ＭＤＣＫ細胞［３１−３４］；アフリカミドリザルに由来する、Ｖｅｒｏ細胞［３５−３７］；またはヒト胚網膜芽細胞に由来する、ＰＥＲ．Ｃ６細胞［３８］が挙げられる。これらの細胞系は、広範に、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクションから、ｔｈｅ  Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓから、またはｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から入手することができる。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給しており、ならびにカタログ番号ＣＣＬ−３４でＭＤＣＫ細胞を供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０でＥＣＡＣＣから入手できる。哺乳動物細胞系のあまり好ましくない代案として、カモ（例えば、カモ網膜）または雌鶏に由来する細胞系をはじめとするトリ細胞系を用いてウイルスを増殖させることができる［例えば、参考文献３９−４１］。トリ細胞系の例としては、トリ胚性幹細胞［３９、４２］およびカモ網膜細胞［４０］が挙げられる。適するトリ胚性幹細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞に由来するＥＢｘ細胞系、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４［４３］が挙げられる。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）も使用することができる。
【００５２】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞系は、ＭＤＣＫ細胞系である。原ＭＤＣＫ細胞系は、ＡＴＣＣからＣＣＬ−３４として入手できるが、この細胞系の誘導体も使用することができる。例えば、参考文献３１には、懸濁培養での増殖に順応させたＭＤＣＫ細胞系（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託されている、「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）が開示されている。同様に、参考文献４４には、無血清培養で懸濁状態で増殖するＭＤＣＫ由来細胞系（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託されている、「Ｂ−７０２」）が開示されている。参考文献４５には、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）をはじめとする、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞が開示されている。参考文献４６には、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２０４２）をはじめとする、感染に対して高感受性であるＭＤＣＫ細胞系が開示されている。これらのＭＤＣＫ細胞系は、いずれも使用することができる。
【００５３】
ウイルスを哺乳動物細胞系で増殖させた場合には、有利なことに、その組成物には、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡが無く、その結果、アレルゲン性が低減されるであろう。
【００５４】
ウイルスを細胞系で増殖させた場合には、増殖のための培地、およびまた、培養を開始させるために用いるウイルス接種材料には、好ましくは、単純疱疹ウイルス、呼吸性シンシチウムウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスがないであろう（すなわち、それらの混入について試験し、陰性の結果を得ているであろう）［４７］。単純疱疹ウイルスの不在は、特に好ましい。
【００５５】
ＭＤＣＫ細胞を用いるものなどの細胞系を用いる増殖については、懸濁状態の細胞を用いて［４８−５０］または付着培養での細胞を用いてウイルスを増殖させることができる。懸濁培養のための１つの適するＭＤＣＫ細胞系は、（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９で寄託されている）ＭＤＣＫ  ３３０１６である。代案として、マイクロキャリア培養を用いることができる。
【００５６】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、無血清培養基および／または無タンパク質培地で増殖させる。本発明に関連して、ヒトまたは動物由来の血清からの添加物がない培地を無血清培地と呼ぶ。無タンパク質は、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を場合によっては含むことがあるが、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加剤および無血清タンパク質を除外して細胞の増殖が行われる培養を意味すると解釈する。そのような培養で増殖する細胞は、自然に、タンパク質それら自体を含有するであろう。
【００５７】
インフルエンザウイルス複製を支持する細胞系は、好ましくは、ウイルス複製中、３７℃未満［５１］、例えば、３０〜３６℃で増殖させる。
【００５８】
培養細胞でのウイルス増殖方法は、培養すべき株を培養細胞に接種する工程、例えばウイルス力価または抗原発現などによって決定されるような、ウイルス増殖のために望ましい期間（例えば、接種後２４時間と１６８時間との間）、感染細胞を培養する工程、および増殖したウイルスを回収する工程を一般に含む。１：５００から１：１、好ましくは１：１００から１：５、さらに好ましくは１：５０から１：１０のウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定）対細胞比で培養細胞に接種する。ウイルスを細胞の懸濁液に添加するか、細胞の単層に塗布し、ウイルスを少なくとも６０分間、しかし通常は３００分未満、好ましくは９０分と２４０分との間、２５℃から４０℃、好ましくは２８℃から３７℃で細胞に吸着させる。感染細胞培養物（例えば、単層）は、冷凍−解凍または酵素的作用、いずれかによって除去して、回収する細胞上清のウイルス含有量を増加させることができる。その後、回収した流体を不活化するか、冷凍保存する。培養細胞は、約０．０００１から１０、好ましくは０．００２から５、さらに好ましくは０．００１から２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ」）で感染させることができる。さらにいっそう好ましくは、細胞を約０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させる。感染細胞は、感染の３０から６０時間後に回収することができる。好ましくは、感染の３４から４８時間後に細胞を回収する。さらにいっそう好ましくは、感染の３８から４０時間後に細胞を回収する。一般に、細胞培養中にプロテアーゼ（典型的にはトリプシン）を添加してウイルスを放出させ、それらのプロテアーゼは、培養中の任意の適する工程で添加することができる。
【００５９】
血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主免疫原であり、および概して単純放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定して、ＨＡレベルを参照することによりワクチン用量を標準化する。現行のワクチンは、１株につき約１５μｇのＨＡを概して含有するが、例えば、子供のために、またはパンデミック状況下では、より低い用量も用いられる。より高い用量（例えば、３ｘまたは９ｘ用量［５４、５５］）を有する場合には、１／２（すなわち、ＦＯＣＥＴＲＩＡ（商標）の場合のように、１株につき７．５μｇ  ＨＡ）、１／４（すなわち、ＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）の場合のように、１株につき３．７５μｇ）および１／８などの分割量が用いられている［５２、５３］。従って、ワクチンは、インフルエンザ株１つにつき０．１μｇと１５０μｇとの間、好ましくは０．１μｇと５０μｇとの間、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどのＨＡを含むことがある。特定の用量としては、例えば、１株につき約４５μｇ、約３０μｇ、約１５μｇ、約１０μｇ、約７．５μｇ、約５μｇ、約３．８μｇ、約３．７５μｇ、約１．９μｇ、約１．５μｇなどが挙げられる。１株につき等しいＨＡ質量が一般的である。異なるＨ５クレードにおける株からのＨＡを含む組成物については、１株につき３．７５μｇ、７．５μｇ、または１５μｇ（例えば、概して水中スクアレンエマルジョンなどのアジュバントと併用して、合計７．５μｇのＨＡを与えるように、２×３．７５μｇ）を含むのが有用である。本発明に関してのように、アジュバントがワクチン中に存在するときには、より低い用量（すなわち、＜１５μｇ／用量）がさらに有用である。９０μｇほどもの高い用量が一部の研究（例えば、参考文献５６）では使用されているが、本発明の組成物（特に、ブースティング量の場合）は、通常、１５μｇ／用量以下であろう。
【００６０】
生ワクチンについては、ＨＡ含有量ではなく５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって投薬を測定し、１株につき１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が一般的である。
【００６１】
本発明に伴って使用するＨＡは、ウイルスにおいて見つけられるような天然ＨＡである場合もあり、または修飾されている場合もある。例えば、鳥類においてウイルスを高病原性にさせる決定基（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の開裂部位周辺の高塩基性領域）を除去するようにＨＡを修飾することは公知である。そうしなければ、これらの決定基は、卵内でのウイルスの成長を妨げることがあるからである。
【００６２】
本発明の組成物は、特に、スプリットまたは表面抗原ワクチンについては、洗剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」、例えばポリソルベート８０、として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）もしくは１０、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含むことがある。前記洗剤は、ほんのわずかな量でしか存在しない。従って、前記ワクチンは、オクトキシノール−１０、コハク酸水素α−トコフェリルおよびポリソルベート８０のそれぞれの１ｍｇ／ｍＬ未満を含むことがある。微量での他の残留成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００６３】
宿主細胞ＤＮＡ
細胞系を用いてウイルスを増殖させる場合には、最終ワクチン中の残留細胞系ＤＮＡの量を最小にして、そのＤＮＡの一切の発癌活性を最小にするのが一般的慣例である。従って、細胞系を用いてウイルスを増殖させた場合、たとえ微量の宿主細胞ＤＮＡが存在することがあったとしても、その組成物は、好ましくは、１用量につき１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびさらに好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡしか含有しない。いずれの残留宿主細胞ＤＮＡの平均長も、５００ｂｐ未満、例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。一般に、本発明の組成物から排除することが望ましい宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐより長いＤＮＡである。
【００６４】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、今では、生物学的製剤の常例的規定要件であり、当業者の通常能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために用いられるアッセイは、概して検証済アッセイ［５７、５８］であろう。検証済アッセイの性能特性は、数学的で定量可能な用語で記述することができ、およびその可能性ある誤差源が同定されていることであろう。このアッセイは、一般に、確度、精度、特異性などの特性について試験されているであろう。アッセイが（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知標準量に対して）較正され、試験されていれば、定量的ＤＮＡ測定を常例的に行うことができる。ＤＮＡ定量のために３つの原則技術を用いることができる：ハイブリダイゼーション法、例えば、サザンブロットまたはスロットブロット［５９］；イムノアッセイ法、例えば、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ［６０］；および定量的ＰＣＲ［６１］。これらの方法は、すべて、当業者によく知られているが、それぞれの方法の正確な特徴は、問題となる宿主細胞、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択などに依存し得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅｖｉｃｅからのＴｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、バイオ製剤中の混入ＤＮＡレベルをモニターするために用いられている［６０］。典型的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、ウレアーゼコンジュゲート型抗ｓｓＤＮＡ抗体、とＤＮＡとの反応複合体の非配列特異的形成を必要とする。前記製造業者から入手できる完全Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔには、すべてのアッセイ成分が含まれている。様々な商業製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している；例えば、ＡｐｐＴｅｃ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ（商標）、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、など。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ混入を測定するための化学発光ハイブリダイゼーションアッセイとｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（商標）システムの比較は、参考文献６２において見つけることができる。
【００６５】
混入ＤＮＡは、ワクチン調製中に標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィーなどを用いて除去することができる。残留宿主細胞の除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えば、ＤＮアーゼを使用することによって、増進することができる。宿主細胞ＤＮＡ混入を減少させるための至便な方法は、参考文献６３および６４に開示されており、これは、先ず、ウイルス増殖中に使用することができるＤＮアーゼ（例えば、ベンゾナーゼ）を使用、そして次に、ビリオン分解中に使用することができるカチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する、二工程処理を含む。アルキル化剤、例えばβ−ピロピオラクトン、での処理は、宿主細胞ＤＮＡを除去するために用いることもでき、および有利には、ビリオンを不活化するために用いることもできる［６５］。
【００６６】
血球凝集素１５μｇにつき宿主細胞を＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含有するワクチンが好ましく、容量０．２５ｍＬにつき宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含有するワクチンも好ましい。血球凝集素５０μｇにつき宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含有するワクチンは、さらに好ましく、容量０．５ｍＬにつき宿主細胞ＤＮＡを＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）含有するワクチンもさらに好ましい。
【００６７】
アジュバント（単数または複数）
本発明の組成物は、その組成物を受ける患者において惹起される免疫応答（ホルモンおよび／または細胞応答）を強化するためにアジュバントを含むことがある。
【００６８】
第１クレードワクチンおよび第２クレードワクチンは、両方ともアジュバント添加ワクチンであることが好ましい。それらは、同じアジュバントを利用する場合もあり、または異なるアジュバントを利用する場合もある。２つのワクチンのうち一方だけにアジュバントが添加される場合には、好ましくはそれは第２のものである。
【００６９】
本発明に伴って使用するために適するアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
●  カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはそれらの混合物）を含む、無機塩類含有組成物。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献６６に開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、これらの塩は、任意の適する形態（例えば、ゲル、結晶質、非晶質など）を呈する。これらの塩への吸着が好ましい。前記無機塩類含有組成物は、金属塩の粒子として調合することもできる［６７］。アルミニウム塩アジュバントは、下でさらに詳細に説明する。
【００７０】
●  下でさらに詳細に説明するような、水中油型エマルジョン。
【００７１】
●  下でさらに詳細に説明するような、免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
【００７２】
●  下でさらに詳細に説明するような、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（「３ｄＭＰＬ」；「ＭＰＬ（商標）」としても公知）。
【００７３】
●  イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（「Ｒ−８３７」）［６８、６９］、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［７０］、およびそれらの類似体；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫賦活性イミダゾキノリンについてのさらなる詳説は、参考文献７１から７５において見つけることができる。
【００７４】
●  チオセミカルバゾン化合物、例えば、参考文献７６に開示されているもの。活性化合物の調合、製造およびスクリーニングの方法も参考文献７６に記載されている。前記チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【００７５】
●  ヌクレオシド類似体、例えば：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【００７６】
【化１】
2014159454.tif 000006
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献７７から７９に開示されている化合物；（ｆ）式：
【００７７】
【化２】
2014159454.tif 000007
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、不在、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであり、またはＲ４−５：
【００７８】
【化３−１】
2014159454.tif 000008
（この結合は、
【００７９】
【化３−２】
2014159454.tif 000009
によって示す結合で達成される）
におけるように互いに結合して５員環を形成し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｎ、Ｃ、ＯまたはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、この場合のＲ９ａは、
【００８０】
【化４−１】
2014159454.tif 000010
（この結合は、
【００８１】
【化４−２】
2014159454.tif 000011
によって示す結合で達成される）
であり；
Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
それぞれのＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
それぞれのＲｃは、独立して、Ｈ、ホスファート、ジホスファート、トリホスファート、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
それぞれのＲｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール、またはヘテロシクリルであり；
それぞれのＲｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
それぞれのＲｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスファート、ジホスファート、またはトリホスファートであり；
それぞれのｎは、独立して、０、１、２、または３であり；
それぞれのｐは、独立して、０、１、または２である）を有する化合物；または（ｇ）（ａ）から（ｆ）のいずれかのものの医薬的に許容される塩、（ａ）から（ｆ）のいずれかのものの互変異性体、もしくはその互変異性体の医薬的に許容される塩。
【００８２】
●  トリプタントリン化合物、例えば、参考文献８０に開示されているもの。活性化合物についての調合、製造およびスクリーニングの方法も参考文献８０に記載されている。前記トリセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【００８３】
●  ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［８１］。
【００８４】
●  アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［８３、８４］、ヒドラフタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［８５］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、およびベンザゾール化合物［８６］をはじめとする、参考文献８２に開示されている化合物。
【００８５】
●  ３，４−ジ（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、スタウロスポリン類似体、誘導体化ピリダジン、クロメン−４−オン、インドリノン、キナゾリン、およびヌクレオシド類似体をはじめとする、参考文献８７に開示されている化合物。
【００８６】
●  リン酸アミノアルキルグルコサミニド誘導体、例えば、ＲＣ−５２９［８８、８９］。
【００８７】
●  ホスファゼン、例えば、参考文献９０および９１に例えば記載されているような、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）。
【００８８】
●  小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）、例えば：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
酢酸２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチル
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【００８９】
●  サポニン［参考文献１３３のチャプター２２］、これは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根およびさらに花において見つけられる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。シャボンの木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、商業的には、サルサパリラＳｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、宿根カスミソウ（ブライダルベール）、およびサボンソウ（サボンソウ根）から得られることもある。サポニンアジュバント調合剤としては、ＱＳ２１などの精製調合剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質調合剤が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃをはじめとする特定の精製画分が、同定されている。好ましくは、サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献９２に開示されている。サポニン調合剤は、コレステロールなどのステロールも含むことがある［９３］。サポニンとコレステロールを併用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成することができる［参考文献１３３のチャプター２３］。ＩＳＣＯＭは、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も概して含む。任意の公知サポニンをＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、さらに参考文献９３−９５に記載されている。場合によっては、ＩＳＣＯＭには追加の洗剤がまったくない［９６］。サポニン系アジュバントの開発についての総説は、参考文献９７および９８において見つけることができる。
【００９０】
●  細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）ならびにそれらの無毒化誘導体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として公知の突然変異毒素［９９］。無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとして使用は、参考文献１００に、および非経口アジュバントとしての使用は、参考文献１０１に記載されている。
【００９１】
●  生体接着剤および粘膜接着剤、例えば、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１０２］またはキトサンおよびその誘導体［１０３］。
【００９２】
●  生体分解性で非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましい）から形成され、場合によっては、（例えばＳＤＳで）負電荷表面を有するようにまたは（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤で）正電荷表面を有するように処理された、微粒子（すなわち、直径が〜１００ｎｍから〜１５０μｍ、さらに好ましくは直径が〜２００ｎｍから〜３０μｍ、または直径が〜５００ｎｍから〜１０μｍの粒子）。
【００９３】
●  リポソーム（参考文献１３３のチャプター１３および１４）。アジュバントとしての使用に適するリポソーム調合剤の例は、参考文献１０４〜１０６に記載されている。
【００９４】
●  ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１０７］。そのような調合剤は、オクトキシノールと併用でのポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１０８］、ならびに少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤、例えばオクトキシノール、と併用でのポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［１０９］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、次の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００９５】
●  ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
【００９６】
●  第２のグラム陰性菌由来のリポサッカリド（ＬＰＳ）製剤と併用で、第１のグラム陰性菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム製剤（この場合、前記外膜タンパク質プロテオソームとＬＰＳ製剤は、安定な非共有結合性アジュバント複合体を形成する）。そのような複合体としては、「ＩＶＸ−９０８」、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜とＬＰＳとから成る複合体、が挙げられる。それらは、インフルエンザワクチンのためのアジュバントとして使用されている［１１０］。
【００９７】
●  ポリオキシヨードニウムポリマー［１１１、１１２］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【００９８】
●  メチルイノシン５’−一リン酸（「ＭＩＭＰ」）［１１３］。
【００９９】
●  ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１１４］、例えば、式：
【０１００】
【化５】
2014159454.tif 000012
［式中、Ｒは、水素、直線状もしくは分岐、非置換もしくは置換、飽和もしくは不飽和アシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群より選択される］を有するもの、またはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体。例としては、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリン、などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
●  ＣＤ１ｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１１５−１２２］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミド、など。
【０１０２】
●  ガンマイヌリン［１２３］またはその誘導体、例えばアルガムリン。
【０１０３】
●  参考文献１２４において定義されているとおりの、式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはその塩：
【０１０４】
【化６】
2014159454.tif 000013
例えば、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」または「ＥＲ８０４０５７」、例えば：
【０１０５】
【化７】
2014159454.tif 000014
●  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの脂質Ａの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４（参考文献１２５および１２６に記載されている）。
【０１０６】
●  カチオン性脂質と（通常は中性の）共脂質との調合剤、例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミリストレイルオキシ−プロパナミウムブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ（商標）」）またはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパナミウムブロミド−ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」）。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセネイルオキシ）−１−プロパナミウム塩を含有する調合剤が好ましい［１２７］。
【０１０７】
●  ホスファート含有非環式骨格に連結された脂質を含有する化合物、例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１２８、１２９］：
【０１０８】
【化８】
2014159454.tif 000015
これらおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１３３および１３４においてさらに詳細に論じられている。
【０１０９】
本発明において使用するためのアジュバント（単数または複数）は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストである場合がある。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のもののアゴニストである場合がある。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの薬剤は、先天免疫経路の活性化に有用である。
【０１１０】
単一のワクチンが、前記アジュバントのうちの２つ以上を含むことがある。
【０１１１】
組成物中の抗原およびアジュバントは、概して混合状態であろう。
【０１１２】
アルミニウム塩アジュバント
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムのような公知のアジュバントを使用することができる。これらの名は、どちらも存在する実際の化合物の正確な記述でないので、単に便宜上、用いるが、慣例的なものである（例えば、参考文献１３３のチャプター９を参照のこと）。本発明は、一般にアジュバントとして使用されているいずれの「水酸化物」または「リン酸塩」も使用することができる。
【０１１３】
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、概してオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶質である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ−１の吸収バンドおよび３０９０−３１００ｃｍ−１の強いショルダーの存在によって、他のアルミニウム化合物、例えば水酸化アルミニウム  Ａｌ（ＯＨ）３、と区別することができる［参考文献１３３のチャプター９］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶度は、回折バンドの半値幅（ＷＨＨ）によって表され、あまり結晶質でない粒子は、より小さい晶子のため、より大きな線の広がりを示す。ＷＨＨが増すにつれて表面積が増加し、ならびに高いＷＨＨ値を有するアジュバントほど大きな抗原吸着能力を有すると見られている。（例えば、透過電子顕微鏡において見られるような）繊維状の形態は、水酸化アルミニウムアジュバントに特有である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、概して約１１であり、すなわち、このアジュバントそれ自体は、生理ｐＨで正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４で１ｍｇのＡｌ＋＋＋につき１．８〜２．６ｍｇの間の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１１４】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、概して、少量の硫酸塩も多くの場合含有するヒドロキシリン酸アルミニウム（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）である。それらは、沈殿によって得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度がその塩の中のヒドロキシルに対するリン酸塩の置換度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３と１．２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在により完全なＡｌＰＯ４と区別することができる。例えば、（例えば、２００℃に加熱したときの）３１６４ｃｍ−１のＩＲスペクトルバンドは、構造ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１３３のチャプター９］。
【０１１５】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは０．８と１．２との間、およびさらに好ましくは０．９５±０．１であろう。一般に、前記リン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩については、非晶質であろう。代表的なアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍＬで含まれる、０．８４と０．９２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。前記リン酸アルミニウムは、一般に、粒状（例えば、透過電子顕微鏡で見ると粒子様形態）であろう。前記粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後、０．５〜２０μｍ（例えば、約５−１０μｍ）の範囲内である。ｐＨ７．４で１ｍｇのＡｌ＋＋＋につき０．７〜１．５ｍｇの間の吸着能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１１６】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸塩の置換度に逆比例し、この置換度は、沈殿による塩の調製に用いられる反応条件および反応物の濃度に依存して変わり得る。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変えることによって（より多くのリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）も、またはヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤を添加する（ＰＺＣをより塩基性にする）ことによっても、変えられる。本発明に従って使用するリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間、さらに好ましくは、５．０と６．５との間、例えば約５．７のＰＺＣを有するであろう。
【０１１７】
本発明の組成物を調製するために使用するアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝剤（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはトリス緩衝剤）を含有することがあるが、これは必ずしも必須でない。前記懸濁液は、好ましくは、無菌であり、発熱物質不含である。懸濁液は、遊離水性リン酸イオンを含むことがあり、これは、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、およびさらに好ましくは約１０ｍＭで存在する。懸濁液は、塩化ナトリウムも含むことがある。
【０１１８】
本発明は、ＤＡＲＯＮＲＩＸ（商標）の場合のような、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、リン酸アルミニウムのほうが水酸化アルミニウムより多く存在し得る、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比であり得る。
【０１１９】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍＬ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍＬ、≦４ｍｇ／ｍＬ、≦３ｍｇ／ｍＬ、≦２ｍｇ／ｍＬ、≦１ｍｇ／ｍＬなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍＬと１ｍｇ／ｍＬとの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１２０】
水中油型エマルジョンアジュバント
水中油型エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンへのアジュバント添加の際の使用に特に適することが判明した。様々なそのようなエマルジョンは公知であり、それらは、少なくとも１つの油と少なくとも１つの界面活性剤を概して含み、前記油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝性）であり、生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に、直径が５μｍ未満であり、サブミクロン直径を有することさえあり、マイクロフルイダイザーを用いてこれらの小さなサイズを実現して安定なエマルジョンを生じさせる。２２０ｎｍ未満のサイズを有する小滴は、濾過滅菌に付すことができるので、好ましい。
【０１２１】
本発明は、動物（例えば、魚）または植物源からのものなどの油で用いることができる。植物油源としては、堅果、種子および穀物が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油は、最も一般的に利用でき、堅果油のよい例となる。例えばホホバビーンから得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油およびこれらに類するものが挙げられる。穀物群では、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀粒、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するもの、の油も使用することができる。種子油中に自然には存在しないが、堅実および種子油から出発して適する材料の加水分解、分離およびエステル化により、グリセロールと１，２−プロパンジオールの６−１０炭素脂肪酸エステルを調製することができる。哺乳動物のミルクからの脂肪および油は、代謝可能であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。大部分の魚は、容易に回収することができる代謝性油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうは、ここで用いることができる幾つかの魚油のよい例となる。多数の分岐鎖油が、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、それらは一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサへキサエン、として公知の分岐、不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここでは特に好ましい。スクアラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市場の供給業者から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。他の好ましい油は、トコフェロール（下記参照）である。油の混合物を使用してもよい。
【０１２２】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／疎水性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、次のものを含む（しかし、これらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商標ＤＯＷＦＡＸ（商標）で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール、これは、エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の反復数が様々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシラート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ならびにソルビタンエスエル（一般に、ＳＰＡＮとして公知）、例えば、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）およびモノラウリン酸ソルビタン。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるための好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１２３】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用することができる。モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの併用も適する。もう１つの有用な併用は、ラウレス９と、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１２４】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）０．０１から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１から０．１％、特に０．００５から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１から１０％、および特に０．１から１％または約０．５％である。
【０１２５】
本発明に関して有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
●  スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。容量でのこのエマルジョンの組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量に置き換えると、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および約０．４８％Ｓｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」［１３０−１３２］として公知であり、例えば、参考文献１３３のチャプター１０および参考文献１３４のチャプター１２にさらに詳細に記載されている。前記ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝剤を含む。
【０１２６】
●  スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を含むことがある。Ｓｐａｎ８５（例えば１％で）および／またはレシチンを含むこともある。これらのエマルジョンは、２から１０％スクアレン、２から１０％トコフェロールおよび０．３から３％Ｔｗｅｅｎ８０を有することがあり、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、≦１（例えば、０．９０）である。これがより安定なエマルジョンをもたらすからである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容量比、または約１１：５の重量比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解して２％溶液を得ること、その後、９０ｍＬのこの溶液と、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍＬのスクアレン）の混合物とを混合すること、その後、その混合物をミクロ流体化することによって作ることができる。結果として生ずるエマルジョンは、例えば１００ｎｍと２５０ｎｍとの間、好ましくは約１８０ｎｍの平均径を伴う、サブミクロン油滴を有することができる。
【０１２７】
●  スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含むことがある。このエマルジョンは、リン酸緩衝剤も含有することがある。
【０１２８】
●  ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、これら三成分を約７５：１１：１０の重量比（例えば、７５０μｇ／ｍＬ  ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍＬ  コハク酸α−トコフェロール）で含むことができ、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のなんらかの寄与を含むであろう。このエマルジョンは、スクアレンも含むことがある。このエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含むことがある。その水性相は、リン酸緩衝剤を含有することがある。
【０１２９】
●  スクアレン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中で調合することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、および「ＳＡＦ−１」アジュバント［１３５］ではトレオニルーＭＤＰと共に使用されている（０．０５−１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアレン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバント［１３６］（５％  スクアレン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート８０）の場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰ無しで使用することもできる。ミクロ流体化が好ましい。
【０１３０】
●  スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、および／または２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴を（容量で）少なくとも９０％を有する［１３７］。このエマルジョンは、次のもののうちの１つ以上も含むことがある：アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖、例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；および／またはアルキルポリグリコシド。そのようなエマルジョンを凍結乾燥させることができる。
【０１３１】
●  ０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１３８に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン小滴サイズが有利である。
【０１３２】
●  非代謝性油（例えば、軽油）および少なくとも１つの界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性コンジュゲート（例えば、グルクロン酸のカルボキシル基による脱アシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって製造される、参考文献１３９に記載されている、ＧＰＩ−０１００）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤を含むことがある。
【０１３３】
●  サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がヘリカルミセルとして会合しているエマルジョン［１４０］。
【０１３４】
●  鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコールおよび非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１４１］。
【０１３５】
●  鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１４１］。
【０１３６】
本発明の好ましい水中油型エマルジョンは、スクアレンを含む。
【０１３７】
前記エマルジョンを、送達時に抗原と即時混合することができる。従って、前記アジュバントおよび抗原は、使用時の最終調合の準備が整っている、包装されたまたは配給されるワクチンの中に別々に保持されることがある。一般に、前記抗原は、二液を混合することによってワクチンが最終調製されるように、水性形態であろう。混合するための二液の容量比は、様々（例えば、５：１と１：５との間で）であり得るが、一般には約１：１である。エマルジョンおよび抗原を反復投与用キットに別々に保管する場合には、混合して５ｍＬ、例えば１０×０．５ｍＬ用量、のアジュバント添加ワクチンを生じさせるために、２．５ｍＬのエマルジョンを収容しているバイアルおよび２．５ｍＬの水性抗原を収容しているバイアルとして製品を提供することができる。
【０１３８】
抗原とアジュバントを混合した後、血球凝集素抗原は、一般には水溶液中に残存するが、それ自体、油／水海面付近に分布し得る。一般に、あったとしても少しの血球凝集素しかそのエマルジョンの油相に侵入しないであろう。
【０１３９】
組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれを使用してもよいが、α−トコフェロールが好ましい。前記トコフェロールは、幾つかの形態、例えば異なる塩および／または異性体、を呈することがある。塩としては、有機塩、例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などが挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは、両方とも、使用することができる。有利には、老人患者（例えば、６０歳以上の年齢の患者）において使用するためのワクチンにはトコフェロールを含める。ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対してプラスの効果を及ぼすと報告されているためである［１４２］。それらは、前記エマルジョンを安定させるために役立ち得る抗酸化特性も有する［１４３］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協働することが判明した。さらに、コハク酸α−トコフェロールが、インフルエンザワクチンと相溶性であることおよび水銀化合物の代替として有用な保存薬であることは公知である［１３］。
【０１４０】
免疫賦活性オリゴヌクレオチド
免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチド修飾体／類似体、例えば、ホスホロチオアート修飾体を挙げることができ、および２本鎖である場合もあり、または（ＲＮＡを除き）１本鎖である場合もある。参考文献１４４、１４５および１４６には、可能な類似体置換、例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１４７−１５２においてさらに論じられている。ＣｐＧ配列を、ＴＬＲ９、例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴに向けることができる［１５３］。ＣｐＧ配列、例えばＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）は、Ｔｈ１免疫応答の誘導にとって特異的であり得、または例えばＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂ細胞応答の誘導にとってより特異的である。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１５４−１５６において論じられている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用できるように構築される。場合によっては、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端で結合させて「イムノマー」を形成することができる。例えば、参考文献１５３および１５７−１５９を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知のＣｐＧ７９０９である。
【０１４１】
ＣｐＧ配列の使用の代案として、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することができる［１６０］。これらのオリゴヌクレオチドには、非メチル化ＣｐＧモチーフがない場合がある。
【０１４２】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチである場合がある。例えば、それは、１つより多くの連続チミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１６０に開示されているような、ＴＴＴＴ）を含むことがあり、および／またはチミジンを＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）有するヌクレオチド組成を有することがある。例えば、それは、１つより多くの連続シトシンヌクレオチド（参考文献１６０に開示されているような、ＣＣＣＣ）を含むことがあり、および／またはシトシンを＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）有するヌクレオチド組成を有することがある。これらのオリゴヌクレオチドには、非メチル化ＣｐＧモチーフがない場合がある。
【０１４３】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、少なくとも２０のヌクレオチドを概して含むであろう。それらは、１００より少ないヌクレオチドを含むことができる。
【０１４４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ３１（商標）［１６１］として公知である。従って、本発明に伴って使用するアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは多数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５−４０の間のヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは多数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオン性ポリマー、例えば、オリゴペプチド（例えば、５〜２０の間のアミノ酸）との混合物を含むことがある。前記オリゴヌクレオチドは、２６−ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１４）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。前記ポリカチオン性ポリマーは、１１−ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号１５）を含むペプチドであり得る。
【０１４５】
３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリル脂質Ａとしても公知）は、モノホスホリル脂質Ａ中の還元末端グルコサミンの位置３が脱アシル化されているアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損突然変異体から調製されたものであり、脂質Ａに化学的に類似しているが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠く。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、ならびにＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦをはじめとする幾つかのサイトカインの放出を刺激する（参考文献１６２も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、初めに参考文献１６３に記載された。
【０１４６】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変わる（例えば、異なる長さのものであり得る３、４、５または６個のアシル鎖を有する）、関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知）単糖類が、それらの２位炭素（すなわち、位置２および２’）でＮ−アシル化され、３’位にＯ−アシル化も存在する。炭素２に結合している基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合している基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合している基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は、
【０１４７】
【化９】
2014159454.tif 000016
である。
【０１４８】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは８と１６との間、さらに好ましくは９と１２との間であり、および最も好ましくは１０である。
【０１４９】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、それぞれ独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、この場合のＲ４は、−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３であり、ｍの値は、好ましくは８と１６との間、およびさらに好ましくは１０、１２または１４である。２位におけるｍは、好ましくは１４である。２’位におけるｍは、好ましくは１０である。３’位におけるｍは、好ましくは１２である。従って、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸からの−Ｏ−アシル基である。
【０１５０】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈであるときには、その３ｄＭＰＬは、アシル鎖を３つ（位置２、２’および３’のそれぞれに１つ）しか有さない。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの２つだけが−Ｈであるときには、その３ｄＭＰＬは、４つのアシル鎖を有することができる。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの１つだけが−Ｈであるときには、その３ｄＭＰＬは、５つのアシル鎖を有することができる。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’がいずれも−Ｈでないときには、その３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有することができる。本発明に従って使用する３ｄＭＰＬアジュバントは、３つから６つのアシル鎖を有するこれらの形態の混合物であり得るが、その混合物中に６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬを含むこと、および特に、ヘキサアシル鎖形態が、全３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％またはそれ以上、を確実に構成することが好ましい。６つのアシル鎖を有する３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性が大きい形態であることが判明した。
【０１５１】
従って、本発明の組成物に含めるための３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、
【０１５２】
【化１０】
2014159454.tif 000017
である。
【０１５３】
３ｄＭＰＬを混合物の形態で使用する場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度への言及は、その混合物中の併用３ｄＭＰＬ種を指す。
【０１５４】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを有する、例えば直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを有する、ミセル状凝集体または粒子を形成することがある。これらのいずれかまたは両方を本発明に伴って使用することができ、常例的アッセイによってよりよい粒子を選択することができる。本発明に従って使用するには、より小さい粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明水性懸濁液を生じさせられるほど小さいもの）が、それらの優れた活性のため、好ましい［１６４］。好ましい粒子は、２２０ｎｍ未満、さらに好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満の平均径を有し、および１００ｎｍ未満の平均径を有することさえある。しかし、ほとんどの場合、前記平均径は、５０ｎｍより小さくはないであろう。これらの粒子は、濾過滅菌に適する十分な小ささである。粒径は、平均粒径を明らかにする常例的な動的光散乱技術によって評定することができる。粒子がｘｎｍの直径を有すると言われる場合、一般に、この平均値付近に粒径分布があるであろうが、数で少なくとも５０％（例えば、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、またはそれ以上）の粒子が、ｘ±２５％範囲内の直径を有するであろう。
【０１５５】
３ｄＭＰＬは、有利には、水中油型エマルジョンと併用することができる。実質的にすべての３ｄＭＰＬが、そのエマルジョンの水性相に位置するだろう。
【０１５６】
３ｄＭＰＬは、それ自体で使用することができ、または１つ以上のさらなる化合物と併用することができる。例えば、ＱＳ２１サポニン［１６５］（水中油型エマルジョン［１６６］を含む）との、免疫賦活性オリゴヌクレオチドとの、ＱＳ２１と免疫賦活性オリゴヌクレオチドの両方との、リン酸アルミニウム［１６７］との、水酸化アルミニウム［１６８］との、またはリン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムの両方との、３ｄＭＰＬの併用は、公知である。
【０１５７】
医薬組成物
本発明の組成物は、医薬的に許容され、および概して水性形態である。それらは、抗原（および、適用可能な場合にはアジュバント）に加えて成分を含むことがあり、例えば、それらは、１つ以上の製薬用担体（単数または複数）および／または賦形剤（単数または複数）を概して含む。そのような成分の論考は、参考文献１６９において入手できる。
【０１５８】
前記組成物は、保存薬、例えば、チオメルサール（例えば、１０μｇ／ｍＬで）または２−フェノキシエタノールを含むことがある。しかし、前記ワクチンには、水銀材料が実質的にない（すなわち、５μｇ／ｍＬ未満）、例えば、チオメルサール不含であるべきことが好ましい［１３、１７０］。水銀を含有しないワクチンは、さらに好ましい。保存薬不含ワクチンは、特に好ましい。
【０１５９】
張度を制御するために、生理的塩、例えばナトリウム塩を含めることが好ましい。１ｍｇ／ｍＬと２０ｍｇ／ｍＬとの間で存在し得る、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましい。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１６０】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の、および好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る、重量オスモル濃度有するであろう。重量オスモル濃度は、予防接種によって引き起こされる疼痛に影響を及ぼさないと以前に報告されている［１１７］が、それでもやはり、この範囲内でオスモル濃度を保持することが好ましい。
【０１６１】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含むことがある。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤；トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを伴う）；またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、５−２０ｍＭ範囲内で含まれるであろう。
【０１６２】
組成物のｐＨは、一般には５．０と８．１との間、より典型的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、７．０と７．８との間であろう。従って、本発明のプロセスは、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含むことがある。
【０１６３】
前記組成物は、好ましくは、無菌である。前記組成物は、好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量につき＜１のＥＵ（エンドトキシンユニット、標準測度）、および好ましくは１用量につき＜０．１  ＥＵを含有している。前記組成物は、好ましくはグルテン不含である。
【０１６４】
前記組成物は、単回免疫処置用の材料を含むことがあり、または多回免疫処置用の材料を含むことがある（すなわち、「反復投与」キット、例えば１０回分用のもの）。反復投与構成の場合は保存薬を含めることが好ましい。反復投与用組成物に保存薬を含めることの代案として（またはそれに加えて）、材料取り出し用の無菌アダプターを有する容器の中に前記組成物を収容することができる。
【０１６５】
インフルエンザワクチンは、約０．５ｍＬの投薬量で概して投与されるが、例えば、（例えば月齢３６ヶ月以下の）子供には、半分の用量（すなわち、約０．２５ｍＬ）が投与されることがある。
【０１６６】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間で保管する。それらを冷凍すべきではない。理想的には、直射光を避けてそれらを保存すべきである。
【０１６７】
本発明のキット
本発明は、本発明の１つより多くの組成物、例えばプライミング組成物およびブースティング組成物、を収容しているキットを含む。前記２つのキット成分は、実質的に異なる時に患者に投与されるので、別々に保持されるであろう。
【０１６８】
キット内のそれぞれの個々のワクチンは、すぐに使用できるようになっている場合もあり、または送達時に即時調製できるようになっている場合もある。この即時用の構成は、アジュバントと抗原を使用するときまで別々に保持することができ、これは、水中油型エマルジョンアジュバントを使用するときに特に有用である。
【０１６９】
ワクチンを即時調製する場合、その成分は、キットの中で互いに物理的に離れており、様々な方法でこの分離を達成することができる。例えば、２つの成分は、２つの別々の容器、例えば、バイアル、例えば抗原バイアルおよびエマルジョンバイアル、の中にある場合がある。その後、それら２つのバイアルの内容物を、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、それらを他方のバイアルに添加することによって、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、それらを第三の容器の中で混合することによって、混合することができる。好ましい構成では、前記キット成分の一方が注射器の中にあり、他方がバイアルなどの容器の中にある。前記注射器を（例えば、針と共に）使用して、混合のためにその内容物を前記第２の容器に挿入し、その後、その混合物をその注射器の中に引き取ることができる。その後、その注射器の混合内容物を、一般には新たな滅菌針によって、患者に投与することができる。注射器に一方の成分を充填することにより、患者投与のために別の注射器を使用する必要が無くなる。
【０１７０】
別の好ましい構成では、ワクチンの２つの成分が一緒に保持されるが、同じ注射器、例えば二室シリンジ、例えば参考文献１７２〜１７９などに開示されているものなどの中に別々に保持される。その注射器を（例えば、患者への投与中に）動かすと、それら二室の内容物が混合される。この構成により、使用時の別個の混合工程の必要が回避される。
【０１７１】
ワクチンを即時調製する場合、その成分は、一般に水性形態であろう。一部の構成では、成分（概して、アジュバント成分ではなく抗原成分）は、乾燥形態で（例えば、凍結乾燥形態で）あり、他方の成分は、水性形態である。それら２つの成分を混合して、乾燥成分を再び活性化し、患者への投与のための水性組成物を生じさせることができる。概して、凍結乾燥成分は、注射器ではなくバイアルの中に配置されるだろう。乾燥成分は、安定剤、例えばラクトース、スクロースまたはマンニトール、ならびにそれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などを含むことがある。１つの可能性のある構成は、プレフィルド注射器内の水性アジュバントとバイアル内の凍結乾燥抗原成分とを使用する。
【０１７２】
組成物またはキット成分の包装
本発明の組成物（またはキット成分）に適する容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て注射器）、鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌でなければならない。
【０１７３】
組成物／成分をバイアルの中に配置する場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料製である。バイアルは、好ましくは、それに組成物を添加する前に滅菌する。ラテックス感受性患者での問題を避けるために、バイアルを、好ましくは、ラテックス不含ストッパーで密封し、また、すべての包装材料中にラテックスがないことが好ましい。前記バイアルは、１回量のワクチンを含む場合もあり、または１回分より多い用量、例えば、１０回分の用量を含む場合もある（「反復投与」バイアル）。好ましいバイアルは、無色ガラス製である。
【０１７４】
バイアルは、プレフィルド注射器をそのキャップに挿入できる、その注射器の内容物をそのバイアルに放出（して、例えば、凍結乾燥材料をその中で再構成）することができる、およびそのバイアルの内容物を取り出してその注射器に戻すことができるように改造されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有することがある。前記バイアルから前記注射器を外した後、針を取り付けることができ、前記組成物を患者に投与することができる。前記キャップは、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されるので、そのキャップに接触できるようにする前にそのシールまたはカバーを取り外さなければならない。バイアルは、特に反復投与用バイアルについては、その内容物の無菌除去を可能にするキャップを有することがある。
【０１７５】
組成物／成分を注射器に包装する場合、その注射器は、それに付いた針を有することがある。針が付いていない場合には、組み立てて使用するためにその注射器に別の針を備えさせることができる。そのような針は、さや付きである場合がある。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージ針が典型的である。ロット番号、インフルエンザシーズンおよび内容物の使用期限を印刷することができるはぎとり式ラベルを注射器に備えさせて、記録保持を助長することができる。注射器におけるプランジャーは、吸引中にそのプランジャーが偶発的にはずれないようにするために、好ましくは、ストッパーを有する。それらの注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有することがある。使い捨て注射器には１回量のワクチンが入っている。この注射器は、針の取り付け前はその先端を密封するために先端キャップを一般に有するであろう。この先端キャップは、好ましくは、ブチルゴム製である。注射器と針を別々に包装する場合には、好ましくは、その針にブチルゴムシールドを装着する。好ましい注射器は、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）で市販されている。ブチルゴムは、例えば反復投与キットにおける、バイアルのストッパーに適する材料でもある。
【０１７６】
例えば子供への送達を助長するために、半分の用量の容積を示すマークを容器につけることができる。例えば、用量０．５ｍＬが入っている注射器は、容積０．２５ｍＬを示すマークを有することがある。
【０１７７】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）を使用する場合には、ソーダ石灰ガラス製ではなくホウケイ酸ガラス製の容器を使用することが好ましい。
【０１７８】
キットまたは組成物は、そのワクチンの詳説、例えば、投与についての説示、そのワクチン中の抗原の詳説などを含むリーフレットと共に（例えば、同じ箱の中に）包装することができる。前記説示は、例えば、予防接種後のアナフィラキシー反応の場合などに容易に利用できるアドレナリンの溶液を保持するための、警告を含むこともある。
【０１７９】
処置方法およびワクチンの投与
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適し、および本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法であって、本発明の組成物をその患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【０１８０】
本発明は、医療において使用するための、例えば患者における免疫応答を惹起する際に使用するための、本発明のキットまたは組成物も提供する。
【０１８１】
本発明は、同時投与、別投与または逐次投与のための、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原およびＨ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原であって、第１クレードと第２クレードとが互いに異なるインフルエンザウイルス抗原も提供する。
【０１８２】
本発明は、療法において併用するための、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原およびＨ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原であって、第１クレードと第２クレードとが互いに異なるインフルエンザウイルス抗原も提供する。
【０１８３】
本発明は、療法において使用するための、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原とＨ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原との組み合わせであって、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる組み合わせも提供する。
【０１８４】
本発明は、患者における免疫応答を惹起するための医薬品の製造における、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原の使用であって、医薬品が、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原と共に投与するために調製され（または、と共に投与され）、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる使用も提供する。
【０１８５】
本発明は、患者における免疫応答を惹起するための医薬品の製造における（ｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原および（ｉｉ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原の使用であって、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる使用も提供する。
【０１８６】
本発明は、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原で予め免疫されている患者における免疫応答を惹起するための医薬品の製造における、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原の使用であって、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる使用も提供する。これらの予め免疫されている患者は、様々な方法で、例えば、Ｈ５血球凝集素での再免疫処置に応答するであろうメモリーＢ細胞の存在により、一般集団と区別される。
【０１８７】
本発明は、患者における免疫応答を惹起するための医薬品の製造における、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第１クレードからのインフルエンザウイルス抗原の使用であって、患者が、後に、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの第２クレードからのインフルエンザウイルス抗原で免疫されることとなり、第１クレードと第２クレードとが互いに異なる使用も提供する。
【０１８８】
本発明に従って惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答を含むであろう。インフルエンザウイルス予防接種後の抗体応答、中和能力および防御を評定する方法は、当該技術分野において周知である。人間に関する研究により、ヒトインフルエンザウイルスの血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関する（約３０−４０の血清サンプル血球凝集阻害力価が相同ウイルスによる感染からの５０％防御を生じさせる）ことが証明された［１８０］。概して、抗体応答は、血球凝集阻害によって、マイクロ中和によって、単純放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）によって、および／または一元放射溶血（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該技術分野において周知である。
【０１８９】
本発明組成物は、様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫処置経路は、（例えば、腕または下肢への）筋肉内注射による経路であるが、他の利用できる経路としては、皮下注射経路、鼻腔内経路［１８１−１８３］、経口経路［１８４］、皮内経路［１８５、１８６］、皮膚を通した経路、経皮経路［１８７］などが挙げられる。
【０１９０】
本発明のワクチンは、子供および大人の両方を処置するために使用することができる。インフルエンザワクチンは、月齢６ヶ月からの小児および成人免疫処置における使用に現在推奨されている。従って、患者は、１歳未満、１−５歳、５−１５歳、１５−５５歳、または少なくとも５５歳である場合がある。前記ワクチンを受けることが好ましい患者は、老人（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケア従事者、軍人および軍職員、妊婦、慢性病、免疫不全患者、ワクチンを受ける前の７日間に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記参照）を摂取した患者、卵アレルギーを有する人および海外旅行をする人である。しかし、前記ワクチンは、これらの群のみに適するのではなく、より一般的に人々に使用することができる。パンデミック株については、すべての年齢群に投与することが好ましい。
【０１９１】
本発明の好ましい組成物は、ＣＰＭＰ有効度基準の１、２または３を満たす。成人（１８−６０歳）の場合、これらの基準は、（１）≧７０％  抗体保有率；（２）≧４０％  抗体陽転率；および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増加である。老人（≧６０歳）の場合、これらの基準は、（１）≧６０％  抗体保有率；（２）≧３０％  抗体陽転率；および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増加である。これらの基準は、少なくとも５０人の患者での非盲検研究に基づく。
【０１９２】
本発明のプライム−ブースト実施形態では、患者を反復投与スケジュールに付す。反復投与スケジュールでは、同じまたは異なる経路、例えば、非経口的プライムおよび粘膜的ブースト、粘膜的プライムおよび非経口的ブーストなどによって、様々な用量を与えることができる。反復投与量は、概して、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与することとなる。
【０１９３】
本発明が、異なるＨ５クレードに対して予め免疫されている患者を免疫すること（ブースティング）を含む場合、そのブースター量は、以前の投与の数ヵ月後、例えば、少なくとも６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月、４８ヶ月、６０ヶ月またはそれ以上後に投与することができる。
【０１９４】
組成物が、Ｈ５インフルエンザＡウイルスの１つより多くのクレードからのＨＡを含む実施形態において、この組成物は、単回投与スケジュールによって投与される場合もあり、または反復投与スケジュールによって投与される場合もある。１用量以上（概して２用量）の投与は、免疫がない患者において、例えば、以前にインフルエンザワクチンを受けたことが全くない人に、またはＨ５などの新たなＨＡサブタイプに対する予防接種に、特に有用である。上と同様に、反復投与量は、概して、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）離して投与することとなる。
【０１９５】
本発明の組成物は、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、ヘルスケア専門家または予防接種センターへの同じ医療相談または訪問中に）、例えば、麻疹ワクチン、耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、複合Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌複合ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、呼吸器性シンシチウムウイルスワクチン、肺炎球菌複合ワクチンなどと実質的に同時に、患者に投与することができる。肺炎球菌ワクチンまたは髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、老人患者では特に有用である。
【０１９６】
同様に、本発明の組成物は、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性の抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、ヘルスケア専門家または予防接種センターへの同じ医療相談または訪問中に）患者に投与することができる。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼ阻害剤、例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エン酸［これらのエステル（例えば、エチルエステル）およびこれらの塩（例えば、リン酸塩）を含む］が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、オセルタミビルリン酸塩（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））としても公知の、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸塩（１：１）である。
【０１９７】
さらなる実施形態
上の実施形態に加えて、本発明は、（ａ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの少なくとも１つの株（例えば、１、２、３、４、５または６の異なる株）からの血球凝集素抗原と、（ｂ）（ｉ）Ｈ７インフルエンザＡウイルスの少なくとも１つの株および／または（ｉｉ）Ｈ９インフルエンザＡウイルスの少なくとも１つの株からの血球凝集素抗原とを含む、免疫原性組成物も提供する。従って、ワクチンは、血球凝集素Ｈ５＋Ｈ７、Ｈ５＋Ｈ９またはＨ５＋Ｈ７＋Ｈ９を含むことがある。Ｈ５インフルエンザＡウイルスの少なくとも２つの株（例えば、２、３、４、５または６の異なる株）からの血球凝集素抗原を含むことが好ましく、この場合、これらの株は、好ましくは、本明細書に記載するような、異なるクレードのものである。１つのＨ５株と１つのＨ７株のみからの血球凝集素を有する二価の組み合わせは、好ましくない［１８８］。
【０１９８】
本発明は、（ａ）Ｈ５インフルエンザＡウイルスの少なくとも１つの株（例えば、１、２、３、４、５または６の異なる株）からの血球凝集素抗原と、（ｂ）インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ２、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５および／またはＨ１６のうちの少なくとも２つからの血球凝集素抗原とを含む、免疫原性組成物も提供する。１つより多くのＨ５株からの血球凝集素を含む場合には、これらの株は、好ましくは、本明細書に記載するような、異なるクレードのものである。
【０１９９】
総論
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「から成ること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、Ｘから排他的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔ）ことがあり、または何らかの追加のもの、例えばＸ＋Ｙ、を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）ことがある。
【０２００】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙが「実質的にない」組成物は、Ｙが完全にないこともある。必要な場合には、「実質的に」という語を本発明の定義から省略することがある。
【０２０１】
数値ｘに関して、用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０２０２】
特に述べていない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いずれの特定の混合順序も必要としない。従って、成分をいずれの順序で混合してもよい。３つの成分がある場合には、２つの成分を互いに併せることができ、その後、その併せたものを第三の成分と併せることなどができる。
【０２０３】
動物の（および特にウシの）材料を細胞の培養に使用する場合、それらは、伝搬性海綿状脳症（ＴＳＥ）がない、および特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）がない源から得るべきである。全体的にみて、動物由来の材料が完全にない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０２０４】
化合物を組成物の一部として身体に投与する場合には、その化合物の代わりに適するプロドラッグを代替的に用いることができる。
【０２０５】
細胞基質を再集合または逆遺伝学的手順に用いる場合、好ましくは、それは、例えばヨーロッパ連合医薬品質原料管理規格（Ｐｈ  Ｅｕｒ）のｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ５．２．３におけるような、ヒト用ワクチン生産における使用に認可されたものである。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】参考文献３および１８９から取った、Ｈ５株の系統樹である。
【図２】参考文献３および１８９から取った、Ｈ５株の系統樹である。
【発明を実施するための形態】
【０２０７】
ヒトに関する研究Ｉ
Ｈ５Ｎ３株Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１９９７（クレード０）から調製したインフルエンザワクチンで患者を免疫した。前記ワクチンは、アジュバント非添加型のもの（第２群）であるか、ＭＦ５９水中油型エマルジョンをアジュバントとして添加したもの（第１群）であった。第三の患者群（第３群）は、Ｈ５Ｎ３ワクチンを受けなかった。
【０２０８】
インフルエンザシーズン後（少なくとも６年後）、患者を、Ｈ５Ｎ１株（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４＝クレード１；クレード２を用いてもよい）から調製したインフルエンザワクチンで免疫した。第０日および第２１日に、２用量を投与し、これらは、両方とも、７．５μｇの血球凝集素およびＭＦ５９アジュバントを含有した。抗原的に異なるＨ５ウイルスに対する予防接種前および後の抗体を、血球凝集阻害（ＨＡＩ）、抗体中和（ＭＮ）および一元放射溶血（ＳＲＨ）によって測定した。
【０２０９】
結果を表Ｉに示す。簡単に言うと、クレード０ワクチンによって予めプライミングした患者は、この新たなクレードに対して、プライミングしていない患者より良好で迅速な免疫応答を見せた。プライミングした群の中で、アジュバント添加プライミング量を受けた患者は、アジュバント非添加プライミング量を受けた患者より良好な免疫応答を見せた。
【０２１０】
幾何平均抗体力価および血清応答は、プライミングしていない被験体よりプライミングした被験体のほうが有意に高かった。ワクチンの１回投与後、第７日までに、第１群の患者の≧８０％が、原Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／９７クレード０抗原に対してばかりでなく、試験したクレード１、２．１、２．２および２．３トリＨ５ウイルス変異体すべてに対して、≧１：４０の抗体保有ＨＡＩ力価を達成した。さらに、プライミングした被験体が、それらの原プライミング抗原に優先的に応答したことを示唆する証拠はなく、これは、「抗原原罪」［１９０］に関する懸念を和らげた。
【０２１１】
従って、抗原的におよび遺伝的に遠い、異なるＨ５クレード内の株から調製したワクチンで数年前にプライミングされた被験体において、１回のワクチン投与に従って異なるインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスに対する防御的抗体応答を迅速に誘導することができる。
【０２１２】
この臨床研究のさらなる詳説は、参考文献１９１において入手できる。そこに述べられているように、クレード１株またはクレード２．２株に対する抗体の幾何平均力価は、プライミングされていない被験体（群０）の中でよりプライミングされた被験体（第１群および第２群）の中でのほうが有意に高かった。第１４日以後、両方のウイルスに対する抗体の力価は、プレーン−プライミングされた群（第２群）におけるよりアジュバント−プライミングされた群（第１群）におけるほうが有意に高かった。最高力価は、第１群において第１４日に観察された。予防接種後力価とＨ５Ｎ３ワクチンの以前の投与回数またはそれらの抗原含有量との関係は、観察されなかった。第７日までに、第１群の患者の少なくとも８０％は、血球凝集阻害アッセイで試験したすべての野生型ウイルスについて少なくとも１：４０の力価を有した。
【０２１３】
パンデミック蔓延のモデリングは、ウイルス伝播の最大減少が、パンデミックの勃発後２週間以内の応答の誘導によって達成されることを示す。ワクチンの２回投与を必要とするため、迅速なワクチン配備が難しくなる。しかし、このヒトに関する研究は、Ｈ５抗原（特に、アジュバント添加Ｈ５抗原）での被験体のプライミングが、低用量での抗原的に異なる（異なるＨ５  ＨＡクレード）ワクチンの投与後に迅速に起動し長期間続く免疫メモリーを誘導することを示している。
【０２１４】
さらなる研究において、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４クレード１  Ｈ５Ｎ１に対して交差反応性のメモリーＢ細胞が、ベースラインでの３つすべての患者群の血液において同等の頻度で検出された。それにもかかわらず、第１ブースター投与の三週間後、第１群における患者は、第２群および第３群より有意に多いＨ５Ｎ１特異的メモリーＢ細胞を提示した。これは、アジュバント添加Ｈ５Ｎ３ワクチンでの先行プライミングが、Ｈ５Ｎ１に対する交差反応性がより高いメモリーＢ細胞のプールを誘導したことを示唆している。一貫して、第１群における患者は、第２群または第３群における患者より速いおよび高い抗体応答を有し、ならびに第１群および第２群における患者は、第３群における患者より有意に良好におよび速く応答した。１回のクレード１ワクチン投与後、第７日までに、第１群におけるすべての患者は、クレード０、１、２．１．３、２．２および２．３．４からの幾つかの抗原的に異なる高病原性野生型ウイルスへの抗体陽転を果たしたが、第２群では、第１４日までにしか同等の抗体陽転率が観察されなかった。逆に、クレード０およびクレード１ウイルスへの８０％の抗体陽転率を果たすために、第３群患者については２回のクレード１ワクチン投与を必要とした。
【０２１５】
ヒトに関する研究ＩＩ
ＭＦ５９をアジュバントとして添加したＨ５Ｎ１ワクチンの２回のプライミング投与（第０日および第２１日）を成人および老人患者に施した。前記ウイルス株は、クレード１に分類されるＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４であった。第４３日に免疫応答を評定し、３つすべてのＣＰＭＰ基準を満たした：抗体保有率および抗体陽転率は、両方とも少なくとも８０％であり、ＧＭＴ増加は、少なくとも５倍であった。
【０２１６】
２回のプライミング投与の約１８ヶ月後、クレード２に分類される株Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５に基づくがＭＦ５９をアジュバントとして添加したＨ５Ｎ１を、６０人を超える患者にさらに投与した。この投与の直後、およびその７日後と２１日後の両方に、血清サンプルを採取した。それらの血清サンプルでのＨＩ、ＳＲＨおよびＭＮ試験によって免疫原性を評価した。
【０２１７】
ヒトに関する研究ＩＩＩおよびＩＶ
試験ＮＣＴ００７０３０５３は、クレード１ワクチン（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）および／またはクレード２ワクチン（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５）を使用する。Ｈ５株に以前に曝露されていない成人に、（ａ）第０日にクレード１ワクチンおよび第２８日にクレード２ワクチン；（ｂ）第０日にクレード１ワクチンおよび第１８０日にクレード２ワクチン；または（ｃ）第０日および第２８日にクレード１ワクチンとクレード２ワクチンの合剤を施す。両方ではなくクレード１ワクチンまたはクレード２ワクチンのみを施す、適切な対照も含める。各時点での合計抗原用量は、９０μｇ  ＨＡであり、これは、群（ａ）および（ｂ）については単一の株からの９０μｇ、または群（ｃ）についてはそれぞれの株からの２ｘ４５μｇであった。この研究は、アジュバント非添加型不活化サブビリオンワクチンを使用する。この研究は、２０１０年まで完了しないであろう。
【０２１８】
試験ＮＣＴ００６８００６９は、クレード１ワクチン（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）を以前に受けた患者にクレード２ワクチン（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５）の１回量を投与することを含む。前記抗原用量は、不活化サブビリオンワクチン１５μｇまたは９０μｇのいずれかである。この研究は、２００９年まで完了しないであろう。
【０２１９】
マウスに関する研究ＩおよびＩＩ（ＤＮＡ免疫処置：参照のため）
関連のない実験［１９２］で、Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／０４（クレード１）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５（クレード２）ウイルスからのＨＡを発現するアデノウイルスベクターを構築した。
【０２２０】
これらのベクター両方を別々に使用して、および併用して、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。合計用量は、ベクター１０８ｐｆｕであり、併用群にはそれぞれのベクターを５ｘ１０７ｐｆｕ施した。４週間後、同じワクチン構築物（単数または複数）を含有するブースターをマウスに施し、３週間後、中和抗体および血球凝集阻害抗体の検出のために採血した。
【０２２１】
いずれか一方のベクターのみで予防接種したマウスは、血球凝集阻害および中和抗体を生産したが、交差反応性は検出されなかった。しかし、両方のベクターで予防接種したマウスは、両方のクレードからのウイルスに対する防御的中和抗体力価を惹起した。
【０２２２】
同様の研究［１９３］において、５または１０いずれかの血球凝集素ＤＮＡ免疫原の合剤をプラスミド発現ベクターとしてマウスに施した。５つのＨＡの第１の合剤は、クレード０、２．２（３株）および２．５における株からのものであった。５つのＨＡの第２の合剤は、クレード０、１、２．１．３、２．２および２．３．４からのものであった。前記１０価は、これら１０株の合剤であった。これらのワクチンは、ＨＰＡＩ  Ｈ５Ｎ１の多数の数を中和する抗体を惹起した。
【０２２３】
このタイプの３価ＤＮＡワクチン［１９３］を使用して、ニワトリも試験した。これらの株は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（クレード１）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５（クレード２．３．４）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５（クレード２．１．３）であった。これらのニワトリは、疾病に対して防御された。
【０２２４】
マウスに関する研究ＩＩＩ
参考文献８に詳細に記載されているように、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（クレード１）またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５（クレード２）からのＨ５血球凝集素を含む二価ワクチンをマウスに施した。２つのタイプの二価ワクチンを試験した：組換えＨ５血球凝集素に基づくものと、ＶＬＰに基づくもの。いずれのワクチンも外因性アジュバントを含まなかったが、組換えタンパク質と比較して、ＶＬＰは、その特別な性質のため、内因性アジュバント効果を生じさせることができる。それぞれの一価ＶＬＰを対照として使用した。ｂａｃｍｉｄからのＳｆ９昆虫細胞において抗原を発現させた。前記二価ワクチン中の抗原は、１：１  ＨＡ重量比で混合した。
【０２２５】
定量的ＥＬＩＳＡおよびＨＡＩによって免疫応答を評定した。二価ＶＬＰ混合物で予防接種したすべてのマウスは、ＶｉｅｔＮａｍ／１２０３／２００４ウイルス（ＧＭＴ  １１５±３６）とＩｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５ウイルス（８０±０）の両方に対するＨＡＩ抗体を惹起した。対照的に、アジュバント非添加組換えタンパク質の混合物で予防接種したマウスの３３％しか、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５ウイルスに対するＨＡＩ力価（３６±１２）を有さなかった。
【０２２６】
致死的攻撃研究においても免疫応答を評定した。攻撃株は、２つのワクチン株のＰＲ８／３４リアソータントであった。いずれかのウイルスで攻撃した非予防接種マウスは、感染後、第６日までに原体重の≧２０％を失った。組換えＨＡタンパク質の二価混合物で予防接種したマウスは、クレード１またはクレード２いずれかの攻撃株によって攻撃したとき、それらの原体重の〜１５％を失った。クレード１  ＶＬＰ、クレード２  ＶＬＰ、またはＶＬＰ混合物で予防接種し、その後、クレード１ウイルスで攻撃したマウスは、体重減少も、感染の臨床徴候も有さなかった。クレード１  ＶＬＰで予防接種し、その後、クレード２ウイルスで攻撃したマウスは、攻撃から防御されず、攻撃後、第６日までに死亡した。クレード２  ＶＬＰまたはＶＬＰ混合物で予防接種したマウスは、すべて、クレード２ウイルス攻撃から防御された。
【０２２７】
従って、クレード１およびクレード２  ＶＬＰは、両方とも、マウスにおいて免疫原性であり、相同株でのウイルス攻撃に対して防御した。ＶＬＰの二価混合物を使用した場合、免疫原性は保持された。さらに、二価ＶＬＰを受けていたマウスは、クレード１またはクレード２ウイルスいずれかによる攻撃に対して防御された。参考文献８に報告されているように：「これらの結果は、非常に有意であり、ならびにＨ５Ｎ１に対する多価ワクチンが、Ｈ５Ｎ１インフルエンザのクレードおよびサブクレードの多様性に立ち向かうための妥当な戦略であるようであることを明示している。」
単なる例として本発明を説明したこと、ならびに本発明の範囲および精神から逸脱することなく本発明に変更を加えることができることは、理解されるであろう。
【０２２８】
【表１】
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【０２２９】
【数１】
2014159454.tif 000019
【０２３０】
【数２】
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【０２３１】
【数３】
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【数４】
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【０２３２】
【数５】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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