(57)【要約】【課題】  ビタミンＫ依存性タンパク質を簡便かつ大量に製造可能であることと、得られたビタミンＫ依存性タンパク質が十分にγ−グルタミルカルボキシル化されていることとの両方の条件を満足する、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質を製造する手段を提供することを課題とする。【解決手段】  γ−グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)をコードする遺伝子およびDT−ジアホラーゼ(NQO1)をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを、鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞を利用した発現系に用いることにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)をコードする遺伝子およびDT−ジアホラーゼ(NQO1)をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルス。
【請求項２】
ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子がさらに組み込まれている請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項３】
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、ビタミンＫ依存性凝固因子である請求項２に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項４】
前記ビタミンＫ依存性凝固因子が、プロトロンビン、第VII因子、第IX因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロテインＺからなる群より選択される請求項３に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫または鱗翅目昆虫の培養細胞に感染させることにより得られる、宿主細胞。
【請求項６】
GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを含む、組換えビタミンＫ依存性タンパク質の製造用キット。
【請求項７】
ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスをさらに含む請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記組換えバキュロウイルスが、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子をさらに組み込まれている請求項６に記載のキット。
【請求項９】
GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを用いて、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を鱗翅目昆虫または前記鱗翅目昆虫の培養細胞に発現させる工程を含む、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
前記発現工程において、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスをさらに用いる請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記組換えバキュロウイルスが、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子をさらに組み込まれている請求項９に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記発現工程が、鱗翅目昆虫においてγ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を発現させる工程である請求項９〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記発現工程が、鱗翅目昆虫の幼虫または蛹においてγ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を発現させる工程である請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記鱗翅目昆虫がカイコである請求項９〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載された製造方法で製造された、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えバキュロウイルスおよびこれを含む組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質の製造用キットに関する。また、本発明は、組換えバキュロウイルスを感染させた宿主細胞にも関する。さらに、本発明は、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＫは、種々のビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾を担うγ−グルタミルカルボキシラーゼ(GGCX)の補因子である。ビタミンＫの存在下でGGCXは、種々のビタミンＫ依存性タンパク質の所定のグルタミン酸残基をカルボキシル化して、γ−カルボキシグルタミン酸(Gla)に変換する。このγ−グルタミルカルボキシル化は、ビタミンＫ依存性タンパク質の生物学的機能(例えば、血液凝固、骨代謝、シグナル伝達など)に極めて重要であることが知られている。例えば、ビタミンＫ依存性タンパク質の一種である血液凝固第II因子(プロトロンビン)や第Ｘ因子はγ−グルタミルカルボキシル化されることによって、凝固反応の場である細胞膜のリン脂質への結合が可能となり、これにより他の因子からの活性化反応を受けられるようになる。
【０００３】
第II因子や第Ｘ因子のようなビタミンＫ依存性凝固因子は、主にヒトまたはウシの血漿を原料として調製されているが、感染性物質の混入や製品のロット間の差が問題となっている。そのため、近年では、哺乳動物細胞を利用した遺伝子組換え技術によりビタミンＫ依存性凝固因子を製造する方法が研究・開発されている。
【０００４】
しかし、哺乳動物細胞を利用した発現系によって得られたビタミンＫ依存性凝固因子は、完全にはγ−グルタミルカルボキシル化されていないことが知られている。γ−グルタミルカルボキシル化されていない凝固因子を活性化させることは一般に困難であるので、産業上の利用の観点からは、組換えビタミンＫ依存性凝固因子は、タンパク質発現系で得られた段階で十分にγ−グルタミルカルボキシル化されていることが望まれる。そこで、哺乳動物細胞を利用した発現系において、ビタミンＫ依存性タンパク質とGGCXとを共発現させることで、γ−グルタミルカルボキシル化タンパク質を得る方法が開発されている(特許文献１参照)。
【０００５】
他方で、ビタミンＫ依存性タンパク質のγ−グルタミルカルボキシル化には、GGCXの他に、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ(VKOR)およびDT−ジアホラーゼ(NAD(P)H依存性キノンオキシドレダクターゼ１；NOQ1とも呼ばれる)も関与することが知られている(非特許文献１参照)。ここで、γ−グルタミルカルボキシル化に直接関与する酵素はGGCXであり、VKORおよびNQO1はビタミンＫのリサイクルに関与する酵素であるが、近年では、哺乳動物細胞を利用した発現系において、ビタミンＫ依存性タンパク質、GGCXおよびVKORを共発現させることで、γ−グルタミルカルボキシル化タンパク質を得る方法も開発されている(特許文献２参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３８０１９号
【特許文献２】国際公開第２００６／０６７１１６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tie J-K.ら、Blood. vol. 117, p. 2967-2974 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の方法はいずれも哺乳動物細胞を利用した発現系を用いているので、γ−グルタミルカルボキシル化タンパク質の収量は工業的規模の製造の観点からは極めて少なく、また製造コストも高いという問題がある。
【０００９】
他方、大腸菌を利用した発現系では、所望のタンパク質の大量発現が期待できるが、発現させたタンパク質には翻訳後修飾がなされないことが知られている。さらに、構造が複雑なタンパク質を発現させた場合、そのほとんどが不溶性凝集体となることも知られている。また、鱗翅目昆虫を利用した発現系では、天然型タンパク質に近い翻訳後修飾のなされたタンパク質の発現が期待できるが、本発明者らの予備実験では、カイコに発現させたビタミンＫ依存性タンパク質はほとんどγ−グルタミルカルボキシル化されていなかった。
【００１０】
上記のような事情に鑑みて、本発明者らは、ビタミンＫ依存性タンパク質を簡便かつ大量に製造可能であることと、得られたビタミンＫ依存性タンパク質が十分にγ−グルタミルカルボキシル化されていることとの両方の条件を満足する、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質を製造する手段を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスと、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスとを用いた鱗翅目昆虫の発現系により、ビタミンＫ依存性タンパク質を簡便かつ大量に得ることができ、得られたビタミンＫ依存性タンパク質が十分にγ−グルタミルカルボキシル化されていることを見出して、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを提供する。また、本発明は、この組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫または鱗翅目昆虫の培養細胞に感染させることにより得られる、宿主細胞を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを含む、組換えビタミンＫ依存性タンパク質の製造用キットを提供する。また、本発明は、この組換えバキュロウイルスを用いて、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を鱗翅目昆虫または該昆虫の培養細胞に発現させる工程を含む、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、鱗翅目昆虫または該鱗翅目昆虫の培養細胞を利用した発現系を介して、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を簡便かつ大量に製造することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】GGCX、NQO1およびVKORのそれぞれを単独で発現させるか、またはそれらのうちの２種を共発現させるための組換えバキュロウイルスを感染させたカイコ由来培養細胞における各タンパク質の発現量を示す写真である。
【図２】図２Ａは、実施例１で作製した各種の組換えバキュロウイルスと、ヒト第Ｘ因子を発現させるための組換えバキュロウイルスとを感染させたカイコ幼虫におけるヒト第Ｘ因子の発現量を示す写真であり、図２Ｂは、発現させたヒト第Ｘ因子のγ−グルタミルカルボキシル化の程度を示す写真である。
【図３】図３Ａは、GGCXおよびNQO1を共発現させるための組換えバキュロウイルスと、ヒトプロトロンビンを発現させるための組換えバキュロウイルスとを感染させたカイコ蛹におけるヒトプロトロンビンの発現量を示す写真であり、図３Ｂは、発現させたヒトプロトロンビンのγ−グルタミルカルボキシル化の程度を示す写真である。
【図４】図４Ａは、実施例１で作製した各種の組換えバキュロウイルスと、ヒト第Ｘ因子を発現させるための組換えバキュロウイルスとを感染させたカイコ幼虫におけるヒト第Ｘ因子の発現量を示す写真であり、図４Ｂは、発現させたヒト第Ｘ因子のγ−グルタミルカルボキシル化の程度を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の組換えバキュロウイルスは、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれており、鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞においてGGCXおよびNQO1を共発現させることができる。本発明の組換えバキュロウイルスは、鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞において、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を発現させる場合に好適に用いられる。すなわち、本発明の組換えバキュロウイルスと、所望のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスとを鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞に感染させることにより、該昆虫または培養細胞において、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を大量に発現させることができる。
【００１７】
本明細書において、ビタミンＫ依存性タンパク質とは、ビタミンＫの存在下でGGCXにより、所定のグルタミン酸残基をカルボキシル化されてGlaに変換されるタンパク質を意味する。そのようなタンパク質としては、例えば、ビタミンＫ依存性凝固因子、骨Glaタンパク質、マトリックスGlaタンパク質、増殖抑制特異的タンパク質６およびアカントフィナエFXa様タンパクなどが挙げられる。また、ビタミンＫ依存性凝固因子は、γ−グルタミルカルボキシル化されることによって活性化されるか、または活性化反応を受けられるようになる凝固因子であれば特に限定されず、例えば、プロトロンビン(第II因子)、第VII因子、第IX因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺなどが挙げられる。
【００１８】
本発明の実施形態において、GGCXをコードする遺伝子(以下、「GGCX遺伝子」ともいう)は、GGCXを有する所望の生物種に由来するGGCX遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくはヒトGGCX遺伝子であり、より好ましくは配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。なお、ヒトGGCX遺伝子の塩基配列自体は公知であり、例えば、米国国立医学図書館の国立生物情報センター(National Center for Biotechnology Information：NCBI)により提供されるデータベースには、アクセッションナンバーEU847509で登録されている。あるいは、GGCX遺伝子として、野生型GGCXと同等の生物活性を有する変異型GGCXをコードする遺伝子を用いることもできる。
【００１９】
本発明の実施形態において、NQO1をコードする遺伝子(以下、「NQO1遺伝子」ともいう)は、NQO1を有する所望の生物種に由来するNQO1遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくはヒトNQO1遺伝子であり、より好ましくは配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である。なお、ヒトNQO1遺伝子の塩基配列自体は公知であり、例えば、NCBIにより提供されるデータベースには、アクセッションナンバーAK312368で登録されている。あるいは、NQO1遺伝子として、野生型NQO1と同等の生物活性を有する変異型NQO1をコードする遺伝子を用いることもできる。
【００２０】
本発明の組換えバキュロウイルスのDNAにおけるGGCX遺伝子およびNQO1遺伝子の位置は、各遺伝子がコードする酵素が鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞において発現される限り特に限定されない。したがって、本発明の組換えバキュロウイルスのDNAにおいて、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子は連続して挿入されていてもよいし、互いに離れた位置に挿入されていてもよい。これらの遺伝子がバキュロウイルスDNAに連続して挿入されている場合は、GGCXおよびNQO1は融合タンパク質として発現されることとなる。なお、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子のうち、いずれを上流とするかは特に限定されない。他方、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子がバキュロウイルスDNAにおいて互いに離れた位置に挿入されている場合は、GGCXおよびNQO1はそれぞれ別個のタンパク質として発現されることとなる。本発明の実施形態においては、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子は、バキュロウイルスDNAにおいて互いに離れた位置に挿入されていることが好ましい。
【００２１】
本発明の実施形態において、バキュロウイルスの種類は、鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞に感染可能なウイルスであれば特に限定されないが、好ましくは核多角体病ウイルス(NPV)またはその改変ウイルスである。そのようなウイルスとしては、例えばBmNPV、HycuNPV、AnpeNPV、AcNPV、カイコガ科のカイコ(Bombyx mori)やヤガ科のオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)などの両宿主に感染する組換えバキュロウイルス(特開２００３−５２３７１号公報参照)などが挙げられる。好ましい実施形態においては、システインプロテアーゼ欠損(CPd)バキュロウイルスを用いる(特願平７-３０３４８８号参照)。
【００２２】
本発明の組換えバキュロウイルスは、当該技術において公知の方法により作製することができる。そのような方法としては、例えば、相同組換えにより所望の遺伝子をバキュロウイルスDNAに挿入可能なトランスファーベクターを用いる方法が挙げられる。この方法では、所望の遺伝子が組み込まれたトランスファーベクターと、制限酵素などにより直線化したバキュロウイルスDNAとを鱗翅目昆虫の培養細胞にコトランスフェクションし、感染細胞をスクリーニングすることにより、組換えバキュロウイルスを得ることができる。
【００２３】
本発明の実施形態において、トランスファーベクターは、鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞での遺伝子発現を可能にするプロモータを有し、該プロモータの下流に所望の遺伝子の挿入が可能なベクターDNAであれば特に限定されない。そのようなトランスファーベクター自体は当該技術において公知であり、例えばpM02、pM23、pCPM、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392などが挙げられる。なお、上記のプロモータは当該技術において公知のプロモータから適宜選択することができ、例えば、ポリへドリンプロモータ、p10プロモータ、カイコアクチンプロモータなどが挙げられる。
【００２４】
トランスファーベクターを用いて本発明の組換えバキュロウイルスを作製する場合、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子は同一のトランスファーベクターに組み込まれていてもよいし、それぞれ別個のトランスファーベクターに組み込まれていてもよい。GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子をそれぞれ別個のトランスファーベクターに組み込む場合、これら２種のトランスファーベクターは、バキュロウイルスDNA中の互いに異なる位置に各遺伝子を組み込むことができるベクターの組み合わせであることが好ましい。そのようなベクターの組み合わせとしては、例えば、バキュロウイルスDNAのポリへドリン遺伝子部位を所望の遺伝子に組換え可能なトランスファーベクターと、バキュロウイルスDNAのシステインプロテアーゼ遺伝子部位を所望の遺伝子に組換え可能なトランスファーベクターとの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
本発明の実施形態においては、必要に応じて、GGCXおよびNQO1にタンパク質分泌シグナル配列を融合させてもよい。すなわち、本発明の組換えバキュロウイルスにおいては、タンパク質分泌シグナル配列をコードする遺伝子をGGCX遺伝子およびNQO1遺伝子のそれぞれの上流または下流にさらに組み込んでいてもよい。そのようなタンパク質分泌シグナル配列は、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質の種類などに応じて、鱗翅目昆虫を利用する発現系において用いられる公知の配列から適宜選択することができる。例えば、プロトロンビン由来分泌シグナル配列(配列番号３)、カイコ由来30Kシグナル配列(配列番号４)およびカイコ由来SPシグナル配列(配列番号５)などが挙げられる。
【００２６】
本発明の実施形態においては、必要に応じて、GGCXおよびNQO1に機能性タグを融合させてもよい。すなわち、本発明の組換えバキュロウイルスにおいては、機能性タグをコードする遺伝子をGGCX遺伝子およびNQO1遺伝子のそれぞれの上流または下流にさらに組み込んでいてもよい。そのような機能性タグの種類としてはタンパク質精製用タグが特に好ましく、例えば、FLAGタグ、6×Hisタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の別の実施形態においては、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスに、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子がさらに組み込まれていてもよい。この場合、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子は、バキュロウイルスDNAにおいて、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子とは離れた位置に、発現可能に組み込まれていることが望ましい。すなわち、ビタミンＫ依存性タンパク質は、GGCXおよびNQO1とは別個のタンパク質として発現されることとなる。このような組換えバキュロウイルスによれば、該ウイルス単独で、鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞において、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を大量に発現させることが可能となる。
【００２８】
本発明の範囲には、上記の本発明の組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫または鱗翅目昆虫の培養細胞に感染させることにより得られる宿主細胞も含まれる。
【００２９】
本発明の実施形態において、鱗翅目昆虫は、組換えタンパク質の発現に適する公知の鱗翅目昆虫であれば特に限定されず、例えば、カイコ(Bombyx mori)、クワゴマダラヒトリ(Spilosoma imparilis)、サクサン(Antheraea pernyi)、スポドプテラ・フルギペルーダ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusiani)などが挙げられる。それらの中でもカイコが特に好ましい。なお、鱗翅目昆虫は、成虫、蛹および幼虫のいずれの形態であってよいが、セリンプロテアーゼの活性およびバキュロウイルスへの感受性の観点から、蛹または幼虫を用いることが好ましい。また、鱗翅目昆虫の培養細胞としては、組換え型タンパク質の発現に適する鱗翅目昆虫から樹立した細胞株であれば特に限定されず、例えばBmN、BmN4、SpIm、Anpe、Sf9、Sf21、High5などが挙げられる。
【００３０】
本発明の組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫またはこの鱗翅目昆虫の培養細胞に感染させる手段は特に限定されず、当該技術において公知の方法から適宜選択できる。例えば、鱗翅目昆虫に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を該昆虫に注射する方法などが挙げられる。また、培養細胞に感染させる場合は、組換えバキュロウイルスを含む液を培養培地に添加すればよい。鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞に組換えバキュロウイルスを感染させてから５〜８日間飼育または培養すると、宿主細胞において、組換えタンパク質が発現している。
【００３１】
本発明の実施形態においては、鱗翅目昆虫またはこの鱗翅目昆虫の培養細胞に、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを感染させた後、所望のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスをさらに感染させることもできる。
【００３２】
本発明の範囲には、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを含む、組換えビタミンＫ依存性タンパク質の製造用キット(以下、単に「キット」ともいう)も含まれる。なお、この組換えバキュロウイルスについては、本発明の組換えバキュロウイルスについて述べたことと同様である。
【００３３】
本発明の実施形態においては、組換えバキュロウイルスは、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子をさらに組み込まれていることが好ましい。すなわち、バキュロウイルスDNAにおいて、GGCX遺伝子、NQO1遺伝子およびビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子の３種が組み込まれている。この実施形態の組換えバキュロウイルスについては、本発明の組換えバキュロウイルスについて述べたことと同様である。
【００３４】
別の実施形態においては、本発明のキットは、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスをさらに含むことが好ましい。なお、このバキュロウイルスは、所望の遺伝子としてビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を用いていること以外は、本発明のバキュロウイルスと同様にして作製することができる。ここで、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを「第１バキュロウイルス」とも呼び、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルスを「第２バキュロウイルス」とも呼ぶ。この実施形態のキットにおいては、第１バキュロウイルスと第２バキュロウイルスとは別々の容器に保存されていてもよいし、両者を混合して１つの容器に保存されていてもよい。なお、第１バキュロウイルスと第２バキュロウイルスとを混合して保存する場合、両者の混合割合は特に限定されないが、好ましくはウイルス力価で１：１となるように混合する。
【００３５】
本発明の範囲には、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを用いて、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞に発現させる工程を含む、組換え型ビタミンＫ依存性タンパク質の製造方法も含まれる。(以下、単に「製造方法」ともいう)も含まれる。なお、この組換えバキュロウイルス、鱗翅目昆虫およびこの昆虫の培養細胞については、本発明の組換えバキュロウイルスについて述べたことと同様である。
【００３６】
本発明の実施形態においては、組換えバキュロウイルスは、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子をさらに組み込まれていることが好ましい。この実施形態の組換えバキュロウイルスについては、本発明の組換えバキュロウイルスについて述べたことと同様である。あるいは、GGCXをコードする遺伝子およびNQO1をコードする遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルス(第１バキュロウイルス)と共に、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれた組換えバキュロウイルス(第２バキュロウイルス)を用いることが好ましい。
【００３７】
本発明の製造方法においては、上記の組換えバキュロウイルスを鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞に感染させることによって、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を発現させることができる。なお、感染させる手段は、本発明の宿主細胞について述べたことと同様である。
【００３８】
本発明の製造方法において、第１バキュロウイルスおよび第２バキュロウイルスを用いる場合、鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞に同時に感染させてもよいし、一方の組換えバキュロウイルスを感染させた後に、他方の組換えバキュロウイルスを感染させてもよい。この場合、１回目の感染から１週間以内に２回目の感染を行うことが好ましい。なお、第１バキュロウイルスと第２バキュロウイルスとの使用量の割合は特に限定されないが、好ましくはウイルス力価で１：１となる量である。
【００３９】
通常、鱗翅目昆虫またはその昆虫の培養細胞に組換えバキュロウイルスを感染させてから５〜８日間飼育または培養することにより、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を発現させることができる。本発明の実施形態においては、目的タンパク質を発現させた鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞から、該タンパク質を取得する手段は特に限定されない。例えば、鱗翅目昆虫を用いた場合は、体液を採取するか、または該昆虫を破砕してホモジェネートを調製することで、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を取得することができる。また、培養細胞を用いた場合は、該細胞を物理的に破砕するか、または界面活性剤などの細胞溶解剤を含む溶液に溶解することで、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を取得することができる。
【００４０】
本発明の製造方法では、必要に応じて、上記の発現工程で得られた鱗翅目昆虫またはこの昆虫の培養細胞から、γ−グルタミルカルボキシル化されたビタミンＫ依存性タンパク質を含む可溶性画分を取得する工程をさらに含むことができる。可溶性画分は、上記のようにして得た鱗翅目昆虫の体液もしくはホモジェネート、または細胞破砕液もしくは細胞ライセートを濾過または遠心して、上清を分離することにより得ることができる。なお、遠心の際に、サンプルに任意に適当な緩衝液を添加してもよい。そのような緩衝液はタンパク質の保存に適するものであれば特に限定されず、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられる。
【００４１】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
実施例１：  組換えバキュロウイルスの作製および発現の検討
(１)GGCX、NQO1およびVKORのそれぞれをコードする遺伝子のサブクローニング
すでに報告されているヒトGGCX遺伝子の塩基配列(NCBI Acc. No. EU847509)、ヒトNQO1遺伝子の塩基配列(NCBI Acc. No. AK312368)およびヒトVKOR遺伝子の塩基配列(NCBI Acc. No. AY521634)に基づいて、各遺伝子をサブクローニングするためのプライマーセットを設計した。各プライマーの塩基配列を以下に示す。なお、各プライマーにはそれぞれ適切な制限酵素サイトの塩基配列が付加されている。
【００４３】
(i) GGCX遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- GGGGTACCATGGCGGTGTCTGCCGGGTCCGC -3'  (配列番号６)
Ｒ：5'- GCTCTAGAGAACTCTGAGTGGACAGGATCA -3'   (配列番号７)
(ii) NQO1遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- GAAGATCTATGGTCGGCAGAAGAGCACTGATCGTA -3'  (配列番号８)
Ｒ：5'- GCTCTAGATTTTCTAGCTTTGATCTGGTTGTCAGTT -3' (配列番号９)
(iii) VKOR遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- GGGGTACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT -3' (配列番号１０)
Ｒ：5'- GCTCTAGATCAGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG -3' (配列番号１１)
【００４４】
上記のプライマーセットを用いて、ヒト肝臓cDNAライブラリー(clontech社)を鋳型とするPCR法によってGGCX遺伝子、NQO1遺伝子およびVKOR遺伝子を単離した。単離した各遺伝子のDNA断片をQIAquick(QIAGEN社)を用いて精製し、制限酵素(GGCX：KpnIおよびXbaI、NQO1：XbaI、VKOR：KpnIおよびXbaI)で処理した。得られた各断片をpM23ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイトへ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをそれぞれpM-GGCX、pM-NQO1およびpM-VKORと呼ぶ。これらのプラスミドは、Polh部位組換え用トランスファープラスミドである。また、上記の制限酵素処理後の各DNA断片をpCPMベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイトにも組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをそれぞれpCPM-GGCX、pCPM-NQO1およびpCPM-VKORと呼ぶ。これらのプラスミドは、CP部位組換え用トランスファープラスミドである。
【００４５】
なお、上記のトランスファープラスミドはいずれも、導入遺伝子の下流にFLAGタグをコードする遺伝子が組み込まれているので、各トランスファープラスミドを用いて発現させたタンパク質のＣ末端にはFLAGタグが融合される。
【００４６】
(２)組換えバキュロウイルスの作製
(2-1)単独発現ウイルスの作製
GGCX、NQO1およびVKORのそれぞれを単独で発現させるための組換えバキュロウイルスを作製した。これらの組換えバキュロウイルスの作製は、Maedaらの方法(InverterbrateCell system and Applications, Vol.1, p.167-181,CRC Press, Boca Raton(1989))を改変して行った。具体的には次のとおりである。まず、上記のPolh部位組換え用トランスファープラスミドをPlasmid purification kit(QIAGEN社)によって精製した。そして、各トランスファープラスミド(0.5μg)と、直鎖化したCPdバキュロウイルス(ATCC VR2500)のDNA(0.2μg)とをリポフェクション試薬(X-tremeGENE 9 DNATransfection Reagent：ロシュ社)を用いて、BmN細胞(Maeda, 1989)にコトランスフェクトした。スクリーニングは96穴プレートを利用した限界希釈法により行い、感染兆候が確認されたウイルスを選抜し、培養上清を回収した。これにより、GGCX遺伝子、NQO1遺伝子およびVKOR遺伝子をそれぞれ組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。得られたウイルスをそれぞれGGCX単独発現ウイルス、NQO1単独発現ウイルスおよびVKOR単独発現ウイルスと呼ぶ。
【００４７】
(2-2)共発現ウイルスの作製
GGCXおよびNQO1、並びにGGCXおよびVKORのそれぞれの組み合わせを共発現させるための組換えバキュロウイルスを作製した。これらの組換えバキュロウイルスの作製は、上記(2-1)の方法を改変して行った。具体的には次のとおりである。上記のPolh部位組換え用トランスファープラスミドおよびCP部位組換え用トランスファープラスミドをPlasmid purification kit(QIAGEN社)によって精製した。そして、各Polh部位組換え用トランスファープラスミド(0.5μg)と、各CP部位組換え用トランスファープラスミド(0.5μg)と、5cut CPdバキュロウイルス(ATCC VR2500)のDNA(0.2μg)とをリポフェクション試薬(X-tremeGENE 9 DNATransfection Reagent：ロシュ社)を用いて、BmN細胞(Maeda, 1989)にコトランスフェクトした。スクリーニングは96穴プレートを利用した限界希釈法により行い、感染兆候が確認されたウイルスを選抜し、培養上清を回収した。これにより、GGCX遺伝子、NQO1遺伝子およびVKOR遺伝子をそれぞれ組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。得られたウイルスをそれぞれGGCX/NQO1共発現ウイルスおよびGGCX/VKOR共発現ウイルスと呼ぶ。
【００４８】
(３)BmN細胞におけるタグ融合プロトロンビンの発現の検討
上清の回収後、BmN細胞のライセートを調製した。得られたライセートについて、SDS-PAGEおよび抗FLAG抗体(和光純薬工業株式会社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図１に示す。図１より、BmNライセート中に、GGCX、NQO1およびVKORであると予測される分子量を有するタンパク質が発現していることを確認した。
【００４９】
実施例２：  カイコにおけるビタミンＫ依存性タンパク質の発現およびγ−グルタミルグルタミルカルボキシル化の検討
(１)第Ｘ因子およびプロトロンビンのそれぞれをコードする遺伝子のサブクローニング
データベースに公開されているヒト第Ｘ因子遺伝子(以下、hFX遺伝子ともいう)の塩基配列(NCBI Acc. No. BC_040125)およびヒトプロトロンビン遺伝子(以下、hPTH遺伝子ともいう)の塩基配列(NCBI Acc. No. NM_000506)に基づいて、各遺伝子をクローニングするためのプライマーセットを設計した。各プライマーの配列を以下に示す。なお、各プライマーにはそれぞれ適切な制限酵素サイトの塩基配列が付加されている。
【００５０】
(i) hFX遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- AAGGTACCCGGGGATCCATGGGGCGCCCACTG -3' (配列番号１２)
Ｒ：5'- AATCTAGATCACTTTAATGGAGAGGACGTTAT -3' (配列番号１３)
(ii) hPTH遺伝子用プライマーセット
Ｆ：5'- AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG -3'    (配列番号１４)
Ｒ：5'- AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT -3' (配列番号１５)
【００５１】
上記のプライマーセットを用いて、ヒト肝臓cDNAライブラリー(clontech社)を鋳型とするPCR法によってhFX遺伝子およびhPTH遺伝子を単離した。単離したDNA断片をQIAquick(QIAGEN社)を用いて精製し、制限酵素KpnIおよびXbaIで処理した後に、pM23ベクター(シスメックス株式会社)のマルチクローニングサイトへ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをそれぞれpM-FXおよびpM-PTHと呼ぶ。
【００５２】
(２)組換えバキュロウイルスの作製
第Ｘ因子およびプロトロンビンのそれぞれを単独で発現させるための組換えバキュロウイルスを作製した。これらの組換えバキュロウイルスの作製は、pM-FXおよびpM-PTHを用いて、上記実施例１の(2-1)と同様にして行った。これにより、第Ｘ因子遺伝子およびプロトロンビン遺伝子をそれぞれ組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。得られたウイルスをそれぞれFX単独発現ウイルスおよびPTH単独発現ウイルスと呼ぶ。
【００５３】
(３)ビタミンＫ依存性タンパク質の発現およびγ−グルタミルカルボキシル化
(3-1)ヒト第Ｘ因子
(i)ヒト第Ｘ因子の発現およびγ−グルタミルカルボキシル化の検討
FX単独発現ウイルスと、上記の実施例１で作製した各発現ウイルスとをウイルス力価で１：１の比率となるように混合し、これをカイコ幼虫(品種：近秋錦和。上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて幼虫まで人工飼育)に接種した。また、対照として、FX単独発現ウイルスのみをカイコ幼虫に接種した。ウイルス接種７日後に、感染幼虫より体液を抽出した。第Ｘ因子の発現量を確認するために、得られた体液の一部についてSDS-PAGEおよび抗Factor X抗体(Enzyme research Laboratories社)を用いたウエスタンブロットで解析した。また、γ−グルタミルカルボキシル化された第Ｘ因子を検出するために、得られた体液について抗Gla-domain抗体(積水メディカル株式会社)を用いて免疫沈降を行い、得られた沈降物についてSDS-PAGEおよび抗Factor X抗体(Enzyme research Laboratories社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図２に示す。なお、図２の各試験区におけるサンプルは、以下のとおりである。
【００５４】
試験区１：  GGCX/NQO1共発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区２：  GGCX/VKOR共発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区３：  GGCX単独発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区４：  NQO1単独発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区５：  VKOR単独発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルス
試験区６：  FX単独発現ウイルス
ＰＣ    ：  天然型ヒト第Ｘ因子(Haematologic Technologies社)
ＮＣ    ：  未感染カイコ幼虫体液
【００５５】
図２Ａより、試験区１〜６のいずれにおいてもバンドが確認されたことから、第Ｘ因子の発現量に大きな差異は見られないことがわかった。図２Ｂより、FX単独発現ウイルスとGGCX/NQO1共発現ウイルスとを感染させたサンプル(試験区１)では、他のサンプル(試験区２〜６)に比べて、顕著に高いシグナルが得られた。この結果より、カイコ幼虫において、GGCXおよびNQO1と、第Ｘ因子とを共発現させた場合に、γ−グルタミルカルボキシル化された第Ｘ因子を効率よく得られることが示唆された。
【００５６】
(ii)ヒト第Ｘ因子の発現量の検討
GGCX/NQO1共発現ウイルスおよびFX単独発現ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液に含まれるヒト第Ｘ因子の濃度を、human Factor X ELISA kit(Assaypro社)を用いたサンドイッチELISA法によって測定した。その結果、体液中には500μg/ml程度のヒト第Ｘ因子が含まれていることがわかった。カイコ幼虫１頭あたりの体液の回収量は0.4 ml程度であることから、カイコ幼虫１頭あたりの発現量は200μg程度であると予測される。
【００５７】
(3-2)ヒトプロトロンビンについて
PTH単独発現ウイルスと、GGCX/NQO1共発現ウイルスとをウイルス力価で１：１の比率となるように混合し、これをカイコ蛹(品種：近秋錦和。上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて蛹まで人工飼育)に接種した。また、対照として、PTH単独発現ウイルスのみをカイコ幼虫に接種した。ウイルス接種７日後に感染した蛹を回収し、これを−80℃で凍結した。凍結した蛹をブレンダーで破砕した。得られた破砕液中の蛹残渣を低速遠心処理およびろ過によって除去して、ホモジェネートを得た。プロトロンビンの発現量を確認するために、得られたホモジェネートの一部についてSDS-PAGEおよび抗トロンビン抗体(Novus社)を用いたウエスタンブロットで解析した。また、γ−グルタミルカルボキシル化されたプロトロンビンを検出するために、得られた体液について抗Gla-domain抗体(積水メディカル株式会社)を用いて免疫沈降を行い、得られた沈降物についてSDS-PAGEおよび抗トロンビン抗体(Novus社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図３に示す。なお、図３の各試験区におけるサンプルは、以下のとおりである。
【００５８】
試験区１：GGCX/NQO1共発現ウイルスおよびPTH単独発現ウイルス
試験区２：PTH単独発現ウイルス
ＰＣ    ：天然型ヒトプロトロンビン(ヒト血漿由来、Calbiochem社)
ＮＣ    ：未感染カイコホモジェネート
【００５９】
図３Ａより、試験区１および２のいずれにおいてもバンドが確認されたことから、プロトロンビンの発現量に大きな差異は見られないことがわかった。図３Ｂより、PTH単独発現ウイルスとGGCX/NQO1共発現ウイルスとを感染させたサンプル(試験区１)では、他のサンプル(試験区２)に比べて、顕著に高いシグナルが得られた。この結果より、カイコ蛹において、GGCXおよびNQO1と、プロトロンビンとを共発現させた場合に、γ−グルタミルカルボキシル化されたプロトロンビンを効率よく得られることが示唆された。
【００６０】
実施例３：  カイコにおけるビタミンＫ依存性タンパク質のγ−グルタミルカルボキシル化の条件の検討
上記の実施例２で作製したFX単独発現ウイルスと、上記の実施例１で作製した各発現ウイルスとを、ウイルス力価で下記の比率となるように混合し、これをカイコ幼虫(品種：近秋錦和。上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて幼虫まで人工飼育)に接種した(試験区１〜４)。また、対照として、FX単独発現ウイルスのみをカイコ幼虫に接種した(試験区５)。
【００６１】
ウイルス接種７日後に、感染幼虫より体液を抽出した。第Ｘ因子の発現量を確認するために、得られた体液の一部についてSDS-PAGEおよび抗Factor X抗体(Enzyme research Laboratories社)を用いたウエスタンブロットで解析した。また、γ−グルタミルカルボキシル化された第Ｘ因子を検出するために、得られた体液について抗Gla-domain抗体(積水メディカル株式会社)を用いて免疫沈降を行い、得られた沈降物についてSDS-PAGEおよび抗Factor X抗体(Enzyme research Laboratories社)を用いたウエスタンブロットで解析した。結果を図４に示す。図４の各試験区におけるサンプルは、以下のとおりである。
【００６２】
試験区１：  GGCX単独発現ウイルス：NQO1単独発現ウイルス：FX単独発現ウイルス＝１：１：１
試験区２：  GGCX単独発現ウイルス：VKOR単独発現ウイルス：FX単独発現ウイルス＝１：１：１
試験区３：  GGCX単独発現ウイルス：NQO1単独発現ウイルス：VKOR単独発現ウイルス：FX単独発現ウイルス＝１：１：１：１
試験区４：  GGCX/NQO1共発現ウイルス：FX単独発現ウイルス＝１：１
試験区５：  FX単独発現ウイルス
ＰＣ    ：  天然型ヒト第Ｘ因子(Haematologic Technologies社)
【００６３】
図４Ａより、試験区１〜５のいずれにおいてもバンドが確認されたことから、第Ｘ因子の発現量に大きな差異は見られないことがわかった。図４Ｂより、FX単独発現ウイルスとGGCX/NQO1共発現ウイルスとを感染させたサンプル(試験区１)では、他のサンプル(試験区１〜３および５)に比べて、顕著に高いシグナルが得られた。この結果より、カイコ幼虫において、γ−グルタミルカルボキシル化に関与する各因子(GGCX、NQO1およびVKOR)と、第Ｘ因子とをそれぞれ単独で発現させるバキュロウイルスを用いる発現系では、γ−グルタミルカルボキシル化された第Ｘ因子はほとんど得られないことがわかった。したがって、γ−グルタミルカルボキシル化された第Ｘ因子を効率よく得るためには、GGCX遺伝子およびNQO1遺伝子が同一のバキュロウイルスに組み込まれたGGCX/NQO1共発現ウイルスを用いる必要があることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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