(57)【要約】      （修正有）【課題】感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体およびそれを用いた診断キットの提供。【解決手段】感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体は、特定の配列からなるアミノ酸配列を有するプリオンタンパク質のペプチドと結合する。また、感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体は、βシート構造を有するプリオンタンパク質を識別することができる。プリオンタンパク質はβオリゴマーを生成する。【選択図】図１
2014125487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に記載のアミノ酸配列を有するプリオンタンパク質のペプチドと結合することを特徴とする感染型プリオンタンパク質を識別可能なモノクローナル抗体。
【請求項２】
βシート構造を有するプリオンタンパク質を識別可能であることを特徴とする請求項１に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能なモノクローナル抗体。
【請求項３】
βオリゴマーを生成するプリオンタンパク質を識別可能であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能なモノクローナル抗体。
【請求項４】
エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能なモノクローナル抗体。
【請求項５】
エピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能なモノクローナル抗体。
【請求項６】
βシート構造を有する組み換えプリオンタンパク質を生成するステップ（ａ）と、
ステップ（ａ）で得られた組み換えプリオンタンパク質をマウスに投与し、マウスの免疫応答により抗体を生成するステップ（ｂ）と、
抗体を分離および純化するステップ（ｃ）と、
を含むことを特徴とする感染型プリオンタンパク質を識別可能な抗体の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｂ）で得られた抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項６に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能な抗体の製造方法。
【請求項８】
前記組み換えプリオンタンパク質は、構造がαシートからβシートに変更し、βオリゴマー形成することを特徴とする請求項６に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能な抗体の製造方法。
【請求項９】
前記組み換えプリオンタンパク質は、Ｓｅｒ−１３２、Ａｓｎ−１８１、Ｃｙｓ１７９、および、Ｃｙｓ−２１４に対応する遺伝子の変異により得られることを特徴とする請求項６に記載の感染型プリオンタンパク質を識別可能な抗体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする感染型プリオンタンパク質に特異性を有する診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染型プリオンタンパク質（ｓｃｒａｐｉｅ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体に関し、詳しくは、プリオンタンパク質のＣ末端のβシート（β  ｓｈｅｅｔ）構造を有するペプチドと結合し、プリオン病の検査に適用することが可能なモノクローナル抗体、および、それを用いた診断キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プリオン病（ｐｒｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、または別名の伝達性海綿状脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、略称ＴＳＥ）は、脳組織に海綿状態が現れ、神経細胞が死亡し、星状細胞が増殖し、組織染色体に澱粉状の物質（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｌａｑｕｅ）が現れることが病理的特徴を有する。一方、臨床的特徴は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）のように、長期の潜伏期を経て病状が徐々に進行し、運動失調、痴呆などを引き起こす（非特許文献１、非特許文献２）ほかに、伝染性を持つことである。深刻な場合、動物に関わるスクレイピー（Ｓｃｒａｐｉｅ）および狂牛病（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ、略称ＢＳＥ）と、人間に関わるクロイツフェルト・ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ，  略称ＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（Ｇｅｒｓｔｍ・ｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ、略称ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（Ｆａｔａｌ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｉｎｓｏｍｎｉａ、略称ＦＦＩ）とが発症する。人間に関わるプリオン病の場合、ＧＳＳ、ＦＦＩおよびｆＣＪＤは、遺伝性であり、Ｋｕｒｕ、ｉＣＪＤおよびｖＣＪＤは後天性であり、ｓＣＪＤは未知である。それに対し、動物の場合、同類の死体を食べる習慣があれば、伝達性ミンク脳症（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｍｉｎｋ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）が発症する。スクレイピー（Ｓｃｒａｐｉｅ）に感染した羊由来の肉骨粉を牛の飼料に混入すれば狂牛病（ＢＳＥ）が牛に発症する。
【０００３】
イギリスでは、１９８６年に大量の牛を死亡させる前代未聞の疾病が出現した。後から検査した結果により、狂牛病が判明した（非特許文献３）。狂牛病は、イギリスの続き、ほかの国にも広がって大規模感染を発生させた。現今の研究結果により、ＢＳＥの原因は、牛用飼料に添加する肉骨粉がスクレイピー病原を大量含有したことに関係がある。つまり、ＢＳＥは、動物種別の差異に問われず、別の動物種に発症する疾病を誘発する可能性があることが考えられる。それに対し、１９２０年代初期に人間に発症したクロイツフェルト・ヤコブ病は、非常に珍しい疾病と診断され、発症率が百万人に０．５から１人であった。この疾病の病理および症状は狂牛病に似ていた。
【０００４】
過去数年にわたって各国は、ＢＳＥが極めて深刻な問題と確信できるようになった。現今の病原鑑定法は死後摘出した脳組織を標本源として使用することが一般的であり、感染症状がひどかった牛から脳組織を摘出し、乳剤を製作し、続いてマウスを人工接種により感染させ、ＢＳＥ病原の伝染性を検証する。しかしながら、伝染性があるか否かを検証するには、接種から１５０日間あまりの感染期を経ることが必要である。一方、ＷＨＯおよびＯＩＥに承認された診断法は死後の臨床疾患、症状および顕微鏡的病理変化を検査し、免疫組織化学染色およびウェスタンブロット法を行うことをプリオン病の診断根拠とする（非特許文献４、非特許文献５）。一般的なＢＳＥ検査法は、次の通りである。
【０００５】
１、ウェスタンブロット法は、プロテアーゼＫによってＰｒＰＳｃを加水分解し、２７から３０ｋＤａ（ＰｒＰres）の信号を生じ、脳組織ホモジネートとプロテアーゼＫを反応させ、続いて  （ＤＹＥＤＲＹＹＲＥエピトープに対して反応する）  モノクローナル抗体６Ｈ４によって検査することであるため、ＰｒＰCフラグメントの全長が加水分解されず、ＰｒＰ２７−３０信号に干渉するという現象が発生する酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）と比べて、検査上のミスが少ないだけでなく、新たなＰｒＰScの種（ｓｔｒａｉｎ）を発現することができる。
【０００６】
２、  ＣＥＡ／ＢｉｏＲａｄ検査方法は、脳組織の活性を除去し（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、濃縮するステップを行った後、二種類のモノクローナル抗体によってサンドイッチ型酵素免疫測定を行う。別の方法に対し、この方法は検出感度が高く、０．５−２．０  ｐｍｏｌに達するが、脳組織液を純化し、濃縮するには相当な時間および人の手を費やすことが必要であるだけでなく、完全に加水分解されなかったＰｒＰCフラグメントの妨害を受けるという問題を抱える。
【０００７】
３、構造依存性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）免疫システムは、本来および変性後のＰｒＰに対する抗体の鎖結合能と変異後のＰｒＰに対する抗体の鎖結合能とが異なることに基づいたサンドイッチ型酵素免疫分析法である。抗体はタンパク質分解酵素に頼ることなく、変性後のＰｒＰScに現れた構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を識別できるため、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋを反応させるＰｒＰＳｃ  ｓｔｒａｉｎを検出できるが、別の迅速な検査方法と比べて処理ステップが多いことはその欠点である。
【０００８】
上述した方式は、潜在的な問題を抱え、かつ検査限界が高過ぎる（それに対し検査限界が最も低い検査方法はＣＥＡ／ＢｉｏＲａｄ検査方法である。）ため、多くの牛を検査する際、ＰｒＰＳｃ潛伏期間中でも臨床症状が何も現れなければ、化学検査結果は偽陽性（Ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）である。一方、人間にもこのような状態が発生する。生存しているＣＪＤ患者に対する発症前検査（ｐｒｅ−ｓｙｍｐｔｏｍ）の研究が進んでいる最中では、状態が不明確なままｖＣＪＤ患者に手術、臓器移植、輸血などの医療行為を行う際、高温および殺菌剤に耐えるＰｒＰScを一旦手術器具に付着させれば、完全に除去できないだけでなく、感染が広がってｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ  ＣＪＤを発症させるような問題がある。一方、ＰｒＰScの特性により、標本を摘出した後、タンパク質分解酵素処理を行わなければならないため、もともとの存在量が少ないＰｒＰScを流失させ、検査限界に至らず、偽陽性反応を呈するという問題が発生する。上述した問題に対し、タンパク質分解酵素処理を行う必要なく、臨床病状の発症前に生体状態を維持したうえで摘出した標本からＰｒＰScを特異的に識別し、検査限界を向上させることができる検査方法を探ることが必要である。
【０００９】
プリオン病研究は、ＰｒＰSc構造を特異的に結合させる抗体の発展に重点が据えられる。プリオンタンパク質の特徴は病毒、細菌など感染性物質のように激しい免疫反応を引き起こすことがない。ＰｒＰタンパク質が正常に出現する動物（Ｐｒｎｐ+/+）にプリオン病が発症する過程において、正常なＢ細胞、Ｔ細胞の表面にＰｒＰCが広く分布し、ＰｒＰScの初期構造がＰｒＰCに似ているため、Ｂ細胞は免疫寛容性を持ち、免疫反応が起こらない（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
【００１０】
しかしながら、ここ数年にわたって様々な策略を弄しても、ＰｒＰScを識別できる特異性の高い抗体を発展させることができなかった。抗体は、牛、マウス、人間に沈殿したＰｒＰCに免疫を生じるが、実際に応用される際、プリオンタンパク質に対する結合能力が弱いため、臨床診断を実現させることができない（非特許文献９）。従って、改めて全長フラグメント（Ｎ端除外）の免疫原を採用する策略を修正し、βシートが主体となる組み換えタンパク質を製作し、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）残基を増加し、異なる動物種のｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ序列に基づいて合成ペプチドフラグメント（非特許文献１０）を設計し、スクレイピー関連繊維（ｓｃｒａｐｉｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｒｉｂｒｉｌ、略称ＳＡＦ）を使用すること（非特許文献１１）によってＰｒＰScを識別可能な抗体を発現する。しかしながら、実験結果により、ＰｒＰCは、依然として識別されたことが判明した。これまで発現された多くの抗ＰｒＰ抗体は各種タイプのＰｒＰを識別できるが、本来の状態を呈するＰｒＰScを識別する際、微弱な信号しか現れない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌｕｄｌａｍ，  Ｃ．Ａ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：１２８９−１２９０，  １９９８。
【非特許文献２】Ｓｏｔｏ，  Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：８０９−８１９，  ２００４。
【非特許文献３】Ｗｅｌｌｓ，  Ｇ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｒｅｃｏｒｄ  １２１：４１９−４２０，  １９８７。
【非特許文献４】Ｈａｒｄｔ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １２２：４３−５３，  ２０００。
【非特許文献５】Ｉｎｇｒｏｓｓｏ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，  ２７３−２８０，  ２００２。
【非特許文献６】Ｂｕｅｌｅｒ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ７３，  １３３９−１３４７，  １９９３。
【非特許文献７】Ｋａｓｃｓａｋ，  Ｒ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：３６８８，  １９８７。
【非特許文献８】Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，  Ｓ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６７：６０２−６１３，  １９９３。
【非特許文献９】Ｋｏｒｔｈ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：７４，  １９９９。
【非特許文献１０】Ｐａｒａｍｉｔｈｉｏｔｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３。
【非特許文献１１】Ｍｏｒｅｌ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９：３０１４３−３０１４９，  ２００４。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【００１３】
また、本発明は、感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体を含む感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）に特異性を有する診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明による感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に記載されているアミノ酸配列を有するプリオンタンパク質のペプチドと結合する。
【００１５】
また、感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体は、βシート構造を有するプリオンタンパク質を識別することができる。プリオンタンパク質はβオリゴマーを生成する。
【００１６】
また、感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に記載されているプリオンタンパク質ペプチドと結合する。感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に記載のプリオンタンパク質ペプチドと結合する。
【００１７】
本発明による感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）を識別可能なモノクローナル抗体の製造方法は、βシート構造を有する組み換えプリオンタンパク質を生成するステップ（ａ）と、ステップ（ａ）で得られた組み換えプリオンタンパク質をマウスに投与し、マウスの免疫応答により抗体を生成するステップ（ｂ）と、抗体を分離および純化するステップ（ｃ）と、を含む。抗体はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体である。
組み換えプリオンタンパク質は、構造がαシートからβシートに変更し、βオリゴマー形成する。
前記組み換えプリオンタンパク質は、Ｓｅｒ−１３２、Ａｓｎ−１８１、Ｃｙｓ１７９、および、Ｃｙｓ−２１４に対応する遺伝子の変異により得られる。
【００１８】
これにより、上述の抗体を含む診断キットを用いて、プリオン病を検査することができる。検査方法は、脳の組織標本を作るステップと、本発明により掲示されるモノクローナル抗体によって免疫分析を行い、感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）が標本に存在するか否かを検査するステップとを含む。脳の組織標本は脳組織ホモジネートである。脳の組織標本は脳組織切片である。
【００１９】
感染型プリオンタンパク質（ＰｒＰSc）は、βシート構造を有するプリオンタンパク質である。感染型プリオンタンパク質はβオリゴマーを生成する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＥＬＩＳＡ分析（Ａ）およびＳｔｒｉｐ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析（Ｂ）に基づいて、Ａ２、Ａ３、３Ｂと腫瘍細胞とを結合させたＨＡＴ培地から選び出した抗体の分泌状態を確認した結果を示す特性図である。
【図２】抗−ｍβＰｒＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＡ２、Ａ３、３Ｂのアイソフォーム抗体とを比較した結果を示す特性図である。
【図３】モノクローナル抗体Ａ、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ、３Ｂによって量が異なるｍｏｕｓｅ  βＰｒＰおよび組み換え型ｂｏｖｉｎｅ  ＰｒＰを識別する差異を、ｄｏｔ  ｐｌｏｔ方式で比較した結果を示す特性図である。
【図４】Ａ２（Ａ）、Ａ３（Ｂ）、３Ｂ（Ｃ）によってｍｏｕｓｅ  βＰｒＰおよびαＰｒＰを識別する差異を、ＥＬＩＳＡ方法で比較した結果を示す特性図である。
【図５】ペプチドスキャン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃａｎ）によってモノクローナル抗体のエピトープ配列を分析した結果を示す特性図である。Ａ−Ｃは、９３から２３０のｍｏｕｓｅ  ＰｒＰ配列を２２段に分割し、９６穴を有する免疫酵素分析トレーにペプチドフラグメントを付着させて、ＥＬＩＳＡ分析を行う結果である。Ｄは、ペプチドスキャンによって得たエピトープ配列と抗体との対照である。
【図６】ｍＡｂ  即ちＡ２、Ａ３、３Ｂによってそれぞれ正常なマウスの脳組織ホモジネートおよび感染したマウスの脳組織ホモジネートを識別する差異を、ウェスタンブロット法で分析した結果を示す特性図である。（＋）は５０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫの処理を受けたことを示す。（−）は５０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫの処理を受けていないことを示す。標本は、正常なマウスの脳組織ホモジネートＮＢＨ（ｌａｎｅ  ３，  ４，  ７，  ８，  １１，  １２，  １４，  １５）および感染型ＰｒＰSc（１０％  ２２Ｌ  ）  を含有したマウスの脳組織ホモジネート（ｌａｎｅ  １，  ２，  ５，  ６，  ９，  １０，１３）である。
【図７】実験室で作った三つのＰｒＰを識別可能なモノクローナル抗体Ａ、Ａ２、Ａ３、３Ｂにより、２２Ｌ  ＰｒＰScに感染して病変したマウスの脳組織切片および正常なマウスの脳組織切片（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に免疫組織化学的染色を行い、検査した結果を示す特性図である。写真に示した部位は小脳である。免疫前（Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）実験組はＢＡＬＢ／ｃマウス免疫前血清を陰性対照組（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として採用する。左側に示したのは、使用した抗体、即ち免疫前、Ａ２、３Ｂ、Ａ３である。下側に示したのは、顕微鏡の拡大倍数である。前の二列は、感染したマウスの脳組織切片である。第三列は、正常なマウスの脳組織切片である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の特徴および長所を実施形態に基づいて詳細に説明する。実施形態は説明に用いるため、本発明の請求範囲を限定することができない。
【００２２】
なお、本発明により提示された実施形態において、以下の実験器具、装置、方法およびそれに関連する結果と、内容を明確にするために提示された標題または補助標題とは本発明の請求範囲を限定するものではない。
【００２３】
（一実施形態）
（モノクローナル抗体の製造）
まずマウス・プリオンタンパク質上のＳｅｒ−１３２、Ａｓｎ−１８１、Ｃｙｓ１７９、Ｃｙｓ−２１４四つの位置に変異を導入する。続いて電子スピン共鳴（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略称ＥＰＲ）、Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍによって分析を行う。分析結果により、組み換えマウス・プリオンタンパク質は低塩ｐＨ＝７かつ常温下で主体がαからβシートに自動的に変わり、かつβオリゴマーを自動的に合成することが判明した。続いて、作った構造が自発的変化するマウスｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ即ちｍｏｕｓｅ  βＰｒＰ  （構造がＰｒＰScに近いと認められる）をマウスの免疫原として独特のモノクローナル抗体を作る。
【００２４】
続いて、大腸菌によって発現された、βシートが構造上の主体となる５０μｇの組み換えマウス・プリオンタンパク質（ｍｏｕｓｅ  βＰｒＰ、略称ｍβＰｒＰ）に１Ｘ  ＰＢＳを加え、体積を２５０μｌまで増大させ、そして２５０μｌの完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を加え、それらを注射筒内に混ぜ合わせ、そののちＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射を行い、抗原を導入する。続いて、２週間後ＢＡＬＢ／ｃマウスに追加注射を行う。まず５０μｇのｍβＰｒＰに１Ｘ  ＰＢＳを加え、体積を２５０μｌまで増大させ、そして２５０μｌの不完全フロイントアジュバント（ＩｎＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｔｅ）を加え、それらを注射筒内に混ぜ合わせ、そののちＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射を行い、抗原を導入する。続いて追加注射を行うごとに一週間後採血および血清分離を行い、酵素免疫分析を進める。５回の追加注射が完了した後、採血した血から分離した血清に酵素免疫分析を行うことによってマウスを決め、続いて細胞結合を行う。
【００２５】
組み換えｍβＰｒＰを注射した後、特定の抗体は脾臓内のＢ細胞に発現する。特定の抗体とがん細胞とを結合させることによって体外培養できる細胞株を生成する。細胞株は特定の抗体を有する。本実験はまず抗原に対して免疫になるマウス（ＢＡＢＬ／ｃ  ｍｉｃｅ）の脾臓と骨髄腫細胞株ＮＳ−１とを結合させる。続いてＨＡＴ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍに細胞を培養するステップを進める。まず９０個の穴を有する培養トレーを六つ用意する。六つの培養トレーに細胞を移し、７から１４日間培養し、細胞成長状態を観察する。続いて、三つの制限的な希釈法（細胞を急速に希釈する方法、細胞を緩慢に希釈する方法および細胞計数法）に基づいて単一の親細胞からなるモノクローナル抗体を生成し、酵素免疫分析法およびウェスタンブロット法に基づいて特異性を確認する。確認結果により、三つの抗ｍβＰｒＰモノクローナル抗体を有する細胞株Ａ２、Ａ３、３Ｂを選び出す（図１参照）。
【００２６】
続いて、モノクローナル抗体を有する細胞株をマウスの腹腔内に注入し、成長させ、腹水から高濃度のモノクローナル抗体を得るステップを進める。モノクローナル抗体の細胞培養液において、ＨＡＴ培地はマウスに毒性反応を引き起こす。マウスの体内から高濃度のモノクローナル抗体を得るために、モノクローナル抗体を有する細胞株を選び出した後、マウスの体内に注入する前にそれらを一般のＲＰＭＩ培地に移さなければならない。続いて、腹水の中のモノクローナル抗体を純化するステップを進める。０．５ｍｌのｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｐｌｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｇｒｏｓｅを試験管柱に入れ、そののち１ｍｌの１ＸＰＢＳでａｇｒｏｓｅを洗浄し、続いて１ＸＰＢＳと同量で混合して合わせて６ｍｌとなる腹水を試験管柱に加え、試験管柱内に３から５回循環させ、そののち５ｍｌの１ＸＰＢＳでａｇｒｏｓｅを洗浄する。続いて１０ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＡＣ  （ｐＨ＝３）  ＋  ０．０１％アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）を試験管柱に加え、抗体を純化し、３から５回繰り返し、そののち２．５  ｍｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ  ＋  ０．０１％アジ化ナトリウムを、純化を一回繰り返して得た抗体に加え、ｐＨバランスを取る。続いて５ｍｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ＝３）  ＋  ０．０１％アジ化ナトリウムを試験管柱に加え、抗体を純化し、３から５回繰り返し、そののち１．２５  ｍｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ  ＋  ０．０１％アジ化ナトリウムを、純化を二回繰り返して得た抗体に加え、ｐＨバランスを取る。続いて二回別々取った抗体を遠心濃縮チューブに混合させ、遠心濃縮チューブによって１ｍｌ以下に濃縮し、定量し、そののち、試験管に１００μｇずつの量（ファージ発現技術に用いる）を入れ、残りを−２０℃／−８０℃で保管する。
【００２７】
（抗ｍβＰｒＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ２、Ａ３、３Ｂのアイソフォームの鑑定）
まず９６個の穴を有する免疫酵素分析トレーに２．５μｇ／ｍｌの免疫グロブリンを付着させる。続いて、一つは培養中に腫瘍細胞と結合したＡ２、Ａ３、３Ｂ培養液の上澄み液を使用する。一つは異なる免疫グロブリン（ＨＲＰと結合して重鎖のＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を識別する抗体およびＨＲＰと結合して軽鎖のκ鎖およびλ鎖を識別する抗体）を使用する。続いて４９０波長を読み取ることによってモノクローナル抗体の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を発現する。結果により、本発明により作られた三つの抗ｍβＰｒＰモノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂの免疫グロブリンは重鎖がＩｇＭ、軽鎖がκ鎖であることが判明した。（図２参照）
モノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂによって量が異なるｍβＰｒＰおよび組み換え型ウシＰｒＰを識別する差異を、ｄｏｔ  ｐｌｏｔ方式で比較する。
【００２８】
本来（ｎａｔｉｖｅ）の構造を維持したうえで異なる立体構造で存在する同じ動物種のＰｒＰをドットブロット（Ｄｏｔ  ｂｌｏｔ）法に基づいて分析する。ｍαＰｒＰはモノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）で存在する。ｍβＰｒＰはオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）で存在する。５μｇ、１μｇ、０．５μｇ、０．１μｇのｍβＰｒＰおよびｍαＰｒＰをＰＶＤＦ膜に点状に分布させ、そののち５％の牛乳を加え（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）、異なる倍率で希釈したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ２、Ａ３、３Ｂを反応させ、一級抗体を生成し、そしてマウスの免疫前血清を負対照組として反応を進行させる。結果は図３に示したとおりである。
【００２９】
図３Ａに示すように、モノクローナル抗体Ａ２の濃度が１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間である場合、ｍβＰｒＰを識別する限界が比較的よいだけでなく、０．１μｇのタンパク質を検出することができる。５μｇのｍαＰｒＰを測定する際、１μｇのタンパク質を検出することができる。一方、濃度が１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ａ２は１０μｇのｍαＰｒＰに反応し、微弱な信号を生じるが、ｍβＰｒＰには反応しない。図３Ｂに示すように、モノクローナル抗体Ａ３の濃度が１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間である場合、ｍβＰｒＰを識別する信号はｍαＰｒＰを識別する信号より比較的よく、特に星マークで示したところがさらに著しい。一方、抗体の濃度が１μｇ／ｍｌである場合、上述した二つのタンパク質を識別する差はあまりない。図３Ｃに示すように、モノクローナル抗体３Ｂの濃度が１μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌの間である場合、５μｇのｍβＰｒＰを識別する状態がｍαＰｒＰを識別する状態より良好である。モノクローナル抗体３Ｂの濃度が５０μｇ／ｍｌである場合、０．１μｇのｍβＰｒＰを識別する状態がｍαＰｒＰを識別する状態より良好である。それ以外の違いはあまりない。上述した内容をまとめてみると、三つのモノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３ＢはｍαＰｒＰまたはｍβＰｒＰを識別でき、特に濃度が１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間である場合、ｍαＰｒＰより、ｍβＰｒＰに対する検査限界が比較的よい。
【００３０】
モノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３ＢによってｍβＰｒＰおよびαＰｒＰを識別する差異を、ＥＬＩＳＡ方法によって分析する、即ちＥＬＩＳＡ分析を進める。まず、それぞれのモノクローナル抗体の異なるタンパク質を識別する状態を数値化して表現する。続いて２００ｎｇ／ｗｅｌｌのマウスのｍβＰｒＰおよびαＰｒＰを免疫酵素分析トレーの穴に別々に付着させ、続いて、異なる倍率で希釈したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａ２、Ａ３、３Ｂを第一抗体、抗マウスのＩｇＭ  （１：４０００）抗体を第二抗体にして反応を進行させる。続いてＯＰＤによって着色を行う。結果により、モノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂは濃度が１μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌの間である際、ｍβＰｒＰに対する識別能力がｍαＰｒＰに対する識別能力より高い（図４参照）。組み換えタンパク質を識別した結果は図１に示した結果を含み、タンパク質が本来の状態（ｎａｔｉｖｅ）を維持した上で存在することを表示する。一方、本発明によるモノクローナル抗体は別の動物種（ウシ）由来のＰｒＰを識別でき、かつモノマーおよびオリゴマーに対する親和性が異なる。
【００３１】
（モノクローナル抗体のエピトープ配列の分析）
（ペプチドスキャン（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃａｎ）による分析）
９３から２３０のｍＰｒＰ配列を２２段に分割する。一つの段は１２個のアミノ酸から組成され、かつ六つのアミノ酸リピートを有する。９６個の穴を有する免疫酵素分析トレーにこれらのペプチドフラグメントを付着させ、ＥＬＩＳＡ分析を進める。一つは純化されたモノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂを使用し、かつＨＲＰと結合する抗マウスＩｇＭポリクローナル抗体を二次抗体として使用する。
【００３２】
・図５に示すように、ペプチドスキャン結果により、モノクローナル抗体Ａ３のペプチドのエピトープは１４１−１５２  ＧＮＤＷＥＤＲＹＹＲＥＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ２）であるのに対し、モノクローナル抗体Ａ２、３Ｂのペプチドのエピトープは同じ位置１７１−１８２  ＱＮＮＦＶＨＤＡＶＣＩＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ３）であることが判明した。
【００３３】
（ファージ発現技術）
四回繰り返して選び出したファージ群落を任意に選び、そのＤＮＡを抽出し、配列整理を行う。配列を整理した結果は下記の通りである。配列の後の括弧は即ち（発現の回数／選び出した全部の配列数）を示す。太字は交差試験に出現した配列である。表の一番下の欄は統合できる配列である。下線は比較後出現した配列である。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
【表２】
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【００３６】
【表３】
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【００３７】
上述した結果により、モノクローナル抗体Ａ２は５種のファージ配列が出現し、交差試験に繰り返して出現したマウスＰｒＰに対応する配列が１６３−ＲＰＶＤＱＹＳＮＱＮＮＦＶＨＤＡＶＣＩＴ−１８２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ４）である。モノクローナル抗体Ａ３は５種の配列が出現するが、対応する配列が見付からない。モノクローナル抗体３Ｂは５種の配列から統合され、Ｎ端位置に近い２３−ＭＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＳＲＹＰＧＱＧＳＰ−４５  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ５）の三つの抗体のエピトープが見付かった。
【００３８】
上述により、モノクローナル抗体Ａ３のエピトープはＧＮＤＷＥＤＲＹＹＲＥＮ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ２）である。モノクローナル抗体Ａ２、３Ｂのエピトープは同じ位置１７１−１８２  ＱＮＮＦＶＨＤＡＶＣＩＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．  ３）である。三種のモノクローナル抗体のエピトープは異なる動物種のアミノ酸配列に対し、高度保留性を有する。
【００３９】
（正常なマウスの脳組織および感染したマウスの脳組織の抗ＰｒＰScモノクローナル抗体による識別）
（ウェスタンブロット法に基づいた分析）
本実験は正常なマウスの脳組織ホモジネートおよび感染したマウスの脳組織ホモジネートをモノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂによって識別する差異を、ウェスタンブロット法に基づいて分析する。標本は、正常なマウスの脳組織ホモジネートＮＢＨ  （ｌａｎｅ  ３，  ４，  ７，  ８，  １１，  １２，  １４，  １５）および感染型ＰｒＰSc（１０％  ２２Ｌ  ）  を含有したマウスの脳組織ホモジネート（ｌａｎｅ  １，  ２，  ５，  ６，  ９，  １０，１３）である。標本において、５０μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ処理を３７℃で１時間行うステップを受ければ（＋）で表示し、受けなければ（−）で表示する。続いて５ｍＭのＰＭＳＦを加え、処理を１０分間行い、そののち反応を中止させる。続いて反応が起こったサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＰＶＤＦ膜に点状に分布させ、一級抗体即ちモノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂ、ＳＡＦ３２と、二級抗体即ちＨＲＰと結合する抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ抗体（１：１００００）とを反応させ、続いてＥＣＬによって着色処理を行う。
【００４０】
ウェスタンブロット法に基づいて分析した結果により、プロテアーゼＫ処理を受けなかった本発明によるモノクローナル抗体はＰｒＰScを識別でき、それぞれのグリコシル化を識別するパターンが異なり、識別信号の強さが正常なマウスの脳組織に対する識別信号より大きい（図６参照）。上述した結果により、本発明によるモノクローナル抗体は、タンパク質分解酵素処理を行う必要なく、臨床病状の発症前に生体状態を維持したうえで摘出した標本から直接ＰｒＰScを特異的に識別する診断法および診断キットに適用できるため、標本処理および検出にかかる手間を効果的に省くことができることが判明した。
【００４１】
（免疫組織化学的染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））
本発明により作られた三つのＰｒＰを識別できるモノクローナル抗体Ａ２、Ａ３、３Ｂにより、２２Ｌ  ＰｒＰScに感染して病変したマウスの脳組織切片および正常なマウスの脳組織切片（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）に免疫組織化学的染色を行い、マウスの脳組織に出現したＰｒＰScの状態を検査する。まず正常なマウスの脳組織（ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）および感染したマウスの脳組織を染色し、そののち顕微鏡（１００倍および２００倍）で小脳を観察し、写真を取ると同時に、マウスの免疫前（Ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）血清からなる陰性対照組（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較する。結果は図７に示した通りである。
【００４２】
切片を免疫組織化学的に染色した結果により、染色されたモノクローナル抗体Ａ２は小脳皮質の顆粒層および分子層の神経細胞の近くに分布する斑点状（ｐｌａｑｕｅ）信号を呈示する。染色されたモノクローナル抗体３Ｂは小脳の顆粒層および分子層に斑点状に分布する信号を呈示する。それに対し、モノクローナル抗体Ａ３の免疫組織化学的染色によって呈示された信号は小脳白質（ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ）に拡散（ｄｉｆｆｕｓｅ）する。一方、染色された正常なマウスの脳組織にはこれらの抗体が明確な信号を呈示しない。
【００４３】
本発明によるモノクローナル抗体のエピトープは異なる動物種に対し、高度保留性を有するため、異なる動物種の感染型プリオンタンパク質の検出およびプリオン病の検査に適用することができる。プリオン病は動物に発症する狂牛病（ＢＳＥ）およびスクレイピー（Ｓｃｒａｐｉｅ）と、人間に発症するタイプが異なるクロイツフェルト・ヤコブ病ＣＪＤ（散発性（ｓｐｏｒａｄｉｃ）ＣＪＤ、変異型（ｖａｒｉａｎｔ）ＣＪＤ、医原性（ａｔｒｏｇｅｎｉｃ）ＣＪＤ、遺伝性（ｆａｍｉｌｉａｌ）ＣＪＤなど）とを含む。一方、本発明によるモノクローナル抗体はＰｒＰScに対する臨床検査、例えば組織切片上の抗体染色およびＣａｐｔｕｒｅ  ＥＩＡ法による血液検査、脳脊髄液検体に適用できるほかに、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、略称ＳＰＲ）技法に合わせることによって検査限界および感度を向上させることができる。
【００４４】
（ほかの実施形態）
本説明により提示されたあらゆる特徴は任意の方法によって組み合わせることができる。本発明により提示された特徴は目的が同じ特徴または目的に似ている特徴に取り替えられてもよい。したがって、特別に明確に表示しない限り、本発明により提示された特徴は系列が同等な実施形態または類似した実施形態である。
【００４５】
この技術を熟知している人ならば、上述した説明により本発明の基本特徴を容易に理解できる。発明の趣旨を逸脱しない範囲において変更、修正および別の用途に適用する状況は本発明の請求範囲に属すべきである。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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