(57)【要約】【課題】効率的に生産でき、かつ安全性の高い、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生低下の優れた抑制剤、およびそれを含む外用剤および化粧料を提供することにある。【解決手段】本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、燕窩の酵素分解物を有効成分とする、真皮線維芽細胞における紫外線照射によるコラーゲン産生低下の抑制剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
燕窩の酵素分解物を有効成分とする、真皮線維芽細胞における紫外線照射によるコラーゲン産生低下の抑制剤。
【請求項２】
酵素分解物がプロテアーゼによる分解物である、請求項１に記載のコラーゲン産生低下抑制剤。
【請求項３】
酵素分解物の分子量が、７０〜２００，０００である、請求項１または２に記載のコラーゲン産生低下抑制剤。
【請求項４】
酵素分解物の平均分子量が、１，０００〜５０，０００である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン産生低下抑制剤。
【請求項５】
紫外線照射により皮膚真皮繊維芽細胞において生ずるＩ型コラーゲン産生低下を抑制するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコラーゲン産生低下抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のコラーゲン産生低下抑制剤を含んでなる、皮膚外用組成物。
【請求項７】
紫外線照射を受ける前または後におけるスキンケアに用いられる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
紫外線照射を受けた皮膚において生ずる、肌の張りおよびツヤの低下、およびシワの予防もしくは改善に用いられる、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
化粧料である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、燕窩の酵素分解物を有効成分とする真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生低下の抑制剤に関する。詳しくは本発明は、紫外線照射により皮膚真皮繊維芽細胞において生ずるＩ型コラーゲン産生低下を抑制する、コラーゲン産生低下抑制剤に関する。さらに本発明は、その有効成分である燕窩の酵素分解物を含む、皮膚外用組成物および化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌荒れやしわ、肌のたるみ、張りの低下等の肌のトラブルは、特に女性にとって重大な関心事である。これらの肌のトラブルは、通常、環境的な要因や、老化といった加齢に伴う要因、さらにはストレスなどの心理的要因などにより引き起こされると考えられている。特に、近年の紫外線の増大や、エアコンの多用などに伴う生活環境の乾燥化などによる肌に悪影響を及ぼす環境的要因は増大しつつある。
【０００３】
皮膚組織は、表皮、真皮、皮下組織からなる。真皮には、コラーゲンやヒアルロン酸が多く含まれ、皮膚の保水性や弾力性に大きく関与している。コラーゲンやヒアルロン酸は、真皮中に存在する真皮繊維芽細胞が産生することが知られている。
【０００４】
コラーゲンはヒトの生体内に存在するタンパク質のうち約３０％を占め、その７０％が真皮に存在すると言われている。真皮に存在するコラーゲンとしては、Ｉ型コラーゲンやIII型コラーゲンが含まれるが、主要なものはＩ型コラーゲンである。
【０００５】
従来、肌の張りやツヤの向上、シワの予防改善を目的として、コラーゲンを配合した化粧料を外用で使用し、皮膚にコラーゲンを直接補う方法が多用されてきた。しかしながら、外用でコラーゲンを補った場合、皮膚真皮におけるコラーゲン量を増加させることは困難であったため、肌の張りやツヤの向上、シワの予防改善のためには、必ずしも十分とは言えなかった。
【０００６】
皮膚が紫外線を含む光に曝されると、真皮の細胞外マトリックスの大半を占めるコラーゲンが顕著に減少し、その線維束の乱れが生じることが知られている。このため、真皮のコラーゲン量を増加させることは、シワの改善や予防などに有用であるとされている（非特許文献１（「機能性化粧品素材の開発のための実験法」（芋皮玄爾 監修）、２００７年発行、シーエムシー出版、第４５〜４７頁））。またここには、中波紫外線（ＵＶＢ）の照射によって、真皮繊維芽細胞のコラーゲン合成が大きく低下することが示されている。ここには、Ｉ型コラーゲン合成促進剤の例として、ビタミンＣ誘導体、乳清成分などが例示されている。
【０００７】
一方、文献（非特許文献２（Akiko Kojima-Yuasa, et al., Fragrance Journal, April, 2009, No. 346 (Vol.37, No. 4), pp.103-））には、コラーゲン産生能の低下を抑制することは、ＱＯＬの向上改善に有用であり、皮膚におけるコラーゲン量の低下は、シワやたるみなどの原因となることが示されている。
【０００８】
このため、紫外線照射を受けた真皮繊維芽細胞のコラーゲン合成の低下現象を抑制もしくは改善することは、紫外線に曝された皮膚に起こりうるコラーゲン低下にともなう、肌の張りやツヤの低下を予防もしくは改善し、またシワの予防もしくは改善の観点から、重要であるといえる。
【０００９】
しかしながら、従来、真皮線維芽細胞が作るＩ型コラーゲンの産生を促進しようとする試みは多く成されているものの（例えば、特開２００８−１０５９８４号公報（特許文献１）や、ＷＯ２００４／０８５４２９（特許文献２））、紫外線照射を受けた真皮繊維芽細胞のコラーゲン合成の低下現象自体を、直接、抑制し、または改善を図ることによって、真皮におけるコラーゲンの現象を抑えることについては、本発明者らの知る限り、検討は殆ど進んでいない。
【００１０】
燕窩は、アナツバメが自らの唾液を糸状にして作る巣であり、その成分としては、糖タンパク質を多く含み、脂質は殆ど含まれないことが知られている。燕窩は、従来、中華料理における食用素材や、漢方薬の原料などに使用されている。近年では、燕窩を原料に用いた健康食品なども開発されているが、外用剤や化粧料のような外用用途への適用例はまだ僅かしか知られていない。
【００１１】
特開２００３−９５９６１号公報（特許文献３）には、燕窩の酵素分解物を用いた経口用の美肌促進剤が開示されている。しかしながら、ここには、経口用途のみが示されているに過ぎず、外用用途への利用可能性については何ら記載も示唆もされていない。またここでの効果は、肌のしっとり感の向上や、キメの細かな肌を得ることであって、肌の張りやツヤの向上や、シワの改善を伴う、Ｉ型コラーゲンの産生促進能については、何ら記載されておらず、また、紫外線照射を受けた真皮繊維芽細胞のコラーゲン合成の低下を抑制し得ることについても記載も示唆もされていない。
【００１２】
ＷＯ９９／０２２７０９（特許文献４）には、燕窩の含水溶剤抽出物、特に熱水抽出物を含む化粧料が開示されている。この化粧料は、スキンケア用途に使用でき、外用用途で使用するものである。またここには、燕窩の含水抽出物が、皮膚細胞におけるコラーゲン合成促進効果を示すことも開示されている。しかしながら、ここで使用される抽出物は、燕窩を熱水抽出して、固形分を除去したものであり、燕窩全体を酵素処理してそのまま使用する燕窩酵素分解物とは、明らかに異なるものである。またここには、紫外線照射を受けた真皮繊維芽細胞のコラーゲン合成の低下を抑制し得ることについては記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００８−１０５９８４号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００４／０８５４２９
【特許文献３】特開２００３−９５９６１号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ９９／０２２７０９
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「機能性化粧品素材の開発のための実験法」（芋皮玄爾 監修）、２００７年発行、シーエムシー出版、第４５〜４７頁
【非特許文献２】Akiko Kojima-Yuasa, et al., Fragrance Journal, April, 2009, No. 346 (Vol.37, No. 4), pp.103-
【発明の概要】
【００１５】
本発明者等は今般、燕窩の酵素分解物が、紫外線照射を受けた皮膚真皮繊維芽細胞において見られるＩ型コラーゲン合成低下現象を効果的に抑制する効果のあることを、予想外にも見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
なお本発明者等は、同時に、燕窩の酵素分解物が、皮膚真皮繊維芽細胞におけるＩ型コラーゲンの優れた産生促進効果を有することも見出している。
【００１６】
よって本発明は、効率的に生産でき、かつ安全性の高い、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生低下の優れた抑制剤、およびそれを含む外用剤および化粧料の提供をその目的とする。
【００１７】
本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、燕窩の酵素分解物を有効成分とする、真皮線維芽細胞における紫外線照射によるコラーゲン産生低下の抑制剤である。
【００１８】
本発明の一つの好ましい態様によれば、前記酵素分解物は、プロテアーゼによる分解物である。
【００１９】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、前記酵素分解物の分子量は、７０〜２００，０００である。
【００２０】
本発明の一つのさらに好ましい態様によれば、前記酵素分解物の平均分子量は、１，０００〜５０，０００である。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、紫外線照射により皮膚真皮繊維芽細胞において生ずるＩ型コラーゲン産生低下を抑制するためのものである。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤を含んでなる、皮膚外用組成物が提供される。好ましくはこの組成物は、紫外線照射を受ける前または後におけるスキンケアに用いられ、より好ましくは、紫外線照射を受けた皮膚において生ずる、肌の張りおよびツヤの低下の予防もしくは改善、およびシワの予防もしくは改善に用いられる。
【００２３】
本発明の別のより好ましい態様によれば、本発明による皮膚外用組成物は、化粧料である。
【００２４】
本発明によれば、燕窩の酵素分解物を有効成分として使用することで、ヒト皮膚真皮線維芽細胞において起こりうるコラーゲンの産生低下を、効果的に抑制し改善することができる。特に紫外線照射を受けた皮膚真皮繊維芽細胞において見られるＩ型コラーゲン産生低下現象に対して効果的な抑制もしくは改善効果を得ることができる。またこの真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生低下の抑制効果に基づいて、酵素分解物を皮膚外用用途または化粧料用途に使用することで、線維芽細胞のコラーゲン産生低下に伴う肌の張り（弾力性）や肌のツヤの低下を改善し、さらには、シワを予防または改善することができる。
特にこれらの効果は、日焼け後の肌においてコラーゲン合成が低下したような状態の肌において有効である。このようにして本発明によれば、消費者のＱＯＬの向上を図ることができる。また、使用される酵素分解物は、食用素材としても周知な燕窩を使用するため、安全性が高く、消費者にも受け入れられやすいものである。さらに酵素分解物は、燕窩をそのまま酵素処理して得ることができるため、効率的に製造でき、また製造コストも低く抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】燕窩サンプル中のシアル酸量の測定結果を示すグラフである。
【図２】燕窩サンプル中のタンパク質量の測定結果を示すグラフである。
【図３】ＧＰＣ−ＨＰＬＣによる燕窩酵素分解物１の測定結果を示すグラフである。
【図４】ＧＰＣ−ＨＰＬＣによる燕窩酵素分解物２の測定結果を示すグラフである。
【図５】コラーゲンの産生促進能の測定結果を示すグラフである。
【発明の具体的説明】
【００２６】
有効成分
本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、前記したように、燕窩の酵素分解物を有効成分とする。
【００２７】
酵素分解物の原料である燕窩は、アナツバメが自らの唾液を糸状にして作る巣であり、その成分としては、糖タンパク質を多く含み、脂質はほとんど含まれていない。ここでアナツバメとは、アマツバメ科（Apodidae）のアナツバメ属（Collocalia）に属するツバメ類のことであり、例えば、Apodidae Collocalia francica、Apodidae Collocalia salangana、Apodidae Collocalia fuciphaga、Apodidae Collocalia inexpectata、Apodidae Collocalia vestita、Apodidae Collocalia esculenta、Apodidae Collocalia maximusなどが挙げられる。
【００２８】
本発明において、燕窩は、市販品を使用できる。一般に市販されている燕窩には、毛や糞等の汚れを取り除いて洗浄しただけのものから、燕窩のクズを集めて漂白と洗浄を繰り返して成形したものまで、様々な種類があるが、本発明で用いる燕窩は、前処理において過度の洗浄や漂白等が行われていない燕窩を用いることが好ましい。
【００２９】
燕窩の酵素分解物とは、燕窩を酵素反応を適用して分解し、得られたものを意味し、燕窩またはその処理物を、プロテアーゼやプロテアーゼを含む複合酵素等を用いて分解することにより得ることができる。ここで分解処理に使用する酵素としては、好ましくはプロテアーゼであり、より好ましくはパンクレアチンである。
【００３０】
燕窩の酵素分解物は、通常、まず加熱殺菌処理を施した後、水中にて酵素処理に付すことによって行うことができる。殺菌処理の条件は、慣用の加熱殺菌条件を適宜参考にして設定することができ、酵素処理の条件も、使用する酵素の種類や、燕窩の状態に応じて適宜設定することができる。
より具体的な例を挙げれば、燕窩の酵素分解物は、以下のようにして調製することができる。
【００３１】
例えば、粉砕した燕窩に、その質量の１０〜５０倍の水を加えて膨潤させた後、６０〜１３０℃で、５秒〜３０分間加熱殺菌処理する。その後、適量の酵素をそのまま添加して、酵素の至適ｐＨ、至適温度で０．５〜４８時間酵素反応を行なう。酵素反応終了後、加熱処理等により酵素を失活させ、反応液を濾過して不溶物を除去することにより、燕窩の酵素分解物を得ることができる。また、この酵素分解物は、必要に応じて乾燥して粉末化してもよい。なお、上記の各工程においては、適宜ｐＨ調整、脱色、脱臭等の操作を行なってもよい。
【００３２】
別の例として、燕窩の処理物を酵素分解する場合には、粒径２ｍｍ以下、好ましくは１５０μｍ以下に粉砕した燕窩に、その質量の１０〜１００倍の水を加えて、１〜６０℃、０．５〜４８時間静置または撹拌して膨潤させた後、６０〜１３０℃、５秒〜３０分間加熱殺菌処理し、必要に応じて濾過して、得られた溶液を、上記と同様にして酵素処理に付すことにより、燕窩の酵素分解物を得ることができる。
【００３３】
酵素分解物の調製法において、酵素反応の時間が長いほど、タンパク質の分解が進み、より低分子のタンパク質を含む、酵素分解物が得られることとなる。本発明においては、酵素反応時間を、０．５〜４８時間、好ましくは３〜３６時間、より好ましくは約２４時間程度として、酵素反応をより進行させた酵素分解物が好ましい。
【００３４】
このようにして得られる燕窩の酵素分解物の分子量は７０〜２００，０００が好ましく、７０〜１８０，０００がより好ましい。さらに好ましくは、分子量は、７０〜１５０，０００であり、さらにより好ましくは、７０〜１２０，０００である。
【００３５】
また燕窩の酵素分解物の平均分子量（重量平均分子量）は、３００〜１００，０００が好ましく、５００〜７０，０００がより好ましい。さらに好ましくは、平均分子量は、７００〜６０，０００であり、さらにより好ましくは、１，０００〜５０，０００である。
なお、燕窩酵素分解物については必要に応じて、ここでの操作条件を適宜変更したり、慣用の精製もしくは分画方法を適用したりすることによって、さらに前記平均分子量の下限値を、好ましくは５，０００以上、より好ましくは１０，０００以上、さらに好ましくは１５，０００以上、さらにより好ましくは２０，０００以上とすることができる。
【００３６】
皮膚外用組成物
本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤は、単独でそのままでも使用することができるが、化粧料、医薬品、医薬部外品などの種々の皮膚外用組成物に添加剤として含有させることができ、真皮線維芽細胞のコラーゲン産生低下を抑制する効果を有する組成物を得ることができる。得られた組成物は、スキンケア、好ましくは、紫外線照射を受ける前または後におけるスキンケア、よち好ましくは、紫外線照射を受けた皮膚において生ずる、肌の張りおよびツヤの低下の改善、およびシワの予防もしくは改善に有効に使用することができる。
【００３７】
本発明による有効成分である燕窩の酵素分解物は、紫外線照射を受けたヒト皮膚真皮繊維芽細胞において見られるＩ型コラーゲン産生の低下を効果的に抑制する活性を有する（後述する実施例の試験結果）。
【００３８】
したがって、本発明において、コラーゲン産生低下の抑制活性とは、ヒト皮膚真皮の繊維芽細胞において起こりうるコラーゲンの産生能の低下を抑制もしくは改善する作用を意味し、これにより、ヒト皮膚真皮においるコラーゲン量の現象を抑制もしくは改善し得ることを意味する。真皮のコラーゲン量の低下を抑制もしくは改善することによって、シワの改善や予防効果が得られ、また、コラーゲン産生低下に伴う肌の張り（弾力性）や肌のツヤの低下を予防もしくは改善できることは、当業者にとり周知のことであり、容易に理解し得ることである（例えば、前述の文献（「機能性化粧品素材の開発のための実験法」（芋皮玄爾 監修）、２００７年発行、シーエムシー出版、第４５〜４７頁（非特許文献１））や、文献（Akiko Kojima-Yuasa, et al., Fragrance Journal, April, 2009, No. 346 (Vol.37, No. 4), pp.103-（非特許文献２））などにこの点が明確に示されている。
特にこれらの効果は、日焼け後の肌においてコラーゲン合成が低下したような状態の肌において有効であるといえる。したがって、本発明による有効成分が、真皮の繊維芽細胞におけるコラーゲン産生低下の抑制活性を有することが確認されていることから、本発明による有効成分が、スキンケアに有効であることは明らかである。特に、本発明の有効成分が、紫外線照射を受ける前または後におけるスキンケア、より好ましくは、紫外線照射を受けた皮膚において生ずる、肌の張りおよびツヤの低下の改善、およびシワの予防もしくは改善に有効であることは明らかである。さらに、本発明による有効成分は、老化による肌の弾力低下の改善、しわの予防などにも有効である。
【００３９】
なお、本明細書において、肌の張りやツヤの低下、シワなどの肌もしくは皮膚の状態の「予防または改善」とは、該状態の、調節、進行の遅延、緩和、発症予防、再発予防、抑制などを包含する意味で使用される。
【００４０】
よって前記したように、本発明の別の態様によれば、本発明によるコラーゲン産生低下抑制剤を含んでなる、皮膚外用組成物が提供される。好ましくは、皮膚外用組成物は、医薬品、医薬部外品、または化粧料として提供され、より好ましくは、化粧料として提供される。
【００４１】
本発明による皮膚外用組成物（特に化粧料）において、有効成分である燕窩酵素分解物の含有量（乾物換算）は、特に制限はなく、組成物の形態により異なるが、一般には固形分として、０．００１〜２０重量％、好ましくは０．００５〜５重量％の範囲であり、組成物の形態に応じて適宜変更することができる。
【００４２】
あるいは、本発明による皮膚外用組成物における燕窩酵素分解物の含有量（乾物換算）は、１日当り０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ〜２ｍｇ、１平方ｃｍあたりの皮膚に適用できるように含むことが好ましい。
【００４３】
本発明による皮膚外用組成物は、有効成分を含み、かつ真皮線維芽細胞におけるコラーゲンの産生低下の抑制効果を損なわない限りにおいて、本発明による皮膚外用組成物は、他の任意成分をさらに含んでなることができる。このような任意成分としては、例えば、皮膚外用剤や化粧料に慣用されている各種成分、例えば、保湿剤、低級アルコール、多価アルコール、糖類、界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酸化防止剤、防腐防菌剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、香料、色素、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン類、アミノ酸類、抗炎症剤、水、ペプチド、糖アルコール類、酵素類、植物エキス類、抗酸化物質類、タルク、クレイ、花粉、パールなどが挙げられる。
【００４４】
ここで保湿剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸等の酸性ムコ多糖類、アミノ酸、コラーゲン、エラスチンなどが挙げられる。
【００４５】
低級アルコールとしては、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノールなどが挙げられる。
【００４６】
多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、ペンタエリストリール、ジペンタエリスリトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3−ブチレングリコールなどが挙げられる。
【００４７】
糖類としては、例えば、グルコース、マルトース、ラクトース、Ｄ−グルクロン酸、サッカロース、Ｄ−ソルビット、ソルビタン、セルロース、デンプンなどの糖類、オリゴ糖類、多糖類及びこれらの誘導体などが挙げられる。
【００４８】
本発明による皮膚外用組成物は、燕窩酵素分解物を含むコラーゲン産生低下抑制剤およびこれらの任意成分を、公知の方法に従って適宜配合し調整することによって、ローション、乳液、クリーム、保湿液、パック剤、化粧水、ボディローション、ボディクリームなどの種々の化粧料において慣用の製品形態とすることができる。本発明による皮膚外用組成物は、さらに、ファウンデーション類、リップスティック、アイシャドウ、頬紅などのメーキャップ化粧品や、日焼け止め用製品や防臭化粧品などの薬用化粧品、シャンプーやヘアリンス、整髪料などの頭髪用化粧品、皮膚洗浄剤や浴剤の浴用化粧品などとして用いてもよい。
【００４９】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の有効成分である酵素分解物の有効量を、ヒトを含む哺乳動物の皮膚に適用することを含んでなる、皮膚におけるコラーゲンの産生低下を抑制する方法が提供される。なおここで「有効量」とは、適用によって、体内における所望の領域において、コラーゲンの産生低下の抑制活性を発揮しうるのに十分な量である。
【００５０】
さらに本発明のさらに別の一つの態様によれば、本発明の有効成分の有効量を、ヒトを含む哺乳動物の、紫外線照射を受ける前または後における皮膚に適用することを含んでなる、スキンケア方法が提供される。同様に、本発明の有効成分の有効量を、ヒトを含む哺乳動物の皮膚に適用することを含んでなる、紫外線照射を受けた皮膚において生ずる、肌の張りとツヤの低下を改善し、シワを予防もしくは改善する方法も提供される。なおここで「有効量」とは、所望の効果が得られるのに十分な量である。
【００５１】
なお本明細書において、「約」および「程度」を用いた値の表現は、その値を設定することによる目的を達成する上で、当業者であれば許容することができる値の変動を含む意味である。例えば、所定の値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内の変動を許容し得ることを意味する。
【実施例】
【００５２】
以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００５３】
（１）  燕窩サンプルの調製
(1-1)  燕窩酵素分解物１
市販の無漂白の燕窩を粉砕機で粉砕して、１００メッシュパス（粒径１５０μｍ以下）の燕窩粉末を得、この燕窩粉末に、約５０倍量（質量）の水を加えて５℃で２０時間膨潤させた後、１２１℃、１５分間加熱殺菌処理した。
【００５４】
得られた処理液を冷却した後、ｐＨを調整し、燕窩粉末に対して２質量％の量のプロテアーゼ含有酵素（商品名「パンクレアチンＦ」、天野製薬株式会社製）を添加して、４５℃で３時間反応させた。
【００５５】
この酵素反応液をｐＨ７．０に調整した後、９０℃で５分間加熱して酵素を失活させて、濾過し、濾液を回収した。この濾液を濃縮後、凍結乾燥して、「燕窩酵素分解物１」を得た。
【００５６】
(1-2)  燕窩酵素分解物２
酵素反応の時間を２４時間とした以外は、前記(1-1)項の酵素分解物１と同様に行い、「燕窩酵素分解物２」を得た。
【００５７】
(1-3)  燕窩熱水抽出物（比較例）
市販の無漂白の燕窩（乾燥物）４０ｇを粉砕機で粉砕し、この粉砕物を、１０００ｍｌの蒸留水に加えて、加熱還流下にて２時間抽出処理を行った。加熱還流後、静置した後、上清を分取して濾過し、濾液を回収した。残渣についてはさらに、上記と同様に１０００ｍｌの蒸留水に加えて、加熱還流下にて再抽出処理を行った後、固形物残渣を濾過により除去し、濾液を回収した。得られている濾液（抽出液）を併せ、減圧下にて濃縮し、得られた濃縮物を凍結乾燥して、黄白色の「燕窩熱水抽出物」（比較例）を得た。
【００５８】
（２）  燕窩サンプルの分析
得られた各燕窩サンプル（燕窩酵素分解物１、燕窩酵素分解物２および燕窩熱水抽出物）中のシアル酸量とタンパク質量とを下記のようにして測定した。
シアル酸の量は、各試料を酸加水分解後に高速液体クロマトグラフィーにて遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸として測定した。
タンパク質の量は、Ｂｒａｄ ｆｏｒｄ法に基づくBio Rad社のプロテインアッセイキットを使用して測定した。
【００５９】
結果は、図１および図２に示される通りであった。
【００６０】
次に、燕窩酵素分解物１および燕窩酵素分解物２に含まれるタンパク質の分子量およびその分布を測定するため、下記のような条件にて、ＧＰＣによる分析を行った。
【００６１】
［ＨＰＬＣの測定条件］
・カラム：  Shodex Asahipak GS320HQ （φ7.6×300mm）
・カラム温度：  ３５℃
・移動相：  50mM ＣＨ３ＣＯＯＮＨ３  ｐＨ６．７
・流速：  ０．４ml/min
・試料注入量：  １０μｌ
・検出器：  紫外分光検出器（ＵＶ２２０ｎｍにて測定）
［使用した分子量マーカー］
・ＢＳＡ  MW 66,000
・Gly-gly  MW 132.1
・Gly-gly-gGly  MW 189.17
・L-Asparaginic acid  MW133.1
・DL-Asparaginic acid  MW 150.1
・N-Acetylneuraminic acid  MW 309.3
【００６２】
測定結果は、図３および図４に示される通りであった。
【００６３】
さらに、燕窩酵素分解物に含まれるタンパク質の分子量について、ウエスタンブロッド法を使用して評価した。具体的には、まず、前記した測定法に従い、燕窩酵素分解物中のタンパク質の量を確認した。燕窩酵素分解物由来のタンパク質（１００μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、１０〜１５％のポリアクリルアミドにより分離した。ゲルに展開したタンパク質をImmuno-blot ＰＶＤＦ膜（Polyvinylidene difluoride、Bio-Lad Lab社より入手）に転写した。ＰＶＤＦ膜を３％スキムミルクと０．１％ Tween-20を含むＰＢＳ中にて、１時間ブロッキングし、視覚的に判定した。
なお、タンパク質の分子量の評価にあたっては、公知文献（Guo, C. T., Suzuki Y., et al., Antiviral Res. 70, pp.140-146 (2006) に示されているデータも参考にした。
【００６４】
これらの結果から、燕窩酵素分解物中に含まれるタンパク質分子量は、約７０〜１２０，０００程度（なお評価条件によっては、上限値は２００，０００程度となる場合がある）の範囲で存在することがわかった。
【００６５】
さらに、得られた結果から、燕窩酵素分解物１におけるタンパク質の平均分子量は、約５５，０００であるとわかった。また、燕窩酵素分解物２におけるタンパク質の平均分子量は、約３３，０００であるとわかった。
【００６６】
（３）  紫外線照射に伴う真皮繊維芽細胞におけるコラーゲンの産生低下の抑制効果
正常ヒト皮膚真皮線維芽細胞（ＫＦ−４１０９、クラボウ社より入手）を、０．５％仔牛血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地（SIGMAより入手）を用いて、９６穴プレートに２×１０４cellsの細胞密度にて播種した。播種２４時間後、下記所定の濃度の各燕窩サンプルを含有した０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。
またサンプル濃度については下記のとおりであった：
(i)  酵素分解物の濃度（０、７８．１、３１２．５、１２５０、５０００μｇ／ｍｌ）、
(ii) 熱水抽出物の濃度（０、１．５６、６．２５、２５、１００μｇ／ｍｌ）。
【００６７】
培養後、培地上清の一部を回収し、上清中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００６８】
測定結果から、燕窩の酵素分解物が、ヒト皮膚真皮線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生を有意に増加させることが認められた。これは、比較例である熱水抽出物の場合に比べて顕著な違いが見られた。
【００６９】
培養後、さらに、所定の濃度の各燕窩サンプルを含有したＨａｎｋ’ｓ緩衝液中にて、ＵＶＢ（中波紫外線）を照射した後（紫外線照射器（フィリップス社製TL20W/12RS）、ＵＶ短波長カットフィルター（カットオン波長３００ｎｍ）を使用））、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。
培養後、培地上清を回収し、上清中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
細胞は０．１％Triton X-100溶液にて溶解後、タンパク質量を定量した。
【００７０】
ＥＬＩＳＡ法では、一次抗体に、Anti-Human Collagen Type I 抗体（Rabit）を用い、二次抗体にヒストファインＰＯ（Rabit）を用い、さらに発色剤には、2,2'-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用い、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。
タンパク質量の定量は、ＢＣＡ法（ビシンコニン法）（ペプチド結合に反応させた銅イオンをＢＣＡ（ビシンコニン酸）と反応させ、波長５６２ｎｍでの吸収を測定する方法）によって行った。
培地中のＩ型コラーゲン量は、全細胞のタンパク質量で培地中のＩ型コラーゲン量を除することによって単位タンパク質量当たりのＩ型コラーゲン産生量として算出した。
【００７１】
結果は図３に示される通りであった。
結果から、燕窩の酵素分解物が、ＵＶＢ照射による真皮線維芽細胞におけるＩ型コラーゲン産生低下を、有意に抑制することが確認された。また熱水抽出物（比較例）の場合には、このような抑制効果は見られなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年7月9日(2014.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
燕窩の酵素分解物を有効成分とする、真皮線維芽細胞における紫外線照射によるコラーゲン産生低下の抑制剤。