(57)【要約】【課題】クロマトグラフィーで分離されたサンプルの化学構造の分析に必要なラマン信号を、サンプルに影響を与えず、高感度で得られる薄層クロマトプレート及びその使用方法を提供する。【解決手段】表面増強層２と分離層３が積層された積層体が基板１上に形成される。例えば、基板１の表面に貴金属ナノ粒子５からなる表面増強層２が形成され、表面増強層２の表面に分離層３が形成される。これにより、サンプルに影響を与えず、ラマン信号を高感度で得られる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
貴金属ナノ粒子のサイズよりも小さい間隔で前記貴金属ナノ粒子が配置された表面増強層と試料を展開するための分離層が積層された積層体が、基板上に形成されたことを特徴とする薄層クロマトプレート。
【請求項２】
前記貴金属ナノ粒子は、誘電体ナノ粒子の表面を貴金属で被覆した構造であることを特徴とする請求項１に記載の薄層クロマトプレート。
【請求項３】
前記誘電体ナノ粒子における前記貴金属の被覆は、真空蒸着又はスパッタリングによって形成されることを特徴とする請求項２に記載の薄層クロマトプレート。
【請求項４】
前記表面増強層において前記貴金属ナノ粒子が配置される領域は、前記試料の展開領域と重なるように、前記薄層クロマトプレートの一部の領域に形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の薄層クロマトプレート。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の薄層クロマトプレートを用いて、試料の展開中又は展開の終了時に、前記貴金属ナノ粒子と前記試料との相互作用による表面増強ラマン効果により、分子の化学構造に関する情報を得ることを特徴とする薄層クロマトプレートの使用方法。
【請求項６】
前記基板側から励起光を照射してラマン散乱光を測定することを特徴とする請求項５に記載の薄層クロマトプレートの使用方法。
【請求項７】
第１の基板上に試料を展開するための分離層が積層された第１の積層体において試料の展開中又は展開の終了時に、第２の基板上に貴金属ナノ粒子のサイズよりも小さい間隔で前記貴金属ナノ粒子が配置された表面増強層が積層された第２の積層体の前記表面増強層を前記分離層に接触させてラマン散乱光を測定することを特徴とする薄層クロマトプレートの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン分光法等と組み合わせて用いることができる薄層クロマトプレート及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマン分光は分子の同定に極めて有効な手法であるが、異物や夾雑物を含むサンプルにおいては分析が困難であるといった問題点を抱えている。このため、あらかじめ薄層クロマトグラフィー、電気泳動、液相クロマトグラフィー等で分離してから分析することが必要である。
【０００３】
一方、従来の薄層クロマトグラフィーは、サンプルを展開して乾燥させた後に、サンプル自体の発色体もしくはゲル担体に含まれる蛍光色素の消光によって、分離後のスポットの位置を確認するものである。
【０００４】
薄層クロマトグラフィーとラマン分光法を併用する場合、分離の最中もしくは直後に、そのままの状態で直接ラマン分光により分析できれば望ましいが、ラマン信号の散乱断面積は極めて低いことから、ラマン信号を感度良く測定することは、非常に困難である。
【０００５】
そこで、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）による信号増強と組み合わせることが検討されてきており、例えば、図９（ａ）に示されているように、サンプルをＴＬＣ基板（薄層クロマト基板）８１で分離してから、表面増強ラマン分光に有効とされている銀ナノ粒子からなる貴金属コロイド８２を滴下して、図９（ｂ）に示すように、ラマン分光測定装置８３で信号を測定する提案がされている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】D. Li et al. Facile on-site detection of substituted aromatic pollutants in water using thin layer chromatography combined with surface-enhanced Raman spectroscopy, Environ. Sci. Technol. 2011, 45, 4046-4052.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記従来の方法においては、サンプルの分離後に貴金属コロイドを添加しているので、銀ナノ粒子の吸着密度は不均一となりラマン信号は均一になりにくい。また、球状のコロイドを添加しているので、コロイドが分散されてしまい、増強効果が弱くなる。
【０００８】
さらに、上記のように、サンプルの展開後に貴金属コロイドを添加する方法では、貴金属コロイドの添加時にサンプルが再度展開してしまい、正確な測定が行えないという問題がある。
【０００９】
本発明は、上述した課題を解決するために創案されたものであり、クロマトグラフィーで分離されたサンプルの化学構造の分析に必要なラマン信号を、サンプルに影響を与えず、高感度で得られる薄層クロマトプレート及びその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の薄層クロマトプレートは、貴金属ナノ粒子のサイズよりも小さい間隔で前記貴金属ナノ粒子が配置された表面増強層と試料を展開するための分離層が積層された積層体が、基板上に形成されたことを主要な特徴とする。
【００１１】
また、本発明の薄層クロマトプレートの使用方法は、基板と、試料を展開するための分離層と、貴金属ナノ粒子のサイズよりも小さい間隔で前記貴金属ナノ粒子が配置された表面増強層とが積層された積層体を含む薄層クロマトプレートを用いて、試料の展開中又は展開の終了時に、前記貴金属ナノ粒子と前記試料との相互作用による表面増強ラマン効果により、分子の化学構造に関する情報を得ることを主要な特徴とする。
【００１２】
また、本発明の薄層クロマトプレートの使用方法は、第１の基板上に試料を展開するための分離層が積層された第１の積層体において試料の展開中又は展開の終了時に、第２の基板上に貴金属ナノ粒子のサイズよりも小さい間隔で前記貴金属ナノ粒子が配置された表面増強層が積層された第２の積層体の前記表面増強層を前記分離層に接触させてラマン散乱光を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、薄層クロマトプレートにおいて貴金属ナノ粒子が高密度で配置された表面増強層と分離層が積層されているので、試料の展開中又は展開終了時に、分離されたスポット中に存在する分子の化学構造に関する情報を、試料に影響を与えず、そのままの状態の試料から高感度に得ることができる。また、本発明により、例えば、環境モニタリング等で採取される夾雑物や異物を含むサンプルにおいても、分離および分析を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の薄層クロマトプレートの構造を示す断面図である。
【図２】本発明の薄層クロマトプレートの構造を示す断面図である。
【図３】サンプルの展開方法と測定方法を示す図である。
【図４】薄層クロマトプレートの表面増強層によるラマン信号の増強効果を示す図である。
【図５】薄層クロマトプレートにより得られたＭＢとＢＰＥのラマンスペクトルを示す図である。
【図６】薄層クロマトプレートにより分離された夾雑物からのラマンスペクトルを示す図である。
【図７】薄層クロマトプレートの他の構成例を示す図である。
【図８】薄層クロマトプレートの一部の領域に貴金属ナノ粒子が形成された構成例を示す図である。
【図９】従来における薄層クロマトグラフィーと表面増強ラマン分光を組み合わせた測定方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明の一実施形態を説明する。構造に関する図面は模式的なものであり、現実のものとは異なる。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれている。
【００１６】
本発明の薄層クロマトプレートは、図１に示されている様に、複数の貴金属ナノ粒子からなる表面増強層２を組み込んでいる。図１の実施形態では、基板１の表面に貴金属ナノ粒子５からなる表面増強層２を積層し、表面増強層２の表面に分離層３を積層した。
【００１７】
このように、表面増強層２と分離層３が接して積層された積層体が基板１上に形成される。図１では、積層体の表面増強層２側が基板１の表面上に接するように配置されているが、後述するように、積層体の分離層３側が基板１の表面上に接するように配置しても良い。
【００１８】
また、貴金属ナノ粒子５は、基礎となるナノ粒子２ｂ上に帽子形状の貴金属層２ａが被覆されている。貴金属ナノ粒子５は、図１（ｂ）の例では、隣り合う貴金属層２ａが接触するように２次元状又は１次元状に配列されており、これら配列された複数の貴金属ナノ粒子５により表面増強層２が構成される。
【００１９】
基板１は、ガラス、石英、シリコン、プラスティック等の材料が用いられる。また、ナノ粒子２ｂには、シリカ、ポリスチレン、酸化チタン等の誘電体によるナノオーダーの粒径の粒子が用いられる。貴金属層２ａは、金や銀、白金等の貴金属が用いられる。
【００２０】
分離層３は、固定相とも呼ばれるもので、従来の薄層クロマトグラフィーと同じ材料が用いられる。例えば、分離層３は、シリカゲル、アルミナ、セルロース等により構成される。
【００２１】
具体的には、次の方法により形成することができる。例えば、基板１としてスライドガラスを用い、表面増強層２に配置される貴金属ナノ粒子５の基礎となるナノ粒子２ｂとしてシリカナノ粒子を用いた場合を説明する。
【００２２】
スライドガラス表面を３−アミノプロピルメトキシシラン等で処理し、スライドガラス表面のシラノール基とシリカナノ粒子表面の水酸基間の結合により、粒径２０ｎｍから１０００ｎｍのシリカナノ粒子をスライドガラス表面に吸着する。
【００２３】
次に、真空蒸着ないしはスパッタリングにより厚さ２０ｎｍから２００ｎｍの金ないしは銀を堆積させることにより、シリカナノ粒子の上に帽子状の貴金属層２ａを形成する。この方法により、基板１表面に強固に結合された単層の貴金属ナノ粒子５からなる表面増強層２が得られる。これらのナノ粒子はお互いに高密度で接していることから、増強効果に有効であるホットスポットが多く形成され、増強に有効である。
【００２４】
表面増強層２を形成後、吸着剤、担体、充填剤などと呼ばれる材料を表面増強層２の表面にコーティングして乾燥させ、分離層３を形成する。
【００２５】
上記のように、ナノ粒子２ｂを単層で均一の厚さに形成することにより、図１（ｂ）に示される構造が得られる。試料を分離層３に添加すると、試料のサンプル分子１０は、分離層３を破線の矢印で示す方向に移動し、試料中のサンプル分子１０が、分離層粒子３ａによる吸着作用又は分配作用等によって、展開、分離される。このサンプル分子１０は、表面増強層２に存在する貴金属ナノ粒子５と接触するので、増強されたラマン信号の測定が可能となる。
【００２６】
図１（ｂ）に示されるように、上記の製造方法では、隣接する貴金属層２ａが接するように、貴金属ナノ粒子５を最密に配置することができる。しかし、最密に配置しなくても、図２に示されるように、高密に配置した構造であっても良い。図２は、表面増強層２を構成する貴金属ナノ粒子５は基板１上に吸着されているのは、図１と同じである。しかし、隣の貴金属層２ａ同士は接触しておらず、少し隙間が開いていている。
【００２７】
図２では、隣り合う貴金属ナノ粒子５の間隔ｔが、貴金属ナノ粒子５のサイズＤよりも小さくなるように配置されている。ここで、サイズＤは、帽子状の貴金属層２ａの横方向の長さである。
【００２８】
（実施例）
基板１として、スライドガラス等の平坦のガラス基板を、ナノ粒子２ｂとしてシリカ粒子を用意する。ガラス基板の表面にシリカ粒子を単層となるように吸着させるため、３−アミノプロピルメトキシシラン、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等の水溶液ないしはエタノールもしくはメタノール溶液に、１分から１時間浸漬する。次に精製水で洗浄し、１０分ほど乾燥させることにより、ガラス表面上にシラノール基を形成させる。
【００２９】
次に、シリカのナノ粒子懸濁液を加え、１分から１０分ほど静置することにより、シリカナノ粒子の単層が形成される。最後に、金、銀等の貴金属を真空蒸着することにより、表面増強ラマン分光に適した帽子状の貴金属層２ａが積層された貴金属ナノ粒子５が形成され、表面増強層２が形成される。
【００３０】
分離層３の形成については、ガラス基板上に薄層を形成する従来の方法を用いる。例えば、メルク社のＴＬＣ−シリカゲル（ＧＦ６０２５４）を蒸留水に懸濁して５ｍｇ／ｍｌの濃度にし、表面増強層２上に塗布し、室温で３時間乾燥、もしくはホットプレートで加熱して乾燥する。
【００３１】
以上により、図１の薄層クロマトプレートが完成する。測定に際しては、図３（ａ）に示すように、薄層クロマトプレートに試料２０を滴下し、展開用の有機溶媒２２を含むシャーレ２１に薄層クロマトプレートの末端を漬け、密閉された容器２３中に静置する。そうすると、試料２０が矢印１１の方向に展開される。次に、図３（ｂ）に示すように、基板１の下方から励起光３１を照射すると、表面増強層２の貴金属ナノ粒子５によって増強されたラマン散乱光３２が展開された試料から放射され、高感度のラマン信号が得られる。なお、ラマン信号の測定は、試料の展開中もしくは展開終了後に測定してもよい。
【００３２】
図４には、薄層クロマトプレートに滴下されたトランス−１、２−ビス（４−ピリジル）エチレン（ＢＰＥ）のラマンスペクトルを示す。図４（ａ）は表面増強層を有していない従来の薄層クロマトグラフィーから得られたスペクトルであり、図４（ｂ）は表面増強層を有する本発明における薄層クロマトプレートを用いたスペクトルである。
【００３３】
励起波長は７８５ｎｍ（オーシャンオプティクスレーザー７８５ｎｍ）であり、同社製のＵＳＢ４０００にて測定した。図４（ａ）及び（ｂ）ともに、縦軸はカウント値、横軸はラマンシフト（ｃｍ−１）を示す。図４（ａ）では、領域Ａにラマン信号を確認することはできないが、図４（ｂ）では、領域Ｂにラマン信号のピークを確認することができる。このように、本発明の薄層クロマトプレートは、信号増強に有効であることがわかる。
【００３４】
次は、本発明の薄層クロマトプレートが分離能および増強能を同時に備えていることを示す。図５は、ＢＰＥとメチレンブルー（ＭＢ）をそれぞれ単独で測定したラマンスペクトルを示す。図５（ａ）は、メチレンブルー（ＭＢ）の分子構造式を示し、図５（ｂ）は本発明の薄層クロマトプレートにＭＢを滴下して測定したラマンスペクトルを示す。一方、図５（ｃ）は、ＢＰＥの分子構造式を示し、図５（ｄ）は本発明の薄層クロマトプレートにＢＰＥを滴下して測定したラマンスペクトルを示す。また、図５（ｂ）及び（ｄ）ともに、縦軸はカウント値、横軸はラマンシフト（ｃｍ−１）を示す。
【００３５】
図６は、本発明の薄層クロマトプレートで、ＢＰＥとＭＢの混合物を分離した後に測定したラマンスペクトルを示している。図６（ａ）は、ＢＰＥ（０．１ミリモル）とＭＢ（１ミリモル）を混合して、薄層クロマトプレートに滴下し、１５分間展開した後の状態を示す写真である。展開溶媒はメタノールとトルエンとの割合が６：４となるように混合した。
【００３６】
ＢＰＥとＭＢの混合物は、原点Ｘに滴下しており、展開後には、スポットＹ、スポットＺに分離された物質が残っている。図６（ａ）に示されるように、スポットＹの中心からスポットＺの中心までの距離は１ｃｍである。図６（ｂ）は分離層で展開する前の混合物のラマンスペクトルである。なお、図６（ｂ）〜（ｅ）は、いずれも、縦軸はカウント値、横軸はラマンシフト（ｃｍ−１）を示す
【００３７】
図６（ｃ）〜（ｄ）は、１５分間展開した後に得られたラマンスペクトルを示す。図６（ａ）において混合物が滴下された原点Ｘのラマンスペクトルが図６（ｃ）に示されている。図６（ａ）のスポットＺのラマンスペクトルが図６（ｄ）、図６（ａ）のスポットＹのラマンスペクトルが図６（ｅ）である。
【００３８】
図６（ａ）の展開後の原点Ｘから最も遠い位置に展開されたスポットＹに対応する図６（ｄ）のラマンスペクトルでは、図５（ｄ）に示されるＢＰＥのラマンスペクトルのみが単独で観察できるので、混合物が分離されて夾雑物を含むサンプル中の被検体を検出できたことがわかる。
【００３９】
薄層クロマトプレートにおいて表面増強層を基板上に形成する以外の方法を図７に示す。図７（ａ）は、図１で説明したのと同様、基板１上に表面増強層２を形成し、表面増強層２上に分離層３を設けたものである。図３（ｂ）で説明したように、基板１側から励起光を照射するが、基板１の高さは一定なので、励起光が基板１から表面増強層２に到達するまでの距離は、励起光の入射位置によって変わらず、試料と貴金属ナノ粒子との相互作用による表面増強効果による測定を正確に行うことができる。
【００４０】
図７（ｂ）は、基板１上に分離層３を形成し、分離層３上に表面増強層２を形成している。このように、表面増強層２と分離層３が積層された積層体が基板１上に形成されているが、積層体の分離層３側が基板１の表面上に接するように配置される。
【００４１】
図７（ｂ）の構造では、基板１の上方から励起光を照射してラマン散乱光の測定を行う。図７（ｂ）の構造は、図７（ａ）の構造ほど、ラマン信号は強くならないが、既に調製された市販の薄層クロマトグラフィーを構成材料として利用できる利点がある。
【００４２】
また、図７（ｃ）に示されるように、基板１５上に分離層１６が積層された従来の薄層クロマトグラフィーで試料を展開中又は展開した後に、基板８上に表面増強層７が形成された積層体の表面増強層７を、従来の薄層クロマトグラフィーの分離層１６に密着させて測定することもできる。手間が増えるが、市販の薄層クロマトグラフィーがそのまま利用できる利点がある。なお、表面増強層７は、図１、２で述べたのと同様、貴金属ナノ粒子５が高密度に配置された層で、貴金属ナノ粒子５は、基礎となるナノ粒子２ｂ上に帽子形状の貴金属層２ａが被覆された構造となっている。
【００４３】
ところで、薄層クロマトプレートで展開する分子が貴金属と特異的に反応することが懸念される場合には、貴金属ナノ粒子５の吸着面積を極力抑制して展開に対する悪影響を抑制することも可能である。
【００４４】
例えば、図８のように、スポット４１から実線の矢印で示される試料の展開方向に対して、表面増強層２の一部の領域又は薄層クロマトプレートの一部の領域に貴金属ナノ粒子５を配置し、試料の展開領域と重なるよう構成することができる。
【００４５】
図８（ａ）では、貴金属ナノ粒子５を小さな円形状の領域４２に形成している。図８（ｂ）は、展開方向に沿って細い線状の領域４３を、図８（ｃ）は、展開方向に対して直角方向に矩形状の領域４４を形成している。さらに、図８（ｄ）のように、展開方向に対して斜め方向の矩形状の領域４５を形成しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の薄層クロマトプレート及びその使用方法は、ラマン分光法を用いて、異物や夾雑物を含むサンプルを分析できるので、例えば、環境モニタリング、品質管理等の分野に適用することができる。
【符号の説明】
【００４７】
１      基板
２      表面増強層
２ａ    貴金属層
２ｂ    ナノ粒子
３      分離層
３ａ    分離層粒子
５      貴金属ナノ粒子
７      表面増強層
８      基板
１０    サンプル分子
１５    基板
１６    分離層
【図１】
2014215266.tif 000003
【図２】
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【図３】
2014215266.tif 000005
【図４】
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【図５】
2014215266.tif 000007
【図７】
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【図８】
2014215266.tif 000009
【図９】
2014215266.tif 000010
【図６】
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