(57)【要約】【課題】嫌気性アンモニア酸化細菌の検出を精度良く行う。【解決手段】嫌気性アンモニア酸化細菌を含有する試料を脂質染色剤で染色する。染色した試料に、波長５００〜５６０ｎｍのＧｒｅｅｎ励起光（Ｇ励起）を照射して６００ｎｍ付近の赤色蛍光を検出する。検出された赤色蛍光により、ナイルレッドにより染色された脂質（つまりは、細菌）の存在箇所を検出する。また、染色した試料に、波長４５０〜４９０ｎｍのＢｌｕｅ励起光（Ｂ励起）を照射して５００〜５７０ｎｍ付近の緑色蛍光を検出する。検出された緑色蛍光により、嫌気性アンモニア酸化細菌が特異的に分泌するラダラン脂質を検出する。Ｇ励起とＢ励起により得られる画面を重ね合わせ、脂質染色剤で染色された細菌から嫌気性アンモニア酸化細菌を識別する。【選択図】図３
2014236685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性アンモニア酸化細菌を脂質染色剤により染色して検出する嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法であって、
前記脂質染色剤は、ラダラン脂質と結合することで第１の蛍光物質を形成し、前記ラダラン脂質と異なる脂質と結合することで第２の蛍光物質を形成するものであり、
前記第２の蛍光物質を励起する光と異なる波長を含む光を照射して前記第１の蛍光物質を励起し、該第１の蛍光物質の蛍光に基づいて、嫌気性アンモニア酸化細菌を検出する
ことを特徴とする嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法。
【請求項２】
前記脂質染色剤は、ナイルレッドである
ことを特徴とする請求項１に記載の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法。
【請求項３】
前記ナイルレッドの濃度範囲は、０．０１〜７００μｇ／ｍｌである
ことを特徴とする請求項２に記載の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法。
【請求項４】
前記第１の蛍光物質を励起する光は、４５０〜４９０ｎｍの波長の光を含む
ことを特徴とする請求項２または請求項３に記載の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法。
【請求項５】
前記第１の蛍光物質を励起する光の照射時間は、５分以内である
ことを特徴とする請求項４に記載の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法。
【請求項６】
前記第２の蛍光物質の蛍光と、前記第１の蛍光物質の蛍光とに基づいて、嫌気性アンモニア酸化細菌を検出する
ことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物学分野では、特定属種の細菌を検出する方法として、菌体内のｒＲＮＡを標的とした蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）法が普及し、一般的に広く使用されている。この方法は、嫌気性アンモニア酸化細菌の検出にも利用されている。細菌のｒＲＮＡは、界、科、属、種等のレベルで共通な塩基配列を含んでおり、分類・同定にはその塩基配列が利用される場合が多い。また、ｒＲＮＡは細胞内含有量が高いため、ＦＩＳＨの標的として一般的に用いられている。
【０００３】
ＦＩＳＨ法は、図５に示すように、細菌のｒＲＮＡの塩基配列に特異的な蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを細胞内でハイブリダイズさせ、その蛍光を蛍光顕微鏡下で検出・計数するものである。蛍光色素で標識したプローブ（ＦＩＳＨプローブ）とハイブリダイズした細菌は、励起光を照射すると色素由来の蛍光を発するので、この蛍光を検出することで目的の細菌の存在の有無、または生物膜中の空間分布状況を把握することができる。
【０００４】
ＦＩＳＨ法の検出感度は、主として細胞内のｒＲＮＡ含量に依存することから、貧栄養な環境下に生息するｒＲＮＡ含量が少ない細菌に対しては、十分な蛍光強度が得られず、その適用が制限される場合がある。したがって、より強い蛍光が得られる色素を選択することが重要であり、現在、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）等がプローブの標識に良く利用されている。また、蛍光シグナルを増強させる手段として、プローブに酵素を結合させ、酵素反応を利用して蛍光を増幅させる方法がある（例えば、非特許文献１−３）。さらに、ＤＶＣ（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖｉａｂｌｅ  Ｃｏｕｎｔ）法と組み合わせたＤＶＣ−ＦＩＳＨ法や細胞内で遺伝子増幅する各手法を用いることで検出感度を向上させる手法も提案されている（例えば、非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１２−５０３７８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lebaron, P., P.Catala, C.Fajon, F.Joux, J.Baudart, and L Bernard., "A new sensitive, whole-cell hybridization technique for detection of bacteria involving a biotinylated oligonucleotide probe targeting rRNA and tyramide signal amplification.", Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63, 3274-3278
【非特許文献２】Kenzaka, T., N.Yamaguchi, K.Tani, and M.Nasu., "rRNA-targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial community structure in river water.", Microbiology, 1998, 144, 2085-2093
【非特許文献３】Yamaguchi N., S.Inaoka, K.Tani, T.Kenzaka, and M.Nasu., "Detection of specific bacterial cells with 2-hydroxy-3-naphthoic acid-2'-phenylanilide phosphate and fast red TR in situ hybridization.", Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, 275-278
【非特許文献４】Kogure, K., U.Simidu, and N.Taga., "A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria.", Can. J. Microbiol, 1979, 25, 415-420
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＦＩＳＨ法は、標的細菌を正確に検出するためには時間と熟練を要することが少なくない。
【０００８】
例えば、ＦＩＳＨ法は、ｒＲＮＡをターゲットとして細菌固有の塩基配列にＦＩＳＨプローブをハイブリダイズすることで目的とする細菌を検出するが、非特異的な部位にＦＩＳＨプローブがハイブリダイズしたりするおそれがある。また、自己蛍光を有する介雑物が存在する場合には、目的とする細菌と介雑物との区別が困難となるおそれがある。
【０００９】
また、目的とする微生物量が少ない検体に対して、ＦＩＳＨ法でその微生物中の存在有無を把握する場合は、介雑物や自己蛍光物質が検出結果に大きく影響するおそれがある。
【００１０】
上記事情に鑑み、本発明は、嫌気性アンモニア酸化細菌の検出精度向上に貢献する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成する本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の一態様は、嫌気性アンモニア酸化細菌を脂質染色剤により染色して検出する嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法であって、前記脂質染色剤は、ラダラン脂質と結合することで第１の蛍光物質を形成し、前記ラダラン脂質と異なる脂質と結合することで第２の蛍光物質を形成するものであり、前記第２の蛍光物質を励起する光と異なる波長を含む光を照射して前記第１の蛍光物質を励起し、該第１の蛍光物質の蛍光に基づいて、嫌気性アンモニア酸化細菌を検出することを特徴としている。
【００１２】
また、上記目的を達成する本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の他の態様は、上記嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法において、前記脂質染色剤は、ナイルレッドであることを特徴としている。
【００１３】
また、上記目的を達成する本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の他の態様は、上記嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法において、前記ナイルレッドの濃度範囲は、０．０１〜７００μｇ／ｍｌであることを特徴としている。
【００１４】
また、上記目的を達成する本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の他の態様は、上記嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法において、前記第１の蛍光物質を励起する光は、４５０〜４９０ｎｍの波長の光を含むことを特徴としている。
【００１５】
また、上記目的を達成する本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の他の態様は、上記嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法において、前記第１の蛍光物質を励起する光の照射時間は、５分以内であることを特徴としている。
【００１６】
また、上記目的を達成する本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の他の態様は、上記嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法において、前記第２の蛍光物質の蛍光と、前記第１の蛍光物質の蛍光とに基づいて、嫌気性アンモニア酸化細菌を検出することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
以上の発明によれば、嫌気性アンモニア酸化細菌の検出精度向上に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法のフローを示す図である。
【図２】（ａ）本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法による嫌気性アンモニア酸化細菌の検出画像、（ｂ）同検出方法による大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の検出画像、（ｃ）同検出方法による活性汚泥の検出画像である。
【図３】（ａ）赤色蛍光による全てのバクテリアの検出画像、（ｂ）緑色蛍光による嫌気性アンモニア酸化細菌の検出画像、（ｃ）赤色蛍光と緑色蛍光による嫌気性アンモニア酸化細菌の検出画像である。
【図４】本発明の実施形態２に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法のフローを示す図である。
【図５】ＦＩＳＨ法の概要を説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法は、嫌気性アンモニア酸化細菌が特異的に分泌するとされているラダラン脂質を検出ターゲットに設定して、嫌気性アンモニア酸化細菌を検出するものである。
【００２０】
嫌気性アンモニア酸化細菌は、亜硝酸塩とアンモニウムから窒素ガスを生成する能力を有する細菌である。この細菌を利用したアンモニア処理方法は、一般的に排水中のアンモニア処理で利用されている硝化−脱窒素法よりも省エネルギー、低コストで窒素除去が可能になる点から、近年、注目を集めている。
【００２１】
嫌気性アンモニア酸化細菌は、例えば、１６ｓｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）の解析によれば、Ｐｌａｎｃｔｍｙｃｅｔｅｓに属する細菌が含まれる。嫌気性アンモニア酸化細菌の細胞には、特異な形態的特徴がある。例えば、嫌気性アンモニア酸化細菌の細胞壁にはペプチドグリカンが存在せず、特有の「ラダラン（ｌａｄｄｅｒａｎｅ）脂質」が存在することが知られている。
【００２２】
そこで、発明者らは、鋭意研究の結果、一般的な脂質を検出する脂質染色剤とラダラン脂質を結合させた場合、一般的な脂質が結合した場合の蛍光とは異なる蛍光を検出することができることを発見し、本発明を完成するに至ったものである。
【００２３】
つまり、本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法は、脂質染色剤とラダラン脂質を結合させ、ラダラン脂質に蛍光指標を付与して嫌気性アンモニア酸化細菌を検出する。
【００２４】
［実施形態１］
図１を参照して、本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法について説明する。
【００２５】
嫌気性アンモニア酸化細菌は、自己造粒し、直径０．２〜５ｍｍ程度の粒状の塊を形成する。この塊はグラニュールと呼ばれ、メタン発酵菌でも見られる生物膜の一種である。グラニュールは、嫌気性アンモニア酸化細菌と種々の共生菌から形成されており、グラニュール中の嫌気性アンモニア酸化細菌の分布状況を把握することは、嫌気性アンモニア酸化細菌を用いた排水処理設備を長期間安定的に運転管理する上で重要な情報となる。そこで、実施形態１では、グラニュール中の嫌気性アンモニア酸化細菌の分布状況を検出する。以下、本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法の具体的な工程について説明する。
【００２６】
［第１の工程（グラニュールの固定処理工程）］
第１の工程では、グラニュールの固定処理を行う（ステップＳ１）。グラニュールの固定処理は、例えば、グルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒド等を用いて行う。グラニュールを含有する試料に、例えば、パラホルムアルデヒドをその濃度が４質量％になるように添加し、室温（２５℃）下で２〜１２時間程度保存して化学固定を行う。なお、冷蔵庫中（４℃）であれば、２４時間程度保存することで化学固定を行うことができる。
【００２７】
［第２の工程（試料切片の切り出し処理工程）］
第２の工程では、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡等で観察するための試料切片の切り出しを行う（ステップＳ２）。
【００２８】
固定処理後の試料を純水で数回洗浄した後、凍結切片作製用コンパウンドに３０分〜２時間浸漬させる。なお、試料切片作製用コンパウンドは、Ｏ．Ｃ．Ｔ（Optimal Cutting Temperature）コンパウンドとも呼ばれ、例えば、ポリエチレンビニル、ポリエチレングリコールを主成分とする溶液である。その後、固定処理後の試料をコンパウンドに浸漬させた状態で、−８０℃のディープフリーザや液体窒素を用いて急速冷凍させる。この急速冷凍処理後の試料を−２０℃の冷蔵庫内に１〜３時間保存し、試料温度を−２０℃程度に下げ、温度調整したコンパウンド包埋試料を得る。
【００２９】
ミクロトームを用いて、コンパウンド包埋試料から厚さ５〜６０μｍの厚さの切片を切り出し、切り出した試料切片をスライドグラスに固着させる。
【００３０】
なお、試料切片をスライドグラスに固着させた後、試料切片が固着されたスライドグラスをエタノール溶液に浸漬すると、コンパウンドの除去と細胞固定の補強を行うことができる。例えば、低濃度のエタノール溶液から徐々に高濃度エタノール溶液に浸漬させる。より具体的な例としては、５０％、７０％、８０％、１００％のエタノール溶液を調整し、濃度が低い順にそれぞれ１分ずつ試料切片を浸漬させる。
【００３１】
［第３の工程（嫌気性アンモニア酸化細菌の染色工程）］
スライドグラス上の試料切片に染色液を滴下し、３０分〜１時間程度、暗所で静置して嫌気性アンモニア酸化細菌を染色する（ステップＳ３）。
【００３２】
染色液に用いる染色剤としては、例えば、親油性の色素であって、嫌気性アンモニア酸化細菌と結合して異なる色のシグナルを発するものを用いる。具体的には、ナイルレッド（Nile red (CAS No.7385-67-3)）、ナイルブルー硫酸水素塩（Nile Blue Hydrogensulfate）、オイルレッドＯ（1-(2,4-Xylidylazo)-2-naphthol）、ズダンIII（Sudan III）、ズダンIV（Sudan IV）、ズダンブラックＢ（Sudan Black B）等の脂質染色剤を使用することができる。なお、ナイルレッドは、嫌気性アンモニア酸化細菌を染色した場合、緑色と赤色のシグナルを得ることができ、嫌気性アンモニア酸化細菌と他の細菌との区別を行うことが容易であるので好ましい。
【００３３】
染色剤にナイルレッドを使用した場合、ナイルレッドの濃度を０．０１〜７００μｇ／ｍｌに調整した染色液を使用することで、試料切片中の嫌気性アンモニア酸化細菌を染色して検出することができる。より好ましくは、ナイルレッドの濃度を５０〜１００μｇ／ｍｌに調整した染色液を使用することで、ナイルレッドがラダラン脂質と結合することによって生じる緑色のシグナルをより鮮明に検出することができる。
【００３４】
嫌気性アンモニア酸化細菌を染色剤で染色した後は、余分な染色液を純水で洗浄・除去し、退色防止剤をカバーグラスと試料切片との間に封入する。蛍光色素は、励起光を当てると退色するので、退色防止剤として、例えば、０．１％ｐａｒａｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを含む５０％グリセロール溶液等を封入することで退色を大幅に防止することができる。
【００３５】
［第４の工程（嫌気性アンモニア酸化細菌の検出工程）］
第３の工程で染色された観察用プレパラート上の試料切片を蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡等で観察する（ステップＳ４）。ここでは、染色剤として、ナイルレッドを用いた場合について説明する。
【００３６】
波長５００〜５６０ｎｍの光を含む励起光であるＧｒｅｅｎ励起光（Ｇ励起）を試料切片に照射し、６００ｎｍ付近の赤色蛍光を検出する。この赤色蛍光を検出して、ナイルレッドにより染色された脂質（つまりは、細菌）の存在箇所を検出する。Ｇ励起は、ナイルレッドを用いて脂質を検出する場合に、通常行われる検出方法である。
【００３７】
また、波長４５０〜４９０ｎｍの光を含む励起光であるＢｌｕｅ励起光（Ｂ励起）を試料切片に照射して、５００〜５７０ｎｍ付近の緑色蛍光を検出する。この緑色蛍光を検出することで、Ｇ励起により検出された赤色蛍光のうち、嫌気性アンモニア酸化細菌に相当するシグナルを識別することができる。この現象は、嫌気性アンモニア酸化細菌が分泌するラダラン脂質とナイルレッドが結合することにより生じるものと考えられている。なお、この緑色蛍光は、退色防止剤を封入しても退色が速いので、励起光の照射時間は、５分以内であることが好ましい。
【００３８】
以上のように第４の工程では、嫌気性アンモニア酸化細菌から緑色と赤色のシグナルが得られ、その他の細菌からは赤色のシグナルを得ることができる。そして、Ｇ励起とＢ励起により得られる画像（以後、Ｇ励起画像、Ｂ励起画像と称する）を重ね合わせることで、ナイルレッドで染色された細菌から嫌気性アンモニア酸化細菌を識別し、より正確に嫌気性アンモニア酸化細菌の所在を把握することができる。
【００３９】
また、Ｂ励起画像のみで、嫌気性アンモニア酸化細菌を検出することも可能である。この場合も、微分干渉顕微鏡や位相差顕微鏡を用いて、試料全体のコントラスト（嫌気性アンモニア酸化細菌の輪郭）が強調された画像（微分干渉像）や明視野画像を取得し、この取得された画像に、Ｂ励起画像を重ね合わせることで、嫌気性アンモニア酸化細菌をより正確に識別することができる。
【００４０】
さらに、Ｂ励起画像、Ｇ励起画像及び微分干渉像を取得して、これら３画像を重ね合わせることで、嫌気性アンモニア酸化細菌が存在している部分だけ緑色に発光している画像を得ることができる。なお、Ｂ励起画像、Ｇ励起画像及び微分干渉像の取得順序は、特に限定されるものではないが、同時に取得すると各画像間の重ね合わせが容易となるので、好ましい。
【００４１】
［実施例１］
具体的な実施例を挙げて、実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法についてより詳細に説明する。実施例１では、図１に示したフローに従って、グラニュール中の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出を行った。
【００４２】
［ステップＳ１］
グラニュールを含有する試料に、パラホルムアルデヒドの濃度が４質量％になるように、パラホルムアルデヒドを添加し、室温（２５℃）下で１２時間保存して化学固定を行った。
【００４３】
［ステップＳ２］
固定処理後の試料を純水で数回洗浄した後、凍結切片作製用コンパウンドに２時間浸漬させた。その後、固定処理後の試料をコンパウンドに浸漬させた状態で、−８０℃のディープフリーザで急速冷凍させた。この急速冷凍処理後の試料を−２０℃の冷蔵庫内に３時間保存して、コンパウンド包埋試料を得た。
【００４４】
ミクロトームを用いてコンパウンド包埋試料から厚さ６０μｍの試料切片を切り出し、スライドグラスに固着させた。
【００４５】
試料切片をスライドグラスに固着させた後、試料切片を、５０％、７０％、８０％、１００％の濃度のエタノール溶液にそれぞれ１分ずつ濃度が低い順に浸漬させた。
【００４６】
［ステップＳ３］
スライドグラス上の試料切片にナイルレッドの濃度が１００μｇ／ｍｌの染色液を滴下し、暗所で１時間静置して嫌気性アンモニア酸化細菌を染色した。染色後、余分な染色液を純水で洗浄・除去し、市販の退色防止剤をカバーグラスと試料切片との間に封入した。
【００４７】
［ステップＳ４］
染色された観察用プレパラート上の試料切片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＦＶ−１０００）で観察した。
【００４８】
試料切片に波長５００ｎｍのＧｒｅｅｎ励起光（Ｇ励起）を照射し、６００ｎｍ付近の赤色蛍光を検出した。また、試料切片に波長４５０ｎｍのＢｌｕｅ励起光（Ｂ励起）を照射して、５００〜５７０ｎｍ付近の緑色蛍光を検出した。さらに、試料切片の微分干渉像を取得した。
【００４９】
図２（ａ）は、嫌気性アンモニア酸化細菌を含有するグラニュールのＢ励起画像、Ｇ励起画像及び微分干渉像の３画像を重ね合わせた画像である。また、図２（ｂ），（ｃ）は、それぞれ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を含有する試料と、活性汚泥を含有する試料に対して、ステップＳ１からステップＳ４の処理を行って得られたＢ励起画像、Ｇ励起画像及び微分干渉像の３画像を重ね合わせた画像である。
【００５０】
図２（ａ）から明らかなように、実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法によれば、脂質を染色する染色剤とラダラン脂質とが結合することによって生じる緑色蛍光を検出することで、グラニュールにおける嫌気性アンモニア酸化細菌の分布状態を把握することができた。一方で、図２（ｂ），（ｃ）に示すように、大腸菌や活性汚泥では、緑色蛍光シグナルを得ることができなかった。
【００５１】
なお、図３（ａ）に示すように、赤色蛍光を検出するだけでは、嫌気性アンモニア酸化細菌と他の細菌（バクテリア）とが検出されるので、他の細菌から嫌気性アンモニア酸化細菌を区別することが困難である。これに対して、図３（ｂ）に示すように、緑色蛍光を検出すると、嫌気性アンモニア酸化細菌の分布状態を把握することができる。つまり、嫌気性アンモニア酸化細菌は、ラダラン脂質とそれ以外の脂質を含んでいると考えられ、ラダラン脂質由来の蛍光シグナル（緑色蛍光）を得ることで、嫌気性アンモニア酸化細菌の所在を把握することができる。なお、染色剤とラダラン脂質とが結合することで検出される緑色蛍光だけでも、嫌気性アンモニア酸化細菌の分布状態を把握することは可能であるが、図３（ｃ）のように、赤色蛍光と緑色蛍光とを重ね合わせた画像を得ることで、嫌気性アンモニア酸化細菌の分布状態をよりはっきりと把握することができる。
【００５２】
以上のような、本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法によれば、嫌気性アンモニア酸化細菌を選択的に検出することができる。つまり、嫌気性アンモニア酸化細菌に特有のラダラン脂質を選択的に検出することができるので、従来の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法（例えば、ＦＩＳＨ法）よりも嫌気性アンモニア酸化細菌を精度よく検出することができる。
【００５３】
また、脂質染色剤として、例えば、ナイルレッドのような脂質と結合して初めて蛍光物質となる染色剤を用いると、介雑物の影響を受けないため、ＦＩＳＨ法よりも正確に嫌気性アンモニア酸化細菌を検出することができる。
【００５４】
通常、生物膜をナイルレッドで染色する時には、１０μｇ／ｍｌ以下の濃度のナイルレッドが用いられる。これに対して、本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法では通常の使用濃度よりも濃い濃度である、５０〜１００μｇ／ｍｌで嫌気性アンモニア酸化細菌を染色することで、ナイルレッドとラダラン脂質とが結合することによって生じる緑色蛍光をより鮮明に検出することができる。
【００５５】
また、本発明の実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法は、脂質染色剤で染色された試料の蛍光色の波長により、嫌気性アンモニア酸化細菌を特定するので、通常のＦＩＳＨ法による嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法よりも試料の調整から検出（観察）までに要する時間を大幅に短縮することができる。
【００５６】
なお、ラダラン脂質とナイルレッドが結合した箇所に、５００〜５６０ｎｍの励起光を照射すると、赤色蛍光を検出することができる。この理由として、ラダラン脂質以外の脂質が存在している、あるいは、ナイルレッドとラダラン脂質が結合することにより緑色蛍光を発する構造だけでなく、赤色蛍光を発する構造が存在する等の理由が考えられる。
【００５７】
［実施形態２］
次に、図４を参照して、本発明の実施形態２に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法について詳細に説明する。
【００５８】
実施形態２に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法では、分散汚泥中の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出を行う。なお、実施形態２に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法は、試料をスライドグラス上に固着させる方法が異なることを除いて実施形態１の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法と同じである。よって、試料の染色方法（ステップＳ３）や試料の検出方法（ステップＳ４）は、実施形態１の方法と同じであるので、同じ符号を付して説明を省略する。
【００５９】
［第１’の工程（分散汚泥の固定処理工程）］
第１’の工程では、嫌気性アンモニア酸化細菌を含有する分散汚泥の固定処理を行う（ステップＳ１’）。分散汚泥の固定処理は、例えば、グルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒド等を用いて行う。嫌気性アンモニア酸化細菌を含有する分散汚泥に、例えば、パラホルムアルデヒドをその濃度が４質量％になるように添加し、室温（２５℃）下で２〜１２時間程度保存して化学固定を行う。なお、冷蔵庫中（４℃）であれば、２４時間程度保存することで化学固定を行うことができる。
【００６０】
［第２’の工程（試料準備工程）］
固定処理後の試料を純水で数回洗浄した後、試料を菌体光学密度（ＯＤ６６０）が、０．１〜０．５程度になるように純水中に分散させ、得られた分散液をスライドグラス上に滴化・乾燥固着させる（ステップＳ２’）。
【００６１】
そして、染色工程（ステップＳ３）を経て、スライドグラス上に固着された試料を染色し、検出工程（ステップＳ４）により、試料中の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出を行う。
【００６２】
以上のような、本発明の実施形態２に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法によれば、実施形態１に係る嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法と同様に、嫌気性アンモニア酸化細菌を精度よく検出することができる。また、通常のＦＩＳＨ法による嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法よりも試料の調整から検出（観察）までに要する時間を大幅に短縮することができる。
【００６３】
以上、具体的な例を挙げて説明したように、本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法によれば、嫌気性アンモニア酸化細菌を精度良く検出することができる。また、嫌気性アンモニア酸化細菌の検出時間を大幅に短縮することができる。
【００６４】
ＦＩＳＨ法では、ｒＲＮＡやゲノムＤＮＡの目的箇所に蛍光プローブをハイブリダイゼーションさせた後、余分は蛍光プローブを洗浄する。一般的なプロトコルではハイブリダイゼーションに要する時間は２時間から２４時間であり、洗浄工程に要する時間は１０〜６０分である。これに対して、本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法では、染色と洗浄に要する時間は３０分程度である。また、ＦＩＳＨ法におけるハイブリダイゼーション工程と洗浄工程では温度を厳密に管理する必要があるが、本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法はすべて室温下で作業することができる。これらの点から本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法は、生物膜中の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出時間を大幅に短縮できるだけでなく、作業性も改善できる。したがって、本発明の嫌気性アンモニア酸化細菌の検出方法を排水処理場での嫌気性アンモニア酸化細菌の検出試験に適用することで、排水処理場における嫌気性アンモニア酸化細菌を短時間で容易に検出することができる。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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