(57)【要約】【課題】簡単な操作で、微生物の蛍光染色を成し得るデバイスを提供すること。【解決手段】水性ゲル基材に蛍光性の色素が含浸されてなる微生物蛍光染色デバイス。この蛍光染色デバイスを、スライドガラスに固定した微生物に接触させることにより染色する。この方法によれば、通常の蛍光染色法で必要な脱色操作をしなくても蛍光顕微鏡で明瞭に観察できる。液体の染色剤でないので、取り扱いが容易であり、染色剤が飛び散って、器具や衣服等を汚染するようなことがない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル基材に蛍光性の色素が含浸されてなる微生物蛍光染色デバイス。
【請求項２】
ゲル基材がアガロース、カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ポリアクリルアミド又はセルロースである請求項１のデバイス。
【請求項３】
さらに、防腐剤、ｐＨ調整剤又は無機酸塩類を含む請求項１又は２のデバイス。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載の蛍光染色デバイスを、スライドガラスに固定した微生物に接触させることによりを染色し、これを観察することを特徴とする微生物の検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の蛍光染色検出に用いるデバイスに関する。さらに詳しくは、操作が簡便でかつ脱色工程が不要となる蛍光染色デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物においては、菌種の推定等のために、その形態を鑑別することは非常に重要である。形態観察は、グラム染色法等により微生物を染色し、顕微鏡で観察する方法が一般的である。また、結核菌や、真菌類、および原虫類では、細胞壁構造が特殊なため、その特性を利用し、蛍光染色による識別が行われる。例えば、結核菌類は、ほかの細菌類と染色性および脱色性が異なり、強力に染色されたのち、酸やアルコール処理により脱色されにくく、真菌類では細胞壁の構成多糖類が異なり色素特異的に染色されるので、蛍光染色により、結核菌や真菌、および原虫であることを識別できる。また、これらの微生物は発育が遅いため、検体中に微量しか存在しないことがあるが、蛍光染色を用いると、視野中の菌量が少ないときでも菌体を見つけやすい、染色時間が短い等の利点もある。
【０００３】
従来の染色法においては、通常、微生物特有の構成成分に強く結合するクリスタルバイオレット、オーラミンＯ、カルボールフクシン等の染色剤を作用させ、その後アルコール、ピクリン酸、塩酸アルコール等により脱色を行い、乾燥および対比染色後、光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡で観察を行う。この時、特定の蛍光染料に特異的に結合する構成成分を有する微生物のみが染色されて、検出可能な微生物像が得られる。
【０００４】
従来の染色液を用いた、微生物の蛍光染色では、染色液を、直接スライドガラス上に固定した微生物の上にスポイトやピペットで滴下して行うが、染色液は染料が水、エタノール等に溶存した液体であることから、周囲に飛散し、実験設備等を汚染するといった問題点がある。染色後の脱色に用いる脱色液も同様である。また、色素を含んだ液体であるため、液が飛び散り衣服等に付着・汚染する。染色剤は特殊な化学物質であるため廃液処理の問題もある。
【０００５】
さらに、例えば、グラム染色したのち、スライドガラス上の特定の部分、例えば試料を塗付した標本領域の半分のみなどを蛍光染色して対比観察するような場合、染色液が液体であるために、スライドグラスの上で流れてしまい、染色範囲を限定することが困難で、所望の対比観察することができないという問題点がある。また、１つの材料について異なる染色を行う場合、各別に標本を作製し、各々について、異なる染色を行う必要があるが、この作業労力が容易でない。
【０００６】
蛍光染色法の作業を簡素化する方法として、例えば特許文献１には、顕微鏡スライドに可撓性の膜又はフィルムを取り付け、そのいずれかの相対する面に染色剤を配した染色装置が開示されている。しかしながら、この方法では、スライドグラス上に固定された微生物がフィルムの粘着剤等により剥がれてしまう可能性があり、ごく微量の菌を検出するには検出感度の点で問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００１−５１５２１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、簡単な操作で、微生物の蛍光染色を成し得るデバイスを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
斯かる実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った。まず、染色液をゲル基材に混和含浸させた、染色ゲル基材を、直接スライドグラス上の被検体上に置くことで、蛍光染色が可能となることを見出した。さらに、全く意外にも、通常の染色液の場合には脱色操作が必要であったにもかかわらず、本方法を用いて染色した場合には、当該目的菌のみが明瞭に染色され、脱色操作を必要とせずとも明瞭な蛍光染色像が得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
１．ゲル基材に蛍光性の色素が含浸されてなる微生物蛍光染色デバイス。
２．ゲル基材がアガロース、カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ポリアクリルアミド又はセルロースである前記１のデバイス。
３．さらに、防腐剤、ｐＨ調整剤又は無機酸塩類を含む前記１又は２のデバイス。
４．前記１〜３の何れか１項記載の蛍光染色デバイスを、スライドガラスに固定した微生物に接触させることによりを染色し、これを観察することを特徴とする微生物の検出法。
【発明の効果】
【００１１】
微生物の蛍光染色において、本発明の染色デバイスをスライドガラス上に固定した微生物の上に置くだけで、微生物を染色することが可能となる。本発明の染色デバイスを用いることにより、染色液の飛散による染色時の汚染をなくすることができる。また、脱色操作をしなくとも、簡単な操作で微生物の蛍光染色を行うことが出来る。さらに、既に別の染色操作がなされたスライドガラス上の試料塗布した特定の部分のみを蛍光染色し、対比観察することも可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に用いる、染色液を含浸させるゲル基材としては、水性ゲル基材が好ましい。ゲル基材としては、例えば、アガロース、カラギーナン、キサンタンガム、ゼラチン、ポリアクリルアミド、セルロース等が挙げられる。このうち、加工性の点からアガロースが好ましい。本発明のゲル基材の濃度としては、０．１〜１０質量％が好ましく、０．５〜５質量％がより好ましく、１％〜２質量％が特に好ましい。
【００１３】
本発明に用いる、蛍光色素としては、従来微生物の蛍光染色に用いられてものであれば特に制限はない。例えば、Ｕｖｉｔｅｘ  ２Ｂ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒ  ３５１：ＣＡＳ  Ｎｏ．２７３４４−４１−８）、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ  Ｍ２Ｒ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒ  ２８：ＣＡＳ  Ｎｏ．４４０４−４３−７）、アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、蛍光性直接染料などの蛍光色素が挙げられる。このうち染色および蛍光観察のしやすさの点からＵｖｔｅｘ  ２Ｂが好ましい。本発明の蛍光色素のゲル中の濃度としては、０．００１〜０．５質量％が好ましく、より好ましくは０．００５〜０．５質量％、特に好ましくは０．０１％〜０．１質量％である。
【００１４】
本発明の染色デバイスには、保存の点でさらに防腐剤、無機酸塩類、ｐＨ緩衝剤等を添加することが好ましい。防腐剤としては、例えば、Ｐｒｏ  Ｃｌｉｎ、アジ化ナトリウム、安息香酸またはその塩等が例示できる。無機酸塩類としては、例えば、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が例示できる。ｐＨ緩衝剤としては、例えばリン酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、グッドバッファー等が例示できる。
【００１５】
本発明のデバイスは、例えば、次のようにして製造することができる。粉末状の水性ゲル基材を水又は緩衝液に溶解する。溶解は加温して行うのが好ましい。別に、染色剤、防腐剤、無機酸塩類、ｐＨ緩衝剤等の必要な剤を水又は緩衝液に分散又は溶解する。両者を混合して、染色剤等が溶解している水性ゲル基材の溶液を得る。ゲル基材は溶解に温度と時間を要するので、染色剤等の剤とは別々に溶解した方が、剤に必要以上の熱負荷を与えないので、好ましいが、一つの液でゲル基材と他の剤を同時に溶解することも可能である。
【００１６】
このようにして得た染色剤を含むゲル基材溶液を、例えば、ポリエステル、ポリエチレン、ポリスチレン、テフロン（登録商標）、アクリル、ポリ乳酸、ポリカーボネート等のフィルムやシート、あるいはガラスの上に流して、冷却して固化する。アクリルアミドのような場合は、レドックス触媒のような必要な固化剤を加える。固化したゲルはフィルムやシートから剥がして、又は剥がさずに付着させたまま、必要に応じて所望の形状、大きさに裁断して、本発明の染色デバイスとすることができる。ゲルの厚さに特に制限はないが、通常１〜１０ｍｍである。
【００１７】
本発明のデバイスを使用して染色を行うには、スライドグラス等に固定した微生物の検体に本発明のデバイスを直接載せて接触させるだけでよい。微生物の固定は常法どおり、バーナーで炙ったり、メタノール滴下により行う。接触時間は染色が十分に行われる時間であれば特に制限はない。通常１〜２分である。
このようにして染本発明のデバイスを用いて染色すると、通常は必要な脱色をおこなうことなく、染色された微生物を観察することが可能である。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
［染色デバイスの作製］
以下に示す組成のＡ液を、混合して、８０℃の温浴中で保温した。同様に、以下に示す組成のＢ液を、３００Ｗの電子レンジを用い、撹拌しながら完全に溶解し、８０℃の温浴中で保温した。Ａ液とＢ液を混合して十分に混和した後、水平な机に設置したポリエステルフィルム上に厚さが約５ｍｍになるように塗布し、冷却して固化させた。固化させたものは１ｃｍ角程度にポリエステルフィルムごと裁断し、本発明の染色デバイスを作製した。
【００１９】
Ａ液
Ｕｖｉｔｅｘ  ２Ｂ                      ４０ｍｇ
硫酸ナトリウム                        ５００ｍｇ
ユニオナールＬ                            １μｌ
Ｐｒｏ  Ｃｌｉｎ  ２００                ５０μｌ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０    ２５ｍｌ
Ｂ液
アガロース                            ７５０ｍｇ
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０    ２５ｍｌ
【００２０】
実施例２
［染色試験］
別々のスライドガラス上に、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ  １０２３１およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  １６４０４を火炎固定したものを、各２枚作成した。２枚のスライドガラスのうち一方は予めグラム染色を行い、他方はそのまま試験に供した。
各スライドグラス上の菌が塗布固定された箇所に本発明染色デバイスを密着させ、１分間静置した。その後、染色デバイスを取り除き、蛍光顕微鏡にて観察を行った。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
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「良好」明瞭な染色像が得られたことを意味する
【００２２】
表１に示すように、本発明染色デバイスでは、スライドガラス上の微生物を脱色操作なしに簡便かつ迅速に蛍光染色することができた。また、既に別の染色操作されたスライドガラスにおいても、同様に染色することが出来、簡便かつ迅速に対比観察可能であることを示した。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明の蛍光染色デバイスは、簡便な操作で微生物を染色でき、微生物の同定に極めて有用である。