(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍の診断および治療に有用な抗体並びに抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応し、リン酸化されたセリンのリン酸化ｐ６２蛋白質を認識し、リン酸化されていないセリンの非リン酸化ｐ６２蛋白質を認識しない抗リン酸化ｐ６２抗体を利用する、腫瘍の診断及び治療。そのリン酸化を阻害する物質、または脱リン酸化する物質をスクリーニングすることによって得る、抗腫瘍剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されている、単離されたリン酸化ｐ６２タンパク質、または前記リン酸化セリンを有する一部。
【請求項２】
請求項１に記載のリン酸化ｐ６２タンパク質を認識し、前記セリンがリン酸化されていない非リン酸化ｐ６２タンパク質を認識しない抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体またはその一部をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のＤＮＡを含み、請求項１または２に記載の抗体またはその一部を発現することができる発現ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡを有し、請求項２に記載の抗体またはその一部を発現する細胞。
【請求項６】
請求項２に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
請求項２に記載の抗リン酸化ｐ６２抗体を含有する、腫瘍の診断剤。
【請求項８】
前記腫瘍が肝がんであることを特徴とする、請求項７に記載の診断剤。
【請求項９】
請求項２に記載の抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部、請求項４に記載の発現ベクター、または請求項５に記載の細胞を含有する、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の医薬組成物を含有する、抗腫瘍剤。
【請求項１１】
治療対象とする腫瘍が、肝がんである、請求項１０に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
ｐ６２タンパク質に対し、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンのリン酸化を阻害する物質、リン酸化された前記セリンを脱リン酸化する物質をスクリーニングする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のリン酸化ｐ６２タンパク質とＫｅａｐ１の結合を阻害する物質をスクリーニングする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記抗腫瘍剤の治療対象とする腫瘍が、肝がんである、請求項１２または１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されている、単離された変異ｐ６２タンパク質、または前記変異アミノ酸を有する一部。
【請求項１６】
配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがグリシンまたはアラニンで置換されている、単離された変異ｐ６２タンパク質、または前記変異アミノ酸を有する一部。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の前記変異ｐ６２タンパク質、または前記変異アミノ酸を有する一部をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の診断剤、医薬組成物及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｒｆ２（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ２）は転写因子の一つであるが、細胞がストレスを受けていない状態では、ユビキチンＥ３リガーゼアダプター蛋白質Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ  ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）に捕獲され、ユビキチン化を受けることによりプロテアソームによって恒常的に分解されている。しかし、所定のストレス状態では、Ｋｅａｐ１が修飾され、Ｎｒｆ２との結合が阻害されるため、Ｎｒｆ２は核内に蓄積し、一連の抗酸化タンパク質および解毒酵素の遺伝子発現を誘導するという生体防御システムが構築される。一部の肺がんなどでは、Ｎｒｆ２またはＫｅａｐ１に変異が生じ、これらの相互作用ができなくなった結果、抗がん剤耐性を獲得していることが知られていた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、選択的オートファジーのアダプター分子として知られるｐ６２は、Ｋｅａｐ１に対して、Ｎｒｆ２が結合する領域と共通のドメイン（ａａ３０９−６２４）に結合することができる。したがって、オートファジーの減弱、もしくはp６２の過剰発現により、細胞内にｐ６２が蓄積した場合には、Ｋｅａｐ１とＮｒｆ２の結合は競合阻害を受け、遊離されたＮｒｆ２が上記の生体防御システムを発動する（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。
【０００４】
これまでに、ｐ６２は、肝臓がんやグリオーマなどの悪性腫瘍において過度に蓄積することが知られていた。そこでは、Ｋｅａｐ１とｐ６２の結合増加が、悪性化した肝臓がんの増殖に有利に働くことが示唆され、両者の結合阻害ががん治療のターゲットと考えられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／０８３６３７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Komatsu M. et al., Nat. Cell Biol. 2010 vol.12 p.213-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腫瘍の診断および治療に有用な抗体並びに抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
マウスｐ６２のＫｅａｐ１結合領域（ａａ３４６−３５９）（以下、ＫＩＲという。）は生物種間で高く保存されており、そこに存在するＳＴＧＥのアミノ酸配列を用いてＫｅａｐ１と相互作用している。しかしながら、ｐ６２ＫＩＲとＫｅａｐ１の結合親和性は、Ｎｒｆ２より著しく低いことが生化学的解析で示されており、細胞内でのＫｅａｐ１とｐ６２の結合のメカニズムは明らかではなかった。本発明者らは、配列番号１のｐ６２のアミノ酸配列における３５１番目のセリンがリン酸化されることで、ＫＩＲのＫｅａｐ１−ＤＣドメインに対する結合親和性がＮｒｆ２−ＥＴＧＥのＫｅａｐ１−ＤＣドメインに対する結合親和性と同程度まで増強されることを見出し、本発明の完成に至った
本発明の一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されている、単離されたリン酸化ｐ６２タンパク質、または前記リン酸化セリンを有する一部である。
【０００９】
本発明の他の一実施形態は、前記リン酸化ｐ６２タンパク質を認識し、前記セリンがリン酸化されていない非リン酸化ｐ６２タンパク質を認識しない抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部である。
【００１０】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記抗体またはその一部をコードするＤＮＡである。
【００１１】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記ＤＮＡを含み、前記抗体またはその一部を発現することができる発現ベクターである。
【００１２】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記ＤＮＡを有し、前記抗体またはその一部を発現する細胞である。
【００１３】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１４】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記抗リン酸化ｐ６２抗体を含有する、腫瘍の診断剤である。前記腫瘍が肝がんであってもよい。
【００１５】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部、前記発現ベクター、または前記細胞を含有する、医薬組成物である。この医薬組成物が、抗腫瘍剤であってもよい。この抗腫瘍剤の治療対象とする腫瘍が、肝がんであってもよい。
【００１６】
本発明のさらに他の一実施形態は、ｐ６２タンパク質に対し、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンのリン酸化を阻害する物質、リン酸化された前記セリンを脱リン酸化する物質をスクリーニングする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法である。
【００１７】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記リン酸化ｐ６２タンパク質とＫｅａｐ１の結合を阻害する物質をスクリーニングする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法である。
【００１８】
前記いずれのスクリーニング方法においても、前記抗腫瘍剤の治療対象とする腫瘍が、肝がんであってもよい。
【００１９】
本発明のさらに他の一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されている、単離された変異ｐ６２タンパク質、または前記変異アミノ酸を有する一部である。
【００２０】
本発明のさらに他の一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがグリシンまたはアラニンで置換されている、単離された変異ｐ６２タンパク質、または前記変異アミノ酸を有する一部である。
【００２１】
本発明のさらに他の一実施形態は、前記変異ｐ６２タンパク質、または前記変異アミノ酸を有する一部をコードするＤＮＡである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、腫瘍の診断および治療に有用な抗体並びに抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】様々な種におけるｐ６２のホモログ（配列番号１１〜１９）のＫｅａｐ１−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ（ＫＩＲ）およびＬＣ３認識配列（ＬＲＳ）のアライメントを示す図である。黒およびグレーを付した部分は、それぞれ、完全保存および部分的保存の同一のアミノ酸配列を示す（上から、マウス、ラット、ヒト、オランウータン、ウシ、ネッタイツメガエル、アフリカツメガエル、フグ、ゼブラフィッシュのｐ６２を示す）。
【図２】等温滴定熱量測定による、Ｋｅａｐ１−ＤＣ（配列番号２４）と、非リン酸化ｐ６２−ＫＩＲ（配列番号２１）、リン酸化ｐ６２−ＫＩＲ、またはＮｒｆ２−ＥＴＧＥモチーフ（配列番号２６）との結合等温線を示す図である。
【図３】Ｓｔｒｅｐタグを付けたｐ６２をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎにより得た沈殿物に対してラムダタンパク質ホスファターゼ（Ｌａｍｄａ  ＰＰ）で処理したもの(＋)、および処理していないもの（−）を準備し、抗ｐ６２抗体および抗リン酸化ｐ６２抗体をそれぞれ用いて行なったイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図４】ＦＬＡＧタグを付けたｐ６２ｗ．ｔ．（配列番号１）（正常型ｐ６２）、アデノウイルス感染系を用いて３５１番目のセリンをグルタミン酸に置換したＳ３５１Ｅ（配列番号２）（疑似リン酸化型ｐ６２）、３５１番目のセリンをアラニンに置換したＳ３５１Ａ（配列番号４）（非リン酸化型ｐ６２）、および３５２番目のトレオニンをアラニンに置換したＴ３５２Ａ（配列番号６）（Ｋｅａｐ１との結合能の欠損型ｐ６２）を過剰発現させたマウスの正常肝細胞から調製した抽出液のイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図５】ＦＬＡＧタグを付けたＫｅａｐ１（配列番号２３）をＧＦＰ、ＧＦＰ−ｐ６２ Ｓ３５１Ｅ（配列番号２）またはＧＦＰ−ｐ６２ Ｓ３５１Ａ（配列番号４）と共発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抽出液における、ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降物のイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図６】抗ｐ６２抗体と抗リン酸化ｐ６２抗体と、または抗リン酸化ｐ６２抗体とＫｅａｐ１とにより免疫染色した、ＨＣＣの画像である。バー：１０μｍ
【図７】Ｈｕｈ−１親株、Ｈｕｈ−１＿ｐ６２−／−、または野生型ｐ６２（配列番号７）又はｐ６２変異型（ｐ６２Ｓ３４９Ｅ（配列番号８）、Ｓ３４９Ａ（配列番号９）またはＴ３５０Ａ（配列番号１０））を導入したＨｕｈ１＿ｐ６２−／−細胞を、それぞれヌードマウスの皮下に移植した。（ａ）移植から５０日後のマウスおよびマウスから取り出した腫瘍の画像である。（ｂ）移植から５０日後の腫瘍の容積（左）および重量（右）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２６】
＝＝リン酸化ｐ６２タンパク質＝＝
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されている、単離されたリン酸化ｐ６２タンパク質、または前記リン酸化セリンを有する一部である。
【００２７】
「ｐ６２（またはｐ６２タンパク質）」は、ユビキチン結合タンパク質として知られている。ｐ６２のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列の情報は、一般に利用可能な配列データベースから入手することができる。それらのデータベースのアクセッション番号のいくつかをここに記載する。［データベース名称：アクセッション番号（種名）］：ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００３８９１．１（ヒト）、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００３９００．４（ヒト）、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿０３５１４８．１（マウス）、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿０１１０１８．２（マウス）Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ：００８６２３．１（ラット）、ＮＣＢＩ：ＮＰ＿７８７０３７．２（ラット）、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿１７５８４３．３（ラット）、Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ：Ｑ５ＲＢＡ５．１（オランウータン）。本明細書中で「ｐ６２」という場合、ｐ６２の種々（例えば、哺乳動物種（例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラットなど）、は虫類、両生類、魚類など。）のホモログが含まれるものとする。そのようなホモログのアミノ酸配列は、例えば、マウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号１）に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、もしくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはマウスｐ６２のアミノ酸配列（配列番号１）において１〜数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる。
【００２８】
本明細書において「リン酸化ｐ６２タンパク質」とは、３５１番目のセリンがリン酸化されたマウスｐ６２（配列番号１）、またはこのセリンに対応するセリン（ラットｐ６２では３４８番目のセリン、ヒトｐ６２（配列番号７）では３４９番目のセリン、オランウータンｐ６２では３４９番目のセリン、ウシｐ６２では３４９番目のセリン、ネッタイツメガエルｐ６２では３５５番目のセリン、アフリカツメガエルｐ６２では３５７番目のセリン、フグｐ６２では３３２番目のセリン、ゼブラフィッシュｐ６２では２６０番目のセリン）がリン酸化されているマウス以外の哺乳動物種（例：ヒト、サル、ウシ、ラット等）もしくはその他の種（例：は虫類、両生類、魚類等）のｐ６２のホモログを意味する。
【００２９】
また、本明細書において「リン酸化セリンを有する一部」とは、リン酸化された、マウスｐ６２における３５１番目のセリン、またはｐ６２のホモログにおいて対応するリン酸化セリンを有する、単離されたｐ６２の一部を意味する。ここで、「一部」とは、アミノ酸が２個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは１０個以上、さらに好ましくは５０個以上からなるペプチドであればよく、また、４００個以下、好ましくは３００個以下、より好ましくは２００個以下、さらに好ましくは１００個以下からなるペプチドであればよい。
【００３０】
また、本明細書において、「単離された」とは生体内に存在するものではないということを意味し、製造方法については限定されない。従って、細胞から抽出されたものであっても、化学的に合成されたものであっても、生体外にあればよく、その製法によっては限定されない。
【００３１】
なお、本発明のタンパク質またはその一部は、マウスｐ６２における３５１番目のセリン、またはｐ６２のホモログにおいて対応するセリンが、グルタミン酸またはアスパラギン酸に置換され、リン酸化ｐ６２タンパク質を模した変異ｐ６２タンパク質（本明細書では「疑似リン酸化ｐ６２変異タンパク質」と呼ぶ）（例えば、マウスｐ６２の場合、配列番号２または３）、または当該セリンが、アラニンまたはグリシンに置換され、非リン酸化ｐ６２タンパク質を模した変異ｐ６２タンパク質（本明細書では「疑似非リン酸化ｐ６２変異タンパク質」と呼ぶ）（例えば、マウスｐ６２の場合、配列番号４または５）であってもよく、変異アミノ酸を有する変異ｐ６２タンパク質の一部であってもよい。
【００３２】
以上に記載したタンパク質またはその一部は、化学合成されたものであってもよく、大腸菌や哺乳類培養細胞などで発現させた組換えタンパク質や組換えペプチドであってもよい。当業者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを含み、常法によって組換えタンパク質や組換えペプチドを作製できる。
【００３３】
なお、本明細書において「Ｋｅａｐ１相互作用領域（Ｋｅａｐ１−Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：ＫＩＲ）」とは、マウスｐ６２（配列番号１）のアミノ酸配列中の３４６番目〜３５９番目のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列の領域（配列番号２０）、またはマウス以外の哺乳動物種（例：ヒト、サル、ウシ、ラット等）もしくはその他の種（例：は虫類、両生類、魚類等）のｐ６２のアミノ酸配列中の上記部分アミノ酸配列の領域に対応する高度に保存されたアミノ酸配列の領域であって、Ｋｅａｐ１と特異的に結合するｐ６２上の領域を指すものとする（図１を参照）。
【００３４】
Ｋｅａｐ１（Ｋｅｌｃｈ-ｌｉｋｅ  ＥＣＨ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）のアミノ酸配列またはそれをコードするヌクレオチド配列の情報は、一般に利用可能な配列データベースから入手することができる。それらのデータベースにおけるアクセッション番号のいくつかをここに記載する。［データベース名称：アクセッション番号（種名）］：Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ：Ｑ１４１４５．２（ヒト）、Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ：Ｑ９Ｚ２Ｘ８．１（マウス）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ３４６３９．１（マウス）、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２００６３．１（マウス）、Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ：Ｑ６８４Ｍ４．１（ブタ）。本明細書中で「Ｋｅａｐ１」という場合、ｋｅａｐ１の種々（例えば、哺乳動物種（例：ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラットなど）、は虫類、両生類、魚類など。）のホモログが含まれるものとする。そのようなホモログのアミノ酸配列は、例えば、ヒトＫｅａｐ１のアミノ酸配列（配列番号２５）に対して、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、もしくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはヒトＫｅａｐ１のアミノ酸配列において１〜数個（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、もしくはそれ以上）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる。
【００３５】
＝＝抗リン酸化ｐ６２抗体＝＝
本明細書中、「抗リン酸化ｐ６２抗体」とは、マウスｐ６２（配列番号１）においては３５１番目のセリン、または他の動物種においては当該セリンに対応するセリンがリン酸化されたリン酸化ｐ６２タンパク質を認識し、マウスｐ６２においては３５１番目のセリン、または他の動物種においては当該セリンに対応するセリンがリン酸化されていないｐ６２タンパク質（本明細書では「非リン酸化ｐ６２タンパク質」と称する）を認識しない抗体を意味する。この抗体は、リン酸化ｐ６２タンパク質と結合するが、非リン酸化ｐ６２タンパク質とは結合しない抗体、あるいは、リン酸化ｐ６２タンパク質と反応するが、非リン酸化ｐ６２タンパク質とは反応しない抗体であってもよい。また、抗体が認識する対象のｐ６２の由来する動物種は特に限定されないが、哺乳類であることが好ましく、マウス、ラット、ヒトのｐ６２であることがより好ましい。なお、抗体の抗原認識についての種特異性は特に限定されず、例えば、ヒトｐ６２についてのみリン酸化ｐ６２と非リン酸化ｐ６２を識別できる抗体、マウスｐ６２についてのみリン酸化ｐ６２と非リン酸化ｐ６２を識別できる抗体、ヒトとヒト以外のｐ６２についてリン酸化ｐ６２と非リン酸化ｐ６２を識別できる抗体（例えば、ヒトとマウスについてリン酸化ｐ６２と非リン酸化ｐ６２を識別できる抗体や、ヒトとサルについてはリン酸化ｐ６２と非リン酸化ｐ６２を識別できるが、マウスについては識別できない抗体）、など、様々な認識パターンが考えられる。
【００３６】
抗リン酸化ｐ６２抗体は、リン酸化ｐ６２タンパク質に対して高い結合親和性を有している抗体であって、結合定数（Ｋａ）が１０９Ｍ-１以上、好ましくは１０１０Ｍ-１以上、より好ましくは１０１１Ｍ-１以上であることが好ましい。また、非リン酸化ｐ６２タンパク質に対しては低い結合親和性を有している抗体であって、結合定数（Ｋａ）が１０４Ｍ-１以下、好ましくは１０３Ｍ-１以下、より好ましくは１０２Ｍ-１以下であることが好ましい。なお、抗リン酸化ｐ６２抗体は、疑似リン酸化ｐ６２変異タンパク質を認識し、非リン酸化ｐ６２タンパク質を認識しないことが好ましい。
【００３７】
また、この抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でもよく、ヒト型抗体等の人工抗体であっても構わない。これらの抗体は、当業者には明らかな製造方法に従って製造することができる。抗体産生に用いる抗原としては、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンがリン酸化されている、単離されたリン酸化ｐ６２タンパク質、または前記リン酸化セリンを有する一部などが使用できる。リン酸化セリンのかわりにアスパラギン酸やグルタミン酸を導入した疑似リン酸化ｐ６２変異タンパク質または当該アスパラギン酸やグルタミン酸を有する一部を用いてもよい。これらペプチドの詳細は、上述した通りである。抗体は、リン酸化ｐ６２タンパク質抗原カラムの吸着画分を、さらに非リン酸化ｐ６２タンパク質抗原カラムへ通した溶出画分を得る方法により、最終的に、非リン酸化ｐ６２タンパク質は認識せずにリン酸化ｐ６２タンパク質を認識する抗体を精製することが可能である。
【００３８】
本明細書中、「抗リン酸化ｐ６２抗体の一部」とは、可変領域を含む抗原結合断片を意味し、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ´）２フラグメント等が例示できる。これらのフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体をタンパク質分解酵素によって部分消化することにより得ることができる。なお、タンパク質分解酵素としては、FabフラグメントやＦ（ａｂ´）２フラグメントを得ることができるものであればどのようなものであってもよいが、例えば、ペプシン、フィシン等の分解酵素を用いることができる。
【００３９】
さらに他の実施態様として、抗リン酸化ｐ６２抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ、またはそのＤＮＡを有し、抗リン酸化ｐ６２抗体またはそのフラグメントを発現する発現ベクターが挙げられる。これらのＤＮＡや発現ベクターは、当業者には明らかな製造方法に従って製造することができる。
抗リン酸化ｐ６２抗体またはそのフラグメントは、大腸菌や哺乳類の培養細胞などで機能するプロモーターを用いて発現ベクターを作製し、宿主細胞内に導入して抗体やそのフラグメントを発現させ、精製することによって作製しても良い。その際、シグナルペプチドを付加し、細胞外に分泌させるのが好ましい。
【００４０】
＝＝腫瘍の診断剤＝＝
Ｋｅａｐ１−ＤＣに対する結合定数（Ｋａ）は、実施例に示すように、非リン酸化ｐ６２のＫＩＲが（５．６７±１．１９）x１０４Ｍ-１、Ｎｒｆ２−ＥＴＧＥが（６．８３±２．１６）x１０６Ｍ-１であるので、非リン酸化ｐ６２が存在しても、通常はＫｅａｐ１とＮｒｆ２が優先的に結合している。しかしながら、リン酸化ｐ６２−ＫＩＲのＫｅａｐ１−ＤＣに対する結合定数は（５．１２±１．８０）x１０６Ｍ-１であり、非リン酸化ｐ６２のＫＩＲより約１００倍高く、Ｋｅａｐ１−ＤＣとＮｒｆ２−ＥＴＧＥの結合定数と同レベルである。従って、ｐ６２は、リン酸化されることによって、Ｎｒｆ２と共存していてもＫｅａｐ１と結合できるようになり、Ｎｒｆ２が遊離する。そして遊離Ｎｒｆ２はその標的遺伝子群の発現を促すため、悪性化したがんの増殖において有利に働く。
【００４１】
このように、がん細胞内で、リン酸化ｐ６２が多く存在するほど、遊離Ｎｒｆ２は増加する。したがって、リン酸化ｐ６２を検出又は定量することにより、腫瘍の悪性化を診断することができる。
【００４２】
具体的には、一定時間をおいて、２回またはそれ以上、患者の腫瘍細胞におけるリン酸化ｐ６２を定量し、リン酸化ｐ６２の量、または全体のｐ６２に対する割合が増加していれば、その腫瘍は悪性化しており、減少していれば良化していると判断できる。そして、この方法を用いれば、抗がん剤の有効性を確認することもできる。つまり、抗がん剤を投与した前後で患者の腫瘍細胞におけるリン酸化ｐ６２を定量し、リン酸化ｐ６２の量、または全体のｐ６２に対する割合が増加していればその腫瘍に有効でなく、減少していれば有効であると判断できる。そして、この有効性に基づいて、使用する抗腫瘍剤を選択することができる。Ｎｒｆ２の標的遺伝子群には、多剤排出トランスポーター遺伝子が含まれており、一部の肺癌細胞ではＮｒｆ２の活性化を介した抗腫瘍剤耐性が知られている。したがって、リン酸化ｐ６２の減少を指標として選択された抗腫瘍剤は、薬剤耐性を起こしにくい薬剤であるとも言える。
【００４３】
リン酸化ｐ６２の検出方法は、特に限定されないが、抗体を用いるアッセイ、すなわち免疫アッセイであることが好ましく、例えばイムノブロッティンブ法、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織染色法が挙げられる。
【００４４】
抗リン酸化ｐ６２抗体は、このように、簡便にリン酸化ｐ６２を検出し、又は定量することができるので、腫瘍の診断剤として有用である。
【００４５】
＝＝医薬組成物＝＝
本発明にかかる医薬組成物は、抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部、抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部をコードするＤＮＡを含み、抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部を発現することができる発現ベクター、抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部をコードするＤＮＡを有し、抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部を発現する細胞を含有し、例えば、抗腫瘍剤として用いることができる。この抗リン酸化ｐ６２抗体またはその一部は、リン酸化ｐ６２タンパク質がＫｅａｐ１に結合することを阻害する阻害抗体であることが好ましく、特にＫｅａｐ１−ＤＣドメイン（例えば、ａａ３０９−６２４（配列番号２７）の領域や、ａａ３２１-６０９（配列番号２４）の領域）に結合することを阻害する阻害抗体であることが好ましい。
【００４６】
医薬組成物の投与対象は、脊椎動物であれば特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。例えば、腫瘍患者に本発明の医薬組成物を投与することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制させることが期待できる。抗腫瘍剤の治療対象とする腫瘍としては、特に限定されないが、ｐ６２のリン酸化によって悪性化している腫瘍であればよいが、肝がんであることが好ましい。
【００４７】
この医薬組成物は、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加し、錠剤、粉剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などに剤形化しても良く、これにより、抗腫瘍剤を製造することができる。ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される医薬の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択して用いることができる。例えば、医薬が溶液形態として調製される場合、担体として、精製水（滅菌水）または生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。また、この医薬には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含ませることができる。医薬の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤等の非経口投与形態が好ましい。特に注射剤や点滴剤として用いる場合は、必要に応じて塩溶液、ブドウ糖やアミノ酸等の通常の補液などと混合して静脈内、筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内に投与する。この医薬は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗腫瘍剤や、症状を緩和する薬剤など）と組み合わせて使用してもよい。
【００４８】
＝＝抗腫瘍剤のスクリーニング方法＝＝
本発明にかかる抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、ｐ６２タンパク質に対し、候補物質が、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、または当該セリンに対応するセリンのリン酸化を阻害できるかどうか、あるいはリン酸化されたセリンを脱リン酸化できるかどうかを評価することにより行なうことができる。また、候補物質が、リン酸化ｐ６２タンパク質とＫｅａｐ１の結合を阻害するかどうかを評価することによっても行うこともできる。実施例で示すように、これらの物質は、腫瘍細胞の増殖を抑制するのに有効である。よって、本発明にかかるスクリーニング方法によれば、抗腫瘍剤を効率的に得ることが可能になる。抗腫瘍剤の治療対象とする腫瘍としては、特に限定されないが、ｐ６２のリン酸化によって悪性化している腫瘍であればよく、例えば、肝がんであることが好ましい。また、候補物質は特に限定されず、抗体などのタンパク質や高分子であっても、化合物などの低分子であっても構わない。
【００４９】
具体的なスクリーニング方法は、当業者が適宜設計することができるが、例えば、候補物質を、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリンがリン酸化されたリン酸化ｐ６２を有するマウス培養細胞に添加し、添加前後で、リン酸化ｐ６２の量を測定し、その量が、投与前より投与後に低下すれば、その化合物は抗腫瘍剤の可能性を有する。リン酸化ｐ６２タンパク質の量は、リン酸化ｐ６２タンパク質を認識し、当該セリンがリン酸化されていない非リン酸化ｐ６２タンパク質を認識しない抗リン酸化ｐ６２抗体を用いてイムノブロッティング等を行うことにより定量することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００５１】
＜実施例１＞
本実施例では、ｐ６２がリン酸化することにより、Ｋｅａｐ１に対する結合親和性が増強することについて示す。
【００５２】
（１）細胞外におけるリン酸化ｐ６２のＫｅａｐ１に対する結合親和性
等温滴定熱量測定によりマウスＫｅａｐ１−ＤＣ（ａａ３２１-６０９、配列番号２４）と、非リン酸化マウスｐ６２のＫＩＲ（配列番号２１）、リン酸化マウスｐ６２のＫＩＲ（配列番号２１）、およびマウスＮｒｆ２のＥＴＧＥモチーフ（配列番号２６）との相互作用の結合等温線を作成した（図２）。
【００５３】
まず、ＭｉｃｒｏＣａｌｉＴＣ２００システム（ＧＥヘルスケア社）を用いて等温滴定熱量測定を２５℃で行なった。０．１ｍＭ非リン酸化ＫＩＲ（348ＶＤＰＳＴＧＥＬＱ356、配列番号２１）を２．５μｌずつ、攪拌シリンジ（１０００ｒｐｍ）から２００μｌの０．１ｍＭ Ｋｅａｐ１−ＤＣに３分間隔で１６回投入した。０．６ｍＭリン酸化ＫＩＲ（348ＶＤＰ（ｐＳ）ＴＧＥＬＱ356）を１．３μｌずつ、攪拌シリンジ（１０００ｒｐｍ）から２００μｌの０．０６ｍＭ Ｋｅａｐ１−ＤＣに２分間隔で３０回投入した。０．４ｍＭＮｒｆ２−ＥＴＧＥモチーフ（７６ＬＤＥＥＴＧＥＦＬ８４、配列番号２６）を１μｌずつ、攪拌シリンジ（１０００ｒｐｍ）から２００μｌの０．０４ｍＭ Ｋｅａｐ１−ＤＣ（配列番号２４）に２分間隔で４０回投入した。結合データはＯｒｉｇｉｎ７（ＧＥヘルスケア社）を用いて解析した。
【００５４】
＝＝結果＝＝
Ｋｅａｐ１−ＤＣに対する結合定数（Ｋａ）はそれぞれ、非リン酸化ＫＩＲが（５．６７±１．１９）x１０４Ｍ-１、リン酸化ｐ６２−ＫＩＲが（５．１２±１．８０）x１０６Ｍ-１、Ｎｒｆ２−ＥＴＧＥが（６．８３±２．１６）x１０６Ｍ-１であった。
【００５５】
Ｋｅａｐ１−ＤＣに対する結合親和性は、リン酸化ｐ６２のＫＩＲが非リン酸化ｐ６２のＫＩＲより約１００倍高く、それはＫｅａｐ１−ＤＣとＮｒｆ２−ＥＴＧＥの結合親和性に匹敵していた。
【００５６】
（２）抗リン酸化ｐ６２抗体の作製
配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリンをリン酸化し、さらにＮ末端にシステイン残基を付加したアミノ酸配列、ＣＫＥＶＤＰ（ｐＳ）ＴＧＥＬＱＳＬＱ（配列番号２２）からなるペプチドを合成し、ＨＰＬＣで精製した。この抗原ペプチドに対し、Ｎ末端システイン残基へＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ-ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ,スカシガイヘモシアニン）をキャリアとしてＭＢＳ（ｍ-Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ-Ｎ-ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）法で結合させた。作製したコンジュゲーションペプチド（合成ペプチド３ｍｇ＋キャリアタンパク質２ｍｇ）を５ｍＬのリン酸緩衝液で溶解し、免疫動物のウサギ１羽に対して、初回は、合成ペプチド２００μｇに相当する量を完全フロイントアジュバントと混合したエマルジョンを皮下注射によって投与した。１４日後に、合成ペプチド１００μｇに相当する量を不完全フロイントアジュバントと混合したエマルジョンを皮下注射によって投与した。その後、１４日毎に同様な抗原投与をさらに４回行った。初回の抗原投与から７７日目に全採血し、２０ｍＬの抗血清を得た。次に、抗原に用いたリン酸化ｐ６２ペプチドを固相化したアフィニティーカラムを作製し、これを用いて抗血清に含まれるリン酸化ｐ６２と結合する抗体をアフィニティー精製した。精製抗体を、さらに非リン酸化ｐ６２ペプチドを固相化したアフィニティーカラムへ通すことで、素通り画分に回収された精製抗体を、リン酸化ｐ６２と特異的に結合する抗リン酸化ｐ６２抗体とした。
【００５７】
作製した抗リン酸化ｐ６２抗体の、リン酸化ｐ６２タンパク質（配列番号１）に対する特異性を確認した。Ｓｔｒｅｐタグを付けたｐ６２（配列番号１）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させた。この細胞抽出液からＳｔｒｅｐ-ｐ６２タンパク質をＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎセファロース（ＩＢＡ社）でアフィニティー精製した。精製したＳｔｒｅｐ-ｐ６２タンパク質をラムダタンパク質ホスファターゼ（Ｌａｍｄａ  ＰＰ）で処理したもの(＋)、および処理していないもの（−）を準備し、各々の試料を１２％ビス−トリスゲルおよびＭＯＰＳ-ＳＤＳバッファーを用いてＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により分離、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にトランスファーした。リン酸化に関わらずｐ６２のＣ末領域を認識する抗ｐ６２抗体（ＧＰ-６２Ｃ：Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）（図３左ＰＶＤＦメンブレン）と、ここで作製した抗リン酸化ｐ６２抗体（図３右ＰＶＤＦフメンブレン）を用いてイムノブロッティング解析を行なった。
【００５８】
＝＝結果＝＝
抗リン酸化ｐ６２抗体は、リン酸化ｐ６２タンパク質を認識し、非リン酸化ｐ６２タンパク質を認識しないことが確認できた。
【００５９】
（３）細胞内におけるリン酸化ｐ６２とＫｅａｐ１の相互作用
ＦＬＡＧタグを付けた配列番号１のｐ６２w.t.（正常型）、配列番号１のｐ６２の３５１番目のセリンをグルタミン酸に置換したＳ３５１Ｅ（配列番号２）（擬似リン酸化型ｐ６２）、配列番号１のｐ６２の３５１番目のセリンをアラニンに置換したＳ３５１Ａ（配列番号４）（非リン酸化型ｐ６２）、および配列番号１のｐ６２の３５２番目のトレオニンをアラニンに置換したＴ３５２Ａ（配列番号６）（Ｋｅａｐ１との結合能の欠損型ｐ６２）を、アデノウイルス作製キット(タカラバイオ株式会社)により、野生型ｐ６２（ｐ６２w.t）（配列番号１）.および変異型ｐ６２（ｐ６２Ｓ３５１Ｅ（配列番号２）、ｐ６２Ｓ３５１Ａ（配列番号４）およびｐ６２Ｔ３５２Ａ（配列番号６））をコードするＤＮＡをそれぞれ組み込んだアデノウイルスを作製した。次に、正常肝細胞を２ｍｌの増殖培地（１０％ウシ胎児血清，５Ｕ／ｍＬペニシリン，５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むウイリアムスＥ培地）中で２４時間培養した後、その培地を、アデノウイルスをＭＯＩが５０となるように添加した培地と交換し、そのまま細胞を培養した。培地交換から２４時間後、細胞全体の抽出液（Ｔｏｔａｌ）及び核画分の抽出液（Ｎｕｃｌｅｕｓ）を調製した。次に、細胞全体の抽出液を用いて、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）によって免疫沈降物（ＩＰ：ＦＬＡＧ（ｐ６２））を得た。次に、試料を１２％ビス−トリスゲルおよびＭＯＰＳ−ＳＤＳバッファーを用いてＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。そして、抗ｐ６２抗体（ＧＰ６２Ｃ：Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）、抗Ｋｅａｐ１抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社）、抗リン酸化ｐ６２抗体、抗Ｎｑｏ１抗体（Ａｂｃａｍ社）、抗Ａｃｔｉｎ抗体（ＭＡＢ１５０１Ｒ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗Ｎｒｆ２抗体（Ｈ-３００：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＬａｍｉｎＢ抗体（Ｍ-２０：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてイムノブロッティングを行った。実験は３回行い、その代表的な結果を図４に示す。
【００６０】
＝＝結果＝＝
細胞内Ｋｅａｐ１は、Ｓ３５１ＡよりもＳ３５１Ｅ（配列番号６）に結合した。また、Ｓ３５１Ｅを発現させた細胞内では、核内へのＮｒｆ２の著しい蓄積が生じ、さらにＮｒｆ２の標的であるＮｑｏ１のタンパク質の発現も誘導されていた。
【００６１】
（４）細胞内におけるリン酸化ｐ６２の、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１の相互作用への影響
ＦＬＡＧタグをＮ末端に結合させたマウスＫｅａｐ１（配列番号２３）と、ＧＦＰ、ＧＦＰ−ｐ６２、ＧＦＰ−Ｓ３５１Ｅ（配列番号２）またはＧＦＰ−Ｓ３５１Ａ（配列番号４）を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、溶解用バッファーにより溶解して細胞抽出液を得た。次に抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いて免疫沈降を行い、ＦＬＡＧタグを付加したＫｅａｐ１およびＫｅａｐ１と相互作用しているタンパク質複合体を回収した。細胞抽出液（ｃｒｕｄｅ）と回収したタンパク質複合体（ＩＰ：ＦＬＡＧ（Ｋｅａｐ１））を１２％ビス−トリスゲルおよびＭＯＰＳ-ＳＤＳバッファーを用いてＮｕＰＡＧＥ電気泳動システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりゲルに展開し、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、抗ｐ６２抗体（ＧＰ６２Ｃ：Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）、抗Ｎｒｆ２抗体（Ｈ−３００：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗アクチン抗体（ＭＡＢ１５０１Ｒ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて、イムノブロッティングを行った。結果を図５に示す。
【００６２】
＝＝結果＝＝
Ｓ３５１Ｅの過剰発現により、Ｋｅａｐ１と相互作用しているタンパク質複合体の中に、Ｎｒｆ２が検出されなかった。すなわち、Ｓ３５１Ｅの過剰発現によってＮｒｆ２とＫｅａｐ１の相互作用が消失した。
【００６３】
＝＝まとめ＝＝
このように、ｐ６２はリン酸化されることによってＫｅａｐ１との結合親和力が増強してＫｅａｐ１と結合するようになり、それに伴って、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から解離するようになる。
【００６４】
＜実施例２＞
本実施例では、ｐ６２のリン酸化が腫瘍細胞の増殖に関係していることを示す。
【００６５】
（１）ヒト肝細胞癌の免疫染色
ヒト肝細胞癌（細胞名：Ｈｕｈ−１）を、１０％ウシ胎児血清、５Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有させたＷｉｌｌｉｕｍ’ｓ  Ｅ 培地中で培養した。
【００６６】
ヒト肝細胞癌をディッシュ上で培養し、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液で１５分間固定し、５０μｇ／ｍｌジギトニンで１０分間の膜透過処理を施し、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  社、＃Ｇ−９３９１）含有ＰＢＳで３０分間ブロッキングした。
【００６７】
次に、第一抗体と1時間インキュベートした。この第一抗体としては、抗ｐ６２抗体（ＧＰ６２Ｃ：Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）、抗Ｋｅａｐ1抗体(Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社)および作製した抗リン酸化ｐ６２抗体を用い、抗ｐ６２抗体と抗リン酸化ｐ６２抗体と、または抗リン酸化ｐ６２抗体と抗Ｋｅａｐ１抗体による二重免疫染色を行なった。洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を結合させた抗モルモットＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）または、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７を結合させた抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）添加して３０分間インキュベートした。細胞は、プランアクロマート対物レンズ（６３×/１．４０  Ｏｉｌ  ＤＩＣ，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）を用いて共焦点レーザースキャン顕微鏡システム（ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ，  Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社）で観察した。
【００６８】
＝＝結果＝＝
図６に示したように、ヒト肝細胞癌におけるｐ６２陽性凝集体のｐ６２はリン酸化されており、その凝集体にはＫｅａｐ１が含まれていた。
【００６９】
（２）ｐ６２のリン酸化とＨＣＣの増殖について
まず、ヒトｐ６２（配列番号７）の３４９番目のセリンをグルタミン酸に置換したＳ３４９Ｅ（配列番号８）（疑似リン酸化型ｐ６２）、ヒトｐ６２の３４９番目のセリンをアラニンに置換したＳ３４９Ａ（配列番号９）（非リン酸化型ｐ６２）、およびヒトｐ６２の３５０番目のトレオニンをアラニンに置換したＴ３５０Ａ（配列番号１０）（Ｋｅａｐ１との結合能の欠損型ｐ６２）をコードするｐ６２ｃＤＮＡを作製した。
【００７０】
次に、Ｈｕｈ−１細胞に対してＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅシステム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、  ＣｏｍｐｏＺｒ（登録商標）Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて、ｐ６２がノックアウトされた[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−]細胞株を作製した。次に、アデノウイルス作製キット(タカラバイオ株式会社)を用いて、ｐ６２w.t.およびｐ６２変異型を組み込んだアデノウイルスを作製した。そして、[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−]細胞株を２ｍｌの増殖培地（１０％ウシ胎児血清、５Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有させたＷｉｌｌｉｕｍ’ｓ  Ｅ 培地）中で２４時間培養した後、その培地を、アデノウイルスをＭＯＩが５０となるように添加した新鮮培地に交換し、そのまま細胞を培養することにより、先に得られた[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−]細胞株に対して、野生型ヒトｐ６２（配列番号７）を導入した[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２ｗ．ｔ．]細胞株、Ｓ３４９Ｅ（配列番号８）を導入した[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２Ｓ３４９Ｅ]細胞株、Ｓ３４９Ａ（配列番号９）を導入した[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２Ｓ３４９Ａ]細胞株、Ｔ３５０Ａ（配列番号１０）を導入した[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２Ｔ３５０Ａ]細胞株を作製した。
【００７１】
次に、各細胞をそれぞれヌードマウスの皮下に移植した。図７（ａ）は[Ｈｕｈ−1]親株（図中左上）、[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−]細胞株（図中右上）、[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２ｗ．ｔ．]細胞株（図中左中央）、[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２Ｓ３４９Ｅ]細胞株（図中右中央）、[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２Ｓ３４９Ａ]細胞株（図中左下）、および[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−_ｐ６２Ｔ３５０Ａ]細胞株（図中右下）をそれぞれ３匹に移植して５０日後のマウスおよびマウスから取り出した腫瘍の写真である。そして、細胞株それぞれにつき５匹のマウスに移植して、移植から５０日後の腫瘍の容積（左）および重量（右）を測定した。細胞株ごとにそれらの平均値±標準誤差を算出し、図７（ｂ）のグラフに示す。
【００７２】
＝＝結果＝＝
ｐ６２（Ｓ３４９Ｅ）を[Ｈｕｈ−１_ｐ６２−／−]に導入した腫瘍細胞をヌードマウスに移植すると、in vivoで腫瘍細胞の増殖が有意に促進された（ｐ＜0.05、ｔ検定）（図７（ｂ））。
【００７３】
このように、ｐ６２のリン酸化が腫瘍細胞を悪性化させるので、抗リン酸化ｐ６２抗体を用いることで、腫瘍の性質を診断することおよび腫瘍の治療と対策を考案することが可能となる。
【００７４】
また、Ｓ３４９ＡやＴ３５０ＡをＨｕｈ−１_ｐ６２−／−に導入しても、腫瘍細胞の増殖力は回復しない（図７（ｂ））。このことから、配列番号１のアミノ酸配列における３５１番目のセリン、またはこのセリンに対応するセリンのリン酸化を阻害する物質、またはリン酸化されたそのセリンを脱リン酸化する物質、あるいはリン酸化ｐ６２タンパク質とＫｅａｐ１の結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、抗腫瘍剤をスクリーニングすることができると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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