(57)【要約】【課題】  農作物, 果樹, 園芸植物等の栽培現場において、実際の罹病度合いの測定を行うことなく、高い精度で迅速に判定が可能な、病害抵抗性の識別方法の開発を課題とする。また、遺伝子マーカーでは検出が困難な圃場抵抗性に対して、植物種や病害の種類に限定されることなく、精度良く識別できる方法の開発を課題とする。【解決手段】  植物病害発生環境で農作物等を栽培した植物の茎葉を試料とし、1H-NMRスペクトルのプロファイリングを行うことにより、判定対象植物の病害に対する抵抗性の強度を判定することを特徴とする、病害抵抗性品種系統の識別方法、を提供する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病害発生環境で生育させた以下(A), 及び, (B1)若しくは(B2), に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を各試料として用い、；各試料からの抽出液を得、；1H-NMR分析に供し、；得られた1H-NMRスペクトルの信号範囲全体を0.5〜60Hzの幅で等間隔に分割し、各領域の面積値を算出し、；当該面積値を基に前記各試料間の統計的な差異の有無を検出し、；判定対象植物の前記病害に対する抵抗性の強度を判定する、；ことを特徴とする、病害抵抗性品種系統の識別方法。
(A) 判定対象植物。
(B1) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記病害に対する抵抗性を有さない又は極めて弱い抵抗性しか有さない植物。
(B2) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記病害に対する強い抵抗性を有する植物。
【請求項２】
前記植物病害の原因微生物が、Phytophthora属に属する疫病菌であることを特徴とする、請求項1に記載の識別方法。
【請求項３】
前記1H-NMRスペクトルにおいて統計的な差異が検出されるシグナルが、L-リンゴ酸のプロトンに由来するシグナルである、請求項1又は2に記載の識別方法。
【請求項４】
植物病害発生環境で生育させた前記(A), (B1), 及び(B2)に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を試料として用いることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の識別方法。
【請求項５】
前記1H-NMRスペクトルの分割が、信号範囲全体を1〜20Hzの幅で等間隔に分割するものである、請求項1〜4のいずれかに記載の識別方法。
【請求項６】
前記試料の抽出に用いる溶媒が、50〜200mMのリン酸塩をpH緩衝成分として含むpH6〜8の重水溶媒である、請求項1〜5のいずれかに記載の識別方法。
【請求項７】
前記(A)〜(C)に記載の植物茎葉試料が、各試料につき2検体以上用いることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の識別方法。
【請求項８】
前記統計的差異の有無の検出が、クラスタリング解析によって行うものである、請求項7に記載の識別方法。
【請求項９】
前記クラスタリング解析が、最長距離法又は群平均法によって行うものである、請求項8に記載の識別方法。
【請求項１０】
前記判定対象の植物の病害抵抗性が、圃場抵抗性である、請求項1〜9のいずれかに記載の識別方法。
【請求項１１】
植物疫病発生環境で生育させた以下(A), 及び, (B1)若しくは(B2), に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を各試料として用い、；当該各試料に含まれるL-リンゴ酸含量を定量し、；得られたL-リンゴ酸含量値の各試料間の差異の有無を検出し、判定対象植物の疫病抵抗性の強度を判定する、；ことを特徴とする、植物疫病抵抗性品種系統の識別方法。
(A) 判定対象植物。
(B1) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記植物疫病に対する抵抗性を有さない又は極めて弱い抵抗性しか有さない植物。
(B2) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記植物疫病に対する強い抵抗性を有する植物。
【請求項１２】
植物疫病発生環境で生育させた前記(A), (B1), 及び(B2)に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を試料として用いることを特徴とする、請求項11に記載の識別方法。
【請求項１３】
前記L-リンゴ酸含量の定量を、ペーパークロマトグラフィー, 薄層クロマトグラフィー, 高速液体クロマトグラフィー, ガスクロマトグラフィー, 又はキャピラリー電気泳動を用いて行うことを特徴とする、請求項11又は12のいずれかに記載の識別方法。
【請求項１４】
前記L-リンゴ酸含量の定量を、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼの酵素反応を利用して行うことを特徴とする、請求項11〜13のいずれかに記載の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、1H-NMRスペクトルのプロファイリングを行うことにより、判定対象植物の病害に対する抵抗性の強度を判定することを特徴とする、病害抵抗性品種系統の識別方法に関する。
さらに本発明は、L-リンゴ酸含量を指標とすることにより、判定対象植物の植物疫病に対する抵抗性の強度を判定することを特徴とする、植物疫病抵抗性品種系統の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
・罹病度合い測定による病害抵抗性識別法
従来、農作物, 果樹, 園芸植物等が有する病害抵抗性を識別するためには、実際に罹病を伴う栽培試験を行って、罹病度合いを比較等する手法が取られてきた。
具体的には、病害発生圃場での栽培試験、ハウス内での病原微生物の接種試験、農業現場での実証試験、などにより行われてきた。
【０００３】
しかし、圃場やハウス内での罹病度合いの比較により抵抗性を判定する手法は、(i) 長期間の栽培試験を反復して行う必要があり、迅速に判定することができないという欠点があった。
また、(ii) 気象状況により、病害の発生程度が変化する場合が多く、精度の点で安定した試験を行うことができない課題があった。
また、(iii) 栽培試験に伴い、病害の原因微生物が周囲に拡大する危険性があった。また、重要農作物の病害については、農業現場に近い環境での接種試験自体が制限されており、自由に試験を行えない問題があった。
また、(iv) 栽培試験には、作物種ごとに育種者の高度な現場知識と経験が必要であり、現状の人的資源や技術の点で、多くの試験を行えない問題があった。
【０００４】
・遺伝子マーカーを用いた病害抵抗性識別法
そこで、病害発生が顕在化していない段階において、病害抵抗性遺伝子をマーカーとして用いて、病害抵抗性を有する品種系統を識別する手法が研究されている。
【０００５】
しかし、(i) 病害抵抗性に関与する遺伝子の多くは未同定であり、原因遺伝子の解明には、変異体作成や遺伝子導入等、高度な同定試験が必要である。
また、(ii) 遺伝子導入法は、全ての植物において必ずしも可能な方法ではない。
そのため、全ての農作物等において、病害抵抗性遺伝子の同定試験が行えるわけではない。
【０００６】
また、(iii) 関与する原因遺伝子が少数の遺伝子である場合には、遺伝子マーカーを用いての病害抵抗性の識別は有効であるが、多くの遺伝子が僅かずつ異なって抵抗性が発揮される場合（QTLの場合）には、遺伝子マーカーでは識別できない場合が多い。
【０００７】
また、(iv) 野外の栽培環境下においてのみ抵抗性が発現される場合（圃場抵抗性の場合）、遺伝子マーカーでの選別は極めて困難である（例えば、非特許文献1,2 参照）。
例えば、植物自身の遺伝的な背景の違いに加え、病害の原因微生物以外の微生物が植物に侵入及び共生することによって病害抵抗性が発揮される場合もあり、遺伝子マーカーでは全く識別できない抵抗性も存在する（例えば、非特許文献3 参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Vivianne et al., European Journal of Plant Pathology 105, p241-250, 1999
【非特許文献２】Milhovilovich et al., Theor Appl Genet 120, p1265-1278, 2010
【非特許文献３】Clarke et al., Plant Disease 90, p994-998, 2006
【非特許文献４】Summner 2003et al., Phytochemistry, 62, p817-836, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明では、農作物, 果樹, 園芸植物等の栽培現場において、実際の罹病度合いの測定を行うことなく、高い精度で迅速に判定が可能な、病害抵抗性の識別方法の開発を課題とする。
また、本発明では、遺伝子マーカーでは検出が困難な圃場抵抗性に対して、植物種や病害の種類に限定されることなく、精度良く識別できる方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
環境要因の影響による植物自身の代謝経路全体の変化は複雑であり、前もって予想することは困難である。植物が作り出す代謝物は、20万種類以上とも言われており、環境要因によりどこがどう変わるかを予測することは、実質的には不可能だからである。
そのため、特定の成分や遺伝子だけを調べるターゲット解析では、そもそもターゲット自体が不明であるため、要因と関係のある差違を検出できない場合がほとんどである。
【００１１】
そこで、本発明者らは、分析試料から膨大な物質情報を含むスペクトルデータを短時間で取得できる、NMR分析技術に注目した。
しかし、現実的には、NMRの検出感度はHPLC等の分離分析と一般的に組み合わせて用いられるMSやUVなどの検出手法と比べると低く（μmolスケール：LC/UVの1/103, GC/MSの1/106）、植物代謝産物等の微量な変化を精度良く検出するには、困難性が伴っていた（例えば、非特許文献4 参照）。
また、NMRスペクトルの統計処理において、具体的に手法の検討が必要であった。
【００１２】
また、病徴が発現していない植物体において、どのようなサンプリングを行えば病害に対する抵抗性の強弱を検出できるかも全く不明であった。
【００１３】
そこで、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、植物病害発生環境で農作物等を栽培し、実際に病徴が発現する前の茎葉を試料とし、1H-NMRスペクトルのプロファイリングを行うことにより、判定対象植物の病害に対する抵抗性の強度を、精度良く判定できることを見出した。
そして、本発明者らは、上記プロファイリングの結果から、植物が有する植物疫病に対する抵抗性の強度を、L-リンゴ酸含量を指標とすることによって精度良く判定できることを見出した。
【００１４】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
・〔請求項1〕に係る本発明は、植物病害発生環境で生育させた以下(A), 及び, (B1)若しくは(B2), に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を各試料として用い、；各試料からの抽出液を得、；1H-NMR分析に供し、；得られた1H-NMRスペクトルの信号範囲全体を0.5〜60Hzの幅で等間隔に分割し、各領域の面積値を算出し、；当該面積値を基に前記各試料間の統計的な差異の有無を検出し、；判定対象植物の前記病害に対する抵抗性の強度を判定する、；ことを特徴とする、病害抵抗性品種系統の識別方法、に関する。
(A) 判定対象植物。
(B1) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記病害に対する抵抗性を有さない又は極めて弱い抵抗性しか有さない植物。
(B2) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記病害に対する強い抵抗性を有する植物。
・〔請求項2〕に係る本発明は、前記植物病害の原因微生物が、Phytophthora属に属する疫病菌であることを特徴とする、請求項1に記載の識別方法、に関する。
・〔請求項3〕に係る本発明は、前記1H-NMRスペクトルにおいて統計的な差異が検出されるシグナルが、L-リンゴ酸のプロトンに由来するシグナルである、請求項1又は2に記載の識別方法、に関する。
・〔請求項4〕に係る本発明は、植物病害発生環境で生育させた前記(A), (B1), 及び(B2)に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を試料として用いることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の識別方法、に関する。
・〔請求項5〕に係る本発明は、前記1H-NMRスペクトルの分割が、信号範囲全体を1〜20Hzの幅で等間隔に分割するものである、請求項1〜4のいずれかに記載の識別方法、に関する。
・〔請求項6〕に係る本発明は、前記試料の抽出に用いる溶媒が、50〜200mMのリン酸塩をpH緩衝成分として含むpH6〜8の重水溶媒である、請求項1〜5のいずれかに記載の識別方法、に関する。
・〔請求項7〕に係る本発明は、前記(A)〜(C)に記載の植物茎葉試料が、各試料につき2検体以上用いることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の識別方法、に関する。
・〔請求項8〕に係る本発明は、前記統計的差異の有無の検出が、クラスタリング解析によって行うものである、請求項7に記載の識別方法、に関する。
・〔請求項9〕に係る本発明は、前記クラスタリング解析が、最長距離法又は群平均法によって行うものである、請求項8に記載の識別方法、に関する。
・〔請求項10〕に係る本発明は、前記判定対象の植物の病害抵抗性が、圃場抵抗性である、請求項1〜9のいずれかに記載の識別方法、に関する。
・〔請求項11〕に係る本発明は、植物疫病発生環境で生育させた以下(A), 及び, (B1)若しくは(B2), に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を各試料として用い、；当該各試料に含まれるL-リンゴ酸含量を定量し、；得られたL-リンゴ酸含量値の各試料間の差異の有無を検出し、判定対象植物の疫病抵抗性の強度を判定する、；ことを特徴とする、植物疫病抵抗性品種系統の識別方法、に関する。
(A) 判定対象植物。
(B1) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記植物疫病に対する抵抗性を有さない又は極めて弱い抵抗性しか有さない植物。
(B2) 前記判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記植物疫病に対する強い抵抗性を有する植物。
・〔請求項12〕に係る本発明は、植物疫病発生環境で生育させた前記(A), (B1), 及び(B2)に記載の植物について、実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を試料として用いることを特徴とする、請求項11に記載の識別方法、に関する。
・〔請求項13〕に係る本発明は、前記L-リンゴ酸含量の定量を、ペーパークロマトグラフィー, 薄層クロマトグラフィー, 高速液体クロマトグラフィー, ガスクロマトグラフィー, 又はキャピラリー電気泳動を用いて行うことを特徴とする、請求項11又は12のいずれかに記載の識別方法、に関する。
・〔請求項14〕に係る本発明は、前記L-リンゴ酸含量の定量を、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼの酵素反応を利用して行うことを特徴とする、請求項11〜13のいずれかに記載の識別方法、に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、農作物, 果樹, 園芸植物等の病害抵抗性の品種系統を、実際の罹病度合いの測定を行うことなく（病害の病徴の発現前において）、高い精度で且つ迅速に識別することを可能とする。
また、本発明は、植物疫病に対する抵抗性を有する品種系統を、L-リンゴ酸含量を指標とすることにより、高い精度で且つ迅速に識別することを可能とする。
【００１６】
特に、本発明においては、特定の遺伝子型によって発揮される抵抗性（真正抵抗性）だけでなく、野外の栽培環境下においてのみ発現される抵抗性（圃場抵抗性）に対しても、植物種や病害の種類に限定されることなく、病害抵抗性の品種系統を識別することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】試験例1における栽培試験において、バレイショ栽培の状況を撮影した写真像図である。(A)：バレイショ疫病発生前の状況。(B)：バレイショ疫病発生後の状況。
【図２】実施例1(2)の1H-NMRスペクトルのプロファイリングにおいて、解析手順を模式化した図である。
【図３】試験例1における栽培試験において、各バレイショ品種の植栽配置を示す模式図である。  なお、グレーで示した区画は、除外区（本試験の対象としない植物を植栽した区画）を示す。
【図４】実施例1(1)においてサンプリングした、バレイショ主茎上部に位置する側枝全体を示す図である。
【図５】実施例1(2)において、最長距離法によりクラスタリング解析を行った場合のデンドログラムである。
【図６】実施例1(2)において、群平均法によりクラスタリング解析を行った場合のデンドログラムである。
【図７】実施例2(1)において、抵抗性をほとんど示さない品種（男爵薯）の1H-NMRスペクトルを示す図である。(A) 2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppm領域。(B) 4.27〜4.31ppm領域。なお、図中では、統計解析に用いた3反復試料のスペクトルを、線種を変えて（実線、一点鎖線、点線にて）重ねて示している。
【図８】実施例2(1)において、抵抗性の強い品種（マチルダ：圃場抵抗性品種）の1H-NMRスペクトルを示す図である。(A) 2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppm領域。(B) 4.27〜4.31ppm領域。なお、図中では、統計解析に用いた3反復試料のスペクトルを、線種を変えて（実線、一点鎖線、点線にて）重ねて示している。
【図９】実施例2(1)において、抵抗性が極めて強い品種（ゆきつぶら：真正抵抗性品種）の1H-NMRスペクトルを示す図である。(A) 2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppm領域。(B) 4.27〜4.31ppm領域。なお、図中では、統計解析に用いた3反復試料のスペクトルを、線種を変えて（実線、一点鎖線、点線にて）重ねて示している。
【図１０】実施例2(2)において、L-リンゴ酸の化学式におけるC-2プロトン, C-3プロトンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、1H-NMRスペクトルのプロファイリングを行うことにより、判定対象植物の病害に対する抵抗性の強度を判定することを特徴とする、病害抵抗性品種系統の識別方法に関する。
さらに本発明は、L-リンゴ酸含量を指標とすることにより、判定対象植物の植物疫病に対する抵抗性の強度を判定することを特徴とする、植物疫病抵抗性品種系統の識別方法に関する。
【００１９】
〔植物病害〕
本発明の識別方法にて抵抗性を判定可能な植物病害としては、原因微生物が感染して罹病し、病徴が発現する病害であれば如何なる病害をも挙げることができる。
例えば、植物疫病、そうか病、紫紋羽病、白紋羽病、青かび病、灰色かび病等を挙げることができる。
【００２０】
これらの中でも、特に本発明の識別方法では、各種疫病の病徴を引き起こすPhytophthora属（エキビョウキン属）に属する微生物（疫病菌）が罹病して病徴が発現する病害（植物疫病）に対して、植物が有する抵抗性を精度良く判定することが可能となる。
ここで、疫病菌とは、原生生物である卵菌類のPhytophthora属に属し、植物に感染して病徴を発現する微生物を指す。
当該疫病菌は、植物に空気感染し、植物体中では菌糸を伸ばして生育する。そして、宿主となった植物の葉に病徴を発現させて植物の生育に大きな影響を与える。
【００２１】
疫病菌は、種によって宿主となる植物種や範囲が異なるが、具体的には、以下のものを挙げることができる。
P. infestansでは、バレイショやトマトに対して感染し被害を与える。特にP. infestans de Bary（バレイショ疫病菌）は、バレイショに対して甚大な被害を与える。
また、P. cinnamomiは、900種以上の宿主が知られており、農作物全般に大きな被害を与えている。
また、P. ramorum（Sudden oak deathの病原菌）ではオーク, ナラ等、；P. cactorumでは野菜や果樹全般、；P. capsiciではナス科, ウリ科、；P. cinnamomiでは果樹全般、；P. citricolaではブドウ, ミカン、；P. citrophthoraではウリ科、；P. cryptogeaでは野菜や果樹全般、；P. drechsleriでは野菜や果樹全般、；P. medicaginisではアルファルファ, ヒヨコマメ、；P. megaspermaでは野菜, 果樹, イネ、 P. nicotianae（P. parasitica）では野菜や果樹全般、；P. palmivoraでは果樹や木本類全般、；P. porriではネギ類, ニンジン等、；P. sojaeではダイズ, ルーピン、；P. syringaeではミカン類, バラ科果樹、；に感染し、被害を与えることが知られている。
【００２２】
〔植物体試料〕
・判定対象植物の種類
本発明の識別方法に供する植物の種類としては、上記植物病害の原因微生物に感染して、罹病して病徴が発現する被子植物に属する植物であれば、如何なる植物をも試料として採用できる。
ここで被子植物としては、真正双子葉類（キク目、ナス目、シソ目、リンドウ目、ナデシコ目、ブドウ目、アブラナ目、ユキノシタ目等）に加えて、進化系統的に早い時期に分岐したモクレン目、スイレン目、コショウ目、クスノキ目、単子葉類（イネ目、ユリ目等）等、全ての顕花植物を挙げることができる。
また、分類的に上記に属するものであれば、農作物、果樹、園芸植物等、商業的な全ての対象植物について、本発明による識別が可能である。
【００２３】
特には、Phytophthora属の疫病菌が感染して病徴が発現する、ナス科, ウリ科, ブドウ科, イネ科, マメ科, バラ科, ミカン科, ネギ科, ブナ科, に属する植物を挙げることができる。
好ましくは、P. infestansが感染して病徴が発現するナス属植物（特にバレイショ, トマト）を挙げることができる。
さらに好ましくは、P. infestans (Mont.) de Baryが感染して病徴が発現するバレイショを挙げることができる。
【００２４】
・植物病害発生環境での生育
本発明の識別方法では、判定対象である植物の個体を、植物病害発生環境で、生育させる（栽培する）ことを要する。
ここで、当該環境として具体的には、(i)植物病害の原因微生物が生息（生育状態だけでなく休眠状態も含む。また、難培養性(VNC)状態のものも含む。）している土壌又は水を有する環境, (ii)当該微生物が感染した植物体堆積物を含む環境, (iii)前記(i)や(ii)の環境に隣接する環境であって、原因微生物が常時侵入している環境, (iv)水源上流域に上記(i)や(ii)の環境がある環境であって、原因微生物が常時侵入している環境, を挙げることができる。
当該環境として、具体的には、1〜7年前の年度（好ましくは1〜3年前の年度）に、対象とする植物病害が発生した環境（畑作圃場、農場、果樹園、茶園、水田、転換畑、植物工場における水耕栽培等）を挙げることができる。
また、人為的に、植物病害の原因微生物を散布, 放菌等した環境を挙げることもできる。
【００２５】
ここで、植物病害発生環境で生育させた植物とは、播種や幼苗の移植段階から当該環境で生育させた植物は当然に含まれるものであるが、健全環境にて一定期間生育させた後、当該病害発生環境の土壌に移植したものも含まれる。
具体的には、当該病害発生環境の土壌に移植してから、少なくとも3日以上、好ましくは10日以上の生育を行った植物を指す。
【００２６】
当該環境での生育により、植物病害の原因微生物が植物体に感染し、植物体茎葉における代謝物組成の変化が促された状態となる。
また、植物自体の遺伝的要因に加えて、「（病害の原因微生物以外の）他の微生物の感染や共生」が、圃場抵抗性の発現に必要となる場合があるが、当該栽培の過程で感染及び共生が行われた状態となる。
【００２７】
・茎葉
本発明の識別方法に供する試料の茎葉としては、植物病害の病徴が発現していない生育段階のものでも好適に用いることができる。
なお、勿論であるが、当該試料としては、病徴が発現している生育段階の茎葉であっても、用いることができる。
【００２８】
ここで茎葉としては、葉や茎のみを単独で用いることもできるが、茎が木化していない限りは、茎と葉の両方を含むようにして試料とすることが望ましい。
なお、葉のみを用いる場合は、葉脈を含むように葉全体を用いることが好適である。
【００２９】
特には、先端部を含む複数枚の葉（2枚以上, 好ましくは3枚以上）が展開した茎（主枝, 側枝）を用いることが望ましい。
なお、具体的には、ナス科植物では主茎の側の上位側枝全体を、；木本植物の場合は木化の程度が低い若い枝先の葉が展開している部分、；ロゼット植物では主枝部分、；、つる植物では、先端部と葉を含むつるの先端部分、；イネ科植物では、未展開葉および複数枚の上位展開葉および茎、；等を用いることが望ましい。
なお、茎葉には、側芽等として花芽を含むものであっても良い。
【００３０】
・対照植物
本発明の識別方法では、前記判定対象植物と比較が可能である、陽性対照植物又は陰性対照植物のどちらかが必要である。
なお、識別の正確性を向上させるためには、好ましくは、陽性対照植物と陰性対象植物の両方を用いることが望ましい。
【００３１】
ここで、陽性対照植物としては、判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記病害に対する抵抗性を有さない又は極めて弱い抵抗性しか有さない植物を指すものである。
具体的には、抵抗性がない又は抵抗性の弱い品種系統に属することが判明している植物を、用いることができる。
【００３２】
また、陰性対照植物としては、判定対象植物と同じ種に属し, 且つ, 前記病害に対する強い抵抗性を有する植物を指すものである。
具体的には、抵抗性の強い品種系統に属することが判明している植物を用いることができる。
【００３３】
本発明の識別方法では、病害抵抗性の違いに由来する代謝産物組成の変化のみを精度よく検出するため、それ以外の要因に由来する代謝変化（例えば、生育段階等の生理的要因等の違い等）をできるだけ抑える（代謝産物組成の背景を試料間で均一にする）必要がある。
そこで、本発明の識別方法では、判定対象植物から採取した茎葉と実質的に同じ生育段階と認められる茎葉を、対照植物から採取する必要がある。
ここで、異なる生育段階の茎葉を用いた場合、代謝産物組成の背景が異なる可能性があり、正確な判定を行うことができない。
【００３４】
・検体数
本発明の識別方法では、データの信頼性を考慮すると、各試料につき2検体以上, 好ましくは3検体以上をNMR分析に供することが望ましい。
なお、後述する統計解析（クラスタリング解析）を行うためには、階層構造（クレード形成）の原理上、最低でも合計4検体（例えば、判定対象植物から2検体＋対照植物から2検体の計4検体）、をNMR分析に供することが必要となる。
【００３５】
〔NMR分析〕
・抽出の前処理
本発明では、試料からの抽出操作の前処理として、上記茎葉に対して粉砕, 粉末化, 擂潰, 磨砕等の処理を行うことが望ましい。例えば、液体窒素を用いて凍結したものを真空中で凍結状態のまま乾燥させた後、粉末化させる操作を採用することができる。
【００３６】
・抽出溶媒
本発明では、上記茎葉試料を1H-NMR分析に供するため、抽出を行うことを要する。
ここでの抽出溶媒としては、代謝化合物の抽出が可能な溶媒であれば、如何なる溶媒をも用いることができる。好ましくは、水溶性溶媒（例えば水）、一価アルコール溶媒（例えばメタノール）、クロロホルムを含む有機溶媒等を好適に用いることができる。
例えば、単糖類, 非極性アミノ酸の挙動を主目的とする場合は、メタノール抽出が好適である。また、極性アミノ酸, リン酸やカルボン酸等の極性官能基を有する化合物の挙動を主に目的とする場合は、水溶性溶媒が好適である。
【００３７】
なお、本発明においては、後述するNMR分析用溶媒を、直接抽出溶媒として用いることも可能である。
【００３８】
・抽出操作
茎葉試料と抽出溶媒は、混合後に均一に攪拌混合することが望ましい。
また、抽出効率の向上のため、ボルテックス処理（攪拌処理）、ローテーターによる混和、超音波処理等を行うことも有効である。
【００３９】
抽出温度としては、室温程度（例えば10〜40℃）を採用することができるが、好ましくは、加熱処理を行うと抽出効率を向上や内在性酵素の失活の点で好適である。
例えば、50℃以上, 好ましくは80℃以上, さらには90℃以上の加熱条件を行うことが好適である。なお、上限としては、抽出溶媒の蒸気圧が使用する容器の耐圧以下となる温度、例えば耐圧性の低い容器を使用して水溶性溶媒を用いる場合であれば100℃を挙げることができる。
【００４０】
抽出時間としては、室温程度で抽出を行う場合、抽出量を確保するために、好ましくは5分以上, さらには10分以上, さらには30分以上, さらには60分以上で行うことが望ましい。また、上限としては、成分の分解を防ぐ観点から、24時間以内, 好ましくは3時間以内, 好ましくは2時間以内で行うことが望ましい。
加熱条件で抽出を行う場合、好ましくは1分以上, さらには3分以上, さらには5分以上, さらには10分以上を挙げることができる。また、上限としては、成分の分解を防ぐ観点から、60分以内, 好ましくは30分以内, さらには20分以内で行うことが望ましい。
【００４１】
また、抽出効率の向上のため、ボルテックス処理（攪拌処理）、ローテーター、超音波処理等を行うことも有効である。
【００４２】
抽出後は、抽出上清（液相）と残渣（固相）を固液分離し、抽出上清のみを回収して、NMR分析に供することが望ましい。
固液分離の手段としては、遠心分離, 濾過（濾紙, フィルター等）, デカンテーション等によって簡便に行うことができる。
また、必要に応じて、上記抽出操作を2回以上行い、回収した抽出上清を一つに合わせて、分析に供する態様も可能である。
また、必要に応じて、濃縮操作（凍結乾燥やエバポレーター等）や精製（カラム精製等）を行うことで、分析感度を向上させることも可能である。
【００４３】
・NMR分析用溶媒
本発明では、上記茎葉試料を1H-NMR分析に供するため、上記抽出成分が溶媒に溶解した状態とすることを要する。
また本発明では、上記溶媒として、重溶媒を用いることが好適である。ここで重溶媒とは、磁場ロック用に重水素（D）を分子中に含む溶媒であり、重水, 重メタノール, 重クロロホルム等を指すものである。
【００４４】
また本発明では、上記溶媒として、pH緩衝成分を含む溶媒を用いることが好適である。
ここでpH緩衝成分としては、水溶性溶媒の場合はリン酸塩等を挙げることができる。
また、リン酸塩の種類としては、リン酸二水素カリウムとリン酸水素二カリウムの混合物を用いることが望ましい。
リン酸塩を用いる場合の濃度としては、50〜200mMが好適であるが、さらには75〜150mM, さらには80〜120mM, さらには90〜110mMが好適である。
ここで、所定範囲より塩濃度が低すぎる場合、1H-NMRスペクトルの波形（ピーク）がブロードとなり、検出感度が低下し好ましくない。一方、高すぎた場合、溶解効率が低下するほか、高磁場NMR装置においては誘電損失による感度低下を起こすため好ましくない。
また、pHの範囲としては、5.5〜8.5, 好ましくは6.0〜8.0, さらには6.5〜7.5, 特には7.0付近であることが望ましい。
【００４５】
・1H-NMRスペクトル
本発明では、上記調製した抽出液をNMR試料管に充填し、NMR（核磁気共鳴）分析装置での分析に供することで、NMRスペクトルを得る。
ここで、NMR分析装置とは、静磁場中に置かれた試料内の所定の原子核に、対応する周波数のラジオ波パルスを照射し、所定の原子核からのNMR信号を、所定時間後に検出する装置である。
【００４６】
本発明では、核種として「1H」の原子核を検出対象とし、1次元の1H-NMRスペクトルの信号を得る。
1H-NMRでは、測定試料中の磁気的に非等価な環境にある水素核を、印加したラジオ波パルスと相互作用する周波数、すなわち、共鳴周波数の違いとして検出する。
水素核が磁気的に非等価な環境となる直接的要因としては、水素核近傍の電子密度の違いや、磁気的異方性の影響の違い等を挙げることができる。また、間接的要因としては、水素核を構成要素として含んでいる化合物の種類や、化合物を構成する化学結合の種類や官能基の種類、あるいは温度変化や周辺プロトン（例えば溶媒）との化学交換による相互作用などの物理的・化学的要因を挙げることができる。
例えば、メチル基の水素核は高磁場側（低周波数側）に、芳香環の水素核は低磁場側（高周波数側）に互いにシフトして観測される。共鳴周波数の絶対値は静磁場の強度に比例して大きくなるが、磁場強度の異なる装置で測定したスペクトルであっても、化学シフト値で表した試料中の磁気的に非等価な水素核の共鳴周波数の違いは、同じ値を示す。
また、化学シフト波形の面積は、各プロトンの量を反映した情報となる。
【００４７】
〔プロファイリング〕
本発明の識別法では、上記1H-NMRスペクトルから得られる情報に対してプロファイリングを行うことで、判定対象植物の前記病害に対する抵抗性の強度を判定することが可能となる（例えば、図2 参照）。
【００４８】
・スペクトルの分割と面積の算出
当該プロファイリングを行うためには、各試料に関する情報として、1H-NMRスペクトルの波形を等間隔に分割し、各領域に含まれる波形の面積値を算出する操作を行う。
具体的には、1H-NMRスペクトルの信号範囲全体を、0.5〜60Hz, 好ましくは1〜40Hz, さらには1〜20Hz, 特には1〜5Hzの幅で等間隔に分割し、各領域に含まれる波形の面積（積分値）を算出する。
ここで、分割の幅が細かすぎる場合、同じ化学シフトのプロトンが、分かれた領域に分割される可能性があり好適でない。また、分割の幅が広すぎる場合、化学シフト情報が少なくなり好ましくない。
なお、当該分割操作は、判定対象植物と対照植物で、同様に行うことを要する。
【００４９】
・統計的解析
当該プロファイリングでは、領域分割後の化学シフトの面積情報（それぞれのプロトンについての量の情報）を基に、各試料間の統計的な差異の有無を検出し、抵抗性の強度を判定することができる。
【００５０】
統計的解析の好適な手法としては、クラスタリング解析を挙げることができる。
ここで、クラスタリング解析とは、上記算出した化学シフトの面積値に基づいて、各試料間で総当たり的な比較解析を行い、各試料間の類否関係を階層構造（クレード）として判定する解析手法である（例えば、図5,6 参照）。
なお、解析を行うためには、階層構造（クレード形成）の原理上、最低でも合計4検体（例えば、判定対象植物から2検体＋対照植物から2検体の計4検体）、をNMR分析に供することが必要となる。
【００５１】
当該クラスタリング解析の具体的な手法としては、試料個体間の類似度又は距離として、相関係数やユークリッド距離等を採用することができる。特には、ピアソンの相関係数用いることが好適である。
試料個体間やクラスター間を結合するときの方法としては、最長距離法, 群平均距離法, 重心法，ウォード法等を採用することができる。特には最長距離法が好適である。
【００５２】
当該クラスタリング解析では、各試料間の代謝産物組成に関して、統計的有意差のない試料どうしが1つのクレードを形成する。また、各クレードどうしについても、統計的有意差のないクレードどうしは、さらに大きなクレードを形成する。
これにより、各試料間の代謝物組成の相違に基づく関係性（階層構造）を知ることができる。
【００５３】
・病害抵抗性の度合いの判定
本発明では、各試料間の代謝物組成の相違を、対象植物体が有する抵抗性の強度に応じた量的な変化として、検出することが可能となる。
即ち、本発明では、上記統計的差違の有無の検出（特にクラスタリング解析）した情報から、判定対象植物の前記病害に対する抵抗性の強度を判定することが可能となる。
【００５４】
例えば、判定対象植物が、陽性対照植物（抵抗性なし/弱い）と有意差がなければ、当該判定対象植物は、抵抗性がない又は弱いと判定できる。
また、判定対象植物が、陰性対照植物（抵抗性強い）と有意差がなければ、当該判定対象植物は、抵抗性が強いと判定できる。
また、クラスタリング解析の場合は、同じクレードに属すると判定された植物どうしは、抵抗性の強度が同程度であると判定できる。
【００５５】
なお、本発明における病害抵抗性の度合いを判定する原理は、病害原因微生物の感染等に起因した植物体の代謝物組成の量的変化を検出することによる。
即ち、本発明において識別可能な病害抵抗性の種類としては、真正抵抗性だけでなく、圃場抵抗性についての強度の判定が可能となる。
【００５６】
本発明における病害抵抗性とは、病害原因微生物に感染はするが病徴が発現しにくくなる性質を指す。例えば、感染しても発症が遅い、又は、感染しても軽症ですむ性質を指す。
ここで、「真正抵抗性」とは、特定の病原菌系統のみに特異的な抵抗性を示す性質を指す。比較的に少数の遺伝子によって発現する性質である。従って、遺伝子型に対応しない病原菌系統には抵抗性が発揮されない。
一方、「圃場抵抗性」とは、野外の栽培環境下においてのみ抵抗性が発現される抵抗性の総称である。真正抵抗性とは反対に、病原菌の系統に関わらず抵抗性が発現される。比較的に多数の遺伝子（QTLの場合を含む）によって発現する性質であると考えられているが、全容は明らかではない。
また、圃場抵抗性の一態様として、植物自体の遺伝的要因に加えて、（病害の原因微生物以外の）他の微生物の感染や共生が行われることにより、はじめて抵抗性が発現される場合がある。
【００５７】
当該識別方法では、同じ品種系統に属する植物体は同じ抵抗性強度のグループに分類される。
従って、本発明では、1H-NMRスペクトルからの情報をプロファイリングすることで、判定対象の植物が属する品種系統全体が有する病害抵抗性の強度を、精度良く判定することが可能となる。
【００５８】
〔疫病抵抗性の判定指標となる代謝化合物〕
・L-リンゴ酸含量
上記解析を疫病菌の抵抗性に関して行った場合、代謝組成の変化は、L-リンゴ酸2位及び3位のプロトン強度の変化として検出される。
即ち、本発明においては、植物疫病に対する抵抗性の強度の度合いを、茎葉におけるL-リンゴ酸含量を指標として、精度良く判定することができる。
【００５９】
ここで、被子植物において生成されるリンゴ酸は、主としてTCA回路に由来するL-リンゴ酸であると示唆されている（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesデータベース(http://www.genome.jp/kegg/)）。
TCA回路は、酸素呼吸を行う生物全般に存在する代謝経路であることから、L-リンゴ酸は生物全般に共通に存在する代謝物質であると推測される。
なお、L-リンゴ酸の光学異性体であるD-リンゴ酸は、哺乳類や微生物の一部にはその生成経路の存在が確認されているが、植物での存在は報告されていない。
【００６０】
本発明の識別方法において、L-リンゴ酸含量を指標として判定可能な病害としては、Phytophthora属（エキビョウキン属）の微生物（疫病菌）が引き起こす植物疫病を挙げることができる。
特には、P. infestansに属する疫病菌が引き起こすナス属植物（特にバレイショ, トマト）の植物疫病を挙げることができる。
【００６１】
また、試料として供する茎葉部位としては、上記と同様であるが、植物病害の病徴が発現していない生育段階のものでも好適に用いることができる。
【００６２】
・L-リンゴ酸含量の定量方法
ここで、L-リンゴ酸含量の定量は、上記1H-NMRスペクトルの2位及び3位のプロトンを示す化学シフトのピークを測定し、ピーク面積値から求めた検量線等から算出することが可能である。
【００６３】
また、本発明においては、NMR分析以外でも、常法にてL-リンゴ酸を定量できる方法であれば、如何なる方法でも採用することができる。
例えば、ペーパークロマトグラフィー, 薄層クロマトグラフィー, 高速液体クロマトグラフィー, ガスクロマトグラフィー, キャピラリー電気泳動等を用いて分画し、これらに質量分析機, 電気化学検出器, エバポレイト光散乱検出器などを接続して、定量することが可能となる。
【００６４】
・簡易定量方法
また、本発明においては、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼの酵素反応を利用して、L-リンゴ酸の定量を極めて簡便に行うことが可能となる。
ここで、当該酵素を用いた定量法の具体的な態様としては、以下(i)〜(iv)の工程を順に行うことにより行うことが可能となる。
(i) 対象植物の茎葉の各試料から、水溶性溶媒にて抽出液を調製する。
(ii) 前記(i)で調製した水溶性抽出液に、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びNADを加えることで、L-リンゴ酸をオキザロ酢酸に酸化する。
(iii) 前記(ii)の反応液にL-グルタミン酸を加え、オキザロ酢酸トランスアミナーゼを作用させることでオキザロ酢酸をL-アスパラギン酸に変換し、330〜350nm（好ましくは340nm）の吸光度を測定する。
(iv) 前記吸光度の値から生成されたNADHの増加量を定量し、当該NADHの増加量から換算してL-リンゴ酸含量を定量する。
【００６５】
また、別の態様としては、以下(a)〜(d)の工程を順に行うことにより行うことが可能となる。
(a) 前記バレイショ茎葉の各試料から水溶性溶媒にて各抽出液を調製する。
(b) 前記(1)で調製した水溶性抽出液と、グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ, NAD＋, L-グルタミン酸 , ジホラーゼ, ヨードテトラゾリウム塩化物, を含む水溶液を調製する。
(c) 前記(b)で調製した水溶液に、L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼを加えることで、L-リンゴ酸を出発基質とした連鎖的な酵素反応を行い、最終産物としてINTホルマザンを生成させ、500〜510nm（好ましくは505nm）の吸光度を測定する。
(d) 前記吸光度の値から生成されたINTホルマザンの生成量を定量し、当該INTホルマザン生成量から換算してL-リンゴ酸含量を定量する。
【００６６】
・病害抵抗性の度合いの判定
本発明では、各試料間のL-リンゴ酸含量の相違を、対象植物体が有する植物疫病抵抗性の強度に応じた量的な変化として、検出することが可能となる。
具体的には、本発明では、判定対象植物に植物疫病抵抗性がない又は弱い場合は、L-リンゴ酸含量が低い値として検出される。
一方、判定対象植物に植物疫病抵抗性が強い場合は、L-リンゴ酸含量が高い値として検出される。
これは、疫病菌の感染に対する植物側の代謝応答が、疫病抵抗性の強度によって異なるためと推測される。
【００６７】
当該L-リンゴ酸含量を指標とする場合、必ずしも統計的解析は必須ではないが、好ましくは、統計的な有意差を検出する解析により、抵抗性の度合いを判定することが望ましい。
例えば、t-検定等の統計解析により、有意差の有無を検出することが望ましい。
【００６８】
ここで、判定対象植物が、陽性対照植物（抵抗性なし/弱い）と有意差がなければ、当該判定対象植物は、抵抗性がない又は弱いと判定できる。
また、判定対象植物が、陰性対照植物（抵抗性強い）と有意差がなければ、当該判定対象植物は、抵抗性が強いと判定できる。
【００６９】
当該識別方法では、同じ品種系統に属する植物体は同程度の抵抗性強度を示す。
従って、本発明では、L-リンゴ酸含量を指標とすることにより、判定対象植物が属する品種系統全体が有する植物疫病抵抗性の強度を、精度良く判定することが可能となる。
【００７０】
〔バレイショ疫病の判定への応用〕
本発明における上記識別方法は、特に、バレイショが有するバレイショ疫病抵抗性の度合いの判定に、好適に応用できる。
バレイショ疫病は、Phytophthora infestans (Mont.) de Bary（バレイショ疫病菌）によって引き起こされ、バレイショ栽培に甚大な被害を与えるため、品種系統が有する抵抗性強度の判定は、育種の現場において重要となる。
また、本発明の識別方法は、バレイショ疫病菌の系統（病原菌レース）に依存することなく、適用が可能である。
【００７１】
ここでバレイショ（馬鈴薯, ばれいしょ）とは、ナス科ナス属に属するSolanum tuberosumに分類される植物種を指す。別名としてジャガイモの名称が常用されている。
地下茎である澱粉やビタミンC含量が豊富な塊茎部分を食用とし、保存に適するため、世界中で重要な農作物である。原産地は南米高地であるため、寒冷地や痩せた土地でも生育に適する。
【００７２】
本発明では、バレイショに属する如何なる品種系統に対しても、バレイショ疫病に対する抵抗性の強度を判定することができる。
ここでバレイショ品種系統としては、例えば、男爵薯, コナフブキ, さやか, マチルダ, さやあかね, ゆきつぶら, メークイン, ホッカイコガネ, 北海101号, コナフブキ, トヨシロ, とうや, ワセシロ, ひたひめ, インカのめざめ, スノーデン, 北育19号, イリダ, 花標津, ユキラシャ, 勝系20号, スノーマーチ, スタールビー, ピルカ, ニシユタカ等を挙げることができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００７４】
〔試料例1〕『バレイショ品種』
以下の実施例において用いたバレイショ品種について、表1に整理して記載した。
ここで、男爵薯は、バレイショ疫病に対して抵抗性をほとんど示さず、全ての疫病菌の系統に感染する品種である。
コナフブキ, さやかは、バレイショ疫病に対して相対的に弱い（男爵薯より若干だけ強い）圃場抵抗性を示す品種である。
一方、マチルダ, さやあかねは、バレイショ疫病に対して強い圃場抵抗性を示す品種である。
また、ゆきつぶらは、特定の疫病菌系統に対して抵抗性を示す真性抵抗性を示す品種である。抵抗性の度合いは、圃場抵抗性のものよりも高い。
【００７５】
【表１】
2014003909.tif 000003
【００７６】
〔試験例1〕『圃場栽培試験』
バレイショ疫病に対する抵抗性が異なるバレイショ品種について、疫病罹病度の推移を調査し、それぞれの品種が有する疫病抵抗性強度を実際に判定した。
【００７７】
(1)「疫病発生圃場での栽培」
2008年度に、北海道芽室町の北海道農業研究センター新生圃場（バレイショ疫病が多発する圃場：バレイショ疫病菌が生育又は休眠状態にて存在する圃場）において、上記バレイショ6品種を栽培した。
具体的な植栽としては、図3に示す配置にて、1品種につき10株を1区画に植え、それを2区画ずつ栽培した。また、除外区（グレーで示した区画）として、本試験の対象としない植物（男爵薯）を植栽した。なお、図中の一マスは、一区画（＝一畦：0.75m×3m）を示す。
【００７８】
栽培過程において、バレイショ疫病の発生について罹病度合い（罹病した葉の率）を経時的に調査した。
なお、疫病羅病度（罹病葉率）としては、全体の葉に対して罹病葉が観察された割合が1％以下の場合は「0.0」、；50％程度の場合は「5.0」；、100％の場合は「10.0」、のように記載した。当該値は、10株×2区画の平均値で示した。
また、病状進展度合いを示す値として、AUDPC（Area Under disease Progress Curve：病状伸展曲線下面積）値を、以下の式(1)により算出した（Theor Appl. Genet. 102, 32-40, 2001）。なお、式(1)において、Xiはi番目の観察日、Yiはi番目の観察日における疫病罹病度を示す。
これらの結果を、表2に示した。なお、疫病発生前の栽培状況を撮影した写真像図を図1(A)に、発生後に撮影したものを図1(B)に示した。
【００７９】
【数１】
2014003909.tif 000004
【００８０】
(2)「結果」
その結果、男爵薯, コナフブキ, さやかでは、7月下旬から疫病の罹病を有する葉が観察され始め、8月中旬には疫病罹病度が95〜100％に達した。また、7/19から8/8までのAUDPC値は103〜143、7/19から8/26までのAUDPC値は283〜323という高い値であった。
この結果から、男爵薯, コナフブキ, さやかでは、疫病に対する抵抗性が弱いことが確認された。特に男爵薯の抵抗性が一番弱いことが確認された。
【００８１】
一方、マチルダ, さやあかねでは、7月下旬から8月上旬に疫病の罹病を有する葉が観察されはじめたが、8月中旬の疫病罹病度は38〜53％程度であった。また、7/19から8/8までのAUDPC値は29〜32、7/19から8/26までのAUDPC値は119〜148という低い値であった。
このことから、マチルダ, さやあかねでは、疫病に対する抵抗性が強いことが確認された。
【００８２】
特にゆきつぶらでは、8月上旬になってから疫病の罹病を有する葉が観察されはじめたが、8月中旬の疫病罹病度は28％程度であった。また、7/19から8/8までのAUDPC値は7、7/19から8/26までのAUDPC値は108という特に低い値であった。
このことから、ゆきつぶらでは、疫病に対する抵抗性が極めて強いことが確認された。
なお、当該圃場の疫病菌系統は、ゆきつぶら（真正抵抗性品種）の疫病抵抗性に対応した系統であることが推測された。
【００８３】
【表２−１】
2014003909.tif 000005
【００８４】
【表２−２】
2014003909.tif 000006
【００８５】
〔実施例1〕『バレイショ疫病抵抗性に関わるNMRスペクトルの変化』
試験例1で疫病抵抗性の強度を判定した6品種について、植物代謝の変化をNMRスペクトルの違いとして検出した。
【００８６】
(1)「NMR計測用サンプルの調製」
2010年度の4月17日から、試験例1と同様にして、上記バレイショ6品種を栽培したところ、7月中旬に男爵薯（最も抵抗性の弱い品種）の葉に疫病の病徴が観察され始めた。
そこで、7月18日の午前10〜11時に、疫病の病徴がまだ確認されていない株（各品種系統につき3株ずつ）から、主茎上部に位置する側枝全体（成葉複数及び側茎：図3 参照）を複数ずつサンプリングした。
【００８７】
採取した茎葉を液体窒素で直ちに凍結して凍結乾燥し、代謝を停止させた。当該乾燥試料を微粉砕した後、10.0mgを採取し、緩衝液（重水 90.0mL, 1M K2HPO4軽水溶液 6.15 mL, 1M KH2PO4軽水溶液 3.85 mL, 3-(トリメチルシリル)-1-プロパンスルホン酸ナトリウム (DSS) 21.8 mg）700μLを加えて、5分間, 90℃で振盪抽出した。
遠心分離して得られた上澄みをNMR試料管にいれ、温度298Kにて、DRX500（クライオプローブ, Dual, 13C{1H}, z-gradient, Bruker社製）を用いてNMRスペクトルを測定した。
【００８８】
(2)「NMRスペクトルのプロファイリング」
得られた1H-NMRスペクトルの-0.2ppmから9.4ppmまでの領域を、2.5Hzの幅（0.005ppm）で等間隔に分割し（1920個の領域に分割し）、各領域の面積を、内部標準シグナル（DSSのトリメチルシリルシグナル, 0ppm）の面積を1として規格化し、階層的クラスタリング手法により統計解析を行った。（なお、当該解析手順のフローを、図2に示した。）
階層的クラスタリングは、ダナ・ファーバー癌研究所が提供するフリーソフトウェア、Mev（MultiExperiment Viewer、http://www.tm4.org/mev/）を利用して行い、クラスターの形成にはピアソンの相関係数と最長距離法を用いた。また、最長距離法の代わりに群平均法を用いてもクラスター形成を行った。
最長距離法での結果を図5に、群平均法での結果を図6に示した。
【００８９】
(3)「結果」
その結果、(i) 抵抗性を示さない品種である男爵薯と、弱い抵抗性（圃場抵抗性）しか示さないコナフブキ, さやかは、1つのクレードを形成することが示された。
また、(ii) 強い圃場抵抗性を示す品種であるマチルダ, さやあかねは、1つのクレードを形成することが示された。
そして、(iii) 真正抵抗性の品種であり、当該圃場の疫病菌系統に対して極めて強い抵抗性を示したゆきつぶらは、1つのクレードを形成することが示された。
【００９０】
なお、当該(i)〜(iii)のクレードは、最長距離法と群平均法のいずれのクラスタリング方法を採用した場合でも、共通して形成されることが示され、信頼性の高い結果であることが示された。
【００９１】
これらの結果から、疫病発生圃場で栽培したバレイショについて、疫病の病徴が顕在化していない段階の茎葉を採取し、水溶性抽出物全体のNMRスペクトルを統計解析することによって、供試した株（植物個体）の病害抵抗性の強度を、明確に判別できることが示された。
また、同じ品種系統に属する植物体（株）は同じクレードを形成することから、供試した株が属する品種系統が有する病害抵抗性の強度についても、明確に判別できることが示された。
【００９２】
〔実施例2〕『代謝物マーカーの同定』
各品種間の前記NMRスペクトルの違いを比較することによって、抵抗性の違いに関与する代謝物の同定を行った。
【００９３】
(1)「1H-NMRスペクトルの相違」
実施例1で得られた6品種のNMRスペクトルを比較したところ、2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppm, 4.27〜4.31ppmの3つの領域に、明確な相違があることが示された。
2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppmのスペクトル領域について、抵抗性のない品種（男爵薯）の結果を図7(A)に、抵抗性の強い品種（マチルダ：圃場抵抗性品種）の結果を図8(A)、抵抗性が極めて強い品種（ゆきつぶら：真正抵抗性品種）の結果を図9(A)に示した。
また、4.27〜4.31ppmのスペクトル領域のシグナルについて、抵抗性のない品種（男爵薯）の結果を図7(B)に、抵抗性の強い品種（マチルダ：圃場抵抗性品種）の結果を図8(B)、抵抗性が極めて強い品種（ゆきつぶら：真正抵抗性品種）の結果を図9(B)に示した。
これらの図が示すように、当該スペクトル領域の3つのシグナルは、抵抗性の強度に応じて、高くなる傾向を示した。
【００９４】
(2)「代謝物質の同定」
次いで、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQCスペクトル等の2次元NMRスペクトルの解析により、当該シグナルを示す物質の同定を行った。
【００９５】
その結果、2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppmのシグナルは、リンゴ酸のC-3における2つのプロトンを示すシグナルであることが明らかになった（図10 参照）。
また、4.27〜4.31ppmのシグナルは、リンゴ酸のC-2におけるプロトンを示すシグナルであることが明らかになった（図10 参照）。
【００９６】
(3)「考察」
これらのことから、2.32〜2.38ppm, 2.63〜2.68ppm, 4.27〜4.31ppmの3つの領域のシグナルの相違が、実施例1におけるNMRスペクトルのプロファイリング結果に関与することが明らかになった。
また、これらのシグナルは、リンゴ酸のC-3プロトン, C-2プロトンに対応することから、茎葉中の「リンゴ酸」の含量を指標（マーカー）として、供試した株（品種系統）のバレイショ疫病に対する抵抗性強度の違いを、明確に識別できることが示された。
【００９７】
〔実施例3〕『酵素法によるL-リンゴ酸定量法を利用した疫病抵抗性強度の判別』
上記茎葉中のリンゴ酸含量の定量について、酵素法による簡易的なL-リンゴ酸定量法が可能かを検討した。
【００９８】
(1)「抽出液の調製」
実施例1(1)で採取したバレイショ茎葉のうち、抵抗性のない品種（男爵薯）、抵抗性の強い品種（マチルダ：圃場抵抗性品種）、抵抗性が極めて強い品種（ゆきつぶら：真正抵抗性品種）の3品種の各茎葉について、液体窒素で直ちに凍結して凍結乾燥し、代謝を停止させた。
当該乾燥試料を微粉砕した微粉砕試料各10.0mgを採取し、超純水700μLを加えて、5分間, 90℃で振盪抽出した。
抽出後、遠心分離して得られた上清100μLに超純水を加え、水抽出液の1/50希釈液を調製した。（なお、実施例2の結果からリンゴ酸含量が特に高いと予想されるゆきつぶらについては、1/100希釈液を調製した。）
【００９９】
(2)「L-リンゴ酸含量に相関する吸光度の値（ΔE値）の測定」
ロシュ・ダイアグノスティク社が製造するリンゴ酸定量キット(F-キットL-リンゴ酸)を用いて、推奨プロトコールに従い、上記水抽出液中に含まれるL-リンゴ酸量を定量した。
上記調製した各抽出液の希釈液675μLに、溶液I(L-グルタミン酸を含む溶液)675μL, 溶液II(β-NADを含む溶液)135μL, 溶液III(グルタミン酸-オキザロ酢酸トランスアミナーゼを含む溶液)6.75μLの試料液を混合した。
混合後、当該混合液を光路長1cmのキュベットに移し、25℃で3分間放置し、340nmの吸光度(E1値)を測定した。
溶液IV(L-リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む溶液)6.75μLを添加し、25℃で10分間放置することで酵素反応を行い、340nmの吸光度(E2値)を測定した。なお、光波長340nmは、NADHの吸収波長である。
また、ブランク値を測定するため、各抽出液の希釈液の代わりに超純水675μLを用いて同様の操作を行い、混合液の340nmの吸光度（B1値）及び酵素反応後の340nmの吸光度（B2値）を測定した。
【０１００】
上記測定した抽出希釈液のE1値及びE2値, ブランク値であるB1値及びB2値を用いて、以下の式(2)により、ΔE値（酵素反応後のNADH増加量を表す吸光度の値）を算出した。
ここで、NADHは、出発基質であるL-リンゴ酸から上記連鎖的酵素反応により生成された物質であるため、当該ΔE値は、抽出希釈液に含有されていたL-リンゴ酸量に相関する値となる。
【０１０１】
【数２】
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【０１０２】
(3)「L-リンゴ酸含量の算出」
L-リンゴ酸標準液(0.016mM)を希釈して1/100倍, 1/200倍、1/500倍, 1/800倍, 1/1000倍の各標準液を作成し、各抽出液の希釈液の代わりにこれらの各標準液を用いて同様の操作を行い、ΔE値とL-リンゴ酸濃度の相関を示す検量線を作成した。
そして、当該検量線と上記各試料抽出希釈液のΔE値を用いて、各バレイショ品種茎葉の乾燥重量1mgあたりのL-リンゴ酸含量を算出した。結果を表3に示した。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
(4)「結果」
その結果、各茎葉に含まれるL-リンゴ酸含量は、抵抗性のない品種（男爵薯）では9.97μg/mg(乾重)、抵抗性の強い品種（マチルダ：圃場抵抗性品種）では22.2μg/mg(乾重)、抵抗性が極めて強い品種（ゆきつぶら：真正抵抗性品種）では50.3μg/mg(乾重)であった。
即ち、疫病発生圃場で栽培したバレイショの茎葉に含まれるL-リンゴ酸含量は、疫病抵抗性強度に応じて高い値を示すことが示された。
【０１０５】
このことから、酵素法による簡易的なL-リンゴ酸定量法を用いた方法により、バレイショ品種が有する疫病抵抗性強度を、迅速且つ簡便に判別可能できることが示された。
【０１０６】
〔比較例1〕『D-リンゴ酸未含量の確認』
上記茎葉中のリンゴ酸含量の変化に、D-リンゴ酸含量の変化が関与しているかを確認した。
【０１０７】
(1)「抽出液の調製」
実施例3(1)に記載の方法と同様にして、抵抗性のない品種（男爵薯）、抵抗性の強い品種（マチルダ：圃場抵抗性品種）、抵抗性が極めて強い品種（ゆきつぶら：真正抵抗性品種）の3品種の各茎葉からの水抽出液を調製した。
なお、含有量が低い場合を想定して、1/20希釈液を調製した。
【０１０８】
(2)「D-リンゴ酸含量に相関する吸光度の値（ΔE値）の測定」
ロシュ・ダイアグノスティク社が製造するリンゴ酸定量キット(F-キットD-リンゴ酸)を用いて、推奨プロトコールに従い、上記水抽出液中に含まれるD-リンゴ酸量の定量を試みた。
上記調製した各抽出液の希釈液915μLに、溶液I(HEPES緩衝液, pH 9.0) 508 μL, 溶液II(β-NADを含む溶液)50.8 μLの試料液を混合した。
混合後、当該混合液を光路長1cmのキュベットに移し、25℃で6分間放置し、340nmの吸光度(E1値)を測定した。
溶液III(D-リンゴ酸デヒドロゲナーゼを含む溶液)25.4μLを添加し、25℃で10分間放置することで酵素反応を行い、340nmの吸光度(E2値)を測定した。なお、光波長340nmは、NADHの吸収波長である。
また、ブランク値を測定するため、各抽出液の希釈液の代わりに超純水675μLを用いて同様の操作を行い、混合液の340nmの吸光度（B1値）及び酵素反応後の340nmの吸光度（B2値）を測定した。
【０１０９】
上記測定した抽出希釈液のE1値及びE2値, ブランク値であるB1値及びB2値を用いて、上記の式(2)により、ΔE値（酵素反応後のNADH増加量を表す吸光度の値）を算出した。
ここで、NADHは、出発基質であるD-リンゴ酸から上記連鎖的酵素反応により生成された物質であるため、当該ΔE値は、抽出希釈液に含有されていたD-リンゴ酸量に相関する値となる。
【０１１０】
(4) 結果
その結果、定量に用いた各希釈液の濃度を実施例3(1)の2.5〜5倍の濃さに調製したにも関わらず、算出されたΔE値は0であった。即ち、各希釈液からは、D-リンゴ酸が全く検出されなかった。
このことから、1H-NMRスペクトルにより検出された信号強度の変化は、L-リンゴ酸含量の変化に由来するものであり、疫病菌の感染に対する茎葉中のリンゴ酸含量の変化（代謝応答）は、「L-リンゴ酸含量」の変化であることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明は、農業の育種分野で広く利用可能である。また、品種と圃場・栽培環境の組み合わせによる病害抵抗性の違いを評価できることから、農業生産分野でも活用できる。
また、本発明は、基本特許となるべきものであり、今後、幅広い応用・実用化段階の技術開発が必要である。
例えば、本手法で開発したマーカー（特にL-リンゴ酸）については、病害抵抗性識別キット等の利用形態での普及が期待される。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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