(57)【要約】      （修正有）【課題】セルロース系バイオマスの分解反応条件に対して十分に安定したセルラーゼを、微生物表面上に発現させた微生物の提供。【解決手段】以下の構成要素を含む核酸分子：(1)シグナルペプチドをコードする部分、(2)異種セルラーゼをコードする部分、(3)随意によりプロテアーゼ認識部位をコードする部分、(4)膜貫通リンカーをコードする部分、及び(5)オートトランスポーター又はその変異体のトランスポータードメインをコードする部分。前記セルラーゼは、β-グルコシダーゼ又はエンド又はエキソセルラーゼを含む群から選択される核酸分子。前記核酸分子に適切に作用可能に連結され、イソプロピルチオグルコピラノシド（ＩＰＴＧ）又はアラビノースを添加することにより活性化可能であることが好ましい発現制御配列を含む核酸分子。【選択図】図１
2014171474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成要素を含む核酸分子:
(1)シグナルペプチドをコードする部分、
(2)異種セルラーゼをコードする部分、
(3)随意によりプロテアーゼ認識部位をコードする部分、
(4)膜貫通リンカーをコードする部分、及び
(5)オートトランスポーター又はその変異体のトランスポータードメインをコードする部分。
【請求項２】
前記セルラーゼは、β-グルコシダーゼ又はエンド又はエキソセルラーゼであり、好ましくは、枯草菌のエンドセルラーゼ、Clostridium thermocellumのエキソセルラーゼ、及びClostridium thermocellumのβ-グルコシダーゼを含む群から選択される、請求項1記載の核酸分子。
【請求項３】
オートトランスポーターのトランスポータードメインは、Ssp、Ssp-h1、Ssp-h2、PspA、PspB、Ssa1、SphB1、AspA/NalP、VacA、AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、パータクチン、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、AgA1プロテアーゼ、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanB、及びその変異体を含む群から選択される、請求項1又は2記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子に適切に作用可能に連結され、イソプロピルチオグルコピラノシド(IPTG)又はアラビノースを添加することにより活性化可能であることが好ましい発現制御配列を含む、請求項1乃至3の何れかに記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項1乃至4の何れかに記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項６】
請求項5記載のポリペプチドを表面上に発現する、或いは、請求項1乃至4の何れかに記載の核酸分子を用いて形質転換された、微生物。
【請求項７】
グラム陰性微生物、好ましくは大腸菌に基づく、請求項6記載の微生物。
【請求項８】
請求項6又は7記載の細胞から取得可能な、膜画分。
【請求項９】
以下のステップを含む、少なくとも1つのセルラーゼを用いた反応産物を生産する方法:
(i)請求項6又は7記載の微生物又は請求項8記載の膜調製物を調製するステップと、
(ii)前記微生物及び/又は前記膜調製物を、セルラーゼ活性に適した条件下で、1つ以上のセルラーゼ基質に接触させるステップ。
【請求項１０】
前記セルラーゼにより触媒された前記反応の前記産物は、単糖、二糖、又はオリゴ糖であり、前記少なくとも1つのセルラーゼ基質は、多糖源、特に好ましくはセルロース源である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(ii)は、4.5乃至6.5の範囲内、好ましくは5.5乃至6.5の範囲内のpHで実施される 請求項9又は10記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(ii)は、30乃至80℃の範囲内、好ましくは50乃至65℃の範囲内の温度で実施される、請求項9乃至11の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ(ii)において、グルコシダーゼを添加する、請求項9乃至12の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(ii)において用いた前記微生物を回収する追加ステップ(iii)を含む、請求項9乃至13の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップを含む、表面に組換えセルラーゼを提示する微生物を生産する方法:
a)請求項1乃至請求項4の何れかに記載の核酸配列を前記微生物へ挿入するステップと、
b)随意により、前記微生物を、発現制御配列を活性化する物質により処理するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以下の構成要素を含む核酸分子に関する:
(1)シグナルペプチドをコードする部分、(2)異種セルラーゼをコードする部分、(3)随意によりプロテアーゼ認識部位をコードする部分、(4)膜貫通リンカーをコードする部分、及び(5)オートトランスポーター(autotranspoter)又はその変異体のトランスポータードメインをコードする部分。
【０００２】
本発明の他の態様は、上述した核酸分子によりコードされたポリペプチド、対応するポリペプチドを表面上に提示する微生物、及びこうした微生物から取得可能な膜画分に関する。本発明は、更に、微生物又は膜画分を用いた反応産物、特にセルロース反応産物を生産する方法と、セルラーゼにより触媒された反応からの産物を生産するための微生物及び/又は膜調製物の使用とに関する。
【背景技術】
【０００３】
セルラーゼは、セルロースを基本単位であるβ-グルコースに分解することが可能な酵素である。セルラーゼは、例えば、特殊な細菌及び鞭毛虫類等の植物分解生物のごく一部と、菌類等の木材分解微生物とからのみ形成される。こうした酵素を用いて、対応する微生物は、通常3000乃至15,000個のグルコース分子から成るセルロースを分割し、代謝的に再循環させて、分解産物に、更に最終的にはグルコースにすることができる。セルラーゼは、特に、3種類の酵素型を含み、これらの複合効果により、セルロース分子の合理的な消化が可能になる。
【０００４】
1.エンドセルラーゼ群(酵素クラスEC 3.2.1.4):これらの酵素は、セルロースを大きな部分に分割し、他のセルラーゼとは異なり、セルロース鎖内でも機能することができる。特に、エンドセルラーゼは、セルロース分子が互いに対して不規則となる「非晶質領域」において活性を有することがきる。結果として、これらの酵素は、より多数の鎖末端を生成する。
【０００５】
2.エキソセルラーゼ群(EC 3.2.1.91):これらの酵素は、セルロースを末端からのみ分割し、セルロース鎖を継続的に短くする。エキソセルラーゼの反応は、一般に、セルロース鎖からセロビオース単位(二糖)を分離するが、更にグルコース、セロトリオース、又はセロテトラオースも分離する。
【０００６】
3.セロビアーゼ又はβ-グルコシダーゼ(EC 3.2.1.21):この酵素群は、セロビオースの2個のグルコース分子間のβ-グリコシド結合を分割することにより、グルコースを他の代謝プロセスにおいて利用可能にする。
【０００７】
上述した3種類の酵素型は、それぞれ単独でセルロース系バイオマスを攻撃することができる。しかしながら、前記酵素型の組み合わせは、高度な相乗的挙動を示し、セルロース系バイオマスの異なる天然構造単位を攻撃する。特に、セロビアーゼが使用される場合、エンドセルラーゼ及びエキソセルラーゼがもたらすセロビオース、セロトリオース、及び他の高セロオリゴ糖のグルコースへの分解が、酵素触媒反応の平衡を変位させるため、更に効果的な変換を促進することが期待できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
セルロース及びヘミセルロースは、木材及び多くの植物の主成分であるため、自由に利用可能な原料を意味する。しかしながら、材料の変換に関する問題の1つは、材料を分割して、例えばグルコースとするのが困難なことにあり、バイオエタノールを得る際の広範な使用にとって障害となる。最新技術では、現在、セルロースをグルコースに分解するために使用される幾つかの精製酵素が存在しており、一般には、Trichoderma reesei又はC. acetobulyticum等の菌類培養物から単離する必要がある(Shah et al., App. Biochem. Biotech. (1991), vol. 18/29, 99 - 106参照)。個別の酵素を精製すること、及びセルロース系バイオマスの分解に使用する前に効果的な酵素カクテルを混合することは、現在の技術水準において大きなコスト要因を意味する。最新技術では、得られた産物から、対応する遊離酵素を回収することも可能である。したがって、第一に、簡易な作製及び混合プロセスを可能にし、第二に、使用後に酵素を簡単な方法で回収できる、セルラーゼの既製形態が必要である。
【０００９】
したがって、本発明の課題の1つは、セルラーゼ活性を有する作用物質を提供することにあり、作用物質は、基質分子に容易にアクセス可能であるだけでなく、簡単な方法で増幅、再循環、及び再生が可能である。これにより、新しい作用物質を反復的に作製する必要なく、幾つかの触媒ステップが可能となるべきである。本発明の他の課題は、遺伝的特徴、熱安定性、保存性、安定性に関して好ましい性質を示す作用物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、驚くべきことに、オートトランスポーター系を用いることにより、セルロースの分割及び取得された産物のその後の分離のための反応条件に対して十分に安定したセルラーゼを、微生物表面上に発現させることが可能であることを発見した。更に、驚くべきことに、対応するセルラーゼを表面上に有する微生物は、様々な溶液及び緩衝液中において、異なる条件下で長期に亘りインキュベート及び安定状態の維持が可能であることを発見した。
【００１１】
オートディスプレイは、細菌表面上に組換えタンパク質を提示するための優れたツールを意味する。この発現系は、V型分泌系に属するオートトランスポーターのタンパク質ファミリの分泌機構に基づいている。
【００１２】
グラム陰性菌において、オートトランスポーター経路は、タンパク質の細胞表面への輸送と、細胞外空間におけるタンパク質の分泌との両方のために形成された(Jose and Meyer, 2007)。オートトランスポータータンパク質は、細胞表面への輸送のための全ての構造的要件を満たす前駆タンパク質として合成される(Jose, 2006)。これらは、N末端シグナルペプチドを伴って合成され、それは、内膜の通過を可能にするSec経路において典型的である。ペリプラズムに入ると、前駆体のC末端部は、シグナルペプチドを切り離した後、外膜内への折り畳みを生じ、βバレルとして知られる細孔状の構造となる。N末端に付着したパッセンジャードメインは、この細孔を介して移行する(Jose et al., 2002)。ここで、パッセンジャードメインは、自己タンパク分解又は付加的なプロテアーゼにより分離可能となり、或いは、トランスポータードメインを介した細胞エンベロープとの固着を維持する。
【００１３】
天然のパッセンジャーを組換えタンパク質に置き換えることは、その表面移行につながる。これを行うには、遺伝子工学プロセスを用いて、シグナルペプチドと、組換えパッセンジャーと、βバレルと、表面への無制限のアクセスに必要な、介在するリンカー領域とから成る人工前駆体を構築する必要がある。AIDA-Iオートトランスポーターは、このように使用して、様々なパッセンジャードメインの効率的な表面ディスプレイを行うことに既に成功している(Henderson et al., 2004)。オートディスプレイ系では、活性酵素上でのサブユニットの自己会合が、例えば、二量体酵素ソルビトールデヒドロゲナーゼにおいて観察されている(Jose, 2002; Jose and von Schwichow, 2004)。
【００１４】
特に、オートディスプレイ技術は、オートトランスポータータンパク質の天然分泌機構に基づくオートディスプレイ系により、大腸菌及び他のグラム陰性菌の外膜の表面上において特異タンパク質を発現させる方法である(A. Banerjee et al. (2002))。この場合、組換えパッセンジャータンパク質の輸送は、そのコード配列を、シグナルペプチドとオートディスプレイベクタの転位ドメインとの間のコード配列のリーディングフレームに、遺伝子工学手法を用いて挿入するだけで発生させることができる。シグナルペプチドは、コレラ毒素のサブユニットから得ることが可能であり、人工プロモーターと組み合わせることができる。結果として、外膜を越えた移行のためのパッセンジャータンパク質は、オートトランスポーターとして知られる他のタンパク質と共に、組換え融合タンパク質として大腸菌(AIDA-I)の外膜上に発現される(Jose, 2006)。オートトランスポーターのC末端部分は、大腸菌膜の外膜内で細孔状構造(βバレル)を形成する(Jose, 1995, 2006, 2007)。
【００１５】
オートディスプレイ系の概念は、Jose et al. (1995)により最初に記述されており、15年以上前から知られている。この間に、オートディスプレイ系は、ニトリラーゼが固定化された細胞(WO 2011/057820参照)やレドックス活性酵素を有する細胞(WO 2012/025628参照)を生産するために使用可能であることが明らかとなっている。このレドックス活性酵素は、レドックス因子特にNAD/NADH及びNADP/NADPHを再生し、所望の活性を示した。しかしながら、オートディスプレイ系を新たな酵素クラスに移行させることは、特に、場合によって必要となるシャペロンが不在の状態では、タンパク質の正しい折り畳みが保証されないため、当業者にとって依然として大きな問題となっている。これまで、セルラーゼの固定化のためのオートトランスポーター系の使用は、最新技術において教示も示唆もされていない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の課題は、独立請求項の内容により解決される。好適な実施形態は、従属請求項から導くことができる。
【００１７】
本発明の課題は、以下を含む核酸分子により、第1の態様に従って解決される:
(1)シグナルペプチドをコードする部分、
(2)異種セルラーゼ又はその変異体をコードする部分、
(3)随意によりプロテアーゼ認識部位をコードする部分、
(4)膜貫通リンカーをコードする部分、及び
(5)オートトランスポーター又はその変異体のトランスポータードメインをコードする部分。
【００１８】
本発明の他の態様は、対応する核酸分子の転写により得られるタンパク質及びポリペプチドと、対応するタンパク質を含む微生物と、こうした微生物から得られる膜調製物とに関する。本発明の他の態様は、以下のステップを含む、少なくとも1つのセルラーゼを用いた反応産物を生産する方法に関する:
(i)セルラーゼを表面上に提示する少なくとも1つの微生物、及び/又はこの微生物の膜調製物の調製、及び
(ii)少なくとも1つの微生物及び/又は膜調製物を、セルラーゼ活性に適した条件下で、1つ以上のセルラーゼ基質に接触させること。
【００１９】
最後に、本発明は、更に、セルラーゼ触媒作用により生産可能な反応産物を作製する記載の微生物又は膜調製物の使用と、対応する微生物及び膜調製物を生産する方法とに関する。
【００２０】
本発明の好適な一実施形態において、核酸分子は、発現調節用の配列に機能的に連結される。好適な一実施形態において、本明細書で使用される「発現調節用の配列」という用語は、好ましくは、発現調節用の配列の下流にある核酸分子の発現レベルを調節可能な核酸配列を示す。発現調節用の配列は、例えば、プロモーター(promoter)にすることができる。当業者は、発現調節に適した配列と、こうした配列の核酸分子との機能的連結のための方法とに精通している。本発明との関連において、発現調節配列は、誘導原であるイソプロピルチオグルコピラノシド(IPTG)又はアラビノース(arabinose)、特にL-アラビノースを利用して活性化可能な発現レギュレーターをコードするものが特に好適である。
【００２１】
本発明の好適な一実施形態において、核酸分子は、組換えプラスミドの一部である。
【００２２】
本発明の好適な一実施形態において、本明細書で使用される「異種」という用語は、遺伝子工学的方法を用いて、例えば、発現調節用の配列と、通常は、この発現調節用の配列の制御下に無い発現対象配列とをスプライシングすることにより、或いは、元の配列からの点突然変異を有する配列を使用することにより、構築された核酸分子を示す。そのため、たとえ構築物の一部分だけが異種と記載される場合でも、これは構築物全体が異種であることを意味する。当業者は、遺伝子工学的方法に精通している。他の好適な実施形態において、本明細書で使用される「異種」という用語は、発現調節用の配列、及び/又は、発現調節用の配列とは異なる生物に由来し且つ発現対象である融合配列にスプライシングされたポリペプチドをコードする核酸分子を示す。好適な他の実施形態において、本明細書で使用される「異種」という用語は、セルラーゼポリペプチドに関連して、セルラーゼをコードする核酸分子の部分が、トランスポータードメイン又は発現調節用の配列又は膜貫通リンカー等、他の少なくとも1つの部分とは異なる生物から取得又は取り出しされたことを意味する。例えば、セルラーゼは、枯草菌から得られたとしても、他の全ての配列が大腸菌から得られた場合、異種となる。他の好適な実施形態において、本明細書で使用される「異種」という用語は、異種として説明された核酸配列が、この核酸配列を発現又は増幅するために使用された宿主又は意図した宿主と異なる生物に由来することを意味する。
【００２３】
特に好適な一実施形態において、核酸分子は、配列番号1、配列番号3、又は配列番号5の配列、或いはその変異体を含む。
【００２４】
本発明の好適な一実施形態において、本明細書で使用される「シグナルペプチド」という用語は、好ましくはポリペプチドのN末端に位置し、ポリペプチドが宿主細胞のサイトゾルにおいて発現された際に、細胞の特定の区画、好ましくはサイトゾルとは異なる区画へ移行させる作用を有するアミノ酸配列を示す。特に好適な一実施形態において、宿主細胞は、グラム陰性菌であり、シグナルペプチドは、新生又は完成ポリペプチドを、グラム陰性菌細胞のペリプラズム又は外膜内へ移行させる。
【００２５】
本発明の他の好適な実施形態において、本明細書で使用される「プロテアーゼ認識部位」という用語は、プロテアーゼにより特異的に認識される、ポリペプチド内の特異アミノ酸配列パターンであって、プロテアーゼがポリペプチドに結合して切断するようになるものを示す。
【００２６】
本発明の範囲内において、本明細書で使用される「膜通過リンカー」という用語は、好ましくは、オートトランスポータードメインをレドックス因子再生ポリペプチドに連結するために使用され、かつ、レドックス因子再生ポリペプチドの独立した折り畳み及び/又は輸送を可能にする上で十分な柔軟性を有する、柔軟なポリペプチド部分を示す。
【００２７】
本発明の好適な一実施形態において、「オートトランスポーターのトランスポータードメイン」という用語は、核酸分子の発現産物が、細胞内、好ましくは細菌細胞質内においてリボソームにより合成され、細胞の外膜、好ましくは細胞外環境に露出された外膜の側に移行する場合に、核酸分子の発現産物を得るために使用可能なドメインを示す。特に好適な実施形態において、トランスポータードメインは、前記発現産物を外膜の外部表面に配置する作用を有する。本発明の好適な実施形態において、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、細胞の外膜に位置するタンパク質であり、セルラーゼをコードする部分は、トランスポータードメインのドメイン、ループ、又は他の何らかの部分の一部であり、或いは、それに融合し、セルラーゼが細胞の表面に提示されるようになる。本発明の他の好適な実施形態において、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、細胞の表面にポリペプチドを提示するために使用可能な系のタンパク質である。
【００２８】
好適な実施形態において、アミノ鎖又は核酸配列の変異体は、本願において明示的に、例えば、名称又は受託番号により、又は更に「の変異体」という用語により示すか、或いは黙示的に、例えば、本発明に関連する機能の説明により示す。好適な実施形態において、「変異体」という用語は、基準となるアミノ酸に対して60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98、又は99％の同一性を有し、同等の条件下において、類似するセルラーゼ活性を示すアミノ酸又は核酸配列を含む。好適な一実施形態において、「変異体」という用語は、アミノ酸配列に関して、基準配列に対して1個以上の保存的アミノ酸交換を有するアミノ酸配列を含む。好適な一実施形態において、アミノ酸配列又は核酸配列の「変異体」という用語は、アミノ酸配列又は核酸配列の活性部分及び/又はフラグメントを含む。好適な一実施形態において、本明細書で使用される「活性部分」という用語は、完全長のアミノ酸又は核酸配列よりも短いが、例えばセルラーゼとしての必須の生物活性の少なくとも一部を依然として維持しているアミノ酸配列又は核酸配列を示す。好適な一実施形態において、核酸の「変異体」という用語は、好ましくは厳密な条件下で、基準核酸とハイブリッド形成する相補鎖の核酸を含む。ハイブリッド形成反応の厳密性は、当業者が容易に決定可能であり、通常は、プローブ長、洗浄温度、塩濃度の関数としての経験的計算となる。一般に、プローブが長い程、完全なアニーリングのために高い温度を要し、プローブが短い程、低い温度を要する。ハイブリッド形成は、一般に、相補鎖が鎖の融点を下回る温度の環境にある時、変性DNAの復元能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の度合いが高い程、付与可能な相対温度は高くなる。したがって、相対温度が高い場合、反応条件の厳密性は高くなり、温度が低い程、この厳密性は低下することになる。ハイブリッド形成の厳密性の詳細及び説明は、Ausubel et al. (1995)において確認することができる。別の好適な実施形態において、核酸又はアミノ酸の「変異体」という用語は、少なくとも一定の度合いまで、基準核酸又はアミノ酸と同じ生物活性及び/又は機能を有する核酸又はアミノ酸を示す。好適な実施形態の1つにおいて、本明細書で使用される核酸配列の「変異体」という用語は、基準アミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を示す。
【００２９】
好適な一実施形態において、「セルラーゼ」という用語は、クラスEC 3.2.1.4、EC 3.2.1.91、又はEC 3.2.1.21からの酵素を示す。他の好適な実施形態において、セルラーゼは、枯草菌又はClostridium thermocellum由来のセルラーゼである。セルラーゼは、エンド型、エキソ型、又はエキソセルラーゼ又はβ-グルコシダーゼにすることができる。しかしながら、本発明の範囲では、好ましくは、枯草菌由来のエンドセルラーゼ、Clostridium thermocellum由来のエキソセルラーゼ、又はClostridium thermocellum由来のβ-グルコシダーゼである。配列番号2、配列番号4、又は配列番号6、或いはその変異体による配列を有する酵素である場合、特に好ましい。
【００３０】
好ましくは、セルラーゼは、オートトランスポーターのトランスポータードメインと融合される。
【００３１】
本発明によるオートトランスポーターのトランスポータードメインは、オートトランスポーターの任意のトランスポータードメインにすることが可能であり、好ましくは、βバレル構造を形成することができる。βバレル構造と、βバレルオートトランスポーターの好適な例との広範な説明は、WO 97/35022に開示されており、出典を明記することにより本願明細書の一部を成す。Henderson et al. (2004)は、適切なオートトランスポータードメインを有するオートトランスポータータンパク質を説明している(概要は、Henderson et al., 2004の表1において確認可能)。Henderson et al. (2004)の開示は、出典を明記することにより本願明細書の一部を成す。例えば、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、以下から選択することができる:Ssp(P09489、S. marcescens)、Ssp-h1(BAA33455、S. marcescens)、Ssp-h2(BAA11383、S. marcescens)、PspA(BAA36466、P. fluorescens)、PspB(BAA36467、P. fluorescens)、Ssa1(AAA80490、P. haemolytica)、SphB1(CAC44081、B. pertussis)、AspA/NalP(AAN71715、N. meningitidis)、VacA(Q48247、H. pylori)、AIDA-I(Q03155、E. coli)、IcsA(AAA26547、S. flexneri)、MisL(AAD16954、S. enterica)、TibA(AAD41751、E. coli)、Ag43(P39180.E. coli)、ShdA(AAD25110、S. enterica)、AutA(CAB89117、N. meningitidis)、Tsh(I54632、E. coli)、SepA(CAC05786、S. flexneri)、EspC(AAC44731、E. coli)、EspP(CAA66144、E. coli)、Pet(AAC26634、E. coli)、Pic(AAD23953、E. coli)、SigA(AAF67320、S. flexneri)、Sat(AAG30168、E. coli)、Vat(AAO21903、E. coli)、EpeA(AAL18821、E. coli)、EatA(AAO17297、E coli)、Espl(CAC39286、E. coli)、EaaA(AAF63237、E. coli)、EaaC(AAF63038、E. coli)、Pertactin(P14283、B. pertussis)、BrkA(AAA51646、B. pertussis)、Tef(AAQ82668、B. pertussis)、Vag8(AAC31247、B. pertussis)、PmpD(O84818、C. trachomatis)、Pmp20(Q9Z812、C. pneumoniae)、Pmp21(Q9Z6U5、C. pneumoniae)、lgA1 protease(NP_283693、N. meningitidis)、App(CAC14670、N. meningitidis)、lgA1 protease(P45386、H. influenzae)、Hap(P45387、H. influenzae)、rOmpA(P15921、R. rickettsii)、rOmpB(Q53047、R. rickettsii)、ApeE(AAC38796、S. enterica)、EstA(AAB61674、P. aeruginosa)、Lip-1(P40601、X. luminescens)、McaP(AAP97134、M. catarrhalis)、BabA(AAC38081、H. pylori)、SabA(AAD06240、H. pylori)、AlpA(CAB05386、H. pylori)、Aae(AAP21063、A. actinomycetem-comitans)、NanB(AAG35309、P. haemolytica)、及びこれらのオートトランスポーターの変異体。オートトランスポータータンパク質の例のそれぞれについて、オートトランスポーターを取得可能な適切なGenBank受入番号及び種の例を括弧内に記載している。本発明の範囲内において、オートトランスポーターのトランスポータードメインは、好ましくは、Ssp、Ssp-h1、Ssp-h2、PspA、PspB、Ssa1、SphB1、AspA/NalP、VacA、AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、Espl、EaaA、EaaC、パータクチン、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20.Pmp21、AgA1プロテアーゼ、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanB、及びその変異体を含む群から選択される。特に好適な一実施形態において、トランスポータードメインは、グラム陰性菌細胞、特に大腸菌のAIDA-I型の、オートトランスポーター経路とも呼ばれるオートディスプレイ系のトランスポータードメイン、或いはその変異体であり、例えば、Niewert et al.(2001)により説明されるものである。
【００３２】
上述したオートトランスポーター配列の変異体は、例えば、膜貫通部分に属していないβバレルのループ構造のアミノ酸配列を変更することで取得できる。随意により、表面ループをコードする核酸は、全て削除することができる。加えて、保存的アミノ酸交換は、両親媒性のβ折り畳みシート構造内で行うことが可能であり、即ち、親水性アミノ酸の他の親水性アミノ酸との交換、及び/又は疎水性アミノ酸の他の疎水性アミノ酸との交換にすることができる。好ましくは、変異体は、アミノ酸レベルにおいて、対応するオートトランスポータードメインの自然発生配列と、特にβ折り畳みシート構造の領域において、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％の配列同一性を有する。
【００３３】
上述したように、本発明の課題は、一態様において、上述したようにポリペプチドを表面上に発現するか、或いは上述したように核酸分子を用いて形質転換された微生物により解決される。
【００３４】
好適な一実施形態において、本明細書で使用される「微生物」という用語は、「宿主細胞」という用語と相互に交換可能に使用され、ポリペプチドを発現することが可能な微生物を示す。こうした微生物は、「全細胞触媒」又は「全細胞生体触媒」と呼ばれる場合もある。他の好適な実施形態において、細胞又は宿主細胞は、原核細胞、好ましくはグラム陰性菌細胞であり、特に好ましくは大腸菌細胞である。他の好適な実施形態において、細胞は、真核細胞である。他の好適な実施形態において、細胞又は宿主細胞は、原核生物の胞子である。
【００３５】
細菌細胞は、疎水性の膜により互いに分離された多数の区画を含む。グラム陽性菌細胞は、サイトゾル、即ち細胞の内部を区切る形質膜を有する。形質膜は、ペプチドグリカン層に囲まれている。一方、グラム陰性菌は、形質膜に加えて、外膜として知られる別の膜を有する。本明細書で使用される「表面」という用語は、好ましくは、環境に露出される微生物の層を示し、ここで、環境とは、例えば、対象となる細胞の培養液として用いられる液体培地である。特に好適な一実施形態において、本発明によるポリペプチドは、グラム陰性菌細胞の外膜の外側に発現される。好適な一実施形態において、本発明によるポリペプチドは、グラム陰性菌細胞の外膜の内側に発現される。他の好適な実施形態において、本発明によるポリペプチドは、外膜が除去されたグラム陰性菌細胞であるスフェロプラストの外側に発現される。当業者は、スフェロプラストを生成するために使用可能な方法に精通している。他の好適な実施形態において、本発明によるポリペプチドは、グラム陽性菌細胞の外側に発現される。したがって、「表面状に表示」及び「表面上に発現」という用語は、本明細書で使用される際には同じ意味を有する。
【００３６】
他の態様によれば、本発明の課題は、本発明の先行する態様による細胞から得ることが可能な膜画分により解決される。
【００３７】
本発明の好適な一実施形態において、膜画分又は膜調製物は、相互に交換可能に用いられる2つの用語であり、本発明の第1の態様によるセルラーゼを、好ましくは触媒活性状態で含む。本明細書で使用される「膜画分」及び「膜調製物」という用語は、好ましくは、膜成分、好ましくはグラム陰性菌の外膜の成分が濃縮された産物を示す。当業者は、膜調製物を生成するために使用可能なプロトコル及び方法に精通している。例えば、細菌細胞を培養物から採取し、例えば、凍結融解のサイクル、音波放射、溶解緩衝液中での再懸濁等により溶解させた後、分画遠心を行い、細胞の膜画分を単離する。本発明の好適な一実施形態において、膜調製物は、外膜の調製物であり、即ち、外膜の成分が、サイトゾル、内膜、及びペリプラズム等の他の膜及び区画の成分と比較して濃縮された調製物である。当業者は、外膜又はその成分を単離又は濃縮するために使用可能なプロトコル及び方法、例えば、細菌細胞のリゾチーム処理及びその後の遠心分離ステップに精通している。好適な一実施形態において、膜画分は、処理済みの膜画分にすることが可能であり、即ち、膜画分の内容物又は特性は、例えば、膜画分のタンパク質成分を精製すること、或いは、膜画分を可溶化すること及び/又はベシクル内の膜画分の成分を取り出すことにより修飾されている。本発明の好適な一実施形態において、膜画分は、例えば、ベッセル又はカラムの表面に、固定化することができる。
【００３８】
他の態様によれば、本発明の課題は、以下のステップを含む、少なくとも1つのセルラーゼを用いた反応産物を生産する方法により解決される:
(i)セルラーゼを表面上に提示する少なくとも1つの微生物、及び/又はこの微生物の膜調製物の調製、及び(ii)少なくとも1つの微生物及び/又は膜調製物を、セルラーゼ活性に適した条件下で、1つ以上のセルラーゼ基質に接触させること。「提示された」という表現は、本発明に関連して、セルラーゼが微生物又は微生物群を囲む媒体へ突出することを意味すると理解されるべきである。
【００３９】
本発明による方法は、セルラーゼにより触媒された反応の産物が単糖、二糖、又はオリゴ糖であり、少なくとも1つのセルラーゼ基質が多糖源、特に好ましくはセルロース源である場合に特に有利に応用することができる。「多糖源」及び「セルロース源」という用語は、材料が多糖又はセルロースを好ましくは主成分として含むが、必ずしも、それのみから成るものではないことを意味すると理解されるべきである。セルロース源がセルロースである場合、使用するセルラーゼに応じて、結果的に生じた産物としてグルコース、セロビオース、及びグルコースに基づくオリゴ糖を得ることができる。
【００４０】
更に、本発明による方法は、ステップ(ii)において用いた微生物を回収するステップ(iii)を含む場合に、更に有利に応用することができる。回収は、例えば、反応混合物から細胞を遠心分離して行うことができる。
【００４１】
本発明の範囲において、ステップ(ii)は、好ましくは、4.5乃至6.5のpH範囲、特に好ましくは5.5乃至6.5の範囲内で実施するべきであることが分かっている。セルラーゼは、対応するpH値に対して最も高い活性を示す。更に、ステップ(ii)中の温度は、30乃至80℃の範囲内、好ましくは50乃至65℃の範囲内で選択することが有益であると証明されており、これは、セルラーゼがこの温度範囲において最も高い活性レベルを示すためである。
【００４２】
上述した方法において、最終産物としてグルコースを生産しないセルラーゼが使用された場合、多量のセロビオースが存在すると、酵素の活性が損なわれる恐れがあるため、生産された産物をグルコースに変換することが有益となる可能性がある。したがって、本発明の範囲では、上述した方法のステップ(ii)において、グルコシダーゼを添加することが好適となる。好ましくは、グルコシダーゼは、微生物に関連する酵素ではなく、特に好ましくは、アーモンドからのβ-グルコシダーゼである。
【００４３】
任意の多糖を、セルラーゼ分解の産物である多糖源として使用することができる。しかしながら、本発明の範囲では、セルロース源を多糖源として用いた場合に特に有利となることが分かっている。セルロース源は、一方として、異物を僅かな割合のみ含む精製セルロースにすることができる(好ましくは、80％/wt未満の範囲、特に90％/wtの範囲)。特に、直接使用可能な共同廃水、或いは、公知の方法を用いてセルロースを回収し微生物(群)により変換可能な共同廃水にすることができる。同じく、木材パルプ業又は製紙工場からのセルロース含有廃水をセルロース源として利用することができる。しかしながら、例えば、前処理されている場合がある木材等の汚染物を含むセルロース源を用いることも可能となる。木材は、マツ、カラマツ、トウヒ、ブナ、ユーカリ、モミ、ポプラ、マツ、ブナ、オーク、トネリコ、クリ、カバノキ、サクラ、カエデ、又はクルミから選択された木材にし得るという利点がある。本発明の範囲内の好適な木材は、ポプラ材である。或いは、しかしながら、藁等、セルロースを含む一年生植物の残存物を、本発明による方法において多糖源として使用することができる。対応する木材又は植物残存物は、前処理し、例えば、含有し得るヘミセルロースを全て除去することができる。しかしながら、多糖源は、有意な量のリグニンを含むことが可能であり、ヘミセルロースを含む木材又は植物残存物を用いることも可能である。
【００４４】
本発明による方法において、特定のクラスのセルラーゼを表面に提示する1種類の微生物を使用可能だが、様々なクラスのセルラーゼを表面に提示する微生物の混合物を使用することも可能である。当該方法において、少なくとも1つのエンドセルラーゼと少なくとも1つのエキソセルラーゼとの少なくとも1つの混合物を使用する場合が好ましく、少なくとも1つのエンドセルラーゼと少なくとも1つのエキソセルラーゼと少なくとも1つのβ-グルコシダーゼとの少なくとも1つの混合物を使用する場合が特に好ましい。特に好適な一実施形態において、エンドセルラーゼ対エキソセルラーゼ修飾微生物の比は、25:75乃至75:25、特に好ましくは25:75乃至40:60であり、混合物にはβ-グルコシダーゼ修飾微生物は含まれない。他の好適な実施形態において、方法は、エンドセルラーゼ及びエキソセルラーゼ及びβ-グルコシダーゼ修飾微生物が、特に好ましくは約1:2:1の比で存在する混合物を使用する。エンドセルラーゼは、配列番号2のペプチド配列を含むことが好ましい。エキソセルラーゼは、これとは独立して、配列番号4のペプチド配列を含むことが好ましい。β-グルコシダーゼは、これとは独立して、配列番号6のペプチド配列を含むことが好ましい。
【００４５】
本発明の他の態様は、セルラーゼにより触媒された反応の産物を生産するための、上述したような微生物、又は上述したような膜画分の使用に関する。特に好ましい一実施形態において、産物は、セルロースの分解産物であり、特にグルコース及び/又はセロビオースである。
【００４６】
他の好適な実施形態において、本発明の課題は、以下のステップを含む、表面上にセルラーゼを提示する微生物を生産するための方法により解決される:
(a)核酸分子に適切に作用可能に連結された発現制御配列を含む、上述したような核酸分子を微生物に挿入すること、及び随意により、
(b)発現制御配列を活性化する物質に微生物を接触させること。
【００４７】
同じく、本発明の課題は、上述したステップ(a)及び(b)に加えて、微生物から膜調製物を取得する後続ステップを含む、膜調製物を生産するための方法により解決される。このステップに必要な手段は、以前に説明したものと同じである。
【００４８】
別の好適な実施形態において、本発明の課題は、表面上にセルラーゼを提示する1つ以上の上述した微生物及び/又は対応する膜調製物を含む組成物により解決される。
【００４９】
本発明を、更に、以下の各図、限定的なものと見做すべきではない実施例、本発明から導くことが可能な他の特徴、実施形態、主要点、及び利点により説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】オートディスプレイカセットの概略構造。シグナルペプチド(SP)は、内膜を越えて輸送する役割を果たす。βバレル(β-barrel)は、外膜への折り畳みを発生させ、そこで構築物を固定する。リンカー(linker)は、この場合はCipAであるパッセンジャー(passenger)の細胞表面への完全な転位を保証するために必要となる。
【図２】誘導性T7系(左)と構成性の系(右)とにおけるCel5Aの発現のためのプラスミドの制限地図。左のプラスミドは、pET-11d(Novagen)の誘導体であり、大腸菌株BL21(DE3)中に形質転換されており、右のプラスミドはpJM007(Maurer et al., 1997)の誘導体であり、大腸菌BL21中に形質転換されている。
【図３】誘導性pBAD系(左)と構成性の系(右)とにおけるCelK融合タンパク質の発現のためのプラスミドの制限地図。左のプラスミドは、pBAD/gIII A(Invitrogen)の誘導体であり、大腸菌株BL21中に形質転換されており、右のプラスミドは、pJM007(Maurer et al., 1997)の誘導体であり、大腸菌BL21中に形質転換されている。
【図４】誘導性T7系(左)と構成性の系(右)とにおけるBglA融合タンパク質の発現のためのプラスミドの制限地図。左のプラスミドは、pET-11d(Novagen)の誘導体であり、大腸菌株BL21(DE3)中に形質転換されており、右のプラスミドは、pJM007(Maurer et al., 1997)の誘導体であり、大腸菌BL21中に形質転換されている。
【図５】大腸菌BL21(DE3)の表面上でのCel5A融合タンパク質と、ナンセンス対照(NC)の融合タンパク質との発現の比較。外膜タンパク質は、差次的な細胞分画により単離し、SDS-PAGE(10％アクリルアミド)を用いて分離し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色している。M:タンパク質サイズの標準。-/+IPTG:誘導なし又は誘導あり、WT:宿主株。
【図６】大腸菌BL21(DE3)上でのCel5A融合タンパク質の表面ディスプレイの証明。外膜タンパク質は、差次的な細胞分画により単離し、SDS-PAGE(10％アクリルアミド)を用いて分離し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色している。M:タンパク質サイズの標準、WT:宿主株、PK:プロテイナーゼK。PKによる細胞全体の消化は、外膜タンパク質の単離前に行われた。
【図７】CelK条件下でのp-ニトロフェノラートのスペクトル。5mMのp-ニトロフェノールを、10分間の60℃でのインキュベーションと、その後のアルカリ化との後、クエン酸ナトリウム緩衝液(pH6)中で測光法により判定した。
【図８】CelK活性の誘導性(pBAD)対構成性(pJM)。細胞は、p-ニトロフェノール-セロビオシドと共に3分間(3min)、60℃、pH6でインキュベートした。インキュベート後、炭酸ナトリウムを用いてアルカリ化を行った。結果的に生じたp-ニトロフェノラートを400nmで検出した。ブランク(Blank):緩衝液+基質(細胞なし)。WT:宿主株(プラスミド無し)。
【図９】CelK活性に対するナンセンス対照(NC)。細胞はp-ニトロフェノール-セロビオシドと混合し、60℃、pH6でインキュベートした。形成されたp-ニトロフェノラートを1、2、3、及び4分後に400nmで検出した。アルカリ化は、事前に炭酸ナトリウムを用いて行った。WT:宿主株。数字はMW±SD、n=2。
【図１０】大腸菌BL21上でのCelK融合タンパク質とナンセンス対照(NC)からの融合タンパク質との発現の比較。外膜タンパク質は、差次的な細胞分画により単離し、SDS-PAGE(10％アクリルアミド)を用いて分離し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。M:タンパク質サイズの標準、WT:宿主株。
【図１１】CelK株の保存安定性。細胞を8日間、4℃で保存し、その後、CelK活性を60℃、pH6において、400nmで生産されたp-ニトロ-フェノラートの増加により判定した。WT:宿主株、NC:ナンセンス対照。数字はMW±SD、n=3。
【図１２】大腸菌BL21上でのCelK融合タンパク質の表面ディスプレイの証明。外膜タンパク質は、差次的な細胞分画により単離し、SDS-PAGE(10％アクリルアミド)を用いて分離し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色している。M:タンパク質サイズの標準、WT:宿主株、PK:プロテイナーゼK。PKによる細胞全体の消化は、外膜タンパク質の単離前に行われた。
【図１３】大腸菌BL21(DE3)及び大腸菌BL21表面上での誘導性pET系及び構成性pJM系におけるBglA融合タンパク質の発現。外膜タンパク質は、差次的な細胞分画により単離し、SDS-PAGE(10％アクリルアミド)を用いて分離し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。WT:宿主株、n.ind及びind.:-/+IPTG、M:タンパク質サイズの標準。
【図１４】BglA活性の誘導性(pET)対構成性(pJM)。細胞は、p-ニトロフェノール-グルコピラノシドを用いて1時間、60℃、pH6でインキュベートした。インキュベートに続いて、炭酸ナトリウムによりアルカリ化を行った。結果的に生じたp-ニトロフェノラートを400nmで検出した。ブランク(Blank):緩衝液+基質(細胞なし)。WT:宿主株(プラスミド無し)。数字はMW±SD、n=3。
【図１５】BglA活性及びナンセンス対照(CelK)。細胞は、p-ニトロフェノール-グルコピラノシドと混合し、60℃、pH6でインキュベートした。結果的に生じたp-ニトロフェノラートを15、30、45、及び60分後に400nmで検出した。アルカリ化は、事前に炭酸ナトリウムを用いて行った。宿主株大腸菌BL21(DE3)を対照として用いた。ブランク(Blank):緩衝液+基質(細胞なし)。数字はMW±SD、n=3。
【図１６】大腸菌BL21(DE3)上におけるBglA融合タンパク質の表面ディスプレイの証明。外膜タンパク質は、差次的な細胞分画により単離し、SDS-PAGE(10％アクリルアミド)を用いて分離し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。M:タンパク質サイズの標準、WT:宿主株、PK:プロテイナーゼK。PKによる細胞全体の消化は、外膜タンパク質の単離前に行われた。
【図１７】pH5及びpH6におけるCelK活性。CelK活性は、60℃、pH5及びpH6において、400nmでのp-ニトロフェノラートの増加により判定した。P-ニトロフェノール-セロビオシドを基質として用い、宿主株大腸菌BL21を対照として用いた。数字はMW±SD、n=3。
【図１８】Cel5A株のCMCase活性。Cel5A株及び宿主株大腸菌BL21(DE3)を、1％CMCと混合し、60℃、pH6でインキュベートした。様々なインキュベーション時間後、形成された還元糖を、DNSアッセイにより540nmで検出した。ブランク細胞(BZ):細胞のみ(CMCなし)、ブランク基質(BS):CMC+緩衝液のみ(細胞なし)。数字はMW±SD、n=3。
【図１９】β-グルコシダーゼの存在下及び非存在下におけるCelK株のアビセラーゼ活性。CelK株を、アーモンドから作成したβ-グルコシダーゼの存在下及び非存在下(+/-)で、1％アビセルと混合し、60℃、pH6でインキュベートした。様々な間隔の後、形成された還元糖(resulting red. sugars)を、DNSアッセイにより540nmで検出した。宿主株大腸菌BL21を対照として用いた。A:540nmでの吸収値。ブランク細胞(BZ):細胞のみ(アビセルなし)、ブランク基質(BS):アビセル+緩衝液のみ(細胞なし)。B:CelK株により形成されたmgグルコース/ml単位の還元糖。数字はMW±SD、n=3。
【図２０】マイクロタイタプレートスケールでのオートディスプレイセルラーゼの濾紙(FP)活性。セルラーゼを、様々な比でFPプレート(2.4mg)と共に60℃でインキュベートした。BglAを含まない混合物は、アーモンド由来の0.5U/mlのβ-グルコシダーゼを含む。様々なインキュベーション期間後、形成された還元糖をDNSアッセイにより540nmで検出した。A:540nmでの吸収値。WT:宿主株、ブランク基質(BS):FP+緩衝液(細胞なし)。B:セルラーゼにより形成されたmgグルコース/ml単位の還元糖。数字はMW±SD、n=2。
【図２１】オートディスプレイセルラーゼの濾紙(FP)活性:マクロタイタプレートスケール対標準。セルラーゼを等量で混合し、2.4mg濾紙プレート(マイクロ)又は50mg濾紙ストリップ(標準)と共に3日間60℃でインキュベートした。形成された還元糖をDNSアッセイにより540nmで検出した。A:540nmでの吸収値。WT:宿主株、ブランク基質(BS):FP+緩衝液(細胞なし)。B:セルラーゼにより形成されたmgグルコース/ml単位の還元糖。数字はMW±SD、n=2。
【図２２】オートディスプレイセルラーゼによるポプラの分解。セルラーゼ(Cellulase)を等量で混合し、4％のポプラ(Poplar)と共に88時間、60℃でインキュベートした。形成された還元糖をDNSアッセイにより540nmで検出した。数字はMW±SD、n=2。
【実施例】
【００５１】
概要
【００５２】
セルラーゼは、オートディスプレイカセットにおいて、「パッセンジャー」として結合し、タンパク質が融合タンパク質として発現されるようにした。図1は、こうした構築物の概略構造を示している。オートディスプレイカセットは、様々な発現システムにおいて確認されており、セルラーゼパッセンジャーのクローニング用には、最初に2つの誘導性オートディスプレイ系、即ち、IPTG(pET誘導体)及びアラビノース(pBAD誘導体)を使用し、更に構成性(pJM誘導体)を使用した。
【００５３】
3種類のセルラーゼの遺伝子配列は、大腸菌の「コドン使用頻度」に適合しており、Life Technologies(GeneArt(登録商標) Gene Synthesis)により合成された。最適化した遺伝子配列と、それに由来するアミノ酸配列は、配列プロトコル内に存在する。遺伝子は、付着したXhoI及びKpnIインタフェースを用いてオートディスプレイベクタに挿入した。セルラーゼ毎に、誘導性及び構成性のオートディスプレイ系を使用した。誘導性の系の場合は、pETオートディスプレイベクタを、エンドセルラーゼCel5A及びβ-グルコシダーゼBglAに対して用いた。CelKは、2.4kbであり、非常に大きいため、pBADオートディスプレイベクタをCelKに対して用いており、これはpETオートディスプレイベクタと比較して小さいためである。したがって、オートディスプレイセルラーゼプラスミドは、全て10kb未満であり、表1に概要を示す。それぞれのプラスミドカードは、図2乃至4に図示している。
【００５４】
【表１】
2014171474.tif 000003
【００５５】
IPTGにより誘導可能なプラスミド(pET誘導体)は、大腸菌BL21(DE3)(B, F-, dcm, ompT, lon, hsdS (rB- mB-) gal, λ(DE3))中に形質転換した。アラビノースにより誘導可能なプラスミド(pBAD誘導体)及び構成性のもの(pJM誘導体)に対しては、大腸菌BL21(B, F-, dcm, ompT, lon, hsdS (rB- mB-) gal)を用いた。生成した大腸菌株も図1に列挙している。
【００５６】
セルラーゼの発現条件
【００５７】
セルラーゼ融合タンパク質の発現は、IPTGを添加することにより、或いはL-アラビノースにより誘導した。構成性の発現の場合は、誘導原を添加する必要はない。生成されたセルラーゼ株(表1参照)の発現条件を表2に示す。IPTG又はL-アラビノースは、本培養のOD578が0.5乃至0.6に達した直後に添加した。
【００５８】
【表２】
2014171474.tif 000004
【００５９】
セルラーゼの輸送に対するペリプラズムのジスルフィド架橋の影響を排除するため、細胞は、10mMのβ-メルカプトエタノール(ME)と共に培養した。ME無しで培養した細胞を比較として用いた。
【００６０】
実施例1:エンドセルラーゼCel5A
【００６１】
Cel5A株(大腸菌BL21(DE3)pET-AT-Cel5A及び大腸菌BL21pJM-AT-Cel5A)を、表2に従って、ME無し及び有りで増殖させ、活性試験用、或いは外膜タンパク質の単離用に調製した。
【００６２】
Cel5A活性:誘導性対構成性
【００６３】
エンドセルラーゼの活性は、CMCプレートアッセイを用いて検出した。これには、アッセイ緩衝液及び基質(カルボキシメチル-セルロース)から成る寒天プレートを作製することが含まれる。10μlの細胞(OD57820)をプレートのそれぞれに滴下し、50℃でインキュベートした。CMCプレートは、n>6の単量体を含む多糖鎖を染色するコンゴレッドを用いて染色する。最後に、NaClを用いてプレートを脱色する。CMCが壊れる場合、薄いハロが細胞の回りに形成され、加水分解されないCMC分子は、引き続き、暗赤色の染色を示す。
【００６４】
50℃での最適なインキュベーション期間を決定するために、0.5乃至2時間の時系列を選択した。セルラーゼ株に加えて、宿主をCMCの分解についても試験した。結果は、誘導性Cel5A株が時間依存性のCMC分解を引き起こすことを示した(インキュベーション期間が増加するとハロが大きくなる)。これに対して、CMCの分解は、構成性Cel5A株では検出されなかった。予想通りに、宿主は、CMCの分解を示さなかった。増殖中のMEの添加は、影響を有しなかった。
【００６５】
当該実験は、CMCの分解が誘導性Cel5A株により可能になることを示した。細胞は、メルカプトエタノールの添加無しで増殖可能である。CMCプレートでは30分間のインキュベーション期間で十分である。
【００６６】
Cel5A活性:ナンセンス対照
【００６７】
βバレルのCel5A活性に対する影響を排除するため、CMCを分解することができない異なるパッセンジャーを表面上に有する細胞により、CMCプレートアッセイを実施した。以下、この株をナンセンス対照と呼ぶ。試験は、プロモーターが「漏出性」であるかに関しても実施した。これは、誘導原の添加が無くともCel5A融合タンパク質が発現されることを意味する。これを行うために、Cel5A株を誘導せずに、活性を誘導細胞と比較した。試験では、非誘導Cel5A株が僅かなCMC分解を示すことが明らかとなった。これは、誘導原無しで、Cel5A融合タンパク質の一定量の発現が生じることを示している。しかしながら、誘導Cel5A株のCMC分解は、より強く表れている。ナンセンス対照は、プラスミド無しの宿主株と全く同じように、CMCの分解を示さない。ナンセンスコントロール及び宿主の非常に僅かなハロは、緩衝液試料と同程度である。そのため、これは寒天プレートに対する緩衝液の非特異的反応である。
【００６８】
Cel5A株のβバレル分子の数とナンセンス対照とが比較可能であることを保証するために、外膜タンパク質を試験細胞から単離し、SDS-PAGEを用いて分離した。大腸菌外膜タンパク質OmpF(37kDa)及びOmpA(35kDa)を、外膜画分に対するマーカータンパク質として用いた。結果を図5に示す。IPTGによる誘導後、Cel5A融合タンパク質と、ナンセンス対照の融合タンパク質とについて、計算された約102kDa及び96kDaのMWに良く対応する同程度の強さの帯が検出された。非誘導Cel5A株では、Cel5A融合タンパク質に対して帯は検出されなかった。同じく、予想通り、宿主は、Cel5A融合タンパク質及びナンセンス対照に対する帯を示さなかった。
【００６９】
したがって、Cel5A株が発生させるCMCの分解は、特異的セルラーゼ反応に関与することが明らかとなった。
【００７０】
Cel5A株の保存安定性。
【００７１】
Cel5A株を4℃で保存可能かを試験するため、試験3.2による細胞の活性を、10日間の保存後に判定した。この試験により、保存されたCel5A株が、この期間に活性の喪失を示さないことが明らかとなった。CMCの分解は、新鮮な細胞と同程度である。宿主及びナンセンス対照は、CMCの分解を示さなかった。
【００７２】
試験により、Cel5A株を少なくとも10日間4℃で、活性の喪失無く保存可能であることが明らかとなった。
【００７３】
Cel5A株の表面ディスプレイ
【００７４】
Cel5A融合タンパク質の発現の成功については上述した。しかしながら、外膜の融合タンパク質の検出からは、その配向性に関する結論は何も得られていない。酵素は、必要に応じて、細胞外空間又はペリプラズムに方向付けることができる。完全な細菌細胞をプロテイナーゼKと共にインキュベートした後、細菌外膜タンパク質を調製することにより、オートディスプレイパッセンジャーの表面ディスプレイを検出することができる。こうしたプロテイナーゼK分子は、そのサイズのため、大腸菌の外膜を通過できないため、細胞全体を、こうしたプロテアーゼとインキュベートすることにより、外膜の表面上に位置するタンパク質の消化が生じる。外膜タンパク質OmpF及びOmpAは、膜内在性タンパク質であるため、プロテアーゼ消化から保護される。したがって、プロテアーゼ処理後の検出は、細胞の完全性の指標と見做すことができる。
【００７５】
表面ディスプレイを検出するために、Cel5A株を、Cel5A発現の誘導後、プロテイナーゼKと共にインキュベートした。プロテアーゼにより処理していない誘導細胞を、比較として用いた。大腸菌宿主株及び非誘導Cel5A株を対照として用いた。図6では、約102kDaでのIPTG誘導後のCel5A融合タンパク質の上述した強い発現を確認することができる(図4参照)。予想通り、大腸菌宿主と非誘導Cel5A株とは、約102kDaでの発現が検出されなかった。強いCel5Aの発現のため、Cel5A融合タンパク質の完全なタンパク質分解は、困難である。プロテアーゼ処理に続いてCel5Aの帯が減少し、それと同時にOmpF-及びOmpA-の帯が維持されることは、Cel5Aの外向きの配向性を明らかに表している。
【００７６】
実施例2:エキソセルラーゼCelK
【００７７】
CelK株(大腸菌BL21pBAD-AT-CelK及び大腸菌BL21pJM-AT-CeI5K)を表2に従って、メルカプトエタノール無し及び有りで培養し、活性試験用、或いは外膜タンパク質の単離用に調製した。
【００７８】
CelK活性:p-ニトロフェノラートアッセイ
【００７９】
エキソセルラーゼの活性は、p-ニトロフェノラートの増加を介して測光法により判定した。P-ニトロフェノール-セロビオシドを基質として用いた。参考文献では、p-ニトロフェノラートについて380乃至420nmの吸収極大が記載されている。p-ニトロフェノラートの測定に最適な波長を決定するために、まず、CelKアッセイ条件下でスペクトルを記録した。これを行うために、p-ニトロフェノールを、クエン酸ナトリウム緩衝液pH6に添加し、60℃でインキュベートした。p-ニトロフェノラートの黄色の発色はアルカリ性の時に最も顕著になるため、試料は、炭酸ナトリウムを用いて更にアルカリ化し、マイクロタイタプレートにおいて測光法により測定した。図7は、CelK条件下において、p-ニトロフェノラートの測定が約360乃至450nmにおいて可能であることを示している。参考文献に基づいて、400nmでの吸収測定を、以下のCelKアッセイ用として定めた。
【００８０】
CelK株の活性を判定するために、標準曲線をp-ニトロ-フェノラート(0mM乃至1mM)により作成した。p-ニトロフェノラート試料は、CelK試料と同様に処理し、無希釈と1:2の希釈とのそれぞれで測定した。
【００８１】
CelK活性:構成性対誘導性
【００８２】
予備のCelK試験では、誘導性CelK株が構成性CelK株と比較して、大きな活性を示すことが明らかとなった。正確な比を決定するため、活性を直接比較により判定した。結果を図8に示す。誘導性CelK株では、標準曲線を用いて、210mU/OD5781/mlの活性が判定された。構成性CelK株では、60℃で3分後に、使用したOD5781において変換が観察されなかった。したがって、構成性CelK株(OD5781)は、30分間、60℃でインキュベートした。この場合、400nmでの吸収が0.25と判定され、これは2.2mU/OD5781/mlの活性に対応する。したがって、誘導性CelK株は、構成性CelK株と比較して、約100倍の活性を有する。そのため、他の試験は、誘導性CelK株により継続した(メルカプトエタノール無しでの培養)。
【００８３】
CelK活性:ナンセンス対照
【００８４】
エンドセルラーゼと同様に、活性に対するナンセンス対照をエキソセルラーゼについても試験した。図12は、混合物内のCelK株のOD578が1以下となるべきであることを示している。以下の試験では、OD5780.5を試験した。p-ニトロフェノラートの形成は、約3分後に既に非常に顕著となったため(図8参照)、0乃至4分の時系列を試験用に選択した。これを行うために、CelK株、ナンセンス対照、及び宿主株をp-ニトロフェノールセロビオシドと混合し、1分毎に、形成されたp-ニトロフェノラートを400nmで測定した。試料は、アルカリ化前に1:2で希釈した。結果を図9に示す。OD5780.5は、活性測定に十分であることが分かった。CelK株では、標準曲線(1:2希釈)を用いて、約300mU/OD5781/mlの活性が計算された。最初の3分間を観察した。その後、反応は線形ではなくなった。ナンセンス対照は、宿主株と同様に、基質の変換を示さなかった。
【００８５】
CelK融合タンパク質とナンセンス対照の融合タンパク質との発現が同じであるかを検証するために、活性化試験に加えて、外膜のタンパク質を単離し、SDS-PAGEを用いて分離した。大腸菌外膜タンパク質OmpF(37kDa)及びOmpA(35kDa)を外膜画分に対するマーカータンパク質として用いた。結果を図10に示す。アラビノースによる誘導後、CelK融合タンパク質と、ナンセンス対照の融合タンパク質とについて、計算された約139kDa及び103kDaのMWに良く対応する同程度の強さの帯が検出された。2つの融合タンパク質の帯は、宿主株において観察されなかった。
【００８６】
この試験は、p-ニトロフェノラートの変換が特異的CelK反応であることを示している。
【００８７】
CelK株の保存安定性
【００８８】
CelK株を4℃で保存可能かを試験するため、上述した試験からの細胞の活性を、8日間の保存後に判定した。図11は、保存されたCelK株がこの期間に活性の喪失を示さないことを明らかにしている。p-ニトロフェノラートの形成は、新鮮な細胞と同程度である(図9)。ここでも、同じく、約300mU/OD5781/mlの活性が達成された。宿主及びナンセンス対照は、基質の変換を示さなかった。
【００８９】
試験により、CelK株を少なくとも8日間、4℃で、活性の喪失無く保存可能であることが明らかとなった。
【００９０】
CelK株の表面ディスプレイ
【００９１】
CelK融合タンパク質の発現の成功については既に図10に示した。酵素の外向きの配向性を確認するため、CelK株をプロテイナーゼKにより処理した後、外膜タンパク質を単離した。OmpF及びOmpAを、プロテアーゼ処理後の細胞の完全性の証明として取り入れた。
【００９２】
CelK株を、CelK発現の誘導後、プロテイナーゼKと共にインキュベートした。プロテアーゼにより処理していない誘導細胞を、比較として用いた。大腸菌宿主株及び非誘導CelK株を対照として用いた。図12では、約139kDaでのアラビノース(arabinose)誘導に続く、上述したCelK融合タンパク質の強い発現を確認することができる。予想通り、大腸菌宿主と非誘導CelK株とは、約139kDaでの発現が検出されなかった。強いCelKの発現のため、CelK融合タンパク質の完全なタンパク質分解は、困難である。 CelKの帯は、完全に消える場合もあるが、OmpAの帯も宿主株と比較して幾分弱い。しかしながら、これは、酵素の外向きの配向性を明らかに表している。
【００９３】
実施例3:β-グルコシダーゼBglA
【００９４】
BglAの発現及び活性:誘導性対構成性
【００９５】
融合タンパク質の発現は、構成性の系の場合、24時間に亘り37℃で行われた。pET系の発現の誘導は、1mMのIPTGと共に30℃で細胞を1時間インキュベートすることにより、OD578が0.6となった時点で達成された。10mMのβ-メルカプトエタノールを培養中に添加する必要はなく、これは、BglAアミノ酸配列がシステインを1個のみ含み、輸送に影響する可能性のあるペリプラズム内でのジスルフィド架橋の形成が生じないためである。
【００９６】
2種類のBglA株(誘導性及び構成性)を生成後、大腸菌の外膜におけるBglA融合タンパク質の発現を検証の対象とした。これを行うため、両株の外膜タンパク質を単離し、SDS-PAGEにより分離した。大腸菌外膜タンパク質OmpF(37kDa)及びOmpA(35kDa)を、外膜画分に対するマーカータンパク質として用いた。結果を図13に示す。誘導性発現系の場合、IPTGによる誘導後、BglA融合タンパク質について、計算された約101kDaのMWに良く対応する強い帯が検出された。非誘導BglA株及び宿主株では、予想通り、BglA融合タンパク質に対して帯は検出できなかった。構成性の系では、BglA融合タンパク質の発現は検出されなかった。経験によれば、構成的に発現されたパッセンジャーのクーマシー染色による検出は、感度が十分ではない。
【００９７】
BglA融合タンパク質の発現を検証後、p-ニトロフェノール-グルコピラノシドを基質として、構成性及び誘導性の株のBglA活性を判定した。BglA株の活性は、400nmでのp-ニトロ-フェノラートの形成を介して、測光法により判定した。エキソセルラーゼCelKとは異なり、p-ニトロフェノール-グルコピラノシドを基質として用いた。アッセイを確立するために、試験は、最初にβ-グルコシダーゼ(アーモンド由来)を用いて実施した。これを行うために、この酵素に最適な条件を選択した(pH5及び35℃)。2種類の濃度を用いた。β-グルコシダーゼの濃度依存性活性を検出した。ブランクは、予想通り、p-ニトロフェノラートの増加を示さなかった
【００９８】
BglA活性は、400nmにおいて生じるp-ニトロフェノラートの吸収測定(黄変)により判定する。反応は、公表されているBglAに最適な条件に基づいて、pH値6.0及びインキュベーション温度60℃で行った。BglA株の基質とのインキュベーション期間は未知であるため、反応混合物は、明確な黄変(p-ニトロフェノラート)が確認可能となるまでインキュベートした。誘導性BglA株の場合、これは60℃で1時間後に記録された。光度測定前に、細胞を分離し、上清を96ウェルマイクロタイタプレートに移した。炭酸ナトリウムを加えてアルカリ化した後、吸収測定を400nmで行った。図14では、誘導性BglA株がp-ニトロフェノール-グルコピラノシドを変換可能であることが確認できる(p-ニトロフェノラートの400nmでの増加)。これに対し、構成性BglA株は、60℃で1時間以内にp-ニトロフェノラートの形成を示さなかった。これより長いインキュベーション時間は試していない。ブランク及び宿主株は、共に基質の変換を示さなかった。他の2種のセルラーゼと同じく、誘導性発現系が、より優れた活性を達成した
【００９９】
BglA活性:ナンセンス対照
【０１００】
誘導性BglA株が活性を有することが明らかになった時点で、活性を更に良く判定できるように時系列を記録した。同時に、他の2種類のセルラーゼに対応して、「ナンセンス対照」も試験した。これは、基質を変換することができない、異なるパッセンジャーを表面上に提示する大腸菌株であった。CelK株を選択した。セルラーゼではあるが、CelKは、p-ニトロフェノール-グルコピラノシドを変換することができない。BglA活性を判定するために、最初に、p-ニトロフェノールの標準曲線を記録した。次にBglA株、ナンセンス対照(CelK株)、及び宿主株をp-ニトロフェノール-グルコピラノシドと混合し、60℃での様々なインキュベーション期間後に、形成されたp-ニトロフェノラートを400nmで測定した。図15では、BglA株が時間と共にp-ニトロフェノラートの継続的な増加を示すことが確認できる。標準曲線を用いて、約1mU/ml/OD1のBglA活性が計算された。ナンセンス対照は、宿主株大腸菌BL21(DE3)と同じく、基質の変換を示さなかった。
【０１０１】
大腸菌BL21(DE3)上でのBglAの表面ディスプレイ
【０１０２】
誘導性の株での良好なBglA活性は、図14に示しており、BglA融合タンパク質の発現は、図13に例示している。表面ディスプレイを検出するために、BglA株を、BglA発現の誘導後、プロテイナーゼKと共にインキュベートした。プロテアーゼは、そのサイズのため、大腸菌内に到達できないため、細胞の表面に存在するタンパク質のみを消化する。比較として、プロテアーゼにより処理していない誘導細胞を用いた。大腸菌宿主及び非誘導BglA株を対照として用いた。OmpA及びOmpFは、膜内在性タンパク質であり、プロテアーゼ消化から保護される。したがって、これらは細胞の完全性の指標の役割を果たす。図13では、約101kDaでのIPTG誘導後のBglA誘導タンパク質の上述した強い発現を確認することができる。予想通り、約101kDaでの発現は、大腸菌宿主株と非誘導BglAとにおいては検出されなかった(図16)、強いBglAの発現のため、BglA融合タンパク質の完全なタンパク質分解は、困難である。プロテアーゼ処理に続いてBglAの帯が減少する一方でOmpF-及びOmpA-の帯が維持されていることは、経験によれば、BglAの外向きの配向性を明らかに表している。
【０１０３】
実施例4
【０１０４】
オートディスプレイ技術を活用して、3種類の活性セルラーゼを大腸菌の表面上に提示することができた。全ての場合において、誘導発現系が最善となった。セルラーゼ株及びその培養は、表2に概要を示している。
【０１０５】
オートディスプレイセルラーゼ群を共に相乗的セルロース消化に用いるために、pH値及び温度等の共通パラメータを定める必要がある。エキソセルラーゼ及びβ-グルコシダーゼは、最適なpHが6.0である、最適な温度は60℃である。しかしながら、エンドセルラーゼは、最適なpHが5.0であり、最適な温度は50℃である。
【０１０６】
共通温度の決定
【０１０７】
3種類のセルラーゼのうち2種類(CelK及びBglA)は最適温度が60℃であるため、エンドセルラーゼCel5Aも60℃で活性を有するかを試験する必要がある。参考文献には、60℃でのCel5A活性は、50℃での活性と比較して僅かに減少するとされている(約5乃至10％)(Lin L et al, 2009)。Cel5Aの活性を、pH5においてCMCプレート試験を用いて判定した。これは、Cel5A細胞をCMCプレート上に滴下した後、30分間、50℃、55℃、及び60℃でインキュベートすることにより行った。宿主株大腸菌BL21(DE3)及び緩衝液を対照として用いた。CMCプレートは、コンゴレッドを用いて染色した。最後に、プレートをNaClにより脱色した。用いた全ての温度で、Cel5A細胞が同様に分解し(薄いハロ)、一方、宿主株及び緩衝液は陰性となることが分かった。したがって、Cel5A細胞は、60℃でも使用することができる。したがって、以下において、3種類全てのセルラーゼによる作業は60℃で実施した。
【０１０８】
共通pH値の決定
【０１０９】
エキソセルラーゼ(CelK)及びβ-グルコシダーゼ(BglA)は、最適なpHが6である。しかしながら、エンドセルラーゼ(Cel5A)は、最適なpHが5である。参考文献には、pH6でのCel5A活性は、pH5と比較して減少するとされている(Lin L et al, 2009)。したがって、CelKをpH5で使用可能かを試験する必要がある。これを行うために、タンパク質発現の誘導に続いて、CelK株を、最初にpH6のクエン酸ナトリウム緩衝液中、次にpH5の酢酸ナトリウム緩衝液中で採取した。CelK活性は、60℃でのp-ニトロフェノールセロビオシド(pNPC)の分解による400nmにおけるp-ニトロフェノラートの増加から判定した。宿主株大腸菌BL21を対照として用いた。図17は、両方のpH条件下でp-ニトロフェノラートの増加が確認できる一方、宿主株は変化していない。更に、pH5と比較して、pH6では、より多くのp-ニトロフェノラートが生産されていることも確認できる。pH6では、平均270mU/ml/OD1のCelK活性が達成されている。しかしながら、pH5では、約110mU/ml/OD1のみとなった。したがって、アッセイにおいてpHがpH6からpH5へ低下することにより、CelK活性は60％低下する。
【０１１０】
活性の喪失は、エンドセルラーゼCel5Aについても、pHが5から6に上昇した際に記述されている。しかしながら、β-グルコシダーゼBglAも最適なpHが6であるため、後続のアッセイはpH6で実施し、1種類の酵素のみを最適ではないpH条件下で使用しなければならない状態とする。
【０１１１】
還元糖の検出:DNSアッセイの確立
【０１１２】
次にオートディスプレイセルラーゼの共通セルラーゼ活性を、セルロース基質について試験した。これは、特に、比色分析を用いて、ジニトロサリチル酸法に従って、放出された還元糖を測定することにより行った(Miller GL 1959)。当該方法では、カルボニル化合物の酸化を、アルカリ条件下で3,5-ジニトロサリチル酸におけるニトロ基の還元に結び付ける。これには、3,5-ジニトロサリチル酸を、吸収極大540nmの3-アミノ-5-ニトロサリチル酸に還元することが含まれる。この反応において、DNS溶液の色は、橙黄色から赤に変化する。
【０１１３】
エンドセルラーゼCel5AのCMCase活性
【０１１４】
これまでCel5A活性は、CMCプレート試験を用いて間接的に測定してきた。DNS法を用いることにより、形成されたカルボキシメチルセルロースの還元末端を、Cel5A反応により定量的に判定することができる。これを行うために、Cel5A株を1％CMCに混合し、60℃でインキュベートした。様々なインキュベーション期間後、細胞を分離し、上清をDNS試薬と混合した。95℃及び4℃でのインキュベーションに続いて、540nmでの吸収を測光法により判定した。宿主株大腸菌BL21(DE3)を対照として用いた。対照として、細胞のみ(BZ)又はCMCのみ(BS)を用いた。図18では、Cel5A株が、DNS試薬を用いて検出可能な還元末端を形成することが確認できる。カルボキシメチル置換のため、CMCの分解は、エンドセルラーゼが置換の度合いに影響されることから線形反応ではなくなる。そのため、変換率は、約5％を超えるべきではない。60℃で30分後、Cel5A株は、CMCの約8％を変換する。Cel5A活性をより良好に推定するためには、60℃でのインキュベーションを30分未満にするべきである。宿主株と使用した他の2つの対照とは、予想通り、エンドセルラーゼ活性を示さなかった。
【０１１５】
実施例5:エキソセルラーゼCelKのアビセラーゼ活性
【０１１６】
エキソセルラーゼ活性は、これまでp-ニトロフェノール-セロビオシドにより判定してきた。これは、可溶性であり、したがって容易に変換可能な物質である。結晶セルロース領域でのCelK活性を試験するために、アビセル(微結晶セルロース)を基質として用いた。これは、CelK株を1％アビセルと共に60℃でインキュベートすることにより行われ、様々なインキュベート期間後に、放出された還元糖をDNSアッセイにより540nmで判定した。還元糖の濃度は、グルコース標準曲線を用いてmgグルコース/ml単位で判定した。エキソセルラーゼはセロビオースを放出するため、セロビオースを分解してグルコースの形態で2還元糖単位に分解するβ-グルコシダーゼをアビセル変換中に添加した。グルコース標準曲線に基づいて計算されることから、これにより、形成された還元糖の量をより正確に判定することができる。同時に、セロビオースは、エキソセルラーゼの阻害剤として機能するが、β-グルコシダーゼを用いて除去される。アビセルの変換は、アーモンド由来の市販の精製β-グルコシダーゼの存在下及び非存在下で解析した。宿主株大腸菌BL21を比較として用いた。対照として、細胞のみ(BZ)又は基質のみ(BS)を用いた。図19Aから、CelK株が微結晶セルロースを分解可能であることが確認できる。宿主株及び使用した対照は、還元糖の増加を示さない。放出された還元糖の濃度は、図19Bに示す。予想通りに、アーモンド由来のβ-グルコシダーゼ存在下では、β-グルコシダーゼ無しでの変換と比較して濃度が高くなっている。
【０１１７】
β-グルコシダーゼBglA:pNPGase活性
【０１１８】
市販のセルラーゼ混合物Celluclast()(Novozymes)は、菌類であるTrichoderma reseei ATCC 26921由来のセルラーゼを含む。この混合物は、セルロースのグルコース、セロビオース、及び高次グルコースポリマーへの分解を触媒する。セルロースの変換を可能な限り高めるため、Aspergillus niger(Novozym(登録商標)188)由来のβ-グルコシダーゼを付加的に使用することが推奨される。記載されている用量は、Novozyme1％Celluclast及び0.2％Novozym188である。Celluclastの最適条件は、温度50乃至60℃及びpH値4.5乃至6.0である。したがって、比較のため、60℃及びpH6のオートディスプレイセルラーゼの反応条件を採用した。
【０１１９】
β-グルコシダーゼ活性は、p-ニトロフェノール-グルコピラノシド(pNPG)を用いて測光法(pNPGase活性)により、400nmでのp-ニトロフェノール-グルコピラノシドの増加を介して判定した。これは、BglA株(OD57820)をpNPGと共に15分間60℃でインキュベートすることにより行った。宿主株大腸菌BL21(DE3)及び緩衝液(ブランク)を対照として用いた。比較のため、1％Celluclast及び0.2％Novozym188を、pNPGと共に60℃でインキュベートした。僅か3分後に強い黄変が確認されたため、p-ニトロフェノラート含量を、BglAに対応する15分後ではなく、3分後に測定した。1％Celluclast及び0.2％Novo188は、BglA株との比較として、OD57820の濃度で使用され、p-ニトロフェノラートのより強い増加を示した。対照は、予想通り、pNPGase活性を示さなかった。
【０１２０】
p-ニトロフェノラート標準を利用して、β-グルコシダーゼ活性をU/I単位で計算した(表3参照)。Novozym188は、BglA株と比較して14倍良好な活性を示した。Celluclastは、12倍の強さの活性を示した。
【０１２１】
【表３】
2014171474.tif 000005
【０１２２】
エキソセルラーゼCelK:pNPCase活性
【０１２３】
エキソセルラーゼの活性を、実用的な理由から、p-ニトロフェノール-セロビオシド(pNPC)を用いて、400nmでのp-ニトロフェノラートの増加を介して、測光法により判定した(pNPCase活性)。これは、CelK株(OD5780.5)及びCelluclast(1％)をpNPCと共に、4分間、60℃でインキュベートすることにより行った。宿主株大腸菌BL21及び緩衝液(ブランク)を対照として用いた。OD5780.5のCelK株は、1％Celluclastと比較してp-ニトロフェノラートの強い増加を示した。使用した対照は共に、予想通り、pNPCase活性を示さなかった。p-ニトロフェノラート標準を利用して、CelK活性をU/l単位で計算した(表4参照)。CelK株は、Celluclastと比較して、2倍のpNPCase活性を示した。
【０１２４】
【表４】
2014171474.tif 000006
【０１２５】
エンドセルラーゼCel5A:CMCase活性
【０１２６】
エンドセルラーゼ活性を、CMCを用いて、DNSアッセイにより還元糖を判定することで計算した(CMCase活性)。これは、Cel5A株(OD57820)及びCelluclast1％をCMCと共に15分間、60℃でインキュベートすることにより行った。宿主株大腸菌BL21(DE3)及び緩衝液(ブランク)を対照として用いた。Celluclastでは、Cel5A株と比較して、より強い還元糖の放出が観察された。グルコース標準曲線を利用して、CMCase活性をU/I単位で計算した(表5参照)。Celluclastは、Cel5A株と比較して、2.4倍良好なCMCase活性を示した。しかしながら、CMCは、エンドセルラーゼに対して特異的ではない。エキソセルラーゼ及びβ-グルコシダーゼも、CMCから少量の還元糖を放出する。CelluclastはTrichodermaセルラーゼの混合物であるため、CMCそれ自体は、表面にエンドセルラーゼを1つのみ提示するCel5A株と比較して、より良好に変換される。したがって、Celluclastの2.4倍良好なCMCase活性は、2.4倍良好なエンドセルラーゼ活性と同じではない。
【０１２７】
【表５】
2014171474.tif 000007
【０１２８】
実施例6:オートディスプレイセルラーゼの再循環
【０１２９】
可溶性酵素と比較したオートディスプレイセルラーゼの利点の1つは、反応混合物から全細胞触媒を回収することが簡単な点である。細胞を沈殿させ、適切な緩衝系に再懸濁させた後、更に変換のために利用することができる。再循環プロセスがセルラーゼの活性に影響を与えるかを試験するため、基本活性(サイクル0)を判定した後、セルラーゼ株を合計2回、回収して新鮮な基質と混合した(サイクル1及び2)。再循環させたセルラーゼ株の活性のパーセンテージを、それぞれの基本活性と比較して判定した。
【０１３０】
β-グルコシダーゼBglAの再循環:pNPGase活性
【０１３１】
β-グルコシダーゼ活性は、p-ニトロフェノール-グルコピラノシド(pNPG)を用いて測光法により、400nmでのp-ニトロフェノラートの増加を介して判定した(pNPGase活性)。これは、BglA株(OD57820)をpNPGと共に15分間、pH6、及び60℃でインキュベートすることにより行った。次に、細胞を沈殿させ、再懸濁後に活性を再び測定した(サイクル1及び2)。活性は、400nmでのp-ニトロフェノラートの増加により判定し、3回の個別の測定からの平均値を表す。再循環試験の結果は、酵素活性が標準偏差の範囲内で、全サイクルに対して同じレベルで移行することを示している。したがって、再循環は、BlgA活性に影響を及ぼさない。そのため、BglA株は、反応混合物から回収後、少なくとも2回の再使用が可能である。
【０１３２】
エキソセルラーゼCelKの再循環:pNPCase活性
【０１３３】
エキソセルラーゼの活性を、p-ニトロフェノール-セロビオシド(pNPC)を用いて、400nmでのp-ニトロフェノラートの増加を介して、測光法により判定した(pNPCase活性)。これは、CelK株(OD5780.5)をpNPCと共に、4分間、pH6、及び60℃でインキュベートすることにより行った。次に、細胞を沈殿させ、再懸濁後に活性を再び測定した(サイクル1及び2)。活性は、400nmでのp-ニトロフェノラートの増加により判定し、3回の個別の測定からの平均値を表す。再循環試験の結果は、酵素活性が標準偏差の範囲内で、全サイクルに対して同じレベルで移行することを示している。したがって、再循環は、CelK活性に影響を及ぼさない。そのため、BglA株と同様に、CelK株は、少なくとも2回の再使用が可能である。
【０１３４】
エンドセルラーゼCel5Aの再循環:CMCase活性
【０１３５】
エンドセルラーゼ活性を、DNSアッセイにより還元糖を判定することで計算した(CMCase活性)。これは、Cel5A株(OD57820)をCMCと共に15分間、pH6、及び60℃でインキュベートすることにより行った。次に、細胞を沈殿させ、再懸濁後に活性を再び測定した(サイクル1及び2)。放出された還元糖は、540nmでのDNSアッセイにより検出した。判定された値は、3回の個別の測定の平均値である。Cel5A活性は、最初の回収後、14％の減少を示した(サイクル1)。更なる再循環(サイクル2)の後、基本活性(サイクル0)と比較して約63％の活性低下が記録された。BglA-及びCelK-株とは異なり、Cel5A株の再循環には、活性の減少が伴う。しかしながら、第1のサイクル後の活性低下は大きくないため、Cel5A株は、少なくとも1回の再使用が可能である。
【０１３６】
実施例7:濾紙アッセイ(FPA)
【０１３７】
FPAは、セルラーゼ活性全体(エキソセルラーゼ、エンドセルラーゼ、及びβ-グルコシダーゼ)を分析するための標準的方法であり、Mandelsらにより1976年に開発された。IUPAC(国際純正・応用化学連合)によれば、FPAは、1×6cmの濾紙ストリップ(ワットマンNo.1)を標準基質(約50mg)として、合計体積1.5mlで実施される。濾紙活性の国際単位(FPU)は、放出マイクロモルグルコース当量(還元糖)毎分である。FPAでは、50mgの濾紙から60分で2mg以下のグルコースが放出されるべきである(4％変換)。セルロースの構造から、分解は非線形となる。したがって、4％までの変換のみが線形として表される。形成された還元糖は、DNS法を用いて判定する。オートディスプレイセルラーゼ毎の活性が検出可能となったため、次に相乗的活性を調査する必要があった。これは、3種類全てのセルラーゼから混合物を生成し、FP活性を判定することにより行われる。
【０１３８】
マイクロタイタプレートスケールでのFPアッセイ
【０１３９】
合計体積が1.5mlであり、多量のDNS試薬(混合物当たり3ml)が使用されるため、幾つかのセルラーゼ混合物のFP活性を調査したい場合、IUPACによるFPAは、非常に複雑になる。参考文献において、FPアッセイは、合計体積71μlでのマイクロタイタプレートスケールで説明されている(Xiao Z et al, 2004)。これを行うために、穿孔器を利用してFPプレートを作成した。濾紙に対する反応物の体積の比は、濾紙の面積により計算した(FPプレート対FPストリップ)。これにより、たとえマイクロタイタプレートスケールであっても、IUPACに従って混合物が作成される状態を確保した。個別のオートディスプレイセルラーゼの最善の混合比は未知であったため、様々な混合物のFP活性を試験した。BglA株を含まない混合物をアーモンド由来のβ-グルコシダーゼと混合した。宿主株(BZ)及び緩衝液を含むFPプレート(BS)を対照として用いた。FPase活性は、60℃での様々なインキュベーション期間後に、DNSアッセイを用いて、放出された還元糖により判定した。測定前に、全ての混合物は、10分間に亘りβ-グルコシダーゼと混合し、未変換のセロビオースが分解してグルコースとなった状態を確保し、より正確な還元糖の判定を行った。細胞を分離した後、上清中の還元糖を、540nmで判定した。結果を図20に示す。市販β-グルコシダーゼとのセルラーゼ混合物と、3種類全てのオートディスプレイセルラーゼの混合物は、濾紙の変換を示した。5日間の60℃でのインキュベーション後、50:50(CelK:CeI5A)混合物が最善であることが分かった。使用した対照は、陰性であり、濾紙の変換を示さなかった(図20A)。放出された還元糖(released reduced sugars)の量は、mgグルコース/ml単位で、グルコース標準曲線を用いて判定した(図20B参照)。5日後、約0.2mg/mlが達成された。セルロースの非晶及び結晶構造のため、分解は、線形反応にならない。したがって、FPase活性(FPase-Activity)をIUPACの記述通りにFPU/I単位で判定するために、1時間の測定値を調べた。結果を表6に要約する。
【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
FPアッセイの標準
【０１４２】
FPプレートの変換に使用される合計体積が少ないため(71μl)、FPプレートが殆ど全ての流体を吸収することから、3日後に細胞を分離するのが困難であることが分かった。そのため、IUPACによる標準FPアッセイを、合計体積1.5mlで実施した。マイクロタイタプレートスケールの混合物を対照として用いた。これを行うために、3種類全てのオートディスプレイセルラーゼを、同じ比で混合し、最初に1×6cmの濾紙ストリップ(標準)、次に濾紙プレート(マイクロ)と共に、3日間、60℃でインキュベートした。宿主株及び細胞無しの濾紙(BS)を対照として用いた。結果を図21に示す。60℃で3日後、標準混合物において、マイクロ混合物と比較して、より多くの還元糖が形成されたことが確認できる。標準混合物では、細胞が常に濾紙ストリップに接触しているため、混合が良好となる。マイクロ混合物では、細胞の大部分が濾紙プレートの上方にあるため、全ての細胞が常にFPに接触している訳ではない、使用した2種類の対照は、予想通り、FPase活性(FPase-Activity)を示さなかった(図21A)。放出される還元糖(released red. sugars)の量は、グルコース標準曲線を利用して、mgグルコース/ml単位で判定した(図21B参照)。マイクロ(Micro)混合物において、60℃で3日後に、0.06mg/mlの還元糖が判定された。一方、標準(Standard)混合物では、0.38mg/mlが達成された。したがって、混合が良好であることから、6.3倍の収量が達成された。
【０１４３】
実施例8:ポプラ材の変換
【０１４４】
オートディスプレイセルラーゼは、濾紙を分解可能であることが分かった(図20参照)。濾紙はリグニンを含まず、ヘミセルロースを非常に少ない割合でのみ含むため、次に、より複雑な基質を用いる必要がある。このため、蒸気圧処理したポプラを用いた。ヘミセルロースは前処理により除去したが、リグニンは依然として存在している。リグニンは、セルラーゼの表面を覆うことから、第1に物理障壁を形成し、セルラーゼはリグニンとの結合が可能であり、ここでも、セルロースに到達できなくなるため、第2に化学障壁を形成する。セルラーゼのポプラ分解を調べるために、オートディスプレイセルラーゼを等量で混合し、4％のポプラと共に88時間に亘り60℃でインキュベートした。宿主株及び細胞を含まない緩衝液中のポプラ(BS)を対照として用いた。インキュベーションに続いて、ポプラ及び細胞を遠心分離により沈殿させた。上清を更に用いて、形成された還元糖をDNSアッセイにより判定した。結果を図22に示す。上清は、既に測定前にDNS試薬に類似した黄色がかった色を示した。そのため、DNS試薬とのインキュベーション後、540nmでの吸収値は、上清が透明であったFPアッセイによるものと比較して、高くなった(図20参照)。利用できる適切なグルコース標準が存在しないため、濃度をmgグルコース/ml単位で判定することはできなかった。しかしながら、60℃で88時間後に、使用した2種類の対照と比較して高い吸収が、セルラーゼにより観察された。したがって、オートディスプレイセルラーゼは、更に複雑な基質も変換することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１４５】
参考文献
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Xiao Zhizhuang, Storms R, Tsang A (2004) Biotechnology and Bioengineering 88 (7): 832-837
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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