(57)【要約】      （修正有）【課題】爪からアミノ酸光学異性体を迅速かつ高効率で抽出する方法を提供する。【解決手段】ヒト爪試料を洗浄及び粉砕した後、２０℃以上６０℃以下でメタノール溶媒を用いて超音波処理することによりアミノ酸を抽出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト爪試料を洗浄及び粉砕した後、２０℃以上６０℃以下でメタノール溶媒を用いて超音波処理することによりアミノ酸を抽出することを特徴とするアミノ酸光学異性体の抽出方法。
【請求項２】
上記抽出を２〜５回に分けて行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
１回当たりの抽出時間が５〜３０分間であり、合計抽出時間が１５〜９０分間である請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、爪からアミノ酸光学異性体を迅速・高効率で抽出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内を構成するタンパク質は、約２０種類のアミノ酸から作られており、血中や尿などのアミノ酸を用いた疾患マーカーの探索や生体機能に関わる研究が盛んに行われてきている。
更に、ここ十数年のうちに分析技術の進展に伴い、人にも様々なＤ型のアミノ酸が存在し、多様な生理機能を果たしていることが明らかになってきた。
人の生体中のアミノ酸を測定する場合には、血液や尿などが使われているが、生体内での代謝が早く、長くても過去数週間以内の生体情報しか得ることができなかった。
【０００３】
また、血液を検体とした場合、「痛みを伴う」侵襲的な方法で採取しなければならなく、採取者が医師や看護師に限定されることから、採集者の限定と痛みを感じることで敬遠されるといった課題があった。尿を検体とした場合、衛生面で問題となる。
【０００４】
従来、生体中のアミノ酸を分析するうえで、アミノ酸光学異性体を爪から迅速・高精度で抽出可能な方法がなかった。このようなことから、爪を用いた「痛みを伴わない」非侵襲的な方法で、血液検査と同等の精度、多検体同時抽出が可能なアミノ酸光学異性体の抽出方法が望まれていた。
【０００５】
本発明者は、研究を重ねた結果、爪からアミノ酸光学異性体として、Ｌ型１５種類、Ｄ型５種類を抽出、検出したこと（非特許文献１参照）、及びヒト爪中のアミノ酸光学異性体の定量値及びそのピーク面積Ｄ／Ｌ比が、健常人と糖尿病患者の間に有意差があること（非特許文献２参照）を報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Z. Min, et al., Anal. Methods., 2010, 2, 1233-1235
【非特許文献２】J. Z. Min, et al., Journal of Chromatography B, 879 (2011)3220-3228
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１及び２に記載の方法は、いずれも抽出溶媒としてメタノールを用いているが、非特許文献１には詳細な抽出条件は開示されておらず、非特許文献２に記載の方法では、ヒト爪を粉砕後、粉砕した爪をメタノール溶媒で５０℃、１２時間抽出を行っている。
しかしながら、爪の検査を実施していくうえで、血液検査と同等の精度、多検体同時検査（時間短縮）や低コストを実現するために、特に爪の前処理方法（洗浄、粉砕、抽出）は、爪の洗浄に手作業で１検体１０分以上かかり、爪からのアミノ酸抽出に１２時間以上かかっていることが問題となっていた。
【０００８】
これらの知見に基づいて、本発明者は、爪からアミノ酸光学異性体を迅速かつ高効率で抽出する方法を開発するに至ったものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）ヒト爪試料を洗浄及び粉砕した後、２０℃以上６０℃以下でメタノール溶媒を用いて超音波処理することによりアミノ酸を抽出することを特徴とするアミノ酸光学異性体の抽出方法。
（２）上記抽出を２〜５回に分けて行う上記（１）に記載の方法。
（３）１回当たりの抽出時間が５〜３０分間であり、合計抽出時間が１５〜９０分間である上記（１）又は（２）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、爪からアミノ酸光学異性体を迅速に、抽出効率が高く抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各抽出条件における抽出Ｄ−アミノ酸のピーク面積を示すグラフである。
【図２】各抽出条件における抽出Ｌ−アミノ酸のピーク面積を示すグラフである。
【図３】各抽出条件における抽出Ｄ−アミノ酸のピーク面積と内部標準物質ピーク面積との比を示すグラフである。
【図４】各抽出条件における抽出Ｌ−アミノ酸のピーク面積と内部標準物質ピーク面積との比を示すグラフである。
【図５】４℃、５０℃、６０℃、室温（２５℃）におけるアラニンの経時抽出を示すグラフである。
【図６】４℃、５０℃、６０℃、室温（２５℃）におけるロイシンの経時抽出を示すグラフである。
【図７】抽出回数におけるＤ−アミノ酸の抽出量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
ヒト爪試料の洗浄は、ヒト爪に付着している不純物を除去できる方法であれば、特に制限はないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の洗浄剤の水溶液を用いて超音波洗浄後、水洗してＳＤＳ等の洗浄剤を除去することが好ましい。
通常、洗浄された爪試料を乾燥機、デシケーター等で乾燥するが、この際、洗浄後濡れた爪試料を乾燥させることなく、液体窒素で凍結させて、ステンレス等のビーズによる粉砕を行うことにより処理時間を短縮することができる。
【００１３】
アミノ酸光学異性体を迅速かつ高効率で抽出するため、抽出を２０℃以上６０℃以下でメタノール溶媒を用いて超音波処理することにより行う。
上記抽出は、処理時間及び抽出効率の点から、２〜５回に分けて行うことが好ましく、３回に分けて行うことが更に好ましい。
メタノール溶媒の１回当たりの使用量は、粉砕した爪試料５．０ｍｇ当たり通常２００μＬ〜１０００μＬ、好ましくは５００μＬである。
１回当たりの抽出時間は、通常５〜３０分間、好ましくは１０〜２０分間であり、合計抽出時間は、通常１５〜９０分間、好ましくは３０〜６０分間である。
【００１４】
超音波処理の条件は、通常発振周波数（ｋＨｚ）３０〜６０であり、好ましくは４０である。
抽出温度は、２０℃以上６０℃以下であることが必要であり、好ましくは２５℃以上６０℃以下、更に好ましくは４５℃以上５５℃以下、特に好ましくは４０℃以上５０℃以下である。
抽出の最適条件は、４０〜５０℃、１５分ずつ３回である。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
（実施例及び比較例）
代表例として、従来法である粉砕した爪をメタノール溶媒で５０℃、１２時間抽出（比較例１）と、超音波抽出法（実施例１）及びマイクロ粉砕抽出法（比較例２）の比較評価試験を次のように実施した。
【００１６】
（１）前処理
ヒト爪試料を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液中で１分間超音波洗浄し、この操作を更に２回繰り返した。洗浄液を除去し、蒸留水で３回洗浄してドデシル硫酸ナトリウムを除去した。
濡れた爪試料を乾燥或いは液体窒素で凍結させて、ステンレスのビーズを入れてShake Master（株式会社バイオメディカルサイエンス）を用いて粉砕した。
【００１７】
（２）抽出
粉砕した爪試料５．０ｍｇに、５μＭ６−アミノヘキサン酸（内部標準物質）水溶液２０μｌ及びメタノール９８０μｌを加えて、次の（ａ）及び（ｂ）の方法で抽出を行った。また、上記のShake Masterによる粉砕をせずに、マイクロ粉砕抽出法により粉砕及び抽出を行ったものを比較例２とした。
（ａ）５０℃、１２時間抽出（比較例１）
（ｂ）超音波抽出法（発振周波数（ｋＨｚ）４０）（実施例１）
（ｃ）マイクロ粉砕抽出法（比較例２）
【００１８】
得られた抽出液の溶媒を留去し、非特許文献２（J. Z. Min, et al., J. Chromatography B, 879 (2011)3220-3228）記載の方法に従って、Ｒ（−）−４−（３−イソチオシアナトピロリジン−１−イル）−７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールによるアミノ酸光学異性体の誘導体化、及びＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳを組み合わせて、アミノ酸光学異性体を測定した。
【００１９】
マイクロ粉砕抽出法（３０分間粉砕）だけでの抽出と、超音波抽出法として非熱作用の超音波で５０℃、１５分ずつ５回の抽出をして、Ｄ，Ｌ−アミノ酸の検出を行った結果、マイクロ粉砕抽出法だけではほとんど検出されないに対し、超音波抽出法では、従来法のメタノール溶媒で５０℃、１２時間抽出したＤ，Ｌ−アミノ酸ピーク面積とほぼ同等に検出が認められた（図１〜４）。
【００２０】
また、爪からの溶媒の違いにおけるＤ，Ｌ−アミノ酸抽出効率の比較評価試験を次のように実施した。
メタノール溶媒で５０℃、１２時間抽出による従来法の溶媒をＨＣｌ溶媒、ＮａＯＨ溶媒に替えて、３種類の溶媒による抽出をして、Ｄ，Ｌ−アミノ酸の検出を行った結果、爪をメタノール溶媒に溶解した場合には、Ｄ，Ｌ−アミノ酸のピークが検出されたが、爪をＨＣｌ溶媒、ＮａＯＨ溶媒に溶解した場合には目的ピークがほとんど検出されなかった。
【００２１】
更に、メタノール溶媒によるＤ，Ｌ−アミノ酸の抽出における温度と時間の最適条件を得るための比較評価試験を次のように実施した。
粉砕した爪サンプルを秤量し、メタノールを加え、４℃、５０℃、６０℃、室温（２５℃）でそれぞれ５時間、８時間、１２時間、２４時間抽出を行い、経時抽出を行った結果、ほとんど全ての温度で１２時間を越えると、Ｄ，Ｌ−アミノ酸の抽出量に変化がないという結果が得られ、また最もＤ，Ｌ−アミノ酸の抽出効率がよかった抽出温度は、５０℃であることが認められた（図５及び６）。
【００２２】
更に、多検体同時処理や迅速性を図るうえで、抽出法による評価試験を次のように実施した。
同じ爪に等量のメタノール溶媒を用い、４０〜５０℃、１５分ずつ５回繰り返し超音波抽出を行った結果、３回目からはＤ−アミノ酸のピークはほとんど検出されず、３回の抽出で十分に爪中Ｄ−アミノ酸が抽出されることがわかった（図７）。
【００２３】
これらのことから、ヒト爪中のＤ，Ｌ−アミノ酸の抽出には、従来法であったメタノール溶媒を用いた５０℃、１２時間抽出より、超音波を用いたメタノール溶媒、４０〜５０℃、１５分ずつ３回が最適条件であることがわかり、４５分以内に従来法と同等の抽出効果が得られるため、従来法より１６倍抽出時間を短縮することができ、多検体分析に応用可能であることが示唆された。
【００２４】
したがって、本発明は爪からアミノ酸光学異性体を迅速かつ高効率で抽出する方法として期待できる。特に、爪は、他の臨床検査試料である血液、尿、唾液と比較して、数ヶ月以上の長期にわたる体内の栄養状態や過去の薬物使用履歴などの生体情報が得られ、しかも非侵襲で採取できることから検査試料としての好適である。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
ヒト爪中のアミノ酸光学異性体の定量値及びそのピーク面積Ｄ／Ｌ比が、健常人と糖尿病患者の間に有意差があることが知られており、本発明のアミノ酸光学異性体の抽出方法は糖尿病をはじめとする慢性疾患等のリスク判定に適用することができる。なお、上述のように、ヒト爪は、他の臨床検査試料である血液、尿、唾液と異なり採取が容易で、採取者も限定されないという利点を有する。このため、被験者自身が、採取した爪を検査機関に持ち込みあるいは送付することで糖尿病等のリスク判定を気軽に抵抗なく行うことができるという利点を有する。また、薬局、コンビニエンスストアなどの店舗で、採取した爪を適切に保管する専用キットを購入できるようにすれば、被験者の検査機関への持ち込みや送付の手間を軽減でき、糖尿病検査等のさらなる普及に貢献できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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