(57)【要約】【課題】グリチルリチン酸含有の割合を高く保持したまま、カンゾウ属植物を継代し増殖し得るカンゾウ属植物株等を提供する。【解決手段】カンゾウ属植物株は、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株（ＧｕＩＶ１株）、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株（ＧｕＩＶ２株）、又は、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１の株（Ｇｕ＃１１株）におけるＳＱＳ（スクアレン合成酵素）２遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７の部分配列、又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４の部分配列を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有する、ことを特徴とするカンゾウ属植物株。
【請求項２】
前記配列は、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１株（ＧｕＩＶ１株）、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２株（ＧｕＩＶ２株）、又は、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１の株（Ｇｕ＃１１株）におけるＳＱＳ（スクアレン合成酵素）２遺伝子、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子又はＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子の部分配列である、
ことを特徴とする請求項１に記載のカンゾウ属植物株。
【請求項３】
配列表の配列番号１又は２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーであって、
配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする識別マーカー。
【請求項４】
配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーであって、
配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする識別マーカー。
【請求項５】
配列表の配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーであって、
配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列、又は、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする識別マーカー。
【請求項６】
植物体の茎葉部を株の根元より切除し、当該切除した茎葉部から葉を切除して茎切片を露出し、
前記露出した植物体の茎切片を水で湿潤し、
前記湿潤した植物体の茎切片を流水で処理し、
前記流水で処理した植物体の茎切片を挿し床に挿し木する、
ことを特徴とする増殖方法。
【請求項７】
前記植物体は、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなる、
ことを特徴とする請求項６に記載の増殖方法。
【請求項８】
養液を貯留する養液槽と、
前記養液槽内に略鉛直方向に形成され、上端開口部に植物体を設置する一又は複数の筒状部と、
前記養液槽内の養液の水位を変動させる水位変動手段と、を備え、
前記水位変動手段は、前記植物体の根部の先端が前記養液槽の上端位置と下端位置との間の中間位置に達するまで、前記養液の水位を当該中間位置より上の第１の位置に設定し、その後当該中間位置より下の第２の位置に設定する、
ことを特徴とする水耕栽培装置。
【請求項９】
前記植物体は、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなる、
ことを特徴とする請求項８に記載の水耕栽培装置。
【請求項１０】
前記第１の位置は、前記養液槽の上端位置から１〜１０ｃｍ下の位置であり、前記第２の位置は、前記養液槽の下端位置から１〜１０ｃｍ上の位置である、
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の水耕栽培装置。
【請求項１１】
前記筒状部は、前記養液を吸収する材料で形成される、
ことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の水耕栽培装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンゾウ属植物株、識別マーカー、増殖方法、及び、水耕栽培装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物は、マメ科（Leguminosae）の多年草で、中国北部、ロシア南部、中央アジア、地中海地方などの乾燥地帯に主に自生する。例えば、中国北部などに自生するウラルカンゾウ（G. uralensis）、地中海地方などに広く自生するスペインカンゾウ（G. glabra）などが広く知られている。
【０００３】
東洋医学（漢方）の分野では、古くから、カンゾウ属植物のストロンを含む根部を乾燥させたものなどが生薬「甘草」として重用されている。甘草の乾燥粉末・エキスなどには、抗炎症作用、抗潰瘍作用、抗アレルギー作用、鎮咳作用、抗癌作用、抗ウイルス作用及び抗菌作用等の様々な薬理活性があり、医薬品としても重要なグリチルリチン酸（Ｃ４２Ｈ６２Ｏ１６）が含まれる。カンゾウ属植物においては、グリチルリチン酸はカリウム塩とカルシウム塩の混合物として蓄積され、これを総じてグリチルリチンという。甘草の主な薬効成分としてのグリチルリチン酸は、トリテルペン配糖体の一つで、カンゾウ属植物の根部などに多く含有し、この根部から抽出・精製することにより、製造される。
【０００４】
グリチルリチン酸を製造するための原材料として、野生のカンゾウ属植物が収穫され用いられている。一方、カンゾウ属植物の乱獲による環境破壊や資源の枯渇化の問題が顕在化している。そのため、カンゾウ属植物を安定供給するための栽培・増殖方法を確立することが望まれている。例えば、特許文献１には、グリチルリチン酸含有の割合が高く保持されたまま、カンゾウ属植物を継代し増殖しうるカンゾウ属植物株及びカンゾウ属植物増殖方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に開示されるカンゾウ属植物株は、自生しているカンゾウ属植物に比べ、グリチルリチン酸を多く含有している。しかしながら、このカンゾウ属植物株は、他のカンゾウ属植物株に比べて増殖能があまり高くないため、短期間で効率的に増殖することが困難な場合がある。このため、グリチルリチン酸含有の割合を高く保持したまま、カンゾウ属植物を継代し増殖し得る新たなカンゾウ属植物株が求められている。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、グリチルリチン酸含有の割合を高く保持したまま、カンゾウ属植物を継代し増殖し得るカンゾウ属植物株等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るカンゾウ属植物株は、
配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有する、ことを特徴とする。
【０００９】
前記配列は、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ１（以下、「ＧｕＩＶ１」と記載する）株、ＧｕＴＳ７１−０８ＩＶ２（以下、「ＧｕＩＶ２」と記載する）株、又は、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１（以下、「Ｇｕ＃１１」と記載する）株におけるＳＱＳ（スクアレン合成酵素）２遺伝子、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子又はＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子の部分配列でもよい。
【００１０】
本発明の第２の観点に係る配列表の配列番号１又は２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーは、
配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする。
【００１１】
本発明の第３の観点に係る配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーは、
配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする。
【００１２】
本発明の第４の観点に係る配列表の配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別する識別マーカーは、
配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列、又は、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる、
ことを特徴とする。
【００１３】
本発明の第５の観点に係る増殖方法は、
植物体の茎葉部を株の根元より切除し、当該切除した茎葉部から葉を切除して茎切片を露出し、
前記露出した植物体の茎切片を水で湿潤し、
前記湿潤した植物体の茎切片を流水で処理し、
前記流水で処理した植物体の茎切片を挿し床に挿し木する、
ことを特徴とする。
【００１４】
前記植物体は、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなってもよい。
【００１５】
本発明の第６の観点に係る水耕栽培装置は、
養液を貯留する養液槽と、
前記養液槽内に略鉛直方向に形成され、上端開口部に植物体を設置する一又は複数の筒状部と、
前記養液槽内の養液の水位を変動させる水位変動手段と、を備え、
前記水位変動手段は、前記植物体の根部の先端が前記養液槽の上端位置と下端位置との間の中間位置に達するまで、前記養液の水位を当該中間位置より上の第１の位置に設定し、その後当該中間位置より下の第２の位置に設定する、
ことを特徴とする。
【００１６】
前記植物体は、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなってもよい。
【００１７】
前記第１の位置は、前記養液槽の上端位置から１〜１０ｃｍ下の位置であり、前記第２の位置は、前記養液槽の下端位置から１〜１０ｃｍ上の位置でもよい。
【００１８】
前記筒状部は、前記養液を吸収する材料で形成されてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、グリチルリチン酸含有割合の高いカンゾウ属植物の増殖を行うことができるため、生薬の甘草又はグリチルリチン酸の生産効率を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施形態に係る水耕栽培装置を示す模式図であり、（ａ）は側断面図、（ｂ）は上面図である。
【図２】ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【図３】ＳＱＳ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【図４】ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【図５】養液栽培３６２日後のＧｕ＃１１株の植物体を示す図である。
【図６】ＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの植物体において、二次代謝物含量を測定した結果を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、挿し木から３１日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。
【図８】発根した挿し木苗を水耕栽培装置に移植した後のＧｕ＃１１株、及びＧｕＩＶ２株を示す図である。
【図９】（ａ）、（ｂ）は、水耕栽培を開始してから１週間後、５週間後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。
【図１０】（ａ）、（ｂ）は、水耕栽培を開始してから７１日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。
【図１１】（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る水耕培養装置に移植した直後、移植してから１３日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。
【図１２】（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る水耕培養装置を用いて水耕栽培を開始してから１３７日後のＧｕ＃１１株、１４２日後のＧｕＩＶ２株を示す図である。
【図１３】水耕栽培を行ったＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の植物体において、根の収量、グリチルリチン酸収量及び二次代謝物含量を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（カンゾウ属植物株）
本発明の実施形態に係るカンゾウ属植物株は、薬効成分として有用なグリチルリチン酸を根部に多量に含有するカンゾウ属植物株であり、継代し増殖し得る株である。
【００２２】
本明細書において「カンゾウ属（Glycyrrhiza）植物」は、根部にグリチルリチン酸を含有する植物であるが、根部以外の茎部、葉などにグリチルリチン酸を含有する植物でもよい。例えば、ウラルカンゾウ（G. uralensis）、スペインカンゾウ（G. glabra）、チョウカカンゾウ（G. inflata）、G. acanthocarpa、G. aspera、G. astragalina、G. bucharica、G. echinata、G. eglandulosa、G. foetida、G. foetidissima、G. gontscharovii、G. iconica、G. korshinskyi、G. lepidota、G. pallidiflora、G. squamulosa、G. triphylla、G. yunnanensis、これらカンゾウ属植物の変種などが適用可能であり、ウラルカンゾウ及びスペインカンゾウが好適であり、ウラルカンゾウがより好適である。
【００２３】
根部（地下部）は、根・ストロンなどを、茎部（茎葉部、地上部）は茎・頂芽・シュート・節・葉などを広く包含する。茎部の切片は、二以上の節を含むように２〜２０ｃｍ程度の長さに調製することが好ましい。切片の調製は、例えば、鋏・カッター・メスなど、公知の切断手段などを用いて行うことができる。
【００２４】
本カンゾウ属植物株として、例えば、ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株、Ｇｕ＃１１株のいずれかが挙げられる。本出願人は、これらの株を、独立行政法人医薬基盤研究所薬用植物資源研究センター筑波研究部育種生理研究室（所在地：日本国茨城県つくば市八幡台１−２）内において自己寄託し、維持・保存している。本出願人は、日本国特許法施行規則第２７条の３各号に該当する場合、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲することを保証する。
【００２５】
ウラルカンゾウＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株、Ｇｕ＃１１株は、ＳＱＳ（スクアレン合成酵素）２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２部分、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有する。ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列、及び、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列は、グリチルリチン酸を含む二次代謝物（リキリチン、イソリキリチン、グリシクマリン等）を根部に多量に含有させ、株を継代し増殖し得る植物に必要な配列である。
【００２６】
配列表の配列番号１、２の配列は、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列の部分配列である。また、配列表の配列番号３〜６の配列は、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列の部分配列である。配列表の配列番号７〜９の配列は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２部分、エキソン３〜イントロン４部分を含むエキソン１〜エキソン５部分における塩基配列である。配列番号１〜９の配列は、カンゾウ属植物株の遺伝子に、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列の部分配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列の部分配列、及び／又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有するか否かを判別するために有用な配列であり、遺伝子に配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、根部に多量のグリチルリチン酸を含有する株であると判別できる。
【００２７】
本カンゾウ属植物株は、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列の部分配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列の部分配列、又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有する株であり、これらの部分配列である配列番号１〜９のいずれかの配列を有する。
【００２８】
本カンゾウ属植物株は、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列、又は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４部分における塩基配列の相同性が、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上である塩基配列を有してもよい。
【００２９】
以上のように、配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、グリチルリチン酸の含有割合が高い株であり、配列番号１〜９の配列を検出することにより、グリチルリチン酸の含有割合が高い株を識別することができる。
【００３０】
（識別マーカー）
本発明の実施形態に係る識別マーカーは、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株を識別するマーカーである。本識別マーカーを用いて、カンゾウ属植物株から抽出するＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法により該当する領域を増幅し、その増幅産物を解析することにより、薬効成分として有用なグリチルリチン酸を根部に多量に含有するカンゾウ属植物株を識別できる。
【００３１】
本識別マーカーは、配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、又は、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列、からなる。ここで、相補的とは、各塩基のａ（アデニン）とｔ（チミン）とを、ｇ（グアニン）とｃ（シトシン）とを入れ換えた状態をいう。また、逆相補的とは、塩基配列の５’末端と３’末端とを入れ換えた状態をいう。
【００３２】
配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＳＱＳ２遺伝子のイントロン１〜イントロン２を増幅し得る配列からなるプライマーである。配列番号１０の配列は、フォワードプライマーに相当し、配列番号１１の配列は、リバースプライマーに相当する。この識別マーカーにより、配列表の配列番号２の配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。
【００３３】
配列番号１２、及び、配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７を増幅し得る配列からなるプライマーである。配列番号１２の配列は、フォワードプライマーに相当し、配列番号１３、１４の配列は、リバースプライマーに相当する。この識別マーカーにより、配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。なお、リバースプライマーに相当する配列表の配列番号１３、１４の配列については、どちらか一方を使用してもよく、また、両方使用してもよい。
【００３４】
配列番号１５、及び、配列番号１６及び／又は１７の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２を増幅し得る配列からなるプライマーであり、配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のエキソン３〜イントロン４を増幅し得る配列からなるプライマーである。配列番号１５、１８の配列は、フォワードプライマーに相当し、配列番号１６、１７、１９の配列は、リバースプライマーに相当する。この識別マーカーにより、配列表の配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。なお、リバースプライマーに相当する配列表の配列番号１６、１７の配列については、どちらか一方を使用してもよく、また、両方使用してもよい。
【００３５】
配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、上述したように、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株である。ＰＣＲ法により、本識別マーカーを用いて、これらグリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株のＤＮＡを増幅できるため、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株と他のカンゾウ属植物株とを区別することができる。これにより、本識別マーカーを用いることにより、簡易かつ高精度に、グリチルリチン酸の含有割合が高いカンゾウ属植物株を検出することができる。
【００３６】
ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅する方法は、通常公知の方法を用いることができる。例えば、リアルタイム−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primers）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法などの通常公知の方法を用いることができる。また、ＰＣＲした後の増幅産物については、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などの通常公知の方法を用いて、増幅産物を検出できる。また、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認してもよい。また、ＰＣＲ法の反応条件（温度、時間等）は、ＤＮＡ含有量、及び、酵素の種類・量によって変化するものであり、任意である。
【００３７】
カンゾウ属植物株からＤＮＡを抽出する方法は、フェノール法、市販の核酸抽出用のキット、装置を用いる通常公知の方法を用いることができる。
【００３８】
以上のように、配列表の配列番号１０、１１の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号１又は２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別（区別）することができる。また、配列表の配列番号１２、及び、配列表の配列番号１３及び／又は１４の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。また、配列表の配列番号１５、及び、配列表の配列番号１６及び／又は１７の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号７、８のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができ、配列表の配列番号１８、１９の配列と同一、相補的又は逆相補的な配列からなる識別マーカーは、配列表の配列番号９の配列を有するカンゾウ属植物株を検出することができる。配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、グリチルリチン酸を含む二次代謝物の含有割合が高い株であるため、配列番号１０〜１９の配列を有する識別マーカーを用いることにより、二次代謝物の含有割合が高いカンゾウ属植物株を検出することができる。
【００３９】
（増殖方法）
本発明の実施形態に係る植物体の増殖方法は、植物体の茎を挿し穂として、挿し床に挿すことにより、植物体の個体数を増やす方法である。本増殖方法では、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源、発根促進剤が含まれた液体培地などを必要としないため、安価で、かつ、簡単な操作で、植物体を増殖することができる。
【００４０】
まず、植物体の茎葉部（地上部）を（親）株の根元より切除し、茎葉部の根元を直ちに純水に浸ける。次に、茎葉部からすべての葉を切除して２節を含む約３〜１０ｃｍ長の茎切片を調製し、茎切片を直ちに純水に浸ける。次に、純水を流しながら（流水処理しながら）茎切片を、閉鎖温室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で１時間、静置する。次に、鉢に充填したバーミキュライトを純水で良く湿潤させて中央に穴を開け、静置した茎切片を挿し木する。そして、挿し木した茎切片を、１日１回１０分間、灌水しながら、グロースチャンバー室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%、照度25,000〜30,000 lux）で栽培する。
【００４１】
以上の手順で植物体を栽培することにより、同一クローン由来の株を多数栽培できるため、植物体の大量増殖に有用である。また、炭酸ガス施肥、特定波長域の光源、特定の液体培地などを必要としないため、安価で、かつ、簡単な操作で、植物体を増殖することができる。さらに、これらの手順は、全て閉鎖温室内で行うことができるため、気候の影響などを受けずに栽培でき、また、一年を通じての収穫が可能になるという利点がある。
【００４２】
本植物体は、配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株からなる植物であるが、これらのカンゾウ属植物に限定されず、マオウ属植物のシナマオウなどの薬用植物であってもよい。また、葉を切除する植物体の茎切片長は、植物体、栽培環境などによって適宜変更できる。
【００４３】
親株の植え付け材料は、特に限定されない。例えば、種子から苗を育成し、その苗を増殖（栽培）に供してもよいし、水耕栽培・圃場栽培・組織培養などにより得られたカンゾウ属植物株を栽培に供してもよいし、それらの株から所定長の茎切片を調製し、その茎切片を栽培に供してもよい。
【００４４】
温度、湿度、照度、照明時間などの栽培環境は、植物体によって適宜変更でき、また、流水処理時間も任意である。また、茎切片を洗浄する水は、純水に限定されず、窒素分、リン分、カリウム分、金属成分などの植物の生長に必要な成分を含有する水溶液を用いることもできるし、水道水あるいは井戸水を用いることもできる。また、茎切片を純水に浸漬する時間は、植物体によって適宜変更できる。
【００４５】
茎切片は、任意の節数を含むものを用いることができ、例えば、１節でも良いし、３節以上でも良い。茎切片を、２以上の節を含むように２〜２０ｃｍ程度の長さに調製することが好ましく、より好ましくは３〜１０ｃｍ程度の長さに調製することである。茎切片の調製は、例えば、鋏・カッター・メスなど、公知の切断手段などを用いて行うことができる。
【００４６】
挿し木に用いる土（支持体）は、バーミキュライトに限定されず、公知の支持体を用いることができる。例えば、ロックウール、ハイドロボール、ココピート、パミスサンド、オアシス及び、これらの混合物を用いることもできる。また、養液肥料、オーキシンなどの発根促進剤、メネデールなどの植物活力素を用いてもよい。
【００４７】
植物体を栽培するための養液は、水、又は、窒素分、リン分、カリウム分、金属成分などの植物の生長に必要な成分を含有する水溶液であればよく、公知のものを用いることができる。
【００４８】
（水耕栽培装置）
本発明の実施形態に係る水耕栽培装置１００について、図１を参照して説明する。水耕栽培装置１００は、主として根を薬用部位とする薬用植物の栽培に適しており、植物を支持するためにパミスサンドなどの支持体を有さないため、より簡便に、低コストで、植物体を栽培できる装置である。
【００４９】
水耕栽培装置１００は、養液槽１１０、上板部１２０、筒状部１３０、支持部１４０、養液１５０、水位変動手段（図示せず）を備える。
【００５０】
養液槽１１０は、養液１５０を貯留するための槽である。養液槽１１０の上端開口部には、上板部１２０が載置される。
【００５１】
養液槽１１０は、例えば、外寸：幅55.1cm×奥行39.9cm×高さ30.7cmからなるポリプロピレン製コンテナであるが、公知のものを広く利用でき、特に限定されない。また、材質は、特に限定されないが、長期間、養液１５０を貯留しても劣化の少ないものが好ましい。例えば、熱可塑性樹脂（高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂など）製のもの、発泡性樹脂（発泡ポリスチレン、発泡ポリプロピレン、発泡ポリウレタンなど）製のものなどを利用できる。
【００５２】
上板部１２０は、植物体を定植するための１又は複数の穴１２１が形成され、穴１２１には、支持部１４０により支持（固定）された植物体が設置される。
【００５３】
上板部１２０の材質は、公知のものを用いることができ、特に限定されないが、一定の強度を有し、外力によって変形せず、耐水性があり、長期間の栽培によっても溶解・腐食しない素材が好ましい。例えば、発泡性樹脂（発泡スチロール、ポリスチレンフォーム、発泡ポリプロピレン、硬質発泡ウレタンなど）製のもの、軽量プラスチック、木材、同形状のポリタンクなどは、比較的安価で、目的の形状に成形・加工しやすく、耐久性にも優れ、好適である。
【００５４】
筒状部１３０は、植物体の根部をその筒内で伸長させ、また、管内の根の過度の乾燥を防ぎ、養液を根に供給するためのものであり、筒状部１３０の上端開口部に植物体が設置される。筒状部１３０は、上板部１２０の穴１２１から挿入され、養液槽１１０内で略鉛直方向に形成されるよう設置される。筒状部１３０は、例えば、不織布からなり、養液１５０を吸収し、毛細管現象により、植物体の根部に養液１５０を供給する。筒状部１３０の下端開口部、養液１５０を吸収する側面部から、養液１５０が自由に出入りでき、養液槽１１０内の水位と筒状部１３０内の水位がほぼ同じになるように形成されている。
【００５５】
筒状部１３０の長さ・径の大きさは、植物種や根部の太さ・長さに応じて、適宜設定できる。例えば、筒状部１３０の長さは１０ｃｍ〜１ｍ、孔径は直径２〜２０ｃｍが好適である。また、筒状部１３０の材質は、吸水性および通気性が高く略筒型形状を有する公知のものを用いることができる。
【００５６】
支持部１４０は、植物体（の基部、根部）を支持するためのものであり、例えば、水分を吸収するスポンジ状の部材から形成される。植物体の基部、根部に支持部１４０が巻き付けられ、支持部１４０が巻き付けられた植物体が上板部１２０の穴１２１から差し込まれることにより、植物体が筒状部１３０に固定され、設置される。
【００５７】
支持部１４０の長さ・径の大きさは、植物種や根部の太さ・長さに応じて、適宜設定できる。また、支持部１４０の材質は、合成樹脂製の板状物など、公知のものを用いることができる。
【００５８】
養液１５０は、水若しくは肥料・各種栄養素などが溶解した水であり、養液槽１１０に貯留される。養液１５０は、栽培する植物種などに応じて、公知のものを適宜利用できる。
【００５９】
水位変動手段は、養液槽１１０に貯留される養液１５０の水位を調節するものである。水位変動手段は、例えば、供給ポンプ、排水ポンプ、水位センサー、植物体感知センサー、タイマーなどから構成され、養液１５０の量（水位）、養液１５０の給排水速度、タイミングなどを制御する。
【００６０】
水位変動手段は、植物体が水耕栽培装置１００に設置（定植）されてから、植物体の根部の先端が、養液槽１１０の上端位置（開口部）と下端位置（底面部）との中間位置（または、筒状部１３０の上端位置と下端位置との中間位置）に達するまで、養液１５０の水位をこの中間位置より上の位置になるように設定し、植物体の根部の先端がこの中間位置に達した後は、養液１５０の水位を中間位置より下の位置になるように設定する。より好ましくは、水位変動手段は、植物体の根部の先端が中間位置に達するまで、養液１５０の水位を、養液槽１１０の上端位置から１〜１０ｃｍ下の位置、または、５ｃｍ下に設定し、植物体の根部の先端が中間位置に達した後は、養液１５０の水位を、養液槽１１０の下端位置から１〜１０ｃｍ上の位置、または、５ｃｍ上に設定する。
【００６１】
養液１５０の水位は、植物体の根部の大きさ（長さ）、養液槽１１０の大きさ（深さ）に応じて、適宜設定できるものであり、植物体の根部（特に細根）に養液１５０を供給できればよいため、植物体の根部の伸長に合わせて、逐次設定変更できる。また、養液１５０の水位を変動（設定変更）した場合、また、定期的に、植物体の根部から生長した細根を切除することもできる。
【００６２】
水耕栽培装置１００で栽培する植物体の種類は特に限定されないが、カンゾウ属植物体、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物体に適用できる。また、水耕栽培装置１００は、グロースチャンバー室、閉鎖温室、ガラス温室、ビニールハウス、培養庫など、植物の生育に必要な環境を提供できる任意の場所に設置される。例えば、水耕栽培装置１００は、グロースチャンバー室内に設置され、グロースチャンバー室内において、温度、湿度、照明時間が適宜設定変更され、植物体を栽培するのに適した環境が提供される。
【００６３】
以上のように、水耕栽培装置１００を用いることにより、植物体の収穫部位（地下部組織）を肥大させることができる。また、水耕栽培装置１００では、植物体を支持するためにパミスサンドなどの支持体を使用していないため、より簡便に、低コストで、効率的に植物体を栽培できる。
【００６４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００６５】
（カンゾウ属植物の検出）
配列表の配列番号１０〜１９の配列からなる識別マーカー（プライマー）を用いて、配列番号１〜９の配列を有するカンゾウ属植物体を検出した。まず、各カンゾウ属植物体から葉１枚を採取し、採取した葉及びステンレスビーズ（φ4.8mm）２個を2.0mL滅菌凍結保存チューブ（アシスト製）に取り、ビーズ破砕装置（トミー精工製Micro Smash MS-100） を用いて葉を破砕し、DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN製） を用いて各カンゾウ属植物体のゲノムDNAを調製した。
【００６６】
調製したゲノムDNAの溶液をそのまま、または、DNase free水を加え、10 ng/μLになるように希釈し、これを鋳型にGoTaq Green Master Mix（Promega製）またはExTaq（タカラバイオ製）を用いて、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン２を含むイントロン１〜イントロン２、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７、及び、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅した。増幅により得られたＰＣＲ増幅産物は、１％アガロースゲルで電気泳動し、増幅バンドのパターンを比較した。
【００６７】
ＳＱＳ２遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１０の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１１の配列からなるリバースプライマーを用いた。また、イントロン７の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１２の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１３、１４の配列からなるリバースプライマーを用いた。また、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１５の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１６、１７の配列からなるリバースプライマーを用い、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のエキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅するプライマーには、配列番号１８の配列からなるフォワードプライマー、配列番号１９の配列からなるリバースプライマーを用いた。
【００６８】
ＳＱＳ２遺伝子のイントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するＰＣＲ機器には、iCycler（Bio-Rad製）を、ＰＣＲ酵素には、Go Taq Green Master Mix（Promega製）を、それぞれ用いた。イントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、Go Taq Green Master Mix 3μL、forward primer (10 μM) 1μL、reverse primer (10 μM) 1 μL、鋳型ゲノムDNA 1μL (total 6μL)に調製し、94℃ 5 min(分) → [94℃ 30 sec(秒) → 58℃ 30 sec → 72℃ 1 min]×30サイクル → 72℃ 10 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。
【００６９】
また、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７の部分配列を増幅するＰＣＲ機器には、2720 Thermal Cycler（ABI製）を、ＰＣＲ酵素には、ExTaq（タカラバイオ製）を、それぞれ用いた。イントロン７の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、ExTaq 0.1μL、10 × ExTaq buffer 2μL、dNTPs 1.6μL、forward primer (10 μM) 1μL、reverse primer (10 μM) 1μL、ddH2O 12.3μL、genome DNA (10 ng/μL) 2μLに調製し、94℃ 2 min → [94℃ 30 sec → 60℃ 30 sec → 72℃ 45 sec]×30サイクル → 72℃ 5 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。
【００７０】
また、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２、エキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅するＰＣＲ機器には、2720 Thermal Cycler（ABI製）を、ＰＣＲ酵素には、GoTaq Green Master Mix（Promega製）を、それぞれ用いた。イントロン１〜イントロン２の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、Go Taq Green Master Mix 3μL、forward primer (10μM) 1μL、reverse primer (10μM)、鋳型ゲノムDNA 1μL (total 6μL) に調製し、94℃ 2 min → [94℃ 30 sec → 62℃ 30sec → 72℃ 45 sec]×30サイクル → 72℃ 5 min → 4℃ ∞ の条件でＰＣＲを行った。また、エキソン３〜イントロン４の部分配列を増幅するＰＣＲ条件として、１サンプル当たりのＰＣＲ反応液を、Go Taq Green Master Mix 3μL、forward primer (10μM) 1μL、reverse primer (10μM) 1μL、鋳型ゲノムDNA 1μL、ddH2O 4.5μL (total 15μL)に調製し、94℃ 2 min → [94℃ 30 sec → 60℃ 30sec → 72℃ 1 min]×30サイクル → 72℃ 5 min → 4℃ ∞の条件でＰＣＲを行った。
【００７１】
図２は、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。図２中において、λ/PstIはマーカーであり、１〜３２はＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンを区別するための名称であり、Ｇｕ２３２−６＃６はＧｕＴＳ７１−０８系統以外の実生クローンの名称である。同図に示すように、配列表の配列番号１２、１３の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の両方又は一方の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。このＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株は配列番号３〜６の配列を含むため、配列番号１２〜１４の識別マーカーは、配列番号３〜６の配列を有するカンゾウ属植物体を識別できる識別マーカーであることが明らかとなった。
【００７２】
なお、配列番号１２、１４のプライマーセットではイントロン７配列を増幅可能であるのに対し、配列番号１２、１３のプライマーセットではＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株に特徴的なイントロン７配列のみの増幅が可能であった。また、ＧｕＩＶ１株とＧｕＩＶ２株では増幅されるイントロン７配列の長さが異なるため、お互いに区別が可能であった。
【００７３】
図３は、ＳＱＳ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。図３中において、λ/PstIはマーカーであり、＃１〜＃３はウラルカンゾウ株を区別するための名称であり、＃１はＧｕＩＶ２株、＃２はＧｕ２−３−２株、＃３はＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローンの株識別番号１１の株（Ｇｕ＃１１株）である。同図に示すように、配列表の配列番号１０、１１の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、＃３であるＧｕ＃１１株は、ＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するカンゾウ属植物体であるため、配列表の配列番号１０、１１の識別マーカーは、ＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、配列番号１０、１１の識別マーカーを用いた場合、Ｇｕ２−３−２株では、ＰＣＲ産物を与えないため（＃２）、配列番号１０、１１の識別マーカーを用いることにより、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列と、Ｇｕ２−３−２株タイプの配列とを識別（区別）できた。
【００７４】
図４は、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。図４中において、λ/PstIはマーカーであり、＃１〜＃４はウラルカンゾウ株を区別するための名称であり、＃１はＧｕ２−３−２株、＃２はＧｕＩＶ２株、＃３はＧｕＩＶ１株、＃４はＧｕ＃１１株であり、＃５は水である。同図に示すように、配列表の配列番号１５、１６の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、Ｇｕ２−３−２株及びＧｕ＃１１株の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、配列表の配列番号１５、１７の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。また、配列表の配列番号１８、１９の識別マーカー（プライマー）を用いた場合、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株及びＧｕ＃１１株の配列を有するカンゾウ属植物体を検出できた。このため、配列番号１５〜１９の識別マーカーを用いることにより、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列、Ｇｕ２−３−２株タイプの配列、Ｇｕ＃１１株タイプの配列をそれぞれ識別（区別）できた。
【００７５】
以上の結果から、配列番号１０、１１の識別マーカーは、ＳＱＳ２遺伝子のエキソン１〜エキソン３部分における塩基配列を有するＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株、つまり、配列番号１、２の配列を有するカンゾウ属植物株を識別できた。また、配列番号１２〜１４の識別マーカーは、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列を有するＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株、つまり、配列番号３〜６のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別できた。また、配列番号１５〜１７の識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のイントロン１〜イントロン２部分における塩基配列、配列番号１８、１９の識別マーカーは、ＣＹＰ７２Ａ１５４遺伝子のエキソン３〜イントロン４部分における塩基配列を有するＧｕ２−３−２株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株及びＧｕ＃１１株、つまり、配列番号７〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株を識別できた。
【００７６】
（グリチルリチン酸量の測定）
Ｇｕ＃１１株、及び、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列においてＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株から植出した植物体に含まれるグリチルリチン酸量を測定した。
【００７７】
Ｇｕ＃１１株について、培養苗を径3cmのジフィーセブン水でふくらむタネまき土ポット（サカタのタネ製）に植出し、培養庫（25℃、14時間明期、相対湿度40%）で２９日間馴化後、ハイドロボールを支持体とする養液栽培装置に移植した。養液栽培装置に移植した培養苗を、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で２００日間、さらに閉鎖温室（25℃、14時間明期、相対湿度55%）で１６２日間（計３６２日間）養液栽培（マツザキ1号及びマツザキ2号、栽培２０６日後までは標準濃度の２５％、その後は標準濃度の５０％）した後、植物体を収穫し、植物体の根の収量及び二次代謝物含量を測定した。図５は、養液栽培３６２日後のＧｕ＃１１株の植物体を示す図である。図５に示す植物体について、根の収量及び二次代謝物含量を測定した。
【００７８】
二次代謝物含量を測定する際の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）条件を以下のように設定した。HPLCのカラムに、TSKgel ODS-100V（径4.6mm×長さ250mm、粒径5μm、東ソー株式会社製）を、ガードカラムに、TSKguardgel ODS-100V（径3.2mm×長さ15mm、粒径5μm、東ソー株式会社製）を用いた。移動相に、アセトニトリル（溶媒A）と１％酢酸（溶媒B）とを混合して用いた。溶出開始から０〜２１分間は溶媒Aの混合比率を２０〜７６％に直線的に上げ、２１〜２２分間は溶媒Aの混合比率を７６〜１００％に直線的に上げ、２２〜２４分間は溶媒Aの混合比率を１００％にし、２４〜２５分間は溶媒Aの混合比率を１００〜２５％に直線的に下げ、流速1.0mL/min、カラム温度４０℃に設定した。定量検出はUV254nmで、定性検出（検出ピークの同定）はUV200〜400nmで行った。
【００７９】
その結果、Ｇｕ＃１１株の根（径1mm以上）の乾燥重量：4.82 g、グリチルリチン酸収量：129.2 mgであり、Ｇｕ＃１１株の乾燥根の二次代謝物含量は、グリチルリチン酸：2.68%乾燥重量、リキリチン：1.70%乾燥重量、イソリキリチン：0.15%乾燥重量、グリシクマリン：0.11%乾燥重量であった。このため、Ｇｕ＃１１株は、高二次代謝物生産能を有することが明らかとなった。
【００８０】
また、ＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列においてＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株について、Ｇｕ＃１１株と同様に、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で８４〜９６日間、養液栽培した後、植物体の根における二次代謝物含量を測定した。二次代謝物含量を測定する際のHPLC条件は以下のように設定した。HPLCのカラムに、ACQUITY UPLC BEH C18（径2.0mm×長さ50mm、粒径1.7μm、waters製）を用いた。移動相に、0.1％ギ酸（溶媒A）とアセトニトリル（溶媒B）とを混合して用いた。溶出開始から0〜0.45分間は溶媒Aの混合比率を８０％に、０．４５〜６．５分間は溶媒Aの混合比率を８０〜３０％に直線的に下げ、６．５〜６．７５分間は溶媒Aの混合比率を３０〜０％に直線的に下げ、６．７５〜７分間は溶媒Aの混合比率を80%にし、流速0.8mL/min、カラム温度４０℃に設定した。定量検出は、グリチルリチン酸はUV254nmで、リキリチン及びイソリキリチンは316nmで、グリシクマリンは350nmで行った。
【００８１】
図６は、ＧｕＩＶ１株及び／又はＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株の植物体において、二次代謝物含量を測定した結果を示す図である。図６中において、ＩＶ１はＣＹＰ８８Ｄ６遺伝子のイントロン７部分における塩基配列においてＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株であり、ＩＶ２は同塩基配列においてＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株であり、ＩＶ１＋ＩＶ２は、同塩基配列においてＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の両タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株である。また、７１＃１〜７１＃３２は、ＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株を区別するための名称である。同図に示すように、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するＧｕＴＳ７１−０８系統実生クローン株の植物体は、二次代謝物含量が高いことが明らかとなり、特にＧｕＩＶ１株タイプの配列を有するクローンでは７１＃１２が、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有するクローンでは７１＃１が、ＧｕＩＶ１株とＧｕＩＶ２株の両方のタイプを有するクローンでは７１＃３１が、二次代謝物含量割合が高い優良カンゾウ属植物株であることが明らかとなった。
【００８２】
以上の結果から、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株タイプの配列を有する植物体、つまり、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物株は、グリチルリチン酸を含む二次代謝物含量割合が高いカンゾウ属植物株であることが明らかとなった。
【００８３】
（カンゾウ属植物の挿し木による増殖）
高含量のグリチルリチン酸を生産する、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株を親株として、カンゾウ属植物の地上茎の挿し木による増殖を行った。
【００８４】
Ｇｕ＃１１株及びＧｕＩＶ１株については２２８日間、ＧｕＩＶ２株については２３６日間、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）でパミス（登録商標）を支持体とする養液栽培（大塚ハウス1号6g+大塚ハウス2号4g/8L、標準濃度の50%）した後、各株からなるカンゾウ属植物の地上茎（茎葉）を株の根元より切除し、直ちに純水を張った2Lポリビーカーに茎の根元を浸けた。全ての葉を茎より切除して2節を含む約3〜10cm長の茎切片を調製し、直ちに2Lポリビーカー中の純水に浸け、閉鎖温室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で１時間、純水による流水処理（水流の下に茎切片の入った2Lポリビーカーを置き、そのまま水を流しながら静置）を行った。シロイヌナズナ用屋内育成・種子回収キットアラシステム（ビーエム機器株式会社製）にバーミキュライト（有限会社タカムラ製）を充填し、純水で良く湿潤させて中央にピンセットで穴を開け、流水処理が完了した茎切片を挿し（挿し木し）、１日１回１０分間、アラトレイ（水受けトレイ）に灌水しながら、グロースチャンバー室内（25℃、16時間明期、相対湿度60%、光源：岩崎電気社製メタルハライドランプ セラルクス、照度25,000〜30,000 lux）で栽培管理した。
【００８５】
図７（ａ）〜（ｃ）は、挿し木から３１日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株を示す図である。また、表１は、挿し木から３７日後のＧｕ＃１１株及び３８日後のＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の発根率の結果である。さらに、図８は、発根した挿し木苗を水耕栽培装置に移植した後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。
【表１】
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【００８６】
図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、カンゾウ属植物の地上茎を挿し木することにより、カンゾウ属植物株を増殖できた。また、表１に示すように、各株の発根率は、Ｇｕ＃１１株：60.0%、ＧｕＩＶ１株：61.3%、ＧｕＩＶ２株：62.6%であった。さらに、図８に示すように、挿し木苗は、発根後も生育し続けることが明らかとなった。
【００８７】
以上の結果から、カンゾウ属植物を堀上収穫してストロンを調製することなく、カンゾウ属植物の地上茎を挿し木することにより増殖が可能であり、さらに、挿し木苗も水耕栽培によりに旺盛に生育する。このため、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、及び、ＧｕＩＶ２株、つまり、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物は、容易にかつ指数的に増殖可能な株であることが明らかとなった。
【００８８】
（水耕栽培装置）
支持体を使用していない水耕栽培装置を用いて、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、及び、ＧｕＩＶ２株を栽培した。
【００８９】
ストロン挿しにより増殖させたＧｕＩＶ１株のストロン部、及び、地上茎挿し木により増殖させたＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株の茎の基部を、予め水で湿らせたアクアサプライヤｆマットSR180（幅3cm×長さ17.5cm）で包み、予め水で湿らせたフロートミニ用苗床スポンジ（径5.1cm）に挟み、径4cmの穴を有する本実施形態の水耕栽培装置に設置した。また、同苗の基部を予め水で湿らせたフロートミニ用苗床スポンジ（径5.1cm）に挟み、その周りを予め水で湿らせたアクアサプライヤｆマットSR180（幅12.5cm×17.5cmで円筒型に成型）で包み、径4cmの穴を有する実施形態に係る水耕栽培装置（養液槽の外寸cm：縦68.4×横42.3×高さ16、養液面が高い状態に相当）に設置した。肥料養液（大塚ハウス1号6g+大塚ハウス2号4g/8L：標準濃度の50%）をタンクに入れ、水面の高さを苗床スポンジがある水耕栽培装置の上面から約5cm下（または、苗の基部から約10cm下）に保ちながら水耕栽培を行った。
【００９０】
図９（ａ）、（ｂ）は、水耕栽培を開始してから１週間後、５週間後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。同図に示すように、支持体を使用していない水耕栽培装置を用いても、カンゾウ属植物株を栽培することができた。
【００９１】
次に、水耕栽培装置を用いて水耕栽培開始２５〜７８日後に、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１、ＧｕＩＶ２株の地上茎を切除して植物体を穴から抜き取り、苗床スポンジとアクアサプライヤｆマットSR180を取り除いて根の最大根幅を計測した。
【００９２】
図１０（ａ）、（ｂ）は、水耕栽培を開始してから７１日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。同図に示すように、各株の根の気相部分（養液面より上の部分）が肥大し、細根（養液面より下の部分）が発達した。
【００９３】
次に、各株の細根を切除して、再び苗の基部を予め水で湿らせたフロートミニ用苗床スポンジ（径5.1cm）に挟み、その周りを予め水で湿らせたアクアサプライヤｆマットSR180（幅12.5cm×30cmの上下2ヶ所をホッチキスでとめ、円筒型に成型）で包み、径4cmの穴を有する本実施形態の水耕栽培装置（養液槽の外寸cm：縦55.1×横39.9×高さ30.7、養液面が低い状態に相当）に設置した。養液槽の水面の高さを、水耕栽培装置の下面から5〜15cm（または、苗の基部から15〜25cm）を維持するように肥料養液（大塚ハウス1号6g+大塚ハウス2号4g/8L：標準濃度の50%）を供給しながら、グロースチャンバー室（25℃、16時間明期、相対湿度60%）で、さらに水耕栽培を行った。水耕栽培５３〜６６日後（はじめの水耕栽培から９１〜１４２日後）に植物体の地下部を収穫し、根の生育、収量及び二次代謝物含量の調査を行った。
【００９４】
図１１（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る水耕栽培装置（養液面が低い状態に相当）に移植した直後、移植してから１３日後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ２株を示す図である。また、図１２（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る水耕栽培装置を用いて水耕栽培を開始してから１３７日後（養液面が低い状態の装置に移植してから６６日後）のＧｕ＃１１株、１４２日後（養液面が低い状態の装置に移植してから６６日後）のＧｕＩＶ２株を示す図である。また、図１３は、水耕栽培を行ったＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の植物体において、根の収量、グリチルリチン酸収量及び二次代謝物含量を測定した結果を示す図である。また、表２は、実施形態に係る水耕栽培装置を用いて水耕栽培を開始してから１３７〜１４２日後（養液面が低い状態の装置に移植してから６４〜６６日後）のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株の生育結果である。
【表２】
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【００９５】
図１１（ａ）、図１１（ｂ）、図１２（ａ）、図１２（ｂ）、表２に示すように、Ｇｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株、ＧｕＩＶ２株は、支持体を使用していない水耕栽培装置を用いても生育し、すべての株で根の肥大が認められた。特にＧｕ＃１１株は、最大根幅が1cm以上であり、径2mm以上の根の長さも最大であった。また、図１３に示すように、水耕栽培後のＧｕ＃１１株、ＧｕＩＶ１株及びＧｕＩＶ２株の根（径2mm以上）のグリチルリチン酸含量は、Ｇｕ＃１１株：0.83%、ＧｕＩＶ１株：1.26%、ＧｕＩＶ２株：1.05%と高く、他の二次代謝物も多く生産されていた。
【００９６】
以上の結果から、支持体を使用していない水耕栽培装置を用いても、カンゾウ属植物を効率的に栽培でき、栽培したカンゾウ属植物の根部からグリチルリチン酸を含む二次代謝物を効率的に生産できることが明らかとなった。また、水耕栽培装置において支持体を使用していないため、より簡便で、低コストで、単位面積あたりの栽培株数の増加が可能である。また、配列表の配列番号１〜９のいずれかの配列を有するカンゾウ属植物は、水耕栽培でも効率的に栽培が可能である。
【符号の説明】
【００９７】
１００  水耕栽培装置
１１０  養液槽
１２０  上板部
１２１  穴
１３０  筒状部
１４０  支持部
１５０  養液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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