(57)【要約】【課題】検体中に、細菌や、酵母が混入していた場合に、それらを同一培地中、同一時間の培養で共に検出可能にまで培養可能な、酵母・細菌共通培養方法およびこれに用いる酵母・細菌共通培養培地を提供すること。【解決手段】細菌培養用培地を用い、細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件下で細菌および酵母を含有する可能性のある検体を培養する酵母・細菌共通培養方法並びに当該方法による培養物中から、細菌および酵母をそれぞれ検出する検体中の細菌および酵母の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌培養用培地を用い、細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件下で、細菌および酵母を含有する可能性のある検体を培養することを特徴とする酵母・細菌共通培養方法。
【請求項２】
細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件での培養が、細菌用培養培地のｐＨを、５〜６.５、培養温度を２０〜３０℃とする培養である請求項１記載の酵母・細菌共通培養方法。
【請求項３】
細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件での培養が、細菌用培養培地に１〜８ｇ／Ｌとなる量の、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロースおよびデキストリンから選ばれる糖成分を追加で添加した培地を使用し、ｐＨを、５〜６.８、培養温度を２０〜３０℃とする培養である請求項１記載の酵母・細菌共通培養方法。
【請求項４】
細胞培養用培地が、レシチンおよび非イオン性界面活性剤が加えられたトリプトンソイ培地である請求項１ないし３の何れかの項記載の酵母・細菌共通培養方法。
【請求項５】
細菌培養用培地を用い、細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件下で細菌および酵母を含有する可能性のある検体を培養した後、当該培養物中の細菌および酵母をそれぞれ検出することを特徴とする検体中の細菌および酵母の検出方法。
【請求項６】
細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件での培養が、細菌用培養培地のｐＨを、５〜６.５、培養温度を２０〜３０℃とする培養である請求項５記載の検体中の細菌および酵母の検出方法。
【請求項７】
細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件での培養が、細菌用培養培地に１〜８ｇ／Ｌの、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロースおよびデキストリンから選ばれる糖成分を追加で添加した培地を使用し、ｐＨを、５〜６.８、培養温度を２０〜３０℃とする培養である請求項５記載の検体中の細菌および酵母の検出方法。
【請求項８】
細胞培養用培地が、レシチンおよび非イオン性界面活性剤が加えられたトリプトンソイ培地である請求項５ないし７の何れかの項記載の検体中の細菌および酵母の検出方法。
【請求項９】
検体が、防腐剤あるいは抗菌剤を含むものである請求項５ないし８の何れかの項記載の検体中の細菌および酵母の検出方法。
【請求項１０】
レシチンおよび非イオン性界面活性剤が加えられたとリプトンソイ培地に、更に酸性剤または緩衝剤を加え、そのｐＨを５ないし６.５としてなることを特徴とする酵母・細菌共通培養培地。
【請求項１１】
請求項１０記載の酵母・細菌共通培養培地に、追加糖成分として、１ないし８ｇ／Ｌとなる量の、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロースおよびデキストリンよりなる群から選ばれる糖成分を添加してなる、酵母・細菌共通培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母と細菌を同一培地中で増殖させることのできる培養方法に関し、更に詳細には、医薬品・化粧品等の酵母、細菌が存在することが問題となる検体について、これらの存在が極めて少ないか、あるいは存在しないことを保証するための試験における、酵母と細菌を同一培地中で一緒に増殖可能な培養方法およびそのために使用される共通培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、真核生物であるのに対し、細菌は原核生物であるため、共に培地中での培養は可能であっても、従来、そのために使用する培地としては別のものが使用されていた。
【０００３】
例えば、日本薬局方に収載されている微生物限度試験は、医薬品・化粧品等の微生物汚染の有無を確認する検査法であり、製品の出荷判定として用いられることが多いが、近年の改訂（非特許文献１）により、検査対象菌株として、従来の細菌の他、酵母であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が追加された。
【０００４】
そしてこの結果、同一検体について、酵母用培地と細菌用培地で別個にこれらを増殖させるための培養を行い、その後、各検査対象菌株の存在を個別に検出、確認することが実施されている。そして、この従来法では、原核生物であり、増殖速度の速い細菌では、増殖培養の時間が比較的短くてすむため、最終的な検査、判定までの時間は、２日程度と短いのに対し、真核生物に属する酵母であるカンジダ・アルビカンスは、増殖培養時間が長いため、判定終了までには、５日間程度かかっていた。
【０００５】
このように、同じ検体の判定であっても、細菌用と酵母用の別個の培地による培養が必要であるため、培養の終了時間が異なり、検査の手続が煩雑になると共に、最終的に検査が終了し、製品の出荷が行えるようになるまでに時間がかかるという問題があった。
【０００６】
このようなことから、酵母と細菌を同一培地中、同一時間で培養した培養物中から、次の微生物存在確認試験に使用できる試料を得ることが求められるが、現在に至るまで、そのような条件を満たすような培地は提供されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】２００９年第１５改正日本薬局方第一追補
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記実情に鑑みなされたものであり、仮に細菌・酵母が検体中に混入していた場合に、それらを共に検出可能にまで培養可能な、酵母・細菌共通培養方法およびこれに用いる酵母・細菌共通培養培地を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、微生物の培養方法およびそのための培地に関し鋭意検討を行った。そしてその結果、細菌用培地において、細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させることにより、同一の培地中で検体中の酵母と細菌を共に検出可能な数まで増殖でき、これらが検出可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、細菌培養用培地を用い、細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件下で、細菌および酵母を含有する可能性のある検体を培養することを特徴とする酵母・細菌共通培養方法である。
【００１１】
また本発明は、細菌培養用培地を用い、細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件下で検体を培養した後、当該培養物中の細菌および酵母をそれぞれ検出することを特徴とする検体中の細菌および酵母の検出方法である。
【００１２】
更に本発明は、レシチンおよび非イオン性界面活性剤が加えられたトリプトンソイ培地に、更に酸性成分または緩衝剤を加え、そのｐＨを、５ないし６.５としてなることを特徴とする酵母・細菌共通培養培地である。
【００１３】
更にまた本発明は、上記酵母・細菌共通培養培地に、追加糖成分として１〜８ｇ／Ｌとなる量の、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロースおよびデキストリンから選ばれる糖成分を添加してなる、酵母・細菌共通培養培地である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明方法によれば、検体中に存在する可能性のある細菌と酵母とを同時に培養、増殖させることができるので、これらを別個の培地で、しかも異なる時間培養していた従来法と比べ、検査手続を簡素化することができる。また、酵母増殖のための培養が短縮するため、検査に要する全体の時間も短縮し、製品の検査、出荷のための時間も短くすることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、主に日本薬局方に収載されている微生物限度試験の改良に関するものであり、医薬品や化粧品（以下、「製品」ということがある）中に存在する可能性のある細菌および酵母（以下、「検査微生物」と総称することがある）を増殖するための培養工程において、同一の培養培地を用い、同一時間で検査微生物の培養をおこなうものである。
【００１６】
本発明方法では、基本的には細菌用培養培地を用いるが、これを細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖が向上する条件で使用するか、当該培地を細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖が向上するように変性するか、あるいはこの双方の技術を採用する。
【００１７】
すなわち、従来提供されていた細菌培養用培地は、細菌の速やかな増殖を追求するものであったため、この中で細菌と共に酵母を培養した場合、酵母の培養が遅れ、その同定に必要な程度にまで増殖させることはできない。しかし、単に培養期間を延長すると、培養液中の栄養素が枯渇してしまうため、酵母が十分に増殖ができなくなり、また、細菌は増殖しすぎて増殖曲線上の死滅期に入ってしまい、いずれも正しく同定できないことがある。一方、微生物限度試験は製品検査に一般的に行われる試験方法であるが、製品製造日程の都合に応じて長時間の培養となる場合があるため、培養時間が長期に亘っても増殖曲線上の対数増殖期を維持することが必要である。そこで本発明では、培養終了時に細菌も酵母も、増殖曲線上で同じ対数増殖期に存在し、かつ酵母を同定可能な程度にまで増殖させるために、培地中での細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を高めるものである。
【００１８】
いいかえると、本発明の細菌の増殖を抑制し、かつ酵母の増殖を向上させる条件下で、細菌および酵母を含有する可能性のある検体を培養するとは、培養終了時に細菌も酵母も、増殖曲線上で同じ対数増殖期に存在し、かつ酵母を同定可能な程度にまで増殖させることを意味する。
【００１９】
具体的に、本発明の培養方法を実施するには、次の手段の何れかを採用できる。
（１）細菌用培養培地のｐＨを、５〜６.５程度、好ましくは、５〜６に調整し、温度を２０〜３０℃程度、好ましくは２０〜２５℃として培養する。
（２）細菌用培養培地に、追加糖成分として１〜８ｇ／Ｌの、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロースおよびデキストリンから選ばれる糖成分を添加した培地を使用し、ｐＨを、５〜６.８程度、好ましくは、５〜６.５、温度を２０〜３０℃程度、好ましくは２０〜２５℃として培養する。
【００２０】
本発明において使用される培地は、日本薬局方に収載されている微生物限度試験で用いられる細菌用培養培地であれば特段制約はないが、好ましいものとしては、レシチンおよび非イオン性界面活性剤が加えられたトリプトンソイ培地（ＳＣＤＬＰ培地）が挙げられる。
【００２１】
このＳＣＤＬＰ培地は、ペプトン ２０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４２.５、グルコース ２.５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌの組成に、微生物の生長に影響を与えない量のレシチンおよび界面活性剤（ポリソルベート８０等）を添加したもので、その使用時のｐＨは、７.１〜７.５である。この培地は、含まれているレシチンと界面活性剤（ポリソルベート８０）により、医薬品や化粧品中に含まれる各種防腐剤や殺菌剤例えば四級アンモニウム化合物やパラオキシ安息香酸エステル類、ビスービグアニド類などを不活性化させるため、これら製品中の細菌や酵母を防腐剤等の影響なく培養することができ、正確にそれら菌を同定できる。なお、市販されているものとしては、「ＳＣＤＬＰブイヨン培地‘栄研’」（栄研化学株式会社製；レシチン１ｇ／Ｌ、ポリソルベ−ト８０  ７ｇ／Ｌ含有）が例示できる。
【００２２】
本発明方法の第一の態様は、上記のように細菌用培養培地のｐＨを、５〜６.５程度、好ましくは、５〜６に調整し、温度を２０〜３０℃程度、好ましくは２０〜２５℃として培養するというものであるが、このｐＨは、酵母（真菌）についての至適ｐＨに近いものである。同様に、上記温度も酵母の至適温度に近い温度である。
【００２３】
このように、培地組成自体は、細菌用のものを使用しながらも、培養条件を酵母（真菌）に適したものとすることで、細菌と酵母の同時培養が可能となるのである。
【００２４】
なお、本発明の第一の態様の実施に有利に利用できる培地としては、ＳＣＤＬＰ培地のような細菌用培養培地組成中に、そのｐＨを、５〜６.５程度とすることのできる塩酸、酢酸、乳酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素一カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素一ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウムなどの公知の無機酸あるいは有機酸等の酸性剤または緩衝剤を配合したものを使用すればよい。この中で、特に塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素一カリウムが好適に使用できる。
【００２５】
以上説明した、この方法では、製品から採取した検体を約２４〜９６時間培養することで、仮にこの製品中に検査微生物が存在した場合、十分に検出可能なレベルまで増殖させることができる。
【００２６】
本発明方法の第二の態様は、第一の態様で使用する細菌用培養培地に、更に追加成分として糖を加えるというものである。この培養培地に追加される糖成分としては、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、デキストリンが挙げられ、その量は、培養時の培地中で１〜８ｇ／Ｌとなる量である。このように糖が追加された培養培地では、酵母がこの糖を資化することでその増殖が盛んになる。
【００２７】
なお、この第二の態様では、追加等のみならず、更に酵母に好ましい条件で培養することもできる。具体的には、ｐＨを、５〜６.８程度、好ましくは、５〜６.５、温度を２０〜３０℃程度、好ましくは２０〜２５℃として培養することができる。
【００２８】
この第二の態様を実施するために使用される培地としては、細菌培養培地中に、１〜８ｇ／Ｌとなる量のグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロースまたはデキストリンを配合した培地が挙げられる。また、より好ましい結果を得るには、更にこの培地中に、そのｐＨを、５〜６.８程度とすることのできる公知の酸性剤や、緩衝剤を加えたものを挙げることができる。
【００２９】
この第二の態様でも、約２４〜９６時間培養することで、仮に製品中に検査微生物が存在した場合、十分に検出可能なレベルまで増殖させることができる。
【００３０】
上記本発明の酵母・細菌共通培養方法で培養された、検査微生物の検出方法について説明する。この検出方法は、従来公知の検査微生物を、医薬品、化粧品についての日本薬局方による微生物限度試験では、細菌である緑膿菌、黄色ブドウ状球菌、大腸菌と、酵母であるカンジダ・アルビカンスを、それぞれの検出に適した培地（以下、「選択培地」という）を用い、これら選択培地に培養物の所定量を個別に塗布、培養し、一定時間後に選択培地に検査微生物の特徴的コロニーが認められるか否かを判定する。
【００３１】
そして、この結果、特徴的コロニーが検出されなかった場合、製品中への微生物混入がないと判断され、製品として出荷が可能となるのである。
【００３２】
この検査微生物の検出方法は、上記医薬品や化粧品はもとより、それ以外の防腐剤や抗菌剤を含む製品について適用でき、製品の安全性を保証することができるものである。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３４】
実  施  例  １
以下に示す試験培地を使用し、種々の条件で、細菌・酵母複合菌試料を培養して、細菌と酵母がそれぞれ検出可能な程度まで増殖するかどうかを確認した。増殖は、細菌および酵母について、試験培地と同じ培地を用い、ｐＨ６.８、温度３２.５℃で培養（標準培養）した場合と比較し、下記増殖スコアを求め、このスコアを総合した増殖性判定基準により評価した。また、増殖時間は、酵母（カンジダ・アルビカンス）が、初期菌数（１〜９ＣＦＵ／ｍＬ）から１０３ＣＦＵ／ｍＬにまでかかった時間により下記増殖時間判定基準で評価した。この結果を表１に示す。
【００３５】
［  試験培地組成  ］
ペプトン                    ２０ｇ／Ｌ
リン酸一水素二カリウム      ２.５ｇ／Ｌ
グルコース                  ２.５ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム                ５ｇ／Ｌ
レシチン                      １ｇ／Ｌ
ポリソルベート８０            ７ｇ／Ｌ
脱イオン水                    １０００  ｍＬ
【００３６】
［  細菌・酵母複合菌試料  ］
緑膿菌として、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  １３２７５株、黄色ブドウ球菌として、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｙｌｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＩＦＯ  １３２７６株、大腸菌として、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＩＦＯ  ３９７２株、酵母として、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＩＦＯ１５９４株を使用した。これらを、試験培地中に、それぞれ、１〜９ＣＦＵ／ｍＬ、１〜９ＣＦＵ／ｍＬ、１〜９ＣＦＵ／ｍＬ、１〜９ＣＦＵ／ｍＬとなるように添加し、混合して細菌・酵母複合菌試料とした。
【００３７】
［  増殖スコア  ］
酵母（カンジダ・アルビカンス）
評  点    ：    内    容
３      ：  標準培養に比べ、培養菌数が２桁（１００倍）以上多い。
２      ：  標準培養に比べ、培養菌数が１桁（１０倍）以上、２桁（１００倍）
未満である。
１      ：  標準培養に比べ、培養菌数がほぼ１桁（５〜１０倍）多い。
０      ：  標準培養とほぼ同じ培養菌数（０.７〜５倍）である。
−１      ：  標準培養に比べ、培養菌数がほぼ１桁（０.７倍）少ない。
−２      ：  培養菌が検出されない。
注）上記酵母の菌数は、クロモアガーカンジダ寒天培地（ＣＨＲＯＭａｇａｒ社製）を用い、混釈培養後、検出した緑青色コロニーをカンジダ・アルビカンスとして計測した。
【００３８】
細  菌（緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌）
評  点    ：    内    容
３      ：  細菌数が１０６ＣＦＵ／ｍＬ以上である。
２      ：  細菌数が１０５ＣＦＵ／ｍＬ以上である。
１      ：  細菌数が１０４ＣＦＵ／ｍＬ以上である。
０      ：  細菌数が１０３ＣＦＵ／ｍＬ以上である。
−１      ：  細菌数が１０２ＣＦＵ／ｍＬ以上である。
−２      ：  細菌数が１０２ＣＦＵ／ｍＬ以下である。
注）上記細菌についての数は、緑膿菌はＮＡＣ寒天培地（栄研化学株式会社製）、黄色ブドウ球菌はＭＳ寒天培地（栄研化学株式会社製）、大腸菌はＥＭＢ寒天培地（栄研化学株式会社製）をそれぞれ選択培地として用い、混釈培養後、ＮＡＣ寒天培地では緑色〜青色、ＭＳ寒天培地では黄色、ＥＭＢ寒天培地では黒色のコロニーを、各々の対象細菌数として計測した。緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌の菌数のうち、最も菌数が少ない菌種の評点を、その培養条件における評点とした。
【００３９】
［  増殖性判定基準  ］
評  価    ：    内    容
◎      ：  細菌の増殖スコアが０〜３で、酵母の増殖スコアが２〜３
○      ：  細菌の増殖スコアが０〜３で、酵母の増殖スコアが１
△      ：  細菌の増殖スコアが０〜３で、酵母の増殖スコアが０
×      ：  細菌の増殖スコアおよび酵母の増殖スコアの少なくとも一方が、−２〜
−１
【００４０】
［  増殖時間判定基準  ］
評  価    ：    内    容
◎      ：  ２４時間以内
○      ：  ２４〜４８時間
△      ：  ４８〜９６時間
×      ：  ９６時間以上
注）上記評価の「×」には、一旦増殖したが、その後９６時間以内に減少が見
られた場合も含む。
【００４１】
［  結  果  ］
【表１】
2014171443.tif 000002
【００４２】
この結果、標準培養条件から温度を下げただけでも「菌増殖性」及び「増殖時間」の向上が認められたが、更にｐＨを低く調整した場合に顕著な「菌増殖性」及び「増殖時間」改善効果が得られ、培養温度２０〜３０℃、ｐＨ５.０〜６.５の組み合わせ範囲内であれば細菌と酵母の増殖が良好であることが明らかとなった。
【００４３】
実  施  例  ２
表２に示す、所定量のグルコースを更に加えた試験培地を用い、同表に示す条件下で、実施例１で使用した細菌・酵母複合菌試料を培養し、細菌と酵母がそれぞれ検出可能な程度まで増殖するかどうかを確認した。増殖に関する確認は、実施例１に記載の方法で行った。この結果も表２に示す。
【００４４】
［  結  果  ］
【表２】
2014171443.tif 000003
【００４５】
この結果から、グルコース追加添加により「菌増殖性」及び「増殖時間」が向上することが明らかとなった。その効果は標準培養条件でも一部傾向が認められたが、培養温度を２０〜３２.５℃、ｐＨを５.０〜６.５とした場合に、より顕著な効果が得られた。なお、表１の結果でもｐＨ５.０かつ温度２５℃、及びｐＨ６.０かつ温度２５℃で良好な「菌増殖性」及び「増殖時間」が示されているが、更にグルコース１〜７.５ｇ／Ｌを追加添加した表２の方が、より「菌増殖性」及び「増殖時間」に優れていた。しかし、グルコース追加添加量が１０ｇ／Ｌになると逆に酵母の増殖に悪影響が現れ、菌数が減少に転じて「増殖時間」が×となった。
【００４６】
実  施  例  ３
表３に示す種類および量の各種糖類を実施例１の試験培地に加え、これを用いて、同表に示す条件下で、実施例１で使用した細菌・酵母複合菌試料を培養し、細菌と酵母がそれぞれ検出可能な程度まで増殖するかどうかを確認した。増殖に関する確認は、実施例１に記載の方法で行った。この結果も表３に示す。
【００４７】
［  結  果  ］
【表３】
2014171443.tif 000004
【００４８】
この結果から、培地に新たな糖成分としてマルトース、（Ｄ）−ガラクトース、（Ｄ）−フルクトース、スクロース、デキストリンを添加した場合にも、グルコース追加添加と同様に、「菌増殖性」及び「増殖時間」改善効果があることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明方法によれば、検体中に存在する可能性のある細菌と酵母とを同時に培養、増殖させることができ、別個の培地で、異なる時間培養していた従来法と比べ、検査手続を簡素化することができる。また、酵母増殖のための培養が短縮するため、検査に要する全体の時間も短縮し、製品の検査、出荷のための時間も短くすることができる。
【００５０】
従って本発明方法は、医薬品・化粧品等の微生物汚染の有無を簡便かつ早期に確認することが可能であり、これら製品の安全性確保のために有用である。