(57)【要約】      （修正有）【課題】単離されたモノクローナル抗体、特に高親和性にてGlypican-3に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体及びGlypican-3抗体を含む医薬組成物の提供。【解決手段】Glypican-3抗体を発現するための、Glypican-3抗体をコードしている核酸分子、発現ベクター、宿主細胞と抗Glypican-3抗体の製造方法。その免疫複合体、二重特異的分子およびGlypican-3抗体を含む医薬組成物、Glypican-3の検出方法、並びに肝細胞癌などの種々のGlypican-3に関連する症状を処置するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が1x10-7M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ヒト抗体である、請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項３】
キメラまたはヒト化抗体である、請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項４】
IgG1またはIgG4アイソタイプの完全長抗体である、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項５】
抗体断片または単鎖抗体である、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項６】
抗体が5x10-8M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項７】
抗体が5x10-9M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項８】
ヒトGlypican-3が配列番号 36[ジーンバンク・アクセッション番号NM_004484]として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項９】
抗体がHep-3BまたはHep-G2腫瘍細胞に実質的に結合する、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
Glypican-3への結合について参照抗体と交差競合し、KD1x10-7M以下にてヒトGlypican-3に結合する、
単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
参照抗体が、
a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項10記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
参照抗体が、
a)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項10記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
参照抗体が
a)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項10記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
ヒトVH5-51遺伝子の産物であるか、またはヒトVH5-51遺伝子から得られる重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分、
ここで、該抗体がGlypican-3に特異的に結合する。
【請求項１５】
ヒトVKA27遺伝子産物であるか、またはヒトVKA27遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分、
ここで、該抗体がGlypican-3に特異的に結合する。
【請求項１６】
ヒトVH5-51遺伝子の産物であるか、またはヒトVH5-51遺伝子から得られる重鎖可変領域をさらに含む、請求項15記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１７】
a)配列番号 1を含む重鎖可変領域CDR1;
b)配列番号 4を含む重鎖可変領域CDR2;
c)配列番号 7を含む重鎖可変領域CDR3;
d)配列番号 10を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)配列番号 13を含む軽鎖可変領域CDR2；および
f)配列番号 16を含む軽鎖可変領域CDR3、
を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項１８】
a)配列番号 2を含む重鎖可変領域CDR1;
b)配列番号 5を含む重鎖可変領域CDR2;
c)配列番号 8を含む重鎖可変領域CDR3;
d)配列番号 11を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)配列番号 14を含む軽鎖可変領域CDR2；および
f)配列番号 17を含む軽鎖可変領域CDR3、
を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項１９】
a)配列番号 3を含む重鎖可変領域CDR1;
b)配列番号 6を含む重鎖可変領域CDR2;
c)配列番号 9を含む重鎖可変領域CDR3;
d)配列番号 12を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)配列番号 15を含む軽鎖可変領域CDR2；および
f)配列番号 18を含む軽鎖可変領域CDR3、
を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項２０】
a)配列番号 19、20、および21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
b)配列番号 22、23、および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分、
ここで、該抗体がGlypican-3に特異的に結合する。
【請求項２１】
a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２２】
a)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域：および
b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
a)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分、および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２５】
治療剤と結合された、請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
【請求項２６】
請求項25記載の免疫複合体および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２７】
治療剤が細胞毒素である、請求項25記載の免疫複合体。
【請求項２８】
請求項27記載の免疫複合体および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２９】
治療剤が放射性同位体である、請求項25記載の免疫複合体。
【請求項３０】
請求項29記載の免疫複合体および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項３１】
請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分の重鎖をコードしている、単離された核酸分子。
【請求項３２】
単離された核酸分子が、配列番号 25、26、および27からなるリストから選択されたV領域を含む、請求項31記載の単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分の軽鎖をコードしている単離された核酸分子。
【請求項３４】
単離された核酸分子が、配列番号 28、29、および30からなるリストから選択されたV領域を含む、請求項33記載の単離された核酸分子。
【請求項３５】
請求項31から34のいずれか一項記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項３６】
請求項35記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３７】
a)請求項1記載の抗体をコードしている１以上の核酸分子を含む宿主細胞を得ること、
b)宿主細胞培養において宿主細胞を増殖させること、
c)１以上の核酸分子が発現する宿主細胞培養条件を提供すること、および
d)宿主細胞または宿主細胞培養物から抗体を回収すること、
を含む、抗Glypican-3抗体を製造する方法。
【請求項３８】
細胞を、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、Glypican-3を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３９】
腫瘍細胞が肝臓組織から得られる、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
抗体、またはその抗原結合部分が免疫複合体である、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫複合体が治療剤に結合されている、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
治療剤が細胞毒素である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
治療剤が放射性同位体である、請求項41記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の背景）
Glypican-3は、グリコシル-ホスファチジルイノシトール-固定化ヘパラン硫酸のプロテオグリカンのglypican ファミリーに属する腫瘍胎児抗原である。Glypicanは、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンと呼ばれるコンプレックス多糖鎖に共有結合することを特徴とする。Glypicanは、細胞-細胞外基質インターフェースにて細胞シグナル伝達に関与する[Sasisekharan et al., Nature Reviews|Cancer, Volume 2 (2002).]。現在までに、6つの異なるメンバーのヒトglypicanファミリーが同定されている。細胞膜結合Glypican-3は、１以上のジスルフィド結合により結合された2つのサブユニットから構成される。
【背景技術】
【０００２】
Glypican-3は、成長中の胎児の肝臓および胎盤において発現し、正常な成人組織においては下方調節されるかまたは沈黙の状態にある。Glypican-3 遺伝子の変異および枯渇は、ヒトのシンプソン・ゴラビ・ベーメル(Simpson-Golabi-Behmel)またはシンプソン(Simpson)異形性症候群に関与する。Glypican-3は、様々な癌で発現され、特に肝細胞癌(「HCC」)、黒色腫、ウィルムス腫瘍、および肝芽腫で発現される[Jakubovic and Jothy; Ex. Mol. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005).]。
【０００３】
HCCは、世界中で癌関連死の第三番目の腫瘍病因である。各年につき、HCCは、約百万人の死亡者数を占めている[Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005).] 。
肝臓の硬変をもたらす、ウイルス性B型肝炎、ウイルス性C型肝炎、および慢性的な重度の飲酒は、依然としてHCCの最も一般的な病因である。その発症率は、ウイルス性C型肝炎感染の蔓延のために米国で劇的に増加しており、次の20年の間に増加すると考えられている。HCCは、まず肝臓移植または腫瘍切除により処置される。患者の予後は、潜在的な肝臓機能および腫瘍を診断する時期の双方に依存している[Parikh and Hyman, Am J Med. 120(3):194-202 (2007).]。効果的なHCC処置方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（本発明の要約）
本発明は、Glypican-3に結合して、多くの所望の特性を示す単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供するものである。これらの特性には、ヒトGlypican-3への高親和性結合が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関するものであり、ここで該抗体は、
(a) 1x10-7 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する；
(b) Glypican-3により形質転換したヒトCHO細胞に結合する。
【０００６】
好ましくは、抗体はヒト抗体であるが、別の実施態様において、抗体はネズミ抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。
【０００７】
一実施態様において、抗体は、5 x 10-8 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合するか、2 x 10-8 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合するか、1 x 10-8 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合するか、5x10-9 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合するか、4x10-9 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合するか、3x10-9M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合するか、または2 x 10-9 M以下のKDにてヒト Glypican-3に結合する。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供するものであって、ここで該抗体は、
(a)配列番号 19、20、および21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 22、23、および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む参照抗体と、Glypican-3への結合に対して交差競合する。
【０００９】
様々な実施態様において、
参照抗体には、
(a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれるか、または
参照抗体には、
(a)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれるか、または
参照抗体には、
(a)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、ヒトVH5-51遺伝子の産物であるか、またはヒトVH5-51遺伝子から得られる重鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供するものであって、ここで該抗体は、Glypican-3に特異的に結合する。本発明は、ヒトVKA27の遺伝子の産物であるか、またはヒトVKA27の遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分をも提供するものであって、ここで該抗体は、Glypican-3に特異的に結合する。
【００１１】
好ましい実施態様において、本発明は、
(a)ヒトVH 5-51遺伝子の重鎖可変領域；および
(b)ヒトVK A27遺伝子の軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供するものであって、ここで該抗体は特異的にGlypican-3に結合する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、
CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域；および
CDR1、CDR2、およびCDR3 配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供するものであって、
ここで、該抗体は
(a) 重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号 7、8、および9のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含み；
(b)軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号 16、17、および18のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含み；
(c)抗体は1x10-7 M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する；または
(d)Glypican-3により形質転換されたヒトCHO細胞に結合する。
【００１３】
好ましくは、該重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号 4、5、および6のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変；ならびに該軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号 13、14、および15のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含んでいる。好ましくは、該重鎖可変領域CDR1配列は、配列番号 1、2、および3のアミノ酸配列からなる群アミノ酸配列、およびその保存的改変を含み；ならびに該軽鎖可変領域CDR1配列は、配列番号 10、11、および12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む。
【００１４】
好ましい組合せは、次のものを含む:
(a)配列番号 1を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号 4を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号 7を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号 10を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号 13を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f)配列番号 16を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１５】
別の好ましい組合せは、次のものを含む：
(a)配列番号 2を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号 5を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号 8を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号 11を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号 14を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f)配列番号 17を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１６】
別の好ましい組合せは、次のものを含む：
(a)配列番号 3を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号 6を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号 9を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号 12を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号 15を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f)配列番号 18を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００１７】
本発明の好ましい別の抗体、またはその抗原結合部分には次のものが含まれる；
(a)配列番号 19、20および21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；および
(b)配列番号 22、23および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域;
ここで、該抗体はGlypican-3に特異的に結合する。
【００１８】
好ましい組合せには、次のものを含む：
(a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００１９】
別の好ましい組合せには、次のものを含む：
(a)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、；および
(b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２０】
別の好ましい組合せには、次のものを含む：
(a)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００２１】
本発明の別の態様において、Glypican-3への結合について、前記抗体のいずれかに記載の抗体と競合する抗体またはその抗原結合部分が提供される。
【００２２】
本発明の抗体は、例えば完全長抗体、例えばIgG1またはIgG4アイソタイプの完全長抗体であってもよい。あるいは、該抗体は、抗体断片、例えばFab、Fab'またはFab'2断片、または単鎖抗体であり得る。
【００２３】
本発明は、治療剤、例えば細胞毒素または放射性同位体に結合した本発明の抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫複合体もまた提供する。本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分以外の異なる結合特異性を有する第二の機能部分と連結した、本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異的分子を提供する。
【００２４】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分、本発明の免疫複合体または二重特異的分子、および医薬上許容される担体を含む組成物も提供する。
【００２５】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分をコードしている核酸分子は、かかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞と同様に本発明に包含される。
【００２６】
本発明は、Glypican-3を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。該方法は、該細胞と、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の抗Glypican-3抗体、またはその抗原結合部分とを接触させることを含む。好ましい実施態様において、該腫瘍細胞は、肝臓組織から得られる。さらに、抗体、またはその抗原結合部分は免疫複合体であってもよい。本発明の免疫複合体は、治療剤、例えば細胞毒素または放射性同位体であってもよい。
【００２７】
本発明の他の態様および利点は、限定として解釈されるべきではない下記詳細な説明および実施例から明白である。本明細書により引用されたあらゆる文献の内容、ジーンバンク・エントリー(Genbank entries)、特許および公開特許は出典明示により本明細書の一部とする。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、高親和性にてGlypican-3に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。特定の態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞系列配列から得られる、および／または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの特定の構造的特徴を含む。本発明は、単離された抗体、かかる抗体の作製方法、かかる抗体を含む免疫複合体および二重特異的分子、ならびに本発明の抗体、免疫複合体または二重特異的分子を含有する医薬組成物を提供するものである。また、本発明は、該抗体を用いる方法、例えばGlypican-3を検出する方法、ならびにGlypican-3の発現に関連のある疾患、例えばGlypican-3を発現する肝臓細胞悪性腫瘍を処置する方法にも関する。従って、本発明は、HCCなどの肝臓細胞悪性腫瘍を処置するために、本発明の抗Glypican-3抗体を使用する方法も提供する。
【００２９】
本発明がより容易に理解され得るように、具体的な用語を最初に定義する。さらなる定義については、詳細な説明を通して説明される。
【００３０】
用語「Glypican-3」「グリピカンプロテオグリカン3」、「GPC3」、「OTTHUMP00000062492」、「GTR2-2」、「SGB」、「DGSX」、「SDYS」、「SGBS」、「OCI-5」、および「SGBS1」は、互換的に使用され、およびヒトGlypican-3の変異体、アイソフォームおよび種ホモログを包含する。従って、この開示に関するヒト抗体は、特定の場合において、ヒト以外の種由来のGlypican-3と交差反応し得る。特定の実施態様において、該抗体は、１以上のヒトGlypican-3 タンパク質について完全に特異的であり得、また非ヒト交差反応性に関する種または他のタイプを提示できない。例示的なヒトGlypican-3の完全なアミノ酸配列は、Genbank/NCBIアクセッション番号NM_004484(配列番号 36)を有する。
【００３１】
「免疫応答」なる用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、および上記の細胞または肝臓によって産生された可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用を指し、それによって侵入した病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌様細胞、または自己免疫もしくは病的な炎症の場合、正常なヒト細胞もしくは組織の選択的な損傷、破壊、またはヒト体内からの排除が起こる作用を指す。
【００３２】
「シグナル伝達経路」なる用語は、細胞の一つの部分から細胞のもう一つの部分へのシグナルの伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関連を指す。本明細書において用いられるように、「細胞表面受容体」という句には、例えばシグナルを受けることができる、および細胞の細胞質膜を超えて、かかるシグナルを伝達することができる分子および分子の複合体が含まれる。本発明の「細胞表面受容体」の例は、Glypican-3 受容体である。
【００３３】
本明細書において参照される「抗体」なる用語は、抗体全体および任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）、またはその一本鎖が含まれる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって互いに結合した少なくとも二つの重鎖（H）および二つの軽鎖（L）を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は3つのドメインCH1、CH2、およびCH3を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は一つのドメインCLを含む。VHおよびVL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域が散在する相補性決定領域（CDR）と呼ばれる高度可変領域に関してさらに細分化される。それぞれのVHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRを含み、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順に整列する:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、多様な免疫系の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一の成分（C1q）を含む、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介する可能性がある。
【００３４】
本明細書において用いられるように、抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）は、抗原（例えば、Glypican-3）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行い得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合断片の例には、（i）Fab断片、すなわちVL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片；（ii) F(ab')2断片、すなわちヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合した二つのFab断片を含む二価の断
片；(iii) ヒンジ領域の一部を有する本質的にFabであるFab'断片（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993参照のこと）；(iv) VHおよびCH1 ドメインからなるFd断片；(v) 抗体の一つのアームのVLおよびVH ドメインからなるFv断片、(vi) VHドメインからなるdAb断片(Wardら(1989) Nature 341:544-546)；(vii) 単離された相補性決定領域(CDR)；および (viii)ナノボディ、すなわち単一の可変ドメインおよび二つの定常領域を含む重鎖可変領域が含まれる。さらに、Fv断片の二つのドメイン、VLおよびVHは、異なる遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、VLおよびVH領域の一対が一価の分子を形成する一つのタンパク質の鎖としてそれらを作製できるようにする合成リンカーによって結合させることができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えばBirdら (1988) Science 242:423-426；および Hustonら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。かかる一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれると意図される。これらの抗体断片は、当業者には既知の従来技術を用いて得られ、断片は無傷の抗体と同じように有用性に関してスクリーニングされる。
【００３５】
本明細書において用いられるように「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すと意図される（例えば、Glypican-3に特異的に結合する単離抗体は、Glypican-3以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、Glypican-3に特異的に結合する単離抗体は、他の種からのGlypican-3分子のような他の抗原に対して交差反応性を有する。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００３６】
本明細書で使用した「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについての単一の結合特異性および親和性を提示する。
【００３７】
本明細書で使用した「ヒト抗体」なる用語には、フレームワークおよびCDR領域の双方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する抗体が含まれると意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合には、該定常領域もまた同様に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、イン・ビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはイン・ビボで体細胞突然変異導入された変異）が含まれてもよい。しかしながら、本明細書で使用した「ヒト抗体」なる用語には、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列から得られるCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体は含まれないと意図される。
【００３８】
「ヒトモノクローナル抗体」なる用語は、フレームワークとCDR領域の双方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばヒト重鎖トランスジーンと軽鎖トランスジーンとを含むゲノムを有するトランスジェニックマウスから得たB細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマによって産生される。
【００３９】
本明細書で使用した「組換え型ヒト抗体」なる用語には、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離される全てのヒト抗体、例えば（a）ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックであるかまたは導入染色体性（transchromosomal）である動物（例えば、マウス）、もしくはそれらから調製されたハイブリドーマ（下記にてさらに記述する）から単離された抗体、(b) ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（transfectoma）から単離された抗体、(c) 組換え型複合ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および(d) ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体、が含まれる。かかる組換え型ヒト抗体は、フレームワークおよびCDR領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から得られる可変領域を有する。しかしながら、特定の態様において、かかる組換え型ヒト抗体ヒト抗体を、イン・ビトロ変異誘発（または、ヒトIg配列に関してトランスジェニックである動物を用いる場合には、イン・ビボ体細胞突然変異誘発）に供することができ、こうして該組換え型抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VHおよびVL配列に由来し、またそれに関連するものの、イン・ビボでヒト抗体生殖系列範囲内には天然で存在しない可能性がある配列となる。
【００４０】
本明細書において用いられるように「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、IgMまたはIgG1）を指す。
【００４１】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」なる句は、本明細書においては「抗原に特異的に結合する抗体」なる用語と互換的に用いられる。
【００４２】
「ヒト抗体誘導体」なる用語は、ヒト抗体の任意の改変型、例えば抗体ともう一つの物質または抗体との結合体を指す。
【００４３】
「ヒト化抗体」なる用語は、マウスなどのもう一種の哺乳動物種の生殖細胞系列から得られるCDR配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すと意図される。
さらなるフレームワーク領域の改変を該ヒトフレームワーク配列内で行ってもよい。
【００４４】
「キメラ抗体」なる用語は、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体から得られる抗体のような、可変領域配列が一つの種に由来し、定常領域配列が別の種から得られる抗体を指すと意図される。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「ヒトGlypican-3に特異的に結合する」抗体は、ヒトGlypican-3に対してKDが1 x 10-7 M以下にて、より好ましくは5 x 10-8 M以下、より好ましくは3 x 10-8 M以下、より好ましくは1 x 10-8 M以下、さらにより好ましくは5 x 10-9 M以下にて結合する抗体を指す。
【００４６】
本明細書において用いられるように、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」とは、該タンパク質または細胞に結合しないか、または高親和性にて結合しないこと、即ち、該タンパク質または細胞に対して、KDが1 x 10-6以上、より好ましくは1 x 10-5以上、より好ましくは1 x 10-4 以上、より好ましくは1 x 10-3 以上、さらにより好ましくは1 x 10-2 以上にて結合することを意味する。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「Kassoc」または「Ka」なる用語は、特定の抗体-抗原相互作用の会合速度を指し、また本明細書において用いられる用語「Kdis」または「Kd」なる用語は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指すと意図される。本明細書において用いられるように、「KD」なる用語は、Kaに対するKdの比（すなわちKd/Ka）から得られた解離定数を指すと意図され、モル濃度（M）として表記される。抗体のKD値は、当技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、好ましくはBiacore（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いて表面プラズモン共鳴を用いることによる。
【００４８】
本明細書において用いられるように、IgG抗体の「高親和性」抗体なる用語は、標的抗原に対してKDが 1 x 10-7 M以下、より好ましくは5 x 10-8 M以下、さらにより好ましくは1 x 10-8 M以下、さらにより好ましくは5 x 10-9 M以下 および さらにより好ましくは1 x 10-9 M以下を有する抗体を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに関して変化しうる。例えば、IgMアイソタイプに関する「高親和性」結合は、KDが10-6 M以下、より好ましくは10-7 M以下、さらにより好ましくは10-8 M以下を有する抗体を指す。
【００４９】
本明細書において用いられるように、「被験者」なる用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」なる用語には、全ての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類等のような哺乳類および非哺乳類が含まれる。
【００５０】
本発明の多様な態様は、下記の章においてさらに詳細に説明される。
【００５１】
抗Glypican-3抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特色または特性を特徴とする。例えば、該抗体は、ヒトGlypican-3に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、Glypican-3に高い親和性で、例えばKDが1 x 10-7 Mまたはそれ以下にて結合する。本発明の抗Glypican-3抗体は好ましくは以下の特徴の一つまたは複数を示す:
(a)KDが1x10-7 M以下にてヒトGlypican-3に結合する;
(b)Glypican-3により形質転換されたヒトCHO細胞に結合する。
【００５２】
好ましくは、該抗体は、ヒトGlypican-3に対してKDが5 x 10-8M以下にて結合し、ヒトGlypican-3に対してKDが2 x 10-8 M以下にて結合し、ヒトGlypican-3に対してKDが5x10-9 M以下にて結合し、ヒトGlypican-3に対してKDが4x10-9M以下にて結合し、ヒトGlypican-3に対してKDが3x10-9M以下にて結合するか、またはヒトGlypican-3に対してKDが2.1 x 10 M以下にて結合する。
【００５３】
該抗体は、Glypican-3内に存在する抗原性エピトープに好ましく結合し、このエピトープは他のタンパク質には存在しない。該抗体は、Glypican-3に対して通常結合するが、他のタンパク質に結合しないか、または低い親和性にて、例えばKDが1 x 10-6 以上、より好ましくは1 x 10-5 以上、より好ましくは1 x 10-4 以上、より好ましくは1 x 10-3 以上、さらにより好ましくは1 x 10-2 以上にて他のタンパク質に結合する。好ましくは、該抗体は、関連タンパク質に実質的に結合せず、例えば該抗体は、Glypican-1、Glypican-2、Glypican-4またはGlypican-6に実質的に結合しない。
【００５４】
一実施態様において、抗体は、Glypican-3を発現する細胞に内在化され得る。抗体の内在化を評価するための標準的アッセイは当業者に知られており、例えばHumZap 内在化アッセイが挙げられる。
【００５５】
Glypican-3に対する抗体の結合能を評価するための標準的なアッセイ法は、例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIAおよびフローサイトメトリー分析を含み、当技術分野において公知である。好適なアッセイ法が実施例において詳細に記述される。該抗体の結合速度論（例えば、結合親和性）はまた、Biacore（登録商標）システム分析のような、当技術分野において既知の標準的なアッセイ法によって評価することができる。腫瘍細胞、例えばHep-3bまたはHep-G2 (ATCC 寄託番号 HB-8064およびHB-8065、各々)への結合を評価するために、細胞を、公的に利用可能な提供機関、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができ、また標準的なアッセイ法、例えばフローサイトメトリー分析に使用することができる。
【００５６】
モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10
本発明の好ましい抗体は、実施例1および2に記載されるように単離および構造の特徴付けを行ったヒトモノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10である。4A6、11E7、および16D10のVHアミノ酸配列を、各々配列番号 19、20、および21に示す。4A6、11E7、および16D10のVLアミノ酸配列を、各々配列番号 22、23、および24に示す。
【００５７】
これらの抗体のそれぞれがGlypican-3に結合できることから、本発明の他の抗Glypican-3結合分子を作製するために、VHおよびVL配列を「混合してマッチさせる」ことができる。かかる「混合してマッチさせた」抗体のGlypican-3結合は、先に記述したおよび実施例において記述した結合アッセイ法（例えば、ELISA）を用いて試験することができる。好ましくは、VHおよびVL鎖を混合してマッチさせた場合、特定のVH/VL対のVH配列を構造的に類似したVH配列と置換する。同様に、好ましくは特定のVH/VLの対のVL配列を構造的に類似したVL配列と置換する
【００５８】
従って、一態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
(a)配列番号 19、20、および21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
(b)配列番号 22、23、および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ここで、該抗体は、Glypican-3、好ましくはヒトGlypican-3に特異的に結合する。
【００５９】
好ましい重鎖および軽鎖の組合せは、次のものを包含する：
(a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および(b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
(b)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および(b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(c)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および(b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
【００６０】
別の態様において、本発明は、4A6、11E7、および16D10の重鎖および軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3を含む抗体、またはそれら組合せを含む抗体を提供する。4A6、11E7、および16D10のVH CDR1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 1、2および3に示す。4A6、11E7、および16D10のVHCDR2のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 4、5、および6に示す。4A6、11E7、および16D10のVHのCDR3のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 7、8、および9に示す。4A6、11E7、および16D10のVkのCDR1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 10、11、および12に示す。4A6、11E7、および16D10のVkのCDR2のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 13、14、および15に示す。4A6、11E7、および16D10のVkのCDR3のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号 16、17、および18に示す。該CDR領域は、Kabatシステム(Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)を用いて示された。
【００６１】
これらの抗体がGlypican-3に結合することができ、かつ抗原結合特異性が主にCDR1、CDR2、およびCDR3領域によって提供されることから、VHのCDR1、CDR2、およびCDR3配列ならびにVkのCDR1、CDR2、およびCDR3配列を、本発明の別の抗Glypican-3結合分子を作製するために、「混合してマッチさせる」ことができる(すなわち、異なる抗体からのCDRを混合してマッチさせることができるが、それぞれの抗体は、VHのCDR1、CDR2、およびCDR3ならびにVkのCDR1、CDR2、およびCDR3を含有できる)。かかる「混合してマッチさせた」抗体が結合するGlypican-3を、先に記述した結合アッセイを用いて試験することができ、また実施例(例えば、ELISA、Biacore（登録商標）分析)において試験することができる。好ましくは、VHのCDR配列を混合してマッチさせる場合、特定のVHの配列から得られるCDR1、CDR2および／またはCDR3配列を構造的に類似したCDR配列と置換した。同様に、VkのCDR配列を混合してマッチさせる場合、特定のVkの配列からのCDR1、CDR2 および／またはCDR3配列を、好ましくは構造的に類似したCDR配列に置換する。一つまたは複数のVHおよび／またはVLのCDR領域の配列を、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10に関して本明細書において開示されたCDR配列から得られる構造的に類似した配列に置換することによって新規のVHおよびVL配列を作製することができることは当業者に容易に理解されるであろう。
【００６２】
従って、別の態様において、本発明は、以下を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する：
(a)配列番号 1、2および3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1;
(b) 配列番号 4、5、および6からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2;
(c) 配列番号 7、8、および9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3;
(d) 配列番号 10、11、および12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e) 配列番号 13、14、および15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f) 配列番号 16、17、および18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3;
ここで、該抗体は、Glypican-3に特異的に結合する、好ましくはヒトGlypican-3に特異的に結合する。
【００６３】
好ましい実施態様において、抗体は下記を含む:
(a)配列番号 1を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号 4を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号 7を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号 10を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号 13を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f)配列番号 16を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６４】
別の好ましい実施態様において、抗体は下記を含む:
(a)配列番号 2を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号 5を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号 8を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号 11を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号 14を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f)配列番号 17を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６５】
別の好ましい実施態様において、抗体は下記を含む:
(a)配列番号 3を含む重鎖可変領域CDR1;
(b)配列番号 6を含む重鎖可変領域CDR2;
(c)配列番号 9を含む重鎖可変領域CDR3;
(d)配列番号 12を含む軽鎖可変領域CDR1;
(e)配列番号 15を含む軽鎖可変領域CDR2；および
(f)配列番号 18を含む軽鎖可変領域CDR3。
【００６６】
当技術分野において、CDR3ドメインは、CDR1ドメインおよび／またはCDR2ドメインから独立して、単独で同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、および予想通り、共通のCDR3配列に基づき同じ結合特異性を有する複数の抗体が生成され得ることが周知である。例えば、Klimka et al., British J. of Cancer 83(2): 252-260 (2000)（マウス抗CD30抗体Ki-4の重鎖可変ドメインCDR3のみを用いるヒト化抗CD30抗体の作製について記述する）；Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296: 833-849 (2000)（その親のマウスMOC-31の抗EGP-2抗体の重鎖CDR3配列のみを用いる組換え型EGP-2抗体を記述する)；Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8910-8915(1998)（各メンバー抗体がCDR3ドメイン以外は異なる配列を含み、かつその親のマウス抗体と同等またはそれよりも高い親和性でその親マウス抗体と同じエピトープに結合できる、マウス抗インテグリンαvβ3抗体LM609の重鎖および軽鎖の可変CDR3ドメインを用いるヒト化抗インテグリンαVβ3抗体のパネルを記述する）Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (CDR3ドメインがその抗原結合に最も大きな寄与を提供することを開示する)；Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (ヒト胎盤DNAに対する三つのFab（SI-I、SI-40、およびSI-32）の重鎖CDR3配列を、抗破傷風トキソイドFabの重鎖に移植することにより、既存の重鎖CDR3を置き換えることを述べており、CDR3ドメインが単独で結合特異性を付与することを実証する)；および Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (親の多特異性Fab LNA3の重鎖CDR3のみを、単一特異性IgG破傷風トキソイド結合Fab p313抗体の重鎖に移入することで、その親Fabの結合特異性を十分に維持できたという移植術を記載する)を参照されたい。これらの参考文献は各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６７】
従って、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物由来の抗体由来の１以上の重鎖および／または軽鎖のCDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供するものであって、ここで該モノクローナル抗体は、Glypican-3に特異的に結合できる。特定の態様において、本発明は、非ヒト抗体、例えばマウス抗体またはラット抗体由来の一以上の重鎖および／または軽鎖のCDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供するものであって、ここで該モノクローナル抗体はGlypican-3に特異的に結合できる。いくつかの実施態様において、非ヒト抗体から得られる１以上の重鎖および／または軽鎖CDR3ドメインを含むかかる本発明の抗体は、対応する親の非ヒト抗体と(a) 結合に関して競合することができ; (b) 機能的特徴を保持し; (c) 同じエピトープに結合し; および／または (d) 類似の結合親和性を有する。
【００６８】
別の局面において、本発明は、Glypican-3に特異的に結合できるヒト抗体、例えば非ヒト動物から得られたヒト抗体由来の１以上の重鎖および／または軽鎖のCDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供する。他の態様において、本発明は、第一のヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得たヒト抗体からの１以上の重鎖および／または軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供するものであって、ここで該第一のヒト抗体はGlypican-3に特異的に結合でき、かつここで第一のヒト抗体から得られる該CDR3ドメインは、Glypican-3に対する結合特異性を欠くヒト抗体のCDR3ドメインをGlypican-3に特異的に結合できる第二のヒト抗体を生成するように置換する。いくつかの実施態様において、第一のヒト抗体から得られる１以上の重鎖および／または軽鎖CDR3ドメインを含むかかる本発明の抗体は、対応する親の第一ヒト抗体と(a)結合に関して競合することができ；(b)機能的特徴を保持し；(c)同じエピトープに結合し；および／または(d)類似の結合親和性を有する。
好ましい実施態様において、第一のヒト抗体は、4A6、11E7、および16D10である。
【００６９】
特定の生殖細胞系列配列を有する抗体
特定の実施態様において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
【００７０】
例えば、好ましい実施態様において、本発明は、ヒトVH5-51遺伝子の産物であるかまたはこれから得られる重鎖可変領域を含み、Glypican-3に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供するものである。別の好ましい実施態様において、本発明は、ヒトVKA27遺伝子の産物であるかまたはヒトVKA27遺伝子から得られる軽鎖可変領域を含み、Glypican-3に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供するものである。別の好ましい実施態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供するものであって、ここで抗体は次のものを含む：
(a)ヒトVH5-51遺伝子(この遺伝子は配列番号 31に示すアミノ酸配列をコードする)からの産物であるかまたはヒトVH5-51遺伝子から得られる重鎖可変領域;
(b)ヒトVKA27遺伝子(この遺伝子は配列番号 33に示すアミノ酸配列をコードする)の産物であるかまたはヒトVKA27から得られる軽鎖可変領域；および
(c)Glypican-3、好ましくはヒトGlypican-3に特異的に結合する。
【００７１】
VH 5-51 および VK A27を有する抗体の例は4A6、11E7、および16D10である
本明細書において用いられるように、ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖系列配列「の産物である」または「から得られる」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系には、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを対象抗原によって免疫する段階、またはファージにおいて提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを対象抗原によってスクリーニングする段階が含まれる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「から得られる」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較する段階、およびヒト抗体の配列に対して配列において最も近い（すなわち最大の％同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択する段階によって、同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物である」または「から得られる」ヒト抗体は、例えば天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的変異の意図的な導入のために、生殖系列配列と比較してアミノ酸の差違を含んでもよい。しかし、選択されたヒト抗体は典型的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも90％同一であり、他の種（例えば、マウス生殖細胞系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較して、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも95％、またはさらに少なくとも96％、97％、98％、もしくは99％同一であってもよい。典型的に、特定のヒト生殖細胞系列配列から得られるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からアミノ酸わずか10個の差を示すに過ぎないと考えられる。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸わずか5個、またはさらに4、3、2、または1個の差を示すに過ぎない可能性がある。
【００７２】
相同な抗体
さらに別の態様において、本発明の抗体は、本明細書に記述の好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖領域を含み、本発明の抗Glypican-3抗体の所望の機能的特性を保持している。
【００７３】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供するものであり:
(a)重鎖可変領域は配列番号 19、20および21からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含み；
(b)軽鎖可変領域は、配列番号 22、23、および24からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含み；および
(c)抗体がヒトGlypican-3にKDが1x10-7M以下で結合する。
【００７４】
また、抗体は、ヒトGlypican-3にてトランスフェクトしたCHO細胞に結合できる。
【００７５】
多様な実施態様において、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。
【００７６】
他の態様において、VHおよび／またはVLアミノ酸配列は、先に記載した配列に対して85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％相同であり得る。先に記載した配列のVHおよびVL領域に対して高い(即ち80%以上)相同性を示すVHおよびVL領域を有する抗体は、配列番号 25、26、27、28、29、および30をコードする核酸分子の突然変異生成(例えば、部位特異的またはPCRによる突然変異誘発)、その後に本明細書に記述の機能的アッセイ法を用いて、glypican-3に結合する能力について、コードされた改変抗体の保持された機能に関して試験を行うことによって、得ることができる。
【００７７】
本明細書において用いられるように、2つのアミノ酸配列の間の％相同性は、2つの配列との間の％同一性と等価である。2つの配列の間の％同一性は、多数の同一位置の機能である、2つの配列の最適なアラインメントのために導入されることが必要であるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた配列が共有する同一の位置の数の関数(即ち、%相同性＝同一の位置の数#/位置の総数#x100)である。2つの配列の間での配列の比較および％同一性の決定は、以下の非制限的な実施例に記述されるように数学アルゴリズムを用いて達成され得る。
【００７８】
2つのアミノ酸配列間の％同一性は、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を用いて、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み入れられているE. Meyers and W. Miller（Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17 (1988)）のアルゴリズムを用いて決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間の％同一性は、GCGソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）におけるGAPプログラムに組み入れられているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453(1970)）のアルゴリズムを用いて、Blossum 62行列またはPAM250行列のいずれかを用いて、ギャップ加重16、14、12、10、8、6、または4および長さの加重1、2、3、4、5、または6を用いて決定することができる。
【００７９】
追加的に、または代替的に、本発明のタンパク質配列はさらに、例えば関連する配列を同定するために公共のデータベースの検索を行うための「検索配列」として用いることができる。かかる検索は、Altschulら(1990)J. Mol. Biol. 215:403-10のXBLASTプログラム（バージョン2.0）を用いて行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本発明の抗体分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア＝50、ワード長＝3によって行うことができる。比較目的のためにギャップを加えたアラインメントを得るために、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記述されるようなGapped BLASTを使用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを用いることができる。www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００８０】
保存的改変を有する抗体
特定の態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含んでおり、これらの１以上のCDR配列は、本明細書に記載した好ましい抗体(例えば、4A6、11E7、および16D10)またはその保存的改変に基づく特定のアミノ酸配列を含み、該抗体は本発明の抗Glypican-3抗体に関する所望の機能的特性を保持している。従って、本発明は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域ならびにCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する:ここで
(a)該重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号 7、8、および9のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、ならびにその保存的改変を含み;
(b)該軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号 16、7、および18のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、ならびにその保存的改変を含み；ならびに
(c)該抗体が、ヒトGlypican-3にKDが1x10-7M以下で結合する。
【００８１】
抗体は、ヒトGlypican-3でトランスフェクトしたCHO細胞に結合できる。
【００８２】
好ましい実施態様において、該重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号 4、5、および6のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含み；ならびに該軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号 13、14、および15のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、およびその保存的改変を含む。別の好ましい実施態様において、該重鎖可変領域CDR1配列は、配列番号 1、2、および3のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列配列およびその保存的改変を含む；ならびに該軽鎖可変領域CDR1配列は、配列番号 10、11、および12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的改変を含む。
【００８３】
様々な態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体でありうる。
【００８４】
本明細書において用いられるように、「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意な影響を及ぼさないまたは変化させないアミノ酸改変を指すと意図される。かかる保存的改変には、アミノ酸置換、付加および欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β-分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このように、本発明の抗体のCDR領域内の一つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸に置換することができ、変化した抗体を、本明細書に記述の機能的アッセイ法を用いて、glypican-3に結合する能力に関して試験することができる。
【００８５】
配列番号 1、2、または3の重鎖CDR1配列は、１以上の保存的配列改変、例えば、1、2、3、4、または5以上のアミノ酸の置換、付加または削除を含み得る；配列番号 10、11、または12の軽鎖CDR1配列は、１以上の保存的配列改変、例えば、1、2、3、4、または5以上のアミノ酸の置換、付加または削除を含み得る；配列番号 4、5、または6に示した重鎖CDR2配列は、１以上の保存的配列改変、例えば、1、2、3、4、または5以上のアミノ酸の置換、付加または削除を含み得る；配列番号 13、14または15に示した軽鎖CDR2配列は、１以上の保存的配列改変、例えば、1、2、3、4、または5以上のアミノ酸の置換、付加または削除を含み得る；配列番号 7、8、または9に示した重鎖CDR3配列は、１以上の保存的配列改変、例えば、1、2、3、4、または5以上のアミノ酸の置換、付加または削除を含み得る；および／または配列番号 16、17または18に示した軽鎖CDR3配列は、１以上の保存的配列改変、例えば、1、2、3、4、または5以上のアミノ酸の置換、付加または削除を含み得る。
【００８６】
本発明の抗Glypican-3抗体としての同じエピトープに結合する抗体
別の実施態様において、本発明は、ヒトGlypican-3に対して、同一のエピトープに結合する抗体を提供する、本発明の任意のGlypican-3モノクローナル抗体(すなわち、Glypican-3に対する結合に関して本発明の任意のモノクローナル抗体との交差競合能を有する抗体)と同じエピトープに結合する抗体を提供する。交差競合研究の基準抗体は、モノクローナル抗体4A6 (配列番号 19および22に示したとおり、各々VHおよびVL配列を有する)、モノクローナル抗体11E7 (配列番号 20および23に示したとおり、各々VHおよびVL配列を有する)、またはモノクローナル抗体16D10 (配列番号 21および24に示したとおり、各々VHおよびVL配列を有する)。かかる交差競合抗体は、標準的なGlypican-3結合アッセイ法において4A6、11E7、または16D10とのその交差競合能に基づいて同定することができる。例えば、BIAcore（登録商標）分析、ELISA法、またはフローサイトメトリーを用いて、本発明の抗体との交差競合能を証明できる。例えば、ヒトGlypican-3に対する4A6、11E7、または16D10の結合を試験抗体が阻害できる能力は、該試験抗体が、ヒトGlypican-3との結合に関して4A6、11E7、または16D10と競合でき、このため4A6、11E7、または16D10としてヒトGlypican-3と同じエピトープに結合することを示す。好ましい実施態様において、4A6、11E7、または16D10としてヒトGlypican-3と同じエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例において記述されるように調製および単離することができる。
【００８７】
操作および改変された抗体
本発明の抗体を、改変抗体を遺伝子工学的に操作するために使用できる本明細書に開示される１以上のVHおよび／またはVL配列を有する抗体を開始材料として用いてさらに調製することができ、この改変抗体は開始抗体と比較した場合に改変された性質を有し得る。
抗体は、1つまたは双方の可変領域(即ち、VHおよび／またはVL)内、例えば１以上のCDR領域内の、および／または1以上のフレームワーク領域内の１以上のアミノ酸を改変することにより操作され得る。追加的または代替的に、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を変化させて、定常領域内の残基を改変することによって作成することができる。
【００８８】
特定の実施態様において、CDRの移植を用いて、抗体の可変領域を操作するできる。抗体は、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)に存在するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。このために、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列よりも個々の抗体の間でより多様である。CDR配列はほとんどの抗体-抗原相互作用に関与していることから、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列に移植された特異的な天然に存在する抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することによって、特異的な天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え型抗体を発現させることができる(例えば、Riechmann, L.ら(1998) Nature 332:323-327; Jones, P.ら(1986) Nature 321:522-525; Queen, C.ら(1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Winterに対する米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらに対する米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762および6,180,370号を参照されたい)。
【００８９】
従って、本発明の別の実施態様は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関連するものであって、各々配列番号 1、2および3、配列番号 4、5および6、ならびに配列番号 7、8および9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含んでいる重鎖可変領域、そして各々配列番号 10、11および12、配列番号 13、14および15、ならびに配列番号 16、17および18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2、およびCDR3配列を含んでいる軽鎖可変領域を含む。このように、かかる抗体は、モノクローナル抗体4A6、11E7または16D10のVHおよびVLのCDR配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有してもよい。
【００９０】
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公的なDNAデータベースまたは公開された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖細胞系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットでwww. mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能）ならびにKabat, E.A.ら(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest"、第5版、米国保健社会福祉省、NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I.M.ら(1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops", J. Mol. Biol. 227:776-798；およびCox, J.P.L.ら(1994)"A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage."Eur. J. Immuol. 24:827-836において認められうる;上記それぞれの内容物が参照として本明細書に組み入れられる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子に対する生殖細胞系列DNA配列をGenbankデータベース中に見出すことができる。例えば、HCo7 HuMAbマウスで見出された以下の重鎖生殖系列配列は、ここに示すGenbankアクセッション番号で入手できる：1-69 (NG_0010109、NT_024637およびBC070333)、3-33(NG_0010109およびNT_024637)ならびに3-7(NG_0010109およびNT_024637)。別の例として、HCo12 HuMAbマウスで見出された以下の重鎖生殖細胞系列配列は、ここに示すGenbankアクセッション番号で入手できる：1-69(NG_0010109、NT_024637、およびBC070333)、5-51(NG_0010109およびNT_024637)、4-34(NG_0010109およびNT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、ならびに3-23(AJ406678)。
【００９１】
抗体のタンパク質配列は、当業者に周知のGapped BLAST（Altsuchul et al. (1997) Nuleic Acids Research 25: 3389-3402）と呼ばれる配列類似性検索法の一つを使用して作成されたタンパク質配列データベースと比較される。BLASTは、抗体配列とデータベース配列の間の統計的に有意なアラインメントが整列させた文字の高スコアセグメント対（high-scoring segment pairs)(HSP）を含む可能性があるという点で発見的アルゴリズムである。伸長または短縮によってそのスコアを改善できないセグメント対は、ヒット（hit）と呼ばれる。簡単に言うと、VBASE由来（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php）のヌクレオチド配列は翻訳され、FR1〜FR3のフレームワーク領域およびその間の領域を含む領域が保持される。データベース配列は98残基の平均長を有する。そのタンパク質の全長において正確に一致する重複配列は排除される。消失した低複雑性フィルター（low complexity filter）を除いてデフォルトの標準パラメータを用いるblastpプログラム、およびBLOSUM62の置換行列式を用いるタンパクのBLAST探索により、配列一致を与える上位5ヒットを抽出する。ヌクレオチド配列は6つのフレーム全てにおいて翻訳され、一致したデータベース配列のセグメントの中のストップコドンのないフレームはヒットの可能性があるとみなされる。これはその後、6つのフレーム全ての抗体配列を翻訳し、その翻訳を6つのフレーム全てにおいて動的に翻訳されるVBASEヌクレオチド配列と比較するBLASTプログラムtblastxを用いて確認される。
【００９２】
同一（identity）とは、抗体配列とタンパク質データベースの間の、その配列全長にまたがる正確なアミノ酸の一致である。正（positive）（同一+置換一致）は、同一ではないが、BLOSUM62置換行列により導かれたアミノ酸置換である。抗体配列が同じ同一性でデータベース配列の中の2つと一致する場合、最も正値が高いヒットが一致配列のヒットであると決定され得る。
【００９３】
本発明の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体によって用いられるフレームワーク配列と構造的に類似の、例えば本発明の好ましいモノクローナル抗体によって用いられるVH5-51フレームワーク配列(配列番号 31)および／またはVKA27フレームワーク配列(配列番号 33)と類似の配列である。VHのCDR1、CDR2、およびCDR3配列、ならびにVKのCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、そこからフレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において認められる配列と同一の配列を有するフレームワーク領域に移植することができる、またはCDR配列を生殖細胞系列配列と比較して一以上の変異を含むフレームワーク領域に移植することができる。例えば、特定の場合では、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有用である（例えば、Queenらに対する米国特許第5,530,101号；5,585,089号；5,693,762号；および6,180,370号を参照されたい）ことが判っている。
【００９４】
可変領域の修飾に関するもう一つのタイプは、VHおよび／またはVKのCDR1、CDR2および／またはCDR3領域内のアミノ酸配列を変異させて、それによって目的とする抗体の１以上の結合特性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的変異誘発またはPCR媒介変異誘発を行い、該変異(複数を含む)を導入することが可能であり、そして抗体結合に対する影響または他の目的とする機能特性を、本明細書に記述のおよび実施例において提供されるようなイン・ビトロまたはイン・ビボのアッセイ法において評価することができる。好ましくは保存的改変（上記のように）を導入する。該変異は、アミノ酸置換、付加、または欠失であってもよいが、好ましくは置換である。さらに、通常、CDR領域内で変化させる残基は、わずか1、2、3、4、または5個に過ぎない。
【００９５】
従って、別の実施態様において、本開示は、(a)配列番号 1、2、および3からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号 1、2および3と比較した場合に1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVHのCDR1領域；(b)配列番号 4、5、および6からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号 4、5、および6と比較した場合に1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVHのCDR2領域；(c)配列番号 7、8、および9からなる群から選択されるアミノ酸配列、 または配列番号 7、8、および9と比較した場合に1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVHのCDR3領域；(d)配列番号 10、11、および12からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号 10、11、および12と比較した場合に1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVKのCDR1領域；(e)配列番号 13、14、および15からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号 13、14、および15と比較した場合に1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVKのCDR2領域；ならびに(f) 配列番号 16、17、および18からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号 16、17、および18と比較した場合に1、2、3、4もしくは5個のアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むVKCDR3領域を含んでいる重鎖可変領域を含む単離された抗Glypican-3モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【００９６】
本発明の操作された抗体には、例えば抗体の特性を改善するために、VHおよび／またはVK内のフレームワーク残基に対して改変を行った抗体が含まれる。通常、かかるフレームワーク改変は、抗体の免疫原性を減少させるように行われる。例えば、一つのアプローチは、対応する生殖系列配列に対して一つまたは複数のフレームワーク残基を「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、そこから抗体が由来する生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含んでもよい。かかる残基は、抗体のフレームワーク配列を、抗体が得られる生殖細胞系列配列と比較することによって同定することができる。例えば、4A6については、Kabat番号付与システムを用いると、VHのアミノ酸残基#73(FR3内)は、アルギニン(配列番号 19)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列中のこの残基はリジン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すためには、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的変異誘発またはPCR媒介変異誘発により、その生殖細胞系配列に「復帰突然変異」されることが可能である(例えば、4A6のVHのVH残基#73(FR3の残基#8)を、アルギニンからリジンに「復帰突然変異」させることが可能である。)
【００９７】
別の例において、4A6については、VHのアミノ酸残基#76(FR3内)はアルギニン(配列番号 19)であるが、対応するVH 5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はセリン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列を、その生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、4A6のVHの残基#76 (FR3の残基#11)を、アルギニンからセリンに「復帰突然変異」させることが出来る。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明に含まれることが意図される。
【００９８】
別の例において、4A6については、VHのアミノ酸残基#89(FR3内)はロイシン(配列番号 19)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はメチオニン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば4A6のVHの残基#89 (FR3の残基#27)は、ロイシンからメチオニンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００９９】
別の例において、11E7について、VHのアミノ酸残基#76(FR3内)はアルギニン(配列番号 20)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はセリン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば11E7のVHの残基#76(FR3の残基#11)を、アルギニンからセリンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１００】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#10 (FR1内)はアスパラギン酸塩(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はグルタミン酸塩(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば16D10のVHの残基#10(FR1の残基#10)を、アスパラギン酸塩からグルタミン酸塩に「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０１】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#12 (FR1内)はスレオニン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はリジン(配列番号 31)である。 フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#12(FR1の残基#12)は、スレオニンからリジンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０２】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#24(FR1内)はバリン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51 生殖細胞系列配列内のこの残基はグリシン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#24(FR1の残基 #24)を、バリンからグリシンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０３】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#28(FR1内)はアルギニン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はセリン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば16D10のVHの残基#28(FR1の残基 #28)を、アルギニンからセリンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０４】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#37(FR2内)はメチオニン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51生殖細胞系列配列内のこの残基はバリン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#37(FR2の残基#2)を、メチオニンからバリンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０５】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#41(FR2内)はセリン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51の生殖細胞系列配列におけるこの残基はプロリン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#41(FR2の残基#6)をセリンからプロリンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０６】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#66(FR3内)はヒスチジン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51の生殖細胞系列配列内のこの残基はグルタミンである(配列番号 31)。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#66 (FR3の残基#1)をヒスチジンからグルタミンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０７】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#76(FR3内)はアスパラギン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51の生殖細胞系列配列内のこの残基はセリン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#76(FR3の残基#11)を、アスパラギンからセリンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０８】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#81(FR3内)はアルギニン(配列番号 21)であるが、対応するVH 5-51 生殖細胞系列配列内のこの残基はグルタミン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば16D10のVHの残基#81(FR3の残基#16)を、アルギニンからグルタミンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０９】
別の例において、16D10について、VHのアミノ酸残基#89(FR3内)はイソロイシン(配列番号 21)であるが、対応するVHの5-51の生殖細胞系列配列内のこの残基はメチオニン(配列番号 31)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVHの残基#89(FR3の残基#27)をイソロイシンからメチオニンに「復帰突然変異」させることができる。かかる「復帰突然変異された」抗体もまた、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１１０】
同様に、本発明は、軽鎖内のフレームワーク残基の「復帰突然変異」を提供する。例えば、16D10について、VKのアミノ酸残基#3 (FR1内)はロイシン(配列番号 24)であるが、対応するVKのA27生殖細胞系列配列内のこの残基はバリン(配列番号 33)である。フレームワーク領域配列をその生殖細胞系列の構成に戻すために、例えば、16D10のVKの残基#3(FR1の残基#3)をロイシンからバリンに「復帰突然変異」させることができる。
【０１１１】
もう一つのタイプのフレームワーク改変は、T細胞エピトープを除去して、それによって抗体の起こりうる免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内の、または場合によっては一つ以上のCDR領域内の一以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチはまた、Carrらによる米国特許公開第20030153043号にさらに詳細に記述されている。
【０１１２】
フレームワークまたはCDR領域内で行う改変の他にまたはその代わりに、本発明の抗体は、Fc領域内での改変を含むように、典型的には、例えば血清中半減期、補体固定、Fc受容体結合、および／または抗原依存的細胞障害性のような抗体の一以上の機能的特性を変化させるように操作してもよい。さらに、本発明の抗体は、化学的に改変されてもよく(例えば、１以上の化学部分を抗体に結合させることができる)、またはそのグリコシル化を変化させるように、再度抗体の１以上の機能的特性を変化させるように改変してもよい。これらの態様のそれぞれを下記にさらに詳細に記述する。Fc領域における残基の番号付けは、KabatのEUインデックスの通りである。
【０１１３】
一実施態様において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変更させるように、例えば増加または減少するように改変される。このアプローチは、Bodmerらの米国特許第5,677,425号においてさらに記述される。CH1のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするように、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように改変される。
【０１１４】
別の実施態様において、抗体のFcヒンジ領域を抗体の生物学的半減期を減少させるように変異させる。より具体的には、抗体が、天然のFc-ヒンジドメインSpA結合と比較してブドウ球菌プロテインA（SpA）結合を正常に機能を果たさないように、１以上のアミノ酸変異を、Fc-ヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン界面領域に導入する。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記述される。
【０１１５】
別の実施態様において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように改変される。
様々なアプローチが可能である。例えば、Wardらに対する米国特許第6,277,375号に記述されるように、１以上の以下の変異を導入できる：T252L、T254S、およびT256F。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、Prestaらによる米国特許第5,869,046および6,121,022号に記載のとおり、抗体を、IgGのFc領域のCH2ドメインの二つのループから得たサルベージ受容体結合エピトープを含むように、CH1またはCL領域内で変化させることができる。
【０１１６】
さらに別の実施態様において、Fc領域を、抗体のエフェクター機能を変化させるために少なくとも一つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することによって変化させる。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320および322から選択された１以上のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに対して変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基に置換することができる。親和性が変化したエフェクターリガンドは、例えばFc受容体または補体のC1成分となりうる。
このアプローチは、いずれもWinterらによる米国特許第5,624,821号および同5,648,260号にさらに詳しく記述されている。
【０１１７】
別の実施態様において、C1q結合が変化し、および／または補体依存的細胞障害性（CDC）が減少または消失されるように、アミノ酸残基329、331および322から選択された１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号にさらに詳しく記述されている。
【０１１８】
別の実施態様において、アミノ酸位置231および239位内での１以上のアミノ酸残基を、それによって抗体の補体固定能を変化させる。このアプローチは、BodmerらによるPCT国際公開公報第WO 94/29351号に詳細に説明されている。
【０１１９】
別の実施態様において、Fc領域を、以下の位置：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438または439での一以上のアミノ酸を改変することによって、抗体の抗体依存的細胞障害性（ADCC）を媒介する能力を増加させるように、および／またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増加させるように改変される。このアプローチは、PrestaによりPCT国際公開公報第WO 00/42072号に詳しく記述されている。さらに、FcγRI、FcγRII、FcγR IIIおよびFcRnに関するヒトIgG1上の結合部位がマッピングされており、結合の改善を示す変種が記述されている（Shields, R.L.ら(2001),J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照されたい）。256、290、298、333、334および339位での特異的変異は、FcγRIIIに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の複合変異体は、FcγRIII結合を改善することが示された：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224AおよびS298A/E333A/K334A。
【０１２０】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、無グリコシル化(aglycoslated)抗体を作製することができる(即ち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることにより為すことができる。かかる糖質の改変は、例えば抗体配列内で１以上のグリコシル化の部位を改変することにより達成され得る。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を消失させ、そうしてその部位でのグリコシル化を消失させる１以上のアミノ酸置換を行い得る。かかる無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。かかるアプローチは、Coらの米国特許第5,714,350および6,350,861号によりさらに詳細に記述されている。
【０１２１】
追加的にまたは代替的に、例えば、フコシル残基の減少量を有する低フコシル化抗体または二分岐性GlcNac構造の増加を有する抗体のような、変化したタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。かかる変化したグリコシル化パターンは、抗体のADCC能を増加させることが証明されている。かかる糖質改変は、例えば変化したグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。
変化したグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野で記述されており、本発明の組換え型抗体を発現させて、それによって変化したグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として用いることができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705、およびMs709は、Ms704、Ms705、およびMs709細胞株で発現される抗体がそれらの糖中のフコースを欠如するように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子であるFUT8（α(1,6)フコシルトランスフェラーゼ）を欠如している。Ms704、Ms705、およびMs709のFUT8-/-細胞株は、2つの置換ベクターを用いてCHO/DG44細胞のFUT8遺伝子を標的破壊することによって作製された(Yamaneらによる米国特許公報第20040110704号およびYamane-Ohnukiら(2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照されたい）。別の例として、Hanaiらによる欧州特許第1,176,195号には、かかる細胞株において発現された抗体が、α1,6結合関連酵素を減少させるかまたは除去することによって低フコシル化を示すように、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子を有する細胞株が記述されている。Hanaiらはまた、抗体のFc領域に結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを付加するための低い酵素活性を有するか、または酵素活性を有しない細胞株、例えばラットの骨髄腫細胞株YB2/0（ATCC CRL 1662）について記述している。PrestaによるPCT国際公開公報第03/035835号は、Asn(297)結合糖にフコースを結合させる能力が低下した変種CHO細胞株であるLec 13細胞について記述しており、またその宿主細胞において発現した抗体のフコシル化が低下することになることを記述している(Shields, R.L. ら(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740もまた参照されたい)。UmanaらによるPCT国際公開公報第WO 99/54342号は、操作された細胞において発現された抗体が、二分岐性GlcNac構造の増加を示し、それによって抗体のADCC活性の増加が起こる（Umanaら(1999)Nat. Biotech. 17：176-180もまた参照されたい）ように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnT III））を発現させるように操作された細胞株を記述している。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断してもよい。例えば、フコシダーゼであるα-L-フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を取り除く(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23)。
【０１２２】
本発明に含まれる本明細書に記述の抗体のもう一つの改変はPEG化である。抗体は例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにPEG化することができる。抗体をPEG化するために、抗体またはその断片を典型的に、一以上のPEG基が抗体または抗体断片に結合するようになる条件下で、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコール（PEG）と反応させる。好ましくは、PEG化は、反応性PEG分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われる。本明細書において用いられるように、「ポリエチレングリコール」という用語はモノ(C1-C10)アルコキシまたはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドのような、他のタンパク質を誘導体化するために用いられているPEGの任意の型を含むと意図される。特定の実施態様において、PEG化される抗体は、無グリコシル化抗体である。タンパク質をPEG化する方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimuraらによる欧州特許第0 154 316号およびIshikawaらによる欧州特許第0 401 384号を参照されたい。
【０１２３】
抗体の物理的特性
本発明の抗体はさらに、抗Glypican-3抗体の様々な物理的特性により特徴付けられ得る。様々なアッセイ法を使用して、これらの物理的特性に基づき異なる抗体クラスを検出および／または識別することができる。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のいずれかに一以上のグリコシル化部位を含み得る。可変領域に一以上のグリコシル化部位が存在することにより、抗体の免疫原性が増加し、抗原の結合の変化により抗体のpKが変化し得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、N-X-S/T配列を含むモチーフで起こることが知られている。可変領域のグリコシル化は、抗体を切断してFabを生成し、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイ法を用いてグリコシル化を試験するGlycoblotアッセイ法を用いて試験され得る。あるいは、可変領域のグリコシル化は、Fabから糖類を切断して単糖にし、個々の糖類の含有量を分析するダイオネクスライトクロマトグラフィ（Dionex light chromatography）（Dionex-LC）を用いて試験することができる。いくつかの例において、抗Glypican-3抗体が可変領域のグリコシル化を含まないことが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選別することによってか、当業者に周知の標準的技術を用いてグリコシル化モチーフ内の残基を突然変異させることによってのいずれかによって達成され得る。
【０１２５】
好ましい実施態様において、本発明の抗体はアスパラギン異性部位を含まない。脱アミド作用またはイソアスパラギン酸作用は、各々N-G配列またはD-G配列上で生じ得る。脱アミド作用またはイソアスパラギン酸作用は、主鎖よりも側鎖のカルボキシ末端からねじれ構造を形成することにより抗体の安定性を減少させるイソアスパラギン酸を形成する。イソアスパラギン酸の生成は、逆相HPLCを用いてイソアスパラギン酸を試験するイソ-クアント（iso-quant）アッセイ法を用いて測定され得る。
【０１２６】
各抗体は、固有の等電点（pI）を有し得るが、一般的に抗体は6〜9.5のpH範囲にある。
IgG1抗体のpIは、典型的には7〜9.5のpH範囲に含まれ、IgG4抗体のpIは、典型的には6〜8のpH範囲に含まれる。抗体は、この範囲外のpIを有し得る。その効果は一般的には知られていないが、正常範囲外のpIを有する抗体は、イン・ビボの条件下である程度アンフォールディング（unfolding）となり、不安定である場合があるという説がある。等電点は、pH勾配を形成し、精度向上のためにレーザー集光を利用し得るキャピラリー電点電気泳動アッセイ法を用いて試験することができる（Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67)。いくつかの例において、抗Glypican-3抗体が正常範囲に含まれるpI値を含むことが好ましい。これは、正常範囲内のpIを有する抗体を選別することによってか、または当技術分野で周知の標準的技術を用いて荷電表面残基を突然変異させることによってのいずれかによって達成され得る。
【０１２７】
各抗体は、熱安定性の指標となる融解温度を有し得る(Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。熱安定性の高さは、イン・ビボでの抗体全体の安定性の高さを示す。抗体の融点は、例えば、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) 等の技術を用いて測定され得る。TM1は、抗体の最初のアンフォールディングの温度を示す。TM2は、抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般的に、本発明の抗体のTM1は、60℃以上であり、好ましくは65℃以上であり、さらにより好ましくは70℃以上である。あるいは、抗体の熱安定性は、円偏光二色性を用いて測定され得る(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)。
【０１２８】
好ましい実施態様において、抗体は急速に分解しないものが選択される。抗Glypican-3抗体の断片化は、キャピラリー電気泳動（CE）およびMALDI-MSを用いて測定されることができ、これらは当技術分野で十分に理解されている(Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32)。
【０１２９】
別の好ましい実施態様において、抗体は最小の凝集効果を有するものが選択される。凝集は、望ましくない免疫応答の誘因および／または変化したもしくは好ましくない薬物動力学的特性をもたらし得る。一般的に、抗体は、25％またはそれ以下、好ましくは20％またはそれ以下、さらにより好ましくは15％またはそれ以下、さらにより好ましくは10％またはそれ以下、さらにより好ましくは5％またはそれ以下の凝集性を有する抗体が許容できる。凝集は、一量体、二量体、三量体、または多量体を同定するサイズ排除カラム（SEC）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）および光散乱を含む当技術分野で周知のいくつかの技術によって測定することができる。
【０１３０】
抗体を操作する方法
先に記述したように、本明細書に開示のVHおよびVK配列を有する抗Glypican-3抗体を用いて、VHおよび／またはVK配列、またはそれに結合した定常領域を改変することによって、新規抗Glypican-3抗体を作製することができる。このように、本発明の別の態様において、本発明の抗Glypican-3抗体、例えば4A6、11E7、および16D10の構造的特徴を用いて、抗Glypican-3 抗体、本発明の抗体の少なくとも一つの機能的特性、例えばヒトGlypican-3への結合を保持する構造的に関連する抗Glypican-3抗体を作製する。例えば、4A6、11E7および16D10、またはその変異の１つまたは複数のCDR領域を、組換え的に公知のフレームワーク領域および／または他のCDRと組み合わせて、先に記載したように、さらなる組換え操作した本発明の抗Glypican-3抗体を作製することができる。他のタイプの改変には、先の章で記述された改変が含まれる。操作された方法の開始材料は、本明細書において提供した、１以上のVHおよび／またはVK配列、または１以上のそのCDR領域である。操作された抗体を作製するために、本明細書において提供された１以上のVHおよび／またはVK配列または１以上のそのCDR領域を有する抗体を実際に調製する必要はない(即ち、タンパク質として発現する)。むしろ、配列に含まれる情報を開始材料として用いて、元々の配列から得られる「第二世代」の配列を作製した後、「第二世代」の配列を調製してタンパク質として発現させる。
【０１３１】
従って、別の実施態様において、本発明は、以下を含む抗Glypican-3抗体を調製する方法を提供する：
(a)
(i)配列番号 1、2、および3からなる群より選択されるCDR1配列、
配列番号 4、5、および6からなる群より選択されるCDR2配列、および／または
配列番号 7、8、および9からなる群より選択されるCDR3配列を含む、
重鎖可変領域抗体配列
；ならびに／または
(ii)配列番号 10、11、および12からなる群より選択されるCDR1配列、
配列番号 13、14、および15からなる群より選択されるCDR2配列、および／または
配列番号 16、17、および18からなる群より選択されるCDR3配列を含む;
軽鎖可変領域抗体配列を提供すること、
(b) 重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも一つのアミノ酸残基を変化させて、少なくとも一つの変化した抗体配列を作製すること；ならびに
(c) 変化した抗体配列をタンパク質として発現させること。
【０１３２】
標準的な分子生物学技術を用いて変化した抗体配列を調製および発現させることができる。
【０１３３】
好ましくは、変化した抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記述の抗Glypican-3抗体の機能的特性の一つ、一部、または全てを保持する抗体であり、該機能的特性とは以下を含むがこれらに限定されない：
(i)ヒトGlypican-3に対してKDの1x10-7Mまたはそれ以下で結合し;
(ii)Glypican-3で形質転換されたヒトCHO細胞に結合する。
【０１３４】
改変抗体の機能的特性は、当技術分野で使用可能なおよび／または本明細書に記述の標準的なアッセイ法（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ法）を用いて評価することができる。
【０１３５】
本発明の抗体を操作する方法の特定の態様において、抗Glypican-3抗体コード配列の全てまたは一部に沿って突然変異を無作為または選択的に導入することができ、得られた改変抗Glypican-3抗体を、本明細書に記述の結合活性および／または他の機能的特性に関してスクリーニングすることができる。変異法は当技術分野において記述されている。例えば、ShortによるPCT国際公開公報第02/092780号は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリ、またはその組み合わせを用いて抗体の変異を作製してスクリーニングする方法を記述している。あるいは、LazarらPCT国際公開公報第03/074679号は抗体の物理化学特性を最適にするために、コンピュータースクリーニング法を用いる方法を記述している。
【０１３６】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明のもう一つの局面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は全細胞、細胞溶解物、または部分精製もしくは実質的に精製型で存在してもよい。核酸は、アルカリ／SDS処置、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知の他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の混入物から精製されている場合に「単離されている」または「実質的に純粋にされている」。例えば、F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAとなりえて、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい態様において、核酸はcDNA分子である。
【０１３７】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、下記にさらに記述するように、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ）によって発現される抗体に関して、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅またはcDNAクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）から得られた抗体について、抗体をコードする1以上の核酸をライブラリーから回収することができる。
【０１３８】
本発明の好ましい核酸分子は、4A6、11E7、または16D10モノクローナル抗体のVHおよびVL 配列をコードする分子である。4A6、11E7、または16D10のVH配列をコードしているDNA配列は、配列番号 25、26、および27各々に示される。4A6、11E7、または16D10のVL配列をコードしているDNA配列は、配列番号 28、29、および30各々に示される。
【０１３９】
本発明の別の好ましい核酸は、配列番号 25、26、27、28、29、および30に示される配列の一つと少なくとも80%の配列同一性、例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99% 配列同一性を有する核酸であって、この核酸は、本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードしている。
【０１４０】
2つの核酸配列間の％同一性は、2つの配列の至適アラインメントのために導入が必要であるギャップ数および各ギャップ長を考慮した、配列中のヌクレオチドが同一である位置の数である。配列の比較および2つの配列間の％同一性を、数学的アルゴリズム、例えば、上記したMeyers and MillerのアルゴリズムまたはAltschulのXBLASTプログラムを用いて達成することができる。
【０１４１】
またさらに、本発明の好ましい核酸は、配列番号 25、26、27、28、29、および30に示される核酸配列の１以上のCDRコード部分を含む。この実施態様において、該核酸は、4A6、11E7、または16D10の重鎖CDR1、CDR2および／またはCDR3配列、または4A6、11E7、または16D10の軽鎖CDR1、CDR2および／またはCDR3配列をコードし得る。
【０１４２】
また、配列番号 25、26、27、28、29、または30のかかるCDRコード部分と、少なくとも80%、例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%配列同一性を有する核酸も、本発明の好ましい核酸である。かかる核酸は、非CDRコード領域および／またはCDRコード領域において配列番号 25、26、27、28、29、または30の対応する部分とは異なり得る。差違がCDR-コード領域内にある場合、該核酸によりコードされた核酸CDR領域は、通常、4A6、11E7、および16D10の対応するCDR配列と比較して、本明細書に規定されたとおり１以上の保存的配列修飾を含む。
【０１４３】
VHおよびVLセグメントをコードするDNA断片が得られた後に、例えば可変領域遺伝子を完全長の抗体鎖遺伝子、Fab断片遺伝子、またはscFv遺伝子に変換するために、これらのDNA断片を標準的な組換えDNA技術によってさらに操作することができる。これらの操作において、VL-またはVH-コードDNA断片を、抗体の定常領域または柔軟なリンカーのようなもう一つのタンパク質をコードするもう一つのDNA断片に作動可能に結合させる。明細書中で使用される用語「作動可能に結合した」とは、二つのDNA断片によってコードされるアミノ酸配列がなおもフレーム内に留まるように二つのDNA断片を結合させることを意味すると意図される。
【０１４４】
VH領域をコードする単離DNAは、VHコードDNAを、重鎖定常領域（CH1、CH2、およびCH3）をコードするもう一つのDNA分子に作動可能に連結させることによって、完全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., ら(1991)、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)、これらの領域を含むDNA断片は、標準的 PCR増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域であり得るが、最も好ましくはIgG1またはIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子に関して、VH-コードDNAを、重鎖CH1定常領域のみをコードするもう一つDNA分子に作動可能に結合させることができる。
【０１４５】
VL領域をコードする単離されたDNAは、VL-コードDNAを軽鎖定常領域CLをコードするもう一つのDNA分子に作動可能に結合させることによって、完全長の軽鎖遺伝子（さらにFab軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当業者には周知である(例えば、Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)、これらの領域を含むDNA断片は標準的なPCR増幅によって得ることができる。好ましい態様において、軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域となりうる。
【０１４６】
scFv遺伝子を作製するために、VHおよびVLコードDNA断片を、VLおよびVH領域が柔軟なリンカーによって結合した連続した一本鎖タンパク質として発現できるように、VHおよびVLコードDNA断片を、柔軟なリンカー、例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードするもう一つの断片に作動可能に結合させる(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照されたい）。
【０１４７】
モノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体(mAbs)は、通常のモノクローナル抗体の方法論、例えばKohler and Milstein(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、多様な技術によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション技法は原則として好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばBリンパ球のウイルスまたは腫瘍遺伝子形質転換を用いることができる。
【０１４８】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常によく確立された技法である。免疫プロトコールや融合のために免疫した脾臓を単離する技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合技法も同様に公知である。
【０１４９】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製した非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、目的とする非ヒトハイブリドーマから得ることができる、標準的な分子生物学技術を用いて、非ネズミ(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含有するようにに操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いてマウス可変領域をヒト定常領域に結合させることができる(例えば、Cabillyらに対して米国特許第4,816,567号を参照されたい)。ヒト化抗体を作製するために、当技術分野で公知の方法を用いてネズミCDR領域をヒトフレームワークに挿入することができる (例えば、Winterらの米国特許第5,225,539号、およびQueenらの米国特許第5,530,101号；5,585,089；5,693,762および6,180,370号を参照されたい)。
【０１５０】
好ましい実施態様において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。Glypican-3に対するかかるヒトモノクローナル抗体を、マウス系よりむしろヒト免疫系の一部を有するトランスジェニックまたは導入染色体性マウスを用いて作製することができる。これらのトランスジェニックおよび導入染色体性マウスには、本明細書においてHuMabマウス（登録商標）およびKMマウス（登録商標）と各々呼ばれるマウスが含まれ、これらを本明細書において「ヒトIgマウス」と総称する。
【０１５１】
HuMAb マウス（登録商標）(Medarex（登録商標）, Inc.)は、内因性のμおよびκ鎖座を不活化する標的化変異と共に非再配列ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ座を含む(例えば、Lonbergら(1994) Nature 368(6474): 856-859を参照されたい)。従って、マウスは、マウスIgMまたはκの発現の減少を示し、免疫に反応して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランスジーンがクラススイッチおよび体細胞突然変異を受けて、高親和性ヒトIgGκモノクローナル抗体を産生する(Lonberg, N.ら(1994)上掲； Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101の論評；Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546)。HuMAb マウス（登録商標）の調製および使用ならびにかかるマウスが担持するゲノム改変は、Taylor, L.ら(1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillonら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi ら(1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon ら(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. ら (1994) International Immunology 6: 579-591；および Fishwild, D.ら(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851に詳細に記述されており、この全ての内容を出典明示により本明細書の一部とする。さらに、米国特許第5,545,806；5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299；および 5,770,429号; 全てLonbergおよびKayについて; Suraniらに対して米国特許第5,545,807号; LonbergおよびKayに対して全てPCT国際公開公報第 WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884およびWO 99/45962；ならびにKormanらに対するPCT 国際公開公報第WO 01/14424を参照されたい。
【０１５２】
別の実施態様において、本発明のヒト抗体は、トランスジーンおよび導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウス、例えば、ヒト重鎖トランスジーンとヒト軽鎖導入染色体とを担持するマウスのようなマウスを用いて作製することができる。このマウスは、本明細書において「KM マウス（登録商標）」と呼ばれ、かかるマウスは、IshidaらにてPCT 公開公報番号第WO 02/43478号において詳細に記述されている。
【０１５３】
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するもう一つのトランスジェニック動物系は、当技術分野で入手可能であり、本発明の抗Glypican-3抗体を作製するために用いることができる。例えば、Xenomouse（Abgenix, Inc.）と呼ばれるもう一つのトランスジェニック系を用いることができ；かかるマウスは例えば、Kucherlapatiらにて米国特許第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号；および第6,162,963号に記述されている。
【０１５４】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別の導入染色体性動物システムが、当技術分野で入手可能であり、本発明の抗Glypican-3抗体を作製するために用いることができる。「TCマウス」と呼ばれるヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の双方を担持するマウスを用いることができ; そのようなマウスはTomizukaら(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記述されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが当技術分野において記述されており(Kuroiwa ら(2002) Nature Biotechnology 20:889-894、PCT出願番号WO/2002/092812）、本発明の抗Glypican-3 抗体を惹起するために使用され得る。
【０１５５】
本発明のヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリィをスクリーニングするために、ファージディスプレイ法を用いて調製することができる。ヒト抗体を単離するためのそのようなファージディスプレイ法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ladner らの米国特許第5,223,409号; 5,403,484；および 5,571,698; Dowerらの米国特許第5,427,908号および5,580,717号; MaCaffertyらの米国特許第5,969,108および6,172,197号；ならびにGriffithsらの米国特許第5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915および6,593,081号を参照されたい。
【０１５６】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫時にヒト抗体反応が生じるように、ヒト免疫細胞が再構成されているSCIDマウスを用いて調製することができる。かかるマウスは、例えばWilsonらの米国特許第5,476,996号および第5,698,767号に記述されている。
【０１５７】
ヒトIgマウスの免疫
ヒトIgマウスを用いて本発明のヒト抗体を産生する場合、Lonberg, N.ら(1994) Nature 368(6474): 856 859; Fishwild, D.ら(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851；および PCT公開公報第WO 98/24884およびWO01/14424により記載されるように、かかるマウスを、Glypican-3 抗原および／または組換え型Glypican-3、またはGlypican-3を発現する細胞、またはGlypican-3 融合タンパク質の精製または濃縮調製物を用いて免疫することができる。好ましくは、マウスは初回注射時6-16週齢であると考えられる。例えば、Glypican-3抗原の精製または組換え型調製物（5-50μg）を用いてヒトIgマウスを腹腔内注射によって免疫することができる。
【０１５８】
Glypican-3に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するための詳細な方法を、下記の実施例1に記述する。様々な抗原による経験の蓄積から、抗原をフロイントの完全アジュバントと共に最初に腹腔内注射(IP)による免疫化の後、隔週に抗原をフロイントの不完全アジュバントと共に注射した場合に（全体で6回まで）トランスジェニックマウスが反応することが示されている。しかし、フロイント以外のアジュバントもまた有効であることが判明している。さらに、アジュバントの非存在下では細胞全体が高い免疫原性であることが判明している。免疫応答は、眼窩後方採血によって得られた血漿サンプルによって免疫プロトコールの経過にわたりモニターすることができる。血漿をELISA（下記のとおり）によってスクリーニングすることができ、抗Glypican-3ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に用いることができる。屠殺および脾臓摘出の3日前に、マウスに抗原を静脈内に追加免疫することができる。各免疫について2〜3回融合を行う必要があると予想される。通常、マウス6〜24匹を各抗原によって免疫する。一実施態様において、HCo7、HCo12またはHCo17ヒト重鎖トランスジーン系統を担持するマウス株を用いる。代替的にまたは追加的に、KMマウス（登録商標）株を用いることができる。さらに、2以上のこれらの株を、複数の異なるヒト重鎖トランスジーンを有するマウス1匹に交配させることができる。
【０１５９】
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫したマウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離して、マウス骨髄腫細胞株のような好適な不死化細胞株に融合させることができる。得られるハイブリドーマは、抗原-特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫したマウスから得られる脾細胞リンパ球の単一細胞懸濁液を、50％PEGによって、1/6の数のP3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1580）に融合することができる。あるいは、免疫したマウスから得られる脾細胞リンパ球の単一細胞懸濁液を、CytoPulse大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland)を用いる、電気融合方法を基にした電場を用いて融合できる。平底マイクロタイタープレートにおいて細胞を約2×105個で播種した後、20％胎児クローン血清、18％「653」条件培地、5％origin（IGEN）、4 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、5 mM HEPES、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50ユニット/mlペニシリン、50 mg/mlストレプトマイシン、50 mg/mlゲンタマイシン、および1×HAT（Sigma；HATを融合後24時間で加える）を含む選択培地において2週間インキュベートした。約2週間後、HATをHTに置換した培地中で細胞を培養することができる。次いで、個々のウェルを、ヒトモノクローナル抗体IgMおよびIgG抗体に関してELISAによってスクリーニングすることができる。ハイブリドーマの十分な増殖が起こった後、培地を通常10〜14日後に観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再度播種して、再度スクリーニングし、ヒトIgGに関して依然として陽性であれば、モノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをイン・ビトロで培養し、特徴付けのために組織培養培地において抗体の少量を産生させて特性解析することができる。
【０１６０】
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、2Lのスピナーフラスコにおいて増殖させることができる。上清を濾過して濃縮してから、プロテインA-セファロース（Pharmacia, Piscataway, N.J.）によるアフィニティクロマトグラフィーを行うことができる。溶出したIgGをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックして、純度を確認することができる。該緩衝溶液を、PBSに交換して、濃度を吸光係数1.43を用いてOD280によって決定することができる。モノクローナル抗体を、一定分量に分けて-80℃で保存することができる。
【０１６１】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
本発明の抗体はまた、例えば、当技術分野において周知（例えば、Morrison, S.(1985)Science 229:1202）の組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生することができる。
【０１６２】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物学技術（例えば、目的とする抗体を発現するハイブリドーマを用いるPCR増幅またはcDNAクローニング）によって得ることができ、遺伝子が転写および翻訳制御配列に機能的に結合するように発現ベクターにDNAを挿入することができる。この状況において、「機能的に結合した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその目的とする機能を示すように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされていることを意味すると意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞と適合性があるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、異なるベクターに挿入することができ、またはより典型的に双方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法によって発現ベクターに挿入する（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）。本明細書に記述の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、VHセグメントが該ベクター内でCHセグメントに機能的に結合し、VKセグメントがベクター内でCLセグメントに機能的に結合するように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長の抗体遺伝子を作製することができる。追加的にまたは代替的に、組換え型発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで結合するように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）となりうる。
【０１６３】
抗体鎖遺伝子に加えて、発明の組換え型発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。
「調節配列」という用語には、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれると意図される。かかる調節配列は、例えばGoeddel（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Acadamic Press, San Diego, CA(1990)）に記述される。
当業者によは認識されるであろうが、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベル等のような要因に依存する可能性がある。哺乳類宿主細胞発現にとっての好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）およびポリオーマ）から得られるプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーターのような、非ウイルス調節配列を用いてもよい。さらに、調節エレメントには、例えば、SV40初期プロモーターからの配列および1型ヒトT細胞白血病ウイルスの長末端反復を含む、SRαプロモーター系などの異なる起源からの配列が含まれる(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
【０１６４】
抗体鎖遺伝子および調節配列の他に、本発明の組換え型発現ベクターは、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列(例えば、複製開始点) および選択マーカー遺伝子のようなさらなる配列を担持していてもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞の選択を容易にする(例えば、全てAxelらにより米国特許第4,399,216、4,634,665および5,179,017を参照されたい)。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、G418、ヒグロマイシン、またはメソトレキセートのような薬物に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（メソトレキセート選択／増幅によってdhfr-宿主細胞において用いるため）およびneo遺伝子（G418選択のため）が挙げられる。
【０１６５】
軽鎖および重鎖を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。様々な型の「トランスフェクション」は、外因性のDNAを原核または真核宿主細胞に導入するために一般的に用いられる多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、およびDEAEデキストラントランスフェクション等を含むと意図される。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞および最も好ましくは哺乳類宿主細胞における抗体の発現は、そのような真核細胞および特に哺乳類細胞が、適切に構築された免疫学的に活性な抗体をアセンブリおよび分泌させる可能性が原核細胞より高いことから、最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞発現は、高い収率で活性な抗体を産生するためには無効であることが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
【０１６６】
本発明の組換え型抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えば、R.J, Kaufman and P.A. Sharp(1982)Mol. Biol.159:601-621において記述されるDHFR選択マーカーと共に用いられる、Urlaub and Chasin(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記述されるdhfr-CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が挙げられる。特に、NSO骨髄腫細胞を用いる使用に関して、別の好ましい発現系は、WO 87/04462(Wilsonに)、WO 89/01036 (Bebbingtonに)およびEP 338,841 (Bebbingtonに)に開示されたGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え型発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞において抗体を発現させるために、またはより好ましくは宿主細胞が増殖した培地に抗体を分泌させるために十分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
【０１６７】
抗原に結合する抗体の特徴付け
本発明の抗体は、例えば標準的なELISAによってGlypican-3に対する結合に関して試験することができる。要約すると、マイクロタイタープレートを、0.25μg/ml精製Glypican-3のPBS溶液によってコーティングした後、5% 牛血清アルブミンのPBS溶液によってブロッキングした。抗体の希釈液（例えば、Glypican-3免疫マウスからの血漿の希釈液）を各ウェルに加えて、37℃で1〜2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenによって洗浄した後、 アルカリホスファターゼに結合させた二次試薬（例えば、ヒト抗体に関して、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬）と共に37℃で1時間インキュベートした。洗浄後に、該プレートをpNPP基質（1 mg/ml）にて展開させて、OD 405-650で分析した。好ましくは、最高の力価を示すマウスを融合に用いる。
【０１６８】
上記のELISA法はまた、Glypican-3免疫原との反応陽性を示すハイブリドーマに関してスクリーニングするために用いることができる。Glypican-3に対して高い結合力で結合するハイブリドーマをサブクローニングしてさらに特徴を調べる。親細胞の反応性を保持する（ELISAによる）各ハイブリドーマからのクローン1個を-140℃で保存されるバイアル5〜10個の細胞バンクを作製するため、および抗体を精製するために選択することができる。
【０１６９】
抗Glypican-3抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを、モノクローナル抗体精製のために2Lのスピナーフラスコにおいて増殖させることができる。上清を濾過して濃縮してから、プロテインA-セファロースによるアフィニティクロマトグラフィー（Pharmacia, Piscataway, NJ）を行うことができる。溶出したIgGは、純度を確保するために、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーによってチェックすることができる。緩衝液をPBSに交換して、吸光係数1.43を用いてOD280によって濃度を決定することができる。
モノクローナル抗体を一定分量に分けて、−80℃で保存することができる。
【０１７０】
選択された抗Glypican-3モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合する能力を決定するために、各抗体を市販の試薬を用いてビオチン結合することができる(Pierce, Rockford, IL)。Glypican-3被覆ELISAプレートを用いて、非標識モノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験を行うことができる。ビオチン化mAb結合は、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼプローブによって検出することができる。
【０１７１】
精製抗体のアイソタイプを決定するために、特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて、アイソタイプELISAを行うことができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルを1μg/ml抗ヒト免疫グロブリンによって4℃で一晩コーティングした。1％BSAによってブロッキングした後、プレートを1μg/mlまたはそれ以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプコントロールに室温で1〜2時間反応させた。次に、ウェルをヒトIgGまたはヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ結合プローブに反応させることができる。プレートを上記のように展開して分析する。
【０１７２】
抗Glypican-3ヒトIgGを、ウェスタンブロッティングによってGlypican-3抗原との反応性に関してさらに試験することができる。簡単に説明すると、Glypican-3を調製して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロースメンブレンに転写して、10％仔ウシ胎児血清によってブロッキングし、試験すべきモノクローナル抗体によってプローブした。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBY基質タブレット（Sigma Chem., St. Louis, Mo）を用いて展開することができる。
【０１７３】
本発明の抗体の結合特異性を、Glypican-3を発現する細胞への抗体の結合をモニターすることにより、例えばフローサイトメトリーによっても決定できる。通常、細胞株、例えばCHO細胞株を、Glypican-3の膜貫通形態をコードする発現ベクターにてトランスフェクトし得る。トランスフェクトされたタンパク質は、myc-tagなどのタグを、該タグに対する抗体を用いて検出するために好ましくはN-末端で含むことができる。Glypican-3への本発明の抗体の結合を、トランスフェクトされた細胞を抗体とインキュベートすること、および結合抗体を検出することにより決定する。トランスフェクトされたタンパク質上の該タグと抗体の結合を、陽性コントロールとして使用することができる。
【０１７４】
Glypican-3についての本発明の抗体の特異性を、Glypican-3との結合を決定する方法と同じ方法を用いて、抗体が別のタンパク質(例えば、Glypican-1、Glypican-2、Glypican-4またはGlypican-6)またはGlypican-3自身に結合するかしないかを決定することによりさらに試験されてもよい。
【０１７５】
免疫複合体
別の態様において、本発明は、細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素のような治療部分に結合した抗Glypican-3抗体またはその断片を特徴とする。かかる結合体は、本明細書において「免疫複合体」と呼ばれる。1または複数の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と呼ばれる。細胞毒素または細胞毒性薬剤には、細胞にとって有害である（例えば、殺す）任意の物質が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ならびにピューロマイシンおよびその類似体または相同体が含まれる。治療物質にはまた、例えば抗代謝剤(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BSNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス-ジクロロジアミンプラチナ（II）（DDP）（シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアンスラマイシン（AMC））、および抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１７６】
本発明の抗体に結合することができる他の好ましい治療的細胞毒素の例には、デュオカルマイシン、カリケアミシン、メイタンシンおよびアウリスタチンならびにその誘導体が挙げられる。例示的なカリケアミシン抗体結合体は市販されている(Mylotarg（登録商標）; American Home Products)。
【０１７７】
細胞毒素は、当技術分野で利用できるリンカー技術を用いて本発明の抗体に結合することができる。細胞毒素を抗体に結合するために用いられているリンカーのタイプの例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、およびペプチド含有リンカーが挙げられるが、これらに限定するものではない。リソソーマル画分内で低いpHによる切断に対して感受性があるか、または例えばプロテアーゼ、例えばカテプシン（例えば、カテプシンB、C、D）のような腫瘍組織において選択的に発現されるプロテアーゼなどによる切断に対して感受性があるリンカーを選択することができる。
【０１７８】
細胞毒素の例示は、例えば米国特許番号6,989,452、7,087,600、および7,129,261、ならびにPCT出願番号PCT/US02/17210、PCT/US2005/017804、PCT/US06/37793、PCT/US06/060050、PCT/US2006/060711、WO/2006/110476、および米国特許出願番号60/891,028に説明されており、これら全体を出典明示により本明細書の一部に組み込む。細胞毒素のタイプのさらなる議論、抗体と治療剤を結合するためのリンカーおよび方法についても、Saito, G. ら(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264を参照されたい。
【０１７９】
本発明の抗体もまた、細胞毒性放射性薬剤を作製するために放射性同位元素に結合させることができ、同様に放射性免疫複合体と呼ばれる。診断または治療的に用いるために抗体に結合させることができる放射性同位元素の例には、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90およびルテニウム177が含まれるが、これらに限定されない。放射性免疫複合体を調製する方法は当技術分野で確立されている。放射性免疫複合体の例には、Zevalin（登録商標）（IDEC Pharmaceuticals）およびBexxar（登録商標）（Corixa Pharmaceuticals）が挙げられ、および同様の方法が、本発明の抗体を用いて放射性免疫複合体を調製することができる。
【０１８０】
本発明の抗体結合体を用いて、所定の生体反応を改変することができ、薬物部分は古典的な化学治療物質に限定されないと解釈される。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。かかるタンパク質には、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素のような酵素的に活性な毒素またはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン-γのようなタンパク質;または生体応答調節物質、例えばリンフォカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、もしくは他の増殖因子が含まれてもよい。
【０１８１】
かかる治療部分を抗体に結合させるための技術は周知であり、例えば、Arnonら"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy." in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery" in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsonら(eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy." in Monolonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpeら, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) を参照されたい。
【０１８２】
二重特異的分子
別の態様において、本発明は、本発明の抗Glypican-3抗体またはその断片を含む二重特異的分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、別の機能的分子、例えばもう一つのペプチドまたはタンパク質（例えば、もう一つの抗体または受容体のリガンド）に誘導体化または連結させて、少なくとも二つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異的分子を作製することができる。本発明の抗体を、実際に、１以上の機能的分子に誘導体化または連結させて、２以上の結合部位および／または標的分子に結合する多重特異的分子を作製することもでき；かかる多重特異的分子はまた、本明細書において用いられるように「二重特異的分子」という用語に含まれると意図される。本発明の二重特異的分子を作製するために、本発明の抗体は、それによって二重特異的分子が得られるように、他の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣体のような一以上の他の結合分子に機能的に連結（例えば、化学的カップリング、遺伝子的融合、非共有結合会合、またはその他）させることができる。
【０１８３】
従って、本発明には、Glypican-3に対する少なくとも一つの第一の結合特異性および第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異的分子が含まれる。本発明の特定の態様において、第二の標的エピトープはFc受容体であり、例えばヒトFcγRI(CD64)またはヒトFcα受容体(CD89)である。そのため、本発明は、FcγRまたはFcαR発現エフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージ、または多形核細胞（PMN）] とGlypican-3を発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的分子は、Glypican-3発現細胞をエフェクター細胞に標的化して、例えばGlypican-3発現細胞の食作用、抗体依存的細胞性細胞障害性（ADCC）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの産生のような、Fc受容体媒介エフェクター細胞活性を誘発する。
【０１８４】
二重特異的分子が多重特異的である本発明の実施態様において、分子にはさらに、抗Fc結合特異性および抗Glypican-3結合特異性の他に、第三の結合特異性を含めることができる。一実施態様において、第三の結合特異性は抗増強因子（EF）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子である。「抗増強因子部分」は、所定の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによってFc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定因子の作用の増強が起こる抗体、機能的抗体断片またはリガンドとなりうる。「抗増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合することができる。または、抗増強因子部分は、第一および第二の結合特異性が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は、細胞障害性T細胞（例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、または標的細胞に対する免疫応答の増加が起こる他の免疫細胞によって）に結合することができる。
【０１８５】
一実施態様において、本発明の二重特異的分子は、結合特異性として、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAbまたは一本鎖Fvを含む少なくとも一つの抗体、またはその抗体断片を含む。抗体はまた、その内容を参照により本明細書に組み入れられる、Ladnerらの米国特許第4,946,778号に記述されるようにFvまたは一本鎖構築体のような軽鎖もしくは重鎖二量体、またはその任意の最小の断片であってもよい。
【０１８６】
一実施態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性は、その結合がヒト免疫グロブリンG（IgG）によって遮断されないモノクローナル抗体によって提供される。本明細書において用いられるように、「IgG受容体」という用語は、第1染色体上に存在する任意のγ鎖遺伝子8個を指す。これらの遺伝子は、３つのFcγ受容体クラスに分類される膜貫通または可溶性受容体イソ型を全体で12個コードする。一つの好ましい実施態様において、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは、72 kDa分子であり、これは単量体IgGに対して高い親和性（108〜109 M-1）を示す。
【０１８７】
特定の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の産生および特徴付けは、PCT国際公開公報第88/00052号およびFangerらの米国特許第4,954,617号に記述されており、その教示が完全に参照により本明細書に組み入れられる。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位でFcγRI、FcγRII、またはFcγRIIIのエピトープに結合し、このようにその結合は、IgGの生理的レベルによって実質的に遮断されない。本発明において有用である特異的抗FcγRI抗体は、mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62、およびmAb 197である。mAb 32を産生するハイブリドーマは、American Type Culture Collection ATCCアクセッション番号HB 9469から入手可能である。別の実施態様において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22（H22）のヒト化型である。H22抗体の産生および特徴付けは、Graziano, R.F.ら(1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 およびTempestらのPCT国際公開公報第WO 94/10332に記述されている。H22抗体産生細胞株は、American Type Culture CollectionにHA022CL1の名称で寄託され、アクセッション番号CRL 11177を有する。
【０１８８】
さらに他の好ましい態様において、Fc受容体の結合特異性は、その結合が好ましくはヒト免疫グロブリンA（IgA）によって遮断されないヒトIgA受容体、例えばFc-α受容体（FcαRI（CD89））に結合する抗体によって提供される。「IgA受容体」という用語には、第19染色体に存在する一つのα遺伝子（FcαRI）の遺伝子産物が含まれると意図される。この遺伝子は、55〜110 kDaのいくつかの選択的スプライシング膜貫通イソ型をコードすることが知られている。FcαRI（CD89）は、単球／マクロファージ、好酸球および好中球顆粒球にて構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団では発現されない。FcαRIは、IgA1およびIgA2の双方に対して中等度の親和性（〜5×107 M-1）を有し、これはサイトカイン、例えばG-CSFまたはGM-CSF等に暴露することにより増加される(Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。IgAリガンド結合ドメイン外でFcαRIに結合するA3、A59、A62およびA77と同定された4つのFcαRI-特異的モノクローナル抗体が記述されている(Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764)。
【０１８９】
FcαRIおよびFcγRIは、本発明の二重特異的分子において用いるための好ましい誘発受容体であるが、その理由は、それらが(1)免疫エフェクター細胞、例えば単球、PMN、マクロファージ、および樹状細胞において主に発現される; (2) 高レベルで発現される（例えば、細胞あたり5,000〜100,000個）; (3) 細胞毒性活性のメディエータである（例えば、ADCC、貪食）；および(4) それらに標的化される自己抗原を含む抗原の抗原提示の増強を媒介するためである。
【０１９０】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異的分子において用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１９１】
本発明の二重特異的分子は、当技術分野で公知の方法を用いて、構成成分結合特異性部分、例えば抗FcRおよび抗Glypican-3結合特異性部分を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異的分子の各結合特異性部分を個々に作成し、それらを互いに結合させることができる。結合特異性部分がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合のために多様なカップリング剤または架橋剤を用いることができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシニミジル-S-アセチル-チオアセテート（SATA）、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、およびスルホスクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)(例えば、Karpovskyら(1984)J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MAら(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法には、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan ら(1985) Science 229:81-83、およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375) において記述される方法が含まれる。好ましい結合物質は、SATAおよびスルホ-SMCCであり、いずれもPierce Chemical Co.（Rockford, IL）から入手できる。
【０１９２】
結合特異性部分が抗体である場合、それらを、二つの重鎖のC-末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合させることができる。特に好ましい態様において、ヒンジ領域は結合の前に奇数、好ましくは1個のスルフヒドリル残基を含むように改変される。
【０１９３】
あるいは、両方の結合特異性部分が、同じベクターにおいてコードされ、同じ宿主細胞において発現およびアセンブリされる。この方法は、二重特異的分子は、mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二重特異的分子は、一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子となり得るか、または二つの結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子となり得る。二重特異的分子は、少なくとも2本の一本鎖分子を含んでいてもよい。二重特異的分子を調製する方法は、例えば米国特許第5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498；および 5,482,858に記述されており、これらの全てを出典明示により本明細書に組み入れる。
【０１９４】
その特異的標的に対する二重特異的分子の結合は、例えば酵素結合結合免疫吸着測定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、FACS分析、バイオアッセイ法（例えば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイ法によって確認することができる。 これらのアッセイ法のそれぞれは一般的に、目的とする複合体に対して特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることによって、特に目的とするタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えば、FcR-抗体複合体は、例えば、抗体-FcR複合体を認識して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出することができる。あるいは、複合体は、任意の多様な他のイムノアッセイ法を用いて検出することができる。例えば、抗体を放射活性標識して、ラジオイムノアッセイ法（RIA）において用いることができる(例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたい。本明細書に出典明示により本明細書に組み入れられる)。放射性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを用いるような手段によって検出することができる。
【０１９５】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、医薬上許容される担体と共に製剤化された、本発明のモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を一つまたは組合せて含む組成物、例えば薬学的組成物を提供する。かかる組成物には、一つまたは組合せた（例えば、二つまたはそれ以上の異なる）本発明の抗体、免疫複合体、または二重特異的分子が含まれてもよい。
例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合する、または相補的活性を有する抗体（または免疫複合体もしくは二重特異的分子）の組み合わせを含むことが可能である。
【０１９６】
本発明の医薬組成物もまた、併用治療において、すなわち他の物質と併用して投与することができる。例えば、併用治療には、少なくとも一つの他の抗炎症または免疫抑制剤と併用した本発明の抗Glypican-3抗体が挙げられる。併用治療に使用できる治療物質の例示には、本発明の抗体の使用に関する下記の章においてより詳しく記述される。
【０１９７】
本明細書において用いられるように、「医薬上許容される担体」には、生理的に適合性のある任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が挙げられる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮内投与（例えば注射または注入）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体、または二重特異的分子は、酸の作用および化合物を不活化する可能性がある他の天然の条件から化合物を保護する材料によってコーティングしてもよい。
【０１９８】
本発明の医薬組成物には、一以上の医薬上許容される塩が含まれてもよい。「医薬上許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持して、望ましくない毒性作用を与えない塩を指す（例えば、Berge, S.M.ら(1977)J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照されたい）。
かかる塩の例示には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、燐酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、および燐等のような非毒性の無機酸と共に、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等のような非毒性有機酸から得られる塩が挙げられる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウム等のようなアルカリ土類金属と共に、例えばN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、塩素、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカイン等のような非毒性の有機アミンから得られる塩が挙げられる。
【０１９９】
本発明の医薬組成物にはまた、医薬上許容される抗酸化剤が含まれてもよい。医薬上許容される抗酸化剤の例には、(1) アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤；(2) アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、プロピルガレート、およびα-トコフェロール等のような脂溶性抗酸化剤；および (3) クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、および燐酸等のような金属キレート剤、が含まれる。
【０２００】
本発明の医薬組成物において用いることができる好適な水溶性および非水溶性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール等）、およびその好適な混合物、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが含まれる。例えば、レシチンのようなコーティング材料を用いることによって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。
【０２０１】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の予防は、微生物の存在の予防は、上記滅菌技法によって、および様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸等を含めることによって確保してもよい。例えば、糖、塩化ナトリウム等のような等張剤を組成物に含ませることが望ましいかも知れない。さらに、注射用医薬形態の吸収持続型は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を含むことによって得てもよい。
【０２０２】
医薬上許容される担体には、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。このような媒体および物質を薬学的に活性の物質のために使用することが当該技術において知られている。如何なる通常の媒体または物質も活性化合物と不適合性である場合を除き、本発明の薬学的組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に、組成物に組み入れることができる。
【０２０３】
治療的組成物は典型的に、製造および保存条件で滅菌および安定でなければならない。
組成物は、溶液、微小乳剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の調製された構造体として調製することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、およびその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体となりうる。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって得ることができる。
【０２０４】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、上記成分の一つまたはそれらの組み合わせとともに適切な溶媒中に組み入れた後、必要に応じて滅菌精密濾過をすることにより調製することができる。一般的に、分散剤は、基本的な分散媒体および先に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。分散剤は、滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分に、事前に無菌ろ過した溶液からのあらゆる所望の追加成分を加えた粉末となる真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）である。
【０２０５】
担体材料と配合して単一の投与剤形を生じることができる活性成分の量は、治療すべき被験者、および特定の投与様式に応じて変化すると考えられる。担体材料と配合して単一の投与剤形を生じることができる活性成分の量は、一般的に治療効果を生じる組成物の量であると考えられる。一般的に100％のうち、この量は活性成分の約0.01％〜約99％、好ましくは約0.1〜約70％、最も好ましくは、医薬的に許容され得る担体との配合中に活性成分が約1％〜約30％の範囲である。
【０２０６】
投与計画は、目的とする最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、1回ボーラス投与を行ってもよく、数回に投与量を分けて経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性に応じて投与量を減ずるかまたは増量することもできる。
特に、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を単位投与形態として製剤化するのが有利である。本明細書において用いられる単位投与剤形は、治療すべき被験者に関して単位用量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な医薬用担体と関連させて所望の治療効果をもたらすように計算され、あらかじめ決定された活性成分の量を含む。本発明の単位投与剤形の仕様は、(a) 活性化合物の独自の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに(b) 個体における感受性に関する治療のためにそのような活性化合物を調剤する場合の当技術分野において固有の制限により左右され、かつ直接的に依存する。
【０２０７】
抗体を投与する場合、用量は、約0.0001〜100 mg/kg、およびより通常0.01〜5 mg/kg宿主体重の範囲である。例えば、用量は、0.3 mg/kg体重、1 mg/kg体重、3 mg/kg体重、5 mg/kg体重、または10 mg/kg体重であるか、または1-10 mg/kgの範囲内でありうる。例示的な処置方法には、1週間に1回、2週間に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回、毎月1回、3ヶ月に1回、または3〜6ヶ月毎に1回の投与が挙げられる。本発明の抗Glypican-3抗体に関する好ましい投与計画には、1 mg/kg体重または3 mg/kg体重を静脈内投与によって投与することが含まれ、抗体は以下の投与計画の一つを用いて投与される：(i) 4週間毎に6回投与、その後3ヶ月毎；(ii) 3週間毎 （iii）3 mg/kg体重の後に1 mg/kg体重を3週間毎。
【０２０８】
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する2つまたはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与して、この場合、投与される各抗体の用量は、示された範囲内に入る。抗体は通常、複数回投与される。投与間隔は、例えば毎週、毎月、3ヶ月毎または毎年であってもよい。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液中レベルを測定することによって示されるように不規則であることも可能である。いくつかの方法において、用量は約1〜1000 μg/mlの抗体血漿濃度となるように、およびいくつかの方法において約25〜300μg/mlに達するように調節される。
【０２０９】
あるいは、抗体は徐放製剤として投与することができ、この場合には、この場合必要な投与回数はより少ない。用量および投与回数は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般的に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、その後にヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与の用量および頻度数は、治療が予防的または治療的であるか否かに応じて変化しうる。予防的適用の場合、比較的低用量を比較的少ない回数で長期間投与する。患者によっては、人生の残りの期間、治療を受け続ける。治療用途においては、疾患の進行が減少または停止するまで、および好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高用量を比較的短期間で投与することが時に必要である。その後、患者に予防的方法で投与することができる。
【０２１０】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベル変化させることで、患者に対して毒性を示すことなく特定患者に対して目的とする治療応答を得る有効な活性成分、組成および投与様式を得ることができる。選択される用量レベルは、使用した本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、治療期間、他の薬剤、用いる特定の組成物と併用して使用した化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および既往歴、および医学の技術分野において周知の因子を含む様々な薬物動態因子に左右されると考えられる。
【０２１１】
本発明の抗Glypican-3抗体の「治療的有効量」によって、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、無病期間の回数および期間の増加、または疾患に罹患したことによる不全または障害の予防が起こる。例えば、Glypican-3+腫瘍の処置に関して、「治療的有効量」は、好ましくは細胞増殖または腫瘍の増殖を、非処置被験者と比較して少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、およびさらにより好ましくは少なくとも約80％阻害する。化合物が腫瘍の増殖を阻害できる能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性を、化合物の細胞増殖阻害能を調べることによって評価することができ、かかる阻害は当業者に公知のアッセイ法によるイン・ビトロで測定できる。治療用化合物の治療的有効量は、被験者における腫瘍の大きさを減少させることができるか、またはそうでなければ症状を改善することができる。当業者であれば、被験者の体格、被験者の症状の重症度、および選択した特定の組成物または投与経路のようなファクターに基づいてかかる量を決定することができるであろう。
【０２１２】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の多様な方法の1つまたは複数を用いて、1つまたは複数の投与経路によって投与することができる。当業者によって認識されるであろうが、投与経路および投与様式は所望の結果に応じて変化すると思われる。発明の抗体の好ましい投与経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書において用いられるように「非経口投与」なる句は、通常、注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、およびこれには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢内、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注注射および点滴が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１３】
あるいは、本発明の抗体は、局所、表皮、または粘膜内投与経路のような、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下、または局所のような、非経口経路によって投与することができる。
【０２１４】
活性化合物は、迅速な放出に対して化合物を保護する担体と共に調製することができ、例えば、インプラント、経皮パッチ、および微小封入送達系を含めた徐放製剤などである。エチレン-酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。かかる製剤の調製に関する多くの方法が特許出願されており、当分野の技術者には公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０２１５】
治療組成物は、当技術分野で公知の医療用装置によって投与することができる。例えば、好ましい実施態様において、本発明の治療組成物は、米国特許第5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824;または 4,596,556に開示される装置のような針のない皮下注射装置によって投与することができる。本発明において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、以下が含まれる：制御された速度で薬剤を分配するための埋め込み式微量注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603; 皮膚を通して薬剤を投与するための治療装置を開示する米国特許第4,486,194号；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233；持続的薬物送達のための可変流速埋め込み型注入装置を開示する米国特許第4,447,224；多室区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196；および浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,475,196。これらの特許は、参照により本明細書に組み入れられる。そのような多くの他のインプラント、送達システム、およびモジュールは、当業者に公知である。
【０２１６】
特定の態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、イン・ビボで適切な分布を確保するために調製することができる。例えば、血液−脳関門(BBB) は、多くの高親水性の化合物を排除する。本発明の治療化合物がBBBを確実に通過するためには（所望であれば）、それらを例えばリポソームに調製することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第4,522,811号；5,374,548号；および5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送され、そうして標的化薬物送達を増強する一つまたは複数の部分を含んでもよい（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例としてのターゲティング部分には、葉酸塩またはビオチン（例えば、米国特許第5,416,016、Lowらに対する)；マンノシド(Umezawaら, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180);界面活性剤プロテインA受容体(Briscoeら. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier ら(1994) J. Biol. Chem. 269:9090);K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273)を参照されたい。
【０２１７】
用途および方法
本発明の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物、および方法は、Glypican-3媒介障害の診断および処置を伴う多数のイン・ビトロおよびイン・ビボ診断および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、多様な障害を処置、予防、および診断するために、イン・ビトロまたはエクス・ビボで培養細胞に、または例えばイン・ビボでヒト被験者に投与することができる。本明細書で使用されるように、用語「患者」には、ヒトおよび非ヒト動物を包含することが意図される。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、およびは虫類などが挙げられる。好ましい被験者にはGlypican-3活性によって媒介される障害を有するヒト患者が含まれる。該方法は、異常なGlypican-3発現に関連した障害を有するヒト患者を処置するために特に好適である。Glypican-3に対する抗体を別の物質と共に投与する場合、両者を順に、または同時に投与することができる。
【０２１８】
Glypican-3に関する本発明の抗体の特異的結合を考慮すると、本発明の抗体は、細胞表面上のGlypican-3発現を特異的に検出するために用いることができ、その上免疫アフィニティ精製によってGlypican-3を精製するために用いることができる。
【０２１９】
さらに、多様な肝臓腫瘍細胞上のGlypican-3の発現を考慮すると、本発明のヒト抗体、抗体組成物および方法を用いて、腫瘍形成性障害、例えば、HCC細胞などを含むGlypican-3を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害を有する患者を処置する。
【０２２０】
一実施態様において、本発明の抗体(例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異的および二重特異的分子および組成物）は、Glypican-3のレベル、またはその膜表面上にGlypican-3を含む細胞のレベルを検出するために用いることができ、次にこのレベルを、特定の疾患症状に結びつけることができる。または、抗体を用いて、Glypican-3機能を阻害または遮断することができ、次にこれを特定の疾患症状の予防または改善に結びつけて、それによって疾患のメディエーターとしてGlypican-3を関係づけることができる。これは、サンプルおよびコントロールサンプルを、抗体とGlypican-3の複合体とを形成できる条件下で、抗Glypican-3抗体に接触させることによって行うことができる。抗体とGlypican-3とのあいだに形成された如何なる複合体も検出して、サンプルおよびコントロールにおいて比較する。
【０２２１】
別の態様において、本発明の抗体(例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子および組成物)は、最初に、イン・ビトロでの治療的または診断的使用に関連した結合活性に関して試験することができる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例において記述されるフローサイトメトリーアッセイ法を用いて試験することができる。
【０２２２】
本発明の抗体(例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子、免疫複合体および組成物)は、Glypican-3関連疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。 例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異的または二重特異的分子および免疫複合体はイン・ビボまたはイン・ビトロで、次の１以上の生物学的活性を誘発するために用いることができる： Glypican-3を発現する細胞の増殖を阻害するおよび／またはGlypican-3を発現する細胞を殺す活性；ヒトエフェクター細胞の存在下でGlypican-3を発現する細胞の食作用もしくはADCCを媒介するか、またはGlypican-3に対するGlypican-3リガンド結合を遮断する活性。
【０２２３】
特定の態様において、抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子および組成物）は、多様なGlypican-3関連疾患を処置、予防、または診断するためにイン・ビボで用いられる。Glypican-3関連疾患の例には、特に、HCCおよび他の肝臓癌が挙げられる。
【０２２４】
本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異的および二重特異的分子および免疫複合体）をイン・ビボおよびイン・ビトロで投与するために好適な経路は、当技術分野において周知であり、当業者によって選択されうる。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈内または皮下）によって投与することができる。用いられる分子の適した用量は、被験者の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および／または配合に依存すると考えられる。
【０２２５】
先に記述したように、本発明のヒト抗Glypican-3 抗体は、１または複数の他の治療物質、例えば細胞障害物質、放射性障害物質、または免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、物質に連結させることができ（免疫複合物として）、または物質とは別に投与することができる。後者の場合（別に投与）、抗体は、物質の前、後、もしくは同時に投与することができるか、または他の公知の治療法、例えば抗癌治療、例えば放射線療法と同時投与することができる。かかる治療物質には、特に、それ自身、患者にとって毒性または亜毒性であるレベルに限って有効であるドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミド、ヒドロキシウレアなどの抗新生物剤が含まれる。シスプラチンは、100 mg/用量を4週間毎に1回静脈内投与し、アドリアマイシンは60〜75 mg/ml用量を21日毎に静脈内投与する。本発明のヒト抗Glypican-3抗体またはその抗原結合断片と化学療法剤とを同時投与することは、ヒト腫瘍細胞に対して細胞障害効果を生じる異なるメカニズムによって操作する二つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、薬物に対する耐性の発生、またはそれらを抗体に非反応性にすると思われる腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決することができる。
【０２２６】
標的特異的エフェクター細胞、例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子）に連結したエフェクター細胞もまた、治療物質として用いることができる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球、または単球のようなヒト白血球でありうる。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞、および他のIgGまたはIgA受容体を有する細胞が含まれる。所望の場合には、エフェクター細胞は、処置される被験者から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理的に許容される溶液における細胞懸濁液として投与することができる。投与される細胞数は、108〜109個のオーダーでありうるが、これは治療目的に応じて変化すると思われる。一般的に、該量は、標的細胞、例えばGlypican-3を発現する腫瘍細胞での局在を得るために、および例えば食作用によって殺細胞を行うために十分である思われる。投与経路も同様に変化しうる。
【０２２７】
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞を除去するための他の技術と共に行うことができる。例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子）および／またはこれらの組成物を有するエフェクター細胞を用いる抗腫瘍治療を用いる抗腫瘍治療を、化学療法と共に用いることができる。さらに、併用免疫療法は、異なる二つの細胞障害性エフェクター集団を腫瘍細胞の拒絶に向けるために用いてもよい。例えば、抗FcγRIまたは抗CD3に連結した抗Glypican-3抗体を、IgGまたはIgA受容体特異的結合物質と共に用いてもよい。
【０２２８】
本発明の二重特異的および多重特異的分子はまた、例えば、細胞表面上での受容体のキャッピングおよび排除などにより、エフェクター細胞上のFcγRまたはFcγRレベルを調節するために用いることができる。抗-Fcレセプターの混合物も同様に、この目的のために用いることができる。
【０２２９】
補体結合部分、補体に結合するIgG1、-2、もしくは-3、またはIgMからの部分を有する発本明の組成物(例えば、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、複数の特異的および二重特異的分子および免疫複合体)は、補体の存在にも使用され得る。一実施態様において、本発明の結合物質および適当なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞集団のエクスビボ処置は、補体または補体を含む血清を加えることによって補うことができる。本発明の結合物質をコーティングした標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善されうる。別の態様において、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子）をコーティングした標的細胞はまた、補体によって溶解されうる。さらにもう一つの態様において、本発明の組成物は補体を活性化しない。
【０２３０】
本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、多重特異的および二重特異的分子および免疫複合体）はまた、補体と共に投与することができる。特定の態様において、本開示は、ヒト抗体、多重特異的または二重特異的分子、および血清または補体を含む組成物を提供する。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異的、または二重特異的分子に対して非常に近位に存在する場合に有利でありうる。または本発明のヒト抗体、多重特異的、または二重特異的分子および補体または血清は個別に投与することができる。
【０２３１】
また、本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異的、または多重特異的分子、または免疫複合体）および使用説明書を含むキットも同様に本発明の範囲に含まれる。キットはさらに、免疫抑制剤、細胞障害物質、または放射性障害物質、または本発明の一つもしくは複数のさらなるヒト抗体（例えば、Glypican-3抗原において第一のヒト抗体とは異なるエピトープに結合する補体活性を有するヒト抗体）のような一つまたは複数のさらなる試薬を含みうる。
【０２３２】
従って、本発明の抗体組成物により処置される患者は、ヒト抗体の治療効果を増強または強化する細胞毒性物質または放射毒性物質などの別の治療物質をさらに投与する（本発明のヒト抗体の前、同時、または後に）ことができる。
【０２３３】
他の態様において、被験者を、例えば被験者をサイトカインによって処置することによって、FcγまたはFγ受容体の発現または活性を調節、例えば増強または阻害する物質によってさらに処置することができる。多重特異的分子による処置の際に投与するために好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、および腫瘍壊死因子（TNF）が含まれる。
【０２３４】
本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異的および二重特異的分子）はまた、例えばかかる細胞を標識するために、FcγRまたはGlypican-3を発現する細胞を標的とするために用いることができる。かかる用途に関して、結合物質を、検出されうる分子に連結することができる。このように、本発明は、FcγR、またはGlypican-3のようなFc受容体を発現する細胞をエクス・ビボまたはイン・ビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子であってもよい。
【０２３５】
特定の態様において、発明は、サンプルおよびコントロールサンプルを、抗体またはその一部とGlypican-3との複合体を形成させる条件で、Glypican-3に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片に接触させる段階を含む、サンプル中のGlypican-3抗原の存在を検出するための、またはGlypican-3抗原の量を測定するための方法を提供する。その後、複合体の形成が検出されるが、ここでコントロールサンプルと比較してサンプルのあいだで複合体の形成が異なれば、サンプル中にGlypican-3抗原が存在することを示している。
【０２３６】
別の実施態様において、本発明は、被験者におけるGlypican-3媒介障害、例えば、HCCおよび他の肝臓癌を処置する方法を提供する。
【０２３７】
さらにもう一つの態様において、本発明の免疫複合体を用いて、かかる化合物（例えば、治療物質、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤等）を抗体に連結させることによって、Glypican-3細胞表面受容体を有する細胞に、化合物をターゲティングすることができる。例えば、抗Glypican-3抗体を、米国特許第6,281,354および6,548,530、米国特許出願公開第20030050331、20030064984、20030073852、および20040087497に記述されるか、または国際公開公報WO 03/022806に公開される毒素化合物のいずれかに結合することができる。このように、本発明はまた、Glypican-3を発現する細胞をエクス・ビボまたはイン・ビボで局在化させるための方法(例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素共因子のような検出可能な標識によって)を提供する。あるいは、免疫複合体は、Glypican-3に細胞毒素または放射性毒素をターゲティングすることによってGlypican-3細胞表面受容体を有する細胞を殺すために用いることができる。
【０２３８】
本発明は、下記実施例によりさらに説明されるが、これらをさらに制限的に解釈すべきではない。本出願を通して引用した全ての図面および全ての参考文献、特許、ならびに公表された特許出願の内容物は、特に参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１Ａ】図1Aは、4A6 ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号 25)およびアミノ酸配列(配列番号 19)示す。CDR1(配列番号 1)、CDR2(配列番号 4)およびCDR3(配列番号 7)領域に線を付し、該V、DおよびJ生殖細胞系列誘導体を示した。
【図１Ｂ】図1Bは、4A6 ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号 28)およびアミノ酸配列(配列番号 22)示す。CDR1(配列番号 10)、CDR2(配列番号 13)およびCDR3(配列番号 16)領域に線を付し、該VおよびJ生殖細胞系列誘導体を示した。
【図２Ａ】図2Aは、11E7 ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号 26)およびアミノ酸配列(配列番号 20)示す。CDR1(配列番号 2)、CDR2(配列番号 5)およびCDR3(配列番号 8)領域に線を付し、該VおよびJ生殖細胞系列誘導体を示した。
【図２Ｂ】図2Bは、11E7 ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号 29)およびアミノ酸配列(配列番号 23)を示す。CDR1(配列番号 11)、CDR2(配列番号 14)およびCDR3(配列番号 17)領域に線を付し、該VおよびJ生殖細胞系列誘導体を示した。
【図３Ａ】図3Aは、16D10 ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号 27)およびアミノ酸配列(配列番号 21)を示す。CDR1(配列番号 3)、CDR2(配列番号 6)およびCDR3(配列番号 9)領域に線を付し、該VおよびJ生殖細胞系列誘導体を示した。
【図３Ｂ】図3Bは、16D10 ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(配列番号 30)およびアミノ酸配列(配列番号 24)を示す。CDR1(配列番号 12)、CDR2(配列番号 15)およびCDR3(配列番号 18)領域に線を付し、該VおよびJ生殖細胞系列誘導体を示した。
【図４】図4は、ヒト生殖細胞系列VH 5-51 アミノ酸配列(配列番号 31)およびヒト生殖細胞系列JH JH4b アミノ酸配列(配列番号 32)と、4A6 (配列番号 19)の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図５】図5は、ヒト生殖細胞系列VH 5-51 アミノ酸配列(配列番号 31)およびヒト生殖細胞系列JH JH4b アミノ酸配列(配列番号 32)と、11E7(配列番号 20)の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図６】図6は、ヒト生殖細胞系列VH 5-51 アミノ酸配列(配列番号 31)およびヒト生殖細胞系列JH JH4b アミノ酸配列(配列番号 32)と、16D10 (配列番号 21)の重鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図７】図7は、ヒト生殖細胞系列Vk A27 アミノ酸配列(配列番号 33)およびヒト生殖細胞系列JK JK4 アミノ酸配列(配列番号 34)と、4A6 (配列番号 22)の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図８】図8は、ヒト生殖細胞系列Vk A27 アミノ酸配列(配列番号 33)およびヒト生殖細胞系列JK JK4 アミノ酸配列(配列番号 34)と、11E7 (配列番号 23)の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図９】図9は、ヒト生殖細胞系列Vk A27 アミノ酸配列(配列番号 33)およびヒト生殖細胞系列JK JK1 アミノ酸配列(配列番号 35)を有する16D10 (配列番号 24)の軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図１０】図10は、4A6、11E7、および16D10 モノクローナル抗体のHCC 細胞株 Hep-3Bに対する結合親和性を示す。結合を蛍光活性化細胞ソーター("FACS")アッセイを用いて測定した。
【図１１】図11は、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、HCC 細胞株Hep-3BおよびHep-G2に特異的に結合することを示す。結合を、FACSアッセイを用いて測定した。
【図１２】図12は、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、親のCHO細胞株ではなく、Glypican-3 発現ベクターにより安定にトランスフェクトされたCHO細胞に特異的に結合することを示す。結合を、FACSアッセイを用いて測定した。
【図１３】図13は、患者から採取されたモノクローナル抗体4A6は肝臓癌細胞に結合することを示す。抗体結合は、免疫組織化学アッセイにおいて明らかにされた。
【図１４】図14は、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、Hep-3B 細胞のナチュラルキラー(「NK」)T-細胞媒介性殺傷を媒介できることを示す。殺傷を、抗体依存性の細胞毒性("ADCC")アッセイにより測定した。
【図１５】図15は、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、細胞-表面のGlypican 3に結合した後にHep-3B細胞により内在化されることを示す。内在化を、Hum-ZAPアッセイ(Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)により測定した。
【図１６】図16は、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10が、細胞-表面のGlypican 3に結合した後にHep-3B 細胞により内在化されることを示す。内在化が免疫蛍光アッセイにおいて明らかにされた。
【実施例】
【０２４０】
実施例1:Glypican-3抗原に対するヒトモノクローナル抗体の作成
抗原
非Glypican-3ポリペプチドである、ヒスチジンタグと結合したGlypican-3タンパク質の細胞外ドメインを含む組換え融合タンパク質、即ちGlypican-3-hisを作成した。Glypican-3-hisを、標準的な組換え方法により作成し、免疫化のための抗原として使用した。さらに、Glypican-3-Myc発現構築体を用いてトランスフェクトしたCHO細胞および細胞株Hep-G2を、免疫化のための抗原として使用した。
【０２４１】
トランスジェニックHuMAbマウス（登録商標）およびKMマウス（登録商標）
Glypican-3に対して完全なヒトのモノクローナル抗体を、ヒトの抗体遺伝子を発現する、トランスジェニックHuMAb Mouse（登録商標）のHCo17株および染色体導入トランスジェニックマウスのKM株の各々を用いて調製した。HCo17株を、国際公開公報第WO/2005/058815に記述されたとおりに構築し、これを出典明示により本明細書の一部とする。該KM株を、国際公開公報第WO02/43478に記述されたとおりに構築し、これらを出典明示によりその全てを本明細書に組み入れられる。
【０２４２】
HuMabマウスおよびKMマウス免疫付与
Glypican-3に対して完全なヒトモノクローナル抗体を作成するために、HuMAbマウス（登録商標）およびKMマウス（登録商標）のマウスを、CHO-S細胞、Glypicn-3-Mycタンパク質を発現するCHO細胞およびHep-G2細胞内で発現したGlypican-3-hisタンパク質を用いて免疫化した。HuMAbマウス（登録商標）についての一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N.ら(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. ら(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびPCT国際公開公報WO98/24884に記述されている。マウスは、最初の抗原注入時に6-16週齢であった。Glypican-3融合タンパク質またはGlypican-3発現細胞(1x107 細胞)の精製組換え調製物(5-25μg)を用いて、各々HuMabマウス（登録商標）およびKMマウス（登録商標）を免疫した。
【０２４３】
トランスジェニックマウスを、完全フロイントアジュバントまたはRibiアジュバント中の抗原を用いて、腹腔内（IP）、皮下(Sc)または足蹠(FP)いずれかにて免疫した後、不完全フロイントまたはRibiアジュバント中の抗原を用いて3-21日間IP、ScまたはFP免疫を行った(計12回免疫まで)。免疫反応を後眼窩採血により観察した。血漿をELISAおよびFACSにより（後述のようにして）スクリーニングし、および十分な抗Glypican-3ヒト免疫グロブリン価を有するマウスを融合に使用した。屠殺して脾臓を摘出する2、3日前にマウスに抗原で静脈内追加免疫を行った。通常どおり、各抗原について10-35回の融合をおこなった。数十匹のマウスを各抗原について免疫した。
【０２４４】
抗Glypican-3 抗体を産生するHuMabマウス（登録商標）またはKMマウス(登録商標）の選択
Glypican-3に結合する抗体を産生するHuMabマウス（登録商標）またはKMマウス(登録商標）を選別するために、Fishwild, D.ら(1996)（上掲）によって記述されたELISAによって免疫マウス由来の血清を試験した。簡単に言うと、PBS中1〜2μg/mlの精製組み換え型Glypican-3でマイクロタイタープレートをコーティングし、50μl／ウェルを4℃で一晩インキュベートし、次いでPBS/Tween(0.05%)中に5％トリの血清の200μl／ウェルでブロッキングした。Glypican-3免疫化マウス由来の血漿希釈物を各ウェルに加え、周囲温度で1〜2時間インキュベートした。そのプレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ヒトIgGFcポリクローナル抗体と共に室温で1時間インキュベートした。洗浄後、そのプレートをABTS基質で展開し、分光光度計を用いてOD415〜495で分析した。
【０２４５】
次いで、免疫化マウス由来の血清を、Glypican-3を発現しないコントロール細胞株ではないが組換えヒトGlypican-3を発現する細胞株への結合について、フローサイトメトリーによりさらにスクリーニングした。簡単にいうと、抗Glypican-3抗体の結合を、1:20希釈にてGlypican-3発現CHO細胞と抗Glypican-3抗体とのインキュベーションにより評価した。該細胞を洗浄し、結合をFITC標識抗ヒトIgG Abを用いて検出した。フローサイトメトリー分析を、FACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて行った。抗Glypican-3抗体の最も高い力価を示したマウスを融合に用いた。融合は後述のように行い、ハイブリドーマ上清を、ELISAおよびFACSにより抗Glypican-3活性について試験した。
【０２４６】
Glypican-3に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製：
HuMab マウス（登録商標）またはKMマウス（登録商標）から単離したマウス脾細胞は、サイトパルス大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse large chamber cull fusion electroporator)(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD) を用いる電場型電気融合を用いて融合された。次いで、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングした。免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、SP2/0サイトパルス大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)を用いる電場型電気融合を用いて非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1581）と融合させた。細胞を、平底マイクロタイタープレートにおいて約1x104細胞/ウェルで播種して、その後10％ウシ胎児血清、10％P388D1（ATCC, CRL TIB-63）調整培地、ならびに5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50mg/mlゲンタマイシン、および1×HAT（Sigma, CRL P-7185）を加えたDMEM（Mediatech, CRL 10013、高グルコース、L-グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含む）中の3-5%origen(IGEN)を含む選択培地において約2週間インキュベートした。1〜2週間後、HATをHTに置換した培地において細胞を培養した。個々のウェルを、ヒト抗Glypican-3モノクローナルIgG抗体に関してELISAおよびFACS（上記）によってスクリーニングした。十分なハイブリドーマの増殖が起こった後、培地を通常10〜14日後にモニターした。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種して、再度スクリーニングし、ヒトIgGに関してなおも陽性であれば、抗Glypican-3 モノクローナル抗体を、限界希釈によって少なくとも2回サブクローニングした。次いで、安定なサブクローンをイン・ビトロで培養して、さらなる特徴付けのために組織培養培地において抗体を少量産生させた。
【０２４７】
HuMAbマウス（登録商標）から作成したハイブリドーマクローン4A6、11E7、および16D10を、さらなる分析のために選択した。
【０２４８】
実施例2:ヒトモノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10の構造の特徴付け
4A6、11E7、および16D10のモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列を、各々標準的なPCR技術を用いて4A6、11E7、および16D10ハイブリドーマから得て、標準的なDNA配列決定技術を用いて配列決定を行った。
【０２４９】
4A6の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図1Aおよび配列番号 25および19各々に示す。
【０２５０】
4A6の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図1Bならびに配列番号 28および22各々に示した。
【０２５１】
4A6重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列との比較から、該4A6重鎖は、ヒト生殖細胞系列VH5-51由来のVHセグメントおよびヒト生殖細胞系列JH4b由来のJHセグメントから作成することが示された。4A6VH配列と生殖細胞系列VH 5-51配列のアラインメントを図4に示す。CDR領域決定に関するKabat系を用いる4A6VH配列のさらなる分析から、図1Aおよび4、ならびにそれぞれ配列番号 1、4および7に示されるような重鎖CDR1領域、CDR2領域およびCD3領域が記載された。
【０２５２】
4A6軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列の比較から、該4A6軽鎖は、ヒト生殖細胞系列VKA27由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系列JK4由来のJKセグメントから作成されることが示された。4A6VL配列と生殖細胞系列VKA27配列のアラインメントを図7に示した。CDR領域決定に関するKabat系を用いる4A6VL配列のさらなる分析から、図1Bおよび7、ならびにそれぞれ配列番号 10、13、および16に示されるような軽鎖のCDR1領域、CDR2領域およびCD3領域が記載された。
【０２５３】
11E7の重鎖可変領域に関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図2Aならびにそれぞれ配列番号 26および20に示した。
【０２５４】
11E7の軽鎖可変領域に関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図2Bならびにそれぞれ配列番号 29および23に示した。
【０２５５】
11E7重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列の比較から、該11E7重鎖は、ヒト生殖細胞系列VH5-51由来のVHセグメントおよびヒト生殖細胞系列JH4b由来のJHセグメントから作成されることが示された。11E7VH配列と生殖細胞系列VH5-51配列とのアラインメントを図5に示した。CDR領域決定に関するKabat系を用いる11E7VH配列のさらなる分析から、図2Aおよび5、ならびにそれぞれ配列番号 2、5、および8に示されるような重鎖のCDR1領域、CDR2領域およびCD3領域が記載された。
【０２５６】
11E7軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列の比較から、該11E7軽鎖は、ヒト生殖細胞系列VK A27由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系列JK4由来のJKセグメントから作成されることが示された。11E7 VL 配列と生殖細胞系列VK A27 配列のアラインメントを図8に示した。カバット系のCDR領域決定を用いた11E7VL配列のさらなる分析から、図2Bおよび8、ならびにそれぞれ配列番号 11、14、および17に示されるような軽鎖のCDR1領域、CDR2領域およびCD3領域が記載された。
【０２５７】
16D10の重鎖可変領域に関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図3Aならびにそれぞれ配列番号 27および21に示した。
【０２５８】
16D10の軽鎖可変領域に関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図3Bならびにそれぞれ配列番号 30および24に示した。
【０２５９】
16D10 重鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列の比較から、該16D10重鎖は、ヒト生殖細胞系ヒト生殖細胞系列VH5-51由来のVHセグメントおよびヒト生殖細胞系列JH4b由来のJHセグメントから作成されることが示された。16D10 VH配列と生殖細胞系VH5-51配列とのアラインメントを図6に示す。CDR領域決定に関するKabat系を用いる16D10VH配列のさらなる分析から、図3Aおよび6、ならびにそれぞれ配列番号 3、6、および9に示されるような重鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が記載された。
【０２６０】
16D10 軽鎖免疫グロブリン配列と公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列の比較から、該16D10軽鎖は、ヒト生殖細胞系列VKA27由来のVLセグメントおよびヒト生殖細胞系列JK1由来のJKセグメントから作成されることが示された。16D10 VL 配列と生殖細胞系列VKA27配列のアラインメントを図9に示した。CDR領域決定に関するKabat系を用いる16D10VL配列のさらなる分析から、図3Bおよび9、ならびにそれぞれ配列番号 12、15、および18に示されるような軽鎖CDR1、CDR2およびCD3領域が記載された。
【０２６１】
実施例3：抗Glypican-3ヒトモノクローナル抗体の結合特異性および結合動態の特徴付け
本実施例において、抗Glypican-3抗体の結合親和性、動態および特異性をバイアコア分析(Biacore)およびフローサイトメトリーによって試験した。
【０２６２】
結合親和性および動態
抗Glypican-3 抗体を、バイオコア分析(BiacoreAB, Uppsala, Sweden)により親和性および結合動態について特徴付けを行った。Glypican-3を、Biacoreにより提供される標準的アミンカップリング化学およびキットを用いて、一級アミンを介してCM5チップ(カルボキシメチルデキストラン被覆チップ)に共有結合させた。結合を、40μL/分間の流速にて、20、10、5、2.5および1.25μg/mlのHBS-EP緩衝液(BiacoreABにより提供される)の抗Glypican-3 モノクローナル抗体の濃度系列を流すことにより測定した。バックグラウンドの結合を、同じチップ全体でIgG1の濃度系列を流すことにより明らかにした。抗原-抗体会合動態を3分間追跡し、解離動態を10分追跡した。会合および解離曲線を、BIA評価ソフトウェア(BiacoreAB)を用いて1:1のLangmuir結合モデルと適合させた。決定したKD、konおよびKoff値を表１に示した。
【０２６３】
【表１】
2014236734.tif 000002
【０２６４】
FACSにより測定された結合親和性
抗Glypican-3 抗体を、蛍光活性化細胞ソーター(「FACS」)アッセイを用いて、高親和性にて細胞-表面 Glypican-3 タンパク質に結合することを示した。HCC細胞株のHep-3Bを96ウェルプレートの各ウェルに2x105 細胞密度で添加した。4A6、11E7、および16D10 モノクローナル抗体を、開始濃度20μg/mlで添加し、1:3希釈にて抗体を連続希釈して添加した。該細胞を洗浄し、結合を、FITC標識抗ヒトIgGAbを用いて検出した。フローサイトメトリー分析を、FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA)を用いて行った。平均蛍光強度("MFI")としてプロットして得られる結合親和性を、図10に示した。抗体の結合親和性は、濃度依存様式でHCC細胞に結合する。各抗体に対する有効濃度("EC50")を、50%の平均蛍光強度("MFI")をもたらす濃度として決定した。この例において、最も高い結合親和性を、0.83のMFIを示した4A6抗体にて観察した。次善の観察された親和性は16D10に対してであり、これは1.39のEC50を示した。3つの抗体のなかで観察された最低の親和性は11E7であり、1.98のEC50を示した。
【０２６５】
FACSにより測定した結合特異性
抗Glypican-3抗体は、FACSアッセイを用いて高特異性にて細胞表面のGlypican-3タンパク質に結合することが示された。HCC細胞株のHep-3BおよびHep-G2を1x105細胞密度にてDMEM＋10% FBS中で増殖させた。4A6、11E7、および16D10 モノクローナル抗体を、10μg/mlの濃度にて添加した。さらに、3つの陰性コントロールを比較のために分析した。これらの陰性コントロールは、(1)全く染色しない、(2)添加された二次抗体のみ、および(3)hIgG1アイソタイプコントロール抗体であった。細胞を洗浄し、結合をFITC-標識抗ヒトIgG Abにて検出した。フローサイトメトリー分析を、FACS Calibur flow cytometerを用いて行った。図11は、抗Glypican-3抗体が高親和性にてHCC細胞を結合することを示す。これに対して、陰性コントロールサンプルは、HCC細胞への結合をいずれも示さなかった。
【０２６６】
細胞表面上でGlypican-3を安定に発現するチャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞株を開発し、フローサイトメトリーによりGlypican-3 モノクローナル抗体の特異性を決定するのに使用した。CHO細胞を、Glypican-3をコードする完全長cDNAを含有する発現プラスミドを用いて形質転換(transfected)した。3つの抗Glypican-3モノクローナル抗体の結合を、10μg/mlの濃度で各Glypican-3抗体と共にインキュベートすることにより評価した。細胞を洗浄し、結合をフィコエリトリン標識抗ヒトIgG Ab(BD Biosciences)で検出した。二次抗体のみを陰性コントロールとして使用した。この結果を図12に示した。Glypican-3モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、親のCHO細胞株ではなくGlypican-3により形質転換したCHO細胞株に結合した。これらのデータは、Glypican-3に対するモノクローナル抗体の特異性を示す。
【０２６７】
Biacoreによる抗Glypican-3 モノクローナル抗体のエピトープ結合
エピトープ結合を、抗Glypican-3抗体が、重複エピトープに結合するかどうかを決定するためにBiacoreanalysisにより行った。重複エピトープを有する抗体は、Glypican-3に対する結合には競合するが、異なるエピトープを有するものは競合せず、同時に該抗原に結合する。精製した4A6および16D10を、標準的アミンカップリングプロトコールを用いてCM5チップ上で4000 RUにて固定した。注入の前に、Glypican-3-his(50 nM)を、4A6、11E7、または16D10モノクローナル抗体と共に少なくとも1時間予めインキュベートした。抗体濃度は、400nMで開始する2倍希釈系列であった。抗体-抗原混合物を、流速5μl/分で5分間注入した。4A6、11E7、および16D10のモノクローナル抗体の各々は、濃度依存様式で固定化した4A6および16D10抗体への結合に競合することができた。これは、4A6、16D10、および11E7が、重複エピトープを持つことを示す。
【０２６８】
実施例4：Glypican-3抗体は肝臓癌組織に結合する
抗Glypican-3モノクローナル抗体4A6を、ヒト肝臓癌組織に結合することを示した。肝臓癌患者由来の生検組織を得て、抗体を免疫組織化学染色のために使用した(Cytomyx, MA)。5μmの組織中心部を使用した。スライド上での30分間乾燥させた後、組織セクションを、室温で5分間アセトンにて固定した。スライドを、PBSで洗浄し、次いで血清不含タンパク質およびペルオキシダーゼブロッカー(Dako S2001、CO)によりブロッキングし、その後に45分間室温で5μg/mlにて一次抗体コンプレックスと共にインキュベートした。次いで、該スライドを洗浄し、30分間FITC結合二次抗体(Jackson Immunoresearch Lab, 109-097-003)と共にインキュベートし、PBSで洗浄し、ポリマーHRP結合体(Dako, CO, K4063)と共に20分間インキュベートした。色原体(Dako K3464)を基質として用いて、茶色に染色させる。スライドを、Faramount Aqueous Mounting Media (Dako, S3025)中に埋包した。4A6は、肝臓腫瘍細胞に特異的に結合することが判った。図13に例示したとおり、4A6モノクローナル抗体は、周辺の正常組織ではなく癌性の肝臓組織を特異的に染色する。モノクローナル抗体で染色した場合、他の組織は、陰性または非特異的染色を示し、それには子宮、肺、肝臓、腎臓、大腸、頸部、胸部、骨髄、副腎腺、小脳、大脳、食道、心臓、前立腺、胎盤、下垂体、卵巣、膵臓、中皮、唾液腺、扁桃腺、皮膚、小腸、骨格筋、胃、睾丸、胸腺、および甲状腺が挙げられる。このデータから、抗Gpc3 HuMab 4A6は、肝臓腫瘍において発現したGcp3を認識することが示された。
【０２６９】
実施例5：抗Glypican-3 抗体活性
モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、抗体依存性細胞毒性("ADCC")アッセイを用いて、ナチュラルキラーT-細胞存在下で、Gcp3 陽性Hep-G2 細胞を殺傷することが示された。
【０２７０】
ヒトエフェクター細胞を、下記のとおり全血から調製した。ヒト末梢血単核細胞を、標準的Ficoll-paque 分離によりヘパリン化した全血から精製した。細胞を、10% FBS 200U/ml ヒトIL-2(PeproTech, NJ)を含有するRPMI 1640培地に再懸濁し、37℃で終夜インキュベートした。翌日、細胞を回収し、RPMI + 1% BSA(アッセイ培地)で2回洗浄し、1x10e6/mlにて再懸濁した。
【０２７１】
平底の96ウェルプレート中で1x10e4/ウェルの標的細胞(100μl)を、一晩37℃でアッセイ培地中でインキュベートした。標的細胞を2回アッセイ培地で洗浄した後、アッセイ培地(100μl)を各ウェルに添加し、10ug/mlの終濃度にて、エフェクター細胞(50μl)とアイソタイプコントロールとして抗Gpc3抗体またはヒトIgG1(50μl)いずれかとを用いてインキュベートした。Gpc3+Hep-G2 細胞株を、Takara LDH 細胞毒性検出キット(Roche, 04744 926001, Switzerland)を用いて、抗Gpc3抗体とADCCに特異的な抗体について、下記のとおりに蛍光発光分析を試験した。標的細胞株であるHep-G2を、標的：エフェクター比が1:50にてエフェクター細胞と共にインキュベートした。18時間37℃でインキュベーションの後、上清(100μl)を回収し、新しい平底96ウェルプレートに移しかえた。溶液C(100ul)を各ウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。490 nMでのサンプルの吸光度を、SPECTRAMAX 340 PC (MTX Lab System, VA)にて測定した。溶菌%を、3回平均吸光度を計算し、バックグラウンドを控除して計算した。
【０２７２】
図14に見られるとおり、4A6、11E7、および16D10モノクローナル抗体の各々は、hIgG1アイソタイプコントロール抗体と比較したように、ナチュラルキラーT-細胞により、Hep-3b細胞の特異的溶菌をもたらす。
【０２７３】
実施例6：抗Glypican-3抗体内在化
モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10は、Hum-Zapアッセイを用いて、細胞と結合して、Hep-3b細胞により内在化されることが示された。Hum-ZAPアッセイは、毒素サポリン(saporin)(Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100)と抗ヒトIgG二次抗体との結合により、抗Glypican-3 モノクローナル抗体の内在化を示した。最初に、4A6、11E7、および16D10をHep-3B 細胞の表面に結合させた。次いで、Hum-ZAP抗体を一次抗体に結合させた。次に、この一次抗体/Hum-ZAP複合体が該細胞により内在化された。Saporinの細胞内への侵入は、タンパク質合成阻害およびその結果として細胞死をもたらした。
【０２７４】
Hum-ZAP アッセイを下記のように行った。各細胞を、ウェルあたりに3x103細胞密度で播種した。抗Glypican-3 モノクローナル抗体またはアイソタイプコントロールヒトIgGを連続希釈した後、細胞に添加した。次いで、Hum-ZAPを2μg/mlの濃度で添加し、プレートを96時間インキュベートした。プレート内の細胞生存能力を、CellTiter-Glo(登録商標) 発光細胞生存能力アッセイキット(Promega, G7571)により検出し、Luminomitor(Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA)によりプレートを490nMで読みとる。データをPrism (Graphpad)により分析した。図15に見られるとおり、細胞死は、4A6、11E7、および16D10モノクローナル抗体濃度に比例した。こうして、抗Glypican-3 モノクローナル抗体は、hIgG1 アイソタイプコントロール抗体と比較すると、Hep-3b細胞により効率的に内在化された。
【０２７５】
免疫組織化学物質染色アッセイを用いて、モノクローナル抗体4A6、11E7、および16D10もまた、Hep-3b細胞により内在化されることが示された。細胞解離溶液にて回収した細胞を、96ウェルプレートの各ウェルにおいて104 細胞/100μlの培地で播種し、30分間氷上で5μg/mlのFACS緩衝液(PBS + 5% FBS)の濃度にて各モノクローナル抗体と共にインキュベートした。ヒトIgG1アイソタイプコントロールを、陰性コントロールとして使用した。
細胞を2回洗浄し、培地(100μl／ウェル)に再懸濁し、次いでフィコエリトリン(Jackson ImmunoResearch Lab, PA)と結合したヤギ抗ヒト二次抗体と共に1:100希釈にて30分間インキュベートした。次いで該細胞を、培地で洗浄し、蛍光顕微鏡の下で直ぐに画像化するか、または後の時点で画像化するために37℃でインキュベートした。細胞形態学の画像および染色細胞の免疫蛍光強度を、図16に示したとおり、0、30または60分間でNikon TE200 カメラを撮影した。蛍光は、4A6、11E7、および16D10抗体で染色した細胞においてのみ観察された。蛍光はIgG1コントロール抗体では検出されなかった。
【０２７６】
図16で示されるとおり、抗体の添加後0分間で、細胞を細胞表面で染色した。30分後に、細胞は、抗体を内在化し始めた。60分間の後、該抗体は、該細胞によりほぼ完全に内在化された。これは、該ヒト抗Glypican-3モノクローナル抗体が、Glypican-3発現HCC細胞に結合する際に特異的に内在化されることを示す。
【０２７７】
実施例7：抗Glypican-3 抗体安定性
熱安定性
抗Glypican-3 モノクローナル抗体の熱安定性を、4A6、11E7、および16D10抗体について融解温度の熱量分析により決定した。融点(Tm)の熱量測定を、自動サンプラーと接続したVP-キャピラリーDSC示差走査マイクロ熱量計プラットフォーム(MicroCal LLC, Northampton, MA, USA)を用いて行った。試料細胞量は0.144mLであった。抗体に対する変性データを、30〜95℃、1℃／分の速度にて、pH7.4のリン酸緩衝生理学的食塩水（PBS）中で、2.3μMの濃度のサンプルを加熱することにより得た。同じ緩衝液を基準細胞に使用して、比較によりモル熱容量を得た。観察されたサーモグラムを基準線補正し、ソフトウェアOrigin v.7.0を用いて非-2-状態モデル(non-2-state model)に基づき正規化したデータを分析した。このデータを表2に示したように、16D10は、3つの抗Glypican-3 モノクローナル抗体の熱安定性について最も高い温度を示すことが観察された。
表2. 示差走査熱量計:
【表２】
2014236734.tif 000003
【０２７８】
蛍光分光法により測定した化学安定性
4A6、11E7、および16D10の安定性を、蛍光分光法による化学変性のミッドポイントを測定することにより比較した。化学変性の蛍光測定を、Micromaxプレートリーダー(SPEX, Edison, NJ)を備えつけたSPEX Fluorolog 3.22で行った。測定を、16の異なる濃度のPBS緩衝液中の塩酸塩グアニジンにて20時間平衡化した抗体サンプルに対して行った。該測定を、黒色の非結合表面の384ウェルプレート(Corning, Acton, MA)において行い、12μLのウェル容量中に1μMの抗体を用いた。蛍光を、280 nmで励起させ、放射スペクトルを320と400 nmの間で測定した。スキャンスピードは、1秒間／nmであり、スリットを5 nmのバンドパスに設定した。緩衝液ブランクを、PBSを用いて行い、データから自動的に控除した。
データを、GraphPad Prismソフトウェアを用いて、2-状態変性モデル(2-state model)に適合させた。表3に示したとおり、11E7は二相性のアンホールディングを示したが、16D10および4A6は同じような熱安定性を示すことが観察された。
【０２７９】
表3：蛍光分光法により決定される化学変性
【表３】
2014236734.tif 000004
【０２８０】
明明細書に引用した全ての引用文献には、限定するものではないが、全ての技術文献、公開物、特許、特許出願、プレゼンテーション、テキスト、報告書、写本、パンフレット、書籍、インターネットの投稿、学術論文、定期刊行物、製品概況報告書などが含まれ、その全てにおいてこの明細書中に出典明示により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の文献における論述は、その著者により為された主張を単に要約することを意図するもので、全ての引用文献が先行技術を構成することを承認するものではなく、また出願人は引用した文献の精度および妥当性に対して批判する権利を留保するものである。
【０２８１】
先に記載した発明は、理解を明確にするという目的のために説明かつ例示によりある程度詳細記述してきたが、特定の変更や改変は、本願目的または添付の特許請求の範囲から逸脱せずに為されるべきであることは本発明の教示から当業者には明らかであろう。
【０２８２】
【表４】
2014236734.tif 000005
【図１Ａ】
2014236734.tif 000006
【図１Ｂ】
2014236734.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2014236734.tif 000010
【図３Ｂ】
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【図４】
2014236734.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2014236734000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年7月29日(2014.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体が1x10-7M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ヒト抗体である、請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項３】
キメラまたはヒト化抗体である、請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項４】
IgG1またはIgG4アイソタイプの完全長抗体である、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項５】
抗体断片または単鎖抗体である、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項６】
抗体が5x10-8M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項７】
抗体が5x10-9M以下のKDにてヒトGlypican-3に結合する、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項８】
ヒトGlypican-3が配列番号 36[ジーンバンク・アクセッション番号NM_004484]として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項９】
抗体がHep-3BまたはHep-G2腫瘍細胞に実質的に結合する、請求項2記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
Glypican-3への結合について参照抗体と交差競合し、KD1x10-7M以下にてヒトGlypican-3に結合する、
単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
参照抗体が、
a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項10記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
参照抗体が、
a)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項10記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
参照抗体が
a)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項10記載の抗体、またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
a)配列番号 1を含む重鎖可変領域CDR1;
b)配列番号 4を含む重鎖可変領域CDR2;
c)配列番号 7を含む重鎖可変領域CDR3;
d)配列番号 10を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)配列番号 13を含む軽鎖可変領域CDR2；および
f)配列番号 16を含む軽鎖可変領域CDR3、
を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項１５】
a)配列番号 2を含む重鎖可変領域CDR1;
b)配列番号 5を含む重鎖可変領域CDR2;
c)配列番号 8を含む重鎖可変領域CDR3;
d)配列番号 11を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)配列番号 14を含む軽鎖可変領域CDR2；および
f)配列番号 17を含む軽鎖可変領域CDR3、
を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項１６】
a)配列番号 3を含む重鎖可変領域CDR1;
b)配列番号 6を含む重鎖可変領域CDR2;
c)配列番号 9を含む重鎖可変領域CDR3;
d)配列番号 12を含む軽鎖可変領域CDR1;
e)配列番号 15を含む軽鎖可変領域CDR2；および
f)配列番号 18を含む軽鎖可変領域CDR3、
を含む、請求項1記載の抗体。
【請求項１７】
a)配列番号 19、20、および21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
b)配列番号 22、23、および24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分、
ここで、該抗体がGlypican-3に特異的に結合する。
【請求項１８】
a)配列番号 19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
b)配列番号 22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
a)配列番号 20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域：および
b)配列番号 23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２０】
a)配列番号 21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
b)配列番号 24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分、および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２２】
治療剤と結合された、請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫複合体。
【請求項２３】
請求項22記載の免疫複合体および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２４】
治療剤が細胞毒素である、請求項22記載の免疫複合体。
【請求項２５】
請求項24記載の免疫複合体および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２６】
治療剤が放射性同位体である、請求項22記載の免疫複合体。
【請求項２７】
請求項26記載の免疫複合体および医薬上許容される担体を含む、組成物。
【請求項２８】
請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分の重鎖をコードしている、単離された核酸分子。
【請求項２９】
単離された核酸分子が、配列番号 25、26、および27からなるリストから選択されたV領域を含む、請求項28記載の単離された核酸分子。
【請求項３０】
請求項1記載の抗体、またはその抗原結合部分の軽鎖をコードしている単離された核酸分子。
【請求項３１】
単離された核酸分子が、配列番号 28、29、および30からなるリストから選択されたV領域を含む、請求項30記載の単離された核酸分子。
【請求項３２】
請求項28から31のいずれか一項記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項３３】
請求項32記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３４】
a)請求項1記載の抗体をコードしている１以上の核酸分子を含む宿主細胞を得ること、
b)宿主細胞培養において宿主細胞を増殖させること、
c)１以上の核酸分子が発現する宿主細胞培養条件を提供すること、および
d)宿主細胞または宿主細胞培養物から抗体を回収すること、
を含む、抗Glypican-3抗体を製造する方法。
【請求項３５】
細胞を、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有効な量の請求項1記載の抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、Glypican-3を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３６】
腫瘍細胞が肝臓組織から得られる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
抗体、またはその抗原結合部分が免疫複合体である、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
抗体、またはその抗原結合部分を含む免疫複合体が治療剤に結合されている、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
治療剤が細胞毒素である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
治療剤が放射性同位体である、請求項38記載の方法。
【外国語明細書】
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【配列表】
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