(57)【要約】      （修正有）【課題】メラニン生成又は色素沈着を調節するための標的遺伝子又はタンパク質を同定し、メラニン生成又は色素沈着を操作する化合物のスクリーニング法を提供する。【解決手段】メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを、in vitroで接触させる工程と、被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを、in vitroで接触させる工程と、
前記被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程と
を含む方法。
【請求項２】
脱色素、美白、又はメラニン生成の抑制のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
前記被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを減少させる化合物を選択する工程と
を含む方法。
【請求項３】
メラニン生成又は色素沈着を誘導するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
前記被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを増加させる化合物を選択する工程と
を含む方法。
【請求項４】
前記被験化合物と細胞とを接触させる工程の前に、メラニン生成及び／又は色素沈着を誘導する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な前記細胞は、ヒトメラノーマ細胞又はメラノサイトを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
色素沈着又はメラニン生成を誘導するための医薬組成物であって、（ｉ）Ｈｓｐ６０遺伝子及び／又はモータリン遺伝子を含む発現ベクター、又は（ｉｉ）Ｈｓｐ６０タンパク質及び／又はモータリンタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項８】
前記組成物は、皮膚の障害を治療するために使用される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記皮膚の障害は、癌、色素沈着過度、発疹及びケロイドからなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
モータリン、ＨＳＰ６０、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に基づいてミトコンドリア機能を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
【請求項１１】
モータリン、ＨＳＰ６０、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に関与する細胞の酸化ストレス反応を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
【請求項１２】
皮膚の美白のために、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により得られる、モータリン及びＨｓｐ６０から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤の化粧品への使用。
【請求項１３】
培養皮膚細胞のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法であって、
幹細胞を皮膚細胞にin vitroで分化させる工程と、
前記培養皮膚細胞中のモータリン及び／又はＨｓｐ６０の量を調節する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物のスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  メラニン生成とは、メラノサイトと呼ばれる特殊なメラニン生成細胞がメラニン色素を生成するプロセスである。メラノサイトは表皮の基底層にある細胞の５％から１０％を占める。通常は皮膚１平方ミリメートル当たり１０００個から２０００個のメラノサイトがある。サイズは様々であるが、メラノサイトは通常、７マイクロメートルの長さである。
【０００３】
[0003]  メラニンのレベルは異なるヒト個体群で変化し、メラノサイトの活動レベル及びそれが生成するユーメラニン及びフェオメラニンの量に応じて、明るい生体色素から暗い生体色素の個体まで変化する。このプロセスは、メラノサイトがアミノ酸チロシンからメラニンを生成するために必要なチロシナーゼ酵素によって調節され、前駆物質プロオピオメラノコルチンから生成されるＭＳＨ及びＡＣＴＨペプチドなどのホルモンに大きく影響される。ＵＶ−Ｂ放射への曝露によって低レベルのメラニン生成が刺激される。
【０００４】
[0004]  合成されると、メラニンはメラノソームと呼ばれる特殊な構造に貯蔵される。メラノソームは、樹状突起と呼ばれる腕状構造に沿ってケラチノサイトの最上層へと送られる。メラニンは、そこでＵＶに誘導される損傷から皮膚を保護する際に重要な役割を果たす。内因性色素のレベルが低い個体は、皮膚癌の発病率が高い傾向があり、したがってメラニン生成を誘導する作用物質には、ＵＶに誘導される皮膚の損傷及び発癌現象に対する保護物質として潜在能力がある。さらに、色素沈着を誘導する化学物質は、皮膚癌の分化剤としても働くことができる。他方で、脱色素を誘導する作用物質は、（ｉ）しみ、すなわち老化した皮膚や、又はケロイド又は炎症後色素沈着過剰症などの特定の皮膚の状態に現れる暗い斑点の治療、及び（ｉｉ）化粧品で所望されるような皮膚の美白に有益である。メラニン生成は、まだ完全には理解されていない複雑なプロセスである。このプロセスに関与する細胞因子の同定の研究や、その安全で機能的な操作へのアプローチが必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
[0005]  1. Chiang HM, Lin JW, Hsiao PL, Tsai SY, Wen KC. Hydrolysates of citrus plants stimulate melanogenesis protecting against UV-induced dermal damage. Phytother Res 2010; 25: 569-76.
2. Kimura Y, Sumiyoshi M. French maritime pine bark (Pinus maritima Lam.) extract (Flavangenol) prevents chronic UVB radiation-induced skin damage and carcinogenesis in melanin-possessing hairless mice. Photochem Photobiol 2010; 86: 955-63.
3. Gidanian S, Mentelle M, Meyskens FL, Jr., Farmer PJ. Melanosomal damage in normal human melanocytes induced by UVB and metal uptake--a basis for the pro-oxidant state of melanoma. Photochem Photobiol 2008; 84: 556-64.
4. Costin GE, Hearing VJ. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. Faseb J 2007; 21: 976-94
5. Seo YK, Kim SJ, Boo YC, Baek JH, Lee SH, Koh JS. Effects of p-coumaric acid on erythema and pigmentation of human skin exposed to ultraviolet radiation. Clin Exp Dermatol 2011; 36: 260-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]  本発明の目的は、メラニン生成又は色素沈着を調節するための標的遺伝子又はタンパク質を同定し、メラニン生成又は色素沈着を操作する化合物のスクリーニング法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]  本発明の発明者らは、上記問題の解決を目指して鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、モータリン及びＨｓｐ６０が皮膚の色素沈着に関与していることを実証した。さらに具体的には、本発明者らは、モータリン又はＨｓｐ６０の発現レベルが高いと、メラニン生成又は色素沈着が増加し、モータリン又はＨｓｐ６０の発現又は機能を抑制すると皮膚の脱色素又は美白につながることを明らかにした。
【０００８】
[0008]  したがって、本発明は以下に関する。
［１］メラニン生成又は色素沈着を調節するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを、in vitroで接触させる工程と、
被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程とを含む方法。
［２］脱色素、美白、又はメラニン生成の抑制のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを減少させる化合物を選択する工程とを含む方法。
［３］メラニン生成又は色素沈着を誘導するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを接触させる工程と、
被験化合物から、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを増加させる化合物を選択する工程とを含む方法。
［４］被験化合物と細胞とを接触させる工程の前に、メラニン生成及び／又は色素沈着を誘導する工程をさらに含む、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞は、ヒトメラノーマ細胞又はメラノサイトを含む、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］色素沈着又はメラニン生成を誘導するための医薬組成物であって、（ｉ）Ｈｓｐ６０遺伝子及び／又はモータリン遺伝子を含む発現ベクター、又は（ｉｉ）Ｈｓｐ６０タンパク質及び／又はモータリンタンパク質を含む、医薬組成物。
［８］組成物が皮膚の障害を治療するために使用される、［７］に記載の医薬組成物。
［９］皮膚の障害が、癌、色素沈着過度、発疹及びケロイドからなる群から選択される、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］モータリン、ＨＳＰ６０、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に基づいてミトコンドリア機能を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
［１１］モータリン、ＨＳＰ６０、及びミトコンドリア中の他のタンパク質に関与する細胞の酸化ストレス反応を操作する工程を含む、色素沈着又はメラニン生成に介入する方法。
［１２］皮膚の美白のために、［１］〜［６］のいずれか１項の方法により得られる、モータリン及びＨｓｐ６０から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤の化粧品への使用。
［１３］培養皮膚細胞のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法であって、
幹細胞を皮膚細胞にin vitroで分化させる工程と、
培養皮膚細胞中のモータリン及び／又はＨｓｐ６０の量を調節する工程とを含む方法。
【発明の効果】
【０００９】
[0009]  本発明のスクリーニング法により、メラニン生成又は色素沈着を調節する候補化合物、特に脱色素、美白、若しくはメラニン生成抑制のための候補化合物、又はメラニン生成若しくは色素沈着を誘導する候補化合物が選択される。選択される脱色素、美白、メラニン生成抑制のための化合物は、しみ、ケロイド、又は色素沈着過度を治療する薬品として、又は化粧品の美白作用物質として使用することができる。他方で、メラニン生成又は色素沈着を誘導するために選択される化合物は、ＵＶに誘導される皮膚の損傷又は発癌性に対する保護作用物質として、又は皮膚癌の分化作用物質として使用することができる。
【００１０】
[0010]  本発明の医薬組成物は、チロシナーゼの活性化を通して色素沈着又はメラニン生成を誘導する。
【００１１】
[0011]  本発明のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法により、移植に使用するために培養する皮膚の色を適宜調節することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
[0012]
【図１】図１は、コントロール、及び白い肌のドナー由来のＯＡＧ処理した初代メラノサイト（Ａ）、及びヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１（Ｂ）におけるメラノソーム誘導の免疫組織化学的分析の結果を示す。
【図２】図２は、ＯＡＧ処理した（中心）、又はＯＡＧとビタミンＣで処理した（右）Ｇ３６１のメラニン含有量を示す。
【図３】図３は、チロシナーゼのウェスタンブロッティング（Ａ）、及びチロシナーゼ活性アッセイ（Ｂ）の結果を示す。
【図４】図４は、ＯＡＧでメラニン生成を誘導したときのメラノソーム及びＨｓｐ６０の免疫染色の結果を示す。
【図５】図５は、ＯＡＧでメラニン生成を誘導したときのメラノソーム及びモータリンの免疫染色の結果を示す。
【図６】図６は、ＯＡＧ処理したＧ３６１細胞中でＨｓｐ６０又はモータリンをノックダウンしたときのメラニン含有量を示す。
【図７】図７は、ＯＡＧ処理したＧ３６１細胞中でＨｓｐ６０又はモータリンをノックダウンときのチロシナーゼ活性を示す。
【図８】図８は、Ｇ３６１細胞中でモータリンを過剰発現させたときのメラニン含有量を示す。
【図９】図９は、Ｇ３６１細胞中でモータリンを過剰発現させたときのメラノソーム染色を示す。
【図１０】図１０は、Ｇ３６１細胞中でモータリンを過剰発現させたときのチロシナーゼ活性を示す。
【図１１】図１１は、様々な濃度でＴＸＣ処理した後にＯＡＧ処理した又はＯＡＧ未処理のＧ３６１細胞内のメラニン含有量を示す。
【図１２】図１２は、様々な濃度でＴＸＣ処理した後にＯＡＧ処理した又はＯＡＧ未処理のＧ３６１細胞のチロシナーゼ活性を示す。
【図１３】図１３は、ＴＸＣ処理したＧ３６１細胞のチロシナーゼ、モータリン及びＨｓｐ６０の発現を示す。
【図１４】図１４は、本発明のスクリーニング法の概略的な例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（スクリーニング法）
[0013]  本発明のスクリーニング法は、メラニン生成又は色素沈着を調節する候補化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）被験化合物と、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とをin vitroで接触させる工程と、（ｉｉ）被験化合物からモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程とを含む方法である。工程（ｉｉ）では、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを少なくとも２０％変化させる任意の化合物を選択することが好ましい。
【００１４】
[0014]  本明細書で使用する「メラニン生成」という用語は、メラノサイト中でメラニンが生成されるプロセスを意味する。上述したように、メラニン生成が起きるためにはチロシナーゼが必要である。チロシナーゼは、メラノサイト中のチロシンを酸化してフェノールを生成し、これがさらに酵素的に又は非酵素的に酸化され、脱カルボキシル化され、重合されてメラニン、すなわち茶色系又は黒い色素を生成する。
【００１５】
生成されると、メラニンはメラノソームと呼ばれる細胞小器官に貯蔵されて、ケラチノサイトの最上層へと搬送され、これで細胞核中のＤＮＡを紫外線損傷から保護する。
【００１６】
本明細書で使用する「色素沈着」という用語は、メラニンが過剰に蓄積して皮膚が着色されるプロセスを意味する。
【００１７】
[0015]  本明細書で使用する「メラニン生成又は色素沈着を調節する」という用語は、メラニン生成又は色素沈着の促進又は抑制を操作することを意味する。すなわち、メラニン生成又は色素沈着の調節とは、メラニン生成の抑制、脱色素、又は美白の誘導と、メラニン生成又は色素沈着の誘導との両方を含む。
【００１８】
[0016]  本明細書で使用する「候補化合物」という用語は、本発明のスクリーニング法で使用することができる任意の物質を意味する。候補化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、糖類、脂質、低分子化合物、植物抽出物及びポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
[0017]  本明細書で使用する「モータリン」とはあるタンパク質であり、ミトコンドリア熱ショックタンパク質７０（ｍｔｈｓｐ７０）、ペプチド結合タンパク質７４（ＰＢＰ７４）、又はブドウ糖調節タンパク質７５（Ｇｒｐ７５）とも呼ばれ、タンパク質のＨｓｐ７０シャペロンファミリーのメンバーであり、様々な細胞内の位置でユニークな機能的特徴を有することが示されている。モータリンの機能的役割は、その細胞内局在に基づいて２つの主要クラスに分類することができる。第１のクラスの機能は、ミトコンドリア内で生じる機能に関し、核でコードされているタンパク質のミトコンドリア内への取り込み、新生タンパク質の折り畳み、ミトコンドリア内のタンパク質分解、及び完全性（integrity）及び機能を維持するためのミトコンドリア内成分との相互作用への関与を含む。第２のクラスの機能は、ミトコンドリア外での役割に関し、幾つかの細胞質の小胞体及び核タンパク質、中心体、成長因子、免疫系成分、及び代謝成分との相互作用と機能的調節とを含む（Wadhwa R他、J Biol Chem 1993; 268: 6615-21、Wadhwa R他、J Biol Chem 1998; 273: 29586-91、Wadhwa R他、Cancer Res 2000; 60: 6818-21、Kaul SC他、J Biol Chem 2005、Kanai M他、Genes Cells 2007; 12: 797-810、Ma Z他、Oncogene 2006; 25: 5377.5390、Lu WJ他、Cell Death Differ 2011; 18: 1046-56、Pilzer D他、Int Immunol 2005; 17: 1239-48）。
【００２０】
[0018]  モータリンはヒトの癌において濃縮されることが多く、ヒトの発癌性と機能的に関連づけられてきた（Cussac他、2006、Dundas他、2005、Ma他、2006、Shin他、2003、Wadhwa他、2006、Lu他、2011、Yi他、2008）。モータリンの発現レベルが比較的高い癌細胞は、足場非依存性成長、ヌードマウスにおける腫瘍形成及び走化性など、悪性の増大を示す。タンパク質発現の定量的評価により、高レベルのモータリンを発現する腫瘍は、腫瘍の体積及び転移など、より攻撃的な悪性表現型を有することが分かる（Dundas他、2005、Lu他、2011）。さらに腫瘍組織におけるモータリンの発現レベルは、低い患者生存率（Dundas他、2005）及び手術後の腫瘍の再発（Yi他、2008）と正の相関を示す。
【００２１】
[0019]  正常なヒトの線維芽細胞でモータリンを強制的に過剰発現させると、その寿命が延長する（Kaul他、2001、Wadhwa他、1998、Wadhwa他、2002c）。癌以外に、モータリンはニューロン分化（Shin他、2012）、肥満（Olivia他、2012）及びＮＦκ−Ｂシグナル伝達（Li他、2010）など、ニューロン機能において役割を果たすことが報告されている。ミトコンドリア機能不全が、神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病）や脳虚血などの幾つかの主要な神経疾患の病因に関与しているという概念と一致して、モータリン機能不全もこのような疾患に関与していることが示されている。
【００２２】
[0020]  熱ショックタンパク質６０（Ｈｓｐ６０）は、タンパク質のアセンブリと折り畳み（SoltysとGupta、1997）さらに細胞のストレス反応（GuptaとKnowlton、2002）に関与することが判明している別のミトコンドリアのストレスタンパク質である。モータリンと同様に、ＨＳＰ６０はミトコンドリア内及びミトコンドリア外の部位に見られ（SoltysとGupta、1996、Cechetto他、2000、Cicconi他、2004）、多くの種類の腫瘍で上方制御されている（Cappello他、2003、Pignatelli他、2003）。さらに、モータリン及びＨｓｐ６０は複合体中に存在し、発癌に寄与していることが示されている（Wadhwa他、2005）。
【００２３】
[0021]  本明細書で使用する「モータリン」又は「Ｈｓｐ６０」は、メラニン生成又は色素沈着を誘導する機能を有する限り、自然に発生する又は人工的な変異体を含む。このような変異体は、例えばモータリン又はＨｓｐ６０と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、メラニン生成又は色素沈着誘導能を有するポリペプチドを含んでいてもよい。変異体タンパク質がメラニン生成又は色素沈着誘導能力を有するか否かは、当業者は、本出願の実施例で説明するような任意の既知の方法により容易に識別することができる。
【００２４】
[0022]  本明細書で使用する「モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞」という用語は、モータリン及びＨｓｐ６０のうち少なくとも一方を、常に又は一過性に発現可能な細胞を指す。本明細書で使用する「発現」という用語は、鋳型ＤＮＡのシーケンスに基づいてｍＲＮＡが合成される転写と、ｍＲＮＡを順番に解読するｔＲＮＡによってタンパク質が合成される翻訳との両方を含む。モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞の例は、メラノサイト及びメラノーマ細胞を含む。メラノサイトは、チロシナーゼを含み、チロシンからメラニンを生成する細胞である。メラノーマは、メラノサイト内で発生する悪性腫瘍である。メラノーマ細胞としては、マウスのメラノーマＢ１６細胞、ヒトのメラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞、及びヒトのメラノーマＧ３６１細胞が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞は既知の方法で培養することができる。
【００２５】
本出願でモータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞は、必ずしもメラニンを生成する細胞ではない。
【００２６】
[0023]  被験化合物とモータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞とを接触させる工程は、当業者が適宜行うことができる。例えば、このような工程は、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を発現可能な細胞の培地に適切な濃度で被験化合物を添加することによって行うことができる。
【００２７】
[0024]  被験化合物からモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程は、例えば、細胞と被験化合物を接触させる前後にわたる複数の時点で、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを決定し、少なくとも２つの時点の発現レベルを比較することによって行うことができる。選択される化合物はモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％変化させる。
【００２８】
[0025]  細胞内のモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルの測定は、サンプル中の特定のタンパク質又はｍＲＮＡを検出又は測定する任意の方法で行うことができる。このような方法としては、タンパク質の量を決定することができるイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、及びｍＲＮＡの量を決定することができるノーザンハイブリダイゼーション又は定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。これらの中で、本発明のスクリーニング法には、その単純さゆえに抗Ｈｓｐ６０抗体又は抗モータリン抗体を使用するイムノアッセイを使用することができる。
【００２９】
[0026]  イムノアッセイのうち、酵素結合免疫吸着法（「ＥＬＩＳＡ」）が好ましい場合がある。何故なら、検出剤に結合した酵素を使用すると、タンパク質濃度の決定をより容易かつ迅速にできるからである。
【００３０】
例えば、ＥＬＩＳＡを使用することによってモータリンの量を決定するためには、抗モータリン抗体を固相担体上で固定化し、その後に細胞溶解物を固相担体の表面に適用する。次に、第１の抗体によって認識されたエピトープとは異なるエピトープを認識し、酵素で標識された第２の抗モータリン抗体を追加し、捕捉されたモータリンと反応するようにインキュベートする。洗浄した後、発色させるために酵素の基質を固相担体の表面に添加する。モータリンの量は、吸光度などを測定することによって決定することができる。サンプル中で固相担体上に固定化された抗体とモータリンとの反応が生じた後、モータリンに特異的に結合する標識されていない一次抗体を使用し、次に第１の抗体に特異的に結合する標識されている二次抗体を使用することによって、モータリンを標識してもよい。
【００３１】
ペルオキシダーゼを酵素として使用する場合、基質は例えば３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）とすることができる。アルカリホスファターゼを酵素として使用する場合、基質は例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＮＰＰ）とすることができる。
【００３２】
[0027]  「固相担体」という用語は特に限定されず、例えばガラス、金属又はポリマーなどで作製したマイクロタイタープレート、プレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、又はＰＶＤＦ膜を含むことができる。標的タンパク質を捕捉するための抗体は、任意の既知の方法で固定化することができる。
【００３３】
[0028]  抗モータリン抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体とすることができ、両方とも任意の既知の方法により生成することができる。モノクローナル抗体は、モータリン又はその断片でヒト以外の哺乳動物を免疫し、その哺乳動物から抗体産生細胞を分離して、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマによって産生された抗体を精製することによって生成することができる。ポリクローナル抗体は、モータリン又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。抗モータリン抗体として、既存の抗体を使用することもできる。
【００３４】
[0029]  抗Ｈｓｐ６０抗体は、抗モータリン抗体に関して以上に説明したのと同じ方法で得ることができる。
【００３５】
[0030]  本発明者らは、後述する実施例で示すように、モータリン又はＨｓｐ６０の発現が増大するほど、チロシナーゼの活性が増大して、メラニン生成及び色素沈着が促進されることを見出した。
【００３６】
したがって、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを上昇させる物質は、紫外線に誘導される皮膚の損傷又は発癌に対する保護物質、又は皮膚癌の分化剤として使用することができる。
【００３７】
他方で、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを低下させる物質は、しみ、すなわち老化した皮膚や、ケロイド又は炎症後色素沈着過剰症などの特定の皮膚の状態に現れる暗い斑点の治療剤として使用することができる。このような物質は、美白を目的とする化粧品としても有用である。本明細書で使用する「美白」という用語は、皮膚の色をより透明に、より明るく、又はより白くするか、又は皮膚の暗い斑点又はそばかすを減少させるという意味である。
【００３８】
[0031]  本発明のスクリーニング法は、細胞と被験化合物とを接触させる工程の前に、細胞のメラニン生成又は色素沈着を誘導する工程をさらに含むことができる。このようなメラニン生成又は色素沈着の誘導は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）又はアルファ−メラノサイト刺激ホルモン（αＭＳＨ）を細胞の培地に添加することによって行うことができる。
【００３９】
[0032]  本発明のスクリーニング法によってモータリン及び／又はＨｓｐ６０の細胞発現レベルを低下させる化合物として選択される化合物は、美白を目的とする化粧品の成分として使用してもよい。
【００４０】
[0033]  図１４は、本発明のスクリーニング法の概略的な例を示す。
【００４１】
図に示すように、Ｇ３６１細胞を９６ウェルプレートに準備し、Ｇ３６１細胞の色素沈着を誘導するためにプレートの各ウェルにＯＡＧを添加する。その後、候補化合物を適切な濃度で各ウェルに添加し、インキュベートする。化合物と標的との反応が生じるように、当業者はインキュベーションの条件を適宜決定することができる。
【００４２】
本発明のスクリーニング法は毒性アッセイを含むことができ、それによって細胞毒性を有する化合物を候補から除去することができる。毒性アッセイは、当業者が適宜行うことができる。
【００４３】
最後に、各ウェルのモータリン濃度を、例えばＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。
【００４４】
（化粧品）
[0034]  本発明の化粧品は、細胞中のモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを低下させる化合物を含む。
【００４５】
本明細書で使用する「化粧品」という用語は、例えば、美しくする、魅力を増進する、又は身体の構造又は機能に影響せずに外観を変更するために人体に適用することが意図された物質又は組成物を意味する。このような用語の解釈は、各国の当局による定義に従ってもよい。
【００４６】
[0035]  本発明の化粧品の形態は特に限定されないが、水系（例えばスキンローション）、乳化剤系（例えばエマルジョン又はクリーム）、粉末、油脂、ゲル、軟膏、水−油の２相系（例えば油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョン）、水−油−粉末の３相系などを含むことができる。その使用又は剤形も特に限定されず、剤形は、クリーム、エマルジョン、ローション、フェイシャルマスク、口紅、ファンデーション、ゼリー、軟膏、フィルム、粉末など、通常の化粧品に使用される任意の剤形とすることができる。
【００４７】
[0036]  本発明の化粧品の製造方法は特に限定されず、化粧品の任意の既知の生産方法を含むことができる。例えばエマルジョン又はクリームの場合、選択される化合物を水相成分に乳化剤で溶解させ、油相成分を添加し、次に混合して成分を乳化することによって生成することができる。
【００４８】
[0037]  本発明の化粧品の組成物の特定の例は粉末成分、液体油脂、固形脂肪、ワックス、炭化水素油、高級脂肪酸、高級アルコール（好ましくは６個以上の炭素原子を有するアルコール、さらに好ましくは１０個以上の炭素原子を有するアルコール）、合成エステル油、シリコーン化合物、界面活性剤、共界面活性剤、被膜形成剤、ゲル化剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール又はその誘導体、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、植物抽出物、有機アミン、高分子エマルジョン、冷却剤、ｐＨ調節剤、緩衝液、香料及び水を含む。従来の方法により所望の剤形形態を生成するために、かかる構成要素を必要に応じて適宜添加することができる。
【００４９】
[0038]  本発明の目的が損なわれない限り、これらの添加剤の含有量に特定の制限はなく、含有量は剤形又は製品の形態に応じて適宜選択することができる。これらの添加剤は、任意の工程で添加することができる。これらの添加剤を添加するタイミングは、添加剤の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
[0039]  粉末成分の例としては、タルク、カオリン、雲母、絹雲母、白雲母、金雲母、合成雲母、赤雲母、黒雲母、バーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、珪酸アルミニウム、珪酸バリウム、珪酸カルシウム、珪酸マグネシウム、珪酸ストロンチウム、金属タングステン酸塩、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、か焼硫酸カルシウム（焼き石膏）、燐酸カルシウム、フッ素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミック粉末、金属石鹸（例えばミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム及びステアリン酸アルミニウム）及び窒化ホウ素などの無機粉末；ポリアミド樹脂粉末（ナイロン粉末）、ポリエチレン粉末、ポリメチルメタクリレート粉末、ポリスチレン粉末、スチレン／アクリル酸共重合体樹脂粉末、ベンゾグアナミン樹脂粉末、ポリテトラフルオロエチレン粉末及びセルロース粉末などの有機粉末；アルミニウム粉末及び銅粉末などの金属粉末顔料；ジルコニウム−、バリウム−、及びアルミニウム−レーキなどの有機顔料；クロロフィル及びβ−カロテンなどの天然色素が挙げられる。
【００５１】
[0040]  液体油脂の例としては、アボカド油、椿油、カメ油、マカダミアナッツ油、トウモロコシ油、ミンク油、オリーブ油、菜種油、卵黄油、ごま油、杏仁油、麦芽油、トガリバサザンカ油、ひまし油、亜麻仁油、ベニバナ油、綿実油、紫蘇油、大豆油、ピーナツ油、茶種油、カヤ種油、米糠油、中国桐油、日本桐油、ホホバ油、胚芽油、及びトリグリセリンが挙げられる。
【００５２】
[0041]  固体油脂の例としては、カカオバター、ココナツ油、馬油、硬化ココナツ油、ヤシ油、牛脂、羊脂、硬化牛脂、パーム核油、ラード、牛骨脂肪、木蝋核油、硬化油、牛脚油、木蝋、及び硬化ひまし油が挙げられる。
【００５３】
[0042]  ワックスの例としては、蜜蝋、カンデリラ蝋、綿蝋、カルナウバ蝋、ベーラム蝋、中国虫白蝋、鯨蝋、モンタン蝋、ふすま蝋、ラノリン、カポック蝋、アセチル化ラノリン、液体ラノリン、サトウキビ蝋、ラノリン脂肪酸イソプロピルエステル、ラウリン酸ヘキシル、還元ラノリン、ホホバ蝋、ハードラノリン、セラック蝋、ＰＯＥラノリンアルコールエーテル、ＰＯＥラノリン酢酸アルコール、ＰＯＥコレステロールエーテル、ラノリン脂肪酸ポリエチレングリコール、及びＰＯＥ水素化ラノリンアルコールエーテルが挙げられる。
【００５４】
[0043]  炭化水素油の例としては、液体パラフィン、オゾケライト、スクアラン、プリスタン、パラフィン、セレシン、スクアレン、ワセリン、微結晶蝋、及び水素化ポリデセンが挙げられる。
【００５５】
[0044]  高級脂肪酸の例としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、ウンデシレン酸、トール油酸、イソステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。
【００５６】
[0045]  高級アルコールの例としては、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、及びセトステアリルアルコールなどの直鎖アルコール；モノステアリルグリセリルエーテル（バチルアルコール）、２−デシルテトラデカノール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、ヘキシドデカノール、イソステアリルアルコール、及びオクチルドデカノールなどの分枝アルコールが挙げられる。
【００５７】
[0046]  合成エステル油の例としては、トリプロピレングリコールジネオペンタノエート、イソノナン酸イソノニル、ミリスチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸デシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、アセチル化ラノリン、ステアリン酸イソセチル、イソステアリン酸イソセチル、コレステリル１２−ヒドロキシステアリン酸塩、エチレングリコールジ−２−ヘキサン酸エチル、ジペンタエリスリトール脂肪酸エステル、Ｎ−アルキルグリコールモノイソステアレート、ネオペンチルグリコールジカプリレート、リンゴ酸ジイソステアリル、グリセリルジ−２−ヘプチルウンデカノエート、トリメチロールプロパントリ−２−ヘキサン酸エチル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトールテトラ−２−ヘキサン酸エチル、グリセリルトリ−２−ヘキサン酸エチル、トリオクタン酸グリセリル、トリイソパルミチン酸グリセリル、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、セチル２−ヘキサン酸エチル、２−パルミチン酸エチルヘキシル、トリミリスチン酸グリセリル、グリセリドトリ−２−ヘプチルウンデカノエート、ひまし油脂肪酸メチルエステル、オレイン酸オレイル、アセトグリセリド、２−パルミチン酸ヘプチルウンデシル、アジピン酸ジイソブチル、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸−２−オクチルドデシルエステル、ジ−２−アジピン酸ヘプチルウンデシル、ラウリン酸エチル、ジ−２−セバシン酸エチルヘキシル、２−ミリスチン酸ヘキシルデシル、２−パルミチン酸ヘキシルデシル、２−アジピン酸ヘキシルデシル、セバシン酸ジイソプロピル、２−コハク酸エチルヘキシル、及びクエン酸トリエチルが挙げられる。
【００５８】
[0047]  シリコーン化合物の例としては、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン及びジフェニルポリシロキサンなどの直鎖状ポリシロキサン類、及びオクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン及びドデカメチルシクロヘキサシロキサンなどの環状ポリシロキサン類を含むシリコーン油；三次元ネット構造を形成するシリコーン樹脂；シリコーンエラストマー；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン及びフッ素変性ポリシロキサンなどの様々な変性ポリシロキサンが挙げられる。
【００５９】
[0048]  シリコーンエラストマーの例としては、非乳化有機ポリシロキサンエラストマー又は乳化有機シロキサンエラストマーが挙げられる。非乳化有機ポリシロキサンエラストマーの例としては、ジメチコーン／ビニルジメチコーンクロスポリマー、ラウリルジメチコーン／ビニルジメチコーンクロスポリマーなどが挙げられる。
【００６０】
[0049]  ジメチコーン／ビニルジメチコーンクロスポリマーには例えばＤＣ９０４０及びＤＣ９０４５という商品名でDOW CORNINGから市販されている製品と、ＳＦＥ８３９という商品名でGENERAL ELECTRICから市販されている製品及びVelvasilシリーズの製品；例えばＫＳＧ−１５、ＫＳＧ−１６及びＫＳＧ−１８という商品名でSHIN ETSUから市販されている製品（［ジメチコーン／フェニルビニルジメチコーンクロスポリマー］）；GRANT INDUSTRIESからのGransil（商標）シリーズの製品が含まれる。
【００６１】
[0050]  ラウリルジメチコーン／ビニルジメチコーンクロスポリマーには例えばＫＳＧ−３１、ＫＳＧ−３２、ＫＳＧ−４１、ＫＳＧ−４２、ＫＳＧ−４３、及びＫＳＧ−４４という商品名でSHIN ETSUから市販されている製品が含まれる。
[0051]  乳化オルガノシロキサンエラストマーとしては、ポリアルコキシル化シリコーンエラストマー又はポリグリセロール化シリコーンエラストマーなどが挙げられる。
[0052]   ポリアルコキシル化シリコーンエラストマーとしては、ＤＯＷ  ＣＯＲＮＩＮＧ社より「ＤＣ９０１０」及び「ＤＣ９０１１」などの名称で市販されているもの、信越化学工業株式会社より「ＫＳＧ−２０」、「ＫＳＧ−２１」、「ＫＳＧ−３０」、「ＫＳＧ−３１」、「ＫＳＧ−３２」、「ＫＳＧ−３３」、「ＫＳＧ−２１０」、「ＫＳＧ−３１０」、「ＫＳＧ−３２０」、「ＫＳＧ−３３０」、「ＫＳＧ−３４０」及び「Ｘ−２２６１４６」などの名称で市販されているものなどが挙げられる。
[0053]  ポリグリセロール化シリコーンエラストマーとしては、信越化学工業株式会社より「ＫＳＧ−７１０」、「ＫＳＧ−８１０」、「ＫＳＧ−８２０」、「ＫＳＧ−８３０」、「ＫＳＧ−８４０」、「ＫＳＧ−３１」、「ＫＳＧ−３２」、「ＫＳＧ−４１」、「ＫＳＧ−４２」、「ＫＳＧ−４３」及び「ＫＳＧ−４４」などの名称で市販されているものなどが挙げられる。
【００６２】
[0054]  さらに、シリコーン樹脂加水分解タンパク質も使用することができる。シリコーン樹脂加水分解タンパク質の例としては、（加水分解絹／ＰＧ−プロピルメチルシランジオール）クロスポリマー及び（トリメチルシリル加水分解小麦タンパク質／ＰＧ−プロピルメチルシランジオール）クロスポリマーが挙げられる。市販されている製品をシリコーン樹脂加水分解タンパク質として使用することができる。このような市販されている製品の例としては、PROTESIL FN、PROTESIL LH、及びPROTESIL GLHという商品名のSeiwa Kasei Co., LTD.の製品が挙げられる。
【００６３】
[0055]  界面活性剤の例としては、親油性非イオン性界面活性剤及び親水性非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００６４】
[0056]  親油性非イオン性界面活性剤の例としては、ソルビタンモノオレエート、モノイソステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、ジグリセロールソルビタンペンタ−２−エチルヘキシレート及びジグリセロールソルビタンテトラ−２−エチルヘキシレートなどのソルビタン脂肪酸エステル；グリセリルモノ綿実油脂肪酸、グリセリルモノエルケート、セスキオレイン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、グリセリルα，α’−ピログルタミン酸オレイン酸、及びモノステアリン酸リンゴ酸グリセリルなどのグリセリルポリグリセリル脂肪酸；モノステアリン酸プロピレングリコールなどのプロピレングリコール脂肪酸エステル；水素化ひまし油誘導体；グリセリンアルキルエーテルが挙げられる。
【００６５】
[0057]  非イオン性界面活性剤油の例としては、ＰＯＥ−モノオレイン酸ソルビタン、ＰＯＥ−モノステアリン酸ソルビタン、ＰＯＥ−モノオレイン酸ソルビタン及びＰＯＥ−テトラオレイン酸ソルビタンなどのＰＯＥ−ソルビタン脂肪酸エステル；ＰＯＥ−モノラウリン酸ソルビトール、ＰＯＥ−モノオレイン酸ソルビトール、ＰＯＥ−ペンタオレイン酸ソルビトール、ＰＯＥ−モノステアリン酸ソルビトールなどのＰＯＥソルビトール脂肪酸エステル；ＰＯＥ−モノオレイン酸グリセリン、ＰＯＥ−モノステアリン酸グリセリン、ＰＯＥ−モノイソステアリン酸グリセリン及びＰＯＥ−トリイソステアリン酸グリセリンなどのＰＯＥ−グリセリン脂肪酸エステル；ＰＯＥ−モノオレイン酸、ＰＯＥ−ジステアリン酸、ＰＯＥ−モノジオレイン酸及びエチレンジステアリン酸グリコールなどのＰＯＥ−脂肪酸エステル；ＰＯＥ−ラウリルエーテル、ＰＯＥ−オレイルエーテル、ＰＯＥ−ステアリルエーテル、ＰＯＥ−ベヘニルエーテル、ＰＯＥ−２−オクチルドデシルエーテル及びＰＯＥ−コレスタノールエーテルなどのＰＯＥ−アルキルエーテル；プルロニック型界面活性剤（例えばPluronic）；ＰＯＥ−ＰＯＰ−セチルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ−２−デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ−モノブチルエーテル、ＰＯＥ−ＰＯＰ−水素化ラノリン及びＰＯＥ−ＰＯＰ−グリセリンエーテルなどのＰＯＥ−ＰＯＰ−アルキルエーテルが挙げられる。
【００６６】
[0058]  共界面活性剤の例としては、高級アルコールが挙げられる。なかでも、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール、セトステアリルアルコールなどの線状脂肪アルコールが好ましい。セチルアルコールがさらに好ましい。
【００６７】
[0059]  ゲル化剤の例としては、非イオン性ポリマー、陽イオンポリマー、さらに陰イオンポリマー及び陰イオン基がある両性ポリマー、例えばアラビアゴム、カラギーナン、カラヤゴム、トラガカントゴム、マルメロの種（マルメロ）、カゼイン、ゼラチン、ペクチン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、ペクチン、フコイダン、ガラクトマンナン、カードラン、ゲランガム、Fucogel（登録商標）（フコースが豊富な多糖）、コラーゲン、ヒアルロン酸ナトリウム、Alcasealan（登録商標）（アルカリゲネスから生成される多糖）、プロピレンアルギン酸グリコール、及びジアルキルジメチルアンモニウム硫酸セルロース）が挙げられる。
[0060]  金属イオン封鎖剤としては、例えば、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジフォスホン酸、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジフォスホン酸四ナトリウム塩、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸、リン酸、クエン酸、アスコルビン酸、コハク酸、エデト酸、エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸３ナトリウム等が挙げられる。
【００６８】
[0061]  低級アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブチルアルコール、及びｔ−ブチルアルコールが挙げられる。
[0062]  多価アルコール又はその誘導体としては、例えば、２価のアルコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、トリメチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、テトラメチレングリコール、２，３−ブチレングリコール、ペンタメチレングリコール、２−ブテン−１，４−ジオール、ヘキシレングリコール、オクチレングリコール等）；３価のアルコール（例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等）；４価アルコール（例えば、１，２，６−ヘキサントリオール等のペンタエリスリトール等）；５価アルコール（例えば、キシリトール等）；６価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール等）；多価アルコール重合体（例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール等）；２価アルコールアルキルエーテル類（例えば、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル等）；２価アルコールエーテルエステル（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート等）；グリセリンモノアルキルエーテル（例えば、キミルアルコール、セラキルアルコール、バチルアルコール等）；糖アルコール（例えば、ソルビトール、マルチトール、マルトトリオース、マンニトール、ショ糖、エリトリトール、グルコース、フルクトース、デンプン分解糖、マルトース、キシリトース、デンプン分解糖還元アルコール等）等が挙げられる。
[0063]  単糖としては、例えば、三炭糖（例えば、Ｄ−グリセリルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン等）；四炭糖（例えば、Ｄ−エリトロース、Ｄ−エリトルロース、Ｄ−トレオース、エリスリトール等）；五炭糖（例えば、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｌ−キシルロース等）；六炭糖（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−タロース、Ｄ−プシコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｌ−マンノース、Ｄ−タガトース等）；七炭糖（例えば、アルドヘプトース、ヘプロース等）；八炭糖（例えば、オクツロース等）；デオキシ糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース、６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース、６−デオキシ−Ｌ−マンノース等）；アミノ糖（例えば、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸、アミノウロン酸、ムラミン酸等）；ウロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−マンヌロン酸、Ｌ−グルロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｌ−イズロン酸等）等が挙げられる。
[0064]  オリゴ糖としては、例えば、ショ糖、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ゲンチオビオース、ウンビリシン、ラフィノース、ゲンチアノース、マルトトリオース、メレジトース、プランテオース、ウンベリフェロース、スタキオース、ベルバスコース等が挙げられる。
[0065]  アミノ酸としては、例えば、中性アミノ酸（例えば、スレオニン、システイン等）；塩基性アミノ酸（例えば、ヒドロキシリジン等）等が挙げられる。また、アミノ酸誘導体として、例えば、アシルサルコシンナトリウム（ラウロイルサルコシンナトリウム）、アシルグルタミン酸塩、アシルβ−アラニンナトリウム、グルタチオン、ピロリドンカルボン酸等が挙げられる。
[0066]  有機アミンとしては、例えば、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、トリイソプロパノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール等が挙げられる。
[0067]  高分子エマルジョンとしては、例えば、アクリル樹脂エマルジョン、ポリアクリル酸エチルエマルジョン、アクリルレジン液、ポリアクリル酸アルキルエマルジョン、ポリ酢酸ビニル樹脂エマルジョン、天然ゴムラテックス等が挙げられる。
【００６９】
[0068]  これらの添加剤はCosmetic, Toiletry and Fragrance Associationが出版した２００２年のInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook第９版で言及されており、それを参照することができる。
【００７０】
[0069]  本発明による外用剤用組成物は、ビタミン、抗酸化剤、保湿剤、血流促進剤、抗菌剤、細胞（皮膚）活性剤、皮膚軟化剤、老化防止剤、汚染防止剤、角質溶解剤、収斂剤、抗炎症剤、美白剤、及び日焼け止め剤などの様々な活性剤をさらに含むことができる。
[0070]  ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ6、Ｃ、Ｅおよびその誘導体、パントテン酸およびその誘導体、ビオチン等が挙げられる。
[0071]  抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、グルコシドアスコルビル、リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウム、ソルビン酸アスコルビルなどのアスコルビン酸及びその誘導体；酢酸トコフェロール、ソルビン酸トコフェロール、その他のトコフェロールのエステルなどのトコフェロール及びその誘導体；ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）；没食子酸エステル；リン酸；クエン酸；マレイン酸；マロン酸；コハク酸；フマル酸；ケファリン；ヘキサメタリン酸塩；フィチン酸；エチレンジアミンテトラ酢酸：及びアイリッシュモス（Chondrus crispus）、ロディオラ属（Rhodiola）、高度好熱菌、マテ茶葉、オーク材、カユ・ラペ樹皮（kayu rapet bark）、サクラ葉、イランイラン葉（ylang ylang leaves）などの植物エキスが挙げられる。
[0072]   保湿剤としては、例えば、ポリエチレングリコール；プロピレングリコール；ジプロピレングリコール；グリセリン；１，３−ブチレングリコール；キシリトール；ソルビトール；マルチトール；コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類；ヒアルロン酸；ヒアルロン酸ナトリウム；ヒアルロン酸アセチルナトリウム；ムコイチン硫酸；カロニン酸；アテロコラーゲン；コレステリル−１２−ヒドロキシステアレート；胆汁酸塩；ピロリドンカルボン酸塩及び乳酸塩などのＮＭＦ（自然保湿因子）の主成分；尿素、システイン及びセリンなどのアミノ酸類；短鎖可溶性コラーゲン；ジグリセリン（ＥＯ）ＰＯ付加物；NOFより「Lipidure HM」及び「Lipidure PBM」などの名称で市販されている２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのホモポリマー又はコポリマー；パンテノール；アラントイン；NOFより「Wilbride S 753」の名称で市販されているPEG/PPG/ポリブチレングリコール-8/5/3グリセリン；旭化成ケミカルズ株式会社より「AMINOCOAT」の名称で市販されているトリメチルグリシン；スウィートチェスナット（Castanea sativa）エキス、ヘーゼルナットタンパク質加水分解物、チューベローズ（Polianthes tuberosa）多糖類、アルガンツリー種子油（Argania spinosa kernel oil）、丸善製薬株式会社より「真珠エキス」（登録商標）の名称で市販されているコンキオリン含有真珠エキスなどの各種植物エキスが挙げられる。
[0073]  皮膚軟化剤としては、ポリメタクリル酸グリセリル、メチルグルセス−２０（methyl gluceth-20）などが挙げられる。
[0074]  老化防止剤としては、例えば、アシルアミノ酸（具体的には、SEDERMA社より「Maxilip」、「Matrixyl 3000」、「Biopeptide CL」の名称で市販されているもの、SEPPIC社より「Sepilift」の名称で市販されているものなどが挙げられる。）；エンドウ（Pisum sativum）エキス；ダイズタンパク質加水分解物；マンヌロン酸メチルシラノール；加水分解ペポカボチャ種子油粕；セネデスムスエキスなどが挙げられる。
[0075]  抗汚染剤としては、例えば、ワサビノキ種子エキス（Moringa pterygosperma seed extracts）（具体的には、LSN社より「Purisoft」の名称で市販されているものが挙げられる。）；シアバターエキス（具体的には、SILAB社より「Detoxyl」の名称で市販されているもの、セイヨウキズタエキス（ivy extract）、フィチン酸、ヒマワリ種子エキスのブレンド（例えば、SEDERMA社より「OSMOPUR」の名称で市販されているもの）などが例示される。）などが挙げられる。
[0076]  角質溶解剤としては、例えば、α−ヒドロキシ酸（具体的には、グリコール酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マンデル酸及び酒石酸などが例示される）、β−ヒドロキシ酸（具体的には、サリチル酸などが例示される）、それらのエステル（具体的には、乳酸Ｃ１２−１３アルキル）及びこれらのヒドロキシ酸を含む植物エキス（具体的には、ロゼリソウ（Hibiscus sabdriffa）エキスなどが例示される）などが挙げられる。
【００７１】
[0077]  収斂剤の例としては、ハマメリス抽出物などが挙げられる。
[0078]  抗炎症剤としては、例えば、ビサボロール、アラントイン、トラネキサム酸、酸化亜鉛、硫黄酸化物及びその誘導体、コンドロイチン硫酸塩、グリチルリチン酸及びその誘導体（グリチルリチン酸塩など）などが挙げられる。
[0079]  また、本発明の外用剤用組成物は、メラニン生成メカニズム（ステージI）に関与するメラニン細胞特異的糖タンパク質であるPmel17などの構造タンパク質の合成を阻害するために、ホワイトニング剤を少なくとも１種含んでいてもよい。ホワイトニング剤としては、BASF社より「Cytovector」（商標）の名称で市販されているフェルラ酸含有サイトベクター（水、グリコール、レシチン、フェルラ酸、ヒドロキシエチルセルロース）などが挙げられる。
【００７２】
[0080]  さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、特許出願第ＷＯ２００９／０１０３５６号に記載されているように、少なくとも１つのペプチドを含むことができる。
【００７３】
[0081]  さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、メラニン合成への抑制効果及び／又は小眼球関連転写因子（ＭＩＴＦ）発現への抑制効果及び／又は抗チロシナーゼ活性及び／又はエンドセリン−１合成への抑制効果を有する美白剤を含むことができる。このような美白剤の例としては、Licorice抽出物（商標）という商品名でMaruzen Pharmaceuticalsから市販されている甘草エキスを挙げることができる。
[0082]  さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、ビタミンＣ化合物などの抗酸化作用をも有するホワイトニング剤を含んでいてもよい。例えば、アスコルビン酸塩、脂肪酸又はソルビン酸のアスコルビルエステル、その他のアスコルビン酸誘導体などが挙げられる。具体的には、リン酸アスコルビル塩（リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウムなど）、アスコルビン酸のサッカリドエステル（アスコルビル−２−グルコシド、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル  Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル  Ｌ−アスコルビン酸など）が例示される。このタイプの活性成分は、ＤＫＳＨ社より「Ascorbyl glucoside」（商標）の名称で市販されている。
[0083]  さらに、本発明の水中油型乳化組成物は、他のホワイントニング剤を含んでいてもよい。例えば、植物エキス（房咲水仙などのエキス）、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、システイン、４−チオレゾルシン、レゾルシノールもしくはルシノール又はそれらの誘導体、グリチルリチン酸及びヒドロキノン−β−グルコシドなどの色素沈着抑制剤を含んでいてもよい。
[0084]  さらに、必要に応じて、本発明による外用剤用組成物は、有機及び／又は無機日焼け止め剤を含んでいてもよい。
[0085]  有機日焼け止め剤の例としては、ジベンゾイルメタン誘導体（例えば、ブチルメトキシジベンゾイルメタン（HOFFMANN LA ROCHEからParsol 1789という商品名で市販されている製品）など）；桂皮酸誘導体（例えばエチルヘキシルメトキシ桂皮酸エステル（HOFFMANN LA ROCHEからParsol MCXという商品名で市販されている製品）、サリチル酸塩、パラアミノ安息香酸など）；β−β’−ジフェニルアクリル酸誘導体；ベンゾフェノン誘導体；ベンジリデンショウノウ誘導体（テレフタリリデン−ジショウノウスルホン酸；フェニルベンズイミダゾール誘導体；トリアジン誘導体；フェニルベンゾトリアゾール誘導体；アントラニル酸誘導体などが挙げられ、いずれもコーティング又はカプセル化されていてもよい。
【００７４】
[0086]  無機日焼け止め剤の例としては、例えば酸化チタン、酸化鉄、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム又は酸化セリウムナノ顔料のようなコーティングした、又はコーティングしていない金属酸化物から形成したナノ顔料を挙げることができ、これはすべてそれ自体がよく知られているＵＶ光防護剤である。
【００７５】
[0087]  本発明の外用剤用組成物の剤形形態は任意に選択可能であり、溶液型、エマルジョン型、及びゲル型のいずれかを採用することができる。これは外用剤用組成物に導入され、任意のタイプの液体又は半液体又は固体組成物とすることができ、溶液、エマルジョン、ゲルを含むが、任意選択で自身中に水及び／又は油相を含む粉末でもよい。
【００７６】
[0088]  さらに外用剤用のこれらの組成物の製品形態も任意に選択可能であり、組成物は、顔用クレンザ、フェースローション、エッセンス液、乳液、クリーム及びパックなどの顔用化粧品；ファンデーション、口紅及びアイシャドーなどのメーキャップ用化粧品；身体用メーキャップ製品；ヘアケア化粧品；口腔ケアの洗面用化粧品；香水類；洗浄剤；及び軟膏に適用可能である。
【００７７】
（医薬組成物）
[0089]  本発明のスクリーニング法により選択されるモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを低下させる化合物は、しみ、ケロイド、又は色素沈着過度など、過剰なメラニンによって引き起こされる疾患又は症状の治療に使用する医薬組成物に使用することができる。
【００７８】
本発明のスクリーニング法により選択されるモータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを上昇させる化合物は、癌の治療又は予防に、又は皮膚癌の分化に使用する医薬組成物に使用することができる。
【００７９】
上記医薬組成物は、標的細胞のミトコンドリア機能及び／又は酸化ストレスに作用することができる。
【００８０】
[0090]  本発明の医薬組成物は、任意の既知の方法により製剤化することができる。製剤の例としては、顆粒、細顆粒剤、粉末薬剤、錠剤、カプセル型製剤、液体薬剤、シロップ剤、咀嚼型製剤、トローチ剤、舌下製剤などの経口剤；軟膏、ゲル、クリーム、パッチなどの局所製品；注射用製剤；吸入薬；点眼液；座剤を挙げることができる。
【００８１】
各製剤における選択された化合物の量は、当業者が適宜決定することができる。
【００８２】
[0091]  本発明は、（ｉ）モータリン及び／又はＨｓｐ６０遺伝子を含む発現ベクター、又は（ｉｉ）モータリンタンパク質及び／又はＨｓｐ６０タンパク質を含む医薬組成物も提供する。
【００８３】
このような医薬組成物は、患者の体内のモータリン及び／又はＨｓｐ６０を直接増加させ、メラニン生成又は色素沈着を誘導することができる。したがって、医薬組成物は、ＵＶに誘導される皮膚の損傷又は皮膚癌の予防薬として、又は皮膚癌の分化剤として使用することができる。
【００８４】
この医薬組成物は、上記方法によって調製してもよい。
【００８５】
（培養皮膚の色の操作方法）
[0092]  本発明は培養皮膚細胞のメラニン生成又は色素沈着を操作する方法も提供し、これは、幹細胞をin vitroで皮膚細胞に分化させる工程と、培養皮膚細胞中のモータリン及び／又はＨｓｐ６０の量を調節する工程とを含む。
【００８６】
この方法により、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞などの幹細胞を分化させることによって培養皮膚を生成する場合に、例えば培養皮膚を移植する患者の皮膚の色にあわせて、培養皮膚の色を操作することができる。
【００８７】
[0093]  モータリン及び／又はＨｓｐ６０の量の調節は、例えば本発明のスクリーニング法により選択される化合物を幹細胞の培地に添加することによって行うことができる。モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを上昇させる化合物を培地に添加すると、培養皮膚の色を褐色又は黒の方向に変化させることができる。他方で、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを低下させる化合物を培地に添加すると、培養皮膚の色を白の方向に変化させることができる。
【００８８】
モータリン及び／又はＨｓｐ６０の量の調節は、モータリン及び／又はＨｓｐ６０を培地に直接添加することによって、又はモータリン及び／又はＨｓｐ６０遺伝子を含む発現ベクターで幹細胞を形質転換させることによって実行することができる。
【００８９】
実施例
[0094]  以降で本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はそれに限定されないことに留意されたい。
【００９０】
以下の実施例に使用される方法について、次に説明する。
【００９１】
材料及び方法
細胞培養、処理及びトランスフェクション
ヒトメラノーマＧ３６１は、日本の東北大学生物医学的研究用細胞資源センターから購入し、加湿したインキュベータ（３６℃、５％ＣＯ2）内で１０％のウシ胎児血清を添加したDMEM-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Invitrogen)中で培養した。明るい肌及び暗い肌のドナー由来のヒト初代メラノサイトは、ScienCell Research Laboratoriesから購入し、推奨されたメラノサイト増殖培地で培養した。細胞は、推奨されたプロトコルに従い、Fugene (Roche)を使用して、モータリン又はＨＳＰ６０タンパク質をコードする発現プラスミドで形質転換した。通常、７０〜８０％コンフルエントの６ｃｍの培養皿に、３〜５μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。細胞はプラスミドで４８時間インキュベートし、その後に細胞を回収して、下記のようなプロトコルによって発現を示す遺伝子を調べた。ｓｈＲＮＡトランスフェクションについては、Oligofectamine（商標） Transfection Reagent （Life technologies（商標））を製造業者の指示に従って使用した。トランスフェクトした細胞を、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を添加した培地で２４〜４８時間インキュベートし、次に下記のようなアッセイのために処理した。
【００９２】
薬剤処理
細胞は、ジアシルグリセロール（ＯＡＧ、２０μｇ／ｍｌ）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ−１００μＭ）(Merck Millipore)、ＰＤ９８０５９（２０μｇ／ｍｌ）（Life Technologies)及び過酸化水素（１５０〜３００μＭ）などの色素誘導物質で４８時間処理した。
【００９３】
ビタミンＣ処理
細胞はジアシルグリセロール（ＯＡＧ、２０μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、その後に下記のような通常の培地又はビタミンＣ（０．１〜０．３ｍＭ）で２４〜４８時間回収した。
【００９４】
ＴＸＣ処理
細胞はＴＸＣで以下のように処理した。
【００９５】
Ｇ３６１細胞を一晩培養し、表面に十分付着させて、その後に下記のようにＴＸＣ添加培地又はＯＡＧで処理し、その後に図に示した用量のＴＸＣ培地内で回収した。
【００９６】
Ｈｓｐ６０及びモータリンのノックダウン
−モータリンｓｈＲＮＡベクターの構築
モータリンを標的とするｓｈＲＮＡを発現するプラスミドを、既報（Miyagishi他（２００４）J Gene Med, 6: 715-723及びYoo他、（２０１０）J. Gene Medicine 12, 586-595）にしたがって、Ｕ６プロモータベクターで生成した。モータリンについて使用した３つの標的サイトは#007-GCAACAAGCTGAAAGAAGA（配列番号：１）、#008-GCCAGAAGGACAACATATG（配列番号：２）及び#009-GAATGAGGCTAGACCTTTA（配列番号：３）であった。通常、モータリン標的ｓｈＲＮＡを生成するために、センスオリゴヌクレオチド5' -gatcccGCAACAAGCTGAAAGAAGAttcaagagaTCTTCTTTCAGCTTGTTGCttttttggaaa-3'（配列番号：４）及びそれとコグネートのアンチセンスオリゴヌクレオチド5'-agcttttccaaaaaaGCAACAAGCTGAAAGAAGAttcaagagaTCTTCTTTCAGCTTGTTGCgg-3'（配列番号：５）をアニールすることによって、ヒトモータリンを標的とするｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡ断片を生成した。１９−ヌクレオチドのモータリン標的配列は大文字で表示され、９−ヌクレオチドヘアピン及び指向性クローニングに必要な配列は小文字で示されている。
【００９７】
−ＨＳＰ６０  ｓｈＲＮＡベクターの構築
ＨＳＰ６０を標的とするｓｈＲＮＡを発現するベクターを上述したように生成した。使用した２つの標的サイトは-5' GTGAGATGAGGAGCCAGTACC 3'（配列番号：６）及び5' TTCAAGCATTAAGGCTCGGGC 3'（配列番号：７）であった。
【００９８】
−ＨＳＰ６０及びモータリン過剰発現ベクター
Ｈｓｐ６０及びモータリンを過剰発現させるために、レトロウィルス発現システムを使用した。既報（Wadhwa他、2006 International J Cancer, 118: 2973-2980）にしたがって、完全長のＨＳＰ６０又はモータリンタンパク質をコードするｃＤＮＡをベクターのＢａｍＨＩサイト内にクローニングした。レトロウィルスを産生するために、Ｐｌａｔ−Ｅ、すなわちエコトロピック・マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）パッケージング細胞株に、pVPack-GP（gal及びpolを発現する）及びpVPack VSVG（envを発現する）ベクター（カリフォルニア州Stratagene）と、pCXneoレトロウィルスベクター又はpCX4neo／モータリンをFuGENE6（Boehringer Mannheim）を使用してトランスフェクトした。４８時間後に培養上清を採取し、０．４５μｍのフィルタで濾過して、感染用のウィルス株として使用した。ＭＣＦ７細胞（６ウェルディッシュで２×１０5／ウェル）を８μｇ／ｍｌのポリブレンで１時間、３７℃で処理し、その後に２００μｌの濾過したウィルスストックを１時間、細胞に感染させた。プレートは１５分おきに傾けて、ウィルス粒子を細胞全体に広げた。１時間後、２ｍｌのＤＭＥＭを培養物に加えて、ウィルスストックを希釈し、次にプレートを３７℃でさらに４８時間インキュベートした。安定した発現細胞株が得られるまで、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を含む培地内で細胞を選別した。
【００９９】
チロシナーゼＥＬＩＳＡ
細胞（約１００００個／ウェル）を９６ウェルのNunc-Immuno maxisorpプレートで培養した。約７０％コンフルエントで、上述のように細胞にｓｈＲＮＡプラスミド（１００ｎｇ／ウェル）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ピューロマイシン添加培地内で細胞を選別し、次に下記のようにチロシナーゼＥＬＩＳＡのために処理した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（Santa Cruz Biotehnology）中に溶解させた。溶解物中のタンパク質濃度を測定し（Pierce BCA Protein Assayキット、Thermo Scientific）、コーティング緩衝液（０．１Ｍの重炭酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中でサンプルを１μｇ／μｌの濃度まで希釈した。コーティング緩衝液で１００μｌの最終ボリュームとして５μｇのタンパク質サンプルを各ウェルに加えた。プレートを１０分間優しく振盪し、次にしっかり密封して室温で２時間放置した。溶液を廃棄し、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ０．５％のTween 20）で５分間洗浄した。ブロッキング緩衝液（２００μｌ）を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートし、その後に洗浄緩衝液で２回（毎回３分間）洗浄した。抗チロシナーゼ抗体（５０μｌ、ブロッキング緩衝液中に５μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、プレートを密封して１〜２時間室温に維持し、その後に洗浄緩衝液で洗浄した（３×１０分間）。プレートを２次抗体（アルカリホスファターゼ、ＡＰヤギ抗ラビットＩｇＧ）で１時間インキュベートし、その後に洗浄緩衝液で３〜５回洗浄した。１００μｌのＡＰ（−ニトロフェニルホスフェート、Disodium Salt、PNPP）用基質を各ウェルに加えた。プレートを再び密封して３０分間放置し、その後にチロシナーゼ発現の定量的評価を表す４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【０１００】
メラニン含有量
細胞を９６ウェルプレートで培養し、プレートの表面に２４時間付着させ、その後に上述のとおり図の説明文で示したようにトランスフェクション及び処理をした。細胞をＰＢＳで洗浄した。各々に水酸化カリウム（ＫＯＨ−０．８５Ｎ、１００μｌ）を加えた。プレートを暗所で一晩優しく振盪した。色素の吸光度を４０５ｎｍで測定した。標準的な精製メラニン（シグマ）を使用して、メラニン含有量を計算した。
【０１０１】
免疫染色
細胞を、１２ウェル培養ディッシュに配置したカバーガラス上で培養し、処理した。上述の処理の最後に、カバーガラスを冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞を予め冷却したメタノール：アセトン（１：１ｖ／ｖ）混合物で５〜１０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．２％のトリトンＸ−１００で１０分間透過性処理して、ＰＢＳ中び２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２０分間ブロッキングした。細胞を、抗モータリン、抗ＨＳＰ６０、抗チロシナーゼ、及び抗メラノソーム抗体で染色した。Alexa-488又はAlexa-594結合抗体（Molecular probes）で２次染色することにより、免疫染色を視覚化した。ＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００（ＰＢＳＴ）で３回から４回洗浄した後、細胞にFluoromount（Difco）を重ねた。落射蛍光のカールツァイス顕微鏡で細胞を検査した。
【０１０２】
ウェスタンブロッティング
細胞を６ウェルプレートで増殖させ、処理した。上述したトランスフェクション又は薬剤処理の後、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物（３０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、その後に半乾燥トランスファブロッタを使用してニトロセルロース膜（Millipore）上に転写した。イムノアッセイは抗モータリン、抗ＨＳＰ７０及び抗チロシナーゼ抗体で行った。形成された免疫複合体は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ラビット／マウス免疫グロブリンＧで視覚化した。LAS 3000 mini（富士フイルム）でバンドを検出した。
【０１０３】
結果
メラニン生成に関与する遺伝子をスクリーニングするアッセイの確立
図１は、コントロール及び明るい肌のドナー由来のＯＡＧ処理した初代メラノサイト（Ａ）及びヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１（Ｂ）におけるメラノソーム誘導の免疫組織化学的分析の結果を示す。細胞を検出するために核染色法としてＰＩ染色法を使用した。明るい肌のドナー由来の初代メラノサイト及びヒトメラノーマ細胞Ｇ３６１の両方で、ＯＡＧによりメラノソーム産生が誘導された。
【０１０４】
図２は、メラニン含有量の計算結果を示す。ＯＡＧ処理した細胞で、メラニン含有量の増加が観察された。ビタミンＣ（脱色素のための陽性コントロール）での処理は、ＯＡＧで誘導されるメラニンの含有量低下を引き起こした。
【０１０５】
図３は、チロシナーゼのウェスタンブロッティング（Ａ）及びチロシナーゼＥＬＩＳＡアッセイ（Ｂ）の結果を示す。ＯＡＧ処理したＧ３６１細胞では、チロシナーゼの発現及び活性の増大が観察された。ビタミンＣ処理は、ＯＡＧで誘導されるチロシナーゼの減少を引き起こした。
【０１０６】
これらの結果は、この実験システムが本発明の効果を適切に示すことを裏付けた。ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果、モータリン及びＨｓｐ６０遺伝子を選択し、メラニン生成におけるその役割の検証に用いた。
【０１０７】
選択した遺伝子のメラニン生成におけるその役割の検証
図４は、ＯＡＧでメラニン生成を誘導した際のメラノソーム及びＨｓｐ６０の免疫染色の結果を示す。ＯＡＧによるメラニン生成の誘導の結果、Ｈｓｐ６０が上方制御された。
【０１０８】
図５は、ＯＡＧでメラニン生成を誘導した際のメラノソーム及びモータリンの免疫染色の結果を示す。ＯＡＧによるメラニン生成の誘導の結果、モータリンが上方制御された。
【０１０９】
図６は、ＯＡＧで処理したＧ３６１細胞におけるＨｓｐ６０又はモータリンのノックダウンの際のメラニン含有量を示す。Ｈｓｐ６０又はモータリンのノックダウンにより、Ｇ３６１細胞中のメラニンがＯＡＧで誘導される量が減少した。
【０１１０】
図７は、ＯＡＧで処理したＧ３６１細胞中でＨｓｐ６０又はモータリンのノックダウンの際のチロシナーゼ活性を示す。Ｈｓｐ６０及びモータリンのノックダウンにより、Ｇ３６１細胞中のチロシナーゼ活性のＯＡＧ誘導による増加が減少した。
【０１１１】
図８は、Ｇ３６１細胞においてモータリンを過剰発現させたときのメラニン含有量を示す。モータリンが過剰発現した結果、内因性のメラニン含有量が増加した。
【０１１２】
図９は、Ｇ３６１細胞においてモータリンを過剰発現させたときのメラノソーム染色を示す。モータリンが過剰発現した結果、内因性のメラノソームが増加した。
【０１１３】
図１０は、Ｇ３６１細胞においてモータリンを過剰発現させたときのチロシナーゼ活性を示す。モータリンが過剰発現した結果、チロシナーゼ活性が増加した。
【０１１４】
以上の結果は、Ｈｓｐ６０及びモータリンの細胞内含有量が、チロシナーゼ活性及びメラニン産生とメラノソーム産生と正に相関することを示す。したがって、Ｈｓｐ６０及びモータリンをメラニン生成の指標として使用できることが確認される。
【０１１５】
本発明のスクリーニング法の有用性の検証
図１１は、様々な濃度でＴＸＣ処理した後の、ＯＡＧ処理又はＯＡＧ未処理のＧ３６１細胞内のメラニン含有量を示す。ＴＸＣ処理は、内因性のメラニン及び細胞内でＯＡＧに誘導されたメラニンの減少を引き起こした。
【０１１６】
図１２は、様々な濃度でＴＸＣ処理した後の、ＯＡＧ処理又はＯＡＧ未処理のＧ３６１細胞のチロシナーゼ活性を示す。ＴＸＣ処理は、細胞内でＯＡＧに誘導されたチロシナーゼ活性の減少を引き起こした。
【０１１７】
図１３は、ＴＸＣ処理したＧ３６１細胞のチロシナーゼ及びＨｓｐ６０の発現、及びＴＸＣ処理したＧ３６１細胞のＯＡＧに誘導されたモータリンの発現を示す。ＴＸＣ処理は、Ｇ３６１細胞におけるチロシナーゼ及びＨｓｐ６０の内因性発現、及びモータリンの内因性及びＯＡＧ誘導性発現を引き起こした。
【０１１８】
以上の結果は、チロシナーゼ、モータリン及びＨｓｐ６０の発現を減少させるＴＸＣ処理が、Ｇ３６１細胞内の内因性又はＯＡＧ誘導性のメラニンの減少を誘導することを示す。これらの結果に基づき、本発明のスクリーニング法によって選択される化合物は、モータリン及び／又はＨｓｐ６０の発現レベルを低下させるので、ＴＸＣと同様に、脱色素、美白又はメラニン生成の抑制に有用であることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2014215286.tif 000013
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2014215286000001.pdf