(57)【要約】      （修正有）【課題】C8位にエチリデン基を有するバクテリオクロリン化合物の製造方法、並びにそのための酵素の提供。【解決手段】バクテリオクロロフィルbもしくはバクテリオクロロフィルgを産生する光合成細菌由来のBchX、BchY及びBchZに、C8位にビニル基を有するクロリン化合物を接触することにより、B環の共役ジエン部分を1,4付加還元して、C8位にエチリデン基を有する、バクテリオクロリン化合物を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオクロロフィルbもしくはバクテリオクロロフィルgを産生する光合成細菌由来のBchX、BchY及びBchZに、下式(1)：
【化１】
2014003938.tif 000019
（式中、
Ｒ１はビニル基、1-ヒドロキシエチル基又はアセチル基を示し、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１−１８アルキル基、ファルネシル基、フィチル基、ゲラニルゲラニル基、ジヒドロゲラニルゲラニル基又はテトラヒドロゲラニルゲラニル基を示し、
Ｍは存在しないか、2価の金属原子を示す。）
で表される化合物を接触させることを特徴とする、下式(2)：
【化２】
2014003938.tif 000020
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される化合物の製造方法。
【請求項２】
BchX、BchY及びBchZがそれらをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から得られたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
BchX、BchY及びBchZがブラストクロリス・ビリディス（Blastochloris viridis）、チオフラビコッカス・モビリス（Thioflavicoccus mobilis）又はヘリオバクテリウム・モデスティカルダム（Heliobacterium modesticaldum）由来である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ｍがマグネシウム原子又は亜鉛原子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化３】
2014003938.tif 000021
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化４】
2014003938.tif 000022
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
【請求項６】
以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化５】
2014003938.tif 000023
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号４に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化６】
2014003938.tif 000024
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
【請求項７】
以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号６に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化７】
2014003938.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号６に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化８】
2014003938.tif 000026
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
【請求項８】
請求項５記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項９】
以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化９】
2014003938.tif 000027
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
【請求項１０】
請求項６記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項１１】
以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化１０】
2014003938.tif 000028
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
【請求項１２】
請求項７記載のタンパク質をコードするDNA。
【請求項１３】
以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【化１１】
2014003938.tif 000029
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
【請求項１４】
以下の(a)〜(c)から選ばれる１以上のDNAを含有する発現ベクター。
(a) 請求項８又は９記載のDNA
(b) 請求項１０又は１１記載のDNA
(c) 請求項１２又は１３記載のDNA
【請求項１５】
請求項１４記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５記載の宿主細胞を培地中で培養し、得られる培養物から請求項５記載のタンパク質、請求項６記載のタンパク質及び請求項７記載のタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質を回収することを含む、該タンパク質の製造方法。
【請求項１７】
宿主細胞がバクテリオクロロフィルaを産生する光合成細菌である、請求項１５記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオクロロフィルbもしくはgを産生する光合成細菌又は該細菌由来のタンパク質BchX、BchY及びBchZを用いた、バクテリオクロリン環のC8位にエチリデン基を有する化合物の製造方法、並びにバクテリオクロロフィルbを産生する光合成細菌由来の新規タンパク質BchX、BchY及びBchZに関する。
【背景技術】
【０００２】
再生可能エネルギーの利用拡大に向けて、太陽光発電の導入を進める必要があるが、そのためには太陽電池の低コスト化と大量生産が重要である。ところが、現在の太陽電池の原料である高純度シリコンは高価な上、わが国ではその安定確保にも問題を抱えている。
シリコン太陽電池に代わる次世代太陽電池として、光合成初期過程と類似する色素の光誘起電子移動を利用する色素増感太陽電池が注目を集めている。これまでに、人工ポルフィリンを増感色素として利用したもののほか、天然のクロロフィルa誘導体を利用した色素増感太陽電池が報告されている。しかし、光エネルギー変換効率を高めるには、より長波長の近赤外領域に吸収波長を伸ばすことが望まれる。
【０００３】
バクテリオクロロフィル（BChl）は、酸素非発生型光合成細菌から見出されたテトラピロール類に対して与えらえた名称であり、aからgまでの7種類が有り、これまでにBChl fを除く6種類が天然より見出されている。このうち、BChl a、BChl b及びBChl gは、テトラピロール環のB、D両環のβ位のC-C二重結合が単結合に還元されたバクテリオクロリン骨格を有し、一方、BChl c〜fはD環のみが還元されたクロリン骨格を有している。BChl c/d/eは、緑色硫黄細菌の膜外アンテナ系であるクロロゾーム内の光捕集部に存在し、タンパク質が関与しない色素のみの自己会合体を形成している。これに対し、BChl aやBChl bは紅色光合成細菌に、BChl gはヘリオバクテリアにそれぞれ存在し、オリゴペプチドと非共有結合して色素−タンパク複合体を形成している。
（バクテリオ）クロロフィルの吸収スペクトルは、長波長側からQy、Qx、By、Bxの4つの吸収帯があるが（By・Bx帯をまとめてソーレー帯ともいう）、バクテリオクロリン骨格を有するBChl a/b/gは、クロリン骨格を有するBChl c/d/eや植物クロロフィルに比べてQy帯が近赤外領域に大きく長波長シフトしている。中でも、BChl bは、C8位のエチリデン側鎖の存在により、BChl aよりもQy帯がさらに長波長シフトしている。従って、BChl bや17位上のプロピオネート残基における長鎖炭化水素基が除去されたバクテリオクロロフィリドb（BChlide b）、それらから中心金属が脱離したバクテリオフェオフィチンb（BPhe b）やバクテリオフェオフォルバイドb（BPheoide b）を、安価にかつ大量に供給できれば、光エネルギー変換効率が向上した光デバイス等の生産に有用である。
【０００４】
しかしながら、BChl bもしくはBChl gを産生する光合成細菌において、バクテリオクロリン骨格のC8位にエチリデン基を導入する生合成経路は未だ不明のままであった。従来の仮説では、BChl a産生菌と同様に、クロロフィリドa（Chlide a）からBchX、BchY及びBchZの3つのタンパク質からなるクロロフィリドaレダクターゼ（COR）の作用によりB環のC7-8位の二重結合が単結合となり（非特許文献１）、さらにBchF及びBchCの作用によってC3位がアセチル化されてBChlide aが生じた後、未知の酵素の作用によりC8位のエチル基がエチリデン基に変換されると予測されていたが、そのような反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質は、BChl b産生菌からは単離されていなかった。
【０００５】
一方、光還元によって人工的にテトラピロール環のA環上にエチリデン基を導入することは可能となっているが、B環上にエチリデン基を化学的に導入したとの報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nomataら、J. Biol. Chem., 281(21): 15021-15028 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、BChl b産生菌及びBChl g産生菌におけるバクテリオクロリン環のC8位にエチリデン基が導入される生合成経路を解明し、当該生合成経路に関与する酵素遺伝子を同定し、当該酵素を用いて効率的なBChl bもしくはBChl g又はそれらの誘導体を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、BChl b産生菌及びBChl g産生菌には、BChl a産生菌が有する、8-ビニルクロロフィリドa（8V-Chlide a）の8-ビニル基をエチル基に還元する酵素(3,8-)ジビニルプロトクロロフィリドa 8-ビニルレダクターゼ（DVR）が存在しないことに着目し、BChl b産生菌及びBChl g産生菌は、8V-Chlide aから直接BChl gを生じる（即ち、クロリン環のB環の共役ジエンを1,4付加還元して、バクテリオクロリン環のC8位にエチリデン基を与える反応を触媒する）酵素を有しているのではないかと予測した。
そこで、本発明者らは、BChl b産生菌であるブラストクロリス・ビリディス（Blastochloris viridis）のゲノムDNAから、BChl a産生菌のBchX、BchY及びBchZ遺伝子のオルソログを単離し、大腸菌にサブクローニングしてBchX/Y/Zを発現させ、これに8V-Chlide aを反応させ、HPLCにて反応物を分析したところ、意外にもBChlide g（17位に長鎖炭化水素基が結合してBChl gとなる前駆体）が生成していることを見出した。さらに驚くべきことに、B. ビリディス由来のBchX/Y/ZにChlide aを作用させても、3-ビニルバクテリオクロロフィリドa（3V-BChlide a）は生成しなかった。シークエンシングの結果、B. ビリディス由来のBchX/Y/Zは、BChl a産生菌であるロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）由来のBchX/Y/Zとそれぞれ高い配列類似性を示したことから、両者が異なる反応を触媒することは全く予想外であった。
さらに、本発明者らは、BChl g産生菌であるヘリオバクテリウム・モデスティカルダム（Heliobacterium modesticaldum）の既知ゲノム配列よりBchX、BchYおよびBchZ遺伝子を検索し、これらにコードされるタンパク質をB. ビリディス由来BchX/Y/Zと同様、8V-Chlide aのB環上の共役ジエンを1,4付加還元してBChlide gを生じさせる酵素活性を有するものとして同定した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下のものを提供する。
〔１〕バクテリオクロロフィルbもしくはバクテリオクロロフィルgを産生する光合成細菌由来のBchX、BchY及びBchZに、下式(1)：
【００１０】
【化１】
2014003938.tif 000002
【００１１】
（式中、
Ｒ１はビニル基、1-ヒドロキシエチル基又はアセチル基を示し、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１−１８アルキル基、ファルネシル基、フィチル基、ゲラニルゲラニル基、ジヒドロゲラニルゲラニル基又はテトラヒドロゲラニルゲラニル基を示し、
Ｍは存在しないか、2価の金属原子を示す。）
で表される化合物を接触させることを特徴とする、下式(2)：
【００１２】
【化２】
2014003938.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される化合物の製造方法。
〔２〕BchX、BchY及びBchZがそれらをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞から得られたものである、上記〔１〕記載の方法。
〔３〕BchX、BchY及びBchZがブラストクロリス・ビリディス（Blastochloris viridis）、チオフラビコッカス・モビリス（Thioflavicoccus mobilis）又はヘリオバクテリウム・モデスティカルダム（Heliobacterium modesticaldum）由来である、上記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕Ｍがマグネシウム原子又は亜鉛原子である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００１４】
【化３】
2014003938.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００１６】
【化４】
2014003938.tif 000005
【００１７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
〔６〕以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００１８】
【化５】
2014003938.tif 000006
【００１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号４に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００２０】
【化６】
2014003938.tif 000007
【００２１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
〔７〕以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質。
(a) 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号６に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００２２】
【化７】
2014003938.tif 000008
【００２３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号６に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００２４】
【化８】
2014003938.tif 000009
【００２５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質
〔８〕上記〔５〕記載のタンパク質をコードするDNA。
〔９〕以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００２６】
【化９】
2014003938.tif 000010
【００２７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
〔１０〕上記〔６〕記載のタンパク質をコードするDNA。
〔１１〕以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００２８】
【化１０】
2014003938.tif 000011
【００２９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
〔１２〕上記〔７〕記載のタンパク質をコードするDNA。
〔１３〕以下の(a)又は(b)のDNA。
(a) 配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、下式(3)：
【００３０】
【化１１】
2014003938.tif 000012
【００３１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
〔１４〕以下の(a)〜(c)から選ばれる１以上のDNAを含有する発現ベクター。
(a) 上記〔８〕又は〔９〕記載のDNA
(b) 上記〔１０〕又は〔１１〕記載のDNA
(c) 上記〔１２〕又は〔１３〕記載のDNA
〔１５〕上記〔１４〕記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
〔１６〕上記〔１５〕記載の宿主細胞を培地中で培養し、得られる培養物から上記〔５〕記載のタンパク質、上記〔６〕記載のタンパク質及び上記〔７〕記載のタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質を回収することを含む、該タンパク質の製造方法。
〔１７〕宿主細胞がバクテリオクロロフィルaを産生する光合成細菌である、上記〔１５〕記載の細胞。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、Qy帯がより長波長の近赤外領域にあるBChl bもしくはg又はその誘導体を安定に提供することができるので、光吸収帯の変化した機能性色素を産業的に利用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−１】B. ビリディス由来のBchXと他の光合成細菌由来の既知BchXとのアミノ酸配列のalignmentを示す図である。R. caps: ロドバクター・カプスラタス (Rhodobacter capsulatus); R. spha: ロドバクター・スフェロイデス (Rhodobacter sphaeroides); B. viridis: ブラストクロリス・ビリディス (Blastochloris viridis); THIO. mobilis: チオフラビコッカス・モビリス(Thioflavicoccus mobilis); H. modesti: ヘリオバクテリウム・モデスティカルダム (Heliobacterium modesticaldum)
【図１−２】B. ビリディス由来のBchYと他の光合成細菌由来の既知BchYとのアミノ酸配列のalignmentを示す図である。図中の細菌名の略称は上記と同様。
【図１−３】B. ビリディス由来のBchZと他の光合成細菌由来の既知BchZとのアミノ酸配列のalignmentを示す図である。図中の細菌名の略称は上記と同様。
【図２】8-vinyl-Chlide a（Ａ）又はChlide a（Ｂ）を基質として用いた場合の（残留基質を含む）反応生成物の80％アセトン中での吸収スペクトルを示す図である。図中の破線はBchX/Y/Zを加えていない場合の対照実験結果であり、実線は実施例に従って90分間反応させた場合の吸収スペクトルである。グラフの横軸は波長（nm）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、BChl bもしくはBChl gを産生する光合成細菌由来のBchX、BchY及びBchZに、下式(1)：
【００３５】
【化１２】
2014003938.tif 000013
【００３６】
（式中、
Ｒ１はビニル基、1-ヒドロキシエチル基又はアセチル基を示し、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１−１８アルキル基、ファルネシル基、フィチル基、ゲラニルゲラニル基、ジヒドロゲラニルゲラニル基又はテトラヒドロゲラニルゲラニル基を示し、
Ｍは存在しないか、2価の金属原子を示す。）
で表される化合物を接触させることにより、下式(2)：
【００３７】
【化１３】
2014003938.tif 000014
【００３８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される化合物を製造する方法を提供する。
本発明で用いられるBChl bもしくはBChl g産生菌由来のタンパク質BchX、BchY及びBChZで構成される酵素（BchX/Y/Zと略記する場合がある）は、式(1)で表されるC8位にビニル基を有するクロリン化合物のB環の共役ジエン部分を1,4付加還元して、C8位にエチリデン基を有するバクテリオクロリン化合物に変換する反応を触媒する。当該酵素は、BChl aを産生する光合成細菌（例、ロドバクター・カプスラタス等）由来のBchX/Y/Zが有するクロロフィリドaレダクターゼ（COR）活性、即ち、下式(4)：
【００３９】
【化１４】
2014003938.tif 000015
【００４０】
で表される反応を触媒する活性を有しない。
【００４１】
本発明で用いられるBchX、BchY及びBchZが由来する光合成細菌としては、BChl bもしくはBChl gを産生するものであれば特に制限はなく、BChl b産生菌としては、例えば、ブラストクロリス・ビリディス、チオフラビコッカス・モビリス、チオコッカス・ペニヒ (Thiococcus pfennigii)、チオアルカリコッカス・リムナエウス(Thioalkalicoccus limnaeus)、ブラストクロリス・スルフォビリディス(Blastochloris sulfoviridis)、ハロロドスピラ・ハロクロリス(Halorhodospira halochloris) 等が、また、BChl g産生菌としては、例えば、ヘリオバクテリウム・モデスティカルダム、ヘリオバクテリウム・クロラム (Heliobacterium chlorum)、ヘリオバクテリウム・ゲスティ(Heliobacterium gestii)、ヘリオフィラム・ファシアタム (Heliophilum fasciatum)、ヘリオバクテリウム・モビリス (Heliobacillus mobilis) 等が挙げられる。好ましくは、B. ビリディス、T. モビリス、H. モデスティカルダム由来のBchX、BchY及びBchZを用いることができる。
【００４２】
BchX、BchY及びBchZは、(1)BChl bもしくはBChl gを産生する細菌を原料として抽出精製する方法、(2)化学的に合成する方法、(3)遺伝子組換え技術によりBchX、BchY又はBchZを発現するように操作された細胞から精製する方法、あるいは(4) BchX、BchY又はBchZをコードする核酸から無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等を適宜用いることによって取得することができる。
【００４３】
天然にBChl bもしくはBChl gを産生する細菌（BChl b/g産生菌）からのBchX、BchY及びBchZの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。BChl b/g産生菌を適当な緩衝液中でホモジナイズし（光合成細菌は嫌気性菌であるため、操作は嫌気チャンバー内で脱気した溶液を用いて行うことが望ましい）、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。BchX、BchY及びBchZは精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、BChl b/g産生菌の粗抽出物自体を用いてもよい。
【００４４】
化学合成によるBchX、BchY及びBchZの製造は、例えば、配列番号２、４及び６に示される各アミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成することにより行うことができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のBchX、BchY及びBchZを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszky and M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, NewYork (1965)
【００４５】
このようにして得られた本発明のBchX、BchY及びBchZは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるBchX、BchY及びBchZが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００４６】
本発明のBchX、BchY及びBchZは、好ましくは、該タンパク質をコードする核酸をクローニング（もしくは化学的に合成）し、該核酸を担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。
【００４７】
酵素遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行われる。まず、所望の酵素を産生する細胞または組織より、該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン法や質量分析などを用いて決定する。また、ペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのアミノ酸配列を同様にエドマン法や質量分析により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたcDNAまたはゲノミックDNAライブラリーから、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするDNAをクローニングする。
あるいは、完全または部分精製された酵素の全部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法にしたがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたcDNAまたはゲノミックDNAライブラリーから、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードするDNAをクローニングすることもできる。
目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素の遺伝子が公知である場合、例えば、NCBI BLASTのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にアクセスし、該公知遺伝子のヌクレオチド配列と相同性を有する配列を検索し、ヒットしたヌクレオチド配列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするDNAをクローニングすることができる。例えば、配列番号２、４及び６に示される各アミノ酸配列からなるB. ビリディス由来BchX、BchY及びBchZの場合、H. モデスティカルダム由来のBchX、BchY及びBchZ（配列番号８、１０及び１２）とアミノ酸レベルで、それぞれ38%、33%及び37%の同一性（相同性はそれぞれ56%、53%及び54%）があるので、B. ビリディス由来のBchX、BchY及びBchZ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、３及び５）とのホモロジー検索により、H. モデスティカルダムのゲノム上のBchX、BchY及びBchZをコードするORF（配列番号７、９及び１１）を見出すことができる。
また、ヒットしたヌクレオチド配列を基にして、適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成し、BChl b/g産生菌より調製したゲノムDNA画分または全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）またはReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。
上記のようにして得られたDNAのヌクレオチド配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
【００４８】
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
【００４９】
BchX、BchYもしくはBchZをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該タンパク質を製造することができる。
BchX、BchYもしくはBchZをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、BchX、BchYもしくはBchZをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。BchX、BchY及びBchZをコードするDNAは、それぞれ別個のベクターに挿入してもよいし、2つ以上を単一のベクターに挿入してもよい。例えばCOR活性を有するBChl a産生菌由来のBchlX/Y/Zとのアナロジーから、本発明のBchX/Y/Zも、BchY/Zが、電子を基質に伝達し還元反応を完結する触媒コンポーネントとして機能し、BchXは、触媒コンポーネントに電子を伝達する還元コンポーネントとして機能することが予測され得るので、BchXをコードするDNAを単独で発現ベクターに搭載し、BchYをコードするDNAとBchZをコードするDNAとを別個の1つの発現ベクターに搭載することもできる。BchX/Y/Zは由来となるBChl b/g産生菌のゲノム上では1つのオペロン内に存在するので、BchYをコードするORFとBchZをコードするORFの両方を含むゲノム配列を発現ベクターにサブクローニングすることで、単一のプロモーターからポリシストロニックにBchY/Zを発現するようにデザインすることもできる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）などが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。  宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
【００５０】
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびShine-Dalgarno（SD）配列を包含する。宿主として酵母を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、mRNAの5’側および3’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。
【００５１】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60巻，160(1968)〕，JM103〔Nucleic Acids Research，9巻，309(1981)〕，JA221〔Journal of Molecular Biology，120巻，517(1978)〕，HB101〔J. Mol. Biol.，41巻，459(1969)〕，C600〔Genetics，39巻，440(1954)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔Gene，24巻，255(1983)〕，207-21〔J. Biochem.，95巻，87(1984)〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。
【００５２】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。エシェリヒア属菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻，2110(1972)やGene，17巻，107(1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168巻，111(1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。酵母は、例えば、Methods in Enzymology，194巻，182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75巻，1929(1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
【００５３】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜8である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜43℃で、約3〜24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜40℃で、約６〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77巻，4505(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81巻，5330(1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜8である。培養は、通常約20℃〜35℃で、約24〜72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内にBchX、BchY及びBchZを生成させることができる。
【００５４】
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、BchX、BchY及びBchZを自体公知の方法に従って分離精製することができる。例えば、培養物から公知の方法で集めた菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体を破壊した後、遠心分離やろ過により粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、Triton X-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた粗抽出液中に含まれるBchX、BchY及びBchZは、自体公知の方法に従ってさらに精製することができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
【００５５】
かくして得られるBchX、BchYもしくはBchZが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
【００５６】
組換えBchX/Y/Zを迅速且つ簡便に取得する手段として、各タンパク質のコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするDNA配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のBchX/Y/Z活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりBchX/Y/Zを分離回収する方法が好ましく例示される。精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（IDA）基、ニトリロトリ酢酸（NTA）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（TED）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、HA、FLAGペプチド、Strepタグペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。
【００５７】
本発明の別の好ましい態様においては、宿主細胞としてBChl a産生菌を用いて、BChl b/g産生菌由来のBchX、BchY及びBchZを組換え生産する形質転換体を作製することができる。一般に、BChl a産生菌の中には、BChl b/g産生菌に比べて培養が容易で、世代時間も比較的短く、高密度培養可能なものが多く存在するので、タンパク質の大量発現系として有用である。例えば、R. カプスラタスにおける大量発現ベクターとして、広宿主域ベクターpBBR1-MCS2から構築されたpJN3やpJNYを挙げることができる。いずれのベクターも、集光性バクテリオクロロフィル結合タンパク質をコードするpucABの発現を制御し、嫌気条件下で高い転写活性を示すpucプロモーターの下流にクローニング部位があり、目的タンパク質をコードするDNAを挿入できる。pucプロモーターとクローニング部位との間に、pJN3は6xHNタグ、pJNYはStrepタグが挿入されており、発現したタンパク質の精製を容易にしている。薬剤耐性マーカーとしてpBBR1-MCS2由来のカナマイシン耐性遺伝子に加え、新たにスペクチノマイシン耐性遺伝子が導入されている。
R. カプスラタスの形質転換（発現ベクターの導入）は、大腸菌との接合（発現ベクターを含むドナー大腸菌と、接合を誘発するヘルパー大腸菌と、レシピエントのR. カプスラタスとの三親接合）を利用して行うことができる。ドナー大腸菌は特に制限はなく、JM105等の通常の菌株を用いればよい。ヘルパー大腸菌としては、ヘルパープラスミドpDPT51を有するXL1-Blue、DH5、C600等が使用できる。R. カプスラタスとしては、pucプロモーターが野生株より強く誘導されるDB176等を用いてもよい。
【００５８】
R. カプスラタス等のBChl a産生菌にBChl b/g由来のBchX、BchY及びBchZをコードするDNAを導入すると、得られた形質転換体はBChl aに加えてBChl b/gをも産生する能力を持つようになる。ここで、相同組換えを用いてDVRを不活性化させ、形質転換体をBChl b/g菌に変換することができる。特に、BChl a産生菌のBChl高産生能を保持したまま、生成物をBChl b/gに変換することができるので、このような形質転換体は、BChl b/gの微生物生産による収量向上を実現可能である。
特に、R. カプスラタスはGTAと呼ばれるファージ様粒子を作るが、GTA過剰生産変異株（例、R121、Y262、CB1127株）を用い、大腸菌との接合によりターゲッティングベクターを該変異株に導入し培養すると、培地中に多量のGTAが蓄積し、このうちあるものはターゲティングベクターを切り出し、粒子内に取り込んでいる。そこで、この培養濾液をレシピエントのR. カプスラタスと接触させると、GTAからターゲッティングベクターがレシピエント菌体内に導入され、相同組換えが誘発されるので、効率よく標的遺伝子座に目的遺伝子をターゲッティングすることができる。
【００５９】
上記いずれかの方法により製造されたBChl b/g産生菌由来のBchX/Y/Zを用いて、バクテリオクロリン化合物のC8位にエチリデン基を導入する反応（B環の共役ジエン部分の1，4付加還元反応）は、以下のように行われる。
反応の基質となる化合物は、下式(1)：
【００６０】
【化１５】
2014003938.tif 000016
【００６１】
（式中、
Ｒ１はビニル基、1-ヒドロキシエチル基又はアセチル基を示し、
Ｒ２は水素原子、Ｃ１−１８アルキル基、ファルネシル基、フィチル基、ゲラニルゲラニル基、ジヒドロゲラニルゲラニル基又はテトラヒドロゲラニルゲラニル基を示し、
Ｍは存在しないか、2価の金属原子を示す。）
で表される化合物であれば、特に限定されない。
ここで「Ｃ１−１８アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、カプリリル、ラウリル、パルミチル、ステアリル等が挙げられる。
また、中心金属「Ｍ」としては、例えば、マグネシウム原子、亜鉛原子、銅原子などの２価の金属原子が挙げられるが、好ましくはマグネシウム原子又は亜鉛原子である。天然のBChl b/gからは中心金属として亜鉛原子を含むものは見いだされていないが、マグネシウムの場合よりも安定に保持されるため、当該色素を産業的に利用する場合に好適である。
式(1)で表される化合物は、自体公知の方法により化学的に、あるいは一部のBChl生合成酵素を欠損した変異光合成細菌を培養すること等により製造することができる。また、一部の化合物は市販されている。
【００６２】
共役ジエンの1,4付加還元反応は、適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、HEPES緩衝液等）中で、上記基質、BchX/Y/Z、ATP、2価金属イオン等を適当な濃度で混合し、嫌気条件下、暗所にてインキュベートすることにより行われ得る。基質濃度は、例えば0.1〜100 μM、好ましくは1〜50 μM、より好ましくは5〜10 μMである。BchX/Y/Zの添加量は、例えば、0.001〜20 mg/ml、好ましくは0.01〜2 mg/ml、より好ましくは0.02〜0.5 mg/mlである。ATPの添加濃度は、例えば0.1〜10 mM、好ましくは1〜5 mM、より好ましくは1〜2 mMである。2価金属イオンとしては、MgCl2、ZnCl2、CuCl2等を、例えば0.1〜20 mM、好ましくは2〜10 mM、より好ましくは5〜6 mMで添加することができる。
【００６３】
反応液には、ジチオトレイトール(dithiothreitol)、ホスホクレアチン(phosphocreatine)、クレアチン・ホスホキナーゼ(creatine phosphokinase)、ジチオナイト(sodium dithionite)、Triton X-100TM等をさらに添加することが望ましい。
【００６４】
反応は、BchX/Y/Zの好適温度、好適pHの範囲内で行うことが望ましい。例えば、反応温度は10〜50℃、好ましくは20〜45℃である。また、反応液のpHとしては、例えば、pH6〜10、好ましくは7〜9である。反応時間も特に制限はないが、例えば10分〜24時間、好ましくは30分〜6時間である。
【００６５】
反応により生成した下式(2)：
【００６６】
【化１６】
2014003938.tif 000017
【００６７】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される化合物は、反応液を、例えばジエチルエーテルやアセトン等の有機溶媒で抽出し、逆相HPLCやLC/MS等の分析手法を用いて、生成物に相当するピークを与えたフラクションを回収することにより分離精製することができる。
【００６８】
本発明はまた、下式(3)：
【００６９】
【化１７】
2014003938.tif 000018
【００７０】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＭは、前記と同義である。）
で表される反応を触媒する、新規タンパク質BchX/Y/Zを提供する。
【００７１】
本発明のBchXは、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号２に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質
本発明のBchYは、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である。
(a) 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号４に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号４に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質
本発明のBchZは、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である。
(a) 配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号６に示されるアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質
(c) 配列番号６に示されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有し、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質
【００７２】
上記(b)において「数個」とは、2個、3個、4個、5個、もしくは6個を意味する。
【００７３】
上記(c)におけるアミノ酸配列の同一性・相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００７４】
本発明はまた、上記の新規BchX、BchY及びBchZタンパク質をコードするDNAを提供する。
本発明の新規BchXをコードするDNAは、好ましくは、以下の(a)又は(b)のDNAである。
(a) 配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
本発明の新規BchYをコードするDNAは、好ましくは、以下の(a)又は(b)のDNAである。
(a) 配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
本発明の新規BchZをコードするDNAは、好ましくは、以下の(a)又は(b)のDNAである。
(a) 配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるDNA
(b) 上記(a)のDNAに相補的なDNAと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質とともに、式(3)で表される反応を触媒するタンパク質をコードするDNA
【００７５】
上記(b)において、「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば95%、97%、又は98％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1xSSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1xSSC、0.1％SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1xSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件等が挙げられる。
【００７６】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例１  B. ビリディス由来のBchX、BchY及びBchZ遺伝子の単離
配列番号1の塩基配列、および配列番号3と5の塩基配列を同時に含むDNAをPCR法によりB. ビリディスのゲノムDNAを鋳型として増幅した。
5’末端側に対応するプライマーとして
5’ -ATGGTAACCTGCATTAGCGCCATGACGTCCCCCGCCAGAGC-3’（配列番号13）を、
また3’末端側に対応するプライマーとして、
5’-ATGGTAACCTGCATTATATCACACCGTGTCGTAAATCACTTCGA-3’（配列番号14）を用いて、PCR反応により配列番号1に示す塩基配列（以下、bchXと表記する）を含むDNAを、および5’末端側に対応するプライマーとして
5’ -ATGGTAGGTCTCAGCGCCATGAGGGCTGCCAGTTACGTTC-3’（配列番号15）を、
また3’末端側に対応するプライマーとして、
5’-ATGGTAGGTCTCATATCACGCAGCCTGCCCCCCGACA-3’（配列番号16）を用いて、PCR反応により配列番号3と5に示す塩基配列（以下、それぞれbchY、bchZと表記する）を含むDNAを増幅させた（PCR条件：94℃-2分30秒を1サイクル。94℃-30秒、60℃-30秒、72℃-3分30秒を35サイクル。72℃-8分、4℃-∞を1サイクル。TOYOBO KOD-plus-を使用）。PCR反応により増幅されたbchX、およびbchY-bchZを含むDNAを含有する反応溶液に対して、NucleoSpin Extract II kit(Macherey-Nagel社)を用いてプライマーの除去およびバッファー置換を行った。
得られたbchXを含むDNA断片を制限酵素BspMI（New England BioLabs社）で、bchY-bchZを含むDNA断片を制限酵素BsaI（New England BioLabs社）でそれぞれ処理し、同様にBsaIで処理したpASK-IBA5plus（IBA社製）に挿入してそれぞれpA5-BvXとpA5-BvYZを得た。得られたプラスミドはシーケンシングを行い、PCRで増幅されたbchXとbchY-bchZにエラーがないことを確認した。図１−１〜図１−３にB. ビリディス由来のBchX、BchY及びBchZと、他の光合成細菌由来の既知BchX、BchY及びBchZとのアミノ酸配列のalignmentを示す。
pA5-BvXとpA5-BvYZをそれぞれ別個に発現用宿主であるE. コリ Rosetta2（Novagen社）に導入し、形質転換体を得た。
【００７８】
実施例２  B. ビリディス由来BchX/Y/ZとR. カプスラタス由来BchX/Y/Zの酵素活性
（１）大腸菌での発現
pA5-BvXとpA5-BvYZをそれぞれ導入した形質転換体を100 mLのLB培地で前培養した。一晩暗所37℃で培養した前培養液の全量を1.2 LのLB培地に添加し、暗所37℃で2時間培養した。その後、アンヒドロテトラサイクリン(anhydrotetracycline)を最終濃度200 μg/Lとなるように添加し、暗所20℃で6時間培養して目的蛋白質を大量に発現させた。
（２）活性測定
250 mLの100 mM HEPES-KOH緩衝液（pH 8.0）中で、5 mM MgCl2、5 mM ジチオトレイトール、2 mM ATP、20 mM ホスホクレアチン、21 units/ul クレアチン・ホスホキナーゼ、0.7 mM ジチオナイト、0.05% Triton X-100TM、基質として5 mM Chlide aあるいは5 mM 8-vinyl-Chlide a、精製したBchXを0.1 mg/mL、共精製したBchYとBchZを0.02 mg/mlとなるようにそれぞれ添加し、嫌気チャンバー内、暗所34℃で90分間反応を行った。反応時間経過後、反応液に1 mLのアセトンを加えて蛋白質を変性させることで反応を停止させ、卓上遠心機により遠心操作を行い、変性蛋白質を沈殿させて、色素を含む上清画分を回収した。上清画分に対して当量のヘキサンを加えてよく撹拌し、卓上遠心機により遠心操作を行い、下層のアセトン/水層を回収し、分光光度計を用いて吸収スペクトルを測定した。各基質を用いた場合の、（残留基質を含む）反応生成物の80％アセトン中での吸収スペクトルを図２に示す。図中の破線はBchX/Y/Zを加えていない場合の対照実験結果であり、実線は実施例に従って90分間反応させた場合の吸収スペクトルである。8-vinyl-Chlide aを基質として用いた場合、666 nm付近の基質由来の吸収ピークが減少して、新たに756 nmにピークを示すBChlide gが生成された（図２Ａ）。一方、Chlide aを基質として用いた場合、B. ビリディス由来のBchX/Y/ZをChlide aと混合させても、基質由来の吸収ピーク(666 nm)が減少するのみで、何も反応物が生じなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明のBChl b/g産生菌由来のBchX/Y/Zを用いることにより、バクテリオクロリン骨格のC8位上にエチリデン基を導入することが可能となる。こうして得られる色素は、他のクロリン又はバクテリオクロリン化合物に比べて最長吸収波長極大が近赤外領域にシフトしているので、これを色素増感剤として用いることにより、従来よりも光エネルギー変換効率に優れた色素増感太陽電池を提供できる可能性がある。
また、がん細胞は活発に細胞分裂して増殖しており、大きなπ平面を有する脂溶性のポルフィリン化合物を取り込みやすいので、これを利用してがん細胞と正常細胞を区別するのにポルフィリン化合物を用いることが試みられている。しかし、細胞表面から深い部分については、ヘムなどの生体色素が吸収してしまうため、可視光はがん部に到達できないという問題があった。C8位にエチリデン基を有するバクテリオクロリン化合物は、より長波長の近赤外領域に吸収帯を有するので、深部のがん診断にも有用である。
さらに、クロロフィル分子は抗がん作用も有することが明らかとなっており、光線力学療法として研究が進められている。したがって、がん細胞に選択吸着する近赤外領域に強い吸収帯を有するC8エチリデンバクテリオクロリン化合物は、がん治療にも有用なツールとなり得る。
【図２】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【配列表】
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