(57)【要約】【課題】プロポリスエキスの生理活性、特に抗癌活性と抗菌活性を、効率よく、安全に向上させる方法、および強化されたプロポリス抽出物を含有した食品を提供すること。【解決手段】プロポリス抽出物とワインの混合物を１２０℃以上に加熱処理することで、プロポリス抽出物が有する抗菌活性、抗癌活性を強化し、いずれもプロポリス抽出物とワインの混合物より優れた作用を奏することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロポリス抽出物とワインの混合物を１２０℃以上で加熱することを特徴とするプロポリス抽出物の生理活性強化方法。
【請求項２】
強化された生理活性が抗癌作用又は抗菌作用である請求項１記載のプロポリス抽出物の生理活性強化方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法で生理活性が強化されたプロポリス抽出物を含有する食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロポリス抽出が持っている生理活性を安全かつ簡易な方法で強化する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロポリスは、セイヨウミツバチなどのミツバチが巣内を病原菌やウイルスから守るため、巣の中に塗りこめている樹脂状の物質である。プロポリスの成分は巣の周りの樹木や薬草などの植物の分泌液や新芽、花粉、さらにはこれらを集めたセイヨウミツバチ自らが分泌した蜜蝋が含まれている。そのため、巣の周囲の環境やミツバチの種類により、プロポリスの原塊の成分も異なることが知られている(非特許文献1参照)。
【０００３】
また、「ポリス(都市国家)のプロ(前面)」(を守る)というギリシャ語が「プロポリス」の語源となっているように、ヨーロッパにおいては古代ギリシャの時代よりこの物質の持つ抗菌力を様々な形で利用し、東ヨーロッパを中心に民間薬として用いられてきたことが報告されている。その後、プロポリスには抗菌性、鎮痛、抗炎症、抗酸化、免疫力増強、血液浄化などの生理活性も有することが知られ、経口投与のほか塗布など外用する地域もある。これらの生理活性を発揮するための有効成分としては、抗酸化活性の高いフラボノイドのほか、テルペノイド、多糖成分が明らかにされている。
【０００４】
さらに、前記の通り、生産地域によってプロポリスに含まれる成分に違いがあるように、生産地域によってプロポリスの有効成分の種類や含量も様々であり、その生理活性も様々な特徴を持つことが報告されている。
【０００５】
例えば、抗酸化作用については、ポルトガル産プロポリスは地域により抗酸化活性が変動するという報告があり、ブラジル産プロポリスに関しては地域に加え、季節によっても抗酸化活性は変動することが報告されている。
また、中国産とブラジル産のプロポリスを脂溶性及び水溶性の溶媒にて調整したそれぞれのエキスは抗酸化活性及び成分比に大きな違いがあることが報告され、ブラジル産プロポリスに含まれるカフェ酸（caffeic acid）、アルテピリン（Artepillin）Ｃ及びドルパニン（drupanin）が抗酸化活性に優れているという報告や、プロポリスより単離した新規フラバノン化合物及び該フラバノン化合物が優れた抗酸化活性を有しているという報告もされている(非特許文献２，３，４，５、特許文献１参照)。
【０００６】
抗菌活性については、プロポリスに含まれているArtepillin C及びバッカリン（baccharin）が抗菌作用に優れているという報告があり、またbaccharinにメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用があることも報告されている(特許文献２、３参照)。
【０００７】
一方、抗癌作用については、プロポリスより単離したキナ酸誘導体に癌細胞に対する増殖抑制作用、細胞分化誘導作用、アポトーシス誘導作用を確認したという報告や、プロポリスに含まれるArtepillinＣには正常なアポトーシスに影響を与えずに異常細胞のアポトーシスを促進する効力があるという報告や、さらにはプロポリスに含まれるArtepillinＣに加え、drupanin及びbaccharinの抗癌作用も報告され、プロポリン（propolin）Ａ及びpropolinＢについてはミトコンドリア経路を介してアポトーシスが誘導されているという報告もされている(特許文献４、５、非特許文献６、７参照)。
【０００８】
以上のように、プロポリスは生理活性を有する化合物を数多く含有しており、それらの効果は様々である。しかしながら、プロポリスに含まれるそれら化合物の含有量はごく微量であり、各化合物を工業的な規模で生産するのが難しい状況である。さらに、プロポリスは、蜂製品特有のにおいが在り、アルテピリンＣなどに由来する刺激臭を有しているため、カプセルなどを除き、食品に添加する場合、不快な味や臭いの原因になる。
【０００９】
そこで、プロポリスの添加量を減らしてもその生理活性を発揮させるため、プロポリス自体の生理活性効果や生理活性化合物含量を高める技術が開示されている。
例えば、抗菌活性の向上については、プロポリス又はプロポリス由来のケルセチンとα-グルコシル糖化物について糖転移酵素反応を行う方法が報告されている。
また、プロポリス中に含まれる特定のフラボノイド類にプレニル基転移酵素を作用させて新規プレニルフラボノイドを得る方法においては抗菌活性に加え、抗癌活性の向上も報告されている。
次いで、抗癌活性の向上については、プロポリスと紅豆杉を配合する方法、プロポリス中の有機酸をエステル化する方法、プロポリス又はプロポリス由来のArtepillinＣを担子菌類の菌糸体により発酵処理を行い、新規桂皮酸誘導体を得る方法が報告されている(特許文献６〜１０参照)。
【００１０】
しかし、上記の酵素反応は工業レベルにおいては高コストであり、反応を制御することは困難である。また菌体培養法については培養後の目的物の精製・単離方法が複雑である。さらにその他の手法においては反応工程で化学物質を用いるから、最終産物を食品に応用するにはハードルが多い。
【００１１】
また、本件出願人も、プロポリス抽出物から、抗癌、抗菌活性を有する２，６−ジプレニル−４−ビニルフェノールを生成する方法を報告している（特許文献１１）。しかし、プロポリス抽出物自体の生理活性を高めることに関しては、検討の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４２６８８９６号公報
【特許文献２】特許第３４８１２６９号公報
【特許文献３】特開平９−１５１１３１号公報
【特許文献４】特開２００６−２１３６３６号公報
【特許文献５】特開平９−３２８４２５号公報
【特許文献６】特許第３１３４２３３号公報
【特許文献７】特開２００９−４６４１４号公報
【特許文献８】特開２００３−２５２７７３号公報
【特許文献９】特開２００７−５３９４７号公報
【特許文献１０】特開２００８−８１号公報
【特許文献１１】特開２０１１−２１３６７５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】日経バイオ  最新用語辞典  第5版
【非特許文献２】Food and Chemical Toxicology 46 3482-3485 (2008)
【非特許文献３】eCAM 177 1-9 2008
【非特許文献４】Boil. Pharm. Bull. 32(12) 1947-1951 (2009)
【非特許文献５】BMC Complementry and Alternative Medicine 9:4 1-9 (2009)
【非特許文献６】Boil. Pharm. Bull. 26(7) 1057-1059 (2003)
【非特許文献７】Cancer Letters 245 218-231 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、プロポリスエキスの生理活性、特に抗癌活性と抗菌活性を、効率よく、安全に向上させる方法および強化されたプロポリス抽出物を含有した食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らはプロポリスに関する前記の状況を鑑みて、プロポリスの生理活性向上を目指し鋭意検討した結果、プロポリスエキスとワインの混合物を加熱処理することで、抗癌作用や抗菌作用が向上することを発見し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の要旨は、
〔１〕プロポリス抽出物とワインの混合物を１２０℃以上で加熱することを特徴とするプロポリス抽出物の生理活性強化方法、
〔２〕強化された生理活性が抗癌作用又は抗菌作用である前記〔１〕記載のプロポリス抽出物の生理活性強化方法、
〔３〕前記〔１〕又は〔２〕記載の方法で生理活性が強化されたプロポリス抽出物を含有する食品
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、プロポリス抽出物の生理活性を向上させることができる。これにより、これまでと同様の効果を期待できるプロポリス抽出物の量が減ることで、プロポリス由来の不快な匂いや味が軽減した食品を作製することができる。
特に、本発明により、プロポリス抽出物の抗癌作用又は抗菌作用を向上させることができるため、例えば、本発明により得られる処理済のプロポリス抽出物を食品に含有させることで、抗癌作用に優れていたり、口腔内環境を良くしたり、又は保存しても痛み難い食品を作製することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、プロポリス抽出物とワインの混合物を１２０℃以上になるように加熱処理する工程を有する方法であり、本発明により、加熱処理前よりも、加熱処理物である反応後組成物の生理活性を高めることができる。
【００２０】
上記のプロポリス抽出物としては、プロポリス成分を僅かでも含有している組成物であれば何ら制限されるものではないが、プロポリス原塊やプロポリス原塊を公知の方法で抽出したプロポリス抽出物などが含まれる。
【００２１】
プロポリス抽出物を得るために用いられるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本などのアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国などのあらゆる産地のものが使用可能である。ブラジル産プロポリスを作るミツバチは在来種のセイヨウミツバチとアフリカミツバチの交配したミツバチであり、プロポリスの生産量はセイヨウミツバチよりも多いことが知られている。よって、上記の中でもブラジル産プロポリスを用いることは原材料の確保、ロット差の問題を考慮した場合、より好ましい。
【００２２】
また、プロポリス抽出物の種類としては、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界抽出物、ミセル化抽出物などが挙げられる。以上の中からどの抽出物を用いてもよいが、中でも高い生理活性を有することが頻繁に報告されているアルコール抽出物や含水アルコール抽出物を使用することが好ましい。なお、アルコール抽出物や含水アルコール抽出物を調製するために用いられるアルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノールなどの主に低級アルコールが用いられるが、最終産物の食品への利用を考慮すると、上記の中でもエタノールを用いることがより好ましい。
【００２３】
例えば、プロポリスのエタノール抽出物は、それに含まれているプロポリスの固形分を考慮し、希釈または濃縮する必要がある。希釈に用いる溶媒としては、水、前記アルコール、さらに水、アルコールよりも高沸点の液体油脂等が挙げられる。
前記希釈や濃縮後の溶液中のプロポリス抽出物の濃度としては０．０１〜７０重量％程度が好ましい。実際には３〜６０％程度がより反応効率が高く、より好ましい。
【００２４】
本発明では、前記プロポリス抽出物をワインと混合して混合物を得る。
前記ワインの種類や産地についての限定はない。また、混合の手法についても限定はなく、反応容器に入れたワイン中に前記プロポリス抽出物を添加してもよいし、プロポリス抽出物を入れた反応容器中にワインを注いでもよい。
【００２５】
なお、前記混合物中のプロポリス抽出物とワインの重量比率としては、１００：１〜１：１００が好ましい。
また、前記混合物中には、加熱処理を効率よく行う観点から、水、前記アルコール、さらに水、アルコールよりも高沸点の液体油脂等の溶媒を添加することもできる。
【００２６】
次いで、本発明では、前記混合物を１２０℃以上になるように加熱処理する。
前記加熱処理時の温度については１２０℃以上であればよいが、前記温度はより高い方が生理活性の向上するため好ましい。本発明においては、加熱処理により前記混合物の温度を１２０℃以上、好ましくは１３０℃以上とする。また、前記温度の上限は、生理活性が顕著に低減しない温度であればよいが、安全性や加工コストを考えると５００℃以下が好ましく、３００℃以下がより好ましい。
【００２７】
加熱時間も加熱温度と同様に限られたものではない。特に、加熱時間は加熱温度との兼ね合いによるものであり、加熱温度に応じた加熱時間にすることが望ましい。例えば、１３０℃付近で加熱する場合は、５分〜１８０分の加熱時間が望ましい。
【００２８】
加熱時の熱源については、前記混合物の温度を１２０℃以上に加熱できるものであれば特に制限はなく、適切な反応容器を直火で加温、マイクロウェーブで加温、スチームで加温、温水で加温、電熱線で加温など何でも良く、反応容器を湯浴やオイルバス中で加温しても良い。
また、反応温度を上昇させる上で、前記混合物の溶媒として水やアルコールよりも高沸点の液体油脂等を使用することも有効な手法である。
オートクレーブで加圧加温することや、工業的にはレトルト殺菌機を本目的のために使用して加熱する手法は、条件を設定できたなら、その作業性の高さから実用的であり好ましい。
中でも、前記加熱処理は、処理予定のプロポリス抽出物とワインを含む組成物を加熱および加圧しやすい観点から、オートクレーブ処理することが好ましい。使用するオートクレーブ装置については、加熱処理時に前記温度および圧力の範囲に調整できるものであればよく、特に限定はない。
【００２９】
また、本発明において、加熱処理の際の温度、そして時間を管理する方法は、様々な方法があり、どのような方法で制御を行ってもよい。
【００３０】
前記のようにして得られる反応後組成物は、原料として用いたプロポリス抽出物の生理活性、特に抗癌活性と抗菌活性が向上したものとなることから、機能性食品、健康食品、健康志向食品等の食品に使用することができる。
【００３１】
前記食品としては、例えば、飲料、ゼリー、菓子など、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量などから保存や携帯に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレットなどが挙げられるが、特に限定はない。また、これらの食品を組み合わせて組成物として使用することも可能である。
【００３２】
また、前記食品としては、水、アルコール、澱粉室、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料または素材との組成物として、さらには、必要に応じて、他の生理活性物質の組成物としての形態も包含する。
【００３３】
本発明で得られる反応後組成物を食品に添加する場合には、該食品中に対して、通常は０．００１〜３０重量％添加することが好ましい。
【００３４】
また、前記反応後組成物を添加した食品は、安全性に優れたものであるので、ヒトに対してだけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなどの哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類などの治療剤または飼料に配合してもよい。
【００３５】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
（実施例１：プロポリス抽出物とワインの加熱処理）
プロポリスエキス（アピ（株）製、固形分値約１３重量％）１０ｇと赤ワイン（メルシャン社製）１００ｍｌを混合し（混合物のｐＨ５．０）、オートクレーブ（三洋電機（株）製、「ＳＡＮＹＯ  ＬＡＢＯ  ＡＵＴＯＣＬＡＶＥ」）にて１３０℃、６０分間で加熱した。得られた反応後組成物はさらに凍結乾燥処理を行い、黄褐色の粉体を１１ｇ得た。これを以下実験に使用した。また、プロポリスエキス１０ｇと赤ワイン１００ｍｌの混合物を凍結乾燥処理したものも以下の実験に使用した。必要に応じてこの作業を繰り返した。
【００３７】
（実施例２：ヒト骨髄球性白血病細胞に対する抗癌作用）
次に癌細胞に対する組成物の効果を見るため、ＨＬ−６０細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｏｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ：ヒト骨髄球性白血病細胞）を用いた癌細胞増殖抑制作用について試験した。
【００３８】
ＨＬ−６０細胞の培養には、４ｍＭグルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  シグマアルドリッチジャパン社製）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を含む高栄養培地「ＲＰＭＩ−１６４０」（シグマアルドリッチジャパン社製）を使用した。試験には細胞培養用９６ウェルプレート（コーニングジャパン（株）製）を用い、５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整したＨＬ−６０細胞を１ウェルあたり１００μＬずつ播種して試験に使用した。
【００３９】
試料は、実施例１より得られるプロポリスエキスとワインの反応後組成物に加え、プロポリスエキスとワインの混合物（加熱処理なし）、ネガティブコントロールとしてＤＭＳＯを用いた。試料調製は、実施例１より得られるプロポリスエキスとワインの反応後組成物およびプロポリスエキスとワインの混合物（加熱処理なし）をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、ＨＬ−６０細胞培養液中の最終濃度がそれぞれ３１．３μｇ／ｍｌ、６２．５μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌとなるように添加して、３７℃、５％ＣＯ2の培養条件下で試験を開始した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
【００４０】
生存細胞数の定量は「Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８」（（株）同人化学研究所製）を用いたＭＴＴ法にて行った。つまり、試験開始より２４時間後、各ウェルにＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８溶液を１０μＬ添加し、よく攪拌した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で１時間の遮光反応を行った。その後にプレートリーダー（「ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＦＣ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いて測定波長４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに細胞生存率を算出した。細胞生存率とは、溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した培養液の生存細胞数を１００％とし、各化合物の濃度下における細胞の生存細胞数を相対値として算出した値である。各化合物濃度と細胞生存率の関係から、細胞増殖を５０％抑制する濃度ＩＣ50（５０％阻害濃度）を算出した（表１）。表１に示す結果から、プロポリスエキスとワインの反応後組成物に優れた癌細胞増殖抑制能が認められた。この抗癌作用は、プロポリスエキスとワインの混合物（加熱処理なし）よりも高い活性を示し、加熱加圧処理することでプロポリスエキスとワインの高機能化が可能であることが示された。
【００４１】
【表１】
2014008013.tif 000002
【００４２】
（実施例３：細菌の発育阻止作用）
細菌の発育阻止作用の効果をみるため、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ（う蝕性細菌）を用いた発育阻止に対する試験を行った。
【００４３】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓはNBRC１３２７６株、Ｓ．ｍｕｔａｎｓはNBRC１３９５５株を使用した。前培養にはBHI液体培地（ブレインハートインフュージョンブロス）を両株共に用いた。濁度により菌数を測定し、約３×１０3／mlに菌数を調整した。
【００４４】
試料は、実施例１より得られるプロポリスエキスとワインの反応後組成物に加え、プロポリスエキスとワインの混合物（加熱処理なし）、ネガティブコントロールとしてＤＭＳＯを用いた。試料調製は、実施例１より得られるプロポリスエキスとワインの反応後組成物およびプロポリスエキスとワインの混合物（加熱処理なし）をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）にて溶解し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは２１ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌを各１ｍｌずつ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは３０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、各１ｍｌずつ調整した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓはミューラー・ヒントン寒天培地１５ｍｌに対して、各濃度の試料を３００μｌずつ添加し、シャーレに流し入れ固め、完全に表面を乾燥させ、プレートを作成した。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、ＢＨＩ寒天培地１５ｍｌに対して、同じく各試料を３００μｌずつ添加し、同じ手順でプレートを作成した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを同量添加したものをネガティブコントロールとした。
【００４５】
各濃度のプレートに、調整した菌液を１００μｌスプレッドし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは３７℃で２４時間、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは３７℃で「アネロパックケンキ」（商品名、三菱ガス化学株式会社）を使用し２４時間培養した。ＤＭＳＯの生育阻害の有無を見る為、ネガティブコントロールのコロニー数が３００前後かどうか確認した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ共に３００前後であり、ＤＭＳＯの生育阻害の影響は見られなかった。
【００４６】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの生育抑制の結果は表２、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは表３で表した。表２、表３の結果より、プロポリスエキスとワインの反応後組成物に優れた細菌の生育抑制効果がみられた。生育抑制効果は、プロポリスエキスとワインの混合物（加熱処理なし）よりも高い活性を示し、試料調製濃度が高い場合には殺菌効果も確認されたことから、加熱加圧処理することでプロポリスエキスとワインの高機能化が可能であることが示された。
【００４７】
【表２】
2014008013.tif 000003
【００４８】
【表３】
2014008013.tif 000004
【００４９】
（実施例４：生理活性を強化したプロポリスとワインの反応後組成物を含有する食品）
実施例１で得た生理活性を強化したプロポリスエキスとワインの反応後組成物１０ｇをあらかじめ１００ｍＬのエタノールに溶解させ、これにパラチニット（パラチニット社製）５００ｇ、還元麦芽糖水飴（株式会社東和化成工業製、Ｂｘ７０）７１４ｇ（固形分５００ｇ）からなる糖液を真空釜で混合し、真空度−６００ｍｍＨｇの条件で１５５℃まで炊き上げた。次にこれを冷却盤にあけ、約１００℃で、クエン酸１５ｇ、レモン香料１．１ｍＬ、色素1ｍＬを添加、混合後に固化してノンシュガーハードキャンディを得た。このノンシュガーハードキャンディは、プロポリス特有の刺激や匂いが少なく食べやすいものになっているとともに、定期的に摂取することで癌患者における癌の拡散のリスクを低減したり、健常者でも癌の発生のリスクを低減したり、癌の予防を期待した機能性食品としても利用できる。また、口腔内環境改善を期待した機能性食品としても利用できる。