(57)【要約】【課題】２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生成において、脱炭酸および酸化反応を１つの酵素が触媒するこれまで単離されたことのない新規な４−ケトアラボン酸合成酵素を提供する。【解決手段】以下のような物理化学的特性を有する４−ケトアラボン酸合成酵素により解決する。ａ）至適ｐＨ：４．５から７．０、ｂ）至適温度：０℃から６０℃、ｃ）分子サイズ：９２,２００±３,５００ダルトン（サブユニットの分子サイズ４６，１００±１，５００ダルトンからなる２つのサブユニット）、ｄ）基質特異性：２，５−ジケトグルコン酸、ｅ）補酵素：チアミンピロホスフェート、ピロロキノリンキノン【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のような物理化学的特性を有する４−ケトアラボン酸合成酵素。
ａ）至適ｐＨ：４．５から７．０
ｂ）至適温度：０℃から６０℃
ｃ）分子サイズ：９２,２００±３,５００ダルトン（サブユニットの分子サイズ４６，１００±１，５００ダルトンからなる２つのサブユニット）
ｄ）基質特異性：２，５−ジケトグルコン酸
ｅ）補酵素：チアミンピロホスフェート、ピロロキノリンキノン
【請求項２】
前記４−ケトアラボン酸合成酵素が、グルコノバクター属に属する微生物由来である、請求項１に記載の４−ケトアラボン酸合成酵素。
【請求項３】
前記微生物が、グルコノバクター  オキシダンスである、請求項２に記載の４−ケトアラボン酸合成酵素。
【請求項４】
前記微生物が、グルコノバクター  オキシダンス  ＮＢＲＣ  ３２９２、その機能的同等物、継代培養、変異株又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項３に記載の４−ケトアラボン酸合成酵素。
【請求項５】
以下のような物理化学的特性、
ａ）至適ｐＨ：４．５から７．０
ｂ）至適温度：０℃から６０℃
ｃ）分子サイズ：９２,２００±３,５００ダルトン（サブユニットの分子サイズ４６，１００±１，５００ダルトンからなる２つのサブユニット）
ｄ）基質特異性：２，５−ジケトグルコン酸
ｅ）補酵素：チアミンピロホスフェート、ピロロキノリンキノン
を有する４−ケトアラボン酸合成酵素の製造方法であって、
好気条件下、液体ないしは固体培養培地中で上記の性質を有する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物を培養し、該生物の細胞を破砕し、該微生物の破砕された細胞の無細胞抽出液より該酵素の単離精製を行う、４−ケトアラボン酸合成酵素の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が、グルコノバクター  オキシダンスである、請求項５に記載の４−ケトアラボン酸合成酵素の製造方法。
【請求項７】
前記微生物がグルコノバクター  オキシダンス  ＮＢＲＣ  ３２９２、その機能的同等物、継代培養、変異株又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項６に記載の４−ケトアラボン酸合成酵素の製造方法。
【請求項８】
４−ケトアラボン酸合成酵素を２，５−ジケトグルコン酸と接触させる、４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法であって、
該４−ケトアラボン酸合成酵素が、
（ｉ）以下のような物理化学的特性を有する４−ケトアラボン酸合成酵素
ａ）至適ｐＨ：４．５から７．０
ｂ）至適温度：０℃から６０℃
ｃ）分子サイズ：９２,２００±３,５００ダルトン（サブユニットの分子サイズ４６，１００±１，５００ダルトンからなる２つのサブユニット）
ｄ）基質特異性：２，５−ジケトグルコン酸
ｅ）補酵素：チアミンピロホスフェート、ピロロキノリンキノン
または
（ｉｉ）好気条件下、液体ないしは固体培養培地中で上記の性質を有する４−ケトアラボン酸合成酵素を生産する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物、
または
（ｉｉｉ）該微生物の無細胞抽出液
からなる群から選択される少なくとも１種類である、４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。
【請求項９】
前記微生物が、グルコノバクター  オキシダンスである、請求項８に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物が、グルコノバクター  オキシダンス  ＮＢＲＣ  ３２９２、その機能的同等物、継代培養、変異株又は誘導体からなる群から選択される少なくとも１種類である、請求項９に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【請求項１１】
さらに、４−ケトアラボン酸合成酵素を電子受容体の存在下に２，５−ジケトグルコン酸と接触させる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異なる２種類の触媒機能（脱炭酸および酸化反応）を有する多機能型酵素で、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸へ変換するこれまでに単離されたことのない新規な４−ケトアラボン酸合成酵素及びその製造方法並びに該酵素を用いた４−ケト−Ｄ−アラボン酸及びその塩類（以下「４−ケト−Ｄ−アラボン酸類」という。）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アラボン酸類の１つである４−ケト−Ｄ−アラボン酸は、Ｄ−酒石酸の製造原料にも利用することができる有用な物質である（特許文献１）。
【０００３】
一方、Ｄ−酒石酸は、光学活性を有する物質で、医薬品、農薬などを製造する際の光学分割剤や不斉化合物の原料として用いられると共に、Ｄ−酒石酸誘導体の原料としても工業的に利用されている重要な物質である。
【０００４】
これまで、酵素による２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造に関する２つの文献（特許文献２および非特許文献１）がある。それら２つの文献はいずれもアダチ（Ａｄａｃｈｉ）らによって報告され、自然界から分離されたグルコンアセトバクター  リキファシエンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の異なる２種類の膜結合型酵素（２，５−ジケトグルコン酸から４-ケト-Ｄ-アラビノースへの変換を触媒する２，５−ジケトグルコン酸脱炭酸酵素、及び４-ケト-Ｄ-アラビノースから４−ケト−Ｄ−アラボン酸への変換を触媒する４-ケト-Ｄ-アルドペントース  １−脱水素酵素）の作用により２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸が生成することを述べている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１７１９２７号公報
【特許文献２】特開２０１２−１３１７６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】アダチら（Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、「バイオサイ、バイオテクノル、バイオケム（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ）」、（社）日本農芸化学会、２０１１、７５（９）、ｐ．１８０１−１８０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
醗酵法あるいは休止菌体反応による従来の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生産には長時間を要し、また、生成された４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を含む醗酵液あるいは反応液から高純度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を採取するには、多くの手間と時間を要する。工業生産においては、短時間で高純度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類が高効率で製造される必要がある。
【０００８】
従来の醗酵法および休止菌体反応による４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造法の欠点を解決するには、短時間で、高純度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を製造可能な酵素法が好ましい。ところで、該酵素法による４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造には、原料として安価で多量の２，５−ジケトグルコン酸の供給が必要となる。２，５−ジケトグルコン酸生産菌としては、これまでタウタメラ菌、シュードモナス菌、酢酸菌などで報告がある。なかでもタウタメラ菌による２，５−ジケトグルコン酸の生産性は優れていて、すでに工業的規模で２，５−ジケトグルコン酸の製造法が確立している［ソノヤマら（Ｓｏｎｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、「アプライ、エンバイロン、マイクロバイオル（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、アメリカン  ソサイアティ  フォ  マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８２、４３（５）、ｐ．１０６４−１０６９］。
【０００９】
これまで、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を酵素法により製造するには、上述のように、２，５−ジケトグルコン酸から４-ケト-Ｄ-アラビノースへの変換を触媒する２，５−ジケトグルコン酸脱炭酸酵素、及び４-ケト-Ｄ-アラビノースから４−ケト−Ｄ−アラボン酸類への変換を触媒する４-ケト-Ｄ-アルドペントース  １−脱水素酵素の２種類の酵素の存在が必要であった。
【００１０】
そこで本発明は、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生成において、脱炭酸および酸化反応を１つの酵素が触媒するこれまで単離されたことのない新規な４−ケトアラボン酸合成酵素とその製造方法、該酵素を用いた４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前述の酵素法による２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造を構築するために、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の変換を触媒する酵素について鋭意研究を行った結果、ある特定の細菌の細胞を破砕して得られる無細胞抽出液、さらに無細胞抽出液を超高速遠心などにより分画された細胞膜画分懸濁液、可溶化処理により目的の酵素を細胞膜から遊離した可溶化溶液、さらには各種クロマトグラフィー処理により種々の純度で精製された４−ケトアラボン酸合成酵素は、短時間の反応で２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を生産し、得られた４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を含む反応液をそのまま濃縮後、結晶化あるいはイオン交換などのクロマト処理により、効率よく、高純度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の取得が可能であることを見出した。
【００１２】
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、以下のような物理化学的特性を有する４−ケトアラボン酸合成酵素を提供するものである。
ａ）至適ｐＨ：４．５から７．０
ｂ）至適温度：０℃から６０℃
ｃ）分子サイズ：９２,２００±３,５００ダルトン（サブユニットの分子サイズ４６，１００±１，５００ダルトンからなる２つのサブユニット）
ｄ）基質特異性：２，５−ジケトグルコン酸
ｅ）補酵素：チアミンピロホスフェート、ピロロキノリンキノン
【００１３】
また、本発明は上記ａ）〜ｅ）のような物理化学的特性を有する４−ケトアラボン酸合成酵素の製造方法であって、好気条件下、液体ないしは固体培養培地中で上記の性質を有する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物を培養し、該生物の細胞を破砕し、該微生物の破砕された細胞の無細胞抽出液より該酵素の単離精製を行う、４−ケトアラボン酸合成酵素の製造方法を提供するものである。
【００１４】
さらに本発明は、４−ケトアラボン酸合成酵素を２，５−ジケトグルコン酸と接触させる、４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造方法であって、該４−ケトアラボン酸合成酵素が、（ｉ）上記ａ）〜ｅ）のような物理化学的特性を有する４−ケトアラボン酸合成酵素、または（ｉｉ）好気条件下、液体ないしは固体培養培地中で上記の性質を有する４−ケトアラボン酸合成酵素を生産する能力をもつグルコノバクター属に属する微生物、または（ｉｉｉ）該微生物の無細胞抽出液からなる群から選択される少なくとも１種類である、４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生育可能な培地で培養したグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）の細胞から様々な純度の４−ケトアラボン酸合成酵素を調製し、該酵素により、２，５−ジケトグルコン酸から短時間で高純度の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を効率良く生産させ、４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を製造するに至り、本発明の４−ケトアラボン酸合成酵素を用いた酵素法による４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の製造は、工業的な製造にも利用でき、その実用性は高い。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。すなわち、本実施形態において、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類への変換を触媒する４−ケトアラボン酸合成酵素は後述の実施例に示した工程を経て精製され、該精製酵素標品の物理化学的諸特性を以下に示す：
【００１７】
４−ケトアラボン酸合成酵素の精製に先立ち、酵素活性は以下の２つの方法で測定された。
【００１８】
１）酵素活性の測定
１−１）生成物を定量することによる酵素活性測定法
精製された４−ケトアラボン酸合成酵素の基質特異性試験、速度定数の算定試験を除く酵素学的特性試験は、標準的な反応混合液として５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．７５）中に５２ｍＭ  ２，５−ジケトグルコン酸、１ｍＭ  チアミンピロホスフェート（本文中以下、「ＴＰＰ」と記載する）、１μＭ  ピロロキノリンキノン（本文中以下、「ＰＱＱ」と記載する）、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．１ｍＭ  フェナジンメトサルフェート（本文中以下、「ＰＭＳ」と記載する）および該精製酵素、あるいは“酵素なし”の混合液を２５℃で、３時間、ゆっくり振とうし、４−ケト−Ｄ−アラボン酸量をショウデックス  ＲＳｐａｋ  ＤＥ−６１３カラム（６．０ｍｍ内径×１５０ｍｍ長、ショウデックス社製）を用いて紫外線（ＵＶ）検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー社製）を用いて２１０ｎｍの波長で高速液体クロマトグラフィー（ＤＰ−８０２０、東ソー社製）（本文中以下、「ＨＰＬＣ」と記載する）分析を行い、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を定量した。比較対照として“酵素なし”の反応液で検出された４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の量を差し引いた値を該酵素による４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生成量とした。
【００１９】
上記の活性測定法を用いて、４−ケトアラボン酸合成酵素活性に対する酸素の要求性を調べた。同じ組成からなる１５０ μＬの反応混合液をそれぞれ、２枚のマイクロプレート（９６ウェル）の各ウェルに分注し、氷上で冷却した。１枚のプレートは密封可能なビニール袋に入れ、デシケータ中、真空ポンプで−０．１ＭＰａ以下まで減圧し、３分後、デシケータ内を窒素ガス（純度：９９．９９９％）で置換し、即座に取り出し、ビニールテープで密封した。窒素置換したプレートおよび大気中で氷冷したプレートを同時に、２５℃でゆっくり振とうし、反応を開始した。３時間後の反応液中の４ケトアラボン酸をＨＰＬＣで定量した。結果を表１に示す。大気中、窒素ガス置換した反応液中の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生成量はほとんど変わらず、４−ケトアラボン酸合成酵素活性は酸素を必要としなかった。
【００２０】
【表１】
2014113105.tif 000002
【００２１】
１−２）分光学的な酵素活性測定法
後述の実施例に示すように、本酵素は大気中、及び窒素ガス（無酸素状態）中のいずれの反応条件においても４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生成量は変わらないことから、酸素を直接電子受容体として利用しない（表１）。本発明の酵素は人工的電子受容体として２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（本文中以下、「ＤＣＩＰ」と記載する）を利用することができる。
【００２２】
基質特異性試験、およびミカエリス定数（Ｋｍ）の算定試験についての該酵素活性は、分光光度計（ＵＶ２２００、島津製作所社製）を用いて、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度の減少を２５℃で測定することによっておこなった。具体的には、反応混合液は１３５μＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．７５）中に、１ｍＭ  ＴＰＰ、１μＭ  ＰＱＱ、０．１７８μＭ  ＤＣＩＰ、該精製酵素（０．１０４μｇ）または“酵素なし”、７．２〜５７．８ｍＭ  ２，５−ジケトグルコン酸からなり、反応は基質を最後に加えて、反応を開始し、ＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度の減少を測定した。比較対照として、上記記載の混合液中で基質を含まない反応液の吸光度の減少を測定し、その値を差し引いた。
【００２３】
２）蛋白質の定量
酵素溶液中の蛋白質含量はローリー（Ｌｏｗｒｙ）法により定量した［ローリーら（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、「ジャーナル、バイオル、ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、アメリカン  ソサイアティ  フォ  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９５１、１９３（１）、ｐ．２６５−２７５］。標準蛋白質として牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、シグマ−アルドリッチ社製）を用いた。一方、各種クロマトグラフィーでの溶出液中の蛋白質含量は、分光光度計を用いてＵＶ２８０ｎｍの吸光度を標準蛋白質としての牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）の吸光度と比較して定量した。
【００２４】
３）４−ケトアラボン酸合成酵素の精製
本発明による４−ケトアラボン酸合成酵素はグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属する該酵素を生産する株、あるいは該酵素生産能を有する突然変異株を増殖可能な培地を用いて好気培養条件下で培養し、得られた培養液を遠心分離、あるいはろ過などの方法で取得した細胞をビーズにより該酵素活性を失活しない温度で冷却しながら細胞を破砕し、超高速遠心により無細胞抽出液から細胞膜を分離・取得し、細胞膜と結合した該酵素を可溶化剤により可溶化し、可溶化液を種々のクロマトグラフィーを用いて活性を維持し、単一なピークを示すまでクロマトを行い、同時に溶出画分の変性系ＳＤＳ−電気泳動分析で均一なペプチドバンドを示すまで、該酵素の精製を続けた。以下に、得られた精製標品の物理化学的特性を記す。
【００２５】
４）分子サイズ
４−ケトアラボン酸合成酵素の分子サイズはゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより決定した。該クロマトグラフィーの溶出液には、０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、５ｍＭ  ジチオスレイトール（本文中以下、ＤＴＴと記す）、２００ｍＭ  ＫＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）を用いて、予め平衡化したセファクリルＳ-２００ＨＲ  １６/６０（ＧＥヘルスケア社製）に該酵素溶液をロードした。分子量スタンダードマーカーとして、ウシ由来チロブロブリン（６６９,０００ダルトン）、ウシ由来ガンマ−グロブリン（１５８,０００ダルトン）、ニワトリ由来オボアルブミン（４４,０００ダルトン）、ウマ由来ミオグロビン（１７,０００ダルトン）およびビタミンＢ１２（１,３７０ダルトン）（バイオラッドラボラトリー社製）をもちい、それらのスタンダード蛋白質の較正曲線から本酵素のみかけ上の分子サイズを９２,２００±３,５００ダルトンと決定した。
【００２６】
つぎに本酵素の分子構造を解析するために、本酵素はＤＴＴ存在下、ソディウム  ドデシル  サルフェート（本文中以下、ＳＤＳと記す）で９０℃、３分間加熱処理を施し、その分子構造を変性系ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１５％ゲル濃度）分析で解析した。分子量スタンダードマーカーとしてウサギ筋肉由来ホスホリラーゼ  ｂ（９７,０００ダルトン）、ウシ血清由来アルブミン（６６,０００ダルトン）、ニワトリ卵白由来オボアルブミン（４５,０００ダルトン）、ウシ赤血球由来カルボニック  アンヒドラーゼ（３０,０００ダルトン）、ダイズ由来トリプシン  インヒビター（２０,１００ダルトン）および牛乳由来アルファラクトアルブミン（１４,４００ダルトン）（ＧＥヘルスケア社製）をもちい、そのスタンダード蛋白質の検量線から、Ｒｆ値＝０．３５６の位置に単一バンドとして染色され本酵素のユニットサイズを４６，１００±１，５００ダルトンと決定した。
【００２７】
ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる本酵素のみかけ上の分子サイズ（９２,２００±３,５００ダルトン）および、変性系ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による本酵素のサブユニットの分子サイズ（４６，１００±１，５００ダルトン）から本酵素の分子構造を解析すれば、２つのサブユニットから成る２量体構造であることが示された。
【００２８】
５）基質特異性
４−ケトアラボン酸合成酵素の基質特異性は２，５−ジケトグルコン酸のかわりに様々なアルファ‐オキソ酸、アルドース、ペントース、トリオースなどを用いて１−２）の酵素活性法のＤＣＩＰ由来の色の退色を肉眼的に判定して、基質特異性を決定した。測定結果は表２に示す。オキザロ酢酸については２６、５２ｍＭの両濃度において、“酵素あり”および“酵素なし”の条件で、ともにＤＣＩＰ由来の青色が退色し、本酵素の基質であるか不明であった。２，５−ジケトグルコン酸のみが基質となると結論づけた。
【００２９】
【表２】
2014113105.tif 000003
【００３０】
６）至適ｐＨ
４−ケトアラボン酸合成酵素の酵素活性とｐＨの関連性を酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．５から６．５）、ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ６．５から７．９）およびトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９から９．０）を用いて測定した。結果を表３に示す。本酵素はｐＨ  約４．５から７．０の範囲で高い活性を示し、ｐＨ  ６．０でもっとも高い活性を示した。
【００３１】
【表３】
2014113105.tif 000004
【００３２】
７）ｐＨ安定性
４−ケトアラボン酸合成酵素は様々なｐＨの緩衝液（ｐＨ  ４．５、５．０、５．５、６．０および６．５の酢酸緩衝液、ｐＨ  ６．５、６．７５、７．０、７．２５、７．５、７．７５および７．９のＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ  ７．９、８．５および９．０のトリス−塩酸緩衝液）中、氷上で１６時間放置し、ｐＨ安定性を調べた。測定結果を表４に示す。本酵素はｐＨ  ４．５から７．５の酸性から弱塩基性領域で安定で、ｐＨ  ７．７５以上のアルカリ領域では不安定であった。
【００３３】
【表４】
2014113105.tif 000005
【００３４】
８）至適温度
４−ケトアラボン酸合成酵素の酵素活性を０℃から６０℃の様々な温度で測定した。測定結果は表５に示す。本酵素は１５℃から５０℃の温度範囲で高い酵素活性を示し、０℃から６０℃の温度範囲で山型の曲線を示した。
【００３５】
【表５】
2014113105.tif 000006
【００３６】
９）熱安定性
４−ケトアラボン酸合成酵素の熱安定性を調べるために、０℃から６０℃の様々な温度で１０分間放置し、ただちに酵素活性を調べた。測定結果を表６に示す。本酵素は５０℃以下では安定であるが、６０℃では活性はほとんど失活する。
【００３７】
【表６】
2014113105.tif 000007
【００３８】
１０）金属イオンの影響
様々な金属イオンの酵素活性に対する影響を測定した。表７に結果を示した。試験した金属イオンの中でＭｎ２＋イオンのみが酵素活性をやや促進し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＮｉ２＋イオンは酵素活性に、ほとんど影響しなかった。他の金属イオン（Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、ＭｏＯ４２＋、Ｚｎ２＋）は酵素活性を強力に阻害した。
【００３９】
【表７】
2014113105.tif 000008
【００４０】
１１）阻害剤の影響
金属キレート剤であるエチレンジアミン  テトラアセチック  アシッド（本文中以下、「ＥＤＴＡ」と記載する）に対する酵素活性の阻害を試験した。表８に結果を示す。６．４ｍＭの濃度までは、ほとんど酵素活性に阻害を示さなかった。
【００４１】
【表８】
2014113105.tif 000009
【００４２】
１２）Ｋｍ（ミカエリス定数）値の測定
１−２）に記されている方法を用いて、酸化速度と基質濃度変化の関係をみかけ上のミカエリス定数（Ｋｍ）として決定するために測定した。標準的反応混合液を用いて、基質濃度を変化させ、酵素活性を測定した。その結果、２，５−ジケトグルコン酸に対するＫｍ値は３９．４ｍＭと算出された。
【００４３】
１３）補酵素の要求性
１３−１）ＴＰＰの要求性  １−１）に記載した方法を用いて、４−ケトアラボン酸合成酵素活性に対するＴＰＰの要求性を調べた。ＴＰＰの濃度は“ゼロ”または“1ｍＭ”からなる反応混合液を０、０．５、１、２、３時間、反応させ、反応液中の４ＫＡの生成量をＨＰＬＣで定量した。表９に結果を示す。1ｍＭ  ＴＰＰは４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生成に著しい促進効果を示した。
【００４４】
【表９】
2014113105.tif 000010
【００４５】
１３−２）ＰＱＱの要求性  １−１）に記載した方法を用いて、４−ケトアラボン酸合成酵素活性に対するＰＱＱの要求性を調べた。補酵素として“ＴＰＰのみ“または“ＴＰＰおよび1μＭ（終濃度）ＰＱＱ”からなる反応混合液を３時間反応させ、反応液中の４ＫＡの生成量をＨＰＬＣで定量した。表１０に結果を示す。ＰＱＱの添加は４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生成に著しい促進効果を示した。
【００４６】
【表１０】
2014113105.tif 000011
【００４７】
１４）４−ケトアラボン酸合成酵素の精製法
該酵素の精製には、以下の汎用される精製法の組み合わせが有効である。
【００４８】
汎用される精製法としては超高速遠心、硫酸アンモニウム、あるいはポリエチレングリコールなどによる無細胞抽出液の分画、可溶化剤処理、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、水素結合クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および塩析などを挙げることができる。
【００４９】
本発明による４−ケトアラボン酸合成酵素は、該酵素を生産可能な微生物を増殖可能な培地で培養し、得られた細胞を破砕し、破砕細胞から得られる無細胞抽出液、好ましくは超高速遠心により沈殿した細胞膜画分から調製する。
【００５０】
本発明の４−ケトアラボン酸合成酵素を生産する微生物は、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、あるいは該酵素を生産する突然変異株を生産する組換え株を含む。また、本菌株と機能的同等な株、継代培養株、変異株又は誘導株からなる群から選択される少なくとも１種類も本発明に含まれる。
【００５１】
本実施形態における細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＢＲＣ）など、各公的菌株保存機関で保管されているグルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属に属する菌株を用いることができる。４−ケトアラボン酸合成酵素を保有する好適な菌株としては、グルコノバクター  オキシダンス  サブエスピー  メラノゲヌス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓ）  ＮＢＲＣ３２９２を挙げることができる。
【００５２】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。すなわち、本実施形態において、「４−ケトアラボン酸合成酵素を生産する微生物」とは、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類への変換を触媒する４−ケトアラボン酸合成酵素を有する細菌を該細菌の生育に適した培地で培養することによって、４−ケトアラボン酸合成酵素を生産する能力を有する細菌を意味し、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌を例示することができる。
【００５３】
本実施形態における該細菌の培養にあたって、本微生物は好気的条件下、増殖可能な栄養源を含んだ液体あるいは固体培地によって行なわれる。培養はｐＨ約４．０から９．０の範囲で行なえるが、好ましくはｐＨ約５．０から８．０の範囲が望ましい。培養時間は通常、１５時間から７日間で好ましい結果が得られるが、１５時間以前であっても適度な細胞増殖が認められれば、その限りではない。培養のための好ましい温度範囲は、約１３℃から３３℃が望ましい。
【００５４】
本実施形態における該細菌の培養にあたって、細胞生産培地には、資化可能な炭素源、利用可能な窒素源や無機物質、ビタミン類、微量成分および他の成育促進因子などを含む。たとえば資化可能な炭素源としてはマンニトール、フラクトース、グルコース、グルコン酸、ソルビトール、グリセリンおよびこれらに類する物質が使用できる。なお、これら糖類の添加濃度は、０．１〜２０．０％（ｗ／ｖ）の範囲で細胞生産培地に添加することが該酵素を有する細胞の生産をより向上させる観点から好ましい。
【００５５】
また、細胞生産培地の窒素源としては、例えば、ペプトン、大豆粉、コーンスチープパウダー、コーンスチープリカー、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類等の有機窒素源や塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等の無機窒素源を単独又は複合的に用いることができる。なお、工業的生産の観点からは、安価であるコーンスチープパウダーやコーンスチープリカー等の窒素源を利用することが好ましい。なお、これら窒素源の添加濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）〜５．０％（ｗ／ｖ）の範囲で細胞生産培地に添加することが該酵素を有する細胞の生産をより向上させる観点から好ましい。
【００５６】
細胞生産培地の無機金属塩としては、例えば、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルト、鉄等の硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩又は燐酸塩を用いることが好ましい。また、必要に応じて少量の動物油、植物油、鉱油等を培養液に用いることが細胞の生産をより向上させる観点から好ましい。
【００５７】
本実施形態における好適な細胞生産培地としては、マンニトール２．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．３％（ｗ／ｖ）から成る培地を例示すことができる。
【００５８】
なお、フラスコで培養する際、培地への適量の炭酸カルシウムの添加は、該細菌の増殖に伴う有機酸等の弱酸性有機酸の生成によって培養液のｐＨの顕著な低下を防ぐために好ましく、細胞の生産性の増加に良い結果をもたらす。
【００５９】
一方、炭酸カルシウム添加の代わりに酸溶液及び／又はアルカリ溶液を培養液中に加えながら該細菌の増殖に伴う有機酸等の弱酸性有機酸の生成によって培養液のｐＨの顕著な低下を防ぐために好ましく、細胞の生産性の増加に良い結果をもたらす。
【００６０】
なお、培養時の培養液のｐＨの範囲としては、ｐＨ３〜９の範囲内が好適であり、ｐＨ３〜８の範囲内がより好適であり、ｐＨ３〜６の範囲内がさらに好適である。
【００６１】
前記酸溶液は、塩酸や硫酸等の酸水溶液を用いることができ、前記アルカリ溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムやアンモニア水等のアルカリ水溶液を用いることができる。
【００６２】
本実施形態における培養温度は、１０℃〜４０℃の範囲内の温度が好ましく、２５℃〜３５℃の範囲内がより好ましい。
【００６３】
本実施形態における培養時の酸素条件は、通気攪拌培養等の好気的条件が好ましい。
【００６４】
１．酵素反応液中から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の採取
本実施形態における酵素反応液中からの４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を採取する方法は、陰イオン交換樹脂を用いるイオン交換法や電気透析法等の一般的な有機酸の精製方法を適応できる。
【００６５】
例えば、本実施形態における酵素反応液を遠心分離やろ過によって得られる遠心上澄液又はろ液と、細胞などの残渣に分離し、この遠心上澄液又はろ液のｐＨを水酸化ナトリウムなどのアルカリ溶液でｐＨ７．０以上に調整する。また、ｐＨ調整後の遠心上澄液又はろ液を活性型の強塩基性陰イオン交換樹脂（例えば、蟻酸型）カラムに通過させ、４−ケト−Ｄ−アラボン酸等の有機酸を吸着させる。その後、低濃度の緩衝液でカラムの洗浄を行った後、緩衝液の濃度を高めることによって有機酸を溶出させることができる。なお、溶出時において、一定量ずつ溶出液を分画することで目的の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を高純度で得ることができる。
【００６６】
上記、分画したそれぞれの画分をＨＰＬＣによって分析し、目的の４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を含む画分を集めて、これを強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、Ｈ型）カラムで処理することで、遊離型の４−ケト−Ｄ−アラボン酸を得る。
【００６７】
さらに、前記で得た遊離型の４−ケト−Ｄ−アラボン酸を含む画分から蟻酸を除去するために、４０℃以下の温度条件で減圧濃縮を行い、真空減圧下で数時間、乾燥することが好ましい。また、この操作によって得られた４−ケト−Ｄ−アラボン酸を少量の純水に溶解し、低温で保持（例えば、５℃で１〜３日間）することで４−ケト−Ｄ−アラボン酸の結晶を析出させることができる。
【００６８】
一方、遊離型の４−ケト−Ｄ−アラボン酸溶液を適当な濃度の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム又はアンモニアなどで中和し、低温で保持することで、各種４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を析出させることができる。
【００６９】
これら析出した結晶は、ガラスフィルターによって集め、これを真空乾燥することで高純度の各種４−ケト−Ｄ−アラボン酸類を得ることができる。
【００７０】
２．４−ケトアラボン酸合成酵素の単離精製の概略
以下に、培養後の細胞から４−ケトアラボン酸合成酵素の単離精製法の実施態様を記す。
【００７１】
（１）培養を終了した醗酵槽内の培養液を遠心分離もしくはろ過により細胞を収集する。
【００７２】
（２）該細胞を緩衝液に懸濁したあと、ビーズ、ホモジナイザー、超音波、リゾチーム処理などの方法で破砕する。
【００７３】
（３）得られた無細胞抽出液を超高速遠心により細胞質画分と細胞膜画分に分離する。
【００７４】
（４）細胞膜に結合している４−ケトアラボン酸合成酵素を適切な可溶化剤で可溶化処理を行い、可溶化溶液を得る。
【００７５】
（５）可溶化溶液は各種クロマトグラフィー処理を組み合わせて、単離精製を行う。
【実施例】
【００７６】
以下に、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００７７】
実施例１  ４−ケトアラボン酸合成酵素の調製
すべての操作は特に記載しない限り４℃で行った。
（１）グルコノバクター  オキシダンス  サブエスピー  メラノゲヌス  ＮＢＲＣ３２９２の培養
滅菌した６００  ｍｌのマンニトール  ２．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス  ０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン  ０．３％（ｗ／ｖ）から成る細胞取得培地を仕込んだ１-Ｌ容醗酵槽に、細胞取得培地を入れた試験管で、予め、２８℃で１９時間、１分間あたり２５０回転で振とう培養した１２  ｍＬのグルコノバクター  オキシダンス  サブエスピー  メラノゲヌス  ＮＢＲＣ  ３２９２の種培養液を殺菌培地入り醗酵槽に植菌し、２８℃、１ｖｖｍの通気をしながら、１分間あたり７００回転で攪拌培養を開始した。１６時間後、得られた培養液は１０℃で１５分間、１分間あたり８，０００  回転で遠心を行い、細胞を沈殿させた。得られた細胞は１００  ｍＬの０．８５％  ＮａＣｌ溶液で1回洗浄し、６．２３  ｇのウエット細胞を得た。３基の１-Ｌ容醗酵槽の培養から１８．７  ｇのウエット細胞が得られた。収穫した細胞は、つぎの精製段階まで−３０℃で１週間、冷凍保存をした。
【００７８】
（２）細胞破砕および無細胞抽出液の調製
上記ステップ（１）で得られた約１４ｇのグルコノバクター  オキシダンス  サブエスピー  メラノゲヌス  ＮＢＲＣ３２９２細胞を５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＴＰＰ、０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオライド（本文中以下、「ＰＭＳＦ」と記載する）および５ｍＭ  ＤＴＴを含む１７５ｍＬの１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．５）に懸濁し、その懸濁液をホモジナイザー（バイオスペック社製）チャンバーに入れ、同量のジルコニア／シリカビーズ（直径０．１  ｍｍ、バイオスペック社製）を加えて２５０  ｍＬになるように充填した。そのチャンバーは氷中で１０分間冷却したあと、１分間運転した。その後、チャンバーは、１０分間氷中で冷却して再度、１分間運転を行いビーズで破砕した。
【００７９】
ビーズを含む細胞破砕液からビーズを除くために、低速遠心によりビーズと細胞破砕液に分け、ビーズは７０  ｍＬの破砕緩衝液で洗浄し、洗浄液は最初の細胞破砕液とあわせて最終的には２１５  ｍＬの破砕緩衝液を得た。その細胞破砕液は５℃、５，０００  ｒｐｍで１０分間、遠心を行って未破砕の細胞および少量の培地成分などの残渣を除き、無細胞抽出液を得た。つぎの精製段階まで−３０℃で冷凍保存をした。
【００８０】
（３）無細胞抽出液の超高速遠心による細胞内蛋白質の分画
上記ステップ（２）で得た無細胞抽出液は、４℃、１００,０００×ｇで７０分間、遠心分離を行い、遠心上澄（細胞質画分）と沈殿物（細胞膜画分）に分離した。沈殿した細胞膜画分は０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ  ７．０）で遠心上澄と同量の２０８  ｍＬの懸濁液を調製した。両画分は、２  Ｌの０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で一晩、透析を行い、透析を行った両画分の酵素液はそれぞれ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で４倍に希釈して、１−１）の酵素活性測定法により、酵素活性を調べた。その結果、酵素活性は細胞質画分には少量の酵素活性が検出されたが、大部分の酵素活性は細胞膜画分に検出された。
【００８１】
（４）細胞膜画分の可溶化剤による４−ケトアラボン酸合成酵素の可溶化
上記ステップ（３）で酵素活性が検出された細胞膜懸濁液から４−ケトアラボン酸合成酵素の可溶化を行った。上記ステップ（３）で得た２００  ｍＬの細胞膜懸濁液に終濃度で２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、２００ｍＭ  ＫＣｌになるように２０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０と２Ｍ  ＫＣｌ溶液を加えて、４℃のクロマトチャンバー内で４時間、ゆっくりシーソー振とうをおこなった。その後、４℃、１０,０００×ｇで１０分間、遠心分離を行い、遠心上澄を２  Ｌの０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で一晩、透析を行い、透析液は０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で４倍に希釈して、１−１）の酵素活性測定法により、酵素活性を確認した。
【００８２】
（５）疎水クロマトグラフィー（イソプロピルリガンド）による４−ケトアラボン酸合成酵素の分離
上記（４）で得られた５０  ｍＬの可溶化溶液（約６０  ｍｇの蛋白質を含む）を１  Ｌの２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１．５Ｍ  硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で一晩、透析を行い、あらかじめ、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１．５Ｍ  硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で平衡化したリソース  イソ（ＲｅｓｏｕｒｃｅＴＭ  ＩＳＯ、ファルマシア社製）疎水性カラムにロードした。カラムからの溶出液はＵＶ２８０ｎｍでの吸光度を追跡した。ロード終了後、カラムから非吸着蛋白質が溶出し終わるまで、１分間当たり０．５  ｍＬの流速で平衡化緩衝液を流した。その後、１分間当たり０．５  ｍＬの流速で、４０分間で硫酸アンモニウム濃度を１．５  Ｍから０．６  Ｍまで直線的に低下させ、溶出液は各２  ｍＬづつ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０の濃度になるように、予め、各分画チューブには０．２  ｍＬの２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を添加して分画を行った。各溶出分画は２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で一晩、透析を行い、酵素活性を調べた。その結果、０．９７５Ｍ  硫酸アンモニウム濃度付近で４−ケトアラボン酸合成酵素活性は溶出した。活性が認められた溶出画分は２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で透析を行い、その透析サンプルはＤＴＴ存在下、変性系ソディウム  ドデシル  サルフェート（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動（ゲル濃度：１５％）分析を行った。その結果、酵素活性が認められた溶出液には分子サイズが４５,０００ダルトン付近と９７,０００から６６,０００ダルトン付近に、コマジー  ブリリアント  ブルー（ＣＢＢ）染色で、強く染色されるバンドが観察された。それら２本のバンドの濃さは分画チューブごとに比例的ではなく、また、各溶出画分の酵素活性の強さとＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの染色バンドの強さから４５,０００ダルトン付近のバンドが該酵素由来のサブユニット由来のペプチドであると予想された。
【００８３】
（６）疎水クロマトグラフィー（フェニルリガンド）による４−ケトアラボン酸合成酵素の分離
上記（５）で得られたリソース  イソ疎水性カラムクロマトグラフィーで得られた７  ｍＬの酵素活性画分（５．５ｍｇの蛋白質を含む）を１  Ｌの２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．８Ｍ  硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で一晩、透析を行い、あらかじめ、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．８Ｍ  硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で平衡化したリソース  フェニル  （ＲｅｓｏｕｒｃｅＴＭ  ＰＨＥ、ファルマシア社製）疎水性カラムにロードした。カラムからの溶出液はＵＶ２８０ｎｍでの吸光度を追跡した。ロード終了後、カラムから非吸着蛋白質が溶出し終わるまで、１分間当たり０．２  ｍＬの流速で平衡化緩衝液を流した。その後、１２０分間で１分間当たり０．２  ｍＬの流速で硫酸アンモニウム濃度を０．８  Ｍからゼロまで直線的に低下させ、その後、６０分間、硫酸アンモニウムゼロで流した。溶出液は各０．５  ｍＬづつ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０の濃度になるように、予め、各分画チューブには０．０５  ｍＬの２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を添加して分画を行った。各溶出分画は２００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で一晩、透析を行い、酵素活性を調べた。その結果、硫酸アンモニウム濃度ゼロ付近で４−ケトアラボン酸合成酵素活性が溶出した。活性が認められた溶出画分は２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で透析を行い、その透析サンプルはＤＴＴ存在下、変性系ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ゲル濃度：１５％）分析を行い、蛋白質の均一性を調べた。その結果、酵素活性が認められた溶出液には分子サイズが４５,０００ダルトン付近にＣＢＢ染色で１本のバンドが観察され、該酵素のサブユニットのサイズは４６，１００±１，５００ダルトンと算出された。
【００８４】
実施例２  酵素反応で生成した４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の精製
（１）酵素反応による４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生産
精製した４−ケトアラボン酸合成酵素を用いて、１−１）の酵素活性測定法を参考にして、２，５−ジケトグルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸類の生産をおこなった。１０  ｍＬの５０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ＝６．７５）中に５２ｍＭ  ２，５−ジケトグルコン酸、１ｍＭ  ＴＰＰ、1μＭ  ＰＱＱ、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．１ｍＭ  フェナジンメトサルフェートおよび該精製酵素（６６．７  μｇの蛋白質を含む）を含む混合液を３０−ｍＬ容三角フラスコに調製し、２５℃で、３時間、ゆっくり振とうした。反応終了後、反応液は８，０００  ｒｐｍで１０分間遠心をして、少量の残渣を除いた。その遠心上澄中の４−ケト−Ｄ−アラボン酸生成量をＨＰＬＣにより定量したところ、約１０  ｍＬの上澄には約１２７  ｍｇの４−ケト−Ｄ−アラボン酸類が含まれていた。
【００８５】
（２）４−ケト−Ｄ−アラボン酸の精製
前記１０  ｍＬの反応遠心上澄を２Ｍ  水酸化ナトリウムでｐＨ  ７．０に調整後、２０  ｍｌのアンバ−ライトＣＧ４００陰イオン交換樹脂（蟻酸型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムを通した。さらに、そのカラムに６０  ｍｌの２０ｍＭ  蟻酸ナトリウム緩衝液を通過させ、カラムを洗浄した後、各７０  ｍｌの２０ｍＭ  蟻酸ナトリウム緩衝液と５００ｍＭ  蟻酸ナトリウム緩衝液を用いた直線的な濃度勾配によって吸着物質を溶出させ、溶出する溶液は試験管で２．５  ｍｌずつ分画した。
【００８６】
分画した画分は、それぞれＨＰＬＣで分析を行い、７．７分の保持時間に示すピークをもつ分画番号３７〜４５の画分の溶出液を集めた。
【００８７】
また、前記回収した溶出液を２０  ｍｌのアンバーライトＣＧ１２０陽イオン交換樹脂（Ｈ型、ローム・アンド・ハース社製）のカラムに通過させた後、さらに５０  ｍｌの脱イオン水でカラムの洗浄を行い、カラムを通過した非吸着画分及び洗液を回収した。
【００８８】
さらに、この回収した溶液を３５℃で減圧濃縮し、蟻酸を除去した後、このペースト状濃縮物を少量の水に溶解し、５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。また、再度、少量まで減圧濃縮後、この濃縮液にエタノールを白濁するまで加え、５℃で保持することで結晶を得た。
【００８９】
また、得られた結晶をグラスフィルターで集め、室温で２時間真空乾燥を行うことで、約１３１  ｍｇの４−ケト−Ｄ−アラボン酸のナトリウム塩の結晶を回収できた。
【００９０】
（３）採取された反応生成物のＬＣ／ＭＳによる同定
得られた２ｍｇの結晶を１  ｍＬの水に溶解した溶液を用いてＬＣＭＳ分析をおこなった。分析カラムとしてディスカバリー  ＨＳ  Ｆ５，  ２５ｃｍ×４．６ｍｍ（スペルコ社製）を用いて、フォトダイオードアレー検出器を装着したＬＣＭＳ−２０１０Ａ液体クロマトグラフ質量分析計（島津製作所社製）を用いて０．１％  蟻酸含有の２％  アセトニトリル水溶液溶媒移動相を用いて分析を行った。１９０〜３００ｎｍで検出される液体クロマトグラムと検出されたピークの紫外線吸収スペクトル及び陰イオンマススペクトル、マスクロマトグラムを解析した。
【００９１】
１）得られた結晶のＬＣ-ＭＳ分析
ＬＣクロマトグラムでの結晶溶液の保持時間（分）：１０.３
紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ（ｎｍ）：１９２〜２３０(エンド吸収)
ＭＳマススペクトル(測定モード：ネガティブ)：ｍ/ｚ １６３.０[Ｍ-Ｈ]-
分子量：１６４
【００９２】
ＬＣ-ＭＳ分析により、ＬＣの保持時間および紫外線吸収スペクトル、ＭＳのマススペクトルから、上記、酵素反応による生成物は４−ケト−Ｄ−アラボン酸と同定した。