(57)【要約】【課題】分析者が想定しない翻訳後修飾も含めた様々な翻訳後修飾の存在の有無を、定量的且つ迅速に判断可能な情報を提供する。【解決手段】翻訳後修飾を受けたペプチドを含む試料に対するＭＳ2スペクトルデータが読み込まれると、既知の全ての翻訳後修飾の質量に相当するm/z差を有する２本のピークがペアピークとして全て抽出される。そして、翻訳後修飾物毎にペアピークの出現数countとペアピークの信号強度の積算値TICとが計算され、その出現数count及び積算値TICのリストが翻訳後修飾情報表示画面３００の統計量リスト表示領域３０４に表示される。また、同表示画面３００のスペクトル表示領域３０２にはＭＳ2スペクトルが、ヒストグラム表示領域３０５にはm/z差と出現数countとの関係を示すヒストグラムが表示され、リスト上で分析者が指定した翻訳後修飾に対応したピークや縦棒が他と区別可能に表示される。【選択図】図４
2014215172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳後修飾を受けたペプチドの構造を解析するために、該ペプチドを含む試料を質量分析することにより得られた又はインソース分解若しくはポストソース分解を含む１回以上の解離操作を伴う質量分析を行うことにより得られたＭＳnスペクトルデータ（ここでｎは１以上の整数）を解析する質量分析データ解析装置であって、
a)得られたＭＳnスペクトルデータの中で、既知である複数の翻訳後修飾に相当する質量電荷比差を有する２本のピークをペアピークとして全て抽出し、その質量電荷比差毎にペアピークの出現量及び／又はペアピークに対応するイオンの検出量を示す統計量を計算するペアピーク統計量算出部と、
b)該ペアピーク統計量算出部により計算された質量電荷比差毎の統計量を、その質量電荷比差又はそれに相当する翻訳後修飾物に対応付けてリスト化して表示画面上に表示する統計量表示処理部と、
c)該統計量表示処理部により表示されたリスト上で分析者が任意の質量電荷比差又は翻訳後修飾物を指定するための指定部と、
d)前記得られたＭＳnスペクトルデータに基づくＭＳnスペクトルと前記質量電荷比差毎の統計量に基づくグラフとの少なくとも一方を表示画面上に表示するとともに、その表示したグラフ上で、前記指定部を用いて指定された質量電荷比差又は翻訳後修飾物に対応するピーク又は部分を他とは識別可能に特徴付けて描出する指定結果表示処理部と、
を備えることを特徴とするペプチド構造解析のための質量分析データ解析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記統計量は、質量電荷比差毎のペアピークの出現数、及び、そのペアピークを構成するピークの信号強度の積算値であることを特徴とするペプチド構造解析のための質量分析データ解析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記指定結果表示部は、前記ＭＳnスペクトルと、質量電荷比差とペアピークの出現数との関係を示すヒストグラムとを表示し、前記指定部による指定に応じて、そのＭＳnスペクトル上のピーク、及び前記ヒストグラム上の縦棒を他とは異なる表示形式とすることを特徴とするペプチド構造解析のための質量分析データ解析装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析データ解析装置であって、
前記統計量表示処理部は前記リスト中の統計量をソートする機能を含むことを特徴とするペプチド構造解析のための質量分析データ解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質由来の被検ペプチドが含まれる試料を質量分析することにより得られた質量分析データを解析することでペプチドの構造を解析する質量分析データ解析装置に関し、さらに詳しくは、目的イオンに対する質量分析を行うことで得られる又は該目的イオンを１回以上解離させたあとに質量分析を行うことで得られるＭＳn（ここでｎは１以上の整数）スペクトルデータを利用して、翻訳後修飾を受けたタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列とその修飾部位とを推定するための質量分析データ解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は様々な要因により翻訳後修飾を受け、その修飾の種類も非常に多様である。こうした翻訳後修飾を受けたタンパク質は生体組織における生体活動に重要な役割を果たしていることも多い。例えば典型的な翻訳後修飾の一つであるリン酸化は生体内での情報伝達に大きな役割を果たしていることが知られており、タンパク質のリン酸化・脱リン酸化を調べることは各種疾病の診断、疾病の要因解明、などに非常に重要である。
【０００３】
近年、タンパク質を網羅的に解析するプロテオーム解析の手法は広く用いられており、その技術的な進歩には著しいものがある。プロテオーム解析分野において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）を始めとする質量分析装置を用いたペプチドの構造解析手法として、データベース検索法がよく知られている。一般に、データベース検索法では、ＭＳn分析を行うことで得られたＭＳnスペクトルに現れるピークの質量電荷比情報を集めたピークリストと、データベースに登録されているタンパク質より理論的に算出される質量電荷比や実際に実験を行って得られたタンパク質のピークリストなどとを照合し、その一致度を手がかりとしてペプチドのアミノ酸配列を決定する。また、データベース検索に際して、ペプチドの受けた修飾の種類を検索条件として分析者が指定することにより、蓋然性の高いペプチドとその修飾部位とを同定する手法も開発されている。
【０００４】
例えば、ペプチドの構造を解析するために現在幅広く使用されている解析ソフトウエアである英国マトリックス・サイエンス社製のマスコット（Mascot）は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ（MS/MS Ion Search）と名付けられた検索エンジンを備える。図６はマスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索設定画面１００の一例である（非特許文献１参照）。図６に示すように、ＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、タンパク質の分解に使用した消化酵素の種類（エンザイム：Enzyme）設定欄１０１、修飾の種類（モディフィケイション：modification）設定欄１０２、質量分析の精度の許容値（MS/MS tol.）設定欄１０３などのデータベース検索条件の各設定欄に、分析者がそれぞれ入力設定することができるようになっている。こうした条件を分析者が適宜に設定した上で検索の実行を指示すると、指定された複数のＭＳnスペクトルに対し検索条件に従ったデータベース検索が行われ、スペクトルデータの一致度（スコア）が高いペプチドがリストアップされる。
【０００５】
翻訳後修飾されたペプチドについてデータベース検索を行う場合には、検索設定画面１００の中で、修飾の種類設定欄１０２の「Fixed modifications」及び「Variable modifications」の各項目を分析者が適宜設定する必要がある。なお、マスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチにおいて設定可能な「Variable modifications」の最大数は９に制限されている。
【０００６】
図７は、翻訳後修飾としてリン酸化（Phospho(ST)）を受けたサンプルを測定したＭＳ／ＭＳスペクトルデータについて、「Variable modifications」として「Phospho(ST)」を指定してデータベース検索を実行して得られた検索結果画面２００の一部抜粋である。図７の上部のグラフ２０１は、横軸に質量電荷比をとってＭＳ／ＭＳスペクトルデータをグラフ表示したものであり、例えば「b(15)-98」のピーク２０１ａは、リン酸基が付加しているフラグメントイオンb(15)からリン酸基のニュートラルロスが生じたピークであることが分かる。ここで、「98」という数値は「98Da」を意味する。図７下部の表２０２は、上記グラフ２０１上に現れる各ピークについての詳細な検索結果である。詳しい説明は省くが、ここでは翻訳後修飾に関する情報は記載されない。
【０００７】
しかしながら、分析者が常に正しく各検索項目を設定できるとは限らない。例えば、精度許容値「MS/MS tol.」を小さく見積もってしまったり正しい「Variable modifications」を予想することが困難であったりすることは頻繁に起こり得る。主としてこうした問題を解決するため、予めタンパク質の種類を限定した上で検索パラメータの設定誤差を許容するエラートレラントサーチと呼ばれる方法も開発されている（非特許文献３参照）。なお、エラートレラントサーチを行う場合には、図６に示した検索設定画面１００において「Error tolerant」のチェックボックス１０４にチェックを入れてから実行を指示すればよい。
【０００８】
以下に、エラートレラントサーチ法を簡単に説明する。エラートレラントサーチでは、まず分析者が設定した検索条件の下でＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行し、予め設定されたホモロジーレベルと呼ばれる閾値以上のスコアでヒットしたペプチドを含むタンパク質候補を抽出する。このＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、「Variable modifications」として分析者が設定したものを使用する。そうして抽出したタンパク質候補のペプチドにおいて、次の四つの（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）の検索条件の設定誤差を許容する条件の下でデータベース検索を試みる。
【０００９】
（Ａ）エンザイムの検索項目を「semi-specific」に設定する。「semi-specific」とは、酵素による特異的切断が片側のみで起こるものである。
（Ｂ）「missed cleavage」の数を１だけ増加させる。「missed cleavage」とは、本来は切断されるべきでない部位で解離により結合が切断されることを意味する。
（Ｃ）全ての「Variable modifications」を１ずつ順番に設定する。
（Ｄ）一つのアミノ酸の変異（substitution）を考慮する。
上記のようなデータベース検索によりヒットしたペプチド候補の中で、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ実行時よりもスコアが高く、且つ予め設定されたアイデンティファイレベル（上記ホモロジーレベルよりも高いレベル）と呼ばれる閾値以上のスコアでヒットしたペプチドを選択し、これを検索結果として表示する。なお、修飾なし（none-modification）の結果は修飾あり（modification）の結果より優先する。
【００１０】
エラートレラントサーチ法では、最初にＭＳ／ＭＳイオンサーチを実行しタンパク質を限定したうえで条件を緩和した検索を行うので、全てのタンパク質を検索対象とする通常のＭＳ／ＭＳイオンサーチよりも処理時間を短縮することができる。
【００１１】
しかしながら、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法及びエラートレラントサーチ法による翻訳後修飾の探索には次のような問題がある（特許文献１参照）。
（１）上述したように翻訳後修飾を検索する際には、分析者自身が検索条件として翻訳後修飾の候補を指定しなければならず、当然のことながら、指定しなかった翻訳後修飾については検索が行われない。そのため、分析者にとって想定外である翻訳後修飾が解析対象のＭＳnスペクトルデータに存在していた場合には、翻訳後修飾を同定することができない。なお、前述したようにマスコットにおいて「Variable modifications」として指定できる翻訳後修飾の最大数は９であり、それよりも多数の翻訳後修飾候補がある場合には、複数回の同定作業を実施する必要がある。
【００１２】
（２）エラートレラントサーチ法では、最初に検索対象のタンパク質を限定してしまうため、その時点で目的のタンパク質を除外してしまうと、上記手順によるデータベース検索の際に設定誤差を拡げてもヒットすることは期待できない。こうした見逃しを避けるには、同一サンプルに対する測定を行って得られたＭＳnスペクトルデータを用いて事前に翻訳後修飾を受けない（又は翻訳後修飾が脱離した）タンパク質の同定を行い、そうして同定されたタンパク質に絞ってエラートレラントサーチを行う必要がある。しかしながら、この場合には、事前に同定されたタンパク質に限ってのみしか翻訳後修飾を検索することができない。
【００１３】
（３）翻訳後修飾の検索作業を検索エンジンが担い、その結果のみが出力されるため、例えば分析者がその検索の過程が適切であるか否かを視覚的に判断できるような余地がない。また、出力される結果からは、目的の翻訳後修飾が解析対象であるＭＳnスペクトルデータ中に、全体としてどれくらいの割合で、どのm/z値のピークに含まれているのかを、分析者が視覚的にも定量的にも判断することができない。
【００１４】
なお、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法は、マスコット以外の他のアミノ酸配列解析用ソフトウエア、例えばX!Tandemなどにも搭載されているが、これらでも事情は同様である。
【００１５】
一方、解析対象であるＭＳnスペクトルデータから翻訳後修飾を探索する別の手法として、非特許文献４に記載のものがある。この文献では、二つのマススペクトルの間の相関係数及び一つのマススペクトルの自己相関係数を用いて、それらスペクトル中における下記三つのマスシフト（mass shift）、つまりはペアピークの質量差、を簡易的に探索する手法が提案されている。
（１）安定同位体標識由来のマスシフト
（２）ニュートラルロス由来のマスシフト
（３）特定のイオン系列（例えばｂ系列等）を除外した場合のマスシフト
このうち、翻訳後修飾の探索に利用できるのはニュートラルロス由来のマスシフトである。図８は該文献中で示されている、或るマススペクトル中の自己相関関数の計算結果である。このような結果によれば、Offset（＝mass shift）＝79.96における自己相関関数値が高いことから、マススペクトル中にm/z＝79.96差であるペアピークが多く存在する、と判断でき、これはm/z差から推測してリン酸化由来のペアピークであると判断できる。
【００１６】
しかしながら、こうした相関係数を用いた翻訳後修飾の探索には次のような問題がある。即ち、この方法では、相関係数の大きさによって翻訳後修飾の有無を判断することになるが、相関係数の解釈は一般的に難しく、どの程度の大きさの相関係数があれば翻訳後修飾があるといえるのかを判断できるような基準はない。そのため、実際には、或る翻訳後修飾が存在する可能性が高いといった不確定な結論しか導き出せない。また、相関係数により或る翻訳後修飾の存在が推測されたとしても、その翻訳後修飾由来のペアピークがマススペクトル上のどこにどの程度存在するのかを判断することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２０１０−３８６６４号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】「マトリクス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオン・サーチ（Matrix Science - Mascot - MS/MS Ions Search）」、[online]、英国マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成24年12月3日検索]、インターネット＜URL : http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS＞
【非特許文献２】「エラー・トレラント・サーチ（Error Tolerant Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成24年12月3日検索]、インターネット＜URL : hthttp://www.matrixscience.com/help/error_tolerant_help.html＞
【非特許文献３】デビッド（David M. Creasy）ほか、「エラー・トレラント・サーチング・オブ・アンインタプリテッド・タンデム・マス・スペクトロメトリ・データ（Error Tolerant Searching of Uninterpreted Tandem Mass Spectrometry Data）」、プロテオミクス（Proteomics）、2002年、Vol.2、Issue 10、pp.1426-1434
【非特許文献４】マチュー（Matthew J. Sniatynski,）ほか、「コリレイション・アンド・コンボリューション・アナリシス・オブ・ペプチド・マス・スペクトラ（Correlation and Convolution Analysis of Peptide Mass Spectra.）」、アナリティカル・ケミストリ（Anal. Chem.）、2006年、Vol.78、pp.2600-2607
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明はこうした点に鑑みて成されたものであり、その主な目的は、翻訳後修飾を受けたペプチドについて得られたＭＳnスペクトルデータに基づいて、分析者が想定する翻訳後修飾のみならず想定しないような翻訳後修飾も含めた様々な翻訳後修飾の存在の有無を、定量的且つ迅速に判断することができる質量分析データ解析装置を提供することである。
【００２０】
また、本発明の他の目的は、分析者により指定された翻訳後修飾の有無を視覚的且つ定量的に分かり易く提示することで、分析者が客観的にその結果を評価することができる質量分析データ解析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記課題を解決するために成された本発明は、翻訳後修飾を受けたペプチドの構造を解析するために、該ペプチドを含む試料を質量分析することにより得られた又はインソース分解若しくはポストソース分解を含む１回以上の解離操作を伴う質量分析を行うことにより得られたＭＳnスペクトルデータ（ここでｎは１以上の整数）を解析する質量分析データ解析装置であって、
a)得られたＭＳnスペクトルデータの中で、既知である複数の翻訳後修飾に相当する質量電荷比差を有する２本のピークをペアピークとして全て抽出し、その質量電荷比差毎にペアピークの出現量及び／又はペアピークに対応するイオンの検出量を示す統計量を計算するペアピーク統計量算出部と、
b)該ペアピーク統計量算出部により計算された質量電荷比差毎の統計量を、その質量電荷比差又はそれに相当する翻訳後修飾物に対応付けてリスト化して表示画面上に表示する統計量表示処理部と、
c)該統計量表示処理部により表示されたリスト上で分析者が任意の質量電荷比差又は翻訳後修飾物を指定するための指定部と、
d)前記得られたＭＳnスペクトルデータに基づくＭＳnスペクトルと前記質量電荷比差毎の統計量に基づくグラフとの少なくとも一方を表示画面上に表示するとともに、その表示したグラフ上で、前記指定部を用いて指定された質量電荷比差又は翻訳後修飾物に対応するピーク又は部分を他とは識別可能に特徴付けて描出する指定結果表示処理部と、
を備えることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る質量分析データ解析装置による解析対象であるＭＳnスペクトルデータを得るための質量分析装置は、イオン源として例えばＭＡＬＤＩイオン源やＥＳＩ（エレクトロスプレイイオン化）イオン源を用いたものとするとよい。また、該質量分析装置においてイオンを解離させてプロダクトイオンを生成するイオン解離部は、プロダクトイオンに付加されている修飾物の脱落が少ない解離手法、例えば低エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）を用いたものであることが好ましい。何故なら、ＭＳn分析に際してのイオン解離操作において修飾物が脱離したプロダクトイオンしか生成されない、或いは生成されるプロダクトイオンの修飾物の大部分が脱離したプロダクトイオンであるような状況であると、目的とするペアピークの抽出が困難であるからである。また、イオンの解離はインソース分解やポストソース分解による自然解離であってもよい。
【００２３】
また、ｎの値は１以上の任意の整数であるが、典型的にはｎは２、最大でも５程度である。ｎが２である場合には、上記質量分析装置として三連四重極型質量分析装置を用いることができる。３次元四重極型又はリニア型のイオントラップを利用した質量分析装置はｎの値に拘わらず用いることができる。なお、イオン解離としてインソース分解やポストソース分解を用いた場合には、本発明におけるＭＳnスペクトルデータは擬似（pseudo）ＭＳnスペクトルデータである。
【００２４】
本発明に係る質量分析データ解析装置では、解析対象のＭＳnスペクトルデータが与えられると、ペアピーク統計量算出部はまずピーク検出を行い、既知である複数の翻訳後修飾に相当する質量電荷比差を有する２本のピークをペアピークとして全て抽出する。実測により得られる質量電荷比には装置の質量精度や分解能に依存する幅が避けられないから、翻訳後修飾物の構造から算出される理論的な質量電荷比値に対し所定の許容幅を定めてペアピークを抽出するとよい。もちろん、こうして抽出されるペアピークは意図する翻訳後修飾が付加したペプチドと該修飾がないペプチドとのペアに対応したものである場合もあるが、ノイズピークや別のペプチド由来のピークが偶然ペアピークを形成している場合もある。こうした偽のペアピークを識別するための情報として、ペアピーク統計量算出部は質量電荷比差毎にペアピークの出現量とペアピークに対応するイオンの検出量の少なくとも一方を示す統計量を計算する。
【００２５】
ＭＳnスペクトル上のピークの信号強度はその質量電荷比を有するイオンの検出量に対応しているから、質量電荷比差毎のペアピークに対応するイオンの検出量を示す統計量とは、例えば、その質量電荷比差を持つ全てのペアピークに含まれるピークの信号強度の積算値である。統計量は、質量電荷比差毎のペアピークの出現数と、そのペアピークを構成するピークの信号強度の積算値のいずれか一方でもよいが、好ましくは、つまりは信頼性を上げるためには、それら両方の値を統計量として用いるのがよい。
【００２６】
上述したようにノイズピークや別のペプチド由来のピークが偶然ペアピークを形成している場合もあり得るが、或る翻訳後修飾を受けたペプチドが試料中に多く含まれる場合には、確率的に、その翻訳後修飾に相当する質量電荷比差を有するペアのイオンが多く観測される筈である。したがって、そのペアのイオンの多さは、その質量電荷比差を有するペアピークの個数と信号強度として現れる。そこでペアピーク統計量算出部により質量電荷比差毎にこうした統計量が計算されると、統計量表示処理部はその質量電荷比差又はそれに相当する翻訳後修飾物に対応付けてそれら統計量をリスト化し、モニタの表示画面上に表示することで分析者に提示する。
【００２７】
分析者は指定部により、表示されたリスト上で確認したい質量電荷比差又は翻訳後修飾物を指定する。指定結果表示処理部は上記ＭＳnスペクトルデータに基づくＭＳnスペクトルと質量電荷比差毎の統計量に基づくグラフとの少なくとも一方を表示画面上に表示するが、上記指定部を用いて質量電荷比差又は翻訳後修飾物が指定されると、その指定された質量電荷比差又は翻訳後修飾物に対応するピーク又は部分を他とは識別可能に特徴付けて描出する。ここでいう他とは識別可能に特徴付けた表示とは、他とは異なる表示色を用いた表示、他とは異なる輝度や色の濃さを用いた表示などが考えられる。
【００２８】
一実施態様として、上記指定結果表示部は、ＭＳnスペクトルと、質量電荷比差とペアピークの出現数との関係を示すヒストグラムとを表示し、上記指定部による指定に応じて、そのＭＳnスペクトル上のピーク、及び上記ヒストグラム上の縦棒を他とは異なる表示形式とする構成とすることができる。
【００２９】
こうした特徴的な表示により、分析者は、自分がリスト上で指定した質量電荷比差又は翻訳後修飾物に対応するピークがＭＳnスペクトル上のどの位置にあるのかを視覚的に知ることができるとともに、ヒストグラム上で他の質量電荷比差や翻訳後修飾物と比べてどの程度出現頻度が高いのか（或いは低いのか）を視覚的に把握することができる。
【００３０】
また、本発明に係る質量分析データ解析装置において、好ましくは、上記統計量表示処理部は上記リスト中の統計量をソートする機能を含むようにするとよい。具体的には例えば、統計量が質量電荷比差毎のペアピークの出現数とそのペアピークを構成するピークの信号強度の積算値の二つである場合に、その一方の統計量の多い順に質量電荷比差や翻訳後修飾物を並べ替えることができるようにするとよい。それによって、分析者はその統計量に基づいてどのような翻訳後修飾物が存在する可能性が高いのかを迅速且つ的確に判断することができる。
【００３１】
なお、ここで「既知である複数の翻訳後修飾」とは、一般に発見されている全ての翻訳後修飾であることが望ましい。それにより、分析者が全く想定しない翻訳後修飾についても、その修飾を受けたペプチドが試料中に存在する場合にその情報を分析者に提示することができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係るペプチド構造解析のための質量分析データ解析装置によれば、試料について得られたＭＳnスペクトルデータに基づいて、分析者が予測している翻訳後修飾のみならず全く予測していないような或いは充分に把握していないような翻訳後修飾についても、どのような翻訳後修飾がどの程度存在するのかを定量的に且つ分かり易く分析者に提示することができる。また、分析者が指定した翻訳後修飾の有無についても視覚的且つ定量的に分かり易く提示することができる。それによって、分析者は当該発明とは別に求まるペプチド同定結果等と併せて、どのような翻訳後修飾ペプチドがどの程度存在するのかを的確に且つ迅速に判断することが可能となり、翻訳後修飾を受けたタンパク質やペプチドの構造解析の効率改善とその精度向上に大きく寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に係る質量分析データ解析装置を含むペプチド構造解析システムの一実施例の全体構成図。
【図２】本実施例のペプチド構造解析システムにおいて実施される翻訳後修飾解析の処理手順を示すフローチャート。
【図３】図２に示した翻訳後修飾解析を説明するための模式図。
【図４】リン酸化ペプチドに対して得られたＭＳ2スペクトルデータについて本実施例によるデータ解析処理を実施した結果の表示画面の一例を示す図。
【図５】ヒトトランスフェリン由来のＨｅｘＮＡｃ付加ペプチドに対して得られたＭＳ2スペクトルデータについて本実施例によるデータ解析処理を実施した結果の表示画面の一例を示す図。
【図６】マスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチの検索設定画面の一例を示す図。
【図７】リン酸化ペプチドを測定したＭＳ2スペクトルデータについて、マスコットで「Variable modifications」として「Phospho(ST)」を指定してデータベース検索を実行して得られた検索結果画面の一部抜粋を示す図。
【図８】非特許文献４に示されている、或るマススペクトル中の自己相関関数の計算結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明に係る質量分析データ解析装置について、該装置を含むペプチド構造解析システムを例に挙げて説明する。
図１はこの実施例のペプチド構造解析システムの全体構成図、図２は本システムにおけるペプチド構造解析（翻訳後修飾解析）の処理手順を示すフローチャート、図３は図２に示した翻訳後修飾解析の手法を説明するための模式図である。図４はリン酸化ペプチドに対して得られたＭＳ2スペクトルデータについて得られた翻訳後修飾情報表示画面３００の一例を示す図である。
【００３５】
図１に示すように、本実施例のペプチド構造解析システムは大別して、試料に対し分析を実行してデータを収集するための質量分析部１と、コンピュータを中心に構成され、収集されたデータを解析処理するためのデータ処理部２と、入力部４や表示部５が接続され、ユーザインターフェイスの機能及びシステム全体の統括的な制御を担う制御部３と、から成る。
【００３６】
質量分析部１はマトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ）であり、被検試料中の分子や原子をイオン化するＭＡＬＤＩ法によるイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、質量電荷比に応じたイオンの選別と衝突誘起解離（ＣＩＤ）によるイオンの解離操作とを実行可能な３次元四重極型のイオントラップ１１と、そのイオントラップ１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器１２と、質量電荷比に応じて時間的に分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１３と、イオン検出器１３で得られる検出信号をデジタルデータに変換するアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）１４と、これら各部の動作を制御する分析制御部１５と、を備える。
ここでは、イオン化部１０はＭＡＬＤＩイオン源であるが、イオン化法はこれに限るものではなく、例えばＥＳＩなどを用いてもよい。また、質量分離器には飛行時間型質量分離器以外の、例えば四重極マスフィルタなどを用いてもよい。さらに、イオントラップ１１の代わりにコリジョンセルを用いてもよく、この場合、質量分析部１は三連四重極型質量分析装置でもよい。
【００３７】
データ処理部２は、アナログデジタル変換器１４により得られるスペクトルデータを格納するスペクトルデータ格納部２１、スペクトル解析部２２、ペプチドのアミノ酸配列及び修飾部位を推定するための同定用情報が予め登録された同定用データベース２５、その同定用データベース２５を用いＭＳ1スペクトルデータやＭＳ2スペクトルデータに基づいてペプチドのアミノ酸配列などを推定するペプチド同定部２３、ペプチドが受けている翻訳後修飾を探索しそれに基づく情報を分析者に提供する翻訳後修飾探索処理部２４、などを機能ブロックとして含む。本実施例のペプチド構造解析システムに特徴的な処理を実行する翻訳後修飾探索処理部２４は、ペアピーク抽出部２４１、ペアピーク統計量算出部２４２、翻訳後修飾情報表示処理部２４３を含み、またこれに関連して同定用データベース２５は、翻訳後修飾情報記憶部２５１を含む。翻訳後修飾情報記憶部２５１には、これまでに発見されている様々な種類の翻訳後修飾について、その翻訳後修飾物の名称と質量とが対応付けて記憶されている。
【００３８】
データ処理部２、及び制御部３、さらには場合によっては分析制御部１５の一部の機能は、パーソナルコンピュータ（又はさらに高機能なワークステーションなど）をハードウエア資源とし、該コンピュータにインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアが動作することにより具現化されるものとすることができる。この場合、入力部４はパーソナルコンピュータに接続されるキーボードや、マウス等のポインティングデバイスであり、表示部５はモニタディスプレイである。
【００３９】
まず、本実施例のペプチド構造解析システムにおいて分析対象である試料に対するデータを収集する際の手順と動作とを説明する。
分析者は目的とするタンパク質を適宜の酵素（例えばトリプシン酵素）により消化し、翻訳後修飾ペプチドを含む被検試料を調製する。そして、該被検試料を質量分析部１に装填し、ＭＳ1分析を実行する。即ち、分析制御部１５の制御の下に、イオン化部１０では被検試料中の各種物質をイオン化し、生成されたイオンをイオントラップ１１内に一旦捕捉する。そのあとに、捕捉された各種イオンをほぼ同時に射出して飛行時間型質量分離器１２に送り込み、質量電荷比に応じて時間差がついたイオンをイオン検出器１３により検出する。イオン検出器１３で得られた検出信号はアナログデジタル変換器１４でデジタルデータに変換されてスペクトルデータ格納部２１に保存される。
【００４０】
スペクトル解析部２２では収集されたスペクトルデータに基づいてＭＳ1スペクトルが作成され、所定の基準に基づいて目的とするペプチドであると推定されるイオンがプリカーサイオンとして選択される。プリカーサイオンが選択されると、次に、分析制御部１５の制御の下に、質量分析部１により、同じ被検試料に対し、プリカーサイオンの質量電荷比を設定したＭＳ2分析が実行される。即ち、イオン化部１０において被検試料から生成された各種イオンは一旦イオントラップ１１に捕捉され、イオントラップ１１において、指定された質量電荷比を持つイオンのみが選別された後にＣＩＤによる１回の解離操作がなされる。それによってプリカーサイオンが解離して生成された各種プロダクトイオンがイオントラップ１１から一斉に出射され、飛行時間型質量分離器１２により質量電荷比に応じて分離されてイオン検出器１３により検出される。イオン検出器１３で得られた検出信号はアナログデジタル変換器１４でデジタルデータに変換されてスペクトルデータ格納部２１に保存される。なお、スペクトル解析部２２で複数のプリカーサイオンが選択された場合には、そのプリカーサイオン毎にＭＳ2スペクトルデータが収集される。
【００４１】
こうしてスペクトルデータ格納部２１には、被検試料に含まれる目的のペプチド由来のＭＳ2スペクトルデータが収集される。こうして得られたＭＳ2スペクトルデータに基づいて、次のようにして翻訳後修飾の探索が実行される。なお、こうした翻訳後修飾の探索処理は、図１に示したようなシステムの状態で実行することも可能であるが、質量分析部１とデータ処理部２とを切り離した状態、つまりは実質的にパーソナルコンピュータのみの状態でも実行することができる。
【００４２】
翻訳後修飾の探索処理が開始されると、まず、翻訳後修飾探索処理部２４においてペアピーク抽出部２４１はスペクトルデータ格納部２１から処理対象であるＭＳ2スペクトルデータを読み込む（ステップＳ１）。具体的には、分析者が入力部４で所定の操作を行うと、翻訳後修飾情報表示処理部２４３は図４に示すような翻訳後修飾情報表示画面３００を表示部５の画面上に表示する。ただし、このとき、スペクトル表示領域３０２、統計量リスト表示領域３０４、ヒストグラム表示領域３０５、は空欄である。分析者がファイル指定欄３０１に読み込みたいデータファイルの名称を入力して右側のボタンをクリック操作すると、指定されたデータファイルが読み込まれる。データファイルが読み込まれると、翻訳後修飾情報表示処理部２４３は、該ファイルに含まれるデータからＭＳ2スペクトルを作成し、それをスペクトル表示領域３０２に表示する。
【００４３】
ペアピーク抽出部２４１は、そのＭＳ2スペクトルに観測される全てのピークを検出し、質量電荷比と信号強度とを含むピーク情報を収集する。そして、翻訳後修飾情報記憶部２５１に記憶されている全ての翻訳後修飾物の質量に相当する質量電荷比差を有する２本のピークをペアピークとして全て抽出する（ステップＳ２）。実際には、質量分析部１による測定では或る程度の質量電荷比の誤差が避けられないから、具体的には次のようにペアピークを抽出するとよい。
【００４４】
いま、或る一つの翻訳後修飾物Ａの精密な質量がＭaであるとする。これに装置の質量電荷比誤差などを見込んだマージン±ΔＭを考慮すると、翻訳後修飾物Ａの質量範囲はＭa±ΔＭ（つまりはＭa−ΔＭ〜Ｍa＋ΔＭの範囲）である。ＣＩＤ等により翻訳後修飾物Ａが付加したペプチドから翻訳後修飾物Ａが脱離すると、その脱離がないペプチド由来のイオンピークからその翻訳後修飾物Ａの質量分だけ小さな質量電荷比に脱離が生じたペプチド由来のイオンピークが観測される。つまり、翻訳後修飾物Ａの質量範囲Ｍa±ΔＭに相当するニュートラスロス質量差を持つペアピークがあれば、そのペアピークは翻訳後修飾物Ａが付加したペプチド由来イオンピークと翻訳後修飾物Ａが脱離した（厳密に言えば１個の翻訳後修飾物Ａが脱離した）ペプチド由来イオンピークである可能性がある。そこで、翻訳後修飾情報表示画面３００上の「mass tolerance」設定欄３０３に入力されている値をΔＭとして質量電荷比の差が質量範囲Ｍa±ΔＭの範囲に入る２本のピークを探索し、それに該当する２本のピークは翻訳後修飾物Ａに対応するペアピークであるとして抽出する。図３（ａ）に示すように、このとき、ＭＳ2スペクトル上でのペアピークの位置（質量電荷比）自体は問わない。こうしたペアピークの抽出を全ての翻訳後修飾物について実行する。
【００４５】
次に、ペアピーク統計量算出部２４２は、翻訳後修飾物毎に、抽出されたペアピークの数（出現数）countと、抽出された全てのペアピークの信号強度の積算値TICを計算する。後者は、例えば或る翻訳後修飾物に対するペアピークが全部で１個しか見つからなければ、その１個のペアピーク、つまり２本のピークの信号強度の和をとればよい。或る翻訳後修飾物に対するペアピークが全部で２個見つかった場合には、その２個のペアピーク、つまり４本のピークの信号強度の和をとればよい（図３（ｂ）、（ｃ）参照）。なお、一般に「TIC」は本来ＭＳ1スペクトルデータに存在する全てのピークの強度和を指すが、本明細書中では便宜上、或る特定の質量電荷比を持つ全てのペアピークの強度和のことを指すものとする。
【００４６】
或る翻訳後修飾を受けているペプチドについてＭＳ2スペクトルデータを取得した場合には、通常、その翻訳後修飾に関するペアピーク信号強度積算値TIC及びペアピーク出現数countが共に大きな値を持つ筈である。ただし、ペプチドとは無関係のノイズピーク同士やノイズピークとペプチド由来イオンピークとをペアピークとして抽出してしまう場合もあり、ペアピーク出現数countにはこうした偽のペアピークの数も含まれる。 特にノイズの多い環境下ではこうした偽のペアピークは多くなるため、ペアピーク出現数countのみを翻訳後修飾の有無の指標とすると、充分に高い信頼度で以て翻訳後修飾の有無を判断することが難しい。そこで、ここではペアピーク出現数countのみならず、ペアピーク信号強度積算値TICも翻訳後修飾の有無判定の指標として採用している。このペアピーク信号強度積算値TICが大きければ、抽出されたペアピークは信頼度の高いピークであるといえる。
【００４７】
次に、翻訳後修飾情報表示処理部２４３は、翻訳後修飾の名称及び質量に対応した統計量、つまり図３（ｄ）に示すように、ペアピーク信号強度積算値TIC及びペアピーク出現数countを一覧表とした統計量リストを作成する（ステップＳ４）。さらに、各翻訳後修飾の質量とペアピーク出現数countとの関係を示すヒストグラムを作成する（ステップＳ５）。そして、ステップＳ４で作成された統計量リストを統計量リスト表示領域３０４に、ステップＳ５で作成された出現数ヒストグラムをヒストグラム表示領域３０５にそれぞれ表示する（ステップＳ６）。
【００４８】
分析者は必要に応じ、翻訳後修飾情報表示画面３００上のソート指示欄３０６でソート項目を指定する。分析者がソート項目の指定を変更すると、ステップＳ７でＹｅｓと判定され、翻訳後修飾情報表示処理部２４３は指定された規則に則って統計量リスト中の表示をソートする（ステップＳ８）。図４に示した例では、「TIC」の項目でのソートが指示されているため、ペアピーク信号強度積算値TICが大きい順に統計量リスト中の各行がソートされる。例えば「count」の項目でのソートが指示されれば、ペアピーク出現数countが大きい順に統計量リスト中の各行がソートされる。ソートによって上位に表示される翻訳後修飾は存在の可能性が高いといえるから、分析者はソート項目の指定を適宜変更し、ソートされた結果を元に翻訳後修飾の存在の有無を判断する。
【００４９】
また、分析者が統計量リスト中の任意の翻訳後修飾の名称（その名称が含まれる行）をクリック操作すると（ステップＳ９でＹｅｓ）、翻訳後修飾情報表示処理部２４３はスペクトル表示領域３０２に表示されているＭＳ2スペクトル上で、指定された翻訳後修飾に相当するペアピークの表示色を他のピークの表示色とは異なる色に変更する。また、ヒストグラム表示領域３０５に表示されている出現数ヒストグラム上で、指定された翻訳後修飾に対応する縦棒の表示色を他の縦棒の表示色とは異なる色に変更する（ステップＳ１０）。なお、図４では表示色の相違を表現できないので、他と異なる色で表示される特定のピーク及び縦棒をグレースケールで黒で示し、他のピーク及び縦棒を灰色で示している。こうした表示により、分析者は指定した翻訳後修飾がＭＳ2スペクトル上においてどのような信号強度でどのような質量電荷比に分布しているのかが視覚的に把握できる。また、出現数ヒストグラムでは、指定した翻訳後修飾に相当するペアピークの数が全体に対してどの程度の割合であるのかが視覚的に把握できる。
【００５０】
図４に示した実測例は、図７に示した従来例で解析に用いた、リン酸化：Phospho（ニュートラルロス質量は97.977Da）が翻訳後修飾として起こっているペプチドについて得られたＭＳ2スペクトルデータに対して本発明の手法を適用したものである。解析を行う上での「mass tolerance」の設定も同じである。なお、翻訳後修飾情報記憶部２５１には、ＭＳ／ＭＳイオンサーチで指定可能な約３００種類の翻訳後修飾を登録しておいた。
【００５１】
周知のようにリン酸はかなり脱離し易い修飾物であるので、ＭＳ2スペクトル上では、或る程度信号強度が高い、リン酸脱離が起こっているペアピークが数多く測定されることが予想される。実際に、求まった統計量リストをペアピーク信号強度積算値TICでソートすると、脱水（ニュートラルロス質量は18.011Da）やそのmass tolerance内のニュートラルロスを除けば、Phospho(ST)が最上位でヒットする。また、このPhospho(ST)はペアピーク出現数countも21と充分に大きいといえる。さらに、Phospho(ST)を指定してそれに相当するペアピークを異なる表示色に変更したＭＳ2スペクトルをみると、信号強度の高いピークは殆ど全てリン酸化が起こっている又はその可能性があるペアピークであることが視覚的に判断できる。さらにまた、同じくPhospho(ST)を指定してそれに相当する縦棒を異なる表示色に変更した出現数ヒストグラムをみると、リン酸化が起こっている又はその可能性があるペアピークの数は、他の翻訳後修飾が起こっている又はその可能性があるペアピークの数よりも充分に多いことが視覚的に把握できる。
【００５２】
図５に別の実測例を示す。図５はトランスフェリン由来のＨｅｘＮＡｃ（ニュートラルロス質量は203.079Da）が翻訳後修飾として起こっているペプチドについて得られたＭＳ2スペクトルデータに対して本発明の手法を適用したものである。図５中の統計量リストはペアピーク信号強度積算値TICでソートされている。結果として、脱塩（ニュートラルロス質量は17.027Da）やそのmass tolerance内のニュートラルロスが起こっている翻訳後修飾の次に高い順位に、ＨｅｘＮＡｃがリストアップされている。また、ＨｅｘＮＡｃはペアピーク出現数countも充分に大きく、ＭＳ2スペクトル及び出現数ヒストグラムからも、図４に示した実測例と同様のことが視覚的に把握できる。
このように、本実施例のペプチド構造解析システムにおけるデータ解析処理の結果、表示される翻訳後修飾情報表示画面３００上の表示によれば、起こっている又はその可能性がある翻訳後修飾の情報を的確に且つ分かり易く分析者に提示することができる。
【００５３】
上記実施例では、ＭＳ2スペクトルデータに基づいて翻訳後修飾の統計量を算出していたが、さらに解離操作の段数を増やしたｎが３以上であるＭＳnスペクトルデータに基づいて翻訳後修飾の統計量を算出し、これにより作成したリストやグラフを分析者に提示するようにしてもよい。
また、解析対象のＭＳnスペクトルデータはいわゆる擬似ＭＳn（PseudoMSn）スクトルデータでもよい。即ち、或る種の翻訳後修飾はＣＩＤなどの解離操作ではなく、インソース分解やポストソース分解でも比較的容易に脱離することが知られている。こうした翻訳後修飾を受けたペプチドの構造解析を行う場合には、通常、ＣＩＤなどの意図的なＣＩＤ操作を行わずに得られた擬似ＭＳ2スペクトル上で翻訳後修飾が脱離したペプチド由来イオンと同じ翻訳後修飾が脱離していないペプチド由来イオンとが明瞭に現れるから、この擬似ＭＳ2スペクトルデータに対して本発明によるデータ解析手法をそのまま利用することができる。実際、先ほど一例として示した図５のＭＳ2スペクトルデータはPseudoMS3のデータである。
【００５４】
さらにまた、意図的なインソース分解やポストソース分解以外の通常の質量分析の過程でも、翻訳後修飾が比較的容易に起こることがある。したがって、上述した本発明に係るデータ解析手法は通常の質量分析で得られたＭＳ1スペクトルデータに対しても適用し得る。
【００５５】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００５６】
１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…飛行時間型質量分離器
１３…イオン検出器
１４…アナログデジタル変換器
１５…分析制御部
２…データ処理部
２１…スペクトルデータ格納部
２２…スペクトル解析部
２３…ペプチド同定部
２４…翻訳後修飾探索処理部
２４１…ペアピーク抽出部
２４２…ペアピーク統計量算出部
２４３…翻訳後修飾情報表示処理部
２５…同定用データベース
２５１…翻訳後修飾情報記憶部
３…制御部
４…入力部
５…表示部
３００…翻訳後修飾情報表示画面
３０１…ファイル指定欄
３０２…スペクトル表示領域
３０３…「mass tolerance」設定欄
３０４…統計量リスト表示領域
３０５…ヒストグラム表示領域
３０６…ソート指示欄
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図５】
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