(57)【要約】【課題】  細胞の保持性に優れ、早期に生理活性のある連続した三次元模擬組織である培養された細胞を利用することができる細胞培養担体、およびその使用方法を提供すること。【解決手段】  本発明の細胞培養担体は、無機成分を含む、平均流量孔径が１〜２００μｍの多孔質体に、細胞培養した細胞層を二層以上有する状態のまま、凍結した状態にある。本発明の細胞培養担体は、ベースとなる多孔質体が細胞の保持性に優れているとともに、細胞培養した細胞層を二層以上有する、連続した三次元模擬組織の状態で凍結しているため、解凍後には生理活性の回復の早いものである。本発明の細胞培養担体は、前記細胞培養担体を解凍した後、細胞培養を行って使用できる。【選択図】      図８
2014113060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機成分を含む、平均流量孔径が１〜２００μｍの多孔質体に、細胞培養した細胞層を二層以上有する状態のまま、凍結した状態にあることを特徴とする、細胞培養担体。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養担体を解凍した後、細胞培養を行うことを特徴とする、細胞培養担体の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養担体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、遊離した細胞を凍結保存する方法が知られている。例えば、ディッシュやボトルなどで培養した細胞を、トリプシン処理によって担体から剥がし、遠心分離して回収した後、保存液による洗浄と遠心分離を繰り返し、続いて、保存チューブに細胞を入れ、保存液でチューブを満たし、フリーザーで冷却した後で、液体窒素中で保存する方法があった。しかしながら、この方法は操作が煩雑な上、トリプシン処理や洗浄の際に、細胞にストレスがかかるため、解凍後に生理活性の回復に時間がかかるという問題があった。
【０００３】
これに関連して本願出願人は、「動物細胞接着材料を親水性樹脂又はキトサンとの混合物の形で全表面上に分散して含む不織布に、動物細胞を付着させて凍結保存する動物細胞の保存方法」（特許文献１）を提案した。具体的には、レーヨン繊維からなるニードルパンチフェルトを、ポリウレタンエマルジョンとエポキシ系架橋剤とを含むバインダーで接着し、キトサン、フィブロイン及びゼラチンからなる被覆液で被覆した不織布（培養担体）に、細胞培養した後、保存液でリンスし、不織布を凍結保存することを提案した。
【０００４】
しかしながら、このようなニードルパンチフェルトの平均孔径は細胞の大きさに比べて非常に大きいため、解凍時に一時的に接着性の低下した細胞を、フェルト中に保持することができず、凍結保存試薬の除去の際に細胞が流出してしまう危険性があった。また、細胞の大きさに比べてフェルトの平均孔径が大きいため、三次元的に連続した培養細胞を形成することができず、繊維表面のみで細胞が増殖する結果、平面培養と同様の培養形態となるため、凍結保存後に解凍して得られる細胞も平面培養された状態にあった。平面培養により培養した細胞組織は生体内の組織構造と大きく異なるため、本来、細胞のもつ酵素活性や生合成活性等を発揮できないものである。そのため、生体内の組織構造を模した、連続した三次元模擬組織であるように細胞を培養するのが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−２０９７６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上述のような問題点を解決するためになされたものであり、細胞の保持性に優れ、早期に生理活性のある連続した三次元模擬組織である培養された細胞を利用することができる細胞培養担体、およびその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の請求項１にかかる発明は、「無機成分を含む、平均流量孔径が１〜２００μｍの多孔質体に、細胞培養した細胞層を二層以上有する状態のまま、凍結した状態にあることを特徴とする、細胞培養担体。」である。
【０００８】
本発明の請求項２にかかる発明は、「請求項１記載の細胞培養担体を解凍した後、細胞培養を行うことを特徴とする、細胞培養担体の使用方法。」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の請求項１にかかる細胞培養担体は、ベースとなる多孔質体が、平均流量孔径が１〜２００μｍと一般的な細胞の大きさのほぼ１〜２倍であり、しかも無機成分を含んでいることからある程度の剛性を有し、保形性に優れているため、細胞の保持性に優れているとともに、細胞培養した細胞層を二層以上有する状態にある、つまり、連続した三次元模擬組織であるように、高密度に細胞が培養された状態で凍結している。このように、三次元模擬組織である状態で凍結しているため、解凍後には生理活性の回復の早いものである。更に、細胞培養担体は凍結した状態にあるため、所望時期に解凍し、連続した三次元模擬組織である培養された細胞を利用することができる。
【００１０】
本発明の請求項２にかかる細胞培養担体の使用方法は、前記細胞培養担体を解凍した後、細胞培養を行うため、所望時期に、連続した三次元模擬組織である培養された細胞を利用することのできる方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の多孔質体を製造することのできる静電紡糸装置の一態様を模式的に示す説明図
【図２】紡糸用無機系ゾル溶液中に浸したエッジ電極を模式的に示す説明図
【図３】紡糸用無機系ゾル溶液中に浸したコンベア状のワイヤ電極を模式的に示す説明図
【図４】（ａ）  沿面放電素子の構造を模式的に示す平面図  （ｂ）  沿面放電素子の構造を模式的に示す側面図
【図５】本発明の多孔質体を製造することのできる静電紡糸装置の別の一態様を模式的に示す説明図
【図６】本発明の多孔質体を製造することのできる静電紡糸装置の更に別の一態様を模式的に示す説明図
【図７】（ａ）  実施例１の多孔質体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）（ｂ）  実施例１の細胞培養７日目における多孔質体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）（ｃ）  実施例１の細胞培養７日目における多孔質体断面の電子顕微鏡写真（４００倍）
【図８】（ａ）  実施例１の細胞培養担体を解凍し、培養１日後における、細胞培養担体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）（ｂ）  実施例１の細胞培養担体を解凍し、培養１日後における、細胞培養担体断面の電子顕微鏡写真（１０００倍）（ｃ）  実施例１の細胞培養担体を解凍し、培養４日後における、細胞培養担体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）（ｄ）  実施例１の細胞培養担体を解凍し、培養４日後における、細胞培養担体断面の電子顕微鏡写真（１０００倍）
【図９】（ａ）  比較例１の培養した細胞を解凍し、培養１日後の光学顕微鏡写真（１００倍）（ｂ）  比較例１の培養した細胞を解凍し、培養４日後の光学顕微鏡写真（１００倍）
【図１０】（ａ）  比較例２の培養した細胞を解凍し、培養１日後の光学顕微鏡写真（１００倍）（ｂ）  比較例２の培養した細胞を解凍し、培養４日後の光学顕微鏡写真（１００倍）
【図１１】凍結前における培養した細胞のＡＬＢ発現量を１とした時の、解凍し、培養４日後における培養した細胞のＡＬＢ発現量の割合を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の細胞培養担体を構成する多孔質体は平均流量孔径が１〜２００μｍと一般的な細胞の大きさのほぼ１〜２倍であり、しかも無機成分を含んでいることからある程度の剛性を有し、保形性に優れているため、培養操作性に優れ、細胞の保持にも優れ、細胞へダメージを与えにくく、しかも培養細胞間の剥離が生じにくい。また、保形性に優れているため、細胞培養した細胞層を二層以上有する、つまり、連続した三次元模擬組織であるように、高密度に細胞を培養することができる。このように、三次元模擬組織であるように培養された状態で凍結しているため、本発明の細胞培養担体は解凍後の生理活性の回復の早いものである。
【００１３】
本発明の多孔質体はその構造を維持できるように、無機成分を含んでいる。このような無機成分としては、例えば、リチウム、ベリリウム、ホウ素、炭素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、ケイ素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ルビジウム、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、セシウム、バリウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、又はルテチウムの各酸化物を挙げることができ、具体的には、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができる。前記の無機成分は、一成分の酸化物から構成されていても、二成分以上の酸化物から構成されていても良い。例えば、ＳｉＯ２−Ａｌ２Ｏ３のニ成分から構成することができる。
【００１４】
本発明の細胞培養担体を構成する多孔質体は、平均流量孔径が１〜２００μｍと一般的な細胞の大きさ（１〜１００μｍ）の１〜２倍で、細胞の保持性に優れるため、連続した三次元模擬組織であるように細胞を培養することができる。より一般的な細胞の大きさは１〜５０μｍであるため、平均流量孔径は１〜１００μｍであるのが好ましく、更に一般的な細胞の大きさは３〜２５μｍであるため、平均流量孔径は３〜５０μｍであるのが更に好ましく、更に一般的な細胞の大きさは５〜１０μｍであるため、平均流量孔径は５〜２０μｍであるのが更に好ましい。
【００１５】
この「平均流量孔径」は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６に規定されている方法により得られる値をいい、例えば、ポロメータ（Ｐｏｌｏｍｅｔｅｒ、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）社製）を用いて、ミーンフローポイント法により測定される値をいう。
【００１６】
本発明の多孔質体の形態はどのような形態からなっていても良いが、例えば、不織布、織物、編物、発泡体、中空糸集合体、繊維及び／又は粒子を押し固めた成形体、又はこれらの複合体であることができる。これらの中でも、連続した三次元模擬組織を形成できるように、嵩高で、比表面積の広い多孔質体であることができる不織布を含んでいるのが好ましい。なお、多孔質体は不織布のような二次元的形態であっても、中空円筒形、円筒形などの三次元的形態であっても良い。三次元的形態の多孔質体は、例えば、不織布等の二次元的形態の多孔質体を成形することによって、或いは、繊維及び／又は粒子を三次元的形態に成形することによって得ることができる。
【００１７】
この好適な不織布形態からなる多孔質体の場合、三次元模擬組織であるように細胞を培養することができるように、平均繊維径３μｍ以下の繊維からなるのが好ましく、２μｍ以下の繊維からなるのがより好ましく、１μｍ以下の繊維からなるのが更に好ましい。本発明における「平均繊維径」は繊維５０点における繊維径の算術平均値をいい、「繊維径」は多孔質体を撮影した５０００倍の電子顕微鏡写真をもとに測定した、繊維の長さ方向に対して直交する方向における長さを繊維径とする。
【００１８】
このような不織布を構成する繊維は有機系繊維であっても、無機系繊維であっても、有機系繊維と無機系繊維とが混在していても良いが、無機系繊維を含んでいると、繊維自体が剛性に優れており、細胞培養時、凍結時、解凍時及び解凍後の細胞培養時に、保形性に優れているため好適である。この好適である無機系繊維としては、例えば、無機系ゲル状繊維、無機系乾燥ゲル状繊維、無機系焼結繊維がある。無機系ゲル状繊維とは、溶媒を含む状態の繊維であり、無機系乾燥ゲル状繊維とは、無機系ゲル状繊維中に含まれる溶媒などが抜けた状態の繊維であり、無機系焼結繊維とは、無機系乾燥ゲル状繊維（多孔質）が、焼結（無孔質）した状態の繊維である。このような好適である無機系繊維は多孔質体の３０ｍａｓｓ％以上を占めているのが好ましく、５０ｍａｓｓ％以上を占めているのがより好ましく、７０ｍａｓｓ％以上を占めているのが更に好ましく、１００ｍａｓｓ％を占めているのが最も好ましい。
【００１９】
また、多孔質体は空隙率が９０％以上であると、細胞と、細胞との足場となる多孔質体構成材（例えば、繊維）との接着効率が向上し、また、多孔質体構成材の密度が低く、細胞が多孔質体の内部まで広がりやすく、更に、細胞に必要不可欠な栄養素や酸素などの供給効率が向上しやすいため細胞増殖能に優れ、高密度培養でき、三次元模擬組織であるように細胞を培養することができるため好適である。好ましい空隙率は９１％以上であり、より好ましくは９２％以上であり、更に好ましくは９３％以上であり、更に好ましくは９４％以上である。上限は特に限定するものではないが、保形性の点から９９．９％以下であるのが好ましい。
【００２０】
なお、「空隙率」は次の式から算出することができる。
Ｐ＝［１−Ｗｆ／（Ｖ×ＳＧ）］×１００
ここで、Ｐは多孔質体の空隙率（％）、Ｗｆは多孔質体の重量（ｇ）、Ｖは多孔質体の体積（ｃｍ３）、ＳＧは多孔質体構成材の比重（ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ表す。
【００２１】
例えば、不織布のように厚さが均一な場合、次の式から算出することができる。
Ｐ＝［１−Ｗｎ／（ｔ×ＳＧ）］×１００
ここで、Ｐは不織布の空隙率（％）、Ｗｎは不織布の目付（ｇ／ｍ２）、ｔは不織布の厚さ（μｍ）、ＳＧは不織布構成繊維の比重（ｇ／ｃｍ３）をそれぞれ表す。
【００２２】
なお、目付は、最も面積の広い面の面積と重量を測定し、１ｍ２当たりの重量に換算した値であり、厚さは、最も面積の広い面に対する荷重が３０ｇ／ｃｍ２となるように設定したマイクロメーターで測定した値である。
【００２３】
本発明の多孔質体は、細胞培養時、凍結時、解凍時及び解凍後の細胞培養時における保形性に優れているように、部分的に融着した状態にあるのが好ましい。部分的に融着している場合、ドット状又はライン状であることができ、前者のドット状である場合、その形状は、例えば、長方形などの矩形、円形、楕円形、長円形などの丸形、又はこれらの組合せであることができ、後者のライン状である場合、直線、曲線又はこれらの組合せであることができる。特に、多孔質体の外縁がライン状又はドット状に融着していると、多孔質体の保形性に優れ、細胞培養時、凍結時、解凍時及び解凍後の細胞培養時に変形しにくいため好適である。
【００２４】
このように外縁が融着している場合、保形性に優れているように、外縁部における多孔質体の厚さ方向における内部においても、多孔質体構成材が融着しているのが好ましい。具体的には、外縁部における多孔質体の融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真において、粒状の塊（融着部）の占める面積が、多孔質体の断面積の５％以上を占めており、好ましくは１０％以上占めており、更に好ましくは１５％以上占めており、更に好ましくは２０％以上占めている。なお、前記粒状の塊（融着部）の占める面積が５％未満であっても、融着部の数が５ヶ所以上であるように融着していれば、保形性に優れる多孔質体である。
【００２５】
なお、外縁部における多孔質体の厚さ方向断面における、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率及び融着部の数は、次の操作により得られる値をいう。
（１）多孔質体の融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真を撮影する。
（２）前記電子顕微鏡写真において、融着部分における厚さを一辺（短辺）とし、前記厚さの５倍の長さを一辺（長辺）とする長方形の枠を任意の箇所に設定し、測定領域を確定する。
（３）前記測定領域内における粒状の塊（融着部）の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率（Ａｒｃ）は、次の式から算出する。
Ａｒｃ＝（Ａｔｃ／Ａｍｃ）×１００
ここで、Ａｔｃは測定した融着部の面積の総和、Ａｍｃは測定領域の面積、をそれぞれ意味する。
【００２６】
なお、多孔質体構成材料が接着剤で接着していない場合には、保形性に優れるように、多孔質体の外縁がライン状又はドット状に融着しているとともに、多孔質体の主面における融着した外縁よりも内側においても、ドット状又はライン状に部分的に融着しているのが好ましい。このように多孔質体の主面における融着した外縁よりも内側においても融着している場合、融着した外縁よりも内側における融着部の総面積が、主面における融着した外縁に囲まれた面積の５％以上を占めるように融着しているのが好ましく、１０％以上を占めるように融着しているのがより好ましい。なお、多孔質体の主面における融着部が１点以上で融着しているのが好ましく、５点以上で融着しているのがより好ましい。また、主面における融着した外縁に囲まれた領域に２点以上融着している場合、任意の箇所で融着していることができるが、融着部が分散して融着していると、より保形性に優れている。
【００２７】
なお、多孔質体の主面における融着した外縁よりも内側において、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率及び融着部の数は、次の操作により得られる値をいう。
（１）  多孔質体の主面全体の電子顕微鏡写真を撮影する。
（２）  多孔質体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域の面積を測定する。
（３）  多孔質体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域における、粒状の塊（融着部）の占める面積、又は融着部の数を測定する。なお、粒状の塊（融着部）の占める面積の比率（Ａｒｓ）は、次の式から算出する。
Ａｒｓ＝（Ａｔｓ／Ａｍｓ）×１００
ここで、Ａｔｓは多孔質体の主面における融着部の占める面積の総和、Ａｍｓは多孔質体の主面における外縁の粒状の塊（融着部）により囲まれた領域の面積、をそれぞれ意味する。
【００２８】
本発明における「融着」とは、多孔質体構成材（例えば、繊維）が溶融して多孔質体構成材の形状を喪失し、多孔質体構成材の横断面積の２倍以上の大きさを有する粒状の塊の状態で固着し、多孔質体構成材間に介在していることをいう。このような状態は、多孔質体の厚さ方向における断面電子顕微鏡写真、及び／又は多孔質体の主面における電子顕微鏡写真から確認することができる。なお、「多孔質体構成材の横断面積」は粒状の塊に隣接する箇所における多孔質体構成材の横断面積をいう。また、「多孔質体構成材が溶融して粒状の塊の状態で固着している」ことは、ＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分析：Energy dispersive X-ray spectrometry）などの微小領域を分析可能な元素分析により、多孔質体構成材を構成する元素と粒状の塊を構成する元素とが同じであることによって確認できる。
【００２９】
本発明の多孔質体は接着剤で接着されているのが好ましい。更に保形性に優れ、細胞培養時、凍結時、解凍時及び解凍後の細胞培養時に変形しにくいためである。特に、多孔質体の内部を含む全体において、多孔質体構成材間に被膜を形成することなく、接着剤で接着していると、多孔質体の内部構造を損なわず、三次元模擬組織であるように細胞を培養することができるため好適である。つまり、細胞培養に必要な足場が多く、高密度培養できるとともに、細胞に必要不可欠な栄養素や酸素などを効率的に供給しやすい。また、嵩高であるため培養状態を観察しやすい。
【００３０】
この接着剤は有機系接着剤であっても、無機系接着剤であっても、或いは有機系接着剤と無機系接着剤とを併用しても良いが、多孔質体が有機系成分から構成されている場合には、多孔質体が変形しにくいように、無機系接着剤を含む接着剤で接着されている。多孔質体が無機系成分から構成されている場合であっても、多孔質体が更に変形しにくくなるため、無機系接着剤を含む接着剤で接着されているのが好ましい。
【００３１】
なお、多孔質体が機能性に優れているように、金属イオン含有化合物を含有していると、細胞機能誘導因子を奏する。例えば、細胞の分裂・増殖・分化、血液の凝固、筋肉の収縮、神経感覚細胞の興奮、貪食、抗原認識、抗体分泌など免疫反応、各種ホルモン分泌など広範囲な生体反応に関与し、また、リンと共にヒドロキシアパタイト結晶を形作って骨や歯牙のマトリクス構造に沈着して強度を与えるカルシウム、細胞外液の浸透圧維持のために働くナトリウム、酸素の運搬作用、及びエネルギー代謝における電子伝達体（チトクロムＣ）の必須部位である鉄、骨と歯牙の主要な無機成分であるマグネシウム、神経興奮性の維持、筋肉の収縮、細胞内の浸透圧維持のために働くカリウム、或いは銅、ヨウ素、セレン、クロム、亜鉛又はモリブデンなどの金属を含んでいると、細胞機能を向上させることができる。
【００３２】
この金属イオン含有化合物は、例えば、金属塩であることができ、金属塩としては、例えば、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、炭酸塩、リン酸水素塩、炭酸水素塩、硝酸塩、水酸化物などを挙げることができる。特に、カルシウムイオン含有塩、マグネシウムイオン含有塩、アパタイト（りん灰石）を含有する多孔質体は、細胞機能を高めた細胞培養を行うことができる。
【００３３】
このように、本発明の多孔質体は無機成分を含んでいることによって、多孔質体の形態安定性が高く、細胞培養時、凍結時、解凍時及び解凍後の細胞培養時に変形しにくいものである。なお、例示したように、無機系繊維及び／又は無機系接着剤として含んでいる必要はなく、例えば、無機粒子を含んでいることによっても、無機粒子の剛性によって多孔質体の形態安定性が向上し、細胞培養時、凍結時、解凍時及び解凍後の細胞培養時に変形しにくい。本発明の多孔質体は変形しにくいように、５０ｍａｓｓ％以上の無機成分から構成されているのが好ましく、７０ｍａｓｓ％以上の無機成分から構成されているのがより好ましく、９０ｍａｓｓ％以上の無機成分から構成されているのが更に好ましく、１００ｍａｓｓ％無機成分から構成されているのが最も好ましい。
【００３４】
このような最も好ましい、１００ｍａｓｓ％無機成分からなる、平均流量孔径が１〜２００μｍの不織布形態の多孔質体、つまり、無機系繊維からなる不織布形態の多孔質体は、例えば、次のようにして製造することができる。
（１）無機成分を主体とする化合物を含む紡糸用無機系ゾル溶液を用いて、静電紡糸法により無機系繊維を紡糸する工程（紡糸工程）、
（２）前記無機系繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、無機系繊維ウエブを形成する工程（集積工程）、
（３）前記無機系繊維ウエブを結合して不織布（多孔質体）とする工程（結合工程）
を含み、所望により、（２）の集積工程の後に、熱処理する工程を更に含むことができる。
【００３５】
更には、金属イオン含有化合物含有溶液を前記不織布（多孔質体）に付与し、不織布に機能性を付与する工程（金属イオン含有化合物含有溶液付与工程）を更に含むことができる。なお、金属イオン含有化合物含有溶液付与工程に替えて、又は加えて、紡糸工程（１）で使用する紡糸用無機系ゾル溶液に金属イオン含有化合物を添加することができる。また、結合工程（３）が接着用無機系ゾル溶液に由来する無機系接着剤で無機系繊維ウエブを接着する工程である場合、又は結合工程（３）とは別に接着用無機系ゾル溶液に由来する無機系接着剤で接着する工程を含む場合には、金属イオン含有化合物含有溶液付与工程に替えて、又は加えて、接着用無機系ゾル溶液に金属イオン含有化合物を添加することができる。
【００３６】
以下、紡糸工程（１）及び集積工程（２）を実施することのできる静電紡糸装置の一態様を模式的に示す説明図である図１をもとに、不織布（多孔質体）の製造方法を説明する。
【００３７】
図１において、静電紡糸装置１は、繊維の原料となる、無機成分を主体とする化合物を含む紡糸用無機系ゾル溶液を吐出できる紡糸ノズル２と、この紡糸ノズル２の先端下方に配置された繊維回収装置である繊維回収容器３内に配置された捕集部材４とを備えている。さらに、紡糸ノズル２に対向して配置され、吐出されて形成する繊維とは反対極性のイオンを発生できるイオン発生手段であると共に、電気的に繊維を吸引できる対向電極５を備えている。紡糸ノズル２には、紡糸用無機系ゾル溶液を供給できるゾル溶液供給機６が接続されており、紡糸ノズル２及び対向電極５には、それぞれ第１高電圧電源７、第２高電圧電源８が接続されている。また、繊維回収容器３には、繊維を繊維回収容器３に吸引できる吸引機９が設けられている。
【００３８】
紡糸ノズル２としては、内径０．０１〜５ミリ程度の金属又は非金属パイプを使用できる。また、図２に示すように、紡糸用無機系ゾル溶液２１を収容したゾル溶液容器２２中に回転するノコギリ状歯車２０を浸漬させ、対向電極５に向かうノコギリ状歯車２０の先端部２０ａを電極とするエッジ電極を使用することもできる。同様に図３に示すように、ワイヤ２０ｂをローラー２３によってゾル溶液容器２２内を回転させ、紡糸用無機系ゾル溶液２１の付着したコンベア状のワイヤ２０ｂを電極として使用することもできる。なお、図３においては、対向電極（図示しない）は、紙面に対して垂直に配置されている。さらに、従来の種々の静電紡糸用電極を利用することができる。
【００３９】
対向電極５としては、例えば、コロナ放電用ニードル（高電圧印加あるいは接地でもよい）、コロナ放電用ワイヤ（高電圧印加あるいは接地でもよい）、交流放電素子などが使用できる。この交流放電素子として、図４（ａ）（ｂ）に示すような沿面放電素子を使用できる。すなわち図４（ａ）（ｂ）において、沿面放電素子２５は、誘電体基板２６（例えば、アルミナ膜）を挟んで放電電極２７及び誘起電極２８を設け、これらの電極間に交流電源２９によって交流高電圧を印加することにより、放電電極２７部分で沿面放電を起こし、正及び負のイオンを生成させることができる。
【００４０】
紡糸工程（１）では、まず、（１）無機成分を含む化合物を含有する紡糸用無機系ゾル溶液を形成する。
【００４１】
この紡糸用無機系ゾル溶液は、本明細書に記載の製造方法で最終的に得られる無機系繊維を構成する元素を含む化合物を含有する溶液（原料溶液）を、１００℃以下程度の温度で加水分解させ、縮重合させることによって得ることができる。前記原料溶液の溶媒は、例えば、有機溶媒（例えば、アルコール）及び／又は水であることができる。
【００４２】
この化合物を構成する元素は特に限定するものではないが、例えば、リチウム、ベリリウム、ホウ素、炭素、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、ケイ素、リン、硫黄、カリウム、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ルビジウム、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、セシウム、バリウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、又はルテチウムなどを挙げることができる。
【００４３】
前記の化合物としては、例えば前記元素の酸化物を挙げることができ、具体的には、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができる。前記無機成分は、一成分の酸化物から構成されていても、二成分以上の酸化物から構成されていても良い。例えば、ＳｉＯ２−Ａｌ２Ｏ３のニ成分から構成されていても良い。
【００４４】
前記の紡糸用無機系ゾル溶液は、後述する繊維を形成する工程において紡糸が可能となる粘度を有していることが必要である。その粘度は、紡糸可能な粘度である限り特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜１００ポイズ、より好ましくは０．５〜２０ポイズ、特に好ましくは１〜１０ポイズ、最も好ましくは１〜５ポイズである。粘度が１００ポイズを超えると細繊維化が困難となる結果、平均流量孔径が１〜２００μｍの不織布とすることが困難となる傾向があり、０．１ポイズ未満になると繊維形状が得られなくなる傾向があるためである。なお、ノズルを使用する場合には、ノズル先端部分における雰囲気を原料溶液の溶媒と同様の溶媒ガス雰囲気とすることにより、１００ポイズを超える紡糸用無機系ゾル溶液であっても紡糸可能な場合がある。
【００４５】
紡糸工程（１）で用いる紡糸用無機系ゾル溶液は、上述のような無機成分以外に、有機成分を含んでいることができ、この有機成分として、例えば、シランカップリング剤、染料などの有機低分子化合物、ポリメチルメタクリレートなどの有機高分子化合物などを挙げることができる。より具体的には、前記原料溶液に含まれる化合物がシラン系化合物である場合には、メチル基やエポキシ基で有機修飾されたシラン系化合物が縮重合したものを含んでいることができる。
【００４６】
前記原料溶液は、前記原料溶液に含まれる化合物を安定化する溶媒［例えば、有機溶媒（例えば、エタノールなどのアルコール類、ジメチルホルムアミド）又は水］、前記原料溶液に含まれる化合物を加水分解するための水、及び加水分解反応を円滑に進行させる触媒（例えば、塩酸、硝酸など）を含んでいることができる。また、前記原料溶液は、例えば、化合物を安定化させるキレート剤、前記化合物の安定化のためのシランカップリング剤、圧電性などの各種機能を付与することができる化合物、透明性、接着性改善、柔軟性、硬度（もろさ）調整のための有機化合物（例えば、ポリメチルメタクリレート）、ヒドロキシアパタイトなどの細胞親和性のある無機成分、あるいは染料などの添加剤を含んでいることができる。なお、これらの添加剤は、加水分解を行う前、加水分解を行う際、或いは加水分解後に添加することができる。
【００４７】
また、前記原料溶液は、無機系又は有機系の微粒子を含んでいることができる。前記無機系微粒子としては、例えば、酸化チタン、二酸化マンガン、酸化銅、二酸化珪素、活性炭、金属（例えば、白金）を挙げることができ、有機系微粒子として、色素又は顔料などを挙げることができる。また、微粒子の平均粒径は特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１μｍ、より好ましくは０．００２〜０．１μｍである。このような微粒子を含んでいることによって、光学機能、多孔性、細胞親和性、触媒機能、タンパク質吸着機能、或いはイオン交換機能などを付与することができる。更に、前記原料溶液は後述の金属イオン含有化合物を含有していても良い。
【００４８】
テトラエトキシシランの場合、水の量がアルコキシドの４倍（モル比）を超えると曳糸性のゾル溶液を得ることが困難になるため、アルコキシドの４倍以下であるのが好ましい。
【００４９】
なお、触媒として塩基を使用すると、曳糸性のゾル溶液を得ることが困難になるため、塩基を使用しないのが好ましい。
【００５０】
また、反応温度は使用溶媒の沸点未満であれば良いが、低い方が、適度に反応速度が遅く、曳糸性のゾル溶液を形成しやすい。あまり低すぎても反応が進行しにくいため、１０℃以上であるのが好ましい。
【００５１】
前述のような静電紡糸装置１による無機系繊維ウエブの形成［すなわち、紡糸工程（１）及び集積工程（２）］は、次のように行われる。
【００５２】
まず、紡糸する繊維の原料となる紡糸用無機系ゾル溶液をゾル溶液供給機６から紡糸ノズル２に供給する。次に、紡糸ノズル２及び対向電極５間に高電圧を印加した状態で、紡糸ノズル２の先端から紡糸用無機系ゾル溶液を吐出する。すると、帯電した液状のゾル溶液はその溶媒が揮発し、凝固してゲル状の無機系繊維となり対向電極５に向かって飛翔する［以上、紡糸工程（１）］。このとき、紡糸ノズル２に対向して配置された対向電極５から、繊維に向かってイオン５ａが照射される。このイオンによって繊維の帯電が中和され、静電気力による飛翔力を失い、重力、微風、及び／又は吸引機９の作用により、繊維は繊維回収容器３の方向へ飛翔し、繊維回収容器３内の捕集部材３の上に集積する。従って、低密度で綿状の無機系繊維ウエブを得ることができる［以上、集積工程（２）］。
【００５３】
なお、イオンの発生及び照射は、連続的に又は不連続的に行うことができる。また、紡糸ノズル２と対向電極５との間に電界が生じれば良く、いずれか一方のみに高電圧を印加し、他方を接地しても良い。また、紡糸ノズル２は加熱されていても、加熱されていなくても良い。
【００５４】
図５は、紡糸工程（１）及び集積工程（２）を実施することのできる静電紡糸装置の別の態様を模式的に示す説明図である。
【００５５】
図５において、静電紡糸装置１Ａは、図１におけるイオンを発生できると共に、繊維を吸引できる対向電極５に替えて、電離放射線を照射できる電離放射線源１０と、繊維を吸引できるネット状の対向電極５（第３高電圧電源１１に接続されている）を用いること以外は、図１における静電紡糸装置１と同様の構成であるため、重複する説明は割愛する。
【００５６】
静電紡糸装置１Ａにおいて、第１高電圧電源７及び／又は第３高電圧電源１１により所定の電圧を紡糸ノズル２及び／又は対向電極５に印加することにより、紡糸ノズル２と対向電極５との間に電位差が生じ、繊維は電気的に吸引されて、対向電極５に向かって飛翔する［以上、紡糸工程（１）］。この飛翔する繊維に対して、電離放射線源１０から電離放射線１０ａを照射し、気体をイオン化する。このイオンによって、繊維の帯電が中和され、静電気力による飛翔力を失い、重力、微風及び／又は吸引機９の作用により、繊維が繊維回収容器３に向かって飛翔し、捕集部材４の上に集積する。従って、低密度で綿状の無機系繊維ウエブを得ることができる［以上、集積工程（２）］。電離放射線源１０を使用した場合には、その線量を紡糸ノズル２と対向電極５との間の電位差の形成とは独立して調節できるため、安定して無機系繊維ウエブを得ることができる。
【００５７】
なお、電離放射線源１０としては種々の放射線源を使用することができ、特にＸ線照射装置が望ましい。なお、対向電極５は紡糸ノズル２との間に電位差が生じれば良く、接地されていても、電圧が印加されていても良い。また、電離放射線源１０は、繊維に対して放射線を照射できれば良く、対向電極５の背後に位置している必要はない。さらに、対向電極５はネット状である必要はなく、電離放射線が透過できれば種々の部材を使用することができ、蒸着フィルムであっても使用できる。
【００５８】
図６は、紡糸工程（１）及び集積工程（２）を実施することのできる静電紡糸装置の更に別の態様を模式的に示す説明図である。
【００５９】
図６において、静電紡糸装置１Ｂは、第１紡糸ノズル２ａと第２紡糸ノズル２ｂとが、互いに対向して配置されている。第１紡糸ノズル２ａには、紡糸用無機系ゾル溶液を供給できる第１ゾル溶液供給機６ａ及び高電圧を印加できる第１高電圧電源７が接続され、第２紡糸ノズル２ｂには、紡糸用無機系ゾル溶液を供給できる第２ゾル溶液供給機６ｂ及び第１高電圧電源７とは反対極性の高電圧を印加できる第２高電圧電源８がそれぞれ接続されている。その他は、静電紡糸装置１と同様な構成であるため、重複する説明は割愛する。
【００６０】
静電紡糸装置１Ｂにおいて、第１高電圧電源７及び第２高電圧電源８により互いに反対極性の電圧を、それぞれ第１紡糸ノズル２ａ、第２紡糸ノズル２ｂに印加しながら、第１紡糸ノズル２ａ及び第２紡糸ノズル２ｂから紡糸用無機系ゾル溶液を吐出する［以上、紡糸工程（１）］。すると、互いに反対極性に帯電した繊維は、対向して吐出されることにより接触及び接近して電荷が中和され、静電気力による飛翔力を失い、重力、微風及び／又は吸引機９の作用により、繊維は繊維回収容器３に向かって飛翔し、捕集部材４の上に集積する。従って、低密度で綿状の無機系繊維ウエブを得ることができる［以上、集積工程（２）］。なお、第１紡糸ノズル２ａからのゾル溶液吐出条件と、第２紡糸ノズル２ｂからのゾル溶液吐出条件とが異なるように調整することにより、繊維径が異なる、繊維構成材の組成が異なるなど、異種の無機系繊維が混在する無機系繊維ウエブを製造できる。
【００６１】
なお、第１紡糸ノズル２ａ及び第２紡糸ノズル２ｂからの紡糸用無機系ゾル溶液の吐出は、連続的に又は不連続的に行うことができる。また、第１紡糸ノズル２ａと第２紡糸ノズル２ｂとの間に電界が生じれば良く、これらのいずれか一方のみに高電圧を印加し、他方を接地しても良い。また、第１紡糸ノズル２ａ及び第２紡糸ノズル２ｂは加熱されていても、加熱されていなくても良い。
【００６２】
上述した静電紡糸装置１、静電紡糸装置１Ａ、静電紡糸装置１Ｂにおいては、１つの紡糸ノズル２、２ａ、２ｂに対して１本の紡糸ノズルを使用した態様であるが、紡糸ノズルは１本である必要はなく、生産性を高めるために、２本以上の紡糸ノズルを備えていることができる。
【００６３】
また、これらの静電紡糸装置においては、紡糸空間における空気の速度を５〜１００ｃｍ／秒、好ましくは１０〜５０ｃｍ／秒とすることができるように、捕集部材４の下方に吸引機９を設けているが、吸引機９に加えて、又はこれに替えて、送風装置を捕集部材４の上方に設けることができる。これによって、繊維の捕集性を向上させ、安定して無機系繊維ウエブを製造することができる。
【００６４】
集積工程（２）で得られた無機系繊維ウエブは、そのままの状態で次の結合工程（３）に供給することができるし、熱処理した後に、次の結合工程（３）に供給することもできる。この熱処理（以下、後述の「接着用熱処理」と区別する必要がある場合、「集積後熱処理」と称することがある）を実施することにより、繊維同士を接着することができるため、保形性に優れ、細胞培養時に変形しにくい多孔質体を製造することができる。
【００６５】
この集積後熱処理は、例えば、オーブン、焼結炉等を用いて実施することができ、その温度は無機系繊維ウエブを構成する無機成分によって適宜設定する。一般的に、この集積後熱処理温度は２００℃以上であるのが好ましく、３００℃以上であるのが好ましい。このような温度で集積後熱処理をすると、無機系繊維ウエブの構造が安定化及び強度が増す、つまり、繊維同士がその交点で点状に接着するため、次の結合工程等の際に、無機系繊維ウエブの形態を維持することができる。
【００６６】
なお、無機系繊維が水酸基を有する場合、５００℃以下の温度で集積後熱処理を実施すると、繊維単位重量あたりの水酸基量を５０μｍｏｌ／ｇ以上とすることができ、不織布の親水性を高めることができるため、スフェロイド形態の細胞を培養しやすい。一方で、集積後熱処理の温度を５００℃よりも高くすることによって、疎水性を高めることができるため、細胞の接着性を高めることができ、連続した三次元模擬組織であるように細胞を培養しやすい。また、無機系繊維同士の接着力が高まるため、無機系繊維ウエブの強度を高めることができる。
【００６７】
集積工程（２）で得られた無機系繊維ウエブは、そのままの状態で結合工程（３）に供給することができるし、前述のように集積後熱処理した後に、結合工程（３）に供給することもできる。この結合工程（３）としては、例えば、部分的に融着加工する工程や接着剤により接着する工程を挙げることができる。
【００６８】
部分的に融着加工すると、無機系繊維ウエブの嵩高さを損なうことなく、保形性に優れた不織布とすることができる。また、部分的に融着加工することによって、無機系繊維の離脱も防ぐことができる。
【００６９】
この部分的に融着した部分はドット状又はライン状であることができ、前者のドット状である場合、その形状は、例えば、長方形などの矩形、円形、楕円形、長円形などの丸形、又はこれらの組合せであることができ、後者のライン状である場合、直線、曲線又はこれらの組合せであることができる。特に、無機系繊維ウエブの外縁をライン状又はドット状に融着すると、不織布の保形性に優れるため好適である。
【００７０】
このように外縁を融着加工する場合、保形性に優れているように、外縁部における不織布の厚さ方向における内部においても、無機系繊維が融着するように、融着加工するのが好ましい。具体的には、外縁部における不織布の厚さ方向における断面の電子顕微鏡写真において、粒状の塊（融着部）の占める面積が、不織布の断面積の５％以上となるように、好ましくは１０％以上となるように、更に好ましくは１５％以上となるように、更に好ましくは２０％以上となるように、融着加工を行うのが好ましい。なお、前記粒状の塊（融着部）の占める面積が５％未満であっても、融着部の数が５ヶ所以上であるように融着加工を実施すれば、保形性に優れる不織布を製造できる。
【００７１】
なお、後述のような無機系接着剤で接着しない場合には、無機系繊維ウエブの外縁をライン状又はドット状に融着加工するとともに、無機系繊維ウエブの主面における、融着加工した外縁よりも内側においても、ドット状又はライン状に部分的に融着して、保形性を高めるのが好ましい。このように、無機系繊維ウエブの主面における、融着加工した外縁よりも内側においても融着加工する場合、保形性に優れるように、主面における融着加工した外縁よりも内側における融着総面積が、主面における融着した外縁に囲まれた面積の５％以上を占めるように融着加工を実施するのが好ましく、１０％以上を占めるように融着加工するのがより好ましい。なお、主面における融着した外縁に囲まれた領域における融着部が１点以上であるように融着加工するのが好ましく、５点以上であるように融着加工するのがより好ましい。また、主面における融着した外縁に囲まれた領域に２点以上融着加工する場合、任意に設定した箇所に融着加工することができるが、融着部が分散するように融着加工すると、保形性の点で優れている。
【００７２】
このように、無機系繊維ウエブを部分的に融着する方法としては、例えば、集光した光やレーザーを照射する方法、ガスバーナーを使用する方法、放電を使用する方法、電子ビームを使用する方法、などを挙げることができる。これらの中でもレーザーによる方法は、熱源が広範囲に広がらず、所望箇所のみを融着させるのが容易で、また、非接触であることから小さい歪で融着させることができるため、嵩高性を損なうことがなく、更には、瞬時に伝送・投下が可能な熱源であるため、好適である。
【００７３】
結合工程（３）としては、上述のような部分的に融着加工する工程に替えて、又は加えて、接着剤により接着する工程を実施することができる。なお、部分的に融着加工する工程と接着剤により接着する工程の両方を実施する場合には、どのような順序で行っても構わない。なお、接着剤により接着する工程は、無機成分を主体とする化合物を含む接着用無機系ゾル溶液に由来する無機系接着剤で、無機系繊維ウエブを接着するのが好ましい。不織布が変形しにくく、無機系繊維の離脱防止性に優れているためである。
【００７４】
この接着工程は無機系繊維ウエブの表面のみなど一部のみを接着しても良いが、変形しにくく、繊維の離脱防止性を高める意味では、無機系繊維ウエブの内部を含む全体を無機系接着剤で接着するのが好ましい。なお、無機系繊維ウエブの全体を無機系接着剤で接着する際に嵩が潰れてしまわないように、接着用無機系ゾル溶液を付与した後の余剰の接着用無機系ゾル溶液は、通気により除去するのが好ましい。
【００７５】
この接着用無機系ゾル溶液を構成する化合物としては、無機系繊維を構成する元素を含む化合物と同様のものを使用できるが、無機系繊維ウエブを接着できる限り、紡糸用無機系ゾル溶液と同じであっても異なっていてもよい。例えば、接着用無機系ゾル溶液は曳糸性である必要はなく、曳糸性がなくてもよい。また、有機粒子又は無機粒子が含まれていてもよい。更に、紡糸用無機系ゾル溶液を希釈したものであってもよく、濃度は適宜選択することができる。特には、金属アルコキシド加水分解縮合物であるのが好ましい。更に、接着用無機系ゾル溶液は金属イオン含有化合物を含有していても良い。
【００７６】
この接着用無機系ゾル溶液の無機系繊維ウエブへの付与は無機系繊維ウエブに付与できる限り、特に限定するものではないが、その全体に均一に、すなわち、無機系繊維ウエブの外側部分と同様に、内部まで接着用無機系ゾル溶液を到達させ、付与できるように、例えば、無機系繊維ウエブを接着用無機系ゾル溶液に浸漬することにより、付与するのが好ましい。なお、集積工程（２）の後に、無機系繊維ウエブの集積後熱処理を実施した場合には、接着用無機系ゾル溶液に浸漬しても無機系繊維がばらけにくいため、接着用無機系ゾル溶液に浸漬する場合には集積後熱処理を実施するのが好ましい。
【００７７】
このように、無機系繊維ウエブを接着用無機系ゾル溶液に浸漬した場合には、無機系繊維ウエブに含まれる余剰の接着用無機系ゾル溶液を、通気により除去するのが好ましい。無機系繊維ウエブは、無機系繊維から構成されているため、吸引及び／又は加圧により通気させて余剰の接着用無機系ゾル溶液を除去しても、厚さを潰すことがなく、また、繊維間に被膜を形成することなく、無機系接着剤で接着することができる。
【００７８】
無機系繊維ウエブを無機系接着剤で接着する場合、接着用無機系ゾル溶液を無機系繊維ウエブに付与した後に、室温で自然乾燥するか、熱処理（「接着用熱処理」ということがある）をして接着することができる。接着用熱処理する場合、接着用無機系ゾル溶液に含まれる溶媒などを揮発させることができれば良く、例えば、８０〜１５０℃の温度で１０〜３０分間保持することにより実施することができる。
【００７９】
なお、この接着用熱処理においては、接着用無機系ゾル溶液に含まれる溶媒などを揮発させた後に、所望により、接着用無機系ゾル溶液及び／又は無機系繊維を無機化するために、焼成処理を行なうことができる。この焼成処理を実施することにより、接着用無機系ゾル溶液を無機化した場合には、無機系繊維ウエブの繊維交点を接着した無機系接着剤の強度が向上し、無機系繊維を無機化した場合には、無機系繊維の強度が向上し、より変形しにくくなる。
【００８０】
この焼成処理は、例えば、焼結炉やオーブンを用いて実施することができ、その温度は無機系接着剤又は無機系繊維を構成する無機成分によって適宜設定する。一般的に焼成温度は２００℃以上であることが好ましく、より好ましくは３００℃以上である。なお、焼成をする場合には、無機系繊維間に被膜を形成することなく、また、空隙率を下げることのないように、無荷重で焼成を実施するのが好ましい。
【００８１】
なお、無機系繊維が水酸基を有する場合、５００℃以下の温度で接着用熱処理（焼成処理を含む）を実施することによって、繊維単位重量あたりの水酸基量を５０μｍｏｌ／ｇ以上とすることができ、親水性が向上し、スフェロイド形態の細胞を培養しやすい。一方で、接着用熱処理温度（焼成処理を含む）の温度を５００℃よりも高くすることによって、疎水性を高めることができるため、細胞の接着性を高めることができ、連続した三次元模擬組織であるように細胞を培養しやすい。また、無機系繊維同士の接着力が高まるため、不織布の強度を高めることができる。
【００８２】
本発明においては、紡糸工程（１）、集積工程（２）及び結合工程（３）に加えて、金属イオン含有化合物含有溶液を不織布に付与し、機能性を不織布に付与することができる。
【００８３】
この金属イオン含有化合物を構成する金属として、例えば、カルシウム、ナトリウム、鉄、マグネシウム、カリウム、銅、ヨウ素、セレン、クロム、亜鉛、又はモリブデンなどを挙げることができる。これらの金属は細胞機能誘導因子である。
【００８４】
この金属イオン含有化合物は、例えば、金属塩であることができ、金属塩としては、例えば、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、炭酸塩、リン酸水素塩、炭酸水素塩、硝酸塩、水酸化物などを挙げることができる。特に、カルシウムイオン含有塩、マグネシウムイオン含有塩、アパタイト（りん灰石）を付与すると、細胞機能を高めた細胞培養を行うことができる。
【００８５】
この金属イオン含有化合物の付与方法としては、例えば、金属イオン含有化合物含有溶液中に不織布を浸漬する方法、金属イオン含有化合物含有溶液を不織布に塗布又はスプレーする方法などを挙げることができる。無機系繊維がシリカ繊維の場合、金属イオン含有化合物含有溶液に浸漬、金属イオン含有化合物含有溶液を塗布又はスプレーした後、熱処理（焼成処理）を行い、金属イオン含有化合物を高濃度で付与するのが好ましい。
【００８６】
より具体的には、カルシウムイオン含有塩又はマグネシウムイオン含有塩を付与した不織布は、例えば、カルシウム塩又はマグネシウム塩を適当な溶媒（例えば、低級アルコール）に溶解した溶液に、不織布を浸漬することにより、あるいは、前記溶液を塗布又はスプレーすることにより得ることができる。
【００８７】
また、アパタイトを付与した不織布は、例えば、シリカ繊維のように、表面に水酸基を含む無機系繊維を、少なくともリン酸イオンとカルシウムイオンを含む人工体液中に浸漬させることにより、無機系繊維上にアパタイトを析出させることができる。無機系繊維がシリカ繊維の場合（特に、骨培養基材用繊維構造体とする場合）には、集積後熱処理を行なわないか、集積後熱処理を行う場合には、無機系繊維ウエブを５００℃以下（好ましくは１２０〜３００℃）の温度で集積後熱処理することによって、繊維単位重量あたりの水酸基量を５０μｍｏｌ／ｇ以上とすることができ、好ましくは１００μｍｏｌ／ｇ以上とすることができる。また、接着用無機系ゾル溶液を付与した後の接着用熱処理（乾燥及び／又は焼成）においても、上記集積後熱処理と同様の温度範囲で行い、繊維単位重量あたりの水酸基量を５０μｍｏｌ／ｇ以上（より好ましくは１００μｍｏｌ／ｇ以上）とするのが好ましい。
【００８８】
なお、本発明においては、金属イオン含有化合物を付与することに替えて、又は付与することに加えて、不織布にコラーゲン、ラミニンなどの細胞接着性を補助するタンパク質を付与することもできる。
【００８９】
以上は、無機系繊維からなる不織布形態の多孔質体の製造方法であるが、無機系繊維ウエブである必要はなく、有機系繊維ウエブであっても良いし、無機系繊維と有機系繊維とが混在する混在繊維ウエブであっても良い。また、繊維の紡糸方法は、静電紡糸法により紡糸する必要はなく、特開２００９−２８７１３８号公報に開示されているような、液吐出部から吐出された紡糸液に対して、ガスおよび随伴気流による剪断力が１本の直線状となるように作用させる方法により紡糸しても良い。
【００９０】
本発明の細胞培養担体は上述のような多孔質体に、細胞培養した細胞層を二層以上有する状態のまま、凍結した状態にある。前述の通り、細胞培養担体を構成する多孔質体は平均流量孔径が１〜２００μｍであるため、細胞の保持性に優れており、また、多孔質体に細胞培養した細胞層は二層以上有する三次元模擬組織の、高密度状態にあるため、この状態で凍結した本発明の細胞培養担体の細胞層も三次元模擬組織の高密度状態にある。そのため、解凍後における細胞の生理活性の回復が早い。また、細胞培養担体は凍結した状態にあるため、所望時期に解凍し、連続した三次元模擬組織に培養された細胞を利用することができる。
【００９１】
本発明の細胞培養担体に使用できる細胞は特に限定されるものではないが、例えば、各種不死化細胞株、小型肝細胞などの正常細胞などのin vitroで増殖能を有する細胞であることができる。また、間葉系幹細胞、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であっても良い。更に、細胞種は一種類である必要はなく、目的の擬似生体組織を構成する上で必要な細胞種の複数種類から構成されていることもある。
【００９２】
また、細胞培養する際の播種濃度は細胞種によって異なり、細胞層を二層以上有する三次元模擬組織を形成できる播種濃度を実験的に適宜設定する。例えば、細胞種がヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２である場合には、多孔質体の培養上面の面積に対して、２×１０５〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２ の濃度で播種するのが好ましい。また、細胞培養は、例えば、多孔質体を培養皿等に入れ、培地に懸濁した細胞を静かに播種し、適宜（例えば、毎日）、培地交換を行うことによって実施できる。例えば、倍加増殖時間が２４〜４８時間程度の細胞を上記濃度で播種した場合、一週間程度で３層程度の三次元模擬組織を有する細胞層を形成することができる。
【００９３】
本発明の細胞培養担体は細胞培養した細胞層を二層以上有する、三次元模擬組織であるように細胞培養した状態の高密度状態で凍結した状態にあるが、細胞層が多いほど、より三次元模擬組織であるため、細胞層を三層以上有するのが好ましい。なお、過度に多層であると、細胞層の内部における細胞に、酸素などの生存に必要な物質が行き渡らなくなる恐れがあるため、細胞種ごとに、適宜実験で確認する。つまり、凍結前の細胞培養担体、つまり多孔質体に二層以上の細胞層を培養した後、細胞層の単離が可能な場合には、トリパンブルー染色法による生細胞数をカウントすることにより、また、凍結前の細胞培養担体から細胞層の単離が不可能な場合には、ＭＴＴ法やＲＮＡ抽出量から生細胞数を間接的に予測することにより、培養した細胞層が増殖期であることを確認することによって、必要物質が行き渡っていることを確認できる。
【００９４】
本発明の細胞培養担体は細胞層を二層以上有する状態のまま、凍結した状態にあるが、凍結する前に、氷結晶の成長を抑制する添加物を含む凍結用培地に置換するのが好ましい。細胞培養時の培地のまま凍結すると、細胞内部に氷の結晶が成長して細胞を破壊するためである。このような凍結用培地としては、例えば、１０％（体積比）ジメチルスルホキシドを含むウシ胎児血清を挙げることができる。なお、凍結は従来から公知の方法により実施することができ、容器に収納した後、プログラムフリーザー等のフリーザー及び／又は液体窒素で凍結する方法を例示することができる。
【００９５】
このような本発明の細胞培養担体は、解凍した後に、更に細胞培養を行った後、培養評価に使用することができる。このように、本発明によれば、所望時期に、連続した三次元模擬組織である培養された細胞を利用することができる。
【００９６】
なお、解凍は従来から公知の方法により実施することができる。例えば、インキュベーターやウォーターバスにより解凍することができる。なお、解凍後の細胞培養は、通常の培地で置換した後に行うのが好ましい。また、培地は凍結前の培地と同じであっても良いし、異なっていても良い。更に、凍結操作に弱い、あるいは、増殖能を持たない初代細胞など共培養する場合には、解凍後に、再度、細胞の播種を行っても良い。更に、解凍後の培地交換時期は特に限定するものではないが、例えば、培地に含まれるｐＨ指示薬の色が酸性側に傾き始めたら交換するのが好ましい。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明の細胞培養担体について具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、繊維単位重量あたりの水酸基量は多孔質体の水酸基量を水酸基量測定に用いた多孔質体の繊維量（単位：ｇ）で除した商であり、水酸基量は中和滴定法を用いて定量した値である。つまり、多孔質体を２０ｖｏｌ％の塩化ナトリウム水溶液５０ｍＬ中に分散させた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を中和点まで滴下し、中和に必要な水酸化ナトリウム滴下量から、多孔質体の水酸基量を決定した（参考文献参照）。
（参考文献）
George W S.,Determination of Specific Surface Area of Colloidal Silica by Titration with Sodium Hydroxide,Anal.Cheam.;28,1981-1983,(1956)
【００９８】
（実施例１）
紡糸工程（１）及び集積工程（２）
金属化合物としてのテトラエトキシシラン、溶媒としてのエタノール、加水分解のための水、及び触媒として１規定の塩酸を、１：５：２：０．００３のモル比で混合し、温度７８℃で１０時間の還流操作を行い、次いで、溶媒をロータリーエバポレーターにより除去して濃縮した後、温度６０℃に加熱して、粘度が２ポイズのゾル溶液を形成した。得られたゾル溶液を紡糸用無機系ゾル溶液として用い、中和紡糸法によりゲル状シリカ繊維ウエブを作製した。
【００９９】
なお、中和紡糸法は、特開２００５−２６４３７４号公報の実施例８と同じ紡糸条件で実施した。つまり、図１の対向電極５として、図４の対向電極（沿面放電素子２５）を紡糸容器室内に収納した紡糸装置を使用し、次の条件で紡糸した。
【０１００】
紡糸ノズル：内径０．４ｍｍの金属製注射針（先端カット）
紡糸ノズルと対向電極との距離：２００ｍｍ
対向電極及びイオン発生電極（両電極を兼ねる）：ステンレス板（誘起電極）上に厚さ１ｍｍのアルミナ膜（誘電体基板）を溶射し、その上に直径３０μｍのタングステンワイヤ（放電電極）を１０ｍｍの等間隔で張った沿面放電素子（タングステンワイヤ面を紡糸ノズルと対向させると共に接地し、ステンレス板とタングステンワイヤ間に交流高電圧電源により５０Ｈｚの交流高電圧を印加）
第１高電圧電源：−１６ｋＶ
第２高電圧電源：±５ｋＶ（交流沿面のピーク電圧：５ｋＶ、５０Ｈｚ）
気流：水平方向（紙面上、左から右方向）２５ｃｍ／ｓｅｃ、鉛直方向（紙面上、捕集部材４の上から下方向）１５ｃｍ／ｓｅｃ
紡糸容器内の雰囲気：温度２５℃、湿度４０％ＲＨ以下
連続紡糸時間：３０分以上
【０１０１】
集積後熱処理
次に、前記工程で得られたゲル状シリカ繊維ウエブを、８００℃で３時間の集積後熱処理をすることにより、乾燥シリカ繊維ウエブ（目付：８ｇ／ｍ２）を作製した。
【０１０２】
接着用無機系ゾル溶液付与工程
繊維間接着のために用いる接着用無機系ゾル溶液として、金属化合物としてテトラエトキシシラン、溶媒としてエタノール、加水分解のための水、及び触媒として硝酸を、１：７．２：７：０．００３９のモル比で混合し、温度２５℃、攪拌条件３００ｒｐｍで１５時間反応させた。反応後、酸化ケイ素の固形分濃度が０．２５％となるようにエタノールで希釈し、シリカゾル希薄溶液（接着用無機系ゾル溶液）とした。
【０１０３】
次いで、乾燥シリカ繊維ウエブを前記シリカゾル希薄溶液に浸漬した後、吸引により余剰のシリカゾル希薄溶液を除去することにより、シリカゾル希薄溶液含有シリカ繊維ウエブを作製した。
【０１０４】
接着用熱処理工程
次いで、シリカゾル希薄溶液に含まれる溶媒を除去し、繊維交点の接着のために、シリカゾル希薄溶液含有シリカ繊維ウエブを無荷重下、５００℃で３時間焼成（接着用熱処理）して、内部を含む全体をシリカで接着したシリカ繊維不織布を作製した。
【０１０５】
融着工程
次いで、前記シリカ繊維不織布に対して、パルス状炭酸ガスレーザー（波長：１０．６μｍ、出力：３Ｗ、レーザー径：１２７μｍ、レーザー照射数：１０００パルス／インチ）を走査速度２ｃｍ／ｓｅｃで照射し、１ｃｍ角の大きさとなるように融着するとともに切断して、外縁をライン状（連続した直線状）に融着したシリカ繊維融着不織布（目付：８ｇ／ｍ２、厚さ：０．１５ｍｍ、空隙率：９５％、平均流量孔径：７μｍ、水酸基量：５０μｍｏｌ／ｇ）を作製した。
【０１０６】
このシリカ繊維融着不織布（＝多孔質体、シリカの比重＝２ｇ／ｃｍ３）を構成するシリカ繊維の平均繊維径は１μｍであり、多孔質体の融着部を含む厚さ方向断面の電子顕微鏡写真において、粒状の塊（融着部）の占める面積が、多孔質体の断面積の２３．６％を占めていた。
【０１０７】
培養工程
このシリカ繊維融着不織布を用いて７日間、細胞培養を行い、３０μｍ程度（３層以上）の細胞層を有する三次元模擬組織を形成した。なお、培養前の多孔質体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）、培養７日目における多孔質体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）、及び培養７日目における多孔質体断面の電子顕微鏡写真（４００倍）を、それぞれ図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示す。なお、図７（ｃ）において、矢印で示す範囲が細胞層である。また、培養条件は次の通りである。
【０１０８】
（培養条件）
ＨｅｐＧ２細胞（ATCC：HB-0865、参考文献：Knowles BB, et al., Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen., Science 209:497-499,1980.PubMed:6248960）の培養を、Williams’s Medium E（購入会社名：シグマ社）に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、抗生物質（６０μｇ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）を添加した培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて実施した。培養環境としては、２４ウェルプレートの各ウェル内に、シリカ繊維融着不織布（１ｃｍ×１ｃｍ）を載置し、ＨｅｐＧ２細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）１ｍＬを播種し、１日毎に培地交換を行った。
【０１０９】
細胞培養担体の調製
前記細胞培養後のシリカ繊維融着不織布の培地を、細胞凍結用試薬［ウシ胎児血清：ジメチルスルホキシド＝９：１（体積比）］で置換し、この細胞凍結用試薬を含有する状態のままバイアルに封入した後、−８０℃のディープフリーザーで１週間凍結し、本発明の細胞培養担体を得た。
【０１１０】
細胞培養担体の使用
前記細胞培養担体を３７℃に設定したウォーターバスにより解凍した後、担体をバイアルから市販の２４ウェルプレートに移し、細胞凍結用試薬を前記凍結前と同じ培地１ｍｌで穏やかに３回置換した。その後、培地交換を行わなかったこと以外は前記凍結前と同じ操作で４日間の細胞培養を行った。
【０１１１】
なお、解凍１日後に、細胞培養担体を凍結乾燥した後に撮影した細胞培養担体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）、解凍１日後に、細胞培養担体を凍結乾燥した後に撮影した細胞培養担体断面の電子顕微鏡写真（１０００倍）、解凍４日後に、細胞培養担体を凍結乾燥した後に撮影した細胞培養担体表面の電子顕微鏡写真（３００倍）、解凍４日後に、細胞培養担体を凍結乾燥した後に撮影した細胞培養担体断面の電子顕微鏡写真（１０００倍）を、それぞれ図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）として示す。なお、図８（ｂ）（ｄ）において、矢印で示す範囲が細胞層である。
【０１１２】
（比較例１）：浮遊状態での凍結方法；
市販の培養皿を用いて、実施例１と同じ培地で培養したＨｅｐＧ２細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解させた０．１ｗ／ｖ％トリプシン−１．０６ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液で剥離した後、１．２×１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるように、実施例１と同じ細胞凍結用試薬に懸濁させた。この細胞懸濁液を１ｍＬ／ｖｉａｌになるように凍結用チューブに封入し、一週間、−８０℃ディープフリーザーで凍結させた。
【０１１３】
一週間後、３７℃に設定したウォーターバスにより解凍した後、１ｍＬの細胞懸濁液に対して、細胞凍結用試薬を前記凍結前と同じ培地１０ｍＬで置換した。その後、前記凍結前と同じ培地５ｍＬに細胞を再懸濁させ、市販の直径６ｃｍの培養皿に播種して、通常の平面培養を４日間行った。
【０１１４】
なお、解凍１日後の光学顕微鏡写真（１００倍）、解凍４日後の光学顕微鏡写真（１００倍）を順に、図９（ａ）、（ｂ）として示す。
【０１１５】
（比較例２）：２４ウェルプレート底面に細胞を固定化したまま凍結する方法；
市販の２４ウェルプレートに、細胞密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＨｅｐＧ２を播種し、実施例１と同じ培地で一晩接着させた。
【０１１６】
次の日、培地を除去し、実施例１と同じ細胞凍結用試薬３００μＬを各ウェルに添加し、プレートをビニールテープで封入した後、一週間、−８０℃のディープフリーザーで保存した。
【０１１７】
一週間後、３７℃に設定したウォーターバスにプレートを浮かべて解凍した後、実施例１と同じ培地１ｍＬで穏やかに３回置換した。その後、前記凍結前と同じ操作で４日間の細胞培養を行った。
【０１１８】
なお、解凍１日後の光学顕微鏡写真（１００倍）、解凍４日後の光学顕微鏡写真（１００倍）を順に、図１０（ａ）、（ｂ）として示す。
【０１１９】
（生理活性の評価）
実施例１及び比較例１の場合、凍結前に、市販キット（Roche Applied Science, High Pure RNA Isolation Kit）を用いて、ＲＮＡを抽出した。また、解凍し、培養４日後に、同様にＲＮＡを抽出した。
【０１２０】
これら抽出したＲＮＡから市販キット（Roche Applied Science,Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）を内在性コントロールとし、ＡＬＢ（アルブミン、肝臓が特異的に産生する血清タンパク質）の肝機能マーカーの発現を、リアルタイムＰＣＲ（Roche Applied Science, LightCycler（登録商標）nano）で観察した。
【０１２１】
なお、リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎプローブ法で実施した（Roche Applied Science,FastStart Essential DNA Probes Master）。また、ＧＡＰＤＨ遺伝子、及びＡＬＢ遺伝子検出用のプライマーとプローブは次の通りである。
【０１２２】
ＧＡＰＤＨ  ；
プライマー配列：５´ａｇｃｃａｃａｔｃｇｃｔｃａｇａｃａｃ３´、  ５´ｇｃｃｃａａｔａｃｇａｃｃａａａｔｃｃ３´
プローブ：＃６０（Roche Applied Science,Universal ProbeLibrary） 
ＡＬＢ；
プライマー配列：５´：ｇｔｇａｇｇｔｔｇｃｔｃａｔｃｇｇｔｔｔ３´、５´ｇａｇｃａａａｇｇｃａａｔｃａａｃａｃｃ３´
プローブ：＃７（Roche Applied Science,Universal ProbeLibrary）
【０１２３】
凍結前の細胞の発現量をそれぞれ１とした時の、解凍し、培養４日後の細胞のＡＬＢ発現量の割合で比較した。これらの結果は図１１に示す通りであった。
【０１２４】
（考察）
本発明の多孔質体を用いて７日間培養したＨｅｐＧ２細胞は、多孔質体の播種面側で隙間無く増殖し、３０μｍほどの厚みのある細胞層を形成していた（図７（ｃ））。ＨｅｐＧ２細胞１つの大きさは直径約１０μｍであるので、形成された細胞層は少なくとも３層以上の細胞からなる三次元模擬組織を有すると考えられた。
【０１２５】
なお、凍結保存から解凍した直後の細胞は、細胞が再び生理活性を取り戻すまでに、一時的な接着性低下が見られることが知られているが、本発明の細胞培養担体を解凍した場合（実施例１）、培養担体表面では多少の細胞の脱離が見られるものの、培養担体内部に、均一に細胞が残存しており、細胞同士の三次元的な接着は保たれていた（図８（ａ）、（ｂ））。また、培養４日後には、細胞同士の接着がさらに増強し、凍結前の状態に回復した（図８（ｃ）、（ｄ））。
【０１２６】
実施例１の結果から、解凍後の接着力の低下した細胞を安定的に保持するには、細胞を保持しやすい孔径と、その孔径を維持できる保形性の高い無機成分を含むという本発明の多孔質体の構造的な特徴が大きく寄与していると考えられた。
【０１２７】
一方、浮遊状態で細胞を凍結保存する一般的な手法を実施した比較例１では、解凍し、培養１日後に、細胞と培養皿との間に弱い接着が起こり（図９（ａ））、培養４日後には細胞が増殖して培養皿面を覆いつくした（図９（ｂ））。
【０１２８】
また、通常の平面培養状態で細胞を凍結・解凍した比較例２の場合には、細胞凍結用試薬の除去の際に、細胞が殆ど剥離してしまい、残った細胞はわずかであった（図１０（ａ））。また、このように解凍後の細胞密度が低かったことから、これらの細胞は培養４日後に接着性を取り戻すことなく死んでしまった（図１０（ｂ））。
【０１２９】
このように、実施例１と比較例１では、解凍後、培養４日ほどで凍結前の状態への形態的な回復がみられた。そのため、実施例１と比較例１における、細胞の機能的な回復を比較したところ、肝機能マーカーであるＡＬＢの発現量は、本発明の細胞培養担体である実施例１の方が凍結前の水準に早く回復していた（図１１）。これは、本発明の細胞培養担体を構成する多孔質体が、解凍した細胞を生体組織に模倣した三次元培養状態に維持できたことにより、生理活性の回復が促進されたためであると考えられた。
【０１３０】
以上のように、本発明の細胞培養担体を構成する多孔質体は、培養細胞を、生体組織を模倣した三次元培養状態で保存することを可能にし、その結果、解凍した細胞の早期の生理活性の回復を促進したと考えられた。これらの効果は、本発明の細胞培養担体を構成する多孔質体の細胞を保持し易い孔径と、その孔径を維持できる剛性の高い無機成分を含んでいることによって発揮されたものであると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明の細胞培養担体の使用方法は、細胞の凍結保存の効率化や動物実験の代替法として、医療や創薬研究における細胞評価の分野に大きく寄与することが期待される。
【符号の説明】
【０１３２】
１、１Ａ、１Ｂ  静電紡糸装置
２  紡糸ノズル
２ａ  第１紡糸ノズル
２ｂ  第２紡糸ノズル
３  繊維回収容器
４  捕集部材
５  対向電極
５ａ  イオン
６  ゾル溶液供給機
６ａ  第１ゾル溶液供給機
６ｂ  第２ゾル溶液供給機
７  第１高電圧電源
８  第２高電圧電源
９  吸引機
１０  電離放射線源
１０ａ  電離放射線
１１  第３高電圧電源
２０  ノコギリ状歯車
２０ａ  先端部
２０ｂ  ワイヤ
２１  紡糸用無機系ゾル溶液
２２  ゾル溶液容器
２３  ローラー
２５  沿面放電素子
２６  誘電体基板
２７  放電電極
２８  誘起電極
２９  交流電源
【図１】
2014113060.tif 000003
【図２】
2014113060.tif 000004
【図３】
2014113060.tif 000005
【図４】
2014113060.tif 000006
【図５】
2014113060.tif 000007
【図６】
2014113060.tif 000008
【図７】
2014113060.tif 000009
【図８】
2014113060.tif 000010
【図９】
2014113060.tif 000011
【図１０】
2014113060.tif 000012
【図１１】
2014113060.tif 000013