(57)【要約】      （修正有）【課題】アシルホモセリンラクトンの一種であるC12HSL合成酵素をコードする遺伝子、及びこの遺伝子が発現する酵素を用いたC12HSLの製造方法を提供する。【解決手段】下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質；(ａ)特定配列により示されるアミノ酸配列、(ｂ)特定配列により示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、(ｃ)特定配列により示されるアミノ酸配列と少なくとも80％のホモロジーを有するアミノ酸配列。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質；
(ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列、
(ｂ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(ｃ)配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％のホモロジーを有するアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項３】
下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかの塩基配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；
(ａ)配列番号２に示される塩基配列、
(ｂ)配列番号２に示される塩基配列の相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
(ｃ)配列番号２に示される塩基配列と少なくとも80％のホモロジーを有する塩基配列。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からC12HSL合成酵素を採取することを特徴とする、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシルホモセリンラクトン合成酵素をコードする遺伝子、及び当該遺伝子を用いた形質転換体によるアシルホモセリンラクトン合成酵素の製造方法、さらに当該酵素による特定のアシルホモセリンラクトン化合物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は自然環境中において非常に複雑なコミュニティーを形成しており、微生物同士が常に相互作用し、環境適応機構を発達させている。中でも、化合物を介した微生物間のシグナル伝達機構は、コミュニティーを発達、維持するために必要とされている(非特許文献１)。特定の真正細菌において、菌数依存的に生物活性を制御するシステムをQuorum sensing(QS)という(非特許文献２)。
微生物はオートインデューサー(AI)と呼ばれる低分子化合物を言葉のように利用して互いに情報交換しており、バイオフィルム形成や発光、走化性、病原因子の発現に関与している(非特許文献３、４)。グラム陰性細菌における代表的なAIはアシルホモセリンラクトン(N-acyl-L-homoserine lactones：AHLs)であり、３位の炭素の状態やアシル鎖の長さが異なるAHLの異性体がAIとして利用されている。アシルホモセリンラクトンは、下記式(１)で表される。
【化１】
2014003920.tif 000002
・・・式(１)
(式中、Ｒは水素原子、水酸基、または酸素原子を表し、ｎは0〜10の整数を表す。)
QS機構により制御されている微生物の病原性発現を抑止する新たな手法の構築に、AIを活用することが注目されており、将来的に医療分野や工業分野など幅広い応用が期待されている(非特許文献５)
【０００３】
アシルホモセリンラクトン(AHL)は、化学合成法によっても製造可能ではあるが、環境低負荷型の効率のよい製造法として微生物由来のAHL合成酵素を用いる酵素法が想定されている(非特許文献５)。しかし、すでにアシルホモセリンラクトンの微生物変換に関わるいくつかの遺伝子・酵素が報告されているが、現在報告されているAHL合成酵素は、単一のAHLを生産するものではなかった
(非特許文献６、７、８)。
【０００４】
最近、アシルホモセリンラクトン化合物のうちで、下記式(２)で表される、ドデカノイルホモセリンラクトン(N-dodecanoyl-L-homoserine lactone ：C12HSL)が、環境微生物や病原性微生物が産生する微生物間コミュニケーション物質として、環境微生物の挙動を制御し、特に病原性微生物に対する病原性発現を調節する物質として注目を集めている(非特許文献９、１０、１１)。
【化２】
2014003920.tif 000003
・・・式(２)
しかしながら、従来報告されているC12HSLを生産する微生物は、C12HSL以外のAHL異性体を副生成物として含むAHL混合物として産生するため、C12HSL化合物を単離する為には複雑な精製工程を経る必要があった(非特許文献１１)。
したがって、C12HSLを単一の生成物として生産可能なAHL合成酵素を探索し、当該酵素遺伝子のクローニング及びそれを用いた組換え微生物による効率的なC12HSLの生産が望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ryan, R.P. et al., Microbiology 2008. 154:1845-1858.
【非特許文献２】Whitehead, N.A.et al., FEMS Microbiology Rev. 2001. 25:365-404.
【非特許文献３】Zhang, L.H. Trends Plant Sci. 2003. 8:238-244.
【非特許文献４】Morohoshi, T. et al., J. Bacteriol. 2007. 189:8333-8338.
【非特許文献５】Engebrecht, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984. 81:4154-4158.
【非特許文献６】Bassler, B. L. et al., Mol. Microbiol 1994. 13:273-286.
【非特許文献７】Whitehead, N. A.et al., FEMS Microbiol. Rev. 2001. 25:365-404.
【非特許文献８】Williams, P.et al., Trans. R Soc. B. 2007. 362:1119-1134.
【非特許文献９】Mattiuzzo M, et al., Environ Microbiol. 2011, 13:145-62.
【非特許文献１０】Weeks JN, et al., BMC Microbiol. 2010, 8:167.
【非特許文献１１】Iida A, et al., J Bacteriol. 2008, 190:2546-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アシルホモセリンラクトンの一種であるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の合成酵素をコードする遺伝子、及びこの遺伝子が発現する酵素を用いたドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、メタゲノムライブラリーからアシルホモセリンラクトン(AHL)の１種であるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の合成活性を有する新規な合成酵素をコードする遺伝子(ahlI遺伝子)を単離することに成功した。そして、当該遺伝子がコードするドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素(配列番号１)が、AHL化合物の異性体を副産物として含むこと無く、式(２)のドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)のみを製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕  下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質；
(ａ)配列番号１に示されるアミノ酸配列、
(ｂ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
(ｃ)配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％のホモロジーを有するアミノ酸配列。
〔２〕  前記〔１〕に記載のタンパク質をコードする核酸。
〔３〕  下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかの塩基配列を含み、かつドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸；
(ａ)配列番号２に示される塩基配列、
(ｂ)配列番号２に示される塩基配列の相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、
(ｃ)配列番号２に示される塩基配列と少なくとも80％のホモロジーを有する塩基配列。
〔４〕  前記〔２〕又は〔３〕に記載の核酸を含むベクター。
〔５〕  前記〔４〕に記載のベクターを含む形質転換体。
〔６〕  前記〔５〕に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からC12HSL合成酵素を採取することを特徴とする、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素の製造方法。
〔７〕  前記〔５〕に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規なドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素をコードする遺伝子が提供される。これらの遺伝子がコードする酵素は、ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)を他のAHL化合物を含むことなく単一のAHL産物として合成することができるためドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)の精製が容易である。当該C12HSL合成酵素遺伝子による形質転換微生物を用いることで、QS機構による微生物の病原性発現の調節作用が期待されるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)を、安価で安定かつ効率的に供給可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】精製したC12HSL化合物の1H NMR：(図中、横軸はppmを表す。)
【図２】精製したC12HSL化合物の13H NMR：(図中、横軸はppmを表す。)
【図３】精製したC12HSL化合物のFAB質量分析装置による質量分析
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に本発明を詳細に説明する。
１．ドデカノイルホモセリンラクトン(N-dodecanoyl-L-homoserine lactone：C12HSL)
微生物間のコミュニケーションに用いられるオートインデューサー(AI)のうち、グラム陰性細菌における代表的なAIは下記式(１)で表されるアシルホモセリンラクトン(AHLs)である。
【化１】
2014003920.tif 000004
・・・式(１)
(式中、Ｒは水素原子、水酸基、または酸素原子を表し、ｎは0〜10の整数を表す。)
本発明の目的化合物であるドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)は、グラム陰性細菌間のオートインデューサー(AI)として広く知られるアシルホモセリンラクトン化合物のうちでも、環境微生物の挙動を制御し、特に病原性微生物に対する病原性発現を調節する物質として注目を集めている下記式(２)の化合物である。
【化２】
2014003920.tif 000005
・・・式(２)
【００１２】
２．ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素遺伝子について
(２−１)C12HSL合成酵素遺伝子の単離
本発明者は、新規なC12HSL合成酵素遺伝子を単離するため、まず、森林土壌から複合微生物のDNAを抽出し、宿主として大腸菌(Escherichia coli)  EPI300株とベクターとしてフォスミド(Fosmid)ベクターを利用して、平均約40kbpの長さのDNAを含むクローン群からなるメタゲノムライブラリーを構築した。
当該メタゲノムライブラリーをLB(Luria-bertani)液体培地で培養し、さらにC12HSLを感知する微生物センサーの菌体懸濁液を培養し、微生物センサーが陽性を示したクローンを得た。フォスミドDNAを抽出して塩基配列の決定を行い、その結果、既知のアシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子と相同性がある新規の遺伝子の単離に成功した。
当該遺伝子を発現させ、その発現タンパク質がアシルホモセリンラクトンのうちでドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)のみを合成する活性を有することを確認して、該遺伝子がC12HSL合成酵素をコードする遺伝子であると同定し、該遺伝子について、ahlIと命名した。ahlI遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸をコードする遺伝子であり、配列番号２の塩基配列からなる。
【００１３】
(２−２)本発明のC12HSL合成酵素遺伝子
本発明のC12HSL合成酵素遺伝子の典型的な遺伝子は上記ahlI遺伝子であるが、その部分配列であっても、また当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じている場合であっても、当該タンパク質がC12HSL合成活性を有している限り、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子に含まれる。
すなわち、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子がコードするC12HSL合成酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、C12HSLの合成能のある酵素活性を有するタンパク質と表現することができる。ここで、「１若しくは数個」というとき、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは１〜５個を表す。
また、C12HSL合成酵素の全長でなく部分配列であってもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％のホモロジーを有するアミノ酸配列であればよい。
したがって、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子は、上記のように表されるC12HSL合成酵素をコードする核酸である、ということができる。
また、本発明のC12HSL合成酵素遺伝子は、典型的なahlI遺伝子の塩基配列である配列番号２を用いて、以下のように表現することもできる。
下記の(ａ)〜(ｃ)に示されるいずれかの塩基配列を含み、かつC12HSL合成酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸であると表現することもできる。
(ａ)配列番号２に示される塩基配列。
(ｂ)配列番号２に示される塩基配列の相補的な配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列。
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性(identity  80％以上、好ましくは90％以上)を有するDNAがハイブリダイズする条件をいう。このような「ストリンジェントな条件」は、例えば、2 x SSC、0.1％SDS及び50％ホルムアミドの溶液中で25℃にて加温した後、0.1 x SSC、0.1％SDSの溶液中で68℃にて洗浄する条件をいう。
但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、これら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
(ｃ)配列番号２に示される塩基配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％のホモロジーを有する塩基配列。
【００１４】
(２−３)C12HSL合成酵素遺伝子の調製法
上記遺伝子は、他のC12HSL合成活性を持つ細菌から調製したDNAから、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができる。同様に上記遺伝子の塩基配列から設計したプロープを用いたハイブリダイズ法を利用することもできる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の遺伝子の変異型であって上記機能又は活性を有するものを合成することもできる。遺伝子への変異の導入法は限定されないが、市販の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット(例えばMutan-K(TAKARA社製)やMutan-G(TAKARA社製)などを用いることができる。
【００１５】
３．C12HSL合成酵素産生能を有する形質転換体
(３−１)C12HSL合成酵素遺伝子発現ベクター
本発明のC12HSL合成酵素遺伝子発現ベクターは、適当なベクターにC12HSL合成酵素遺伝子を連結することにより得られる。
本発明で使用するベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなど宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。またそのベクターが機能するものであれば大腸菌、放線菌など宿主も限定されない。
ベクター中に導入する遺伝子の方向及び順序は、遺伝子が発現され、発現されたタンパク質が酵素として機能しうるのであれば、任意に配列及び選択してよい。
【００１６】
(３−２)本発明のC12HSL合成酵素遺伝子発現ベクターを含む形質転換体: 
本発明においては、上記C12HSL合成酵素遺伝子発現ベクターを含む形質転換体として、人為的に上記作製したベクターを導入した微生物が包含されるが、これらに限定されない。
本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを上記宿主に導入し、形質転換を行うことにより作製される。形質転換体を作製する場合、上記組換えベクターを宿主に導入することにより行われるが、これにはそれ自体公知のエレクトロポレーション法、プロトプラスト法、塩化カルシウム法(スフェロプラスト法)などの手法を用いることができる。また、形質転換体の作製に際しては、ベクターや宿主、高発現を誘導する誘導基質やプロモーター、オペレーター、エンハンサーなどの組み合わせを考慮して、これらを選択して用いることによって、C12HSL合成酵素産生能を有する形質転換体を作製することができる。
典型的には、C12HSL合成酵素遺伝子を発現プラスミドベクターに組み込み、大腸菌に導入し、発現させる。
本実施例では、宿主としてEscherichia coli DH5alpha株、ベクターとして、開始コドンATG、及びその上流にRBS、さらに上流にlacプロモーターを含むpUC19ベクターを使用した例を示す。得られたC12HSL合成酵素遺伝子が導入された形質転換体は、良好なC12HSL合成酵素の生産性を示している。
この例に限らず宿主やベクター、発現制御系などをうまく機能する様に組み合わせて用いることによって、C12HSL合成酵素遺伝子を高発現する微生物の作製が可能となる。
【００１７】
４．ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)合成酵素について  
(４−１)本発明のC12HSL合成酵素
本発明のC12HSL合成酵素は、典型的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質であるが、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、C12HSLの合成能のある酵素活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、「１若しくは数個」というとき、1〜10個、好ましくは1〜5個を表す。また、C12HSL合成酵素の全長でなく部分配列であってもよく、配列番号１に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％のホモロジーを有するアミノ酸配列であればよい。
【００１８】
(４−２)本発明のC12HSL合成酵素の製造法
本発明において、目的のC12HSL合成酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。放線菌や細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００１９】
上記で示した組み換え大腸菌の場合は当研究分野で通常用いる栄養培地で培養し、必要に応じてIPTGなどの誘導物質を加えることにより、大腸菌が増殖できる栄養培地中での酵素の高発現を行うことができる。通常の培養条件では、適宜、抗生物質を加えたLB培地(1.0％ペプトン、0.5％乾燥酵母エキス、1.0％NaClから成る)で37℃、8-12時間前培養し、この十分増殖した菌体を種菌として、新しいLB培地に容量比1-5％植菌、37℃、2-4時間本培養し、IPTGを加え、さらに30℃で2-4時間培養する。
他の形質転換体の場合も、それぞれの宿主細胞用に適した培地で培養する。形質転換微生物の場合、懸濁培養する際には懸濁液の濃度は、600nmの濁度で1-2が好適であり、必要に応じて増減できる。
【００２０】
培養後、目的の酵素のタンパク質が菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の酵素タンパク質を通常のタンパク質精製方法を用いて単離精製することができる。目的の酵素タンパク質が得られたか否かは、単離した後に、一般的なタンパク質の同定方法であるSDS-PAGE等によっても確認することができるが、形質転換体の発現産物である組換えC12HSL合成酵素により培養液中に分泌されるC12HSLを抽出して同定することによっても、組換えC12HSL合成酵素がC12HSLを合成する酵素活性を有するか否かを確認することができる。
【００２１】
５．組換えC12HSL合成酵素によるC12HSLの生産方法
(５−１)C12HSLの生産方法
ドデカノイルホモセリンラクトン(C12HSL)は、前記C12HSL合成酵素産生能を有する形質転換体を培養して組換えC12HSL合成酵素を産生する際に、当該培養液中に前記組換えC12HSL合成酵素の基質の前駆体となるアミノ酸が含まれていれば、宿主となる微生物により当該組み換えC12HSL合成酵素基質であるS-アデノシルメチオニンとアシル-アシルキャリアータンパク質(Acyl-ACP)が製造されて、直接培養液中にC12HSLが分泌される。
また、前記の本発明の組換えC12HSL合成酵素を単離して、又は単離せずに培養液の状態で取得し、基質であるS-アデノシルメチオニンとアシル-アシルキャリアータンパク質(Acyl-ACP)に作用させれば、C12HSLが合成される。
【００２２】
(５−２)C12HSLの単離精製方法
上記形質転換体の培養菌体、若しくは培養上清又は酵素反応液から、有機溶媒等を用いて抽出する。その際、培養菌体、若しくは培養上清は、適当な緩衝液に懸濁して調製した菌懸濁液としてもよい。緩衝液としては種々の緩衝液を使用でき、また緩衝液の代わりに、水や培地等を使用することもできる。
C12HSLを精製するためには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを単独又は組み合わせて用いることができる。
本発明の実施例では、まずイオン交換クロマトグラフィーを用い、エタノールを用いて溶後、クロロフォルムを用いた溶媒抽出を行い、クロロフォルム層をシリカゲルカラムで精製し(展開溶媒は、クロロフォルム：メタノール＝20：1)、最終的には逆相高速液体クロマトグラムにより単離した。
【００２３】
(５−３)C12HSLの同定
C12HSL化合物を簡便に同定するためには、Andersenらの方法(Andersen，J.B.et al.，2001，Appl．Environ．Microbiol．67：575-585)により作製できるC12HSLを感知する微生物センサー(Andersen，J．B．et al.，2001，Appl．Environ．Microbiol. 67：575-585)が用いられる。当該「微生物センサー」を用いることで、C12HSLのゲルクロマトグラフィーなどを用いた精製過程で得られたどの画分にC12HSLが濃縮されているかが簡便に判定できる。
C12HSLが、他のアシルホモセリンラクトン類が含まれない状態で単離されていることを、正確に判定するためには、得られたC12HSL化合物に対して核磁気共鳴スペクトル、旋光性、質量分析を測定し、標準品の数値と対比すればよい。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００２５】
(実施例１)大腸菌によるC12HSL遺伝子の発現
(１−１)C12HSL遺伝子の単離
森林土壌(茨城県つくば市)から複合微生物の由来のDNAを抽出し、木村らの方法(Kimura N．et al.，Microbes Environ，2010，25：133-9.)に従って、メタゲノムライブラリーを構築した。具体的には、宿主として大腸菌(Escherichia coli)EPI300株とベクターとしてフォスミド(Fosmid)ベクターを利用し、平均約40kbpの長さのDNAを含むクローン群としてのメタゲノムライブラリーを構築した。
構築したメタゲノムライブラリーをLB(Luria-bertani)液体培地で培養し、さらにC12HSLを感知する微生物センサー(Andersen，J．B．et al.，2001，Appl．Environ. Microbiol. 67：575-585)の菌体懸濁液を培養し、微生物センサーが陽性を示したクローンを得た。得られたクローンのM12株からフォスミドDNAを抽出して塩基配列の決定を行い、その結果、AHL合成遺伝子と相同性がある新規の遺伝子(ahlI遺伝子)の単離に成功した。
【００２６】
(１−２)ahlI遺伝子による形質転換大腸菌の作製
メタゲノムクローン  M12株からフォスミドDNAの塩基配列を決定し、それを鋳型としてahlI遺伝子(配列番号１)をPCRにより増幅し、pUC19ベクター(タカラバイオ社)に導入した。
PCRに用いたプライマーの配列は、次の通りである。
ahlIF-1(5’- ATGCGTAGGGTTAAAGATGTCGA-3’(配列番号３)
ahlIR-1(5’- TCA CGC CTC TGC GCC GAC CAA TC-3’(配列番号４)
pUC19ベクターは開始コドンとするATGとその上流にRBS、さらに上流にlacプロモーターを含むもので、用いる遺伝子をその開始コドンと読み枠に合わせて導入することにより、他菌株からの遺伝子でも効率的な発現が期待できるものである。構築したプラスミドを宿主としてEscherichia coli DH5alpha株へ形質転換した。
【００２７】
(１−３)形質転換大腸菌の培養と微生物細胞の集菌
実施例１で得られた組み換え大腸菌を50μg/mlのアンピシリンを含む3ml LB培地に植菌し、37℃で一晩振盪して前培養した。
前培養した組み換え大腸菌を20L LB培地に植菌し、培養液の600nmの吸光度が0.6になったときにlacプロモーター誘導剤である１mMのIPTGを添加した。その後、37℃でさらに4時間培養した。
培養液を250ml容量の遠心チューブに入れ6,000rpmで15分遠心、集菌しペレット状の菌体を得た。
【００２８】
(実施例２)C12HSL化合物の単離
(実施例１)で得られたペレット状の菌体を40mlのLB培地を加えて溶解し、80mlのエタノールを加え、10分間手動で撹拌後、8,000rpmで15分間遠心分離を行い、エタノールをガラスのバイアルに移した。イオン交換クロマトグラフィー  Diaion HP-20(三菱ケミカル)を用いて化合物の分離を行った。化合物はエタノールを用いて溶出した。
得られた溶出液に対して、クロロフォルムを用いた溶媒抽出を行い、クロロフォルム層をシリカゲルカラムで精製した。展開溶媒は、クロロフォルム：メタノール＝20：1を用いた。
C12HSL化合物を感知する微生物センサーを用いてC12HSLを含む画分を特定し、さらに当該画分をシリカゲルカラムで精製し、最終的に下記の逆相高速液体クロマトグラムによりC12HSL化合物の分離を行った。
カラム  ：Cosmosil 5C18-MS-II  (内径4.6mm、長さ25cm、ナカライテスク社)
溶出条件：30％から100％メタノール、流速0.6ml min-1、解析時間30分
検出波長：220nm
保持時間：27.1min
【００２９】
(実施例３)C12HSL化合物の同定
(実施例２)で単離されたC12HSL化合物を、下記の分析条件で同化合物の核磁気共鳴スペクトルを核磁気共鳴装置(NMR)JEOL社  JNM-A500を用いて行ったところ、図１と図２に示す値が得られた。
分析条件：500MHz for 1H，125MHz for 13C in CDCl3
次いで、同化合物の旋光性をDIP-1000デジタル旋光計(Jasco社)を用いて行ったところ、立体配置は2Sという値が得られた。
さらに、FAB質量分析装置(FAB MS)(JEOL社  JMS-700 MStation)を用いて質量分析(マトリックスとしてグリセロールを使用)を行ったところ、図３に示す値が得られた。
【００３０】
以上の解析結果から、(実施例１)で得られたahlI遺伝子を発現する組換え大腸菌が生産するAHL化合物は、FAB MSや旋光計、NMRの計測からC12HSLと同定された。
すなわち、(実施例１)で得られたahlI遺伝子が、式(２)のC12HSL合成酵素遺伝子であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明により、QS機構による微生物の病原性発現の調節作用が注目されるC12HSLの安価で安定かつ効率的な供給が可能となり、将来的に医療分野や工業分野など幅広い応用が期待されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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