(57)【要約】【課題】デンタルプラークの細菌叢の詳細な解析を課題とする。【解決手段】本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする微生物の解析方法を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者からデンタルプラークを採取し、
採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、
抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、
増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする
デンタルプラークの細菌叢の解析方法。
【請求項２】
被験者からデンタルプラークを採取し、
採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、
抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、
増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、
齲蝕になりやすさの診断を補助するためのデータ収集方法。
【請求項３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する際にマイクロリアクター内で増幅されることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の解析方法。
【請求項４】
遺伝子の配列の解析は、パイロシーケンス法によることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の解析方法。
【請求項５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する際に検体に特有のタグ配列を付加したプライマーを使用することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の解析方法。
【請求項６】
プラーク形成から１から５日目のいずれかにおいてデンタルプラークを採取することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の解析方法。
【請求項７】
プラーク形成から４日目のデンタルプラークを採取することを特徴とする請求項５に記載の解析方法。
【請求項８】
口腔内プラーク形成装置を用いて形成されたデンタルプラークを採取することを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の解析方法。
【請求項９】
請求項１および請求項１に係る請求項３から８の解析方法に用いられるデンタルプラークの細菌叢の解析キット。
【請求項１０】
請求項２および請求項２に係る請求項３から８のデータ収集方法に用いられる齲蝕になりやすさの診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はデンタルプラークの細菌叢の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
齲蝕の発症にデンタルプラークが決定的な原因子として働くことは周知の事実である。一方、従来の齲蝕病因論では、ミュータンス連鎖球菌が主要な齲蝕原性細菌とされるが、これだけで成人の齲蝕病態を十分に説明することができなかった。  
デンタルプラークはバイオフィルムの成熟に伴い、細菌の種類ならびに各細菌の割合が変化することでその病原性が変化すると考えられる。これまでのところデンタルプラークを構成する細菌叢の経時的変化については１９６７年にＲｉｔｚ  ＨＬが報告した結果（非特許文献１）に報告がある。しかし、この報告のみでは、複雑な細菌叢を背景とする齲蝕原性バイオフィルムの詳細な構成を解明するには多くの課題を残している。
【０００３】
一方、近年の分子遺伝工学手法の発達により、細菌群集の解析を培養法に頼ることなく実施できるようになり、複雑な細菌叢の解析に新しい取り組みが進められるようになってきた。発明者らは以前、新しい細菌叢分析法として独自に開発した改良Ｔｅｒｍｉｎａｌ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（Ｔ−ＲＦＬＰ）法を用いて、バイオフィルムとして形成されるデンタルプラークの成熟過程を経日的に追跡することに成功し、興味ある知見を得た（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２３４６８７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈ．Ｌ．  Ｒｉｔ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｈｉｆｔｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｐｌａｑｕｅ．  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２（２２）：  １５６１-１５６８
【非特許文献２】Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（６）：４１９−２８，２００７
【非特許文献３】ＩＳＭＥ  Ｊ.,３（１）：６５−７８，２００９．
【非特許文献４】Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．,６３（３）：８７２−８０，２００７．
【非特許文献５】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９：１１４１−１１５２，２００９．
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、デンタルプラークの細菌叢の解析方法を提供する。
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
デンタルプラークの細菌叢の詳細な解析を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする微生物の解析方法を提供する。
また、本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、齲蝕になりやすさを診断する方法を提供する。
さらに、本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、齲蝕になりやすさの診断を補助するためのデータ収集方法を提供する。
【０００９】
本発明においては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する際に、マイクロリアクター内で増幅し、遺伝子の配列の解析は、パイロシーケンス法により行うことができる。また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する際に、検体に特有のタグ配列を付加したプライマーを使用することができる。また、プラーク形成から１から５日目のいずれかにおいてデンタルプラークを採取することができ、とりわけ４日目のデンタルプラークを採取することが好適である。さらには、デンタルプラークの採取の際には、口腔内プラーク形成装置を用いてもよく、その際は、装着から１から５日目のいずれか、とりわけ４日目の口腔内プラーク形成装置からデンタルプラークを採取することが好適である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、デンタルプラークの細菌叢の詳細な解析が可能となる。マイクロリアクターを用いることで大量の遺伝子情報を得られる。パイロシーケンス法により行うことで、比較的安価に高速に大量の解析を行うことができる。また、検体に特有のタグ配列を付加したプライマーを使用することにより、得られた結果の情報処理が容易となる。
【００１１】
さらには、実施例に示すように、プラーク形成から１日目から５日目、とりわけ４日目のデンタルプラークを採取することにより、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群とで明確な差のある解析結果を得ることができる。すなわち、本発明の方法により、齲蝕になりやすさの診断、あるいは、診断を補助するデータ収集が可能となる。
【００１２】
また、デンタルプラークの採取の際に、口腔内プラーク形成装置を用いて行うことで、ｉｎ  ｖｉｖｏで長期に渡りプラークを形成することができ、経日的な解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】デンタルプラーク形成装置の例を示す。
【図２】各細菌の構成比率を示す。
【図３】菌属レベルでの細菌構成の比率を示す。
【図４】菌属レベルでの細菌構成の比率を示す。
【図５】菌属レベルでの細菌構成の比率を示す。
【図６】菌種レベルでの細菌構成の比率を示す。
【図７】菌種レベルでの細菌構成の比率を示す。
【図８】菌種レベルでの細菌構成の比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とするデンタルプラークの細菌叢の解析方法を提供する。
また、本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、齲蝕になりやすさの診断方法を提供する。
さらに、本発明は被験者からデンタルプラークを採取し、採取したデンタルプラーク中のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡ中の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、増幅された遺伝子の配列の解析を行うことを特徴とする、齲蝕になりやすさの診断を補助するためのデータ収集方法を提供する。
【００１５】
デンタルプラークとは歯垢ともいい、歯や歯肉に付着するバイオフィルムからなり、細菌をはじめとする微生物およびその代謝物が多く含まれる。
１６Ｓ  ｒＲＮＡとはリボソームのサブユニットを構成するＲＮＡである。リボソームは配列の保存性が高く、生物種の比較の際の目安となりやすい。中でも１６Ｓ  ｒＲＮＡは適度な長さを持っており、生物種の決定に好都合に用いられる。
細菌叢とは、特定の環境中に存在する細菌の集合をいう。本明細書において、細菌とは、微生物のことを指し、真正細菌のみでなく、古細菌、真核生物、菌類、粘菌、ウィルスなどを含む。
【００１６】
齲蝕になりやすさとは、個人が齲蝕になる傾向を指す。同じ環境であっても、個人により、齲蝕になる場合と、ならない場合がある。一般的に、齲蝕経験のない者、あるいは少ない者は、齲蝕になりやすさが低く、齲蝕経験の多い者は、齲蝕になりやすさが高いと考えられる。
本実施例では、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群とで細菌の構成に差が見られる場合を示す。被験者から採取して解析した細菌の構成が、齲蝕多発群の細菌構成に一致する、あるいは、類似すれば、齲蝕になりやすさが高いと診断でき、齲蝕経験のない群の細菌構成に一致する、あるいは類似すれば、齲蝕になりやすさが低いと判断することができる。
【００１７】
本発明において、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する際には、マイクロリアクター内で増幅されることができる。
マイクロリアクターとは、微小なサイズの反応容器のことであり、より具体的にはエマルジョンを挙げることができる。近年、大量遺伝子解析の際、あらかじめアダプターを付加された遺伝子を、アダプターを介してビーズに結合して、エマルジョン内で増幅することで、ビーズ上で、クローナルに遺伝子を増幅する技術が用いられている。
【００１８】
遺伝子の配列の解析は、パイロシーケンス法によることができる。パイロシーケンス法とは、遺伝子配列の解析の方法で、対象となるＤＮＡを鋳型として複製を行う際に、取り込こまれたヌクレオチドから放出されるピロリン酸を検出することを特徴とする方法である。ピロリン酸の検出には、ＡＴＰを介し、ルシフェリンの発光に基づくことが多い。たとえば、デオキシリボヌクレオチドを一種類ずつ加え、その際に、どの程度発光が起こるかを検出することで、どの遺伝子が取り込まれたことが分かり、遺伝子配列を決定することができる。
【００１９】
また、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅する際に検体に特有のタグ配列を付加したプライマーを使用することができる。タグ配列とは、遺伝子配列の解析の際に、試料がどの検体に由来するか知るための手がかりとすべく、人為的に挿入される配列のことである。
【００２０】
本発明は、デンタルプラーク形成から１から５日目、さらに好ましくは４日目のデンタルプラークを採取することができる。デンタルプラーク形成の際は、形成開始の直前に口腔内を洗浄し、その後、デンタルプラーク採取まで口腔内の洗浄を行わないことにより達成できる。デンタルプラークは形成の期間を経た後に、主に口腔内の歯面から綿棒等で採取することができる。
【００２１】
一方、デンタルプラークの採取には口腔内プラーク形成装置を用いて行うことができる。口腔内デンタルプラーク形成装置とは、ｉｎ  ｖｉｖｏでデンタルプラークの形成のために用いられる、着脱可能な装置をいい、歯面の代替となるプラーク形成部を含んでおり、好ましくは、プラーク形成部は焼結体合成ハイドロキシアパタイトからなる。
【００２２】
口腔内プラーク形成装置を装着する場合は、装着した日から１から５日目、さらに好ましくは４日目のデンタルプラークを採取することができる。実施例では、口腔内プラーク形成装置を用いており、装置の装着から４日目の口腔内プラーク形成装置から、採取されるデンタルプラークの細菌叢は、齲蝕の有無によりもっとも顕著に差が認められた。
【００２３】
また、本発明は、上記の細菌叢の解析方法あるいは、齲蝕になりやすさの診断を補助するためのデータ収集方法に用いるための、キットを提供する。
キットは、それぞれの方法を実施するために用いられる、各種試薬、バッファー、酵素、オリゴＤＮＡのほか、デンタルプラークを採取するための綿棒などの道具、あるいは、口腔内プラーク形成装置を含むことができる。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００２５】
１．被験者
九州大学歯学部の学生を対象にボランティアを１５５名程募り、ボランティア全員に対して齲蝕の診査を行った。齲蝕の診査は、歯冠部齲蝕については社団法人日本学校歯科医会の「う歯（Ｃ）及び要観察歯（ＣＯ）の検出基準」に準じて齲歯（Ｃ）を検出し、根面齲蝕についてはＷＨＯの基準に準じてＣを検出した。その結果に基づき、齲蝕を多発する１０名を被験者として選んだ。また、被験者に過去の齲蝕経験を質問し、その結果をもとに齲蝕を有さない被験者からなるグループを１０名設定した。すなわち、合計２０名を本実施例における被験者とした。
被験者の年齢、性別および齲蝕に関する健康パラメータを表１に示す。各１０名ずつ、齲蝕を多発する被験者からなるグループ（被験者Ａ〜Ｊ）ならびに齲蝕を有さない被験者からなるグループ（被験者Ｋ〜Ｓ）を選出した。なお、実験開始後、装置装着に対する違和感のため協力できない者が齲蝕を有さない被験者からなるグループに１名発生したため、最終的には齲蝕を有さない被験者からなるグループは９名となった。
被験者の年齢は２１歳から２８歳であり、齲蝕を多発する被験者からなるグループの平均年齢は２４．１歳、齲蝕を有さない被験者からなるグループの平均年齢は２３．２歳であったが、ｔ検定により両群間に有意な差は認められなかった。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
２．口腔内デンタルプラーク形成装置
ｉｎ  ｖｉｖｏでのデンタルプラークの形成のため、図１に示す着脱可能なデンタルプラーク形成装置を作成した。経日的なプラーク形成過程の観察には１０日間程度成熟させたプラークが必要であるが、実際の歯面のプラークの清掃を被験者に長期間停止させることは侵襲性や不快感を考えると倫理的に不可能である。そのため、図１に示す着脱可能な口腔内装置を開発した。  
被験者の下顎歯列の印象を採得し、採取した印象をもとにマウスピース様の装置を歯科用の即時重合レジンを用いて作製し、装置による咬頭干渉がないように架橋部を残して咬合面を削除した。両側の臼歯部頬側面には、スティッキーワックスによって、歯面の代替となる焼結体合成ハイドロキシアパタイトのプラーク形成プレート（直径５ｍｍ、厚さ２ｍｍの円筒状のプレート）を６枚ずつ接着し、プラークの形成面とした。装置の装着にあたっては、被験者に試適し、歯肉や粘膜への侵襲がないことおよび発音障害などが生じないことを確認した。
装着に際しては、以下の点を被験者に確認した。
（１）食事および歯磨き時は装置を外し、生理食塩水を満たしたケースに入れて保管すること。  
（２）その際、決してハイドロキシアパタイトのプレートの面には触れないこと。
（３）食事および歯磨き時以外は常に装置を装着しておくこと。
【００２８】
３．プラークの調製ならびにサンプルからの細菌ＤＮＡの抽出
装置装着から５日目までは１日ごとに１枚、さらに７日目に１枚、装置からプラーク形成プレートを取り外し，溶菌液の入ったチューブの中に浸漬した。超音波処理でプラーク形成プレートからプラークを剥ぎ取り、遠心分離機でプラークを一旦沈殿させ、溶菌液からプラーク形成プレートを除去した。取り除いたプラーク形成プレートについては、その表面にプラークの付着が無いことを顕微鏡で確認した。
サンプル中に含まれるＤＮＡの抽出は、非特許文献２の方法を一部改良して行った。菌を採取したチューブの中に０．３ｇのｚｉｒｃｏｎｉａ−ｓｉｌｉｃａ  ｂｅａｄｓ（直径０．１ｍＭ：Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ）と１個のｔｕｎｇｓｔｅｎ−ｃａｒｂｉｄｅ  ｂｅａｄ（直径３ｍＭ：Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて９０℃で１０分間加温した後、Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  Ｇｅｎｉｅ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて菌体を震盪、破砕し、２００μｌの１％  ＳＤＳ溶液を加えて、７０℃で１０分間加温した。さらに、蛋白質成分を除去するため、フェノール（ｖ／ｖ）による抽出を１回、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）混合溶液による抽出を１回行った後、エタノール沈殿処理を行い、生じた沈殿物を５０μｌのＴＥ溶液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ  を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液  ；  ｐＨ８．０）に溶解し、ＤＮＡ試料として分析時まで−３０℃で凍結保存した。
【００２９】
４．４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔによる遺伝子情報の取得
抽出ＤＮＡ試料から１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。この際、アダプター配列と、検体ごとに人為的に取り決めた遺伝子配列（タグ）、が含まれるように増幅した。
すなわち、５’側にアダプター配列  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｄａｐｔｏｒ  Ａと６塩基のタグ配列（ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＡＴ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＮＮＮ  ＮＮＮ）を付与した８Ｆ（ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＹＭ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ）をフォワードプライマーとして、アダプター配列  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｄａｐｔｏｒ  Ｂ（ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ）を付与した３３８Ｒ（ＧＧＡ  ＣＴＡ  ＣＣＲ  ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＣＴＡ  Ａ）をリバースプライマーとしてＰＣＲ法により行った。用いたプライマーの配列を表２に示す。なお、検体数に対し、プライマーの種類が少ないが、これは反応と解析を３回に分けて行ったためである。
【００３０】
【表２−１】
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【００３１】
【表２−２】
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【００３２】
ＰＣＲ反応にはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社）を用いた。１μｌの鋳型ＤＮＡ（１００−５００ｎｇ／μｌになるよう希釈したもの）に５μｌのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ  硫酸アンモニウム、１００ｍＭ  塩化カルシウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１００μｇウシ血清アルブミンを含む１．２Ｍトリス塩酸緩衝液；ｐＨ８．０）、５μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２μｌの２５ｍＭ  塩化マグネシウム、各０．５μｌの１μＭ両プライマー、１μｌのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）を加えた後、滅菌蒸留水を加えて総量を５０μｌとしてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応にはＢｉｏｍｅｔｒａ  Ｔ３  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。反応条件は９８℃  １５秒、６０℃  ２秒、７２℃  ３０秒で３０サイクルの反応を行った。得られたＰＣＲ産物は、泳動用ゲルすなわち２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアガロースを含む１×ＴＡＥを用いて、アガロース電気泳動を行い、目的のバンド出現部位を切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用いて精製し、未反応プライマー、プライマーダイマー、その他非特異的増幅断片の除去を行った。
【００３３】
精製した１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子増幅断片を含む各溶液はＮａｎｏＤｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いＤＮＡ濃度を測定し、各検体について等濃度（５０ｎｇ／μｌ）になるように調整したのち混合した。混合検体は北海道システム・サイエンス株式会社に受託し、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＦＬＸ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による塩基配列の解読を行った。
すなわち、上記で得られたアダプターが付加されたＤＮＡは、一本鎖にした後、アダプターを介してビーズに結合した。ビーズを油水エマルジョンの中に包み込み、ビーズ１つとＤＮＡフラグメント１つを持つマイクロリアクターを形成し、リアクター内にてＤＮＡ断片を増幅した。増幅反応後ＤＮＡフラグメントがビーズに結合している状態で油水エマルジョンを破壊した。
【００３４】
以上によって、ＤＮＡはビーズごとにクローナルに増幅された。これらのビーズを濃縮し、配列解析をするためのピコタイタープレート上に添加した。ピコタイタープレートを装置にセットし、それぞれの配列をパイロシークエンス法により解読した。すなわち、ポリメラーゼによりテンプレートに相補的な塩基が取り込まれた際に放出されるピロリン酸を、ルシフェリンの発光に基づき、ＣＣＤカメラで検出することにより、ＤＮＡの配列を解読した。
【００３５】
５．塩基配列データ解析
得られた塩基配列データは、まずＰＨＰで記述したスクリプトにより断片長が２４０塩基以下のもの、平均Ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅが２５を下回るものを取り除き、次にＲで記述したスクリプトにより８Ｆプライマーを含まないもの、６塩基を超えるホモポリマーを含むもの、Ｎを含むものを解析から除外した。残りの配列については挿入した６塩基のタグ配列の情報をもとに各被験者に振り分けた。それぞれの配列はＨｕｍａｎ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＯＭＤ）に登録されている１６４７の口腔細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（ＨＯＭＤ  ｒＲＮＡ  ＲｅｆＳｅｑ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１）に対して相同性検索を行い、９８．５％以上の相同性が認められた場合該当の菌種に振り分けた。振り分けられなかった配列についてはＲＤＰ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  に公開されているｃｏｍｐｌｅｔｅ−ｌｉｎｋａｇｅ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｔｏｏｌを用い、９７％以上の相同性を持つものをＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃＵｎｉｔ（ＯＴＵ）としてまとめた。さらにＤｅｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｒｅｑｕｅｓｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎを用い各ＯＴＵから代表配列を選出した。代表配列はＲＤＰ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いて属レベルまでその由来を決定した。
なお、各菌の存在比率の比較にはＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ−ｓｕｍ  ｔｅｓｔ  を用いた。
【００３６】
６．パイロシーケンスにおける解析リード数
１９名の被験者から得られた１から５日目のプラーク検体、計９５サンプルについて１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のパイロシーケンスを行い、プライマーに組み込まれたタグ配列を元にデータの解析を行った。得られた３７２，２９６  リードの塩基配列のうち、解析可能なものは２４４，０１７リードであった。検体ごとの解析リード数を表３に示す。平均２５６８  ±  ９１６リード、最高４７１７リード（Ｒ，Ｄａｙ４）、最低８２７  リード（Ｎ，Ｄａｙ３）であった。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
７．齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の検出細菌種数、細菌群集の構成の複雑さの比較
齲蝕多発群と齲蝕経験のない群について、検出ＯＴＵ（細菌種）数、Ｃｈａｏ１、Ｓｈａｎｎｏｎ  ｉｎｄｅｘの比較を行った。３日目、４日目については解析リード数に差が認められるため一概に比較することは出来ないが、１日目と２日目は、齲蝕経験のない群において、齲蝕多発群に比べて有意に多くのＯＴＵが検出されており、プラーク形成初期においては齲蝕多発群の細菌群集構成がよりシンプルであることが示唆された。最大検出ＯＴＵ数であるＣｈａｏ１、細菌群集の複雑さを示すＳｈａｎｎｏｎ  ｉｎｄｅｘ  においても有意とはいえないものの、同様の傾向が認められた（表４）。
【００３９】
【表４】
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齲蝕多発群と比べて有意な差を認めたものを＊で示す。
【００４０】
８．プラーク中の細菌構成の５日間での変化
１９名の被験者のプラーク中からは４０菌属と属レベルまでは分類することの出来ない２４の細菌群が検出された。そのうちＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｔｅｒｒａｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｒｏｔｈｉａ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  の８菌属は１９名全員から検出され、これら８菌属で全体の７割以上を占めていた。各菌属の構成比率を図２に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓが経過日数に関わらず最も優勢である一方で、その比率は日数経過に伴って減少が認められた。反対に上記８菌属以外の細菌の比率が日数の経過とともに増加していた。
【００４１】
９．菌属レベルでの齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の細菌構成の違い
菌属レベルでの細菌構成の比率を図３から図５に示す。図３以降の図においては、縦軸はパーセントを示し、横軸は１９人の被験者に対応している。検出された６４の菌属ないし細菌群のうち、９つは齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の間にその存在比率に有意な違いが認められた。そのうちＡｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ、Ｃｌａｓｓ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｅｌｌａ、Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、ＴＭ７は、５日間のうちどこかで齲蝕経験のない群で多く存在した。特にＧｅｍｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  の２菌属はプラーク形成初期、すなわち１日目から３日目にかけて齲蝕経験のない群で有意に高比率検出されており、細菌の初期付着過程における齲蝕病原性の違いに何らかの影響を及ぼしている可能性が考えられる。一方でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  は２日目に、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  は２、４、５日目に齲蝕多発群において有意に高比率検出された。特にＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａが齲蝕多発群においてプラーク成熟期にその比率が増加しているのは興味深い。これらの結果は齲蝕のなりやすさの診断の際の基準となりうる。
【００４２】
１０．ＯＴＵレベル（菌種レベル）での齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の細菌構成の違い
菌属レベルでの細菌構成の比率を図６から図８に示す。今回検出された５００ＯＴＵのうち、１２ＯＴＵは齲蝕多発群と齲蝕経験のない群の間でその存在比率に有意な違いが認められた。そのうち８ＯＴＵは齲蝕経験のない群で優勢になっており、４ＯＴＵは齲蝕多発群で優勢であった。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖａ  とＧｅｍｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ  は付着初期に齲蝕経験のない群で特に高比率で検出された。Ｇｅｍｅｌｌａ属についてはその他のＧｅｍｅｌｌａ属の菌種（Ｇ．  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｇ．  ｍｏｒｂｉｌｌｏｒｕｍ）については有意差こそ認められないものの齲蝕多発群でより高頻度に検出されており、前年度のＴ−ＲＦＬＰ解析における結果とも良く一致していたと言える。反対に齲蝕多発群において高比率で検出されたのは、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＯＴ５３とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ  であった。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ  は１日目こそ有意差が認められないものの５日間にわたり齲蝕多発群において非常に高比率で検出され、かつコントロール群でほとんど検出されなかった。これらの結果は齲蝕のなりやすさの診断の際の基準となりうる。パイロシーケンスのリード長は４００塩基弱と短く菌種同定精度には若干不安があるため本結果からＳ．  ｏｒａｌｉｓ  であると言い切るには至らないが、齲蝕に関連のある特定のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  属の菌種の存在が示唆されたといえる。ちなみに本ＯＴＵの塩基配列はＳ．  ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．  ｓｏｂｒｉｎｕｓ  とは大きく異なっており、これらの菌種とは考え難い。
【００４３】
１１．考察
本研究から、歯の表面に形成されるデンタルプラークの形成過程には個人差があるが、縁上プラークはほぼ４日間程度で一定の細菌叢に落ち着くことが示唆された。また、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群のプラーク細菌叢はプラーク形成後４日目の菌叢全体像のパターン分析によって明確に識別できた。両群間では年齢に有意な差はなく、齲蝕の誘発に関連する唾液流出量や緩衝能にも有意な差が認められなかったことから、両群間の齲蝕経験の差の大部分はプラークを構成する細菌種の差によって説明できると考えられる。また、本実施例で示された、齲蝕多発群と齲蝕経験のない群との細菌の構成の差は、被験者から採取して解析した細菌の構成から、齲蝕になりやすさの判断の基準となりうる。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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