(57)【要約】【課題】眼瞼疾患を評価できるモデル動物及びスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ヘアレス動物の眼瞼の状態を変化させる方法、その方法により得られる眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物、そのモデル動物の製造方法、そのモデル動物を利用したスクリーニング方法及びそのスクリーニング方法により選択される眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質、ならびに、当該物質を有効成分として含有する眼瞼疾患の治療又は予防剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアレス動物に対して脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限することによるヘアレス動物の眼瞼の状態を変化させる方法。
【請求項２】
眼瞼の状態の変化が、マイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
へアレス動物がへアレスマウス又はヘアレスラットである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
へアレス動物がＨｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウスである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
摂取量を制限する脂質が必須脂肪酸である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
摂取量を制限する必須脂肪酸がリノール酸又はα−リノレン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
摂取量を制限するミネラルがマグネシウムである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
脂質の摂取量を３ｍｇ／ｋｇ／日以下に制限する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
マグネシウムの摂取量を０．１５ｍｇ／ｋｇ／日以下に制限する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＲ−ＡＤ飼料を与えることにより脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限する期間が３日間以上である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により得られる眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物。
【請求項１３】
眼瞼疾患がマイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張を伴う疾患である、請求項１２に記載のモデル動物。
【請求項１４】
眼瞼疾患が眼瞼炎、眼瞼縁炎、マイボーム腺機能不全、マイボーム腺炎又はマイボーム腺梗塞である、請求項１２に記載のモデル動物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法による眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１４のいずれかに記載のモデル動物に被験物質を投与し、その眼瞼の状態を測定することを特徴とする、眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
眼瞼の状態がマイボーム腺又はその周辺の状態である、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
マイボーム腺及びその周辺の状態がマイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
被験物質を点眼投与する、請求項１６〜１８のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択される眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質。
【請求項２１】
請求項２０に記載の物質を有効成分として含有する眼瞼疾患の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘアレス動物の眼瞼の状態を変化させる方法、その方法により得られる眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物、そのモデル動物の製造方法、そのモデル動物を利用したスクリーニング方法及びそのスクリーニング方法により選択される眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質、ならびに、当該物質を有効成分として含有する眼瞼疾患の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイボーム腺は瞼板内にあり、上下の眼瞼縁に開口部を持つ脂腺である。マイボーム腺から分泌される脂質は、眼瞼縁や涙液最表層に分布して、涙液蒸発の抑制、涙液安定性の促進、涙液の眼表面への伸展の促進、眼瞼縁における涙液の皮膚への流出の抑制、等の働きを担っており、マイボーム腺の機能に異常をきたすと、眼瞼炎、マイボーム腺機能不全、マイボーム腺炎又はマイボーム腺梗塞等の眼瞼疾患が引き起こされる。
【０００３】
眼瞼炎は、瞼が炎症を起こしている症状であり、ただれ、かゆみ、痛みを伴い、悪化するとまつ毛が抜けたり、瞼が肥厚したりする。発症部位が、主にまつ毛の根元付近に起こるものを眼瞼縁炎又は前部眼瞼炎、主にまぶたの皮膚に起こるものを眼瞼皮膚炎、マイボーム腺開口部を結ぶ線より結膜側に発症するものを後部眼瞼炎と呼ぶ。また、主に目尻に起こるものを眼角眼瞼炎と呼ぶ。原因としては、細菌等の感染による化膿性のもの、アトピー性のもの、皮脂腺の過剰分泌による脂漏性のものがあり、ステロイド剤、抗生物質、抗ヒスタミン薬等が治療薬として用いられている。
【０００４】
マイボーム腺機能不全とは、マイボーム腺の油脂の出口を含めて、その機能に異常をきたした状態をいう。大別すると、油脂の分泌量が減少する分泌減少型と、油脂の分泌が過剰になる分泌増加型の二つのタイプがある。原因としては、閉塞性、委縮性、先天性等の原発性のものと、酒さ、アトピー、アレルギー性結膜炎、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、移植片対宿主病、トラコーマ、眼感染症、脂漏性皮膚炎、コンタクトレンズ装用、リュウマチ、乾癬、脂質代謝異常、白内障手術、近視矯正手術等に続発する続発性のものがある。症状は目の充血、異物感、乾燥感、灼熱感、かゆみ等多様で、抗生物質等が治療薬として用いられている。
【０００５】
一方、へアレスマウスやヘアレスラットは、その毛がないという特徴から、ヒトの皮膚のモデル動物として医薬品や化粧品の研究に利用されており、ＨＲ−１系へアレスマウスにＨＲ−ＡＤ飼料を与えた場合の皮膚に対する影響を検討した報告がある（Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００５，Ｊｕｎ，１４（６），４６０−４６８（非特許文献１））。しかしながら、へアレス動物に対して脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限することによる眼瞼部への影響を検討した報告はこれまでに存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００５，Ｊｕｎ，１４（６），４６０−４６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
眼瞼疾患の治療又は予防薬の創製には、治療又は予防効果が評価できるモデル動物を利用したスクリーニングが不可欠である。しかしながら、これまでに眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価できるモデル動物は存在しなかった。
【０００８】
そこで、本発明者らは、眼瞼疾患を評価できるモデル動物及びスクリーニング方法を見出すべく鋭意研究を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
その結果、へアレス動物に対して脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限することで、驚くべきことにマイボーム腺開口部が閉塞し、及び／又は、マイボーム腺開口部周辺毛細血管が拡張することを見出した。さらに、これらの症状が既存薬により改善されることも見出した。そして、被験物質を投与した後のこれらの症状を測定することで、眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）ヘアレス動物に対して脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限することによるヘアレス動物の眼瞼の状態を変化させる方法。
【００１１】
（２）眼瞼の状態の変化が、マイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張である、上記（１）に記載の方法。
【００１２】
（３）へアレス動物がへアレスマウス又はヘアレスラットである、上記（１）又は（２）に記載の方法。
【００１３】
（４）へアレス動物がＨｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウスである、上記（１）又は（２）に記載の方法。
【００１４】
（５）摂取量を制限する脂質が必須脂肪酸である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（６）摂取量を制限する必須脂肪酸がリノール酸又はα−リノレン酸である、上記（５）に記載の方法。
【００１６】
（７）摂取量を制限するミネラルがマグネシウムである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（８）脂質の摂取量を３ｍｇ／ｋｇ／日以下に制限する、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
（９）マグネシウムの摂取量を０．１５ｍｇ／ｋｇ／日以下に制限する、上記（７）に記載の方法。
【００１９】
（１０）ＨＲ−ＡＤ飼料を与えることにより脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限する、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（１１）脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限する期間が３日間以上である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法により得られる眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物。
【００２２】
（１３）眼瞼疾患がマイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張を伴う疾患である、上記（１２）に記載のモデル動物。
【００２３】
（１４）眼瞼疾患が眼瞼炎、眼瞼縁炎、マイボーム腺機能不全、マイボーム腺炎又はマイボーム腺梗塞である上記（１２）に記載のモデル動物。
【００２４】
（１５）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法による眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物の製造方法。
【００２５】
（１６）上記（１２）〜（１４）のいずれかに記載のモデル動物に被験物質を投与し、その眼瞼の状態を測定することを特徴とする、眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質のスクリーニング方法。
【００２６】
（１７）眼瞼の状態がマイボーム腺又はその周辺の状態である上記（１６）に記載のスクリーニング方法。
【００２７】
（１８）マイボーム腺及びその周辺の状態がマイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張である上記（１７）に記載のスクリーニング方法。
【００２８】
（１９）被験物質を点眼投与する上記（１６）〜（１８）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２９】
（２０）上記（１６）〜（１９）のいずれかに記載のスクリーニング方法により選択される眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質。
【００３０】
（２１）上記（２０）に記載の物質を有効成分として含有する眼瞼疾患の治療又は予防剤。
【００３１】
尚、上記（１）から（２１）の各構成は、任意に１以上を選択して組み合わせることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、被験物質の眼瞼疾患の治療又は予防効果を簡便に評価することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のヘアレス動物の眼瞼状態の変化方法は、ヘアレス動物に対して脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限することによってヘアレス動物の眼瞼の状態を変化させることを特徴とする。本発明のヘアレス動物の眼瞼状態の変化方法に利用される「ヘアレス動物」とは、毛のない哺乳動物であり（ただし、ヒトは除く）、具体例としては、へアレスマウス、へアレスラット、へアレスハムスター、ヘアレスモルモット、ヘアレスウサギ等が挙げられ、へアレスマウス、ヘアレスラットが好ましく、Ｈｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウスが特に好ましい。Ｈｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウスは、株式会社星野試験動物飼育所により生産されている。へアレス動物の雌雄、週齢、体重については、特に制限はない。
【００３４】
本発明において制限される脂質の種類に特に制限はないが、必須脂肪酸であることが好ましく、リノール酸又はα−リノレン酸が特に好ましい。脂質の摂取制限は、一日の摂取量を３ｍｇ／ｋｇ以下とすることで行われ、２ｍｇ／ｋｇ以下とすることが好ましく、１．５ｍｇ／ｋｇ以下とすることが特に好ましい。また、脂質を制限する方法に特に制限はないが、粗脂質が２質量％以下含まれる飼料を給餌する場合が好ましく、粗脂質が１質量％以下含まれる飼料を給餌する場合がより好ましく、ＨＲ−ＡＤ飼料を給餌する場合が特に好ましい。ＨＲ−ＡＤ飼料は日本農産工業株式会社により製造されている。
【００３５】
本発明において制限されるミネラルの種類に特に制限はないが、マグネシウムが特に好ましい。ミネラルの摂取制限は、一日の摂取量を０．１５ｍｇ／ｋｇ以下とすることで行われ、０．１ｍｇ／ｋｇ以下とすることが好ましく、０．０７５ｍｇ／ｋｇ以下とすることが特に好ましい。また、制限する方法に特に制限はないが、ミネラルが０．１質量％以下含まれる飼料を給餌する場合が好ましく、ミネラルが０．０５質量％以下含まれる飼料を給餌する場合がより好ましく、ＨＲ−ＡＤ飼料を給餌する場合が特に好ましい。
【００３６】
本発明において、脂質及び／又はミネラルの摂取制限は、好ましくは３日間以上、より好ましくは７日間以上、特に好ましくは１４日間以上継続される。
【００３７】
本発明は、上述した本発明のヘアレス動物の眼瞼状態の変化方法により得られる眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物についても提供する。また、本発明は、上述した本発明のヘアレス動物の眼瞼状態の変化方法による眼瞼疾患の治療又は予防効果を評価するためのモデル動物の製造方法についても提供する。
【００３８】
本発明において「眼瞼疾患」とは、眼瞼に生じる疾患をいい、マイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張を伴う疾患であることが好ましい。具体例としては、眼瞼炎、眼瞼縁炎、マイボーム腺機能不全、マイボーム腺炎、マイボーム腺梗塞等が挙げられる。
【００３９】
本発明において「眼瞼炎」とは、瞼が炎症を起こしている症状であり、前部眼瞼炎、眼瞼縁炎、後部眼瞼炎、眼瞼皮膚炎、眼角眼瞼炎等が含まれる。原因として、細菌等の感染による化膿性のもの、アトピー性のもの、脂漏性のもの等がある。
【００４０】
本発明において「マイボーム腺機能不全」とは、マイボーム腺の油脂の出口を含めて、その機能に異常をきたした状態をいい、油脂の分泌が減少する分泌減少型と油脂の分泌が過剰になる分泌増加型とが存在する。原因として、閉塞性、委縮性、先天性等の原発性のものと、酒さ、アトピー、アレルギー性結膜炎、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、移植片対宿主病、トラコーマ、眼感染症、脂漏性皮膚炎、コンタクトレンズ装用、リュウマチ、乾癬、脂質代謝異常、白内障手術、近視矯正手術等に続発する続発性のものがある。
【００４１】
本発明において「マイボーム腺炎」とは、マイボーム腺が炎症を起こしている症状であり、マイボーム腺梗塞は、マイボーム腺の導管内で角化物と油脂の混合物が固まっている症状である。
【００４２】
本発明はさらに、上述した本発明のモデル動物に被験物質を投与し、その眼瞼の状態を測定することを特徴とする、眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質のスクリーニング方法についても提供する。
【００４３】
本発明における「被験物質」としては、公知又は新規の合成又は天然化合物が挙げられる。具体例としては、芳香族化合物、脂肪族化合物、環状又は鎖状ペプチド、タンパク質、糖、核酸及びこれらの誘導体、並びにこれらの塩等が挙げられる。
【００４４】
本発明における被験物質は、経口でも、非経口でも投与することができ、点眼投与が特に好ましい。
【００４５】
被験物質を点眼投与する場合、被験物質を精製水、生理食塩液、緩衝液等に溶解又は懸濁させ、投与することができる。
【００４６】
また、白色ワセリン、流動パラフィン等の基剤を用いて調製した眼軟膏を塗布することにより被験物質を投与することもできる。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法を実施する場合、被験物質の治療効果は、脂質及び／又はミネラルの摂取量を制限して得られたモデル動物に被験物質を投与した後、モデル動物の眼瞼の状態を測定することにより評価できる。一方、被験物質の予防効果は、モデル動物の作製と同時期又はその前に被験物質を投与した時のモデル動物の眼瞼の状態を測定することにより評価できる。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法を実施する場合、被験物質を投与した動物とビヒクルや生理食塩液を投与した動物との眼瞼の状態を比較することが好ましい。また、脂質及び／又はミネラルの摂取量が制限されていない動物を比較対照に用いるのが好ましい。ここで、脂質及び／又はミネラルの摂取量が制限されていない動物とは、通常試料、例えば、粗蛋白質、粗脂質、粗灰分、粗繊維、水分、可溶性無窒素物、ミネラル等が一定の割合で配合された飼料で、好ましくは粗脂質が３〜７質量％、マグネシウムが０．１５〜０．４質量％含まれる飼料、より好ましくは、粗脂質が４〜６質量％、マグネシウムが０．２〜０．３質量％含まれる飼料を給餌することにより得られる動物である。
【００４９】
本発明における眼瞼疾患の治療又は予防効果の評価はモデル動物の眼瞼の状態を測定して行われ、マイボーム腺又はその周辺の状態を測定して行うのが好ましく、マイボーム腺開口部の閉塞及び／又はマイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張を測定して行うのがより好ましい。
【００５０】
マイボーム腺開口部の閉塞を測定して評価する場合は、スリットランプ等を用いてマイボーム腺開口部を観察し、閉塞しているマイボーム腺の数を測定して評価することが好ましい。ここで、「閉塞している」とは、マイボーム腺開口部が白濁して盛り上がった状態、又はマイボーム腺開口部が白色若しくは黄白色に混濁した状態等をいう。スクリーニング基準は投与する被験物質の量や使用する動物種等に応じて設定することができ、特に制限はないが、被験物質投与群の閉塞しているマイボーム腺の数の平均値がビヒクル又は生理食塩液投与群より少ないことが好ましく、被験物質投与群の閉塞しているマイボーム腺の数がビヒクル又は生理食塩液投与群より有意に少ないことがより好ましい。
【００５１】
マイボーム腺開口部周辺毛細血管の拡張を測定して評価する場合は、スリットランプ等を用いてマイボーム腺開口部を観察し、マイボーム腺開口部の間を走行する拡張した毛細血管の数を測定して評価することが好ましい。拡張した毛細血管とは、血管径が拡大した結果、通常視認できない毛細血管が確認できる状態にある毛細血管などをいう。スクリーニング基準は投与する被験物質の量や使用する動物種等に応じて設定することができ、特に制限はないが、被験物質投与群の拡張した毛細血管の数の平均値がビヒクル又は生理食塩液投与群より少ないことが好ましく、被験物質投与群の拡張した毛細血管の数がビヒクル又は生理食塩液投与群より有意に少ないことがより好ましい。
【００５２】
本発明はさらに、上述した本発明のスクリーニング方法により選択される眼瞼疾患の治療又は予防効果を有する物質、ならびに、当該物質を有効成分として含有する眼瞼疾患の治療又は予防剤についても提供する。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
１．ＨＲ−ＡＤ飼料の給餌によるマイボーム腺開口部の閉塞及びマイボーム腺周辺毛細血管への影響
（給餌した飼料）
・通常飼料給餌群：ＣＲＦ−１飼料（オリエンタル酵母工業株式会社製）
・ＨＲ−ＡＤ飼料給餌群：ＨＲ−ＡＤ飼料（日本農産工業株式会社製）
（実験方法）
５週齢の雄性Ｈｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウスを通常飼料給餌群、ＨＲ−ＡＤ飼料給餌群に群分けし（各群６匹）、それぞれに通常飼料、ＨＲ−ＡＤ飼料を給餌し、自発的に摂取させた。給餌開始後、１４日目、２８日目、４２日目に、スリットランプを用いて、マイボーム腺開口部ならびにその周辺を観察し、上眼瞼の中央８個のマイボーム腺開口部の中で、閉塞している開口部の数を計測した。この実験では、「閉塞している」状態として、マイボーム腺開口部が白濁して盛り上がった状態を確認した。また、上眼瞼のマイボーム腺開口部と開口部の間を走行する拡張した毛細血管の本数を計測した。ここで、「拡張した毛細血管」とは、血管径が拡大した結果、通常視認できない毛細血管が確認できる状態にある毛細血管をいう。
【００５５】
（結果及び考察）
マイボーム腺開口部の閉塞数についての結果を表１、拡張毛細血管本数についての結果を表２に示す。
【００５６】
【表１】
2014023526.tif 000002
【００５７】
【表２】
2014023526.tif 000003
【００５８】
ＨＲ−ＡＤ飼料給餌開始後１４日目、２８日目、４２日目において、ＨＲ−ＡＤ飼料給餌群では、通常飼料給餌群に比べ、マイボーム腺開口部の閉塞数の増加、拡張毛細血管本数の増加が認められた。
【００５９】
２．治療薬の効果の確認
（給餌した飼料）
・通常飼料給餌群：ＣＲＦ−１飼料（オリエンタル酵母工業株式会社製）
・ＨＲ−ＡＤ飼料給餌群：ＨＲ−ＡＤ飼料（日本農産工業株式会社製）
（実験方法）
６週齢の雄性Ｈｏｓ：ＨＲ−１系ヘアレスマウスを通常飼料給餌群（６匹）、ＨＲ−ＡＤ飼料給餌群（１２匹）に群分けし、それぞれに通常飼料、ＨＲ−ＡＤ飼料を給餌し、自発的に摂取させた。給餌開始後２８日目に、ＨＲ−ＡＤ飼料給餌群のマイボーム腺開口部をスリットランプを用いて観察し、マイボーム腺開口部の閉塞数の平均値のばらつきが小さくなるように、生理食塩液投与群とＡｚａＳｉｔｅ（登録商標）点眼液（１％  ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）投与群に群分けした（各群６匹）。給餌開始後２９日目より、生理食塩液、ＡｚａＳｉｔｅ（登録商標）点眼液を２８日間点眼した（２μＬ／眼、投与開始１日目および２日目は１日２回、３日目以降は１日１回）。給餌開始後、４２日目、５６日目に、スリットランプを用いて、マイボーム腺開口部を観察し、上眼瞼の中央８個のマイボーム腺開口部の中で、閉塞している開口部の数を計測した。
【００６０】
（結果及び考察）
結果を表３に示す。
【００６１】
【表３】
2014023526.tif 000004
【００６２】
ＡｚａＳｉｔｅ（登録商標）点眼液投与群は生理食塩液投与群に比べ、明らかにマイボーム腺開口部の閉塞数を改善し、本試験系で薬効評価が可能なことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明により、被験物質の眼瞼疾患の治療又は予防効果を簡便に評価することができ、眼瞼疾患の治療又は予防薬を効率的に創製することができる。