(57)【要約】【課題】非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層を用いて、紫外線傷害に対する抵抗性の評価指標を提供することを課題とする。【解決手段】テープストリッピング法によって採取した皮膚角層中のＤＪ−１タンパク質の発現量を指標とする紫外線傷害に対する抵抗性の評価方法。【選択図】図１
2014163715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層のＤＪ−１タンパク質の発現量を測定することを特徴とする、紫外線傷害に対する抵抗性の評価方法。
【請求項２】
被験者の評価対象部位の角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるＤＪ−１の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＤＪ−１タンパク質の発現量を、標本集団の前記評価対象部位の角層のＤＪ−１の発現量分布と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする請求項１記載の評価方法。
【請求項３】
皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである請求項２に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線傷害に対する抵抗性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線傷害は照射された紫外線がメラニンの保護能力を超える時に起こる。紫外線傷害の現象には２種類あり、紫外線にあたった直後には発症せず、２〜６時間後皮膚が赤くなり、６〜４８時間後に痛みが最もひどくなるサンバーン（紅斑：ｓｕｎｂｕｒｎ）と、２４〜７２時間の間、色素沈着が進行するサンタン(ｓｕｎｔａｎ)がある。サンバーンはＵＶＢが表皮を透過し、真皮乳頭体まで達した結果、乳頭体内の毛細血管が炎症反応として充血を起こし、皮膚の色が赤くなった状態（紅斑）を指す。紫外線量がメラニン色素の防御反応を超えると、細胞組織が損傷を受け、発熱や水泡、痛みが起きる。これを日光皮膚炎という。
【０００３】
また、サンタンはＵＶＡがメラノサイトに働きかけ、メラニン色素の生成を促す。ＵＶＡは発赤や炎症を伴うことは無いが、皮膚の新陳代謝を遅らせるためシミを発生する。
これら紫外線傷害の元となっている紫外線には皮膚に対する発ガン作用、白内障等の眼疾患への影響、免疫機能への影響など多くの健康への影響が懸念されている。皮膚においても紫外線にさらされると、様々な紫外線傷害を引き起こす。紫外線は皮膚に炎症を起こしたり、皮膚の不飽和脂質を酸化して脂質ラジカルを発生させ、過酸化脂質を生成する。この様な紫外線による炎症や酸化は組織、細胞、ＤＮＡの傷害を引き起こす。皮膚の紫外線曝露による現象としては一般的に、シワ、シミ、皮膚癌等が挙げられる。
【０００４】
近年、疫学的なデータとして紫外線に対する感受性の違い（肌の色、スキンタイプ等）により皮膚癌のリスクが高まるとの報告もある。さらに皮膚癌の一種である悪性黒色腫（メラノーマ）の危険リスク度はｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ１  ｒｅｃｅｐｔｏｅｒの１塩基置換の遺伝子変異によりリスクが数倍高くなることも明らかとなっている。紫外線に対する感受性はスキンタイプ（紫外線傷害を受けた際のサンバーン、サンタンの状態の違いにより分類）によって大きく異なり、６段階に分類するタイプ別にわけたり、赤み（紅斑）を生じる最小紫外線エネルギー（最小紅斑量：ＭＥＤ)を目安に行われたりするが、前者は主観的観測、また後者は紫外線を当てなくては測定できないというリスクが伴う。オゾン層破壊などにより以前にも増して紫外線増加が問題になっており、個人に対する紫外線への感受性リスク評価も適切に行われる必要がある。
【０００５】
一方、一般的にシミと言われている色素沈着ができる初期段階においては、皮膚表面に顕在化する前に様々な刺激により表皮角化細胞がα−ＭＳＨ、ｂＦＧＦ、ＣＧＲＰ、エンドセリンなどの情報伝達物質を生成し、メラノサイトに伝達される。メラノサイトに伝達された後、細胞内においてメラニン色素が大量に作られる。さらに紫外線によってターンオーバーが異常となり、大量に作られたメラニン色素が排出できないため色素性病変へと変化する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いた実験においてもメラノサイトにＵＶを照射した場合、細胞の増殖因子マーカーであるｐ７３、Ｎｕｐ８８、ｐ２７、Ｉｄ１、ＰＣＮＡが、またアポトーシス関連蛋白質であるｂｃｌ−２の発現が増減したという報告がある（非特許文献１）。
【０００６】
これまでに、バイオプシーによる皮膚組織を用いて侵襲的にシミ部と正常部を比較し、シミ部においてはＮＴ−３、ＡＤＡＭ９、ＨＢ−ＥＧＦといった蛋白質の発現が顕著に増加したという報告がある（特許文献１）。さらに、皮膚のシミ形成を予知する検査方法として、バイオプシーによってＭＬＳＴＤ１、ＭＯＧＡＴ１、Ｍｃｐ９、Ｋｒｔ２−６ｂ等のｍＲＮＡ量を測定し、しみ形成のリスクを判断できるという報告がある（特許文献２、３、４）。また、非侵襲的な方法としてテープストリッピングもしくは擦過を介して採取した皮膚に由来する角層を試料として、インターロイキン１（ＩＬ−１）とインターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の存在量分析をし、肌質の評価をする方法が特許文献５に開示されている。
【０００７】
また本出願人は、非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層からアネキシンII、ブレオマイシン  ハイドロラーゼ、カテプシンＤ、アルギナーゼ−１、ＳＣＣＡ２を検出し、皮膚サンバーンに対する抵抗性の指標とする技術を特許出願した（特許文献６）。また、非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層からブレオマイシン  ハイドロラーゼ、 アネキシンII、カテプシンＤ、アルギナーゼ−１、β−アクチン、ケラチン１４、ケラチン１、ＳＣＣＡ２を検出し、色素沈着傾向の指標とする技術を特許出願した（特許文献７）。
【０００８】
さらにまた、本出願人は、抗酸化作用を有するＤＪ−１タンパク質（別名ＰＡＲＫ-７タンパク質）がアトピー性皮膚炎マーカーとして有用であることを見出して特許出願した（特許文献８）。加えて、近年このＤＪ−１タンパク質が各種疾患のマーカーとして利用可能であることが徐々に明らかになってきている。特許文献９には酸化型ＤＪ−１タンパク質を特異的に認識する抗体が開示されている。そして、この抗体を用いて酸化型ＤＪ−１を測定することでアルツハイマー病やパーキンソン病を診断する方法が提案されている。また特許文献１０には、脳脊髄液や血液などのＤＪ−１タンパク質を測定することで脳傷害性の疾患を診断する方法が開示されている。また特許文献１１には、ＤＪ−１タンパク質を測定することで糖尿病性網膜症を診断する方法と試薬が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２０５２４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１０６７４５号公報
【特許文献３】特開２００５−１１０５０５号公報
【特許文献４】特開２００７−２８９０６３号公報
【特許文献５】特許第３５９０７０８号公報
【特許文献６】特開２０１０−１５１４８２号公報
【特許文献７】特開２００９−００８６０７号公報
【特許文献８】ＷＯ２００７／０４６４６３号公報
【特許文献９】特開２０１０−１８３８４３号公報
【特許文献１０】ＷＯ２００７／０６０８８６号公報
【特許文献１１】特開２００９−１６８８１９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２４（１２）：１９２９−１９３４，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、非侵襲的な手段を用いて採取した皮膚角層を用いて、紫外線傷害に対する抵抗性の評価指標を提供することを課題とする。尚、本発明で言う紫外線傷害に対する抵抗性とは、紫外線曝露による発赤が１５日以内に回復し、また、皮膚の明度も併せて回復することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、ヒトの日焼けを研究する過程で、非侵襲的な手法を用いて得られたヒト皮膚角層のＤＪ−１タンパク質を測定することで紫外線傷害に対する抵抗性を評価できることを見出した。本発明はこの研究成果に基づくものである。
（１）皮膚角層のＤＪ−１タンパク質の発現量を測定することを特徴とする、紫外線傷害に対する抵抗性の評価方法。
（２）被験者の評価対象部位の角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層におけるＤＪ−１の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたＤＪ−１タンパク質の発現量を、標本集団の前記評価対象部位の角層のＤＪ−１の発現量分布と比較する比較工程と、を備えたことを特徴とする（１）記載の評価方法。
（３）皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである（２）に記載の評価方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、紫外線を実際に照射することなく、ヒトの紫外線傷害に対する抵抗性を評価することができる。またバイオプシーなど人体に影響を及ぼす手法ではなく、非侵襲的なテープストリッピング手段を用いて採取した皮膚角層を用いて評価することができるので安全であり、かつ簡便である。
さらにまた本発明により、紫外線による炎症（紅斑）の回復力を評価することが可能となる。
また、紫外線による炎症の回復力が低いと、紫外線曝露による皮膚老化、シワ、シミ、さらには皮膚癌のリスクが高いと推測されるので、紫外線傷害に対する抵抗性の弱い人には、あらかじめ強力なサンスクリーン剤の使用を薦める等の美容カウンセリングを的確に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】紫外線照射した皮膚の１５日後の「赤み」の程度とＤＪ−１の発現量の関係を解析したグラフである。
【図２】紫外線照射した皮膚の１５日後の「白さ」の程度とＤＪ−１の発現量の関係を解析したグラフである。
【図３】ＤＪ−１初期値で分類した被験者に紫外線照射した皮膚の「赤み」の指標であるΔａ*値の経時変化を示すグラフである。
【図４】ＤＪ−１初期値で分類した被験者に紫外線照射した皮膚の「白さ」の指標であるΔＬ*値の経時変化を示すグラフである。
【図５】無作為に選択した成人７１６名のＤＪ−１測定値の分布と累積数を示すグラフである。縦軸左は人数を示し、縦軸右は累積率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
本発明の評価方法は、皮膚角層におけるＤＪ−１タンパク質の存在量を指標とすることを特徴としている。
ＤＪ−１タンパク質とはＰＡＲＫ７とも呼ばれ、分子量１９，８９１Ｄａの細胞内タンパク質である。ＤＪ−１タンパク質はパーキンソン病に関係したタンパク質として同定されていたが、その後皮膚の創傷治癒過程での再上皮化（ｒｅ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）に関与することが明らかになった。また、その立体構造からプロテアーゼとしても働いているという可能性が示唆されている。
皮膚角層は、皮膚の一番上にある組織であり、体の外からの異物や刺激から皮膚を守る働きを有している。
【００１６】
本発明における評価対象部位は、角層が入手できる部分であれば、いかなる部位をも包含しうるが、主な部位としては顔面、頚部、上腕部を挙げることができる。従来の方法に従い、これらの部位の皮膚由来の角層を得ることができる。なお外科的に皮膚を摘出する等の方法は、ユーザーに負担を与えるため、本発明の実施にあたってはテープストリッピング、擦過等の簡便に角層を得られる方法を採用することが好ましい。特にテープストリッピング法が好ましい。
【００１７】
各試料のＤＪ−１タンパク質の発現量は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、ＤＪ−１タンパク質に対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング等の方法を用いることができる。
【００１８】
採取した試料からＤＪ−１タンパク質をそれ自体既知の生化学的方法、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジュネート法を用いて可溶性画分を調製する。可溶性画分を抽出後、速やかにＤＪ−１を測定する。
そしてＤＪ−１タンパク質の発現量が多い人は、紫外線傷害に対する抵抗性が強いものと評価する。
またＤＪ−１の測定結果に基づき、日焼けに注意が必要な者に屋外活動を注意するよう指導することができる。あるいは、ＤＪ−１の測定結果から、紫外線傷害の抵抗性が低いことが判明した場合は、紫外線遮蔽効果の強い化粧料を選択することなどの対処を一人一人が採ることができる。  
そして、従来あいまいな基準で行われていた化粧料選択のカウンセリングを科学的な根拠をもって正確に行うことができる。
【００１９】
本願発明は、テープストリッピング等の非侵襲的な方法によって安全に、かつ容易に皮膚角層を採取して、その皮膚角層を用いて短時間に特定のタンパク質の発現量を測定することができる。このため、化粧品売り場等で簡単に測定して、その場で化粧料選択の情報として活用することができる。この結果に基づいて、適した化粧料を表示することもできる。
【００２０】
本発明を実施するための、皮膚角層の採取とタンパク質の抽出、ＤＪ−１タンパク質発現量の測定は次の操作により実施することができる。
（１）テープストリッピング法による角層の採取
テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に付着した角層を採取する方法である。
市販の粘着テープを用いて、例えばヒト頬部に粘着テープを押し付けることにより、角層を粘着テープに付着させて採取することができる。市販の粘着テープとしてはアサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、ＰＲＯＭＯＴＯＯＬ社製角質チェッカー（ディスクタイプＷ、ディスクタイプＧ、ＰＲＯタイプ）、Ｉｎｔｅｇｒａｌ社製Ｃｏｒｎｅｏｆｉｘ、３Ｍ社製透明テープ、３Ｍ社製透明両面テープ等が挙げられる。
【００２１】
（２）角層からのタンパク質抽出用バッファー
粘着テープに付着した角層から角層タンパク質を抽出するために抽出バッファーを用いる。抽出バッファーとして例えばPBS（０．１％SDS含有）などを例示できる。
【００２２】
（３）角層タンパク質の抽出
角層の付着した粘着テープを円筒容器に入れて、高速回転するホモジナイゼーション用のペッスル（以下、「ペッスル」と呼ぶ）を用いて粘着面を擦ることにより迅速に角層タンパク質の抽出が可能である。粘着テープは粘着面を円筒容器内側に向けて、粘着面の反対面を円筒容器の内側に沿わせるようにして、円筒容器に入れる。粘着テープの粘着面とは反対側の面を円筒容器の内側に沿わせて入れることにより、ペッスルで容易に粘着面を擦ることができる。
あるいは角層の付着した粘着テープを抽出バッファーに浸してスクレーパーで擦って角層タンパク質を抽出しても良く、振盪法や超音波法を用いても良い。
あるいはまた、ガラスビーズを用いてボルテックスミキサーなどの装置によって振盪しながら破砕し、抽出しても良い。
【００２３】
（４）角層タンパク質抽出液の回収
角層タンパク質抽出液を約１分間静置し、泡を沈静化し、その後、円筒容器から角層タンパク質抽出液を吸引して回収する。
【００２４】
（５）角層タンパク質中のＤＪ−１タンパク質の発現量の分析
得られた角層タンパク質抽出液中のＤＪ−１タンパク質は、免疫ブロッティング法、ELISA法、抗体チップ法、FRET法など公知の方法により定量分析することができる。
以下に実施例を示し本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００２５】
１．紫外線照射に対する抵抗性と皮膚角層のＤＪ−１タンパク質量の変化測定
男女１９名の被験者の紫外線照射による皮膚赤みの変化、照射後の回復の程度とＤＪ−１タンパク質の関係を調べた。
＜紫外線照射及び照射前後の皮膚状態の観察＞
健常肌を有する男女19名の上腕内側部にデルマレイ（テルモ・クリニカルサプライ社製）を用いて60mJ/cm2照射（1cm×1cm）紫外線を照射した。紫外線照射前および1、5、8、15日後に分光測色計（SM-500、コニカミノルタ社製）で皮膚色を測定し、皮膚状態を観察した。
また、紫外線照射前および照射8日後に角層チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いてテープストリッピング法により角層を採取した。
【００２６】
＜角層中のＤＪ−１タンパク質発現量の測定＞
ガラスビーズとT-PERバッファー（Thermo scientific）500μlの入ったチューブに角層を採取した角層チェッカーを入れ、25分ボルテックスミキサーにて振盪し、角層タンパク質を抽出した。各サンプルのタンパク量はBCA protein Assay Kit (Thermo Scientific)で測定した。角層抽出液中に含まれるＤＪ−１タンパク質量はHuman Park7/ＤＪ−１タンパク質 DuoSet  (R&D systems社製)を用いて定量した。タンパク質測定、ＤＪ−１タンパク質の測定はキットの測定マニュアルに従った。ＤＪ−１タンパク質量はタンパク質１μｇ当たりのＤＪ−１量（ｐｇ/μｇ  Protein）で表した。
【００２７】
＜測定結果の解析＞
（１）紫外線照射に伴う赤み（発赤）変化とＤＪ−１タンパク質量の関係解析
紫外線照射15日目の赤みの指標であるΔa*値より以下の2群に分けた。
「赤みが戻らない」：15日目にΔa*値が１以上の被験者( 7名)
「赤みが戻る」    ：15日目にΔa*値が1未満の被験者(12名)
なお「赤みが戻る」と評価した被験者は紫外線抵抗性があるといえる。
【００２８】
「赤みが戻らない」群のＤＪ−１タンパク質の測定結果：
ＤＪ−１タンパク質中央値：1.60pg/μg  protein、平均値：1.52 pg/μg  protein
「赤みが戻る」群のＤＪ−１タンパク質の測定結果：
ＤＪ−１タンパク質中央値：2.59pg/μg  protein、平均値：2.66 pg/μg  protein
二群間の有意差検定を、マン・ホイットニーＵ検定法を用いて行った。
二群のＤＪ−１タンパク質の測定値には有意差があり、「赤みが戻る」群の被験者のＤＪ−１タンパク質は「赤みが戻らない」群の被験者に比較して高い値を示した。その境界値は２ｐｇ/μg  protein付近であった。二群のＤＪ−１タンパク質量の比較と検定結果を図１に示した。
【００２９】
（２）紫外線照射後の「白さ」の回復程度による解析
15日目のΔL*値より以下の2群に分けた。
紫外線照射前より「白さが戻らない」：15日目にΔL*値が-1未満の被験者( 6名)
紫外線照射前の「白さが戻る」      ：15日目にΔL*値が-1以上の被験者(13名)
なお「白さが戻る」とした被験者は紫外線抵抗性があるといえる。
【００３０】
「白さが戻らない」：ＤＪ−１タンパク質中央値：1.59pg/μg  protein、平均値：1.46 pg/μg  protein
「白さが戻る」：ＤＪ−１タンパク質中央値：2.11pg/μg  protein、平均値：2.60 pg/μg  protein
二群間の有意差検定を、マン・ホイットニーＵ検定法を用いて行った。
二群のＤＪ−１タンパク質の測定値には有意差があり、「白さが戻る」群の被験者のＤＪ−１タンパク質は「白さが戻らない」群の被験者に比較して高い値を示した。その境界値は２ｐｇ/μg  protein付近であった。二群のＤＪ−１タンパク質量の比較と検定結果を図２に示した。
以上の１．２．の解析結果から、ＤＪ−１タンパク質の発現量は日焼けからの回復能力の指標となりうることが明らかとなった。
【００３１】
（３）ＤＪ−１タンパク質初期値による「赤み」、「白さ」の解析
紫外線照射0日目のＤＪ−１タンパク質量（初期値）の上位30%、下位30%の被験者に分け、「赤み」と「白さ」の状態を比較解析した。「ＤＪ−１タンパク質少」に分類した被験者6名のＤＪ−１タンパク質初期値は0.65-1.59 pg/μg  proteinに分布していた。
一方「ＤＪ−１タンパク質多」に分類した被験者６名のＤＪ−１タンパク質初期値は、2.87-4.85 pg/μg  protein に分布していた。
紫外線照射後の皮膚の「赤み」を示すΔa*の変化を図３に示した。紫外線照射15日後には、ＤＪ−１の初期値の高い群は、「赤み」を示すΔa*値が０まで低下し、発赤から回復したことが確認された。一方、ＤＪ−１の初期値の低い群は紫外線照射１５日後もΔa*値は殆ど低下しなかった。紫外線照射１５日目のＤＪ１の高い群と低い群の赤みの差は、マン・ホイットニーのＵ検定で５％の危険率で有意であった。このことから、ＤＪ−１の初期値の高い群は、紫外線傷害からの回復力を有することが分かった。
【００３２】
紫外線照射後の皮膚の「白さ」を示すΔL*の変化を図４に示した。図４に示すとおり紫外線照射２４時間後の皮膚の「白さ」の程度はＤＪ−１の初期値の高い群がＤＪ−１の初期値の低い群に比べて高い値を示した。このことからＤＪ−１の高い群は、ＤＪ−１の低い群より紫外線抵抗性を有していることが分かった。
【００３３】
また紫外線照射15日後には、ＤＪ−１の初期値の高い群は、「白さ」を示すΔL*値が上昇しほぼ初期値まで回復したことが確認された。一方、ＤＪ−１の初期値の低い群は紫外線照射１５日後もΔL*値は殆ど変化しなかった。紫外線照射１５日目のＤＪ−１の高い群と低い群のΔL*の差は、マン・ホイットニーのＵ検定で５％の危険率で有意であった。このことから、ＤＪ−１の初期値の高い群は、紫外線傷害からの回復力を有することが分かった。
【００３４】
以上の紫外線照射後の皮膚の「赤み」変化、「白さ」変化とＤＪ−１初期値の解析結果から、ＤＪ−１を指標として、紫外線傷害に対する皮膚の抵抗性と回復性を評価することが可能であることが分かった。またその抵抗性の境界はＤＪ−１を指標とした場合２ｐｇ/μg  protein付近にあるものと予想される。
【００３５】
２．無作為選抜した205名のＤＪ−１タンパク質量の分布と紫外線傷害抵抗性予測
（１）試験試料の採取
無作為に選抜した女性205名を対象として、頬よりテープストリッピング法によって角層サンプルを採取した。サンプルは1部位より1枚採取した。
【００３６】
（２）角層中ＤＪ−１測定
ガラスビーズとT-PERバッファー（Thermo scientific社）500μlの入ったチューブに角層を採取した角層チェッカーを入れ、25分ボルテックスミキサーにて振盪し、角層タンパク質を抽出した。各サンプルのタンパク量はBCA protein Assay Kit (Thermo Scientific社)で測定した。測定には角層サンプルを10μlに reagentA: reagentB=50:1で混和した液200μlを加え、60℃30分でインキュベーションしたのち、562nmの吸光度で測定した。同時にウシ血清アルブミン（BSA）で検量線を作成した。この検量線と吸光度の値からタンパク量を算出した。
角層抽出液中に含まれるＤＪ−１量はHuman Park7/ＤＪ−１ DuoSet  (R&D systems社)を用いて定量した。測定結果を０．５ｐｇ/μｇ  ｐroteinきざみの人数及び累計率として図５に示した。
【００３７】
図５に示したとおり、無作為に抽出した２０５名のＤＪ−１タンパク質の角層内の発現量は、0.29pg/μg proteinから8.8ｐｇ/μｇ  ｐroteinまでの広い範囲で分布していた。平均値は2.6pg/μg  proteinであった。
１の試験で予測した２ｐｇ/μｇ  ｐroteinを紫外線傷害抵抗性の境界値とすると、約４０％の被験者は紫外線傷害の抵抗性が低いと予測した。
【図１】
2014163715.tif 000003
【図２】
2014163715.tif 000004
【図３】
2014163715.tif 000005
【図４】
2014163715.tif 000006
【図５】
2014163715.tif 000007