(57)【要約】      （修正有）【課題】レーザー顕微解剖領域の画定方法及びレーザー顕微解剖システムの提供。【解決手段】プレパラートの或る部分１０を表現する第一のデジタル画像１１、１２、１３、２１、２２を捕捉し、プレパラートの同じ部分１０の少なくとも１つの第二の画像１１、１２、１３を捕捉する、レーザー顕微解剖方法において、第一のデジタル画像と第二のデジタル画像が互いに重ね合わされることで、プレパラートの同じ部分１０のライブオーバーレイ画像２１、２２、２３、３４がライブモードで生成され、レーザー顕微解剖領域を画定するために、マーキング３１０、３２０、３３０、３４０がライブオーバーレイ画像上で生成され、第一のデジタル画像が第一の顕微鏡検査方法によりプレパラートの部分１０を表現し、少なくとも１つの第二のデジタル画像が少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法によりプレパラートの同じ部分１０を表現する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー顕微解剖システム（１００）のホルダー（１０３）により保持されるプレパラート（１０４）のレーザー顕微解剖領域のレーザー顕微解剖を行う方法において、
前記レーザー顕微解剖システム（１００）の制御装置（１１５）によって前記ホルダー（１０３）を保持位置へ駆動するステップと、
前記プレパラート（１０４）の或る部分（１０）を表現する第一のデジタル画像（１１、１２、１３、２１、２２）を捕捉するステップと、
前記プレパラート（１０４）の同じ前記部分（１０）の少なくとも１つの第二の画像（１１、１２、１３）を捕捉するステップと、
を有し、
前記プレパラート（１０４）の同じ前記部分（１０）のライブオーバーレイ画像（２１、２２、２３、３４）が、前記第一のデジタル画像と前記少なくとも１つの第二のデジタル画像を互いに重ね合わせることによって、ライブモードで生成されて、表示エリア（１１８）に表示され、
前記レーザー顕微解剖領域を画定するために、マーキング（３１０、３２０、３３０、３４０）が前記ライブオーバーレイ画像上で生成され、捕捉され、
前記第一のデジタル画像が少なくとも１つの第一の顕微鏡検査方法により前記プレパラート（１０４）の前記部分（１０）を表現し、前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法により前記プレパラートの同じ前記部分（１０）を表現する、方法。
【請求項２】
前記ホルダー（１０３）が、前記第一のデジタル画像及び／又は前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が捕捉される前に、前記保持位置に固定され、前記マーキング（３１０、３２０、３３０、３４０）の捕捉後まで固定されたままとされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レーザー顕微解剖によって前記マーキング（３１０、３２０、３３０、３４０）に沿って前記レーザー顕微解剖領域を切り出すステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホルダー（１３０）が、前記第一のデジタル画像及び／又は前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が捕捉される前に、前記保持位置に固定され、前記レーザー顕微解剖領域の切り出し後まで固定されたままとされる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のデジタル画像と前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が高いピクセル精度で重ねられる、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第一のデジタル画像と前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が、前記プレパラートの同じ前記部分を同じ倍率で捕捉する、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のデジタル画像と前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が、前記プレパラートの同じ前記部分を異なる倍率で捕捉し、前記ライブオーバーレイ画像を生成するために、低倍率のほうの前記少なくとも１つのデジタル画像がより高倍率に電子的に拡大される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のデジタル画像を前記制御装置の計算ユニットに移入するステップを更に含み、前記第一のデジタル画像を移入するステップが、前記第一のデジタル画像取得時の前記レーザー顕微解剖システムに関する前記プレパラートの局所座標を移入するステップを含み、
前記保持位置への駆動は前記局所座標に基づいて行われる、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のデジタル画像を保存するステップ及び／又は、
前記少なくとも１つの第二のデジタル画像を保存するステップ及び／又は、
前記オーバーレイ画像（２１、２２、２３、２４）を保存するステップ及び／又は、
前記保持位置の前記局所座標を保存するステップ
を更に有する、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
更なるデジタル画像を捕捉するステップを含み、
前記更なる画像が更なる種類の照明により前記プレパラートの前記部分（１０）を表現し、
前記第一のデジタル画像と前記少なくとも１つの第二のデジタル画像と前記更なるデジタル画像とが前記オーバーレイ画像の中で互いに重ね合わされる、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のデジタル画像が、第三のデジタル画像（１１、１２、１３）と第四のデジタル画像（１１、１２、１３）が互いに重ね合わされた第二のオーバーレイ画像（２１、２２、２３）であり、前記第三と前記第四のデジタル画像が異なる種類の照明による前記プレパラートの前記部分（１０）を表現する、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
レーザー顕微解剖システム（１００）の制御装置（１１５）によって実行される時に、前記装置に請求項１〜１１の何れか一項による方法ステップを実行させるプログラムコード手段を有するコンピュータプログラム。
【請求項１３】
レーザー顕微解剖システム（１００）の制御装置（１１５）によって実行される時に、前記装置に請求項１〜１１の何れか一項による方法ステップを実行させるプログラムコード手段を有するコンピュータプログラムが記憶された機械可読記憶媒体。
【請求項１４】
プレパラート（１０４）のためのホルダー（１０３）と、
前記ホルダー（１０３）を保持位置へ駆動する制御装置（１１５）と、
第一と少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法により前記保持位置にある前記プレパラート（１０４）の或る部分（１０）を捕捉する顕微鏡（１０１）と、
前記プレパラート部分の第一と少なくとも１つの第二のデジタル画像（１１、１２、１３）をそれぞれ捕捉するデジタル画像捕捉装置（１１７、１２３）と、
レーザー顕微解剖領域のダイセクションを、前記プレパラート部分（１０）から所定のマーキング（３１０、３２０、３３０、３４０）に沿って前記領域をレーザーカットすることによって行うレーザー装置（１３０）と、
を有するレーザー顕微解剖システム（１００）において、
前記第一と少なくとも１つの第二のデジタル画像（１１、１２、１３）とがライブモードで重ねられ、表示エリア（１１８）上にライブオーバーレイ画像として表示されるようにセットアップされた計算ユニット（１２３）を前記デジタル画像捕捉装置が備えて構成され、前記第一のデジタル画像が前記第一の顕微鏡検査方法により生成され、前記少なくとも１つの第二のデジタル画像が前記少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法により生成され、
前記プレパラート部分（１０）内の前記レーザー顕微解剖領域を画定するために、前記ライブオーバーレイ画像上に生成された前記マーキング（３１０、３２０、３３０、３４０）を捕捉するマーキング捕捉ユニット（１２４）が設けられる、レーザー顕微解剖システム。
【請求項１５】
前記デジタル画像捕捉装置が、前記第一及び／又は前記少なくとも１つの第二のデジタル画像のほか前記オーバーレイ画像を保存する一時メモリーを有する、請求項１４に記載のレーザー顕微解剖システム。
【請求項１６】
前記画像捕捉装置の前記一時メモリーと前記計算ユニット（１２３）及び／又は前記マーキング捕捉ユニット（１２４）が、前記制御装置（１１５）の、及び／又は関連するコンピュータ（１２０）の構成要素である、請求項１５に記載のレーザー顕微解剖システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザー顕微解剖システムのホルダーにより保持されているプレパラート上のレーザー顕微解剖領域の画定方法に関する。プレパラートの或る部分の第一のデジタル画像と同じ部分の第二のデジタル画像を重ね合わせたオーバーレイ画像を表示エリア上に表示する。オーバーレイ画像上で、マーキングを生成し、捕捉してレーザー顕微解剖領域を画定する。本発明は更に、これに対応するレーザー顕微解剖システムと、上記の方法を実行するためのプログラムコード手段を有するコンピュータプログラムと、このコンピュータプログラムを保存するためのコンピュータ可読記憶媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
レーザー顕微解剖は、顕微鏡検査中の組織検体から選択された組織領域又は細胞を、更に分析するために、集束レーザービームを利用して切り出す（ダイセクション；解剖）方法である。このために、プレパラートの顕微鏡検査領域をコンピュータの援用によりディスプレイ上でデジタル電子画像として視覚化する。その後、この電子画像の上で分析すべき小領域をマーキングし、分離する。
【０００３】
特許文献１は、いわゆる「連続切片カッティング」（ＳＳＣ）の一例に関する。同文献には、第一の検体切片の（第一の）画像と第二の検体切片の（第二の）画像が生成される顕微解剖方法が記載されている。第一の画像内で画定された標的領域に基づいて、第二の画像及びそれに対応する第二の検体切片の中の標的領域が選択され、その後、この領域が例えばレーザービームによって切り出される。それゆえ、切り抜き線を画定するために２つの異なる検体切片の特性が伝送される。２つの画像を重ねることにより、第一の画像の領域が第二の画像のそれと確実に合致する。
【０００４】
特許文献２は、順に背後に配置された複数の組織切片を有する切片スタックの中の、第一の、未処理の切片の画像を、別の、第二の、処理済みの準備された切片の画像とデジタル処理で重ねることによって観察対象の領域を決定する方法を開示している。第二のプレパラート切片は切片スタックにおいて第一の切片に隣接しており、例えば特定の構造が認識可能となるような方法で染色することができる。隣接する切片の、染色又はその他の処理を利用して可視化された特徴は、画像を重ねることにより、未処理の第一の切片上の解剖領域の選択に用いることができる。それゆえ、この方法によれば、解剖部位（dissectate）が未処理の状態に保たれ、それゆえ、その後の分析のために当初の状態のまま入手できるようなダイセクションが可能となる。
【０００５】
切片スタックの中の隣接するプレパラート切片は相互に類似するが、通常はその構造の点で同じではない。これに加えて、異なるプレパラート切片の処理と観察のためには一般に、第一の切片の画像を顕微鏡下で捕捉し、その後、顕微鏡のステージから取り外す必要があり、取り外してからでないと第二のプレパラート切片を観察することができず、また第二のプレパラート切片を同じ位置に設置しなければならない。これには多大な時間と労力が費やされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／００４５７９０Ａ１号明細書
【特許文献２】オーストリア特許公告第５０５６６９Ａ４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、解剖領域の選択とマーキングのために費やされる時間と労力を削減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的は、特許請求の範囲の独立項の特徴を有する方法、レーザー顕微解剖システム、コンピュータプログラム、コンピュータ可読記憶媒体によって達成される。好ましい実施形態は、それぞれの従属項と以下の説明の主旨である。
【０００９】
本発明による方法は、レーザー顕微解剖システムのホルダーよって保持されるプレパラートの或る部分におけるレーザー顕微解剖領域を画定するのに適している。ホルダーは例えば、顕微鏡の顕微鏡ステージとすることができ、この顕微鏡によってプレパラート部分の拡大画像を生成できる。プレパラートの或る部分の顕微鏡検査のために、本発明によれば、ホルダーの保持位置への駆動はレーザー顕微解剖システムの制御装置によって行われる。保持位置は、光学顕微鏡の光軸に関して固定され、対象物の視野内に位置付けられる。制御ユニットは、例えば、それぞれの顕微鏡検査領域を光学的に観察している使用者によって操作されても、又は事前に設定された局所座標へと駆動してもよい。本発明による方法は更に、プレパラートの或る部分を表現する第一のデジタル画像の捕捉と、同じ部分の第二のデジタル画像の捕捉と、第一と第二のデジタル画像を重ね合わせたオーバーレイ画像の生成及び表示エリアでの表示と、を含む。
【００１０】
第一のデジタル画像は、少なくとも１つの第一の顕微鏡検査方法によってプレパラートのその部分を表現する。第二のデジタル画像は、第一のそれとは異なる少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法によってプレパラートの同じ部分を表現する。
【００１１】
第一と第二の顕微鏡検査方法は各々、例えば、特定の種類の照明（例えば、特定の照明方向、入射又は透過照明、選択された光フィルター及び／又は特定波長の使用等）の使用によって、又は１つ又は複数の選択された蛍光励起によって、又は対比を利用した方法（例えば、位相差方式等）によって、又はこれらの方法の組み合わせによって決定可能である。
【００１２】
本発明によれば、レーザー顕微解剖領域を画定するためのマーキングがオーバーレイ画像上に生成され、捕捉される。
【００１３】
ここでは、オーバーレイ画像が表示エリアに「ライブ」モードで表示されるライブ画像であることが重要である。「ライブ」画像、即ち「ライブ」モードで表示される画像は、本願の内容においては、ワーキングメモリー又はそれに対応する一時記憶装置に保存され、即座に表示、処理可能な画像として理解されるものとする。それゆえ、特にリアルタイムでのアクセスを含め、即時フルアクセスが可能である。逆に言えば、これは、本発明による方法では、外部の画像データベース又は相応の不揮発性メモリー及び相応の電子画像処理ソフトウェアの使用を不要にできることを意味し、それは、この方法には重ねるべき画像だけを一時的に保存すればよいからである。必要なのは画像を重ねるためのアルゴリズムの実行だけである。ライブオーバーレイ画像に基づいて、どの領域のダイセクション（細かな切り分け）を行うかに関する決定を直ちに下すことができる。それゆえ、大きな画像スタックを不揮発性メモリーに保存して、その後処理する必要がなく、同じ対象領域に何度も移動して戻る必要もない。これに加えて、２種類又はそれ以上の顕微鏡検査方法を使ってプレパラートの或る部分の画像を生成し、これを積み重ねて保存することも不要となる。その代わりに、利用可能な顕微鏡検査方法の中から解剖領域の選択とマーキングに特に適した２つ（又はそれ以上）を瞬時に選択できる。
【００１４】
従って、選択された第一の顕微鏡検査方法に基づいてプレパラートの或る部分の第一のデジタル画像をライブモードで生成し、一時的に保存する。選択された第二の顕微鏡検査方法によって同じ部分の第二のデジタル画像を生成し、表示エリアに表示する。次に、第一と（少なくとも１つの）第二のデジタル画像を重ねてライブオーバーレイ画像とする。ライブモードで、次にレーザー顕微解剖領域を画定するためのマーキングを生成し、その後に行われるレーザーマイクロダイレクションのために捕捉する。
【００１５】
それゆえ、本発明によるレーザー顕微解剖方法は、遅延のない方法で、それゆえ、より迅速に、使用者にとってより経済的かつ、より人間工学的に動作し、それは、画像のオーバーレイが別のソフトウェアモジュールに依存せずに、レーザー顕微解剖制御ソフトウェアのユーザープログラムの中で直接、リアルタイムで行うことができ、その後、ライブオーバーレイ画像の中に直接、所望のマーキングを生成でき、その目的のために画像を運び出し及び移入する工程が不要となるからである。保持位置の転送や変換もまた省略できる。
【００１６】
ライブオーバーレイ画像は、好ましくは制御装置のソフトウェアプログラムによって生成され、例えば、関連するピクセル値の追加を利用して生成でき、第一と第二のデジタル画像の両方の特定の特徴を表す。従って、マーキングはこれらの特徴を考慮して行うことができる。プレパラートは、第二と第一の画像を捕捉する合間に移動又は再配置する必要がない（但し、その排除が意図されるわけではない）。特に、第二のプレパラートを所定の位置に置く必要がなく、顕微鏡検査方法を変えさえすればよい。本発明による方法はそれゆえ、ダイセクションの対象となる領域を迅速かつ正確に選択することを可能にする。
【００１７】
好ましい実施形態において、ホルダーは第一のデジタル画像及び／又は第二のデジタル画像（即ち、第一のデジタル画像及び第二のデジタル画像の少なくとも一方）を捕捉する前に保持位置に固定され、マーキングの捕捉後まで、又はレーザー顕微解剖領域の切り出し後まで固定されたままとされる。これによって、簡単で迅速な方法でプレパラートのその部分は第一のデジタル画像の捕捉時に第二のデジタル画像の捕捉時と同じ位置に位置付けられ、従って２つの画像が正確に重ねられ、及び／又はダイセクションがマーキングに従って正確に行われることが保証されるようにすることが可能となる。
【００１８】
レーザー顕微解剖に関する現在の要求を満たすために、重ねるべき画像が高いピクセル精度で重ねられれば有益である。高いビクセル精度での重ね合わせは、電子的及び／又は光学的に実現できる。電子的な方法としては、相応の画像処理ソフトウェアプログラムが、特定された画像の特徴に基づいて、画像を高いピクセル精度で重ねることができる。他方で、光学的方法では、異なる顕微鏡検査方法を用いて取得される画像が、画像センサーにより、高いピクセルスケール精度で、即ち相互に関して移動されずに取得されることが保証され、その結果、状況によっては画像シフトのその後の電子的な修正を完全に省くことができる。
【００１９】
この種の光学的な「ゼロピクセルシフト」方式は、例えば独国特許第１０３２１０９１ Ｂ４号明細書又は独国特許第１０ ２００５ ０４５ １６５ Ｂ４号明細書から知られている。独国特許第１０３ ２１ ０９１ Ｂ４号明細書によれば、重ねるべき画像は２つの顕微鏡検査方法、即ち一方で透過光干渉顕微鏡法（ＩＣＴ）と、他方で蛍光顕微鏡法によって取得される画像である。ＩＣＴ法で分析器として使用される偏向フィルターは、蛍光観察時には光路から外されるが、最大で約３分間、ビームを若干偏向させる。例えば、顕微鏡が焦点距離２００ｍｍのチューブレンズを有する場合、この種の分析器の場合、検体の中間画像を最大で１７５μｍのオフセットを発生させる。その結果として今度は、約８μｍのピクセルサイズを有するＣＣＤカメラにおいて、画像はその分析器によって約２０ピクセル分オフセットされる。このピクセルオフセットを排除するために、この文献では２つのガラスウェッジプレートが提案されており、これらは分析器のすぐ背後に配置され、これが分析器によって発生したビーム偏向をゼロに戻す補償を行うように実施され、そのように向けられる。
【００２０】
もう一方の特許文献、独国特許第１０ ２００５ ０４５ １６５ Ｂ４号明細書では、蛍光キューブのブロッキングフィルターによって発生したビームオフセットが補償される。このビーム偏向はわずか約１０”であるが、依然として約１．５ピクセル分のオフセットを発生させることができる。このピクセルオフセットをゼロに低減させるために、この文献では、ブロッキングフィルター基板、即ちその上に薄膜システムが実装されるブロッキングフィルターの透明基板を、ウェッジ角度を有する透明ウェッジプレートとして実施することと、これらを光軸に関して、ビーム偏向ができるだけ小さくなるように、或いはまったくないように整列させることが提案されている。同じことが、蛍光キューブ内にあるダイクロイックビームスプリッタにも当てはまり、これは（ブロッキングフィルターのように）ビーム偏向を発生させることができる。
【００２１】
高いピクセル精度で重ね合わせるために提示された方法の代わりに、特定の顕微鏡検査方法によって発生したピクセルシフトを測定し、画像の重ね合わせの点でそれを考慮に入れ、補償することが可能である。
【００２２】
次に、重ねられたライブ画像の上のマーキングを、理想的には、アクティブライブ画像に高いピクセル精度で転写しなければならず、このマーキングに沿ってレーザーを高いピクセル精度で案内しなければならない。オーバーレイ画像はもちろん、運び出して画像メモリーに保存し、後の文書化に備えることができる。
【００２３】
第一のデジタル画像が第一の、早い段階における顕微鏡下でのプレパラートの表現であり、第二のデジタル画像が第二の、その後の段階における、但し特に現在の観察時点における顕微鏡下のプレパラートの表現であれば有益でありうる。
【００２４】
第一のデジタル画像の捕捉は、第一のデジタル画像を外部の記憶媒体から制御装置の計算ユニットに移入することを含むことができ、この第一のデジタル画像はそれまでに取得され、その外部の記憶媒体に保存されたものである。この実施形態において、第一のデジタル画像を移入することは、第一のデジタル画像の取得に関する局所座標を移入することを含み、これは好ましくは、より早い段階において行われた画像取得の点で、レーザー顕微解剖システムに関するプレパラートの局所座標を含む。この場合、保持位置への駆動はこの局所座標に基づいて行われる。
【００２５】
外部に保存された画像はこれによって、第一のデジタル画像として使用できる。制御ソフトウェアは好ましくは、レーザー顕微解剖システムを、移入された局所座標に基づいて、プレパラートがレーザー顕微解剖システムに関して第一のデジタル画像の取得時と同じ位置に移動されるような方法で方向付ける。これによって、第一と第二の画像を正確に重ねること、及び／又はマーキングに従って（これはマークに沿うことを含む）正確にダイセクションを行うことが可能となる。
【００２６】
第一のデジタル画像と（少なくとも１つの）第二のデジタル画像は、プレパラートの中の同じ部分を同じ倍率で捕捉できる。倍率は、レーザー顕微解剖に使用される顕微鏡の顕微鏡倍率によって周知の方法で決定される。しかしながら、その代わりに、第一のデジタル画像と（少なくとも１つの）第二のデジタル画像がプレパラートの中の同じ部分を異なる倍率で捕捉すれば有利でありうる。プレパラートの関連部分は、例えば、そのプレパラート部分の隣接領域も表現される概観画像の形態の第一のデジタル画像で表現され、その一方で、第二のデジタル画像は、例えば、実質的に関連部分だけを高倍率で表現する。ライブオーバーレイ画像を生成するには、より低倍率の（少なくとも１つの）デジタル画像をより高倍率に電子的に拡大する。このような手順により、例えば別の解剖領域が位置特定されるかもしれない場合に、解剖領域の位置特定がより容易となる。
【００２７】
この方法は好ましくは、第一のデジタル画像を保存すること、及び／又は第二のデジタル画像を保存すること、及び／又はオーバーレイ画像を保存すること、及び／又は保持位置の局所座標を保存することを含む。それによって、これに対応するデータが保持され、例えばその後の分析において、又はダイセクション工程の記録／文書化に利用できる。保持位置の局所座標を保存する場合、いったんマーキングを捕捉すると、（例えばプレパラートの別の領域にマーキングするために）プレパラートをまず外し、又は別の位置に移動し、その後、その領域のダイセクションのために保持位置に戻すことができる。その結果、一方で複数の領域をマーキングするステップと、他方でそれらの領域をダイセクションするステップを相互に分離することができる。
【００２８】
この方法は別のデジタル画像の捕捉を含むことができ、別のデジタル画像は、好ましくは第一と第二の顕微鏡検査方法とは異なる少なくとも１つの別の顕微鏡検査方法により、プレパラート部分を表現する。第一のデジタル画像と第二のデジタル画像と更に別のデジタル画像はその後、重ね合わせてオーバーレイ画像とすることができる。
【００２９】
それゆえ、例えばマーキングの点で、プレパラートの中の、３つ又はそれ以上の顕微鏡検査方法を連続して使用することによってのみ可視化できる部分に関するデータを取り込むことができる。
【００３０】
第一のデジタル画像は、今度はオーバーレイ画像とすることができ、これを本明細書においては区別しやすいように「第二のオーバーレイ画像」と呼ぶ。すると、上記のオーバーレイ画像は第一のオーバーレイ画像となり、この中では（第一のデジタル画像で構成される）第二のオーバーレイ画像と第二のデジタル画像が重ね合わされている。第一のオーバーレイ画像は、第三のデジタル画像と第四のデジタル画像を重ねることから生成でき、又はすでに生成されていてもよく、この点で、第三と第四のデジタル画像は、プレパラートの中の、第二のデジタル画像と同じ部分を示しているが、相互に異なり、また第二の顕微鏡法とも異なるそれぞれ第三と第四の顕微鏡検査方法に基づいて生成されたものである。
【００３１】
前述の場合と同様に、これによって、第三と第四の照明方法から得ることのできる別の情報を取り入れることが可能となる。第一のデジタル画像が制御装置の計算ユニットに移入される上記の実施形態と組み合わせることによって、第二のオーバーレイ画像はまた、例えば特別な画像処理ソフトウェアプログラムを利用して、すでに生成され、及び／又は外部に保存されていてもよい。
【００３２】
マーキングは、例えば、パターン認識ソフトウェアプログラムを利用して自動的に生成されても、使用者が手で入力してもよい。表示エリアは例えば、グラフィカルユーザーインタフェースとすることができ、その上で使用者はコンピュータ用入力手段を利用して、例えばカーソルの位置付けと移動又はコンピュータ機能の呼び出し等の作業を行うことができ、それによってマーキングを生成できる。
【００３３】
マーキングは例えば、マーキングの特定の形状（例えば、長方形、正方形、楕円形又は円形）を画定する、選択された所定の仕様に従って実現することができる。これによってマーキングはより容易に、それゆえより早くなる。
【００３４】
本発明は更に、上で詳しく説明した本発明による方法を実行するためのレーザー顕微解剖システムに関する。この目的のために、レーザー顕微解剖システムは、プレパラートのホルダーと、ホルダーを保持位置へと駆動する制御装置と、第一と少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法によってプレパラートの保持位置におけるプレパラートの或る部分を捕捉する顕微鏡と、それぞれ上記のプレパラート部分の第一と少なくとも１つの第二のデジタル画像を捕捉するためのデジタル画像捕捉装置と、を含む。システムは更に、レーザー顕微解剖領域のダイセクションを、その領域をプレパラート部分から所定のマーキングに沿ってレーザーで切り出すことによって行うレーザー装置を含む。デジタル画像捕捉装置は、この点に関して、第一と少なくとも１つの第二のデジタル画像がライブモードで重ねられ、表示エリアにライブオーバーレイ画像として表示されるような方法で設定される計算ユニットを含み、第一のデジタル画像は上記の第一の顕微鏡検査方法で生成され、少なくとも１つの第二のデジタル画像は上記の少なくとも１つの第二の顕微鏡検査方法で生成される。最後に、レーザー顕微解剖システムは、ライブオーバーレイ画像の上に生成された、プレパラート部分の中のレーザー顕微解剖領域を画定するためのマーキングを捕捉するマーキング捕捉ユニットを含む。レーザー顕微解剖領域のダイセクションはその後、捕捉されたこのマーキングに基づくレーザーカットによって実現され、ホルダーは好ましくは、レーザーカット中に保持位置に固定されたままとされる。
【００３５】
本発明によるレーザー顕微解剖システム及び上記システムの可能な実施形態の利点に関しては、本発明によるレーザー顕微解剖方法に関する上述の全文を引用できる。レーザー顕微解剖システムのデジタル画像捕捉装置は好ましくは、第一及び／又は少なくとも１つの第二のデジタル画像のほかオーバーレイ画像を保存する一時メモリーを含む。すでに詳しく上述したように、本発明ではバルク画像メモリーを不要とすることができる（但し、その排除が意図されるわけではない）。デジタル画像捕捉装置の計算ユニットは、画像の重ね合わせのためのアルゴリズムのみを含んでいればよい。このアルゴリズムは特に、システム内の既存の制御ソフトウェアの構成要素とすることができる。画像捕捉装置の一時メモリーと計算ユニットはこれに対応して制御装置の構成要素とすることができる。これに加えて、上述のマーキング捕捉ユニットは制御装置の中に実装することができる。
【００３６】
本発明の別の利点と実施形態は、添付の図面と説明から明らかとなる。
【００３７】
当然のことながら、上述の特徴と以下に説明する特徴は、記載されているそれぞれの組み合わせのみで利用可能というわけではなく、他の組み合わせも、又は分離しても、本発明の範囲から逸脱しない。
【００３８】
本発明を例示的実施形態に基づいて図面中に概略的に描いており、図面を参照しながら以下に詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】いくつかのデジタル画像とそのオーバーレイを概略的に示す。
【図２】レーザー顕微解剖システムの概略側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
図１は、プレパラート（この場合、単一細胞）の或る部分１０を表現する３つのデジタル画像１１、１２、１３を示しており、これらは各々が細胞の特定の特性又は詳細を認識可能な状態にする異なる顕微鏡検査方法による。
【００４１】
画像１１は、第一の顕微鏡検査方法としてＤＡＰＩ蛍光染色を用いた時に見られる状態の細胞を示す。それによって細胞核は認識可能であるが、細胞壁は検出できない。後者は画像１３では見え、これは第二の顕微鏡検査方法として微分干渉（ＤＩＣ）法を使って取得された。画像１２においては、細胞プラズマ中の具体的にマーキングされた細胞小器官が、第三の顕微鏡検査方法として緑色蛍光法を使って可視化されており、この画像でも細胞壁は検出不能である。画像１１、１２、１３の各々は、本願の用語においては第一又は第二のデジタル画像として、同様に第三、第四、又はそれ以降のデジタル画像として選択的に使用できる。
【００４２】
画像２１、２２、２３は、各々が画像１１、１２、１３のうちの２つで構成されるオーバーレイ画像であり、画像２１では画像１１と１２、画像２２では画像１２と１３、画像２３では画像１１と１３が重ね合わされている。最後に、画像２４は３つの画像１１、１２、１３から構成されるか、これらの画像のうちの１つとそれぞれ残りの２つの画像のオーバーレイ画像とで構成されるオーバーレイ画像である。本願の用語では、例えば、画像２２を第一のデジタル画像として、第二のデジタル画像としての画像１１と重ねることができる。
【００４３】
画像３１〜３４においては、それぞれのオーバーレイ画像２１〜２４にマーキングを追加することによって、レーザー顕微解剖領域が画定されている。
【００４４】
画像３１では、マーキングライン３１０が、標本輪郭の検出後に画像処理ソフトウェアを使って自動的に、又は適当な入力装置、例えばコンピュータのマウス又は、画像２１が表示されているタッチセンサーディスプレイ上でペンを使って手で引かれている。例えば細胞壁がその後の観察に無関係であれば、オーバーレイ画像２１に追加されたマーキングを利用して細胞核を細胞小器官とともにダイセクションすることができる。
【００４５】
他方で、特に染色された細胞小器官を含む細胞全体のダイセクションを行うように切り出そうとする場合、細胞壁の表現を視覚化することが必要となりうる。細胞核の染色から取得できる情報が重要でない場合は、オーバーレイ画像２２を使用することが適当である。細胞小器官に加えて細胞核に関する情報も利用される場合（例えば、ダイセクションを行い、更に観察するべき細胞が、特定の特性を呈する核を有する細胞だけである場合）、オーバーレイ画像２４を使用することが好ましいかもしれない。
【００４６】
画像３２と３４はこれに対応して、それぞれのマーキング３２０と３４０を外周縁の形態で示しており、これらはそれぞれオーバーレイ画像２２と２４に挿入されている。マーキングライン３２０は例えば、例えばコンピュータのマウスを利用して、又は好ましくはそのオーバーレイ画像のための表示エリアであるタッチセンサー表面上でペンを使って手で引かれている。他方でマーキングライン３４０は、楕円を生成する自動機能を利用して引かれている。有利な点として、後者は例えばコンピュータのマウス等の入力手段で引くことによって、軸比及び／又は大きさの点で適当に方向付け、移動させ、及び／又は調整することができる。或いは、マーキングライン３４０は画像ソフトウェアによって、それが細胞壁を表す線３４１を最小限の間隙を設けて取り囲むような方法で、及び／又は楕円の面積が最小限となるように自動的に生成することができる。楕円の軸比は事前に設定することができ、特に、それによって楕円を円として実施するように決定することもできる。
【００４７】
画像３３では、長方形のマーキングラインが同様にオーバーレイ画像２３に挿入されている。これもまた、入力手段を移動させることによって軸比及び／又は大きさの点で適当に整列させ、移動させ、及び／又は調整することができ、或いは、例えば特定の辺比が設定されたところで、画像ソフトウェアを介して最適な方法で生成できる。
【００４８】
マーキング３１０、３２０、３３０、３４０はレーザー解剖システムの制御ソフトウェアによってそれぞれ捕捉でき、解剖機構はこれに対応して、マーキングされた領域が境界線に沿って切り出されるような方法で制御できる。
【００４９】
図２は、本発明に使用可能なレーザー顕微解剖システムを示す。レーザー顕微解剖システムは、既存の技術からそれ自体よく知られている。例えば、独国特許第１０ ２００５ ０２８ ０６２ Ｂ４号明細書に詳細に記載されているもののようなレーザー顕微解剖システムを引用できる。従って、後述のこのシステムの具体的な詳細に関しては、この文献を明確に引用する。
【００５０】
図２は、この種のレーザー顕微解剖システム１００の概略側面図である。このシステム１００は、Ｘ−Ｙステージを有する顕微鏡１０１を含み、ステージはモーター駆動で移動でき、検体ホルダー１０３を受ける役割を果たし、ホルダーには観察され、及び／又は切片にされるべきプレパラート１０４が載置される。番号１０５は概して、この場合はプレパラート１０４の透過照明を行うための照明システムを示す。そのために、照明光路を生成するための下流の照明光学系（詳しくは図示せず）を有するハロゲンランプ又は白色光ＬＥＤ等の光源１０６が設けられている。この照明光路は偏向ミラー１０７と集光装置１１１によって下からプレパラート１０４へと向けられる。顕微鏡１０１は更に、対物レンズ１０９のほか顕微鏡要素（それ以上詳しくは図示されない）、例えばズームシステム、チューブレンズ、接眼レンズ等を含む。
【００５１】
プレパラート１０４を通過した光は対物レンズ１０９へと進み、これがプレパラート１０４の或る部分を捕捉し、観察者は接眼レンズ１１２を通じて、その部分の、それぞれの顕微鏡検査方法に対応する拡大像を見ることができる。顕微鏡１０１は更にカメラ１１７に接続され、これが、例えばＣＣＤチップを介して、そのプレパラート部分のデジタル画像を捕捉できる。カメラ１１７によって取得された画像データはコンピュータ１２０に送られ、それ自体は表示エリア１１８（ここではモニタ）に接続されており、そこに画像化されたそのプレパラート部分の画像を表示できる。コンピュータ１２０とカメラ１１７は図２では別々に描かれているが、コンピュータ、特に計算ユニット１２３は全体的又は部分的にカメラと１つの一体ユニットを形成してもよい。
【００５２】
図のレーザー顕微解剖システム１００は更に、レーザーカットによってレーザー顕微解剖領域のダイセクションを行うためのレーザー装置１３０を含む。そのために、レーザー１２２が顕微鏡１０１に、例えばレーザー１２２を顕微鏡スタンド１０８に接続することによって連結される。レーザー１２２により生成されるレーザービーム１３１は、要素（後述）を介して顕微鏡１０１の光軸１１０へと連結され、プレパラート１０４に合焦されて切り出しを行う。レーザービーム１３１とプレパラート１０４の間の相対移動によって、対応する解剖領域が、すると、事前に設定されたマーキング（切り抜き線）に沿ってプレパラートから切り出される。この相対移動は、レーザービーム１３１を固定しながらＸ−Ｙステージ１０２と、それゆえホルダー１０３を相応に移動させることによって実行できるが、レーザーカット中にＸ−Ｙステージ１０２とホルダー１０３を固定しながらレーザービーム１３１を移動させるほうが好ましい。
【００５３】
この目的のために、レーザービーム１３１は、（任意選択により設けられる）減衰ユニット１１６と焦点調整光学系１１９と絞りユニット１１４を通って案内される。これらの要素によって、レーザービームの焦点はプレパラート１０４の中の所望の部位に所望の強度と形状で周知の方法により生成される。偏向要素１１３は、レーザービーム１３１を顕微鏡１０１の光軸１１０に連結する役割を果たす。例えば、ＵＶレーザーがレーザー１２２として適当である。
【００５４】
制御装置は図２において１１５で示されている。これは、図２に例示的に示されているように、相互に別々のユニットを含むことができるが、実際には、制御装置は原則として、特に例えばコンピュータ１２０に組み込むことのできるユニットを表す。この例示的実施形態において、制御装置１１５はレーザー１２２、減衰ユニット１１６、焦点調整光学系１１９、絞りユニット１１４、Ｘ−Ｙステージ１０２に接続され、それによってこれらの要素を適当に駆動することができる。カメラ１１７と接続することも好ましく、それによって画像形成パラメータを調整できる。それ以上の詳細に関しては、前述の独国特許第１０ ２００５ ０２８ ０６２ Ｂ４号明細書を引用できる。
【００５５】
偏向ユニット１２１が絞りユニット１１４と偏向要素１１３の間に配置されて、レーザー顕微解剖領域のダイセクションを行うためにレーザービームの焦点を事前に設定されたマーキングに沿って移動させ、この偏向ユニット１２１自体は制御装置１１５に接続されている。この偏向ユニット１２１は１対のウェッジプレートを含み、その中の個々のウェッジプレートは相互に関して変更可能な方法で方向付けることができる。レーザービームはこれによって、周知の方法で光軸からオフセットに等しい量だけ偏向可能であり、その結果、レーザービームは対応するオフセットでプレート１０４に当たる。それによって、偏向ユニット１２１を適当に駆動することにより、レーザービームの焦点を任意に事前に設定されるマーキング又は切り抜き線に沿って案内することが可能となる。
【００５６】
本明細書で説明するレーザー顕微解剖システム１００によって、特にホルダー１０３の保持位置を固定した状態で、あるプレパラート部分を第一と第二の顕微鏡検査方法によって捕捉することができる。各種の利用可能な顕微鏡検査方法はすでに前述した。透過照明用の照明システム１０５だけが図２に描かれている。その他の顕微鏡検査方法、例えば対比を利用する方法や入射光蛍光方式等に必要な要素は個別に描かれていない。しかしながら、２種類の顕微鏡検査方法をまた、２種類の透過照明方式、例えば透過明視野及び透過暗視野照明を使って実施することもできる。このために、図に示される照明システム１０５の照明光路の入射角は、相応に調整する必要があるであろう。
【００５７】
デジタル画像捕捉装置は、この場合、カメラ１１７と計算ユニット１２３により構成でき、それぞれ同じプレパラート部分の第一と第二のデジタル画像を捕捉し、これら２つの画像は異なる顕微鏡検査方法により生成される。計算ユニット１２３は、第一と第二のデジタル画像がライブモードで重ねられ、表示エリア１１８にライブオーバーレイ画像として表示されるような方法でセットアップされる。表示エリア１１８の観察者はそれゆえ、例えば各種の利用可能な顕微鏡検査方法によって関連するサンプル部分を見ることができる。これに対応するデジタル画像の例については、図１に関して詳しく説明した。すると、観察者は例えば、２つ（又は３つ、又はそれ以上の）顕微鏡検査方法を解剖領域の画定に最も適したものとして決定できる。その目的のために、観察者は特に、ライブオーバーレイ画像を生成し、これらが表示エリア１１８にライブモードで表示されるようにすることができる。異なるプレパラート又は異なるプレパラート部分には、別の顕微鏡検査方法が今度はより適当であるかもしれない。対応する、一時的に保存された画像が重ねられ、表示エリア１１８にライブオーバーレイ画像として表示される。観察者は、このオーバーレイ画像の中にレーザー顕微解剖領域を適切にマーキングすることができる。適当なマーキング手段については、すでに説明文の中で詳しく述べた。マーキング捕捉ユニット１２４がマーキングを捕捉し、この目的のために、例えばマーキングが切り抜き線に変換され、その後、これに沿ってレーザービーム１３１が移動される。マーキング捕捉ユニット１２４はこの場合、コンピュータ１２０の構成要素であり、それと制御装置１１５により、偏向ユニット１２１が駆動される。
【符号の説明】
【００５８】
１０  プレパラート部分
１１、１２、１３  第一又は第二のデジタル画像
２１、２２、２３、２４  オーバーレイ画像
３１、３２、３３、３４  マーキングを含むオーバーレイ画像
３１０、３２０、３３０、３４０  マーキング
１００  レーザー顕微解剖システム
１０１  顕微鏡
１０２  Ｘ−Ｙステージ
１０３  ホルダー
１０４  プレパラート（準備された試料）
１０５  照明システム
１０６  光源
１０７  偏向ミラー
１０８  顕微鏡スタンド
１０９  対物レンズ
１１０  光軸
１１１  集光装置
１１２  接眼レンズ
１１３  偏向要素
１１４  絞りユニット
１１５  制御装置
１１６  減衰ユニット
１１７  カメラ
１１８  表示エリア
１１９  焦点調整光学系
１２０  コンピュータ
１２１  偏向ユニット
１２２  レーザー
１２３  計算ユニット
１２４  マーキング捕捉ユニット
１３０  レーザー装置
１３１  レーザービーム
【図１】
2014078008.tif 000003
【図２】
2014078008.tif 000004
【外国語明細書】
2014078008000001.pdf
2014078008000002.pdf
2014078008000003.pdf
2014078008000004.pdf