(57)【要約】【課題】ＧＰＮＭＢに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体およびその使用を提供すること。【解決手段】重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にフレームワーク領域および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）に及ぶ連続する重鎖および軽鎖配列に対応する配列を含むアミノ酸配列およびそれらをコードする塩基配列が提供される。また、本発明は抗ＧＰＮＭＢ抗体を含む免疫複結合体およびそのような免疫結合体を使用する方法を提供する。さらに、本発明は抗ＧＰＮＭＢ抗体成分と抗ＣＤ３成分とを含む二重特異性抗体およびそのような二重特異性抗体を使用する方法を提供する。【選択図】図１
2014003986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＧＰＮＭＢに対する特異性を有する抗体、およびそのような抗体の使用に関する。特に、本発明はＧＰＮＭＢに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体およびその使用を提供する。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にフレームワーク領域および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）に及ぶ連続した重鎖および軽鎖配列に対応する配列を含むアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列が提供される。また、本発明は抗ＧＰＮＭＢ抗体を含む免疫結合体およびそのような免疫結合体を使用する方法を提供する。さらに、本発明は抗ＧＰＮＭＢ抗体成分と抗ＣＤ３成分とを含む二重特異性抗体およびそのような二重特異性抗体を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＧＰＮＭＢ
「ｎｍｂ」（アクセッション番号Ｘ７６５３４  ＥＭＢＬ）と呼ばれる推定膜貫通糖タンパク質（以下、ＧＰＮＭＢと称する）が同定され、高悪性度の黒色腫細胞系に比較して低転移性のヒト黒色腫癌細胞系と異種移植片において異なる形で発現すると非特許文献１に記載されている。ＧＰＮＭＢはｐＭｅｌ１７黒色腫に特異的なタンパク質の前駆体と、３３％の同一性を共有する（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  ＰＮＡＳ  ８８：９２２８−９２３２）。ＧＰＮＭＢは樹状細胞結合型膜貫通タンパク質であるＤＣ−ＨＩＬに対して７１％相同である（Ｓｈｉｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．  ２７６：８１２５−８１３４）。ＧＰＮＭＢは、造血成長因子によって誘導されるニューロキニン−１タンパク質ＨＧＦＩＮ（Ｂａｎｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｒｅｇ．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １１１：１６９−１７８）または骨関連遺伝子オステオアクチビン（Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  ２００３，  １３（２−４）：２０５−２２０）としても知られている。
【０００３】
ｎｍｂは高転移性ｎｍｂ陰性黒色腫細胞系の転移能を低減できることも報告された（非特許文献１）。ＧＰＮＭＢは、公開データベース検索と発現プロファイリング後に、神経膠芽腫の候補腫瘍マーカーとみなされた（非特許文献２）。この遺伝子は、肺腫瘍で過剰発現することがわかり（特許文献１）、ならびに乳癌、直腸癌および大腸癌で過剰発現することがわかった（特許文献２）。さらに、ＮＣＢＩ  ＳＡＧＥデータは、胃癌と膵臓癌におけるこの遺伝子の過剰発現を示している。マウス相同分子種は、結節性硬化症結合症候群のＴＳＣ２ノックアウトモデルに由来する神経幹細胞系ＮＳＣで高度に上方制御されることが示された（特許文献３）。
【０００４】
抗体
免疫グロブリンとしても知られる抗体は、典型的には、２本の軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）と２本の重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤａ）からなる四量体グリコシル化タンパク質である。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。ＬおよびＨ鎖のカルボキシ末端部分はそれぞれエフェクター機能に主に関与する１つおよび３つまたは４つの定常領域を有する。カッパとラムダとに分類される２種類のヒトＬ鎖が存在する。Ｈ鎖は、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義する定常領域アミノ酸配列に基づくミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはエプシロンとして分類される。さらに、アイソタイプは例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスに分割してよい。
【０００５】
免疫グロブリンはＢリンパ球によりインビトロで自然に作られうる。Ｂ細胞の各クローンは、独自の予定抗原結合構造を有する抗原レセプターを有する抗体を産生する。約１０７の可能性のある抗原レセプターのレパートリーが抗原刺激前にインビボで存在する。この多様性は、体細胞組換え、すなわち、異なる抗原遺伝子断片の結合により作られる。免疫グロブリンＨ鎖、カッパＬ鎖およびラムダＬ鎖は３つの別々の遺伝子座によりコードされ、各遺伝子座は、可変（Ｖ）領域、定常（Ｃ）領域および結合（Ｊ）領域をコードする少なくとも３種類の遺伝子断片の複数のコピーを有し、重鎖遺伝子は多様性（Ｄ）領域も含む。利用可能な多様な遺伝子断片（４５重鎖Ｖ；３５カッパＶ；２３重鎖Ｄ；６重鎖Ｊ；５カッパＪ）の中からの特定のＶ、ＣおよびＪ領域（および重鎖についてのＤ）の選択は、Ｂ細胞中に示される生殖細胞系配列のおよそ１０１１の可能な特異性を生む。Ｖ、ＣおよびＪ領域の結合は結合点で残基の損失または付加をもたらしうる。ヒト抗体のＬおよびＨ鎖Ｖ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる３種類の高頻度可変領域の骨格を形成する比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。重鎖または軽鎖のいずれかのアミノ末端から、Ｖ領域は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の順番でＦＲ領域とＣＤＲ領域から構成される。Ｄ（重鎖のみ）およびＪ領域とのＶ領域の結合はＣＤＲ３−ＦＲ４を付加する。ＣＤＲは一般的に抗原結合に関与する。
【０００６】
疾患を根絶し、かつ正常な組織を提供する目的で、モノクローナル抗体の特異性はそれら抗体をインビボで癌を標的とさせる魅力的な物質としている。当初、マウスモノクローナル抗体を利用したこのアプローチは、免疫原性等の潜在的な効能の限界、非効率的なエフェクター機能および短いインビボ半減期に遭遇してきた。ヒト抗体の定常領域に組み合わされたマウスモノクローナル抗体の可変領域に結合する抗原を利用しようとしたキメラ抗体（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，  ｅｔ  ａｌ  １９８４  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９８４  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）；ヒト免疫グロブリンに対するマウス抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）に結合する抗原をグラフトしたヒト化抗体（Ｊｏｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８８  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，  ｅｔ
ａｌ，  １９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；  Ｖａｕｇｌｕｍ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９８  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：５３５−５３９）；および抗体の単鎖ｓｃＦｖｓまたはＦａｂ断片のファージディスプレイライブラリー（ｄｅ  Ｈａａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９９  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：  １８２１８−１８２３０；  Ｋｎａｐｐｉｋ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０００  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６；  Ｓｈｅｅｔｓ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９８  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２；  Ｖａｕｇｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：３０９−３１４，  １９９６；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３２４５−３２６０）に対する技術が開発された。さらに、完全ヒトモノクローナル抗体の免疫化と産生に関して、ヒト免疫グロブリン遺伝子と非機能性内在性遺伝子を有するトランスジェニック動物が開発された（Ｆｉｓｌｒｗｉｌｄ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４５−８５１；  Ｍｅｎｄｅｚ，  ｅｔ  ａｌ，  １９９７
Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６；  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  ｅｔ
ａｌ，  １９９９  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３，  ６８９８−６９０６）。
【０００７】
一本鎖抗体：一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖｓ）が１９８０年代末に最初に記載された（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ
８５：５８７９−５８８３（１９８８））。典型的には長さが５〜２７アミノ酸残基の範囲のポリペプチドリンカーを用いて、可変軽鎖領域のＣ末端（ＶＬ）を可変重鎖領域のＮ末端（ＶＨ）に結合させる。もしくは、リンカーはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に結合させる。両形式（ＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬ）が文献においてうまく使用されてきた。文献で使用された最も一般的なリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３の１５アミノ酸のリンカーであるが、２０５Ｃと呼ばれる２５アミノ酸のリンカー等、利用された他の幾つかのリンカーが存在する（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３０：１０１１７−１０１２５（１９９１））。一本鎖抗体が専門病院で現在利用されている：最も進んだものの１つがｈ５Ｇ１．１またはパキセリズマブである。このｓｃＦｖはヒトＣ５補体に対して特異的であり、心肺バイパス手術を受けた心臓病患者の臨床試験に使用されている（Ｓｈｅｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．  ７７：９４２−９４９（２００４））。
【０００８】
二重特異性抗体（ｂｉ−Ａｂｓ）：かなりの進展がなされたｍＡｂ研究の一領域は二重特異性抗体（ｂｉＡｂｓ）の開発にある。二重特異性を有する治療抗体分子の開発には明確な利点が存在する。例えば、ｂｉＡｂｓは望まれない細胞に対するＣＴＬ等の免疫エフェクター細胞を標的とするメディエーターとして働くことができる（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ５：４１３−４１９（２００３））。別の例において、ＦｃガンマレセプターＣＤ１６、ＣＤ６４およびＣＤ８９に対して化学的に結合する二重特異性抗体は、従来のＩｇＧ抗体よりもインビトロでさらに顕著に効果的であった（Ｐｅｉｐｐ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｒｉｕｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．３０：５０７−５１１（２００２））。実行可能な治療学としてｂｉＡｂｓを開発する課題の１つは、臨床的応用のために十分に大量の安定部分の産生にある。別の課題は、有効標的と、治療薬を導く基礎生物学との適切な組合せを決定することにある。ｂｉＡｂｓで経験された困難性についての最近の概説については、（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２６：１−９  （２００５）；  Ｐｅｉｐｐ  ａｎｄ  Ｖａｌｅｒｉｕｓ，  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．３０：５０７−５１１（２００２））を参照されたい。
【０００９】
二重特異性一本鎖抗体（ｂｉ−ｓｃＦｖ）：注目すべき種類の作りうるｂｉＡｂは二重特異性一本鎖抗体またはｂｉ−ｓｃＦｖである。ｂｉ−ｓｃＦｖの産生に関する概説については、（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｅ  Ｇａｌｌ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ  ７：２３３−２４２（２００４））を参照されたい。典型的には、ｂｉ−ｓｃＦｖは、２つの異なる抗体に由来する４つの可変領域、２つの重鎖（ＶＨ）および２つの軽鎖（ＶＬ）からなる。４つの前記領域は、長さが５〜２７アミノ酸の範囲にある３つの短いリンカーにより互いに結合している。この種の抗体の生物学的活性は分子の構築に関する幾つかの特徴に依存する。例えば、抗体のＶ領域間のリンカー配列と、（２つの抗体の）４つの抗体Ｖ領域自体の順序とを変更でき、ならびに使用される発現系を変更できる；これらのすべてが多様な得られる産物の可溶性と生物学的活性に大きく影響を与えうる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３３０：９９−１１１（２００３）；  Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  １７：３５７−３６６  （２００４）；
Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５：２６１３−１６１９（１９９９））。
【００１０】
細胞傷害性Ｔリンパ球：正常な環境下では、ＣＤ３／Ｔ細胞レセプター（ＣＤ３／ＴＣＲ）結合体が特定のＡｇペプチドを伴う関連ＭＨＣに結合するときに、Ｔ細胞が活性化される。ＣＤ３／ＴＣＲのＭＨＣとの結合は、病原体または腫瘍に対する免疫応答を誘発するために必要な細胞内シグナルをもたらす。Ｔ細胞活性化を引き起こす同様のシグナルは、ＣＤ３／ＴＣＲ結合体の一定の構造に結合することのできる抗体によっても達成されうる。文献には、ＴＣＲ／ＣＤ３結合体と腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）との両方を認識するｂｉＡｂｓが、標的細胞の存在下にＣＴＬの活性化プログラムを誘発できることが示されている（Ｃｈａｐｏｖａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５：１２９６−１３０３（１９９５））。
組換え技術は、インビボ効能を高めることを目的に抗体分子のさらなる向上を可能とするために利用されている。そのような技術は、例えば、分子サイズ、親和性、薬物動態、毒性、特異性、結合価、エフェクター機能、直接または間接のアーミング、併用療法および多様なプロドラッグ手法の最適化を提供する。
ＧＰＮＭＢを発現する病態のインビボ標的化に適する抗体を有し、治療効力を可能とすることが望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３００６４９４７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３１００７２０号明細書
【特許文献３】国際公開第２００３／０８０８５６号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｗｅｔｅｒｍａｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（１９９５）６０：７３−８１
【非特許文献２】Ｌｏｇｉｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）１０：１３９３−１４０２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、ＧＰＮＭＢに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、ならびにそのような抗体の改変体、誘導体および抗原結合断片を提供する。
【００１４】
本発明は、ＧＰＮＭＢに対する特異性を提供するヒト抗体遺伝子断片の好ましい体細胞組換え、およびこれらの遺伝子断片を起源とする遺伝子操作された抗ＧＰＮＭＢ抗体改変体および誘導体を提供する。さらに、本発明は、ＧＰＮＭＢに対して結合特異性を有する多重親和性成熟ヒト抗体を提供する。
【００１５】
一実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢに結合する抗体またはその結合断片において、該抗体またはその結合断片がＧＰＮＭＢ誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、Ｍａｂ１．２．１、Ｍａｂ１．１０．１およびＭａｂ２．２２．１からなる群から選択された完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体、または抗完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体であるＭａｂ１．２．１、Ｍａｂ１．１０．１またはＭａｂ２．２２．１と同じ抗原結合ビン中の抗体に交差反応することを特徴とする抗体またはその結合断片を提供する。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢに結合する抗体またはその結合断片において、該抗体またはその結合断片がＧＰＮＭＢ誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、Ｍａｂ２．３．１およびＭａｂ１．１５．１からなる群から選択された完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体、または完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体であるＭａｂ２．３．１またはＭａｂ１．１５．１と同じ抗原結合ビン中の抗体に交差反応することを特徴とする抗体またはその結合断片を提供する。
【００１７】
さらに別の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢに結合する抗体またはその結合断片において、該抗体またはその結合断片がＧＰＮＭＢ誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体Ｍａｂ２．１０．１、または完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体Ｍａｂ２．１０．１と同じ抗原結合ビン中の抗体に交差反応することを特徴とする抗体またはその結合断片を提供する。
【００１８】
一実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢを過剰発現する細胞に対して細胞傷害効果を有する裸のＩｇＧ１抗ＧＰＮＭＢ抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明は、裸のＩｇＧ１抗ＧＰＮＭＢ抗体および免疫調節物質（例えば、インターフェロンおよびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない）を含有する組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＧＰＮＭＢの過剰発現に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、抗ＧＰＮＭＢ抗体またはその断片および細胞毒性薬を含有する免疫結合体を提供する。特定の実施態様において、細胞毒性薬はオーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０）またはその誘導体である。そのような免疫結合体の使用方法も提供される。
【００２０】
一実施態様において、本発明は、標的腫瘍細胞のＴ細胞による細胞障害死滅を可能とする、抗ＧＰＮＭＢ成分と抗ＣＤ３抗体成分を含有する二重特異性抗体を提供する。別の実施態様において、本発明は、細胞毒性薬に結合体化させた一本鎖Ｆｖ抗体を提供する。特定の実施態様において、細胞毒性薬はオーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０）またはその誘導体である。そのような二重特異性抗体および結合体化一本鎖Ｆｖ抗体の使用方法も提供される。
【００２１】
本発明の抗ＧＰＮＭＢヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列およびそれらをコードする核酸配列が提供される。
【００２２】
ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体を含有する治療組成物等、該抗体を含有する組成物および使用方法が提供される。特に、抗ＧＰＮＭＢ抗体を含有する治療用免疫結合体およびＧＰＮＭＢを発現する癌および他のＧＰＮＭＢ関連疾患を治療する細胞毒性薬または細胞分裂阻害剤が提供される。投与計画も提供される。
本開示のさらなる態様が一部は下記の説明に示され、一部は説明から明らかとなり、また本発明を実施することによって理解されるだろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＧＰＮＭＢに特異的に結合する、単離されたヒト抗体。
（項目２）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１記載の抗体。
（項目３）
前記抗体が、１０７Ｍ−１よりも高い親和定数でＧＰＮＭＢに特異的に結合する、項目１記載の抗体。
（項目４）
ＶＨ１−２、ＶＨ２−５、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−５９およびＶＨ５−５１からなる群から選択される領域を含む、項目１記載の抗体。
（項目５）
さらに、Ａ２、Ａ３、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ２およびＯ１からなる群から選択される領域を含む、項目４記載の抗体。
（項目６）
ＶＨ１−２、ＶＨ２−５、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−５９およびＶＨ５−５１からなる群から選択される領域に由来する領域を含む、項目１記載の抗体。
（項目７）
さらに、Ａ２、Ａ３、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、Ｌ２およびＯ１からなる群から選択される領域に由来する領域を含む、項目６記載の抗体。
（項目８）
配列番号２、２０、３８、５６、７４、９２、１１０、１２８、１４６、１６４、１８２、２００、２１８、２３６、２５３、２５６、２６０、２６５、２７０、２７４、２７７、２８１および２８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１記載の抗体。
（項目９）
さらに、配列番号１１、２９、４７、６５、８３、１０１、１１９、１３７、１５５、１７３、１９１、２０９、２２７および２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目８記載の抗体。
（項目１０）
配列番号４、６、８、１３、１５、１７、２２、２４、２６、３１、３３、３５、４０、４２、４４、４９、５１、５３、５８、６０、６２、６７、６９、７１、７６、７８、８０、８５、８７、８９、９４、９６、９８、１０３、１０５、１０７、１１２、１１４、１１６、１２１、１２３、１２５、１３０、１３２、１３４、１３９、１４１、１４３、１４８、１５０、１５２、１５７、１５９、１６１、１６６、１６８、１７０、１７５、１７７、１７９、１８４、１８６、１８８、１９３、１９５、１９７、２０２、２０４、２０６、２１１、２１３、２１５、２２０、２２２、２２４、２２９、２３１、２３３、２３８、２４０、２４２、２４７、２４９、２５１、２５４、２５７、２６１、２６６、２７１、２７８、２８２、２８６、２５５、２５８、２６２、２６７、２７２、２７５、２７９、２８３、２８７、２５９、２６３、２６４、２６８、２６９、２７３、２７６、２８０、２８４および２８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲを含む、項目１記載の抗体。
（項目１１）
抗体が、Ｍａｂ１．１０．２、Ｍａｂ１．１５．１、Ｍａｂ１．２．２、Ｍａｂｌ．７．１、Ｍａｂ２．１０．２、Ｍａｂ２．１５．１、Ｍａｂ２．１６．１、Ｍａｂ２．１７．１、Ｍａｂ２．２１．２、Ｍａｂ２．２２．１、Ｍａｂ２．２４．１、Ｍａｂ２．３．１、Ｍａｂ２．７．１およびＭａｂ２．８．１からなる群から選択される、項目１記載の抗体。
（項目１２）
抗体がＩｇＧ１抗体である、項目１〜１１のいずれかに記載の抗体。
（項目１３）
項目１記載の抗体と細胞毒性薬とを含む、免疫結合体。
（項目１４）
前記抗体がＭａｂ１．１５．１である、項目１３記載の免疫結合体。
（項目１５）
前記細胞毒性薬がオーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０）またはその誘導体である、項目１３記載の免疫結合体。
（項目１６）
項目１３記載の免疫結合体を含む、医薬組成物。
（項目１７）
項目１２記載の抗体と免疫調節物質とを含む、医薬組成物。
（項目１８）
ヒトフレームワーク領域とＧＰＮＭＢに対する特異的な結合手段とを含む、抗体。
（項目１９）
前記手段が、配列番号４、６、８、１３、１５、１７、２２、２４、２６、３１、３３、３５、４０、４２、４４、４９、５１、５３、５８、６０、６２、６７、６９、７１、７６、７８、８０、８５、８７、８９、９４、９６、９８、１０３、１０５、１０７、１１２、１１４、１１６、１２１、１２３、１２５、１３０、１３２、１３４、１３９、１４１、１４３、１４８、１５０、１５２、１５７、１５９、１６１、１６６、１６８、１７０、１７５、１７７、１７９、１８４、１８６、１８８、１９３、１９５、１９７、２０２、２０４、２０６、２１１、２１３、２１５、２２０、２２２、２２４、２２９、２３１、２３３、２３８、２４０、２４２、２４７、２４９、２５１、２５４、２５７、２６１、２６６、２７１、２７８、２８２、２８６、２５５、２５８、２６２、２６７、２７２、２７５、２７９、２８３、２８７、２５９、２６３、２６４、２６８、２６９、２７３、２７６、２８０、２８４および２８８を含むか、またはそれらに由来するＣＤＲを含む、項目１８記載の抗体。
（項目２０）
項目１記載の抗体をコードする、単離された核酸。
（項目２１）
項目２０記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２２）
項目２１記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目２３）
宿主細胞が、大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞またはＮＳＯ細胞である、項目２２記載の宿主細胞。
（項目２４）
前記核酸が、配列番号２、２０、３８、５６、７４、９２、１１０、１２８、１４６、１６４、１８２、２００、２１８、２３６、２５３、２５６、２６０、２６５、２７０、２７４、２７７、２８１および２８５からなる郡から選択されるアミノ酸配列をコードする、項目２３記載の核酸。
（項目２５）
前記核酸が、配列番号１、１９、３７、５５、７３、９１、１０９、１２７、１４５、１６３、１８１、１９９、２１７、２３５、１０、２８、４６、６４、８２、１００、１１８、１３６、１５４、１７２、１９０、２０８、２２６および２４４からなる郡から選択される塩基配列を含む、項目２４記載の核酸。
（項目２６）
ＧＰＮＭＢに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の製造方法において、（ａ）置換されるＣＤＲ３を含むか、もしくはＣＤＲ３をコードする領域を欠く可変領域をコードする核酸の出発レパートリーを提供し；（ｂ）配列番号８、２６、４４、６２、８０、９８、１１６、１３４、１５２、１７０、１８８、２０６、２２４、２４２、２５９、２６３、２６４、２６８、２６９、２７３、２７６、２８０、２８４および２８８からなる群から選択される配列に実質的に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸に該レパートリーを組み合わせて、可変領域をコードする核酸の産物レパートリーを提供するようにドナー核酸をレパートリー中のＣＤＲ３領域に挿入し；（ｃ）産物レパートリーの核酸を発現し；（ｄ）ＧＰＮＭＢに対して特異的な結合断片を選択し；（ｅ）特異的な抗原結合断片または結合断片をコードする核酸を回収することを含む、方法。
（項目２７）
項目２６記載の方法により産生される、抗体。
（項目２８）
ＧＰＮＭＢに結合する抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片がＧＰＮＭＢ誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、Ｍａｂ１．２．１、Ｍａｂ１．１０．１およびＭａｂ２．２２．１からなる群から選択された完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体、または完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体Ｍａｂ１．２．１、Ｍａｂ１．１０．１またはＭａｂ２．２２．１と同一の抗原結合性ビン中の抗体に交差反応する、抗体またはその結合断片。
（項目２９）
ＧＰＮＭＢに結合する抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片がＧＰＮＭＢ誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、Ｍａｂ２．３．１およびＭａｂ１．１５．１からなる群から選択された完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体、または完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体Ｍａｂ２．３．１またはＭａｂ１．１５．１と同一の抗原結合性ビン中の抗体に交差反応する、抗体またはその結合断片。
（項目３０）
ＧＰＮＭＢに結合する抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片がＧＰＮＭＢ誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体Ｍａｂ２．１０．１、または完全ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体Ｍａｂ２．１０．１と同一の抗原結合性ビン中の抗体に交差反応する、抗体またはその結合断片。
（項目３１）
モノクローナルヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体のＶＬ領域を該抗ＧＰＮＭＢ抗体のＶＨ領域に結合させた、一本鎖Ｆｖ抗体。
（項目３２）
さらに、抗ＣＤ３１抗体のＶＨ領域を該抗ＣＤ３抗体のＶＬ領域に結合させた、項目３１記載の一本鎖Ｆｖ抗体。
（項目３３）
項目３１記載の一本鎖Ｆｖ抗体と細胞毒性薬とを含む、免疫結合体。
（項目３４）
さらに、シグナルペプチドまたはフラグタグを含む、項目３１または３２記載の一本鎖Ｆｖ抗体。
（項目３５）
配列番号３５５のアミノ酸配列を含む、項目３１記載の一本鎖Ｆｖ抗体。
（項目３６）
配列番号３５７または配列番号３５９のアミノ酸配列を含む、項目３２記載の一本鎖Ｆｖ抗体。
（項目３７）
ＧＰＮＭＢの過剰発現に関連する疾患を治療または予防する方法であって、（ａ）項目１２記載の抗体、（ｂ）項目１３または３３記載の免疫結合体、または（ｃ）項目３２記載の一本鎖Ｆｖ抗体を含有する有効量の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
（項目３８）
前記疾患が、黒色腫またはＣＮＳ系の新生物である、項目３７記載の方法。
（項目３９）
前記ＣＮＳ系の新生物が、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫または新生物性髄膜炎である、項目３８記載の方法。
（項目４０）
前記被験体がヒトである、項目３７記載の方法。
（項目４１）
前記方法が、項目１２記載の免疫結合体を被験体に投与することを含み、有効量が２〜４回の投与で０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの単位用量である、項目３７記載の方法。（項目４２）
前記有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの単位用量である、項目４１記載の方法。（項目４３）
前記有効量が約１ｍｇ／ｋｇの単位用量である、項目４１記載の方法。
（項目４４）
生物試料中のＧＰＮＭＢの過剰発現細胞を検出する方法であって、該試料と項目１〜１１のいずれかに記載の抗体を含有する組成物とを接触させることを含む方法。
（項目４５）
前記方法が免疫組織化学である、項目４４記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】４処置のために４日おきの２．５０〜２０ｍｇ／ｋｇの静脈内処置後の胸腺欠損マウスにおける腫瘍成長の阻害、およびＳＫ−ＭＥＬ−２異種移植片の完全な退縮。ビンブラスチン（１．７ｍｇ／ｋｇ静脈内ｑ４ｄ×４）およびパクリタキセル（２４ｍｇ／ｋｇ静脈内ｑ２ｄ×４）等の参照医薬に対する腫瘍保持動物の応答も示す。コントロールグループはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水のいずれかにより処置される。
【図２】抗ＧＰＮＭＢ抗体によるＵＡＣＣ−６２黒色腫細胞の間接的な免疫毒素死滅。
【図３】オーリスタチンＥ（ＡＥ）結合体化抗ＧＰＮＭＢ抗体とともにインキュベートされたＵＡＣＣ−６２細胞のコロニー形成の阻害。
【図４】４処置のために４日おきの５．０ｍｇ／ｋｇのＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ静脈内処置後の胸腺欠損マウスにおける腫瘍成長の阻害、およびＳＫ−ＭＥＬ−２異種移植片の完全な退縮。非結合ＣＲ０１１または遊離モノエチルオーリスタチンＥに対する腫瘍保持動物の応答の欠如は、インタクトな免疫結合体が抗腫瘍効果に必須であることを示す。
【図５】４処置のために４日おきの１．２５〜２０ｍｇ／ｋｇの静脈内処置後の胸腺欠損マウスにおける腫瘍サイズの減少とＳＫ−ＭＥＬ−２異種移植片の完全な退縮。ビンブラスチン（１．７ｍｇ／ｋｇ静脈内ｑ４ｄ×４）およびパクリタキセル（２４ｍｇ／ｋｇ静脈内ｑ２ｄ×４）等の参照医薬に対する腫瘍保持動物の応答も示す。コントロールグループはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または生理食塩水のいずれかにより処置される。
【図６】胸腺欠損マウスにおける１および１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗体の血清濃度−時間プロフィール。検出は、ＣＲ０１１抗原（ＣＧ５６９７２、ＧＰＮＭＢ）および西洋ワサビパーオキシダーゼ結合体化抗ヒトグロブリンを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで達成された。示された結果はμｇ／ｍＬ（左のｘ軸）およびマイクロモル濃度（右のＸ軸）として示される血清濃度である。
【図７】治療パーセントとして表される総合応答を、５つの異なる段階的な投与間隔（すなわち、治療間の０、１、４、８および１６日）で処置された試験動物について記録した。ラインの傾きは０と有意差がない（ｐ＜０．２９０４）。
【図８】投与間隔の関数として、かつ累積用量により階層化された完全退縮の比率。各グループに関して、ｎ＝６マウス／グループ。定着したＳＫ−ＭＥＬ−２腫瘍移植片（１４日目、８０ｍｇ）を有する胸腺欠損マウスをＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥで静脈内処置し、完全な退縮の発生率を記録する。
【図９】ＧＰＮＭＢの異所性発現の効果またはＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥに対する感受性。ＨＥＫ２９３細胞に空ベクター（ベクター）またはＧＰＮＭＢを含むプラスミド（ＧＰＮＭＢ）を材料と方法に記載されたようにトランスフェクトする。Ａ．細胞溶解物を、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から調製し、ＧＰＮＭＢ（上のパネル）またはアクチン（下のパネル）の発現を免疫ブロットにより決定する。レーン１：空ベクターのトランスフェクション。レーン２：ＧＰＮＭＢトランスフェクション。Ｂ．空ベクターまたはＧＰＮＭＢがトランスフェクトされた細胞でのＧＰＮＭＢ発現のフローサイトメトリー分析。Ｃ．トランスフェクトされた細胞のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥのインビトロ成長の阻害。細胞を、多様な濃度のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ（菱形：ベクターまたは円：ＧＰＮＭＢ）またはＩｇＧ２−ｖｃＭＭＡＥ（三角：ベクターまたは四角：ＧＰＮＭＢ）で９６時間処置する。クローン形成アッセイ後、生存フラクションを未処置コントロールに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍグラフ化ソフトウエアを用いてコントロールの比率として示す。各処置を三連で実施する。２つの独立した実験からの代表的なグラフを示す。
【図１０】内在性ＧＰＮＭＢ発現に対するＧＰＮＭＢ  ｓｉＲＮＡの効果とＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥに対する感受性。ＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞に５０ｎＭのコントロールｓｉＲＮＡまたはＧＰＮＭＢを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトする。Ａ．トランスフェクションの２日後と４日後にトランスフェクトＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞から細胞溶解物を調製し、ＧＰＮＭＢ（上のパネル）またはアクチン（下のパネル）の発現を免疫ブロットにより決定する。レーン１：模擬物（オリゴフェクタミン）トランスフェクション。レーン２：コントロールｓｉＲＮＡトランスフェクション。レーン３：ＧＰＮＭＢ  ｓｉＲＮＡトランスフェクション。Ｂ．トランスフェクションの２日後と４日後のＧＰＮＭＢ発現のフローサイトメトリー分析。ＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞に、模擬物、コントロールｓｉＲＮＡまたはＧＰＮＭＢ  ｓｉＲＮＡを材料と方法に示すようにトランスフェクトする。Ｃ．模擬物（菱形）、コントロールｓｉＲＮＡ（円）またはＧＰＮＭＢ  ｓｉＲＮＡ（三角）をトランスフェクトしたＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞におけるＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥのインビトロ成長阻害を材料と方法に記載するようにクローン形成アッセイにより決定する。生存フラクションを未処置コントロールに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍグラフ化ソフトウエアを用いてコントロールの比率として示す。各処置を三連で実施する。２つの独立した実験からの代表的なグラフを示す。
【図１１】ＩｇＧ２（Ｂ２、Ｂ１９）またはＩｇＧ１（コントロール、Ｂ１６）コントロールに比較したアイソタイプコントロール、ハイブリドーマＩｇＧ２（Ｂ２）、組換えＩｇＧ２（Ｂ１９）、およびＧＣ５６９７２／ＧＰＮＭＢに対するＩｇＧ１（Ｂ１６）によるＳＫ−ＭＥＬ−２のＦＡＣＳ分析。
【図１２】（Ａ）ＰＢＭＣおよびｍＡｂ（ＩｇＧ１）が仲介するＳＫ−ＭＥＬ−２細胞のＡＤＣＣ。ＡＤＣＣエフェクター機能は、示されるように１０、３０，６０および１００の標的：エフェクター比を用いて、２、５および１０μｇ／２００μｌにて記載されたように測定する。（Ｂ）ＰＢＭＣおよびｍＡｂ（ＩｇＧ２）はＳＫ−ＭＥＬ−２細胞にＡＤＣＣを引き起こさない。ＡＤＣＣエフェクター機能は、示されるように１０、３０，６０および１００の標的：エフェクター比を用いて、０、２、５および１０μｇ／２００μｌにて記載されたように測定する。
【図１３−１】ヒト癌細胞系と組織におけるＣＧ５６９７２の発現。（Ａ）ヒト脳腫瘍細胞系または（Ｂ）ヒト脳腫瘍神経膠腫および髄芽腫生検のＲＴＱ  ＰＣＲ分析。
【図１３−２】ヒト癌細胞系と組織におけるＣＧ５６９７２の発現。（Ｃ）ヒト脳腫瘍および乏突起細胞腫組織におけるＣＧ５６９７２発現のマイクロアレイ分析。材料と方法に記載のように組織または細胞系を収集し、ｍＲＮＡを調製し、ＲＴＱ  ＰＣＲまたはＣｕｒａＣｈｉｐ分析を実施した。
【図１４】ＣＧ５６９７２に対するＣＲ０１１ｍＡｂの細胞表面結合のＦＡＣＳ分析。ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＸＦ−４９８、Ｕ−１１８−ＭＧ、ＳＮＢ−７８、ＳＦ−５３９およびＳＦ−２６８の各細胞を飽和濃度（１０μｇ／ｍＬ）のＣＲ０１１ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧ２で標識する。材料と方法に記載するようにＰＥ結合体化ヤギ抗ヒト第２抗体を用いるフローサイトメトリーにより結合ｍＡｂを検出する。ＧＭ：幾何平均。ＳＦ−２６８細胞系はＣＧ５６９７２転写物に対して陰性であり、陰性コントロールとして用いる。
【図１５】ヒト脳腫瘍細胞系におけるＣＧ５６７２発現の免疫ブロット分析。細胞溶解物をトリス−グリシンゲルで分離し、膜に移す。免疫ブロット分析をＣＧ５６９７２に対するポリクローナル抗体により行なった後、材料と方法に記載のように増強化学発光検出により行なう。矢じりはｐ１００と１２０ＣＧ５６９７２種の相対的な移動度を示す。ＳＦ−２６８細胞系はＣＧ５６９７２転写物に対して陰性であり、陰性コントロールとして用いる。
【図１６】星細胞腫／神経膠芽腫の細胞成長のＣＲ０１１０−ｖｃＭＭＡＥインビトロ成長阻害。ＸＦ−４９８、ＳＮＢ−７８、Ｕ−１１８−ＭＧ、ＳＦ−５３９、ＬＯＸＩＭＶＩおよびＳＦ−２６８の各細胞を示された濃度のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥとともにインキュベートする。また、細胞を材料と方法に記載のようにコントロールＰＫ１６．３ｍＡｂ（表１に示すデータ）とともにインキュベートする。細胞成長はクローン形成アッセイにより決定した。生存クローンをカウントし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍグラフ化ソフトウエアを用いてプロットする。実験は三連で行い、２回繰り返す。代表的な実験を示す。細胞死滅のＩＣ５０をｎｇ／ｍＬ濃度にて示す。ＬＯＸＩＭＶＩとＳＦ−２６８細胞系はＣＧ５６９７２転写物に対して陰性であり、陰性コントロールとして用いる。
【図１７】ＣＲ０１１改変抗体の開発。４つの抗体可変（Ｖ）領域（ｂｉ−ｓｃＦｖに関してＣで示す）は、ＣＲ０１１と抗ＣＤ３の全ＩｇＧの抗原結合部位を構成する軽重鎖可変領域（ＶＬおよびＶＨ）に由来する。２つの個々のｓｃＦｖ成分を連結する中央リンカー（点線で示す）は、ｂｉ−ｓｃＦｖの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ成分が結合する細胞障害性Ｔ細胞により提供される効果的な細胞溶解活性等、各ｓｃＦｖ成分の得られた活性を決定するのに重要な役割を果たすだろう。
【図１８】Ａ．ＣＲ０１１  ｓｃＦｖ（四角）およびＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ（菱形）。両ＣＲ０１１抗体がＧＰＮＭＢ標的に結合した。Ｂ．２種類のＣＲ０１１改変抗体産物（矢印）のウエスタンブロット。クローン１６はＣＲ０１１  ｓｃＦｖ（モノマー）を発現するＣＨＯＫ１系に対応し、クローン１７はＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ（ダイマー）を発現するＣＨＯＫ１に対応した。クローン１６と１７は改変抗体産物を作るために用いられる。
【図１９】標的細胞の細胞表面に発現した天然のＧＰＮＭＢタンパク質に対するＣＲ０１１  ｓｃＦｖおよびＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ産物の結合のフローサイトメトリー分析。ヒトＴ細胞がＣＤ３の源として用いられ、ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞がＧＰＮＭＢの源として用いられる。
【図２０】細胞毒性分析は、精製ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ（ＣＲ０１１  ｓｃＦｖではない）が、Ｔリンパ球によるＧＰＮＭＢ陽性ＳＫ−Ｍｅｌ−５腫瘍細胞の死滅を引き起こすことを示した。
【図２１】マレイミドコアプロイル−バリン−シトルリン−モノメチル−オーリスタチンＥ（ｖｃＭＭＡＥ）の化学構造。
【図２２】ＣＲ０１１抗体のジスルヒドはＴＣＥＰの存在下に穏やかに還元され、１つのＡｂあたり約４つのチオールを生成する。次に、ｖｃＭＭＡＥを抗体溶液に加える。チオレートのマレイミド基に対する求核攻撃は安定なチオエステル結合をもたらす。得られた結合体は混合物から精製する。
【図２３】ｐＨ７．０およびｐＨ９．０でＴＣＥＰの存在下または不存在下でのｖｃＭＭＡＥのＮＡｃＣｙｓとの反応。１Ａ：ＶＣＭＭＡＥはリン酸（ｐＨ７）緩衝液中でのインキュベーション後にＮＡｃＣｙｓ付加物に完全に変わる。Ｂ〜Ｅ：ホウ酸緩衝液中のｖｃＭＭＡＥのインキュベーション過程での副産物の出現。Ｆ〜Ｉ：ホウ酸緩衝液（ｐＨ９）中かつＴＣＥＰの存在下での副産物の出現。
【図２４】システインと反応できず、したがってＣＲ０１１と結合体化することのできないリテンションタイム９．２分の副産物のＬＣＭＳによる同定。
【図２５】ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）中、ＴＣＥＰの存在下または不存在下でのインキュベーション後のＮＡｃＣｙｓ−ｖｃＭＭＡＥ形成と副産物（スクシンイミジル−ｖｃＭＭＡＥ）形成の速度論。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される「抗体」との用語は、免疫グロブリンまたはその断片または誘導体を指し、インビトロまたはインビボで産生するかにかかわらず抗原結合部位を含有するポリペプチドを包含する。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、改変抗体およびグラフト化抗体が含まれるが、これらに限定されない。「インタクトな抗体」等の「インタクトな」との用語によって特に修飾されていない限り、本開示の目的のための「抗体」との用語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−Ａｂ、Ｆｄ、ｄＡｂ等の抗体断片および抗原結合機能（すなわち、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する能力）を保持する他の抗体断片も包含する。
【００２５】
本明細書中で使用される「抗原結合領域」および「抗原結合断片」および「結合断片」との用語は、抗体と抗原との間の特異的な結合に関与するアミノ酸を含有する抗体分子の部分をいう。例えば、抗原が大きい場合、抗原結合領域は抗原の一部のみに結合するだけであろう。抗原結合領域との特異的な相互作用に関与する抗原分子部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」と称される。
【００２６】
抗原結合領域は、典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むが、両方を含むことは必ずしも必要ではない。例えば、いわゆるＦｄ抗体断片はＶＨ領域のみからなるが、それでもなおインタクトな抗体の一部の抗原結合機能を保持している。
【００２７】
本明細書中で使用される「レパートリー」との用語は、発現させる免疫グロブリンをコードする配列に完全または部分的に由来するヌクレオチドの遺伝的に多様な集団をいう。これらの配列は、例えば、Ｈ鎖のＶ、ＤおよびＪセグメント、および例えば、Ｌ鎖のＶおよびＪセグメントのインビボ再編成により生じる。もしくは、それら配列は、再構成を引き起こすインビトロ刺激によって細胞系から生じさせてよい。もしくは、それら配列の一部または全ては、例えば、未再構成のＶセグメントをＤセグメントおよびＪセグメントに、ヌクレオチド合成、ランダム変異導入法および他の方法（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号に開示された方法）によって組み合わせて得てもよい。
【００２８】
本明細書中で使用される「特異的相互作用」および「特異的結合」との用語は、比較的安定な結合体を生理学的条件下に形成する２つの分子をいう。特異的結合は、高親和性と低〜中容量とにより特徴付けられ、これは中〜容量を有する低親和性を通常有する非特異的結合と区別される。典型的には、親和性定数ＫＡが１０６Ｍ−１よりも高いか、またはさらに好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合に、結合は特異的であるとみなされる。必要であれば、非特異的結合は、特異的結合に実質的に影響を与えることなく、結合条件を変えることにより低減させることができる。抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度等の適当な結合条件は当業者により通常の技術を用いて最適化されるだろう。
【００２９】
本明細書中で使用される「実質的に示されている」との用語は、本発明の関連するＣＤＲ、ＶＨまたはＶＬ領域が、配列の示された特定領域（例えば、ＣＤＲ）と同一であるか、またはごく僅かな違いを有するだけであることを示す。ごく僅かな違いとして、特定領域の配列中のいずれか５個のアミノ酸のうち１個または２個のアミノ酸の置換等、マイナーなアミノ酸変化が挙げられる。
【００３０】
本明細書中で使用される「ＣＲ０１１」との用語は、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体をいう。一部実施態様において、ＣＲ０１１は本出願の表２Ａ〜表２Ｄに同定されている抗体をいう。一部実施態様において、ＣＲ０１１は本発明に記載されるＭａｂ１．１５．１をいう。
【００３１】
「ＧＰＮＭＢ」および「ＣＧ５６９７２」との用語はここでは互換的に使用される。本明細書中で使用される「ＧＰＮＭＢ」または「ＣＧ５６９７２」との用語は、配列番号２８９に示されるアミノ酸配列を有する膜貫通糖タンパク質、その類似体、誘導体または断片、またはＧＰＮＭＢを含む融合タンパク質、その類似体、誘導体または断片をいう。一定の実施態様において、「ＧＰＮＭＢ」との用語は、ＧＰＮＭＢの成熟したプロセス形をいう。他の実施態様において、「ＧＰＮＭＢ」との用語は、ＧＰＮＭＢの細胞外領域をいう。
【００３２】
本明細書中で使用される「ＧＰＮＭＢ活性」との用語は、ＧＰＮＭＢに関連する１種類以上の活性をいう。ＧＰＮＭＢ活性を「調節する」とは、ＧＰＮＭＢにより観察され、かつＧＰＮＭＢに帰することのできるベースライン結果を変更することである。ＧＰＮＭＢ活性を「中和する」とは、１種類以上の効果、例えば、ＧＰＮＭＢにより観察され、かつＧＰＮＭＢに帰することのできる活性を無効にすることである。
【００３３】
本明細書中で使用される「単離された」との用語は実質的にその自然環境にない分子をさす。例えば、単離されたタンパク質は、それが由来する細胞源または組織源の細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。「単離された」との用語は、単離されたタンパク質が、医薬組成物として投与されるのに十分純粋であるか、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、より好ましくは少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）純粋、さらにより好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）純粋である調製物をいう。
【００３４】
本明細書中で使用される「阻害する」または「の阻害」との用語は、測定可能な量までの減少、または完全に阻害することをいう。
【００３５】
細胞に対する作用薬の効果に関して本明細書中で使用される「細胞障害効果」は細胞の死滅を意味する。「細胞静止作用」とは細胞増殖の阻害をいう。「細胞毒性薬」とは、細胞に対して細胞障害または細胞静止作用を有することで細胞集団内の細胞の成長をそれぞれ枯渇させるか、または阻害する物質をいう。
【００３６】
本明細書中で使用される「妨げる」、「予防する」、「妨げている」、「予防している」、「阻止」および「予防」との用語は、治療薬の投与または複数の治療薬の組合せの投与から得られる被験体中のＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連した疾患（例えば、癌）の発達または発症の阻害、またはＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連した疾患（例えば、癌）の１つ以上の症状の再発、発症または発達の阻止をいう。
【００３７】
本明細書中で使用される「有効量」との用語は、患者の症状の改善をもたらすか、所望の生物学的成果を達成するために、ＧＰＮＭＢの活性を減少するのに十分な投与量または量をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される「予防効果のある量」との用語は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連する疾患（例えば、癌）またはその１つ以上の症状の発達、再発または発症の阻止をもたらすか、または別の治療薬の予防効果を増強または向上するのに十分な治療薬の量をいう。
【００３９】
本明細書中で使用される「プロトコール」は投与スケジュールおよび投与計画を含む。ここでのプロトコールは使用方法であり、予防プロトコールと治療プロトコールを含む。
【００４０】
本明細書中で使用される「被験体」および「患者」との用語は互換的に用いられる。本明細書中で使用される「被験体」および「患者」との用語は動物、好ましくは、哺乳類、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、カニクイザル等のサル、チンパンジーおよびヒト）、より好ましくはヒトをいう。
【００４１】
ここで使用される「治療剤」との用語は、本発明において、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連する疾患（例えば、癌）またはその１つ以上の症状の阻止、治療、処置または改善に用いることのできる物質をいう。一定の実施態様において、「治療剤」とは、ＧＰＮＭＢに免疫特異的に結合する抗体をいう。一定の他の実施態様において、「治療剤」との用語はＧＰＮＭＢに免疫特異的に結合する抗体以外の物質をいう。
【００４２】
本明細書中で使用される「治療」および「治療剤」との用語は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連する疾患（例えば、癌）またはその１つ以上の症状の阻止、治療、処置または改善に用いることのできるプロトコール、方法および／または物質をいう。一定の実施態様において、「治療」および「治療剤」との用語は、癌、または医療関係者等の当業者に知られているその１つ以上の症状の治療、処置、予防または改善に有用な抗癌治療、生物学的治療、支持療法および／または他の治療をいう。
【００４３】
本明細書中で使用される「治療する」、「治療」および「治療している」との用語は、原発性、局所的または転移性癌組織の根絶、除去、緩和または調節、またはＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連した疾患の進行、重症度および／または期間の減少または改善、または１つ以上の療法剤の投与から生じるそれらの１つ以上の症状の改善をいう。一定の実施態様において、癌の文脈におけるそのような用語は、癌性細胞の成長の低下、癌性細胞の数の減少および／または腫瘍の成長、形成および／または容積の減少をいう。他の実施態様において、そのような用語は、そのような疾患を有する被験体に１つ以上の療法剤を投与することから生じる癌の広がりの最小化または遅延をいう。治療として、例えば、症状の重症度、症状の数または再発の頻度の低減を挙げることができる。
【００４４】
特に定めのない限り、ここに記載の本発明に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者により共通して理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、ここに記載の細胞および組織培養、分子生物学およびタンパク質とオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される用語は当分野でよく知られ、常用されている。標準的な技術が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養と形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション）のために用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の指示書によるか、または当分野で通常達成されるように、またはここに記載のように実施する。前記技術と手順は、一般的に、当分野でよく知られた慣用の方法によるか、または本明細書全体にわたって引用され、論じられる多様な一般的な文献やさらに特定の文献に記載されるように実施する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，
Ｎ  Ｙ．  １９８９を参照）。ここに記載の分析化学、合成有機化学および医薬品化学と製薬化学に関連して利用される用語および実験手順と技術は当分野でよく知られており、慣用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品、製剤および投与ならびに患者の治療のために用いられる。
【００４５】
本発明は、ＧＰＮＭＢに対して特異性を有するＶＨとＶＬ領域ＦＲとＣＤＲ領域の塩基配列やアミノ酸配列等、生殖系列ヒト抗体重鎖Ｖ、Ｄ、Ｊの組合せと軽鎖Ｖ、Ｊの組合せを提供する。
【００４６】
抗原にさらされると、生殖系列配列に基づく抗原結合特異性を有するＢ細胞は活性化され、増殖し、分化して、異なるアイソタイプの免疫グロブリンを産生し、ならびに体細胞突然変異および／または親和性成熟を受けて、抗原に対するさらに高い親和性を有する免疫グロブリンを産生する。本発明は、ＧＰＮＭＢに対する特異性を有するそのような親和性成熟Ｖ領域ＦＲとＣＤＲ領域の塩基配列とアミノ酸配列を提供する。
【００４７】
抗体分子の抗原結合部分を含むＦａｂタイプの抗体断片は、Ｖ領域と第一定常領域を有するＨ鎖の一部にジスルヒド結合により共有結合したＬ鎖からなってよい。一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）はポリペプチドリンカーによりＬ可変領域に結合したＨ可変領域を有する。本発明は、ＧＰＮＭＢに対して特異的に結合する抗体の生殖系列領域または親和性成熟Ｖ領域に由来する配列を有するＦａｂ分子やｓｃＦｖ分子等の抗体断片を提供する。
【００４８】
二重特異性抗体や二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合やＦａｂ’断片の結合等の多様な方法により作ることができる（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ，  １９９０  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．
７９：  ３１５−３２１；  Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−１５５３を参照）。二重特異性抗体は、単一結合部位を有する断片の形態（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦｖ）では存在しない。
【００４９】
そのような二機能性抗体や二重特異性抗体が本発明で意図され、本発明に包含されることが理解されよう。ＧＰＮＭＢ、および細胞傷害性Ｔリンパ球上のＣＤ３抗体に対して特異性を有する二重特異性一本鎖抗体は、これらＴ細胞を、ＧＰＮＭＢを発現する腫瘍細胞に向かわせ、腫瘍のアポトーシスと根絶を引き起こすために使用することができる。この目的のための二重特異性ｓｃＦｖ構築物がここに記載される。ＧＰＮＭＢに対して特異的なｓｃＦｖ成分は、ここに記載の抗ＧＰＮＭＢ抗体から得ることができる。一部実施態様において、ここに開示される抗ＧＰＮＭＢ抗体成分は、ＧＰＮＭＢに対する生物学的活性ｓｃＦｖを作るために用いることができる。治療に役立つ二重特異性ｓｃＦｖの抗ＣＤ３
ｓｃＦｖ成分はジェンバンクに寄託された配列（受託番号ＣＡＥ８５１４８）から得られた。ＣＤ３または他のＴ細胞抗原を標的とすることが知られている別の抗体は、一本鎖骨格にあろうが、完全なＩｇＧにあろうが、抗ＧＰＮＭＢに結合させた場合に悪性腫瘍を治療するために同様に有効であろう。
【００５０】
ＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、Ｌカッパまたはラムダ定常領域等のＨまたはＬ定常領域またはアイソタイプＨ定常領域を含んでよい。本発明の一実施態様において、ＧＰＮＭＢに対する結合特異性を有するヒト抗体は、下記重鎖Ｖ領域：ＶＨ１−２（配列番号３０８）、ＶＨ２−５（配列番号３６０）、ＶＨ３−１１（配列番号３６１）、ＶＨ３−２１（配列番号３６２）、ＶＨ３−３０（配列番号３６３）、ＶＨ３−３３（配列番号３６４）、ＶＨ４−３１（配列番号３６５）、ＶＨ４−５９（配列番号３６６）またはＶＨ５−５１（配列番号３６７）；下記重鎖Ｄ領域：Ｄｌ−２０（配列番号３７５により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄｌ−２６（配列番号３７６により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ３−１０（配列番号３７７により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ３−１６（配列番号：３７８により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ３−２２（配列番号３７９により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ３−９（配列番号３８０により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ４−１７（配列番号３８１により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ５−２４（配列番号３８２により翻訳されるアミノ酸配列）、Ｄ６−１３（配列番号３８３により翻訳されるアミノ酸配列）またはＤ６−１９（配列番号３８４により翻訳されるアミノ酸配列）；下記重鎖Ｊ領域：ＪＨ３ｂ（配列番号３８５）、ＪＨ４ｂ（配列番号３８６）、ＪＨ５ｂ（配列番号３８７）またはＪＨ６ｂ（配列番号３８８）；軽鎖Ｖカッパ領域Ａ２（配列番号３７３）、Ａ３（配列番号３７１）、Ａ２０（配列番号３７０）、Ａ２７（配列番号３６９）、Ａ３０（配列番号３７４）、Ｌ２（配列番号３７２）またはＯ１（配列番号３６８）；およびＪ領域ＪＫ１（配列番号３８９）、ＪＫ２（配列番号３９０）、ＪＫ３（配列番号３９１）、ＪＫ４（配列番号３９２）またはＪＫ５（配列番号３９３）等の生殖細胞系列配列を含む。（一般的には、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  １９８７  ａｎｄ  １９９１；さらに、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  １９８７  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７；  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３を参照されたい）。発明の特定の実施態様において、ＧＰＮＭＢに対する結合特異性を有するヒト抗体は表１に示されるように組み合わされた生殖細胞系列領域である。
表１：ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体生殖細胞系列領域組合せ
【００５１】
【表１】
2014003986.tif 000003
本発明の実施態様において、単離された抗体は、配列番号２、配列番号２０、配列番号３８、配列番号５６、配列番号７４、配列番号９２、配列番号１１０、配列番号１２８、配列番号１４６、配列番号１６４、配列番号１８２、配列番号２００、配列番号２１８、配列番号２３６、配列番号２５３、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号２６５、配列番号２７０、配列番号２７４、配列番号２７７、配列番号２８１および配列番号２８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ポリペプチドを有する。そのようなアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号１９、配列番号３７、配列番号５５、配列番号７３、配列番号９１、配列番号１０９、配列番号１２７、配列番号１４５、配列番号１６３、配列番号１８１、配列番号１９９、配列番号２１７および配列番号２３５からなる群から選択される塩基配列によってコードされうる。別の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢに特異的に結合し、かつ配列番号１１、配列番号２９、配列番号４７、配列番号６５、配列番号８３、配列番号１０１、配列番号１１９、配列番号１３７、配列番号１５５、配列番号１７３、配列番号１９１、配列番号２０９、配列番号２２７および配列番号２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ポリペプチドを有する単離された抗体を提供する。そのようなアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号２８、配列番号４６、配列番号６４、配列番号８２、配列番号１００、配列番号１１８、配列番号１３６、配列番号１５４、配列番号１７２、配列番号１９０、配列番号２０８、配列番号２２６および配列番号２４４からなる群から選択される塩基配列によってコードされうる。さらに別の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢに特異的に結合し、かつ配列番号２、配列番号２０、配列番号３８、配列番号５６、配列番号７４、配列番号９２、配列番号１１０、配列番号１２８、配列番号１４６、配列番号１６４、配列番号１８２、配列番号２００、配列番号２１８、配列番号２３６、配列番号２５３、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号２６５、配列番号２７０、配列番号２７４、配列番号２７７、配列番号２８１および配列番号２８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを有し、かつ配列番号１１、配列番号２９、配列番号４７、配列番号６５、配列番号８３、配列番号１０１、配列番号１１９、配列番号１３７、配列番号１５５、配列番号１７３、配列番号１９１、配列番号２０９、配列番号２２７および配列番号２４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを有する単離された抗体を提供する。本発明のさらに別の実施態様において、抗ＧＰＮＭＢ抗体は、下記のＨまたはＬのＣＤＲポリペプチド配列：配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５４、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６６、配列番号２７１、配列番号２７８、配列番号２８２、配列番号２８６、配列番号２５５、配列番号２５８、配列番号２６２、配列番号２６７、配列番号２７２、配列番号２７５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７６、配列番号２８０、配列番号２８４および配列番号２８８の少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００５２】
特定の実施態様において、ヒト抗ＧＰＮＭＢ抗体は、Ｍａｂｌ．１０．２、Ｍａｂｌ．１５．１、Ｍａｂｌ．２．２、Ｍａｂｌ．７．１、Ｍａｂ２．１０．２、Ｍａｂ２．１５．１、Ｍａｂ２．１６．１、Ｍａｂ２．１７．１、Ｍａｂ２．２１．２、Ｍａｂ２．２２．１、Ｍａｂ２．２４．１、Ｍａｂ２．３．１、Ｍａｂ２．７．１およびＭａｂ２．８．１である。これらの抗体は、表２Ａ〜表２Ｄに示されるように本出願で同定されたアミノ酸配列と、それらをコードする核酸配列を有する。
表２Ａ：抗体の塩基（ＤＮＡ）配列とアミノ酸配列
【００５３】
【表２Ａ】
2014003986.tif 000004
表２Ｂ：抗体の塩基（ＤＮＡ）配列とアミノ酸配列
【００５４】
【表２Ｂ】
2014003986.tif 000005
表２Ｃ：抗体の塩基（ＤＮＡ）配列とアミノ酸配列
【００５５】
【表２Ｃ】
2014003986.tif 000006
表２Ｄ：抗体の塩基（ＤＮＡ）配列とアミノ酸配列
【００５６】
【表２Ｄ】
2014003986.tif 000007
（ＶＨ４−３１由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体）
特定の実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ４−３１を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【００５７】
【化１】
2014003986.tif 000008
特定の実施態様において、配列番号２５３はＤ３−２２またはＤ１−２０に組み合わされる。さらに、配列番号２５３とＤ３−２２またはＤ１−２０との組み合わせがＪＨ６ｂまたはＪＨ４ｂと組み合わされ、特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ１．１５．１、Ｍａｂｌ．７．１およびＭａｂ２．２２．１は配列番号２０、配列番号５６および配列番号１６４のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１９、配列番号５５および配列番号１６３の塩基配列によりコードされうる。
【００５８】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ４−３１ＣＤＲまたはその親和性成熟配列である：
【００５９】
【化２】
2014003986.tif 000009
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号２２、配列番号５８および配列番号１６６から選択されるＣＤＲ１配列を含む。
【００６０】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ４−３１ＣＤＲまたはその親和性成熟配列である：
【００６１】
【化３】
2014003986.tif 000010
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号２４、配列番号６０および配列番号１６８から選択されるＣＤＲ２配列を含む。
【００６２】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、配列番号１７０を有するＤ３−２２、ＪＨ６ｂの組合せである。もしくは、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、配列番号２６または配列番号６２を有するＤ１−２０、ＪＨ４ｂの組合せである。
【００６３】
（ＶＨ１−２由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体）
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ１−２を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【００６４】
【化４】
2014003986.tif 000011
特定の実施態様において、配列番号２５６はＤ３−１０またはＤ６−１９に組み合わされる。さらに、配列番号２５６とＤ３−１０またはＤ６−１９との組み合わせがＪＨ４ｂまたはＪＨ５ｂと組み合わされ、特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．３．１およびＭａｂ２．１７．１は配列番号１２８および配列番号２００のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１２７および配列番号１９９の塩基配列によりコードされうる。
【００６５】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ１−２ＣＤＲまたはその親和性成熟配列である：
【００６６】
【化５】
2014003986.tif 000012
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１３０および配列番号２０２から選択されるＣＤＲ１配列を含む。
【００６７】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ１−２ＣＤＲまたはその親和性成熟配列である：
【００６８】
【化６】
2014003986.tif 000013
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１３２および配列番号２０４から選択されるＣＤＲ２配列を含む。
【００６９】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、下記のアミノ酸配列を有する、生殖細胞系Ｄ３−１０、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列である：
【００７０】
【化７】
2014003986.tif 000014
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１３４および配列番号２０６から選択されるＣＤＲ３配列を含む。
【００７１】
（ＶＨ２−５由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体）
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ２−５を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【００７２】
【化８】
2014003986.tif 000015
特定の実施態様において、配列番号２６０はＤ３−９またはＤ３−１６に組み合わされ、さらに、ＪＨ４ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．８．１およびＭａｂ１．２．２は配列番号３８および配列番号２３６のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号３７および配列番号２３５の塩基配列によりコードされうる。
【００７３】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ２−５ＣＤＲまたはその親和性成熟配列である：
【００７４】
【化９】
2014003986.tif 000016
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号４０および配列番号２３８から選択されるＣＤＲ１配列を含む。
【００７５】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ２−５ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【００７６】
【化１０】
2014003986.tif 000017
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号４２および配列番号２４０から選択されるＣＤＲ２配列を含む。
【００７７】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、生殖細胞系Ｄ３−９、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【００７８】
【化１１】
2014003986.tif 000018
ここで、Ｘ１はＹまたはＨである；
Ｘ２はＹまたはＦである；および
Ｘ３はＹまたはＮである
（配列番号２６３）。
【００７９】
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号２４２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００８０】
さらに別の特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、生殖細胞系Ｄ３−１６、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【００８１】
【化１２】
2014003986.tif 000019
ここで、Ｘ１はＶまたはＤである
（配列番号２６４）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号４４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００８２】
（ＶＨ３−３３由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体）
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ３−３３を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【００８３】
【化１３】
2014003986.tif 000020
特定の実施態様において、配列番号２５６はＤ３−１０またはＤ４−１７に組み合わされ、さらにＪＨ４ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．７．１およびＭａｂ２．１５．１は配列番号９２および配列番号２１８のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号９１および塩基配列２１７によりコードされうる。
【００８４】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ３−３３ＣＤＲまたはその親和性成熟配列である：
【００８５】
【化１４】
2014003986.tif 000021
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号９４および配列番号２２０から選択されるＣＤＲ１配列を含む。
【００８６】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ３−３３ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【００８７】
【化１５】
2014003986.tif 000022
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号９６および配列番号２２２から選択されるＣＤＲ２配列を含む。
【００８８】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ３−１０、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【００８９】
【化１６】
2014003986.tif 000023
特定の実施態様は、配列番号２２４のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体２．７．１である。
【００９０】
別の実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ４−１７、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【００９１】
【化１７】
2014003986.tif 000024
ここで、Ｘ１はＹまたはＳである；
（配列番号２６９）
特定の実施態様は、配列番号９８のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体２．１５．１である。
【００９２】
（ＶＨ３−１１由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体）
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ３−１１を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【００９３】
【化１８】
2014003986.tif 000025
特定の実施態様において、配列番号２７０はＤ６−１３に組み合わされ、さらにＪＨ３ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．１６．１は配列番号１１０のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１０９の塩基配列によりコードされうる。
【００９４】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ３−１１ＣＤＲ１またはその親和性成熟配列である：
【００９５】
【化１９】
2014003986.tif 000026
ここで、Ｘ１はＤまたはＳである；
Ｘ２はＳまたはＹである；
Ｘ３はＳまたはＴである；
（配列番号２７１）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１１２のＣＤＲ１配列を含む。
【００９６】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ３−１１ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【００９７】
【化２０】
2014003986.tif 000027
ここで、Ｘ４はＳまたはＩである；
Ｘ５はＴまたはＩである；
Ｘ６はＴまたはＩである；
Ｘ７はＹまたはＨである；
（配列番号２７２）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１１４のＣＤＲ２配列を含む。
【００９８】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ６−１３、ＪＨ３ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【００９９】
【化２１】
2014003986.tif 000028
ここで、Ｘ１はＧまたはＤである；
Ｘ２はＩまたはＧである；
（配列番号２７３）
特定の実施態様は、配列番号１１６のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体２．１６．１である。
【０１００】
ＶＨ３−２１由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体：
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ３−２１を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【０１０１】
【化２２】
2014003986.tif 000029
ここで、Ｘ１はＥまたはＱである；
Ｘ２はＶまたはＥである；
Ｘ３はＥまたはＱである；
Ｘ４はＦまたはＬである；
Ｘ５はＳまたはＦである；
（配列番号２７４）
特定の実施態様において、配列番号２７４はＤ１−２６に組み合わされ、さらにＪＨ４ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．２１．１は配列番号１４６のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１４５の塩基配列によりコードされうる。
【０１０２】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、配列番号１４８の生殖細胞系ＶＨ３−２１ＣＤＲ１またはその親和性成熟配列である。
【０１０３】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記式の生殖細胞系ＶＨ３−２１ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【０１０４】
【化２３】
2014003986.tif 000030
ここで、Ｘ５はＳまたはＦである；
（配列番号２７５）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１５０のＣＤＲ２配列を含む。
【０１０５】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ１−２６、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【０１０６】
【化２４】
2014003986.tif 000031
ここで、Ｘ１はＧまたはＤである；
Ｘ２はＩまたはＷである；
（配列番号２７６）
特定の実施態様は、配列番号１５２のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体２．２１．１である。
【０１０７】
ＶＨ３−３０由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体：
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ３−３０を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【０１０８】
【化２５】
2014003986.tif 000032
ここで、Ｘ１はＴまたはＡである；
Ｘ２はＳまたはＮである；
（配列番号２７７）
特定の実施態様において、配列番号２７７がＤ３−１０に組み合わされ、さらにＪＨ６ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．１０．２は配列番号７４のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号７３の塩基配列によりコードされうる。
【０１０９】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記のアミノ酸配列を有する生殖細胞系ＶＨ３−３０ＣＤＲ１またはその親和性成熟配列である：
【０１１０】
【化２６】
2014003986.tif 000033
ここで、Ｘ１はＴまたはＡである；
（配列番号２７８）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号７６のＣＤＲ１配列を含む。
【０１１１】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記の生殖細胞系ＶＨ３−３０ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【０１１２】
【化２７】
2014003986.tif 000034
ここで、Ｘ２はＳまたはＮである；
（配列番号２７９）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号７８のＣＤＲ２配列を含む。
【０１１３】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ３−１０、ＪＨ６ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【０１１４】
【化２８】
2014003986.tif 000035
ここで、Ｘ１はＩまたはＤである；
Ｘ２はＴまたはＬである；
Ｘ３はＭまたはＶである；
Ｘ４はＶまたはＩである；
Ｘ５はＩまたはＲである；
Ｘ６はＩまたはＧである；
（配列番号２８０）
特定の実施態様は、配列番号８０のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体２．１０．２である。
【０１１５】
ＶＨ４−５９由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体：
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ４−５９を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【０１１６】
【化２９】
2014003986.tif 000036
ここで、Ｘ１はＧまたはＤである；
Ｘ２はＳまたはＮである；
Ｘ３はＩまたはＦである；
（配列番号２８１）
特定の実施態様において、配列番号２８１がＤ６−１９に組み合わされ、さらにＪＨ４ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ１．１０．２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１の塩基配列によりコードされうる。
【０１１７】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記のアミノ酸配列を有する生殖細胞系ＶＨ４−５９ＣＤＲ１またはその親和性成熟配列である：
【０１１８】
【化３０】
2014003986.tif 000037
ここで、Ｘ１はＧまたはＤである；
Ｘ２はＳまたはＮである；
（配列番号２８２）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号４のＣＤＲ１配列を含む。
【０１１９】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記の生殖細胞系ＶＨ４−５９ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【０１２０】
【化３１】
2014003986.tif 000038
ここで、Ｘ３はＩまたはＦである；
（配列番号２８３）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号６のＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
【０１２１】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ６−１９、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【０１２２】
【化３２】
2014003986.tif 000039
ここで、Ｘ１はＳまたはＤである；
Ｘ２はＳまたはＲである；
（配列番号２８４）
特定の実施態様は、配列番号８のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体１．１０．２である。
【０１２３】
ＶＨ５−５１由来の抗ＧＰＮＭＢ抗体：
特別な実施態様において、本発明のＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体は、生殖細胞系Ｖ重鎖領域ＶＨ５−５１を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する：
【０１２４】
【化３３】
2014003986.tif 000040
ここで、Ｘ１はＫまたはＱである；
Ｘ２はＳまたはＩである；
Ｘ３はＳまたはＮである；
Ｘ４はＩまたはＶである；
Ｘ５はＧまたはＤである；
Ｘ６はＭまたはＩである；
（配列番号２８５）
特定の実施態様において、配列番号２８５がＤ５−２４に組み合わされ、さらにＪＨ４ｂと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのＧＰＮＭＢ結合性ヒト抗体、例えば、Ｍａｂ２．２４．１は配列番号１８２のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１８１の塩基配列によりコードされうる。
【０１２５】
さらに、特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ１配列は、下記のアミノ酸配列を有する生殖細胞系ＶＨ５−５１ＣＤＲ１またはその親和性成熟配列である：
【０１２６】
【化３４】
2014003986.tif 000041
ここで、Ｘ２はＳまたはＩである；
Ｘ３はＳまたはＮである；
（配列番号２８６）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１８４のＣＤＲ１配列を含む。
【０１２７】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ２配列は、下記の生殖細胞系ＶＨ５−５１ＣＤＲ２またはその親和性成熟配列である：
【０１２８】
【化３５】
2014003986.tif 000042
ここで、Ｘ４はＩまたはＶである；
Ｘ５はＧまたはＤである；
（配列番号２８７）
特定の実施態様において、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、配列番号１８６のＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
【０１２９】
特別な実施態様において、Ｈ鎖ＣＤＲ３配列は、Ｄ５−２４、ＪＨ４ｂの組合せまたはその親和性成熟配列であり、下記のアミノ酸配列を含む：
【０１３０】
【化３６】
2014003986.tif 000043
ここで、Ｘ１はＲまたはＫである；
Ｘ２はＬまたはＨである；
（配列番号２８８）
特定の実施態様は、配列番号１８８のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体２．２４．１である。
【０１３１】
本発明の抗体は、ＧＰＮＭＢ（配列番号２８９）のエピトープに、好ましくはＧＰＮＭＢの成熟配列内で、さらに好ましくはＧＰＮＭＢの細胞外領域（ＥＣＤ）内で結合する。
【０１３２】
本発明の抗体は、１０−６〜１０−１１の親和性でＧＰＮＭＢに結合する。好ましくは、１０−７以上、さらに好ましくは１０−８以上の親和性で結合する。好ましい実施態様において、ここに記載の抗体は非常に高い親和性（Ｋｄ）でＧＰＮＭＢに結合し、例えば、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、または１０−１４Ｍ未満、またはこれらいずれかの範囲または値等の、しかし、これらに限定されないＫｄでＧＰＮＭＢに結合することができるヒト抗体である。親和性および／または結合活性の測定は、ここに記載するように、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）および／またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定することができる。特別な実施態様において、本発明の抗体は５０〜１５０ｐＭの範囲のＫｄでＧＰＮＭＢに結合する。
【０１３３】
エピトープマッピングおよび二次構造と三次構造の分析を行なって、開示された抗体およびそれらの抗原との結合体により推定される特定の３Ｄ構造を同定することができる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｅｄ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６を参照）。そのような方法として、Ｘ線結晶構造解析（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ，  １１：  ７−１３，  １９７４）および今回開示された抗体の仮想表現のコンピュータモデル（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
さらに、抗体により認識されるタンパク質免疫原の特定部分を、タンパク質の一部分、例えばＮ末端とＣ末端ハーフに対する抗体反応性を分析することにより決定してよい。次に、得られる反応性断片は、最小反応性ペプチドが定められるまで免疫原のさらに小さい部分を抗体により継続的に分析することで、さらに細かく調べることができる。もしくは、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体の結合特異性（すなわちエピトープ）を、還元剤の不存在下または存在下のいずれかでＧＰＮＭＢ免疫原をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することにより決定し、イムノブロッティングにより分析してよい。エピトープマッピングは、タンパク質−タンパク質相互作用の部位を決定するために用いられるＳＥＬＤＩ．ＳＥＬＤＩプロテインチップ（登録商標）（ＬｕｍｉＣｙｔｅ）アレイを用いて実施してもよい。ＧＰＮＭＢタンパク質抗原またはその断片は、プロテインチップアレイ表面に共有結合的に固定化した抗体により特異的に捕らえてもよい。結合抗原を、レーザー誘起脱着プロセスにより検出して、直接分析してそれらの質量を決定してよい。
【０１３５】
ここに記載される抗ＧＰＮＭＢ抗体により認識されるエピトープは、繊維状ファージ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）上に示されるランダムペプチド１２量体のコンビナトリアルライブラリーにプロテインチップアレイをさらすことにより決定してよい。抗体結合ファージは溶出され、次に増幅され、さらなる結合と増幅サイクルを経て、結合配列に利するプールを濃縮する。３または４ラウンド後に、個々の結合性クローンを、抗原塗布ウエル上で実施されるファージＥＬＩＳＡにより結合性についてさらに調べ、陽性クローンの特定のＤＮＡ配列決定により特徴付ける。
【０１３６】
誘導体
さらに、本開示はＧＰＮＭＢに対して特異的な抗体を得るための方法を提供する。そのような抗体中のＣＤＲは、表１に同定されたＨおよびＬ可変領域の特定の配列に限定されず、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する能力を保持する配列の改変体を含んでよい。そのような改変体は、表１に示される配列から、当業者によって当分野でよく知られた技術を用いて得てよい。例えば、アミノ酸置換、欠失または付加をＦＲおよび／またはＣＤＲに対して行なうことができる。ＦＲの変更は通常抗体の安定性と免疫原性を向上させるように設計するが、ＣＤＲの変更は典型的には抗体の、その標的に対する親和性を高めるように設計する。ＦＲの改変体は、天然の免疫グロブリンアロタイプも含む。そのような親和性を高める変更は、ＣＤＲの変更と抗体のその標的に対する親和性の試験を伴う日常的な技術により実験的に決定してよい。例えば、保存アミノ酸置換は開示されたＣＤＲのいずれか１つで行なうことができる。多様な変更は当分野に記載される方法にしたがって行なうことができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｅｄ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，  １９９５）。これらのものとして、機能的に等しいアミノ酸配列をコードする異なるコドンを配列内で置換して、「サイレント」変化を作って変化させた塩基配列が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。配列内のアミノ酸の置換物は、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してよい（表３を参照）。さらに、ポリペプチド内の天然の残基はアラニンと置換してもよい（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｓｕｐｐｌ．  ６４３：５５−６７，  １９９８；  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．
３５：１−２４，  １９９８）。
【０１３７】
表３．アミノ酸の置換
【０１３８】
【表３】
2014003986.tif 000044
本発明の抗体の誘導体および類似体は、組換えや合成法等の当分野でよく知られた多様な技術により作ることができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１３９】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させる置換、（２）酸化に対する感受性を減少させる置換、（３）タンパク質結合体を形成する結合親和性を変える置換、（４）結合親和性を変える置換、および（４）そのような類似体の他の物理化学的または機能的性質を付与または修飾する置換である。類似体として、天然のペプチド配列以外の配列の多様な変異タンパク質を挙げることができる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存アミノ酸置換）は、天然の配列（好ましくは分子間接触を形成する領域の外側のポリペプチド部分）において行なってよい。保存アミノ酸置換は親配列の構造的特徴を実質的に変えてはならない（例えば、置換アミノ酸は親配列で生じるヘリックスを壊したり、親配列を特性付ける他の種類の二次構造を壊したりする傾向があってはならない）。当分野で認識されたポリペプチドの二次および三次構造の例が当分野で記載されている（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））。
【０１４０】
一実施態様において、本発明のＨ可変領域のアミノ酸配列改変体であるＨ可変領域を作る方法は、今回開示されたＨ可変領域のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸を付加、欠失、置換または挿入し、任意に、このように提供されたＨ可変領域を１つ以上のＬ可変領域に組合せ、Ｈ可変領域またはＨ可変／Ｌ可変の組合せを、ＧＰＮＭＢに対する特異的結合について調べ、任意に、そのような抗原結合領域のＧＰＮＭＢ活性を調節する能力を調べる工程からなる。Ｌ可変領域は、表１に示されるものと同一であるか、または実質的に示されるアミノ酸配列を有してよい。
【０１４１】
ここに開示されるＬ可変領域の１つ以上の配列変化を１つ以上のＨ可変領域に組み合わせる類似の方法を用いることができる。
【０１４２】
本開示のさらなる態様は、ＧＰＮＭＢに特異的に結合する抗原結合断片を調製する方法を提供する。本方法は、（ａ）置換されるＣＤＲ３を含むか、もしくはＣＤＲ３をコードする領域を欠くＨ可変領域をコードする核酸の出発レパートリーを提供し；（ｂ）Ｈ可変ＣＤＲ３に関してここで実質的に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸に該レパートリーを組み合わせて、Ｈ可変領域をコードする核酸の産物レパートリーを提供するようにドナー核酸をパートリー中のＣＤＲ３領域に挿入し；（ｃ）産物レパートリーの核酸を発現し；（ｄ）ＧＰＮＭＢに対して特異的な結合断片を選択し；（ｅ）それをコードする特異的結合断片または核酸を回収することを含む。
【０１４３】
さらに、置換されるＣＤＲ３を含むか、またはＣＤＲ３をコードする領域を欠くＬ可変領域をコードする核酸のレパートリーに本発明のＬ可変ＣＤＲ３を組み合わせる類似の方法を使用してよい。ドナー核酸は、配列番号２、配列番号２０、配列番号３８、配列番号５６、配列番号７４、配列番号９２、配列番号１１０、配列番号１２８、配列番号１４６、配列番号１６４、配列番号１８２、配列番号２００、配列番号２１８、配列番号２３６、配列番号２５３、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号２６５、配列番号２７０、配列番号２７４、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８５、配列番号１１、配列番号２９、配列番号４７、配列番号６５、配列番号８３、配列番号１０１、配列番号１１９、配列番号１３７、配列番号１５５、配列番号１７３、配列番号１９１、配列番号２０９、配列番号２２７および配列番号２４５に実質的に示されるアミノ酸配列をコードする核酸から選択してよい。本発明のＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）をコードする配列は、組換えＤＮＡ技術、例えば、Ｍａｒｋｓ等（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０：７７９−７８３）に記載された方法を用いて各ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠く多様な領域のレパートリーに導入してよい。特に、可変領域の５’末端に向けられたか、またはそれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＨ可変遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと併用して、ＣＤＲ３を欠くＨ可変領域のレパートリーを提供することができる。このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３に組み合わせてよい。類似の技術を用いて、ＣＤＲ３由来の配列を、ＣＤＲ３を欠くＨ可変またはＬ可変領域のレパートリーと組み替えて、この組み替えた完全Ｈ可変またはＬ可変領域を同族のＬ可変またはＨ可変領域に組み合わせて本発明のＧＰＮＭＢに特異的な抗体を作ってよい。次に、このレパートリーは、適当な抗原結合断片が選択できるように、ＷＯ９２／０１０４７に記載されたようなファージディスプレイシステム等の適当な宿主系で提示してよい。  
【０１４４】
類似の組み替えまたはコンビナトリアル技術を用いてよい（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ，
Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）。さらなる実施態様において、１つ以上の選択されたＨ可変および／またはＬ可変遺伝子のランダム変異導入法、例えば変異性ＰＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：３５７６−３５８０）を用いて、ここに記載の配列から得られた１つ以上の配列を保有する新規なＨ可変またはＬ可変領域を作ってよい。使用してよい別の方法は変異誘発をＨ可変またはＬ可変遺伝子のＣＤＲに直接向けることである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９４）９１：３８０９−３８１３；  Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６３：  ５５１−５６７）。同様に、一つ以上か、または３つのすべてのＣＤＲをＨ可変またはＬ可変領域のレパートリーにグラフトしてよく、次に、これらの可変領域をＧＰＮＭＢに対して特異的な抗原結合性断片に関してスクリーニングする。
【０１４５】
免疫グロブリン可変領域の部分は、実質的にここに示されるＣＤＲｓの少なくとも１つ、および任意に、ここに示される介在性フレームワーク領域を含むだろう。この部分は、ＦＲ１とＦＲ４のいずれか、または両方の少なくとも約５０％を含んでよく、この５０％はＦＲ１のＣ末端の５０％とＦＲ４のＮ末端の５０％である。可変領域の実質的な部分のＮ末端側またはＣ末端側の終端のさらなる残基は、通常は天然の可変領域部には付随しないものである。例えば、組換えＤＮＡ技術による抗体の構築は、クローニングまたは他の操作工程を容易にするために導入されるリンカーによりコードされるＮまたはＣ末端残基の導入をもたらすだろう。他の操作工程は、免疫グロブリン重鎖定常領域、（例えば、ジィアボディーの産生における）他の可変領域、または以下にさらに詳しく説明するタンパク質性標識等のさらなるタンパク質配列に可変領域を結合させるリンカーの導入をともなう。
【０１４６】
実施例で示される実施態様はＨ可変領域とＬ可変領域の「マッチング」ペアを含むが、代わりとなる実施態様はＬ可変領域かＨ可変領域のいずれかに由来する単一のＣＤＲのみを含む抗原結合断片を含んでよいことを当業者は理解するだろう。単鎖の特定の結合領域のいずれか１つを使用して、例えばＧＰＮＭＢに結合することのできる二領域特異的抗原結合断片を形成することのできる相補的領域をスクリーニングすることができる。このスクリーニングは、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含む個々のコロニー用いて、他の鎖（ＬまたはＬ）をコードするクローンの完全ライブラリーに感染させ、得られた二重鎖の特定の結合領域を、記載されるようにファージディスプレイ法にしたがって選択するＷＯ９２／０１０４７に開示されたいわゆる階層二重コンビナトリアル手法を用いるファージディスプレイスクリーニング法により達成してよい。
【０１４７】
ここに記載の抗ＧＰＮＭＢ抗体は、別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（アルブミン、別の抗体等）、毒素、放射性同位元素、細胞毒性薬または細胞分裂阻害剤に連結することができる。例えば、抗体は化学的架橋により、または組換え法により連結することができる。さらに、抗体は、多様な非タンパク質性タンパク質の１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンに、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号または米国特許第４，１７９，３３７号に示される方法で結合してもよい。抗体は、例えば、それらの循環半減期を長くするために、ポリマーへの共有結合によって化学修飾することができる。それらを付着させる例示的なポリマーと方法は、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，４９５，２８５号および米国特許第４，６０９，５４６号にも示されている。
【０１４８】
開示された抗体は、天然のパターンとは異なるグリコシル化パターンを有するように変更してもよい。例えば、１つ以上の炭水化物部分を欠失させることができ、および／または１つ以上のグリコシル化部位を本来の抗体に付加できる。今回開示の抗体に対するグリコシル化部位の付加は、当分野で知られているグリコシル化部位コンセンサス配列を含むようにアミノ酸配列を変えることにより達成してよい。抗体上の炭水化物部分の数を多くする別の手段は、抗体のアミノ酸残基に対するグリコシドの化学的または酵素的結合によるものである（ＷＯ  ８７／０５３３０；  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２２：２５９−３０６，１９８１）。抗体からの炭水化物部分の除去は化学的または酵素的に達成してよい（Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２５９：  ５２，  １９８７；  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１８：１３１，  １９８１；  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １３８：３５０，  １９８７）。抗体に検出可能な標識または機能標識を付加してもよい。検出可能な標識として、慣用の化学を用いて抗体に付着してよい１３１Ｉまたは９９Ｔｃ等の放射性標識が挙げられる。検出可能な標識として、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等の酵素標識も挙げられる。検出可能な標識として、特定の同族の検出可能な部分（例えば、標識されたアビジン）に対する結合により検出してよいビオチン等の化学部分がさらに挙げられる。
【０１４９】
抗体の結合価は、親和性と結合活性、結合部位におけるリテンションタイムに影響を与えるように、要求にあった設計をしてよい（例えば、Ａｍ  Ｈ．  Ｐａｔｈｏｌ，  ２００２  １６０：１５９７−１６０８；  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２  ４５：２２５０−２２５９；  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２  ８６：１４０１−１４１０；  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｅｎｇ．  ２００１  １８：９５−１０８；  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２  １００：３６７−３７４を参照）。
【０１５０】
多重特異性（二機能性）結合試薬を本発明のＧＰＮＭＢに特異的な配列に基づいて設計してよい（Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｅｎｇ．  ２００１  １８：３１−４０）。例えば、二特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合やＦａｂ’断片の結合等の多様な方法により作ることができる（Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９０，  ７９：３１５−３２１；，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９，  ２１４８：１５４７−１５５３）。ＧＰＮＭＢに対する特異性と第２分子に対する第２特異性を構成するそのような二特異性抗体はよく知られた技術を用いて作成することができる（Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９４，４：７２−８１；  Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，  ｓｕｐｒａ．；  Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２
Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２）。このようにして作られた二特異性抗体は、ＧＰＮＭＢを発現する細胞を選択的に死滅させる。
【０１５１】
ＣＤＲ配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９３、配列番号１９５、配列番号１９７、配列番号２０２、配列番号２０４、配列番号２０６、配列番号２１１、配列番号２１３、配列番号２１５、配列番号２２０、配列番号２２２、配列番号２２４、配列番号２２９、配列番号２３１、配列番号２３３、配列番号２３８、配列番号２４０、配列番号２４２、配列番号２４７、配列番号２４９および配列番号２５１に示されるものとはごくわずかに異なる抗体、および配列番号２５４、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６６、配列番号２７１、配列番号２７８、配列番号２８２、配列番号２８６、配列番号２５５、配列番号２５８、配列番号２６２、配列番号２６７、配列番号２７２、配列番号２７５、配列番号２７９、配列番号２８３、配列番号２８７、配列番号２５９、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７６、配列番号２８０、配列番号２８４、配列番号２８８が本発明の範囲に含まれる。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水的または立体化学的特性を有する関連アミノ酸により置換される。そのような置換は当業者の通常の技術内に存在するだろう。ＣＤＲとは異なり、ＦＲには、抗体の結合特性に悪影響を与えることなしに、さらに実質的な変化を起こしうる。ＦＲの変化として、抗原接触のため、または結合部位の安定化のために重要な一定のフレームワーク残基の設計、例えば、定常部のクラスまたはサブクラスの変化、Ｆｃレセプター結合等のエフェクター機能を変更しうる特定のアミノ酸残基の変化（米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，６４８，２６０号；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １４７：２６５７−２６６２；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９−３２４）、または定常部が由来する種の変更が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
当業者は、上記の誘導体や改変は網羅的ではないこと、他の多くの改変は本開示の技術を鑑みれば当業者に明らかであることを理解するだろう。
【０１５３】
核酸、クローニングおよび発現系
さらに、本開示は、開示された抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡからなり、全体的または部分的に合成または組換えであってよい。ここに示される塩基配列への言及は、その特定された配列を有するＤＮＡ分子も包含し、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、ＵがＴに置換されている特定された配列を有するＲＮＡ分子も包含する。
【０１５４】
ここに提供される核酸は、ここに開示されたＣＤＲ、Ｈ可変領域および／またはＬ可変領域をコードする領域を包含する。
【０１５５】
また、本開示は、ここに開示されたＣＤＲ、Ｈ可変領域および／またはＬ可変領域をコードする少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、ファーミジド、転写カセットまたは発現カセットの形態の構築物を提供する。
【０１５６】
さらに、本開示は、上記の１種類以上の構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０１５７】
ＣＤＲ（ＨまたはＬ可変領域のいずれかに由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）、Ｈ可変またはＬ可変領域をコードする核酸、ならびにコードされた産物を作る方法も提供される。本方法は、コード核酸に由来するコードされた産物を発現することを含む。発現は、核酸を含む組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することにより達成されるだろう。発現による産生後、Ｈ可変またはＬ可変領域、または特定の結合メンバーは適当な技術を用いて単離および／または精製し、次に必要に応じて使用してよい。
【０１５８】
抗原結合断片、Ｈ可変および／またはＬ可変領域およびコード核酸分子およびベクターを、それらの自然環境から、実質的に純粋または均一な形で単離および／または精製してよく、核酸の場合、必要とされる機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないか、または実質的に含まないものであってよい。
【０１５９】
抗体産生に適当な細胞等の多様な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングと発現のシステムは当分野でよく知られている（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｅｄｓ．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ
ａｌ．，  １９９９）。手短に言えば、適当な宿主細胞として、細菌、植物細胞、哺乳類の細胞および酵母およびバキュロウイルスが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当分野で利用可能な哺乳類の細胞系として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスミエローマ細胞およびその他多数が挙げられる。通常の細菌宿主は大腸菌である。本発明に適合するタンパク質発現系を用いて、開示された抗体を作ってもよい。適当な発現系としてトランスジェニック動物も挙げられる（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｅｄｓ．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｔ，  １９９９）。
【０１６０】
適当なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて他の配列等の適当な制御配列を含むように選択し、構築することができる。ベクターはプラスミドであるか、ウイルス性であり、例えば必要に応じてファージまたはファージミドであってよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｌｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９を参照）。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入と遺伝子発現、およびタンパク質の分析における核酸の操作のために多くの知られた技術や手順が当分野で公知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄｓ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９２）。
【０１６１】
また、本発明は、ここに開示の核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、そのような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。その導入は利用可能な技術を用いてよい。真核細胞に関しては、適当な技術として、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、リポソーム媒介形質移入、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアまたは昆虫細胞に関してはバキュロウイルスを用いた形質導入が挙げられるだろう。細菌細胞に関しては、適当な技術として、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、およびバクテリオファージを用いた形質移入が挙げられよう。核酸の細胞への導入後に、例えば、宿主細胞を遺伝子発現の条件下で培養することにより核酸からの発現を引き起こすか、核酸を発現させる。
【０１６２】
免疫結合体
別の態様において、本発明の抗体は、別の治療物質または細胞毒性物質を、ＧＰＮＭＢを発現する細胞に送達するターゲッティング剤として用いることができる。この方法は、治療物質または細胞毒性物質に結合させた抗ＧＰＮＭＢ抗体を、該抗体をＧＰＨＮＭＢに結合させる条件下に投与することを含む。
【０１６３】
抗ＧＰＮＭＢ抗体は、細胞毒性化合物等の治療剤に結合体化させて、得られた免疫結合体がＧＰＮＭＢ発現細胞に対して細胞毒性作用または細胞静止作用を及ぼすようにする。抗体に対して結合体化させる特に適当な部分は化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、または毒素である。例えば、抗ＧＰＮＭＢ抗体は、化学療法剤（下記参照）等の細胞毒性剤または毒素（アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素）に結合体化させることができる。もしくは、抗ＧＰＮＭＢ抗体はプロドラッグ変換酵素に結合体化させてよい。プロドラッグ変換酵素は、抗体またはその誘導体に組換え融合させることができ、または公知の方法を用いてそれに化学結合させることができる。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１６４】
ＧＰＮＭＢを発現する細胞に対して治療効果を及ぼす物質は、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体に結合体化させる物質として用いることができる。有用な種類の細胞毒性剤として、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝バインダー、ＤＮＡ複製インヒビター、アルキル化剤（例えば、シス−プランチン、モノ（プラチナ）、ビス（プラチナ）および三核プラチナ結合体およびカルボプラチン等のプラチナ結合体）、アントラサイクリン類、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ素化プリミジン類、イオノホア、レキシトロプシン類、ニトロソ尿素類、プラチノール類、予備形成化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン類、放射線増感剤、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド類等が挙げられる。
【０１６５】
治療剤は細胞毒性薬であることができる。適当な細胞毒性薬として、例えば、ドラスタチン類（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ副溝バインダー（例えば、エンジイン類およびレキシトロプシン類）、キュオカルマイシン類、タキサン類（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシン類、ビンカアルカロイド類、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コムブレタスタチン、ネトロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン類、セマドチン、メイタンシノイド類、ディスコデルモリド、エレウテロビンおよびミトキサントロンが挙げられる。
【０１６６】
特定の実施態様において、細胞毒性薬または細胞分裂阻害剤はオーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０）またはその誘導体（例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されたエステル）である。他の典型的なオーリスタチン誘導体として、ＡＦＰ、ＭＭＡＲおよびＭＭＡＥが挙げられる。オーリスタチンＥとその誘導体の合成と構造は米国特許出願第２００３００８３２６３号、ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４２０９、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１３４３５、米国特許第６，３２３，３１５号、米国特許第６，２３９，１０４号、米国特許第６，０３４０６５号、米国特許第５，７８０，５８８号、米国特許第５，６６５，８６０号、米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第５，６３５，４８３号、米国特許第５，５９９，９０２号、米国特許第５，５５４，７２５号、米国特許第５，５３０，０９７号、米国特許第５，５２１，２８４号、米国特許第５，５０４，１９１号、米国特許第５，４１０，０２４号、米国特許第５，１３８，０３６号、米国特許第５，０７６，９７３号、米国特許第４，９８６，９８８号、米国特許第４，９７８，７４４号、米国特許第４，８７９，２７８号、米国特許第４，８１６，４４４号、米国特許第４，４８６，４１４号に記載されている。
【０１６７】
特定の実施態様において、抗ＧＰＮＭＢ抗体１．１５．１を、細胞内プロテアーゼ感受性バリン−シトルリンペプチドリンカーによりモノメチルオーリスタチンＥに結合させた（ｖｃＭＭＡＥ）。免疫結合体を作る方法は、Ｄｏｒｏｎｉｎａ  Ｓ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ，  ２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７９４に見ることができる。
【０１６８】
治療剤をタンパク質、特に抗体に結合させる技術は当分野で知られている（例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８５；  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ
ｅｔ  ａｌ．，  １９８７  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒａｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ２ｎｄ  ｅｄ．  １９８７；  Ｔｈｏｒｐｅ  １９８５，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  ＥＤＩＴＯＲ，  １９８５；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂａｌｄｗｉｎ
ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５；  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６２：１１９−５８を参照）。
【０１６９】
本発明の一定の実施態様において、ＧＰＮＭＢを発現する細胞に結合する抗ＧＰＮＭＢ抗体は内部移行して該細胞内に蓄積する。それにより、抗ＧＰＮＭＢ抗体免疫結合体はＧＰＮＭＢを発現する細胞に蓄積する。典型的に、抗ＧＰＮＭＢ抗体免疫結合体が内部移行する場合、該物質は優先的に活動性がある。もしくは、抗ＧＰＮＭＢ免疫結合体は内部移行せず、医薬が細胞膜に結合することによって、ＧＰＮＭＢを発現する細胞を枯渇させ、阻害するのに効果的である。治療剤は、抗体から（例えば、加水分解または切断剤により）切断されないのであればその活性を減少させるように結合体化することができる。この場合、該物質は、標的の細胞内環境において切断に感受性があるが、細胞外環境には実質的に感受性のない切断性リンカーによって、抗体またはその誘導体に結合させえるので、該結合体は、ＧＰＮＭＢを発現する細胞により内部移行した場合（例えば、エンドソーム環境内、または例えばｐＨ感受性またはプロテアーゼ感受性の理由でリソソーム環境内または小窩内）、抗体またはその誘導体から切断される。
【０１７０】
免疫結合体治療剤は原形質膜に比べて荷電（例えば、原形質膜に比べて分極しているか、正味荷電）させることにより、細胞によっていったん内部移行したら原形質膜を通過する該物質の能力をさらに最小化することができる。
【０１７１】
抗ＧＰＮＭＢ抗体免疫結合体は、治療剤と抗体との間にリンカー部を含むことができる。リンカーは細胞内条件では切断可能であるので、リンカーの切断は細胞内環境で治療物質を抗体から遊離させる。リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ等の、しかし、これらに限定されない細胞内ペプチターゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーであってよい。ペプチジルリンカーはしばしば少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤として、カテプシン類およびＤおよびプラスミンを挙げることができ、これら全てが標的細胞内で活性のある医薬の放出をもたらすジペプチド医薬誘導体を加水分解することが知られている（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  １９９９  Ｐｈａｒｍ．  Ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照）。他のリンカーは例えば米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。
【０１７２】
リンカーはｐＨ感受性であり、リソソーム中に見られるような酸性条件下でしばしば加水分解可能である（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号、米国特許第５，８２４，８０５号、米国特許第５，６２２，９２９号、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  １９９９  Ｐｈａｒｍ．  Ｔｈｅｒａｐｕｅｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３；  Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  ＢＩｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：１４６５３−１４６６１を参照）。そのようなリンカーは血液中のような中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのｐＨであるｐＨ５．５または５．０以下では不安定である。リンカーは還元条件下で切断可能となりうる（例えば、ジスルヒドリンカー）（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４７：５９２４−５９３１；  Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ  ｅｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；米国特許第４，８８０，９３５号を参照）。リンカーはマロン酸エステルリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｂｉｏｏｒｇ−  Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．  ３（１０）：１２９９−１３０４）または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ  ｅｔ
ａｌ．，  １９９５，  Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１３１２）であってよい。
【０１７３】
本発明の予防的および治療的使用
本発明の抗体は、それらの使用方法に応じて、ＧＰＮＭＢのアゴニストかアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。抗体は、被験体、特にヒトにおいて、内科的疾患を予防、診断または治療するために用いることができる。本発明の抗体はＧＰＮＭＢまたはＧＰＮＭＢを発現する細胞の単離にも使用することができる。さらに、抗体は、疾患の危険性があるか、疾患を受けやすい被験体または異常なＧＰＮＭＢ発現または機能に関連した疾患を有する被験体を治療するために用いることができる。本発明の抗体はそのような被験体においてＧＰＮＭＢを検出するために用いることができる。
【０１７４】
本発明は、ＧＰＮＭＢを発現する細胞を標的とし、およびＧＰＮＭＢの発現または機能を阻害し、および／または細胞過剰増殖性細胞疾患に対する治療的または予防的効果を有する有効量の組成物を投与することを含む、被験体におけるＧＰＮＭＢの過剰発現に関連する疾患または疾患および／または細胞過剰増殖性疾患、特に癌の治療および／または予防のための方法を提供する。一実施態様において、本発明の方法は、本発明の抗体および細胞過剰増殖性細胞疾患に対する細胞毒性薬を含む免疫結合体を含有する組成物を被験体に投与することを含む。別の実施態様において、本発明の方法は、本発明の裸のＩｇＧ１抗体および１種類以上の免疫調節物質を含有する組成物をその必要のある被験体に投与することを含む。さらに別の実施態様において、本発明の方法は、細胞毒性薬に結合体化させた単鎖Ｆｖ抗体（抗ＧＰＮＭＢ）を含有する組成物、または単鎖抗ＧＰＮＭＢ抗体成分および抗ＣＤ３抗体成分を有する二重特異性抗体を含有する組成物をその必要のある被験体に投与することを含む。好ましい実施態様において、細胞過剰増殖性細胞疾患は癌である。さらに好ましくは、癌は、メラノーマ、または中枢神経系の癌、例えば、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫または新生物性髄膜炎である。
【０１７５】
本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性により特徴付けられるか、またはそれに関連した疾患またはその徴候の予防および／または治療のために、被験体、好ましくはヒト被験体に、本発明の１つ以上の抗体および該抗体を含有する組成物を投与することを含む治療を提供する。一実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性により特徴付けられるか、またはそれに関連した疾患またはその徴候を予防または治療する方法において、本発明の有効量の１つ以上の抗体をその必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。ある実施態様において、本発明の１つ以上の抗体を含む１つ以上の免疫結合体の有効量を、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性により特徴付けられるか、またはそれに関連した疾患またはその徴候を予防または治療するために、それを必要とする被験体に投与する。
【０１７６】
また、本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に特徴付けられるか、またはそれに関連した疾患を予防または治療する方法において、本発明の１つ以上の抗体および本発明の抗体以外の１つ以上の療法剤（例えば、１つ以上の予防剤または治療剤）を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。本発明の併用療法の予防剤または治療剤は経時的または同時に投与することができる。特定の実施態様において、本発明の併用療法剤は、本発明の１つ以上の抗体の有効量、および該抗体とは異なる作用機構を有する少なくとも１つの他の療法剤（例えば、予防剤または治療剤）の有効量を含む。一定の実施態様において、本発明の併用療法剤は、抗体とともに作用することにより相加効果または相乗効果を有する本発明の１つ以上の抗体の予防効果または治療効果を向上する。一定の実施態様において、本発明の併用療法剤は療法剤（例えば、予防剤または治療剤）に関連した副作用を低減する。
【０１７７】
併用療法剤の予防剤または治療剤は、同一の医薬組成物にて、被験体に、好ましくはヒト被験体に投与することができる。もしくは、併用療法剤の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物にて、被験体に同時に投与することができる。予防剤または治療剤は同一または異なる投与経路により被験体に投与してよい。
【０１７８】
特定の実施態様において、ここに記載の本発明の１つ以上の抗体を含有する医薬組成物は、被験体、好ましくはヒトに投与して、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性により特徴付けられるか、またはそれに関連した疾患またはその徴候の予防および／または治療する。本発明にしたがえば、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体以外の１つ以上の療法剤（例えば、予防剤または治療剤）を含んでもよい。
【０１７９】
本発明の抗体は、（診断方法または効能マーカーとしての使用において）生物試料中のＧＰＮＭＢの存在を検出するために用いてもよい。検出されたＧＰＮＭＢの量はＧＰＮＭＢの発現レベルに関連させてよく、次にこれを、当分野で公知の方法を用いて、疾患、腫瘍型、全身腫瘍組織量または腫瘍の病期に関連させる（例えば、ＡＡＰＳ  Ｌｉｇａｎｄ
Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｆｏｃｕｓ  Ｇｒｏｕｐ（ＬＢＡＢＦＧ）の推奨  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ｎｏｖ；２０（ｌｌ）：１８８５−９００を参照）。抗体を用いる検出方法は当分野でよく知られ、例えば、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫測定法、免疫ブロット、ウエスタンブロット、ＩＨＣ、免疫蛍光法、免疫沈降法が挙げられる。抗体は、ＧＰＮＭＢを検出するためにこれらの一種類以上の技術を取り込んだ診断キットにて提供してよい。そのようなキットは、タンパク質の検出を助ける他の成分、詰め込み、使用説明書または他の材料を含んでよい。特定の実施態様において、本発明の抗体は放射性同位元素に結合体化してよく、ＧＰＮＭＢを過剰発現する細胞を検出するために被験体に注射する。
【０１８０】
抗体が診断目的に供される場合、例えば、リガンド基（ビオチン等）または検出可能なマーカー基（蛍光基、放射性同位体または酵素）によってそれら抗体を修飾することは望ましいであろう。必要なら、本発明の抗体は慣用技術を用いて標識してよい。適当な検出可能な標識として、例えば、フルオロフォア、クロモフォア、放射性原子、電子密度の高い試薬、酵素、および特定の結合パートナーを有するリガンドが挙げられる。酵素は典型的にはそれらの活性により検出される。例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計で定量可能な青色色素へと変換するその能力により検出することができる。検出のために適当な結合パートナーとして、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当分野で知られている多数のレセプター／リガンド対が挙げられるが、これらに限定されない。他の組合せや可能性は当業者には容易に明らかであり、本発明の範囲内の等価物とみなされる。
【０１８１】
本発明の抗体は、治療学として有効なＧＰＮＭＢの阻害剤を同定するスクリーニング方法に用いることができる。そのようなスクリーニングアッセイにおいて、第１結合混合物はＧＰＮＭＢと本発明の抗体を組み合わせることにより形成され、第１結合混合物中の結合量（Ｍ０）を測定する。さらに、第２混合物はＧＰＮＭＢ、抗体およびスクリーニングされる化合物または物質を組み合わせることにより形成され、第２結合混合物中の結合量（Ｍ１）を測定する。試験される化合物は、別の抗ＧＰＮＭＢ抗体であってよい。次に、第１結合混合物と第２結合混合物中の結合量は例えばＭ１／Ｍ０比を計算することにより比較する。該化合物または物質は、第１結合混合物に比較して第２結合混合物中の結合の減少が観察される場合、ＧＰＮＭＢに関連する応答を調節することができるとみなされる。結合混合物の処方と最適化は当分野の技量の範囲にあり、そのような結合混合物は結合を増強または最適化するために必要な緩衝液と塩を含有してもよく、さらなるコントロールアッセイが本発明のスクリーニングアッセイに含めてよい。ＧＰＮＭＢ−抗体の結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは約３０％を超えるだけ低下させることがわかった化合物がこうして同定され、次に、必要であれば、下記に記載のように他のアッセイまたは動物模型で疾患を改善する能力について二次的にスクリーニングしてよい。ＧＰＮＭＢと抗体との結合力は、例えば、当分野でよく知られた技術である酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴に基づく技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて測定することができる。
【０１８２】
次に、化合物を下記の実施例に記載するようにインビトロで調べてよい。
【０１８３】
投与の量と頻度
ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性により関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患の予防および／または治療に効果的な本発明の予防薬または治療薬または組成物の量は標準的臨床方法により決定することができる。例えば、癌の治療および／または予防に効果的な組成物の投与量は組成物を動物模型に投与することにより決定できる。さらに、インビトロアッセイを任意に用いて最適な投与量範囲の同定に役立ててよい。予備的な投与量を例えば動物試験に基づいて決定し、ヒト投与のための投与量のスケーリングを当分野で受け入れられたプラクティスにしたがって実施する。毒性と治療効力は細胞培養物または実験動物での標準的な製薬手順により決定することができる。細胞培養アッセイまたは動物研究から得られたデータはヒトに使用される投与量範囲を明確に表すのに用いることができる。１つの動物模型で得られる治療効果のある投与量は、他の動物、例えばヒトに使用するために当分野で知られている変換因子を用いて変換することができる（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ５０（４）：２１９−２４４を参照）。
【０１８４】
好ましい効果的な用量の選択は、当業者に公知の幾つかの因子の考慮に基づき当業者によって（例えば、臨床試験により）決定することができる。そのような因子として、治療または予防すべき疾患、伴う症状、患者の体重、性別、免疫状態、および投与医薬組成物の精度を反映すると当業者に知られている他の因子が挙げられる。適当な投与計画はそのような因子を考慮することにより、および文献に報告され、例えば、米医薬品便覧（第５９版、２００５年）に推薦される投与量に従うことにより、当業者によって選択することができる。
【０１８５】
製剤に使用される正確な用量は投与経路および癌の程度にも依存し、実施者の判断および各患者の状況にしたがって決定しなければならない。効果的用量は、インビトロまたは動物模型試験系から得られる用量反応曲線から外挿により求めてよい。
【０１８６】
患者に投与される他の癌治療剤については、多様な癌療法剤の典型的な用量が当分野で知られている。本発明が与えられれば、一定の好ましい実施態様は、併用治療計画で、単一薬の投与に推薦される投与量よりも低い投与量の投与を包含するだろう。
【０１８７】
特定の実施態様において、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患（例えば、癌）の被験体における予防および／または治療のために投与される本発明の抗体または抗体を含有する免疫結合体の投与量は、３０ｍｇ／（患者の体重）ｋｇ以下、２５ｍｇ／ｋｇ以下、２０ｍｇ／ｋｇ以下、１５ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１２ｍｇ／ｋｇ以下、１１ｍｇ／ｋｇ以下、１０ｍｇ／ｋｇ以下、９ｍｇ／ｋｇ以下、８ｍｇ／ｋｇ以下、７ｍｇ／ｋｇ以下、６ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、４ｍｇ／ｋｇ以下、３ｍｇ／ｋｇ以下、２ｍｇ／ｋｇ以下、または１ｍｇ／ｋｇ以下である。別の実施態様において、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性により関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患（例えば、癌）の被験体における予防および／または治療のために投与される本発明の抗体または免疫結合体の投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約７ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約６ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの単位用量である。一定の実施態様において、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患（例えば、癌）の被験体における予防および／または治療のために投与される本発明の抗体または抗体を含有する免疫結合体の投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇの単位用量である。
【０１８８】
一定の実施態様において、被験体に、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療するために、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の有効量の１つ以上の用量を投与し、ここで該抗体、免疫結合体、組成物または併用療法剤の効果的量の用量は、当分野でよく知られたインビトロおよび／またはインビボアッセイにおいて、ＰＢＳ等のコントロールに比較して癌性細胞の増殖を、少なくとも約２０％〜２５％、好ましくは、少なくとも２５％〜３０％、少なくとも３０％〜３５％、少なくとも３５％〜４０％、少なくとも４０％〜４５％、少なくとも４５％〜５０％、少なくとも５０％〜５５％、少なくとも５５％〜６０％、少なくとも６０％〜６５％、少なくとも６５％〜７０％、少なくとも７０％〜７５％、少なくとも７５％〜８０％、少なくとも８０〜８５％、少なくとも８５％〜９０％、少なくとも９０％〜９５％、または少なくとも９５％〜９８％だけ減少および／または阻害する。
【０１８９】
他の実施態様において、被験体に、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療するために、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の効果的量の１つ以上の用量を投与し、ここで効果的量の用量は、本発明の抗体の少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬまたは少なくとも４００μｇ／ｍＬの血清力価を達成する。さらに別の実施態様において、被験体に本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の効果的量の用量を投与して、抗体の少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬまたは少なくとも４００μｇ／ｍＬの血清力価を達成し、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の効果的量の引き続く用量を投与して、少なくとも０．１μｇ／ｍＬ、少なくとも０．５μｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、少なくとも、２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも６μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも１５μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも２５μｇ／ｍＬ、少なくとも５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１００μｇ／ｍＬ、少なくとも１２５μｇ／ｍＬ、少なくとも１５０μｇ／ｍＬ、少なくとも１７５μｇ／ｍＬ、少なくとも２００μｇ／ｍＬ、少なくとも２２５μｇ／ｍＬ、少なくとも２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも２７５μｇ／ｍＬ、少なくとも３００μｇ／ｍＬ、少なくとも３２５μｇ／ｍＬ、少なくとも３５０μｇ／ｍＬ、少なくとも３７５μｇ／ｍＬまたは少なくとも４００μｇ／ｍＬの血清力価を維持する。これらの実施態様に従えば、被験体に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の引き続く用量を投与してよい。
【０１９０】
特定の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療する方法において、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の少なくとも０．０ｌｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくともｌｍｇ／ｋｇまたは少なくとも１．１ｍｇ／ｋｇの単位用量を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療する方法において、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも１．１ｍｇ／ｋｇの単位用量を、７日毎に１回、好ましくは、１０日毎に１回、１２日毎に１回、１４日毎に１回、１６日毎に１回、１８日毎に１回、３週間毎に１回または１ヵ月毎に１回、それを必要とする被験体に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様において、本発明の免疫結合体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇの単位用量で、１０〜２０日毎に１回、２〜４サイクルで投与される。
【０１９１】
本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療する方法において、（ａ）本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の予防効果または治療効果のある量の１つ以上の用量を、それを必要とする被験体に投与し、（ｂ）抗体または複数の抗体の一定数の用量の投与後に該被験体中の投与された抗体または複数の抗体の血漿レベル／濃度をモニターすることを含む方法を提供する。さらに、好ましくは、用量の一定数が、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の予防効果または治療効果のある量の１、２、３、３、４、５、６、７または８用量である。
【０１９２】
特定の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療する方法において、（ａ）本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ（好ましくは、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも１．１ｍｇ／ｋｇ）の用量を、それを必要とする被験体に投与し、（ｂ）被験体中の投与された抗体または複数の抗体の血漿レベルが０．１μｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．２５μｇ／ｍＬ未満、０．５μｇ／ｍＬ未満、０．７５μｇ／ｍＬ未満、または１μｇ／ｍＬ未満であるときに１つ以上の引き続く用量を投与することを含む方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療する方法において、（ａ）本発明の１つ以上の抗体の少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ（好ましくは、少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも０．８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも１．１ｍｇ／ｋｇ）の１つ以上の用量を、それを必要とする被験体に投与し、（ｂ）一定数の用量の投与後に該被験体中の投与された抗体または複数の抗体の血漿レベルをモニターし、（ｃ）被験体中の投与された抗体または複数の抗体の血漿レベルが０．１μｇ／ｍＬ未満、好ましくは０．２５μｇ／ｍＬ未満、０．５μｇ／ｍＬ未満、０．７５μｇ／ｍＬ未満、または１μｇ／ｍＬ未満であるときに本発明の抗体または複数の抗体の引き続く１つの用量を投与することを含む方法を提供する。好ましくは、用量の一定数が、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体の有効量の１、２、３、３、４、５、６、７または８用量である。
【０１９３】
ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療するためにこれまで使われてきたか、または現在使われている、本発明の抗体または免疫結合体以外の療法剤（例えば、予防剤または治療剤）は、本発明の方法にしたがって、本発明の１つ以上の抗体または免疫結合体と組み合わせて投与して、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を治療および／または予防することができる。好ましくは、本発明の療法剤に組み合わせて用いられる予防剤または治療剤の投与量は、ＧＰＮＭＢの異常な発現および／または活性に関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患を予防および／または治療するためにこれまで使われてきたか、または現在使われているものよりも低い。
【０１９４】
多様な実施態様において、療法剤（例えば、予防剤または治療剤）は、５分しないうちに、３０分しないうちに、１時間おいて、約１時間おいて、約１時間〜約２時間おいて、約２時間〜約３時間おいて、約３時間〜約４時間おいて、約４時間〜約５時間おいて、約５時間〜約６時間おいて、約６時間〜約７時間おいて、約７時間〜約８時間おいて、約８時間〜約９時間おいて、約９時間〜約１０時間おいて、約１０時間〜約１１時間おいて、約１１時間〜約１２時間おいて、約１２時間〜１８時間おいて、１８時間〜２４時間おいて、２４時間〜３６時間おいて、３６時間〜４８時間おいて、４８時間〜５２時間おいて、５２時間〜６０時間おいて、６０時間〜７２時間おいて、７２時間〜８４時間おいて、８４時間〜９６時間おいて、または９６時間〜１２０時間おいて投与される。好ましい実施態様において、２つ以上の療法剤が同一の患者診察のうちに投与される。
【０１９５】
一定の実施態様において、本発明の１つ以上の抗体および１つ以上の他の療法剤（例えば、予防剤と治療剤）は循環的に投与する。循環治療は、第１療法剤（例えば、第１の予防剤または治療剤）の一時期の投与とそれに続く第２療法剤（例えば、第２の予防剤または治療剤）の一時期の投与、任意にそれに続く第３療法剤（例えば、予防剤または治療剤）の一時期の投与などを伴い、これらの続いて行なう投与を繰り返し、すなわち、それらの療法剤の１つに対する耐性の発達を低減させるサイクルを行なって、それら療法剤の１つの副作用を避けるか、低減させ、および／またはそれら療法剤の効能を向上させる。
【０１９６】
医薬組成物と投与方法
本開示は、抗ＧＰＮＭＢ抗体を含有する組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的用途と患者への投与に適するものだろう。典型的に、組成物は本発明の１つ以上の抗体と薬学的に許容される賦形剤を含有する。「薬学的に許容される賦形剤」との語句は、医薬品投与に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗かび剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性のある物質のそのような媒体や薬剤の使用は当分野でよく知られている。組成物は、追加治療機能、付加治療機能または増強治療機能を提供する他の有効化合物を含んでもよい。医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに、投与の指示説明書とともに含まれてもよい。
【０１９７】
本発明の医薬組成物は、意図する投与経路に適合性のあるように処方される。この投与を達成する方法は当業者に知られている。この投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮であってよい。局所または経口投与してよい組成物、または粘膜を透過できる組成物を得ることもできよう。
【０１９８】
皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、典型的には、注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールやメチルパラベン類等の抗菌剤；アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸等のキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝剤；および塩化ナトリウムやブドウ糖等の等張調整剤などの１種類以上の成分を含む。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節することができる。そのような調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または反復投与バイアルに封入してよい。
【０１９９】
注射に適する医薬組成物として、滅菌水溶液か分散液と滅菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末とが挙げられる。静脈内投与のために適当な担体として、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度に流動的でなければならない。製造と保存の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。微生物の作用の阻止は、多様な抗菌剤や抗かび剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チロメサール等により達成することができる。多くの場合で、等張剤、例えば、糖類；マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含ませることは好ましいであろう。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合に必要とされる粒径の維持により、および／または界面活性剤の使用により維持することができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含ませることによってもたらすことができる。
【０２００】
一般的に、経口組成物は不活性な希釈剤または可食担体を含む。これらはゼラチンカプセルに封入または錠剤へと圧縮される。経口投与のために、抗体は賦形剤と組み合わされ、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で用いられる。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント物質が組成物の一部として含ませることができる。これら錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン等のバインダー；デンプンまたはラクトース等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅｓ等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースやサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー等の着香料といった成分または類似の性質の化合物のいずれも含むことができる。
【０２０１】
全身投与は経粘膜的または経皮的手段によってもよい。経粘膜または経皮投与のために、浸透すべきバリアに適当な浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般的に知られており、例えば、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、トローチ剤、鼻腔用スプレー、吸入器または座薬を使用することにより達成してよい。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体の場合、組成物は、（例えば、米国特許第６，０３０，６１３号に記載されたＦｃＲｎレセプター仲介経路により）腸、口または肺中の粘膜を透過することができるだろう。経皮投与のために、有効化合物を、当分野で一般的に知られているように軟膏剤、軟膏、ゲルまたはクリームに配合してよい。吸入による投与のためには、抗体は、適当な噴霧剤、例えば、二酸化炭素等の気体を含む加圧容器またはディスペンサーまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの形で与えてよい。
【０２０２】
一定の実施態様において、今回開示の抗体は、移植片およびマイクロカプセル化デリバリーシステム等の放出制御製剤等、体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、多無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。今回開示の抗体を含有するリポソーム懸濁液も薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、当業者に公知の方法にしたがって、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されたように調製することができる。
【０２０３】
投与の容易性および投与量の均一性のために、経口または非経口の組成物を投与量単位形で処方することは有利であろう。本明細書中で使用される「投与量単位形」との用語は、単位投与量として治療される被験体に適する物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要とされる医薬担体と共同して望まれる治療効果を生じるように計算された所定量の有効化合物を含む。
【０２０４】
本発明の組成物の毒性と治療効能は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的操作により決定することができる。毒性効果と治療効果の用量比は治療係数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。
【０２０５】
本発明で用いられるいずれの組成物に関しても、治療効果のある用量は細胞培養アッセイから初めに推定することができる。適当なバイオアッセイの例として、ＤＮＡ複製アッセイ、クローン形成アッセイおよび例えば実施例に記載のような他のアッセイが挙げられる。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータはヒトで使用される投与量の範囲を明確に示す際に用いることができる。用量は、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るように動物モデルで処方してよい。血漿での循環レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定してよい。特定の投与量の効果は、適当なバイオアッセイでモニターすることができる。投与量は、毒性が在るか無しかの血中濃度の範囲内にあることが好ましい。この投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に基づきながら変えてもよい。
【０２０６】
抗体は、当分野でよく知られた技術を利用して修飾し、免疫毒素とすることができる（Ｖｉｔｅｔｔａ  １９９３，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：２５２；米国特許第５，１９４，５９４号）。細胞毒性免疫結合体は当分野で知られており、治療剤として用いられてきた。そのような免疫結合体は、例えばメイタンシノイド類（米国特許第６，４４１，１６３号）、チューブリン重合阻害剤であるオーリスタチン（Ｍｏｈａｍｍａｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ  １５（２）：３６７−７２；  Ｄｏｒｏｎｉｎａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４）、ドラスタチン誘導体（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．  １２１（２）：９７−１０６）２１（３）７７８−７８４）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）；メイタンシノイド類（ＤＭｌ）、タキサンまたはメルタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いてよい。
【０２０７】
抗ＧＰＮＭＢ抗体を利用する免疫放射性医薬品は、当分野でよく知られる技術を利用して調製してよい（Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，  ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６）；米国特許第４，６８１，５８１号、米国特許第４，７３５，２１０号、米国特許第５，１０１，８２７号、米国特許第５，１０２，９９０号（ＲＥ３５，５００）、米国特許第５，６４８，４７１号および米国特許第５，６９７，９０２号）。免疫毒性および放射標識抗体分子のそれぞれが、ＧＰＮＭＢを発現する細胞を選択的に死滅させる。放射標識は当分野で知られており、診断用または治療用の放射性免疫結合体のために用いられてきた。放射標識の例として、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、レニウム−１８６、レニウム−１８８、サマリウム−１５３、銅−６４、スカンジウム−４７）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、放射性免疫結合体による臨床診断に用いられる放射性核種として、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、６７Ｇａならびに１１１Ｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、標的免疫治療に利用できる可能性のために多様な放射性核種で標識されていてもよい（Ｐｅｉｒｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｔ．，  １９８７を参照）。これらの放射性核種として、例えば、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅならびに９０Ｙが挙げられ、それほどではないが、１９９Ａｕや６７Ｃｕ．Ｉ−（１３１）（例えば、米国特許第５，４６０，７８５号を参照）が挙げられる。放射性治療キレーターおよびキレーター結合体が当分野で知られている（米国特許第４，８３１，１７５号、米国特許第５，０９９，０６９号、米国特許第５，２４６，６９２号、米国特許第５，２８６，８５０号および米国特許第５，１２４，４７１号）。
【実施例】
【０２０８】
実施された実験および得られた結果を含む下記実施例は例示の目的のみに提供されるものであって、本発明を限定するものとして理解されるべきではない。
【０２０９】
（実施例１：免疫原）
組換えヒトＧＰＮＭＢ（配列番号２８９）、特に細胞外領域（ＥＣＤ）を、免疫原として使用するために調製した。一般的に、Ｃ末端Ｖ５−ＨＩＳタグを有するＧＰＮＭＢのＥＣＤをコードするｃＤＮＡはＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、発現させて、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ  ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）による陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する。試料を１ＭのＮａＣｌでｐＨ５．５にて溶出した後に、金属アフィニティークロマトグラフィー（ファルマシア金属キレート、５ｍＬ）を行なった。試料を１０ＣＶ（カラム体積）にわたる１０〜５００ｍＭのイミダゾールのリニアグラジエントに対して溶出させた。２０ｍＭトリス／５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（２Ｌ×２）を用いて透析した。次に、試料を０．２２μｍのフィルターでろ過した。
【０２１０】
（実施例２：免疫化）
完全ヒト抗体を作るために好ましい方法は、ヒト重鎖遺伝子座とカッパ軽鎖遺伝子座の２４５ｋｂと１９０ｋｂの大きさの生殖細胞系列配置を含むように設計されたマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株を用いる（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１；  Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，  １９９８  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：４８３−４９５；米国特許第６，１６２，９６３号、米国特許第６，１５０，５８４号、米国特許第６，１１４，５９８号、米国特許第６，０７５，１８１号および米国特許第５，９３９，５９８号）。別法であるミニ遺伝子座法では、外因性Ｉｇ遺伝子座を、Ｉｇ遺伝子座からの断片（個々の遺伝子）を包含させることにより模倣する。例えば、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および第２定常領域（好ましくはガンマ定常領域）を、動物に挿入される構築物に形成する（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２，  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９９３，  Ｌｏｎｈｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４），  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９４），  ａｎｄ  Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）；米国特許第５，５４５，８０７号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，６２５，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第６，２５５，４５８号、米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第６，０２３，０１０号、米国特許第５，６１２，２０５号、米国特許第５，７２１，３６７号、米国特許第５，７８９，２１５号、米国特許第５，６４３，７６３号、米国特許第５，９８１，１７５号）。λκＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、ラムダＶ領域を利用して抗ＧＰＮＭＢ抗体を作るために用いてよいことがわかっている。そのような抗体は本発明の範囲にある。
【０２１１】
免疫化
（実施例１で調製された）ＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓ免疫原を抗原として用いた。ＧＰＮＭＢに対するモノクローナル抗体はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＸＭＧ２株）、Ａｂｇｅｎｉｘ社、フレモント、カリフォルニア州を連続的に免疫化することにより発達させた。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物は、すべての注射について足蹠経路によって免疫を行なった。各注射の全体積は１マウスあたり５０μｌであり、１足蹠あたり２５μｌであった。
【０２１２】
同齢集団１（１０×ＭＧ２マウス）に対する最初の免疫化は、１マウスあたり１００μｇのａｌｕｍゲル（「Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ」：リン酸アルミニウムゲルアジュバント、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  ＢＩＯＳＥＣＴＯＲ（商標）ａ／ｓ、Ｅ．Ｍ．  Ｓｅｒｇｅｎｔ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｃｌｉｆｔｏｎ，  ＮＪ，  ｃａｔ．＃１４５２−２５０）により配布）と１：１（ｖ／ｖ）で混合させた１０μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓを用いた。それに続く５回の追加免疫はパイロジェンフリーＤ−ＰＢＳ中の１００μｇのａｌｕｍゲルと１：１（ｖ／ｖ）で混合した５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓを用いて行なった。７回目の追加免疫物は、ＴＩＴＥＲＭＡＸ  ＧＯＬＤ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔ．＃Ｔ２６８４）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓからなった。８回目の注射液は、１００μｇのａｌｕｍゲルと１：１（ｖ／ｖ）で混合した５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓからなった。最終的な追加免疫は、パイロジェンフリーＤＰＢＳ中の５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓを用いてアジュバントなしで行なった。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスはこのプロトコールのために０日目、３日目、６日目、１０日目、１４日目、１７日目、２３日目および２７日目に免疫化し、融合を３１日目に実施した。６回目の追加免疫後の２１日目にＲｅｔｒｏ−Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｂｌｅｅｄ操作により失血させた。
【０２１３】
同齢集団２（１０×ＭＧ２マウス）に対する最初の免疫化は、１マウスあたり１００μｇのａｌｕｍゲルと１：１（ｖ／ｖ）で混合させた１０μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓを用いた。それに続く２回の追加免疫は、パイロジェンフリーＤ−ＰＢＳ中の１００μｇのａｌｕｍゲルと１：１（ｖ／ｖ）で混合した５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓを用いて行なった。４回目の追加免疫物は、ＴＩＴＥＲＭＡＸ  ＧＯＬＤ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ；ｃａｔ．＃Ｔ２６８４）と１：１（ｖ／ｖ）で混合した５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓからなった。それに続く５回目〜７回目の注射液は、１００μｇのａｌｕｍゲルと１：１（ｖ／ｖ）で混合した５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓからなった。８回目の注射と最終的な追加免疫は、パイロジェンフリーＤＰＢＳ中の５μｇのＧＰＮＭＢ−Ｖ５Ｈｉｓを用いてアジュバントなしで行なった。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスはこのプロトコールのために０日目、３日目、７日目、１１日目、１４日目、１７日目、２２日目、２５日目および７４日目に免疫化し、融合を７８日目に実施した。６回目の追加免疫後の２１日目にＲｅｔｒｏ−Ｏｒｂｉｔａｌ  Ｂｌｅｅｄ操作により失血させた。
【０２１４】
足蹠注射は、両後足の腹側表面のみを用いて下記プロトコールにより実施した。取り付けた２８または３０ゲージ×１／２”注射針を有するインシュリン１／２ｍＬ注射器を用いて筋肉組織を突き刺すことなしに皮膚下に溶液を注射した。注射を受けるマウスは、その首と背中に沿った柔らかい毛をつかんで固定し、反転させて、腹部側にアクセスできるようにした。マウスの後足をつかんで、注射針を足首に（斜面側面を上にして）挿入し、注射針の先が足に達するまで皮膚の真下を通した。注射針を、足の内側に向かって位置する静脈をさけるために注意して後足の外側長さに沿って挿入した。針の先が足にいったん達したら、抵抗が感じられるまでか、または示された体積が投与されるまでその溶液をゆっくりと注入した。次に、注射針を引き抜き、２番目の後足に同様に注入した。
【０２１５】
下記の表４はマウスの２集団に関する免疫化スケジュールを提供する。
【０２１６】
表４：ＧＰＮＭＢ抗原（ＧＰＮＭＢ可溶性、０．４３ｍｇ／ｍＬ）の免疫化スケジュール
【０２１７】
【表４−１】
2014003986.tif 000045
【０２１８】
【表４−２】
2014003986.tif 000046
力価による収集のための動物の選択
免疫化ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスからの血清中の抗ＧＰＮＭＢ抗体力価はＥＬＩＳＡにより決定した。簡単に説明すれば、３セットのＥＬＩＳＡを設定した。１μｇ／ｍＬのＧＰＮＭＢ（＋ＮＭＢ）、１μｇ／ｍＬのＧＰＮＭＢ（−ＮＭＢ）および１μｇ／ｍＬのＮＭＢを、抗原コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３（分子量８４）８．４ｇ／Ｌ）中、Ｃｏｓｔａｒ  Ｌａｂｃｏａｔユニバーサルバインディングポリスチレン９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）に一晩、４℃でコーティングした。翌日、プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ中、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に、プレートを２００μｌ／ウエルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）でブロックし、室温で１時間インキュベートした。一時間のブロッキング後、プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＧＰＮＭＢで免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスまたは未処置ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物を、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中で、１：１００の最初の希釈物からデュプリケートで１：３希釈にて滴定した。最後のウエルをブランクとして残した。これらのプレートを室温で２時間インキュベートし、次にプレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液で３回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃに特異的な西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）結合体化抗体を１μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、１時間室温でインキュベートした。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ発色基質（ＢｉｏＦ×ＢＳＴＰ−０１００−０１）を加えることにより、１０〜２０分間または陰性コントロールウエルが色を示し始めるまでプレートを展開した。次に、ストック溶液（１ボトルあたり１００ｍＬのＨ２Ｏで再構成したＴＭＢ用６５０ｎＭのストック試薬（ＢｉｏＦ×ＢＳＴＰ−０１００−０１））を加えることによりＥＬＩＳＡを停止した。各ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物の特定の力価を６５０ｎｍでの光学密度から決定し、下記の表２と表３に示す。力価の値は、バックグランドの２倍のＯＤの読みを有する血清の最大希釈の逆数である。したがって、数値が高ければ高いほど、ＧＰＮＭＢに対する液性免疫反応が高かった。結果を表５に示す。
【０２１９】
表５：ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）抗ＧＰＮＭＢ血清力価
【０２２０】
【表５】
2014003986.tif 000047
また、ＵＡＣＣ−６２、ＳＦ５３９、ＳＫＭＥＬ５、Ｕ８７ＭＧおよびＬＯＸｌＭＶＩ細胞系に対する反応性に関して免疫化動物からのプールされた抗ＧＰＮＭＢ血清をＦＡＣＳにより評価した。プールされた血清を、抗ＩＬ１３血清（コントロール）および１：１０、１：１００で希釈された前失血（コントロール）に比較して、１：１０、１：１００および１：５００で調べた。
【０２２１】
（実施例３：抗体）
ハイブリドーマ細胞系を、慣用の技術を用いて抗ＧＰＮＭＢ力価を有することが示された免疫化マウスから作った（Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．  １５：１４６−１５６を参照）。
【０２２２】
免疫マウスを頸椎脱臼により屠殺し、各同齢集団からリンパ節を収集し、プールした。リンパ球をＤＭＥＭ中で粉砕することで解離させて細胞を組織から遊離し、細胞をＤＭＥＭに懸濁した。細胞数を数えて、１億個のリンパ球あたり０．９ｍＬのＤＭＥＭを細胞ペレットに加えて細胞を穏やかに、しかし完全に再懸濁した。１億個細胞あたり１００μｌのＣＤ９０＋磁気ビーズを用いて、細胞を、４℃で１５分間磁気ビーズとともにインキュベートすることにより標識した。１０８個までの陽性細胞を含む磁気標識細胞懸濁物（または２×１０９個までの全細胞）をＬＳ＋カラムにかけ、このカラムをＤＭＥＭで洗浄した。全溶出物をＣＤ９０陰性フラクション（これら細胞のほとんどはＢ細胞であると予想される）として集めた。
【０２２３】
上記の洗浄された濃縮Ｂ細胞と、ＡＴＣＣ（ｃａｔ．＃ＣＲＬ１５８０）から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２３，  １９７９，  １５４８−１５５０）とを１：１の比率で混合することにより融合を行なった。細胞混合物を８００ｇで遠心することにより穏やかにペレット化した。上清を完全に除去した後、細胞を、２〜４ｍＬのＰｒｏｎａｓｅ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，  ｃａｔ．＃５３７０２；ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬ）で２分間以内で処理した。次に、３〜５ｍＬのＦＢＳを加えて酵素活性を停止し、電気細胞融合溶液ＥＣＦＳ（０．３Ｍスクロース、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｓ７９０３、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｍ２５４５、０．１ｍＭ酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｃ４７０５）を用いて、懸濁液を４０ｍＬの全容積に調節した。上清を遠心後に除去し、細胞を４０ｍＬのＥＣＦＳに再懸濁した。この洗浄工程を繰り返して、細胞をＥＣＦＳに２×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。
【０２２４】
電気細胞融合（ＥＣＦ）は、融合発生器、モデルＥＣＭ２００１、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ社、サンジエゴ、カリフォルニア州を用いて実施した。使用された融合チャンバーの大きさは２．０ｍＬであり、Ａｂｇｅｎｉｘ社の最適機器設定を用いてＥＣＦを行なった。
【０２２５】
ＥＣＦ後、細胞懸濁液を無菌条件下で融合チャンバーから注意して取り出して、同じ体積のハイブリドーマ培養培地（ＤＭＥＭ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含み、Ｌ−グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、ＯＰＩ（オキサロアセテート、ピルベート、ウシインシュリン）（すべてＳｉｇｍａより）およびＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を補充した滅菌チューブに移した。細胞を、１５〜３０分間、３７℃でインキュベートし、次に４００ｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心した。細胞を小体積のハイブリドーマ選択培地（０．５×ＨＡ（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ培養培地）に穏やかに再懸濁し、その体積を、９６ウエルプレートあたり合計５×１０６Ｂ細胞の最終プレーティングとウエルあたり２００μＬに基づいて、より多くのハイブリドーマ選択培地で適切に調整した。細胞を穏やかに混合し、９６ウエルプレートに分注し、成長させた。７日目か１０日目に、培地の１／２を除去し、細胞にハイブリドーマ選択培地を再供給した。
【０２２６】
培養の１４日後、ハイブリドーマの上清をＧＰＮＭＢに特異的なモノクローナル抗体についてスクリーニングした。一次スクリーニングにおいて、ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２−５６５−１３６）を、コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３、８．４ｇ／Ｌ）中の５０μＬ／ウエルのＧＰＮＭＢ（１μｇ／ｍＬ）でコートし、次に４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。２００μＬ／ウエルのブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。ハイブリドーマ上清および陽性と陰性のコントロールのアリコート（５０μＬ／ウエル）を加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。全体にわたって用いた陽性コントロールは、関連するＧＰＮＭＢで免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスからの血清であり、陰性コントロールはＫＬＨで免疫したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の関連株からの血清であった。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μＬ／ウエルの検出抗体ヤギ抗ｈｕＩｇＧｆｃ−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ１０５０７、使用濃度は１；２０００希釈であった）を加えて、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌ／ウエルのＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂ．  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＴＭＳＫ−０１００−０１）を加え、（陰性コントロールウエルがやっと色を示し始めるまで）プレートを約１０分間発達させた。次に、５０μｌ／ウエルの停止溶液（ＴＭＢ停止溶液（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂ．  Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＳＴＰＲ−０１００−０１））を加え、プレートを４５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて読んだ。
【０２２７】
一次スクリーニングに基づく陽性ハイブリドーマ細胞成長ウエルからの古い培養上清を完全に除去し、ＩＬ−１ｂ陽性ハイブリドーマ細胞を新鮮なハイブリドーマ培養培地に懸濁し、２４ウエルプレートに移した。培養の２日後、これらの上清を二次確認スクリーニングに使える状態となった。二次確認スクリーニングにおいて、一次スクリーニングの陽性物を、上記のようにＧＰＮＭＢ結合体ＥＬＩＳＡと、重鎖および軽鎖の両方について完全にヒト組成であることを示すために二次確認ＥＬＩＳＡ用の二組の検出系（一組がｈＩｇＧ検出のためであり、一組がヒトＩｇカッパ軽鎖検出（ヤギ抗ｈＩｇカッパ−ＨＲＰ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２０６０−０５）のためである）とでスクリーニングした。二組のＥＬＩＳＡの手順は、３種類の異なる検出抗体を別々に用いた以外は上記載と同じである。二次確認ＥＬＩＳＡアッセイからのすべての陽性ヒット物はＩＬ−１ａと交差反応するものを除外するためにＥＬＩＳＡにより免疫原に対する結合に関して対抗スクリーニングを行なった。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２−５６５−１３６）を、コーティング緩衝液（０．１ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６、ＮａＨＣＯ３、８．４ｇ／Ｌ）中１μｇ／ｍＬの関連Ｖ５Ｈｉｓ融合タンパク質で５０μＬ／ウエルにてコートし、次に４℃で一晩インキュベートした。これ以降の手順は上記と同じである。作られた３３種類の完全ヒトＧＰＮＭＢ特異的モノクローナル抗体が存在する。
【０２２８】
ハイブリドーマ上清を、実施例２に記載のようにＥＬＩＳＡにより、ＧＰＮＭＢに対する結合に関してスクリーニングした。結果を表６に示す。
表６．ハイブリドーマ抗ＧＰＮＭＢ活性
【０２２９】
【表６−１】
2014003986.tif 000048
【０２３０】
【表６−２】
2014003986.tif 000049
一定のハイブリドーマ細胞上清（２９）を、研究グレードのＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａＣｏｒｅ（登録商標）２０００バイオセンサーによりＧＰＮＭＢに対する結合に関して分析した。細胞上清の１：２５希釈物を５分間、プロテインＡ表面上を通した後、該表面を１０分間洗浄した。引き続いて、ＧＰＮＭＢを９０秒間、該表面上に８８０ｎＭの濃度で注入した後、解離させた。二重参照結合データは、シグナルをコントロールフローセルから引き、抗原注入直前に注入された緩衝液のベースラインドリフトを引くことにより得られた。各ｍＡｂに関するＧＰＮＭＢ結合データを、各表面に捕捉されたｍＡｂの量に関して基準化した。基準化されたドリフト補正応答も測定した。センサーグラムを単純１：１動態模型に適合させた。結果を表７に示す。１６の細胞上清がＧＰＮＭＢと有意に結合したｍＡｂを含み、３種類のＭａｂｓである１５．１、１５．２および１５．３がＧＰＮＭＢに対して強い結合を示した。
【０２３１】
表７
【０２３２】
【表７】
2014003986.tif 000050
（実施例４：抗体のグループ化（ｂｉｎｎｉｎｇ））
ここに記載の一定の抗体は、米国特許出願第２００３０１５７７３０号に記載されているプロトコールにしたがってグループ化した。ＭｘｈＩｇＧ結合体化ビーズを一次抗体に対する結合のために調製する。必要とされる上清の容量は式：（ｎ＋１０）×５０μＬ（式中、ｎ＝プレート上の試料の総数）を用いて計算される。濃度が知られている場合、０．５μｇ／ｍＬを用いる。ビーズ貯蔵物を穏やかにボルテックスで攪拌し、次に上清中で、１ウエルあたり各ビーズの２５００の濃度まで、または０．５×１０５／ｍＬまで希釈し、シェーカーで暗所、室温で一晩、または０．５μｇ／ｍＬの知られている濃度の場合、２時間インキュベートする。吸引後、５０μＬの各ビーズをフィルタープレートの各ウエルに加え、次に、１００μＬ／ウエル洗浄緩衝液を加え、吸引することにより一回洗浄した。抗原とコントロールをフィルタープレートに５０μＬ／ウエルで加え、次にカバーをかぶせて、暗所で１時間、シェーカー上でインキュベートする。洗浄工程後、未知の二次抗体を、一次抗体に用いられたのと同じ希釈（または知られている場合は同じ濃度）を用いて、５０μＬ／ウエルで加える。次に、プレートを暗所で２時間、シェーカー上、室温でインキュベートした後、洗浄工程に供する。次に、１：５００で希釈した５０μＬ／ウエルのビオチニル化ｍｘｈＩｇＧを加えて、暗所で１時間、シェーカー上、室温にてインキュベートする。洗浄工程後、５０μＬ／ウエルのストレプトアビジン−ＰＥを１：１０００で加え、暗所で１５分間、シェーカー上、室温にてインキュベートする。洗浄工程後、各ウエルを８０μＬのブロッキング緩衝液に再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘを用いて読む。結果は、モノクローナル抗体は異なるグループに属することを示す。異なるグループ（ｂｉｎ）からの抗体による競争結合は類似または隣接するエピトープに対する抗体特異性を支持する。非競争的結合は独自のエピトープに対する抗体特異性を支持する。
【０２３３】
６種類の抗ＧＰＮＭＢ抗体の結合をさらに調べるために３種類のグループを作った。グループ１はＧＰＮＭＢ抗体（１．２．１）、（１．１０．１）および（２．２２．１）を含んだ。グループ２はＧＰＮＭＢ抗体（２．３．１）および（１．１５．１）を含み、グループ３はＧＰＮＭＢ抗体（２．１０．１）を含んだ。グループ化アッセイの結果を下記の表８と表９に示す。
【０２３４】
表８
【０２３５】
【表８】
2014003986.tif 000051
表９
【０２３６】
【表９】
2014003986.tif 000052
（実施例５：ＧＰＮＭＢ免疫組織化学（ＩＨＣ）分析）
抗ＧＰＮＭＢモノクローナル抗体を、冷凍され固定化された組織試料に対する反応性に関して評価した。組織片（５μｍ）をホルマリンとパラフィンに包埋された組織試料から切り出し、キシレン、およびＰＢＳで終わる段階的なエタノール系中でインキュベートすることにより再水和した。内因性のパーオキシダーゼ活性を、メタノール中の過酸化水素の３％溶液でクエンチした。
【０２３７】
組織片をブロッキング緩衝液（５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、ＰＢＳ中）で１時間ブロックした。一次抗体と二次抗体を、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡと１％ヤギ血清中で、１時間３７℃で、抗ＧＰＮＭＢまたはコントロールＩｇＧ：二次ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）の約１０：１のモル比で前結合体化した。結合体をヒト血清の１：２０００希釈物でブロックし、再び１時間３７℃でインキュベートした。組織片を、ブロッキング緩衝液で希釈した抗ＧＰＮＭＢ抗体またはアイソタイプコントロール抗体結合体とともに１時間インキュベートした。切片を、ＰＢＳを３回変えてそれぞれ５〜１０分間洗浄し、ストレプトアジピン結合体化西洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）の１：２００（ブロッキング緩衝液中）希釈物とともに３０分間インキュベートし、次に前と同様に洗浄した。抗体は、ＤＡＢ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）を用いて検出した。切片をヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で対比染色し、アルコールとキシレンにより脱水し、パーマウント（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でカバースリップした。
【０２３８】
抗ＧＰＮＭＢ  Ｍａｂｓ２．２２．１および２．２２．２を用いて、正常なヒト組織と腫瘍ヒト組織のマイクロアレイ（ＩＭＰＡＴＨ、Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を染色した。陽性染色が、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、食道癌および頭頸部癌、扁平上皮癌、黒色腫および正常な皮膚試料に見られた。黒色腫および肺癌は、膜と細胞質に位置する細胞内染色で最も高い染色強度を示した。また、抗ＧＰＮＭＢ  Ｍａｂ２．１０．２は原発性黒色腫を染色した。
【０２３９】
黒色腫組織マイクロアレイの抗ＧＰＮＭＢ抗体染色は、表１０と表１１に示されるように陽染性である高い比率の黒色腫を示した。
【０２４０】
表１０：抗ＧＰＮＭＢ  Ｍａｂ黒色腫染色強度
【０２４１】
【表１０】
2014003986.tif 000053
０（無染色）〜３（強い染色）のスケール
表１１：抗ＧＰＮＭＢ  Ｍａｂ染色頻度
【０２４２】
【表１１】
2014003986.tif 000054
＊ポジティブ染色を示す腫瘍細胞％
抗ＧＰＮＭＢ抗体は、一般的な腫瘍組織マイクロアレイにおける肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）の１４試料のうち１０試料を染色し、ＳＣＣに特異的なアレイ中で６０試料のうち２４試料が陽性であった。
【０２４３】
（実施例６：黒色腫細胞系に結合する抗ＧＰＮＭＢ抗体のＦＡＣＳ分析）
黒色腫癌細胞系ＵＡＣＣ−６２により発現する細胞膜結合性ＧＰＮＭＢタンパク質に対する抗ＧＰＮＭＢ抗体の特異性をＦＡＣＳ分析によって分析した。ＧＰＮＭＢ抗原を発現しない腎臓癌細胞系ＴＫ１０を陰性コントロールとして用いた。アイソタイプにマッチする抗体ｐＫ１６．３を陰性コントロールして用いた。細胞を、ＰＢＳ（ＣａとＭｇとを含まない）で２回洗浄し、細胞が脱離するまで３７℃でヴェルセンとともにインキュベートし、カウントし、１アッセイチューブあたり１００万細胞を分注した。次に、細胞を２回洗浄し、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３および４％ＦＢＳ）に再懸濁した。１μｇ／ｍＬの一次抗体を細胞に加えた。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、２〜３回洗浄し、１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。Ｒ−ＰＥ結合体化ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を１：１００希釈で加え、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の０．５〜１ｍＬの１％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２４４】
ＧｅＯ平均比として示される結果を表１２に要約し、ＴＫ１０細胞ではなく、ＵＡＣＣ−６２細胞が２．１０．２抗体、２．２２．１抗体および１．１５．１抗体により検出された細胞表面上でＣＲ０１１タンパク質を高発現することを示す。
【０２４５】
表１２：抗ＧＰＮＭＢ染色の（ｐＫ１６に比較した）Ｇｅｏ平均比
【０２４６】
【表１２】
2014003986.tif 000055
黒色腫細胞系間ので相対的なＧＴＮＭＢ抗原発現を調べるために、Ｍａｂ１．１５．１抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析による１５黒色腫細胞系の一団を調べた。表１３に示されるように、８０％（１２／１５）の細胞系がＧＰＮＭＢ抗原発現を示した。細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ−２が、調べられた細胞系間で最も高いＧｅｏ平均比を示した。
【０２４７】
表１３：黒色腫細胞系の抗ＧＰＮＭＢ染色のＧｅｏ平均比
【０２４８】
【表１３】
2014003986.tif 000056
（実施例７：リンパ腫と白血病に結合する抗ＧＰＮＭＢ  ＭＡｂのＦＡＣＳ分析）
造血悪性細胞の表面上のＧＰＮＭＢの相対的な発現を測定するために、多様なリンパ腫と白血病に由来する細胞系を抗ＧＰＮＭＢ抗体とともにインキュベートし、ＦＡＣＳにより分析した。リンパ腫と白血病に由来する細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、アッセイチューブあたり１００万細胞を再懸濁した。１μｇ／ｍＬのＭＡｂ１．１５．１抗体を細胞に加え、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を２〜３回洗浄し、１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。Ｒ−ＰＥ結合体化ヤギ抗ヒト抗体を１：１００希釈で加え、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．５〜１ｍＬの１％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０２４９】
骨髄細胞系とリンパ系に由来する検査細胞系の約半分はＧＰＮＭＢ細胞表面発現を示した（表１４）。細胞系Ｕ９３７は、調べられた細胞系中で最大Ｇｅｏ平均比を示した。
【０２５０】
表１４：リンパ腫および白血病細胞の抗ＧＰＮＭＢ染色のＧｅｏ平均比
【０２５１】
【表１４】
2014003986.tif 000057
（実施例８：ＩＰとウエスタンブロット分析によるＧＰＮＭＢタンパク質の検出）
細胞を、ＰＢＳ（ＣａとＭｇとを含まない）で２回洗浄し、細胞が脱離するまで３７℃でヴェルセンとともにインキュベートし、カウントし、集め、溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍトリス塩酸、１０％グリセロール、１％ＮＰ−４０、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび膵臓抽出物、プロナーゼ、サーモリシン、キモトリプシンおよびパパインを含むプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ））中で、３０分間氷上で溶解した。上清を集めて、タンパク濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）により決定した。一次抗体を細胞溶解物に加え、氷上で３時間インキュベートした後、プロテインＧアガロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）を２時間加えた。免疫沈澱タンパク質を洗浄し、試料緩衝液中で沸騰させ、４〜２０％ゲルにより分離した。免疫ブロットのために、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）に移し、抗ＧＰＮＭＢ抗体（０．５μｇ／ｍＬ）をプローブに用いて調べた後、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の１：４０００希釈物で調べた。免疫結合体をＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）により検出した。
【０２５２】
ウエスタンブロット分析は、抗ＧＰＮＭＢ抗体がＵＡＣＣ−６２、ＳＫ−Ｍｅｌ５およびＳＫ−Ｍｅｌ２の各細胞系の細胞溶解物中に発現したＧＰＮＭＢ抗体を免疫沈降することを示した。これらの結果は、ＦＡＣＳにより決定された細胞表面発現と一致する。
【０２５３】
（実施例９：抗ＧＰＮＭＢ抗体仲介の間接的細胞死滅）
ＧＰＮＭＢ抗原を発現する細胞系ＵＡＣＣ−６２および非発現細胞系ＴＫ１０を平底９６ウエル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）にウエルあたり３０００細胞の密度で塗布した。細胞がおよそ２５％の密集度に一度達したら、１００ｎｇ／ウエルの二次抗体−毒素結合体（ヤギ抗ヒトＩｇＧサポリン；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ、ＨＵＭ−ＺＡＰ；ｃａｔ．＃ＩＴ−２２）を加えた。抗ＧＰＮＭＢ
ＭＡｂｓ２．１０．２、２．２２．１、１．１５．１またはアイソタイプコントロールｍＡｂ（ｐＫ１６．３）を各ウエルに１０または５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ＭＳ−２６９−ＰＡＢＸ、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を陽性一次抗体コントロールとして用いた。６００μＭの化学療法剤５−ＦＵを陽性試薬コントロールとして用いた。５日目に、細胞をトリプシン処理し、６ウエル組織培養プレートに移し、３７℃でインキュベートした。プレートを毎日調べ、８〜１０日の間にすべてのプレートをギムザ染色し、コロニーをカウントした。
【０２５４】
処理後のＧＰＮＭＢ陽性ＵＡＣＣ−６２の生存率を図２に示す。化学療法剤５−ＦＵは完全な死滅を誘導した一方で、単独またはアイソタイプコントロールｐＫ１６．３抗体と組み合わせたサポリン毒素結合体化二次抗体の添加は両細胞系の細胞成長に対して効果を持たなかった。ＵＡＣＣ−６２とＴＫ１０細胞系の両方がＥＧＦＲタンパク質を発現し、ＥＧＦＲ特異的抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）および二次抗体毒素結合体の添加はＵＡＣＣ−６２とＴＫ１０細胞の完全な死滅をもたらした。同一の用量で、３種類のすべてのＧＰＮＭＢ特異的抗体２．１０．２、２．２２．１および１．１５．１はＵＡＣＣ−６２細胞の７０％を超える死滅を誘導した。抗ＧＰＮＭＢ抗体２．１０．２と２．２２．１はＧＰＮＭＢ陰性ＴＫ１０細胞において５％未満の細胞死を誘導し、１．１５．１は２４％未満の細胞死を誘導した。
【０２５５】
（実施例１０：オーリスタチン−Ｅ（ＡＥ）結合体化抗ＧＰＮＭＢ抗体による細胞死滅）
ＵＡＣＣ−６２とＴＫ１０細胞を平底９６ウエル組織培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に塗布した。２日目または細胞がおよそ２５％の密集度に達したら、アイソタイプコントロール、ＥＧＦＲ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ  ＭＳ−２６９−ＰＡＢＸ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）、２．２２．１または２．１０．２等の多様な濃度（１〜１０００ｎｇ／ｍＬ）の未結合体化およびオーリスタチンＥ結合体化抗体（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、ＵＳＡ）を細胞に加えた。ＭＡｂ２．３．１はＦＡＣＳ分析により示されるようにＧＰＮＭＢ発現細胞に結合しないので本研究におけるアイソタイプコントロールのために選択された。ＥＧＦレセプターに対して作られたモノクローナル抗体を用いて、ＡＥ結合体化抗体が仲介する特異的な死滅を示した。５日目に、細胞をトリプシン処理し、６ウエル組織培養プレートに移し、３７℃でインキュベートした。プレートを毎日調べた。８〜１０日目に、すべてのプレートをギムザ染色し、プレート上のコロニーをカウントした。
【０２５６】
ＧＰＮＭＢ陽性ＵＡＣＣ−６２細胞および陰性ＴＫ１０細胞における生存度を図４と図５にそれぞれに示す。結果は、未結合体化およびＡＥ結合体化２．６．２免疫結合体がＵＡＣＣ−６２細胞とＴＫ１０細胞の両方の成長に対して効果を持たなかったことを示す。しかし、ＵＡＣＣ−６２とＴＫ１０の両細胞系が用量依存的にＡＥ−ＥＧＦＲ免疫結合体仲介の細胞死滅を受け、１０００ｎｇ／ｍＬで細胞死が９５％を超えた。同一の用量で、２．２２．１−ＡＥ免疫結合体と２．１０．２−ＡＥ免疫結合体は、アイソタイプコントロールに比べてＵＡＣＣ−６２細胞のおよそ７５％の細胞死を引き起こした。細胞死滅応答は用量依存性であった。ＧＰＮＭＢ陰性ＴＫ１０細胞生存は同じ用量範囲において２．２２．１−ＡＥ免疫結合体や２．１０．２−ＡＥ免疫結合体によって影響を受けることはなかった。これらの結果は、抗原発現細胞に対するＡＥ結合体化抗ＧＰＮＭＢ抗体の特異的な細胞毒性効果を示す。
【０２５７】
（実施例１１：Ｍａｂ１．１５．１−ＡＥ免疫結合体死滅を受けやすい黒色腫細胞）
黒色腫細胞系を平底９６ウエル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に塗布した。２日目または細胞がおよそ２５％密集度に達するまで、多様な濃度の未結合体化およびオーリスタチンＥ結合体化１．１５．１を細胞に加えた。ＭＡｂ２．６．２−ＡＥも、この研究で結合体化アイソタイプコントロールとして用いた。５日目、細胞をトリプシン処理し、６ウエル組織培養皿に移し、３７℃でインキュベートした。プレートを毎日調べた。８〜１０日目、すべてのプレートをギムザ染色し、プレート上のコロニーをカウントした。
【０２５８】
ＧＰＮＭＢ陽性と陰性細胞に対する１．１５．１−ＡＥ仲介死滅のＩＣ５０を表１５に示す。非結合体化１．１５．１およびＡＥ結合体化２．６．２は調べられたすべての黒色腫細胞系の成長に効果を持たなかった。しかし、細胞系ＳＫ−Ｍｅｌ２、ＷＭ−２６６−４、Ｇ３６１、ＵＡＣＣ−２５７、ＵＡＣＣ−６２、ＲＰＭＩ−７９５１およびＳＫ−Ｍｅｌ５は、用量依存的に１．１５．１−ＡＥに感受性があった。ＳＫ−Ｍｅｌ２はこの研究において最も低いＩＣ５０を示した（表１５）。これらの結果は、ＧＰＮＭＢを発現する黒色腫細胞のほとんどに対してＡＥ結合体化１．１５．１の特異的かつ細胞毒性効果を示す。
【０２５９】
表１５：Ｇｅｏ平均比および黒色腫細胞の１．１５．１−ＡＥ死滅のＩＣ５０値
【０２６０】
【表１５】
2014003986.tif 000058
（実施例１２：リンパ腫と白血病細胞系のＭａｂ１．１５．１−ＡＥ死滅）
６ウエル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）への被覆前に、リンパ腫と白血病細胞系を、メチルセルロース基本培地（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）と混合し、多様な濃度の非結合体化およびオーリスタチンＥ結合体化１．１５．１抗体と混合した。さらに、Ｍａｂ２．６．２−ＡＥはＧＰＮＭＢを発現する細胞に結合しないので、本研究の結合体化アイソタイプコントロールとして含めた。プレートを３７℃でインキュベートし、毎日調べた。１４〜１８日目に、プレート上のコロニーをカウントした。
【０２６１】
抗原を発現する細胞に対する１．１５．１−ＡＥ誘導細胞死滅のＩＣ５０を表１６に示す。非結合体１．１５．１およびＡＥ結合体化２．６．２免疫複合体はすべての抗原陽性造血細胞系の成長に対して効果を持たなかった。しかし、表１６に示されるように、骨髄系またはリンパ球系に由来する細胞系Ｕ９３７、ＳＲおよびＴＨＰ−１は、用量依存的に２０７ｎｇ／ｍＬ（１．４ｎＭ）〜３４０ｎｇ／ｍＬ（２．４ｎＭ）の範囲のＩＣ５０値をもって１．１５．１−ＡＥ仲介死滅に感受性があった。これらの結果はＧＰＮＭＢ抗原を発現する造血悪性細胞系の特異的細胞毒性効果を示す。
【０２６２】
表１６：Ｇｅｏ平均比および黒色腫および白血病細胞の１．１５．１−ＡＥ死滅のＩＣ５０値
【０２６３】
【表１６】
2014003986.tif 000059
（実施例１３：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥはヒトＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫異種移植片の成長を阻害して胸腺欠損マウスに定着した黒色腫腫瘍の完全な退縮を導く（研究Ｎ−３８６））
研究Ｎ−３８６は、胸腺欠損マウスに定着したヒトＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫異種移植片に対する抗体−医薬結合体ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの効力と治療的効能を評価するために実施された。
【０２６４】
材料と方法：
試験動物：ヒト腫瘍異種移植片のために用いられる５〜６週齢の胸腺欠損マウス（ＣＤ−１ｎｕ／ｎｕメス）はＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得た。動物は、実験動物保護の評価認定のための国際協会（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣインターナショナル））のガイドラインにしたがって特定のパソゲンフリー条件で収容した。試験動物にはペレット状の餌と水を自由に与え、調節換気（暖房・換気および空調）、温度（２２±２℃）、相対湿度（５５％±１５％）および明期（１２時間）を有する部屋に保持した。すべての研究は承認された施設の動物保護と使用のプロトコールにより実施した。
【０２６５】
ヒト黒色腫異種移植片モデル。ＣＲ０１１−ＭＭＡＥ免疫結合体の腫瘍阻害活性は、既報の方法（Ｇｅｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  Ｒｅｐ．３：１−１０４（１９７２）を参照）にしたがって、胸腺欠損マウスを用いた抗腫瘍異種移植モデルで測定した。簡単に説明すると、胸腺欠損マウス腫瘍ドナーから切り取られたヒト黒色腫（６０〜１２５ｍｇ）の小断片を、外套針を用いて試験動物に皮下移植した。腫瘍が定着したら（１０〜２０日間）、動物を組み合わせて集団にわけ（ｎ＝６マウス／グループ）、静脈内注射（尾静脈）による処置を実施した。
【０２６６】
ＳＫ−ＭＥＬ−２ヒト黒色腫（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−６８）は悪性黒色腫を有する６０歳の白色系男性の転移部位（大腿の皮膚）に由来し、ＳＫ−ＭＥＬ−５ヒト黒色腫（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−７０）は悪性黒色腫を有する２４歳の白色系女性の転移部位（腋窩リンパ節）に由来した（Ｆｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ５９：２２１−２２６（１９７７）を参照）。両細胞系はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得た。
【０２６７】
処置の効果は副尺付きカリパスを用いて、２直径に沿った繰り返しの腫瘍測定によりモニターする；腫瘍サイズ（単位：ｍｇ）は、比重を１．０とみなして、標準式：（Ｗ２×Ｌ）／２を用いて計算した。腫瘍サイズと体重は毎週２回評価した。ただし、マウスは毎日調べ、瀕死の動物は、過剰な痛みやストレスの臨床的徴候（すなわち、衰弱、猫背の姿勢、麻痺／不全麻痺、膨張した腹部、潰瘍形成、膿腫、発作および／または出血）が注意されるのであれば人道的に安楽死させた。２，０００ｍｇを超える腫瘍を有する動物は研究から外し、人道的に安楽死させた。
【０２６８】
胸腺欠損マウスにおける異種移植の研究は、多様な物質に関する抗腫瘍効果を効果的に示し、次にそれら物質が臨床的な癌に対して活性を有することが示される（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８４：１４２４−１４３１（２００１））。
【０２６９】
結果：
ＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫に対するインビボ抗腫瘍効果。ＧＰＮＭＢを発現する細胞に対してＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥのインビトロでの効力と細胞毒性に基づいて、抗腫瘍効果をインビボで調べた。
【０２７０】
皮下のヒトＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫の成長に対する静脈内ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ処置の効果を図１に示す。ＳＫ−ＭＥＬ−２腫瘍断片を移植し、腫瘍が定着した後（１７日目、６１ｍｇ）、処置を下記の静脈投与により開始した：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ（０．６２５〜２０ｍｇ／ｋｇ静脈内、４日毎に合計４処置（すなわち、ｑ４ｄ×４）；食塩水とリン酸緩衝食塩水コントロール（静脈内、ｑ４ｄ×４）；および２種類の公知の抗腫瘍参照薬剤である硫酸ビンブラスチン（静脈内、１．７ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄ×４）およびパクリタキセル（静脈内、２４ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｄ×４）。参照薬剤は以前の研究において決定された最大許容用量（ＭＴＤ）で投与された。
【０２７１】
食塩水またはＰＢＳで処置した動物中の腫瘍は腫瘍質量が２，０００ｍｇに達するまで進行的に成長し、この質量に達した時点で動物を研究から外し、人道的に安楽死させた。ＳＫ−ＭＥＬ−２腫瘍は、免疫が低下したホストにおいて高い「接種」率（９７％）と低い自発的退縮率（３％）を有する（Ｄｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｉｎ
ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｄｒｕｇｓ，
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．４２（Ｆｉｅｂｉｇ  ＨＨ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ  ＤＰｅ  ｅｄｓ）ｐｐ  １−２２，  Ｃｏｎｔｒｉｂ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂａｓｅｌ，  Ｋａｒｇｅｒ（１９９２））。
【０２７２】
ビンブラスチンは非常にわずかで、顕著ではない抗腫瘍効果（Ｐ≦０．２０）を生じた；この腫瘍モデルや他の腫瘍モデル（例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−５）において、ビンブラスチンは目立つ腫瘍成長の阻害を生じるが、これが有意であるのはごくわずかである。しかし、パクリタキセルは、処置の開始後のおよそ２週間、有意な腫瘍成長の阻害と腫瘍静止（すなわち、１００％の成長阻害）を示した（Ｐ≦０．００７７）。
【０２７３】
ＳＫ−ＭＥＬ−２を有するマウスに対して静脈内投与されたＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗腫瘍効果は著しかった。２０、１０、５または２．５ｍｇ／ｋｇで、腫瘍は試験動物のほとんどで迅速に大きさが小さくなった；顕著な治療効果が治療開始の早くも４日後に注意された（Ｐ≦０．０１４）。完全に退縮した腫瘍は観察期間中（＞２００日）再成長することはなかった。
【０２７４】
この研究における動物は肉眼的検査で異常な治療効果を示さなかった。週２回の体重測定では、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによる処置の体重または体重増加に対する観察可能な、または統計的に有意な効果は示されなかった。
【０２７５】
結論：
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥは、腫瘍成長の阻害として始まるが、すぐに定着ヒト黒色腫異種移植片の完全な退縮を導く実質的で、用量依存的な再現性のある抗腫瘍効果を生じる；この退縮は長く続き、成功した治療後の腫瘍の再成長は観察されなかった。
【０２７６】
（実施例１４：抗体とそれらの対応するＤＮＡの配列決定）
ハイブリドーマからのヒトＧＰＮＭＢ  ｍＡｂ由来の重鎖とκ鎖の転写物の配列は、ｐｏｌｙ（Ａ＋）ＤＮＡから生じたＰＣＲ生成物の直接の配列決定により得られた。さらに、ＰＣＲ生成物は、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲＩＩにクローニングし、Ｐｒｉｓｍダイターミネーター配列決定キットおよびＡＢＩ３７７配列決定装置を用いて両鎖の配列を決定した。各ＰＣＲ反応は、下記表１７に示される５’センスプライマーの混合物を用いた。
【０２７７】
表１７：使用されたプライマー
【０２７８】
【表１７】
2014003986.tif 000060
ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（登録商標）とＧＥＮＥＷＯＲＫＳ（商標）を用いて、すべての配列は「Ｖ  ＢＡＳＥ配列ディレクトリ」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＲＣ
Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）との配列比較により分析した。
【０２７９】
実施例１５：抗ＧＰＮＭＢ抗体の構造分析
表１７に示された抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列を決定してそれらのＤＮＡとタンパク質配列を決定した。
抗体−１．１０．２
重鎖可変領域
塩基配列
【０２８０】
【化３７】
2014003986.tif 000061
アミノ酸配列
【０２８１】
【化３８】
2014003986.tif 000062
表１８：１．１０．２重鎖Ｖ部領域
【０２８２】
【表１８】
2014003986.tif 000063
＊配列番号２のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０２８３】
【化３９】
2014003986.tif 000064
アミノ酸配列
【０２８４】
【化４０】
2014003986.tif 000065
表１９：１．１０．２軽鎖Ｖ部領域
【０２８５】
【表１９】
2014003986.tif 000066
＊配列番号１１のアミノ酸残基
抗体−１．１５．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０２８６】
【化４１】
2014003986.tif 000067
アミノ酸配列
【０２８７】
【化４２】
2014003986.tif 000068
表２０：１．１５．１重鎖Ｖ部領域
【０２８８】
【表２０】
2014003986.tif 000069
＊配列番号２０のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０２８９】
【化４３】
2014003986.tif 000070
アミノ酸配列
【０２９０】
【化４４】
2014003986.tif 000071
表２１：１．１５．１軽鎖Ｖ部領域
【表２１】
2014003986.tif 000072
【０２９１】
＊配列番号２９のアミノ酸残基
抗体−１．２．２
重鎖可変領域
塩基配列
【０２９２】
【化４５】
2014003986.tif 000073
アミノ酸配列
【０２９３】
【化４６】
2014003986.tif 000074
表２２：１．２．２重鎖Ｖ部領域
【０２９４】
【表２２】
2014003986.tif 000075
＊配列番号３８のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０２９５】
【化４７】
2014003986.tif 000076
アミノ酸配列
【０２９６】
【化４８】
2014003986.tif 000077
表２３：１．２．２軽鎖Ｖ部領域
【０２９７】
【表２３】
2014003986.tif 000078
＊配列番号４７のアミノ酸残基
抗体−１．７．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０２９８】
【化４９】
2014003986.tif 000079
アミノ酸配列
【０２９９】
【化５０】
2014003986.tif 000080
表２４：１．７．１重鎖Ｖ部領域
【０３００】
【表２４】
2014003986.tif 000081
＊配列番号５６のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３０１】
【化５１】
2014003986.tif 000082
アミノ酸配列
【０３０２】
【化５２】
2014003986.tif 000083
表２５：１．７．１軽鎖Ｖ部領域
【０３０３】
【表２５】
2014003986.tif 000084
＊配列番号６５のアミノ酸残基
抗体−２．１０．２
重鎖可変領域
塩基配列
【０３０４】
【化５３】
2014003986.tif 000085
アミノ酸配列
【０３０５】
【化５４】
2014003986.tif 000086
表２６：２．１０．２重鎖Ｖ部領域
【０３０６】
【表２６】
2014003986.tif 000087
＊配列番号７４のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３０７】
【化５５】
2014003986.tif 000088
アミノ酸配列
【０３０８】
【化５６】
2014003986.tif 000089
表２７：２．１０．２軽鎖Ｖ部領域
【０３０９】
【表２７】
2014003986.tif 000090
＊配列番号８３のアミノ酸残基
抗体−２．１５．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３１０】
【化５７】
2014003986.tif 000091
アミノ酸配列
【０３１１】
【化５８】
2014003986.tif 000092
表２８：２．１５．１重鎖Ｖ部領域
【０３１２】
【表２８】
2014003986.tif 000093
＊配列番号９２のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３１３】
【化５９】
2014003986.tif 000094
アミノ酸配列
【０３１４】
【化６０】
2014003986.tif 000095
表２９：２．１５．１軽鎖Ｖ部領域
【０３１５】
【表２９】
2014003986.tif 000096
＊配列番号１０１のアミノ酸残基
抗体−２．１６．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３１６】
【化６１】
2014003986.tif 000097
アミノ酸配列
【０３１７】
【化６２】
2014003986.tif 000098
表３０：２．１６．１重鎖Ｖ部領域
【０３１８】
【表３０】
2014003986.tif 000099
＊配列番号１１０のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３１９】
【化６３】
2014003986.tif 000100
アミノ酸配列
【０３２０】
【化６４】
2014003986.tif 000101
表３１：２．１６．１軽鎖Ｖ部領域
【０３２１】
【表３１】
2014003986.tif 000102
＊配列番号１１９のアミノ酸残基
抗体−２．１７．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３２２】
【化６５】
2014003986.tif 000103
アミノ酸配列
【０３２３】
【化６６】
2014003986.tif 000104
表３２：２．１７．１重鎖Ｖ部領域
【０３２４】
【表３２】
2014003986.tif 000105
＊配列番号１２８のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３２５】
【化６７】
2014003986.tif 000106
アミノ酸配列
【０３２６】
【化６８】
2014003986.tif 000107
表３３：２．１７．１軽鎖Ｖ部領域
【０３２７】
【表３３】
2014003986.tif 000108
＊配列番号１３７のアミノ酸残基
抗体−２．２１．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３２８】
【化６９】
2014003986.tif 000109
アミノ酸配列
【０３２９】
【化７０】
2014003986.tif 000110
表３４：２．２１．１重鎖Ｖ部領域
【０３３０】
【表３４】
2014003986.tif 000111
＊配列番号１４６のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３３１】
【化７１】
2014003986.tif 000112
アミノ酸配列
【０３３２】
【化７２】
2014003986.tif 000113
表３５：２．２１．１軽鎖Ｖ部領域
【０３３３】
【表３５】
2014003986.tif 000114
＊配列番号１５５のアミノ酸残基
抗体−２．２２．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３３４】
【化７３】
2014003986.tif 000115
アミノ酸配列
【０３３５】
【化７４】
2014003986.tif 000116
表３６：２．２２．１重鎖Ｖ部領域
【０３３６】
【表３６】
2014003986.tif 000117
＊配列番号１６４のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３３７】
【化７５】
2014003986.tif 000118
アミノ酸配列
【０３３８】
【化７６】
2014003986.tif 000119
表３７：２．２２．１軽鎖Ｖ部領域
【０３３９】
【表３７】
2014003986.tif 000120
＊配列番号１７３のアミノ酸残基
抗体−２．２４．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３４０】
【化７７】
2014003986.tif 000121
アミノ酸配列
【０３４１】
【化７８】
2014003986.tif 000122
表３８：２．２４．１重鎖Ｖ部領域
【０３４２】
【表３８】
2014003986.tif 000123
＊配列番号１８２のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３４３】
【化７９】
2014003986.tif 000124
アミノ酸配列
【０３４４】
【化８０】
2014003986.tif 000125
表３９：２．２４．１軽鎖Ｖ部領域
【０３４５】
【表３９】
2014003986.tif 000126
＊配列番号１９１のアミノ酸残基
抗体−２．３．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３４６】
【化８１】
2014003986.tif 000127
アミノ酸配列
【０３４７】
【化８２】
2014003986.tif 000128
表４０：２．３．１重鎖Ｖ部領域
【０３４８】
【表４０】
2014003986.tif 000129
＊配列番号２００のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３４９】
【化８３】
2014003986.tif 000130
アミノ酸配列
【０３５０】
【化８４】
2014003986.tif 000131
表４１：２．３．１軽鎖Ｖ部領域
【０３５１】
【表４１】
2014003986.tif 000132
＊配列番号２０９のアミノ酸残基
抗体−２．６．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３５２】
【化８５】
2014003986.tif 000133
アミノ酸配列
【０３５３】
【化８６】
2014003986.tif 000134
表４２：２．６．１重鎖Ｖ部領域
【０３５４】
【表４２】
2014003986.tif 000135
＊配列番号３１０のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３５５】
【化８７】
2014003986.tif 000136
アミノ酸配列
【０３５６】
【化８８】
2014003986.tif 000137
表４３：２．６．１軽鎖Ｖ部領域
【０３５７】
【表４３】
2014003986.tif 000138
＊配列番号３１９のアミノ酸残基
抗体−２．７．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３５８】
【化８９】
2014003986.tif 000139
アミノ酸配列
【０３５９】
【化９０】
2014003986.tif 000140
表４４：２．７．１重鎖Ｖ部領域
【０３６０】
【表４４】
2014003986.tif 000141
＊配列番号２１８のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３６１】
【化９１】
2014003986.tif 000142
アミノ酸配列
【０３６２】
【化９２】
2014003986.tif 000143
表４５：２．７．１軽鎖Ｖ部領域
【０３６３】
【表４５】
2014003986.tif 000144
＊配列番号２７７のアミノ酸残基
抗体−２．８．１
重鎖可変領域
塩基配列
【０３６４】
【化９３】
2014003986.tif 000145
アミノ酸配列
【０３６５】
【化９４】
2014003986.tif 000146
表４６：２．８．１重鎖Ｖ部領域
【０３６６】
【表４６】
2014003986.tif 000147
＊配列番号２３６のアミノ酸残基
軽鎖可変領域
塩基配列
【０３６７】
【化９５】
2014003986.tif 000148
アミノ酸配列
【０３６８】
【化９６】
2014003986.tif 000149
表４７：２．８．１軽鎖Ｖ部領域
【０３６９】
【表４７】
2014003986.tif 000150
＊配列番号２４５のアミノ酸残基
（実施例１６：診断剤としての抗ＧＰＮＭＢ抗体の使用）
試料中のＧＰＮＭＢ抗原の検出：
下記は、試料中のＧＰＮＭＢ抗原を検出するための酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のプロトコールである。この測定法において、９６ウエルマイクロタイタープレートや３８４ウエルマイクロタイタープレート等のマイクロタイタープレートのウエルをＧＰＮＭＢに対する第一の完全ヒトモノクローナル抗体により数時間吸着させる。固定化抗体は、試験試料に存在するかもしれないＧＰＮＭＢのいずれかに対する捕捉抗体として働く。ウエルをすすぎ、分析物の非特異的吸着を妨げるために、乳タンパク質やアルブミン等のブロッキング剤で処理する。
【０３７０】
続いて、ＧＰＮＭＢ抗原を含むと疑われる試験試料、または標準量のＧＰＮＭＢ抗原を含む溶液でウエルを処理する。そのような試料は、例えば、病理の診断指標となると考えられる血中のＧＰＮＭＢレベルを有すると疑われる被験体からの血清試料であってよい。
【０３７１】
試験試料またはスタンダードを洗い流した後、ビオチンによる結合体化によって標識された第二完全ヒトモノクローナル抗ＧＰＮＭＢ抗体によりウエルを処理する。標識された抗ＧＰＮＭＢ抗体は検出抗体として働く。過剰な第二抗体を洗い流した後、アビジン結合体化西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）と適当な発色性基質で処理する。試験試料中の抗原の濃度はスタンダード試料から作成した標準曲線との比較により決定する。
【０３７２】
このＥＬＩＳＡアッセイは、試験試料中のＧＰＮＭＢ抗原の検出のために非常に特異的でありとても感受性のあるアッセイを提供する。
【０３７３】
患者中のＧＰＮＭＢ抗原濃度の決定：
サンドイッチＥＬＩＳＡはヒト血清中のＧＰＮＭＢレベルを定量するために用いることもできる。サンドイッチＥＬＩＳＡに使用される２種類の完全ヒトモノクローナル抗ＧＰＮＭＢ抗体はＧＰＮＭＢ分子上の異なるエピトープを認識する。このＥＬＩＳＡは下記の通り実施する：コーティング緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中、２μｇ／ｍＬの濃度で５０μｌの捕捉用抗ＧＰＮＭＢ抗体をＥＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）にコートする。４℃で一晩のインキュベーション後、プレートを２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０１％チメロサール）で１時間、２５℃で処理する。プレートをＰＢＳ中の０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液ＷＢ）で洗浄する（３×）。正常血清または患者血清（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ、Ｂｉｏｒｅｃｌａｉｍａｔｉｏｎ）を、５０％ヒト血清を含むブロッキング緩衝液で希釈する。プレートを血清試料とともに一晩、４℃でインキュベートし、ＷＢで洗浄し、次に１００μｌ／ウエルのビオチニル化検出用抗ＧＰＮＭＢ抗体とともに１時間、２５℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをＨＲＰ−ストレプトアビジンとともに１５分間インキュベートし、前と同じように洗浄し、次に色の発生のためにＨ２Ｏ２中の１００μｌ／ウエルのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ展開溶液）で処理する。反応は５０μｌ／ウエルのＨ２ＳＯ４（２Ｍ）で停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて４９２ｎｍで分析した。血清試料中のＧＰＮＭＢの濃度は４パラメーター曲線適合プログラムを用いて精製ＧＰＮＭＢ抗原の希釈物と比較することにより計算する。
患者の癌の段階付け：
上記診断例で示され、論じられた結果に基づいて、ＧＰＮＭＢ抗原の発現レベルに基づき被験体の癌の段階付けができることが理解されよう。癌の一定の種類（例えば、黒色腫）について、疾患の進行の多様な段階および／または癌の治療的処置における多様な時点で診断される患者からの血液試料を採取する。血液試料に存在するＧＰＮＭＢ抗原の濃度を、存在する抗原の量を特異的に決定する方法を用いて決定する。そのような方法には、ＥＬＩＳＡ法、例えば前記の診断例に記載した方法がある。進行または治療の各段階に関する統計的に有意な結果を提供する試料集団を用いて、各段階に特徴的と見なされる抗原の濃度範囲が明確に示される。
【０３７４】
研究下の患者の癌の進行を段階付けるために、または被験体の治療コースに対する応答を特徴付けるために、血液試料を被験体から採取し、試料中に存在するＧＰＮＭＢ抗原の濃度を決定する。このように得られた濃度は、その値がどの範囲の濃度に入るのかを同定するために用いられる。このように同定された範囲は、診断被験体の多様な集団で同定された進行段階または治療段階に関連し、よって、研究下の被験体の段階が提供される。
【０３７５】
（実施例１７：ＧＰＮＭＢに対する抗体による癌の診断）
卵巣癌腫瘍を有すると疑われる被験体を同定し、疑われた腫瘍からの組織試料を試験するために取り出す。次に、取り出された組織を、比色分析用標識を有する抗ＧＰＮＭＢ抗体に接触させる。抗ＧＰＮＭＢ抗体が取り出された組織に特異的に結合するかどうかを決定する。結合は癌性組織を示す一方で、結合の欠如は非癌性組織を示す。このように患者の状態を診断して、引き続く試験、カウンセリングおよび／または治療を容易にする。
【０３７６】
（実施例１８：ＧＰＮＭＢに対する抗体による癌の治療）
腫瘍細胞上のＧＰＮＭＢの標的化は癌の危険があるか、または癌に苦しむ被験体を治療するために有用である。そのような被験体は、本発明の抗ＧＰＮＭＢ抗体による治療から恩恵を受けるだろう。典型的には、抗体は、外来患者の設定で、ゆっくりとした静脈内（ＩＶ）注射により約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量にて週１回の投与で投与する。抗体の適当な治療効果のある用量は治療を行う医師により選択され、おおよそ１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇおよび５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲にあるだろう。
【０３７７】
さらに、抗体はＧＰＮＭＢ関連疾患に関連する疾患を予防し、および／またはその重症度および／または症状を低減するために用いられる。
【０３７８】
ヒトおける抗体の臨床的有効性を調べるために、特に卵巣癌、肺癌または結腸癌等の、しかしこれらに限定されない癌を有する個人を同定し、治療集団にランダム化する。治療集団は、抗体治療を受けない集団および異なる用量の抗ＧＰＮＭＢ抗体で治療する集団を含む。個人は前向きにフォローされ、抗体治療を受ける個人は状態の改善を示す。
【０３７９】
（実施例１９：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗腫瘍効果の特異性（ＣＲ０１１−ＯＮＣ−１））
この研究は抗体−医薬結合体の構成成分とその製剤の抗腫瘍効果を決定し、これらの結果をインタクトな免疫結合体の抗腫瘍効果に関連付けるために行なった。
【０３８０】
結果：
ＳＫ−ＭＥ−２黒色腫の断片を外套針によりマウスに移植し、腫瘍が定着した後、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥと多様な成分による治療を調べて、この物質の抗腫瘍効果の特異性を示した。リン酸緩衝食塩水（ベヒクル）または免疫結合体調製物の成分（３％ＤＭＳＯ、スクロース、リン酸媒体）のいずれかが投与されたコントロールグループは腫瘍サイズを最大２，０００ｍｇまで絶えず増加させて、この時点でそれら動物を研究から排除した。明らかな、または統計的に有意な抗腫瘍効果は観察されなかった。しかし、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ治療（５ｍｇ／ｋｇ／治療、ｑ４ｄ×４）は最初の２投与後に測定可能な阻害を生じた。腫瘍成長阻害は、認識可能な腫瘍がすべての６試験動物で検出されなくなるまで続いた（図４）。予備試験において、腫瘍退縮は完全であり、長期にわたる観察期間（２００日まで）にもかかわらず腫瘍の再増殖がその後に起こることはなかった。
【０３８１】
結論：
免疫結合体により生じる退縮は、免疫結合体の個々の成分によるものではなく、また該免疫結合体の製剤の成分によるものでもない。このことは、ＣＲ０１１抗体のみの処理（グループ３）または遊離モノメチルオーリスタチンＥによる処理（グループ４）（適用される用量はインタクトな免疫結合体に含まれるものと同一である）の後に腫瘍成長の阻害がないことにより示される。さらに、遊離のＭＭＡＥで注意された抗腫瘍効果の欠如は、抗体−医薬結合体からの持続放出の結果としてのＭＭＡＥの抗腫瘍効果が免疫結合体の抗腫瘍効果を説明するものではないと示唆する。抗体−ＭＭＥＡ結合体からのＭＭＡＥの放出は、インビトロで非常に遅いプロセスであることが示され（抗ＣＤ３０抗体−オーリスタチンＥ免疫結合体の場合でＴ１／２β＝６．０日（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｔ．，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：８４３−８５２（２００５））、ヒト黒色腫異種移植片の成長を低減するのに効果的ではなかった本研究に用いられた「大量瞬時投与量」よりもさらにかなり低い血漿または血清濃度を提供するにちがいない。
【０３８２】
（実施例２０：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥはヒトＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫異種移植片の成長を阻害して胸腺欠損マウスに定着した黒色腫腫瘍の完全な退縮を導く（ＣＲ０１１−ＯＮＣ−３））
この研究は、定着したヒト黒色腫であるＳＫ−ＭＥＬ−５異種移植片の第２モデルに対する抗体−医薬結合体であるＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの効力と治療有効性を評価するために実施された。
【０３８３】
結果：
起源は無関係であるが、ＳＫ−ＭＥＬ−５は細胞膜の表面上でＧＰＮＭＢを発現し、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによりインビトロで死滅させられる。この研究において、ベヒクルＰＢＳと食塩水および参照薬剤のビンブラスチンとパクリタキセルとともに、ＣＲ０１１免疫結合体の抗腫瘍効果を調べた。ＳＫ−ＭＥＬ−２腫瘍と同じように、ビンブラスチンは、食塩水とＰＢＳコントロールグループと比較した場合に、目立つが、有意ではない腫瘍成長阻害（Ｐ≦０．２１）を生じた（図５）。しかし、パクリタキセルによる治療の開始後すぐに、有意な腫瘍成長阻害が治療開始の３日後には観察され（Ｐ≦０．０３９）、この抗腫瘍効果が続いて、１００％成長阻害（静止）を生じた。ＳＫ−ＭＥＬ−５を有する試験動物のビンブラスチンとパクリタキセルに対する応答は短いものであった。最大許容用量での治療の休止後、腫瘍は迅速な進行性の成長を再開した。長期で無腫瘍の一匹の生存動物がパクリタキセルグループに存在し、一つの自然退行が食塩水で処理されたグループに存在した。
【０３８４】
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによる治療後、実質的な腫瘍成長阻害ならびに腫瘍成長の遅延と完全な退縮がＳＫ−ＭＥＬ−５癌を持った動物で起こり、これらの効果は用量に依存した。１０ｍｇ／ｋｇ／処置において、食塩水（Ｐ≦０．００９６）に比較して処置が始まった後、早くも７日目（２処置に相当）と、ＰＢＳ処置のコントロール（Ｐ＝０．０３９）に比較して、処置が始まった後、早くも１０日目に有意な抗体効果が認められた。用量依存的にＣＤ０１１−ｖｃＭＭＡＥは腫瘍の成長の遅れを生じて、定着したＳＫ−ＭＥＬ−５黒色腫異種移植片の完全な退縮をもたらした（完全な退縮を有する動物の比率に関しては、図５の表挿入を参照されたい）。完全な退縮が、１．２５ｍｇ／ｋｇ／処理ではなく、２．５ｍｇ／ｋｇ／処置のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ用量で起こった。
【０３８５】
以前の研究にあるように、免疫結合体による毒性の徴候は体重または体重増加に対する効果の死亡率からもわかるように治療動物に起こらなかった。
【０３８６】
結論：
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥは、ＳＫ−ＭＥＬ−５ヒト黒色腫の定着異種移植片に対して実質的で用量依存性の抗腫瘍効果を及ぼす。一回または二回だけの処置後、有意な腫瘍成長の阻害が注意され、長期の腫瘍のない生存動物を導く。完全な退縮が≧２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内（ｑ４ｄ×４）用量で生じた。
【０３８７】
（実施例２１：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ（ＣＲ０１１−ＰＫ−１Ａ）の薬物動態）
この研究の目的は、予想される臨床的投与経路である静脈内注射の後のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥのインビボ安定性を示すことにあった。
【０３８８】
材料と方法
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥのＣＲ０１１抗体成分をサンドイッチタイプの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。このＥＬＩＳＡでは、血清を、ＣＲ０１１抗体に対する同種抗原（ＧＰＮＭＢ、ＣＧ５６９７２−０３）で被覆したマイクロタイタープレートのウエルに加え、ヒト抗体の量を信号発生剤（西洋ワサビパーオキシダーゼ）に結合体化させた抗グロブリンにより検出した。
【０３８９】
結果：
薬物動態。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗体成分の化合物利用性の持続性を胸腺欠損マウスにおける薬物動態研究で調べた（研究ＣＲ０１１−ＰＫ−１、図６）。抗体−医薬結合体の血清濃度−時間プロフィールを、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの静脈内投与後に胸腺欠損マウスで決定し、その結果を図６に示す。１または１０ｍｇ／ｋｇを静脈内で受けた胸腺欠損マウスはサンプリング時間の全期間（４２日間）にわたって用量に比例する血清濃度を示した。濃度−時間のパターンは二相性であった。しかし、初期相（α）は全ＡＵＣの＜２％に寄与するだけの小さいものであった。それにもかかわらず、化合物は末梢血液から非常にゆっくりと消失し（Ｔ１／２β＝１０．３日間）、１μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬの血清濃度が投与後６週間血液に残存した。
【０３９０】
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの薬物動態パラメーターの推定を表４８に示す。一つのパラメーターが注目に値する。定常状態での分配量（Ｖｓｓ）は非常に低く、理論的最小値に近づいている；このことは、化合物が血管外空間の外側に分布していないことを示唆する。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの分布パターンならびにβ排出相は一般的に抗体に関して得られた値と十分一致し（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｂｙ  Ｍａｈｍｏｏｄ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，
Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ４４：  ３３１−  ３４７  （２００５）；またはＬｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ９３：  ２６４５−２６６８（２００４）を参照）、類似の医薬負荷を有する抗体−オーリスタチンＥ免疫結合体について得られた値に一致する（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０：７０６３−７０７０（２００４））。
表４８．静脈内投与後のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥに関するＰＫパラメーター。
【０３９１】
【表４８】
2014003986.tif 000151
略号：  Ａ：アルファ相の前指数関数的定数；  Ａｌｐｈａ：アルファ相の指数関数的速度定数；  ＡＵＣ：０から無限までの曲線下の全領域；  Ｂ：ベータ相の前指数関数的定数；  Ｂｅｔａ：ベータ相の指数関数的速度定数；  Ｃｌ：総クリアランスまたは全身クリアランス；  Ｃｍａｘ：最大の観察濃度；  ＭＲＴ：平均滞留時間；  体積：中心コンパートメントの体積；  Ｖｓｓ：定常状態分配量
薬物動態パラメーターの推定を表４８に示す。一つのパラメーターが注目に値する。定常状態での分配量（Ｖｓｓ）は理論的最小値に近づいている。これらのデータは、化合物が血管外空間の外側に分布しないことを示唆する。総合すれば、これらのデータは、−ｖｃＭＭＡＥ細胞毒性部分を有する他の免疫結合体に関するデータと十分一致する（Ｈａｍｂｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０（２００４）を参照）。
【０３９２】
結論：
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ抗体−医薬結合体は、黒色腫異種移植片の破壊と根絶に十分な連続的な曝露を好ましいとする血清−濃度プロフィールを有する。静脈内投与後の免疫結合体は、腫瘍細胞の長期間の曝露を確実にする十分に長い半減時間（Ｔ１／２β＝１０．３日間）を有し、頻繁な投与を必要としないだろう。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥのインビボ（例えば、胸腺欠損マウス）での持続性は他のオーリスタチンＥ免疫結合体に匹敵する。
【０３９３】
（実施例２２：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗腫瘍効果のスケジュール依存性（ＣＲ０１１−ＯＮＣ−１））
本研究の目的は、ＣＲ０１１抗体−医薬結合体の治療的抗腫瘍効果が投与計画に依存する程度を決定し、可能であれば、この異種移植モデルの最適投与間隔を決定することであった。
【０３９４】
材料と方法：
本研究のプロトコールを表４９に示す。治療的抗腫瘍効果が投与スケジュールにより影響されるとの仮説を調べるために、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗腫瘍効果を５つの異なる投与間隔（すなわち、治療間の０、１、４、８および１６日間）で測定し、各投与間隔で３つの投与量レベルを用いた（すなわち、２、８および３２ｍｇ／ｋｇの蓄積量）；各グループに関して、ｎ＝６匹の胸腺欠損マウス。
【０３９５】
注意：この実験におけるすべての５組のグループ（例えば、グループ５、６および７は１つの組を表し、それぞれ３２、８および２ｍｇ／ｋｇの蓄積量を受けた）が同一の蓄積量を受けたが、「大量瞬時投与量」を受けた最初の組は他の４組とは異なることに注意されたい。４組のグループが４処理を受けたのに対し、第一の組がただ１つの「大量瞬時投与」しか受けなかったので（下記表４９のカラム７を参照）、「大量瞬時投与」組の各グループのＣｍａｘは他の４組のＣｍａｘよりもおそらく４倍高かったであろう（静脈内投与後の用量直線性の薬物動態に関するセクションを参照されたい）。
表４９．投与間隔研究のプロトコール（ＣＲ０１１−ＰＨＭ−２）
【０３９６】
【表４９】
2014003986.tif 000152
結果：
この研究のために、５つの異なる投与間隔を実験的に調べた後（すなわち、治療間の０、１、４、８および１６日間）、長期の腫瘍のない生存動物による完全な完全退縮の頻度を決定した。１つの組が、段階的な用量レベルであるが一つの投与間隔の３グループと定義される（グループ５、６および７が１組を表し、これらのすべてのグループが１日の投与間隔で処置された）グループの各組の総合応答を図７に示す。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥに応答する試験動物の総合応答は、大量瞬時投与と１日と４日の投与間隔とが、投与間の８日や１６日等の長い間隔と比較して治癒比率にごくわずかな利点を提供することを示唆するように思える。しかし、この効果は有意ではなかった（Ｐ＜０．２９０４）。したがって、これらのデータは、ＳＫ−ＭＥＬ−２モデルにおけるＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの抗腫瘍効果がスケジュールに左右されないことを示唆する。この結論は、他のグループよりもおよそ４倍も高い血漿濃度にさらされた大量瞬時投与組の試験動物（グループ２、３および４）が治癒被験体の高い比率を示さなかったことから支持される。
【０３９７】
多様な投与量レベルの効果の検討を含むように本研究の当初の設計を拡大した。各組について、１グループの動物は、４日の投与間隔を用いた以前の研究で長期の腫瘍のない動物を導く一致した治療効果を提供した８ｍｇ／ｋｇの累積用量を受けさせた。さらに、２ｍｇ／ｋｇと３２ｍｇ／ｋｇの累積用量を用いた。
【０３９８】
多様な投与間隔と併せた投与量レベルの効果を図８に示す。３２ｍｇ／ｋｇの累積用量を受けた胸腺欠損マウスは、投与間隔とは関係なく各グループの１００％において完全な退縮を示した；すなわち、３２ｍｇ／ｋｇの累積用量はスケジュール非依存性であり、試験動物の１００％（６匹の動物／グループの５グループ＝３０試験動物）で完全な退縮に十分な用量よりもはるかに高い用量を示す。８ｍｇ／ｋｇの累積用量を受けた動物はスケジュール依存性を示さず、完全な退縮のほとんど同一の比率を示した（すなわち、２８／３０＝９３％）。２ｍｇ／ｋｇ（累積用量）を受けた試験動物は（ｑ４ｄ×４の正規化投与計画を用いた）予備研究において治療の閾値以下であることが認められ、これは有意ではないがスケジュール依存性であると思われ、かなり低い完全縮退比率（すなわち、１３％）を生じた。
【０３９９】
結論：
投与間隔研究からのデータは、ＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫異種移植片の応答がＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの投与スケジュールに依存しないことを示す。大量瞬時投与または低い投与間隔による投薬計画には何の利点も示すことができなかったが、一定の閾値累積用量未満では、複数の処置を単一の大量瞬時投与へと組み合わせることには幾つかの利点が存在するとの示唆がある。
【０４００】
（実施例２３：ヒト黒色腫におけるＧＰＮＭＢ転写物の発現）
ＧＰＮＭＢは、神経膠芽腫で発現し、神経膠芽腫由来の腫瘍細胞のインビトロとインビボでの侵襲性を仲介することが最近示された（例えば、Ｌｏｇｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０：１３９３−１４０２（２０００）；およびＲｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：１５９５１−１５９７５（２００３））。これらの発見を確認し、これら発見をさらなる癌型まで拡張するために、ヒト癌細胞系と組織中のＧＰＮＭＢ転写物の発現を調べた。
【０４０１】
材料と方法：
ＤＮａｓｅ消化工程を有するＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。ワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを下記のように実施した。ＲＴ：１サイクルにつき５０℃で４５分間および９５℃で１５分間。ＰＣＲ：９５℃で１分間、５０℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル、７２℃で１０分間の最終伸長。生成物は、２％アガロース／０．３３％低融点アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。各ＲＮＡ試料の統合性を、ＧＡＰＤＨを増幅するために設計されたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検証した。使用された特定のプライマー（５’−３’）は以下の通りである：
【０４０２】
【化９７】
2014003986.tif 000153
ＲＴＱ−ＰＣＲ分析は、ＴａｑＭａｎ試薬（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列決定システムにより実施した。等量の（複数の）正規化ＲＮＡを、ＧＰＮＭＢに特異的なプライマーを用いる４０サイクルのＰＣＲ反応で鋳型として用いて閾サイクル（ＣＴ）値を得た。下記のプライマー（５’−３’）を用いた：
【０４０３】
【化９８】
2014003986.tif 000154
結果：
我々の転写物発現分析は、ＧＰＮＭＢが高い比率のヒト転移性黒色腫試料中で強く発現することを示した。ＧＰＮＭＢは、調べられた５／７黒色腫細胞系および５／５黒色腫の臨床種で高度に発現（ＣＴ＜２７．０）していることがＲＴＱ−ＰＣＲを用いてわかった（表５０）。対照的に、ＧＰＮＭＢは、我々の実験で陰性コントロールとして用いられた腎臓癌細胞ＴＫ−１０では発現しなかった。
表５０：ヒト黒色腫細胞系と臨床種におけるＧＰＮＭＢ転写物の発現
【０４０４】
【表５０】
2014003986.tif 000155
＊ＲＴＱ−ＰＣＲ分析からの閾サイクル（ＣＴ）値。
【０４０５】
これらの結果を拡大するために、１７種類の黒色腫細胞系の一団中のＧＰＮＭＢの発現を半定量ＲＴ−ＰＣＲにより調べた（表５１）。これらの結果は、ＧＰＮＭＢ転写物が１５／１７の黒色腫細胞系で高く発現し、１／１７の黒色腫細胞系（Ａ−３７５）で低く発現し、１／１７の黒色腫細胞系（ＬＯＸＩＭＶＩ）やコントロールＴＫ−１０では検出不能であることを示す。
【０４０６】
表５１．ＲＴ−ＰＣＲ分析
【０４０７】
【表５１】
2014003986.tif 000156
＊ＲＴ−ＰＣＲ分析：強（＋＋＋）、弱（＋）または検出不能（−）。
【０４０８】
さらに、黒色腫細胞系におけるＧＰＮＭＢ転写物の発現を公知の黒色腫／メラニン形成細胞関連癌転写物（ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびｐＭＥＬ−１７）と比較（表５１）すると、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼおよびｐＭＥＬ−１７はそれぞれ１３／１７、１４／１７および１２／１７の黒色腫細胞系において強い発現を示した。注目すべきは、１２／１７の試料が高いレベルのＧＰＮＭＢおよび３種類すべての黒色腫／メラニン形成細胞関連遺伝子を共発現した。検出不可能なＧＰＮＭＢ発現を有したＬＯＸＩＭＶＩとＴＫ−１０の両細胞系は、調べられた３種類の黒色腫／メラニン形成細胞関連遺伝子の発現も欠いた。
【０４０９】
（実施例２４：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの成長阻害活性はＧＰＮＭＢ発現に依存する）
材料と方法
フローサイトメトリー：細胞系の細胞表面上のＧＰＮＭＢ発現の定量的分析はフローサイトメトリーにより決定した。約１×１０６個の細胞を収集し、洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、４％ＦＢＳおよび０．１％ＮａＮ３を含む染色緩衝液中のＣＲ０１１またはアイソタイプ対応コントロール抗体のいずれかの飽和量（１０μｇ／ｍＬ）とともに３０分間氷上でインキュベートした後、洗浄し、１：１００のＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）による３０分間の氷上の染色を行なった。細胞を１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳに固定化し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより調べた。データ分析をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエアバージョン３．３を用いて実施し、幾何学的蛍光強度比（ＧＭＲ）を細胞タイプのそれぞれで決定した。
【０４１０】
細胞表面結合抗体の内部移行は、改良型フローサイトメトリー操作により評価した。簡単に説明すると、細胞懸濁液を１０μｇ／ｍＬの非結合体またはＭＭＡＥ結合体化のＣＲ０１１で氷上３０分間標識した。細胞の洗浄後、インキュベーションを３７℃に１時間シフトして、結合体化抗体を内部移行させた。氷上に残った細胞（全表面結合）または３７℃でインキュベートした細胞（内部移行）をＰＥ結合体化ヤギ抗ヒト抗体（１：１００）で３０分間染色して、細胞表面に保持されたＣＲ０１１を検出した。標識された細胞を上記のようにフローサイトメトリーで分析した。内部移行した抗体の比率をＧＭＲおよび下記式を用いて決定した。
内部移行比率＝全表面結合（４℃）−全表面結合（３７℃）／全表面結合（４℃）×１００
免疫沈降および免疫ブロット分析：細胞を採取し、１％ＮＰ−４０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍトリス塩酸、１０％グリセロール、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む溶解緩衝液中、３０分間氷上で溶解した。上清を集め、タンパク質濃度をＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で決定した。免疫沈降のために、２μｇの一次抗体を０．５〜１ｍｇの全細胞溶解物に加え、４℃で３時間インキュベートした後、プロテインＡアガロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともに氷上で２時間インキュベートした。アガロースビーズを氷冷ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）中で洗浄した。免疫沈降物を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰させ、遠心した後、上清から回収した。
【０４１１】
免疫ブロット分析のために、全細胞溶解物（５０μｇ）または免疫沈澱物を還元条件下で４〜２０％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、電気泳動により０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。膜を、ＴＢＳＴ中の３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で３時間ブロックし、ウサギ抗ＧＰＮＭＢポリクローナル抗体（１：１０００）をプローブとして用いて３時間調べた。パーオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を加え、３０分間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、製造業者のプロトコールにしたがって増強化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供した。
【０４１２】
クローン形成アッセイ：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの成長阻害活性をクローン形成アッセイにより決定した。細胞を９６ウエルプレートにコートし、一晩回復させた。非結合体ＣＲ０１１、遊離ＭＭＡＥ、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥまたはアイソタイプ対応ｖｃＭＭＡＥ結合体化抗体を多様な濃度でサブコンフルエントな細胞培養物に加え、４日間３７℃でインキュベートした。次に、細胞を６ウエルプレートに移し、コロニーを形成させた。コロニーをギムザ染色（Ｓｉｇｍａ）で染色し、カウントした。生存細胞フラクションを、処理試料と未処理コントロールの比率に基づいて計算した。結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍバージョン４ソフトウエアを用いたコントロールの比率として表した。ＩＣ５０は、未処理のコントロール培養物に比較してコロニー形成の５０％の減少をもたらす濃度と定義した。
【０４１３】
結果：
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ成長阻害活性がＧＰＮＭＢ発現に依存することを示すために、全長ＧＰＮＭＢタンパク質をＨＥＫ２９３細胞中に異所的に発現させた。免疫ブロット（図９Ａ）およびＦＡＣＳ（図９Ｂ）分析により、ＧＰＮＭＢがＧＰＮＭＢ／プラスミド移入細胞で発現したことを確認した。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによる細胞の処理とそれに続くクローン形成アッセイにより、ＧＰＮＭＢを発現するＨＥＫ２９３細胞は、ＧＰＮＭＢ発現を欠くコントロール細胞よりも、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ仲介成長阻害に対してさらに感受性があることを示した（図９Ｃ）。
【０４１４】
これらの発見をさらに検証するために、ＧＰＮＭＢを発現するＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトして、内在性ＧＰＮＭＢ発現を特異的に阻害した。トランスフェクションの２日後と４日後に実施された免疫ブロットとＦＡＣＳ分析は、全ＧＰＮＭＢ（図１０Ａ）と表面ＧＰＮＭＢ（図１０Ｂ）タンパク質レベルが、トランスフェクション後のＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞中で、コントロールトランスフェクタントに比較して有意に減少することを示した。ＧＰＮＭＢ発現の量はトランスフェクション後、少なくとも７日間減少した。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによるこれらの細胞の処理は、ＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞が、ｓｉＲＮＡ仲介ＧＰＮＭＢのノックダウン後のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの成長阻害活性に対して感受性がさらに低いことを示した（図１０Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの成長阻害活性が細胞表面ＧＰＮＭＢ発現を必要としたことを示す。
【０４１５】
（実施例２５：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによる細胞周期停止とアポトーシスの誘導）
成長阻害のＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの機構を評価するために、細胞周期分析を実施した。
【０４１６】
材料と方法：
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの細胞周期効果は、細胞を完全成長培地で２４時間または４８時間処理した後に評価した。簡単に説明すると、示された時間間隔で３０μＭのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ，Ｓｉｇｍａ）のパルスを細胞に３０分間与え、細胞を固定し、メタノール中で透過処理した。新生ＤＮＡ合成を抗ブロモデオキシウリジン−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）染色により検出した。全ＤＮＡ含量はヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。アポトーシス分析のために、細胞を上記のように処理し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで標識した後、製造者のプロトコールにしたがってアネキシンＶ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ
ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてヨウ化プロピジウムを排除した。（以前の実施例に記載した）フローサイトメトリーを用いて、細胞周期とアポトーシス研究を評価した。
【０４１７】
結果：
ＧＰＮＭＢ陽性ＳＫ−Ｍｅｌ−２細胞または陰性ＴＫ−１０コントロール細胞を、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥで多様な時間処理した後、ブロモデオキシウリジンで３０分間処理して、新生ＤＮＡ合成を検出し、最後にヨウ化プロピジウムで処理して、全ＤＮＡ含量を検出した。ＤＮＡ合成と細胞周期進行をフローサイトメトリーで決定した（表５２）。
表５２．ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ処理細胞の細胞周期の分析
【０４１８】
【表５２】
2014003986.tif 000157
細胞周期分析はフローサイトメトリーにより実施し、細胞サイクルの各相の細胞のパーセントをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により決定した。
【０４１９】
１０００ｎｇ／ｍＬのＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥに対する（しかし、イソタイプコントロールＩｇＧ２−ｖｃＭＭＡＥに対してではない）ＧＰＮＭＢ陽性細胞の２４時間の曝露は、未処置細胞と比較してＧ１とＳ相の細胞の減少比率（１０％）とＧ２／Ｍの細胞の増加比率（１８．６％）をもたらした。対照的に、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥはＧＰＮＭＢ陰性細胞の周期に影響を与えなかった。処置の４８時間後に、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥはＧ１とＳ相の細胞の比率（１１％）を減少し、Ｇ２／Ｍの細胞の比率（２４％）を増加させた。
【０４２０】
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ処置後の亜Ｇ１集団の増加はアポトーシスの開始を示唆した。この可能性を調べるために、アネキシンＶ表面結合とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除の損失を用いてアポトーシスの分析を実施した。我々の結果は、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ処置の４８時間に続いて単一染色された（アネキシン−Ｖ＋／ＰＩ−）細胞の１１％の増加により示されるように、１０００ｎｇ／ｍＬのＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥはＧＰＮＭＢを発現する細胞に対して特異的にアポトーシスを誘導することを示した（表５３）。
表５３．ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによるヒト黒色腫細胞におけるアポトーシスの誘導
【０４２１】
【表５３】
2014003986.tif 000158
アポトーシスの分析はフローサイトメトリーにより実施し、４分円ＵＬ（左上）、ＵＲ（右上）、ＬＬ（左下）およびＬＲ（右下）中の細胞のパーセントをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により決定した。ＡｎｎＶ：アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩ：ヨウ化プロピジウム
さらに、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ処置後の二重染色（アネクチン−Ｖ＋／ＰＩ＋）細胞の増加はＣＲ０１１免疫結合体が細胞死を増強することを示した。総合すると、これらの結果はＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥがＧ２／Ｍ細胞周期停止を選択的に誘導した後にアポトーシス性の細胞死をもたらすことを示唆する。
【０４２２】
（実施例２６：ＣＲ０１１：抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の機構を利用する黒色腫治療に用いられる裸の完全ヒトＩｇＧ１）
黒色腫と脳腫瘍細胞の表面に顕著に観察される抗原であるＣＧ５６９７２／ＧＰＮＭＢに対する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）−ＩｇＧ２を作った。裸のＣＲ０１１  ＩｇＧ２  ｍＡｂ（ｍＡｂ１．１５）は、ＣＧ５６９７２を発現する細胞に対してインビトロでもインビボでも効果を持たなかった。よって、ＩｇＧ２からＩｇＧ１にスイッチするアイソタイプは、ｍＡｂに、ＡＤＣＣエフェクター機能によりヒト黒色腫細胞を死滅させることができるのかどうかを調べた。
【０４２３】
簡単に説明すると、ＣＲ０１１をＩｇＧ２からＩｇＧ１抗体にスイッチするために、ＩｇＧ１（アロタイプＧｍ（ｆ））の定常領域をコードする二本鎖ＤＮＡを合成し、重複ＰＣＲアプローチを用いて、ＩｇＧ２定常領域をＩｇＧ１定常領域に置換した。それらの配列を下記に示す：
ＣＲ０１１ｍＡｂ１．１５．１成熟重鎖（ＩｇＧ２）：
【０４２４】
【化９９】
2014003986.tif 000159
ＣＲ０１１ｍＡｂ１．１５．１成熟重鎖（ＩｇＧ１）：
【０４２５】
【化１００】
2014003986.tif 000160
最初に、細胞表面上にＣＧ５６９７２を発現し、ＣＲ０１１ＩｇＧ２に結合することが示されているＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫細胞上のＩｇＧ１とＩｇＧ２完全ヒトモノクローナル抗体の結合性を分析した。図１１に示されるように、ＩｇＧ１とＩｇＧ２の両方のｍＡｂが、アイソタイプコントロールｍＡｂに比べてＳＫ−ＭＥＬ−２細胞上の同程度のＦＡＣＳシフトを引き起こし（図１１）、両方のアイソタイプが、同程度の飽和密度と親和性をもってＣＧ５６９７２／ＧＰＮＭＢに結合することを示した。
【０４２６】
次に、ＣＲ０１１  ＩｇＧ１  ｍＡｂは、ヒトＰＢＭＣの存在下の培養液中のＳＫ−ＭＥＬ−２細胞にＡＤＣＣを誘導できるのかどうかを調べた。ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅを用いて全血から単離した。簡単に説明すると、５０ｍＬのチューブ中で、１５ｍＬのＰＢＳを、１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅを下層にした２０ｍＬの全血に加えて、チューブを２０００ＲＰＭで遠心した。単核細胞を界面から集め、ＰＢＳで３回洗浄した。ＡＤＣＣアッセイを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの細胞溶解用蛍光アッセイ（ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞毒性アッセイ）を用いて、９６ウエルプレート中で実施した。この操作は標的細胞に蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ、ビス（アセトキシメチル）ターピリジン−ジカルボキレート）を負荷することに基づく。この親水性リガンドは膜を迅速に通過する。細胞内で、そのエステル結合は加水分解して、膜をもはや通過できない親水性リガンド（ＴＤＡ、ターピリジン−ジカルボン酸）を形成する。細胞溶解後、リガンドは遊離し、ユウロピウム溶液に導かれる。ユウロピウムとリガンドは高い発光性があり安定なキレート（ＥｕＴＤＡ）を形成する。蛍光強度は、励起と発光の波長をそれぞれλｅｘ＝３４０ｎｍとλｅｍ＝６１３ｎｍを用いて記録する。
【０４２７】
ＳＫ−ＭＥＬ−２細胞における抗体依存性仲介細胞毒性を、１０、３０、６０および１００のエフェクター：標的比と、ＣＧ５６９７２／ＧＰＮＭＢに対するＩｇＧ１またはＩｇＧ２  ｍＡｂの多様な濃度（２、５、１０μｇ／２００μｌ）とを用いてＰＢＭＣとＣＲ０１１モノクローナル抗体の存在下で検定した。我々のデータは、３０〜１００倍のＰＢＭＣ、ＩｇＧ１  ｍＡｂが用量依存的にＳＫ−ＭＥＬ−２細胞の細胞溶解を引き起こす一方で（図１２Ａ）、ＩｇＧ２  ｍＡｂは細胞溶解を示さないこと（図１２Ｂ）を示した。したがって、我々は、ＣＧ５６９７２／ＧＰＮＭＢに対するＣＲ０１１  ＩｇＧ１  ｍＡｂは、Ｇ５６９７２／ＧＰＮＭＢを発現する細胞をインビトロで殺すことができ、ＡＤＣＣエフェクター機能によりインビボで潜在的にヒト黒色腫を殺すことができると結論する。ＣＲ０１１  ＩｇＧ１  ｍＡｂは、高用量ＩＬ−２、インターフェロン−ガンマまたはＴＮＦ−アルファ等の転移性黒色腫にいくつかの臨床的有益性を提供できる免疫エフェクターサイトカイン類に組み合わせることも有用となりうる。ＣＲ０１１は、ワクチン免疫治療、ＭＤＸ−０１０等の免疫調節物質、放射線治療および／または化学療法と組み合わせて黒色腫を治療するために用いることもできる。
【０４２８】
（実施例２７：星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫およびＣＮＳの他の腫瘍の治療）
星細胞腫／神経膠芽腫は、満たされていない顕著な医療ニーズを代表する医薬難治性腫瘍である。これらのヒト癌組織と癌細胞系で高度に発現するヒト遺伝子（ＧＰＮＭＢとしても知られる）としてＣＧ５６９７２を同定した。ＣＧ５６９７２はヒト脳において非常に限定された発現パターンを有する小胞輸送に潜在的に関与するタイプＩの膜貫通タンパク質である。我々は、ＣＧ５６９７２細胞外領域（アミノ酸２３〜４８０）に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作った。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥと命名した我々の主要なモノクローナル抗体は生物化学的に特性付けられ、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫または神経外胚葉起源のヒト脳腫瘍に由来する細胞系に対する治療活性について調べられた。
【０４２９】
転写物発現の分析は、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫に由来する脳腫瘍または神経外胚葉起源の腫瘍における高度に上昇したＣＧ５６９７２ｍＲＮＡの発現を示すが、正常な脳では制限された低い発現を示した。ＣＲ０１は、ＦＡＣＳ分析により、脳腫瘍細胞系上の表面ＣＧ５６９７２に結合した。ＣＲ０１１  ｍＡｂのウエスタンブロットは１００と１２０ｋＤａの遺伝子産物を予測した。クローン形成アッセイはＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ
ｍＡｂが脳腫瘍細胞系の成長を阻害することを示した。
【０４３０】
材料と方法
細胞系と培養条件：すべてのヒト細胞系であるＳＫ−ＭＥＬ−２、ＸＦ−４９８、ＳＮＢ−７８、Ｕ−１１８−ＭＧ、ＳＦ−５３９、Ｈ７９ＭＧ、Ｄ３９２−ＭＧ、Ｄ５３４−ＭＧ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｕ−２５１、ＳＦ−２９５、Ｄ４５０−ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、ＳＦ−２６８、Ｔ９８ＧおよびＳＷ−１７８３はアメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得るか、またはＮＣＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）からから購入した。細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｏｄｌａｎｄ、ＣＡ）およびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に維持した。
【０４３１】
リアルタイム定量的ＲＣＲ（ＲＴＱ−ＰＣＲ）：全ＲＮＡは、ＤＮａｓｅ消化工程を用いるＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ）を用いて単離した。ＲＮＡ試料は、市販されている正常ヒト組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得るか、または仕様書にしたがって成長させた細胞系から得た。ＲＮＡを収集し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）試薬（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて、ＰＣＲを既に記載されているように実施した（Ｓｈｉｍｋｅｔｓ  ＲＡ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９９．  １７−８：７９８−８０３）。βアクチンとグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを製造業者の指示にしたがって用いることでＲＮＡを基準化した。等量の基準化ＲＮＡを、ＣＧ５６９７２に特異的な試薬を用いるＰＣＲ反応で鋳型として用いて、閾サイクル（ＣＴ）値を得た。グラフで表現するために、ＣＴ数を、最大レベルの発現を示す試料に対する相対的な発現に変換した。ＲＴＱ−ＰＣＲ分析は、ＴａｑＭａｎ試薬（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いたＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列決定システムにより行なった。下記プライマー（５’−３’）が用いられた：
【０４３２】
【化１０１】
2014003986.tif 000161
ＣｕｒａＣｈｉｐ（商標）：組織をトリゾールに溶解した。１５ｍｇの全ＲＮＡをｐｏｌｙ（Ｔ）プライマーとともに用いることによりビオチン標識ｃＤＮＡを作った。１１，０００個のオリゴヌクレオチドプローブの専売ＣｕｒａＣｈｉｐマイクロアレイ（ＣｕｒａＧｅｎ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）にハイブリダイズさせることにより遺伝子発現を評価した。スライドを一定の回転で１５時間、３０℃でハイブリダイズし、３０分間、室温で洗浄し、ストレプトアビジン溶液中でインキュベートし（４℃、３０分間）、１５分間室温で洗浄し、Ｃｙ３結合体化検出緩衝液中でインキュベートし（４℃、３０分間）、１５分間、室温で３回洗浄した。スライドをスキャンし（ＧＭＳ４１８スキャナー、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、ＩＭＡＧＥＮＥソフトウエア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｍａｒｉｎａ  Ｄｅｌ  Ｒｅｙ、ＣＡ）を用いることにより分析した。データを９０番目のパーセンタイル正規化に供し、ＣＧ５６９７２遺伝子の発現をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現と比較して分析した。ＣＧ５６９７２を検出するために用いたオリゴヌクレオチドは、５’−ＴＧＡＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＴＧＴＡ（配列番号３４１）である。ＧＡＰＤＨを検出するために用いたオリゴヌクレオチドは、ＧＡＰＤＨ転写物（受託番号ＮＭ＿００２０４６）の塩基対１２４３〜１２７２に対応する５’−ＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＡＡＧＴＡＣＣＣ（配列番号３４２）である。
【０４３３】
フローサイトメトリー：細胞系の表面上のＣＧ５６９７２発現の定量分析はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により決定した。およそ１×１０６個の細胞を採取し、洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、４％ＦＢＳおよび０．１％ＮａＮ３を含む染色緩衝液中で飽和量（１０μｇ／ｍＬ）のＣＲ０１１またはアイソタイプ適合コントロール抗体のいずれかとともに３０分間、氷上でインキュベートした後、洗浄し、１：１００のＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）結合体化ヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）により３０分間、氷上で染色した。細胞を１％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで調べた。データ分析はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエア、バージョン３．３を用いて実施し、各細胞タイプの幾何平均蛍光強度比（ＧＭＲ）を決定した。
【０４３４】
免疫ブロット分析：ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＸＦ−４９８、ＳＮＢ−７８、Ｕ−１１８−ＭＧ、ＳＦ−５３９、Ｈ７９ＭＧ、Ｄ３９２−ＭＧ、Ｄ５３４−ＭＧ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｕ−２５１、ＳＦ−２９５、Ｄ４５０−ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、ＳＦ−２６８、Ｔ９８ＧおよびＳＷ−１７８３の各細胞を採取し、１％ＮＰ−４０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２Ｍトリス塩酸、１０％グリセロール、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび完全なプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む溶解緩衝液中で、氷上、３０分間溶解した。上清を集め、タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で決定した。免疫ブロットアッセイのために、６ウエルＦａｌｃｏｎ組織培養皿から採取した集密的な細胞の１ウエルからの４０μｌの全細胞溶解物をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰し、遠心し、還元条件下で４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により分離した。ゲルを０．４５μｍのＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に電気泳動により移した。膜をＴＢＳＴ中の３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により３時間ブロックし、抗ＧＰＮＭＢポリクローナルＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；  １μｇ／ｍＬ、合計１０μｇ））をプローブとして用いて３時間調べた。パーオキシダーゼ結合体化抗ヤギ第二抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を加え、３０分間インキュベートした。膜をＴＢＳＴ中で洗浄し、製造業者のプロトコールにしたがって増強化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供した。
【０４３５】
クローン形成アッセイ：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの成長阻害活性はクローン形成アッセイにより決定した。細胞を９６ウエルプレートに蒔き、一晩回復させた。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥまたはアイソタイプ適合モノクローナル抗体を多様な濃度でサブコンフルエントな細胞培養物に加え、４日間、３７℃でインキュベートした。次に、細胞を６ウエルプレートに移し、コロニーを形成させた。コロニーをギムザ染色（Ｓｉｇｍａ）で染色し、カウントした。生存細胞フラクションは処置細胞と未処置細胞の比率に基づいて計算した。結果はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ４ソフトウエアを用いてコントロールの比率として表した。ＩＣ５０は、未処置コントロール培養物に比較して、コロニー形成の５０％の減少をもたらす濃度と定義された。
【０４３６】
結果：
１．ヒト星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫、および神経外胚葉起源の腫瘍におけるＣＧ５６９７２転写物の発現
ヒト癌細胞系および組織におけるＣＧ５６９７２転写物の発現を調べた（図１３Ａと１３Ｂ）。この転写物発現分析は、ＣＧ５６９７２が、調べられた全ての（１５／１５）ヒト脳癌細胞系において強く発現することを示した（図１３Ａ）。ＲＴＱ−ＰＣＲを用いて、ＣＧ５６９７２が、混合された神経膠芽腫／星細胞腫起源、神経膠芽腫／神経膠腫、星細胞腫および転移性神経芽細胞腫の細胞で発現することがわかった。脳またはＣＮＳの腫瘍細胞系のほとんどがＣＴ＜２７の高レベルの発現を示した。注目すべきは、ＣＧ５６９７２が、ＸＦ−４９８、Ｕ−１１８−ＭＧ、ＳＮＢ−７８およびＳＦ−５３９の各細胞において高度に発現する（ＣＴ＜２７．０）ことがわかった。図１３Ｂに示されているように、ＣＧ５６９７２は、４／５の神経膠腫ヒト生検および１／４の髄芽腫ヒト生検でも高レベルで発現した。ヒト遺伝子の大きな一団（図１３Ｃ）を含むインハウスチップからのマイクロアレイ分析を用いて、ＣＧ５６９７２は星細胞腫または神経膠芽腫起源の５／９の脳腫瘍ならびに４／９の乏突起細胞腫に高度に発現することがわかった。これらの腫瘍発現プロフィールの分析は、ＣＧ５６９７２メッセージが正常な脳組織においてかなり低い程度まで検出されることを示した。これらのデータは、ニューロンやグリア細胞等の正常なヒト脳におけるＣＲ０１１染色の欠如を示した我々の免疫組織化学的データとも一致する。総合すると、これらのデータは、ＣＧ５６９７２転写物は脳腫瘍や乏突起細胞腫細胞系、およびヒト腫瘍から単離された試料において非常に高い量で発現していることを示す。
２．ＣＧ５６９７２／ＧＰＮＭＢに対する完全ヒトＣＲ０１１モノクローナル抗体の産生
ＣＧ５６９７２タンパク質はタイプ１の膜貫通糖タンパク質であると予想されている。ＣＧ５６９７２転写物の高度発現と、ヒト癌試料におけるこのタンパク質の潜在的な細胞表面局在化は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を潜在的な癌治療剤として作る自信を我々に与えた。したがって、我々はヒトＣＧ５６９７２細胞外領域（ＥＣＤ；アミノ酸２３〜４８０）をクローニングした。クローニングされたｃＤＮＡの配列決定は、エキソン６／７境界での選択的スプライシングのためによると思われるインフレームの３６塩基挿入の存在を明らかにし、これは、公になったＧＰＮＭＢタンパク質配列の３３９残基後にさらなる１２アミノ酸（ＡＴＴＬＫＳＹＤＳＮＴＰ）（配列番号３４３）を付加した。３６塩基挿入の確実性をＲＴ−ＰＣＲにより実証した。次に、このｃＤＮＡをヒトＨＥＫ２９３細胞に発現した。得られたタンパク質を回収し、馴化培地から精製し、免疫原として用いて、ＣＧ５６９７２−ＥＣＤに対する完全ヒトｍＡｂを作った。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の免疫後、ＣＧ５６９７２−ＥＣＤタンパク質をＥＬＩＳＡにより特異的に認識するｍＡｂを作った。１．１５と命名された我々の主要なｍＡｂ、すなわち精製ＣＧ５６９７２−ＥＣＤに対するＣＲ０１１は、精製ＣＧ５６９７２−ＥＣＤタンパク質に対して５２ｎＭのＫｄを示し、詳細な特性付けのために選択され、この実例の残り部分の焦点となるだろう。
３．ヒト脳腫瘍におけるＣＧ５６９７２タンパク質発現のＣＲ０１１  ｍＡｂ１．１５による検出
多様な脳腫瘍細胞系上のＣＧ５６９７２タンパク質の表面発現をフローサイトメトリーで調べるために、ＣＲ０１１モノクローナル抗体をさらに用いた（図１４と表５４）。ＦＡＣＳ分析は、脳腫瘍細胞系であるＸＦ−４９８、Ｕ−１１８−ＭＧ、ＳＮＢ−７８およびＳＦ−５３９（これらすべてはＣＧ５６９７２転写物発現に対して陽性である）が、ＣＲ０１１モノクローナル抗体により、アイソタイプコントロールｍＡｂバックグランドを超える少なくとも１．５倍の表面染色を示した（図１４）。ＣＧ５６９７２転写物発現に対して特に弱く陽性（ＣＴ＞３２）であった細胞系ＳＦ−２６８（図１３Ｃおよび表５４）はコントロールｍＡｂバックグランドを超える約１．５倍と予想される最小表面染色を示した。ＣＧ５６９７２発現に対する陽性コントロールであるＳＫ−ＭＥＬ−２黒色腫細胞系は強い細胞表面染色を示した。
【０４３７】
脳腫瘍細胞系の一団中のＣＧ５６９７２タンパク質の発現を調べるために、全細胞溶解物を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、膜フィルターに移し、ＣＧ５６９７２ポリクローナル抗体による免疫ブロット分析に供した。図１５に示されるように、ＣＧ５６９７２ポリクローナル抗体は、ＣＧ５６９７２転写物を発現することが示された多様な脳腫瘍細胞系から約１００と１２０ｋＤａのＣＧ５６９７２の差別的なグリコシル化産物である２つのタンパク質種を検出した（図１３Ａ）。ＣＧ５６９７２タンパク質は、ＸＦ−４９８、ＳＮＢ−７８およびＨ７９−ＭＧおよびＳＦ−５３９の各細胞において高度に発現した。ｐ１００とｐ１２０の両種は、Ｕ−１１８−ＭＧ、Ｕ２５１、Ｄ５３４−ＭＧおよびＤ４５０−ＭＧにおいて低い程度で検出された。ＣＧ５６９７２タンパク質は、ＣＧ５６９７２転写物を弱く発現する細胞系ＳＦ−２６８でほとんどまたはまったく発現されなかった。アイソタイプ適合コントロールＩｇＧ２抗体は調べられた細胞系のいずれからもＣＧ５６９７２を免疫沈降させなかった。これらのすべてのデータは脳腫瘍における予想された分子量のＣＧ５６９７２タンパク質の細胞表面発現と一致する。
４．ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥによる星細胞腫／神経膠芽腫細胞系のインビトロ成長阻害
ＣＧ５６９７２は非常に限定されたヒト組織発現パターンを有する。予備研究では、ＣＲ０１１は、直接に用いられた場合、ＣＧ５６９７２を発現する癌細胞系の成長を阻害することはなかった（データは示さず）。ＣＧ５６９７２は脳腫瘍と黒色腫上の細胞表面分子であり、ＣＲ０１１はＣＧ５６９７２を発現する細胞とともにインキュベーションした後は内部移行したので、我々は、タンパク質合成阻害剤（サポリン）結合体化第２抗体と組み合わせた場合にＣＲ０１１が癌細胞の成長を阻害するかどうかを調べた。ＣＲ０１１は、ＣＧ５６９７２を発現する癌細胞の成長を特異的に阻害することができることを我々の結果はしめした（データは示さず）。よって、高度に安定であるが、細胞内プロテアーゼにより分解されるバリン−シトルリン（ｖｃ）リンカーを用いて、ＣＲ０１１を細胞毒性医薬のモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に直接結合した。得られた抗体−医薬結合体をＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥと命名した。
【０４３８】
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥが脳腫瘍細胞の成長を特異的に阻害するのかどうかを調べるために、クローン形成アッセイを実施して、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ処置後の細胞生存度を評価した。図１６と表５４に示されるように、ＣＧ５６９７２を発現する細胞は、ＣＲ０１１−ｖｖＭＭＡＥにより誘導した成長阻害に対しては感受性があったが、この抗原を十分に発現しない（３μｇ／ｍＬ未満のｖｃＭＭＡＥの濃度）細胞はそうではなかったこと（ＳＦ−２６８とＬＯＸＩＭＶＩを参照）を我々の結果は示した。注目すべきことに、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥは、ＸＦ−４９８、ＳＮＢ−７８、Ｕ−１１８−ＭＧおよびＳＦ−５３９の各細胞上で、およそ２１５、４５０、１２５０および１０５０ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０を有した（図１６と表５４）。これらの実験において、ＩＣ５０はＦＡＣＳ分析で測定された細胞表面密度と相関した。対照的に、結合体化コントロールヒトＩｇＧ２抗体−ｖｃＭＭＡＥは、３μｇ／ｍＬまでの濃度で調べられたいずれの細胞系（表５４）の成長も１．５または４．５μｇ／ｍＬを超えるＩＣ５０で阻害することはできなかった（表５４）。
表５４．ＲＴＱ  ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、およびＣＲ０１１−ｍＡｂによるヒト癌細胞系の成長のインビトロ阻害
【０４３９】
【表５４】
2014003986.tif 000162
ａＣＲ０１１ｖｃＭＭＡＥ（ｍＡｂ１．１５）：ＣＴ値は材料と方法に記載のようにＲＴＱ  ＰＣＲにより決定した。幾何平均比（ＧＭＲ）はフローサイトメトリー分析により決定した。抗体−医薬細胞毒性（ＡＤＣ）または細胞死滅は記載のようにクローン形成アッセイにより決定した。ｂＩＣ５０値は、三連ウエルで実施された各実験で代表的なクローン形成アッセイの平均とＳＤである。
【０４４０】
結論：
これらのデータは、ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥが、星細胞腫／神経膠芽腫およびそれらの転移ならびに髄芽腫と神経外胚葉起源の脳腫瘍の治療に非常に強力で選択的な物質であることを示す。ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥは黒色腫の脳への転移や新生物性髄膜炎等の他の脳新生物の治療にも有用でありうる。
【０４４１】
（実施例２８：ＣＲ０１１に由来する改変抗体）
本研究のＣＲ０１１  ｂｉ−ｓｃＦｖ（図１７を参照）は細胞毒性ヒトＴリンパ球上のＴ細胞レセプターのＣＤ３エピトープに結合し、同時にＧＰＮＭＢを発現する異常細胞を標的とするように設計され、異常細胞の溶解または破壊を容易にする最終結果をもたらす。
【０４４２】
ｍＡｂ  ＣＲ０１１（クローン１．１５）のＶＬとＶＨ領域が下記の３種類のＣＲ０１１系改変抗体の構築に用いられた：
（１）ＣＲ０１１一本鎖抗体（ＣＲ０１１  ｓｃＦｖ）
（２）ＣＲ０１１×抗ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（ｂｉ−ｓｃＦｖ）リンカーセットＬ４−Ｌ２−Ｌ４
（３）ＣＲ０１１×抗ＣＤ３二重特異性一本鎖抗体（ｂｉ−ｓｃＦｖ）リンカーセットＬ４−Ｌ４−Ｌ４
ＣＲ０１１  ｓｃＦｖタンパク質の成分は、シグナルペプチド−ＶＬ（ＣＲ０１１）−リンカー４−ＶＨ（ＣＲ０１１）−フラグタグであった。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（リンカーセットＬ４−Ｌ２−Ｌ４）タンパク質の成分は、シグナルペプチド−ＶＬ（ＣＲ０１１）−リンカー４−ＶＨ（ＣＲ０１１）−リンカー２−ＶＨ（抗ＣＤ３）−リンカー４−ＶＬ（抗ＣＤ３）−フラグタグであった。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（リンカーセットＬ４−Ｌ４−Ｌ４）タンパク質の成分は、シグナルペプチド−ＶＬ（ＣＲ０１１）−リンカー４−ＶＨ（ＣＲ０１１）−リンカー４−ＶＨ（抗ＣＤ３）−リンカー４−ＶＬ（抗ＣＤ３）−フラグタグであった。
【０４４３】
上で概略した多様なＤＮＡ成分を用いて３種類のＣＲ０１１改変抗体産物を作った。ＤＮＡ成分はＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎにより合成され、市販のプラスミドベクターに当業者の精通した方法によってクローニングした。次に、これらのプラスミドをＰＣＲに使用して、上記の３例で示した成分を組み合わせて発現ベクター用改変抗体挿入断片を作った。下記の本発明を実施する宿主発現系の例において、ＣＲ０１１発現ベクターのためにＣＨＯＫ１哺乳類細胞を使用したが、発現はこれらの細胞に限定されない；本発明のＣＲ０１１改変抗体は、ｐＥＴベクター、誘導ベクターおよび構成的ベクター等の、しかしこれらに限定されない他のベクター、システムおよび細胞を用いて発現できることが当業者により理解され、宿主として、大腸菌、バチルス種、酵母、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたは昆虫細胞が挙げられよう。他の発現宿主として、多様な植物種やヤギ等のトランスジェニック動物も挙げることができる。
【０４４４】
ＳＰ（シグナルペプチド）：分泌される産物を発現するためにシグナルペプチドを我々の構築物に組み込んだ。ＣＨＯ細胞からの発現に利用されたシグナルペプチドは、免疫グロブリン軽鎖リーダーペプチド（Ｊｉｒｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）またはＣＲ００２抗体（ＣｕｒａＧｅｎ）から得た。
【０４４５】
ｂｉ−ｓｃＦｖ成分の順番：抗体可変領域の順番は両ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物中に次の通り固定した：ＶＬＩ−Ｌ−ＶＨＩ−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ２。４Ｖ領域のそれぞれはリンカーセグメントＬにより連結した。ＶＬ１とＶＨ１は、ＣＲ０１１の免疫グロブリンの軽鎖と重鎖のそれぞれの可変領域を表し、ＶＨ２とＶＬ２は、両ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物に用いられた抗ＣＤ３抗体の免疫グロブリンの重鎖と軽鎖のそれぞれの可変領域を表す。Ｖ領域の他の順番は、当業者により認識されるように２つのｓｃＦｖ成分のために使うこともでき、それらの産物の生物活性を評価した。
【０４４６】
タグ：ＣＲ０１１改変抗体のＣ末端に８アミノ酸のフラグタグを用いて産物の検出と精製を容易にした（Ｈｉｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。
【０４４７】
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ：ｂｉ−ｓｃＦｖ構築物を作るために用いられた抗ＣＤ３抗体のＶＬとＶＨ成分の配列は、ＮＣＢＩデータベースで受託番号ＣＡＥ８５１４８（Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）に見られるだろう。
【０４４８】
構築物に用いられるリンカー：２つのモノマーｓｃＦｖ成分をＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）中で連結するＬ２（５アミノ酸の短いリンカー）の配列はＧ４Ｓ（Ｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）である。Ｌ４は、２０５Ｃリンカー（Ｄｅｎｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）に基づく２５アミノ酸のリンカー（ＬＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＬ（配列番号３４４））であり、ＣＲ０１１  ｂｉ−ｓｃＦｖ種の両方に用いられ、ＣＲ０１１  ＶＬおよびＶＨと、抗ＣＤ３  ＶＨおよびＶＬとを連結する。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）の場合、Ｌ４は２成分ｓｃＦｖ成分を連結するためにも用いられる。ＣＲ０１１  ｓｃＦｖについては、Ｌ４リンカーが２つの可変領域の連結のために用いられた。
１．ＣＲ０１１  ｓｃＦｖおよびＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ種の発現用ＤＮＡプラスミド構築物
ＣＲ０１１  ｓｃＦｖフラグタグ：ＣＲ０１１  ｓｃＦｖの発現構築物を生じさせるＰＣＲ増幅産物は、製造業者の指示通りにＦ１／Ｒ１プライマーを用いた後、Ｆ１ネステッド／Ｒ１プライマー対（表５５）とＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｃａｔ＃６００３２２）を用いたネステッドＰＣＲにより合成ＤＮＡ鋳型（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ）から作成した。ＣＲ０１１  ｓｃＦｖカセットをコードするＳａｌ  Ｉ／ＥｃｏＲＩ  ＰＣＲ断片は、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ｃａｔ＃ＬＫ１１０２５）を用いてｐＣＴＮベクター（ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、哺乳類用発現ベクター）の対応する制限部位にクローニングした。
表５５
【０４４９】
【表５５】
2014003986.tif 000163
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４）リンカーセットフラグタグ：（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４）リンカーセットを有するＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖに関するＰＣＲ増幅産物は、製造業者の指示通りにＦ２／Ｒ２プライマーを用いた後、Ｆ２ネステッド／Ｒ２プライマー対（オリゴヌクレオチドの配列については表５５を参照されたい）とＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｃａｔ＃６００３２２）を用いたネステッドＰＣＲにより合成ＤＮＡ鋳型（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ）から作成した。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４）ｂｉ−ｓｃＦｖをコードする配列を有するＳａｌ  Ｉ／ＥｃｏＲＩ  ＰＣＲ断片は、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ  ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ｃａｔ＃ＬＫ１１０２５）を用いてｐＣＴＮベクターの対応する制限部位にクローニングした。
【０４５０】
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４）リンカーセットフラグタグ：（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４）リンカーセットを有するＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖに関するＰＣＲ増幅産物は、製造業者の指示通りにＦ３／Ｒ３プライマーを用いた後、Ｆ３ネステッド／Ｒ３プライマー対（表５５）とＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｃａｔ＃６００３２２）を用いたネステッドＰＣＲにより合成ＤＮＡ鋳型（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ）から作成した。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖをコードする配列を有するＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ
ＰＣＲ断片は、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ｃａｔ＃ＬＫ１１０２５）を用いてｐＥＥ１４．４ＦＬ２発現ベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  ｐｌｃ、２２８  Ｂａｔｈ  Ｒｏａｄ、Ｓｌｏｕｇｈ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ  ＳＬｌ  ４Ｄｘ、ＵＫ）の対応する制限部位にクローニングした。
【０４５１】
上記の３種類の発現構築物挿入断片のＤＮＡ配列は関連ＤＮＡ産物の両ストランドの配列決定により確認した。
２．ＣＨＯＫ１細胞におけるＣＲ０１１改変抗体のタンパク質産生
接着性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫ１）細胞（ＡＴＣＣ  ｃａｔａｌｏｇ＃ＣＣＬ−６１）を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ、ｃａｔ＃１００１０６）、ＧＳサプリメント（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃  ５８６７２−１００Ｍ）および５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１５７５００７８）を補ったＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１０５６４−０１１）にて成長させた。
【０４５２】
ＣＨＯＫｌ細胞に、ＦｕＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ＃１８１５０７５）を製造業者の指示にしたがってインファクトした。発現と分泌はトランスフェクションの約４８時間後に実施されたウエスタンブロットにより確認した。分泌された安定なＣＲ０１１
ｓｃＦｖおよびＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）系の選択は選択培地Ａ（表５６）中で実施した一方で、分泌された安定なＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖ（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）系は選択培地Ｂ（表５７）中で実施した。
【０４５３】
表５６
【０４５４】
【表５６】
2014003986.tif 000164
表５７
【０４５５】
【表５７】
2014003986.tif 000165
いずれの場合も、分泌産物であるＣＲ０１１  ｓｃＦｖおよびＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ  ＣＨＯＫｌの９６クローンのうち８クローンを拡大させ、保存した。いずれの場合も生成物を分泌する最も良い安定なクローンを、振盪フラスコ内で選択培地Ｃ（表５８）を用いて３７℃で５％ＣＯ２での懸濁培養に順応させた。ＣＲ０１１ｓｃＦｖとＣＲ０１１×ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖに関するタンパク質の産生は選択培地Ｄ（表５９）の４Ｌ中、３０℃で５％ＣＯ２にて実施した。
【０４５６】
表５８
【０４５７】
【表５８】
2014003986.tif 000166
表５９
【０４５８】
【表５９】
2014003986.tif 000167
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ  ＣＨＯＫｌの２００クローンのうちわずかに１クローンのみが分泌産物を産生することがわかった：このクローンを拡大させ、これを保存した。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）クローンに対するタンパク質の産生は、セルファクトリー装置（Ｎｕｎｃ，ｃａｔ＃１６４３２７）を用いて、選択培地Ｂ（表５７）、１ｍＭ酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ｂ５８８７）中、３７℃で１０％ＣＯ２にて実施した。
３．ＣＲ０１１改変抗体のタンパク質精製
ＣＲ０１１  ｓｃＦｖフラグとＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖフラグに関するタンパク質精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーの３工程で達成された。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖフラグタンパク質の精製には、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いた。
【０４５９】
アフィニティークロマトグラフィーは、ＢｉｏＣＡＤ７００Ｅ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃Ａ２２２０−２５ｍＬ）を製造業者の指示にしたがって使用して実施した。イオン交換クロマトグラフィーは、平衡緩衝液として２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）および０〜１ＭのＮａＣｌのグラジエント溶出を用いるＭｏｎｏＱ  ５／５０ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｃａｔ＃１７−５１６６−０１）により実施した。サイズ排除クロマトグラフィーは、ＢｉｏＣＡＤ７００Ｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）液体クロマトグラフィー装置でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５／１０／３００ＧＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｃａｔ＃１７−５１７４−０１）を製造業者のプロトコールにしたがって実施した。
【０４６０】
１Ｌの馴化ＣＨＯＫ１培地からの適当な収量は下記の通りである：
（１）ＣＲ０１１  ｓｃＦｖ：  １．０ｍｇ
（２）ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ：  ０．５ｍｇ
（３）ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ：  １．５ｍｇ
精製タンパク質のＮ末端アミノ酸配列は、エドマン分解により当業者に公知の方法を用いて決定した。最初の５アミノ酸の配列はいずれの場合（ＣＲ０１１  ＶＬタンパク質の成熟Ｎ末端）もＥＩＶＭＴであり、シグナルペプチドによる正確なプロセシングが起こって、予想された配列と大きさの可溶性分泌産物が得られたことを示す。
【０４６１】
３種類のＣＲ０１１改変産物のＤＮＡとアミノ酸配列を以下に示す。
ＣＲ０１１  ｓｃＦｖ−（ＶＬ−Ｌ４−ＶＨ）フラグの配列番号。ヒトカッパ軽鎖のシグナルペプチドはＫａｂａｔ等  ４５ＣＬＬ−ＣＬ）に記載されたように用いた。Ｃ末端に含まれるＦＬＡＧタグが存在した。Ｋｏｚａｋ配列ＣＣＡＣＣは５’ＰＣＲプライマーに含まれた。
【０４６２】
【化１０２】
2014003986.tif 000168
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ−の配列番号。ヒトカッパ軽鎖のシグナルペプチドはＫａｂａｔら  ４５ＣＬＬ−ＣＬ）に記載されたように用いた。Ｃ末端に含まれるＦＬＡＧタグが存在した。
【０４６３】
【化１０３】
2014003986.tif 000169
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ４−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ−の配列番号。ＣＲ００２のシグナルペプチドを用いた。Ｃ末端に含まれるＦＬＡＧタグが存在した。
【０４６４】
【化１０４】
2014003986.tif 000170
４．３種類のＣＲ０１１改変抗体のＥＬＩＳＡによる試験、フローサイトメトリーおよび細胞毒性の決定
ＥＬＩＳＡ：ＣＲ０１１改変抗体の精製組換えＧＰＮＭＢ（２μｇ／ｍＬ）への結合を、一晩４℃で被覆されたプレートを用いて測定した。次に、プレートをブロックし、洗浄した。ＣＲ０１１改変抗体の多様な希釈物をウエルに加えた。プレートを１時間インキュベートし、洗浄した。ＨＲＰ結合体化抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をウエルに１時間加え、洗浄し、反応物を、ＴＭＢ基質試薬を製造業者（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に記載されたように展開した。
【０４６５】
ＣＲ０１１  ｓｃＦｖとＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖのＧＰＮＭＢへの結合は図１８に示されるように最初にＥＬＩＳＡで確認した。プレートに、ＨｉｓとＶ５をタグとして付加したヒトＧＰＮＭＢタンパク質を塗布した。塗布されたプレートを、ＣＲ０１１×抗ＣＤ３  ｂｉ−ｓｃＦｖを含む上清か、または精製ＣＲ０１１  ｓｃＦｖモノマーを含む上清のいずれかとともにインキュベートした。組換えｍＡｂ（モノマーとダイマーの両方）の結合は、抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ結合ｍＡｂ
Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。図１８からわかるように、記載の両抗ＧＰＮＭＢ抗体種は組換えＧＰＮＭＢタンパク質に結合し、改変抗ＧＰＮＭＢ抗体の特異性と結合活性が、この例に記載された方法を用いて保存されたことを示している。
【０４６６】
フローサイトメトリー：ＣＲ０１１改変抗体の天然のタンパク質への結合はＦＡＣＳにより分析した。簡単に説明すると、ヒトＴ細胞とＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞をＣＲ０１１  ｓｃＦｖかＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ（５μｇ／試料／１００μｌ）のいずれかとともにインキュベートし、その後にマウス抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）とＰＥ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）による染色を行なった。１万の結果を集めて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて分析した。
【０４６７】
細胞表面に発現した天然のＧＰＮＭＢタンパク質へのＣＲ０１１  ｓｃＦｖとＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ産物の結合を確かめるために、ＧＰＮＭＢを自然に発現するＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞を用いた。ｂｉ−ｓｃＦｖのヒトＣＤ３分子への結合を確認するために、精製ヒトＴ細胞を使用した。陽性コントロールとして、天然ＰＥ結合体化抗ＣＤ３−ＰＥおよびＣＲ０１１  ｍＡｂを使用した。ＣＲ０１１  ｓｃＦｖの結合を、抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ  Ｍ２を用いて検出し、続いてＰＥ結合体化抗マウスＩｇＧによる染色を行なう一方、ＣＲ０１１  ｍＡｂ結合の検出のために、抗ヒトＩｇＧ−ＰＥを用いた。Ｔ細胞に結合したコントロール抗ＣＤ３  ｍＡｂおよびＳＫ−Ｍｅｌ−５腫瘍細胞に結合したコントロール抗ＧＰＮＭＢ  ｍＡｂを用いた。ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖのみがＴ細胞を染色した；予想されたようにＣＲ０１１  ｓｃＦｃｖモノマーはＣＤ３陽性Ｔ細胞に結合しなかった（図１９を参照）。ＣＲ０１１  ｓｃＦｖモノマーかＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖのいずれかによるＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞への結合は低いレベルで存在した（表１９）。
【０４６８】
細胞毒性：ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖがヒトＴリンパ球に関連ヒト腫瘍細胞を殺すように再指令する能力はフローサイトメトリーにより測定した。腫瘍細胞をＰＫＨ２緑色発光リンカーキット（Ｓｉｇｍａ）で標識し、洗浄した。精製Ｔ細胞は、精製ｂｉ−ｓｃＦｖの存在下または不存在下で、ＰＫＨ２標識腫瘍細胞とともにＯ／Ｎ培養した。ＧＰＮＭＢ陽性腫瘍細胞の死をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みにより測定した。
【０４６９】
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ産物がＧＰＮＭＢ陽性細胞のＴ細胞仲介死滅を高める能力を評価するために、細胞毒性試験を実施した。精製Ｔ細胞を、多様な量の精製ＣＲ０１１  ｓｃＦｖとＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ産物の存在下で、ＰＫＨ２標識ＳＫ−Ｍｅｌ−５（ＧＰＮＭＢ陽性）腫瘍細胞とともにＯ／Ｎ培養した。
【０４７０】
結論：
ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖは、Ｔリンパ球によるＳＫ−Ｍｅｌ−５腫瘍細胞の死滅を有意に高めた（図２０）。対照的に、単一特異的抗ＧＰＮＭＢ  ｓｖＦｖの付加はＳＫ−Ｍｅｌ−５腫瘍の死滅を高めなかった。さらに、腫瘍細胞を、ＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖとともに、Ｔリンパ球なしに培養した場合、細胞毒性は観察されなかった（図２０）。これらのデータはＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖが、Ｔ細胞とＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞との間に十分な橋渡しを提供して、細胞死を誘導すること、およびこの改変ＣＲ００１二重特異性抗体の両成分に生物活性があることを示す。したがって、本発明のＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖ改変抗体を、黒色腫、および存在するＧＰＮＭＢとＴ細胞の上方制御されたレベルが存在する場合の他の癌等の疾患を治療する治療薬として用いてよい。
【０４７１】
発光やクロム放出アッセイ等の細胞毒性分析の他の方法を用いて、腫瘍を治療する際のＣＲ０１１×抗ＣＤ３（Ｌ４−Ｌ２−Ｌ４リンカーセット）ｂｉ−ｓｃＦｖの有用性を示すことができる。他のリンカーを用いて、上記のＣＲ０１１×抗ＣＤ３（リンカーセットＬ４−Ｌ４−Ｌ４）分子におけるように２つのｓｃＦｖモノマー成分を連結することもよい。
【０４７２】
（実施例２９：ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの最適化生産プロセス）
ＣＲ０１１ＡＥは、プロテアーゼ切断性リンカーにより毒素オーリスタチンＥに結合体化させた抗ＧＰＮＭＢ（ＣＧ５６９７２）完全ヒト抗体ＣＲ０１１からなる抗体−医薬結合体である。抗体に対する毒素の比率は約４．０であるが、３．５〜４．２の範囲であってよい。ＣＲ０１１抗体はＩｇＧ２であるが、遊離のチオールを反応部位として用いて、１個の抗体分子あたり１２個までの毒素分子を付加することができる。
【０４７３】
マレイミドコアプロリル−バリン−シトルリン−モノメチル−オーリスタチンＥ（ｖｃＭＭＡＥ）の構造を図２１に示す。
【０４７４】
結合体化：ＶＣＭＭＡＥが付着したＣＲ０１１ｍＡｂからなる医薬−基質を作るプロセス。結合体化プロセスの概略を図２２に要約する。
【０４７５】
簡単に説明すれば、ＣＲ０１１完全ヒト抗体の結合体化プロセスは、１）ダイアフィルトレーションによる緩衝液の交換とスクロースの除去、２）ジスルヒド還元、３）ｖｃＭＭＡＥへの結合体化、そして最後に、４）ダイアフィルトレーションによる結合体化ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥの精製という４工程からなる。工程全体にわたって幾つかのアッセイ、すなわち、エルマンのアッセイおよびタンパク質濃度の決定等の工程内アッセイが存在する。プロセスの終わりに、医薬物質、すなわち結合体は、抗体に対する医薬の比率、遊離医薬の含量およびタンパク質濃度に関して分析する。
【０４７６】
原体抗体のダイアフィルトレーション：リン酸緩衝液ｐＨ７−１０％スクロースに最初に処方した原体抗体は緩衝液を結合体化緩衝液（ホウ酸塩、ｐＨ９．０−ＮａＣｌ）になるまでダイアフィルトレーションによって１０ダイア体積にわたって交換した。ダイアフィルトレーションの終わりに、ＣＲ０１１をおよそ５．５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、１．２および０．２２μｍからなる２フィルターのセットによりろ過した。スクロースは還元に干渉するので緩衝液の交換は必要である。さらに、高いｐＨはＣＲ０１１の溶解性を高める。
【０４７７】
ＣＲ０１１還元−概論：ＣＲ０１１はＩｇＧ２アイソタイプ産物として作られ、ヒンジ部分に６ジスルヒド結合を含む。これらのジスルヒドは温和な条件下で還元されて１２システイン残基を生じる。したがって、１抗体あたり最大１２個のｖｃＭＭＡＥ医薬分子を付加することができる。しかし、このプロセスに関して、その目的は平均４個のｖｃＭＭＡＥ分子を有する結合体を作ることにあるので、原体抗体は部分的に還元されるだけである。その理由は二通りある。第一は、ＭＭＡＥに関連する潜在的な全身毒性を減少させることにより治療濃度域を広げるためである。第二に、疎水性医薬により付与される非常に低い溶解性のために、低い凝集で完全に充填された結合体を作ることは困難であり、ときには不可能であるためである。
【０４７８】
プロセス：トリス−（カルボキシエチル）−ホスフィンまたはＴＣＥＰを、９０ＲＰＭに設定した攪拌器を装備したジャケット付き反応器中でＣＲ０１１に対する４：１のモル比（ＴＣＥＰ：ｍＡｂ）で、およそ５．５ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた。反応を１ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下、３時間、３７℃で進めた。最後に、エルマンのアッセイを用いて遊離チオールの量を決定した。典型的に、それは１抗体あたり４．２チオールであった。次に、反応器を４℃に冷却した。
【０４７９】
ＣＲ０１１結合体化−概説：ＴＣＥＰは還元中、完全に消費されなかった。残ったＴＣＥＰはｖｃＭＭＡＥと反応することができた。しかし、この偽の副反応は、結合体化反応と比較して遅いものであり、過剰のｖｃＭＭＡＥを加えることにより軽減することができる。ＤＴＴに比較してＴＣＥＰの利点は、残った還元剤の除去を必要としないことである。
【０４８０】
プロセス：ｖｃＭＭＡＥをＤＭＳＯに溶解し、２０％モル過剰で還元ＣＲ０１１ｍＡｂに加えた。反応物を１時間進めた。ＤＭＳＯの最終濃度は４％（ｖ／ｖ）である。ＤＭＳＯはこのプロセスで２つの目的を演じた。それは医薬を可溶化するために必要とされ、また結合体を可溶化することにも役立つ。結合体化の最後に、Ｎ−アセチルシステインを加えて未反応の医薬をクエンチした。
【０４８１】
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ精製：反応器の温度を室温とした。４０％のスクロース保存溶液を用いて最終スクロース濃度を１０％（ｗ／ｖ）に調節した後、３００ｍＭヒスチジンＨＣｌ（ｐＨ５．０）緩衝液を用いて最終的にｐＨ６．０とするｐＨ調節を行なった。次に、１０ダイア体積を用いて、２０ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０−１０％スクロース（ｗ／ｖ）緩衝液へのダイアフィルトレーションにより、結合体を精製した。ダイアフィルトレーションの終わりに、結合体をおよそ７ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、１．２、０．４５および最終的に０．２２μｍのフィルターからなる３フィルターのセットによりろ過した。
【０４８２】
ＣＲ０１１−ｖｃＭＭＡＥ形成：結合体を、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０２％の最終濃度まで加え、処方緩衝液（２０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）、１０％スクロース、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて６ｍｇ／ｍＬ（±１０％）に希釈することにより処方した。次に、結合体を、２ロット以上が作られる場合、プールするまで（ステージングタイムとしても知られる）、４℃で保存した。プール後、最終的な濃度を５．０ｍｇ／ｍＬ（±５％）に調節し、医薬物質を冷凍保存した。
１．前結合体化ＵＦ／ＤＦ：スクロースの除去
ＵＦ／ＤＦ中のスクロースの除去速度をエルマンアッセイによりモニターし、かつ１Ａｂあたりの最大ＳＨ比を達成するために必要とされるダイア体積を予想するために、実験を行なった。
【０４８３】
ＣＲ０１１還元を妨げないレベルまでスクロースを除去するために、少なくとも６ダイア体積を実施することが望ましいことがわかった。構造安定性を保証するために、少なくとも１０ダイア体積をプロセス中に利用しなければならない。
２．結合体化反応における凝集に対するＤＭＳＯ比率の効果
結合体化反応において、（１）凝集および（２）医薬：Ａｂモル比（すなわち、結合体化の完全性）に対するＤＭＳＯの効果を決定するために実験を実施した。
【０４８４】
１２％ＤＭＳＯとの反応における凝集体の比率は１５％ＤＭＳＯ、４．４％および３．０％のそれぞれにおけるよりも低いことがわかった。１０％スクロースが処方緩衝液に含まれる場合、処方（ｐＨ９．０）緩衝液は（ｐＨ７．０）緩衝液に比較して凝集や収率に対して効果を持たなかった。１０％、８％、６％および４％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ反応物における凝集体の比率はそれぞれ２．７、１．７、１．０および０．５％であった。このことは、ＣＲ０１１とＣＲ０１１ＡＥは、高い比率のＤＭＳＯが存在する場合に凝集化を非常に受けやすかったことを示唆する。
【０４８５】
すべての４種類の結合体化反応は、すべての４反応が完了したことを示唆する４．０医薬／Ａｂの最終モル比をもたらした。結合体化反応におけるＤＭＳＯ比率の安全域は４〜６％である。これは１％以下の凝集レベルを生じると予想された。
５．ｖｃＭＭＡＥに対するＣＲ０１１の結合体化中の副反応の研究
実験を行なって、（１）不完全な結合体化と低医薬負荷をもたらす、マレイミド−医薬を未反応副産物に変換する副反応の程度と速度論を調べ、（２）副反応に影響を与える因子を決定し、（３）古いｖｃＭＭＡＥロット（ＳＧＤ１００６−０−０４）が新しいロット（ＳＧＤ１００６−０−０６）と比較して反応性が異なったかどうかを決定した。
【０４８６】
ｖｃＭＭＡＥを３０μＭの最終濃度で含む反応物（１００μｌ）を、（ｖｃＭＭＡＥに対して）２倍モル過剰のＴＣＥＰの存在下または不存在下のいずれかでホウ酸（ｐＨ９．０）緩衝液中でインキュベートした。反応物を０、２、７または１５分の時点で過剰なＮＡｃＣｙｓによりクエンチした。コントロールは、１５分の時点でクエンチしたリン酸（ｐＨ７．０）緩衝液中のｖｃＭＭＡＥからなった。それらのクロマトグラムを図２３に示す。
【０４８７】
医薬添加の１５分後のｐＨ７リン酸緩衝液と０分後のｐＨ９．０ホウ酸緩衝液中で、（ｒｔ＝９．０時間）を有する単一Ｃｙｓクエンチ生成物が形成される（ＡとＢを比較されたい）。ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）において、未反応副産物が時間依存的に形成される（ｒｔ＝９．２分）（Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）。（ＣＲ０１１結合体化条件におけるように）ホウ酸緩衝液中およびＴＣＥＰの存在下で、未反応性生成物の形成が触媒されて、わずか２分間のインキュベーション後にマレイミドのスクシンイミドへの＞９０％変換がもたらされた（Ｆ〜Ｉ）。古いｖｃＭＭＡＥロット（ＳＧＤ−１００６−０−０６）と新しいロット（ＳＧＤ−１００６−０−０４）の両方が、高いｐＨとＴＣＥＰに対して類似する反応性ならびに類似の反応論を示した。
【０４８８】
図２４は、未反応性生成物のスクシンイミジル−ＶＣＭＭＡＥとしてのＬＣ−ＭＳ同定を示す（ｒｔ＝９．２分、ｍ／ｚ＝１３１８）。図２５はＴＣＥＰの存在下または不存在下でのスクシンイミドの形成の相対的な速度論を示す。
【０４８９】
結論：
副生成物は、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）の代わりにｐＨ９で実施された結合体化の結果である。副生成物の形成はＴＣＥＰの存在下で大きき増強させられる。主要な安定副生成物はＬＣ−ＭＳによりスクシンイミジル−ｖｃＭＭＡＥと同定された。少数で安定性の低い副生成物は依然として同定されていない。ｖｃＭＭＡＥの両ロットは類似した挙動を示した。
６．ｖｃＭＭＡＥに対するＣＲ０１１の結合体化中の副反応の克服
大過剰の医薬を結合体化に提供することにより副反応が克服できるかどうかを調べるために実験を実施した。
【０４９０】
副反応を抑制する幾つかの方法が提案された：（１）低いｐＨ（例えば、９．０の代わりに８．５）での結合体化の実施（ＣＲ０１１の減少した溶解性による高いリスク）、（２）ＵＦ／ＤＦによる過剰なＴＣＥＰの除去（実用的ではない）、（３）前もって加えられた過剰なＶＣＭＭＡＥの上昇（実用的）。
【０４９１】
前もって緩衝液を５０ｍＭホウ酸−５０ｍＭ  ＮａＣｌに交換した１００ｍｇのＣＲ０１１をＴＣＥＰで還元して１Ａｂあたり４．３５遊離チオールを生成した。反応物を二等分した。最初の半分の５０ｍｇでは、１チオールあたり１医薬の比率に基づいて１０％過剰のＶＣＭＭＡＥを加えた。二番目の半分では、２０％過剰を用いた。１０ｍＭヒスチジンｐＨ６／１０％スクロース溶液へと交換するＵＦ／ＤＦにより結合体を精製した。その結果を表６０に要約する。
【０４９２】
表６０．１チオールあたりの１医薬の比率に基づき多様な過剰量のｖｃＭＭＡＥを用いたＣＲ０１１−ＶＣＭＭＡＥ結合体の調製。Ａｂに対する医薬の比率はＲＰ  ＨＰＬＣにより決定した。
【０４９３】
【表６０】
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結論
２０％過剰に対する１０％過剰のｖｃＭＭＡＥの使用を１００ｍｇ結合体化において比較した。さらに過剰のｖｃＭＭＡＥは予測された値にさらに近いＡｂに対する医薬の比を与えたために、最適であると決定された。
【０４９４】
等価物
上述の説明および実施例は、抗体の一定の好ましい実施態様を詳細に示し、本発明の意図する最良の態様を説明する。しかし、上述のものが本文中にどのように詳細に説明されようと、ここに記載の抗体の製造方法および使用方法は多くの方法で実施しされ得るものであって、本発明は添付の請求の範囲とその等価物にしたがって理解されなければならない。前記の書かれた明細書は当業者がここに記載の明細書を実施することを可能とするには十分であると見なされる。
(配列表）
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
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【数２３】
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【数２４】
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【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
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【数３１】
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【数３２】
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【数３３】
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【数３４】
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【数３５】
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【数３６】
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【数３７】
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【数３８】
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【数３９】
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【数４０】
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【数４１】
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【数４２】
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【数４３】
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【数４４】
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【数４５】
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【数４６】
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【数４７】
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【数４８】
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【数４９】
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【数５０】
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【数５１】
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【数５２】
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【数５３】
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【数５４】
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【数５５】
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【数５６】
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【数５７】
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【数５８】
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【数５９】
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【数６０】
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【数６１】
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【数６２】
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【数６３】
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【数６４】
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【数６５】
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【数６６】
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【数６７】
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【数６８】
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【数６９】
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【数７０】
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【数７１】
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【数７２】
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【数７３】
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【数７４】
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【数７５】
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【数７６】
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【数７７】
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【数７８】
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【数７９】
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【数８０】
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【数８１】
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【数８２】
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【数８３】
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【数８４】
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【数８５】
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【数８６】
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【数８７】
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【数８８】
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【数８９】
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【数９０】
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【数９１】
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【数９２】
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【数９３】
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【数９４】
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【数９５】
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【数９６】
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【数９７】
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【数９８】
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【数９９】
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【数１００】
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【数１０１】
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【数１０２】
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【数１０３】
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【数１０４】
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【数１０５】
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【数１０６】
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【数１０７】
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【数１０８】
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【数１０９】
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【数１１０】
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【数１１１】
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【数１１２】
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【数１１３】
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【数１１４】
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【数１１５】
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【数１１６】
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【数１１７】
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【数１１８】
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【数１１９】
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【数１２０】
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【数１２１】
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【数１２２】
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【数１２３】
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【数１２４】
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【数１２５】
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【数１２６】
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【数１２７】
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【数１２８】
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【数１２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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