(57)【要約】【課題】成育が進んだ蛹は、菌が感染せずに羽化してしまうが、羽化の発生は、歩留まりだけの問題ではなく、蛾尿による環境悪化の問題があることから、昆虫のみに生命活動の抑制を働かせることで菌が昆虫に感染しやすい状態とし、成育が進んだ蛹であっても、羽化を抑制して冬虫夏草の感染率を向上させることができる冬虫夏草の培養方法を提供すること。【解決手段】本発明の冬虫夏草の培養方法は、昆虫を寄主とし、冬虫夏草の菌を、昆虫に植菌した後に、昆虫に対して炭酸ガスを作用させることを特徴とする。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、
前記冬虫夏草の菌を、前記昆虫に植菌した後に、前記昆虫に対して炭酸ガスを作用させることを特徴とする冬虫夏草の培養方法。
【請求項２】
前記昆虫として蚕を用いたことを特徴とする請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項３】
前記炭酸ガスを、前記昆虫が麻酔状態となる濃度としたことを特徴とする請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項４】
前記蚕が蛹期であり、炭酸ガス濃度を４３％以上としたことを特徴とする請求項２に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項５】
植菌した後の前記昆虫を容器内に入れ、前記容器内に前記炭酸ガスを導入した後に前記容器を密閉することを特徴とする請求項１から請求項４に記載の冬虫夏草の培養方法。
【請求項６】
請求項１から請求項４に記載の冬虫夏草の培養方法に用いる培養装置であって、
植菌した後の前記昆虫を入れる麻酔室と、
前記麻酔室に前記炭酸ガスを導入するガス発生源と
を備え、
前記麻酔室には、上部に空気導出孔を設けたことを特徴とする培養装置。
【請求項７】
前記麻酔室には、前記ガス発生源から連続的に前記炭酸ガスを導入することを特徴とする請求項６に記載の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冬虫夏草の培養方法及びそれに用いる培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
冬虫夏草（コルディセプス属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｐｐ．）とペキロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．））は、昆虫寄生真菌類である。
冬虫夏草とその生産物は、よい科学的根拠が乏しいながらも、糖尿病、心血管疾患や癌や代謝病を防ぎ、そして／または、それらの疾病を遅らせるのに有益であると主張される栄養剤として広く利用されている（非特許文献１）。
サナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）の水抽出物によるインシュリン抵抗性の減少とインシュリン分泌物の増加効果に関するＩｎ  ｖｉｖｏ効果（非特許文献２）、Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓのプルテオグルカン複合物による抗腫瘍活性（非特許文献３）、チベット産冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）の熱水抽出による抗高脂血症効果（非特許文献４）などは、科学的根拠があり注目に値する。
非特許文献５はチベット産冬虫夏草抽出物がＤ−ガラクトースを投与されたマウスの学習・記憶能力を向上させる可能性のあることを示している。
非特許文献６は、カイコを特異的に宿主として昆虫体内で培養されたハナサナギタケ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｕｉｐｅｓ）の熱水抽出物が、高齢化マウスの脳機能低下を防ぐ可能性のあることを示している。
しかしながら、冬虫夏草（コルディセプス属とペキロマイセス属）は、既に自然界での採取量は極めて少なく、希少資源である。また、チベット産冬虫夏草の採取による自然破壊は、社会問題となっている。従って、冬虫夏草の人工栽培が注目されている。
我が国では、島根県津和野町（旧日原町）において、カイコを特異的に宿主とした昆虫体内での冬虫夏草（サナギタケ、ハナサナギタケ及びコナサナギタケ）の培養方法（特許文献１）が確立している。同地域では、津和野の培養方法による冬虫夏草に、桑葉で飼育したカイコを用いており、津和野の培養方法による冬虫夏草に関する新たな生理活性機能を見い出すための研究も平行して進められている（非特許文献７）。
津和野の培養方法による冬虫夏草は、生きたカイコの蛹に植菌を行って栽培することを特徴としている。カイコ体内で確実に菌核を作った後に子実体が形成されるため、臭みが少ないだけでなく、高い生理活性機能も期待されている。
植菌は、カイコが上蔟から羽化（通常、上蔟日から１６日程度）した蛹に行わなければならない。しかし、上蔟から７日までは、蛹の体表面は柔らかく植菌過程で傷つくおそれがある。更に、たとえ７日から１６日前であっても、成育が進んだ蛹は感染することなく羽化してしまう。よって、植菌期間は非常に限られている。
島根県津和野町では、高齢化に伴う同地域内での養蚕農家の減少から、２０１０年に他地域から２０万頭の蛹を搬入したが、その大半が感染することなく羽化してしまい、冬虫夏草の生産に大きな打撃を受けた。そして、その後の研究で、その原因が蛹の成育が進んだことであると分かった。
ところで、炭酸ガスを用いた麻酔は、動物に用いられる（特許文献２）他、魚に対しても用いられている（特許文献３、特許文献４）。
また、炭酸ガス麻酔は、研究現場において昆虫にも利用されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３５９３４２９号
【特許文献２】特許第２６２０１２１号
【特許文献３】特開２００７−１８６４７６号公報
【特許文献４】特開２００８−５４５５９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｒ．Ｒ．Ｍ．  （２００８）  Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  -  Ａ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｆｕｎｇａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ？  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ６９，  １４６９-１４９５
【非特許文献２】Ｃｈｏｉ、  Ｓ．  Ｂ．、  Ｐａｒｋ、  Ｃ．  Ｈ．、  Ｃｈｏｉ、  Ｍ．  Ｋ．、  Ｊｕｎ、  Ｄ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｐａｒｋ、  Ｓ．  （２００４）  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｍｉｌｉｔａｒｉｓ、  Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ、  ａｎｄ  Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｕｉｐｅｓ  ｉｎ  ９０％  ｐａｎｃｒｅａｔｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  ｒａｔｓ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、  ６８、  ２２５７-２２６４
【非特許文献３】Ｎａｋａｍｕｒａ、  Ｔ．、  Ｍａｔｓｕｇｏ、  Ｓ．、  Ｕｚｕｋａ、  Ｙ．、  Ｍａｔｓｕｏ、  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋａｗａｇｉｓｈｉ、  Ｈ．  （２００４）  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｃｅｌｉａ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｐｈｅｌｌｉｎｕｓ  ｌｉｎｔｅｕｓ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、  ６８、  ８６８-８７２
【非特許文献４】Ｋｏｈ、  Ｊ．−  Ｈ．、  Ｋｉｍ、  Ｊ．  −Ｍ．、  Ｃｈａｎｇ、  Ｕ．−  Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｕｈ、  Ｈ．−  Ｊ．  （２００３）  Ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｏｔ−ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｆｒｏｍ  ｍｙｃｅｌｉａ  ｏｆ  Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．、  ２６、  ８４−８７
【非特許文献５】Ｊｉ、  Ｄ．−Ｂ．、  Ｙｅ、  Ｊ．、  Ｌｉ、  Ｃ．−Ｌ．、  Ｗａｎｇ、  Ｙ．−Ｈ．、  Ｚｈａｏ、  Ｊ．  ａｎｄ  Ｃａｉ、  Ｓ．−Ｑ．  （２００９）  Ａｎｔｉａｇｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｅｘｔｒａｃｔ．  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．  Ｒｅｓ．、  ２３、  １１６-１２２
【非特許文献６】Ｔｓｕｓｈｉｍａ、  Ｍ．、  Ｙａｍａｍｏｔｏ  K．、  Ｇｏｒｙｏ、  Ｍ．、  Ｓｕｚｕｋｉ、  Ｆ．  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ、  Ｋ  （２０１０）  Ｈｏｔ−ｗａｔｅｒ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｏｆ  Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｕｉｐｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｉｌｉｗｏｒｍ  ｐｕｐａｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｒａｉｎ  ａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｉｃｏｌｏｇｙ．、  ７９−２、  ４５−５１
【非特許文献７】鈴木幸一（２００５）昆虫テクノロジーの総論―研究開発動向―Ｉｎ：昆虫テクノロジー研究とその産業利用、ｐｐ．３−１２、シーエムシー出版  東京
【非特許文献８】Ｂｏｏｒｍａｎ、  Ｊ．  （１９７５）  Ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｓｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｌａｂ  Ｐｒａｃｔ．、  ２４−２、  ９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献２の炭酸ガス麻酔は、屠殺処理する際に生鳥が暴れることを防止するものである。
また、特許文献３及び特許文献４にて提案されている活魚に対する炭酸ガス麻酔は、薬物による麻酔と同様に、暴れを防止して魚体の損傷や体力消耗を防止するために用いられており、食用の際の安全性や残存毒性の問題から薬物に代わるものとして用いている。
非特許文献８の場合にも、炭酸ガスを昆虫の動きを停止させるために用いている。
このように、炭酸ガス麻酔は、一般には動きを静止させるために用いられる。
津和野式冬虫夏草の培養によれば、昆虫は菌に対する生体防御機構が働き、冬虫夏草の菌は昆虫の生体防御機構に対する突破機構が働いており、麻酔作用が昆虫と菌との両者に作用しては感染率を向上させることはできない。
例えば、実験用の昆虫においては、炭酸ガス麻酔とともに冷蔵麻酔が用いられることがあるが、冷蔵麻酔によれば、昆虫とともに菌の活動も停止してしまい、菌の感染率を上げることはできない。
ところで、成育が進んだ蛹は、菌が感染せずに羽化してしまうが、羽化の発生は、歩留まりだけの問題ではなく、蛾尿による環境悪化の問題があることから、生育が進んだ蛹での感染の実現が強く望まれている。
【０００６】
そこで本発明は、成育が進んだ蛹であっても、羽化を抑制して冬虫夏草の大量安定生産を実現できることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１記載の本発明の冬虫夏草の培養方法は、昆虫を寄主とした冬虫夏草の培養方法であって、前記冬虫夏草の菌を、前記昆虫に植菌した後に、前記昆虫に対して炭酸ガスを作用させることを特徴とする。
請求項２記載の本発明は、請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法において、前記昆虫として蚕を用いたことを特徴とする。
請求項３記載の本発明は、請求項１に記載の冬虫夏草の培養方法において、前記炭酸ガスを、前記昆虫が麻酔状態となる濃度としたことを特徴とする。
請求項４記載の本発明は、請求項２に記載の冬虫夏草の培養方法において、前記蚕が蛹期であり、炭酸ガス濃度を４３％以上としたことを特徴とする。
請求項５記載の本発明は、請求項１から請求項４に記載の冬虫夏草の培養方法において、植菌した後の前記昆虫を容器内に入れ、前記容器内に前記炭酸ガスを導入した後に前記容器を密閉することを特徴とする。
請求項６記載の本発明の培養装置は、請求項１から請求項４に記載の冬虫夏草の培養方法に用いる培養装置であって、植菌した後の前記昆虫を入れる麻酔室と、前記麻酔室に前記炭酸ガスを導入するガス発生源とを備え、前記麻酔室には、上部に空気導出孔を設けたことを特徴とする。
請求項７記載の本発明は、請求項６に記載の培養装置において、前記麻酔室には、前記ガス発生源から連続的に前記炭酸ガスを導入することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、冬虫夏草の菌を、昆虫に植菌した後に、昆虫に対して炭酸ガスを作用させることで昆虫の生命活動が抑制され、菌が感染しやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施例による炭酸ガス麻酔による実験方法を示す図
【図２】同実施例による冷蔵麻酔による実験方法を示す図
【図３】同実施例による炭酸ガス麻酔による実験結果を示す図
【図４】同実施例による冷蔵麻酔による実験結果を示す図
【図５】同実施例による対照区と冷蔵麻酔区との羽化率の比較を示す図
【図６】同実施例による炭酸ガス麻酔による蛹の羽化への影響を示す図
【図７】同実施例による炭酸ガス麻酔日数による感染への影響を示す図
【図８】同実施例に用いた炭酸ガス麻酔装置の構成図
【図９】本発明の他の実施例による炭酸ガス麻酔装置の構成図
【図１０】本発明の更に他の実施例に用いた炭酸ガス麻酔装置の構成図
【図１１】同実施例による炭酸ガス麻酔による有効性についての実験結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下本発明の実施の形態による冬虫夏草の培養方法について説明する。
本発明による冬虫夏草は、中国において冬虫夏草と呼ばれるチベット産冬虫夏草に限らず、子嚢菌類のバッカクキン科などの昆虫にとりつく昆虫寄生菌であり、カメムシ目、チョウ目、コウチュウ目、ハチ目、バッタ目、トンボ目、ハエ目など、寄主昆虫も多岐にわたる。
しかし、本発明における冬虫夏草の培養方法は、生きた状態の昆虫に冬虫夏草の菌を植菌するものを対象とする。
植菌には、冬虫夏草の子実体に形成された子嚢胞子又は分生胞子を用いる他、菌糸体を用いることもできる。また植菌は、昆虫体内への直接接種の他、体表面への散布や、餌への散布でもよい。
【００１１】
本発明は、昆虫への植菌の後に、昆虫に対して炭酸ガス麻酔を用いることを特徴とするが、ここでの炭酸ガス麻酔は、炭酸ガスの作用によって、昆虫が仮死状態、入眠状態、麻痺状態に陥ることを意味し、何らかの生命活動の抑制が生じているものである。
後述するように、蚕の蛹にあっては、麻酔後において完全に覚醒して羽化する場合もあるが、例えば覚醒はしても、その後羽化に至らない場合もある。
すなわち、本発明における麻酔状態とは、寄主である昆虫に対して何らかの生命活動が抑制される状態をいい、炭酸ガスを作用させない場合と比較して、昆虫を冬虫夏草の菌に感染しやすい状態とするものである。
【００１２】
本発明の第１の実施の形態による冬虫夏草の培養方法は、冬虫夏草の菌を、昆虫に植菌した後に、昆虫に対して炭酸ガスを作用させるものである。本実施の形態によれば、炭酸ガスが作用することで昆虫の生命活動が抑制され、菌が感染しやすくなる。
【００１３】
本発明の第２の実施の形態は、第１の実施の形態による冬虫夏草の培養方法において、昆虫として蚕を用いたものである。本実施の形態によれば、蚕を寄主とする、ハナサナギタケ、コナサナギタケ、サナギタケ、ウスキサナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）において、特に生育の進んだ蛹に対して羽化を抑えて感染させることができる。
【００１４】
本発明の第３の実施の形態は、第１の実施の形態による冬虫夏草の培養方法において、炭酸ガスを、昆虫が麻酔状態となる濃度としたものである。本実施の形態によれば、昆虫を冬虫夏草の菌に感染しやすい状態とすることができる。
【００１５】
本発明の第４の実施の形態は、第２の実施の形態による冬虫夏草の培養方法において、蚕が蛹期であり、炭酸ガス濃度を４３％以上としたものである。本実施の形態によれば、蚕の蛹の外観上の活動が停止し、羽化直前の蛹であっても確実に感染させることができる。
【００１６】
本発明の第５の実施の形態は、第１から第４の実施の形態による冬虫夏草の培養方法において、植菌した後の昆虫を容器内に入れ、容器内に炭酸ガスを導入した後に容器を密閉するものである。本実施の形態によれば、炭酸ガスを連続供給しなくても昆虫の生命活動を抑制し、冬虫夏草の菌に感染しやすい状態とすることができる。
【００１７】
本発明の第６の実施の形態は、第１から第４の実施の形態による冬虫夏草の培養方法に用いる培養装置において、植菌した後の昆虫を入れる麻酔室と、麻酔室に炭酸ガスを導入するガス発生源とを備え、麻酔室には、上部に空気導出孔を設けたものである。本実施の形態によれば、麻酔室内の空気を導出して炭酸ガス雰囲気とすることができるとともに、圧力の上昇による昆虫への影響を無くすことができる。
【００１８】
本発明の第７の実施の形態は、第６の実施の形態による培養装置において、麻酔室には、ガス発生源から連続的に炭酸ガスを導入するものである。本実施の形態によれば、ガスバリアー性の低い材質の麻酔室であっても、確実に炭酸ガスを作用させることができる。
【実施例】
【００１９】
カイコ（春嶺×鐘月（しゅんれい×しょうげつ））は、４令まで人工飼料で育てられ、４令の後に桑葉で育てられた。
冬虫夏草の菌（コルディセプスミリタリス（ＮＢＲＣ  Ｎｏ．１００７４１））は（独立行政法人製品評価技術基盤機構）から購入した。
【００２０】
まず、炭酸ガス麻酔による実験方法について説明する。
図１に、炭酸ガス麻酔による実験方法を示す。
上蔟日の後８日目に繭から蛹を取り出した。１回の実験では、同じ日に眼点が発現した蛹を２００頭用いた。
眼点発現後５日間（図２の「１日後」から「５日後」まで）、毎日４０頭の蛹に植菌を行った。４０頭の内の２０頭を炭酸ガス麻酔装置に入れ、残りの２０頭を対照区とした。植菌は、蛹に注射器を用いて行った。
炭酸ガス麻酔装置内の蛹は、植菌の２日後に炭酸ガス麻酔装置から取り出し、感染確認は、眼点発現後１０日〜２５日に行った。その後は、対照区と同じ条件の下で行った。感染は、蛹の硬化によって判断し、植菌から２５日を越えても硬化しないものについては腐敗と判断した。
図１に示す方法で、６回の実験を行った。
【００２１】
次に、冷蔵麻酔による実験方法について説明する。
図２に、冷蔵麻酔による実験方法を示す。
上蔟日の後８日目に繭から蛹を取り出した。１回の実験では、同じ日に眼点が発現した蛹を２００頭用いた。
眼点発現後５日間（図２の「１日後」から「５日後」まで）、毎日４０頭の蛹に植菌を行った。４０頭の内の２０頭を冷蔵麻酔装置（５℃の冷蔵）に入れ、残りの２０頭を対照区とした。植菌は、蛹に注射器を用いて行った。
冷蔵麻酔装置内の蛹は、植菌の２日後に冷蔵麻酔装置から取り出し、感染確認は、眼点発現後１０日〜２５日に行った。その後は、対照区と同じ条件の下で行った。感染は、蛹の硬化によって判断し、植菌から２５日を越えても硬化しないものについては腐敗と判断した。
図２に示す方法で、３回の実験を行った。
また、３回の実験で羽化した蛹については、羽化日を確認した。
【００２２】
炭酸ガス麻酔による感染効果はＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｔｅｓｔを用い、冷蔵麻酔による感染効果はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を用い、冷蔵麻酔による羽化率はＫａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ  （ｆａｉｌｕｒｅ  ｒａｔｅ  ｐｌｏｔ）を用いた。Ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意差があるとした。
【００２３】
図３に、炭酸ガス麻酔による実験結果を示す。
蛹の成長が進むと、対照区に現れるように感染数は減少した（１日目に対して４日目でP＜  ０．００１、５日目でP＜０．０００１）。この減少のほとんどは羽化によるものであった。対照区の６グループ合計は６００頭であり、羽化が２８６頭であり腐敗が７頭であった。
これに対して、炭酸ガス麻酔区では、蛹の成長が進んだ後に植菌を行ったものもほとんどが感染している（１日目に対して４日目でＰ＝０．７８１７、５日目でＰ＝０．２４４１）。炭酸ガス麻酔区の６グループ合計は６００頭であり、羽化が１０頭であり腐敗が１５頭であった。
以上の結果より、炭酸ガス麻酔区では、眼点発現から日数が経過して蛹の成長が進んでも、感染率は低下しなかった。
【００２４】
図４に、冷蔵麻酔による実験結果を示す。
蛹の成長が進むと、対照区に現れるように感染数は減少した。この減少のほとんどは羽化によるものであった。対照区の３グループ合計は３００頭であり、羽化が１５８頭であり腐敗が９頭であった。
また、冷蔵麻酔区においても、対照区と同様に感染数は減少した。この減少のほとんどは羽化によるものであった。対照区の３グループ合計は３００頭であり、羽化が１４２頭であり腐敗が２１頭であった。
冷蔵麻酔区と対象区とを比較すると、１日目から５日目いずれにおいても、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定では両者の間に統計学上の有意差（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）は認められなかった。
【００２５】
図５に、対照区で羽化した１５８頭と冷蔵麻酔区で羽化した１４２頭について、羽化率を示す。対照区（平均７．０２５、標準誤差０．１０８）に対して冷蔵麻酔区（平均８．８４５、標準誤差０．１１８）では、明らかに羽化が遅れていることが分かる（P＜０．０００１）。
以上の結果より、冷蔵麻酔区では、対照区に対して羽化の発生時期に遅れは生じるが、感染率の向上は見られなかった。
【００２６】
図６は、炭酸ガス麻酔による蛹の羽化への影響を示す図であり、縦軸には羽化数を、横軸には炭酸ガス麻酔日数を示している。
炭酸ガス麻酔日数を１日、２日、３日と変えた場合の、それぞれ羽化を確認したものである。植菌は行っていない、各１０頭の蛹を用いた。
１日では、９頭が羽化したが、３日ではほとんどが羽化に至らなかった。確実に羽化を押さえるには長期間炭酸ガス環境下に置くことがよいが、蛹へのダメージを極力抑えることで腐敗を抑えることができることから、麻酔期間は、２日以下とすることが好ましい。なお、本実験では、炭酸ガス濃度は、高濃度ガス検知器（ＸＰ−３１４０  株式会社レックス）で測定し、８５％以上に設定した。炭酸ガス濃度を低くする場合には、麻酔期間が長期化しても、羽化数は増加した。
なお、本実験では、炭酸ガス濃度を８５％以上としたが、４３％以上で蛹の活動が停止し麻酔状態となることを確認している。
【００２７】
図７は、炭酸ガス麻酔日数を１日と２日とした場合の感染への影響を示す図であり、縦軸には感染数を、横軸には植菌日（眼点発生からの経過日数）を示している。
本実験では、各２０頭の蛹を用い、上蔟から１１日目に眼点が発現した蛹を用いた。
感染数は、炭酸ガス麻酔日数が１日の場合、対照区と比較すると向上したが、２日と比較すると劣った。
従って、麻酔期間は、２日とすることが好ましい。
【００２８】
次に、上記実施例に用いた炭酸ガス麻酔装置の構成について以下に説明する。
図８は、本実施例に用いた炭酸ガス麻酔装置の構成図である。
炭酸ガス麻酔装置は、炭酸ガス発生容器（ガス発生源）１と、植菌後の蛹２を炭酸ガス雰囲気中に露出させる麻酔容器（麻酔室）３とをビニールチューブ（連結管）４で接続し、ドライアイス５を炭酸ガス発生容器１に入れ、ドライアイス５から発生する炭酸ガスを麻酔容器３に連続供給した。
ドライアイス（株式会社大陸）は、１．５kg×２（３kgセット）／日を用いた。
【００２９】
炭酸ガス発生容器１には、１１Ｌの容器（２５０mm×３００mm×１５０mm）を用い、麻酔容器３には３５０Ｌの容器（４４０mm×７４０mm×３５０mm）を用いた。
炭酸ガス発生容器１内で炭酸ガスを発生させ、炭酸ガス発生容器１の下部から炭酸ガスを導出し、麻酔容器３の下部から炭酸ガスを供給した。確実に炭酸ガスを供給するために、炭酸ガス発生容器１と麻酔容器３とは、所定の高低差（８０ｃｍ）を付けるとともに、ドライアイス５による冷却の影響を避けるために、ビニールチューブ４を十分に長くして炭酸ガスを常温まで昇温して麻酔容器３に供給した。
麻酔容器３は、上蓋式とし、上蓋３ａには小孔（空気導出孔）３ｂを設けた。麻酔容器３を上蓋式とすることで、蛹２の出し入れ時の外部への炭酸ガスの流出影響を少なくした。また、上蓋３ａに小孔３ｂを設けることによって、窒素及び酸素を麻酔容器３から抜けやすくすることで、麻酔容器３の内圧が上昇することを防ぎ、圧力による影響を無くした。
【００３０】
次に、本発明の他の実施例による炭酸ガス麻酔装置の構成について以下に説明する。
図９は、本実施例に用いた炭酸ガス麻酔装置の構成図である。
本実施例では、炭酸ガス発生容器１に代えて炭酸ガスボンベ７を用いたものを示している。本実施例のように炭酸ガスの発生源として炭酸ガスボンベ７を用いることもでき、炭酸ガスボンベ７には、レギュレータ６を介してビニールチューブ４を接続する。
その他の構成は、先の実施例と同一構成であるので同一符号を付して説明を省略する。
【００３１】
次に、本発明の更に他の実施例による炭酸ガス麻酔装置の構成について以下に説明する。
図１０は、本実施例に用いた炭酸ガス麻酔装置の構成図である。
本実施例では、炭酸ガスボンベ７を用い、レギュレータ６から複数経路に分岐させ、それぞれの経路に、直列に麻酔容器３を併設している。最下流側の麻酔容器３には，上蓋３ａに小孔（空気導出孔）３ｂを形成している。各麻酔容器３同士は、上方位置を接続する連結管４と下方位置を接続する連結管４で連結している。上方位置を連結する連結管４は、麻酔容器３の両端付近に一対設け、下方位置を連結する連結管４も、麻酔容器３の両端付近に一対設けている。
濃度測定器８は、最下流側の麻酔容器３に設けている。
【００３２】
本実施例のように、複数の麻酔容器３を併設することで、それぞれの麻酔容器３を独立させることができ、蛹の出し入れ時の炭酸ガス濃度の低下を、開放する麻酔容器３だけにとどめ、他の麻酔容器３への影響を少なくすることができる。また、連結管４を麻酔容器３の上方位置に設けることで、麻酔容器３の上方空間に酸素が残留することを防止することができる。また、連結管４を麻酔容器３の下方位置にも設けることで、下流側に位置する麻酔容器３への炭酸ガスの供給速度を早くすることができる。
また、最下流の麻酔容器３に小孔３ｂを形成することで、上流から下流に向けた炭酸ガスの流れを促進することができる。更に、小孔３ｂは、上蓋３ａに形成するため、比重の重い炭酸ガスを麻酔容器３内に滞留させた状態で、酸素を排出することができる。
【００３３】
上記実施例では、植菌を行った直後（数時間以内）に、蛹を炭酸ガス麻酔装置に入れた場合を説明したが、植菌日から９日目で、生きている蛹に対して炭酸ガス麻酔の有効性について実験を行った。
図１１に結果を示す。
植菌から９日目で、未羽化状態で生きている蛹を炭酸ガス装置に入れ、炭酸ガス麻酔を行った。炭酸ガス麻酔期間は、２日間、３．５日間、５日間で行った。
２日間の麻酔では、１６頭は羽化したが、９頭は感染した。なお、総数に対して、羽化数と感染数の合計が少ないのは、羽化せずに腐敗したためであった。
なお、図１１には示していないが、比較例として、植菌日から９日目で、未羽化状態で生きている蛹２５頭に対して炭酸ガス麻酔を行わず放置したが、２５頭全てが羽化した。
従って、植菌から日数が経過しても、羽化前であれば炭酸ガス麻酔が有効に作用することが明らかとなった。
【００３４】
上記実施例では、炭酸ガスを連続して供給する場合を説明したが、麻酔容器３内が所定濃度の炭酸ガス濃度に達した後に、ビニールチューブ４からの導入を停止し、小孔（空気導出孔）３ｂを閉塞して、麻酔容器３を密閉してもよい。ただし、密閉容器３がガスバリアー機能を備えていない場合には、時間の経過とともに炭酸ガス濃度が低下するため、断続的に炭酸ガスを供給することが好ましい。
また、麻酔容器３に代えて、ビニール袋やナイロン袋を用いて炭酸ガスを封入してもよいが、この場合にもガスバリアー機能を備えていなければ、炭酸ガス濃度の低下に留意する必要がある。
【００３５】
全国に残存する養蚕農家からの蚕の蛹の供給を受けて冬虫夏草を培養するためには、搬送期間における蚕の生育を考慮しなければならない。冷蔵搬送によって生育を押さえることはできるが、大量の繭の搬送にあっては、十分な冷却効果を得ることができず、冷却効果を得るために少量ずつに小分けすると、莫大な搬送費用が発生してしまう。
また、生きた蚕での冬虫夏草の培養において、羽化の発生は、蛾尿による汚染対策を行わなければならず、臭気による作業環境の悪化も作業員にとっては大きな苦痛を伴う。
従って、本発明によって、生育の進んだ蛹の羽化発生を抑えられることは、生きた蚕による冬虫夏草の培養において極めて有効である。
今回の炭酸ガス麻酔により、今まで困難であった種類の冬虫夏草の培養が安定して行える可能性があり、また、蚕以外の昆虫への応用によって、今まで培養ができていなかった新たな冬虫夏草の培養が期待できる。
本実施例では、冬虫夏草の菌としてサナギタケを用いたが、サナギタケとは子実体の形態が異なるハナサナギタケやコナサナギタケを用いた蚕蛹への感染メカニズムは、ほぼ同じであることを既に確認しており、本発明はハナサナギタケやコナサナギタケをはじめとする他の冬虫夏草の菌に適用できる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、生きた昆虫を用いた冬虫夏草の培養方法に適している。
【符号の説明】
【００３７】
１  炭酸ガス発生容器（ガス発生源）
２  蛹
３  麻酔容器（麻酔室）
３ａ  上蓋
３ｂ  小孔（空気導出孔）
４  ビニールチューブ（連結管）
５  ドライアイス
６  レギュレータ
７  炭酸ガスボンベ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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