(57)【要約】      （修正有）【課題】食品中の１種又は複数のアリサイクロバチルス属の微生物を高感度且つ特異的に検出するための核酸、核酸の集合、支持体、アッセイキット、及び方法の提供。【解決手段】核酸は、特定の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、核酸。
【請求項２】
配列番号３１〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列番号１６〜３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸を２つ以上含む、核酸の集合。
【請求項６】
前記２つ以上の核酸が、２つ以上の異なる核酸を含む、請求項５に記載の集合。
【請求項７】
前記２つ以上の核酸が、
（ａ）配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１〜３４、４２〜４５、５３〜５７、６７、及び７１〜７２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第１の核酸、並びに
（ｂ）配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３５〜４１、４６〜５２、５８〜６６、６８〜７０、及び７３〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第２の核酸
を含み、前記２つ以上の核酸の各々が、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項５又は６に記載の集合。
【請求項８】
前記２つ以上の核酸が、
（ａ）配列番号１−２；
（ｂ）配列番号４−５；
（ｃ）配列番号７−８；
（ｄ）配列番号１０−１１；又は
（ｅ）配列番号１３−１４、
を含み、前記２つ以上の核酸の各々が、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項５又は６に記載の集合。
【請求項９】
前記２つ以上の核酸が、
（ａ）配列番号１６−１７；
（ｂ）配列番号１９−２０；
（ｃ）配列番号２２−２３；
（ｄ）配列番号２５−２６；又は
（ｅ）配列番号２８−２９
からなる、請求項５又は６に記載の集合。
【請求項１０】
前記２つ以上の核酸が、
（ａ）配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１〜３４、４２〜４５、５３〜５７、６７、及び７１〜７２からなる群から選択される第１の核酸、
（ｂ）配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３５〜４１、４６〜５２、５８〜６６、６８〜７０、及び７３〜７４からなる群から選択される第２の核酸、並びに
（ｃ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、及び３０からなる群から選択される第３の核酸
を含み、前記２つ以上の核酸の各々が、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項５又は６に記載の集合。
【請求項１１】
前記２つ以上の核酸が、
（ａ）配列番号１−３；
（ｂ）配列番号４−６；
（ｃ）配列番号７−９；
（ｄ）配列番号１０−１２；又は
（ｅ）配列番号１３−１５、
を含み、前記核酸の各々が、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、請求項５又は６に記載の集合。
【請求項１２】
前記２つ以上の核酸が、
（ａ）配列番号１６−１８；
（ｂ）配列番号１９−２１；
（ｃ）配列番号２２−２４；
（ｄ）配列番号２５−２７；又は
（ｅ）配列番号２８−３０
からなる、請求項５又は６に記載の集合。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸又は請求項５〜１２のいずれか一項に記載の核酸の集合が固定されている支持体。
【請求項１４】
検出可能な標識を更に含む、請求項１３に記載の支持体。
【請求項１５】
食品中の、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出する方法であって、
（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップと、
（ｂ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の核酸の集合、又は請求項１３若しくは１４に記載の支持体を、前記少なくとも１つの試験サンプルと、前記核酸と前記微生物核酸との複合体形成が可能な条件下で接触させるステップと、
（ｃ）前記複合体を検出するステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの試験サンプル中の前記複合体の存在を、微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の不在と比較するステップと
を含み、前記複合体の検出が、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在の指標となる、方法。
【請求項１６】
食品の腐敗を引き起こす１種又は複数の微生物の存在を検出するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウスからなる群から選択される１種又は複数の微生物の存在を検出するステップを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記食品が飲料である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記食品が果汁である、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［電子ファイルで提出された資料の参照による組み込み］
[0001]本明細書と同時に提出され、以下の通りに識別されるコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表を参照によりその全体を本明細書に組み込む：「７１６８９５ＳＴ２５．ＴＸＴ」と命名され、２０１４年５月２８日の日付がある１つの１３，７０１バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【０００２】
［発明の背景］
[0002]微生物（例えば、細菌）は、製造の間又は後に食品（例えば、果汁）の腐敗を引き起こす可能性がある。いくつかの微生物は、食品腐敗並びに例えば、不快臭、不快な味及び食品を食用として危険にすること、などいくつかの好ましくない影響のうち任意の１つ又は複数を引き起こす可能性がある。食品を腐敗させる微生物の存在を正確且つ迅速に検出できないことにより、食品腐敗の危険性が増加する可能性がある。食品の腐敗を引き起こす微生物の迅速且つ正確な検出にとっての障壁には、例えば、微生物を検出するのに使用される従来の細菌学的方法の所要時間の長さがある。これら従来の方法は、完了するのに平均１０〜１２日間かかる場合がある。正確な検出にとっての別の障壁には、例えば、食品を腐敗させない微生物のゲノム配列と比較して、食品を腐敗させるいくつかの微生物の類似性があり得る。
【０００３】
[0003]従って、食品の腐敗を引き起こす微生物を検出するための組成物及び方法を改善する必要性がある。
【０００４】
［発明の概要］
[0004]本発明の一実施形態は、配列番号１〜１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する核酸を提供する。
【０００５】
[0005]本発明の別の実施形態は、２つ以上の核酸を含む核酸の集合であって、各核酸が、配列番号１〜１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する、核酸の集合を提供する。
【０００６】
[0006]本発明のなお別の実施形態は、本発明の核酸又は核酸の集合が固定されている支持体を提供する。
【０００７】
[0007]本発明の別の実施形態は、食品中の、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出する方法であって、（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップと、（ｂ）本発明の核酸、核酸の集合、又は本明細書に記載される支持体のいずれかを、その核酸と微生物核酸との複合体形成が可能な条件下で、少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップと、（ｃ）複合体を検出するステップと、（ｄ）少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の存在を、微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の不在と比較するステップとを含み、複合体の検出が、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在の指標となる、方法を提供する。
【０００８】
[0008]本発明の好ましい実施形態は、食品中の、食品を腐敗させる１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出する方法であって、（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップと、（ｂ）本発明の核酸、核酸の集合、又は本明細書に記載される支持体のいずれかを、その核酸と微生物核酸との複合体形成が可能な条件下で、少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップと、（ｃ）複合体を検出するステップと、（ｄ）少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の存在を、微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の不在と比較するステップとを含み、複合体の検出が、食品を腐敗させる１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在の指標となる、方法を提供する。
【０００９】
［発明の詳細な説明］
[0009]本発明の一実施形態は、配列番号１〜１５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、３５ヌクレオチド以下の長さを有する核酸を提供する。本発明の一実施形態において、ヌクレオチド配列は、３５ヌクレオチド以下の長さまでの追加のヌクレオチドを含むことができる。この点で、本発明の一実施形態は、配列番号３１〜７４からなる群から選択され、３５ヌクレオチド以下の長さを有するヌクレオチド配列を提供する。本発明のなお別の実施形態において、核酸は、配列番号１６〜３０からなる群から選択され、３５ヌクレオチド以下の長さを有するヌクレオチド配列を含む。核酸は、３５ヌクレオチド以下の任意の適当な長さであることができる。例えば、核酸は、長さ３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、又は１５ヌクレオチド以下であることができる。本発明のなお別の実施形態において、核酸は、配列番号１〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなることができる。
【００１０】
[0010]一実施形態において、核酸は、単離又は精製されている。本発明の核酸は、有利には、食品中の１種又は複数の微生物の存在を検出するための、微生物核酸と特異的にハイブリダイズし得るフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを提供する。いくつかの実施形態において、プライマー及びプローブは、微生物の特定の属のうち複数の種の核酸と特異的にハイブリダイズする（以下「属特異的核酸」）。他の実施形態において、プライマー及びプローブは、微生物の特定の種の核酸と特異的にハイブリダイズする（以下「種特異的核酸」）。
【００１１】
[0011]本発明の属特異的核酸を使用して、食品サンプルにおいて食品の腐敗を引き起こす可能性がある又はない１種又は複数の微生物の存在を検出することができる。本発明の一実施形態において、本発明の属特異的核酸は、アリサイクロバチルス属の様々な異なる種の微生物のいずれかのうち２種以上の存在を特異的に検出することができる。本発明の属特異的核酸よって検出されるアリサイクロバチルス属種の数は、限定されるものではないが、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３種以上のアリサイクロバチルス属種を含むことができる。本発明の属特異的核酸よって検出されるアリサイクロバチルス属株の数は、限定されるものではないが、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００種以上のアリサイクロバチルス属株を含むことができる。本発明の属特異的核酸によって特異的に検出可能な微生物の典型的な種には、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、アリサイクロバチルス・コンタミナンス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、アリサイクロバチルス・ディサルフィドキシダンス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｏｏｘｉｄａｎｓ）、アリサイクロバチルス・ファスティディオサス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓｕｓ）、アリサイクロバチルス・フェロオキシダンス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｙｄａｎｓ）、アリサイクロバチルス・ヘスペリダム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｉｄｕｍ）、アリサイクロバチルス・ポモルム（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｍｏｒｕｍ）、アリサイクロバチルス・サッカリ（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ）、アリサイクロバチルス・センダイエンシス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｄａｉｅｎｓｉｓ）、アリサイクロバチルス・シズオケンシス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｚｕｏｋｅｎｓｉｓ）、アリサイクロバチルス・トレランス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｏｌｅｒａｎｓ）、アリサイクロバチルス・ブルカナリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｕｌｃａｎａｌｉｓ）、アリサイクロバチルス・テングコンゲンシス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｎｇｃｈｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、アリサイクロバチルス・アシドフィルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓ）、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓ）、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｒｂａｒｉｕｓ）のうち任意の１種又は複数が含まれる。好ましい実施形態において、本発明の属特異的核酸は、アリサイクロバ��ルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウスのうち任意の１種又は複数を特異的に検出する。本発明の一実施形態において、属特異的核酸は、配列番号１〜３、１６〜１８、及び３１〜４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む又はそれからなることができる。
【００１２】
[0012]本発明の種特異的な核酸を使用して、食品サンプルに腐敗を引き起こす１種又は複数の微生物の存在を検出することができる。本発明の一実施形態において、本発明の核酸は、食品サンプルに腐敗を引き起こすアリサイクロバチルス属の様々な異なる種の微生物のうち任意の１種又は複数の存在を特異的に検出することができる。本発明の核酸よって特異的に検出可能な、食品サンプルに腐敗を引き起こす微生物の典型的な種には、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウスのうち任意の１種又は複数がある。本発明の一実施形態において、種特異的な核酸は、配列番号４〜１５、１９〜３０、及び４２〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む又はそれからなることができる。本発明の属特異的核酸及び種特異的核酸、並びに本発明の核酸によって特異的に検出可能な微生物の典型的な種は、表１〜４に説明される。
【００１３】
【表１】
2014236727.tif 000002
【００１４】
【表２】
2014236727.tif 000003
【００１５】
【表３】
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【００１６】
【表４】
2014236727.tif 000005
【００１７】
[0013]本発明の核酸は、多くの利点をもたらす。これらの利点には、例えば、迅速で、高感度で、特異的な微生物の検出があり得る。例えば、市販の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に基づく方法を使用する１種の腐敗性種の検出と比較すると、本発明の核酸の組合せは、腐敗を引き起こす可能性があるアリサイクロバチルス属のより数多くの種類、例えば４種を含む、の検出を実現することも可能である。本発明の核酸は、例えば、市販のｑＰＣＲに基づく方法を使用する３８種のアリサイクロバチルス属株の検出と比較すると、より数多くの株、例えば、２００種以上のアリサイクロバチルス属株の検出を実現することも可能である。本発明の核酸の一実施形態は、腐敗を引き起こす可能性がある又はないアリサイクロバチルス属の微生物の存在も検出可能にし、有利には、アリサイクロバチルス属微生物の存在を決定するための迅速且つ高感度な一次スクリーニング試験を一般に可能にする。この一次スクリーニング試験を、有利には、腐敗を引き起こす可能性があるアリサイクロバチルス属微生物の特定の種の存在を試験する前に、利用できる。腐敗を引き起こすアリサイクロバチルス属種の特異的検出は、腐敗性アリサイクロバチルス属種と非腐敗性アリサイクロバチルス属種の間の高い配列類似性により難しい場合があるが、本発明の核酸の実施形態は、腐敗を引き起こすアリサイクロバチルス属種を有利に特異的に検出する。従って、本発明の核酸は、腐敗を引き起こす可能性があるアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出し、食品の汚染及び不快なにおいの発生を防止することを有利に可能にする。
【００１８】
[0014]本発明の核酸は、微生物の任意の型の核酸を特異的に検出することができる。本発明の一実施形態において、微生物核酸は、ＤＮＡである。更に別の実施形態において、本発明の核酸は、配列番号１〜７４のいずれかに相補的であるヌクレオチド配列からなる核酸である。配列番号１〜７４のいずれかに相補的である核酸は、微生物ＲＮＡを検出することができる。
【００１９】
[0015]本発明は、本明細書に記載される核酸のいずれかと少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【００２０】
[0016]一実施形態において、本発明の核酸は、検出可能な標識を更に含む。標識は、本発明の核酸と微生物核酸とのハイブリダイゼーション、例えば複合体、を検出するのに適した任意の標識であることができる。典型的な検出可能な標識には、放射性標識、非放射性標識、蛍光標識、及び化学発光標識のうち任意の１つ又は複数があり得る。
【００２１】
[0017]本発明の別の実施形態は、本明細書に記載される核酸のいずれか２つ以上を含む核酸の集合を提供する。本発明の一実施形態において、集合は、本明細書に記載される核酸のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含む又は更に含むことができる。集合は、本発明の核酸を任意の適当な数含むことができる。例えば、集合は、約２〜約７５個以上の核酸、約１０未満〜約７０個以上の核酸、約２０未満〜約６０個以上の核酸、又は約３０以下〜約５０個以上の核酸を含むことができる。この点で、集合は、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、３６個以上、３７個以上、３８個以上、３９個以上、４０個以上、４１個以上、４２個以上、４３個以上、４４個以上、４５個以上、４６個以上、４７個以上、４８個以上、４９個以上、５０個以上、５１個以上、５２個以上、５３個以上、５４個以上、５５個以上、５６個以上、５７個以上、５８個以上、５９個以上、６０個以上、６１個以上、６２個以上、６３個以上、６４個以上、６５個以上、６６個以上、６７個以上、６８個以上、６９個以上、７０個以上、７１個以上、７２個以上、７３個以上、又は７４個以上の核酸を含むことができる。集合のうち２個以上の核酸が互いに同一であってもよいが、好ましい実施形態では、２個以上の核酸は互いに異なっている。従って、２個以上の異なる核酸は、２種以上の異なる微生物の核酸と有利にハイブリダイズすることができ、従って、食品中の２種以上の異なる微生物の存在を検出することができる。
【００２２】
[0018]本発明の一実施形態において、核酸の集合は、第１の核酸及び第２の核酸を含む。第１の核酸は本明細書に記載される任意のフォワードプライマーであることができ、第２の核酸は本明細書に記載される任意のリバースプライマーであることができる。この点で、集合は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１〜３４、４２〜４５、５３〜５７、６７、及び７１〜７２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第１の核酸並びに配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３５〜４１、４６〜５２、５８〜６６、６８〜７０、及び７３〜７４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む第２の核酸を含むことができ、２つ以上の核酸の各々は、３５ヌクレオチド以下の長さを有する。本発明の一実施形態において、集合は、（ａ）配列番号１〜２、（ｂ）配列番号４〜５、（ｃ）配列番号７〜８、（ｄ）配列番号１０〜１１、又は（ｅ）配列番号１３〜１４を含むヌクレオチド配列を含み、２つ以上の核酸の各々は、３５ヌクレオチド以下の長さを有する。本発明の別の実施形態において、集合は、（ａ）配列番号１６〜１７、（ｂ）配列番号１９〜２０、（ｃ）配列番号２２〜２３、（ｄ）配列番号２５〜２６、又は（ｅ）配列番号２８〜２９からなる核酸を含む。本明細書に記載される集合のヌクレオチド配列は、本発明の他の態様と関連して本明細書に記載される通り、任意の適当な長さであることができる。
【００２３】
[0019]本発明の一実施形態において、集合の第１及び第２の核酸は、両方とも属特異的核酸である。この点で、集合の第１及び第２の核酸の両方とも、２種以上のアリサイクロバチルス属種とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号１及び２、（２）配列番号１及び１７、（３）配列番号１及び３５、（４）配列番号１及び３６、（５）配列番号１及び３７、（６）配列番号１及び３８、（７）配列番号１及び３９、（８）配列番号１及び４０、（９）配列番号１及び４１、（１０）配列番号１６及び２、（１１）配列番号１６及び１７、（１２）配列番号１６及び３５、（１３）配列番号１６及び３６、（１４）配列番号１６及び３７、（１５）配列番号１６及び３８、（１６）配列番号１６及び３９、（１７）配列番号１６及び４０、（１８）配列番号１６及び４１、（１９）配列番号３１及び２、（２０）配列番号３１及び１７、（２１）配列番号３１及び３５、（２２）配列番号３１及び３６、（２３）配列番号３１及び３７、（２４）配列番号３１及び３８、（２５）配列番号３１及び３９、（２６）配列番号３１及び４０、（２７）配列番号３１及び４１、（２８）配列番号３２及び２、（２９）配列番号３２及び１７、（３０）配列番号３２及び３５、（３１）配列番号３２及び３６、（３２）配列番号３２及び３７、（３３）配列番号３２及び３８、（３４）配列番号３２及び３９、（３５）配列番号３２及び４０、（３６）配列番号３２及び４１、（３７）配列番号３３及び２、（３８）配列番号３３及び１７、（３９）配列番号３３及び３５、（４０）配列番号３３及び３６、（４１）配列番号３３及び３７、（４２）配列番号３３及び３８、（４３）配列番号３３及び３９、（４４）配列番号３３及び４０、（４５）配列番号３３及び４１、（４６）配列番号３４及び２、（４７）配列番号３４及び１７、（４８）配列番号３４及び３５、（４９）配列番号３４及び３６、（５０）配列番号３４及び３７、（５１）配列番号３４及び３８、（５２）配列番号３４及び３９、（５３）配列番号３４及び４０、又は（５４）配列番号３４及び４１を含む属特異的集合を含むことができる。
【００２４】
[0020]他の実施形態において、フォワード及びリバースプライマーの両方とも、同じ微生物種の核酸とハイブリダイズする。この点で、集合の第１及び第２の核酸の両方とも、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリスの核酸とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号４及び５、（２）配列番号４及び２０、（３）配列番号４及び４６、（４）配列番号４及び４７、（５）配列番号４及び４８、（６）配列番号４及び４９、（７）配列番号４及び５０、（８）配列番号４及び５１、（９）配列番号４及び５２、（１０）配列番号１９及び５、（１１）配列番号１９及び２０、（１２）配列番号１９及び４６、（１３）配列番号１９及び４７、（１４）配列番号１９及び４８、（１５）配列番号１９及び４９、（１６）配列番号１９及び５０、（１７）配列番号１９及び５１、（１８）配列番号１９及び５２、（１９）配列番号４２及び５、（２０）配列番号４２及び２０、（２１）配列番号４２及び４６、（２２）配列番号４２及び４７、（２３）配列番号４２及び４８、（２４）配列番号４２及び４９、（２５）配列番号４２及び５０、（２６）配列番号４２及び５１、（２７）配列番号４２及び５２、（２８）配列番号４３及び５、（２９）配列番号４３及び２０、（３０）配列番号４３及び４６、（３１）配列番号４３及び４７、（３２）配列番号４３及び４８、（３３）配列番号４３及び４９、（３４）配列番号４３及び５０、（３５）配列番号４３及び５１、（３６）配列番号４３及び５２、（３７）配列番号４４及び５、（３８）配列番号４４及び２０、（３９）配列番号４４及び４６、（４０）配列番号４４及び４７、（４１）配列番号４４及び４８、（４２）配列番号４４及び４９、（４３）配列番号４４及び５０、（４４）配列番号４４及び５１、（４５）配列番号４４及び５２、（４６）配列番号４５及び５、（４７）配列番号４５及び２０、（４８）配列番号４５及び４６、（４９）配列番号４５及び４７、（５０）配列番号４５及び４８、（５１）配列番号４５及び４９、（５２）配列番号４５及び５０、（５３）配列番号４５及び５１、又は（５４）配列番号４５及び５２を含むアリサイクロバチルス・アシドテッレストリス特異的集合を含むことができる。
【００２５】
[0021]別の実施形態において、集合の第１及び第２の核酸の両方とも、アリサイクロバチルス・アシドフィルスとハイブリダイズすることができる。この点で、集合は、（１）配列番号７及び８、（２）配列番号７及び２３、（３）配列番号７及び５８、（４）配列番号７及び５９、（５）配列番号７及び６０、（６）配列番号７及び６１、（７）配列番号７及び６２、（８）配列番号７及び６３、（９）配列番号７及び６４、（１０）配列番号７及び６５、（１１）配列番号７及び６６、（１２）配列番号２２及び８、（１３）配列番号２２及び２３、（１４）配列番号２２及び５８、（１５）配列番号２２及び５９、（１６）配列番号２２及び６０、（１７）配列番号２２及び６１、（１８）配列番号２２及び６２、（１９）配列番号２２及び６３、（２０）配列番号２２及び６４、（２１）配列番号２２及び６５、（２２）配列番号２２及び６６、（２３）配列番号５３及び８、（２４）配列番号５３及び２３、（２５）配列番号５３及び５８、（２６）配列番号５３及び５９、（２７）配列番号５３及び６０、（２８）配列番号５３及び６１、（２９）配列番号５３及び６２、（３０）配列番号５３及び６３、（３１）配列番号５３及び６４、（３２）配列番号５３及び６５、（３３）配列番号５３及び６６、（３４）配列番号５４及び８、（３５）配列番号５４及び２３、（３６）配列番号５４及び５８、（３７）配列番号５４及び５９、（３８）配列番号５４及び６０、（３９）配列番号５４及び６１、（４０）配列番号５４及び６２、（４１）配列番号５４及び６３、（４２）配列番号５４及び６４、（４３）配列番号５４及び６５、（４４）配列番号５４及び６６、（４５）配列番号５５及び８、（４６）配列番号５５及び２３、（４７）配列番号５５及び５８、（４８）配列番号５５及び５９、（４９）配列番号５５及び６０、（５０）、配列番号５５及び６１、（５１）配列番号５５及び６２、（５２）配列番号５５及び６３、（５３）配列番号５５及び６４、（５４）配列番号５５及び６５、（５５）配列番号５５及び６６、（５６）配列番号５６及び８、（５７）配列番号５６及び２３、（５８）配列番号５６及び５８、（５９）配列番号５６及び５９、（６０）配列番号５６及び６０、（６１）配列番号５６及び６１、（６２）配列番号５６及び６２、（６３）配列番号５６及び６３、（６４）配列番号５６及び６４、（６５）配列番号５６及び６５、（６６）配列番号５６及び６６、（６７）配列番号５７及び８、（６８）配列番号５７及び２３、（６９）配列番号５７及び５８、（７０）配列番号５７及び５９、（７１）配列番号５７及び６０、（７２）配列番号５７及び６１、（７３）配列番号５７及び６２、（７４）配列番号５７及び６３、（７５）配列番号５７及び６４、（７６）配列番号５７及び６５、又は（７７）配列番号５７及び６６を含むことができる。
【００２６】
[0022]別の実施形態において、集合の第１及び第２の核酸の両方とも、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカスとハイブリダイズすることができる。この点で、集合は、（１）配列番号１０及び１１、（２）配列番号１０及び２６、（３）配列番号１０及び６８、（４）配列番号１０及び６９、（５）配列番号１０及び７０、（６）配列番号２５及び１１、（７）配列番号２５及び２６、（８）配列番号２５及び６８、（９）配列番号２５及び６９、（１０）配列番号２５及び７０、（１１）配列番号６７及び１１、（１２）配列番号６７及び２６、（１３）配列番号６７及び６８、（１４）配列番号６７及び６９、又は（１５）配列番号６７及び７０を含むことができる。
【００２７】
[0023]別の実施形態において、集合の第１及び第２の核酸の両方とも、アリサイクロバチルス・ヘルバリウスとハイブリダイズすることができる。この点で、集合は、（１）配列番号１３及び１４、（２）配列番号１３及び２９、（３）配列番号１３及び７３、（４）配列番号１３及び７４、（５）配列番号２８及び１４、（６）配列番号２８及び２９、（７）配列番号２８及び７３、（８）配列番号２８及び７４、（９）配列番号７１及び１４、（１０）配列番号７１及び２９、（１１）配列番号７１及び７３、（１２）配列番号７１及び７４、（１３）配列番号７２及び１４、（１４）配列番号７２及び２９、（１５）配列番号７２及び７３、又は（１６）配列番号７２及び７４を含むことができる。
【００２８】
[0024]本発明の一実施形態において、核酸の集合は、少なくとも１つのプライマー及びプローブ、好ましくは少なくとも１つのフォワードプライマー、少なくとも１つのリバースプライマー、及び少なくとも１つのプローブを含むことができる。プローブは、本発明の他の態様と関連して本明細書に記載されるいずれかの核酸を含むことができる。この点で、集合は、（ａ）配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１〜３４、４２〜４５、５３〜５７、６７、及び７１〜７２からなる群から選択される第１の核酸、（ｂ）配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３５〜４１、４６〜５２、５８〜６６、６８〜７０、及び７３〜７４からなる群から選択される第２の核酸、並びに（ｃ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、及び３０からなる群から選択される第３の核酸を含むことができ、核酸の各々は３５ヌクレオチド以下の長さを有する。
【００２９】
[0025]本発明の一実施形態において、集合の第１、第２、及び第３の核酸は、全て属特異的核酸である。この点で、集合の第１、第２、及び第３の核酸の各々は、２種以上のアリサイクロバチルス属種の核酸とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、本明細書に記載される属特異的集合（１）〜（５４）のいずれかと組合せて配列番号３又は１８を含むことができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号１−３、（２）配列番号１、３及び１７、（３）配列番号１、３及び３５、（４）配列番号１、３及び３６、（５）配列番号１、３及び３７、（６）配列番号１、３及び３８、（７）配列番号１、３及び３９、（８）配列番号１、３及び４０、（９）配列番号１、３及び４１、（１０）配列番号１６、３及び２、（１１）配列番号１６、３及び１７、（１２）配列番号１６、３及び３５、（１３）配列番号１６、３及び３６、（１４）配列番号１６、３及び３７、（１５）配列番号１６、３及び３８、（１６）配列番号１６、３及び３９、（１７）配列番号１６、３及び４０、（１８）配列番号１６、３及び４１、（１９）配列番号３１、３及び２、（２０）配列番号３１、３及び１７、（２１）配列番号３１、３及び３５、（２２）配列番号３１、３及び３６、（２３）配列番号３１、３及び３７、（２４）配列番号３１、３及び３８、（２５）配列番号３１、３及び３９、（２６）配列番号３１、３及び４０、（２７）配列番号３１、３及び４１、（２８）配列番号３２、３及び２、（２９）配列番号３２、３及び１７、（３０）配列番号３２、３及び３５、（３１）配列番号３２、３及び３６、（３２）配列番号３２、３及び３７、（３３）配列番号３２、３及び３８、（３４）配列番号３２、３及び３９、（３５）配列番号３２、３及び４０、（３６）配列番号３２、３及び４１、（３７）配列番号３３、３及び２、（３８）配列番号３３、３及び１７、（３９）配列番号３３、３及び３５、（４０）配列番号３３、３及び３６、（４１）配列番号３３、３及び３７、（４２）配列番号３３、３及び３８、（４３）配列番号３３、３及び３９、（４４）配列番号３３、３及び４０、（４５）配列番号３３、３及び４１、（４６）配列番号３４、３及び２、（４７）配列番号３４、３及び１７、（４８）配列番号３４、３及び３５、（４９）配列番号３４、３及び３６、（５０）配列番号３４、３及び３７、（５１）配列番号３４、３及び３８、（５２）配列番号３４、３及び３９、（５３）配列番号３４、３及び４０、（５４）配列番号３４、３及び４１、（５５）配列番号１、２、及び１８、（５６）配列番号１、１８及び１７、（５７）配列番号１、１８及び３５、（５８）配列番号１、１８及び３６、（５９）配列番号１、１８及び３７、（６０）配列番号１、１８及び３８、（６１）配列番号１、１８及び３９、（６２）配列番号１、１８及び４０、（６３）配列番号１、１８及び４１、（６４）配列番号１６、１８及び２、（６５）配列番号１６、１８及び１７、（６６）配列番号１６、１８及び３５、（６７）配列番号１６、１８及び３６、（６８）配列番号１６、１８及び３７、（６９）配列番号１６、１８及び３８、（７０）配列番号１６、１８及び３９、（７１）配列番号１６、１８及び４０、（７２）配列番号１６、１８及び４１、（７３）配列番号３１、１８及び２、（７４）配列番号３１、１８及び１７、（７５）配列番号３１、１８及び３５、（７６）配列番号３１、１８及び３６、（７７）配列番号３１、１８及び３７、（７８）配列番号３１、１８及び３８、（７９）配列番号３１、１８及び３９、（８０）配列番号３１、１８及び４０、（８１）配列番号３１、１８及び４１、（８２）配列番号３２、１８及び２、（８３）配列番号３２、１８及び１７、（８４）配列番号３２、１８及び３５、（８５）配列番号３２、１８及び３６、（８６）配列番号３２、１８及び３７、（８７）配列番号３２、１８及び３８、（８８）配列番号３２、１８及び３９、（８９）配列番号３２、１８及び４０、（９０）配列番号３２、１８及び４１、（９１）配列番号３３、１８及び２、（９２）配列番号３３、１８及び１７、（９３）配列番号３３、１８及び３５、（９４）配列番号３３、１８及び３６、（９５）配列番号３３、１８及び３７、（９６）配列番号３３、１８及び３８、（９７）配列番号３３、１８及び３９、（９８）配列番号３３、１８及び４０、（９９）配列番号３３、１８及び４１、（１００）配列番号３４、１８及び２、（１０１）配列番号３４、１８及び１７、（１０２）配列番号３４、１８及び３５、（１０３）配列番号３４、１８及び３６、（１０４）配列番号３４、１８及び３７、（１０５）配列番号３４、１８及び３８、（１０６）配列番号３４、１８及び３９、（１０７）配列番号３４、１８及び４０、又は（１０８）配列番号３４、１８及び４１を含む属特異的集合を含むことができる。
【００３０】
[0026]本発明の一実施形態において、集合の第１、第２、及び第３の核酸は、全てアリサイクロバチルス・アシドテッレストリス特異的核酸である。この点で、集合の第１、第２、及び第３の核酸の各々は、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリスの核酸とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス・アシドテッレストリス特異的集合（１）〜（５４）のいずれかと組合せて配列番号６又は２１を含むことができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号４−６、（２）配列番号４、６及び２０、（３）配列番号４、６及び４６、（４）配列番号４、６及び４７、（５）配列番号４、６及び４８、（６）配列番号４、６及び４９、（７）配列番号４、６及び５０、（８）配列番号４、６及び５１、（９）配列番号４、６及び５２、（１０）配列番号１９、６及び５、（１１）配列番号１９、６及び２０、（１２）配列番号１９、６及び４６、（１３）配列番号１９、６及び４７、（１４）配列番号１９、６及び４８、（１５）配列番号１９、６及び４９、（１６）配列番号１９、６及び５０、（１７）配列番号１９、６及び５１、（１８）配列番号１９、６及び５２、（１９）配列番号４２、６及び５、（２０）配列番号４２、６及び２０、（２１）配列番号４２、６及び４６、（２２）配列番号４２、６及び４７、（２３）配列番号４２、６及び４８、（２４）配列番号４２、６及び４９、（２５）配列番号４２、６及び５０、（２６）配列番号４２、６及び５１、（２７）配列番号４２、６及び５２、（２８）配列番号４３、６及び５、（２９）配列番号４３、６及び２０、（３０）配列番号４３、６及び４６、（３１）配列番号４３、６及び４７、（３２）配列番号４３、６及び４８、（３３）配列番号４３、６及び４９、（３４）配列番号４３、６及び５０、（３５）配列番号４３、６及び５１、（３６）配列番号４３、６及び５２、（３７）配列番号４４、６及び５、（３８）配列番号４４、６及び２０、（３９）配列番号４４、６及び４６、（４０）配列番号４４、６及び４７、（４１）配列番号４４、６及び４８、（４２）配列番号４４、６及び４９、（４３）配列番号４４、６及び５０、（４４）配列番号４４、６及び５１、（４５）配列番号４４、６及び５２、（４６）配列番号４５、６及び５、（４７）配列番号４５、６及び２０、（４８）配列番号４５、６及び４６、（４９）配列番号４５、６及び４７、（５０）配列番号４５、６及び４８、（５１）配列番号４５、６及び４９、（５２）配列番号４５、６及び５０、（５３）配列番号４５、６及び５１、（５４）配列番号４５、６及び５２、（５５）配列番号４−６、（５６）配列番号４、２１及び２０、（５７）配列番号４、２１及び４６、（５８）配列番号４、２１及び４７、（５９）配列番号４、２１及び４８、（６０）配列番号４、２１及び４９、（６１）配列番号４、２１及び５０、（６２）配列番号４、２１及び５１、（６３）配列番号４、２１及び５２、（６４）配列番号１９、２１及び５、（６５）配列番号１９、２１及び２０、（６６）配列番号１９、２１及び４６、（６７）配列番号１９、２１及び４７、（６８）配列番号１９、２１及び４８、（６９）配列番号１９、２１及び４９、（７０）配列番号１９、２１及び５０、（７１）配列番号１９、２１及び５１、（７２）配列番号１９、２１及び５２、（７３）配列番号４２、２１及び５、（７４）配列番号４２、２１及び２０、（７５）配列番号４２、２１及び４６、（７６）配列番号４２、２１及び４７、（７７）配列番号４２、２１及び４８、（７８）配列番号４２、２１及び４９、（７９）配列番号４２、２１及び５０、（８０）配列番号４２、２１及び５１、（８１）配列番号４２、２１及び５２、（８２）配列番号４３、２１及び５、（８３）配列番号４３、２１及び２０、（８４）配列番号４３、２１及び４６、（８５）配列番号４３、２１及び４７、（８６）配列番号４３、２１及び４８、（８７）配列番号４３、２１及び４９、（８８）配列番号４３、２１及び５０、（８９）配列番号４３、２１及び５１、（９０）配列番号４３、２１及び５２、（９１）配列番号４４、２１及び５、（９２）配列番号４４、２１及び２０、（９３）配列番号４４、２１及び４６、（９４）配列番号４４、２１及び４７、（９５）配列番号４４、２１及び４８、（９６）配列番号４４、２１及び４９、（９７）配列番号４４、２１及び５０、（９８）配列番号４４、２１及び５１、（９９）配列番号４４、２１及び５２、（１００）配列番号４５、２１及び５、（１０１）配列番号４５、２１及び２０、（１０２）配列番号４５、２１及び４６、（１０３）配列番号４５、２１及び４７、（１０４）配列番号４５、２１及び４８、（１０５）配列番号４５、２１及び４９、（１０６）配列番号４５、２１及び５０、（１０７）配列番号４５、２１及び５１、又は（１０８）配列番号４５、２１及び５２を含むアリサイクロバチルス・アシドテッレストリス特異的集合を含むことができる。
【００３１】
[0027]本発明の一実施形態において、集合の第１、第２、及び第３の核酸は、全てアリサイクロバチルス・アシドフィルス特異的核酸である。この点で、集合の第１、第２、及び第３の核酸の各々は、アリサイクロバチルス・アシドフィルスの核酸とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス・アシドフィルス特異的集合（１）〜（７７）のいずれかと組合せて配列番号９又は２４を含むことができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号７−９、（２）配列番号７、９及び２３、（３）配列番号７、９及び５８、（４）配列番号７、９及び５９、（５）配列番号７、９及び６０、（６）配列番号７、９及び６１、（７）配列番号７、９及び６２、（８）配列番号７、９及び６３、（９）配列番号７、９及び６４、（１０）配列番号７、９及び６５、（１１）配列番号７、９及び６６、（１２）配列番号２２、９及び８、（１３）配列番号２２、９及び２３、（１４）配列番号２２、９及び５８、（１５）配列番号２２、９及び５９、（１６）配列番号２２、９及び６０、（１７）配列番号２２、９及び６１、（１８）配列番号２２、９及び６２、（１９）配列番号２２、９及び６３、（２０）配列番号２２、９及び６４、（２１）配列番号２２、９及び６５、（２２）配列番号２２、９及び６６、（２３）配列番号５３、９及び８、（２４）配列番号５３、９及び２３、（２５）配列番号５３、９及び５８、（２６）配列番号５３、９及び５９、（２７）配列番号５３、９及び６０、（２８）配列番号５３、９及び６１、（２９）配列番号５３、９及び６２、（３０）配列番号５３、９及び６３、（３１）配列番号５３、９及び６４、（３２）配列番号５３、９及び６５、（３３）配列番号５３、９及び６６、（３４）配列番号５４、９及び８、（３５）配列番号５４、９及び２３、（３６）配列番号５４、９及び５８、（３７）配列番号５４、９及び５９、（３８）配列番号５４、９及び６０、（３９）配列番号５４、９及び６１、（４０）配列番号５４、９及び６２、（４１）配列番号５４、９及び６３、（４２）配列番号５４、９及び６４、（４３）配列番号５４、９及び６５、（４４）配列番号５４、９及び６６、（４５）配列番号５５、９及び８、（４６）配列番号５５、９及び２３、（４７）配列番号５５、９及び５８、（４８）配列番号５５、９及び５９、（４９）配列番号５５、９及び６０、（５０）、配列番号５５、９及び６１、（５１）配列番号５５、９及び６２、（５２）配列番号５５、９及び６３、（５３）配列番号５５、９及び６４、（５４）配列番号５５、９及び６５、（５５）配列番号５５、９及び６６、（５６）配列番号５６、９及び８、（５７）配列番号５６、９及び２３、（５８）配列番号５６、９及び５８、（５９）配列番号５６、９及び５９、（６０）配列番号５６、９及び６０、（６１）配列番号５６、９及び６１、（６２）配列番号５６、９及び６２、（６３）配列番号５６、９及び６３、（６４）配列番号５６、９及び６４、（６５）配列番号５６、９及び６５、（６６）配列番号５６、９及び６６、（６７）配列番号５７、９及び８、（６８）配列番号５７、９及び２３、（６９）配列番号５７、９及び５８、（７０）配列番号５７、９及び５９、（７１）配列番号５７、９及び６０、（７２）配列番号５７、９及び６１、（７３）配列番号５７、９及び６２、（７４）配列番号５７、９及び６３、（７５）配列番号５７、９及び６４、（７６）配列番号５７、９及び６５、（７７）配列番号５７、９及び６６、（７８）配列番号７、８、及び２４、（７９）配列番号７、２４及び２３、（８０）配列番号７、２４及び５８、（８１）配列番号７、２４及び５９、（８２）配列番号７、２４及び６０、（８３）配列番号７、２４及び６１、（８４）配列番号７、２４及び６２、（８５）配列番号７、２４及び６３、（８６）配列番号７、２４及び６４、（８７）配列番号７、２４及び６５、（８８）配列番号７、２４及び６６、（８９）配列番号２２、２４及び８、（９０）配列番号２２、２４及び２３、（９１）配列番号２２、２４及び５８、（９２）配列番号２２、２４及び５９、（９３）配列番号２２、２４及び６０、（９４）配列番号２２、２４及び６１、（９５）配列番号２２、２４及び６２、（９６）配列番号２２、２４及び６３、（９７）配列番号２２、２４及び６４、（９８）配列番号２２、２４及び６５、（９９）配列番号２２、２４及び６６、（１００）配列番号５３、２４及び８、（１０１）配列番号５３、２４及び２３、（１０２）配列番号５３、２４及び５８、（１０３）配列番号５３、２４及び５９、（１０４）配列番号５３、２４及び６０、（１０５）配列番号５３、２４及び６１、（１０６）配列番号５３、２４及び６２、（１０７）配列番号５３、２４及び６３、（１０８）配列番号５３、２４及び６４、（１０９）配列番号５３、２４及び６５、（１１０）配列番号５３、２４及び６６、（１１１）配列番号５４、２４及び８、（１１２）配列番号５４、２４及び２３、（１１３）配列番号５４、２４及び５８、（１１４）配列番号５４、２４及び５９、（１１５）配列番号５４、２４及び６０、（１１６）配列番号５４、２４及び６１、（１１７）配列番号５４、２４及び６２、（１１８）配列番号５４、２４及び６３、（１１９）配列番号５４、２４及び６４、（１２０）配列番号５４、２４及び６５、（１２１）配列番号５４、２４及び６６、（１２２）配列番号５５、２４及び８、（１２３）配列番号５５、２４及び２３、（１２４）配列番号５５、２４及び５８、（１２５）配列番号５５、２４及び５９、（１２６）配列番号５５、２４及び６０、（１２７）配列番号５５、２４及び６１、（１２８）配列番号５５、２４及び６２、（１２９）配列番号５５、２４及び６３、（１３０）配列番号５５、２４及び６４、（１３１）配列番号５５、２４及び６５、（１３２）配列番号５５、２４及び６６、（１３３）配列番号５６、２４及び８、（１３４）配列番号５６、２４及び２３、（１３５）配列番号５６、２４及び５８、（１３６）配列番号５６、２４及び５９、（１３７）配列番号５６、２４及び６０、（１３８）配列番号５６、２４及び６１、（１３９）配列番号５６、２４及び６２、（１４０）配列番号５６、２４及び６３、（１４１）配列番号５６、２４及び６４、（１４２）配列番号５６、２４及び６５、（１４３）配列番号５６、２４及び６６、（１４４）配列番号５７、２４及び８、（１４５）配列番号５７、２４及び２３、（１４６）配列番号５７、２４及び５８、（１４７）配列番号５７、２４及び５９、（１４８）配列番号５７、２４及び６０、（１４９）配列番号５７、２４及び６１、（１５０）配列番号５７、２４及び６２、（１５１）配列番号５７、２４及び６３、（１５２）配列番号５７、２４及び６４、（１５３）配列番号５７、２４及び６５、又は（１５４）配列番号５７、２４及び６６を含むアリサイクロバチルス・アシドフィルス特異的集合を含むことができる。
【００３２】
[0028]本発明の一実施形態において、集合の第１、第２、及び第３の核酸は、全てアリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス特異的核酸である。この点で、集合の第１、第２、及び第３の核酸の各々は、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカスの核酸とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス特異的集合（１）〜（１５）のいずれかと組合せて配列番号１２又は２７を含むことができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号１０−１２、（２）配列番号１０、１２及び２６、（３）配列番号１０、１２及び６８、（４）配列番号１０、１２及び６９、（５）配列番号１０、１２及び７０、（６）配列番号２５、１２及び１１、（７）配列番号２５、１２及び２６、（８）配列番号２５、１２及び６８、（９）配列番号２５、１２及び６９、（１０）配列番号２５、１２及び７０、（１１）配列番号６７、１２及び１１、（１２）配列番号６７、１２及び２６、（１３）配列番号６７、１２及び６８、（１４）配列番号６７、１２及び６９、（１５）配列番号６７、１２及び７０、（１６）配列番号１０、１１、及び２７、（１７）配列番号１０、２７及び２６、（１８）配列番号１０、２７及び６８、（１９）配列番号１０、２７及び６９、（２０）配列番号１０、２７及び７０、（２１）配列番号２５、２７及び１１、（２２）配列番号２５、２７及び２６、（２３）配列番号２５、２７及び６８、（２４）配列番号２５、２７及び６９、（２５）配列番号２５、２７及び７０、（２６）配列番号６７、２７及び１１、（２７）配列番号６７、２７及び２６、（２８）配列番号６７、２７及び６８、（２９）配列番号６７、２７及び６９、又は（３０）配列番号６７、２７及び７０を含むアリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス特異的集合を含むことができる。
【００３３】
[0029]本発明の一実施形態において、集合の第１、第２、及び第３の核酸は、全てアリサイクロバチルス・ヘルバリウス特異的核酸である。この点で、集合の第１、第２、及び第３の核酸の各々は、アリサイクロバチルス・ヘルバリウスの核酸とハイブリダイズすることができる。一実施形態において、集合は、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス・ヘルバリウス特異的集合（１）〜（１６）のいずれかと組合せて配列番号１５又は３０を含むことができる。一実施形態において、集合は、（１）配列番号１３−１５、（２）配列番号１３、１５及び２９、（３）配列番号１３、１５及び７３、（４）配列番号１３、１５及び７４、（５）配列番号２８、１５及び１４、（６）配列番号２８、１５及び２９、（７）配列番号２８、１５及び７３、（８）配列番号２８、１５及び７４、（９）配列番号７１、１５及び１４、（１０）配列番号７１、１５及び２９、（１１）配列番号７１、１５及び７３、（１２）配列番号７１、１５及び７４、（１３）配列番号７２、１５及び１４、（１４）配列番号７２、１５及び２９、（１５）配列番号７２、１５及び７３、（１６）配列番号７２、１５及び７４、（１７）配列番号１３、１４、及び３０、（１８）配列番号１３、３０及び２９、（１９）配列番号１３、３０及び７３、（２０）配列番号１３、３０及び７４、（２１）配列番号２８、３０及び１４、（２２）配列番号２８、３０及び２９、（２３）配列番号２８、３０及び７３、（２４）配列番号２８、３０及び７４、（２５）配列番号７１、３０及び１４、（２６）配列番号７１、３０及び２９、（２７）配列番号７１、３０及び７３、（２８）配列番号７１、３０及び７４、（２９）配列番号７２、３０及び１４、（３０）配列番号７２、３０及び２９、（３１）配列番号７２、３０及び７３、又は（３２）配列番号７２、３０及び７４を含むアリサイクロバチルス・ヘルバリウス特異的集合を含むことができる。
【００３４】
[0030]一実施形態において、集合は、（ａ）配列番号１〜３、（ｂ）配列番号４〜６、（ｃ）配列番号７〜９、（ｄ）配列番号１０〜１２、又は（ｅ）配列番号１３〜１５を含む２つ以上の核酸を含み、核酸の各々は、３５ヌクレオチド以下の長さを有する。別の実施形態において、集合は、（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、又は（ｅ）配列番号２８〜３０からなる核酸を２つ以上含む。一実施形態において、集合は、配列番号１〜７４のうち任意の１つ又は複数に相補的な配列を含むことができる。
【００３５】
[0031]核酸の集合は、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス属種の任意の１、２、３、若しくは４つを検出するための核酸を、単独で又は本明細書に記載される属特異的核酸のいずれかと組合せて含むことができる。本発明の一実施形態において、核酸の集合は、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス属種の４つ全てを検出するための核酸を、本明細書に記載される属特異的核酸のいずれかと組合せて含む。
【００３６】
[0032]本明細書では「ヌクレオチド配列」又は「核酸」とは、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを一般に意味し、ＤＮＡ又はＲＮＡは、合成若しくは天然源から得られる（例えば、単離及び／又は精製される）一本鎖若しくは二本鎖あることができ、ＤＮＡ又はＲＮＡは、天然、非天然若しくは改変されたヌクレオチドを含有することができ、ＤＮＡ又はＲＮＡは、無改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるリン酸ジエステルの代わりに、天然、非天然若しくは改変されたヌクレオチド間結合、例えばホスホルアミダート結合又はホスホロチオエート結合を含有することができる。本発明の核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、及び／又は置換も含まないことが、一般に好ましい。しかし、本明細書に述べられるように、いくつかの実例においては１つ又は複数の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが核酸にとって適当な場合がある。
【００３７】
[0033]本発明の核酸は、当技術分野において公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  ２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９４を参照のこと。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を増加させる若しくはハイブリダイゼーションにおいて形成される二本鎖の物理的な安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチド）を使用して化学的に合成できる。核酸を生成するのに使用できる修飾ヌクレオチドの例には、それだけには限らないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンがある。別法として、本発明の１つ又は複数の核酸は、企業、例えばＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から購入できる。
【００３８】
[0034]本発明の一実施形態は、１種又は複数の微生物の１つ又は複数の種を特異的に検出するための核酸の集合を含むアッセイキットを提供する。アッセイキットは、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス属種の任意の１、２、３、若しくは４つを検出するための核酸の１つ又は複数の集合を、単独で又は本明細書に記載される属特異的集合のいずれかと組合せて含むことができる。本発明の一実施形態において、アッセイキットは、本明細書に記載されるアリサイクロバチルス属種の４つ全てを検出するための核酸の集合を、本明細書に記載される属特異的集合のいずれかと組合せて含む。本発明の一実施形態において、アッセイキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＭｇ＋＋のうち任意の１つ又は複数を更に含むことができる。
【００３９】
[0035]ＤＮＡポリメラーゼは、限定されるものではなく、ｑＰＣＲ又はＰＣＲに適した任意のＤＮＡポリメラーゼであることができる。典型的なＤＮＡポリメラーゼには、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ポリメラーゼ及びパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ｐｆｕ）ポリメラーゼがある。
【００４０】
[0036]緩衝液は、限定されるものではなく、ＰＣＲ又はｑＰＣＲに適した任意の緩衝液であることができる。典型的な緩衝液には、ＫＣｌ、トリス及びＭｇＣｌ２の組合せ並びに（ＮＨ４）２ＳＯ４、トリス−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、β−メルカプトエタノール、及びＥＤＴＡの組合せがある。
【００４１】
[0037]本発明の一実施形態は、本発明の核酸又は本明細書に記載される核酸の集合のいずれかが固定されている支持体を提供する。本発明の別の実施形態は、試験しようとするサンプルが固定されており、１つ又は複数の本発明の核酸又は１つ又は複数の核酸の集合がアプライされる、支持体を提供する。支持体は、本発明の核酸を固定するのに適した任意の支持体であることができる。典型的な支持体は、米国特許第６，８２１，７７１号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。他の典型的な支持体には、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡから入手可能なジーンディスク（ＧＥＮＥＤＩＳＣ）プレートがある。
【００４２】
[0038]支持体は、検出可能な標識を更に含むことができる。標識は、本発明の核酸と微生物核酸との複合体を検出するのに適した任意の標識であることができる。典型的な検出可能な標識には、放射性標識、非放射性標識、蛍光標識、及び化学発光標識のうち任意の１つ又は複数があり得る。
【００４３】
[0039]本発明のなお別の実施形態は、食品中の、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出する方法であって、（ａ）食品から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップと、（ｂ）本発明の核酸、核酸の集合、又は本明細書に記載される支持体のいずれかを、その核酸と微生物核酸との複合体形成が可能な条件下で、少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップと、（ｃ）複合体を検出するステップと、（ｄ）少なくとも１つの試験サンプルの複合体の存在を、微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の不在と比較するステップとを含み、複合体の検出が、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在の指標となる、方法を提供する。
【００４４】
[0040]本方法は、試験しようとする食品のサンプルを得るステップと、任意の適当な方式でサンプル中の微生物を培養するステップとを含むことができる。例えば、食品が果汁である場合、サンプルは、果汁濃縮物、殺菌果汁、無殺菌果汁、他の果汁、又は任意の更なる添加物若しくは果汁原材料のうち任意の１つ又は複数であることができる。更なる添加物及び果汁原材料には、例えば、水（例えば、凝縮水及び／又は最終ジュース製品に添加される水）、可溶性添加物、及び、例えば糖（固体又は液体）等の甘味料、のうち任意の１つ又は複数があり得る。
【００４５】
[0041]当技術分野で周知のように、本方法は、任意の適当な培地で微生物を培養するステップを含むことができる。培地は、試験しようとする食品及び微生物の性質に応じて選択することができる。典型的な培地には、酵母−スクロース−グルコース（ＹＳＧ）培地、ジャガイモデキストロース培地及びアリサイクロバチルス属培地用（ＢＡＴ）培養液があり得る。
【００４６】
[0042]当技術分野で周知のように、微生物は、任意の適当な温度で任意の適当な期間培養することができる。培養温度及び期間は、試験しようとする食品及び微生物の性質に応じて選択することができる。例えば、微生物は、約４０℃〜約６０℃、好ましくは約４５℃〜約５０℃の温度で培養することができる。微生物は、約１日〜約１４日間、好ましくは約２日〜約７日間培養することができる。
【００４７】
[0043]当技術分野で周知のように、本方法は、任意の適当な方法で、微生物から核酸を抽出するステップを含むことができる。核酸は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡであり得る。当技術分野で周知のように、核酸を抽出する手順は、試験しようとする食品、微生物、及び核酸の性質に応じて選択することができる。核酸は、グラム陽性及びグラム陰性細菌を溶解し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）阻害剤を使用せずに試験可能な量のＤＮＡを回収する任意の様式で抽出されることが好ましい。核酸抽出は、様々な市販の核酸抽出キットのいずれかを製造業者の説明書に従って使用して実施できる。典型的なＤＮＡ抽出キットには、例えば、ＰＦＯＯＤキット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡより入手可能）があり得る。
【００４８】
[0044]本方法は、本発明の核酸と微生物核酸との複合体形成が可能な条件下で、本発明の核酸、核酸の集合、又は支持体を、少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップを含む。当技術分野で周知のように、この点で、本方法は、本発明の核酸が微生物核酸と特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、抽出した核酸のサンプルを本発明の核酸と接触させるステップを含む。当技術分野で周知のように、本方法は、任意の適当な型のＰＣＲを使用して、本発明の核酸及び微生物核酸を増幅するステップを含むことができる。
【００４９】
[0045]本方法は、複合体を検出するステップを含む。当技術分野で周知のように、複合体は、例えば、放射性標識又は色素を使用して検出できる。好ましい実施形態において、本方法は、例えば、レーザーを使用して蛍光色素から放射される光を測定するステップを含む。複合体を検出するステップは、形成された複合体の量を測定するステップを任意で更に含むことができる。
【００５０】
[0046]本方法は、少なくとも１つの試験サンプルの複合体の存在を微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の不在と比較するステップを更に含むことができる。少なくとも１つの試験サンプルの複合体の存在は、１種又は複数の微生物の存在の指標となり、少なくとも１つの試験サンプルの複合体の不在は、１種又は複数の微生物の不在の指標となる。本発明の一実施形態において、本方法は、微生物核酸を含まない陰性サンプルの標識によって生成されるシグナルのバックグラウンドレベルを決定するステップと、シグナルのバックグラウンドレベルを試験サンプルにおいて検出されるシグナルのレベルと比較するステップとを含む。陰性サンプルにおいて測定されたシグナルと比較して、試験サンプルにおけるより高い又はより低いシグナルのレベルは、１種又は複数の微生物の存在の指標となり得る。
【００５１】
[0047]一実施形態において、本方法は、少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の量を微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の量と比較するステップを任意に含み、少なくとも１つの試験サンプルの複合体の量の増大が、１種又は複数の微生物の存在の指標となる。この点で、サンプル中に検出される複合体の量が、微生物核酸を含まないことが既知の陰性サンプルにおいて検出される複合体の量以下である場合、サンプルは食品を腐敗させる微生物について陰性である。サンプル中に検出される複合体の量が、微生物核酸を含まないことが既知の陰性サンプルにおいて検出される複合体の量より多い場合、サンプルは食品を腐敗させる微生物について陽性である。
【００５２】
[0048]本方法は、有利には、２つ以上の異なる食品サンプル中の微生物の存在を同時に試験するステップを含むことができる。この点で、少なくとも１つの試験サンプルは、順次又は同時に試験される２つ以上の異なるサンプル、すなわち、順次又は同時に試験される３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上のサンプルであることができる。
【００５３】
[0049]本方法は、食品の腐敗を引き起こす任意の１種又は複数の微生物の存在を検出するステップを含むことができる。本発明の一実施形態において、本方法は、食品サンプルにおいて食品の腐敗を引き起こす可能性がある又はない１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出するステップを含む。この点で、本方法は、本明細書に記載される属特異的核酸又はその集合のいずれかを使用して、アリサイクロバチルス属の様々な異なる種の微生物のいずれかのうち２種以上の存在を検出するステップを含むことができる。
【００５４】
[0050]別の実施形態において、本方法は、食品サンプルに腐敗を引き起こす微生物の１つ又は複数の種の存在を検出するステップを含む。この点で、本方法は、本明細書に記載される種特異的核酸又はその集合のいずれかを使用して、食品サンプルに腐敗を引き起こすアリサイクロバチルス属の様々な異なる種の微生物のうち任意の２種以上の存在を検出するステップを含むことができる。本方法は、例えば、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウスのうち任意の１種又は複数を検出するステップを含むことができる。
【００５５】
[0051]本方法は、任意の食品中の微生物を検出するステップを含むことができる。食品は、例えば、乳製品；脂肪、油、及び脂肪乳液；食用の氷（例えば、シャーベット及びソルベを含む）；果物及び野菜（例えば、キノコ及び菌類、根菜及び塊茎、豆及び豆類、並びにアロエベラを含む）；海草；木の実及び種子；菓子；穀物及び穀物加工品；焼成品（例えば、パン）；肉及び肉加工品（例えば、家禽及び獲物を含む）；魚及び魚加工品（軟体動物、甲殻類、及び棘皮動物を含む）；卵及び卵加工品；例えば、ハチミツ及び糖（固体又は液体）を含めた甘味料；塩、香辛料、スープ、ソース、サラダ、タンパク質加工品；特定の栄養的利用を目的とする食品；並びに飲料（例えば、水、果汁、ビール、及びワイン）、のうち任意の１つ又は複数であることができる。好ましい実施形態において、食品は果汁である。
【００５６】
[0052]本発明の別の実施形態は、環境中の、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在を検出する方法であって、（ａ）環境から単離された微生物核酸を含む少なくとも１つの試験サンプルを得るステップと、（ｂ）本発明の核酸、核酸の集合、又は本明細書に記載される支持体のいずれかを、その核酸と微生物核酸との複合体形成が可能な条件下で、少なくとも１つの試験サンプルと接触させるステップと、（ｃ）複合体を検出するステップと、（ｄ）少なくとも１つの試験サンプル中の複合体の存在を、微生物核酸を含まない陰性サンプルの複合体の不在と比較するステップとを含み、複合体の検出が、１種又は複数のアリサイクロバチルス属微生物の存在の指標となる、方法を提供する。本発明の一実施形態において、環境とは、食品の製造、加工、及び／又は包装（例えば、瓶詰め）で起こる環境である。例えば、環境サンプルは、大気サンプル又は食品の製造、加工、及び／若しくは包装（例えば、瓶詰め）に利用される対象の表面のサンプルであることができる。例えば、表面は、食品を包装するのに使用される瓶又は缶の表面であることができる。本方法は、それ以外では、本発明の他の態様と関連して本明細書に記載される通りであってもよい。
【００５７】
[0053]本明細書では用語「単離される」とは、天然の環境から取り出されることを意味する。本明細書では用語「精製される」とは、純度が高められることを意味し、「純度」とは相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈されるものではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であることができ、６０％、７０％若しくは８０％、９０％以上であることができ、又は１００％であることができる。
【実施例】
【００５８】
[0054]以下の実施例は、本発明を更に例示するが、当然ながら、いかなる形であれ本発明の範囲を制限するものと解釈すべきでない。
【００５９】
実施例１
[0055]この実施例は、一般的なアリサイクロバチルス属（アリサイクロバチルス属種）並びにアリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウス種の微生物の、本発明の核酸を使用する検出について実証している。
【００６０】
[0056]アリサイクロバチルス属種は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）又はライプニッツ研究所ＤＳＭＺ−ドイツ微生物細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭ）から得られる。ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ抽出キット（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡから入手可能）を使用して、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（ＡＴＣＣ登録番号４３０３４）、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス（ＤＳＭ２４９８）、アリサイクロバチルス・アシドフィルス（ＤＳＭ１４５５８）、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス（ＡＴＣＣ４９０２９）、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウス（ＤＳＭ１３６０９）から単離される（「標的ＤＮＡ」）。細菌ＤＮＡは、１０ｍＭトリスｐＨ８．３を用いて１５０，０００ゲノム単位（ＧＵ）／μＬの濃度に希釈される。トリスｐＨ８．３緩衝液（１０ｍＭ）を標的無し対照（ＮＴＣ）として使用する。
【００６１】
[0057]フォワードプライマー（配列番号１６）、リバースプライマー（配列番号１７）、及びプローブ（配列番号１８）を含む、属（アリサイクロバチルス属種）特異的な核酸の集合を使用して、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス由来ＤＮＡを試験する。フォワードプライマー（配列番号１９）、リバースプライマー（配列番号２０）、及びプローブ（配列番号２１）を含む、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス特異的な核酸の集合を使用して、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス由来ＤＮＡを試験する。フォワードプライマー（配列番号２２）、リバースプライマー（配列番号２３）、及びプローブ（配列番号２４）を含む、アリサイクロバチルス・アシドフィルス特異的な核酸の集合を使用して、アリサイクロバチルス・アシドフィルス由来ＤＮＡを試験する。フォワードプライマー（配列番号２５）、リバースプライマー（配列番号２６）、及びプローブ（配列番号２７）を含む、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス特異的な核酸の集合を使用して、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス由来ＤＮＡを試験する。フォワードプライマー（配列番号２８）、リバースプライマー（配列番号２９）、及びプローブ（配列番号３０）を含む、アリサイクロバチルス・ヘルバリウス特異的な核酸の集合を使用して、アリサイクロバチルス・ヘルバリウス由来ＤＮＡを試験する。各種由来のＤＮＡを、０（標的無し対照（ＮＴＣ））、ＰＣＲウェル当たり２５ＧＵ又はＰＣＲウェル当たり１２．５ＧＵで試験する。プローブは、５’を６−ＦＡＭ蛍光色素及び３’をＢＨＱ１消光物質で標識する。
【００６２】
[0058]ジーンディスクプレート（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡから入手可能）を、製造業者の説明書に従って調製する。
【００６３】
[0059]定量的（ｑ）ＰＣＲ混合物キット（「マスターミックス」）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡから入手可能なジーンディスク検出キットに含まれる）を、核酸の各集合（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、及び（ｅ）配列番号２８〜３０について別々に調製する。ＰＣＲ反応混合物中のプライマーの濃度は３００ｎＭであり、ＰＣＲ反応混合物中のプローブの濃度は２００ｎＭである。ジーンディスクサイクラー（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡから入手可能）に組み込まれているバーコードリーダーを使用して、ジーンディスクプレートにあるバーコード及びマスターミックスバッグに入っている識別カード上のバーコードをスキャンする。ジーンディスクサイクラーの製造業者の説明書に従って、サンプル名を入力する。ジーンディスクプレート領域の各々に対応する１．５ｍＬマイクロチューブを標識する。マスターミックスを、２秒間ボルテックスし、次いで短く２秒間遠心する。マスターミックス（６μＬ）を、各マイクロチューブに添加する。マイクロチューブを閉じる。ＤＮＡサンプルを卓上遠心機で１５秒間遠心する。
【００６４】
[0060]ピペットを使用して、各種由来のＤＮＡサンプル（６μＬ）を、対応するマスターミックスを含有するマイクロチューブに移す。チューブを閉じて相互汚染を防ぐ。チューブを、２秒間穏やかに混合し、次いで小型遠心機を使用して２秒間遠心する。各マイクロチューブからの１２μＬを、適当なジーンディスクプレート領域に添加する。従って、対応するＤＮＡサンプルと共に、（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、及び（ｅ）配列番号２８〜３０の各々を同じジーンディスクプレートの別々の領域に添加する。
【００６５】
[0061]ジーンディスクプレートを装着する。ジーンディスクプレートの上部に封印蓋を置き、蓋を穏やかに押し込んで漏出がないことを確認し、真空を開始する。ジーンディスクサイクラーが、真空化が９０％完了していることを示したら、ジーンディスクプレートを軽くたたいて、残っている泡を取り除く。真空を解放した後に、蓋を取り外す。各ジーンディスクプレート領域に鉱油（４滴）を入れる。ジーンディスクプレート上に封印蓋を置き、真空を開始する。真空サイクルの終わりに蓋を取り外し、７０％エタノールで拭くことよってきれいにする。ウェルを検査して、アッセイキットを失敗させる可能性がある不十分又は不均一に充填されたウェルがないことを確認する。
【００６６】
[0062]指定された位置に封印蓋を置きかえる。ジーンディスクサイクラーにジーンディスクプレートを注意深く挿入し、ジーンディスクサイクラーの蓋を閉じる。熱サイクル条件を使用してＰＣＲを行う。熱サイクル条件は、１１２℃、１０８℃、５０℃、及び６０℃の４つの温度を含む。サイクル時間は、１サイクルにつき８０秒で４５サイクルである。ＰＣＲの最後に、ジーンディスクプレートを取り外し、廃棄する。
【００６７】
[0063]データを分析する。サイクル閾値（Ｃｔ）によってリアルタイムＰＣＲデータを定量化した。ＰＣＲ効率及び直線性も、決定する。
【００６８】
[0064]ＮＴＣは、標的分子の非存在下における非特異的シグナルを測定する。表５に示すように、ＮＴＣに対して測定されたＣｔ値は３８より大きく、この値はバックグラウンドシグナルと考えられる。３８未満のＣｔ値は、微生物の存在について陽性と考えられる。表５に示すように、核酸（ａ）配列番号１６〜１８（ＡＡＳ）、（ｂ）配列番号１９〜２１（ＡＡＴ）、（ｃ）配列番号２２〜２４（ＡＡＰ）、（ｄ）配列番号２５〜２７（ＡＣＨ）、及び（ｅ）配列番号２８〜３０（ＡＨＢ）の集合は、ＮＴＣに対して得られたＣｔ値より小さいＣｔ値をもたらす。従って、（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、及び（ｅ）配列番号２８〜３０は、ＰＣＲウェル当たり１２．５ＧＵ及び２５ＧＵで、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウスＤＮＡをそれぞれ検出する。阻害対照は、陽性ＰＣＲシグナルをもたらし、サンプル又はサンプル中の汚染物質（複数可）の存在下におけるＰＣＲ阻害の程度を測定する。
【００６９】
【表５】
2014236727.tif 000006
【００７０】
実施例２
[0065]この実施例は、標的アリサイクロバチルス属ＤＮＡを検出するための本発明の核酸の感度について実証している。
【００７１】
[0066]実施例１の手順に従って滴定実験を実施して、（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、及び（ｅ）配列番号２８〜３０の各々の能力を試験し、それによって様々な量のアリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウスＤＮＡ（標的ＤＮＡ）をそれぞれ検出した。試験した標的ＤＮＡの量は、ＰＣＲウェル当たり１０，０００、１，０００、１００、５０及び１０ＧＵであった。結果は、（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、及び（ｅ）配列番号２８〜３０の各々が、ＰＣＲウェル当たり１０，０００、１，０００、１００、５０及び１０ＧＵの量でそれぞれの標的ＤＮＡを検出できることを示した。従って、本発明の核酸は、ゲノムＤＮＡで１０ＧＵの検出限界（ＬＯＤ）を有する。
【００７２】
実施例３
[0067]この実施例は、本発明の核酸の特異性について実証している。
【００７３】
[0068]４種の腐敗性アリサイクロバチルス属種及び７種の非腐敗性アリサイクロバチルス属種（表６）、並びに１５種の非アリサイクロバチルス属種（表７）からゲノムＤＮＡを単離し、実施例１に記載の通り希釈する。トリスｐＨ８．３緩衝液（１０ｍＭ）を標的無し対照（ＮＴＣ）として使用する。
【００７４】
[0069]実施例１の手順に従って、（ａ）配列番号１６〜１８、（ｂ）配列番号１９〜２１、（ｃ）配列番号２２〜２４、（ｄ）配列番号２５〜２７、及び（ｅ）配列番号２８〜３０の各々を使用して、表６及び７の微生物の各々由来のＤＮＡサンプルを試験する。全てのプローブを、５’を６−ＦＡＭ蛍光色素及び３’をＢＨＱ１消光物質で又は５’をＲＯＸ蛍光色素及び３’をＢＨＱ２消光物質で標識する。
【００７５】
【表６】
2014236727.tif 000007
【００７６】
【表７】
2014236727.tif 000008
【００７７】
[0070]実施例１で述べたように、ＮＴＣに対して測定されたＣｔ値は３８より大きく、この値はバックグラウンドシグナルと考えられる。従って、３８未満のＣｔ値は、微生物の存在について陽性と考えられる。
【００７８】
[0071]表６及び７に示すように、配列番号１９〜２１、配列番号２２〜２４、配列番号２５〜２７、及び配列番号２８〜３０の各々は、ＰＣＲウェル当たり１，０００ＧＵで、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウス標的ＤＮＡをそれぞれ特異的に検出する。しかし、非標的アリサイクロバチルス属ＤＮＡ及び非アリサイクロバチルス属種由来ＤＮＡの存在下では、バックグラウンドシグナルしか検出されない。従って、配列番号１９〜２１は、アリサイクロバチルス・アシドテッレストリスに対して特異性が高く、配列番号２２〜２４は、アリサイクロバチルス・アシドフィルスに対して特異性が高く、配列番号２５〜２７は、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカスに対して特異性が高く、配列番号２８〜３０は、アリサイクロバチルス・ヘルバリウスに対して特異性が高い。
【００７９】
[0072]表６及び７に示すように、属特異的な配列番号１６〜１８は、ＰＣＲウェル当たり１，０００ＧＵで、腐敗性及び非腐敗性アリサイクロバチルス属種ＤＮＡを検出した。しかし、非アリサイクロバチルス属種由来ＤＮＡの存在下では、バックグラウンドシグナルしか検出されない。従って、配列番号１６〜１８は、アリサイクロバチルス属の微生物に対して特異性が高い。
【００８０】
実施例４
[0073]この実施例は、一般的なアリサイクロバチルス属（アリサイクロバチルス属種）並びにアリサイクロバチルス・アシドテッレストリス、アリサイクロバチルス・アシドフィルス、アリサイクロバチルス・サイクロヘプタニカス、及びアリサイクロバチルス・ヘルバリウス種の微生物の、本発明の核酸を使用する検出について実証している。
【００８１】
[0074]９６穴プレートにおいて全容積２５μＬのＰＣＲ反応混合物中に各種由来のサンプルＤＮＡ  １．２μＬを使用して、実施例１の手順を進める。陰性対照は、水２．５μＬであった。ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ＳＴＥＰＯＮＥＰＬＵＳ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で熱サイクル条件を使用して、ＰＣＲを行う。熱サイクル条件は、９５℃で１５秒間（変性）及び６０℃で６０秒間（アニーリング及び伸長）を４０サイクル含む。
【００８２】
[0075]結果は、実施例１において得られた結果と一致している。
【００８３】
[0076]参照により組み込まれるものとして各参照文献を個別に及び具体的に示しその全体を本明細書に記載する場合と同程度に、本明細書に引用する刊行物、特許出願及び特許を含めた全ての参照文献を参照により本明細書に組み込む。
【００８４】
[0077]本明細書において特に明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、本発明に記載の内容において（特に以下の特許請求の範囲の内容において）、用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び「少なくとも１つの」並びに類似の論及の使用は、単数と複数の両方に及ぶものと解釈される。本明細書において特に明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、１つ又は複数の項目（例えば「Ａ及びＢの少なくとも１つ」）のリストを受ける用語「少なくとも１つ」の使用は、列挙された項目（Ａ若しくはＢ）又は列挙された項目のうち２つ以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）から選択される１つの項目を意味するものと解釈される。用語「含む」、「有する」、「含む」、及び「含有する」は、特に明記しない限り、制限のない用語（即ち、「を含むがこれに限定されない」という意味）として解釈される。本明細書における数値範囲の説明は、単にその範囲内に該当する各数値を個別に指す略記法としての役割しか意図しておらず、本明細書において別段の指示がない限り、各数値は、本明細書において個別に列挙されるように、明細書に組み込まれる。本明細書において特に明記されない又は文脈よって明確に否定されない限り、本明細書に記載される全ての方法は任意の適当な順序で実施することができる。本明細書で使用されるあらゆる例又は例示的な言い回し（例えば、「など」）は、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、特に主張しない限り、本発明の範囲に制限を加えるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠ないずれの請求項にも記載されていない要素を示すとは解釈されないものとする。
【００８５】
[0078]本発明を実施するにあたって本発明者に既知の最良の様式を含めて、この発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載されている。これら好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読めば即座に当業者に明らかになろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に利用することを期待し、本明細書において具体的に記載される以外の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、準拠法に認められているように、この発明は、本明細書に添付されている請求項に記載の内容の修正及び同等物を全て含む。そのうえ、本明細書において特に明記しない又は文脈によって明確に否定しない限り、その考えられる全ての変形における上記要素のいずれの組合せも本発明に包含される。
【配列表】
2014236727000001.app
【外国語明細書】
2014236727000001.pdf