(57)【要約】【課題】便中または尿中の微量ヘモグロビンが高感度に測定でき、便中または尿中に共存する還元性物質などの影響が無く、生化学自動分析機に適用可能で定量的な測定が出来る安価な測定法および試薬を提供する。【解決手段】色素源として、フェノチアジン構造やジフェニルアミン構造を持つ式１または式２で表される化合物とハイドロペルオキシドを使用し、ヘモグロビンの触媒作用による分解反応で色素が生成する反応を利用し、測定試薬PHが５．５−８の中性付近の条件を採用することで、検体中の還元性物質の影響のなく、微量なヘモグロビン量を定量的に検出測定できる試薬を構築し、高感度で定量性のあるヘモグロビン高感度測定法と試薬を開発する事で可能になった。本開発の試薬は生化学自動分析装置に簡便に適応できるため、検査室において利用可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
PHが５．５−８の緩衝液中で、色素源として式１または式２で表されるフェノチアジン構造あるいはジフェニルアミン構造を持つ化合物、およびハイドロペルオキシドを使用し、ヘモグロビンの触媒活性を利用して色素を生成させ、発生した色素の吸光度を測定するヘモグロビンの測定法。
【請求項２】
便中または尿中のヘモグロビンを測定する試薬である請求項１の測定法。
【請求項３】
ハイドロペルオキシドがクメンハイドロペルオキシドまたはターシャリーブチルハイドロペルオキシドである請求項１または請求項２の測定法。
【請求項４】
検体中の還元性物質をヨウ素酸塩で酸化処理、および／またはアスコルビン酸オキシダーゼで消去する請求項２、または請求項３、の測定法。
【請求項５】
緩衝剤がグッドの緩衝剤ＡＤＡおよび／またはグリシルグリシンである請求項１、または請求項４、の測定法。
【請求項６】
色素源として式１または式２で表されるフェノチアジン構造あるいはジフェニルアミン構造を持つ化合物、およびハイドロペルオキシドを含有し、PHが５．５−８であるヘモグロビンの測定試薬。
【請求項７】
緩衝剤がグッドの緩衝剤ＡＤＡおよび／またはグリシルグリシンである請求項６、の試薬。
【請求項８】
ハイドロペルオキシドがクメンハイドロペルオキシドまたはターシャリーブチルハイドロペルオキシドである請求項６、または請求項７、の試薬。
【請求項９】
ヨウ素酸塩および／またはアスコルビン酸オキシダーゼを含有する請求項６、または請求項７、または請求項８、の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸癌検診あるいは血尿を診断する臨床診断の分野において使用される、便中または尿中のヘモグロビンを定量的に測定し、共存する物の影響のない高感度な測定方法および試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来ヘモグロビンの安価な定量法は、ヘモグロビンにシアン化カリとフェリシアン化カリを使用してシアンメトヘモグロビンにして測定する方法が行われている。しかしこの方法は数ｇ／ｄＬレベルのかなり高濃度のヘモグロビン量でなければ測定できないため、主として血中ヘモグロビンの定量測定に使用されており、便中や尿中の低濃度のヘモグロビンの定量測定には使用できなかった。  具体的には、便中ヘモグロビンでは、大腸癌の健診に重要なスクリーニング検査になっているが、数１００ｎｇ／ｄＬの微量なヘモグロビンが検出可能な高感度な測定法が必要であり、尿中のヘモグロビンでは、腎臓疾患を初期診断するレベル即ち尿試験紙で±とされる３００ｎｇ/mL程度のヘモグロビンを検出する必要がある。この濃度では従来法のシアンメトヘモグロビン法では検出が不可能であった。
【０００３】
現在、尿中のヘモグロビンを検出する際に最も使用されているのは尿試験紙である。尿試験紙は簡易な方法で操作できるが、結果の判定が主に目視で行われ、どうしても定性的な診断結果となる。
また、一般に尿試験紙の問題点として、偽陽性反応や偽陰性反応も挙げられている。偽陽性反応の原因 としては強度細菌尿、強度白血球尿
精液の大量混入 古い尿、アルカリ性尿などがあり、 偽陰性反応の原因としては 強力な還元物質（アスコルビン酸等）の混入 高比重尿、高蛋白尿などがある。
これらは、尿試験紙の反応が１００％検体中の水分を使用する事、即ち検体／試薬の比が無限大であり、検体自身が反応の媒体でなければならない事により、検体中の種々の影響物質がダイレクトに高濃度で反応系に入って来る事が原因である。ヘモグロビンを検出するには検体／試薬の比が大きいほど高感度になるが、反面影響物質も大量に入ってくる事になり、前出の原因が無視できなくなる状況になる。この点を解消するには、検体／試薬の比を出来るだけ小さくすること、即ち微量のヘモグロビンで大きな吸光度を得る高感度な測定法が必要になる。
また尿試験紙は低濃度の感度が十分ではなく、定量性でなく定性性であるため、尿試験紙の判定で±とされた場合は、再検として患者は尿の沈査中の赤血球数を顕微鏡でカウントする検査を受ける必要が生じていた。この±とされる３００ｎｇ/mL程度のヘモグロビンを定量的に検出する事ができれば再検の確率は低下し、再検のためわざわざ患者が採来院する必要が少なくなる。この様に高感度な測定法で定量が出来れば再検する必要性はぐんと少なくなる。尿試験紙検査ではヘモグロビンの検出にヘモグロビンの偽パーオキシダーゼ作用を利用し、ハイドロペルオキシドと色素源の酸化反応による呈色を測定する方法である。この方法は色素源としてテトラメチルベンジジンや、o-トリジンが使用されている。しかしこれらの色素源は酸化反応で色素を発生するが、１分子の色素を発生させるのに、２個の水素原子を酸化する必要があり、ヘモグロビンの偽パーオキシダーゼ作用による色素発生が遅く、感度不足で定量的な測定が出来ない。
また、尿中には、ビタミンＣ入りのドリンク剤などを飲んだ場合に高濃度のアスコルビン酸が含まれるが、アスコルビン酸は酸化発色反応を阻害する他、発色した色素そのものを還元して無色にするため、偽陰性になってしまう危険性がある。通常アスコルビン酸の消去には、アスコルビン酸オキシダーゼを使用するが、しかしこの色素源を使った酸化発色反応の至適PHは４−４．５の範囲にあり、アスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼを処方するに当たり、この測定試薬の条件下では、アスコルビン酸オキシダーゼの安定性を確保することが難しい状況であった。このため、十分にアスコルビン酸の影響をなくすことが出来ない。
【０００４】
この様な感度的な問題の解決法として、抗ヘモグロビン抗体を使用し、抗原抗体反応の結果生じる濁りを吸光度的に測定する方法やネフェロメーターで濁度測定する方法も提案された。しかし、この方法では免疫法であるためアスコルビン酸の影響はないが、試薬にポリクローナル抗体を使用するために非常に高価であり、かつ、濁度を測定するには特別な機器が必要であった。またポリクローナル抗体を作成するには羊や山羊などの大動物に長期間抗原を免疫し、血液を採取・精製して取得するが、動物の個体差があり、抗体の再現性にも問題があった。
【０００５】
一方、色素源として、式１や式２に示すフェノチアジン構造やジフェニルアミン構造を持ち、分解反応で色素が生成する構造の物質を使用して、過剰量のヘモグロビンを触媒として、食油中の過酸化脂質などをハイドロペルオキシド量を測定する方法は提案されているが、逆に、この色素源とハイドロペルオキシドを使用して、ヘモグロビンを測定する方法は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】なし
【特許文献２】なし
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】河合圭一、鈴木英治、他      日本口腔外科学会雑誌    vol 31 No8  1854-1858 (1985)アルフレッサファーマ（株）  ネスコート「ヘモキット−N」  添付文書David A.A, Samuel S.  Clin. Chem.  Vol21 362-369  (1975)CrosbyW.H.  Furth F.W.  Blood  vol11  380-383  (1956)渡辺信子、  橋本佳明、  etc    臨床病理  vol 51 403-408 (2003)フレグランス  ジャーナル  No.76(1986)   p31 〜34 Biochemistry International  Vol.10 No.2 February (1986)  p205-211 Agric. Biol.Chem. 49(9)  (1985)    2799-2801Isao Fujii, Noriaki Hirayama,Norihito Aoyama, Akira Miike   Bull. Chem. Soc. Jpn.   69, 1423-1427(1996)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
便中または尿中のヘモグロビンが高感度に測定でき、便中または尿中に共存する還元性物質などの影響が無く、生化学自動分析機に適用可能で定量的な測定が出来る安価な測定法および試薬が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者は種々検討の結果、色素源として、フェノチアジン構造やジフェニルアミン構造を持つ式１または式２で表される化合物とハイドロペルオキシドを使用し、ヘモグロビンの触媒作用による分解反応で色素が生成する反応を利用し、測定試薬PHが５．５−８の中性付近の条件でヘモグロビン量に比例して色素生成反応の速度が増加し、約５分以内に反応が終了し、極微量なヘモグロビン濃度を定量的に測定可能な測定系を開発した。本発明の反応では、従来の様な色素源にある水素原子２個の酸化反応ではなく、色素源分子のカルバモイル残基の結合1つを分解する事で色素が発生する反応を応用する。即ち１分子の色素を発生させるのに、１個の結合子を分解すれば良く、あとは分解されたものが自然に系中の酸素により色素へと酸化されるためヘモグロビンの触媒作用による色素発生が早く、発生する色素の分子吸光係数が大きいため、高感度な測定が出来る事が判明し本発明を完成した。
本発明は次の１〜９に関する。
１、PHが５．５−８の緩衝液中で、色素源として式１または式２で表されるフェノチアジン構造あるいはジフェニルアミン構造を持つ化合物、およびハイドロペルオキシドを使用し、ヘモグロビンの触媒活性を利用して色素を生成させ、発生した色素の吸光度を測定するヘモグロビンの測定法。
２、便中または尿中のヘモグロビンを測定する試薬である１、の測定法。
３、ハイドロペルオキシドがクメンハイドロペルオキシドまたはターシャリーブチルハイドロペルオキシドである１、または２、の測定法。
４、検体中の還元性物質をヨウ素酸塩で酸化処理、および／またはアスコルビン酸オキシダーゼで消去する２、または３、の測定法。
５、緩衝剤がグッドの緩衝剤ＡＤＡおよび／またはグリシルグリシンである１、または４、の測定法。
６、色素源として式１または式２で表されるフェノチアジン構造あるいはジフェニルアミン構造を持つ化合物、およびハイドロペルオキシドを含有し、PHが５．５−８であるヘモグロビンの測定試薬。
７、緩衝剤がグッドの緩衝剤ＡＤＡおよび／またはグリシルグリシンである６、の試薬。
８、ハイドロペルオキシドがクメンハイドロペルオキシドまたはターシャリーブチルハイドロペルオキシドである６、または７、の試薬。
９、ヨウ素酸塩および／またはアスコルビン酸オキシダーゼを含有する６、または７、または８、の試薬。
検体としては、尿の場合は随時採取された原尿またはヘモグロビンを安定化する溶液で希釈した液が検体であり、便の場合は数ｍｇ〜数１０ｍｇの便を一定量の純水またはヘモグロビン安定化剤を含有する溶液で分散溶解したものをそのままもしくは不溶成分を濾過した濾液を検体とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、腎臓疾患を初期診断するレベル即ち尿試験紙で±とされる低濃度の尿中のヘモグロビンや、初期の大腸癌スクリーニングで行われる便中のヘモグロビン測定に使用出来る高感度な測定法と試薬を提供する。尿中には、ビタミンＣ入りのドリンク剤などを飲んだ場合に高濃度のアスコルビン酸が含まれるが、本発明の試薬はｐＨが５．５〜８の範囲にできるため、還元性物質の代表であるアスコルビン酸を消去できるアスコルビン酸オキシダーゼを試薬中に処方することが出来るため、影響もない。
【００１１】
また、尿中にはアスコルビン酸以外にも還元性物質が含まれている。その具体的な例として、チオール基を持つシステイン、グルタチオンなどや尿酸、ビリルビンも存在する。これらの影響を消去するために、本発明の試薬にはヨウ素酸塩類を添加して使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
一般式１と一般式２を示す。
図１に本発明に使用される色素源の一般式、式１と式２を示す。式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同一もしくは異なって良く、水素、Ｃ1〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン基、アリール基、またはヒドロキシル基やカルボキシル基、１または２級アミノ基、ハロゲン基、スルホニル基などで置換されたＣ1〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン基、アリール基を示し、ＺとＹは同一もしくは異なって良く酸素原子、硫黄原子を示し、Ｒ５は水素Ｃ1〜Ｃ６のアルキル基、アルキレン基、アリール基、または置換アルキル基、置換アルキレン基、置換アリール基を示す。置換基とはヒドロキシル基やカルボキシル基、１または２級アミノ基、ハロゲン基、スルホニル基などを示す。Ｒ６、Ｒ７は同一もしくは異なって良く、水素、ハロゲン基、ニトロ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、置換アミノ基、スルホニル基、ニトリル基、Ｃ１〜Ｃ３の置換もしくは非置換アルキル基示す。ここでの置換基とは前述の置換基を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
測定は次のような工程で測定される。
（１）試薬１としてＰＨ５．５〜８に緩衝能のある緩衝液に色素源、アスコルビン酸オキシダーゼ、必要であればシクロデキストリンまたは界面活性剤、および反応促進物質、ヨウ素酸塩等を添加含有させた液を使用し、これに検体を添加して３７℃約３〜７分間加温する。この工程で検体中に含有される可能性のある影響物質を消去または影響しなくなるように処理する。
（２）次にＰＨ５．５〜８の緩衝液にハイドロペルオキシドと界面活性剤、必要であればシクロデキストリンまたは界面活性剤、および反応促進物質等を含有する試薬２を（１）に添加・混合し、さらに３７℃で3〜７分間加温する。この工程で色素源とハイドロペルオキシドの存在下ヘモグロビンの触媒作用で色素が生成する。
（３）吸光度を測定し、標準液のそれと比較してヘモグロビン濃度を算出する。
工程（１）〜（３）の操作は近年では生化学自動分析装置で自動的に実施される。自動分析機の第１試薬に相当する所に試薬１をセットし、第2試薬に相当する所には試薬２をセットする。
具体的には工程（１）において、還元性影響物としてのアスコルビン酸はアスコルビン酸オキシダーゼでデヒドロアスコルビン酸に酸化されて影響が解消され、システイン、ビリルビンはヨウ素酸カリウムの様な弱酸化力のある化合物による酸化で解消される。検体の濁りに対しては界面活性剤により可溶化されて影響が解消される。
工程（２）においては、色素源とハイドロペルオキシドの存在下ヘモグロビンの触媒作用で色素が生成するが、存在するヘモグロビン量によって触媒作用および色素生成が増減し、結果としてヘモグロビン量と色素量が比例する。
工程（３）においては、工程（２）で精製した色素量を、吸光度を測定することで検出し、その吸光度はヘモグロビン量と比例する。
【００１４】
色源体として体的には式１または式２で表される化合物を使用する。
式１は一般にフェノチアジンまたはフェノオキサジンと言われる化合物の誘導体であり、もっとも好適に使用される。
【００１５】
式２は一般にジフェニルアミン誘導体であるが、パラ位に電子供与基が望ましく、上記化合物に比べて少し感度が劣るが、試薬盲検が小さい。
【００１６】
本発明に使用する色素源の具体的な例としては、たとえばBiochemistry 
International  Vol.10 No.2 February (1986)  p205-211 やAgric. Biol. Chem. 49(9)  (1985)    2799-2801あるいはBull. Chem. Soc. Jpn.   69,
1423-1427 (1996)に示された色素源や、ＤＡ−６７（和光純薬工業）として、市販されているものが代表的なものである。例示すれば、１０Ｎ―メチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン（ＭＣＤＰと略す）、１０Ｎ―カルボキシルメチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン（和光純薬工業、ＤＡ−６７と略）、１０Ｎ―メチルチオカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン（ＭＴＤＰ）、１０Ｎ―カルボキシルメチルチオカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン、１０Ｎ―メチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノ―２―ニトロフェノチアジン、１０Ｎ―カルボキシルメチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノ―２―ニトロフェノチアジン、１０Ｎ―メチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノ―２―クロロフェノチアジン、１０Ｎ―カルボキシルメチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノ―２―クロロフェノチアジン、１０Ｎ―フェニルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン、１０Ｎ―カルボキシルフェニルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン、１０Ｎ―フェニルメチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン、１０Ｎ―ヒドロキシメチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン、１０Ｎ―カルボキシルエチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン、４,４‘―ジメチルアミノジフェニル―Ｎ―メチルカルバモイル―アミン、４,４‘―ジメチルアミノジフェニル―Ｎ―メチルチオカルバモイル―アミン等が用いられる。用いる濃度としては０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬの範囲がよい。これらの中には水溶性の乏しいものがある。この様なものを水溶液中に溶解させるものとして、下記に挙げる界面活性剤や抱接作用のあるシクロデキストリン類が用いることが出来る。
【００１７】
本発明に使用される緩衝剤としては、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩等の有機酸の他、グリシルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤も良い。特に好適には、グリシルグリシン緩衝剤、グッド緩衝剤である。用いられる濃度は通常緩衝効果のある１−１００ｍＭが良い。
【００１８】
また、本発明には、便中の脂肪成分や尿中の濁りを可溶化させる界面活性剤も使用できる。たとえばポリエチレンオキサイド鎖および、中〜高級脂肪酸を持つ界面活性剤、例示すればツイーン２０やツイーン６０、ツイーン６５、ツイーン８０、トリトンＸ―１００、エマルゲン類（花王）、プルロニック類（旭電化）、テトロニック類（旭電化）も良いが、添加により得られる吸光度が減少するものもあり、可溶化能と求める吸光度を鑑みて適宜添加する。また、高級脂肪酸のスルホン酸塩であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やラウリル硫酸カリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸カリウム、パルミチル硫酸ナトリウム、ステアリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム及びラウリル硫酸トリエタノールアミン等も使用できる。特にＳＤＳは反応速度上昇に効果もあり、好適に用いられる。
また、ヘモグロビンの触媒作用をさらに促進するものとして、ベンズイミダゾール構造を持つものが好適である。特に２―メチルベンズイミダゾールやチアベンダゾールなどが挙げられる。
【実施例１】
【００１９】
測定試薬の作成
ＡＤＡ緩衝剤の５０ｍＭ（同仁化学研究所）のＰＨ６．０溶液にβ−シクロデキストリン（和光純薬工業）を４ｍｇ／ｍＬ、２−メチルベンゾイミダゾール（和光純薬工業）１ｍｇ／ｍＬ、チアベンダゾール（和光純薬工業）０．０２ｍｇ／ｍＬ、トリエチレンテトラミン−ヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ、同仁化学研究所）１ｍｇ／ｍＬ、ヨウ素酸カリウム（和光純薬工業）１ｍｇ／ｍＬを添加溶解し、再度ＰＨを６．０に調製し、基本緩衝液とした。
次に基本緩衝液１００ｍＬにツイーン２０（和光純薬工業）を５ｍｇ／ｍＬ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、和光純薬工業）１ｍｇ／ｍＬ、クメンヒドロペルオキシド（和光純薬工業）を５ｍｇ添加して撹拌・溶解して、均一にしたものを試薬２とした。また、基本緩衝液１００ｍＬに、ＤＡ−６７（和光純薬工業）を１０ｍｇ添加し、良く撹拌溶解したものを試薬イＲ１とし、さらに、イＲ１の５０ｍＬにアスコルビン酸オキシダーゼ（和光純薬工業）５００単位添加して試薬ロＲ１とした。
一方、比較のために基本緩衝液のｐＨを４．５に調製した後、色素源ＤＡ―６７の代わりに、ｏ―トリジン塩酸塩５ｍｇを基本緩衝液５０ｍＬに溶解し、同様にアスコルビン酸オキシダーゼ（和光純薬工業）５００単位添加したものをハＲ１としたを用意した。測定にはそれぞれイＲ１、ロＲ１、ハＲ１を第１試薬として検体を前処理し、その後Ｒ２を第２試薬として添加し、ヘモグロビンの触媒反応を進行させる。
【実施例２】
【００２０】
ヘモグロビンの測定
実施例１で作成したイＲ１、ロＲ１をそれぞれ試薬１とし、実施例１の試薬２を使用して次の実験を行った。人血由来ヘモグロビン（シグマ−アルドリッチ）を生理食塩水で溶解、希釈して３．８μｇ／ｍＬの濃度にし、これをヘモグロビンの標準液とした。また、影響物としてアスコルビン酸の１００ｍｇ／ｄＬの溶液、尿酸の１０ｍｇ／ｄＬの溶液も作成した。また人の随時尿も用意した。１０ｍＬ入り試験管を６本用意し、これに（１）生理食塩水２００μＬ、（２）ヘモグロビン標準液１００μＬと生理食塩水１００μＬ、（３）アスコルビン酸の溶液１００μＬとヘモグロビン標準液１００μＬ、（４）尿酸の溶液１００μＬとヘモグロビン標準液１００μＬ、（５）随時尿１００μＬと生理食塩水１００μＬ、（６）随時尿１００μＬとヘモグロビン標準液１００μＬを入れ、次に各試験管に実施例１のイＲ１またはロＲ１の試薬１を２ｍＬずつ入れ、添加撹拌して３７℃、３分間加温した。次に各試験管にＲ２を１ｍＬずつ添加撹拌して３７℃、７分間加温した。分光光度計（島津ＵＶ２６００型）で各溶液の吸光度を測定したところ、表１に示す結果となった。
【表１】
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感度としては一定量のヘモグロビンの触媒反応の結果生成する色素の吸光度とし、アスコルビン酸の影響としては、アスコルビン酸とヘモグロビン標準液を添加したものの吸光度とヘモグロビン標準液のみを添加したものの吸光度の比を百分率で表した％をアスコルビン酸の影響とした。また、尿酸の影響については尿酸とヘモグロビン標準液を添加したものの吸光度とヘモグロビン標準液のみを添加したものの吸光度の比を百分率で表した％を尿酸の影響とした。尿成分の影響は随時尿とヘモグロビン標準液を添加したものから尿単独のものの吸光度の差とヘモグロビン標準液のみを添加したものの吸光度の比を百分率で表した％を尿成分の影響とした。
色素を本発明のＤＡ―６７を使用した場合、ｏ−トリジンを使用した場合に比べて約１０〜１２倍になり、非常に高感度な分析試薬が構築できた。また、アスコルビン酸オキシダーゼの添加効果は、アスコルビン酸オキシダーゼを添加していない場合（イＲ１）、回収率が４５％大きく影響を受けたが、添加した場合（ロＲ１）の９８．８％では、大きく差が出た。尿酸の影響は色素が本発明の色素を使用すればほとんど影響はないが、色素が従来のテトラメチルベンジジンでは２６％と大きな影響もあった。尿の中には尿酸の他にアスコルビン酸、微量であるがシステインなどのＳＨ化合物も含まれているため、従来の色素では影響もかなりある。しかし、本発明の色素では、アスコルビン酸オキシダーゼを入れておけば回収率も高く、影響がほとんどなかった。
【実施例３】
【００２１】
実施例２のヘモグロビン標準液を生理食塩水で希釈して、尿試験紙で＋１と判定される濃度である０．６μ／ｍＬ、±と判定される０．３μｇ／ｍＬのヘモグロビン溶液を作成し、上記ロＲ１とＲ２を使用して感度を求めるため（１）と（２）の操作をそれぞれ５回ずつ行い、感度の統計処理を行ったところ、それぞれ０．６μｇ／ｍＬでは平均０．０６６ＡＢＳ、変動係数３．１％、０．３μｇ／ｍＬでは平均０．０３２ＡＢＳ、変動係数５．２％という結果であった。この程度の感度（吸光度）と再現性（変動係数）であれば定量的にヘモグロビンが測定できる。
一方、尿試験紙としてテルモ社製、「ウリエースKc」を使用し、前述の０．６μｇ／ｍＬおよび０．７μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、および０．４μｇ／ｍＬの液に浸責して２０秒後に判定した所、０．６μｇ／ｍＬのものはほぼ＋１、０．３μｇ／ｍＬのものは±と判定されたが、０．６μｇ／ｍＬと０．７μｇ／ｍＬのものの区別は難しく、．３μｇ／ｍＬと０．４μｇ／ｍＬのものの区別も難しい状況であった。これでは、試験紙を使用した測定は定量的とは言えない。
【実施例４】
【００２２】
ＭＴＤＰ、ＭＣＤＰの合成
メチレンブルー（和光純薬工業）１０ｇを脱イオン水１Ｌに室温で溶解し、これにハイドロサルファイトナトリウム２０ｇを添加して撹拌し、メチレンブルーを還元してロイコメチレンブルーを合成した。この溶液にさらにクロロホルムを３００ｍＬ添加ししてゆっくり撹拌し、クロロホルム層にロイコメチレンブルーを抽出溶解させた。クロロホルム層を分液ロートで分離し、分離したクロロホルム層に乾燥した濾紙を投げ込んでクロロホルム層を乾燥した。濾紙を取り出し、クロロホルム層にメチルイソチオシアナート（シグマ−アルドリッチ）１５ｇを添加して、室温で２日間反応させてＭＴＤＰを合成した。内径５ｃｍガラスカラムにシリカゲル６０（和光純薬工業）を５００ｍＬ詰めてクロロホルムで洗浄し、クロロホルム／酢酸エチル／酢酸＝７０／３０／２の溶液でコンディショニングしたカラムに反応液を添加し、そのままクロロホルム／酢酸エチル／酢酸＝７０／３０／２の溶液で溶出した。シリカゲル薄層クロマトグラフィーでＭＴＤＰを確認しながらリッチカットを取得し、リッチカットをロータリーエバポレータで減圧濃縮した。濃縮残渣にメタノール２００ｍＬを入れて加温しながら溶解し、溶解後氷冷して再結晶させた。減圧下、ヌッチェに濾紙を当てて、メタノールで洗浄後、メタノールを入れた残渣を濾過し、再結晶したＭＴＤＰを取得した。デシケータ中で減圧乾燥して約３．５ｇのＭＴＤＰを得た。
また、上記クロロホルム層にメチルイソチオシアナートの代わりにメチルイソシアナート１５ｍＬを添加して、上記と同じ操作法で再結晶したＭＣＤＰ５．２ｇを得た。
【実施例５】
【００２３】
アスコルビン酸オキシダーゼを添加した実施例２のロＲ１と同様の組成を第１試薬とし、色素源のＤＡ−６７の代わりに、イ：実施例４で合成したＭＴＤＰを、ロ：１０Ｎ―メチルカルバモイル―３，７ジメチルアミノフェノチアジン（ＭＣＤＰ）、ハ：ＤＡ−６４（和光純薬工業）を使用して実施例２と同様な実験を行った。ただし、ＭＴＤＰとＭＣＤＰを基本緩衝液に溶解する際には、１０ｍｇをメタノール２ｍＬにあらかじめ溶解した後に緩衝液に添加して溶解した。また、ＭＴＤＰ，ＭＣＤＰを使用したイ、ロの場合の分光光度計の波長は６６６ｎｍ、ＤＡ−６４を使用したハの場合の波長は７２０ｎｍを使用した他は同様に行った。
結果を表２に示す。
【表２】
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本発明の色素源を使用してヘモグロビンを測定すれば、高感度なヘモグロビンの測定が出来、アスコルビン酸の影響や尿成分の影響も非常に少なく測定可能であった。また、尿試験紙で＋１と判定される濃度である０．６μ／ｍＬ、±と判定される０．３μｇ／ｍＬのヘモグロビン溶液ではそれぞれ吸光度が表２に示すように十分に感度がある結果であった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明の測定法と試薬は、微量な尿中または便中のヘモグロビンを検出・定量出来る感度を持ち、一番問題として言われているアスコルビン酸の還元性による影響もほとんどない試薬と測定法が提供できた。これにより、従来尿試験紙の判定で±とされた場合は、再検として患者は尿の沈査を顕微鏡で見る検査を受ける必要が生じていたが、この±とされる３００ｎｇ/mL程度のヘモグロビンを定量的に検出する事ができる様になるため、再検の確率は低下し、再検のためわざわざ患者が採来院する必要が少なくなる可能性がある。
【符号の説明】
【００２５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同一もしくは異なって良く、水素、Ｃ1〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン基、アリール基、またはヒドロキシル基やカルボキシル基、１または２級アミノ基、ハロゲン基、スルホニル基などで置換されたＣ1〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン基、アリール基を示し、ＺとＹは同一もしくは異なって良く酸素原子または硫黄原子を示し、Ｒ５は水素、Ｃ1〜Ｃ６のアルキル基、アルキレン基、アリール基、または置換アルキル基、置換アルキレン基、置換アリール基を示す。置換基とはヒドロキシル基やカルボキシル基、１または２級アミノ基、ハロゲン基、スルホニル基などを示す。Ｒ６、Ｒ７は同一もしくは異なって良く、水素、ハロゲン基、ニトロ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、置換アミノ基、スルホニル基、ニトリル基を示し、ここでの置換基とは前述の置換基を示す。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月17日(2013.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】色素源の構造式の図式１はフェノチアジン型の色素源を一般式で表したものであり、Rｎ、Y、Zは下記の意味を示す。式２はジフェニルアミン型の色素源を一般式で表したものであり、Rｎ、Yは下記の意味を示す。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同一もしくは異なって良く、水素、Ｃ1〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン基、アリール基、またはヒドロキシル基やカルボキシル基、１または２級アミノ基、ハロゲン基、スルホニル基などで置換されたＣ1〜Ｃ４のアルキル基、アルキレン基、アリール基を示し、ＺとＹは同一もしくは異なって良く酸素原子、硫黄原子を示し、Ｒ５は水素Ｃ1〜Ｃ６のアルキル基、アルキレン基、アリール基、または置換アルキル基、置換アルキレン基、置換アリール基を示す。置換基とはヒドロキシル基やカルボキシル基、１または２級アミノ基、ハロゲン基、スルホニル基などを示す。Ｒ６、Ｒ７は同一もしくは異なって良く、水素、ハロゲン基、ニトロ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、置換アミノ基、スルホニル基、ニトリル基、Ｃ１〜Ｃ３の置換もしくは非置換アルキル基示す。ここでの置換基とは前述の置換基を示す。