(57)【要約】      （修正有）【課題】微小幹細胞に関する詳細な解析や応用研究に必要な、大量の微小幹細胞を容易に調製する方法を提供すること。【解決手段】骨質を材料として微小幹細胞を分離することを特徴とする、微小幹細胞の分離方法。骨質由来微小幹細胞の免疫染色によるマーカーが、幹細胞マーカー陽性、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、血管内皮細胞マーカー陽性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも１種を指標として微小幹細胞を分離する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨質を材料として微小幹細胞を分離することを特徴とする、微小幹細胞の分離方法。
【請求項２】
微小幹細胞が直径10μm以下である、請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
幹細胞マーカー陽性、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも１種を指標として微小幹細胞を分離する、請求項１又は２に記載の分離方法。
【請求項４】
さらに、血管内皮細胞マーカー陽性を指標として微小幹細胞を分離する、請求項３に記載の分離方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の分離方法によって分離された微小幹細胞。
【請求項６】
（a）骨質由来であり、
（b）直径10μm以下であり、
（c）幹細胞マーカー陽性であり、
（d）血球系細胞マーカー陰性であり、且つ
（e）アポトーシスマーカー及び／又は死細胞マーカー陰性であり、
微小幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小幹細胞の分離方法、及び該分離方法によって得られた微小幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には、VSEL（Very Small Embryonic-Like stem cell）という極めて微小な幹細胞が存在することが知られている。
【０００３】
微小幹細胞の分離方法としては、骨髄や臍帯血中から、微小幹細胞の性質（表面マーカー等）を利用して分離する方法が各種報告されている（非特許文献１〜６）。例えば、非特許文献１においては、マウスの骨髄から、Lineageマーカー及びCD45が陰性であり、且つSca-1が陽性である細胞を微小幹細胞として分離したこと、及び該細胞は核／細胞比が大きい非常に小型（直径2〜4μm）の細胞であることが報告されている。非特許文献２においては、ヒト臍帯血から、Lineageマーカー及びCD45が陰性であり、且つCXCR4、CD34、又はCD133が陽性である細胞を微小幹細胞として分離したこと、及び該細胞は核／細胞比が大きい非常に小型（直径3〜5μm）の細胞であることが報告されている。また、非特許文献３においては、アセトアルデヒド脱水素酵素（ALDH）の活性が高いことが、微小幹細胞の分離の指標となり得ることが報告されている。非特許文献４においては、微小幹細胞は比重が大きいため、遠心による分離方法では同じく比重が大きな赤血球との分離が困難であることを課題としており、遠心加速度を変えて数回に分けて遠心分離を行うことにより微小幹細胞を赤血球と分けて分離できることが報告されている。非特許文献５及び６においては、微小幹細胞が小型の細胞であることに着目し、ヒト又はマウスの骨髄から、直径が2〜10μmの細胞であり、且つLineageマーカー及びCD45が陰性であり、且つCXCR4、CD34、又はCD133が陽性である細胞を微小幹細胞として分離したことが報告されている。
【０００４】
微小幹細胞については、核／細胞比が大きく極めて小型であるという形態的な特徴のみならず、性質的な特徴についても各種報告されている（非特許文献７〜１２）。例えば、非特許文献７においては、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、肝臓障害を引き起こす四塩化炭素（CCl4）、又は筋肉障害を惹起するcardiotoxinをマウスに投与すると、微小幹細胞が末梢血中に動員されることが報告されている。非特許文献８には、微小幹細胞のゲノムにおいては、多能性幹細胞マーカーであるOct4遺伝子のプロモーター領域のクロマチン構造がオープンになっていること、及びゲノム刷り込みが見られる遺伝子について、ES細胞とは異なるメチル化パターンを有するという、エピジェネティックな特性が報告されている。非特許文献９には、微小幹細胞が、膵臓発生のマーカーである、Nkx6.1、Pdx1、及びPtf1を高く発現しているということが報告されている。非特許文献１０においては、心筋梗塞モデルマウスに対して微小幹細胞を投与すると、左心室機能が改善したことが報告されている。非特許文献１１には、脳梗塞後に、微小幹細胞が末梢血中に動員されることを示唆する結果が報告されている。非特許文献１２においては、マウス骨髄中の微小幹細胞数が加齢と共に減少することが報告されている。
【０００５】
このような性質を有する微小幹細胞については、その分化多能性についても各種報告されている（非特許文献１、１３〜１４）。例えば、非特許文献１においては、微小幹細胞を単核細胞と共に各種分化誘導培地中で培養する実験により、微小幹細胞が3胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力を示すことを明らかにしたことが報告されている。非特許文献１３及び１４においては、微小幹細胞をOP9細胞（ストローマ細胞）と共培養すると、血液系細胞に分化することが報告されている。
【０００６】
このような微小幹細胞に関する更なる解析、及び再生医療等の分野における応用を見据えた場合、微小幹細胞を効率的に分離することが求められる。しかしながら、既報の骨髄や臍帯血を材料とする分離方法（例えば非特許文献１〜６）は、微小幹細胞の分離効率が非常に低い。そのため、微小幹細胞に関する詳細な解析やその応用研究は、現段階では困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kucia M, Ratajczak MZ et al. A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4+SSEA-+Oct-4+stem cells identified in adult bone marrow. Leukemia 20:857-869, 2006.
【非特許文献２】Kucia M, Ratajczak MZ et al. Morphological and molecular characterization of novel population of CXCR4+SSEA-4+OCT4+ very small embryonic-like cells purified from human cord blood-preliminary report. Leukemia 21:297-303,2007.
【非特許文献３】Paczkowska E, et al.: Aldehyde dehydrogenase (ALDH)- a promising new candidate for use in preclinical selection of pluripotent very small embryonic-like stem cells (VSEL SCs) of high long-term repopulating hematopoietic potential. Ann Transplant 16:59-71,2011.
【非特許文献４】Bhartiya D, et al.: Very small embryonic-like stem cells with maximaum regenerative potential get discarded during cord blood banking and bone marrow processing for autologous stem cell therapy. Stem Cells and Development 21:1-6,2012.
【非特許文献５】Sovalat H, et al.: Identification and isolation from either adult human bone marrow or G-CSF-mobilized peripheral blood of CD34+/CD133+/CXCR4+/Lin-CD45- cells, featuring morphological, molecular, and phenotypic characteristics of very small embryonic-like (VSEL) stem cells. Exp Hematol 39:495-505,2011.
【非特許文献６】Zuba-Surma EK, et al.: “Small stem cells” in adult tissues: Very small embryonic-like stem cells stand up ! Cytometry PartA 75A:4-13,2009.
【非特許文献７】Kucia M et al.: Evidence that very small embryonic like (VSEL) stem cells are mobilized into peripheral blood. Stem Cells 26:2083-2092,2008.
【非特許文献８】Shin DM, et al.: Novel epigenetic mechanisms that control pluripotency and quiescence of adult bone marrow-derived Oct4+ very small embryonic-like stem cells. Leukemia 23:2042-2051,2009.
【非特許文献９】Huang Y, et al.: Bone marrow transplantation temporarily improves pancreatic function in streptozotocin-induced diabetes: Potential involvement of very small embryonic-like cells. Transplantation  89:677-685,2010.
【非特許文献１０】Dawn B, et al.: Transplantation of bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells attenuates left ventricular dysfunction and remodeling after myocardial infaction. Stem Cells 26:1646-1655,2008.
【非特許文献１１】Paczkowska E, et al.: Clinical evidence that very small embryonic-like stem cells are mobilized into peripheral blood after stroke. Stroke 40:1237-1244,2009.
【非特許文献１２】Zuba-Surma EK, et al.: Very small embryonic-like stem cells in adult tissues-potential implications for aging. Mech Ageing Dev 130:58-66,2009.
【非特許文献１３】Ratajczak J, et al.: Adult murine bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells differentiate into the hematopoietic lineage after coculture over OP9 stromal cells. Exp Hematol 39:225-237,2011.
【非特許文献１４】Ratajczak J et al.: Hematopoietic differentiation of umbilical cord blood-derived very small embryonic/epiblast-like stem cells. Leukemia 25:1278-1285,2011.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、効率的に微小幹細胞を分離する方法を提供することを課題とする。より具体的には、微小幹細胞に関する詳細な解析や応用研究に必要な、大量の微小幹細胞を容易に調製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、間葉系幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞が含まれることがよく知られている骨髄ではなく、骨質に大量の微小幹細胞が含まれていることを見出した。そして、骨質を材料として微小幹細胞を分離することにより、非常に効率的に微小幹細胞を分離できることを見出した。さらに、骨質由来の微小幹細胞は、骨髄や臍帯血由来の微小幹細胞とは異なる性質を有していることをも見出した。これらの知見に基づき、さらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【００１０】
即ち、本発明は、下記の構成を有するものを包含する。
項1-1．  骨質を材料として微小幹細胞を分離することを特徴とする、微小幹細胞の分離方法。
項1-2．  骨皮質を材料として微小幹細胞を分離することを特徴とする、微小幹細胞の分離方法。
項２.  微小幹細胞が直径10μm以下である、項1-1又は1-2に記載の分離方法。
項3-1．  幹細胞マーカー陽性、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも１種を指標として微小幹細胞を分離する、項1-1〜２のいずれかに記載の分離方法。
項3-2．  少なくとも血球系細胞マーカー陰性を指標として微小幹細胞を分離する項3-1に記載の分離方法。
項3-3．  少なくとも血球系細胞マーカー陰性及び幹細胞マーカー陽性を指標として微小幹細胞を分離する項3-1又は3-2に記載の分離方法。
項3-4．  幹細胞マーカー陽性、血球系細胞マーカー陰性、並びにアポトーシスマーカー及び／又は死細胞マーカー陰性を指標として微小幹細胞を分離する、項3-1〜3-3のいずれかに記載の分離方法。
項４.  さらに、血管内皮細胞マーカー陽性を指標として微小幹細胞を分離する、項3-1〜3-4のいずれかに記載の分離方法。
項５.  項1-1〜４のいずれかに記載の分離方法によって分離された微小幹細胞。
項６.  （a）骨質由来であり、
（b）直径10μm以下であり、
（c）幹細胞マーカー陽性であり、
（d）血球系細胞マーカー陰性であり、且つ
（e）アポトーシスマーカー及び／又は死細胞マーカー陰性である
微小幹細胞。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、微小幹細胞を効率的に分離することができるため、容易に大量の微小幹細胞を調製することができる。また、材料である骨質は、有用部分である骨髄を除いた後に残る部分であり、通常廃棄される。したがって、骨質を材料とする本発明の分離方法は、材料を容易に且つ大量に、しかも低コストで準備できる点でも、極めて優れている。また、本発明により分離された骨質由来の微小幹細胞は、従来知られている骨髄や臍帯血由来の微小幹細胞とは性質が異なっている。したがって、本発明の分離方法によれば、微小幹細胞として新規の細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】骨質又は骨髄に含まれるマウス微小幹細胞の割合を示す。
【図２】マウス微小幹細胞の分離結果を示す。
【図３】骨質又は骨髄に含まれるマウス微小幹細胞の割合を示す。
【図４】ヒト骨質由来微小幹細胞の分離結果を示す。
【図５】微小幹細胞の形態を示す。
【図６】骨質由来微小幹細胞の遺伝子発現パターンを示す。
【図７】マウス骨質由来微小幹細胞の陽性マーカー及び陰性マーカーを示す。
【図８】ヒト骨質由来微小幹細胞の陽性マーカー及び陰性マーカーを示す。
【図９】骨質由来微小幹細胞と間葉系幹細胞の大きさの比較を示す。
【図１０】骨質由来微小幹細胞と間葉系幹細胞の増殖特性を示す。
【図１１】マウス骨髄由来微小幹細胞と造血幹細胞の大きさの比較を示す。
【図１２】マウス骨質由来微小幹細胞と造血幹細胞の大きさの比較を示す。
【図１３】ヒト骨質由来微小幹細胞と、間葉系幹細胞及び造血幹細胞との大きさの比較を示す。
【図１４】加齢による骨質由来微小幹細胞数の挙動を示す。
【図１５】GFPマウス骨質由来微小幹細胞の観察結果を示す。
【図１６】CCl4投与前後の肝臓組織切片標本のHE染色結果を示す。
【図１７】CCl4投与前後の血清トランスアミナーゼ（AST、ALT）の推移を示す。
【図１８】CCl4投与前後の微小幹細胞の割合を示す。
【図１９】破骨細胞の活性化による微小幹細胞及び造血幹細胞の挙動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
1．微小幹細胞の分離方法
本発明は、骨質を材料として微小幹細胞を分離することを特徴とする、微小幹細胞の分離方法に関する。
【００１４】
骨質とは骨基質を主成分とする骨組織部分であり骨髄とは区別される組織である。本発明において、骨質は、骨（硬骨の場合、通常、骨膜、骨質、及び骨髄からなる）の骨髄以外の部分である限り特に限定されない。具体的に、骨質としては、例えば硬骨における骨膜及び骨質からなる部分が挙げられ、好ましくは硬骨における骨膜を含まない骨質部分（緻密骨及び海綿骨からなる）が挙げられ、より好ましくは硬骨における骨皮質（緻密骨部分）が挙げられる。材料となる骨質は１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００１５】
骨質の由来生物は、骨を有する生物である限り特に限定されない。具体的に、骨質の由来生物としては、例えばヒト、マウス、アカゲザル、ウサギ、若しくはラット等の哺乳類；ニワトリ等の鳥類；アフリカツメガエル等の両生類；又はゼブラフィッシュ、メダカ、若しくはトラフグ等の魚類が挙げられ、好ましくはヒト、マウス、アカゲザル、ウサギ、又はラット等の哺乳類が挙げられ、より好ましくはヒト、マウス、又はラットが挙げられる。骨質の由来生物は１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００１６】
骨質の原料である骨の種類は、特に限定されず、種々の種類のものを採用することができる。具体的に、骨質が由来する骨の種類としては、例えば上腕骨、橈骨、尺骨、大腿骨、脛骨、若しくは腓骨等の長骨；手根骨、若しくは足根骨等の短骨；頭頂骨、後頭骨、肋骨、若しくは胸骨等の扁平骨；又は上顎骨等の含気骨が挙げられ、好ましくは上腕骨、橈骨、尺骨、大腿骨、脛骨、又は腓骨等の長骨が挙げられ、より好ましくは大腿骨、又は脛骨が挙げられる。骨質の原料は１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００１７】
骨質は、骨髄を含有する骨を原料とする場合は、例えば骨を切断し、骨の内腔に存在する骨髄を除去することにより得ることができる。骨髄の除去は、公知の方法により行うことができる。例えば、PBSなどの緩衝液を洗浄液として、骨の内腔を洗い流すという方法が挙げられる。また、骨髄を含有しない骨を原料とする場合は、骨をそのまま骨質として用いることができる。なお、原料である骨としては、例えば骨頭置換術等の手術で取り除かれた骨頭を採用することができる。
【００１８】
得られた骨質は、そのまま材料として用いてもよいが、公知の方法により破砕又は粉砕してから用いる方が好ましい。破砕又は粉砕方法としては、例えば乳鉢上ですりつぶす方法や、各種破砕機又は粉砕機を用いる方法が挙げられる。
【００１９】
微小幹細胞の分離は、微小幹細胞の分離方法として知られている公知の方法に従って行うことができる。公知の方法としては、例えば非特許文献１〜６に記載の方法を挙げることができる。具体的には、例えば、材料である骨質から細胞を抽出し、得られた細胞抽出物から、微小幹細胞の性質として公知の性質を指標として細胞を分離することにより行われる。
【００２０】
細胞の抽出は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、細胞抽出に使用される公知のタンパク質分解酵素で、骨質を処理することにより行われる。この処理により、骨質中の骨基質を構成するコラーゲンなどのタンパク質が分解され、骨基質中に埋め込まれて存在する細胞が抽出される。
【００２１】
タンパク質分解酵素は、骨基質を構成するタンパク質を分解する活性を有する酵素であれば特に限定されない。タンパク質分解酵素としては、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、又はプロナーゼが挙げられ、好ましくはコラゲナーゼ又はディスパーゼが挙げられ、より好ましくはコラゲナーゼとディスパーゼの混合物が挙げられる。コラゲナーゼとディスパーゼの混合物としては、重量比（コラゲナーゼ重量：ディスパーゼ重量）が、例えば1．0：0.1〜10、好ましくは1．0：0.5〜4、より好ましくは1．0：1．0〜1.5である混合物が挙げられる。タンパク質分解酵素は１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００２２】
タンパク質分解酵素による処理は、公知の酵素処理方法、具体的には、例えばタンパク質分解酵素が含まれた溶媒中で、骨質（好ましくは骨質粉砕物）を反応させることにより行われる。
【００２３】
溶媒は、タンパク質分解酵素が失活せず、且つ細胞が変性しない限り特に限定されない。溶媒としては、例えばPBSなどの緩衝液、又はα培地等の細胞培養培地を用いることができる。
【００２４】
タンパク質分解酵素の濃度は、タンパク質分解酵素が活性を発揮する限り特に限定されず、タンパク質分解酵素の種類に応じて適宜設定することができる。タンパク質分解酵素の濃度としては、例えば0.1〜10μg/mL、好ましくは1．0〜6.0μg/mL、より好ましくは2.5〜4.0μg/mLが挙げられる。
【００２５】
反応温度は、タンパク質分解酵素が失活せず、且つ細胞が変性しない限り特に限定されず、タンパク質分解酵素の種類に応じて適宜設定することができる。反応温度としては、例えば20〜50℃、好ましくは30〜40℃が挙げられる。
【００２６】
処理時間は、タンパク質分解酵素が活性を発揮することができる限り特に限定されない。処理時間としては、例えば0.5〜4時間、好ましくは1〜2時間が挙げられる。
【００２７】
なお、カルシウムイオンやマグネシウムイオン等により活性が阻害されるタンパク質分解酵素（例えば下記のトリプシン等）を使用する場合は、さらにEDTAやEGTA等のキレート剤を、例えば0.5〜1.5ｍMの濃度になるようにさらに加えるとよい。また、反応中は、反応溶液中の骨質が沈澱しないように、穏やかに撹拌するとよい。
【００２８】
得られた細胞抽出物からの、微小幹細胞の性質として公知の性質を指標とした細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。
【００２９】
例えば、微小幹細胞は非常に小型の細胞（マウスでは直径3〜5μm程度、ヒトでは直径4〜7μm程度）であるため、直径が10μmより大きな骨質内の他の細胞（骨芽細胞や破骨細胞）と、大きさの点で区別することができる。したがって、例えば直径が10μm以下であることを指標として、好ましくは死細胞に由来する細胞断片などを排除することを目的として直径が4〜10μmであることを指標として、微小幹細胞を分離することができる。
【００３０】
直径を指標として細胞を分離する場合は、例えばフローサイトメーターにより、直径を示す前方散乱光を測定し、一方でコントロール（例えば直径4μmのビーズ及び直径10μmのビーズ）の前方散乱光を測定し、コントロールの測定結果に基づいて、直径が4〜10μmの細胞をフローサイトメーターの細胞分取機能を用いて分取する。
【００３１】
また、別の例として、骨髄や臍帯血由来の微小幹細胞は、特徴的なマーカーを指標として分離したことが報告されている。したがって、微小幹細胞に特徴的な細胞マーカーの陽性及び／又は陰性を指標として、微小幹細胞を分離することができる。具体的には、例えば、幹細胞マーカー陽性、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも１種を指標として、好ましくは血球系細胞マーカー陰性を指標として、より好ましくは血球系細胞マーカー陰性及び幹細胞マーカー陽性を指標として、さらに好ましくは、血球系細胞マーカー陰性、幹細胞マーカー陽性、並びにアポトーシスマーカー及び又は死細胞マーカー陰性を指標として、微小幹細胞を分離することができる。
【００３２】
幹細胞マーカーとしては、幹細胞マーカーとして公知のマーカーである限り特に限定されず、例えば胚性幹細胞マーカー、造血幹細胞マーカー、神経幹細胞マーカー、又は間葉系幹細胞マーカー等の各種幹細胞マーカーが挙げられる。具体的には、例えばSca-1、CD133、CD34、VE-cadherin、Nestin、Oct-4、Nanog、CXCR4、Tie2、Flk-1、PDGFRα、CD105、CD90.2、CD49e、CD49f、CD29、CD90、又はCD271等が挙げられ、好ましくは、Sca-1、CD133、CD34、VE-cadherin、Nestin、Tie2、PDGFRα、CD105、CD90.2、CD49e、CD49f、CD29、又はCD90が挙げられ、より好ましくはSca-1、CD34、VE-cadherin、CD105、CD90.2、CD49e、CD49f、又はCD29が挙げられ、さらに好ましくはSca-1、CD34、CD105、CD90.2、CD49e、CD49f、又はCD29が挙げられる。幹細胞マーカーは１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３３】
血球系細胞マーカーとしては、血球系細胞、例えば好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、若しくはマクロファージ等の白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、又は樹状細胞等のマーカーとして公知のマーカーである限り特に限定されない。具体的には、例えばB220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、Ter119、CD2、CD3、CD4、CD14、CD19、CD24、CD41、CD56、CD66c、CD235a、又はCD45等を挙げることができる。なお、好ましくは、マウスの場合はB220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、及びTer119全てをLineageマーカーとして用い、ヒトの場合はCD2、CD3、CD4、CD14、CD19、CD24、CD41、CD56、CD66c、及びCD235a全てをLineageマーカーとして用い得る。血球系細胞マーカーは１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３４】
アポトーシスマーカーとしては、具体的には、例えばAnnexinV、TUNEL、JC-1、cytochrome C、Rhodamine 123、又はTMRE/TMRM等が挙げられ、好ましくはAnnexinVが挙げられる。アポトーシスマーカーは１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３５】
死細胞マーカーとしては、具体的には、例えば7ADD、PI、又はHoechst 33258等が挙げられ、好ましくは7ADDが挙げられる。死細胞マーカーは１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３６】
さらに、幹細胞マーカー陽性、血球系細胞マーカー陰性、アポトーシスマーカー陰性、及び死細胞マーカー陰性よりなる群から選択される少なくとも１種を指標とすることに加えて、血管内皮細胞マーカー陽性を指標として微小幹細胞を分離することが好ましい。また、さらにその他のマーカーが陽性であることを指標として微小幹細胞を分離してもよい。
【００３７】
血管内皮細胞マーカーとしては、血管内皮細胞マーカーとして公知のマーカーである限り特に限定されない。具体的には、例えばCD34、PECAM-1(CD31)、又はVE-Cadherin等が挙げられる。血管内皮細胞マーカーは１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３８】
その他のマーカーとしては、例えばCD71が挙げられる。その他のマーカーは１種又は２種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００３９】
これらのマーカーを指標にした微小幹細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、細胞を染色し、染色された細胞が発する蛍光量に基づき陽性又は陰性を判断し、陽性又は陰性の細胞を分取することにより行われる。具体的には、これら一連の作業は、例えば細胞分取機能を有するフローサイトメーターを用いて行うことができる。
【００４０】
細胞の染色は、例えばマーカーが細胞内在性のタンパク質（例えば幹細胞マーカー等）である場合は、マーカーに対する標識抗体を用いて細胞抽出物中の細胞を免疫染色することにより行うことができ、マーカーがタンパク質以外の細胞内在性因子（例えば細胞表面のフォスファチジルセリン等）に結合する非標識物（例えばAnnexinV（アポトーシスマーカー））である場合は、該マーカーを標識したものを用いて細胞抽出物中の細胞を染色することにより行うことができ、マーカーがタンパク質以外の細胞内在性因子（例えばDNA等）に結合する標識物（蛍光物質）（例えば7ADD（死細胞マーカー））である場合は、該マーカーを用いて細胞抽出物中の細胞を染色することにより行うことができる。
【００４１】
マーカーに対する標識抗体や、標識されたマーカーは、各種市販されたものを用いることができる。或いは、公知の方法に従って、マーカーに対する抗体やマーカーを細胞に結合させた後、該抗体や該マーカーに対して標識物をさらに結合させてもよい。標識物の種類としては、FITC、PE、Pacific Blue、APC、PE-Cy7、PE-Cy5、PerCP、Brilliant Violet 570、又はBrilliant Violet421が挙げられる。標識物の選択は、使用するマーカー間で、標識物の蛍光励起波長や蛍光波長のピークができるだけ重ならないものを選択する方が好ましい。
【００４２】
陽性又は陰性の判断は、公知の方法に従って、染色された細胞が発する蛍光量に基づいて行われる。この判断は、公知の手法に従って行うことができる。例えば、ネガティブコントロール細胞（具体的には、例えばアイソタイプコントロール抗体で染色された細胞）が発する蛍光量をバックグラウンドの蛍光量とし、バックグラウンドに対して十分に高い蛍光量を基準に、該基準よりも蛍光量が低い細胞を陰性細胞と判断し、該基準よりも蛍光量が高い細胞を陽性細胞と判断する。
【００４３】
陽性又は陰性の細胞の分取は、公知の方法に従って、例えば液滴荷電方式、又はセルキャプチャー方式等により行うことができる。
【００４４】
骨質を材料として微小幹細胞を分離することにより、微小幹細胞を効率的に分離することができ、且つ大量の微小幹細胞を容易に調製することができる。また、材料である骨質は通常廃棄される部分であるため、骨質を材料とした上記分離方法は、原材料コストが非常に低い点、及び原材料調達が容易である点で優れている。
【００４５】
2．骨質由来微小幹細胞
本発明は、上記「1．微小幹細胞の分離方法」により分離された微小幹細胞に関する。また、本発明は、（a）骨質由来であり、（b）直径10μm以下であり、（c）幹細胞マーカー陽性であり、（d）血球系細胞マーカー陰性であり、且つ（e）アポトーシスマーカー陰性である微小幹細胞にも関する。以下、これらを総称して「本発明の微小幹細胞」と示すこともある。
【００４６】
（a）：骨質由来とは、本来骨質に存在している細胞であることを示す。骨質については上記「1．微小幹細胞の分離方法」と同様である。
【００４７】
（b）：微小幹細胞の大きさは、直径10μm以下であり、好ましくは4〜10μmである。
【００４８】
（c）、（d）、及び（e）：微小幹細胞は、幹細胞マーカー陽性であり、血球系細胞マーカー陰性であり、且つアポトーシスマーカー陰性であることによって特徴付けられる。好ましくは、さらに血管内皮細胞マーカーが陽性であることにより特徴付けられる。幹細胞マーカー、血球系細胞マーカー、アポトーシスマーカー、及び血管内皮細胞マーカーについて、並びに陽性又は陰性の判断については上記「1．微小幹細胞の分離方法」と同様である。
【００４９】
本発明の微小幹細胞は、骨質由来であるが故に、従来知られている骨髄や臍帯血由来の微小幹細胞とは性質が異なっている。したがって、本発明の微小幹細胞は、従来の微小幹細胞とは異なる新規の細胞であり、新たな研究材料として提供されるものである。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
実施例1：細胞表面マーカーを指標としたマウス骨質由来微小幹細胞の分離
骨髄由来微小幹細胞を分離する指標として既に知られている（非特許文献※１）、Lineage及びCD45が陰性であり且つSca-1が陽性であるという指標に基づき、マウス骨質を材料として微小幹細胞を分離した。具体的には次のように行った。
【００５２】
［細胞液の調製］
6匹の8週齢雌C57BL/6マウスより、合計12本の脛骨（tibia）を採取した。これらの脛骨を材料として、下記（1）〜（4）の4つの方法により細胞液を調製した。なお、下記方法で用いるCollagenase-Dispase液は、PBSを用いてCollagenase type I（Invitrogen社）溶液(10μg/ml)、及びDispase（Invitrogen社）溶液(10μg/ml)をそれぞれ別々に調製した後、millipore filterで滅菌し、滅菌済みCollagenase溶液3mlと滅菌済みDispase溶液4mlとを混合し、さらに20%FCSを含むα培地13mlを混合して調製した。
（1）Bone Marrow (flush)：脛骨4本の骨端を切除し、脛骨内腔に存在する骨髄を、PBS＋2%FCSで洗い流した。得られた骨髄液を細胞液とした。
（2）Bone (crush)：（1）で残った、骨髄が除去された骨質部分を乳鉢で粉砕し、得られた粉砕物をPBS＋2%FCSで洗浄した。洗浄後に残った粉砕物をビーカーに入れ、該粉砕物が十分に浸る程度にcollagenase-dispase液を加えた。該ビーカーを37℃の恒温器中の振盪プレート上におき、ビーカー内の液を穏やかに撹拌しながら1時間処理した。得られた処理液を細胞液とした。
（3）Whole bone wash (wash)：脛骨4本を乳鉢で粉砕し、得られた粉砕物をPBS＋2%FCSで洗浄した。洗浄液を回収し、これを細胞液とした。
（4）Whole bone (whole)：脛骨 4本を乳鉢で粉砕し、得られた粉砕物を上記（2）と同様にcollagenase-dispase液で処理した。得られた処理液を細胞液とした。
【００５３】
［免疫染色］
上記（1）〜（4）の4つの方法によって得られた細胞液（flush、crush、wash、whole）中の細胞等を、FITC標識されたLineageマーカー（B220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、Ter119)抗体、PE標識されたCD45抗体、Pacific Blue標識されたSca-1抗体、APC標識されたPDGFRα抗体、7ADD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて、定法に従って免疫染色した。
【００５４】
［FACS解析］
FACS（FACS Aria（BD Bioscience））により、細胞等が免疫染色された細胞液から、Lineage（血球系細胞マーカー）及びCD45（血球系細胞マーカー）が陰性であり、且つSca-1（幹細胞マーカー）が陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。なお、陽性であるか陰性であるかの境界の設定は、定法に従って行った。
【００５５】
［結果］
上記（1）〜（4）の4つの方法によって得られた細胞液（flush、crush、wash、whole）それぞれに含まれる微小幹細胞の割合を図1に示す。図1の結果は、上記実験を合計3回施行し、得られた結果の平均値を求め、SD（standard deviation, 標準偏差）エラーバーを付したものである。図1より、上記（2）の方法によって得られた細胞液（crush：骨質を材料として調製された細胞液）に含まれる微小幹細胞（骨質由来微小幹細胞）の割合は、上記（1）の方法によって得られた細胞液（flush：骨髄を材料として調製された細胞液）に含まれる微小幹細胞（骨髄由来微小幹細胞）の割合よりも、有意に（P<0.01）高いことが示された。このことから、微小幹細胞を分離する材料として骨質を用いることにより、従来知られていた材料である骨髄に比べて遥かに効率的に微小幹細胞を分離できることが明らかとなった。
【００５６】
実施例2.細胞直径及び細胞表面マーカーを指標としたマウス骨質由来微小幹細胞の分離
骨髄由来微小幹細胞は、直径が5μm前後と非常に小型であることが知られている（非特許文献※１）。そこで、細胞表面マーカーに加えて細胞直径を指標として、骨質由来微小幹細胞を分離した。具体的には次のように行った。
【００５７】
［細胞液の調製、免疫染色、FACS解析］
まず実施例1と同様に、細胞液を調製し、これらの細胞液中の細胞等を免疫染色した。次に、この細胞液から、直径が4〜10μmの細胞を分離した。具体的には、FACS解析において粒子の大きさを示す前方散乱光（FSC）を、4μmと10μmの2種類のビーズそれぞれについて測定し、この測定結果に基づき、細胞のFSC解析において直径4〜10μmの大きさにゲートを設定して分離した。このゲートの設定により、直径4μm以下の細胞断片を除去すると共に、直径10μm以上の造血幹細胞（HSC）や間葉系幹細胞（MSC）の混入を防ぎ、精度の高い解析やソーテイング（細胞分取）が期待される。さらに、ゲート内の細胞から、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、及びCD45（血球系細胞マーカー）陰性であり、且つSca-1（幹細胞マーカー）陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。
【００５８】
［結果］
FACSによる分離結果を図2に示す。図2中、Aは、骨髄を材料とした場合の分離結果を示し、Bは、骨質を材料とした場合の分離結果を示す。骨髄を材料とした場合、微小幹細胞の細胞分画（CD45とSca-1の展開図の右下枠）には極めて少数の細胞しか認められなかった（図2A）。一方、骨質を材料とした場合、微小幹細胞の細胞分画には多数の細胞が認められた（図2B）。図3には、骨質を材料とした場合（図3中、「Bone」）及び骨髄を材料とした場合（図3中、「Bone Marrow」）における、細胞液に含まれる微小幹細胞の割合を示す。微小幹細胞の割合は、骨質を材料とした場合（1507±1082個/1×106 events）の方が、骨髄を材料とした場合（25±17個/1×106 events）よりも有意に（P<0.01）高い値であった。
【００５９】
実施例3：細胞表面マーカー及び細胞直径を指標としたヒト骨質由来微小幹細胞の分離
ヒト骨質を材料として、微小幹細胞を分離し、ヒト骨髄の結果と比較した。具体的には次のように行った。
【００６０】
［細胞液の調製］
関西医科大学倫理委員会の承認（関医倫第1114号）の下に、大腿骨の人工骨頭置換術の際に切除された大腿骨骨端部の骨皮質ブロック（1〜2cm角）の提供を受けた。骨皮質ブロックを生理食塩水で数回洗浄する際に、この洗浄液を回収し、溶血処理を行って骨髄由来細胞液を得た。残った骨皮質ブロックをcollagenase-Dispase液で分散し、37℃で1時間震盪処理した。分散後、骨皮質ブロックはスポンジ状となり、骨皮質細胞浮遊液が得られた。その後、70μmのセルストレーナーを通して骨片や細胞集塊を除去した。さらに溶血操作を行って赤血球を除去し、骨質由来細胞液を得た。
【００６１】
［免疫染色］
得られた細胞液中の細胞等を、FITC標識されたLineageマーカー(CD2、CD3、CD4、CD14、CD19、CD24、CD41、CD56、CD66c、CD235a)抗体、Pacific Blue標識されたCD45抗体、PE-Cy7標識されたCD34抗体、7AAD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて、定法に従って免疫染色した。
【００６２】
［FACS解析］
FACSを用いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、実施例2と同様に直径4〜10μmの細胞等を分離し、さらに7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、及びCD45（血球系細胞マーカー）陰性であり、且つCD34（幹細胞マーカー）陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。
【００６３】
［結果］
FACSによる分離結果を図4に示す。図4中、骨髄を材料とした場合（A）の微小幹細胞の細胞分画（CD45とCD34の展開図の右下枠）には極少数の細胞しか認められなかった。これに対して、骨質を材料とした場合（B）の微小幹細胞の細胞分画（CD45とCD34の展開図の右下枠）には多数の細胞が認められた。
【００６４】
試験例1：骨質由来微小幹細胞の形態の観察
マウス骨質由来微小幹細胞及びヒト骨質由来微小幹細胞の形態を観察した。具体的には次のように行った。
【００６５】
［マウス骨質由来微小幹細胞の分離］
実施例1と同様に、細胞液を調製し、細胞液中の細胞を免疫染色した。続いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、Lineage（血球系細胞マーカー）及びCD45（血球系細胞マーカー）が陰性であり且つSca-1（幹細胞マーカー）が陽性である細胞を微小幹細胞として分離し、これをマウス骨質由来微小幹細胞とした。
【００６６】
［ヒト骨質由来微小幹細胞の分離］
実施例3と同様に、細胞液を調製し、細胞液中の細胞を免疫染色した。続いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、直径が4〜10μmであり、且つ7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、及びCD45（血球系細胞マーカー）陰性である細胞を分離し、これをヒト骨質由来微小幹細胞とした。
【００６７】
［形態の観察］
分離された微小幹細胞の核をHoechst33342により定法に従って染色し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００６８】
［結果］
結果を図5に示す。図5中、Aはマウス骨質由来微小幹細胞の観察結果を示し、Bはヒト骨質由来微小幹細胞の分離過程を表すFACSデータ、及びヒト骨質由来微小幹細胞の観察結果を示す。図5より、骨質由来微小幹細胞は、直径が5μm前後であり、ほとんど細胞質が認められない、核／細胞比が大きな小型細胞であることが示された。この形態は、既報の骨髄由来微小幹細胞と類似した形態であった。
【００６９】
試験例2：骨質由来微小幹細胞の遺伝子発現パターンの解析
骨質由来微小幹細胞の遺伝子発現パターンを、胚性幹細胞（ES cell）、造血幹細胞（HSC（KSL））、間葉系幹細胞（MSC）と比較した。具体的には次のようにして行った。
【００７０】
［細胞の調製］
骨質由来微小幹細胞は、実施例1と同様の方法によって調製した。胚性幹細胞は、B6マウス由来の胚性幹細胞を使用した。間葉系幹細胞は、B6マウスの骨髄から、上記実施例1と同様に細胞液を調製し、該細胞液中の細胞を、FITC標識されたLineageマーカー（B220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、Ter119)抗体、PE標識されたCD45抗体、Pacific Blue標識されたSca-1抗体、APC標識されたPDGFRα抗体、7ADD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて、定法に従って免疫染色し、さらにFACSにより7ADD、AnnexinV、Lineage、及びCD45が陰性で、且つSca-1及びPDGFRαが陽性である細胞を分取することにより調製した。造血幹細胞は、B6マウスの骨髄から、上記実施例1と同様に細胞液を調製し、該細胞液中の細胞を、FITC標識されたLineageマーカー（B220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、Ter119)抗体、APC標識されたCD45抗体、Pacific Blue標識されたSca-1抗体、PE標識されたc-kit抗体、7ADD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて、定法に従って免疫染色し、さらにFACSにより7ADD、AnnexinV、及びLineageが陰性で、且つCD45、c-kit、及びSca-1が陽性である細胞を分取することにより調製した。
【００７１】
［発現パターンの解析］
各細胞より、定法に従ってmRNAを回収し、cDNAを合成した。胚性幹細胞マーカー（Oct4、Nanog、Rex1、Dppa3）、造血幹細胞マーカー（c-kit、Tal1、GATA2）、及び間葉系幹細胞マーカー（Nestin、Ang1、CXCL12、VE-Cadherin）の発現量を、realtime RT-PCRにより測定し、比較Ct法により定量した。
【００７２】
［結果］
表1に定量結果を示す。表1における数値は各種マーカーの発現量を示すものであり、胚性幹細胞マーカーの発現量については胚性幹細胞における発現量を1とし、造血幹細胞マーカーの発現量については造血幹細胞における発現量を1とし、間葉系幹細胞マーカーの発現量については間葉系幹細胞における発現量を1とした場合の値を示す。また、表1の結果をレーダープロットで表したものを図6に示す。
【００７３】
【表１】
2014073084.tif 000002
【００７４】
図6に示されるように、胚性幹細胞（ES cell）は胚性幹細胞マーカーであるOct4、Nanog、Rex1、Dppa3と間葉系幹細胞マーカーであるVE-cadherinを強く発現していた。造血幹細胞（KSL）は、造血幹細胞マーカーであるTal1、GATA2、c-kitと間葉系幹細胞マーカーであるAng1、VE-cadherinを強く発現していた。間葉系幹細胞（MSC）は、間葉系幹細胞マーカーであるAng1、CXCL12、Nestin、VE-cadherinを発現していた。一方、骨質由来微小幹細胞は、これらの3種類の幹細胞とは全く異なる遺伝子発現パターンを示し、間葉系幹細胞マーカーであるVE-cadherin、Nestinを強く発現していた。ただし、表1に示されるように、骨質由来微小幹細胞は、弱いながらも胚性幹細胞マーカーであるOct-4及びNanogを発現していた。
【００７５】
試験例3：骨質由来微小幹細胞の陽性マーカー及び陰性マーカーの解析
骨質由来微小幹細胞の陽性マーカー及び陰性マーカーを同定した。具体的には次のようにして行った。
【００７６】
試験例3-1：マウス骨質由来微小幹細胞の陽性マーカー及び陰性マーカーの解析
［陽性マーカー及び陰性マーカーの解析］
まず実施例1と同様に、骨質から細胞液を調製した。次に、得られた細胞液中の細胞を、FITC標識されたLineageマーカー(B220、CD11b、Ly6G、TcRαβ、TcRγδ、Ter119)抗体、APC標識されたCD45抗体、Pacific Blue標識されたSca-1抗体、7AAD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて定法に従って免疫染色し、さらにc-kit、CD133、CXCR4、Notch-1、Notch-3、Notch-4、SSEA-1、SSEA-4、PDGFRα、PDGFRβ、CD34、CD29、Flk1、CD71、CD105、CD90.2、CD49e、CD49f、c-Met、CD31、VE-cadherin、及びTie2のいずれか1つに対するPE標識抗体を用いて定法に従って免疫染色した。免疫染色された細胞液から、実施例1と同様に、Lineage（血球系細胞マーカー）及びCD45（血球系細胞マーカー）が陰性であり且つSca-1（幹細胞マーカー）が陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。得られた微小幹細胞について、c-kit、CD133、CXCR4、Notch-1、Notch-3、Notch-4、SSEA-1、SSEA-4、PDGFRα、PDGFRβ、CD34、CD29、Flk1、CD71、CD105、CD90.2、CD49e、CD49f、c-Met、CD31、VE-cadherin、及びTie2のそれぞれについて、陽性か或いは陰性かの判定をFACS解析により行った。
【００７７】
［結果］
各マーカーについてのFACSの解析結果を図7に示す。図7中、白抜きのピークは、各マーカーそれぞれに対する特異抗体で免疫染色された骨質由来微小幹細胞のピークを示し、グレーで塗りつぶされたピークは、アイソタイプコントロール抗体で免疫染色された骨質由来微小幹細胞のピークを示す。すなわち、グレーで塗りつぶされたピークに比べて、白抜きのピークが右側（より蛍光強度が強い側）にシフトしていれば、そのマーカーは骨質由来微小幹細胞において陽性であることを示す。図7の結果より、骨質由来微小幹細胞においては、CD34、CD90.2、CD49e、CD49f、CD29が強く発現されていると考えられる。また、CD133、CXCR4、Flk-1、CD71、PDGFRα、CD105、CD31、VE-cadherinは陽性を示す傾向にあり、一方、Notch-1、Notch-3、Notch-4、SSEA-1、SSEA-4、PDGFRβ、c-kit、c-Metは陰性を示す傾向にあることが明らかとなった。ただし、陽性を示す上記マーカーについてもCD29を除いて、白抜きピークとグレーで塗りつぶされたピークが一部重なっていることから、これらのマーカーについて全ての骨質由来微小幹細胞が陽性を示すわけではないと考えられる。
【００７８】
以上より、骨質由来微小幹細胞は、幹細胞マーカー、間葉系幹細胞マーカー、血管内皮細胞マーカーを発現する特異な細胞であると考えられる。
【００７９】
試験例3-2：ヒト骨質由来微小幹細胞の陽性マーカー及び陰性マーカーの解析
［陽性マーカー及び陰性マーカーの解析］
まず実施例3と同様に、骨質から細胞液を調製した。次に、得られた細胞液中の細胞を、FITC標識されたLineageマーカー(CD2、CD3、CD4、CD14、CD19、CD24、CD41、CD56、CD66c、CD235a)抗体、APC標識されたCD45抗体、Pacific Blue標識されたCD34抗体、7AAD、及びFITC標識されたAnnexinVを用いて定法に従って免疫染色し、さらにCD49ｆ、CD90、CD105、CD271、N-cadherin、KDR、CD133、CXCR4、Tie2、TRA1-60、及びTRA1-81のいずれか1つに対するPE標識抗体を用いて定法に従って免疫染色した。免疫染色された細胞液から、実施例3と同様に、Lineage（血球系細胞マーカー）及びCD45（血球系細胞マーカー）が陰性であり且つCD34（幹細胞マーカー）が陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。得られた微小幹細胞について、CD49ｆ、CD90、CD105、CD271、N-cadherin、KDR、CD133、CXCR4、Tie2、TRA1-60、及びTRA1-81のそれぞれについて、陽性か或いは陰性かの判定をFACS解析により行った。
【００８０】
［結果］
各マーカーについてのFACSの解析結果を図8に示す。図8中、各マーカーそれぞれに対する展開図中、右上の枠内に細胞が多い程、そのマーカーの陽性傾向が強いことを示す。図8の結果より、骨質由来微小幹細胞においては、CD49f、CD90、CD105、CD271が陽性を示すことが明らかとなった。一方、N-cadherin、KDR(Flk-1) 、CD133、CXCR4、Tie2、Tra-1-60、Tra-1-81は陰性を示す傾向にあることが明らかとなった。
【００８１】
試験例4：骨質由来微小幹細胞と間葉系幹細胞又は造血幹細胞との相違の解析
骨質由来微小幹細胞が、間葉系幹細胞又は造血幹細胞とは異なる細胞であることを示すために、以下の実験を行った。
【００８２】
試験例4-1：マウス骨質由来微小幹細胞と間葉系幹細胞との相違
マウス骨質由来微小幹細胞、及び別途調整した間葉系幹細胞について、細胞の大きさを比較した。さらに、これらの細胞を培養し、増殖特性を解析した。具体的には次のように行った。
【００８３】
［細胞の大きさの測定］
実施例1と同様に、細胞液を調製し、細胞液中の細胞を免疫染色した。続いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、CD45（血球系細胞マーカー）、及びPDGFRα陰性であり、且つSca-1（幹細胞マーカー）陽性である細胞を微小幹細胞として分離し、これをマウス骨質由来微小幹細胞とした。得られたマウス骨質由来微小幹細胞と別途公知の方法に従って調整した間葉系幹細胞について、細胞の大きさを示す前方散乱光（FSC）を測定した。
【００８４】
［微小幹細胞の増殖特性の解析］
分離されたマウス骨質由来微小幹細胞と間葉系幹細胞とを、それぞれ、F12/DMEM (1：1), 2% B27, 20 ng/ml bFGF, 10 ng/ml EGFを含む培地中で1週間、定法に従って培養した。培養中の細胞を倒立位相差顕微鏡で観察した。
【００８５】
［結果］
前方散乱光（FSC）の測定結果を図9に示す。図9中、グレーで塗りつぶされたピークは、マウス骨質由来Lin-CD45-Sca-１+PDGFRα-細胞（微小幹細胞を含む）のFSCの分布（平均蛍光強度：160）を示し、白抜きのピークは、間葉系幹細胞（Lin-CD45-Sca-１+PDGFRα+細胞）のFSCの分布（平均蛍光強度519）を示す。このように、マウス骨質由来微小幹細胞は間葉系幹細胞に比べて小型な細胞であることから、両者は異なる細胞であることが示唆された。
【００８６】
倒立位相差顕微鏡による観察結果を図10に示す。間葉系幹細胞（MSCs）は分裂増殖してクラスターを形成することが観察されたが、骨質由来微小幹細胞は分裂・増殖が観察されなかった。このことより、骨質由来微小幹細胞はdormant state (long G0/G1)にあることが示唆された。このように、両者は増殖特性が異なることから、異なる細胞であることが示唆された。
【００８７】
試験例4-2：マウス骨質由来微小幹細胞と造血幹細胞との相違
マウス骨質由来微小幹細胞及び造血幹細胞について、細胞の大きさを比較した。具体的には次のように行った。
【００８８】
［細胞の大きさの測定］
実施例1と同様に、細胞液を調製し、細胞液中の細胞を免疫染色した。続いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、c-kit、及びCD45（血球系細胞マーカー）陰性であり、且つSca-1（幹細胞マーカー）陽性である細胞を微小幹細胞として分離した。一方、細胞等が免疫染色された細胞液から、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）陰性であり、且つSca-1（幹細胞マーカー）、CD45（血球系細胞マーカー）、及びc-kit陽性である細胞を造血幹細胞として分離した。得られたマウス骨質由来微小幹細胞と造血幹細胞について、細胞の大きさを示す前方散乱光（FSC）を測定した。
【００８９】
［結果］
FACSによる分離の結果及び前方散乱光（FSC）の測定結果を、図11及び図12に示す。図11は骨髄を材料とした場合の結果を示し、図12は骨質を材料とした場合の結果を示す。図11及び図12中、cが微小幹細胞を示し、bが造血幹細胞を示す。図11及び図12のFSCの測定結果中、白抜きのピークが各マーカーを指標として分離された細胞の前方散乱光の分布を示し、グレーで塗りつぶされたピークは直径が4μm又は10μmのビーズの前方散乱光の分布を示す。骨質を材料とした場合の結果を示す図12より、マウス骨質由来微小幹細胞（c）は造血幹細胞（b）に比べて小型な細胞であった。このことより、両者は異なる細胞であることが示唆された。
【００９０】
試験例4-3：ヒト骨質由来微小幹細胞と間葉系幹細胞又は造血幹細胞との相違
ヒト骨質由来微小幹細胞、間葉系幹細胞、及び造血幹細胞について、細胞の大きさを比較した。具体的には次のように行った。
【００９１】
［細胞の大きさの測定］
実施例3と同様に、細胞液を調製し、細胞液中の細胞を免疫染色した。続いて、細胞等が免疫染色された細胞液から、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、CD45、及びSSEA-4陰性であり、且つCD34（幹細胞マーカー）陽性である細胞をヒト骨質由来微小幹細胞として分離した。一方、細胞等が免疫染色された細胞液から、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）、及びCD34（幹細胞マーカー）陰性であり且つSSEA-4陽性である細胞を間葉系幹細胞として分離し、7ADD（死細胞マーカー）、AnnexinV（アポトーシスマーカー）、Lineage（血球系細胞マーカー）陰性であり且つCD34（幹細胞マーカー）、CD45（血球系細胞マーカー）、及びCD133（幹細胞マーカー）陽性である細胞を造血幹細胞として分離した。得られたヒト骨質由来微小幹細胞、間葉系幹細胞、及び造血幹細胞について、細胞の大きさを示す前方散乱光（FSC）を測定した。
【００９２】
［結果］
結果を図13に示す。図13中、AはFACSによる分離結果を示し、Bは前方散乱光（FSC）の測定結果を示す。図13B中、グレーで塗りつぶされたピーク（c）はヒト骨質由来微小幹細胞（Lin-CD45-CD34+SSEA-4-細胞）の前方散乱光の分布（平均蛍光強度：169）を示し、上段の白抜きのピーク（a）は造血幹細胞（Lin-CD45+CD34+CD133+細胞）の前方散乱光の分布（平均蛍光強度：412）を示し、下段の白抜きのピークは（b）間葉系幹細胞（Lin-CD45-CD34-SSEA-4+細胞）の前方散乱光の分布（平均蛍光強度：462）を示す。図13より、ヒト骨質由来微小幹細胞は間葉系幹細胞及び造血幹細胞に比べて小型な細胞であった。このことより、ヒト骨質由来微小幹細胞は、間葉系幹細胞及び造血幹細胞とは異なる細胞であることが示唆された。
【００９３】
試験例5：加齢による骨質由来微小幹細胞数の挙動
個体の加齢に伴い、骨髄由来微小幹細胞数は減少することが報告されている。そこで、骨質由来微小幹細胞についても加齢による細胞数の挙動を調べ、骨髄由来微小幹細胞と比較した。具体的には次のように行った。
【００９４】
［加齢による細胞数の挙動の解析］
9〜11週齢の雌C57BL/6マウス、又は1年齢の雌C57BL/6マウスから、実施例1と同様に骨質由来微小幹細胞及び骨髄由来微小幹細胞を分離し、材料（骨髄又は骨質）から調製された細胞液中に微小幹細胞が含まれる割合を測定した。
【００９５】
［結果］
微小幹細胞が含まれる割合を図14に示す。図14に示されるように、骨髄由来微小幹細胞の割合は、若齢マウス（9〜11週齢）で1x106 events当たり37±29個、加齢マウス（1年齢）で27±17個であり、加齢により減少傾向を示した。一方、骨質由来微小幹細胞数は、若齢マウスで1x106 events当たり4,721±3,070個、加齢マウスで12,404±8,354個と加齢により有意（P<0.05）に増加傾向を示した。このように、骨質由来微小幹細胞と骨髄由来微小幹細胞とは、加齢による細胞数の挙動が異なっていた。
【００９６】
試験例6：GFPマウス骨質由来微小幹細胞の同定
細胞移植や再生医療等への応用を考慮すると、細胞のin vivoイメージングは重要な解析手段となる。そこで、GFPマウスを用いて、骨質由来微小幹細胞の同定を試みた。具体的には次のように行った。
【００９７】
［GFPマウスからの骨質由来微小幹細胞の分離及び観察］
8週齢の雌GFPマウス（C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)）を用いて、実施例1と同様に骨質由来微小幹細胞を分離した。分離された骨質由来微小幹細胞を蛍光顕微鏡で観察し、細胞の直径を測定した。対照として、別途定法により調製されたGFPマウス骨髄由来の血液細胞についても同様に観察し、細胞の直径を測定した。
【００９８】
［結果］
細胞の観察結果を図15に示す。図15に示すように、GFPマウス骨質由来微小幹細胞の平均直径は4.94±0.44μmであり、図4に示されるマウス骨質由来微小幹細胞の直径と同程度であった。また、対照のGFPマウス骨髄由来血液細胞（平均直径8.46±1.12μm）と比べて小型であった。
【００９９】
試験例7：肝障害による骨質由来微小幹細胞数の挙動
肝障害により、骨髄由来微小幹細胞が末梢血中に動員されることが知られている。そこで、骨質由来微小幹細胞について、肝障害による細胞数の挙動を調べ、骨髄由来微小幹細胞と比較した。具体的には次のように行った。
【０１００】
［肝障害による細胞数の挙動の解析］
8〜10週齢の雌C57BL/6マウスに、四塩化炭素（CCl4）をマウス体重の1g当たり1μl腹腔内投与して、肝障害モデルを作製した。CCl4投与後、24時間、48時間、72時間、又は1週間後に、脛骨の骨質、脛骨の骨髄、及び末梢血を採取して、それぞれを材料として実施例1と同様に微小幹細胞を分離し、各材料から調製された細胞液中に微小幹細胞が含まれる割合を測定した。また、肝障害の程度は、肝臓組織切片標本のHE染色と、血清中のトランスアミナーゼ（AST、ALT）（肝障害マーカー）の測定とにより確認した。
【０１０１】
［結果］
肝臓組織切片標本のHE染色結果を図16に示す。図16に示すように、CCl4投与後48時間後に、肝障害を示す肝細胞の壊死、出血が最も多く観察され、1週間後には投与前と同じ程度まで回復していた。また、図17にCCl4投与前後の血清トランスアミナーゼ（AST、ALT）の推移を示す。AST、ALT共にCCl4投与後24時間目より上昇が見られ、48時間目にピークに達し、1週間後には投与前と同じレベルまで回復していた。以上、組織観察及び肝障害マーカーの測定より、本実験においては、CCl4投与後48時間が肝障害のピークであることが示された。
【０１０２】
CCl4投与前後の微小幹細胞が含まれる割合を図18に示す。図18中、「BM」は骨髄由来微小幹細胞の割合を示し、「Bone」は骨質由来微小幹細胞の割合を示し、「PB」は末梢血由来微小幹細胞の割合を示す。図18に示すように、骨質由来微小幹細胞の割合は、CCl4投与後24時間、48時間で有意に上昇し（P<0.05）、肝障害の程度と相関していた。また、肝障害の悪化に伴い、末梢血由来微小幹細胞の割合は上昇傾向を示したがbase lineが低値のため有意差は認められなかった。一方、骨髄由来微小幹細胞の割合には有意な変動が認められなかった。このように、骨質由来微小幹細胞と、骨髄由来微小幹細胞及び末梢血由来微小幹細胞とは、肝障害による細胞数の挙動が異なることが示唆された。
【０１０３】
試験例8：破骨細胞の活性化による骨質由来微小幹細胞の挙動
微小幹細胞の末梢血中への動員機序に破骨細胞が関与しているか調べた。具体的には、破骨細胞の活性化による微小幹細胞数の変化を、骨質由来、末梢血由来、及び骨髄由来それぞれの微小幹細胞及び造血幹細胞について調べることにより行った。より具体的には次のように行った。
【０１０４】
［破骨細胞の活性化による細胞数の挙動の解析］
8週齢の雌C57BL/6マウスに、破骨細胞の活性化因子であるsRANKLをマウス体重の1kg当たり0.5mg腹腔内投与した。投与は実験開始初日（0日目）及び1日目に行った。2日目〜6日目それぞれにおいて、脛骨の骨質、脛骨の骨髄、及び末梢血を採取し、それぞれを材料として、実施例1と同様に微小幹細胞を分離し、一方で試験例4-2と同様に造血幹細胞を分離した。そして、各材料から調製された細胞液中に含まれる微小幹細胞又は造血幹細胞の割合を測定した。
【０１０５】
［結果］
結果を図19に示す。図19中、「c」はsRANKL投与前に採取した脛骨の骨質、脛骨の骨髄、及び末梢血を材料とした場合（コントロール）を示す。図19に示すように、sRANKL投与後の2日目及び3日目に骨質中の微小幹細胞の割合の有意な増加（P＜0.05）が認められた。一方、骨髄又は末梢血中の微小幹細胞の割合には有意な変化は認められなかった。また、骨髄中の造血幹細胞の割合はsRANKL投与後の2日目において有意に増加（P＜0.05）した。末梢血中の造血幹細胞の割合はsRANKL投与後の3日目において有意に減少（P＜0.05）した。以上より、破骨細胞の活性化は骨質中の微小幹細胞の増殖を促進するが、末梢血中への微小幹細胞の動員には関与していないことが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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