(57)【要約】      （修正有）【課題】容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックス添加剤を提供する。【解決手段】添加剤として、メチル３，５−ジアルコキシ安息香酸、又は２，５−ジアルコキシ安息香酸、又はメチル２，５−ジアルコキシ安息香酸を用いる。（アルコキシ基の炭素数は２〜８。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2014174015.tif 000013
（式中、Ｍｅはメチル基を表し、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。）；  又は、
下記一般式（II）：
【化２】
2014174015.tif 000014
（式中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。）
で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体をマトリックスの添加剤として用いる質量分析法。
【請求項２】
分析対象が、疎水性化合物である、請求項１に記載の質量分析法。
【請求項３】
分析対象が、疎水性ペプチドである、請求項１又は２に記載の質量分析法。
【請求項４】
前記マトリックスとして、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる化合物を用いる、請求項１〜３のうちのいずれかに記載の質量分析法。
【請求項５】
前記一般式（Ｉ）おいて、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数４〜８のアルキル基を表し、又は、前記一般式（II）において、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なっていてもよく、炭素数４〜８のアルキル基を表す、請求項１〜４のうちのいずれかに記載の質量分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療及び創薬分野において応用されうる質量分析法、特に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より詳しくは、本発明は、特定化合物をマトリックス添加剤として用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックス添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）や２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３２６３９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、ＭＡＬＤＩ質量分析法においてイオン化効率が低いという問題がある。
【０００５】
本発明の目的は、測定対象分子の修飾（具体的には、標識又はラベル化等）を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックス添加剤を提供することにある。とくに、本発明の目的は、測定対象分子の修飾（具体的には、標識又はラベル化等）を行うことなく、容易に且つ効率よく、ＭＡＬＤＩ質量分析におけるイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を用いる質量分析法、及びＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックス添加剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意検討の結果、特定のジアルコキシ安息香酸誘導体が、質量分析法におけるマトリックスとしては機能しないがマトリックスの添加剤として用いることによって、疎水性化合物のようなイオン化が難しい分子種をも効率よくイオン化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2014174015.tif 000002
（式中、Ｍｅはメチル基を表し、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。）；  又は、
下記一般式（II）：
【化２】
2014174015.tif 000003
（式中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。）
で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体をマトリックスの添加剤として用いる質量分析法。
【０００８】
（２）  分析対象が、疎水性化合物である、上記（１）に記載の質量分析法。
【０００９】
（３）  分析対象が、疎水性ペプチドである、上記（１）又は（２）に記載の質量分析法。本明細書において、ペプチドにはタンパク質も含まれる。
【００１０】
（４）  前記マトリックスとして、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる化合物を用いる、上記（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の質量分析法。
【００１１】
（５）  前記一般式（Ｉ）おいて、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数４〜８のアルキル基を表し、又は、前記一般式（II）において、Ｒ21及びＲ22が、同一又は異なっていてもよく、炭素数４〜８のアルキル基を表す、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の質量分析法。
【００１２】
・下記一般式（Ｉ）：
【化３】
2014174015.tif 000004
（式中、Ｍｅはメチル基を表し、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。）；  又は、
下記一般式（II）：
【化４】
2014174015.tif 000005
（式中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。）
で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体である、質量分析用マトリックスの添加剤。
【００１３】
・疎水性化合物の質量分析に用いられる、上記の質量分析用マトリックスの添加剤。
【００１４】
・疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、上記の質量分析用マトリックスの添加剤。
【００１５】
・α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、上記の質量分析用マトリックスの添加剤。
【００１６】
・前記一般式（Ｉ）おいて、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数４〜８のアルキル基を表し、又は、前記一般式（II）において、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なっていてもよく、炭素数４〜８のアルキル基を表す、上記の質量分析用マトリックスの添加剤。
【発明の効果】
【００１７】
本発明において、上記一般式（Ｉ）又は一般式（II）で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体を質量分析のマトリックス添加剤として用いる。前記特定のジアルコキシ安息香酸誘導体をマトリックス添加剤として用いると、疎水性化合物、特に疎水性ペプチドのようなイオン化が難しい分子種のイオン化効率を向上させることができる。そのため、本発明によれば、測定対象分子のイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックスが提供される。本発明は、特にＭＡＬＤＩ質量分析法に向けられ、分析対象が疎水性化合物である場合に適しており、疎水性ペプチドである場合に特に適している。
【００１８】
本発明により、測定対象分子（特に疎水性ペプチド）の質量分析測定による検出感度向上を達成することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において、上記一般式（Ｉ）又は一般式（II）で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体を質量分析のマトリックス添加剤として用いる。
【００２０】
【化５】
2014174015.tif 000006
【００２１】
式（Ｉ）中、Ｍｅはメチル基を表し、Ｒ11及びＲ12は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。すなわち、式（Ｉ）で示される化合物は、３，５−ジアルコキシ安息香酸メチルエステルである。式（Ｉ）においてＲ11及びＲ12が表す炭素数Ｃ２〜８のアルキル基としては、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基が挙げられる。これらのアルキル基は直鎖状であってもよいし、又は分岐状であってもよい。分岐状のものとしては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、イソペンチル基、２−エチルヘキシル基などが挙げられる。これらのうち、炭素数Ｃ４〜８のアルキル基が好ましく、炭素数Ｃ４〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数Ｃ４のアルキル基が特に好ましい。分析対象が疎水性化合物である場合には、疎水性化合物のイオン化のために、Ｒ11及びＲ12が表すアルキル基がある程度の疎水性を有することが必要であると考えられる。Ｒ11及びＲ12が表すアルキル基の合計炭素数が８以上となることが好ましい。
【００２２】
【化６】
2014174015.tif 000007
【００２３】
式（II）中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なっていてもよく、炭素数２〜８のアルキル基を表す。すなわち、式（II）で示される化合物は、２，５−ジアルコキシ安息香酸又はそのメチルエステルである。式（II）においてＲ21及びＲ22が表す炭素数Ｃ２〜８のアルキル基としては、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基が挙げられる。これらのアルキル基は直鎖状であってもよいし、又は分岐状であってもよい。分岐状のものとしては、例えば、イソプロピル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、イソペンチル基、２−エチルヘキシル基などが挙げられる。これらのうち、炭素数Ｃ４〜８のアルキル基が好ましく、炭素数Ｃ４〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数Ｃ４のアルキル基が特に好ましい。分析対象が疎水性化合物である場合には、疎水性化合物のイオン化のために、Ｒ21及びＲ22が表すアルキル基がある程度の疎水性を有することが必要であると考えられる。Ｒ21及びＲ22が表すアルキル基の合計炭素数が８以上となることが好ましい。また、Ｒが水素原子の場合であっても、２位のアルコキシル基の酸素原子との水素結合により、カルボキシル基のフリー度合いは小さいと推測される。
【００２４】
上記式（Ｉ）又は式（II）で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体は、当業者に知られた方法により合成することができる。
【００２５】
上記式（I）又は式（II）で示されるジアルコキシ安息香酸誘導体は、マトリックスレーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析におけるマトリックスの添加剤として有用である。前記のジアルコキシ安息香酸誘導体化合物は、マトリックスと混合して使用することによって、マトリックスによる測定対象のイオン化能力を増強し、検出限界の向上を図ることができる。
【００２６】
本発明において、前記添加剤が添加されるべきマトリックスとしては特に限定されない。公知のマトリックスから当業者によって適宜選択されてよいが、例えば、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、及び１，５−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれるマトリックスを用いることができる。
【００２７】
本発明のマトリックス添加剤を用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が５００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００の分子でありうる。好ましくは、本発明のマトリックス添加剤は、疎水性物質のイオン化を促進できるので、疎水性物質の質量分析に用いられる。この場合、試料中には、分析対象としての疎水性物質以外に、他の物質（例えば親水性物質）が混在していてもよい。本発明のマトリックス添加剤は、実施例で示すように、マトリックスとしてのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）に対して添加した場合、４−ＣＨＣＡ単独の場合と比べて、親水性物質のイオン化を促進せず、疎水性物質のイオン化を選択的に促進することができる。このため、試料中に疎水性物質と親水性物質とが混在していても、疎水性物質を容易に分析することができる。この点から、本発明のマトリックス添加剤は、疎水性物質の質量分析に好適に適用できる。
【００２８】
疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは、例えば１０００以下、好ましくは−１０００以下でありうる。
【００２９】
あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＨＰＬＣインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。ＨＰＬＣインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸（HFBA）を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相ＨＰＬＣ保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、ＨＰＬＣインデックスは、例えば４０以上、例えば４０〜１０，０００、好ましくは１００〜１，０００でありうる。
【００３０】
さらに、本発明における疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙによって疎水性と判断しうる程度であればよい。ＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、Oleg V. Krokhin によりAnalytical Biochemistry, 78, 7785-7795, 2006に報告されている。ＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）の保持時間に対するペプチド配列特異的なアルゴリズムsequence-specific retention calculator (SSRCalc)に基づく疎水性指標である。ＨＰＬＣインデックスあるいはＢＢインデックスがアミノ酸組成情報のみを基に保持時間を推算するのに対し、ＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙはペプチドの一次構造・二次構造までを含めて保持時間を推算する。本発明において、分析対象が、疎水性ペプチドである場合には、疎水性の程度は、ＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙを指標とすることが適している。より具体的には、ＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、例えば３０以上、好ましくは４０〜７０でありうる。
【００３１】
本発明においては、特に疎水性ペプチド（本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる）のイオン化能増強効果が高い。疎水性ペプチドであるか否かについては、ＢＢインデックス、ＨＰＬＣインデックス又はＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ、好ましくはＳＳＲＣａｌｃ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ又はＨＰＬＣインデックスを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、疎水性度のより高いアミノ酸をより多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。疎水性ペプチドは、このようなペプチドの一次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相ＨＰＬＣカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。
【００３２】
質量分析用結晶は、分析対象と、マトリックスと、マトリックス添加剤とを溶媒中に少なくとも含む混合液の液滴を質量分析用ターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも分析対象、マトリックス、及びマトリックス添加剤）を残渣として得る工程とによって得ることができる。得られた残渣が、すなわち質量分析用結晶である。本明細書においては、質量分析用結晶と残渣とは同義である。
【００３３】
質量分析用ターゲットとしては、通常ＭＡＬＤＩ質量分析用として用いられる導電性を有する金属製プレートを使用することができる。具体的には、ステンレス製又は金製のプレートを用いることができる。
【００３４】
前記混合液の液滴をターゲットプレート上に用意する具体的方法としては特に限定されない。例えば、まず、分析対象を含む試料溶液とマトリックス溶液と添加剤溶液とをそれぞれ別々に、又は分析対象を含む試料溶液と添加剤を混合したマトリックス溶液とをそれぞれ別々に調製する。次に、それら溶液を混合させて混合液を得て、得られた混合液をターゲットプレート上に滴下する。又は、それら溶液をそれぞれターゲットプレート上の同じ位置に滴下することにより、ターゲットプレート上で混合させる（on-target mix法）。on-target mix法の場合、溶液の滴下順序は任意である。
【００３５】
マトリックスに対する添加剤の比率は、例えば、マトリックスの０．０１〜５０倍、好ましくは０．０５〜０．５倍のモル比を目安にすることができる。
【００３６】
より具体的には、添加剤は、例えば、０．５〜５０ｍｇ/ｍＬ、好ましくは５〜１０ｍｇ/ｍＬ、例えば５ｍｇ/ｍＬの溶液に調製することができる。マトリックスは、例えば、１ｍｇ/ｍＬ〜飽和濃度、好ましくは１〜１０ｍｇ/ｍＬ、例えば１０ｍｇ/ｍＬの溶液に調製することができる。これら添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、１０：１〜１：１０、好ましくは１：１〜１：１０、例えば１：１０の体積比で混合することができる。
【００３７】
前記混合液の溶媒としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ）及び水などからなる群から選ばれうる。より具体的には、混合液の溶媒としては、例えば、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、ＭｅＯＨ−ＴＦＡ、ＭｅＯＨ水溶液、ＥｔＯＨ−ＴＦＡ水溶液、ＥｔＯＨ水溶液、ＴＨＦ−ＴＦＡ水溶液、ＴＨＦ水溶液、ＤＭＳＯ−ＴＦＡ水溶液、ＤＭＳＯ水溶液などが用いられ、より好ましくは、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液やＡＣＮ水溶液を用いることができる。ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液におけるＡＣＮの濃度は例えば１０〜９０体積％、好ましくは２５〜７５体積％であり、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５〜１体積％、好ましくは０．０５〜０．１体積％でありうる。
【００３８】
前記混合液の液滴の体積としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液の液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、０．１μＬ〜２μＬ程度、例えば０．５μＬ程度の液滴を形成することができる。
【００３９】
次に、ターゲットプレート上の混合液の液滴から溶媒を除去する。溶媒の除去には溶媒の自然蒸発が含まれる。蒸発によって生じる残渣（すなわち質量分析用結晶）１個当たりに含まれるマトリックスの量は、例えば１〜１，０００ｎｍｏｌ、好ましくは１０〜１００ｎｍｏｌを目安にすることができる。分析対象の量は、例えば、マトリックス３０ｎｍｏｌに対し、５０ａｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、又は１００ａｍｏｌ〜５０ｐｍｏｌの範囲で許容される。
【００４０】
残渣は、ターゲットプレートとの接触面において、略円の形状をなす。すなわち、残渣の外縁は略円の形状である。前記の略円の平均直径は、試料量、滴下量、マトリックス量及び溶媒組成等によって異なりうるが、例えば１〜３ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。なお、平均直径とは、１個の残渣において、前記の略円の重心を通る直線が残渣の外縁で切り取られた線分の長さの平均である。
【００４１】
本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４３】
［実施例１］
本実施例においては、マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ，Laser Bio）を用いて、添加剤として、次の化学式で示されるメチル  ３，５−ジｎ−ブトキシ安息香酸(Methyl 3,5-di(n-butoxy) benzoate,Ｃ４−Ｍ３，５−ＤＢＢとして表記する)、又は２，５−ジｎ−ブトキシ安息香酸(3,5-di(n-butoxy) benzoate,Ｃ４−２，５−ＤＢＢとして表記する)を用いた。
【００４４】
【化７】
2014174015.tif 000008
【００４５】
【化８】
2014174015.tif 000009
【００４６】
（１−１）４−ＣＨＣＡの10 mg/mL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water) (%は体積を基準とする。以下において同様)と、Ｃ４−Ｍ３，５−ＤＢＢの5 mg/mL 溶液(50%ACN/0.1%TFA water)とを１０：１(v/v)で混合し、添加剤混合マトリックス溶液４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−Ｍ３，５−ＤＢＢを作成した。
（１−２）同様に、４−ＣＨＣＡの10 mg/mL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water) と、Ｃ４−２，５−ＤＢＢの5 mg/mL 溶液(50%ACN/0.1%TFA water)を１０：１(v/v)で混合し、添加剤混合マトリックス溶液４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−２，５−ＤＢＢを作成した。
【００４７】
（２）試料溶液として、疎水性ペプチドHumaninの 20 amol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。同様に、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の20 amol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
【００４８】
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に、（２）の疎水性ペプチド試料溶液又は親水性ペプチド試料溶液と、（１−１）の添加剤混合マトリックス溶液又は（１−２）の添加剤混合マトリックス溶液とを0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００４９】
（比較用）
（１）マトリックス溶液として、４−ＣＨＣＡの10 mg/mL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
【００５０】
（２）試料溶液として、疎水性ペプチドHumaninの 20 amol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。同様に、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の20 amol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
【００５１】
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に、（２）の疎水性ペプチド試料溶液又は親水性ペプチド試料溶液と、（１）のマトリックス溶液とを0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００５２】
【表１】
2014174015.tif 000010
【００５３】
表１に示すように、４−ＣＨＣＡ単独で使用した場合に比べ、添加剤混合マトリックス４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−Ｍ３，５−ＤＢＢ、又は４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−２，５−ＤＢＢを用いると、疎水性ペプチドHumaninの検出限界が1/100、すなわち、感度が100倍向上したことを確認した。一方、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の検出限界については、４−ＣＨＣＡ単独で使用しても、添加剤混合マトリックス４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−Ｍ３，５−ＤＢＢ、又は４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−２，５−ＤＢＢを使用しても変化は見られなかった。
【００５４】
このように、上記マトリックス添加剤は、親水性ペプチドβ-amyloid  1-11のＭＡＬＤＩイオン化を促進せず、疎水性ペプチドHumaninのＭＡＬＤＩイオン化を促進し、そのため、疎水性ペプチドHumaninを高感度で検出できることが示された。
【００５５】
［比較例１］
本比較例においては、マトリックスとして、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ，Laser Bio）を用いて、添加剤として、次の化学式で示される３，５−ジｎ−ブトキシ安息香酸(3,5-di(n-butoxy) benzoate,Ｃ４−３，５−ＤＢＢとして表記する)を用いた。
【００５６】
【化９】
2014174015.tif 000011
【００５７】
（１）４−ＣＨＣＡの10 mg/mL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water) と、Ｃ４−３，５−ＤＢＢの5 mg/mL 溶液(50%ACN/0.1%TFA water)とを１０：１(v/v)で混合し、添加剤混合マトリックス溶液４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−Ｍ３，５−ＤＢＢを作成した。
【００５８】
（２）試料溶液として、疎水性ペプチドHumaninの 20 amol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。同様に、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の20 amol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
【００５９】
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に、（２）の疎水性ペプチド試料溶液又は親水性ペプチド試料溶液と、（１）の添加剤混合マトリックス溶液とを0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。
【００６０】
【表２】
2014174015.tif 000012
【００６１】
表２に示すように、４−ＣＨＣＡ単独で使用した場合に比べ、添加剤混合マトリックス４−ＣＨＣＡ＋Ｃ４−３，５−ＤＢＢを用いても、感度向上は見られなかった。なお、表２における４−ＣＨＣＡ単独の結果は、上記実施例１の比較用として示したものである。