(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の可溶化活性を有する多量体タンパク質を提供する。【解決手段】下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれかのサブユニットが会合した多量体タンパク質を、可溶化活性を有する多量体タンパク質とする。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるサブユニット（ｂ）特定のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるサブユニット（ｃ）特定のアミノ酸配列との同一性が７０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニット【選択図】図１
2014113108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１種類のサブユニットが会合し、且つ、タンパク質の高次構造に対する可溶化活性を有することを特徴とする多量体タンパク質。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるサブユニット
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるサブユニット
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が７０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニット
【請求項２】
前記多量体タンパク質１分子における前記会合したサブユニットの数が、１０〜１２個である、請求項１記載の多量体タンパク質。
【請求項３】
前記サブユニットが、ヒト由来である、請求項１または２記載の多量体タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の多量体タンパク質を含むことを特徴とするタンパク質可溶化剤。
【請求項５】
可溶化対象のタンパク質が、タンパク質凝集体およびフォールディングタンパク質の少なくとも一方である、請求項４記載のタンパク質可溶化剤。
【請求項６】
前記可溶化対象のタンパク質が、アミロイドβ、プリオンタンパク質、αシヌクレイン、アクチン、ＤＮａｓｅ  Ｉ、α因子前駆体タンパク質およびスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）からなる群から選択された少なくとも１つである請求項５記載のタンパク質可溶化剤。
【請求項７】
被検タンパク質に請求項１から３のいずれか一項に記載の多量体タンパク質を接触させる工程を含むことを特徴とする、タンパク質の可溶化方法。
【請求項８】
被検タンパク質を請求項１から３のいずれか一項に記載の多量体タンパク質により可溶化する工程と、前記被検タンパク質の可溶化物を検出する工程とを含むことを特徴とする、タンパク質の分析方法。
【請求項９】
前記被検タンパク質が、アミロイドβ、プリオンタンパク質、αシヌクレイン、アクチン、ＤＮａｓｅ  Ｉ、α因子前駆体タンパク質およびスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）からなる群から選択された少なくとも１つである、請求項８記載の分析方法。
【請求項１０】
請求項８または９記載の前記被検タンパク質の分析方法に使用する分析試薬であって、請求項１から３のいずれか一項記載の多量体タンパク質を含むことを特徴とする分析試薬。
【請求項１１】
タンパク質凝集体またはフォールディングタンパク質が指標タンパク質となる疾患の罹患危険度の分析方法であって、
被験者の生体試料に請求項１から３のいずれか一項に記載の多量体タンパク質を接触させ、前記生体試料中の前記指標タンパク質を可溶化する工程と、
前記指標タンパク質の可溶化物を検出する工程とを含むことを特徴とする疾患の罹患危険度の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の可溶化活性を有する多量体タンパク質、それを用いたタンパク質の可溶化剤、可溶化方法、分析方法、その分析試薬および疾患の罹患危険度の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前頭側頭葉型認知症、ピック病、アルツハイマー病、プリオン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病等は、早期発見および治療が困難な神経変性疾患であり、そのメカニズムの解明が急務とされている。そして、近年、これらの神経変性疾患の患者について、脳内におけるタンパク質凝集体の発生および蓄積が確認され、これらが、病態誘導および維持に関与しているとの報告がある。
【０００３】
しかしながら、前記各種神経変性疾患で観察されるタンパク質凝集体、例えば、前頭側頭葉型認知症由来ＴＤＰ−４３小体、ピック病由来ピック球、アルツハイマー病由来老人斑、プリオン病由来プリオン斑、パーキンソン病由来レビー小体、筋萎縮性側索硬化症由来ブニナ小体等の構造物は、極めて凝集性が高い。このため、既存のタンパク質変性剤およびタンパク質分解酵素では、このようなタンパク質凝集体の可溶化が困難であり、タンパク質を可溶化して解析するという一般的手段がとれない。その結果、前記各種神経変性疾患の原因となるタンパク質凝集体の構成成分の同定が、未だ困難との問題がある。
【０００４】
そこで、タンパク質凝集体を可溶化する新たな方法が求められており、タンパク質の高次構造に対して、可溶化活性を有する出芽酵母由来の多量体タンパク質が報告されている（特許文献１）。この多量体タンパク質によれば、タンパク質の高次構造におけるフォールディングをほぐすことができるため、前述のような、タンパク質凝集体の解析への利用が期待できる。しかしながら、臨床医療における応用の面から、より効果に優れる可溶化方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３５６４９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、タンパク質の可溶化活性を有する多量体タンパク質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の多量体タンパク質は、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１種類のサブユニットが会合し、且つ、タンパク質の高次構造に対する可溶化活性を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるサブユニット
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるサブユニット
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が７０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニット
【０００８】
本発明のタンパク質可溶化剤は、前記本発明の多量体タンパク質を含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のタンパク質の可溶化方法は、被検タンパク質に前記本発明の多量体タンパク質を接触させる工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
本発明のタンパク質の分析方法は、被検タンパク質を前記本発明の多量体タンパク質により可溶化する工程と、前記被検タンパク質の可溶化物を検出する工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の分析試薬は、前記被検タンパク質の分析方法に使用する分析試薬であって、前記本発明の多量体タンパク質を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の疾患の罹患危険度の分析方法は、タンパク質凝集体またはフォールディングタンパク質が指標タンパク質となる疾患の罹患危険度の分析方法であって、
被験者の生体試料に前記本発明の多量体タンパク質を接触させ、前記生体試料中の前記指標タンパク質を可溶化する工程と、
前記指標タンパク質の可溶化物を検出する工程とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の多量体タンパク質は、タンパク質の高次構造に対する可溶化活性を示すことから、例えば、タンパク質凝集体およびフォールディングタンパク質等を可溶化できる。このため、本発明の多量体タンパク質によれば、例えば、前記神経変性疾患等で観察される前記タンパク質凝集体等を可溶化し、分析することが可能になる。このため、本発明は、臨床医療および生化学分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例２におけるウエスタンブロットの写真である。
【図２】図２は、実施例３におけるウエスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、実施例４におけるコイルドコイルドメインの予測図である。
【図４】図４は、実施例５におけるコイルドコイルドメインの予測図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜多量体タンパク質＞
本発明の多量体タンパク質は、前述のように、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）からなる群から選択された少なくとも１種類のサブユニットが会合し、且つ、タンパク質の高次構造に対する可溶化活性を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるサブユニット
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるサブユニット
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が７０％以上であるアミノ酸配列からなるサブユニット
【００１６】
本発明において、「タンパク質の高次構造に対する可溶化活性」とは、例えば、タンパク質凝集体の可溶化活性、フォールディングタンパク質の可溶化活性等の意味を含む。前記タンパク質凝集体とは、例えば、高次構造変化を起こしたタンパク質が会合した構造体、前記フォールディングタンパク質とは、例えば、折りたたまれたタンパク質を意味する。
【００１７】
本発明の多量体タンパク質によって可溶化できる可溶化対象のタンパク質は、例えば、高次構造のペプチドも含む。
【００１８】
前記可溶化活性の測定方法は、特に制限されない。以下に、基質となる前記可溶化対象のタンパク質として、出芽酵母由来α因子前駆体タンパク質（Ｐｒｏ  αＦ）（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０１５１３７）を使用する、測定方法の一例を示す。なお、これは一例であって、本発明を制限するものではない。
【００１９】
２００ｎｇのＰｒｏ  αＦおよび５００ｎｇ（タンパク質量）の被検サンプルを１００μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ）に懸濁し、３０℃で３０分間インキュベートする。前記インキュベート後、２μＬの５０μｇ／ｍＬ  トリプシンを添加し、混和後、１６℃で１５分間インキュベートする。次に、１００μｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤を添加し、氷上で５分間静置後、５μＬの２ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡおよび１２μＬの１００％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し、攪拌する。前記攪拌後、−８０℃で１５分以上静置し、さらに、４℃  １５，０００ｋｒｐｍで２５分間遠心する。得られたペレットを、８μＬの２ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ緩衝液に懸濁し、泳動サンプルを調製する。そして、前記泳動サンプルを電気泳動に供し、前記電気泳動後、抗Ｐｒｏ  αＦ抗体を用い、Ｐｒｏ  αＦを定量する。また、ネガティブコントロールとして、前記被検サンプルを未添加とする以外は、同様にしてＰｒｏ  αＦの検出を行う。そして、ネガティブコントロールに比べ、前記被検サンプルを添加した系のＰｒｏ  αＦの量が、有意に低下している場合、前記被検サンプルに可溶化活性があると判断する。また、ネガティブコントロールのＰｒｏ  αＦの量に対する、前記被検サンプルを添加した場合のＰｒｏ  αＦの量の比から、活性の程度を評価できる。
【００２０】
以下に、前記（ａ）のサブユニットのアミノ酸配列（配列番号１）およびそれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号２）を示す。前記（ａ）のサブユニットは、ヒト由来のサブユニットである。
（配列番号１）
MARLLRSATWELFPWRGYCSQKAKGELCRDFVEALKAVVGGSHVSTAAVVREQHGRDESVHRCEPPDAVVWPQNVEQVSRLAALCYRQGVPIIPFGTGTGLEGGVCAVQGGVCVNLTHMDRILELNQEDFSVVVEPGVTRKALNAHLRDSGLWFPVDPGADASLCGMAATGASGTNAVRYGTMRDNVLNLEVVLPDGRLLHTAGRGRHFRKSAAGYNLTGLFVGSEGTLGLITATTLRLHPAPEATVAATCAFPSVQAAVDSTVHILQAAVPVARIEFLDEVMMDACNRYSKLNCLVAPTLFLEFHGSQQALEEQLQRTEEIVQQNGASDFSWAKEAEERSRLWTARHNAWYAALATRPGCKGYSTDVCVPISRLPEIVVQTKEDLNASGLTGSIVGHVGDGNFHCILLVNPDDAEELGRVKAFAEQLGRRALALHGTCTGEHGIGMGKRQLLQEEVGAVGVETMRQLKAVLDPQGLMNPGKVL
（配列番号２）
atggcccgactgctcaggtctgcaacctgggagctgttcccctggaggggctactgctcccagaaggcaaagggagagctctgcagggacttcgtagaggctctgaaggccgtggtgggcggctcccacgtgtccactgccgcggtggtccgagagcagcacgggcgcgatgagtcggtgcacaggtgcgaacctcctgatgctgtggtgtggccccagaacgtggagcaggtcagccggctggcagccctgtgctatcgccaaggtgtgcccatcatcccattcggcaccggcaccgggcttgagggtggcgtctgtgctgtgcagggcggcgtctgcgttaacctgacgcatatggaccgaatcctggagctgaaccaggaggacttctctgtggtggtggagccaggtgtcacccgcaaagccctcaacgcccacctgcgggacagcggcctctggtttcccgtggacccaggcgcggacgcctctctctgtggcatggcggccaccggggcgtcggggaccaacgcggtccgctacggcaccatgcgggacaacgtgctcaacctggaggtggtgctgcccgacgggcggctgctgcacacggcgggccgaggccggcatttccggaagagtgcagccggctacaacctcacggggctcttcgtgggctccgaggggacgctgggcctcatcacagccaccaccctgcgcctgcaccctgcccctgaggccacagtggccgccacgtgtgcgttccccagtgtccaggctgctgtggacagcactgtacacatcctccaggctgcagtgcccgtagcccgcattgagttcctggatgaagtcatgatggatgcctgcaacaggtacagcaagctgaattgcttagtggcgcccacactcttcctggagttccatggctcccagcaggcactggaggagcagctgcagcgcacagaggagatagtccagcagaacggagcctctgacttctcctgggccaaggaggccgaggagcgcagccggctttggacagcacggcacaatgcctggtacgcagccctggccacgcggccaggctgcaagggctactccacggatgtgtgtgtgcccatctcccggctgccggagatcgtggtgcagaccaaggaggatctgaatgcctcaggactcacaggaagcattgtcgggcatgtgggtgacggcaacttccactgcatcctgctggtcaaccctgatgacgccgaggaactgggcagggtcaaggcttttgcagaacagctgggcaggcgggcactggctctccacggaacgtgcacgggggagcatggcatcggaatgggcaagcggcagctgctgcaggaggaggtgggcgccgtgggcgtggagaccatgcggcagctcaaggccgtgctagacccccaaggcctcatgaatccaggcaaagtgctgtga
【００２１】
前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のサブユニットを含む多量体タンパク質が、前記可溶化活性を有する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、１〜１４５個、好ましくは１〜７２個、より好ましくは１〜２４個、特に好ましくは３個、２個または１個である。
【００２２】
前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のサブユニットを含む多量体タンパク質が、前記可溶化活性を有する範囲であればよい。前記「同一性」は、例えば、７５％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である。
【００２３】
前記サブユニットは、コイルドコイルドメインを有することが好ましい。前記コイルドコイルドメインの位置は、特に制限されず、例えば、前記サブユニットの中央領域、Ｃ末端領域等があげあれる。前記コイルドコイルドメインは、例えば、ヒトの場合、中央領域にあることが好ましい。前記中央領域は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）サブユニットのアミノ酸配列において、好ましくはＮ末端アミノ酸を１番目として１１５〜５００番目の領域であり、より好ましくは２９６〜４６０番目の領域であり、さらに好ましくは３２７〜４５１番目の領域である。具体例として、前記（ａ）のサブユニットの場合、例えば、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末端のアミノ酸を１として、３２７〜４５１番目である。
【００２４】
前記（ｂ）および（ｃ）のサブユニットは、例えば、前記（ａ）のサブユニットにおける前記コイルドコイルドメインが高度に保存されていることが好ましく、例えば、前記中央領域、前記Ｃ末端領域があげられる。具体例として、前記（ｂ）および（ｃ）のサブユニットは、配列番号１の３２７〜４５１番目の領域との相同性が、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％が好ましく、より好ましくは１００％である。
【００２５】
前記多量体タンパク質１分子における前記会合したサブユニットの数は、特に制限されず、例えば、５〜２０個であり、好ましくは８〜１５個であり、より好ましくは１０〜１２個である。前記多量体タンパク質を形成するサブユニットは、例えば、前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のいずれか１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
【００２６】
前記サブユニットの会合の形式は、特に制限されず、例えば、共有結合による会合でもよいし、非共有結合による会合でもよい。前記共有結合は、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合等があげられる。また、前記非共有結合は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス力による結合等があげられる。
【００２７】
前記サブユニットの由来は、特に制限されず、例えば、ヒトが好ましく、前述のように、配列番号１のアミノ酸配列からなるサブユニットは、ヒト由来である。
【００２８】
本発明の多量体タンパク質におけるサブユニットは、この他に、例えば、ヒトを除く非ヒト動物由来があげられ、前記非ヒト動物は、例えば、ウシ、線虫等があげられる。以下に、前記（ａ）のサブユニットとして、ウシ由来のサブユニットのアミノ酸配列（配列番号３）ならびにそれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号４）を示す。
（配列番号３）
MMMPRLVPRWPAWLFCWRAACIQGASVRQKMWAGPSKIPGLGGPRGAWGTSPLVPRGSCSASSRTPEVTLTPERYPVQRLPFSVVSEDDLAALERVVPGRVITDPEELEPPNVDWLRTVRGSSKVLLRPRTTQEVAHILRYCHERNLAVNPQGGNTGMVGGSTPVFDEIILSTALMNQVLSFHDVSGVLVCQAGCVLEALSQYVEERGFIMPLDLGAKGSCHIGGNVATNAGGLRVLRYGSLRGTVLGLEVVLADGTVLNCLTSLRKDNTGYDLKQLFIGSEGTLGVITAVSILCPPKPSTVNVAFLGCPGFAEVLQTFRTCRAMLGEILSAFEFMDAECMKLVRLHLGLSCPVQESPFYVLIETAGSGPGHDAEKLGCFLEQVLDSGLVTDGTLGSDERRIKMLWALRERITEALSHDGYVYKYDLSLPLDQLYDLVGDLRARLGPSAKHVVGYGHLGDGNLHLNVTSEAFSTSLLGALEPYVYEWTAGQRGSVSAEHGLGFKKKDVLGYSKPPEALQLMRQLKALLDPKGILNPYKMLPTHA
（配列番号４）
atgatgatgccccgtctggtgccccggtggcctgcgtggctcttctgctggcgggcagcctgcattcagggagcctctgtgagacagaagatgtgggcagggccgtccaagatccctgggctgggcggcccgcgaggggcctggggcaccagccccctggttccacgaggcagctgctcagcctcctcccgcactcctgaggtgacgctgaccccggagcggtaccctgtgcagcggctgcccttctccgtggtgtctgaggacgacctggccgccctggagcgagtcgtccctggcagggtcatcacagacccggaggagcttgagcctcccaacgtggactggctgaggacagtccgaggttccagcaaggtgctgctgaggccgcggacgacccaggaggtggcacacatcctcaggtactgccacgagcggaacctggctgtgaacccacaggggggcaacacaggcatggtgggcggcagcacacccgtcttcgacgagatcattctgtccaccgccctaatgaaccaggtcctcagctttcatgacgtgtcgggggtcctggtctgccaggcggggtgtgtcttggaggcgctgagccagtacgtggaggagcggggcttcatcatgcctttggacctcggggcgaagggcagctgccacatcggggggaatgtggccaccaacgcaggcggcctgcgggtcctgcgatacggctccctgcgggggacggtcctgggcctggaagtggtgctggccgacggaaccgtcctgaactgcctcacgtctcttcgaaaggacaacacgggctacgacctgaagcagctcttcattgggtcagagggcaccctgggggtcatcacggctgtgtccattctgtgtccgcccaagcccagcactgtgaacgtggccttcctcggctgtccgggctttgctgaagttctgcagaccttccgcacctgcagggcaatgctgggcgagatcctgtctgcgtttgagttcatggacgctgagtgcatgaagctggtcaggctccacctcggtctctcctgccccgtgcaagaaagccccttctacgtcctcattgagacggcgggctctgggccggggcacgatgccgaaaagctgggctgcttcctggagcaggtgctggattcggggctggtgaccgatgggaccctgggcagtgacgagaggaggatcaagatgctgtgggcactcagggagaggatcactgaggccctgagccatgacggctacgtgtacaagtacgacctctcgctgcccctggaccagctctacgacctcgtgggcgacctgcgtgcccggctcggcccaagcgccaagcacgtggtgggctacggccacctgggggacgggaacctgcatctcaacgtgacgtctgaggccttcagcacgtccctgctgggtgccctggagccctacgtgtacgagtggacagcggggcagcggggtagtgtcagcgccgagcacggcctgggcttcaagaagaaggacgtcctcggctacagcaagccccctgaggcgctgcagctcatgaggcagctcaaggccctcctggaccccaagggcatcctgaacccctacaagatgctgcccacccacgcctga
【００２９】
本発明の多量体タンパク質の製造方法は、特に制限されず、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【００３０】
本発明の多量体タンパク質の製造には、例えば、前記サブユニットをコードするポリヌクレオチドを使用できる。前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、前記サブユニットのアミノ酸配列に基づいてコドンに置き換えることで設計できる。具体例として、前記（ａ）のサブユニットをコードするポリヌクレオチドは、前述のように、配列番号２の塩基配列で表すことができる。
【００３１】
前記ポリヌクレオチドから本発明の多量体タンパク質を製造する場合、前記ポリヌクレオチドは、例えば、無細胞タンパク質合成系に使用してもよいし、非ヒト宿主（以下、宿主ともいう）に導入して使用してもよい。
【００３２】
前記ポリヌクレオチドの導入対象は、特に制限されず、例えば、前記宿主に導入することが好ましい。前記宿主に前記ポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記本発明の多量体タンパク質を発現する形質転換体の製造、前記本発明の多量体タンパク質の製造等が可能である。前記宿主は、特に制限されず、例えば、前述した本発明のポリヌクレオチドの使用目的に応じて、適宜選択できる。前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、これらの培養細胞等があげられる。
【００３３】
前記ポリヌクレオチドによって、前記本発明の多量体タンパク質を製造する場合、前記宿主は、特に制限されない。前記宿主は、前述と同様であるが、中でも、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞またはこれらの培養細胞等が好ましい。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等があげられる。前記宿主に、前記ポリヌクレオチドを導入することで、例えば、前記多量体タンパク質を製造できる。
【００３４】
前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
【００３５】
前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、後述するような発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【００３６】
前記発現ベクターは、例えば、前記宿主において、前記ポリヌクレオチドがコードする前記サブユニットを発現可能なように、機能的に前記ポリヌクレオチドが連結されていればよく、その他の構成は何ら制限されない。前記宿主は、特に制限されず、適宜選択できる。前記宿主は、前記ポリヌクレオチドの説明と同様に、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または、これらの培養細胞等があげられる。
【００３７】
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記ポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（Ｍｅｒｃｋ）、ｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ株式会社）、ＰＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ）等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、前記ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられ、また、ｐＹＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＳＣ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。前記ベクターは、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合、例えば、バイナリーベクターが好ましく、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＰＺＰ２０２、ｐＢＩＮＰＬＵＳおよびｐＢＩＮ１９等があげられる。
【００３８】
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記サブユニットの発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等があげられる。前記プロモーターは、この他に、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記サブユニットの発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【００３９】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【００４０】
前記発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、宿主の種類、前記発現ベクターの種類等に応じて、適宜決定できる。前記宿主および前記導入方法は、例えば、前記ポリヌクレオチドの説明と同様である。
【００４１】
発現させた前記多量体タンパク質は、例えば、発現後、そのまま使用してもよいし、さらに精製したものを使用してもよい。精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種クロマトグラフィー等があげられる。
【００４２】
このようにして得られる本発明の前記多量体タンパク質は、後述するように、例えば、タンパク質の可溶化、タンパク質の分析等に使用できる。
【００４３】
＜タンパク質可溶化剤＞
本発明のタンパク質可溶化剤は、前述のように、前記本発明の多量体タンパク質を含むことを特徴とする。本発明のタンパク質可溶化剤は、前記多量体タンパク質を含むことが特徴であって、その他の構成は何ら制限されない。本発明のタンパク質可溶化剤は、後述のように、例えば、タンパク質の可溶化、タンパク質の分析等に使用できる。
【００４４】
本発明のタンパク質可溶化剤は、例えば、前記多量体タンパク質に加えて、公知のタンパク質可溶化剤を含んでもよい。
【００４５】
＜タンパク質の可溶化方法＞
本発明のタンパク質の可溶化方法は、被検タンパク質に前記本発明の多量体タンパク質を接触させる工程を含むことを特徴とする。本発明のタンパク質の可溶化方法は、前記多量体タンパク質を含むことが特徴であって、その他の工程は何ら制限されない。本発明のタンパク質の可溶化方法によれば、被検タンパク質を可溶化できる。
【００４６】
前記被検タンパク質は、前述のように、例えば、タンパク質凝集体およびフォールディングタンパク質があげられる。前記被検タンパク質の具体例としては、例えば、アミロイドβ、プリオンタンパク質、αシヌクレイン、アクチン、ＤＮａｓｅ  Ｉ、α因子前駆体タンパク質、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）等があげられる。前記ＳＯＤは、例えば、マンガン−ＳＯＤ（Ｍｎ−ＳＯＤ）があげられる。
【００４７】
前記被検タンパク質は、例えば、精製タンパク質でもよいし、未精製タンパク質でもよく、後者としては、例えば、組織抽出物、細胞抽出物等でもよい。
【００４８】
本発明のタンパク質の可溶化方法において使用する前記多量体タンパク質の由来は、特に制限されず、例えば、前記被検タンパク質の種類によって、適宜決定できる。前記被検タンパク質がヒト由来の場合、前記多量体タンパク質の由来は、ヒトが好ましい。
【００４９】
前記被検タンパク質への前記多量体タンパク質の接触は、例えば、前記被検タンパク質に前記多量体タンパク質を添加する、または、前記多量体タンパク質に前記被検タンパク質を添加することで行える。前記多量体タンパク質の添加量は、特に制限されず、前記被検タンパク質の種類によって、適宜決定できる。前記添加量は、例えば、前記多量体タンパク質：前記被検タンパク質（モル比）が、１：０．５〜１０であり、好ましくは１：１〜５である。
【００５０】
前記多量体タンパク質と前記被検タンパク質との反応条件は、特に制限されず、被検タンパク質の種類によって、適宜決定できる。前記反応条件の反応温度は、例えば、２０〜４２℃であり、好ましく、２５〜３７℃であり、より好ましくは３０℃である。前記反応条件の反応時間は、例えば、１０分〜１２時間であり、好ましくは２０分〜６時間であり、より好ましくは３０分〜１時間である。
【００５１】
前記多量体タンパク質と前記被検タンパク質との接触は、例えば、溶媒存在下で行うことが好ましい。前記溶媒として、例えば、水または緩衝液等の水系溶媒が好ましい。前記溶媒のｐＨは、特に制限されず、前記被検タンパク質が可溶化活性を示す範囲であればよく、例えば、ｐＨ６．０〜８．５であり、ｐＨ６．８〜７．４が好ましい。前記溶媒中で前記多量体タンパク質と前記被検タンパク質とを接触させる場合、前記多量体タンパク質と前記被検タンパク質との割合（モル比）は、例えば、前記多量体タンパク質：前記被検タンパク質が、１：０．５〜１０であり、好ましくは１：１〜５である。
【００５２】
＜タンパク質の分析方法＞
本発明のタンパク質の分析方法は、被検タンパク質を前記多量体タンパク質で可溶化する工程と、前記被検タンパク質の可溶化物を検出する工程とを含むことを特徴とする。本発明のタンパク質の分析方法は、前記多量体タンパク質を含むことが特徴であって、その他の工程は何ら制限されない。本発明の分析方法によれば、例えば、前記被検タンパク質を定性分析、または、定量分析できる。
【００５３】
前記被検タンパク質の可溶化方法は、前述のタンパク質の可溶化方法の説明と同様である。前記被検タンパク質は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【００５４】
前記被検タンパク質の可溶化物の検出は、特に制限されず、公知のタンパク質検出方法を採用できる。前記タンパク質検出方法は、例えば、抗原抗体法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法等があげられる。
【００５５】
＜分析試薬＞
本発明の分析試薬は、前記被検タンパク質の分析方法に使用する分析試薬であって、前記本発明の多量体タンパク質を含むことを特徴とする。本発明の分析試薬は、前記多量体タンパク質を含むことが特徴であって、その他の構成は何ら制限されない。前記分析試薬によれば、前述のように、前記被検タンパク質の分析が行える。また、前記分析試薬は、後述する、本発明の疾患の罹患危険度の分析方法にも使用できる。
【００５６】
前記分析試薬は、前記多量体タンパク質に加えて、さらに、前記被検タンパク質の検出試薬を含んでもよい。前記検出試薬は、例えば、前記被検タンパク質に対する抗体があげられる。この場合、さらに、前記被検タンパク質と前記抗体との結合を検出する物質を含むことが好ましい。前記検出物質は、例えば、前記抗体に対する検出可能な標識化抗体と、前記標識に対する基質との組合せ等があげられる。
【００５７】
＜疾患の罹患危険度の分析方法＞
本発明の疾患の罹患危険度の分析方法は、タンパク質凝集体またはフォールディングタンパク質が、指標タンパク質となる疾患の罹患危険度の分析方法であって、
被験者の生体試料に前記本発明の多量体タンパク質を接触させ、前記生体試料中の前記指標タンパク質を可溶化する工程と、
前記指標タンパク質の可溶化物を検出する工程とを含むことを特徴とする。本発明の疾患の罹患危険度の分析方法は、前記多量体タンパク質を含むことが特徴であって、その他の工程は何ら制限されない。本発明の疾患の罹患危険度の分析方法によれば、例えば、前記指標タンパク質の発現量を指標に、被験者の疾患の罹患危険度を分析できる。
【００５８】
前記指標タンパク質は、例えば、アミロイドβ、プリオンタンパク質、αシヌクレイン、アクチン、Ｍｎ−ＳＯＤ等のＳＯＤ等があげられる。
【００５９】
前記指標タンパク質の可溶化方法および前記可溶化タンパク質の検出方法は、例えば、前述の通りである。
【実施例】
【００６０】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【００６１】
［実施例１］
本発明の多量体タンパク質を、以下の方法により調製した。
【００６２】
（１）多量体タンパク質の発現
ヒト多量体タンパク質のサブユニットをコードする配列番号２のポリヌクレオチドとヒスチジンタグのポリヌクレオチドとを機能的に連結したポリヌクレオチドを、バキュロウイルス産生用のｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターにクローニングした。このクローニングベクターを、昆虫細胞Ｓｆ９細胞に、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、導入した。前記導入後、前記細胞を５〜7日間培養し、前記サブユニット発現用のバキュロウイルスを含む培養上清を回収した。前記Ｓｆ９細胞の培養は、１０％ＦＢＳを含むＧｒａｃｅ培地を使用し、２７℃で行った（以下、同様）。
【００６３】
次に、新たなＳｆ９細胞に、前記培養上清をＭＯＩ２〜５となるように加え、前記バキュロウイルスを感染させた。前記感染後、２〜３日間培養し、前記多量体タンパク質を含むＳｆ９細胞を回収した。
【００６４】
（２）多量体タンパク質の精製
前記Ｓｆ９細胞に、その４倍重量のＮｉ−ＮＴＡ用平衡化バッファーを加え、細胞懸濁液を調製した。前記Ｎｉ−ＮＴＡ用平衡化バッファーの組成は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦとした（以下同様）。次に、前記細胞懸濁液に等体積量のガラスビーズを加え、ホモジェナイズした。そして、ホモジェナイズした懸濁液を、４℃、５分間、５，０００ｒｐｍの条件で遠心し、上清を回収後、前記上清を、再度、４℃、５０分間、５０，０００ｒｐｍの条件で遠心した。さらに、前記遠心後、得られたペレットに等重量の前記Ｎｉ−ＮＴＡ用平衡化バッファーを加え、ガラスダウンスホモジナイザー（ＷＨＥＡＴＯＮ）を用い、ペレット懸濁液を調製した。
【００６５】
前記ペレット懸濁液の１．２〜１．３倍体積量のＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）をＮｉ−ＮＴＡ用平衡化バッファーで平衡化し、これを前記ペレット懸濁液に加え、多量体タンパク質を前記Ｎｉ−ＮＴＡアガロースに結合させた。次に、前記Ｎｉ−ＮＴＡアガロースをエコノカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に詰め、Ｎｉ−ＮＴＡ用溶出バッファーを用い、前記多量体タンパク質を含む溶出液を回収した。前記Ｎｉ−ＮＴＡ用溶出バッファーの組成は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  イミダゾールとした（以下同様）。そして、前記溶出液を、イオン交換カラム用平衡化バッファーにより透析した。前記イオン交換カラム用平衡化バッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴとした（以下同様）。
【００６６】
ＤＥＡＥ−Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＭｏｎｏＱレジン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、前記イオン交換カラム用平衡化バッファーで平衡化し、これを前記透析後の溶出液に加え、前記溶出液中の前記多量体タンパク質を前記レジンに吸着させた。前記溶出液に対する前記レジンの添加量は、前記細胞重量１ｍｇあたり、前記レジン３〜３．５ｍＬとした。次に、前記レジンを、前記イオン交換カラム用平衡化バッファーで洗浄後、エコノカラムに詰め、イオン交換カラム用溶出バッファーを用い、前記レジンから前記多量体タンパク質を溶出した。前記イオン交換カラム用溶出バッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、ＮａＣｌとした。前記イオン交換カラム用溶出バッファーにおけるＮａＣｌの濃度は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ｍｍｏｌ／Ｌまたは５００ｍｍｏｌ／Ｌとした。
【００６７】
得られた溶出液を、限外濾過フィルター（商品名Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、添付のプロトコルにしたがって６０μＬまで濃縮した。前記濃縮後の前記溶出液を、ゲル濾過カラム（商品名Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰＣ３．２／３０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＳｍａｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、多量体タンパク質を含む画分を精製した。
【００６８】
［実施例２］
前記実施例１で調製した多量体タンパク質を用い、ピック小体を可溶化し、その可溶化物を検出した。
【００６９】
ピック小体は、以下の方法で調製した。まず、ピック病剖検脳由来凍結切片を、抗異常リン酸化タウ抗体（ＡＴ８、Ｔｈｅｒｍｏ）にて免疫組織染色後、前記抗体により染色されたピック小体を、レーザーマイクロダイセクター（Ｎａｏｍｉ  Ｓ．  Ｈａｃｈｉｙａ  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｔｏｓｈｉ  Ｋａｎｅｋｏ、「ＣＨＡＰＴＥＲ１２：Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｓｅｒ−ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、Ｖｏｌ．８２、ｐ．３５５−３７５参照）を用いて回収した。
【００７０】
次に、Ｈｅｐｅｓ緩衝液に、前記ピック小体５個と前記多量体タンパク質（タンパク質量０．５ｍｇ）とを添加し、１時間反応させた。前記Ｈｅｐｅｓ緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰとした。そして前記反応液から、ピック小体１個に相当する１／５体積量をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。前記泳動後のゲルを前記抗体ＡＴ８と反応させた後、ウエスタンブロッティング試薬（商品名ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて発色させ、前記発色を光化学検出装置（商品名ＶｅｒｓａＤｏｃ５０００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ)で測定することにより、異常リン酸化タウタンパク質の検出を行った。ネガティブコントロールとして、前記多量体タンパク質を未添加とした以外は、同様にして電気泳動を行った。
【００７１】
この結果を図１に示す。図１は、ピック小体に含まれる異常リン酸化タウタンパク質を検出したウエスタンブロットの写真である。図１において、レーン１は、分子量マーカー、レーン２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのサンプルバッファーのみ、レーン３は、前記多量体タンパク質未添加のネガティブコントロール、レーン４は、前記多量体タンパク質添加の実施例の結果を示す。図１に示すように、レーン３のネガティブコントロールでは、ピック小体由来の可溶化物のバンドが検出できなかったのに対し、レーン４の実施例では、ピック小体の可溶化物のバンドが検出できた。これらの結果から、前記多量体タンパク質は、タンパク質凝集体に対して優れた可溶化活性を示すことがわかった。
【００７２】
［実施例３］
前記実施例１において、ヒト多量体タンパク質のサブユニットをコードする配列番号２のヌクレオチドに代えて、ウシ多量体タンパク質のサブユニットをコードする配列番号４のヌクレオチドを使用した以外は、同様にしてウシ多量体タンパク質を調製した。これを用い、Ｐｒｏ  αＦを可溶化し、その可溶化物を検出した。
【００７３】
まず、２００ｎｇのＰｒｏ  αＦおよび５００ｎｇ前記ウシ多量体タンパク質を１００μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ）に懸濁し、３０℃で３０分間インキュベートした。前記インキュベート後、２μＬの５０μｇ／ｍＬ  トリプシンを添加し、混和後、１６℃で１５分間インキュベートした。次に、１００μｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤を添加し、氷上で５分間静置後、５μＬの２ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡおよび１２μＬの１００％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加し、攪拌した。前記攪拌後、−８０℃で１５分以上静置し、さらに、４℃  １５，０００ｒｐｍで２５分間遠心した。得られたペレットを、８μＬの２ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ緩衝液に懸濁し、泳動サンプルを調製した。そして、前記泳動サンプルを電気泳動に供し、前記電気泳動後、抗Ｐｒｏ  αＦ抗体を用い、Ｐｒｏ  αＦを定量した。また、ネガティブコントロールとして、前記ウシ多量体タンパク質を未添加とした以外は、同様にしてＰｒｏ  αＦの検出を行った。
【００７４】
この結果を図２に示す。図２は、Ｐｒｏ  αＦを検出したウエスタンブロットの写真である。図２において、レーン１は、分子量マーカー、レーン２は、前記ウシ多量体タンパク質未添加のネガティブコントロール、レーン３は、前記ウシ多量体タンパク質添加の実施例の結果を示す。図２に示すように、レーン２のネガティブコントロールのＰｒｏ  αＦのタンパク質の量に対して、レーン３の実施例では、Ｐｒｏ  αＦのタンパク質の量が減少していた。この結果から、前記ウシ多量体タンパク質は、フォールディングタンパク質に対して優れた可溶化活性を示すことがわかった。
【００７５】
［実施例４］
ヒト由来多量体タンパク質について、配列番号１のアミノ酸配列に基づき、ＣＯＬＩＳ（ＥＭＢｎｅｔ）を用いて、プロトコルにしたがって、コイルドコイルドメインを解析した。
【００７６】
この結果を図３に示す。図３は、ヒト由来多量体タンパク質のコイルドコイルドメインの予測領域を示すグラフである。図３において、縦軸は、コイルドコイルの形成確率を、横軸は、Ｎ末端のアミノ酸を１番目とした場合のアミノ酸の番号を示し、ｗｉｎｄｏｗ＝１４は、１４アミノ酸残基を一単位として解析した結果を、ｗｉｎｄｏｗ＝２１は、２１アミノ酸残基を一単位として解析した結果を、ｗｉｎｄｏｗ＝２８は、２８アミノ酸残基を一単位として解析した結果を示す。図３に示すように、ヒト由来多量体タンパク質は、中央領域に２つのコイルドコイルドメインを持つことがわかった。
【００７７】
［実施例５］
ウシ由来多量体タンパク質について、配列番号３のアミノ酸配列に基づき、実施例４と同様の方法によりコイルドコイルドメインを解析した。
【００７８】
この結果を図４に示す。図４は、前記ウシ由来多量体タンパク質のコイルドコイルドメインの予測領域を示すグラフである。図４において、縦軸は、コイルドコイルの形成確率を、横軸は、Ｎ末端のアミノ酸を１番目とした場合のアミノ酸の番号を示し、ｗｉｎｄｏｗ＝１４は、１４アミノ酸残基を一単位として解析した結果を、ｗｉｎｄｏｗ＝２１は、２１アミノ酸残基を一単位として解析した結果を、ｗｉｎｄｏｗ＝２８は、２８アミノ酸残基を一単位として解析した結果を示す。図４に示すように、前記ウシ由来多量体タンパク質は、Ｃ末端領域に１つのコイルドコイルドメインを持つことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の多量体タンパク質は、タンパク質の高次構造に対する可溶化活性を示し、タンパク質凝集体およびフォールディングタンパク質を可溶化できる。本発明によれば、神経変性疾患等で観察される前記タンパク質凝集体等を可溶化し、分析することが可能になる。このため、本発明は、臨床医療および生化学分野において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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