(57)【要約】      （修正有）【課題】果実の成熟、野菜の成熟、花の老化、落葉、及び種子発芽のより良好な制御、並びに種々の農産物（例えば、果実、野菜、及び切り花）の保管寿命を延ばすことができる、植物発育プロセスを遅延させるための方法に関する。【解決手段】特定の実施形態において、１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、及びこれらのバクテリアのあらゆる組み合わせを含む混合物から成る群より選択される方法。上述のバクテリアのうちの１つ以上を含む触媒を備える、植物発育プロセスを遅延させるための装置。バクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、及びそれらの混合物から成る群より選択される誘導剤への露出によって誘導される方法。【効果】冷蔵を必要とせず、産生物の輸送距離を延ばし、植物の成熟及び老化に起因する産生物損失を軽減する。【選択図】図４
2014113158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物部分を１つ以上のバクテリアに露出させるステップを含む、植物発育プ
ロセスを遅延させるための方法であって、前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種
、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、およびそ
れらの混合物から成る群より選択され、前記１つ以上のバクテリアが、前記植物発育プロ
セスを遅延させるのに十分な量で、前記植物または植物部分に露出される、方法。
【請求項２】
前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ロドコッカス種は、ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３株、ロドコッ
カス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロドコッカス−エリスロポリス、またはそれらの混合物を
含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のバクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそ
れらの混合物から成る群より選択される誘導剤への露出によって誘導される、請求項１に
記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のバクテリアは、アスパラギンへの露出によって誘導される、請求項４に
記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のバクテリアは、アスパラギン、コバルト、および尿素への露出によって
誘導される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記植物または植物部分は、前記１つ以上のバクテリアに間接的に露出される、請求項
１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物または植物部分は、前記１つ以上のバクテリアに直接的に露出される、請求項
１に記載の方法。
【請求項９】
前記植物発育プロセスは、果実または野菜の成熟である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物部分は、果実である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記果実は、クライマクテリック型果実である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記クライマクテリック型果実は、バナナ、桃、およびアボカドから成る群より選択さ
れる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記果実は、非クライマクテリック型果実である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記植物部分は、野菜である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物部分は、花であり、前記植物発育プロセスは、花の老化である、請求項１に記
載の方法。
【請求項１６】
前記花は、カーネーション、バラ、ラン、スベリヒユ、アオイ、またはベゴニアである
、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記植物発育プロセスは、落葉である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタ
ミカム、およびそれらの混合物から成る群より選択される１つ以上のバクテリアを含む触
媒を備える、植物発育プロセスを遅延させるための装置であって、前記１つ以上のバクテ
リアは、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で提供される、装置。
【請求項１９】
前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種を含む、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記ロドコッカス種は、ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３株、ロドコッ
カス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロドコッカス−エリスロポリス、またはそれらの混合物を
含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記１つ以上のバクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそ
れらの混合物から成る群より選択される誘導剤への露出によって誘導される、請求項１８
に記載の装置。
【請求項２２】
前記植物発育プロセスは、果実または野菜の成熟、花の老化、および落葉から成る群よ
り選択される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２３】
前記１つ以上のバクテリアは、架橋ＤＥＡＥセルロースを含むマトリクス、アルギン酸
を含むマトリクス、カラギーンを含むマトリクス、架橋アルギン酸を含むマトリクス、架
橋カラギーンを含むマトリクス、ポリアクリルアミドを含むマトリクス、またはアルギン
酸カルシウムビーズ内に固定される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２４】
前記マトリクスは、架橋ＤＥＡＥセルロースを含み、前記ＤＥＡＥセルロースは、グル
タルアルデヒドで架橋される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記触媒は、物理的構造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取
り付けられる、触媒モジュール内に存在する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２６】
植物または植物部分への前記触媒の露出を調整するように、制御デバイスをさらに備え
る、請求項１８に記載の装置。
【請求項２７】
前記植物発育プロセスの遅延における前記触媒の有効性を監視するための、監視デバイ
スをさらに備える、請求項１８に記載の装置。
【請求項２８】
前記物理的構造体は、フィルム、シート、被覆層、スロット付きチャンバ、箱、ポーチ
、およびバッグから成る群より選択される、請求項２５に記載の装置。
【請求項２９】
前記触媒モジュールは、取り外して第２の触媒モジュールと置き換えることができる、
請求項２５に記載の装置。
【請求項３０】
２つ以上の触媒モジュールが、前記物理的構造体内に配置されるか、その上に配置され
るか、またはそれに取り付けられる、請求項２５に記載の装置。
【請求項３１】
前記物理的構造体は、前記触媒モジュール内への空気流を可能にする、請求項２５に記
載の装置。
【請求項３２】
前記触媒モジュール内への前記空気流を制御するための要素をさらに備える、請求項３
１に記載の装置。
【請求項３３】
前記物理的構造体は、冷蔵構造体として提供される、請求項２５に記載の装置。
【請求項３４】
前記物理的構造体内の水分レベルを制御するための要素をさらに備える、請求項２５に
記載の装置。
【請求項３５】
前記物理的構造体内の二酸化炭素レベルを調節するための要素をさらに備える、請求項
２５に記載の装置。
【請求項３６】
植物発育プロセスを遅延させるための通気性触媒装置であって、
第１の層と、
ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミ
カム、およびそれらの混合物から成る群より選択される１つ以上のバクテリアを含む触媒
を含む第２の層であって、前記１つ以上のバクテリアは、前記植物発育プロセスを遅延さ
せるのに十分な量で提供される、第２の層と、
第３の層と、
を備え、前記第２の層は、前記第１および第３の層の間に位置付けられ、前記第１および
第３の層のうちの少なくとも１つは、前記装置に構造的完全性を提供する、
通気性触媒装置。
【請求項３７】
前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種を含む、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記ロドコッカス種は、ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３株、ロドコッ
カス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロドコッカス−エリスロポリス、またはそれらの混合物を
含む、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
前記１つ以上のバクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそ
れらの混合物から成る群より選択される誘導剤への露出によって誘導される、請求項３６
に記載の装置。
【請求項４０】
前記植物発育プロセスは、果実または野菜の成熟、花の老化、および落葉から成る群よ
り選択される、請求項３６に記載の装置。
【請求項４１】
前記第３の層は、前記触媒装置を別個の構造体に取り付けるために使用することができ
る、粘着剤層を露出させるように、前記第２の層から取り外すことができる、請求項３６
に記載の触媒装置。
【請求項４２】
前記第２の層は、前記粘着剤層である、請求項４１に記載の触媒装置。
【請求項４３】
触媒構造体を別個の構造体に取り付けるために使用することができる、粘着剤層を露出
させるように、前記第３の層から取り外すことができる、前記第３の層に隣接する第４の
層をさらに備える、請求項３６に記載の触媒装置。
【請求項４４】
前記第３の層は、前記接着剤層である、請求項４３に記載の触媒装置。
【請求項４５】
請求項３６に記載の触媒装置を含む通気性のバッグまたはポーチ。
【請求項４６】
植物または植物部分を、ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバ
クテリウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物から成る群より選択される、１つ
以上のバクテリアの酵素抽出物に露出させるステップを含む、植物発育プロセスを遅延さ
せるための方法であって、前記バクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿
素、およびそれらの混合物から成る群より選択される誘導剤によって誘導され、前記酵素
抽出物が、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で、前記植物または植物部分
に露出される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物または植物部分を１つ以上のバクテリアまたは酵素に露出させるステッ
プを含む、植物の発育を遅延させるための方法に関する。植物発育プロセスを遅延させる
ための装置がさらに提供される。
【背景技術】
【０００２】
植物および植物部分内のエチレン産生は、損傷、ホルモン（例えば、オーキシン）の適
用、嫌気性条件、冷却、熱、渇水および病原体感染を含む、種々の外部要因およびストレ
ス要因によって誘導される。果実または野菜の成熟、種子発芽、落葉、および花の老化を
含む、種々の植物発育プロセス中には、さらなるエチレン産生も観察される。
【０００３】
植物におけるエチレン生合成は、一般的に、従来「ヤン（Ｙａｎｇ）サイクル」と称さ
れる、３つの酵素が関係する酵素スキームとして示され、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニ
ン（ＳＡＭ）シンターゼは、メチオニンのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅ
ｔ）への変換を触媒し、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）シンター
ゼは、ＡｄｏＭｅｔのＡＣＣへの変換を触媒し、ＡＣＣオキシダーゼは、ＡＣＣのエチレ
ンおよび副産物の二酸化炭素およびシアン化水素への変換を触媒する。例えば、植物にお
けるエチレン生合成およびエチレンによって調節される植物の発育プロセスの概要につい
ては、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（２００１）  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｈｏｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  （Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【０００４】
以前の研究は、クライマクテリック型果実において、エチレン生合成の突然かつ顕著な
増加によって、少なくとも部分的に、成熟が誘導されることを証明した。エチレン産生の
突発は、クライマクテリック型果実の果実成熟プロセスに関係づけられているが、特に非
クライマクテリック型果物においては、その厳密な機構は完全には分かっていない。非ク
ライマクテリック型果実にはエチレン産生の突発は存在しないが、非クライマクテリック
型果実はエチレンに反応する。さらに、果実、野菜、および他の植物産生物間で、合成さ
れるエチレンの量、そしてまた、特定の産生物のエチレンに対する感度が異なる。例えば
、リンゴは、高レベルのエチレン産生およびエチレン感度を示すが、チョウセンアザミは
、低レベルのエチレン産生およびエチレン感度を示す。例えば、ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ
．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｄｕｃｅ／Ｓｔｏｒａｇｅ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ
（最終アクセス日、２００７年３月６日）の、Ｃａｎｔｗｅｌｌ（２００１）「Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｔ
ｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｆｒｅｓｈ  Ｆｒｕｉｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｇｉｔａｂｌｅｓ」を参照
されたく、参照することによりその全体が本願明細書に組み込まれる。果実の成熟は、一
般的に、色の変化、果皮の軟化、果実の糖含量および風味の変化をもたらす。成熟は、最
初のうちは果実をより食用に適した魅力的なものにするが、そのプロセスは、最終的に、
果実品質の劣化および変質をもたらし、消費には向かないものにしてしまい、大幅な商業
の財政的損失につながる。成熟プロセスの制御は、成熟を受ける果実および他の農産物の
保管寿命の改善、および輸送、貯蔵、および販売が可能な時間の延長に望ましい。
【０００５】
クライマクテリック型果実におけるエチレン生合成の急増に加えて、成熟に関係のある
変化は、呼吸速度の上昇にも関連する。果実、野菜、および他の植物産生物の呼吸の結果
として熱が産生され、結果的には、これらの商品の保管寿命および必要な貯蔵条件（例え
ば、冷蔵）に影響を与える。呼吸速度が速い植物産生物（例えば、チョウセンアザミ、切
り花、アスパラガス、ブロッコリ、ホウレンソウ等）は、低呼吸速度のもの（例えば、木
の実、ナツメヤシ、リンゴ、柑橘類の果実、ブドウ等）よりも短い保管寿命を呈する。呼
吸は、温度、大気組成、物理的ストレス、光、化学的ストレス、放射線、水ストレス、成
長調節物質、および病原体の攻撃を含む、多数の環境要因によって影響を受ける。特に、
温度は、呼吸速度において重要な役割を果たす。果実、野菜、および他の植物産生物に関
する呼吸代謝および推奨される制御大気条件の概要については、例えば、Ｋａｄｅｒ（２
００１）  Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．
２２Ａ：２９−７０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｄａｖｉｓ
）；ｕｓｎａ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｈｂ６６／０１９ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．ｐｄｆ（
最終アクセス日、２００７年３月６日）の、Ｓａｌｔｖｅｉｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  
ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｄａｖｉｓ）「Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌ
ｉｓｍ」、およびｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ．ｕｃｄａｖｉｓ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｄｕｃｅ／
Ｓｔｏｒａｇｅ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ（最終アクセス日、２００７年３月６日）の、
Ｃａｎｔｗｅｌｌ（２００１）  「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄ
ｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｆｒｅｓｈ  Ｆｒｕｉｔ
ｓ  ａｎｄ  Ｖｅｇｉｔａｂｌｅｓ」を参照されたく、参照することによりそれらの全体
が本願明細書に組み込まれる。
【０００６】
果実成熟プロセスを遅延させるための方法および組成物は、例えば、銀塩（例えば、チ
オ硫酸銀）、２，５−ノルボルナジエン、過マンガン酸カリウム、１−メチルシクロプロ
パン（１−ＭＣＰ）、シクロプロパン（ＣＰ）、およびその誘導体の適用を含む。これら
の化合物には、重金属の存在、悪臭、および圧縮時の爆発性等の、重大な不利な点があり
、該化合物を食品業界では受け入れられないもの、または適用性が限られたものにする。
エチレン産生を制限する核酸配列を導入することによって、特に、ＡＣＣシンターゼまた
はＡＣＣオキシダーゼ酵素の発現を削減することによって、植物発育プロセス（例えば、
果実の成熟）を遅延させるように、エチレン産生を制御するための遺伝子組み換え手法も
調査中である。しかしながら、遺伝子が組み換えられた農産物に対する大衆の反応は、全
てが好意的なわけではない。
【０００７】
したがって、植物発育プロセスを遅延させるための安全な方法および装置に対する技術
には、重大な必要性が残されたままである。このような方法および装置は、果実の成熟、
野菜の成熟、花の老化、落葉、および種子発芽のより良好な制御を提供すること、ならび
に種々の農産物（例えば、果実、野菜、および切り花）の保管寿命を延ばすことができ、
それによって、冷蔵を必要とせずにこれらの産生物の輸送距離をより長くすることが可能
となり、産生物の消費者に対する望ましさを高め、また、尚早の成熟および老化に起因す
る産生物損失に関連する財政的コストを削減する。
【発明の概要】
【０００８】
果実の成熟、野菜の成熟、花の老化、および落葉を含むが、これらに限定されない、植
物発育プロセスを遅延させるための方法が提供される。本発明の方法は、概して、植物ま
たは植物部分を、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量の１つ以上のバクテ
リアに露出するステップを含む。本発明の特定の態様において、バクテリアは、ロドコッ
カス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、お
よびそれらの混合物から成る群より選択される。本方法の実行時に使用されるバクテリア
は、関心の植物発育プロセスを遅延させるバクテリアの能力を誘導するように、例えば、
アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそれらの混合物を含む、誘導剤でさ
らに処理することができる。
【０００９】
本発明は、バクテリアのうちの１つ以上、特にロドコッカス種、シュードモナス−クロ
ロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、またはその混合物を含む触媒を備
える、植物発育プロセスを遅延させるための装置を提供する。植物または植物部分の触媒
への露出を可能にし、関心の植物発育プロセスを遅延させる、あらゆる装置が、本発明に
よって包含される。例示的装置は、触媒が、マトリクス内に固定され、あらゆる物理的構
造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられるものを含む
。以下に、開示される装置の種々の構成が想定され、より詳細に記述される。植物発育プ
ロセスを遅延させるための本発明の方法および装置は、果実、野菜、および花等の植物産
生物の、保存期間の延長および長距離輸送の円滑化、消費製品の満足度の改善、および尚
早の成熟または老化によって生じる産生物損失を削減するといった、特定の用途を見出す
。
【００１０】
上のように本発明を概括的に説明したが、以下、ここで添付図面を参照する。それらは
必ずしも原寸に比例して描かれたものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】果実の成熟を遅らせるための３層装置の限定的でない描写を示す図である。外層（ＡおよびＢで示す）は、装置に構造的完全性を提供する。触媒層は、以下に定義されるように、本発明の酵素のうちの１つ以上を含み、外層の間に位置付けられる。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、果実の成熟を遅らせるための種々の装置の限定的でない描写を提供する図である。これらの装置は、触媒層と、構造的完全性を提供することを意図する１つ以上の層と、装置を使用する前に取り外されることを意図する１つ以上の層と、を備える。これらの層のうちの１つ以上を取り外すことで、例えば、他の物理的構造体への装置の取り付けのための粘着剤を露出させ得る。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、果実の成熟を遅らせるための装置の限定的でない描写を示す図である。装置は、フィルム層上に固定され、物理的構造体（例えば、果実の貯蔵／輸送に好適な箱）に取り付けられる触媒を含む。
【図４】果実の成熟を遅らせるための装置の限定的でない描写を提供する図である。装置は、以下に定義される、１つ以上の触媒モジュール要素の挿入および交換を可能にする、スロット付きチャンバ構造体を含む。物理的構造体の外層は、触媒内への空気流を可能にする材料で構成することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の特定の実施形態を参照して、特に、これとともに提供される種々の図面
を参照して、本発明をより完全に記述する。実際には、本発明は、多くの異なる形態で具
体化することができ、本願明細書に記載される実施形態に制限されるものと解釈されるべ
きではない。むしろ、これらの実施形態は、適用される法律要件を本開示が満たすように
提供される。本願明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、
および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００１３】
本願明細書の全体にわたって、「含む（備える）」またはその文法的変形は、明示され
た要素、整数またはステップ、または要素群、複数の整数またはステップを包含するが、
他のいかなる要素、整数またはステップ、または要素群、複数の整数またはステップの除
外も暗示しないことを理解されるであろう。
【００１４】
本発明は、植物または植物部分を１つ以上のバクテリアに露出させるステップを含む、
植物発育プロセスを遅延させるための方法を提供する。特定の実施形態においては、植物
または植物部分を、ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリ
ウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物から成る群より選択される、１つ以上の
バクテリアに露出させるステップを含む、植物発育プロセスを遅延させる方法が導き出さ
れ、１つ以上のバクテリアが、植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で、植物また
は植物部分に露出される。関心の植物発育プロセスを遅延させるための、および本願明細
書に記述される方法を実行するための装置が、さらに提供される。本発明の方法および装
置は、例えば、果実／野菜の成熟または花の老化を遅延させるように、および果実、野菜
、または花の保存期間を延ばすように使用することができ、それによって、このような植
物産生物の輸送、配達、および販売を容易にする。
【００１５】
本願明細書で使用する場合、「植物」または「植物部分」は、無傷植物、および果実、
野菜、花、種子、葉、木の実、胚、花粉、胚珠、枝、実、穂、穂軸、外皮、茎、根、根端
、葯等を含むが、これらに限定されない、あらゆる植物部分を含むように広く定義される
。特定の実施形態では、植物部分は、果実、野菜、または花である。本発明の特定の態様
において、以下に詳述するように、植物部分は、果実、より具体的にはクライマクテリッ
ク型果実である。
【００１６】
本発明の方法および装置は、概してエチレン生合成の増加に関連する植物発育プロセス
等の、植物発育プロセスを遅延させることを目的とする。「植物発育プロセス」は、果実
の成熟、野菜の成熟、花の老化、落葉、種子発芽等を含むが、これらに限定されない、植
物または植物部分のあらゆる成長または発育プロセスを意味することを意図したものであ
る。特定の実施形態において、関心の植物発育プロセスは、果実または野菜の成熟、花の
老化、または落葉、より特定すると果実または野菜の成熟である。本願明細書に定義され
る「植物発育プロセスを遅延させる」およびその文法的変形は、関心の植物発育プロセス
のあらゆる減速、中断、抑制、または阻害、あるいは、一般的に特定の植物発育プロセス
に関連する植物または植物部分に対する表現型または遺伝子型の変化を指す。例えば、関
心の植物発育プロセスが果実の成熟である時には、果実の成熟の遅延は、概して、成熟プ
ロセス（例えば、上述のように、色の変化、果皮（例えば、子房壁）の軟化、糖含量の増
加、風味の変化、果実の全般的な劣化／変質、および消費者に対する果実の望ましさの減
少）に関連する、変化の阻害を含み得る。当業者は、果実が成熟するのに必要な時間の長
さは、例えば、果実の種類および利用される特定の貯蔵条件（例えば、温度、湿度、空気
流等）に依存して変化することを認識するであろう。したがって、「果実の成熟を遅延さ
せる」ことは、１〜９０日、特に１〜３０日、より特定すると５〜３０日の遅延となる。
果実の成熟、野菜の成熟、花の老化、および落葉等の植物発育プロセスの遅延を評価する
ための方法は、当業者の日常的な能力に十分含まれ、例えば、未処理の植物または植物部
分における植物発育プロセスとの比較に基づき得る。本発明の特定の態様において、本方
法の実行によって生じる植物発育プロセスの遅延は、未処理の植物または植物部分と、ま
たは関心の植物発育プロセスを遅らせることが知られている１つ以上の薬剤で処理した植
物または植物部分とに対して、相対的に評価することができる。例えば、本発明の方法の
実践から生じる果実の成熟の遅延は、未処理の果実、または上述したような抗成熟剤によ
って処理した果実の果実成熟時間と比較し得る。
【００１７】
植物発育プロセスを遅延させるための本発明の方法は、一般的に、植物または植物部分
を、以下のバクテリアのうちの１つ以上に露出するステップを含む。ロドコッカス種、シ
ュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、またはこれら
のバクテリアのあらゆる組み合わせを含む混合物。特定の実施形態において、１つ以上の
バクテリアは、ロドコッカス種、より具体的には、ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  
９６２５３株、ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロドコッカス−エリスロポリス、
またはそれらの混合物を含む。本願明細書で使用する場合、植物または植物部分の上述の
バクテリアのうちの１つ以上への露出は、例えば、無傷の細菌細胞、細菌細胞溶解物、お
よび酵素活性を持つ細菌抽出物（すなわち「酵素抽出物」）への露出を含む。細菌細胞を
含む、細胞からの溶解物および酵素抽出物を調製するための方法は、従来技術において日
常的なものである。本発明の方法および装置に使用される１つ以上のバクテリアは、本願
明細書において、より全般的に「触媒」と称される場合もある。
【００１８】
本発明の方法によれば、１つ以上のバクテリアが、植物発育プロセスを遅延させるのに
十分な量で、植物または植物部分に露出される。本発明のバクテリアのうちの１つ以上に
植物または植物部分を「露出する」ステップは、植物または植物部分にバクテリアを提供
するためのあらゆる方法を含む。間接的な露出方法は、例えば、バクテリアまたはバクテ
リアの混合物を、一般的な近さで植物または植物部分に配置する（すなわち、間接的な露
出）ステップを含む。他の実施形態では、バクテリアは、植物または植物部分のより近く
に、または直接的な接触を介して露出され得る。さらに、本願明細書に定義されるように
、本発明の１つ以上のバクテリアの「十分な」量は、本方法で利用される特定のバクテリ
ア、バクテリアが（例えば、上述のように、無傷の細菌細胞、細胞溶解物、または酵素抽
出物として）植物または植物部分に露出される形態、バクテリアが植物または植物部分に
露出される方法、および露出時間の長さを含むが、これに限定されない、種々の要因に依
存する。それは、当業者にとって、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに必要な１つ
以上のバクテリアの「十分な」量を判定することは、日常的実験となるであろう。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種、シュードモ
ナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物
から成る群より選択されるが、植物または植物部分に露出された時に、植物発育プロセス
を遅延させるあらゆるバクテリアを、本方法および装置に使用することができる。例えば
、ノカルジア属［日本国特許出願第５４−１２９１９０号を参照されたい］、ロドコッカ
ス［日本国特許出願第２−４７０号を参照されたい］、リゾビウム［日本国特許出願第５
−２３６９７７号を参照されたい］、クレブシエラ［日本国特許出願第５−３０９８２号
］、アエロモナス［日本国特許出願第５−３０９８３号］、アグロバクテリウム［日本国
特許出願第８−１５４６９１号］、バチルス［日本国特許出願第８−１８７０９２号］、
シュードノカルディア［日本国特許出願第８−５６６８４号］、シュードモナス、および
マイコバクテリウムに属するバクテリアは、本発明に従って使用することができる微生物
の限定的でない例である。所与の属内の全ての種が、同じ特性を呈し得るというわけでは
ない。したがって、所望の活性（例えば、果実の成熟等の特定の植物発育プロセスを遅延
させる能力）を呈することができる株を含むが、概して所望の活性を呈さない１つ以上の
種を有することが一般に知られている、属を有することが可能である。しかしながら、本
願明細書に提供される開示および従来技術の一般知識に照らして、当業者にとって、特定
の種が所望の活性のうちの１つ以上を有するかどうかを判定するアッセイを実行するのは
、日常的実験となるであろう。
【００２０】
本発明による有用なバクテリアの特定の例には、ノカルジア種、ロドコッカス種、ロド
コッカス−ロドクロウス、クレブシエラ種、アエロモナス種、シトロバクター−フロイン
ディ、アグロバクテリウム−リゾネゲス、アグロバクテリウム−ツメファシエンス、キサ
ントバクター−フラブス、エルウィニア−ニグリフルエンス、エンテロバクター種、スト
レプトマイセス種、リゾビウム種、リゾビウム−ロティ、リゾビウム−レグミノサーラム
、リゾビウム−メリオティ、カンディダ−グイリアモンジ、パントエア−アグロメランス
、クレブシエラ−ニューモニアエ亜種ニューモニアエ、アグロバクテリウム−ラジオバク
ター、バチルス−スミシイ、シュードノカルディア−サーモフィラ、シュードモナス−ク
ロロラフィス、シュードモナス−エリスロポリス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカ
ム、ロドコッカス−エリスロポリス、ノカルジア−ファルシニカ、シュードモナス−アエ
ルギノーザ、およびヘリコバクター−ピロリが挙げられるが、これらに限定されない。特
定の実施形態において、ロドコッカス属からのバクテリア、より具体的には、ロドコッカ
ス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３株（ＡＴＣＣ寄託番号５５８９９；１９９６年１２
月１１日にＡＴＣＣに寄託）、ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２株（ＡＴＣＣ寄託番号
５５８９８；１９９６年１２月１１日にＡＴＣＣに寄託）、ロドコッカス−エリスロポリ
ス、またはそれらの混合物が、本発明の方法および装置に使用される。
【００２１】
本発明の特定の態様において、１つ以上のバクテリアは、好適な誘導剤への露出または
これによる処理によって、所望の特徴（例えば、果実の成熟等の植物発育プロセスを遅延
させる能力）を呈するように「誘導される」。誘導剤には、アスパラギン、グルタミン、
コバルト、尿素またはそのあらゆる混合物が挙げられるが、これに限定されない。特定の
実施形態において、バクテリアは、アスパラギンの誘導剤、より具体的には、アスパラギ
ン、コバルト、および尿素を含む誘導剤の混合物に露出されるか、またはこれによって処
理される。誘導剤は、所望の細胞の培養中にいつでも添加することができる。例えば、バ
クテリアに関して、培地は、バクテリアの培養を開始する前に、誘導剤を補充することが
できる。代替として、バクテリアは、バクテリアを成長させるように、所定の期間、媒質
上で培養することができ、誘導剤は、バクテリアに所望の酵素活性を誘導するように、１
回以上の所定の回数添加することができる。さらに、誘導剤は、バクテリアの成長が完了
した後に、バクテリアの所望の活性を誘導するように、成長媒質に（または予め成長させ
たバクテリアを含む別個の混合物に）添加することができる。
【００２２】
特定の機構に制限することを意図していないが、本発明のバクテリアを「誘導する」ス
テップは、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、および／またはアスパラギナーゼ等の１
つ以上の酵素の産生（または産生の増加）をもたらし得、これらの酵素のうちの１つ以上
の誘導は、関心の植物発育プロセスを遅延させる役割を果たし得る。「ニトリルヒドラタ
ーゼ」「アミダーゼ」、および「アスパラギナーゼ」は、バクテリア、菌類、植物、およ
び動物を含むが、これに限定されない、種々の有機体からの細胞内に存在する一群の酵素
を含む。このような酵素は、当業者によく知られており、各酵素類は、認識された酵素活
性を有する。「酵素活性」は、本願明細書で使用する場合、概して、酵素が、ある化合物
を他の化合物に変換する等の、プロセスにおいて触媒として機能する酵素の能力を指す。
具体的には、ニトリルヒドラターゼは、ニトリル（またはシアノヒドリン）の、対応する
アミド（またはヒドロキシ酸）への加水分解を触媒する。アミダーゼは、アミドの対応す
る酸またはヒドロキシ酸への加水分解を触媒する。同様に、アスパラギナーゼＩ等のアス
パラギナーゼ酵素は、アスパラギンのアスパラギン酸への加水分解を触媒する。
【００２３】
本発明の特定の態様において、酵素活性は、（一般的に、細胞乾燥重量、例えば単位／
ｍｇ  ｃｄｗに基づいて）酵素または細胞の質量あたりの「単位」という表現で表すこと
ができる。「単位」は、概して、時間の関数として、指定された一連の条件下で、特定の
量の化合物を、異なる化合物に変換する能力を指す。特定の実施形態において、１「単位
」のニトリルヒドラターゼ活性は、１μｍｏｌのアクリロニトリルを、７．０のｐＨおよ
び３０℃の温度で、１分あたり、細胞１ミリグラム（乾燥重量）につき、その対応するア
ミドに変換する能力に関連させることができる。同様に１単位のアミターゼ活性は、１μ
ｍｏｌのアクリルアミドを、７．０のｐＨおよび３０℃の温度で、１分あたり、細胞１ミ
リグラム（乾燥重量）につき、その対応する酸に変換する能力に関連させることができる
。さらに、１単位のアスパラギナーゼ活性は、１μｍｏｌのアスパラギンを、ｐＨ７．０
および温度３０℃で、１分あたり、細胞１ミリグラム（乾燥重量）につき、その対応する
酸に変換する能力に関連させることができる。ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ活性、
またはアスパラギナーゼ活性を測定するためのアッセイは、当技術分野において知られて
おり、例えば、遊離アンモニアの検出を含む。Ｆａｅｃｅｔｔ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ（１
９６０）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１５６−１５９を参照されたく、参照す
ることによりその全体が本願明細書に組み込まれる。
【００２４】
植物または植物部分を、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、また
はそれらの混合物から成る群より選択される１つ以上の酵素に露出するステップを含む、
植物発育プロセスを遅延させる方法であって、植物発育プロセスを遅延させるのに十分な
量または酵素活性レベルの１つ以上の酵素が、植物または植物部分に露出される方法が、
本発明によってさらに包含される。例えば、上述の酵素（すなわち、ニトリルヒドラター
ゼ、アミダーゼ、および／またはアスパラギナーゼ）のうちの１つ以上を産生する、産生
するように誘導される、または産生するように遺伝子が組み換えられた細胞全体が、植物
発育プロセスを遅延させる方法において使用され得る。代替として、ニトリルヒドラター
ゼ、アミダーゼ、および／またはアスパラギナーゼは、上述の細胞のうちのいずれかから
単離、精製、または半精製されて、より単離された形態で植物または植物部分に露出され
得る。例えば、Ｇｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６
：２３４８０−２３４８５；Ｎａｇａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１３８−１４４；Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  
Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：１９４７−１９５２；Ｋａｔｏ
ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３：６６２−６７０を
参照されたく、それらの全ては、参照することによりそれらの全体が本願明細書に組み込
まれる。当業者は、単一の細胞型が、本発明の２つ以上の酵素を産生する（または産生す
るように、誘導する、あるいは遺伝子を組み換える）ことができ得ることをさらに認識さ
れるであろう。そのような細胞は、開示された方法および装置での使用に好適である。
【００２５】
種々の有機体から得られるいくつかのニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、およびアス
パラギナーゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、公的に入手可能な配列データベース
に開示されている。当技術分野において知られている代表的なニトリルヒドラターゼおよ
び脂肪族アミダーゼの限定的でないリストを、表１および２、ならびに配列表に記載する
。表１および２に関する「タンパク質スコア」は、質量分光データに基づいた、単離タン
パク質同定における信頼区間のパーセンテージ（信頼区間％）の概要を提供する。
【００２６】
【表１】
2014113158.tif 000003
【００２７】
【表２】
2014113158.tif 000004
【００２８】
概して、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼまたはあらゆるそれら
の組み合わせを産生すること、または産生するように誘導することができる、あらゆる細
菌、真菌、または動物細胞が、本発明の実行において使用されて得る。ニトリルヒドラタ
ーゼ、アミダーゼ、および／またはアスパラギナーゼは、特定の有機体（例えば、バクテ
リア、真菌、植物細胞、または動物細胞）から、細胞内で構成的に産生されて得、または
代替として、細胞は、好適な誘導剤による「誘導」を行うだけで、所望の単一または複数
の酵素を産生し得る。「構成的に」とは、本発明の少なくとも１つの酵素が、継続的に産
生される、または特定の細胞型で発現されることを意味することを意図している。しかし
ながら、他の細胞型は、上述のように、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに十分な
量または細胞活性レベルで、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、および／またはアスパ
ラギナーゼを発現するように「誘導」される必要があり得る。すなわち、本発明の酵素は
、好適な誘導剤への露出、またはこれによる処理を行なった後にのみ産生され（または十
分なレベルで産生され）得る。このような誘導剤は、当技術分野において知られており、
上記に概説されている。例えば、本発明の特定の態様において、１つ以上のバクテリアは
、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、またはそのあらゆる混合物、より具体的
には、アスパラギン、コバルト、および尿素の混合物等の誘導剤によって処理される。さ
らに、２００７年１月３０日に出願された、係属中の米国特許出願第１１／６６９，０１
１号、名称「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」に開示されて
いるように、アスパラギナーゼＩ活性は、アミノ酸を含有するアミド、またはその誘導体
を補充した媒質において、ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６６２２（グラム陽性
）、またはロドコッカス種ＤＡＰ  ９６２５３（グラム陽性）内に誘導することができる
。他のロドコッカス株も同様に、アミノ酸を含有するアミドまたはその誘導体を利用して
、アスパラギナーゼＩ酵素活性を呈するように、選択的に誘導することができる。
【００２９】
本発明の他の態様では、アスパラギンの存在下でアスパラギナーゼＩ活性を産生するシ
ュードモナス−クロロラフィス（ＡＴＣＣ寄託番号４３０５１）、および同じくアスパラ
ギナーゼ活性の産生を示したグラム陽性バクテリアである、Ｂ．ｋｌｅｔｏｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ寄託番号２１５３３）が、開示された方法で使用される。フザリウム
属、植物細胞、および動物細胞からのもの等の、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、お
よび／またはアスパラギナーゼを発現する真菌細胞もまた、細胞全体として、または上述
の酵素のうちの１つ以上が単離される源として、本願明細書に開示されている方法および
装置において使用され得る。
【００３０】
さらなる実施形態において、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、および／またはアス
パラギナーゼを発現するように遺伝子を組み換えた宿主細胞は、植物の発育プロセスを遅
延させるための本方法および装置に従って、植物または植物部分への露出に使用すること
ができる。具体的には、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、またはアスパラギナーゼを
符号化するポリヌクレオチド（または、それぞれが、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ
、またはアスパラギナーゼを符号化する、複合ポリヌクレオチド）を、本発明の酵素のう
ちの１つ以上を発現する遺伝子組み換え細胞を産生するように、標準的な分子生物学技術
によって、宿主細胞内に誘導することができる。「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオ
チド構成体」、「ヌクレオチド」、または「ヌクレオチド構成体」という用語の使用は、
本発明を、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドまたはヌクレオチドに制限することを意図して
いない。当業者は、ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドが、リボヌクレオチド、および
リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせを含むことができることを
認識されるであろう。このようなデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、
天然分子および合成類似体の両者を含む。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖形態、二
本鎖形態等を含むが、これらに限定されない、全ての配列形態も包含する。
【００３１】
所望の酵素活性（すなわちニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、またはアスパラギナー
ゼ活性）を維持するポリペプチドを符合化するポリヌクレオチドの変異体および断片はま
た、本発明の実行において使用され得る。「断片」は、ポリヌクレオチドの一部分を意図
したものであり、したがって、対応するタンパク質の一部分も符号化する。酵素ヌクレオ
チド配列の断片であるポリヌクレオチドは、概して、少なくとも１０、１５、２０、５０
、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、
５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２０
０、１，３００、または１，４００の連続するヌクレオチド、または最高で完全長までの
酵素ポリヌクレオチド配列内に存在するヌクレオチド数を含む。ポリヌクレオチド断片は
、所望の酵素活性を有するポリペプチドを符合化し、概して、少なくとも１５、２５、３
０、５０、１００、１５０、２００、または２５０の連続するアミノ酸、または最高で本
発明の完全長の酵素アミノ酸内に存在するアミノ酸の総数までを符号化する。「変異体」
とは、実質的に類似した配列を意味することを意図している。概して、本発明の特定の酵
素配列の変異体は、標準的な配列整列プログラムによって決定される、基準酵素配列に対
して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％
、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。本発明によって包含される変
異体ポリヌクレオチドは、所望の酵素活性を有するポリペプチドを符合化する。
【００３２】
遺伝子組み換え細胞の産生に関して使用される場合、「導入する」という用語は、宿主
細胞、特に大腸菌等の微生物に、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼおよび／または、ア
スパラギナーゼを符合化するポリヌクレオチドを提供することを意味することを意図する
。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内へのその潜在的挿
入を含む、配列が宿主細胞の内部を利用するような様態で提供される。本発明の方法は、
配列を宿主細胞内に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチドが、少なく
とも１つの宿主細胞の内部に接近するに過ぎない。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入す
るための方法は、当技術分野においてよく知られており、安定なトランスフェクション法
、過渡的なトランスフェクション法、およびウイルス媒介性の方法を含むが、これらに限
定されない。「安定なトランスフェクション」とは、宿主細胞内に導入されるポリヌクレ
オチド構成体が、宿主のゲノム内に統合され、その子孫によって継承できることを意味す
ることを意図している。「過渡的なトランスフェクション」または「過渡的な発現」とは
、ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されるが、ホストのゲノム内に統合されないこと
を意味することを意図している。
【００３３】
さらに、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、またはアスパラギナーゼヌクレオチド配
列は、例えば、宿主細胞内へ導入するためのプラスミド上に含有され得る。代表的な関心
のプラスミドは、画定されたクローニング部位、複製開始点、および選択可能な標識を有
するベクターを含む。プラスミドは、転写および翻訳開始配列と、転写および翻訳ターミ
ネータと、をさらに含むことができる。プラスミドはまた、少なくとも１つの独立したタ
ーミネータ配列と、真核生物、原核生物、または両者でのカセットの複製を可能にする配
列と、原核および真核生物系両者の選択標識と、を含有する遺伝子発現カセットも含むこ
とができる。ベクターは、原核生物、真核生物、または最適には両者の複製および統合に
好適である。クローニング、パッケージング、および発現系および方法の概要に関しては
、Ｇｉｌｉｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９７９）  Ｇｅｎｅ  ８：８１−９７；Ｒｏ
ｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：７３１−７３４；Ｂｅ
ｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８９）  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．１５２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１−３
（２ｄ  ｅｄ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，
ｅｄｓ．（１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗｙｏｒｋ；１９９４年追補）を参照されたい。本発明の酵素のうちの
１つ以上を発現する遺伝子組み換え宿主細胞は、細胞全体として、または本発明の１つ以
上の酵素を単離することができる生物学的源として、開示された方法および装置において
使用され得る。
【００３４】
植物発育プロセスを遅延させるための、および本発明の方法を実行するための装置がさ
らに提供される。特定の実施形態において、ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラ
フィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物から成る群より
選択される、１つ以上のバクテリアを含む触媒を備える、植物発育プロセス、特に果実の
成熟を遅延させるための装置が、本発明によって包含される。ロドコッカス−ロドクロウ
スＤＡＰ  ９６２５３株、ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロドコッカス−エリス
ロポリス、またはそれらの混合物を、本発明の特定の態様において使用することができる
。本発明の装置の１つ以上のバクテリアは、上記に定義されるように、植物発育プロセス
を遅延させるのに十分な量で提供される。本発明の他の態様において、触媒は、植物発育
プロセスを遅延させるのに十分な量または酵素活性レベルの、１つ以上の酵素（すなわち
、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、および／またはアスパラギナーゼ）を含む。本発
明の装置における触媒として使用するための所望の酵素源は、上でも詳述されている。例
えば、触媒は、本発明の酵素のうちの１つ以上を産生する（または産生するように、誘導
される、あるいは遺伝子が組み換えられる）、細胞全体の形態で使用され得、または単離
、精製、半精製形態で酵素自体を含むことができる。
【００３５】
本発明によって包含される植物発育プロセスを遅延させるための装置は、種々の好適な
形式で提供され得、また、単回使用または複数回使用（例えば、「再充電可能」）に適切
なものであり得る。さらに、本発明の装置は、住居および商業環境の両方での使用を見出
す。例えば、このような装置は、住居または商業用冷蔵庫内に統合すること、果実、野菜
、または花の長距離輸送のために、列車、トラック等の中に含めること、またはこのよう
な植物産生物の貯蔵または輸送のための独立型キャビネットとして使用することができる
。例示的な、本発明の限定的でない装置を、以下および図１〜４に示す。
【００３６】
特定の実施形態において、触媒は、固定化形式で提供される。触媒を固定するためのあ
らゆるプロセスまたはマトリクスは、植物発育プロセスを遅延させる１つ以上のバクテリ
ア（または酵素）の能力が維持される限り、使用され得る。例えば、触媒は、アルギン酸
（例えば、アルギン酸カルシウム）、カラギーン、ＤＥＡＥセルロース、またはポリアク
リルアミドを含むマトリクス内に固定され得る。他のこのようなマトリクスは、当技術分
野においてよく知られており、さらに、触媒マトリクスの機械的強度を増加させるように
、グルタルアルデヒドまたはポリエチレンイミンを含むが、これに限定されない、あらゆ
る適切な架橋剤で架橋され得る。本発明の一態様において、触媒は、グルタルアルデヒド
架橋ＤＥＡＥセルロースマトリクス内に固定される。触媒、特に固定化形態の触媒は、さ
らに、「触媒モジュール要素」として提供され得る。触媒モジュール要素は、例えば、触
媒との潜在的な接触を削減する、触媒の交換を容易にする、または触媒全体の空気流を可
能にする、さらなる構造体内に、固定化触媒等の触媒を備える。
【００３７】
一実施形態において、マトリクスは、アルギン酸またはその塩を含む。アルギン酸は、
異なる配列またはブロック内で互いに共有結合される、それぞれ、（１−４）リンクβ−
Ｄ−マンヌロネート（Ｍ）のホモポリマーおよびそのＣ−５エピマーα−Ｌ−グルロネー
ト（Ｇ）残基との線状コポリマーである。モノマーは、連続するＧ残基（Ｇブロック）、
連続するＭ残基（Ｍブロック）、交互するＭおよびＧ残基（ＭＧブロック）のホモポリマ
ーブロック、またはランダムに編成されたブロックで見ることができる。一実施形態にお
いて、アルギン酸カルシウムは、強化アルギン酸カルシウム基質を形成するように、基質
として、より具体的には、ポリエチレンイミン等で架橋されたアルギン酸カルシウムとし
て使用される。このような固定化技術の記述は、Ｂｕｃｋｅ（１９８７）「Ｃｅｌｌ  Ｉ
ｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｌｇｉｎａｔｅ」ｉｎ  Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３５（Ｂ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｍｏｓｂａｃｈ，ｅ
ｄ．）に見出すことができ、参照することにより本願明細書に組み込まれる。ポリエチレ
ンイミン架橋アルギン酸カルシウムを使用する、例示的な固定化方法は、下記の実施例５
にも記載されている。別の実施形態において、マトリクスは、アミド含有ポリマーを含む
。１つ以上のアミド基を含むあらゆるポリマーを、本発明に従って使用することができる
。一実施形態において、基質は、ポリアクリルアミドポリマーを含む。
【００３８】
固定化触媒マトリクスの機械的強度の増加は、架橋を通じて達成することができる。例
えば、細胞は、細胞の凝集を形成するように、化学的に架橋することができる。一実施形
態において、採取される細胞は、グルタルアルデヒド使用して架橋される。例えば、細胞
は、脱イオン水とグルタルアルデヒドとの混合物中に懸濁し、その後、最大凝集が達成さ
れるまで、ポリエチレンイミンを添加することができる。架橋細胞（一般的に、多数の細
胞で形成される粒子の形態）は、単純な濾過によって採取することができる。このような
技術のさらなる説明は、Ｌｏｐｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｊ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１９：７０−７５に提供されており、参照することによりその
全体が本願明細書に組み込まれる。グルタルアルデヒドで架橋したＤＥＡＥセルロースに
おける、細胞、特にロドコッカス種細胞の固定化のための一般プロトコルも、下記の実施
例４に概説される。
【００３９】
本発明の特定の態様において、固定化触媒または１つ以上の触媒モジュール要素は、「
物理的構造体」内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられる
。物理的構造体には、１つ以上の触媒モジュール要素を保持することができる、フィルム
、シート、被覆層、箱、ポーチ、バッグ、およびスロット付きチャンバが挙げられるが、
これらに限定されない。特定の実施形態において、物理的構造体は、果実、野菜、または
花の輸送または貯蔵に好適な容器を備える。物理的構造体は、２つ以上の個々の構造体を
さらに備えてもよく、それによって、個々の構造体の全てが、中央の触媒または触媒モジ
ュール要素に接続される。本願明細書において上述した物理的構造体は、随意に、外部手
段によって冷蔵され得、または物理的構造体自体の中に冷蔵ユニットを含み得る。
【００４０】
関心の植物発育プロセスを遅延させるための触媒の有効性を監視する（触媒または触媒
モジュールをいつ交換すべきかを判断する）ための、または空気流、含水量／湿度、およ
び二酸化炭素レベルを測定または監視するための要素が、随意に、本発明の装置内に含ま
れ得る。植物発育プロセスを遅延させるためのあらゆる装置は、触媒または触媒モジュー
ル要素への、またはこれを通る空気流を可能にするように、１つ以上の要素をさらに備え
ることができる。当業者は、触媒、触媒モジュール要素、または物理的構造体の大気条件
を監視および制御するための、本願明細書に記載された装置に対する他の可能な変形例を
容易に想定するであろう。温度、大気組成（例えば、相対湿度、Ｏ２およびＣＯ２レベル
）、物理的応力、光、化学的ストレス、放射線、水ストレス、成長調節物質、および病原
体の攻撃等の条件は、呼吸速度において重要な役割を果たし、果実、野菜、花、および他
の植物関連の産生物の保管寿命に大きな影響を及ぼす。貯蔵のための温度および大気条件
は、関心の果実、野菜、または植物産生物に応じて変動するが、推奨される貯蔵温度は、
一般的に、約０℃〜２０℃の範囲であり、Ｏ２およびＣＯ２レベルは、それぞれ、約１〜
１０％および０〜２０％の範囲である。果実、野菜、および関連する植物産生物の貯蔵に
は、概して、約５０％〜約１００％の相対湿度、特に８５％〜９５％、より具体的には約
９０％〜９５％が推奨される。植物産生物の呼吸速度と保管寿命との間の重要な相関を考
慮すると、このような産生物の変質を遅延させるには、上述の要因の制御が重要である。
したがって、二酸化炭素量を削減するように、装置内に二酸化炭素捕捉剤を提供すること
ができる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態では、複数の層を備える、植物発育プロセスを遅延させるため
の通気性の触媒装置が提供される。例えば、図１に示されているように、触媒装置１０は
、外層１２および１４と、外層１２と１４との間に位置付けられる中間触媒層１６とを含
むことができる。触媒層１６は、１つ以上のバクテリア（例えば、ロドコッカス種、シュ
ードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、およびそれらの
混合物）、または酵素（ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、および
それらの混合物）であって、関心の植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で提供さ
れる、１つ以上のバクテリアまたは酵素と、第３の層と、を含む。本実施形態において、
外層１２および１４のうちの１つ以上は、触媒装置１０に構造的完全性を提供する。外層
１２および１４は、一般的に、触媒層１６への空気流を可能にするが、一部の実施形態に
おいては、例えば、装置が箱の側面を形成し、箱の最外層が、触媒層を環境に露出させな
いよう所望される場合に、非通気性の外層を有することが好都合となり得る。触媒装置１
０は、本発明に従って、再使用可能または再使用不可能なバッグまたはポーチで提供する
ことができる。一実施形態において、触媒層１６は、ロドコッカス種細胞、特にロドコッ
カス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３株、ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロド
コッカス−エリスロポリス、またはそれらの混合物を含む。本発明の装置における触媒と
して利用される細菌細胞は、上記に詳述したように、１つ以上の誘導剤（例えば、アスパ
ラギン、グルタミン、コバルト、尿素、またはそれらの混合物）によって誘導し得る。
【００４２】
図２Ａ〜２Ｃは、植物発育プロセスを遅延させるための、本発明による代替の装置を示
している。これらの装置は、複数の層を含み、層のうちの１つ以上は取り外し可能である
。図２Ａに示されるように、装置は、通気性の構造層２２と、触媒層２４と、を含むこと
ができる。取り外し可能な層２６および／または２８は、構造層２２および／または触媒
層２４に沿って提供することができ、一般的に、触媒を使用する前、または活性化する前
に取り外されることを意図している。本発明の特定の態様において、取り外し可能な層２
６および２８の取り外しによって、触媒構造体の配置または取り付けを容易にする粘着剤
が、別個の物理的構造体に露出する。図２Ｂは、装置３０が、２つの通気性の構造層３２
および３４と、中間触媒層３６と、取り外し可能な層３８と、を含む、代替の一実施形態
を示している。図２Ｃは、装置４０が、２つの通気性の構造層４２および４４と、中間触
媒層４６と、２つの取り外し可能な層４８および５０と、を含む、さらに別の実施形態を
示している。
【００４３】
図３Ａ〜３Ｂは、触媒が、板紙箱等の容器の内側に取り付けられる、代替の一実施形態
６０を示している。図３Ａに示されるように、容器の側面６２は、粘着剤層６６の使用を
通じてそこに取り付けられる、触媒層６４を含む。剥離可能なフィルム６８は、触媒層を
環境への露出から保護するように、触媒層６４に隣接して提供することができる。剥離可
能なフィルム６８は、容器内に提供される植物部分に触媒を露出させ、それによって不要
な植物発育プロセスを遅延させることによって、触媒層６４内の触媒を活性化するように
取り外すことができる。
【００４４】
図３Ｂは、図３Ａに示す様態で、触媒構造体を容器内部に取り付ける前の触媒構造体７
０を示している。触媒構造体７０は、触媒層６４、粘着剤層６６、および剥離可能なフィ
ルム６８に加えて、さらなる剥離可能なフィルム７２を含む。剥離可能なフィルム７２は
、剥離可能なフィルム６８と同様に、それが包装、出荷、または貯蔵される時に、触媒構
造体７０を保護する。剥離可能なフィルム７２は、図３Ａに示す様態で、粘着剤層６６を
露出させて、触媒構造体７０を容器内部に取り付けることができるように、取り外すこと
ができる。
【００４５】
図４は、触媒カセット（例えば、カセット８６）を受容するための２つのスロット８２
および８４を含む、触媒構造体８０を示している。触媒カセット８６は、通気性があり、
容易にスロット８４に挿入すること、またはそこから取り外すことができる。したがって
、触媒カセット８６は、触媒構造体８０において新しい触媒カセットの使用が所望される
場合に、容易に置き換えることができる。触媒カセット８６は、本願明細書に記述されて
いるような触媒を含み、好ましくは、マトリクス内に固定される。触媒構造体８０は、触
媒カセット８６を通る空気流を可能にするように、メッシュスクリーン等の、向かい合っ
た通気性の表面８８および９０を含むことができる。触媒構造体８０は、代替の実施形態
では、当業者に理解されるように、１つだけの通気性の表面、２つの向かい合っていない
通気性の表面、または３つ以上の通気性の表面を含むことができる。図４は、触媒カセッ
ト（例えば、カセット８６）を受容するための２つのスロット８２および８４を含んでい
るが、当業者は、触媒構造体８０が、カセットを受容するための１つ以上のスロットを含
むことができることを理解されるであろう。触媒構造体８０は、果実または花等の植物部
分を輸送するのに使用される容器内に提供することによって、または、例えば本願明細書
に論じられているような粘着剤層を使用することによって、容器に取り付けることができ
る。
【００４６】
本方法および装置は、あらゆる関心の植物または植物部分の植物発育プロセスを遅延さ
せるのに使用され得る。特定の実施形態では、本発明の方法および装置は、成熟を遅延さ
せることを目的とし、植物部分は、成熟を受ける果実（クライマクテリック型、または非
クライマクテリック型）、野菜、または他の植物部分である。当業者は、「クライマクテ
リック型果実」は、果実の成熟中に突発のエチレン産生を呈するが、「非クライマクテリ
ック型果実」は、概して、成熟プロセス中に、エチレン生合成の大幅な増加を受けるとは
考えられないことを認識するであろう。例示的な関心の果実、野菜、および他の植物産生
物には、リンゴ、アプリコット、ビリバ、パンノキの実、チェリモヤ、フェイジョア、イ
チジク、グァバ、パラミツ、キーウィ、バナナ、桃、アボカド、リンゴ、カンタロープ、
マンゴー、マスクメロン、ネクタリン、柿、サポーテ、トゲバンレイシ、オリーブ、パパ
イア、パッションフルーツ、梨、プラム、トマト、ピーマン、ブルーベリー、カカオ、カ
シュー、キュウリ、グレープフルーツ、レモン、ライム、トウガラシ、サクランボ、オレ
ンジ、ブドウ、パイナップル、イチゴ、スイカ、タマリロ、および木の実が挙げられるが
、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の他の態様においては、花の老化、しおれ、器官脱離、または花弁の閉鎖を遅延
させる方法および装置が導き出される。本発明の実行においては、あらゆる花を使用し得
る。例示的な関心の花には、バラ、カーネーション、ラン、スベリヒユ、ウスベニアオイ
、およびベゴニアが挙げられるが、これらに限定されない。切り花、より具体的にはバラ
およびカーネーション等の商業的に重要な切り花は、特に関心の対象となる。特定の実施
形態において、エチレンに敏感な花が、本発明の実行において使用される。エチレンに敏
感な花には、ユリズイセン属、アネモネ属、アンスリウム属、キンギョソウ属、シナギク
属、アスティルベ属、カトレア属、シンビジウム属、ダリア属、デンドロビウム属、ナデ
シコ属、ユーストマ属、フリージア属、ガーベラ属、カスミソウ属、アイリス属、レンリ
ソウ属、ユリ属、リモニウム属、ネリネ属、ローザ属、ハシドイ属、チューリップ属、お
よびヒャクニチソウ属の花が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なエチレンに
敏感な花には、ヒガンバナ科、ネギ科、スズラン科、キスゲ科、ヒアシンス科、ユリ科、
ラン科、ザクロソウ科、サボテン科、キキョウ科、ナデシコ科、ベンケイソウ科、リンド
ウ科、アオイ科、イソマツ科、スベリヒユ科、ナス科、アガーベ科、アスフォデル科、ク
サスギカズラ科、シュウカイドウ科、スイカズラ科、マツムシソウ科、トウダイグサ科、
マメ科、シソ科、フトモモ科、アカバナ科、ユキノシタ科、およびクマツヅラ科のものも
挙げられる。例えば、Ｖａｎ  Ｄｏｏｍ（２００２）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎ
ｙ  ８９：３７５−３８３；Ｖａｎ  Ｄｏｏｍ（２００２）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏ
ｔａｎｙ  ８９：６８９−６９３、およびｈｏｒｔｎｅｔ．ｃｏ．ｎｚ／ｐｕｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ／ｈｏｒｔｆａｃｔｓ／ｈｆ３０５００４．ｈｔｍ（最終アクセス日２００７年
３月２０日）の、Ｅｌｇａｒ（１９９８）  「Ｃｕｔ  Ｆｌｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｆｏｌ
ｉａｇｅ−Ｃｏｏｌｉｎｇ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒ
ｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」を参照されたく、参照することによりそれらの全体が本願明
細書に組み込まれる。落葉を遅延させるための方法および装置も、本発明によって包含さ
れる。植物、果実、野菜、および花産業においては、成熟、老化、および器官離脱等の植
物発育プロセスを調節するための方法および装置に大きな商業的関心が存在している。
【００４８】
当業者は、本願明細書に開示されている方法または装置のうちのいずれかを、植物発育
プロセス、特に、概してエチレン生合成の増加（例えば、果実／野菜の成熟、花の老化、
および落葉）に関係するプロセスを遅延させるための、他の公知の方法と組み合わせるこ
とができることをさらに認識されるであろう。さらに、上述のように、エチレン産生の増
加は、病原性有機体による植物または植物部分の攻撃中にも観察されている。したがって
、本発明の方法および装置は、病原体に対する応答の改善におけるさらなる用途を見出し
うる。
【００４９】
以下の実施例は、例証として提供されるものであり、制限するためのものではない。
【実施例】
【００５０】
実験
以下、本発明を、具体的な種々の実施例を参照して説明する。以下の実施例は、本発明
を制限することを目的としたものではなく、むしろ例示的実施形態として提供される。
【００５１】
実施例１：誘導されたロドコッカス種への露出による果実の成熟の遅延
アスパラギン、アクリロニトリル、またはアセトニトリルによって誘導されるロドコッ
カス種細胞を、ＤＥＡＥセルロースのグルタルアルデヒド架橋マトリクス内に固定した。
細胞を誘導し、上述のマトリクスを準備する方法を以下に詳述する。
【００５２】
架橋ＤＥＡＥセルロース触媒マトリクスを、３つの別個の紙バッグ内に配置し（バッグ
あたり、湿重量約１〜２グラムの細胞で充填）、各バッグには、未成熟のバナナ、桃、ま
たはアボカドを入れた。負の対照として、触媒マトリクスの非存在下で、同じ果実を別個
の紙バッグ内に配置した。紙バッグは、室温に維持し、果実の成熟および劣化の徴候に対
して、産生物を毎日観察した。
【００５３】
触媒マトリクスに露出された全ての産生物は、果実の成熟の大幅な遅延を示した。より
具体的には、触媒マトリクスの存在下では、桃の硬度および皮の完全性が、より長く維持
された。同様に、バナナについては、負の対照に対して、褐色斑点の出現が遅延され、硬
度がより長く維持された。
【００５４】
実施例２：全般的な発酵および誘導プロトコル
発酵プロセス
他の実験で使用するためのロドコッカス種株ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２、およ
びロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６５２３の発酵には、以下の一般プロトコルお
よび培地を利用した。
【００５５】
発酵容器は、溶解酵素（ＤＯ）およびｐＨを測定するプローブ、およびグルコース濃度
（オフライン）を測定するサンプリングデバイスによって構成した。矯正剤（例えば、酸
、塩基、または消泡剤）、誘導剤、栄養素、および補充物を添加するために、さらなるポ
ートを使用した。予め洗浄した容器は、現場で消毒した。好適な基本培地（１または１．
５倍）Ｒ２ＡまたはＲ３Ａを使用した。これらの培地の特定の成分は後述する。ある実験
において、媒質の内容物に対するある種の置換を行った。例えば、時には、プロテオース
ペプトンおよび／またはカザミノ酸の代わりに、Ｐｒｏｆｌｏ（登録商標）（Ｔｒａｄｅ
ｒ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｅｎｐｈｉｓ，ＴＮ）を使用した。さらに、ある実験におい
ては、Ｐｒｏｆｌｏ（登録商標）（Ｔｒａｄｅｒ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｅｎｐｈｉｓ
，ＴＮ）の代わりに、Ｈｙ−Ｃｏｔｔｏｎ  ７８０３（登録商標）（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）、Ｃｏｔｔｅｎｓｅｅ
ｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ、Ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ−Ｕｌｔ
ｒａｆｉｌｔｅｒｅｄ（Ｍａｒｃｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｔ
ｓｔａｄｔ，ＮＪ）を使用した。
【００５６】
栄養素補充のための供給プロファイルは、Ｒ２ＡまたはＲ３Ａ基本培地を、より豊富な
媒質、すなわち２倍のＹＥＭＥＡと徐々に置き換えるように設定したが、その成分も以下
に詳述する。他の随意の栄養素補充物は、マルトース５０％（ｗ／ｖ）およびデキストロ
ース５０％（ｗ／ｖ）を含む。時折、マルトースおよびデキストロースの代わりに、デキ
ストロース同等物（グルコース、マルトース、およびより高多糖類）を含有する商品を使
用した。
【００５７】
接種物は、好適な固体媒質上でのロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２およびロドコッカ
ス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６５２３株の培養物から調製し、それらの適切な温度（例え
ば、３０℃）で培養した。特定の実施形態では、細胞は、４〜１４日間、好ましくは７日
間、ＹＥＭＥＡ寒天プレート上で成長させた。代替として、接種物は、以前の発酵作業に
よる冷凍細胞濃縮物から調製した。細胞濃縮物は、一般的に、発酵槽内に存在するものの
２０倍を超える濃度で調製した。加えて、接種物は、時折、好適な二相媒質（すなわち、
同じ、または異なる組成物の固体媒質を覆う液体媒質の組み合わせ）から調製した。二相
媒質を使用する時には、媒質は、概して、液体層および固体層の両方にＹＥＭＥＡを含有
した。
【００５８】
ニトリルヒドラターゼの誘導については、５〜２００ｐｐｍのＣｏＣｌ２、および７５
０ｍｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの尿素を達成するように、ｔ＝０時間で、ＣｏＣｌ２−６Ｈ２Ｏ
および尿素を添加したが、概して、１０〜５０ｐｐｍのＣｏＣｌ２、および７５００ｍｇ
／ｌ〜７．５ｇ／ｌの尿素が好ましい。特定の一実施形態では、発酵中に、尿素および／
またはコバルトを再び添加した。例えば、等容量の尿素および１５０ｐｐｍのＣｏＣｌ２
を、４〜６時間で、または２４〜３０時間で添加した。尿素に加えて、最終濃度３００〜
５００ｐｐｍのアクリロニトリル／アセトニトリル、または０．１Ｍ〜０．２Ｍのアスパ
ラギンの添加を、種々の時間で開始し、段階的に、または一定の速度で行った。細胞塊お
よび酵素濃度が許容可能になった時、一般的には２４〜９６時間後に、発酵作業を終了し
た。
【００５９】
細胞は、次いで、バッチまたは連続遠心分離、デカンティング、または濾過を含むが、
これらに限定されない、あらゆる許容可能な方法によって採取した。採取した細胞は、発
酵プロセス中に使用される誘導剤が補充される、５０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
等の好適な緩衝液中で、２０倍に濃縮される容量まで再懸濁した。細胞濃縮物は、次いで
、特に急速冷凍によって冷凍した。冷凍細胞は、後の使用のために、−２０℃〜−８０℃
で、または液体窒素下で貯蔵した。
【００６０】
培地の説明
【表３】
2014113158.tif 000005
【００６１】
誘導
ロドコッカス種株ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２、およびロドコッカス−ロドクロ
ウスＤＡＰ  ９６５２３の誘導には、以下の一般プロトコルを利用した。
【００６２】
揮発性の液体誘導剤（例えば、アクリロニトリル／アセトニトリル）を、特定の液体誘
導剤の濃度に基づいて、濾過殺菌した液体誘導剤として、容量分析的に添加した。固体誘
導剤（例えば、アスパラギン／グルタミン）の場合は、固体の重さを量り、培養物媒質に
直接的に添加した。結果として生じる媒体は、加圧滅菌した。フィルタ殺菌した液体誘導
剤を利用した時には、培地を単独で加圧滅菌し、液体誘導剤を添加する前に４０℃まで冷
却した。関心の誘導剤の代表的な濃度は、アクリロニトリル／アセトニトリルが５００ｐ
ｐｍ、アスパラギン／グルタミンが５００ｐｐｍ、およびスクシノニトリルが５０ｐｐｍ
であった。細胞は、次いで、指定の媒質上で成長させ、特定の酵素活性およびバイオマス
のためにさらに分析した。
【００６３】
実施例３：亜硝酸ヒドラターゼ、アミダーゼ、およびアスパラギナーゼ活性、ならびにア
スパラギン誘導ロドコッカス種細胞内のバイオマスの分析
ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、およびアスパラギナーゼ活性、ならびにバイオマ
スを、ロドコッカス種株のロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２およびロドコッカス−ロド
クロウスＤＡＰ  ９６５２３からのアスパラギン誘導細胞内で評価した。培地の成分、投
与方法、速度、および細胞に提供されるアスパラギンの濃度、ならびに細胞源に対する種
々の変形例を、上述の酵素の活性、およびバイオマスへのそれらの影響に関して分析した
。本実施例のＡ〜Ｇ項は、各組の試験条件の詳細を説明し、各指定条件下で得られた酵素
活性およびバイオマスの要約を提供する。
【００６４】
Ａ．基本的には、上記の実施例２に述べられているように、固体媒質から採取したロド
コッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３の細胞を使用して植菌した、２０リットルの
発酵槽に、誘導剤のアスパラギンを継続的に補充した（０．２Ｍの溶液、１２０μｌ／分
）。Ｈｙ−Ｃｏｔｔｏｎ  ７８０３（登録商標）を、上述のＲ３Ａ媒質中のプロテオース
ペプトン＃３の代わりに使用した。発酵作業の終了時点で、アクリロニトリル固有のニト
リルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、およびバイオマスを、当技術分野で知られてい
る標準的な手法に従って測定した。
【００６５】
ニトリルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、およびバイオマスの結果を、下記表３に
提供するが、活性は、単位／ｍｇ  ｃｄｗ（細胞乾燥重量）で与えられる。１単位のニト
リルヒドラターゼ活性は、ｐＨ７．０および温度３０℃で、１分あたり、細胞１ミリグラ
ム（乾燥重量）につき、１μｍｏｌのアクリロニトリルを、その対応するアミドに変換す
る能力に関連する。１単位のアミダーゼ活性は、ｐＨ７．０および温度３０℃で、１分あ
たり、細胞１ミリグラム（乾燥重量）につき、１μｍｏｌのアクリルアミドを、その対応
する酸に変換する能力に関連する。バイオマスは、ｇ／ｌ  ｃｗｗ（細胞湿重量）で充填
される細胞として記録される。
【００６６】
【表４】
2014113158.tif 000006
【００６７】
Ｂ．基本的には、上記の実施例３Ａに述べられているように、下述する媒質に変更し、
ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６５２３細胞によって、酵素活性およびバイオマ
スを評価した。より具体的には、ＹＥＭＥＡ、デキストロース、またはマルトースを、プ
ロテオースペプトン＃３の代用物としてＨｙ−Ｃｏｔｔｏｎ  ７８０３（登録商標）をさ
らに含有する、修飾Ｒ３Ａ媒質に添加した。０．２Ｍのアスパラギン溶液の添加は、ｔ＝
８時間で開始し、１２０μｌ／分の連続的な速度で行った。発酵作業の終了時点で、アク
リロニトリル固有のニトリルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、およびバイオマスを測
定した。結果を表４に要約する。ＹＥＭＥＡ、デキストロース、またはマルトースの媒質
への添加によって、生ずるバイオマスの増加が観察された。
【００６８】
【表５】
2014113158.tif 000007
【００６９】
Ｃ．固体媒質からのロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２細胞を、２０リットルの発酵作
業のための接種源として使用した（発酵プロセスの詳細については、実施例２を参照され
たい）。０．２Ｍのアスパラギン溶液の添加は、ｔ＝２４時間で開始し、２ｍｌ／分の速
度で５０〜７０分間、半連続的に６時間毎に行った。Ｈｙ−Ｃｏｔｔｏｎ  ７８０３（登
録商標）を、修飾Ｒ３Ａ媒質中のプロテオースペプトン＃３の代わりに使用した。発酵作
業の終了時点で、アクリロニトリル固有のニトリルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、
およびバイオマスを測定した。結果を表５に要約する。
【００７０】
【表６】
2014113158.tif 000008
【００７１】
Ｄ．固体媒質からのロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２細胞を、２０リットルの発酵作
業のための接種源として使用した。０．２Ｍのアスパラギン溶液の添加は、ｔ＝１２時間
で開始し、２．５ｍｌ／分の速度で１２〜８５分間、半連続的に６時間毎に行った。Ｃｏ
ｔｔｏｎ  Ｓｅｅｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅを、修飾Ｒ３Ａ媒質のプロテオースペプト
ン＃３の代わりに使用した。発酵作業の終了時点で、アクリロニトリル固有のニトリルヒ
ドラターゼ活性、アミダーゼ活性、およびバイオマスを測定し、結果を表６に要約する。
【００７２】
【表７】
2014113158.tif 000009
【００７３】
Ｅ．予め冷凍したロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３細胞を、２０リット
ルの発酵作業のための接種源として使用した。ＹＥＭＥＡ、デキストロース、またはマル
トースを、プロテオースペプトン＃３の代用物としてＨｙ−Ｃｏｔｔｏｎ  ７８０３（登
録商標）をさらに含有する、修飾Ｒ３Ａ媒質に添加した。０．１５Ｍのアスパラギン溶液
の添加は、ｔ＝８時間で開始し、１２０μｌ／分の連続的な速度で行った。発酵作業の終
了時点で、アクリロニトリル固有のニトリルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、および
バイオマスを測定した。結果を表７に要約する。
【００７４】
【表８】
2014113158.tif 000010
【００７５】
Ｆ．三相媒質上で成長させたロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３細胞を、
２０リットルの発酵作業のための接種源として使用した。炭水化物（すなわち、ＹＥＭＥ
Ａ、デキストロース、またはマルトース）の添加によって補充し、プロテオースペプトン
＃３の代わりにＣｏｔｔｏｎｓｅｅｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅをさらに含有する、修飾
Ｒ３Ａ媒質を使用した。０．１５Ｍのアスパラギン溶液の添加は、ｔ＝１０時間で開始し
、１０００μｌ／分の連続的な速度で行った。発酵作業の終了時点で、アクリロニトリル
固有のニトリルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、アスパラギナーゼＩ活性、およびバ
イオマスを測定した。結果を表８に要約する。
【００７６】
【表９】
2014113158.tif 000011
【００７７】
Ｇ．二相媒質上で成長させたロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３細胞を、
２０リットルの発酵作業のための接種源として使用した。マルトース（デキストロースの
代わりに）、およびプロテオースペプトン＃３の代用物としてＨｙ−Ｃｏｔｔｏｎ  ７８
０３（登録商標）を含有する、修飾Ｒ３Ａ媒質を使用した。０．１５Ｍのアスパラギン溶
液の添加は、ｔ＝８時間で開始し、４７６μｌ／分の連続的な速度で行った。発酵作業の
終了時点で、アクリロニトリル固有のニトリルヒドラターゼ活性、アミダーゼ活性、およ
びバイオマスを測定し、結果を表９に要約する。
【００７８】
【表１０】
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【００７９】
実施例４：グルタルアルデヒドで架橋したＤＥＡＥセルロースにおけるロドコッカス種細
胞の固定化
米国特許第４，２２９，５３６号、およびＬｏｐｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．
（２００５）  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１９：７０−７５に記載されている方法か
ら導出された修正プロセスを、グルタルアルデヒド架橋ＤＥＡＥセルロースを含むマトリ
クス内にロドコッカス種を固定するのに使用する。
細胞の調製
【００８０】
ロドコッカス細胞は、適切な培地（例えば、ＹＥＭＥＡ−マルトース＋誘導剤、二相培
養物等）内で成長させ、８，０００回転で１０分間の遠心分離によって採取する。結果と
して生じた細胞ペレットを、１００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で再懸
濁し、８，０００回転で１０分間、遠心分離する。細胞ペレットを再懸濁し、８，０００
回転で１０分間、遠心分離するこのプロセスを二回繰り返す。最終細胞試料の充填湿重量
（ｗｗ）を記録する。細胞の小試料のニトリルヒドラターゼ活性を行い、細胞全体の酵素
活性を評価する。
【００８１】
細胞の固定化
採取したロドコッカス種細胞と同量のＤＥＡＥセルロースが得られ、細胞およびＤＥＡ
Ｅセルロースは、１００ｍｌの脱イオンＨ２Ｏ中で再懸濁される。０．５％の最終濃度を
達成するのに十分なグルタルアルデヒドの２５％溶液の容量を、撹拌しながら、細胞／Ｄ
ＥＡＥセルロースの混合物に添加する。混合物を１時間撹拌し、その後、４００ｍｌの脱
イオンＨ２Ｏを、さらに撹拌しながら添加する。撹拌している間、５０％（溶液重量）の
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ＭＷ  ７５０，０００）を添加する。凝集が完了するまで
撹拌を続ける。凝集させた混合物を濾過し、適切なサイズの注射器で押し出す。固定化細
胞は、小片に分割し、終夜乾燥して、使用前に約２〜３ｍｍの顆粒状に切断する。
【００８２】
実施例５：アルギン酸カルシウムにおけるロドコッカス種細胞の固定化およびアルギン酸
カルシウムビーズの硬化
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３５（Ｂ）のＢｕｃｋｅ（
１９８７）「Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｌｇ
ｉｎａｔｅ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｒ
ｉｆｏｒｎｉａ；Ｍｏｓｂａｃｈ，ｅｄ）に記載されている方法から採用したプロセスを
、アルギン酸カルシウム中にロドコッカス種を固定するのに使用する。
【００８３】
細胞の調製
ロドコッカス種細胞は、上記の実施例４に述べられているように調製される。
【００８４】
細胞の固定化
２５ｇの４％ナトリウムアルギン酸溶液を、１ｇのナトリウムアルギン酸を２４ｍｌの
５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．２）中に溶解することによって生成する。２５ｍｇの
ナトリウムメタ過ヨウ素酸塩を、アルギン酸溶液に添加し、２５℃で１時間、またはアル
ギン酸が完全に溶解するまで撹拌する。上述のように調製した細胞を、５０ｍＭのトリス
ＨＣｌ（ｐＨ７．２）中で最終容量が５０ｍｌになるまで再懸濁し、次いで、撹拌しなが
ら、ナトリウムアルギン酸溶液に添加する。結果として生じるビーズを、２７ゲージ針に
よって、５００ｍｌの０．１ＭのＣａＣｌ２溶液中に押し出す。針は、概して、空気がビ
ーズの中に入らないように、また、ビーズに刺さらないように、溶液の約２インチ上に配
置される。ビーズは、ＣａＣｌ２溶液中で約１時間で硬化し、次いで、ビーズを、水です
すいで、使用前に０．１ＭのＣａＣｌ２溶液中に４℃で貯蔵する。
【００８５】
ロドコッカス種細胞を含むアルギン酸カルシウムビーズの硬化
上記に概説したように調製したアルギン酸カルシウムビーズは、ＰＥＩで架橋すること
によってさらに増強し得る。ビーズは、２Ｌの０．１ＭのＣａＣｌ２溶液（０．１ＭのＣ
ａＣｌ２溶液中に２０ｇの５０％ＰＥＩ）中の０．５％ＰＥＩ中で培養する。最終溶液の
ｐＨは、必要に応じて、ＨＣｌまたはＮａＯＨによって７．０に調整し、ビーズは、２４
時間培養する。ビーズは、次いで、水ですすいで、使用前に、０．１ＭのＣａＣｌ２溶液
中に４℃で貯蔵する。
【００８６】
上述の説明に示される内容の利益を有する、本発明に関連する当業者には、本願明細書
に記載される本発明の多数の変形例および他の実施形態が想起されるであろう。したがっ
て、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、その変形例および
他の実施形態が、添付の特許請求の範囲に含まれることを意図するものであると理解され
たい。特定の用語を本願明細書に用いたが、それらは一般的に使用され、記述を意識した
だけのものであり、制限するためのものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月17日(2014.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物部分を１つ以上のバクテリアに露出させるステップを含む、植物発育プロセスを遅延させるための方法であって、前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種、シュードモナス−クロロラフィス、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記１つ以上のバクテリアが、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で、前記植物または植物部分に露出される、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月14日(2014.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または植物部分を１つ以上の単離された酵素に露出させるステップを含む、植物発育プロセスを遅延させるための方法であって、前記１つ以上の単離された酵素は、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択され、前記１つ以上の単離された酵素が、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で、前記植物または植物部分に露出される、方法。
【請求項２】
前記１つ以上の単離された酵素は、１つ以上のバクテリアにより提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の単離された酵素は、前記１つ以上のバクテリアから精製または半精製される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種、ブレビバクテリウム−ケトグルタミカム、シュードモナス−クロロラフィス、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のバクテリアは、ロドコッカス種を含み、任意選択的に、前記ロドコッカス種は、ロドコッカス−ロドクロウスＤＡＰ  ９６２５３株、ロドコッカス種ＤＡＰ  ９６６２２株、ロドコッカス−エリスロポリス、またはそれらの混合物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上のバクテリアは、アスパラギン、グルタミン、コバルト、尿素、およびそれらの混合物から成る群より選択される誘導剤への露出によって誘導される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
前記植物または植物部分は、前記１つ以上の酵素に間接的または直接的に露出される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物発育プロセスは、果実の成熟、野菜の成熟、または落葉である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記植物部分は、果実、野菜、または花であり、任意選択的に、前記果実は、クライマクテリック型果実であり、任意選択的に、前記クライマクテリック型果実は、バナナ、桃、プラム、ネクタリン、リンゴ、トマト、梨、およびアボカドから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物部分は、花であり、前記植物発育プロセスは、花の老化、しおれ、落花または花弁の閉鎖であり、任意選択的に、前記花は、カーネーション、バラ、ラン、スベリヒユ、アオイ、またはベゴニアである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物発育プロセスを遅延させることにより、前記植物または植物部分の保管寿命の増加をもたらすか、または前記植物または植物部分の長距離輸送を容易にする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の単離された酵素は固定され、物理的構造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複数の層を備える、植物発育プロセスを遅延させるための装置であって、少なくとも１つの層は、ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される１つ以上の単離された酵素を含む触媒を含み、前記触媒は、フィルム、シート、被覆層、箱、ポーチ、バッグ、またはスロット付きチャンバなどの物理的構造体内に配置されるか、その上に配置されるか、またはそれに取り付けられ、前記１つ以上の単離された酵素は、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で提供される、装置。
【請求項１４】
前記１つ以上の単離された酵素は、架橋ＤＥＡＥセルロースを含むマトリクス、アルギン酸を含むマトリクス、カラギーンを含むマトリクス、ポリアクリルアミドを含むマトリクス、またはアルギン酸カルシウムビーズ内に固定される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
請求項１３に記載の植物発育プロセスを遅延させるための装置であって、
前記装置は、植物発育プロセスを遅延させるための通気性触媒装置であり、
第１の層と、
ニトリルヒドラターゼ、アミダーゼ、アスパラギナーゼ、およびそれらの混合物から成る群から選択される１つ以上の単離された酵素を含む触媒を含む第２の層であって、前記１つ以上の単離された酵素は、前記植物発育プロセスを遅延させるのに十分な量で提供される、第２の層と、
を備え、前記第１の層は、前記装置に構造的完全性を提供する、装置。
【請求項１６】
前記物理的構造体は、フィルム、シート、被覆層、箱、ポーチ、バッグ、またはスロット付きチャンバである、請求項１３〜１５のいずれかに記載の装置。
【外国語明細書】
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