(57)【要約】      （修正有）【課題】サーモアスカス（Thermoascus）属真菌を迅速かつ正確に検出、他の属の真菌と識別しうる方法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は特定の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されており、かつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌の検出を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに
下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス（Thermoascus）属真菌の検出を行う、サーモアスカス属真菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
検出を行うために、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子又はβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌の検出を行う、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、サーモアスカス属真菌のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌検出を行う、請求項２記載の検出方法。
【請求項４】
前記サーモアスカス属真菌のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列が下記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかである、請求項１〜３のいずれか記載の検出方法。
（ｅ）配列番号５に記載のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｇ）配列番号６に記載のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｉ）配列番号７に記載のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｊ）配列番号７に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項５】
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌検出を行う、請求項２記載の検出方法。
【請求項６】
前記サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかである、請求項１、２及び５のいずれか記載の検出方法。
（ｋ）配列番号８に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｌ）配列番号８に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｍ）配列番号９に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｎ）配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド若しくは下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス（Thermoascus）属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、請求項７記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項９】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸にハイブリダイズすることができ、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、請求項８記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
（ｅ）配列番号５に記載のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｇ）配列番号６に記載のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｉ）配列番号７に記載のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｊ）配列番号７に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項１０】
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅でき、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項９記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項１１】
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、下記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸にハイブリダイズすることができ、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、請求項８記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
（ｋ）配列番号８に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｌ）配列番号８に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
（ｍ）配列番号９に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｎ）配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
【請求項１２】
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅でき、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項１１記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むサーモアスカス（Thermoascus）属真菌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーモアスカス（Thermoascus）属真菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性の菌類（真菌）は自然界に広く分布し、野菜、果物等の農作物で繁殖し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染する。しかも、耐熱性の真菌は通常の他の真菌に比べて高い耐熱性を有する子嚢胞子を生活環の中で形成する。例えば酸性飲料の加熱殺菌処理を行ったとしても耐熱性真菌が生存、増殖し、カビの発生原因となることがある。
【０００３】
加熱殺菌処理後の飲食品からも検出されることがある汚染事故の原因菌の主な耐熱性真菌の１種として、サーモアスカス属に属する耐熱性真菌が知られている。飲食品及びこれらの原材料中の耐熱性真菌による事故防止のためには、サーモアスカス属に属する耐熱性真菌の検出が重要であり、サーモアスカス属の菌種は飲食品業界で重要危害菌として警戒されている。
【０００４】
従来のサーモアスカス属真菌の検出方法、及び他の属との識別方法は、培養を用いた形態学的な分類が主である。この方法は形態学的な特徴が発生するまで培養を続ける必要があるため、最短でも１４日以上の長期間を必要とする。また、形態学的な同定には極めて高い専門性を必要とするため、判定者によって同定結果が異なる危険性が否定できない。さらには加熱や薬剤などによる損傷菌体等は形態形成能を失うケースが存在し、それら菌体は長期間培養を行っても特徴的な形態を形成しないことから、検出・識別結果の正確性に問題があった。
このように真菌の検出に長期間を要し、さらには他の属との識別結果の正確性に問題がある形態学的な方法は、飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるとは言いがたい。従って、こうした従来の迅速性と正確性の問題を解決した検出方法の確立が求められてきた。
【０００５】
真菌類の迅速性及び正確性の高い検出方法としては、遺伝子の特定の塩基配列を標的とした増幅法（たとえばＰＣＲ法やＬＡＭＰ法）が知られている。また、サーモアスカス属と他の属とを識別する遺伝子の存在は知られており（例えば、非特許文献１参照）、DDBJ等の公共の遺伝子データベースにサーモアスカス属真菌の遺伝子の塩基配列情報は登録されている。しかし、サーモアスカス属真菌のＤＮＡの塩基配列のデータベースが現在のところ脆弱であり、サーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出するための高感度のプライマーの設計には至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J．Houbraken，et  al.，Studies  in  Mycology，2011，vol．70，p．1-51
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
耐熱性を有する真菌は、サーモアスカス属真菌以外にも存在し、それらの耐熱性は属や種により異なることが知られている。したがって、飲食品業界などにおいて、サーモアスカス属真菌などの耐熱性菌の制御（混入防止、殺滅、増殖阻止）には各菌種の微生物学的な特性に合せた制御方法を決定することが必要となる。そこで、飲食品業界などにおいて危害菌の迅速かつ正確なリスク評価を行うには、サーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出することが重要となる。
【０００８】
本発明は、飲食品業界などにおいて危害菌とされているサーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出し、他の属の真菌と識別しうる方法を提供することを課題とする。また、本発明はこの方法に適用可能なオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような課題に鑑み、本発明者等は、サーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。具体的には、本発明者らは、サーモアスカス属真菌のＲＮＡポリメラーゼIIラージサブユニット遺伝子（以下、本明細書において「RPB1遺伝子」ともいう）及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づく分子系統分類学的手法を用いて、鋭意検討を行った。その結果、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の中に、他の真菌のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する部位（以下、「可変部位」ともいう）が存在することを見出した。また、これらの可変部位をターゲットとすることでサーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【００１０】
本発明は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対並びに下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌の検出を行う、サーモアスカス属真菌の検出方法に関する。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【００１１】
また、本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド若しくは前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対に関する。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むサーモアスカス属真菌検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検出方法は、飲食品の汚染事故の原因菌の１種であるサーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出し、他の属の真菌と識別することができる。また、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド対及び検出キットは、前記方法に好適に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列に基づいて作成した、サーモアスカス属真菌の分子系統樹を示す図である。
【図２】サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）及びサーモアスカス・アウランティアカス（Thermascus aurantiacus）のRPB1遺伝子の塩基配列、並びにサーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・サーモフィラス及びサーモアスカス・アウランティアカスのRPB1遺伝子の塩基配列における前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図３】サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列、並びにサーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す図である。
【図４】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図５】実施例における、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図６】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【図７】実施例における、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＰＣＲ産物の電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子又はβ−チューブリン遺伝子の特定の部分塩基配列、すなわち本領域に存在するサーモアスカス属真菌に特異的な塩基配列部位（可変部位）にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌の検出を行い、サーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出する方法である。ここで、「可変部位」とは、RPB1遺伝子又はβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中で塩基変異が蓄積しやすい部位であり、この部位の塩基配列は他菌種との間で大きく異なる。
【００１５】
サーモアスカス属真菌はユウロチウム（Eurotium）目に属し、有性世代（完全世代）で耐熱性が極めて強い子のう胞子を形成する。
成熟した子のう胞子は、９０℃におけるＤ値（初期の生残する菌数を1/10に殺菌するのに必要な時間）が約３０分であり、食品業界において商業的無菌を担保する殺菌である６Ｄ殺菌（初発菌数を1／1000000に低減する殺菌）を行うことができない。また、サーモアスカス属真菌は土壌に広く分布するため、農作物由来の原料から食品中に混入するリスクが高い。さらにはサーモアスカス属真菌は酸性飲料のpＨでも用意に増殖可能であるため、加熱殺菌後生残したサーモアスカス属真菌は食品中で増殖して腐敗事故を引き起こす可能性がある。
【００１６】
本明細書において、「RPB1」とはＲＮＡを合成する酵素でありＤＮＡを鋳型にしてｍＲＮＡやｓｎＲＮＡ遺伝子の多くを転写するＲＮＡポリメラーゼIIを構成する複数のサブユニットの内、ＤＮＡ結合能及びＲＮＡ合成能を有するサブユニットの１種であり、「RPB1遺伝子」とは、RPB1をコードする遺伝子である。また、「β−チューブリン」とは微小管を構成する蛋白質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。
【００１７】
本明細書における「属」とは、サーモアスカス属真菌及びその他の耐熱性真菌のＤＮＡ（好ましくは、RPB1遺伝子、β−チューブリン遺伝子、又はRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子）の塩基配列について分子系統分類学的手法を用いて作成した分子系統樹に基づいて分類した、近縁関係にあるサーモアスカス属真菌の菌種群を意味する。
前記分子系統樹の作成方法としては特に制限はなく、通常の方法により作成することができる。例えば、近隣結合法（neighbor-joining  method）、最大節約法（Maximum  parsimony）、最尤法（Maximum  likelihood  estimation）、ベイズ法、非加重結合法（Unweighted  Pair  Group  Method  with  Arithmetic  mean）等を用いて作成することができる。本発明においては、近隣結合法を用いて分子系統樹を作成することが好ましい。
本発明における「サーモアスカス属真菌」には、具体的に、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・サーモフィラス、及びサーモアスカス・アウランティアカス等が含まれる。さらには、ビソクラミス・ヴァールコサ（Byssochlamys verrucosa）（J．Houbraken  et  al.，Studies  in  Mycology，2011，vol．70，p．1-51参照）などのように、分類学上別種に分類されていても、後述に示すようにRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の少なくとも一方に特定の塩基配列を有するものであれば、本発明における「サーモアスカス属真菌」に含まれる。なお、J．Houbraken  et  al.により、ビソクラミス・ヴァールコサはビソクラミス属よりもむしろサーモアスカス属により近縁であり、本来サーモアスカス属に分類されるべきものとされている（J．Houbraken  et  al.，Studies  in  Mycology，2011，vol．70，p．1-51参照）。
【００１８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１９】
本発明の検出方法は、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子又はβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位に対応する核酸で表されるオリゴヌクレオチド対を用いることを特徴とする。
発明者等は、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、種間での遺伝的距離と塩基配列の相同性の解析を行った。すなわち、シークエンシング法によりサーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を決定し、アライメント解析により一致する塩基領域の検討を行った。その結果、RPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中に同一属内では保存性が高いが異なる属間で塩基配列の保存性が低く、属によって固有の塩基配列を有する可変部位を見い出した。この可変部位においてサーモアスカス属真菌は属固有の塩基配列を有している。そのため、当該領域はサーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出するための遺伝学的な指標として有用である。
【００２０】
本発明の検出方法は、下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いる。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
前記オリゴヌクレオチド対を使用してサーモアスカス属真菌を検出し、同定することにより、サーモアスカス属真菌の検出が可能となる。
【００２１】
サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子の塩基配列中の可変部位を図２、並びに配列番号５〜７に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、図２は、サーモアスカス・クラスタセウスCBS181.67株、サーモアスカス・サーモフィラスCBS528.71株及びサーモアスカス・アウランティアカスCBS396.78株のRPB1遺伝子の塩基配列、並びにサーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・サーモフィラス及びサーモアスカス・アウランティアカスのRPB1遺伝子の塩基配列における前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す。また、配列番号５に記載の塩基配列は、サーモアスカス・クラスタセウスCBS181.67株のRPB1遺伝子の塩基配列を示し、配列番号６に記載の塩基配列は、サーモアスカス・アウランティアカスCBS396.78株のRPB1遺伝子の塩基配列を示し、配列番号７に記載の塩基配列は、サーモアスカス・サーモフィラスCBS528.71株のRPB1遺伝子の塩基配列を示す。
前記（ａ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、The_RPB_F2ともいう）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、The_RPB_R2ともいう）はそれぞれ、配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列のうち６７位〜９０位までの領域及び４３８位〜４６２位までの領域にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は属間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はサーモアスカス属真菌が固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、サーモアスカス属真菌を属レベルで迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればサーモアスカス属真菌に特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による検出が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりサーモアスカス属真菌を検出することが可能となる。
【００２２】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｅ）配列番号５に記載のRPB1遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号５に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｇ）配列番号６に記載のRPB1遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号６に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｉ）配列番号７に記載のRPB1遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｊ）配列番号７に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号７に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
【００２３】
本発明の検出方法に用いる前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、サーモアスカス属真菌の属レベルでの検出に使用できれば、配列番号１又は２に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号１又は２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつサーモアスカス属真菌の属レベルでの検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２４】
サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位を図３、並びに配列番号８及び９に記載の塩基配列に基づき説明する。なお、図３は、サーモアスカス・クラスタセウスCBS181.67株及びサーモアスカス・アウランティアカスCBS396.78株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列、並びにサーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドが認識する塩基配列の位置関係を示す。また、配列番号８に記載の塩基配列は、サーモアスカス・クラスタセウスCBS181.67株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を示し、配列番号９に記載の塩基配列は、サーモアスカス・アウランティアカスNRRL5861株のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を示す。
前記（ｃ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、The_F2ともいう）及び前記（ｄ）のオリゴヌクレオチド（本明細書において、The_R2ともいう）はそれぞれ、配列番号８に記載の塩基配列のうち３３位〜５３位までの領域及び３０６位〜３２８位までの領域、配列番号９に記載の塩基配列のうち５２位〜７２位までの領域及び３２３位〜３４５位までの領域、にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。これらの領域は属間での塩基配列の保存性が低い可変領域であり、これらの領域の塩基配列はサーモアスカス属真菌が固有に有する塩基配列であることを本発明者らが見出した。
したがって、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて、サーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）を迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、本領域にポリメラーゼによるＤＮＡの伸長方向であるプライマーの３’末端５塩基以上がハイブリダイズするように設計すればサーモアスカス属真菌に特異的なプライマーとして用いることが可能であり、それらのプライマーを用いたＰＣＲ法による同定が可能となる。また、本領域を１０塩基以上ハイブリダイズするように設計したプローブは、サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするため、ハイブリダイズの有無によりサーモアスカス属真菌を検出することが可能となる。
【００２５】
本発明において、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドを用いて、下記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸（好ましくは、前記可変部位）の存在を確認することが好ましい。
（ｋ）配列番号８に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｌ）配列番号８に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌（好ましくは、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種）の検出に使用できる塩基配列、配列番号８に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌（好ましくは、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種）の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｍ）配列番号９に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｎ）配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌（好ましくは、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種）の検出に使用できる塩基配列、配列番号９に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌（好ましくは、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種）の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
【００２６】
本発明の検出方法に用いる前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号３又は４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明の検出方法に用いるオリゴヌクレオチドは、サーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）の検出に使用できれば、配列番号３又は４に記載の塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号３又は４に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、置換又は挿入されており、かつサーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）の検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２７】
前記オリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００２８】
前記オリゴヌクレオチドは、例えばＤＮＡ自動合成機等を用いた化学合成等の通常の合成方法により調製することができる。また、サーモアスカス属真菌の遺伝子から制限酵素等を用いて直接切り出したり、また遺伝子をクローニングして単離精製した後、制限酵素などを用いて切り出して調製することも可能である。操作の容易さ、大量かつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得られる点から化学合成により調製するのが好ましい。
【００２９】
前記オリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の部分塩基配列で表される核酸の存在を確認し、サーモアスカス属真菌を検出する方法として特に制限はなく、シークエンシング法、ハイブリダイゼンション法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法など通常用いられる遺伝子工学的手法で行うことができる。
【００３０】
本発明の検出用オリゴヌクレオチドは、核酸プローブ及び／又は核酸プライマーとして用いることができる。
【００３１】
核酸プローブは、前記オリゴヌクレオチドを標識物によって標識化することで調製することができる。前記標識物としては特に制限されず、放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体などの通常の標識物を用いることができる。標識方法は、末端標識でも、配列の途中に標識してもよく、また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。かかる標識の検出手段としては、例えば核酸プローブが放射性同位元素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等、蛍光物質で標識されている場合には蛍光顕微鏡等、化学発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用いた解析やＣＣＤカメラを用いたデジタル解析等が挙げられる。このようにして標識化されたオリゴヌクレオチドを、通常の方法により検査対象物から抽出された核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした検出用オリゴヌクレオチドの標識を測定することでサーモアスカス属真菌を検出することができる。核酸とハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
また、前記オリゴヌクレオチドは、固相担体に結合させて捕捉プローブとして用いることもできる。この場合、捕捉プローブと、標識核酸プローブの組み合わせでサンドイッチアッセイを行うこともできるし、標識を目示として標的核酸を捕捉することもできる。
【００３２】
本発明の検出方法において、サーモアスカス属真菌を検出するために、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いたハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。サーモアスカス属真菌を属レベルで検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いるのが好ましい。サーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）を検出するためには、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プローブとして用いるのが好ましい。
【００３３】
被検体中のサーモアスカス属真菌を属レベルで検出するためには、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。上記核酸プローブはサーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子の塩基配列中の可変部位と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のサーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に属レベルで検出することができる。
被検体中のサーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）を検出するためには、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を標識化して核酸プローブとし、得られた核酸プローブをＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブの標識を適当な検出方法により検出すればよい。上記核酸プローブはサーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列中の可変部位と特異的にハイブリダイズするので、被検体中のサーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出することができる。
ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした核酸プローブの標識を測定する方法としては、通常の方法（ＦＩＳＨ法、ドットブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法等）を用いることができる。
【００３４】
本発明の検出方法において、サーモアスカス属真菌の検出を行うため、前記オリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認することが好ましい。ＤＮＡ断片を増幅する方法として特に制限はなく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。
本発明において、ＰＣＲ法により増幅反応を行いサーモアスカス属真菌の検出を行う場合について詳しく説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００３５】
本発明において、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子の塩基配列（好ましくは、前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌の属レベルでの検出を行うのが好ましい。ここで、本発明における「サーモアスカス属真菌」は、分類学上の分類に関わらず、配列番号５〜７のいずれか記載のRPB1遺伝子の塩基配列を有するものの他、配列番号５〜７のいずれか記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列、又は、配列番号５〜７のいずれか記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をRPB1遺伝子に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸又はその一部を増幅でき、サーモアスカス属真菌を属レベルで迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をサーモアスカス属真菌検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
【００３６】
本発明において、サーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）を検出するためには、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド）からなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行い、サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列（好ましくは、前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれか）で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌の検出を行うのが好ましい。ここで、本発明における「サーモアスカス属真菌」は、分類学上の分類に関わらず、配列番号８若しくは９に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を有するものの他、配列番号８若しくは９に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の塩基配列、又は、配列番号８若しくは９に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、をβ−チューブリン遺伝子に含むものも包含する。なお、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲによって前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸又はその一部を増幅でき、サーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出するための核酸プライマーとして機能し得る。したがって、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をサーモアスカス属真菌検出用オリゴヌクレオチド対とすることができる。
【００３７】
ＰＣＲの条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃以上（好ましくは５９℃以上）６５℃以下（好ましくは６２℃以下）で５秒以上６０秒以下、好ましくは６２℃で６０秒、行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを好ましくは３５サイクル以下（擬陽性が生じるのを防ぐ観点で、好ましくは３０サイクル以下）行う。
前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてＰＣＲを行う場合、好ましいＰＣＲ条件としては、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９５℃以上９８℃以下で５秒以上６０秒以下行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５５℃以上（好ましくは５９℃以上）６５℃以下（好ましくは６２℃以下）で５秒以上６０秒以下、好ましくは６１℃以上６２℃以下で６０秒、行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を約７２℃で１０秒以上６０秒以下行い、これらを１サイクルとしたものを３５サイクル以下（擬陽性が生じるのを防ぐ観点で、好ましくは３０サイクル以下）行う。
【００３８】
本発明において、遺伝子断片の確認は通常の方法で行うことができる。例えば増幅産物について電気泳動を行い増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法、増幅産物量を経時的に計測する方法、増幅産物の塩基配列を解読する方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、遺伝子増幅処理後に電気泳動を行い、増幅した遺伝子の大きさに対応するバンドの有無を確認する方法が好ましい。また、本発明において、増幅産物の検出は通常の方法で行うことができる。例えば増幅反応時に放射性物質などで標識されたヌクレオチドを取り込ませる方法、蛍光物質などで標識されたプライマーを用いる方法、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にエチジウムブロマイドなどのＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入れ込む方法等が挙げられるが、本発明はこれらの方法に限定されるものではない。本発明においては、増幅したＤＮＡ２本鎖の間にＤＮＡと結合することにより蛍光強度が強くなる蛍光物質を入り込ませる方法が好ましい。
検体に検出対象真菌が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでＤＮＡ断片が確認される。具体的には、検体にサーモアスカス属真菌が含まれる場合、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約400bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。また、検体にサーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスの両方又はいずれか）が含まれる場合、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いて得られたＰＣＲ産物の電気泳動を行うと、約250bpのサイズでＤＮＡ断片が確認される。このような操作を行うことにより、検体に検出対象真菌が含まれているかを確認することができる。
【００３９】
本発明において、前記オリゴヌクレオチド対を用いて被検体のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の部分塩基配列を決定し、該部分塩基配列が前記（ｅ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかに含まれるか否かを確認することで、前記（ｅ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しサーモアスカス属真菌を検出することもできる。すなわち、本発明の検出方法は、被検体の有するRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも１種の部分塩基配列を解析・決定し、決定した塩基配列と前記（ｅ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかとを比較し、その一致又は相違に基づいて前記（ｅ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認しサーモアスカス属真菌の検出を行うものである。
例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかとを比較し、前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をサーモアスカス属真菌と同定することができる。このようにして、サーモアスカス属真菌を属レベルで迅速かつ正確に検出することができる。
あるいは、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲを行い前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅して増幅産物の有無を確認し、得られる増幅産物の塩基配列と前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかとを比較し、前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の存在を確認する。増幅産物の塩基配列が、前記（ｃ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列で表される核酸の一部として含まれていれば検体に含まれる微生物をサーモアスカス属真菌（特に、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカス）と同定することができる。このようにして、サーモアスカス属真菌を迅速かつ正確に検出することができる。
塩基配列を解析・決定する方法としては特に限定されず、通常行われているＲＮＡ又はＤＮＡシークエンシングの手法を用いることができる。
具体的には、マクサム−ギルバート法、サンガー法等の電気泳動法、質量分析法、ハイブリダイゼーション法等が挙げられる。サンガー法においては、放射線標識法、蛍光標識法等により、プライマー又は、ターミネーターを標識する方法が挙げられる。
【００４０】
本発明において、増幅反応に用いられるプライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後、吸着カラム、高速液体クロマトグラフィーや電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、通常の方法を使用して合成できる。
【００４１】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体、飲食品又はその原材料の包装容器等を用いることができる。
検体からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、サーモアスカス属真菌の検出を行うのに未精製の状態でも十分な精製度及び量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルムで処理したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。また、被検体中のＲＮＡを逆転写して得られるＤＮＡを用いることもできる。
【００４２】
本発明のサーモアスカス属真菌検出キットは、前記本発明のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチド対を核酸プローブ又は核酸プライマーとして含有するものである。本発明のキットは、前記核酸プローブ及び核酸プライマーの他に、目的に応じ、標識検出物質、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、真菌の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対によって検出が可能であることを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の方法により増幅される領域を含んだゲノムＤＮＡが挙げられる。
【００４３】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のサーモアスカス属真菌の検出方法、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対、サーモアスカス属真菌検出キット、使用、並びに方法を開示する。
【００４４】
＜１＞下記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに下記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌の検出を行う、サーモアスカス属真菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号１に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号２に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号３に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号３に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
（ｄ）配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号４に記載の塩基配列との相同性が７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）でありかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
【００４５】
＜２＞検出を行うために、前記少なくとも１種のオリゴヌクレオチド対を用いてサーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子又はβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌の検出を行う、前記＜１＞項記載の検出方法。
＜３＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌の検出を行う、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜４＞前記サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子の塩基配列が下記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかである、前記＜１＞〜＜３＞項のいずれか記載の検出方法。
（ｅ）配列番号５に記載のRPB1遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｆ）配列番号５に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号５に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｇ）配列番号６に記載のRPB1遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｈ）配列番号６に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号６に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｉ）配列番号７に記載のRPB1遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｊ）配列番号７に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号７に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はその相補配列
＜５＞前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応法を行い、サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列で表される核酸の一部を増幅し、増幅産物の有無を確認し、サーモアスカス属真菌の検出を行う、前記＜２＞項記載の検出方法。
＜６＞前記サーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列が下記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかである、前記＜１＞、＜２＞及び＜５＞項のいずれか記載の検出方法。
（ｋ）配列番号８に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｌ）配列番号８に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号８に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
（ｍ）配列番号９に記載のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列又はその相補配列
（ｎ）配列番号９に記載の塩基配列において１若しくは数個（好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、配列番号９に記載の塩基配列に対して７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上）の相同性を有しかつサーモアスカス属真菌の検出に使用できる塩基配列、又はこれらの相補配列
＜７＞前記検出方法によりサーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種を検出する、前記＜１＞、＜２＞、＜５＞及び＜６＞項のいずれか記載の検出方法。
【００４６】
＜８＞前記（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド若しくは前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対。
【００４７】
＜９＞前記オリゴヌクレオチドが核酸プローブ又は核酸プライマーである、前記＜８＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１０＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸にハイブリダイズすることができ、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜９＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１１＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｅ）〜（ｊ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅でき、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜１０＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１２＞前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸にハイブリダイズすることができ、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プローブ又は核酸プライマーとして機能し得る、前記＜９＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１３＞前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応法によって前記（ｋ）〜（ｎ）の塩基配列のいずれかで表される核酸の一部を増幅でき、サーモアスカス属真菌を検出するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記＜１２＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
＜１４＞前記サーモアスカス属真菌が、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜１２＞又は＜１３＞項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
【００４８】
＜１５＞前記＜８＞〜＜１４＞項のいずれか記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含むサーモアスカス属真菌検出キット。
【００４９】
＜１６＞サーモアスカス属真菌検出用核酸プライマーとしての、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１７＞サーモアスカス属真菌検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜１８＞前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをサーモアスカス属真菌検出用核酸プライマーとして使用する方法。
＜１９＞サーモアスカス属真菌検出用核酸プライマーとしての、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜２０＞サーモアスカス属真菌検出用核酸プライマーの製造のための、前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドの使用。
＜２１＞前記（ｃ）及び（ｄ）のオリゴヌクレオチドをサーモアスカス属真菌検出用核酸プライマーとして使用する方法。
＜２２＞前記サーモアスカス属真菌が、サーモアスカス・クラスタセウス及びサーモアスカス・アウランティアカスからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜１９＞〜＜２１＞項のいずれか記載の使用又は方法。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５１】
試験例１  サーモアスカス属真菌を含む耐熱性真菌の分子系統樹の作成
下記の方法により、サーモアスカス属真菌（サーモアスカス・アウランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、及びサーモアスカス・クラスタセウス）、及び各種耐熱性真菌（タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、タラロマイセス・マクロスポラス（Talaromyces macrosporus）、タラロマイセス・ヘリクス（Talaromyces helicus  var．helices）、タラロマイセス・トラキスペルムス（Talaromyces trachyspermus）、タラロマイセス・プルプレウス（Talaromyces purpureus）、タラロマイセス・ウォルトマンニー（Talaromyces wortmannii）、タラロマイセス・バシリスポラス（Talaromyces bacillisporus）、タラロマイセス・サーモフィレス（Talaromyces thermophiles）、タラロマイセス・ルテウス（Talaromyces luteus）、タラロマイセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）、タラロマイセス・ビソクラミドイデス（Talaromyces byssochlamydoides）、ビソクラミス・スペクタビリス（Byssochlamys spectabilis）、ビソクラミス・ニベア（Byssochlamys nivea）、タラロマイセス・レイセタナス（Talaromyces leycettanus）、ハミゲラ・アベラネラ（Hamigera avellanea）、ハミゲラ・ストリアータ（Hamigera striata）、及びアスペルギルス・フミガタス（Asperguillus fumigatus））のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列をJ．Houbraken  et  al.，Studies  in  Mycology，2011，vol．70，p．1-51に記載されている方法を参考にして決定した。
【００５２】
ポテトデキストロース寒天培地（PDA培地、Difco社製）を用いて、各菌体を適温（２５℃、３０℃、３７℃）で５〜７日間暗所培養を行った。Geneとるくん（酵母用）High
Recovery（TAKARA社製）を用いて菌体からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度が５ｎｇ／μＬとなるようにＴＥバッファーで調製した。
各菌種のRPB1遺伝子の塩基配列をDNA  data  bank  of  Japan（DDBJ:http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html）のARSA検索、及びF1843プライマー（5’-atttygayggtgaygaratgaac-3’：配列番号１０）とR3096プライマー（5’-gracrgtdccrtcatayttracc-3’：配列番号１１）を用いたＰＣＲ（変性温度９４℃３０秒、アニーリング温度４７℃３０秒、伸長温度７２℃１分の４０サイクル）で得られたＰＣＲ産物の解析により得た。各菌種のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列をDNA  data  bank  of  JapanのARSA検索、及びBt2aプライマー（5’-aataggtgccgctttctgg-3’：配列番号１２）とBt2bプライマー（5’-agttgtcgggacggaagag-3’：配列番号１３）（Glass  and  Donaldson，Appl  Environ  Microbiol  61：1323−1330，1995）を用いたＰＣＲ（変性温度９８℃５秒、アニーリング温度５５℃５秒、伸長温度７２℃１０秒の３５サイクル）で得られたＰＣＲ産物の解析により得た。ＰＣＲ産物について２％アガロースゲルを用いて電気泳動してサイズを確認した後、High  Pure  PCR  Product  purification  kit（商品名、ロシュ社製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物はTerminator  Cycle  Sequencing  Ready  Reaction  kit（商品名、Applied  Biosystems社製）を用いて、RPB1遺伝子については新たにR2623プライマー（5’-gcrttgttsaratccttmarrctc-3’：配列番号１４）を用いて、β−チューブリン遺伝子については前記プライマーを用いてラベル化し、ABI  PRISM  3130  Genetic  Analyzer（Applied  Biosystems社製）で電気泳動を実施した。電気泳動時の蛍光シグナルからの塩基配列の決定には、ソフトウェア‘ATGC  Ver．4’（Genetyx社製）を使用した。
得られた塩基配列をClustal  X（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を使用してアライメント解析を行い、ソフトウェアNJPLOTを用いて近隣結合法による解析を行い、分子系統樹を作成した。作成した分子系統樹を図１に示す。
【００５３】
図１に示すように、サーモアスカス・アウランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス及びサーモアスカス・クラスタセウスは互いに近縁関係にある単一の菌種群を構成し、他の耐熱性真菌とは区別されることがあきらかである。
また、図１には示していないが、ビソクラミス属に分類されているビソクラミス・ヴァールコサは、サーモアスカス属真菌の分岐内に存在するため、本来はサーモアスカス属に分類されるべきものとされている（J．Houbraken  et  al.，Studies  in  Mycology，2011，vol．70，p．1-51参照）。
【００５４】
試験例２  サーモアスカス属真菌に特異的なRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の解析
上記の方法により決定したサーモアスカス属真菌各種や、各種真菌の公知のRPB1遺伝子及びβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、Clustal  W（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてアライメント解析を行い、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子に特異的な塩基配列（The_RPB_F2：atctgccggcgtgatgtgttcctg（配列番号１）、The_RPB_R2：gttgtgcagaagccagtagttgacc（配列番号２））、及びサーモアスカス属真菌のβ−チューブリン遺伝子に特異的な塩基配列（The_F2：gatggttgtggtgatgctgga（配列番号３）、The_R2：acgaggaacgtacttgttgccat（配列番号４））を決定した。
【００５５】
実施例
（１）プライマーの設計
上記で決定したサーモアスカス属真菌に特異的な塩基配列部位をもとに、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（The_RPB_F2プライマー）、配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（The_RPB_R2プライマー）、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（The_F2プライマー）及び配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（The_R2プライマー）を設計し、シグマアルドリッチジャパン社に合成依頼し（脱塩精製品、０．０２μｍｏｌスケール）、購入した。
【００５６】
（２）検体の調製
設計したプライマーの有効性の評価に用いる真菌、すなわちサーモアスカス属真菌とその他の耐熱性真菌、並びに飲食品での事故事例で報告されている真菌等としては、表１〜３に記載した菌株を使用した。これらの菌株に関しては、The  Centraalbureau  voor  Schimmelculturesが保管しCBSナンバーにより管理されている株、千葉大学真菌医学研究センターが保管しSUNナンバーにより管理されている株、千葉大学真菌医学研究センターが保管しIFMナンバーにより管理されている株、及び独立行政法人製品評価技術基盤機構が保管しNBRCナンバーにより管理されている株を入手し、使用した。
各菌株を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて各菌の至適温度で７日間培養した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
【表２】
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【００５９】
【表３】
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【００６０】
培養した各菌体を白金耳を用いて回収し、ゲノムＤＮＡ調製用キット（アプライドバイオシステムズ社製PrepMan  ultra（商品名））を用いて、ゲノムＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液の濃度は５ｎｇ／μＬに調製した。
【００６１】
（３）サーモアスカス属真菌の検出１
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製した表１及び２に記載の真菌のゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、SapphireAmp  Fast  PCR  Master  Mix（商品名、タカラバイオ社製）２５μＬ及び無菌蒸留水２２μＬを混合し、The_RPB_F2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ及びThe_RPB_R2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬを加え、ＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６２℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
【００６２】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から３．５μＬ又は２．５μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic  Acid  sample  loading  buffer  ５×（BIO  RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２０分間；又は１００Ｖ、４５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図４及び５に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図４は表１に示す真菌の試料についての電気泳動図を示し、図５は表２に示す真菌の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ  Load  100bp  molecular  Ruler（商品名、BIO  RAD社製）を用いた。
【００６３】
その結果、サーモアスカス属真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、約400bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、サーモアスカス属真菌以外の耐熱性真菌、及びその他食品の製造環境から広く検出される真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。したがって、本発明によれば、サーモアスカス属真菌を属レベルで特異的に検出することができる。
【００６４】
（４）サーモアスカス属真菌の検出２
ＤＮＡテンプレートとして上記で調製した表１及び３に記載の真菌のゲノムＤＮＡ溶液１μＬ、SapphireAmp  Fast  PCR  Master  Mix（商品名、タカラバイオ社製）２５μＬ及び無菌蒸留水２２μＬを混合し、The_F2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ及びThe_R2プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬを加え、ＰＣＲ溶液を調製した。
ＰＣＲ溶液について、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーＤＩＣＥ（タカラバイオ）を用いて遺伝子増幅処理を行った。ＰＣＲ条件は、９７℃、１０分間の処理後、(i)９７℃、１分間の熱変性反応、(ii)６１℃又は６２℃、１分間のアニーリング反応、及び(iii)７２℃、１分間の伸長反応を１サイクルとしたものを３０サイクル行い、反応液を７２℃で１０分間保持した。
【００６５】
ＰＣＲ後、ＰＣＲ溶液から３．５μＬ又は２．５μＬを分取してローディングバッファー（Nucleic  Acid  sample  loading  buffer  ５×（BIO  RAD社製））０．５μＬと十分に混和し、２％アガロースゲルを用いて電気泳動（１３５Ｖ、２０分間；又は１００Ｖ、４５分間）を行った。電気泳動終了後、アガロースゲルをSYBR  Safe  DNA  gel  stain  in  1×TAE（インビトロジェン）でＤＮＡを染色後、増幅されたＤＮＡ断片の有無を確認した。その結果を図６及び７に示す。図中の番号は表記載の対応する試料番号の試料から抽出したＤＮＡを用いて反応を行ったサンプルであることを示している。なお、図６は表１に示す真菌の試料についての電気泳動図を示し、図７は表３に示す真菌の試料についての電気泳動図を示す。なお、分子量マーカーとして、EZ  Load  100bp  molecular  Ruler（商品名、BIO  RAD社製）を用いた。
【００６６】
その結果、サーモアスカス属真菌のうち、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・アウランティアカス又はビソクラミス・ヴァールコサのゲノムＤＮＡを含む試料では、約250bpのサイズで遺伝子断片が確認された。一方、前記真菌以外の耐熱性真菌、及びその他食品の製造環境から広く検出される真菌のゲノムＤＮＡを含む試料では、遺伝子断片は確認されなかった。
【００６７】
上記の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、サーモアスカス属真菌のRPB1遺伝子又はβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列の存在を確認することができ、RPB1遺伝子を迅速かつ正確に検出できることがわかる。したがって、本発明の方法によれば、従来の方法と比較して、より迅速かつより正確にサーモアスカス属真菌を一括して検出することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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