(57)【要約】      （修正有）【課題】１，４−ブタンジオールの高効率生産のために１，４−ブタンジオールの高濃度下で効率よく生長できる改変微生物及び該改変微生物を利用した１，４−ブタンジオールの生産方法を提供する。【解決手段】ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、欠失または破壊された改変微生物、および前記微生物による１，４−ブタンジオールの生産方法。【効果】１，４−ブタンジオール耐性が増加することで、高濃度の１，４−ブタンジオールの存在下でも１，４−ブタンジオールを高効率で生産することができる。【選択図】図４
2014023528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、欠失または破壊された、改変微生物。
【請求項２】
前記改変微生物は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ラクトコックス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オリゴトロファ属（Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）から誘導される、請求項１に記載の改変微生物。
【請求項３】
前記改変微生物は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２）から誘導される、請求項２に記載の改変微生物。
【請求項４】
前記遺伝子は、遺伝子組み換え法、遺伝子サイレンシング、突然変異誘発、またはスクリーニングによって欠失または破壊される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変微生物。
【請求項５】
前記遺伝子は、改変前の微生物にトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を導入することによって、欠失または破壊される、請求項４に記載の改変微生物。
【請求項６】
前記改変微生物は、野生型の微生物に比べて最大群集率（Ｍａｘ．  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が増加したものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変微生物。
【請求項７】
前記改変微生物は、寄託番号ＫＣＴＣ１２２０８ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２０９ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２１０ＢＰ及びＫＣＴＣ１２２１１ＢＰからなる群から選択されるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の改変微生物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の改変微生物をグルコース含有培地で培養する段階；及び、前記の培養によって生成された１，４−ブタンジオールを回収する段階を含む、１，４−ブタンジオールの生産方法。
【請求項９】
請求項８の方法によって回収された１，４−ＢＤＯからポリブチレンサクシネートを生成する段階を含む、ポリブチレンサクシネートの生産方法。
【請求項１０】
請求項８の方法によって回収された１，４−ＢＤＯからポリブチレンテレフタレートを生成する段階を含む、ポリブチレンサクシネートの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
改変微生物及び該改変微生物を利用した１，４−ブタンジオールの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ブタンジオール（１，４−Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）は、世界的に年間約１００万トン以上生産されており、ガンマ−ブチロラクトン（γ−ｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ、ＧＢＬ）、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ、ＴＨＦ）、ピロリドン（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、Ｎ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、ＮＭＰ）などの製造に使用される溶媒である。１，４−ブタンジオールは、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  ｂｕｔａｄｉｅｎｅ  ｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＡＢＳ）及びポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ、ＰＵＲ）などの単量体としても使用可能であり、テトラヒドロフランに転換されてスパンデックス（ｓｐａｎｄｅｘ）繊維の原料であるポリテトラメチレンエーテルグリコール（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｅｔｈｅｒ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＴＭＥＧ）としても利用できる。
【０００３】
１，４−ブタンジオールを微生物により製造する方法がこれまでに知られている。微生物を用いれば、経済的に有用である。１，４−ブタンジオールを微生物により製造する方法としては、例えば、特許文献１〜４、非特許文献１に記載の方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１−００１４６６９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９−００４７７１９号明細書
【特許文献３】韓国公開特許第２００９−００２５９０２号明細書
【特許文献４】韓国公開特許第２００７−００９６３４８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，４−ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７，  ４４５−４５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発酵により産生される１，４−ブタンジオールが蓄積されて、培地中に高濃度で存在すると、微生物に対して毒性となる可能性がある。具体的には、１，４−ブタンジオールの高濃度環境下では、微生物の活動が低下し、ブタンジオールの生産効率が低下したり、または、微生物が生存できなくなったりする場合があった。したがって、微生物のブタンジオール生産能に影響を与える前に１，４−ブタンジオールを回収する必要があり、生産性がよくなかった。
【０００７】
本発明の一目的は、より高い濃度の１，４−ブタンジオールの存在下でも効率よく成長できる微生物を提供することである。本発明の他の目的は、該微生物を用いて１，４−ブタンジオールの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一側面によると、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、欠失または破壊された、改変微生物が開示される。他の側面によると、前記の改変微生物をグルコース含有培地で培養する段階；及び、前記の培養によって生成された１，４−ブタンジオールを回収する段階を含む、１，４−ブタンジオールの生産方法が開示される。
【発明の効果】
【０００９】
前記の改変微生物は、１，４−ブタンジオールへの耐性が増加することによって、高濃度の１，４−ブタンジオールの存在下でも１，４−ブタンジオールを高効率で生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、１，４−ブタンジオールの生合性経路を示す。
【図２】図２は、実施例２に係るＡ４８菌株の成長曲線を示す。
【図３】図３は、実施例３に係るＦ２２菌株、Ｆ６６菌株及びＧ６５菌株の成長曲線を示す。
【図４】図４は、Ａ４８菌株、Ｆ２２菌株、Ｆ６６菌株及びＧ６５菌株の最大群収率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書においては、当業者に公知の、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、ＤＮＡシークエンシングおよびＤＮＡ組み換え分野において通常用いられる慣用技術を含むものである。慣用技術は、当業者に知られており、多くの著書及び関連研究に記述されている。
【００１２】
本明細書において異なる定義がない限り、使用されるすべての技術又は科学用語は、本分野にて通常の技術者が通常的に理解するような意味を有する。本明細書に用いられる用語は、多くの科学辞典に記載されており、本分野で利用可能である。本明細書にて説明されたものと類似あるいは等価の方法及び物質が、本発明において使用されうる。したがって、本開示が明細書中で述べた特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されると解されるべきではなく、当業者によって適宜変更または改変可能である。
【００１３】
また、特に断らなければ、核酸は、左側から右側に向かって、５'から３'方向に記載され、アミノ酸配列は、左側から右側に向かって、Ｎ末端からＣ末端方向に記載される。
【００１４】
本明細書において、数値範囲を規定する際に上限値が記載されている場合には、該数値範囲は、上限値より低い数値範囲を全て含む。本明細書において、数値範囲を規定する際に下限値が記載されている場合には、該数値範囲は、上限値より高い数値範囲を全て含む。本明細書において記載されるすべての数値範囲は、より良いすべての数値範囲を含む。
【００１５】
本明細書における発明の名称は、本明細書全体を参照することによって把握される、本発明の多様な側面または実施形態を制限するものではない。
【００１６】
本発明は、１，４−ブタンジオールの高効率生産のために、高濃度の１，４−ブタンジオールに耐性を有する改変微生物を提供するものである。
【００１７】
従来、１，４−ブタンジオールのような化学物質を生物学的な生成工程である発酵によって製造しようとする試みが行われてきた。発酵は、糖を消費して該糖を所望の化学物質に転換させる多様な種類の微生物によって行われる。
【００１８】
しかしながら、化学物質が生産されればされるほど、発酵培地内に高濃度の化学物質が蓄積され、微生物、特にバクテリアに対して毒性となりうる。すなわち、バクテリアが、毒性環境でうまく活動することができず生存できなくなったり、経済的に不利な程度にまで生産効率が低下する。
【００１９】
したがって、微生物がより高い濃度の化学物質の存在下でも効率よく成長できるならば、短期間に多くの化学物質を生産することができる。
【００２０】
一実施形態よると、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、欠失または破壊された、改変微生物が提供される。
【００２１】
本明細書で使用される、用語「１，４−ブタンジオール（１，４−Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）」は、化学式Ｃ4Ｈ10Ｏ2で表わされる有機化合物であって（以下、「１，４−ＢＤＯ」ともいう）、大きく２段階を経て生成できる。１，４−ＢＤＯの生合成経路を図１に示した。
【００２２】
第１段階でアルファ−ケトグルタル酸塩（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）またはコハク酸塩（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）は、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ）に転換される。具体的に、アルファ−ケトグルタル酸塩（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）またはコハク酸塩は、スクシニル−ＣｏＡ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ）、スクシニルセミアルデヒド（ｓｕｃｃｉｎｙｌ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ）、４−ヒドロキシ酪酸塩（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）を経て、４−ヒドロキシ酪酸−ＣｏＡに転換される。アルファ−ケトグルタル酸塩は、アルファ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってスクシニル−ＣｏＡに転換され（１０）、コハク酸塩はスクシニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｓｕｃｃｉｎｙｌ−ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によってスクシニル−ＣｏＡに転換される（２０）。スクシニル−ＣｏＡは、スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってスクシニルセミアルデヒドに転換される（３０）。一方、アルファ−ケトグルタル酸塩は、アルファ−ケトグルタレートデカルボキシラーゼ（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）によってスクシニル−ＣｏＡを生成することなく、直接スクシニルセミアルデヒドに転換することもできる（１０'）。スクシニルセミアルデヒドは、４−ヒドロキシブタノエートデヒドロゲナーゼ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によって４−ヒドロキシ酪酸塩に転換される（４０）。４−ヒドロキシ酪酸塩は、４−ヒドロキシ酪酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ−ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によって４−ヒドロキシ酪酸−ＣｏＡに転換することができ（５０）、またブチレートキナーゼ（ｂｕｔｙｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）によって４−ヒドロキシブチリルフォスフェートに転換されたあと（６０）、ホスホトランスブチリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｂｕｔｙｒｙｌａｓｅ）によって４−ヒドロキシ酪酸−ＣｏＡに転換することもできる（７０）。
【００２３】
第２段階で４−ヒドロキシ酪酸−ＣｏＡは、４−ヒドロキシブチルアルデヒド（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を経て１，４−ＢＤＯに転換される。４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によって４−ヒドロキシブチルアルデヒドに転換されたあと（８０）、アルコールデヒドロゲナーゼによって最終的に１，４−ＢＤＯに転換される（９０）。
【００２４】
改変微生物は、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、欠失または破壊されることにより、１，４−ブタンジオールの耐性が増加することで、高濃度の１，４−ＢＤＯの存在下でも１，４−ＢＤＯの生合成経路が効率よく機能する。
【００２５】
代謝的に「操作された」（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ／ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）という用語は、微生物において、化学物質のような所望の代謝産物を新たに生産させる、または生産性を向上させるために行われるあらゆる操作を含む。例えば、代謝的に「操作された」（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ／ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）とは、生合成された遺伝子、オペロンと関連する遺伝子、そしてこれらの核酸配列の調節因子（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の合理的な経路をデザインし、組み合わせる、またはある遺伝子を欠失または破壊することを含む。「代謝的に操作された」という用語は、遺伝子操作および適切な培養条件を用いて、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、タンパク質安定性（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）とタンパク質の機能性（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を調節し、最適化することによって、代謝フラックス（流量）（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｌｕｘ）を最適化させることをさらに含むことができる。改変された遺伝子は、ホスト（例えば、微生物）に対して異種である、すなわち、微生物が天然に有する遺伝子とは異なる。かような遺伝子は、突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、または発現制御配列の導入によって天然の遺伝子が改変されることにより、宿主（例えば、微生物）に異種性であり得る。
【００２６】
従って、高濃度の１，４−ＢＤＯに耐性を有するように、代謝的に「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」微生物は、例えば、変異原（例えば、トランスポゾン）を微生物に導入して、微生物が内在的に有する細胞生理と生化学を改変する（例えば、新たな代謝産物生産能を獲得する、または代謝産物を生産する能力が向上する）ことによって製造することができる。
【００２７】
適切な培養条件は、微生物の代謝作用による化合物の生産を可能にする培養条件であれば特に限定されず、培養培地のｐＨ、イオン強度、栄養含量などの条件、温度、酸素、二酸化炭素、窒素含量、湿度等を適宜調整すればよい。宿主細胞として機能することができる微生物に適合する培養条件は、広く知られている。
【００２８】
本発明の改変微生物を構築するための、親微生物は、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよい。また、親微生物は、１，４−ＢＤＯ産生能を有する。これらは野生型であっても変異を施したものであってもよい。具体的には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ラクトコックス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オリゴトロファ属（Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択されるものであるが、これに限定されるものではない。中でも、コリネバクテリウム属の微生物を用いることが好ましい。コリネバクテリウム属の微生物としては、コリネバクテリウムグルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウムグルタミカム  ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウムグルタミカム  ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウムグルタミカム  ＡＴＣＣ１３８７０などが挙げられ、中でも、コリネバクテリウムグルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２が好ましい。コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は、グラム陽性菌株であって、グルタミン酸、リジン、トレオニン、イソロイシンなどのアミノ酸の生産に広く使用されている。コリネバクテリウムグルタミカムは、生育条件を容易に調整でき、成長が速く、遺伝子構造が安定的であるため突然変異の発生可能性が少ない。また、コリネバクテリウムグルタミカムは、非病原性菌株であり、胞子を作らないため、環境に対する有害性がない。特に、大腸菌に比べて約４倍以上の濃度で培養が可能であるため、好ましい。
【００２９】
本明細書で使用された、用語「遺伝子（ｇｅｎｅ）」は、コーディング領域（エクソン）の他、５'非翻訳領域（５'  ＵＴＲ）またはリーダー配列及び３'非翻訳領域（３'  ＵＴＲ）またはトレーラー配列、イントロンを含む、ポリヌクレオチド配列を意味する。
【００３０】
本明細書で相互交換的に使用される、用語"ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）"及び"核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）"は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。これは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはプリン及びピリミジン塩基または他の自然的、化学的改変、生化学的改変、非−自然的または誘導化されたヌクレオチド塩基を含むポリペプチドを含むが、これに制限されるものではない。ポリヌクレオチドの非制限的な例は、遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、ＥＳＴｓ、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝形のポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。既知のタンパク質を暗号化する多くのヌクレオチド配列が生成され得ることが理解できる。
【００３１】
一実施形態では、改変微生物は、親微生物において、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子が欠失または破壊されたものである。
【００３２】
「ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、欠失される」とは、遺伝子のコーディング領域が欠失し、遺伝子の発現が低下または欠失することを指す。この際、欠失は、コーディング領域の全体を欠失させてもよく、また、一部（好ましくはコーディング領域の５０％以上）を欠失させてもよい。さらに全体を欠失させる場合には、１，４−ＢＤＯ生産に関するその他の機能が失われない限り、遺伝子に隣接する領域も併せて広く欠失させてもよい。
【００３３】
また、「ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらに相当する遺伝子からなる群から選択される１種以上が、破壊される」とは、正常な遺伝子産物が産生できないことを指す。遺伝子、そのプロモーターまたはターミネーター領域が、例えば、欠失、挿入または突然変異によって改変されることで遺伝子を破壊することができる。
【００３４】
欠失または破壊は、遺伝子組み換え法、遺伝子サイレンシング、突然変異誘発、またはスクリーニングによって行うことができる。遺伝子組み換え法としては、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。また、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。スクリーニングは、自然発生的に生じた変異株をスクリーニングする方法である。
【００３５】
好適な一実施形態は、改変前の微生物にトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を導入することによって、遺伝子を欠失または破壊する方法である。下記実施例においては、トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を利用したランダム変異誘発法（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行うことによってスクリーニングされた。
【００３６】
トランスポゾン変異誘発は、遺伝子解析のためのツールとして公知である（Ｐ．  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ’’Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎ  
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ’’  Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００３７】
Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、ファージＭｕなどのような多様なトランスポゾンが当技術分野で公知である。中でも、Ｔｎ５は挿入特異性をほとんど有さず、そのサイズは相対的に小さいため好ましい。抗生物質耐性または他の選択マーカー遺伝子に連結した転位に必要な１９ｂｐのＴｎ５逆位反復からなるＭｉｎｉ−Ｔｎ５と称される多様なＴｎ５誘導体も本発明に有用である。そのようなＭｉｎｉ−Ｔｎ５は、Ｔｎ５トランスポザーゼ（ｔｎｐ）とともに自殺ベクターに挿入され、効率的なＴｎ５自殺変異誘発系が構築される。トランスポゾンによるランダム変異誘発は、自殺プラスミドまたはファージベクターを使用することによって、例えば形質転換、形質導入、接合交配またはエレクトロポレーションを介して標的細菌細胞にトランスポゾンを導入することを伴う。得られた変異体を、トランスポゾンが有するマーカーを活用してスクリーニングできる。使用したベクターを分離により除去した後、微生物ゲノムへのトランスポゾンの転位が検出できる。
【００３８】
本明細書で使用される、用語「トランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）」は、挿入配列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ともいい、染色体やプラスミド上で動ける塩基配列のことを意味する。トランスポゾンにはトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）という転位酵素があって、特異塩基配列を感知して挿入させることができる活性を有している。現在まで、多様なバクテリアにおいて数百個のトランスポゾンが知られている（ＴＲＡＮＳＰＯＳＯＮ−ＢＡＳＥＤ  ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ  ＦＯＲ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＦＵＮＣＴＩＯＮＡＬ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ  （２００３）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７：  ３−２９  Ｆｉｎｂａｒｒ  Ｈａｙｅｓ）。
【００３９】
トランスポゾンは特に制限されるものではないが、例えば、下記のような塩基配列を有したトランスポゾンが挙げられる。
配列番号５：  トランスポゾン（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ社、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭ  ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ  ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ  Ｋｉｔ）
１  ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡ  ＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣ  ＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣ  ＧＡＴＧＡＡＴＴＧＣ  ＴＴＣＧＴＴＡＡＴＡ
５１  ＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧ  ＴＧＴＴＣＣＡＣＡＧ  ＧＧＴＡＧＣＣＡＧＣ  ＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣ  ＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣ
１０１  ＣＧＧＡＴＧＣＣＡＴ  ＴＴＣＡＴＴＡＣＣＴ  ＣＴＴＴＣＴＣＣＧＣ  ＡＣＣＣＧＡＣＡＴＡ  ＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡ
１５１  ＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣ  ＡＡＣＣＴＧＴＴＧＡ  ＴＡＧＴＡＣＧＴＡＣ  ＴＡＡＧＣＴＣＴＣＡ  ＴＧＴＴＴＣＡＣＧＴ
２０１  ＡＣＴＡＡＧＣＴＣＴ  ＣＡＴＧＴＴＴＡＡＣ  ＧＴＡＣＴＡＡＧＣＴ  ＣＴＣＡＴＧＴＴＴＡ  ＡＣＧＡＡＣＴＡＡＡ
２５１  ＣＣＣＴＣＡＴＧＧＣ  ＴＡＡＣＧＴＡＣＴＡ  ＡＧＣＴＣＴＣＡＴＧ  ＧＣＴＡＡＣＧＴＡＣ  ＴＡＡＧＣＴＣＴＣＡ
３０１  ＴＧＴＴＴＣＡＣＧＴ  ＡＣＴＡＡＧＣＴＣＴ  ＣＡＴＧＴＴＴＧＡＡ  ＣＡＡＴＡＡＡＡＴＴ  ＡＡＴＡＴＡＡＡＴＣ
３５１  ＡＧＣＡＡＣＴＴＡＡ  ＡＴＡＧＣＣＴＣＴＡ  ＡＧＧＴＴＴＴＡＡＧ  ＴＴＴＴＡＴＡＡＧＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ
４０１  ＴＡＴＡＴＡＡＧＧＣ  ＴＴＴＴＡＡＡＧＣＴ  ＴＴＴＡＡＧＧＴＴＴ  ＡＡＣＧＧＴＴＧＴＧ  ＧＡＣＡＡＣＡＡＧＣ
４５１  ＣＡＧＧＧＡＴＣＴＧ  ＣＣＡＴＴＴＣＡＴＴ  ＡＣＣＴＣＴＴＴＣＴ  ＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡ  ＣＡＴＡＧＡＴＣＣＧ
５０１  ＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧ  ＧＴＧＣＡＧＧＧＣＧ  ＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧ  ＣＧＴＴＴＣＣＡＧＡ  ＣＴＴＴＡＣＧＡＡＡ
５５１  ＣＡＣＧＧＡＡＡＣＣ  ＧＡＡＧＡＣＣＡＴＴ  ＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧ  ＣＴＣＡＧＧＴＣＧＣ  ＡＧＡＣＧＴＴＴＴＧ
６０１  ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴ  ＣＧＣＴＴＣＡＣＧＴ  ＴＣＧＣＴＣＧＣＧＴ  ＡＴＣＧＧＴＧＡＴＴ  ＣＡＴＴＣＴＧＣＴＡ
６５１  ＡＣＣＡＧＴＡＡＧＧ  ＣＡＡＣＣＣＣＧＣＣ  ＡＧＣＣＴＡＧＣＣＧ  ＧＧＴＣＣＴＣＡＡＣ  ＧＡＣＡＧＧＡＧＣＡ
７０１  ＣＧＡＴＣＡＴＧＣＧ  ＣＡＣＣＣＧＴＧＧＣ  ＣＡＧＧＡＣＣＣＡＡ  ＣＧＣＴＧＣＣＣＧＡ  ＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣ
７５１  ＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣ  ＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣ  ＧＧＡＣＧＣＧＡＴＧ  ＧＡＴＡＴＧＴＴＣＴ  ＧＣＣＡＡＧＧＧＴＴ
８０１  ＧＧＴＴＴＧＣＧＣＡ  ＴＴＣＡＣＡＧＧＧＴ  ＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴ  ＣＴＣＴＧＡＴＧＴＴ  ＡＣＡＴＴＧＣＡＣＡ
８５１  ＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴ  ＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴ  ＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡ  ＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴ  ＴＡＣＡＴＡＡＡＣＡ
９０１  ＧＴＡＡＴＡＣＡＡＧ  ＧＧＧＴＧＴＴＡＴＧ  ＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣ  ＡＡＣＧＧＧＡＡＡＣ  ＧＴＣＴＴＧＣＴＣＧ
９５１  ＡＧＧＣＣＧＣＧＡＴ  ＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡ  ＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴ  ＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧ  ＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧ
１００１  ＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴ  ＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣ  ＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣ  ＧＡＣＡＡＴＣＴＡＴ  ＣＧＡＴＴＧＴＡＴＧ
１０５１  ＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡ  ＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧ  ＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡ  ＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡ  ＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴ
１１０１  ＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧ  ＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡ  ＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡ  ＣＴＡＡＡＣＴＧＧＣ  ＴＧＡＣＧＧＡＡＴＴ
１１５１  ＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴ  ＣＣＧＡＣＣＡＴＣＡ  ＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴ  ＣＣＧＴＡＣＴＣＣＴ  ＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴ
１２０１  ＧＧＴＴＡＣＴＣＡＣ  ＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣ  ＣＣＣＧＧＡＡＡＡＡ  ＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡ  ＧＧＴＡＴＴＡＧＡＡ
１２５１  ＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧ  ＡＴＴＣＡＧＧＴＧＡ  ＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴ  ＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧ  ＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴ
１３０１  ＧＣＧＣＣＧＧＴＴＧ  ＣＡＴＴＣＧＡＴＴＣ  ＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡ  ＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴ  ＡＡＣＡＧＣＧＡＴＣ
１３５１  ＧＣＧＴＡＴＴＴＣＧ  ＴＣＴＣＧＣＴＣＡＧ  ＧＣＧＣＡＡＴＣＡＣ  ＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡ  ＣＧＧＴＴＴＧＧＴＴ
１４０１  ＧＡＴＧＣＧＡＧＴＧ  ＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡ  ＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴ  ＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧ  ＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴ
１４５１  ＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡ  ＡＴＧＣＡＴＡＡＡＣ  ＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴ  ＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴ  ＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡ
１５０１  ＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡ  ＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴ  ＧＡＴＡＡＣＣＴＴＡ  ＴＴＴＴＴＧＡＣＧＡ  ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡ
１５５１  ＡＴＡＧＧＴＴＧＴＡ  ＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧ  ＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡ  ＡＴＣＧＣＡＧＡＣＣ  ＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡ
１６０１  ＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣ  ＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴ  ＧＣＣＴＣＧＧＴＧＡ  ＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴ  ＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡ
１６５１  ＡＡＣＧＧＣＴＴＴＴ  ＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴ  ＧＧＴＡＴＴＧＡＴＡ  ＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴ  ＧＡＡＴＡＡＡＴＴＧ
１７０１  ＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴ  ＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡ  ＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣ  ＴＡＡＴＣＡＧＡＡＴ  ＴＧＧＴＴＡＡＴＴＧ
１７５１  ＧＴＴＧＴＡＡＣＡＣ  ＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡ  ＴＴＡＣＧＣＴＧＡＣ  ＴＴＧＡＣＧＧＧＡＣ  ＧＧＣＧＧＣＴＴＴＧ
１８０１  ＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴ  ＣＧＡＡＣＴＴＴＴＧ  ＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡ  ＧＧＡＴＣＡＧＡＴＣ  ＡＣＧＣＡＴＣＴＴＣ
１８５１  ＣＣＧＡＣＡＡＣＧＣ  ＡＧＡＣＣＧＴＴＣＣ  ＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣ  ＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡ  ＡＡＴＣＡＣＣＡＡＣ
１９０１  ＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴ  ＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣ  ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣ  ＣＧＴＧＧＣＧＧＧＧ  ＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡ
１９５１  ＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣ  ＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡ  ＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴ  ＴＧＡＧＡＴＧＴＧＴ  ＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡ
２００１  Ｇ
ＮＣｇｌ２８８６遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ゲノム上に存在する（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０２０９３０、ヌクレオチド配列：下記配列番号６）。
配列番号６：
１  ａｔｇｃｔｇｇｃａｇ  ｇｃａｔｇｃｃｔａａ  ｔｔｔａａａｃｇｃｔ  ｇａｇｇａｇｃｔａｇ  ｃａｇｔｃｃｇｃｇｔ  ｇｃｇａｃｃｃｇｃｇ
６１  ｃｔｇａｃａａａａｃ  ｔｃｔａｃｇｔｔｃｔ  ｃｔａｔｔｔｃｃｇｃ  ｃｇｃｔｃｔｇｔｇａ  ａｔｔｃｔｇａｃｃｔ  ｃｔｃｇｇｇｔｃｃａ
１２１  ｃａｇｃｔｃａｃｔａ  ｔｔｔｔｇａｇｔｃｇ  ｃｃｔｇｇａａｇａａ  ａａｃｇｇｃｃｃａｔ  ｃｃｃｇａａｔｔａｇ  ｔｃｇｃａｔｃｇｃｇ
１８１  ｇａａｃｔｔｇａａｇ  ａｔａｔｔｃｇｔａｔ  ｇｃｃａａｃｃｇｃｔ  ｔｃｇａａｔｇｃｔｃ  ｔｇｃａｔｃａｇｃｔ  ｇｇａｇｃａａｃｔｃ
２４１  ａａｃｃｔｇｇｔｔｇ  ａｇｃｇｔａｔｃｃｇ  ｃｇａｃａｃｃａａａ  ｇａｃｃｇｃｃｇａｇ  ｇｃｇｔｇｃａｇｇｔ  ｔｃａｇｃｔｃａｃｔ
３０１  ｇａｔｃａｔｇｇａｃ  ｇｃｇａａｇａｇｃｔ  ｔｇａｇｃｇｃｇｔｇ  ａａｃａａｔｇａａｃ  ｇａａａｃｇｃａｇａ  ｇａｔｇｇｃｔｃｇａ
３６１  ｃｔｃｃｔｔｇａａａ  ｔｇｃｔｃａｃｃｃｃ  ａｇａｇｃａｇｃｔｇ  ｇａａｃｇｔａｃｃｇ  ａａｇａｃｃｔｇｇｔ  ｇｇａｔａｔｃａｔｔ
４２１  ａｃｔｇａｇｃｔｔｇ  ｃａｇａｇｇｔｇｔａ  ｃｇｇｔａｇｃｔｇｇ  ａａａｇａｇａｃｃｇ  ａｃａｇｃｇｇｔｔｃ  ｔｔａａ
該遺伝子は、下記配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする。
配列番号１：  Ａ４８＿ＮＣｇｌ２８８６＿Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ＿ｆａｃｔｏｒ
１  ＭＬＡＧＭＰＮＬＮＡＥＥＬＡＶＲＶＲＰＡＬＴＫＬＹＶＬＹＦＲＲＳＶＮＳＤＬＳＧＰＱＬＴＩＬＳＲＬＥＥ
５１  ＮＧＰＳＲＩＳＲＩＡＥＬＥＤＩＲＭＰＴＡＳＮＡＬＨＱＬＥＱＬＮＬＶＥＲＩＲＤＴＫＤＲＲＧＶＱＶＱＬＴ
１０１  ＤＨＧＲＥＥＬＥＲＶＮＮＥＲＮＡＥＭＡＲＬＬＥＭＬＴＰＥＱＬＥＲＴＥＤＬＶＤＩＩＴＥＬＡＥＶＹＧＳＷ
１５１  ＫＥＴＤＳＧＳ
配列番号１のアミノ酸配列のタンパク質は、転写調節因子であり、詳細は不明であるが、該転写因子が機能しないことによって、１，４−ＢＤＯの高濃度存在下でも微生物が成長することができると考えられる。
【００４０】
また、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子に相当する遺伝子とは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを満たす遺伝子である：（ａ）配列番号１に対して７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）配列番号１において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（ここで、数個とは、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることが好ましい）、（ｃ）配列番号６の塩基配列と、７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するＤＮＡ。上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子においては、コードするタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質の転写因子機能を有することが好ましい。
【００４１】
ＮＣｇｌ２０９０遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ゲノム上に存在する（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０２０１２２、ヌクレオチド配列：配列番号７）。
配列番号７：
１  ｇｔｇｔｃａｃｃｇａ  ｔｃａｔｔｃｇｔａａ  ａｔｔｇａｇｔａｔｃ  ｃｃｃｇａｇｔｔｃａ  ｃｃａｃｃａａｃａｃ  ｃｃｃａｇｔｇｔｔｇ
６１  ｇｔｇｇａｔａｔｃｔ  ａｃａｔｃｇｃａｇｃ  ｇａｔｇａａｃｔａｔ  ｇａｃａａａｇｃａａ  ｔｃａｇｇｇａｔａｃ  ｃｃｇｇａｔｃｇａａ
１２１  ｇｔｃｔｇｇｃｇｇａ  ｇａａａｃｔｃｃｃａ  ｇａａｃｃｃｃｇｇａ  ｔｔｃａｃａｇｃａｇ  ｔｇｇｃａｇｃｇｃｔ  ｇａｔｇｇａｔｇａｔ
１８１  ｃａｇｇｔｃｇｔｇｇ  ｇｃｇｔｇｇｃｃｔａ  ｔｇｇｃｔｔｃａａｔ  ｇｇｃａｇｃｃｃａｇ  ａｔｃａｔｔｇｇｔｇ  ｇｃａａｃａｃｃａａ
２４１  ｔｔａｃｇｃｃｇｇｇ  ｇａｃｔｃｃｇａｃａ  ａｃａａｇｇａｇｇｃ  ｃｃｇａｃｇｇａａｇ  ａｇｇａａａｔｃｃａ  ｔａｔｃａｔｃｃａｃ
３０１  ａａｃｔａｃｔｔｔｇ  ａｇｇｔｔｇｃｇｇａ  ａｇｔｔｃａｔｇｔｔ  ｃａｇｃｃｔｇｇｃｔ  ｔｃｃａａｇｇｔｃａ  ｃｇｇｃａｔｔｇｇｃ
３６１  ｃｇａａａｇｃｔｇａ  ｔｇｃａｔｇａａｃｔ  ｇｔｔａａａａｇａｃ  ａａａｃａａａａｃａ  ｃｔｔｔｔｇｃｃａｔ  ｔｔｔｇｔｃｔａｃａ
４２１  ｃｃｃｇａｇｇｔｃｇ  ａｃｇａｔｇａｇｇｃ  ｇａａｃｃａｔｇｃｇ  ｔｔｔａｇｃｃｔｇｔ  ａｔｃｇｃｔｃｔｃｔ  ｃｇｇｃｔｔｃａｃｔ
４８１  ｇａｃｔｔｇｃｔｃａ  ｇｇｃａｇｔｔｔａｇ  ｇｔｔｔｇａｃｇｇｇ  ｇａｔｃａａｃｇｇｃ  ｃｇｔｔｔｇｃｃｇｔ  ａｔｔｇａｔｃａｃｃ
５４１  ｇｃｃｃｔｃｃｃｃｃ  ｔｔｃａｔｇａｔｔｃ  ｃｔａａ
該遺伝子は、ＧＣＮ５−関連のＮ−アセチルトランスフェラーゼである、下記配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする。
配列番号２：  Ｆ２２＿ＮＣｇｌ２０９０＿ＧＣＮ５−ｒｅｌａｔｅｄ＿Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
１  ＭＳＰＩＩＲＫＬＳＩＰＥＦＴＴＮＴＰＶＬＶＤＩＹＩＡＡＭＮＹＤＫＡＩＲＤＴＲＩＥＶＷＲＲＮＳＱＮＰＧ
５１  ＦＴＡＶＡＡＬＭＤＤＱＶＶＧＶＡＹＧＦＮＧＳＰＤＨＷＷＱＨＱＬＲＲＧＬＲＱＱＧＧＰＴＥＥＥＩＨＩＩＨ
１０１  ＮＹＦＥＶＡＥＶＨＶＱＰＧＦＱＧＨＧＩＧＲＫＬＭＨＥＬＬＫＤＫＱＮＴＦＡＩＬＳＴＰＥＶＤＤＥＡＮＨＡ
１５１  ＦＳＬＹＲＳＬＧＦＴＤＬＬＲＱＦＲＦＤＧＤＱＲＰＦＡＶＬＩＴＡＬＰＬＨＤＳ
詳細は不明であるが、配列番号２のアミノ酸配列のタンパク質が機能しないことによって、１，４−ＢＤＯの高濃度存在下でも微生物が成長することができると考えられる。
【００４２】
また、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子に相当する遺伝子とは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを満たす遺伝子である：（ａ）配列番号２に対して７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）配列番号２において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（ここで、数個とは、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることが好ましい。）、（ｃ）配列番号７の塩基配列と、７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するＤＮＡ。上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子においては、コードするタンパク質が、ＧＣＮ５−関連のＮ−アセチルトランスフェラーゼ活性を有することが好ましい。
【００４３】
ＮＣｇｌ０２２４遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ゲノム上に存在する（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０２１２４８、ヌクレオチド配列：配列番号８）。
配列番号：８
１  ａｔｇａａｃａｃｔｇ  ａａｇａｇｇａｔｇｇ  ｃｃｔｇａｇｃｔｔｔ  ｇｃａｇｔｔａｃｇｇ  ｃｔａｃｃｔｔａｇｔ  ｔｇａａｇｇｔａａａ
６１  ｔｇｇｃａｇｇｔａｃ  ｇｃｇａｇｔｔｔｇａ  ｇｇａｔｃａｃｔｔｃ  ｔｃｃａａｇｃｔｃｔ  ｃｔａｃｃｔｃｔａｔ  ｔａａｔｇｃｇｇｔｔ
１２１  ｃｇｃｔｃｇｃｔｇｃ  ｇｔａｇｃｇａｇｇｇ  ｇｃｃｇｇｃｇｔｔｔ  ｇｃｇｃｔｇｔｔｇｔ  ｇｃｇｔｔｇａｔｇａ  ｔｇａａｔａｔｔｔｔ
１８１  ｇｔｇａｔｇｇｔｇｃ  ｇｔｃｃｃａｃｃｃｃ  ａａｇｔａｇｇｇｔａ  ｔｔｃｃｔｔｔｔｃｃ  ｔｔｔｃｇｇａｔｇｃ  ｇｃｃｇａｔｇｇｃｔ
２４１  ｇｔｃｇａｃｇａｔｇ  ａｔｔｔｃｇｃｃｇｃ  ｃｇｃｇｇｔｇａｔｇ  ｇａｔｇａａｃｔｃｇ  ａｔｇｃｇｇａｔｃｔ  ｔｃｃａｇａｔａｔｃ
３０１  ａａｃｃｃｔｇａｔｇ  ａｔｔｔｇｇａｃｇａ  ｃａｔｃｇａｔｃｃａ  ｔｇｇｃｃａｇａａｇ  ｇｔｇａｔｔｔｃｇａ  ｔａｔｔｔｔｇｇｃｇ
３６１  ｇａｔｔｔｇｇｇｇｃ  ｔｇｔｃｔｇａｇｇａ  ｇｇｔｔｃｔｔｔｃｃ  ｇｔｇａｔｔｔｇｃｇ  ａｔｇａｃａｔｇｇａ  ｔｔｔｇｇａｔｃｃｔ
４２１  ｔｃｃｇａａｃａａｔ  ｔｇｃｔｇｃｇｃａｔ  ｃｇｃｇｇａａｇａａ  ｃｔｃｇｇｔｔｔｔｇ  ａｔａａｔｇａｔｃｔ  ｇｇｃｔｃｇｇｇｔｇ
４８１  ｇｔｇｇｇａｔｔｃｇ  ａｃｔａｇ
該遺伝子は、下記配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする。
配列番号３：  Ｆ６６＿ＮＣｇｌ０２２４＿Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ＿ｐｒｏｔｅｉｎ
１  ＭＮＴＥＥＤＧＬＳＦＡＶＴＡＴＬＶＥＧＫＷＱＶＲＥＦＥＤＨＦＳＫＬＳＴＳＩＮＡＶＲＳＬＲＳＥＧＰＡＦ
５１  ＡＬＬＣＶＤＤＥＹＦＶＭＶＲＰＴＰＳＲＶＦＬＦＬＳＤＡＰＭＡＶＤＤＤＦＡＡＡＶＭＤＥＬＤＡＤＬＰＤＩ
１０１  ＮＰＤＤＬＤＤＩＤＰＷＰＥＧＤＦＤＩＬＡＤＬＧＬＳＥＥＶＬＳＶＩＣＤＤＭＤＬＤＰＳＥＱＬＬＲＩＡＥＥ
１５１  ＬＧＦＤＮＤＬＡＲＶＶＧＦＤ
詳細は不明であるが、配列番号３のアミノ酸配列のタンパク質が機能しないことによって、１，４−ＢＤＯの高濃度存在下でも微生物が成長することができると考えられる。
【００４４】
また、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子に相当する遺伝子とは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを満たす遺伝子である：（ａ）配列番号３に対して７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）配列番号３において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなる遺伝子（ここで、数個とは、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることが好ましい。）、（ｃ）配列番号７の塩基配列と、７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するＤＮＡ。上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子においては、コードするタンパク質が、配列番号３のタンパク質の活性を有することが好ましい。
【００４５】
ＮＣｇｌ２９５６遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２ゲノム上に存在する（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：１０２１００４、ヌクレオチド配列：配列番号９）。
配列番号９：
１  ａｔｇａａａｃｃａｃ  ａａｃｔｔａｔｔｇｃ  ａｔｃｔｔｇｃｔｇｇ  ａｃｃａｇｃｇｃｇｇ  ｇａｇａｃｇｃｃｇｃ  ａｃｃｃｇａｔｃｇｔ
６１  ｇａｃｇａｔｃｔｃａ  ｇｃａｇｃｃｃａｇｔ  ａｇｃａａｔｃｇａｔ  ｇａｇｃｇｃａｔｃｇ  ｃｔｃｔａｇｔｃｇｃ  ｔｇａａａｃｃｇｇｔ
１２１  ｔｇｇｇｃａｇｇｃａ  ｔｔｇｇｇｃｔｔｇｔ  ｔｃａｃｇｃｃｇａｔ  ｃｔｃａｔｃａａａｇ  ｃａｃｇｃｇａｃａｃ  ｃａｔｔｇｇｃｔａｃ
１８１  ｇａｇｇａａｔｔｇｃ  ｇｃｃｇａｃｇｃａｔ  ｃｃａｃｇｃｔｇｃａ  ｇｇａａｔｔｇａａａ  ｔｃａｔｔｇａｇｇｔ  ｇｇａｇｔｔｃｃｔｃ
２４１  ａａｔｇｇｔｔｇｇｔ  ｇｇｇｃｇａｃｔｇｇ  ｔｇｃｇｇａａｃｇｃ  ｃａａｇａｇｔｃｃｇ  ａｔｇｃｃｇｔｔｃｇ  ｔｇｃｇｇａｔｃｔｇ
３０１  ｔｔｔｇｃｔｇｃｇｇ  ｃｇｃａａｇｃｔｃｔ  ｔｇｇｔｔｃｃｃｃａ  ｃａｃａｔｔａａｇｇ  ｔｃｇｇａｇｃａｇｇ  ａｇａｇｇｇｃａｃｃ
３６１  ａａｔｇｇｔｇｔｇｇ  ｔｔｃｃｃａｔｔｇｃ  ｔｃａｃａｔｇｇｃｃ  ａｇｔｇｃｇｔｔｔａ  ｃｔｇａｔｃｔｃｇｃ  ｔｇｃｇｇａａｇｃｔ
４２１  ｇａａｇｃｔｃａｔｇ  ｇｃｇｔｃａａｇｃｔ  ｃｇｃｇｔｔｇｇａａ  ｇｃａａｃｔｃｃｇｔ  ｔｔｔｃｔｃａｃｃｔ  ｇａａｇａｃｃａｔｃ
４８１  ｔａｃｇａｃｇｃｇｃ  ｔｇｇａａｇｔｔｇｔ  ｃａｇｃｃａｔｔｃｃ  ｇａｔａｇｃｃｃａｔ  ｃｇｇｃｔｇｇａｃｔ  ｃａｔｇｇｔｔｇａｔ
５４１  ａｔｃｔｇｇｃａｃａ  ｃｃｇｃｇａａａａｔ  ｃｇｇａａｔｃｃｃｃ  ａａｃｇａｔｇａａｃ  ｔｇｔｇｇｃｇｃａａ  ｃａｔｔｃｃａｃｔｇ
６０１  ｔｃｃａａｇｇｔｃａ  ａｃｇｃａｇｔｇｇａ  ｇｇｔｔｇａｔｇａｔ  ｇｇｔｔｔｃａｔｔｇ  ａｃａｃｃｃｃａａｔ  ｔｇａｔｃｔｔｔｔｃ
６６１  ｇａｔｇａｃｔｃｃａ  ｃｃａａｃｃｇｔｃｇ  ｃｇｃｇｔａｃｔｇｃ  ｇｇｔｇａａｇｇｃｇ  ａａｔｔｔｇａｔｃｃ  ｃｇｃａａｇｃｔｔｃ
７２１  ａｔｃｃｇｔｇｇｃｇ  ｃｃａｔｃｇａｃｇｃ  ｃｇｇｔｔｇｇａｃｇ  ｇｇｃｇｃａｔａｔｇ  ｇｔｇｔｇｇａａａｔ  ｔａｔｔｔｃｃｇｃａ
７８１  ｇａｇｃａｃｃｇａａ  ｇｃｃｔｃｃｃｇｇｔ  ｇａａａｇａａｇｇｇ  ｃｔｇｃａａｃｇｔｇ  ｃｔｔｔｃｇａｃａｃ  ｃａｃｃａｔｃｇｃａ
８４１  ｇｃｇｔｔｔｇａａｃ  ａａｇｃｔｇｃｔｃｇ  ｔｃｔｃｇｃｃｃｃｃ  ｔｃｃａｃｔａａｃｔ  ｇａ
該遺伝子は、下記配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする。
配列番号４：  Ｇ６５＿ＮＣｇｌ２９５６＿Ｓｕｇａｒ＿ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿ｉｓｏｍｅｒａｓｅ＿ｅｐｉｍｅｒａｓｅ
１  ＭＫＰＱＬＩＡＳＣＷＴＳＡＧＤＡＡＰＤＲＤＤＬＳＳＰＶＡＩＤＥＲＩＡＬＶＡＥＴＧＷＡＧＩＧＬＶＨＡＤ
５１  ＬＩＫＡＲＤＴＩＧＹＥＥＬＲＲＲＩＨＡＡＧＩＥＩＩＥＶＥＦＬＮＧＷＷＡＴＧＡＥＲＱＥＳＤＡＶＲＡＤＬ
１０１  ＦＡＡＡＱＡＬＧＳＰＨＩＫＶＧＡＧＥＧＴＮＧＶＶＰＩＡＨＭＡＳＡＦＴＤＬＡＡＥＡＥＡＨＧＶＫＬＡＬＥ
１５１  ＡＴＰＦＳＨＬＫＴＬＫＴＩＹＤＡＬＥＶＶＳＨＳＤＳＰＳＡＧＬＭＶＤＩＷＨＴＡＫＩＧＩＰＮＤＥＬＷＲＮ
２０１  ＩＰＬＳＫＶＮＡＶＥＶＤＤＧＦＩＤＴＰＩＤＬＦＤＤＳＴＮＲＲＡＹＣＧＥＧＥＦＤＰＡＳＦＩＲＧＡＩＤＡ
２５１  ＧＷＴＧＡＹＧＶＥＩＩＳＡＥＨＲＳＬＰＶＫＥＧＬＱＲＡＦＤＴＴＩＡＡＦＥＱＡＡＲＬＡＰＳＴＮ
詳細は不明であるが、配列番号４のアミノ酸配列のタンパク質が機能しないことによって、１，４−ＢＤＯの高濃度存在下でも微生物が成長することができると考えられる。
【００４６】
また、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子に相当する遺伝子とは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを満たす遺伝子である：（ａ）配列番号４に対して７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子、（ｂ）ＮＣｇｌ２９５６遺伝子に相当する遺伝子は、配列番号４において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（ここで、数個とは、１〜１０個であることが好ましく、１〜５個であることが好ましく、１〜３個であることが好ましい。）、（ｃ）配列番号８の塩基配列と、７０％以上、より好ましい順に、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するＤＮＡ。上記（ａ）〜（ｃ）の遺伝子においては、コードするタンパク質が、糖リン酸イソメラーゼ／エピメラーゼ活性を有することが好ましい。
【００４７】
本明細書で使用される、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、配列類似性または配列同一性のことを意味する。前記の相同性は、当業界に知られている標準技術（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２：４８２［１９８１］；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８：４４３  ［１９７０］；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  ［１９８８］；  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのようなプログラム及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２：３８７−３９５  ［１９８４］）を使用して測定できる。
【００４８】
ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子は、親微生物菌株に対して天然または外因性であり得る。
【００４９】
本明細書で使用された、用語"外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）"は、考慮される遺伝物質が親微生物株に対して天然ではないことを意味する。前記の用語"天然（ｎａｔｉｖｅ）"は、宿主細胞の野生型細胞のゲノム内で発見される遺伝物質のことを意味する。
【００５０】
本明細書で使用される、用語「由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」は、指示された供給源から全体的にまたは部分的に遺伝物質を分離したり、指示された供給源から遺伝物質を精製することを意味する。
【００５１】
ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子は、古細菌、真正細菌、酵母、植物、昆虫、動物、人間のような原核及び真核の有機体のすべてから由来できる。例えば、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．  ｃｏｌｉ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、  クロストリジウムクルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、クロストリジウムアセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウムベエイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウムサッカロパー  ブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウムパーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウムディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ラルストニアユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、マイコバクテリウムボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）及びコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からなる群から１種以上選択されるが、これに限定されるものではない。
【００５２】
ＮＣｇｌ２８８６遺伝子、ＮＣｇｌ２０９０遺伝子、ＮＣｇｌ０２２４遺伝子、ＮＣｇｌ２９５６遺伝子、およびこれらの遺伝子に相当する遺伝子は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から由来されたものである。
【００５３】
改変微生物は、野生型の微生物に比べて最大群集率（Ｍａｘ．  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が増加したものであることが好ましい。最大群集率が野生型に比べて増加しているか否かは、下記実施例に記載のように、１，４−ＢＤＯを８０ｇ／Ｌ含むＬＢ培地で、下記実施例に記載の培養条件で６４時間まで培養した場合に、ＯＤ６００の最大値が野生型よりも大きいか否かで判断する。つまり最大群収率は、下記式：
【００５４】
【数１】
2014023528.tif 000003
【００５５】
で表される。
【００５６】
本発明において、最大群収率は、１５％以上であることが好ましい。
【００５７】
本発明の改変微生物は、寄託番号ＫＣＴＣ１２２０８ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２０９ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２１０ＢＰ及びＫＣＴＣ１２２１１ＢＰからなる群から選択されるものであることが好ましい。
【００５８】
他の一実施形態によると、上記改変微生物を利用した１，４−ＢＤＯの生産方法が提供される。該方法は、改変微生物をグルコース含有培地で培養する段階（Ｉ）；及び、段階（Ｉ）の培養によって生成した１，４−ＢＤＯを回収する段階を含むことができる。改変微生物を培養する段階は、発酵条件下で行なうことができる。
【００５９】
細胞培養に使用される培地は、適切な補充物を含有した最小または複合培地のような、宿主細胞の成長に適合する任意の通常的な培地であり得る。具体的には、炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく含有するものであれば、合成培地、天然培地のいずれも使用可能である。また、上記培地は、固体または液体培地のいずれであってもよい。適合する培地は、商業的な販売者から入手可能であり、または公知された製造法に従って製造できる（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。
【００６０】
培地は改変微生物によって発酵できる糖を含む発酵培地であり得る。糖は、６炭糖、例えば、グルコース、グリカンまたはグルコースの他の多糖、グルコースオリゴマー、例えば、マルトース、マルトトリオース及びイソマルトトリオース、パノース、フルクトース及びフルクトースオリゴマーであり得る。発酵培地は、またアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム及び尿素のような窒素原；リン酸水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムのような無機塩；及び、必要に応じて、ペプトン、肉抽出物、酵母抽出物、とうもろこし浸漬液、カザミノ酸、ビオチン、チアミンのような各種のビタミンを含む栄養分を含むことができる。
【００６１】
改変微生物は、回分培養、半回分培養または連続培養の条件下で培養できる。古典的な回分培養方法は、閉じたシステムを使用し、一回ごとに、培地は発酵が実行される前に作られ、媒質に微生物を接種する。特定の場合において、培地中のｐＨ及び酸素含量は変化するが、炭素源含量は変化しない。バッチシステムにおいては、代謝物及び生物量は、発酵が停止するまで絶え間なく変わる。バッチシステムにおいては、細胞は停止された遅滞期から高度成長の対数期に進み、最終的には、成長率が減少または止まる、静止期に至る。処理されなければ、停止相の細胞は最終的には死ぬことになる。一般的に、対数期の細胞は、ほとんどのタンパク質を作る。
【００６２】
回分培養の変形が、半回分培養システムである。該システムにおいて、栄養（例えば、炭素源、窒素源、Ｏ2及び通常、他の栄養）は、これらの培養物の濃度が限界値未満に落ちるときにのみ添加される。半回分培養システムは、異化生成物の抑制が細胞の代謝を抑制し、培地内で栄養素を制限された量で有することが好ましいときに有用である。半回分培養システムにおける実際の栄養濃度は、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ2のような不要なガスの部分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて予測される。回分培養及び半回分培養が一般的であり、当業界に知られている。
【００６３】
連続培養は、特定の培地を連続体にバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に添加し、等量の馴化培地が、プロセス中同時に除去される開放システムである。連続培養は、一般的に細胞が最初に対数期の成長にある一定の高密度の培養物を維持する。連続培養は、細胞成長または最終の生成物濃度に影響を及ぼす、一または複数の因子を操作することができる。例えば、炭素源または窒素源のような制限栄養素は、一定の速度で、他のすべての因子は調節してもよい。他のシステムにおいて、成長に影響を与える多くの因子は、培地の濁度によって測定される細胞濃度が一定に維持される間、連続的に変化する。連続システムは、一定状態の成長条件を維持しようとする。従って、培地が抜け出ることによる細胞損失は、発酵における細胞成長速度に対してバランスがとれる。生成物の形成速度を最大化する技術だけでなく、連続培養のプロセスの間、栄養素及び成長因子を維持する方法は、当業界に知られている。
【００６４】
前記の培養によって生成された１，４−ＢＤＯを回収する段階は、バイオプロセスで使用される任意の方法によって行なうことができる。例えば、塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留法、クロマトグラフィ及び電気透析法を含み、分離、精製または収集の方法が使用できる。
【００６５】
また、本発明の他の一実施形態は、上記方法により回収された１，４−ＢＤＯからポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ；ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を生成する段階を含む、ポリブチレンサクシネートの生産方法である。
【００６６】
例えば、回収された１，４−ＢＤＯをコハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはジメチル−スクシネート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）と縮重合することによってＰＢＳを製造することができる。ＰＢＳは、脂肪族ポリエステル系高分子であって、優れた生分解特性と成形性を保有しているため、魚網用だけでなくフィルム及び包装容器などに使用できる。
【００６７】
また、本発明の他の一実施形態は、上記方法により回収された１，４−ＢＤＯからポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ；ｐｏｌｙｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）を生成する段階を含む、ポリブチレンテレフタレートの生産方法である。
【００６８】
例えば、回収された１，４−ＢＤＯをテレフタル酸（ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌｉｃ  ａｃｉｄ）またはジメチル−テレフタレート（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）と縮重合することによってＰＢＴを製造することができる。ＰＢＴは、ポリエステル系高分子であって、優れた結晶性、寸法安定性及び成形性を保有しているため、電気、電子及び自動車用部品だけでなく、エンジニアーリングプラスチック材料として使用できる。
【００６９】
以下、発明の理解を助けるために、以下実施例を提示する。下記の実施例は、発明をより容易に理解するために提供されるだけで、発明の保護範囲が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１：
１，４−ＢＤＯ耐性遺伝子の発掘
コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２）を用いて、トランスポゾン（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ  社、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭ  ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ  ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ  Ｋｉｔ）を利用したランダム変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行った。具体的な実験方法については、製品に添付されたインストラクションにしたがって行った。次いで、変異株をスクリーニングした。その結果、Ａ４８菌株、Ｆ２２菌株、Ｆ６６菌株、及びＧ６５菌株が取得された。挿入されたＴｎ５のゲノム領域を特定したところ、Ａ４８菌株は、ＮＣｇｌ２８８６内、Ｆ２２菌株は、ＮＣｇｌ２０９０内、Ｆ６６菌株は、ＮＣｇｌ０２２４内、Ｇ６５菌株は、ＮＣｇｌ２９５６内にＴｎ５が挿入していることがわかった。
【００７１】
Ａ４８菌株、Ｆ２２菌株、Ｆ６６菌株及びＧ６５菌株をそれぞれ寄託番号ＫＣＴＣ１２２０８ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２０９ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２１０ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２１１ＢＰにて寄託した。
【００７２】
実施例２：  Ａ４８菌株の成長曲線の測定
Ａ４８菌株の成長曲線を測定して、ＮＣｇｌ２８８６遺伝子が欠失されていない野生型のＣ．  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２と比べて成長上の違いがあるかを確認した。
【００７３】
各菌株は、３０℃で１６時間前培養し、前培養された各菌株をそれぞれ１，４−ＢＤＯ  ８０ｇ／Ｌを含んでいるＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ／ｐＨ７．０）  ５０ｍＬに６００ｎｍで菌による吸光度（ＯＤ６００）が０．１になるように接種した。接種された各菌株を３０℃で２００ｒｐｍで培養しながら３時間ごとに６００ｎｍで吸光度（ＯＤ６００）を測定し、成長を観察した。その結果を下記の表１及び図２に示した。
【００７４】
【表１】
2014023528.tif 000004
【００７５】
実施例３：Ｆ２２菌株、Ｆ６６菌株及びＧ６５菌株の成長曲線の測定
Ｆ２２菌株、Ｆ６６菌株及びＧ６５菌株の成長曲線を測定して野生型のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２に比べて成長上の違いがあるかを確認した。
【００７６】
各菌株は、３０℃で１６時間前培養しており、前記の前培養された各菌株をそれぞれ１，４−ＢＤＯ  ８０ｇ／Ｌを含んでいるＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ／ｐＨ７．０）  ５０ｍＬに６００ｎｍで菌による吸光度（ＯＤ６００）が０．１になるように接種した。接種された各菌株を３０℃で２００ｒｐｍで培養しながら２〜１８時間ごとに６００ｎｍで吸光度（ＯＤ６００）を測定し、成長を観察した。
【００７７】
その結果を下記の表２及び図３に示した。
【００７８】
【表２】
2014023528.tif 000005
【００７９】
前記の実施例２及び３の結果をまとめて、相対的なＭａｘ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを図４に示した。
【００８０】
図４から分かるように、変異Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株は、野生型の菌株に比べてＭａｘ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎが増加した。即ち、１，４−ＢＤＯが高濃度で存在しても、１，４−ＢＤＯを高効率で生産できることが分かる。
【００８１】
以上、本発明内容の特定部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる実施例に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されるわけではないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、特許請求範囲の技術的思想によって定められなければならない。
【図１】
2014023528.tif 000006
【図２】
2014023528.tif 000007
【図３】
2014023528.tif 000008
【図４】
2014023528.tif 000009
【配列表】
2014023528000001.app