(57)【要約】【課題】本発明は、抗生物質濃度の測定方法および測定キットを提供する。【課題を解決するための手段】本発明の一実施例による抗生物質の濃度測定方法は、抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップと、抗生物質の抗体が１つ以上結合されたシリカコーティング蛍光粒子を準備するステップと、磁性粒子をシリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップと、反応したシリカコーティング蛍光粒子にレーザーを照射するステップを含む。【選択図】図３
2014071120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップと、
前記抗生物質の抗体が１つ以上結合されたシリカコーティング蛍光粒子を準備するステップと、
前記磁性粒子を前記シリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップと、
前記反応した前記シリカコーティング蛍光粒子にレーザーを照射するステップを含む抗生物質の濃度測定方法。
【請求項２】
前記の抗生物質は、エンロフロキサシン、シプロフロキサシン、サリノマイシン、およびスルファチアゾールの中から選択される一つ以上の抗生物質であることを特徴とする、請求項１に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項３】
前記抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップは、
前記磁性粒子の表面にアミン基を結合させるステップおよび前記アミン基が結合された前記磁性粒子と前記抗生物質とをアミド結合させるステップとをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項４】
前記磁性粒子の表面にアミン基を結合させるステップの後、架橋剤を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項５】
前記アミン基が結合された前記磁性粒子と前記抗生物質とをアミド結合させるステップの後、
磁石を用いて前記抗生物質がアミド結合された前記磁性粒子を捕集するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項６】
前記シリカコーティング蛍光粒子を準備するステップは、
第１蛍光物質からなる蛍光粒子をシリカでコーティングしてシリカコーティング蛍光粒子を形成させるステップと、
前記シリカコーティング蛍光粒子に前記抗生物質の抗体を１つ以上結合させるステップとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項７】
前記第１の蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネートおよびシアニンから選択される１つ以上の蛍光物質であることを特徴とする、請求項６に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項８】
前記シリカコーティング蛍光粒子に抗生物質の抗体を結合させるステップは、
前記シリカコーティング蛍光粒子の表面にカルボキシル基を結合させるステップと、
前記カルボキシル基が結合された前記シリカコーティング蛍光粒子と前記抗生物質の抗体とをアミド結合させるステップとを含むことを特徴とする、請求項６に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項９】
前記シリカコーティング蛍光粒子の表面にカルボキシル基を結合させるステップの後、
架橋剤を添加するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項１０】
前記シリカコーティング蛍光粒子に前記抗生物質の抗体を１つ以上結合させるステップの後、
前記シリカコーティング蛍光粒子に結合された前記抗生物質の抗体の量を測定するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項１１】
前記シリカコーティング蛍光粒子に結合された前記抗生物質の抗体の量を測定するステップは、
前記抗生物質の抗体に特異的な二次抗体が結合された第２蛍光物質を前記シリカコーティング蛍光粒子と混合するステップおよび
波長が異なる光で前記第１の蛍光物質と、前記第２蛍光物質とを測定するステップを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項１２】
前記磁性粒子を前記シリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップの後、
磁石を用いて前記シリカコーティング蛍光粒子と反応させられた前記磁性粒子を捕集するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗生物質の濃度測定方法。
【請求項１３】
抗生物質と結合可能な官能基が付着した磁性粒子を含む第１測定ユニットおよび
前記抗生物質の抗体が結合したシリカコーティング蛍光粒子を含む第２の測定ユニットを含む抗生物質の濃度測定キット。
【請求項１４】
前記官能基はアミン基であることを特徴とする、請求項１３に記載の抗生物質の濃度測定キット。
【請求項１５】
前記抗生物質はエンロフロキサシン、シプロフロキサシン、サリノマイシン、およびスルファチアゾールの中から選択される一つ以上の抗生物質であることを特徴とする、請求項１３に記載の抗生物質濃度測定キット。
【請求項１６】
前記シリカコーティング蛍光粒子は、フルオレセインイソチオシアネートおよびシアニンの中から選択されている１つ以上の蛍光物質を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の抗生物質の濃度測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質濃度の測定方法および測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質(antibiotics)は、微生物が生産する代謝産物であって、少量で他の微生物の発育を抑制したり、死滅させたりする物質として、豚、鶏および牛など食肉用家畜に広く使用されている。ただ、食肉用の家畜に使用された抗生物質は、動物の体内で容易に分解されないため、食肉用家畜を摂取する際に抗生物質が体内に流入されることがある。体内に流入された抗生物質は、中枢神経に影響を与えることができ、医薬品に対する病原体の耐性を誘導することもある。
【０００３】
したがって、食肉用家畜の抗生物質の濃度をモニターリングすることは、食品安全性の検査において重要な項目の一つとされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、簡単な工程および低い検出限界を有する抗生物質の濃度の測定方法を提供することである。
【０００５】
本発明が解決しようとする他の課題は、簡単な工程と低い検出限界を有する抗生物質濃度の測定キットを提供することである。
【０００６】
本発明の解決しようとする課題は、上記技術的課題に制限されず、言及されていないまた他の技術的課題は、以下の記載から当業者に明確に理解できる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
課題を解決するための、本発明の一実施形態による抗生物質濃度の測定方法は、抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップと、抗生物質の抗体が１つ以上結合されたシリカコーティング蛍光粒子を準備するステップと、磁性粒子をシリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップと、反応したシリカコーティング蛍光粒子にレーザーを照射するステップとを含んでいる。
【０００８】
他の課題を解決するための、本発明の一実施形態に係る抗生物質濃度の測定キットは、抗生物質と結合可能な官能基が付着された磁性粒子を含む第１測定ユニットおよび抗生物質の抗体が結合されたシリカコーティング蛍光粒子を含む第２測定ユニットを含む。
【０００９】
その他、実施例の具体的な事項は、発明の詳細な説明および図面に含まれている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の実施例によると、少なくとも次のような効果がある。
【００１１】
低コストの簡単な工程で、迅速に抗生物質の濃度を測定することができる。
【００１２】
また、極少量の抗生物質の正確な濃度を測定することができる。
【００１３】
本発明による効果は、上記で例示された内容によって制限されず、さらに様々な効果が本明細書の中に含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、抗生物質の中のエンロフロキサシン、シプロフロキサシン、サリノマイシンおよびスルファチアゾールを示す化学式である。
【図２】図２は、本発明の一実施例によるエンロフロキサシンの濃度測定方法を概略的に示す概念図である。
【図３】図３は、本発明の一実施例による抗生物質濃度の測定方法の概要を示すフローチャートである。
【図４】図４は、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）およびシリカコーティングＦＩＴＣ粒子のｐＨ安定性試験の測定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣからなる中心粒子およびシリカコーティングＦＩＴＣ粒子のフォトブリーチング安定性試験の測定結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＦＩＴＣのメタルクエンチング安定性試験の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、シリカコーティングＦＩＴＣ粒子のメタルクエンチング安定性試験の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の利点および特徴、並びにそれらを達成する方法は、添付の図面とともに詳細に後述される実施例を参照すれば明らかになるのである。
【００１６】
しかし、本発明は下記で開示される実施例に限定されるものではなく、相違する様々な形で実現されるものであり、本実施例は、単に本発明の開示を完全にし、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に発明の範囲を知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範囲によって定義されるのみである。
【００１７】
以下、添付の図面を参照して、本発明の実施のための具体的な内容を詳しく説明する。図面に関係なく、同じ部材番号は同じ構成要素を指し、「および／または」は、言及されたアイテムのそれぞれおよび１つ以上の全ての組み合わせを含む。
【００１８】
本明細書で使用する用語は、実施例を説明するためのものであり、本発明を制限するものではない。本明細書において、単数形は文中で特に言及しない限り、複数形も含んでいる。明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及された構成要素の外に１つ以上の他の構成要素の存在または追加を排除しない。
【００１９】
他の定義がなければ、本明細書で使用されるすべての用語（技術および科学的用語を含む）は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者に共通して理解することができる意味として用いられる。また、一般的に使用され辞書に定義されている用語は、明白かつ特別に定義されない限り、理想的または過度に解釈されない。
【００２０】
以下、図面を参照して本発明の実施例について説明する。
【００２１】
図１は、抗生物質であるエンロフロキサシン、シプロフロキサシン、サリノマイシンおよびスルファチアゾールの化学式を示す図である。図２は、本発明の一実施例によるエンロフロキサシンの濃度測定方法を概略的に示す概念図である。図３は、本発明の一実施形態による抗生物質濃度の測定方法を概略的に示すフローチャートである。以下、図１、図２および図３を参照して、本発明の一実施例による抗生物質濃度の測定方法について説明する。
【００２２】
本発明の一実施形態による抗生物質の濃度の測定方法は、抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップ（Ｓ１）と、抗生物質の抗体が１つ以上結合されたシリカコーティング蛍光粒子を準備するステップ（Ｓ２）と、磁性粒子をシリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップ（Ｓ３）と、反応したシリカコーティング蛍光粒子にレーザーを照射するステップ（Ｓ５）を含む。
【００２３】
上記の抗生物質は、エンロフロキサシン、シプロフロキサシン、サリノマイシンおよびスルファチアゾールの中から選択することができる。
【００２４】
上記抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップの前に、抗生物質の前処理ステップ（Ｓ１１）をさらに含むことができる。すなわち、本発明の例示的な実施例において、豚、鶏および牛などの食肉に存在する多くのタンパク質および脂肪を先に除去した後、食肉から抗生物質を抽出することができる。上記食肉からタンパク質を除去するための例示的な方法は、アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を食肉に投入した後、ボルテックス処理（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）と超音波処理（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を含むことができる。また、上記食肉から脂肪を除去する例示的な方法として、上記タンパク質が除去された溶液から上澄み液を収集し、ヘキサンを上記アセトニトリルと同じ体積率で入れた後、ボルテックスおよび超音波処理をする方法を適用することができる。残りの不純物を除去するために、シリンジフィルター（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ）を利用して０．２μｍ以上の不純物を除去することがさらにできる。
【００２５】
上記抗生物質と結合された磁性粒子を準備するステップは、磁性粒子の表面にアミン基を結合させるステップ（Ｓ１２）、およびアミン基が結合された磁性粒子と抗生物質をアミド結合させるステップ（Ｓ１４）を含むことができる。このとき、磁性粒子にアミン基を結合させるステップ（Ｓ１２）は、磁性粒子に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ：３−ＡＰＴＥＳ）とオルトケイ酸テトラエチル（Ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ：ＴＥＯＳ）を投入した後、撹拌するステップを含むことができる。
【００２６】
上記磁性粒子の表面にアミン基を結合させるステップ（Ｓ１２）後に、架橋剤を添加するステップ（Ｓ１３）がさらに加わってもよい。このとき、上記架橋剤としては、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（Ｎ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ：ＥＤＣ）およびＮ?ヒドロキシコハク酸イミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）の中から選ばれる一つ以上を使用することができる。
【００２７】
本発明の一実施形態による抗生物質の濃度の測定方法は、上記アミン基が結合された磁性粒子と抗生物質とをアミド結合させるステップ（Ｓ１４）の後に、抗生物質がアミド結合された磁性粒子を、磁石を用いて捕集するステップ（Ｓ１５）をさらに含むことができる。磁石を利用して磁性粒子を捕集すると、抗生物質の濃度が高くなるので、抗生物質の濃度測定の際、有利である。
【００２８】
上記シリカコーティング蛍光粒子を準備するステップは、第１蛍光物質からなる蛍光粒子をシリカでコーティングしてシリカコーティング蛍光粒子を形成させるステップ（Ｓ２１）、およびシリカコーティング蛍光粒子に抗生物質の抗体を１つ以上結合させるステップを含むことができる。第１の蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）およびシアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ：Ｃｙ）の中から選択される一つ以上の物質であってもよい。
【００２９】
ここで、上記第１蛍光物質からなる蛍光粒子は、第１蛍光物質を有機溶媒に投入した後、超音波分解して、第１蛍光物質を有機溶媒に完全に溶解させるステップおよび光を遮断した状態で、第１蛍光物質が溶解した有機溶媒を撹拌させるステップにより製造することができる。
【００３０】
上記第１蛍光物質からなる蛍光粒子をシリカでコーティングしてシリカコーティング蛍光粒子を形成させるステップ（Ｓ２１）は、ヘプタン（Ｈｅｐｔａｎｅ）にドクサートナトリウム塩（Ｄｏｃｕｓａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）と脱イオン水（Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  Ｗａｔｅｒ：ＤＩＷ）を混合および撹拌して逆相マイクロエマルジョン（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を作るステップ、逆相マイクロエマルジョンに第１蛍光物質からなる蛍光粒子を投入して撹拌させるステップおよび光を遮断した状態で、ＴＥＯＳおよびＮＨ４ＯＨを投入して反応させるステップを含むことができる。
【００３１】
上記シリカコーティング蛍光粒子は、１０℃〜９０℃で製造することができ、好ましくは、７５℃〜８５℃で製造することができる。
【００３２】
上記シリカコーティング蛍光粒子は、表面がシリカでできているため、様々な外部要因に影響を受けることを少なくするができる。例えば、蛍光粒子が生体分子に直接結合された場合、溶媒、空気、金属、塩などの様々な外部要因によってクエンチングが発生して、時間の経過とともに次第に蛍光度が減少する傾向を示すことがある。上記シリカコーティング蛍光粒子は、蛍光粒子にシリカコーティングが存在するため、様々な外部要因からの影響を防いで、時間が経っても元の蛍光度を持続的に維持させることができる。同様の原理で、上記蛍光粒子にシリカコーティングを適用すると、光源として使用するレーザーによって発生するフォトブリーチング（光脱色）現象から蛍光粒子を保護できる利点およびｐＨの変化にも一定の蛍光度を保つことができるという利点がある。
【００３３】
上記シリカコーティング蛍光粒子に抗生物質の抗体を１つ以上結合させるステップは、シリカコーティング蛍光粒子の表面にカルボキシル基を結合させるステップ（Ｓ２２）、およびカルボキシル基が結合されたシリカコーティング蛍光粒子と抗生物質の抗体とをアミド結合させるステップ（Ｓ２４）を含むことができる。
【００３４】
上記シリカコーティング蛍光粒子の表面にカルボキシル基を結合させるステップ（Ｓ２２）は、シリカコーティング蛍光粒子に３−ＡＰＴＥＳとＴＥＯＳとを混合して撹拌するステップ、およびジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）に無水コハク酸（Ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を溶かし、シリカコーティング蛍光粒子と混合して撹拌するステップを含むことができる。
【００３５】
上記シリカコーティング蛍光粒子の表面にカルボキシル基を結合させるステップ（Ｓ２２）後に、架橋剤を添加するステップ（Ｓ２３）をさらに含むことができる。ここで、上記架橋剤は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドおよびＮ?ヒドロキシコハク酸イミドまたは、これらの組み合わせから選択することができる。
【００３６】
上記シリカコーティング蛍光粒子に抗生物質の抗体を１つ以上結合させるステップの後、シリカコーティング蛍光粒子に結合された抗生物質の抗体の量を測定するステップ（Ｓ２５）をさらに含むことができる。したがって、その後蛍光測定法を用いてシリカコーティング蛍光粒子の量を測定する時、自ずとシリカコーティング蛍光粒子に結合された抗生物質の抗体の量も分かることができ、抗生物質の抗体に結合された抗生物質の濃度測定の検出限界は、さらに低くなりうる。
【００３７】
上記シリカコーティング蛍光粒子に結合された上記抗生物質の抗体の量を測定するステップ（Ｓ２５）は、抗生物質の抗体に特異的な二次抗体が結合された第２蛍光物質を上記シリカコーティング蛍光粒子と混合するステップ、および互いに波長の異なる光線を持って、第１蛍光物質と第２蛍光物質を測定するステップを含むことができる。例えば、第１蛍光物質に入射される第１波長の光線で第１蛍光物質の蛍光度を測定し、第２蛍光物質に入射される第２波長の光線で第２蛍光物質の蛍光度を測定して比較分析すると、単一シリカコーティング蛍光粒子に結合された抗生物質の量を測定することができる。
【００３８】
上記磁性粒子をシリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップ（Ｓ３）は、磁性粒子に結合された抗生物質と、シリカコーティング蛍光粒子に結合された抗生物質との抗体の抗原抗体反応ステップを含むことができる。抗原抗体反応は、抗体が対応する抗原のみを選択して反応する、極めて特異性の高い反応である。抗生物質の抗体は、抗生物質のみを選択して反応するので、抗生物質と結合された磁性粒子と、抗生物質の抗体と結合したシリカコーティング蛍光粒子とが結合することができる。したがって、シリカコーティング蛍光粒子の蛍光性は、直接抗生物質の濃度と関連付けることができる。
【００３９】
上記磁性粒子をシリカコーティング蛍光粒子と反応させるステップ（Ｓ３）の後、シリカコーティング蛍光粒子に反応した磁性粒子を、磁石を用いて捕集するステップ（Ｓ４）をさらに含むことができる。磁石を利用して磁性粒子を捕集すると、抗生物質およびシリカコーティング蛍光粒子の濃度が高くなるので、抗生物質の濃度測定の際、有利である。
【００４０】
上記磁石を用いて上記シリカコーティング蛍光粒子に反応した磁性粒子を捕集するステップ（Ｓ４）は、上述の抗生物質がアミド結合した磁性粒子を、磁石を用いて捕集するステップ（Ｓ１５）と並行することもできるが、これらのいずれかのみで行われることもある。
【００４１】
上記反応した上記シリカコーティング蛍光粒子にレーザーを照射するステップ（Ｓ５）は、蛍光測定法によりシリカコーティング蛍光粒子の蛍光度を測定するステップをさらに含むことができる。蛍光測定法は、例えば、レーザー誘導蛍光顕微鏡（Ｌａｓｅｒ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＬＩＦＭ）を利用した測定法でもよい。
【００４２】
上述の抗生物質濃度の測定方法は、低コストの簡単な工程で迅速に抗生物質の濃度を測定することができる。また、上述の抗生物質の濃度測定方法によれば、測定対象の抗生物質が極少量であっても、その濃度を正確に測定することができる。つまり、酵素結合免疫吸着剤検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）による抗生物質濃度測定の検出限界は約１ｐｐｂであるが、本発明の一実施例による抗生物質の濃度測定方法による検出限界は、０．０４５ｐｐｂまで低下することができる。
【００４３】
以下、本発明の一実施例による抗生物質濃度の測定キットについて説明する。本発明の一実施例による抗生物質濃度の測定キットは、上述の本発明の一実施例による抗生物質の濃度測定方法に使用されるキットであるため、以下では相違点を中心に説明する。
【００４４】
抗生物質濃度測定キットは、抗生物質と結合可能な官能基が付着した磁性粒子を含む第１測定ユニット、および抗生物質の抗体が結合したシリカコーティング蛍光粒子を含む第２測定ユニットを含む。この時、抗生物質と結合可能な官能基は、アミン期でもよい。
【００４５】
抗生物質濃度測定キットは、第１測定ユニットおよび第２測定ユニットのみで構成されるため、持ち運びが容易である。また、上述のように、抗生物質の濃度測定キットを用いると、低コストの簡単な工程で迅速に微量の抗生物質の濃度を測定することができる。
【００４６】
以下、製造例、実施例、および比較例を通して本発明を詳細に説明する。これは、本発明の説明のためだけのものであって、これにより本発明の範囲が限定されることはない。
【００４７】
＜製造例１＞エンロフロキサシンの濃度測定キットの製造
（１）アミン基が結合した磁性粒子の製造
磁性粒子に３−ＡＰＴＥＳおおびＴＥＯＳ５５μｌを一緒に入れて、２４時間撹拌しながら反応させて、アミン基を磁性粒子の表面に結合させた。
（２）エンロフロキサシンの抗体が１つ以上結合されたシリカコーティングＦＩＴＣ粒子の製造
１．ＦＩＴＣからなる中心粒子（以下、「ＦＩＴＣ粒子」と称する）の製造
ＦＩＴＣ１０ｍｇを１０ｍｌのエタノールに入れ、５分間の超音波分解させながらＦＩＴＣをエタノールに完全に溶かした。その後３−ＡＰＴＥＳを５０μｌ添加し、磁気バーを入れて２４時間撹拌反応させた。撹拌反応は、ＦＩＴＣが光との直接接触を避けられるように、アルミ箔を利用して光を遮断した状態で行った。
【００４８】
２．シリカコーティングＦＩＴＣ粒子の製造
ヘプタン４８ｍｌにドキュセートナトリウム塩を５ｍｍｏｌ、ＤＩＷ８６０μｌを入れて１０分間磁気バーを用いて撹拌させながら、逆相マイクロエマルジョンを作った。逆相マイクロエマルジョンにＦＩＴＣからなる蛍光粒子３００μｌ入れて３０分間磁気バーを用いて撹拌させた。その後、アルミ箔を利用して光を遮断した状態で、ＴＥＯＳ４３０μｌと、触媒の役割をする２５％ＮＨ４ＯＨ２７０μｌとを入れて２４時間反応させた。
【００４９】
３．シリカコーティングＦＩＴＣ粒子の表面にカルボキシル基を結合
シリカコーティングＦＩＴＣ粒子に３−ＡＰＴＥＳとＴＥＯＳとを５５μｌ一緒に入れ２４時間撹拌しながら反応させて、アミン基をシリカコーティングＦＩＴＣ粒子の表面に活性化させた。その後、アミン基をカルボキシル基に再び変形させるために、ＤＭＳＯにコハク酸無水物を溶かしシリカコーティングＦＩＴＣ粒子に添加して、さらに２時間撹拌しながら反応させた。
【００５０】
４．カルボキシル基が結合したシリカコーティングＦＩＴＣ粒子と１つ以上のエンロフロキサシンの抗体を結合
カルボキシル基が結合したシリカコーティングＦＩＴＣ粒子に、架橋剤であるＥＤＣ、ＮＨＳを２：１の割合で一緒に入れる。その後、エンロフロキサシン抗体を１０μｌ添加して２時間反応させた。
【００５１】
＜製造例２＞シプロフロキサシンの濃度測定キットの製造
製造例１のエンロフロキサシンの抗体の代わりにシプロフロキサシンの抗体を使用したことを除いては、製造例１と実質的に同じ方法でシプロフロキサシンの濃度測定キットを製造した。
【００５２】
＜製造例３＞シリカコーティング蛍光粒子に結合された抗体の量を測定キットの製造
（１）エンロフロキサシンの抗体が１つ以上結合されたシリカコーティングＣｙ５粒子の製造
製造例１の（２）のＦＩＴＣの代わりにシアニン５（Ｃｙ５）を使用したことを除いては、製造例１の（２）と実質的に同じ方法でエンロフロキサシンの抗体が１つ以上結合されたシリカコーティングＣｙ５粒子を製造した。
（２）エンロフロキサシンの抗体に特異的な二次抗体が結合したＦＩＴＣ製造
ＦＩＴＣの架橋剤であるＥＤＣ、ＮＨＳを２：１の割合で一緒に入れてくれた。その後、エンロフロキサシンの抗体に特異的な二次抗体を１００μｌ添加し、２時間反応させた。
【００５３】
＜製造例４＞前処理試料の製造
タンパク質の除去のためにアセトニトリルを粉砕された肉試料に入れた。溶媒を入れた混合物にボルテックスおよび超音波処理で１０分間振動（ｓｈａｋｉｎｇ）させた。上澄み液を収集し、脂肪を除去するためにヘキサンをアセトニトリルと同じ体積率で入れた。その後、ボルテックスおよび超音波処理で１０分間振動させた後、脂肪層を除去した。残りの不純物を除去するために、シリンジフィルターを用いて０．２μｍ以上の不純物を除去した。
【００５４】
＜実験例１＞シリカコーティングＦＩＴＣ粒子の安定性試験
（１）ｐＨ安定性試験
バイアルを用意し、バイアルに存在する金属または影響性のあるイオンを除去するために２０％のＨＮＯ３で保管されているバイアルを、脱イオン水（ＤＩＷ）を用いて数回洗浄した。複数のバイアルにｐＨ１〜１３までの溶液を１ｍｌずつ入れた。ｐＨ１〜１３の状態にするために、ＮａＯＨおよびＨＮＯ３を用いてｐＨを調節した。溶液に蛍光粒子、すなわちＦＩＴＣまたはシリカコーティングＦＩＴＣ粒子を２μｌ添加し、ローテーターを用いて回転させながら１時間反応させる。ＬＩＦＭを利用して蛍光を測定した。ｐＨ安定性試験に対する測定結果は、図４に示されている。
（２）フォトブリーチング安定性試験
ＦＩＴＣは、エタノールに溶かしてＤＩＷを用いて希釈し、ＦＩＴＣ粒子、シリカコーティングＦＩＴＣ粒子も、上記と同様ＤＩＷで希釈し実験して試料を準備した。レーザーを継続的に試料に照射し、１分毎に光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ：ＰＭＴ）と光子数測定器（ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ）を利用して計２０分の蛍光強度を測定する。フォトブリーチングの安定性試験に対する測定結果は、図５に示されている。
（３）メタルクエンチング安定性試験
塩化物（ｃｈｌｏｒｉｄｅ）形態のＮａ＋、Ｋ＋を、それぞれ濃度０、１０、５０、１００、２００、５００、７００、１０００、５０００ｎｇ／ｍｌになるように調製した。調製された金属溶液は、濃度別に１ｍｌずつバイアルに移し、これに蛍光粒子、すなわちＦＩＴＣまたはシリカコーティングＦＩＴＣ粒子を２μｌずつ加えよく混ぜ、ＬＩＦＭ、ＰＭＴおよび光子数測定器を用いて蛍光を測定した。ＦＩＴＣはＤＩＷに容易に溶けないので、１ｍｇ／ｍｌのエタノールに溶かした後、１０μｌの溶液を１ｍｌのＤＩＷに希釈して使用する。メタルクエンチング安定性試験に対する測定結果は、図６および図７に示されている。図６は、ＦＩＴＣのメタルクエンチングの安定性試験の結果であり、図７は、シリカコーティングＦＩＴＣ粒子のメタルクエンチングの安定性実験の結果である。
【００５５】
＜実験例２＞シリカコーティング蛍光粒子に結合された抗体量の測定実験
製造例３によって製造されたキットを使用してシリカコーティング蛍光粒子に結合された抗体の量を測定した。具体的には、エンロフロキサシンの抗体が１つ以上結合されたシリカコーティングＣｙ５粒子と、エンロフロキサシンの抗体に特異的な二次抗体が結合したＦＩＴＣとが混合された混合物を形成した後、ＬＩＦＭを利用して、Ｃｙ５の蛍光を測定するための６３２．８ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー（Ｈｅ／Ｎｅｒｅｄ ｌａｓｅｒ）と、ＦＩＴＣの蛍光を測定するための４７３ｎｍの半導体励起固体（Ｄｉｏｄｅ−ｐｕｍｐｅｄ  ｓｏｌｉｄ−ｓｔａｔｅ：ＤＰＳＳ）ブルーレーザーを混合物に照射した。シリカコーティングＣｙ５粒子の量を意味するＣｙ５の蛍光度と、エンロフロキサシンの抗体の量を意味するＦＩＴＣの蛍光度とを比較分析した結果、シリカコーティングＣｙ５粒子の表面にエンロフロキサシン抗体が５．２８ｎｍｏｌ分存在した。
【００５６】
＜実施例１＞エンロフロキサシンの濃度の測定実験
製造例１で製造したエンロフロキサシンの濃度測定キットを使用して１０ｎｇ／ｍＬのエンロフロキサシンを測定したとき、６．９５ｎｇ／ｍＬのエンロフロキサシンが測定された。
【００５７】
＜実施例２＞シプロフロキサシンの濃度の測定実験
製造例２で製造したシプロフロキサシンの濃度測定キットを使用して１０ｎｇ／ｍＬのシプロフロキサシンを測定したとき、７．３４ｎｇ／ｍＬのシプロフロキサシンが測定された。
【００５８】
＜比較例１＞
酵素結合免疫吸着剤検定法を利用したエンロフロキサシンの濃度測定キットを使用して１０ｎｇ／ｍＬのエンロフロキサシンを測定したとき、２．１７ｎｇ／ｍＬのエンロフロキサシンが測定された。
【００５９】
＜比較例２＞
酵素結合免疫吸着剤検定法を利用したシプロフロキサシンの濃度測定キットを使用して１０ｎｇ／ｍＬのシプロフロキサシンを測定したとき、２．９４ｎｇ／ｍＬのシプロフロキサシンが測定された。
【００６０】
以上、実施例を参照して本発明の実施例を説明したが、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な態様で実施できることは理解できることである。したがって、上述の実施例は、すべての面において例示にすぎず、限定的ではないものと理解するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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