(57)【要約】【課題】４０℃且つｐＨ４で優れた油脂分解能力を発揮することのできる微生物を用いた油脂分解用微生物製剤及び廃液処理方法を提供する。【解決手段】バークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）を含有する油脂分解用微生物製剤。油脂を含む廃液中に前記微生物を添加することにより、前記廃液中の油脂を分解させることを特徴とする廃液処理方法。前記微生物はｐＨ３．５〜９前後の広いｐＨ範囲において、及び／又は３０℃〜４５℃で優れた油脂分解能力を発揮することができる。【選択図】図５
2014023474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０℃且つｐＨ４で油脂分解能を有するバークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）に属する微生物を含有することを特徴とする油脂分解用微生物製剤。
【請求項２】
前記微生物が、バークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）Ｒ１２８株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３９３）であることを特徴とする請求項１に記載の油脂分解用微生物製剤。
【請求項３】
油脂を含む廃液中に、４０℃且つｐＨ４で油脂分解能を有するバークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）に属する微生物を添加することにより、前記廃液中の油脂を分解させることを特徴とする廃液処理方法。
【請求項４】
前記微生物が、バークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）Ｒ１２８株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３９３）であることを特徴とする請求項３に記載の廃液処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油脂分解能力を有する微生物を用いた微生物製剤及び同微生物を用いた廃液処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品加工工場や商業施設の厨房などから排出される排水には多量の油脂が含まれるため、下水道や浄化槽等への配管設備の機能を著しく妨げるおそれがある場合には、該配管設備にグリーストラップ（グリース阻集器）を設置することが義務づけられている。しかし、こうしたグリーストラップでは、油脂の蓄積によるトラップ機能の低下、トラップの閉塞による排水管の閉塞、悪臭発生などの問題が生じることがある。
【０００３】
そこで、前記のような問題を解決するために、油脂分解能力を有する微生物（油脂分解微生物）を利用した生物学的処理法が提案されており、こうした油脂分解微生物を含有した微生物製剤も開発されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ロドトルラ  パシフィカ（Rhodotorula pacifica、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１２１）及び、クリプトコッカス  ローレンティ（Cryptococcus laurentii、ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１２２）を利用した油脂分解用微生物製剤が開示されており、この微生物製剤によれば、低窒素、低リン濃度の環境下でも高い油脂分解効果を得ることができ、且つ３０℃以下の低い温度でも各種油脂を効率よく分解することができると記載されている。
【０００５】
ところが、油脂濃度の高い排水に対して上記のような生物学的処理法を適用すると、油脂分解微生物によって油脂が生分解された際に生成される脂肪酸により、排水が酸性になる。特にその傾向はグリーストラップで強く、グリーストラップ排水はｐＨ３．５〜４．５を示す。従来知られている油脂分解微生物の大部分は、油脂分解能力の至適ｐＨが８前後である。このため、前記のような低ｐＨの環境下では、油脂分解能力を十分に発揮できない。
【０００６】
これに対して、本発明者らは微生物を探索した結果、低ｐＨの環境下でも高い油脂分解効果を有する微生物を見いだし、この微生物を含有する油脂分解用微生物製剤及び該微生物を用いた廃液処理方法に関する特許出願を行った（特許文献２参照）。特許文献２に開示されている油脂分解用微生物製剤及び廃液処理方法は、ラオウルテラ  プランティコーラ（Raoultella planticola）を利用したものであり、ｐＨ３前後の低ｐＨ条件下でも高い油脂分解効果を奏する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2008-142042号公報
【特許文献２】特開2012-105635号公報
【特許文献３】特開2008-220201号公報
【特許文献４】特開平09-085283号公報
【特許文献５】特開2004-242553号公報
【特許文献６】特開2002-125659号公報
【特許文献７】特開2010-214310号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、グリーストラップには厨房などで使用された熱水が流れ込むことが多く、このような場合には水温が４０℃を超える。しかしながら、上記した微生物製剤に用いた微生物は３５℃を超えると油脂分解活性が低下し、４０℃では油脂分解活性が完全に消失してしまう。
【０００９】
本発明は上記のような課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、４０℃且つｐＨ４で優れた油脂分解能力を発揮することのできる微生物を用いた微生物製剤及び廃液処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された本発明に係る油脂分解用微生物製剤は、４０℃且つｐＨ４で油脂分解能を有するバークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）を含有することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明に係る廃液処理方法は、油脂を含む廃液中に、４０℃且つｐＨ４で油脂分解能を有するバークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）を添加することにより、前記廃液中の油脂を分解させることを特徴としている。
上記した油脂分解用微生物製剤或いは廃液処理方法においては、前記微生物として、バークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）Ｒ１２８株（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３９３）を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
上記のバークホルデリア  マルティボランスに属する微生物は、ｐＨ３．５〜ｐＨ９前後の広いｐＨ範囲において、また、３０℃〜４５℃の温度範囲で優れた油脂分解能力を発揮する。そのため、この微生物を含む本発明の油脂分解用微生物製剤を用いることにより、また、この微生物を用いる本発明の廃液処理方法を実施することにより、従来既知の微生物では十分な油脂分解を行うことが困難であったグリーストラップ等の４０℃且つｐＨ４の環境下においても、高効率な油脂分解を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Burkholderia multivorans  Ｒ１２８株及び標準株ＮＢＲＣ−１０２０８６のｐＨ４、４０℃における油脂分解能力の経時変化を示すグラフ。
【図２】各種ｐＨにおけるBurkholderia multivorans  Ｒ１２８株の油脂分解能力を示すグラフ。
【図３】各種ｐＨにおけるBurkholderia multivorans  Ｒ１２８株の油脂分解能力を示すグラフ。
【図４】各種温度におけるBurkholderia multivorans  Ｒ１２８株の油脂分解能力を示すグラフ。
【図５】各種温度におけるBurkholderia multivorans  Ｒ１２８株の油脂分解能力を示すグラフ。
【図６】各種油脂分解条件におけるBurkholderia multivorans  Ｒ１２８株及び標準株ＮＢＲＣ−１０２０８６の油脂分解能力を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
これまでバークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物において油脂分解能を有する例はいくつか報告されている（特許文献３〜７）。例えば特許文献３には、油脂分解能を有する微生物フサリウム・スピーシーズ（Fusarium sp.）とバークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）ＤＷ２−１株を併用する廃水処理方法が開示されている。この廃液処理方法によれば、バークホルデリア・スピーシーズ（Burkholderia sp.）ＤＷ２−１株の併用により、３０℃におけるフサリウム・スピーシーズ（Fusarium sp.）の油脂分解能の向上がみられることが記載されている。
【００１５】
また、特許文献４及び５には、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）を用いた廃液処理方法が開示されている。特許文献４では、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＦＥＲＭＰ−１５０３４株が５０℃の高温で好気的に油脂を分解することが、特許文献５には、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＦＥＲＭＰ−１５０３４株が常温（３０℃）で高い油脂分解能を有することがそれぞれ記載されている。
【００１６】
特許文献６には、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＩＫ菌株が２０℃〜３５℃の温度範囲で優れた油脂分解能を有すること、及び３０℃且つｐＨ７〜ｐＨ８において優れた油脂分解能を有することが記載されている。
【００１７】
特許文献７には、異なる複数種類のバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）に属する微生物を用いることにより、温度又はｐＨが変動しても安定して油脂分解を行うことができる廃液処理方法が開示されている。この廃液処理方法に用いられる微生物としてバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｂ株(S73株)、及びバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＳＢ−Ｈ株（８１５株）が挙げられており、前者は１０℃且つｐＨ７で油脂分解能を有し、後者は３０℃且つｐＨ４〜ｐＨ７で、あるいは、ｐＨ７且つ２０℃〜３０℃で油脂分解能を有すると記載されている。
【００１８】
このように、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物について、低温（１０℃）から高温（５０℃）までの様々な温度で、或いは様々なｐＨで油脂分解能を発揮することが報告されているが、低ｐＨ且つ高温という厳しい条件下で油脂分解能力を発揮する微生物は報告がない。そこで、本発明者らは、バークホルデリア（Burkholderia）属に属する微生物において、低ｐＨ条件下で且つ３５℃以上の高温下でも優れた油脂分解能力を発揮することのできる微生物を探索するため、油脂含有人工下水培地（ｐＨ４）を用いて土壌等の500試料に対して集積培養を行い、スクリーニングを行った。その結果、油脂分解活性が高かった１つの菌株を選抜した。この菌株について、光学顕微鏡による形態観察を行ったところ、以下のような結果が得られた。
【００１９】
【表１】
2014023474.tif 000003
【００２０】
同菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列は、配列表の配列番号１に示した通りである。
【００２１】
以上の試験結果及び塩基配列から、本発明者らは上記の菌株を、バークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）と同定し、同菌株をBurkholderia multivorans Ｒ１２８と命名した。この菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている（受領日：２０１２年７月２４日、受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３９３）。
【００２２】
これまで同属同種の微生物において低ｐＨで、且つ高温下で油脂分解能を示す例は報告されていない。そこで、本発明者らは、前記バークホルデリア  マルティボランスＲ１２８株と、その標準株であるバークホルデリア  マルティボランスＮＢＲＣ−１０２０８６を用いてその油脂分解能力を確認するための試験を行った。試験結果については後述するが、バークホルデリア  マルティボランスＲ１２８株及び同標準株ＮＢＲＣ−１０２０８６はいずれも従来から知られている油脂分解微生物に比べて３５℃以上の高温下で高い油脂分解能力を発揮し、しかも両者はほぼ同等の油脂分解能力を示した。従って、本発明に係る微生物製剤及び廃液処理方法に用いられる油脂分解微生物は、バークホルデリア  マルティボランスＲ１２８株及びその標準株ＮＢＲＣ−１０２０８６に限定されず、バークホルデリア  マルティボランスという菌種を指す。
【００２３】
本発明に係る微生物製剤は、上記のバークホルデリア  マルティボランスを含有するものである。該微生物の製剤化方法としては、例えば、村尾澤夫他１名編「応用微生物学改訂版」（１９９３年、培風館）、上島孝之著「産業用酵素」（１９９５年、丸善）、又は微生物研究法懇談会編、「微生物学実験法」（１９９３年、講談社）などに記載されている方法を用いることができる。以下に具体的な製剤化方法を列挙するが、本発明に係る微生物製剤は下記の方法で製造された物に限定されるものではない。
【００２４】
液状製剤とする場合には、例えば、以下のいずれかの方法で製剤化することができる。
（Ａ）上記微生物を肉汁培地などの一般栄養培地で１２時間〜３６時間程度培養し、必要に応じてこれにｐＨ調整剤などを添加して製剤とする。
（Ｂ）遠心分離等により上記（Ａ）の培養物から菌体を回収し、該菌体を生理食塩水等の媒体に適当な濃度となるように懸濁する。そして、必要に応じてこれにｐＨ調整剤などを加えて製剤とする。
（Ｃ）限外ろ過膜（ＵＦ膜）等により上記（Ａ）の培養物を適当な濃度に濃縮し、必要に応じてこれにｐＨ調整剤等を添加して製剤とする。
（Ｄ）遠心分離等により上記（Ａ）の培養物から菌体を回収し、該菌体を肉汁培地等の培地に懸濁する。そして、必要に応じてこれにｐＨ調整剤などを加えて製剤とする。
【００２５】
粉末製剤とする場合には、例えば、以下のいずれかの方法で製剤化することができる。
（ａ）上記微生物を肉汁培地などの一般栄養培地で１２時間〜３６時間程度培養し、必要に応じてこれにｐＨ調整剤などを加え、凍結乾燥等によって乾燥させて製剤とする。
（ｂ）遠心分離等により上記（ａ）の培養物から菌体を回収し、該菌体を生理食塩水又はスキムミルクとグルタミン酸ナトリウム等から成る溶液等の媒体に適当な濃度となるように懸濁し、必要に応じてこれにｐＨ調整剤などを加え、凍結乾燥等により乾燥させて製剤とする。
（ｃ）遠心分離等により上記（ａ）の培養物から菌体を回収し、該菌体を肉汁培地等の培地に懸濁し、必要に応じてこれにｐＨ調整剤等を加え、凍結乾燥等によって乾燥させて製剤とする。
（ｄ）上記（ａ）から（ｃ）のものに、繊維くず、おがくず、白土、ケイソウ土などの微粉体を加えて製剤とする。
【００２６】
また、上記の方法の他に、担体結合法、架橋法、包括法、複合法等の公知技術により、上記の微生物を種々の固定化用材料によって固定化してもよい。更に、上記微生物を他の公知の錠剤化技術によって錠剤化するようにしてもよい。
【００２７】
本発明に係る廃液処理方法は、油脂分を含む廃液に上記のバークホルデリア  マルティボランスを添加することにより前記廃液中の油脂分を分解させるものである。上述した通り、本発明の微生物は酸性領域においても高い油脂分解能力を維持できるものであるから、本発明に係る廃液処理方法は、例えば、上述のグリーストラップ内の廃液の処理等に好適に適用することができる。なお、本発明に係る微生物製剤及び廃液処理方法で用いられる微生物（以下「本発明に係る油脂分解微生物」と呼ぶ）は、３０℃〜４５℃においてより高い分解率を得ることができるため、比較的高温の温水が流入することの多いグリーストラップに好適に対応することができる。
【００２８】
上記本発明に係る微生物製剤及び廃液処理方法は、動植物由来の油脂、特に動物性の油脂の分解に好適に用いることができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明に係る油脂分解用微生物製剤及び廃液処理方法の効果を確認するために行った試験例について説明する。
【００３０】
（試験例１）
実際にグリーストラップ槽から採取した排水を使用して、本発明に係る油脂分解微生物（実施例）及び別の油脂分解微生物（比較例）の４０℃、ｐＨ４における油脂分解能力を比較した。なお、前記本発明に係る油脂分解微生物としては、上述のバークホルデリア  マルティボランス（Burkholderia multivorans）Ｒ１２８株（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１３９３）、及びその標準株であるＮＢＲＣ−１０２０８６株を使用した（以下、試験例１〜４において同じ）。また、比較例（以下、対照区）の油脂分解微生物としては、市販の油脂分解微生物資材を使用した。
【００３１】
まず、長野県松本市の和食レストランのグリーストラップ槽より採水した排水を７％ＨＣｌでｐＨ４．０に調整し、1000 mLビーカーに1000 mL分注した。この排水に1x108細胞／mLに調整した油脂分解微生物をそれぞれ10 mLずつ植菌し、４０℃で４日間（９６時間）、撹拌機を用いて撹拌し、ｎ−ヘキサン抽出物質濃度（油脂濃度）の経時変化を測定した。なお、ｎ−ヘキサン抽出物質の測定は、昭和４９年環境庁告示第６４号付表４に基づいて行った。
【００３２】
上記の結果を図１に示す。対照区の油脂分解微生物は、別途行った２５℃での４日間処理では本発明の油脂分解微生物とほぼ同等の高い油脂分解能力を示したが、４０℃、ｐＨ４での４日間の試験では、図１に示すように、殆ど油脂を分解しなかった。一方、本発明に係る油脂分解微生物（Burkholderia multivorans）およびその標準株であるＮＢＲＣ−１０２０８６株は極めて強い油脂分解活性を示した。なお、対照区の微生物による油脂分解能力の至適温度は２５℃であるが、４０℃における油脂分解能力は２５℃における油脂分解能力の５０％以下であることから、対照区の微生物の油脂分解能力は４０℃では顕著に抑制されていることが分かる。一方、本発明に係る油脂分解微生物による油脂分解能力の至適温度は３５℃であるが、３０℃〜４５℃ではほぼ同等の油脂分解能を示す。このことから、対照区の油脂分解微生物と比べて本発明に係る油脂分解微生物は、３５℃を超える高温でも油脂分解能力が低下せず、且つ、３０℃〜４５℃という広い温度範囲で油脂分解能力が変化しないことが確認された。
【００３３】
（試験例２）
本発明に係る油脂分解微生物の各種ｐＨにおける油脂分解能力を評価した。
【００３４】
油脂分解能力は、以下の手順によって評価した。
（１）バッフルフラスコに培地100 mL、混合油脂（サラダ油：ラード油：牛脂＝１：１：１（w/w））3000 ppm を加えたものに本発明に係る油脂分解微生物の前培養液を１％接種し、４０℃、120 rpm で２４時間振盪培養を行った。前記培地の組成は以下の表２の通りである。ｐＨ調整は、ｐＨ３〜６は塩酸で、ｐＨ７〜９はＮａＯＨで行った。
【００３５】
【表２】
2014023474.tif 000004
【００３６】
（２）培養終了後にオートクレーブ処理を行わずに、以下の手順でクロロホルム−メタノール抽出を行った。
まず、培養液全量を分液ロートに入れ、クロロホルム−メタノール（３：１（v/v））溶液４０mLで培養フラスコを洗浄し、その洗液で培養液中の油脂分を抽出した。クロロホルム層（下層）のみを分取し、水層（上層）は再度クロロホルム−メタノール溶液４０mLで抽出した。その後、クロロホルム層（下層）と水層（上層）をそれぞれ遠心管に移し，10000 rpm で１０分間遠心分離後、これらを分液ロートに静かに戻し、クロロホルム層（下層）のみ分取した。
（３）その後、無水硫酸マグネシウムで脱水、ろ過した後、ろ液をナス型フラスコに取り、溶媒を減圧除去して残った油脂重量を測定した。
（４）対照区として、前培養液を接種しないものも同様に２４時間振盪培養及び抽出を行い、残存油脂重量を測定した。
（５）対照区と実験区（前培養液を接種したもの）中の残存油脂量から、油脂分解率を下式により算出した。
油脂分解率（％）＝［（対照区の残存油脂重量−実験区の残存油脂重量）／対照区の残存油脂重量］×１００
【００３７】
以上による油脂分解能力の評価試験（ｎ＝３）の結果を図２に示す。グリーストラップの排水は通常ｐＨ３．５〜４．５と極めて低い値を示す。このような排水中で油脂を効率的に分解するためには、こうした酸性環境下で強い油脂分解能力を示す微生物が必要である。本発明に係る油脂分解微生物は、図２に示す通り、ｐＨ３．５〜９で優れた油脂分解活性を示すので、グリーストラップ及びその後段の工程において使用できる極めて適用範囲の広い油脂分解微生物であるといえる。
【００３８】
（試験例３）
本発明に係る油脂分解微生物の各種ｐＨにおける油脂分解能力を試験例２とは別の培地を用いて評価した。本試験例３で用いた培地の組成を以下の表３に示す。培地の組成が異なる以外は、試験例２と同様にして行った。
【表３】
2014023474.tif 000005
【００３９】
上記による油脂分解能の評価試験（ｎ＝３）の結果を図３に示す。試験例２ほどではないものの本試験例３においても、本発明に係る油脂分解微生物の油脂分解能力はｐＨ３．５〜９の間で高い値を示した。
【００４０】
（試験例４）
本発明に係る油脂分解微生物の各種温度における油脂分解能力を評価した。
【００４１】
油脂分解能力の評価は、培地をｐＨ４（ｐＨは塩酸で調整）とし、培養温度を２０℃〜５０℃の間で種々に変えた点以外は、試験例１と同様にして行った。
【００４２】
上記による油脂分解能力の評価試験（ｎ＝３）の結果を図４に示す。本発明に係る油脂分解微生物の油脂分解能力は２０℃〜３５℃で急増し、４０℃〜５０℃で急減したが、３５℃〜４０℃ではほぼ一定であった。特に、３０℃〜４５℃では、3000 ppm のサラダ油：ラード：牛脂＝１：１：１（w/w）から成る混合油脂を１日あたり約４０％〜６０％分解した。このように、本発明に係る油脂分解微生物は広い温度範囲で高い油脂分解能を示す油脂分解微生物であるといえる。
【００４３】
（試験例５）
本発明に係る油脂分解微生物の各種温度における油脂分解能力を評価した。
【００４４】
油脂分解能力の評価は、培地をｐＨ４（ｐＨは塩酸で調整）とし、培養温度を２５℃〜４５℃の間で種々に変えた点以外は、試験例２と同様にして行った。
【００４５】
上記による油脂分解能力の評価結果を図５に示す。本発明に係る油脂分解微生物の油脂分解能力は２５℃〜３５℃で急増し、３５℃〜５０℃で漸減した。そして、３０℃〜４５℃では、3000 ppm のサラダ油：ラード：牛脂＝１：１：１（w/w）から成る混合油脂を１日あたり約４０％〜６０％分解した。このように、本発明に係る油脂分解微生物は広い温度範囲で高い油脂分解能を示す油脂分解微生物であるといえる。
【００４６】
（試験例６）
本発明に係る油脂分解微生物としてバークホルデリア  マルティボランスＲ１２８株及び標準株ＮＢＲＣ−１０２０８６を使用し、同微生物の各種ｐＨ及び各種温度における油脂分解能力を評価した。
油脂分解能力の評価は、培地をｐＨ４とｐＨ８の２種類とした点、及び培地温度を２５℃と４０℃の２種類とした点以外は、試験例１と同様にして行った。
【００４７】
上記による油脂分解能力の評価結果を図６に示す。図６から明らかなように、本発明に係る油脂分解微生物はＲ１２８株と標準株はいずれも、２５℃及び４０℃いずれの温度条件下においても、ｐＨ４とｐＨ８の双方で優れた油脂分解能力を発揮した。
【００４８】
（試験例７）
本発明に係る油脂分解微生物としてバークホルデリア  マルティボランスＲ１２８株を使用し、各種油脂に対する分解能力を評価した。
油脂分解能力の評価は、油脂の種類が異なる以外は、試験例１と同様にして行った。
上記による油脂分解能力の評価結果を下記の表４に示す。
【表４】
2014023474.tif 000006
表４から明らかなように、本発明に係る油脂分解微生物は、オレイン酸や該オレイン酸のような不飽和脂肪酸を多く含む油脂に対して高い分解能力を発揮し、パルミチン酸やステアリン酸のような飽和脂肪酸に対する分解能力は低いことが分かった。
【図１】
2014023474.tif 000007
【図２】
2014023474.tif 000008
【図３】
2014023474.tif 000009
【図４】
2014023474.tif 000010
【図５】
2014023474.tif 000011
【図６】
2014023474.tif 000012
【配列表】
2014023474000001.app