(57)【要約】【課題】不良土壌においても鉄の有効利用を可能とし、かつ、土壌中に鉄の過剰蓄積を起こさない、安全性の高い農園芸用資材、及びその利用に関する技術を提供すること。【解決手段】グルタミン酸、アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸を含み、少なくともいずれかのアミノ酸の使用時の濃度が６ｍＭ以上であり、かつ、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の含有量が、使用時の濃度で１０ｍＭ以下である、植物の鉄利用能改善剤を、石灰質アルカリ土壌等で栽培される植物に施用することにより、植物の鉄利用に関与する遺伝子の発現を増強し、植物の鉄利用能を改善する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸、アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸を含み、少なくともいずれかのアミノ酸の使用時の濃度が６ｍＭ以上であり、かつ、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の含有量が、使用時の濃度で１０ｍＭ以下である、植物の鉄利用能改善剤。
【請求項２】
グルタミン酸、アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸の合計量が、使用時の濃度として２００ｍＭ以下である、請求項１に記載の植物の鉄利用能改善剤。
【請求項３】
アルギニンがアルギニン塩酸塩である、請求項１又は２に記載の植物の鉄利用能改善剤。
【請求項４】
グルタミン酸またはアルギニンが発酵副生物由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物の鉄利用能改善剤。
【請求項５】
植物の鉄利用に関与する遺伝子群の発現量を増強する効果を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物の鉄利用能改善剤。
【請求項６】
葉面散布又は根圏施用により植物に施用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物の鉄利用能改善剤。
【請求項７】
石灰質アルカリ土壌で栽培される植物に施用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物の鉄利用能改善剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物の鉄利用能改善剤を植物に施用することを含む、植物の鉄利用を改善する方法。
【請求項９】
グルタミン酸及びアルギニンを含み、これらの両方のアミノ酸の使用時の濃度がいずれも６ｍＭ以上であり、かつ、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の含有量が、使用時の濃度で１０ｍＭ以下である、植物の生育促進剤。
【請求項１０】
グルタミン酸及びアルギニンの合計量が、使用時の濃度として２００ｍＭ以下である、請求項９に記載の植物の生育促進剤。
【請求項１１】
グルタミン酸またはアルギニンが発酵副生物由来である、請求項９又は１０に記載の植物の生育促進剤。
【請求項１２】
石灰質アルカリ土壌で栽培される植物に施用される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の植物の生育促進剤。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の植物の生育促進剤を植物に施用することを含む、植物の生育を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の生育促進剤、具体的には植物の鉄利用能改善剤、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上の陸地には、67%の不良土壌（石灰質土壌、高塩類集積土壌、強酸性土壌、重金
属集積土壌等）が存在する。今後爆発的に増加すると予想される人口に見合う食糧増産を達成するために、これらの不良土壌でも生育を可能にする技術を創製することは、重要な打開策の一つである。とくに、前記のような不良土壌のうち半分は、アルカリ性化した石灰質土壌と考えられている。
【０００３】
石灰質アルカリ土壌では、植物の生存に必須な元素である鉄が水酸化鉄（III）の結晶
として不溶態化するため、植物が吸収できず鉄欠乏状態に陥る。植物において、鉄はクロロフィル生合成、光合成、呼吸など様々な機能を果たすために不可欠な元素で、鉄が欠乏すると著しい生育不全を招き、作物の収量・品質低下を生じる。そのため、石灰質アルカリ土壌における作物の鉄栄養を改善し、そこでの作物栽培を可能にする技術を提供することは、人口爆発に対応した食糧増産を達成するために重要である。
【０００４】
高等植物の鉄獲得戦略は、ストラテジ−I（Strategy-I）とストラテジ−II（Strategy-II）の２つに区分される。
ストラテジ−Iは、イネ科を除く高等植物の鉄獲得戦略である。土壌中の三価の不溶態
鉄を、根の細胞表面に存在する三価鉄還元酵素により還元し、二価鉄のトランスポーターで吸収する機構である。この機構を有する植物の中には、根圏にプロトンを放出し、根圏のpHを下げることで三価鉄還元酵素の活性を増加させる機構を有しているものや、フェノール系化合物を根圏に放出し、形成されたFe(III)-フェノール系化合物キレートとして根の三価鉄還元酵素に供給する機構を持っているものが存在する。これまでに、アブラナ科植物であるシロイヌナズナの根に特異的に発現する二価鉄のトランスポーター（Iron transporter 1；IRT1）や、シロイヌナズナの三価鉄還元酵素（Ferric reductase oxidase 2；FRO2）などが同定されている（非特許文献１）。
【０００５】
ストラテジーIIは、単子葉植物のうちイネ科植物にのみ見られる鉄獲得戦略である。イネ科植物は、鉄欠乏条件下で、三価鉄キレート活性を有するムギネ酸類（Mugineic acids、以下、「MAs」と記載することがある）を合成して根圏に放出し、Fe(III)-MAs錯体として根から鉄を吸収する(非特許文献２)。MAsの合成酵素として、これまでにニコチアナミ
ン合成酵素（Nicotianamine synthase；NAS、非特許文献３）やニコチアナミン・アミノ
基転移酵素（Nicotianamine aminotransferase；NAAT、非特許文献４）などが同定されている。
【０００６】
近年、前記鉄獲得に関与する遺伝子群（以下、「鉄利用遺伝子群」ともいう）の転写を調節する仕組みが明らかにされてきた。なかでも、シロイヌナズナの二価鉄トランスポーター遺伝子IRT1や、三価鉄還元酵素遺伝子FRO2の発現を直接制御する因子として、basic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子群の一部が機能することが明らかにされた（非特許文献５）。これらの転写因子のうち、FIT(FER-like Deficiency Induced Transcription Factor)/bHLH29は、bHLH38またはbHLH39とヘテロダイマーを形成して、下流のIRT1、FRO2などの鉄利用遺伝子群の発現制御を行う（非特許文献６）。FIT/bHLH29およびbHLH38、bHLH39を同時に過剰発現させた遺伝子組み換えシロイヌナズナでは、IRT1およびFRO2の発現誘導による鉄内在量の増加とともに、鉄欠乏培地での生育が改善される（鉄欠乏耐性が付与
される）ことから、これら一連のbHLH型転写因子の遺伝子発現量またはタンパク質量が、シロイヌナズナの鉄栄養に直接関わっていると考えられている（非特許文献６）。
【０００７】
石灰質アルカリ土壌での作物栽培において近年注目されている技術としては、前記鉄栄養に関わる因子の遺伝子組み換え技術が挙げられる。前記シロイヌナズナでの例に加えて、鉄欠乏土壌に耐性が低い作物として知られているイネに遺伝子組み換えを行った例では、三価鉄キレート活性を有するMAsの合成酵素であるNAATの、オオムギ由来の遺伝子の過
剰発現により、アルカリ性に偏った水田での生育が改善したとの報告がある（非特許文献７）。このように、遺伝子組み換え技術は石灰質アルカリ土壌での作物栽培において効果的な手段であると考えられる一方で、現時点で遺伝子組み換え技術自体が社会的に受け入れられている国が少ないことから、実用性のある技術とは言い難い。
【０００８】
石灰質アルカリ土壌での作物栽培において実用化されている技術としては、三価鉄のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)キレートや、N,N'-エチレン-ビス-(ヒドロキシフェニル)グ
リシン(EDDHA)キレートなど、三価鉄キレート化合物を含有する資材を土壌に施用するこ
とが一般的である。しかし当該方法は、化学的に安定な鉄キレート物質を多量に土壌へ放散することによる、土壌重金属汚染が将来的な問題となる。例えば、植物においてフリー体の鉄が過剰に蓄積すると、細胞での過剰の活性酸素発生により生育に障害が生じるほか、土壌中での鉄の過剰蓄積は必須元素のカリウム、リン、銅、亜鉛などのミネラルの吸収に拮抗阻害的に作用するため、安易な多量の鉄投入は避けなければならない。そのため、多量の鉄施用を避ける目的で、鉄キレート化合物と、ある物質を混合して施用することで、鉄施用効果を増強する試みがなされている。例えば、腐植酸（非特許文献８）、クエン酸（非特許文献９）、アミノ酸（非特許文献１０）が報告されている。とくにアミノ酸は、ミネラル成分と混合して施用することで、ミネラルの吸収を促進する場合があるとの報告がある（非特許文献１１）。
【０００９】
アミノ酸に関しては、培養液中の鉄量を制限して水耕栽培したトマトに対し、植物抽出物由来アミノ酸溶液を葉面散布すると、葉内鉄含量が低下した一方で、水耕液に混合した場合は、葉内鉄含量がわずかに増加したとの報告がある（非特許文献１１）。しかしながら、水耕液の場合であっても、抽出物由来のためアミノ酸単独の効果とはいえず、葉面散布ではむしろ鉄含量が低下しているため、好ましい技術ではない。この報告で用いているアミノ酸溶液には、最も多いアミノ酸としてグルタミン酸が0.0244%程度含まれるようで
ある。また、ウキクサの鉄吸収に対する低濃度アミノ酸（200μM）処理の効果を調べた報告では、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、アラニン、グリシン、セリンのいずれかのアミノ酸処理によって鉄吸収が促進された一方で、システイン、グルタミン、アルギニン塩酸塩、スレオニン、フェニルアラニンのいずれかのアミノ酸処理では鉄吸収が抑制されたとしているが（非特許文献１０）、ウキクサ特有の現象である可能性が考えられるほか、単純に鉄含量を高めているため鉄過剰蓄積が問題になる可能性がある。
【００１０】
また、アミノ酸と鉄を含む配合肥料の施用によりイネ種子の鉄含量を増加させるとの記載がなされた報告があるが（特許文献１）、アミノ酸単独の効果ではなく、データが記載されておらず、メカニズムも不明である。同様に、アミノ酸と鉄を含む配合固肥の施用により作物の品質を向上できるとの記載がなされた報告があるが（特許文献２）、アミノ酸単独の効果ではなく、データが記載されておらず、メカニズムも不明である。
【００１１】
以上のように、関連報告例は存在する一方で、鉄含量の増加がアミノ酸自体の効果であることを証明している例や、顕著に鉄栄養を改善できている例はほとんどない。単純に鉄含量を高めている報告例が目立つ一方で、前記のように過剰な鉄蓄積は植物体にとって好ましくない場合がある。さらにメカニズムが不明で技術の応用が困難である。また、何らかの鉄化合物をアミノ酸と同時に施用する技術では、前記鉄の多量施用による土壌汚染を
完全には回避できず、抜本的な技術とは言えない。
【００１２】
尚、前記アミノ酸、またはアミノ酸を含有する混合物の、植物における鉄栄養への影響を報告している例では、施用時の最終濃度は、最高で5.3mM（グルタミン酸）である（特
許文献１）。
【００１３】
また、従来、アミノ酸又はアミノ酸を含む組成物は肥料として用いられており、例えば、と畜の副産部分ないし副産部分混合物の加水分解物である植物の生長調整剤（特許文献３）、あるいは、ゼラチン廃棄物をリン酸により加水分解して得られるアミノ酸および／又はペプチドからなるアミノ酸肥料が開示されている（特許文献４）。しかしながら、特定のアミノ酸が、単なる栄養成分として以上に、植物の生育に特に有効であることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】中国公開特許101376612A
【特許文献２】中国公開特許102442857A
【特許文献３】特開昭62-84007
【特許文献４】特開2006-290716
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Walker, E.L. and Connolly, E.L., Curr. Opin. Plant Biol. 2008, 11:530-535
【非特許文献２】Kobayashi, T. and Nishizawa, N.K., Annu. Rev. Plant Biol. 2012, 63:131-152
【非特許文献３】Inoue, H., et al., Plant J. 2003, 36:366-381
【非特許文献４】Inoue, H., et al., Plant Mol. Biol. 2008, 66:193-203
【非特許文献５】Wang, H.Y. et al., Planta 2007, 226:897-908
【非特許文献６】Yuan, Y., et al., Cell Res. 2008, 18:385-397
【非特許文献７】Takahashi, M., et al., Nat. Biotech. 2001, 19:466-469
【非特許文献８】Sanchez, A.S., et al., J. Plant Nutr. 2005, 28:1877-1886
【非特許文献９】Rodriguez-Lucena, P., et al., J. Plant Nutr. Soil Sci., 2010, 173:120-126
【非特許文献１０】Tanaka, O., et al., Plant Cell Physiol. 1987, 28(4):697-702
【非特許文献１１】Cerdan, M., et al., Acta Hort. 2009, 830:481-488
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、不良土壌においても鉄の有効利用を可能とし、かつ、土壌中に鉄の過剰蓄積を起こさない、安全性の高い農園芸用資材、及びその利用に関する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、植物の生育促進物質、特に植物の鉄利用能改善物質を探索したところ、アミノ酸であるグルタミン酸およびアルギニンの一定濃度以上の処理により、植物の鉄利用に関わる一連の遺伝子群の発現量が上昇すること、すなわち、一定濃度以上のグルタミン酸およびアルギニンに鉄利用能改善効果があること、および植物の生育促進に寄与することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
【００１８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）グルタミン酸、アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸を含み、少なくともいずれかのアミノ酸の使用時の濃度が６ｍＭ以上であり、かつ、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の含有量が、使用時の濃度で２ｍＭ以下である、植物の鉄利用能改善剤。
（２）グルタミン酸、アルギニン又はこれらの両方のアミノ酸の合計量が、使用時の濃度として２００ｍＭ以下である、前記植物の鉄利用能改善剤。
（３）アルギニンがアルギニン塩酸塩である、前記植物の鉄利用改善剤。
（４）グルタミン酸またはアルギニンが発酵副生物由来である、前記植物の鉄利用能改善剤。
（５）植物の鉄利用に関与する遺伝子群の発現量を増強する効果を有する、前記植物の鉄利用能改善剤。
（６） 葉面散布又は根圏施用により植物に施用される、前記植物の鉄利用能改善剤。
（７）石灰質アルカリ土壌で栽培される植物に施用される、前記植物の鉄利用能改善剤。（８）前記植物の鉄利用能改善剤を植物に施用することを含む、植物の鉄利用を改善する方法。
（９）グルタミン酸及びアルギニンを含み、これらの両方のアミノ酸の使用時の濃度がいずれも６ｍＭ以上であり、かつ、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の含有量が、使用時の濃度で２ｍＭ以下である、植物の生育促進剤。
（１０）グルタミン酸及びアルギニンの合計量が、使用時の濃度として２００ｍＭ以下である、前記植物の生育促進剤。
（１１）グルタミン酸またはアルギニンが発酵副生物由来である、前記植物の生育促進剤。
（１２）石灰質アルカリ土壌で栽培される植物に施用される、前記植物の生育促進剤。
（１３）前記植物の生育促進剤を植物に施用することを含む、植物の生育を促進する方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、植物の鉄利用能を効果的に改善させることができる。その結果、不良土壌における植物の鉄欠乏状態を改善し、植物の生育を促進させることができる。本発明の鉄利用能改善剤を植物に施用すると、鉄利用マスター因子であるbHLH型転写因子群、二価鉄トランスポーター遺伝子、三価鉄還元酵素遺伝子などの発現が誘導され、植物の鉄利用能が改善され、その結果、植物の生育を促進することができると考えられる。これにより、農園芸用作物の栽培土壌アルカリ化による減収や品質低下を直接的に防ぐことができ、もって植物の生育を促進させることができるため、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】各種アミノ酸の葉面散布によるシロイヌナズナ地上部における鉄利用関連遺伝子発現誘導効果を示す図。「Control」は対照区を示す（以下、同じ）。
【図２】グルタミン酸の根圏施用によるシロイヌナズナ地下部における鉄利用関連遺伝子発現誘導効果を示す図。
【図３】グルタミン酸及びアルギニンの混合液の葉面散布によるシロイヌナズナ地上部における鉄利用関連遺伝子発現誘導効果を示す図。
【図４】グルタミン酸発酵副生物の葉面散布によるシロイヌナズナ地上部における鉄利用関連遺伝子発現誘導効果を示す図。
【図５】グルタミン酸の根圏施用によるイネ地下部における鉄利用関連遺伝子発現誘導効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
＜１＞植物の鉄利用能改善剤とその利用
本発明の鉄利用能改善剤は、グルタミン酸、アルギニン、又はこれらの両方のアミノ酸を含む。鉄利用能改善剤は、グルタミン酸及びアルギニンの両方を含むことが好ましい。
【００２３】
グルタミン酸及びアルギニンは、それぞれL-体、D-体のいずれであってもよく、L-体及びD-体を任意の割合で含む混合物であってもよいが、L-体が好ましい。
【００２４】
グルタミン酸は、フリー体でもよく、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩であってもよく、それらの混合物であってもよいが、ナトリウム塩が発酵製造過程の観点から好ましい。
【００２５】
また、アルギニンは、フリー体でもよく、塩酸塩、酢酸塩等の塩であってもよく、それらの混合物であってもよいが、特に塩酸塩が溶解度および鉄利用遺伝子発現誘導効果の観点から好ましい。
【００２６】
本発明の鉄利用能改善剤の形態は、使用時に溶液として調製することができるものであれば特に制限されず、液剤、粉剤、粒剤、乳剤、水和剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤等の何れの剤型でもよく、施用の為の薬剤の形態、その使用形態、施用方法は特に限定されるものではない。
【００２７】
鉄利用能改善剤に含まれるグルタミン酸及びアルギニンの少なくとも一方は、使用時の濃度が6mM以上である。
鉄利用能改善剤がグルタミン酸又はアルギニンの一方を含む場合は、使用時の濃度として、6mM以上、好ましくは8mM以上、より好ましくは10mM以上である。
また、鉄利用能改善剤がグルタミン酸及びアルギニンの両方を含む場合は、グルタミン酸及びアルギニンのうち一方の使用時の濃度が6mM以上、好ましくは8mM以上、より好ましくは10mM以上である限り、他方のアミノ酸の濃度はそれよりも低くてもよいが、好ましい形態では、グルタミン酸及びアルギニンの合計量は、使用時の濃度として、12mM以上、好ましくは16mM以上、より好ましくは20mM以上である。
グルタミン酸及びアルギニンの両方を含む場合、グルタミン酸のアルギニンに対する量比（モル比）（グルタミン酸：アルギニン）は、特に制限されないが、好ましくは10:1〜1:2、より好ましくは5:1〜1:1である。
【００２８】
また、グルタミン酸及び／又はアルギニンの濃度（使用時）の上限は、グルタミン酸又はアルギニンを単独で含む場合は、好ましくは200mM以下、より好ましくは100mM以下、さらに好ましくは50mM以下であり、グルタミン酸及びアルギニンの両方を含む場合は、合計量で、好ましくは200mM以下、より好ましくは100mM以下、さらに好ましくは50mM以下である。アミノ酸の濃度が高すぎると、植物に対して薬害が引き起こされる場合がある。
【００２９】
「使用時の濃度として」とは、鉄利用能改善剤が固形状又は粉体状の場合は、水、アルコール等の溶媒に溶解又は分散して、植物体又は土壌に施用する際のグルタミン酸及び／又はアルギニンの濃度を意味する。また、鉄利用能改善剤が液状であって、水等の溶媒で希釈して植物体又は土壌に施用する場合、希釈後の濃度を意味する。
【００３０】
本発明の鉄利用能改善剤は、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸を含んでいてもよいが、それらの濃度が高いと、グルタミン酸やアルギニンが析出することがあるため、他のアミノ酸の濃度は低い方が好ましく、他のアミノ酸を含まないことがより好ましい。具体的には、グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の濃度は、使用時の濃度（アミノ酸が複数種の場合は合計）として、好ましくは10mM以下、より好ましくは5mM以下、
さらに好ましくは2mM以下である。
グルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸としては、リジン、ヒスチジン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、グリシン、スレオニン、セリン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、シスチン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン酸、及びアスパラギン等が挙げられる。
【００３１】
本発明の鉄利用能改善剤が液状であって、使用時に希釈を要しない場合は、グルタミン酸及び／又はアルギニンの含有量は、上記の使用時の濃度と同じである。
【００３２】
本発明の鉄利用能改善剤は、グルタミン酸及び／又はアルギニンを所定量含み、他のアミノ酸の含有量が所定量以下であって、かつ、本発明の効果を損なわない限り、さらに任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、溶媒、担体、pH調整剤、植物体への展着力を高めるための展着剤、植物への浸透性を高めるための界面活性剤等の成分、肥効を高めるためのミネラル等の肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、例えば、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
【００３３】
担体成分としては、例えば、本発明の植物生長促進剤が底床添加剤又は固形剤である場合には、バーミキュライト、タルク、珪藻土、カオリン、炭酸カルシウム、クレー、水酸化カルシウム、白土、シリカゲル等の無機質や小麦粉、澱粉等の固体担体を、また液剤である場合には、水、キシレン等の芳香族炭化水素類、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の液体担体を用いることができる。
【００３４】
鉄利用能改善剤の製造に用いるグルタミン酸及びアルギニンは、精製品、例えば一般に試薬として販売されているものであってもよく、これらのアミノ酸を含む発酵副生物等であってもよい。発酵副生物としては、グルタミン酸又はアルギニンの製造のための発酵で得られた発酵液、発酵液からこれらのアミノ酸を晶析により回収した後の母液、粗製品、精製工程で生じる副生物が挙げられる。
【００３５】
特に、本発明で用いるグルタミン酸及び／又はアルギニンは、産業上の観点等から、発酵副生物であることが好ましい。
【００３６】
発酵副生物は、培地から目的物質を分離した発酵液（「発酵副生液」ともいう）、その濃縮液もしくは乾固物、又はそれらの分画物等のいずれであってもよい。また、発酵副生液は、培地から目的物質を採取するために酸等が添加されてもよく、除菌等のために加熱処理されてもよい。
具体的には、グルタミン酸及び／又はアルギニン発酵副生液の調製法は、以下の方法が例示される。すなわち、コリネバクテリウム属、パントエア属またはエシェリヒア属等に属する微生物を使用し、スクロース、デンプン、サトウキビ、コーン、甜菜、キャッサバ、ユーグレナ等の藻類等の糖源、または菜種油、パーム油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油、コメ油、ヘンプ・オイル、魚油、豚脂、牛脂、ラフィド藻、ボトリオコッカス等の藻類等由来の油源を主原料とした炭素源、窒素源の他に、無機イオンその他の栄養素を適宜含有される培地を用いて発酵を行うことができる。次に、当該発酵液を硫酸又は塩酸等を用いてpHを低下させてグルタミン酸またはアルギニン結晶を析出させ、得られた結晶を分離後、母液を更に濃縮加熱処理を行って調製されたものを発酵副生液として使用することができる。このような発酵副生液の原液は、通常グルタミン酸またはアルギニンを約1
〜10重量％含有している。また、糖類、発酵菌体、有機態窒素、無機態窒素、ビタミン等の植物生長に必要な栄養分も多量に含まれている（固形分含量は30〜50重量％）。
【００３７】
アミノ酸発酵副生物は固形物でも液状物でも良いが、発酵副生液の状態で使用することが操作上また利用上好ましい。
【００３８】
後述の実施例で使用したGFCP（Glutamate fermentation co-product）は、上記のよう
にして得られたグルタミン酸発酵副生液である。
【００３９】
鉄利用能改善剤は、固体状又は粉体状の場合は、使用に際して水、アルコール等の溶媒に溶解又は分散させてもよい。また、液状の場合は、これらの溶媒で希釈してもよい。
【００４０】
本発明の鉄利用能改善剤のグルタミン酸及び／又はアルギニン量は前述の通りであり、前記記載の濃度は、鉄利用能改善剤が固形又は粉体状の場合は、使用時に溶液にしたときの濃度である。また、鉄利用能改善剤が液状であって、希釈して用いる場合は、前記記載の濃度は使用時に希釈した後の濃度である。
【００４１】
本発明の鉄利用能改善剤は、植物の生長点のみならず、茎や葉をはじめとする植物体の一部又は全体に液剤や乳剤として散布、滴下あるいは塗布等することができる葉面散布剤として使用できる。また、土壌への表面散布、潅注、土壌への混合、又は根を浸漬処理することができる根圏施用剤としても使用できる。
【００４２】
本発明の鉄利用能改善剤の対象となる植物は、特に制限されず、双子葉植物であってもよく単子葉植物であってもよい。また、樹木であってもよく、草本であってもよい。また、野生植物であってもよく、農業、園芸、又は林業用植物であってもよい。農業、園芸、又は林業用植物には、例えば作物（果菜類を含む）、穀物、観賞用植物、花卉、果樹などが含まれる。後述の実施例では、双子葉植物としてアブラナ科のシロイヌナズナ、単子葉植物としてイネ科のイネをそれぞれ選択したが、いずれの植物もアミノ酸処理による鉄利用遺伝子発現誘導を示した。したがって、本発明の植物の生長促進剤は、アブラナ科やイネ科に限られず、いかなる植物にも有効に使用できる。
【００４３】
本発明の鉄利用能改善剤は、植物の鉄利用能を改善する効果を有する。本発明の植物生長促進剤により付与される鉄利用能改善効果の種類は、特に制限されず、例えば、石灰質アルカリ土壌での作物栽培における様々な鉄欠乏症状を軽減できる。鉄欠乏症状とは、植物の生存に必須な元素である鉄の含量が不足する、あるいは酸化や何らかの物質との化合物形成により鉄が利用困難な形態で存在することにより、植物が生命活動に利用できないことで生じる、種々の生育障害のことを言う。症状としては、葉緑体の合成が妨げられ葉が黄白化するクロロシスや、クロロシスによる栄養不足が原因で生じる作物減収・品質低下が一般的である。植物の鉄利用能改善とは、典型的には鉄利用能の増強を意味する。
【００４４】
鉄利用能改善効果としては、例えば、bHLH型転写因子や二価鉄トランスポーター等の鉄利用に関与する遺伝子の発現を増強する効果が挙げられる。「遺伝子の発現を増強する」とは、例えば、本発明の鉄利用能改善剤を施用しない場合と比較して、遺伝子の発現量が増大することをいう。遺伝子の発現量は、例えば、本発明の鉄利用能改善剤を施用しない場合と比較して、遺伝子の転写量又は遺伝子産物の生成量が1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上に増大すればよい。また、「遺伝子の発現を増強する」と
は、本発明の鉄利用能改善剤の施用なしには発現が認められない場合に、本発明の植物の生長促進剤の施用により発現が認められるようになる場合を含む。
【００４５】
本発明の鉄利用能改善剤により発現誘導されると遺伝子群としては、例えば、実施例に示すbHLH型転写因子遺伝子（bHLH38、bHLH100）や二価鉄トランスポーター遺伝子（IRT1
）、あるいは三価鉄還元酵素遺伝子（FRO2、FRO3）、イネ科のムギネ酸合成酵素遺伝子（OsNAS2、OsNAAT1）等のような、鉄吸収に関わる遺伝子、及び、植物体内の鉄分配（鉄恒
常性）に関わる遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されず、植物における鉄獲得戦略であるストラテジーIおよびストラテジーII、その他いかなる鉄獲得戦略においても、そ
れらに関わる全ての遺伝子群又はそれらのうちのいくつかが発現誘導されることが期待できる。
【００４６】
また、本発明の鉄利用能改善剤により付与される鉄利用能改善効果の種類は、鉄欠乏症状の軽減にとどまらず、例えば、鉄過剰症状の軽減や、健全な植物の生育促進であってもよい。鉄過剰症状とは、土壌の急激な酸性化により、不溶態の三価鉄が可溶態の二価鉄に還元されることにより、植物が過剰に二価鉄を吸収してしまい、細胞での過剰な活性酸素発生を誘導することにより生じる生育障害のほか、土壌での鉄の過剰蓄積により必須元素のカリウム、リン、銅、亜鉛、マンガンなどのミネラルの吸収が拮抗阻害されることにより生じるミネラル欠乏症状を含む。本発明の鉄利用能改善剤により鉄利用能を改善することで、植物体内に蓄積した鉄を植物が利用可能な形態へ変化させることができ、活性酸素発生を抑制し、生育障害を軽減できるほか、鉄以外のミネラルバランスを調節し植物にとって好ましい栄養状態に改善することができる。また、健全な植物の鉄利用能をさらに増強することにより、作物増収、品質向上を図ることもできる。
【００４７】
上記のとおり、本発明の鉄利用能改善剤を植物に施用することにより、植物の鉄利用能を効果的に改善することができる。すなわち、本発明の他の形態は、上記鉄利用能改善剤を植物に施用することを含む、植物の鉄利用能を改善する方法である。
【００４８】
本発明の鉄利用能改善剤の施用の方法は特に制限されず、その剤形、施用対象の植物、畑や水田等の状態、および農業従事者の事情等に応じて適宜設定することができる。本発明の鉄利用能改善剤は、いかなる性質の土壌で栽培されている作物に施用してもよいが、好ましくは石灰質アルカリ土壌で栽培されている作物である。また、鉄利用能改善剤は、通常の（健全に生育できる）土壌で栽培されている作物、又は鉄過剰な酸性土壌で栽培されている作物に施用してもよい。
【００４９】
本発明の鉄利用能改善剤は、植物体の一部に施用してもよく、植物体の全体に施用してもよい。例えば、植物の生長点のみならず、茎や葉をはじめとする植物体の一部又は全体に液剤や乳剤として散布、滴下あるいは塗布等することができる。また、本発明の鉄利用能改善剤は、根圏に施用してもよい。根圏への施用としては、例えば土壌への表面散布、潅注、土壌への混合、又は根への浸漬処理が挙げられる。これらの中では、葉面散布か根圏施用が好ましい。
【００５０】
本発明の鉄利用能改善剤を植物に施用する時期や頻度は、施用目的や植物体の生育ステージ等に応じて適宜設定することができる。例えば、アルカリ性に偏っている水田に移植する前のイネに対してはイネの苗床に施用することで幼苗の鉄利用能を強化できる。また、アブラナ科植物など葉物野菜に対しては、石灰質アルカリ土壌において長期間栽培され鉄欠乏症状に陥る前にあらかじめ施用することで、クロロシスや本葉の萎れなどの品質低下の軽減が期待できる。
【００５１】
本発明の鉄利用能改善剤の施用量は、有効成分の濃度、施用時期、施用回数、植物の種類、栽培密度、生育段階、施用方法等に応じて適宜設定することができる。葉面散布では、例えば、有効成分を前記含有量で含有する鉄利用能改善剤を、通常100〜5000L／ヘクタール、好ましくは500〜1000L／ヘクタールで施用すればよい。また、鉄利用能改善剤を根圏に施用する場合も、葉面散布の場合と同様に施用量を設定すればよい。施用回数は、特に制限されないが、例えば1週おきに1回、計3回程度である。
【００５２】
＜２＞本発明の植物の生育促進剤とその利用
上述したとおり、本発明の鉄利用能改善剤は、植物の生育を促進する効果をも有する。従って、本発明の他の形態は、グルタミン酸、アルギニン、又はこれらの両方を所定量含む、植物の生育促進剤である。本発明の植物の生育促進剤は、グルタミン酸及びアルギニンの両方を含むことが好ましい。
【００５３】
グルタミン酸及び／又はアルギニンの含有量、剤型、任意成分等は、前記鉄利用能改善剤と全く同様である。
植物生育促進剤の好ましい形態では、グルタミン酸及びアルギニンの両方を含み、これらの両方のアミノ酸の使用時の濃度はいずれも6mM以上である。すなわち、植物生育促進
剤の好ましい形態は、使用時の濃度として、6mM以上のグルタミン酸、及び6mM以上のアルギニンを含む。グルタミン酸含量は、より好ましくは8mM以上、更に好ましくは10mM以上
であり、アルギニン含量は、より好ましくは8mM以上、更に好ましくは10mM以上である。
グルタミン酸及びアルギニンの合計量は、使用時の濃度として12mM以上、好ましくは16mM以上、より好ましくは20mM以上である。
【００５４】
グルタミン酸のアルギニンに対する量比（モル比）（グルタミン酸：アルギニン）は、特に制限されないが、好ましくは10:1〜1:2、より好ましくは5:1〜1:1である。
【００５５】
また、グルタミン酸及びアルギニンの濃度（使用時）の上限は、各々好ましくは200mM
以下、より好ましくは100mM以下、さらに好ましくは50mM以下であり、グルタミン酸及び
アルギニンの合計の濃度（使用時）の上限は、好ましくは200mM以下、より好ましくは100mM以下、さらに好ましくは50mM以下である。
【００５６】
本発明の植物生育促進剤に含まれるグルタミン酸及びアルギニン以外のアミノ酸の含有量は、使用時の濃度（アミノ酸が複数種の場合は合計）として、好ましくは10mM以下、より好ましくは5mM以下、さらに好ましくは2mM以下である。
【００５７】
本発明の植物の生長促進剤を植物に施用することにより、植物の生長を促進させることができる。すなわち、本発明の他の形態は、上記植物の生長促進剤を植物に施用することを含む、植物の生長を促進する方法である。
植物の生育促進剤を施用する対象の植物、施用方法等は、前記鉄利用能改善剤と全く同様である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
下記実施例において、グルタミン酸及びアルギニンはいずれもＬ−体である。
【００５９】
〔実施例１〕鉄利用関連遺伝子発現に対する各種アミノ酸処理の影響
（１）植物体の栽培方法
植物材料として、前記ストラテジーIを鉄獲得戦略とする、アブラナ科シロイヌナズナ
（Arabidopsis thaliana）の野生型株Columbia(Col-0)を用いた。栽培には、Murashige and Skoog（MS）培地組成を元にシロイヌナズナ栽培に適した組成に改良したOptimized（Opt）MS無機塩類（下記）に、1% sucrose、0.5% gellangum（和光純薬株式会社）を加えて固めた無菌寒天培地を用いた。10cm径の深底シャーレ（サンセイ医療器材株式会社）を用い、日周は16時間明期で、光強度は約130μmol m-2 s-1、23℃で栽培した。実験には12日間無菌栽培した植物を用いた。
【００６０】
＜OptMS無機塩類の組成＞
2.5mM      NH4NO3
2.5mM      KH2PO4/K2HPO4 (pH5.7)
2mM        KCl
2mM        KNO3
3mM        Ca(NO3)2
2mM        MgSO4
0.1mM      Fe(III)-EDTA
0.1mM      MnCl2
0.1mM      H3BO3
30μM       ZnSO4
0.5μM      CuSO4
1μM        NaMoO4
0.1μM      CoCl2
10μM       NaCl
【００６１】
（２）アミノ酸散布
９種類のアミノ酸の個別散布には、それぞれ10mM水溶液を調製し、展着剤としてアプローチBI（花王（株））を1/1000濃度で添加し、分注ビン（サンプラテック）を用いて寒天上の植物体地上部へ溶液を約1mL/100cm2で噴霧処理することで行った。対照区（図１中にはControlと表す）には水にアプローチBIを添加したものを散布した。その後23℃で24時
間栽培した。
【００６２】
（３）RNA抽出と定量的RT-PCR
鉄利用関連遺伝子の転写量を定量するため、葉面散布後24時間栽培したシロイヌナズナの地上部を回収後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。凍結状態のまま植物破
砕機MM300 MIXER MILL GRINDER（Retsch）により破砕した。EZ1 RNA Tissue Mini Kit（QIAGEN）および自動抽出装置Magtration System 12GC（QIAGEN）を用いてRNA抽出を行った後、リアルタイムPCR装置（7500 Real Time PCR System；Life technologies）を用い、
定量的RT-PCRによりbHLH38遺伝子（At3g56970）、bHLH100遺伝子（At2g41240）の発現量
の比較を行った。遺伝子名の後に付されたカッコ内の記号は、AGI（Arabidopsis Genome Initiative）コードである。両遺伝子はシロイヌナズナの鉄利用に寄与することが既に報告されており、植物体全体で発現している（Wang, HY. et al., Planta., 2007, 226:897-908）。両遺伝子の翻訳産物は、他のbHLH型転写因子とヘテロダイマーを形成して、下流のIRT1、FRO2などの鉄還元吸収遺伝子群の発現制御を行っている。
遺伝子の発現量は、内部標準として用いたハウスキーピング遺伝子ACTIN2（At3g18780
）の発現量に対する相対値として算出した。本実施例、及び以下の実施例で、各遺伝子の増幅に用いたプライマー配列は、表１に示すとおりである。表１中、AGI codeはArabidopsis Genome Initiative コードを、RAP IDはThe Rice Annotation Project DatabaseのIDを示す。
【００６３】
【表１】
2014073993.tif 000003
【００６４】
（４）結果
アミノ酸を散布した後の植物体から抽出したRNAを用いて鉄利用関連遺伝子の発現量を
定量した結果を、図１に示す。図１には、それぞれ３サンプルの実験の平均値とSDを示した。グルタミン酸ナトリウム（図中では「GluNa」と表す。以下、「グルタミン酸」と記
載する）およびアルギニン処理区において、bHLH38およびbHLH100遺伝子発現が、対照区
に比べ顕著に増加していた。とくにグルタミン酸のこれらの遺伝子に対する発現誘導効果が大きかった。両遺伝子の翻訳産物は転写因子として機能し、下流の鉄還元吸収遺伝子群の発現を制御するマスター因子と考えられている（Walker, E. and Connolly, E., Curr.
Opin. Plant Biol., 2008, 11:530-535）。このことから、前記ストラテジーIを鉄獲得
戦略とする植物のモデルであるアブラナ科シロイヌナズナにおいて、グルタミン酸およびアルギニンは、鉄利用のマスター制御因子の発現を誘導し、鉄利用関連遺伝子群の発現量を上昇させる効果があることが示された。
【００６５】
〔実施例２〕グルタミン酸処理による鉄利用関連遺伝子発現誘導効果
鉄利用の転写因子遺伝子発現に対して、グルタミン酸およびアルギニンを葉面散布すると発現が誘導されることが明らかとなったことから、次にそれらの下流で機能する鉄利用関連遺伝子の発現に対して、アルギニンよりも誘導効果が大きいと予想されたグルタミン酸に注目して、その効果を調べた。
【００６６】
植物体の栽培方法
（１）植物材料として前記Col-0を用いた。栽培は前記手法に準じた。実験には12日間無
菌栽培した植物を用いた。
【００６７】
（２）アミノ酸根圏施用
bHLH型転写因子の下流で機能する鉄利用遺伝子のうち代表的なものとして、二価鉄トランスポーター遺伝子や三価鉄還元酵素遺伝子が挙げられる。とくに二価鉄トランスポーターは植物体地下部での発現が強いことが知られているため、グルタミン酸を根圏施用し、地下部での遺伝子発現を調べることとした。グルタミン酸根圏施用には、10mMに調製した水溶液を深型シャーレに30mL注ぎ、寒天栽培された植物体を根が傷つかないよう引き抜いて、水溶液が入ったシャーレ上に地下部が浸漬されるように浮かべた。対照区（図２中にはControlと表す）には水を使用した。その後23℃で24時間培養した。
【００６８】
（３）RNA抽出と定量的RT-PCR
鉄利用関連遺伝子の転写量を定量するため、24時間根圏施用したシロイヌナズナの地下部を回収後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。前記手法を用いてRNAを調製し、定量的RT-PCRによりIRT1遺伝子（At4g19690）、FRO2遺伝子（At1g01580）の発現量の比較を行った。これらの遺伝子はシロイヌナズナの鉄利用に寄与することが既に報告されており、植物体地下部で強く発現している（Walker, E. and Connolly, E., Curr. Opin. Plant Biol., 2008, 11:530-535）。遺伝子の発現量は、内部標準として用いたハウスキーピング遺伝子ACTIN2（At3g18780）の発現量に対する相対値として算出した。各遺伝子の
増幅に用いたプライマー配列は、表１に示すとおりである。
【００６９】
（４）結果
グルタミン酸を根圏施用した後の植物体地下部から抽出したRNAを用いて鉄利用関連遺
伝子の発現量を定量した結果を、図２に示す。図２には、それぞれ３サンプルの実験の平均値とSDを示した。グルタミン酸処理区において、IRT1およびFRO2遺伝子発現が、対照区に比べ顕著に増加していた。このことから、グルタミン酸は地下部鉄利用関連遺伝子の発現量を上昇させる効果があることが示された。
【００７０】
〔実施例３〕グルタミン酸、アルギニン、アルギニン塩酸塩、又はこれらの混合物の処理による鉄利用関連遺伝子発現誘導効果
（１）植物体の栽培方法
植物材料として前記Col-0を用いた。栽培は前記手法に準じた。実験には12日間無菌栽
培した植物を用いた。
【００７１】
（２）アミノ酸散布
グルタミン酸、アルギニン、アルギニン塩酸塩の単独アミノ酸散布にはそれぞれ10mM水溶液を、グルタミン酸とアルギニン塩酸塩の混合溶液散布には、それぞれ5mMの溶液を同
量混合したものを、各々用いて、前記手法に従い散布処理を行った。対照区（図３中にはControlと表す）には水にアプローチBIを添加したものを散布した。その後23℃で24時間
栽培した。
【００７２】
（３）RNA抽出と定量的RT-PCR
鉄利用関連遺伝子の転写量を定量するため、葉面散布後24時間栽培したシロイヌナズナの地上部を回収後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。前記手法を用いてRNAを調製し、定量的RT-PCRによりbHLH100遺伝子（At2g41240）、FRO3遺伝子（At1g23020）の
発現量の比較を行った。これらの遺伝子はシロイヌナズナの鉄利用に寄与することが既に報告されている（Walker, E. and Connolly, E., Curr. Opin. Plant Biol., 2008, 11:530-535）。遺伝子の発現量は、内部標準として用いたハウスキーピング遺伝子ACTIN2（At3g18780）の発現量に対する相対値として算出した。各遺伝子の増幅に用いたプライマー
配列は、表１に示すとおりである。
【００７３】
（４）結果
アミノ酸を散布した後の植物体から抽出したRNAを用いて鉄利用関連遺伝子の発現量を
定量した結果を図３に示す。図３には、それぞれ３サンプルの実験の平均値とSDを示した。アミノ酸で処理した全ての区において、bHLH100およびFRO3遺伝子発現が、対照区に比
べ顕著に増加していた。単独アミノ酸処理の中では、グルタミン酸およびアルギニン塩酸塩の遺伝子発現誘導効果がより顕著であった。また、グルタミン酸またはアルギニン塩酸塩を単独で処理した場合よりも、これらの両方で処理した場合に、遺伝子発現誘導効果が高まることが明らかになった。
【００７４】
〔実施例４〕グルタミン酸発酵副生物処理による鉄利用関連遺伝子発現誘導効果
（１）植物体の栽培方法
植物材料として前記Col-0を用いた。栽培は前記手法に準じた。実験には12日間無菌栽
培した植物を用いた。
【００７５】
（２）グルタミン酸、アルギニン塩酸塩およびグルタミン酸発酵副生物散布
グルタミン酸およびアルギニン塩酸塩散布にはそれぞれ10mM水溶液を用いた。グルタミン酸発酵副生物（図中ではGFCPと表す。Glutamate fermentation co-productの頭文字を
とったものである）散布には、原液を0.5%になるように希釈したものを用いた。これらの溶液を用いて、前記手法に従い散布処理を行った。対照区（図４中にはControlと表す）
には水にアプローチBIを添加したものを散布した。その後23℃で24時間栽培した。
【００７６】
（３）RNA抽出と定量的RT-PCR
鉄利用関連遺伝子の転写量を定量するため、葉面散布後24時間栽培したシロイヌナズナの地上部を回収後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。前記手法を用いてRNAを調製し、定量的RT-PCRによりbHLH100遺伝子（At2g41240）、FRO3遺伝子（At1g23020）の
発現量の比較を行った。遺伝子の発現量は、内部標準として用いたハウスキーピング遺伝子ACTIN2（At3g18780）の発現量に対する相対値として算出した。各遺伝子の増幅に用い
たプライマー配列は、表1に示すとおりである。
【００７７】
（４）結果
アミノ酸を散布した後の植物体から抽出したRNAを用いて鉄利用関連遺伝子の発現量を
定量した結果を図４に示す。図４には、それぞれ３サンプルの実験の平均値とSDを示した。グルタミン酸発酵副生物（GFCP）処理によって、bHLH100およびFRO3遺伝子発現が、対
照区に比べ顕著に増加していた。このことから、鉄利用関連遺伝子の発現誘導効果は、アミノ酸精製品のみならず、その発酵副生物にも存在することが明らかになった。
【００７８】
〔実施例５〕イネの鉄利用関連遺伝子発現に対するグルタミン酸根圏施用効果
（１）植物体の栽培方法
植物材料としてイネ（Oryza Sativa）の栽培品種「日本晴」を用いた。園芸用培養土（クミアイニッピ1号; 日本肥糧株式会社）に播種後、第３葉期まで栽培した植物を用いた
。日周は16時間明期で、光強度は約150μmol m-2 s-1、27℃で栽培した。
【００７９】
（２）グルタミン酸根圏施用
10mMに調製したグルタミン酸水溶液にイネ栽培ポットを浸漬し、ポット底面からグルタミン酸水溶液を吸収させることで、根圏施用した。対照区（図５中にはControlと表す）
には水を用いた。その後27℃で48時間栽培した。
【００８０】
（３）RNA抽出と定量的RT-PCR
鉄利用関連遺伝子の転写量を定量するため、24時間根圏施用したイネの地下部を、培養土をよく洗い流した上で回収後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。前記手法
を用いてRNAを調製し、定量的RT-PCRによりOsNAS2遺伝子（Os3g0307200）、OsNAAT1遺伝
子（Os2g0306401）の発現量の比較を行った。これらの遺伝子は、イネの鉄獲得戦略であ
る前記ストラテジーIIに関わることが報告されている（Inoue, H. et al., Plant J., 2003, 36:366-381、Inoue, H. et al., Plant Mol. Biol., 2008, 66:193-203）。イネ科植物は鉄欠乏条件下で、三価鉄キレート活性を有するムギネ酸類(MAs）を合成して根圏に放出し、Fe(III)-MAs錯体として根から鉄を吸収する(Kobayashi, T. and Nishizawa, N.K.,
Annu. Rev. Plant Biol. 2012, 63:131-152)。OsNAS2およびOsNAAT1は、MAsの合成酵素
遺伝子である。遺伝子の発現量は、内部標準として用いたハウスキーピング遺伝子Ubiquitin5（Os6g0650100、図５中ではUBQと表す）の発現量に対する相対値として算出した。各
遺伝子の増幅に用いたプライマー配列は、表１に示すとおりである。
【００８１】
（４）結果
根圏施用後の植物体地下部から抽出したRNAを用いて鉄利用関連遺伝子の発現量を定量
した結果を図５に示す。図５には、それぞれ３サンプルの実験の平均値とSDを示した。グルタミン酸根圏施用によって、OsNAS2およびOsNAAT1遺伝子発現が、対照区に比べ顕著に
増加していた。このことから、前記ストラテジーIIを鉄獲得戦略とする植物のモデルであるイネにおいても、グルタミン酸処理によって鉄利用関連遺伝子発現が誘導されることが明らかになった。
【図１】
2014073993.tif 000004
【図２】
2014073993.tif 000005
【図３】
2014073993.tif 000006
【図４】
2014073993.tif 000007
【図５】
2014073993.tif 000008
【配列表】
2014073993000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
近年、前記鉄獲得に関与する遺伝子群（以下、「鉄利用遺伝子群」ともいう）の転写を調節する仕組みが明らかにされてきた。なかでも、シロイヌナズナの二価鉄トランスポーター遺伝子IRT1や、三価鉄還元酵素遺伝子FRO2の発現を直接制御する因子として、basic helix-loop-helix(bHLH)型転写因子群の一部が機能することが明らかにされた（非特許文献５）。これらの転写因子のうち、FIT(FER-like Deficiency Induced Transcription Factor)/bHLH29は、bHLH38またはbHLH39とヘテロダイマーを形成して、下流のIRT1、FRO2などの鉄利用遺伝子群の発現制御を行う（非特許文献６）。FIT/bHLH29およびbHLH38、bHLH39を同時に過剰発現させた遺伝子組み換えシロイヌナズナでは、IRT1およびFRO2の発現誘導による鉄内在量の増加とともに、鉄欠乏培地での生育が改善された（鉄欠乏耐性が付与された）ことから、これら一連のbHLH型転写因子の遺伝子発現量またはタンパク質量が、シロイヌナズナの鉄栄養に直接関わっていると考えられている（非特許文献６）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（３）RNA抽出と定量的RT-PCR
鉄利用関連遺伝子の転写量を定量するため、葉面散布後24時間栽培したシロイヌナズナの地上部を回収後、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。凍結状態のまま植物破
砕機MM300 MIXER MILL GRINDER（Retsch）により破砕した。EZ1 RNA Tissue Mini Kit（QIAGEN）および自動抽出装置Magtration System 12GC（QIAGEN）を用いてRNA抽出を行った後、リアルタイムPCR装置（7500 Real Time PCR System；Life technologies）を用い、
定量的RT-PCRによりbHLH38（At3g56970）、bHLH39（At3g56980）、bHLH100（At2g41240）、FIT/bHLH29（At2g28160）、FRO2（At1g01580）、FRO3（At1g23020）、IRT1（At4g19690）およびNAS4（At1g56430）の各遺伝子発現量を解析した。遺伝子名の後に付されたカッ
コ内の記号は、AGI（Arabidopsis Genome Initiative）コードである。本実施例に示すbHLH転写因子は、シロイヌナズナの鉄利用に寄与し、植物体全体で発現している（Wang, HY. et al., Planta., 2007, 226:897-908）ことが報告されている。FIT/bHLH29遺伝子の翻訳産物は、他のbHLH型転写因子とヘテロダイマーを形成して、下流のIRT1、FRO2、FRO3などの鉄還元吸収遺伝子群の発現制御を行っている。NAS4遺伝子は、シロイヌナズナ植物体
内で鉄と錯体を形成し鉄輸送、鉄利用に関与すると考えられている、ニコチアナミンの合成酵素をコードする遺伝子である。
遺伝子の発現量は、内部標準として用いたハウスキーピング遺伝子ACTIN2（At3g18780
）の発現量に対する相対値として算出した。本実施例、及び以下の実施例で、各遺伝子の増幅に用いたプライマー配列は、表１に示すとおりである。表１中、AGI codeはArabidopsis Genome Initiative コードを、RAP IDはThe Rice Annotation Project DatabaseのIDを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【表１】
2014073993.tif 000009
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（４）結果
アミノ酸を散布した後の植物体から抽出したRNAを用いて鉄利用関連遺伝子の発現量を
定量した結果を、図１に示す。図１には、それぞれ３サンプルの実験の平均値とSDを示した。グルタミン酸ナトリウム（図中では「GluNa」と表す。以下、「グルタミン酸」と記
載する）およびアルギニン処理区において、bHLH38、bHLH39、bHLH100、FIT/bHLH29、FRO2、FRO3、IRT1およびNAS4の各遺伝子発現が、対照区に比べ顕著に増加していた。とくに
グルタミン酸のこれらの遺伝子に対する発現誘導効果が大きかった。bHLH遺伝子の翻訳産
物は転写因子として機能し、下流の鉄還元吸収遺伝子群（FRO2、FRO3、IRT1）の発現を制御するマスター因子と考えられている（Walker, E. and Connolly, E., Curr. Opin. Plant Biol., 2008, 11:530-535）。前述のように、NAS4遺伝子は、シロイヌナズナ植物体内で鉄と錯体を形成し鉄輸送、鉄利用に関与すると考えられている、ニコチアナミンの合成酵素をコードする遺伝子である。これらの結果から、前記ストラテジーIを鉄獲得戦略と
する植物のモデルであるアブラナ科シロイヌナズナにおいて、グルタミン酸およびアルギニンは、鉄利用のマスター制御因子の発現を誘導し、鉄利用関連遺伝子群の発現量を上昇させる効果があることが示された。背景技術にて述べたように、FIT/bHLH29およびbHLH38、またはFIT/bHLH29およびbHLH39が同時に発現上昇した場合、IRT1およびFRO2の発現誘導による鉄内在量の増加とともに、鉄欠乏培地での生育が改善されたことが報告されている（Yuan, Y., et al., Cell Res. 2008, 18:385-397、第391頁第41〜44行）。従って、本
実施例においても同様の遺伝子発現上昇が認められたことから、グルタミン酸およびアルギニンで処理した植物では、鉄欠乏環境において生育が改善されることが明らかである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2014073993000001.app
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2014073993.tif 000010