(57)【要約】      （修正有）【課題】微量のＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅法などにおいて、高い信頼性をもって用いることができるＤＮＡ親和性物質含有組成物、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法、ＤＮＡ親和性物質の精製方法、およびＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットを提供する。【解決手段】ＤＮＡ親和性物質含有組成物は、鎖置換型ＤＮＡ増幅法において増幅可能なＤＮＡを、前記組成物中のＤＮＡ親和性物質１００ｎｇあたり０ａｇ以上３０ａｇ未満含有するものであり、また、前記ＤＮＡ親和性物質を精製する方法は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとの組み合わせを含む前記方法。【選択図】図５
2014171421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ親和性物質含有組成物であって、鎖置換型ＤＮＡ増幅法において増幅可能なＤＮＡの含有量が、前記組成物中のＤＮＡ親和性物質１００ｎｇあたり０ａｇ以上３０ａｇ未満である、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物。
【請求項２】
鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）〜（３）の条件下で行われるマルチプリープライムローリングサークル増幅によって検出可能なＤＮＡを含まない、請求項１に記載のＤＮＡ親和性物質含有組成物：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３）３０℃における１６時間の伸長反応。
【請求項３】
ＤＮＡ親和性物質含有組成物であって、
鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）〜（３）の条件下で行われるマルチプリープライムローリングサークル増幅によって検出可能なＤＮＡを含まない、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３）３０℃における１６時間の伸長反応。
【請求項４】
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、
前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとの組み合わせを含む製造方法により製造された、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質含有組成物。
【請求項５】
ＤＮＡ親和性物質の精製方法であって、
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、
前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとの組み合わせを含む、前記ＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項６】
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部を、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡの残部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ
を含む、請求項５に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項７】
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ
を含む、請求項５に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項８】
ＤＮＡ吸着剤が、カチオン性ポリマーを含んで構成されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項９】
ＤＮＡ吸着剤が、アミン含有ポリマーおよび陰イオン交換担体からなる群から選択される１種または２種以上を含んで構成されている、請求項５〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項１０】
ＤＮＡ不活化剤が、ＤＮＡインターカレート剤およびＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項５〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ親和性物質が、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項５〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ親和性物質が、鎖置換型ＤＮＡ増幅法に用いられるものである、請求項５〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法で精製された、ＤＮＡ親和性物質含有組成物。
【請求項１４】
ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップ、
前記混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部を、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡの残部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化して、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を得るステップ
を含む、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップ、
前記混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去して、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を得るステップ
を含む、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットであって、
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するためのＤＮＡ吸着剤、および
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するためのＤＮＡ不活化剤を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ親和性物質含有組成物、ＤＮＡ親和性物質の精製方法、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法およびＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼなどに代表されるＤＮＡ親和性物質は、遺伝子工学において広く用いられている。かかる物質は、その名のとおり、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に対して親和性を有することから、製造過程や抽出過程において、ＤＮＡ親和性物質にＤＮＡ（以下、夾雑ＤＮＡという）が付着・混入する可能性が極めて高い。例えば、市販されているＤＮＡポリメラーゼであって、耐熱性のＴａｑポリメラーゼや３０℃付近で活性を示す中温性の鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼであるφ２９ＤＮＡポリメラーゼには、細菌性の夾雑ＤＮＡが含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１および９を参照）。
【０００３】
このような夾雑ＤＮＡによる汚染は、ＤＮＡ親和性物質を用いる際に種々の悪影響をもたらす。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）によりＤＮＡを増幅する際に、夾雑ＤＮＡが微量でも混入したＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いると、鋳型として投入したＤＮＡだけでなく、夾雑ＤＮＡについてもＤＮＡ増幅が起こる。その結果、増幅後のＤＮＡの組成がオリジナル（鋳型ＤＮＡのソース）のＤＮＡとは異なるものとなり、増幅後の解析、例えば目的とするＤＮＡの特定、定量化、配列決定の際に、誤った結果を導き出すという問題点が指摘されている（例えば、非特許文献９を参照）。
【０００４】
一方、近年、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ増幅方法である、マルチプリープライムローリングサークル増幅（Multiply prime Rolling Cycle Amplification：ＭＰＲＣＡ）法やマルチプルディスプレースメント増幅（Multiple Displacement Amplification：ＭＤＡ）法を応用した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡクローニング法が普及しつつある（例えば、非特許文献２および３を参照）。これらの方法は、理論上１分子のＤＮＡの増幅を可能とすることから、様々な応用が期待されている。しかしながら、このような方法において極めて微量の鋳型ＤＮＡを用いた場合には、試料全体における、鋳型ＤＮＡに対する夾雑ＤＮＡの割合が高くなり、結果として夾雑ＤＮＡ由来の増幅物が偽陽性を示すこととなり、実験結果の信頼性を揺るがす大きな問題となっている。
【０００５】
かかる問題を解決すべく、夾雑ＤＮＡを除去する方法であって、ＤＮＡ分解酵素であるＤＮａｓｅＩが中温性であることを利用した、ＤＮａｓｅＩ処理により耐熱性酵素中のＤＮＡ汚染を除去した後に９５℃にてＤＮａｓｅＩを失活させることを含む方法（非特許文献４）が開示されている。しかしながら、同方法は、高温での処理を伴うため、耐熱性酵素について用いることができるものの、高温にて失活する酵素に対しては使用することができず、広範囲の酵素に対する応用に適さない。
【０００６】
また、非特許文献１には、φ２９ＤＮＡポリメラーゼから夾雑ＤＮＡを除去する方法として、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを精製用タグタンパク質との融合タンパク質として発現させた後、ＤＮａｓｅI処理を繰り返すことにより夾雑ＤＮＡを斬減した後、融合タンパク質精製用カラムでφ２９ＤＮＡポリメラーゼを精製する方法が開示されており、同方法により精製されたφ２９ＤＮＡポリメラーゼは、夾雑ＤＮＡに汚染されていない旨記載されている。
【０００７】
また、非特許文献５には、ＤＮＡ親和性タンパク質の精製方法として、ポリエチレンイミンで処理することにより、夾雑ＤＮＡを沈殿物として取り除く方法が開示されている。また、非特許文献６には、ＰＣＲ反応溶液にＤＮＡインターカレート剤であるエチジウムモノアジドを添加し、ハロゲンランプにより光を照射することにより、Ｔａｑポリメラーゼに混入したＤＮＡの増幅能を不活化することが記載されている。そして、非特許文献７には、ＰＣＲ反応溶液に、ＤＮＡインターカレート剤であるソラレンを添加し、ＵＶ処置を施すことによって、混入ＤＮＡの増幅能を不活化する方法が開示されている。
しかしながら、非特許文献６および７に記載の方法は、大量の熱を発するハロゲンランプやＵＶ処置により光照射を行うため、耐熱性ではない酵素に対しては使用することができず、広範囲の酵素に対する応用に適さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Blainey PC, et al., “Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination”, Nucleic Acids Res., 2011, 39(4): 319
【非特許文献２】Dean FB et al., “Rapid amplification of plasmid and phase DNA using phi29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification”, Genome Research, 2001, 11, 1095−1099
【非特許文献３】Dean FB et al., “Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5261-5266
【非特許文献４】Rochelle, PA, et al., “DNase 1 treatment of Taq DNA polymerase for complete PCR decontamination”, BioTechniques, 1992, 13 (4): 520
【非特許文献５】Burgess RR, “Use of polyethyleneimine in purification of DNA-binding proteins”, Methods Enzymol., 1990, 208: 3-10
【非特許文献６】Rueckert A, et al., “Removal of contaminating DNA from polymerase chain reaction using ethidium monoazide”, Journal of Microbiological Methods, 2007, 68: 596-600
【非特許文献７】Jinno Y, et al., “Use of psoralen as extinguisher of contaminated DNA in PCR”, Nucleic Acids Research, 1990, 18: 6739
【非特許文献８】Ambion(R), “DNase I demystified”, [online]、[2007年7月10日検索]、インターネット＜ＵＲＬ：http://ja.invitrogen.com/site/jp/ja/home/References/Ambion-Tech-Support/nuclease-enzymes/general-articles/dnase-i-demystified.html＞
【非特許文献９】Niimi, H, et al. “A novel eukaryote-made thermostable DNA polymerase which is free from bacterial DNA contamination”, Journal of Clinical Microbiology, 2011, Sept, 3316-3320
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、本願発明者らは、食品、医療、工業分野等において環境中に存在する未知の微生物の超微量のゲノムＤＮＡを、直接増幅する機会が増加する中で、従来の方法により精製したＤＮＡ親和性物質における夾雑ＤＮＡの除去が不十分であり、とくに、当該ＤＮＡ親和性物質が超微量の鋳型ＤＮＡを増幅する際の使用に耐え得るものではないとの新たな認識を持つに至った。
【００１０】
例えば、非特許文献８には、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとが共存した場合に、ＤＮａｓｅＩが一本鎖ＤＮＡを分解できる効率は二本鎖ＤＮＡの５００分の１であることが記載されていることからも、非特許文献１に記載のＤＮａｓｅＩ処理では、一本鎖ＤＮＡの分解が不十分であることが理解できる。
【００１１】
また、非特許文献１には、デジタルＰＣＲ装置を用いることで一般的な反応スケール（数十μＬ）の数千分の１の反応スケール（６ｎＬ）で増幅反応を行うデジタルＭＤＡ法を開発し、その増幅反応においては夾雑ＤＮＡの増幅が認められない旨記載されている。しかしながら、一般的に、反応スケールを極端に小さくすると、増幅反応に必要な成分が不足して、十分な量の増幅物が得られない。実際に、本願発明者らが、非特許文献１に記載の方法で精製した酵素に対応する、ＤＮａｓｅＩ処理のみで精製した酵素を用いて、一般的な２０μＬの反応スケールで、鋳型ＤＮＡを投入せずにＤＮＡ増幅反応を行ったところ、鋳型ＤＮＡを投入しなかったにも拘らず増幅産物が検出され、ＤＮａｓｅＩ処理のみで精製した酵素には夾雑ＤＮＡが含まれていることを見出した。したがって、非特許文献１に記載の、デジタルＰＣＲ装置を用いた極微量な反応スケールでの分析方法では、φ２９ＤＮＡポリメラーゼに夾雑ＤＮＡが一切混入していない証拠とはなり得ない。
【００１２】
また、本願発明者らは、非特許文献５に記載された、ポリエチレンイミンなどに代表されるＤＮＡ吸着剤を用いる方法によって得たＤＮＡ親和性物質についてもまた、ＤＮＡに高い親和性を持つＤＮＡポリメラーゼからＤＮＡを完全に除去できないとの認識を持つに至った。
【００１３】
したがって、本発明の課題は、従来技術における問題点を解消し、微量のＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅法などにおいて、高い信頼性をもって用いることができるＤＮＡ親和性物質含有組成物を提供すること、ならびに、ＤＮＡ親和性物質の精製方法、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法およびＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、ＤＮＡ吸着剤とＤＮＡ不活化剤とを組み合わせることにより、ＤＮＡ親和性物質含有混合物から夾雑ＤＮＡを除去することを可能とすることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下に関する。
[１]ＤＮＡ親和性物質含有組成物であって、鎖置換型ＤＮＡ増幅法において増幅可能なＤＮＡの含有量が、前記組成物中のＤＮＡ親和性物質１００ｎｇあたり０ａｇ以上３０ａｇ未満である、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物。
[２]鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）〜（３）の条件下で行われるマルチプリープライムローリングサークル増幅によって検出可能なＤＮＡを含まない、[１]のＤＮＡ親和性物質含有組成物：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３）３０℃における１６時間の伸長反応。
[３]ＤＮＡ親和性物質含有組成物であって、
鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）〜（３）の条件下で行われるマルチプリープライムローリングサークル増幅によって検出可能なＤＮＡを含まない、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３）３０℃における１６時間の伸長反応。
[４]ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、
前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとの組み合わせを含む製造方法により製造された、[１]〜[３]のいずれかのＤＮＡ親和性物質含有組成物。
[５]ＤＮＡ親和性物質の精製方法であって、
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、
前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとの組み合わせを含む、前記ＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[６]ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部を、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡの残部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ
を含む、[５]のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[７]ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ
を含む、[５]のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[８]ＤＮＡ吸着剤が、カチオン性ポリマーを含んで構成されている、[５]〜[７]のいずれかのＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[９]ＤＮＡ吸着剤が、アミン含有ポリマーおよび陰イオン交換担体からなる群から選択される１種または２種以上を含んで構成されている、[５]〜[８]のいずれかのＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[１０]ＤＮＡ不活化剤が、ＤＮＡインターカレート剤およびＤＮＡ分解酵素からなる群から選択される１種または２種以上である、[５]〜[９]のいずれかに記載のＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[１１]ＤＮＡ親和性物質が、ＤＮＡポリメラーゼである、[５]〜[１０]のいずれかのＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[１２]ＤＮＡ親和性物質が、鎖置換型ＤＮＡ増幅法に用いられるものである、[５]〜[１１]のいずれかのＤＮＡ親和性物質の精製方法。
[１３][５]〜[１２]のいずれかのＤＮＡ親和性物質の精製方法で精製された、ＤＮＡ親和性物質含有組成物。
[１４]ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップ、
前記混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部を、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡの残部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化して、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を得るステップ
を含む、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法。
[１５]ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップ、
前記混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ、および
前記混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去して、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を得るステップ
を含む、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法。
[１６]ＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットであって、
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するためのＤＮＡ吸着剤、および
ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するためのＤＮＡ不活化剤を含む、前記キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、従来技術における問題点を解消し、微量のＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅法などにおいて、高い信頼性をもって用いることができるＤＮＡ親和性物質含有組成物を提供すること、ならびに、ＤＮＡ親和性物質の精製方法、ＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法およびＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットを提供することができる。
また、本発明のＤＮＡ親和性物質含有組成物を、鋳型ＤＮＡを投入せずにＤＮＡ増幅法において用いると、夾雑ＤＮＡの増幅が起こらない、陰性コントロールを取ることが可能となる。
【００１７】
ここで、一般に、市販の酵素を含む組成物には、酵素の保存性等を考慮して各種安定剤等が含まれているが、酵素を含む組成物の製造者らは、当該組成物の具体的な組成や製造方法を十分には開示しない傾向にある。したがって、酵素を使用する研究者らは、このような組成が不明な市販の酵素を含む組成物を対象として酵素の精製を行うのが現状困難な状況にある。また、遺伝子工学関連の研究に用いられる酵素を合成するには多額の費用および時間を必要とするため、酵素を使用する研究者らは、酵素を含む組成物を自身で調製して、これについて酵素の精製を行うことも困難である。
【００１８】
このような状況下において、本願発明は、従来知られているＤＮＡ親和性物質が超微量の鋳型ＤＮＡを増幅する際の使用に耐え得るものではないという本願発明者らの新たな認識に基づいて、このような問題を解決すべくなされたものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、（Ａ）本発明の第１実施態様における製造方法および精製方法を示すフロー図、（Ｂ）前記フロー図に記載された方法のより具体的な一例を示す概要図である。
【図２】図２は、（Ａ）本発明の第２実施態様における製造方法および精製方法を示すフロー図、（Ｂ）前記フロー図に記載された方法のより具体的な一例を示す概要図である。
【図３】図３は、実施例１におけるφ２９ＤＮＡポリメラーゼの精製過程及び精製結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例２におけるφ２９ＤＮＡポリメラーゼの精製過程及び精製結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例１および２において精製されたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびに市販酵素をそれぞれ用いた、ＭＰＲＣＡ反応による夾雑ＤＮＡの検出および比較結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例１および２、および比較例１および２において精製されたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびにEpicentre社製φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ＭＰＲＣＡ反応による夾雑ＤＮＡの検出および比較結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例２で得られた精製φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＭＰＲＣＡ反応による増幅結果を示す図である。
【図８】図８は、図７について2nd Derivative Maximum法により作成した検量線を示す図である。
【図９】図９は、実施例１および２、および比較例２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびにEpicentre社製φ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＭＰＲＣＡ反応による増幅結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を、好適な実施態様に基づいて、添付の図面を参照しつつ、詳細に説明する。
まず、本発明のＤＮＡ親和性物質含有組成物に先立って、ＤＮＡ親和性物質の精製方法およびＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法について説明する。
【００２１】
（ＤＮＡ親和性物質の精製方法およびＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法）
本発明のＤＮＡ親和性物質の精製方法は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとの組み合わせを含む。
【００２２】
また、本発明のＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップと、前記混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップと、前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップとを含む。
【００２３】
≪第１実施態様≫
図１は、（Ａ）本発明の第１実施態様における製造方法および精製方法を示すフロー図、（Ｂ）前記フロー図に記載された方法のより具体的な一例を示す概要図である。
【００２４】
図１（Ａ）に示すように、本実施態様の製造方法は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップ（Ｓ−１：準備ステップ）、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部を、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ（Ｓ−２：吸着ステップ）、および前記混合物に含まれるＤＮＡの残部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化して、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を得るステップ（Ｓ−３：不活化ステップ）を含む。
【００２５】
また、本実施態様の精製方法は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部を、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ（Ｓ−２）、および前記混合物に含まれるＤＮＡの残部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ（Ｓ−３）を含む。すなわち、本発明の製造方法は、本発明の精製方法を用いて、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を製造する方法である。
本実施態様において、吸着ステップにて夾雑ＤＮＡの少なくとも一部を除去し、不活化ステップにて夾雑ＤＮＡの残部の増幅能を不活化することにより、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの全てを除去および／または不活化することができる。なお、説明の容易化のために、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれ、除去または不活化すべきＤＮＡを夾雑ＤＮＡともいう。
【００２６】
以下、各ステップについて詳細に説明する。
なお、本明細書中においてとくに明記しない限り、各ステップは任意の温度、例えば常温、任意の雰囲気下、例えば空気雰囲気下、任意の気圧、例えば常圧で行うことができる。また、記載する手段が公知の場合には、公知の諸条件に合わせて本方法を行うことができる。
【００２７】
＜準備ステップ＞
まず、本ステップによって、ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備する。
ここで、本明細書において、ＤＮＡ親和性物質とは、ＤＮＡに対し親和性を有する物質であり、このような性質を有するものであればとくに限定されないが、例えば、デオキシヌクレオチドを基質とした反応に関与可能な酵素や、これを構成するタンパク質、当該タンパク質の一部分と同一の構造を有するポリペプチド等が挙げられる。
ＤＮＡ親和性物質は、生物由来の天然のものであってもよいし、遺伝子組換え体由来のものであってもよいし、化学的に合成されたものであってもよい。
【００２８】
上述の酵素の例としては、ＤＮＡの複製や修復において用いられるＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲｅｃＡタンパク質やＤＮＡ結合タンパク質が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、とくに限定されないが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、逆転写酵素、φ２９ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、中温性酵素であり、ＭＤＡ法やＭＰＲＣＡ法において好適であるという観点において、高い鎖置換活性およびプロセシビティーを備えるφ２９ＤＮＡポリメラーゼがとくに好ましい。
【００２９】
さらに、ＤＮＡ親和性物質は、アフィニティタグが結合したタグ融合物質、特に、タグ融合タンパク質であることが好ましい。これにより、目的とするＤＮＡ親和性物質をＤＮＡ親和性物質含有混合物の他の成分から分離することが容易となる。一方で、このようなアフィニティタグが後述するステップにおける各処理を阻害することはない。
このようなアフィニティタグとしては、特に限定されないが、例えば、グルタチオントランスフェラーゼタグ（Gluthathione transferase tag; ＧＳＴタグ、各社）、マルトースバインディングプロテインタグ（Maltose binding protein tag； ＭＢＰタグ、New England BioLabs社）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ、各社）、Ｔ７タグ（Merck社）、相補的サブユニットタグ（Ｓタグ、Merck社）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（Merck社）、ビオチンタグ（Promega社）ハロタグ（Promega社）などからなる群から選択される１種または２種以上を用いることができる。上述した中でも、利用上の簡便さの観点から、ＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグが好ましい。
また、ＤＮＡ親和性物質含有混合物中において、ＤＮＡ親和性物質は、いかなる状態で存在していてもよいが、好ましくは、ＤＮＡ親和性物質含有混合物は液体を含み、ＤＮＡ親和性物質は液体中に存在する。このような場合、例えば、ＤＮＡ親和性物質は、上記液体中に溶解していてもよいし、分散または懸濁していてもよい。また、例えば、遺伝子組換え体などの生体細胞中に内包された状態で、上記液体中に分散または懸濁していてもよい。
このような液体としては、特に限定されないが、例えば、トリス、リン酸、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液、ＬＢや２×ＹＴ等の液体培地などが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、ＤＮＡ親和性物質含有混合物は、その他の任意の成分を含んでいてもよい。
【００３０】
また、本実施態様で用いられるＤＮＡ親和性物質含有混合物として、市販のＤＮＡ親和性物質含有混合物をそのまま用いてもよいし、新たに調製したものを用いてもよい。
ＤＮＡ親和性物質含有混合物を新たに調製する場合においては、任意の方法により、ＤＮＡ親和性物質含有混合物を調製することができる。例えば、ＤＮＡ親和性物質が生体分子である場合、かかる生体分子をコードするゲノム遺伝子を、プラスミドなどを用いてクローニングし、大腸菌などで発現する。以下に、具体的な例を述べる。
【００３１】
例えば、ＤＮＡ親和性物質が、タンパク質である場合には、まず、制限酵素を認識することができるプライマーを用いて、かかるタンパク質のゲノムＤＮＡを増幅する。
制限酵素としては、とくに限定されないが、例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩなどが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３２】
次に、制限酵素を用いて、増幅産物を適当な発現ベクターに組み込んで組み換えベクターを作製する。発現ベクターとしては、とくに限定されないが、ｐＧＥＸ系（GE healthcare社）、ｐＥＴ系（Merck社）、ｐＣｏｌｄ系（タカラバイオ社）、ｐＭＡＬ系（New England BioLabs社）、PinPoint Vector（Promega社）などを用いることができる。また、利用する融合タンパク質を発現させるホスト細胞は、発現用ベクターのプロモーター配列に応じて適したホスト細胞を選ぶことができる。例えばｐＧＥＸ系であれば、ＢＬ２１系の大腸菌（各社）、ｐＥＴ系であればＢＬ２１（ＤＥ３）系（各社）などのホスト細胞を利用することができる。またホスト細胞を使わない場合は、無細胞系発現システムも、発現ベクターのプロモーターに応じて適宜利用することができる。例えばｐＥＴ系であれば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを利用した無細胞系発現システム（各社）を利用することができる。
【００３３】
最後に、かかる組み換えベクターを、発現用のホスト細胞に形質転換して培養した後、ＤＮＡ親和性タンパク質の発現の誘導を行う。培養の条件はとくに限定されないが、例えば、形質転換させたホスト細胞のみを得るために、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤を含む培養液で、適当な温度および時間で振とうにより、１回以上培養することができる。本明細書における融合タンパク質の発現誘導は、当該業者に公知な任意の方法で行うことができる。例えばｐＧＥＸ系やｐＥＴ系ベクターであれば、イソプロピルガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；ＩＰＴＧ、各社）の添加による誘導や、Overnight Express（登録商標）システム（Merck社）による自動誘導を利用することができる。また、ｐＣｏｌｄ系ベクターでは、コールドショックによる誘導も可能である。同様に、ヒートショックタンパク質プロモーターを有するベクターでは、ヒートショックによる誘導を利用することができる。さらに、ｐＥＴ系ベクターなどＴ７プロモーターによる制御を行うベクターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするバクテリオファージの感染、例えばλＣＥ３の感染による発現誘導を利用することができる。培養後は、培養液からホスト細胞を、遠心分離などによって回収することができる。
なお、ＤＮＡ親和性物質を、前述のアフィニティタグが結合したタグ融合物質とする場合には、ＤＮＡ親和性タンパク質を、アフィニティタグとの融合タンパク質として発現させることができる。
【００３４】
本ステップにおいて、ホスト細胞で発現させた場合、好ましくは、細胞からＤＮＡ親和性物質を任意の方法により抽出する。抽出方法はとくに限定されず、例えば、浸透圧ショック法、界面活性剤によるもの、酵素消化法、タンパク質抽出剤、超音波処理、フレンチプレス、ダイノミル処理、乳鉢によるもの、ホモジナイザーによるもの、ガラスビーズによるものなど種々の方法が挙げられる。その際、ホスト細胞の細胞壁の破壊を簡易にするために、リゾチーム（各社）等の溶菌酵素を加えることができる。また、発現細胞が大腸菌であれば、市販のタンパク質抽出試薬、例えば、BugBuster(登録商標）Protein Extraction Reagent(Merck社)、B-PER(登録商標)Bacterial Protein Extraction Reagent(Thermo Fisher Scientific社）、FastBreak（登録商標）Cell Lysis Reagent(Promega社）なども、適宜利用することができる。ゲノムＤＮＡによるホスト細胞破砕液の粘度上昇を防ぐために、前述の抽出液に、例えばデオキシリボヌクレアーゼＩ（各社）、Benzonase（登録商標）Nuclease（Merck社）、Cryonase（登録商標）Cold-active Nuclease（タカラバイオ社）などを加えることができる。さらに、ＤＮＡ親和性物質の可溶化を促進して回収量を増加させるために、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎＸ−１００やＴｒｉｔｏｎＸ−４０５等や、変性剤、例えばグアニジン塩酸塩、尿素、トレハロース、アルギニン塩酸塩などを、適宜添加することができる。また、ＤＮＡ親和性物質を安定化させる目的として、還元剤、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、トリスヒドロキシプロピルホスフィンやエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、プロテアーゼ阻害剤などを適宜添加してもよく、これらを１種または２種以上含んでもよい。
【００３５】
上述したような方法によって得られるＤＮＡ親和性物質含有混合物は、一般に夾雑ＤＮＡを含み、このようなＤＮＡは、従来の方法により十分に除去することが困難である。
【００３６】
＜吸着ステップ＞
次に、図１（Ａ）で示すように、本ステップでは、準備ステップで準備されたＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれる夾雑ＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去する（Ｓ−２）。
上述したように、ＤＮＡ親和性物質含有混合物がホスト細胞やプラスミドを用いて準備された場合、ＤＮＡ親和性物質含有混合物には、一般に、ホスト細胞のゲノムＤＮＡないしプラスミドＤＮＡが含まれる。
【００３７】
なお、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれる夾雑ＤＮＡとは、ＤＮＡ親和性物質に付着しているＤＮＡに限らず、ＤＮＡ親和性物質から物理的に離れた状態で該混合物中に浮遊するＤＮＡも含まれる。したがって、本ステップにおいては、これらの全ての種類のＤＮＡを除去することを目的とする。
本明細書において、夾雑ＤＮＡとは、二本鎖ＤＮＡに限らず、一本鎖ＤＮＡをも含むものである。
【００３８】
ＤＮＡ吸着剤としては、ＤＮＡを吸着する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、カチオン性ポリマーを含んで構成されるものが挙げられる。カチオン性ポリマーは、その分子中においてカチオン性基を有するため、負電荷を有するＤＮＡを吸着することができる。
このようなカチオン性ポリマーを含んで構成されるＤＮＡ吸着剤としては、例えば、陰イオン交換担体や、アミン含有ポリマー等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３９】
ＤＮＡ吸着剤を用いて、夾雑ＤＮＡをＤＮＡ親和性物質含有混合物から除去する方法としては、とくに限定されないが、とくにＤＮＡ親和性物質含有混合物が液体の場合には、例えば沈殿除去または通液除去が挙げられる。
沈殿除去では、ＤＮＡ親和性物質含有混合物にアミン含有ポリマー等のＤＮＡ吸着剤を添加して、前記混合物に含まれる夾雑ＤＮＡをＤＮＡ吸着剤に吸着させた状態で沈殿させ、沈殿物を前記混合物から除去することにより、前記混合物から夾雑ＤＮＡを除去する。
通液除去では、かかる混合物を陰イオン交換担体等のＤＮＡ吸着剤に通液させて、前記混合物に含まれる夾雑ＤＮＡをＤＮＡ吸着剤に吸着させて、夾雑ＤＮＡを前記混合物から除去する。
【００４０】
準備ステップでホスト細胞およびプラスミドを用いた場合、準備したＤＮＡ親和性物質含有混合物中にはホスト細胞およびプラスミド由来の夾雑ＤＮＡが多い。そのため、準備ステップの直後に吸着ステップを行う本実施態様においては、吸着ステップで可能な限り多くの夾雑ＤＮＡを一挙に除去することが好ましく、これは、アミン含有ポリマーによって達成される。
【００４１】
本発明において、アミン含有ポリマーとしては、前記目的を達成するためのものであればとくに限定されないが、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンおよび、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ポリリジン、ポリヒスチジン、ポリビニルアミンなどのアミン含有カチオン性ポリマーなどのカチオン性ポリマーを用いる。これらのうち、微量に存在するＤＮＡを吸着できるという観点から、アミン含有カチオン性ポリマーを用いるのが好ましく、ポリエチレンイミンを用いるのがより好ましい。
アミン含有ポリマーの重量平均分子量はとくに限定されないが、６００〜１００，０００であり、好ましくは５，０００〜１００，０００であり、ＤＮＡ沈殿効率の観点から、とくに好ましくは６０，０００〜８０，０００である。
アミン含有ポリマーの添加量はとくに限定されないが、例えば、ＤＮＡ親和性物質１ｍｇに対して０．０００１ｇ〜０．１ｇ、好ましくは０．００１ｇ〜０．０５ｇ、洗浄効率の観点から、とくに好ましくは０．００１〜０．００５ｇである。
アミン含有ポリマーを用いてＤＮＡ親和性物質含有混合物を処理する場合、処理時間は、１〜１０分、好ましくは１〜５分、より好ましくは１〜２分である。
アミン含有ポリマーを用いる場合、吸着ステップを行う作業温度は、０〜２５℃、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは０〜４℃である。
【００４２】
アミン含有ポリマーを添加した場合は、撹拌することによって吸着ステップを行うことができる。
ＤＮＡを吸着したあと、例えば洗浄、カラム、フィルター濾過を１種または２種以上組み合わせて、かかる作業を１回または２回以上行うことによりアミン含有ポリマーを除去する。
【００４３】
アミン含有ポリマーを混合液に添加して、ＤＮＡを吸着して沈殿させる場合は、沈殿と上清とを遠心分離などによって分離し、上清のみを回収することができる。ＤＮＡを吸着により除去するステップは、１回以上繰り返すことができる。
【００４４】
使用するＤＮＡ吸着剤の量は、その種類によっても異なり、とくに限定されないが、添加する形態のものは、ＤＮＡ親和性物質１ｍｇに対し、０．０００１〜０．１ｇ、好ましくは、０．００１〜０．０５ｇであり、洗浄効率の観点から、とくに好ましくは０．００１ｇ〜０．００５ｇである。
【００４５】
一方で、本発明に用いるＤＮＡ吸着剤として、陰イオン交換樹脂を用いることができる。
本発明において、陰イオン交換樹脂としては、例えば、第１級〜第３級アミノ基、第４級アンモニウム基などの官能基を担持する担体などが挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。上述した中でも、ＤＮＡを強力に引き寄せて吸着するという観点から、とくに第４級アンモニウム基を担持する担体が好ましい。
【００４６】
陰イオン交換樹脂の形態としては、とくに限定されないが、膜状、粒子状、繊維状が挙げられ、表面積が比較的大きいことや、担体の取り扱いが容易となる観点から、粒子状であることが好ましい。
粒子状の陰イオン交換樹脂を用いた場合には、その粒径はとくに限定されないが、例えば３〜１０００μｍであり、好ましくは２５〜２００μｍである。
粒子状の陰イオン交換樹脂の量はとくに限定されないが、ＤＮＡ親和性物質１ｍｇに対し、陰イオン交換樹脂の膨潤体積として０．０１〜１０ｍＬ、好ましくは、０．１〜５ｍＬ、より好ましくは、０．５〜２ｍＬである。
【００４７】
陰イオン交換樹脂を用いる場合には、作業が容易となる観点から、スピンカラムなどの各種カラムや、コニカルチューブなどのデバイスと組み合わせて用いることが好ましい。この場合、吸着ステップを行うために、陰イオン交換樹脂を担持するデバイスにＤＮＡ親和性物質含有混合物を通液することができる。
吸着ステップにおいて可能な限り多量のＤＮＡを吸着するために、通液の回数を２回以上としてもよい。
【００４８】
精製用担体の形状はとくに限定されないが、例えば、粒子状、ゲル状、磁性粒子であってよく、好ましくは、光照射時の取扱いの観点から、粒子状である。
精製用担体を用いる量は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡ親和性物質を固定できるものであればとくに限定されないが、例えば、ＤＮＡ親和性物質１ｍｇに対して、膨張体積約０．０１〜１０ｍＬ、好ましくは、０．１〜５ｍＬ、ＤＮＡ親和性物質の目的含有量を確保する観点から、とくに好ましくは０．５〜２ｍＬである。
【００４９】
＜不活化ステップ＞
最後に、本ステップでは、吸着ステップでＤＮＡ吸着剤によりＤＮＡを吸着させてＤＮＡ親和性物質含有混合物から除去させた後のものに対し、これに依然として含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化する（図１（Ａ）：Ｓ−３）。本明細書において、単に「ＤＮＡを不活化する」と記載した場合も、ＤＮＡの増幅能を不活化することを意味する。
【００５０】
なお、ＤＮＡ不活化剤が標的とするＤＮＡとは、ＤＮＡ親和性物質に付着しているＤＮＡに限らず、ＤＮＡ親和性物質から物理的に離れた状態で該混合物中に浮遊するＤＮＡも含まれる。
【００５１】
ＤＮＡ不活化剤とは、ＤＮＡの増幅能を不活化するものであればとくに限定されないが、例えば、ＤＮＡを分解することや、ＤＮＡを変性することにより、ＤＮＡの増幅を不可能にするものである。したがって、ＤＮＡ不活化剤には、ＤＮＡ分解酵素などに代表されるＤＮＡ分解剤や、ＤＮＡを変性して増幅不能にするＤＮＡインターカレート剤などが挙げられる。
本態様においては、ＤＮＡ不活化剤がＤＮＡの混入源になる可能性があるという理由により、夾雑ＤＮＡを新たに導入するリスクの低い化学物質である、ＤＮＡインターカレート剤を用いることが好ましい。
【００５２】
ＤＮＡインターカレート剤としてはエチジウムブロミド、エチジウムモノアジドなどのエチジウム系物質や、８−メトキシソラレンなどのソラレン誘導体が挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いることができ、好ましくはエチジウムモノアジドを用いる。エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）は、ＤＮＡに結合し、ＤＮＡの二本鎖配列の間にインターカレートし、３８０ｎｍ〜８００ｎｍ程度の光を照射することにより、ＤＮＡを切断する。ソラレン誘導体は、ＤＮＡの二本鎖配列の間にインターカレートし、３２０ｎｍ〜４００ｎｍ程度の光を照射することにより、隣接するピリミジン塩基と結合して二本鎖間を強力に結合することにより、ＤＮＡが熱変性の影響を受けず、その結果としてＤＮＡの増幅を妨げる。
【００５３】
なお、ＤＮＡ親和性物質が耐熱性の低い酵素の場合には、酵素活性を維持するために、光源の選択に留意する必要がある。ＵＶ、蛍光灯、白熱灯などの光照射により、酵素が失活する可能性があることから、所望する波長の光を照射することができる有機または無機発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが好ましい。例えば、エチジウムモノアジドについては、約４５０ｎｍに発光波長のピークを有する白色光ＬＥＤ、ソラレン誘導体については、波長約３６５ｎｍのＵＶ線のみを発するＬＥＤを使用することが好ましい。このようなＬＥＤは、熱をほとんど生じないという利点および波長選択的に発光して不必要な短波長の放射線（例えば短波長ＵＶ）を発しないという利点を有する。したがって、エチジウムモノアジドやソラレン誘導体などのＤＮＡインターカレート剤を用いる非耐熱性酵素の精製は、ＬＥＤの開発の進歩により実施することが可能になったともいえる。
【００５４】
使用するＤＮＡ不活化剤の量は、その種類によっても異なるが、とくにＤＮＡインターカレート剤の場合には、ＤＮＡ親和性物質１ｍｇに対して、１〜１０００μｇ、好ましくは、１０〜５００μｇであり、とくに好ましくは５０〜１００μｇである。
ＤＮＡインターカレート剤を用いてＤＮＡ親和性物質含有混合物を処理する場合、処理時間は、５〜１２０分、好ましくは３０〜１２０分、より好ましくは３０〜６０分である。
ＤＮＡインターカレート剤を用いる場合、不活化ステップを行う作業温度は、０〜２５℃、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは１〜４℃である。
【００５５】
一方、ＤＮＡ分解酵素としては、ＤＮａｓｅＩ（各社）、Mycrococcal Nuclease（各社）、Benzonase（登録商標）ヌクレアーゼ(Merck社）、Cryonase（登録商標）Cold-active Nuclease（タカラバイオ社）などが挙げられ、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。Mycrococcal Nucleaseはカルシウムイオン存在下でのみＤＮＡ分解活性が認められるため、反応液にカルシウムイオンを１−５ｍＭ添加する必要がある。また、ＤＮａｓｅＩはカルシウムイオンが存在しない場合、２本鎖ＤＮＡの完全切断能力が著しく劣るため、反応液にカルシウムイオンを０．５−２ｍＭ添加することが望ましい。
ＤＮＡ分解酵素を用いる場合には、例えば、ヌクレアーゼ緩衝液とともに用いることができる。
【００５６】
使用するＤＮＡ分解酵素の量は、その種類によっても異なるが、ＤＮａｓｅＩの場合には、ＤＮＡ親和性物質１ｍｇに対して、１〜１０００ユニット、好ましくは、１０〜５００ユニットであり、とくに好ましくは２５〜１００ユニットである。
ＤＮＡ分解酵素を用いてＤＮＡ親和性物質含有混合物を処理する場合、処理時間は、１〜４８時間、好ましくは６〜４８時間、より好ましくは１５〜２５時間である。
ＤＮＡ分解酵素を用いる場合、不活化ステップを行う作業温度は、０〜２５℃、好ましくは０〜１０℃、より好ましくは１〜４℃である。
【００５７】
本ステップには、使用し終わったＤＮＡ不活化剤を、例えば洗浄、カラム、フィルター濾過により除去することが含まれてもよい。
【００５８】
また、本ステップにおいて、ＤＮＡの不活化を行う前にＤＮＡ親和性物質にアフィニティタグを付着させた場合には、その際に、アフィニティタグを介して、これをさらに精製用担体に担持させることが好ましい。これにより、複数のＤＮＡ親和性物質をまとめて精製用担体に固定して、ＤＮＡ親和性物質に付着したＤＮＡを効率的に分解・除去することができる。ＤＮＡ親和性物質からアフィニティタグを切り離すことによって、精製用担体およびアフィニティタグをＤＮＡ親和性物質からまとめて切り離すことができる。ここで用いられる精製用担体としては、とくに限定されないが、アフィニティタグの種類に依存する任意の担体、例えば、ＧＳＴタグであればグルタチオン（各社）、Ｈｉｓタグであれば２価の金属イオン（各社）、ＭＢＰタグであればマルトース（New England BioLabs社）、Ｔ７タグであれば抗Ｔ７抗体、ＳタグであればS-Protein（Merck社）、ＳｔｒｅｐタグＩＩであればStrept・Tactin（登録商標、Merck社）、ハロタグであればハロタグリガンド（Promega社）、ビオチンタグであればストレプトアビジンやアビジン（各社）が付加された担体を用いることができる。
【００５９】
また、本ステップにおいて、ＤＮＡ親和性物質がアフィニティタグを有する場合、ＤＮＡの不活化を終えたあとにアフィニティタグをＤＮＡ親和性物質から切り離すことを含んでもよい。これにより、より純粋なＤＮＡ親和性物質含有組成物を得ることができる。
具体的には、例えば、Factor Xa プロテアーゼ (各社)、エンテロキナーゼ（各社）、ＨＲＶ−３Ｃプロテアーゼ（各社）、PreScission（登録商標）プロテアーゼ（GE healthcare社）、Generase（登録商標）I(New England BioLabs社）、Furin(New England BioLabs社）などのプロテアーゼをＤＮＡ親和性物質含有混合物に添加することにより、ＤＮＡ親和性物質に付着したアフィニティタグを切断することができる。
【００６０】
以上の各ステップを経ることにより、ＤＮＡ親和性物質含有混合物から夾雑ＤＮＡが除去および／または不活化された、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を得ることができる。
なお、得られたＤＮＡ親和性物質含有組成物に、保存安定性の確保や使用目的に応じて、グリセロール、緩衝液、還元剤、キレート剤、界面活性剤などの任意の添加剤を加えてもよい。
【００６１】
得られたＤＮＡ親和性物質含有組成物は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、ＭＤＡ、ＲＣＡ（ローリングサークル増幅）、ＭＰＲＣＡなどの増幅法、とくに微量のＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅法において、高い信頼性をもってＤＮＡ増幅試薬などとして用いることができる。
本発明によると、１コピー〜１０コピー程度の超微量の鋳型ＤＮＡによる精密な増幅法を用いた場合でも、夾雑ＤＮＡによる影響を受けないことから、信頼性の高い実験結果を得ることができる。
【００６２】
なお、本実施態様において、とくに、ＤＮＡ吸着剤としてポリエチレンイミンを、ＤＮＡ不活化剤としてエチジウムモノアジドを夫々用いた場合には、後述する第２実施態様と比べ、作業負担が少なくなる。
【００６３】
≪第２実施態様≫
図２は、（Ａ）本発明の第２実施態様における製造方法および精製方法を示すフロー図、（Ｂ）前記フロー図に記載された方法のより具体的な一例を示す概要図である。
【００６４】
図２（Ａ）に示すとおり、本実施態様の製造方法は、ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備するステップ（Ｓ−１：準備ステップ）、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップ（Ｓ’−２：不活化ステップ）、および前記混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するステップ（Ｓ’−３：吸着ステップ）を含む。
本実施態様において、不活化ステップにて夾雑ＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を不活化し、吸着ステップにて夾雑ＤＮＡを吸着して混合物から除去することにより、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡの全てを除去および／または不活化する。
【００６５】
以下、図２を参照して本発明の第２実施態様について説明するが、前述した第１実施態様との相違点を中心に説明し、共通点についてはその説明を省略する。
【００６６】
＜準備ステップ＞
第１実施態様と同様に、本ステップにより、ＤＮＡ親和性物質含有混合物を準備する。
【００６７】
＜不活化ステップ＞
図２（Ａ）で示すように、本ステップは、準備したＤＮＡ親和性物質含有混合物に対して行う、これに含まれるＤＮＡの少なくとも一部の増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するステップである（Ｓ’−２）。本ステップは、上述した第１実施態様の不活化ステップと同様にして行うことができるが、本実施態様における好ましい条件を以下に述べる。
【００６８】
まず、本実施態様におけるＤＮＡ不活化剤としては、多量に存在するＤＮＡを短時間で十分に処理することができるという観点から、ＤＮＡ分解酵素を用いるのが好ましく、ＤＮａｓｅＩを用いるのがより好ましい。
【００６９】
また、効率的に不活化ステップを行ううえで、ＤＮＡの不活化を行う前に、ＤＮＡ親和性物質を、前述した精製用担体に担持させることが好ましい。これにより、複数のＤＮＡ親和性物質をまとめて精製用担体に固定し、これらに付着したＤＮＡの不活化を効率的に行うことができる。
精製用担体に担持させる方法としては、とくに限定されないが、例えば前述したアフィニティタグを用いるものが挙げられる。本実施態様において、精製用担体およびアフィニティタグは、ＤＮＡ親和性物質を可溶性画分として得られる可能性が高いことおよび穏やかな条件で精製できるという観点から、グルタチオンセファロースおよびＧＳＴが好ましい。
【００７０】
＜吸着ステップ＞
次に、図２（Ａ）で示すように、本ステップでは、前述の不活化ステップで処理されたＤＮＡ親和性物質含有混合物に依然として含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去する（Ｓ’−３）。本ステップは、上述した第１実施態様の吸着ステップと同様にして行うことができるが、本実施態様における好ましい条件を以下に述べる。
【００７１】
まず、本実施態様におけるＤＮＡ吸着剤としては、微量に存在するＤＮＡを吸着できることおよびＤＮＡ親和性物質とＤＮＡ吸着剤とを容易に分離できるという観点から、陰イオン交換樹脂を用いるのが好ましい。
また、前述の不活化ステップにおいて、前述したアフィニティタグおよび精製用担体を用いた場合には、本ステップにおける吸着の効率を向上するために、ＤＮＡの吸着を行う前にアフィニティタグの切り離しを行うことが好ましい。
【００７２】
以上の各ステップを経ることにより、第１実施態様と同様の効果を得ることができる。第２実施態様の方法において、とくにＤＮＡ不活化剤としてＤＮａｓｅＩを、ＤＮＡ吸着剤として陰イオン交換担体を用いた場合、第１実施態様の方法よりも短時間でＤＮＡ親和性物質の精製またはＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造を行うことができる。
【００７３】
（ＤＮＡ親和性物質含有組成物）
本発明は、鎖置換型ＤＮＡ増幅法において増幅可能なＤＮＡの含有量が、前記組成物中のＤＮＡ親和性物質１００ｎｇあたり０ａｇ以上３０ａｇ未満である、ＤＮＡ親和性物質含有組成物にも関する。
鎖置換型ＤＮＡ増幅法は、微量のＤＮＡを鋳型として用いた場合であっても、これを増幅・検出することができるものである。このため、微量のＤＮＡを鋳型にする鎖置換型ＤＮＡ増幅法において、微量でも夾雑ＤＮＡを含むＤＮＡポリメラーゼを用いると、これが増幅され、上記微量の鋳型ＤＮＡ由来のＤＮＡの検出が困難となる場合が多い。しかしながら、本願発明者らは、ＤＮＡ親和性物質含有組成物において、増幅可能な夾雑ＤＮＡの含有量が上記範囲内、すなわちＤＮＡ親和性物質１００ｎｇあたり３０ａｇ未満であると、かかる夾雑ＤＮＡは、通常の条件を用いる鎖置換型ＤＮＡ増幅法において検出されないことを見出した。
ＤＮＡ親和性物質含有組成物中における、鎖置換型ＤＮＡ増幅法において増幅可能なＤＮＡの含有量は、上記範囲内であればとくに限定されないが、より高純度のＤＮＡ親和性物質含有組成物を得るために、好ましくは、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物中のＤＮＡ親和性物質１００ｎｇあたり、０〜２５ａｇであり、より好ましくは、０〜１５ａｇである。
【００７４】
また、上記ＤＮＡ親和性物質含有組成物は、さらに、鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）〜（３）の条件下で行われるＭＰＲＣＡによって検出可能なＤＮＡを含まないことが好ましい：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３）３０℃における１６時間の伸長反応。
【００７５】
本発明はまた、ＤＮＡ親和性物質含有組成物であって、
鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）〜（３）の条件下で行われるＭＰＲＣＡによって検出可能なＤＮＡを含まない、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３）３０℃における１６時間の伸長反応、にも関する。
上述したような条件において、通常の反応スケール（約２０μＬ）で増幅反応を行った場合、例えば、ＤＮＡ親和性物質１００ｎｇに対して３０ａｇ以上の濃度で試料中に存在する極めて微量のＤＮＡであっても検出が可能である。したがって、上記ＤＮＡ親和性物質含有組成物は、このような極めて微量のＤＮＡの検出を行う場合に、増幅試薬として好適に用いることができる。
【００７６】
本発明はまた、ＤＮＡ親和性物質含有組成物であって、
鋳型ＤＮＡを含まない試料に対して用いられた際に、以下の（１）、（２）および（３’）の条件下で行われるリアルタイムＭＰＲＣＡによって検出可能なＤＮＡを含まない、前記ＤＮＡ親和性物質含有組成物：
（１）９５℃における１分間の加熱処理、
（２）２５℃における３０分間のアニーリング、
（３’）３０℃における９時間の伸長反応、にも関する。
上記（３’）の伸長反応は、好ましくは１１時間、より好ましくは１２時間、さらに好ましくは１６時間、さらにより好ましくは２４時間行われる。
ここで、検出可能なＤＮＡとは、ゲル上で蛍光標識が肉眼で視認できる程度をいい、例えば、アガロースゲル電気泳動後に、アガロースゲル中のＤＮＡを臭化エチジウムで検出した場合、１ｎｇ／バンド以上のものをいう。また、増幅反応溶液に発色用試薬を加えて増幅反応を行う場合には、蛍光強度が上昇することをいい、例えば、SYBR(R) Green II（タカラバイオ社）などの発色用試薬を終濃度で１×濃度となるように増幅反応溶液に添加してリアルタイムＰＣＲ装置を用いて蛍光強度を観測しながら増幅反応を行った場合には、蛍光強度が反応開始時の２倍以上に上昇することをいう。
【００７７】
本発明にかかるＤＮＡ親和性物質含有組成物は、とくに、ＤＮＡ増幅法において試薬として用いられた場合に、ノイズが少なく、信頼性の高い結果を出すことができる点で有用である。ＤＮＡ増幅法は、とくに限定されないが、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＭＤＡ、ＲＣＡ、ＭＰＲＣＡなどの増幅法である。とくに、ＭＤＡ、ＲＣＡ、ＭＰＲＣＡ反応の場合には、試薬としてＤＮＡ親和性物質含有組成物を用いる場合、極端に少ない反応スケールで用いると十分な量の増幅物が得られないため、一般的には、ＤＮＡ親和性物質を約０．２〜１．０％含む、約２０〜１００μＬのＤＮＡ親和性物質含有組成物の反応スケールで行う。
本明細書において、反応スケールとは、ＤＮＡ増幅反応溶液の合計液量を指し、ＤＮＡ親和性物質、プライマー、サンプル溶液、水、ＤＮＡ増幅用緩衝液、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、無機ピロフォスファターゼなどの、ＤＮＡ増幅に必要な任意の物質を含む液体の全量である。
【００７８】
上述したような本発明のＤＮＡ親和性物質含有組成物は、例えば、ＤＮＡ親和性物質を第１または第２実施態様における精製方法によって精製することによって、あるいは、第１または第２実施態様における製造方法によって製造することにより得ることができる。
【００７９】
（キット）
本発明はまた、ＤＮＡ親和性物質を精製するためのキットであって、ＤＮＡ親和性物質含有混合物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ吸着剤に吸着させて前記混合物から除去するためのＤＮＡ吸着剤、および前記混合物に含まれるＤＮＡの増幅能を、ＤＮＡ不活化剤により不活化するためのＤＮＡ不活化剤を含む、前記キットに関する。
本キットに含まれるＤＮＡ吸着剤は、上述したＤＮＡ親和性物質の精製方法において用いることのできるＤＮＡ吸着剤から選択される１種または２種以上の組み合わせとすることができる。
また、本キットに含まれるＤＮＡ不活化剤は、上述したＤＮＡ親和性物質の精製方法において用いることのできるＤＮＡ不活化剤から選択される１種または２種以上の組み合わせとすることができる。
また、本キットは、本発明のＤＮＡ親和性物質の精製方法および本発明のＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造方法のために用いられることができる。したがって、本キットには、さらに、例えば、取扱い説明書、ＤＮＡ親和性物質、ＤＮＡ親和性物質のゲノムＤＮＡなどに代表される、本発明の精製方法および製造方法に必要なものが含まれてもよい。
【００８０】
以上、本発明の好適な実施態様について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
例えば、任意の構成を付加・削除・転換してもよく、各剤を２種以上組み合わせて用いてもよく、各工程やステップは１回以上繰り返してもよい。
【実施例】
【００８１】
以下に、本発明を実施例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８２】
１．ＤＮＡ親和性物質の精製およびＤＮＡ親和性物質含有組成物の製造
１−１．実施例１
＜準備ステップ（Ｓ−１）＞
（ＧＳＴ融合バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ発現ベクターの作製）
バクテリオファージφ２９のゲノムＤＮＡを鋳型として、制限酵素であるＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩの認識配列をそれぞれ付加した示したプライマー（配列番号１および２）を用いて、ＰＣＲでφ２９ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を増幅した。増幅産物をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（GE healthcare社）のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩサイト間に連結し、ＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼを発現するための組み換えプラスミドｐＧＥＸ−φ２９ｐｏｌを作製した。
【００８３】
（ｐＧＥＸ−φ２９ｐｏｌの発現用大腸菌ＢＬ２１株への導入、およびＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼの誘導）
大腸菌ＢＬ２１株コンピテント細胞（Novagen社）にｐＧＥＸ−φ２９ｐｏｌを形質転換した。ｐＧＥＸ−φ２９ｐｏｌが導入された大腸菌株を０．０５ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０°Ｃで、８時間振とう培養した。さらに、前記培養液０．２５ｍＬを０．２％のラクトース、０．０５％のグルコース、１ｍＭの硫酸マグネシウム、０．０５ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地２５０ｍＬに添加し、３０℃で１８時間振とう培養を行い、ＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導した。その後、培養液を４℃で１５分間遠心分離（５，０００×ｇ）を行い、大腸菌体を回収した。回収した大腸菌体は使用するまで−８０℃で保存した。
【００８４】
（菌体破砕）
ＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼが誘導された大腸菌体１ｇにつき、４ｍＬのBugBuster（登録商標）Protein Extraction Reagent（Merck社）、１００ユニットのBenzonase（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ社）、１００μＬの５Ｍ  塩化ナトリウムおよび０．８ｍｇのリゾチーム（ナカライ社）を加えて懸濁し、氷冷水中で５分間、菌体を破砕した。
【００８５】
＜吸着ステップ（Ｓ−２）＞
菌体破砕液には速やかに、５ｍＬのＤＮＡ沈殿液（５０ｍＭ  トリス−塩酸  ｐＨ７．５，２Ｍ  塩化ナトリウム，１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０および０．６％ポリエチレンイミン）を加えよく懸濁した後、４°Ｃで１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行う事により、沈殿と上清に分離させた。上清を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移し、さらに等量の希釈液（５０ｍＭ  トリス−塩酸  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｗｅｅｎ２０、および１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０）を加えてよく懸濁後、４°Ｃで１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離する事により、沈殿と上清に分離させた。上清を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移し、５ｇのトレハロース（林原社）を加え、溶解した後に、あらかじめ洗浄したおいた膨潤体積約１ｍＬのグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＳ４Ｂ）担体（GE healthcare社）カラムにかける事によって、ＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼをＧＳ４Ｂ担体に吸着させた。ＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼを吸着させたＧＳ４Ｂカラムは、あらかじめ氷水中で冷却しておいた８ｍＬの洗浄液１（５０ｍＭ  トリス−塩酸  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０および０．５Ｍ  トレハロース）で洗浄した後、２５０ｍＬの洗浄液２（５０ｍＭトリス−塩酸  ｐＨ７．５，３Ｍ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｗｅｅｎ２０および１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０）で洗浄し、残留ポリエチレンイミンを除去した。
【００８６】
＜不活化ステップ（Ｓ−３）＞
洗浄されたカラム中のＧＳ４Ｂ担体は、あらかじめ氷水中で冷却しておいた１０ｍＬの洗浄液１で懸濁後、清浄なシャーレに移し、１００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロミドモノアジド液を加えた後、アルミホイルで遮光後、４°Ｃで３０分間震盪した。遮光震盪後、アルミホイルを外し、発光ダイオード（パナソニック、ＬＤＡ９ＤＨ）から可視光を、４°Ｃにおいて６０分間照射した。洗浄後、約１ｍＬのプロテアーゼ緩衝液でＧＳ４Ｂ担体を懸濁後、２．０ｍＬチューブ（BioPur、エッペンドルフ社）に移し、さらに１ｍＬのプロテアーゼ緩衝液（６６ｍＭ  トリス−塩酸  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  ｐ４０および１ｍＭ  トリスヒドロキシホスフィン）で洗浄した。洗浄したＧＳ４Ｂ担体を２００μＬのプロテアーゼ緩衝液で懸濁し、３０ユニットのPreScission（登録商標）プロテアーゼ（GE healthcare社）を加え、４°Ｃで１２０時間以上反応することによりＧＳＴ−ｔａｇ部分からφ２９ＤＮＡポリメラーゼを分離させた。分離したφ２９ＤＮＡポリメラーゼは、４°Ｃで５００×ｇ、２分間遠心分離する事により、ＧＳ４Ｂ担体から回収した。回収した酵素液に等量のグリセロール液（Invitrogen社）および１/５００倍量の１Ｍ  ジチオスレイトールを加えて良く攪拌したものを精製酵素として−２０°Ｃで保存した。
【００８７】
１−２．実施例２
＜準備ステップ（Ｓ−１）＞
実施例１と同様にベクターを作製し、大腸菌株でポリメラーゼの発現を誘導した。
（菌体破砕）
ＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼが誘導された大腸菌体２ｇにつき、８ｍＬのBugBuster（登録商標）Protein Extraction Reagent（Merck社）、５６０ユニットのＤＮａｓｅＩ（Roche社）、１．６ｍｇのリゾチーム（ナカライ社）を加えて懸濁し、氷冷水中で３０分間放置し、菌体を破砕した。その後、ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５を終濃度１％になるように添加した後、４℃で１５分間遠心分離（８，５００×ｇ）を行い、上清を回収した。
【００８８】
＜不活化ステップ（Ｓ’−２）＞
上清を洗浄液（５０ｍＭ  トリス−酢酸  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  酢酸カリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５、１ｍＭ  ジチオスレイトール）で平衡化した２ｍＬのグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＳ４Ｂ）担体（GE healthcare社）が入った１５ｍＬコニカルチューブに添加し、４℃で３０分間撹拌することでＧＳ４Ｂ担体にＧＳＴ融合φ２９ＤＮＡポリメラーゼを吸着させた。撹拌後、４℃で５分間遠心分離（５００×ｇ）を行い、上清を除去してＧＳ４Ｂ担体を回収した。回収したＧＳ４Ｂ担体を、あらかじめ４℃に冷却した洗浄液１０ｍＬで５回洗浄することにより、菌体破砕液の夾雑成分を除去した。洗浄後、ＧＳ４Ｂ担体をあらかじめ４℃に冷却したヌクレアーゼ緩衝液（３３ｍＭ  トリス−酢酸  ｐＨ７．５、６６ｍＭ  酢酸カリウム、１０ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ  塩化カルシウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に置換した後、冷ヌクレアーゼ緩衝液２ｍＬと１００ユニットのＤＮａｓｅＩを添加し、４℃で１８時間撹拌することで、夾雑ＤＮＡを分解した。
【００８９】
撹拌後、４℃で５分間遠心分離（５００×ｇ）を行い、上清を除去してＧＳ４Ｂ担体を回収した。回収したＧＳ４Ｂ担体を冷洗浄液１０ｍＬで５回洗浄した後、エンプティーカラムに移し、洗浄液を１００ｍＬ通液して分解されたＤＮＡとＤＮａｓｅＩを洗浄した。カラム洗浄後、ＧＳ４Ｂ担体を新しい１５ｍＬコニカルチューブに移し、冷溶出緩衝液（３３ｍＭ  トリス−酢酸、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  酢酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に置換した後、冷溶出緩衝液１ｍＬとPreScission（登録商標）プロテアーゼ（GE healthcare社）４０Ｕを添加し、４℃で１８時間撹拌することで、ＧＳＴタグとφ２９ＤＮＡポリメラーゼを切り離した。撹拌後、ＧＳ４Ｂ担体懸濁液を４℃で５分間遠心分離（５００×ｇ）を行い、ＧＳ４Ｂ担体から遊離したφ２９ＤＮＡポリメラーゼを含む上清を回収した。
【００９０】
＜吸着ステップ（Ｓ’−３）＞
回収した上清１ｍＬを溶出緩衝液で平衡化した１ｍＬのセルロファイン（登録商標）ＫＡＮＴＯ  ＱＡＥ−５００（ＱＡＥ）担体（関東化学社）が入った新しい１５ｍＬ容コニカルチューブに添加し、４℃で３０分間撹拌することで、残存する夾雑ＤＮＡをＱＡＥ担体に吸着させた。撹拌後、ＱＡＥ担体懸濁液を０．１μｍフィルターろ過を行い、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを含むろ液を回収した。ろ液０．６ｍＬに対して８０％グリセロール含有緩衝液（８０％グリセロール、３３ｍＭ  トリス−酢酸，ｐＨ７．５、１００ｍＭ  酢酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５、１ｍＭ  ジチオスレイトール）１ｍＬを混合したものを精製酵素液とし、−２０°Ｃで保存した。
【００９１】
１−３．比較例１（不活化ステップを用いない方法）
実施例１において記載した条件と同一の条件で（ただし、エチジウムモノアジドによる不活化ステップを用いない）、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を作製した。
【００９２】
１−４．比較例２（吸着ステップを用いない方法）
実施例２において記載した条件と同一の条件で（ただし、ＱＡＥによる吸着ステップを用いない）、ＤＮＡ親和性物質含有組成物を作製した。
【００９３】
２．評価
２−１．実施例１および２で得たφ２９ＤＮＡポリメラーゼのタンパク質純度の確認
実施例１および２の各精製過程および精製酵素をｅ−ＰＡＧＥＬ  ５−１２．５％グラジェントゲル（アトー社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色によりφ２９ＤＮＡポリメラーゼを検出した結果を図３および４に夫々示した。
実施例１および２ともに、精製酵素には約６７ｋＤａであるφ２９ＤＮＡポリメラーゼ以外のバンドはほとんど検出されず、高純度に精製されていることが確認された。
【００９４】
２−２．実施例１および実施例２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびに市販酵素における夾雑ＤＮＡの検出および比較
（ＤＮＡ増幅反応）
実施例１および２で得たφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびに市販酵素のφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭＰＲＣＡ法によるＤＮＡ増幅反応を行った。市販酵素のφ２９ＤＮＡポリメラーゼとしては、Epicentre社、New England Biolabs社、Fermentas社、和光純薬社が発売しているものを用いた。鋳型ＤＮＡはｐＵＣ１９ＤＮＡ（タカラバイオ社）を精製水で０．５×１０６コピー／μＬに調製した。ＲＮＡプライマーは６塩基のランダムＲＮＡプライマーで全塩基がチオリン酸エステルで結合したものを用いた。
【００９５】
ＭＰＲＣＡ反応は、鋳型ＤＮＡまたは精製水（鋳型ＤＮＡなし）２μＬにアニーリングバッファー（１５０ｍＭ  トリス−塩酸，ｐＨ７．５、１００ｍＭ  塩化カリウム、４０ｍＭ  塩化マグネシウム）２μＬ、１００μＭ  ＲＮＡプライマー２μＬ、精製水４μＬを混合して９５℃で１分間加熱後、２５℃まで３０分かけて冷却した後、リアクションバッファー（２００ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ７．５、４００ｍＭ  塩化カリウム、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、１００ｍＭ  硫酸アンモニウム２μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ２μＬ、１００ｍＭ  ジチオスレイトール  １μＬ、２００Ｕ／ｍｇ  Pyrophosphatase（Roche社）０．１μＬ、１００ｎｇ／μＬ  φ２９ＤＮＡポリメラーゼ  １μＬ、精製水３．９μＬを混合して３０℃で１６時間インキュベートすることで行った。その後、φ２９ＤＮＡポリメラーゼを失活させるため、反応液を６５℃で１０分間インキュベートした。反応液をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１０倍希釈し、その５μＬを１％アガロースゲルで電気泳動後、臭化エチジウムで染色して増幅の有無を確認した。
【００９６】
（ＤＮＡ増幅反応の結果）
実施例１および２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびにEpicentre社、New England Biolabs社、Fermentas社、和光純薬社のφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＭＰＲＣＡ法によるＤＮＡ増幅反応を行った結果を図５に示す。市販酵素では何れの酵素でも鋳型ＤＮＡを反応系に添加していないにも関わらず、ＤＮＡの増幅が認められた。実施例１および２で得られた精製φ２９ＤＮＡポリメラーゼでは鋳型ＤＮＡなしではＤＮＡの増幅は認められず、鋳型ＤＮＡに依存した信頼性の高い増幅結果が得られた。
【００９７】
２−３．実施例１および２、および比較例１および２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびに市販酵素を用いたＭＰＲＣＡ法による夾雑ＤＮＡの検出と比較
実施例１および２、および比較例１および２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびにEpicentre社のφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型ＤＮＡとして１０４、１０３、１０２、１０１、１、０コピーのｐＵＣ１９ＤＮＡ（タカラバイオ社）を上述の方法と同様に、ＭＰＲＣＡ法により増幅した。反応液を精製水で１０倍希釈した後、その５μＬを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、全量を１％アガロースゲルで電気泳動後、臭化エチジウムで染色してＤＮＡを検出した。結果を図６に示す。各レーンの上部に記載した数字は鋳型ＤＮＡとして使用したｐＵＣ１９ＤＮＡのコピー数、Ｍは分子量マーカーを示す。ｐＵＣ１９ＤＮＡに由来する増幅産物は図中に矢印で示したｐＵＣ１９ＤＮＡのサイズである約２．７ｋｂのバンドとして検出され、夾雑ＤＮＡに由来する増幅産物は約２．７ｋｂ以外のバンドとして検出される。Epicentre社、比較例１（実施例１のＥＭＡ処理なし）および２（実施例２のＱＡＥ処理なし）で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼでは、それぞれ１０コピー、１コピー、１０２コピー以下のｐＵＣ１９ＤＮＡを鋳型ＤＮＡにした場合、ｐＵＣ１９ＤＮＡのサイズ以外のバンドが検出され、夾雑ＤＮＡの増幅が認められた（図６）。
一方、実施例１および２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼでは、ｐＵＣ１９ＤＮＡのサイズ以外のバンドは検出されなかった。この結果から、ＤＮＡ吸着剤およびＤＮＡ不活化剤が無い場合には、夾雑ＤＮＡの除去が不十分であったが、両方の剤を用いると、夾雑ＤＮＡが十分に除去されていることがわかる。
【００９８】
２−４．実施例２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いたリアルタイムＭＰＲＣＡ反応による増幅結果
リアルタイムＭＰＲＣＡ反応は、ＭＰＲＣＡ反応液にSYBR(R)Green II（タカラバイオ社）を終濃度で１×濃度となるように添加し、リアルタイムＰＣＲ装置であるThermal Cycler Dice(R)Real Time System II（タカラバイオ社）を用いて１５分間隔で蛍光強度を測定しながら３０℃で２４時間インキュベートすることで行った。鋳型ＤＮＡとして１０６、１０４、１０２、１、０コピーのｐＵＣ１９ＤＮＡ（タカラバイオ社）を検出した結果を図７に示す。また、2nd Derivative Maximum法により作成した検量線を図８に示す。
【００９９】
２−５．実施例１および２、および比較例２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼならびに市販酵素を用いたリアルタイムＭＰＲＣＡ反応による夾雑ＤＮＡの検出および比較
実施例１および２で得られた精製φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、比較例２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Epicentre社のφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型ＤＮＡなしでＭＰＲＣＡ法によるＤＮＡ増幅反応を行った結果を図９に示す。Epicentre社および比較例２（実施例２のＱＡＥ処理なし）で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼでは鋳型ＤＮＡを反応系に添加していないにも関わらずＤＮＡ増幅に伴う蛍光強度の上昇が認められ、夾雑ＤＮＡ量は図８の検量線からそれぞれ３９２コピーと１４コピーのｐＵＣ１９ＤＮＡに相当する。
実施例１および実施例２で得られた精製φ２９ＤＮＡポリメラーゼでは蛍光強度の上昇は認められない。
【０１００】
３．ＭＰＲＣＡ法におけるＤＮＡ検出限界値の測定
実施例１および２で得られたφ２９ＤＮＡポリメラーゼを１００ｎｇ用い、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（ＤＮＡ重量約３ａｇ／コピー）を鋳型ＤＮＡとして、そのコピー数を１、１０１、１０２、１０３、１０４と変動させて、上記と同じ条件下で、ＭＰＲＣＡ法により増幅させた。すると、１コピーでは検出不可能であったが、１０１コピー以上の鋳型ＤＮＡを用いると検出可能であった（図６）。したがって、ＤＮＡポリメラーゼを１００ｎｇ用いた際には、ｐＵＣ１９ＤＮＡの１０１コピー分の重量である約３０ａｇが検出限界値であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明により製造したＤＮＡ親和性物質含有組成物（例えば、夾雑ＤＮＡが精製除去されたＤＮＡポリメラーゼ）を用いることで、夾雑ＤＮＡの影響を受けず、１分子のＤＮＡの検出・増幅が可能となり、実験結果の信頼度が飛躍的に向上することから、分子生物学などの研究上の需要は非常に大きいものと思われる。
また近年、環境中に多数存在する培養法が不明な微生物（難培養微生物）のゲノムＤＮＡを直接ＤＮＡ増幅して配列解析を行うことによって、そのゲノム配列から有用な遺伝子資源を探索するメタゲノム解析が頻繁に行われているが、そのＤＮＡ増幅方法として中温性酵素のφ２９ＤＮＡポリメラーゼを利用した鎖置換増幅法が注目されている。本発明を利用して精製されたφ２９ＤＮＡポリメラーゼを利用したメタゲノム解析は、僅か１個体の菌体からのＤＮＡ増幅が可能となるため、本発明を利用して精製された中温性酵素によるＤＮＡ増幅技術は食品関連、医療用、工業用など利用可能性は高いと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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