(57)【要約】【課題】下痢型ストレス性腸障害の予防及び治療剤を提供する。【解決手段】ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株及びその製造法、該派生株、その菌体処理物又はそれらの混合物を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害の軽減剤、この軽減剤を含む、食品添加剤、動物添加剤、動物飼料及び医薬組成物。【選択図】図１
2014113137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株。
【請求項２】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤。
【請求項３】
前記CP2305s株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株が、生菌体又は殺菌体である、請求項2に記載の軽減剤。
【請求項４】
前記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、請求項2又3に記載の軽減剤。
【請求項５】
ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の軽減剤。
【請求項６】
大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項2〜5のいずれか1項に記載の軽減剤。
【請求項７】
ストレス性下痢の改善剤である、請求項2〜6のいずれか1項に記載の軽減剤。
【請求項８】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤を動物飼料成分と配合して動物飼料を製造する工程を含む、動物飼料の製造方法。
【請求項９】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する動物飼料。
【請求項１０】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤。
【請求項１１】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加物。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品。
【請求項１３】
機能性飲食品である、請求項12に記載の飲食品。
【請求項１４】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤を食品用の担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加剤をさらに混合して、機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法。
【請求項１５】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患を予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる乳酸菌。
【請求項１８】
前記ストレス性腸障害の軽減作用が、明細書の実施例3記載の下痢スコアでラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、請求項17記載の乳酸菌。
【請求項１９】
明細書の実施例3記載の方法によって下痢スコアを評価した場合においてプラセボと比較して有意（ｐ＜0.05vsプラセボ）にストレス性下痢を抑制しかつCP2305株と異なる乳酸菌。
【請求項２０】
氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、請求項17〜19のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２１】
ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項17〜20のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２２】
大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項17〜21のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２３】
上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、請求項17〜22のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２４】
上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の派生株又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）の派生株である請求項17〜23のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２５】
腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防又は軽減に用いるための請求項17〜24のいずれか１項記載の乳酸菌。
【請求項２６】
乳酸菌を10℃以下の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
【請求項２７】
乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、乳酸菌。
【請求項２９】
上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、請求項28記載の乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株及びその製造法に関する。
本発明は、上記の低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株又はその処理物を有効成分として含む、ストレス性腸障害の軽減剤に関する。
【０００２】
本発明はまた、上記軽減剤を含有する、食品添加剤若しくは動物飼料添加剤、或いは、食品又は医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸菌にストレス抑制作用や胃腸疾患に有効である可能性を示す先行技術文献が、以下に例示するようにいくつか散見される。
【０００４】
例えば、特開2009-102292号公報（特許文献１）には、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピシーズ・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)である乳酸菌FERM P-19169を有効成分とし、サイトカイン産生調節作用、感染防御作用、肥育作用又は下痢抑制作用に基づくストレス抑制剤が記載されている。この文献では、ストレス抑制とは、ストレスを引き起こす外部刺激であるストレッサーにより生じた生体の非特異的反応を抑制することによって、食欲減退、消化不良、不眠、体調不良、感染症などの症状を緩和することができると記載されている。
【０００５】
特開2009-100692号公報（特許文献2）及び特開2008-212140号公報（特許文献3）には、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス属微生物を含有することを特徴とする哺乳動物用乳酸菌製剤が記載されており、特定の乳酸菌を、哺乳動物に投与することにより、優れたストレス軽減効果を発揮し、ストレスに起因する下痢症などの消化器疾患を予防及び治療し得ると記載されている。
【０００６】
日本特許第4350170号公報（特許文献4）には、ヒト及び動物における胃腸障害の予防及び/又は処置に必要な薬学的調製物であって、寄託番号NCIMB 40564を有するラクトバチルス・カゼイ・ラムノーサス(Lactobacilluscasei rhamnosus)LB21の生存可能な微生物株を、微生物がその生存性を維持している少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリア媒体に含むことを特徴とする、薬学的調製物が記載されている。
【０００７】
特開2011-200211号公報（特許文献5）には、ラクトバチルス・ガセリMCC1183株を含有する抗潰瘍剤が記載されており、この薬剤は、ヘリコバクター・ピロリに起因する胃潰瘍又は十二指腸潰瘍の予防又は治療に用いられると記載されている。
【０００８】
特表2009-511471号公報（特許文献6）には、自己免疫疾患の治療及び/又は予防のための薬学的組成物の製造のための、乳酸菌から選択された少なくとも1種のプロバイオティクス細菌 (Probiotic bacteria) 株の使用が記載されており、該自己免疫が、多発性硬化症(MS)、アレルギー、乾癬、関節リウマチ（rhematoid arthritis）、クローン病（Crohn’s disease）、潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、炎症性腸疾患、及び全身性エリテマトーデスなどの臓器特異的自己免疫（organ specific autoimmunity）からなる群から選ばれる、また、乳酸菌株が、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、及びラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）からなる群より選ばれると記載されている。
【０００９】
日本特許4853986号公報（特許文献7）には、ラクトバチルス・ガセリSBT2055(LG2055という)(FERM P-15535)の菌体又はその発酵産物を有効成分とする炎症性腸疾患及び/又は過敏性腸症候群の予防及び治療剤が記載されており、また、一般に過敏性腸症候群の治療について、心理的ストレスのコントロールを行うとともに、整腸薬、緩下薬から抗精神病薬まで、症状に応じた段階的な薬物治療が施されていると記載されている。
【００１０】
澤田大輔ら、第13回腸内細菌学会(平成21年)、東京、日本（非特許文献1）には、ラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体によるストレス緩和作用、例えばストレス性腹痛を改善することが記載されている。
【００１１】
Daisuke Sawada et al., The 10th Syｍposium on Lactic Acid Bacteria （2011年）、オランダ国、Federation of European Microbiological Societies (FEMS)とNetherlands Society for Microbiology (NVvM)（非特許文献２）には、過敏性腸症候群（IBS）患者にCP2305株生菌体を投与したことが記載されているが下痢症状緩和に関する記載はない。
【００１２】
特開2003-95963号公報（特許文献8）には、ラクトバチルス・ガセリの菌体又はその発酵産物による炎症性腸疾患又は過敏性腸症候群の予防及び治療剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開2009-102292号公報
【特許文献２】特開2009-100692号公報
【特許文献３】特開2008-212140号公報
【特許文献４】日本特許第4350170号公報
【特許文献５】特開2011-200211号公報
【特許文献６】特表2009-511471号公報
【特許文献７】日本特許4853986号公報
【特許文献８】特開2003-95963号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】澤田大輔ら、第13回腸内細菌学会(平成21年)、東京、日本
【非特許文献２】Daisuke Sawada et al., The 10th Syｍposium on Lactic Acid Bacteria （2011年）、オランダ国、Federation of European Microbiological Societies (FEMS)と Netherlands Society for Microbiology (NVvM)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
乳酸菌の一種であるラクトバチルス・ガセリ株が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群などの胃腸障害の予防又は治療に有効であるという記載はある。また、そのような胃腸障害には、ストレスとの関係を推定する記載もある。しかし、従来、ラクトバチルス・ガセリ株が、ストレスを抑制して過剰な腸運動を正常に保持しながら、ストレス性下痢症状を有意に改善する、ストレス性腸障害の軽減作用を有する低温耐性乳酸菌についての記載がない。
【００１６】
さらに、製造上問題となる低温に耐性があるストレス性腸障害等の効果を有する乳酸菌は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、以下の特徴を包含する。
(1) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株。
(2) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤。
(3) 上記CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株が、生菌体又は殺菌体である、上記(2)に記載の軽減剤。
(4) 上記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、上記(2)又(3)に記載の軽減剤。
(5) ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、上記(2)〜(4)のいずれかに記載の軽減剤。
(6) 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、上記(2)〜(5)のいずれかに記載の軽減剤。
(7) ストレス性下痢の改善剤である、上記(2)〜(6)のいずれかに記載の軽減剤。
(8) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤を動物飼料成分と配合して、ストレス性腸障害軽減効果を有する動物飼料を製造することを含む、動物飼料の製造方法。
(9) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する動物飼料。
(10) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加
剤。
【００１８】
(11) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加物。
(12) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品。
(13) 機能性食品である、上記(12) に記載の飲食品。
(14) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤を食品用の担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加剤をさらに混合して、ストレス性腸障害軽減効果を有する機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法。
(15) ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害を予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
(16) 上記(2)〜(7)のいずれかに記載の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、ストレス性腸障害を予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
(17) ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる乳酸菌。
(18) 上記ストレス性胃腸障害の軽減作用が、後述の実施例3記載の下痢スコアで上記株と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、上記(17)に記載の乳酸菌。
（19) 後述の実施例3記載の方法によって下痢スコアを評価した場合においてプラセボと比較して有意（ｐ＜0.05vsプラセボ）にストレス性下痢を抑制しかつCP2305株と異なる乳酸菌。
(20) 氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、上記(17)〜(19)に記載の乳酸菌。
【００１９】
(21) ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、上記(17)〜(20)のいずれかに記載の乳酸菌。
(22) 大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、上記(17)〜(21)のいずれかに記載の乳酸菌。
(23) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、上記(17)〜(22)のいずれかに記載の乳酸菌。
（24） 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の派生株又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）の派生株である上記(17)〜(23)のいずれかに記載の乳酸菌。
(25) 腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は炎症性腸疾患の予防又は軽減に用いるための上記(17)〜（24）のいずれかに記載の乳酸菌。
(26) 乳酸菌を10℃以下、7℃以下、5℃以下、3℃以下、2℃以下、1℃以下、又は氷上、の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
(27) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌又は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）である、上記(26)に記載の方法。
(28) 氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、乳酸菌。
(29) 上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、上記(28)記載の乳酸菌。
【００２０】
ここで、上記(18)の「後述の実施例3記載の下痢スコア」は、具体的には、本明細書実施例3記載の方法により評価された下痢スコアであるが、簡単に説明すると、糞便重量（i値）×糞便スコア（ii値）の10回分の総和を指す。i値は、測定された糞便の重量（g）であり、ii値は、図5に示された糞便スコア基準から決定されたスコア（すなわち、スコア1、普通便；スコア2、やや下痢便；スコア3、形が崩れだした下痢便；スコア4、形のない下痢便）である。
【００２１】
さらにまた、上記(19)の「後述の実施例3記載の方法」は、簡単に説明すると、ラット（4週齢、雄）に、CRF-1（商標）餌25gに対し、菌数2.0×1010個が含まれる試験菌体の凍結乾燥粉末を配合した試験菌体配合餌を3週間自由摂取させたのち、コルチコトロピン放出因子（CRF; Corticotropin Releasing Factor）溶液を該ラットに125μg/kg腹腔内投与してストレス性下痢を誘発させ、CRF投与後の100分間の糞便状況を下痢スコア（上記）を用いて評価し（各群19匹）、その結果に基づいて試験菌体のストレス性下痢抑制を評価することを含む方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）から派生した株もしくはCP2305s株から派生した株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物は、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害して腸運動を正常に保持すること、並びに、被験体のストレス性下痢を効果的に抑制するため、ストレス性腸障害の予防、軽減又は治療に有効である。特に、本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物は、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害して腸運動を正常に保持すること、並びに、被験体のストレス性下痢を効果的に抑制するため、ストレス性腸障害の予防、軽減又は治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】この図は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株にコールドショックを施して得られた低温耐性株（CP2305s、A〜D）の生菌率を示す。
【図２】この図は、CRF誘発下痢モデルに対するラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体、殺菌体、及び派生株CP2305s殺菌体の影響を示す。プラセボは、CP2305株非含有の陰性対照である。また、＊は、危険率pが0.05未満であることを示す。
【図３】この図は、CRF誘発後の結腸クロライド・チャネル関連遺伝子発現変動を示す。プラセボ群でCRF投与後に増加するクロライド・チャネル関連遺伝子を、CP2305株投与群では抑制することを示している。図中、図中、Agtはangiotensinogen (serpin peptidase inhibitor, clade A, member 8)、Adcy5はadenylate cyclase 5、Adora1はAdenosine receptor A1、Ngfはnerve growth factor (beta polypeptide)、Igf2はinsulin-like growth factor 2、Igf1はinsulin-like growth factor 1 を表す。
【図４】この図は、骨盤(副交感)神経に対するCP2305株投与の影響を示す。
【図５】この図は、本発明に関する実験における下痢スコアを算出するための、糞便スコア基準を示したものである。糞便の「水分状況」・「形状」によって糞便スコアを１〜4の4段階で評価を行った（表中の糞便の色は糞便スコア基準の対象としないが、本発明の効果を示すための参考情報として付する。）。
【図６】この図は、CRF誘発下痢モデルに対する各種乳酸菌投与の影響を示す。乳酸菌は、ラクトバチルス・ガセリCP2305株の生菌体、公知寄託菌株A（L. gasseri）および市販生菌製剤B（L. acidophilus 含む）である。プラセボは、CP2305株非含有の陰性対照である。また、＊は、危険率pが0.05未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明をさらに具体的に説明する。
＜低温耐性ラクトバチルス・ガセリ株＞
本発明は、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、を提供する。
【００２５】
ラクトバチルス・ガセリ株を、10℃以下の温度に暴露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を１回以上繰り返すこと、生存した低温耐性株を回収することを含む方法を用いることによって、低温耐性株を製造することができる。この操作によって、コールドショック後に、生菌率が約60％以上、好ましくは、約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、85％以上、90％以上、の低温耐性株を得ることができる。
【００２６】
このようなコールドショック法により、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）を含めて数種の低温耐性株得ることができた（図１）。このラクトバチルス・ガセ
リCP2305s株は、本出願人により、ブダペスト条約の規定に基づく国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、2012年8月14日付でNITE BP-1405として国際寄託されている。
【００２７】
なお、親株であるラクトバチルス・ガセリCP2305株は、本出願人により、ブダペスト条約の規定に基づく国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、2007年9月11日付でFERM BP-11331として国際寄託されている。
【００２８】
＜ストレス性腸障害等の軽減剤＞
本発明は、第2の態様により、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した低温耐性派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤を提供する。
CP2305s株、又はCP2305株からの低温耐性派生株は、生菌体又は殺菌体のいずれでもよい。
【００２９】
本明細書中の「被験体」は、哺乳類及び鳥類に属する動物、好ましくはヒトなどの霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウなどの家畜動物、ウマなどの競技用動物、イヌ、ネコなどの愛玩動物などである。
【００３０】
また、本発明のCP2305s株と同様に、CP2305株もしくはCP2305s株からの他の派生株もまた、親株と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有する、かつ、前記株と異なるラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌として得ることができる。そのような派生株は、親株に紫外線を照射すること、変異原性物質の存在下で親株を培養すること、至適温度以外の温度で培養すること、有機溶剤存在下で培養することなどの、親株にとって非一般的な条件下に親株を置くことによって作製可能である。変異原性物質として、例えば、3-アミノ-1,4-ジメチル-5H-ピリド[4,3-b]インドール（Trp-P-1）、2-アミノ-6-メチルイミダ-5H-ピリド[1,2-a-3’,2’-d]-イミダゾール（Glu-P-1）、2-アミノ-3,4-ジメチルイミダゾ[4,5-f]キノリン（MeIQ）、4-ニトロキノリン-Ｎ-オキシド（4NQO）、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）などが挙げられる。目的の派生株は、例えば、(1)ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有する、例えばストレス性腸障害の軽減作用が下痢スコアで前記株と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、(2)氷上で5時間以上保持したときの生存率が60％以上である、(3)ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、(4)大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、ことを指標にして、選抜することができる。本発明は、このような(1)の特性、及び、(2)〜(4)のいずれかの特性を有する乳酸菌にも関する。
【００３１】
関連する公知ラクトバチルス・ガセリ株に関して、炎症性腸疾患又は過敏性腸症候群の予防・治療効果があるラクトバチルス・ガセリSBT 2055株(FERM P-15535)が知られている（特開2003-95963号公報）。この菌は、日本人の腸から分離・培養された乳酸菌であり、DDS誘発潰瘍性大腸炎モデルを使用した生菌での試験では、対照群に比べて血便や下血が抑制されたと報告されている。また、腸内菌叢を改善して下痢の発症を低減するラクトバチルス・ガセリOLL2716株(FERM BP-6999)が知られている（特開2004-305128号公報）。その実施例では、仔牛の飼育の間に下痢の発生率（試験牧場に導入後2週間以内に下痢を発生した率）が低下したと記載されている。しかし、これらの公知ラクトバチルス・ガセリ株は、以下に記載するように、CP2305株や、その低温耐性派生株であるCP2305s株と明ら
かに異なる株である。
【００３２】
本発明の、CP2305株の低温耐性株であるCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株、の生菌体及び殺菌体、並びに該株の菌体処理物は、意外にも腸管からの水分過剰分泌を抑制する作用を有し、ストレス性下痢を著しく抑制する効果を有している（図1及び図2参照）。この作用は、親株であるラクトバチルス・ガセリCP2305株の殺菌発酵乳を、公知の寄託ラクトバチルス・ガセリ株、L. acidophilus、B. pseudocatenulatum、L. delbrueckii、S. thermophilus及びL. kefirgranumの殺菌発酵乳と比較した場合であっても、格別有意である。腸管からの水分過剰分泌の抑制は、CRF投与ラットの結腸組織での遺伝子発現の網羅的解析により、CP2305株が、大腸クロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していることによることが立証された（図3参照）。このCP2305株はまた、今回、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有することが、下部大腸を神経支配する骨盤（副交換）神経の電気活動を測定することによって証明された。CP2305株の投与によって、被験体のストレス時の腸管機能が正常に回復し維持される。このため、CP2305株は、ストレス性腸障害の下痢症状を有意に軽減するという格別の効果を有する。上記のCP2305s株及びその低温耐性株などの派生株もまた、ストレス性腸障害、とりわけストレス性下痢、を軽減する作用効果を有する。
【００３３】
本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株は、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を使用して、適当な条件下で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、乳酸菌の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する菌株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、廃糖蜜などを使用することができる。また、窒素源としてはカゼインの加水分解物、乳漿タンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物を使用することができる。無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばMRS液体培地、GAM培地、BL培地、Briggs LiverBroth、獣乳、脱脂乳、乳性ホエーなどが挙げられる。好ましくは、滅菌されたMRS培地を使用することができる。
【００３４】
また、本発明のCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株の培養は、20℃〜50℃、好ましくは25℃〜42℃、より好ましくは約37℃において、嫌気的培養条件下で行う。温度条件は、恒温槽、マントルヒーター、ジャケットなどにより調整することができる。ここで、嫌気条件下とは、菌が増殖可能な程度の低酸素環境下のことであり、例えば嫌気チャンバー、嫌気ボックス又は脱酸素剤を入れた密閉容器若しくは袋などを使用することにより、あるいは単に培養容器を密閉することにより、嫌気条件とすることができる。培養は、静置培養、振とう培養、タンク培養などのいずれの培養様式でもよい。また、培養時間は3時間〜100時間又はそれ以上、好ましくは約10時間〜50時間とすることができる。培養開始時の培地のpHは3.5〜8.0に維持することが好ましい。
【００３５】
培養後、培養液から濾過、遠心分離等の分離技術により分離した生菌体、或いは生菌体含有培養液を得ることができる。また、これらの生菌体又はその培養液を、オートクレーブ等による公知の殺菌処理にかけることによって、殺菌体を得ることができる。また、生菌体又は生菌体培養液から菌体処理物を作製し、必要に応じて殺菌処理にかけることができる。
【００３６】
菌体処理物は、菌体を、乾燥処理、破壊又は破砕処理、発酵処理などの物理的、化学的、生物学的処理等にかけることによって得られるものである。したがって、本発明で使用する菌体処理物の例は、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体、発酵処理物（例えば、発酵乳）などである。
【００３７】
乾燥菌体は、上記培養液から分離した菌体を、必要であれば殺菌処理にかけられた菌体を、乾燥処理にかけることによって得ることができる。乾燥処理としては、例えばドラム乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などを挙げることができる。
【００３８】
破壊菌体又は破砕菌体は、菌体を、破砕、磨砕、酵素処理、薬品処理、溶解などによって処理することによって得ることができる。破壊菌体又は破砕菌体は、破壊又は破砕された菌体の固体成分及び可溶性成分のすべてから本質的になり、例えば破壊物又は破砕物をそのまま凍結乾燥にかけることによって得ることができる。破壊又は破砕は、公知の手法、例えば物理的破砕、酵素溶解処理、薬品処理、等によって行うことができる。物理的破砕は、湿式又は乾式のいずれで行ってもよく、ホモゲナイザー、ボールミル、ビーズミル、ダイノミル、遊星ミル等を使用した撹拌により、ジェットミル、フレンチプレス、細胞破砕機、等を使用して行うことができる。酵素溶解処理は、例えばリゾチームなどの酵素を用いて、菌の細胞構造を破壊することによって行うことができる。薬品処理は、グリセリン脂肪酸エステル、ダイズリン脂質などの界面活性剤を使用して、菌の細胞構造を破壊することによって行うことができる。好ましくは、物理的破砕である。
【００３９】
破砕物を調製するための具体的な方法は、例えば、菌の懸濁液を、公知のダイノミル細胞破砕機（DYNO-MILL破砕装置など）において、ガラスビーズを使用して、周速10.0〜20.0m/s（例えば約14.0m/s）、処理流速0.1〜10L/10min（例えば約1L/10min）にて、破砕槽温度10〜30℃（例えば約15℃）で1〜7回（例えば3〜5回）処理することによって、菌体を破砕することを含む。また例えば、菌の懸濁液を、公知の湿式ジェットミル細胞破砕機（JN20 ナノジェットパルなど）において、吐出圧力50〜1000Mpa（例えば270MPa）、処理流速50〜1000（例えば300ml/min）にて、1〜30回（例えば10回）処理することによって、菌体を破砕することができる。また、公知の乾式遊星ミル細胞破砕機（GOT5 ギャラクシー5など）において、菌体粉末を各種ボール（例えばジルコニア製10mmボール、ジルコニア製5mmボール、アルミナ製1mmボール）共存下で、回転数50〜10,000rpm（例えば240rpm、190rpm）で30分〜20時間（例えば5時間）処理することによって、菌体を破砕することも可能である。菌体粉末を公知の乾式ジェットミル細胞破砕機（ジェットOマイザーなど）において、供給速度0.01〜10000g/min（例えば0.5g/min）、吐出圧力1〜1000kg/cm2（例えば6kg/cm2）の圧力にて、複数回処理することによって、菌体を破砕してもよい。
【００４０】
発酵乳は、生乳、脱脂粉乳又は豆乳などに菌株を接種し、乳酸菌発酵条件にて発酵を行うことによって得ることができる。得られる発酵産物は、必要に応じて、濾過、希釈、濃縮などの処理にかけてもよい。
【００４１】
上記の菌体及び菌体処理物は、そのまま使用するか、或いは、殺菌処理にかけて殺菌体としうる。殺菌処理は、例えば高エネルギー線照射による殺菌、加熱殺菌、加圧殺菌、オートクレーブ殺菌などの公知の処理を含む。好ましい殺菌法は、オートクレーブ殺菌である。この方法は、オートクレーブ（高圧蒸気滅菌器）内で、生菌又は生菌含有培養液を、例えば約10分〜１時間にわたり、加圧水蒸気下で例えば110℃〜140℃の温度で殺菌することを含む。
【００４２】
上記の特性のために、本発明のCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、或いはその菌体処理物は、下記に記載する、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤として有用である。
【００４３】
明細書中「ストレス性下痢」とは、脳内ストレスホルモンが分泌されるようなストレスに曝露された状況下、すなわちストレスに起因する腸管での水分過剰分泌を伴う症状であり、腹痛を伴う場合と伴わない場合がある。
【００４４】
明細書中「ストレス性腹痛」とは、脳内ストレスホルモンが分泌されるようなストレスに曝露された状況下、すなわちストレスに起因する腸管において生じる腹痛を意味する。
【００４５】
したがって、特に、健常人に対するストレスに起因するストレス性の症状である点において、明細書中、「ストレス性下痢」と「ストレス性腹痛」は、過敏性腸症候群（IBS）の患者と区別される。
【００４６】
明細書中、「ストレス性下痢」と「ストレス性腹痛」をあわせて、「ストレス性腸障害」と呼ぶ。
したがって、明細書中、「ストレス性腸障害の下痢症状」とは、ストレス性下痢の症状を意味する。
【００４７】
明細書中「腸管の水分過剰分泌」とは、ストレス起因か否か関係なく、腸管での水分過剰分泌を意味する。
【００４８】
明細書中「過敏性腸症候群」とは、過敏性腸症候群は、腸の粘膜に炎症やポリープ・腫瘍など（器質的病変という）がなく、ただ腸の働きが強くなりすぎることによって腹痛や便通異常（特に、下痢、便秘・下痢を繰り返す交替型）などといった症状が現れる病気である。特に、下痢型過敏性腸症候群は、大腸の知覚過敏により腸内容物通過時に過敏な反応が起こり、排出を促す収縮運動が過剰に誘発され、下痢症状が頻発し慢性的な腹痛を伴うことから、ストレスによる継続的不安に悩まされ精神疾患の併発率が高まる。診断基準は、RomeIIIに規定されており、ストレス環境の有無に関係なくQOLの低い患者である。
【００４９】
明細書中、「炎症性腸疾患」とは、主として消化管に原因不明の炎症を起こす慢性疾患の総称で、主に潰瘍性大腸炎、クローン病の2疾患からなる。ストレスによって悪化し、下痢症状を伴う。
【００５０】
本発明の軽減剤は、CP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、その菌体処理物、或いはその混合物からなる有効成分を、以下のものに限定されないが、該軽減剤あたり、例えば約0.1重量％〜100重量％、好ましくは約10重量％〜約90重量％含有する。
【００５１】
上記軽減剤は、上記有効成分の他に、賦形剤、希釈剤又は担体、必要に応じてその他の添加物を含むことができる。その形態は、固体形態又は液体形態のいずれでもよい。固体形態は、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレットなどの任意の形状からなる。また、液体形態は、例えば懸濁液、乳濁液、発酵液（例えば発酵乳）などの形状である。
【００５２】
賦形剤、希釈剤又は担体は、以下に述べるような食品、動物飼料又は医薬品で通常使用されうる物質である。他の添加物は、必ずしも必要ないが、添加する場合、以下に記載されるような、例えば保存料、pH調整剤、乳化剤、酸化防止剤、着色料などを挙げることができる。
【００５３】
＜食品又は動物飼料＞
本発明は、第3の態様により、上記のラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、或いは、上記軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤を提供する。
【００５４】
上記軽減剤が、有効成分の他に、賦形剤、希釈剤又は担体、及びその他の添加物を含む場合、食品添加剤又は動物飼料添加剤として使用することができる。これらの食品添加剤又は動物飼料添加剤は、固体形態又は液体形態のいずれでもよい。固体形態は、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレット、ゲル、カプセルなどの任意の形状からなる。また、液体形態は、例えば懸濁液、乳濁液、発酵液（例えば発酵乳）などの形状である。賦形剤、希釈剤又は担体は、食品又は動物飼料で通常使用されうる物質であり、また他の添加物は、例えば保存料、pH調整剤、乳化剤、着色料、栄養補助剤、（天然若しくは人工）甘味料、調味料、香料などを挙げることができる。
【００５５】
食品添加剤又は動物飼料添加剤は、上記軽減剤を、以下のものに限定されないが、添加剤あたり、例えば約1重量％〜約50重量％、好ましくは約5重量％〜約20重量％含有することができる。
【００５６】
食品添加剤又は動物飼料添加剤は、食品又は動物飼料に添加して、被験体の腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減するために使用することができる。
【００５７】
本発明はさらに、上記の軽減剤を含む動物飼料、或いは、上記の軽減剤を動物飼料成分と配合して、被験体の腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減する効果を有する動物飼料を製造することを含む、動物飼料の製造方法を提供する。
【００５８】
すなわち、動物飼料を製造するための飼料成分に、本発明の軽減剤を有効量配合し、必要であれば任意の剤型に製剤化することによって動物飼料を製造することができる。
【００５９】
本発明はさらに、上記のラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、或いは、上記の軽減剤を含む飲食品、機能性飲食品、或いは、上記の軽減剤を食品用担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加物をさらに混合して、被験体の腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患を軽減する効果を有する機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法を提供する。
【００６０】
動物飼料又は機能性飲食品において、上記軽減剤の配合量は、飼料や飲食品の形態や求められる効果（すなわち、被験体のストレス性下痢等を抑制する）を考慮して、当業者が適宜定めることができる。動物飼料又は機能性飲食品中のCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の殺菌体もしくは生菌体及び/又は菌体処理物の総量が、以下のものに限定されないが、該菌の生菌量として、105〜1014cfu/g、好ましくは106〜約1013cfu/g、より好ましくは107〜1012cfu/gに相当する量であるか、或いは、該菌の量として、例えば0.001重量％〜10重量％、好ましくは0.01〜5重量％となるような量である。その有効量は、添加量と下痢症状の軽減効果との関係に基づいて、当業者が適宜設定することが可能である。
【００６１】
動物飼料の剤型は、固体形態の場合、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレットなどの任意の形状からなり、また、液体形態の場合、例えば懸濁液、発酵乳などの形状である。
【００６２】
機能性食品の剤型は、固体形態の場合、例えば粉末、顆粒、タブレット、ペレット、ゲル、カプセルなどの任意の形状からなり、また、液体形態の場合、例えば懸濁液、乳濁液、発酵乳などの形状である。
【００６３】
上記の剤型中、タブレット、ペレット及びカプセルは、必要であれば、腸溶性となるように腸溶性物質で単層又は多層にコーティングすることができる。腸溶性物質は、胃液等の酸性域のpHで溶けず、中性域のpHで溶解するものであり、例えばヒプロメロースフタル酸エステル、セラック、ゼイン、ラクトフェリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロースなどを挙げることができる。
【００６４】
賦形剤、希釈剤又は担体は、以下のものに限定されないが、水、乳発酵液、炭酸水、エタノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、カルボキシメチルセルロース、スターチ、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどを挙げることができる。
【００６５】
動物飼料又は機能性飲食品の製造においては、飼料又は飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用しうる。添加物としては、以下のものに限定するものではないが、着色料（植物色素、合成色素等）、香料（天然香料等）、甘味料（ステビア、アステルパーム等）、保存料（酢酸ナトリウム、ソルビン酸等）、乳化剤（コンドロイチン硫酸ナトリウム、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）、酸化防止剤（EDTA二ナトリウム、ビタミンC等）、pH調整剤（クエン酸等）、化学調味料（イノシン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム等）、増粘剤（キサンタンガム等）、膨張剤（炭酸カルシウム等）、消泡剤（リン酸カルシウム）、結着剤（ポリリン酸ナトリウム等）、栄養強化剤（カルシウム強化剤、ビタミンA等）、等が挙げられる。その他、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、食物繊維、酸味料、安定剤、フレーバー、天然物エキスなどを配合しうる。配合量は、添加物としての効果が発揮される量であり、適宜選択可能である。
【００６６】
＜医薬組成物＞
本発明はさらに、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス性腸障害を予防、軽減又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００６７】
或いは、本発明は、上記の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、被験体のストレス性腸障害、とりわけストレス性下痢、を予防、軽減又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００６８】
いずれの医薬組成物においても、本発明の有効成分は、ストレス性腸障害、とりわけストレス性下痢を抑制する効果を有する。
【００６９】
CP2305s株、又はCP2305株又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、又はその菌体処理物は、上記のとおり、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経抑制を阻害する作用、すなわち抗ストレスにより腸管運動を正常に維持する働きを有すること、及び、大腸クロライドチャネルを抑制し、それによって腸管での水分過剰分泌を抑制する作用を有し、ストレス性下痢を抑制、軽減又は改善する。ストレスは、ストレスに過敏な腸障害をもたらし、該障害の症状を悪化させる。本発明のCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、或いはその菌体処理物は、ストレス性腸障害、とりわけストレス性腸障害の頻発の下痢症状を抑制するため、ストレス性腸障害の予防、軽減又は治療のために有効である。この効果は、市販されるいずれのラクトバチルス・ガセリ株製剤と比較しても高いことが確認された。
【００７０】
医薬組成物は、上記効果を発揮するかぎりいずれの剤型に製剤化しうる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤、乳濁剤、発酵乳剤などであり、経口製剤、坐剤など、特に経口製剤が好ましい。
【００７１】
本発明の有効成分に、薬学的に許容される通常用いられる賦形剤、担体、希釈剤、崩壊剤、結合剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、滑沢剤、保存剤、界面活性剤、甘味料、矯味剤、芳香剤、酸味料、着色剤などの添加物を剤型に応じて配合し、常法に従って製造することができる。これらの物質の例は、上記の物質である。
【００７２】
医薬組成物中の上記のCP2305s株、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株などの派生株、及び/又は菌体処理物の総量が、以下のものに限定されないが、該菌の生菌量として、105〜1012cfu/g、好ましくは106〜約1012cfu/g、より好ましくは107〜1012cfu/gに相当する量であるか、或いは、該菌の量として、例えば0.001重量％〜10重量％、好ましくは0.01〜5重量％となるような量である。その有効量は、添加量と下痢症状の軽減効果との関係に基づいて、当業者が適宜設定することが可能である。
【００７３】
好ましい投与法は、経口投与又は坐剤投与である。
本発明の医薬組成物は、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防、ストレス時の下痢症状の悪化、の予防、軽減又は治療に有効である。
【００７４】
以下に実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に制限されないものとする。
【００７５】
［実施例１］
＜低温耐性株の育種＞
内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に入った10mlの培養液（食添培地）にラクトバチルス・ガセリCP2305株（菌数103個〜104個）を接種し、37℃、19時間培養を行った。
【００７６】
19時間の培養後、この内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管を、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に挿入し(氷上)急速冷却し5時間保持した。この培養、および冷却を80回繰返し、低温耐性の高い株を育種した。
【００７７】
本明細書において「氷上」とは、内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に10mlの培養液を入れて、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に試験管を挿入して冷却している状態をいう。
なお、本明細書で使用する「食添培地」の組成は下記のとおりである（表１）。
【表１】
2014113137.tif 000003
【００７８】
＜低温耐性株の評価＞
本発明の低温耐性株の評価における上記低温耐性株の生存性の評価を、下記の式のように、低温曝露前後の生菌率（本明細書において「生存率」ともいう。）で評価した。具体的には、評価対象株（菌数103個〜104個）を内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管に入った10mlの培養液（食添培地）に接種し、37℃、19時間培養を行った。19時間の培養後、この内径15mmのpolypropylene製の容量15mlの試験管を、試験管内の液面以上となる十分な量の氷の中に試験管を挿入して(氷上)にて急速冷却し、氷上で5時間保持した後、急速冷却前(低温暴露前)の生菌数と氷上で5時間保持後(低温曝露後)の生菌数を比較し下記式で生菌率を評価する。
【００７９】
生菌率は、少なくとも60%以上、好ましくは65%以上、さらに好ましくは、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上の生菌率を示す株が好ましい。
生菌率(%)=低温曝露後の生菌数/低温曝露前の生菌数×100
上記生菌数のカウント方法は、培養液をMRS寒天培地またはBCP加プレートカウント寒天培地に塗抹し、37℃微好気で48時間培養を行い、コロニーをカウントし生菌数を測定し評価した。
【００８０】
上記育種および評価により、60%以上の生菌率を示すCP2305s株などの数種の耐性株を取得した(図1)。
【００８１】
［実施例２］
＜低温耐性株の製造方法＞
なお、低温耐性株の製造方法としては、例えば、CP2305株は10℃以下で生存率が低くなる傾向を示す。このため、低温耐性株の製造方法としては、対象株を、培養液(例:食添培地)にて適度な培養温度(例:37℃程度)で程度な培養時間(例:19時間程度)培養し、その後、培養液を10℃以下、好ましくは7℃以下、より好ましくは5℃以下、さらに好ましくは3℃以下、2℃以下、1℃以下の温度に適度な時間（例：5時間）曝露して、また、必要に応じ、これらの培養、低温曝露を繰り返すことによって、目的とする温度である低温に耐性がある株を製造する。
【００８２】
［実施例３］
SD雄ラット（４週齢、日本チャールス・リバー社製）を12時間毎の明暗周期下（8時より12時間点灯）で１週間飼育後、試験菌体配合餌を以下のように3週間自由摂取させた。
a)餌は、オリエンタル酵母株式会社のCRF-1粉末餌を使用した。
b)上記餌（CRF−１）25gに対し、菌数2.0×1010個が含まれる試験菌体の凍結乾燥粉末を配合（餌CRF-1：25gに対し、凍結乾燥粉末0.25g）し、試験菌体配合餌とした。
c)試験菌体配合餌を３週間自由摂取させた。
d)この試験による菌体摂食量はおおよそ2.0×1010個/日と推定された。
e)各群19匹に摂取させた。
【００８３】
3週間後、CRF（Corticotropin Releasing Factor、アナスペック社製、USA）溶液を125μg/kg腹腔内投与し、ストレス性下痢を誘発させ、CRF投与後の100分間の糞便状況を以下に記載する下痢スコアにて評価し、試験菌体のストレス性下痢抑制を評価した。
【００８４】
下痢スコアの定義は、以下のとおりである。
(a)CRF投与後の100分間の糞便を10分間隔で10回採取する。
(b)各回で採取した糞便の重量をg単位で測定する(各回の糞便重量(i値))。例えば、ある回の糞便重量が0.4gであった場合は、i値=0.4とする。
(c)各回で採取した糞便について、糞便の水分状況及び形状から図5に示す糞便スコア基準により、各回の糞便スコアとして数値化する（各回の糞便スコア（ii値））
(d)各回の糞便重量（i値）×各回の糞便スコア（ii値）を求める。
(e)各回で求めた、糞便重量（i値）×糞便スコア（ii値）の10回分の総和を「下痢スコア」と定義する。
(f)これによって、CRF投与後100分間の糞便状況を、プラセボ（CRF-1のみ）も含めて評価した（Dunnetの多重比較により評価）。
【００８５】
［実施例４］
上記実験および定義された下痢スコアに基づいて、下記の効果を確認した。
その結果、ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（殺菌体）は、プラセボ（CRF-1のみ）と比較して、有意にストレス性下痢を抑制した（図2）。下痢抑制効果は、CP2305株（生菌体及び殺菌体）と比べて同等の効果を有している。
【００８６】
上記実施例3の結果から、乳酸菌において、実施例3における下痢スコアにおいて11以下の乳酸菌を得ることが証明された。下痢スコアは、好ましくは10以下、さらに好ましくは9以下である。
【００８７】
さらに、実施例3の結果から、下痢スコアにおいてプラセボに対する下痢スコアの低減割合が90％以下の乳酸菌が得られることが証明された。下痢スコアの低減割合は好ましくは85％以下、より好ましくは、80％以下が好ましい（下痢スコア低減割合＝評価対象株下痢スコア/プラセボ下痢スコア×100）。
【００８８】
［実施例５］
比較対象とした寄託菌株Ａ菌体の結果は、CP2305株と同菌数投与した結果である。また、市販生菌製剤Ｂの結果は、ヒト1日分の摂取用量の重量をラットの体重換算で、単位体重あたり同量となるよう投与した結果である（図6）。本結果から従来下痢抑制作用があるとされている市販生菌剤などよりストレス性下痢を抑制する作用がCP2305株であることが証明され、CP2305s株もCP2305株と同様のストレス性下痢の抑制効果があることからCP2305s株の優位性が証明された。
【００８９】
［実施例６］
さらにまた、CRF投与4時間後に解剖を実施し、結腸組織をISOGEN(ニッポンジーン)およびRNeasy Mini Kit(Qiagen,USA)にて総RNAを抽出後、遺伝子発現をRat whole genome ver. 3 (G4847B,Agilent,USA)で網羅的に解析を行った。その結果、プラセボ群でCRF投与後に増加するクロライド・チャネル関連遺伝子を、CP2305株投与群では抑制することを確認した（図3）。従って、CP2305株はクロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していると考えられ、また、同様の下痢抑制効果を有するCP2305s株もクロライドチャネルを抑制し、水分の移動を制御していると考えられる。
【００９０】
［実施例７］
SD系雄ラット（４週齢、株式会社紀和動物製）を12時間毎の明暗周期下（8時より12時間点灯）で１週間飼育後、CP2305株配合餌もしくは未配合対照粉餌を3週間自由摂食させた。実験当日はラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔し、頚静脈に静脈投与用のカニューレを挿入し、その後、下部大腸を神経支配する骨盤（副交感）神経を銀電極で吊上げ、その電気活動を測定した。測定値が安定した時期にCRF溶液（1μg/kg）を頚静脈投与し骨盤神経の電気活動（PNA）の変化を電気生理学的に測定した。データは5分間毎の5秒あたりの発火頻度の平均値にて解析し、頚静脈投与直前の値（0分値）を100％として百分率で示した。その結果、ストレスホルモン(CRF）投与することで、ラット大腸を神経支配する骨盤（副交感）神経活動が抑制されることを確認した。更にはCP2305株の投与がストレス誘発の骨盤(副交感)神経抑制を阻害することを確認した（図4）。従って、CP2305株の投与により、ストレス時の腸管機能が正常に保たれるものと考えられ、また、同様の下痢抑制効果を有するCP2305s株も同様の効果があると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明のラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はCP2305株もしくはCP2305s株からの低温耐性派生株、その菌体処理物、或いはその混合物は、ストレス誘発性骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害して腸運動を正常に保持するとともに、被験体のストレス性腸障害、とりわけ該障害の下痢症状、を抑制、軽減又は改善することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年1月20日(2014.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株。
【請求項２】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の軽減剤。
【請求項３】
前記CP2305s株、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株が、生菌体又は殺菌体である、請求項2に記載の軽減剤。
【請求項４】
前記菌体処理物が、乾燥菌体、破壊菌体、破砕菌体又は発酵乳である、請求項2又3に記載の軽減剤。
【請求項５】
ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の軽減剤。
【請求項６】
大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項2〜5のいずれか1項に記載の軽減剤。
【請求項７】
ストレス性下痢の改善剤である、請求項2〜6のいずれか1項に記載の軽減剤。
【請求項８】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤を動物飼料成分と配合して動物飼料を製造する工程を含む、動物飼料の製造方法。
【請求項９】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する動物飼料。
【請求項１０】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤を含有する食品添加剤又は動物飼料添加剤。
【請求項１１】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する食品添加物。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を含有する飲食品。
【請求項１３】
機能性飲食品である、請求項12に記載の飲食品。
【請求項１４】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤を食品用の担体、賦形剤又は希釈剤と混合し、場合により食品添加剤をさらに混合して、機能性飲食品を製造することを含む、機能性飲食品の製造方法。
【請求項１５】
ラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）もしくはCP2305s株から派生した派生株、の生菌体又は殺菌体、それらの菌体処理物、或いはそれらの混合物、を有効成分として含有することを特徴とする、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
請求項2〜7のいずれか1項に記載の軽減剤と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤又は希釈剤とを含む、腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患を予防、軽減又は治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性腸障害の軽減作用を有し、かつCP2305株と異なる乳酸菌。
【請求項１８】
前記ストレス性腸障害の軽減作用が、明細書の実施例3記載の下痢スコアでラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）と同等以上のストレス性下痢抑制作用を有する、請求項17記載の乳酸菌。
【請求項１９】
明細書の実施例3記載の方法によって下痢スコアを評価した場合においてプラセボと比較して有意（ｐ＜0.05vsプラセボ）にストレス性下痢を抑制しかつCP2305株と異なる乳酸菌。
【請求項２０】
氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、請求項17〜19のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２１】
ストレスによる骨盤（副交感）神経活動の抑制を阻害する作用を有する、請求項17〜20のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２２】
大腸クロライドチャネルを抑制することによって水分分泌を抑制する作用を有する、請求項17〜21のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２３】
上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、請求項17〜22のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２４】
上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）、ラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）の派生株又はラクトバチルス・ガセリCP2305s株（NITE BP-1405）の派生株である請求項17〜23のいずれか1項に記載の乳酸菌。
【請求項２５】
腸管での水分過剰分泌、ストレス性腸障害、過敏性腸症候群、下痢型過敏性腸症候群又は、炎症性腸疾患の予防又は軽減に用いるための請求項17〜24のいずれか１項記載の乳酸菌。
【請求項２６】
乳酸菌を10℃以下の温度に曝露し、生存した低温耐性株を選抜し、育種すること、必要に応じてこの操作を繰り返すこと、及び生存した低温耐性株を回収することを含む、乳酸菌低温耐性株の製造方法。
【請求項２７】
乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌、又はラクトバチルス・ガセリCP2305株（FERM BP-11331）である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
氷上で5時間保持したときの生存率が、60％以上である低温耐性を有する、乳酸菌。
【請求項２９】
上記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリ種に属する乳酸菌であることを特徴とする、請求項28記載の乳酸菌。