(57)【要約】      （修正有）【課題】エンドトキシンを対象として試料をアッセイする方法を提供する。【解決手段】（ａ）アッセイの対象となる試料をＬＡＬ試薬と接触させ、エンドトキシンが上記試料中に存在する場合にはエンドトキシンが前記試薬と反応して凝固生成物が形成されるステップと、（ｂ）光ファイバーの端部を前記試料と接触させ、凝固生成物が存在する場合には凝固生成物が上記光ファイバーの上記端部上に形成する及び／又は上記端部に結合し、上記光ファイバーの上記端部がある光学的厚さを有し、凝固生成物が上記光ファイバーの上記端部上に形成する及び／又は上記端部に結合すると、上記光学的厚さが当初の厚さから増加するステップと、（ｃ）上記試料との接触後、上記光ファイバーの上記端部における上記光学的厚さを測定するステップとを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシンを対象として試料をアッセイする方法であって、前記方法は、
（ａ）アッセイの対象となる試料をＬＡＬ試薬と接触させ、エンドトキシンが前記試料中に存在する場合にはエンドトキシンが前記試薬と反応して凝固生成物が形成されるステップと、
（ｂ）光ファイバーの端部を前記試料と接触させ、凝固生成物が存在する場合には凝固生成物が前記光ファイバーの前記端部上に形成する及び／又は前記端部に結合し、前記光ファイバーの前記端部がある光学的厚さを有し、凝固生成物が前記光ファイバーの前記端部上に形成する及び／又は前記端部に結合すると、前記光学的厚さが当初の厚さから増加するステップと、
（ｃ）前記試料との接触後、前記光ファイバーの前記端部における前記光学的厚さを測定し、前記当初の厚さからの光学的厚さの増加はエンドトキシンの存在を示し、光学的厚さが増加しないことはエンドトキシンが存在しないことを示すステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料中のエンドトキシン濃度を定量するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料受け入れチャンバー内に前記試料を配置するステップと、前記試料を、前記試料受け入れチャンバーから、ＬＡＬ試薬を有する反応チャンバーに受け渡し、前記光ファイバーの前記端部が前記反応チャンバー内で前記試料と接触するステップと、前記試料との接触後、前記光ファイバーの前記端部における前記光学的厚さを測定するステップとを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
複数の光ファイバーの前記端部を前記試料と接触させるステップと、前記試料との接触後、前記複数の光ファイバーの前記端部における前記光学的厚さを測定するステップとを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
複数の光学的端部が束状に配置され、前記方法が、前記複数の光ファイバーの前記端部を前記試料と接触させるステップと、前記試料との接触後、前記複数の光ファイバーの前記端部における前記光学的厚さを測定するステップとを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
エンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットであって、前記キットは、端部を有する光ファイバーを備えるバイオセンサーとハウジングとを備え、
前記ハウジングは基部とキャップとを備え、
前記基部は、溝と、側壁を有する反応チャンバーとを備え、
前記反応チャンバーは、前記側壁を貫通する開口部を有し、
前記開口部は溝と連通し；
前記キャップは、試料受け入れチャンバーと突起部とを備え、
前記突起部は、側壁と突起部の前記側壁を貫通する少なくとも１つの開口部とを備え、
前記キャップは、前記基部と脱着可能に嵌合可能である、キット。
【請求項７】
ＬＡＬ試薬と、端部を有する光ファイバーを備えるバイオセンサーとを更に具備し、
前記反応チャンバーが、その中にＬＡＬ試薬を有し、
前記光ファイバーが、前記基部の前記溝の中に配置され、
前記光ファイバー端部が、前記開口部を通じて前記反応チャンバーと連通している、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
複数のバイオセンサー及び複数の反応チャンバーを備え、各反応チャンバーが、光ファイバーの前記端部と連通している、請求項６又は７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]細菌エンドトキシンは、グラム陰性菌から産生、分泌、及び／又は放出されうる。細菌エンドトキシンは、様々な物質、例えば水、食品、医薬製品、及び非経口処方物等を汚染し得る。細菌エンドトキシンは、ヒトにとって危険であり、また時に致命的となり得る。業界の中でもとりわけ医薬品、医療機器、食品、及び飲料品の各業界の製造業者は、自社の製品が、享受者又は消費者の健康を損ねるような濃度の汚染物質を含まないことを検証する基準を満たさなければならない。例えば、医薬品及び医療機器の特定の製造業者は、自社の製品が検出可能な濃度のグラム陰性菌エンドトキシンを含まないことを立証しなければならないだろう。さらに、グラム陰性菌に感染した可能性のある患者に対して適切な医学的な治療を速やかに開始するために、エンドトキシンが存在するかどうか、また可能な場合には、患者内のエンドトキシン濃度をできる限り早期に確認することが重要である。
【０００２】
[0002]エンドトキシンの代表的なアッセイ法は、カブトガニ・アメボサイト・ライセート（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）を利用する。ＬＡＬは、エンドトキシンに曝露されて、ゲルクロットアッセイ法、エンドポイント比濁測定法、動力学的比濁測定法、又はエンドポイント発色法により分析される生成物を生成する凝固カスケードを引き起こす。
【０００３】
[0003]しかし、エンドトキシンの存否及び／又は濃度を検出する方法及びシステムについて改善する必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]本発明の実施形態は、エンドトキシンを対象として試料をアッセイする方法であって、（ａ）アッセイの対象となる試料をＬＡＬ試薬と接触させるステップであり、エンドトキシンが試料中に存在する場合にはエンドトキシンが試薬と反応し、凝固生成物が形成されるステップと、（ｂ）光ファイバーの端部を試料と接触させるステップであり、凝固生成物が存在する場合には凝固生成物が光ファイバーの端部上に形成する及び／又は端部に結合し、光ファイバーの端部がある光学的厚さを有し、凝固生成物が光ファイバーの端部上に形成する及び／又は端部に結合するときに光学的厚さが当初の厚さから増加するステップと、（ｃ）試料との接触後、光ファイバーの端部における光学的厚さを測定するステップであり、当初の厚さからの光学的厚さの増加はエンドトキシンの存在を示し、光学的厚さが増加しないことはエンドトキシンが存在しないことを示すステップとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、試料中のエンドトキシン濃度を定量するステップを含む。
【０００５】
[0005]いくつかの実施形態では、この方法は、複数の光ファイバーの端部を接触させるステップと、試料との接触後、複数の光ファイバーの端部における光学的厚さを測定するステップとを含む。複数の光ファイバーを含む方法に関するこのような実施形態では、ファイバーは個別に利用され得る、及び／又はファイバーは束状に構成され得る。
【０００６】
[0006]別の実施形態では、エンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットが提供され、該キットは、端部を有する光ファイバーを備えるバイオセンサーとＬＡＬ試薬とを具備する。
【０００７】
[0007]なおも別の実施形態では、エンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットが提供され、該キットはハウジングを備え、ハウジングは基部とキャップとを備え、基部は、溝と、側壁を有する反応チャンバーとを備え、チャンバーは、側壁を貫通する開口部を有し、開口部は、溝と連通し、キャップは、試料受け入れチャンバーと突起部とを備え、突起部は、側壁と、突起部の側壁を貫通する少なくとも１つの開口部とを備え、キャップは、基部と脱着可能に嵌合可能である。より好ましい実施形態では、反応チャンバーはその中にＬＡＬ試薬を有し、及び／又は光ファイバーは基部の溝内に配置され、光ファイバーの端部は、開口部を通じて反応チャンバーと連通している。
【０００８】
[0008]本発明の別の実施形態によるエンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットは、端部を有する光ファイバーを備えるバイオセンサー、ＬＡＬ試薬、及びハウジングを具備し、ハウジングは基部とキャップとを備え、基部は、溝と、側壁を有する反応チャンバーとを備え、チャンバーは、側壁を貫通する開口部を有し、開口部は、溝と連通し、キャップは、試料受け入れチャンバーと突起部とを備え、突起部は、側壁と突起部の側壁を貫通する少なくとも１つの開口部とを備え、キャップは、基部と脱着可能に嵌合可能であり、反応チャンバーは、その中にＬＡＬ試薬を有し、光ファイバーは基部の溝内に配置され、光ファイバーの端部は、開口部を通じて反応チャンバーと連通している。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
[0009]図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の実施形態によるアッセイで使用するのに適する、説明的な光学アセンブリを示す。
[0010]図２は、本発明の実施形態によるアッセイにおいて、異なるエンドトキシン濃度における用量反応を示す。
[0011]図３は、本発明の実施形態による、異なるバイオセンサー及び異なる試料チャンバーを用いたアッセイにおいて、異なるエンドトキシン濃度における用量反応を示す。図３Ａ及び図３Ｂは、ポリスチレン製試料チャンバー及びポリプロピレン製試料チャンバーをそれぞれ有する、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）で官能化されたバイオセンサーを示す図である。図３Ｃ及び図３Ｄは、ポリスチレン製試料チャンバー及びポリプロピレン製試料チャンバーをそれぞれ有する、ＳｉＯ２で官能化されたバイオセンサーを示す。
[0012]図４は、本発明の実施形態による、試料を揺動するステップを含むアッセイ（図４Ａ）、及び試料を揺動するステップを含まないアッセイ（図４Ｂ）において、異なるエンドトキシン濃度における用量反応を示す。
[0013]図５は、本発明の実施形態によるキットを示し、基部とキャップとを具備するハウジングを説明し、基部は、溝と、側壁を有する反応チャンバーとを備え、チャンバーは、側壁を貫通する開口部を有し、キャップは、試料受け入れチャンバーと突起部とを備え、突起部は、側壁と、突起部の側壁を貫通する少なくとも１つの開口部とを含み、キャップは、基部と脱着可能に嵌合可能である。図５Ａは、斜視図及び部分分解図を示し、図５Ｂ及び５Ｃは、基部の上面図及び正面図をそれぞれ示し、また基部の溝に配置された端部を有する光ファイバーも示しており、端部は開口部を通じて反応チャンバーと連通している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[0014]本発明の実施形態に基づき、エンドトキシンを対象として試料をアッセイする方法であって、（ａ）アッセイの対象となる試料をＬＡＬ試薬と接触させるステップであり、エンドトキシンが試料中に存在する場合にはエンドトキシンが試薬と反応し、凝固生成物が形成されるステップと、（ｂ）光ファイバーの端部を試料と接触させるステップであり、凝固生成物が存在する場合には凝固生成物が光ファイバーの端部上に形成する及び／又は端部に結合し、光ファイバーの端部がある光学的厚さを有し、凝固生成物が光ファイバーの端部上に形成する及び／又は端部に結合するときに光学的厚さが当初の厚さから増加するステップと、（ｃ）試料と接触した後、光ファイバーの端部における光学的厚さを測定するステップであり、当初の厚さからの光学的厚さの増加はエンドトキシンの存在を示し、光学的厚さが増加しないことはエンドトキシンが存在しないことを示すステップとを含む、方法が提供される。
【００１１】
[0015]いくつかの実施形態では、この方法は、試料中のエンドトキシン濃度を定量するステップを含む。
【００１２】
[0016]いくつかの実施形態では、この方法は、複数の光ファイバーの端部を接触させるステップと、試料との接触後、複数の光ファイバーの端部における光学的厚さを測定するステップとを含む。複数の光ファイバーを含む方法に関するこのような実施形態では、ファイバーは個別に利用され得る、及び／又はファイバーは束状に構成され得る。
【００１３】
[0017]１つの実施形態では、エンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットが提供され、該キットは、端部を有する光ファイバーを備えるバイオセンサーとＬＡＬ試薬とを具備する。
【００１４】
[0018]別の実施形態では、エンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットが提供され、該キットは、基部とキャップとを備えるハウジングを具備し、基部は、溝と、側壁を有する反応チャンバーとを備え、チャンバーは、側壁を貫通する開口部を有し、開口部は、溝と連通し、キャップは、試料受け入れチャンバーと突起部とを備え、突起部は、側壁と、突起部の側壁を貫通する少なくとも１つの開口部とを備え、キャップは、基部と脱着可能に嵌合可能である。より好ましい実施形態では、反応チャンバーはその中にＬＡＬ試薬を有し、及び／又は光ファイバーは基部の溝内に配置され、光ファイバーの端部は、開口部を通じて反応チャンバーと連通している。
【００１５】
[0019]別の実施形態では、エンドトキシンを対象として試料をアッセイするキットが提供され、該キットは、端部を有する光ファイバーを備えるバイオセンサー、ＬＡＬ試薬、及びハウジングを具備し、ハウジングは基部とキャップとを備え、基部は、溝と、側壁を有する反応チャンバーとを備え、反応チャンバーは、側壁を貫通する開口部を有し、開口部は、溝と連通し、キャップは、試料受け入れチャンバーと突起部とを備え、突起部は、側壁と、突起部の側壁を貫通する少なくとも１つの開口部とを備え、キャップは、基部と脱着可能に嵌合可能であり、反応チャンバーはその中にＬＡＬ試薬を有し、光ファイバーは基部の溝内に配置され、光ファイバーの端部は、開口部を通じて反応チャンバーと連通している。
【００１６】
[0020]キットの好ましい実施形態では、キットには、複数の光ファイバーが含まれる。より好ましくは、キットには、複数の反応チャンバーが含まれ、各チャンバーには、少なくとも１つの光ファイバーが含まれる。
【００１７】
[0021]エンドトキシンを検出する従来型のシステムには、１つ又は複数の以下の欠点、例えば、凝集形成の有無の判断が主観的な判断となり得る、及び／又は試料を乱すと、凝集形成が妨害される又は凝集が破壊されうる；濁度測定法は、試料又は試料チャンバー中に不純物が存在すると、その影響を受けうる；試薬添加、及び検出開始のタイミングは、慎重に時間設定されなければならない、比色定量ラベル及び／又は二次色素を必要とする；基質の色の変化を測定しなければならない、及び／又はリアルタイムモニタリングではなくエンドポイント測定に限り可能であるという欠点がある。
【００１８】
[0022]対照的に、本発明に基づけば、再現性及び信頼性のある、ラベル不要なアッセイ法が提供され、制御されたタイミングを伴う、ユーザーによる最低限のステップしか要求しない。濁度又は基質の色を測定する必要はない。このアッセイ法は、ゲル−クロット法のＬＡＬ試薬及び比濁測定タイプＬＡＬ試薬のいずれについても、これらと共に使用するのに適する。さらに、定量的なリアルタイムデータを、迅速に取得することができる。
【００１９】
[0023]本発明に基づけば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、試料中のエンドトキシンの存否及び／又は量が求められる。同法は、２つの表面、すなわちバイオセンサー端部表面（層を形成する結合物質を含み得る）、及び内部参照層から反射される白色光の分析を含む、ラベルを用いない技術である。バイオセンサー端部に物質又は分子が結合すると、端部で光学的厚さが増加し、その結果、端部における層の厚さの変化の直接的な指標である波長シフトを引き起こす。未結合の物質又は分子、周辺媒体の屈折率変化、及び／又は流速の変化は、端部における層の厚さに影響を及ぼさない。伝統的に、ＢＬＩが、分析対象物及び分析対象物結合分子と共に用いられてきたが、この場合一方の種類の分子（例えば、分析対象物結合分子）がバイオセンサー端部に固定化され、そしてバイオセンサー端部は試料ボリューム内に配置され、また他方の種類の分子（例えば、分析対象物分子）は、試料ボリューム内に存在する場合には、固定化された分子と特異的に結合して、端部における層の厚さが増加する。
【００２０】
[0024]しかし、本発明の発明者らは、驚くべきことに、エンドトキシンアッセイにおいて、分析対象物及び分析対象物結合分子を用いず、また一方の種類の分子を端部に固定化して試料内の他方の種類の分子と特異的に結合させることをしなくても、ＢＬＩが利用可能であることを見出した。むしろ、エンドトキシンアッセイにおいて、凝固カスケード生成物は、バイオセンサー端部とは分離及び独立して形成可能であり、そして当該生成物は、その後バイオセンサーの端部と結合する、及び／又は当該凝固カスケード生成物は、バイオセンサーの端部上に形成可能である。
【００２１】
[0025]本発明の実施形態は、様々な用途、例えばライン上、ライン近傍、検査室、及び医療現場におけるエンドトキシン汚染を試験する用途で利用可能であり、また業界の中でもとりわけ医薬品、医療機器、食品、飲料品業界、及び電子産業の製造業者にとって特に有用である。
【００２２】
[0026]幅広く様々な試料が、本発明の実施形態により分析可能であり、また試料源の範囲は、例えば水、入荷原材料（尿及び医薬製品の調製で用いられる出発物質等、ただしこれらに限定されない）、及び生体試料に及ぶ。生体試料として生体液が挙げられ、これには、生物に関連した任意の処理液又は未処理液、尿、脳脊髄液、腹水、唾液、並びに、全血、臍帯血、及び保存血又は新鮮血を含む血液；処理された血液、例えば生理食塩水、栄養剤、及び／又は抗凝固剤溶液を含む、ただしこれらに限定されない少なくとも１つの生理的溶液により稀釈された血液等；例えば血小板濃縮物（ＰＣ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）、血小板を含まない血漿、血漿、新鮮な凍結血漿（ＦＦＰ）、血漿から得られる成分、濃縮赤血球（ＰＲＣ）、バフィーコート（ＢＣ）等の血液成分；血液若しくは血液成分に由来する、又は骨髄に由来する血液製剤；幹細胞；血漿から分離され、生理的溶液又は凍結保護液中に再懸濁された赤血球；並びに血漿から分離され、生理的溶液又は凍結保護液中に再懸濁された血小板が含まれる。本明細書で用いる場合、血液製剤又は生体液とは上記成分を意味し、またその他の手段により取得され、類似した特性を有する類似した血液製剤又は生体液も意味する。上記のような生体試料は、次の成分、例えばＥＤＴＡ及びヘパリンの１つ又は複数を追加成分として含み得る（例えば、血漿を含む生体試料は、ＥＤＴＡ及び／又はヘパリンも含み得る）。
【００２３】
[0027]本発明に基づき、下記の定義が用いられる。
【００２４】
[0028]ＬＡＬ試薬。ＬＡＬ試薬には、カブトガニ等の甲殻類（例えば、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）種、タキプレウス（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ）種、及びカルシノスコルピウス（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ）種）から得られる任意のアメボサイト・ライセート（ａｍｅｂｏｉｄ  ｌｙｓａｔｅ）、並びに合成ＬＡＬ試薬が含まれる。様々なＬＡＬ試薬が、本発明で使用するのに適し、また適するＬＡＬ試薬は当技術分野において公知である。適する市販のＬＡＬ試薬は、例えばＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，  Ｉｎｃ．、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ、及びＬｏｎｚａから入手可能である。ＬＡＬ試薬は一般的に凍結乾燥され、そしてエンドトキシンを含まない水又は低エンドトキシン水（ＬＥＷ）で戻される（「ＬＡＬ試薬水」と呼ばれることもある）。
【００２５】
[0029]バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）。上記のとおり、ＢＬＩは、ラベル不要の技術であり、２つの表面、すなわちバイオセンサー端部表面（層を形成する結合物質を含み得る）、及び内部参照層から反射される白色光の分析を含む。バイオセンサー端部に物質又は分子が結合すると、端部で光学的厚さが増加し、その結果、端部における層厚変化の直接的な指標である波長シフトを引き起こす。本発明の実施形態に基づき用いられるＢＬＩ技術は、例えば、米国特許第５８０４４５３号及び同第７３９４５４７号、並びに米国特許出願第２０１０／００９３１０６号及び国際公開第２００６／１３８２９４号パンフレットに開示されている。本発明の実施形態による端部を官能化したバイオセンサーを提供する際には、様々な化学作用が使用に適する。
【００２６】
[0030]試料ボリュームを、例えば反応チャンバー若しくは反応槽、試料容器、又は、反応チャンバー、反応槽、及び／若しくは試料容器を備えるキットに収納する際には、様々な材料が使用に適する。望む場合には、当該材料は、例えばＬＡＬ試薬及び／又はＬＡＬを含まない水を収納するのにも適すると考えられる。本発明に基づき使用可能な材料（例えば、容器、チャンバー及び／又は槽を形成するための）は、ポリマー又はガラスが一般的であり、またこれには、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルアセテート、ポリカーボネート、ガラス（ホウケイ酸ガラスを含む）、及びポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）が含まれる。いくつかの実施形態では、容器、チャンバー、及び／又は反応槽は、所定の物質でコーティングされる（又は例えば、非特異的結合を低減するためにコーティングされ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされる）。適する物質及びコーティング物は、市販の物質及びコーティング物を含め、当技術分野において公知である。
【００２７】
[0031]以下で議論されるように、いくつかの実施形態では、バイオセンサー端部表面（例えば、端部の化学的性質）は、反応槽表面より親水性であるのが望ましいであろう。
【００２８】
[0032]アッセイは、様々なフォーマットで実施可能であり、例えば試料容器、反応チャンバー、及び／又は反応槽は、チューブ、キュベット、カートリッジ、ウェル、又はマルチウォールプレート（例えば、９６穴又は３８４穴プレート）等の支持体を備え得る。試料は、２つ以上の用途、例えば研究実験室用途、及び／又は医療機器試験、及び／又は医薬品試験で試験可能である。
【００２９】
[0033]本発明の実施形態は、静止した液体試料又は流動する液体試料について実施可能である。
【００３０】
[0034]試料は、任意の適する容量であってよい。一般的な試料容量は約４μＬ〜約２５０μＬの範囲であるが、より大きい又は小さい容量も利用可能である。
【００３１】
[0035]アッセイは、任意の適する温度で実施可能であり、一般的に、温度範囲は約３０℃〜約４５℃であり、またいくつかの実施形態では、好ましい温度は、３７±０．５／１℃である。
【００３２】
[0036]アッセイは、任意の適するｐＨで実施可能であり、一般的にｐＨは、約６〜約８の範囲である。
【００３３】
[0037]本発明の実施形態は、例えば閾値時間、シグモイド曲線近似（ＥＣ５０及びヒルスロープの決定）、曲線下面積（ＡＵＣ）、一次導関数、ラグタイムの決定、及び修正Ｃｔアルゴリズムを含め、様々なデータ分析法と互換性を有する。
【００３４】
[0038]本発明の実施形態は、ＢＬＩに基づく様々な市販の装置及びシステムを用いて実施可能であり、単一センサー式及び複数センサー式（例えば、１６センサー）の装置及びシステムを含み、これは非スイッチング方式又はスイッチング方式のいずれの装置及びシステムであってもよく、スイッチング方式の装置及びシステムがより好ましい。ＢＬＩに基づく好適な市販の装置及びシステムとして、オクテット（ＯＣＴＥＴ）（登録商標）装置プラットフォーム（例えば、オクテット（登録商標）ＱＫ３８４／ＲＥＤ３８４、オクテット（登録商標）ＲＥＤ９６、オクテット（登録商標）ＱＫｅ／ＱＫ）、並びにブリッツ（ＢＬＩＴＺ）（商標）システム下での、例えばフォルテバイオ（ｆｏｒｔｅＢＩＯ）（登録商標）（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹの事業部）から入手可能な装置が挙げられる。
【００３５】
[0039]一般的に、本発明の実施形態に基づき使用するＢＬＩに基づくシステムは、光源、バイオセンサーを備える光学アセンブリ、光源から光学アセンブリに延在する第１の光導波路又は光ファイバー、光学アセンブリから、該光学アセンブリで反射された光波の干渉により生じた干渉シグナルを検出するための検出器ユニットまで反射光を運ぶ第２の光導波路又は光ファイバー、及び、両ファイバーを光学的に結びつける光学カプラーを備える。光源からの光は、光学アセンブリにより方向付けされ、また光学カップリングアセンブリにより検出器に向けて反射される。好適な光源、検出器ユニット、光ファイバー、及びカップリング構成要素は、当技術分野において公知である。
【００３６】
[0040]本発明の各構成要素を下記により詳細に記載するが、その場合、類似の構成要素は類似の参照番号を有する。
【００３７】
[0041]図１Ａは、バイオセンサー２６を備える代表的な光学アセンブリを示し、光源からバイオセンサーまで延在する第１の光導波路又はファイバー３２の遠位領域の隣接部分であり、ファイバーはバイオセンサーに固定して取り付けられている。図に示されているバイオセンサーは、その下側（遠位側）及び上側（近位側）の端面上にそれぞれ形成された第１及び第２の反射面４２、４０を有する透明な光学要素３８を備える。第１の反射面４２の表面は、凝固カスケード生成物の層からなる。第２の反射面４０は、層がバイオセンサー上に方向付けされた光の一部分を反射するように機能するように、光学要素３８の屈折率より実質的に高い屈折率を有する透明な物質の層として形成される。凝固したカスケード生成物の存否、濃度、及び／又はバイオセンサーに対する結合率の測定は、バイオセンサーの２つの反射面から反射した光ビームの干渉により可能となる。その他のすべての層の厚さは同一のまま留まるので、２つの表面で反射された光波により形成された干渉波は、厚さの変化に応じて位相変化する。
【００３８】
[0042]図１Ｂは、第１の光導波路又はファイバー５２の遠位側端部に脱着可能に担持されたバイオセンサー５０を備える別の代表的な光学アセンブリを示す。図に示されているバイオセンサーは、図１Ａに示す第１及び第２の反射面４２、４０に対応する第１及び第２の反射面６２、６４を有する透明な光学要素６０を備える。図に示されているバイオセンサーには、一般的に１００ｎｍを上回り、好ましくは約２００ｎｍを上回る厚さを有する第２の光学要素６６がさらに含まれ、層６４（約３０ｎｍ未満の厚さを有するのが好ましい）は、光学要素６０及び６６の間に、図に示すとおり挟まれている。図１Ｂは、ファイバー端部上をスライドし、またファイバー上の輪状のリム又はデタント５６がアームに形成された相補的な凹所と嵌合することによりファイバーをグリップするように設計された可撓性のグリッピングアーム５４も示す。この付属物は、バイオセンサーをファイバー上に配置して、ファイバーの遠位側端部と光学アセンブリの対峙する側（上側）の間に空隙５８、一般的に約１００ｎｍ以下又は約２マイクロメーター以上の空隙を設けることができる。
【００３９】
[0043]遠位側表面と近位側表面の間、すなわち図１Ａ及び１Ｂに示した２つの反射面の間のバイオセンサーの厚さ「ｄ」は、一般的に少なくとも５０ｎｍ、及びいくつかの実施形態では、少なくとも１００ｎｍ（例えば、約１００〜約５，０００ｎｍの範囲、より一般的には、約４００〜約１，０００ｎｍ）である。代表的な屈折率及びバイオセンサーを形成するための材料として、例えば米国特許第５８０４４５３号及び同第７３９４５４７号、並びに米国特許出願第２０１０／００９３１０６号、及び国際公開第２００６／１３８２９４号に開示されているものが挙げられる。
【００４０】
[0044]いくつかの実施形態では（図示せず）、バイオセンサーは、端部コネクター（束状のファイバーを備え得る）と連結可能なディスポーザブルの検出器端部（例えば、国際公開第２００６／１３８２９４号に開示されている）を備え、ディスポーザブルの検出器端部は、光ファイバーセクション（近位側端部及び遠位側端部を有し、近位側端部は端部コネクター内のファイバー（複数可）と連結し、遠位側端部は上記で議論した２つの反射面を含む）、及びコネクター構造物を備え、またアッセイシステムは、一度に２つ以上のディスポーザブル端部（例えば、８個の端部）を有するように設計される。かかるシステムは、ファイバーアセンブリ及びコネクターの収集を行う光学カップリングアセンブリを備えることができ、また同一の光源及び／又は検出器ユニットについて異なる種類のカップリングアセンブリを使用することも可能にし、また、同一の光学カップリングアセンブリについて、異なる種類の検出器端部を使用することを可能にする。
【００４１】
[0045]図５は、本発明で使用する代表的なキット１０００を示し、該キットは、ハウジング５００を備え、ハウジングは、基部１００とキャップ２００とを備え、基部１００は、溝１２０、側壁１１０を有する反応チャンバー１０１（環状のチャンバーとして示す）を備え、チャンバーは、側壁を貫通する開口部１１１を有し、開口部は、溝と連通し；キャップ２００は、試料受け入れチャンバー（環状のチャンバーとして示す）２０１、ポート２０２、及び突起部２０５を備え、突起部２０５は、側壁２１０と突起部の側壁を貫通する少なくとも１つの開口部２１１とを含み、キャップは、基部と脱着可能に嵌合可能である。図に示されている実施形態では、基部は、試料受け入れチャンバー２０１を取り巻くカラー１０２を有し、カラーの内径は、キャップ内の突起部の外径に一般的に対応する。
【００４２】
[0046]図５Ｂ（基部の上面図）及び図５Ｃ（基部の正面図）に示すように、バイオセンサーの光ファイバーは、基部の溝の中に配置されるのが好ましく、この場合、光ファイバーの端部は開口部を通じて反応チャンバーと連通している。いくつかの実施形態では、キットは、例えばユーザーがキャップ内の試料受け入れチャンバーを経由してキットに試料を添加できるように反応チャンバー内にＬＡＬ試薬をさらに備え、この場合、試料は、試料受け入れチャンバーからポート及び突起部側壁内の開口部を通過し、試料受け入れチャンバー内に至り、ここで試料はＬＡＬ試薬と接触し、そして凝固カスケード生成物がバイオセンサーの光ファイバー端部上に形成する、及び／又は端部に結合する。
【００４３】
[0047]図に示されている実施形態では、キットは、キャップを基部と嵌合し、またキャップを基部から取り外すための保持アセンブリ３００をさらに備える。一般的に、保持アセンブリは、少なくとも１つのアーム（屈曲した端部を有する２つのアーム３０１を基部の一部として示す）、及び少なくとも１つのスロット（２つのスロット３０２をキャップの一部として示す）を備え、アーム（複数可）はスロット（複数可）を通過し、そしてアーム（複数可）の端部（複数可）はキャップ（複数可）の平面と嵌合する。保持アセンブリは、キャップ及び基部が正しく配置したときに限り、キャップが基部と嵌合するように構成されるのが好ましい。例えば、図に示されている実施形態では、キャップと基部を１８０°誤って配置することができないように、アームとスロットはずらして配置される。
【００４４】
[0048]キットは、滅菌梱包物の一部として、例えばハードケース及び／又はブリスターパック内に提供可能である。
【００４５】
[0049]様々な反応チャンバー、反応槽、試料容器、及び／又は、反応チャンバー、反応槽、及び／又は試料容器を備えるキットは、本発明で使用するのに適する。
【００４６】
[0050]下記の例は、本発明をさらに説明するが、もちろん、いかなる方法によってもその範囲が制限されるものとは解釈すべきでない。下記の実験では、エンドトキシン濃度既知の標準を、対照標準エンドトキシン（ＣＳＥ）、又は参照標準エンドトキシン（ＲＳＥ）、及び低エンドトキシン水（ＬＥＷ）を用いて作製する。実施例で別途記載しない限り、ウェルの反応ボリュームは８０μＬであり、３２０μｇの凍結乾燥されたＬＡＬ試薬を含み、対照はエンドトキシンを含まないＬＥＷのブランクであり、またアッセイは、３７℃、ｐＨ６．３で実施する。
【００４７】
[0051]実施例１、３〜６、及び８の試料は、オクテット（登録商標）ＱＫｅ装置（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹの事業部のフォルテバイオ（登録商標））を用いて、ＢＬＩにより分析した。
【００４８】
実施例１
[0052]この実施例は、本発明の実施形態に基づく試料のアッセイにおいて、様々なエンドトキシン濃度が定量可能であることを実証する。
【００４９】
[0053]ＳｉＯ２で官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許第７３９４５４７号の一般的記載に従い作製する。
【００５０】
[0054]５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度を調製する。凍結乾燥されたＬＡＬ試薬（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．；Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を、エンドトキシンを含まない水で戻し、また１０００ｒｐｍで撹拌される３８４穴ポリプロピレンプレートのウェル内で、ＲＳＥと接触させる。
【００５１】
[0055]試料をＢＬＩにより分析し、結果を図２に示す。
【００５２】
[0056]この実施例は、アッセイ感度が０．００５ＥＵ／ｍｌと低いことを示す。
【００５３】
実施例２
[0057]この実施例は、屈折計（モデル３３４６１０；Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いて、異なる濃度のエンドトキシンについて凝固したときの屈折率（ＲＩ）を測定する。
【００５４】
[0058]溶液を、エンドトキシンを含まない１．５ｍＬの微量遠心チューブ内で混合し、そして各試料２０μＬを装置の試料ステージにピペット分取する。結果は以下のとおりである。
【表１】
2014215298.tif 000002
【００５５】
[0059]この実施例は、３０００ＥＵ／ｍＬまでの範囲でエンドトキシン濃度が異なっても、凝固したときに屈折率（ＲＩ）に変化は認められず、したがってＢＬＩシグナルは、ＲＩの変化に起因しないことを実証する。
【００５６】
実施例３
[0060]この実施例は、従来方式のゲル−クロットアッセイ法と比較して、本発明の実施形態に基づき実施される、ゲル−クロット試薬を用いたＢＬＩアッセイは、より低い検出限界を有することを実証する。
【００５７】
[0061]ＳｉＯ２で官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許第７３９４５４７号の一般的記載に従い調製する。
【００５８】
[0062]５０、５、０．５、０．０５、０．００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度を調製する。凍結乾燥されたＬＡＬ試薬（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．；Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を、エンドトキシンを含まない水で戻し、１０００ｒｐｍで撹拌される３８４穴ポリプロピレンプレートのウェル内で、エンドトキシンと接触させる。
【００５９】
[0063]ゲル−クロットアッセイ法（従来方式）、及び本発明の実施形態に基づくＢＬＩアッセイ法（ゲル−クロット試薬を使用）を、５０、５、０．５、０．０５、０．００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度について実施する。凝固物が、検出可能な濃度のエンドトキシン存在下で形成する。
【００６０】
[0064]従来方式のゲル−クロットアッセイ法は、アッセイ時間が６０分経過した後、エンドトキシン濃度が５０、５、及び０．５ＥＵ／ｍＬのとき、維持された凝固物を示す。このアッセイ法は、エンドトキシン濃度が０．０５ＥＵ／ｍＬのとき、不完全な凝固を示し、エンドトキシン濃度が０．００５及び０ＥＵ／ｍＬのとき、凝固を示さない。
【００６１】
[0065]本発明の実施形態に基づき実施されるゲル−クロット試薬を用いるＢＬＩアッセイ法は、アッセイ時間が３４分経過した後、エンドトキシン濃度が、５０、５、０．５、及び０．０５ＥＵ／ｍＬのとき、凝固を示す。このアッセイ法は、エンドトキシン濃度が０．００５のとき、微小なシグナルを示し、エンドトキシン濃度が０ＥＵ／ｍＬのときシグナルを示さない。
【００６２】
[0066]この実施例は、従来方式のゲル−クロットアッセイ法とは対照的に、本発明の実施形態に基づき実施されるＢＬＩアッセイ法は、少なくとも０．０５ＥＵ／ｍｌの感度を有し、約半分の時間で結果が得られることを示す。
【００６３】
実施例４
[0067]この実施例は、本発明の実施形態に基づく試料のアッセイにおいて、様々なバイオセンサー化学及び異なるプレートが利用可能であることを実証する。
【００６４】
[0068]ＳｉＯ２で官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許第７３９４５４７号の一般的記載に従い調製し、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）で官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許出願第２０１０／００９３１０６号の一般的記載に従い調製する。
【００６５】
[0069]５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度を調製する。凍結乾燥されたＬＡＬ試薬（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．；Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を、エンドトキシンを含まない水で戻し、１０００ｒｐｍで撹拌される９６穴ポリスチレンプレート、及び３８４穴ポリプロピレンプレートのウェル内で、エンドトキシンと接触させる。
【００６６】
[0070]試料をＢＬＩにより分析し、結果を図３Ａ〜３Ｄに示す。
【００６７】
[0071]この実施例は、ポリスチレンプレート及びポリプロピレンプレートを用いて、５０、５、及び０．５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が、ＳｉＯ２で官能化された端部、及びＡＰＳで官能化された端部を有するバイオセンサーの両方により検出可能であることを示す。ＡＰＳで官能化された端部を有するバイオセンサーは、ポリスチレンプレート及びポリプロピレンプレートを用いて０．０５、及び０．００５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度も検出することができる。
【００６８】
実施例５
[0072]この実施例は、本発明の実施形態に基づき、揺動しながら、及び揺動しないで行う試料のアッセイにおいて、様々なエンドトキシン濃度が定量可能であることを実証する。
【００６９】
[0073]ＳｉＯ２で官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許第７３９４５４７号の一般的記載に従い調製する。
【００７０】
[0074]５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度を調製する。凍結乾燥されたＬＡＬ試薬（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．；Ｅａｓｔ  Ｆａｌｍｏｕｔｈ、ＭＡ）を、エンドトキシンを含まない水で戻し、１０００ｒｐｍ（揺動時）又は０ｒｐｍ（揺動無し）で撹拌される、３８４穴ポリプロピレンプレート（ウェル反応ボリュームは４０μＬ；試料対ＬＡＬ比は４：１）のウェル内で、エンドトキシンと接触させる。
【００７１】
[0075]試料をＢＬＩにより分析し、結果を図４Ａ及び４Ｂに示す。
【００７２】
[0076]この実施例では、揺動しないと反応速度は低下し、シグナルも減少するが、低い濃度の方が高い濃度よりも減速する。しかし、この実施例は、５０、５、０．５、０．０５、及び０．００５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が、本発明の実施形態に基づき、揺動する場合及びしない場合でも検出可能であることを示す。
【００７３】
実施例６
[0077]この実施例は、エンドトキシン濃度が、本発明の実施形態に基づくＢＬＩによる試料のアッセイにおいて、異なる温度で定量可能であることを実証する。
【００７４】
[0078]ＳｉＯ２で官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許第７３９４５４７号の一般的記載に従い調製する。５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度を調製する。３３℃、３５℃、３７℃、及び４１℃で、アッセイを実施する。
【００７５】
[0079]４つの温度すべてにおいて、５０、５、及び０．５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が検出可能である。０．０５ＥＵのエンドトキシン濃度は、３３℃、３５℃、及び３７℃において検出可能である。
【００７６】
実施例７
[0080]この実施例は、エンドトキシン濃度が、本発明の実施形態に基づくＢＬＩによる試料のアッセイにおいて、旋回式撹拌（ｒｐｍ）と比較して直線式撹拌（１分間当たりのストローク）を実施する、及び実施しない場合であっても、定量可能であることを実証する。
【００７７】
[0081]直線式撹拌無しの分析用として、３０００、３００、３０、３、及び０ＥＵ／ｍＬの濃度のエンドトキシンを調製する。
【００７８】
[0082]直線式撹拌有りの分析用として、３５０、３５、３．５、及び０．３５ＥＵ／ｍＬの濃度のエンドトキシンを調製する。
【００７９】
[0083]ＡＰＳで官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許出願第２０１０／００９３１０６号の一般的記載に従い調製する。
【００８０】
[0084]この実施例の試料を、直線式撹拌を用いて試料を撹拌可能なブリッツ（商標）システム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹの事業部のフォルテバイオ（登録商標））を用いて、ＢＬＩにより分析する。
【００８１】
[0085]一方の試料のセットを、１分間当たり１２００ストロークで撹拌し、他方は撹拌しない。
【００８２】
[0086]アッセイを２５℃で実施し、撹拌を受ける各分析対象試料ボリュームは４μＬであり、撹拌しない各試料ボリュームは２００μＬである。
【００８３】
[0087]この実施例は、直線式撹拌を行っても、また行わなくても試料中のエンドトキシン濃度が検出可能であることを示し、特に３０００、３００、３０、及び３ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が、撹拌無しのアッセイにおいて検出可能であること、及び３５０、３５、３．５、及び０．３５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が、直線式撹拌有りの場合に検出可能であることを示す。
【００８４】
実施例８
[0088]５０、５、０．５、０．０５、０．００５、０．０００５、及び０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度を調製する。ＡＰＳで官能化された端部を有するバイオセンサーを、米国特許出願第２０１０／００９３１０６号の一般的記載に従い調製する。
【００８５】
[0089]試料のセットを、１００ｒｐｍ、１０００ｒｐｍ、及び１４００ｒｐｍの旋回式撹拌速度で撹拌する。
【００８６】
[0090]試料をＢＬＩにより分析する。撹拌速度１００ｒｐｍで、５０、５、０．５、及び０．０５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が検出可能である。撹拌速度１０００ｒｐｍでは、５０、５、０．５、０．０５、及び０．００５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が検出可能である。撹拌速度１４００ｒｐｍでは、５０、５、０．５、及び０．０５ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン濃度が検出可能である。
【００８７】
[0091]この実施例は、本発明の実施形態に基づき、異なる撹拌速度の試料の分析において、エンドトキシン濃度が定量可能であることを実証する。
【００８８】
[0092]本実施例はまた、分析を実施するのに撹拌が不要であり、ある程度の撹拌は凝固時間を短縮するものの、高速撹拌しても必ずしも凝固をさらに加速させないことも示す。
【００８９】
[0093]公表文献、特許出願、及び特許を含む本明細書で引用されたすべての参考文献を、各参考文献が、あたかも参考として個別かつ特別に援用するべく提示されたかのように、また本明細書にそのまま記載されたかのように、これと同一の範囲まで本明細書において参考として援用する。
【００９０】
[0094]本発明を記載する文脈において（特に、下記の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つの」及び類似した指示対象語を使用する場合、それは、本明細書に別途明記しなければ、又は文脈から明らかに矛盾しなければ、単数形と複数形の両方が含まれるものと解釈される。用語「少なくとも１つの」とこれに続く１つ又は複数の項目のリスト（例えば、「少なくとも１つのＡ及びＢ」）を使用する場合、それは、本明細書に別途明記されなければ又は文脈から明らかに矛盾しなければ、リスト化された項目より選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又はリスト化された項目の２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味するものと解釈される。用語「備える」、「有する」、「含む」、及び「含有する」は、別途明記しない限り非制限的用語と解釈される（すなわち、「〜を含む、ただしこれらに限定されない」を意味する）。本明細書において数値範囲を詳細に記載する場合、本明細書に別途明記しなければ、それは、単に当該範囲内の個々の数値それぞれを個別に参照する簡便な方法として役立つように意図されており、また個々の数値それぞれは、あたかもこれを本明細書において個別に列挙したかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書に別途明記しなければ又は文脈から明らかに矛盾しなければ、任意の適する順番で実施可能である。本明細書に記載するあらゆるすべての事例、又は実例的な用語（例えば、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）を使用する場合、それは、単に本発明をより適切に説明するように意図されており、別途主張がなければ、本発明の範囲に制限を設けるものではない。本明細書のいかなる用語も、本発明の実践に必要不可欠な特許請求の範囲外の任意の要素を示すものと解釈してはならない。
【００９１】
[0095]本発明の好ましい実施形態が、本発明者らに既に知られている本発明を実施するための最良モードを含め、本明細書に記載されている。そのような好ましい実施形態の変形形態は、上記説明を閲読すれば当業者にとって明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてかかる変形形態を採用することを期待し、また本発明者らは、本明細書に特別に記載するものとは異なるやり方で、本発明を実践する狙いも有する。したがって、本発明には、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙する発明の対象のすべての改造物及び等価物が、該当する法令の許可に従い含まれる。さらに、すべての考え得る上記要素の変形形態に含まれる上記要素の任意の組み合わせが、本明細書に別途明記しなければ又は文脈から明らかに矛盾しなければ、本発明により取り込まれる。
【図１Ａ】
2014215298.tif 000003
【図１Ｂ】
2014215298.tif 000004
【図２】
2014215298.tif 000005
【図３Ａ】
2014215298.tif 000006
【図３Ｂ】
2014215298.tif 000007
【図３Ｃ】
2014215298.tif 000008
【図３Ｄ】
2014215298.tif 000009
【図４Ａ】
2014215298.tif 000010
【図４Ｂ】
2014215298.tif 000011
【図５Ａ】
2014215298.tif 000012
【図５Ｂ】
2014215298.tif 000013
【図５Ｃ】
2014215298.tif 000014
【外国語明細書】
2014215298000001.pdf