(57)【要約】【課題】水素イオン輸送活性を可逆的に制御することが可能なリポソームを提供すること。【解決手段】Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得するＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームを作製する。かかるリポソームは、リポソーム内の水素イオンを制御することが可能となり、リポソーム内に封入する薬剤や生理活性物質の安定性が保たれ、その結果、かかるリポソームを薬物送達システムに利用すると、薬剤や生理活性物質の量及び投与回数の軽減が可能になると共に薬剤や生理活性物質の作用を高め、さらには副作用を軽減することも可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得するＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソーム。
【請求項２】
ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素がバチルス属細菌由来であることを特徴とする請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
バチルス属細菌が好熱菌バチルスＰＳ３（Bacillus sp.PS3）であることを特徴とする請求項２記載のリポソーム。
【請求項４】
Ｆoａサブユニットのへリックス４の１８３番目又は１８４番目と、Ｆoｃサブユニットのへリックス２の６７番目又は６８番目がシステイン残基に置換されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のリポソーム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載のリポソームにおいて、酸化剤又は還元剤による処理によってリポソーム内の水素イオン濃度を調整する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水素イオン輸送の制御が可能なＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームに関し、より詳しくはＦoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得する、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームはリン脂質の二分子膜からなる閉鎖小胞であり、一つの分子内に親水性部分と疎水性部分とをもたせた分子から作られる複合体である。このリポソームは水に難溶な薬剤や生理活性物質等を保持できるため、薬物送達システム（Drug Delivery System:DDS）や化粧料等の分野において幅広く利用されている。しかしながら、リポソーム内の環境によっては、薬剤や生理活性物質等の安定性に影響を与え、薬剤や生理活性物質等の機能を不活性化することもあり、封入可能な薬剤や生理活性物質等が制限されていた。また、多くの薬剤や生理活性物質は電解質であり、非イオン型で膜を透過してイオン型で作用するという性質を有している。したがって、リポソーム内の水素イオン濃度を適切に制御しなければならなかったが、未だリポソーム内の水素イオン濃度を制御するための満足のいく手法が確立していないのが現状である。
【０００３】
一方、水素イオン輸送を行う酵素として、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素が知られている。この酵素は、ミトコンドリア、葉緑体、細菌の膜に存在し、水素イオンの流れでＡＴＰを合成している酵素である。ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素は、ＦoとＦ1の２つの部位からなり、Ｆo部位はａ、ｂ、ｃのサブユニットから構成され、Ｆ１部位はα、β、γ、δ、εのサブユニットから構成され、Ｆo部位とＦ１部位は共通のシャフト（γε−ｃリング）を有している。Ｆo部位では水素イオンの流れによりｃサブユニットのリング（以下、「ｃリング」ともいう。）をａｂ２に対して回転させ、Ｆ１の中でγεがα３β３に対して回転することでβサブユニットにおいてＡＴＰが合成される。逆反応としては、Ｆ１部位でＡＴＰの加水分解によりγεを回転させてｃリングが回転することで、水素イオンがｃリングとＦoａサブユニットの間を通して輸送される。
【０００４】
近年、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の構造や機能が明らかになってきており、さらなる機能解析のために、シャフトの回転を制御する方法が知られている。具体的には、葉緑体Ｆ１−ＡＴＰａｓｅのγサブユニットの調節領域を含むアミノ酸配列を、細菌由来のＦ１−ＡＴＰａｓｅのγサブユニット中に移植することを特徴とする回転の制御が可能なＦ１−ＡＴＰａｓｅの作製方法（例えば、特許文献１参照）が知られている。また、Ｆo部分とＦ１部分とが結合したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素において、Ｆo部分のｃサブユニットを構成するアミノ酸配列のＮ端側から２番目の非システイン残基がシステイン残基に置換されている改変型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素分子（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【０００５】
さらに、ＦoｂサブユニットとＦoｃサブユニットのジスルフィド結合形成によりｃリングの回転を制御することが知られている（例えば、非特許文献１参照）が、Ｆo中にＦoｂが２つあり、これらが互いにジスルフィド結合を形成することによってＦoｂサブユニットとＦoｃサブユニットとのジスルフィド結合の形成効率が６０％程度であり、水素イオン輸送の制御を行うには不十分であった。さらに、大腸菌由来のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素において、ａサブユニットの４番目のへリックスとｃサブユニットの２番目のへリックスのアミノ酸をシステインに置換して、酸化処理によりジスルフィド結合が形成されることが知られている（例えば、非特許文献２参照）が、酸化剤の添加により水素イオン輸送を制御することはできなかった。このほか、ＦoａサブユニットとＦoｃサブユニットを一本のポリペプチドで融合する方法も知られているが（例えば、非特許文献３、４参照）、タンパク質加水分解酵素で処理することで融合を切断するため、可逆的に水素イオン輸送を制御することはできなかった。このように、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の機能解析については徐々に明らかになってきたが、この酵素を、リポソーム内の水素イオン濃度を制御する酵素として応用した研究は十分に進められていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−４７４７６号公報
【特許文献２】特開２００３−３３４０７０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Suzuki, T. et al., J. Biol. Chem. 277: 13281-13285 (2002)
【非特許文献２】Jiang, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6607-6612 (1998)
【非特許文献３】Mitome, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 33: 12159-12164 (2004)
【非特許文献４】Mitome, N. et al., Biochemical Journal 430: 171-177 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、水素イオン輸送活性を可逆的に制御することが可能なリポソームを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者は、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の立体構造に着目し、Ｆoａサブユニットの１８３番目のロイシン又は１８４番目のロイシンと、Ｆoｃサブユニットの６７番目のフェニルアラニン又は６８番目のイソロイシンが近い場所にあると考えた。そこで、ａサブユニットの１８３番目又は１８４番目のロイシンとｃサブユニットの６７番目のフェニルアラニン又は６８番目のイソロイシンをシステインに置換したところ、酸化状態でＡＴＰ加水分解活性が低下することを見出した。ここで発明者は、このＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素をリポソームの水素イオン輸送へ応用できないかと考え、上記置換して変異させたＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素をリポソームに再構成したところ、可逆的に水素イオン輸送活性を制御できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、［１］Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得するＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームや、［２］ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素がバチルス属細菌由来であることを特徴とする上記［１］記載のリポソームや、［３］バチルス属細菌が好熱菌バチルスＰＳ３（Bacillus sp.PS3）であることを特徴とする上記［２］記載のリポソームや、［４］Ｆoａサブユニットのへリックス４の１８３番目又は１８４番目と、Ｆoｃサブユニットのへリックス２の６７番目又は６８番目がシステイン残基に置換されていることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のリポソームや、［５］上記［１］〜［４］のいずれか記載のリポソームにおいて、酸化剤又は還元剤による処理によってリポソーム内の水素イオン濃度を調整する方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソーム内の水素イオンを可逆的に制御することが可能となり、リポソーム内に封入する薬剤や生理活性物質の安定性が保たれ、その結果、かかるリポソームを薬物送達システムに利用すると、薬剤や生理活性物質の量及び投与回数の軽減が可能になると共に、薬剤や生理活性物質の作用を高め、さらには副作用を軽減することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＣＲで用いたプライマーの位置を示す図である。
【図２】変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のＡＴＰ加水分解活性を示す図である。
【図３】Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にシステインを導入した変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の酸化状態及び還元状態を示す図である。
【図４】左は変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームの酸化状態と還元状態の概念図であり、右はａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃを再構成したリポソームの水素イオン輸送活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームとしては、Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得するものであれば特に制限されず、酸化状態ではチオール基によるジスルフィド結合によりＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素におけるａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２が結合することで、ｃリングの回転が抑えられて水素イオン輸送活性を喪失するが、還元状態ではＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットにおいてジスルフィド結合が形成されないため、リングが回転して水素イオン輸送活性を獲得する。
【００１４】
上記酸化状態とは、二つの近接するチオール基がジスルフィド結合を形成した状態をいい、上記還元状態とは、ジスルフィド結合が還元され、遊離チオール基となっている状態をいう。
【００１５】
上記ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素としては、Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれ１つ以上のシステイン残基を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得する酵素であり、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、好熱菌バチルスＰＳ３（Bacillus sp. PS3）等のバチルス属細菌や、大腸菌（Escherichia coli）や、メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）等のメタノサルシナ属細菌や、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）等のラクトバチルス属細菌や、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）等のロドバクター属細菌や、モーレラ・サーモアセティカ（Moorella Thermoacetica）等のモーレラ属細菌や、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）等のコリネバクテリウム属細菌由来のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を挙げることができ、好ましくはバチルス属細菌由来のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を挙げることができ、中でも好熱菌バチルスＰＳ３由来のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を挙げることができる。また、Ｆoａサブユニットのへリックス４の１８３番目又は１８４番目と、Ｆoｃサブユニットのへリックス２の６７番目又は６８番目をシステイン残基に置換したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素、例えば好熱菌バチルスＰＳ３由来のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を好適に挙げることができ、より具体的には、Ｆoａサブユニットのへリックス４の１８４番目と、Ｆoｃサブユニットのへリックス２の６７番目又は６８番目をシステイン残基に置換した好熱菌バチルスＰＳ３由来のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を挙げることができる。
【００１６】
上記Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にシステイン残基を有するＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素としては、野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のＦoａサブユニットのへリックス４及び／又はＦoｃサブユニットのへリックス２にシステイン残基を人為的に導入したものを用いることもできるが、Ｆoａサブユニットのへリックス４及びＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基をあらかじめ有している天然変異のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を用いてもよい。上記システイン残基を導入したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の生産方法としては、野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素をコードするヌクレオチド配列において、Ｆoａサブユニットのへリックス４及び／又はＦoｃサブユニットのへリックス２をコードするヌクレオチド配列部位に対して部位特異的にシステイン置換変異を導入したヌクレオチド配列を作製し、そのシステイン置換変異したヌクレオチド配列を任意の宿主―ベクター系により発現させる方法を挙げることができる。部位特異的に変異を導入する方法としては、メガプライマー法、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、クイックチェンジ法等の公知の手法を用いることができる。導入するシステイン残基は、ａサブユニットおよびｃサブユニットにおいて、同じサブユニット内でのジスルフィド結合を防ぐため、各サブユニットにおいて１つであることが好ましい。
【００１７】
上記水素イオン輸送活性としては、水素イオンがリポソームの外から内へ、又は内から外へ輸送される活性をいい、この活性はＡＣＭＡ（9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine）法、パッチクランプ法により測定することができる。また、上記「酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失する」とは、ＡＣＭＡ法で測定した場合に水素イオン輸送活性が完全に失われるか、あるいは還元状態におけるイオン輸送活性と比較して０．１倍以下、好ましくは０．０５倍以下、さらに好ましくは０．０３倍％以下、もっとも好ましくは０．０１倍％以下になることをいう。一方、「還元状態で水素イオン輸送活性を獲得する」とは、ＡＣＭＡ法で測定した場合に酸化状態におけるイオン輸送活性と比較して１０倍以上、好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、もっとも好ましくは１００倍以上になることをいう。
【００１８】
上記リポソームの構成成分としては、リン脂質、コレステロール類、脂肪酸等を挙げることができ、具体的にはホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質や、あるいは常法によりこれらに水素添加したものの他、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン等の合成リン脂質が挙げることができ、ホスファチジルコリンおよび大豆レシチンを好適に挙げることができる。
【００１９】
上記リポソームは、通常知られている方法、例えばソニケーション法、バイオビーズ法、ボルテクスィング法、プレベシクル法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エクストルージョン法等によって形成することができる。具体的には、リン脂質をグリセロール含有溶液中で撹拌して懸濁し、懸濁液を超音波処理して液体窒素で凍結し、さらにこれを自然解凍する方法が挙げられる。
【００２０】
上記再構成とは、脂質二重膜にタンパク質の少なくとも一部が埋め込まれることによって生体内における状態に類似した系を構築することであり、上記ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成とは、Ｆo部位が脂質二重膜に組み込まれ、Ｆ１部位がリポソームの外側に配置されるように構成されていることをいう。
【００２１】
上記酸化剤又は還元剤による処理によってリポソーム内の水素イオン濃度を調整する方法としては、上記リポソームにおいて、酸化剤又は還元剤で処理することによりジスルフィド結合を可逆的に制御し、リポソーム内が任意の水素イオン濃度になるように調整する方法であれば特に制限されず、上記酸化剤としては、硫酸銅（ＣｕＳＯ4）、亜酸化銅（Ｃｕ2Ｏ）、リン銅（ＣｕＰ）、塩化銅（ＣｕＣｌ2）等の銅化合物や、過酸化水素水、ヨウ素を挙げることができ、硫酸銅を好適に挙げることができる。一方、上記還元剤としては、ジスルフィド結合を切断して、チオール基を遊離させることができる任意の物質を用いることができ、１，４−ジチオスレイオール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、２−メルカプトエタノール、トリ−ｎ−ブチルホスフィン、グルタチオン、チオレドキシン、グルタチオンレダクターゼ、ＮａＢＨ4、チオグリコール酸、一酸化窒素（ＮＯ）を挙げることができ、ＤＴＴを好適に挙げることができる。
【００２２】
使用する酸化剤の濃度は、用いる酸化剤により適宜調整できるが、例えば、硫酸銅の場合は最終濃度が２０μＭ〜５００μＭであることが好ましく、５０μＭ〜３００μＭであることがより好ましく、１００μＭ〜２５０μＭであることがさらに好ましい。酸化剤の処理時間は５分〜２時間であることが好ましく、１５分〜１時間であることがより好ましく、２０分〜４０分であることがさらに好ましい。酸化剤で処理する際の温度は室温で十分であるが、酸化剤の量に応じて、冷却下で行うこともできる。
【００２３】
使用する還元剤の濃度は、用いる還元剤により適宜調整できるが、例えばＤＴＴの場合は最終濃度が５ｍＭ〜２００ｍＭであることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭであることがより好ましく、４０ｍＭ〜６０ｍＭであることがさらに好ましい。還元剤の処理時間は５分〜２時間であることが好ましく、１５分〜１時間であることがより好ましく、２０分〜４０分であることがさらに好ましい。還元剤で処理する際の温度は室温で十分であるが、還元剤の量に応じて、冷却下で行うこともできる。
【実施例１】
【００２４】
［ＡＴＰ加水分解活性］
（測定の原理）
Ｆoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にそれぞれシステイン残基を有するＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素（以下、「変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素」ともいう。）及びかかる変異を有さない野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素（以下、「野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素」ともいう。）を発現するプラスミドで形質転換した５種類の大腸菌から酸化処理又は還元処理した反転膜を作製し、その反転膜を用いてＡＴＰ加水分解活性の測定を行い、酸化処理した場合と還元処理した場合におけるＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のＡＴＰ加水分解活性の変化を調べた。測定の原理としては、変異ＡＴＰ合成酵素を酸化処理すると、ａサブユニットのシステイン残基とｃサブユニットのシステイン残基の距離が６Å以内ならばチオール基同志がジスルフィド結合を形成し、ジスルフィド結合が形成されればｃサブユニットの回転が制御され、ＡＴＰ加水分解活性が低くなるというものである。
【００２５】
（変異プラスミドの作製）
好熱菌バチルスＰＳ３由来の野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素をコードするプラスミドpTR-ASDS(Suzuki, et al., Journal of Biological Chemistry 277: 13281-13285(2002))を鋳型として、メガプライマー法を用いてａサブユニットのへリックス４とｃサブユニットのへリックス２にシステイン残基を導入した。上記野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素をコードするプラスミドpTR-ASDSにはすでにβサブユニットのＮ末端にＨｉｓ１０−ｔａｇが導入してある。なお、好熱菌バチルスＰＳ３由来の野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素はＦoａサブユニットの４番目のへリックスとＦoｃサブユニットにはシステイン残基は有していない。
【００２６】
変異導入プライマーはａサブユニットのへリックス４の１８３残基目のロイシンをシステイン、１８４残基目のロイシンをシステイン、ｃサブユニットのへリックス２の６７残基目のフェニルアラニンをシステイン、６８番目のイソロイシンをシステインに置換するように設計した。この変異導入プライマーを用いて、以下の４種類の変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素、つまり、１）ａサブユニットのへリックス４の１８３残基目のロイシンとｃサブユニットのへリックス２の６７残基目のフェニルアラニンがシステインに置換されたａＬ１８３ＣｃＦ６７Ｃ、２）ａサブユニットのへリックス４の１８３残基目のロイシンとｃサブユニットのへリックス２の６８番目のイソロイシンがシステインに置換されたａＬ１８３ＣｃＩ６８Ｃ、３）ａサブユニットのへリックス４の１８４残基目のロイシンとｃサブユニットのへリックス２の６７残基目のフェニルアラニンがシステインに置換されたａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃ、４）ａサブユニットのへリックス４の１８４残基目のロイシンとｃサブユニットのへリックス２の６８番目のイソロイシンがシステインに置換されたａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃを発現する４種類の変異プラスミド（以下、単に「変異プラスミド」ともいう。）を作製した。
【００２７】
以下に変異プラスミドの作製手順を示す。リバースプライマー（aL183C-R（配列番号１）またはaI184C-R（配列番号２）：ａサブユニット変異導入用プライマー）とフォワードプライマーRV-M（配列番号３）を用い、pTR-ASDSを鋳型としてKOD DNA polymerase（東洋紡社製）でＰＣＲを行った（１ｓｔＰＣＲ）。ＰＣＲの条件としては、９８℃で１５秒、５５℃で５秒、７４℃で３０秒を２５サイクル行った。次に１ｓｔＰＣＲ産物をそれぞれWizard（登録商標）Genomic DNA Purification Kit（プロメガ社製）で精製し、精製した断片それぞれをフォワードプライマーとし、リバースプライマー（ｃサブユニット変異導入用プライマー）にはＳｐｅＩ切断部位を含むcF67C-R（配列番号４）またはcI68C-R（配列番号５）を用いて、pTR-ASDSを鋳型としてＥＸ−ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）でＰＣＲを行った（２ｎｄＰＣＲ）。ＰＣＲの条件としては、９８℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を３０サイクル行った。得られた２ｎｄＰＣＲ産物は目的の変異領域と制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩ切断サイトを持つようになる。１ｓｔＰＣＲ、２ｎｄＰＣＲで用いたプライマーの位置を図１に示す。さらに２ｎｄＰＣＲ産物をエタノール沈殿し、変異を含む領域を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで切り出しWizard（登録商標） Genomic DNA Purification Kit（プロメガ社製）で精製した（ｉｎｓｅｒｔＤＮＡ）。同様に、pTR-ASDSを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで切り出し、ｖｅｃｔｏｒ側のＤＮＡをWizard（登録商標） Genomic DNA Purification Kit（プロメガ社製）で精製した。このｉｎｓｅｒｔＤＮＡとｖｅｃｔｏｒＤＮＡでライゲーションを行い、４種類の変異プラスミドpTR-aL183CcF67C、pTR-aL183CcI68C、pTR-aL184CcF67C、pTR-aL184CcI68Cを得た。また、得られた変異プラスミドを、それぞれＡＴＰ合成酵素を欠損した大腸菌ＤＫ−８株のコンピテントセルに導入した。それぞれの菌体から、プラスミドを精製し、制限酵素チェック、ＤＮＡシークエンスにより目的の変異が導入されていること、目的外の変異が導入されていないことを確認した。
【００２８】
（ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素溶液の調製）
ＬＢ培地（１０ｇ  Ｂａｃｔｏ  Ｐｅｐｔｏｎｅ、５ｇ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇＮａＣｌ、寒天１５ｇを１Ｌの蒸留水に溶かした培地）１Ｌに１００μｇ／ｍｌ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを加え、pTR-ASDS及び上記作製した４種類の変異プラスミドをもつ大腸菌（ＤＫ−８）をそれぞれ３７℃、２４ｈ振盪培養した。遠心分離（７５００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した後、ＰＡ３バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５ｍＭ  Ｍｇ（ＮＯ３）２）と、酸化剤としてＣｕＳＯ４（最終濃度２００μＭ）とを加えて全量を８ｍｌとし、懸濁後、２５℃、３０分間置いた。１Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５を最終濃度１０ｍＭとなるように加え、遠心分離（７５００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。回収した菌体を４０ｍｌのＰＡ３バッファーで懸濁した後、遠心分離（７５００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。回収した菌体を４０ｍｌのＰＡ３バッファーで懸濁した後、超音波破砕器で５〜１０分超音波破砕した。破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分、４℃）して潰れ残りの菌体などを除いた後、上清を超遠心分離（４００００ｒｐｍ、１ｈ、４℃）して膜画分を回収して反転膜を得た。この反転膜には、発現したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素が酸化状態で膜上に存在している。回収した膜画分は１ｍｌのＰＡ３バッファーで懸濁した。懸濁液に対し、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水で調整して酸化状態のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素溶液を得た。一方、懸濁液にし、ＤＴＴを最終濃度が５０ｍＭになるように加え、タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌになるようにＰＡ３バッファーで調製して還元状態のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素溶液を得た。タンパク質の定量は、濃度既知のＢＳＡを標準品としてＬｏｗｒｙ法で行った。
【００２９】
（ＡＴＰ加水分解活性の測定）
ＡＴＰ加水分解活性の測定は、ＡＴＰ再生系によるＮＡＤＨの吸収の減少を紫外・可視分光光度計で測定することによって求めた。
【００３０】
４５℃でプレインキュベートした１．５ｍｌ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．０ｍＭ  ＡＴＰ、１．７５ｍＭ  ＮＡＤＨ、２．５ｍＭ  ＫＣＮ、０．１ｍｇ／ｍｌ  カルボニルシアニド−ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（以下、「ＦＣＣＰ」ともいう。））にピルビン酸キナーゼ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、乳酸脱水素酵素（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）をキュベットに加えた。測定開始３０秒後に２０μｌの還元状態のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素溶液又は酸化状態のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素溶液を加えた。ＡＴＰ加水分解活性の測定は、紫外・可視分光光度計はＵｌｔｒｏｓｐｅｃ  ６３００  ｐｒｏ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を使用し、波長３４０ｎｍ、温度４５℃、時間３００秒で測定を行った。ＡＴＰ加水分解活性は測定開始後２４０秒から３００秒の傾きの値から比活性を計算することによって求めた。各試料６回測定し、比活性平均値を出した。
【００３１】
（ＡＴＰ加水分解活性の測定結果）
図２に酸化状態と還元状態におけるＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のＡＴＰ加水分解活性を示す。薄い灰色（右側）が酸化状態（ｏｘ）の測定データで、濃い灰色（左側）が還元状態（ｒｅｄ）の測定データである。グラフの上部に示した数値は酸化によるＡＴＰ加水分解活性の低下率を表している。横軸は野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素（ＰＴＲ１９ＡＳＤＳ）、及び４種類の変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素（ａＬ１８３ＣｃＦ６７Ｃ、ａＬ１８３ＣｃＩ６８Ｃ、ａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃ、ａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃ）を示し、縦軸は比活性（μｍｏｌ／分／ｍｇ）を示す。野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の酸化状態と還元状態の比活性を見比べてみると、比活性は同程度だった。このことから、野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素ではＡＴＰの加水分解が酸化によって阻害されないことが示された。また、４種類の変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の中ではａＬ１８３ＣｃＦ６７Ｃが一番高く、０．２３μｍｏｌ／分／ｍｇであった。他の３種類は０．１３〜０．１４μｍｏｌ／分／ｍｇであった。酸化処理によるＡＴＰ加水分解活性の阻害率は、ａＬ１８３ＣｃＦ６７Ｃでは２０．４％、ａＬ１８３ＣｃＩ６８Ｃでは１５．６％、ａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃでは２１．３％、ａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃでは１６．７％であった。この結果から、酸化処理によるジスルフィド結合の形成によってＡＴＰ加水分解活性を制御することができるということ、及びａサブユニットのへリックス４の１８３番目又は１８４番目のロイシンと、ｃサブユニットのへリックス２の６７番目のフェニルアラニン又は６８番目のイソロイシンはいずれも近い距離に存在していることが明らかとなった。図３にＦoａサブユニットのへリックス４とＦoｃサブユニットのへリックス２にシステインを導入した変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の酸化状態及び還元状態を示す。
【実施例２】
【００３２】
［ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を再構成したリポソームの水素イオン輸送活性］
野生型ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素およびａＬ１８３ＣｃＦ６７Ｃ、ａＬ１８３ＣｃＩ６８Ｃ、ａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃ、ａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃの４種類の変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を発現した大腸菌を超音波処理して得られた膜画分から、界面活性剤であるドデシルマルトシド（n‐dodecyl‐β‐D‐maltoside：ＤＤＭ)でＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を可溶化し、Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製した。一方、リポソームは大豆のリン脂質を超音波処理することにより調製した。凍結融解法でそれぞれのＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素をリポソームの脂質二重膜に再構成し、この再構成したリポソームを酸化、還元処理した際のＡＴＰ加水分解による水素イオン輸送活性を調べた。以下、詳細に説明する。
【００３３】
（Ｎｉ−ＮＴＡカラムの調製）
Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（２０ｍｌ、キアゲン社製）に、カラム体積の３倍量のミリＱ水を加え、重力によりドレインした。次に、カラム体積の１０倍量の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ＤＤＭ溶液を加えた。
【００３４】
（膜画分の調製）
ＬＢ培地（１０ｇ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、５ｇ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１０ｇＮａＣｌ、寒天１５ｇを１Ｌの蒸留水に溶かした培地）１Ｌに１００μｇ／ｍｌ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを加え、pTR-ASDS及び上記作製した４種類の変異プラスミドをもつ大腸菌（ＤＫ−８）をそれぞれ３７℃、２４ｈ振盪培養した。遠心分離（７５００ｒｐｍ、１０分、４℃）で菌体を回収した。回収した菌体を４０ｍｌのＰＡ３バッファーで懸濁した後、超音波破砕器で５〜１０分超音波破砕した。破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分、４℃）して潰れ残りの菌体などを除いた後、上清を超遠心分離（４００００ｒｐｍ、１ｈ、４℃）して膜画分を回収して反転膜を得た。この反転膜には、発現したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素が膜上に存在している。回収した膜画分は１ｍｌのＰＡ３バッファーで懸濁後、−８０℃で保存した。反転膜を使用する前に、濃度既知のＢＳＡを標準品としてＬｏｗｒｙ法でタンパク質定量を行った。
【００３５】
（膜画分からのＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素の可溶化及びＮｉ−ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーによる精製）
上記調製した膜画分を１０ｍｇ/ｍｌとなるようにｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５  ２００ｍＭ  Ｎａ2ＳＯ4）で希釈した。ダウンス型ホモジナイザー（ＩＷＡＫＩ社製）を用いて懸濁後、懸濁液４０ｍlを５０ｍｌのチューブに移し、×５０  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）１粒を１ｍｌのミリＱ水に溶解）を１ｍｌ加えた。次に、ボルテックスで弱く撹拌しながら、５ｍｌのマイクロピペットを用いて、２０％ＤＤＭを４．５５ｍｌ一気に加えた。２０分氷上に置いた後、超遠心チューブに移し、超遠心をｐ４５ＡＴローター（日立工機社製）を用いて、３８Ｋ、４０分、４℃の条件で行った。
【００３６】
上清をコーニングチューブに移し、その上清約４０ｍｌとＮｉ−ＮＴＡレジン（キアゲン社製）２０ｍｌを容量１００ｍｌの蓋付き試薬瓶に移して混和した後、試薬瓶内のレジンと可溶化の上清を１ｈ、４℃の条件で、ＢＩＯ−ｓｈａｋｅｒ  ＢＲ４０−ＬＦ(タイテック社製)で往復振とう撹拌した。
【００３７】
次に、上記調製したＮｉ−ＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗレジンをカラムに移し、素通りで壁、ピペット、ふたを洗浄した。クローズドカラムをセットアップし、カラム体積の１０倍量の洗浄バッファー１（２５ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ＤＤＭ）で洗浄し、さらにカラム体積の１０倍量の洗浄バッファー２（４０ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、  ０．０５％ＤＤＭ）で洗浄後、カラム体積の１０倍量の溶出バッファー（２００ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、  ０．０５％ＤＤＭ）で溶出した。
【００３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のフラクションを確認し、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素のフラクションをあわせて、Amicon ultra centrifugal filters Ultracel（登録商標）-100K UFC910024（ミリポア社製）で１０ｍｇ/ｍｌとなるように濃縮し、精製したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を得た。
【００３９】
（リポソームの調整）
大豆由来のＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｌｃｈｏｌｉｎｅ  ＴｙｐｅＩＩ−Ｓ（シグマ・アルドリッチ社製）４４ｍｇを０．５ｍＭ  ＤＴＴを含むＰＡ３バッファー  １ｍｌにスターラーで攪拌してよく懸濁した。次に、縣濁液をチップ型超音波破砕機ＵＲ２００P（トミー精工社製）で５〜１０秒×２回超音波処理した後、液体窒素でいったん凍結させた。さらにこれを室温に放置して自然解凍し、リポソーム溶液を得た。１ｍｌずつ分注して液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。
【００４０】
（リポソームへの再構成）
精製したＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素（１０ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）、２００μＭ（最終濃度）ＣｕＳＯ４にリポソーム溶液２００μｌを加えた。室温で１５分置いた後、液体窒素でいったん凍結させ、これを室温で放置して自然解凍した。次に、等量の蒸留水を加え、超音波処理を５秒かけた。超遠心（７００００ｒｐｍ、３０分、４℃）でリポソームを沈殿させ、２００μｌのＰＡ３バッファーで縣濁した。得られた懸濁液を、以後の水素イオン輸送活性の測定において、酸化処理した変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を再構成したリポソームとして用いた。また、２００μｌのＰＡ３バッファーの代わりに５０ｍＭ  ＤＴＴを含む２００μｌのＰＡ３バッファーで縣濁した懸濁液を、還元処理した変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を再構成したリポソームとして用いた。
【００４１】
（水素イオン輸送活性の測定）
水素イオン輸送活性の測定には、ＡＣＭＡ法を用いた。ＡＣＭＡは、吸収極大４１２ｎｍを持ち、強い蛍光を発し４７１ｎｍに蛍光極大を有するΔｐＨ指示薬である。ＡＣＭＡは、膜に可逆的に結合し膜内が酸性化すると消光するという性質を持つ。この性質を利用し、ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素がＡＴＰの加水分解により水素イオンをリポソーム内に輸送する活性、つまり水素イオン輸送活性を測定できる。なお、以下に用いたＦＣＣＰはイオノフォアであり、膜内外野ΔｐＨを解消する。実際に行った実験の手順を以下に示す。
【００４２】
キュベットにＰＡ４バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２．４ｍｌを加え、ＡＣＭＡ（０．３ｍｇ／ｍｌ）２４μｌをここに加えて懸濁した。この懸濁液にＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素（野生型、ａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃ、Ｌ１８４ＣｃＩ６８Ｃ）を再構成したリポソーム１０ｍｇ／ｍｌを１００μｌ加えた。蛍光分光器（日本分光社製）にキュベットをセットし、励起波長４１０ｎｍ、蛍光波長４８０ｎｍ、４２℃で測定開始した。次に、２００ｍＭ  ＡＴＰを１２μｌ加えて反応開始した（最終濃度  １ｍＭ）。その後ＦＣＣＰ（１００μｇ/ｍｌ）を１２μｌ加え反応停止した。
【００４３】
（水素イオン輸送活性の測定結果）
野生型のＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を再構成したリポソームでは、酸化処理、還元処理いずれもＡＴＰの添加に伴い膜内への水素イオン流入によりＡＣＭＡの蛍光の消光がみられ、蛍光強度は６％減少した。還元処理した変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を再構成したリポソームでは、ａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃを再構成したリポソームでは５．７％、ａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃを再構成したリポソームでは４．７％の蛍光の消光が確認された。次に、ＣｕＳＯ４により酸化処理したａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃ又はａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃを再構成したリポソームではいずれも水素イオン輸送活性が確認されなかった。ａＬ１８４ＣｃＦ６７Ｃを再構成したリポソームによる測定結果を図４右に示し、変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームの酸化状態と還元状態の概念図を図４左に示す。ａＬ１８４ＣｃＦ６７ＣとａＬ１８４ＣｃＩ６８Ｃが還元状態で水素イオン輸送活性を有し、酸化状態で水素イオン輸送活性を失ったことで、近接しているａサブユニットのへリックス４とｃサブユニットのへリックス２の２つのシステインが酸化処理によりジスルフィド結合を形成しｃリングが回転できなくなり、水素イオン輸送活性を失うことが確認できた。こうして、変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームでは、酸化状態で水素イオン輸送活性を喪失し、還元状態で水素イオン輸送活性を獲得すること、及び変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームを用いると、酸化還元処理によってリポソーム内の水素イオン濃度を可逆的に制御できることが明らかとなった。さらに、変異ＦoＦ1−ＡＴＰ合成酵素を脂質二重膜に再構成したリポソームを用いることで、ＡＣＭＡのような塩基性物質のリポソーム内への取り込み制御が可能であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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