(57)【要約】      （修正有）【課題】シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生を抑えてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成するＬ−ピペコリン酸水酸化酵素、および該ピペコリン酸水酸化酵素を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法の提供。【解決手段】ピペコリン酸水酸化酵素の活性部位に特定の変異を導入することにより、副生成物であるシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生成を抑え、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成することのできる、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、該ホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、該ホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質。
【請求項３】
他のアミノ酸残基が、９５番目はアラニンまたはトリプトファン、９７番目は、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、チロシンおよびシステインからなる群より選ばれるいずれか１つ、１０１番目はバリンまたはトレオニン、１１４番目はグリシンである請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項４】
以下の（１）〜（５）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がアラニンであり、９７番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸配列
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がトリプトファンであり、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであるアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がトリプトファンであり、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１１４番目の残基がグリシンであるアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１０１番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１０１番目のアミノ酸残基がトレオニンであるアミノ酸配列
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項８】
下記工程（１）および（２）を含むシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
（１）請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物を用意する工程
（２）工程（１）で用意した蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物とピペコリン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該水性媒体から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取する工程
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞をＬ−ピペコリン酸を含有する培地に培養し、培養物中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該培養物から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取することを特徴とする、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛋白質を生産する能力を有し、かつ該蛋白質の基質となるＬ−ピペコリン酸を生産する能力を有する宿主細胞を培地に培養し、培養物中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該培養物から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取することを特徴とする、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−ピペコリン酸を水酸化してシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成するＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素、および該Ｌ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法、該Ｌ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素を生産する能力を有する微生物または形質転換体を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−プロリンは、多数の医薬品の構成単位であることから、その水酸化物であるヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、医薬品の合成原料として工業的に有用な物質である。Ｌ−プロリンと同じＬ−イミノ酸であるＬ−ピペコリン酸は、天然に存在する種々の有用な生理活性物質の構成要素として含まれているので、その水酸化物はヒドロキシ−Ｌ−プロリンと同様に医薬品の合成原料としても有用な化合物といえる。
【０００３】
ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｌ−ピペコリン酸にヒドロキシル基が導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種である。ヒドロキシル基が導入される部位（３位、４位又は５位の炭素原子）の違いと、ヒドロキシル基の空間的配置（トランス配置又はシス配置）の違いとにより６種類の異性体が存在する。
【０００４】
よって、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を医薬品の合成原料として用いる場合、他の異性体比率が低いヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸、すなわち光学純度が高いヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が必要とされるが、例えば効率のよいシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造法は知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｌ−ピペコリン酸はＬ−プロリンの誘導体であり、プロリン水酸化酵素はピペコリン酸も基質として水酸化する。本発明者らが、プロリン水酸化酵素である国際公開第２００９／１３９３６５号に記載のＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ由来のプロリン水酸化酵素およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のプロリン水酸化酵素を用いてＬ−ピペコリン酸を水酸化したところ、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が得られるものの、副生成物であるシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸が多量に生成することがわかった。
【０００６】
したがって、本発明は、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生を抑えてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成するＬ−ピペコリン酸水酸化酵素、および該ピペコリン酸水酸化酵素を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法、該ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物または形質転換体を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ピペコリン酸水酸化酵素がピペコリン酸を水酸化する反応を立体的に考察し、ピペコリン酸水酸化酵素の活性部位に特定の変異を導入することにより、副生成物であるシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生成を抑え、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成できることを見出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質。
２．配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、該ホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、該ホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質。
３．他のアミノ酸残基が、９５番目はアラニンまたはトリプトファン、９７番目は、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、チロシンおよびシステインからなる群より選ばれるいずれか１つ、１０１番目はバリンまたはトレオニン、１１４番目はグリシンである前項１または２に記載の蛋白質。
４．以下の（１）〜（５）のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる前項１〜３のいずれか１に記載の蛋白質。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がアラニンであり、９７番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸配列
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がトリプトファンであり、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであるアミノ酸配列
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がトリプトファンであり、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１１４番目のアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１０１番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１０１番目のアミノ酸残基がトレオニンであるアミノ酸配列
５．前項１〜４のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
６．前項５に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡ。
７．前項６に記載の組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
８．下記工程（１）および（２）を含むシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
（１）前項１〜４のいずれか１に記載の蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物を用意する工程
（２）工程（１）で用意した蛋白質または該蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞の培養物若しくは該培養物の処理物とピペコリン酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該水性媒体から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取する工程
９．前項１〜４のいずれか１に記載の蛋白質を生産する能力を有する宿主細胞をＬ−ピペコリン酸を含有する培地に培養し、培養物中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該培養物から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取することを特徴とする、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
１０．前項１〜４のいずれか１に記載の蛋白質を生産する能力を有し、かつ該蛋白質の基質となるＬ−ピペコリン酸を生産する能力を有する宿主細胞を培地に培養し、培養物中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該培養物から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取することを特徴とする、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のピペコリン酸水酸化酵素は、活性部位に特定の変異が導入され、ピペコリン酸水酸化酵素の活性中心の鉄原子と基質であるピペコリン酸との立体的な位置関係が変わることにより、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生を抑え、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成することができる。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生を抑えてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で生成するＬ−ピペコリン酸水酸化酵素、および該ピペコリン酸水酸化酵素を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法、該ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物または形質転換体を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、培養液に含まれるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸をＦｍｏｃ誘導体化した後、ＨＰＬＣ分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の蛋白質としては、以下の（１）〜（３）記載のいずれか１の蛋白質を挙げることができる。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質。
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、該ホモログ蛋白質のアミノ酸配列と配列番号１で表されるアミノ酸配列とをアライメントしたときに、該ホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなり、且つＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質。
（３）他のアミノ酸残基が、９５番目はアラニンまたはトリプトファン、９７番目は、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、チロシンおよびシステインからなる群より選ばれるいずれか１つ、１０１番目はバリンまたはトレオニン、１１４番目はグリシンである（１）または（２）記載の蛋白質。
【００１３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質をいう。
【００１４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を有するとは、配列番号１で表されるアミノ酸配列とホモログ蛋白質のアミノ酸配列とが、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有することをいう。
【００１５】
Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来である配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質の具体例としては、配列番号４６で表されるＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ由来のシス−４−プロリンヒドロキシラーゼ、配列番号４７で表されるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏａｍｅｒｉｃａｎｕｍのシス−４−プロリンヒドロキシラーゼ等を挙げることができる。  
【００１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列と、ホモログ蛋白質のアミノ酸配列とのアライメントは、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いる。
【００１７】
Ｌ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性とは、Ｌ−ピペコリン酸のシス−５位を水酸化する酵素の活性をいう。本発明の蛋白質によりＬ−ピペコリン酸を水酸化して得られるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸とシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の比率（ｃｉｓ−５／ｃｉｓ−３）は、５．０以上であることが好ましく、１０．０以上であることがより好ましく、２０．０以上であることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明の上記（１）〜（３）記載の蛋白質において、配列番号１の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目のアミノ酸残基、または配列番号１の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目に対応するアミノ酸残基の１つ以上が他のアミノ酸残基に置換されていればよく、例えば、２〜４のアミノ酸残基の任意の組合せが他のアミノ酸残基に置換されていてもよい。
【００１９】
本発明の蛋白質としてより好ましくは、上記（１）〜（３）記載の蛋白質のアミノ酸配列において、以下の［１］〜［５］のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を挙げることができる。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がアラニンであり、９７番目のアミノ酸残基がアラニンであるアミノ酸配列
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がトリプトファンであり、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであるアミノ酸配列
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９５番目のアミノ酸残基がトリプトファンであり、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１１４番目のアミノ酸残基がグリシンであるアミノ酸配列
［４］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１０１番目のアミノ酸残基がバリンであるアミノ酸配列
［５］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のアミノ酸残基がフェニルアラニンであり、１０１番目のアミノ酸残基がトレオニンであるアミノ酸配列
【００２０】
２．本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡとしては、上記１に記載の本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００２１】
３．本発明の形質転換体
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体としては、上記２のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用い、宿主細胞を公知の方法で形質転換して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００２２】
宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
【００２３】
４．本発明のＤＮＡの調製
（１）Ｌ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
Ｌ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブを用い、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１またはホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを有する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーションにより、または配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ若しくはホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１もしくはホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを有する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
【００２４】
ホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列は、上記１のホモログ蛋白質のアミノ酸配列をもとに、またはそれらのＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒをもとにデータベースを検索し、容易に取得することができる。
【００２５】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
【００２６】
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，  ７４，５４６３（１９７７）］、またはＡＢＩ３７００ＤＮＡアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００２７】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【００２８】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００２９】
上記において、ホモログ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、好ましくは配列番号４４で表されるＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ由来のシス−４−プロリンヒドロキシラーゼ、配列番号４５で表されるＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏａｍｅｒｉｃａｎｕｍのシス−４−プロリンヒドロキシラーゼをコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００３０】
（２）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、該アミノ酸配列の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれるアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えば、モレキュラー・クローニング第３版およびカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。
【００３１】
また、同様の方法により、ホモログ蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、ホモログ蛋白質とを上記１の方法によってアライメントしたときに、ホモログ蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号１の９５番目、９７番目、１０１番目および１１４番目からなる群より選ばれるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、１つ以上のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に変異を導入することにより取得することができる。
【００３２】
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆ、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５Ｗ、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５ＷＥ１１４Ｇ等に含まれるＬ−ピペコリン酸  シス−５−水酸化酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
【００３３】
５．本発明の形質転換体の製造
本発明の形質転換体としては、本発明のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００３４】
本発明のＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８，  ６０６９  （１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ  ＩＩ（インビトロジェン社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、ｐＱＥ−６０（キアゲン社製）等を挙げることができる。
【００３５】
宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などを挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＡＴＣＣ  １２４３５、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ  ＭＰ３４７、エシェリヒア・コリ  ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１、エシェリヒア・コリ  ＭＥ８４１５等を挙げることができる。
【００３６】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等を挙げることができる。
【００３７】
上記方法によって得られる本発明の形質転換体としては、例えば、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆ、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５Ｗ、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５ＷＥ１１４Ｇ等を用いて形質転換して得られる形質転換体を挙げることができる。
【００３８】
６．本発明の蛋白質の製造法
（１）本発明の蛋白質を生産する形質転換体の製造
本発明のＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産効率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００３９】
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
【００４０】
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【００４１】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４３】
発現ベクターとしては、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＱＥ−６０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３１（特開平３−２１０１９０号公報）、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＴｒｃ９９Ａ（インビトロジェン社製）、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）、ｐＧＨＡ２〔エシェリヒア・コリ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔エシェリヒア・コリ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９）、ｐＲＩ１０９（特表２０００−４４８８６号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。
【００４４】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４５】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。組換え体ＤＮＡには、本発明のＤＮＡの発現に転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４６】
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆ、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５Ｗ、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５ＷＥ１１４Ｇ等を挙げることができる。原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ  ＮＭ５２２、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＮＹ４９、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０等を挙げることができるが、好ましくはエシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＤＨ５α、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＭＭ２９４、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０、エシェリヒア・コリ  ＮＹ４９、エシェリヒア・コリ  ＧＩ６９８、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ２１１７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ２１１７１等を挙げることができる。
【００４７】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭５７−１８６４９２号公報、特開昭５７−１８６４９号公報）、電気穿孔法［例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，４０９６（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１（１９９９）］、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
【００４８】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。
【００４９】
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１  プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【００５０】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、キャンディダ属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリュイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）等を挙げることができる。
【００５１】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等を挙げることができる。
【００５２】
（２）本発明の蛋白質の製造法
上記（１）の方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
【００５３】
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌等の原核生物、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
【００５４】
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
【００５５】
上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５６】
エシェリヒア・コリ等の原核生物または酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５７】
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００５８】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００５９】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００６０】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜１１に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００６１】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６３】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
【００６４】
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６５】
本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、生産させる蛋白質の構造を変えることができる。
【００６６】
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００６７】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００６８】
また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
【００６９】
本発明の形質転換体により製造された蛋白質を単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
【００７０】
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００７１】
また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として蛋白質の不溶体を回収する。回収した蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該蛋白質を正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該蛋白質の精製標品を得ることができる。
【００７２】
本発明の蛋白質、あるいは該蛋白質に糖鎖の付加された蛋白質等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいは該蛋白質の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００７３】
このようにして取得される蛋白質として、上記１に記載の蛋白質を挙げることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。例えば、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、特開平５−３３６９６３号公報、国際公開第９４／２３０２１号に記載の方法に準じて、本発明の蛋白質をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７４】
また、本発明の蛋白質をＦｌａｇペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗Ｆｌａｇ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］や、ポリヒスチジンとの融合蛋白質として生産し、ポリヒスチジンと高親和性を有する金属配位レジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することもできる。更に、該蛋白質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
【００７５】
上記で取得された蛋白質のアミノ酸配列情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、アプライド・バイオシステムズ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００７６】
７．シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造法
上記３の微生物または形質転換体の培養物もしくは該培養物の処理物、または上記１の本発明の蛋白質とピペコリン酸とを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該水性媒体から該シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取することにより、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができる。
【００７７】
（１）本発明の蛋白質を酵素源として用いるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法
本発明の製造方法において、酵素源として本発明の蛋白質を用いる場合、基質に用いられるピペコリン酸としては、Ｌ−ピペコリン酸が挙げられる。
【００７８】
上記製造方法において、本発明の蛋白質は、基質として用いるＬ−ピペコリン酸１ｍｇあたり好ましくは０．０５〜５０ｍｇ、より好ましくは０．１〜２０ｍｇ添加する。また、基質として用いるピペコリン酸は、好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜１０ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
【００７９】
上記製造法において、エネルギー源としてＡＴＰを用いることができ、ＡＴＰは、０．５ｍｍｏｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
【００８０】
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ピペコリン酸の水酸化酵素活性を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＴＥＳ緩衝液などを挙げることができる。
【００８１】
ピペコリン酸の水酸化反応は水性媒体中、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃の条件で好ましくは１０分〜５時間、より好ましくは３０分〜１時間行う。
【００８２】
（２）微生物または形質転換体の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造法
本発明の製造法において酵素源として用いられる微生物または形質転換体の培養物としては、該微生物または形質転換体を上記６の培養方法で培養して得られる培養物を挙げることができる。
【００８３】
微生物または形質転換体の培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などを挙げることができる。
【００８４】
形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる場合、基質に用いられるピペコリン酸としては、上記（１）と同様にＬ−ピペコリン酸を挙げることができる。
【００８５】
該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるＬ−ピペコリン酸１ｍｇあたり湿菌体重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
【００８６】
基質として用いるピペコリン酸は、上記（１）と同じように水性媒体中に添加することができる。上記（１）と同様、ＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、エネルギー源として用いることができる。
【００８７】
水性媒体としては、上記（１）の媒体を用いることができ、加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
【００８８】
ピペコリン酸の水酸化反応の反応条件は、上記（１）と同様の条件を挙げることができる。
【００８９】
上記（１）および（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００９０】
（３）発酵法によるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造法
上記４の方法により得られる組換え体ＤＮＡで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成、蓄積させ、該培養物からシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を採取することにより、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができる。
【００９１】
宿主細胞としては、Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力を有する微生物が好ましく、より好ましくは、Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物を挙げることができ、例えば、特開平６−３８７８１号公報、特許４５１６７１２号公報に記載の微生物を挙げることができる。また、Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力が低い、又は生産能力がない微生物もまた宿主細胞として用いることができる。
【００９２】
該形質転換体を培地に培養する方法は、微形質転換体の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００９３】
すなわち、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
【００９４】
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００９５】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
【００９６】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００９７】
Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力が低い、又は生産能力がない微生物を宿主細胞として用いる場合、培地にＬ−ピペコリン酸を添加してもよい。培地に添加するＬ−ピペコリン酸の濃度は、好ましくは０．１〜５０ｇ／ｌ、より好ましくは０．５〜２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜１０ｇ／ｌである。
【００９８】
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００９９】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【０１００】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１０１】
上記方法で製造されるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸としては、上記（１）と同様のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を挙げることができる。
【０１０２】
培養物中に生成、蓄積したシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【実施例】
【０１０３】
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
［１］第一世代変異体の構築
（１）野生型ＳｍＰ４Ｈ評価プラスミド；ｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈの造成
Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ＮＢＲＣ１４７８２Ｔ）株由来Ｌ−プロリン  シス−４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（配列番号１）が組み込まれたプラスミドｐＥＣＡＣ４７６８６（国際公開第２００９／１３９３６５号）を鋳型とし、配列番号２、配列番号３のプライマーセットを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ）を使用した。反応条件は表１に示す通りとした。
【０１０５】
【表１】
2014236713.tif 000002
【０１０６】
取得したＰＣＲ断片とベクターｐＴｒｃ９９Ａ（インビトロジェン）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた３７℃、１６時間の反応により切断した。切断断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）で精製した後、それぞれの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ）を使用する１６℃、３時間の反応により連結した。
【０１０７】
ライゲーション産物を、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ）にヒートショック法により導入した。これをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３７℃、１６時間培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）５ｍＬ中で、３０℃、１８時間培養し、その後ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を使用して目的のプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの内部塩基配列をＤＮＡシークエンサーにて解析し、所望のＤＮＡが挿入されていることを確認し、これをｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈと命名した。
【０１０８】
（２）ＳｍＰ４ＨＶ９７変異体プラスミドの造成
ＳｍＰ４Ｈの９７番目のバリン残基を様々なアミノ酸残基に置換した変異体を取得するために、ｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈを鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、融合ＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ）を使用した。
【０１０９】
１段階目のＰＣＲによりＬフラグメントとＲフラグメントを得て、２段階目のＰＣＲによりＬフラグメントとＲフラグメントの混合液を鋳型として用いることで、目的のＳｍＰ４Ｈ変異体断片を増幅した。反応条件は表２に示す通りとした。ＰＣＲにより得られた遺伝子断片は上記と同様の方法によりｐＴｒｃ９９Ａベクターに導入し、目的のプラスミドを得た。
【表２】
2014236713.tif 000003
【０１１０】
ＰＣＲにおけるプライマーの組み合わせは以下とした。
Ｖ９７Ａ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号４）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号５）
Ｖ９７Ｇ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号６）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号７）
Ｖ９７Ｓ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号８）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号９）
Ｖ９７Ｃ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号１０）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号１１）
Ｖ９７Ｄ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号１２）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号１３）
Ｖ９７Ｎ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号１４）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号１５）
Ｖ９７Ｋ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号１６）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号１７）
Ｖ９７Ｈ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号１８）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号１９）
Ｖ９７Ｙ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号２０）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号２１）
Ｖ９７Ｆ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号２２）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号２３）
Ｖ９７Ｍ；Ｌフラグメント（配列番号２−配列番号２４）、Ｒフラグメント（配列番号３−配列番号２５）
【０１１１】
ＰＣＲに用いた各プライマーの配列情報を表３に示す。
【０１１２】
【表３】
2014236713.tif 000004
【０１１３】
以下、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、９７番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換したＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をＶ９７Ａと表記し、他の置換されたＬ−ピペコリン酸水酸化酵素も同様に表記する。
【０１１４】
［２］第一世代変異体の評価
（１）Ｖ９７Ｘの評価１
プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈ（野生型）、もしくは、ｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｘ（変異型）を用いて、エシェリヒア・コリＷ３１１０株を形質転換し、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈ（野生型）、および、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｘ（変異型）を得た。
【０１１５】
また、国際公開第２００９／１３９３６５号に記載のＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ由来のプロリン水酸化酵素についても、上記のｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈ（野生型）の作成法に準じて、ｐＴｒｃ９９Ａをベクターとして発現型プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ１Ｐ４Ｈ（野生型）を作成し、該プラスミドを用いてエシェリヒア・コリＷ３１１０株を形質転換し、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｍ１Ｐ４Ｈ（野生型）を得た。
【０１１６】
上記操作で得られた形質転換体をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、ＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース  ２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物  ２ｇ／Ｌ、カザミノ酸  ５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム  ２ｇ／Ｌ、クエン酸  １ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム  １４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム  １６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩  １０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物  ５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物  １０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ピペコリン酸  １ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が５ｍＬ入った太型試験管に０．１ｍＬ植菌し、３０℃で４時間培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して、３０℃で３０時間、振盪培養した。
【０１１７】
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（ｃｉｓ５体、ｃｉｓ３体）は、Ｆｍｏｃ誘導体化した後、ＨＰＬＣ分析した（ｎ＝２）。その結果を表４に示す。
【０１１８】
【表４】
2014236713.tif 000005
【０１１９】
表４に示すように、Ｖ９７Ａ、Ｖ９７Ｍ、Ｖ９７Ｆ、Ｖ９７Ｙ及びＶ９７Ｃの変異にシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（Ｃ５）の力価向上及び／またはシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（Ｃ３）の副生低減がみられた。
【０１２０】
（２）Ｖ９７Ｘの評価２
ｐＴｒｃ９９Ａ−ＳｍＰ４Ｈを鋳型とし、配列番号２６、配列番号２７のプライマーセットを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ）を使用した。反応条件は表１と同様とした。
【０１２１】
取得したＰＣＲ断片とベクターｐＴｒＳ３１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩを用いた３７℃、１６時間の反応により切断した。切断断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）で精製した後、それぞれの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ）を使用する１６℃、３時間の反応により連結した。ライゲーション産物を、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ）にヒートショック法により導入した。
【０１２２】
これをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３７℃、１６時間培養し、得られたコロニーをＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）５ｍＬ中で、３０℃、１８時間培養し、その後ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を使用して目的のプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドの内部塩基配列をＤＮＡシークエンサーにて解析し、所望のＤＮＡが挿入されていることを確認し、これをｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４Ｈと命名した。
【０１２３】
また、上記［１］（２）の手法に準じて、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４Ｈを鋳型としてＶ９７Ｆ変異の導入をＰＣＲ法にて行った。所望のＤＮＡが得られていることを確認し、これをｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆと命名した。
【０１２４】
上記［１］で得られた変異酵素を発現する大腸菌、及びベクターを変更した上記の変異酵素を発現する大腸菌の変換活性を、上記［２］（１）と同様の手段で評価した。結果を表５に示す。
【０１２５】
【表５】
2014236713.tif 000006
【０１２６】
表５に示すように、Ｖ９７Ｆの変異によりシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（Ｃ５）の力価が顕著に向上し、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸（Ｃ３）の副生が低減することがわかった。
【０１２７】
［３］第二世代変異体の構築と評価と評価
（１）アミノ酸点変異ライブラリー［Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ］の構築
変異対象とするアミノ酸残基は、活性中心周辺のアミノ酸残基として、Ｉ９４、Ｖ９５、Ｓ９８、Ｅ９９、Ｎ１００、Ａ１０１、Ｃ１０２、Ｉ１０３を選択した。
【０１２８】
ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆを鋳型とし、ランダム配列を含む以下のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、融合ＰＣＲを実施した。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＭＡＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラ）を使用した。
【０１２９】
１段階目のＰＣＲによりＬフラグメントとＲフラグメントを得て、２段階目のＰＣＲでＬフラグメントとＲフラグメントの混合液を用いることで、ＳｍＰ４Ｈ変異体断片を増幅した。反応条件は表２の通りとした。
【０１３０】
変異体断片は上記と同様の方法によりｐＴｒＳ３１ベクターに導入し、目的のプラスミドを得た。ランダム配列部分は一般的なＮＮＫコドン法（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか、ＫはＧもしくはＴのどちらかに限定）を用いた。
【０１３１】
取得したＰＣＲ断片とベクターｐＴｒＳ３１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩを用いた３７℃、１６時間の反応により切断した。切断断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）で精製した後、それぞれの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ）を使用する１６℃、１６時間の反応により連結した。
【０１３２】
ライゲーション産物を、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ）にヒートショック法により導入した。これをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３７℃、１６時間培養することで、２００〜５００個のコロニーを得た。これらのコロニーを滅菌水  ２ｍＬで懸濁し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を使用してプラスミドを抽出した。
【０１３３】
取得したプラスミドを、大腸菌ＡＴＣＣ１２４３５を親株としてＷｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．（２００１）４１（２）２２３−８に記載の方法に準じて取得した酢酸耐性変異株であるＡＴＣＣ１２４３５−ＡＣＲ株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法により導入した。これをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３０℃、１６時間培養することで、点変異体ライブラリーを得た。
【０１３４】
ＰＣＲにおけるプライマーＤＮＡの組み合わせは以下の通りとした。
Ｉ９４；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号２８）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号２９）
Ｖ９５；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号３０）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号３１）
Ｓ９８；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号３２）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号３３）
Ｅ９９；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号３４）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号３５）
Ｎ１００；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号３６）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号３７）
Ａ１０１；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号３８）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号３９）
Ｃ１０２；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号４０）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号４１）
Ｉ１０３；Ｌフラグメント（配列番号２６−配列番号４２）、Ｒフラグメント（配列番号２７−配列番号４３）
【０１３５】
ＰＣＲに用いたプライマーの配列情報を表６に示す。
【０１３６】
【表６】
2014236713.tif 000007
【０１３７】
（２）第二世代変異体の評価
プラスミドｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４Ｈ（野生型）、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆ、もしくは、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆ（点変異ライブラリー）を用いて、ＡＴＣＣ１２４３５−ＡＣＲ株を形質転換し、ＡＴＣＣ１２４３５−ＡＣＲ／ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４Ｈ（野生型）、ＡＴＣＣ１２４３５−ＡＣＲ／ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆおよび、ＡＴＣＣ１２４３５−ＡＣＲ／ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７Ｆ（点変異ライブラリー）を得た。
【０１３８】
上記操作で得られた形質転換体をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し生育したコロニー６４〜１００個をランダムに選抜した。これらをＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース  ４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ２ｇ／Ｌ、イーストエクストラクト  １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物  ０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム  １ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物  ２７８ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物  １５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ピペコリン酸  ２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム  ２５ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．８に調整後、グルコース水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が５ｍＬ入った太型試験管に０．１ｍＬ植菌し、３０℃で４８時間、振盪培養した。
【０１３９】
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｆｍｏｃ誘導体化した後ＨＰＬＣ分析し、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生が低減される変異体をスクリーニングした。
【０１４０】
変異点は、取得した変異体から抽出したプラスミドの内部塩基配列をＤＮＡシークエンサーにて解析した。その結果を表７に示す。
【０１４１】
【表７】
2014236713.tif 000008
【０１４２】
表７に示すように、シス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生が低減される変異体として、Ｖ９７ＦＶ９５Ｗ、Ｖ９７ＦＡ１０１Ｖ、Ｖ９７ＦＡ１０１Ｔが同定された。
【０１４３】
［４］第三世代変異体の構築と評価
（１）ランダム変異体ライブラリーの構築
ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５Ｗを鋳型とし、配列番号２６および配列番号２７からなるプライマーセットを用いて、突然変異誘発条件でのＰＣＲを実施した。ランダム突然変異導入は、ＤｉｖｅｒｓｉｆｙＴＭ  ＰＣＲ  ランダム突然変異誘発キット（クロンテック）を用いることで行った。キットに添付のマニュアルに従い、１０００ｂｐあたり、２〜３個の変異が導入される条件でＰＣＲを行った。反応条件は表８の通りとした。
【０１４４】
【表８】
2014236713.tif 000009
【０１４５】
取得したＰＣＲ断片とベクターｐＴｒＳ３１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩを用いた３７℃、１６時間の反応により切断した。切断断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）で精製した後、それぞれの断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラ）を使用する１６℃、１６時間の反応により連結した。ライゲーション産物は、エタノール沈殿により脱塩した後、エシェリヒア・コリＨＳＴ０８（タカラ）株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法により導入した。これをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３７℃、１６時間培養することで、〜１０５個のコロニーを得た。これらのコロニーを滅菌水２ｍＬで懸濁し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を使用してプラスミドを抽出した。
【０１４６】
取得したプラスミドを、評価用宿主であるＡＴＣＣ１２４３５−ＡＣＲ株のコンピテントセルにエレクトロポレーション法により導入した。これをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬ  アンピシリン）で３０℃、１６時間培養することで、ランダム突然変異体ライブラリーを得た。
【０１４７】
（２）変異酵素の評価
作製したランダム突然変異体ライブラリーからの高活性変異体のスクリーニングは、９６穴ディープウェルプレートとＴＬＣを用いた一次スクリーニング、試験管培養による二次スクリーニングの順に実施した。
【０１４８】
一次スクリーニングは、以下の方法で行った。上記（１）で得られたランダム突然変異体ライブラリーをＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し生育したコロニー約２０００個をランダムに選抜した。これらをＬＢ培地０．５ｍＬが入った９６穴ディープウェルプレート（グライナー）にそれぞれ植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。
【０１４９】
評価培地［グルコース  ４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ２ｇ／Ｌ、イーストエクストラクト  １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物  ０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム  １ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物  ２７８ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物  １５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ピペコリン酸  ２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム  ２５ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．８に調整後、グルコース水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が０．５ｍＬ入った９６穴ディープウェルプレートに０．０５ｍＬ植菌し、３０℃で４８時間、振盪培養した。
【０１５０】
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を下記条件によりＴＬＣ分析した。
（ＴＬＣ条件）
・展開溶媒［ｎ−ＢｕＯＨ：酢酸：水＝３：１：１
・ＴＬＣプレート［フナセルＳＦ、微結晶セルロース薄層プレート（フナコシ）］、
・定色試薬［ニンヒドリン（和光純薬）］。
【０１５１】
ピペコリン酸消費量が多く、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産が高い変異体を選抜し、二次スクリーニングを実施した。二次スクリーニングは、以下の方法で行った。
【０１５２】
上記の一次スクリーニングで得られた変異体をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、ＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース  ４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム  １０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ２ｇ／Ｌ、イーストエクストラクト  １ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物  ０．５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム  １ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物  ２７８ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム  １５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ピペコリン酸  ２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム  ２５ｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．８に調整後、グルコース水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が５ｍＬ入った太型試験管に０．１ｍＬ植菌し、３０℃で４８時間、振盪培養した。
【０１５３】
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｆｍｏｃ誘導体化した後ＨＰＬＣ分析し、ｐＴｒＳ３１−ＳｍＰ４ＨＶ９７ＦＶ９５Ｗを有するコントロール株よりシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の力価が２〜３倍向上し、かつシス−３−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の副生が同程度に低減した変異体Ｒ６８を選抜した。
【０１５４】
変異点は、取得した変異体から抽出したプラスミドの内部塩基配列をＤＮＡシークエンサーにて解析した。その結果、上記で選抜された変異体Ｒ６８が有する変異は、Ｖ９７ＦＶ９５ＷＥ１１４Ｇであると同定した。
【０１５５】
（ＨＰＬＣ解析）
培養液に含まれるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｆｍｏｃ誘導体化した後、ＨＰＬＣ分析した。培養液を１３０００回転で１０分遠心分離して得られる培養上清をＦｍｏｃ化に用いた。
【０１５６】
培養上清１５μＬと１００ｍＭホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）２８５μＬを混合し、これにＦｍｏｃ化試薬（４５ｍｇ  ９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ／３０ｍＬ  アセトン）３００μＬを混合した後、４０分間室温で反応させた。反応後、２５％アセトニトリル／２５０ｍＭホウ酸ナトリウム液（ｐＨ５．５）を６００μＬ加えて希釈した。必要に応じてこれをさらに希釈し、ＨＰＬＣ分析のサンプルとした。
【０１５７】
試料は、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５  ４．６ｘ２５０ｍｍ（野村化学）を装備したＬＣ−１０ＡＤ  ｖｐ  ＨＰＬＣシステム（日立）を用いて分析、定量した。分析には、下記の条件を用いた。移動相には、終濃度５０ｍＭ、ｐＨ５．０に調整した酢酸ナトリウム水溶液とアセトニトリルを８：２の比で含む移動相Ａ、終濃度５０ｍＭ、ｐＨ５．０に調整した酢酸ナトリウム水溶液とアセトニトリルを２：８の比で含む移動相Ｂを用いた。
【０１５８】
移動相の流速は１．５ｍＬ／ｍｉｎ、移動相Ａと移動相Ｂの混合比は、０〜１０分は８５：１５の一定で、１０〜１２分は８５：１５から２０：８０の勾配、１２〜１３分は２０：８０の一定で、１３〜１４分は２０：８０から８５：１５の勾配、１４〜２０分は８５：１５の一定に変化させた。
【０１５９】
カラム温度は４０℃とした。ＵＶ検出の場合は２５４ｎｍの紫外線吸収を測定し、蛍光検出の場合は、励起波長（Ｅｘ）２４５ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）３１６ｎｍで測定した。結果を図１に示す。
【０１６０】
図１に示すように、得られた変異Ｖ９７ＦＶ９５ＷＥ１１４Ｇを有する変異体Ｒ６８はＨＰＬＣクロマトにより再現性が確認できた。
【図１】
2014236713.tif 000010
【配列表】
2014236713000001.app