(57)【要約】【課題】細胞培養のための気体透過性装置及び方法を提供する。【解決手段】複数の高さに培地を有し、且つ培地容積に対する気体透過性表面領域の或る割合を有する、細胞培養装置及び細胞培養方法を含む。これらの装置及び方法は、細胞培養効率及びスケールアップ効率を改善することを可能にする。【選択図】  図１Ａ
2014236753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するための方法において、
ａ）単区画からなる細胞培養装置であって、前記単区画の少なくとも底部の少なくとも一部が非孔性気体透過性材料からなる細胞培養装置を形成する工程と、
ｂ）前記単区画に一定量の培地と細胞を投入する工程と、
ｃ）前記細胞培養装置が所定の位置に配備されたときに前記培地が前記単区画の最も低い面をなす前記底部の最も低い点から２．０ｃｍを越えて存在するように前記培地の分量を調節する工程と、
ｄ）前記細胞培養装置を細胞の培養のために適切な一定の組成を有する周囲気体を有する設置の場所に設置する工程であって、前記細胞培養装置は前記底部が前記単区画の前記最も低い面をなす方向に配備すべく、前記細胞培養装置を設置する工程と、
ｅ）前記培地を混合し、または攪拌するための設計となっている道具によって前記培地を混合することなく、静止培養を行う工程とを備える、方法。
【請求項２】
前記区画は少なくとも一部が気体透過性材料からなる第１の側壁を有し、前記細胞培養装置は、前記方向とは異なる方向に再配備され、前記細胞の少なくとも一部は前記第１の側壁に引き寄せられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が前記底部の最も低い点から２．５ｃｍを越えて存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が前記底部の最も低い点から３．０ｃｍを越えて存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が前記底部の最も低い点から４．０ｃｍを越えて存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記底部は前記非孔性透過性材料から少なくとも一部がなる水平な部分を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記底部の全体が前記非孔性透過性材料からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培地の一部は培養されるべき前記細胞の直接に上方の部分でない領域に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞培養装置はバッグの形態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培養装置は、前記非孔性気体透過性材料の少なくとも一部に接触している少なくとも１つの気体透過性材料支持部をさらに備え、前記非孔性気体透過性材料の少なくとも一部は前記細胞培養の場所の周囲気体と接触している、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、細胞培養効率を改善する方法及び装置に関する。これらの方法及び装置は、気体交換のために気体透過性物質を利用し、細胞培養倍地の高さの増大を可能にし、気体透過性装置の培地容積許容積（volume capacity ：容積容量）に対する表面積の割合を減少させ、且つ従来の細胞サポートスカフォールドを一体化する。さまざまな利益が当然得られ、それらの利益には在庫品用空間、インキュベータ用空間、廃棄用空間及び労力のより効率的な使用、並びに混入の危険性の減少が含まれる。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００３年１０月８日付けで出願された米国仮出願第６０／５０９，６５１号（その全体が参照により本明細書中に援用される）の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
［関連技術において記載される従来技術の制限の考察］
細胞の培養は、バイオテクノロジーの重要な要素である。細胞は、研究段階の間は少量で培養され、そして、通常、培養の規模は、研究がその目的であるヒト及び動物の保健医療に利益を与えることに移行するにしたがって増大する。この規模の増大は、しばしば、スケールアップと称される。或る装置及び方法は、広範な細胞型を培養することを可能にするとして、研究段階の細胞培養に関して十分に確立されており、したがって、最も幅広い対象に対して有用である。これらの装置は、マルチウェル組織培養プレート、組織培養フラスコ、ローラボトル及び細胞培養用バッグを含む。残念ながら、これらの装置は非効率的であり、これらはスケールアップ時の労力、混入の危険性及び費用の観点で、より非効率的にさえなる。研究及びスケールアップ効率を改善する、スケールアップを研究し且つ維持する、代替的な装置及び方法を作製することが必要とされている。本考察は、従来技術における制限の多くを特定し、以下により詳細に記載される解決策を示す。
【０００４】
研究規模の細胞培養に重要な１つの寄与要因は、複雑性のレベルが低いことである。複雑性を最小限にする装置は、細胞培養培地を混合又は潅流させる補助器材を必要としない。これらはしばしば、静止装置（static device ）と称される。静止装置は、２つの広義のカテゴリー、すなわち１）気体透過性ではなく、気体／液体界面を利用して細胞に酸素添加する装置、及び２）気体透過性であり、装置ハウジングを介する気体移動（gas transfer）を利用して細胞に酸素添加する装置にさらに分けることができる。従来のペトリ皿、マルチウェル組織培養プレート、組織培養フラスコ、及びマルチシェルフ組織培養フラスコが、第１のカテゴリーに含まれる。細胞培養用バッグ及び区画化（compartmentalized ）フラスコが、第２のカテゴリーに含まれる。これらの静止装置の全ては、さまざまな理由（培地が存在することのできる高さの制限を含む）から非効率的である。
【０００５】
培地の高さは、ペトリ皿、マルチウェル組織培養プレート、組織培養フラスコ及びマルチシェルフ組織培養フラスコにおいて、気体交換を供する方法に応じて制限される。細胞の要求を満たすために、酸素は気体／液体界面から、装置のうち細胞が存在する下方（下部）表面に拡散しなければならない。十分な酸素供給を確保するために、これらの装置における使用に関して推奨される細胞培養培地の最大高さは、約３ｍｍである。
【０００６】
制限された培養培地の高さは不利益をもたらす。制限された培養培地の高さは、少量の細胞しかサポートすることができない少量の培地容積となる。培地は、培養を維持するために連続的に除去及び添加されなくてはならず、これは、取り扱い頻度、労力及び混入の危険性を増加させる。装置においてより多くの細胞を培養するためのただ１つの方法は、
この装置の設置面積を大きくすることで、より多くの培地を存在させることができるというものである。大きい設置面積を有する装置の作製は製造の見地から困難であり、典型的なインキュベータ及びフローフードにおいて利用可能な制限された空間量を直ちに大きくし、装置の取り扱いをより難しくする。したがって、市販の細胞培養装置は小さい。このように、培養のスケールアップは、複数の装置を使用すること、又はより精巧な、複雑な、且つ費用のかかる代替品を用いることが必要である。
【０００７】
組織培養フラスコは、機能するために気体／液体界面依存型の静止装置固有の問題の良い例を提供する。組織培養フラスコは、細胞を、通常２５ｃｍ２〜２２５ｃｍ２の範囲の面積を有する面に存在させる。組織培養フラスコに推奨される培地の高さは、２ｍｍ〜３ｍｍである。例えば、コーニング（Corning ）（登録商標）は、そのＴ−２２５ｃｍ２フラスコに関して、４５ｍｌ〜６７．５ｍｌの作業容積を推奨している。したがって、１，０００ｍｌの培養には、１５〜２２個の間のＴ−２２５ｃｍ２フラスコを必要とする。これは、労力及び混入の危険性の増加につながる、１５〜２２個の装置を培養に必要とするだけではなく、フラスコが約９５％の気体と５％のみの培地を保持する様式に設計されているため、非常に非効率的な空間使用も生じさせる。例えば、典型的なＴ−１７５フラスコの本体は、およそ長さ２３ｃｍ×幅１１ｃｍの設置面積を有し、約３．７ｃｍの高さであり、したがって、約９３６ｃｍ３の空間を占める。しかし、このフラスコは通常、約５０ｍｌ未満の培地しか扱わない。したがって、本体中に存在する培地（５０ｍｌ）は、本体（９３６ｃｍ３）が占める空間に対して、フラスコの内容物の９５％近くが気体にすぎないことを示す。この非効率的な空間使用は、貴重なインキュベータ用空間を無駄にすることに加えて、出荷（shipping）、滅菌、保管及び廃棄の費用を増大させる。
【０００８】
別の一般的に使用される研究規模の細胞培養装置は、マルチウェル組織培養プレートである。従来の組織培養フラスコと同様に、気体／液体界面を、各ウェルの底からわずか２ｍｍ〜３ｍｍの高さに維持することは、標準的な操作手順である。プレートを細胞培養研究室内のあちこちに移動させる時にこぼすこと（spillage）からの保護を提供するために、典型的な市販の９６ウェル組織培養プレートの各ウェルは約９ｍｍの深さである。この深さは、６ウェル組織培養プレートに関しては最大約１８ｍｍまで増える。９６ウェルプレートの場合、気体は各ウェルの約７５％を占め、培地は各ウェルの約２５％を占める。６ウェルプレートの場合には、気体は各ウェルの約９５％を占め、培地は各ウェルの約５％を占める。この非効率的な形状は、装置の出荷、滅菌、保管及び廃棄の費用を増大させる。
【０００９】
多くの用途において、小容積の培地を除去及び置換することにより培地に頻繁に栄養供給する必要性は、問題となり得る。例えば、マルチウェル組織培養プレートの目的が実験を実施することである場合、培地を処理することはこれらの実験の結果に影響を与えかねない。また、培地容積が非常に小さいため、溶質濃度の好ましくない変化がごく少量の蒸発とともに起こり得る。細胞培養機能を損失することなく、培地が増大した高さで存在することを可能にするマルチウェル組織培養プレートは、培養を生かし続けるのに必要な操作を最小限にすることにより、且つ、蒸発により生じる濃度変化の程度を減少させることにより、従来のプレートに勝るであろう。
【００１０】
頻繁な培地交換は、時間がかかること、費用がかかることでもあり、混入の危険性が増加することにつながる。特殊な液体取り扱い器材（マルチチャネルピペット等）によりこの問題を緩和する試みは、問題の発生源、すなわち培地の高さが低いことに対処していない。最良の解決策は、より多くの培地を各ウェル内に存在させることである。残念ながら、この解決策は、気体／液体界面を利用する気体交換の必要性のため、従来のプレートでは可能ではなかった。
【００１１】
従来の装置に対するより良い代替品が必要とされている。組織培養装置が、機能するために気体／液体界面にだけに頼るのではなく、従来のフラスコ及びマルチウェルプレートのように使用が容易であり、同じ設置面積を有する装置においてより多くの細胞を培養することが可能であり、且つ容易に、且つ直線的にスケーリング可能ならば、効率的な利得は、ヒト及び動物の保健医療を進歩させるために使用するこれらの細胞に関する費用の削減に変わるであろう。本明細書中において、気体透過性物質がいかにして使用されるか、且つ、新規な構成がこの目的をいかにして達成することができるかが示されるであろう。
【００１２】
気体交換の単一源としての気体／液体界面を排除する細胞培養装置が提案され、市場に参入している。このアプローチは、下方気体透過性膜の使用に頼って、培地の底に気体交換をもたらす。気体／液体界面に対する単一依存とは対照的に、これはより多くの気体移動を可能にする。提案された装置及び市販の装置は、細胞培養用バッグ、区画化気体透過性フラスコ、気体透過性カートリッジ、気体透過性ペトリ皿、気体透過性マルチウェルプレート及び気体透過性ローラボトルを含む。
【００１３】
残念ながら、各気体透過性装置は、固有の非効率性及びスケールアップ欠点を有する。細胞培養用バッグ、気体透過性カートリッジ、気体透過性ペトリ皿、気体透過性マルチウェルプレート、区画化気体透過性フラスコ及び気体透過性ローラボトルの主な制限は、培地の高さの制限、培地容積に対する過剰な気体透過性表面積の割合、及び接着細胞を培養するのに不適な形状を含む。この結果、多数の装置に必要とされるスケールアップを強制し、装置設計選択肢を制限し、且つ、スケールアップが起こるにつれて費用及び複雑性を増加させることになる。
【００１４】
気体透過性装置を取り巻く先行技術の綿密な検討は、従来の見識（conventional wisdom ）及び装置設計が、いかにして培地の高さ及び装置内に存在する培地の容積を制限するかを示す。１９７６年の非特許文献１において、気体透過性膜で作製された密封容器の操作の仮説が分析されている。イェンセン（Jensen) 他は、培地中における溶質輸送の形態としての拡散を記載しており、この論文は「拡散はフィックの法則に従って進行する」と述べている。イェンセン他は、「（イェンセン他の）図２は、気体透過性物質で作製されたバッグにおいて培養された細胞の拡散特性を示す」と述べている。本明細書中における図１Ａは、イェンセン他の図２を示し、ここでＤｃｍは培地の拡散係数である。本明細書中における図１Ｂは、イェンセン他の図３を示し、ここで、気体透過性容器におけるＰＯ２及びＰＣＯ２に対する定常値モデルは、拡散に基づく培地全体の直線衰退として示される。
【００１５】
１９７７年に、イェンセン（非特許文献２）は、「気体透過性、非多孔性プラスチックフィルム」を使用して細胞培養装置を形成する「主要な技術革新（innovation）」を記載している。本明細書中における図２は、イェンセンの図２を示す。本明細書中における図２に示されるように、装置は、非常に低い高さの培地（わずか０．７６ｍｍ）、及び培地容積に対する非常に高い気体透過性表面の割合を作り出した。スケールアップに関して、装置は約９１４．４ｃｍ（３０フィート）の長さを得、特別注文の器材を使用して潅流される。
【００１６】
１９８１年に、イェンセン（非特許文献３）は、「培養槽設計は、培養される細胞全てに固定され、且つ一定である小さな拡散距離を組込まなければならない。この設計は、培養をスケールアップさせることがこの拡散距離を変化させないようでなければならない」と具体的に記述している。実際、培地は気体透過性膜から非常に離れた高さで存在するべきではないとする従来の見識は今日も存続しており、気体透過性物質を利用する市販製品及びこれらに関連する特許から明らかである。さらに、培地容積に対する高い気体透過性表面の割合も存続している。
【００１７】
さまざまな気体透過性細胞培養装置が、１９８１年以降、市場に参入し、提案されてきた。しかし、主要な設計要素としての拡散に対する継続的な信頼は、特許、装置設計、装置仕様及び気体透過性装置に関する操作指示書の総説に基づく場合であるように見える。設計基準として、拡散モデルは、培地の高さを制限し、培地容積に対する高い気体透過性表面の割合を導き、且つ非効率的な装置形状に寄与する。
【００１８】
バッグ形態の市販の気体透過性細胞培養装置は、現在、細胞培養に関して使用される標準的な装置フォーマットである。イェンセンの構成のように、これらの製品は、培地の下方面及び上方面を介した気体交換を、気体透過性物質を介して可能にする。イェンセンによって提示された装置とは異なり、潅流は必要ない。通常、これらは潅流されず、細胞培養インキュベータ内に存在する。このことは、費用及び複雑性を減少させ、且つこれらの装置を市場に受け入れられる装置にする。しかし、細胞培養培地が気体透過性膜間に存在する時の気体透過性膜間の制限された距離は、これらの装置を、効率的なスケールアップに関して形状的に不適切にする影響を及ぼす。より多くの培地が必要となると、バッグの大きさは水平方向に比例的に増大しなくてはならない。したがって、これらは通常、２リットルを超える大きさでは不可能であり、多数の装置をスケールアップさせることを必要とする。さらに、これらは、従来の装置において使用される標準的な液体取り扱いツールと適合しておらず、そのため、研究規模の培養を実施するのに一定レベルの複雑性をもたらす。
【００１９】
バッグは、気体透過性フィルムの２つのシートをともに積層させることにより製造される。典型的なバッグの断面が、特許文献１から抜粋した図３に示され、これはＳｉ‐Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグ（メドトロニック社（Medtronic Inc.））として商品化されている。従来の静止細胞培養装置の有益な特徴は、細胞が存在する領域での培地の均一な分布である。当業者は特に、培地が装置全体を通して一定の高さで存在することを確実にする目的でインキュベータを同じ高さにすることに多大な注意を払う。図３のバッグの断面を見ることにより、たとえインキュベータがどのような高さであっても培地がいかにして、全ての下方気体透過性フィルム上に均一な高さで存在しないかが分かる。フィルム同士はその周辺で噛み合うため、培地は、その周辺近くでは、バッグの他の部分とは異なる高さで存在することを余儀なくされる。培地容積が増加するに従って、バッグは円筒形状をとり始め、培地分布は悪化する。細胞は、不均一形状に応じて、潜在的な栄養素勾配を受け得る。多すぎる培地がバッグ中に存在する場合、下方面は非水平状態で存在するであろう。これもまた問題となる。バッグ中に存在する懸濁細胞は、均一に分布しないであろう。代わりに、細胞は、低い位置に重力により沈み、積み重なり、この積み重なり内に栄養素及び酸素の勾配が形成されるに従い死ぬであろう。接着細胞の場合、これらは均一に播種されないが、これは、バッグの各部分に存在する種菌（inoculum）の量が変わるであろうためである。バッグがいっぱいになりすぎると生じる形状的な問題に加え、１，０００ｍｌを超える培地の重量も、特許文献１に記載されるように、バッグに損傷を与える可能性がある。バッグの形状的な制限を克服したとしても、バッグ及び他の気体透過性装置に関する指示書及び特許は、培地が非常に高すぎて存在するときに、拡散障壁は装置が機能することを妨げるという所見に基づいて制限が存在することを示す。
【００２０】
細胞培養用バッグは、オリゲンバイオメディカルグループ（OriGen Biomedical Group ）（ＯｒｉＧｅｎＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグ）、バクスターインターナショナル社（Baxter）（特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５に関連するＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商品）Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標））、メドトロニック社（Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）、特許文献１）、バイオベクトラ社（Biovectra ）（ＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標））及びアメリカンフルオロシール社（American Fluoroseal ）（特許文献６及びと特許文献７に含まれる、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）培養バッグシステム）から市販されてい
る。仕様書、操作指示書及び／又は特許は、各製品に対する培地の高さ及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合を決定する。
【００２１】
パティリョ（Pattillo）他（バクスターインターナショナル社（Baxter InternationalInc. ）に譲渡された特許文献２及び特許文献３）は、典型的なバッグは、「全容積の約
１／４〜１／２を満たされて、培地及び細胞の容積の比較的高い内表面積比を提供し、それにより十分な酸素がバッグ内で拡散し、且つ二酸化炭素がバッグの外に拡散することで細胞の代謝及び増殖を容易にすることができる」と記述している。パティリョ他の観点から、バクスターインターナショナル社製のＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標）バッグに関して実現される最適な培地高は、その６００ｃｍ２バッグに対するものであって、１．０ｃｍ〜２．０ｃｍの培地の高さ、及び、２．０ｃｍ２／ｍｌ〜１．０ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する気体透過性表面積の割合を与える。
【００２２】
ＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標）バッグに関する製品チラシ（product literature：製品資料）は、「ＶｅｃｔｒａＣｅｌｌの１Ｌ容器は最大５００ｍＬまでの培地を保持することができる。ＶｅｃｔｒａＣｅｌｌの３Ｌ容器は最大１，５００ｍＬまでの培地を保持することができる」と記述している。したがって、バクスターインターナショナル社製のバッグと同様に、最大培地容量は、バッグの全容量の１／２である。売り出されているさまざまなバッグの大きさのうち、３Ｌバッグが最も高い培地高（１．９２ｃｍ）を可能とし、且つ、培地容積に対する最も低い気体透過性表面積の割合（１．０４ｃｍ２／ｍｌ）を有する。
【００２３】
培地が物理的に混合するオービタルシェーカに存在する場合、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグに関して、１．６ｃｍの培地高が、製品チラシにおいて推奨されており、特許文献１において明記されている。これは、混合環境において使用される場合、１．２５ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する気体透過性表面積の割合をもたらす。混合は通常、拡散勾配を崩壊させるために、且つ溶質移動を高めるために使用されるため、当業者は、培地の高さはバッグがオービタルシェーカに置かれていない場合に低減されるべきであることを、結論付けるであろう。
【００２４】
ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグに関する製品チラシは、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）培養バッグを１センチメートル未満の厚さの高さの培地で満たすことを特に推奨しているが、これは、「さらなる培地は、栄養素又は気体拡散を妨害し得る」からである。したがって、拡散に関する懸念は、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグにおける培地の高さを制限する。これは、１．０ｃｍの高さの培地で、２．０ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する気体透過性表面積の割合をもたらす。
【００２５】
ＯｒｉＧｅｎＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグに関する製品チラシは、１．０ｃｍ（ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグと同じ高さ）の高さの培地での呼び容積（nominal volume）を明記している。売り出されているさまざまなＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグのうち、これらの１２０ｍｌバッグが、１．８ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する最も低い気体透過性表面積の割合を与える。
【００２６】
制限された培地の高さの最終的な結果は、これらの製品を使用した培養のスケールアップは非実用的であるということである。例えば、ＬｉｆｅｃｅｌｌＸ−Ｆｏｌｄ（商標）バッグが、１０Ｌの培地を２．０ｃｍの培地高で含有し得るようにスケールアップされるのならば、この設置面積は少なくとも５，０００ｃｍ２でなくてはならないであろう。この扱いにくい形状だけではなく、設置面積は直ちに、標準的な細胞培養インキュベータを規格外に大きくさせる（outsize ）ため、特別注文のインキュベータが必要となり得る。また、これらの構成の全ては、気体移動に関してバッグの上方面及び下方面の両方に頼っ
ているため、バッグ内で使用される気体移動面積は必要以上に大きくなる。
【００２７】
この非実用的な形状は、市販されているバッグの大きさを制限してきた。各供給業者からの最も大きなバッグに対して推奨される培地容積は、振とうする場合、ＯｒｉＧｅｎＰｅｒｍａＬｉｆｅ（商標）バッグに関しては２２０ｍｌ、ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグに関しては７３０ｍｌ、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）Ｘ−Ｆｏｌｄ（商標）バッグに関しては１，０００ｍｌ、ＶｅｃｔｒａＣｅｌｌ（商標）バッグに関しては１，５００ｍｌ、及びＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグに関しては２，０００ｍｌである。したがって、スケールアップは、多数の個別のバッグの使用を必要とするため、労力及び混入の危険性の増加を含むさまざまな理由によって非効率的なプロセスとなる。
【００２８】
細胞培養用バッグに伴なう別の欠点は、従来のフラスコのように使用が容易ではないということである。細胞培養用バッグの中及び外への液体の輸送は困難である。細胞培養用バッグは、シリンジ、針又はポンプ配管と噛み合うようになっている配管接合部を備えて構成されている。これは閉鎖系操作に適しているが、研究規模の培養には適さず、ピペットの使用が、より容易であるとともにより一般的な、液体を取り扱う方法である。ピペットを使用することができないことは、バッグに添加又は除去される培地の所望量が、典型的な太さのシリンジの６０ｍｌ容積を超える場合、非常に不都合である。この場合、シリンジは、６０ｍｌの輸送ごとに、配管に対し接続及び取り外しを行わなければならない。例えば、６００ｍｌを含有するバッグは、６０ｍｌシリンジでは最大１０回の接続及び１０回の取り外しを必要とするため、バッグを取り扱う時間及び混入の可能性を増加させるであろう。接続回数を最小限にするために、ポンプを使用して培地を輸送することができる。しかし、これは小規模の培養に対して費用を追加させるとともに複雑性を与える。細胞培養用バッグを利用する多くのハイブリドーマコアラボラトリー（hybridoma core laboratories ）は、準備時に一度バッグを満たし、これらの接続により生じる混入の高い危険性及びポンプの複雑性のために、再び細胞を供給することはない。
【００２９】
マツミヤ（Matsumiya ）他（特許文献８）は、液体輸送の問題を、バッグと培地保管室とを一体化することによりなくすことを試みている。培養室及び培地保管室を接続し、新鮮な培地が必要となったときは、培地を培地室から培養室へと通過させる。このことが培地輸送を助け得る一方、バッグのスケールアップ効率を制限する、制限された培地の高さ及び培地容積に対する高い気体透過性表面積の割合に対する解決策は存在しない。この開示は、０．３７ｃｍの培地高、及び、５．４ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する気体透過性表面積の割合を提示している。
【００３０】
カートリッジ形式の気体透過性細胞培養装置は、細胞培養用バッグとは異なり、側壁を有するものとして市場に導入されてきた。これらの種類の装置は、側壁を使用して、上方及び下方の気体透過性フィルムを分離する。これは、培地の高さを装置全体を通して均一にすることを可能にする。残念ながら、これらの装置は、バッグよりもスケールアップにさらに適していないが、これは、これらの装置が少量の培地しか含有しないためである。少量の培地は、培地容積に対する高い気体透過性表面積の割合を生じさせる試みの結果である。
【００３１】
Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）と呼ばれるこのような１つの製品が、バイオクリスタル社（BioChrystal Ltd.）から提供されている。この製品は、その上方面及び下方面が、気体透過性シリコーンフィルムと結合している容器であり、上方面及び下方面の表面積はそれぞれ５０ｃｍ２である。側壁は、気体移動の為ではなく、上方気体膜及び下方気体膜を分離するのに必要な硬さを与えるために選択された材料から成るものである。製品チラシは、この重要な特徴である、「大きな表面積対容積比を有する２つの増殖面」を宣伝している。この製品に関する非特許文献４の論文において、特許出願人のバーバラ・ギレム（
Barbera-Guillem ）は、「マイクロタイタープレートの設置面積の場合、膜面積は最大化され、容積は最小化され、最大の気体相互交換を有する巨大な増殖面を提供する空間をもたらす」と記述している。この製品をいかにして使用するかを規定する操作プロトコルは、わずか１０ｍｌの培地の導入を明記しており、それにより培地が存在することができる高さを０．２ｃｍに制限している。この装置と関連する特許文献９（２００２年６月２５日付けで出願）は、最大１．２７ｃｍ（０．５インチ）までの高さが可能であるが、０．１８ｃｍ〜約０．２ｃｍ（約０．０７〜約０．０８インチ）の高さがより好ましいであろうと記述している。同様に、この装置と関連する特許文献１０は、最大２０ｍｍまでの高さが可能であるが、４ｍｍの高さがより好ましいであろうと記述している。この特許において記載される１．２７ｃｍというより高い高さが市販の装置に組み込まれたとしても、この培地の高さはバッグで可能な高さを超えることはない。さらに、このことは、培地容積に対する気体透過性表面積の割合を１．００ｃｍ２／ｍｌ（バッグと同様）にしか減少させないであろう。特許文献９は、装置の１つの側面のみが気体透過性である構成を示す。この構成（商品化されていない）において、１．２７ｃｍ（０．５インチ）の培地の高さでは、０．７９ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する気体透過性表面積の割合が得られ、この割合は、細胞培養用バッグのものよりも若干低いであろう。したがって、側壁があるにもかかわらず、形状が最大の培地高を可能にしたとしても、バッグと比較して、スケールアップ効率は改善されていない。
【００３２】
また、カートリッジ形式の気体透過性細胞培養装置は、ＭＡＢＩＯインターナショナルラボラトリー（Laboratories MABIO‐International ）（登録商標）により市場に導入されおり、これはＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）培養カセットと呼ばれている。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）のように、製品設計も操作指示書も、バッグと比較して、培地の高さの増大、又は培地容積に対する気体透過性表面積の割合を提供しない。ＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）２５培養カセットに関する操作指示書は、１０ｍｌ未満の培地が２５ｃｍ２の下方気体透過性表面上に存在するべきであると記述している。下方気体透過性物質の表面積がわずか２５ｃｍ２であるため、これはわずか０．４ｃｍの高さの培地を生じる。また、装置の頂部及び底部は気体透過性物質から成るため、５．０ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する高い気体透過性表面積の割合が存在する。ＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）２５０培養カセットに関する操作指示書は、１６０ｍｌ未満の培地が２５０ｃｍ２の下方気体透過性表面上に存在すべきであることを記述しており、これは０．６４ｃｍの低い培地の高さ、及び、３．１２５ｃｍ２／ｍｌの、培地容積に対する高い気体透過性表面積の割合をもたらす。
【００３３】
カートリッジ形式の気体透過性細胞培養装置は、最近、セラティス社（Celartis）により市場に導入されており、これはＰｅｔａｋａ（商標）と呼ばれる。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）及びＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）培養カセットと同様に、これらの装置もまた、上方及び下方の気体透過性フィルムを分離する手段として機能する側壁を有する。上記の製品と異なり、この製品は標準的なピペット及びシリンジと適合可能であるため、液体取り扱いの利便性を改善する。しかし、製品設計も操作指示書も、バッグと比較して、培地の高さの増大又は培地容積に対する気体透過性表面積の割合の減少を提示していない。この操作指示書は、２５ｍｌ未満の培地が、上方及び下方の気体透過性表面の間に存在するべきであり、これらの上方及び下方の気体透過性表面は１６０ｃｍ２という総表面積を有する。製品チラシは、０．１５６ｍｌ／ｃｍ２という「最適化された培地／表面積」を明記している。したがって、培地の高さはわずか０．３１ｃｍであり、培地容積に対する最適化された気体透過性表面積の割合は６．４ｃｍ２／ｍｌである。
【００３４】
スケールアップに関する市販のカートリッジ形式の気体透過性装置の制限は、これらの装置に対して利用可能な最大培養容積を検討したときに明確になる。Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）は最大１０ｍｌまでの培養容積を提供し、ＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）培
養カセットは最大１６０ｍｌまでの培養容積を提供し、Ｐｅｔａｋａ（商標）は最大２５ｍｌまでの培養容積を提供する。したがって、ちょうど１，０００ｍｌの培養を実施するためには、１００個のＯｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カートリッジ、７個のＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）培養カセット、又は４０個のＰｅｔａｋａ（商標）カートリッジが必要となるであろう。
【００３５】
ザルトリウスグループのビバサイエンス社（Vivascience Sartorius Group ）は、ｐｅｔｒｉＰＥＲＭと呼ばれる気体透過性ペトリ皿を市場に導入している。ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ３５及びｐｅｔｒｉＰＥＲＭ５０はそれぞれ、従来の３５ｍｍ径及び５０ｍｍ径のペトリ皿の形態の製品である。これらの底部は気体透過性である。ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ３５ｍｍ皿及びｐｅｔｒｉＰＥＲＭ５０ｍｍ皿の壁はそれぞれ、６ｍｍ及び１２ｍｍの高さである。ビバサイエンス社の製品仕様は、ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ３５が９．６ｃｍ２の気体透過性膜面積及び３．５ｍｌの最大液体容積を有し、０．３６ｃｍの最大の培地高をもたらすことを示し、且つｐｅｔｒｉＰＥＲＭ５０が１９．６ｃｍ２の気体透過性膜面積及び１０ｍｌの最大の液体容積を有し、０．５１ｃｍの最大の培地高をもたらすことを示す。ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ製品は、培地の上方面を周囲気体と連通させるカバーと、培地の下方面を周囲気体と連通させる下方気体透過性物質とを有するように設計されている。したがって、ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ３５の培地容積に対する最小の気体透過性表面積の割合は２．７４ｃｍ２／ｍｌであり、ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ５０の培地容積に対する最小の気体透過性表面積の割合は１．９６ｃｍ２／ｍｌである。他の気体透過性装置のように、ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ製品もまた、スケールアップに関して非効率的である。わずか１，０００ｍｌの培養を実施するために、少なくとも１００個の装置が必要である。さらに、これらの装置は、閉鎖系として操作することができない。
【００３６】
ガブリッジ（Gabridge）（特許文献１１）は、高分解能顕微鏡用に設計された、ペトリ皿のような頂部カバーを備えて構成される気体透過性細胞培養装置を記載する。ウエルの深さは、「顕微鏡に関して最も使いやすい大きさ」に基づき、０．６３５ｃｍ（０．２５インチ）である。最良の場合でも、この装置は０．６３５ｃｍの高さの培地しか保持することができない。
【００３７】
ザルトリウスグループのビバサイエンス社はまた、ＬｕｍｏｘＭｕｌｔｉｗｅｌｌと呼ばれる気体透過性マルチウェル組織培養プレートを市場に導入している。これらの製品は、グライナー・バイオワン社（Greiner Bio ‐One ）からも流通されている。これらは２４、９６及び３９４ウェルフォーマットで入手可能である。プレートの底部は、非常に低い自己蛍光を有する５０μｍ（ミクロン）の気体透過性フィルムから成る。各ウェルの壁高は、２４ウェル版に関しては１６．５ｍｍ、９６ウェル版に関しては１０．９ｍｍ、３８４ウェル版に関しては１１．５ｍｍである。各ウェルに関する最大の作業培地の高さは、２４ウェル版に関しては１．０３ｃｍ、９６ウェル版に関しては０．９７ｃｍ、３８４ウェル版に関しては０．９１ｃｍであると定められている。従来のマルチウェルプレートと比較して培地の高さが改善されるとはいえ、他の静止気体透過性装置の制限内である。
【００３８】
フュラー（Fuller）他（特許文献１２）は、表面に模様をつける（texturing ）ことにより、下方気体透過性シリコーン材料の表面積を増大する気体透過性マルチウェルプレートを提示する。しかし、壁高は単に「標準的なマイクロタイタープレート」のものに制限されており、したがって、従来のプレートと比較して培地の高さの増大を可能とすることができない。
【００３９】
包括的に、静止型気体透過性細胞培養装置が、市販の装置において使用されるものよりも厚い膜を使用することができるならば、有利であろう。シリコーンに頼っている単区画静止型気体透過性細胞培養装置に関する従来の見識は、特許文献１において記載されるよ
うに、適切な機能には、気体透過性物質の厚さが約０．０１３ｃｍ（約０．００５インチ）未満又はそれ以下である必要があることを指示している。Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグは、ジメチルシリコーンから構成され、約０．０１１ｃｍ（約０．００４５インチ）の厚みを有する。バーバラ・ギレム他（特許文献９）及びバーバラ・ギレム（特許文献１０）は、気体透過性膜の厚みは、膜が適したポリマー類（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルフォン、ポリテトラフルオロエチレン又はシリコーン共重合体を含む）から成る場合、約０．００３ｃｍ（約０．００１２５インチ）未満〜約０．０１３ｃｍ（約０．００５インチ）の範囲であり得ることを記述している。フィルムをこの薄さに維持することは、フィルムが破裂しやすく、製造中に容易に針穴が開きやすく、且つシートプロファイル以外のプロファイルを許容しない、カレンダ加工（calendaring ）以外の任意の方法により作製することが困難であるため、不都合である。本明細書中において、従来の見識を超える増加した厚みのシリコーンがいかにして細胞培養を妨げないかが示されるであろう。
【００４０】
改善された静止型気体透過性装置が必要とされている。気体透過性装置が垂直方向でスケールアップすることが可能であるならば、より多くの培養を、任意の所定の設置面積の装置で実施することができるため、且つより人間工学的な設計選択肢が可能であるため、効率は改善されるであろう。
【００４１】
区画化された静止型気体透過性装置は、従来の培養装置の代替品を提供する別の種類の製品である。しかし、これらもまた、培地の高さの制限及び培地容積に対する過剰な気体透過性表面積の割合によってスケールアップ効率が制限されている。これらの種類の装置は、気体透過性膜と半透過性膜との間に細胞をトラップすることにより、高密度培養環境を作製するのに特に有用である。市販化されてはいないものの、ボグラー（Vogler）（特許文献１３）は、細胞を気体透過性物質の近傍に配置し、且つ非気体透過性側壁を含有する区画化装置構成を開示する。細胞区画は、下方気体透過性物質から成り、上方の半透過性膜により囲まれている。培地区画は、半透過性膜上に直接的且つ全体的に存在する。気体透過性膜は、この培地区画の頂部上に存在する。培地は、装置の気体透過性底部上に全体的に存在するように制約される。この特許は、０．４ｃｍの側壁を有する細胞培養区画、０．８ｃｍの側壁を有する培地区画、９ｍｌの細胞培養容積、１８ｍｌの基本培地容積、２２ｃｍ２の下方気体透過性膜、及び２２ｃｍ２の上方気体透過性膜での試験を記載する。これは、０．４ｃｍの細胞区画培地の高さを生じ、培地区画内において培地が０．８ｃｍの高さで存在することを可能にする。さらに、１．７６ｃｍ２／ｍｌの、総培地容積に対する高い総気体透過性表面積の割合が存在する。非特許文献５において、ボグラーは特許文献１３の装置を使用した生物学的結果を提示する。非特許文献５は、非特許文献１及び非特許文献３を、「操作の理論的基礎」として具体的に引用している。試験装置（fixture ）に関する寸法は、２８．７ｃｍ２の下方気体透過性膜及び２８．７ｃｍ２の上方気体透過性膜、５．１ｍｌの培地を細胞区画内に存在させる０．１８ｃｍの細胞区画の壁高、並びに２７．８ｍｌの培地を培地区画内に存在させる０．９７ｃｍの培地区画の壁高を記載している。培地の高さの合計は、細胞区画内においては０．１８ｃｍ、培地区画内においては０．９７ｃｍに制限されており、１．７４ｃｍ２／ｍｌの、総培地容積に対する高い総気体透過性表面積の割合を有する。
【００４２】
インテグラバイオサイエンス社（Integra Biosciences ）は、ＣＥＬＬｉｎｅ（商標）と呼ばれる区画化気体透過性製品を市場で売っている。ボグラーの装置のように、細胞区画は、下方気体透過性膜及び上方半透過性膜により囲まれる。しかし、ボグラーの形状とは異なり、装置内の全ての培地は、気体透過性膜上に全体が存在する必要はない。一部の基礎培地のみが、半透過性膜上に存在する必要がある。インテグラバイオサイエンス社の製品を含む特許、及び製品チラシは、細胞区画内の液体の高さを約１５ｍｍより低く維持する必要性を記載している。気体透過性膜表面積１ｃｍ２当たり５ｍｌ〜１０ｍｌの栄養
培地の割合が、適切な細胞サポートとして記載されている（特許文献１４及び特許文献１５）。細胞培養面積に対して培地容積を増大することは供給の頻度を最小化する観点において有利であるものの、実際には、気体透過性表面積の各ｃｍより高い培地高は制限されている。これらの特許に含まれる装置の市販設計は、他の気体透過性装置のように、これらは細胞上に存在することができる培地の量を制限することを示す。培地容積の半分より多くが、半透過性膜のすぐ上の領域には存在せず、細胞のすぐ上に存在している培地の高さを減少させる。装置の非気体透過性側壁は、使用に関する指示に従って操作されるとき、ＣＥＬＬｉｎｅ（商標）製品における半透過性膜上に培地が存在する場所の高さが、ＣＬ１０００ウェルにおいてはおよそ３．８ｃｍ、ＣＬ３５０ウェルにおいては２．６ｃｍ、ＣＬ６ウェルにおいては１．９ｃｍであるように設計されている。使用に関する指示に従って操作されるとき、細胞培養区画内に存在している培地の高さは、ＣＬ１０００ウェルに関しては１５ｍｍ、ＣＬ３５０ウェルに関しては１４ｍｍ、ＣＬ６ウェルに関しては２６ｍｍである。この特許は、装置は培地の上方面で気体／液体界面を一体化すると記載する。したがって、気体移動が装置の底部を介して且つ培地の頂部で起こるため、培地容積に対する気体移動表面積の割合もまた制限される。各装置に関する培地容積に対する気体移動表面積の割合は、ＣＬ１０００ウェルに関してはおよそ０．３１ｃｍ２／ｍｌ、ＣＬ３５０ウェルに関しては０．３２ｃｍ２／ｍｌ、ＣＬ６ウェルに関しては１．２０ｃｍ２／ｍｌである。
【００４３】
ベイダー（Bader ）（特許文献１６）もまた、区画化気体透過性装置を導入する。側壁がなく、これは袋の形態である。これは区画化され、細胞を栄養素から、微孔膜によって分離する。他の区画化気体透過性装置のように、培地の高さは制限される。特許文献１６は、この装置において最大１〜２ｃｍまでの培地の高さを達成することができるが、実際の高さは、「フィックの拡散の法則に従う培地層」の関数としてのＯ２供給に基づいて調整される必要があることを記述している。バッグの上方及び下方面は気体透過性であるため、装置をその最大容積まで充填すると、１．０ｃｍ２／ｍｌの、総培地容積に対する最小の総気体透過性表面積の割合が得られる。
【００４４】
区画化気体透過性装置が垂直方向にスケールアップする能力を増加することができたなら、これらの装置は、培養の規模が増大するに従って、より効率的な設置面積を有するであろう。垂直のスケールアップを提供する静止区画化気体透過性装置が必要である。
【００４５】
静止気体透過性装置と比較して効率を改善することを試みる気体透過性装置が導入されてきた。これらの装置は、従来のローラボトルと類似した様式で動作し、回転動作（rolling action）を付随する培地混合により物質移動を改善することを試みる。しかし、効率的なスケールアップは達成されていない。この１つの理由は、静止装置のように、設計仕様が、気体透過性装置の壁から培地が存在することのできる距離を制約することにある。このことは装置の培地容積を制限する。したがって、複数の装置がスケールアップのために必要となる。
【００４６】
スポルディング（Spaulding ）（特許文献１７）は、ドーナツ型の気体透過性壁を備えて構成されたローラボトルを開示する。内部円筒壁及び外部円筒壁は、周囲気体と連通する。壁の気体透過性の性質は酸素を細胞に提供し、細胞は内部及び外部の円筒壁により囲まれた区画内に存在する。細胞区画は培地で完全に満たされ、これは細胞せん断を制限する観点において有利である。スポルディングは、「酸素効率は培養培地中の移動（travel）距離の関数として減少し、有効性は酸素表面から約２．５４ｃｍ（約１インチ）以下に制限される」と記述している。したがって、スポルディングにより記述されたこの設計制限は、十分な酸素添加を提供するために、内部円筒壁と外部円筒壁との間の距離を５．０１ｃｍ以下に維持することを含む。この様式では、細胞は、気体透過性壁から２．５０５ｃｍより遠くに存在することができない。このことはまた、約０．７９ｃｍ２／ｍｌの、
培地容積に対する気体透過性表面積の割合をもたらす。さらに、中空の気体透過性コアを有する必要性は、空間を無駄にする。この装置は、５ｃｍの長さ当たり１００ｍｌの培地の内部容積しか有さず、等しい長さの従来のボトルの５００ｍｌと対照的である。培地容積の制限は、この装置を、従来のローラボトルよりもスケールアップ効率が低いものとしているが、これは、より多くのボトルが等量の培養に必要であるからである。この装置に伴なう別の問題は、エッチングされた孔（直径９０μｍ（ミクロン））を気体移動のために使用することである。これらの孔は、気体の進入を可能にするのに十分大きいが、液体が細胞区画から出ることを防ぐのに十分小さい。しかし、ほとんどの滅菌フィルターは０．４５μｍ（ミクロン）、より一般的には０．２μｍ（ミクロン）の粒子が通過することを妨害するため、これらの孔は細胞区画の細菌侵入を許してしまうであろう。
【００４７】
１９９２年１２月に出願された特許において、ウルフ（Wolf）他（特許文献１８）は、ディスク形状に構成された気体透過性バイオリアクターを記載し、これはその軸の周囲を回転する。この装置の形状は、シュワルツ（Schwarz ）他（特許文献１９）の提案に伴なう欠陥を修正することを試みている。特許文献１９では、気体透過性管状挿入物（tubular insert）が、円筒型ローラボトル内に存在し、外部ハウジングは気体透過性でない。これは、ビーズに付着した接着細胞を培養することに成功したものの、懸濁細胞を培養することは成功しなかったとウルフ他は記述している。この装置は、平坦な末端の一方又は両方が気体に透過性である状態で構成される。ディスクは、遠心力の影響を低減するために、約１５．２４ｃｍ（約６インチ）の直径に制限されている。この発明者等は、「培養培地中の酸素の部分圧又は部分圧勾配は、透過性膜からの距離の関数として減少する」と記述しており、これはイェンセンによって１９７６年に発表された思考プロセスと同じである。この発明者等は、「細胞が透過性膜から離れすぎている場合、細胞は増殖しないであろう」とも記述している。したがって、ディスクの両端が気体透過性である場合、幅は約５．０８ｃｍ（２インチ）未満に制限される。これらの寸法制限は、装置が保持することのできるほとんどの培地は、１，５０２ｍｌ未満であることを意味する。したがって、培養の大きさをスケールアップするに従って、より多くの装置を使用しなければならない。また、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は少なくとも０．７９ｍｌ／ｃｍ２でなければならず、細胞は気体透過性壁から１．２７未満の位置に存在しなければならない。さらに、装置は既存の研究器材との使用に適してはおらず、且つ特殊な回転器材及び空気ポンプを必要とする。
【００４８】
１９９６年２月に出願された特許において、シュワルツ（特許文献２０）は、ローラボトルと類似した様式で回転する気体透過性末端を有するディスク形状の気体透過性バイオリアクターを記載する。残念ながら、特許文献１８と同様に、バイオリアクターの長さは約２．５４ｃｍ以下に制限されている。バイオリアクターの全ての面が気体透過性でない限り、距離はさらに小さくなる。装置の最大直径は１５．２４ｃｍである。したがって、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は少なくとも０．７９ｍｌ／ｃｍ２でなければならず、細胞は気体透過性壁から１．２７ｃｍより遠くには決して存在することはできない。回転動作を伴なったとしても、従来の静止培養バッグと比較して、培地に対する気体透過性表面積の割合の実質的な減少を提供せず、培養の大きさをスケールアップするに従って、より多くの装置を使用する必要がある。
【００４９】
シンセコン社（Synthecon Incorporated）から市販されている、ＲｏｔａｒｙＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＳｙｓｔｅｍ（商標）と呼ばれる製品ラインは、スポルディング、シュワルツ及びウルフ他の特許のさまざまな態様を一体化する。結果として得られる製品は、少ない培地容積（１０ｍｌ〜５００ｍｌ）を有し、特別注文の回転器材を必要とし、標準的な研究室ピペットと適合性でなく、且つ等容積の培地を保持する従来の装置の費用と比較した場合に非常に高価である。したがって、これらは、単一装置フォーマットにおける効率の改善の必要性に取り組んでいないため、市場に対して小さな影響しか与えなかった。
【００５０】
ファルケンベリ（Falkenberg）他（特許文献２１及び特許文献２２）は、透析膜により区画化された気体透過性ローラボトルを記載する。このボトルにより収容され得る培地容積は３６０ｍｌであり、そのうちの６０ｍｌは細胞区画内に、３００ｍｌは栄養素区画内に存在する。一実施の形態において、ボトルの末端は気体透過性である。特許文献２２は、ボトルの末端が気体透過性である場合、「少なくとも５０ｃｍ２の表面積を有する気体交換膜は、３５ｍｌの細胞培養に適していることが証明された」と記述している。したがって、容積に対する最小の気体透過性表面積の割合は１．４３ｃｍ２／ｍｌである。別の実施の形態では、ボトルの本体が気体透過性であり、表面積は２４０ｃｍ２である。この気体透過性表面は、槽内に存在する３６０ｍｌ容積の培地全体に酸素添加する。したがって、容積に対する最小の気体透過性表面積の割合は０．６７ｃｍ２／ｍｌである。ボトルの直径はおよそ５ｃｍであり、ボトルの長さはおよそ１５ｃｍである。このように、ボトルは、およそ１１．５ｃｍの直径及び最大およそ３３ｃｍの長さを有する従来のローラボトルよりもはるかに小さい。この装置は高密度懸濁細胞培養に関して有用であるものの、その制限された培地容積は、スケールアップに必要な装置の数を減少させることができない。さらに、付着面領域を提供しないため、この装置は接着培養には適さない。
【００５１】
ファルケンベリ他（特許文献２３）は、特許文献２１及び特許文献２２において規定される装置の改良版を記載する。内部の加圧による損傷を防ぐ崩壊可能なシージングの形態における特徴が開示される。気体はボトルの末端を介して供給され、気体透過性シージングを介して「供給チャンバ内に拡散する」ことができる。残念ながら、ボトル寸法が変えられないままであるため、この装置は、スケールアップに必要な装置の数を減少させることができない。さらに、この装置は接着培養に不適なままである。
【００５２】
ザルトリウスグループのビバサイエンス社は、ファルケンベリ他の特許と関連するｍｉｎｉＰＥＲＭと呼ばれる製品を販売している。最大の細胞区画モジュールは５０ｍｌであり、最大の栄養素モジュールは４００ｍｌである。したがって、この市販の装置中に存在することができる最大の培地の容積は４５０ｍｌである。この市販の装置の小さいサイズは、特別注文の回転器材の必要性とあいまって、スケールアップの問題の解決を難しくしている。
【００５３】
回転型気体透過性装置が１つの装置当たりにより多くの培地を供給することができ、それによりスケールアップに必要な装置の数が減少するように該装置を改善する必要性がある。これは、培地容積に対する減少した気体透過性表面積の割合が存在する場合に達成することができる。別の問題は、非標準的な研究室器材が、既存の装置の操作に必要であることである。標準的な研究室器材の使用はまた、より多くの使用者がこの技術を利用することを可能にするであろう。
【００５４】
上記の考察は、既存の及び提案された細胞培養装置における効率的なスケールアップを制限する設計欠陥に焦点を当ててきた。上述した制限に加えて、接着細胞培養が目的である場合にスケールアップの効率を制限するさらなる問題が存在する。
【００５５】
酸素添加のために気体／液体界面に依存する従来の静止装置に関して、接着細胞培養の非効率性は、１つの装置当たり制限された付着面領域により生じる。例えば、装置の底部のみが、ペトリ皿、マルチウェルプレート及び組織培養フラスコを用いた細胞付着に適している。従来のフラスコが、この問題のよい例を提供する。上述したように、典型的なＴ−１７５フラスコは約９３６ｃｍ３を占める。しかし、これは、接着細胞が付着するための表面積をわずか１７５ｃｍ２しか与えない。したがって、増殖面に対する占められた空間の割合（５．３５ｃｍ３／ｃｍ２）は非常に非効率的なものである。
【００５６】
従来フラスコの表面積における欠陥に取り組むことを試みる製品が入手可能である。マルチシェルフ組織培養フラスコ、例えばＮＵＮＣ（商標）ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ（特許文献２４）及びコーニング製のＣｅｌｌＳｔａｃｋ（商標）（特許文献２５）は、ポリスチレンシェルフを垂直方向に積層させる（stack ）ことにより、表面積を増大させる。この装置は、培地及び気体をシェルフ間に存在させるように設計されている。これは、培養される細胞の数が増加される場合、装置の設置面積を従来のフラスコと比較して減少させる。マルチシェルフフラスコのプロファイル（profile ）もまた、従来のフラスコよりも空間効率が良い。例えば、ＮＵＮＣ（商標）ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙのシェルフ間の空間は約１．４ｃｍであるが、これは典型的なＴ−１７５フラスコの底部と頂部との間の距離である３．７ｃｍと対照的である。空間の使用の低減は、滅菌、出荷、保管、インキュベータ用空間及び装置の廃棄の観点から費用を節約する。この形式の装置はまた、スケールアップ時の取り扱い量を減少させるが、これは、複数の組織培養フラスコを満たすのではなく、１つのマルチシェルフ装置を満たせばよいからである。さらに、従来のポリスチレンの使用が容易に適応させられる。残念ながら、この装置は、そのシェルフがそれぞれ、酸素を供給するために気体／液体界面を必要とするため、未だ有効性において最適とは言えない。
【００５７】
ＣｅｌｌＣｕｂｅ（登録商標）は、コーニングライフサイエンス社（Corning Life Science）から入手可能な接着細胞培養装置である。これは、マルチシェルフ組織培養フラスコと類似した様式で構成されているが、気体／液体界面を排除している。したがって、気体が存在しないために、垂直に積層された細胞付着シェルフ間の距離は減少する。このことは、装置が占める空間量を減少させる。しかし、気体交換を提供するために、酸素添加した培地の連続的な潅流が必要である。このことは、コーニング製のＣｅｌｌＳｔａｃｋ（商標）と比較して非常に高いレベルでの費用及び複雑性をもたらし、研究規模の培養に関して劣ったものとしている。
【００５８】
静止気体透過性装置は、ＮＵＮＣ（商標）ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ、コーニング製のＣｅｌｌＳｔａｃｋ（商標）又はＣｅｌｌＣｕｂｅ（登録商標）より優れた代替品を提供しない。細胞培養用バッグ及び気体透過性カートリッジは、従来の組織培養フラスコよりも広い付着領域を提供することができる。これは、細胞を装置の上方面及び下方面の両方で培養することが可能になるからである。しかし、細胞付着に適した気体透過性物質は、従来のポリスチレンよりもはるかに高価であり得る。また、気体透過性装置の上方面及び下方面の両方が細胞を増殖させたとしても、同じ設置面積を占める従来の気体／液体界面形式の装置と比較して、わずか２倍の表面積の増加しか得られないであろう。さらに、上述したスケールアップによる欠陥による制限は残っている。
【００５９】
フュラー他（特許文献１２）は、気体移動及び細胞付着に関するより広い表面積を可能にするために気体透過性物質の表面に模様をつける新規なバッグを提示する。しかし、培地の高さはまた、市販のバッグの高さに制限されている。これは、このバッグが他のバッグと同一の様式で製作されるからである。培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、他のバッグよりも高くさえなるが、不均一な培地分布が存在する。
【００６０】
ベスホスキー（Basehowski）他（特許文献２６）は、底部を気体透過性にし、平滑にし、且つ細胞付着のために帯電させることにより、接着培養に適した気体透過性バッグを提案する。このバッグの頂部の内表面は下方気体透過性表面とくっつくことを防ぐために模様をつけられている。このバッグは、下方面しか細胞付着に使用せず、表面積対設置面積比の効率は従来のフラスコと同じでしかない。
【００６１】
今日まで、気体／液体界面への依存を排除し、且つ潅流の必要なしに多層フラスコのスカフォールドを一体化することができる装置を、いかにして作製するかについての指針は
不十分である。静止気体透過性装置は、装置の底部及び頂部を介する気体移動のみを可能にする。したがって、従来のスカフォールド（マルチシェルフ組織培養フラスコ内に備えられたスチレンシェルフ等）を含む場合、これらは細胞がある位置での気体交換を阻害する効果を有するであろう。気体透過性物質は、付着スカフォールドが十分な気体移動を妨げない様式で位置決めするべきである。これがいかに有益になるかは、本明細書中の発明の詳細な説明においてさらに説明されるであろう。
【００６２】
スケールアップ時により効率的な細胞培養装置を提供する必要性は、静止細胞培養装置に制限されず、ローラボトルにも当てはまる。従来のローラボトルは、気体／液体界面の使用により機能する。その形状は、より大きい表面積及びより多い培地容積を巧みな様式で提供する一方、フラスコ及びバッグよりも小さい設置面積を占める。これらの全世界的な使用は、在庫品用空間、インキュベータ用空間、労力及び生物学的有害物質の廃棄用空間の使用の減少をもたらすため、より効率的な配置を提供する装置に対する市場の要求の証拠を提供する。
【００６３】
ボトルが接着培養に使用される場合、細胞はボトルの内壁に付着する。回転ボトルが付着した細胞を周期的に培地及び気体空間中を移動させるのに従って、細胞は栄養素及び気体交換を得る。ローラボトルの使用は接着細胞に制限されない。これらはまた、懸濁細胞を培養するのにも一般的に使用される。例えば、モノクローナル抗体を産生するためのマウスハイブリドーマの培養は、ローラボトル内で日常的に行われている。典型的な懸濁細胞培養の用途において、設置面積及びサイズ対フラスコに関する効率の改善を達成することができ、ローラボトルの取り扱いの簡便性が細胞培養用バッグよりも優れており、少ない費用及び低い複雑性のレベルがスピナーフラスコよりも優れている。ローラボトルの有数の供給業者であるコーニング（登録商標）は、８５０ｃｍ２ボトルに対して、１７０ｍｌ〜２５５ｍｌの間の培地容積を推奨している。ボトルの実際の容積は約２，２００ｍｌである。したがって、ローラボトルは接着細胞培養及び懸濁細胞培養の両方に対して有利であるものの、培養プロセス中のローラボトルの大部分（約８８％）は気体から成るため、これは未だ非常に非効率的な形状である。ローラボトルはまた、静止装置の簡便性からも逸脱するが、これは、補助的なローラメカニズムが必要であるためである。さらに、これらは細胞にせん断力を与える。これらのせん断力は、せん断を受けやすい細胞を損傷又は殺傷し得、また従来の静止装置には存在しない。
【００６４】
マッカリール（McAleer ）他（特許文献２７）は、細胞が、ボトルの長さに沿って下に向かって配置された平行なディスクの両側に付着することを可能にするように構成されたローラボトル装置を記載する。水平位置で回転する従来のボトルとは異なり、この装置は培地中へ、次に気体中へディスクを持っていくように転倒（tumbles end over end）する。これは、ボトル中に存在する気体の容積を減少させることはない。それどころか、「本発明の別の利点は、非常に少ない容積の液体を使用することができることである」と記述している。これは、機能するために、ボトル中の、潅流されなければならない大容積の気体の存在に完全に依存する。従来のボトルにおける空間の効率的な使用を妨げる過剰容積の気体が残存する。また、せん断力は低減されない。
【００６５】
スピルマン（Spielmann ）（特許文献２８）は、拡大した液体／気体交換表面を提供するローラボトル装置を記載する。複数のトレーがボトル内に平行に配置されている。トレーは、培養のための表面積を増大させ、ボトルが回転するに従って液体がトレー上を流れることを可能にするように設計されている。接着細胞の場合、付着のためにより広い表面積が利用可能である。懸濁細胞の場合、細胞は「気体相及び液体相と接触しながら」トレーによって攪拌される。せん断力は存在したままである。この装置は改善された表面積を備えるものの、気体交換を提供するためにはボトル中の気体の存在に完全に依存している。したがって、この装置は空間効率における基本的な制限（ボトル中に存在しなくてはな
らない過剰容積の気体）に取り組んでいない。
【００６６】
ローラボトルが大幅に改善された培地容積対気体比を可能にするように作製されたならば、スケールアップに必要とされる装置の数が低減されることになるため、これはより経済的な選択肢を提供するであろう。８５０ｃｍ２ボトルに関する典型的な培地容積は１７０ｍｌ〜２５５ｍｌであるが、その許容積は２，２００ｍｌであるため、約９〜１３倍の栄養素許容積の増大が、ボトルを培地で満たすことにより利用可能となり得る。簡便性を保つため、気体／液体界面から独立している、培養物に酸素添加する複雑ではない方法が存在することが必要であろう。また、接着培養に関して、表面積は、培地容積の増大と比例して増大するべきである。これらの特徴を有する気体透過性装置は、滅菌の費用、出荷、保管、インキュベータ用空間の使用、労力及び廃棄費用を９倍〜１３倍減少させることができる。細胞にかかるせん断力もまた、低減され得る。
【００６７】
接着培養に関して、提案された及び市販の回転型気体透過性装置は、従来のボトルより優れた代替品を提供しないが、これは、従来の付着面を一体化していないからである。代わりに、これらの装置は、小区域の付着面又はビーズに依存している。ビーズは、接着培養を実施する装置に対して新たな一連の問題をもたらす。ビーズは、均一に播種するのが難しく、顕微鏡的に細胞の集密性又は形態を査定することが不可能であり、細胞の回収が望ましい場合は、ビーズに付着している細胞とビーズを分離しなくてはならない。
【００６８】
気体透過性ローラボトルにおけるビーズの使用を排除することが試みられてきた。ネーゲル（Nagel ）他（特許文献２９）は、ファルケンベリ他の装置に対して、ビーズを用いることなく接着細胞に対する培養能を生み出すことを試みている。１つの細胞付着マトリックスが、細胞培養区画内の気体膜の内部面（face）に備えられている。接着培養が可能であるものの、ボトルの寸法は変えられないままであり、その小さいサイズのために、スケールアップに必要とされる装置の数を減少させることはできない。また、酸素は、まず気体透過性膜、次に細胞付着マトリックスを通って細胞に到達するように移動されなければならない。さらに、わずか１つの細胞付着マトリックス層しか利用可能ではなく、これは、ＮＵＮＣ（商標）ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ及びコーニング製のＣｅｌｌＳｔａｃｋ（商標）の多層とは対照的である。さらに、細胞の集密性及び形態の顕微査定は適応されない。
【００６９】
改善された気体透過性ローラボトルが必要である。これは、培地で満たされることが可能であり、標準的なローララックにおいて使用され、培地容積の増大と正比例して細胞付着面積を増大させ、且つ従来のボトルの使いやすさを保持するべきである。本明細書中に、このローラボトルがいかにして達成され得るかが示されるであろう。
【００７０】
シン（Singh ）（特許文献３０）は、「気体透過性表面に依存している装置の全て」に関して、「スケールアップは制限される」と記述している。気体透過性装置のスケールアップの欠陥を解決するために、バッグが開示されている。非気体透過性バッグは、培地と気体とを、おおよそ等しい比率で一体化する。このバッグはロッカープレート上に位置決めされ、この振とう運動（rocking motion）が培地内中に波を生み出し、これは気体移動を促進する。この特許は、ＷａｖｅＢｉｏｒｅａｃｔｏｒと呼ばれる、ウェーブバイオテック社（Wave Biotech）から入手可能な市販製品を含む。残念ながら、この装置を機能させるためには、特別注文の振とう及び温度制御器材を購入しなくてはならず、このバッグは培地を保持する許容積を実質的に変えない。気体透過性バッグのように、ＷａｖｅＢｉｏｒｅａｃｔｏｒバッグは、それが担持する許容積の１／２未満の培地で満たされる。したがって、このバッグは培地の高さを制限し、且つ気体透過性バッグと同様のスケールアップの欠陥を受け継いでいる。
【００７１】
要約すると、研究規模の細胞培養により高い効率性をもたらし、且つスケールアップ時に効率性を失わない、改善された細胞培養装置及び細胞培養法に対する必要性が存在する。機能するために気体／液体界面に依存している従来の装置は、労力、滅菌費用、出荷費用、保管費用、インキュベータ用空間の使用、廃棄費用及び混入の危険性の観点で非効率的である。これらの装置は、ペトリ皿、マルチウェル組織培養プレート、組織培養フラスコ、マルチシェルフ組織培養フラスコ及びローラボトルを含む。気体透過性装置もまた非効率的であり、多くの場合、機能するために気体／液体界面を必要とする装置の簡便性を失う。ｐｅｔｒｉＰＥＲＭ及びＬｕｍｏｘＭｕｌｔｉｗｅｌｌプレート気体透過性装置は、それらの従来の相当物（counterpart ）の形態であり、従来装置の非効率性を受け継いでいる。気体透過性バッグは、培地の高さの制限、不均一な培地分布、培地容積に対する高い気体透過性物質表面積の割合の使用、及び充填中に存在する混入の危険性のために、非効率的である。気体透過性カートリッジは、低い高さの培地を有し、培地容積に対する高い気体透過性表面積の割合を使用し、小容積の培地を収容し、且つスケールアップ時に非常に多くの数のユニットが維持される必要があるため、非効率的である。回転型気体透過性装置は、その壁が互いに分離され得る距離を制限する形状的な制約を有し、制限された培地容積に応じて、スケールアップ時に多くの数のユニットを必要とし、且つしばしば特別注文の回転器材を必要とするため、スケールアップに関して非効率的である。接着培養が望ましい場合、従来装置は、非常に非効率的な付着表面積に対する装置容積の割合を有し、空間を無駄にする。静止型、混合型、及び回転型気体透過性装置は、制限された表面積、表面積を増大するためのビーズの使用、従来のシート状スチレン表面の欠失、及び顕微的な評価を実施することの不能性等の理由から、接着培養に関してさらに非効率的となる。
【００７２】
本明細書中に開示される或る実施形態は、より効率的な細胞培養装置及び細胞培養法を提供し、さまざまな新規の特質を一体化することができる気体透過性装置を作製することにより、従来の装置及び方法の制限を克服する。これらのさまざまな特質は、気体／液体界面に依存しない気体交換、培地の高さの増大、培地容積に対する気体透過性表面積の割合の低減、装置の側壁を介した気体交換、従来の材料から成る細胞サポートスカフォールド、及び気体透過性物質の厚みの増加を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００７３】
【特許文献１】米国特許第５，６８６，３０４号
【特許文献２】米国特許第４，８２９，００２号
【特許文献３】米国特許第４，９３７，１９４号
【特許文献４】米国特許第５，９３５，８４７号
【特許文献５】米国特許第６，２９７，０４６号
【特許文献６】米国特許第４，８４７，４６２号
【特許文献７】米国特許第４，９４５，２０３号
【特許文献８】米国特許第５，２２５，３４６号
【特許文献９】米国特許出願第１０／１８３１３２号
【特許文献１０】ＷＯ００／５６８７０
【特許文献１１】米国特許第４，４３５，５０８号
【特許文献１２】ＩＰＮ  ＷＯ０１／９２４６２
【特許文献１３】米国特許第４，７４８，１２４号
【特許文献１４】米国特許第５，６９３，５３７号
【特許文献１５】米国特許第５，７０７，８６９号
【特許文献１６】米国特許第６，４６８，７９２号
【特許文献１７】米国特許第５，３３０，９０８号
【特許文献１８】米国特許第５，１５３，１３１号
【特許文献１９】米国特許第５，０２６，６５０号
【特許文献２０】米国特許第５，７０２，９４１号
【特許文献２１】米国特許第５，４４９，６１７号
【特許文献２２】米国特許第５，５７６，２１１号
【特許文献２３】米国特許第５，６８６，３０１号
【特許文献２４】米国特許第５，３１０，６７６号
【特許文献２５】米国特許第６，５６９，６７５号
【特許文献２６】米国特許第４，９３９，１５１号
【特許文献２７】米国特許第３，８３９，１５５号
【特許文献２８】米国特許第５，６５０，３２５号
【特許文献２９】米国特許第５．７０２，９４５号
【特許文献３０】米国特許第６，１９０，９１３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００７４】
[発明の概要]
下方気体透過性物質から成る気体透過性装置に関して、培地の高さを、従来の見識により決定される、又は市販されている装置において利用可能な高さよりも増大させることは有益であり得ることが発見された。本発明の発明者等によって、細胞培養培地内の基質の対流は、従来認識されているよりも重要な役割を果たすと予想される。物質移動のための拡散への歴史的な依存は、対流が与える寄与を過小評価しているように見受けられる。このことは、細胞培養培地中のグルコース及び乳酸塩等の基質の移動速度を過小評価することにつながり、従来許容されていたよりも細胞から遠くに存在する培地が細胞に対して有用であり得ることを認識することができないであろう。培地中の基質の移動速度が過小評価されると、細胞から遠すぎると思われている領域内に存在する培地は、無駄であると間違って見なされるであろう。論理的な結論として、装置によって占められる空間を減少させ、より経済的に滅菌、出荷、保管及び廃棄されるようにするために、気体透過性装置が細胞に対して有用であり得るよりも少ない培地を保持するように不必要に構成されることになる。
【００７５】
いずれにしても、従来の見識よりも離れた距離に存在している培地がいかに有益であり得るかの例として、試験を実施し、ここで、培地の高さは、従来提言されている高さ、さらには市販されている静止気体透過性装置において可能である高さをはるかに超えて増大された。通常の細胞培養用途の評価（マウスハイブリドーマを使用）は、従来の見識と比較して培地の高さを増大させることにより、より多くの細胞が、装置の所定の設置面積内に存在することが可能であることを示した。以前には認識されていないこの有益性は、より効率的な細胞培養及びプロセススケールアップを提供するさまざまな細胞培養装置構成を可能にする。
【００７６】
本明細書中における本発明の装置及び方法は、装置の壁が気体透過性であり、スカフォールドが存在し、且つ装置が静止モードで操作される場合、気体／液体界面は十分な気体交換に必要ないことを示す。このことは、従来装置における気体の存在に起因する過剰な装置サイズに対する必要性を排除し、且つ気体透過性装置が従来のスカフォールドを一体化することを可能にする。これは、従来装置よりも小さな空間を占めるさまざまな細胞培養装置構成を可能にし、且つこれらの装置をスケールアップに関してより効率的にする。やはり、本発明者等により、対流の役割は寄与因子であり得ることが予期される。
【００７７】
また、気体透過性ローラボトルに対する形状構成（従来の見識の指示と相反する）は、細胞を首尾よく培養することができるということが発見された。この新たな形状は、装置が、従来可能であるよりも多くの培地を収容することを可能にし、それによりスケールア
ップ効率を改善する幾何形状を得る。このことは、酸素添加のための気体を収容する従来のボトルの無駄な空間を排除し、且つスケールアップ効率の観点で気体透過性ボトルよりも優れる細胞培養装置構成が存在することを可能にする。
【００７８】
また、細胞を、従来の見識が提唱するよりも厚いシリコーン気体透過性物質を使用して、効率的に培養することができることが発見された。
これらの発見は、細胞を培養する新たな装置及び方法を作り出すことを可能にし、これらは、現在の装置（ペトリ皿、マルチウェル組織培養プレート、組織培養フラスコ、マルチシェルフ組織培養フラスコ、ローラボトル、気体透過性ペトリ皿、気体透過性マルチウェルプレート、気体透過性細胞培養用バッグ、区画化気体透過性装置及び気体透過性回転装置等）を上回る劇的な効率及びスケールアップの改善を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００７９】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さの増大及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合の低減を可能にするために壁高を増大することにより、優れた気体透過性細胞培養装置を提供する。
【００８０】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さを増大すること及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合を低減することにより、気体透過性細胞培養装置を使用する優れた細胞培養法を提供する。
【００８１】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、気体透過性物質から少なくとも部分的に成る側壁を介して気体交換を可能にすることにより、優れた細胞培養装置を提供する。
本明細書中に開示される或る実施の形態は、気体透過性物質から少なくとも部分的に成る側壁を介して気体交換を可能にすることにより、気体透過性装置を使用する優れた細胞培養法を提供する。
【００８２】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さの増大及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合の低減を可能にするために壁高を増大することにより、気体透過性マルチウェル組織培養プレートに対する優れた代替物を提供する。
【００８３】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さの増大及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合の低減を可能にするために壁高を増大することにより、気体透過性ペトリ皿に対する優れた代替物を提供する。
【００８４】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、より多くの栄養を含むサポートを提供するために培地の高さを増大すること、及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合を低減することにより、気体透過性細胞培養用バッグにおける細胞培養の方法に対する優れた代替法を提供する。
【００８５】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さの増大及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合の低減を可能にするために壁高を増大することにより、気体透過性カートリッジに対する優れた代替物を提供する。
【００８６】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地を従来可能であるよりも気体透過性物質から遠い位置に存在させることを可能にする形状を作製することにより、気体透過性ローラボトルに対する優れた代替物を提供する。
【００８７】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、水平位置及び垂直位置で操作することができる優れた気体透過性細胞培養装置を提供する。
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さの増大及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合の低減を可能にするために壁高を増大することにより、区画化気体透過性装置に対する優れた代替物を提供する。
【００８８】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、培地の高さを増大すること、及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合を低減することにより、区画化気体透過性装置を使用する優れた細胞培養法を提供する。
【００８９】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、気体交換のためにシリコーン材料を利用する優れた気体透過性細胞培養装置を、０．０１３ｃｍ（０．００５インチ）よりも大きい厚さであるシリコーンを用いて構成することにより、提供する。
【００９０】
本明細書中に開示される或る実施の形態は、改善された細胞培養用バッグを提供し、ここでは、気体透過性物質は、０．０１３ｃｍ（０．００５インチ）を超える厚さであるシリコーンである。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１Ａ】Ｄｃｍが培地の拡散係数であり、ＰＯ２及びＰＣＯ２の定常値に関するモデルが気体透過性容器内に示されるこのイェンセン他の論文の図２を示す、断面図。
【図１Ｂ】Ｄｃｍが培地の拡散係数であり、ＰＯ２及びＰＣＯ２の定常値に関するモデルが気体透過性容器内に示されるこのイェンセン他の論文の図３を示す、断面図。
【図２】イェンセン、「制御環境における大量細胞培養」、細胞培養及びその応用、Academic Press（１９７７年）からの図２の複写図であり、下方培地高容積を備えて構成された気体透過性細胞培養装置を示す、断面図。
【図３】Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグ（メドトロニック社）として商品化されている米国特許第５，６８６，３０４号の図２の複写図であり、典型的な細胞培養用バッグ断面を示す断面図。
【図４Ａ】大きな容積の培地を下方気体透過性物質上に存在させるように構成された、その下方気体透過性物質から成るハウジングを備えた細胞培養装置（取り外し可能なリッドがその装置を混入から保護する）を示す一実施形態の断面図。
【図４Ｂ】大きな容積の培地を下方気体透過性物質上に存在させるように構成された、その下方気体透過性物質から成るハウジングを備えた細胞培養装置（容器は隔壁から出入可能）の一実施形態を示す断面図。
【図４Ｃ】装置がその側面を下にして置かれ、非回転位置又は回転位置で操作され得るような気体透過性物質から成る壁を備えた細胞培養装置の一実施形態を示す断面図。
【図５】細胞を下方気体透過性物質の下面にほぼ均等に分布させ、下方気体透過性物質の底面（underside ）に気体を提供させるように構成された、下方気体透過性物質を備えた気体透過性細胞培養装置の一実施形態を示す断面図。
【図６】装置プロファイルをさらに増大させることなく、さらに栄養補助を提供するために、培養される細胞の真上ではない領域に培地を維持するように構成された、気体透過性細胞培養装置の一実施形態を示す断面図。
【図７Ａ】気体透過性細胞培養装置内の培地の容積が変わる場合、その装置の高さを調節し、それにより培養プロセスの各段階でできるだけ小さな空間を占め、且つプロセスの費用を削減する最小容積状態で、滅菌、出荷、保管、及び廃棄能を可能とし得るように構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態を示す断面図。
【図７Ｂ】気体透過性細胞培養装置内の培地の容積を変える場合、その装置の高さを調節し、それにより培養プロセスの各段階でできるだけ小さな空間を占め、且つプロセスの費用を削減する最小容積状態で、滅菌、出荷、保管、及び廃棄能を可能とし得るように構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態を示す断面図。
【図８】従来のマルチウェル組織培養装置に比べ、１つのウェル当たり増加される培地の容積を保持することが可能であり、それにより１つのウェル当たりに存在する細胞数(amount)を増加することにより、より効率的な研究規模の培養を可能とし、栄養供給の頻度を低減させ、且つより良いクローン選択の可能性を与える、マルチウェルフォーマットにおいて構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態を示す斜視図。
【図９Ａ】気体透過性側壁を備えて構成されたマルチウェルフォーマットにおける気体透過性細胞培養装置（装置の各ウェルの下面は、従来の組織培養フラスコとまったく同一の材料から成り得る。気体交換に必要とされるような気体／液体界面の除去は、１つのウェル当たりの細胞数の増加、及び／又は栄養供給の頻度の減少、インキュベータ用空間のより良い使用、並びに滅菌、出荷、保管、及び廃棄の費用削減を可能とする。）の実施形態を示す斜視図。
【図９Ｂ】気体透過性側壁を備えて構成されたマルチウェルフォーマットにおける気体透過性細胞培養装置（装置の各ウェルの下面は、従来の組織培養フラスコとまったく同一の材料から成り得る。気体交換に必要とされるような気体／液体界面の除去は、１つのウェル当たりの細胞数の増加、及び／又は栄養供給の頻度の減少、インキュベータ用の空間のより良い使用、並びに滅菌、出荷、保管、及び廃棄の費用削減を可能とする。）の実施形態を示す断面図。
【図１０Ａ】気体／液体界面の必要性がなく、接着細胞を培養するためのスカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置（水平及び垂直方向に直線的に規模拡大可能であり、従来の接着培養装置に比べ、より優れた効率性を生み出す。スカフォールドの片面又は両面で細胞を培養することが可能である。回転型又は非回転型状態のいずれかで操作され得る。）の一実施形態を示す断面図。
【図１０Ｂ】気体／液体界面の必要性がなく、接着細胞を培養するためのスカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置（水平及び垂直方向に直線的にスケールアップ可能であり、従来の接着培養装置に比べ、より優れた効率性を生み出す。スカフォールドの片面又は両面で細胞を培養することが可能である。回転型又は非回転型状態のいずれかで操作され得る。）の一実施形態を示す断面図。
【図１１】少なくとも１つが最適な顕微的細胞査定に適した複数のスカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態を示す断面図。
【図１２Ａ】表面積のさらなる増大を提供し、気体透過性細胞培養装置にさらに高い効率性をもたらすように構成されたスカフォールドの実施形態を示す斜視図。
【図１２Ｂ】表面積のさらなる増大を提供し、気体透過性細胞培養装置にさらに高い効率性をもたらすように構成されたスカフォールドの実施形態を示す断面図。
【図１２Ｃ】表面積のさらなる増大を提供し、気体透過性細胞培養装置にさらに高い効率性をもたらすように構成されたスカフォールドの実施形態を示す上面図。
【図１２Ｄ】表面積のさらなる増大を提供し、気体透過性細胞培養装置にさらに高い効率性をもたらすように構成されたスカフォールドの実施形態を示す断面図。
【図１３】複数のスカフォールド及び気体透過性物質から成る少なくとも１つの側壁を備えた気体透過性細胞培養装置（気体交換の手段としての気体／液体界面の必要性を排除し、より効率的な空間の使用、並びに関連した滅菌、出荷、保管、インキュベータ用空間の使用、及び廃棄に関する費用の有益性をもたらす。）の一実施形態を示す分解斜視図。
【図１４Ａ】スカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態（その位置決めは、トリプシンの使用を最小限にし、細胞領域に対する培地の割合を変更し、且つ出荷、在庫、及び廃棄用空間を最小限にすることを含み得る有益性のために調整され得る。）を示す断面図。
【図１４Ｂ】スカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態（その位置決めは、トリプシンの使用を最小限にし、細胞領域に対する培地の割合を変更し、且つ出荷、在庫、及び廃棄用空間を最小限にすることを含み得る有益性のために調整され得る。）を示す断面図。
【図１４Ｃ】スカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態（その位置決めは、トリプシンの使用を最小限にし、細胞領域に対する培地の割合を変更し、且つ出荷、在庫、及び廃棄用空間を最小限にすることを含み得る有益性のために調整され得る。）を示す断面図。
【図１４Ｄ】スカフォールドを備えて構成された気体透過性細胞培養装置の一実施形態（その位置決めは、トリプシンの使用を最小限にし、細胞領域に対する培地の割合を変更し、且つ出荷、在庫、及び廃棄用空間を最小限にすることを含み得る有益性のために調整され得る。）を示す断面図。
【図１４Ｅ】隣接するスカフォールドとの間で等間隔を維持するために構成されたスカフォールドを示す斜視図。
【図１５Ａ】装置の本体が固定された高さに保たれたまま、スカフォールド間の距離が変更され得るように構成されたスカフォールドの一実施形態（装置の本体の形を変えさせる必要がなく、トリプシンの使用を最小限にし、又は培養領域に対する培地の割合を変更することを含む有益性を提供することができる。）を示す断面図。
【図１５Ｂ】装置の本体が固定された高さに保たれたまま、スカフォールド間の距離が変更され得るように構成されたスカフォールドの一実施形態（装置の本体の形を変えさせる必要がなく、トリプシンの使用を最小限にし、又は培養領域に対する培地の割合を変更することを含む有益性を提供することができる。）を示す断面図。
【図１５Ｃ】装置の本体が固定された高さに保たれたまま、スカフォールド間の距離が変更され得るように構成されたスカフォールドの一実施形態（装置の本体の形を変えさせる必要がなく、トリプシンの使用を最小限にし、又は培養領域に対する培地の割合を変更することを含む有益性を提供することができる。）を示す断面図。
【図１６】培地の高さが細胞増殖及び抗体産生に及ぼす効果を査定するために使用される筒状試験装置（この試験装置を用いた生物学的評価は、従来の見識における限界を超えて培地の高さを増す有益性、及び従来の装置の培地容積に対する気体透過性表面積の割合を減らす能力を示した。これらの驚くべき結果は、以前に考えられていない装置構成が存在することを可能とする。）の断面図。
【図１７】試験装置の側壁を介した気体移動を可能とすることにより気体／液体界面の非存在下で接着細胞を培養する能力を査定するために使用される試験装置（この試験装置を用いた生物学的評価は、気体／液体界面の非存在下で細胞を培養する能力を示した。これらの驚くべき結果は、以前に考えられていない装置構成が存在することを可能とする。）の断面図。
【図１８】試験装置の側壁を介した気体移動を可能とすることにより気体／液体界面の非存在下で接着細胞を培養する能力を査定するために使用される試験装置（複数のスカフォールドをその試験装置に一体化させた。この試験装置を用いた生物学的評価は、気体／液体界面の非存在下で細胞を培養する能力を示した。これらの驚くべき結果は、以前に考えられていない装置構成が存在することを可能とする。）の断面図。
【図１９Ａ】スカフォールドの上面及び下面上に細胞を播種する能力を査定するために使用される試験装置（この試験装置を用いた生物学的評価は、装置の側壁を介して気体交換が行われた場合、気体／液体界面の非存在下で細胞を培養する能力、それは接着表面積に対する下方気体透過性物質の表面積が機能的であり、培地容積に対する下方気体透過性物質の表面積が機能的であり、且つ装置が非回転型位置又は回転型位置にある場合、細胞を培養し得ることを示した。）の断面図。
【図１９Ｂ】図１９Ａの試験装置の１つのスカフォールドを示す斜視図。
【図２０】実施例４に記載された、細胞分布パターンを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
［発明の詳細な説明］
従来の細胞培養装置又は方法では考えられていない高さに培地を保持することができる気体透過性装置を構成することにより、取り扱い頻度、労力、滅菌費用、出荷費用、保管費用、インキュベータ用空間の使用、廃棄費用、及び混入の危険性を減らすことを含む利
点を生じることができる。また、培地容積に対する気体透過性表面積の割合を、従来の細胞培養装置又は方法では考えられていない割合まで減少させることも、培養効率を増大させ得る。これにより、装置の長さ又は幅を対応して増大させることなく、培地の高さを増大させることが可能となる。好ましい実施形態では、培地の高さを増大させるか、又は培地容積に対する気体透過性表面積の割合を減らすかのいずれかを可能とする措置がとられる。培地の高さを増大させ、且つ培地容積に対する気体透過性表面積の割合を減らすことの両方を可能とする措置がとられる。
【００９３】
培地が従来の見識を超えた高さにあることを可能とする気体透過性装置及び方法に関する多種多様な実施形態が可能である。それらは、従来の装置の形態又は完全に新規の形態を取ることができる。形態が最大で５０ｍｍ径の気体透過性ペトリ皿である場合、培地の高さは、好ましくは０．３６ｃｍを上回るべきである。好ましい壁高は、６ｍｍを上回る。形態が５０ｍｍ径を超える気体透過性ペトリ皿である場合、培地の高さは、好ましくは０．５１ｃｍを上回るべきである。好ましい壁高は１２ｍｍを上回る。形態が３８４ウェル以上のマルチウェル組織培養プレートである場合、培地の高さは、好ましくは、０．９１ｃｍを上回るべきであり、好ましいウェルの深さは１１．５ｍｍを上回る。２４ウェル未満〜３８４ウェル未満では、培地の高さは、好ましくは０．９７ｃｍを上回るべきであり、好ましいウェルの深さは１０．９ｍｍを上回る。２４ウェル以下では、培地の高さは、好ましくは１．０３ｃｍを上回るべきであり、好ましいウェルの深さは１６．５ｍｍを上回る。形態が気体透過性カートリッジである場合、培地の高さ及び壁高は、好ましくは１．２７ｃｍを超えるべきである。細胞培養用バッグの形態では、培地の高さは最高点で２．０ｃｍ高を超えていることが好ましい。形態が区画化された装置であり、その装置内の培地全てが半透過性膜の上全体に存在する場合、栄養区画の培地の高さは、好ましくは半透過性膜の上の１．０ｃｍ高であるべきである。形態が区画化された気体透過性装置である場合、栄養区画の培地の高さは、好ましくは半透過性膜の上の３．８ｃｍ高を超えるべきである。
【００９４】
従来の見識に比べて、培地容積に対する気体透過性表面積の割合を減らすことを目的とした設計である場合、気体透過性装置及び方法に関する多種多様な実施形態が可能である。それらは、従来の装置の形態又は完全に新規の形態を取ることができる。形態が５０ｍｍ径以下の気体透過性ペトリ皿である場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは２．７４ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。形態が５０ｍｍ径以上の気体透過性ペトリ皿である場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは１．９６ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。形態が３８４ウェル以上のマルチウェル組織培養プレートである場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは１．１０ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。２４ウェル未満〜３８４ウェル未満では、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは１．０３ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。２４ウェル以下では、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは０．９７ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。形態が、カートリッジの２つの側面が気体透過性である気体透過性カートリッジの場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは０．７９ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。細胞培養用バッグの形態では、培地容積に対する気体透過性表面積の割合が１．０ｃｍ２／ｍｌを下回ることが好ましい。形態が区画化された装置であり、その装置内の培地全てが半透過性膜の上全体に存在する場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは１．７４ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。形態が区画化された装置であり、その装置内の培地全てが半透過性膜の上全体には存在しない場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、好ましくは、０．３１ｃｍ２／ｍｌを下回るべきである。
【００９５】
図４Ａは、本発明の一実施形態の断面図を示す。気体透過性細胞培養装置１０は、細胞２０が下方気体透過性物質３０上に存在することが可能となるように構成されている。図
４Ａは、ペトリ皿の形式で組み立てられた気体透過性細胞培養装置１０を示すが、培地が従来の見識の高さを超えた高さに位置させることを可能にする、かなり多くの形状及び大きさでも可能である。
【００９６】
頂部カバー５５を取り外して、培地５０を、注入又はピペット操作のいずれかで都合よく気体透過性細胞培養装置１０へ添加し、且つ気体透過性細胞培養装置１０から除去することを可能とすることができる。しかし、培地５０に対するアクセスはまた、細胞培養装置に共通したかなりの数の方法、例えば、蓋、隔壁及び管で行うことができる。閉鎖系が望まれる場合では、気体透過性細胞培養装置１０は注入管及び排出管を備えて構成され得る。それらの管は、テルモメディカル社（Terumo Medical Corp.）（サマセット、NJ）製の器材等を用いて、滅菌管状材料の結合により、培地源及び廃棄袋と接続され得る。また、隔壁構成又は当業者に既知の任意の他の技法を用いて、密閉容器を作製することもできる。例えば、図４Ｂに示されるように、気体透過性細胞培養装置１０は、隔壁６５を備えた密閉容器として代替的に構成され得る。
【００９７】
気体透過性細胞培養装置１０が培地５０で完全に満たされ、且つ細胞が重力により培地５０外に沈むことを意図する場合では、気体透過性細胞培養装置１０の頂部形状により、培地５０が下方気体透過性物質３０上に均一な高さで存在することが可能となることが好ましい。それにより、細胞が培地５０内で懸濁状態から重力によって沈む場合、下方気体透過性物質３０上で細胞の均一な堆積が可能となる。図４Ｂの構成はこの目的を達成する。
【００９８】
下方気体透過性物質、例えば物質３０は、任意の膜、フィルム又は気体透過性細胞培養装置に使用される材料、シリコーン、フルオロエチレンポリプロピレン、ポリオレフィン及び酢酸ビニルエチレン共重合体等、であり得る。細胞培養における気体透過性物質及びそれらの使用についての学識に関する広範囲に及ぶ情報源は、さらなる指針（例えば、同時係属中の米国特許出願第１０／４６０，８５０号（その全体が本明細書中に援用される））に用いることができる。フィルム及び膜という用語の使用は、気体透過性物質全体にわたる非常に薄い間隔（distance）を含意する。また、本発明の実施形態は、記載された装置及び方法の気体透過性物質が、フィルム及び膜に付随した厚さを超える場合に機能することを本発明者等は見出した。したがって、培養物の気体交換に寄与する装置の一部は、本明細書中で気体透過性物質と呼ばれる。
【００９９】
気体透過性物質は、気体透過性、透湿性、細胞との所望の細胞相互作用に向けて改変する能力、光学的透明度、物理的強度等を含む多様な特性を基に選択されるべきであることが当業者に認識されよう。細胞培養に首尾よく使用されている気体透過性物質の種類を記載する多種多様の情報が存在する。シリコーンはしばしば、良好な選定子となる。シリコーンには優れた酸素透過性があり、光学観察を可能とし得り、簡単には破壊せず、通常、細胞がシリコーンに結合せず、多種多様な形状に簡単に製造され得る。シリコーンが使用される場合、気体移動が望まれる部位で、約０．５０８ｃｍ（０．２インチ）未満、約０．２５４ｃｍ（０．１インチ）未満、約０．１２７ｃｍ（０．０５インチ）未満、又は約０．０７６ｃｍ（０．０３０インチ）未満であり得る。材料の最良の選択法は用途による。例えば、低温保存にさらされるであろう用途では、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）が好ましいであろう。細胞が気体透過性物質に付着する接着培養に関しては、ＷＯ０１／９２４６２号、米国特許第４，９３９，１５１号、米国特許第６，２９７，０４６号及び米国特許出願第１０／１８３，１３２号に、指針を与える多くの情報源がある。
【０１００】
シリコーンが気体透過性物質として使用される場合、従来の見識を超えて厚さを拡大することは、設計に関する選択肢を拡大し、製造プロセスの費用を削減し、且つ破壊の可能性を最小限にし得る。例えば、大きな表面積を有する一部を成形することは、その一部が
非常に薄くなければならない場合、おそらく難しい。なぜなら、成形物のコアと本体との間の非常に小さな間隙に、材料が流れ込まない場合があるからである。その一部を厚くすること、つまりその間隙を広げることは、成形プロセスを容易にすることができる。成形に対する利点があり得ることに加えて、より厚い気体透過性物質はまた、ほとんど破壊しないか又はピンホールを示さない。
【０１０１】
壁の高さ、例えば壁４０は、装置のスケールアップ効率に重要な役割を担っている。従来の静止気体透過性装置では、培地の高さに限界がある。例えば、バッグは壁を備えておらず、指示書は培地の高さを制限し、カートリッジ式装置のみ非常に高さの低い壁を備える（例えば、Ｏｐｔｉｃｅｌｌ（登録商標）カートリッジ、ＣＬＩＮＩｃｅｌｌ（登録商標）培養カセット、及びＰｅｔａｋａ（商標）カートリッジ）。本発明の目的は、培地の高さを増大させ、それにより装置の効率を増大させることである。壁の高さは、どのくらいの培地が装置に存在できるかを決定し得る。培地を加えることによって、より大きな供給源である基質(substrate) 、及び廃棄生成物用のより大きなシンクを提供する。壁高を高めることにより、スケールアップの間、より多くの培地が必要とされる場合、装置の配置はインキュベータ、フローフード及び生物学的有害廃棄物袋の形状と適合する。さらに、細胞が存在する表面積に対する容積の増大は、存在する細胞当たり、より多くの培地が与えられることを可能とし得る。そのことは、栄養供給の頻度を減らす効果があり、したがって労力及び混入の危険性を減らすことができる。装置設置面積１ｃｍ２当たり存在する細胞数を増大させる効果もあり得る。
【０１０２】
また、培地の容積を増大させる壁を組み立てることは、培地蒸発の影響を小さくする有益な効果もあり得る。培地蒸発は、培地内に存在する溶質の濃度を変えてしまうため、細胞培養では問題となる。既存の気体透過性装置はこのような事象になりやすい。なぜなら、それらの装置の培地容積に対する気体透過性表面積の割合が高いからである。このような事象を防止する試みは、例えば米国特許出願第１０／２１６，５５４号及び米国特許第５，６９３，５３７号に記載されているが、装置内の培地の容積を増大させるだけで、蒸発の影響を減らすことができる。従来の静止気体透過性装置に気体透過性表面積に対する培地容積の割合を増大させた場合、溶質濃度変化の割合は、蒸発がある場合に比例的に減少し得る。
【０１０３】
好ましい実施形態では、壁は、気体／液体界面に依存した装置の高さを超過した高さに培地を存在させることができるようにすべきであり、通常の静止気体透過性装置の高さを上回ることがより好ましい。例えば、壁４０の高さは、３ｍｍを超え、より好ましくは２．０ｃｍを超え、その結果利点を与え得る。従来の気体透過性装置よりもより多くの培地を装置に加える選択肢を装置の使用者に提供することにより、１つの装置当たりより多くの細胞を収容する能力、装置への栄養供給頻度の低減、及び設置面積を増大させることのない装置のスケールアップを含む、多くの利点が生じる。壁は任意の生体適合性材料から構成することができ、液体密封シール（liquid tight seal ）を形成するように下方気体透過性物質と結合させる（mate: 噛み合わせる）べきである。下方気体透過性物質を壁と結合させる方法としては、接着結合、ヒートシール、圧縮圧密（compression squeeze ）、及び部分間の封止を作り出すために一般的に使用される任意の他の方法が挙げられる。任意選択として、壁及び下方気体透過性物質は、同一の材料で形成され、単一体として製造することができる。例えば、シリコーンが用いられる場合、壁及び下方気体透過性物質は、単一気体透過性部品となるように液体注入成形されるか又はディップ成形され得る。それにより、気体透過性細胞培養装置が、図４Ｂに示されるように垂直に立てて置かれるか、又は、その上に細胞２０が静置している気体透過性壁４１を示している図４Ｃに示されるように、装置の側面を下に置く場合に細胞がその上に存在するような気体透過性面を作る利点がある。
【０１０４】
或る特定の気体透過性細胞培養装置の側面を下に置くことは、装置が、狭間隔のインキュベータ棚に対して高すぎる場合に、装置のプロファイル（profile ：横幅）が小さくなるため、インキュベータ用空間を最適に使用するのに役立つことができる。気体透過性細胞培養装置の側面を下に置くことが望ましい場合、装置を円形にする代わりに正方形又は長方形にすれば、装置の側面を下に置いた場合に、細胞が存在する平面が作り出されるであろう。これは、細胞が互いの上に積み重なり、場合によっては危険な勾配を生じることになる、集中局在化領域を防ぐため、有利である。装置の深さと幅の寸法が異なる場合、細胞がその上に存在するような３つの相互性表面領域を利用することができる。また、気体透過性細胞培養装置が配置された位置に応じて３つの代替的な最大培地高が存在する。装置がこれらの代替位置での操作用に組み立てられた場合、装置が置かれる面は気体透過性物質から成ることが好ましい。それにより、この面に重力によって沈む細胞が気体交換に最適な近傍にあることを可能とする。
【０１０５】
実験室の空間の使用を最も効率的にし、培地内の勾配形成を最小限にし、且つ播種中に下方気体透過性物質上で細胞が均一に堆積することを可能にするために、培地を気体透過性物質上に比較的対称的な形状で保持する、構造的に十分な強度を有する壁が構成されることが好ましい。ｐＨ又は混入状態を判定するために、壁は培地の色変化を視覚的に評価することが可能であれば、また有利である。気体透過性細胞培養装置が容易に手で持ち上げられることが可能なように壁が構成されてもよい。壁が気体透過性であることが望ましい場合、また、頑丈な位置に壁を固定するために、別個の独立体が壁の周辺に設置された場合、大部分の壁と気体の接触が阻止されないようにすることが好ましい。
【０１０６】
気体透過性細胞培養装置は、静止モード又は回転モードのいずれかで機能するように構成され得る。そのようにするためには、気体透過性細胞培養装置は、好ましくは円筒型であるべきである。円筒型に形作られた本体は、装置が標準的なローララックに配置される場合、正方形又は長方形の本体よりもより多くの容積を備える。しかし、非筒状の本体形状でも、本体の周りに円形のハウジングを取り付けることにより、ローララックで機能することができる。使用者に、装置を垂直、水平又は回転位置で機能させる選択を与えることが望ましい場合、気体透過性細胞培養装置の底及び側壁の両方が気体透過性物質から成るべきである。装置が水平、回転又は非回転位置で操作されるだけの場合、費用面でより効率的であり、装置の端面が気体透過性物質から成らない場合に蒸発する表面積を最小限にし得る。
【０１０７】
気体透過性細胞培養装置が下方気体透過性物質を備えた筒状の形状に構成され、且つその壁が気体透過性物質から成る場合、使用者の選択に応じて装置が垂直に立てて配置されるか、又は回転され得る。最大混合が或る用途（例えば、抗体産生時間を減らすように求められる場合であり得る）に有益性がある場合、気体透過性細胞培養装置を回転することが有利であり得る。この任意選択性が望まれる場合、気体透過性細胞培養装置の壁は、下方気体透過性物質について記載された同一方法で気体透過性にされるべきである。ボトルの長さ又は直径に制限はないが、気体透過性細胞培養装置が標準的なローララックで機能することができるように壁が標準的なローラボトルの直径と一致している場合、有利であり得る。
【０１０８】
細胞のせん断を低減させることが望ましい場合、細胞のせん断の一因となり得ないように、装置全体を培地で満たすことによりその装置から気体を除去し得る。ポートは、培地が装置全体を満たす際の混入の危険性を減らす、かなりの数の方法で設計され得る。また、装置が回転されるか、又は装置の側面で機能する場合、側面だけが気体透過性物質から成る必要がある。
【０１０９】
培地が従来の見識を上回る高さで存在することを可能とする装置によってもたらされる
、スケールアップの利点は、本明細書中の生物学的結果を示す実施例を踏まえて、当業者に明らかとなるであろう。スケールアップの効率性の例として、気体透過性細胞培養装置が、垂直位置で操作される円筒型であり、その底部が気体交換に付される場合、直径を倍にすると、容積は、高さが一定に保たれる場合の４倍に増大する。例えば、およそ１１．４３０ｃｍ（４．５インチ）径及び約１９．５５８ｃｍ（７．７インチ）高の装置は、約２Ｌの培地を収容し得る。装置の直径を約２２．８６０ｃｍ（９．０インチ）にすることにより、装置は８Ｌの培地を収容し得る。装置の直径を約４５．７２０ｃｍ（１８．０インチ）にすることにより、装置は３２Ｌの培地を収容し得る。したがって、重要なパラメータ、例えば、培地の高さ、及び培地容積に対する気体透過性表面積の割合、を一定に保ちながら、培養容積を容易にスケールアップすることができる。これらのパラメータを一定に保つことにより、小容積用の装置に開発されたプロトコルは、装置の容積が増大してもおそらく不変のままである。
【０１１０】
気体透過性細胞培養装置が垂直位置で操作され、且つ懸濁細胞が培養される場合、周囲気体が、下方気体透過性物質の下面と比較的非閉塞的に接触し得る場合に利点がある。例えば、棚が穿孔されていないインキュベータ内で、下方気体透過性物質がインキュベータの棚と接触するようにした場合、培養物内及び培養物外への気体の移動が制限され得る。図５の断面図に示される実施形態では、下方気体透過性物質サポート８０は、下方気体透過性物質３０が気体区画９０を維持することにより周囲気体と必ず接触するよう作用する。好ましい実施形態では、培養物をサポートするのに必要とされる気体交換の量を減らさずに下方気体透過性物質サポート８０が下方気体透過性物質３０と部分的に接触することができるようにすることで、気体区画９０が維持される。周囲気体にさらすことに加えて、下方気体透過性物質サポート８０は、細胞２０がどんなに低い位置でも積み重ならないように実質的に水平な状態で下方気体透過性物質３０を維持する。これは、細胞２０が下方気体透過性物質３０の全体にわたって均等に分布し得る状態に対して、拡散勾配を生じ、且つ細胞増殖を制限するであろう。したがって、下方気体透過性物質サポート８０の設計目的は、物質が実質的に水平に保たれることを必要とする多くの場所で、下方気体透過性物質３０の下面と十分な気体を接触させたまま、下方気体透過性物質３０と接触させることであり得る。当業者は、この目的を達成する多くの方法があることを認識しているであろう。図５に示されるように、突出部１１０がこの目的を達成する。
【０１１１】
「インサーキットテスター（bed of nails：ネイルベッド）」構成は、十分な気体交換をさせながら、実質的に水平位置で下方気体透過性物質３０を維持する１つの方法である。例えば、均等に分布され、且つ下方気体透過性物質サポートから１ｍｍ突出する１ｍｍ×１ｍｍの正方形は、実質的に水平位置で下方気体透過性物質を保持することができる。突出部１１０が、図５に示されるように、下方気体透過性物質サポート８０の表面の５０％を占める場合、この構成は、十分な気体交換により、約０．０１０ｃｍ（０．００４インチ）厚のシリコーン膜上で１ｃｍ２当たり約１億〜１．５億個のマウスハイブリドーマ細胞を培養することを可能とする。また、図５に示されるように、下方の気体出入開口部１００は、気体が受動拡散により下方気体透過性物質サポート８０の気体区画９０に対する出入りを可能にする。これは、気体透過性細胞培養装置１０Ｂを、補助的なポンプ機構を必要とせずに周囲条件下で機能させる。足場９５は下方気体透過性物質サポート８０を持ち上げ、周囲気体が下方の気体出入開口部１００で利用可能になるようにさせる。この情報はまた、装置が回転モード又は非回転モードのいずれかで、装置の側面について記載されるように機能する場合、側壁周辺の気体区画を維持するのに適用される。気体透過性物質に十分な気体の接近を可能にする他の可能性も利用できる。インテグラバイオサイエンス社（Integra Biosciences AG）製、例えばＣＥＬＬｉｎｅ（商標）製品は、下方のプラスチックサポートから３０．４８ｃｍ（１フィート）持ち上げたオープンメッシュを用いて、気体透過性膜への気体のアクセスを可能にしている。また、米国特許第５，６９３，５３７号もこの特徴に対する付記的なガイダンスを提供している。
【０１１２】
図５に示される構成では、蓋７０が培地出入口６０を覆い、混入を防ぐ。Ｏ−リング７５は、装置が水平位置にあるか、完全に満たされているか、又は偶発的に落下するような場合等、培地５０が気体透過性細胞培養装置１０Ｂから漏れないように保証する。
【０１１３】
或る特定の実施形態では、培地は下方気体透過性物質上全体に存在する必要はない。棚間の距離が制限されたインキュベータでの使用に望まれ得るような、垂直な細胞培養装置のプロファイルを減らすために、培地の一部は下方気体透過性物質の直に上ではない領域に存在し得る。図６の断面図は、垂直位置で操作される場合の気体透過性細胞培養装置１０Ｃのプロファイルを減らすために、壁４０Ｃが下方気体透過性物質３０から隔てられた懸濁細胞培養用に構成された実施形態を示す。この構成では、気体透過性細胞培養装置１０Ｃの幅又は直径を単に拡大することにより、装置のプロファイルを減らしながら、細胞が存在する表面積に対する培地容積の割合が一定に保たれ得る。細胞２０が、播種、栄養供給及び取り扱いの際に、下方気体透過性物質３０上に存在し続けることを確実にするよう留意すべきである。内壁４２は、重力により細胞２０を下方気体透過性物質３０上の領域に維持することにより、このことを達成する。好ましい実施形態では、壁は、３ｍｍを上回る下方気体透過性物質３０よりも上の高さに培地を存在させることができるようにすべきである。
【０１１４】
図７Ａ及び図７Ｂは、装置内に存在する培地容積に応じて装置の高さを上げるか、又は下げることができる、気体透過性細胞培養装置に関する好ましい実施形態の断面図を示す。図７Ａでは、培地５０を気体透過性細胞培養装置１０Ｄに加え、浮き胴（buoyant shoulder）２５と接触させる。図７Ｂでは、培地５０は浮き胴２５に上方の力を及ぼし、その結果、培地５０の容積が増大するに応じて気体透過性細胞培養装置１０Ｄの高さが上がる。示された構成では、壁４０Ｄは気体透過性細胞培養装置１０Ｄの高さを伸縮させるように形作られたベローである。浮き胴２５は、培地５０よりも密度が小さい任意の生体適合性材料であり得る。また、浮き胴は壁４０の一体部分であり得る。気体透過性細胞培養装置１０Ｄを上方に伸長するのに十分な力を発揮するには、培地５０の適切な容積を移動させる大きさに作るべきである。この構成では、気体透過性細胞培養装置１０Ｄは、培養を行うのに必要な分だけの空間だけを占め、１つの製品で様々な用途に最適な大きさとなり得る。例えば、ハイブリドーマを培養することに適した培地の容積は、膵島を維持することに適した培地の量とは異なる場合がある。そのような場合、気体透過性細胞培養装置１０Ｄは、各用途に必要な分だけの空間を占めるだけでよい。また、最小容積の状態で、滅菌、出荷、保管、インキュベーション及び廃棄することが可能であり、それにより培養プロセスの費用を削減できる。当業者は、例えば、同時係属中の米国特許出願第１０／４６０，８５０号で記載されるような多種多様な機械的メカニズム等、浮力以外の装置の形状（プロファイル）を変更する多くの他の方法があることを認識するであろう。
【０１１５】
図８は、各ウェルの底部が気体透過性である、気体透過性マルチウェルプレート１５に関する実施形態を示す。下方気体透過性物質３０Ａの特性は、図４Ａの実施形態で記載されたものと同一である。６ウェルプレートを示すが、従来の６ウェル、２４ウェル、４８ウェル、及び９６ウェルフォーマットを含む、かなりの数の個々のウェル４５を提示することができる。壁４０Ｅは、従来のマルチウェルプレートの壁高を超過する下方気体透過性物質３０Ａを越える高さに、培地を存在させるように構成されている。それにより、従来のマルチウェルプレートに比べて設置面積を減らしつつ、各ウェルに存在し得る細胞の数を増大させる。例えば、マウスハイブリドーマ細胞は通常、培地１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞の密度で存在し得る。ウェルが８．６ｍｍ径、培地の高さが２ｍｍである場合、０．１２ｍｌの培地では、約０．１２×１０６個の細胞が１つのウェル当たり存在することができる。壁を高くすることにより、１ｍｌの培地がウェルに存在し得る場合、ほぼ５倍もの細胞（すなわち、１ｍｌ当たり１×１０６個の細胞）をサポートするのに十分な
培地が１つのウェル当たり存在し得る。但し、多数の細胞が０．５８ｃｍ２の表面積（すなわち、８．６ｍｍ径）の気体透過性物質上に存在し得るとする。実施例１は、１×１０６個を超える多くのマウスハイブリドーマ細胞が、培地容積に依存したこの大きさの表面積に存在し得ることを示す。より多くの培地が、より多くの細胞のサポートができるので、栄養供給の頻度を減らし、培地の組成を変える蒸発速度を低減することができる。
【０１１６】
壁は任意の生体適合性材料から構成することができ、液体密封シールを形成する方法で、下方気体透過性物質に噛み合わされなければならない。下方気体透過性物質３０Ａを壁４０Ｅに噛み合わせる方法は、図４Ａの実施形態に関して記載されたものと同一である。また、図４Ａの実施形態に記載されるように、壁４０Ｅ及び下方気体透過性物質３０Ａは同一の材料で形成され、且つ単一体として製造され得る。下方気体透過性物質３０Ａは、図５に示されるように実質的に水平位置で支えられ得る。ここで、下方気体透過性物質サポート８０は、気体区画９０と連通する下方気体出入開口部１００を備えて構成される。ウェル４５の底部のスパンが小さい場合、サポートは不必要である場合がある。なぜなら、気体透過性物質の厚さ及び物理特性によっては、下方気体透過性物質３０Ａの物理的強度が下方気体透過性物質３０Ａを適切な水平位置に保持し得るからである。この場合、気体移動が、穿孔されていない棚を備えたインキュベータにおいて問題とならないように、足場９５Ａを用いて気体透過性マルチウェルプレート１５を持ち上げることができる。頂部カバー５５Ａは、混入を防ぎ、蒸発を最小限にする。
【０１１７】
図９Ａは、一部を切り取った斜視図を示し、図９Ｂのウェル４５Ａは、気体透過性マルチウェルプレート１６に関する好ましい実施形態のＡ−Ａでの断面図を示す。この実施形態では、ウェルの壁は気体透過性である。６ウェルプレートを示すが、従来の６ウェル、２４ウェル、４８ウェル、及び９６ウェルフォーマットを含む、かなりの数の個々のウェル４５Ａが提示され得る。従来のマルチウェル組織培養プレートの顕微的付着表面、又は可視光特性のいずれかを保持することが望ましい場合、この構成は有益であり得る。さらに、各ウェル４５Ａを、細胞培養に使用される従来のマルチウェルプレートの最大の深さよりも深くすることにより、より多くの培地が培養に利用することができ、且つ壁の気体透過性の性質が培養物の適切な気体交換を可能とし、気体／液体界面の位置決めが重要ではないように得る。非気体透過性底部３１を液密的に気体透過性壁４１と噛み合わせる。この目的を達成する多くの方法がある。例えば、非気体透過性底部３１の直径が気体透過性壁４１の直径を僅かに上回ると、気体透過性壁４１に非気体透過性底部３１に対し力が加えられ、それにより液体密封シールを作製することができる。気体透過性壁４１は、図４Ａの気体透過性物質に関して記載されたような任意の特性を有し得る。しかし、好ましい実施形態では、気体透過性壁４１はシリコーンから成る。なぜなら、シリコーンには、液体注入成形により容易に製造される性能、並びに延伸及び非気体透過性底部３１に対する液体密封シールを付与する潜在的性能があるからである。非気体透過性底部３１は、従来のマルチウェル組織培養プレートで一般に使用される任意のプラスチック、又は当業者には既知の任意の他の細胞付着材料であり得る。
【０１１８】
気体透過性物質から気体透過性マルチウェルプレート１６のウェル底部を含む各ウェルを製造することで、シール接合部がなくて済むため、それほど高価ではないであろう。そのため、接着培養が望まれる場合、適したスカフォールドがウェルの底部に配置され得る。顕微的な評価が望まれる場合、光学的透明度を確実にするように留意すべきである。細胞培養の熟練者（当業者）に既知のいかなる細胞付着面もウェルに配置され得る。細胞付着面が浮揚性である場合、細胞付着面をウェル内に圧入することにより、細胞付着面を所望の位置に維持させることができる。細胞付着面を適所に保持する多くの他の方法もまた可能である。
【０１１９】
図１０Ａ及び図１０Ｂは、接着細胞を培養する場合、空間をより効率的に利用する気体
透過性細胞培養装置の一実施形態の断面図を示す。スカフォールド１２０は気体透過性細胞培養装置１０Ｅ内に存在する。側壁４０Ｆは気体透過性物質から成り、そのため装置の側面を介した気体交換が可能である。この様式では、高さが増大するに伴いスカフォールド１２０が均一に拡大（scale ）され得るため、気体透過性細胞培養装置１０Ｅは高さに制限はない。より多くの細胞を培養させるには、装置をより高くし、より多くのスカフォールド１２０を加えるだけでよい。好ましい実施形態では、各スカフォールド１２０間の距離は、スケールアップの間、一定に維持される。例えば、スペーサ１３５を有するスカフォールド１２０を構成することにより、スカフォールドが等しい距離離れて維持され、且つ気体透過性細胞培養装置１０Ｅの底部と平行に保持され、垂直直線方向にスケールアップされる。ピペット出入開口部１２５は、気体透過性細胞培養装置１０Ｅ全体からピペット出入を可能とし、培地が加えられる際にガス抜きをするための開口部を備える。ピペット出入は、中央に示されているが、任意の位置にあることができるか、又は針若しくは隔壁等の任意の他の液体取り扱い形態に有利になるように、完全に取り除くことができる。図１０Ａでは、各スカフォールド１２０上の種菌１３０の容積が等しいので、細胞２０Ａは種菌１３０内でよく懸濁されており、且つ各スカフォールド１２０の上面の周りで均等に分配され得る。スカフォールド１２０の両面が接着細胞を培養することを意図する場合、図１０Ａに示されるように、播種は先にスカフォールド１２０の片面を播種することにより２段階で行われ得る。細胞が重力によって堆積し、スカフォールド１２０の表面に付着した後、気体透過性細胞培養装置１０Ｅは再播種され、１８０度回転してスカフォールド１２０の反対面を露出させる。その後、図１０Ｂに示すように、細胞２０Ａを固着させ、スカフォールド１２０の露出面に付着させる。
【０１２０】
細胞付着後、スカフォールドの片面に播種するには通常２４時間未満かかり、利便性（convenient）のある任意の静止位置、例えば垂直、転置又はその側面上等で装置が操作され得る。必要に応じて、使用者がローラボトルにより等しいフォーマットを望む場合、装置が回転され得る。従来の装置とは異なり、気体交換が気体透過性壁によって生じ、且つ気体／液体界面の必要性がないため、装置は完全に培地で満たされ得る。この様式では、装置は従来の装置よりも、装置の空間の使用に効率的である。なぜなら、培養物の気体交換のために、装置内に気体を存在させる必要がないからである。装置内で培養され得る細胞数に対する制限要因としては、スカフォールド表面積の量、培地が存在する容積、装置の壁に使用される材料の気体透過性及び厚さ、細胞が存在する、装置の気体透過性壁からの距離、並びに培養される細胞の型が挙げられる。
【０１２１】
気体透過性細胞培養装置を設計する場合に、スカフォールド領域に対する培地容積の割合が重要であることを理解することは、装置のアウトプットを予測する助けと成り得る。例えば、培養がこれまでローラボトルで行われている場合、ローラボトル培養の表面積に対する培地の容積は気体透過性細胞培養装置に再現され得る。例えば、１５０ｍｌの培地を用いて既存の培養が従来の８５０ｃｍ２ローラボトルで行われ、且つ気体透過性培養細胞装置が、従来のボトルと同一の外側形状を有している場合、表面積に対する培地容積の割合は一定に保たれ得る。従来の８５０ｃｍ２ローラボトルの形状で構成された気体透過性細胞培養装置は、約２，２００ｍｌの培地を保ち得る。それは、従来のローラボトルの１５０ｍｌ培地容積に比べ、培地容積が１４．６７倍増加する。したがって、１２，４７０ｃｍ２である表面積における１４．６７倍の増加は、相当の表面積に対する培地の割合を等しく維持する必要がある。そのため、気体透過性細胞培養装置が２，２００ｍｌの培地を含有し、且つスカフォールド表面積が１２，４７０ｃｍ２である場合、通常１つのボトル当たり１５０ｍｌで操作する約１５個の従来の８５０ｃｍ２ローラボトルで培養される細胞と同数の細胞を培養することが予想され得る。また、栄養供給の頻度もほとんど同一であるはずである。
【０１２２】
細胞の集密性を顕微的に査定する性能は、多くの用途に有用である。最も下のスカフォ
ールドが気体透過性細胞培養装置の底部を成す場合、細胞の集密性を査定するのに用いられ得る。各スカフォールド上に存在する培地の容積が播種の間等しい場合、任意のスカフォールド上に存在する細胞の量は培養中比較的等しくなる。したがって、１つのスカフォールドが他のスカフォールドの代表例となり得る。いくつかの顕微鏡では、最も下のスカフォールドを、逆転させて顕微的に観察できる位置に物理的に移動させる性能は、集密性及び形態を良好に査定しやすくし得る。図１１の断面図に示される構成は、このことを達成し得る方法を示す。壁４ＧＨが柔軟性である場合、シリコーン等の多くの気体透過性物質の中から製造されるような場合に、気体透過性細胞培養装置１０Ｆに対して最も下のスカフォールド１２０の移動を可能とするために襞が付けられ得る（pleated ）。顕微的な評価はまた、図１１に示された固定化位置に気体透過性細胞培養装置１０Ｆを製造することにより可能とすることができ、それにより、気体透過性細胞培養装置１０Ｆに対して最も下のスカフォールド１２０を移動させる必要がなくなる。
【０１２３】
図１０Ａ、図１０Ｂ及び図１１に示されるスカフォールドは平坦であるが、スカフォールドは細胞が付着できるいかなる配置形状であってもよい。例えば、表面を波形に成形することは平面に対して表面積を増大することができ、それにより所定のスカフォールド上に存在し得る接着細胞の量を増大させる。図１２Ａは、波形に成形された丸状のスカフォールド１２０Ａの斜視図を示す。このスカフォールド１２０Ａは直線方向に波形に成形される。図１２ＢはＡ−Ａでの断面図を示す。図１２Ｃは丸状の波形に成形されたスカフォールド１２０Ｂの斜視図を示す。このスカフォールド１２０Ｂは、円方向で波形に成形され、図１２ＤはＢ−Ｂでの断面図を示す。速い速度の気体移動が非常に活発な細胞をサポートするために必要であるいくつかの用途では、図１２Ａの構成が優れ得る。なぜなら、図１２Ｃの構成の場合のように、気体移動用のチャネルがスカフォールドの端によって閉塞されない（unobstructred ）ためである。気体透過性細胞培養装置が回転される他の用途では、図１２Ｃの構成が優れ得る。なぜなら、その形状が、細胞のせん断を引き起こし得る渦巻きを最小限にし得るからである。
【０１２４】
構成、顕微的観察の方法、並びに図１０Ａ、図１１及び図１２に記載されたもの等のスカフォールド領域を増大する方法は、マルチウェルフォーマットに一体化され得る。これらの構成は、大きさにおいて完全にスケーリング可能である。図９Ｂは、スペーサ１３５により所定の距離離れて維持された複数のスカフォールド１２０を備えて構成された大表面積ウェル４６を示す。それらを通常の伝統的なマルチウェル組織培養プレートのウェルの大きさにすることにより、１つのウェル当たりに存在する接着細胞数を実質的に増大させ得る。壁４１Ａは気体透過性であることが好ましい。
【０１２５】
図１３は、組織培養フラスコフォーマットと同様のフォーマットで細胞を培養するのに有用である気体透過性細胞培養装置に関する構成の一切断面を示す。この実施形態では、装置の少なくとも１つの壁が気体移動を行う。この装置は、空間をよりコンパクトに使用できるようにしながら、気体透過性細胞培養装置に従来の組織培養フラスコと同一の特質を保持させるので有益である。望ましい特質としては、注入又はピペット操作での培地の搬入及び除去の容易さ、顕微的観察能、混入又はｐＨの変化を示し得る培地の色の変化が容易に見られること、並びに出荷、保管及びインキュベータ用空間を最も効率的に利用するための装置の積載可能性が挙げられる。しかし、組織培養フラスコ操作に必要とされる気体／液体界面が除かれ、且つ１つ又は複数のスカフォールドが存在し得るため、気体透過性細胞培養装置は組織培養フラスコよりも優れる。図示の実施形態では、気体透過性細胞培養装置１２は、少なくとも１つの気体透過性壁２００を備えた液体密封外枠から成る。培地出入口６０Ａは蓋７０Ａで覆われる。スカフォールド１２０Ｄは、種菌と培地が各スカフォールド１２０Ｄの間に存在できる間隔を有して、互いに平行に配向される。好ましくは、各スカフォールド上に存在する種菌又は培地を等量にするために、スカフォールド１２０Ｄは等間隔に位置付けられる。気体透過性壁２００の気体透過性物質は、図４Ａ
に示される実施形態の下方気体透過性物質３０に関して記載されたものと同一の特質を有する。好ましい実施形態では、スカフォールド１２０Ｄは、従来の組織培養フラスコに存在する物質の特徴と一致した物質の特徴を有する。頂部壁２０１及び最も底部のスカフォールド１２０Ｄは透明であるので、培地の色を視覚的に査定すること、並びに底部のスカフォールド１２０Ｄを顕微的に評価することが可能である。後部壁又は他の壁を気体透過性にすることにより、さらに気体移動能を作り出すことができる。それは、気体透過性細胞培養装置１２の設置面積をさらに増大させることが可能となる効果を有し得る。例えば、気体透過性壁２００の気体移動能が、約１２．７００ｃｍ（５インチ）幅のスカフォールド１２０Ｄ上に存在する細胞をサポートする場合、反対側の壁を気体透過性にするとスカフォールド１２０Ｄが約２５．４００ｃｍ（１０インチ）幅である場合に十分な気体移動能が可能となる。気体透過性細胞培養装置１２が垂直方向にスケールアップする機能（capacity）に制限はない。
【０１２６】
図１４Ａ〜図１４Ｅは、細胞を培養する際に、より効率的に空間を利用する別の方法を示す。この構成では、スカフォールド１２０Ｅは気体透過性細胞培養装置１０Ｇ内に存在する。この装置は培地５０が加えられると容積を拡大することができる。図１４Ａでは、気体透過性細胞培養装置１０Ｇが装置自体の重さで崩壊の状態にある。これにより、使用される前に、出荷、滅菌及び保管用の空間を効率的に使用することが可能である。スカフォールド１２０Ｆをできる限り互いに近接させる。各スカフォールド１２０Ｆは、下方の隣接したスカフォールド１２０Ｆに力を及ぼすスプリングアーム１４５を用いて成形される。圧縮されたスプリングアーム１４５は拡張しようとするが、気体透過性細胞培養装置１０Ｇの上方部分の重さがスプリング力を上回るため、拡張することができない。図１４Ｂでは、種菌１３０Ａを加えることにより浮き胴２５Ａに対して働いた力を受けて、気体透過性細胞培養装置１０Ｇの高さが上がっている。浮き胴２５Ａによる種菌１３０Ａの転移により働く上方への力は、スプリングアーム１４５Ｋのスプリング力と組み合わされた場合、気体透過性細胞培養装置１０Ｇの上方部分の重さを上回る。スプリングアーム１４５がその下方の隣接したスカフォールド１２０Ｆに対して及ぼす力のため、スカフォールド１２０Ｆが離れて互いに等間隔で保持される。各スカフォールド１２０Ｆ上に直接存在する種菌１３０Ａの体積が、各スカフォールド１２０Ｆ上に堆積され得る細胞の量を表す場合、互いに等間隔を保持することは、播種の際に特に有益である。スカフォールド１２０Ｆのそれぞれの上に存在する種菌１３０Ａを等しい体積にすることにより、等しい数の細胞が各スカフォールド１２０Ｆ上に存在することができる。図１４Ｃでは、細胞集団の拡大と栄養要求量の増大に伴う培地５０の追加に応じて、図１４Ｂに比べ、気体透過性細胞培養装置１０Ｇの高さを再度上げている。スカフォールド１２０Ｆは、スプリ
ングアーム１４５がその下方の隣接したスカフォールド１２０Ｆに対して及ぼす力のため、さらに離れて互いに等間隔で保持される。各スカフォールド１２０Ｆの間の一定した距離は、細胞の位置する場所全てにおいて表面積に対する培地５０の容積の一定の割合を保障し、勾配形成の可能性を減らす。図１４Ｄにおいて、培地５０の除去及び浮き胴２５Ａの上方への力の喪失により、気体透過性細胞培養装置１０Ｇは崩壊している。気体透過性細胞培養装置は、今は廃棄用に効率的な大きさとなっている。接着細胞の回復が必要な場合では、気体透過性細胞培養装置１０Ｇを崩壊させることは、培地５０を除去するとともにトリプシンを加える場合、有益である。この様式では、細胞を回復させるのにわずか少量のトリプシンしか必要とされない。当業者は、気体透過性細胞培養装置１０Ｇの高さを変更する多くの他の方法が適用され得ることを認識するであろう。
【０１２７】
図１４Ｅの斜視図に示されるように、スプリングアーム１４５はスカフォールド１２０Ｆ内に直接成形され得る。スプリングアーム１４５は、少なくとも３つの場所に位置決めすることが好ましく、スカフォールド１２０Ｆが平面であり、且つ隣接したスカフォールド１２０Ｆに平行のままであることを確実にする。細胞接着につながるあらゆる材料が許容されるが、好ましいスカフォールド１２０Ｆ用の材料はかなり脆性のあるポリスチレン
である。したがって、スプリングアーム１４５が、圧力で亀裂が生じることを防止するために良好な成形部品設計によって構成されることを確実にするよう留意すべきである。応力の低い部品設計の技法は、プラスチック部品設計の熟練者（当業者）によく知られている。
【０１２８】
気体透過性細胞培養装置の高さに関係なくスカフォールドの位置を移動することが望まれる場合がある。例えば、伸長しない壁を備えた気体透過性細胞培養装置を構成するほうが、より経済的だが、培養中それぞれのスカフォールド上の表面積に対する培地容積の割合を変更することによってその用途が依然として利益を得られる場合、これは実用的であり得る。図１５Ａ〜図１５Ｃはそのような目的を達成する一実施形態を示す。明確には、気体透過性細胞培養装置の一部だけが示される。図１５Ａに示される気体透過性細胞培養装置の一部の上面図では、スカフォールド間の距離を変えるために、３つの持ち上げポスト（elevation post）１６０が３つのランプ１５０のそれぞれを上方に移動するように位置付けされる。
【０１２９】
スカフォールド間の距離を変える方法は、図１５Ｂ及び図１５Ｃを検討することにより最もよく理解され得る。図１５Ｂは図１５ＡのＡ−Ａ断面図を示す。図１５Ｂで示されるように、２つのスカフォールド１２０Ｇ間の距離が最小となる位置のスカフォールド１２０Ｇを示す。ランプ１５０はスカフォールド１２０Ｇの頂部から延び、持ち上げポスト１６０はスカフォールドロケータスクリュー１７０から延びる。持ち上げポスト１６０はランプ１５０の上方への移動を始めていない。スカフォールド間の最小距離は、ランプ１５０上に存在するスカフォールド１２０Ｇの下方面と接触するランプ１５０の高さによって決まることが分かる。図１５Ｃを参照すると、スカフォールド１２０Ｇはそれらの間の距離が最大となる位置にある。スカフォールドロケータスクリュー１７０が回転矢印１８０の方向に回転することで、持ち上げポスト１６０がランプ１５０を上り、その上に存在するスカフォールド１２０Ｇを上昇させる。持ち上げポスト１６０がランプ１５０Ｌの最も高い点に存在する場合、ランプ１５０の高さと持ち上げポスト１６０の高さを足したものに等しいスカフォールド１２０Ｌ間の最大距離が達成される。スカフォールドロケータスクリュー１７０が回転する際、スカフォールド１２０Ｇが回転するのを防止することにより、持ち上げポスト１６０がランプ１５０を上昇移動する間に、ランプ１５０を固定位置に留まらせる。これは、さねはぎ配置で気体透過性細胞培養装置壁の内部にスカフォールド１２０Ｇを噛み合わせることにより達成することができる。図１５Ａのスカフォールドの上面図で最もよく示されるように、つまみ２１２は気体透過性壁４０Ｈから延び、各スカフォールド１２０Ｇの溝２１５と噛み合う。これは、ロケータスクリュー１７０の回転中にスカフォールド１２０Ｇの回転を防止するだけではなく、スカフォールド１２０Ｇから気体透過性壁４０Ｈが引き離されるのも阻止する。こうして、気体透過性細胞培養装置の形状が保持される。ロケータスクリュー１７０は、滅菌ピペットチップにより回転されるように構成され、それにより装置の混入を防ぎ、標準的な実験器具の使用によりスカフォールド間の距離を再配置することを可能にし得る。
【０１３０】
本発明は以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに説明される。
実施例
【実施例１】
【０１３１】
培地の高さが細胞増殖及び抗体産生に及ぼす効果
下方気体透過性物質から成る装置により、培地の高さを変更することが細胞増殖及び抗体産生に及ぼす影響を査定するため、評価を行った。培地容積に対する気体透過性物質表面積の割合を変更することの効果もまた査定された。下方気体透過性物質及び従来の見識を超えた高さで培地を保持する能力を備えて構成された単区画の試験装置を、従来の見識の範囲内の高さで培地を保持した単区画の対照試験装置と比較した。Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒ
ｅバッグ（米国特許第５，６８６，３０４号）に定められた１．６ｃｍという培地の高さの限定に対して比較を行った。対照試験装置は、高さ１．６ｃｍで培地を収容するように構成し、試験装置全てに使用された気体透過性物質は、実際のＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグから得られた気体透過性物質から成っていた。
【０１３２】
管状試験装置１０５を図１６に示されるように構成した。壁４０ＩをＵｌｔｅｍ１０００（高温ポリカーボネート）円筒型ストックから機械加工し、内径約２．５４０ｃｍ（１．００インチ）及び外径約３．８１０ｃｍ（１．５０インチ）の管が得られた。厚い壁により、壁を介した気体移動が培養を促進しないことを保証した。下方気体透過性物質３０Ａを、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグから除去されたシリコーンから成る厚さ０．０４５のシートから製造し、機械加工された管の底部に液密的に固定し、その上に存在する細胞２０Ｂ用の５．０７ｃｍ２の生育面積が得られた。下方気体透過性物質サポート８０Ｍもまた、Ｕｌｔｅｍ１０００から機械加工した。下方気体透過性物質３０Ａを、気体区画９０Ａを保持するメッシュ１１５により水平位置に保った。メッシュ１１５は、約２．５４０ｃｍ（１インチ）当たり１６本の約０．０５１ｃｍ（０．０２０インチ）径のストランドで構成された。下方気体出入開口部１００Ａを、５％ＣＯ２、９５％Ｒ．Ｈ．および３７Ｃの周囲環境で気体連通させた。試験装置内に備えた培地５０Ａの量を異なるものとした時の、細胞２０Ｂを増殖させる装置の生産能力を比較した。壁４０Ｉに密着固定した蓋７０Ｂにより筒状の試験装置１０５を混入から保護した。試験によって、培地５０Ａが細胞上約１．６ｃｍ、３．２ｃｍ、５．６ｃｍ、１０．２ｃｍ、１５．３ｃｍ、及び２０．４ｃｍの高さに存在した場合の結果を比較した。培地５０Ａは、１０％のＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳが添加されたＨｙｃｌｏｎｅＨｙＱＳＦＭ４ＭＡｂ−Ｕｔｉｌｉｔｙで構成された。細胞２０ＢはＩｇＧを分泌するマウスハイブリドーマ細胞であり、下方気体透過性物質３０Ａ  １ｃｍ２当たり０．７６×１０６個の播種密度で播種した。周囲条件を５％ＣＯ２、９５％Ｒ．Ｈ．、及び３７Ｃとした。周期的に細胞の計数とモノクローナル抗体産生の測定値をＥＬＩＳＡにより取った。表１はその結果を示す。
【０１３３】
【表１】
2014236753.tif 000003
従来の見識を代表する試験装置の対応するパラメータ（すなわち１．６ｃｍ）で任意の所定の試験装置で測定された各パラメータを割ると、従来の見識を超えた高さに培地を存在させる利点が明らかに示される。試験装置が１．６ｃｍ（すなわち、１．２５ｃｍ２／
ｍｌ）の高さで培地を含有する場合、培地容積に対する気体透過性表面積の割合は、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグの割合で試験装置の割合を割ることにより求められる。表２にこの様式における表１のデータを提示する。
【０１３４】
【表２】
2014236753.tif 000004
表２のデータは、気体透過性細胞培養装置の配置を変更してより多くの培地を細胞上に存在させる利点を明らかに示す。例えば、最後の行は、装置が従来の細胞培養用バッグの１２．７５倍の高さに培地を保持することができる場合、この装置はそれが占める据付面積１ｃｍ２当たり２．９１倍の細胞を培養することか可能であり、完全産生時間が２．８３倍増加するだけで１１．９９倍のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を産生することを示す。また、培養容積に対する気体透過性物質表面積の割合がＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグのものと比較された場合、劇的にその割合が減少し得る。その割合がＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグにより使用される割合のわずか４％であった場合でさえ、培養物を効率的に増殖させた。これにより、培地の高さを上げつつ、装置の設置面積は固定されたままにさせることを含む、多種多様の装置構成の存在が可能である。また、より多くの培地が気体透過性表面積１ｃｍ２当たりに存在するので、蒸発の影響を最小限にさせる。
【０１３５】
重要なことに、このデータは、培養物が増えるが装置の設置面積は小さいままであり得ることを示す。表３は、試験装置に存在する培地の容積を収容するために必要な装置の設置面積の表面積を示す。１行目は試験装置内の培地容積を示す。２行目は、培地を益々加える際に固定されたままの試験装置の設置面積を示す。３行目は、試験装置に存在する培地の容積を保つために通常のバッグで必要とされ得る設置表面積を示す。この場合、設置面積は、メーカの推奨する培地の高さである１．６ｃｍで１行目の容積を含有する場合のＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグに関して示される。４行目は設置面積の差異を示す。例えば、試験装置が１０３．４ｍｌの培地を含む場合、メーカの推奨に従って操作された場合のＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグの設置面積は６４．６ｃｍ２となり得るが、試験装置の設置面積はわずか５．１ｃｍ２で済む。そのため、培地を２０．３９ｃｍの高さに存在させた試験装置は、ほぼ同一の量のＭａｂを産生するためにＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグに必要な設置面積の８％の設置面積が必要なだけで済んだ。
【０１３６】
【表３】
2014236753.tif 000005
従来の構成の全てに関連する非常に多くの有益性がある。扱いにくい形状の従来の細胞培養用バッグを除外し、インキュベータ用空間のより効率的な使用、より容易な培地の搬入と除去、及び混入危険性の減少に関連した多種多様な有益性を生じることができる。気体透過性カートリッジに存在する少容積の培地は、カートリッジを高くし、培地容積の許容積に対する気体透過性膜の割合を減らすことにより大幅に増加され得る。それは、スケールアップの際にほとんど構成部品が必要とされないことを可能とする効果を有する。従来の気体透過性のペトリ皿及びマルチウェルプレートのフォーマットに関して、装置の設置面積、又は必要とされる装置の数を増やすことなく、より多くの細胞が１つのユニット当たりで存在し得る。また、栄養供給の頻度を低減させ得る。蒸発の影響を最小限にすることは全ての構成で成し遂げられ得る。なぜなら、培地容積に対する気体透過性表面積の割合が大幅に低減され得るからである。
【実施例２】
【０１３７】
気体透過性シリコーンの厚さが細胞増殖に及ぼす影響
米国特許第５，６８６，３０４号及び米国特許出願第１０／１８３１３２号によって記載されたような従来の見識、及びシリコーンを使用する市販の気体透過性製品のデザインは、約０．０１３ｃｍ（０．００５インチ）を超える厚さのシリコーンが使用されるべきではないことを指示している。しかし、厚さを増大することは製造面及び製品の信頼性の点で利点がある。したがって、下方シリコーン気体透過性物質の厚さが細胞増殖に及ぼす影響を査定するために評価を行った。従来の見識の物質の厚さを、厚さを増大させた同一の材料と比較した。
【０１３８】
筒状の試験装置を図１６に示されるように構成した。壁をＵｌｔｅｍ１０００（高温ポリカーボネート）円筒型ストックの中から機械加工し、内径約２．５４０ｃｍ（１．００インチ）及び外径約３．８１０ｃｍ（１．５０インチ）の筒が得られた。下方気体透過性物質の４つのはっきり異なる厚さの構成物を、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグから除去されたシリコーンのシートから作製した。下方気体透過性物質３０Ａを２重、３重、及び４重の層に製造したが、それは、面の周りに均等に分布されたＵＶ硬化シリコーングルーを用いてシリコーンシートを接着し、シート間に空気の隙間を残さずに積層することにより形成した。硬化後、積層シート及び単一シート対照物を機械加工された筒の底部に液密的に固定し、細胞をその上に存在させる５．０７ｃｍ２の生育面積を得た。試験を３回行った。下方気体透過性物質３０Ａを、実施例１で説明したように構成された下方気体透過性物質サポート８０により水平位置に保たせた。試験によって、培地が細胞上２０．４ｃｍの高さに存在した場合の結果を比較した。培地は１０％のＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳを添加したＨｙｃｌｏｎｅＨｙＱＳＦＭ４ＭＡｂ−Ｕｔｉｌｉｔｙで構成された。マウスハイブリドーマ細胞を、下方気体透過性物質１ｃｍ２当たり４．３×１０６個の生細胞の播種密度で播種した。周囲条件を５％ＣＯ２、９５％Ｒ．Ｈ．、及び３７Ｃとした。周期的に細胞を計数し、グルコースの測定値を取った。表４はその結果を示す。
【０１３９】
【表４】
2014236753.tif 000006
従来の見識を代表する単一の約０．０１１ｃｍ（０．００４５インチ）厚のシートに関して収集したデータに対してデータを参照することによりデータを正規化した。厚さを劇的に増加させる効果が細胞増殖を支援する能力において著しく負の影響とはならないことがはっきりと分かる。物質の厚さを約４倍、すなわち約０．０１１ｃｍ（０．００４５インチ）から約０．０４１ｃｍ（０．０１６インチ）に増加させた場合、細胞増殖における影響はなかった。シリコーン膜の厚さを５．３３倍、すなわち約０．０１１ｃｍ（０．００４５インチ）から約０．０６１ｃｍ（０．０２４インチ）に増加させた場合、生育能は１１％だけ減少した。同様に、従来の見識を超えた７．３３倍の厚さの増大は生育能を２１％だけ減少させた。モノクローナル抗体の産生のためのハイブリドーマ培養等の多くの細胞培養の用途で、７９％の生存度が一般に認められている。例えば、ＣＥＬＬｉｎｅ（商標）製品では、操作説明書に記載されているように、ハイブリドーマ生存度は通常５０％である。そのため、装置のデザインは、劇的に性能を低下させることなくより厚いシリコーンの壁を収納し得る。単純化された液体注入成形又はより低いピンホール電位(potential) 等の組み立て及び機能の改善は、厚さの増加による結果であり得る。要約すれば、以前まで可能であると思われていたものよりも厚い壁を備えた高い機能性を有する細胞培養装置の設計が可能である。
【実施例３】
【０１４０】
回転型及び非回転型装置での高い液体の高さでの細胞の培養能
従来の見識とは異なる様式で気体透過性細胞培養装置を構成することにより得られる利点を査定するために評価を行った。２つの一般的なフォーマット、すなわち、１）非回転型気体透過性装置、及び２）回転型気体透過性装置を評価した。非回転型気体透過性装置の構成では、培地の高さは、従来の見識によって課された制限をかなり超えていた。培地容積に対する気体透過性表面積の割合は従来の見識のものよりもかなり低く減少した。回転型気体透過性装置の構成では、最新型の気体透過性回転型ボトルのものよりも、培地を気体透過性壁からさらに離れて存在させ、より多くの培地を１つの装置当たりに存在させた。
【０１４１】
モノクローナル抗体は通常、細胞培養用バッグ及び回転ボトルを利用して産生される。従来の８５０ｃｍ２のローラボトルは対照物としての機能を果たした。試験装置を図４に示される実施形態に従って構成し、従来の８５０ｃｍ２のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ローラボトルと同一の寸法を有するように寸法を構成した。気体透過性物質は、米国特許第５，６８６，３０４号でさらに規定されたようなＳｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグのものと同一であった。非回転型試験装置の気体透過性表面積は装置の底部面の面積に限定され、９８ｃｍ２であった。側壁は気体透過性ではなかった。回転型試験装置の気体透過性表面積は、装置の円筒の側壁面全体の面積に限定され、８５０ｃｍ２であり、その端部は気体透過性ではなかった。培地は、２．５％のＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳを添加したＨｙｃｌｏｎｅＳＦＭ４ＭＡｂで構成された。各試験装置に、使用される培地１ｍｌ当たり細胞
密度０．０４×１０６個のマウスハイブリドーマ細胞を播種した。試験装置それぞれに２，０５０ｍｌの培地を入れた。周囲条件を５％ＣＯ２、９５％Ｒ．Ｈ．、及び３７Ｃとした。
【０１４２】
従来のローラボトルに、ローラボトルでの使用に推奨される最大量の培地である２５５ｍｌの培地を入れた。抗体の存在をＥＬＩＳＡで確かめた。表５はその結果を示す。
【０１４３】
【表５】
2014236753.tif 000007
表５は、従来のローラボトル対照物と同一容積の空間を占める回転型及び非回転型気体透過性試験装置が、如何に約９倍多くの抗体を産生することができるかを示す。表５はまた、如何に回転型気体透過性フォーマットを使用して、静置型気体透過性対応物に比べて抗体を産生するのに必要な時間の総計を減らすことができるのかを示す。２０％の時間削減（３日）が達成された。重要なことに、回転型及び非回転型フォーマットは空間面で効率的な配置で少なくとも９倍の改善を生み出すことができ、従来のローラボトルと比較して、滅菌、出荷、保管、労力、インキュベータ用空間、及び廃棄の費用の削減をもたらす。
【０１４４】
この結果はまた、従来の見識からかけ離れた様式で気体透過性装置を構成することにより得られる利点を明らかに示す。非回転型試験装置における培地の高さは約２０．９ｃｍであり、従来の細胞培養用バッグの推奨された最高高さを１０倍超えた高さであった。装置が２．０ｃｍの培地の高さに組み立てられた場合、等量の培地を収容するために、非回転型試験装置の設置面積の１０倍を超える１，０２５ｃｍ２の設置面積が必要であったであろう。
【０１４５】
回転型気体透過性装置の配置の有益性は大変多い。回転型試験装置は従来のローラボトル（２５５ｍｌ）で推奨される培地の最大容積の８倍近い培地の容積、シンセコン社からのＲｏｔａｒｙＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＳｙｓｔｅｍ（商標）の４倍を超える培地容積、ＭｉｎｉＰＥＲＭの５倍近い培地容積、及びスポウドリィング(Spaudling) 、シュワルツ(Schwarz) 及びウルフ( Wolf)他、及びファルケンブルク(Falkenberg)他の特許提案で可
能とされたよりもかなり多くの培地容積を収容した。また、培地は、スポルディング、シュワルツ及びウルフ他の特許提案で特定された限度の２倍を超えた、試験装置の気体透過性壁の任意の部分から最大５．６ｃｍに存在した。回転させるための特別な機器をいずれも必要とする、市販のシンセコン(Synthecon) 社（商標）からのＲｏｔａｒｙＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍ（商標）、及びザルトリウスグループのビバサイエンス社からのｍｉｎｉＰＥＲＭ（商標）とは異なり、回転型試験装置は標準的なローララック上で機能することができた。そのため、回転型気体透過性装置のスケールアップ効率は他の装置及び手法よりも
はるかに優れる。
【実施例４】
【０１４６】
気体／液体界面の非存在下での接着細胞の培養能
気体透過性壁を介して生じる気体交換を可能とすることにより、気体／液体界面が存在しない場合の接着細胞の培養能を査定するために評価を行った。試験装置を図１７に示されるような様式で構成した。この装置は気体／液体界面により気体が移動する可能性を排除した。気体透過性壁試験装置１２は、長方形の液体密封外枠２４１から成り、１つの気体透過性壁２００Ａ及び５つの非気体透過性壁２１０で構成された。気体透過性壁２００Ａはシリコーン膜から成り、およそ０．００４５の厚さであり、メドトロニック社（ミネアポリス）から購入した。この膜はメドトロニック社で、Ｓｉ−Ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）バッグを製造するために使用される。液体搬入口２２０及び液体除去口２３０は、播種及び栄養供給を可能とする。対照Ｆａｌｃｏｎ（商標）Ｔ−１７５組織培養フラスコに相当する接着面を設けるために、底部接着スカフォールド２４０は、Ｆａｌｃｏｎ組織培養フラスコから除去されたプラスチックの断片で構成された。外枠２４１の内寸法は深さ６ｃｍ、幅１０ｃｍ、及び高さ０．６３５ｃｍであった。そのため、気体透過性壁２００Ａは幅１０ｃｍ及び高さ０．６３５ｃｍであり、６．３５ｃｍ２の表面積を生じた。底部接着スカフォールド２４０は幅１０ｃｍ及び深さ６ｃｍであり、６０ｃｍ２の接着面を可能とした。気体透過性壁試験装置１２を、播種中、培地で全体的に満たし、それにより全ての気体／液体界面が排除された。そのため、気体交換は気体透過性壁２００Ａに対しての垂直方向への拡散によって生じるだけとなり得る。６０，０００個のＢＨＫ生細胞（９８％の生存度）から成る種物を、１０％のＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳ及び１％のＬ−グルタミンを添加した３８．１ｍｌのＥＭＥＭ培地に懸濁させた。そのため、播種密度は、利用可能な接着スカフォールド２４０領域１ｃｍ２当たり生細胞１０，０００個であった。培地の容積に対する気体透過性膜の表面積は０．１６７ｃｍ２／ｍｌであった。接着スカフォールドの表面積に対する気体透過性膜の表面積は０．１０６ｃｍ２／ｃｍ２であった。対照Ｔ−１７５組織培養フラスコに同じ播種密度及び生存度で同一の細胞を播種した。気体透過性壁試験装置１２及びＴ−１７５対照を５％ＣＯ２、９５％Ｒ．Ｈ．、及び３７℃の標準的な細胞培養用インキュベータに配置した。
【０１４７】
細胞は底部接着スカフォールド２４０及び対照Ｔ−１７５フラスコ上に重力により沈降し、集密に達するまでその培養物を維持した。試験装置及び対照物の両方が接着スカフォールド全体にわたって集密な単層を示した。視覚的な顕微比較により、気体透過性試験装置１２及びＴ−１７５対照フラスコの両方の細胞密度はほぼ一致して現れた。Ｔ−１７５フラスコをトリプシン処理し、細胞を計数すると、細胞は１ｃｍ２当たりおよそ１９０，０００個の細胞の密度に達していることが確認された。試験装置をライトギムザ染色し、底部接着スカフォールド２４０全体にわたって細胞分布を確認した。図２０は、分布パターンを示し、ここで「前」は気体透過性壁２００に近接しており、「中間」は気体透過性壁２００と反対の非気体透過性壁２１０の間のほぼ中間であり、且つ「後」は反対の非気体透過性壁２１０に近接している。
【０１４８】
図２０は、装置の壁が気体透過性である場合、細胞が気体／液体界面、機械混合、又は潅流の非存在下でスカフォールド上で集密に増殖し得ることをはっきりと示す。そのため、壁による気体移動は、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１、及び図１４Ａ〜図１４Ｅに示される装置を含む本明細書中に記載されるタイプの細胞培養装置が十分に機能するために適切である。実施例４はまた、気体透過性細胞培養装置の壁のうちのただ１つが気体透過性物質から成っていればよいことを示しており、よって豊富な装置設計の選択肢が見えてくる。例えば、気体透過性装置は、１つの側壁を気体透過性にすることにより従来のＴ−フラスコフォーマットに構築されてもよい。この様式では、気体／液体界面が必要とされないので、より多くの培地が培養に利用され得るか又は装置のプロファイル
が低減され得る。
【実施例５】
【０１４９】
気体／液体界面の非存在下における、複数の接着スカフォールド上での細胞の培養能
気体／液体界面が存在することなく複数のスカフォールド上に接着細胞を培養する能力を査定するために、評価を行った。気体交換は気体透過性装置の壁を介して行われた。気体透過性試験装置は、気体／液体界面による気体移動の可能性を排除した図１８に示したような様式で構成された。マルチスカフォールド試験装置１４は、１つの気体透過性壁２００Ｂ及び５つの非気体透過性壁２１０Ａで構成された長方形の液体密封外枠で構成された。気体透過性壁２００Ｂは、０．０１５厚の成形シリコーン物質で構成された。液体搬入口２２０Ａ及び液体除去口２３０Ａは播種及び栄養供給を可能とする。接着スカフォールド２４０Ａは、ＮＵＮＣ（商標）ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ細胞培養装置から除去されたプラスチックで構成された。マルチスカフォールド試験装置１４の内寸法は長さ１５．２４ｃｍ、幅７．６２ｃｍ、及び高さ２．５４ｃｍであった。そのため、気体透過性壁２００Ｂは幅７．６２ｃｍ、及び高さ２．５４ｃｍであり、１９．３５ｃｍ２の気体透過性物質表面積を生じた。各接着スカフォールド２４０Ａは幅６．６ｃｍ、及び長さ１５．０３ｃｍであり、１つの接着スカフォールド２４０Ａ当たり９９ｃｍ２の接着表面積を生じた。
【０１５０】
マルチスカフォールド試験装置１４の１つの試験群では、４つの接着スカフォールド２４０Ａが、これらのスカフォールドのそれぞれの間の間隙を５．０８ｍｍとして上下に垂直に配置され、その結果、総接着表面積が１つの装置当たり３９６ｃｍ２となった。このバージョンのマルチスカフォールド試験装置１４内の培地の容積は、１９５ｍｌであった。培地の容積に対する気体透過性膜の表面積は、０．０９９ｃｍ２／ｍｌであった。接着スカフォールド２４０Ａの総表面積に対する気体透過性膜の表面積は、０．０４９ｃｍ２／ｃｍ２であった。
【０１５１】
マルチスカフォールド試験装置１４の別の試験群では、５つの接着スカフォールドが、これらのスカフォールドのそれぞれの間の間隙を２．５４ｍｍとして上下に垂直に配置され、その結果、総接着表面積が１つの装置当たり４９５ｃｍ２となった。各マルチスカフォールド試験装置内の培地の容積は、１７０ｍｌであった。培地の容積に対する気体透過性膜の表面積は、０．１１４ｃｍ２／ｍｌであった。接着スカフォールド２４０Ａの総表面積に対する気体透過性膜の表面積は、０．０３９ｃｍ２／ｃｍ２であった。
【０１５２】
マルチスカフォールド気体透過性試験装置１４を、播種中、培地で全体的に満たし、それによりいかなる気体／液体界面をも排除した。そのため、気体交換は気体透過性壁に対して垂直方向に拡散することでのみ生じ得る。播種密度は、利用可能な接着スカフォールド領域１ｃｍ２当たり１５，０００個のＢＨＫ生細胞であった。培地は、１０％のＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳ及び１％のＧｉｂｃｏＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎＳｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎを添加したＧｉｂｃｏＧＭＥＭで構成された。また、対照Ｔ−１７５組織培養フラスコに、同じ播種密度及び生存度で、ＢＨＫ細胞を３０ｍｌの同一の培地組成中に播種した。マルチスカフォールド気体透過性試験装置１４及びＴ−１７５対照物を５％ＣＯ２、９５％Ｒ．Ｈ．、及び３７℃の標準的な細胞培養インキュベータに配置した。
【０１５３】
細胞は各接着スカフォールド２４０Ａ及び対照Ｔ−１７５フラスコ上に重力により沈降し、集密に達するまでその培養物を維持した。４日以内に培養を終結させた。接着スカフォールド２４０Ａ全てをマルチスカフォールド気体透過性試験装置１４から除去した。視覚的な顕微比較により、マルチスカフォールド気体透過性試験装置１４及びＴ−１７５対照フラスコの両方の試験群の細胞密度がほぼ一致して現れ、およそ９５％の集密性であった。
【０１５４】
このことは、培養装置内に気体ヘッドスペースを維持する必要性を排除することにより、空間をさらにより効率的に使用する能力を示す。装置が培養を支援するのに必要とされる培地のみを保持するため、装置のプロファイルが著しく低減され得る。この新規装置は従来のＴ−フラスコ、ＮＵＮＣ（商標）ＣｅｌｌＦａｃｔｏｒｙ、及びＣｏｒｎｉｎｇＣｅｌｌＳｔａｃｋ（商標）よりもさらによりコンパクトである。このことは、滅菌、出荷、保管、及び廃棄費用の節約をもたらす。さらに、インキュベータ用空間、及びフローフード用の空間がより効率的に使用される。
【実施例６】
【０１５５】
垂直位置において播種された接着細胞培養に関する気体透過性非回転型細胞培養装置
従来のフラスコに比べ、細胞を培養するために１つを超えるスカフォールドを備えて構成された非回転型気体透過性細胞培養装置の性能を評価するために試験装置を構成した。図１９Ａは、気体透過性試験装置２６０の断面図を示す。スカフォールド１２０Ｈを垂直に配置し、一貫した間隙をスペーサ１３５Ｂにより各スカフォールド１２０Ｈ間で維持した。壁４０Ｊは気体透過性であり、メドトロニック社（ミネアポリス）から購入したシリコーンから成り、およそ０．００４５の厚さであった。縫合部（suture）２７０は気体透過性壁４０に力を加え、バルクヘッドガスケット２８０に気体透過性壁４０を押し付け、気体透過性壁４０と、上方のバルクヘッド２９０及び下方のバルクヘッド３００との間に液体密封シールを作製した。培地出入口６０Ｂは、気体透過性試験装置２６０に対する液体の搬入及び除去を可能にした。蓋７０Ｃは混入を防ぎ、操作中は密栓されていた。図１９Ｂはスカフォールド１２０Ｈの斜視図を示す。このスカフォールドは組織培養処理されたポリスチレンから作られ、約０．１０２ｃｍ（０．０４０インチ）の厚さであった。直径約１．９０５ｃｍ（０．７５インチ）のピペット出入開口部１２５Ａはピペットの出入を可能とし、スカフォールド１２０Ｈ間で気体がトラップされるのを防いだ。４つのベントスロット１９０は、トラップされた気体が出るためのさらなる領域を可能とし、気体／液体界面がすべて除去されるのを確実にした。各スカフォールド１２０Ｈの片面当たりの表面積は約８６ｃｍ２であった。気体透過性試験装置２６０の内径は約１１．１７６ｃｍ（４．４インチ）であり、下方バルクヘッド３００の内側面から上方（上部）バルクヘッド２９０の内側面へ測定した場合の内高は約５．７１５ｃｍ（２．２５インチ）であった。そのため、気体透過性物質の表面積は５６１ｃｍ２であった。８つのスカフォールド１２０Ｈは、スペーサ１３５Ｂを用いて垂直に積層され、スカフォールドそれぞれの間の間隙を約０．６３５ｃｍ（０．２５インチ）に維持した。８つのスカフォールド１２０Ｈの上面の表面積を合わせると、６９５ｃｍ２であった。気体透過性試験装置２６０の内容積はおよそ５００ｍｌであった。したがって、培地容積に対する気体透過性物質の割合は５６１ｃｍ２／５００ｍｌ、すなわち１．１２ｃｍ２／ｍｌであった。
【０１５６】
１％ＧｉｂｃｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＳｏｌｕｔｉｏｎ及び１０％ＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳを添加した５００ｍｌのＧｉｂｃｏＧＭＥＭ培地に懸濁させた１０．４２５×１０６ＢＨＫ細胞を、気体透過性試験装置２６０Ｐに播種し、接着表面積１ｃｍ２当たり細胞１５，０００個の播種密度を生じた。また、対照Ｔ−１７５フラスコにも、３０ｍｌの同等培地の接着表面積１ｃｍ２当たり１５，０００個の細胞を播接した。
【０１５７】
およそ９６時間後、培養を完結させた。気体透過性試験装置２６０を分解し、スカフォールド１２０Ｈのそれぞれを顕微的に検査したところ、細胞の集密パターンが８つのスカフォールド１２０Ｈのそれぞれの上方面上に存在したことを示唆した。また、顕微的な評価により確認されたように、対照Ｔ−１７５フラスコも集密性であった。Ｔ−１７５フラスコ及び気体透過性試験装置２６０をトリプシン処理し、標準的な細胞計数技法を用いて、存在する細胞数を測定した。表６はその結果を要約する。
【０１５８】
【表６】
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表６は、細胞が気体／液体界面の非存在下にもかかわらず新規気体透過性試験装置２６０で増殖及び健全に生き残ることができたことを示す。
【０１５９】
各装置によって占められる空間の容積は注目に値する。気体透過性試験装置２６０の設置面積は１００ｃｍ２であり、ネックを含めた高さは７．６ｃｍであった。そのため、占められた空間は約７６０ｃｍ３であった。ネックを含めたＴ−１７５フラスコの設置面積はおよそ長さ２３ｃｍ×幅１１ｃｍであり、本体は高さ約３．７ｃｍであった。そのため、占められた空間は約９３６ｃｍ３であった。気体透過性試験装置２６０はＴ−１７５フラスコよりも約８．４倍多い細胞を培養したので、同一の時間で同じ量の細胞を得るには８．４個のＴ−１７５フラスコを用いることになるであろう。表７は、表６の実験結果に基づいて、気体透過性試験装置２６０により培養された同数の細胞をＴ−１７５フラスコを用いて生成した場合、占められたであろう空間の差異を示す。
【０１６０】
【表７】
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気体／液体界面を排除する利点は明らかである。１０倍を超える空間の減少が気体透過性試験装置２６０により得られる。このことは、滅菌、出荷、保管、インキュベータ用空間の使用、及び廃棄物処理の費用節約をもたらす。さらに、手で操作されることを必要とする装置の数は著しく減少し、劇的な労力及び混入危険性の低減をもたらす。
【実施例７】
【０１６１】
垂直位置及び反転位置における播種された接着細胞培養に関する気体透過性非回転型細胞培養装置
図１９Ａに示される試験装置を用いて、実施例６で前に規定されたように、細胞がスカフォールドの上面及び底面の両方に接着するかどうかを確かめるために実験を行った。このことは、２段階の播種により完遂し得る。段階１では、垂直位置に配向させたまま、第１の種菌を気体透過性試験装置に配置した。細胞を２４時間かけて、スカフォールド上に重力で沈降させ、且つスカフォールドの上面に接着させた。段階２では、第２の種菌を気体透過性試験装置に配置した。気体透過性試験装置を反転させ、第２の種菌の細胞を、スカフォールド上に重力で沈降させ、且つスカフォールドの底面に接着させた。
【０１６２】
このプロセスを、１ｃｍ２当たり１５，０００個の細胞の密度でスカフォールドの露出表面に播種するのに十分なＢＨＫ細胞から成る各播種で行った。培地組成は実施例６に記載されたものと同一であった。１回目の播種と２回目の播種との間の時間間隔は２４時間とした。２回目の播種後、培養を７２時間で完結させた。装置を分解し、各スカフォールドを顕微的に査定した。細胞を各スカフォールドの上面と底面の両方の上に均一に分布させた。次に、細胞をトリプシンを用いて除去し、計数を行った。表面積１ｃｍ２当たり生細胞の平均数量は、１４４×１０５であり、９９％を超える生存度であった。
【０１６３】
このようにして、細胞を、スカフォールド１２０の上面及び底面上に接着させ、且つ増殖させることができた。したがって、新規気体透過性細胞培養装置は、従来の装置に比べて大きさをさらに低減させることが可能である。接着細胞培養に関して、あらゆる平面に細胞接着領域を有する多種多様なスカフォールドの配置が存在し得る。
【実施例８】
【０１６４】
スカフォールド間の距離を制限した、垂直位置及び反転位置にて播種された接着細胞培養のための気体透過性非回転型細胞培養装置
装置内により大きなスカフォールド領域を挿入することにより、装置の大きさをさらに低減することができるかを確かめるために試験を行った。空間さらに節減するために、各スカフォールドの上方及び下方の面を用いて細胞を培養した。実施例７の気体透過性試験をさらなるスカフォールドを用いて製造した。表面積に対する容積の割合が従来の組織培養フラスコとほぼ同じとなるようにスカフォールドの数及びスカフォールド間の距離を選択した。従来のＴ−１７５フラスコに推奨される培地容積は、約１６〜３２ｍｌと異なる（インビトロジェンライフテクノロジー（Invitrogen Life Technologies））。このことは、接着表面から約０．０９〜０．１８ｃｍのところに培地が存在することを要求する。この実施例の試験装置は２段階で播種され、細胞を各スカフォールドの上面及び下面上に存在させるようにした。したがって、空間及び労力節約の点で気体透過性細胞培養装置がもたらすことのできる価値の控えめな評価を得るために、各スカフォールド間に０．３４ｃｍの培地の高さが存在することを可能にした。この様式では、表面積に対する培地の割合は、Ｔ−１７５フラスコに対して一定に保たれた。事実上、各スカフォールド面はスカフォールド間の培地の半分を利用できた。また、そのスカフォールドに隣接したスカフォールドは、もう半分の培地を利用できた。そのため、スカフォールドの各面に利用可能な培地は、増殖表面１ｃｍ２当たり０．１７ｃｍ高さの従来の組織培養フラスコと一致した。
【０１６５】
１４個のスカフォールドを試験装置に挿入し、およそ０．３４ｃｍの等間隔で配置した。０．１７ｃｍの高さに存在する３０ｍｌの培地を有するＴ−１７５フラスコは、対照物として作用した。実施例７に詳細に記載されたように、ＢＨＫ細胞を用いた播種を２段階で行った。培地組成は、実施例６に記載されたものと同一であった。２回目の播種から７２時間後培養を終結させ、装置を分解し、各スカフォールドを上面及び下面上での細胞の分布に関して顕微的に査定した。各スカフォールドは、Ｔ−１７５フラスコのそれとほぼ同じ上面及び下面上での分布パターンを示した。表７は、新規気体透過生細胞培養装置の表面積を増大させることにより、所定の量の細胞を培養するのに必要とされる空間を従来のＴ−１７５フラスコと比較して減らす方法の例を示す。例えば、新規の気体透過性細胞培養装置が２，４３２ｃｍ２のスカフォールド表面積を含む場合、等しい表面積を提供するには１４個のＴ−１７５フラスコが必要とされるであろう。スカフォールド表面積１ｃｍ２当たり１．７ｍｍの培地が利用可能であるように意図される場合、新規気体透過生細胞培養装置により占められる空間の容積が決定され得る。表８は、この場合の、各タイプの装置により占められる空間の容積の劇的な差異を示す。
【０１６６】
【表８】
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気体透過性細胞培養装置が、従来のフラスコと同一の表面積に対する培地の割合を有するように設計される場合、空間のさらにより効率的な使用をもたらすことが分かる。同じ量の細胞が望まれる場合、気体透過性細胞培養装置が占める空間の容積はＴ−１７５フラスコが占める空間のわずか１／１６である。このことは、滅菌、出荷、保管、及び廃棄に関する費用削減にそのまま言い換えられる。
【０１６７】
本発明は、例示の目的のために示され、且つ上述される上記の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲内に含まれるそのいかなる変更又はその変形をも含むことを意図するものであると理解されるべきである。
【実施例９】
【０１６８】
垂直位置にて播種された接着細胞培養に関する気体透過性回転型細胞培養装置
図１９Ａの断面図で示されたように、且つ実施例５でさらに規定されたように、気体透過性試験装置２６０を構成し、１つを超えるスカフォールドを備えて構成される気体透過性細胞培養装置を回転させる性能を評価した。
【０１６９】
垂直な非回転位置における気体透過性試験装置２６０を用いて、１％のＧｉｂｃｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓＳｏｌｕｔｉｏｎ及び１０％のＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳを添加した、５００ｍｌのＧｉｂｃｏＧＭＥＭ培地に懸濁させた１０．４２５×１０６個のＢＨＫ細胞を、気体透過性試験装置２６０内に播種し、接着表面積１ｃｍ２当たり１５，０００個の細胞の播種密度を生じた。また、対照Ｔ−１７５フラスコにも、３０ｍｌの同等培地の接着表面積１ｃｍ２当たり１５，０００個の細胞を播種した。
【０１７０】
およそ２４時間後、気体透過性試験装置を、１ＲＰＭで回転させた標準なローララック上に配置した。回転開始の３日後、気体透過性試験装置を分解し、スカフォールドのそれぞれを顕微的に試験したところ、細胞の集密パターンが８つのスカフォールドのそれぞれの上面に存在したことを示唆した。対照Ｔ−１７５フラスコもまた、顕微的な評価により確認されたように集密であった。
【０１７１】
このことは、細胞の増殖が新規の気体透過性細胞装置を回転することにより阻害されないことを示す。そのため、回転型又は非回転型であり得る装置を作製することは、使用者のプロトコル開発により多くの選択肢を可能とする。
【０１７２】
本明細書中に記載された本発明における精神から逸脱することなく、多様な変更が本開示に対して成され得ることを当業者は認識するであろう。したがって、例示された実施形態及び記載された実施形態に対して本発明の幅を制限することは意図されない。むしろ、
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲とその均等物により解釈されるべきである。本明細書中に引用された各刊行物、特許、特許出願、及び参考文献は、ここで参照により本明細書に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
2014236753.tif 000018
【図６】
2014236753.tif 000019
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
2014236753.tif 000040
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2014236753.tif 000043
【図１９Ａ】
2014236753.tif 000044
【図１９Ｂ】
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【図２０】
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