(57)【要約】      （修正有）【課題】後不良の肺小細胞がんを検出できる検査法、予後不良の肺小細胞がんを治療する手段、及び予後不良の肺小細胞がんを治療するための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】予後不良の肺小細胞がんにlincRNAであるHOTAIR（そのcDNAは特定の配列で表される塩基配列を有する。）が高発現していることを見出した。肺小細胞がんが予後不良の肺小細胞がんであるか否かを判断するための診断方法であって、検体である肺小細胞がんにおける、lincRNAであるHOTAIRの発現量が、高いほど予後不良であるとする診断方法である。更に、HOTAIRを高発現している肺小細胞がんの増殖を抑制することのできるsiRNA。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺小細胞がん（SCLC）が予後不良の肺小細胞がんであるか否かを判断するための診断方法であって、検体である肺小細胞がん（SCLC）における、lincRNAであるHOTAIR（そのcDNAは配列番号１で表される塩基配列を有する。）の発現量を測定することから成り、HOTAIRの発現量が高いほど予後不良であるとする検査方法。
【請求項２】
更に、肺小細胞がん（SCLC）における、内部標準となる遺伝子の発現量を測定することを含み、内部標準となる遺伝子の発現量に対する、lincRNAであるHOTAIRの発現量が、高いほど予後不良であるとする請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記内部標準となる遺伝子が、β-アクチン又はGAPDHである請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
肺小細胞がん（SCLC）が予後不良の肺小細胞がんであるか否かを判断するために用いる肺小細胞がん検査診断用バイオマーカーであって、lincRNAであるHOTAIR（そのcDNAは配列番号１で表される塩基配列を有する。）から成り、lincRNAであるHOTAIRの発現量が、高いほど予後不良であるとする、予後不良肺小細胞がん検査診断用バイオマーカー。
【請求項５】
更に、内部標準となる遺伝子から発現するmRNAを含み、内部標準となる遺伝子から発現するmRNAの発現量に対する、lincRNAであるHOTAIR領域の発現量が、高いほど予後不良であるとする、請求項４に記載の予後不良肺小細胞がん検査診断用バイオマーカー。
【請求項６】
請求項４に記載の予後不良肺小細胞がん検査診断用バイオマーカーを定量するために使用するためのキットであって、lincRNAであるHOTAIRのｃＤＮＡ（配列番号１）を定量可能なように増幅するプライマー及びポリメラーゼ、及び/又は該ｃＤＮＡに対合させるプローブから成るキット。
【請求項７】
lincRNAであるHOTAIRのcDNAの塩基配列（配列番号１）の801〜819番目の塩基配列を含む配列番号１の塩基配列の連続する３０塩基以下の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド及びその相補的オリゴリボヌクレオチドから成る２本鎖ＲＮＡを有効成分として含む予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤。
【請求項８】
lincRNAであるHOTAIRのcDNAの塩基配列（配列番号１）の801〜819番目の塩基配列を含む、配列番号１の塩基配列の連続する３０塩基以下の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド及びその相補的オリゴリボヌクレオチドから成る２本鎖ＲＮＡを含む予後不良肺小細胞がん増殖抑制用キット。
【請求項９】
ヒト培養肺小細胞がん細胞を用いて、lincRNAであるHOTAIR（そのcDNAは配列番号１で表される塩基配列を有する。）の発現の阻害又は抑制について、候補薬剤をスクリーニングすることから成る、予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
ヒト培養肺小細胞がん細胞株を候補薬剤の存在下で培養し、lincRNAであるHOTAIR（そのcDNAは配列番号１で表される塩基配列を有する。）の発現の阻害又は抑制を調べることから成る請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト培養肺小細胞がん細胞株としてSBC-3細胞株を用いる請求項９又は１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺小細胞がんのうち、予後不良の肺小細胞がんを検出できる検査方法及びバイオマーカー、並びに治療手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺がんは、難治性のがんのひとつで、罹患率と死亡率は、ともに40歳代後半から増加し始め、高齢ほど高くなる。罹患数と死亡数に大きな差はなく、これは、肺がん罹患者の生存率が低いことと関連しており、有用な検査診断法と治療法の開発が求められている。
肺がんを組織学的に分類すると、小細胞がん（Small cell lung cancer：SCLC）と非小細胞がん（Non-small cell lung cancer: NSCLC）の２つに大別される。大多数を占めるNSCLCは、さらに腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がんなどの組織型に分類される。SCLCは、神経内分泌がんの組織型に分類され、肺がんの約15〜20％を占め、一般にNSCLCに比べて転移し易く、増大し易い等の特異な様相を示す。SCLCに対しては、化学療法が主に行われており、通常は手術の対象となりにくいことから、新鮮材料の入手が難しく、研究が遅れがちであるため、SCLCの検査や治療につながるバイオマーカーの探索も進んでいない。
【０００３】
近年、数多くのがん関連遺伝子が報告されているが、HOX遺伝子群の一つであるHOXCクラスターからantisenseに転写されるHOTAIRと呼ばれるRNA（以下単に「HOTAIR」という。）は、long intergenic non-coding RNA (lincRNA)と呼ばれるタンパクをコードしていない長鎖非コードRNAで、比較的最近見出されたがん関連遺伝子である。このHOX遺伝子群は、動物の体節をつくる遺伝子群であり、胎児期には体節をつくるのに寄与しているが、がんの発生や進展にも関わっている。また、HOTAIRはHOXDクラスターの遺伝子発現を制御していると考えられている。
原発性乳がん組織や転移性乳がん組織においてHOTAIRの高発現が確認され、原発性乳がん組織におけるHOTAIRの高発現が転移及び死亡の強力な予測因子として考えられている（非特許文献１、特許文献１）。これらの文献において、乳がんセルラインを用いてHOTAIRを強発現させると、PRC（Polycomb repressive complex）依存的に浸潤能や転移能を増進させ、siHOTAIRを用いると逆にこれらが抑制されることが報告されている。
また、HOTAIRは、大腸がんの予後不良や肝がんの転移に関与していることが報告されている（非特許文献２，３）。
なお、がんは臓器特性やフェノタイプ（表現型）によって発現する遺伝子やタンパク質などのバイオマーカーや薬剤感受性が異なるため、検査法や治療法はがん種ごとに検討される必要がある。乳がんの組織型は主に腺がん（浸潤性）、大腸がんは主に上皮性がんと腺がん、肝がんは主に上皮性がんであり、SCLCの組織型とは異なるため、これらの検査法や治療法はSCLCには適用することができないと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US 2012/0004278
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature. 2010 Apr 15;464(7291):1071-1076
【非特許文献２】Cancer Res. 2011 Oct 15;71(20):6320-6326.
【非特許文献３】Int Med Res. 2011;39(6):2119-2128.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肺小細胞がん(SCLC)には、予後不良のがんと予後良好のがんがある（例えば、実施例１、表１を参照のこと）。予後不良の肺小細胞がんは、発見時には既に転移、全身播種している可能性があることが指摘されている。その治療は困難であり、そのため、早期の発見と治療方法の確立が求められている。
従って、本発明は、肺小細胞がんのうち、予後不良の肺小細胞がんを検出できる検査法とそのバイオマーカーを提供することを目的とする。
更に、本発明は、予後不良の肺小細胞がんの治療剤を提供することを目的とする。
更に、本発明は、予後不良の肺小細胞がんを治療するための薬剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、予後不良の肺小細胞がんにlincRNAであるHOTAIRが高発現していることを見出した。更に、HOTAIRを高発現している肺小細胞がんの増殖を抑制することのできるsiRNAを見出した。
即ち、本発明は、肺小細胞がん（SCLC）が予後不良の肺小細胞がんであるか否かを判断するための診断方法であって、検体である肺小細胞がん（SCLC）における、lincRNAであるHOTAIRの発現量を測定することから成り、HOTAIRの発現量が高いほど予後不良であるとする検査方法である。
また、本発明は、肺小細胞がん（SCLC）が予後不良の肺小細胞がんであるか否かを判断するために用いる肺小細胞がん検査診断用バイオマーカーであって、lincRNAであるHOTAIRから成り、lincRNAであるHOTAIRの発現量が、高いほど予後不良であるとする、予後不良肺小細胞がん検査診断用バイオマーカーである。
また、本発明は、この予後不良肺小細胞がん検査診断用バイオマーカーを定量するために使用するためのキットであって、lincRNAであるHOTAIRのｃＤＮＡ（配列番号１）を定量可能なように増幅するプライマー及びポリメラーゼ、及び/又は該ｃＤＮＡに対合させるプローブから成るキットである。
【０００８】
更に、本発明は、lincRNAであるHOTAIRのcDNAの塩基配列（配列番号１）の801〜819番目の塩基配列を含む配列番号１の塩基配列の連続する３０塩基以下の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド及びその相補的オリゴリボヌクレオチドから成る２本鎖ＲＮＡを有効成分として含む予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤である。
更に、本発明は、lincRNAであるHOTAIRのcDNAの塩基配列（配列番号１）の801〜819番目の塩基配列を含む、配列番号１の塩基配列の連続する３０塩基以下の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド及びその相補的オリゴリボヌクレオチドから成る２本鎖ＲＮＡを含む予後不良肺小細胞がん増殖抑制用キットである。
更に、本発明は、ヒト培養肺小細胞がん細胞を用いて、lincRNAであるHOTAIRの発現の阻害又は抑制について、候補薬剤をスクリーニングすることから成る、予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤のスクリーニング方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】小細胞肺がん（SCLC）組織を示す写真である。図の左側のSCLC組織(cancer)は、ほぼ裸核に近く核小体が不明瞭な小型腫瘍細胞のシート状増殖の様相を示し、図の右側の正常組織(normal)は、肺胞構造が明瞭な様相を示す。点線で示す境界に沿って切り取る。
【図２】35人のSCLC患者を、SCLC組織におけるHOTAIR発現レベルに基づいて並べた図である。図中の縦軸はACTBに対するHOTAIRの発現レベルを示す。ACTBはβ-アクチンを示す。図中の横線は高HOTAIR発現グループ（n=12）と低HOTAIR発現グループ（n=23）の境界線（HOTAIR/ACTB比=1.368）を示す。
【図３】HOTAIRの発現レベルと臨床的特徴を示す図である。図中、"high-HOTAIR"はHOTAIR/ACTB比が1.368以上の高HOTAIR発現グループ、"low-HOTAIR"はHOTAIR/ACTB比が1.368未満の低HOTAIR発現グループを示す。(A) NAC(-) AC(+)-SCLC患者の肺小細胞がん（SCLC）の無再発率を示す。SCLCが再発するに従って数値（無再発率）は下がる。(B) NAC(-) AC(+)-SCLC患者の肺小細胞がん（SCLC）に対する生存率を示す。SCLCのみの理由により死亡した場合に生存していないとし、SCLC以外の理由により死亡した場合には生存したものとみなす。
【図４】(A) qRT-PCRにより調べたSCLC細胞株のHOTAIR発現レベルを示す。HOTAIRの発現量はGAPDHの発現量に対して標準化した。縦軸はGAPDHに対するHOTAIRの発現量を示す。(B) SBC-3細胞株におけるRNA干渉（#1〜#3のsiHOTAIR）によるHOTAIRの発現量の減少を示す。縦軸はGAPDHに対するHOTAIRの発現量を示す。また、siGFPはネガティブコントロールである。(C) RNA干渉によるSBC-3細胞株の増殖の抑制を示す。横軸は培養開始後の経過時間を示し、縦軸は細胞数を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の一態様は、予後不良の肺小細胞がん（SCLC）を、HOTAIRの発現レベルに基づいて判定する検査方法である。
本発明において「予後不良」とは、SCLCの手術後及び術後化学療法施行後に再発率が高いことをいう。SCLCの予後不良により死に至ることが多い。
【００１１】
HOTAIRの発現レベルを調べるために、まずSCLCの手術検体からSCLC成分を採取する。
迅速診断とその後の病理診断にて、採取した検体が、肺小細胞がんであることを確認する必要がある。診断方法としては、迅速診断だけでもよいが、迅速診断と病理診断の両方を行うことが好ましい。
迅速診断は、例えば、以下のようにして行う。凍結検体でクライオスタットを用いてスライスし、ヘマトキシリン‐エオジン染色を行うことによりSCLC成分を目視にて識別する。SCLCは、正常細胞に比べて小型でほぼ裸核に近く、核小体も不明瞭であり、シート状増殖を示すという特徴があるため、目視にておおよそ識別可能である。
病理診断は、例えば、以下のようにして行う。手術検体をホルマリンで数日間固定し、その後サンプルを切り出す。例えば、肺をCT scan画像と同様におよそ5mmの厚さでスライスして、サンプルを得る。それぞれの面における腫瘍領域と周辺の関連領域を中心に更にブロックサイズに切り分けることが好ましい。こうして作成された検体をパラフィン包埋したものを薄切し、プレパラートを作成する。これらの内、SCLC腫瘍成分を多く含む領域で神経内分泌マーカー(例えば、Chromogranin A, Synaptophysin, NCAM/CD56)の抗体を用いた免疫染色を行い、神経内分泌性を確認する。
【００１２】
上記のようにSCLCと判断した検体を、HOTAIRの発現レベルを調べるまで、例えば、次のように保存してもよい。迅速診断時に切り分けた手術検体の一部を研究用としてon iceで検体番号を付与したセラムチューブに3mm角大の組織切片として数個ずつ取り分ける。その後、液体窒素に投入し凍結して、-80℃冷凍庫に保存する。
HOTAIRの発現レベルを調べる際には、この保存しておいた検体を、例えば、次のようにして調製する。この保存検体のセラムチューブを-80℃冷凍庫より出し、チューブ内の組織片を１つ滅菌セッシで取り出し、同じ番号を付与した新たなセラムチューブ内に入れ、直ちに液体窒素に投入する。これを実験室に運び、1症例ずつクライオスタット内に予め用意していたステージの上に置き、蒸留水を検体周囲にまき、アイシングスプレーを用いて凍結させる。これを所定の場所に設置し薄切する。薄切検体はプレパラートに2つほど接着させ、直ちに固定液内（ホルマリン＋メタノール1:1溶液）へ投入する。このプレパラートをヘマトキシリン‐エオジン染色し、腫瘍領域を特定する。一方で、ステージ上の残りの検体は周囲の凍結蒸留水を可能な限り除去し再びセラムチューブにもどし、直ちに液体窒素へ投入する。その後に、組織からのRNA抽出の際にはこのプレパラートに対応する腫瘍成分をon iceで滅菌したメスで切り分け使用する。
【００１３】
本発明の検査方法は、検体である肺小細胞がん（SCLC）における、lincRNAであるHOTAIRの発現量を測定することから成り、HOTAIRの発現量が高いほど予後不良であるとするものである。
本発明で用いられる予後不良肺小細胞がん診断マーカーは、lincRNAであるHOTAIRから成る。
HOTAIRのcDNAは配列番号１で表される塩基配列から成る（NCBI Accession No.：NR_003716.2）。
【００１４】
本発明において予後不良肺小細胞がんの判定を行う場合、HOTAIRの発現量は、内部標準遺伝子の発現量に対する相対量として表すことが好ましい。
内部標準となる遺伝子としては、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（「GAPDH」ともいう。）、β-アクチン(「ACTB」ともいう。)、IPO8等が挙げられるが、組織検体を扱う場合にβ-アクチン（配列番号２、Genbank Accession No.:NM_001101.3）を、一方、細胞検体を扱う場合にはGAPDH（配列番号３、Genbank Accession No.:NM_002046.3）が好ましい。また、がん組織におけるHOTAIRを調べる場合には、内部標準としてβ-アクチン遺伝子を用い、がん細胞におけるHOTAIRを調べる場合には、内部標準としてGAPDH遺伝子を用いることが好ましい（BMC Mol Biol. 2008,9:103)。
【００１５】
従って、本発明の検査方法は、更に、肺小細胞がん（SCLC）における、内部標準となる遺伝子の発現量を測定することを含み、内部標準となる遺伝子の発現量に対する、lincRNAであるHOTAIRの発現量が、高いほど予後不良であるとしてもよい。
また、本発明の予後不良肺小細胞がん診断マーカーは、更に、内部標準となる遺伝子から発現するmRNAを含み、内部標準となる遺伝子から発現するmRNAの発現量に対する、lincRNAであるHOTAIR領域の発現量が、高いほど予後不良であるとしてもよい。
予後不良肺小細胞がんの判定を下式のＨ／Ｒ比を用いて行ってもよい。このＨ／Ｒ比が基準より高いと予後不良、基準より低いと良性と判断でき、また、このＨ／Ｒ比が基準より高いほど肺小細胞がんの再発度が高いと判定できる。基準となるＨ／Ｒ比は、本研究の症例におけるROC curveを用いた検討では、例えば、1.368であった。
Ｈ／Ｒ＝HOTAIR発現量／内部標準遺伝子発現量
【００１６】
HOTAIRと内部標準遺伝子の発現量の検出は、例えば、SYBR Green法やTaqMan法など各種方法を用いたRT-PCR法、Northern blot法、DNAチップ（アフィメトリクス社製等）など、任意の公知の遺伝子発現定量法を用いて行うことができる。
【００１７】
RT-PCR法の１つであるリアルタイム定量PCR法（RT-PCR）は微量なDNAを高感度かつ定量的に検出できるという点で好ましい。RT-PCRでは、HOTAIR(lincRNA)を逆転写してfirst strand cDNAを作成し、これを鋳型にHOTAIR cDNAに特異的なプライマーによりPCR増幅する。逆転写反応は、例えば、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社）などを用いることができる。リアルタイム定量PCR法（qRT-PCR）は、例えば、Applied Biosystems社が提供するTaqMan(登録商標) Gene Expression Assaysを利用することができる。増幅産物は、電気泳動等により分離し、定量することもできるが、Applied Biosystems社ABI PRISM 7000 Sequence Detection SystemやRoche社のLC480 systemなどのリアルタイム定量PCR機器を利用して定量することが正確かつ簡便で好ましい。
リアルタイム定量PCR以外に、様々な測定法（DNAアレイ、ノーザンブロット、ATAC-PCR法など）を用いて、HOTAIR(lincRNA)を定量することができる。
【００１８】
PCR用プライマーとしては、通常、HOTAIR cDNA（配列番号１）や内部標準となる遺伝子のポリヌクレオチドの少なくとも50塩基、好ましくは100〜1,000塩基のポリヌクレオチド部分を挟む約１０〜３０個程度の塩基配列からなる断片が用いられる。
プロ―ブとしては、通常、配列番号１の塩基配列から成るポリヌクレオチド(HOTAIR cDNA)の連続した少なくとも１５個の塩基配列からなる断片が用いられる。プロ―ブの塩基配列は通常１５〜３０塩基、好ましくは２０〜２５塩基である。
HOTAIR(lincRNA)又はそのcDNAの発現量を測定するために、DNAアレイやノーザンブロットを用いる場合には、上記プローブ、ATAC-PCR法などを用いる場合には、上記プライマー、リアルタイム定量PCR法を用いる場合には、上記プライマーと上記プローブが用いられている。
【００１９】
HOTAIRを検出する好ましい方法は、手術腫瘍組織からtotal RNAを抽出し、HOTAIRの上記プライマーを用いてqRT-PCR法で発現状況を確認する。その際、内因性コントロールとして、組織ではβ-アクチン、細胞ではGAPDHを用いることが好ましい。
HOTAIRの発現量の検出方法は、例えば、以下の工程から成る。
ａ）肺小細胞がん（SCLC）患者の手術検体から、SCLC組織を採取する工程、
ｂ）得られたSCLC組織から、RNAを抽出する工程、
ｃ）抽出されたRNAを逆転写し、cDNAを得る工程、
ｄ）得られたcDNAから少なくともHOTAIRの一部を増幅する工程、及び
ｅ）増幅された少なくともHOTAIRの一部を検出する工程
内部標準遺伝子の発現量を利用する場合には、ｄ〜ｅ工程に内部標準遺伝子の増幅及び検出する工程を含み、更に、両発現量を比較する工程を加えればよい。
【００２０】
本発明の予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤は、lincRNAであるHOTAIRのsiRNAを有効成分として含む。
このsiRNAは、配列番号１の塩基配列の801〜819番目の塩基配列を含む配列番号１の塩基配列中の連続する１９塩基を少なくとも含む、配列番号１の塩基配列の連続する３０塩基以下、好ましくは２７塩基以下、好ましくは２３塩基以下の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡである。
【００２１】
本発明で用いるRNA断片としては、標的RNAのセンス又はアンチセンスのものでもよいが、これらはRNaseで容易に分解され、また効果が劣ると考えられるため、これらから成る２本鎖RNAが好ましく用いられる。この２本鎖RNAは通常センスとアンチセンスの２本を別々に合成し、それをハイブリダイズさせて２本鎖にして用いられる。
これらの特定の塩基配列に「相当する」オリゴリボヌクレオチドとは、この遺伝子が転写されて生成するlincRNAの、特定の塩基配列に相当する部分に相補的なRNAという意味であり、具体的にはこの特定のＤＮＡ配列のＴをＵに置き換えたものという意味である。
【００２２】
本願発明のsiRNAは、ヌクレアーゼによる分解を防ぐ処理を施した修飾RNAであってもよく、例えば、2'-O-メチル化や4'-チオ化したRNAアプタマーなどであってもよい。また、抑制能を良好にするため、siRNAの3'末端にoverhang配列（例えば、dTdT、UU、UG等）を付加してもよい(EMBO J. 20: 6877-6888.）。
また予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤は、他の公知の腫瘍増殖抑制剤等との合剤であってもよい。本発明の予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤は、このような他の薬剤を含むキットの形態であってもよいし、滅菌等張塩水、防腐剤、緩衝剤などの薬学的に許容される媒体を含有してもよい。
また、siRNAをリポソームなど適当なキャリヤーに封入して投与してもよい。
また、本発明の予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤は、上記予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤を製剤化したものを希釈剤などと混合して投与するための注射用キットや、製剤化した個々の製剤を投与するための錠剤用キットなどのキットとして提供してもよい。
【００２３】
siRNAを細胞に導入する手段については、特に制限はなく、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション、ウイルスベクターを用いる方法などが挙げられるが、リポソーム等に基づく市販のトランスフェクション試薬を用いるのが簡便である。
高純度・高品質のsiRNA(siHOTAIR)を直接体内へ投与する場合や全身投与の場合などには、静脈内投与で行ってもよく、また病巣に対する直接投与の場合には、内視鏡で患部に投与するほか、手術時に病巣に接種することで行ってもよい。
【００２４】
予後不良肺小細胞がん増殖抑制剤は以下の方法によりスクリーニングすることができる。具体的には、本発明の方法は、ヒト培養肺小細胞がん細胞を準備し、この細胞株を候補薬剤の存在下で培養すること等により候補薬剤と肺小細胞がん細胞とを接触させ、lincRNAであるHOTAIRの発現の阻害又は抑制を調べて候補薬剤の一次スクリーニングを行い、その後、候補薬剤によるヒト培養肺小細胞がん細胞の増殖能及び/又は浸潤能の抑制を調べて二次スクリーニングを行う。スクリーニングに用いるSCLC細胞としては、HOTAIR RNAの発現量の高い細胞株が好ましく、このようなSCLC細胞として、例えば、SBC-3細胞株が挙げられる。SBC-3細胞は、HOTAIR RNAの発現量が高いため、予後不良肺小細胞がんのセルラインに相当すると考えられる。
この方法において、lincRNAであるHOTAIRの発現の阻害又は抑制の程度は、候補薬剤を添加しない対照との比較実験によって判定できる。発現レベルは、肺小細胞がん細胞株から得たtotal RNA又はmRNA又はポリA(+)RNAについて、又は逆転写酵素-PCR (RT-PCR)法によってRNAから合成されたcDNAについて、蛍光又は放射性標識したプローブを用いるハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、DNAマイクロアレイ、組織マイクロアレイなど）によって決定することができる。
RT-PCR、PCR用プライマー、プロ―ブとしては上記のものを使用できる。
このスクリーニングにおいて、HOTAIRの発現が、候補薬剤無添加の対照と比べて、有意に阻害又は抑制され、さらに、肺小細胞がん細胞の増殖能、浸潤能が抑制された場合に、この候補薬剤を肺小細胞がん転移抑制剤とすることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
この実施例で用いた臨床検体を以下のように調整した。
1995年と2010年の間にがん研究会のがん研究所病院で手術を受けた複数のSCLC患者から、手術前に書面によるインフォームドコンセントを得た上で、35のSCLC組織サンプルを得た。また同じ患者から、16の非がん組織サンプルを得た。すべての検体を直ちに液体窒素中で凍結し、-80℃で保存し、RNA抽出を行った。
SCLC組織サンプルの採取は以下のようにして行った。迅速診断のために提出された肺がん組織を含む肺組織を用いて、がん部及び非がん部（がん部より充分に離れた領域）を切除し（図１）、氷上でセラムチューブに入れ、ただちに液体窒素に投入、凍結した。その後の病理診断においてSCLCと診断した症例の迅速診断時保存組織切片を用いて以下の検討を行った。なお、RNA抽出前に、すべての迅速診断時保存組織切片を、クライオスタットで再度スライスし、ヘマトキシリン‐エオジン染色を行っておき、後でSCLC成分が含まれることを確認した。
【００２６】
患者の背景や臨床病理学的因子を表１に示す。
SCLCの再発は、術後経過観察中（術後最長で約15年）の再発精査にて肺および他臓器に新たな病変を認めたものをいい、レトロスペクティブに診療録や画像を検索した。表中、再発した転移先を記載したが、複数に転移したものを含む。
生存又は死亡については、診療録やがん研有明病院病歴室の後追い調査結果（術後最長で約15年）を用いて追跡調査したものを示す。
【００２７】
また、手術中に迅速診断のために病理部へ検体が提出された時点で、採取、保存しておいた上記の35のSCLCサンプルから、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いてHOTAIR発現レベルを調べた。qRT-PCRは以下のようにして行った。
RNeasyミニキット又はRNeasyミニキットプラス（Qiagen社）を用いて、組織及び細胞からtotal RNAを抽出した。High Capacity RNA-to-cDNA(R) kit (AB社製、カタログ番号4387406)を用いて、30ngの全RNAからcDNAを生成した。得られたcDNAを45サイクルのPCR増幅を行った後、LightCycler(登録商標)480 SYBR Green I Master protocol (Roche社, カタログ番号4707516)と、下記プライマーを用いてリアルタイムPCR反応を行い、各遺伝子の発現量を調べた。LightCycler(登録商標)480 real time PCR System (Roche社)上の96ウェルプレートの各サンプルの各遺伝子についてそれぞれ３回試験を行った。組織試料及び異種移植片についてHOTAIR RNAの発現量をβ-アクチン(ACTB)の発現量に対して標準化した。
プライマー：
HOTAIR（F）：5'-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3' （配列番号４）
HOTAIR（R）：5'-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3' （配列番号５）
ACTB（F）：5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3' （配列番号６）
ACTB（R）：5'-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3' （配列番号７）
【００２８】
上記のように、定量RT-PCRを用いて、各新鮮凍結サンプルからRNAを評価した。同じ被験者群の35のSCLC組織と15の非がん組織におけるHOTAIR/ACTB比を調べた。HOTAIR/ACTB比が1.368より上のレベルを高HOTAIR発現とした。この基準によれば、SCLC患者35人のうち12人はHOTAIRの発現が高いと分類され、23人は低いと分類された。
これら２つのグループの臨床病理学的因子を表１に示す。高HOTAIR発現グループは、低HOTAIR発現グループよりも、より多くの再発と死亡を示した。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
実施例２
上記35のSCLCサンプルのうち、病理診断で他の組織型を含まない純粋なSCLC(pure-SCLC)と診断された症例に限定し、且つ、腫瘍の縮小効果を狙って行われる化学療法（Neo-adjuvant chemotherapy (NAC):ネオアジュバント化学療法）の影響を排除するために、手術前にこの化学療法を行っておらず、手術で腫瘍を取り除いた後に補助療法としての術後化学療法（Adjuvant chemotherapy(AC):アジュバント化学療法）を行った患者（NAC(-)AC(+)-SCLC）の18のサンプルについて、高HOTAIR発現グループ(n=8)と低HOTAIR発現グループ(n=10)に分けて、SCLCに起因する患者の死亡及びSCLCの再発について調べた。結果を図３Ａ及びＢに示す。
高HOTAIRグループは、低HOTAIRグループよりも、SCLCの再発が顕著に高く（図３Ａ）、SCLCに起因する患者の死亡も顕著に高い（図３Ｂ）。
【００３１】
実施例３
この実施例で用いた細胞株を以下のように調整した。
SCLC細胞株COLO-668、COR-L51、COR-L88、DMS-79はECACC（The European Collection of Cell Cultures）から得た。SCLC細胞株DMS-53、LU-134A、MS-1、SBC-3、SBC-5、SBC-1、A549とMRC-5は、JCRB（Japanese Collection of Research Bio-resources）又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）から得た。これらの細胞株を、37℃、5％CO2インキュベーター中で、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、ナカライテスク社 カタログ番号08488-55、500ml）で培養した。このダルベッコ改変イーグル培地は、200mMのL-アラニル-L-グルタミン溶液（ナカライテスク社 カタログ番号04260-64）5.0 ml、抗生物質抗真菌混合ストック溶液（ナカライテスク社 カタログ番号02892-54）5.5 ml、及びウシ胎児血清（Biowest社 カタログ番号S1560）50mlを含む。
【００３２】
実施例１と同様に、これら細胞株におけるHOTAIR発現レベルを調べた。HOTAIRの発現量をGAPDHの発現量に対して標準化した。GAPDH用プライマーとして下記のプライマーを用いた。結果を図４Ａに示す。
GAPDH（F）：5'-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3' （配列番号８）
GAPDH（R）：5'-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3' （配列番号９）
【００３３】
HOTAIRの発現量が高かったSBC-3細胞株について、HOTAIRのRNA干渉実験を以下のように行った。LipofectamineTM RNAiMAX（Invitrogen社製、カタログ番号13778-075）を使用して、製造元の指示に従って、細胞に、HOTAIRを標的とする20nMのsiRNAを導入した。この導入の効率は、標識ポジティブコントロール（BLOCK-ITTMのAlexa Fluor(R)赤色蛍光オリゴ（Invitrogen社製、カタログ番号14750-100））を導入後、細胞を5％CO2を含む加湿環境下で37℃で72時間インキュベーションした後、蛍光顕微鏡（ライカDMIRE2）を用いて評価した。その結果、siRNAを20nM（最終濃度）及びLipofectamine RNAiMAXを1.5μlを用いたが、これはSBC-3を24ウェルベースで分析するために最適な条件と考えられる（形質導入効率：100％、ノックダウン効率：50％）。この条件でSBC-3に＃1-3 siHOTAIR（下記）を導入し、72時間後に、このsiRNAを導入された細胞からto-tal RNAを抽出して、定量RT-PCR解析を行った。比較のため、ネガティブコントロールであるGFP遺伝子について同様にRNA干渉を行った。定量RT-PCRは実施例１と同様にして行った。
#1 siHOTAIR：
センス：5'-GAACGGGAGUACAGAGAGAUU-3'、（配列番号１０、配列番号１の801〜819番目に相当する。）
アンチセンス：3'-UUCUUGCCCUCAUGUCUCUCU-5'
#2 siHOTAIR：
センス：5'-CCACAUGAACGCCCAGAGAUU-3'（配列番号１１、配列番号１の840〜858番目に相当する。）
アンチセンス：3'-UUGGUGUACUUGCGGGUCUCU-5'
#3 siHOTAIR：
センス：5'-UAACAAGACCAGAGAGCUGUU-3'（配列番号１２、配列番号１の1005〜1023番目に相当する。）
アンチセンス：3'-UUAUUGUUCUGGUCUCUCGAC-5'
siGFP：
センス：5'-CUACAACAGCCACAACGUCdTdT-3' （配列番号１３）
アンチセンス：3'-TTGAUGUUGUCGGUGUUGCAG-5 '
【００３４】
HOTAIR RNAの発現量を図４Ｂに示す。＃1-3 siHOTAIR導入により、HOTAIR RNAの発現量が減少したことが分かる。
更に、＃1-3 siHOTAIR（下記）を導入後のSBC-3細胞株を37℃、5％CO2インキュベーター中で、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、ナカライテスクカタログ番号08488-55、500ml）で培養した。このダルベッコ改変イーグル培地は、200mMのL-アラニル-L-グルタミン溶液（ナカライテスク カタログ番号04260-64）5.0 ml及びウシ胎児血清（Biowest社 カタログ番号S1560）50mlを含む。培養開始後、0,24,48,72,96時間後のそれぞれの時点における細胞数を自動セルカウンター（BioRad社、TC-10）でカウントした。結果を図４Ｃに示す。#1 siHOTAIRの導入により、SBC-3細胞株の増殖が抑制されたことが分かる。
【図２】
2014003925.tif 000003
【図３Ａ】
2014003925.tif 000004
【図３Ｂ】
2014003925.tif 000005
【図４Ａ】
2014003925.tif 000006
【図４Ｂ】
2014003925.tif 000007
【図４Ｃ】
2014003925.tif 000008
【図１】
2014003925.tif 000009
【配列表】
2014003925000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月28日(2012.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
上記のように、定量RT-PCRを用いて、各新鮮凍結サンプルからRNAを評価した。同じ被験者群の35のSCLC組織と15の非がん組織におけるHOTAIR/ACTB比を調べた（図２）。HOTAIR/ACTB比が1.368より上のレベルを高HOTAIR発現とした。この基準によれば、SCLC患者35人のうち12人はHOTAIRの発現が高いと分類され、23人は低いと分類された。
これら２つのグループの臨床病理学的因子を表１に示す。高HOTAIR発現グループは、低HOTAIR発現グループよりも、より多くの再発と死亡を示した。
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月29日(2012.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
RT-PCR法の１つであるリアルタイム定量PCR法（qRT-PCR）は微量なDNAを高感度かつ定量的に検出できるという点で好ましい。RT-PCRでは、HOTAIR(lincRNA)を逆転写してfirst strand cDNAを作成し、これを鋳型にHOTAIR cDNAに特異的なプライマーによりPCR増幅する。逆転写反応は、例えば、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems社）などを用いることができる。リアルタイム定量PCR法（qRT-PCR）は、例えば、Applied Biosystems社が提供するTaqMan(登録商標) Gene Expression Assaysを利用することができる。増幅産物は、電気泳動等により分離し、定量することもできるが、Applied Biosystems社ABI PRISM 7000 Sequence Detection SystemやRoche社のLC480 systemなどのリアルタイム定量PCR機器を利用して定量することが正確かつ簡便で好ましい。
リアルタイム定量PCR以外に、様々な測定法（DNAアレイ、ノーザンブロット、ATAC-PCR法など）を用いて、HOTAIR(lincRNA)を定量することができる。