(57)【要約】【課題】アナフィラキシーにおけるS1P2の作用とその機構を解明し、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】アナフィラキシーにおけるS1P2の作用機構を解明し、従来の知見とはまったく異なる、「S1P2は、Akt阻害を介したアナフィラキシーでのECにおけるeNOS及びNO生成の刺激を抑制すること、S1P2はこの作用により血管内皮関門障害を防御してアナフィラキシーによる異常を大幅に軽減すること、並びに、S1P2遺伝子を欠損させた非ヒトノックアウト動物は、アナフィラキシーに過敏に反応すること」を見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同染色体上でS1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失しており、脈管形成及び／又は血管新生に関連した疾患又は症状を呈する非ヒトノックアウト動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞を用いて血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
S1P2遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、S1P2遺伝子の破壊又は変異によるものである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
脈管形成及び／又は血管新生に関連した疾患又は症状が、アナフィラキシー、加齢黄斑変性症、血管透過性亢進型肺障害、糖尿病網膜症、腫瘍血管新生、大動脈瘤、動脈硬化、浮腫、血管内膜肥厚、血管閉塞、血管炎又は虚血後血管新生、である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
非ヒトノックアウト動物がホモノックアウト動物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
下記の工程を含む：
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞におけるマーカーを調べ、被験物質を投与しない動物におけるマーカー又はマーカーの基準値と比較する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を治療することができる、発現させなくする、又はその発現を遅らせることができる被験物質を選択する工程、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記被験物質を投与する前後に、血管内皮関門障害に関連した因子を前記動物に投与する工程を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記マーカーは、以下のいずれか１から選ばれる請求項１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（１）eNOSのリン酸化
（２）NO濃度
（３）Aktのリン酸化
（４）cGMPレベル
（５）β-カテニンのS-ニトロシル化
（６）ヘマトクリット値
（７）血管透過性
（８）生存率
（９）体温
（１０）血圧
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物並びに該動物から単離した組織又は細胞を用いた血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
（スフィンゴシン-1-リン酸）
スフィンゴシン-1-リン酸（S1P）は、血管機能、免疫機能の重要な調節因子として認識されている。S1Pは、様々な細胞中のスフィンゴシンキナーゼ（Sphk）-1及び2によって合成される。約10-6M濃度の血漿S1Pは、赤血球、血管内皮細胞（EC）等由来である。S1Pの生物学的活性の大部分は、S1P-特異的Gタンパク質共役受容体ファミリーS1P1〜S1P5によって仲介される。これらのファミリーの内、S1P1、S1P2及びS1P3は、広く主要な受容体サブタイプとして知られている。培養中EC のS1P1及びS1P3のレベルは容易に検出することができる。一方、S1P2のレベルは、非常に低い又は検出不可能である。
しかしながら、本発明者らは、「S1pr2（S1P2と同義）遺伝子座を欠失したLacZ-knockinマウスの様々な器官のECにおいては、S1P2が発現していること」を発見している（非特許文献１）。S1P1及びS1P2は、それぞれ、Gi及びG12/13の特異的カップリングを介して、遊走、増殖を含む細胞応答の明確な効果を示す（非特許文献２、３）。
【０００３】
（アナフィラキシー）
アナフィラキシーは、多臓器での急性アレルギー反応である。肥満細胞表面のIgE受容体に結合したIgEへの抗原結合によりひきおこされる受容体架橋を介して肥満細胞から血小板活性化因子（PAF）、ヒスタミン、ロイコトリエン及びサイトカインが放出される。これらの炎症メディエーターやサイトカインは、血管内皮、平滑筋等に作用し、血管内皮関門を障害して血漿漏出と組織浮腫、低血圧、低体温及び気管支痙攣を引き起こす。現在、生命の危険にかかわるアナフィラキシーの治療は、十分効果的ではない。そのために、アナフィラキシーの新規治療薬の開発が望まれている。アナフィラキシーの新規治療薬開発のためには、アナフィラキシーの根本的な病態生理学機序を解明することが必須である。
しかしながら、現状では、該機序は完全には解明されていない。
【０００４】
生体内外でのS1Pは、内皮S1P1を介して血管内皮関門機能を維持していることが報告されている（非特許文献４）。さらに、血漿S1Pは、抗原チャレンジ、PAF及びヒスタミン投与後のアナフィラキシーでの血漿漏出を防ぐために必要であることが報告されている（非特許文献５）。すなわち、血漿中のS1P-S1P1軸（作用）は、血液関門の完全性を維持するための主要な役割を果している。S1P1とは反して、S1P2の薬理学的遮断は、ヒスタミン誘発漏出を減少させる。さらに、S1P2の遺伝的欠失は、抗原チャレンジ後において、低体温及び血管漏出を弱めることが報告されている（非特許文献６）。しかし、この観察を説明できるS1P2の作用機構は知られていない。
さらに、以下で述べる実施例では、まったく異なる結果を示している。
【０００５】
（内皮一酸化窒素合成酵素）
内皮一酸化窒素合成酵素(eNOS)は、PAF及びVEGFによって誘発される血管透過性の増大に関与している。カルモジュリン依存性酵素eNOSの活性は、細胞内遊離Ca2+の増加、調節タンパク質との相互作用、Aktタンパク質及びプロテインキナーゼAを含むCa2+-非依存性プロテインキナーゼ媒介リン酸化により、刺激される。eNOSのリン酸化は、Ca2+に対してeNOSを過敏にして、その結果としてeNOSを活性化させる。PAF及びヒスタミンを含むアナフィラキシーメディエイターの大部分は、Gタンパク質共役受容体を介して、活性する。
【０００６】
上記述べたように、アナフィラキシーにおけるS1P2の作用とその機構は不明である。また、S1P2の作用は、すでに知られているS1P1の作用機構とはまったく異なる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cancer Res 2010;70:772-781.
【非特許文献２】http://dx.doi.org/10.1128/MCB.20.24.9247-9261.2000
【非特許文献３】Circ Res 2012;111:553-563.
【非特許文献４】J Clin Invest 2001;108:689-701.
【非特許文献５】J Clin Invest 2009;119:1871-1879.
【非特許文献６】J Exp Med 2010;207:465-474.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アナフィラキシーにおけるS1P2の作用とその機構を解明し、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決するために、アナフィラキシーにおけるS1P2の作用機構を解明し、従来の知見とはまったく異なる、「S1P2は、Akt阻害を介したアナフィラキシーでのECにおけるeNOS及びNO生成の刺激を抑制すること、S1P2はこの作用により血管内皮関門障害を防御してアナフィラキシーによる異常を大幅に軽減すること、並びに、S1P2遺伝子を欠損させた非ヒトノックアウト動物は、アナフィラキシーに過敏に反応すること」を見出した。そして、本発明を完成した。
【００１０】
より詳細には、S1P2は、VE-カドヘリン及びβ-カテニンの解離、さらにβ-カテニンのS-ニトロシル化を阻害することによる内皮細胞間関門の崩壊を防ぐことにより、血管漏出を阻害する。S1P2は、アナフィラキシーメディエーター誘発による血管透過性増大を中和するが、血管透過性ベースラインに影響を与えないことを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下からなる。
１．相同染色体上でS1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失しており、脈管形成及び／又は血管新生に関連した疾患又は症状を呈する非ヒトノックアウト動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞を用いて血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法。
２．S1P2遺伝子の全部又は一部の機能の喪失が、S1P2遺伝子の破壊又は変異によるものである、前項１に記載のスクリーニング方法。
３．脈管形成及び／又は血管新生に関連した疾患又は症状が、アナフィラキシー、加齢黄斑変性症、血管透過性亢進型肺障害、糖尿病網膜症、腫瘍血管新生、大動脈瘤、動脈硬化、浮腫、血管内膜肥厚、血管閉塞、血管炎又は虚血後血管新生、である、前項１又は２に記載のスクリーニング方法。
４．非ヒトノックアウト動物がホモノックアウト動物である、前項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
５．下記の工程を含む：
（ａ）前項１〜４のいずれか１項に記載の動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞におけるマーカーを調べ、被験物質を投与しない動物におけるマーカー又はマーカーの基準値と比較する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を治療することができる、発現させなくする、又はその発現を遅らせることができる被験物質を選択する工程、
前項１〜４のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
６．前記被験物質を投与する前後に、血管内皮関門障害に関連した因子を前記動物に投与する工程を含む前項１〜５のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
７．前記マーカーは、以下のいずれか１から選ばれる前項１〜６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
（１）eNOSのリン酸化
（２）NO濃度
（３）Aktのリン酸化
（４）cGMPレベル
（５）β-カテニンのS-ニトロシル化
（６）ヘマトクリット値
（７）血管透過性
（８）生存率
（９）体温
（１０）血圧
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新規な知見「S1P2は、Akt阻害を介したアナフィラキシーでのECのeNOS及びNO生成の刺激を抑制すること、S1P2はこの作用により血管内皮関門障害を防御してアナフィラキシーによる異常を大幅に軽減すること、並びに、S1P2遺伝子を欠損させた非ヒトノックアウト動物は、アナフィラキシーに過敏に反応すること」を基にして、新規な血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】S1P2-欠失は能動的アナフィラキシーを悪化させることを示す結果。  （Ａ）抗原チャンレンジ後の野生型（WT）及びS1P2遺伝子欠損（S1pr2-/-）マウスの生存率。ウシ血清アルブミン（BSA）に感作されたマウスを、14日後にBSAの腹腔内投与により抗原刺激を加え、そして、60分間以上経過観察した。データは、３回の独立実験｛n=14（WT）及び11（S1pr2-/-）｝の統合結果を示す。  （Ｂ）ヘマトクリット値（HCT）は、BSAチャレンジ10分後に測定した。データは、２回の独立実験｛n=5(WT)及び6（S1pr2-/-）｝の統合結果の平均±標準誤差で示す。  （Ｃ、Ｄ）肺のEvans blue血管外漏出を示す結果である。Evans blue色素（1 mg/100μl saline）を、BSAチャレンジあり又はなしの条件下で静脈内投与した。そして、該投与10分後において、麻酔薬過剰投与によりマウスを安楽死させ、右心室を介して生理食塩水を血管内に注入して血管内のEvans blue色素を除去した後に、肺を摘出した。  （Ｃ）同様の結果の各4又は3匹のマウス/遺伝型を使用した２回の独立実験からの7つの肺からの代表的肺の図面。  （Ｄ）肺のEvans blue血管外漏出量の定量｛n=4(WT)及び4（S1pr2-/-）｝。データは、同様の結果の各4又は3匹のマウス/遺伝型を使用した２回の独立実験の結果である。  （Ｂ）、（Ｄ）における括弧内の数値はマウス匹数を表す（以下の図においても同様）。図中の＊は「p＜0.05」、＊＊は「p＜0.01」、及び＊＊＊は「p＜0.001」を意味する。さらに、何も印がない場合には、統計的有意ではないことを意味する（以下の図においても同様）。
【図２】S1P2-欠失はPAF-誘導アナフィラキシーを悪化させることを示す結果。  （Ａ）PAF（20μg/kg）の静脈内投与を受けたWT及びS1pr2-/-マウスの生存率を示す。該生存率は、PAF投与後60分間以上経過観察した。データは、２回の独立実験（n=14/genotype）の統合結果を示す。  （Ｂ）ヘマトクリット値は、PAF投与10分後に測定した。データは、２回の独立実験｛n=7(WT)及び6（S1pr2-/-）｝の統合結果の平均±標準誤差で示す。  （Ｃ〜Ｅ）肺のEvans blue血管外漏出を示す結果である。Evans blueは、図１（Ｃ）で示すように投与して、そして肺を摘出した。  （Ｃ）同様の結果の各4又は3匹のマウス/遺伝型を使用した２回の独立実験からの7つの肺からの代表的肺の図面。  （Ｄ）肺の血管外漏出量の定量｛n=4(WT)及び4（S1pr2-/-）｝。データは、同様の結果の各4又は3匹のマウス/遺伝型を使用した２回の独立実験の結果である。  （Ｅ）肺のヘマトキシリン・エオジン染色組織切片の代表図（n=2/genotype）。矢印は、血管周囲の液体貯留を示す。バーは「100μm」を示す。  （Ｆ）マイルスアッセイを示す。Evans blueを静脈投与されたマウスは、10分後において指定した投与量のPAFの投与を受けた。上図は、4匹のWT及びS1pr2-/-マウスの代表的な皮膚図である。下図は、皮膚でのEvans blue漏出量を示す。データは、２回の独立実験（n=4/genotype）の統合結果を示す。
【図３】S1P2-欠失は、大動脈及び肺でのPAF投与誘導によるAkt及びeNOSのリン酸化及びサイクリックGMP (cGMP)産出を増加させることを示す結果。  （Ａ〜Ｄ）大動脈（Ａ及びＢ）及び肺（Ｃ及びＤ）におけるPAF刺激によるAkt及びeNOSのリン酸化。WT及びS1pr2-/-マウスに、生理食塩水又はPAF（20 μg/kg）を静脈内投与し、そして、10分後において、大動脈及び肺を摘出した。リン酸化-Akt Ser473及び総Aktに対する抗体（Ａ及びＣ）並びにリン酸化-eNOS Ser1177及び総eNOSに対する抗体（Ｂ及びＤ）を使用したウエスタンブロット法によって、組織ホモジネートのAkt及びeNOSのリン酸化を測定した。代表的なブロット及び数量データを示した。データは、３回の独立した実験からの統合結果を平均±標準誤差で示した｛n=4(WT;saline)、4（S1pr2-/-;saline）、6（WT;PAF）及び5（S1pr2-/-;PAF）｝。  （Ｅ）PAF-刺激は、大動脈のcGMPレベルを増加させた。マウスに、生理食塩水又はPAFを投与して、そして大動脈組織を（Ａ〜Ｄ）と同様に摘出した。cGMPレベルは、実施例１の記載の通りに、抽出し、そして測定した。データは、２回の独立した実験からの統合結果を平均±標準誤差で示した。１つのcGMPレベルは、各１つの大動脈から得た｛n=4(WT;saline)、7（S1pr2-/-;saline）、5（WT;PAF）及び6（S1pr2-/-;PAF）｝。
【図４】NOS阻害剤又は遺伝的eNOS欠失は、S1P2-欠失マウスでのPAF-誘導アナフィラキシーの悪化を防ぐことを示す結果。  （Ａ）L-NAME（Nω- L-Nitro- arginine methyl ester）処理又は未処理条件下のWT及びS1pr2-/-マウスのPAF投与10分後のヘマトクリット値。PAFの静脈内投与3時間前に、生理食塩水又はL-NAME（100 mg/kg）を投与した。データは、３回の独立実験の統合結果の平均±標準誤差で示した｛n=3(WT;saline)、4（WT; L-NAME）、4（S1pr2-/-;saline）及び4（S1pr2-/-;L-NAME）｝。  （Ｂ）L-NAME処理又は未処理条件下のWT及びS1pr2-/-マウスにPAF静脈内投与後の生存率。PAFの静脈内後60分間、生存率をモニターした。データは、３回の独立した実験からの統合結果で示した｛n=8(WT;saline)、8（WT; L-NAME）、9（S1pr2-/-;saline）及び10（S1pr2-/-;L-NAME）｝。  （Ｃ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないS1pr2-/-マウスへのPAF投与10分後のヘマトクリット値。データは、２回の独立実験の統合結果の平均±標準誤差で示した。  （Ｄ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないS1pr2-/-マウスへのPAF投与後の生存率。４匹の遺伝的に異なるグループのマウスに、PAF（20 μg/kg）を静脈内投与し、生存率を60分間モニターした。データは、３回の独立した実験からの統合結果で示した。
【図５】遺伝的eNOS欠失は、S1P2-欠失マウスでのアナフィラキシー悪化を防ぐことを示す結果。  （Ａ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないWT及びS1pr2-/-マウスへの抗原又は生理的食塩水投与10分後の血漿ヒスタミン濃度。  （Ｂ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないWT及びS1pr2-/-マウスへの抗原投与10分後のヘマトクリット値。  （Ｃ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないWT及びS1pr2-/-マウスへの抗原投与後の平均動脈血圧の変化。  （Ｄ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないWT及びS1pr2-/-マウスへの抗原投与後の体温の変化。  （Ｅ）Nos3を欠失した又はNos3欠失のないS1pr2-/-マウスへの抗原投与後の生存率。生存率を60分間モニターした。
【図６】PAF-及びS1P-刺激によるAkt及びeNOSのリン酸化並びに一酸化窒素（NO）産出は、S1P2-欠失ECでは増強されることを示す結果。  （Ａ及びＢ）WT及びS1pr2-/-マウスから分離した肺血管内皮細胞（MLEC）でのAkt Ser473（Ａ）及びeNOS Ser1177（Ｂ）のPAF-及びS1P-刺激リン酸化。MLECを、S1P（0.1μM）の添加あり又はなしの条件下で、PAF（100 nM）で20分間刺激した。S1Pは、PAF添加10分前に添加した。上図は代表的なブロット図を示し、下図は定量データを示す。データは、分離細胞調製を使用して実施した４回の独立した実験の平均±標準誤差で示した。  （Ｃ）PAF-、血管内皮成長因子（VEGF）-及びS1P-刺激は、WT及びS1pr2-/-マウスから分離したMLECでのNO産出を増加した。放出されたNOは、実施例１に記載の方法に従い、メディア中のNO2-及びNO3-として測定した。MLECを、10分間のS1P（0.1μM）処理のありなしの条件下で、3時間のVEGF（10 ng/ml）及びPAF（50 nM）で刺激した。S1Pを、PAF及びVEGFの添加10分前に添加した（n=4）。データは、同様な結果を示す分離細胞調製を使用した２回の独立した実験の代表で示した。
【図７】PAF-誘導接着結合崩壊は、S1P2-欠失により悪化し、そして、血管内皮細胞中のNOS阻害剤によって阻害されたことを示す結果。  （Ａ）WT及びS1pr2-/-マウスから分離したMLECのVE-カドヘリン及びβ-カテニンの免疫蛍光染色。MLECを、1%FBS存在下において、30分間のPAF（100 nM）の添加有無条件、さらにはL-NAME（1 mM）の添加有無条件で刺激をした。L-NAMEは、PAF添加10分前に添加した。データは、同じような結果の２つの分離細胞調製を用いて２回の独立実験の代表的な図を示す。  （Ｂ）WT及びS1pr2-/-マウスから分離したMLECでのPAF-及びS1P誘発β-カテニンのS-ニトロシル化。MLECを、血清非存在下で培養し、そして、10分間のL-Nameを加えたS1P（0.1μl）添加有り又は無しの条件下で、PAF（100 nM）で刺激した。S1Pは、PAF添加10分前に添加した。細胞を溶解し、ビオチンスイッチ法とその後の抗β-カテニン抗体を使用したウエスタンブロット法でニトロシル化分析を行った。左図は、代表的なブロットを示す。右図は、S-ニトロソ-β-カテニンの定量データを示す。データは、分離細胞調製を使用した６回の独立実験の平均±標準誤差で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本発明）
本発明は、「S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物並びに該動物から単離した組織又は細胞を用いた血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための候補物質のスクリーニング方法」に関する。
【００１５】
（S1P2遺伝子）
本発明で、非ヒトノックアウト動物の全部又は一部の機能を喪失させるS1P2遺伝子は公知である。よって、自体公知のデータベースより、S1P2遺伝子配列を容易に取得することができる。例えば、マウスのGenBankアクセッション番号は、NM_010333.4等である。
【００１６】
（非ヒトノックアウト動物）
本発明は、相同染色体上でS1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失しており、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を呈する、非ヒトノックアウト動物を提供する。
相同染色体上でS1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させる手法としては、例えば、S1P2遺伝子の破壊又は変異によるものが挙げられる。
【００１７】
本発明に用いられる動物の種類は、特に限定されない。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、チンパンジー及びゼブラフィッシュ等の非ヒト動物が、ノックアウト動物の作製に用いることができる。なかでも、取り扱いが容易で繁殖しやすいマウ、ラットスが好ましい。
【００１８】
本発明において、「遺伝子の機能を喪失させる」とは、「遺伝子の機能を完全に失わせること」の意味に加えて、「遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にすること」の意味をも含む概念である。遺伝子の機能を喪失させるためには、単純に遺伝子を破壊したり、欠損させたり、遺伝子に変異を導入して翻訳の段階で読み枠（ORF；Open Reading Frame）がずれるように操作する等の改変を施したりすればよい。
【００１９】
本発明の「相同染色体上でS1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失しているノックアウト動物」は、実施例に記載のように公知の方法で作製することができる。
例えば、遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。同方法において、S1P2遺伝子のエクソンの少なくとも開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することにより、S1P2の正常な発現を阻害できる。
また、本発明のスクリーニング方法に用いるノックアウト動物は、同方法によって作製されたノックアウト動物のみならず、さらにその子孫をも含む。
さらに、以下では、ノックアウト動物の作製に用いられる非ヒト動物がマウスである場合を例に挙げて説明するが、他の非ヒト動物においても同様の手法が適用することができる。
【００２０】
○ターゲッティングベクターの構築
ターゲッティングベクター構築のため、対象となる動物のS1P2遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからS1P2遺伝子をスクリーニングする。
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく、S1P2遺伝子を破壊し、そしてS1P2の発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。
また、ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、例えば市販のプラスミドをバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー及びネガティブセレクション用のマーカー等の各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。
【００２１】
○S1P2遺伝子欠失非ヒトノックアウト動物の作製
上記方法により作製したターゲッティングベクターを、受精卵、初期胚、又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の個体形成能（分化全能性）をもつ細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて選択できる。
選別後、目的とする相同組換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法等によって確認する。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管又は子宮から採取された８細胞期胚又は胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。
【００２２】
上記８細胞期胚又は胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型S1P2遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のS1P2遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のS1P2遺伝子が破壊されたホモ接合体、即ち本発明で使用するS1P2非ヒトノックアウト動物を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法等によって遺伝子型を調べればよい。
【００２３】
（S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物から単離した組織若しくは細胞）
S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物から単離される組織としては、すべての組織が挙げられ、好ましくは血管由来の組織等である。また、ノックアウト動物から単離される細胞としては、前記組織から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株が挙げられ、具体的には血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、周皮細胞、血管内皮前駆細胞、骨髄由来間葉系細胞等が好ましい。これらの組織や細胞は、当業者に周知の方法によって、S1P2遺伝子欠失非ヒトノックアウト動物から単離することが可能である。
【００２４】
上記S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物並びに該動物から単離した組織又は細胞は、血管内皮関門障害の疾患又は症状を呈する。したがって、該動物並びに該動物から単離した組織又は細胞は、前記疾患又は症状を治療及び／又は予防するための医薬等の開発に使用することができる。
【００２５】
（血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状）
本発明の「血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状」は、血管透過性の疾患又は症状含み、例えば、アナフィラキシー、加齢黄斑変性症、大動脈瘤、動脈硬化、浮腫、血管内膜肥厚、血管閉塞、血管炎、腫瘍血管新生、虚血後血管新生、血管透過性亢進型肺障害、又は糖尿病網膜症等が挙げられ、これらの疾患又は症状は、単独で又は併発して発現しうる。
【００２６】
（スクリーニング方法）
S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物並びに該動物から単離した組織又は細胞を用いることにより、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状の治療及び／又は予防に用いられうる候補物質をスクリーニングすることができる。
【００２７】
本発明によれば、例えば、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）S1P2遺伝子の全部又は一部の機能を喪失させた非ヒトノックアウト動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞におけるマーカーを調べ、被験物質を投与しない動物におけるマーカー又はマーカーの基準値と比較する工程；及び、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を治療することができる、症状を発現させなくする、又はその発現を遅らせることができる被験物質を選択する工程、
を含むスクリーニング方法を提供する。
【００２８】
前記工程（ａ）において、「被験物質」とは、公知物質及び新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリーのほか、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
また、これらの化合物の２種以上の混合物を被験物質として用いることもできる。
さらに、前記工程（ａ）において、被験物質を動物に投与する方法は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与されうる。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、腹腔内、動脈内、筋肉内、等の全身投与、又は標的細胞付近への局所投与等が挙げられる。
加えて、被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等に応じて、適宜設定されうる。
【００２９】
前記工程（ｂ）において、「マーカー」とは、「血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状」を治療することができる、症状を発現させなくする、又はその発現を遅らせることができる指標を意味する。
より詳しくは、被験物質を投与した非ヒトノックアウト動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞におけるマーカーが、被験物質を投与していない非ヒトノックアウト動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞におけるマーカー及び／又はマーカーの基準値と比較することにより、該被験物質が「血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状」を治療することができる、発現させなくする、又はその発現を遅らせることができる治療薬となることができるかどうかを判定することができる。
例えば、判定方法としては、血管組織を染色して顕微鏡で観察する方法、ウエスタンブロット法、免疫沈降等によって特定の標的タンパク質の発現を確認する方法、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等によって特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を確認する方法を比較する方法等が挙げられる。
加えて、マーカーの基準値とは、予め基準値を設定することにより、該基準値を超えた場合又は低下した場合には、被験物質が「血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状」を治療することができる、発現させなくする、又はその発現を遅らせることができる治療薬となることができるかどうかを判定することができる。
なお、本発明で使用するS1P2遺伝子欠失非ヒトノックアウト動物は、血管透過性ベースラインに影響を与えないことを確認しているので、マーカーの基準値と比較することのみで被験物質を容易に選択（判定）することができる。
【００３０】
加えて、本発明で使用する非ヒトノックアウト動物又は該動物から単離した組織若しくは細胞は、下記のマーカーを使用することができる。
（１）eNOSのリン酸化：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（２）NO濃度（NO2-及びNO3-濃度）：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（３）Aktのリン酸化：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（４）cGMPレベル：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（５）β-カテニンのS-ニトロシル化：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（６）体温：被験物質の投与により、数値の低下を抑える、維持又は上昇させることができるかを判定する。
（７）血圧：被験物質の投与により、数値の低下を抑える、維持又は上昇させることができるかを判定する。
（８）ヘマトクリット値：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（９）肺血管透過性：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
（１０）生存率：被験物質の投与により、数値の上昇を抑える、維持又は低下させることができるかを判定する。
【００３１】
さらに、前記被験物質を投与する前後に、血管内皮関門障害に関連した因子を前記動物に投与しても良い。
なお、血管内皮関門障害に関連した因子とは、血小板活性化因子（ＰＡＦ；Platelet-Activating Factor）、ヒスタミン、トロンビン、ブラジキニン（血管透過性亢進因子）（以上、アナフィラキシー・ショック様病態誘発因子）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ；Vascular Endothelial Growth Factor；血管透過性亢進因子）、アンジオポエチン-２（Angiopoietin-2）、アンジオテンシンＩＩ（大動脈瘤誘発因子）、塩化コバルト（虚血誘発因子）、ストレプトゾトシン（糖尿病誘発因子）等が挙げられる。
【００３２】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、下記実施例の全ての動物実験は、研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針及び金沢大学動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。
【実施例１】
【００３３】
（材料及び方法）
実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
【００３４】
（試薬）
S1Pは、BIOMOLから購入した。PAF及びL-NAMEは、Calbiochemから購入した。BSAフリー脂肪酸、百日咳毒素及びヒスタミンをSigmaから購入した。組換VEGF-A165はPetroTechから購入した。
【００３５】
（マウス）
S1pr2-/-マウスは、文献｛Du W等S1P2, the G protein-coupled receptor for sphingosine-1-phosphate,negatively regulates tumor angiogenesis and tumor growth in vivo in mice. Cancer Res;70(2):772-781. 2010｝に記載した方法により作製した。詳しくは、S1pr2-/-マウス（129Ola/J;C57BL/6 mixed background）は、C57BL/6マウスと１回戻し交配をした。Nos3-/-マウス（C57BL/6 background）は、Jackson Laboratoryから得た。S1pr2-/-; Nos3-/-マウス及びWT同複子は、ヘテロ接合体交配により生成した。マウスは、自由に飼料と水が摂取可能な12時間明-12時間暗サイクルの温度制御施設（24℃）で飼育した。尾バイオプシーから採取したゲノムDNAのPCR分析によって、マウスの遺伝子型を確認した。
【００３６】
（アナフィラキシー）
能動的全身アナフィラキシー誘導のために、雄マウス（10-12週）を、0.9％NaCl中の1mg BSA及びアジュバンドである300ng百日咳毒素の腹腔内投与により免疫感作した。14日後において、マウスを、尾静脈を介してBSA（1mg in 100μl physiological saline）の静脈内注射投与によりチャレンジさせた。マウスの生存率、体温及び血圧は、該チャレンジ後の40〜60分間、公知の方法により測定した。別法として、アナフィラキシーは、尾静脈を介してPAF（0.5μg in 100μl saline）の静脈注射投与により誘発した。別段の指示がなければ、投与は、密閉箱に設置して、エーテル麻酔を１分程度実施したマウスに行った。また、いくつかの実験のマウスは、PAF投与3時間前に、L-NAME（2.5mg in 100μl saline）の静脈注射投与を受けた。さらに、別のマウスにおいて、抗原チャレンジ又はPAF投与10分後に、右心室から血液サンプルを得て、ヘマトクリット値及び血漿ヒスタミンレベルを測定した。さらに、肺及び大動脈サンプルは、組織学的分析、組織cGMP及びウエスタンブロット分析のために、摘出した。組織構造分析のために、肺サンプルは、切開時において、4％パラホルムアルデヒド中の0.5％低融点アガロース溶液により膨張させた。サンプルを、パラフィルムで包埋し、シリアルセクションをヘマトキシリン・エオジンで染色し、そして、血管周囲領域は各サンプルのランダムに選択したセクションで評価した。血漿ヒスタミンレベルは、ヒスタミン酵素免疫測定法キット（Bertin Pharma）を使用して測定した。
【００３７】
（血管透過性測定）
肺の血液漏出を評価するために、100μl Evans blue 色素（和光）溶液（1% in saline）を、PAF又はBSAと一緒に、尾静脈に投与した。投与10分後に、マウスを、エーテル麻酔により屠殺し、そして右心室に生理食塩水を浸み込ませて、血管内Evans blue 色素を除去した。次に、肺を摘出し、写真を撮り、60℃一晩乾燥させた。乾燥肺重量を測定し、そして4日間室温において2mlホルムアルデヒドで抽出した。Evans blueコンテントは、ホルムアルデヒド抽出の0D500(500 nm吸光度)を引いたOD620として測定した。マイルスアッセイに関し、100μl Evans blue dyeを、尾静脈に投与して、そして10分間の体内循環をさせた。PAF、ヒスタミン又はPBS（各100μl）を、剃毛前の背中の皮膚に皮内投与した。投与20分間後において、マウスを、エーテル麻酔により屠殺し、さらに全体投与部位を含む皮膚の領域を除去した。Evans blue dyeは、0.4mlホルムアルデヒドでのインキュベーションにより皮膚から抽出し、そして、Evans blueコンテントは前記記載の方法で測定した。
【００３８】
（血圧及び体温測定）
マウスを、ペントバルビタールナトリウム（60 mg/kg, i.p.）で麻酔し、そして、実験期間中には、サーモスタットコントロールヒーティングパッド（ATC-101B;Unique Medical, Japan）上に安置して、体温を37±0.2℃に維持した。麻酔の妥当性を、制御条件下及び尾ピンチ中において、血圧及び呼吸の安定性によってモニターした。麻酔の追加投量（初期投与の10%）は、必要に応じて、腹腔内に投与した。血圧の測定方法は、公知の方法により行った。右大腿動脈にカテーテルを挿入して、トランスデューサー（TP-400T, Nihon Kohden）にて血圧を測定した。右外頸静脈にカテーテルを挿入して、抗原を投与した。血圧は、連続的に測定し、そしてPowerLab（AD Instruments）による40Hzにてデジタル的に記録した。手術終了20分後において、抗原を前記記載の方法で静脈注射した。表１において、意識のあるWTマウス、S1pr2-/-マウス及びNos3-/-マウスの最大血圧、最低血圧及び心拍数を、Softron BP98A（Softron BP98A, Softron Co Ltd, Tokyo）を用いたTail cuff法により非侵襲的に測定した。直腸体温は、直腸プローブ（RET-3, PHYSITEMP INSTRUMENTS）を備えた電子体温計（BDT-100, BRC Bioresearch Center）を使用して、ケージ内で押えた非麻酔マウスで測定した。
【００３９】
（cGMPレベルの測定）
大動脈を、マウスから除去し、そして液体窒素でスナップ凍結した。凍結組織を、氷冷6％トリクロロ酢酸中でホモジナイズし、そして4℃、15分間、2000×gで遠心分離した。得られた上澄み液を回収し、そして、水飽和ジエチルエーテルで4回洗浄した。水様抽出物を、窒素ガス気流下で乾燥させ、そして0.05M酢酸ナトリウムバッファーで溶解した。cGMPの濃度は、ELISA kit（GE Healthcare）を使用して測定した。cGMPの測定値は、サンプル中の総タンパク質含有量で補正し、そしてnmol/g（protein）で表した。
【００４０】
（初代マウス肺内皮細胞の分離及び培養）
MLEC（マウス内皮細胞）を、公知の方法により、コラーゲンA（Roche）での消化、抗マウスCD31抗体（BD Biosciences）及び電磁ビーズ結合ヤギ抗ラット抗体を使用しての磁気分離、並びにMSカラム（Miltenyi Biotec）を使用して、6週目マウスから分離した。MLECは、供給業者のマニュアルに従い、追加成長因子及び2%FBSを含むEGM2-MV培地（Lonza）を含むType I コラーゲン（Nitta Gelatin）コーティングプラスチィック皿で培養した。
【００４１】
（内皮NO産出の測定）
コンフルエントMLECを、14時間1％BAS添加無血清M199培地で血清飢餓培養し、続けて、4時間血清及びBSAフリーDMEMで飢餓培養した。その後、細胞をS1P（0.1 μM）、PAF（100 nM）及びVEGF（10 ng/ml）で3時間刺激した。S1P並びにPAF若しくはVEGFでの共刺激の場合には、S1Pは、PAF又はVEGFの添加10分前に、添加した。培養上澄み液中のNO2-及びNO3-の濃度は、製造元のマニュアルに従い、NO2-/NO3-アッセイ（Dojindo）用Griess Reagent kitを使用して測定した。
【００４２】
（ウエスタンブロット分析）
大動脈及び肺を、周辺組織ではない箇所で切開し、液体窒素でスナップ凍結し、そしてガラスホモジナイザーにより氷冷バッファー｛50mM Tris/HCl(pH7.2),500mM NaCl,10mM MgCl2,1% Triton X-100,0.5% deoxycholate, 0.1% SDS, 10μg/ml leupeptin, 10μg/ml aprotinin, 1 mM PMSF｝でホモジナイズした。遠心（800xg, 15分間、4℃）により組織残屑除去後、上澄み液でウエスタンブロット分析をした。MLECを、処理前に、18時間1％BAS添加無血清M199培地で血清飢餓培養した。培養後細胞を、PBSで洗浄し、そして、スクレイピングにより細胞溶解バッファー｛50mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,5mM EDTA,1% Triton X-100, 1mM Na3VO4, 10mM NaF, 10mM Na-β-glycerophosphate｝で溶解した。次に、細胞溶解物をウエスタンブロット分析に使用した。サンプルを、SDS8%又は10％PAGEで分離し、そして、Immobilon-P membrane（Millipore）で電気的転写した。0.1% Tween-80中の5% BSAでブロッキングした後に、標的タンパク質を、ラビットポリクローナル抗Ser1177-リン酸化-eNOS抗体（1:1000, #9571; Cell Signaling）、ラビットポリクローナル抗Ser473-リン酸化-Akt抗体（1:1000, #4060; Cell Signaling）、ラビットポリクローナル抗eNOS抗体（1:1000, #9586; Cell Signaling）及びラビットポリクローナル抗Akt抗体（1:1000, #9272; Cell Signaling）にて検出した。適切なアルカリホスファターゼ（AP）結合2次抗体でインキュベートした後に、呈色反応を、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-フォスフェイト及びニトロブルーテトラゾリウム（Sigma-Aldrich）で展開した。バンドの光学バンド密度をImage J processing programで測定した。定量値は、ローディングコントロールのバンド濃度を正規化した相対的バンド濃度で表し、そして、コントロールを1.0として、その何倍であるかで示した。
【００４３】
（S-ニトロソ-β-カテニンタンパクの測定）
S-ニトロソ-β-カテニンの量を、抗β-カテニン抗体を使用しての免疫沈降及び、続いて、抗S-ニトロソ-システイン抗体を使用してのウエスタンブロット分析により決定した。MLECをプレートに入れ、コンフルエンスになるまで培養し、その後、刺激前に、18時間無血清M199で血清飢餓培養した。刺激済細胞を、PBSで洗浄し、そして、スクレイピングにより細胞溶解バッファー｛50mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,5mM EDTA,1% Triton X-100, 1mM Na3VO4, 10mM NaF, 10mM Na-β-glycerophosphate｝で溶解し、続けて、10分間、4℃で15,000×gで遠心分離した。細胞上澄み液を回収し、そして、マウスモノクローナル抗β-カテニン抗体（610153; BD Biosciences）を4℃で一晩免疫沈降した。免疫沈降タンパク質を、20μl SDS-PAGEサンプルバッファーに混合し、そして抗β-カテニン抗体及びラビット抗S-ニトロソ-システイン抗体（#5411;Sigma）を使用してのウエスタンブロット分析により検出した。
【００４４】
（免疫蛍光細胞染色）
免疫蛍光細胞染色のために、MLECを、完全成長培地中のコラーゲン（Type I-P, Nitta gelatin）コートカバーガラススライド上で培養し、そして一晩接着させ、さらに、刺激前に、18時間1%FBSを含むM199で培養した。刺激済細胞を、PBSで洗浄した後に、PBS中の予め保温していた4%パラホルムアルデヒドで固定し、その後、15分間、PBS中の1% Triton X-100で透過処理した。細胞を、5% ノーマルヤギ血清で60分間インキュベートして、非特異的タンパク質結合を防いだ。ブロッキング後において、細胞を、ラビットポリクローナル抗VE-カドヘリン（#14-1441-81;eBioscience）又はマウスモノクローナル抗β-カテニン抗体で一晩インキュベートし、続いて、ヤギAlexaFlour 488又は584結合2次抗体（1：1000；Molecular Probe）で1時間インキュベートした。必要な場合には、細胞を、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI, Molecular Probe）で5分間対比染色した。細胞を、抗フェーディング試薬であるFluoromountTMに取り付け、そして、confocal laser-scanning microscope（Zeiss Axiovert 200M with LSM5 Pascal）を使用して検査した。
【００４５】
（統計分析）
すべての値は、平均±標準誤差として示した。データは、対応のないt-検定、両側スチューデントt-検定及びtwo-way ANOVA、続けてボンフェローニポストテストを用いて分析し、GraphPad Prism softwareを用いて統計的有意性を決定した。P < 0.05の値は、統計的に有意と考えた。
【実施例２】
【００４６】
（S1P2がアナフィラキシーにどのような影響を与えるかの確認）
主としてPAFに依存することが知られている能動的全身アナフィラキシーのモデルを使用して、S1P2がアナフィラキシーにどのような影響を与えるかを確認した。
S1pr2-/-マウス及びWTマウスを、アジュバンド存在下において抗原としてBSAで能動感作し、そして、感作２週間後のマウスに、同じ抗原の静脈注射により抗原刺激を行った。S1pr2-/-マウスは、抗原刺激後10分以内から死亡しはじめ、そして、すべてのS1pr2-/-マウスは30分以内に死亡した。一方、WTマウスは、25分後から死亡しはじめ、そして、45％のWTマウスは、チャレンジ60分後においても生存した（図１Ａ）。S1pr2-/-マウスは、血液濃縮により、10分後のヘマトクリット値がWTマウスと比較して高かった（図１Ｂ）。in vivoでの肺血管透過性を定量化するために、静脈内投与したEvans blueの漏出を、抗原刺激後10分において肺を摘出して測定した。S1pr2-/-マウスは、WTマウスと比較して、肺でのEvans blue漏出量が高いことを示した（図１Ｃ、Ｄ）。
これらの結果により、S1pr2-/-マウスは、増強された血管透過性の急性アナフィラキシーの過剰反応を示す。
すなわち、S1pr2-/-マウスは、急性アナフィラキシーの増悪を再現できる優れた非ヒトノックアウト動物であることを確認した。さらに、生存率、ヘマトクリット値及び血管透過性（特に、肺血管透過性）がこのS1P2欠損による増悪のマーカーになることを確認した。
【００４７】
次に、アナフィラキシーメディエーターであるPAFの静脈投与に対するマウスの感受性を確認した。PAF投与後の生存率に関し、S1pr2-/-マウスは急激に低下した。すなわち、90％ WTマウスは、チャレンジ60分後においても生存したが、一方、わずか10％以下のS1pr2-/-マウスのみが生存できた（図２Ａ）。ヘマトクリット値に関し、S1pr2-/-マウスは、PAF投与10分後では、WTマウスと比較して高かった（図２Ｂ）。S1pr2-/-マウスは、WTマウスと比較して、肺でのEvans blue漏出量が高いことを示した（図２Ｃ、Ｄ）。肺の組織学的分析は、「PAF投与後のS1pr2-/-マウスでの血管周囲浮腫は、WTマウスの血管周囲浮腫と比較して、重篤であること」を示した（図２Ｅ）。マイルスアッセイを使用して、S1pr2-/-及びWTマウスの真皮血管透過性でのPAFの効果を分析した。非刺激時の血管透過性は、S1pr2-/-マウス及びWTマウス間においては同じであった（図２Ｆ）。S1pr2-/-マウス及びWTマウスは、皮内注射によるPAF投与により、容量依存的にEvans blue漏出を示したが、S1pr2-/-マウスの漏出は、WTマウスの漏出と比較して、高いことを示した。S1pr2-/-マウスは、ヒスタミン投与により、Evans blueの漏出を示したが、S1pr2-/-マウスの漏出は、WTマウスの漏出と比較して、高いことを示した（図面なし）。
これらの結果により、「S1pr2-/-マウスは、漏出-誘発メディエーターに対して血管透過性の反応が高い」ことを示した。
すなわち、S1pr2-/-マウスは、BSA、PAF投与により急性アナフィラキシーの増悪を迅速に再現できる優れた非ヒトノックアウト動物であることを確認した。
さらに、S1pr2-/-マウスの非刺激時の血管透過性は、野生型マウスのそれと同程度であった。すなわち、被検物質を投与しない場合のS1pr2-/-マウスの血管透過性は、同様に被検物質を投与しない野生型マウスの血管透過性と比較する必要がないので、容易にスクリーニングを実施することができる。
【００４８】
（PAFチャレンジ後において、S1pr2-/-マウスの大動脈及び肺のAkt/eNOS活性化は増大されるかの確認）
内皮プロテインキナーゼAkt及びその下流エフェクターeNOSは、血管透過性を制御することが知られている。そこで、PAF投与後において、生理食塩水を投与したS1pr2-/-及びWTマウスの大動脈及び肺のAkt及びeNOSの活性化を調べた。S1pr2-/-及びWTマウスの両大動脈及び肺は、Akt（図３Ａ及びＣ）及びeNOS（図３Ｂ及びＤ）の非刺激時のリン酸化レベルは同等であった。PAF投与は、両S1pr2-/-及びWTマウスからの大動脈のAktリン酸化を増強したが、S1pr2-/-マウスのリン酸化がより強く増強された（図３Ａ）。PAF投与は、また、両マウスグループの大動脈のeNOSリン酸化を増強したが、S1pr2-/-マウスのリン酸化がより強く増強された（図３Ｂ）。大動脈と同様に、PAF投与は、両S1pr2-/-及びWTマウスの肺のAkt及びeNOSリン酸化を増強したが、S1pr2-/-マウスのリン酸化がより強く増強された（図３Ｃ及びＤ）。PAF投与は、S1pr2-/-マウスの大動脈cGMPレベルを、WTマウスのレベルよりも増強させることができた。非刺激時の大動脈cGMPレベルはS1pr2-/-及びWTマウスで同等であった。PAF投与は、両S1pr2-/-及びWTマウスの大動脈cGMPレベルを増加させたが、S1pr2-/-マウスでより強く増加した（図３Ｅ）。
これらの結果により、S1pr2-/-マウスの血管透過性の過剰な亢進は、血管系のAkt/eNOSシグナル経路及びNO生成によるものであると考えられる。
さらに、Aktのリン酸化、eNOSのリン酸化及びcGMPレベルは、マーカーになることを確認した。
【００４９】
（NOシンターゼ又はeNOS遺伝子欠失の薬理学的阻害が、S1pr2-/-マウスのアナフィラキシーに与える影響の確認）
上記の「S1pr2-/-マウスの膜透過性の過剰増加がAkt/eNOSシグナルパスウエイ及び血管系のNO生成に関与すること」を確認するために、NOシンターゼ阻害剤であるL-NAMEの効果を確認した。
PAF投与3時間前のL-NAME投与は、PAF-誘導致死からS1pr2-/-マウスを保護することを確認した（図４Ａ）。さらに、L-NAMEは、S1pr2-/-マウスでのPAFチャレンジ後のヘマトクリット値の上昇を抑えた（図４Ｂ）。これらの結果は、「NOが、S1pr2-/-マウスのPAF-誘導血管漏出及び致死に関与している」と考えられる。
そこで、PAF-誘導アナフィラキシーでのeNOSの役割を解明するために、S1pr2-/-マウスにNos3-/-マウスを交配して、S1pr2-/-; Nos3-/-複合遺伝子操作マウスを生成した。S1pr2-/-; Nos3-/-マウスは、PAF-誘導致死からほぼ完全に逃れることができた（図４Ｃ）。  この結果に一致して、PAF-誘導ヘマトクリット値の上昇増強は、S1pr2-/-; Nos3-/-マウスでは見られなかった（図４Ｄ）。
【００５０】
さらに、抗原（BSA）投与による急性アナフィラキシーモデルでのeNOSの役割を確認した。Nos3-/-単一遺伝子操作マウスは、抗原投与によるアナフィラキシー死を回避できた。S1pr2-/-; Nos3-/-マウスは、S1pr2-/-単一遺伝子操作マウスと比較して、大幅に抗原チャレンジに耐えた。S1pr2-/-単一遺伝子操作マウスは、抗原チャレンジ8分後に死亡しはじめ、60分後の致死率は85％であった。一方、S1pr2-/-; Nos3-/-マウスは、抗原チャレンジ45分後に死亡しはじめ、60分後の致死率は38％であった（図５Ｅ）。抗原チャレンジ後の血漿ヒスタミンレベルの増加程度は、WT、S1pr2-/-、Nos3-/-、S1pr2-/-; Nos3-/-マウスで同じであった（図５Ａ）。生存率の結果と一致して、S1pr2-/-; Nos3-/-マウスでの抗原チャレンジ10分後のヘマトクリット値は、S1pr2-/-マウスのヘマトクリット値よりも低く、そして、WTマウス及びNos3-/-マウスのヘマトクリット値と同程度であった（図５Ｂ）。
これらの結果は、「血管内皮のeNOSが、S1pr2欠失により引き起こされるアナフィラキシーの悪化に関与していること」が示された。
すなわち、従来の知見は、S1pr2遺伝子欠失マウスでは、アナフィラキシー発症時に血中ヒスタミン濃度がWTマウスよりも上昇していると考えられていた。しかし、S1pr2遺伝子欠失マウスでは、アナフィラキシー発症時に血漿ヒスタミン濃度の上昇がみられない（図５Ｂ）。
【００５１】
抗原投与に対する降圧反応を確認するために、遺伝子操作マウスの動脈圧を測定した。S1pr2-/-マウスは、WTマウスと比較して、定常状態の最大血圧及び最低血圧が明らかに低かった。一方、Nos3-/-マウス及びS1pr2-/-; Nos3-/-マウスは、WTマウスと比較して、最大血圧が高かった（下記表１）。抗原投与により、WTマウスの血圧は急激に約40mmHg低下し、40分以上の間低血圧が続いた（図５Ｃ）。S1pr2-/-マウスにおいて、血圧が急激に降下し、25分以内に測定不能になった。同じ条件下において、S1pr2-/-; Nos3-/-マウス及びNos3-/-マウスは、血圧の一時的な減少が見られたが、50分で回復した。
これらの結果は、「S1pr2-/-マウスは深刻な致命的循環性ショックを示し、そして、Nos3遺伝子欠失はWT及びS1pr2-/-マウスのアナフィラキシー低血圧を防ぐ」ことを示した。
抗原チャレンジは、WTマウスの40分間の観察中では中心部体温の低下を誘導した（図５Ｄ）。S1pr2-/-マウスは、WTマウスと比較して、急激な体温低下を示した。該体温は、致死する約25分間まで連続して低下した。S1pr2-/-; Nos3-/-マウス及びNos3-/-マウスは、一時的な体温減少を示したが、WTマウスよりも減少が低かった。
これらの結果は、「eNOS欠失は、S1P2欠失による低体温の悪化を防いでいること」を示す。
さらに、血圧及び体温は、マーカーになることを確認した。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
（S1P2は血管ECでのAkt-eNOS経路を負に調節することの確認）
S1P2が、S1pr2-/-及びWTマウスから分離したMLECのAkt及びeNOSのリン酸化に対するPAFの影響を確認した。WTマウスのMLECにおいて、PAFは、Akt及びeNOSの両方のリン酸化を刺激した（図６Ａ及びＢ）。S1P単独は、Akt又はeNOSのリン酸化に影響を与えず、むしろ、WT MLECのeNOSのPAF-誘導リン酸化を抑えた。WT MLECの結果とは異なり、S1pr2-/- MLEC中のS1P単独は、Akt及びeNOSのリン酸化を刺激した。さらに、Akt及びeNOSのPAF刺激リン酸化において、S1pr2-/-  MLECは、WT MLECと比較して、高い値を示した。WT MLECとは異なり、S1pr2-/-  MLECにおいて、S1Pは、Akt及びeNOSのPAF刺激リン酸化を減少させなかった。
これにより、S1pr2-/-  MLEC でのPAF＋S1P刺激によるAkt及びeNOSのリン酸化は、WT MLECのリン酸化と比較して、大きかった。そこで、S1P2が、MLEC中のNO産出に与える影響を確認した。WTマウスから分離したMLECにおいて、S1PではなくPAF又はVEGFはNOの生成を刺激した（図６Ｃ）。S1pr2-/-  MLECにおいて、PAF及びVEGFは、WT ECよりもNO産出を強く刺激した。さらに、S1P単独は、S1pr2-/-  MLECのNO産出をゆるやかに刺激しており、eNOSリン酸化の結果と一致していた（図６Ｂ）。加えて、S1Pは、わずかに、S1pr2-/-  MLECのPAF-刺激NO産出を向上させた。
これらの結果は、「S1P2は、Akt及びeNOSのリン酸化を減少させることを介して、ECでのNO産出の抑制作用を及ぼすこと」を示す。
さらに、NO濃度（NO2-及びNO3-の濃度）は、マーカーになることを確認した。
【００５４】
（S1P2は、PAF-誘導β-カテニンのS-ニトロシル化の阻害を介して接着接合の維持に関与しているかどうかの確認）
抗VE-カドヘリン及び抗β-カテニン抗体での免疫蛍光染色を使用して、S1P2がMLECの単分子層の接着結合に対するPAF効果に与える影響を確認した。
未処理条件下のWT及びS1pr2-/- MLECにおいて、VE-カドヘリン及びβ-カテニンは、細胞間接触によりクラスターを形成しており、すなわち、接着接合を形成していた（図７Ａ）。PAF処理は、WT及びS1pr2-/- MLECのVE-カドヘリン及びβ-カテニンの共局在化を崩壊した。しかしながら、接着接合の崩壊は、WT MLECよりもS1pr2-/- MLECで強かった。L-NAMEでの前処理は、実質的には、WT及びS1pr2-/- MLEC両方の接着接合の崩壊を防いだ。これらの結果は、他の結果も併せると、「PAFは、eNOS及びNO生成を促進させることを介して接着接合の崩壊を誘発すること」を示した。
PAFがβ-カテニンのS-ニトロシル化に作用するかどうか、及びS1P2は該作用に影響を与えるかどうかを確認した。WT ECにおいて、PAF、S1P又はそれらの組み合わせ投与のいずれもがβ-カテニンのS-ニトロシル化を増強しなかった（図７Ｂ）。これに反し、S1pr2-/- MLECにおいて、PAF、S1P又はそれらの組み合わせ投与のいずれもがβ-カテニンのS-ニトロシル化を増強した。しかし、PAF及びS1Pの組み合わせ投与による相加作用又は相乗作用が見られなかった。
これらの結果は、「S1P2が、PAFによるNO産出を阻害することによってβ-カテニンのS-ニトロシル化を阻害する結果、接着結合の崩壊を防ぐ」ことを示した。
さらに、β-カテニンのS-ニトロシル化は、マーカーになることを確認した。
【００５５】
（総論）
本実施例では、S1P2（受容体）がアナフィラキシーに対して防御的に作用することを示した。さらに、本実施例では、S1P2のこの防御の機構は、アナフィラキシー時の血管透過性亢進及び低血圧に関与するeNOSの有害な活性化を抑えることであることを示した。すなわち、本実施例では、アナフィラキシーに対する保護的役割を示すS1P2-Akt阻害-eNOS阻害を含む新規内皮シグナル経路を同定した。そして、この同定した知見は、アナフィラキシーの新規治療薬開発だけでなく、「血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状」に関する治療薬の開発に役に立つ。
急性アナフィラキシーモデルにおいて、S1P2欠失は、血漿中のヒスタミン濃度の増加に影響を与えることなく、低血圧、血管透過性、低体温及び致死のすべてを大いに悪化させることを確認した（参照：図１、４及び５）。さらに、S1P2欠失は、アナフィラキシーメディエーターであるPAFの投与によって起因する血管透過性及び致死を悪化させた（参照：図２）。
また、本実施例では、初めて、内皮S1P2がeNOSの活性を阻害することを示した（参照：図６）。すなわち、S1P2欠失は、アナフィラキシーのeNOSの活性を阻害することができない（参照：図３）。さらに、S1pr2-/-マウスの遺伝的又は薬理学的処置によるeNOS阻害は、顕著に、抗原チャレンジ後の生存率、血管透過性、低血圧及び低体温を改善しており、S1P2欠失効果を中和している（参照：図５）。すべてのこれらのデータは、「S1P2は、eNOSを阻害することによるアナフィラキシーに対する保護効果を提供していること」を示す。
肺ECにおいて、PAFは、細胞間接触によるVE-カドヘリン及びβ-カテニン間の崩壊を誘導し、さらにS1P2欠失では崩壊を悪化させる（参照：図７Ａ）。注目すべき結果として、eNOSの薬理学的阻害は、「S1pr2-/-又はWT ECでの接着結合の崩壊を防ぐことにより、NOがPAF-誘導接着結合の崩壊及びS1P2欠失による悪化に関与していること」を示した。S1P有無条件下でのPAF投与は、S1pr2-/-ECでのβ-カテニンのS-ニトロシル化を増強したが、WT ECでは増強しなかった（参照：図７Ｂ）。それゆえに、S1P2は、β-カテニンのS-ニトロシル化の阻害及びそれに続く接着結合の崩壊に関与する機構を介しての関門機能の保護効果を示している。
S1P1及びS1P2は、異なるシグナルパスウエイを活性化させることが知られている。S1P1は、S1P2とは異なり、Gi-PI3K-Aktを介して、eNOSリン酸化を刺激することが知られている。一方、S1P2欠失は、血管透過性のベースラインに影響を与えずに、抗原チャレンジ、PAF投与、ヒスタミン投与後の血管透過性を向上させたことを示した（参照：図１及び２）。
【００５６】
すべての実施例の結果より、「S1P2は、Akt阻害を介したアナフィラキシーでのECのeNOS及びNO生成の刺激を抑制すること」を確認した。より詳細には、S1P2は、VE-カドヘリン及びβ-カテニンの解離、そして続けてβ-カテニンのS-ニトロシル化を阻害することによる細胞間接触の崩壊を保護することにより、血管漏出をブロッキングする。S1P2は、アナフィラキシーメディエーター誘発による血管透過性増大を中和するが、血管透過性ベースラインに影響を与えない。
以上により、S1P2-選択的アゴニストは、S1P1-選択的アゴニストとはまったく異なる、血管内皮関門障害（特に、アナフィラキシー）の治療剤になる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の新規スクリーニング方法により、血管内皮関門障害に関連した疾患又は症状を予防及び／又は治療するための治療薬を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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