(57)【要約】【課題】核酸の指数関数的増幅のためのニック形成および伸長増殖の提供。【解決手段】本発明は、一般に、一定温度における短鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の迅速な指数関数的増幅を対象とする。鎖置換増幅反応などの従来の増幅反応よりも短い配列をより迅速な時間枠において増幅するニック形成反応および伸長反応に依存する、標的の核酸配列を増幅する方法が提供される。本発明の別の実施形態は、例えば、等温条件下において、標的配列を増幅する２つだけの鋳型と、１つまたは２つのニック形成酵素と、ポリメラーゼとを用いる反応を含む。【選択図】図１Ａ
2014073137.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、一定温度における短鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の迅速な指数関数的増幅を対象とする。
【０００２】
関連出願
参照され、参考としてその全体が本明細書に援用される、２００７年７月１４日に出願された「Ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」という名称の米国特許出願第１１／７７８，０１８号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
有害な分子種の存在を迅速に検出することも、対象領域の遺伝子配列を迅速に決定することも可能なシステムに対する必要が急激に高まるにつれ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断法の分野が急速に拡大しつつある。現在の分子診断法は、バイオマーカーの検出を中心とし、小分子検出、免疫ベースのアッセイ、および核酸検査を含む。２本の相補的であるかまたは実質的に相補的な核酸鎖間における生来の特異性により、固有のＤＮＡまたはＲＮＡを用いる迅速で特異的な認識が可能となり、その単純さは、核酸検査を有望なものとしている。細菌性およびウイルス性の危険な作用物質、遺伝子改変された食品、および疾患管理のための単一塩基多型の同定は、これらの分子診断ツールの発展が極めて有利となるいくつかの領域に過ぎない。これらの高まる必要を満たすために核酸増幅法が開発され、これらの特異性および感度の必要に合わせて調整されている。
【０００４】
歴史的に、最も一般的な増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは、その信頼性および特異性のために、多くの場合において、検出法のゴールドスタンダードとなっている。この技法は、ｄｓＤＮＡを変性させるステップと、短鎖オリゴヌクレオチドプライマーをアニールするステップと、熱安定性ポリメラーゼにより鋳型に沿ってプライマーを伸長させるステップとを経るのに、温度循環を必要とする。工学における多くの新規の発展は、これらの反応時間を２０〜３０分間まで短縮するのに成功したが、これらのサーモサイクリングユニットの必要を満たすには、なお大幅な累乗倍の必要が存在する。
【０００５】
温度循環に対する必要を回避するために、各種の等温増幅法が開発されてきた。ＤＮＡおよびＲＮＡの等温増幅法は、この要求から出現した。
【０００６】
転写媒介増幅（ＴＭＡ）は、ＲＮアーゼ活性を有する逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、および５’末端においてプロモーター配列を有するプライマーを用いる。逆転写酵素がプライマーからｃＤＮＡを合成し、ＲＮＡ標的を分解し、逆方向プライマーの結合後に第２鎖を合成する。次いで、ＲＮＡポリメラーゼがｄｓＤＮＡのプロモーター領域に結合し、さらなる逆転写の鋳型として用い得る新規のＲＮＡ転写物を転写する。該反応は、２０〜３０分間で１０億倍の増幅をもたらし得る。このシステムは、他のＤＮＡ増幅法ほどに頑健でなく、したがって、無菌の実験室外におけるＲＮアーゼの遍在のために、現場で展開可能な検査ではない。この増幅法は、自家持続配列複製（３ＳＲ）および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）と極めて類似するが、用いられる酵素が異なる。
【０００７】
単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）もまた、複数のポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨを伴う。まず、逆転写酵素が、ＲＮＡ標的に沿ってキメラプライマーを伸長させる。ＲＮアーゼＨが該ＲＮＡ標的を分解し、ＤＮＡポリメラーゼにｃＤＮＡの第２鎖を合成させる。次いで、ＲＮアーゼＨがキメラプライマーの一部を分解してｃＤＮＡの一部を放出し、結合部位を開放して次のキメラプライマーに結合させ、増幅過程は再度該サイクルを経る。該直鎖状増幅システムが増幅できるＲＮＡ標的は、約３．５時間において極めて低レベルである。
【０００８】
Ｑ−ベータレプリカーゼシステムは、プローブ増幅法である。最適の標的と相補的であるかまたは実質的に相補的なプローブ領域を、Ｑ−ベータレプリカーゼの天然鋳型であるＭＤＶ−１  ＲＮＡ内に挿入する。Ｑ−ベータ法は、合成される産物がそれ自体Ｑ−ベータレプリカーゼの鋳型であるようにＭＤＶ−１プラスミドを複製する結果、鋳型とすべき余剰のレプリカーゼが存在する限り、指数関数的な増幅がもたらされる。Ｑ−ベータ複製工程は、極めて高感度であるが、標的が存在するかどうかにかかわらず増幅が可能であるため、非特異的に結合した複製プラスミド試料をパージする複数回の洗浄ステップが必要とされる。指数関数的増幅の所要時間は約３０分間であるが、すべての洗浄ステップを含む総所要時間は約４時間である。
【０００９】
多数の等温ＤＮＡ増幅法もまた開発されてきた。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、プラスミドおよびウイルスの天然の複製に基づいて開発された。プライマーが、環状の鋳型に沿って伸長する結果として、一本鎖タンデムリピートが合成される。標的の存在下で鋳型を選択的に環状化させ、バックグラウンドの増幅を低減するためには、捕捉ステップ、洗浄ステップ、およびライゲーションステップが必要である。分岐増幅（ＲＡＭ）は、さらなる幾何級数的増幅のためのカスケーディングプライマーを添加する。この技法は、二本鎖または一本鎖の非特異的なサイズの増幅を伴う。
【００１０】
ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）は、熱安定性ヘリカーゼ（Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ）を活用してｄｓＤＮＡの二本鎖を解くことで一本鎖を作製し、次いで、これがポリメラーゼによるプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長に用いられる。熱安定性ＨＤＡ法は、非熱安定性ＨＤＡが必要とする付属タンパク質を必要としない。該反応は単一温度で実施することができるが、初期の熱変性によりプライマーを結合させることで、より多くの産物がもたらされる。７０〜１２０塩基対長の産物を増幅するための反応時間が、１時間を超えることが報告されている。
【００１１】
ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）は、鎖置換能を有する熱安定性ポリメラーゼと、４つ以上のプライマーとを用いる、高感度で特異的な等温増幅法である。プライマーは、標的に沿って、順方向および逆方向の方向に連続的にアニールするよう設計されている。外側プライマーの伸長が、伸長した内側プライマーを置換して一本鎖を放出する。各プライマーは、置換されると、ヘアピンへと閉じて自己プライミングおよびさらなるポリメラーゼ伸長を容易にする、ヘアピン端部を有するように設計される。さらなるループプライマーにより、増幅時間を短縮させることができるが、反応混合物が複雑となる。全体として、ＬＡＭＰは、増幅工程を進めるために標的にアニールしなければならない複数のプライマーにより極めて特異的であることが報告されているが、多重増幅する、すなわち、一度に複数の標的配列を増幅することが困難な増幅法である。反応は等温条件下で進行するが、二本鎖標的には、初期の熱変性ステップが必要とされる。増幅は２５〜５０分間で進行し、ラダーパターンの多様な長さの産物をもたらす。
【００１２】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、１９９２年にＷａｌｋｅｒらにより開発された。この増幅法は、２セットのプライマーと、鎖置換ポリメラーゼと、制限エンドヌクレアーゼとを用いる。バンパープライマーを用いて初期に伸長したプライマーを置換して一本鎖を作製し、次のプライマーに結合させる。制限部位は、プライマーの５’側領域内に存在する。合成された産物内にチオール修飾されたヌクレオチドを組み込み、合成された鎖の切断を阻害する。この修飾により、ポリメラーゼによる伸長が可能な該鎖のプライマー側にニック形成部位が作製される。この手法は、二本鎖標的に対する初期の熱変性ステップを必要とする。次いで、反応は、二本鎖標的領域の融点未満の温度で実行される。この方法を用いると、６０〜１００塩基対長の産物が、通常、３０〜４５分間で増幅される。
【００１３】
これらおよび他の増幅法は、例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；および非特許文献５で論じられている。これらの一般的な増幅法についての他の参考文献は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２；ならびに米国特許公開第２００３００８２５９０号、同第２００３０１３８８００号、同第２００４００５８３７８号、および同第２００６０１５４２８６号を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第７１１２４２３号明細書
【特許文献２】米国特許第５４５５１６６号明細書
【特許文献３】米国特許第５７１２１２４号明細書
【特許文献４】米国特許第５７４４３１１号明細書
【特許文献５】米国特許第５９１６７７９号明細書
【特許文献６】米国特許第５５５６７５１号明細書
【特許文献７】米国特許第５７３３７３３号明細書
【特許文献８】米国特許第５８３４２０２号明細書
【特許文献９】米国特許第５３５４６６８号明細書
【特許文献１０】米国特許第５５９１６０９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５６１４３８９号明細書
【特許文献１２】米国特許第５９４２３９１号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＶａｎＮｅｓｓ，  Ｊら、ＰＮＡＳ、２００３年、第１００巻、第８号、４５０４〜４５０９頁
【非特許文献２】Ｔａｎ，  Ｅ．ら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００５年、第７７巻、７９８４〜７９９２頁
【非特許文献３】Ｌｉｚａｒｄ，  Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９８年、第６巻、１１９７〜１２０２頁
【非特許文献４】Ｎｏｔｏｍｉ，  Ｔ．ら、ＮＡＲ、２０００年、第２８巻、第１２号、ｅ６３頁
【非特許文献５】Ｋｕｒｎ，  Ｎ．ら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、２００５年、第５１巻、第１０号、１９７３〜１９８１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本明細書では、例えば、鎖置換増幅反応などの従来の増幅反応よりも短い配列をより迅速な時間枠において増幅するニック形成反応および伸長反応に依存する、標的の核酸配列を増幅する方法が提供される。本発明の実施形態は、例えば、等温条件下において、標的配列を増幅する２つだけの鋳型と、１つまたは２つのニック形成酵素と、ポリメラーゼとを用いる反応を含む。例示的な実施形態において、ポリメラーゼおよびニック形成酵素は好熱性であり、反応温度はハイブリダイズされる標的領域の融点を大きく下回る。ニック形成酵素は、二本鎖である二重鎖中のただ１本の鎖にニックを形成するため、従来の鎖置換増幅の場合のような修飾ヌクレオチドの組込みは不要である。本発明の方法では、初期の熱変性ステップが必要とされない。反応の単純さにより、例示的な実施形態において、反応は極めて実行しやすく、サーモサイクラーなどの特別の装置を必要とせず、わずか約２．５〜約１０分間でゲノムＤＮＡに由来する２０〜３０ｍｅｒの産物を１０８から１０１０倍に増幅することが可能である。さらに、他の例示的な実施形態において、該方法には、別個の逆転写ステップなしに、ＲＮＡを増幅することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の第１の実施形態では、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性ポリメラーゼである。本発明の他の例において、該ポリメラーゼおよび前記ニック形成酵素は、３７℃、４２℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、または８５℃までの温度において安定である。特定の実施形態において、該ポリメラーゼは、６０℃まで安定である。該ポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩからなる群から選択することができる。
【００１９】
ニック形成酵素は、例えば、ニック形成酵素結合部位の上流においてニックを形成することもあり、例示的な実施形態において、ニック形成酵素は、ニック形成酵素結合部位の下流においてニックを形成することもある。特定の実施形態において、順方向および逆方向の鋳型は、同一のニック形成酵素により認識されるニック形成酵素結合部位を含み、前記第１および前記第２のニック形成酵素は同一である。ニック形成酵素は、例えば、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ、およびＮｔ．Ｂｐｕ１０Ｉからなる群から選択することができる。
【００２０】
本発明の特定の態様において、標的配列は、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む。
【００２１】
ＤＮＡ分子は、例えば、ゲノムＤＮＡであり得る。ＤＮＡ分子は、例えば、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡからなる群から選択することができる。特定の実施形態において、順方向鋳型は、逆方向鋳型と同じ濃度で提供される。他の例において、順方向鋳型は、１：１００〜１００：１の比の範囲にある逆方向鋳型に対する比で提供される。
【００２２】
本発明の他の例において、該方法は、第２のポリメラーゼの使用をさらに含む。増幅は、例えば、一定温度で実施される。この温度は、例えば、５４℃〜６０℃であり得る。反応が生じる時間について述べると、特定の例において、増幅反応は、１〜１０分間にわたり一定温度に保たれる。
【００２３】
本発明は、例えば、ゲル電気泳動、質量分析、ＳＹＢＲ  Ｉ蛍光、ＳＹＢＲ  ＩＩ蛍光、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−３、挿入色素検出、ＦＲＥＴ、分子ビーコン検出、表面捕捉、キャピラリー電気泳動、捕捉による検出を可能とする標識ヌクレオチドの組込み、蛍光分極、および側方流動捕捉からなる群から選択される方法により増幅産物を検出するステップをさらに含む。増幅産物は、例えば、少なくとも１つの捕捉プローブが固体表面上に固定化され、これが増幅された配列に結合する、例えば、固体表面法を用いて検出することができる。
【００２４】
本発明は、多重増幅に用いることができる。したがって、例えば、本発明の特定の実施形態では、少なくとも２つの標的配列が増幅可能である。「増幅可能である」とは、増幅反応が、少なくとも２つの標的配列を増幅するのに適切な鋳型および酵素を含むことを意味する。したがって、例えば、増幅反応は、少なくとも２つの標的配列を検出するように準備することができるが、検査される試料中に実際に存在する標的配列がただ１つの場合もあるため、実際に増幅される配列がただ１つであっても、いずれの配列も増幅可能である。または、２つの標的配列が存在する場合、増幅反応の結果、いずれの標的配列の増幅ももたらされ得る。多重増幅反応は、該反応がそのために適切な鋳型および酵素を含む標的配列の１つ、いくつか、またはすべての増幅を結果としてもたらし得る。
【００２５】
少なくとも１つの鋳型は、例えば、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００２６】
また、本発明の実施形態として、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記逆方向鋳型が、該標的配列の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを、前記ポリメラーゼが前記逆方向鋳型を前記標的配列に沿って伸長させる条件下において提供するステップと；前記伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列の５’末端と同一の３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含む方法も提供される。
【００２７】
当業者は、二本鎖核酸の標的配列の増幅および増幅産物の検出に関する、本明細書で提示される例がまた、一本鎖核酸の標的配列の増幅および増幅産物の検出にも適用されることを理解する。さらに、本発明の例において、標的配列は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体、またはｓｉＲＮＡなどであるがこれらに限定されない、例えば、ＲＮＡであり得る。例えば、標的配列がＲＮＡである、本発明の例示的な実施形態において、ポリメラーゼは逆転写酵素活性を有する。本発明のさらに他の例において、標的配列は、例えば、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡであるか、または、例えば、標的配列は、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡ、もしくはまたＰＣＲ産物からなる群から選択される。
【００２８】
本発明による方法が複数のポリメラーゼの使用を伴う場合、例示的な実施形態では、少なくとも１つのポリメラーゼが逆転写酵素活性を有し得る。
【００２９】
本発明の他の実施形態では、標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む、核酸増幅のための第１鋳型と；前記標的配列のアンチセンス鎖の５’末端と同一の３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む、核酸増幅のための第２鋳型とを含み；前記標的配列が、該アンチセンス鎖の前記３’末端と前記アンチセンス鎖の前記５’末端との間に、いずれの鋳型にも結合しない１〜５のスペーサー塩基を含む、オリゴヌクレオチド鋳型のセットが提供される。
【００３０】
さらに他の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼと；標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む、核酸増幅のための第１鋳型と；標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む、核酸増幅のための第２鋳型と；いずれか１つの酵素が、前記第１鋳型および前記第２鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であるか、または第１酵素が前記第１プライマーのニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、第２酵素が前記第２プライマーの酵素部位においてニックを形成することが可能である、１つまたは２つの熱安定性ニック形成酵素とを含む、核酸増幅のための本発明の方法に従うためのキットが提供される。
【００３１】
キットは、例えば、容器内において、前記ポリメラーゼと、ニック形成酵素と、鋳型とを提供し得る。キットは、例えば、２つの容器内において、前記ポリメラーゼと、ニック形成酵素と、鋳型とを提供し得る。特定の例では、該ポリメラーゼおよびニック形成酵素が第１の容器内にあり、前記鋳型が第２の容器内にある。特定の例において、該ポリメラーゼおよびニック形成酵素は凍結乾燥されている。キットは、例えば、本発明の増幅法に従うための指示書をさらに含み得る。キットは、例えば、キュベットをさらに含み得る。キットは、例えば、側方流動装置またはディップスティックをさらに含み得る。側方流動装置またはディップスティックは、例えば、増幅産物に結合する捕捉プローブをさらに含み得る。キットは、例えば、蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、ポリスチレンビーズなどからなる群から選択される検出器構成要素をさらに含み得る。他の例において、キットの少なくとも１つの鋳型は、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含み得る。
【００３２】
増幅反応には、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）が含まれている。１種または複数種のｄＮＴＰを修飾または標識することができるが、本明細書で論じる通り、本方法において修飾ＮＴＰは必要とされない。ヌクレオチドは、以下の通りに称する。リボヌクレオシド三リン酸は、ＮＴＰまたはｒＮＴＰと称し、Ｎは、特定のリボヌクレオチドを示すＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはｍ５Ｕであり得る。デオキシヌクレオシド三リン酸基質は、ｄＮＴＰと示し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵであり得る。本文全体において、単量体のヌクレオチドサブユニットは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴと示し、ＤＮＡまたはＲＮＡを具体的に指示しない。
【００３３】
別の実施形態では、核酸の増幅方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列と；該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含む順方向鋳型と；該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含む逆方向鋳型と；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素と；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素と；好熱性ポリメラーゼとを含む、標的核酸の混合物を形成するステップを含む方法が提供される。特定の実施形態では、順方向および逆方向の鋳型上におけるニック形成酵素結合部位が同一のニック形成酵素により認識され、ただ１つのニック形成酵素が反応に用いられる。
【００３４】
別の実施形態では、核酸の増幅方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；一本鎖標的配列と；該標的配列の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成酵素結合部位および前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含む逆方向鋳型と；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素と；前記逆方向鋳型を前記標的配列に沿って伸長させる条件下における好熱性ポリメラーゼと；該標的配列の５’末端と同一であるかまたは実質的に同一の３’末端における認識領域とを含む核酸配列を含む順方向鋳型と；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素とを含む、標的核酸の混合物を形成するステップを含む方法が提供される。特定の実施形態では、順方向および逆方向の鋳型上におけるニック形成酵素結合部位が同一のニック形成酵素により認識され、ただ１つのニック形成酵素が反応に用いられる。
【００３５】
本発明の他の実施形態では、本発明の増幅法により得られる増幅された核酸の分離のための方法が提供される。本発明のさらなる実施形態では、例えば、ＳＹＢＲ  Ｉ、ＩＩ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−３、および大半の挿入色素、分子ビーコン、ＦＲＥＴ、蛍光を伴う固定化プローブを用いる表面捕捉、電気化学、または比色検出、質量分析、キャピラリー電気泳動、捕捉もしくは蛍光分極による検出を可能とする標識ヌクレオチドの組込み、側方流動を用いる方法、ならびに捕捉プローブを伴う他の方法を含む、本発明の増幅法により得られる増幅された核酸を検出および／または分析する方法が提供される。
【００３６】
検出に捕捉プローブを用いる方法は、例えば、捕捉プローブが増幅された核酸に結合するように、増幅産物鎖と相補的であるかまたは実質的に相補的な配列を含む核酸分子（捕捉プローブ）の使用を含む。特定の実施形態において、該プローブは、検出可能な標識に連結することができ、増幅産物は、増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブの検出可能な標識に基づいて検出することができる。該反応は、例えば、捕捉プローブ内に組み込まれるか、またはこれに結合する分子に対して方向づけられる抗体をさらに含む。あるいは、例えば、捕捉プローブ、または捕捉プローブに結合する分子は、例えば、酵素標識、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、もしくはベータ−ガラクトシダーゼ、例えば、フルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光標識、または、例えば、化学発光活性もしくは生物発光活性を有する他の分子を組み込み得る。一部の実施形態において、プローブは固体支持体に連結され、増幅産物鎖は、当業者により知られ選択される条件下で、固体支持体に連結された捕捉プローブに特異的に固定化され得る。後者の実施形態において、固体支持体に固定化された増幅産物は、洗浄、イオン交換、固体支持体からの放出、または他の処理ステップなどの処理ステップにかけることができる。一部の実施形態において、増幅産物は、固体支持体に固定化されたときに検出され得る。本発明の実施形態はまた、これらの検出法および分析法の組合せも含む。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
ヌクレオチド配列の増幅方法であって、ポリメラーゼが鋳型核酸を伸長させ、これにより、伸長された鋳型核酸のアンプリコンが得られる条件下で、
増幅反応において、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸を、（ｉ）ポリメラーゼ、（ｉｉ）上記標的ヌクレオチド配列の第１鎖にハイブリダイズする第１鋳型核酸、および（ｉｉｉ）上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の相補体にハイブリダイズする第２鋳型核酸と混合するステップを含み、
上記標的ヌクレオチド配列が２０〜４０ヌクレオチド長であり、
上記標的ヌクレオチド配列が約１０分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅され、
上述のステップが実質的な等温条件下で実施される方法。
（項目２）
ヌクレオチド配列の増幅方法であって、ポリメラーゼが鋳型核酸を伸長させ、これにより、伸長された鋳型核酸のアンプリコンが得られる条件下で、
増幅反応において、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸を、（ｉ）ポリメラーゼ、（ｉｉ）上記標的ヌクレオチド配列の第１鎖にハイブリダイズする第１鋳型核酸、および（ｉｉｉ）上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の相補体にハイブリダイズする第２鋳型核酸と混合するステップを含み、
上記標的ヌクレオチド配列が２０〜４０ヌクレオチド長であり、
上記第１鋳型が上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第１鋳型認識領域を含む核酸配列を含み、
上記第２鋳型が上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の相補体の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第２鋳型認識領域を含むヌクレオチド配列を含み、
上記標的ヌクレオチド配列が、上記第１鋳型認識領域と上記第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含み、
上記標的ヌクレオチド配列が約１０分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅され、上述のステップが実質的な等温条件下で実施される方法。
（項目３）
ヌクレオチド配列の増幅方法であって、ポリメラーゼが鋳型核酸を伸長させ、これにより、伸長された鋳型核酸のアンプリコンが得られる条件下で、
増幅反応において、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸を、（ｉ）ポリメラーゼ、（ｉｉ）上記標的ヌクレオチド配列の第１鎖にハイブリダイズする第１鋳型核酸、および（ｉｉｉ）上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の相補体にハイブリダイズする第２鋳型核酸と混合するステップを含み、
上記第１鋳型が上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の第１鋳型認識領域を含む核酸配列を含み、
上記第２鋳型が上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の相補体の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の第２鋳型認識領域を含むヌクレオチド配列を含み、
上記標的ヌクレオチド配列が約１０分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅され、上述のステップが実質的な等温条件下で実施される方法。
（項目４）
上記第１鋳型が、上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第１鋳型認識領域を含む核酸配列を含み、
上記第２鋳型が、上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖の相補体の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第２鋳型認識領域を含むヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記第１鋳型認識領域と上記第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記第１鋳型および第２鋳型が、上記認識部位の上流にあるニック形成酵素結合部位とニック形成部位とを含み、上記増幅反応が、順方向および逆方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能である１つまたは複数のニック形成酵素をさらに含み、１つのニック形成酵素で上記鋳型の両方にニックを形成することが可能であるか、または少なくとも１つのニック形成酵素により各鋳型にニックを形成することが可能であり、上記１つまたは複数のニック形成酵素が、上記標的配列内においてニックを形成しない、項目２、３、４、または５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記第１鋳型認識領域と上記第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１ヌクレオチド多く含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記第１鋳型認識領域と上記第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも２ヌクレオチド多く含む、項目６に記載の方法。
（項目９）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記第１鋳型認識領域と上記第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも３ヌクレオチド多く含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
上記標的核酸が二本鎖または一本鎖である、項目１から９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
上記標的核酸が二本鎖ＤＮＡである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記標的核酸が一本鎖ＤＮＡである、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
上記標的核酸がＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
上記標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、および合成二本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
上記標的核酸が、ウイルスＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡからなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
上記標的核酸が、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体、および合成ＲＮＡからなる群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
上記ＤＮＡポリメラーゼが好熱性ポリメラーゼである、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
上記ポリメラーゼが、Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩからなる群から選択される、項目１から１６のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
上記ポリメラーゼがＢｓｔ（大断片）である、項目１から１９のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
上記第１および第２の鋳型が、同一のニック形成酵素により認識されるニック形成酵素結合部位を含み、上記第１および上記第２のニック形成酵素が同一である、項目６から１２のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
上記ニック形成酵素が、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ、およびＮｔ．Ｂｐｕ１０Ｉからなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
上記標的ヌクレオチド配列の上記第１鎖と相補的であるかまたは実質的に相補的な上記第１鎖の核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であり、上記標的ヌクレオチド配列と相補的であるかまたは実質的に相補的な上記第２鎖の部分が８〜１５ヌクレオチド長である、項目１から２０のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
上記第１鋳型が上記第２鋳型と同じ濃度で提供される、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
上記第１または第２鋳型のうちの一方が、他方の鋳型に対して１：１００〜１００：１の比の範囲で提供される、項目１から２２のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
第２のポリメラーゼをさらに含む、項目１から２５のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
上記第１または第２のポリメラーゼの少なくとも１つが逆転写酵素活性を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記増幅が５４℃〜６０℃で実施される、項目１から２６のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
上記増幅が５６℃〜５８℃で実施される、項目１から２６のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
上記増幅反応が１〜１０分間にわたり一定温度に保持される、項目１から２８のいずれかに記載の方法。
（項目３０）
上記増幅反応が１〜２０分間にわたり一定温度に保持される、項目１から２８のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
増幅産物を検出するステップをさらに含む、項目１から３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
上記増幅産物が、ゲル電気泳動、質量分析、ＳＹＢＲ  Ｉ蛍光、ＳＹＢＲ  ＩＩ蛍光、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−３、挿入色素検出、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン検出、表面捕捉、キャピラリー電気泳動、捕捉による検出を可能とする標識ヌクレオチドの組込み、蛍光分極、および側方流動捕捉からなる群から選択される検出法により検出される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
少なくとも２つの標的配列が増幅可能である、項目１から３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
上記増幅産物が固体表面上において検出される、項目１から３３のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
少なくとも１つの捕捉プローブが固体表面上に固定化される、項目１から３４のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
少なくとも１つの上記鋳型が、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む、項目１から３５のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
上記標的ヌクレオチド配列が約５分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅される、項目１から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
上記標的ヌクレオチド配列が約２．５分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅される、項目１から３６のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
上記標的ヌクレオチド配列が約５分間で１Ｅ＋７倍以上に増幅される、項目１から３６のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
上記標的ヌクレオチド配列が約５分間で１Ｅ＋８倍以上に増幅される、項目１から３６のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
上記標的ヌクレオチド配列が約５分間で１Ｅ＋９倍以上に増幅される、項目１から３６のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が上記ニック形成部位または上記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において、
ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、
ｉ）上記順方向鋳型が、上記標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、上記標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であり、
ｉｉ）上記逆方向鋳型が、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含み、上記標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと、
ｂ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位の上流、下流、または上記部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｃ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位の上流、下流、または上記部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと、
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと
を含む方法。
（項目４３）
一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、
ａ）一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、上記逆方向鋳型が、上記標的配列の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、上記標的配列の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと、
ｂ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを、上記ポリメラーゼが上記逆方向鋳型を上記標的配列に沿って伸長させる条件下において提供するステップと、
ｄ）上記伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、上記順方向鋳型が上記伸長した逆方向鋳型の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、上記標的アンチセンス鎖の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと、
ｅ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においても、上記標的配列の相補体内においてもニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと
を含み、上記ポリメラーゼが上記順方向および逆方向の鋳型を上記標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、上記ニック形成酵素が上記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において増幅が実施される方法。
（項目４４）
上記ＤＮＡポリメラーゼが好熱性ポリメラーゼである、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４５）
上記ポリメラーゼが、Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩからなる群から選択される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４６）
上記ポリメラーゼがＢｓｔ（大断片）である、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４７）
上記ニック形成酵素が、上記ニック形成酵素結合部位の下流においてニックを形成する、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４８）
上記順方向および逆方向の鋳型が、同一のニック形成酵素により認識されるニック形成酵素結合部位を含み、上記第１および上記第２のニック形成酵素が同一である、項目４２または４３に記載の方法。
（項目４９）
上記ニック形成酵素が、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ、およびＮｔ．Ｂｐｕ１０Ｉからなる群から選択される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５０）
上記標的配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５１）
上記標的配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１ヌクレオチド多く含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５２）
上記標的配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも２ヌクレオチド多く含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５３）
上記標的ＤＮＡ分子が、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡからなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目５４）
上記標的核酸が、ウイルスＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ前駆体からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目５５）
上記順方向鋳型が上記逆方向鋳型と同じ濃度で提供される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５６）
上記順方向鋳型または上記逆方向鋳型のうちの一方が、他の鋳型に対して１：１００〜１００：１の比の範囲の比で提供される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目５７）
第２のポリメラーゼをさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目５８）
上記ポリメラーゼの少なくとも１つが逆転写酵素活性を含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
上記増幅が５４℃〜６０℃で実施される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６０）
上記増幅反応が１〜１０分間にわたり一定温度に保持される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６１）
上記増幅産物を検出するステップをさらに含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６２）
上記増幅産物が、ゲル電気泳動、質量分析、ＳＹＢＲ  Ｉ蛍光、ＳＹＢＲ  ＩＩ蛍光、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−３、挿入色素検出、ＦＲＥＴ、分子ビーコン検出、表面捕捉、キャピラリー電気泳動、捕捉による検出を可能とする標識ヌクレオチドの組込み、蛍光分極、および側方流動捕捉からなる群から選択される方法により検出される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６３）
少なくとも２つの標的配列が増幅可能である、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６４）
上記増幅産物が固体表面上において検出される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６５）
少なくとも１つの捕捉プローブが固体表面上に固定化される、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６６）
少なくとも１つの上記鋳型が、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む、項目４２または４３に記載の方法。
（項目６７）
二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が上記ニック形成部位または上記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において、
ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、
ｉ）上記順方向鋳型が、上記標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、
ｉｉ）上記逆方向鋳型が、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含み、
ｉｉｉ）上記標的配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含むステップと、
ｂ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｃ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと、
ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと
を含む方法。
（項目６８）
一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、
ａ）一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、上記逆方向鋳型が、上記標的配列の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、上記標的配列の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと、
ｂ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｃ）ＤＮＡポリメラーゼを、上記ポリメラーゼが上記逆方向鋳型を上記標的配列に沿って伸長させる条件下において提供するステップと、
ｄ）上記伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、上記順方向鋳型が上記伸長した逆方向鋳型の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、上記標的配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含むステップと、
ｅ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においても、上記標的配列の相補体内においてもニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと
を含み、上記ポリメラーゼが上記順方向および逆方向の鋳型を上記標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、上記ニック形成酵素が上記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において増幅が実施される方法。
（項目６９）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１ヌクレオチド多く含む、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７０）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも２ヌクレオチド多く含む、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７１）
上記標的ヌクレオチド配列が、上記順方向鋳型認識領域と上記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも３ヌクレオチド多く含む、項目６７または６８に記載の方法。
（項目７２）
二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が上記ニック形成部位または上記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において、
ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、
ｂ）上記順方向鋳型が、上記標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、
ｃ）上記逆方向鋳型が、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと、
ｄ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｅ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと、
ｆ）ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと
を含む方法。
（項目７３）
二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が上記ニック形成部位または上記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において、
ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、
ｂ）上記順方向鋳型が、上記標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、
ｉｉ）上記逆方向鋳型が、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと、
ｃ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位の上流、下流、または上記部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｄ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位の上流、下流、または上記部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと、
ｅ）ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと
を含む方法。
（項目７４）
二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が上記ニック形成部位または上記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において、
ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、
ｂ）上記順方向鋳型が、上記標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、
ｃ）上記逆方向鋳型が、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと、
ｄ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｅ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと、
ｆ）ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと
を含み、１２分間にわたって増幅反応を実行すると、２２〜３５ヌクレオチド長の標的配列の少なくとも１Ｅ＋７倍の増幅が得られる方法。
（項目７５）
二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が上記ニック形成部位または上記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において、
ａ）センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、
ｂ）上記順方向鋳型が、上記標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、上記標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であり、
ｃ）上記逆方向鋳型が、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含み、上記標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと、
ｄ）上記順方向鋳型の上記ニック形成部位の上流、下流、または上記部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと、
ｅ）上記逆方向鋳型の上記ニック形成部位の上流、下流、または上記部位においてニックを形成することが可能であり、上記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと、
ｆ）ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと
を含み、１２分間にわたって増幅反応を実行すると、２２〜３５ヌクレオチド長の標的配列の少なくとも１Ｅ＋７倍の増幅が得られる方法。
（項目７６）
核酸の標的配列を増幅するためのキットであって、
ａ）ＤＮＡポリメラーゼと、
ｂ）標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長である核酸増幅のための第１鋳型と、
ｃ）標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、上記標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的な核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長である核酸増幅のための第２鋳型と、
ｄ）いずれか１つの酵素が、上記第１および上記第２の鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であるか、または第１酵素が上記第１プライマーのニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、第２酵素が上記第２プライマーの酵素部位においてニックを形成することが可能である、１つまたは２つの熱安定性ニック形成酵素と
を含むキット。
（項目７７）
上記標的配列が、上記第１鋳型認識領域と上記第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む、項目７６に記載のキット。
（項目７８）
上記ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が容器内にある、項目７６に記載のキット。
（項目７９）
上記ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が２つの容器内にある、項目７６に記載のキット。
（項目８０）
上記ポリメラーゼおよびニック形成酵素が第１の容器内にあり、上記鋳型が第２の容器内にある、項目７６に記載のキット。
（項目８１）
上記ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が乾燥凍結される、項目７６に記載のキット。
（項目８２）
上記増幅方法に従うための指示書をさらに含む、項目７６に記載のキット。
（項目８３）
キュベットをさらに含む、項目７６に記載のキット。
（項目８４）
側方流動装置またはディップスティックをさらに含む、項目７６に記載のキット。
（項目８５）
上記側方流動装置またはディップスティックが捕捉プローブをさらに含む、項目８４に記載のキット。
（項目８６）
蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、ポリスチレンビーズからなる群から選択される検出器構成要素をさらに含む、項目７６に記載のキット。
（項目８７）
少なくとも１つの上記鋳型が、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む、項目７６に記載のキット。
（項目８８）
核酸の標的配列を増幅するためのキットであって、
ａ）ＤＮＡポリメラーゼと、
ｂ）標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸増幅のための第１鋳型と、
ｃ）上記標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、上記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、上記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸増幅のための第２鋳型であって、上記標的配列が、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む、第２鋳型と、
ｄ）いずれか１つの酵素が、上記第１および上記第２の鋳型の上記ニック形成部位においてニックを形成することが可能であるか、または第１酵素が上記第１プライマーのニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、第２酵素が上記第２プライマーの酵素部位においてニックを形成することが可能である、１つまたは２つの熱安定性ニック形成酵素と
を含むキット。
（項目８９）
上記標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的である上記第１鋳型の核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であり、上記標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的である上記第２鋳型の核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長である、項目８８に記載のキット。
（項目９０）
上記ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が容器内にある、項目８８に記載のキット。
（項目９１）
上記ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が２つの容器内にある、項目８８に記載のキット。
（項目９２）
上記ポリメラーゼおよびニック形成酵素が第１の容器内にあり、上記鋳型が第２の容器内にある、項目８８に記載のキット。
（項目９３）
上記ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が乾燥凍結される、項目８８に記載のキット。
（項目９４）
上記増幅方法に従うための指示書をさらに含む、項目８８に記載のキット。
（項目９５）
キュベットをさらに含む、項目８８に記載のキット。
（項目９６）
側方流動装置またはディップスティックをさらに含む、項目８８に記載のキット。
（項目９７）
上記側方流動装置またはディップスティックが捕捉プローブをさらに含む、項目９６に記載のキット。
（項目９８）
蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、ポリスチレンビーズからなる群から選択される検出器構成要素をさらに含む、項目８８に記載のキット。
（項目９９）
少なくとも１つの上記鋳型が、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む、項目８８に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】本発明の反応のメカニズムを示すグラフ図である。図１Ｄは、図１の説明である。
【図１Ｂ】本発明の反応のメカニズムを示すグラフ図である。図１Ｄは、図１の説明である。
【図１Ｃ】本発明の反応のメカニズムを示すグラフ図である。図１Ｄは、図１の説明である。
【図１Ｄ】本発明の反応のメカニズムを示すグラフ図である。図１Ｄは、図１の説明である。
【図２】ＤＮＡのＮＥＡＲ（商標）アッセイからの反応産物の２０％ポリアクリルアミドゲルの図である。
【００３８】
本発明の方法に従った反応を５６℃で２．５分間実施し、次いで９４℃で４分間熱変性させた。６マイクロリットルの反応混合物を約２．５時間１６０Ｖにおいて２０％ポリアクリルアミドゲルに施した。ゲルはＳＹＢＲＩＩゲル染色液で染色した。レーン１：２５ｍｅｒアッセイの標的対照なし。レーン２：２７ｍｅｒアッセイの標的対照なし。レーン３：ゲノムＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＮＡの３．５Ｅ＋５コピーを用いた２５ｍｅｒアッセイ用。レーン４：ゲノムＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＮＡの１．１Ｅ＋６コピーを用いた２７ｍｅｒアッセイ用。
【図３】本発明の方法を使用するＲＮＡアッセイからの反応産物の２０％ポリアクリルアミドゲルの図である。
【００３９】
反応は５６℃で１２分間実施し、次いで９４℃で４分間熱変性させた。６マイクロリットルの反応混合物を約２．５時間１６０Ｖにおいて２０％ポリアクリルアミドゲルに施した。ゲルはＳＹＢＲＩＩゲル染色液で染色した。レーン１および２：Ｅｂｏｌａ  Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ）の１Ｅ＋６コピーを用いた２５ｍｅｒアッセイの反応用。レーン３および４：２５ｍｅｒアッセイの標的対照なしの反応。２５ｍｅｒの反応産物は白枠で輪郭を描く。
【図４】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＤＮＡアッセイ産物の質量スペクトルの図である。
【００４０】
Ａ）標的の０コピーまたはＢ）反応に加えたゲノムＤＮＡの５Ｅ＋５コピー。反応は１０分間実施し、次いで９４℃で４分間熱変性させた。１０マイクロリットルの試料をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳに注入した。２６ｍｅｒ産物およびその相補配列の（−４）の荷電状態を黒枠で輪郭を描く。最小隣接ピークは主要産物のナトリウム付加物である。
【図５】ＭＳ２ゲノムＲＮＡアッセイ産物の質量スペクトルの図である。
【００４１】
Ａ）標的の０コピー、Ｂ）ＭＳ２ゲノムＲＮＡの１Ｅ＋６コピー、またはＣ）反応に加えた合成標的ＤＮＡの１Ｅ＋６コピー。反応は１０分間実施し、次いで９４℃で４分間熱変性させた。１０マイクロリットルの試料をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳに注入した。２７ｍｅｒ産物およびその相補配列の（−４）の荷電状態を黒枠で輪郭を描く。最小隣接ピークは主要産物のナトリウム付加物である。
【図６】蛍光挿入色素を使用した増幅の実時間検出の図である。
【００４２】
標的対照なし（ＮＴＣ、白色三角形）と比較した５００コピー（四角形）でのＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓのゲノムＤＮＡの実時間増幅。反応は５８℃で１０分間実施し、ＳＹＢＲＩＩを用いて実時間蛍光によってモニターした（ｎ＝５）。
【図７】蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用した増幅の実時間検出の図である。
【００４３】
標的対照なし（ＮＴＣ、白色三角形）と比較した１０，０００コピー（四角形）でのＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓの合成ＤＮＡの実時間増幅。反応は５７℃で１０分間実施した、ｎ＝３。
【図８】分子ビーコンを使用して実時間で検出したＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのＤＮＡ増幅の図である。
【００４４】
０コピー（白色三角形）または１Ｅ＋５コピー（四角形）のいずれかを反応混合物に加え、５７．５℃で１０分間実施した。
【図９】平均ＡＵＣ値と比較した偽陽性率試験の結果の図である。
【００４５】
エラーバーは一標準偏差を示す。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアッセイは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡの存在下および不在下において５５℃で１０分間実施した。酵素は９４℃で４分間熱変性させた。１０μＬの試料をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳに注入し、産物ピークの濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を分析した。真陽性は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤＮＡの１０，０００コピーおよび近傍分類種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のＤＮＡの９９０，０００コピーを含有していた。真陰性は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡの１０，０００コピーおよび近傍分類種のＤＮＡの９９０，０００コピーを含有しており、水の陰性対照は対照としてＤＮＡを含有しなかった。
【図１０】異なる２日で実験を実施した異なるオペレーターによる、分子ビーコン検出を使用した複製試験の図である。
【００４６】
反応は（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡの５００コピーの存在下および不在下において）５７．５℃で１０分間実施し、９４℃で４分間熱殺菌した。３００ｎＭの分子ビーコンを加え４５、５０、および５７℃でモニターした（ｎ＝２４）。
【図１１】分子ビーコン検出を使用した反応の感度の図である。
【００４７】
アッセイは５７．５℃で１０分間実施した。９４℃における４分間の熱不活化ステップで反応を停止させた。３００ｎＭの分子ビーコンを加え、蛍光は５７．５℃でモニターした（ｎ＝３）。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡの１Ｅ＋６、５Ｅ＋５、５Ｅ＋４、５Ｅ＋２、５０、および０（ＮＴＣ）インプットコピーで増幅した反応混合物の存在下で始めてビーコンに関して蛍光をモニターし、ビーコン単独のバックグラウンド蛍光と比較した（ＭＢ）。
【図１２】ＮＥＡＲ反応における増幅産物の最終濃度の図である。
【００４８】
ＮＥＡＲ（商標）反応を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡの様々なコピーを用いて５５℃で１０分間実施した。９４℃における４分間の熱不活化ステップで反応を停止させた。１０マイクロリットルの試料をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳに注入し、１９４４ダルトンでの産物ピークのＡＵＣを分析し、標準曲線と比較した。
【図１３】インプットＲＮＡ標的コピー数と増幅産物の最終濃度の相関関係の図である。
【００４９】
ＥｂｏｌａのＮＥＡＲ（商標）アッセイは、ＥｂｏｌａゲノムＤＮＡに相当する合成ＲＮＡの様々なコピーを用いて５５℃で１２分間実施した。９４℃における４分間の熱不活化ステップで反応を停止させた。１０マイクロリットルの試料をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳに注入し、１９３６ダルトンでの産物ピークのＡＵＣを分析し、ＡＵＣ値の標準曲線と比較した。（ｎ＝３）
【図１４】ＮＥＡＲ反応特異性を実証する質量スペクトルによる産物の分析の図である。
【００５０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＮＥＡＲ（商標）反応を、５６℃で１０分間Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのコピーの希釈物の存在下で実施し（ｎ＝３）、次いで９４℃で４分間熱変性させた。１０μＬの試料をＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳに注入し、産物ピークのＡＵＣ値を分析した。
【図１５】増幅に対する干渉物質の影響の図である。
【００５１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤＮＡの反応は５５℃で１０分間実施し、９４℃で４分間加熱して停止させた。反応はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡの１Ｅ＋５コピーの存在下（「＿１Ｅ＋５」）または標的ＤＮＡの不在下（「＿０」）において三連で実施した。試料ｘは干渉物質を加えない対照アッセイである。干渉物質Ａ〜ＦはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアッセイに５０％の反応体積で加えた。質量スペクトルによる産物のピークのＡＵＣは二元ＡＮＯＶＡおよびボンフェロニのｔ−検定を使用して分析した。（キー：Ａ＝なし；Ｂ＝ハウスダスト、スキムミルク；Ｃ＝ＡＺ試験用ダスト、フミン酸；Ｄ＝ディーゼルのすす；Ｅ＝スキムミルク；Ｆ＝カビ胞子）
【図１６】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ／Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＤＮＡ二重鎖反応に関するゲル電気泳動の結果の図である。
【００５２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂｓ）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂａ）のＤＮＡの両方に特異的な鋳型を含めたＮＥＡＲ（商標）反応を、標的ＤＮＡの不在下（陰性）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのみの存在下（２７ｍｅｒ産物に関して陽性）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの両方の存在下（それぞれ２７ｍｅｒおよび２５ｍｅｒ産物に関して陽性）において実施した。このアッセイ中で使用した標的コピー数は５００，０００コピーであった。アッセイは５７℃で１０分間実施した。鋳型は増幅を制御するためのアッセイ間で濃度が異なっていた（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに関して１００ｎＭおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに関して５０ｎＭ）。試料は約２時間１６０Ｖにおいて２０％ポリアクリルアミドゲルに施した。ゲルはＳＹＢＲＩＩ蛍光色素で染色し、イメージングした。蛍光バンドは定量化し、積分光学濃度（ＩＯＤ）として分析した（ｎ＝８）。
【図１７】ゲル電気泳動によって示したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ／Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＤＮＡ二重鎖反応に関する特異性の結果の図である。
【００５３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂｓ）とＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂａ）のＤＮＡの両方用の鋳型を含むＮＥＡＲ（商標）反応を、標的ＤＮＡの不在下（陰性）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤＮＡのみの存在下（２７ｍｅｒ産物に関して陽性）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの両方のＤＮＡの存在下（それぞれ２７ｍｅｒおよび２５ｍｅｒ産物に関して陽性）において実施した。このアッセイ中存在したそれぞれのゲノムの標的コピー数は５００，０００コピーであった。すべての反応は、外因性核酸としてＢａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの５００，０００コピーを含有していた。鋳型は増幅を制御するためのアッセイ間で濃度が異なっていた。アッセイは５７℃で１０分間実施し、９４℃で４分間熱変性させ、６マイクロリットルを２０％ゲル上に載せ、約２時間１６０Ｖで実施した。ゲルはＳＹＢＲＩＩ蛍光色素で染色し、イメージングした。蛍光バンドは定量化し、積分光学濃度（ＩＯＤ）として分析した。
【図１８】ＭＳ２／ＥｂｏｌａのＲＮＡ二重鎖反応に関するゲル電気泳動の結果の図である。
【００５４】
ＭＳ２アッセイとＥｂｏｌａアッセイの両方用の鋳型を含むＮＥＡＲ（商標）反応を、標的ＲＮＡの不在下（陰性、レーン２〜５）、ＭＳ２のみの存在下（２７ｍｅｒ産物、レーン６および７）、およびＭＳ２のＲＮＡとＥｂｏｌａのＲＮＡの両方の存在下（２７ｍｅｒおよび２５ｍｅｒ産物、それぞれレーン８および９）において実施した。このアッセイ中で使用した標的コピー数は１Ｅ＋６コピーであった。アッセイは５７℃で１０分間実施した。鋳型は増幅を制御するためのアッセイ間で濃度が異なっていた。試料は約２．５時間１６０Ｖにおいて２０％ポリアクリルアミドゲルに施した。ゲルはＳＹＢＲＩＩ蛍光色素で染色し、イメージングした。蛍光バンドは定量化し、積分光学濃度（ＩＯＤ）として分析した。
【図１９】溶解胞子由来のＤＮＡの増幅の質量スペクトルによる分析の図である。
【００５５】
溶解試料と非溶解試料を比較した増幅産物質量からの平均ＡＵＣ値。次いで溶解胞子試料をマスター混合物に加え、５５℃で１０分間実施し、９４℃で４分間熱変性させ、分析用の質量スペクトルを施した。産物ピークのＡＵＣを平均し比較した。（ｎ＝３）
【図２０】表面検出用の捕捉および伸長手法の実証の図である。
【００５６】
Ａ．）平均結合（ポリメラーゼを加えない陽性反応産物）、Ｂ．）５００，０００の標的（ポリメラーゼを加えた陽性反応産物）、およびＣ．）標的なし（ポリメラーゼを加えた陰性反応）を比較する。ＮＥＡＲ（商標）アッセイは５５℃で１０分間実施し、９４℃で４分間熱変性させ、次いで５’末端で表面と結合した捕捉プローブをプレートに加えた。ポリメラーゼは陽性反応の１ウェルに加える。プレートは５５℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＳＹＢＲＩＩを加え、３回洗浄し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで読み取る（４９５ｎｍ励起／５３０ｎｍ発光）。
【図２１】ゲノムＤＮＡの１Ｅ＋６コピーの存在下（四角形）およびの不在下（白色三角形）において、表面に固定した一鋳型を用いるＮＥＡＲ（商標）ＦＲＥＴアッセイの擬似実時間蛍光検出の図である。
【００５７】
反応はニュートラアビジンで被覆した平底９６ウェルプレートにおいて実施した。１マイクロモルのＦＲＥＴ標識逆方向鋳型の溶液を、軽く混合しながら３７℃で１時間インキュベートした。ウェルはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で３回洗浄して非結合鋳型を切り離した。本発明の方法のＮＥＡＲ（商標）の反応混合物をウェルに加え（採取したそれぞれの時間地点の１つ）、１３５ＲＰＭに設定した振とうインキュベーター中の加熱ブロック部において５８℃でインキュベートした。１マイクロリットルのＥＤＴＡをウェルに加えて反応を停止させることによって時間地点を得た。蛍光はＴｅｃａｎ１００プレートリーダーを使用して底部から読み取った。
【図２２】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに関する検出限界アッセイの図である。一連のアッセイをＣｈｌａｍｙｄｉａ標的の２倍希釈物を使用して実施した。Ａ）３アッセイからの平均として検出限界を示す蛍光検出の棒グラフ。Ｂ）個々のアッセイの結果を示す棒グラフ。
【図２３】Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとＬ．ｉｎｎｏｃｕａの識別の図である。２つの異なる細菌を識別するためのアッセイの能力を決定するために実施した一連のアッセイの結果を示す棒グラフ。
【図２４】ウイルスＲＮＡを用いたアッセイの図である。ウイルスＲＮＡ標的の様々な希釈物を用いた本発明の方法の一連のアッセイの結果を示す棒グラフ。
【図２５】ｂａｒ遺伝子標的配列の検出用のアッセイの結果を示す棒グラフの図である。
【図２６】ｍｉＲＮＡ標的配列の検出用の本発明の方法のアッセイの結果を示す棒グラフの図である。
【図２７】Ｇｃアッセイ：ＬＯＤの図である。Ａ）ゲノム標的配列の検出用の一連のアッセイの平均を示す棒グラフ。Ｂ）それぞれ５０のゲノムコピーを含む個々のアッセイの結果。
【図２８】Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＮＥＡＲ（商標）アッセイの図である。Ａ）試料に加えた参照オリゴヌクレオチドの量と濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の間の相関関係を決定するための標準曲線。Ｂ）生成した特異的産物の量を決定するための本発明の方法のアッセイの結果を示す棒グラフ。Ｃ）アッセイの結果を示す表。
【図２９】スペーサー長試験の図である。Ａ）様々なスペーサー長の影響を決定するための本発明の方法のアッセイの結果を示す棒グラフ。Ｂ）異なるスペーサー長を得るために使用した鋳型配列。
【図３０】図２９中に示したアッセイ用に使用した鋳型設計の図である。
【図３１】安定化領域の影響の図である。Ａ）安定化領域を含むオリゴ鋳型、または安定化領域を含まないオリゴ鋳型のいずれかを使用する本発明の方法のアッセイの結果のグラフ。Ｂ）Ａ）のグラフの一部の拡大。
【図３２】Ｍｇ＋２濃度の滴定の図である。Ａ）様々な量のＭｇ＋２を使用するＮＥＡＲアッセイのセットの結果を示す棒グラフ。Ｂ）アッセイの構成要素を記載する表。
【図３３】本発明の方法の反応のメカニズムを示す図である。
【図３４Ａ】標的およびオリゴ鋳型配列の例の一覧の図である。
【図３４Ｂ】標的およびオリゴ鋳型配列の例の一覧の図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書では、短鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の指数関数的増幅のための方法が提供される。
【００５９】
本発明の標的核酸は、二本鎖および一本鎖の核酸分子を含む。該核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。標的核酸がＲＮＡ分子である場合、該分子は、例えば、二本鎖、一本鎖であることもあり、該ＲＮＡ分子は、一本鎖である標的配列を含むこともある。標的核酸は、例えば、ゲノム核酸、プラスミド核酸、ミトコンドリア核酸、細胞核酸、およびウイルス核酸を含む。標的核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、遺伝子、任意の種類の細胞ＲＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドであり得る。「ゲノム核酸」とは、例えば、胞子内に存在するゲノムを含む、例えば、動物ゲノム、植物ゲノム、昆虫ゲノム、および細菌ゲノムを含む任意のゲノムに由来する任意の核酸を意味する。二本鎖ＤＮＡの標的核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、および合成二本鎖ＤＮＡ、または本明細書で説明されるかもしくは当技術分野で知られる他の種類のＤＮＡを含む。一本鎖ＤＮＡの標的核酸は、例えば、ウイルスＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡ、または本明細書で説明されるかもしくは当技術分野で知られる他の種類のＤＮＡを含む。ＲＮＡの標的核酸は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体、ならびにｓｉＲＮＡ、または本明細書で説明されるかもしくは当技術分野で知られる他のＲＮＡを含む。
【００６０】
マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）は、遺伝子調節に関与する約２１〜２３ヌクレオチド長の短い一本鎖のＲＮＡ配列である。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡに対して部分的に相補的であるため、メッセンジャーＲＮＡの翻訳に干渉すると考えられる（例えば、Ｒｕｖｋｕｎ，  Ｇｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、７９７〜９９頁（２００１年）；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、８５４〜５８頁（２００１年）；Ｌａｕ，  Ｎ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、８５８〜６２頁（２００１年）；Ｌｅｅ，  Ｒ．Ｃ．およびＡｍｂｒｏｓ，  Ｖ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、８６２〜６４頁（２００１年）；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，  Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２００２〜０３頁（２００２年）；Ｌｌａｖｅ，  Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２０５３〜５６頁（２００２年）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，  Ｇ．およびＺａｍｏｒｅ，  Ｐ．Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２０５６〜６０頁（２００２年）を参照されたい）。ノックアウトマウスにおいて近年報告された研究によれば、マイクロＲＮＡはまた、免疫系においても役割を有し得る（例えば、Ｗａｄｅ，  Ｎ．、「Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｒｅｖｅａｌ  ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｔｉｍｅｓ、２００７年４月２７日を参照されたい）。本発明の方法を用いてもまた検出し得るマイクロＲＮＡ前駆体は、例えば、一次転写物（プリｍｉＲＮＡ）、およびｍｉＲＮＡへとさらにプロセシングされるプレｍｉＲＮＡというステム−ループ構造のＲＮＡを含む。
【００６１】
短鎖干渉ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、例えば、ウイルス複製または遺伝子発現の下方調節におけるＲＮＡ干渉に関与することが分かっている、少なくとも部分的に二本鎖で約２０〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である（例えば、Ｚａｍｏｒｅら、２０００年、Ｃｅｌｌ、第１０１巻、２５〜３３頁；Ｂａｓｓ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、４９４〜４９８頁；およびＫｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、国際ＰＣＴ公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、国際ＰＣＴ公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、国際ＰＣＴ公開第００／０１８４６号；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ、国際ＰＣＴ公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、国際ＰＣＴ公開第９９／０７４０９号；ならびにＬｉら、国際ＰＣＴ公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８１８〜１８１９頁；Ｖｏｌｐｅら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２２１５〜２２１８頁；ならびにＨａｌｌら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２２３２〜２２３７頁；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、２０５６〜６０頁；ＭｃＭａｎｕｓら、２００２年、ＲＮＡ、第８巻、８４２〜８５０頁；Ｒｅｉｎｈａｒｔら、２００２年、Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．、第１６巻、１６１６〜１６２６頁；ならびにＲｅｉｎｈａｒｔおよびＢａｒｔｅｌ、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９７巻、１８３１頁を参照されたい）。
【００６２】
「標的配列」という用語の使用は、センス鎖もアンチセンス鎖も指す場合があり、また、それらが標的核酸、元の標的配列の増幅されたコピー、または該配列の増幅産物上に存在する場合の配列も指す。増幅産物は、標的配列の他、少なくとも１つの他の配列または他のヌクレオチドを含むより大きな分子であり得る。標的配列の長さ、およびグアノシン：シトシン（ＧＣ）濃度（パーセント）は、反応が実行される温度に依存し、この温度は、反応で用いられるポリメラーゼおよびニック形成酵素の安定性に依存する。当業者は、試行アッセイを行って、反応条件に適切な該長さおよびＧＣ濃度を決定することができる。例えば、ポリメラーゼおよびニック形成酵素が６０℃まで安定である場合、標的配列は、例えば、１９〜５０ヌクレオチド長の場合もあり、例えば、２０〜４５、２０〜４０、２２〜３５、または２３〜３２ヌクレオチド長の場合もある。これらの条件下におけるＧＣ濃度は、例えば、６０％未満、５５％未満、５０％未満、または４５％未満であり得る。標的配列およびニック形成酵素は、標的配列が、反応混合物中に含まれるどのニック形成酵素に対するニック形成部位も含有しないように選択される。
【００６３】
標的配列は、胞子、ウイルス、細胞、原核動物もしくは真核動物に由来する核酸、または任意の遊離核酸を含有する試料を含むがこれらに限定されない多くの種類の試料から増幅することができる。例えば、アッセイでは、溶解の必要なしに、胞子の外側にあるＤＮＡを検出することが可能である。試料は、標的配列を含有することが疑われる任意の物質から単離することができる。例えば、動物、例えば、ヒトなどの哺乳類の場合、試料は、血液、骨髄、粘液、リンパ液、硬組織、例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、もしくは卵巣、生検、痰、唾液、涙液、便、または尿を含み得る。あるいは、標的配列は、空気、植物、土壌、または生物体を含有することが疑われる他の物質中に存在し得る。
【００６４】
標的配列は、粉塵、花粉、および煤煙（例えば、ディーゼル排気に由来する）などの環境汚染物質、または、尿、粘液、もしくは唾液などの臨床的に重要な基質もまた含有し得る試料中に存在し得る。標的配列はまた、排水、飲料水、空気、ミルク、または他の食品中にも存在し得る。これらの汚染物質の濃度に応じて、当業者に知られる試料精製法により、増幅の成功に対する阻害物質を除去することが必要とされ得る。精製は、例えば、洗浄剤溶解物、超音波処理、ガラス製ビーズによるボルテキシング、またはフレンチプレスの使用を伴い得る。この精製はまた、試料標的の濃縮も結果としてもたらし得る。試料はまた、例えば、濾過、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、または密度依存遠心分離によってもさらに精製することができる。具体的な実施形態において、試料は、標的核酸の予備精製なしに、反応混合物に直接に添加するか、またはあらかじめ希釈し、次いで、反応混合物に添加することができる。
【００６５】
オリゴヌクレオチドは、２つ以上、例えば、３つを超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子である。オリゴヌクレオチドの長さは、それがどのように用いられるかに依存する。オリゴヌクレオチドは、合成またはクローニングによって抽出することができる。
【００６６】
２つの核酸配列を指す場合の「相補的な」という用語は、一般に、２つの配列が、２つの核酸のハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖ヌクレオチド配列を安定化させるのに十分な水素結合を２つの核酸の間で形成する能力を指す。２つの配列において、一方の配列中におけるすべてのヌクレオチドは、他方の配列中における対応するヌクレオチドに相補的であり得る。一部の実施形態では、２つの配列中における対応するヌクレオチド（すなわち、非相補的ヌクレオチド）間には、例えば、１０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、２０ヌクレオチド中に１ミスマッチ、または３０ヌクレオチド中に１ミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在することがあり、本明細書では、これらの配列を「実質的に相補的な」と称する。図１Ａ〜１Ｄに示す通り、各鋳型核酸は、鋳型核酸がハイブリダイズする標的核酸鎖（またはその相補体）に相補的であるかまたは実質的に相補的な認識領域を含むことが多い。これもまた図１Ａ〜１Ｄに示す通り、各鋳型核酸は、標的核酸配列またはその相補配列に相補的でないかまたは実質的に相補的でない、認識領域の５’側の安定化領域およびニック作用物質の認識領域を含むことが多い。
【００６７】
本明細書で用いられる「ハイブリダイゼーション」および「結合」は互換的に用いられ、互いと相補的な核酸配列の非共有結合または「塩基対合」を指す。特定のプローブがポリヌクレオチド配列との塩基対合を保つかどうかは、相補性の程度、プローブの長さ、および結合条件の厳密性に依存する。厳密性を上昇させれば、相補性の程度も上昇させなければならず、かつ／または結合または塩基対合のためのプローブを長くして安定性を保たなければならない。
【００６８】
本明細書で用いられる「厳密性」とは、核酸がその下に置かれる、ｐＨの極限値、高温、および塩濃度など、二本鎖核酸を構成要素の一本鎖に解離させる条件の組合せを指す。「高度な厳密性」という表現は、特異的な塩基対合だけが生じるのに十分厳密であるかまたは制限的であるハイブリダイゼーション条件を指す。特異性は、標準的なサザンハイブリダイゼーションプロトコール（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、第９８巻、５０３頁（１９７５年）で説明される）の下で、オリゴヌクレオチドプローブまたはこれに密接に関連する配列を用いて固有の配列の検出を可能とするのに十分であるものとする。
【００６９】
鋳型は、標的配列の認識領域に結合し、また、認識領域の上流におけるニック形成酵素結合領域およびニック形成酵素結合領域の上流における安定化領域も含有するオリゴヌクレオチドと定義される。
【００７０】
「認識領域」とは、標的配列上における核酸配列と相補的であるかまたは実質的に相補的な鋳型上における核酸配列を意味する。「標的配列上における認識領域」とは、鋳型と相補的であるかまたは実質的に相補的であり、これに結合する、標的配列上におけるヌクレオチド配列を意味する。
【００７１】
「安定化領域」とは、例えば、ニック形成反応および／または伸長反応のための分子を安定化するように設計された、例えば、約５０％のＧＣ含量を有する核酸配列を意味する。
【００７２】
例えば、標的配列または鋳型などにおける核酸分子上における特定の配列の位置取りを説明する場合、「３’側」および「５’側」という用語は、互いに対して特定の配列または領域の位置を指すことが、当業者には理解される。したがって、配列または領域が、別の配列または領域に対して３’側であるかまたはその３’側である場合、該位置は、該別の配列または領域と、その核酸鎖の３’ヒドロキシルとの間である。核酸内における位置が、別の配列または領域に対して５’側であるかまたはその５’側である場合、それは、該位置が、該別の配列または領域と、その核酸鎖の５’リン酸との間にあることを意味する。
【００７３】
ポリメラーゼはとは、ヌクレオチドの特異的な組込みを触媒して、例えば、鋳型オリゴヌクレオチドなど、核酸の標的配列に対するプライマー分子の３’ヒドロキシル末端を伸長させることが可能なタンパク質である。ポリメラーゼは、高い反応温度においてもそれが活性であるように、例えば、好熱性であり得る。それはまた、例えば、鎖置換能も有し得る。しかし、それは、極めて前進性である必要はない（１回の合成につき３０〜４０ヌクレオチドで十分である）。用いられるポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないことが多い。ポリメラーゼが逆転写酵素活性（Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩなど）もまた有する場合、反応はまた、別個の逆転写酵素を用いずに、１ステップでＲＮＡ標的を増幅することも可能である。反応には複数のポリメラーゼを組み入れることができ、一例では、１つのポリメラーゼが逆転写酵素活性を有し、他のポリメラーゼは逆転写酵素活性を欠くことがある。例示的な実施形態において、ポリメラーゼはＢＳＴ（大断片）である。ポリメラーゼは、例えば、表１に列挙される１つまたは複数のポリメラーゼからなる群から選択することができる。
【００７４】
【表１】
2014073137.tif 000003
以下の逆転写酵素（ＲＴ）の非限定的な例：ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＳｅｎｓｉＳｃｒｉｐｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ＨＩＶ  ＲＴ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＩｍＰｒｏｍ  ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を本方法の反応において用いて、ＲＮＡ配列を検出する場合の性能を改善することができる。
【００７５】
これらの異なるＲＴは、標準的な反応緩衝液中において異なるレベルで作用し、この性能等級が以下に列挙される。「＋」は、増幅反応が、結果として特異的産物をもたらすことを意味する。より多くの「＋」は、反応がより良好に作用することを示し、「＋＋＋＋＋」は、最良の結果を示す。「−」は、反応が、結果として特異的産物をもたらさないか、またはバックグラウンドを上回る特異的産物をもたらさなかったことを示す。
【００７６】
【表２】
2014073137.tif 000004
「ニック形成」とは、完全または部分的な二本鎖核酸の二本鎖部分のただ１本の鎖の切断を指す。核酸にニックを形成する位置を、ニック形成部位と称する。ニック形成酵素が認識する認識配列を、ニック形成酵素結合部位と称する。「ニックを形成することが可能である」とは、ニック形成酵素の酵素能を指す。
【００７７】
ニック形成酵素とは、二本鎖ＤＮＡに結合し、二本鎖による二重鎖の１本の鎖を切断するタンパク質である。ニック形成酵素は、結合部位またはニック形成酵素認識部位の上流を切断することもあり、下流を切断することもある。例示的な実施形態において、反応は、産物の配列がニック形成部位を有さないように、結合部位の下流を切断するかまたはこれにニックを形成するニック形成酵素（上方鎖ニック形成酵素）の使用を含む。結合部位の下流を切断する酵素を用いることで、ニック形成酵素を置換する必要なしに、ポリメラーゼによるより容易な伸長が可能となる。ニック形成酵素は、ポリメラーゼと同じ反応条件において機能しなければならないので、両者のための２つの理想的条件の間での最適化が必要である。ニック形成酵素は、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社およびＦｅｒｍｅｎｔａｓ社から入手できる。ニック形成酵素は、例えば、表３に列挙される１つまたは複数のニック形成酵素からなる群から選択することができる。
【００７８】
【表３】
2014073137.tif 000005
ニック形成酵素は、例えば、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｂ．ＢｔｓＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ社製）、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０１（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ社製）、およびＮｔ．Ｂｐｕ１０１（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製）からなる群から選択することができる。特定の実施形態において、ニック形成酵素は、Ｎｔ．ＮＢｓｔ．ＮＢＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、およびＮｂ．ＢｓｒＤＩからなる群から選択することができる。当業者は、本明細書で具体的に言及されるニック形成酵素以外の各種のニック形成酵素も、本方法で用い得ることを承知している。
【００７９】
本方法のニック形成酵素およびポリメラーゼは、例えば、室温で安定であり得、該酵素はまた、例えば、３７℃、４２℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、または８５℃までの温度でも安定であり得る。特定の実施形態において、該酵素は、６０℃まで安定である。
【００８０】
酵素が３７℃、４２℃、５０〜６０℃、５４〜６０℃、５６〜５８℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、または８５℃までの温度で安定である場合、該酵素は「好熱性」である。
【００８１】
産物または増幅産物は、ニックを形成され、放出される、標的に沿う鋳型の伸長の最終結果として定義される。次いで、この産物は、増幅サイクルにフィードバックされる場合もあり、その相補鎖または分子ビーコンにアニールする場合もある。
【００８２】
「天然ヌクレオチド」とは、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸、またはウリジル酸を指す。「誘導体化ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド以外のヌクレオチドである。
【００８３】
反応は、例えば、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの天然ヌクレオチドの存在下で実施することができる。反応はまた、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、または３５Ｓなどの、例えば、放射性標識、アルカリホスファターゼなどの酵素標識、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、または蛍光色素などで標識されたｄＮＴＰの存在下でも実施することができる。これらの誘導体化ヌクレオチドは、場合によって、鋳型内にも存在し得る。
【００８４】
「一定温度」、「等温条件」、「本質的に等温の」、または「等温で」とは、増幅反応の経過時において、反応温度が本質的または実質的に一定に保たれる反応条件のセットを意味する。本方法の増幅法の利点は、高温と低温との間で温度を循環させる必要がないことである。ニック形成反応および伸長反応は、同一温度または同一の狭い温度範囲内において作用する。しかし、温度を正確に１つの温度に維持する必要はない。高温を維持するのに用いられる装置により、反応混合物の温度が、数度、または、例えば、１度、０．８度、０．６度、０．４度、または０．２度未満など、１０分の数度変化する場合、これは増幅反応に有害ではなく、やはり等温反応であると考えることができる。
【００８５】
「多重増幅」という用語は、対象の１種または複数種の核酸の増幅を指す。例えば、それは、多重鎖置換増幅の例を提供する、例えば、米国特許第５，４２２，２５２号および同第５，４７０，７２３号において論じられる通り、同一の試料に由来する複数の配列の増幅を指す場合もあり、試料中における複数の配列のうちの１つの増幅を指す場合もある。該用語はまた、複数の試料中に存在する１つまたは複数の配列の同時的または段階的な増幅も指す。
【００８６】
鋳型の設計
順方向および逆方向の鋳型、ならびに第１および第２の鋳型は、オリゴヌクレオチドの５’末端に安定化領域があり、安定化領域の下流にニック形成酵素結合部位およびニック形成部位があり、ニック形成酵素結合部位およびニック形成部位の下流の３’末端に認識領域があるように設計される。オリゴ鎖の全長は、各個別領域の長さ、温度、標的配列の長さ、およびＧＣ濃度に応じて、１９〜４０ヌクレオチド、例えば、１９〜４０、２３〜４０、２０〜３０、２０〜２４、２３〜２４、２３〜３２、２５〜４０、２７〜４０、または２７〜３５ヌクレオチドの範囲であり得る。当業者には、鋳型のこれらの特徴の間でどのようにバランスをとるかがか分かるであろう。鋳型は、１本がセンス鎖に結合し、もう１本がアンチセンス鎖に結合する両者を合わせて、標的配列の１００％以下に結合するように設計することができる。各鋳型の長さは、他の鋳型と同じである必要はない。例えば、順方向鋳型が標的アンチセンス鎖の約６０％に結合する場合、逆方向鋳型は、例えば、標的センス鎖の約４０％に結合し得る。鋳型は、いずれの鋳型にも結合しない、標的配列上におけるスペーサー塩基を許容するように設計することができる。したがって、鋳型は、標的配列の約３０％、約４０％、約５０％、または約６０％に結合し得る。
【００８７】
順方向鋳型認識領域は、標的センス鎖の５’側領域と実質的に同一であるかまたはこれと同一であり、標的部位アンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的であるように設計される。順方向鋳型認識領域は、任意の適切な長さ、例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６塩基長であり、場合によっては、８〜１６、９〜１６、１０〜１６、８〜１２、８〜１５、９〜１５、１０〜１５、または１１〜１４ヌクレオチド長である。例示的な実施形態において、該長さは、１１〜１３、１１〜１２、１２、または１２〜１３ヌクレオチド長である。逆方向鋳型認識領域は、標的部位センス鎖の３’末端と実質的に相補的であるかまたはこれと相補的であるように設計される。逆方向鋳型認識領域は、任意の適切な長さ、例えば、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６塩基長であり、場合によっては、８〜１６、９〜１６、１０〜１６、８〜１２、８〜１５、９〜１５、１０〜１５、または１１〜１４ヌクレオチド長である。例示的な実施形態において、該長さは、１１〜１３、１１〜１２、１２、または１２〜１３ヌクレオチド長である。第１鋳型認識領域の長さは、第２鋳型認識領域の長さと同一である場合もあり、異なる場合もある。
【００８８】
鋳型認識配列は、生物の固有配列または実質的な固有配列と相補的であるかまたは実質的に相補的であることが多い。本明細書で用いられる「固有配列」という用語は、既知の他の生物には存在しない、ある生物におけるヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いられる「実質的な固有配列」とは、生物の特定のファミリーまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０種までの他の生物において存在するヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態において、固有配列または実質的な固有配列は、リボソームＲＮＡまたはリボソームＲＮＡをコードするＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に存在する。
【００８９】
当業者は、最適で効果的な増幅に適切な認識領域の長さを決定することができる。特定の実施形態において、適切な特異性を提供するには、８塩基長の鋳型認識領域が下限である。反応の解析特異性は、順方向および逆方向の鋳型の２つの鋳型認識領域の総和と関連する。例えば、各鋳型が８ヌクレオチドの認識領域を有する場合、これにより、「標的サイズ」と称する８＋８＝１６ヌクレオチドの固有の組合せを検出することが可能なアッセイがもたらされる。所与のＤＮＡ鎖に対して、１６ヌクレオチドの標的サイズは、４．２９×１０９通りの可能な組合せを有する。ヒトゲノムは３．３×１０９ヌクレオチド長である。したがって、統計学的に述べると、特異的な１６ヌクレオチドの配列は、ヒトゲノム中において約１回出現すると予測される。標的サイズが、例えば、１５ヌクレオチドに減少すると、ヒトゲノムにおいて、平均で３回出現すると予測され（３．３×１０９回の出現において１．０７×１０９通りの可能性）、したがって、１６ヌクレオチドの標的サイズほど特異的ではない。１４塩基のアッセイ標的サイズをもたらす７ヌクレオチドの認識領域を有するアッセイの場合、これは、ヒトゲノムにおいて１２回出現すると予測される（３．３×１０９回の出現において２．６８×１０８通りの可能性）。この場合、診断的状況では価値の低い、特異性の低いアッセイがもたらされる。したがって、各鋳型に対して８塩基の認識領域が、特定のアッセイに対する下限であると考えられることが多い。
【００９０】
【表４】
2014073137.tif 000006
本発明による増幅アッセイを実施して、認識領域の最適の長さを決定した。標的ＤＮＡの０または１００，０００個のコピーを用いる１０分間のアッセイにおいて、２０ｍｅｒの認識領域の鋳型セットが検出可能な特異的産物をもたらさなかったのに対し、１２ｍｅｒの認識領域の鋳型セットを用いると特異的産物が検出された。１６ｍｅｒの認識領域の鋳型セットは、結果として検出可能な特異的産物をもたらしたが、検出された特異的産物は、１２ｍｅｒの認識領域の鋳型セットを用いるアッセイにおける場合の４分の１であった。特定の実施形態では、１５ｍｅｒの認識領域の鋳型セットの使用により、１６ｍｅｒの認識領域の鋳型セットよりも多くの特異的産物がもたらされた。
【００９１】
したがって、特定の例示的な実施形態では、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；該逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含む方法が提供される。したがって、特定の実施形態において、順方向鋳型もしくは逆方向鋳型の認識領域、または順方向鋳型および逆方向鋳型の各々は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的配列は、該順方向鋳型認識領域と該逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む。
【００９２】
別の例示的な実施形態では、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、該逆方向鋳型が、該標的配列の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型を該標的配列に沿って伸長させる条件下においてＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと；該伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、該標的配列の５’末端と同一の３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含む方法が提供される。したがって、特定の実施形態において、順方向鋳型もしくは逆方向鋳型の認識領域、または順方向鋳型および逆方向鋳型の各々は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、標的配列は、該順方向鋳型認識領域と該逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む。
【００９３】
特定の実施形態において、増幅反応が実施される温度は、鋳型および標的の融点（Ｔｍ）より低い。特定の実施形態において、反応温度は、例えば、鋳型および標的のＴｍよりも１℃〜１０℃、１℃〜８℃、１℃〜６℃、１℃〜４℃、１℃〜２℃、２℃〜１０℃、２℃〜８℃、２℃〜６℃、２℃〜４℃、２℃〜２℃；２℃〜４℃；または２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、もしくは８℃低い。反応温度はまた、反応産物（例えば、図１Ｂおよび図１Ｃに示される、ステップ９Ａ後における増幅二重鎖のニック形成およびポリメラーゼ伸長の産物）のＴｍより低いことも多い。反応温度は、初期鋳型／標的配列複合体（図１Ａのステップ（１）の上方の図）のＴｍよりも高い場合がある。鋳型が伸長して安定的な複合体を形成すると、安定的な複合体のＴｍは、反応温度よりも高くなる。
【００９４】
したがって、鋳型／標的核酸のＴｍは、反応温度よりも高いことが多く、場合によって、該Ｔｍは、反応温度よりも５℃以上高いか、または、例えば、反応温度よりも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、もしくは８℃以上高い。ニック形成後においてニックを形成された鎖の各部分のＴｍは反応温度よりも高いことが多く、場合によって、ニックを形成された各部分のＴｍは反応温度よりも５℃以上高いか、または、例えば、反応温度よりも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、もしくは８℃以上高い。鋳型および標的のＴｍは、例えば、反応条件の塩濃度を考慮し、ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／のワールドワイドウェブＵＲＬにおいて、ＩＤＴ  Ｏｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）用に提供されるプログラムを用いて計算することができる。ＩＤＴ社のウェブサイトで論じられている通り、該Ａｎａｌｙｚｅｒを用いるＴｍの計算は、以下の通りに実行される。
【００９５】
融点（ＴＭ）とは、オリゴヌクレオチド二重鎖の５０％が一本鎖形態であり５０％が二本鎖形態である温度である。Ｏｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒは、短いＤＮＡ二重鎖に適用可能な最隣接二状態モデル：
【００９６】
【数１】
2014073137.tif 000007
［式中、ΔＨ°（エンタルピー）およびΔＳ°（エントロピー）は、配列および公表された最隣接熱力学パラメータから計算された融解パラメータであり、Ｒは、理想気体定数（１．９８７ｃａｌ・Ｋ−１モル−１）であり、［オリゴ鎖］は、オリゴヌクレオチドのモル濃度であり、−２７３．１５の定数によりケルビンから摂氏度数へと温度が変換される］からＴＭを推定する。最も正確な最隣接パラメータは、ＤＮＡ／ＤＮＡ塩基対（Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３６巻、１０５８１頁）、ＲＮＡ／ＤＮＡ塩基対（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３４巻、１１２１１頁）、ＲＮＡ／ＲＮＡ塩基対（Ｘｉａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、１４７１９頁）、およびＬＮＡ／ＤＮＡ塩基対（ＭｃＴｉｇｕｅ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４３巻、５３８８頁）について、以上の刊行物から入手した。
【００９７】
ＴＭは、溶媒の一価の塩濃度（［Ｎａ＋］）に依存する。ＴＭの直線補正は、当技術分野において既知の方法である。ＩＤＴ社のウェブサイトで論じられている通り、ＩＤＴ社の研究者は、各種のナトリウム緩衝液中における約１００種の短いＤＮＡ二重鎖に対して、一連の大規模なＵＶ融解実験（約３０００回の測定）を実施し、この一次関数が不正確であると判定した。Ｏｌｉｇｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒでは、改良された二次ＴＭ塩補正関数（Ｏｗｃｚａｒｚｙ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４３巻、３５３７頁）、
【００９８】
【数２】
2014073137.tif 000008
［式中、ｆ（ＧＣ）は、ＧＣ塩基対の割合である］が用いられている。
【００９９】
特定の実施形態において、認識領域の長さは、標的配列内において、順方向鋳型認識領域内に存在せず、また、逆方向鋳型認識領域内にもその相補配列を有さない、少なくとも１ヌクレオチドが存在するように調整される。これらのスペーサー塩基（「スペーサー領域」を形成する）は、順方向鋳型の３’末端と逆方向鋳型の３’末端との間に存在する、標的配列内に含有されるヌクレオチドである。スペーサー塩基は、例えば、それらが、順方向鋳型の３’末端と逆方向鋳型の３’との間における標的のセンス配列およびアンチセンス配列の部分として示され、また、「スペーサー領域」内にあるものとしても示される、図３０において示されている。例えば、図３０の鋳型Ｔ２およびＴ１を標的と共に用いる場合、標的のセンス鎖は１つのスペーサー塩基（または１ヌクレオチドのギャップ）であるＴを有し、標的のアンチセンス鎖は１つのスペーサー塩基（または１ヌクレオチドのギャップ）であるＡを有する。特定の実施形態において、標的配列内には、５以下のスペーサー塩基が存在する。例示的な実施形態において、スペーサー塩基数は２〜３である。特定の実施形態において、スペーサー塩基数は１、２、または３である。他の実施形態では、１つのスペーサー塩基が存在する。他の実施形態では、２つのスペーサー塩基が存在する。他の実施形態では、３つのスペーサー塩基が存在する。他の実施形態において、スペーサー塩基数は１、２、３、４、または５である。
【０１００】
したがって、本方法の例示的な実施形態において、標的配列は、第１鋳型の３’末端にハイブリダイズする標的配列のヌクレオチドと、第２鋳型の３’末端にハイブリダイズする第１鎖の相補体のヌクレオチドに対応するヌクレオチドとの間に１〜５ヌクレオチドを含む。「対応するヌクレオチド」とは、２本の鎖が整列する場合、標的のヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズする該標的のヌクレオチド配列の１本の鎖上におけるヌクレオチドを意味する。これらの１〜５ヌクレオチドはまた、スペーサー塩基とも呼ばれる。
【０１０１】
これらのスペーサー塩基は、プライマーダイマーと同様の形で、重複鋳型を原因とする伸長により増幅される任意のバックグラウンド産物から、真の増幅産物を識別することを可能とする。これを考慮することで、バックグラウンドのノイズと標的配列の増幅との間の識別の改善が可能となる。しかし、これらのスペーサー塩基は、増幅の進行には必要とされない。
【０１０２】
したがって、特定の例示的な実施形態では、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；該逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含み、該標的配列が、該順方向鋳型認識領域と該逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む方法が提供される。したがって、特定の実施形態において、標的配列は、該順方向鋳型認識領域と該逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１、２、３、４、または５ヌクレオチド多く含む。
【０１０３】
別の例示的な実施形態では、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、該逆方向鋳型が、該標的配列の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型を該標的配列に沿って伸長させる条件下においてＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと；該伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、該標的配列の５’末端と同一の３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含み、該標的配列が、該順方向鋳型認識領域と該逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む方法が提供される。したがって、特定の実施形態において、標的配列は、該順方向鋳型認識領域と該逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１、２、３、４、または５ヌクレオチド多く含む。
【０１０４】
鋳型のニック形成酵素結合部位の配列は、各鋳型にどのニック形成酵素が選択されるかに依存する。単一のアッセイにおいて異なるニック形成酵素を用い得るが、単純な増幅では、例えば、いずれの鋳型との使用でも単一のニック形成酵素が用いられる。したがって、本方法の実施形態は、いずれの鋳型共に同一のニック形成酵素に対する認識部位を含み、反応においてただ１つのニック形成酵素が用いられる実施形態を含む。これらの実施形態において、第１および第２のニック形成酵素は同一である。本方法はまた、各鋳型が異なるニック形成酵素に対する認識部位を含み、反応において２つのニック形成酵素が用いられる実施形態も含む。
【０１０５】
例えば、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩの場合、酵素結合部位は５’−ＧＡＧＴＣ−３’であり、該酵素は、この部位の４ヌクレオチド下流の上方鎖にニックを形成する（すなわち、ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ＾）。増幅反応は、これらの４ヌクレオチド（Ｎ）の配列にはほとんど依存しないが、この領域の最適の配列はＧＣ含量が２５％以下であり、該結合領域の５’側のヌクレオチドにはチミンが隣接する。後者の規定により、ポリメラーゼにより付加される追加のアデニンを有する産物のプライミング能がもたらされる。適用に応じて４ヌクレオチドの配列を最適化し、ヘアピン、セルフダイマー、またはヘテロ二量体の存在を創出または除去することができる。
【０１０６】
鋳型オリゴヌクレオチドの５’末端における安定化領域は、ＧＣが約５０％であるように設計される。したがって、ＧＣ含量は、例えば、約４０％〜６０％、約４２％〜５８％、約４４％〜５６％、約４６％〜５４％、約４８％〜５２％、または約４９％〜５１％であり得る。これらのパラメータは、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ酵素の場合、８〜１１ヌクレオチドの安定化領域長を結果としてもたらすが、最短で６ヌクレオチドおよび最長で１５ヌクレオチドの長さも調べられており、この増幅法ではこれらも作用することが示されている。より長い安定化領域または５０％を超えるＧＣ％の上昇も、より高い反応温度におけるニック形成反応および伸長反応をさらに安定化させ得る。順方向および逆方向の鋳型の５’側の安定化領域の配列は通常同一であるが、目的が各産物鎖を独立に捕捉することである場合は変化し得る。この領域の配列はニック形成部位または認識領域に干渉しないものとするが、鋳型配列内における短い内部ヘアピンは、実時間の結果を改善したことが示されている。
【０１０７】
特定の実施形態では、核酸の相互反応（例えば、鎖間相互作用または鎖内相互作用）を不安定化させる１種または複数種の作用物質が増幅工程内に組み入れられるが、代替的な実施形態では、１種または複数種のこのような作用物質が増幅工程内に組み入れられることはない。核酸相互作用を不安定化させる作用物質の例は、二本鎖構造（例えば、二本鎖ＤＮＡ）および／または鎖内構造（例えば、ＲＮＡにおける二次構造または三次構造）を不安定化させる作用物質であり、ベタインおよび他のテトラアンモニウム化合物、ホルムアミド、グリセロール、ソルビトール、過塩素酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、低級アルキルアルコール（例えば、エタノール、１〜４炭素のアルコール）、尿素、トリアルキルアンモニウム塩（例えば、トリエチルアンモニウムクロリド）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）一本鎖結合（ｓｓｂ）タンパク質などのｓｓｂタンパク質、例えば、大腸菌ＤＮＡヘリカーゼＩ、ＩＩ、またはＩＶなどのヘリカーゼ、低級アルキル（１〜４Ｃの）アルコールなどを含むがこれらに限定されない。理論に拘束されずに述べれば、このような作用物質は、核酸相互作用の融点（Ｔｍ）を低下させる（例えば、二重鎖のＴｍを低下させる）。当業者は、例えば、不安定化の量の他、酵素活性を維持する必要を考慮して、反応に適切な不安定化剤および該適切な不安定化剤の濃度を決定することができる。濃度の例は、約１０％のグリセロール、約１０％の過塩素酸ナトリウム、約１０％のＤＭＳＯ、約１０％のソルビトール、約２．４モルのトリエチルアンモニウムクロリド、および約１、２、３、４、または５モルを超えるベタイン、例えば、約５〜６モルのベタインを含む。ベタインまたはＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から、例えば、カタログ番号Ｂ２６２９またはＢ０３００で購入することができる。ベタインは、例えば、低濃度のＤＭＳＯ、例えば、１Ｍのベタインに対して約１〜２または約１．３％のＤＭＳＯと組み合わせて用いることができる。
【０１０８】
本方法の鋳型は、例えば、スペーサー、遮断基、および修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、天然のヌクレオチドおよびヌクレオチド三リン酸とは組成および／または構造が異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在する二本鎖核酸の１本の鎖上に修飾が存在する場合、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸が、修飾鎖を制限酵素による切断から保護する形で、本明細書で用いられる修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸を修飾することができる。したがって、修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸の存在により、二本鎖核酸の切断ではなくニック形成が促進される。遮断基は、鋳型に付加されて、ポリメラーゼによる標的配列から独立した核酸の重合を阻害し得る化学基である。遮断基は通常、鋳型の３’末端に位置する。遮断基の例は、例えば、アルキル基、ヌクレオチド以外のリンカー、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸、および、例えば、コルジセピンを含む３’−ＯＨを欠くヌクレオチド誘導体を含む。スペーサーの例は、例えば、Ｃ３スペーサーを含む。スペーサーは、例えば、鋳型内において、また、例えば、５’末端においても用いて、例えば、標識などの他の基に結合させることができる。
【０１０９】
鋳型の伸長のためには、非修飾ヌクレオチドが提供されることが多い。伸長した鋳型内への組込みのためには、修飾されないヌクレオチドおよびヌクレオチド誘導体が提供されないことが多い。しかし、特定の実施形態では、１種または複数種の修飾されたヌクレオチドおよびヌクレオチド誘導体を提供し、伸長した鋳型内に組み込むことができる。
【０１１０】
増幅反応はまた、ヘルパーオリゴヌクレオチドも含み得る。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、例えば、約５〜１０、５〜１５、５〜２０ヌクレオチド長である。ヘルパーオリゴヌクレオチドが存在すると、増幅反応の速度、量、または感度が増大し得る。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、最終産物内には組み込まれない。当業者は、反応に添加するのに適切なヘルパーオリゴヌクレオチドの他、該添加量も決定することができるであろう。適切なヘルパーオリゴヌクレオチドを決定する方法の一例は、標的核酸の各領域またはその相補体と相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、それらを様々な量でアッセイに添加し、ヘルパーオリゴヌクレオチドを伴うアッセイを、ヘルパーオリゴヌクレオチドを伴わない対照としてのアッセイと比較することである。認識領域またはその相補体の上流または下流の領域と相補的なヘルパーオリゴヌクレオチドを合成することができる。例えば、認識領域の上流また下流において５〜１０塩基ごとにスペースを置いた領域と相補的な、約１０塩基長のヘルパーオリゴヌクレオチドのセットを合成し、次いで、対合したそれらが増幅反応を増強する能力について調べることができる。
【０１１１】
増幅の詳細な機構
本方法の増幅反応は、すべて反応温度に保持された、核酸標的、少なくとも２つの鋳型オリゴヌクレオチド、ニック形成酵素、例えば、好熱性のニック形成酵素、好熱性ポリメラーゼ、および緩衝液成分を必要とする。鋳型認識領域は、相補的であるかまたは実質的に相補的な標的配列と相互作用する。標的および鋳型の相補的であるかまたは実質的に相補的な領域の融点は、反応温度よりも十分に低いので、２本の核酸鎖間における相互反応は一過性であるが、好熱性ポリメラーゼが鋳型の３’末端から標的鎖に沿って伸長させるのに十分な時間が与えられる。実験では、特定のポリメラーゼが一本鎖オリゴヌクレオチドに結合することが示されている。この複合体のあらかじめの形成により、増幅工程の速度を速めることができる。
【０１１２】
二本鎖標的の場合、二本鎖ＤＮＡの正常なブリージング時においては、いずれの鋳型も、対応する標的鎖と同時に相互反応し得る（順方向鋳型はアンチセンス鎖と相互反応し、逆方向鋳型はセンス鎖と相互反応する）。標的はまた、ゲノム配列内における単一または二重のニック部位によっても作製することができる。一本鎖標的（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の場合、まず、逆方向鋳型が結合して伸長する（図１、工程１および２）。伸長した配列は、順方向鋳型に対する相補体を含む。次いで、順方向鋳型が標的のある領域を置換し、順方向鋳型認識領域に相補的であるかまたは実質的に相補的な３’側の合成領域に結合する（ステップ３）。代替的に、別の逆方向鋳型もまた、認識領域において初期の伸長した逆方向鋳型を置換し、一本鎖の伸長した逆方向鋳型を作製して順方向鋳型に結合させ得る。該鋳型の初期の結合および伸長は、合成された産物の融点が反応温度を上回るように、より短鎖のＤＮＡを伸長させるプロセッシブでないポリメラーゼにより促進される。次いで、次の鋳型認識部位が結合し、ポリメラーゼに伸長させるための一本鎖産物が用意される。
【０１１３】
順方向鋳型は、逆方向鋳型の５’末端まで伸長し、逆方向鋳型のための二本鎖ニック形成酵素結合部位を作製する（ステップ５）。次いで、ニック形成酵素が二重鎖に結合し、逆方向鋳型鎖の認識配列の上流（上方鎖ニック形成酵素の場合）に直接にニックを形成する（ステップ６）。該ニック下流の核酸配列は放出され（融点が反応温度に近い場合）、かつ／または３’−ＯＨニック部位からのポリメラーゼ合成により置換される。ポリメラーゼは、順方向鋳型に沿って、順方向鋳型の５’末端まで伸長させる（ステップ８）。両方の鋳型の伸長から形成される二本鎖により、二重鎖のいずれの端部にもニック形成酵素結合部位が作製される。この二本鎖を、ＮＥＡＲ（商標）増幅二重鎖と称する。ニック形成酵素が結合しニックを形成するとき、２つのニック部位（５’−リン酸および３’−ＯＨを伴う）の間に位置し、通常２３（であるがこれに限定されない）〜２９塩基長の範囲にある標的産物が放出される（ステップ９〜１１Ａ）か、または標的産物およびニック部位の逆方向相補体および鋳型の安定性領域（通常３６〜４８塩基長）を含有する一本鎖でニックを形成された産物が放出される（ステップ９〜１１Ｂ）。反応機構の別の表示を図３３に示す。
【０１１４】
産物２に対する産物１の比は、鋳型の濃度を変化させることにより調整することができる。順方向：逆方向の鋳型比は、例えば、１００：１、７５：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１：１、１：２．５、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：７５、または１：１００のモル比で変化し得る。産物の比（Ｂに対するＡ）は、ポリメラーゼに対するニック形成酵素の比に依存する、すなわち、ポリメラーゼが伸長させる前に両方の鎖に同時にニックを形成するニック形成酵素が比較的少ないので、ポリメラーゼの濃度が高いと、結果として長さがより長い産物（Ｂ）が多く得られる。逆方向鋳型の置換／放出産物が順方向鋳型にフィードされ、これと逆のことも起きるので、指数関数的な増幅が達成される。ニック形成酵素：ポリメラーゼ比は、例えば、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：１５、１：２０の酵素単位比で変化し得る。特定の実施形態において、ポリメラーゼに対するニック形成酵素の比は、例えば、１：３、１：２、１：１．５、または１：０．８であり得る。当業者は、これらの比が概数値を表し得ることを認める。このニック形成工程およびポリメラーゼ伸長工程は、供給源の１つ（通常はｄＮＴＰまたは酵素）を使い切るまで継続される。
【０１１５】
実施例で示される通り、反応が実行される時間は、例えば、約１分間以内、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０分間以内で変化し得る。速度が問題でない場合は、より長い反応時間により許容される結果が得られる場合がある。一部の実施形態において、反応は、１〜２０分間、１〜１５分間であるか、または特定の実施形態では、１〜１０、１〜８、１〜５、１〜２．５、２．５〜５、２．５〜８、２．５〜１０、もしくは２．５〜２０分間である。本明細書で説明される増幅工程は、効率的であり、例えば、実施例で示される通り、一部の実施形態では、例えば、５分間または１０分間の反応時間枠において、約１×１０６倍以上の増幅、約１×１０７倍以上の増幅、約１×１０８倍以上の増幅、約１×１０９倍以上の増幅、または約１×１０１０倍以上の増幅がなされる。反応は高感度であり、試料中において最小で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００コピー以上、試料中において最大で約２００、５００、１，０００、５，０００、もしくは１０，０００コピー以上を検出することが可能であるか、または、例えば、約３．３２Ｅ−１３マイクロモル〜約３．３２Ｅ−８マイクロモル、約１．６６Ｅ−１２マイクロモル〜約３．３２Ｅ−８マイクロモル、約３．３２Ｅ−１３マイクロモル〜約３．３２Ｅ−７マイクロモル、もしくは約３．３２Ｅ−１３マイクロモル〜約３．３２Ｅ−６マイクロモルの濃度で存在する標的を検出し得る。
【０１１６】
特定の例示的な実施形態では、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；該逆方向鋳型が、標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含み、等温条件下の１０分間において約１０６（１Ｅ＋０６）コピーの標的配列が作製される方法が提供される。他の実施形態では、１０分間で約１０７（１Ｅ＋０７）コピーの標的配列が作製される。多重増幅アッセイの場合、同量のコピーを作製する時間は、例えば、１２、１４、１５、１８、または２０分間まで延長される場合がある。これらのアッセイにおける標的配列のサイズは、効率の計算上、例えば、約２０〜４０ヌクレオチド、約２０〜３０ヌクレオチド、または、例えば、約２０〜３３ヌクレオチドであり得る。反応時間は、増幅反応が開始するように、すべての反応産物が同じ容器（ｖｅｓｓｅｌ、ｃｏｎｔａｉｎｅｒなど）内に存在する時間から、反応を停止させるのに熱が加えられるかまたは化学作用物質が添加される時間まで計算される。
【０１１７】
別の例示的な実施形態では、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、該逆方向鋳型が、該標的配列の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型を該標的配列に沿って伸長させる条件下においてＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと；該伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、該標的配列の５’末端と同一の３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含み、等温条件下の１０分間において約１０６（１Ｅ＋０６）コピーの標的配列が作製される方法が提供される。他の実施形態では、１０分間で約１０７（１Ｅ＋０７）コピーの標的配列が作製される。多重増幅アッセイの場合、同量のコピーを作製する時間は、例えば、１２、１４、１５、１８、または２０分間まで延長される場合がある。これらのアッセイにおける標的配列のサイズは、効率の計算上、例えば、約２０〜４０ヌクレオチド、または、例えば、約２０〜３３ヌクレオチドであり得る。反応時間は、増幅反応が開始するように、すべての反応産物が同じ容器（ｖｅｓｓｅｌ、ｃｏｎｔａｉｎｅｒなど）内に存在する時間から計算される。
【０１１８】
本方法は、増幅法において増幅された核酸から標的配列を解離させるのに必要とされることが多い温度循環の使用を必要としない。反応温度は、配列の長さおよびＧＣ濃度に基づいて変化することがあるが、当業者が理解する通り、温度は、非特異的結合を最小化するのに十分な程度に高いものとする。温度はまた、反応酵素であるニック形成酵素およびポリメラーゼにも適するものとする。例えば、反応は、約５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、または６０℃で実行することができる。一部の実施形態において、反応は、約３７℃〜８５℃、３７℃〜６０℃、５４℃〜６０℃、５５℃〜６０℃、５８℃〜６０℃で実行され、例示的な実施形態では、５６℃〜５８℃で実施される。特定の実施形態において、該工程には変性ステップが存在しない。本方法の一部の実施形態において、鋳型を標的核酸と相互作用させるステップを含む全増幅工程は、実質的な等温条件内において、変性ステップ（例えば、著明な温度上昇（例えば、９０〜１１０℃への温度上昇））なしに実施される。
【０１１９】
特定の例示的な実施形態では、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；該逆方向鋳型が、標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含み、上述のステップが等温条件下で実施される方法が提供される。
【０１２０】
別の例示的な実施形態では、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が該ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される条件下において；一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、該逆方向鋳型が、該標的配列鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；該逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；該逆方向鋳型を該標的配列に沿って伸長させる条件下においてＤＮＡポリメラーゼを提供するステップと；該伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、該順方向鋳型が、該標的配列の５’末端と同一の３’末端における認識領域と、該認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、該ニック形成酵素結合部位および該ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むステップと；該順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、該標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含み、上述のステップが等温条件下で実施される方法が提供される。
【０１２１】
ポリメラーゼは、ニック形成酵素の前、後、またはこれと同時に、標的の核酸分子と混合することができる。例示的な実施形態において、反応緩衝液は、ニック形成酵素およびポリメラーゼのいずれにも適するように最適化される。
【０１２２】
反応は、すなわち、供給源の１つを使い切ると終了させることができる。または、反応は、例えば、熱による不活性化、もしくはＥＤＴＡの添加、高濃度の塩、もしくは洗浄剤など、当業者に知られる方法を用いて停止させることができる。例示的な実施形態において、増幅後に質量分析を用いる場合、ＥＤＴＡを用いて反応を停止させることができる。
【０１２３】
反応成分
１．５ｍＬのエッペンドルフ管では、上から下への順で以下の試薬が組み合わされる。
【０１２４】
【数３】
2014073137.tif 000009
本例における成分濃度は、以下の通りである。
【０１２５】
【数４】
2014073137.tif 000010
緩衝条件、ＭｇＳＯ４濃度、ポリメラーゼ濃度、および鋳型濃度のすべてにおける変化は、アッセイ配列および所望の検出法に基づいて最適化することができる。例えば、より高濃度の酵素ストックを用いる場合は、グリセロール量を低下させることができる。特定の実施形態において、反応剤として添加されるＭｇ２＋イオンの濃度は、約９ｍＭ〜約２５ｍＭ、約９ｍＭ〜２１ｍＭ、約９〜２１ｍＭ、約９〜２０ｍＭ、約９〜１５ｍＭであり、例えば、例示的な実施形態において、約１０ｍＭ〜約１８ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１０ｍＭ〜２１ｍＭ、約１２〜２１ｍＭ、約１０〜２０ｍＭ、約１０〜１５ｍＭ、約１０．３ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０．３ｍＭ〜約１４．９ｍＭ、または約１５ｍＭである。また、当業者は、ＥＤＴＡまたはＢＳＡなしに反応を実行し得るが、反応において、酵素の保存用緩衝液の一部としてこれらの成分が存在し得ることも認める。用量は、より大量またはより少量の総反応容量に応じて増減させることができる。用量は通常、５μＬ〜１００μＬである。
【０１２６】
鋳型濃度は、標的濃度を上回ることが典型的である。順方向および逆方向の鋳型の濃度は同じ濃度でもあり得、１つの産物の増幅を他の産物の増幅に対して偏向させるよう、異なる濃度でもあり得る。各々の濃度は通常、１０ｎＭ〜１μＭである。
【０１２７】
ＢＳＡ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗浄剤、ＤＭＳＯ、ＤＴＴ、およびＲＮアーゼ阻害剤などの添加剤を、増幅反応に有害な作用を及ぼすことのない最適化の目的で組み入れることができる。
【０１２８】
標的の調製／添加
標的は、１倍濃度のＴｈｅｒｍｏｐｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ、１倍濃度のＴＥ（ｐＨ７．５）、またはＨ２Ｏ中において希釈することができる。高温の開始条件により、より速くより特異的な増幅が可能となる。この場合、反応混合物（から酵素または鋳型および標的を除いたもの）を反応温度まで加熱して２分間置き、その後、他の成分（酵素または鋳型／標的）に反応混合物を添加する。反応において必要とされる水の総量までの任意の容量で標的を添加することができる。この場合、標的は、水で希釈される。総反応容量５０マイクロリットルの上例では、１回の反応につき２．５マイクロリットルの調製された標的を添加して、総反応容量を５０マイクロリットルにするものとする。本方法の反応容量は、使用者の必要に応じて増加させることも減少させることもできる。本方法では、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０マイクロリットル以上の反応容量、または、例えば、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００マイクロリットルのより大きな反応容量を用いることができる。
【０１２９】
反応の実行
反応は一定温度で、Ｂｓｔポリメラーゼ（大断片）とＮｔ．Ｂｓｔ．ＮＢ１ニック形成酵素との組合せの場合、通常５４℃〜６０℃で実行する。他の酵素の組合せも用いることができ、最適の反応温度は、協同作用するニック形成酵素およびポリメラーゼの両方に対する最適温度の他、反応産物の融点にも基づく。反応は、例えば、所望量の増幅が達成されるまで、２．５〜１０分間にわたり保温される。反応は、酵素を不活化する熱による不活化ステップにより停止させることができる（熱により死滅させ得る酵素を用いる場合）。代替的に、反応は、これにＥＤＴＡを添加することにより停止させることができる。
【０１３０】
リードアウト
増幅された標的配列は、当業者に知られる任意の方法により検出することができる。非限定的な例として述べると、本明細書では、これらの既知の方法のいくつかが提示される。一方法において、増幅産物は、ゲル電気泳動により検出することができ、したがって、特定の長さを有する反応産物が検出される。例えば、ヌクレオチドは、例えば、ビオチンなどで標識することができる。ビオチンで標識された増幅配列は、シグナル生成酵素、例えば、ペルオキシダーゼに結合したアビジンを用いて捕捉することができる。
【０１３１】
核酸検出法では、二本鎖ＤＮＡを特異的に染色する色素を用いることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合時において蛍光の増強を示す挿入色素は、分子生物学および細胞生物学において基本的なツールである。色素は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡに挿入するフルオロフォアである場合があり、以下の例：アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ヘキスト色素、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＢＲ  Ｉ（非対称性のシアニン色素）、ＳＹＢＲ  ＩＩ、ＴＯＴＯ（チアゾールオレンジの二量体）、およびＹＯＹＯ（オキサゾールイエローの二量体）などを含み得るがこれらに限定されない。色素は、各種の検出法と共に用いると核酸検出感度増大の可能性をもたらし、多様な最適の使用パラメータを有し得る。例えば、ゲル電気泳動後のアガロースゲルおよびＰＣＲ時においてＤＮＡを染色するには一般的に臭化エチジウムが用いられ（Ｈｉｑｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻、４１３〜４１７頁、１９９２年４月）、フローサイトメトリーにより細胞のＤＮＡ倍数性を決定するにはヨウ化プロピジウムおよびヘキスト３３２５８を用い、レーザー誘導蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動による二本鎖ＤＮＡの解析にはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １が用いられ、イオン対のマッチによるポリヌクレオチドクロマトグラフィー後における二本鎖ＤＮＡ検出の増強にはＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎが用いられている（Ｓｉｎｇｅｒら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２４９巻、２２９〜２３８頁、１９９７年）。
【０１３２】
核酸検出法にはまた、標的配列内または対象の標的と相補的であるかもしくは実質的に相補的な配列を含有するプローブ内に直接に組み込まれる、標識されたヌクレオチドも用いることができる。このような標識は、天然において放射性および／または蛍光性であり得、本明細書で論じられる任意の方式で解像することができる。検出は可能であるが、その他の点では天然のヌクレオチドとして機能し得る、標識されたヌクレオチドは、天然のヌクレオチドとして機能しない修飾ヌクレオチドとは識別される。
【０１３３】
核酸産物増幅の検出および／または継続的なモニタリングの方法もまた当業者に知られており、以下でいくつかの例が説明される。
【０１３４】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在は、分子ビーコンにより検出およびモニタリングすることができる。分子ビーコンは、一方の端部におけるフルオロフォアと、反対側の端部における消光色素とを含有する、ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドである。該ヘアピンのループは、標的配列と相補的であるかまたは実質的に相補的なプローブ配列を含有し、該ステムは、プローブ配列の両側に位置する相補的であるかまたは実質的に相補的なアーム配列のアニーリングにより形成される。フルオロフォアおよび消光分子は、各アームの対向する端部において共有結合される。オリゴヌクレオチドがその相補的であるかもしくは実質的に相補的な標的にハイブリダイズすることを阻止する条件下におけるか、または分子ビーコンが溶液中において遊離している場合、蛍光分子と消光分子とは互いに近接し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が阻止される。分子ビーコンが標的分子に遭遇するとハイブリダイゼーションが生じ、ループ構造は、安定的でより固定的な立体構造に転換され、フルオロフォアと消光分子との分離を引き起こし、蛍光がもたらされる（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、１９９６年３月、３０３〜３０８頁）。プローブの特異性により、蛍光の生成は、もっぱら、意図される増幅産物の合成による。
【０１３５】
分子ビーコンは極めて特異的であり、単一塩基多型を識別することが可能である。分子ビーコンはまた、異なる色のフルオロフォアおよび異なる標的配列によっても合成することができ、同じ反応における複数種の産物を同時に定量することを可能とする。定量的な増幅工程の場合、分子ビーコンは、増幅の各サイクル後における増幅された標的に特異的に結合することが可能であり、ハイブリダイズしなかった分子ビーコンは暗色であるので、プローブ−標的ハイブリッドを単離して、増幅産物を定量的に決定する必要がない。結果として得られるシグナルは、増幅産物の量に比例する。これは、実時間で実行することができる。他の実時間の形と同様に、各プライマー／プローブのセットが確度および精度を確保するには、特異的な反応条件を最適化しなければならない。
【０１３６】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によっても検出およびモニタリングすることができる。ＦＲＥＴは、２つの発色団：ドナー分子およびアクセプター分子の間におけるエネルギー移動機構である。略述すると、ドナーフルオロフォア分子は、特定の励起波長で励起される。その後にドナー分子がその基底状態に戻るときの該分子からの発光は、遠距離の双極子間相互作用により、アクセプター分子に励起エネルギーを移動させ得る。アクセプター分子の発光強度はモニタリングが可能であり、ドナーとアクセプターとの間の距離、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとの重複、ならびにドナーの発光双極子モーメントおよびアクセプターの発光双極子モーメントの向きの関数である。ＦＲＥＴは、例えば、分子ビーコンについてみられるＤＮＡ間相互作用における分子動力学を定量化する有用なツールである。特異的産物の生成をモニタリングする場合、プローブの一方の端部をドナー分子で標識し、他方の端部をアクセプター分子で標識することができる。プローブ−標識間のハイブリダイゼーションは、ドナーおよびアクセプターの距離または向きの変化をもたらし、ＦＲＥＴの変化が観察される（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．  Ｌａｋｏｗｉｃｚ、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、第２版（１９９９年７月１日））。
【０１３７】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、質量分析によっても検出およびモニタリングすることができる。質量分析は、標的核酸分子種の構造および量を決定するのに用いることができ、これを用いて複雑な混合物の迅速な解析を提供することができる。該方法に従い試料をイオン化し、結果として得られるイオンをそれらの質量対電荷比により電場および／または磁場内で分離し、検出器によりイオンの質量対電荷比を測定する（Ｃｒａｉｎ，  Ｐ．  Ｆ．およびＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，  Ｊ．  Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９巻、２５〜３４頁（１９９８年））。質量分析法は、例えば、ＭＡＬＤＩ法、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ法、またはエレクトロスプレー法を含む。これらの方法は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）および液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）と組み合わせることができる。ＭＳは、ＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴヌクレオチドの配列決定に適用されている（Ｌｉｍｂａｃｈ  Ｐ．、ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．  Ｒｅｖ．、第１５巻、２９７〜３３６頁（１９９６年）；Ｍｕｒｒａｙ  Ｋ．、Ｊ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、第３１巻、１２０３〜１２１５頁（１９９６年））。ＭＳおよびより具体的に、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ）は、高速のシグナル収集および自動化された固体表面の解析により極めて高度なハイスループットの潜在力を有する。ＭＳは、時間の節約に加えて、分子の内在的な特性を測定し、したがって、著明により有用なシグナルをもたらすことが指摘されている（Ｋｏｓｔｅｒ  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１４巻、１１２３〜１１２８頁（１９９６年））。
【０１３８】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、各種のゲル電気泳動法によっても検出およびモニタリングすることができる。ゲル電気泳動は、マトリックスを介して分子を引き寄せる起電力を用いて、マトリックス、一般には架橋されたポリマーを介する核酸の分離を伴う。分子は異なる速度でマトリックス内を移動し、オートラジオグラフィー、リン光体造影（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）、および核酸キレート化色素による染色を含むがこれらに限定されない多数の方法のいずれか１つにより視覚化および解釈が可能な産物間の分離を引き起こす。
【０１３９】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、キャピラリーゲル電気泳動によっても検出およびモニタリングすることができる。キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）は、従来のゲル電気泳動と、細孔キャピラリー内におけるポリアクリルアミドなどの媒体を用いる液体クロマトグラフィーとの組合せにより、単一塩基までの解像度を有する高速で高効率の核酸分子の分離をもたらす。ＣＧＥは、一般に、最小で６個の染色ＤＮＡを検出し得るレーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）検出と組み合わされる。ＣＧＥ／ＬＩＦ検出は、一般に、臭化エチジウム、ＹＯＹＯ、およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  １を含む蛍光ＤＮＡ挿入色素の使用を伴うが、また、蛍光色素がＤＮＡに共有結合する蛍光ＤＮＡ誘導体の使用も伴い得る。この方法を用いて、複数の異なる標的配列の同時的な同定を行うことができる。
【０１４０】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、各種の表面捕捉法によっても検出およびモニタリングすることができる。これは、特定のオリゴヌクレオチドを表面に固定化して、高感度であると共に高度に選択性でもあるバイオセンサーを作製することにより達成される。この方法で用いられる表面は、金および炭素を含み得るがこれらに限定されず、プローブを表面に結合させる多数の共有結合法または非共有結合法を用いることができる。その後における標的ＤＮＡの検出は、各種の方法によりモニタリングすることができる。
【０１４１】
電気化学法は、一般に、ＤＮＡプローブ電極上におけるメチレンブルーなどの挿入剤の陰極ピークを測定するステップを伴い、方形波のボルタモグラムにより視覚化される。標的配列の結合は、それがｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡと異なる形で相互作用し、ハイブリッド形成の程度を反映する、メチレンブルーのボルタンメトリー還元シグナルの大きさの減少により観察することができる。
【０１４２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）もまた、プローブ結合の反応速度の他、標的捕捉過程をモニタリングするのに用いることができる。ＳＰＲは、蛍光プローブまたは他の標識の使用を必要としない。ＳＰＲは、屈折率の異なる２つの透明の媒質の界面上において反射および屈折される光の原理に依拠する。単色のｐ分極光と、金の薄層を含む界面を有する２つの透明な媒質とを用いると、臨界角を超えた光の全反射が観察されるが、該光の電磁場成分は、屈折率のより小さな媒質中に達し、エバネセント波およびくっきりとした影をもたらす（表面プラズモン共鳴）。これは、波と表面プラズモンとの間における共鳴エネルギー移動による。共鳴条件は、金属薄膜上において吸収される物質により影響され、共鳴単位と質量濃度との間の関係に基づいて、核酸分子、タンパク質、および糖の濃度を測定することができる。
【０１４３】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、側方流動装置によっても検出およびモニタリングすることができる。側方流動装置はよく知られている。これらの装置は、一般に、毛細管力により流体がその中を流れる、固相の流体透過性流路を含む。例は、ディップスティックアッセイおよび各種の適切な被覆を伴う薄層クロマトグラフィープレートを含むがこれらに限定されない。流路上には、試料に対する各種の結合試薬、試料に対する結合パートナーまたは結合パートナーを伴うコンジュゲート、およびシグナル生成システムが固定化されている。試料の検出は、複数の方法、例えば、酵素検出、ナノ粒子検出、比色検出、および蛍光検出で達成することができる。酵素検出は、側方流動装置の表面上における相補的であるかまたは実質的に相補的な核酸標的にハイブリダイズする酵素標識したプローブを伴い得る。結果として得られる複合体は、適切なマーカーにより処理して、読み取り可能なシグナルを発することが可能である。ナノ粒子検出は、金コロイド、ラテックス、および常磁性ナノ粒子を用い得るビーズ技術を伴う。一例では、ビーズを抗ビオチン抗体にコンジュゲートする。標的配列を直接にビオチン化することもでき、標的配列を配列特異的なビオチン化プローブにハイブリダイズさせることもできる。金およびラテックスからは裸眼で見ることのできる比色シグナルが発せされ、常磁性粒子からは、磁場内で励起された場合に、目には見えないシグナルが発せされ、特別の読み取り装置により読み取ることができる。
【０１４４】
例えば、フルオレセインおよびビオチン二重標識オリゴプローブ法、水晶中に埋め込まれたランタニド元素からなる上方変換リン光体レポーターを用いるＵＰＴ−ＮＡＬＦ法（Ｃｏｒｓｔｊｅｎｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４７巻、第１０号、１８８５〜１８９３頁、２００１年）の他、量子ドットの使用など、蛍光ベースの側方流動検出法もまた知られている。
【０１４５】
核酸はまた、側方流動装置上でも捕捉することができる。捕捉手段は、抗体に依存する方法および抗体に依存しない方法を含み得る。抗体に依存する捕捉は、一般に、抗体捕捉ラインと、標的に相補的であるかまたは実質的に相補的な配列である標識プローブとを含む。抗体に依存しない捕捉では、一般に、２つの結合パートナー間における非共有結合的相互作用、例えば、ビオチン化したプローブとストレプトアビジンラインとの間における高親和性で不可逆的な結合が用いられる。捕捉プローブは、側方流動膜上に直接に固定化することができる。抗体に依存する方法および抗体に依存しない方法共に、多重増幅において用いることができる。
【０１４６】
標的の核酸および核酸配列の生成または存在はまた、多重ＤＮＡ配列決定によっても検出およびモニタリングすることができる。多重ＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡプールから標的ＤＮＡ配列を同定する手段である。該技法は、多くの配列決定鋳型の同時的な処理を可能とする。プールされた多数の鋳型は、処理終了時には、個別の配列に分解することができる。略述すると、ＤＮＡ分子をプールし、増幅し、化学的に断片化する。配列決定ゲル上において生成物をサイズにより画分し、ナイロン製の膜へと転写する。標準的なＤＮＡ配列決定法において用いられる方法と同様の方法を用いて、該膜をプローブし、オートラジオグラフ撮影する（Ｃｈｕｒｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年４月８日、第２４０巻（第４８４９号）、１８５〜１８８頁）。オートラジオグラフは評価が可能であり、標的核酸配列の存在を定量化することができる。
【０１４７】
キット
本方法に用いられるキットは、本明細書で説明される通り、例えば、１つまたは複数のポリメラーゼ、順方向および逆方向の鋳型、ならびに１つまたは複数のニック形成酵素を含み得る。１つの標的が増幅される場合、１つまたは２つのニック形成酵素をキット中に組み入れることができる。複数の標的配列を増幅し、これらの標的配列に対して設計される鋳型が、同じニック形成酵素に対するニック形成酵素結合部位を含む場合、１つまたは２つのニック形成酵素を組み入れることができる。または、鋳型が異なるニック形成酵素により認識される場合、例えば、３つ以上など、より多数のニック形成酵素をキット中に組み入れることができる。
【０１４８】
本方法に用いられるキットはまた、任意の数の分離容器、パケット、チューブ、バイアル、マイクロ滴定プレートなどの中における１つまたは複数の成分を含むこともあり、このような容器内における各種の組合せで成分が組み合わされることもある。
【０１４９】
キットの成分は、例えば、１つまたは複数の容器内に存在することもあり、例えば、すべての成分が１つの容器内に存在することもあり、例えば、酵素が鋳型とは別の容器内に存在することもある。成分は、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ、ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ）されることもあり、安定的な緩衝液中に存在することもある。一例では、ポリメラーゼおよびニック形成酵素が単一容器内における凍結乾燥形態で存在し、鋳型が異なる容器内において凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ、ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ）されるかもしくは緩衝液中に存在する。または、別の例では、ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型が、単一容器内において凍結乾燥形態で存在する。または、ポリメラーゼとニック形成酵素とを異なる容器内に分離することもできる。
【０１５０】
キットは、例えば、反応において用いられるｄＮＴＰもしくは修飾ヌクレオチド、反応に用いられるキュベットもしくは他の容器、または乾燥凍結された成分を再水和化する水もしくは緩衝液のバイアルをさらに含み得る。用いられる緩衝液は、例えば、ポリメラーゼ活性およびニック形成酵素活性のいずれに対しても適切であり得る。
【０１５１】
本方法に用いられるキットはまた、本明細書で説明される１つもしくは複数の方法を実施するための指示書および／または本明細書で説明される１つもしくは複数の組成物もしくは試薬の説明書も含み得る。指示書および／または説明書は、冊子形態である場合もあり、キットの添付書中に含まれる場合もある。キットはまた、このような指示書または説明書を提供するインターネットサイトについての説明書も含み得る。
【０１５２】
キットは、例えば、ＦＲＥＴに用いられる試薬、側方流動装置、ディップスティック、蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、またはポリスチレンビーズなど、検出法に用いられる試薬をさらに含み得る。
【０１５３】
本発明および本キットの利点は、それらが、サーモサイクラ−、インキュベーションオーブン、水槽、および伝熱ブロックを含む、一定温度を提供する任意の機器内において用い得ることである。
【０１５４】
したがって、本方法では、ヌクレオチド配列の増幅方法であって、ポリメラーゼが鋳型核酸を伸長させ、これにより、伸長された鋳型核酸のアンプリコンが得られる条件下で、増幅反応において、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸を、（ｉ）ポリメラーゼ、（ｉｉ）該標的ヌクレオチド配列の第１鎖にハイブリダイズする第１鋳型核酸、および（ｉｉｉ）該標的ヌクレオチド配列の第１鎖の相補体にハイブリダイズする第２鋳型核酸と混合するステップを含み、該該標的ヌクレオチド配列が２０〜４０ヌクレオチド長であり、該該標的ヌクレオチド配列が約１０分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅され、上述のステップが実質的な等温条件下で実施される方法が提供される。
【０１５５】
また、ヌクレオチド配列の増幅方法であって、ポリメラーゼが鋳型核酸を伸長させ、これにより、伸長された鋳型核酸のアンプリコンが得られる条件下で、増幅反応において、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸を、（ｉ）ポリメラーゼ、（ｉｉ）該標的ヌクレオチド配列の第１鎖にハイブリダイズする第１鋳型核酸、および（ｉｉｉ）該標的ヌクレオチド配列の第１鎖の相補体にハイブリダイズする第２鋳型核酸と混合するステップを含み、該標的ヌクレオチド配列が２０〜４０ヌクレオチド長であり、該第１鋳型が該標的ヌクレオチド配列の該第１鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第１鋳型認識領域を含む核酸配列を含み、該第２鋳型が該標的ヌクレオチド配列の該第１鎖の相補体の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第２鋳型認識領域を含むヌクレオチド配列を含み、標的ヌクレオチド配列が、該第１鋳型認識領域と該第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含み、該標的ヌクレオチド配列が約１０分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅され、上述のステップが実質的な等温条件下で実施される方法も提供される。
【０１５６】
また、ポヌクレオチド配列の増幅方法であって、ポリメラーゼが鋳型核酸を伸長させ、これにより、伸長された鋳型核酸のアンプリコンが得られる条件下で、増幅反応において、標的ヌクレオチド配列を有する標的核酸を、（ｉ）ポリメラーゼ、（ｉｉ）該標的ヌクレオチド配列の第１鎖にハイブリダイズする第１鋳型核酸、および（ｉｉｉ）該標的ヌクレオチド配列の第１鎖の相補体にハイブリダイズする第２鋳型核酸と混合するステップを含み、該第１鋳型が該標的ヌクレオチド配列の該第１鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の第１鋳型認識領域を含む核酸配列を含み、該第２鋳型が該標的ヌクレオチド配列の該第１鎖の相補体の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における８〜１５ヌクレオチド長の第２鋳型認識領域を含むヌクレオチド配列を含み、該標的ヌクレオチド配列が約１０分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅され、上述のステップが実質的な等温条件下で実施される方法も提供される。
【０１５７】
本方法の特定の態様において、第１鋳型は、標的ヌクレオチド配列の第１鎖の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第１鋳型認識領域を含む核酸配列を含み、第２鋳型は、該標的ヌクレオチド配列の該第１鎖の相補体の３’末端と相補的であるかまたは実質的に相補的な３’末端における第２鋳型認識領域を含むヌクレオチド配列を含む。特定の態様において、標的ヌクレオチド配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む。他の態様において、第１鋳型および第２鋳型は、認識部位の上流におけるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位を含み、増幅反応は、前記順方向および前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能である１つまたは複数のニック形成酵素をさらに含み、１つのニック形成酵素で前記鋳型の両方にニックを形成することが可能であるか、または少なくとも１つのニック形成酵素により各鋳型にニックを形成することが可能であり、前記１つまたは複数のニック形成酵素は、前記標的配列内においてニックを形成しない。
【０１５８】
一部の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１ヌクレオチド多く含む。他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも２ヌクレオチド多く含む。さらに他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも３ヌクレオチド多く含む。
【０１５９】
本方法の特定の態様において、標的核酸は、二本鎖または一本鎖である。特定の態様において、標的核酸は二本鎖ＤＮＡである。他の態様において、標的核酸は一本鎖ＤＮＡである。さらに他の態様において、標的核酸はＲＮＡである。標的核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、および合成二本鎖ＤＮＡからなる群から選択することができる。標的核酸は、例えば、ウイルスＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成一本鎖ＤＮＡからなる群から選択することができる。標的核酸は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ前駆体、および合成ＲＮＡからなる群から選択することができる。
【０１６０】
本発明の方法において、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、好熱性ポリメラーゼである。該ポリメラーゼは、例えば、Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩからなる群から選択することができる。特定の態様において、該ポリメラーゼは、Ｂｓｔ（大断片）である。
【０１６１】
特定の実施形態において、第１および第２の鋳型は、同一のニック形成酵素により認識されるニック形成酵素結合部位を含み、前記第１および前記第２のニック形成酵素は同一である。ニック形成酵素は、例えば、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ、およびＮｔ．Ｂｐｕ１０Ｉからなる群から選択することができる。
【０１６２】
本方法の一部の態様において、標的ヌクレオチド配列の第１鎖と相補的であるかまたは実質的に相補的な第１鎖の核酸配列部分は８〜１５ヌクレオチド長であり、該標的ヌクレオチド配列と相補的であるかまたは実質的に相補的な第２鎖の部分は８〜１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、第１鋳型は、第２鋳型と同じ濃度で提供される。他の態様において、第１または第２鋳型の１つは、１：１００〜１００：１の比の範囲の他の鋳型に対する比で提供される。本方法の反応は、第２のポリメラーゼをさらに含み得る。一部の態様において、第１または第２のポリメラーゼの少なくとも１つは、逆転写酵素活性を含む。
【０１６３】
本方法の特定の実施形態において、増幅は、５４℃〜６０℃で実施される。他の実施形態において、増幅は、５６℃〜５８℃で実施される。特定の実施形態において、増幅反応は、１〜１０分間にわたり一定温度に保持される。他の実施形態において、増幅反応は、１〜２０分間にわたり一定温度に保持される。
【０１６４】
本方法は、増幅産物を検出するステップをさらに含み得る。したがって、特定の態様において、増幅産物は、ゲル電気泳動、質量分析、ＳＹＢＲ  Ｉ蛍光、ＳＹＢＲ  ＩＩ蛍光、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−３、挿入色素検出、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン検出、表面捕捉、キャピラリー電気泳動、捕捉による検出を可能とする標識ヌクレオチドの組込み、蛍光分極、および側方流動捕捉からなる群から選択される検出法により検出される。
【０１６５】
一部の態様では、少なくとも２つの標的配列が増幅可能である。特定の態様において、増幅産物は、固体表面上において検出される。一部の態様では、少なくとも１つの捕捉プローブが固体表面上に固定化される。一部の実施形態において、少なくとも１つの前記鋳型は、例えば、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む。
【０１６６】
本方法の一部の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、約５分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅される。他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、約２．５分間で１Ｅ＋６倍以上に増幅される。他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、約５分間で１Ｅ＋７倍以上に増幅される。他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、約５分間で１Ｅ＋８倍以上に増幅される。さらに他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、約５分間で１Ｅ＋９倍以上に増幅される。
【０１６７】
本方法はまた、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位または前記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、該標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であり；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含み、該標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位の上流、下流、または該部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位の上流、下流、または該部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含む方法も含む。
【０１６８】
また、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記逆方向鋳型が、該標的配列の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、該標的配列の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを、前記ポリメラーゼが前記逆方向鋳型を前記標的配列に沿って伸長させる条件下において提供するステップと；前記伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が前記伸長した逆方向鋳型の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、該標的アンチセンス鎖の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においても、前記標的配列の相補体内においてもニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含み、前記ポリメラーゼが前記順方向および逆方向の鋳型を前記標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、前記ニック形成酵素が前記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において増幅が実施される方法も提供される。本発明の一部の態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性ポリメラーゼである。例えば、該ポリメラーゼは、Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩからなる群から選択することができる。特定の態様において、該ポリメラーゼは、Ｂｓｔ（大断片）である。
【０１６９】
特定の態様において、ニック形成酵素は、ニック形成酵素結合部位の下流においてニックを形成する。他の態様において、順方向および逆方向の鋳型は、同一のニック形成酵素により認識されるニック形成酵素結合部位を含み、前記第１および前記第２のニック形成酵素は同一である。特定の態様において、ニック形成酵素は、例えば、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ、およびＮｔ．Ｂｐｕ１０Ｉからなる群から選択することができる。
【０１７０】
本発明の一部の実施形態において、標的配列は、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む。特定の実施形態において、標的配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１ヌクレオチド多く含む。他の実施形態において、標的配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも２ヌクレオチド多く含む。
【０１７１】
特定の態様において、標的ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、およびウイルスＤＮＡからなる群から選択される。他の態様において、標的核酸は、例えば、ウイルスＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ前駆体からなる群から選択される。他の実施形態において、順方向鋳型は、逆方向鋳型と同じ濃度で提供される。さらに他の態様において、順方向鋳型または逆方向鋳型の１つは、１：１００〜１００：１の比の範囲にある他の鋳型に対する比で提供される。
【０１７２】
特定の実施形態において、本方法は、第２のポリメラーゼをさらに含み得る。例えば、ポリメラーゼの少なくとも１つは、逆転写酵素活性を含み得る。特定の態様において、増幅は、５４℃〜６０℃で実施される。他の実施形態において、増幅反応は、１〜１０分間にわたり一定温度に保持される。
【０１７３】
本方法は、増幅産物を検出するステップをさらに含み得る。例えば、増幅産物は、ゲル電気泳動、質量分析、ＳＹＢＲ  Ｉ蛍光、ＳＹＢＲ  ＩＩ蛍光、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＴＯ−３、挿入色素検出、ＦＲＥＴ、分子ビーコン検出、表面捕捉、キャピラリー電気泳動、捕捉による検出を可能とする標識ヌクレオチドの組込み、蛍光分極、および側方流動捕捉からなる群から選択される方法により検出することができる。
【０１７４】
特定の態様では、少なくとも２つの標的配列が増幅可能である。他の態様において、増幅産物は、固体表面上において検出される。一部の態様では、少なくとも１つの捕捉プローブが固体表面上に固定化される。他の実施形態において、少なくとも１つの前記鋳型は、例えば、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む。
【０１７５】
本方法はまた、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位または前記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含み；前記標的配列が、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含む方法も含む。
【０１７６】
また、一本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、一本鎖標的配列を含む標的核酸を逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記逆方向鋳型が、該標的配列の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、該標的配列の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを、前記ポリメラーゼが前記逆方向鋳型を前記標的配列に沿って伸長させる条件下において提供するステップと；前記伸長した逆方向鋳型を順方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が前記伸長した逆方向鋳型の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、前記標的配列が、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においても、前記標的配列の相補体内においてもニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップとを含み、前記ポリメラーゼが前記順方向および逆方向の鋳型を前記標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、前記ニック形成酵素が前記ニック形成部位においてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において増幅が実施される方法も提供される。
【０１７７】
特定の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１ヌクレオチド多く含む。他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも２ヌクレオチド多く含む。他の実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、前記順方向鋳型認識領域と前記逆方向鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも３ヌクレオチド多く含む。
【０１７８】
また、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位または前記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含む方法も提供される。
【０１７９】
また、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位または前記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位の上流、下流、または該部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位の上流、下流、または該部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含む方法も提供される。
【０１８０】
また、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位または前記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含むステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含み、１２分間にわたって増幅反応を実行すると、２２〜３５ヌクレオチド長の標的配列の少なくとも１Ｅ＋７倍の増幅が得られる方法も提供される。
【０１８１】
本方法はまた、二本鎖核酸の標的配列を増幅する方法であって、ポリメラーゼが順方向および逆方向の鋳型を標的配列に沿って伸長させて二本鎖ニック形成部位を作製し、ニック形成酵素が前記ニック形成部位または前記部位の増幅されたコピーにおいてニックを形成して増幅産物を作製する複数のサイクルにより増幅が実行される本質的に等温の条件下において；センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖標的配列を含む標的のＤＮＡ分子を順方向鋳型および逆方向鋳型と接触させるステップであって、前記順方向鋳型が、該標的配列のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸配列を含み、該標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であり；前記逆方向鋳型が、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含むヌクレオチド配列を含み、該標的のアンチセンス鎖の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長であるステップと；前記順方向鋳型の該ニック形成部位の上流、下流、または該部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第１のニック形成酵素を提供するステップと；前記逆方向鋳型の該ニック形成部位の上流、下流、または該部位においてニックを形成することが可能であり、前記標的配列内においてはニックを形成しない、第２のニック形成酵素を提供するステップと；ＤＮＡポリメラーゼを提供するステップとを含み、１２分間にわたって増幅反応を実行すると、２２〜３５ヌクレオチド長の標的配列の少なくとも１Ｅ＋７倍の増幅が得られる方法も提供する。
【０１８２】
核酸の標的配列を増幅するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼと；標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、該標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長である核酸増幅のための第１鋳型と；該標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、該標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的な該核酸配列部分が８〜１５ヌクレオチド長である核酸増幅のための第２鋳型と；いずれか１つの酵素が、前記第１および前記第２の鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であるか、または第１酵素が前記第１プライマーのニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、第２酵素が前記第２プライマーの酵素部位においてニックを形成することが可能である、１つまたは２つの熱安定性ニック形成酵素とを含むキットが提供される。
【０１８３】
特定の実施形態において、標的配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む。特定の実施形態において、ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型は、容器内に存在する。特定の実施形態において、ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型は、２つの容器内に存在する。他の実施形態では、該ポリメラーゼおよびニック形成酵素が第１の容器に存在し、前記鋳型が第２の容器に存在する。一部の態様において、ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型は、乾燥凍結される。一部の態様において、キットは、増幅法に従うための指示書をさらに含む。キットは、キュベットをさらに含み得る。または、例えば、キットは、側方流動装置またはディップスティックをさらに含み得る。一部の態様において、側方流動装置またはディップスティックは、捕捉プローブをさらに含む。一部の態様において、キットは、蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、ポリスチレンビーズからなる群から選択される検出器構成要素をさらに含む。キットの一部の態様において、少なくとも１つの前記鋳型は、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む。
【０１８４】
また、核酸の標的配列を増幅するためのキットであって、ＤＮＡポリメラーゼと；第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含む核酸増幅のための第１鋳型と；該標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的な３’末端における認識領域と、前記認識領域の上流にあるニック形成酵素結合部位およびニック形成部位と、前記ニック形成部位の上流にある安定化領域とを含み、該標的配列は、第１鋳型認識領域と第２鋳型認識領域とのヌクレオチド和よりも１〜５ヌクレオチド多く含む核酸増幅のための第２鋳型と；いずれか１つの酵素が、前記第１および前記第２の鋳型の該ニック形成部位においてニックを形成することが可能であるか、または第１酵素が前記第１プライマーのニック形成部位においてニックを形成することが可能であり、第２酵素が前記第２プライマーの酵素部位においてニックを形成することが可能である、１つまたは２つの熱安定性ニック形成酵素とを含むキットも提供される。キットの一部の態様において、標的配列のセンス鎖の３’末端と相補的である第１鋳型の核酸配列部分は８〜１５ヌクレオチド長であり、標的配列のセンス鎖の相補体の３’末端と相補的である第２鋳型の核酸配列部分は８〜１５ヌクレオチド長である。
【０１８５】
特定の実施形態において、ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型は、２つの容器内にある。他の実施形態では、該ポリメラーゼおよびニック形成酵素が第１の容器内にあり、前記鋳型が第２の容器内にある。一部の態様において、ポリメラーゼ、ニック形成酵素、および鋳型は、乾燥凍結される。一部の態様において、キットは、増幅法に従うための指示書をさらに含む。キットは、キュベットをさらに含み得る。または、例えば、キットは、側方流動装置またはディップスティックをさらに含み得る。一部の態様において、側方流動装置またはディップスティックは、捕捉プローブをさらに含む。一部の態様において、キットは、蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、ポリスチレンビーズからなる群から選択される検出器構成要素をさらに含む。キットの一部の態様において、少なくとも１つの前記鋳型は、スペーサー、遮断基、または修飾ヌクレオチドを含む。
【実施例】
【０１８６】
（実施例１）
試料のＮＥＡＲ（商標）増幅アッセイ
この実施例は、本発明の方法の典型的なＤＮＡウェットアッセイの例を与える。反応の体積および形式、アッセイを実施する時間の長さ、およびそれぞれの反応物の量に多数の改変を施すことができることを、当業者は理解している。
【０１８７】
２つの９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用して、「ウェット」アッセイ、鋳型／標的プレートおよびマスター混合物プレートを設定する。始めに、５マイクロリットルの鋳型を鋳型標的プレート上の適切なウェルに等分する。「−標的」ウェル（標的を含まない対照ウェル）に関しては、５マイクロリットルのｄＨ２Ｏを加える。試薬マスター混合物は、１本の試験管中でバッファー、塩、ｄＮＴＰ、酵素、およびｄＨ２Ｏを一緒に組み合わせ、試験する試料の数に基づいて適切な体積のそれぞれを使用することによって作製する（この実施例内の表を参照）。４０マイクロリットルの試薬マスター混合物を、マスター混合物プレートの「−標的」と「＋標的」ウェル（標的を含む対照ウェル）の両方に等分し、プレートは熱シーラントで密封する。すべての前のステップは前増幅ルームで実施し、すべての後のステップは後増幅ルームで実施した。熱シーラントを鋳型／標的プレートから、標的を加えるウェルのみから除去し、考えられる汚染を避けるために「−ウェル」は密封状態にする。５マイクロリットルの標的を適切な「＋標的」ウェルに等分する。鋳型／標的プレートは熱シーラントで再度密封する。鋳型／標的プレートとマスター混合物プレートの両方を、サーマルサイクラーを使用してアッセイ温度（例えば、５６℃、５７℃、または５８℃で２〜３分間インキュベートする。熱シーラントは両方のプレートから除去する。マスター混合物プレートのウェルからの４０マイクロリットルの試薬マスター混合物を、鋳型／標的プレート上の適切なウェルに移し、鋳型／標的プレートは熱シーラントで再度密封する。試料はアッセイ温度で５〜１０分間インキュベートする。反応に関する時間は、インキュベーションが始まる時間、試薬マスター混合物を鋳型／標的プレート上のウェルに移し、プレートを密封し、サーマルサイクラー中に置いた直後から計算する。反応は０．１％以上ＳＤＳを加えること、または８０℃で２分間インキュベートすることによって停止させる。
【０１８８】
増幅産物を検出するために、例えば、５マイクロモーラーの分子ビーコン３〜５マイクロリットルをそれぞれのウェルに加え、数回の上下のピペッティングにより混合する。蛍光の読み出しは、アッセイ温度で、１分間のインキュベーション後、分子ビーコン上に存在するフルオロフォアに基づいて適切な波長で実施する。
【０１８９】
単一５０マイクロリットルＤＮＡ反応に関する典型的な試薬の内訳（すべての体積はマイクロリットル単位）
【０１９０】
【数５】
2014073137.tif 000011
５ＸＩＢ２バッファーは：
２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
７５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４
７５ｍＭのＮａ２ＳＯ４
５０ｍＭのＭｇＳＯ４
５ｍＭのＤＴＴ
０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる
典型的な反応は標準標的濃度を有していないが、反応当たりの標的コピーは、例えば下端で１０〜５０から、例えば上端で１Ｅ＋６コピー以上までの範囲である可能性がある。モル濃度の点では、標的の１０コピーを用いる５０マイクロリットルのアッセイは３．３２ｅ−１３マイクロモルであり、標的の５０コピーを用いる５０マイクロリットルのアッセイは１．６６ｅ−１２マイクロモルであり、かつ標的１ｅ６のコピーを用いる５０マイクロリットルのアッセイは３．３２ｅ−８マイクロモルである。
【０１９１】
標的試料は、例えばｄＨ２ＯまたはＴＥ中に際懸濁した精製ＤＮＡまたはＲＮＡ、または精製しなかった試料からなっていてよい。例えば、子宮頸管スワブ臨床試料を回収し、試料はＰｉｅｒｃｅのＬｙｓｅ−Ｎ−ＧｏＰＣＲ試薬（カタログ番号７８８８２）を使用してスワブから溶出および溶解させた。Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏは、非イオン性洗剤ベースである専用製剤である。次いでそれぞれの溶出／溶解試料のアリコートをアッセイに直接加え、結果はアッセイ活性の消失がないことを示す。ウイルス輸送媒体（ＶＴＭ）、Ｍ４またはＭ５のいずれかにおいて回収した臨床試料を使用してアッセイをさらに実施した。ＶＴＭにおいて回収した試料をＰｉｅｒｃｅのＬｙｓｅ−Ｎ−ＧｏＰＣＲ試薬と混合して標的細胞を溶解させ、その後これらの試料のアリコートは、活性の消失なしでアッセイに加えた。最後に、砂、土、粘度、尿および血清などの様々な潜在的阻害剤の存在下でアッセイを実施し、かつこれらの阻害剤のそれぞれは耐用性良好であった。
【０１９２】
（実施例２）
ゲル電気泳動によるＤＮＡのＮＥＡＲ（商標）アッセイ産物の検出
増幅反応産物はゲル電気泳動によって目に見える状態にすることができる。標的の不在下において、（相補的または実質的に相補的な３’塩基を有する）鋳型は１つまたは複数の塩基が重複し、ポリメラーゼがそれぞれの方向に伸長してＮＥＡＲ（商標）増幅二重鎖を生成し（図１Ｂ）、増幅はＮＥＡＲ（商標）増幅と同様のメカニズムで進行して、標的増幅産物より２塩基短い産物を増幅する。鋳型がＡおよびＴで終わる２５ｍｅｒのアッセイの場合、結果として生じるバックグラウンド産物は２３塩基である。２７ｍｅｒのアッセイも、２３ｍｅｒバックグラウンドおよび２７ｍｅｒ産物を形成する。より長い反応産物も増幅する。これらの産物の配列は、図１Ｃ中のステップ９Ｂにより、ニック形成酵素がＮＥＡＲ（商標）増幅二重鎖の両側にニックを形成することができる前の、ポリメラーゼによる伸長によるものであると仮定する。図２は、ゲル電気泳動によって、ＮＥＡＲ（商標）反応産物はバックグラウンド産物と容易に識別されることを示す。
【０１９３】
（実施例３）
ゲル電気泳動によるＲＮＡアッセイ産物の検出
本発明の方法の反応はＲＮＡ標的も増幅することができる。この場合、標的は、ウイルス粒子をシミュレートするためにＭＳ２ファージのコートタンパク質によって被包されたＲＮＡの約６００塩基鎖である、Ｅｂｏｌａ  Ａｒｍｏｒｅｄ  ＲＮＡである。反応は被包ＲＮＡ配列内に含有されるＥｂｏｌａゲノムの２５塩基領域を増幅するように設計する。２０％ポリアクリルアミドゲルにおいて実施した反応の産物（図３）は、増幅２５ｍｅｒ産物ならびに２３ｍｅｒおよび２０ｍｅｒバックグラウンド産物を示す。この実施例は、ウイルス様粒子から放出されたＲＮＡを増幅する反応の能力を実証する。
【０１９４】
（実施例４）
質量分析によるＤＮＡおよびＲＮＡアッセイ産物の検出
本発明の方法の反応増幅産物は、フロントエンドＬＣを備えるＥＳＩ／ＴＯＦシステムを使用する質量分析によって検出することもできる。観察した反応産物は多電荷イオン種である。通常、オリゴヌクレオチド産物の長さに応じて、−３または−４の荷電状態はスペクトル中の主要ピークである（１０００〜３０００ＡＭＵの範囲内）。通常ナトリウム付加物は、約２０〜２５％の強度で主要ピークに隣接するピークとしてスペクトル中に存在する。標的の存在下での陽性反応に特有のピークは、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡ反応に関して図４および５の両方において見ることができる。これらの反応中に形成されたバックグラウンド産物は、これらのスペクトルの質量範囲中には示されない。
【０１９５】
（実施例５）
アッセイ増幅の実時間検出
本発明の方法の増幅反応は、図６中に示すように、ＳＹＢＲＩＩ蛍光色素を用いて実時間でモニターすることもできる。蛍光はＳＹＢＲＩＩが増幅二本鎖産物中に挿入すると増大する。バックグラウンド産物も、実際の産物より遅い速度で蛍光を発生する。増幅配列、反応温度および反応バッファー条件の最適化は、陽性反応と陰性対照の間の明白な区別を目に見える状態にするために必要である。
【０１９６】
（実施例６）
実時間ＮＥＡＲ（商標）アッセイ増幅のＦＲＥＴ検出
ＮＥＡＲ（商標）増幅は、図７中に示すように、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってモニターすることもできる。増幅は二重標識鋳型、それぞれの末端における鋳型（５’−ＦＡＭ、３’−ＢＨＱ）を使用して行う。それが二本鎖になるときニック形成酵素による鋳型の切断によって、ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドから蛍光が発生する。蛍光は初期ニック形成反応によって生成するので、この検出法は非常に感度が良い。鋳型の３’末端は標識の消光によって伸長を妨害されるので、バックグラウンド蛍光の生成は抑制される。
【０１９７】
（実施例７）
実時間ＮＥＡＲ（商標）増幅の分子ビーコン検出
実時間増幅をモニターする第三の方法は、図８中に示すように、分子ビーコンを使用することである。この場合、増幅産物は分子ビーコンのループ領域とハイブリダイズし、ヘアピンステムのそれぞれの末端におけるフルオロフォアとクエンチャーの分離から蛍光の増大をもたらす。この相互作用は増幅後に生じるので、それは偽実時間でありＦＲＥＴ手法と比較して若干応答が遅い可能性があると考えられる。
【０１９８】
（実施例８）
偽陽性率試験
この実験を設計して、本発明の方法の増幅反応が陰性反応において真の産物を生成する、または偽陽性である可能性を調べた。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムに特異的な２５ｍｅｒ領域の特異的増幅を対象とする反応を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡの存在下（ｎ＝１２０）および不在下（ｎ＝３２０）において実施した。終点反応は質量分析計で実施し、質量スペクトル中の産物質量ピークの濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を分析した。図９中に示すように、結果は、いずれの３２０の陰性反応も水対照と等しいＡＵＣ値を有する偽陽性をもたらさなかったことを示す。真陽性のＡＵＣ値は、真陰性から少なくとも３標準偏差離れていた。全体的に、これらの結果は本発明の方法のアッセイの再現性を実証する。
【０１９９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ用のアッセイを開発して、配列５’−ＴＴＡＡＣＧＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＧ−３’を有するｍｏｂＡ−ｎｐｒＥ遺伝子領域の２５ヌクレオチド領域を標的化した。この領域を増幅するために使用した鋳型はＴ１  ５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＣＧＴＣＴＣＴＡ−３’、およびＴ２  ５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡ−３’であった。このアッセイは実質的に実施例１中に記載したのと同様に、ここではＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノムＤＮＡの１０，０００コピーおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡの１００，０００コピー（真陽性）、大腸菌のゲノムＤＮＡの１０，０００コピーおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡの１００，０００コピー（真陰性）または標的なし（水対照）で５６℃において４分間に修正した。次いでそれぞれの試料のアリコートをエレクトロスプレーイオン化質量分析により分析して、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の計算値を使用してそれぞれの反応中に生成した特異的産物の量を決定した。
【０２００】
（実施例９）
ビーコン検出：ビーコン検出によるアッセイの再現性
本発明の方法の反応産物の分子ビーコン検出は終点読み出しとして使用することもできる。図１０中に示すように、反応産物の比は順方向鋳型と逆方向鋳型のインプット比を変えることによって操作することができる。反応産物の１つを優先するために鋳型を非対称にすることによって、分子ビーコンとのハイブリダイゼーションに利用可能である一本鎖産物を与える。開裂した分子ビーコンは蛍光シグナルを生成する。この検出法は非常に再現性がある。この試験では、２人のオペレーターが異なる２日で２連の同じアッセイを実施した。この試験の結果は、ある１日から翌日までのアッセイの再現性、およびオペレーター間の再現性を実証する。
【０２０１】
（実施例１０）
ビーコン検出によるアッセイ感度
ビーコンの読み出し値を用いてアッセイの感度を、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡの希釈物を使用して試験した。図１１中に示すように、標的対照なしを超えてわずか５０コピーを検出した。
【０２０２】
（実施例１１）
ＤＮＡ増幅に関する増幅産物の濃度
アッセイの感度は、反応産物の質量分析による検出を使用してさらに試験した。図１２は、１００コピーまで標的対照なしを超えてシグナルを示す。この試験からのデータを使用して、インプットコピー数と増幅産物の最終量を関連付けた。この試験では、質量スペクトルによる産物ピークのＡＵＣ値を標準曲線に適合させて、アッセイの増幅産物の推定最終濃度を得た。増幅産物の量は、それぞれ１Ｅ＋２および１Ｅ＋５コピーに関して約２５０ｎＭ〜ほぼ１μＭの範囲である。この産物の量は１Ｅ＋８〜７Ｅ＋１０倍の増幅をもたらす。これらの反応はホットスタート条件なしで実施し、実際ホットスタート条件は増幅産物の量を劇的に増大させることが示されており、したがって増幅のさらなる増大を得る。ゼロコピー増幅反応は、標準曲線式中のｙ切片値のために正の最終濃度を有する。
【０２０３】
（実施例１２）
ＲＮＡアッセイに関する増幅産物の濃度
同様の試験を本発明の方法を使用してＲＮＡの増幅に実施した。ＲＮＡ標的の希釈物を本発明の方法のアッセイによって増幅した。産物に質量スペクトルを施し、図１３中に示すように、産物ピークのＡＵＣ値を標準曲線に対して分析して最終産物の濃度を決定した。初期標的の３０および３０，０００コピーで始める１２分間の増幅は、それぞれ３Ｅ＋９〜１Ｅ＋７倍の増幅をもたらす。ＤＮＡ増幅と比較して低い増幅の程度は、その複製能力と比較したポリメラーゼの低い有効性の逆転写酵素能力が原因である可能性がある。さらに、逆方向鋳型の伸長によって形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、通常のＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと比較してより強力な相互作用であり、少ないブリージングを有して、正方向または別の逆方向鋳型が一本の鎖を置換するのを可能にする。しかしながら、ＲＮＡ反応からの増幅産物は＜１００コピーで検出した。
【０２０４】
（実施例１３）
ＤＮＡに対するＮＥＡＲ（商標）反応の特異性
反応産物は通常２０塩基長と３０塩基長の間にあるので、これらの短い増幅アッセイが、他の近傍分類種ゲノムが存在する一配列領域を標的化するほど十分特異的であり得るかどうかに関する疑問が生じる。様々な量の近傍分類種ゲノムＤＮＡの存在下および不在下で増幅反応を実施することによって、反応をその特異性に関して試験した（図１４）。この場合、アッセイはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｐＸＯ２プラスミド中の特異的配列を検出し、かつ近傍分類種ゲノムはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）である。反応は産物ピークに関するＡＵＣ値によって分析した。以下の図は、的確な標的（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の不在下では、真の増幅産物は存在しないことを実証する（レベルが低すぎてそれらはグラフのスケールでは目で見ることができない）。陽性反応の増幅の量は、三連の実験の１つに関する１つの低い値のために、０およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの５Ｅ＋５コピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの５Ｅ＋４コピー）に関する大きなエラーバーと一致する。全体としてこの実験は、アッセイをゲノムの特定領域内に設計するとき、反応は標的配列に非常に特異的であることを実証する。
【０２０５】
（実施例１４）
干渉物質の試験
一群の干渉物質を試験して増幅に対するそれぞれの影響をモニターした。図１５は、干渉物質の存在下での本発明の方法のアッセイの確かな性質を実証する。フミン酸などのＰＣＲを阻害することが知られているいくつかの干渉物質は、このアッセイは阻害しなかったようであるが、それぞれの干渉物質の量は知られていない。統計分析から、干渉物質Ｂ、Ｃ、およびＥのみが対照アッセイｘと統計上異なっていた。Ｂ、Ｃ、およびＥの場合、その差は産物増幅の増大をもたらした。
【０２０６】
（実施例１５）
ＤＮＡアッセイを用いた２配列の多重増幅
ＤＮＡ二重鎖をキャピラリー電気泳動（ＣＥ）検出用に設計した。増幅産物は２５塩基長（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓアッセイ、Ｂａ）および２７塩基長（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアッセイ、Ｂｓ）であり、バックグラウンド産物は２３ｍｅｒであった。反応はそれぞれのゲノムＤＮＡ標的の５Ｅ＋５コピーの有無の下で１０分間実施した。試料は２０％ポリアクリルアミドゲルに施して、反応産物を目に見える状態にした。図１６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのみが存在するとき、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの両方が存在するときの陽性増幅産物の存在を示す。
【０２０７】
（実施例１６）
ＤＮＡアッセイ二重鎖の特異性
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂｓ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（Ｂａ）を用いたＤＮＡ二重鎖反応は、それぞれのゲノムに特異的であることを示した。図１７中に示すように、アッセイは近傍分類種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの存在下において実施した。両方の鋳型のセットおよびＢａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡが存在する陰性反応中で、２５または２７ｍｅｒ領域における産物のバンドは存在しない。特異的ゲノム標的が存在するときのみ産物のバンドが現れ、これは二重鎖反応の特異性を実証する。
【０２０８】
（実施例１７）
ＲＮＡアッセイを用いた多重増幅
２７ｍｅｒ産物を増幅するＭＳ２アッセイおよび２５ｍｅｒ産物を増幅するＥｂｏｌａアッセイを開発し、すべての鋳型がそれぞれのアッセイ中に存在し産物の増幅が存在する標的に依存するように多重増幅した。鋳型のこの組合せは、２３塩基長と２０塩基長であるバックグラウンド産物を形成する。図１８中に示すゲルは、１回の反応中で多数のＲＮＡ標的を増幅する、本発明の方法の反応に関する能力を実証する。
【０２０９】
（実施例１８）
溶解胞子からの増幅
増幅を半処理試料に実施して、溶解により胞子から放出されたＤＮＡを増幅することが可能であるかどうか決定した。陰性対照反応は非溶解状態のＤＮアーゼ処理胞子を含有しており、したがって増幅するためのＤＮＡは存在しないはずであった。陽性対照反応は、溶解により放出されたと推測されるＤＮＡの量付近の濃度で精製ゲノムＤＮＡを含有していた。図１９中の結果は、非溶解状態のＤＮアーゼ処理胞子を用いた増幅は予想通り産物の増幅をもたらさず、一方増幅前に溶解した３試料は理論量の範囲内の産物量をもたらしたことを示す。
【０２１０】
（実施例１９）
捕捉および伸長
本発明の方法の反応産物は、固体表面上で検出することもできる。ビオチン／ストレプトアビジン結合によって表面と５’末端で結合した捕捉プローブは、そこからポリメラーゼが伸長してＳＹＢＲおよび任意の挿入色素が検出し得る安定した二重鎖を形成する反応産物と結合することができる。捕捉プローブの３’塩基は、鋳型またはバックグラウンド産物のいずれにも存在しない産物中の中央スペーサー塩基と相補的であるので、捕捉プローブを設計して、バックグラウンド産物より真の産物との結合による伸長を促進する。図２０は、平均結合（捕捉プローブの伸長を除外するためのポリメラーゼの不在下での同じ反応）、およびバックグラウンド産物のみが増幅されるが、ポリメラーゼの捕捉プローブで安定した二重鎖を形成して伸長することはできない標的なしの対照を超える捕捉プローブおよびポリメラーゼの存在下における産物の増大した蛍光を実証する。
【０２１１】
（実施例２０）
表面ＮＥＡＲ（商標）ＦＲＥＴ  ＤＮＡアッセイ
本発明の方法の反応は、表面上に固定した鋳型を用いて実施することもできる。表面増幅のＦＲＥＴ検出用の鋳型は、３つの修飾：１つの５’ビオチンおよびＴＥＧスペーサー、ビオチン内の１つのＦＡＭフルオロフォア、およびバックグラウンド増幅を阻害するためおよびＦＡＭフルオロフォアを消光するために働く３’末端上のクエンチャーを通常有する。鋳型はビオチン／ストレプトアビジン結合によって表面に固定する。図２１は、追加的に混合しながら固定した両方の鋳型によって、溶液中増幅速度よりはるかに遅い速度で反応が進行することを実証する（ゲノムＤＮＡの１Ｅ＋６コピーに関しては１６分間中の増幅）。１つの鋳型を表面上に固定し、もう１つの鋳型が溶液中に遊離しているとき、増幅反応はゲノムＤＮＡの１Ｅ＋６コピーに関して１０分間の検出に増大する。バックグラウンド産物からの蛍光は、溶液相動態に関して観察したのと同様の産物のシグナル後に約３．５分間観察するが、相当減速する。
【０２１２】
（実施例２１）
ヘルスケアの例
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｔ）のアッセイ
本発明の方法のアッセイを実施してＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｔ）の標的配列の存在を検出した。ＣｔＰ２＿２アッセイの標的配列を含有する合成ＤＮＡの２倍希釈系を使用してアッセイの検出限界を決定した。その反応は、この実施例中に記載するようないくつかの修正で、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施した。希釈系は標的ＤＮＡの１０，０００コピーで始め、反応当たり１コピー未満まで進めた。「標的なし」の対照試料もこの実験に含めた。反応は９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、５０マイクロリットル体積中、以下のバッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭの（ＮＨ４）２（ＳＯ２）、１５ｍＭのＭｇ２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．３ｍＭのｄＮＴＰ、１９．２単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼおよび１５単位のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素中で実施した。鋳型は２００ｎＭ：１００ｎＭ（鋳型１：鋳型２）の比で加えた。反応は以下のように実施した：プレート１では、５マイクロリットルの鋳型混合物を前増幅ルーム中のそれぞれのウェルに加え、密封した。プレート２では、４０マイクロリットルのマスター混合物を前増幅ルーム中のそれぞれのウェルに加え、密封した。マスター混合物は、ｄＨ２Ｏおよび鋳型以外の前述のすべてのアッセイ要素からなっていた。次いでこの２枚のプレートを後増幅ルーム中に移し、そこで５マイクロリットルの標的をプレート１のそれぞれのウェルに加えた（「標的なし」の対照ウェルは除く）。次いで２枚のプレートは、５６℃での２〜３分間のプレインキュベーション用に、５６℃にあらかじめ加熱したサーマルサイクラーに移した。次いでプレート２の中身をプレート１に移し、次いでそれを５６℃で５分間インキュベートした（増幅ステップ）。このインキュベーション後、２分間８０℃で酵素を不活性化することによって反応を停止させた。その後、増幅ＣｔＰ２＿２産物に特異的な分子ビーコンを３００ｎＭの最終濃度まで加え、蛍光は５６℃で検出した。すべての試料は三連で実施し、エラーバーは標準偏差を示す。
【０２１３】
ＣｔＰ２＿２のアッセイは、２つの鋳型、鋳型１（５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＡＧＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧ−３’）および鋳型２（５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡ−３’）を、２００ｎＭ：１００ｎＭの最終鋳型濃度で使用して実施した。蛍光検出に使用した分子ビーコン、ＭＢ５．１８は、５’−ＦＡＭフルオロフォアおよび３’−ＢＨＱ１クエンチャー、および以下の配列：５’−ｃｔｇｇｃＴＡＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡｇｃｃａｇ−３’を含有していた。
【０２１４】
これらの結果は図２２中に示し、アッセイは試料中の標的の１０未満のコピーを効率良く検出することができることを示す。図２２Ｂは、約１〜２のコピーでさえ検出することはできるが、ただし希釈実験のため、いくつかのウェルは統計上如何なる標的ＤＮＡも有さない可能性があることを示す（図２２ｂ、バー１．２のａ、ｂ、およびｃを比較）。
【０２１５】
ＣｔＰ２＿２のアッセイの標的配列は５’ＡＧＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＴＴＡＡＧＣＧＧＴＡＴＡＡ−３’である。子宮頸管スワブまたは膣スワブで回収した試料、スワブで回収し次いでＭ４またはＭ５などのウイルス輸送媒体に移した試料などの臨床試料を、以下のようにアッセイ中で使用するために調製することができる。それぞれのスワブは、３００マイクロリットル〜１マイクロリットルのＰｉｅｒｃｅのＬｙｓｅ−Ｎ−ＧｏＰＣＲ試薬（カタログ番号７８８８２）を含有する１．５ミリリットルまたは２．０ミリリットルのエッペンドルフチューブ中に置く。混合物は、時折混合しながら、放置して室温で５〜１０分間インキュベートする。次いで溶出および溶解試料のアリコートをアッセイに直接加える。ウイルス輸送媒体中に存在する試料に関しては、試料のアリコートは、ＰｉｅｒｃｅのＬｙｓｅ−Ｎ−ＧｏＰＣＲ試薬以上の体積を含有するエッペンドルフチューブに移し（１：１、１：２、１：１０、１：２０などの試料：Ｌｙｓｅ−Ｎ−Ｇｏの比で）、時折混合しながら、放置して室温で５〜１０分間インキュベートすることができる。次いで溶出および溶解試料のアリコートをアッセイに直接加える。
【０２１６】
（実施例２２）
食品安全性用途
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのアッセイ
食品中病原菌を特異的に検出するための本発明の方法のアッセイの有効性を実証するために、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、インスタント食製品由来の食品の安全性への最も深刻な脅威の１つでアッセイを実施した。このアッセイは、この実施例中に記載するようないくつかの修正で、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施した。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌株ＥＧＤ−ｅのゲノムＤＮＡを、密接に関連する非病原種Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ菌株Ｃｌｉｐ１１２６２由来の多量のゲノムＤＮＡと共にアッセイした。図２３中に示すように、ＤＮＡが存在しなかった陰性対照反応はわずかなバックグラウンドレベルの蛍光を示し、５０マイクロリットルの反応当たり１００万ゲノム当量までの多量のＬ．ｉｎｎｏｃｕａのＤＮＡは、バックグラウンド蛍光の有意な増大は示さなかった。しかしながら、１，０００ゲノム当量のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの付加は実質的な蛍光の増大によって容易に検出され、非病原種Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａが１０００倍過剰に、５０マイクロリットルの反応当たり１００万ゲノム当量存在したときでさえ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａの存在によって影響を受けることはなかった。それぞれの反応は、４６ｍＭのＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのジチオスレイトール、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ｍＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からの１９．２単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からの１５単位のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニック形成エンドヌクレアーゼ、２００ｎＭの第１オリゴヌクレオチド、および２マイクロモルの第２オリゴヌクレオチドからなっていた。オリゴヌクレオチドおよびＬｉｓｔｅｒｉａのゲノムＤＮＡを５６℃において酵素バッファー混合物から別々にインキュベートし、次いで５マイクロリットルのこの混合物を４５マイクロリットルの酵素バッファー混合物に加えた。反応混合物は５６℃で１０分間、次いで８０℃で２分間インキュベートした。この後、分子ビーコンの５μＭ溶液３．２マイクロリットルをそれぞれの反応に加えた。分子ビーコンの配列は、それぞれ５’および３’末端にフルオロフォアおよびクエンチャーを有する増幅したＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの配列に特異的であった。分子ビーコンの付加後、反応混合物は５６℃で１分間インキュベートし、次いで蛍光測定を行った。それぞれのアッセイ条件は２連で実施しており、平均蛍光値を示す。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓアッセイの標的配列は５’−ＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＴＡＴＣＧＴＧＴＡＴ−３’である。鋳型配列は以下の通りである：Ｔ１５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＡ−３’およびＴ２５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＡＣＧＡＴＡＡＣ−３’。
【０２１７】
（実施例２３）
ウイルスＲＮＡの例
ウイルス陽性臨床試料から精製したウイルスＲＮＡの１０倍希釈系を使用して、アッセイの検出限界を決定した。ウイルスＲＮＡは、市販のウイルスＲＮＡ精製キットを使用して精製した。「標的なし」の陰性対照試料を含めた。反応は９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、５０マイクロリットル体積中、以下のバッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭの（ＮＨ４）２（ＳＯ２）、１０ｍＭのＭｇ２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．１ｍＭのｄＮＴＰ、１９．２単位のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、７．５単位のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素および４単位のＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素中で実施した。鋳型は４００ｎＭ：２０ｎＭ（鋳型１：鋳型２）の比で加えた。反応は以下のように実施した：プレート１では、５マイクロリットルの鋳型混合物を前増幅ルーム中のそれぞれのウェルに加え、密封した。プレート２では、４０マイクロリットルのマスター混合物を前増幅ルーム中のそれぞれのウェルに加え、密封した。マスター混合物は、水および鋳型以外の前述のすべてのアッセイ要素からなっていた。次いでこの２枚のプレートを後増幅ルーム中に移し、そこで５マイクロリットルの標的をプレート１のそれぞれのウェルに加えた（「標的なし」の対照ウェルは除く）。次いで２枚のプレートは、５６℃での２〜３分間のプレインキュベーション用に、５６℃にあらかじめ加熱したサーマルサイクラーに移した。次いでプレート２の中身をプレート１に移し、次いでそれを５６℃で５分間インキュベートした（増幅ステップ）。このインキュベーション後、２分間８０℃で酵素を不活性化することによって反応を停止させた。その後、増幅産物に特異的な分子ビーコンを３００ｎＭの最終濃度まで加え、蛍光は５６℃で検出した。すべての試料は三連で実施し、エラーバーは標準偏差を示す。結果は図２４中に示す。
【０２１８】
ウイルスＲＮＡアッセイは、２つの鋳型（鋳型１：３１ヌクレオチド長、および鋳型２：３１ヌクレオチド長）を、４００ｎＭ：２０ｎＭの最終鋳型濃度で使用して実施した。蛍光検出に使用した分子ビーコン（ＭＢ）は、５’−ＦＡＭフルオロフォアおよび３’−ＢＨＱ１クエンチャー、および２９ヌクレオチド長の配列を含有していた。標的配列の長さは２６ヌクレオチドであった。
【０２１９】
（実施例２４）
農業用途：農作物における遺伝子組換え形質の検出、遺伝子組換え（ＧＭＯ）および従来型（非ＧＭＯ）トウモロコシのアッセイ用試料調製
本発明の方法のアッセイを使用して、農業用途において遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）を検出することができる。このアッセイを使用して、非組換えトウモロコシＤＮＡのバックグラウンドでトウモロコシゲノムに挿入したｂａｒ遺伝子の存在を検出した。ｂａｒ遺伝子は、広域の除草剤グルホシネートに対する耐性を与える。このアッセイは、本明細書中に記載するようないくつかの修正で、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施した。遺伝子組換えおよび従来型（非組換え）のトウモロコシ種子を適切なレベルの粗さに砕いて、標準的なバッファーを使用して核酸を抽出した。製造者の説明書に従いサイズ排除カラムを使用して、抽出した物質を精製した。精製した核酸を組み合わせて、従来のバックグラウンドで５％ｂａｒ−組換えトウモロコシの最終濃度を得て（例えば、５マイクロリットルのｂａｒトウモロコシＤＮＡ抽出物を９５マイクロリットルの従来型トウモロコシＤＮＡ抽出物と組み合わせた）、または１００％従来型のトウモロコシの場合は非混合状態で使用した。ｂａｒ遺伝子を検出するために使用したオリゴヌクレオチド配列は以下に列挙する。
【０２２０】
鋳型１：ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＣＡ
鋳型２：ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＧＴＣＴＣＧＡＴＧＴＡ
これらの鋳型を設計して以下の産物を生成した：
産物１：ＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡ
産物２：ＴＧＴＣＴＣＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＣＧＡＴＧ
使用したアッセイ試薬は：９．６単位のＢｓｔ．ポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１５単位のＮ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素（ＮＥＢ）、５マイクロリットルのＴｈｅｒｍｏｐｏｌＩバッファー（ＮＥＢ）、２．５マイクロリットルのＮＥＢバッファー３、１２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．３ｍＭのｄＮＴＰ、２．５％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、５マイクロリットルの試料、鋳型および水であった。オリゴヌクレオチドは１０ｎＭ（鋳型１）および１００ｎＭ（鋳型２）の初期濃度で存在した。水を使用して最終体積を５０マイクロリットルに調節し、１０分間のアッセイを５６℃で実施し、次に２分間９４℃でインキュベートして酵素を不活性化させ、次に３００ｎＭの最終濃度で特異的分子ビーコンを用いて５６℃において検出した。この分子ビーコンの配列は以下の配列である：
５’  ＦＡＭ−ＣＣＴＣＧＣＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧ−ＢＨＱ１−３’。
【０２２１】
結果は図２５中に示す。
【０２２２】
（実施例２５）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の検出
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞由来のマイクロＲＮＡのアッセイ用試料調製
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２６）は、高レベルのマイクロＲＮＡ−２１を発現することが知られている（Ｉｏｒｉｏ，  Ｍ．Ｖ．ら、２００５年、ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、第６５巻：７０６５〜７０７０頁）。成熟マイクロＲＮＡ−２１配列を検出するｍｉＲ−２１用のアッセイを開発した：
５’  ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ  ３’
使用した鋳型配列は以下の配列であった（ニック形成酵素の配列に下線を引く）：
鋳型１：ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡ
鋳型２：ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧ
これらの鋳型を設計して以下の産物を生成した：
産物１：ＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＴＴＧＡ
産物２：ＴＣＡＡＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡ
アッセイは、本明細書中に記載するようないくつかの修正で、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施した。ＲＮＡを得るために、１０％のウシ胎児血清、グルコースおよび抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、当業者によく知られている標準的な方法を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を増殖および継代培養した。密集状態に達する前に、トリプシンを用いた処理によってプレートから細胞を除去し、その後−８０℃での凍結前にリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄した。細胞は後に採取し、製造者の説明書に従いＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いたＲＮＡ単離用に一部分を使用した。精製したＲＮＡは２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を使用して定量化した。
【０２２３】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｅｒのＴＲＩ試薬マニュアルによれば、１ｎｇの精製したＲＮＡは出発物質の約１００細胞に相当する。様々な量の精製したＲＮＡを、以下の試薬：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３０ｍＭのＮａ２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのｄＮＴＰ、１９．２単位のＢｓｔ．ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５単位のＮ．ＢｓｔＮＢＩニック形成酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．４単位のＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ）、それぞれ１００ｎＭでの２つのオリゴヌクレオチド、試料および水からなるアッセイ中で使用した。水を使用して最終体積を５０マイクロリットルに調節し、２０分間のアッセイを５６℃で実施し、次に２分間９４℃でインキュベートして酵素を不活性化させた。産物はエレクトロスプレーイオン化質量分析を使用して測定し、産物の量は濃度曲線下面積を計算することによって定量化した。アッセイの結果は図２６中に示す。
【０２２４】
（実施例２６）
ゲノムＤＮＡ標的の検出
本発明の方法のアッセイを、ゲノム標的と結合するように設計したオリゴ鋳型を使用して、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施した。希釈実験を実施して検出の下限を決定した。図２７中に示すように、５０ゲノムコピーで一貫した検出があった。希釈試料が１０ゲノムコピーを含有していたとき、検出はあったが、しかしながら、統計上、検出は一貫していなかった。
【０２２５】
実施例２６（図２７）はＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのアッセイを示す。このアッセイはｐｉｌＱ遺伝子、特に配列５’−ＡＣＴＣＴＡＣＣＡＡＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡ−３’を標的化する。この標的を増幅するために使用した鋳型配列はＴ１５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＣＣ−３’、およびＴ２５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＡＣＣＡＡＣＡ−３’であった。アッセイは、本明細書中に記載するいくつかの修正で、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施した。簡単に言うと、アッセイは５分間５６℃、次に熱不活性化ステップを８０℃で２分間実施して反応を停止させた。増幅した特異的産物の終点検出は、５６℃での１分間のインキュベーション前に、増幅した特異的産物に特異的であった５’−フルオロフォアおよび３’−クエンチャーを含有する３００ナノモルの分子ビーコンを使用して実施した。分子ビーコンの配列は以下の配列であった：５’−ＣＧＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＴＧＴＴＧＧＴＡＧＡＣＡＴＧＣＧ−３’。
【０２２６】
（実施例２７）
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓアッセイ中に生成した特異的産物の計算
本発明の方法のアッセイを、Ｂａｃｉｌｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの標的配列と結合するように設計したオリゴ鋳型を使用して、実施例１中に記載したのとほぼ同様に実施し、その標的はｐｐｓＡ遺伝子であった：
標的配列（２５ｍｅｒ）５’−ＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＡＡ−３’
Ｔ１  ５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＡＡＡ−３’
Ｔ２  ５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣＴ−３’
図２８中に示すように、線形回帰は、試料に加えた参照オリゴの量と濃度曲線下面積（ＡＵＣ）の間の十分な相関関係を示した。この等式を使用して、ゲノムＤＮＡ標的の５０または５００コピーを反応に加えたときに生成した特異的産物の量を決定した。反応は５分間実施した。増幅倍数を計算し、それを以下の表中に示す。
【０２２７】
【表５】
2014073137.tif 000012
計算は以下の：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノム＝４２１４８１４ヌクレオチド、２７８１７７７２４０の分子量（ｇ／ｍｏｌｅ）に基づいた。アボガドロ数（分子／ｍｏｌｅ）＝６．０２Ｅ＋２３。モル中の５０ゲノムコピーに関して、これは８．３０Ｅ−２３をもたらし、モル中の５００ゲノムコピーに関して、これは８．３０Ｅ−２２をもたらす。
【０２２８】
（実施例２８）
異なるスペーサー長の影響
一連のＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｔ）のアッセイを、図２９および３０中に記載したような様々な鋳型を使用して、実施例１および２１中に記載したのとほぼ同様に実施した。図２９は反応の結果を示し、図３０は鋳型設計に関するさらなる詳細を与える。反応は標的の０または１００コピーのいずれかを使用して１０分間実施した。１〜１１の範囲のスペーサー領域長（鋳型が結合した場合、オリゴ鋳型の結合部位間の標的配列上のヌクレオチドの数）を有する、一連のオリゴヌクレオチド鋳型を調製した。この実験に最適なスペーサー長は１、２、３、または４であった。
【０２２９】
２、５、６、７、および８のスペーサー長を使用して実施例２３ｍ中に記載した方法とほぼ同じ方法に従い、同様の実験セットをウイルスＲＮＡ標的に実施した。質量分析によって決定したように、２および５のスペーサー長を使用して最適な特異的産物の検出を見出し、スペーサー長が６以上であり反応を２０分間実施した場合、このアッセイ中で特異的産物は検出しなかった。
【０２３０】
同様の実験を他の標的でも実施した。ｍｉＲ−２１などのいくつかの標的に関して、スペーサーヌクレオチドを鋳型設計に含めなかったとき、反応中に標的配列が存在するかどうかにかかわらず産物を検出した。アッセイ中に標的ＤＮＡが存在するかどうかにかかわらず産物は存在し、標的が存在することを必要とせずに、鋳型セットが特異的産物を生成していたことを示した。他の実験では、０ヌクレオチドのスペーサー領域は特異的産物をもたらした。したがって、本明細書で論じるアッセイ用の鋳型を設計する際には、２セット以上の鋳型を調製して、個々の標的から特異的産物を生成するのに最適であるスペーサー領域の長さを決定しなければならない。
【０２３１】
（実施例２９）
安定化領域の影響
１セットのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｔ）のアッセイを、実施例１および２１中に記載したのとほぼ同様に実施した。安定化領域（５’ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ）を含んだ鋳型、または含まなかった鋳型のいずれかを調製した。反応は標的ＤＮＡの０または１００コピーのいずれかを用いて１０分間実施した。分析は実時間ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ蛍光検出を使用して実施した。図３１中に示すように、安定化領域を含まない鋳型を含有する試料は増幅を示さなかった。別のセットのアッセイでは、ウイルスＲＮＡを使用して、標的の０または１０００コピーのいずれかをアッセイ中に含めた。安定化領域を含まない鋳型を含有する試料は増幅を示さなかったが、一方安定化領域を含む鋳型を含有する試料は急速な増幅を示した。
【０２３２】
（実施例３０）
Ｍｇ＋２濃度の影響
１セットのＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｃｔ）のアッセイを、実施例１および２１中に記載したのとほぼ同様に実施した。このアッセイは様々な濃度のＭｇ＋２を使用して実施した。図３２中に示すように、このセットのアッセイでは、６ｍＭのＭｇ＋２が存在したとき活性の完全な消失を見出し、９ｍＭのＭｇ＋２が存在したとき活性の大幅な低下を見出した。１２ｍＭ〜２１ｍＭのＭｇ＋２濃度で、アッセイを最適に実施した。
【０２３３】
（実施例３１）
他の鋳型／標的の組合せの例
本発明の方法は、本発明の実施形態および実施例中に与える特異的鋳型および標的に限られない。他の標的および鋳型を使用して、本明細書で論じる等温増幅法を実施することができる。他の標的および鋳型の例には、図３４中に示す標的および鋳型があるが、これらだけには限られない。当業者は、図中に示す標的用の他の鋳型を設計することができ、図中に示す標的配列との関連標的配列を反応中で使用することができ、図中に含まれない標的配列が本発明の方法の範囲内にあることを理解している。
【０２３４】
本明細書で参照される各特許、特許出願、刊行物、および文献は、参照により本明細書に組み込まれる。上記特許、特許出願、刊行物、および文献の引用は、前述のいずれかが関連の先行技術であることの承認ではなく、これらの刊行物または文献の内容または発行年月日についての承認を構成することもない。
【０２３５】
単数形である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に別段の指示がない限り、複数形への言及を含む。したがって、例えば、「サブセット（ａ  ｓｕｂｓｅｔ）」への言及は複数のこのようなサブセットを含み、「核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」への言及は当業者に知られる１つまたは複数の核酸およびこれらの同等物を含むなどとなる。「または」という用語は、それが指示する１つまたは複数の項目に対して除外的であることを意味しない。例えば、「ＡまたはＢ」という構造の表現で用いられる場合、それは、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡおよびＢの両方を示し得る。
【０２３６】
別段に定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で説明される方法および系と同様または同等な任意の方法および系を用い得るが、ここでは、方法、装置、および材料が説明される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本発明との関連で用い得る刊行物において報告される工程、系、および方法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が、先行発明の理由でこのような開示に先行する権利を有さないことの承認とはみなされないものとする。
【０２３７】
本発明の基本的な態様から逸脱しない限りにおいて、前述の内容に対して改変を行うことができる。１つまたは複数の特定の実施形態への参照により実質的な詳細において本発明を説明してきたが、当業者は、本適用において具体的に開示される実施形態に対して変更を行うことができ、これらの改変および改善がなお本発明の範囲および精神のうちにあることを認めるであろう。本明細書で例示的に説明された本発明は、本明細書で具体的に開示されない（１つまたは複数の）任意の要素の不在下においても適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書における各場合において、「含む」、「本質的に〜からなる」、および「からなる」といういずれの用語も、他の２つの用語のいずれかによって置換され得る。したがって、用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられ、限定の用語としては用いられず、示され説明される特徴の同等物またはその一部は除外されず、本発明の範囲内では各種の改変が可能であることが認められる。以下の特許請求の範囲では、本発明の実施形態が記載される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【配列表】
2014073137000001.app
【外国語明細書】
2014073137000001.pdf