(57)【要約】      （修正有）【課題】チロシン血症の検査又はフィッシャー比の計測に用いられる、Ｌ−チロシン及び/又はＬ−フェニルアラニンの定量方法を提供する。【解決手段】検体をバチルス・バディウス由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰｈｅＤＨ）、NAD+、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有する所定pHの緩衝液中で混合しNADHを定量する工程(1)、検体をバチルス・スフェリカス由来のPheDH、NAD+、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有する所定pHの緩衝液中混合しNADHを定量する工程(2)、工程(1)のNADH量からＬ−フェニルアラニンの量を定量し、工程(2)のNADH量からＬ−チロシン及びＬ−フェニルアラニンの量を定量し、工程(1)と工程(2)の差分から、検体に含まれるＬ−チロシンを定量する、Ｌ−チロシン及び／又はＬ−フェニルアラニンの総量を定量する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれるL-チロシンの量、L-フェニルアラニンの量、又はL-チロシン及びL-フェニルアラニンの総量を定量する方法であって、
検体の一部をバチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(以下PheDH-BBと略記する)及びNAD+と、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.0以上、7.0以下の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量する工程(1)、
前記検体の残りの少なくとも一部をバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(以下PheDH-BSと略記する) 及びNAD+と、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.7以上、7.0以下の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量する工程(2)、
工程(1)で得られたNADH量から前記検体に含まれるL-フェニルアラニンの量を定量し、工程(2)で得られたNADH量から前記検体に含まれるL-チロシン及びL-フェニルアラニンの量を定量し、工程(1)で得られたNADH量及び工程(2)で得られたNADH量の差分から、前記検体に含まれるL-チロシンを定量する、前記方法。
【請求項２】
工程(1)をpHが6.2以上、6.4以下の緩衝液中で行う請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程(2)をpHが6.8以上、6.9以下の緩衝液中で行う請求項1に記載の方法。
【請求項４】
工程(1)及び工程(2)を1枚のマイクロウェルアレイプレート上の異なるウェルで並行して行い、各ウェル中の溶液のNADHの吸収に対応する吸光度を並行してまたは交互に測定することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
複数の検体の測定を1枚のマイクロウェルアレイプレートにて行う請求項4に記載の方法。
【請求項６】
チロシン血症の検査またはフィッシャー比の計測に用いられる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
被験者からサンプリングした検体のL-チロシン濃度を請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法により測定し、前記測定されたL-チロシン濃度と、健常人が示すL-チロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲と対比することを含む、チロシン血症の検査方法。
【請求項８】
以下の(1)〜(7)の試薬を含むL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニン定量用キット。
(1)バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(以下PheDH-BBと略記する)
(2)バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ (以下PheDH-BSと略記する)
(3)NAD+
(4)pHが6.0以上、7.0以下のPheDH-BB用緩衝液
(5)pHが6.7以上、7.0以下のPheDH-BS用緩衝液
(6)非イオン系界面活性剤
(7)タンパク質ブロック剤
【請求項９】
(4)PheDH-BB用緩衝液は(3)NAD+、(6)非イオン系界面活性剤及び(7)タンパク質ブロック剤を含有するリン酸カリウム緩衝液である請求項8 に記載のキット。
【請求項１０】
(5)PheDH-BS用緩衝液は(3)NAD+、(6)非イオン系界面活性剤及び(7)タンパク質ブロック剤を含有するリン酸カリウム緩衝液である請求項8に記載のキット。
【請求項１１】
(6)マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定が可能な構造のマイクロウェルアレイプレートをさらに含む請求項8〜10のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１２】
チロシン血症の検査またはフィッシャー比の計測に用いられる、請求項8〜11のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１３】
健常人が示すL-チロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲を表示する説明書をさらに含む、請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(以下PheDH-BBと略記する)を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするL-フェニルアラニン定量に用いるための酵素センサー。
【請求項１５】
前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNAD+とを非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.0以上、7.0以下の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量するために用いられる請求項14に記載の酵素センサー。
【請求項１６】
バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ (以下PheDH-BSと略記する)を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするL-チロシン及びL-フェニルアラニン定量に用いるための酵素センサー。
【請求項１７】
前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNAD+と非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.7以上、7.0以下の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量するために用いられる請求項16に記載の酵素センサー。
【請求項１８】
請求項14または15に記載の酵素センサー(以下、PheDH-BB酵素センサーと称する)と請求項16または17に記載の酵素センサー(以下、PheDH-BS酵素センサーと称する)の組合せであって、PheDH-BB酵素センサーで得られたNADH量及びPheDH-BS酵素センサーで得られたNADH量の差分から、検体に含まれるL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンを定量するために用いられる、組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中のL-フェニルアラニン量、L-チロシン量、及びL-フェニルアラニンとL-チロシンの総量を2種類のL-フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを用いる事により定量を行うことに関する。より詳しくは、本発明は、バチルス・バディウス（Bacillus badius）由来フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（以後、PheDH-BBと略すことがある）とバチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）由来フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（以後、PheDH-BSと略すことがある）を用いるL-フェニルアラニン量、L-チロシン量、及びL-フェニルアラニンとL-チロシンの総量の定量に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸の定量は、主に自動アミノ酸分析装置やプレカラム誘導体化逆相HPLCなど誘導体化を伴う機器分析的手法で行われており、高額な機器、試薬、煩雑な誘導体化操作を必要とする。一方、酵素を用いる定量方法は、他の機器分析的手法と比べ、安価で簡易的に行うことができる。フェニルアラニン、チロシンの定量に関しても酵素的定量法の報告がなされているが、特異性と簡易性を兼ね備えた高感度定量法は確立されていない。
【０００３】
多くのフェニルアラニンデヒドロゲナーゼはフェニルアラニンと構造が類似した化合物であるチロシンに対しても反応性を有することから、チロシンが常に存在するような溶液中、例えば、血漿中のフェニルアラニンの定量には不向きであることが指摘されている。この問題を解決するために、これまで、比較的チロシンに対する反応性の低いフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをスクリーニングにより選択すること（非特許文献1）、フェニルアラニンとチロシンに対する反応速度の違いに着目し、チロシンの影響の少ない反応初期の反応速度でフェニルアラニンを測定すること（非特許文献2）が提案されている。
【０００４】
しかし、これらの提案でも、チロシンの影響を受けやすいという問題点があった。また、遺伝子操作技術によりフェニルアラニンデヒドロゲナーゼのフェニルアラニンに対する反応特異性を向上させるために、基質認識部位を改変することが提案されているが、実際には基質認識部位が特定されているに過ぎない（非特許文献3）。
【０００５】
チロシンの酵素的定量に関しても、チロシナーゼを用いた方法が提案されている（非特許文献4）が、チロシナーゼは安定性に乏しいため新鮮なものを使用する必要があり、調製には誘導工程を必要とし、多数のサンプル処理には適していない。また、チロシンデカルボキシラーゼを用いる方法も提案されている（非特許文献5）が、3タイプの酵素反応を必要とし、比較的多量の試料が必要であるという問題点を抱えている。
【０００６】
フェニルアラニン及びチロシンの同時定量に関しても、フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いた方法が提案されている（非特許文献6）。しかしながら、この方法は、2時間の保温時間が必要であるという問題点がある。また、フェニルアラニンヒドロキシラーゼを用いる方法も提案されている（特許文献1）が、分析にカチオン交換クロマトグラフィーを要するという問題点を抱えている。
【０００７】
本発明の発明者らは、先に、バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼとバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼとを用い、両酵素の基質特異性のpH依存性を利用して、L-チロシンを定量する方法を開発した(特許文献2)。この方法では、特定のpHでは、バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼは、L-フェニルアラニンとL-チロシンの両方を基質とし、バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼはL-フェニルアラニンに高い基質特異性を示すことを利用した方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表2000-515388号公報
【特許文献２】特開2012-183027号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Asano Y., Nakazawa A., Endo K. Novel phenylalanine dehydrogenases from Sporosarcina ureae and Bacillus sphaericus. Purification and characterization.  J. Biol. Chem. 262 (1987) 10346-10354.
【非特許文献２】Hummel W., Schutte H., Kula MR. Enzymatic determination of L-phenylalanine and phenylpyruvate with L-phenylalanine dehydrogenase Anal Biochem. 170 (1988) 397-401.
【非特許文献３】Kataoka K., Takada H., Yoshimura T., Furuyoshi S., Esaki N., Ohshima T., Soda K. Site-Directed Mutagenesis of a Hexapeptide Segment Involved in Substrate Recognition of Phenylalanine Dehydrogenase from Thermoactinomyces intermedius. J Biochem 114 (1993) 69-75
【非特許文献４】Kiba N., Suzuki H., Furusawa M. Flow-injection determination of l-tyrosine in serum with immobilized tyrosinase.Talanta. 40 (1993) 995-998.
【非特許文献５】Shimizu H., Taniguchi K., Sugiyama M., Kanno T. Rapid enzymatic analysis of plasma for tyrosine. Clin. Chem. 36 (1990) 32-35.
【非特許文献６】Wibrand F. A microplate-based enzymatic assay for the simultaneous determination of phenylalanine and tyrosine in serum. Clin Chim Acta. 347 (2004) 89-96.
【非特許文献７】Tachibana S., Kuwamori Y., Asano Y. Discrimination of aliphatic substrates by a single amino acid substitution in Bacillus badius and Bacillus sphaericus phenylalanine dehydrogenases. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (2009) 729-732.
【非特許文献８】Oshima T., Misono H., Soda K. Properties of crystalline leucine dehydrogenase from Bacillus sphaericus. J. Biol. Chem. 253 (1978) 5719-5725.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献2に記載の方法は、L-チロシンを定量する方法としては優れた方法であった。
【００１１】
しかし、その後さらに詳細な検討を進めた結果、バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼによるL-フェニルアラニンの反応においては、測定に望ましいとされるpH11.0において、L-フェニルアラニンのみを用いての検量線の作成は十分に可能であるが、L-フェニルアラニン以外のアミノ酸を含有する可能性がある血漿を用いた測定では、終点が定まらずエンドポイント法による定量性に問題があることが明らかになった。
【００１２】
バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼによるL-フェニルアラニン及びL-チロシンとの反応においては、測定に望ましいとされるpH10.4において、L-フェニルアラニン及びL-チロシンのみを用いての検量線の作成は十分に可能であるが、L-フェニルアラニン及びL-チロシン以外のアミノ酸を含有する可能性がある血漿を用いた測定では、終点が定まらずエンドポイント法による定量性に問題があることが明らかになった。
【００１３】
分枝鎖アミノ酸（branched chain amino acid: BCAA；イソロイシン・ロイシン・バリン）と、芳香族アミノ酸（aromatic amino acid: AAA；チロシン・フェニルアラニン）のモル比（BCAA／AAA）をフィッシャー比と言い、健常人のフィッシャー比は、3〜4でほぼ一定である。肝機能が低下すると、肝臓のアミノ酸代謝異常が起こりチロシンやフェニルアラニンの血中への供給量が増え、筋肉や心臓において分枝鎖アミノ酸が分解されることから、フィッシャー比の値が低下する。肝炎・肝硬変・劇症肝炎・肝性脳症などの肝不全で低値を示し、一定値を下回ると治療が必要になる。
【００１４】
フィッシャー比を求めるためには検体中のチロシン及びフェニルアラニンの量を求める必要がある。しかし、上述のように検体中のチロシン及びフェニルアラニンを定量できる酵素法は知られていない。そのため、臨床では、総分枝鎖アミノ酸／チロシンモル比（BTR）がフィッシャー比に代用されることが多い。
【００１５】
そこで本発明の目的は、検体である血漿中のL-チロシン及びL-フェニルアラニンの量を個別により正確に定量できる酵素法を提供することにある。
さらに本発明は、上記酵素法を用いたフィッシャー比を求める方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は以下の通りである。
[1]
検体中に含まれるL-チロシンの量、L-フェニルアラニンの量、又はL-チロシン及びL-フェニルアラニンの総量を定量する方法であって、
検体の一部をバチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(以下PheDH-BBと略記する)及びNAD+と、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.0以上、7.0以下の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量する工程(1)、
前記検体の残りの少なくとも一部をバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(以下PheDH-BSと略記する) 及びNAD+と、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.7以上、7.0以下の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量する工程(2)、
工程(1)で得られたNADH量から前記検体に含まれるL-フェニルアラニンの量を定量し、工程(2)で得られたNADH量から前記検体に含まれるL-チロシン及びL-フェニルアラニンの量を定量し、工程(1)で得られたNADH量及び工程(2)で得られたNADH量の差分から、前記検体に含まれるL-チロシンを定量する、前記方法。
[2]
工程(1)をpHが6.2以上、6.4以下のリン酸カリウム緩衝液中で行う[1]に記載の方法。
[3]
工程(2)をpHが6.8以上、6.9以下のリン酸カリウム緩衝液中で行う[1]に記載の方法。
[4]
工程(1)及び工程(2)を1枚のマイクロウェルアレイプレート上の異なるウェルで並行して行い、各ウェル中の溶液のNADHの吸収に対応する吸光度を並行してまたは交互に測定することを含む、[1]に記載の方法。
[5]
複数の検体の測定を1枚のマイクロウェルアレイプレートにて行う[4]に記載の方法。
[6]
チロシン血症の検査またはフィッシャー比の計測に用いられる、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7]
被験者からサンプリングした検体のL-チロシン濃度を[1]〜[5]のいずれか1項に記載の方法により測定し、前記測定されたL-チロシン濃度と、健常人が示すL-チロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲と対比することを含む、チロシン血症の検査方法。
[8]
以下の(1)〜(7)の試薬を含むL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニン定量用キット。
(1)バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(PheDH-BB)
(2)バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ (PheDH-BS)
(3)NAD+
(4)pHが6.0以上、7.0以下のPheDH-BB用緩衝液
(5)pHが6.7以上、7.0以下のPheDH-BS用緩衝液
(6)非イオン系界面活性剤
(7)タンパク質ブロック剤
[9]
(4)PheDH-BB用緩衝液は(3)NAD+、(6)非イオン系界面活性剤及び(7)タンパク質ブロック剤を含有するリン酸カリウム緩衝液である[8]に記載のキット。
[10]
(5)PheDH-BS用緩衝液は(3)NAD+、(6)非イオン系界面活性剤及び(7)タンパク質ブロック剤を含有するリン酸カリウム緩衝液である[8]に記載のキット。
[11]
(8)マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定が可能な構造のマイクロウェルアレイプレートをさらに含む[8]〜[10]のいずれか1項に記載のキット。
[12]
チロシン血症の検査またはフィッシャー比の計測に用いられる、[8]〜[11]のいずれか1項に記載のキット。
[13]
健常人が示すL-チロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲を表示する説明書をさらに含む、チロシン血症の検査に用いられる[12]に記載のキット。
[14]
バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(PheDH-BB)を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするL-フェニルアラニン定量に用いるための酵素センサー。
[15]
前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNAD+とを非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.0以上、7.0以下の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量するために用いられる[14]に記載の酵素センサー。
[16]
バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ (PheDH-BS) を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることを特徴とするL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニン定量に用いるための酵素センサー。
[17]
前記検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNAD+と非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.7以上、7.0以下の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量するために用いられる[16]に記載の酵素センサー。
[18]
[14]または[15]に記載の酵素センサー(以下、PheDH-BB酵素センサーと称する)と[16]または[17]に記載の酵素センサー(以下、PheDH-BS酵素センサーと称する)の組合せであって、PheDH-BB酵素センサーで得られたNADH量及びPheDH-BS酵素センサーで得られたNADH量の差分から、検体に含まれるL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンを定量するために用いられる、組合せ。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は上記従来技術の問題を解決した、簡便な操作で短時間に実施できる方法であって、ハイスループットスクリーニングにも適した方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例1 (1-1)におけるPheDH-BBによる血漿中フェニルアラニン量の定量の反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を示す。
【図２】実施例1 (1-1)における、pH11.0の緩衝液におけるPheDH-BBの複数のアミノ酸に対する相対活性を示す。
【図３】実施例1 (1-2)における、リン酸カリウム緩衝液（pH6.3）中での反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を示す。
【図４】実施例1 (1-2)における、pH6.3の緩衝液におけるPheDH-BBの複数のアミノ酸に対する相対活性を示す。
【図５】実施例1 (1-2)における、リン酸カリウム緩衝液（pH 6.3）中でのUPLCで得られたフェニルアラニン定量値との比較結果を示す。
【図６】実施例1 (1-3)における、反応液に終濃度0.01 %のTween20を加えた場合の定量性試験の反応条件及び結果を示す。
【図７】実施例1 (1-4)における、反応液中に終濃度0.2 %のBSAを添加した場合の定量性試験の反応条件及び結果を示す。
【図８】実施例1 (1-5)における、3種の血漿中のフェニルアラニンの定量性試験のための希釈直線性試験結果を示す。
【図９】実施例1 (1-6)における酵素安定性試験結果を示す。
【図１０】実施例2 (2-1)における、PheDH-BSによる血漿中フェニルアラニン及びチロシン量の同時定量の反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を示す。
【図１１】実施例2 (2-2)における、リン酸カリウム緩衝液（pH6.9）、終濃度0.1% Tween80及び0.2 % BSAを反応液に添加した場合の反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を示す。
【図１２】実施例2 (2-3)における、3種の血漿中のフェニルアラニン及びチロシン量の総量に対する定量性、希釈直線性を求めるための反応条件及び結果を示す。
【図１３】実施例2 (2-4)における、酵素安定性試験結果を示す。
【図１４】実施例3における、PheDH-BB及びPheDH-BSによる血漿中チロシン量の定量試験の反応条件及び結果を示す。
【図１５】実施例4におけるフィッシャー比及びBTRの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼPheDH(PheDH-BB)及びバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するPheDH (PheDH-BS)を用いてL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンを定量する方法に関する。
【００２０】
より具体的には、本発明は、検体中に含まれるL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンを定量する方法である。
工程(1)は、検体の一部をバチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(PheDH-BB)及びNAD+と、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.0以上、7.0以下の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量する工程である。生成するNADHの定量は、エンドポイント法によって終点を決定する。
工程(2)は、前記検体の残りの少ないとも一部をバチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(PheDH-BS) 及びNAD+と、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.7以上、7.0以下の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量する工程である。この工程でも、生成するNADHの定量は、エンドポイント法によって終点を決定する。
工程(1)で得られたNADH量から前記検体に含まれるL-フェニルアラニンの量を定量し、工程(2)で得られたNADH量から前記検体に含まれるL-チロシン及びL-フェニルアラニンの量を定量し、工程(1)で得られたNADH量及び工程(2)で得られたNADH量の差分から、前記検体に含まれるL-チロシンを定量する。
【００２１】
PheDH-BBは、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有する場合には、pHが6.0以上、7.0以下の範囲においては、L-フェニルアラニンのフェニルピルビン酸へ変換する反応を触媒する（スキーム１ａ）が、L-チロシンの4-ヒドロキシピルビン酸への変換反応は実質的に触媒しない。この点は、実施例においてデータをもって示されている。特に、pHが6.2以上、6.4以下の範囲であれば、L-フェニルアラニンに対する活性は高く、かつL-チロシンに対しては実質的に活性を示さず、特に、pHが6.3の場合、この傾向が顕著である。従って、工程(1)は、pHが6.2以上、6.4以下の緩衝液中で行うことが好ましく、pHが6.3の緩衝液中で行うことが特に好ましい。PheDH-BBの相対活性は、6.0以上、7.0以下のpH範囲では至適pHにおける活性に比べると相当に低い。この点を考慮して、工程(1)の酵素反応におけるPheDH-BBの使用量は、至適pHの条件下において測定された活性値で5〜30 U/mlの範囲、好ましくは10〜20 U/mlの範囲とすることが適当である。緩衝液はリン酸カリウム緩衝液であることが好ましい。工程(1)における酵素反応は、例えば、25〜40℃の範囲で行うことができる。工程(1)における酵素反応の時間は、酵素反応のエンドポイントを考慮して適宜決定でき、例えば、5〜60分の範囲であることができる。
【００２２】
非イオン系界面活性剤は、非イオン系の界面活性剤であれば制限なく使用でき、例えば、エステル型、エーテル型、エステル・エーテル型及びその他の型の非イオン系の界面活性剤を例示できる。より具体的には、非イオン系界面活性剤としては、エーテル型のものが好ましく、エーテル型非イオン系界面活性剤の例としては、Triton X-100(オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）n、nは約10である、HLB13.4〜13.5)またはTween 20(ポリソルベート 20、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB16.7)などを挙げることができる。Tween 20はポリソルベート類の一種であり、ポリソルベート類は、ソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドが約 20 分子縮合したものである。Tween 20以外に、Tween 40(ポリソルベート 40、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB15.6)、Tween 60(ポリソルベート 60、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB14.9)、Tween 65(ポリソルベート 65、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB10.5)、Tween 80(ポリソルベート 80、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、HLB15.0)なども挙げられる。その他にも生化学分野で汎用される例えば、NonidetP-40等を用いることもできる。
【００２３】
タンパク質ブロック剤は、例えば、牛血清アルブミン(BSA)やスキムミルクなどを挙げることができる。
【００２４】
緩衝液中における非イオン系界面活性剤の濃度は、使用する非イオン系界面活性剤の種類や緩衝液のpHなどにより適宜選択することがでる。緩衝液中における非イオン系界面活性剤の濃度は、例えば、0.001〜1質量%の範囲であり、好ましくは0.005〜0.5質量%の範囲である。タンパク質ブロック剤の濃度は、使用するタンパク質ブロック剤の種類や緩衝液のpHなどにより適宜選択することができる。緩衝液中におけるタンパク質ブロック剤の濃度は、例えば、0.001〜1質量%の範囲であり、好ましくは0.01〜0.5質量%の範囲である。
【００２５】
PheDH-BSは、Asano Y.ら Novel Phenylalanine Dehydrogenase from Sporosarcina ureae and Bacillus sphaericus. J. Biological Chemistry Vol.21, No.21 (1987) pp10346-10354に記載されている。この文献においては、PheDH-BSの基質特異性は、pH10.5においてのみ確認されており、それ以外のpH範囲における基質特異性についての記載はない。
【００２６】
PheDH-BSは、NAD+を補酵素として用いて、スキーム１ａ及び１ｂに従って、L-フェニルアラニンとL-チロシンをそれぞれフェニルピルビン酸と4-ヒドロキシピルビン酸に変換する反応を触媒する。L-フェニルアラニン及びL-チロシンに対する基質特性は、実施例において示すように、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有する場合、pHが6.8以上、6.9以下の範囲であれば、L-フェニルアラニン及びL-チロシンの両方に対してほぼ同等の反応性を示す。特に、pHが6.9の場合、この傾向が顕著である。従って、工程(2)は、pHが6.8以上、6.9以下の緩衝液中で行うことが好ましい。緩衝液はリン酸カリウム緩衝液であることが好ましい。PheDH-BSの相対活性は、6.7以上、7.0以下のpH範囲では至適pHにおける活性に比べると相当に低い。この点を考慮して、工程(2)の酵素反応におけるPheDH-BSの使用量は、至適pHの条件下において測定された活性値で10〜60 U/mlの範囲、好ましくは40〜50 U/mlの範囲とすることが適当である。工程(2)における酵素反応は、例えば、25〜40℃の範囲で行うことができる。工程(2)における酵素反応の時間は、酵素反応のエンドポイントを考慮して適宜決定でき、例えば、5〜60分の範囲であることができる。工程(2)において用いる非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤は、工程(1)において例示した非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤の中から適宜選択できる。
【００２７】
工程(2)の緩衝液中における非イオン系界面活性剤の濃度は、使用する非イオン系界面活性剤の種類や緩衝液のpHなどにより適宜選択することがでる。緩衝液中における非イオン系界面活性剤の濃度は、例えば、0.01〜1質量%の範囲であり、好ましくは0.01〜0.5質量%の範囲である。タンパク質ブロック剤の濃度は、使用するタンパク質ブロック剤の種類や緩衝液のpHなどにより適宜選択することができる。緩衝液中におけるタンパク質ブロック剤の濃度は、例えば、0.001〜1質量%の範囲であり、好ましくは0.01〜0.5質量%の範囲である。
【００２８】
PheDH-BBは、Asano Y.らPhenylalanine Dehydrogenase of Bacillus badius. Eur. J. Biochem. 168 (1987) 153-159に記載されている。この文献においては、PheDH-BBの基質特異性は、pH10.4においてのみ確認されており、上記の如く、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有する場合における、pHが6.7以上、7.0以下の範囲における基質特異性についての記載はない。
【００２９】
検体中にL-フェニルアラニンとL-チロシンが存在する場合、工程(1)では、PheDH-BBによって、実質的にL-フェニルアラニンのみが完全に酸化されて、等モルのフェニルピルビン酸を生じるように実験条件、特に反応時間を調整する。L-フェニルアラニンの酸化反応において等モル数のNADHが生成する。但し、この酵素反応ではL-チロシンが酸化されることは実質的にはなく、従って、L-チロシンの酸化に起因するNADHは実質的には生成しない。上記と同様に、生成したNADHは、340 nmにおいて6.22 mM-1・cm-1の減衰係数（extinction coefficient）で分光光度計にて定量できる。反応の終点における吸光度は、L-フェニルアラニンのモル濃度に相当する。事前にNADHの濃度と340 nmにおける吸光度との検量線を作成しておくことで、反応の終点における吸光度から、L-フェニルアラニンのモル濃度を算出できる。
【００３０】
・
L-フェニルアラニンとL-チロシンを含有する工程(1)と同じ検体(同様に採取したサンプルの一部)について、両方の基質が、PheDH-BSによって、ほぼ完全に酸化されて、それぞれ等モルのフェニルピルビン酸と4-ヒドロキシピルビン酸になるように実験条件、特に反応時間を調整する。その際、各酸化反応において、検体中に存在するL-フェニルアラニン及びL-チロシンとそれぞれ等モル数のNADHが生成する。生成したNADHは、340 nmにおいて6.22 mM-1・cm-1の減衰係数（extinction coefficient）で分光光度計にて定量できる。反応の終点における吸光度は、L-フェニルアラニンとL-チロシンの合計モル濃度に相当する。事前にNADHの濃度と340 nmにおける吸光度との検量線を作成しておくことで、反応の終点における吸光度から、L-フェニルアラニンとL-チロシンの合計モル濃度を算出できる。
【００３１】
工程(1)で得られたNADH量及び工程(2)で得られたNADH量(濃度)の差分から、検体に含まれるL-チロシンを定量することができる。即ち、L-チロシンの濃度は、PheDH-BBを用いることで定量したL-フェニルアラニン量とPheDH-BSを用いることで定量したL-フェニルアラニン及びL-チロシンの合計量の差分として計算できる。
【００３２】
【化１】
2014171442.tif 000002
【００３３】
本発明においては、上記工程(1)及び工程(2)を1枚のマイクロウェルアレイプレート上の異なるウェルで並行して行い、各ウェル中の溶液のNADHの吸収に対応する吸光度を並行してまたは交互に測定することを含むことができる。さらに複数の検体のL-チロシン定量を1枚のマイクロウェルアレイプレートにて行うこともできる。このようにすることで、多数の検体について、比較的短時間にかつ簡便にL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンの定量を行うことができる。このようなマイクロウェルアレイプレートを用いる場合には、マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定は、例えば、マイクロプレートリーダーを用いて適宜実施できる。
【００３４】
本発明の上記方法は、例えば、チロシン血症の検査またはフィッシャー比の計測に用いることかできる。
【００３５】
チロシン血症の検査は、具体的には、被験者からサンプリングした検体のL-チロシン濃度を上記本発明の方法により測定することで実施できる。検体のL-チロシン濃度が測定されたら、測定されたL-チロシン濃度と、健常人が示すL-チロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲と対比する。それにより上記被験者がチロシン血症に罹患しているか否かの検査をすることができる。一般的に健常人が示すL-フェニルアラニン及びL-チロシン濃度範囲は、それぞれ68〜72μM及び30〜76μMである(参考文献1)。一方、チロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲は370〜2000μMである(参考文献2)。これまで、チロシン血症患者であるか否かのスクリーニングにおいては、L-チロシン濃度が305μM以上を分別値として用いている(参考文献3)。本発明の方法を用いる場合にも同様のL-チロシン濃度及び濃度範囲を参考にすることができる。但し、被験者がチロシン血症に罹患しているか否かの判断(診断)は医師により実施される。
【００３６】
参考文献:
[1] Okamoto N, Miyagi Y, Chiba A, Akaike M, Shiozawa M, Imaizumi A, Yamamoto H, Ando T, Yamakado M, Tochikubo O. Diagnostic modeling with differences in plasma amino acid profiles between non-cachectic colorectal/breast cancer patients and healthy individuals. Int. J. Med. Med. Sci. 1 (2009) 001-008.
[2] Larochelle J, Mortezai A, Belanger M, Tremblay M, Claveau JC, Aubin G. Experience with 37 infants with tyrosinemia. Canad. Med. Ass. J. 97 (1967) 1051-1054.
[3] Park H, Lee DH., Choi T., Lee YK., Kim J., Ki C., Lee Y. Clinical, biochemical, and genetic analysis of a Korean neonate with hereditary tyrosinemia type 1. Clin. Chem. Lab. Med. 47 (2009) 930-933.
【００３７】
フィッシャー比の計測は、具体的には、被験者からサンプリングした検体のL-チロシン及びL-フェニルアラニン濃度を上記本発明の方法により測定し、同検体のL-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン濃度をロイシンデヒドロゲナーゼにより測定することで実施できる。検体のL-チロシン及びL-フェニルアラニン濃度が測定されたら、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン濃度とのモル比（フィッシャー比）算出する。それにより、各種肝疾患の重篤度を検査することができる。一般的に健常人が示すフィッシャー比は3〜4でほぼ一定である（参考文献4）。一方、肝機能の低下した患者のフィッシャー比は低い値を示す（参考文献5）。本発明の方法を用いる場合にも同様のフィッシャー比を参考にすることができる。但し、被験者の肝疾患の重篤度の判断(診断)は医師により実施される。
【００３８】
参考文献:
[4] Fischer JE, Funovics JM, Aguirre A, James JH, Keane JM, Wesdorp RI, Yoshimura N, Westman T. The role of plasma amino acids in hepatic encephalopathy. Surgery 78 (1975) 276-290.
[5] Morgan MY, Milsom JP, Sherlock S. Plasma ratio of valine, leucine and isoleucine to phenylalanine and tyrosine in liver disease. Gut 19 (1978) 1068-1073.
【００３９】
本発明は、以下の(1)〜(7)の試薬を含むL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニン定量用キットも包含する。
(1)バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するPheDH(PheDH-BB)
(2)バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するPheDH(PheDH-BS)
(3)NAD+
(4)pHが6.0以上、7.0以下のPheDH-BB用緩衝液
(5)pHが6.7以上、7.0以下のPheDH-BS用緩衝液
(6)非イオン系界面活性剤
(7)タンパク質ブロック剤
【００４０】
PheDH-BB及びPheDH-BSは、各菌体から調製することもできるが、遺伝子工学的操作により調製することもできる。PheDH-BB及びPheDH-BSの遺伝子工学的操作による調製方法は、後述の実施例で引用する文献[1]を参照することができる。
【００４１】
NAD+は、正式名称はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであり、例えば、市販の試薬として入手可能である。NAD+は、β-NAD+とも表記される。
【００４２】
pHが6.0以上、7.0以下のPheDH-BB用緩衝液としては、例えば、リン酸カリウム緩衝液、グリシン-KCl-KOH緩衝液、グリシン-NaOH緩衝液、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール-HCl緩衝液、Clark-Lubs緩衝液, ホウ酸緩衝液を挙げることができる。
【００４３】
pHが6.7以上、7.0以下のPheDH-BS用緩衝液としては、例えば、リン酸カリウム緩衝液、グリシン-KCl-KOH緩衝液、Hydroxide-chloride緩衝液を挙げることができる。
【００４４】
PheDH-BB用緩衝液は、所定濃度のNAD+、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するものであることが、測定操作を容易にするという観点から好ましい。同様に、PheDH-BS用緩衝液も、所定濃度のNAD+、非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するものであることが好ましい。非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤は、前述の中から適宜選択できる。
【００４５】
本発明のキットは、上記(1)〜(7)に加えて、(8)マイクロウェル中の溶液の吸収度の測定が可能な構造のマイクロウェルアレイプレートをさらに含むこともできる。マイクロウェルアレイプレートは、高分子材料などで作成し、一平方センチメートル当たり、数個から数万個のウエルからなり、そこで酵素反応が行えるプレートを指す。
【００４６】
本発明のキットは、チロシン血症の検査またはフィッシャー比の計測に用いることができる。チロシン血症の検査用キットにおいては、健常人が示すL-チロシン濃度範囲及びチロシン血症患者が示すL-チロシン濃度範囲を表示する説明書をさらに含むことができる。
【００４７】
<酵素センサー>
本発明の第１の態様の酵素センサーは、バチルス・バディウス(Bacillus badius)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(PheDH-BB)を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置した、L-フェニルアラニン定量に用いるための酵素センサー(PheDH-BB酵素センサー)である。このPheDH-BB酵素センサーは、検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNAD+と非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有する6.0以上、7.0以下の緩衝液中で混合し、生成するNADHを定量するために用いられる。検体や緩衝液などは、前記定量方法と同様である。
【００４８】
本発明の第2の態様の酵素センサーは、バチルス・スフェリカス(Bacillus sphaericus)に由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ(PheDH-BS)を検出用電極に直接または間接的に固定化または配置した、L-チロシン及びL-フェニルアラニン定量に用いるための酵素センサー(PheDH-BS酵素センサー)である。このPheDH-BS酵素センサーは、検出用電極がNADH定量用電極であり、検体とNAD+と非イオン系界面活性剤及びタンパク質ブロック剤を含有するpHが6.7以上、7.0以下の緩衝液中混合し、生成するNADHを定量するために用いられる。検体や緩衝液などは、前記定量方法と同様である。
【００４９】
これらの酵素センサーは、酵素センサーを構成する検出用電極にPheDH-BBまたはPheDH-BSを直接または間接的に固定化または配置したものであり、L-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンの定量に用いるためのものである。本発明の酵素センサーは、好ましくは、PheDH-BBまたはPheDH-BSによりL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンから生成する生成物を直接的に定量的に検出できるものであることが好ましい。加えて、本発明の酵素センサーは、上記酵素以外に、酵素と電極の間の電子の授受を容易にする電気化学メディエーターなどを、上記検出用電極に直接または間接的に固定化または配置したものであることもできる。それ以外の構成は、公知の酵素センサーで採用されている構成をそのまま、または適宜改変して利用することができる。
【００５０】
本発明の酵素センサーは、検体を含有する試験溶液に少なくとも検出用電極部分を浸漬し、試験溶液に、PheDH-BBまたはPheDH-BSによりL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンから生成される生成物を検出用電極で検出する。より具体的には、L-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンから生成する生成物の１つであるNADHを検出できる電極をPheDH-BBまたはPheDH-BSとの組合せで用いることができる。NADHを検出できる電極としては、前述の電気化学メディエーター(電子伝達体)にジアホラーゼやNADHオキシダーゼと組み合わせることもできる。また、PheDH-BBまたはPheDH-BS及びジアホラーゼ、NADHオキシダーゼは、遊離の状態で使用する事もできるが、公知の方法により直接あるいは、間接的に電極へ固定化する事も出来る。その他のNADHを検出できる電極としては、例えば、特開平7-280769号公報及び特開平7-310194号公報に記載のものを例示できるが、これらの限定される意図ではない。
【００５１】
本発明は、上記PheDH-BB酵素センサーとPheDH-BS酵素センサーとの組合せも包含する。この組合せは、PheDH-BB酵素センサーで得られたNADH量及びPheDH-BS酵素センサーで得られたNADH量の差分から、検体に含まれるL-チロシンを定量するために用いられる。NADH量の差分からの、検体に含まれるL-チロシン及び/又はL-フェニルアラニンの定量の方法は、上記定量方法の説明を参照できる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。但し、本発明は実施例の記載に限定される意図ではない。
＜PheDH-BB、及びPheDH-BSの調製＞
PheDH-BBpUC18HまたはPheDH-BSpUC18Hプラスミドを有するE. coli JM109形質転換株（非特許文献7）を0.5 mMアンピシリンを含む5 mlのLB培地で37℃、12時間培養した。この全培養液を2Lのフラスコに0.5 mMアンピシリンを含む500 mlのLB培地に加え、さらに37℃、12時間培養した。その時点でIPTGを0.5 mMの濃度で加え、PheDH-BB及びPheDH-BSの誘導を開始し、さらに37℃で4時間培養を継続した。形質転換株の菌体を4℃で、5000×g、10分間遠心分離し、生理食塩水で2度洗浄した。
菌体を0.3 M NaCl及び25 mMイミダゾールを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）に懸濁し、4℃、20分間の超音波処理により破砕した。破砕物を4℃、28000×gで15分間遠心分離し、上清画分を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液をNi-Sepharose 6 Fast Flowカラムに通し、0.3 M NaCl及び75 mMイミダゾールを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で洗浄後、0.3 M NaCl及び500 mMイミダゾールを含む20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で溶出した。活性フラクションを20 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）で透析し、PheDH-BB及びPheDH-BSの酵素液を得た。
【００５３】
＜超高速アミノ酸分析システム（UPLC）によるヒト血漿中アミノ酸の定量＞
ヒト血漿は市販品を購入した。これらのサンプルは、4℃で限外濾過を行い、タンパク質や高分子物質を除去した。
上述の前処理済みの血漿試料10μlをWaters AccQ-Tag Ultra derivatization kitを用いて誘導体化し、超高速アミノ酸分析システム（Waters Acquity ultra performance LC (UPLC)）を用いて分析を行った。誘導体化条件としては、トータルリカバリーバイアルに試料10μlに対し70μlのAccQ・Tag Ultraホウ酸塩緩衝液を加え、混和後20μlのAccQ・Tag Ultra試薬を加え、撹拌後室温で1分間静置したのち55℃で10分間加温し、誘導体化試料とした。
【００５４】
分析条件を以下に示す。
注入量：1μl
検出：蛍光検出器
移動相：A：10% AccQ・Tag Ultra 溶離濃縮液A
B：AccQ・Tag Ultra 溶離濃縮液B（原液）
分析温度：60℃
メソッド：FLR_Cell_Cult_Seq07
【００５５】
実施例1
＜PheDH-BBによる血漿中フェニルアラニン量の定量＞
(1-1)特許文献１によると本酵素を用いてフェニルアラニンの定量を行うには、反応を行う際のGlycine-KCl-KOH緩衝液のpHは11.0が望ましい記載されている。
しかしながら、Glycine-KCl-KOH緩衝液（pH11.0）中では検量線は十分に作成可能なものの、血漿を用いた場合にはA340の吸光度が大きく上昇してしまい十分な定量性を有していなかった。反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を図1に示す。
【００５６】
これは、Glycine-KCl-KOH緩衝液（pH11.0）中では、PheDH-BBがフェニルアラニンのみならず、多数のアミノ酸に対して活性を示していることに起因するものと思われる。pH11.0の緩衝液におけるPheDH-BBの複数のアミノ酸に対する相対活性を図2に示す。
【００５７】
(1-2)定量を行うための緩衝液を検討したところ、リン酸カリウム緩衝液（pH6.3）中で酵素反応を行うことで、十分な検量線が得られ、血漿を用いた反応でもエンドポイントに達することが明らかとなった。反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を図3に示す。
【００５８】
これはリン酸カリウム緩衝液（pH 6.3）中では、Glycine-KCl-KOH緩衝液（pH11.0）中に比べ、反応性を有するアミノ酸種が減少していることに起因していると思われる。pH6.3の緩衝液におけるPheDH-BBの複数のアミノ酸に対する相対活性を図4に示す。
【００５９】
しかしながら、リン酸カリウム緩衝液（pH 6.3）中でも、UPLCで得られたフェニルアラニン定量値と比較すると、依然として高値を示してしまう状態であった(図5)。
【００６０】
(1-3)反応液に終濃度0.01 %のTween20を加えることで、他のアミノ酸に対する活性が減少しており、限外濾過を行った血漿(Human plasma (ultrafiltration))ではUPLCと同等の定量性を示すことが明らかとなった。反応条件及び結果を図6に示す。しかしながら、依然として無処理の血漿を用いた場合ではUPLCで得られたフェニルアラニンの定量値と比較して、高い値を示しており、さらなる改善が必要であった。
【００６１】
(1-4)反応液中に終濃度0.2 %のBSAを添加することで、無処理の血漿を用いた場合でも十分な定量値が得られることが明らかとなった。反応条件及び結果を図7に示す。これにより、PheDH-BBを用いた血漿中フェニルアラニンの定量が可能となった。
【００６２】
(1-5)この条件を用いて、3種の血漿中のフェニルアラニンの定量性、希釈直線性を求めたところ、十分に定量可能な結果が得られた。反応条件及び結果を図8に示す。
【００６３】
(1-6)酵素安定性
本酵素は安定性にも優れており、安定化剤として知られるグリセロールの有無にかかわらず、4℃以下で保存することで長期的な保存も可能であった。結果を図9に示す。
【００６４】
実施例2
＜PheDH-BSによる血漿中フェニルアラニン及びチロシン量の同時定量＞
(2-1)特許文献１によると本酵素を用いてフェニルアラニン及びチロシンの同時定量を行うには、反応を行う際のGlycine-KCl-KOH緩衝液のpHは10.4が望ましい記載されている。しかしながら、Glycine-KCl-KOH緩衝液（pH10.4）中では検量線は十分に作成可能なものの、血漿を用いた場合にはA340の吸光度が大きく上昇してしまい十分な定量性を有していなかった。反応条件及び結果(検量線及びA340の吸光度経時変化)を図10に示す。
【００６５】
(2-2)上述のPheDH-BBの際に用いた戦略と同様な手法で、定量性の改善を試みた。
その結果、リン酸カリウム緩衝液（pH6.9）、終濃度0.1% Tween80及び0.2 % BSAを反応液に添加することで、十分な検量線が得られ、血漿をもちいた反応でもエンドポイントに達することが明らかとなった。反応条件及び結果を図11に示す。
【００６６】
(2-3)この条件を用いて、3種の血漿中のフェニルアラニン及びチロシン量の総量に対する定量性、希釈直線性を求めたところ、十分に定量可能な結果が得られた。反応条件及び結果を図12に示す。
【００６７】
(2-4)酵素安定性
本酵素も安定性にも優れており、安定化剤として知られるグリセロールの有無にかかわらず、4℃以下で保存することで長期的な保存も可能であった。結果を図13に示す。
【００６８】
実施例3
＜PheDH-BB及びPheDH-BSによる血漿中チロシン量の定量＞
実施例1及び2の検討により、血漿中のフェニルアラニン定量及びフェニルアラニンとチロシンの同時定量が可能となった。つまり、PheDH-BSによって得られた定量値とPheDH-BBによって得られた定量値の差を算出することにより、血漿中のチロシン量が定量可能になる。
そこで、実際にUPLCで得られた定量値との比較を行った。反応条件及び結果を図14に示す。両酵素を用いて定量した場合でもUPLCとほぼ同等の定量性を有していることが明らかとなった。
【００６９】
実施例4
＜PheDH-BB及びPheDH-BSによるフィッシャー比、BTR算出＞
臨床現場では肝機能の低下の指標としてフィッシャー比（総分岐鎖アミノ酸/芳香族アミノ酸モル比）が用いられているが、従来のフィッシャー比算出にはHPLC法を用い、個々のアミノ酸分画定量を実施するため測定が煩雑であった。そこで、実際の現場ではフィッシャー比の代わりにBTR（総分岐鎖アミノ酸/チロシンモル比）が用いられている。
【００７０】
本発明によってフィッシャー比、BTRが迅速かつ簡便に定量可能か解析するために、市販のロイシンデヒドロゲナーゼ（TOYOBO ENZYME）を購入し、フィッシャー比、BTRの算出を試みた。購入したロイシンデヒドロゲナーゼはロイシン、バリン、イソロイシンにも反応性を有することが知られており（非特許文献8）、総分岐鎖アミノ酸の定量が可能である。結果を図15に示す。本発明を既存のアミノ酸定量用酵素と組み合わせることにより、迅速かつ簡便にフィッシャー比及びBTRを算出することも可能であり、十分に実用的な結果が得られた。
【００７１】
実施例5
＜PheDH-BBに関して（フェニルアラニン定量）＞
5-1 界面活性剤及びBSAに関して
2014171442.tif 000003
【００７２】
【表１】
2014171442.tif 000004
N.D: not determined
*：誤差3%未満
**：誤差5%未満
***：誤差10%未満
【００７３】
5-2 緩衝液（Potassium phosphate buffer）のpHに関して
2014171442.tif 000005
【００７４】
【表２】
2014171442.tif 000006
*：誤差3%未満
**：誤差5%未満
【００７５】
実施例6
＜PheDH-BSに関して（フェニルアラニン・チロシン同時定量）＞
6-1 界面活性剤及びBSAに関して
2014171442.tif 000007
【００７６】
【表３】
2014171442.tif 000008
N.D: not determined
*：誤差3%未満
**：誤差5%未満
***：誤差10%未満
【００７７】
6-2 緩衝液（Potassium phosphate buffer）のpHに関して
2014171442.tif 000009
【００７８】
【表４】
2014171442.tif 000010
*：誤差3%未満
**：誤差5%未満
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、アミノ酸に関連する診断等の分野に有用である。
【図１】
2014171442.tif 000011
【図２】
2014171442.tif 000012
【図３】
2014171442.tif 000013
【図４】
2014171442.tif 000014
【図５】
2014171442.tif 000015
【図６】
2014171442.tif 000016
【図７】
2014171442.tif 000017
【図８】
2014171442.tif 000018
【図９】
2014171442.tif 000019
【図１０】
2014171442.tif 000020
【図１１】
2014171442.tif 000021
【図１２】
2014171442.tif 000022
【図１３】
2014171442.tif 000023
【図１４】
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【図１５】
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