(57)【要約】      （修正有）【課題】還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌、及び還元された桂皮酸類縁化合物を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、上記能力を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】桂皮酸類縁化合物を産生する能力を有し、かつ還元された桂皮酸類縁化合物の産生能を有する乳酸菌、及び、前記乳酸菌を植物素材中で培養する工程を含む、フェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法。前記還元された桂皮酸類縁化合物を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品。フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質を有する乳酸菌のスクリーニング方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を含むことを特徴とする、還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法。
【請求項２】
前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記性質を有するものである、請求項１に記載の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法；
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
【請求項３】
前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌がラクトバチルス属の乳酸菌である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される、請求項１から３に記載の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法；
乳酸菌群：ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ブクネリ、エンテロコッカス・フェカリス。
【請求項５】
前記還元された桂皮酸類縁化合物が、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロパラクマル酸又はジヒドロコーヒー酸である、請求項１から４のいずれか１項に記載の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法。
【請求項６】
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌及び還元された桂皮酸類縁化合物を少なくとも含有する、植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品。
【請求項７】
前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記性質を有するものである、請求項６に記載の乳酸菌発酵飲食品；
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
【請求項８】
前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌がラクトバチルス属の乳酸菌である、請求項６又は７に記載の乳酸菌発酵飲食品。
【請求項９】
前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される乳酸菌である、請求項６から８のいずれか１項に記載の乳酸菌発酵飲食品；
乳酸菌群：ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ブクネリ、エンテロコッカス・フェカリス。
【請求項１０】
前記還元された桂皮酸類縁化合物が、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロパラクマル酸又はジヒドロコーヒー酸である、請求項６から９のいずれか１項に記載の乳酸菌発酵飲食品。
【請求項１１】
下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法；
ステップ１：フェルラ酸エチルを含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたジヒドロフェルラ酸を定量するステップ
ステップ２：ステップ１において、フェルラ酸エチルに対して一定割合以上のジヒドロフェルラ酸を産生する性質を有する乳酸菌を判定するステップ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のスクリーニング方法によって還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有すると判定された乳酸菌であって、下記性質を有する乳酸菌；
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェルラ酸（Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）などの桂皮酸類縁化合物を産生する能力を有し、かつフェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物を還元する能力を有する乳酸菌を用いて植物素材を処理する工程を含むことを特徴とする還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法に関する。また、上記能力を有する乳酸菌及び還元された桂皮酸類縁化合物を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、上記能力を有する乳酸菌のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活習慣病や癌、老化などを促進する要因として、生体内における酸化ストレスが重要な因子であることが明らかとなりつつある。酸化ストレスとは、様々な要因（紫外線、喫煙、食品添加物、病原菌、精神的ストレス、過激な運動、虚血、炎症など）により生体内で活性酸素種（ROS）・フリーラジカルが発生する状態であり、それによるダメージが細胞や組織に蓄積することで、最終的に生活習慣病や癌、老化を促進する。生体内には元来、このような酸化ストレスに対する防御機構が備わっており、ROSの発生を抑制したり、ダメージを受けた細胞・組織を修復したりする作用がある。更にヒトは、抗酸化物質を体内で合成したり外部から摂取したりすることにより、体内で発生するフリーラジカルを消去している。ビタミンA・C・E、コエンザイムQ10、αリポ酸、グルタチオンは代表的な抗酸化物質であるが、食品由来の抗酸化成分としては更に、トマトのリコピン、緑茶のカテキン、赤ワインのポリフェノール、ブルーベリーのアントシアニンなども知られている。また、広く植物体内に存在する抗酸化物質として、フェルラ酸やパラクマル酸等のフェノール性化合物が知られており、特に米ぬかや果物、野菜の皮等に多く含まれていることが報告されている。
フェルラ酸やパラクマル酸は、食物中では主に食物繊維（ヘミセルロース）や糖等とエステルの形態で結合しており、そのままの状態では生体内での吸収性が悪い。結合型のフェルラ酸は腸内細菌等により分解を受けることでその一部が遊離のフェルラ酸となり、腸管より吸収されるとされているが、個々人の腸内細菌叢によらず、植物素材から機能性の高いフェルラ酸等を効果的に摂取するためには、事前にフェルラ酸を遊離の形に変換しておくことが重要であると考えられる。一方で、遊離フェルラ酸でも100％が吸収されるわけではなく、また吸収後速やかに消費されてしまうため、遊離フェルラ酸の吸収性と血中での安定性が改善されれば、ヒトが摂取した際の抗酸化能力がより高まることが期待される。
植物体からフェルラ酸類を遊離する方法として、物理化学的処理、酵素処理、微生物処理等による方法についての報告がある。物理化学的処理法としては、米ぬかから米サラダ油、脂肪酸を抽出した残渣をアルカリ処理してフェルラ酸を生成する方法（特許文献１）があるが、高温でアルカリ処理し、その後抽出操作が必要となるため、工程が煩雑といった課題がある。リグニンを、水蒸気を含む気体で高温高圧処理することにより、フェルラ酸等の化合物量を増加させる方法（特許文献２）も知られているが、高温高圧処理のための設備が必要となる。
酵素を用いる方法としては、米ぬかのエタノール抽出物を酵素処理することにより、フェルラ酸を遊離する方法（特許文献３）が知られているが、エタノール抽出とその後の乾燥工程があり、作業が煩雑でエネルギーコストも高い。フェルラ酸エステラーゼやキシラナーゼ、セルラーゼ活性を有する酵素を用いて、遊離フェルラ酸を高含有する発酵アルコール飲料を製造する方法（特許文献４）も報告があるが、実際の工程を考えると、酵素の添加・反応工程が煩雑となり、酵素のコストの問題もある。
微生物を用いる方法としては、ペニシリウム・クリソゲナムの培養液とシュガービートパルプを反応させることによりフェルラ酸を遊離する方法（特許文献５）や、フェルラ酸エステラーゼ活性を有する麹菌を使用すること特徴とする高香味穀類蒸留酒に関する特許（特許文献６）があるが、これらの微生物はプロテアーゼ等の他の酵素活性も強いため、植物素材の風味を大きく変えてしまう可能性がある。
また、遊離のフェルラ酸を合成する方法として、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を用いて、オイゲノールからフェルラ酸を産生する方法（特許文献７、８）が知られているが、オイゲノールは、過剰摂取により血尿・痙攣・下痢・吐き気・意識喪失・めまい・動悸等の症状があらわれるほか、皮膚に触れるとアレルギー反応により皮膚炎を起こすことがある。そのため、食品に残存した場合の安全性に課題がある。ベンズアルデヒド誘導体を触媒の存在下、マロン酸または無水酢酸と反応させることによりフェルラ酸を誘導させる方法（特許文献９）も知られているが、１３５℃程度に加熱処理する必要があり、そのための設備が必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公平７−７８０３２号公報
【特許文献２】特許第４３９８８６７
【特許文献３】特開２００６−１６６８３４号公報
【特許文献４】特開２０１０−１４８４８５号公報
【特許文献５】特開２００６−６７８０３号公報
【特許文献６】特開２００４−２３６６３４号公報
【特許文献７】特開平９−１５４５９１号公報
【特許文献８】特開平５−２２７９８０号公報
【特許文献９】特許第３２７１８７３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、植物素材及び乳酸菌を用いた還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法、乳酸菌及び還元された桂皮酸類縁化合物を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、フェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物を産生する能力を有し、かつフェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物をより生体への移行性や安定性が高い還元体に変換する能力を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、本発明者らは、食経験があり、安全に食することができる乳酸菌をターゲットとして、まずフェルラ酸を植物素材から遊離する乳酸菌を探索した結果、一部の乳酸菌において、フェルラ酸を遊離するフェルラ酸エステラーゼ活性を見出した。ところが、そのうちのある種の乳酸菌はフェルラ酸をジヒドロフェルラ酸（３−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）に代謝するフェルラ酸リダクターゼ活性も保有していることが明らかとなった。本発明者らの鋭意検討の結果、このジヒドロフェルラ酸がフェルラ酸よりも生体への移行性・安定性が向上していることを見出した。以上の知見から、今回見出されたフェルラ酸エステラーゼ活性を持ち、且つフェルラ酸リダクターゼ活性を持つ乳酸菌で植物素材を発酵させることにより、フェルラ酸よりも生体への移行性・安定性が向上した遊離のジヒドロフェルラ酸を生成・蓄積することができ、摂食した際の生体内での抗酸化性を高めた飲食品を提供することができる。さらに、本発明者らは、フェルラ酸エステラーゼ活性を持ち、且つフェルラ酸リダクターゼ活性を持つ乳酸菌につき、フェルラ酸以外の桂皮酸類縁化合物としてコーヒー酸（Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）やパラクマル酸（ｐ−Ｃｏｕｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）のエステルからの遊離活性・還元活性を調べたところ、これらの乳酸菌がジヒドロコーヒー酸（３−（３、４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ジヒドロパラクマル酸（３−（ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）の産生能を有することを見出した。したがって、本発明は多様な還元された桂皮酸類縁化合物の製造方法等を提供する。さらに、本発明は、ジヒドロフェルラ酸等を遊離、蓄積する乳酸菌を取得するための方法として、フェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物を産生する能力を有し、かつフェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物をより生体への移行性が高い還元体に変換する能力を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供する。
すなわち、本発明は下記（１）から（１２）を提供する。
（１）還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を含むことを特徴とする、還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法。
（２）前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記性質を有するものである、上記（１）に記載の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法；
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
（３）前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌がラクトバチルス属の乳酸菌である、上記（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される、上記（１）から（３）に記載の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法；
乳酸菌群：ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ブクネリ、エンテロコッカス・フェカリス。
（５）前記還元された桂皮酸類縁化合物が、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロパラクマル酸又はジヒドロコーヒー酸である、上記（１）から（４）のいずれか１項に記載の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法。
（６）還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌及び還元された桂皮酸類縁化合物を少なくとも含有する、植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品。
（７）前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記性質を有するものである、上記（６）に記載の乳酸菌発酵飲食品；
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
（８）前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌がラクトバチルス属の乳酸菌である、上記（６）又は（７）に記載の乳酸菌発酵飲食品。
（９）前記還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌が下記乳酸菌群から選択される乳酸菌である、上記（６）から（８）のいずれか１項に記載の乳酸菌発酵飲食品；
乳酸菌群：ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ブクネリ、エンテロコッカス・フェカリス。
（１０）前記還元された桂皮酸類縁化合物が、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロパラクマル酸又はジヒドロコーヒー酸である、上記（６）から（９）のいずれか１項に記載の乳酸菌発酵飲食品。
（１１）下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法；
ステップ１：フェルラ酸エチルを含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたジヒドロフェルラ酸を定量するステップ
ステップ２：ステップ１において、フェルラ酸エチルに対して一定割合以上のジヒドロフェルラ酸を産生する性質を有する乳酸菌を判定するステップ。
（１２）上記（１１）に記載のスクリーニング方法によって還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有すると判定された乳酸菌であって、下記性質を有する乳酸菌；
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の製造方法によれば、非常に簡便、効率的、安価な方法で、還元された桂皮酸類縁化合物含有画分を製造することができる。特に、本発明の製造方法は乳酸菌発酵を利用するため、特別な設備を必要とせず、１０℃から５０℃といったコントロールしやすい温度帯で野菜素材中の還元された桂皮酸類縁化合物量を増加させることができる。また、原料として植物素材を用いるため、得られる還元された桂皮酸類縁化合物含有画分は、安全性、栄養価が非常に高く、乳酸菌による発酵のため風味にも優れ、特に飲食品の用途に好適である。還元された桂皮酸類縁化合物含有画分中の植物由来成分は、還元された桂皮酸類縁化合物が生体内で吸収しやすい形態となっていると同時に、桂皮酸類縁化合物よりも安定性が向上しているため、摂取した際に高い機能性が期待される。
本発明はさらに、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法を提供する。本発明スクリーニング方法によれば、本発明製造方法等に好適に利用できる乳酸菌を効率よくスクリーニングすることができる。また、このようにして得られた乳酸菌を定期的に摂取することにより、消化管内においてもこれらの乳酸菌が桂皮酸類縁化合物の還元反応を行なうため、摂取した食品中の桂皮酸類縁化合物の効果がより高まることが期待される。更に、これらの乳酸菌のうち、消化液耐性があり、腸管内でも生存が可能な菌株を用いることで、よりいっそう桂皮酸類縁化合物の効果が高まることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清に遊離したジヒドロフェルラ酸量比を示す。
【図２】フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清に遊離したフェルラ酸量比を示す。
【図３】フェルラ酸を０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清のフェルラ酸及びジヒドロフェルラ酸量比を示す。
【図４】コーヒー酸エチルを０．０５重量％添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地で供試菌株を４８時間培養した後の、培養上清に遊離したコーヒー酸及びジヒドロコーヒー酸量比を示す。
【図５】乳酸菌で発酵させた還元アスパラガス汁中の桂皮酸類縁化合物、還元された桂皮酸類縁化合物の蓄積量を示す。
【図６】乳酸菌で発酵させた米糠抽出液中のジヒドロフェルラ酸の蓄積量を示す。
【図７】フェルラ酸及びジヒドロフェルラ酸量を経口投与したラットの、血漿中のフェルラ酸／ジヒドロフェルラ酸の総量の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（１）本発明の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法
本発明の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法は、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を少なくとも含むことを特徴とする、還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法である。
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌は、植物素材中で遊離の還元された桂皮酸類縁化合物の産生に好適な条件で培養したときに、還元された桂皮酸類縁化合物を遊離できる乳酸菌である限りにおいて特に限定されない。
具体的には、植物素材より桂皮酸類縁化合物を遊離する活性（桂皮酸類縁化合物エステラーゼ活性）を持ち、且つその桂皮酸類縁化合物を一定以上還元された桂皮酸類縁化合物に還元する活性（桂皮酸類縁化合物リダクターゼ活性）を持つことを指標として選択することができる。このように選択される乳酸菌は、植物等に含まれるフェノール性化合物が有するエステル結合を切断する活性を持ち、植物素材より遊離したフェルラ酸等の桂皮酸類縁化合物を血中への移行性・安定性の良い還元体に変換することができる。
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌としては、下記の性質を有するものが例示される。
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
上記性質の有無の試験において、フェルラ酸エチルとしては、例えば東京化成工業株式会社などの公知のものを用いることができる。ジヒドロフェルラ酸としては、例えばＡｌｆａ  Ａｅｓａｒなどの公知のものを用いることが出来る。培地としては、乳酸菌の生育に好適なものを用いることができ、例えばＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地や脱脂乳培地など通常用いる培地の中から、最も対象の乳酸菌の生育に適した培地を適宜選択して使用できる。乳酸菌の生育に好適な培養条件を採用し、これにより培養４８時間で乳酸菌数が十分に増え、フェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸の産生能を適切に評価できる。遊離したフェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸の割合は、培養上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法に供し、フェルラ酸エチル、フェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸のピーク面積を検出することにより算出できる。培地の種類、至適温度等の培養条件、高速液体クロマトグラフィー法の条件等、より具体的には後述の実施例に記載の方法を採用することができる。「前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質」における「３０％以上」とは、３０％から１００％であればよいが、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上と割合が高い程好ましい。本性質を持つ乳酸菌については、フェルラ酸と構造が近似しているコーヒー酸やパラクマル酸などの桂皮酸類縁化合物のエステル体に対しても同様の活性を有し、ジヒドロコーヒー酸やジヒドロパラクマル酸を生成する。
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌の具体例としては、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、オエノコッカス属、エンテロコッカス属に属する乳酸菌が例示される。ラクトバチルス属としては、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ブクネリ等が例示され、エンテロコッカス属としてはエンテロコッカス・フェカリス等が例示される。なかでも、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・デルブルイッキー、ラクトバチルス・ブクネリ、及び、エンテロコッカス・フェカリスが好ましく、ラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３、ＪＣＭ１０２５、ＪＣＭ１０３１、ＪＣＭ１１３０、ＪＣＭ１１３１、ＪＣＭ８７８７、ＪＣＭ８７８８、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・クリスパタスＪＣＭ１０３７、ＪＣＭ１１８５、ＪＣＭ５８０６、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１０３３、ＪＣＭ１１２６、ＪＣＭ１１２７、ラクトバチルス・ジョンソニーＪＣＭ２０１０、ＪＣＭ２１２２、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスＪＣＭ６９８５、ＳＢＴ１１２２３、ラクトバチルス・ガリナラムＪＣＭ１０３６、ラクトバチルス・ファーメンタムＳＢＴ１８４６、ＳＢＴ２５３７、ラクトバチルス・デルブルイッキーＳＢＴ０８０３、ＳＢＴ１３７１、及び、ラクトバチルス・ブクネリＳＢＴ１１４１１、エンテロコッカス・フェカリスＳＢＴ１１２０がより好ましく、ラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３が最も好ましい。
なお、フェルラ酸、コーヒー酸及びパラクマル酸の産生能が確認された乳酸菌は、桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を少なくとも含むことを特徴とする、桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法において利用可能である。そのような乳酸菌は具体的には後述する実施例でフェルラ酸、コーヒー酸及びパラクマル酸の産生能が確認された乳酸菌を例示することができる。
植物素材とは、結合型、エステル型の桂皮酸類縁化合物が少量でも含まれるものであれば特に限定されないが、野菜、穀物、果物、草類、豆類、芋類、種子、米ぬか、ふすま等の素材に由来するものが挙げられる。植物素材とは、上記に例示された植物素材等そのものであってもよいが、植物素材を適宜加工等して得られるものであってもよい。加工方法としては、ミキサー等による粉砕等が例示されるが、特に限定されるものではない。乳酸菌が生育するための十分な水分があることが好ましいが、植物素材を調整後に水分を添加などして調整することもできる。
より効率的に植物素材から桂皮酸類縁化合物を遊離するため、食物繊維分解酵素により植物素材を事前に酵素処理してもよい。使用する酵素としては、キシラナーゼ、セルラーゼ等が例示されるが特に限定されるものではない。例えば、野菜汁に上記酵素を添加し、上記酵素の至適温度で数時間から２日程度酵素反応させて得られる植物素材を用いることにより、より効率的に桂皮酸類縁化合物を遊離することができる。
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌を植物素材中で培養する方法は、植物素材中で乳酸菌が生育し、植物素材から還元された桂皮酸類縁化合物を産生できる条件である限り特に限定されない。例えば、植物素材に乳酸菌培養物を０．５から１０％程度添加し、乳酸菌が生育可能な温度範囲で1日から７日発酵させることにより培養できるが、これに限定されない。
本発明還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法によって得られる還元された桂皮酸類縁化合物含有画分は、植物素材中で乳酸菌を培養して得られる培養物そのものであってもよいが、培養物に添加物等を添加し、又は不純物を除去する等して得られるものであってもよい。また、培養物から還元された桂皮酸類縁化合物を分画、精製する等して、還元された桂皮酸類縁化合物濃度がより高い還元された桂皮酸類縁化合物含有画分とすることもできる。
（２）本発明乳酸菌発酵飲食品
本発明乳酸菌発酵飲食品は、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌、還元された桂皮酸類縁化合物を少なくとも含有する、植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品である。
還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌としては、植物素材中で遊離の還元された桂皮酸類縁化合物の産生に好適な条件で培養したときに、還元された桂皮酸類縁化合物を遊離できる乳酸菌である限りにおいて特に限定されず、具体的には上記（１）本発明の還元された桂皮酸類縁化合物含有画分製造方法で説明したものを用いることができる。
還元された桂皮酸類縁化合物としては、ジヒドロフェルラ酸、ジヒドロコーヒー酸、ジヒドロパラクマル酸が例示される。
植物素材としては、上記（１）本発明還元された桂皮酸類縁化合物含有画分製造方法で説明したものを用いることができる。例えば、野菜汁、果汁等を用いた場合、風味、栄養価が優れた乳酸菌発酵飲料を提供することができる。
本発明乳酸菌発酵飲食品中の桂皮酸類縁化合物濃度は、植物素材中にどの程度含まれているかによるが、本発明の乳酸菌により、素材中の還元された桂皮酸類縁化合物量を増加させることができる。
本発明乳酸菌発酵飲食品の製造方法は特に限定されないが、本発明還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法により製造することができる。
本発明の植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品は、乳や発酵乳などの食品と混合することにより、飲料や発酵乳、デザートなどの形態で提供することができる。
（３）本発明スクリーニング方法
本発明スクリーニング方法は、下記ステップを少なくとも含むことを特徴とする、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法である；
ステップ１：フェルラ酸エチルを含有する培地で検体乳酸菌を培養し、産生されたジヒドロフェルラ酸の化合物を定量するステップ、
ステップ２：ステップ１において、フェルラ酸エチルに対して一定割合以上のジヒドロフェルラ酸を産生する性質を有する乳酸菌を判定するステップ。
本発明スクリーニング方法によれば、コーヒー酸やパラクマル酸などのエステル体に対しても作用することができ、かつ還元された桂皮酸類縁化合物産生能に優れた乳酸菌をスクリーニングすることができる。
ステップ１において、検体乳酸菌とは還元された桂皮酸類縁化合物産生能の有無の判定対象となる乳酸菌である。ステップ１における培養条件は乳酸菌が好適に生育できる限りにおいて特に限定されず、例えば検体乳酸菌の生育に好適な培地にて至適温度で、乳酸菌数が十分に達する適当な時間（例えば１２から４８時間程度）培養することが例示される。含有するフェルラ酸エチル、ジヒドロフェルラ酸の培地中の濃度も特に限定されないが、例えば０．０１から１重量％、好ましくは０．０５重量％程度が例示される。フェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸の定量方法は、例えば高速液体クロマトグラフィー法を採用することができ、例えば上記（１）本発明の還元された桂皮酸類縁化合物酸含有画分の製造方法で説明した方法を採用することができる。ステップ２における一定割合とは、所望の還元された桂皮酸類縁化合物産生能に応じて適宜設定することができ、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％等と設定することができる。
このようにして所望の還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌をスクリーニングすることができ、例えば下記性質を有する乳酸菌を、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌として得ることができる。
性質：フェルラ酸エチルを０．０５重量％添加した培地において、前記乳酸菌の至適温度で４８時間培養したとき、前記フェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸として遊離する性質。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例
に限定されるものではない。
【実施例１】
【０００９】
（ジヒドロフェルラ酸遊離活性を持つ菌株の選抜試験）
試験には表１に示した菌株を使用し、ＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ）にて３７℃（ラクトコッカス・ラクティス及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンスは３０℃）で１６時間培養した。０．０５％フェルラ酸エチル（東京化成工業株式会社）を添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地に菌液を３％接種し、３７℃（ラクトコッカス・ラクティス及びラクトバチルス・ケフィラノファシエンスは３０℃）にて４８時間培養した。培養上清を分画分子量３ｋＤａのＵＦフィルターに通し、通過液を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  １２００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍを用い、カラムはＨｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８，Ｓ−５μｍ，１２ｎｍ  （４．６  ｍｍ  ＩＤ×２５０ｍｍ：  ＹＭＣ）  を用いた。溶媒はＡ液：０．０５％  ＴＦＡ  ｉｎ  ５％アセトニトリル、Ｂ液：０．０５％  ＴＦＡ  ｉｎ  ９５％アセトニトリルを用い、Ｂ液の量が、０→３分は２５％、８分までに３０％、９分までに１００％、９→１４分は１００％、１５分までに２５％、１５→２０分は２５％のグラジエントで行った。溶媒流量は１ｍｌ／分、インジェクション量は１０μｌとし、フェルラ酸の検出は３２０ｎｍで、フェルラ酸の代謝産物であるジヒドロフェルラ酸の検出は２１０ｎｍで行った。同定は保持時間で行い、そのピーク面積値からモル濃度を算出した。
図１に示す通り、供試した３９株のうち２５株が、添加したフェルラ酸エチルの３０％以上をジヒドロフェルラ酸に変換した。特に、ラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３、ＪＣＭ１０２５、ＪＣＭ１１３１、ＪＣＭ８７８７、ＪＣＭ８７８８、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・クリスパタスＪＣＭ１０３７、ＪＣＭ１１８５、ＪＣＭ５８０６、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１０３３、ＪＣＭ１１２６、ＪＣＭ１１２７、ラクトバチルス・ジョンソニーＪＣＭ２０１０、ＪＣＭ２１２２、ラクトバチルス・ガリナラムＪＣＭ１０３６、ラクトバチルス・ファーメンタムＳＢＴ１８４６、ＳＢＴ２５３７、ラクトバチルス・デルブルイッキーＳＢＴ１３７１、ラクトバチルス・ブクネリＳＢＴ１１４１１及びエンテロコッカス・フェカリスＳＢＴ１１２０、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンスＳＢＴ１１２２３はフェルラ酸エチルの８０％以上をジヒドロフェルラ酸に変換した。一方、フェルラ酸エチルの３０％以上をフェルラ酸に代謝・蓄積した株が７株みられ、この内４株はジヒドロフェルラ酸を産生しなかった（図２）。また、供試した１０株はフェルラ酸エチルをほとんど代謝しなかった。以上の結果から、ある一定の乳酸菌はフェルラ酸エステルからフェルラ酸を遊離する活性を持っているが、その中の一部の乳酸菌がフェルラ酸をジヒドロフェルラ酸に還元する活性を持っていることが見出された。
【表１】
2014003929.tif 000003
【実施例２】
【００１０】
（フェルラ酸リダクターゼ活性の評価）
実施例１で評価した菌株のうち、ジヒドロフェルラ酸を産生した５株と、コントロールとしてフェルラ酸を生成した３株を試験に用いた。ＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養した菌液を、０．０５％フェルラ酸を添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地に３％接種し、３７℃にて４８時間培養した。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてフェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸を定量した。
図３に示す通り、実施例１でジヒロドフェルラ酸のみを産生していたＪＣＭ１１３１、ＪＣＭ１１３２、ＪＣＭ１１８５、ＪＣＭ１１２６、ＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３は、添加したフェルラ酸をほぼ全てジヒドロフェルラ酸に変換した。一方、実施例１でフェルラ酸のみを産生していた３株ではフェルラ酸をほとんど代謝・分解せず、ジヒドロフェルラ酸も産生しなかった。以上の方法により、実施例１でフェルラ酸エチルからジヒドロフェルラ酸を産生した株は、フェルラ酸リダクターゼ活性を持つことが確認された。
【実施例３】
【００１１】
（選抜した株による他の桂皮酸類縁化合物の代謝）
植物素材には、フェルラ酸以外にもコーヒー酸やパラクマル酸のような桂皮酸類縁化合物も存在し、フェルラ酸同様にその抗酸化能が知られている。そこで今回選抜した株について、コーヒー酸についてもエステルからの遊離活性・還元活性を示すか評価した。実施例２で使用した菌株を用い、ＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養した菌液を、０．０５％コーヒー酸エチルを添加したＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地に３％接種し、３７℃にて４８時間培養した。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにて分析した。コーヒー酸の検出は３２０ｎｍで、代謝産物であるジヒドロコーヒー酸の検出は２１０ｎｍで行った。同定は保持時間で行い、そのピーク面積値から濃度を算出した。
その結果、図４に示すように、実施例１にてジヒドロフェルラ酸を産生した株はジヒドロコーヒー酸を産生し、実施例１でフェルラ酸を産生した株はコーヒー酸を産生した。以上のことから、本発明により選抜された乳酸菌は、フェルラ酸以外にも多様な桂皮酸類縁化合物をエステル体から切り出し、ジヒドロ体へ還元する能力を有することが判明した。よって本発明の乳酸菌を用いることにより、植物素材から多様な還元された桂皮酸類縁化合物を産生することが期待できる。
【実施例４】
【００１２】
（選抜した株による野菜汁の発酵）
実施例１にてジヒドロフェルラ酸の産生能が高かったラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３を用いて、アスパラガス汁の発酵試験を行った。対照として、実施例１にてフェルラ酸の産生能が高かったラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５を用いた。ＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養した菌液を、０．１％ホエーパウダーを添加した還元アスパラガス汁（２００%還元、９５℃、３０分殺菌）に１％接種し、３７℃にて１６時間培養した。発酵物の上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにて分析した。フェルラ酸、パラクマル酸の検出は３２０ｎｍで、代謝産物であるジヒドロフェルラ酸、ジヒドロパラクマル酸の検出は２１０ｎｍで行った。各化合物の同定は保持時間で行い、そのピーク面積値から濃度を算出した。
その結果、図５に示すように、ラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３にて発酵した場合にはジヒドロフェルラ酸とジヒドロパラクマル酸が１２９μＭ生成・蓄積した。一方、ラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５にて発酵した場合には、フェルラ酸とパラクマル酸が生成・蓄積した。以上のことから、本発明により選抜された乳酸菌株を用いることにより、植物素材から多様な還元された桂皮酸類縁化合物を産生できることが証明された。
【実施例５】
【００１３】
（選抜した株による植物素材の発酵）
実施例１にてジヒドロフェルラ酸の産生能が高かったラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３を用いて、米糠抽出液の発酵試験を行った。対照として、実施例１にてフェルラ酸の産生能が高かったラクトバチルス・ヘルベティカスＦＥＲＭ−ＢＰ０５４４５を用いた。新鮮な米ぬかを１０倍量の水に懸濁し、９０℃で１時間煮出した後、ろ紙でろ過した。ろ液  １ＬにＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ  ５５ｇを溶解し、滅菌後、米ぬか抽出物として発酵試験に用いた。供試菌株はＭＲＳ−Ｂｒｏｔｈ培地にて３７℃で１６時間培養し、米ぬか抽出物に３％接種して、３７℃にて４８時間発酵した。培養上清を実施例１と同様の方法で処理し、ＨＰＬＣにてジヒドロフェルラ酸を定量した。
その結果、図６に示すように、ラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３にて発酵した場合にのみジヒドロフェルラ酸が生成・蓄積した。以上のことから、本発明により選抜された乳酸菌株を用いることにより、米糠などの植物素材からも還元された桂皮酸類縁化合物を産生できることが証明された。
【実施例６】
【００１４】
（フェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸のORAC法による抗酸化活性の評価）
フェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸の抗酸化性を比較するため、ORAC法による測定を行なった。測定はOxiSelect ORAC Activity Assay Kit (CELL BIOLABS)にて、添付のプロトコルに準じて行った。フェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸は50μMとなるようにキット付属のアッセイ用希釈液を用いて調製した。検量線の作成には、キット付属のTrolox標品水溶液を段階希釈したものを使用した。Free radical initiator試薬添加後、速やかに蛍光マイクロプレートリーダーにより蛍光（励起波長480 nm、発光波長520 nm）の測定を開始し、120分まで経時的に測定した。測定後、蛍光強度曲線下の面積を求めてAUC (Antioxidant)とし、それからブランクのAUC (Blank) を差し引いたNet AUCを各サンプルについて算出した。Trolox標品の濃度とNet AUCの検量線を作成し、サンプルのNet AUCに対応するTrolox濃度：TE値(Trolox Equivalent値)を求め、ORAC値とした。測定の結果、フェルラ酸が7.7、ジヒドロフェルラ酸が6.2 mmol TE/gであり、両者で大きな差異は認められなかった。
【実施例７】
【００１５】
（フェルラ酸とジヒドロフェルラ酸の血中への移行性・安定性の評価）
フェルラ酸とジヒドロフェルラ酸の血中への移行性・安定性を評価するため、これらの化合物のラットへの投与試験を行い、末梢血からの回収を行なった。試験には７週齢のラット（Wister、オス：Charles river）を用い、飼育は温度と湿度をコントロール（温度23 ℃ 、相対湿度50 ± 5 % ）した12時間毎の明暗サイクル下で行い、粗飼料Certified Rodent Diet 5002（Lab diet:SLC）及び脱イオン水を自由摂取させた。試験６時間前より絶食させ、体重を測定して平均が同じとなるよう2群に分けた（n=4）。7ｍＭのフェルラ酸またはジヒドロフェルラ酸溶液を１ｍｌ／１００ｇラット体重、ゾンデにて胃内投与し、投与５，１０，１５，３０，６０分後に尾部静脈より採血した。
生体内に吸収されたフェルラ酸、ジヒドロフェルラ酸は代謝を受け、糖や硫酸と結合した抱合型を形成することが知られているため、血漿中の遊離型と抱合型のフェルラ酸／ジヒドロフェルラ酸の総量を測定した。まず血漿25μlをβ-Glcuronidase Type H-2（SIGMA）500Uを含む酵素液（pH5.0の0.1M酢酸ナトリウム溶液にて希釈）25μlと混和し、37℃で2.5時間反応した。反応液を希釈後、分画分子量3,000ｋＤaのUltrafree-MC 3,000 NMWL Filter Unit（MILLIPORE）に供し、通過液を実施例１に記載の方法でＨＰＬＣにて分析した。最終的に投与前の血中濃度を0とした場合の変化量を算出した。
フェルラ酸及びジヒドロフェルラ酸投与後のラット血漿中フェルラ酸及びジヒドロフェルラ酸の総量の経時変化を図７に示す。フェルラ酸又はジヒドロフェルラ酸のどちらを投与した場合も、投与後１５分〜３０分をピークに増加し、その後減少した。しかし、血漿中の最高濃度はフェルラ酸で５．７μＭであったのに対し、ジヒドロフェルラ酸は８．７μＭと高値であった。また、０分から６０分までの血漿中フェルラ酸及びジヒドロフェルラ酸の総量の積分値を求めると（Σ（Δフェルラ酸＋Δジヒドロフェルラ酸）、μＭ×６
０分）フェルラ酸投与が２６２．６μＭ×６０分なのに対し、ジヒドロフェルラ酸投与が３９７．４μＭ×６０分と高値を示した。以上の結果から、ジヒドロフェルラ酸は、フェルラ酸と比較して血中へより多く移行し、血中での保持時間が長いことから、全体として血中でより高い抗酸化性を発揮できると考えられた。よって、本発明の乳酸菌を用いてフェルラ酸を含む素材を発酵させることにより、血中における素材の抗酸化性を高めることができると考えられる。
【実施例８】
【００１６】
（野菜発酵飲料の試作）
選択された乳酸菌を用いて、実際に野菜を発酵した際の発酵性と風味への影響を調べた。市販のキャロット混濁濃縮汁、ブロッコリー混濁濃縮汁、ケール混濁濃縮汁を水で還元し、９５℃で１５分加熱殺菌した。乳酸菌として実施例１でジヒドロフェルラ酸遊離能が高かったラクトバチルス・ガセリＦＥＲＭ−ＢＰ１０９５３を用い、０．５％の酵母エキスを含む１２％還元脱脂乳で３７℃、１６時間培養した後、野菜汁に３％接種して３７℃で１６時間発酵した。
表２に示すように、選択された乳酸菌は様々な野菜汁中でも成育し、適度な酸度の上昇、ｐＨの低下が見られた。風味についても酸味が強すぎず、非常に良好であった。以上の結果から、このようにして選択された乳酸菌によって、野菜の良好な発酵が可能であることが確認された。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明は、フェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物を産生する能力を有し、かつフェルラ酸などの桂皮酸類縁化合物をより生体への移行性・安定性が高い化合物に変換する能力を有する乳酸菌を植物素材中で培養する工程を含むことを特徴とする還元された桂皮酸類縁化合物含有画分の製造方法、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌及び還元された桂皮酸類縁化合物を含有する植物素材由来の乳酸菌発酵飲食品、還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有する乳酸菌のスクリーニング方法等に関する。本発明は食品分野、医薬分野等に利用可能である。
【受託番号】
【００１８】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３
[寄託生物材料への言及]
（１）還元された桂皮酸類縁化合物産生能を有するラクトバチルス・ガセリ菌株
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日（１９９６年３月２７日）（原寄託日）
平成２０年２月２６日（２００８年２月２６日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2014003929.tif 000008
【図５】
2014003929.tif 000009
【図６】
2014003929.tif 000010
【図７】
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