(57)【要約】      （修正有）【課題】爪白癬症の白癬菌を正確且つ簡便に検出し、該種を同定する方法及び該方法に使用するプライマーセットおよびキットを提供する。【解決手段】白癬菌に特異的な、特定の塩基配列を含むプライマーと、他の特定の塩基配列を含むプライマーとのセットを用いることによって、爪から検出されることが報告されている白癬菌以外の真菌を検出することなく、正確かつ簡便に白癬菌を検出し、上記の特定の配列のプライマーセットを用いて増幅された遺伝子断片を、特定の制限酵素により切断することによって、T. rubrumあるいはT. mentagrophytesであるかを同定し白癬菌の種を同定する。【選択図】図１
2014113079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
白癬菌を検出する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、および
（B）調製したＤＮＡに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程を含むことを特徴とする、白癬菌を検出する方法。
【請求項２】
白癬菌を検出する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、
（B）調製したDNAに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって増幅される領域を含む領域を増幅可能な、真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットによって真菌遺伝子を増幅する工程、および
（C）（B）で増幅された遺伝子産物に対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程を含むことを特徴とする、白癬菌を検出する方法。
【請求項３】
真菌共通プライマーセットが配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列を含むプライマーの組合せである、請求項２に記載の白癬菌を検出する方法
【請求項４】
白癬菌の菌種を同定する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、
（B）調製したＤＮＡに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程、及び、
（C）増幅された前記白癬菌遺伝子産物をさらに制限酵素によって切断し該切断された遺伝子断片を、バンドの数および大きさのパターンにより分析する工程を含む、白癬菌の菌種を同定する方法。
【請求項５】
前記制限酵素が、ＨａｅIII及び／又はＨｈａＩ、及び、ＨｐａII及び／又はＨｉｎｆＩである請求項４に記載の白癬菌の菌種を同定する方法。
【請求項６】
前記白癬菌の菌種が少なくともトリコフィトン・ルブルム、及び／又は、トリコフィトン・メンタグロフィテスである請求項４又は５に記載の白癬菌の菌種を同定する方法。
【請求項７】
白癬菌の菌種を同定する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、
（B）調製したＤＮＡに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程、及び、
（C）増幅された前記白癬菌遺伝子産物をシークエンス解析し、配列決定する工程を含む、白癬菌の菌種を同定する方法。
【請求項８】
検体が、爪である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
白癬症を診断するためのキットであって、
白癬菌特異的な配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットを含有することを特徴とする、キット。
【請求項１０】
白癬症を診断するためのキットであって、
真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマー及び、白癬菌特異的な配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットを含有することを特徴とする、キット。
【請求項１１】
真菌共通プライマーが、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列を含むプライマーの組合せである、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
白癬菌特異的な配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとを含む、プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白癬症（特には、爪白癬症）を簡便かつ正確に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界各国で足白癬、爪白癬の疫学的調査が行われ、その羅患率が足白癬で２５％、爪白癬において１３％と極めて高率であることがわかってきた。患者は共に男性に多く、対女性比の１．５倍を示し、４０歳代より加齢とともに羅患率が増加する傾向にある。爪白癬は起炎菌の感染により爪甲下の角質増殖が起こり、臨床像は爪の混濁、肥厚、変形、崩壊を示す。主要な原因菌は白癬菌（トリコフィトン属）であり、具体的には、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum:T. rubrum）およびトリコフィトン・メンタグロフィテス（Trichophyton mentagrophytes:T. mentagrophytes）が知られている。爪白癬症は病巣から菌が検出されて初めて診断が確定するが、臨床検査の現場では爪白癬症が疑われても培養によって菌が検出できなかったり、ＫＯＨ処理による直接鏡検法で確認できなかったり、培養ができても菌種の特定が出来なかったり、分離された菌が白癬菌か雑菌による汚染なのか判然としなかったり、等の問題が日常的に生じている。
このような現状から、白癬菌を検出する方法として、白癬菌の遺伝子検査法が報告されている。例えば、特許文献１では、T. rubrumを特異的に検出するために、T. rubrumの２８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列上の特異プライマー（配列番号１０及び配列番号１１の組合せ）、T. mentagrophytesを特異的に検出するために、T. mentagrophytesの２８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列上の特異プライマー（配列番号８及び配列番号９の組合せ）が開示されている。しかし、後述する実施例にも示すように、これらの組合せでは、特異的にT. rubrumあるいはT. mentagrophytesを検出することはできなかった。また、非特許文献１では、爪白癬症の起因菌であるT. rubrumおよびT. mentagrophytesに対して特異性の高いプライマーを２８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列から設計して、これらの白癬菌を選択的に増幅させるＰＣＲ法を報告している。しかし、後述する実施例にも示すように、この組合せ（配列番号１及び配列番号７の組合せ）では、特異的にT. rubrum及びT. mentagrophytesを検出することはできず、ＫＯＨ処理による直接鏡検法により白癬菌が同定されたサンプルについても白癬菌の同定率は５５．９％と低率であった。
白癬菌以外の真菌による爪真菌症も報告されている（特許文献１）が、臨床現場では、未だ、それらの真菌が起因菌であるか否かにつては議論が分かれている。これらの真菌は雑菌の可能性もあるので、先ずは、白癬菌を正確且つ簡便に検出することが望まれている。
また、爪白癬症以外にも、頭部白癬症、体部白癬症、股部白癬症、足白癬症、手白癬症などが知られている（非特許文献２）。これらの白癬症は、それぞれ、頭部白癬症は、ミクロスポルム・カニス（Microsporum canis:M. canis）、トリコフィトン・トンスランス（Trichophyton tonsurans:T. tonsurans）、T. rubrum、トリコフィトン・ベルルコサム（Trichophyton verrucosum:T. verrucosum）、T. mentagrophytes、体部白癬症は、T. rubrum、股部白癬症は、T. rubrum、T. mentagrophytes、エピデルモフィトン・フロッコサム（Epidermophyton floccosum:E. floccosum）、手白癬症は、T. rubrumが原因菌として知られている。非特許文献３に示すように爪真菌症の原因菌は白癬菌、カンジダ属を主とした酵母様真菌およびFusarium、Aspergillusなど非白癬菌の3菌群に大別される。爪白癬症はT. rubrumないしT. mentagrophytesが主たる原因菌であり、国内外を問わず80〜90％を両菌で占めている。日本医真菌学会疫学調査委員会の結果（1991〜2002）においても我が国の爪白癬の原因菌の約85％がT. rubrum、15％がT. mentagrophytesで占められており、調査する年により稀にE. floccosumが分離される程度である。圧倒的にTrichophyton属の検出が高く、爪白癬症の診断においてTrichophyton属を遺伝子で検出する意義は高いと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−６７６０５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】最新医療情報誌Ａｎｉｍｕｓ（アニムス）、第５１巻、２００８年、Ｐ４５−Ｐ５０
【非特許文献２】真菌誌、第４８巻第３号、２００７年、Ｐ１１６−Ｐ１１９
【非特許文献３】Ｍｅｄ. Ｍｙｃｏｌ.Ｊ. 第５２巻第２号, ２０１１年, Ｐ７７−Ｐ９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、検出が難しい各種白癬症、特には爪白癬症の白癬菌（トリコフィトン属）を正確且つ簡便に検出し、更には、該種（T. rubrumあるいはT. mentagrophytesであるかなど）を同定する方法、該方法に使用するプライマーセットおよびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、爪白癬症の遺伝子検査法について種々検討してきたところ、白癬菌（トリコフィトン属）に特異的なプライマーセットを用いることによって、爪から検出されることが報告されている白癬菌以外の真菌を検出することなく、正確かつ簡便に白癬菌を検出できることを見出し、本発明を完成した。
更に、上記の白癬菌（トリコフィトン属）に特異的なプライマーセットを用いることによって増幅された遺伝子断片を、特定の制限酵素によって切断することによって、T. rubrumあるいはT. mentagrophytesであるかを同定することを見出し、正確かつ簡便に白癬菌の種を同定することも可能にした。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
＜１＞白癬菌を検出する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、および
（B）調製したＤＮＡに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程を含むことを特徴とする、白癬菌を検出する方法。
＜２＞白癬菌を検出する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、
（B）調製したDNAに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって増幅される領域を含む領域を増幅可能な、真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットによって真菌遺伝子を増幅する工程、および
（C）（B）で増幅された遺伝子産物に対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程を含むことを特徴とする、白癬菌を検出する方法。
＜３＞真菌共通プライマーセットが配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列を含むプライマーの組合せである、前記＜２＞に記載の白癬菌を検出する方法
＜４＞白癬菌の菌種を同定する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、
（B）調製したＤＮＡに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を
増幅する工程、及び、
（C）増幅された前記白癬菌遺伝子産物をさらに制限酵素によって切断し該切断された遺伝子断片を、大きさのパターンにより分析する工程を含む、白癬菌の菌種を同定する方法。
＜５＞前記制限酵素が、ＨａｅIII及び／又はＨｈａＩ、及び、ＨｐａII及び／又はＨｉｎｆＩである前記＜４＞の白癬菌の菌種を同定する方法。
＜６＞前記白癬菌の菌種が少なくともトリコフィトン・ルブルム、及び／又は、トリコフィトン・メンタグロフィテスである前記＜４＞又は＜５＞の白癬菌の菌種を同定する方法。
＜７＞白癬菌の菌種を同定する方法であって、
（A）検体から鋳型DNAを調製する工程、
（B）調製したＤＮＡに対し、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットによって特異的に白癬菌遺伝子を増幅する工程、及び、
（C）増幅された前記白癬菌遺伝子産物をさらにシークエンス解析し、配列決定する工程を含む、白癬菌の菌種を同定する方法。
＜８＞検体が、爪である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の方法。
＜９＞白癬症を診断するためのキットであって、
白癬菌特異的な配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットを含有することを特徴とする、キット。
＜１０＞白癬症を診断するためのキットであって、
真菌共通プライマー及び、白癬菌特異的な配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとのセットを含有することを特徴とする、キット。
＜１１＞真菌共通プライマーが、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列を含むプライマーの組合せである、前記＜１０＞に記載のキット。
＜１２＞白癬菌特異的な配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーとを含む、プライマーセット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の実施形態により、従来は達成し得なかった白癬菌のみを特異的かつ簡便に検出あるいは同定することが可能となり、白癬症（特には、爪白癬症）の遺伝子検査を容易に行うことが可能となる。さらに、本発明の実施形態により、白癬菌の種（T. rubrumあるいはT. mentagrophytes）を正確かつ簡便に同定することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】白癬菌として検出された遺伝子産物を、それぞれＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｉｎｆＩの制限酵素で反応させて菌種の特定を実施した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施形態に使用する検体としては、白癬症患者または該患者の疑いのあるヒトの爪、皮膚、毛髪などを使用することができる。本発明の実施形態における白癬菌（トリコフィトン属）に特異的なプライマーセットは白癬菌（トリコフィトン属）に特異的であるので、爪を検体とすれば、爪白癬症を診断可能となり、皮膚、毛髪を対象とする場合には、それ以外の白癬症を診断可能となる。また、白癬菌の内、爪白癬症であれば、T. rubrumあるいはT. mentagrophytesが起因菌となるので、爪を検体として爪白癬症であると診断された場合には、T. rubrumあるいはT. mentagrophytesを含むことが強く推定される。
一方、頭部白癬症は、T. tonsurans、T. rubrum、T. verrucosum、T. mentagrophytesが主な起因菌となるので、頭毛を検体として頭部白癬症であると診断された場合には、T.
tonsuransあるいはT. rubrumあるいはT. verrucosumあるいはT. mentagrophytesを含む
ことが強く推定される。
一方、股部白癬症や足白癬症は、T. rubrum、T. mentagrophytesが主な起因菌となるので、陰股部や足（趾間や足蹠）の皮膚などを検体として股部白癬症や足白癬症であると診断された場合には、T. rubrumあるいはT. mentagrophytesを含むことが強く推定される。
一方、体部白癬症や手白癬症は、T. rubrum、T. mentagrophytesが主な起因菌となるので、体部(頭、手、足、股を除く生毛部)や手（手掌や手指）の皮膚などを検体として体部白癬症や手白癬症であると診断された場合には、T. rubrumあるいはT. mentagrophytesを含むことが強く推定される。
【００１１】
白癬菌（トリコフィトン属）は、現在１７種が知られている。具体的には、前述のトリコフィトン属の菌種を含めて、T. phaseoliforme、T. ajelloi、T. flavescens、T. vanbreuseghemii、T. erinacei、T. simii、T. gloriae、T. mentagrophytes、T. rubrum、T.
tonsurans、T. thuringense、T. terrestre、T. interdigitale、T. violaceum、T. verrucosum、T. schoenleinii、T. concentricumが挙げられる。
【００１２】
検体は、検出したい白癬症に合わせて、適宜採取場所を決定することができる。
例えば、爪白癬症の場合には爪を、ニッパーや爪切り等で切り取り、爪検体とすればよい。爪検体からＤＮＡを抽出するためには、例えば爪を粉砕し、１００℃で１０分間煮沸等により殺菌した後、フェノール抽出し、エタノール沈澱することにより行うことができる。また、ＩＳＯＨＡＩＲ(日本ジーン社)やＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などを使用して、ＤＮＡを抽出することもできる。皮膚検体は、落屑等、毛髪検体は抜け毛あるいは数センチを切り取れば良い。爪検体と同様にして、ＤＮＡを調製することができる。
【００１３】
本発明の実施形態では、上記のように調製した検体をサンプルとして、本発明の実施形態における白癬菌に特異的なプライマーセットを用いて、該白癬菌（トリコフィトン属）を感度良く特異的に増幅することができる。
本発明の実施形態における白癬菌に特異的なプライマーセットとしては、白癬菌の２８Ｓ  ｒＤＮＡに特異的なプライマーセット、具体的には、配列番号１で表される塩基配列を含むプライマー及び配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーの組合せを使用することができる。本発明の実施形態におけるプライマーとしては、前記プライマーと同様に白癬菌を特異的に増幅することができれば、１、２、３、４または５個程度の数塩基の置換・欠失・挿入・付加を行うことができる。特に、プライマーの５’末端には、鋳型配列にマッチした数塩基の付加があってもよい。そのようなプライマーも本発明のプライマーである。
本発明の実施形態における白癬菌を特異的に増幅可能とは、後述の実施例で示すような白癬菌は検出するが白癬菌以外の真菌は検出しないことを意味する。配列番号１あるいは配列番号２は、前記の１７種の白癬菌（トリコフィトン属）の間で１００％保存されていることから、白癬菌を確実に検出することができる。
また、更に感度良く白癬菌を検出するために、上記の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマー及び配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーの組合せで白癬菌遺伝子を増幅する工程の前に、これらのプライマーセットで増幅される特定の領域を含む遺伝子領域を増幅可能なプライマーセットで検体中のＤＮＡを増幅することが好ましい。すなわち、第１回目のＰＣＲによって、少なくとも白癬菌遺伝子を増幅可能なプライマーセットで検体中のＤＮＡを増幅し、次いで、第２回目のＰＣＲによって、その遺伝子増幅産物の内側の塩基配列を増幅しうるプライマー（配列番号１からなるプライマー及び配列番号２からなるプライマー）で白癬菌を特異的に検出する。このような方法は、一般的にネステッドPCR（nested  PCR）法と呼ばれる。
第１回目のＰＣＲで使用可能な、少なくとも白癬菌遺伝子を増幅可能なプライマーセッ
トとしては、公知の真菌の２８Ｓ  ｒＤＮＡを対象とした真菌共通プライマーセットが挙げられ、具体的には、後述する実施例に記載の配列番号３のプライマー及び配列番号４のプライマーを使用することもできる。これらの真菌共通プライマーセットを用いれば、ほとんど全真菌が検出できる。
第１回目のＰＣＲで増幅された遺伝子産物には、検体中の真菌のほとんどが含まれると考えられる。次いで、前記の本発明の白癬菌に特異的なプライマーセットを用いて、第二回目のＰＣＲを行えば、当該真菌の遺伝子産物中の白癬菌の遺伝子のみが増幅される。
【００１４】
第１回目のＰＣＲは、鋳型ＤＮＡを含む検体に、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチド及び反応バッファーを加え、変性、アニール、ＤＮＡ伸長のそれぞれの温度条件でインキュベーションすればよい。使用する装置などに併せて、具体的な反応条件は適宜設定できる。第１回ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡは、例えば電気泳動後、染色することにより確認できる。
第２回目のＰＣＲは、第１回目のＰＣＲと同様に変性、アニール、ＤＮＡ伸長反応を行えばよい。使用する装置などに併せて、具体的な反応条件は適宜設定できる。第２回目のＰＣＲにより増幅されたＤＮＡは、例えば電気泳動後、染色することにより、白癬菌に特異的な遺伝子を検出することができる。
更に、本発明の実施形態では、上記で白癬菌に特異的な遺伝子配列を増幅したあと、特定の制限酵素によって、その増幅された遺伝子配列を切断し、例えば、それを電気泳動後、染色することによって、切断された遺伝子断片の数と大きさのパターンから、白癬菌の種を同定することができる。このような方法は、一般的にＰＣＲ−ＲＦＬＰ法と呼ばれる。
使用可能な制限酵素の種類は、白癬菌として増幅された遺伝子配列が、白癬菌の種毎に識別可能な種特異的なものを選べば良い。制限酵素は１種類でも複数でも良いが、複数の方が同定の精度が高まるので好ましい。また、同じ切断パターンを生じる制限酵素と異なる切断パターンを生じる制限酵素を組み合わせることにより、同定の精度が高まるので好ましい。例えば、非特許文献１に記載のＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｉｎｆＩを組み合わせて使用することができる。T. rubrumやT. mentagrophytesの同定において、ＨｐａＩＩ、ＨｉｎｆＩは、同様な切断パターンを生じ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩは、異なる切断パターンを示す。少なくとも、ＨｐａＩＩ又はＨｉｎｆＩ、及び、ＨａｅＩＩＩ又はＨｈａＩを組み合わせればT. rubrumやT. mentagrophytesを同定することができる。ＨｐａＩＩ及び／又はＨｉｎｆＩ、及び、ＨａｅＩＩＩ及び／又はＨｈａＩの組合せであれば、少なくともT. rubrumやT. mentagrophytesを精度良く同定することができる。
また、本発明の別の実施形態では、上記で白癬菌に特異的な遺伝子配列を増幅したあと、シークエンス解析をすることによって、白癬菌の種を同定することができる。この場合、シークエンス解析により、配列を決定し、配列データベース等により公知の白癬菌の配列と、上記決定した配列とを比較することにより、白癬菌の種を同定することが可能である。
【００１５】
本発明の実施形態において、ＤＮＡ、塩基、遺伝子、鋳型、プライマー、ＰＣＲ、配列、シークエンス解析等の用語の定義に関しては、分子生物学、遺伝学、遺伝子工学等で広く一般的に使用されている用語と同じ意味である。
【００１６】
本発明の実施形態におけるキットは、本発明の実施形態における方法に用いられる白癬菌に特異的なプライマーセットを含有する。また、前記のプライマーセット以外に、遺伝子増幅（ＰＣＲ）に必要な試薬、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）、ヌクレオチド（dNTP混合物）及び反応バッファーを含有させてもよい。
更に、第１回目のＰＣＲに使用する真菌共通プライマーを含有させても良い。
また、白癬菌の菌種を同定するために、前記ＰＣＲ-ＲＦＬＰ法で使用される制限酵素及び反応用の緩衝液や、シークエンス解析に使用する試薬等の、同定に必要な種々の試薬
を含むことができる。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
≪実施例１≫
（１）検体の調製
爪真菌症未治療の爪白癬症が疑われる患者の爪を直接鏡検し、感染の有無を確認した。具体的には、爪検体をメスなどで小片化してスライドガラスに置き、10%KOHを滴下してカバーガラスをかけて１時間くらい室温に放置し、爪の角質がKOHにより溶解されて柔らかくなったあと、カバーガラスの上からピンセットで押して位相差顕微鏡で鏡検する。この装置を使えば菌体をパーカーインクなどで染色することなく明暗の差に変換して見ることができる。
次に、感染が確認された患者の爪に対してエタノール消毒後、爪の遠位側を爪切り、ニッパーで除去して回収した。回収された爪をメスでスライスして小片化して、それぞれ、0.5ｍｇ〜5.0ｍｇになるように秤量して、ＤＮＡ抽出用のサンプルとした。これらのサンプルからＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ含有液３０μＬを鋳型ＤＮＡサンプルとした。
プライマーの特異性の検討には、表２に使用した菌から上記と同様にＤＮＡを抽出した。また、対象とした、ヒトの末梢血サンプルからのＤＮＡはＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して抽出した。
（２）第１回目のＰＣＲ
ＤＮＡ増幅キット（PuPeTaqTM Ready-To-GoTMPCR beads、GE Healthcare社）を用い、総量を２５μＬとし、フォワードプライマーを１０ｐｍｏｌ、リバースプライマーを１０ｐｍｏｌ、２μＬ爪抽出ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ２７２０：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、９５℃１分予備加熱後、９５℃４０秒、５２℃４０秒、７２℃ ２分を２５回のＰＣＲ反応を行い、次いで、９５℃４０秒、５２℃４０秒、７２℃ ２分の１５回の反応を行うが、伸張反応の時間を１サイクルごとに５秒ずつ加算して行き、７２℃１０分の伸張反応を行った。
（３）第２回目のＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）
鋳型ＤＮＡとして第１回目のＰＣＲ産物を用いる以外は第１回目のＰＣＲと同じ反応液組成とした。鋳型ＤＮＡとしては、第１回目のＰＣＲ産物の１μＬを使用した。ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ２７２０：Applied Biosystems社製）により、９４℃３分予備加熱後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を３０回のＰＣＲ反応を行い、７２℃１０分の伸張反応を行った。
【００１８】
≪実施例２：プライマーの特異性の検討≫
（１）プライマーの設計
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲの検討に使用したプライマーセットは、以下のとおり。
（ａ）フォワードプライマーＴＭ０４ＦとリバースプライマーＴＭ０６Ｒの組合せ
（ｂ）フォワードプライマーＴＭ０４ＦとリバースプライマーＴＭ０８Ｒの組合せ
（ｃ）フォワードプライマーＴＭ０４ＦとリバースプライマーＴＭ０９Ｒの組合せ
（ｄ）フォワードプライマーＴＭ０４ＦとリバースプライマーＴＭ１０Ｒの組合せ
（ｅ）フォワードプライマー４２６Ｆとリバースプライマー５２８Ｒの組合せ
（ｆ）フォワードプライマー４３１Ｆとリバースプライマー５６８Ｒの組合せ
また、実施例で使用したプライマーを表１に示す。
【表１】
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（ａ）（ｂ）（ｃ）の各プライマーの設計は次のようにして行った。すなわち、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｅｒｓｉｏｎ．１０を用い、まず、爪から高頻度に検出される白癬菌以外の真菌あるいは酵母様真菌の標準株あるいは分離株の情報を元に、白癬菌（トリコフィトン属）に特異的なプライマーを選択した。ＮＣＢＩの公共のデータベースから２８ＳｒＤＮＡ配列情報を入手して解析に使用した。検討した菌種を表２、一致率を表１に示す。特異的であるとは、白癬菌に対しては１００％一致し、それ以外の菌種に対しては約８０％以下の一致を基準とした。
リバースプライマーＴＭ０６Ｒの場合は、白癬菌に対しては１００％一致し、それ以外の菌種に対しては、６１．９０％〜４２．８５％の一致であった。リバースプライマーＴＭ０８Ｒの場合は、白癬菌に対しては１００％一致し、それ以外の菌種に対しては、８０．９５％〜３８．０９％の一致であった。リバースプライマーＴＭ０９Ｒの場合は、白癬菌に対しては１００％一致し、それ以外の菌種に対しては、８６．９５％〜４３．４７％の一致であった。リバースプライマーＴＭ１０Ｒの場合は、白癬菌に対しては１００％一致し、それ以外の菌種に対しては、７６．１９％〜５２．３８％の一致であった。
フォワードプライマーＴＭ０４Ｒの場合は、白癬菌に対しては１００％一致し、それ以外の菌種に対しては、７６．１９％〜４７．６２％一致であった。
更に、比較として、（ｄ）は、非特許文献１のT. mentagrophytesおよびT. rubrum増幅用プライマーセット、（ｅ）は、特許文献１のT. mentagrophytes増幅用プライマーセット、（ｆ）は、特許文献１のT. rubrum増幅用プライマーセットを使用した。
【００１９】
【表２】
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【００２０】
（２）プライマーの特異性の検討
上記で設計したプライマーの特異性を検討するために、白癬菌（トリコフィトン属）、及び、爪検体から高頻度に検出される前記白癬菌以外の真菌と酵母様真菌、及び、ヒトの末梢血由来ＤＮＡ検体を使用した。
それぞれ、実施例１の方法に従ってＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌種のＤＮＡとの結合を認識した。その結果を表３に示す。（ｂ）フォワードプライマーＴＭ０４（配列番号：１）とリバースプライマーＴＭ０８（配列番号：２）の組合せが、最も白癬菌を特異的に検出することができた。
リバースプライマーＴＭ０８は、白癬菌以外の菌種に対して８０．９５％の一致が認められたにもかかわらず、白癬菌以外の菌種に対して更に低い一致であったプライマーよりも、白癬菌を特異的に検出することができたのは驚くべき結果であった。また、非特許文献１または特許文献１でT. mentagrophytesあるいはT. rubrumに特異的であると開示され
ていたプライマーセット（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）も、白癬菌に特異的ではなく、多くの試行錯誤の結果、本発明の白癬菌に特異的なプライマーセット（ｂ）が決定できた。実施例３では、このプライマーセットを使用した。
【００２１】
【表３】
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【００２２】
≪実施例３：臨床検体における白癬菌の検出≫
爪白癬症患者の臨床検体に対し、実施例１に従って本発明の白癬菌の検出法を施行した。まず、爪白癬症患者の臨床検体８９例を直接鏡検法において、白癬菌の感染を検討した。その結果を表4に示す。KOH陽性は白癬菌有り、KOH陰性は白癬菌無しと評価される。それらの検体を、更に本発明の白癬菌の検出法で検討したところ、KOH陽性サンプル８２例は、全て白癬菌を検出し、KOH陰性サンプル７例においても、その内の５例に白癬菌を検出することができた。直接鏡検法では、８９例中に５例の偽陰性が存在していたことがわかった。直接鏡検法では、８９例中８２例（９２．１％）において白癬菌が認められたが、本発明の白癬菌遺伝子検査法では、８９例中８７例（９７．８％）に白癬菌の存在を認めることができた。一般に直接鏡検法では熟練性が必要であるが、本発明の遺伝子検査法では誰でも容易に且つ高精度に白癬菌の存在を検出可能であり、非常に有用である。
【００２３】
【表４】
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【００２４】
次に、爪白癬症患者の爪検体６１例を培養法により白癬菌感染の有無を検討した。その結果を表５に示す。１１例で白癬菌を検出し、２６例では白癬菌以外の菌を検出した。また、２４例では、いずれの菌も生育しなかった。それらの検体を、更に本発明の白癬菌遺伝子検出法で検討したところ、白癬菌検出サンプル１１例は、全て白癬菌を検出し、非白癬菌検出サンプル２６例においても、その内の２３例に白癬菌を検出することができた。また、菌が生育しなかったサンプル２４例中１６例に白癬菌を検出することができた。
以上より、培養法では、６１例中１１例（１８．０％）に白癬菌の存在が認められたが、本発明の白癬菌遺伝子検査法では、６１例中５０例（８２．０％）に白癬菌の存在を認めることができた。培養法は、判定に数日を要し、ある程度の生菌が存在しないと培養できなかったり、生菌の存在する部位の採取が難しい場合があったりすることから、一般的に煩雑で誤認が多い検査法である。本発明の遺伝子検査法では、容易に且つ高感度に白癬菌の存在を検出可能であり、非常に有用な方法である。
培養法は、非特許文献１の方法に従って行った。すなわち、サブロー寒天培地で２７℃、１０日間培養して得られた、コロニーの形状および分生子の形態学的特徴から菌種を判別した。
【００２５】
【表５】
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【００２６】
≪実施例４：白癬菌種の同定≫
実施例３で白癬菌として検出された遺伝子産物を使用し、白癬菌の菌種の同定を試みた。
（１）手順
実施例３で得られた遺伝子産物を、ＨａｅＩＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｉｎｆＩによって、制限酵素処理した。具体的には、遺伝子産物３μＬに対し、HaeIII, HhaI, HpaII, HinfIをそれぞれ5単位加え、ＰＣＲ  buffer中で35℃、２時間反応させた。反応液を、５%アクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した後、写真撮影したものをBioNumericsソフトウェア（Applied Maths社， Kortrijk, Belgium）により画像解析によって、菌種の同定を行った。T. rubrum (ＡＴＣＣ２８１８８)及び T. mentagrophytes  (IＦＭ５２１８）を標準品として比較に使用した。図１に結果の一部を示す。下向き矢印はT. rubrumによる切断パターンを示し、上向き矢印はT. mentagrophytesを示す。Hpa IIあるいはHinfIは比較例であり、これらの酵素で切断した場合、T. rubrumとT. mentagrophytesのバンドパターンはバンド数および大きさにおいて同一の泳動パターンを示しており、両者を区別することはできない。しかし、別の酵素HaeIIIあるいはHhaIで切断すると、切断されるバンド数や大きさの違いから、T. rubrumとT. mentagrophytesのバンドパターンは異なった泳動パターンを示した。以上より、爪検体１、３、４、５、７、９、１０、１１、１４、１６はT. rubrum型の切断パターン示すことからT. rubrumであり、爪検体６、１５はT. mentagrophytes型の切断パターン示すことからT. mentagrophytesであることが同定できた。 
（２）検討
実施例３の直接鏡検法に続いて本発明の遺伝子検査法により白癬菌を検出した８２例に対して、菌種の同定を行った。６２例がT. rubrum、１２例がT. mentagrophytesと同定できた。８例は、いずれにも同定できなかった。一方、実施例３の培養法に続いて本発明の遺伝子検査法により白癬菌を検出した５０例に対して、菌種の同定を行った。３６例がT.
rubrum、７例がT. mentagrophytesと同定できた。７例は、いずれにも同定できなかった。同定できなかったものの多くは、遺伝子産物が少なかったため検出が困難であった。
以上より、爪白癬症の主要な原因菌であるT. rubrumやT. mentagrophytesの同定までが、迅速かつ容易、また正確に検出できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
白癬症（特には、爪白癬症）の診断において、迅速かつ容易に、また高精度に、白癬菌の検出、更には、白癬菌の菌種の同定が可能となるので、臨床現場での有用性が高い。
【図１】
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【配列表】
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