(57)【要約】【課題】神経細胞の機能が発揮される神経細胞シート及びその製造方法を提供する。【解決手段】軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートと；前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、前記神経細胞を、ＳＤＦ１（Stromal cells-derived factor-1）及びＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant propein-1）の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、を含む、軸索伸展した神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートの製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シート。
【請求項２】
前記培養神経細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群より選択された少なくとも１種の前駆細胞から誘導された細胞である請求項１記載の神経細胞シート。
【請求項３】
前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、並びに、
前記神経細胞を、ＳＤＦ１（Stromal cells-derived factor-1）及びＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant propein-1）の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、
を含む、請求項１又は請求項２記載の神経細胞シートの製造方法。
【請求項４】
前記ＳＤＦ１及びＭＣＰ−１の少なくとも一方の培養液中の濃度が、０．５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬである請求項３記載の神経細胞シートの製造方法。
【請求項５】
前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤が、サイクロパミン、ジェルビン及びトマチジンからなる群より選択された少なくとも１種を含む請求項３又は請求項４記載の神経細胞シートの製造方法。
【請求項６】
前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤の培養液中の濃度が、２．０×１０−７μＭ〜３．０μＭである請求項３〜請求項５のいずれか１項記載の神経細胞シートの製造方法。
【請求項７】
前記分化誘導剤が、レチノイン酸、ノギン、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及び神経細胞成長因子（ＮＧＦ）からなる群より選択された少なくとも１種を含む請求項３〜請求項６のいずれか１項記載の神経細胞シートの製造方法。
【請求項８】
前記前駆細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞及び神経前駆細胞からなる群より選択された少なくとも１種である請求項３〜請求項７のいずれか１項記載の神経細胞シートの製造方法。
【請求項９】
請求項１又は請求項２記載の神経細胞シートを含む移植用シート材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞シート及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、脳卒中の患者数は日本において約１５０万人と言われており、毎年２５万人以上が新たに脳卒中と診断されている。脳卒中に代表される脳血管疾患では、例えば大脳皮質において神経細胞（ニューロン）が損傷又は死滅するため、損傷部位における機能の回復は非常に困難と考えられている。
一般に、生体組織の一部が損傷した場合の治療又は状態を改善するための方法のひとつとして、損傷した部位に、細胞又は損傷した組織の移植が提案されており、一部の組織については実際に実施されている。
移植に用いられる材料として、例えば、特許文献１には、角膜内皮細胞で構成された再生角膜内皮細胞シートが開示されている。また特許文献２には、表皮細胞で構成された表皮培養細胞シート等が開示されている。
大脳皮質における損傷については、神経細胞を損傷部位に注入する方法が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
また、神経疾患の治療として、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を移植して、損傷した中枢神経を再生する医療が注目されている。この治療のために、神経幹細胞／前駆細胞の増殖促進剤（例えば、特許文献３参照）や、分化促進剤（例えば、特許文献４参照）が開発され、それらの使用が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００４／０７３７６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００２／０１０３４９号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−２５４７５３号公報
【特許文献４】特開２０１２−７５３８０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Inflammation and Regeneration, 2010, Vol.30, No.3, pp.193-205
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、表皮細胞等とは異なり、神経細胞が機能的に作用するためには、軸索や髄鞘、シナプスの形成といった複雑な構造が必要である。また、神経細胞は、このような複雑な構造を有する神経細胞が、ネットワークを形成して細胞間相互作用することにより、初めてその機能が発揮される特殊な細胞であることも知られている。このため、神経細胞を移植物として利用するには、単一細胞の状態で損傷部位に注入しても、期待される効果が得られない場合がある。
【０００７】
従って、本発明は、神経細胞の機能が効果的に発揮される神経細胞シート及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］  軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シート。
［２］  前記培養神経細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からなる群より選択された少なくとも１種の前駆細胞から誘導された細胞である［１］に記載の神経細胞シート。
［３］  前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、前記神経細胞を、ＳＤＦ１（Stromal cells-derived factor-1）及びＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant propein-1）の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、を含む、［１］又は［２］に記載の神経細胞シートの製造方法。
［４］  前記ＳＤＦ１及びＭＣＰ−１の少なくとも一方の培養液中の濃度が、０．５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬである［３］記載の神経細胞シートの製造方法。
［５］  前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤が、サイクロパミン、ジェルビン及びトマチジンからなる群より選択された少なくとも１種を含む［３］又は［４］記載の神経細胞シートの製造方法。
［６］  前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤の培養液中の濃度が、２．０×１０−７μＭ〜３．０μＭである［３］〜［５］のいずれかに記載の神経細胞シートの製造方法。
［７］  前記分化誘導剤が、レチノイン酸、ノギン、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及び神経細胞成長因子（ＮＧＦ）からなる群より選択された少なくとも１種を含む［３］〜［６］のいずれかに記載の神経細胞シートの製造方法。
［８］  前記前駆細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞及び神経前駆細胞からなる群より選択された少なくとも１種である［３］〜［７］のいずれかに記載の神経細胞シートの製造方法。
［９］  ［１］又は［２］に記載の神経細胞シートを含む移植用シート材。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、神経細胞の機能が発揮される神経細胞シート及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１にかかる神経細胞シートの光学顕微鏡写真像である（２０倍）
【図２】実施例１にかかる神経細胞シートの光学顕微鏡写真像である（２倍）
【図３】実施例３にかかるマウスＥＳ細胞株からの神経細胞シートの光学顕微鏡写真像である（２０倍）。
【図４】実施例３にかかるマウスｉＰＳ細胞からの神経細胞シートの写真像である（２倍）。
【図５】実施例３にかかるマウス胎児神経前駆細胞からの神経細胞シートの光学顕微鏡写真像である（２０倍）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の神経細胞シートは、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートである。
また、本発明の神経細胞シートの製造方法は、前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること、並びに、前記神経細胞を、ＳＤＦ１（Stromal cells-derived factor-1）及びＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant propein-1）の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること、を含む、軸索伸展した神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートの製造方法である。
【００１２】
前記神経細胞シートは、個々の神経細胞が単に集められたものではなく、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有するので、神経細胞層において、神経細胞による細胞間相互作用が保持されている。このため、細胞間相互作用が保持されていない状態の神経細胞を用いる場合と異なり、神経細胞の高い機能の発揮が期待される。
【００１３】
これを更に説明すれば、神経細胞は、増殖後に最終的に分化すると、軸索伸展可能な突起を有する形態となり、且つ増殖を停止する。神経細胞が機能を発揮するには、神経細胞同士の情報の伝達が不可欠であり、軸索伸展した形態が必須である。本発明にかかる神経細胞シートは、このような軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有するので、神経細胞の細胞間相互作用が保持され、トリプシンを使用して回収された神経細胞を直接投与する従来法より神経細胞の生着率も高くなり、神経細胞の細胞間相互作用に基づく高い機能が発揮される。
【００１４】
また本発明の神経細胞シートの製造方法は、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で前駆細胞から神経細胞を誘導し、また、ＳＤＦ１及びＭＣＰ−１の少なくとも一方を含む培養液中で神経細胞の軸索伸展を誘導して、軸索伸展した培養神経細胞により形成された層を得るので、軸索伸展した培養神経細胞を高い含有率で含む神経細胞層を有し、その結果、神経細胞の機能を発現可能な神経細胞シートを効率よく作製することができる。
【００１５】
本発明において、神経細胞層に関して「神経細胞により形成されている」とは、最終分化を終えた複数の神経細胞を所定条件下で培養することによって伸展した前記複数の神経細胞の軸索が互いに連結することにより、神経細胞層が主として構成されていることを意味する。
本発明において、「軸索伸展した」とは、神経細胞同士が軸細工を網の目状に構築して相互に一体となった状態を意味する。
【００１６】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１７】
［神経細胞シート］
本発明にかかる神経細胞シートは、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する。
【００１８】
＜神経細胞層＞
前記神経細胞層は、軸索伸展した培養神経細胞により形成されている。
神経細胞（ニューロン）は、細胞体と突起（樹状突起及び軸索）からなる複雑な構造を有する細胞であり、機能面から、運動神経細胞、介在神経細胞、及び感覚神経細胞の３種に分けられる。前記神経細胞層を形成する神経細胞は、運動神経細胞、介在神経細胞及び感覚神経細胞のいずれであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。運動機能の修復の点で、運動神経細胞であることが好ましい。運動神経細胞としては、皮質運動神経細胞、脊椎運動神経を挙げることができるが、大脳皮質の機能障害に対する治療的効果の観点から皮質運動神経細胞であることがより好ましい。
【００１９】
また、前記神経細胞層には、層の形状を保持できる範囲で、軸索伸展していない神経細胞が含まれていてもよい。神経細胞が軸索伸展していることは、その形態に基づき、光学顕微鏡、実態顕微鏡により確認することができる。前記神経細胞シートの効果的な機能発現の観点から、軸索伸展している神経細胞の含有率は、前記神経細胞層に含まれる神経細胞の全細胞数の７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。神経細胞全細胞数における軸索伸展している神経細胞数の割合は、ヘマトキシリン・エオジン染色により確認することができる。
【００２０】
前記神経細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞及び神経前駆細胞からなる群より選択された少なくとも１種の前駆細胞から誘導された細胞であることが、細胞の供給量の観点から、好ましい。
前記前駆細胞としては、神経細胞への誘導が可能な細胞であればいずれであってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、胎児神経細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞等を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせ使用することができる。中でも、細胞の供給量の点で、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞であることが好ましい。
【００２１】
これらの細胞は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えば豚、牛、馬など）、小型哺乳類の齧歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）の種々の動物に由来するものから、適宜使用目的に応じて選択することができる。また、細胞の供給源としては、成体に限定されず、胎児由来であってもよい。
【００２２】
胚性幹細胞とは、初期胚に由来する多能性幹細胞をいい、無限増殖能と複数の細胞系列への分化能を有することを特徴としている。胚性幹細胞は、受精卵ないし受精卵より発生が進んだ胚盤胞までの段階の初期胚から単離することができ、また例えば理化学研究所から入手することができる。
【００２３】
ｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ等の遺伝子を体細胞へ導入して作製される多能性幹細胞である（Cell, Vol.131: pp.861-872）。ここで、「多能性」とは、複数の細胞系列への分化能を意味し、奇形腫形成法により確認することができる。ｉＰＳ細胞株としては、市販されているものを利用することができ、例えば、理化学研究所  バイオリソースセンター等より、２５３Ｇ１株（ヒト）、２０１Ｂ７株（ヒト）等として入手することができる。また、ｉＰＳ細胞株は、ヒトの患者皮膚繊維芽細胞から上記文献等に従って新たに作製したｉＰＳ細胞であってもよい。ｉＰＳ細胞及びｉＰＳ細胞から誘導された細胞であることは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ等の検出により確認することができる。
【００２４】
神経幹細胞は、ニューロンおよびグリア細胞に分化する細胞を供給する能力を持つ幹細胞である。また、神経前駆細胞は、神経のみに分化する未分化細胞である。これらの細胞は、厳密に区別することが困難なため、本発明においては区別なく適用される。神経幹細胞又は神経前駆細胞はいずれも、例えば、ヒトｉＰＳ細胞より分化誘導することにより入手することができる。神経幹細胞若しくは神経幹細胞から誘導された細胞、又は神経前駆細胞若しくは神経前駆細胞から誘導された細胞であることは、ネスチン蛋白質の発現、フローサイトメーターによるＮＣＡＭ陽性により確認することができる。
【００２５】
前記神経細胞であることは、上述した特徴的な形態に基づく確認の他、神経細胞のマーカーとして既知の分子の検出により確認することができる。例えば、運動神経細胞のマーカーとしては、ＣＴＩＰ２（COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) - TF (transcription factor) - interaction protein 2）、Ｆｅｚｆ２（ＦＥＺ（Forebraiin embryonic zinc finger） family zing finger 2）、ＦｏｘＰ２（forkhead box P2）、及びＣｒｉｍ１（Cystein-rich motor neuron 1 protein precursor）等を挙げることができる。これらのマーカーの存在の確認は、遺伝子の発現又はタンパク質の検出などの既知の方法により行うことができる。
【００２６】
前記神経細胞層は、神経細胞層を構成する細胞の少なくとも５０％以上が前記神経細胞であればよく、層（シート）の形状を保持できる範囲で、神経細胞以外の細胞を含むことができる。神経細胞シートの強度及び機能性発揮の点で、前記神経細胞シートを構成する全細胞における神経細胞の割合は、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、８５％以上であること更に好ましく、９５％以上であることが更により好ましい。シートを構成する全細胞における神経細胞の割合を高くすると、他種の細胞の混入頻度が低下し、シートの強度が向上する傾向があり、また、単位面積あたりの機能発現効率が高くなる傾向がある。
【００２７】
前記神経細胞層に含まれうる他の種類の細胞としては、血管内皮細胞、線維芽細胞、口腔粘膜上皮細胞、気管気管支上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞、下腸粘膜上皮細胞等の各種上皮細胞などが挙げられる。これらの細胞が含まれる場合には、神経細胞以外の細胞に対して、放射線照射などの既知の増殖抑制処理を行っておくことが好ましい。
前記神経細胞層を構成する細胞の数については特に制限はなく、例えば、０．１個／ｃｍ２〜０．１×１０６個／ｃｍ２とすることができる。
前記神経細胞シートは、移植時等を考慮すると神経細胞層のみで構成されていることが好ましいが、神経細胞層以外の他の層を含むことができる。他の層としては、例えば、線維芽細胞又は上皮細胞を含む細胞層を挙げることができる。これらの他の細胞による層を含むことにより、他の細胞からの因子などにより、神経細胞層に含まれる神経細胞の状態を良好なものにすることができる。
【００２８】
前記神経細胞シートの厚み及び大きさについては特に制限はなく、必要に応じて、適宜調製することができる。前記神経細胞シートにおける神経細胞層の厚みとしては、一般に０．０５ｍｍ〜１ｍｍの範囲とすることができる。
前記神経細胞シートの前記神経細胞層の大きさ及び厚みは、後述する製造方法における培養期間の調整や、細胞の播種密度等を調整することにより、前記神経細胞層の厚みを調節することができる。神経細胞層の厚みは、例えば、神経細胞シートの切片を作製することにより顕微鏡下で確認することができる。他の細胞による層を有する場合には、神経細胞層の厚み及び大きさと同様に、培養期間の調整や、細胞の播種密度等を調整することにより適宜調節することができる。
【００２９】
［神経細胞シートの製造方法］
本発明にかかる神経細胞シートの製造方法は、前駆細胞を、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で培養して、該前駆細胞から神経細胞を誘導すること（以下、細胞誘導工程ということがある）、並びに、前記神経細胞を、ＳＤＦ１（Stromal cells-derived factor-1）及びＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant propein-1）の少なくとも一方を含む培養液中で培養して、前記神経細胞の軸索伸展を誘導し、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を得ること（以下、軸索伸展誘導工程ということがある）、を含む、軸索伸展した培養神経細胞により形成された神経細胞層を有する神経細胞シートの製造方法である。
【００３０】
前記細胞誘導工程では、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含む培養液中で前駆細胞から神経細胞を誘導する。ソニック・ヘッジホッグは、分化誘導に用いられるタンパク質として既知のものであるが、前記製造方法では、ソニック・ヘッジホッグの阻害剤と分化誘導剤とを組み合わせることにより、前駆細胞から神経細胞を高頻度に誘導することができる。
【００３１】
ソニック・ヘッジホッグ阻害剤としては、サイクロパミン、ジェルビン及びトマチジン等を挙げることができ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのソニック・ヘッジホッグ阻害剤の中でも、皮質運動神経細胞の誘導効率の点で、サイクロパミン、ジェルビンが好ましく、サイクロパミンがより好ましい。
【００３２】
前記ソニック・ヘッジホッグ阻害剤の培養液中の濃度としては、用いられるソニック・ヘッジホッグ阻害剤の種類のよって異なるが、サイクロパミンの場合には、２．０×１０−７μＭ〜３．０μＭであることが好ましく、２．５×１０−５μＭ〜２．５×１０−２μＭであることがより好ましい。２．０×１０−７μＭ以上の濃度であれば、前駆細胞から確実に神経細胞を誘導できる傾向があり、３．０μＭ以下の濃度であれば、細胞の死滅をより確実に抑制して充分な数の神経細胞を誘導できる傾向がある。特に、２．５×１０−２μＭ以下とすることにより、確実に運動神経細胞へ誘導することができる。
【００３３】
前記分化誘導剤としては、前駆細胞から神経細胞への分化誘導に寄与することが既知のいずれの分化誘導剤を使用することができる。このような分化誘導剤としては、レチノイン酸（ＲＡ）、ノギン（Noggin）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）及び神経細胞成長因子（ＮＧＦ）等を挙げることができ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。神経細胞への誘導効率の観点から、レチノイン酸、ノギン、ＦＧＦからなる群より選択された２つ以上を組み合わせて使用することが好ましく、レチノイン酸及びノギンの組み合わせであることがより好ましい。また、ノギン、ＦＧＦ及びＮＧＦについては、天然物であってもよく、遺伝子組換え体であってもよい。これらの分化誘導剤は、化合物そのものとして添加してもよく、安定性や反応性の観点から化学的に修飾されたものや多量体形式にしたものであってもよい。例えば、ノギンの場合には、三量体で使用してもよく、免疫グロブリン重鎖の定常部（Ｆｃ）と結合体であってもよい。
【００３４】
前記分化誘導剤の培養液中での濃度は、前駆細胞から神経細胞への分化を誘導可能な濃度であればよく、個々の分化誘導剤にて既知の濃度をそのまま用いることができる。例えば、レチノイン酸の場合には、０．０１μＭ〜１０μＭであることが好ましく、１μＭ〜５μＭであることが更に好ましい。またノギンの場合には、１ｎｇ／ｍｌ〜１,０００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、１００ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌであることが更に好ましい。
【００３５】
前記前駆細胞としては、神経細胞への誘導が可能な細胞であればいずれであってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、神経前駆細胞等を挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて使用することができる。中でも、細胞の供給量の点で、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞であることが好ましい。前記前駆細胞として使用可能な胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、神経前駆細胞等の前駆細胞については、神経細胞シートに関する前駆細胞として記載した事項をそのまま適用することができる。
【００３６】
分化誘導工程に用いられる培養液としては、培養対象となる細胞の種類に応じて適宜選択することができる。使用可能な培養液としては、公知のもののいずれであってもよく、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ培地等を挙げることができる。また、これらの培養液には、一般に添加可能な各種の成分、例えば、グルコース、血清成分、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）などを添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常１０％（v/v）とすることができる。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の培養を行う場合には、血清を含まないことが好ましく、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を用いることが好ましい。
細胞の培養には、通常の培養条件、例えば３７℃の温度で５％ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。
【００３７】
分化誘導工程の培養に用いられる培養器としては、使用する種類の細胞の培養に通常用いられる培養器であれば特に制限はない。例えば、胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞の場合には、生育効率の観点から、付着性を有する培養表面を備えた培養器であることが好ましい。
このような付着性の培養表面を有する培養器としては、例えば、フィブロネクチン（ＦＮ）、ビトロネクチン（ＶＮ）、ラミニン等の細胞接着因子やゼラチン等の水溶性高分子化合物などにより被覆された培養表面を有する培養器等を挙げることができる。
【００３８】
培養器への前駆細胞の播種密度としては、増殖効率の観点からの観点から、例えば１０ｃｍペトリ皿の場合には０．５×１０5／ペトリ皿〜１．０×１０7個／ペトリ皿とすることができる。
【００３９】
前記前駆細胞の種類によっては、増殖効率等の観点から、フィーダー細胞と共に培養してもよい。フィーダー細胞としては、前駆細胞の増殖及び神経細胞シートの機能を損なわないものであればいずれも使用可能であり、一般に、マウス胎児、線維芽細胞等が挙げられる。また、前記フィーダー細胞としては、放射線照射及びマイトマイシンＣ等の薬剤の使用により増殖抑制処理を施したものであることが好ましい。
【００４０】
分化誘導のための培養期間としては、例えば、８〜３０日間とすることができる。神経細胞への分化誘導は、ＰＣＲ法・免疫染色法にてネスチン、ニューロフィラメントＭ鎖、βIIIチューブリンの発現により確認することができる。
【００４１】
前記分化誘導工程の前に、所定の細胞数を満たすことを目的として、前培養工程を設けてもよい。前培養工程としては、分化誘導前の前駆細胞を増殖可能な既知の培養条件を適用することができる。前培養の条件としては、対象となる細胞の種類によって異なるが、当業者であれば、培地組成、培養温度、培養期間等の既知の条件から適宜選択可能である。
【００４２】
前記軸索伸展誘導工程は、ＳＤＦ１及びＭＣＰ−１の少なくとも一方を含む培養液中で前記神経細胞を培養して、軸索伸展した神経細胞により形成された神経細胞層を得ることを含む。ＳＤＦ１及び／又はＭＣＰ−１が存在する培養液中で前記神経細胞を培養するので、神経細胞の軸索伸展が効率よく生じる。
軸索伸展誘導工程は、前記分化誘導工程において分化が進行した神経細胞の軸索を伸展（伸長）させるために行う工程であり、軸索伸展誘導工程を有しない培養では、前記神経細胞シートを得ることができない。
【００４３】
なお、前記軸索伸展誘導工程は、前記分化誘導工程において、前駆細胞から神経細胞への分化が充分に終了した後に行ってもよく、前記分化誘導工程と同時に行ってもよい。前記軸索伸展誘導工程を前記分化誘導工程と同時に行う場合には、軸索伸展誘導工程で用いられる培養液に、分化誘導工程で用いられる分化誘導剤が含まれていてもよい。
【００４４】
ＳＤＦ１（Stromal cell-derived factor 1；ストローマ由来因子）は、細胞の増殖、分化、機能発現を行うサイトカインの１種である（Science, 1993, vol.261, pp.600-603）。ＳＤＦ１を神経細胞へ接触させることにより、神経細胞の成熟を引き起こして、軸索が伸展する。
ＭＣＰ−１（Monocyte chemoattractant protein-1：単球化学誘因タンパク質１）は、塩基性でヘパリン結合性の高い９２〜９９アミノ酸からなるケモカインの１種である（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,Vol.91,pp.3652-3656,1994）。ＭＣＰ−１を神経細胞へ接触させることにより、神経細胞の成熟を引き起こして、軸索が伸展する。
【００４５】
ＳＤＦ１とＭＣＰ−１とは、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。使用する細胞の種類に対応して軸索の伸展効率及び生存率の点から、それぞれを単独でまたは組み合わせて使用することが好ましく、ＳＤＦ１のみを用いることがより好ましい。
【００４６】
軸索伸展誘導工程におけるＳＤＦ１及び／又はＭＣＰ−１の培養液中での濃度は、軸索伸展効率及び生存率の点で、これらを合計で、０．５ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１．０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。０．５ｎｇ／ｍＬ以上であれば、確実に軸索の伸展を誘導可能である。上限値については特に制限はないが、添加量に対する効率的な効果発現の点で３０ｎｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。
【００４７】
特に、ＳＤＦ１を単独で用いる場合の培養液中での濃度は、軸索伸展効率及び生存率の観点から０．５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。またＭＣＰ−１を単独で用いる場合の培養液中での濃度は、軸索伸展効率及び生存率の観点から、０．５ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００４８】
軸索伸展誘導工程における培養条件としては、分化誘導工程における培養条件として挙げたものをそのまま使用することができる。また軸索伸展誘導工程で使用可能な培養液としては、ソニック・ヘッジホッグ阻害剤及び分化誘導剤を含まない以外は、分化誘導工程において記述した培養液及び添加成分をそのまま適用することができる。
【００４９】
軸索伸展誘導工程の期間としては、軸索伸展が確認できる期間であれば特に制限はないが例えば、８〜３０日間とすることができる。
ここで、ＳＤＦ１及び／又はＭＣＰ−１の培地への添加の時期は、培養開始後、毎日添加することができ、３日毎に行うことが更に好ましい。
神経細胞の軸索伸展は、前述したと同様に、光学顕微鏡、実態顕微鏡により確認することができる。
【００５０】
軸索伸展誘導工程における培養は、細胞シートの作製効率の観点から、培養表面上に剥離層を備えた培養器を用いることが好ましい。培養表面上に剥離層を備えた培養器を用いる場合、剥離層上に細胞を播種して培養を行うことにより、剥離層の表面に細胞シートが形成される。その後、剥離層の機能に基づき培養表面と細胞シートとの間を離間させ、細胞シートを培養器から容易に離脱させることができる。
【００５１】
培養表面と細胞シートとの間を離間させることができる剥離層としては、剥離層そのものが分解又は消滅可能なものを挙げることができ、例えば、コラーゲンゲル、温度反応性ポリマー等を挙げることができる。簡便性及び形状維持の点で、温度反応性ポリマーによる剥離層であることが好ましい。
このような温度反応性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡ）又はその誘導体などのヒドロゲルを挙げることができる。例えば、ＰＩＰＡＡは、３２℃以下になると液状化するため、例えば２０℃６０分の低温処理により剥離層を液状化して神経細胞シートを培養表面から離脱させることが可能となる。このような温度反応性ポリマーとしては、メビオールジェル（登録商標）やＢＳＴ−Ｇｅｌ（登録商標）を挙げることができる。超純水に溶解したのち、プラスチックに吸着させる。
またこのような温度反応性ポリマーと、他のコラーゲンゲル等とを組み合わせた多層の剥離層を有する培養器であってもよい。コラーゲンゲル等を用いた場合には、酵素等を用いることによりゲルを分解して細胞シートを剥離させることができる。
【００５２】
軸索伸展誘導工程後には、軸索伸展した神経細胞から形成された神経細胞層を有する神経細胞シートが得られる。前記神経細胞シートの製造方法は、培養器の培養表面から神経細胞シートを分離させて、回収すること（以下、回収工程）を含んでもよい。
回収工程における前記神経細胞シートの回収は、神経細胞シートを培養表面から分離できれば如何なる手段によって行ってもよい。例えば、シートの端部をつまみ上げるなどの方法により分離してもよく、緩やかなピペッティング等により穏やかに剥離してもよい。前記培養器として、剥離層を有する培養器を使用した場合には、剥離層の溶解又は分解を行って、神経細胞シートを分離することができる。
【００５３】
前記神経細胞シートの他の製造方法としては、最終分化を終えた神経細胞を所定の培養器にて培養することによって作製する方法が挙げられる。この場合には、必要に応じて、軸索伸展を誘導する誘導剤を培養液に添加してもよい。
この他の製造方法で使用可能な培養液については、上述したものをそのまま適用することができる。また、軸索伸展を誘導する誘導剤としては、上述したＳＤＦ１、ＭＣＰ−１等を挙げることができる。最終分化を終えた神経細胞に対して誘導剤を使用する場合には、上述した濃度をそのまま適用すればよい。
【００５４】
上記製造方法で得られた神経細胞シートは、軸索伸展し、細胞間相互作用が保持された神経細胞で形成された神経細胞層を有する。このような神経細胞シートが高い機能性を有することは、神経細胞シートにおける神経細胞の含有率の高さや、移植片として移植した場合の神経活動の回復評価等により確認することができる。前記神経活動の回復評価としては、当技術分野で周知の試験を適用すればよい。評価試験としては、神経細胞シートを構成する神経細胞の種類によって異なるが、運動神経細胞の場合には、ビームウオーキング試験、又は回転ロッド試験等を挙げることができる。
【００５５】
［用途］
前記神経細胞シートは、神経細胞の細胞間相互作用が保持されており、トリプシンを使用して単離した細胞を直接用いる従来法より生着率も高くなり、神経細胞の機能が発揮しやすく、高い機能性を有する。このため、前記神経細胞シートは、神経細胞の機能に応じた用途に好ましく用いられる。
例えば、神経細胞の損傷に関連する疾患又は症状の治療が挙げられる。このような疾患としては、脳出血、脳卒中、脳梗塞、脳挫傷等を挙げることができる。このような疾患又は症状の治療においては、前記神経細胞シートを、治療対象部位に移植することによって、治療対象部位における治療的効果の発揮が期待される。前記神経細胞シートを移植した場合、前記神経細胞シートの神経細胞層を構成する神経細胞が細胞間相互作用によって治療対象部位の神経細胞と連絡する、又は治療対象部位へ神経細胞が浸潤して、治療的効果が得られると推測されるが、この理論に拘束されない。
【００５６】
また本発明は、前記神経細胞シートを用いた神経細胞の損傷に関連する疾患又は症状の治療方法も包含する。
前記治療方法では、神経細胞の損傷が生じている又は生じている可能性がある局所に、前記神経細胞シートを移植することを含む。移植方法は、前記神経細胞シートを、損傷部位に適用できれば如何なる方法で移植してもよい。
前記治療方法によれば、細胞間相互作用が保持された神経細胞シートを直接、損傷部位に適用するので、神経細胞相互作用に基づく機能が迅速に発揮され、神経細胞の損傷に起因した疾患の状態又は症状が効果的に改善される。
【００５７】
また前記神経細胞シートは、そのままの形態で患部へ適用可能な移植用シート材として使用することができる。即ち、本発明にかかる移植用シート材は、前記神経細胞シートを含む。本移植用シート材を用いることにより、神経細胞の生着がよく、高い治療効果が期待できる。
【００５８】
前記神経細胞シートは、例えば移植前の取り扱いの観点から、神経細胞層以外の他の層を含むことが好ましい。このような他の層としては、シートの強度を向上させるために基材層が挙げられる。基材層に用いられる基材としては、ニトロセルロースメンブレン等のメンブレンを挙げることができる。前記基材層の厚みとしては特に制限はなく、例えばフィーダー細胞の層であれば０．０５ｍ〜１ｍｍとすることができる。
【００５９】
前記神経細胞シートが前記神経細胞層以外の他の層を有する場合には、本発明の神経細胞シートの製造方法は、前記他の層を前記神経細胞層に付加する工程を更に含むことができる。
例えば、前記神経細胞シートが基材層を有する場合には、前記軸索伸展誘導により得られた神経細胞層の上に、基材を付与する工程を含むことができる。基材の付与は、用いられる基材の種類によって異なるが、例えばメンブレンを基材とした場合には、前記神経細胞層上に載置することができる。また、メンブレンを予め培養表面に載置した後に、前記神経細胞を播種し、その後に前記軸索伸展誘導工程を行ってもよい。
これにより他の層を有する神経細胞シートを得ることができる。
【００６０】
また前記神経細胞シートは、神経細胞に対する薬剤の効果判定や、学術研究のためにも使用することができる。例えば、神経細胞に対する薬剤の効果判定方法は、候補物質を、前記神経細胞シートと接触させること、接触後の神経細胞シートを、所定の生理活性試験に供すること、試験の結果に基づいて候補物質が目的物質であることを判定することを含むことができる。これにより、神経細胞に対して所定の生理活性を有する化合物か否かを簡便に取り扱いよく判定することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００６２】
［実施例１］
（１）前駆細胞の準備
（１−１）ヒトｉＰＳ細胞の維持
ヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１又は２０１Ｂ７（理化学研究所より入手）を、フィーダー細胞（マイトマイシンＣ処理したマウス胎児線維芽細胞）上に１．０×１０６個／１０ｍＬの細胞密度で播種し、２０％（v/v）ノックアウト血清代替（ＫＳＲ：ライフテクノロジーズジャパン社）、非必須アミノ酸混合液、ピルビン酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、２３代以上継代して、３７℃、５％（v/v）ＣＯ２条件下で、培養維持（メンテナンス培養）した。培地交換は、毎日行った。
上記のようにして維持したｉＰＳ細胞のうち、５０代以内の継代数のものであって、正常な核型を有するものを、以下の神経細胞誘導に用いた。
【００６３】
（１−２）サルＥＳ細胞
サルＥＳ細胞株（京都大学より入手）を、上記（１−１）と同様にして、メンテナンス培養を行い、以下の神経細胞誘導に用いた。
【００６４】
（２）前駆細胞から神経細胞への分化誘導の方法とシートの作製
上記のヒトｉＰＳ細胞及びサルＥＳ細胞を、それぞれ回収して、細菌グレードのプラスチックシャーレ（Ｆａｌｃｏｎ社）上に播種して、メンテナンス培養と同一の培地を用いて、浮遊状態による培養を開始した。４日後に、球状の細胞塊である浮遊細胞凝集体（ＥＢ）が得られた。これを回収して、新鮮なフィブロネクチンコーティングペトリ皿（ベクトンディッキンソン社製）に上記培地と共に移し、細胞の付着を確認した後、最終濃度１μＭのレチノイン酸（ＲＡ：シグマ社製）と最終濃度７ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ社製）と、最終濃度２．５×１０−２μＭのサイクロパミン（シグマアルドリッチ社）を添加した（１日目）。その後、３日目において、ＲＡ、Ｎｏｇｇｉｎ−Ｆｃ及びサイクロパミンを含有する培地を、それぞれ、上記と同一最終濃度となるようにペトリ皿に添加した。
【００６５】
培養４日目に、あらかじめ温度反応性ヒドロゲル（メビオールジェル（登録商標）、メビオール株式会社）をコートしてある４８穴培養プレート（メビオール社製）に、上記で得られた細胞を、１×１０５／ウェルの細胞密度で播種し、培養した。３日おきに、ＳＤＦ１（Ａｂｃａｍ社）の最終濃度が１ｎｇ／ｍｌとなるようにＳＤＦ１を含有する培地を添加した。１４日から２１日程度培養を継続した後、２０℃に温度を変更してヒドロゲルを溶解し、更に軽くピペッティングを行って、各ウェルの培養表面からニトロセルロース膜を用いて、神経細胞シートを剥離し、ｉＰＳ細胞由来の神経細胞シートと、ＥＳ細胞由来の神経細胞シートをそれぞれ回収した。
【００６６】
得られた神経細胞シートの性状は、次のようにして確認した。
即ち、上記で得られた神経細胞シートを回収した。トリプシンを用いて浮遊細胞化集団としてＰＥ標識化抗ヒトＮＣＡＭ抗体（ベクトンディキンソン社）を用いて染色し、フローサイトメトリーにてＮＣＡＭ発現細胞の数を確認した。
【００６７】
更に、得られた神経細胞シートに対して、ＣＴＩＰ２（COUP (Chicken ovalbumin upstrem promoter) - TF (transcription factor) - interaction protein 2）に対する抗体（ＡＢＣＡＭ社）、Ｆｅｚｆ２（ＦＥＺ（Forebraiin embryonic zinc finger） family zing finger 2）に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、ＦｏｘＰ２（forkhead box P2)に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、及びＣｒｉｍ１（Cystein-rich motor neuron 1 protein precursor）に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）による染色を行った。
【００６８】
２．５×１０−５μＭのサイクロパミンを用いて得られた神経細胞シートを、光学顕微鏡（カールツァイス社）にて観察した。結果を図１（２０倍）及び図２（２倍）に示す。図１に示されるように、個々の神経細胞の軸索が確認でき、他の神経細胞の軸索と接触し、網目を形成していることがわかる。
また、神経細胞シートでは、全細胞数の６０％以上がＮＣＡＭを発現しており、神経細胞を高い含有率で含む神経細胞シートであることがわかる。更に上記各抗体の染色によって、神経細胞シートを構成している神経細胞は、ヒト運動神経細胞であることであることが確認できた。なお、蛍光免疫染色（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）目視による観察で、フィーダー細胞を０．０１％未満であった。このように、本神経細胞シートは、全細胞のほとんどが、軸索伸展した神経細胞で形成された神経細胞層によって構成されていることが確認できた。
【００６９】
（３）低温傷害による実験的脳損傷と移植
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を移植に使用した。後続のすべての手順は、聖マリアンナ医科大学のガイドラインに沿って行われた。
マウスは麻酔して、定位フレーム (Narishige, Tokyo, Japan) に配置された。穿頭部位としてはコロナ縫合とラムダ縫合と矢状縫合の外側３．０ミリメートルの間の中間で左頭頂骨とした。
液体窒素で冷やした金属プローブを３０秒４回１００グラムの力でそのまま穿頭部位の表面に適用した。各マウスに寒冷傷害を４回投与することにより、確実に片麻痺を再現することができ、脳梗塞モデルマウスを作製した。
【００７０】
この脳梗塞モデルマウスの左大脳運動野に、上記で得られたｉＰＳ細胞由来の神経シート又はサルＥＳ細胞由来の神経細胞シートをそれぞれ移植した。
神経シートは１ｍｍ〜２ｍｍ四方にサイズを整えたのちに、損傷部運動皮質上に広げて静置した。その後、出血の無いことを確認した。その上に人工骨を置く、あるいは人工骨を置かずに頭皮を縫合して、手術を終えた。
なお、免疫抑制に関しては異種移植となるために、シクロスポリン（皮下注射）を１０μｇ／ｇの濃度で、またデキサメタゾン（腹腔内注射）を０．２μｇ／ｇの濃度で、移植前１時間に投与した。移植の翌日から、シクロスポリンを１０μｇ／ｇの濃度は、毎日投与した。
移植後、所定の時期に、下記の運動機能評価を行った。
【００７１】
（４）運動機能評価
移植後、上下肢の運動機能をビームウオーキング試験で評価した。
具体的には、移植後のマウスを、幅７〜８ｍｍ、長さ１２０ｍｍの木の棒（１００ｍｍのソフトパッド上３００ｍｍの高さに設定）の上に置いて、その上を約５０歩、歩かせて、その間に上下肢が木の棒をつかむことに失敗した回数を計測した。結果を表１に示す。
【００７２】
また、移植後の運動機能及び筋肉の協調を、回転試験により評価した。
具体的には、直径３．５ｃｍの回転ロッドを有する回転ユニット（Muromachi社）を使用した。３０ｒｍｐで回転ロッドを回転させて、マウスを回転ロッド上で走らせ、落下するまでの時間を測定した。結果を表２に示す。
【００７３】
ビームウオーキング試験及び回転試験は、それぞれ対象として、移植マウスにおいて神経細胞シートを移植した部位と同一の部位に、神経細胞シートの代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を５μｌ注入したマウスについても同様に行った。結果を表１〜表２にそれぞれ示す。
【００７４】
【表１】
2014023457.tif 000003
【００７５】
【表２】
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【００７６】
表１〜表２に示されるように、神経細胞シートを移植したマウスでは運動機能の回復が認められた。
【００７７】
［実施例２］
上記実施例１で用いたｉＰＳ細胞株を使用し、サイクロパミンの濃度を、２．５μＭ、２．５×１０−４μＭ、２．５×１０−５μＭ、又は２．５×１０−７μＭに変更した以外は、実施例１と同様にして、ｉＰＳ細胞株の神経細胞シートをそれぞれ作製した。
その結果、いずれの濃度のサイクロパミンを用いたものであっても、ｉＰＳ細胞由来の神経細胞シートを得ることができた。特に、サイクロパミンの濃度を、２．５×１０−４μＭ、２．５×１０−５μＭ、又は２．５×１０−７μＭに代えた培養した場合には、充分に軸索が伸展しており、軸索伸展した神経細胞による高い機能の発揮に対する期待がより高い。
【００７８】
なお、２．５μＭのサイクロパミンによって分化誘導させて得られた神経細胞シートでは、血管内皮細胞の混入率が他の細胞シートよりも高いため、細胞シートを培養器の培養表面から、破れないように剥離させるのに注意を要する。
【００７９】
［実施例３］
マウスＥＳ細胞株（Science. 1991 Nov 1;254(5032):707-710、E14.1、Passage number 11-15, normal karyotype：Klaus Rajewsky博士（Cologne University）より供与。）、マウスｉＰＳ細胞（理化学研究所）及びマウス胎児神経前駆細胞（コスモバイオ株式会社）を用いて、実施例１と同様に、最終濃度１μＭのレチノイン酸（ＲＡ：シグマ社製）と最終濃度７ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ社製）と、最終濃度２．５×１０−２μＭのサイクロパミンを用いて分化誘導を行い、最終濃度１ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ１を用いて神経細胞シートを作製した。
【００８０】
なお、マウスＥＳ細胞株、マウスｉＰＳ細胞及びマウス胎児神経細胞の培養条件は、実施例１のヒトｉＰＳ細胞株の培養条件と同様である。得られた神経細胞シートをそれぞれ図３〜図５に示す。なお、図３はマウスＥＳ細胞株からの神経細胞シート（光学顕微鏡、２０倍）、図４はマウスｉＰＳ細胞からの神経細胞シート（２倍）、図５はマウス胎児神経前駆細胞からの神経細胞シート（光学顕微鏡、２０倍）を示す。
図３〜図５に示されるように、いずれの前駆細胞からも軸索伸展した神経細胞シートを得ることができた。
【００８１】
このように本発明の神経細胞シートは、軸索伸展した神経細胞シートで構成され、この神経細胞シートを移植することにより、損傷部位における機能が著しく回復した。このことから、本発明の神経細胞シートは、高い機能性を有するものであることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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