(57)【要約】【課題】高温高圧水蒸気処理装置を用いて汚染を漏らさず高速にＤＮＡを分解除去する方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡ断片を含む水溶液を空気と共にまたは酸素を含む気体と共に容器に密閉する工程と、前記密閉した容器をオートクレーブ内に配置し高温保持することにより、前記密閉した容器内で高温高圧水蒸気処理を行う工程からなる汚染を漏らさずに高効率にＤＮＡを分解除去する方法【選択図】図７
2014213224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ断片を含む水溶液を空気と共にまたは酸素を含む気体と共に容器に密閉する工程と、
前記密閉した容器をオートクレーブ内に配置し高温保持することにより、前記密閉した容器内で高温高圧水蒸気処理を行う工程からなる汚染を漏らさずに高効率にＤＮＡを分解除去する方法。
【請求項２】
処理装置内にＤＮＡ断片の付着した廃棄物やＤＮＡ断片を含む廃液等を入れた非密閉容器、及び、水を入れ、空気と共にまたは酸素を含む気体と共に前記処理装置を密閉する工程と、
前記密閉した処理装置を排気を行わずに加熱して高温保持することにより、前記密閉した処理装置内で高温高圧水蒸気処理を行う工程からなる汚染を漏らさずに高効率にＤＮＡを分解除去する方法。
【請求項３】
前記処理装置内にサーキュレーターを設け、前記高温高圧水蒸気処理を行う工程において前記処理装置内に対流を生じさせて温度と組成の均一化をはかることを特徴とする請求項２記載の汚染を漏らさずに高効率にＤＮＡを分解除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、周辺環境に汚染を拡散することなく、より高速に鋳型ＤＮＡを分解除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列を解読したり、特定の配列を有するＤＮＡのコピー数を定量する方法としては、特定の塩基配列を有するＤＮＡの一部の領域をＰＣＲ法等で数千億のコピーであるＤＮＡの断片に増幅し、その増幅過程または増幅産物を解析するという方法が一般的である。しかし、ＰＣＲで得られたＤＮＡの断片はそれ自体が鋳型としての活性を有しているため、これらがサンプルや試薬等に混入すると再びＰＣＲの鋳型となって増幅される可能性がある。近年ＰＣＲ法の普及に伴い、ＰＣＲ鋳型活性を有するＤＮＡ断片を多量に含む医療・実験廃棄物が発生し、不適切な処置によりフォルス・ポジティブを発生させることが深刻な問題になっている。一般的にＰＣＲの増幅産物を裸で扱う実験室等はそのＤＮＡの断片で汚染されており、正確な定量や診断が出来なくなるという問題を抱えている。
【０００３】
ＤＮＡの鋳型活性の不活化に関しては、従来の高温高圧水蒸気処理装置（オートクレーブ）による１２１℃２０分間の処理では十分な不活化が出来ないということが経験的に明らかであり、多くの報告もなされている。オートクレーブに関しては、本来細菌や細菌の芽胞を死滅させるために用いられてきた装置であり、歴史的経験則から飽和の水蒸気（即ち空気を含まない水蒸気）により１２１℃で１５−２０分間処理するという条件が採用されている。飽和水蒸気を用いる理由としては細菌や芽胞に対する殺傷性が高いという理由のほかに、圧力容器内から空気を排除することにより偏りなく１２１℃の雰囲気を醸成するという目的がある。そのため加熱から殺菌操作の過程で断続的に空気が混じった水蒸気を弁を通じて装置外に放出するという行為が繰り返されることになるが、この空気と水蒸気の混合物には微量ながらＤＮＡの断片が混入する。このため、ＰＣＲ産物等の大量の鋳型ＤＮＡを含む廃棄物をオートクレーブで処理すること自体が実験室環境の汚染やフォルス・ポジティブの原因になっていた。
また、ＤＮＡの鋳型活性を不活化するためには化学処理、紫外線による処理、γ線による処理などが試みられてきたが、いずれも完全に鋳型活性を除くことは難しいとされてきた（特許文献１，非特許文献１〜５等参照）。一方でＤＮase等の酵素を利用することがＤＮＡの分解除去には最も有効であるが、酵素そのものが高価であること、全ての実験器具や試薬類、廃棄物類を処理できるフォーマットの技術ではないことから、特定の場合を除き、あまり現実的なＤＮＡの分解除去方法とは言えなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−２３３４６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ＰＯＲＴＥＲ−ＪＯＲＤＡＮら、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．３０，  ８９−９１（１９９０）
【非特許文献２】ＤＷＹＥＲら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ，  ＶＯＬ．６，  ８７−８８（１９９２）
【非特許文献３】ＳＨＥＮら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ，  ＶＯＬ．２０，  １４７−１５３（２００６）
【非特許文献４】ＧＥＦＲＩＤＥＳら、ＦＯＲＥＮＳＩＣ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ，  ＶＯＬ．４，  ８９−９４（２０１０）
【非特許文献５】ＣＨＡＭＰＬＯＴら、ＰＬＯＳＯＮＥ  Ｖｏｌ．５，  ｅ１３０４２（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
既存のオートクレーブを用いてＰＣＲ産物等のＤＮＡ断片を高温高圧水蒸気処理する場合には次の１）〜３）の問題点が存在する。
１）オートクレーブはそもそもがＤＮＡを分解除去するための技術では無いので、一般的に用いられる条件では十分なＤＮＡの分解処理ができない。
２）オートクレーブは加熱・高温高圧処理の過程で圧力容器内を飽和の水蒸気で置換するため大量の空気と水蒸気を排出するシステムを採用している。このため排気を通じて処理装置内から未処理のＤＮＡ断片が漏出し、周囲を汚染する。
３）上記の排気という操作を行わないと、処理装置内部に高温の水蒸気の層と低温の空気の層が生じてしまい、局所的に十分な処理条件が担保できなくなる。
本発明が解決しようとする課題は、上記１）〜３）に列挙した、従来のオートクレーブの原理・構造・使用方法に起因して生ずる問題点を解消する点にあり、鋳型活性を有するＤＮＡ断片を含む廃棄物を、周辺環境を汚染することなく不活性化することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらを解決するために、鋳型ＤＮＡを外部に漏らさずに処理する方法を鋭意研究した結果、ＤＮＡを含む水溶液を空気（または酸素を含む気体）と共に容器に密閉した状態で高温高圧水蒸気処理することにより、鋳型ＤＮＡを外部に漏らさず、かつ、空気または酸素が共存することによってより高速に鋳型ＤＮＡを分解除去できるという事実を見出し、排気中に未処理のＤＮＡ断片を放出させずに高温高圧水蒸気処理を行うことに関してその有効性を確認し、また、空気（または酸素を含む気体）と密閉した容器中で高温高圧水蒸気処理を行うことがよりＤＮＡ断片の分解処理には有効であるという新たな知見を得た。
具体的には、以下の１〜３の手順に従う。
（１）ＰＣＲ増幅産物等のＤＮＡ断片を含む水溶液を空気（または酸素を含む気体）と共に容器に密閉する。
（２）通常のオートクレーブ内に上記密閉容器を配置し、１２１℃で８０分程度保持し、密閉容器内で高温高圧水蒸気処理を行う。
（３）室温まで冷却後に密閉容器を開け、処理後の残存物を取り出す。
上記の方法で処理するＤＮＡを含む水溶液は１０マイクロリットル程度、上記の操作に用いる密閉容器は２ミリリットル程度のものが望ましい。
【０００８】
容量が大きな密閉容器内では内部の温度の不均衡や水蒸気と空気の偏在が生じ、十分な処理効果が得られない可能性がある。より理想的には、発明を実施するための形態として後記するように、高温高圧で水蒸気処理する装置そのものを密閉型にし、ＤＮＡ断片を含む水蒸気を外部に漏らさない一方で大容量の空気と水蒸気の混合気体によって高温高圧処理をすることが簡便で確実に鋳型ＤＮＡを分解除去するために有用である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、鋳型活性を有するＤＮＡ断片を周辺環境に漏らさず、確実に分解除去することが出来る。従来に比べて実験室等の環境をよりクリーンに保つことにより、フォルス・ポジティブの発生を回避しつつより精密なＤＮＡ断片の定量や塩基配列の解析を可能にする。
また、従来は、１０の１１乗コピー程度（通常のＰＣＲで生じる増幅産物量）のＰＣＲ鋳型活性を完全に除去するためには１２１℃で１００分間以上の処理時間が必要であり、ＰＣＲの廃棄物等を処理する技術としては改善が必要であったが、本発明によれば、ＤＮＡを含む水溶液を完全に密閉して空気が外部の水蒸気に置換されないような条件で１２１℃の高温高圧水蒸気処理を行うことにより、水溶液中のＤＮＡは分解除去することが出来、さらに所要時間も８０分程度に短縮される。
また、従来のオートクレーブでは高圧容器内を１２１℃の水蒸気で均一に満たすために断続的に排気を行って空気を除去していたが、発明を実施するための形態として後記する高温高圧水蒸気処理装置を用いて１２１℃で８０分程度の処理を行えば、小さな容器に封入できるＤＮＡ溶液だけではなく、ＤＮＡが付着した器具やグローブ、紙タオル等の廃棄物、大量の廃液なども周囲に汚染を発生することなく処理することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＤＮＡを含む溶液を空気と密閉し１２１℃で２０分、４０分、および１２０分間処理した後の鋳型活性残存量を示す増幅曲線である。
【図２】ＤＮＡを含む水溶液を空気と密閉し１２１℃で２０分、４０分、および１２０分間処理した後の電気泳動図である。
【図３】ＤＮＡを含む水溶液を空気と密閉し１２１℃で４０分間処理した後の鋳型活性残存量を示す増幅曲線である。
【図４】ＤＮＡを含む水溶液を気相を飽和の水蒸気と置換する状態で１２１℃で４０分間処理した後の鋳型活性残存量を示す増幅曲線である。
【図５】ＤＮＡを含む水溶液を純窒素と密閉し１２１℃で４０分間処理した後の鋳型活性残存量を示す増幅曲線である。
【図６】ＤＮＡを含む水溶液を酸素を除去した空気と密閉し１２１℃で４０分間処理した後の鋳型活性残存量を示す増幅曲線である。
【図７】空気と密閉または気相が飽和の水蒸気と置換する状態で１２１℃で処理した場合の蒸留水・ＴＥバッファー・およびＰＣＲ後の反応液中に含まれるＤＮＡの鋳型活性残存量の経時変化である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
実際の鋳型活性を有するＤＮＡ断片を含む廃棄物は、小容量の容器に密閉できる形状のものには限定されない。したがって、より大きな容量で非脱気の高温高圧水蒸気処理を行うことが望ましい。具体的には、既存のオートクレーブ等の脱気式高温高圧水蒸気処理装置では無く、内部からの蒸気を外部に排出させず、かつ、一様に空気（または酸素）を含む水蒸気で高温高圧に処理する装置を利用し、以下の１〜５の手順に従って処理することにより、様々なフォーマットの廃棄物中に含まれる鋳型ＤＮＡを高効率かつ簡便・確実に分解することが可能になる。
（１）高温高圧水蒸気処理装置内に剥き出しの廃棄物や非密閉の容器に入れた廃液類を入れる。必要に応じてステンレス製のバスケットやバケツ、オートクレーブ用のプラスチック・バッグなどを利用してまとめて処理ができる。
（２）上述の鋳型ＤＮＡを含む廃棄物等と水と空気を処理室内に密閉し、排気を行わずにボイラーの加熱を行う。
（３）このとき処理室内では高温の水蒸気の層と低温の空気の層が生じることがないようにサーキュレーターまたは水蒸気と空気の対流を制御する内部の構造等によって温度と空気・水蒸気の組成の均一化をはかる。
（４）上記のようにして発生させた１２１℃の空気と水蒸気の混合気体中で廃棄物や廃液類を８０分程度処理する。
（５）室温まで冷却後に処理装置を開け、処理後の廃棄物や廃液類を取り出す。
【実施例】
【００１２】
以下本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ｐＵＣ１９プラスミドから「５’−ＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧ」と「５’−ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣ」の配列を有する一対のプライマーを用いて２,６８２塩基対のＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。８.７１×１０10コピー／μＬの濃度で当該ＤＮＡ鋳型を含む水溶液を得、この水溶液をモデルＰＣＲ廃棄物とした。
（２）モデルＰＣＲ廃棄物の水溶液を１０μＬずつ、ポリプロピレン製のマイクロチューブ（アシストチューブ型番７２．６９４．１００Ｓ）４本に分注し、エチレン−プロピレンゴムのＯ−リングを介して専用のネジ口式の蓋で密栓した。また、分注前後のチューブの重量を０.０１μｇの桁で測定し、正確な溶液の分注量を確認した。
（３）密閉状態のままオートクレーブ内に設置し、２０分、４０分、または１２０分間１２１℃で処理した。
（４）３５℃まで冷却後にチューブを取り出し、それぞれ重量を測定して初期サンプル量の２倍容になるようにＴＥバッファーで希釈した。これを３μＬ電気泳動にかけた。
（５）残りのサンプルをさらに１０倍容（トータル２０倍容）に希釈して、そのうち１μＬ×２を鋳型活性の定量に用いた。
（６）鋳型活性の定量は定量ＰＣＲにて、８４塩基対の領域を増幅するプライマー（５’−ＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡと５’−ＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＧ）およびその領域の増幅を検出するためのＴａｑＭａｎプローブ（５’ＦＡＭ−ＡＴＣＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＧＧ−３’ＴＡＭＲＡ）と、アプライドバイオシステムズ社の７９００ＨＴシーケンス・ディテクション・システムを使用して行った。
図１は定量ＰＣＲの増幅曲線で、Ｓ字の立ち上がりが生じるサイクルが左寄りで早いほどより多くの鋳型活性を検出したことになる。図中に示した通り、無処理のものに対して１２１℃で２０分、４０分と処理することにより鋳型活性が減少してゆくことがわかる。１２０分の処理の後には完全に鋳型活性が失われ、Ｓ字の増幅曲線は描かれなくなる。標準サンプルを用いて値付けした結果、１本のチューブに存在した鋳型の量はそれぞれ２０分処理後が５.７４×１０9コピー、４０分処理後が５.１８×１０2コピー、そして１２０分処理後がゼロコピーであった。以上の結果より、飽和水蒸気に曝されず、容器の中に密閉されたＤＮＡ溶液であっても、長時間処理することによりＰＣＲの鋳型活性を除去することができた。一方、同サンプルを電気泳動して臭化エチジウムで染色したものが図２である。第２レーンが無処理、第３レーンが２０分、第４レーンが４０分、第５レーンが１２０分処理後のサンプルであるが、ＤＮＡは１２１℃の処理で速やかに低分子化され、さらに臭化エチジウムで染色されない形状にまで変換されてゆくことが観察された。また、オートクレーブの底に残った水や排出された水蒸気から鋳型活性の増加は検出されなかった。
【００１３】
［比較例１］
（１）実施例１と同じモデルＰＣＲ廃棄物を使用した。
（２）モデルＰＣＲ廃棄物の水溶液を１０μＬずつ、ポリプロピレン製のマイクロチューブ（アシストチューブ型番７２．６９４．１００Ｓ）６本に分注し、エチレン−プロピレンゴムのＯ−リングを介して専用のネジ口式の蓋で密栓した。また、分注前後のチューブの重量を０.０１μｇの桁で測定し、正確な溶液の分注量を確認した。
（３）チューブ３本を密閉状態のまま、また、他のチューブ３本を蓋をせずに完全に気相が飽和の水蒸気と置換する状態でオートクレーブ内に設置し、４０分間１２１℃で処理した。
（４）３５℃まで冷却後にチューブを取り出し、それぞれ重量を測定して初期サンプル量の１００倍容になるようにＴＥバッファーで希釈した。そのうち１μＬ×２を鋳型活性の定量に用いた。
（５）鋳型活性の定量は実施例１と同様に行った。
図３はチューブ内に密閉して高温高圧の処理を行った結果の増幅曲線であるが、３本のチューブのうち２本では完全に鋳型活性が失われている。残りの１本では鋳型活性が残存しているが、チューブ１本当たり１.７４×１０4コピー程度の活性であることから、初期添加量に対して１０7分の１程度にまで鋳型活性が減少していることが分かる。一方、蓋をせずに飽和水蒸気で置換して処理した３本に関しては図４に示す通り全てのチューブで鋳型活性の残留が見られた。３本の平均値で５.９９×１０8コピー程度の活性が残ったことから、処理前の１０００分の１程度の活性が除去されずに残っている。なお、本検討を行うにあたり、実験室を汚染しないためにオートクレーブの排気は全て氷冷したプラスチック・バッグに回収して処分した。
【００１４】
［比較例２］
（１）実施例１と同じモデルＰＣＲ廃棄物を使用した。
（２）モデルＰＣＲ廃棄物の水溶液を１０μＬずつ、ポリプロピレン製のマイクロチューブ（アシストチューブ型番７２．６９４．１００Ｓ）６本に分注し、エチレン−プロピレンゴムのＯ−リングを介して専用のネジ口式の蓋で密栓した。また、分注前後のチューブの重量を０.０１μｇの桁で測定し、正確な溶液の分注量を確認した。
（３）チューブ３本の気相を純窒素で置換して密閉した。また他のチューブ３本の気相をエージレス（三菱ガス化学）を用いて酸素を除いた空気で置換して密閉した。オートクレーブ内に設置し、４０分間１２１℃で処理した。
（４）３５℃まで冷却後にチューブを取り出し、それぞれ重量を測定して初期サンプル量の１００倍容になるようにＴＥバッファーで希釈した。そのうち１μＬ×２を鋳型活性の定量に用いた。
（５）鋳型活性の定量は実施例１と同様に行った。
図５、図６はそれぞれ気相を純窒素、または、酸素を除いた空気と密閉して高温高圧処理を行った後のサンプルの増幅曲線であるが、いずれもしっかりとしたＳ字の曲線が観察され、比較例１の図３（酸素を含む空気と密閉した場合）と比較して、鋳型活性の除去が阻害されていることが分かる。以上の観察から、酸素が共存する状態での高温高圧水蒸気処理がＤＮＡの分解に有効であることが確認された。
【００１５】
［実施例２］
（１）実施例１と同じモデルＰＣＲ廃棄物を使用した。また、限外濾過のスピンカラムを利用してバッファーを蒸留水に置換したサンプルと、ＴＥバッファーに置換したサンプルを調整した。
（２）上記３種類の鋳型ＤＮＡを含む溶液を１０μＬずつ、それぞれ１３本のポリプロピレン製のマイクロチューブ（アシストチューブ型番７２．６９４．１００Ｓ）に分注し、エチレン−プロピレンゴムのＯ−リングを介して専用のネジ口式の蓋で密栓した。また、分注前後のチューブの重量を０.０１μｇの桁で測定し、正確な溶液の分注量を確認した。
（３）チューブを密閉状態のまま、または蓋をせずに完全に気相が飽和の水蒸気と置換する状態でオートクレーブ内に設置し、２０分、４０分、６０分、８０分、１００分、または１２０分間１２１℃で処理した。
（４）３５℃まで冷却後にチューブを取り出し、それぞれ重量を測定して初期サンプル量の１００倍容になるようにＴＥバッファーで希釈した。そのうち１μＬ×２を鋳型活性の定量に用いた。
（５）鋳型活性の定量は実施例１と同様に行った。
図７は蒸留水、ＴＥバッファー、およびＰＣＲ増幅した後のそのままのバッファー組成のサンプルを空気と密閉した状態（■）または蓋をせずに完全に気相が飽和の水蒸気と置換する状態（◆）で一定時間１２１℃で高温高圧処理した後の定量結果で、各処理時間に対するチューブ１本当たりの残存鋳型活性量（コピー数）を表している。鋳型ＤＮＡが含まれる溶液の組成によって分解処理に要する時間に違いはあるが、いずれも空気と密閉して処理したサンプルの方がより早くＤＮＡの鋳型活性を失っている。空気と密閉したものに関しては、長くとも８０分間の処理で鋳型活性の完全除去を達成することができた。
なお、上記実施例１、２では、高温高圧水蒸気処理は１２１℃で処理することで説明したが、１２１℃以上の温度でも同様の効果が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明によれば、汚染を出さずにＤＮＡ断片を高効率で分解することが可能であり、近年ＰＣＲ法の普及に伴い問題となっていた、ＰＣＲ鋳型活性を有するＤＮＡ断片を多量に含む医療・実験廃棄物等の処理に有効である。
【図１】
2014213224.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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