(57)【要約】【課題】簡便にアレルギー反応を検出する方法を提供する。【解決手段】ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応検出方法、および当該検出方法を用いる被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法。
【請求項２】
さらに、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標として、マウス好塩基球のＩｇＥに依存した活性化を検出する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記マウス好塩基球が能動感作又は受動感作して得られたものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載の方法を用いる被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法。
【請求項５】
被検物質とマウス好塩基球とを混合する手順と、
前記マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順と、
前記発現量が、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して低下している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されたと判定し、前記被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順と、を含む、
請求項４記載のアレルゲン活性の評価方法。
【請求項６】
被検物質と、マウス好塩基球と、マウス好塩基球に対するアレルゲンと、を混合する手順と、
前記マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順と、
前記発現量が、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して上昇している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されていないと判定し、前記被検物質が抗アレルギー活性を有すると評価する手順と、を含む、
請求項４記載の抗アレルギー活性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として、マウス好塩基球の、ＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法、及び被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー反応とは、抗原（アレルゲン）に接触することで免疫的に感作された結果、再び抗原（アレルゲン）に接触した際に、過剰な免疫反応が誘導されることである。免疫反応によって、例えば、肥満細胞や好塩基球が活性化され脱顆粒が生じ、ヒスタミンなどのケミカルメディエーターが放出され、眼や皮膚のかゆみ、鼻水などのアレルギー症状が引き起こされる。また、アレルギー症状が全身で起こり、気管支収縮などの激しい症状を呈したものを、アナフィラキシーと呼ぶ。
【０００３】
アレルギー反応を誘導するアレルゲンの検出や、アレルギー反応の抑制剤のスクリーニングには、例えば、げっ歯類などの実験動物を用いてin vivoにおけるアレルギー反応を指標とする方法や、感作された培養細胞における脱顆粒を指標とする方法など、様々な手法が用いられてきた。中でも、特定のアレルゲンに対する抗体を用いて、抗体との反応性を指標とする方法は、アレルゲンの検出に広く用いられてきた。
【０００４】
抗体との反応性を指標としてアレルゲンを検出する方法としては、例えば、特許文献１に、小麦に含まれるアレルゲンの一種であるリピドトランスファープロテインに結合する抗体やこの抗体を含有するアレルゲン検査用キットが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−９１３２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１のアレルゲン検査用キットなどのような抗原と抗体との結合性のみを指標とする方法では、実際にアレルギー反応が誘導されるかという点について評価することが困難である。一方、げっ歯類などの実験動物の個体そのものを用いる方法では、in vivoにおいてアレルギー反応を再現できるものの操作が煩雑であった。このため、アレルギー反応を容易に検出する方法が求められてきた。そこで、本開示は、簡便にアレルギー反応を検出する方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意検討した結果、アレルギー反応の中でもアナフィラキシーが、ＩｇＥの他、ＩｇＧによっても誘導されることから、好塩基球の細胞表面に発現するタンパク質においてＩｇＧ受容体を介した刺激によって変化する分子をスクリーニングした。その結果、ＣＤ２００Ｒ３が、ＩｇＧによる好塩基球の活性化によって発現低下することを新規に見出した。
【０００８】
ＣＤ２００Ｒ３の発現低下は、ＩｇＧ受容体への刺激の程度に依存的であった。また、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下は、ＩｇＧ依存的に活性化された好塩基球にのみ認められ、ＩｇＥ依存的に活性化された好塩基球には認められなかった。以上の知見から、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下をＩｇＧ依存的に活性化された好塩基球の指標として利用できることが明らかとなり、本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法を完成させた。
【０００９】
すなわち本開示は、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として、マウス好塩基球の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法を提供する。
さらに、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標として、マウス好塩基球の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に依存した活性化を併せて検出する方法が好ましい。
前記マウス好塩基球については、能動感作又は受動感作して得られたものを利用することができる。
【００１０】
また、本開示は、上述した好塩基球の活性化を検出する方法を用いる被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法をも提供する。
前記被検物質のアレルゲン活性の評価方法には、被検物質とマウス好塩基球とを混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して低下している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されたと判定し、前記被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順と、を含んでいてもよい。
【００１１】
前記抗アレルギー活性の評価方法には、被検物質と、マウス好塩基球と、マウス好塩基球に対するアレルゲンと、を混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して上昇している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されていないと判定し、前記被検物質が抗アレルギー活性を有すると評価する手順と、を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本開示により、ＩｇＧに依存した好塩基球の活性化を検出することを特徴とする、簡便なアレルギー反応の検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本開示に係るアレルゲン活性の評価方法の手順を示すフローチャートである。
【図２】アレルゲン活性の評価方法の変形例についての手順を示すフローチャートである。
【図３】本開示に係る抗アレルギー活性の評価方法の手順を示すフローチャートである。
【図４】好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化を示す図面代用グラフである。
【図５】ＩｇＧの量とＣＤ２００Ｒ３の発現量との関係を示す図面代用グラフである。
【図６】好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１とＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化を示す図面代用グラフである。
【図７】好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１とＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化を示す図面代用グラフである。
【図８】能動感作されたマウスの好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１とＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化を示す図面代用グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本開示を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１５】
１．ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法
本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出をすることを特徴とするアレルギー反応の検出方法では、マウス好塩基球の表面に存在するＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として用い、ＩｇＧに依存したマウス好塩基球の活性化の検出に基づきアレルギー反応を検出する。
【００１６】
アレルギー反応は、一つの経路として好塩基球の活性化によって誘導される。好塩基球の表面には、ＩｇＧのＦｃ部分に対して親和性を有するＩｇＧ受容体が存在する。ＩｇＧ受容体にＩｇＧが結合し、そのＩｇＧに抗原が結合するとＩｇＧ受容体同士が架橋され、好塩基球は活性化される。活性化された好塩基球においては、脱顆粒や血小板活性化因子（ＰＡＦ）等のケミカルメディエーターの放出が生じ、アレルギー反応が引き起こされる。
【００１７】
本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法において、好塩基球の活性化とは、最終的に脱顆粒やケミカルメディエーターが放出される状態となるまでの好塩基球における変化を指し、例えば、ＩｇＧ受容体同士の架橋などが含まれる。また、ＩｇＧ受容体を介した好塩基球の活性化が、ＩｇＧに依存した活性化である。
【００１８】
マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３は、マウスのＣｄ２００ｒ３遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ＧｅｎｅＩＤ: ７４６０３）にコードされているタンパク質である。ＣＤ２００Ｒ３については、スプライシングバリアントによるアイソフォームが複数知られているが、本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法において、ＣＤ２００Ｒ３は、細胞表面に発現するものであれば何れのアイソフォームであってもよく、特に限定されない。
【００１９】
本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法では、マウス好塩基球の表面に存在するＣＤ２００Ｒ３を検出し、その発現量を測定する。ＣＤ２００Ｒ３の検出には、抗体、アプタマー等を用いる公知のタンパク質の検出方法が利用でき、検出方法は特に限定されない。これらの抗体やアプタマーには、検出のための蛍光物質、放射性同位体又は酵素などの標識が施されていてもよい。また、ＣＤ２００Ｒ３に対する抗体やアプタマーは、常法に従い作製されたものであってもよく、市販品であってもよい。なお、標識された二次抗体を利用して、ＣＤ２００Ｒ３に対する抗体やアプタマーを検出してもよい。
【００２０】
ＣＤ２００Ｒ３の検出には、ＣＤ２００Ｒ３に対する抗体を用いた免疫学的手法によって検出することが可能であり、例えば、フローサイトメトリー法や免疫蛍光顕微鏡法などの公知の方法が利用できる。例えば、マウスの血液など、試料に好塩基球以外の細胞が含まれる状態の場合、フローサイトメータを利用することが好ましい。フローサイトメータを用いる場合、好塩基球以外の細胞が試料に含まれていても、ＣＤ４９ｂなどの一般的な好塩基球のマーカーに対する抗体を用いることで、血液から好塩基球を選別し、選別された細胞（好塩基球）におけるＣＤ２００Ｒ３を検出することができる。また、ＣＤ２００Ｒ３の検出には、アプタマーを用いて検出することも可能である。
【００２１】
フローサイトメトリーや免疫蛍光顕微鏡法などによって、検出されたＣＤ２００Ｒ３については、検出のために用いた抗体等に結合した蛍光物質、放射性同位体又は酵素等の標識物に基づくシグナルの強度から、ＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定することができる。すなわちシグナル強度を比較することで、ＣＤ２００Ｒ３発現量について上昇あるいは低下といった量的な変化を捉えることが可能となる。
【００２２】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法では、シグナル強度等として測定されるＣＤ２００Ｒ３の発現量が、活性化されていない好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３のシグナル強度（発現量）に対して低い場合に、ＣＤ２００Ｒ３の発現は低下したと判定し、その好塩基球が活性化されていると判定する。
【００２３】
活性化されていない好塩基球とは、例えば、抗原や抗体によって感作されていない状態の好塩基球や、感作された好塩基球の抗原と接触される前の状態のものなどである。このような活性化されていない好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量を基準として、基準より発現量が低い好塩基球について、発現低下が見られたと判定する。
【００２４】
基準となる範囲や、基準と比較してＣＤ２００Ｒ３の発現低下と判定する範囲は、マウスの系統や感作方法、ＣＤ２００Ｒ３の検出に用いる抗体や装置等の条件に合わせ適宜設定できる。基準となる範囲については、例えば、活性化されていない好塩基球において測定されたシグナル強度（発現量）の中央値を中心に±６５％の範囲としてもよい。また、例えばフローサイトメトリーを用いてシグナル強度を測定する場合には、従来のフローサイトメータで使用される領域を区切るため領域設定の技術を用いて、基準となる範囲を設定することもできる。
【００２５】
基準となる範囲に対して、発現低下と判定されるＣＤ２００Ｒ３のシグナル強度についても、マウスの系統や感作方法、ＣＤ２００Ｒ３の検出に用いる抗体や装置等の条件に合わせて適宜設定できる。例えば、ＣＤ２００Ｒ３のシグナル強度（発現量）が、基準となる範囲の測定値未満の場合に、その好塩基球において、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られたと判定してもよい。発現低下と判定される範囲は、より好ましくは、基準となる範囲の中央値の２〜３５％である。なお、中央値とは、好塩基球について測定されたＣＤ２００Ｒ３のシグナル強度（測定値）の分布において、昇順又は降順に並べたときの中央に位置する値を指す。測定値の個数が奇数の場合は、中央の測定値を中央値とするが、偶数のときは中央の２つの測定値の平均を中央値とする。また、後述するＣＤ２００Ｒ１の発現量に関する中央値についても同様である。
【００２６】
また、フローサイトメータ等を用いて、試料中に含まれる複数の好塩基球の各々についてＣＤ２００Ｒ３のシグナル強度（発現量）を測定する場合には、例えば、好塩基球全体の１１％以上に上述した発現低下が見られたとき、この試料に含まれる好塩基球においてＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られたと判定することが好ましい。
【００２７】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、好塩基球の活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法で用いられるマウスの系統は特に限定されない。マウスとしては、例えば、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統等のマウスが挙げられる。
【００２８】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法では、上述したマウス好塩基球のＣＤ２００Ｒ３の発現量について発現が低下しているか判定し、発現が低下していると判定された場合には、この発現低下を指標として、その好塩基球のＩｇＧ依存性の活性化を検出する。
【００２９】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法では、上述したようにＣＤ２００Ｒ３の発現低下からＩｇＧに依存的な好塩基球の活性化を検出し、アレルギー反応を検出する。このため、ＥＬＩＳＡ法などを利用した抗原と抗体の結合の反応性のみ指標とする方法と異なり、例えば、抗原によってアレルギー反応が誘導されているか調べることができる。また、抗アレルギー剤がアレルギー反応を抑制しているか、調べることができる。
【００３０】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法は、例えば、食品などに含まれるアレルゲンを検出する方法に利用することができる。被検物質を感作された好塩基球と混合して、ＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化から、試料中にアレルゲンが含まれるか判定する。
【００３１】
なお、本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とするＩｇＧに依存した好塩基球の活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法については、好塩基球の活性化の検出を行うための、好塩基球感作用の抗体と抗ＣＤ２００Ｒ３抗体とを含む、検出キットとして構成することもできる。
【００３２】
また、本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法は、抗アレルギー剤のスクリーニングに利用することもできる。例えば、被検物資、アレルゲン及び感作された好塩基球を混合し、ＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化から、被検物質によってアレルギー反応が抑制されたか判定する。
【００３３】
マウスにおけるアナフィラキシーの発症と、ヒトにおけるアナフィラキシーの発症とは、共通する因子が多く存在するとされている（参考文献３：川崎医療福祉学会誌 (2007)，17(1): 71-79）。このため、マウスの好塩基球を利用した抗アレルギー剤のスクリーニングは、ヒトのアレルギーに対する抑制剤のスクリーニングとしても有効である。
【００３４】
現在、ＣＤ２００Ｒ３はマウスにのみ同定されているが、ヒトを含めた他の哺乳類でホモログが存在する場合には、上述した本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標としてマウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出を特徴とするアレルギーの検出方法は、他の哺乳類の好塩基球についても適用できる。
【００３５】
２．マウス好塩基球の感作
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法で用いる好塩基球は、感作されたものが好ましく、好塩基球の感作は、能動感作であってもよく、受動感作であってもよい。
【００３６】
能動感作は、常法に従って行うことができる。例えば、卵白アルブミンやα−カゼインなどの抗原を、必要に応じてアジュバンドと共に適当な投与間隔で、マウスに数回投与することで能動感作を成立させることができる。なお、能動感作によって、感作されたマウスにおいて、抗原に対するＩｇＧ抗体が産生される場合もあれば、ＩｇＥ抗体が産生される場合もあり、その両方が産生される場合もある。
【００３７】
本開示に係るＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出方法において、抗原には小麦、卵、牛乳等の食物に含まれるタンパク質や、花粉、ダニなどに含まれるタンパク質、その他、核酸など、抗体によって認識されるものであれば、特に限定されない。
【００３８】
受動感作についても、常法に従って行うことができる。例えば、卵白アルブミンやα−カゼインなどの抗原に対するＩｇＧを含む抗体や抗血清を作製し、これをマウスに投与して感作させる。また、抗血清をマウスの好塩基球を含む試料に添加して、好塩基球を感作させてもよい。なお、抗血清の作製方法は、通常行われている一般的な方法で行うことができる。また、ＩｇＧとＩｇＥの温度に対する感受性の違いを利用して、抗血清を熱処理して、ＩｇＥを不活化してもよい。ＩｇＥを不活化させることで、ＩｇＧ受容体を介した刺激のみを好塩基球に誘発できる。
【００３９】
なお、上述した感作の期間におけるマウスの飼育において、飼料は感作に使用する抗原、又は抗体に対する抗原の含有率が低い、又は含有されていないものであることが好ましい。
【００４０】
３．ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＥに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法においては、上述したＩｇＧに依存した活性化の検出に加え、マウス好塩基球のＩｇＥに依存した活性化の検出を行うことが好ましい。
【００４１】
好塩基球の表面には、ＩｇＥのＦｃ部分に対して高い親和性を有するＩｇＥ受容体が存在する。ＩｇＥ受容体にＩｇＥが結合し、そのＩｇＥに抗原が結合するとＩｇＥ受容体同士が架橋され、好塩基球は活性化される。このＩｇＥ受容体を介した好塩基球の活性化が、ＩｇＥに依存した活性化である。
【００４２】
ＩｇＥ受容体を介してマウス好塩基球が活性化されると、マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ１の発現が上昇することが知られている（参考文献１：Clinical and Experimental Allergy (2009) 39:361-369.）。ＣＤ２００Ｒ１は、マウスのＣｄ２００ｒ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｇｅｎｅ ＩＤ: ５７７８１）にコードされているタンパク質である。
【００４３】
マウス好塩基球に発現するＣＤ２００Ｒ１の発現量の測定法は、上述したＣＤ２００Ｒ３に対して用いる方法と同様である。また、マウス好塩基球の感作についても、上述した方法を用いて行うことができる。なお、ＩｇＧの精製のためのアフィニティーカラムなどを利用して、抗血清からＩｇＧを取り除くことで、ＩｇＥ受容体を介した刺激のみを好塩基球に誘発することも可能である。
【００４４】
ＣＤ２００Ｒ１の発現量の上昇は、活性化されていない好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１の発現量を基準とすることで求めることができる。活性化されていない好塩基球とは、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下の判定と同様に、例えば、感作されていない好塩基球や、感作された好塩基球の抗原に接触する前の状態のものである。この活性化されていない好塩基球のＣＤ２００Ｒ１の発現量を基準として、基準より発現量の多い好塩基球について、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇が見られたと判定し、このＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標として、好塩基球のＩｇＥに依存した活性化を検出する。
【００４５】
基準となるＣＤ２００Ｒ１の発現量の数値範囲は、マウスの系統、感作方法、ＣＤ２００Ｒ１の発現量の測定方法などの条件に合わせて適宜設定できる。例えば、活性化されていない好塩基球において測定されたシグナル強度（発現量）の中央値を中心に±５５％の範囲としてもよい。また、基準となる数値範囲に対して、例えば、１５５％以上、より好ましくは、１６０〜８３０％の範囲に上昇していた場合に、その好塩基球において、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇が見られたと判定することが好ましい。また、フローサイトメータ等を用いて、試料中の複数の好塩基球の各々についてＣＤ２００Ｒ１の発現量を測定する場合には、例えば、試料に含まれる好塩基球全体の６％以上に発現上昇が見られたときに、試料中の好塩基球は活性化されたと判定することが好ましい。
【００４６】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法においては、上述したＣＤ２００Ｒ１も活性化のマーカーとして用いることで、好塩基球についてＩｇＧに依存した活性化とＩｇＥに依存した活性化の両方を検出することができる。
【００４７】
これまで、ＩｇＧに依存したアレルギー反応のマーカーとしては、好中球におけるＦｃγＲIIIが知られている（参考文献２：Proc Natl Acad Sci USA (2011), 108 (30): 12413-12418.）。そのため、ＩｇＧ依存性のアレルギー反応とＩｇＥ依存性のアレルギー反応の両方を検出するためには、好中球と好塩基球の２種類の細胞を用いる必要があり、作業が煩雑であった。本開示に係るマウス好塩基球の活性化の検出方法においては、好塩基球のみでＩｇＧ依存性のアレルギー反応とＩｇＥ依存性のアレルギー反応を検出することができるため、アレルギー反応の検出がより簡便となる。
【００４８】
本開示に係る、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法においては、好塩基球についてＩｇＧに依存した活性化とＩｇＥに依存した活性化の両方を、各々の指標で検出できる。このため、例えば、能動感作によって感作されたマウスにおいて、ＩｇＧによる感作が成立しているか、ＩｇＥによる感作が成立しているか、又は両方による感作が成立しているか、調べることが可能となる。このため、後述するアレルゲン活性の評価方法や抗アレルギー活性の評価方法等において、予め感作の状態が把握された好塩基球を用いることも可能となる。
【００４９】
４．ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標とした、アレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法
本開示に係る好塩基球の活性化の検出方法を利用した具体例として、アレルゲン活性の評価方法と抗アレルギー活性の評価方法について、以下に説明する。
【００５０】
（１）アレルゲン活性の評価方法
図１は、本開示に係るアレルゲン活性の評価方法のフローチャートである。アレルゲン活性の評価方法には、被検物質の混合手順Ｓ１、ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２及び被検物質の評価手順Ｓ３が含まれる。各手順について、フローチャートに則して説明する。
【００５１】
被検物質の混合手順Ｓ１は、予め感作された好塩基球と被検物質とを混合する手順である。このとき、被検物質がアレルゲンであれば、被検物質は、好塩基球の表面にＩｇＧ受容体を介して存在するＩｇＧと結合する。この時、被検物質とＩｇＧの結合を促進するために、混合物を３７℃で１〜３時間温めることが好ましく、３７℃で２時間温めることが特に好ましい。なお、マウス好塩基球については、能動感作されたものであっても、受動感作されたものであってもよい。また、好塩基球を含む試料の状態は特に限定されず、全血の状態で本手順Ｓ１に用いてもよい。
【００５２】
ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２は、マウス好塩基球のＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順である。本手順Ｓ２では、被検物質の混合手順Ｓ１で調製された混合物内の好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する。ＣＤ２００Ｒ３の測定方法は、上述した方法を用いることができる。
【００５３】
被検物質の評価手順Ｓ３は、被検物質と混合された好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量が、被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して低下している場合に、このＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られたマウス好塩基球が活性化されたと判定し、被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順である。
【００５４】
本手順Ｓ３では、ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２によって測定されたマウス好塩基球のＣＤ２００Ｒ３の発現量について、被検物質と混合されていないマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量と比較する。被検物質と混合されていないマウス好塩基球とは、例えば感作されたマウス好塩基球に被検物質の代わりにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などのアレルゲン活性を有していない代替品が加えられたものを指す。
【００５５】
本開示に係るアレルゲン活性の評価方法においては、被検物質と混合されていない好塩基球の細胞表面におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量が基準となる。基準となる発現量の数値範囲は、上述した活性化されていない好塩基球における基準値の設定と同様に設定することができる。基準となる数値範囲は、例えば、中央値±６５％である。
【００５６】
本手順Ｓ３においては、ＣＤ２００Ｒ３について基準と比較した結果、ＣＤ２００Ｒ３が発現低下している場合に、被検物質と混合されたマウス好塩基球がＩｇＧ依存的に活性化されたと判定する。被検物質と混合されたマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量についての判定は、上述した発現低下の判定と同様に行うことができる。マウス好塩基球においてＩｇＧ依存的な活性化が見られた場合、マウス好塩基球と混合することでＩｇＧ依存的な活性化を誘導した被検物質について、アレルゲン活性を有すると評価する。また、複数の被検物質についてＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定した場合には、各々の被検物質と混合されたマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量を比較することによって、各被検物質についてアレルゲン活性の強度を評価することもできる。
【００５７】
被検物質が、例えば食品など複数の成分を含有する物であれば、マウス好塩基球が活性化されたと判定された場合、被検物質にアレルゲンが含まれていることを示している。このため、本開示に係るアレルゲン活性の評価方法は、被検物質に含まれるアレルゲンの検出方法としても利用できる。
【００５８】
図２に、本開示に係るアレルゲン活性の評価方法の変形例についてのフローチャートを示す。なお、本開示に係るアレルゲン活性の評価方法において、被検物質の混合手順Ｓ１の前にマウス好塩基球の感作手順が含まれていてもよい。感作手順では、マウス好塩基球について所望のアレルゲンによってアレルギー反応の誘導を可能とするために、上述したマウス好塩基球の感作方法によってマウス好塩基球を感作する。
【００５９】
図２に示すように、本開示に係るアレルゲン活性の評価方法においては、ＣＤ２００Ｒ１の測定手順Ｓ２−２が含まれていることが好ましい。本手順Ｓ２−２が含まれていることにより、被検物質について、アレルギー反応におけるＩｇＧ依存的な活性とＩｇＥ依存的な活性の両方に対するアレルゲン活性を評価できる。
【００６０】
本手順Ｓ２−２では、混合物に含まれる好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ１の発現量を測定する。測定方法は、上述した方法を用いることができる。なお、本手順Ｓ２−２は、ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２−１より前に行ってもよく、例えばフローサイトメータを利用する場合などは、ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２−１と同時に行うこともできる。
【００６１】
（２）抗アレルギー活性の評価方法
図３は、本開示に係る抗アレルギー活性の評価方法のフローチャートである。抗アレルギー活性の評価方法には、被検物質とアレルゲンとの混合手順Ｓ１、ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２、被検物質の評価手順Ｓ３の各手順が含まれる。このうち、（１）において述べたＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２以外の、被検物質とアレルゲンとの混合手順Ｓ１と被検物質の評価手順Ｓ３について説明する。
【００６２】
被検物質とアレルゲンとの混合手順Ｓ１は、被検物質とマウス好塩基球とマウス好塩基球に対するアレルゲンとを混合する手順である。本手順Ｓ１では、予め感作されたマウス好塩基球と、被検物質及びアレルゲンを混合する。この時、アレルゲンとＩｇＧとの結合を促進するために、混合物を３７℃で１〜３時間温めることが好ましく、３７℃で２時間温めることが特に好ましい。なお、好塩基球については、能動感作されたものであっても、受動感作されたものであってもよい。また、好塩基球を含む試料の状態は特に限定されず、全血の状態で本手順Ｓ１に用いてもよい。
【００６３】
被検物質の評価手順Ｓ３は、被検物質とアレルゲンと混合されたマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量が、被検物質と混合せずアレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して上昇している場合に、この被検物質及びアレルゲンと混合されたマウス好塩基球が活性化されていないと判定し、被検物質が抗アレルギー活性を有すると評価する手順である。
【００６４】
本手順Ｓ３では、ＣＤ２００Ｒ３の測定手順Ｓ２において測定されたマウス好塩基球のＣＤ２００Ｒ３の発現量について、被検物質を除いてアレルゲンと混合されたマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量と比較する。被検物質を除いてアレルゲンと混合されたマウス好塩基球とは、例えば、被検物質の代わりにＰＢＳなどの抗アレルギー活性を有していない代替物とアレルゲンと混合されたものを指す。
【００６５】
本開示に係る抗アレルギー活性の評価方法においては、被検物質を除いてアレルゲンと混合された好塩基球の細胞表面におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量が基準となる。基準となる発現量の数値範囲は、上述した活性化されていない好塩基球における基準値の設定と同様に設定することができる。基準となる数値範囲は、例えば、中央値±６５％である。
【００６６】
本手順Ｓ３においては、ＣＤ２００Ｒ３について基準と比較した結果、ＣＤ２００Ｒ３の発現が上昇している場合に、被検物質と混合されたマウス好塩基球についてＩｇＧ依存的に活性化されていないと判定する。被検物質と混合されたマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量についての判定は、上述した発現低下の判定と同様に行うことができる。例えば、ＣＤ２００Ｒ３の発現量が基準となる範囲を超えたときに、そのＣＤ２００Ｒ３は、発現が上昇していると判定することができる。より好ましくは、基準となる範囲の中央値の３〜５０倍となったときにＣＤ２００Ｒ３の発現上昇と判定する。
【００６７】
マウス好塩基球においてＩｇＧ依存的な活性化が見られなかった場合、マウス好塩基球と混合することでＩｇＧ依存的な活性化を阻害した被検物質について、抗アレルギー活性を有すると評価する。また、複数の被検物質についてＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定した場合には、各々の被検物質と混合されたマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量を比較することによって、各被検物質について抗アレルギー活性の強度を評価することができる。
【００６８】
被検物質が、例えば食品など複数の成分を含有する物であれば、マウス好塩基球の活性化が抑制されたと判定された場合、被検物質に抗アレルギー活性を有する成分が含まれていることを示している。このため、本開示に係る抗アレルギー活性の評価方法は、被検物質に含まれる抗アレルギー活性物質の検出方法としても利用できる。
【００６９】
なお、本開示に係る抗アレルギー活性の評価方法においては、図２に示すアレルゲン活性の評価方法の変形例と同様に、アレルギー反応におけるＩｇＧ依存性の活性化とＩｇＥ依存性の活性化の両方に対する被検物質の抗アレルギー活性を評価するために、ＣＤ２００Ｒ１の測定手順Ｓ２−２が含まれていることが好ましい。なお、被検物質とアレルゲンとの混合手順Ｓ１の前にマウス好塩基球の感作手順が含まれていてもよい。
【００７０】
なお、本開示に係る技術は、以下の構成を採用することもできる。
（１）ＣＤ２００Ｒ３の発現低下を指標として、マウス好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することを特徴とするアレルギー反応の検出方法。
前記発現低下とは、活性化されていないマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量を基準とし、該基準未満のこととした場合、
前記基準は、前記活性化されていないマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量の中央値±６５％が好適であることが好ましい。
前記発現低下は、前記中央値の４５％未満が好適であり、２〜３５％がより好適である。
前記発現低下は、前記マウス好塩基球の１１％以上で発現低下が見られることとすることが好ましい。
（２）さらに、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標として、マウス好塩基球のＩｇＥに依存した活性化を検出する、上記（１）記載の方法。
前記発現上昇とは、活性化されていないマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１の発現量を基準とし、該基準を超えることとした場合、
前記基準は、前記活性化されていないマウス好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１の発現量の中央値±５５％が好適である。
前記発現上昇は、前記基準の１５５％以上の範囲とすることが好適であり、１６０〜８３０％の範囲とすることがより好適である。
前記発現上昇は、前記マウス好塩基球の６％以上で発現上昇が見られることとすることが好ましい。
（３）前記マウス好塩基球が能動感作又は受動感作して得られたものである、上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）上記（１）から（３）の何れかに記載の方法を用いる被検物質のアレルゲン活性又は抗アレルギー活性の評価方法。
（５）被検物質とマウス好塩基球とを混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して低下している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されたと判定し、前記被検物質がアレルゲン活性を有すると評価する手順と、を含む、上記（４）記載のアレルゲン活性の評価方法。
前記低下とは、前記被検物質と混合しないときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を基準とし、該基準未満のこととした場合、
前記基準は、前記ＣＤ２００Ｒ３の発現量の中央値±６５％が好適である。
前記低下は、前記中央値の３５％未満が好適であり、２〜３５％がより好適である。
前記低下は、前記マウス好塩基球の１１％以上で前記発現量の低下が見られることとすることが好ましい。
（６）被検物質と、マウス好塩基球と、マウス好塩基球に対するアレルゲンと、を混合する手順と、前記マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定する手順と、前記発現量が、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量に比して上昇している場合に、前記マウス好塩基球が活性化されていないと判定し、前記被検物質が抗アレルギー活性を有すると評価する手順と、を含む、（４）記載の抗アレルギー活性の評価方法。
前記上昇とは、前記被検物質と混合せず前記アレルゲンと混合するときのマウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を基準とし、該基準を超えることとした場合、
前記基準は、前記ＣＤ２００Ｒ３の発現量の中央値±６５％が好適である。
前記上昇は、前記中央値の１．６５倍を超えることが好適であり、３〜５０倍がより好適である。
前記上昇は、前記マウス好塩基球の１１％以上で前記発現量の上昇が見られることとすることが好ましい。
【実施例】
【００７１】
＜試験例１＞
１．マウス好塩基球のＩｇＧ依存的活性化におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化
マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３について、ＩｇＧ受容体を介したマウス好塩基球への刺激により、発現量に変化が生じるか検証した。
【００７２】
［材料と方法］
本試験例に使用するマウスの血液は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）から得た。市販の６週齢のマウス（日本クレア社）を用意し、乳原料を含まない飼料（ＭＲストック、日本農業工業社）を用いて飼育した。１４週齢のマウスおいて、全身麻酔下で後大静脈より血液を採取した。採取した血液に、抗マウスＦｃγＲIII／II抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１μｇ／ｍｌになるように添加して好塩基球を刺激し、試験群１とした。また、対照群１には、抗マウスＦｃγＲIII／II抗体溶液の代わりにＰＢＳを添加した。試験群１及び対照群１を３７℃で１時間保温し、その後、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加して、氷上で１０分間静置した。
【００７３】
試験群１及び対照群１に含まれる細胞に対し、１０％ウマ血清でブロッキングした後、ＡＰＣ標識‐抗マウスＣＤ４９ｂ抗体、ＰＥ標識‐抗マウスＦｃεＲＩα抗体、ＦＩＴＣ標識‐抗マウスＣＤ２００Ｒ３抗体の各抗体を用いて、各々のタンパク質を標識した。なお、ＣＤ４９ｂとＦｃεＲＩαとは、共に好塩基球のマーカーとして一般的なタンパク質である。試験群１及び対照群１の血液について溶血処理を行い、血液から赤血球を除去した後、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製））を用いて測定した。
【００７４】
［結果］
本試験例の結果を図４Ａ〜Ｃに示す。図４Ａ〜Ｃは、フローサイトメータによる測定結果を示すサイトグラムであり、右側のパネルは試験群を、左側のパネルは試験群は対照群を示す。図４Ａの横軸は、細胞の前方散乱光（ＦＳＣ）の強度であり、縦軸は、側方散乱光（ＳＳＣ）の強度である。ＦＳＣの強度は細胞の大きさに関連し、ＳＳＣの強度は細胞内部の構造に関連する。ＦＳＣとＳＳＣの測定結果に基づいて、図４Ａ中Ｐ１で示される領域を、好塩基球が含まれる領域とした。
【００７５】
次に、好塩基球のマーカーに基づいて、ＦＳＣとＳＳＣに基づいて選別された細胞から好塩基球を選別した。図４Ｂの横軸は、抗ＦｃεＲＩα抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗ＣＤ４９ｂ抗体に由来する蛍光強度である。ＦｃεＲＩαとＣＤ４９ｂの染色について陽性と判断された細胞（図４Ｂ、Ｐ２参照。）を好塩基球と判定した。
【００７６】
図４Ｃは、上記の手順によって好塩基球と判別された細胞におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量を示す。図４Ｃの横軸は、抗ＦｃεＲＩα抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗ＣＤ２００Ｒ３抗体に由来する蛍光強度である。図４Ｃに示すように、試験群では、ＣＤ２００Ｒ３の発現量の低下が見られた。本試験例においては、図４Ｃ中Ｐ３で示す領域に含まれる好塩基球を、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下したものとする。Ｐ３の範囲は、対照群におけるＣＤ２００Ｒ３由来の蛍光強度の中央値に対して、２〜３５％にあたる。一方、対照群１においては、ＣＤ２００Ｒ３の発現量の低下が見られた細胞数（Ｐ３に含まれる細胞数）は、試験群１に比べ少なかった。表１に、領域Ｐ３内の好塩基球の割合を示す。
【００７７】
【表１】
2014071040.tif 000002
【００７８】
表１に示すように、試験群１の好塩基球の９８％でＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られるのに対し、対照群１では、好塩基球の１０％にしかＣＤ２００Ｒ３の発現低下は見られなかった。本試験例の結果から、ＩｇＧ受容体を介したマウス好塩基球への刺激によって、ＣＤ２００Ｒ３の発現が低下することが示された。
【００７９】
＜試験例２＞
２．マウス好塩基球における ＩｇＧによるＣＤ２００Ｒ３の発現量低下の誘導
好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下が、ＩｇＧにより誘導されるか検証した。
【００８０】
［材料と方法］
本試験例で用いるα−カゼイン抗血清の作製方法について、簡単に説明する。牛乳成分除去食で飼育したＢＡＬＢ／ｃ（メス、６週齢）に、α−カゼイン（ＳＩＧＭＡ社）をフロイント系アジュバント（初回はフロイント完全アジュバント、２度目以降はフロイント不完全アジュバントを使用）と共に２週間間隔で腹腔内投与した。３度目の投与から１週間後に、全身麻酔下で心臓より血液を採取した。血液から血清を調製し、α−カゼイン抗血清とした。
【００８１】
調製したα−カゼイン抗血清をＰＢＳで１０倍希釈し、同体積のＰｒｏｔｅｉｎ G Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、あるいはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＳＩＧＭＡ社）と共に室温で３時間穏やかに転倒混合した。混合後の抗血清から遠心分離により上清を回収した。得られた抗血清のうち、ＩｇＧへの結合能を有するＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦで処理した抗血清をＩｇＧ除去抗血清とし、ＩｇＧへの結合能を有していないＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂで処理した抗血清をコントロール抗血清とした。
【００８２】
本試験例に使用するマウスの血液は、試験例１と同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）から得た。試験例１と同様に、市販の６週齢のマウスを用意し、乳原料を含まない飼料を用いて飼育した。７週齢のマウスについて、全身麻酔下で後大静脈より血液を採取した。血液に対し１／３０、１／１００、１／３００、１／１０００、又は１／３０００量のＩｇＧ除去抗血清を添加して好塩基球を感作し、これらを試験群２とした。また、コントロール抗血清についても、前述の試験群と等量を血液に添加して好塩基球を感作し、これらを対照群２とした。
【００８３】
α−カゼイン抗血清と混合された後の試験群２及び対照群２を、３７℃で９０分間保温した。その後、α−カゼインを１μｇ／ｍｌになるように添加し、さらに２時間、３７℃で保温した。２ｍＭＥＤＴＡを添加して、氷上で１０分間放置した後、試験群２及び対照群２に含まれる細胞に対し、１０％ウマ血清でブロッキングを行った。その後、ＡＰＣ標識‐抗マウスＩｇＥ抗体、ＰｅｒＣＰ標識‐抗マウスＣＤ４９ｂ抗体、ＦＩＴＣ標識‐抗マウスＣＤ２００Ｒ３抗体により、試験群２及び対照群２に含まれる各々のタンパク質を標識した。溶血処理により赤血球を除去した試験群２及び対照群２について、フローサイトメトリーを行った。試験例１と同様に好塩基球の選別を行い、好塩基球について、試験例１と同様にＣＤ２００Ｒ３の発現量が低下していると判定された細胞の割合を算出した。
【００８４】
［結果］
本試験例の結果を図５に示す。図５の横軸は、α−カゼイン抗血清の濃度であり、縦軸は、ＣＤ２００Ｒ３の発現量の減少が見られた細胞の割合である。図５に示すように、試験群２では、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた細胞は、抗血清の濃度にかかわらず少なかった。一方、対照群２では、抗血清の濃度が高い場合には、ほぼ全ての好塩基球についてＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られ、発現低下が見られた好塩基球の割合は、抗血清の濃度に依存的であった。表２に、抗血清の各濃度におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた好塩基球の割合を示す。
【００８５】
【表２】
2014071040.tif 000003
【００８６】
表２に示すように、ＩｇＧ除去抗血清で処理された試験群２の好塩基球においては、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下がみられた細胞の割合は１０％未満であった。一方、ＩｇＧが除去されていない抗血清で処理された対照群２において、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた好塩基球は、抗血清の希釈倍数が３０倍と１００倍では９９％、３００倍では４９％、１０００倍と３０００倍では、それぞれ５％及び９％であった。
【００８７】
本試験例に示すように、抗血清中のＩｇＧを除去することによりＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られる好塩基球の割合が低下したことから、好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下は、ＩｇＧに依存することが示された。また、対照群２において、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られる好塩基球の割合が抗血清の濃度に依存して低下したことからも、好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下は、ＩｇＧに依存することが示された。
【００８８】
本試験例の結果から、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下の検出が、ＩｇＧに依存した好塩基球の活性化の指標として有効であることが示された。
【００８９】
＜試験例３＞
３．マウス好塩基球のＩｇＥ依存的活性化におけるＣＤ２００Ｒ３の発現量の変化
マウス好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３について、ＩｇＥ受容体を介したマウス好塩基球への刺激によっても、発現量に変化が生じるか検証した。
【００９０】
［材料と方法］
本試験例では、上述した試験例２において作製したα‐カゼイン抗血清を用いた。また、ＩｇＥ不活性化抗血清として、α−カゼイン抗血清を５６℃で６時間保温したものを用意した。
【００９１】
本試験例に使用するマウスの血液は、試験例１、２と同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）から得た。市販の６週齢のマウスを用意し、乳原料を含まない飼料を用いて飼育した。１７週齢のマウスについて、全身麻酔下で後大静脈より血液を採取した。得られた血液に対し、１／１０量のα−カゼイン抗血清、あるいはＩｇＥ不活性化抗血清を添加して好塩基球を感作した。本試験例においては、ＩｇＥ不活性化処理が施されていない抗血清が加えられた血液を試験群３とし、ＩｇＥ不活性化抗血清が加えられた血液を対照群３とした。
【００９２】
試験群３及び対照群３を３７℃で９０分間保温し、その後、α−カゼインを１０μｇ／ｍｌになるように添加し、さらに２時間保温した。試験群３及び対照群３に２ｍＭＥＤＴＡを添加して、氷上で１０分間放置した後、１０％ウマ血清でブロッキング処理を行った。その後、ＡＰＣ標識−抗マウスＩｇＥ抗体、ＰｅｒＣＰ標識−抗マウスＣＤ４９ｂ抗体、ＦＩＴＣ標識−抗マウスＣＤ２００Ｒ３抗体、ＰＥ標識−抗マウスＣＤ２００Ｒ１抗体により、試験群３及び対照群３に含まれる各々のタンパク質を標識した。溶血処理により赤血球を除去した試験群３及び対照群３について、フローサイトメトリーを行った。試験例１と同様に、ＦＳＣとＳＳＣの強度、並びに抗ＣＤ４９ｂ抗体と抗ＩｇＥ抗体に由来する蛍光強度により好塩基球を選別した。好塩基球と判定された細胞について、ＣＤ２００Ｒ１とＣＤ２００Ｒ３の発現強度を測定し、試験例１や後述する試験例５と同様に各々の発現量が変化した細胞の割合を算出した。
【００９３】
［結果］
本試験例の結果を図６に示す。図６Ａは、試験群３及び対照群３においてＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた好塩基球の割合を示す。一方、図６Ｂは、試験群３及び対照群３においてＣＤ２００Ｒ１の発現上昇が見られた好塩基球の割合を示す。また、図６Ａ及び図６Ｂの各々のグラフに示す好塩基球の割合（％）を、表３にまとめた。
【００９４】
【表３】
2014071040.tif 000004
【００９５】
図６Ａ及び表３に示すように、血液をα−カゼイン抗血清で受動感作させた後に、α−カゼインを添加した場合、ほぼ全ての好塩基球について、好塩基球表面のＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた。また、この好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下は、抗血清に対してＩｇＥ不活性化処理を行った場合（対照群３）であっても、生じることが確認された。また、図６Ｂ及び表３に示すように、好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ１についても、血液を抗α−カゼイン抗血清で受動感作させた後に、α−カゼインを添加した場合、ＩｇＥ不活化処理を施した場合（対照群３）に比べ、発現が上昇することが確認された。これらの結果から、好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下は、ＩｇＥに依存した好塩基球の活性化では誘導されないことが示された。
【００９６】
＜試験例４＞
４．好塩基球におけるＣＤ２００Ｒ３の発現低下とＣＤ２００Ｒ１の発現上昇との関連
ＩｇＧ受容体を介した刺激によってＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られる好塩基球において、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇についても見られるか検証した。
【００９７】
［材料と方法］
本試験例に使用するマウスの血液は、試験例１、２、３と同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）から得た。市販の６週齢のマウスを用意し、乳原料を含まない飼料を用いて飼育した。１６週齢のマウスについて、全身麻酔下で後大静脈より血液を採取した。得られた血液に抗マウスＦｃγＲIII／II抗体（濃度１μｇ／ｍｌ）、もしくはヤギ抗マウスＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社、濃度０．５μｇ／ｍｌ）を添加し、前者を試験群４、後者を試験群５とした。また、対照群４として、血液にＰＢＳを加えたものを用意した。
【００９８】
試験群４、試験群５及び対照群４を３７℃で２時間保温し、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加して、氷上で１０分間放置した後、１０%ウマ血清でブロッキング処理を行った。その後、ＡＰＣ標識−抗マウスＩｇＥ抗体、ＰｅｒＣＰ標識−抗マウスＣＤ４９ｂ抗体、ＦＩＴＣ標識−抗マウスＣＤ２００Ｒ３抗体、ＰＥ標識−抗マウスＣＤ２００Ｒ１抗体により、試験群４、試験群５及び対照群４に含まれる各々のタンパク質を標識した。溶血処理により赤血球を除去した後の試験群４、試験群５及び対照群４について、フローサイトメトリーを行った。
【００９９】
［結果］
本試験例の結果を図７に示す。図７Ａ〜Ｃは、フローサイトメータによる測定結果を示すサイトグラムであり、右側のパネルから順に試験群４、試験群５、対照群４を示す。図７Ａの横軸は、ＦＳＣの強度であり、縦軸は、ＳＳＣの強度ある。ＦＳＣの強度とＳＳＣの強度に基づいて、図７Ａ中Ｐ１で示される領域を好塩基球が含まれる領域と判定した。図７Ｂの横軸は、抗マウスＩｇＥ抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗ＣＤ４９ｂ抗体に由来する蛍光強度である。図７Ａ中Ｐ１領域内の細胞から、ＣＤ４９ｂとＩｇＥの染色について陽性と判断された細胞（図７Ｂ、Ｐ２参照。）を選別し、好塩基球と判定した。
【０１００】
図７Ｃの横軸は、抗ＣＤ２００Ｒ３抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体に由来する蛍光強度である。好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３とＣＤ２００Ｒ１について、好塩基球が活性化されていない対照群４における発現量を基準として、試験群４及び試験群５と比較した。対照群における蛍光強度の分布から、領域Ｑ４にプロットされるものをＣＤ２００Ｒ３とＣＤ２００Ｒ１の何れについても発現量が変化していない好塩基球と判定し、領域Ｑ１と領域Ｑ３にプロットされるものをＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた好塩基球、領域Ｑ１と領域Ｑ２にプロットされるものをＣＤ２００Ｒ１の発現上昇が見られた好塩基球と判定した。なお、領域Ｑ１にプロットされるものは、ＣＤ２００Ｒ３とＣＤ２００Ｒ１の両方のタンパク質の発現変化が見られた好塩基球と判定される。領域Ｑ１及び領域Ｑ２と領域Ｑ３及び領域Ｑ４の境界は、対照群４におけるＣＤ２００Ｒ１の蛍光強度の中央値の１５５％に相当し、領域Ｑ１及び領域Ｑ３と領域Ｑ２及び領域Ｑ４の境界は、対照群４におけるＣＤ２００Ｒ３の蛍光強度の中央値の２３％に相当する。また、図７Ｃに示すＣＤ２００Ｒ１又はＣＤ２００Ｒ３の発現量に変化が見られた好塩基球の割合（％）を、表４にまとめた。
【０１０１】
【表４】
2014071040.tif 000005
【０１０２】
図７Ｃ及び表４に示すように、試験群４の、ＩｇＧ受容体への刺激によって活性化された好塩基球において、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた（試験群４、領域Ｑ３参照。）。一方、試験群４の好塩基球において、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇は見られなかった。試験群５のＩｇＥ受容体への刺激によって活性化された好塩基球においては、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇は見られたが（試験群５、領域Ｑ２参照。）、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下は見られなかった。
【０１０３】
本試験例の結果から、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下とＣＤ２００Ｒ１の発現上昇は、それぞれＩｇＧ受容体とＩｇＥ受容体を介した刺激により誘導され、互いに干渉せず、独立して起きることが示された。従って、マウス好塩基球の活性化について、ＩｇＧ依存的である場合と、ＩｇＥ依存的である場合の両方について、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下とＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標とすることによって、各々を区別して検出することが可能となる。
【０１０４】
＜試験例５＞
５．能動感作されたマウスにおける好塩基球の活性化の検出
能動感作マウスの血液を用い、好塩基球表面のＣＤ２００Ｒ１とＣＤ２００Ｒ３の発現変化から感作の状態を評価した。
【０１０５】
［材料と方法］
本試験例では、マウス好塩基球について、能動感作した後に回収した。能動感作の手順を具体的に説明する。市販の３週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（メス）を用意し、乳原料を含まない飼料を用いて飼育した。４週齢時から２週間毎に、水酸化アルミニウムゲルと共にカゼインをマウスの腹腔内へ投与した（ｎ=１０）。４回目の投与から１週間後にマウスから採血した。得られた血液にカゼインを１μｇ／ｍｌとなるように添加し、これを本試験例の試験群（試験群６〜１５）とした。また、カゼインを加えない血液を対照群（対照群６〜１５）とした。試験群及び対照群については、３７℃で２時間保温した後、血液に２ｍＭＥＤＴＡを添加して、氷上で１０分間放置した。試験群及び対照群については、１０%ウマ血清でブロッキングした後、ＡＰＣ標識−抗マウスＣＤ４９ｂ抗体、ＦＩＴＣ標識‐抗マウスＣＤ２００Ｒ３抗体、ＰＥ標識−抗マウスＣＤ２００Ｒ１抗体の各抗体を用いて標識した。溶血処理により試験群及び対照群から赤血球を除去した後、フローサイトメトリーを行った。
【０１０６】
［結果］
本試験例の結果を図８に示す。図８Ａ〜Ｃは、フローサイトメータによる測定結果を示すサイトグラムである。左側のパネルは個体１についての試験群（試験群６）と対照群（対照群６）の結果を示し、右側のパネルは個体２についての試験群（試験群７）と対照群（対照群７）の結果を示す。図８Ａの横軸はＦＳＣの強度であり、縦軸はＳＳＣの強度である。ＦＳＣの強度とＳＳＣの強度に基づいて、図８Ａ中Ｐ１で示される領域を好塩基球が含まれる領域と判定した。図８Ｂの横軸は、抗ＣＤ２００Ｒ３抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗ＣＤ４９ｂ抗体に由来する蛍光強度である。図８Ａ中Ｐ１領域内の細胞から、ＣＤ４９ｂとＣＤ２００Ｒ３の染色について陽性と判断された細胞（図８Ｂ、Ｐ２参照。）を選別し、好塩基球と判定した。
【０１０７】
図８Ｃの横軸は、抗ＣＤ２００Ｒ３抗体に由来する蛍光強度であり、縦軸は、抗ＣＤ２００Ｒ１抗体に由来する蛍光強度である。各々の個体について、対照群におけるＣＤ２００Ｒ３とＣＤ２００Ｒ１の発現量を基準として、各タンパク質の発現量を比較した。対照群６及び対照群７における蛍光強度の分布から、領域Ｐ４にプロットされるものをＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られた好塩基球、領域Ｐ３にプロットされるものをＣＤ２００Ｒ１の発現上昇が見られた好塩基球と判定した。Ｐ４の範囲は、対照群におけるＣＤ２００Ｒ３由来の蛍光強度の中央値に対して、７〜３５％に相当し、Ｐ３の範囲は、照群におけるＣＤ２００Ｒ１由来の蛍光強度の中央値に対して、１６０〜８３０％に相当する。また、図８Ｃに示すＣＤ２００Ｒ１又はＣＤ２００Ｒ３の発現量に変化が見られた好塩基球の割合（％）を、表５にまとめた。
【０１０８】
【表５】
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【０１０９】
個体１においては、図８Ａ及び表５に示すように、カゼインが添加された試験群６の好塩基球において、好塩基球全体の７０％以上でＣＤ２００Ｒ３の発現低下と、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇が見られた。一方、個体２においては、カゼインが添加された試験群７の好塩基球において、好塩基球全体の９８％にＣＤ２００Ｒ３の発現低下が見られたのに対し、ＣＤ２００Ｒ１の発現上昇は好塩基球全体の８％にしか見られなかった。
【０１１０】
本試験例の結果から、個体１では、ＩｇＥ感作とＩｇＧ感作が成立していたことが示された。一方、個体２では、ＩｇＧ感作は成立していたが、ＩｇＥ感作は成立していなかったことが示された。従って、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下とＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標とすることにより、免疫原に対するマウスの感作状態を個体ごとに評価できることが確認された。また、ＣＤ２００Ｒ３の発現低下とＣＤ２００Ｒ１の発現上昇を指標して、個体に発症したアナフィラキシー等のアレルギー反応が、ＩｇＧに依存したものであるか、又はＩｇＥに依存したものであるか、の判定が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本開示に係る好塩基球の活性化の検出に基づくアレルギー反応の検出方法は、好塩基球の表面に発現するＣＤ２００Ｒ３の発現量を測定することによって、好塩基球のＩｇＧに依存した活性化を検出することに基づくため、アレルギー反応を簡便に検出することができる。本開示に係る好塩基球の活性化の検出方法は、被検物質のアレルゲン活性や抗アレルギー活性の評価等に利用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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