(57)【要約】【課題】ＣＤ１６１ｈｉおよび／またはＩＬ１８Ｒａｈｉであり、迅速な薬剤流出能力を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の同定の提供。【解決手段】本発明は、特にＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの表面高発現、および蛍光色素Ｒｈ１２３を迅速に流出させる能力を有する生きた推定上の長命な抗原特異的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉ）の同定および単離のための方法を提供する。本発明は、ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの表面高発現および蛍光色素Ｒｈ１２３を速やかに流出する能力を有する生きた推定上の長命抗原特異的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉ）を同定および単離する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＩＨの助成番号ＡＩ０５３１９３号およびＣＡ１１４５３６号における政府援助によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、推定上の長命なローダミン１２３流出性の中央記憶（ＣＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞およびエフェクター記憶（ＥＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するためのＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現の利用に関する。本発明は、癌および感染性疾患、遺伝子送達、消失標的化免疫療法およびそれに有用な組成物のための養子Ｔ細胞免疫療法における適用を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
感染症および癌を特異的に認識し、制御し排除する能力は、ヒトの免疫の特徴の一つである。免疫系は、１）マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞および好中球によって媒介される応答を有し、比較的少数の病原体関連分子パターンを認識する非特異的な「生得的」免疫系、および２）数百万の異なるペプチド抗原を認識する可能性を有する高特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に媒介される「適応」免疫系に分けることができる。
【０００４】
適応免疫系のＣＤ８＋Ｔ細胞による特異的抗原の認識は、多種多様なＴ細胞受容体（ＴｃＲ）によって媒介される。単一のＴｃＲを担持するＴ細胞は、適切なＭＨＣ分子によって提示される特異的なペプチド抗原を認識することができ、その結果、提示されたペプチド抗原に特異的な「適応」免疫応答をもたらす。「外来」抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の「適応」免疫応答はウィルス感染において十分に特性化されているが、変異または非変異の「自己」抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が、癌および自己免疫疾患などの他の病態に見ることができる（１〜７）。
【０００５】
急性ウィルス感染において、ウィルス由来の抗原は、ウィルス抗原を認識することができ、ヒトでは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌの細胞表面発現およびＣＤ９５発現の非存在を特徴とするＴｃＲを発現するナイーブＴ細胞に対し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって処理されて提示される。次いで、活性化した抗原特異的なナイーブＴ細胞は急速に増殖し、エフェクターＴ細胞集団へと分化する。引き続き、大多数のエフェクターＴ細胞は死滅するが、そのごく一部は生き残って記憶Ｔ細胞となる（８、９）。ウィルスに再攻撃（ｒｅ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）されると、生き残っている記憶Ｔ細胞集団は急速に増殖してエフェクター集団へと分化し、急速に感染を含有し、宿主を防御する能力を有する。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の記憶は、抗原再攻撃がない場合でも７５年間まで持続する、すなわち実質的に、宿主の生涯にわたってその抗原に対する免疫を与えると記載されている（１０）。
【０００６】
生き残っている記憶Ｔ細胞集団は、異種性が高く、ヒトでは、中央記憶（ＣＭ）、エフェクター記憶（ＥＭ）およびエフェクター記憶ＲＡ＋（ＥＭＲＡ）と称される３つの主要なサブセットを含む。これらのサブセット、ならびにそれらのサブ集団は、表現型、個体発生、ホーミング、増殖能力およびサイトカイン分泌が異なっており、免疫記憶の維持に異なる役割を有すると考えられる（１１〜１３）。記憶サブセットの分布は、ＡＰＣおよび抗原の性質、抗原密度およびサイトカインの存在、共刺激分子および炎症伝達物質などの初回免疫の条件の違いによって影響を受ける可能性がある（８）。ＣＤ８＋Ｔ細胞記憶が一たん確立されると、それは抗原が存在しなくても持続し得る（１４、１５）。記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞集団は、ホメオスタティック（定常状態）増殖を行い、異なるサブセットが、インビボで異なるターンオーバー速度を有するようである（１６）。インターロイキン−（ＩＬ−）１５は、ホメオスタティック増殖にとって必須の伝達物質であり、ＩＬ−７は確立された記憶応答の残存にとって重要である（１７〜２２）。ウィルス感染に対する急性エフェクター応答および安定な記憶応答への移行についての理解が進んでいるにも関わらず、ＣＤ８＋記憶が確立されて維持される機序はまだ解明されていない。
【０００７】
自己再生するそしてエフェクターへと分化する能力を有する「幹細胞」様Ｔ細胞の集団が免疫学的記憶の維持を提供し得ると仮定されている（２３）。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のマウスモデルにおいて、推定上の記憶幹細胞が最近確認された（２４）。ＧＶＨＤに罹っているマウスからの第二次移行後、有糸分裂後のＣＤ８＋／ＣＤ４４ｌｏ／ＣＤ６２Ｌｈｉ／Ｓｃａ−ｌｈｉ記憶細胞のみがＧＶＨＤを開始させ、記憶（ＣＭおよびＥＭ）サブセットおよびエフェクターサブセットを生じさせ、増殖可能性を保持することができた。マウスでの別の研究では、ナイーブＴ細胞と抗原との最初の出会いの後に、幹細胞の特徴的な自己再生機序である非対称な細胞分裂が実証された（２５）。最初の分裂後、免疫学的シナプスに「遠位」および「近位」の子孫がそれぞれ、記憶表現型とエフェクター表現型に関してプログラムされた。これらの研究は、抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞記憶が、幹細胞の特性（複数）と自己再生する能力を有する長命な集団によって維持し得ることを示唆している。現在までに、ヒトにおける候補集団は確認されていない。
【０００８】
長命の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞または記憶幹細胞の表現型を同定することにより、感染症、癌および自己免疫疾患の研究および療法に関しての深い示唆が与えられるであろう。幹細胞の挙動および長期生存に合致する特徴を有する、ヒトにおける記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を同定するために、本発明者らは、多パラメーターフローサイトメトリーを用いた。造血幹細胞および癌幹細胞の特徴は、化学療法剤および蛍光色素を流出させる能力である（２６〜３０）。本発明者らは、ＣＭおよびＥＭのＣＤ８＋Ｔ細胞のサブ集団が、蛍光色素および化学療法剤を速やかに流出させる能力を有していることも見出し、これらの細胞は、骨髄抑制性が激しい化学療法後に見られるＣＤ８＋Ｔ細胞記憶の化学療法抵抗性に関与し得ると仮定した。インビトロ試験では、速やかにローダミン１２３（Ｒｈ１２３）を流出させる能力を有するＣＭとＥＭのサブセット（高流出能力に関して、それぞれ、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉと称される）が、細胞毒性の化学療法に応答したアポトーシスに対して、非流出性対応物よりも抵抗性であること、および、化学療法抵抗性が、ＡＴＰ結合カセット共輸送体流出チャネルのブロックによって減少することが実証された。
【０００９】
遺伝子発現プロファイリング試験により、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのＣＤ８＋Ｔ細胞は、類似しているが異なるサブセットを含むことが示されている。またそれらは、ユニークで、他の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞集団またはナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞集団とは異なる遺伝子発現プロファイルを有する。さらなる試験により、Ｒｈ１２３流出記憶集団の免疫表現型は、先に記載したマウスにおける「記憶幹細胞」およびマウスのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の非対称分裂後の「遠位極由来記憶細胞」に類似していることが示された。ＣＭｈｉ集団およびＥＭｈｉ集団は、ポリクローナルＴｃＲのレパートリを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を有し、ＣＭＶ、ＥＭＶおよびインフルエンザ抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、これらサブセット内で同定することができる。
【００１０】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＫＴ３によるポリクローナル刺激に対して無反応性であり、非流出ＣＤ８＋Ｔ細胞に比較して、増殖およびサイトカイン分泌の減少を示す。それらはまた、イオノマイシン刺激に応答して、低い細胞内カルシウムフラックスも示す。増殖およびサイトカイン分泌の減少は、共刺激および炎症性サイトカインにより、部分的に回復し得る。多くの炎症性サイトカインの分泌減少に関わらず、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、他の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットとは対照的に、ＰＭＡ−イノマイシン刺激に応答してＩＬ−１７を分泌した。
【００１１】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが無反応性であることにより、それらは、静止状態に留まり、多くの炎症性病態を除く全ての抗原刺激に応答した分化を避けることができる。ＣＭｈｉが高い３Ｈ−チミジンの取込み、ならびにホメオスタティックサイトカイン、ＩＬ−７およびＩＬ−１５に応答したＣＦＳＥ希薄化を示すことが見られたため、これらの化学療法抵抗性細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のレベルが上昇した際、骨髄抑制性化学療法後のリンパ球最低の間に増殖でき、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞区分を再生成する可能性があることが示唆される。
【００１２】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、臍帯血にはきわめて少数が見られる。それらは成人初期に多数見られ、年齢が進むにつれて減少する。生涯の初期の抗原曝露後に生じ、成人期の炎症性抗原刺激の反復によって徐々に枯渇する集団は、推定上の記憶幹細胞に合致すると考えられる。これはまた、高齢対象においてワクチン効果の減少が認められていることにも合致すると考えられる。
【００１３】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの同定は、Ｒｈ１２３流出アッセイを用いて、インビトロで容易に達成することができるが、機能試験または臨床グレードの単離におけるＲｈ１２３の使用には問題がある。したがって、ヒト血液サンプル中、細胞のこのサブセットを識別し得る細胞表面マーカーを探索するために、本発明者らは多パラメーターフローサイトメトリーを用いた。ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現により、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが多量にあるサブセットが同定され、細胞のインビトロ培養またはＲｈ１２３毒性へ細胞を曝露させることなく、これらの細胞の同定および単離が促進されることを本発明者らは見出した。
【００１４】
記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞が、感染症、癌および自己免疫疾患の予防、制御および療法においてある役割を果たしていることを示唆している広範な証拠がある（１〜７）。第ＩＶ期黒色腫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞養子移入の臨床試験により、５１％までのＣＲ／ＰＲがもたらされており、移入された腫瘍特異的Ｔ細胞の存続が有効性にとって決定的であることが実証された（３１、３２）。ＣＭＶ特異的養子移入試験における所見もまた、存続の必要性を実証しており、腫瘍および感染症に対する、養子Ｔ細胞移入による制御および予防の成功にとって、長命の記憶応答の確立が必須であり得るという仮説を強く裏付けている（３３）。臨床的に明白な癌を排除し、潜在癌における健康的平衡状態の確立における存続性の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の重要な役割を実証しているマウスにおける研究により、これらの試験は補完されている（４）。
【００１５】
記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞のかく乱が疾患過程において重要であるという証拠はあるものの、抗原特異的な免疫記憶を特異的に切断、増強、または移入するための試みは限定的な成功をおさめているに過ぎない。ＣＤ８＋の系またはクローンの移入後の臨床的応答は以前示されているが、インビボでのそれらの予測できない存続に関して散発的であった（３２）。非ヒト霊長類における最近の試験では、双方の集団とも移入前のエフェクター表現型が共通であるという事実にも関わらず、ＣＭ由来のＣＤ８＋クローンは注入後一年まで存続でき、他方、ＥＭ由来のクローンは、アポトーシスによって急速に死滅することが示されている（３４）。このことは、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞は、それらの元の細胞に由来する内因的なプログラムを保持している可能性が考えられ、これが抗原刺激およびクローン増殖後のインビボ生存を決定することを示唆している。移入された記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞がインビボで存続するには、クローンまたは系を適切にプログラムされたサブセットから生成させなければならないことが示唆される。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、長期存続がプログラムされていることを示唆する特徴を持つサブセットである。
【００１６】
存続が適切にプログラムされている記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの同定によって、特異的抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫の移入が促進されるであろう。存続および長命生存がプログラムされているＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、治療的遺伝子の送達媒体としても有用であると考えられる。養子移入後の治療的免疫の維持または遺伝子送達の維持のための長期生存にかなう以外に、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの長命記憶細胞は、毒素結合ＣＤ１６１モノクローナル抗体および／またはＩＬ−１８Ｒαモノクローナル抗体の使用を介し、抗原特異的記憶応答の消失による免疫抑制に関する標的として作用し得る。この療法形体は、自己免疫疾患および移植片対宿主病においてある役割を有し得る。
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ヒトにおける長命記憶細胞の同定は、現在までできていない。ＣＭおよび／またはＥＭのＣＤ８＋Ｔ細胞区画におけるヒトＲｈ１２３流出長命記憶細胞を同定するために、ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現が使用できることを本発明者らは実証する。これらの集団は、養子免疫療法、遺伝子送達のためのＴ細胞源として、または自己免疫疾患もしくは他の免疫病理学的状態の消失を目的とした標的として有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの表面高発現および蛍光色素Ｒｈ１２３を速やかに流出する能力を有する生きた推定上の長命抗原特異的記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉ）を同定および単離する方法を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現を有する単離されたヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球。
（項目２）
前記リンパ球が、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＢＳＡ中、３７℃で３０分未満の培養でＲｈ１２３を能動的に流出させる項目１に記載のＴリンパ球（「迅速流出性Ｔリンパ球および／またはＩＬ−１８ＲαｈｉＴリンパ球」）。
（項目３）
前記リンパ球が、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ９５＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ２５−、ｂｃｌ−２ｈｉ、パーフォリンｉｎｔ、グランザイム  Ａｉｎｔ、ならびにグランザイムＢｉｎｔ／ｎｅｇおよびＮＫＧ２Ｄｉｎｔ／ｎｅｇである、項目１〜２に記載の迅速流出性Ｔリンパ球。
（項目４）
前記リンパ球が、０．０３〜０．３μＭのダウノルビシンで培養後の非流出性Ｔリンパ球よりもアポトーシスに対してより抵抗性であり、このような抵抗性が、流出阻害剤ＰＫ１１１９５により消滅する、項目１〜３に記載の迅速流出性Ｔリンパ球。
（項目５）
前記リンパ球が、２５０〜１０００ｎｇ／ｍｌのプレート結合ＯＫＴ３による刺激に応答して、その非流出性対応物であるＴリンパ球よりも低い増殖を示す、項目１〜４に記載の迅速流出性Ｔリンパ球。
（項目６）
前記リンパ球が、ＣＤ６２Ｌ＋中央記憶Ｔ細胞である、項目１〜５に記載の迅速流出性Ｔリンパ球。
（項目７）
前記リンパ球が、その非流出性対応物であるＴリンパ球と比較して、０．５〜２．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７による４日間の培養に応答して３Ｈ−チミジンの高い取り込みを示す、項目１〜６に記載の迅速流出性Ｔリンパ球。
（項目８）
前記リンパ球が、ＣＤ６２Ｌ−エフェクター記憶Ｔ細胞である、項目１〜５に記載の迅速流出性Ｔリンパ球。
（項目９）
養子免疫療法または遺伝子療法に使用するための、項目１〜８に記載の細胞。
（項目１０）
薬学的に許容できる担体中に項目１〜８に記載の細胞を含む組成物。
（項目１１）
養子免疫療法または遺伝子療法の実施を目的とする薬剤を調製するための、項目１〜８に記載の細胞の使用。
（項目１２）
項目１〜８に記載の前記細胞を、治療的有効量で治療を必要とするヒト対象に投与する工程を含む、前記治療を必要とするヒト対象を治療する方法。
（項目１３）
前記細胞が、自家、同種、または同系の細胞である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記療法が、養子免疫療法である、項目１２〜１３に記載の方法。
（項目１５）
前記対象が、癌、感染症、または医原性免疫不全もしくは先天性免疫不全のうちの少なくとも１つに罹患している、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記療法が遺伝子療法である、項目９〜１３に記載の方法。
（項目１７）
前記対象が、先天性遺伝子障害、癌、感染症、または医原性免疫不全もしくは先天性免疫不全のうちの１つに罹患している、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
治療を必要とするヒト対象における迅速流出性Ｔリンパ球および／またはＣＤ１６１ｈｉＴリンパ球および／またはＩＬ−１８ＲαｈｉＴリンパ球を治療的有効量により消失させる工程を含む、前記治療を必要とするヒト対象を治療する方法。
（項目１９）
前記消失させる工程を、インビボまたはインビトロで実施する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記対象が、自己免疫疾患、移植片対宿主病または移植片の拒絶のうちの少なくとも１つに罹患しているか、またはその危険性がある、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
患者の直接治療により、インビボで前記消失させる工程を実施する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
細胞産物または体外循環からの細胞の枯渇により、エキソビボで前記消失させる工程を実施する、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
移植前に移植片から前記細胞を消失させることにより、前記消失させる工程を実施する、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
毒性基または放射性同位元素に結合しているか、または結合していない抗ＩＬ−１８Ｒαモノクローナル抗体または抗ＩＬ−１８Ｒαポリクローナル抗体により、流出ポンプの阻害をともなうリンパ球毒性薬物治療により、またはそれらの組合せにより、前記消失させる工程を実施する項目２１〜２３に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）中央記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞およびエフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の同定を可能にする蛍光色素結合抗体の組合せ；
（ｂ）ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαならびに適切なイソタイプ対照に対する蛍光色素結合抗体；
（ｃ）Ｒｈ１２３およびＲｈ１２３流出の陰性対照アンタゴニスト；
（ｄ）適切なアッセイ培地；
（ｅ）取扱説明書および包装、
のうちの少なくとも２つの組合せを含む、項目１〜８に記載の迅速流出性Ｔリンパ球の同定または単離のためのキット。
【００１９】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの細胞を、他の組織における幹細胞集団との共通の特徴と合致するインビボでの長期生存および化学療法抵抗性に関してプログラムすることを本発明者らは提案する。ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの表面高発現などの識別される表現型の同定によって、これらのＴ細胞サブセットの単離およびインビトロ操作が可能になるであろう。長命Ｔ細胞を単離し、自家、同種または同系の設定に養子として移入させる能力により、存続性の抗原特異的免疫性の移入が可能になり得る。このことは、限定はしないが、癌または感染症の予防、制御または除去などの適用範囲において重要であり得る。あるいは、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの集団の標的化消失により、自己免疫疾患または移植片対宿主病の強力な免疫抑制および治療をもたらし得る。本発明を用いて、ワクチンまたは免疫抑制剤などの免疫調節療法候補が、インビトロアッセイにおいてハイスループットでスクリーニングされてよい。本発明はまた、治療遺伝子用のインビボ送達媒体として用いることもできる。
【００２０】
言い換えると、本発明の第１の態様は、ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現を有するヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球（例えば、３７℃でＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＢＳＡ培地中、３０分未満に能動的にＲｈ１２３を流出させるリンパ球（「迅速流出および／またはＣＤ１６１ｈｉおよび／またはＩＬ−１８ＲαｈｉＴリンパ球」））である。これらのリンパ球は、単離された、濃縮されたおよび／または精製された形体で提供できる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、ＴｃＲαβ＋、ＴｃＲγδ-、ＣＤ８αｈ
ｉ／ｉｎｔ、ＣＤ８βｈｉ／ｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ９５ｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ２５ｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ５７−、ＣＤ１２７＋、ＣＤ１０３−、ＰＤ−１ｎｅｇ、ｂｃｌ−２ｈｉ、ｂｃｌ−ｘＬｈｉ、パーフォリンｉｎｔ、グランザイムＡｉｎｔ、グランザイムＢｉｎｔ／ｎｅｇおよびＮＫＧ２Ｄｉｎｔである。
【００２２】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、ＭＤＲ−１  ｍＲＮＡの高発現を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、蛍光化学療法剤、ダウノルビシンを活発に流出させる能力を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、０．０３〜０．３μＭのダウノルビシンと共に培養した後のアポトーシスに抵抗性であり、このような抵抗性は、流出阻害剤ＰＫ１１１９５により抑えられる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、２５０〜１０００ｎｇ／ｍｌのプレート結合ＯＫＴ３による刺激に応答しての増殖が無いか、または、非流出対応物であるＴリンパ球よりも低いことが実証されている。増殖の低下は、プレート結合抗ＣＤ２８抗体による共刺激および／または限定はしないが、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３またはそれらの組合せなどのサイトカインの添加により、部分的に回復させることができる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、それらの非流出対応物に比較して、抗ＣＤ２８抗体またはサイトカインと組み合わせたＰＭＡ／イオノマイシンまたはＯＫＴ３による刺激に応答してのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＭＩＰ−１αの分泌を減少させる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、イオノマイシンによる刺激後、低いが不均一のカルシウムフラックスを有する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、ＣＤ６２Ｌ＋中央記憶Ｔ細胞である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、０．５〜２．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７との４日間の培養に応答して、その非流出対応物Ｔリンパ球に比較して、高い３Ｈ−チミジン取込み、および０．５〜２．０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７との８〜１１日間の培養に応答して、ＣＦＳＥのより高い希薄化を実証している。
【００３０】
いくつかの実施形態において、リンパ球は、ＣＤ６２Ｌ−エフェクター記憶Ｔ細胞である。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、養子免疫療法もしくは遺伝子療法における使用のための、または養子免疫療法用もしくは遺伝子療法用の薬剤の調製に使用するための、本明細書に記載したリンパ球である。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容できる担体中、本明細書に記載したリンパ球を含むか、それらから構成されるか、または本質的にそれらから構成される組成物である。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、治療的有効量における本明細書に記載したリンパ球を、治療を必要としているヒト対象に投与することを含む、前記対象を治療する方法である。これらのリンパ球は、自家、同種または同系の細胞であり得る。この方法は、免疫療法または養子免疫療法のために実施でき；この方法は、対象が、癌、感染症、または医原性もしくは先天性の免疫不全症のうちの少なくとも１つに罹患している場合に実施でき；この方法は、遺伝子療法のために実施でき；この方法は、対象が、先天性遺伝子障害、癌、感染症、または医原性もしくは先天性の免疫不全症の１つに罹患している場合に実施できる。養子免疫療法における本発明の使用の一典型例は、同種または異種の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の設定での処置であると考えられる。厳しい免疫抑制の設定において、同種および自家のＨＳＣＴ患者は日和見感染症に罹る危険性が大きい。レシピエントに免疫記憶を移入して命を脅かす可能性のある感染症に対して彼らを防御するために、本発明を使用できる。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの細胞を、移植ドナー（同種ＨＳＣＴの場合）または患者（自己由来ＨＳＣＴの場合）から単離し、感染関連の抗原に対する特異性に関して選択または操作し、増殖させるか、または増殖させず、移植後の設定で患者に戻すことができる。これらのサブセットは、移植後リンパ球減少環境下で分化して、または分化せずに増殖し、免疫記憶を再構成すると考えられる。感染症に特異的なＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの選択により、移植片対宿主病を引き起こさない免疫の再構成が可能になるであろう。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、治療的有効量により、治療を必要としているヒト対象における迅速流出および／またはＣＤ１６１Ｔリンパ球および／またはＩＬ−１８ＲαｈｉＴリンパ球を消失させることを含む、治療を必要としているヒト対象を治療する方法である。この消失させる工程はインビボまたはインビトロで実施することができる。いくつかの実施形態において、対象は、自己免疫疾患、移植片対宿主病または移植片拒絶のうちの少なくとも１つに罹患しているか、またはその危険性がある。いくつかの実施形態において消失させる工程は、患者の直接治療によりインビボで実施され；いくつかの実施形態において消失させる工程は、細胞産物または体外循環からの細胞の枯渇によりエクスビボで実施され；いくつかの実施形態において消失させる工程は、移植前に移植片から前記細胞を消失させることにより実施される。いくつかの実施形態において消失させる工程は、毒性基または放射性同位元素に結合した、または結合していない抗ＣＤ１６１モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体および／または抗ＩＬ−１８Ｒαモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を投与すること、流出ポンプの阻害によるリンパ球毒性剤の処置、またはそれらの組合せにより実施される。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、以下の任意の組合せにおける少なくとも２つ、３つまたは４つの組合せを含む、本明細書に記載した迅速流出性Ｔリンパ球の同定または単離のためのキットである：（ａ）中央記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞およびエフェクター記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の同定を可能にする蛍光色素結合抗体の組合せ；（ｂ）ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαに対する蛍光色素結合抗体および適切なアイソタイプ対照；（ｃ）Ｒｈ１２３およびＲｈ１２３流出の陰性対照アンタゴニスト；（ｄ）適切なアッセイ培地；（ｅ）使用説明書および包装。
【００３６】
本発明の先述の、および他の目的ならびに態様は、本明細書における図面および下記の明細書において、より詳細に説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例１に記載されているとおり、ＣＭおよびＥＭの集団が、迅速にＲｈ１２３を流出しＣＤ１６１ｈｉおよびＩＬ−１８Ｒａｈｉであるサブセットを含有することを示す。
【図２ａ】ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセットがＴｃＲαβ＋およびＴｃＲγδ−であることを示し、Ｖα２４に対する抑制がないことを示し、実施例２に記載されているとおり、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ９５＋、ＣＤ８α＋、ＣＤ８β＋／ｎｅｇ、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ１２２＋、パーフォリンｉｎｔ／ｌｏ、グランザイムＡｉｎｔ／ｌｏ、グランザイムＢｎｅｇ、Ｋｉ６７ｎｅｇ、ｂｃｌ−ｘＬｉｎｔ／ｈｉおよびｂｃｌ−２ｉｎｔ／ｈｉが優勢であることを示す。
【図２ｂ】ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセットがＴｃＲαβ＋およびＴｃＲγδ−であることを示し、Ｖα２４に対する抑制がないことを示し、実施例２に記載されているとおり、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ９５＋、ＣＤ８α＋、ＣＤ８β＋／ｎｅｇ、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ１２２＋、パーフォリンｉｎｔ／ｌｏ、グランザイムＡｉｎｔ／ｌｏ、グランザイムＢｎｅｇ、Ｋｉ６７ｎｅｇ、ｂｃｌ−ｘＬｉｎｔ／ｈｉおよびｂｃｌ−２ｉｎｔ／ｈｉが優勢であることを示す。
【図２ｃ】ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセットがＴｃＲαβ＋およびＴｃＲγδ−であることを示し、Ｖα２４に対する抑制がないことを示し、実施例２に記載されているとおり、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ９５＋、ＣＤ８α＋、ＣＤ８β＋／ｎｅｇ、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ１２２＋、パーフォリンｉｎｔ／ｌｏ、グランザイムＡｉｎｔ／ｌｏ、グランザイムＢｎｅｇ、Ｋｉ６７ｎｅｇ、ｂｃｌ−ｘＬｉｎｔ／ｈｉおよびｂｃｌ−２ｉｎｔ／ｈｉが優勢であることを示す。
【図３】実施例３に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、非対称分裂ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の遠位極に由来する可能性を示唆する表面表現型を有することを示す。
【図４】実施例４に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、それらの非流出対応物よりも高レベルのＭＤＲ−１  ｍＲＮＡを発現し、蛍光化学療法剤、ダウノルビシンを活発に流出することを示す。
【図５】実施例５に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、インビトロでダウノルビシンに誘導されたアポトーシスに対して抵抗性であることを示す。
【図６ａ】実施例６に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、ホメオスタティックサイトカインのＩＬ−７およびＩＬ−１５に応答して分裂し、添加サイトカインの非存在下で、培養後に高生存率を有することを示す。
【図６ｂ】実施例６に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、ホメオスタティックサイトカインのＩＬ−７およびＩＬ−１５に応答して分裂し、添加サイトカインの非存在下で、培養後に高生存率を有することを示す。
【図６ｃ】実施例６に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、ホメオスタティックサイトカインのＩＬ−７およびＩＬ−１５に応答して分裂し、添加サイトカインの非存在下で、培養後に高生存率を有することを示す。
【図６ｄ】実施例６に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、ホメオスタティックサイトカインのＩＬ−７およびＩＬ−１５に応答して分裂し、添加サイトカインの非存在下で、培養後に高生存率を有することを示す。
【図７】実施例７に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、ＯＫＴ３によるポリクローナルＴｃＲ刺激に応答しての３Ｈ−チミジンの取込みが、それらの非流出性対応物に比較して減少したことを示し、３Ｈ−チミジンの取込みが、図に示したように、共刺激後に増加することを示す。
【図８】実施例８に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、それらの非流出性対応物に比較して、異なるサイトカイン分泌プロファイルを有することを示す。
【図９】実施例９に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉが、イオノマイシンに応答してのカルシウムフラックスを、それらの非流出性対応物に比較して減少させることを示す。
【図１０】実施例１０に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセットが、分子スペクトルの型分類により、ポリクローナルＴｃＲレパートリーを含むことを示す。
【図１１】実施例１１に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセット内で、ウィルス抗原四量体陽性細胞を同定することができ、選別したＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセットから、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびインフルエンザに特異的なＣＴＬ応答を生じさせることができることを示す。
【図１２】実施例１２に記載されているとおり、主成分プロットにより示されるように、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉのサブセットはユニークで異なる遺伝子発現プロファイルを有することを示す。
【図１３ａ】実施例１３に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、臍帯血中には稀であり、成人初期に最高であり、年齢が進むと共に頻度の低下が見られることを示す。
【図１３ｂ】実施例１３に記載されているとおり、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、臍帯血中には稀であり、成人初期に最高であり、年齢が進むと共に頻度の低下が見られることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明を、下記でより詳細に説明する。本明細書に引用される米国特許文献の全ての開示物は、参照として、本明細書にそれらの全体が援用されている。
【００３９】
１．定義
本明細書に用いられている「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」はヒトからのものである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は自家（ドナーと（単数または複数の）レシピエントが同一個体）であり；いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同種（ドナーと（単数または複数の）レシピエントが遺伝的に異なる個体）であり；いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は同系（ドナーとレシピエントが遺伝的に同一であって異なる個体）である。
【００４０】
本明細書に用いられる「細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）」とは、その表面にＣＤ８を発現するＴリンパ球（すなわち、ＣＤ８＋Ｔ細胞）のことである。
【００４１】
本明細書に用いられる「中央記憶」Ｔ細胞（または「ＣＭ」）とは、以前、抗原に曝露されたＣＴＬ（「記憶ＣＴＬ」）のことであり、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ／ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉおよびＣＤ９５ｉｎｔ／ｈｉがある。
【００４２】
本明細書に用いられる「エフェクター記憶」Ｔ細胞（または「ＥＭ」）とは、以前、抗原に曝露されたＣＴＬ（「記憶ＣＴＬ」）のことであり、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ／ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉおよびＣＤ９５ｉｎｔ／ｈｉがある。
【００４３】
「迅速流出性Ｔリンパ球」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＭおよびＥＭの集団（それぞれ、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉ）内に見られ、以下の特徴のいくつかまたは全てが確認されている：（ａ）３７℃の温度で、３０分間にわたって、培養物中に色素Ｒｈ１２３を活発に迅速に流出させる；（ｂ）ＣＤ１６１の高表面発現（ＣＤ１６１ｈｉ）および／またはＩＬ−１８Ｒαの高表面発現（ＩＬ−１８Ｒαｈｉ）。このような細胞は、限定はしないが、一般的に以下の特徴を含む：（ａ）ＣＤ１２７およびＣＤ２８の高表面発現；（ｂ）常にではないが、一般に、遠位極複合体または有糸分裂ＣＤ８＋Ｔ細胞の尾肢（ｕｒｏｐｏｄ）由来が示唆されるマーカーの発現（非流出サブセットよりも高い、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ１４８およびＣＤ１６２の表面発現；非流出サブセットよりも低い、ＣＤ８、ＣＤ１１ａおよびＣＤ５０の表面発現）；（ｃ）ＣＤ３＋／ＴｃＲαβ＋／ＴｃＲγδ−；（ｄ）ＣＤ２５、ＣＤ５７、ＰＤ−１、ＣＤ１０３およびＣＤ６９の低い表面発現または表面発現無し；（ｅ）非流出サブセットよりも低いＮＫＧ２Ｄ表面発現；（ｆ）ＣＤ４５ＲＯの中等度／高発現、ＣＤ４５ＲＡの中等度／陰性表面発現およびＣＤ９５の発現；（ｇ）常にではないが、一般に、非流出対応物よりも高いｂｃｌ−２発現およびｂｃｌ−ｘＬ発現；（ｈ）グランザイムＢの陰性発現、グランザイムＡの中等度発現およびパーフォリンの低／中等度発現；（ｉ）ＣＤ８αの通常発現または低発現およびＣＤ８βの通常発現、低発現または発現無し；（ｊ）非流出対応物よりも高いＭＤＲ−１  ｍＲＮＡ発現；（ｋ）健常個体において、非流出対応物よりも低いＫｉ６７発現パーセンテージ。場合によっては、いくつかの実施形態において、迅速流出Ｔリンパ球は、ＣＤ１２２の陽性表面発現を特徴とする。ＣＤ６２Ｌの発現は変動性であり、これによってＣＭまたはＥＭのサブセットにおけるこれらの細胞の存在が確定されることにも注意されたい。このような細胞はまた一般に、限定はしないが、以下の機能的特徴を含む：（ａ）プレート結合ＯＫＴ３による刺激に応答しての増殖が、非流出サブセットに比較して低く、これは、抗ＣＤ−２８抗体またはサイトカインによる共刺激の後に増加し得る；（ｂ）四量体結合および選別サブセットのインビトロ増殖後に抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定する能力によって立証されるウィルス特異的クローンを含有する；（ｃ）化学療法剤の存在または非存在下でのインビトロ培養の間のアポトーシスに対する抵抗性；（ｄ）抗ＣＤ２８抗体またはサイトカインと組み合わせたＰＭＡ／イオノマイシンまたはＯＫＴ３による刺激に応答してのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＭＩＰ−１αの分泌が、非流出性対応物に比較して減少する；（ｅ）蛍光化学療法剤、ダウノルビシンを活発に流出する能力；（ｆ）イオノマイシンによる刺激後の低いが不均一なカルシウムフラックス；（ｇ）ＣＭｈｉ細胞は一般に、非流出性対応物に比較して、ＩＬ−７に応答してのトリチウム標識チミジン（３Ｈ−チミジン）の取込みが増加し、ＣＦＳＥの希薄化が増加する。
【００４４】
本明細書に用いられる「流出ブロッカー」としては、限定はしないが、ＰＫ１１１９５、シクロスポリンＡ、ＰＳＣ８３３、ベラパミルが挙げられる。
【００４５】
本明細書に用いられる「流出剤」としては、限定はしないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、メソトレキサート、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、デキサメタゾンならびに誘導体、エトポシドおよびタキサン類が挙げられる。
【００４６】
本明細書に用いられる「抗原」とは、免疫系によって認識できるタンパク質またはペプチドのことである。
【００４７】
本明細書に用いられる「抗原特異的」とは、ＭＨＣ分子の文脈で提示されたペプチド断片の養子免疫系による高特異的認識の性質を指す。
【００４８】
本明細書に用いられる「抗体」とは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥおよびそれらの全てのアイソタイプなど、免疫グロブリンの全てのタイプを指す。これらの免疫グロブリンのうちで、ＩｇＭおよびＩｇＧが特に好ましい。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよく、また、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトなど、任意の種が出所源であってもよく、また、キメラ抗体でもよい。例えば、Ｍ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６、４０３−１１  （１９８９）を参照されたい。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号明細書、またはＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に開示された方法に従って作製された組換えモノクローナル抗体でもよい。抗体は、ＳｅｇＡｌら、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に開示された方法に従って作製された特定の抗体によって化学的に構築されてもよい。
【００４９】
本明細書に用いられる「自己免疫疾患」は、限定はしないが、全身性紅斑性狼瘡、橋本病、関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドウ病、血栓性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、アレルギー、喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、腎炎、および低形成貧血などの任意の自己免疫疾患であり得る。例えば、米国特許第７，２７９，１６０号明細書を参照されたい。
【００５０】
本明細書に用いられる「癌」としては、限定はしないが、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、口腔咽頭部癌、鼻咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、肺癌、甲状腺癌、脳の癌、造血系癌（限定はしないが、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、急性リンパ腫および慢性リンパ腫および骨髄性白血病など）および皮膚癌（限定はしないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫など）の任意の病理学的変形物が挙げられる。
【００５１】
本明細書に用いられる「ドナー」とは、迅速流出性Ｔリンパ球または他の細胞産物がそこから得られる個体のことである。
【００５２】
本明細書に用いられる「レシピエント」とは、迅速流出性Ｔリンパ球または他の処置を受ける個体のことである。
【００５３】
混合物中の細胞型の量の記述に本明細書中に用いられる「濃縮化」とは、細胞の混合物を、物理的な処理または工程前の同じ混合物と比較して、「濃縮化」型の数の増加をもたらす物理的な処理または工程に供することである。数が少ない細胞型に関して、これらの細胞を、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍またはそれ以上に富化させることができ、しかも「濃縮化」集団（例えば、濃縮化細胞が、その調製物中の総細胞の少なくとも１、５、１０、２０または３０パーセント、またはそれ以上であり、調製物中の総細胞の４０または５０パーセントまで、またはそれ以上である）において細胞の総数（例えば、Ｔ細胞の総数）は比較的少ないままであってよい。他の実施形態において、「濃縮化」細胞を、調製物中の総細胞の少なくとも４０、５０、６０、７０または８０パーセント、またはそれ以上、調製の際に総細胞の９０、９５、または９９パーセントまたはそれ以上になる点まで濃縮化させることができる。
【００５４】
本明細書に用いられる「毒性剤」とは、限定はしないが、放射性同位元素、治療剤、および毒素または細胞毒素が挙げられる。例えば、米国特許第６，２７４，１１８号明細書を参照されたい。
【００５５】
本明細書に用いられる「放射性同位元素」としては、限定はしないが、２２７Ａｃ、２１１Ａｔ、１３１Ｂａ、７７Ｂｒ、１０９Ｃｄ、５１Ｃｒ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１５３Ｇｄ、１９８Ａｕ、１６６Ｈｏ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９１ｒ、１９１Ｉｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１７７Ｔａ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１１９Ｓｂ、１９７Ｈｇ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、および２１２Ｐｂが挙げられる。
【００５６】
本明細書に用いられる「治療剤」としては、限定はしないが、アドリアマイシン、クロロラムブシル、ダウノルビシン、ロイコボリン、フォリン酸、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ネオカルジノスタチン、メルファラン、ビンブラスチン、マイトシン（Ｍｉｔｏｃｙｎ）、メクロレタミン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、シスプラチン、カンヌスチン、シクロフォスファミド、ブレオマイシン、ビンクリスチンおよびシタラビンが挙げられる。
【００５７】
本明細書に用いられる「毒素」または「細胞毒素」としては、限定はしないが、ジフテリア毒素、リシン毒素、モネンシン、ベルカリンＡ、アブリン、サポリン、ビンカアルカロイド、トリコテセン、およびシュードモナスエキソトキシンＡ、およびポークウィードウィルス蛋白が挙げられる。例えば、米国特許第６，６３０，５７６号明細書を参照されたい。
【００５８】
本明細書に用いられる「薬学的に許容できる」とは、化合物または組成物が、疾患の重症度および治療の必要性に鑑みて過度の有害な副作用なしで本明細書で記載された治療を達成させるために対象に対する投与に好適であることを意味する。
【００５９】
ＩＩ．同定
Ｒｈ１２３流出性ＣＭ集団およびＥＭ集団の同定。任意の組織からのＰＢＭＣまたはＴリンパ球を、既知の技法に従って採取することができ、これには、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＢＳＡ（流出用緩衝液）中、５〜１０μｇ／ｍｌでＲｈ１２３（または代替の同様に流出される蛍光染料）が３０分間氷上で装填され、３回洗浄し、流出用緩衝液中３７℃で３０分間培養した。ビンブラスチン（Ｒｈ１２３流出の競合アンタゴニスト）の存在下で培養した対照サンプルを用いてＲｈ１２３の能動的流出を確立し、ゲートすることができる。次にＰＢＭＣの表面を、蛍光色素結合抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５およびＣＤ６２Ｌに対する）により標識することができ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によりＲｈ１２３ｌｏ流出性のＣＭ集団またはＥＭ集団の同定が可能になる。
【００６０】
ＣＤ１６１ｈｉおよび／またはＩＬ−１８ＲαｈｉのＣＭ集団およびＥＭ集団の同定。インビトロ培養においてＲｈ１２３を迅速に流出させる能力に関する代理マーカーとして、ＣＭ集団およびＥＭ集団におけるＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現を利用することができる。Ｔリンパ球は、任意の組織から既知の技法に従って採取することができ、ＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαに対する蛍光色素結合抗体、および他のマーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５およびＣＤ６２Ｌに対する）により標識することができ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、ＣＤ１６１ｈｉおよび／またはＩＬ−１８Ｒαｈｉ流出性のＣＭ集団（ＣＭｈｉ）またはＥＭ（ＥＭｈｉ）集団の同定が可能になる。
【００６１】
ＩＩＩ．単離
Ｒｈ１２３−流出性のＣＭ集団およびＥＭ集団の単離。任意の組織からのＰＢＭＣまたはＴリンパ球を、既知の技法に従って採取することができ、例えば、フローサイトメトリー、免疫磁気分離および／またはアフィニティー結合におけるなど、抗体に対するアフィニティー結合などの既知の技法により濃縮化または枯渇させることができる。例えば、陽性免疫磁気分離によりＣＤ８＋ＣＴＬを単離することができる。陽性選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞フラクションには、流出用緩衝液中、５〜１０μｇ／ｍｌでＲｈ１２３（または代替の同様に流出される蛍光染料）が３０分間氷上で装填され、これを３回洗浄し、流出用緩衝液中３７℃で３０分間培養することができる。ビンブラスチン（Ｒｈ１２３流出の競合アンタゴニスト）の存在下で培養した対照サンプルを用いてＲｈ１２３の能動的流出を確立し、ゲートすることができる。次にＰＢＭＣを、抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５およびＣＤ６２Ｌに対する）により標識することができ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８α＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ流出性のＣＭｈｉ集団またはＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８α＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ流出性のＥＭｈｉ集団の同定および単離が可能になる。
【００６２】
ＣＤ１６１ｈｉおよび／またはＩＬ−１８ＲαｈｉのＣＭ集団およびＥＭ集団の単離。インビトロ培養においてＲｈ１２３を迅速に流出させる能力に関する代理マーカーとして、ＣＭ集団およびＥＭ集団におけるＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαの高発現を利用することができる。任意の組織からのＴリンパ球を、既知の技法に従って採取することができ、例えば、フローサイトメトリー、免疫磁気分離および／またはアフィニティー結合におけるなど、抗体に対するアフィニティー結合などの既知の技法により濃縮化または枯渇させることができる。例えば、陽性免疫磁気分離によりＣＤ８＋ＣＴＬを単離することができる。陽性に選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞フラクションを、抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαに対する）により標識することができ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８α＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ１６１ｈｉ流出性ＣＭｈｉ集団またはＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８α＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＩＬ−１８Ｒαｈｉ流出性ＣＭｈｉ集団またはＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８α＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ１６１ｈｉ流出性ＥＭｈｉ集団あるいはＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８α＋／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＩＬ−１８Ｒαｈｉ流出性ＥＭｈｉ集団の同定および単離が可能になる。
【００６３】
ＩＶ．キット類
本発明の方法（特に細胞集団を同定するステップまたは単離するステップ）の全てまたは一部を実施するのに有用なキット類は、種々の形態のいずれかを取ることができる。一般にキット類は、この操作に必要な抗体または抗体結合体を含むと考えられる。これらの細胞の単離は、多段階工程である。所望の製品（純粋なＣＤ８＋ＣＭｈｉ細胞、純粋なＣＤ８＋ＥＭｈｉ細胞または濃縮化されたＣＤ８＋ＣＭｈｉ細胞およびＥＭｈｉ細胞）およびＣＭｈｉならびにＥＭｈｉ（Ｒｈ１２３流出性および／またはＣＤ１６１ｈｉ  および／またはＩＬ−１８Ｒαｈｉ）の同定方法に応じてキットの多数の組合せが可能である。このキットは、Ｒｈ１２３流出性集団または非流出性集団の同定および分析用、Ｒｈ１２３流出性集団または非流出性集団の非臨床グレードまたは臨床グレードの単離用に使用することができる。このキットは、任意の好適な容器に包装でき、任意に本明細書に記載された方法の全てまたは一部を実施するための取扱説明書を含むことができる。それ故、キットは、限定はしないが、以下のステップの任意の組合せに必要な任意の構成要素を含むであろう：
ｉ）記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の最初の同定、濃縮化および／または単離（陽性または陰性免疫磁気選択または細胞選別）
ｉｉ）免疫磁気分離後の混入細胞（例えば、非ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗体、ストレプトアビジン−蛍光色素結合体、ヤギ抗マウス蛍光色素結合体）の除去
ｉｉｉ）ＣＭおよびＥＭのサブセットの同定、濃縮および／または単離（例えば、蛍色素結合ＣＤ９５およびＣＤ６２Ｌ）
ｉｖ）流出性（Ｒｈ１２３／流出用緩衝液／流出ブロッキング剤）またはＣＤ１６１ｈｉ集団および／またはＩＬ−１８Ｒαｈｉ集団の同定、濃縮および／または単離。
【００６４】
Ｖ．治療用の組成物と方法
ＣＭｈｉ細胞およびＥＭｈｉ細胞は、自家設定、同種設定または同系設定に使用することができる。ＣＭｈｉ集団およびＥＭｈｉ集団は、限定はしないが、以下の適応のために使用するかまたは標的にすることができる：
ａ）癌、感染症または免疫不全における抗原特異的免疫性の移入用
ｂ）自己免疫疾患、移植片対宿主病または移植片拒絶における免疫性の消失標的化用
ｃ）治療遺伝子送達用。
【００６５】
ＶＩ．抗原特異的免疫性の移入
いくつかの実施形態において、本発明のリンパ球を用いて個体に免疫性を付与することができる。「免疫性」とは、リンパ球応答が向けられる病原体による感染に対するかまたは腫瘍に対する応答に関連する１つ以上の因子の増加を意味する。
【００６６】
本発明により治療を受けることのできる対象はヒトである。対象は、男性であっても女性であってもよく、乳児、小児、青年、成人、および老人など、任意の好適な年令であってもよい。
【００６７】
治療を受けることができる対象としては、限定はしないが、造血癌、結腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、皮膚癌（黒色腫を含む）、骨癌、および脳の癌などを含む癌罹患対象が挙げられる。いくつかの実施形態において、知られている腫瘍関連抗原としては、限定はしないが、黒色腫、乳癌、扁平上皮癌、結腸癌、白血病、骨髄腫および前立腺癌が挙げられる（これらの実施形態において、Ｔ細胞受容体遺伝子を導入することによって記憶Ｔ細胞を単離または操作することができる）。他の実施形態において、操作された免疫受容体を発現する遺伝子修飾Ｔ細胞により腫瘍関連抗原を標的にすることができる。例としては、限定はしないが、Ｂ細胞リンパ腫、乳癌、前立腺癌、および白血病が挙げられる。
【００６８】
治療を受けることができる対象としてはまた、限定はしないが、ウィルス、細菌および原生動物の感染症などの感染症に罹患しているか、またはその発症の危険性のある対象が挙げられる。
【００６９】
治療を受けることができる対象としては、限定はしないが、ウィルス性感染症罹患の移植患者など、免疫不全患者が挙げられる。このようなウィルス性感染症としては、限定はしないが、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）感染症、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）感染症、アデノウィルス感染症、インフルエンザ感染症またはパラインフルエンザ感染症、水痘、ヒトヘルペスウィルスタイプ６（ＨＨＶ６）感染症またはＨＨＶ７感染症、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）感染症またはＢＫポリオーマウィルス感染症が挙げられる。
【００７０】
上記のとおり調製された細胞を、当該開示（例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらに対する米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号明細書を参照；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号明細書もまた参照；Ｒｉｄｄｅｌｌに対する米国特許第６，０４０，１７７号明細書もまた参照）に基づいて当業者に明らかである既知の技法またはその変法に従って養子免疫療法に関する方法および組成物に利用することができる。
【００７１】
自家レシピエント、同種レシピエントまたは同系レシピエントの治療にＣＭｈｉおよびＥＭｈｉを使用することができ、インビボ刺激の存在または不在下で採取でき、インビトロ操作してまたはそれ無しで投与できるか、または投与後のインビボ刺激でまたはそれ無しで投与できる。
【００７２】
ＣＭｈｉおよび／またはＥＭｈｉの採取前のインビボ刺激としては、限定はしないが、薬物、ワクチンまたはサイトカインの使用を挙げることができる。インビトロ操作としては、限定はしないが、培養または他の方法、サブセットの濃縮、抗原特異的濃殖、増殖、フィーダー細胞（例えば、照射ＬＣＬまたはＰＢＭＣ）処理、サイトカイン処理、抗体処理、小型分子処理または抗原特異的ＴｃＲ遺伝子または他の治療遺伝子、自殺遺伝子および／またはノックダウン遺伝子による形質導入の任意の組合せを挙げることができる。インビボ刺激としては、限定はしないが、市販のワクチンまたは研究用細胞試薬または非細胞試薬によるワクチン接種、サイトカイン投与または薬物投与を挙げることができる。
【００７３】
ＣＭｈｉ細胞またはＥＭｈｉ細胞を、単離および濃縮して、またはそれらをせずに注入することができる。濃縮または単離の使用と方法は、製品の要件を反映する。いくつかの実施形態において、ドナーまたは培養培地から先ず細胞を採取することによりそれらを製剤化し、次いで洗浄し、投与に好適な媒質および容器の系（「薬学的に許容できる」担体）中で治療的有効量に細胞を濃縮する。好適な注入媒質は、生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）、水中５％デキストロースまたはリンゲル乳酸塩などの任意の等張性媒質製剤であり得る。注入媒質には、ヒト血清アルブミン、ヒト血清または他の栄養物が補給され得る。
【００７４】
注入される細胞量は可変性であり、濃縮またはインビトロ増殖が非存在下での＜１０個の抗原特異的細胞から濃縮およびインビトロ増殖後の１０１２個超の細胞までの範囲であり得る（例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌらに対する米国特許第６，０４０，１７７号明細書、１７欄を参照）。細胞を、単回注入またはある時間の範囲にわたる複数注入により投与できる。しかしながら、異なる個体では応答性の変化が予想されることから、注入される細胞型および量、投与経路、注入回数および複数注入が投与される時間範囲は、環境、身体検査および検査室検査により示され（ｄｉｃｔａｔｅ）、担当医により決定される。
【００７５】
養子免疫療法における本発明の使用の代表的な例は、同種または自家の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の環境における治療と考えられる。厳しい免疫抑制の環境において、同種および自家のＨＳＣＴ患者は、日和見感染症に罹る危険性が大きい。本発明を用いて、生命を脅かす可能性のある感染症に対して患者を防御するために免疫記憶をレシピエントに移入させることができる。ＣＭｈｉ細胞およびＥＭｈｉ細胞を、移植ドナー（同種ＨＳＣＴの場合）または患者（自家ＨＳＣＴの場合）から単離し、感染症関連抗原に対する特異性に関して選択または操作し、増殖または増殖せずに、移植環境の後に患者に戻すことができる。このサブセットは、移植後のリンパ球減少環境下で分化または分化せずに増殖して、免疫記憶を再構成すると考えられる。感染症に特異的なＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの選択により、移植片対宿主病を引き起こすことなく免疫の再構成が可能になるであろう。
【００７６】
ＶＩＩ．消失標的化（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｂｌａｔｉｏｎ）
本発明のさらなる態様は、自己免疫疾患または移植片対宿主病に対する治療としてヒト対象における能動的流出性ＣＭｈｉ細胞および／またはＥＭｈｉ細胞を選択的に枯渇させることによりヒト対象における長命な記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を消失させる方法である。疾患の治療に有効な量でＣＤ１６１および／またはＩＬ−１８Ｒαに選択的に結合する抗体を対象に投与するか、または細胞毒性剤と組み合わせた薬物流出の阻害剤を投与することなど、任意の好適な技法により、この選択的枯渇を実施することができる。
【００７７】
抗体（任意のイソタイプのモノクローナルまたはポリクローナルのいずれか）、または抗体を含有する医薬組成物を、複数の種々の担体中で製剤化することもできるし、または限定はしないが、当技術分野に知られている放射性同位元素、リシンまたはジフテリア毒素など、多数の可能な毒素に結合させることができる。抗体を、限定はしないが、静脈内、腹腔内または槽内などの種々の経路により投与することができよう。本発明の治療的抗体は、好適なスケジュールで疾患の治療に有効な量で投与されるが、当技術分野に知られているように、これらは、具体的な疾患、製剤、投与経路、および対象の状態により幾らか変わり得る。
【００７８】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、細胞毒性剤流出の阻害剤と組み合わせて細胞毒性剤の投与により消失させることができる。インビトロ試験により、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、化学療法誘導アポトーシスから防御され、この防御は、ＡＢＣ共輸送体（薬物流出ポンプ）阻害の存在下で失われることが示されている。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉからの細胞毒性剤流出の防止を用いて、インビボでこれらの細胞集団を減少または消失させることができる。細胞毒性剤および薬物流出阻害剤を、当技術分野に知られている承認プロトコルまたは新規プロトコルで投与することができる。
【００７９】
ＶＩＩＩ．治療用遺伝子送達
いくつかの実施形態において、本発明のリンパ球を用いて治療用遺伝子を個体に送達することができる。治療用遺伝子としては、限定はしないが、遺伝子コード化共刺激分子（例えば、ＣＤ８０）または阻害分子（ＰＤ−Ｌ１）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−７）、アポトーシス誘導シグナルまたは先天性欠損または異常遺伝子（例えば、重症の血友病におけるＶＩＩＩ因子遺伝子）が挙げられるであろう。抗原特異的ＴｃＲをコードする遺伝子をトランスフェクトしたＴ細胞の送達は、「抗原特異的免疫性の移入」で上述されている。
【００８０】
治療用遺伝子送達のための単離、インビトロ操作、製剤化および投与は、「抗原特異的免疫性の移入」で上述されているように、同様の考慮事項を包含する。単離Ｔ細胞に対する遺伝子送達は、インビトロで実施される可能性が高いと考えられるが、インビボで長命記憶細胞を標的にする方法を含むことができる。遺伝子送達のための組換え感染性ウィルス粒子の利用は、本発明のＴリンパ球の形質導入に対する好ましいアプローチである。この方法で用いられているウィルスベクターとしては、シミアンウィルス４０、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）、レトロウィルスおよびレンチウィルスに由来するウィルスベクターならびにそれらの修飾物が挙げられる。このように遺伝子移入および発現方法は多数あるが、本質的には、哺乳動物細胞において遺伝子物質を導入し、発現させるために機能する。他にもあるが、特に、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、および組換えアデノウィルス、アデノ関連ウィルスおよびレトロウィルスによる感染などの上記技法のいくつかを用いて、造血細胞またはリンパ球系細胞に形質導入した。主要なＴリンパ球は、電気穿孔、レトロウィルス感染およびレンチウィルス感染により首尾よく形質導入された。
【実施例】
【００８１】
実施例１：ＣＭ集団およびＥＭ集団は、Ｒｈ１２３を迅速に流出し、ＣＤ１６１ｈｉおよびＩＬ−１８Ｒαｈｉであるサブセットを含有する。
ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離し、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ウシ血清アルブミン（本明細書で流出用緩衝液として知られている）中で洗浄し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＰＢＭＣを氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、ビンブラスチンの存在または非存在下で予め温めた流出用緩衝液中で３７℃、３０分間再懸濁し、この３０分後に、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で一度洗浄し、氷上でＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１６１およびＩＬ−１８Ｒαに対する抗体で２０分間標識した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄後、サンプルをＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローサイトメーター上で分析した。
【００８２】
ＣＭおよびＥＭのサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋の集団中、それぞれＣＤ６２Ｌ＋またはＣＤ６２Ｌ−事象として同定した。Ｒｈ１２３蛍光は、適切な補正および４８８ｎｍでのレーザー励起後の５３０／３０発光フィルタにより同定した。Ｒｈ１２３流出事象は、ビンブラスチンの流出遮断の存在下での培養後に同定された平均蛍光強度よりも低い蛍光を有するものとして定義された。
【００８３】
多くのリンパ球は、Ｒｈ１２３を流出させる能力を有しているが；ＣＭ  ＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＥＭ  ＣＤ８＋Ｔリンパ球の小型サブセットだけが、３０分間にわたってＲｈ１２３を迅速に流出させる能力を有していることを、図１の結果が立証している。流出は、ＭＤＲ−１およびＭＲＰ−１用の非蛍光基質であるビンブラスチンにより遮断され、これはＲｈ  １２３流出の特異性を示す。Ｒｈ  １２３を迅速に流出させるＣＭ細胞およびＥＭ細胞は、高レベルのＩＬ−１８αおよびＣＤ  １６１を発現する。
【００８４】
実施例２：ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＴｃＲαβ＋およびＴｃＲγδである。Ｖα２４に対する制限はない。それらは、主としてＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＯｉｎｔ／ｈｉ、ＣＤ９５＋、ＣＤ８α＋、ＣＤ８β＋／ｎｅｇ、ＣＤ２５ｎｅｇ、ＣＤ２７＋、ＣＤ５６ｐｏｓ／ｎｅｇ、ＣＤ５７ｎｅｇ、ＣＤ２８ｈｉ、ＣＤ１２２＋、ＣＤ１２７ｈｉ、ＰＤ−１ｎｅｇ、ＣＤ１０３ｎｅｇ、ＮＫＧ２Ｄｉｎｔ／ｌｏ、パーフォリンｌｏ／ｉｎｔ、グランザイムＡｉｎｔ、グランザイムＢｎｅｇ、Ｋｉ６７ｎｅｇ、ｂｃｌ−ｘＬｈｉおよびｂｃ１−２ｈｉである。
【００８５】
ＰＢＭＣは、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。表面標識は、氷上で２０分間示したＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１６１に対する抗体および他の抗体を用いて実施した。冷ＰＢＳ中で洗浄後、表面標識サンプルをＢＤ  ＬＳＲ−２フローサイトメーター上で分析した。細胞内染色サンプルをＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ中で固定してから、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／洗浄用緩衝液中で洗浄し、透過化処理し、標識し、次いで上記のとおり分析した。
【００８６】
ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋集団およびＣＤ９５＋集団中、それぞれＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ１６１ｈｉ事象として同定した。
【００８７】
図２ａ〜ｃ）の結果は、ＣＤ８＋ＴｃＲαβ＋Ｔ細胞のＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットのユニークな表現型を示している。この表現型は、記憶集団と合致し、Ｚｈａｎｇら（Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ２００５）により記載されたマウス記憶幹細胞と類似している。この表現型は、ＮＫ細胞および不変ＮＫＴ細胞など、他の特性化されたリンパ球系集団に関して予想されたものとは異なる。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは同様の表現型を有するが、ＣＤ６２Ｌの発現により免疫表現的に区別することができる。明瞭にするために、ＥＭｈｉの表現型だけが、図２ａ）およびｂ）に示されている。図２ｃ）では、試験された全てのドナーからのＣＭｌｏおよびＥＭｌｏと比較して、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉにおいてｂｃｌ−２およびｂｃｌ−ｘｌのより高い発現ならびにＫｉ６７のより低い発現を例示するために示している。
【００８８】
実施例３：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、非対称的に分裂するＣＤ８＋Ｔ細胞の遠位極または分極ＣＤ８＋Ｔ細胞の尾肢からの誘導を示唆する表面表現型を有する。
ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離し、流出用緩衝液中で洗浄し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで５μｇ／ｍｌのローダミン１２３と共に再懸濁した。ＰＢＭＣを氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中で３７℃、３０分間再懸濁し、この３０分後に、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で一度洗浄し、氷上でＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１６に対する抗体およびＣＤ１１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ１４８またはＣＤ１６２のいずれかに対する抗体で２０分間標識した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄後、サンプルをＢＤ
ＦａｃｓＡＲＩＡフローサイトメトリー上で分析した。ＣＭサブセットおよびＥＭサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡｉｎｔ／ｎｅｇ／ＣＤ４５ＲＯ＋集団中、それぞれＣＤ６２Ｌ＋事象またはＣＤ６２Ｌ−事象として同定した。実施例１に記載したように迅速流出の確立を実施した。
【００８９】
図３において、ＣＭｈｉは、分裂ＣＤ８＋Ｔ細胞の「記憶」遠位極または分極ＣＤ８＋Ｔ細胞の尾肢からの誘導と一致する表現型を有することを示している。ＣＭｈｉの表現型は、ＥＭｈｉの表現型と同様であり−明瞭にするために、ＣＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞上に導かれたＦＡＣＳプロファイルだけを示している。ＣＭｈｉおよびＣＭｌｏ集団のＭＦｌを赤で示している。適切な共刺激分子および／または接着分子の存在下でＴｃＲシグナル伝達後、免疫シナプスが、ＡＰＣとＴ細胞との間で形成する。ＣＤ８およびＣＤ１１ａ（他の細胞表面タンパク質の中で）は、能動的に免疫シナプスに局在化し（「近位マーカー」）、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ１４８およびＣＤ１６２は、シナプスから除外され、遠位極複合体（「遠位マーカー」）を形成する。遠位極複合体である尾肢と同様の構造もまた、ケモカインによるいくつかのＴ細胞の刺激に対して形成され、細胞表面マーカーの同様の発現パターンを有する。これらの表面分子が、第一の細胞分裂までかまたは細胞分裂を越えて、免疫シナプスまたは尾肢の内または外に局在化したままであるかどうかは知られていないが；ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの表現型は可変性ではあるが、分裂記憶細胞または尾肢の遠位極から誘導される細胞集団と合致し得ると考えられる。
【００９０】
実施例４：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、それらの非流出性対応物よりも高レベルのＭＤＲ−１ｍＲＮＡを発現し、蛍光化学療法薬であるダウノルビシンを能動的に流出する。
図４ａ）において、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉならびにそれらの非流出性ＩＬ−１８Ｒαｌｏ／ｎｅｇの対応物（ＣＭｌｏおよびＥＭ１ｏ）を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の陰性免疫磁気選択を用いて非ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するビオチン化抗体により単離し、次いで蛍光色素結合ストレプトアビジンで表面標識して非ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＩＬ−１８Ｒαを同定し、ＢＤ  ＦａｃｓＡＲ１Ａフローソーター上で選別した。ＣＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＥＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれストレプトアビジン−／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ＋またはストレプトアビジン−／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ−として規定した。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、ＩＬ−１８Ｒαの高発現により確定した。単離されたＣＭｈｉ、ＣＭｌｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏサブセットにおけるｍｄｒ１の発現は、以下のプライマーおよびプローブを用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応により判定した：ＭＤＲ１順方向−ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＴＡ；ＭＤＲ１逆方向−ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＴＴＴ  ＣＴＧ；ＭＤＲ１プローブ−６ＦＡＭ−ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＣＣＣ  ＴＧＧ−ＴＡＭＲＡ。示された結果を、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化する。３名の正常ドナーからの平均値／ＳＥを示す。
【００９１】
図４ｂ）において、ＰＢＭＣを、流出用緩衝液中１×１０６／ｍｌで再懸濁し、これに、２．５μＭで蛍光化学療法薬であるダウノルビシンを３７℃で２０分間装填してから、３回洗浄し、２５μＭのビンブラスチンの存在または非存在下で３７℃、１時間流出させた。次にＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で一度洗浄し、氷上でＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１またはＩＬ−１８Ｒαに対する抗体で２０分間標識した。氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄後、サンプルをＢＤ  ＬＳＲ−２フローサイトメーター上で分析した。
【００９２】
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、ＭＤＲ−１、Ｒｈ１２３およびダウノルビシンの特異的かつ能動的な流出に関係するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）共輸送体に対するｍＲＮＡを高レベルで発現することを、データは示している。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉ（ＩＬ−１８ＲαまたはＣＤ１６１の高発現により確定）が、化学療法薬を能動的かつ特異的に流出させる能力は、ＭＤＲ−１タンパク質に対する競合アンタゴニストであるビンブラスチンの存在下での流出阻止により示される。阻止はまた、２つの他のＭＤＲ−１チャネルブロッカーであるＰＫ１１１９５およびシクロスポリンＡにより達成された（データは示していない）。
【００９３】
実施例５：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、インビトロでのダウノルビシン誘導アポトーシスに対して抵抗性である。
ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉならびにそれらの非流出ＩＬ−１８Ｒαｌｏ／ｎｅｇ対応物（ＣＭｌｏおよびＥＭ１ｏ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の陰性免疫磁気選択を用いて非ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するビオチン化抗体により単離し、次いで蛍光色素結合ストレプトアビジンで表面標識して非ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＩＬ−１８Ｒαを同定し、ＢＤ  ＦａｃｓＡＲ１Ａフローソーター上で選別した。ＣＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＥＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれストレプトアビジン−／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ＋またはストレプトアビジン−／ＣＤ９５＋／ＣＤ６２Ｌ−として確定した。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、ＩＬ−１８Ｒαの高発現により確定した。流出性および非流出性のＣＭサブセットおよびＥＭサブセットを、ダウノルビシン（ＡＢＣ−Ｂ１共輸送体、ＭＤＲ−１により流出させたアントラサイクリン化学療法剤）の存在または不在下、末梢神経ベンゾジアゼピン受容体アンタゴニストのＰＫ１１１９５によるＭＤＲ−１遮断を用いてまたは用いずに４４時間培養した。培養物を採取し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶおよびＤＡＰＩで染色してから分析した。
【００９４】
図５における結果により、ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、薬理学的濃度（０．１μＭ）でダウノルビシンでの培養により誘導されたアポトーシスに抵抗性であることを示している。化学療法抵抗性は、ＰＫ１１１９５によるＭＤＲ−１の阻害が細胞死の増加をもたらす流出ポンプにより媒介される。ＰＫ１１１９５単独による培養は、生存率を損なわない。
【００９５】
実施例６：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、ホメオスタティックサイトカインであるＩＬ−７およびＩＬ−１５に応答して分裂し、補足サイトカインの不在下での培養後に高生存率を有する。
図６ａ〜ｃ）において、ＰＢＭＣは、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて陽性選択し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中で３７℃、３０分間再懸濁した。ビンブラスチンを対照サンプルに加えて流出の存在を確立した。次にＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で１回洗浄し、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴｃＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する蛍光色素結合抗体で標識した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。ゲーティング方法を図６ａ）に示す。ＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローソーターを用いてサブセットを単離し、ＩＬ−７に応答する増殖は、３Ｈ−チミジンの取込みまたはＣＦＳＥ希釈アッセイにより判定した。ＩＬ−１５に応答する増殖は、ＣＦＳＥ希釈アッセイにより判定した。３Ｈ−チミジンの増殖アッセイは、ＩＬ−７で補足されたＣＴＬ培地中で５日間培養し、次いで３Ｈ−チミジンで一晩パルスしてから、採取し、カウントすることにより実施した。ＣＦＳＥ希釈アッセイは、細胞にＣＦＳＥを装填し、１０日間培養してから生存率をＤＡＰＩで標識し、ＢＤ  ＬＳＲ２フローサイトメーター上で分析することにより実施した。
【００９６】
図６ｄ）において、誘導療法の最下点（１１日目から２２日目）でリンパ球が減少していない健常ドナー（ｎ＝８）またはリンパ球減少の急性骨髄性白血病患者（ｎ＝６）からのＰＢＭＣを、実施例２に記載されたとおり、記憶サブセット上のＫｉ６７発現に関して分析した。リンパ球が減少していない健常ドナーとリンパ球減少の患者との間のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのＫｉ６７発現パーセントの倍率変化を示している。
【００９７】
この結果は、ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットが、細胞周期に入り、ＩＬ−７（図６ｂ）およびＩＬ−１５（図６ｃ）の刺激に応答する分裂を行う能力を有することを示している。ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉはまた、リンパ球が減少した化学療法患者におけるＣＭｌｏおよびＥＭｌｏよりも細胞周期に、より有効に動員され（図６ｄ）、リンパ球減少を誘導するＩＬ−７およびＩＬ−１５媒介増殖に対する感受性が高いことが示唆される。さらに、補足サイトカインの不在下での培養において、ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、それらの非流出性対応物よりも高い生存度を維持する（図６ｂ）。ＩＬ−７およびＩＬ−１５は、記憶Ｔ細胞の長命記憶および生存の維持にとって重要であり、ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＩＬ−７およびＩＬ−１５によるシグナル伝達に感受性である。
【００９８】
実施例７：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、ＯＫＴ３によるポリクローナルＴｃＲ刺激に応答してそれらの非流出性対応物と比較し、３Ｈ−チミジン取り込みの減少を示し、図７に示されるように共刺激後に回復させることができる。
ＣＭｈｉ、ＣＭ１ｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏを、実施例６に記載されたとおり単離した。ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８常磁性ビーズを用いて陽性に選択し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中でビンブラスチンを用いてまたは用いずに３７℃、３０分間再懸濁した。３０分後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で１回洗浄し、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴｃＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する蛍光色素結合抗体で標識した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲｇｄ−／Ｖａ２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。ＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローソーターを用いてサブセットを単離し、指定された条件で２００μｌ  ＣＴＬ中、１ウェル当り１０，０００〜３０．０００個の細胞で９６ウェルプレート内で培養した。ＯＫＴ３を１ウェル当り１００μｌのＰＢＳ中１０００ｎｇ／ｍｌで４℃、６時間インキュベートすることによりプレート結合させ、次いで２００μｌの冷ＰＢＳで２回洗浄してから、選別されたサブセットを平板培養した。抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌで）を、上記のとおりＯＫＴ３と共にプレート結合させた。サイトカイン濃度は以下のとおりであった：ＩＬ−７、２ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−１２、１０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−１５、１ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−１８、８０ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−２３、１０ｎｇ／ｍｌ。サイトカイン共刺激の不在下、サイトカインでの培養は最少増殖をもたらした。ＩＬ−１２単独によるかまたはＯＫＴ３／ＩＬ−１２によるＣＭｈｉサブセットの増殖に関するデータは入手できない。
【００９９】
実施例８：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、それらの非流出性対応物と比較して、異なるサイトカイン分泌プロファイルを有する。
ＣＭｈｉ、ＣＭ１ｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏを、実施例６に記載されたとおり単離した。ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８常磁性ビーズを用いて陽性に選択し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中でビンブラスチンを用いてまたは用いずに３７℃、３０分間再懸濁した。３０分後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で１回洗浄し、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する蛍光色素結合抗体で標識した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖａ２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。ＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローソーターを用いてサブセットを単離し、２００μｌ  ＣＴＬ培地中、１ウェル当り６０，０００個の細胞で平板培養した。ポリクローナル刺激は、単離サブセットをＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）／イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）またはプレート結合ＯＫＴ３／抗ＣＤ２８（実施例７に記載されたとおり調製した）と共に２０時間培養することにより実施した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｒｒａｙアッセイを用いて培養物上澄液中でサイトカイン分泌を検出した。
【０１００】
これらの実験により、ポリクローナル刺激に応答したＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、それらの非流出性対応物よりも、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＭＩＰ−１αの分泌が少なく、ＩＬ−１７の分泌が多いことを示している。
【０１０１】
実施例９：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、それらの非流出性対応物と比較して、イオノマイシンに応答してカルシウム流出を減少させた。
ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により室温で分離し、Ｉｎｄｏ−ｌＡＭ（Ｓｉｇｍａ）１０μＭおよびプロベニシド４ｍＭで補足されたＣＴＬ培地中、ｌ×１０７／ｍ１で３７℃、３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣをＣＴＬ培地中、２５℃で１回洗浄した。表面標識は、ＣＴＬ培地中、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する抗体により室温で１０分間実施した。ＣＴＬ培地中室温で洗浄後、表面標識サンプルを３７℃に４分間温めた後、ＵＶ、紫色、青色、緑色および赤色レーザーを備えたＢＤ  ＬＳＲ−２フローサイトメーター上で高速捕捉した。３０秒の捕捉後、サンプルを吸引ポートから取り出し、イオノマイシンを５μｇ／ｍｌの最終濃度に加え、サンプルを戻し、捕捉を２０，０００事象／秒で継続した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。相対的細胞内カルシウム濃度は、ＵＶバイオレット（４０５ｎｍ）検出器：ＵＶブルー（５０５ｎｍ）検出器におけるＩｎｄｏ−１ＡＭ蛍光の比率として測定され、適切にゲートされたサブセットについての平均比率対時間（秒数）としてプロットする。
【０１０２】
この実験により、ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、それらの非流出性対応物と比較して、カルシウムイオノフォア、イオノマイシンに応答してカルシウムを流動させる異なる能力を有することを実証する。カルシウムフラックスは、抗原特異的ＴｃＲ連結部から下流の近位シグナル伝達事象である。
【０１０３】
実施例１０：実施例１０に記載されているように、ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、分子スペクトルタイピングによればポリクローナルＴｃＲレパートリーを含む。
ＣＭｈｉ、ＣＭ１ｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏを、実施例６に記載されたとおり単離した。ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８常磁性ビーズを用いて陽性選択し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中でビンブラスチンを用いてまたは用いずに３７℃、３０分間再懸濁した。３０分後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で１回洗浄し、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する蛍光色素結合抗体で標識した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖａ２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。未処置ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５−／ＣＤ６２Ｌ＋事象として同定した。ＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローソーターを用いてサブセットを単離した。
【０１０４】
ＴｃＲ  Ｖβ断片の多重ＲＴ−ＰＣＲおよび  Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析により、単離サブセットおよび未処置ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して分子Ｖβスペクトルタイピングを実施した。
【０１０５】
これらの実験は、流出性ＣＭｈｉサブセットおよび流出性ＥＭｈｉサブセットにおけるポリクローナルＴｃＲ  Ｖβの用法を示し、ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセット内のＣＤ８＋Ｔ細胞は、広範囲の抗原に特異的な可能性がある種々のＴｃＲを発現することを実証している。
【０１０６】
実施例１１：実施例１１に記載されているように、ウィルス抗原のテトラマー陽性細胞を、ＣＭｈｉサブセットならびにＥＭｈｉサブセット内で同定することができ、ＣＭＶ−特異的ＣＴＬ応答、ＥＢＶ−特異的ＣＴＬ応答ならびにインフルエンザ−特異的ＣＴＬ応答を、選別されたＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットから生じさせることができる。
ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。表面標識は、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１６１およびＡＰＣ標識ＨＬＡ−Ａ＊０２０１；ＮＬＶペプチドテトラマーに対する抗体により実施して、ＣＭＶのｐｐ６５抗原からのＮＬＶペプチドに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の同定を可能にした。冷ＰＢＳ中で洗浄後、表面標識サンプルを、ＢＤ  ＬＳＲ−２フローサイトメーター上で分析した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。データは図１１ａ）に示している。
【０１０７】
エキソビボでＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットにまれに見られたテトラマー陽性事象が、ウィルス性抗原特異的ＣＴＬであったことを立証するために、自家活性化ペプチドパルス化単球由来のＤＣ（ＭｏＤＣ）との培養により単離ＣＭｈｉサブセットおよび単離ＥＭｈｉサブセットから、抗原特異的ＣＴＬをインビトロで増殖させた。ＣＭｈｉ、ＣＭ１ｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏを、実施例６に記載されたとおりに単離した。ＭｏＤＣは、ＣＤ１４特異的常磁性ビーズを用いて単離されたＣＤ１４＋単球と、ＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）とで５日間培養することにより生じさせた。成熟ＭｏＤＣは、さらにＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）／ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍ１）、ＰＧＥ２（１０００ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍ１）との培養７日目に生じさせた。活性化ＭｏＤＣは、それぞれＣＭＶ、ＥＢＶまたはインフルエンザに由来するＨＬＡ−Ａ＊０２０１−制限ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬまたはＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドの１μｇ／ｍ１と室温で２時間ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中でパルス化した。ＭｏＤＣをＲＰＭＩ１６４０中で３回洗浄し、使用前に照射した（３５００ｃＧｙ）。
【０１０８】
ＣＭｈｉ、ＣＭ１ｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏサブセットを、ＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ７（１ｎｇ／ｍｌ）および１Ｌ−１５（１００ｐｇ／ｍ１）で補足した２００ｍｌのＣＴＬ培地中、Ｔ：ＤＣ比が４：１で、照射、活性化、ペプチドパルス化ＭｏＤＣと共に９６ウェルプレート中で平板培養した。サイトカインおよび半分の培地交換は、４日目と７日目に実施し、ＣＤ８による分析、ＤＡＰＩおよびテトラマーの染色は、１０日目に実施した。データは図１１ｂ）に示している。
【０１０９】
この実験により、希少なウィルス特異的テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、迅速流出性ＣＭｈｉ集団およびＥＭｈｉ集団内でエキソビボで同定できること、および希少なウィルス抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離された流出性ＣＭｈｉサブセットおよび流出性ＥＭｈｉサブセットのインビトロ刺激後に同定できることが立証されている。流出性ＣＭｈｉおよび流出性ＥＭｈｉが、ＯＫＴ３による刺激（実施例７）に対して抵抗性であるという事実にもかかわらず、増殖は、サイトカインと培養することにより回復させることができる。実施例１１において活性化ＭｏＤＣおよびサイトカイン補足の使用により、インビトロで流出性サブセットから抗原特異的ＣＴＬの増殖が可能になる。
【０１１０】
実施例１２：ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ユニークかつ異なる遺伝子発現プロファイルを有する。
ＣＭｈｉ、ＣＭ１ｏ、ＥＭｈｉおよびＥＭｌｏを、実施例６に記載されたとおり単離した。ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血から密度勾配遠心分離により分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８特異的常磁性ビーズを用いて陽性選択し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中でビンブラスチンを用いてまたは用いずに３７℃、３０分間再懸濁した。３０分後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で１回洗浄し、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する蛍光色素結合抗体で標識した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。ＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローソーターを用いてサブセットを単離した。
【０１１１】
ｃＲＮＡは、単離サブセットから生じさせ、遺伝子発現アレイ試験は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＷＧ−６発現ビードチップアレイを用いて実施した。非流出性ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに関連したＣＭｈｉおよびＥＭｈｉの遺伝子発現関係を説明するために主成分プロット上にデータを表示する。このデータにより、迅速流出性（ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉ）サブセットは、未処置または非流出性記憶（ＣＭｌｏおよびＥＭｌｏ）ＣＤ８＋Ｔ細胞のものとは別個の遺伝子発現プロファイルをもつことを示している。さらに、ＣＭｈｉクラスターおよびＥＭｈｉクラスターの分離により、同様の表現型にもかかわらず、ＣＤ６２Ｌ＋（ＣＭｈｉ）およびＣＤ６２Ｌ−（ＣＭ１ｏ）流出性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、異なる遺伝子発現プロファイルを有することが示唆される。
【０１１２】
実施例１３：ＣＭｈｉおよびＥＭｈｉは、臍帯血では希少であり、成人初期にピークに達し、年令が進むとともに頻度の減少が見られる。
ＰＢＭＣを、新鮮な末梢血または臍帯血から密度勾配遠心分離により分離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて陽性選択し、氷冷流出用緩衝液中、１×１０６／ｍｌで１０μｇ／ｍｌのＲｈ１２３と共に再懸濁した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷上で３０分間インキュベートしてから、氷冷流出用緩衝液中で３回洗浄し、予め温めた流出用緩衝液中で３７℃、３０分間再懸濁した。ビンブラスチンを対照サンプルに加えて流出の存在を確立した。次にＣＤ８＋Ｔ細胞を、氷冷ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で１回洗浄し、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＴＣＲγδ、Ｖα２４、ＣＤ８α、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６１に対する蛍光色素結合抗体で標識した。ＣＭｈｉサブセットおよびＥＭｈｉサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｌｏ／ＣＤ１６１ｈｉ事象としてそれぞれ同定した。ＣＭｌｏサブセットおよびＥＭｌｏサブセットは、ＣＤ４−／ＣＤ１６−／ＴｃＲγδ−／Ｖα２４−／ＣＤ８＋／ＣＤ９５＋集団中のＣＤ６２Ｌ＋／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象またはＣＤ６２Ｌ−／Ｒｈ１２３ｈｉ／ＣＤ１６１ｉｎｔ／ｎｅｇ事象としてそれぞれ同定した。ゲーティング方法を図６ａ）に示す。ＢＤ  ＦａｃｓＡＲＩＡフローサイトメーターを用いてサンプルをアッセイした。ＣＭｈｉ表現型細胞およびＥＭｈｉ表現型細胞の頻度を、成人末梢血と比較した臍帯血にみられるＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとして図１３ａ）に示している。親のＣＭおよびＥＭ区画における流出性細胞（上部）および非流出性細胞（下部）のパーセンテージを図１３ｂ）に示している。各点は、単一の健常ドナーを表す。
【０１１３】
上述のものは、本発明の例示であって、それらの限定として解釈してはならない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、本特許請求の範囲の均等物もそれらに含まれる。
【図１】
2014087372.tif 000007
【図２ａ】
2014087372.tif 000008
【図２ｂ】
2014087372.tif 000009
【図２ｃ】
2014087372.tif 000010
【図３】
2014087372.tif 000011
【図４】
2014087372.tif 000012
【図５】
2014087372.tif 000013
【図６ａ】
2014087372.tif 000014
【図６ｂ】
2014087372.tif 000015
【図６ｃ】
2014087372.tif 000016
【図６ｄ】
2014087372.tif 000017
【図７】
2014087372.tif 000018
【図８】
2014087372.tif 000019
【図９】
2014087372.tif 000020
【図１０】
2014087372.tif 000021
【図１１】
2014087372.tif 000022
【図１２】
2014087372.tif 000023
【図１３ａ】
2014087372.tif 000024
【図１３ｂ】
2014087372.tif 000025
【配列表】
2014087372000001.app
【外国語明細書】
2014087372000001.pdf