(57)【要約】【課題】本発明の目的は、高麗人参の実抽出物を用いて、血行を促進させ、血管内皮細胞の生存を増進し、血管内皮細胞の移動性を促進させ、血管内皮細胞の管形成を促進させることによって血管新生を促進させる組成物と、皮膚老化を抑制し、しわを改善し、皮膚美白と皮膚保湿効果を提供する皮膚美容増進用組成物と、陰茎海綿体平滑筋の強い弛緩作用を誘発する信号伝達物質である一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増加させることによって陰茎の勃起を増進し、この結果、男性性機能を改善させる組成物とを提供することである。【解決手段】高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する皮膚老化抑制用組成物が提供される。【選択図】図１
2014080444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する皮膚老化抑制用組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、エタノール及びその後のブタノールの順次抽出物である、請求項１に記載の皮膚老化抑制用組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、油除去抽出物である、請求項２に記載の皮膚老化抑制用組成物。
【請求項４】
前記油除去が、前記エタノール抽出と前記ブタノール抽出の間である、請求項３に記載の皮膚老化抑制用組成物。
【請求項５】
高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する皮膚しわ改善用組成物。
【請求項６】
前記抽出物が、エタノール及びその後のブタノールの順次抽出物である、請求項５に記載の皮膚しわ改善用組成物。
【請求項７】
前記抽出物が、油除去抽出物である、請求項６に記載の皮膚しわ改善用組成物。
【請求項８】
前記油除去が、前記エタノール抽出と前記ブタノール抽出の間である、請求項７に記載の皮膚しわ改善用組成物。
【請求項９】
高麗人参の実エタノール抽出物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物。
【請求項１０】
前記抽出物が、エタノール及びその後のブタノールの順次抽出物である、請求項９に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１１】
前記抽出物が、油除去抽出物である、請求項１０に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１２】
前記油除去が、前記エタノール抽出と前記ブタノール抽出の間である、請求項１１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、皮膚を保湿する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、高麗人参の実エタノール抽出物を、前記組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％の範囲で含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高麗人参の実抽出物を有効成分として含有する血行促進用組成物、血管老化防止用組成物、血管炎症治療用組成物、血管生成促進用組成物、虚血性心疾患治療用組成物、局所の血流不足の改善及び治療用組成物、皮膚美容増進用組成物、及び男性性機能改善用組成物に関する発明である。より詳しくは、本発明は、高麗人参の実抽出物を有効成分として含有し、血管内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）の生成を促進させ、血管内皮細胞の生存を改善させ、血管内皮細胞の移動性を増加させて血管形成による血管新生を促進させ；また、内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）の生成を促進させることで陰茎海綿体を弛緩させるとともに陰茎の勃起を増進させ、この結果、男性性機能を改善させ；抗酸化効果を与え、コラーゲン生合成の促進及びＭＭＰ−１の抑制により皮膚老化を防止し、しわを改善し、メラニン合成の阻害による皮膚美白効果を示し、皮膚保湿効果を示す組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高麗人参（Panax ginseng C.A.Meyer）は、ウコギ科の高麗人参属に属する植物であって、韓国や中国、日本等において約２、０００年前から使われてきた生薬で、経験的に疾病を予防し寿命をのばす目的で使われている。今までに、高麗人参は次の効能及び効果：中枢神経系に対する陽性作用、抗発癌作用、抗癌活性、免疫機能調節作用、抗糖尿作用、肝機能亢進効能、心血管障害の改善、抗動脈硬化作用、血圧調節作用、更年期障害の改善、骨粗鬆症の改善、抗ストレス及び抗疲労作用、抗酸化活性及び老化抑制効能などを有することが分かっている（最新高麗人参「成分及び効能編」、韓国人参煙草研究院、56−112, 1996）。
【０００３】
高麗人参の代表的な有効成分であるジンセノサイド（Ginsenoside）は、高麗人参の地上及び地下部に均一に分布しており、特に高麗人参の根、高麗人参の葉及び高麗人参の実などの部位に応じてジンセノサイドの含量が異なり、また組成も異なることが知られている（Attele AS et al, Biochem Pharmacol., 58; 1685-1693, 1999）。その中でも高麗人参の実は、ジンセノサイドの特有の含量と組成を有するため、高麗人参の根より優れた抗糖尿効能を示すと報告された（Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003）。
【０００４】
高麗人参の実は、昔から高麗人参の他の部位よりも貴重なものと取り扱われ、種子の獲得を目的として選別され収獲されてきた。高麗人参の実は、栽培４年目の４年根から１回だけ採種する。３年根のものから採種すると、種子が小さすぎて良い苗を生産しにくくなる。５年根以上のものから採種すると、種子は丈夫であるがその根は十分に成長しないであろうし、また組織が緻密でないため高品質の紅参を製造することが難しい。また栽培期間中に２回以上採種すると、紅参の数量及び品質が大きく低下する（最新高麗人参「栽培編」、韓国人参煙草研究院、130-131、 1996）。
【０００５】
血液循環については、特に末梢血液循環については、毛細血管の拡張が必須であるといえる。すなわち、血管での血流増加は、必ず血管の拡張を必要とする機序であり、血管を拡張させるためには、ｅＮＯＳ（内皮一酸化窒素合成酵素）の作用によるＮＯが関与するようになる。したがって、高血圧の場合には、ＮＯの生成が低減する（Forete, P. et al., Basal nitric acid synthesis in essential hypertension. Lancet. 1997; 349:837-842）。そして、老化、喫煙、高脂血症、糖尿などの他の要因は、血管中のＮＯを低減させる（Crossman, DC. More problems with endothelium. Q J Med. 1997; 90:157-160）。
【０００６】
血管新生は、既存の血管から新たな血管を成長させる過程であって、血管を構成している内皮細胞の移動、細胞間障壁である細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を通過する浸潤、増殖、及び血管への分化（管形成）といった幾つかの段階を通じて起こる（Folkman, J. et al., Angiogenesis. The Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(16), 10931-10934）。
【０００７】
生理的には、血管新生は、胎児の発生又は女性の月経中に発生し、局所の酸素不足によって一時的に起こることがあり、虚血性疾患や骨折などの血流が不十分な場合には、治療性血管新生が活用されている。また、動脈硬化による虚血性心血管疾患により死亡する死亡率が全世界で一位を占めており、近年、韓国内でもその死亡率が急速にのびてきている（ジョン・ジンオク他、血管新生治療法。大韓血管外科学会誌。2000.16(2), 265-269）。
【０００８】
Ｌ−アルギニンは、化学式Ｃ6Ｈ14Ｎ4Ｏ2で表される塩基性アミノ酸で分子量１７４.２１であり、最初はルピヌス（豆の一種）の芽抽出物から単離された。Ｌ−アルギニンは、タンパク質を構成するアミノ酸の一種として存在し、魚類の精子に存在するタンパク質プロタミンが豊富であり、植物種子中で遊離状態で存在する。また、これは、尿酸生成経路（オルニチン回路）の主要成分であり、アルギナーゼ酵素の作用によって尿素とオルニチンとに分解される。それは、シトルリンとアスパラギン酸から合成され、大人には必須でないアミノ酸であるが、乳児には栄養的に必須のアミノ酸である。
【０００９】
ＮＯ−ニトロ−Ｌ−アルギニンは一酸化窒素合成酵素の阻害剤として知られており、また、ＮＯ−ニトロ−Ｌ−アルギニンが血管の弛緩を妨害し得ることを示す研究がある。しかし、ＮＯ−ニトロ−Ｌ−アルギニンの阻害効果は、Ｌ−アルギニン（３×１０-3ｍｏＬ／Ｌ）の存在下で逆転され得ることを示す他の研究がある（Simonsen et al., Nitric oxide is involved in the inhibitory neurotransmission and endothelium-dependent relaxations of human small penile arteries, Clin Sci. 92:3, 265-75.）。この研究は、Ｌ−アルギニンが一酸化窒素合成酵素のための有効な基質になり得、血管での一酸化窒素（ＮＯ）の遊離を促進し得ることを提案している。
【００１０】
男性の性機能の様態は、性的欲求、陰茎の勃起、射精及びオルガスムからなり、これは、神経系、内分泌系及び血管系の複合的な生理反応によって決められ、このうち一つでも異常があれば性機能障害の原因になることがある。このような性機能障害は、約１０年前までもその大半の原因が心因性であると思われていた。しかし、患者の約５０％以上において性機能障害は血管系、神経系及び内分泌系疾患、糖尿病、高血圧、薬物服用などの様々な原因によることが明らかになってきている。近年、ホスホジエステラーゼＶ抑制剤であるシルデナフィル（sildenafil）が、性機能障害の治療について多くの関心を集めているが、このような治療法は化学薬品を用いて一時的な勃起を誘発させる方法であって、高価であり且つ頭痛、血圧上昇、心臓麻痺などの副作用が多い。特に心臓病による死亡のケースが少なくないと報告されている。したがって、人体の本能的な勃起機能を増強させる安全且つ有効な治療が必要とされており、最近の傾向は、陰茎海綿体平滑筋の強い弛緩作用を示す信号伝達物質である一酸化窒素及びｃＧＭＰの生成を増大させる性機能改善治療の開発に向かっている。
【００１１】
陰茎の勃起中に起こる変化は複雑であって、末梢及び中枢神経系、内分泌系を関与させる高度な協調制御を必要とする。海綿体平滑筋の収縮は、シナプス後α１アドレナリン性受容体の活性化によるノルアドレナリン性神経刺激によって調節され、勃起不全症は、海綿体の内因性平滑筋緊張の増大と関連性があるとされている。しかし、陰茎平滑筋の弛緩は、非アドレナリン性、非コリン性（ＮＡＮＣ）神経伝達によって部分的に媒介され、陰茎海綿体平滑筋の緊張の低減は一酸化窒素が海綿体の弛緩を誘導するためである。性的興奮中に一酸化窒素がニューロン及び内皮から放出され、平滑筋細胞及び内皮細胞に存在する可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）に結合してそれを活性化させることにより、細胞内の環状グアノシン３'−、５'−一リン酸塩（ｃＧＭＰ）のレベルを増大させる。未知の機序を通じて、タンパク質キナーゼＧ活性化が関与すると考えられるが、このｃＧＭＰレベルの増大は、細胞内カルシウム濃度の低減による海綿体の弛緩を誘導する（Ｃａ2+−活性化Ｋ+−チャンネルの活性化に起因する可能性がある）（Chuang et al., cGMP mediates corpus cavernosum smooth muscle relaxation with altered cross-bridge function. Life Sci. 1998; 63(3):185-94）。
【００１２】
一方、現代社会の生活レベルの向上と、人々の外貌に対する多大な関心の増加に伴い、皮膚に塗る化粧品の他、食用製品により皮膚美容を改善しようとする要求が強くなりつつある。すなわち、皮膚老化を抑制し且つしわを改善し、皮膚美白及び皮膚保湿を増進するのに有効な皮膚美容食品に対する関心と期待が高くなっている。
【００１３】
皮膚は、身体の表面を覆っている組職であって、表皮、真皮及び下皮の３層から構成されており、その他、汗腺、皮脂腺、乳腺及び毛根などの副器官がある。さらに、表皮は、角質層、透明層、顆粒層、有棘層、及び基底層に分けられる。表皮を形成する細胞の主な種類は、角質形成細胞とメラニン細胞である。真皮は、上部の乳頭層と下部の網状層の２つの部分に分けられ、粘弾性組職からなるとともに無定形の基質、膠原線維（コラーゲン）及び弾力線維（エラスチン）などの線維状タンパク質から構成されている。乳頭層は、コラーゲン細線維と線維間の空隙から構成され、細胞成分と基質成分が多い。一方、網状層は、太くて凝集したコラーゲン線維と線維間の空隙から構成されている。これらの膠原線維がエラスチンによって繋がっている。
【００１４】
皮膚老化は、その老化の原因によって内因性老化と外因性老化とに区分することができ、内因性老化は、環境変化とは無関係に年をとるにつれて皮膚の構造と生理機能が減退することをいい、外因性老化は、太陽光線などの外部環境への持続的な露出に起因する。特に、光による皮膚老化を光老化といい、紫外線は皮膚老化の生理学的及び形態学的変化の主な原因になる。また、内因性及び外因性老化の影響とともに現代社会の環境的影響及び季節的要因によって、表皮と真皮において糖タンパク質の主要成分であるヒアルロン酸の生合成が減少し、この結果、皮膚が荒れたり乾燥したりするようになる。
【００１５】
内因性皮膚老化が進行すると、皮膚が乾燥し、小じわが増えるとともに深くなる。また、表皮、真皮などの構造及び機能的な変化によって皮膚が弾力性をほとんど失い、弛んで見えるようになる。真皮の厚みは減少するのに対し、コラーゲンの総量は毎年１％ずつ消失し、また残っているコラーゲン線維は、徐々に厚くなりながら架橋し易くなり、溶解度や膨張力などが減少する。同時に弾力線維もより厚くなり、また架橋し易くなる。さらに、真皮内では線維芽細胞の増殖が低下し、コラーゲンの合成及び分解の能力も低減する。
【００１６】
コラーゲンは、皮膚老化に関連した主な皮膚組職成分で、脂肪を除く皮膚の全乾燥重量の７７％、真皮の線維成分の９０％を占めているタンパク質であって、皮膚強度、弾力性及び柔軟性を保持できるようにする機能を果たす。したがって、コラーゲンの合成増進及び分解抑制は、皮膚美容及び皮膚老化抑制に関連する重要な問題になった。
【００１７】
光老化は、内因性老化とは見掛け上の変化は似ているが、組職学的には、角質形成細胞の増殖により表皮が厚くなること、メラニン細胞の増加、及び光による損傷部位における色素沈着に関係する。
【００１８】
清浄で透明な白い肌の持ち主になりたいこともまた、現代人の強い欲望の一つである。ヒトの肌の色は、皮膚中のメラニン濃度と分布によって決められ、遺伝的な要因の他、紫外線、疲れ、ストレスなどの環境的または生理的条件にも関連する。メラニンは、アミノ酸の一種であるチロシンが、チロシナーゼという酵素の作用によりドーパ（ＤＯＰＡ）に変わり、次にドーパキノンに変わった後、非酵素的な酸化反応を経ることによって合成される。メラニンの合成が皮膚中で過度に起こると、肌の色合いを暗くし、肝斑、そばかすなどを発生させたりする。したがって、皮膚中のメラニン色素の合成を阻害すれば、皮膚美白効果を得ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、前記問題点を解決することを目的とする。本発明者らは、高麗人参の地上部である高麗人参の実抽出物が、高麗人参の根や紅参根などの他の部分とは異なる組成及び効能を有することを見出した。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、高麗人参の実抽出物を用いて、血行を促進させ、血管内皮細胞の生存を増進し、血管内皮細胞の移動性を促進させ、血管内皮細胞の管形成を促進させることによって血管新生を促進させる組成物と、皮膚老化を抑制し、しわを改善し、皮膚美白と皮膚保湿効果を提供する皮膚美容増進用組成物と、陰茎海綿体平滑筋の強い弛緩作用を誘発する信号伝達物質である一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増加させることによって陰茎の勃起を増進し、この結果、男性性機能を改善させる組成物とを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
前記目的を達成するために、本発明は、高麗人参の実抽出物を有効成分として含有する血行促進用組成物、血管老化防止用組成物、血管炎症治療用組成物、血管生成促進用組成物、虚血性心疾患治療用組成物、及び局所の血流不足改善及び治療用組成物を提供する。
【００２２】
本発明の実施形態の虚血性心疾患治療用組成物において、前記虚血性心疾患は、動脈硬化、狭心症、または心筋梗塞であることを特徴とする。
【００２３】
本発明の実施形態の組成物において、前記高麗人参の実抽出物は、乾燥された高麗人参の実にエタノールを加えて還流抽出し、ろ過し、濃縮し、油溶性構成物を除去した後にブタノールを加えて抽出し、濃縮して得ることを特徴とする。
【００２４】
また別の態様では、本発明は、有効成分として高麗人参の実抽出物を含有する皮膚美容増進用組成物を提供する。
【００２５】
また別の態様では、本発明は、高麗人参の実抽出物を有効成分として含有する男性性機能改善用組成物を提供する。また、別の態様では、前記有効成分としてさらにＬ−アルギニンを含有する男性性機能改善用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明による高麗人参の実抽出物含有組成物は、血管を拡張させることで血行を促進し、血管老化を抑制し、血管炎症を治療し、血管新成を促進することで動脈硬化、狭心症、及び心筋梗塞のような虚血性心疾患治療に有用であり、また関節炎または骨折による局所の血流不足改善及び治療に有用である。また、皮膚老化抑制効果、皮膚しわ改善効果、皮膚美白効果及び皮膚保湿効果などに優れ、これを有効成分として含有する皮膚美容増進用健康機能補助食品を製造することができる。また、本発明による高麗人参の実抽出物は、血管内皮細胞において一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増加させることにより、一酸化窒素（ＮＯ）の生成によって陰茎の勃起を増進する可能性を提示する。また、このような効果は、一酸化窒素生成酵素の基質であるＬ−アルギニンと併用したときにさらに高められ得る。したがって、高麗人参の実抽出物及びＬ−アルギニンを有効成分として含有する組成物は、男性性機能を効果的に改善する。
本発明の上記及び他の目的、性質、並びに他の利点は、特許請求の範囲とともに、下記の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１ａは血管内皮細胞を共焦点レーザー顕微鏡で撮った写真であり、図１ｂは蛍光強度を無処理群の蛍光強度と比較して示すグラフである。
【図２】図２ａは生存した血管内皮細胞の増殖を示す写真であり、図２ｂは染色された血管内皮細胞の吸光度を比較して示す図である。
【図３】図３ａは染色された血管内皮細胞の移動性を示す写真であり、図３ｂは細胞の移動性を無処理群の移動性と比較して示すグラフである。
【図４】図４ａは固定染色された血管内皮細胞の写真であり、図４ｂは形成された管の長さを無処理群の管の長さと比較して示すグラフである。
【図５】図５ａは大動脈血管の周辺に毛細管形態の新しい血管が伸びていくことを光学顕微鏡を利用して観察した写真であり、図５ｂは新しく発芽、形成された血管の長さと本数で血管発芽の促進効果を評価した後、点数にて表した結果を示すグラフである。
【図６】図６ａはマウス内での血管新生を生体蛍光顕微鏡で観察してリアルタイムで撮った写真であり、図６ｂはコンピュータープログラムを用いて分析した血管の変化を点数にて示すグラフである（０：変化が一番小さい；５：変化が一番大きい）。
【図７】ＬＰＳで誘導させたＮＯ生成の阻害効果を比較するグラフである。
【図８】マウス血液からＮＯ生成量、炎症因子であるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−βの生成量を比較するグラフである。
【図９】試験物質の活性酸素除去活性を示すグラフである。
【図１０】実施例１による高麗人参の実抽出物のコラーゲン生成量を示すグラフである。
【図１１】実施例１による高麗人参の実抽出物のＭＭＰ−１生合成阻害効果を示すグラフである。
【図１２】実施例１による高麗人参の実抽出物のしわ発生の抑制率を示すグラフである。
【図１３】実施例１による高麗人参の実抽出物のしわ減少率を示すグラフである。
【図１４】Ｌ−アルギニン、紅参抽出物及び高麗人参の実抽出物の血管内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）生成促進効果を示す、共焦点レーザー顕微鏡で撮った写真である。
【図１５】Ｌ−アルギニン、紅参抽出物及び高麗人参の実抽出物の血管内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）生成促進効果を相対的蛍光強度として示すグラフである。
【図１６】高麗人参の実抽出物とＬ−アルギニンの一酸化窒素生成相乗効果を相対的蛍光強度にて示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明は、有効成分として高麗人参の実抽出物を含有し、血管内皮細胞でのＮＯ生成を促進させることによって、血液循環を円滑にし、血管内皮細胞の生存を増進させ、血管内皮細胞の分化と移動を促進させ、血管新生を促進させる組成物を提供する。本発明の前記組成物は、血管内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）生成を増加させることで陰茎の勃起を増進させ、この結果、男性性機能を改善するために、有効成分として高麗人参の実抽出物を含有してよく、また、さらにＬ−アルギニンを含有してもよい。
【００２９】
男性の性機能を改善するためには、陰茎海綿体の強い弛緩作用により陰茎勃起を促進させる必要がある。それは、一酸化窒素（ＮＯ）の生成を増加させることに関する。これに関連して、酸化窒素が陰茎勃起に重要な役割をすることが動物実験から明かにされた。血管内皮細胞内の一酸化窒素の生成が、性的刺激下で陰茎の副交感神経末梢においてさらに増加する。一酸化窒素がグアニル酸シクラーゼを活性化させ、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）に転換させる。その結果物のｃＧＭＰは、海綿体平滑筋及び陰茎動脈の弛緩を生じさせる信号を提供して陰茎勃起を誘導するようになる。よって、陰茎勃起が持続するためには一酸化窒素の生成が重要であるといえる。したがって、一酸化窒素生成酵素の基質であるＬ−アルギニンと血管において一酸化窒素（ＮＯ）の生成を促進させる物質との併用は、海綿体内で一酸化窒素の十分な遊離を刺激し、この結果、平滑筋の弛緩を惹起し且つ持続させて血液を流入し、勃起不全を軽減できるようにする。
【００３０】
本発明による男性性機能改善用組成物は、該組成物の種類に応じて高麗人参の実抽出物を、組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％の範囲で含有することを特徴とする。また、Ｌ−アルギニンとの併用時に、Ｌ−アルギニンは、該組成物の総重量に対して０．０１〜９９．９重量％の割合で用いられてよい。
【００３１】
また、皮膚老化を抑制し且つしわを改善し、美白効果及び皮膚保湿効果を示すためには、内的／外的要因によって生成される活性酸素（oxygen free radical）を除去する抗酸化効果、コラーゲン生成促進効果、ＭＭＰ−１抑制効果、チロシナーゼ抑制効果、メラニン生成抑制効果及びヒアルロン酸生成促進効果を必要とする。本発明による高麗人参の実抽出物を含有する皮膚美容増進用組成物は、皮膚老化抑制用、皮膚しわ改善用、皮膚美白用及び皮膚保湿用健康機能補助食品に製剤化することもできる。
【００３２】
本発明による健康機能補助食品組成物は、その組成の種類に応じて高麗人参の実抽出物を、該組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％の範囲で含有することを特徴とする。
【００３３】
本発明の高麗人参の実抽出物含有組成物は、食品、医薬品などの添加剤として用いることもできる。
【００３４】
医薬品用の場合には、本発明による高麗人参の実抽出物を有効成分として含有する組成物を、常用される無機または有機の担体を加えて固形、半固形または液状の経口投与剤あるいは非経口投与剤に製剤化することもできる。
【００３５】
経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、乳濁剤、シロップ剤、ペレット剤などが挙げられる。非経口投与のための製剤としては、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、スプレー、懸濁化剤、乳剤、坐剤などが挙げられる。本発明の有効成分は、常法によって容易に製剤化することができ、界面活性剤、賦形剤、着色料、香辛料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁化剤、その他、常用される補助剤を適当に用いてよい。
【００３６】
本発明の組成物を通常の方法によって薬学剤形に調製してもよい。剤形の調製の際、活性成分を担体とともに混合しまたは担体にて希釈し、あるいは容器形態の担体内に封入させることが好ましい。担体が希釈剤として用いられる場合には、活性成分に対する担体、賦形剤または媒質として作用する固形、半固形または液状の物質であればよい。
【００３７】
好適な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでよい。本発明の組成物を、哺乳動物に投与された後に活性成分が迅速に、持続して、または、遅延して放出できるように当業界によく知られた方法を用いて剤形化してもよい。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈、腹腔、筋肉、局所適用、貼付及びイオントフォレーゼ（iontophoresis）を含む多様な経路から投与すればよく、この中でも局所適用及び経口投与が好ましい。
【００３９】
ヒトの場合、活性化合物の１日の投与量は、１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、５〜７０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であればよく、１回または数回に分けて投与してもよい。しかし、活性成分の実投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重症度などの多くの関連因子に基づいて決めるべきであり、よって、前記投与量は、如何なる方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
機能性食品に適用する場合には、本発明による高麗人参の実抽出物を有効成分とし、当該分野において通常用いられる成分を適宜選定して、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ドリンク剤、ダイエットバー、チョコレート、カラメルまたはお菓子類の剤形などに製剤化することができる。また、健康食品用に適合した機能性原料を付加的に適宜添加してもよい。
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
［実施例１］高麗人参の実抽出物の調製
１）高麗人参の実の前処理：収穫した生高麗人参の実から種子を分離し除去した後、高麗人参の実の果肉と果皮を日光乾燥または熱風乾燥し、乾燥された高麗人参の実を得た。
２）高麗人参の実抽出物の調製：乾燥された高麗人参の実１ｋｇにエタノール３Ｌを加えて還流抽出し、ろ過した後、４０〜４５℃で減圧濃縮して高麗人参の実抽出物３００ｇを得た。
【００４３】
［実施例２］高麗人参の実抽出物の調製
１）実施例１で得た高麗人参の実抽出物１００ｇを水１Ｌに溶解させ、ジエチルエーテル５００ｍｌを加え、分液漏斗を用いて脂溶性成分を除去した。しかる後、残った水層に水飽和ブタノール５００ｍｌを加えた。この処理を３回繰り返し行った。その結果物のブタノール層を減圧濃縮して高麗人参の実抽出物（天然サポニン）６０ｇを得た。
【００４４】
［比較例１］高麗人参の根抽出物の調製
前記実施例１において高麗人参の実の代りに紅参の根を用いたことを除いては、実施例１と同じ方法で調製した。
【００４５】
［試験例１］高麗人参の実抽出物と高麗人参の根の成分の比較
１．ジンセノサイド（高麗人参サポニン）成分の分析
実施例１及び比較例１においてそれぞれ高麗人参の実と高麗人参の根抽出物を調製した後、これら抽出物にエーテル処理を施して脂溶性成分を除去した。その後、ブタノール（ＢｕＯＨ）により天然サポニン（crude saponin）を抽出し、濃縮した。ＨＰＬＣを用いて抽出された天然サポニン中のジンセノサイド（高麗人参サポニン）の成分分析を実施し、その結果を下記表１に表した。
【００４６】
【表１】
2014080444.tif 000003
【００４７】
実施例１において調製した高麗人参の実抽出物は、比較例１において調製した高麗人参の根抽出物よりも約２倍の天然サポニン含量を有する。ジンセノサイドをＰＤ（Protopanaxadiol）系（ジンセノサイド Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄ）とＰＴ（Protopanaxatriol）系（ジンセノサイドＲｅ、Ｒｇ１及びＲｇ２）の割合で表すとそれぞれ０．７３と３．２３であって、このことから分かるように、高麗人参の実抽出物と高麗人参の根抽出物とは、その組成において明らかに異なっている。
【００４８】
２．高麗人参の実抽出物のミネラル成分の分析
実施例１において調製した高麗人参の実抽出物は、高麗人参の根とは異なる「果実」であって、高麗人参の根にはほとんど含有されていないビタミン及びミネラル成分を含有しているものと考えられ、その成分分析を実施し、その結果を下記表２に表した。
【表２】
2014080444.tif 000004
【００４９】
以上のように、本発明において用いる高麗人参の実は、高麗人参の根よりも多くの高麗人参サポニンを含有するとともに、そのサポニン組成が高麗人参の根のサポニン組成とは相当に異なっておる。また高麗人参の実抽出物は、高麗人参の根とは異なり、１６種のビタミンとミネラルを多量含むことを確認することができた。これに基づき、血管での効能に関する下記実験を実施した。
【００５０】
［試験例２］高麗人参の実抽出物のＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）でのＮＯ生成
ヒトの血管内皮細胞にはｅＮＯＳ（内皮一酸化窒素合成酵素）が存在し、その活性が増加することでＮＯ（酸化窒素）を生成させ、その結果、血管を拡張させ、血行を促進する役割を果たすようになる。ヒトの血管内皮細胞を培養した後、高麗人参の実抽出物（実施例１、２）と一般の紅参の根抽出物（比較例１）を培地に処理して生成されるＮＯの量を比較した。
【００５１】
血管内皮細胞をゼラチンコーティングされた２４ウェルプレートに２．５×１０4ｃｅｌｌ／ウェルの密度で付着する。該細胞を成長培地で１２時間培養する。血管内皮細胞を、高麗人参の実抽出物または一般の紅参の根抽出物処理群（実施例１、２、比較例１）、無処理群を用いて１２時間前処理する。その後、ＦＢＳのないＭ１９９培地においてＤＡＦ−ＦＭジアセテート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ、ＯＲ）１０μｍｏｌ／Ｌを用いて３７℃で３０分間処理する。しかる後、血管内皮細胞をＦＢＳのないＭ１９９培地において３回洗浄した後、平行板型フローチャンバ（parallel plate flow chamber）に入れて水銀灯から分離された光で刺激する。励起波長は４８８ｎｍで、ＤＡＦにＮＯが結合されると、５１５ｎｍで蛍光を発する。図１ａは、共焦点レーザー顕微鏡（Atto Bioscience、USA）で撮った写真であり、図１ｂは、Image−Pro Plus v4.5ソフトウェア（Media Cybernetics、San Diego、CA、USA）で分析した蛍光強度を無処理群の蛍光強度と比較して示すグラフである。
【００５２】
図１に示すように、本発明による実施例１、実施例２の高麗人参の実抽出物は、１００μｇ／ｍｌ濃度において無処理群と比べて１３００％〜２０００％のＮＯ生成を示し、比較例１の一般の紅参の根抽出物は、同じ１００μｇ／ｍｌ濃度において約１００〜２００％のＮＯ生成を示した。特に、実施例２の抽出物はより多くのＮＯを生成した。このことから、高麗人参の実抽出物は、一般の紅参の根抽出物と比べて血管内皮細胞でのＮＯ生成能が遥かに優れていることが分かる。実施例１、実施例２の高麗人参の実抽出物の上記のような優れたＮＯ（酸化窒素）生成能は、結局、血管を拡張させ且つ血液循環を促進させる効果を奏する。
【００５３】
［試験例３］血管内皮細胞の生存率調節効果（cell viability）
血管の老化を抑制し、血管を新生させるうえで最も基本的な段階が血管内皮細胞の活性を促進させることであると言える。陽性対照群（VEGF；Vascular endothelial growth factor）と高麗人参の実抽出物（実施例１、２）の処理群おいて、血管内皮細胞の生存率を比較した。
【００５４】
血管内皮細胞の生存率をクリスタルバイオレット染色により測定した。先ず、血管内皮細胞を２４ウェルプレート上に５×１０4の細胞数で付着させた後、成長培地で１２時間培養した。次いで、１％血清が入っているＭ１９９培養液で６時間処理して細胞分裂期を等しく誘導し、実施例１、２をそれぞれ２５、５０、１００μｇ／ｍＬで処理し、陽性対照群を処理した。そして、１８〜２４時間後に培養液を取り除き、生きている血管内皮細胞のみを染色させるためにクリスタルバイオレット染色剤３００μｌを入れ、約３０分間常温で放置した。しかる後、生理活性緩衝液（ＰＢＳ）で２〜３回洗浄した後に１％ＳＤＳ溶液で細胞を粉砕し、５５０ｎｍの吸光値で陽性対照群と実施例１、２を処理した群とを比較することにより細胞の生存率を測定した。
【００５５】
図２ａは生存した血管内皮細胞を撮影したものであり、図２ｂは染色された血管内皮細胞の吸光度を測定して比較したものである。図２ａの写真結果及び図２ｂの吸光度によれば、高麗人参の実抽出物（実施例１、２）処理群は、無処理群に比べて血管内皮細胞の生存率を増進させ、生きている細胞の増殖を促進させる効果を示し、特に実施例２の場合、陽性対照群であるＶＥＧＦよりも血管内皮細胞の生存を増進させ、増殖を促進させることと示された。したがって、高麗人参の実抽出物は、血管内皮細胞の生存率を増進させ、増殖を促進させることにより血管の老化を抑制し、血管新生を促進するということが分かる。
【００５６】
［試験例４］血管内皮細胞移動性の促進効果（ＨＵＶＥＣの移動）
血管新生を測定する一般的な方法の一つである細胞移動性を測定し分析した。細胞の移動性分析は、Boyden's chamber（トランスウェル）を用いた。２４ウェルプレートにそれぞれ血清のないＭ１９９培養液６００μｌを入れ、培養液に高麗人参の実抽出物（実施例１、２をそれぞれ２５、５０、１００μｇ／ｍＬ）及び陽性対照群を処理した後、トランスウェルの下面にゼラチン（１ｍｇ／ｍｌ）を塗抹し、上面に２×１０4個の細胞を付着させた。約４時間経過した後に上面の細胞を綿棒を利用して除去し、下面へ移動した細胞をヘマトキシリンとエオシンで染色し、染色された総細胞数を数えた。図３ａは染色された血管内皮細胞の移動性を撮影した写真であり、図３ｂは細胞の移動性を無処理群の移動性と比較して示すグラフである。
【００５７】
図３に示すように、実施例１、２は、血管内皮細胞の移動性を促進させる効果を示し、特に実施例２は、陽性対照群であるＶＥＧＦよりも優れた結果を示した。したがって、高麗人参の実抽出物は、血管新生の主な機序である血管細胞の移動性を促進させるといえる。
【００５８】
［試験例５］血管内皮細胞の管形成の促進効果
血管新生調節能の測定により細胞による管形成度合いを測定した。一般に、細胞の管形成能力はマトリゲルを用いて実験する。２４ウェルプレートにマトリゲル２５０μｌを塗抹した後、２．５×１０4個の細胞をマトリゲル上に付着させる。所定の時間間隔をおいて無処理群、陽性対照群（VEGF）、高麗人参の実抽出物処理群（実施例１、２）の管形成が生じることを観察し、適正な時点で細胞を固定染色して管形成が生じた度合いをコンピュータープログラムを用いて分析した。図４ａは固定染色された細胞の写真であり、図４ｂは形成された管の長さを無処理群の管の長さと比較して示すグラフである。
【００５９】
図４に示すように、実施例１、２は、血管新生の主な機序である細胞の管形成を促進させる結果を示し、特に実施例２は、陽性対照群よりも優れた効果を示した。
【００６０】
［試験例６］血管発芽（Vessel Sprouting）の促進効果
血管新生調節能の測定により血管から周辺に発芽することを確認した。ＳＤラットを使用し、実験群を無処理群、ＶＥＧＦ処理群、高麗人参の実抽出物（実施例１、実施例２）処理群に区分した。ラットの胸部位を切開して大動脈環（Aortic ring）を得、無血清ＤＭＥＭ培地に保管した後、各大動脈血管に対して培地にＶＥＧＦと高麗人参の実抽出物（実施例１、２）をそれぞれ処理し、３７℃で約７日間培養して血管が周辺に発芽することを観察した。図５ａは、大動脈血管の周辺に毛細血管形態の新しい血管が伸びていくことを光学顕微鏡を用いて観察した写真であり、図５ｂは、新しく発芽、形成された血管の長さと個数で血管発芽（Vessel Sprouting）の促進効果を評価した後、点数にて示したものである。
【００６１】
図５に示すように、高麗人参の実抽出物（実施例１、２）は、血管の発芽を促進させる効能を示し、特に実施例２は、陽性対照群よりも優れた効果を示した。これは、血管新生に対する効能を裏付ける結果であるといえる。
【００６２】
［試験例７］血管新生の促進効果
１．５％イソフルラン溶液とＯ2／Ｎ2Ｏとを混合したものを用いて約６〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスを麻酔させる。マウスの腹部にチタン材質のウィンドウ（直径１９ｍｍ、内径１４ｍｍ、厚さ０．７ｍｍ）をインプラントする。対照群としてＶＥＧＦ  ２０ｎｇ、高麗人参の実抽出物（実施例１、２）をそれぞれマトリゲルに混ぜてからウィンドウ内側の組職中に挿入し、カバースリップを覆ってスナップリングで固定する。血管新生度合いを生体蛍光顕微鏡（intravital fluorescence microscopy）を用いてリアルタイムで目視する。４日が経過した後に血管新生度合いを確認するために、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、FITC）で標識されたデキストラン（MW 250,000 Sigma Chemical, St. Louis、Missouri）を、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で５０μｌずつ、尾静脈に注入する。図６ａは、ブルーライト（４４０〜４７５ｎｍ、励起波長５３０〜５５０ｎｍ、放出波長）を用いる電子倍増ＣＣＤカメラ（Photon Max 512；Princeton Instruments, Trenton, NJ）を利用して生体蛍光顕微鏡像（Zeiss Axiovert 200M microscopy、Oberkocchen、Germany）をリアルタイムで撮った写真であり、図６ｂは、MetaMorph（Universal Imaging Corp., Downingtown, PA）というプログラムを用いて分析した血管の変化を点数にて示すグラフである（０：変化が一番小さい；５：変化が一番大きい）。
【００６３】
図６に示すように、高麗人参の実抽出物（実施例１、２）は、動物において血管新生効能を示し、特に実施例２の場合、陽性対照群よりも優れた血管新生効能を示した。したがって、高麗人参の実抽出物は、血管新生を促進させ、結局、虚血性心血管疾患、局所の血流改善、慢性血管炎症の早期治癒に有効であることが分かる。
【００６４】
［試験例８］血管炎症の調節
１．マクロファージに対してＬＰＳで誘導させたＮＯ（酸化窒素）を抑制する効果（in vitro）
高麗人参の実抽出物の抗血管炎症効果を調べるために、大食細胞に対してＬＰＳで誘導させたＮＯ（酸化窒素）を抑制する実験を実施した。
【００６５】
１０％濃度の血清を添加した培地において、５％ＣＯ2条件下でマクロファージ（Raw 264.7 cell）を培養した。９６ウェルプレート培養器に２×１０5個／ウェルの濃度で培養した後、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、実施例１、実施例２の高麗人参の実抽出物、及び比較例１の紅参の根抽出物をそれぞれ処理した。３７℃で１時間保管した後、ＮＯ生成度合いを測定してＬＰＳで誘導されたＮＯ生成の阻害効果を比較した。ＮＯ生成量の測定は、Ｇｒｉｅｓｓ反応法（Minghetti, L. et al., 1991, Glia 19. 152-160）を用い、その結果を図７に示している。
【００６６】
図７に示すように、本発明による高麗人参の実抽出物（実施例１、２）は、サイトカインとしてのＮＯ生成を効果的に抑制し、その効果が紅参の根抽出物（比較例１）よりも優れていた。特に実施例１が最も優れた効果を示した。したがって、本発明による実施例１、実施例２の高麗人参の実抽出物は、炎症反応の調節による血管炎症緩和と血管炎症による狭心症のような虚血性疾患に有効であるといえる。
【００６７】
２．血管炎症の調節効果（in vivo）
細胞レベルでの結果を基に、動物モデルにおける高麗人参の実抽出物の血管炎症調節効能について実験を実施した。実験群を、無処理群とＬＰＳ誘導群と実施例１、実施例２の高麗人参の実抽出物処理群とに群分けし、マウスを各実験群当たり５匹ずつ割り当てした。
【００６８】
実施例１と実施例２の高麗人参の実抽出物に対し、マウス体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ（１．５ｍｇ／１５ｇマウス）を食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）１ｍｌに希釈したものを第１日目から第３日目まで３回腹腔内注射した。第３日目に注射してから２時間後、ＬＰＳに対してマウス体重１ｋｇ当たり約４ｍｇレベルで食塩水１ｍｌに希釈したものを腹腔内注射して炎症因子を誘発させた。約１２時間後にマウスの腹を切開し心臓の動脈を切断して血液を採取し、−４０℃で保管した。血液をさらに３０分間常温で放置した後、４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を施した後、その上澄液を−２０℃で保管した。血液からＮＯ生成量を測定し、炎症因子であるＰＧＥ２、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−βは電気泳動してウェスタンブロッティングにより確認し、その結果を図８に示した。
図８に示すように、高麗人参の実抽出物（実施例１、実施例２）は、ＬＰＳで誘導される炎症因子の生成を抑制する効果を示し、特に実施例１が最も優れた効果を示した。これは、高麗人参の実抽出物が血管炎症を抑制し且つ虚血性疾患での血管炎症を調節するのに有効であることを示す。
【００６９】
［試験例９］皮膚老化抑制及びしわ改善
１）抗酸化効果
紫外線（ＵＶ）照射によって細胞から生成される活性酸素（ROS；Reactive oxygen species）を除去する能力を比較する実験により抗酸化効果を調査した。陽性対照群として一般に抗酸化効果を比較するのに用いられるトロロックス（trolox）を用い、これを紅参抽出物とも比較した（図９）。また、試験物質で処理していない群を対照群として用いた。
図９に示すように、本発明（実施例１）による高麗人参の実抽出物は、ヒトＨａＣａＴ角質形成細胞単層培養システム（human HaCaT keratinocytes monolayer culture system）において対照群に比べてＵＶによって生成された活性酸素を有意的に消去する効果を示した。これは、抗酸化物質の活性指標として用いられるトロロックスの活性と同程度の優れた活性であり、有意的な消去活性のない紅参抽出物と対照される結果である。すなわち、本発明の実施例１による高麗人参の実抽出物は、皮膚老化の原因になる活性酸素を有意的に消去することによりしわ生成、弾力低下及び色素沈着などを予防する効果を奏することを確認した。
【００７０】
２）Ｉ型プロコラーゲン分析
ヒト線維芽細胞を１０5個／ウェルの濃度で１２ウェルプレート培養器において培養した後、実施例１の高麗人参の実抽出物１ｐｐｍ及び１０ｐｐｍを含む培地に取り替えた。培養３日目に細胞を採取し、ＥＬＩＳＡ法を用いて生成されたＩ型プロコラーゲンの量を定量した。その結果は、試験物質を含まない対照群を１００として測定した値との比較値で算出し、陽性対照群としてＴＧＦ−ｂ（transforming growth factor-b）を用いた。
【００７１】
正常ヒト線維芽細胞単層培養システム（Normal human fibroblast monolayer culture system）において、実施例１の高麗人参の実抽出物は対照群に比べてＩ型プロコラーゲン生成を明らかに促進させる効果を示した。すなわち、実施例１の高麗人参の実抽出物は、人間の皮膚の老化によって発生するコラーゲン生成量の減少現象を抑制することができ、且つしわ改善効果を示した（図１０）。
【００７２】
３）ＭＭＰ−１発現の抑制
ヒト線維芽細胞を１０5個／ウェルの濃度で１２ウェルプレート培養器において培養した。次いで、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）を４０ｍＪ／ｃｍ2で照射した後、実施例１の高麗人参の実抽出物１ｐｐｍ及び１０ｐｐｍを含む培地に取り替えた。培養２日目に細胞を採取し、ＥＬＩＳＡ方法を用いて生成されたＭＭＰ−１（マトリックス・メタロプロティナーゼ Ｉ）の量を定量した。その結果は、試験物質を含まない紫外線対照群を１００として測定した値との比較値で算出し、陽性対照群としてはＴＧＦ−ｂ（形質転換増殖因子−ｂ）を用いた。
【００７３】
正常ヒト線維芽細胞単層培養システムにおいて、本発明による実施例１の高麗人参の実抽出物はＵＶＢ ４０ｍＪ／ｃｍ2照射によって誘導されるＭＭＰ−１の発現を有意的に抑制した。したがって、本発明による実施例１の高麗人参の実抽出物は、内的老化または外的環境要因によって生成される皮膚組職分解酵素であるＭＭＰ−１の生合成を阻害することにより、皮膚老化を抑制し且つしわの改善に有効であることを確認した（図１１）。
【００７４】
４）紫外線によるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の生合成抑制
ヒト線維芽細胞を１０5個／ウェルの濃度で１２ウェルプレート培養器において培養した。次いで、紫外線Ａ（ＵＶＡ）を１５Ｊ／ｃｍ2で照射した後、実施例１及び比較例１の高麗人参の実抽出物０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ及び１０ｐｐｍを含む培地に取り替えた。培養２日目に細胞を採取し、ウェスタンブロッティングを用いて生成されたシクロオキシゲナーゼ−２（cyclooxygenase-2、COX-2）の量を定量した。試験物質で処理していない紫外線対照群を１００として濃度計で測定した値との比較値を下記表３に表した。
【００７５】
【表３】
2014080444.tif 000005
【００７６】
前記表３の結果から、実施例１の高麗人参の実抽出物は、紫外線によるシクロオキシゲナーゼ−２の生合成を濃度依存的に低減させ、ＣＯＸ−２の産物であるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）による皮膚組職分解を防止できることを確認することができた。
【００７７】
５）紫外線による腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の生合成抑制
ヒト角質形成細胞を１０5／ウェル個の濃度で１２ウェルプレート培養器において培養した。次いで、紫外線Ｂを３０ｍＪ／ｃｍ2で照射した後、実施例１の高麗人参の実抽出物及び比較例１の紅参抽出物をそれぞれ０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ及び１０ｐｐｍ含む培地に取り替えた。培養６〜２４時間後に細胞を採取し、ＥＬＩＳＡ（Pharmingen 555212）方法を用いて生成された腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の量を定量し、試験物質で処理していない紫外線対照群を１００として測定した値との比較値を下記表４に表した。
【００７８】
【表４】
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【００７９】
前記表４の結果から、本発明による実施例１の高麗人参の実抽出物が紫外線による腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の生合成を濃度依存的に低減させることにより、腫瘍壊死因子−αの生合成によって生じ得る皮膚老化を予め防止できることを確認した。
【００８０】
６）皮膚老化抑制
本発明の組成物に皮膚老化抑制効能があるか否かを研究するために無毛マウスを動物モデルとして選定した。実験群を、一般飼料群（対照群）と一般飼料＋高麗人参の実抽出物群（実施例１）とに群分けし、６〜７週齢の雌無毛マウスを各群当たり１０匹を割り当てした。１２週間経口投与した後、マウスに対してＵＶ（紫外線）を照射した。
【００８１】
紫外線の照射前と後における同一部位に対する皮膚しわをビジオメーターシステム（Visiometer system；C+K社製）を用いて測定し比較した。皮膚しわの変化量は下記式１で求め、その結果を図１２に示した。
【００８２】
【数１】
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【００８３】
前記式中、「Ｔｄｉ」は９０日目における測定値であり、「Ｔｄｏ」は０日目における測定値である。
【００８４】
図１２の結果、一般飼料を摂取した対照群の皮膚しわは２３０±４９％（平均±標準偏差）の増加を示したのに対し、一般飼料と実施例１の高麗人参の実抽出物を摂取した実験群の皮膚しわは１３０±５１％の増加を示し、優れた皮膚老化抑制効果を示した（図１２）。
【００８５】
７）しわ改善
本発明の組成物が既に生成されたしわに対する改善効能があるか否かを研究するために無毛マウスを動物モデルとして選定した。実験群を、一般飼料群（対照群）と一般飼料＋高麗人参の実抽出物群（実施例１）とに群分けし、６〜７週齢の雌無毛マウスを各群当たり１０匹を割り当てした。ＵＶ（紫外線）を照射してしわを誘発させた後、前記各群に一般飼料と一般飼料＋高麗人参の実抽出物を１２週間経口投与した。
投与前と後における同一部位に対する皮膚しわをビジオメーターシステム（C+K社製）を用いて測定し比較した。皮膚しわの変化量は下記式２で求め、その結果を図１３に示した。
【００８６】
【数２】
2014080444.tif 000008
【００８７】
前記式２中、「Ｔｄｉ」は９０日目における測定値であり、「Ｔｄｏ」は０日目における測定値である。
【００８８】
図１３に示すように、一般飼料を摂取した対照群の皮膚しわは３５±２２％（平均±標準偏差）の減少を示したのに対し、一般飼料とともに実施例１の高麗人参の実抽出物を摂取した対照群の皮膚しわは９８±１７％の減少を示し、優れたしわ改善効果を示すことを確認することができた。
【００８９】
［試験例１０］皮膚美白効果
１）マウスのメラニン細胞を用いたメラニン生成抑制
実施例１の高麗人参の実抽出物のメラニン生成抑制効果を調べるために、マウスのメラニン細胞を用いてメラニン生成抑制効果を測定した。
【００９０】
先ず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のメラニン細胞（MeL-Ab cell）（Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp 188-200）をＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に１０％ウシ胎仔血清ＦＢＳ、１００ｎＭ ２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート、１ｎＭコレラ毒素を添加した培地において３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。培養されたＭｅＬ−Ａｂ細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて分離し、２４−ウェルプレートに１０5細胞／ウェル（cells/well）の濃度で細胞を培養した後、２日目から３日連続して実施例１の高麗人参の実抽出物１０ｐｐｍを添加した。このとき、紅参抽出物及びハイドロキノンを陽性対照群として用いた。しかる後、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄してから１Ｎ水酸化ナトリウムで細胞を溶かした。それを４００ｎｍで吸光度を測定し、下記式３でメラニン生成抑制率を求めた。その結果を下記表５に表した（Dooleyの方法）。
【００９１】
【数３】
2014080444.tif 000009
【００９２】
【表５】
2014080444.tif 000010
【００９３】
前記表５に表したように、実施例１による高麗人参の実抽出物は、対照群である紅参抽出物よりもメラニン生成抑制率が優れており、陽性対照群であるハイドロキノンと同程度のメラニン生成抑制率を示すことを確認した。
【００９４】
２）経口投与による皮膚美白効果
本発明の組成物が健康機能補助食品として美白効果を奏するか否かを研究するために、茶色テンジクネズミ（guinea pig）を動物モデルとして選定した。全ての実験群の動物（各群当たり１０匹）に紫外線を照射して最小紅斑量を測定した。全ての動物に最小紅斑量の紫外線を１日１回ずつ、３日間で照射した。実験群は、一般飼料群と一般飼料＋紅参抽出物群と一般飼料＋高麗人参の実抽出物群（実施例１）とに群分けした。各群の動物に対して５週間自由給食させた。色素沈着は色差計を用いてＬ値（明度）を測定した後、Ｌ値の変化量（各測定日のＬ値と紫外線照射前のＬ値との差）を比較し、その結果を下記表６に表した。
【００９５】
【表６】
2014080444.tif 000011
【００９６】
表６の結果のように、本発明による実施例１の高麗人参の実抽出物を摂取した実験群のＬ値変化量の方が早く減少し、これは、本発明による実施例１の添加群が紅参抽出物を添加した群に比べて黒くなった皮膚が元の肌色に早く戻ることを意味する。したがって、本発明による実施例１の高麗人参の実抽出物が紅参抽出物よりも皮膚美白効果に優れていることを確認した。
【００９７】
［試験例１１］皮膚保湿効果
１）ヒアルロン酸生産能促進
ヒアルロン酸は細胞間隙内に水分を保持する機能をする成分であって、皮膚保湿効果と直接的に関連する皮膚結合タンパク質である。
【００９８】
ヒト表皮細胞を用いて培養した後、その培地を、実施例１の高麗人参の実抽出物を含有させた表皮細胞用培地あるいは表皮細胞の培養用培地（対照群）に取り替えた。同じ条件下で４８時間培養した。しかる後、ヒアルロン酸測定用キットを用いて各試験群に対するヒアルロン酸の量を比較し、その結果を、対照群を１００として測定した値との比較値で示した。
【００９９】
【表７】
2014080444.tif 000012
【０１００】
前記表７に表すように、実施例１による高麗人参の実抽出物は、表皮細胞のヒアルロン酸生成を促進させ、このことから、本発明による実施例１の高麗人参の実抽出物が皮膚の保湿効果を奏することを確認することができた。
【０１０１】
２）経口投与による皮膚保湿効果
本発明の組成物が皮膚保湿効果を奏するか否かを研究するために無毛マウスをモデルとして選定した。実験群を、一般飼料群（対照群）と一般飼料＋紅参抽出物群と一般飼料＋高麗人参の実抽出物群（実施例１）とに群分けし、６〜７週齢の雌無毛マウスを各群当たり１０匹を割り当てした。１２週間経口投与した後、表皮と真皮のヒアルロン酸の含量をヒアルロン酸測定用キットを用いて比較し、その結果を下記表８に表した。
【０１０２】
【表８】
2014080444.tif 000013
【０１０３】
表８に表すように、実施例１による高麗人参の実抽出物を摂取した実験群における表皮及び真皮のヒアルロン酸含量が増加しており、また一般飼料を摂取した実験群と一般飼料と紅参抽出物を摂取した実験群よりも優れた皮膚保湿効果を奏することを確認することができた。
【０１０４】
［試験例１２］高麗人参の実抽出物の血管内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）生成の増加効果
高麗人参の実抽出物を血管内皮細胞に処理したときに、陰茎勃起に重要な信号伝達物質であると知られている一酸化窒素（ＮＯ）の生成増加を観察した。Ｌ−アルギニンを一緒に処理したことを除いては、試験例２と同じ方法で実験を実施した。図１４は、共焦点レーザー顕微鏡（Atto Bioscience、USA））で撮った写真でり、図１５は、蛍光強度をImage-Pro Plus v4.5 software（Media Cybernetics, San Diego, CA, USA）で分析して示すグラフである。図１４及び図１５において、ｃｏｎは対照群、ＲＧは比較例１の紅参抽出物処理群、ＧＢは実施例１の高麗人参の実抽出物処理群を意味し、ＲＧ ５０は紅参抽出物５０μｇ／ｍｌ、ＲＧ １００は紅参抽出物１００μｇ／ｍｌ、Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ２５０はＬ−アルギニン２５０μＭ、Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ５００はＬ−アルギニン５００μＭ、ＧＢ ５０は高麗人参の実抽出物５０μｇ／ｍｌ、ＧＢ １００は高麗人参の実抽出物１００μｇ／ｍｌを処理したことを意味する。
【０１０５】
図１４及び図１５に示すように、高麗人参の実抽出物を処理したときに、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）単層培養システムにおいて対照群に比べて一酸化窒素（ＮＯ）を有意的に増加させる効果を奏し、この効果は濃度依存的であった。紅参対照群は、１００μｇ／ｍｌの濃度で対照群に比べて約１．５倍程度増加した一酸化窒素（ＮＯ）の生成を示し、一酸化窒素生成酵素の基質であるＬ−アルギニンは、２５０μＭ、５００μＭの濃度でそれぞれ約２．７倍、５．５倍程度増加した一酸化窒素（ＮＯ）の生成を示したのに対し、高麗人参の実抽出物は、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度で対照群に比べてそれぞれ約４倍、１２倍程度増加した一酸化窒素（ＮＯ）の生成を示した。すなわち、高麗人参の実抽出物の効能が最も良く、１００μｇ／ｍｌの濃度で紅参抽出物の効能に比べて約８倍程度の優れた効能を示した。
【０１０６】
前記結果から、高麗人参の実抽出物を摂取すれば、血管内皮細胞において一酸化窒素（ＮＯ）の生成が増加するため、陰茎海綿体の血管拡張による陰茎勃起を増進させることができることが分かる。
【０１０７】
［試験例１３］高麗人参の実抽出物とＬ−アルギニンを併用した時の一酸化窒素生成の相乗効果
一酸化窒素生成酵素の基質であると知られたＬ−アルギニンと一酸化窒素（ＮＯ）の生成を促進させる高麗人参の実抽出物とを併用して処理したとき、一酸化窒素の生成が増加するか否かを観察した。
【０１０８】
臍帯から血管内皮細胞を分離し及び培養した。その培養された血管内皮細胞での一酸化窒素（ＮＯ）の生成を測定した。具体的な実験は、前記試験例１２と同様に実施し、その結果を図１６に示した。
【０１０９】
図１６において、ｃｏｎは対照群を意味し、Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ５００はＬ−アルギニン５００μＭ、ＧＢ １００は高麗人参の実抽出物１００μｇ／ｍｌ、Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ＋ＧＢはＬ−アルギニン５００μＭ＋高麗人参の実抽出物１００μｇ／ｍｌを処理したことを意味する。
【０１１０】
図１６に示すように、高麗人参の実抽出物１００μｇ／ｍｌとＬ−アルギニン５００μＭを併用して血管内皮細胞を処理したとき、一酸化窒素（ＮＯ）の生成が、いずれか一方で処理されたときの一酸化窒素（ＮＯ）の生成よりも遥かに増加したことが分かる。つまり、相乗効果が確認された。
【０１１１】
前記結果から一酸化窒素生成酵素の基質であるＬ−アルギニンと高麗人参の実抽出物の併用処方は一酸化窒素の生成を急激に増加させ、したがって、高麗人参の実抽出物とＬ−アルギニンの併用処方は、陰茎海綿体を弛緩させて勃起を誘導及び持続させることにより男性性機能を改善するのに有効である。
【０１１２】
以下、前記組成物の剤形例を説明するが、これは発明を限定するためのものではなく、単に本発明を具体的に説明するためのものに過ぎない。
【０１１３】
［剤形例１］注射剤
実施例１の高麗人参の実抽出物５０ｍｇ、注射用滅菌蒸留水適量、ｐＨ調節剤適量を混合し、その混合物を通常の注射剤の製法によってアンプル（２ｍｌ）に入れて注射剤を得た。
【０１１４】
［剤形例２］液剤
実施例２の高麗人参の実抽出物１００ｍｇ、異性化糖１０ｇ、マンニトール５ｇを適量の精製水に溶解させた。これにレモン香を適量加えてから前記成分を混合し、さらに精製水を加えて総量を１００ｍｌにした。この結果物を茶色のボトルに充填し滅菌して液剤を得た。
【０１１５】
［剤形例３］軟カプセル剤
実施例１の高麗人参の実抽出物５０ｍｇ、Ｌ−カルニチン８０〜１４０ｍｇ、大豆油１８０ｍｇ、ヤシ油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄ロウ４ｍｇ及びレシチン６ｍｇを混合し、通常の方法によって１カプセル当たり４００ｍｇずつ充填して軟カプセル剤を得た。
【０１１６】
［剤形例４］錠剤
実施例２の高麗人参の実抽出物５０ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇ及び麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を用いて顆粒化した後、糖エステル６ｍｇを添加して打錠機で打錠して錠剤を得た。
【０１１７】
［剤形例５］顆粒剤
実施例２の高麗人参の実抽出物５０ｍｇ、無水結晶ぶどう糖２５０ｍｇ及び澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層顆粒機を用いて顆粒化して顆粒剤を得た。
【０１１８】
［剤形例６］ドリンク剤
実施例１の高麗人参の実抽出物５０ｍｇ、ぶどう糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇ、及びオリゴ糖シロップ２５ｇを混合し、これに精製水３００ｍＬを加えてからボトルに２００ｍＬずつ充填する。その後、１３０℃で４〜５秒間滅菌してドリンク剤を得た。
【０１１９】
［剤形例７］高麗人参の実１００％エキス
実施例１の高麗人参の実抽出物の調製の際に固形分６０％以上になるように濃縮し、低温で熟成して１００％エキス製品を得た。
【０１２０】
［剤形例８］丸剤
実施例１の高麗人参の実抽出物０．９ｇ、糖０．３ｇ、澱粉１．９１ｇ及びグリセリン０．５６ｇを混合し、製丸機を用いて丸剤を得た。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態は説明のために開示されているが、当業者であれば、特許請求の範囲に開示されているような発明の範囲及び理念から逸脱することなく各種の改良、追加及び変換が可能であることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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