(57)【要約】【課題】天然高分子である多糖からなる多孔質体であり、平均孔径が生体分子の分離に適したサイズの連続孔を有し、任意の形状に成形可能なモノリス構造体及びその製造方法を提供する。【解決手段】多糖類を、前記多糖類が可溶な溶媒と前記多糖類が不溶な溶媒との混合溶媒に、前記混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、前記多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含む方法により、多糖類モノリス構造体を製造する。得られる多糖類モノリス構造体は、平均孔径０．０１〜２０μｍの連続孔を有し、１００μｍ以上の厚みを有する多孔質体である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類を含むモノリス構造体であって、
平均孔径０．０１〜２０μｍの連続孔を有し、
１００μｍ以上の厚みを有する多孔質体である、多糖類モノリス構造体。
【請求項２】
多糖類がセルロースである、請求項１に記載の多糖類モノリス構造体。
【請求項３】
多糖類の少なくとも１つの水酸基がエステル化された、請求項１又は２に記載の多糖類モノリス構造体。
【請求項４】
架橋構造を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の多糖類モノリス構造体。
【請求項５】
多糖類の少なくとも１つの水酸基にリガンドが導入された、請求項１〜４の何れか一項に記載の多糖類モノリス構造体。
【請求項６】
多糖類モノリス構造体の製造方法であって、
多糖類を、該多糖類が可溶な溶媒と該多糖類が不溶な溶媒との混合溶媒に、混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、
多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含む、製造方法。
【請求項７】
混合溶媒に第三の成分を加える、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
混合溶媒における第三の成分の濃度が、０．１〜５重量％である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
第三の成分がポリエチレングリコールである、請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
混合溶媒における多糖類が可溶な溶媒と多糖類が不溶な溶媒との体積比が、５：９５〜６０：４０である、請求項６〜９の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
混合溶媒における多糖類の濃度が、０．１〜３０重量％である、請求項６〜１０の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
第二工程が、冷却前の多糖類溶液の温度から５〜２００℃低い温度まで冷却することを特徴とする、請求項６〜１１の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
多糖類がエステル化セルロースである、請求項６〜１２の何れか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項６〜１３の何れか一項に記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体を製造し、第二工程後に、多糖類モノリス構造体をケン化する第三工程を含む、多糖類モノリス構造体ケン化物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体ケン化物を製造し、第三工程後に、架橋及び／又はリガンド導入処理を行う第四工程を含む、多糖類モノリス構造体架橋物及び／又はリガンド導入物の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の多糖類モノリス構造体を用いる、目的物質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類モノリス構造体、及びその製造方法に関する。さらに、前記多糖類モノリス構造体を用いる任意の目的物質の精製方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の動物、昆虫およびその細胞や微生物を宿主として製造されるバイオ医薬品の研究開発に注目が集まっている。バイオ医薬品の生産性は、大容量培養、高力価培養によって向上しており、それに伴い精製工程も効率化が求められている。バイオ医薬品は生物由来であるため、非常に高度な精製技術が必要とされ、遠心分離、限外ろ過、精密ろ過、クロマトグラフィーなどを組み合わせて行われているが、特にクロマトグラフィーは精製の核となる技術である。
【０００３】
バイオ医薬品の原料となるたんぱく質、核酸、ウイルス等の分離に用いるクロマトグラフィー用充填剤としては、様々な孔径を持つ多孔性粒子や、吸着性能を付与するために官能基を導入した多孔性粒子が製造され、市販されている。また、これらクロマトグラフィー用充填剤の多くはセルロース等天然高分子が用いられている。
しかし、市販品の多くは分子量数十万程度までのたんぱく質の分離を主目的としたものであり、分子量１００万以上の核酸等の巨大な生体高分子に適したものは少ない。これは、粒子の耐圧強度を損なうことなく、孔径を大きくすることが困難なことに起因している。
【０００４】
ところで、多孔質材料として、三次元網目構造の骨格と空隙をそれぞれ連続に有する一塊の多孔体であるモノリスが次世代型多孔材料として注目されている。モノリスは骨格と流路となる孔のサイズを独立して制御可能である。
【０００５】
例えば、シリカを材料として形成されるシリカモノリスがモノリスカラムとして市販されており、これは分離能が高く、機械的強度に優れている。また、骨格径や流路孔を制御する技術や表面細孔を制御する技術開発が進んでいる。
しかし、そのサイズは内径が０．３ｍｍ以下のキャピラリーサイズのものがほとんどである。これはキャピラリーサイズのモノリスカラムが調製しやすいという理由からである。つまり、シリカモノリスは分析用であり、バイオ医薬品生産における精製工程に利用できる吸着容量を持たない。
【０００６】
シリカの他にも、これまでに高分子材料で構成されるモノリス構造体およびその製造方法が種々報告されている。特許文献１および特許文献２には、合成高分子材料を原料とするモノリス構造体、特許文献３には生分解性を有するポリ乳酸を主成分とするモノリス構造体が開示されている。
しかしながら、天然高分子である多糖からなるモノリス構造体に関する報告は少ない。すなわち、多くの水酸基を有し、タンパク質等の生体物質との相互作用が少ないと予想される多糖骨格のモノリス構造体に関する報告はない。
【０００７】
多糖誘導体であるセルロース誘導体による多孔質膜は、飲料水及び工業用水などの水の精製、化学工業、薬品工業、食品工業の各工程での物質分離と精製、人工腎臓による血液透析を始めとする医療分野での利用など、様々な分野で使用されている。
特許文献４には、セルロース誘導体による多孔質膜の製造方法として、高沸点溶媒を用いる熱誘起相分離法が開示されている。しかし、特許文献４の方法で得られるものは多孔質ではあるがその孔は連続孔ではなく個々に独立した孔であり、カラム材料としての利用
はし難い。また、１〜１００μｍの厚みの膜状の形態のものであり、任意の形状の成形体を製造することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９‐０３００１７号公報
【特許文献２】特開２０１２‐１０７２１６号公報
【特許文献３】特開２０１０‐２６０９５２号公報
【特許文献４】特開２００３‐００１０７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況を鑑みて、本発明は、天然高分子である多糖からなる多孔質体であり、平均孔径が生体分子の分離に適したサイズの連続孔を有し、任意の形状に成形可能なモノリス構造体及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、適切な溶媒を選択することによって、多糖からモノリス構造体を容易に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］多糖類を含むモノリス構造体であって、
平均孔径０．０１〜２０μｍの連続孔を有し、
１００μｍ以上の厚みを有する多孔質体である、多糖類モノリス構造体。
［２］多糖類がセルロースである、［１］に記載の多糖類モノリス構造体。
［３］多糖類の少なくとも１つの水酸基がエステル化された、［１］又は［２］に記載の多糖類モノリス構造体。
［４］架橋構造を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の多糖類モノリス構造体。
［５］多糖類の少なくとも１つの水酸基にリガンドが導入された、［１］〜［４］のいずれかに記載の多糖類モノリス構造体。
［６］多糖類モノリス構造体の製造方法であって、
多糖類を、該多糖類が可溶な溶媒と該多糖類が不溶な溶媒との混合溶媒に、混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、
多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含む、製造方法。
[７] 混合溶媒に第三の成分を加える、[６] に記載の方法。
[８] 混合溶媒における第三の成分の濃度が、０．１〜５重量％である、［７］に記載の
製造方法。
[９] 第三の成分がポリエチレングリコールである、［７］又は［８］に記載の製造方法
。
［１０］混合溶媒における多糖類が可溶な溶媒と多糖類が不溶な溶媒との体積比が、５：９５〜６０：４０である、［６］〜[９]のいずれかに記載の製造方法。
［１１］混合溶媒における多糖類の濃度が、０．１〜３０重量％である、［６］〜[１０]のいずれかに記載の製造方法。
［１２］第二工程が、冷却前の多糖類溶液の温度から５〜２００℃低い温度まで冷却することを特徴とする、［６］〜［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］多糖類がエステル化セルロースである、［６］〜［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］［６］〜［１３］のいずれかに記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体を製造し、第二工程後に、多糖類モノリス構造体をケン化する第三工程を含む、多糖類モノリス構造体ケン化物の製造方法。
［１５］［１４］に記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体ケン化物を製造し、第
三工程後に、架橋及び／又はリガンド導入処理を行う第四工程を含む、多糖類モノリス構造体架橋物及び／又はリガンド導入物の製造方法。
［１６］［１］〜［５］のいずれかに記載の多糖類モノリス構造体を用いる、目的物質の精製方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、安価な多糖や多糖誘導体から、生体高分子の分離に適した孔径を持つモノリス構造体を提供することができる。また、ケン化、架橋、リガンドを導入する工程を経ることによって、モノリス構造体に生体高分子に対する吸着性能を任意に付与することができ、モノリス構造体を用いる目的物質の精製方法に有用な材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】製造例１のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。
【図２】製造例４のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。
【図３】製造例５のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。
【図４】製造例８のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真
【図５】製造例１７のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真
【図６】試験例２の通液時の流速と圧力の関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜１＞多糖類モノリス構造体
一般に、モノリス構造とは、三次元網目構造の骨格と空隙をそれぞれ連続に有する一塊の多孔体構造をいう。
本発明のモノリス構造体は、多糖類を主成分として含み、連続孔を有し、厚みのある立体である多孔質体である。
【００１４】
具体的には、本発明のモノリス構造体は、平均孔径が０．０１〜２０.０μｍの連続孔
を有する。平均孔径は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影した画像より求めることができる。
ここで、連続孔とは、１つ１つ独立した空洞ではなく、連続的な空隙をいう。なお、孔が連続孔であることは、複数のモノリス構造体サンプルのＳＥＭ写真において、孔の形状が同一または類似の形状であることから推測できる。
孔の形状は、構造体表面及び／又は内部にある孔が、円形もしくは楕円形又はそれらに近似した形状のものあることが好ましいが、特に限定されない。
本発明のモノリス構造体は、このような連続孔を有することにより、通液性に優れる。また、官能基やリガンドを任意の量導入することができ、さらに該官能基やリガンドにおける反応効率が良い。そのため、後述する精製方法等に用いるカラム材料に好適である。
【００１５】
また、本発明のモノリス構造体は、１００μｍ以上の、好ましくは１５０μｍ以上の厚みを有し、膜とは異なる立体的な形態である。本発明において、多孔質体の形状は限定されないが、この多孔質体の縦横高さの３つの方向のうち、最短軸方向の長さを便宜的に厚みと呼ぶ。また、本発明のモノリス構造体は、円柱状、円筒状等の任意の形状に成型できる。
【００１６】
本発明のモノリス構造体を主に構成する多糖類としては、セルロース、グルコマンナン等を挙げられる。また、これらの多糖類は多糖類の誘導体をも含み、例えば、エステル化された多糖類でもよい。エステル化多糖類としては、例えば、酢酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸グルコマンナン等が挙げられる。
前記多糖類の分子量は、特に限定されないが、例えば酢酸セルロースの場合は、後述す
る本発明の製造方法における取扱い性と生成するモノリス構造体の強度あるいはモノリス構造体が有する空孔の孔径の観点から、好ましくは１０００〜２０万、より好ましくは５０００〜１０万の平均分子量（Ｍｗ）である。
【００１７】
モノリス構造体の構成材料として、多糖類、特にセルロースを採用することにより、従来のカラム材料であるシリカよりもアルカリ洗浄に耐えうるカラム材料となり得る。また、多糖類は非特異吸着が小さいため、クロマトグラフィー基材として適する。また、多糖類は多くの水酸基を有し、ここに官能基やリガンドを導入しやすい点でも、クロマトグラフィー基材としての有用性がある。なお、シリカでも水酸基に官能基やリガンドを導入することはできるが、導入手順が煩雑であるためあまり実用的でない。
【００１８】
本発明の多糖類モノリス構造体においては、多糖類が種々の官能基で修飾されていてもよく、通常多糖類の少なくとも１つの水酸基に対してそのような修飾がなされる。
例えば、糖の水酸基がエステル化されていてもよく、これにより非特異吸着を抑制することができる。エステルとしては、例えばアセチル基が好ましい。あるいは、糖の水酸基はアセチル化されていたものが、さらに脱アセチル化されてもよい。
また、糖鎖間が架橋されていてもよく、これによりモノリス構造体の強度を向上することができる。
【００１９】
また、本発明の多糖類モノリス構造体においては、多糖類に種々の任意のリガンドが導入されていてもよく、通常多糖類の少なくとも１つの水酸基に対してそのような導入がなされる。リガンドを導入することにより、多糖類モノリス構造体に生体高分子等の目的物質に対する吸着性能を付与することができ、後述する目的物質の精製や検出に好適に利用することができる。
リガンドとしては、特に限定されないが、２−ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩（ＤＥＡＥ）、ＣＭ、スルホン基、４級アンモニウム、硫酸エステル等のイオン交換基や、プロテインＡ、抗体等のタンパク吸着用リガンドや、ポリリジン−ε、ポリリジン−γ等の機能性高分子等が挙げられ、モノリス構造体の使用目的に応じて任意に選択できる。
【００２０】
＜２＞多糖類モノリス構造体の製造方法
本発明の多糖類モノリス構造体は、多糖類を、前記多糖類が可溶な溶媒と前記多糖類が不溶な溶媒との混合溶媒に、前記混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、前記多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含む方法によって、製造することができる。
材料として用いる多糖類には多糖類誘導体も含まれ、好ましい材料としては、エステル化セルロース、エステル化グルコマンナンを挙げることができ、具体的には、酢酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸グルコマンナンが好ましく挙げられ、これらの中でも酢酸セルロースが特に好ましい。
材料として用いる多糖類の分子量は、特に限定されないが、例えば酢酸セルロースの場合は、製造工程中の取扱い性と生成するモノリス構造体の強度あるいはモノリス構造体が有する空孔の孔径の観点から、好ましくは１０００〜２０万、より好ましくは５０００〜１０万の平均分子量（Ｍｗ）である。なお、酢酸セルロースは、平均分子量４００００のものを和光純薬から入手することができ、好ましく利用できる。
【００２１】
本発明の製造方法における第一工程は、多糖類を、前記多糖類が可溶な溶媒（以下、良溶媒とする）と前記多糖類が不溶な溶媒（以下、貧溶媒とする）との混合溶媒に、前記混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る工程である。
このように、多糖類を溶解させる溶媒として、良溶媒と貧溶媒との混合溶媒を採用することにより、所望の多糖類モノリス構造体を容易に製造することが可能となる。
ここで、良溶媒とは、溶質が溶媒に溶解し、固形物を含まない透明な溶液が得られるも
のをいう。ここでは、室温で１重量％以上、さらには１０重量％以上の濃度の溶液が得られる溶媒のことをいう。また貧溶媒とは室温で単独で多糖類を０．０００１重量％以上溶解できないものをいう。
多糖類がエステル化多糖である場合、良溶媒としては、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル、γ‐ブチロラクトン等、エステル、環状エステル類、ジメチルホルムアミド、Ｎ-メチルピロリドン等の含窒素化合物、メチルグリコー
ル、メチルグリコールアセテート等のグリコール類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素、その他ジメチルスルホキシド等又はこれらの組み合わせが挙げられる。
多糖類がエステル化多糖類である場合、貧溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール類、水等又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２２】
良溶媒と貧溶媒との混合割合は、良溶媒が５〜６０ｖ／ｖ％、貧溶媒が９５〜４０ｖ／ｖ％がさらに好ましい。良溶媒の割合が６０ｖ／ｖ％を超えると、多糖類溶液を冷却しても相分離による析出が生じにくい場合がある。また、良溶媒の割合が５ｖ／ｖ％より小さいと、多糖類を均一に溶解させることができない場合がある。
【００２３】
また、混合溶媒中の多糖類の割合は０．１〜３０重量％が好ましく、１〜２０重量％がさらに好ましい。３０重量％を超えると、均一な溶液が得られにくく、きれいな連続孔を有する多孔質体が得られ難い。また、０．１重量％より少ないと、多糖類溶液を冷却しても相分離による析出が生じにくく、また析出を生じても強度が不足し、形状を維持できない。
また、混合溶媒中の多糖類の割合が大きくなるほど、得られる多孔質体の連続孔の孔径は小さくなる傾向にある。そのため、多孔質体を後述するクロマトグラフィーに適用する場合は、混合溶媒中の多糖類の割合を５〜３０重量％、さらには５〜２０重量％とすることが、良好な通液性となる孔径とする観点から特に好ましい。
【００２４】
本発明の製造方法における第一工程は、多糖類を、良溶媒と貧溶媒との混合溶媒に、前記混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る工程であるが、ここに混合溶媒中で可溶な第三の成分を加えることにより、得られる多孔質体の連続孔の孔径を大きくすることができる。
第三の成分としては、多糖類の良溶媒と貧溶媒のどちらに溶解する成分でもよく、混合溶媒中で溶解する成分であればよい。
第三の成分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等の水溶性高分子、グルコース、スクロース、デンプン等の糖類、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等の塩類のような成分を挙げることができ、具体的にはポリエチレングリコールが好ましい。
ポリエチレングリコールの分子量は、特に限定されないが、製造工程中の取扱い性と生成するモノリス構造体の強度あるいはモノリス構造体が有する空孔の孔径の観点から、好ましくは１００〜１００００、より好ましくは１０００〜５０００の平均分子量（Ｍｗ）である。なお、ポリエチレングリコールは、平均分子量３０００のものを和光純薬から入手することができ、好ましく利用できる。
【００２５】
本発明の製造方法における第二工程は、第一工程で得た多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る工程である。
この工程では、相分離が生じ、析出したモノリス構造体を得られる。なお、ここで得られるモノリス構造体は、その孔内部に混合溶媒を包含する。
第二工程においては多糖類溶液を、冷却前の温度（第一工程の溶解時の温度）から、５〜２００℃低い温度まで、好ましくは５℃〜１５０℃低い温度まで、さらに好ましくは５〜１００℃低い温度まで冷却する。この際の降温速度は０．１〜２００℃／分が好ましく
、０．１〜１００℃／分がより好ましい。
【００２６】
本発明のモノリス構造体は、上記の第一工程及び第二工程により得られるが、第二工程の後にさらに以下の処理を必要に応じて行ってもよい。
前述のように、第二工程後のモノリス構造体は、第一工程で用いた混合溶媒をその内部に包含している。そのため、これを任意の溶媒に置換してもよい。置換の方法は特に限定されないが、例えば、第二工程後のモノリス構造体を、任意の溶媒の入った別の容器内に浸漬して、相互拡散による置換を行うことができる。ここで置換溶媒は、第二工程で得られるモノリス構造体の均一性を保つために、第一工程で使用した溶媒と混和することが必要である。好ましい溶媒として、アルコール類、水を挙げることができる。
また、モノリス構造体内部に包含される溶媒を除去する処理を行ってもよい。除去方法は、加熱、減圧等、通常の方法が使用できる。
【００２７】
また、第一工程で材料としてエステル化多糖類を用いた場合は、第二工程の後に第三工程としてケン化（脱エステル化）を行ってもよい。ケン化処理は、アルカリ処理等の常法に従って任意に行うことができる。
【００２８】
さらに、第三工程後のケン化（脱エステル化）したモノリス構造体に対して、そのフリーの水酸基に任意の官能基やリガンドを導入する第四工程を行ってもよい。これにより、前述したような生体高分子等の目的物質に対する吸着性能が付与されたモノリス構造体を得ることができる。
リガンドとしては、特に限定されないが、２−ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩（ＤＥＡＥ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホン基、４級アンモニウム、硫酸エステル等のイオン交換基やフェニル基、ブチル基などの疎水性基、イオン交換と疎水基を併せ持ついわゆるミックスモードの分離に使えるリガンド、プロテインＡ、抗体等のタンパク吸着用リガンドやポリリジン等のポリカチオン、ヘパリンやポリグルタミン酸等のポリアニオンなどの機能性高分子等が挙げられ、モノリス構造体の使用目的に応じて任意に選択でき、その導入方法は、常法に従って任意に行うことができる。
【００２９】
また、第四工程としては、官能基やリガンドの導入に加えて／代えて、多糖類を架橋する処理を行ってもよい。架橋処理は、反応性の二官能試薬を架橋剤として用いて、常法に従って任意に行うことができる。反応性の二官能試薬としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２−ヒドロキシエチルスルホン）、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン、ヒドロキシアルキレンジハロゲン等が好ましく挙げられ、これらのうちエピクロロヒドリンを特に好ましく用いることができる。
【００３０】
＜３＞モノリス構造体を用いる精製方法
本発明のモノリス構造体は、カラム等の態様にしてクロマトグラフィーに用いることができる。
本発明のモノリス構造体は、連続孔を有することにより通液時にカラム内の圧力が上がりにくい。そのため、流速を維持したり大きくしたりすることも可能であるため、クロマトグラフィーの実施に適する。
また、前述のように、本発明のモノリス構造体には、所望の官能基やリガンドを導入することができるため、生体高分子に対する吸着性能を付与することができる。これを利用して、種々の目的物質を精製することが可能となる。例えば、イオン交換基を導入したモノリス構造体を、発現タンパク質の精製に用いたり、リガンドとしてプロテインＡを固定化したモノリス構造体をＩｇＧの精製に適用したり、抗体を固定化したモノリス構造体を
、該抗体に対応する抗原の検出や精製に適用することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
＜製造例１＞
透明試験管中で、酢酸セルロース２００ｍｇ（５重量％）（Ｍｗ：４００００、和光純薬製）を、１，４−ジオキサン０．８ｍＬ（１８ｖ／ｖ％）、エタノール２．８ｍＬ（６５ｖ／ｖ％）、及び水０．７ｍＬ（１７ｖ／ｖ％）の混合溶媒に、６０℃の湯浴中で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を室温（約２６℃）まで冷却して、溶媒を包含するモノリス構造体を得た。得られた溶媒を包含するモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体中に包含される前記混合溶媒を水に置換した。得られたモノリス構造体は、直径１３ｍｍ、長さ約２５ｍｍの円柱状であった。次いで水を包含するモノリス構造体を水中から取り出し、−７８℃で凍結後、室温で減圧乾燥を行い、内部の水を除去した。
得られたモノリス構造体の断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（キーエンス（株）社製、ＶＥ−８８００）で観察した写真を図１に示す。
【００３３】
＜製造例２＞
酢酸セルロース２５０ｍｇを１，４−ジオキサン１．５ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、エタノール３．０ｍＬ（６０ｖ／ｖ％）、及び水０．５ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）の混合溶媒に、６０℃の湯浴中で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を室温（約５℃）まで冷却して、溶媒を包含するモノリス構造体を得た。得られた溶媒を包含するモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体中に包含される前記混合溶媒を水に置換した。得られたモノリス構造体は直径１３ｍｍ、長さ約３０ｍｍの円柱状であった。
【００３４】
＜製造例３＞
混合溶媒の組成を、１，４−ジオキサン１．２ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、エタノール１．４ｍＬ（３５ｖ／ｖ％）、及び水１．４ｍＬ（３５ｖ／ｖ％）とした以外は、製造例1と
同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
【００３５】
＜製造例４＞
多糖類溶液の冷却工程を、３５℃の湯浴中で行う以外は、製造例１と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図２に示す。
【００３６】
＜製造例５＞
多糖類溶液の冷却工程を、３０℃の湯浴中で行う以外は、製造例１と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図３に示す。
【００３７】
＜製造例６＞
多糖類溶液の冷却工程を、０℃で行う以外は、製造例１と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
【００３８】
＜製造例７＞
透明試験管中で、酢酸セルロース３００ｍｇを、クロロホルム１．０ｍＬ（３３ｖ／ｖ％）、及びメタノール２．０ｍＬ（６７ｖ／ｖ％）の混合溶媒に、５０℃の湯浴中で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を製造例１と同様に処理して、円柱状のモノリス構造体を得た。
【００３９】
＜製造例８＞
混合溶媒の組成を、Ｎ−メチルピロリドン０．８ｍＬ（２０ｖ／ｖ％）、エタノール２．０ｍＬ（５０ｖ／ｖ％）、及び水１．２ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）とした以外は、製造例１と同様にして、直径１３ｍｍ、長さ約２５ｍｍの円柱状のモノリス構造体を得た。水を包含するモノリス構造体を水中から取り出し、−７８℃で凍結後、室温で減圧乾燥を行い、内部の水を除去した。
得られたモノリス構造体の断面を走査型電子顕微鏡で観察した写真を図４に示す。
【００４０】
＜製造例９＞
混合溶媒の組成を、Ｎ−メチルピロリドン２．０ｍＬ（５０ｖ／ｖ％）、エタノール０．８ｍＬ（２０ｖ／ｖ％）、及び水１．２ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）とした以外は、製造例1
と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
【００４１】
＜製造例１０＞
混合溶媒の組成を、γ−ブチロラクトン１．８ｍＬ（３４ｖ／ｖ％）、エタノール２．８ｍＬ（５３ｖ／ｖ％）、及び水０．７ｍＬ（１３ｖ／ｖ％）とした以外は、製造例1と
同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
【００４２】
＜製造例１１＞
混合溶媒の組成を、ジメチルスルホキシド１．９ｍＬ（３５ｖ／ｖ％）、エタノール２．８ｍＬ（５２ｖ／ｖ％）、及び水０．７ｍＬ（１３ｖ／ｖ％）とした以外は、製造例1
と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
【００４３】
＜製造例１２＞
５０ｍＬサンプル管にアセチル化グルコマンナン１．０ｇを計り取り、クロロホルム１０ｍＬ（４５ｖ／ｖ％）、及びエタノール１０ｍＬ（５５ｖ／ｖ％）に溶解した以外は製造例７と同様にして、モノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体の大きさは、直径２．４ｃｍ、長さ１．５ｃｍの円柱状であった。
【００４４】
＜製造例１３＞
１００ｍＬナスフラスコ中で、酢酸セルロース２．５ｇを、１，４−ジオキサン１５ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、エタノール３０ｍＬ（７３ｖ／ｖ％）、及び水５．０ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）混合溶媒に、６０℃の湯浴で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を試験管（φ１．５ｃｍ、ｈ１０ｃｍ）中に４．０ｍＬずつ分注した。前記多糖類溶液を１０℃まで冷却して、溶媒を包含するモノリス構造体を得た。得られた溶媒を包含するモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体中に包含される前記混合溶媒を水に置換した。得られたモノリス構造体の大きさは直径１．３ｃｍ、長さ２．２ｃｍの円柱状であった。
【００４５】
＜製造例１４＞
透明試験管中で、酢酸セルロース５００ｍｇ（１０重量％）を、１，４−ジオキサン１．５ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、エタノール３．０ｍＬ（６０ｖ／ｖ％）、及び２０ｗｔ％のポリエチレングリコール（Ｍｗ：３０００、和光純薬製）水溶液０．５ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）の混合溶媒に６０℃の湯浴中で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を２０℃まで冷却して、溶媒を包含するモノリス構造体を得た。得られた溶媒を包含するモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体中に包含される前記混合溶媒を水に置換し、ポリエチレングリコールを除去した。得られたモノリス構造体は、直径１３ｍｍ、長さ約２５ｍｍの円柱状であった。
【００４６】
＜製造例１５＞
１００ｍＬナスフラスコ中で、酢酸セルロース２．５ｇを、１，４−ジオキサン１５ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、エタノール３０ｍＬ（７３ｖ／ｖ％）、及び水５．０ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）混合溶媒に、６０℃の湯浴で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を試験管（φ１．５ｃｍ、ｈ１０ｃｍ）中に４．０ｍＬずつ分注した。前記多糖類溶液を１０℃まで冷却して、溶媒を包含するモノリス構造体を得た。得られた溶媒を包含するモノリス構造体を、別容器内の過剰量のエタノール中に投入し、モノリス構造体中に包含される前記混合溶媒をエタノールに置換した。
３ｍＬのエタノールに１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液１ｍＬを加え、試験管内でよく混合した。ここに先に得られたエタノールで置換したモノリス構造体の１つ（乾燥重量約２００ｍｇ）を入れ、３０℃で５時間振とう（１００ｒｐｍ）して、脱アセチル化を行った。その後、水中に浸漬して、溶媒を置換した。
１．５ｍＬの水中に３２０μＬのエピクロヒドリンを加え、試験管内でよく混合した。ここに先に得られた脱アセチル化後のモノリス構造体を加え、３時間３０℃で振とうした。続いて、別の試験管にエピクロロヒドリン０.１６ｍＬ、水１．５ｍＬ、および１０Ｍ
ＮａＯＨを０．４２ｍＬ加えよく混合した。ここにエピクロロヒドリン水溶液に浸漬したモノリスを加え、５０℃で１５時間振とうして架橋反応を行った。反応終了後、モノリス構造体を水中に投入し、中性になるまで水洗し、内部の溶媒を水で置換した。得られたモノリス構造体は、直径１.２ｃｍ、長さ１．９ｃｍの円柱状であった。
【００４７】
＜製造例１６＞
試験管で２−ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩（和光純薬、以下ＤＥＡＥとする）０．３６ｇをイオン交換水１．５ｍＬに溶解し、製造例１５で得られたモノリスを浸漬し、３０℃で３時間振とう（１００ｒｐｍ）した。続いて別の試験管に水１．０ｍＬ、１０Ｍ ＮａＯＨを０．５２ｍＬ加えよく混合した。ここにＤＥＡＥ水溶液に浸漬したモノリ
スを浸漬し、５０℃で１５時間振とうしてＤＥＡＥ導入反応を行った。反応終了後、モノリス構造体を水中に投入し、洗浄水が中性になるまで水洗し、内部の溶媒を水で置換した。得られたモノリス構造体は、直径１.２ｃｍ、長さ２．０ｃｍの円柱状であった。
【００４８】
製造例１６で得られたモノリス構造体について、以下の手順で中和滴定を行いＤＥＡＥ導入量（イオン交換容量）を測定した。
モノリスを遠心チューブに入れ０．５ＭのＮａＯＨ水溶液に浸漬し、１８時間振とうした。次にＭｉｌｌｉＱ水で洗浄水が中性になるまでモノリスを水洗した。モノリスに付着した余分な水分をふき取り、重量を測定し、含水量を求めた。モノリスに含水量を含めて最終濃度が０．１ＭのＨＣＬ溶液になるように、水と０．５Ｍ ＨＣＬを加え、１６時間
浸漬した。浸漬液２ｍＬをホールピペットで測り取り、０．１Ｍ ＮａＯＨで滴定した。
その結果、ＤＥＡＥ導入量は１．０ｍｅｇ／ｇ−ｄｒｙであった。
【００４９】
＜製造例１７＞
１００ｍＬナスフラスコ中で、酢酸セルロース５．０ｇを、１，４−ジオキサン１５ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、エタノール３０ｍＬ（６０ｖ／ｖ％）、及び２０ｗｔ％ポリエチレングリコール水溶液５．０ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）混合溶媒に６０℃の湯浴で加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を試験管（φ１．５ｃｍ、ｈ１０ｃｍ）中に５．０ｍＬずつ分注した。前記多糖類溶液を２０℃まで冷却して、溶媒を包含するモノリス構造体を得た。得られた溶媒を包含するモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体中に包含される前記混合溶媒を水に置換した。水を包含するモノリス構造体の１つを水中から取り出し、−７８℃で凍結後、室温で減圧乾燥を行い、内部の水を除去した。得られたモノリス構造体の断面を走査型電子顕微鏡で観察した写真を図５に示す。
２．５ｍＬの水に１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液２．５ｍＬを加え、試験管内でよく混合
した。ここに先に得られた水で置換したモノリス構造体の１つ（乾燥重量約４００ｍｇ）を入れ、３０℃で５時間振とう（１００ｒｐｍ）して、脱アセチル化を行った。その後、水中に浸漬して、水溶液が中性になるまで水洗した。
５．０ｍＬの水中に３５０μＬのエピクロヒドリンを加え、試験管内でよく混合した。ここに先に得られた脱アセチル化後のモノリス構造体を加え、２時間３０℃で振とうした。続いて、別の試験管に水２．７５ｍＬ、および１０ＭＮａＯＨを０．２５ｍＬ加えよく混合した。ここにエピクロロヒドリン水溶液に浸漬したモノリスを加え、５０℃で２時間振とうして架橋反応を行った。反応終了後、再びエピクロロヒドリン水溶液（エピクロロヒドリン３５０μｌ／水５ｍｌ）への浸漬、および１０ＭＮａＯＨ水溶液（１０ＭＮａＯＨ０．２５ｍｌ／水２．７５ｍｌ）中での架橋反応を前記記載の要領で行った。その後、モノリス構造体を水中に投入し、中性になるまで水洗し、内部の溶媒を水で置換した。得られたモノリス構造体は、直径１.２ｃｍ、長さ２．１ｃｍの円柱状であった。
【００５０】
＜製造例１８＞
試験管でＤＥＡＥ１．４ｇをイオン交換水２．０ｍＬに溶解し、製造例１７で得られた架橋モノリスを浸漬し、３０℃で３時間振とう（１００ｒｐｍ）した。続いて別の試験管に水１．３ｍＬ、１０Ｍ ＮａＯＨを１．７ｍＬ加えよく混合した。ここにＤＥＡＥ水溶
液に浸漬したモノリスを浸漬し、５０℃で１５時間振とうしてＤＥＡＥ導入反応を行った。反応終了後、モノリス構造体を水中に投入し、洗浄水が中性になるまで水洗し、内部の溶媒を水で置換した。得られたモノリス構造体は、直径１.２ｃｍ、長さ２．２ｃｍの円
柱状であった。
【００５１】
＜参考製造例＞
透明試験管中で、酢酸セルロース０．２５、０．５、又は１．０ｇ（５、１０、又は２０重量％）を、特許文献４に記載のセルロース多孔質膜製造方法で用いている溶媒である２−エチル−１，３−ヘキサンジオールをそれぞれ４．７５、４．５、又は４gを加え、
１５０℃のブロックヒーターで加熱溶解させ、多糖類溶液を得た。得られた多糖類溶液を２０℃まで冷却したところ、５重量％の場合は流動性があり、ゲルとしては成形体が得られなかった。また、１０重量％では冷却すると、沈殿し、不均一析出となった。また、２０重量％では直径１．５ｃｍ、長さ３．２ｃｍの３次元の構造体が得られたが、通液性能が非常に悪くなり孔径も小さかった。
【００５２】
＜試験例１＞連続孔の評価
製造例１の酢酸セルロースモノリス構造体の孔の連続性を調査するために、以下の手順でカラムを組み立てた。
口径０．９ｃｍのロッド状の酢酸セルロースモノリス構造体をカッターで所望の長さに切断した。２．５ｃｍの四弗化パイプ（Ｉ.Ｄ.７−Ｏ.Ｄ.９ｍｍ）（アズワン株式会社より購入）、直径９．３ｍｍ、厚さ２．４ｍｍのポリプロピレン製フリッツ（スペルコ、シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）でモノリスの両端を挟み、更にそれを全長が覆われる長さのテフロン（登録商標）熱収縮チューブＦＥＰ−０９０（アズワン株式会社より購入）の中に入れ全体をドライヤーで加熱して収縮させた。カラムの両端に異型ユニオン（３０−１０ＲＵ６−Ｃ、株式会社サンプラテック製）に接続した。これに外径６ｍｍのチューブ接続し流速を測定した。また、さらに異型ユニオン（Ｕ−２０Ｃ、東京理化器械株式会社）を接続することで１／１６インチ（１．５９ｍｍ）のチューブにてクロマトグラフィーシステムでの測定に用いた。
ＮａＣｌ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、又は鉄コロイド（平均粒径７８ｎｍ）の水溶液をそれぞれカラムに流して、溶出された物質の回収率を調べた。
クロマトグラフィーシステムは、ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＬＰ（バイオ・ラッドラボラトリ
ーズ株式会社）を用い、ＮａＣｌは電気伝導度により、ＢＳＡと鉄コロイドは２８０ｎｍの吸収によりそれぞれ検出した。流速は１．２ｍＬ／ｍｉｎとした。用いたモノリス構造
体は径０．９ｃｍ、長さ２．５ｃｍであった。
ＮａＣｌの場合、カラムは純水によって平衡化した後、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を１０ｍ
Ｌ通液させた。比較のために、カラムを接続せず配管を直接接続して同様に１Ｍ ＮａＣ
ｌ水溶液を流した。それぞれ、溶出時間と電気伝導度をチャートレコーダーで記録した。それぞれのピーク面積はデジタイザーソフト（ｕｎ ｓｃａｎ ｉｔ）を用いて求めた。
ＢＳＡおよび鉄コロイドの場合、カラムはＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社製、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（−）を取扱い説明にしたがって調製した）で平衡化し後、１％
ＢＳＡ、又は２０μｇ／ｍＬの鉄コロイドのＰＢＳ（−）溶液をそれぞれ２ｍＬ通液させた。それぞれ、溶出時間と２８０ｎｍの吸光度をチャートレコーダーで記録した。それぞれのピーク面積はデジタイザーソフト（ｕｎ ｓｃａｎ ｉｔ）を用いて求めた。
いずれの場合もそれぞれ２回繰り返し、平均値から回収率を計算した。
【００５３】
結果を表１に示す。ＮａＣｌ、ＢＳＡ、及び鉄コロイドの何れの試料であっても、ほぼ１００％の回収量となり、製造例１のモノリス構造体の孔は連続している事が確認された。
【００５４】
【表１】
2014224223.tif 000003
【００５５】
＜試験例２＞通液時の流速と圧力の関係の評価
製造例１３および製造例１４の酢酸セルロースモノリスに純水を通液しその際のカラム入り口の圧力を測定した。まず以下の手順でカラムを組み立てた。
口径１．２ｃｍのロッド状の酢酸セルロースモノリス構造体をカッターで所望の長さに切断した。５．０ｃｍの四弗化パイプ（Ｉ.Ｄ.７−Ｏ.Ｄ.９ｍｍ）、直径９．３ｍｍ、厚さ２．４ｍｍのポリプロピレン製フリッツでモノリスの両端を挟み、更にそれを全長が覆われる長さのスミチューブＣ（ＳＵＭＩ−Ｃ−１４、住友電工ファインポリマー株式会社）の中に入れ全体を９５℃の湯浴で加熱して収縮させた。さらにそれを全長が覆われる長さのテフロン（登録商標）熱収縮チューブＦＥＰ−１２０（アズワン株式会社より購入）の中に入れ、全体をドライヤーで加熱して収縮させた。カラムの両端に異型ユニオン（３０−１０ＲＵ６−Ｃ、株式会社サンプラテック製）に接続した。これに外径６ｍｍのチューブ接続し流速を測定した。また、さらに異型ユニオン（Ｕ−２０Ｃ、東京理化器械株式会社）を接続することで１／１６インチ（１．５９ｍｍ）のチューブにてクロマトグラフィーシステムでの測定に用いた。
測定装置としては、ポンプにはＬＣ８Ａ（島津）、圧力計にはＧＰ−Ｍ０２５（キーエンス）、流量計にはＦＤ−ＳＳ０２Ａ（キーエンス）を用いた。用いたモノリス構造体は径０．９ｃｍ、長さ２．５ｃｍであった。通水液としては、３１〜３２℃の純水を用いた。
比較例として、セルロース粒子充填カラムであるセルファイン Ｍａｘ Ｓ−ｒ Ｍｉｎ
ｉカラム（径０．９ｃｍ、長さ１．８ｃｍ、ＪＮＣ株式会社製）を用いて同様に評価した。
結果を図６に示す。製造例１３および製造例１４のモノリス構造体は、粒子充填カラムと比べて非常に低圧で且つ高流速での通液が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、安価な多糖や多糖誘導体から、生体高分子の分離に適した孔径を持つモノリス構造体を提供することができる。また、該モノリス構造体には、生体高分子に対する吸着性能を任意に付与することができ、医薬品製造等における精製工程の効率向上に寄与することができるため、産業上非常に有用である。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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