【手続補正書】
【提出日】令和3年2月25日(2021.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞の解像度で核酸の解析を行う方法であって、
その中にビーズを懸濁させたビーズ流体を提供し、各ビーズが一意のバーコードを有するビーズの第１の整列されたストリームを形成することと；
その中に細胞を懸濁させた細胞流体を提供し、細胞の第２の整列されたストリームを形成することと；
該第１の整列されたストリームと該第２の整列されたストリームを合流させることと；
該ビーズおよび細胞を液滴内に封入して、該細胞の核酸を該ビーズのバーコードで標識することと；
液滴内のビーズ数の第１の分布および液滴内の細胞数の第２の分布を決定することと；
該第１の分布および該第２の分布が過小分散されたポアソン統計量を達成するように、決定された該第１の分布および該第２の分布に基づいて該第１の整列されたストリームを調整することと；
該液滴を収集することであって、単一ビーズと単一細胞を含む液滴の割合が、所定の値を超え、該単一細胞の核酸が、該単一ビーズの一意のバーコードにより標識される、ことと；
単一細胞の解像度で、該収集した液滴からの該核酸のヌクレオチド配列の解析を行うことであって、各細胞の核酸が、一意のバーコードにより標識される、ことと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の整列されたストリームを調整することで、単一液滴において１つのビーズおよび１つの細胞を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一液滴内の前記細胞を溶解することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単一液滴内の前記細胞の単一細胞シークエンシングを行うことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の整列されたストリームを調整することが、前記ビーズ流体に導入される第１の希釈剤を調整することによって、該ビーズ流体の濃度を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の分布および前記第２の分布が過小分散されたポアソン統計量を達成するように、決定された該第１の分布および該第２の分布に基づいて該第２の整列されたストリームを調整すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の整列されたストリームを調整することで、単一液滴において１つのビーズおよび１つの細胞を達成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の整列されたストリームを調整することが、前記細胞流体に導入される第２の希釈剤を調整することによって、該細胞流体の濃度を調整することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズの第１の整列されたストリームを形成することが、前記ビーズ流体をビーズのない流体と並行して流すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビーズ流体とビーズのない流体の並行流における前記ビーズの慣性絞込みをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビーズの第１の整列されたストリームを形成することが、前記ビーズ流体における前記ビーズの慣性絞込みを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞の第２の整列されたストリームを形成することが、前記細胞流体を細胞のない流体と並行して流すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞の第２の整列されたストリームを形成することが、前記細胞流体における細胞の慣性絞込みを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズおよび細胞を液滴内に封入することが、合流された前記第１の整列されたストリームおよび第２の整列されたストリーム内に、液滴生成オイルの２つのストリームを導入することを含み、該液滴生成オイルの２つのストリームが、該合流された第１の整列されたストリームおよび第２の整列されたストリームの方向に対して実質的に垂直に流れる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズ流体が溶解緩衝液を含み、前記ビーズおよび細胞を液滴内に封入して、前記核酸を標識することが、該細胞を溶解することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記液滴を壊し、前記標識された核酸を１つの試料にまとめることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
大量反応において前記試料中の前記標識された核酸を逆転写することをさらに含み、該標識された核酸がＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
大量反応において前記試料中の前記標識された核酸を増幅することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
大量反応において前記試料中の前記標識された核酸をシークエンシングすることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
単一細胞の解像度で、核酸の各量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
各ビーズが、複数のヌクレオチド断片を含み、各ヌクレオチド断片が、
前記ビーズの前記一意のバーコードと、
前記細胞のポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡとハイブリダイズするためのポリＴ配列と、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
各ビーズが、複数のヌクレオチド断片を含み、各ヌクレオチド断片が、
前記ビーズの前記一意のバーコードと、
各ヌクレオチド断片について異なる分子識別子と、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子識別子のカウントを用いて、対応する標識された核酸のカウントを標準化させることをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法を動作させるためのマイクロ流体システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
細胞入口は、細胞流体中に懸濁された細胞６３０をマイクロ流体システム６００へと導入するために構成される。オイル入口は、液滴生成オイル６３２を、オイルチャネル６１４、６１６を通して液滴生成接合部６２６に導入するために構成される。オイルの２つの側方方向流れは、ビーズが液滴生成接合部６２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体６２４のストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、細胞が液滴生成接合部６２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体６３４のストリームから液滴を引っ張る。ビーズ６２２は、液滴生成接合部６２６に入る前に整列される。細胞６３０は、液滴生成接合部６２６に入る前に整列される。ビーズ６２２と細胞６３０の両方ための慣性強制（ｆｏｒｃｉｎｇ）と液滴生成を組み合わせることによって、各々が１つのビーズと１つの細胞とを持つ液滴６３６が形成される。この実施形態は、確率的（ポアソン）ローディングから可能であろうよりも多くの単一粒子液滴（たとえば、１つの細胞および１つのビーズ）と、可能であろうよりも少ない、何も入っていない液滴または複数粒子液滴（たとえば、２つのビーズおよび１つの細胞）を生成する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
一つの細胞入口は、細胞流体中に懸濁された細胞７３０を、細胞チャネル７０８を通してマイクロ流体システム７００へと導入するために構成される。別の細胞入口は、細胞を含まない流体をマイクロ流体システム７００へと導入するために構成される。オイル入口は、液滴生成オイル７３２を、オイルチャネル７１４、７１６を通して液滴生成接合部７２６に導入するために構成される。オイルの２つの側方方向流れは、ビーズが液滴生成接合部７２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性ビーズ流体７２４のストリームから液滴を引っ張る。同様に、オイルの２つの側方方向流れは、細胞が液滴生成接合部７２６に到達するのと同じ頻度またはその倍数で水性細胞流体７３４のストリームから液滴を引っ張る。ビーズ７２２は、液滴生成接合部７２６に入る前に整列される。細胞７３０は、液滴生成接合部７２６に入る前に整列される。ビーズ７２２と細胞７３０の両方ための慣性強制（ｆｏｒｃｉｎｇ）と液滴生成を組み合わせることによって、各々が１つのビーズと１つの細胞とを持つ液滴７３６が形成される。この実施形態は、確率的（ポアソン）ローディングから可能であろうよりも多くの単一粒子液滴（たとえば、１つのビーズおよび１つの細胞）と、可能であろうよりも少ない、何も入っていない液滴または複数粒子（たとえば、２つのビーズおよび１つの細胞）液滴を生成する。
チャネル集約における流体チャネルの幅
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
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