(57)【要約】      （修正有）【課題】骨同化性Ｗｎｔ／ＬＲＰ５シグナリング経路のインヒビターであるＤｋｋ−１に特異的な抗体の提供。【解決手段】ＬＲＰ５へのＤｋｋ−１の結合を抑制する該抗体、又は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）２等は、骨の成長を刺激するための組成物、特に、骨の減少を引き起こす骨障害、例えば骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および骨関節炎等を治療するため、もしくは、新たな骨の産生の促進のためのそれらの使用の組成物において有用である。【選択図】図１Ａ
2014087366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤ
Ｒ１、
（ｉｉ）配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ  Ｃ
ＤＲ２および
（ｉｉｉ）配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ  
ＣＤＲ３
よりなる群から選ばれる１以上の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｂ）（ｉ）配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ
１、
（ｉｉ）配列番号１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ  Ｃ
ＤＲ２および
（ｉｉｉ）配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ  
ＣＤＲ３
よりなる群から選ばれる１以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ、または
（ｃ）（ａ）の１以上のＬＣ  ＣＤＲおよび（ｂ）の１以上のＨＣ  ＣＤＲ
を含んでなり、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合しうる単離された抗体または免疫
学的に機能的なそのフラグメント。
【請求項２】
（ａ）（ｉ）配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤ
Ｒ１、
（ｉｉ）配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＬＣ  Ｃ
ＤＲ２および
（ｉｉｉ）配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＬＣ  
ＣＤＲ３
よりなる群から選ばれる１以上の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｂ）（ｉ）配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ
１、
（ｉｉ）配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣ  Ｃ
ＤＲ２および
（ｉｉｉ）配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＨＣ  
ＣＤＲ３
よりなる群から選ばれる１以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ、または
（ｃ）（ａ）の１以上のＬＣ  ＣＤＲおよび（ｂ）の１以上のＨＣ  ＣＤＲ
を含んでなり、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合しうる、請求項１記載の単離され
た抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項３】
（ａ）（ｉ）配列番号１２に記載されているとおりの配列を有するＬＣ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１３に記載されているとおりの配列を有するＬＣ  ＣＤＲ２お
よび
（ｉｉｉ）配列番号１４に記載されているとおりの配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３
よりなる群から選ばれる１以上の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、
（ｂ）（ｉ）配列番号９に記載されているとおりの配列を有するＨＣ  ＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号１０に記載されているとおりの配列を有するＨＣ  ＣＤＲ２お
よび
（ｉｉｉ）配列番号１１に記載されているとおりの配列を有するＨＣ  ＣＤＲ３
よりなる群から選ばれる１以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ、または
（ｃ）（ａ）の１以上のＬＣ  ＣＤＲおよび（ｂ）の１以上のＨＣ  ＣＤＲ
を含んでなり、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合しうる、請求項２記載の単離され
た抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項４】
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３または配列番号１１のアミノ酸配
列を有するＨＣ  ＣＤＲ３を含む、請求項３記載の単離された抗体または免疫学的に機能
的なフラグメント。
【請求項５】
配列番号１４のアミノ酸配列を有するＬＣ  ＣＤＲ３または配列番号１１のアミノ酸配
列を有するＨＣ  ＣＤＲ３を含む、請求項４記載の単離された抗体または免疫学的に機能
的なフラグメント。
【請求項６】
（ａ）および（ｂ）に記載されているＣＤＲからの少なくとも２つのＣＤＲを含む、請
求項１記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項７】
（ａ）および（ｂ）に記載されているＣＤＲからの少なくとも３つのＣＤＲを含む、請
求項６記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項８】
（ａ）および（ｂ）に記載されているＣＤＲからの少なくとも４つのＣＤＲを含む、請
求項７記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項９】
（ａ）および（ｂ）に記載されているＣＤＲからの少なくとも５つのＣＤＲを含む、請
求項８記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項１０】
（ａ）および（ｂ）に記載されているＣＤＲからの全６個のＣＤＲを含む、請求項９記
載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項１１】
ドメイン抗体である、請求項１記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグ
メント。
【請求項１２】
約２６９ｐＭまたはそれ未満のＫｄでＤｋｋ−１ポリペプチドから解離する、請求項１
記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項１３】
モノクローナル抗体である、請求項１記載の単離された抗体または免疫学的に機能的な
フラグメント。
【請求項１４】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）２である、請求項１記載の単離された
抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項１５】
ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１記載の単離された抗体または免疫学的に機
能的なフラグメント。
【請求項１６】
（ａ）配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ
）、
（ｂ）配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ
）、または
（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨ
を含んでなる単離された抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメント。
【請求項１７】
２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬよりなる、請求項１６記載の単離された抗体また
は免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項１８】
ＶＬが配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＶＨが配列番号８に
対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１６記載の単離された抗体または
免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項１９】
２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬよりなる、請求項１８記載の単離された抗体また
は免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２０】
ＶＬが配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、ＶＨが配列番号８に
対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１６記載の単離された抗体または
免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２１】
２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬよりなる、請求項２０記載の単離された抗体また
は免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２２】
ＶＬが配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＶＨが配列番号８のアミノ酸配列を有する、
請求項２１記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２３】
２つの同一ＶＨおよび２つの同一ＶＬよりなる、請求項２２記載の単離された抗体また
は免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２４】
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖、または
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号７のアミノ酸配列を含む重
鎖
を含む、請求項２２記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２５】
２つの同一軽鎖および２つの同一重鎖よりなる、請求項２４記載の単離された抗体また
は免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２６】
モノクローナル抗体である、請求項１６記載の単離された抗体または免疫学的に機能的
なフラグメント。
【請求項２７】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）．ｓｕｂ．２である、請求項１６記載
の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項２８】
ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１６記載の単離された抗体または免疫学的に
機能的なフラグメント。
【請求項２９】
配列番号３５のアミノ酸３２−２６６より構成され、システイン残基２２０と２４５と
の間のジスルフィド結合により確立された三次構造を有する成熟ヒトＤｋｋ−１タンパク
質に特異的に結合する抗体（ここで、該抗体は、配列番号３５のシステイン残基２０１と
２１０との間のアミノ酸よりなるループを含むエピトープに結合する）または免疫学的に
機能的なそのフラグメント。
【請求項３０】
モノクローナル抗体である、請求項２９記載の単離された抗体または免疫学的に機能的
なフラグメント。
【請求項３１】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または（Ｆａｂ’）．ｓｕｂ．２である、請求項２９記載
の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項３２】
ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項２９記載の単離された抗体または免疫学的に
機能的なフラグメント。
【請求項３３】
Ｄｋｋ−１ポリペプチドへの特異的結合に関して請求項２４記載の抗体と競合する抗体
または免疫学的に機能的なそのフラグメント。
【請求項３４】
２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖（ここで、該重鎖は配列番号３に記載のアミノ酸
配列よりなり、該軽鎖は配列番号７に記載のアミノ酸配列よりなる）よりなる抗体と競合
する、請求項３３記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項３５】
約２６９ｐＭまたはそれ未満のＫｄでＤｋｋ−１ポリペプチドから解離する、請求項３
４記載の単離された抗体または免疫学的に機能的なフラグメント。
【請求項３６】
（ａ）配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲおよび／または（ｂ）配
列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲをコードしており、抗体または免疫
学的に機能的なそのフラグメントをコードする核酸。
【請求項３７】
請求項１６記載の抗体または免疫学的に活性なフラグメントのＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ
とＶＬとの両方をコードする配列を含んでなる核酸。
【請求項３８】
請求項２２記載の抗体または免疫学的に活性なフラグメントのＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ
とＶＬとの両方をコードする核酸セグメントを含んでなる核酸。
【請求項３９】
請求項３７記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３９記載の発現ベクターを含んでなる単離された細胞。
【請求項４１】
請求項４０記載の細胞を培養する段階を含んでなる、抗体または免疫学的に活性なその
フラグメントの製造方法。
【請求項４２】
請求項１記載の抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントと、バッファー、医薬
上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤および保存剤よりなる群から選ばれる成分
とを含んでなる組成物。
【請求項４３】
請求項１６記載の抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントと、バッファー、医
薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤および保存剤よりなる群から選ばれる成
分とを含んでなる組成物。
【請求項４４】
請求項１記載の抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントの有効量を個体に投与す
ることを含んでなる、個体における疾患の治療方法であって、該疾患が、関節炎、幹細胞
再生に応答性の疾患、炎症疾患、神経疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、骨障害および皮膚
疾患よりなる群から選ばれる、方法。
【請求項４５】
該疾患が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および骨関節炎よりなる群から選ばれる、
請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該疾患が骨粗鬆症である、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
請求項１記載の抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントの有効量を個体に投与す
ることを含んでなる、個体における骨の成長を刺激する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄｋｋ−１に選択的に結合する抗体および免疫学的に機能的なそのフラグメ
ント、ならびに多種多様な疾患の治療、例えば、骨量の減少に関連した状態および種々の
非骨関連障害の予防もしくは治療または新たな骨の産生の促進のためのそれらの使用に関
する。
【背景技術】
【０００２】
骨格障害である骨粗鬆症は高齢者における疾患の主要原因である。骨粗鬆症は、骨吸収
（破壊）と骨形成との間の不均衡から生じる骨減少により特徴づけられる。この状態は、
低レベルの外傷後に生じうる骨折のリスクの増加を招く。米国では、現在、約２０００万
人に、骨粗鬆症による椎骨の骨折が認められる。高齢者患者集団では骨折による死亡が珍
しくない。
【０００３】
閉経後の高齢女性は、適切な骨維持に必要なエストロゲンの欠乏により、骨粗鬆症を発
症するリスクが最も高い。不十分なエストロゲンレベルは破壊性破骨細胞の産生および寿
命の増加を招き、そしてこれは骨吸収の増加を招く。その結果、椎骨における年平均５％
の骨減少が認められる。それほど一般的ではないが、骨粗鬆症は高齢男性も罹患する。高
齢男性における骨粗鬆症の存在は、１つには、循環テストステロンの減少により引き起こ
される不十分なエストロゲンレベルによるものでありうる。
【０００４】
骨減少を克服するための治療戦略は骨吸収の予防および骨成長の刺激の両方を含む。有
効な骨粗鬆症治療をもたらしている治療標的の大多数は前者の範疇に属する。したがって
、これまでのところ、この状態の一線級の治療／予防は、ビスホスホナート、エストロゲ
ン、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）およびカルシトニンのような
化合物を使用する骨吸収の抑制であった。骨吸収の抑制は骨量を回復し得ないため、この
アプローチは、既に相当量の骨を喪失している患者には無効な治療法である。また、この
メカニズムにより機能する骨粗鬆症治療の有効性は骨格構造の全体にわたって一貫したも
のではない。なぜなら、骨ターンオーバーの速度は部位によって異なるからである。例え
ば、骨ターンオーバー速度は椎骨の柱骨においては長骨の皮層におけるものより長く、し
たがって、骨吸収インヒビターは寛骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の増加および臀部骨折の予
防にはそれほど有効ではない。したがって、長骨における皮質／骨膜骨形成および骨量を
増加させる骨同化促進物質は、特に臀部骨折の高いリスクを有する患者において、骨粗鬆
症の治療における、満たされていない要求を満たすであろう。
【０００５】
骨粗鬆症を含む代謝障害のための１つの可能な治療標的は低密度リポタンパク質受容体
関連タンパク質５（ＬＲＰ５）である。ＬＲＰ５は、システインに富む相補型ＬＤＬＲリ
ガンド結合ドメインにより特徴づけられる、細胞表面受容体の低密度リポタンパク質受容
体（ＬＤＬＲ）遺伝子ファミリーに属する。ＬＲＰ５は、重篤な骨粗鬆症により特徴づけ
られる常染色体劣性障害である骨粗鬆症偽性神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）の遺伝子座に対
するその接近性に基づいて単離された（Ｈｅｙら，Ｇｅｎｅ  ２１６：１０３−１１１（
１９９８）；米国特許第６，５５５，６５４号および第６，５４５，１３７号）。ＬＲＰ
５受容体が骨粗鬆症の治療標的に相当するという見解に対する更なる裏づけは、ＬＲＰ５
の機能喪失突然変異がＯＰＰＧを引き起こすという観察から得られる（Ｇｏｎｇら，Ｃｅ
ｌｌ  １０７：５１３−５２３（２００１））。
【０００６】
興味深いことに、ＬＲＰ５の異常発現は、顕著に増加した骨量により特徴づけられる常
染色体優性ヒト遺伝的骨格状態である高骨量形質（ＨＢＭ）にも関連している。ＨＢＭ突
然変異のポジショナルクローニングは、ＨＢＭが、機能獲得を招くＬＲＰ５遺伝子のＧ１
７１Ｖ突然変異から生じることを示した（例えば、Ｌｉｔｔｌｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅｔ．７０：１１−１９（２００２）；米国特許第６，７７０，４６１号および第
６，７８０，６０９号；米国公開特許出願番号２００４００３８８６０および２００５０
０７０６９９を参照されたい）。これらの知見は、マウスにおけるＬＲＰ５のヌル突然変
異が重篤な骨減少を引き起こすという事実（Ｋａｔｏ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５７
（２）：３０３−３１４（２００２））と共に、ヒトの骨形成および骨量におけるＬＲＰ
５に関する必須の役割を示した。
【０００７】
ＬＲＰ５遺伝子は、骨成長の刺激におけるその特異的役割にもかかわらず、ほぼ遍在的
な発現プロファイルを有することが示された。ＬＲＰ５の活性化が骨形成を招くメカニズ
ムは不明である。分子レベルで、ＬＲＰ５および密接に関連しているＬＲＰ６はＷｎｔに
対する共受容体としてＷｎｔシグナリングに関与していることが最近示された。Ｗｎｔ遺
伝子は、中枢神経系における細胞成長および分化の媒介のような多種多様な発生過程およ
び成体生理的過程に関与する分泌タンパク質をコードしている。また、ＬＲＰ５およびＬ
ＲＰ６は分泌タンパク質ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）に対する受容体であること
、ならびにＤｋｋ−１に対するそれらの連関はＷｎｔシグナリングを抑制することも示さ
れた（Ｍａｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３２１−３２５（２００１）；Ｓｅｍｅｎｏｖ
ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，（２００１）；Ｂａｆｉｃｏら，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ
ｌ  ３：６８３−６８６（２００１））。
【０００８】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）は、胚頭部誘導に関与しＷｎｔに拮抗する分泌タ
ンパク質である（Ｇｌｉｎｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：３５７−３６２（１９９８）
）。ヒトＤｋｋ−１のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチドは既に記載され
ている（米国特許第６，３４４，５４１号、第６８４４４２２号、第７，０５７，０１７
号；公開特許出願番号２００５００６９９１５；Ｋｒｕｐｎｉｃｋら，Ｇｅｎｅ  ２３８
：３０１−３１３（１９９９））。ヒトにおけるＤｋｋ−１の発現は胎盤に限局されると
考えられたが、これは胚発生におけるＤｋｋ−１の役割を示唆している（Ｋｒｕｐｎｉｃ
ｋら，前掲）。Ａｌｌｅｎら（米国公開特許出願番号２００４００３８８６０）はＬＲＰ
５、ＨＢＭまたはＬＲＰ６とＤｋｋ−１との間の相互作用に関するアッセイを記載してい
る。Ｄｋｋ−１に結合する抗体は前記特許および特許出願ならびに米国公開特許出願番号
２００５００７９１７３および２００６０１２７３９３に既に記載されている。
【０００９】
ヒトＤｋｋ−１は、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−３およびＤｋｋ−４を含むＤｉ
ｃｋｋｏｐｆ遺伝子ファミリーのメンバーである（Ｋｒｕｐｎｉｃｋら，前掲）。Ｄｋｋ
−１およびＤｋｋ−４はクセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）胚におけるＷｎｔ誘導二次軸誘導
を抑制することが示されているが、いずれも、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ
（クセノプス・ディシェベルド）またはＦｒｉｚｚｌｅｄ（フリズルド）により誘発され
る軸誘導を遮断せず、このことは、それらのＷｎｔ抑制活性がＷｎｔシグナリング経路に
おけるＦｒｉｚｚｌｅｄの上流に存在することを示唆している（Ｋｒｕｐｎｉｃｋら，前
掲）。Ｄｋｋ−１は骨形成に抑制効果を及ぼしうるため、それらは骨粗鬆症の予防または
治療のための潜在的標的となりうることが示唆されている（ＰａｔｅｌおよびＫａｒｅｎ
ｓｋｙ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５７２−１５７３（２００２）；Ｂｏｙｄ
ｅｎら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５１３−１５２１（２００２））。Ｄｉｃ
ｋｋｏｐｆ遺伝子ファミリーの他のメンバーと交差反応することなく骨同化における付随
的増進を伴ってＬＲＰ５／６とのＤｋｋ−１の相互作用を選択的に抑制して骨におけるＷ
ｎｔシグナリング経路を刺激する試薬および方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，５５５，６５４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５４５，１３７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７７０，４６１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，７８０，６０９号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００４／００３８８６０号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／００７０６９９号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３４４，５４１号明細書
【特許文献８】米国特許第６，８４４，４２２号明細書
【特許文献９】米国特許第７，０５７，０１７号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００６９９１５号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００５／００７９１７３号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００６／０１２７３９３号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ  ２１６：１０３−１１１（１９９８）
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  １０７：５１３−５２３（２００１）
【非特許文献３】Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７０：１１−１９（２００２）
【非特許文献４】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５７（２）：３０３−３１４（２００    ２）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３２１−３２５（２００１）
【非特許文献６】Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，（２００１）
【非特許文献７】Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：６８３−６８６（２００１）
【非特許文献８】Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：３５７−３６２（１９９８）
【非特許文献９】Ｇｅｎｅ  ２３８：３０１−３１３（１９９９）
【非特許文献１０】Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５７２−１５７３（２００    ２）
【非特許文献１１】Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５１３−１５２１（２００    ２）
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、Ｄｋｋ−１に選択的に結合する抗体および免疫学的に機能的なそのフラグメ
ントを提供する。該抗体および免疫学的に活性なフラグメントはまた、Ｄｋｋ−１とＬＲ
Ｐ５および／またはＬＲＰ６との間の結合を遮断または軽減して、Ｗｎｔシグナリングに
関連した少なくとも１つの活性を刺激する。特に、該抗体および免疫学的に機能的なその
フラグメントは、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ遺伝子ファミリーの他のメンバーとの検出可能な交差
反応を伴うことなく骨量における付随的増進を伴って、ＬＲＰ５／６とのＤｋｋ−１の相
互作用を選択的に抑制して、Ｗｎｔシグナリング経路を刺激する。該抗体およびフラグメ
ントには、天然に存在する構造を有する抗体、および抗原結合ドメインを有するポリペプ
チド（例えば、ドメイン抗体）が含まれる。該抗体およびフラグメントは、多種多様な疾
患の治療、例えば、骨量の減少に関連した状態および種々の非骨関連障害の予防もしくは
治療または新たな骨の産生の促進のために使用されうる。該抗体および選択的結合性物質
の製造において有用な核酸分子、ベクターおよび宿主細胞も提供する。
【００１３】
提供する抗体および免疫学的に機能的なフラグメントのいくつかは、（ａ）（ｉ）配列
番号１２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列
番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ２および（ｉｉｉ
）配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ  ＣＤＲ３よりなる
群から選ばれる１以上の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、（ｂ）（ｉ）配列番号
９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１
０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ２および（ｉｉｉ）配列
番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ  ＣＤＲ３よりなる群から
選ばれる１以上の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ、または（ｃ）（ａ）の１以上のＬＣ  ＣＤＲおよ
び（ｂ）の１以上のＨＣ  ＣＤＲを含む。
【００１４】
そのような抗体またはフラグメントはＤｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合しうる。
ある抗体またはフラグメントは前記ＣＤＲの１、２、３、４、５または全６個を含む。
【００１５】
他の抗体またはフラグメントの軽鎖および重鎖が前記のとおりに提供されるが、前記配
列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。更に他の抗体またはそのフラグメン
トは、配列番号１２に記載されているアミノ酸配列をＣＤＲ１が有し、配列番号１３に記
載されているアミノ酸配列をＣＤＲ２が有し、および／または配列番号１４に記載されて
いるアミノ酸配列をＣＤＲ３が有する軽鎖を有する。また、いくつかの抗体およびフラグ
メントは、配列番号９に記載されているアミノ酸配列をＣＤＲ１が有し、配列番号１０に
記載されているアミノ酸配列をＣＤＲ２が有し、および／または配列番号１１に記載され
ているアミノ酸配列をＨＣ  ＣＤＲ３が有する重鎖を有しうる。個々の抗体またはフラグ
メントは、配列番号１４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、および／または配列番号
１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。
【００１６】
さらに、（ａ）配列番号４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領
域（ＶＬ）、（ｂ）配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変
領域（ＶＨ）、または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨを含む抗体および免疫学的
に機能的なフラグメントを提供する。
【００１７】
さらにまた、構造において類似している抗体または免疫学的に機能的なフラグメントを
提供するが、該ＶＬは配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＶＨは
配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。特定の抗体または機能的フ
ラグメントにおいては、該ＶＬは配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有
し、ＶＨは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらに他の態様
においては、該抗体または免疫学的に機能的なフラグメントは、配列番号４のアミノ酸配
列を有するＶＬ、および／または配列番号８のアミノ酸配列を有するＶＨを含む。
【００１８】
いくつかの抗体またはフラグメントは、配列番号２もしくは３のアミノ酸配列を含む若
しくはそれらよりなる軽鎖、および／または配列番号６もしくは７のアミノ酸配列を含む
若しくはそれらよりなる重鎖を有する。
【００１９】
また、配列番号３５のアミノ酸３２−２６６よりなる、システイン残基２２０と２４５
との間のジスルフィド結合により確立された三次構造を有する成熟ヒトＤｋｋ−１タンパ
ク質に特異的に結合する抗体または免疫学的に機能的なフラグメントを含む。ここで、該
抗体は、配列番号３５のシステイン残基２０１と２１０との間のアミノ酸よりなるループ
を部分的に含むエピトープに結合する。
【００２０】
さらに、Ｄｋｋ−１ポリペプチドへの特異的結合に関して抗体（例えば、前記のもの）
と競合する抗体またはフラグメントを含む。例えば、いくつかの抗体およびフラグメント
は、２つの同一重鎖および２つの同一軽鎖よりなる抗体と競合し、ここで、該重鎖は配列
番号３に記載のアミノ酸配列よりなり、該軽鎖は配列番号７に記載のアミノ酸配列よりな
る。
【００２１】
提供する種々の抗体およびフラグメントは、単一の重鎖および／もしくは軽鎖または単
一の可変軽ドメインおよび／または単一の可変重ドメインを含みうる。他の抗体およびフ
ラグメントは２つの軽鎖および／または２つの重鎖を含む。該抗体またはフラグメントが
２つの軽鎖および／または重鎖を含む場合、いくつかの場合のそれらの２つの軽鎖は互い
に同一であり、同様に、いくつかの場合のそれらの２つの重鎖は同一である。提供する抗
体には、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体が含まれ
うる。免疫学的に機能的なフラグメントには、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’
）２またはドメイン抗体が含まれうるが、これらに限定されるものではない。いくつかの
場合には、該抗体またはフラグメントは約２６９ｐＭまたはそれ未満のＫｄでＤｋｋ−１
ポリペプチドから解離する。
【００２２】
さらに、前記抗体および免疫学的に活性なフラグメントのいずれかを含む医薬組成物を
提供する。そのような組成物は、典型的には、バッファー、医薬上許容される希釈剤、担
体、可溶化剤、乳化剤または保存剤をも含む。医薬組成物または医薬の製造における前記
抗体および免疫学的に活性なフラグメントの使用も記載する。
【００２３】
前記抗体をコードする種々の核酸も提供する。いくつかの核酸は、例えば、（ａ）配列
番号１４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、および／または（ｂ）配列番号１１
に記載のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲをコードしていて、コードされるＣＤＲは、Ｄ
ｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合しうる抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメ
ントをコードしている。特定の態様においては、該核酸は、抗体または免疫学的に活性な
フラグメントの可変軽領域（ＶＬ）および／または可変重領域（ＶＨ）をコードする配列
を含む又はそれらよりなり、ここで、該ＶＬは配列番号４に対して少なくとも８０％、９
０％または９５％の配列同一性を有し、該ＶＨは配列番号８に対して少なくとも８０％、
９０％または９５％の配列同一性を有する。該核酸のいくつかは、配列番号４を含む若し
くはそれよりなるＶＬをコードする配列、および／または配列番号８を含む若しくはそれ
よりなるＶＨをコードする配列を含む。さらに他の核酸は、前記配列特性を有するＶＬま
たはＶＨの両方をコードする配列を含む。前記核酸を含む発現ベクターも本明細書に開示
し、同様に、そのような発現ベクターを含む細胞（例えば下等真核生物細胞、例えば酵母
細胞、または高等真核生物細胞、例えば哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞もしくは昆虫細胞
）も本明細書に開示する。そのような発現ベクターを含有する細胞を培養することによる
、抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントの製造方法も記載する。
【００２４】
もう１つの態様においては、種々の疾患の治療における前記抗体または免疫学的に機能
的なフラグメントの使用を開示する。特定の方法においては、骨粗鬆症、関節炎、多発性
骨髄腫、転移性骨疾患、歯周病、幹細胞再生に応答性の疾患、炎症疾患、神経疾患、眼疾
患、腎疾患、肺疾患および皮膚疾患を治療するために、本明細書に記載の抗体または免疫
学的に活性なフラグメントの有効量を、それを要する個体に投与する。いくつかの治療方
法は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎または骨関節炎を治療することを含む。
【００２５】
さらに、本明細書に記載されている抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントの
治療的有効量を、それを要する個体に投与することを含む、骨量の減少の治療または予防
方法を本明細書において提供する。特定の態様においては、該個体は、骨粗鬆症または他
の骨減少罹患もしくは障害、例えば骨減少症、パジェット病、歯周炎、慢性関節リウマチ
、および不動性（長期臥床）による骨減少に罹患している個体である。この実施形態のも
う１つの態様においては、該個体は、骨に転移する癌に罹患している個体であり、もう１
つの態様においては、該患者は、多発性骨髄腫に罹患している患者である。
【００２６】
骨量の増加を誘導または刺激する方法も開示する。そのような方法は、本明細書に開示
されている抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントの治療的有効量を個体に投与
することを含む。１つの態様においては、該個体は、骨に転移する癌に罹患しており、も
う１つの態様においては、該患者は多発性骨髄腫に罹患している。さらにもう１つの態様
においては、該個体は、骨粗鬆症、骨減少症、パジェット病、歯周炎、慢性関節リウマチ
、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および不動性による骨減少を有する個体から選ばれる。
この方法のもう１つの態様においては、該個体は、骨移植片レシピエント、または骨折に
罹患している個体である。
【００２７】
本明細書に開示されているＤｋｋ−１抗体および免疫学的に機能的なそのフラグメント
は、骨微小環境を侵す癌細胞（例えば、多発性骨髄腫、乳癌、前立腺癌など）の骨破壊性
効果を軽減するための治療的治療をもたらしうる。
【００２８】
前記を考慮して、さらに、本明細書に記載されている抗体または免疫学的に機能的なそ
のフラグメントの治療的有効量を個体に投与することを含む、個体においてＷｎｔ活性を
誘導する方法を提供する。
【００２９】
定義
本明細書中で用いる「抗体」、「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン分子」なる
語は互換的に用いられる。各免疫グロブリン分子は、その特異的抗原にそれが結合するの
を可能にする特有の構造を有するが、すべての免疫グロブリンは、本明細書に記載されて
いるのと同じ全体的構造を有する。基本的な免疫グロブリン構造単位はサブユニットの四
量体を含むことが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを有し、
各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）
を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識をもたらす約１００〜１１０個ま
たはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター
機能をもたらす定常領域を定める。軽鎖はカッパまたはラムダとして分類される。重鎖は
ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして抗体のイソタイプを定める。
【００３０】
軽鎖および重鎖は可変領域および定常領域に細分される（全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅ
ｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照されたい）。したがって、完全抗体は２
つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体の場合を除き、それらの２つの結
合部位は同一である。鎖は全て、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変
領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ全体構造を
示す。各ペアの２つの鎖からのＣＤＲは該フレームワーク領域により整列され、特異的エ
ピトープへの結合を可能にする。これらの用語は、天然に存在する形態、ならびにフラグ
メント（断片）および誘導体を含む。用語の範囲内には、免疫グロブリンのクラス、すな
わち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＤが含まれる。ＩｇＧのサブタイプ、
すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４も用語の範囲内に含まれる。用
語は広義に用いられ、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体
を含む）、および複数のエピトープまたは抗原に結合する抗体組成物を含む。用語は、特
に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異
性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを含むが、それらはＣＨ２ド
メインのＮ結合グリコシル化部位を含む重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインの
部分またはその変異体を少なくとも含有するか又は含有するよう修飾されなければならな
い。また、これらの用語は、Ｎ結合グリコシル化部位を少なくとも含有する少なくともＦ
ａｂ領域の抗体フラグメントを意味しうる。
【００３１】
「Ｆｃ」フラグメントなる語は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する、抗体のＣ末
端領域「結晶性フラグメント」を意味する（図１）。「Ｆａｂ」フラグメントなる語は、
ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含有する、抗体の「抗原結合フラグメント」領
域を意味する（図１）。
【００３２】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる語は、実質的に均一な抗体
の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、該集団を含む個々の抗体は、少量で存在
しうる可能な天然に存在する突然変異の場合を除き同一である。モノクローナル抗体は単
一の抗原部位に対して高特異性である。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対する種
々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは
該抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加え
て、他の免疫グロブリンの混入を伴わないハイブリドーマ培養により合成されうる点で好
都合である。「モノクローナル」なる語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるとい
う抗体の特性を示すものであり、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解
釈されるべきではない。例えば、本明細書におけるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ
ら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法に
より製造されることが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造されうる（例えば
、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。
【００３３】
「抗体」または「免疫グロブリン」なる語の範囲内の「フラグメント」なる語は、種々
のプロテアーゼでの消化により製造されたもの、化学的切断および／または化学的解離に
より製造されたもの、ならびに組換え的に製造されたものを含むが、該フラグメントは尚
も標的分子に特異的に結合しうるものでなければならない。そのようなフラグメントとし
ては、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フ
ラグメントが挙げられる。以下、「免疫グロブリン」なる語は「フラグメント」なる語を
も含む。
【００３４】
免疫グロブリンは更に、配列において修飾されているが尚も標的分子に特異的に結合し
うる免疫グロブリンまたはフラグメント、例えば、種間キメラおよびヒト化抗体；抗体融
合体；ヘテロマー抗体複合体および抗体融合体、例えばジアボディ（二重特異性抗体）、
一本鎖ジアボディおよびイントラボディを含む（例えば、Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ，（Ｍａｒａｓｃｏ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，
Ｉｎｃ．，１９９８））。
【００３５】
「エピトープ」なる語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する、抗原上の部位、あるい
は抗体の産生対象となる及び／又は抗体が結合する、分子上の部位を意味する。例えば、
エピトープは、該エピトープを定める抗体により認識されうる。線状エピトープは、認識
されるエピトープをアミノ酸一次配列が含むエピトープである。線状エピトープはユニー
ク配列内に典型的には少なくとも３個、より通常は少なくとも５個、例えば約８個〜約１
０個のアミノ酸を含む。線状エピトープとは対照的に、コンホメーションエピトープは、
該エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の限定成分では
ないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、該エピトープを定める抗体により必ず
しも認識されないエピトープ）である。典型的には、コンホメーションエピトープは、線
状エピトープに比べて増加した数のアミノ酸を含む。コンホメーションエピトープの認識
に関して、該抗体は該ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タン
パク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合、該コンホメーションエピトープを
形成する或るアミノ酸および／またはポリペプチドバックボーンは、該抗体が該エピトー
プを認識することを可能にするよう並置される。
【００３６】
エピトープのコンホメーションを決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学、二次元核磁
気共鳴分光法および部位特異的スピンラベル法および電子常磁性共鳴分光法が含まれるが
、これらに限定されるものではない。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１
９９６）Ｖｏｌ．６６，Ｍｏｒｒｉｓ（編）を参照されたい。
【００３７】
本明細書中で用いる「Ｄｋｋ−１」は、例えば、Ｄｋｋ−１のアカゲザル、マウスおよ
びヒト形態を含む。ヒトおよびアカゲザルＤｋｋ−１タンパク質のアミノ酸配列を、それ
ぞれ、配列番号３５および３８に示す。ヒトＤｋｋ−１タンパク質（配列番号３５）は、
配列番号３５のアミノ酸１−３１よりなるリーダー配列を有する。マウスＤｋｋ−１タン
パク質配列はＧｌｉｎｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：３５７−３６２（１９９８）に開
示されている。アカゲザルＤｋｋ−１は、国際公開番号ＷＯ２００５０４９６４０に開示
されている。「Ｄｋｋ−１」なる語は、これらの天然タンパク質と免疫学的に交差反応性
である、そのような天然配列の変異体をも含む。これらのＤｋｋ−１タンパク質はＬＲＰ
５またはＬＲＰ６タンパク質とＷｎｔとの間の相互作用を抑制しうる。ヒトＬＲＰ５の典
型的なアミノ酸配列を配列番号３９に示す。ヒトＬＲＰ６をコードする典型的なアミノ酸
配列を配列番号４０に示す。該用語は、本明細書に開示されている抗体が特異的に結合し
うるエピトープを含有する、Ｄｋｋ−１の天然または変異体形態の断片をも意味する。
【００３８】
「骨減少症」なる語は、正常な骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を有するとみなされる標準的
な患者と比較して少なくとも１標準偏差の骨減少を有する患者に関するものである。この
目的においては、該測定値を二重エネルギーＸ線吸収（ＤＥＸＡ）により決定し、患者の
ＢＭＤを、年齢および性別に釣り合わされた標準値（Ｚスコア）と比較する。骨減少症の
判定の際には、１以上の骨からＢＭＤ測定値を得る。
【００３９】
「治療的有効量」なる語は、哺乳動物において治療応答をもたらすと判断された抗Ｄｋ
ｋ−１抗体の量を意味する。そのような治療的有効量は当業者により容易に確認される。
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｄｋｋ−１のＣ末端領域において多次元コンホメーションエピトープを標的
化することによりＬＲＰ５へのＤｋｋ−１の結合を選択的に抑制する抗体または免疫学的
に機能的なそのフラグメントを含む組成物を提供する。該抗体は更に、ＦｃＲｎへの結合
の実質的な変化も半減期の変化も伴うことなく生理的に妥当な程度でいずれのＦｃ受容体
またはＣ１ｑにも該抗体が結合できなくする、該抗体のＦｃドメインへの修飾を含む。換
言すれば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）を誘発
せず免疫複合体も形成することなく、Ｄｋｋ−１の多次元コンホメーションエピトープを
認識する抗体を含む組成物を提供する。現在好ましい実施形態においては、該抗体は完全
ヒトモノクローナル抗体であり、これは、好ましくは、どのような度合であれ、抗体依存
性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）を誘発せず、また、免疫複合体
を形成しない一方で、その正常な薬物動態学的（ＰＫ）特性を保有する。骨同化を刺激す
るための成長中のマウスモデルにおいて、該抗体を含む組成物は、該抗体を含む組成物が
骨粗鬆症の治療に有用であることを示している。
【００４１】
種々の骨同化性標的のうち、骨における規定（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔシグナリン
グ経路は、療法に対する有効かつ安全な同化応答を惹起するための最良の機会を提供する
。規定Ｗｎｔは、２つの共受容体、すなわち、フリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ならびに
ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）５および６（それぞれ配列番号３９および４０を
参照されたい）を介して、シグナルを伝達する。ＬＲＰ５の高次形態（ｈｙｐｅｒｍｏｒ
ｐｈｉｃ）突然変異は、年齢が釣り合わされた正常対照と比較してＢＭＤにおける有意な
増加を引き起こす（臨床集団における平均より約５ＳＤ高い）。その原因となる突然変異
（例えば、Ｇ１７１Ｖ）が、骨量および骨形成速度の増加を招くトランスジェニックマウ
スにおいて試験されている。規定Ｗｎｔシグナリングは、骨において高発現される抑制性
タンパク質Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ１）の存在下で遮断される。Ｄｋｋ−１は、２
６ｋＤａの分子量を有する２６６アミノ酸のタンパク質である。該タンパク質は、システ
インに富む２つのドメイン、すなわち、アミノ酸９７−１３８および１８３−２４５（種
間で高度に保存されているモチーフ）を有する。Ｄｋｋ−１は高い比率の種間配列同一性
／類似性を有する（ヒト：アカゲザル  ９７／９９、ヒト：マウス  ８０／８７およびア
カゲザル：マウス  ７９／８７）。興味深いことに、Ｄｋｋ−１は、ＬＲＰ５の高次形態
Ｇ１７１突然変異体を抑制するその能力を喪失する（該突然変異受容体の中心的シグナリ
ング欠損）。さらに、同様に、Ｄｋｋ−１を欠くヘテロ接合ノックアウトマウスは（Ｇ１
７１Ｖ−ＬＲＰ５マウスの場合と同様に）骨量の増加を示し、これは骨形成速度における
４倍の上昇を伴う。ＬＲＰ５に関する、およびＤｋｋ−１によるその抑制に関する複合的
データは、骨同化応答が、該受容体の選択的活性化を介して、または骨微小環境における
ＬＲＰ５シグナリングのＤｋｋ−１抑制を妨げる阻害性療法により生じうることを示唆し
ている。実際、実施例において示されるとおり、本明細書に開示されている中和抗Ｄｋｋ
−１抗体（０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇ、皮下、週２回）は、遠位および全大腿骨に対する
ＰＴＨ様効果を伴って、成長中のマウスにおいて骨量を増加させた。他の抗Ｄｋｋ−１抗
体も、成長中のマウスにおいて骨量を増加させることが示されている。例えば、米国公開
出願番号２００６０１２７３９３を参照されたい。
【００４２】
したがって、Ｄｋｋ−１の活性を調節するのに有用である、種々の抗Ｄｋｋ−１抗体（
一本鎖抗体、ドメイン抗体、および抗原結合領域を有するポリペプチドを含む）および免
疫学的に機能的なそれらのフラグメントを提供する。これらの抗Ｄｋｋ−１抗体および免
疫学的に機能的なそれらのフラグメントはヒトＤｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合し
、Ｗｎｔシグナリング経路のＤｋｋ−１抑制を軽減し、骨組織における骨形成を誘導する
。
【００４３】
本発明の或る実施形態においては、該抗Ｄｋｋ−１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２または
ＩｇＧ４サブタイプのものである。好ましい実施形態においては、該抗体は完全ヒトモノ
クローナル抗体であり、これは、好ましくは、どのような度合であれ、抗体依存性細胞傷
害（ＡＤＣＣ）、補体媒介性細胞傷害（ＣＭＣ）を誘発せず、また、免疫複合体を形成し
ない一方で、その正常な薬物動態学的（ＰＫ）特性を保有する。現在好ましい実施形態に
おいては、該抗体はＩｇＧ２ｍ４イソタイプを有する（２００６年１０月１７日付け出願
の米国出願番号１１／５８１，９３１および２００５年１０月２１日付け出願の米国出願
１１／２５６，３３２を参照されたい）。
【００４４】
抗体を構成する各軽／重免疫グロブリン鎖ペアの可変領域は典型的には抗原結合部位を
形成する。免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に、３つの超可変領域または「相補性決
定領域」（ＣＤＲ）により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）より
なる同じ全体構造を示す。ＣＤＲは各重鎖／軽鎖ペアの２つの鎖を形成し、これらは、典
型的には、フレームワーク領域により整列されて、標的タンパク質上の特異的エピトープ
に特異的に結合する構造を形成する。天然に存在する軽および重鎖可変領域は共に、典型
的には、該免疫学的鎖のＮ末端からＣ末端に以下の順序のこれらの要素に適合する：ＦＲ
１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。これらのドメインの
それぞれの位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための付番系が案出されている。こ
の付番系はＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｖｉｏｌ．１９６：９０１−９
１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８
９）に記載されている。
【００４５】
提供する抗Ｄｋｋ−１抗体の完全長軽および重免疫グロブリン鎖の幾つかの具体例なら
びに対応ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表１に要約する。
【００４６】
【表１】
2014087366.tif 000003
【００４７】
抗Ｄｋｋ−１抗体は、表１に挙げられている軽鎖のいずれか１つを、表１に挙げられて
いる重鎖のいずれかと合体させることにより形成されうる。いくつかの場合には、該抗体
は、表１に挙げられているものから選ばれる少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含
み、他の場合には、該抗体は２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含有する。一例
としては、抗体または免疫学的に機能的なフラグメントは、表１に挙げられている２つの
Ｌ２軽鎖および２つのＨ１重鎖、または２つのＬ２軽鎖および２つのＨ３重鎖、または２
つのＬ２軽鎖および２つのＨ４重鎖、ならびに軽鎖のペアと重鎖のペアとの他の類似の組
合せを含みうる。
【００４８】
Ｄｋｋ−１のＣ末端領域内の前記多次元コンホメーションエピトープに結合しうる典型
的な抗Ｄｋｋ−１抗体はモノクローナル抗体ＲＨ１−１０、ＲＨ２−１８、ＲＨ２−５９
およびＲＨ２−８０（後記実施例を参照されたい）であり、それらのそれぞれは軽鎖およ
び重鎖を含む。
【００４９】
ＲＨ１−１０の完全軽鎖は、配列番号１７に示すヌクレオチド配列によりコードされ、
ＲＨ１−１０の完全重鎖は、配列番号１９に示すヌクレオチドによりコードされる。ＲＨ
１−１０の対応軽鎖および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１８および２０に示す。
配列番号１８のアミノ酸残基１−２０および配列番号２０の残基１−１９は、それぞれ、
ＲＨ１−１０のこれらの軽鎖および重鎖のシグナル配列に対応する。該シグナル配列を含
有しない該軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４２に示し、該シグナル配列を欠く該重鎖のア
ミノ酸配列を配列番号４１に示す。したがって、前記実施形態の１つの態様においては、
該重鎖は配列番号２０のアミノ酸２０−４５７（配列番号４１に対応するＨ１）よりなり
、この実施形態のもう１つの態様においては、該軽鎖は配列番号１８のアミノ酸２１−２
３７（配列番号４２に対応するＬ１）よりなることが可能である。この実施形態の更にも
う１つの態様においては、該抗体は、配列番号２０のアミノ酸２０−４５７よりなる重鎖
および配列番号１８のアミノ酸２１−２４７よりなる軽鎖の両方を含む。いくつかの場合
には、該抗体は２つの同一の重鎖（それぞれは配列番号２０のアミノ酸２０−４５７より
なる）および２つの同一の軽鎖（それぞれは配列番号１８のアミノ酸２１−２３７よりな
る）よりなる。
【００５０】
ＲＨ２−１８の完全軽鎖は、配列番号１に示すヌクレオチド配列によりコードされ、Ｒ
Ｈ２−１８の完全重鎖は、配列番号５に示すヌクレオチドによりコードされる。ＲＨ２−
１８の対応軽鎖および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および６に示す。配列番号
２のアミノ酸残基１−２０および配列番号６の残基１−１９は、それぞれ、ＲＨ２−１８
のこれらの軽鎖および重鎖のシグナル配列に対応する。該シグナル配列を含有しない該軽
鎖のアミノ酸配列を配列番号３に示し、該シグナル配列を欠く該重鎖のアミノ酸配列を配
列番号７に示す。したがって、前記実施形態の１つの態様においては、該重鎖は配列番号
６のアミノ酸２０−４５７（配列番号７に対応するＨ２）よりなり、この実施形態のもう
１つの態様においては、該軽鎖は配列番号２のアミノ酸２１−２３７（配列番号３に対応
するＬ２）よりなることが可能である。この実施形態の更にもう１つの態様においては、
該抗体は、配列番号６のアミノ酸２０−４５７よりなる重鎖および配列番号２のアミノ酸
２１−２３７よりなる軽鎖の両方を含む。いくつかの場合には、該抗体は２つの同一の重
鎖（それぞれは配列番号６のアミノ酸２０−４５７よりなる）および２つの同一の軽鎖（
それぞれは配列番号２のアミノ酸２１−２３７よりなる）よりなる。
【００５１】
ＲＨ２−５９の完全軽鎖は、配列番号２１に示すヌクレオチド配列によりコードされ、
ＲＨ２−５９の完全重鎖は、配列番号２３に示すヌクレオチドによりコードされる。ＲＨ
２−５９の対応軽鎖および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２２および２４に示す。
配列番号２２のアミノ酸残基１−２０および配列番号２４の残基１−１９は、それぞれ、
ＲＨ２−５９のこれらの軽鎖および重鎖のシグナル配列に対応する。該シグナル配列を含
有しない該軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４４に示し、該シグナル配列を欠く該重鎖のア
ミノ酸配列を配列番号４３に示す。したがって、前記実施形態の１つの態様においては、
該重鎖は配列番号２４のアミノ酸２０−４５７（配列番号４３に対応するＨ３）よりなり
、この実施形態のもう１つの態様においては、該軽鎖は配列番号２２のアミノ酸２１−２
３７（配列番号４４に対応するＬ３）よりなることが可能である。この実施形態の更にも
う１つの態様においては、該抗体は、配列番号２４のアミノ酸２０−４５７よりなる重鎖
および配列番号２２のアミノ酸２１−２３７よりなる軽鎖の両方を含む。いくつかの場合
には、該抗体は２つの同一の重鎖（それぞれは配列番号２４のアミノ酸２０−４５７より
なる）および２つの同一の軽鎖（それぞれは配列番号２２のアミノ酸２１−２３７よりな
る）よりなる。
【００５２】
ＲＨ２−８０の完全軽鎖は、配列番号２５に示すヌクレオチド配列によりコードされ、
ＲＨ２−８０の完全重鎖は、配列番号２７に示すヌクレオチドによりコードされる。ＲＨ
２−８０の対応軽鎖および重鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６および２８に示す。
配列番号２６のアミノ酸残基１−２０および配列番号２８の残基１−１９は、それぞれ、
ＲＨ２−８０のこれらの軽鎖および重鎖のシグナル配列に対応する。該シグナル配列を含
有しない該軽鎖のアミノ酸配列を配列番号４６に示し、該シグナル配列を欠く該重鎖のア
ミノ酸配列を配列番号４５に示す。したがって、前記実施形態の１つの態様においては、
該重鎖は配列番号２８のアミノ酸２０−４５７（配列番号４５に対応するＨ４）よりなり
、この実施形態のもう１つの態様においては、該軽鎖は配列番号２６のアミノ酸２１−２
３７（配列番号４６に対応するＬ４）よりなることが可能である。この実施形態の更にも
う１つの態様においては、該抗体は、配列番号２８のアミノ酸２０−４５７よりなる重鎖
および配列番号２６のアミノ酸２１−２３７よりなる軽鎖の両方を含む。いくつかの場合
には、該抗体は２つの同一の重鎖（それぞれは配列番号２８のアミノ酸２０−４５７より
なる）および２つの同一の軽鎖（それぞれは配列番号２６のアミノ酸２１−２３７よりな
る）よりなる。
【００５３】
提供する他の抗Ｄｋｋ−１抗体は、前記の重鎖および軽鎖のいずれかの組合せにより形
成される抗体の変異体であり、これらの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列に対する少なくと
も７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性をそ
れぞれが有する軽鎖および／または重鎖を含む。いくつかの場合には、そのような抗体は
少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含み、他の場合には、そのような変異体形態は
２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含有する。
【００５４】
また、以下の表２に示すとおり、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３およびＶＬ４よりなる群から
選ばれる軽鎖可変領域ならびに／またはＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４よりなる群
から選ばれる重鎖可変領域とを含む抗Ｄｋｋ−１抗体、ならびにこれらの軽鎖および重鎖
可変領域の免疫学的に機能的なフラグメント（断片）、誘導体、突然変異タンパク質およ
び変異体を提供する。
【００５５】
【表２】
2014087366.tif 000004
【００５６】
したがって、提供する抗Ｄｋｋ−１抗体は、限定的なものではないが、以下の形態を有
するものを含む：ＶＬ１ＶＨ１、ＶＬ１ＶＨ２、ＶＬ１ＶＨ３、ＶＬ１ＶＨ４、ＶＬ２Ｖ
Ｈ１、ＶＬ２ＶＨ２、ＶＬ２ＶＨ３、ＶＬ２ＶＨ４、ＶＬ３ＶＨ１、ＶＬ３ＶＨ２、ＶＬ
３ＶＨ３、ＶＬ３ＶＨ４、ＶＬ４ＶＨ１、ＶＬ４ＶＨ２、ＶＬ４ＶＨ３、およびＶＬ４Ｖ
Ｈ３。いくつかの場合には、前記抗体は２つの軽鎖可変領域ドメインおよび２つの重鎖可
変領域ドメインを含み、ここで、各軽鎖は同一であり、各重鎖は同一である。他の場合に
は、前記抗体は２つの軽鎖可変領域ドメインおよび２つの重鎖可変領域ドメインを含み、
ここで、各軽鎖は異なり、各重鎖は異なる。
【００５７】
そのような抗Ｄｋｋ−１抗体の具体例として、特定の抗体または免疫学的に機能的なそ
のフラグメントはＲＨ２−１８の軽鎖の可変領域または重鎖の可変領域を含むことが可能
であり、ここで、該軽鎖可変領域は配列番号２のアミノ酸２１−１３２（配列番号４に対
応するＶＬ１）よりなり、該重鎖可変領域は配列番号６のアミノ酸２０−１３１（配列番
号８に対応するＶＨ１）よりなる。この実施形態の１つの態様においては、該抗体は２つ
の同一の重鎖および２つの同一の軽鎖よりなる。また、例えば、配列番号２のアミノ酸２
１−１３２よりなる軽鎖可変領域または抗原結合性である若しくは免疫学的に機能的なそ
のフラグメントを含み、さらに、配列番号６のアミノ酸２０−１３１よりなる重鎖可変領
域を含む抗体を提供する。
【００５８】
個々の抗Ｄｋｋ−１抗体は、１〜約２０アミノ酸残基のＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３または
ＶＬ４から選ばれる軽鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む軽鎖可変ド
メインを含むことが可能であり、ここで、それぞれのそのような配列相違は、独立して、
１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。いくつかの抗体における軽鎖可変領域は
、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３またはＶＬ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくと
も７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含む。
【００５９】
個々の抗Ｄｋｋ−１抗体は、１〜約２０アミノ酸残基のＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３または
ＶＨ４から選ばれる重鎖可変ドメインの配列とは異なるアミノ酸の配列を含む重鎖可変ド
メインを含むことが可能であり、ここで、それぞれのそのような配列相違は、独立して、
１個のアミノ酸の欠失、挿入または置換である。いくつかの抗体における重鎖可変領域は
、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３またはＶＨ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくと
も７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本明細書に開示されている個々の抗Ｄｋｋ−１抗体は、表３に要約するとおり、ＣＤＲ
の１以上のアミノ酸配列と同一である又は実質的な配列同一性を有する１以上のアミノ酸
配列を含みうる。
【００６１】
【表３】
2014087366.tif 000005
【００６２】
提供する抗Ｄｋｋ−１抗体および免疫学的に機能的なフラグメントは、前記に挙げたＣ
ＤＲの１以上を含むことが可能であり、該ＣＤＲの任意の組合せを含むことが可能である
。例えば、いくつかの抗体またはフラグメントは軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の両方
を含みうる。ある抗体は、表３に挙げたＣＤＲの変異体形態を含有し、該ＣＤＲの１以上
のそれぞれは、表３に挙げたＣＤＲ配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％また
は９５％の配列同一性を有する。例えば、該抗体またはフラグメントは、表３に挙げたそ
れぞれ軽鎖ＣＤＲ３配列および重鎖ＣＤＲ３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％
または９５％の配列同一性をそれぞれが有する軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の両方を
含みうる。挙げられている配列との相違は、通常、保存的置換である。軽鎖または重鎖Ｃ
ＤＲの１以上を含むポリペプチドは、後記で更に詳しく説明するとおり、適当な宿主細胞
内で該ポリペプチドを発現させるために適当なベクターを使用して製造されうる。
【００６３】
表２および３に開示されている重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲを使用して、ド
メイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）：フラグメント
、Ｆｖ：フラグメント、一本鎖抗体およびｓｃＦｖを含む（これらに限定されるものでは
ない）当業者に公知の種々のタイプの免疫学的に機能的なフラグメントのいずれかを製造
することが可能である。
【００６４】
抗Ｄｋｋ−１抗体エピトープ
抗Ｄｋｋ−１抗体はＤｋｋ−１のＣ末端領域内の複合的な多次元コンホメーションエピ
トープに結合する。コリパーゼでの相同性モデルにより（後記のとおり）、Ｄｋｋ−１の
Ｃ末端ドメインは球状三次構造を形成すると予想される。実施例５に示す結果は、ＲＨ２
−１８抗体により例示されるとおり、抗Ｄｋｋ−１抗体により認識されるエピトープが、
Ｄｋｋ−１のＣ末端内のシステイン・リッチ・ドメイン２におけるＤｋｋ−１の配列およ
び三次構造の両方により影響される複合エピトープであることを示している。図５Ｃは、
アラニン−スキャニングにより決定されたＲＨ２−１８抗体へのＤｋｋ−１の結合に必要
なアミノ酸残基を示すＤｋｋ−１  Ｃ末端ドメイン（アミノ酸１８７−２６６）の構造-
相同性モデルを示す（図５Ｃを参照されたい）。アミノ酸残基Ｓ１８７からＶ１８８、Ｒ
２０３からＫ２０８、Ｅ２４およびＬ２４３の置換は、非変性タンパク質を使用する免疫
ブロット実験において抗原−抗体相互作用の低下をもたらすことが判明した。したがって
、これらのアミノ酸残基は該複合エピトープの形成において重要な役割を果たしているら
しい。該Ｃ末端相同性モデルにおいて示されるアミノ酸配列の範囲外であるアミノ酸残基
Ｒ１７１−Ｌ１７４も該複合エピトープに寄与することが判明した。また、アラニンでの
アミノ酸Ｃ２２０の置換もＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合の喪失を引き起こした。しか
し、Ｄｋｋ−１  Ｃ末端ドメインの第２および第３フィンガー（ループ）に位置づけられ
る図５ｃに示されているアミノ酸残基の特定の置換はＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８の結合
に悪影響を及ぼさないようであった。したがって、それはＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８の
結合に必要であるとはみなされない。
【００６５】
したがって、ＲＨ２−１８抗体は、抗体結合に必要であると確認された第２のシステイ
ン・リッチ・ドメインの種々の別個の領域からの以下のアミノ酸残基を含む複合エピトー
プに結合する：アミノ酸残基Ｓ１８７およびＶ１８８（それらは共に、第１フィンガード
メインに先行する領域内に存在する）ならびにアミノ酸Ｒ２０３、Ｈ２０４、Ｆ２０５、
Ｗ２０６、Ｓ２０７およびＫ２０８（それらは全て、該ドメインの第１フィンガーを構成
する）。さらに、該ドメインのＣ末端側に、そして第２フィンガーに先行して、Ｅ２４１
およびＬ２４３が存在し、それらもＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合に必要であった。最
後に、Ｃｙｓ２２０はＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合に必要である。Ｃｙｓ２２０は適
切な三次構造の確立において重要な役割を果たすと予想され、このこともこのエピトープ
の複合的性質を示すものである。総合すると、該データは、ＲＨ２−１８エピトープが、
Ｄｋｋ−１の第１フィンガードメインＡ２０２−Ｉ２０９を含む（これに限定されるもの
ではない）Ｄｋｋ−１  Ｃ末端領域のトポグラフ的表面により定められることを示唆して
いる。したがって、抗Ｄｋｋ−１抗体は、システイン残基２２０および２４５の間のジス
ルフィド結合により確立される三次構造を有し配列番号３５のアミノ酸３２−２６６より
なる成熟ヒトＤｋｋ−１タンパク質の複合エピトープに結合し、ここで、該抗体は、配列
番号３５のシステイン残基２０１および２１０の間のアミノ酸よりなるループを含むエピ
トープに結合する。
【００６６】
Ｄｋｋ−１のアミノ酸配列はＤｋｋ−２およびＤｋｋ−４のアミノ酸配列と密接に関連
しており、アミノ酸レベルでそれらに対してそれぞれ５０％および４５％の同一性を有す
る。ヒトＤｋｋ−１、−２、−４およびアカゲザルＤｋｋ−１のアミノ酸配列の比較（図
６Ａ）は、前記のとおりＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合に重要であることが確認された
Ｄｋｋ−１内に位置するアミノ酸残基の保存性の欠如を示している。ＲＨ２−１８結合に
必要なＤｋｋ−１内のアミノ酸残基は青色の枠内に囲われている。認められうるとおり、
Ｄｋｋ−２およびＤｋｋ−４における対応領域内の配列保存性の完全な欠如が存在する。
アミノ酸残基Ａｒｇ１７１からＬｅｕ１７４、Ｓｅｒ１８７、Ｖａｌ１８８、Ｓｅｒ２０
７およびＧｌｕ２４１がＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８の結合に必要であることを示した、
Ｄｋｋ−１におけるアミノ酸残基のエピトープマッピングに基づいて、そしてアミノ酸残
基Ａｒｇ１７１からＬｅｕ１７４、Ｓｅｒ１８７、Ｖａｌ１８８、Ｓｅｒ２０７およびＧ
ｌｕ２４１におけるＤｋｋ−１およびＤｋｋ−２およびＤｋｋ−４の間の配列保存性の欠
如に基づいて、ＲＨ２−１８および類似エピトープを共有する他の抗Ｄｋｋ−１抗体はＤ
ｋｋ−１に対する高度の選択性を有すると予想される。実施例５に示すとおり、Ｄｋｋ−
２またはＤｋｋ−４へのＲＨ２−１８の検出可能な特異的結合はほとんど又は全く認めら
れなかった。該抗体の、Ｄｋｋ−１に対する選択性は、少なくとも１００倍であり、アカ
ゲザルＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８の結合の検出限界は約１ｎｇであることが判明した。
これらのデータは、ＲＨ２−１８抗体および本明細書に記載されている類似の抗Ｄｋｋ−
１抗体が、Ｄｋｋ−１の幾つかの異なる領域を含む新規な複合的な三次元エピトープを認
識することを示しており、このことは、ＲＨ２−１８および該類似抗体が特有のものであ
ることを示している。
【００６７】
抗Ｄｋｋ−１抗体の製造
本発明における抗Ｄｋｋ−１抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２
５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されることが可能であり、
あるいは組換えＤＮＡ法により製造されることが可能である（例えば、実施例１；米国特
許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。現在好ましい態様においては、本発明にお
ける抗Ｄｋｋ−１抗体は組換えＤＮＡ法により製造される。
【００６８】
本発明における抗Ｄｋｋ−１抗体をコードする組換えＤＮＡ構築物は、下等真核宿主細
胞、例えば酵母または糸状菌、植物宿主細胞、哺乳類宿主細胞、昆虫宿主細胞または微生
物宿主細胞を形質転換するために使用されうる。形質転換は、宿主細胞内に核酸を導入す
るための任意の公知方法を用いて行われうる。用いられる最適な形質転換法は、形質転換
される宿主細胞のタイプに左右される。
【００６９】
典型的な組換えＤＮＡ発現構築物は、以下のものの１以上をコードするポリペプチドを
コードする核酸分子を含む：重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ
３）、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、および抗Ｄｋｋ−１抗体の軽または
重鎖の１以上のＣＤＲ。これらの核酸配列は、標準的な連結技術を用いて適当な発現ベク
ター内に挿入される。例えば、１つの実施形態においては、ＲＨ２−１８重鎖をコードす
る核酸およびＲＨ２−１８軽鎖をコードする核酸はそれぞれ、発現ベクター内に連結され
、各鎖は別々に発現される。あるいは、重鎖および軽鎖の両方をコードする単一の核酸を
ペプチド切断部位により連結して、単一のポリペプチドとしての軽鎖および重鎖の発現後
に該ペプチド切断部位が切断されて別々の軽鎖および重鎖が得られるようにする。
【００７０】
該発現ベクターは、典型的には、使用される個々の宿主細胞において機能的となるよう
選ばれる。適当な発現ベクターは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入されうる。本発明の抗体お
よびフラグメントをクローニングし発現させるための他の有用なベクターには、Ｂｉａｎ
ｃｈｉおよびＭｃＧｒｅｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８
４（４）：４３９−４４（２００３）に記載されているものが含まれる。他の適当な発現
ベクターは例えばＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編
），１９９０，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００７１】
典型的には、発現ベクターは更に、プラスミドまたはウイルスの維持のための並びに外
在性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための核酸配列を含む。これらの核酸
配列は、典型的には、以下の機能的に連結されたヌクレオチド発現配列の１以上を含む：
プロモーター、１以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与および受容ス
プライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列を
コードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドを
コードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカー要素。
【００７２】
場合によっては、該ベクターは、ポリＨｉｓタグ（例えば、ヘキサＨｉｓ）、または商
業的に入手可能な対応抗体が存在する別のタグ、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザ
ウイルスからの赤血球凝集素）またはｍｙｃをコードする、コード配列の５’または３’
末端に位置するタグコード化配列を含有しうる。該タグは、宿主細胞からの該抗体のアフ
ィニティー精製のための手段として働きうる。アフィニティー精製は、例えば、アフィニ
ティーマトリックスとして該タグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによ
り達成されうる。場合によっては、ついで、例えば切断のための或るペプチダーゼを使用
する種々の手段により、精製抗体から該タグを除去することが可能である。
【００７３】
該発現ベクター内のヌクレオチド発現配列は同種（宿主細胞と同じ種または株に由来す
る）、異種（宿主細胞種または株以外の種に由来する）、ハイブリッド（２以上の起源に
由来する配列の組合せ）、合成または天然物でありうる。したがって、発現配列の起源は
任意の原核生物または真核生物でありうる。該ベクターにおいて有用な発現配列は、当技
術分野でよく知られている幾つかの方法のいずれかにより得られうる。複製起点は、典型
的には、原核生物発現ベクター（特に商業的に購入されるもの）の一部であり、該起点は
宿主細胞内の該ベクターの増幅を補助する。該ベクターが複製起点部位を含有しない場合
、それを、既知配列に基づいて化学合成し、該ベクター内に連結することが可能である。
【００７４】
該発現ベクターは、典型的には、抗Ｄｋｋ−１抗体を産生するよう抗Ｄｋｋ−１抗体を
コードする核酸に機能的に連結された、宿主生物により認識されるプロモーターを含有す
る。プロモーターは誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターでありうる。誘導性プ
ロモーターは、栄養素の存在もしくは非存在または温度変化のような培養条件における何
らかの変化に応答したその制御下、ＤＮＡからの、増加したレベルの転写を開始させる。
一方、構成的プロモーターは連続的な遺伝子産物の産生を開始させる。すなわち、遺伝子
発現に対する実験的制御はほとんど又は全く存在しない。種々の潜在的宿主細胞により認
識される多数のプロモーターがよく知られている。プロモーターを制限酵素消化により起
源ＤＮＡから除去することにより、またはプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応により増
幅し所望のプロモーター配列を該ベクター内に挿入することにより、適当なプロモーター
が、抗Ｄｋｋ−１抗体をコードするＤＮＡに機能的に連結される。酵母宿主で使用する適
当なプロモーターも当技術分野でよく知られている。酵母プロモーターと共に酵母エンハ
ンサーが有利に使用される。哺乳類宿主細胞で使用するための適当なプロモーターはよく
知られており、それらには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例え
ばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイ
ルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはシミアンウイルス４０
（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるものが含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。他の適当な哺乳類プロモーターには、異種哺乳類プロモーター、例え
ば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。抗Ｄｋｋ−１抗体
をコードする核酸の、高等真核生物における転写を増加させるために、該ベクター内にエ
ンハンサー配列が挿入されうる。エンハンサーは、転写を増強するためにプロモーターに
作用する、通常は約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサー
は、比較的に、配向および位置に非依存性である。
【００７５】
発現ベクターにおいては、転写終結配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末
端の３’側に位置し、転写を終結させるように働く。原核細胞内での発現のために使用さ
れる転写終結配列は、典型的には、Ｇ−Ｃに富む断片およびそれに続くポリＴ配列である
。
【００７６】
選択マーカー遺伝子要素は、選択培地内で増殖させる宿主細胞の生存および増殖に必要
なタンパク質をコードする。発現ベクター内で使用される典型的な選択マーカー遺伝子は
、（ａ）原核宿主細胞の場合の例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシ
ンのような抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）該細胞の
栄養要求性欠損を相補するタンパク質、あるいは（ｃ）複合培地からは入手できない決定
的に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択マーカーの具体例には、カナ
マイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が含ま
れる。また、細菌ネオマイシン耐性遺伝子は原核宿主細胞および真核宿主細胞の両方にお
ける選択に使用されうる。
【００７７】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン−ダルガル
ノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）により特徴づけられる。該要素は、
典型的には、プロモーターの３’側、かつ発現されるポリペプチドのコード配列の５’側
に位置する。
【００７８】
いくつかの場合には、特定のグリコシル化構造またはパターンを有する抗Ｄｋｋ−１抗
体が望まれる。例えば、多数の哺乳類および植物細胞は、個体内に導入された場合にタン
パク質を免疫原性にする特定のＮ−グリカンを有するタンパク質を産生する。抗Ｄｋｋ−
１抗体に対する免疫応答の誘発が望ましくない抗Ｄｋｋ−１抗体の場合には、哺乳類宿主
細胞のグリコシル化経路は、望ましくないＮ−グリカンを有さない抗Ｄｋｋ−１抗体を産
生するよう修飾されることが好ましい。特定のＮ−グリカンを有する抗体を産生するため
の哺乳類細胞におけるグリコシル化経路を修飾するための方法は、例えば、国際特許出願
番号ＷＯ００６１７３９および米国公開特許出願番号２００４００９３６２１、２００４
０２５９１５０、２００３０１５７１０８、２００４０１９１２５６、２００４０１３６
９８６および米国特許第６，９４６，２９２号に記載されている。植物におけるグリコシ
ル化経路を修飾するための方法は、Ｃｏｘら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔｌ２６０（２００６年１１月２６日付けオンライン
公開）に記載されている。多数の下等真核生物細胞も、個体内に導入された場合にタンパ
ク質を免疫原性にする特定のＮ−グリカンを有するタンパク質を産生する。抗Ｄｋｋ−１
抗体の場合、該下等真核宿主細胞のグリコシル化経路は、望ましくないＮ−グリカンを有
さない抗Ｄｋｋ−１抗体を産生するよう修飾されることが好ましい。特定のＮ−グリカン
およびグリコシル化パターンを有する抗体を産生するための、酵母を含む下等真核生物に
おけるグリコシル化経路を修飾するための方法は、例えば、米国特許第７，０２９，８７
２号ならびに公開米国特許出願番号２００６００３４８２９、２００６００２４３０４、
２００６００３４８２８、２００６００３４８３０、２００６００２９６０４および２０
０６００２４２９２に記載されている。
【００７９】
適当な条件下で培養された場合の形質転換宿主細胞は抗Ｄｋｋ−１抗体を合成し、つい
でこれは（宿主細胞がそれを培地内に分泌する場合には）培地から採集されることが可能
であり、あるいは（それが分泌されない場合には）それを産生する宿主細胞から直接的に
採集されることが可能である。適当な宿主細胞の選択は、種々の要因、例えば、望まれる
発現レベル、活性のために望ましい又は必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化
またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さに左右される。
【００８０】
発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野でよく知られており、限
定的なものではないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系、例えば、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（
ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多数の他の細胞系を包含す
る。ある実施形態においては、どの細胞系が最高レベルの発現レベルを有し、構成的Ｄｋ
ｋ−１結合特性を有する抗体を産生するのかを決定するために、種々の細胞系を試験する
ことにより、特定のＤＮＡ構築物を発現させるための最良の細胞系が選択されうる。
【００８１】
特定の実施形態においては、該抗体は、ヒト様Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質
を産生するよう遺伝的に操作された下等真核生物細胞内で産生されることが好ましい。米
国特許第７，０２９，８７２号ならびに公開米国特許出願番号２００６００３４８２９、
２００６００２４３０４、２００６００３４８２８、２００６００３４８３０、２００６
００２９６０４および２００６００２４２９２は、特定のＮ−グリカン構造を主に有する
酵母および糸状菌のような下等真核生物細胞内での抗体の産生を開示している。該抗体を
製造するために使用されうる遺伝的に操作された下等真核生物には、ピチア・パストリス
（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉ
ｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌ
ａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラナエフ
ァシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ
（Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈ
ｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒ
ｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ
（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉ
ｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐ
ｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロ
ミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉ
ｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ア
スペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レエ
セイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルッコノウェンセ
（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕ
ｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）およびニュー
ロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）よりなる群から選ばれるも
のが含まれる。
【００８２】
抗Ｄｋｋ−１抗体組成物
さらに、抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントの有効量と医薬
上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントの１
以上とを含む組成物を提供する。したがって、本発明において提供する抗体および免疫学
的に活性なフラグメントの、医薬組成物または医薬の製造における使用も含まれる。その
ような組成物は、種々の骨障害、例えば骨粗鬆症の治療において使用されうる。医薬製剤
用の許容される製剤成分は、用いられる投与量および濃度において被投与者に対して無毒
性である。
【００８３】
提供する抗Ｄｋｋ−１抗体および免疫学的に機能的なフラグメントに加えて、該組成物
は、例えば、該組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色、等張性、匂い、無菌性、安定
性、解離または放出の速度、吸着または浸透の修飾、維持または保存のための成分をも含
有しうる。医薬組成物を製剤化するための適当な物質には、アミノ酸（例えば、グリシン
、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）、抗微生物剤、抗酸化剤（例え
ば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、バッファー（例
えば、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または
他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば
、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピ
ロリドン、ベータ−ｔシクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデ
キストリン）、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノ
ースまたはデキストラン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫
グロブリン）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性重合体（例えば、ポリビニ
ルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存
剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチル
アルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または
過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレング
リコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁化剤、界
面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソル
ベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、
レシチン、コレステロール、チロキサパール）、等張性増強剤（例えば、ハロゲン化アル
カリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトール、ソルビトール）
、運搬用ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバントが含まれるが、これ
らに限定されるものではない。
【００８４】
医薬組成物中の主要ビヒクルまたは担体は本質的に水性または非水性でありうる。その
ような組成物用の適当なビヒクルまたは担体には、注射用水、生理食塩水または人工脳脊
髄液（おそらくは、非経口投与用組成物において一般的な他の物質で補足されたもの）が
含まれる。中性緩衝食塩水、または血清アルブミンと混合された塩類液は更なる典型的な
ビヒクルである。抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントを含む組
成物は、所望の純度を有する選択された組成物を随意的製剤化物質と混合することにより
、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存用に製造されうる。さらに、該抗Ｄｋｋ−
１抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントは、スクロースのような適当な賦形剤
を使用して、凍結乾燥物として製剤化されうる。該製剤化成分は、投与部位において許容
される濃度で存在する。生理的ｐＨまたはそれより若干低いｐＨ、典型的には、約４．０
〜約８．５または約５．０〜８．０のｐＨ範囲を維持するために、バッファーが有利に使
用される。医薬組成物はｐＨ約６．５〜８．５のＴＲＩＳバッファー、またはｐＨ約４．
０〜５．５の酢酸バッファーを含むことが可能であり、これは更に、ソルビトールまたは
その適当な代替物を含みうる。
【００８５】
抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントを含む医薬組成物の有効
量は例えば治療の状況および目的に左右される。したがって、ある実施形態における治療
のための適当な投与量レベルは、部分的には、運搬される分子、該抗Ｄｋｋ−１抗体が使
用される適応症、投与経路ならびに患者のサイズ（体重、体表面積または臓器サイズ）お
よび／または状態（年齢および全身健康状態）に応じて変動する、と当業者は理解するで
あろう。臨床家は投与量を力価測定し、最適な治療効果を得るために投与経路を修飾する
ことが可能である。典型的な投与量は、前記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０
０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲となる。ある実施形態においては、該投与量は０．１
μｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または５
μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲となりうる。一般に、抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫
学的に機能的なそのフラグメントは、等張性緩衝食塩水（２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０
ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５％  ポリソルベート８０，ｐＨ６．４）中の少なくとも
１０ｍｇ／ｍＬの濃度の無菌透明液として製剤化される、と現在予想される。典型的な抗
体製剤は単一用量（１回量）として充填され、０．６ｍＬガラスバイアルにバイアル当た
り３．３ｍＬの溶液が充填され、各バイアルは、Ｗｅｓｔ  Ｆｌｕｏｒｔｅｃ  Ｔｅｆｌ
ｏｎでコーティングされた栓で蓋をされ、アルミニウムキャップで密封される。
【００８６】
骨粗鬆症適応症に対する抗体療法の静脈内投与が許容されると考えられ、本発明におけ
る抗体に関する最適プロファイルは２週間に１回または毎月１回の皮下または腹腔内投与
である。
【００８７】
該抗Ｄｋｋ−１抗体またはフラグメントは骨芽細胞活性の刺激および骨ミネラル濃度ま
たは骨量の増加における治療用途を有する。したがって、これらの抗体およびフラグメン
トは、過剰な骨減少が関わる種々の医学的障害に罹患した患者、または過剰な破骨細胞活
性が必ずしも存在しない可能性がある場合であっても新たな骨の形成を要する患者を治療
するのに有用である。Ｄｋｋ−１活性の遮断は、Ｗｎｔタンパク質によるシグナリングを
介した骨芽細胞活性化の上昇をもたらす。過剰な骨芽細胞活性は、提供する抗Ｄｋｋ−１
抗体および免疫学的に機能的なそのフラグメントで治療されうる多数の骨形成性障害、例
えば骨減少症、骨粗鬆症、歯周炎、パジェット病、不動性による骨減少、溶解性骨転移、
および関節炎、例えば慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、および骨侵食が
関わる他の状態に関連している。
【００８８】
グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、移植後に誘発される骨粗鬆症、化学療法に関連し
た骨粗鬆症、不動誘発性骨粗鬆症、機械的負荷減少による骨粗鬆症、および抗痙攣薬の使
用による骨粗鬆症を含む（これらに限定されるものではない）種々の形態の骨粗鬆症を含
む種々の他の低骨量状態も治療されうる。抗体またはフラグメントの幾つかで治療されう
る他の骨疾患には、腎不全に関連した骨疾患ならびに栄養、胃腸および／または肝臓に関
連した骨疾患が含まれる。
【００８９】
種々の形態の関節炎も治療可能であり、その具体例には、骨関節炎および慢性関節リウ
マチが含まれる。該抗体およびフラグメントは、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ）に
関連した全身性骨減少を治療するためにも使用されうる。関節炎の治療においては、患者
は本発明の抗体またはそのフラグメントの病巣周囲または病巣内注射により利益を得るこ
とが可能である。例えば、該抗体またはそのフラグメントを炎症関節の隣接部位に又は直
接的に炎症関節内に注射して、該部位における損傷骨の修復を促進することが可能である
。
【００９０】
乳癌および前立腺癌のような幾つかの癌は破骨細胞活性を増強し骨吸収を誘導すること
が公知である。骨髄において生じる多発性骨髄腫も骨減少に関連しており、これは１つに
は、おそらく、形質細胞によるＤｋｋ−１の発現の増強によるものであり、ついでこれは
周辺部の骨芽細胞の骨構築活性を抑制する。本発明の抗体または免疫学的に機能的なその
フラグメントを投与することによるＤｋｋ−１活性の軽減は、過剰な破骨活性を相殺する
ように働く骨芽細胞活性の増強をもたらし、それにより、患者において前記障害の重症度
を軽減して、骨侵食を軽減し、新たな骨形成を誘導することが可能である。
【００９１】
該抗Ｄｋｋ−１特異的抗体または免疫学的に機能的なフラグメントの幾つかでの治療は
、骨減少障害に罹患した患者における骨ミネラル密度の有意な増加を誘導しうる。本明細
書に記載されている抗体または免疫学的に機能的なフラグメントでのＤｋｋ−１の抑制は
種々の骨修復用途においても用いられうる。例えば、ある抗体およびフラグメントは、人
工関節に関連した消耗残渣骨溶解の遅延、骨折の回復の加速、および骨移植片が移植され
る、周囲の生きた骨内への該骨移植片の取り込みの促進において有用でありうる。
【００９２】
抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントは、単独で、または他の
治療剤と組合せて、例えば、癌治療剤、破骨細胞活性を抑制する物質もしくは骨芽細胞活
性を増強する他の物質と組合せて投与されうる。例えば、本発明の抗体は、放射線療法ま
たは化学療法を受けている癌患者に投与されうる。
【００９３】
抗Ｄｋｋ−１抗体および免疫学的に機能的なそのフラグメントは、骨量の減少を引き起
こす前記状態の治療のために単独で、あるいは骨成長促進（同化）物質または骨抗吸収物
質、例えば、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１２と称される骨誘導因子；トランスフォーミング増
殖因子−βおよびＴＧＦ−βファミリーメンバー；繊維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１〜ＦＧ
Ｆ−１０；インターロイキン−１インヒビター、ＩＮＦαインヒビター；ＲＡＮＫリガン
ドインヒビター、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、Ｅ系列プロスタグランジン、ビスホスホ
ナートおよび骨増強ミネラル、例えばフッ化物およびカルシウム（これらに限定されるも
のではない）の治療的有効量と組合せて使用されうる。本発明の抗体およびその機能性フ
ラグメントと組合せて使用されうる同化物質には、副甲状腺ホルモンおよびインスリン様
成長因子（ＩＧＦ）が含まれ、後者の物質は、好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質と複合
体化される。
【００９４】
また、該抗Ｄｋｋ−１抗体は、腫瘍細胞に結合し腫瘍成長に対する細胞毒性および／ま
たは静細胞効果を誘導する抗体と組合せて患者に投与されうる。そのような抗体の具体例
には、腫瘍細胞上に存在する細胞表面タンパク質Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ム
チン様糖タンパク質Ｉおよび上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、これらのタンパ
ク質を提示する腫瘍細胞に対する静細胞および／または細胞毒性効果を誘導するものが含
まれる。また、組合せ療法は、腫瘍細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導するポリペ
プチド、例えばＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬを癌治療剤として含みうる。
【００９５】
該抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメントは、同一状態に対して
投与されている他の治療および療法剤と共に投与されうる。抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫
学的に機能的なそのフラグメントは、初期段階の癌（第Ｉ期または第ＩＩ期）による骨量
の減少の開始を予防または軽減するために予防的に投与されることが可能であり、あるい
は骨への転移による骨量の減少の既存状態を改善するために投与されることが可能である
。本発明の抗Ｄｋｋ−１抗体は、骨における腫瘍細胞の増殖を予防および／または治療す
るために使用されうる。腫瘍細胞は、内部骨マトリックスを吸収するよう破骨細胞を刺激
するため、骨に転移する癌は容易に広がりうる。抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫学的に機能
的なそのフラグメントでの治療は、骨芽細胞活性の増強を刺激することによりそのような
転移の部位における骨ミネラル密度を維持するのを助ける。骨への転移能を有する任意の
癌が、転移が生じる前または生じた後に投与される抗Ｄｋｋ−１抗体で予防または治療さ
れうる。
【００９６】
本発明における抗体は単独療法として有効であると予想される。しかし、本発明におけ
る抗体は、骨粗鬆症に対する既存治療剤、例えば、とりわけ、アレンドロネート（ａｌｅ
ｎｄｒｏｎａｔｅ）、リセンドロネート（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）、イバンドロネート
（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、ゾレドロン酸（ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カル
シトニン、エストロゲン、ＰＴＨおよび複合エストロゲン、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘ
ｉｆｅｎｅ）および他の選択的エストロゲン受容体モジュレーター、テリパラチド（ｔｅ
ｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）、ビタミンＤおよびその代謝産物（これらに限定されるものでは
ない）と共に投与されうると予想される。これらの承認治療薬に加えて、本発明における
抗体は、とりわけ、カテプシンＫインヒビター、ＡＴＰ６インヒビター、塩素イオンチャ
ネル−７インヒビター、ドノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）または他の抗ＲＡＮＫ抗体ま
たはインヒビター、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）−Ｆｃ、
αｖβ３インテグリンアンタゴニストおよびカルシリティクス（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃｓ
）を含む（これらに限定されるものではない）骨粗鬆症の治療のための現在開発中の幾つ
かのアプローチのいずれかに対する相乗的／相加的利益をもたらしうることも予想される
。
【００９７】
Ｄｋｋ−１は、骨芽細胞分化の抑制による骨髄腫骨疾患の発病に関連づけられている。
Ｔｉａｎら（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：２４８３−２４９４（２００３））は
、病巣骨病変を有する多発性骨髄腫（ＭＭ）患者におけるＤｋｋ−１遺伝子およびＤｋｋ
−１タンパク質の過剰発現を見出した。インビトロにおいて、組換えヒトＤｋｋ−１また
は骨髄血漿（高いＤｋｋ−１レベルを有するもの）は骨芽細胞機能を抑制した。この効果
はポリクローナル抗Ｄｋｋ−１抗体での処理により中和された。また、処理（自己幹細胞
導入）後のＤｋｋ−１レベルの減少は骨芽細胞機能の正常化に相関しうることが示唆され
、これは、Ｄｋｋ−１活性を遮断して、骨芽細胞機能を回復させ、骨髄腫において観察さ
れる破骨の亢進を相殺する物質（例えば、本明細書に開示されている抗体）を開発するた
めの基礎となりうるであろう（Ｐｏｌｉｔｏｕら，Ｉｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９：１
７２８（２００６）を参照されたい）。
【００９８】
対照またはＤｋｋ−１中和抗体で４〜６週間処理された場合の、種々のレベルのＤｋｋ
−１を発現する初代多発性骨髄腫細胞が移植されたマウスは、対照においてはＢＭＤの減
少を示したが、抗Ｄｋｋ−１抗体群においては前処理レベルからのＢＭＤの増加を示した
（ｐ＜０．００１）。抗Ｄｋｋ−１抗体の骨同化効果は多発性骨髄腫負荷の減少に関連づ
けられた（ｐ＜０．０４）。該著者らは、多発性骨髄腫骨疾患におけるＤｋｋ−１が鍵作
用因子であり、骨髄腫骨におけるＤｋｋ−１活性の遮断が骨溶解骨吸収を軽減し、骨形成
を増強し、多発性骨髄腫の成長を抑制するのを助けると結論づけた（Ｙａｃｃｏｂｙら，
Ｂｌｏｏｄ．２００６年１０月２６日；［印刷前のＥｐｕｂ］を参照されたい）。また、
ＰＣ−３前立腺癌細胞はＷｎｔインヒビターＤｋｋ−１を発現する。Ｄｋｋ−１レベルの
減少は、マウス骨髄腫基質細胞において、ＰＣ−３細胞が、アルカリホスファターゼ産生
およびミネラル化を含む骨芽細胞活性を誘導することを可能にしたが、このことは、Ｄｋ
ｋ−１がＰＣ−３細胞におけるＷｎｔ媒介骨芽細胞活性を遮断したことを示している（Ｈ
ａｌｌら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：７５５４（２００５））。総合すると、前記の
結果は、骨環境を侵すことが知られている癌細胞におけるＷｎｔシグナリングおよびＤｋ
ｋ−１の関与を示唆している。したがって、本明細書に開示されているＤｋｋ−１抗体お
よび免疫学的に機能的なそのフラグメントは、癌細胞（例えば、多発性骨髄腫、乳癌、前
立腺癌など）の骨破壊効果を軽減するための治療を提供しうる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】ＲＨ２−１８軽鎖をコードするプラスミドの概要図を示す。ＯｒｉＰは真    核細胞における発現のためのエプスタインバーウイルス複製起点である。ＨＣＭＶイ    ントロンＡプロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターおよび第１イント    ロンである。ＬＣラムダは軽鎖ラムダ定常領域をコードしている。リーダーは培地内    への該軽鎖ポリペプチドの分泌のためのリーダーまたはシグナル配列をコードしてい    る。ＢＧＨ  ｐＡはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列である。ＳＶ４０    プロモーターはＳＶ４０ウイルスプロモーターである。ＧＳはグルタミンシンターゼ    である。ＳＶ４０はＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。Ｋａｎは大腸菌（    Ｅ．ｃｏｌｉ）における該ベクターの選択のためのカナマイシン遺伝子である。
【図１Ｂ】ＲＨ２−１８重鎖をコードするプラスミドの概要図を示す。ＯｒｉＰは真    核細胞における発現のためのエプスタインバーウイルス複製起点である。ＨＣＭＶイ    ントロンＡプロモーターはヒトサイトメガロウイルスプロモーターおよび第１イント    ロンである。ＩｇＧ２Ｍ４は重鎖ＩｇＧ２Ｍ４定常領域をコードしている。リーダー    は培地内への該軽鎖ポリペプチドの分泌のためのリーダーまたはシグナル配列をコー    ドしている。ＢＧＨ  ｐＡはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列である。    Ｋａｎは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における該ベクターの選択のためのカナマイシン遺    伝子である。
【図１Ｃ】ＲＨ２−１８軽鎖および重鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列（それぞれ配列    番号３および配列番号７）を示す。軽鎖および重鎖配列のリーダー配列は示されてい    ない。可変領域がイタリック体で示されている。
【図１Ｄ】軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）を、生殖系列における該領域    の配列（配列番号１６）と整列させて示す。３つの軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（Ｃ    ＤＲ）が下線で示されており、ＲＨ２−１８における可変領域配列と生殖系列配列と    の間のフレームワークにおけるアミノ酸配列相違が太字で示されている。
【図１Ｅ】重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）を、生殖系列における該領域    の配列（配列番号１５）と整列させて示す。３つの軽鎖（ＨＣ）ＣＤＲが下線で示さ    れており、ＲＨ２−１８における可変領域配列と生殖系列配列との間のフレームワー    クにおけるアミノ酸配列相違が太字で示されている。
【図１Ｆ】インビトロ分析のために精製された１２種の変換された抗Ｄｋｋ−１抗体    のＬＡＢＣＨＩＰ  ９０キャピラリー電気泳動の結果を示す。レーン２はＲＨ２−１    ８抗Ｄｋｋ−１抗体である。
【図２Ａ】ＨＥＫ２９３ｈＬｒｐ５細胞へのＥｕ−Ｄｋｋ−１結合および種々の濃度    の抗Ｄｋｋ−１抗体ＲＨ２−１０、ＲＨ２−１８、ＲＨ２−３１、ＲＨ２−５９およ    びＲＨ２−８０の抑制活性を示す。８Ｂ４は、Ｄｋｋ−１に非特異的な対照抗体であ    る。
【図２Ｂ】拡張された用量範囲を用いて再力価測定されたＲＨ２−１８抗体の結果を    示す。該結果は、このアッセイ形態でＲＨ２−１８抗体が約５ｎＭの有効量を示した    ことを示している。
【図３】Ｗｎｔ３Ａ誘導シグナリングにおけるＤｋｋ−１機能に対する抗Ｄｋｋ−１    抗体ＲＨ１−１０、ＲＨ２−１８、ＲＨ２−３１、ＲＨ２−５９およびＲＨ２−８０    抗体の中和活性を示す。Ｗｎｔ３Ａでの処理（黒塗りの棒グラフ）は、対照処理（白    抜きの棒グラフ）と比較してシグナリング経路を有意に刺激した。示されている濃度    の抗Ｄｋｋ−１抗体を加えた。
【図４】骨芽細胞分化に対するＲＨ２−１８、ＲＨ２−５９およびＲＨ２−８０抗体    の効果を示す。骨芽細胞表現型へのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の分化は内在性ＡＬＰ活    性により決定された。
【図５Ａ】Ｄｋｋ−１のＣ末端領域への特異性を示す抗体ＲＨ２−１８を使用するド    ットブロット結合分析を示す。アカゲザルＤｋｋ−１タンパク質をグリーン蛍光タン    パク質（ＧＦＰ）タグ（ローディング対照）に融合させた。完全長アカゲザルＤｋｋ    −１タンパク質、Ｃ末端領域（残基１５９−２６６をコードするΔＮ−Ｄｋｋ−１）    またはＮ末端領域（残基１−１５８をコードするΔＣ−Ｄｋｋ−１）を発現させ、Ｒ    Ｈ２−１８抗体を使用するドット免疫ブロット法により分析した。
【図５Ｂ】ドットブロット結合分析を示し、これは、Ｄｋｋ−１  Ｃ末端ドメインに    おいて種々のアミノ酸置換が施された場合、ＲＨ２−１８抗体結合が喪失することを    示している。アカゲザルＤｋｋ−１タンパク質をＧＦＰタグ（ローディング対照）に    融合させた。完全長アカゲザルＤｋｋ−１タンパク質、Ｃ末端領域（残基１５９−２    ６６をコードするΔＮ−Ｄｋｋ−１）またはＮ末端領域（ΔＣ−Ｄｋｋ−１）を発現    させ、ＲＨ２−１８抗体を使用するドット免疫ブロット法により分析した。ΔＮ−Ｄ    ｋｋ−１内にアラニン置換を導入した。その置換されたアミノ酸残基の位置番号が示    されている。
【図５Ｃ】ＲＨ２−１８抗体の結合に必要なアミノ酸残基を示すＤｋｋ−１  Ｃ末端    ドメイン（アミノ酸１８７−２６６）の構造-相同性モデルを示す。示されているア    ミノ酸番号はアラニンスキャニングにより置換されている。非変性タンパク質を使用    する免疫ブロット実験において抗原−抗体相互作用の低下をもたらすことが見出され    たアミノ酸残基の置換はアミノ酸Ｓ１８７からＶ１８８、Ｒ２０３からＫ２０８、Ｅ    ２４１、およびＬ２４３である。Ｄｋｋ−１−相同性モデルの範囲外でＲＨ２−１８    抗体結合エピトープに寄与するアミノ酸残基（Ｒ１７１からＬ１７４）が挙げられて    いる。アミノ酸Ｃ２２０の置換もＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８抗体結合の喪失を引き    起こす。残りのアミノ酸残基の置換はＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８抗体の結合に影響    を及ぼさないようであった。
【図６Ａ】ヒト（「Ｈｕｍａｎ」）Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−４およびアカ    ゲザル（「Ｒｈｅｓｕｓ」）Ｄｋｋ−１のアミノ酸配列アライメントを示す。保存ア    ミノ酸が赤色で示されており、非保存アミノ酸が緑色で示されている。ＲＨ２−１８    結合に必要な、Ｄｋｋ−１におけるアミノ酸残基が青色の枠内に囲まれている。アミ    ノ酸残基Ｒ１７１からＬ１７４、Ｓ１８７からＶ１８８、Ｓ２０７およびＥ２４１に    関するＤｋｋ−１およびＤｋｋ−２およびＤｋｋ−４の間の配列保存性の欠如に注目    されたい。
【図６Ｂ】Ｄｋｋ−１へのＲＨ２−１８抗体の特異性を示す種々のＤｋｋアイソフォ    ームを使用するドットブロット分析を示す。天然組換えアカゲザルＤｋｋ−１、Ｄｋ    ｋ−２およびシノモルグスサルＤｋｋ−４タンパク質（０．１ｎｇ〜１００ｎｇ）を    使用した。非関連組換えタンパク質を非特異的アッセイシグナルに関する対照（ＨＩ    Ｓタンパク質）としてローディングし、ＲＨ２−１８抗体でプローブした。
【図７】０．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＲＨ２−１８抗体により遠位大腿骨ミネ    ラル密度（ＢＭＤ）が用量効果的に５．２〜８．７％増加したことを示している。誤    差線＝ＳＥＭ。Ｎ＝１１／群。
【図８】１．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＲＨ２−１８抗体により全大腿骨ＢＭＤ    が４．７〜４．８％増加したことを示している。誤差線＝ＳＥＭ。Ｎ＝１１／群。
【図９】１．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＲＨ２−１８抗体により中央大腿骨ＢＭ    Ｄが用量効果的に３．２〜３．５％増加したことを示している。誤差線＝ＳＥＭ。Ｎ    ＝１１／群。
【図１０Ａ】完全培地内のＨＣＴ１１６細胞において行ったＴＯＰｆｌａｓｈ転写ア    ッセイにおける、ＲＨ２−８０抗体（Ｄｋｋ−１  ＡＢ）の、培養癌細胞に対する転    写効果を示す。８Ｂ４は対照非特異的抗体であった。Ｃｏｎはビヒクル対照であった    。
【図１０Ｂ】完全培地内のＨＣＴ１１６細胞において行った細胞増殖アッセイにおけ    る、ＲＨ２−８０抗体（Ｄｋｋ−１  ＡＢ）の、培養癌細胞に対する転写効果を示す    。８Ｂ４は対照非特異的抗体であった。Ｃｏｎはビヒクル対照であった。
【図１１】腫瘍増殖に関する異種移植片モデルおよび腫瘍増殖に対するＲＨ２−５９    抗体の効果を示す。６週齢ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（ＳＣＩＤ）    マウスの右側腹部への１００μＬのＰＢＳ中の１×１０７  ＨＣＴ１１６細胞の皮下    注射。注射後の第２日に、続いて処理を行い、週２回、合計７回の処理を続けた。リ    ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および非特異的抗体（ＮＳ  ＡＢ）を陰性対照として使用    した。約３．５週の時点で腫瘍を単離した。剖検後に該腫瘍を切除することにより腫    瘍塊を得、秤量した。片側ＡＮＯＶＡを用いて統計分析を行った。全サンプルにおい    て統計的な差は認められなかった。＊  腫瘍細胞を非意図的に真皮内に注射した。各    群における１／５のマウスは腫瘍破裂を有していた。
【０１００】
以下の実施例は、本発明の更なる理解を促すことを意図したものである。
【実施例１】
【０１０１】
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＣＡＴ）ヒト一本
鎖Ｆｖファージディスプレイライブラリー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅ
ｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、ヒト抗Ｄｋｋ−１抗体を製造した。該ライブラリーを
アカゲザルおよびマウスＤｋｋ−１（それぞれＲｈＤｋｋ−１およびＭｓＤｋｋ−１）の
両方に対してパンニングした。各ライブラリーを、ビオチン標識Ｄｋｋ−１（１００ｎＭ
）に対して、３ラウンドの、溶液に基づくパンニングに付した。配列同一性および類似性
の割合はマウスおよびアカゲザルＤｋｋ−１間で高いが、ライブラリー選択が両方の種か
らのＤｋｋ−１と交差反応することを保証するために６つの異なるパンニング法を用いた
（表４）。すべての後続データはスキーム（Ｅ）から導かれる。
【０１０２】
【表４】
2014087366.tif 000006
【０１０３】
該分泌ｓｃＦｖ−ファージクローンの抗原特異性の妥当性を証明するために、ラウンド
２における各ライブラリーからの１７６個のファージクローンおよびそれぞれの３ラウン
ドのライブラリーからの８８個のクローンを、蛍光ユウロピウム−キレート（Ｅｕ）で標
識されたアカゲザルまたはマウスＤｋｋ−１タンパク質およびＬＲＰ５またはＬＲＰ６を
過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用する時間分解蛍光（ＴＲＦ）ＥＬＩＳＡアッセイに
おいて試験した。ヒトＬＲＰ５またはＬＲＰ６を過剰発現するヒト胎児腎ＨＥＫ２９３細
胞へのＥｕ−Ｄｋｋ−１タンパク質結合を、結合リガンドの時間分解蛍光を測定すること
によりモニターした。Ｄｋｋ−１タンパク質がＬＲＰ５（または６）発現細胞に結合した
場合、強力なシグナルが検出された。Ｄｋｋ−１を抗Ｄｋｋ−１抗体の存在下で試験した
場合には、蛍光シグナルの減少はＤｋｋ−１／ＬＲＰ５（または６）相互作用の阻害を示
した。細胞表面へのＤｋｋ−１タンパク質の結合を抑制する能力に関して、この一次アッ
セイにおいて、２６４個のＤｋｋ−１  ｓｃＦＶを試験した。前記アッセイに基づいて、
細胞表面へのＤｋｋ−１の結合を抑制すると確認された群のなかの２０個のｓｃＦＶ（表
５）を完全ヒトＩｇＧへの変換のために選択した。
【０１０４】
【表５】
2014087366.tif 000007
【０１０５】
重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ＩｇＧ２Ｍ４定常領域をコードするＤＮＡにイン
フレームで融合させ、一方、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、対応可変領域と整列し
てラムダまたはカッパ軽鎖定常領域をコードするＤＮＡにインフレームで融合した。一例
として抗体ＲＨ２−１８をコードする発現ベクターを用いることにより、得られた抗体発
現ベクターをプラスミド地図（図１Ａおよび１Ｂ）中に示す。クローニング法を以下に説
明する。使用する軽鎖ラムダベクターを社内で構築した。これは、一方のクローニング部
位の５’末端においてヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）プロモーターおよびリーダー配列に、そし
て他方のクローニング部位の３’側において軽鎖ラムダ配列およびウシ成長ホルモン（Ｂ
ＧＨ）ｐＡポリアデニル化シグナルに隣接するクローニング部位を含む。使用する重鎖Ｉ
ｇＧ２Ｍ４定常領域ベクターを社内で構築した。これは、一方のクローニング部位の５’
末端においてＨＣＭＶプロモーターおよびリーダー配列に、そして他方のクローニング部
位において重鎖ＩｇＧ２Ｍ４配列およびＢＧＨ  ｐＡポリアデニル化シグナルに隣接する
クローニング部位を含む。該発現ベクターは２９３ＥＢＮＡ細胞における持続性発現のた
めのエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ウイルスゲノム由来のｏｒｉＰ、およびカナマ
イシン選択マーカーのための細菌配列、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製起点
を含有する。該抗体のアミノ末端におけるリーダー配列は培地内への発現抗体の分泌をも
たらした。リーダー配列は、重鎖ではＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番
号２９）であり、軽鎖ではＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号３０）
である。１９個のｓｃＦｖリード体の残りを同様にしてＩｇＧに変換した。
【０１０６】
図１Ａおよび１Ｂに示すベクターを作製するために、それぞれの可変領域を、高忠実度
ＰＣＲマスターミックス、鋳型（容量１μＬ）ならびにフォワードおよびリバースプライ
マー（それぞれ１μＬ）を含有する２５μＬの容量中でＰＣＲ精製した。ＰＣＲ条件は、
９４℃で２分間の１サイクル、９４℃で１．５分間、６０℃で１．５分間および７２℃で
１．５分間の２５サイクルならびに７２℃で７分間の最終伸長であった。以下のＰＣＲプ
ライマーを使用した：重鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＧ  ＴＧＴＣＣ  ＡＣＴＣＧ  Ｇ
ＡＧＧＴ  ＧＣＡＧＣ  ＴＧＧＴＧ  ＣＡＧＴＣ  Ｔ−３’（配列番号３１）；重鎖リバ
ース，５’−ＧＣＣＣＴ  ＴＧＧＴＧ  ＧＡＴＧＣ  ＡＣＴＣＧ  ＡＧＡＣＧ  ＧＴＧＡ
Ｃ  ＣＡＧＧＧ  Ｔ−３’（配列番号３２）および軽鎖フォワード，５’−ＡＣＡＧＡ  
ＴＧＣＣＡ  ＧＡＴＧＣ  ＣＡＧＴＣ  ＴＧＴＧＴ  ＴＧＡＣＧ  ＣＡＧＣＣ  Ｇ−３’
（配列番号３３）；軽鎖リバース５’−ＧＴＴＧＧ  ＣＣＴＴＧ  ＧＧＣＴＧ  ＡＣＴＴ
Ａ  ＡＡＡＣＧ  ＧＴＧＡＧ  ＣＴＧＧＧ  Ｔ−３’（配列番号３４）。Ｉｎ−Ｆｕｓｉ
ｏｎ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、増幅された軽鎖およ
び重鎖可変領域ＰＣＲ産物を５’末端における適当なリーダー配列および３’末端におけ
る定常領域とインフレームでクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１０細胞（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内にクローニングした。該クローンのＤ
ＮＡ配列を配列決定により確認し、該ＤＮＡ配列からアミノ酸配列を推定した。ＲＨ２−
１８軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（リーダー配列を伴わないもの）を図１Ｃに示す。可
変領域はイタリック体で示されている。図１Ｄおよび１ＥはＲＨ２−１８軽鎖および重鎖
可変領域のＣＤＲ領域を示し、また、ＲＨ２−１８軽鎖および重鎖改変領域および生殖系
列における対応領域間のフレームワークにおける配列相違を示す。
【０１０７】
ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥはＦｕｇｅｎｔ  ＬＬＣの商標
であり、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪから入手可能である
）を使用して、前記プラスミドを２９３ＥＢＮＡ単層細胞内にトランスフェクトした。ト
ランスフェクトされた細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で
インキュベートし、分泌された抗体を、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いて培地から精製した。精製された濃度の濃度を２８０ｎｍでのＯＤにより決定
し、純度をＬＡＢＣＨＩＰキャピラリーＳＤＳゲル電気泳動（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）により決定した。図１Ｆは、１２種の
変換された抗体のＬＡＢＣＨＩＰ電気泳動の結果を示す。レーン２はＲＨ２−１８抗体を
示す。本明細書に記載されているとおりにインビトロ特徴づけのために該精製抗体を使用
した。また、前記プラスミドを、動物研究の節に記載されているインビボ動物研究のため
のＲＨ２−１８抗体およびその他の抗体の大量製造のために使用した。
【０１０８】
すべての生物アッセイにおいては、アカゲザルＤｋｋ−１タンパク質をバキュロウイル
ス発現により調製し、金属アフィニティー樹脂により精製した。ＣＡＴ−ライブラリーパ
ンニングからの単離された抗Ｄｋｋ−１抗体を、アカゲザル（およびマウス）Ｄｋｋ−１
タンパク質への結合能に基づいて選択した。抗体が細胞表面受容体（ＬＲＰ５／６）との
Ｄｋｋ−１相互作用を抑制し、Ｄｋｋ−１機能を抑制したかどうかを決定するために、以
下のアッセイを確立した：細胞に基づくＤｋｋ−１結合アッセイ、規定（ｃａｎｏｎｉｃ
ａｌ）Ｗｎｔシグナリングを測定するＤｋｋ−１機能分析、および骨芽細胞分化マーカー
であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を使用するＤｋｋ−１機能分析のための細胞分
化アッセイ。（ａ）ＬＲＰ５／６へのＤｋｋ−１結合を遮断するための、（ｂ）Ｗｎｔシ
グナリングにおけるＤｋｋ−１機能を抑制するための、および（ｃ）インビトロでの骨細
胞分化に対する負のＤｋｋ−１機能を中和するための中和抗体を選択するために、前記ア
ッセイを連続的に行った。
【実施例２】
【０１０９】
抗Ｄｋｋ−１抗体の４つがＬＲＰ５／６へのＤｋｋ−１結合を抑制したことを示すため
に、細胞に基づく時間分解蛍光（ＴＲＦ）アッセイを用いた。
【０１１０】
該アッセイのために、該抗Ｄｋｋ−１抗体を、０．２、０．６、２．０、６．０および
２０ｎＭで、ＬＲＰ５を過剰発現するＨＥＫ細胞（ＨＥＫ２９３ｈＬｒｐ５細胞）に加え
た。抗ＩＬ３受容体モノクローナル抗体（８Ｂ４）を陰性対照として使用した。Ｅｕ標識
Ｄｋｋ−１（１００ｐＭ）を、該抗体の非存在下または存在下、該細胞と共に２０分間イ
ンキュベートした。溶解状態で該抗体に結合し該ＨＥＫ２９３ｈＬｒｐ５細胞の細胞表面
への結合が遮断されたＤｋｋ−１を４回の洗浄段階により除去し、細胞表面に結合したＥ
ｕ標識Ｄｋｋ−１をＴＲＦシグナルにより測定した。ヒトＬＲＰ５またはＬＲＰ６を過剰
発現するＨＥＫ２９３細胞へのＥｕ標識Ｄｋｋ−１タンパク質の結合を、結合リガンドの
時間分解蛍光を測定することによりモニターした。これらの抗体の上位５つ（ＲＨ１−１
０、ＲＨ２−１８、ＲＨ２−３１、ＲＨ２−５９およびＲＨ２−８０）の結果を図２Ａお
よび２Ｂを示す。図２Ａは、ＨＥＫ２９３ｈＬｒｐ５細胞へのＥｕ−Ｄｋｋ−１結合、お
よびＬＲＰ５へのＤｋｋ−１の結合を抑制する前記の５つの抗体の能力を示す。図２Ａは
、拡張された用量範囲にわたるＬＲＰ５へのＤｋｋ−１結合のＲＨ２−１８抗体抑制の力
価測定を示す。図２Ｂは、このアッセイ形態でＲＨ２−１８の有効量が約５ｎＭであった
ことを示している。図２Ａおよび２Ｂにおけるデータは、該抗Ｄｋｋ−１抗体の抑制活性
が、低ナノモル範囲において完結するのに十分なものであったこと示している（ＲＨ２−
１８抗体で４．７５ｎＭ）。Ｅｕ標識組換えマウスＤｋｋ−１を使用する追加的分析は同
様の結果を示した。このことは、選択された抗Ｄｋｋ−１抗体の抑制メカニズムがマウス
およびアカゲザルＤｋｋ−１タンパク質の両方において保存されていたことを示している
。
【実施例３】
【０１１１】
この実施例はＷｎｔシグナリングにおけるＤｋｋ−１機能に対する抗Ｄｋｋ−１抗体の
中和活性を示す。Ｄｋｋ−１はβ−カテニンおよび核Ｌｅｆ−１／ＴＣＦを介した規定Ｗ
ｎｔシグナリングの負の調節因子である。
【０１１２】
ＨＥＫ２９３ｈＬｒｐ５細胞を、Ｌｅｆ−１／ＴＣＦ結合部位を有するレポータープラ
スミド（ｐＴＯＰｆｌａｓｈ）およびＬｅｆ−１をコードする発現ベクターでコトランス
フェクトした。ｐＴＯＰｆｌａｓｈ／Ｌｅｆ−１でトランスフェクトされた細胞は、該レ
ポーター（ルシフェラーゼ）の活性の増加により示されるとおり、Ｗｎｔ−リガンドに対
して高応答性である。アカゲザルＤｋｋ−１（５０ｎＭ）はこの細胞系におけるｐＴＯＰ
ｆｌａｓｈ活性を強固に抑制する。ここでは、抗Ｄｋｋ−１抗体ＲＨ１−１０、ＲＨ２−
１８、ＲＨ２−３１およびＲＨ２−８０を、同様にＤｋｋ−１機能を中和するそれらの能
力に関して２０時間にわたって試験した。該抗Ｄｋｋ−１抗体を１０、３０および１００
ｎＭの濃度で加えた。図３に示す結果は、試験した抗Ｄｋｋ−１抗体の全てが細胞表面上
のＬＲＰ５へのＤｋｋ−１結合を遮断し、それによりＷｎｔ３Ａシグナリング経路におけ
るＤｋｋ−１の機能活性を抑制したことを示している。図３に示すとおり、Ｗｎｔ３Ａで
の処理は、対照と比較してシグナリング経路を有意に刺激し、そのアカゲザルＤｋｋ−１
は該レポーター測定のＷｎｔ３Ａ活性化を抑制した。該抗体はＤｋｋ−１の効果を３０ｎ
Ｍ以上の濃度で中和した。試験した全ての抗Ｄｋｋ−１抗体に関して、シグナルは、Ｗｎ
ｔ３Ａリガンド単独の場合よりも上昇することが可能であったことに注目されたい。並行
して行ったアッセイにおいて、Ｗｎｔシグナリングに対するこの抗体効果は、外因的に添
加されたアカゲザルＤｋｋ−１タンパク質の非存在下では観察されなかったため、この効
果は該アッセイ系への組換えＤｋｋ−１タンパク質の添加を要した。
【実施例４】
【０１１３】
インビトロにおける骨芽細胞分化に対する中和性Ｄｋｋ−１抗体の効果を試験した。間
葉多能性細胞系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は骨形成因子での処理により骨芽細胞系列へと分化す
る。３日間にわたるＷｎｔ３Ａでの処理は、初期造骨マーカーであるアルカリホスファタ
ーゼ（ＡＬＰ）の発現を誘導する。内因性ＡＬＰ活性の測定による判定によれば、Ｄｋｋ
−１はＷｎｔ３Ａ誘発性分化を抑制する。この骨芽細胞分化系は、妥当な細胞状況および
より長い３日間のアッセイ期間を提供する。
【０１１４】
内因性ＡＬＰ活性の増加を測定することにより、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の骨芽細胞分
化を決定した。細胞を培養内でコンフルエントにまで増殖させ、骨芽細胞分化を誘導する
ためにＷｎｔ３Ａで３日間処理した。組換えＤｋｋ−１での同時処理はＷｎｔ３Ａ誘発性
ＡＬＰ活性を抑制した。図４に示すとおり、抗Ｄｋｋ−１抗体ＲＨ２−１８、ＲＨ２−５
９またはＲＨ２−８０を１０ｎＭ、３０ｎＭまたは１００ｎＭの最終濃度で加えたところ
、骨芽細胞分化に対するＤｋｋ−１の抑制機能は用量依存的に中和された。Ｄｋｋ−１に
対する１００ｎＭ  ＲＨ２−１８の中和効果はほぼ完全であり、その安定性は、３日間の
アッセイ期間内で中和効果を生成し維持するのに十分なものであった。ＲＨ２−３１は効
力／安定性をほとんど有さないことが判明し、したがって、さらなる研究から除外された
（データ非表示）。処理の最初の２４時間以内に誘導された内因性マーカー遺伝子（ＴＲ
ＯＹ、ＩＧＦＢＰ２、Ａｘｉｎ２）の関連分析は、この細胞バックグラウンドにおけるＷ
ｎｔ３ａ誘導性遺伝子発現のＤｋｋ−１抑制を遮断するこれらの抗体の同様の能力を示し
た。
【実施例５】
【０１１５】
ＲＨ２−１８抗体のエピトープ地図を作成した。Ｄｋｋ−１タンパク質は、それぞれＮ
末端およびＣ末端領域に位置する、システインに富む（システイン・リッチ）２つのドメ
インから構成される。本発明者らは、アカゲザルＤｋｋ−１のＮ末端またはＣ末端領域を
コードするＤｋｋ−１に関する欠失構築物を作製し、Ｄｋｋ−１のＣ末端半分に位置する
システイン・リッチ・ドメイン２が受容体ＬＲＰ５／６へのＤｋｋ−１結合に必要かつ十
分であることを証明した。
【０１１６】
本明細書に開示されている中和抗Ｄｋｋ−１抗体はウエスタン−免疫ブロット上の変性
Ｄｋｋ−１タンパク質を検出できない。さらに、それらは、Ｄｋｋ−１  Ｃ末端に由来す
る別個のペプチドに結合しない。これは、本発明における抗Ｄｋｋ−１抗体により認識さ
れるＤｋｋ−１上のエピトープが複合性である（すなわち、トポグラフに基づくものであ
り、ペプチドに基づくものではない）ことを示唆している。
【０１１７】
図５ＡはＲＨ２−１８を使用するドットブロット結合分析を示す。アカゲザルＤｋｋ−
１タンパク質をＧＦＰタグ（ローディング対照）に融合させた。完全長アカゲザルＤｋｋ
−１タンパク質、Ｃ末端領域（残基１５９−２６６をコードするΔＮ−Ｄｋｋ−１）また
はＮ末端領域（ΔＣ−Ｄｋｋ−１）を発現させ、ＲＨ２−１８抗体を使用するドット免疫
ブロット法により分析した。簡潔に説明すると、一過性にトランスフェクトされた２９３
細胞においてＤＫＫ１−ＧＦＰタグ付き変異体を発現させ、天然馴らし培地をニトロセル
ロース膜上に直接的にブロットした。結合天然タンパク質をタグ−抗体（抗ＧＦＰ，Ａｂ
ｅａｍ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）または抗ＤＫＫ１抗体ＲＨ２−１８でプ
ローブした。アルカリホスファターゼに結合した二次抗体で結合抗体を検出した。
【０１１８】
該ドットブロット分析は、Ｄｋｋ−１のＣ末端領域（アミノ酸１５９−２６６）への中
和抗体ＲＨ２−１８（およびＲＨ１−１０、ＲＨ２−３１、ＲＨ２−５９、ＲＨ２−８０
）の結合を示した。これは、該抗体エピトープが主としてＤｋｋ−１のシステイン・リッ
チ・ドメイン２内に位置づけられることを示した。さらに、該ドットブロット分析は、該
抗体が天然タンパク質に結合することを示した（一方、ウエスタンブロットは変性タンパ
ク質への結合を示さなかった）。Ｄｋｋ−１のＣ末端ドメインは、コリパーゼでの相同性
モデルにより、球状三次構造を形成すると予想される（後記のとおり）。総合すると、こ
れらのデータは、本発明における抗Ｄｋｋ−１抗体および特にＲＨ２−１８抗体のエピト
ープが、Ｄｋｋ−１のそのシステイン・リッチ・ドメイン２内の配列および三次構造の両
方により影響される複合エピトープにより特徴づけられることを示している。
【０１１９】
部位特異的突然変異誘発（アラニンスキャニング法）を用いる該Ｃ末端ドメインの追加
的分析は、Ｄｋｋ−１へのＲＨ２−１８抗体結合に最も重要なＤｋｋ−１アミノ酸残基と
してアミノ酸残基Ｓ１８７からＶ１８８、Ｒ２０３からＫ２０８、およびＥ２４１を特定
した。これに関して、これらの残基に対する突然変異は、ドットブロット分析における該
突然変異Ｄｋｋ−１への該抗体の結合能における顕著な低下を引き起こした（図５Ｂを参
照されたい）。図５Ｂは、ドットブロット結合分析により判定した場合の、Ｄｋｋ−１  
Ｃ末端ドメインにおける種々のアミノ酸置換によるＲＨ２−１８結合の喪失を示している
。アカゲザルＤｋｋ−１タンパク質をＧＦＰタグ（ローディング対照）に融合させた。完
全長アカゲザルＤｋｋ−１タンパク質、Ｃ末端領域（残基１５９−２６６をコードするΔ
Ｎ−Ｄｋｋ−１）またはＮ末端領域（残基１−１５８をコードするΔＣ−Ｄｋｋ−１）を
発現させ、ＲＨ２−１８抗体を使用するドット免疫ブロット法により分析した。ΔＮ−Ｄ
ｋｋ−１内にアラニン置換を導入し、影響を受けたアミノ酸残基が示されている。アラニ
ンスキャニングによるＤｋｋ−１の、独立した構造／機能分析から、該Ｃ末端ドメイン内
のアミノ酸残基Ｒ２０３、Ｈ２０４（Ｆ２０５）がＬＲＰ６へのＤｋｋ−１結合に必要で
あることが確認された（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＫＫｌ  Ｒｅｓｉｄｕ
ｅｓ  Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＬＲＰ５／６
．Ｌｉｐｆｅｒｔら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２１：Ｓ９９（２００６）を
参照されたい）。したがって、これらの残基はＤｋｋ−１機能（ＬＲＰ５／６への結合）
およびＲＨ２−１８抗体への結合の両方に重要である。ＬＲＰ５とのＤｋｋ１相互作用に
要求される鍵アミノ酸残基、およびＲＨ２−１８抗体とのＤｋｋ１結合のためのアミノ酸
残基は、ＲＨ２−１８抗体の抑制活性に関する論理的根拠を提供する。
【０１２０】
図５Ｂに示す突然変異の効果の解釈は第２のシステイン・リッチ・ドメインの三次元モ
デルの状況において最もよく理解される（図５Ｃを参照されたい）。図５Ｃは、アラニン
スキャニングにより決定されたＲＨ２−１８抗体の結合に必要なアミノ酸残基を示すＤｋ
ｋ−１  Ｃ末端ドメイン（アミノ酸１８７−２６６）の構造-相同性モデルを示す（図５
Ｃを参照されたい）。非変性タンパク質を使用する免疫ブロット実験において抗原−抗体
相互作用の低下をもたらすことが見出されたアミノ酸残基の置換はアミノ酸Ｓ１８７から
Ｖ１８８、Ｒ２０３からＫ２０８、Ｅ２４１、およびＬ２４３であり、これらは複合エピ
トープの形成において何らかの役割を果たしているらしい。該Ｃ末端相同性モデルに示さ
れているアミノ酸配列の範囲外であるアミノ酸残基Ｒ１７１からＬ１７４も該複合エピト
ープに寄与することが判明した。また、アラニンでのアミノ酸Ｃ２２０の置換もＤｋｋ−
１へのＲＨ２−１８結合の喪失を引き起こした。
【０１２１】
したがって、ＲＨ２−１８抗体は、抗体結合に必要であると確認された第２のシステイ
ン・リッチ・ドメインの種々の別個の領域からの以下のアミノ酸残基を含む複合エピトー
プに結合する：アミノ酸残基Ｓ１８７およびＶ１８８（それらは共に、第１フィンガード
メインに先行する領域内に存在する）ならびにアミノ酸Ｒ２０３、Ｈ２０４、Ｆ２０５、
Ｗ２０６、Ｓ２０７およびＫ２０８（それらは全て、該ドメインの第１フィンガーを構成
する）。さらに、該ドメインのＣ末端側に、そして第２フィンガーに先行して、Ｅ２４１
およびＬ２４３が存在し、それらもＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合に必要であった。最
後に、Ｃｙｓ２２０はＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合に必要である。Ｃｙｓ２２０は、
Ｄｋｋ−１に結合するためのＲＨ２−１８の適切な三次構造の確立において重要な役割を
果たすと予想され、このこともこのエピトープの複合的性質を示すものである。総合する
と、該データは、ＲＨ２−１８エピトープが、Ｄｋｋ−１の第１フィンガードメインＡ２
０２−Ｉ２０９を含む（これに限定されるものではない）Ｄｋｋ−１  Ｃ末端領域のトポ
グラフ的表面により定められることを示唆している。
【０１２２】
ヒトＤｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−４およびアカゲザルＤｋｋ−１のアミノ酸配列
の比較（図６Ａ）は、前記のとおりにＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８結合に重要であること
が確認されたＤｋｋ−１内に位置するアミノ酸残基の保存性の欠如を示している。ＲＨ２
−１８結合に必要であるとみなされたＤｋｋ−１におけるアミノ酸残基が青色の枠内に囲
われている。アミノ酸残基Ａｒｇ１７１−Ｌｅｕ１７４、Ｓｅｒ１８７からＶａｌ１８８
、Ｓｅｒ２０７およびＧｌｕ２４１に関するＤｋｋ−１およびＤｋｋ−２およびＤｋｋ−
４の間の配列保存性の欠如に注目されたい。ＲＨ２−１８の結合に必要であるＤｋｋ−１
における残基のエピトープマッピングに基づき、そしてアミノ酸残基Ａｒｇ１７１からＬ
ｅｕ１７４、Ｓｅｒ１８７、Ｖａｌ１８８、Ｓｅｒ２０７およびＧｌｕ２４１におけるＤ
ｋｋ−１およびＤｋｋ−２およびＤｋｋ−４の間の配列保存性の欠如に基づき、ＲＨ２−
１８および類似エピトープを共有する他の抗体はＤｋｋ−１に対する高い度合の選択性を
示すと予想される。
【０１２３】
Ｄｋｋ−１のアミノ酸配列はＤｋｋ−２およびＤｋｋ−４のアミノ酸配列と密接に関連
しており、アミノ酸レベルでそれらに対してそれぞれ５０％および４５％の同一性を有す
る。アカゲザルＤｋｋ−２（Ｄｋｋ−２  Ｃ末端領域のＣ末端にｍｙｃおよびＨｉｓ−６
タグを有するアカゲザルＤｋｋ−２のＣ末端領域に融合したアカゲザルＤｋｋ−１のＮ末
端領域よりなるキメラタンパク質を使用；配列番号７１を参照されたい）およびシノモル
グスサルＤｋｋ−４（配列番号７０）に対するＲＨ２−１８の交差反応性を、組換えタン
パク質を使用するドットブロット分析により試験した。天然組換えアカゲザルＤｋｋ−１
、Ｄｋｋ−２およびシノモルグスサルＤｋｋ−４タンパク質（０．１ｎｇ〜１００ｎｇ）
を使用した。非関連組換えタンパク質を非特異的アッセイシグナルに関する対照（ＨＩＳ
タンパク質）としてローディングした。該ドットブロットをＲＨ２−１８でプローブした
。図６Ｂは、Ｄｋｋ−２またはＤｋｋ−４へのＲＨ２−１８の検出可能な特異的結合がほ
とんど又は全く認められなかったことを示している。該抗体の、Ｄｋｋ−１に対する選択
性は、少なくとも１００倍であった。このアッセイ形態においては、アカゲザルＤｋｋ−
１へのＲＨ２−１８の結合の検出限界は約１ｎｇであることが判明した。これらのＤｋｋ
アイソフォームの全濃度におけるシグナル強度は非関連ＨＩＳタグ付きタンパク質に対す
るものに匹敵した。エピトープマッピングおよび配列アライメントデータに一致して、こ
れらのタンパク質への該抗体の交差反応性がほとんど又は全く認められなかったことを示
す結果は、ＲＨ２−１８がＤｋｋ−２またはＤｋｋ−４に結合する確率が低いことを示唆
している。これらのデータは、ＲＨ２−１８および類似抗体が、Ｄｋｋ−１の幾つかの異
なる領域を含む新規な複合的な三次元エピトープを認識することを示しており、このこと
は、ＲＨ２−１８および該類似抗体が特有のものであることを示している。
【実施例６】
【０１２４】
ヒトＤｋｋ−１およびアカゲザルＤｋｋ−１へのＲＨ２−１８抗体のアフィニティーを
、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００装置における該製造業者の説明（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．
，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従う表面プラズモン共鳴によりＲＨ２−１８結合速度
論を測定することにより決定した。ヒトＤｋｋ−１およびアカゲザルＤｋｋ−１に対する
種々のＲＨ２−１８抗体ロットを使用して、いくつかの独立したアフィニティー研究を行
った。各実験に関する算出Ｋｄ値はヒトＤｋｋ−１への結合に関して２０２〜２６９ｐＭ
の範囲であり、その平均値は２５１ｐＭであった。アカゲザルＤｋｋ−１に関しては、外
範囲は７７１〜９３４ｐＭであり、その平均値は８５８ｐＭであった。
【０１２５】
ＲＨ２−１９抗体の量を、サイズ排除クロマトグラフィーにより、他の良く特徴づけら
れたｍＡＢと比較して評価した。該結果は、見掛け上の凝集が全く認められず、ＲＨ２−
１８抗体の優れた安定性を示唆している。
【実施例７】
【０１２６】
ＲＨ２−１８をインビボ薬力学的および効力研究において評価した。
【０１２７】
発生中の骨格におけるＤｋｋ−１／Ｗｎｔ相互作用の阻害が骨量の増加を招くことを示
す遺伝的な概念証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ）データが存在する。また、Ａ
ｍｇｅｎにより開発された抗Ｄｋｋ−１抗体は、３週間の研究においてラットに注射され
た場合（３０ｍｇ／ｋｇ、週２回、皮下）、骨同化性であった（ＤＫＫ１  Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｉｏｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｒ
ｏｄｅｎｔｓ  Ｇｒｉｓａｎｔｉ  Ｍら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２１：Ｓ
２５（２００６）を参照されたい）。成長中の及び成体のマウスの両方において、類似し
た様態で及び類似した期間にわたって骨量増加が認められた。該表現型を薬理学的に実証
するために、インビボ概念証明研究をＲＨ２−１８で行った。この研究は、成体骨格にお
ける応答を後で試験する計画で、成長中のマウスにおいて行った。したがって、該研究の
目的は、すべての被検Ｄｋｋ−１機能をインビトロで中和したＲＨ２−１８抗体が、成長
中の骨格において骨量を増加させることを確認することであった。したがって、試験した
仮定は、ＲＨ２−１８が、成長中のマウスの長骨において骨量を用量−効果的に増加させ
ることであった。
【０１２８】
５週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを入手し、動物施設に１週間順応させた。ＲＨ２−
１８抗体をマウス当たり０．１ｍＬのリン酸バッファー中で皮下（ｓ．ｃ．）投与した。
１群当たり１１匹のマウスが存在した。マウスを連続４週間にわたって週２回、０、０．
５、１．５もしくは５ｍｇ／ｋｇのＲＨ２−１８抗体で、または０．４ｍｇ／ｋｇのＰＴ
Ｈ（１−３４）（皮下、３回／週）で処理した。剖検後、大腿骨および椎骨を解剖して遊
離させ、７０％エタノール中で固定した。全大腿骨をＰｉｘｉｍｕｓ（ＧＥ／Ｌｕｎａｒ
；Ｓｃｈｅｎｅｃｔａｄｙ，ＮＹ）二重エネルギーＸ線吸光光度法により走査した。大腿
骨を、遠位末端から０〜３ｍｍに位置する遠位関心領域（ＲＯＩ）、および遠位末端から
５〜１０ｍｍに位置する中央関心領域に細分した。中央ＲＯＩは１００％皮質骨から構成
され、一方、遠位ＲＯＩは約２０％柱骨である。Ｐｉｘｉｍｕｓソフトウェアは骨ミネラ
ル密度（ＢＭＤ，ｍｇ／ｃｍ２）を全骨（ＷＦＢＭＤ）、遠位大腿骨（ＤＦＢＭＤ）およ
び中央大腿骨（ＣＦＢＭＤ）に関して計算する。結果を図７〜９に示す。
【０１２９】
図７は、０．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＲＨ２−１８抗体により遠位大腿骨ミネラ
ル密度（ＢＭＤ）が用量効果的に５．２〜８．７％増加したことを示している。このＢＭ
Ｄ変化は、十中八九、海綿質骨および皮質骨の両方に対する効果に相当する。図８は、１
．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＲＨ２−１８抗体により全大腿骨ＢＭＤが４．７〜４．
８％増加したことを示している。このＢＭＤ変化は、十中八九、海綿質骨および皮質骨の
両方に対する効果に相当する。図９は、１．５〜５ｍｇ／ｋｇの用量範囲のＲＨ２−１８
抗体により中央大腿骨ＢＭＤが用量効果的に３．２〜３．５％増加したことを示している
。このＢＭＤ変化は主として皮質骨に対する効果に相当する。
【０１３０】
これらの結果は、４週間にわたるマウスへのＲＨ２−１８抗体の投与が、成長中の雌マ
ウスにおける骨量の有意な増加を用量依存的に引き起こしたことを示している。
【０１３１】
マウスへのＲＨ２−１８抗体（これはＤｋｋ−１およびＷｎｔの相互作用を遮断する）
の投与は、成長中のマウスにおける高い骨密度をもたらすことが、該結果から結論づけら
れうる。したがって、Ｄｋｋ−１／Ｗｎｔシグナリング遮断を中和するためにＲＨ２−１
８のような抗体を使用して、成長中の骨格における骨密度を増加させることが可能である
。
【実施例８】
【０１３２】
規定Ｗｎｔシグナリングカスケードは腸上皮細胞増殖を調節する。細胞質シグナリング
中間体（β−カテニン、ＡＰＣ、アクシン（ａｘｉｎ））の遺伝子における遺伝的病変は
転写活性の増強を引き起こし、これは全ての結腸直腸癌の９０％以上に関連している。現
在のところ、Ｄｋｋ−１を含むこの経路を調節する細胞表面受容体または分泌中間体に関
して、そのような腫瘍形成突然変異は記載されていない。それにもかかわらず、Ｄｋｋ−
１を中和する抗体の可能な腫瘍形成効果を評価した。
【０１３３】
Ｄｋｋ−１抗体は、Ｄｋｋ−１が発現される組織に対してのみ、効果を与えるべきであ
る。したがって、Ｄｋｋ−１の組織分布は、安全性の判断において重要な要因である。マ
ウスにおいては、以下の表６に示すとおり、Ｄｋｋ−１は主として骨において発現される
（次に高い発現組織に比べて約６４倍）。
【０１３４】
【表６】
2014087366.tif 000008
【０１３５】
表６は、マウスの選択された組織におけるＤｋｋ−１発現に関するＣＴ値を示す。参考
のために説明すると、ＣＴは閾サイクルである。それは、レポーター蛍光における統計的
に有意な増加がバックグラウンドを超えて検出されうるリアルタイム定量ＰＣＲアッセイ
におけるＰＣＲサイクルである。中央−上位３０ｓにおけるＣＴ値は非常に低い発現ない
し無発現を表す。ｍＲＮＡレベルは、３０＜ＣＴ＜４０であれば低い、３０＜ＣＴ＜２５
であれば中等度、２５＜ＣＴ＜１５であれば高い、と定義される。前記で示したとおり、
Ｄｋｋ−１の発現は、膀胱、腸、肝臓および子宮組織において非常に低いか又は全く認め
られず、骨においては中等度であった。
【０１３６】
ヒトの組織においては、同じ組織におけるＤｋｋ−１の発現レベルはドナーによって異
なることが観察された。発現は一般に、Ｗｎｔシグナリング異常が腫瘍形成に関連づけら
れている正常腸、結腸または肝臓においては最小検出レベルであった（ＣＴ値は高３０ｓ
（すなわち、検出不能））。平均のＤｋｋ−１  ＣＴ値は、ヒト膀胱、頸部、胃および子
宮（Ｗｎｔ／β−カテニン誘発性腫瘍に関連づけられていない組織）に関しては高２０ｓ
におけるものであったが、膝置換後の患者から本発明者らが入手した骨サンプルの幾つか
に関してはそれらは約３０であった。この点においては、Ｄｋｋ−１発現は、典型的には
Ｗｎｔシグナリング誘発性腫瘍に関連づけられていない組織において最高であった。逆に
、細胞質突然変異が腫瘍形成に関連づけられうる組織は実質的なＤｋｋ−１発現を示さな
かった。
【０１３７】
ヒト細胞系においては、ＣＴ値はＭＧ−６３、Ｃａｃｏ−２、ＭＣＦ−７、ＳＷ４８０
およびＨＣＴ１１６細胞に関しては中央２０ｓにおけるものであったが、ＨＥＫ−２９３
、ＳＷ４８およびＤＬＤ１細胞においてはそれらは３０ｓの範囲内のものであった。後者
の２つの細胞系は、細胞質Ｗｎｔシグナリング経路突然変異を有する結腸癌組織に由来す
る。ヒト組織サンプルにおいては、Ｄｋｋ−１は、対（ｐａｉｒｅｄ）正常組織と比べて
腫瘍細胞においてはアップレギュレーションされる傾向にあった。これらの研究において
は、ＴＡＱＭＡＮ系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ
，ＣＡ）を使用するリアルタイム定量ＰＣＲ分析により、これらの細胞におけるＤｋｋ−
１発現を測定し、他の増殖マーカー（Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ、Ｅ２Ｆ１およびＩＧＦＢＰ
−３）のものと比較した。すべてのデータＣＴ値を、対応正常サンプルに対する誘導倍率
に変換した。要約すると、マウスＤｋｋ−１におけるＤｋｋ−１組織分布は、この遺伝子
に関するｍＲＮＡが主として骨において発現されることを示したが、ヒトにおいては、そ
れは骨、膀胱および頸部において発現される。Ｄｋｋ−１は、いくつかの公知増殖マーカ
ーの場合と同様に、ほとんどのヒト腫瘍または癌細胞系において高度にアップレギュレー
ションされる。
【０１３８】
インビボでの正常組織の増殖に対する抗Ｄｋｋ−１抗体の効果をモニターするために、
前記において特定された増殖マーカー（Ｋｉ−６７、ＰＣＮＡ、Ｅ２Ｆ１）、および４週
間処理されたマウス（実施例７に記載されている概念証明研究）における細胞過形成に関
連した遺伝子（ＩＧＦＢＰ−３、Ｄｋｋ−１）のレベルを定量した。これらのマーカーは
、選択された組織（腸、肝臓、膀胱、子宮）における細胞増殖の尺度として選択された。
ＴＡＱＭＡＮ系を用いる定量的ＰＣＲ分析は、４週間の処理の後、対照サンプルと比較し
て抗Ｄｋｋ−１抗体処理サンプルにおいて該増殖マーカーの発現における一貫した又は十
分な相違を示さなかった。
【０１３９】
結腸癌細胞系におけるＤｋｋ−１の、より高い発現に基づいて、転写および増殖に対す
る抗Ｄｋｋ−１抗体の効果をインビトロで評価した。構成的に活性なＷｎｔシグナリング
を示す結腸癌細胞系（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８、ＤＬＤ１およびＨＥＫ２９
３）を使用する増殖アッセイにおいて、ＲＨ２−８０抗体（３０μｇ／ｍＬ）を試験した
。ＭＧ−６３骨肉腫細胞および非特異的抗体８Ｂ４を対照として使用した。細胞増殖を測
定するために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（
ＡＴＣＣ）のプロトコールにより該細胞を培養した。該増殖アッセイを行う前日に、新鮮
に調製された細胞を、１００μＬの対応細胞培地中、９６ウェルＣｙｔｏｓｔａｒシンチ
レーティング・プレートに２〜５×１０３  細胞／ウェルで播いた。翌日、０．５μＣｉ
／ｍＬの［メチル−１４Ｃ］チミジンをＲＨ２−８０抗体、８Ｂ４抗体またはＷｎｔ３Ａ
と共に各ウェルに加えた。該抗体の添加の１日後、２日後、３日後および５日後、１４５
０  ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ  Ｊｅｔ（Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
，ＭＤ）を使用して細胞増殖を測定した。細胞内への［メチル−１４Ｃ］チミジンの、よ
り大量の取り込みは、ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ  Ｊｅｔ上のＣｙｔｏｓｔａｒプレート内で検
出される、より大量の光に相関された。第３日に、治療薬を含有する新鮮培地を細胞に補
充した。図１０Ｂに示すデータは第３日の処理を表している。
【０１４０】
構成的に活性なＷｎｔシグナリングを示す結腸癌細胞系（ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、
ＳＷ４８、ＤＬＤ１およびＨＥＫ２９３）を使用するＴＯＰｆｌａｓｈ転写アッセイにお
いて、ＲＨ２−８０抗体（３０μｇ／ｍＬ）を試験した。ＭＧ−６３骨肉腫細胞および非
特異的抗体８Ｂ４を対照として使用した。
【０１４１】
該アッセイにおいてＷｎｔ／ＤＫＫ１シグナリングを測定するために、トランスフェク
ションの前日に、ＡＴＣＣプロトコールにより、１００μＬの完全細胞培地中、９６ウェ
ルプレート内に２５，０００細胞／ウェルで細胞を播いた。トランスフェクションの当日
、６０μＬのＦｕＧｅｎｅ６、３７５ｎｇのｐＴｏｐｆｌａｓｈ、８０ｎｇ  ｐＴＫｒｅ
ｎｉｌｌａおよび５μｇ  ｐｃＤＮＡ３．１−ＬＥＦ１を最終容量６００μＬのＯＰＴＩ
ＭＥＭに加えた。該混合物を室温で１時間インキュベートした。ついで１．４ｍＬのＯＰ
ＴＩＭＥＭを前記混合物に加え、穏やかに良く混合した。ついで２０μＬの該ＤＮＡ混合
物を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。該プレートを穏やかに叩き、３７℃のイン
キュベーターに戻した。トランスフェクションの翌日、細胞をＲＨ２−８０抗体、８Ｂ４
抗体またはＷｎｔ３Ａのいずれかで処理した。処理の約２４時間後、二重ルシフェラーゼ
アッセイをＰｒｏｍｅｇａプロトコールにより行った。誘導を計算する前に、まず、ルシ
フェラーゼシグナルをレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）シグナルに対して正規化した。対照シグ
ナルと比較することにより、誘導倍率を得た。
【０１４２】
ＨＣＴ１１６細胞を使用する転写および増殖アッセイの結果を図１０Ａおよび１０Ｂに
示す。一般に、該結果は、多数の細胞が、Ｗｎｔ処理によってはそれ以上増強され得ない
高い基底転写レベルを有することを示した。すべての細胞系において、ＲＨ２−８０単独
ではＬＥＦ−１／ＴＣＦプロモーター活性を増強しなかった。応答性のこの欠如は、Ｗｎ
ｔ３ａ処理に応答する細胞、例えばＨＣＴ１１６において見られた。別の分析は、抗Ｄｋ
ｋ−１抗体ＲＨ２−８０が、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ＰＰＡＲｄ、ＦＧＦ１８、ＣＯＸ２、ＩＧ
Ｆ−１およびＩＧＦ−２を含む内因性Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を変化させないことを示し
た。さらに、６つの被検細胞系のいずれにおいても、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−
４、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｓｏｓｔ、ＷＩＦ１およびＣＴＧＦのようなＷｎｔシグナリン
グ成分の誘導は認められなかった。
【０１４３】
該細胞増殖研究において、その結果は、ＲＨ２−８０（３０μｇ／ｍＬ）が被検細胞系
のそれぞれにおいて細胞増殖を増強しないことを示した。アッセイは、血清の存在下、お
よび補足的なＷｎｔ３ａ処理の非存在下または存在下で行った。ＨＣＴ１１６細胞増殖に
対するＲＨ２−８０抗体の効果に関する結果を図１１Ｂに示す。並行して行った分析はＭ
Ｇ−６３、ＨＣＴ１１６およびＳＷ４８０細胞の増殖に対する効果に関してＲＨ２−８０
およびＲＨ２−５９抗体（共に１６μｇ／ｍＬ）を試験した。血清含有培地においては増
殖の増強は観察されなかった。ビヒクル（Ｎ．Ｓ．）と比較してＯＰＴＩＭＥＭ無血清培
地において試験した場合には、ＭＧ−６３およびＨＣＴ１１６細胞のＲＨ２−８０抗体処
理による細胞増殖の刺激は観察されなかった。２０Ｃ２ＨＡ（陰性対照）とＲＨ２−８０
およびＲＨ２−５９（類似効力を有する抗Ｄｋｋ−１抗体）の間の比較において有意性が
観察され、それらは共に、ビヒクル対照（Ｎ．Ｓ．）と比較して僅かな抗増殖効果の傾向
を示した。反復分析は、ＯＰＴＩＭＥＭ中のＳＷ４８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞（よ
り高い初期密度で播かれた）において抗体効果を示さなかった。この点において、ＲＨ２
−５９または２０Ｃ２ＨＡで処理された細胞の増殖における下降傾向は認められず、この
場合もまた、ＲＨ２−８０は該ビヒクル対照と同等に機能した。
【０１４４】
ヒト結腸癌異種移植片のＳＣＩＤマウスにおける
【図１Ａ】
2014087366.tif 000009
【図１Ｂ】
2014087366.tif 000010
【図１Ｃ】
2014087366.tif 000011
【図１Ｄ】
2014087366.tif 000012
【図１Ｅ】
2014087366.tif 000013
【図１Ｆ】
2014087366.tif 000014
【図２Ａ】
2014087366.tif 000015
【図２Ｂ】
2014087366.tif 000016
【図３】
2014087366.tif 000017
【図４】
2014087366.tif 000018
【図５Ａ】
2014087366.tif 000019
【図５Ｂ】
2014087366.tif 000020
【図５Ｃ】
2014087366.tif 000021
【図６Ａ】
2014087366.tif 000022
【図６Ｂ】
2014087366.tif 000023
【図７】
2014087366.tif 000024
【図８】
2014087366.tif 000025
【図９】
2014087366.tif 000026
【図１０Ａ】
2014087366.tif 000027
【図１０Ｂ】
2014087366.tif 000028
【図１１】
2014087366.tif 000029
【外国語明細書】
2014087366000001.pdf