【手続補正書】
【提出日】令和3年4月16日(2021.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1mM未満のATPを含むか又はヌクレオチド類縁体を含む溶液中に含有された、細孔、Hel308ヘリカーゼ及び標的ポリヌクレオチドを含む、標的ポリヌクレオチドを特徴決定するための組成物であって、該標的ポリヌクレオチドの特徴決定が、該標的ポリヌクレオチドの配列、該標的ポリヌクレオチドの長さ、該標的ポリヌクレオチドの同一性、及び該標的ポリヌクレオチドの給源の1以上を同定することを含む、前記組成物。
【請求項２】
前記1mM未満のATPを含む溶液が、0.1μM、1.0μM、10μM、100μM、0.5mM及び0.9mMのATPからなる群から選択される濃度を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記細孔が、生物学的細孔である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
前記生物学的細孔が、ポリペプチド細孔である、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
前記生物学的細孔が、ポリヌクレオチド細孔である、請求項3記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチド細孔が、5ヌクレオチド以下の狭窄ゾーンを有する、請求項4記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチド細孔が、マイコバクテリウム・スメグマチスポリンA(MspA)を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項８】
前記MspAが、配列番号:1のアミノ酸配列、又は配列番号:1との少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも99％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
前記細孔が、固体状態の細孔である、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
前記細孔が、生物学的及び固体状態のハイブリッド細孔である、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
前記生物学的及び固体状態のハイブリッド細孔が、ポリペプチド−固体状態のハイブリッド細孔である、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
前記生物学的及び固体状態のハイブリッド細孔が、ポリヌクレオチド−固体状態のハイブリッド細孔である、請求項10記載の組成物。
【請求項１３】
前記Hel308ヘリカーゼが:
(a)以下のGenbankアクセッションコードのいずれか1つによって規定されるヘリカーゼ:
NP_578406.1、NP_126564.1、NP_143168.1、YP_004424773.1、YP_004623750.1、YP_002307730.1、YP_004763427.1、YP_002959236.1、YP_004071709.1、YP_002994328.1、ZP_04875329.1、YP_003436565.1、YP_004485304.1、YP_004616424.1、ZP_04873370.1、YP_004342552.1、NP_071282.1、2P6R_A、YP_685308.1、YP_001048404.1、YP_919908.1、YP_843229.1、ZP_08045937.1、NP_280985.1、YP_003357840.1、YP_003457479.1、YP_003127632.1、YP_003735335.1、YP_503885.1、BAJ48115.1、YP_001405615.1、YP_306959.1、YP_001031179.1、YP_003541733.1、YP_004384692.1、YP_003725904.1、YP_003405271.1、YP_004244914.1、YP_001540156.1、NP_618094.1、YP_003900980.1、YP_003896003.1、YP_003615773.1、YP_183745.1、YP_001322557.1、YP_002467772.1、YP_003480097.1、YP_004577043.1、YP_004742641.1、NP_632449.1、YP_001097223.1、YP_004742247.1、YP_004794766.1、NP_988010.1、YP_565780.1、YP_001549808.1、YP_001548609.1、YP_001329359.1、YP_004595982.1、YP_656795.1、CCC38992.1、YP_004035272.1、YP_137330.1、YP_001581577.1、EET90255.1、NP_376477.1、YP_001097792.1、ZP_08667240.1、YP_254972.1、EFD92533.1、YP_003176257.1、EGD71904.1、YP_001040230.1、ABZ07376.1、YP_001097458.1、ABZ08606.1、YP_325906.1、YP_930665.1、YP_001435870.1、YP_003668634.1、ZP_08558598.1、YP_002428409.1、YP_004336918.1、ZP_08257442.1、YP_004459284.1、NP_558924.1、YP_004409449.1、YP_003649556.1、ZP_06387115.1、2VA8_A、YP_004809267.1、ADX84345.1、YP_002828439.1、YP_002913571.1、Q97VY9.1、YP_002841682.1、YP_002831080.1、YP_001054984.1、NP_343811.1、YP_001152379.1、YP_001191456.1、NP_147034.2、YP_024158.1、YP_003816358.1、YP_003860265.1、NP_394295.1、YP_876638.1、ZP_05571398.1、YP_004176252.1、YP_001737782.1、EGQ40435.1、YP_002567343.1、YP_001793507.1、YP_003534088.1、YP_004037165.1、NP_111333.1、YP_002565871.1、CCC39675.1、YP_657401.1、YP_003535028.1、YP_003706863.1、ABD17736.1、NP_613398.1、CBH38575.1、EEZ93258.1、YP_004004246.1、YP_003850109.1、YP_003424423.1、YP_004291107.1、YP_447162.1、YP_004519549.1、NP_275949.1、ZP_05975717.2、ZP_03607647.1、YP_001273412.1、YP_003247505.1、NP_248116.1、YP_001324295.1、YP_003536960.1、YP_003131029.1、YP_002567151.1、YP_004035351.1、YP_004808851.1、XP_002716686.1、YP_656834.1、XP_003248103.1、ABC72356.1、CCC39031.1、XP_001165150.2、XP_003225852.1、XP_615375.3、XP_002813286.1、AAR08421.2、EAW79510.1、NP_955452.3、NP_001099348.1、XP_003341262.1、XP_001502374.3、XP_545125.3、XP_002928855.1、NP_084253.1、AAK39635.1、AAN393838.1、XP_003412882.1、YP_003735206.1、YP_004794841.1、XP_416549.2、XP_003427319.1、XP_003202748.1、XP_969311.1、ZP_08046037.1、YP_461714.1、YP_003176510.1、YP_137400.1、NP_001184156.1、NP_280861.1、YP_004595640.1、XP_001521144.2、XP_003261953.1、XP_001358456.2、ZP_0856003.1、XP_002187783.1、XP_002112587.1、YP_003405139.1、EGV92665.1、CBY24305.1、YP_003130565.1、YP_003479811.1、EFB22383.1、YP_003357334.1、YP_325942.1、XP_002912509.1、XP_002704678.1、CAE47762.2、XP_003205636.1、XP_544959.2、EFX86757.1、YP_003389641.1、XP_002602932.1、YP_004144962.1、XP_002124758.1、XP_694437.5、XP_420565.1、XP_003129397.1、EDL20278.1、XP_001517710.2、AAH82601.1、XP_003384429.1、XP_003221282.1、NP_524333.1、AAX33507.1、NP_001074576.1、YP_003523727.1、XP 002120889.1、XP_001892566.1、ABZ09232.1、XP_002814981.1、XP_002717082.1、XP_001104832.1、AAL85274.1、NP_598375.2、Q8TDG4.2、XP_003265889.1、XP_002745688.1、XP_003310356.1、NP_001014156.2、XP_001850567.1、XP_003427318.1、XP_003143912.1、CAG11187.1、XP_001111254.2、XP_003414242.1、XP 002681870.1、EAX05935.1、AAH59917.1、ZP_07082808.1、XP_001494572.3、XP_002714920.1、XP_002598278.1、XP_001943294.1、XP_002803889.1、XP_001651546.1、CAA11679.1、XP_002837795.1、EGT47882.1、EDL99655.1、NP_932124.2、EDL05054.1、及びZP_08963952.1;又は
(b)以下のGenInfo識別子のいずれか1つによって規定されるヘリカーゼ:
GI:121689265、GI:18202135、GI:490144641、GI:506391664、GI:118576895、GI:18202627、GI:503633371、GI:333911571、GI:240102927、GI:315231273、GI:242398904、GI:121723325、GI:24418451、GI:294495240、GI:24418450、GI:116665562、GI:336477283、GI:298674154、GI:500195255、GI:490388033、GI:226740606、GI:497573451、GI:256810263、GI:18202572、GI:502864579、GI:88603707、GI:635552454、GI:502709689、GI:495257384、及びGI:15791161
である、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
前記標的ポリヌクレオチドが、1本鎖ポリヌクレオチド、2本鎖ポリヌクレオチド、及び部分的2本鎖ポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチドを特徴決定するためのシステムであって:
シス面及びトランス面を有する膜に挿入されているポリペプチド細孔;
該膜のシス面で該細孔と接触しているHel308ヘリカーゼ;
該膜のシス面と接触している、標的ポリヌクレオチドと1mM未満のATP又はその類縁体とを含む溶液;
該膜を横切るポテンシャルの差を提供するように適合されている増幅器;
該ポリペプチド細孔を通る該ポリヌクレオチドのフラクショナル工程転位からのシグナルを特徴決定するための指示を有するプロセッサー;及び
該細孔を通って流れるイオン電流を測定するように適合されている検出器
を含み、
該標的ポリヌクレオチドの特徴決定が、該標的ポリヌクレオチドの配列、該標的ポリヌクレオチドの長さ、該標的ポリヌクレオチドの同一性、及び該標的ポリヌクレオチドの給源の1以上を同定することを含む、前記システム。
【請求項１６】
前記指示が、前記Hel308ヘリカーゼの完全転位サイクルの間に少なくとも2つのシグナルを特徴決定するように適合されている、請求項15記載のシステム。
【請求項１７】
前記指示が隠れマルコフモデルを含む、請求項15記載のシステム。
【請求項１８】
前記検出器が、前記Hel308ヘリカーゼの完全転位サイクルの間に少なくとも2つのシグナルを測定するように適合されている、請求項15記載のシステム。
【請求項１９】
前記検出器が、約50kHzのサンプリング速度で電流反応を測定する、請求項15記載のシステム。
【請求項２０】
前記ポリペプチド細孔が、5ヌクレオチド以下を保持できる長さを有する狭窄ゾーンを含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２１】
前記ポリペプチド細孔が、2ヌクレオチド以下を保持できる長さを有する狭窄ゾーンを含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２２】
前記溶液が、約100μM未満のATP又はその類縁体を含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２３】
前記ポリペプチド細孔が、マイコバクテリウム・スメグマチスポリンA（MspA）細孔を含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２４】
前記ポリペプチド細孔が、D90N、D91N、D93N、D118R、D134R及びE139Kからなる群から選択される1以上の変異を含む野生型MspAポリペプチドを含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２５】
前記ポリペプチド細孔が、配列番号:1に対して少なくとも約90%の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２６】
前記ポリペプチド細孔が、配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２７】
前記Hel308ヘリカーゼが、配列番号:04〜65からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するモチーフを含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２８】
前記膜が、脂質二重層を含む、請求項15記載のシステム。
【請求項２９】
前記脂質二重層が、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンを含む、請求項28記載のシステム。