【手続補正書】
【提出日】令和3年2月24日(2021.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の標的化遺伝子解析のための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の捕捉プローブモジュールをタグ付きｃｆＤＮＡライブラリー中の標的遺伝子座位にハイブリダイズさせて、１つまたは複数の捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を形成するステップであって、
各捕捉プローブモジュールが、テール配列と、該標的遺伝子座位内の標的領域とハイブリダイズできる捕捉プローブ配列とを含み、
該タグ付きｃｆＤＮＡライブラリーが、アダプターの各末端にライゲーションしたｃｆＤＮＡ分子を含む、ステップと；
（ｂ）（ａ）からの該１つまたは複数の捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を単離するステップであって、各単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体が、捕捉プローブモジュールとタグ付きｃｆＤＮＡ分子とを含む、ステップと；
（ｃ）（ｂ）からの該１つまたは複数の単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を酵素で処置して、１つまたは複数のハイブリッド核酸分子（ハイブリッド分子）を生成するステップであって、各ハイブリッド分子が、
ｉ．該捕捉プローブモジュールまたはその相補体の少なくとも一部；および
ｉｉ．該タグ付きｃｆＤＮＡ分子またはその相補体の少なくとも一部
を含む、ステップと；
（ｄ）ＰＣＲを使用して該ハイブリッド分子を増幅させるステップと；
（ｅ）該増幅されたハイブリッド分子の定量的遺伝子解析を行うステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が、前記単離されたタグ付きｃｆＤＮＡ分子を鋳型として利用して、前記捕捉プローブの５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ伸長を行い、１つまたは複数のハイブリッド分子を生成することを含み、各ハイブリッド分子が、前記テール配列と、前記捕捉プローブが前記標的領域にハイブリダイズする位置から３’方向に位置する前記標的領域の一領域の相補体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ酵素を使用して、（ｂ）からの前記単離された捕捉プローブ／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体に対して３’−５’エキソヌクレアーゼ処理を行い、一本鎖３’末端を除去し、前記捕捉プローブモジュールの前記テール配列をコピーして、１つまたは複数のハイブリッド分子を生成することを含み、各ハイブリッド分子が、前記標的領域と、前記捕捉プローブモジュールのテール配列の相補体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）が、５’ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ重合、およびＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の協奏作用により、１つまたは複数のハイブリッド分子を生成することを含み、各ハイブリッド分子が、前記標的領域と、前記捕捉プローブモジュールのテール配列の相補体とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉プローブモジュールの前記テール配列が、プライマー結合部位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記捕捉プローブモジュールの前記テール配列が、パートナーオリゴヌクレオチドに対する相補性を有する配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各捕捉プローブモジュールの前記捕捉プローブ配列が、長さ６０ヌクレオチドより小さい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉プローブが、長さ４０ヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの捕捉プローブが前記標的領域の下流にハイブリダイズし、少なくとも１つの捕捉プローブモジュールが前記標的領域の上流にハイブリダイズする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の捕捉プローブが前記標的遺伝子座位にハイブリダイズし、該複数の捕捉プローブの各々が任意の他の捕捉プローブの２００ｂｐ以内にハイブリダイズする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アダプターが、複数のアダプターから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のアダプターの各々が、前記ｃｆＤＮＡライブラリーの増幅のためのプライマー結合部位を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のアダプターの各々が、１つまたは複数のユニークリードコードを含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数のアダプターの各々が、試料多重化のための１つまたは複数の試料コードを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のアダプターの各々が、ＤＮＡシークエンシングのための１つまたは複数の配列を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数のアダプターの各々が、１つまたは複数のシークエンシングプライマー結合部位を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タグ付きｃｆＤＮＡライブラリー中のゲノム当量の数を決定するステップを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子解析が、前記タグ付きｃｆＤＮＡライブラリー中の複数の標的遺伝子座位で行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子解析が、複数のｃｆＤＮＡライブラリー中の複数の標的遺伝子座位で行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記定量的遺伝子解析が、複数のシークエンシングリードを生成するためのＤＮＡシークエンシングを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のシークエンシングリードのバイオインフォマティック解析を行うことをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
バイオインフォマティクス解析が、
（ａ）前記タグ付きｃｆＤＮＡライブラリー中の解析されるゲノム当量の数を定量するため；
（ｂ）前記標的遺伝子座位における遺伝子バリアントを検出するため；
（ｃ）前記標的遺伝子座位内の変異を検出するため；
（ｄ）前記標的遺伝子座位内の遺伝子融合を検出するため；および
（ｅ）前記標的遺伝子座位内のコピー数増減を測定するため
に使用される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象の生体試料からｃｆＤＮＡを単離し、該単離したｃｆＤＮＡからタグ付きｃｆＤＮＡライブラリーを生成するステップを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象の前記生体試料が、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼液、尿、唾液、糞便、粘液（mucous）および汗からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象は遺伝疾患を有すると診断されていない、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象は遺伝疾患を有すると診断されている、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記定量的遺伝子解析が、前記標的化遺伝子座位内の１つまたは複数の遺伝子病変を同定または検出するために使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つまたは複数の遺伝子病変が、ヌクレオチドトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチド挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の遺伝子病変が、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）遺伝子の３’コード領域を別の遺伝子に融合させるゲノム再編成を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＬＫ遺伝子の前記３’コード領域がＥＭＬ４（棘皮動物微小管結合タンパク質様４）遺伝子に融合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝疾患ががんである、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が妊娠している、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記定量的遺伝子解析が、胎児ｃｆＤＮＡ中の１つまたは複数の標的遺伝子座位の１つまたは複数の遺伝子バリアントまたは遺伝子病変を同定または検出するために使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が移植レシピエントである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記定量的遺伝子解析が、前記対象におけるドナーｃｆＤＮＡを同定または検出するために使用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
１つまたは複数の標的遺伝子座位内の１つまたは複数の遺伝子病変を、対象における遺伝疾患を予測、診断またはモニターするための指標とする方法であって、
（ａ）１つまたは複数の捕捉プローブモジュールをタグ付きｃｆＤＮＡライブラリー中の標的遺伝子座位にハイブリダイズさせて、１つまたは複数の捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を形成するステップであって、
各捕捉プローブモジュールが、テール配列と、該標的遺伝子座位内の標的領域とハイブリダイズできる捕捉プローブ配列とを含み、
該タグ付きｃｆＤＮＡライブラリーが、アダプターの各末端にライゲーションしたｃｆＤＮＡ分子を含む、ステップと；
（ｂ）（ａ）からの該１つまたは複数の単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を単離するステップであって、各単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体が、捕捉プローブモジュールとタグ付きｃｆＤＮＡ分子とを含む、ステップと；
（ｃ）（ｂ）からの該１つまたは複数の単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を酵素で処置して、１つまたは複数のタグ付きハイブリッド核酸分子（ハイブリッド分子）を生成するステップであって、各ハイブリッド分子が、
ｉ．該捕捉プローブモジュールまたはその相補体の少なくとも一部；および
ｉｉ．該タグ付きｃｆＤＮＡ分子またはその相補体の少なくとも一部
を含む、ステップと；
（ｄ）ＰＣＲを使用して該ハイブリッド分子を増幅させるステップと；
（ｅ）該増幅されたハイブリッド分子の定量的遺伝子解析を行うステップと；
（ｆ）該ｃｆＤＮＡライブラリー中の該遺伝疾患に関連する１つまたは複数の標的遺伝子座位の定量的遺伝子解析を行うステップと
を含み、該１つまたは複数の標的遺伝子座位における１つまたは複数の遺伝子病変の同定または検出が、該遺伝疾患の予後を予測し、それを診断し、またはその進行をモニターする、方法。
【請求項３７】
前記ｃｆＤＮＡが、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼液、尿、唾液、糞便、粘液および汗からなる群から選択される生体試料から単離される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチド挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記遺伝子病変が、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）遺伝子の３’コード領域を別の遺伝子に融合させるゲノム再編成を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＡＬＫ遺伝子の前記３’コード領域がＥＭＬ４（棘皮動物微小管結合タンパク質様４）遺伝子に融合している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝疾患ががんである、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
１つまたは複数のバイオマーカーを、遺伝疾患のコンパニオン診断の指標とする方法であって、
（ａ）１つまたは複数の捕捉プローブモジュールをタグ付きｃｆＤＮＡライブラリー中の標的遺伝子座位にハイブリダイズさせて、１つまたは複数の捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を形成するステップであって、
各捕捉プローブモジュールが、テール配列と、該標的遺伝子座位内の標的領域とハイブリダイズできる捕捉プローブ配列とを含み、
該タグ付きｃｆＤＮＡライブラリーが、アダプターの各末端にライゲーションしたｃｆＤＮＡ分子を含む、ステップと；
（ｂ）（ａ）からの該１つまたは複数の単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を単離するステップであって、各単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体が、捕捉プローブモジュールとタグ付きｃｆＤＮＡ分子とを含む、ステップと；
（ｃ）（ｂ）からの該１つまたは複数の単離された捕捉プローブモジュール／タグ付きｃｆＤＮＡ複合体を酵素で処置して、１つまたは複数のタグ付きハイブリッド核酸分子（ハイブリッド分子）を生成するステップであって、各ハイブリッド分子が、
ｉ．該捕捉プローブモジュールまたはその相補体の少なくとも一部；および
ｉｉ．該タグ付きｃｆＤＮＡ分子またはその相補体の少なくとも一部
を含む、ステップと；
（ｄ）ＰＣＲを使用して該ハイブリッド分子を増幅させるステップと；
（ｅ）該増幅されたハイブリッド分子の定量的遺伝子解析を行うステップと；
（ｆ）該ｃｆＤＮＡライブラリー中の該遺伝疾患に関連する１つまたは複数のバイオマーカーの定量的遺伝子解析を行うステップと
を含み、該１つまたは複数のバイオマーカーの少なくとも１つの検出、または検出できないことが、該対象を該遺伝疾患について処置すべきかどうかを示す、方法。
【請求項４３】
前記ｃｆＤＮＡが、羊水、血液、血漿、血清、精液、リンパ液、脳脊髄液、眼液、尿、唾液、糞便、粘液および汗からなる群から選択される生体試料から単離される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記バイオマーカーが遺伝子病変である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子病変が、ヌクレオチドトランジションもしくはトランスバージョン、ヌクレオチド挿入もしくは欠失、ゲノム再編成、コピー数の変化、または遺伝子融合を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子病変が、ＡＬＫ遺伝子の３’コード領域を別の遺伝子に融合させるゲノム再編成を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＡＬＫ遺伝子の前記３’コード領域がＥＭＬ４遺伝子に融合している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝疾患ががんである、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。