【手続補正書】
【提出日】令和3年7月5日(2021.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）核酸を含むサンプルであって、呼吸器感染のリスクを有する対象から得られたサンプルであり、血液、血漿、血清、脳脊髄液および滑液から選択されるサンプルを準備し、
（ｂ）前記核酸を含むサンプルからの核酸のハイスループット配列決定を行い、前記呼吸器感染に関連する少なくとも１つの微生物由来の配列リード（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅａｄ）を含む配列リードを生成し、
（ｃ）呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物を検出すること
を含む、呼吸器感染に関連する微生物を検出する方法。
【請求項２】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物が、ウイルス、細菌、真菌種、寄生原虫、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物の前記検出が、呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物の存在および保有率を決定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）の前に、前記核酸にアダプターを連結し、呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物から、アダプター付き核酸を製造することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物由来の前記アダプター付き核酸を配列決定すること含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸がＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が無細胞ＤＮＡまたは無細胞ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの前記微生物を株または種レベルで同定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物由来の核酸の量を特定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物由来の核酸の量が、前記対象の感染状態の指標となる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記対象または前記対象の医療提供者に対して、呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物の存在についての評価を提供することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前に、呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物からのＤＮＡを増幅することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの微生物からのＤＮＡの増幅が、不偏性増幅を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記不偏性増幅がユニバーサルプライマーとのＰＣＲ反応を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが血漿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）が少なくとも１，０００，０００配列リードを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物がアデノウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物がヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
第２の時点で、前記対象から第２のサンプルを取得し、該第２のサンプルについて工程（ｂ）と（ｃ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物がウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物が細菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物が真菌種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
呼吸器感染に関連する前記少なくとも１つの微生物が寄生原虫を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記配列リードが短い配列リードである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
呼吸器感染のリスクを有する前記対象が臓器移植レシピエントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記臓器移植レシピエントが骨髄移植レシピエントである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
呼吸器感染のリスクを有する前記対象が免疫抑制状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
非微生物宿主由来の無細胞核酸を含むサンプルにおける、無細胞微生物配列の存在または保有率を特定するための、１つまたは複数のコンピュータ可読媒体であって、それ自体に記録された一組の命令を含み、該一組の命令がプロセッサによって実行されると、下記工程、
（ｉ）ハイスループット配列決定データについてバイオインフォマティクス分析を行う工程であって、該ハイスループット配列決定データは、非微生物宿主由来の無生物核酸を含むサンプル由来のものであり、該バイオインフォマティクス分析は、ハイスループット配列決定データから非微生物宿主配列を差し引くものである工程、
（ｉｉ）細菌、寄生原虫、または真菌種の、個別の株または種の存在または保有率を評価するために、前記無細胞微生物配列の存在または保有率を特定する工程、が実行される、前記１つまたは複数のコンピュータ可読媒体。
【請求項３０】
それ自体に記録された一組の命令を含む１つまたは複数のコンピュータ可読媒体であって、該一組の命令がプロセッサによって実行されると、下記工程、
（ｉ）対象由来の無細胞核酸のサンプル中で検出された１つ以上の核酸からのハイスループット配列決定データを受け取る工程、
（ｉｉ）バイオインフォマティクス分析をおこなって、前記無細胞核酸のサンプルにおいて検出された１つ以上の核酸由来のハイスループット配列決定データから、対象の配列を差し引く工程；および
（ｉｉｉ）無細胞微生物配列の存在または保有率を、株または種レベルで特定する工程
が実行される、前記１つまたは複数のコンピュータ可読媒体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
本明細書には本発明の好ましい実施形態が示され記載されているが、そのような実施形態は単なる例示として記載されているに過ぎないことが当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく多数の変更、変化および置換が今や当業者に認識されるであろう。本明細書に記載されている本発明の実施形態の種々の代替物が本発明の実施において使用されうると理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定めるものであり、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が本発明に含まれると意図される。
本発明は一態様において以下を提供する。
[項目１]
非微生物宿主からの無細胞核酸のサンプルにおける微生物配列の存在および保有率を決定する方法であって、
（ｉ）個体からの無細胞核酸のサンプルを準備し、
（ｉｉ）該核酸のハイスループット配列決定を行い、
（ｉｉｉ）バイオインフォマティクス分析を行って、分析から宿主配列を差し引き、
（ｉｖ）該非微生物宿主のミクロビオーム評価のために微生物配列の存在および保有率を決定することを含む方法。
[項目２]
複数の微生物の存在および保有率を決定する、項目１記載の方法。
[項目３]
不偏性方法により増幅された核酸サンプルに関してハイスループット配列決定を行う、項目１記載の方法。
[項目４]
少なくとも１０ ６個の配列読取りを行う、項目１記載の方法。
[項目５]
工程（ｉｖ）が、微生物参照配列に位置づけられる配列の被覆率を宿主参照配列の被覆率と比較することを含む、項目１記載の方法。
[項目６]
工程（ｉｉｉ）が、参照宿主配列を特定し、参照宿主ゲノム内に存在する微生物配列または微生物擬態配列をマスクすることを含む、項目１記載の方法。
[項目７]
工程（ｉｉｉ）が、参照微生物配列を特定し、参照微生物ゲノム内に存在する宿主配列または宿主擬態配列をマスクすることを含む、項目１記載の方法。
[項目８]
１以上の病原性微生物の存在を確認する、項目１記載の方法。
[項目９]
２以上の時点で分析を行う、項目１記載の方法。
[項目１０]
前記の１以上の微生物核酸の量が感染状態または治療結果の指標となる、項目１記載の方法。
[項目１１]
所定閾値を超える前記の１以上の核酸の量が感染状態または治療結果の指標となる、項目１０記載の方法。
[項目１２]
該サンプルが、血液、血清、尿および糞便からなる群から選択される、項目１記載の方法。
[項目１３]
該核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡヘアピン、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡヘアピンからなる群から選択される、項目１記載の方法。
[項目１４]
該核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡからなる群から選択される、項目１記載の方法。
[項目１５]
該ミクロビオームの評価を該個体に提供することを更に含む、項目１記載の方法。
[項目１６]
該ミクロビオームの評価が治療に対する応答の決定をもたらす、項目１記載の方法。[項目１７]
該ミクロビオームの評価が人間生理機能の測定をもたらす、項目１記載の方法。
[項目１８]
該ミクロビオームの評価を、該非微生物宿主に存在する微生物に関する病原性スコアを計算するために用いる、項目１記載の方法。
[項目１９]
コンピュータ可読媒体であって、
（ｉ）被験者からのサンプルにおいて検出された１以上の無細胞核酸からのハイスループットデータを受け取り、
（ｉｉｉ）バイオインフォマティクス分析を行って、分析から宿主配列を差し引き、
（ｉｖ）微生物配列の存在および保有率を決定する工程をコンピュータが実行するように該コンピュータ可読媒体に記録された一組の命令を含むコンピュータ可読媒体。
[項目２０]
被験者からのサンプルを準備し、
該サンプルにおける１以上のミクロビオーム核酸の存在または非存在を決定し、
前記の１以上のミクロビオーム核酸の存在に基づいて免疫能を評価することを含む、個体の免疫能を評価する方法。
[項目２１]
該ミクロビオームのウイローム成分を分析する、項目２０記載の方法。
[項目２２]
前記の１以上のウイローム核酸の量の時間的相違が免疫能状態の指標となる、項目２１記載の方法。
[項目２３]
該個体におけるウイルス負荷を定量することを含む、項目２１記載の方法。
[項目２４]
アネロウイルスのウイルス負荷に関してウイロームを分析する、項目２３記載の方法。
[項目２５]
該個体が免疫抑制レジメンを受けている、項目２０記載の方法。
[項目２６]
該個体が移植を受けている、項目２０記載の方法。
[項目２７]
該移植が、骨髄移植、腎臓移植、心臓移植、肝臓移植、膵臓移植、肺移植、腸移植および皮膚移植からなる群から選択される、項目２６記載の方法。
[項目２８]
該核酸が循環性無細胞ＤＮＡである、項目２０記載の方法。
[項目２９]
前記の１以上の核酸の存在または非存在を、配列決定、核酸アレイまたはＰＣＲからなる群から選択される方法により決定する、項目２０記載の方法。
[項目３０]
前記の１以上の核酸の量が移植状態または結果の指標となる、項目２０記載の方法。[項目３１]
所定閾値を超える前記の１以上の核酸の量が移植状態または結果の指標となる、項目３０記載の方法。
[項目３２]
該閾値が、移植拒絶または他の病状の証拠を示さない臨床的に安定な移植後患者に関する規範値である、項目３０記載の方法。
[項目３３]
移植の結果または状態によって異なる所定閾値が存在する、項目３０記載の方法。
[項目３４]
免疫能の評価に従い該個体を治療することを更に含む、項目３０記載の方法。