(57)【要約】【課題】動物細胞の培養に際して、血清含有培地で培養していた細胞を無血清培地で培養するためには、培地中の血清成分を徐々に下げて無血清の環境に細胞を馴らす必要があり、この期間中は効率的にタンパク質を製造することができなかった。【解決手段】接着性を有する動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）を、血清含有培地で培養基材に接着するまで２４時間以上培養した後、培養基材に接着している当該細胞を、直接、無血清培地で培養する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性を有する動物細胞を、血清含有培地で培養基材に接着するまで培養した後、培養基材に接着している当該細胞を、直接、無血清培地で培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
【請求項２】
動物細胞が、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
動物細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）であり、血清含有培地での培養時間が２４時間以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は動物細胞の培養方法に関する。具体的には、動物細胞の培養に使用している培地を血清含有培地から無血清培地へ直接変える方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組み換え技術の進歩により、動物細胞を用いてタンパク質を製造することが可能となった。このような製造を工業的規模で行うためには、動物細胞を効率よく培養することが必要となる。そのため、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（非特許文献１）やＦ１２培地（非特許文献２）、ＲＰＭＩ１６４０培地（非特許文献３）等、様々な培地が開発された。しかしこれらの培地を用いても、それ単独で動物細胞を培養することはできない。これらの培地に血清成分を添加して使用しなければ、細胞が増殖しない。
【０００３】
細胞培養に使用される血清成分は、主にウシ胎児から調製される。しかし、ウシ胎児の使用にはコストや安全性（ウイルスや狂牛病などの感染リスク）、生命倫理上の課題がある。また血清には、アルブミンや抗体を初めとして様々なタンパク質が含まれている。そのため血清存在下で細胞培養を行うと、目的タンパク質の精製が煩雑なものとなる。特に、血清中のタンパク質と類似した性質（表面電荷や分子量・立体構造など）を有するものを製造する場合、その分離、精製は非常に困難なものとなる。
【０００４】
このような課題を克服するため、近年、血清成分を添加しなくても動物細胞を培養・増殖させられる培地（無血清培地）が開発された（特許文献１、非特許文献４）。そしてその結果、細胞から分泌される目的タンパク質の精製作業が容易になった。また精製産物の安全性も高まり、動物細胞を用いて医薬品を作ることも可能になった。しかしこのような培地が開発されたとはいえ、その使用には困難な点もある。
【０００５】
生体内の細胞は通常、血液が存在する状態で生存している。そして細胞は、この血液を介して栄養の摂取や不要物の排泄を行っている。確かに無血清培地は、細胞が生存する環境を参考にして作られている。しかしこの培地中には、血清に含まれる増殖因子やたんぱく質等は存在しない。塩濃度やｐＨ、浸透圧などが最適化されているとはいえ、その環境は生体から大きくかけ離れている。そのためこのような培地で培養を行うと、細胞にストレスを与えることになる。その結果、目的タンパク質の生産性や増殖速度が著しく低下する場合がある。また最悪の場合、新たな環境に馴染めず死んでしまう細胞もいる。そのため無血清培地で細胞を培養してタンパク質の製造を行うためには、馴化と呼ばれる作業が必要となる。つまり、培地に含まれる血清成分の割合を徐々に下げながら無血清培地へと置き換えていく作業が必要になる。そして、時間をかけて無血清状態へ細胞を馴らしてゆく必要がある。このような作業を行うことで、無血清状態によって引き起こされる細胞のストレスを軽減させることができ、細胞の増殖性や生産性を維持したまま培養できる。しかしこのプロセスは一般的に２週間から４週間と長い時間を要する。そしてこの期間中は目的タンパク質を効率よく製造することができない。そのためこの馴化作業は、時間的な損失を生む原因として製造上の大きな課題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００２／０８６１３３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｒｔｏｎ  Ｈ．Ｊ．Ｊ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ６，８９（１９７０）
【非特許文献２】Ｈａｍ  Ｒ．Ｏ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）
【非特許文献３】Ｇｏｄｉｎｇ  Ｊ．Ｗ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，３９，２８５（１９８０）
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ  Ｔ．Ｈ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３９，３６９（１９８０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述したように、血清含有培地で培養していた細胞を無血清培地で培養するためには、培地中の血清成分を徐々に下げて無血清の環境に細胞を馴らす必要がある。しかしこの作業は一般的に２週間から４週間の期間を要し、この期間中は効率的にタンパク質を製造することができない。そのためこの馴化作業は、時間的な損失を生む原因として製造上の大きな課題となっていた。
【０００９】
そこで本発明の目的は、動物細胞の培養に使用している培地を血清含有培地から無血清培地へ直接変える方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来、血清含有培地で培養していた細胞を無血清培地で培養するためには、細胞を無血清培地へ馴化させる必要があった。しかし本発明者が鋭意検討した結果、接着性を有する細胞が培養基材へ接着した後であれば、血清含有培地から無血清培地へ馴化なしに直接培地交換を行っても、タンパク質の生産性に悪影響を及ぼすことの少ない方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下に示す態様を包含する：
（１）接着性を有する動物細胞を、血清含有培地で培養基材に接着するまで培養した後、培養基材に接着している当該細胞を、直接、無血清培地で培養することを特徴とする、動物細胞の培養方法。
（２）動物細胞が、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ細胞である、（１）に記載の方法。
（３）動物細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）であり、血清含有培地での培養時間が２４時間以上である、（１）又は（２）に記載の方法。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の方法が適応できる細胞の種類は非常に幅広く、培養基材との接着性を有する動物細胞であればよく、特にその種類が限定されるわけではない。例えば、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ細胞、アフリカミドリザルの腎臓に由来する細胞であるＣＯＳ細胞、ヒト胎児の腎臓に由来する細胞であるＨＥＫ細胞等をあげることができ、より具体的には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などにおいて適応可能である。中でもチャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞であるＣＨＯ細胞が好ましく、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）が更に好ましい。
【００１４】
本発明の方法に用いられる培地の種類も、非常に幅広い。本発明の方法に用いられる血清含有培地としては、培地中に血清成分が添加されているものであればよく、特にその種類が限定されるわけではない。培地中に含まれる血清成分の割合は、細胞が増殖できる量であればよく、特にその濃度が限定されるわけではない。一般的には、細胞の増殖性への影響を考慮して、好ましくは１から２５％、更に好ましくは２から２０％、とりわけ５から１５％の血清を含む培地の使用が好ましい。本発明によれば、このような濃度の血清含有培地で培養した細胞を、直接無血清培地で培養することができる。血清含有培地の具体例としては、Ｅ−ＲＤＦ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地またはＲＰＭＩ１６４０培地にそれぞれ血清成分を添加したものがあげられる。一方、本発明の方法に用いられる無血清培地としては、培地中に血清成分が含まれていないものであればよく、特にその種類が限定されるわけではない。無血清培地の具体例としては、例えばＥＸ−ＣＥＬＬ３０２倍地（ＳＡＦＣ社）、ＣＤ  ＣＨＯ−Ａ培地（ＧＩＢＣＯ社）、セリシンＧＩＴ培地（日本製薬社）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ社）があげられる。
【００１５】
本発明の方法によって培養を行うには、まず接着性を有する動物細胞を血清含有培地で培養基材に接着するまで培養を行う。ここで培養基材とは、培養に用いられる器具、装置等であり、例えば培養容器、シャーレ、プレート、ローラーボトル等をあげることができる。
【００１６】
このような培養基材に、動物細胞が接着するまで培養を行えばよく、その培養時間は特に限定されるものではない。細胞の接着と、その後の工程における細胞によるタンパク質の生産性とを考慮すると、この血清含有培地での培養は２４時間以上４８時間以下が好ましい。動物細胞が培養基材に接着する量には特に限定はなく、少なくとも一部が接着すればよく、またすべての細胞が接着するまで培養を行ってもよい。ここで、細胞が培養基材に「接着する」とは、その後の培地交換や、それに先立ち行われる緩衝液による細胞の洗浄等によっても、細胞が培養基材から解離、脱離等することなく接着を維持できる状態をいう。
【００１７】
このようにして培養基材に接着している動物細胞を、直接、無血清培地で培養する。ここでいう「直接」とは、それまで培養していた血清含有培地から無血清培地へ、直接切り替えて培養することを意味するものであり、両者での培養の間に、馴化等、他の培地での培養工程が存在しないものである。なお、血清含有培地から無血清培地への切り替えの際には、適宜、培養基材やそれに接着している動物細胞を緩衝液等で洗浄することが好ましい。
【００１８】
また本発明では、培養基材に「接着している」動物細胞を無血清培地で培養することが必須である。よって、培養基材から解離させることなく、接着したままの状態の動物細胞を無血清培地で培養するものである。
【００１９】
無血清培地での培養は長期に渡って継続でき、特にその期間が限定されるわけではない。ただし培地中の栄養素が不足すると細胞が死滅するので、定期的に栄養素を追加したり、新たな無血清培地へ培地交換したりすればよい。培地交換を行うタイミングは、培地中の栄養素が枯渇する前であればいつでもよく、特にその時期が限定されるものではない。ただし細胞による栄養の消費速度などを考慮すると、４日から７日毎の培地交換を目安とするのが望ましい。またこのような培地交換が行える回数は細胞によって異なるが、長期にわたって繰り返すことが可能である。
【発明の効果】
【００２０】
従来、動物細胞を用いてタンパク質を製造する際には、馴化期間中は効率的にタンパク質を製造することができず、時間的な損失を生む原因として製造上大きな課題となっていた。しかし本発明の方法を用いれば、馴化作業がなくとも効率的に細胞を培養し、タンパク質を製造することができる。したがって、馴化作業に伴う時間的損失の発生を抑え、タンパク質の生産性を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】無血清培地で培養した際の細胞増殖性を比較した図である。
【図２】無血清培地で培養した際の抗体発現量を比較した図である。
【図３】無血清培地へ培地交換する過程での純度の評価図である。
【図４】無血清培地での培養時間と抗体発現量の関係を示す図である。
【図５】血清含有培地での培養時間と無血清培地での細胞増殖性との関係を示す図である。
【図６】血清含有培地での培養時間と無血清培地での抗体発現量との関係を示す図である。
【実施例】
【００２２】
以下、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）を用いた実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
［抗体遺伝子のクローニング］
特開２００９−２４０３００号公報に記載の方法により、抗プロゲステロン  ウサギモノクローナル抗体を取得した。まず、プロゲステロンにリンカーを生やしてウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡとする）と結合させた。そしてこのＢＳＡ−プロゲステロンを抗原としてウサギに免疫した。その後、免疫を行なったウサギから抗体産生細胞を単離した。そしてこの細胞から抗体遺伝子をクローニングした。
【００２４】
［抗体安定発現細胞株の樹立］
取得した抗体遺伝子をＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）にトランスフェクションした。そしてこの細胞を４００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように血清含有培地へ懸濁した。この細胞懸濁液を３８４ウエルプレートに５０μＬ／ウエルずつ分注して３７℃・５％  ＣＯ２条件下で１週間培養した。その後培養上清を回収してＥＬＩＳＡを行い、各ウエル中のＣＨＯ−Ｋ１細胞によって発現した抗体の量を調べた。尚、ＥＬＩＳＡの実施手順は以下の通りである。
【００２５】
まずヤギ抗ウサギＩｇＧを０．５μｇ／ｍＬとなるように炭酸塩緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ  ９．６）へ溶かした。そしてこれを５０μＬ／ウエルずつＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウエル）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、洗浄緩衝液（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、  ｐＨ  ７．４）で各ウエルを３回洗浄した。その後ブロッキング緩衝液（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１％  スキムミルク、ｐＨ７．５）を１００μＬ／ウエルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウエルを１回洗浄した。このプレートにインキュベーション緩衝液（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  スキムミルク、ｐＨ７．５）を４８μＬ／ウエルずつ加え、その後、培養上清を２μＬ／ウエルずつ加えた。次にこのプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウエルを３回洗浄した。そしてこのプレートにヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼを含むインキュベーション緩衝液を５０μＬ／ウエルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウエルを３回洗浄した。最後にこのプレートへ５０μＬ／ウエルずつアルカリホスファターゼ緩衝液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）を加えて３０分静置し、蛍光強度を測定して（励起波長  ３６０ｎｍ／測定波長  ４６５ｎｍ）抗体の発現量を調べた。尚、本願実施例及び比較例で行った３８４ウエルプレートでのＥＬＩＳＡは、全てこれと同じ条件で行った。
【００２６】
ＥＬＩＳＡで強いシグナルを発したウエルを選び、その中の細胞を継代して１週間培養した。その後この培養上清を回収してＥＬＩＳＡを行い、抗体の発現が一過性でないことを確認した。尚このＥＬＩＳＡの手順は先程と全く同じだが、９６ウエルプレートを用いて実施した。そのため、各ウエルに分注する緩衝液量を２倍に増やして実験を行った。また培養上清を添加するステップでは、各ウエルに７０μＬずつインキュベーション緩衝液加えた後、培養上清を３０μＬずつ加えた。尚、本願実施例及び比較例で行った９６ウエルプレートでのＥＬＩＳＡは、全てこれと同じ条件で行った。
【００２７】
次に、抗体を安定的に発現する細胞の単クローン化に取り組んだ。実験手法は以下の通りである。まず、先程のＥＬＩＳＡで安定的に抗体を発現していることが確認できた細胞群を４０ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように血清含有培地へ懸濁した。次にこの懸濁液を次々と２倍ずつ希釈してゆき、希釈系列を作製した。そしてこれをそれぞれ５０μＬ／ウエルずつ３８４ウエルプレートに分注して３７℃・５％  ＣＯ２条件下で１０日間培養した。その後３８４ウエルプレートでＥＬＩＳＡを行い、抗体の発現量が高いウエルを調べた。そしてこのウエルを顕微鏡で観察し、ウエル中にある細胞のコロニー数を調べた。観察したウエルの中でコロニー数が１つだけのものを選び、抗体安定発現細胞株として凍結保存した。
【００２８】
尚、本願実施例及び比較例で使用している血清含有培地は、特に断りがない限り、ＥＲＤＦ培地（極東製薬社製）に１０％のウシ血清（ＦＣＳ）を添加したものである。
【００２９】
［無血清培地への培地交換］
抗体安定発現細胞の培地を、２つの段階を経て無血清培地へ切り替えた。以下、その方法について詳細を述べる。まず始めに３７℃・５％  ＣＯ２の条件下で、血清含有培地を用いて細胞を７日間培養した。次に培養容器から培地を除去し、ＰＢＳで培養基材及び接着している細胞を洗った。そして次にここにトリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を培養基材から解離させた。解離した細胞を再び血清含有培地へ懸濁し、１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈して継代した。この細胞を３７℃・５％  ＣＯ２条件下で一晩培養し、細胞が培養基材に接着していることを確認した。この細胞が接着している培養容器から培地を再び除去した。そしてＰＢＳで培養基材及び接着している細胞を洗った後に無血清培地を加え、３７℃・５％  ＣＯ２条件下で培養した。
【００３０】
無血清培地は、各メーカーから販売されている６種類を用いてそれぞれ実験を行った（それぞれＳＦＭ１からＳＦＭ６とする。
ＳＦＭ１：ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＡＣＦ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＡＦＣ社）
ＳＦＭ２：ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯ−２  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＡＦＣ社）
ＳＦＭ３：ＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＨＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＡＦＣ社）
ＳＦＭ４：ＳＦＭ４  ＣＨＯ−Ｕｔｉｌｉｔｙ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）
ＳＦＭ５：ＣＤ−ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ社）
ＳＦＭ６：ＳＦＭ４  ＣＨＯ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）
尚ここではコントロールとして、無血清培地の代わりに血清含有培地を加えたものも用意した。培地交換を行ってから６日後、培養上清を回収した。そして培養容器及び接着している細胞をＰＢＳで洗った後にトリプシン−ＥＤＴＡを加え、培養基材に接着している細胞を解離させた。
【００３１】
［細胞増殖性の比較］
上述の方法で解離させた細胞の数を調べてその増殖性を比較した。その結果、いずれの無血清培地においても、細胞の増殖性を確認することができた（図１）。特にＳＦＭ１，２，５，６では、血清含有培地を使用した時（コントロール）と同等に近いレベルの増殖性を示した（図１）。
【００３２】
［抗体発現量の比較］
回収した培養上清中にある抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べて比較した。その結果、いずれの無血清培地においても、後述の比較例１と比べて抗体の発現量に優れることが明らかとなった（図２）。特にＳＦＭ２，５，６では、血清含有培地を使用した時（コントロール）と同等に近いレベルの量の抗体を発現した（図２）。尚ここでは、血清含有培地の培養上清から得られるＥＬＩＳＡシグナルを１００％として示した。そして、各サンプルのＥＬＩＳＡシグナルを相対的な値として示した。
【００３３】
比較例１
培養基材に接着した細胞を解離させてから無血清培地で培養した。以下、その方法について詳細を述べる。まず始めに３７℃・５％  ＣＯ２の条件下で、血清含有培地を用いて前述の抗体安定発現細胞を７日間培養した。次に培養容器から培地を除去し、ＰＢＳで培養基材及び接着している細胞を洗った。そしてここにトリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を培養基材から解離させた。解離した細胞をＰＢＳで洗った後に無血清培地へ懸濁し、１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈して継代した。そしてこの細胞を３７℃・５％  ＣＯ２条件下で７日間培養した。尚ここではコントロールとして、無血清培地の代わりに血清含有培地へ懸濁したものも用意した。細胞を継代してから７日後、培養上清を回収した。そして培養容器中にある細胞を回収した。
【００３４】
尚、無血清培地は、実施例１と同じ６種類（ＳＦＭ１からＳＦＭ６）を用いてそれぞれ実験を行った。
【００３５】
［細胞増殖性の比較］
上述のようにして得られた解離させた細胞の数を実施例１と同様にして調べて、その増殖性を比較した。その結果、細胞の増殖性が極端に低下する場合が多いことが明らかになった（図１）。
【００３６】
［抗体発現量の比較］
回収した培養上清中にある抗体の発現量をＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）で調べて比較した。その結果、抗体の発現量が極端に低下することが明らかになった（図２）。
【００３７】
実施例２
血清含有培地に添加したウシＩｇＧが、無血清培地中へどの程度混入するか調べた。詳細は以下の通りである。まず、ウシ血清からアフィニテイーカラムでウシＩｇＧを精製し、精製されていることを電気泳動で確認した。そしてこの精製したウシＩｇＧ溶液を５０ｍＭ  ホウ酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．５）で透析し、１ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮した。次に、８．６ｍｇ／５０μＬとなるようにフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣとする）−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドをＤＭＳＯ中へ溶解した。そしてこのＤＭＳＯ溶液を１０μＬとり、先程のウシＩｇＧ溶液５００μＬに添加した。この溶液を室温で３０分間放置した後にＰＢＳで透析し、ＦＩＴＣで標識したウシＩｇＧ（以下、ＦＩＴＣ−ウシＩｇＧとする）を調製した。
【００３８】
次に３７℃・５％  ＣＯ２条件下で、血清含有培地を用いて前述の抗体安定発現細胞を７日間培養した。そして培養容器から培地を除去し、ＰＢＳで培養容器及び接着している細胞を洗った。ここにトリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を培養基材から解離させた。解離した細胞を再び血清含有培地へ懸濁し、１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈して継代した。この時、先程調整したＦＩＴＣ−ウシＩｇＧを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように培地へ添加した。この細胞を３７℃・５％  ＣＯ２条件下で一晩培養し、細胞が培養基材に接着していることを確認し、培養容器中の培地を回収した（サンプル（１）とする）。ここにＰＢＳを加えて培養容器及び接着している細胞を洗い、その洗浄液を回収した（サンプル（２）とする）。そして無血清培地を加えて３７℃・５％  ＣＯ２条件下で６日間培養した後、培地を回収した（サンプル（３）とする）。尚ここでは、無血清培地としてＳＦＭ２を使用した。
【００３９】
以上の実験で回収した３つのサンプル（サンプル（１）〜（３））について、それぞれ希釈系列を作製した。そしてそれぞれ蛍光強度を測定し（励起波長  ４９４ｎｍ／測定波長  ５２１ｎｍ）、各サンプル中に含まれるＦＩＴＣ−ウシＩｇＧの量を調べた。その結果、ＦＩＴＣ−ウシＩｇＧは、ＰＢＳによる洗浄で除去されており、無血清培地（サンプル（３））中にはほぼ存在しない（１μｇ／ｍＬ以下）ことが確認できた（図３）。
【００４０】
実施例３  抗体発現量の安定性評価
無血清培地へ培地交換を行った後も、細胞による抗体の発現が継続的に安定しているか確認した。詳細は以下の通りである。まず始めに３７℃・５％  ＣＯ２の条件下で、血清含有培地を用いて細胞を７日間培養した。次に培養容器から培地を除去し、ＰＢＳで培養基材及び接着している細胞を洗った。そしてここにトリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を培養基材から解離させた。解離した細胞を再び血清含有培地へ懸濁し、１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈して継代した。この細胞を３７℃・５％  ＣＯ２条件下で一晩培養し、細胞が培養基材に接着していることを確認した。この細胞が接着している培養容器から培地を除去した。そしてＰＢＳで培養基材及び接着している細胞を洗った後に無血清培地を加え、３７℃・５％  ＣＯ２条件下で６日間培養した。その後培養上清を回収し、新たに無血清培地を加えて４日間培養した。そして再び培養上清を回収し、新たに無血清培地を加えて５日間培養した。その後再び培養上清を回収し、新たに無血清培地を加えた。そして５日間培養した後に培養上清を回収した。それぞれ回収した培養上清を用いてＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）を行い、そこに含まれる抗体の量を調べた。その結果、無血清培地へ培地交換した後でも、細胞による抗体の発現は３週間に渡って安定していることが確認できた（図４）。尚ここでは、培養を開始してから７日後に回収した培養上清が発するＥＬＩＳＡのシグナルを１００％とした。そして、各サンプルのＥＬＩＳＡシグナルを相対的な値として示した。なおここでは、無血清培地のうちＳＦＭ２を使用した。
【００４１】
実施例４  血清含有培地での培養時間の最適化
血清含有培地での培養時間の最適化を検討した。詳細は以下の通りである。まず始めに３７℃・５％  ＣＯ２の条件下で、血清含有培地を用いて細胞を７日間培養した。次に培養容器から培地を除去し、ＰＢＳで培養基材及び接着している細胞を洗った。そしてここにトリプシン−ＥＤＴＡを加えて細胞を培養基材から解離させた。解離した細胞を再び血清含有培地へ懸濁し、１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈して継代した。この細胞を３７℃・５％  ＣＯ２条件下でそれぞれ２時間、４時間、６時間、２４時間培養した後に培養容器から培地を除去した。いずれの時間においても、細胞は少なくとも一部は培養容器に接着していたが、接着量は培養時間が増加するにつれて増えていることが肉眼でも明らかであった。そしてＰＢＳでこの培養基材及び接着している細胞を洗った後に無血清培地を加え、３７℃・５％  ＣＯ２条件下で培養した。尚ここではコントロールとして、血清含有培地で同様の条件下、一晩培養し、細胞が培養基材に接着していることを確認した後、無血清培地の代わりに血清含有培地を加えたものも行った（ポジティブコントロール）。また上述のように血清含有培地で培養した後に培養基材から解離させた細胞を、無血清培地へ懸濁して継代した細胞も用意した（ネガティブコントロール）。細胞を継代してから７日後、それぞれ培養上清を回収した。そして培養容器及び接着している細胞ををＰＢＳで洗った後にトリプシン−ＥＤＴＡを加え、培養基材に接着している細胞を解離させてその数を調べた。また回収した培養上清を用いてＥＬＩＳＡ（９６ウエルプレート）を行い、そこに含まれる抗体の量を調べた。
【００４２】
その結果、上述のように解離させた細胞を再び血清含有培地で継代し２時間から６時間後に無血清培地へ培地交換した細胞は、ネガティブコントロール（図５，６の０ｈ）と比較して、増殖性や抗体発現量は大きく向上した。一方、上述のように解離させた細胞を再び血清含有培地で継代し２４時間後に無血清培地へ培地交換した細胞は、ポジティブコントロールと同等の増殖性や抗体発現量を示していた（図５、図６）。以上の結果から、無血清培地へ培地交換する際は、上述のように解離させた細胞を再び血清含有培地で継代してから２４時間程度経過した後に培地交換を行うのが望ましいと考えられる。尚、図６では、血清含有培地の培養上清（ポジティブコントロール）から得られるＥＬＩＳＡのシグナルを１００％とした。そして、各サンプルのＥＬＩＳＡシグナルを相対的な値として示した。なおここでは、無血清培地としてＳＦＭ２を使用した。
【００４３】
以上の通り、動物細胞を血清含有培地で培養し、細胞が培養基材へ接着した後であれば、その培養基材に接着している細胞に対して、血清含有培地から無血清培地へ直接培地交換を行って培養しても、タンパク質の生産性に悪影響を及ぼすことが少ないことが明らかになった。本発明の方法を用いることにより、動物細胞を血清含有培地で培養した後に、馴化の工程を行うことなく無血清培地で培養することができ、タンパク質を製造する際に、その生産性を向上することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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