(57)【要約】      （修正有）【課題】DVT（4,8,13-ズバトリエン-1,3-ジオール）のレベルが低減されたタバコ品種、このような品種を作製する方法、およびこのような品種を含むタバコ組成物を提供する。【解決手段】乾燥タバコは、緑葉組織1cm2当たり20μg未満のDVTを有する緑タバコから調製する。緑葉組織1cm2当たり20μg未満のDVTを有する第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程、少なくとも1世代について、該後代植物に自家受粉させる工程、および少なくとも1世代において、KY14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する。【選択図】図３
2014087342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
KY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減された乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物。
【請求項２】
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する緑タバコ（green tobacco）から調製された乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物。
【請求項３】
品種が、DVTのレベルが低減されたものについて選択され、
該品種の植物が、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、
該品種からの乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物。
【請求項４】
乾燥タバコが、KY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べて、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示す、請求項1、2または3のいずれか一項記載の無煙タバコ組成物。
【請求項５】
乾燥タバコにおいて、ソラノン、ソラベチボン、センブレンまたはツンベルゴールのレベルがさらに低減されている、請求項1記載のタバコ組成物。
【請求項６】
緑タバコにおいて、ソラノン、ソラベチボン、センブレンまたはツンベルゴールのレベルがさらに低減されている、請求項2記載のタバコ組成物。
【請求項７】
乾燥タバコにおいて、官能パネル評価により判定される苦味が有意に低減されている、請求項1、2または3のいずれか一項記載のタバコ組成物。
【請求項８】
乾燥タバコが、暗色火力乾燥タバコ（dark fire-cured tobacco）、暗色空気乾燥タバコ（dark air-cured tobacco）、TI 1406以外のバーレー種の空気乾燥タバコ（Burley air-cured tobacco）、熱風乾燥タバコ（flue-cured tobacco）、または日干乾燥タバコ（sun-cured tobacco）である、請求項1、2または3のいずれか一項記載のタバコ組成物。
【請求項９】
乾燥タバコが、以下からなる群より選択される品種からのタバコである、請求項1、2または3のいずれか一項記載のタバコ組成物：
KY 14と名付けられた品種およびその後代の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減される、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、TI 1406、TI 1269、GR139NS、KDH959およびそれらの後代。
【請求項１０】
湿性無煙タバコ、乾式無煙タバコ、噛みタバコ、無煙紙巻きタバコ、可食フィルム、押し出し製品、錠剤、またはタバコ被覆つま楊枝である、請求項1、2または3のいずれか一項記載のタバコ組成物。
【請求項１１】
以下の工程を含む、植物品種を作製する方法：
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程；
少なくとも1世代について、該後代植物を自家受粉させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
【請求項１２】
以下の工程を含む、植物品種を作製する方法：
タバコ植物組織に突然変異を誘発させる工程；
少なくとも1世代について、該突然変異誘発植物組織から誘導される植物を、自家受粉により繁殖させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
【請求項１３】
以下の工程を含む、植物品種を作製する方法：
KY 14と名付けられた品種のタバコと比べて、植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減された第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程；
少なくとも1世代について、該後代植物を自家受粉させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
【請求項１４】
請求項11、12または13のいずれか一項記載の方法により作製される、タバコ植物。
【請求項１５】
請求項11、12または13のいずれか一項記載の方法により作製される、植物品種。
【請求項１６】
前記品種の植物が、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、請求項15記載の植物品種。
【請求項１７】
DVTのレベルが低減されたタバコであるが、表1に示される品種から生産されるものではない、乾燥N.タバカム（N. tabacum）タバコ。
【請求項１８】
緑葉組織中のDVTのレベルが低減されたものについて選択されたタバコ品種の植物から生産される、乾燥タバコ。
【請求項１９】
官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択されたタバコ品種の植物から生産される、乾燥タバコ。
【請求項２０】
以下の工程を含む、苦味が低減されたタバコを調製する方法：
生のタバコ（fresh tobacco）を乾燥させる工程；
乾燥させたタバコを熟成させる工程；および
生のタバコ、乾燥させたタバコ、または熟成させかつ乾燥させたタバコを、食品等級の溶媒で洗浄する工程。
【請求項２１】
食品等級の溶媒が、エタノールである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
洗浄したタバコが、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示す、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
生のタバコが、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示さない、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
官能パネル評価において苦味が有意に低減された、請求項20記載の方法により生産される乾燥タバコ。
【請求項２５】
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する生のタバコから作製される、請求項24記載の乾燥タバコ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2007年2月23日に出願された米国特許出願第60/891,435号、および2007年11月30日に出願された米国特許出願第60/991,579号の優先権を主張するものであり、これらは両方とも、それらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示は、タバコ植物および無煙タバコ組成物に関し、より特には、4,8,13-ズバトリエン-1,3-ジオール（DVT）の低減されたレベルを示すタバコ植物、ならびにこのような植物を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
無煙タバコ製品は、該製品を燃焼に付すことなく、経口で摂取される。これらの製品は、噛みタバコ、乾式嗅ぎタバコおよび湿式嗅ぎタバコを含む種々の形態で製造される。概して、これらの種類の製品は、以下の通りの工程を任意の順序で用いて作製される：
タバコを適した大きさに細断または粉砕する工程；
ケーシング溶液（casing solution）を用いてタバコを浸漬するかまたはタバコに噴霧する工程；
ケーシングしたタバコ（cased tobacco）を部分的に乾燥させる工程；
一定期間、容器中にタバコを保管する工程；および
タバコを包装する工程。
例えば、米国特許第4,528,993号（特許文献1）、同第4,660,577号（特許文献2）、および同第4,987,907号（特許文献3）を参照されたい。
【０００４】
中には、一部の消費者には好まれない感覚刺激性を有する無煙タバコ製品もある。異なる味覚特性をもつ、種々の製品を提供するために、噛みタバコおよび嗅ぎタバコを、種々の香味剤および他の香味増強物質で処理することが多い。しかしながら、香味料の添加は、ある特定の消費者には好まれない可能性がある。無煙タバコ製品を生産する場合、香味料を包含させるには、ほとんどの場合、さらなる加工工程を必要とする（例えば、米国特許出願公開第2005/0115580号（特許文献4）を参照されたい）。従って、代替の香味料プロファイルを与えることにより経口の満足を提供することができるタバコに関する、必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第4,528,993号
【特許文献２】米国特許第4,660,577号
【特許文献３】米国特許第4,987,907号
【特許文献４】米国特許出願公開第2005/0115580号
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、4,8,13-センブラトリエン-1,3-ジオールとも称される4,8,13-ズバトリエン-1,3-ジオール（DVT）のレベルが低減された、タバコの品種を記載する。本開示は、このような品種を作製する方法、およびこのような品種を使用する方法も記載する。DVTの低減されたレベルを示す品種は、一部の消費者に好まれる可能性のある香味料プロファイルを示す。
【０００７】
一局面において、KY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減された乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物が提供される。別の局面において、乾燥タバコを含む無煙タバコ組成物が提供され、該乾燥タバコは、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する緑タバコ（green tobacco）から調製される。別の局面において、品種がDVTのレベルが低減されたものについて選択され、該品種の植物が緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、該品種からの乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物が、提供される。一態様において、乾燥タバコは、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、KY 14と名付けられた品種およびその後代の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減された、TI 1406、TI 1269、GR139NS、KDH959、ならびにそれらの後代からなる群より選択される品種からのタバコである。
【０００８】
一態様において、乾燥タバコは、KY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べて、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示す。一般に、乾燥タバコまたは緑タバコでは、ソラノン、ソラベチボン、センブレン、またはツンベルゴールのレベルも低減されている。特定の態様において、乾燥タバコは、暗色火力乾燥タバコ（dark fire-cured tobacco）、暗色空気乾燥タバコ（dark air-cured tobacco）、TI 1406と名付けられた品種からのタバコ以外のバーレー種の空気乾燥タバコ（Burley air-cured tobacco）、熱風乾燥タバコ（flue-cured tobacco）、または日干乾燥タバコ（sun-cured tobacco）である。代表的な組成物としては、例えば、湿性無煙タバコ、乾式無煙タバコ、噛みタバコ、無煙紙巻きタバコ、可食フィルム、押し出し製品、錠剤、またはタバコ被覆つま楊枝が挙げられる。
【０００９】
一局面において、植物品種を作製する方法が提供される。このような方法には、以下の工程が含まれる：
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程；
少なくとも1世代について、該後代植物に自家受粉させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
【００１０】
別の局面において、植物品種を作製する方法が提供される。このような方法には、以下の工程が含まれる：
タバコ植物組織に突然変異を誘発させる工程；
少なくとも1世代について、該突然変異誘発植物組織から誘導される植物を、自家受粉により繁殖させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
【００１１】
さらに別の局面において、植物品種を作製する方法が提供される。このような方法には、以下の工程が含まれる：
KY 14と名付けられた品種のタバコと比べて、植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減された第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程；
少なくとも1世代について、該後代植物に自家受粉させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
【００１２】
本明細書で開示される方法により作製される、タバコ植物または品種も提供される。このような植物または品種は、通常、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する。
【００１３】
一局面において、DVTのレベルが低減されたタバコであるが、表1に示される品種から生産されるものではない、乾燥N.タバカム（N. tabacum）タバコが提供される。別の局面において、緑葉組織中のDVTのレベルが低減されたものについて選択したタバコ品種の植物から生産される、乾燥タバコが提供される。さらに別の局面において、官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択したタバコ品種の植物から生産される、乾燥タバコが提供される。
【００１４】
一局面において、苦味が低減されたタバコを調製する方法が提供される。このような方法には、以下の工程が含まれる：
生のタバコ（fresh tobacco）を乾燥させる工程；
乾燥させたタバコを熟成させる工程；および
生のタバコ、乾燥させたタバコ、または熟成させかつ乾燥させたタバコを、食品等級の溶媒で洗浄する工程。
代表的な食品等級の溶媒は、エタノールである。特定の態様において、洗浄したタバコは、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示し、かつ特定の態様において、生のタバコは、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示していない。官能パネル評価において苦味が有意に低減され、このような方法により作製される、乾燥タバコが提供される。このような乾燥タバコは、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する生のタバコから作製される。
【００１５】
別途定義されない限り、本明細書で用いられる、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で記載されるものと類似または等価である方法および材料を、本発明の実施において用いることができるが、適した方法および材料を下記に記載する。さらに、材料、方法および例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。本明細書で述べる、全ての刊行物、特許出願、特許および他の文献は、参照によりそれらの全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が掌握する。
【００１６】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細を、添付の図面および下記の説明において説明する。本発明の、他の特徴、目的および利点は、図面および詳細な説明から、ならびに特許請求の範囲から明らかであるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】複数のタバコ品種に由来する葉表面の化合物の薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートの画像である。緑タバコに由来する葉表面の化合物を示す。タバコ品種は、プレートの下部に表示されており、矢印は、DVTに該当する帯を示す。
【図１Ｂ】複数のタバコ品種に由来する葉表面の化合物の薄層クロマトグラフィー（TLC）プレートの画像である。乾燥葉に由来する葉表面の化合物を示す。タバコ品種は、プレートの下部に表示されており、矢印は、DVTに該当する帯を示す。
【図２】TI 1406、KDH960および暗色火力乾燥品種の乾燥葉の組織における、DVTのGC/MS-SPME分析の部分クロマトグラムある。
【図３】DVTのα異性体（パネルA）およびDVTのβ異性体（パネルB）を示す。
【図４】α-DVTおよびβ-DVTのブチルボロン酸誘導体の検量線を示す。
【図５】実施例のパートBで説明される、味覚パネル結果のグラフを示し、ここで、1は低い苦さの強度であり、かつ9は高い苦さの強度である。
【図６】表示したタバコ品種における、平均のα-およびβ-DVT濃度（μg/cm2）のグラフを示す。
【図７】苦味とDVTレベルの間の相関関係を示すグラフである。種々の図面中の同様の参照記号は、同様の要素を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本開示は、例えば、KY 14と名付けられた品種からのタバコと比較した場合に、4,8,13-ズバトリエン-1,3-ジオール（DVT）のレベルが低減されたタバコを記載する。従って、本開示は、DVTのレベルが低減されたタバコ品種、このような品種を作製する方法、およびこのような品種を含むタバコ組成物を記載する。DVTは苦味の感覚刺激特性に関連することが、発明者により見出されたことから、DVTのレベルが低減されたタバコから作製される無煙タバコ組成物は、特有の感覚刺激プロファイルを有することが、発見された。
【００１９】
DVTは、5つの主要な種類のタバコ、すなわち暗色種、バージニア種、バーレー種、オリエンタル種およびシガー種のタバコの葉表面の毛状突起浸出物中にみられる単環式ジテルペノイドの類である、センブラノイドである。センブラノイドおよびそれらの誘導体は、葉表面上の毛状突起の腺頭部で産生され、かつ、糖エステル、ワックス炭化水素、エステルおよびアルコールと共に見つけることができる表面のクチクラワックスの一部である。70より多い様々なセンブラノイドが、センブラノイドに関連する60より多い様々な化合物（例えば、センブラノイドの、生分解、酸化的過程および逆アルドール反応により産生される化合物）と共に、タバコから同定されている。DVTに加えて、他のセンブラノイドまたはセンブラノイドに関連する化合物としては、ソラベチボン、センブレン、ツンベルゴール、ソラノール（solanol）、ノルソラナジオン、およびソラナスコンが挙げられるが、これらに限定されない。センブラノイドおよび関連化合物の総説に関しては、例えば、WahlbergとEklund（1992, Fortschritter der Chemi Organischer Natursfotte, Herzら編, 59: 141-294, Springer Verlag, NY中の「Cembranoids, Pseudopteranoids, and Cubitanoids of Natural Occurrence」）、およびLeffingwell（1999, Tobacco, Production, Chemistry and Technology, DavisとNielsen編, Ch 8, Blackwell Publishing, Oxford中の「Leaf Chemistry」）を参照されたい。
【００２０】
DVTのレベルが低減された、タバコおよびタバコ品種は、NielsenとSeverson（1990, J. Agric. Food Chem., 38: 467-471）で記載される方法により測定される、通常、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVT（例えば、19、18、16、15、14、12、10、8、6、5、4、3、2または1未満のμg DVT/cm2）を示す。DVTのレベルが低減されたことが報告される、ニコチアナ（Nicotiana）の例示的な種としては、N.アクミナタ（N. accuminata）、N.アフリカナ（N. africana）、N.アラタ（N. alata）、N.デブネイ（N. debneyi）、N.グラウカ（N. glauca）、N.ナイチアナ（N. knightiana）、N.ラングスドルフィ（N. langsdorfii）、N.ロンギフロラ（N. longiflora）、N.パニクラタ（N. paniculata）、N.メガロシフォン（N. megalosiphon）、N.プランバギニホリア（N. plumbaginifolia）、N.レパンダ（N. repanda）、N.ラスティカ（N. rustica）、およびN.サンデラエ（N. sanderae）が挙げられ、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する（すなわち、DVTのレベルが低減された）代表的なタバコ品種としては、TI 1406、GR139NS、TI 1269、およびKDH959が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で開示される方法における使用に適した、他のタバコ品種は、例えば、USDAニコチアナ遺伝資源コレクション（USDA Nicotiana Germplasm Collection）（ワールドワイドウェブ上のars-grin.gov/npgsで、オンラインで利用可能である）に見出すことができる。表1は、DVTのレベルが低減されたUSDAニコチアナ遺伝資源コレクションからのN.タバカムの代表的な品種を示す。
【００２１】
（表１）低DVT品種
2014087342.tif 000003
【００２２】
DVTの量における減少が、対照植物におけるDVTの量と比較すると統計学的に有意である場合、DVTの量は、植物中で低減されていると考えられる。DVTにおける「統計学的に有意である」減少とは、適当な母数または非母数の統計解析、例えば、カイ2乗検定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー（Mann-Whitney）検定またはF検定を用いた0.10未満のp値のことをいい、例えば、0.05未満のp値、0.025未満のp値、または0.01未満のp値のことをいう。適した対照植物は、ニコチアナ・タバカム品種であるKY14（PI 552477）である。他の適した対照タバコ植物としては、KY 14、KY171に相当するタバコ植物、または約20μgDVT/cm2緑葉組織を超え約100μgDVT/cm2緑葉組織までのDVTレベルを有するタバコ植物が挙げられる。このような対照植物は、公的に入手可能であり、かつ、例えば、USDAニコチアナ遺伝資源コレクションまたは国立種子貯蔵研究所（National Seed Storage Laboratory）（フォート・コリンズ、コロラド州）から入手することができる。
【００２３】
当技術分野における常用の方法を用いて、DVTを、取得、同定かつ／または測定することができる。DVTを、長さ約15〜25 cmである葉から分析する。一般に、植物が開花し始めるときに（例えば、最初の花が開くときか、または1つまたはそれ以上の蕾が開いたときに）、長さ約20 cmの葉を選択して収穫する。葉を、例えばアセトニトリル、塩化メチレン、アセトンまたはクロロホルム等の溶媒で洗浄することにより、DVTを葉の表面から取り出すことできる。次いで、単環式ジテルペノイドのトリメチルシリル誘導体を、例えば、GCまたはGC/MSを用いて、分離、同定かつ定量化することができる。Arrendaleら（1990, J. Agric. Food. Chem., 38: 75-85）およびSeversonら（1985, J. Agric. Food Chem., 33: 870-75）を参照されたい。一般に、アセトニトリルは、優先的にジテルペンおよび糖エステルを取り出し、一方、他のより少ない極性の溶媒は、ジテルペンおよび糖エステルに加えて、炭化水素を取り出す。あるいは、DVTを誘導化せずに分離することは、HPLCを用いて実行することができる（例えば、GuoとWagner（1995, Planta, 197: 627-32）；Guoら（1994, Arch. Biochem. Biophys., 308: 103-8）を参照されたい）。GC、GC/MS、およびHPLCに加えて薄層クロマトグラフィー（TLC）法も、他のセンブラノイドからDVTを分離または部分的に分離するために用いることができる。代表的なTLC条件は、実施例において、本明細書で開示される。
【００２４】
DVTのレベルが低減されたタバコ品種、およびこのような低DVTタバコを含有するタバコ組成物は、DVTのレベルが低減されていないタバコまたはタバコ組成物と比較した場合、官能パネル評価において改善された香味料特性を示す。このようなタバコを含有するタバコまたはタバコ組成物の香味料特性は、当技術分野で公知の技術を用いた官能パネルにより評価することができる。例えば、Grub（1998, Flavourings, ZieglerとZiegler編, pp. 513-524, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany中）；Tamuraら（1989, Agric. Biol. Chem., 53,1625-1633）；およびDunkelら（2007, J. Agric. Food Chem., 55: 6712-9）に従ってタバコの香味料特性を評価するために、パネリストを訓練して、用いることができる。さらに、ノースカロライナ州立大学の感覚サービスセンター（Sensory Service Center）、シラキュース大学にある官能検査研究所（The Institute for Sensory Research）、オハイオ州立大学の感覚科学グループ（Sensory Science Group）、オレゴン州立大学にある感覚研究所（Sensory Laboratory）およびフィラデルフィアにあるモネル化学感覚センター（Monell Chemical Senses Center）は、官能試験施設を有し、種々の官能評価サービスを提供する。
【００２５】
本開示は、DVTのレベルが低減されたタバコおよびタバコ品種、ならびにこのような植物の作製の方法を記載する。「タバコ」とは、ニコチアナ属の任意の一員（member）の任意の部分、例えば、葉、花、根および茎を意味する。タバコの例示的な種としては、N.ラスティカ、N.タバカム、N.トメントシフォルミス（N. tomentosiformis）、N.シルベトリス（N. sylvestris）およびN.グラウカが挙げられる。本明細書で用いられる「品種」とは、少なくとも1つの特色に関して、個体間での遺伝的変動をほとんど呈さないか、または遺伝的変異を呈さない、植物の群である。本明細書で記載される方法において用いることができるタバコ品種は、火力乾燥および暗色空気乾燥の分類からの品種であり得るが、熱風乾燥または明色空気乾燥（light air-cured）の分類からの品種も用いることができる。「純系」品種は、数世代の自家受粉および選択、あるいは組織または細胞の培養技術を用いた単一の親（parent）からの栄養繁殖により作り出され得る。品種は、別の系列または品種から本質的に誘導することができる。植物の新品種の保護に関する国際条約（International Convention for the Protection of New Varieties of Plants）（1961年12月2日；1972年11月10日、1978年10月23日および1991年3月19日にジュネーブで改訂された）により定義されるように、以下の場合、品種は、最初の品種から「本質的に誘導される」：
a）遺伝子型、または最初の品種の遺伝子型の組み合わせに由来する本質的な特徴の発現を保持しながら、最初の品種から、または最初の品種から主として誘導される品種から、主として誘導される場合；
b）最初の品種と明らかに区別できる場合；および
c）誘導の作用に起因する差異以外は、遺伝子型、または最初の品種の遺伝子型の組み合わせに由来する本質的な特徴の発現が、最初の品種と一致する場合。
品種は、例えば、自然突然変異体または誘発された突然変異体、最初の品種の植物、自家受粉および／または戻し交配の植物、形質転換の植物、あるいは植物栄養繁殖の植物からの変異個体を選択することにより得ることができる。
【００２６】
一態様において、DVTのレベルが低減された、タバコの種またはタバコ品種は、DVTのレベルが低減された品種を、第二の品種の植物（例えば、既存のタバコ品種）と交配することにより生み出すことができる。第二の品種は、例えば、高収量、耐病性、乾燥耐性、糖含量、葉の大きさ、葉幅、葉身長、葉の品質、葉色、葉の発赤、葉の収量、節間長、開花時期、耐倒伏性、茎の太さ、高級指標（high grade index）、乾燥可能性（curability）、乾燥品質、機械での収穫可能性、能力の保持、高さ、成熟、茎の大きさ、および1植物当たりの葉の数を含むが、これらに限定されない望ましい作物の特色を示す、例えば、農学的に優良な品種であることができる。植物を交配する方法は、当技術分野で周知であり、1品種からの雌性柱頭を、第二の品種からの花粉で人工受粉することを含むが、これに限定されない。
【００２７】
このような交配に由来するF1後代植物を、戻し交配または自家受粉することができる。例えば、F1後代を、少なくとも1世代（例えば、1世代、2世代、3世代、4世代、5世代または6世代）の間、自家受粉させることができ、かつ／またはF1後代植物を、親（例えば、BC1、BC2、BC3およびその次の世代の植物）の1つに戻し交配することができる。後代とは、特定の植物または植物品種間での交配からの子孫のことをいい、例えば、特定の植物で発育した種子のことをいう。後代には、F2、F3およびその次の世代の植物で形成される種子も含まれる。他の育種技術も、DVTのレベルが低減されたタバコ品種を作製するために用いることができる。このような方法としては、単粒系統法（single seed descent）、二ゲノム性半数体（dihaploid）の産生、系統育種、および導入遺伝子を用いた組換え技術が挙げられるが、これらに限定されない。任意のこのような交配に由来する後代植物を、DVYのレベルに関してスクリーニングすることができる。例えば、Johnsonら, 1988, Crop Sci., 28: 241を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【００２８】
あるいは、既存のタバコ品種（例えば、DVTのレベルが低減されていないタバコ品種）に、当技術分野で公知の方法を用いて、突然変異を誘発させることができる。イオン化放射、紫外線放射、または化学的突然変異誘発因子を含む種々の突然変異誘発因子により、宿主ゲノムに組み込んだ特定のウイルスの感染により、あるいはインビトロで予め突然変異を誘発させた核酸の導入により、生体または培養細胞に突然変異を誘発することができる。突然変異を誘発させた植物または植物細胞から再生させた植物を自家受粉させ、次いで、DVTのレベルが低減されたこれらの植物に関して、後代をスクリーニングすることができる。
【００２９】
雑種タバコ品種は、最初の品種の雌親植物（すなわち、種子親）の自家受粉を防止する工程、第二の品種の雄親植物からの花粉を雌親植物に受精できるようにする工程、およびF1雑種種子を雌性植物に形成させる工程により、作製することができる。雌性植物の自家受粉は、花の発育の初期段階で、花を除雄することにより防止することができる。あるいは、雄性不稔性型を用いて、雌親植物での花粉形成を防止することができる。例えば、雄性不稔性は、細胞質雄性不稔性（CMS）、核雄性不稔性、遺伝子雄性不稔性、導入遺伝子が小胞子形成および／または花粉形成を阻害する分子雄性不稔性、あるいは自家不和合性により、産生させることができる。CMSを含む雌親植物が、特に有用である。
【００３０】
本明細書に記載される方法（例えば、育種、突然変異誘発）のいずれかにより作製される植物は、多くの異なるアプローチを用いて、DVTのレベルおよび／または苦味を評価することができる。例えば、DVTのレベルは、本明細書に記載される葉表面の化合物を抽出および分離することにより、判定することができる。場合によっては、植物中のDVTのレベルは、1種または複数種の植物と直接的または間接的に比較することができる。加えてまたは代わりに、タバコ葉（緑または乾燥した）の苦味は、本明細書に記載される官能パネルにより評価することができる。DVTのレベルが低減されたことが確認された植物を、さらなる繁殖のために選択することができる。
【００３１】
DVTのレベルが低減されたことが確認されているタバコ植物由来の種子を、圃場に植え、収穫し、かつさらに当技術分野で標準的な方法を用いて加工処理することができる。例えば、DVTのレベルが低減された緑葉タバコは、常法を用いて、例えば、熱風乾燥、火力乾燥、空気乾燥または日干乾燥を用いて乾燥させることができる。様々な種類の乾燥方法の説明に関しては、例えば、Tso（1999, Tobacco, Production, Chemistry and Technology, DavisとNielsen編, Blackwell Publishing, Oxford 中の第1章）を参照されたい。さらに、様々な乾燥する方法に起因するタバコ化学における変化は、よく研究されている。例えば、Peeleら（1996, Rec. Adv. Tob. Sci., 21: 81-133）およびWiernikら（1996, Rec. Adv. Tob. Sci., 21: 39-80）を参照されたい。
【００３２】
いくつかの態様において、DVTのレベルが低減された乾燥タバコは、状態を整え、かつ／または発酵させることができる。状態を整える工程としては、米国特許出願公開第2004/0118422号または同第2005/0178398号に記載される、例えば、加熱する工程、水分を蒸発させる（sweating）工程および低温殺菌工程が挙げられる。通常、発酵は、高い初期水分含量、発熱、および10〜20%の乾燥重量の減少により特徴付けられる。米国特許第4,528,993号、同第4,660,577号、同第4,848,373号および同第5,372,149号を参照されたい。葉の芳香を改良することに加えて、発酵は、葉の色および質感（texture）のどちらかまたは両方を変えることができる。発酵過程の間も、放出ガスが生成され得、酸素が吸収され得、pHが変化し得、かつ保持される水分量が変化し得る。例えば、米国特許出願公開第2005/0178398号、およびTso（1999, Tobacco, Production, Chemistry and Technology, DavisとNielsen編, Blackwell Publishing, Oxford 中の第1章）を参照されたい。
【００３３】
乾燥させた、あるいは乾燥させ、かつ発酵させた、DVTのレベルが低減されたタバコは、さらに加工処理して（例えば、細断するか、広げるか、配合するか、粉にする（mill）か、または細かく砕いて（comminute））、無煙タバコ組成物に用いることができる。例えば、米国特許第4,528,993号、同第4,660,577号および同第4,987,907号を参照されたい。例えば、スヌース型（snus-style）製品および嗅ぎタバコ製品、小袋もしくは箱入りのルーズタバコ（loose tobacco）、噛みタバコ、無煙紙巻きタバコ、可食フィルム片（edible film strip）、タバコ被覆つま楊枝および押出しタバコ製品（extruded tobacco product）を含むがこれらに限定されない、湿性または乾式の無煙タバコ等の無煙タバコ組成物であり、DVTのレベルが低減された、本明細書で記載されるタバコの品種を含有するか、またはDVTのレベルが低減されたものについて選択されたその後代の1種または複数種を含有する、無煙タバコ組成物を生産することができる。多くの無煙タバコ組成物の説明に関しては、例えば、米国特許出願公開第2005/0244521号および同第2006/0191548号を参照されたい。DVTのレベルが低減されたタバコに加えて、本明細書で記載される無煙タバコ組成物は、例えば結合剤、可塑剤、安定剤、および／または香料等の他の成分を含むことができる。
【００３４】
無煙タバコ組成物中、100%の乾燥タバコが、DVTのレベルが低減されたタバコであることができる。例えば、100%の乾燥タバコは、暗色空気乾燥タバコ、バーレー種のタバコ（TI 1406と名付けられたバーレー種のタバコ以外）、空気乾燥タバコ、または暗色火力乾燥タバコであることができる。あるいは、無煙タバコ組成物中の乾燥タバコは、DVTのレベルが低減された1種または複数種のタバコと、DVTのレベルが低減されていない1種または複数種のタバコとの配合物であることができる。DVTのレベルが低減されていない例示的なタバコとしては、LA B21、LN KY171、バスマ（Basma）、ガルパオ（Galpao）、ペリック（Perique）、バインハート1000-1（Beinhart 1000-1）、およびペティコ（Petico）が挙げられる。本明細書で用いられる配合物とは、80%〜99%（例えば、80%〜85%、80%〜90%、85%〜95%、90%〜99%、または95%〜99%）の低DVTタバコを有するタバコの組み合わせのことをいう。例えば、可食フィルム組成物または乾式もしくは半湿性の無煙タバコ組成物中、80%〜100%の乾燥タバコが、DVTのレベルが低減されたタバコからのものであり得るか、または湿式の無煙タバコ組成物中、40%〜100%（例えば、40%〜60%、50%〜70%、または60%〜80%）の乾燥タバコが、DVTのレベルが低減されたタバコからのものであり得る。
【００３５】
本発明に従って、当技術分野の技術の範囲内の、従来の植物育種、植物生物学および生理学、分子生物学、微生物学、ならびに生化学技術だけでなく、官能評価を用いてもよい。本発明を、特許請求の範囲で説明される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例でさらに説明する。
【実施例】
【００３６】
実施例
実施例1-種子源
0.1 gの、TI 1406（PI 408940）、KDH960（PI 531523）、KDH926（PI 531521）、KDH959（PI 531522）、TI 1068（119208）およびKY14（PI 552477）の種子を、オックスフォード国立遺伝資源保管所（Oxford National Germplasm Repository）（ワールドワイドウェブ上のars-grin.gov/npgs/holdings.htmlを参照されたい）（USDA）から入手して、温室および圃場で繁殖させた。
【００３７】
実施例2-温室植物栽培
タバコの種子を、Carolina Soil Mixを含有する鉢に蒔いた。播種後3〜5週で、実生苗を鉢に移して、葉試料を採取するまで温室内で維持した。植物に、肥料をやり、必要に応じて昆虫および疾患に備えた噴霧をした。
【００３８】
実施例3-乾燥葉試料用の葉の作製
移植栽培、圃場での実施（field practice）、および乾燥は、バーレー種タバコに関して推奨されるものに従って行われる。種子をフロートトレイ（float tray）に蒔き、8週間、移植用の温室内で維持した。実生苗を圃場に移植して、植物の先端を切った。先端を切った後4〜5週間で、植物の茎を切断して、空気乾燥させるために納屋に吊るした。乾燥後、1つの等級で葉を茎から分け、解放（bail）した。茎から分ける際に葉試料を採取し、40℃で乾燥させ、Wileyミルで粉砕した。
【００３９】
実施例4-タバコ表面化合物の抽出
それぞれのタバコ種からの10植物の葉の葉身から径5.32 cmのディスク（disk）を切り取ることにより、緑葉のタバコ表面化学物質を植物から抽出した。そこから葉のディスクを得た植物を圃場および／または温室で育て、最初の花が開花し始めたときに、長さが約15〜25 cmであった葉から試料を取得した。
【００４０】
それぞれのディスクを、単一の広口瓶中の100 mlの塩化メチレン中で30秒間やさしく洗浄した。10枚の葉全てからの抽出液を、無水硫酸ナトリウムを敷いたものを通して濾過し、N2を用いて蒸発乾固させ、残渣を10 mlの塩化メチレン中でもとに戻した。
【００４１】
実施例5-タバコ表面化学物質のTLC分析
TLCプレート（Merck TLC Silica Gel 60, 2 mm, 10×20 cm）を、クロロホルム-メタノール（50：1, v/v）中で前洗浄し、風乾して、オーブン中で、120℃で30分間加熱することにより活性化した。緑葉抽出物（図1A）または乾燥葉抽出物（図1B）のタバコ表面化学物質を、CAMAG Automatic TLC Sampler 4を用いてプレート上に載せた（10μl）。プレートを、溶媒としてクロロホルム-メタノール（50：1, v/v）を用いた溶媒箱（solvent chamber）中で展開させた。天蓋内で3分間風乾した後、プレートに、p-アニスアルデヒド-エタノール-硫酸（AESA）溶液を噴霧し、バンドを発色させるためにハンド・ドライヤーで加熱した。
【００４２】
図1は、多数の異なるタバコ品種からの、緑葉（パネルA）または乾燥タバコ（パネルB）で観測された、種々のバンド強度のDVTを示す。TI 1406では、DVTは検出されず、KDH959では、KY14と比較して極めて微量が検出された。さらに、TI 1068は、KY14が有した量と大体同じ量のDVTを有したが、KDH926およびKDH960は、KY14よりも多いDVTを持っていた。
【００４３】
実施例6-乾燥タバコ試料の官能評価
経験を積んだ味覚パネリスト5名を、乾燥タバコ試料における苦味の感覚を判定するために用いた。それぞれのパネリストに、符号を付けた試料を与え、1〜9のスケールで試料における苦味の評点をつけることを求めた。ここで、1は、最も少ない量の苦味を有するとみなされ、9は、最も多い量の苦味を有するとみなされた。パネリストには、各試料の間で、彼らの口蓋を水ですすぎ、かつ塩気のあるクラッカーを摂取することを要求した。それぞれの品種に関する味覚パネルの平均の結果を、表2に示す。
【００４４】
表2に示されるDVTのレベルは、NielsenとSeverson（1990, J. Agric. Food Chem., 38: 467-471）からのものである。
【００４５】
（表２）DVTおよび苦味のレベル
2014087342.tif 000004
【００４６】
実施例7-無煙製品の官能パネル評価
同じ6名の参加者を両方のセッションで用いて、2種の異なる味覚試験を、タバコの3種の異なる品種で行った。6名の参加者全てが、定期的に無煙タバコ製品を使用しており、以前の味覚試験に参加していた。参加者は以前の経験を有するので、感覚刺激的に「苦味」を定義するための訓練セッションは行わなかった。
【００４７】
最初の味覚試験（表3および表4）では、タバコ試料（TI 1406、バーレー種および暗色空気乾燥の）を、4〜8週間、小屋で乾燥させ、乾かし、ミント香料で少し香味付けし（全ての試料を同様の程度に香味付けした）、600μmの粒度に細断し、次いで200μmの平均乾燥粒度までさらに粉にした。2回目の味覚試験（表5および表6）では、タバコ試料を4〜8週間、小屋で乾燥させ、乾かし、少し香味付けした。2回目の味覚試験ために、TI 1406および暗色空気乾燥のタバコ試料を、600μmの粒度に細断し、一方、バーレー種タバコ試料は、2 mmの平均粒度まで粉にした。
【００４８】
両方の試験に関して、舌圧子を用いて試料を計測し、試料の量は参加者の自由裁量のままとし、かつ参加者には、味をみる試料の量を一貫させるよう指導した。参加者には、任意の順番で試料の味をみて、苦味に関して、かつ嗜好性に関して、1〜15の数値スケールで試料を格付けし、かつ試料の間で、彼らの口蓋をクラッカーおよび水で洗い清めることを求めた。仲間の影響を最小限にするために、参加者には、彼らの反応（言葉または顔での）を表現しないようにも指導した。
【００４９】
苦味に関する官能パネル評価の結果を、知覚された苦味がより少ないことを表すより小さい数を用いて、表3および表5に示す。表4および表6は、嗜好性がより高いことを表す、より高い数を用いた、それぞれの乾燥タバコ試料に関するパネリストの嗜好性を示す。味覚パネリストにより、TI 1406は、最も少ない量の苦味および最も高い嗜好性を有すると判断された。
【００５０】
（表３）苦味に関する官能パネル評価
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【００５１】
（表４）官能パネル嗜好性
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【００５２】
（表５）苦味に関する官能パネル評価
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【００５３】
（表６）官能パネル嗜好性
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【００５４】
実施例8-乾燥葉試料のGC/MS-SPME分析
1グラムの粉砕した乾燥タバコ試料を、1 mlの飽和NaCl溶液を含有する40 mlの試料瓶に入れた。上部の空間を、水浴中、75℃で30分間平衡化した。吸着のために、SPME繊維（Supelco, ベルフォンテ, ペンシルヴェニア州）50／30μm DVB／Carboxen／PDMSコーティングを、試料の上部の空間に15分間曝した。試料を、Varianの機器、すなわちスプリット-スプリットレス注入ポートを備えたSaturn 2200 GC/MS/MSで分析した。SPME繊維の脱離を、スプリットレス・モードで、250℃で5分間実行した。GCカラムは、Phenomenex ZB-1ms、すなわち、0.25 mm (i.d.)×30 m の固定化薄膜（0.25μm）であった。移動相は、定圧で1 mL/分の速度のヘリウムであった。オーブンの勾配温度プログラム：全実行時間の102.33分間に関しては、40℃の初期温度を3分間保ち；250℃に3℃で上昇させ、かつ3分間保ち；320℃に3℃で上昇させ、かつ3分間保つ。注入間のカラム洗浄は、オーブン温度を350℃に上げて、かつ5分間保つことにより達成される。MSパラメータは、すなわち、70 eVでの電子イオン化、捕捉温度150℃であり、移送ライン温度は170℃であり、かつ質量範囲は40〜600 amuであった。NIST 05 Mass Spectral Libraryまたは社内の標準物質で生じさせたそれぞれのスペクトルと照合することにより、化合物を同定した。
【００５５】
図2は、α-DVTおよびβ-DVTの部分的なクロマトグラムを示す（α-DVTおよびβ-DVTは共溶出することが留意される）。部分的なクロマトグラムは、ソラノン、ソラベチボン、センブレンおよびツンベルゴールを含む他のセンブラノイドまたはその分解生成物が、TI 1406において、低減されていたことを実証した。
【００５６】
実施例9-材料
クロロホルム、塩化メチレン、および顆粒状無水硫酸ナトリウムは、EMD Chemicals, Inc.（Merck, ダルムシュタット, ドイツ）から入手した。全ての化学物質は、さらなる精製をせずに用いた。チーズクロス（100%純粋な試薬等級）および濾紙は、VWR International, Inc.（ウェストチェスター, ペンシルヴェニア州）から入手した。GCカラムは、Phenomenex, Inc.（トランス, カリフォルニア州）製であった。クエン酸およびカフェイン（食品等級）、酒石酸、およびセライト（CAFAII）は、Sigma-Aldrich（セントルイス, ミズーリ州）製であった。メタノールHPLC等級は、Mallinckrodt Baker, Inc.（フィリップスバーグ, ニュージャージー州）から入手した。ヨウ素無添加の塩化ナトリウム（Morton's International）、砂糖（純粋なサトウキビのグラニュー糖, Domino Foods, Inc.）、およびクラッカー（無塩）は、地元の食品雑貨店から入手した。本調査で用いたタバコは、通常の栽培技術を用いて、ケンタッキー州のウィンチェスターで、圃場または温室で育てたものである。
【００５７】
実施例10-タバコ葉表面の化学物質の抽出
葉、すなわち1植物当たり1枚の葉から、径5.32 cmのディスクを切り取ることにより、緑葉および乾燥葉のタバコ葉表面の化学物質を抽出した。試料には、先端から5番目〜8番目の葉を取得した。圃場におけるそれぞれのタバコの種類に関して10植物からディスクを採取した。植物が開花段階にある場合に、緑葉を収穫した。それぞれのディスクを、アルミ箔で包んだメーソンジャー中の100 ml 塩化メチレン中で30秒間持続的に洗浄した。抽出液を、無水硫酸ナトリウムを敷いたものを通して濾過し、N2を用いて蒸発乾固させ、残渣を10 mlの塩化メチレン中でもとに戻した。全ての工程を、抽出液が光に曝されることを最小限にするように行った。本明細書開示される方法は、NielsenとSeverson（1990, J. Agric. Food Chem., 38: 467-471）の方法がもたらしたよりも多いDVTの収量をもたらしたことが注目される。
【００５８】
実施例11-DVTの単離
DVTを、温室で育てたタバコ生殖質KDH 960の毛状突起浸出物から単離し、圃場のタバコ葉中のDVTの定量における基準物質として用いた。抽出法は、ChangとGrunwald（1976, J. Lipid Res., 17: 7-11）により記載された抽出法であった。チーズクロスのセット当たりの抽出液に関して、20枚の葉試料の束を採取した。チーズクロスワイパーは、46 cm×92 cm（18"×36"）であった。葉の毛状突起浸出物を、以下の通り抽出した。
【００５９】
4枚のチーズクロスを、クロロホルム（CHCl3）で前抽出し、次いで空気乾燥させた。それぞれのクロスを4層に折りたたんだ。折りたたんだチーズクロスのうちの2枚を、順に重ねて、2枚のパンこね台（bread board）にピンで留めた。前抽出したチーズクロスの固定したセットの間に、それぞれのタバコ葉を置き、大きなのし棒（rolling pin）を用いて、一番上のボードをしっかりと圧延した。それぞれの葉を、1回の圧延が1回の前進行程と1回のもどり行程からなる、圧延を10〜12回した後、慎重に取り出して、取り替えた。次いで、チーズクロスのそれぞれのセットを、栓付きの1.0 Lのエルレンマイヤーフラスコ中、周囲温度で、200 rpmで60分間振とうする（New Brunswick Scientific C78 Water Bath Shaker, エジソン, ニュージャージー州）ことにより、300 mLのクロロホルムで抽出した。次いで、抽出液を、セライトを敷いたものを通して、1000 mLのナスフラスコ（24/40ジョイント）中に濾過し、砕片を除去した。クロスを、再び、200 mLのクロロホルムを用いて、2回より多い回数抽出した。抽出液をひとつにして、ロータリー・エバポレーター（減圧制御装置V-805, Buchi Corporation, ニューカッスル, デラウェア州を備え、水冷器WKL 230, Lauda, ドイツを備えた、BUCHI Rotavapor, R-205）で250 mLに濃縮し、次いで、100 mLの1.0 M酒石酸で洗浄した。有機層を、500 mLの分液ロートで分離し、無水顆粒状硫酸ナトリウムを敷いたものを通して濾過し、次いで、ロータリー・エバポレーターを用いて蒸発乾固させた。残渣を、5 mLの褐色保存瓶に移して、溶媒が残存しなくなるまでN2を用いて吹き落とし、冷蔵庫内で保存した。分析は、DVT濃度が81.61%純粋なものであり、α-およびβ-DVTでの収率が68%であることを示した。
【００６０】
実施例12-定量
塩化メチレン中100〜6000μg/mLの範囲のα-およびβ-DVTの6点検量線を、DVT単離物（81.61%純度；図4）の原液から作成した。濃度は、単離物の純度で補正した重量であった。それぞれの標準物質およびタバコ試料を、500μLの溶液または塩化メチレン中の試料を用いて、ピリジン中の過剰のブチルボロン酸500μLで誘導体化した。標準物質および試料を反復して調製し、それぞれの反復物は2回分析した。DVT反応は、必要とされる5μg/mL〜100μg/mLより下の範囲において直線的ではないため、MS反応が検量範囲内になるように、一部のタバコ試料を、濃縮するか、または希釈した。
【００６１】
実施例13-DVTのGC-MS分析
試料を、スプリット-スプリットレス注入ポートを備えたVarianのSaturn 2200 GC-MSで分析した。注入温度は、スプリットモード1：100で250℃であった。GCカラムは、Phenomenex ZB-5すなわち、0.25 mm (i.d.)×30 m、接合膜（0.25μm）であった。移動相は、定圧で1.0 mL/分の流速をともなう超高純度（UHP）ヘリウムであった。オーブンの勾配温度プログラム：150℃の初期温度を0分間保ち；280℃に4℃の増加率で上昇させ、かつ10分間保ち；320℃に80℃の増加率で上昇させ、かつ5.0分間保つ。全データ収集時間は、47.5分間であった。注入間のカラム洗浄は、オーブン温度を280℃〜350℃に上げて、かつ5分間保つことにより達成される。MSパラメータは、すなわち、70 eVでの電子イオン化、捕捉温度150℃であり、移送ライン温度は260℃であり、かつ質量範囲は33〜400 amuであり、クロマトグラムへの溶媒の影響を避けるための2.0分間の走査遅延をともなった。
【００６２】
実施例14-官能評価
味覚パネル訓練
表7に示される、砂糖（甘味）、NaCl（塩味）、クエン酸（酸味）およびカフェイン（苦味）（Dunkelら（2007, J. Agric. Food Chem., 55: 6712-9））の3種の濃度を用いて、パネリストを訓練した。それぞれが前の濃度の半分の濃度となるように、濃度を低減した溶液を調製した。溶液の味をみる前に、パネリストには、彼らの口を精製水ですすぎ、クラッカーを摂取するように指導した。それぞれの溶液は、濃度が増加する順でパネリストに与えられた（Tamuraら（1989, Agric. Biol. Chem., 53: 1625-1633））。溶液の味をみた後、基準タバコ試料（KY14、標準のメッシュサイズに粉砕した）を評価し、苦味に関して5つの評点を割り当てた。KY14を、全てのタバコ評価セッション（session）において、後で対照として用いた。
【００６３】
パネルの訓練は、パネリストが共通データ点を構築するのを助けるための物理的基準（タバコ試料）化学的基準（Sigma-Aldrich, Inc.製の食品等級）を用いて、1週間当たり3セッションで8週間実行した。同じ濃度の基準化合物（BelitzとGrosch（1999, Food Chemistry, pp 33-7 および 763-4））を認識し、かつ同じ評点（表7）を割り当てるように、パネリストを訓練した。最も低い濃度には1の評点を与え、中くらいの濃度には5、かつ最も高い濃度には9を与えた（表7）。訓練セッションの間、官能試験の目的をパネリストに説明し、彼らはそのレキシコン（lexicon）に賛同した。10人の訓練されたパネリストのうち1人が信頼できないと確認され、該パネリストからのデータを除外した。
【００６４】
全ての訓練の間、パネリストには、いずれのセッションの前も少なくとも一（1）時間（ASTM標準）、タバコ製品を使用することを控えることを求めた。パネリストには、試験が完了するまで話すことは許されないと指導した。彼らの最大の能力をパネリストが遂行することを確実にするために、彼らはあらゆる訓練および評価セッションに対応可能であることが推奨された。1週間当たりそれぞれ10人の45分間セッションが、3回開催された。
【００６５】
（表７）化学的官能基準および評点
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【００６６】
味覚パネル評価
味覚試験が、タバコ葉試料の苦味（記述的分析）を決定および評価するために計画された。6〜9名の訓練された味覚パネリスト（Grub（ZieglerとZiegler編による1998, Flavourings, pp. 513-524, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany中）；Tamuraら（1989, Agric. Biol. Chem., 53, 1625-1633））は、乾燥タバコ試料の知覚された苦味を判定するためのセッションごとに対応可能である。それぞれのパネリストに、試料を与え、1〜9の間隔スケールで試料における苦味の評点をつけることを求めた（Adams（BillsとMussinan編による1985, Characterization and measurement of flavor compounds, ACS Symposium Series 289, American Chemical Society, Washington DC, pp 11-25中）；Meilgaardら（1991, Sensory evaluation techniques, 2nd Ed., CRC Press, Boca Raton, FL））。最も苦みが少ない試料であると考えられる場合には、パネリストにより1の評点が与えられ、かつ最も苦みが多い試料であると考えられる場合には9の評点が与えられる。パネリストには、試料間で約5〜10分待ち、この時間の間、彼らが、彼らの口蓋を水および塩を振ったクラッカーですすぐように指導した（LawlessとGillette（BillsとMussinan編の1985, Characterization and measurement of flavor compounds, ACS Symposium Series 289, American Chemical Society, Washington DC, pp 26-41中））。
【００６７】
全ての試料に、無作為の3桁の数字で符号を付け、乾燥させて標準のメッシュサイズに粉砕した。タバコ試料は、試料間で視覚的な違いが明らかにならないようにパネリストに与えられ、湿らせたつま楊枝を用いてパネリストに味見される。それぞれの試料を、3連続のセッションにわたって3回評価した。全ての試行は、例えば匂い、光、音等の環境的な影響を最小限にするようになされ、全てのセッションは、それぞれの日の同じ時間に開催された（アメリカ材料試験協会（ASTM）, テクニカル委員会E18, 標準E18.01〜E18.06）。
【００６８】
味覚パネル結果
図5は、試験したそれぞれのタバコの種類に関する味覚パネルの結果を示す。ここで、1は低い苦さの強度であり、9は高い苦さの強度である。図5から分かるように、TI 1406およびKDH959は、苦味に関して最も低い評点を有し、一方TI 1068およびKDH960は、苦味に関して最も高い評点を有する。
【００６９】
実施例15-圃場で育てたタバコ植物からの、緑葉中のDVTレベルおよび乾燥葉における苦味
品種TI 1406、KDH959、HY14、KDH926、TI 1068およびKDH960に由来するタバコ植物を、2007 Kentucky Tobacco Production Guideに従って、圃場で育てた。緑葉を収穫し、葉表面上に存在するα- DVTおよびβ-DVTを、実施例4における前記のように測定した。図6は、異なるタバコ品種の緑葉中の平均DVT濃度（α- DVTおよびβ-DVT；μg/cm）を示す。図6で分かるように、TI 1406およびKDH960からの緑葉組織中のDVTのレベルは、非常に低かった。
【００７０】
同じ品種からの乾燥タバコ葉の苦味を、実施例14に記載される官能パネルにより評価した。官能評価の結果を表8に示す。
【００７１】
（表８）タバコに関する官能データ
2014087342.tif 000010
同じ文字がその後に続く平均官能評点は、Kruskal-Wallisの多重比較検定に従って、有意差（p＜0.05レベル）がない。
同じ文字がその後に続く平均DVTレベルは、TukeyのHSD検定に従って、有意差（p＜0.05レベル）がない。
【００７２】
苦味と緑葉組織中のDVTのレベルとの間の相関関係を図7に示す。データの直線性から分かるように、DVTのレベルと苦味との間には、正の統計的に有意な相関関係（p≦0.05でR2＝0.876）がある。
【００７３】
実施例16-食品等級の溶媒を用いた洗浄
緑葉成熟段階（green mature leaf stage）および乾燥段階に、それぞれのタバコ品種（TI 1406、KY171、KDH960）から10枚の葉を採取した。葉を、全て縦方向に裂いた。それぞれの葉の半分は、いずれの処理もせずに、37℃で乾かした。残りの半分は、洗浄して、センブラノイドを含有する葉表面の毛状突起浸出物を、本明細書で記載される他の化合物と一緒に取り出した。葉を、3つの1 Lの体積の95%純粋な穀物アルコール（Everclear, Luxco Distilling Co., セントルイス, ミズーリ州）で、30秒間、3回洗浄した。葉を、優しくかき混ぜることにより室温で洗浄して、水気を切り、次いで37℃で乾かした。次いで、洗浄した葉および未洗浄の乾かした葉を、本明細書で記載される訓練された官能パネルにより評価した。結果を、下記の表9および表10に示す。
【００７４】
（表９）洗浄した緑タバコ葉対未洗浄の緑タバコ葉に関する味覚パネル評点
2014087342.tif 000011
【００７５】
（表１０）洗浄した乾燥タバコ葉対未洗浄の乾燥タバコ葉に関する味覚パネル評点
2014087342.tif 000012
【００７６】
KY 171およびKDH 960の葉を、例えば、これらに限定されない、エタノール、酢酸エチル、酢酸ブチル、水、酢酸、プロパノール、またはそれらの任意の組み合わせ等の食品等級の溶媒で洗浄することは、訓練された官能パネルにより判定されたこれらのタバコ苦味評点を、有意に低減した。TI 1406、KY 171およびKDH 960の洗浄した試料の間では、味覚における有意差はなかった。加えて、洗浄したTI 1406と未洗浄のTI 1406との間では、有意差はなかった。統計的有意性は、Mann-WhitneyのU検定を用いて評価した。
【００７７】
実施例17-DVTのレベルが低減されたタバコを含有するフィルム片
タバコフィルム片は、表11に示す成分を用いて作製することができる。例えば、タバコフィルム片は、180°Fに加熱しておいた450グラムの良くかき混ぜて脱イオン化した水が入ったビーカー中で、K-3（60%）、K-100（35%）およびK4M（5%）の等級のDow Chemical製ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）50グラムを混合することにより作製することができる。混合しながら、40グラムの微粉砕したタバコを、15グラムの結晶セルロース（FMC）、17グラムのデンプン（Grain Processing Corp.製のB-700）、16グラムのグリセリン、0.8グラムのポリソルベート80（Unichema）、および4グラムのプロピレングリコールモノステアレート（Danisco製のPGMS）と一緒に、HPMC溶液に添加する。温度が100°Fより下に低下している場合に、10グラムのシナモン香味料および2グラムのスクラロース（人口甘味料）を、溶液に添加する。2グラムの炭酸ナトリウムを添加して、pHを約7.5に調整する。全ての成分を添加して、均一に分散させた時点で、30分間混合し続けながら混合物を水浴中に置き、65°Fに下げる。65°Fの温度で5,000センチポアズのBrookfield粘度が得られるように、必要に応じて追加の水を添加し、約17% w/wの固溶体をもたらす。
【００７８】
次いで、このタバコ含有溶液の一部を、15ミル（0.015インチ）の固定間隙をもつドローダウン・ブレード（draw-down blade）を用いて、ガラス板上に塗布する。該ガラス板を、170°Fに調整された空気循環式実験用乾燥器に入れる。30分後、該ガラス板を乾燥器から取り出し、室温に冷却し、2.5ミル（0.0025インチ）の厚さをもつ乾燥させたフィルムをガラス板から取り外す。次いで、フィルムを、口に入れるために適したより小さい断片に切り分ける。1.0インチ×1.25インチのフィルムの切片は、通常、1分未満で、口中で崩壊し、それによって、香味料、甘味料、およびタバコが放出される。乾燥重量でのこのフィルムのタバコ含量は、25%である。
【００７９】
（表１１）タバコフィルム
2014087342.tif 000013
【００８０】
官能味覚パネルを用いて、TI 1406、KDH959、TI 1068またはKDH960のタバコを含有する、単層または二層のフィルム片を評価する。加えて、タバコを含有するフィルム片を、DVTのレベルに関して評価する。
【００８１】
実施例18-タバコ被覆つま楊枝
タバコで被覆したつま楊枝を作製する。被覆物は、表12に示す成分を用いて作製する。
【００８２】
（表１２）つま楊枝被覆物
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【００８３】
簡単にいうと、水を180°Fに加熱し、例えば水溶性高分子およびタバコ等の固体を水中で激しく混合する。次いで、固体が完全に溶解および／または良く分散するまで、例えば可塑剤等の他の成分を溶液中で激しく混合する。溶液を冷却する。冷却した後、必要に応じて香料を添加することができる。十分に脱気されるまで溶液を減圧下に保ち、次いで80°Fに冷却する。
【００８４】
約2/3〜3/4の普通の木製またはプラスチック製のつま楊枝を、タバコ含有溶液中で転がす（roll）か、タバコ含有溶液に包む（wrap）か、タバコ含有溶液に浸漬するか、またはタバコ含有溶液で被覆して、乾燥させる。
【００８５】
官能味覚パネルを用いて、TI 1406、KDH959、TI 1068またはKDH960のタバコを含む懸濁液で被覆したつま楊枝を評価する。タバコ被覆つま楊枝を、DVTのレベルに関しても評価する。
【００８６】
実施例19-タバコを含有する錠剤および押出し製品
（表１３）錠剤または押出し成形物のためのタバコ粉末
2014087342.tif 000015
【００８７】
タバコを含有する錠剤および／または押出し製品を、顆粒を形成させるための方法で規定の成分を最初に組み合わせることにより作製する。顆粒を作製する過程は、結合溶液を調製する工程、およびそれに続く乾性成分と組み合わせる工程を含み得る。
【００８８】
結合溶液の調製
表13に示される成分量は、別々の入れ物に計り分ける。1種または複数種の可溶性高分子（例えば、予め水和させたアラビアゴム）をゆっくりと水に添加し、ステンレス鋼容器中、高せん断攪拌下で混合する。完全溶解後、マルトデキストリン（M 585, Grain Processing Corporation）をゆっくりと水に添加する。一旦、マルトデキストリンを完全に溶解すると、甘味料を、ゆっくりと添加して、完全な溶解を確実にするために十分に混ぜ合わせる。表13に示される規定量の香料（例えば、ペパーミントおよびスペアミント）を結合溶液に添加する。全混合物を、ホモジナイザーを用いて均質化する。
【００８９】
乾性成分の調製およびそれに続く造粒
表13に示す規定量のタバコ粉末を一緒に配合して、流動層チャンバー（fluid bed chamber）の製品ボウル（product bowl）に入れた。流動層塗装機を用いて、乾性成分配合物に結合溶液を適用して、最終顆粒を形成させる。一旦、乾性成分流動層チャンバー中で流動化し、適温を得ると、結合溶液を乾性成分上にゆっくりと噴霧して顆粒を形成させる。
【００９０】
製品の成形
タバコを含有する錠剤は、顆粒状の材料を適当な量の滑沢剤と組み合わせることにより、かつ、錠剤プレス機等を用いて、該組み合わせたものを錠剤の形状に加工処理することにより製造される。この方法で付与される錠剤の溶解速度は、錠剤プレス機での適当な圧縮および充填のパラメータを活用することにより調節するとことができる。
【００９１】
あるいは、タバコを含有する押出し製品は、顆粒状の材料を適当な量の可塑剤（例えば、水）と組み合わせ、かつ、適当に成形した鋳型が装着された押し出し成形機を用いて、該組み合わせたものを押出された形状（例えば、棒）に加工処理することにより製造される。
【００９２】
実施例20-栽培されたタバコの種類におけるDVT
表14に、示されるタバコの種類における、DVTのレベルを示す（実施例4で本明細書に記載される方法を用いて決定される）。
【００９３】
（表１４）市販タバコのDVT
2014087342.tif 000016
【００９４】
他の態様
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、上述の説明は、説明を意図するものであり、添付の特許請求の範囲の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものでないことが、理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
2014087342.tif 000017
【図１Ｂ】
2014087342.tif 000018
【図２】
2014087342.tif 000019
【図３】
2014087342.tif 000020
【図４】
2014087342.tif 000021
【図５】
2014087342.tif 000022
【図６】
2014087342.tif 000023
【図７】
2014087342.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月26日(2013.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する緑タバコ（green tobacco）から調製された乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物であって、該乾燥タバコが、KY 14品種の乾燥タバコと比べて、官能パネル評価により判定される苦味が有意に低減されている、無煙タバコ組成物。
【請求項２】
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する植物から選択される品種からの乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物であって、該乾燥タバコが、KY 14品種の乾燥タバコと比べて、官能パネル評価により判定される苦味が有意に低減されている、無煙タバコ組成物。
【請求項３】
乾燥タバコにおいて、さらにソラノン、ソラベチボン、センブレンまたはツンベルゴールのレベルがKY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べて低減されている、請求項1または2記載のタバコ組成物。
【請求項４】
乾燥タバコが、暗色火力乾燥タバコ（dark fire-cured tobacco）、暗色空気乾燥タバコ（dark air-cured tobacco）、TI 1406以外のバーレー種の空気乾燥タバコ（Burley air-cured tobacco）、熱風乾燥タバコ（flue-cured tobacco）、または日干乾燥タバコ（sun-cured tobacco）である、請求項1または2記載のタバコ組成物。
【請求項５】
乾燥タバコが、以下からなる群より選択される品種からのタバコである、請求項1または2記載のタバコ組成物：
KY 14と名付けられた品種およびその後代の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減されている、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、TI 1406、TI 1269、GR139NS、KDH959およびそれらの後代。
【請求項６】
湿性無煙タバコ、乾式無煙タバコ、噛みタバコ、無煙紙巻きタバコ、可食フィルム、押し出し製品、錠剤、またはタバコ被覆つま楊枝である、請求項1または2記載のタバコ組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細を、添付の図面および下記の説明において説明する。本発明の、他の特徴、目的および利点は、図面および詳細な説明から、ならびに特許請求の範囲から明らかであるだろう。
[本発明1001]
KY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減された乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物。
[本発明1002]
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する緑タバコ（green tobacco）から調製された乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物。
[本発明1003]
品種が、DVTのレベルが低減されたものについて選択され、
該品種の植物が、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、
該品種からの乾燥タバコを含む、無煙タバコ組成物。
[本発明1004]
乾燥タバコが、KY 14と名付けられた品種の乾燥タバコと比べて、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示す、本発明1001、1002または1003のいずれかの無煙タバコ組成物。
[本発明1005]
乾燥タバコにおいて、ソラノン、ソラベチボン、センブレンまたはツンベルゴールのレベルがさらに低減されている、本発明1001のタバコ組成物。
[本発明1006]
緑タバコにおいて、ソラノン、ソラベチボン、センブレンまたはツンベルゴールのレベルがさらに低減されている、本発明1002のタバコ組成物。
[本発明1007]
乾燥タバコにおいて、官能パネル評価により判定される苦味が有意に低減されている、本発明1001、1002または1003のいずれかのタバコ組成物。
[本発明1008]
乾燥タバコが、暗色火力乾燥タバコ（dark fire-cured tobacco）、暗色空気乾燥タバコ（dark air-cured tobacco）、TI 1406以外のバーレー種の空気乾燥タバコ（Burley air-cured tobacco）、熱風乾燥タバコ（flue-cured tobacco）、または日干乾燥タバコ（sun-cured tobacco）である、本発明1001、1002または1003のいずれかのタバコ組成物。
[本発明1009]
乾燥タバコが、以下からなる群より選択される品種からのタバコである、本発明1001、1002または1003のいずれかのタバコ組成物：
KY 14と名付けられた品種およびその後代の乾燥タバコと比べてDVTのレベルが低減される、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、TI 1406、TI 1269、GR139NS、KDH959およびそれらの後代。
[本発明1010]
湿性無煙タバコ、乾式無煙タバコ、噛みタバコ、無煙紙巻きタバコ、可食フィルム、押し出し製品、錠剤、またはタバコ被覆つま楊枝である、本発明1001、1002または1003のいずれかのタバコ組成物。
[本発明1011]
以下の工程を含む、植物品種を作製する方法：
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程；
少なくとも1世代について、該後代植物を自家受粉させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
[本発明1012]
以下の工程を含む、植物品種を作製する方法：
タバコ植物組織に突然変異を誘発させる工程；
少なくとも1世代について、該突然変異誘発植物組織から誘導される植物を、自家受粉により繁殖させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
[本発明1013]
以下の工程を含む、植物品種を作製する方法：
KY 14と名付けられた品種のタバコと比べて、植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減された第一のタバコ植物を、第二のタバコ植物と交配して、後代植物を作製する工程；
少なくとも1世代について、該後代植物を自家受粉させる工程；および
少なくとも1世代において、KY 14と名付けられた品種のタバコと比べてタバコ中のDVTのレベルが低減されたものについて選択するか、DVTが緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のものについて選択するか、または該世代の植物からのタバコの官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択し、これにより該植物品種を作製する工程。
[本発明1014]
本発明1011、1012または1013のいずれかの方法により作製される、タバコ植物。
[本発明1015]
本発明1011、1012または1013のいずれかの方法により作製される、植物品種。
[本発明1016]
前記品種の植物が、緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する、本発明1015の植物品種。
[本発明1017]
DVTのレベルが低減されたタバコであるが、表1に示される品種から生産されるものではない、乾燥N.タバカム（N. tabacum）タバコ。
[本発明1018]
緑葉組織中のDVTのレベルが低減されたものについて選択されたタバコ品種の植物から生産される、乾燥タバコ。
[本発明1019]
官能パネル評価において苦味が有意に低減されたものについて選択されたタバコ品種の植物から生産される、乾燥タバコ。
[本発明1020]
以下の工程を含む、苦味が低減されたタバコを調製する方法：
生のタバコ（fresh tobacco）を乾燥させる工程；
乾燥させたタバコを熟成させる工程；および
生のタバコ、乾燥させたタバコ、または熟成させかつ乾燥させたタバコを、食品等級の溶媒で洗浄する工程。
[本発明1021]
食品等級の溶媒が、エタノールである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
洗浄したタバコが、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示す、本発明1020の方法。
[本発明1023]
生のタバコが、官能パネル評価において有意に低減された苦味を示さない、本発明1020の方法。
[本発明1024]
官能パネル評価において苦味が有意に低減された、本発明1020の方法により生産される乾燥タバコ。
[本発明1025]
緑葉組織1 cm2当たり20μg未満のDVTを有する生のタバコから作製される、本発明1024の乾燥タバコ。