【手続補正書】
【提出日】令和3年5月12日(2021.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親野生型ヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の変異体であって、
前記ＧＰＣＲの変異体が、
（ｉ）親野生型ヒトＧＰＣＲと比較して少なくとも１つの置換されたアミノ酸を有し、
（ｉｉ）特定の立体構造におけるその親ＧＰＣＲと比較して、同じ特定の立体構造において増大した立体構造の熱安定性を有し、
前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造又はアンタゴニスト立体構造であり、及び、
（ｉｉｉ）その親ＧＰＣＲと比較して、結晶化しやすく、したがって、より構造決定に適している、親野生型ヒトＧＰＣＲの変異体。
【請求項２】
親野生型ヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と比較して少なくとも１つの置換されたアミノ酸を有し、及び、その親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造の熱安定性を有する親野生型ヒトＧＰＣＲの変異体であって、変性条件下において、その親ＧＰＣＲの特定の立体構造と同じ特定の立体構造の寿命が延長しており、及び、前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造又はアンタゴニスト立体構造である、親野生型ヒトＧＰＣＲの変異体。
【請求項３】
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造にある際に前記親ＧＰＣＲに結合するリガンドを選択する工程、
（ｃ）熱の変性条件下におけるリガンド結合能の損失によって表わされるものとして変性を測定することによって、各ＧＰＣＲ変異体が、選択したリガンドの結合について親ＧＰＣＲの立体構造の安定性と比較して、前記リガンドの結合について増大した立体構造の熱安定性を有するか否かを測定する工程、及び
（ｄ）選択したリガンドの結合について親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造の熱安定性を有する変異体を選択する工程
を含み、
工程（ｃ）においてＧＰＣＲが備える前記特定の立体構造が、工程（ｂ）において選択されるリガンドの分類に対応する、
方法によって製造される、特定の立体構造における親ＧＰＣＲと比較して同じ特定の立体構造において増大した立体構造の熱安定性を有し、前記特定の立体構造がアゴニスト立体構造又はアンタゴニスト立体構造である、ＧＰＣＲ変異体。
【請求項４】
前記１つ又は複数の変異体が、製造の方法の工程（ｃ）の前に前記選択したリガンドに接触させられる、請求項３に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項５】
熱変性条件下において、親ＧＰＣＲの特定の立体構造と比較して同じ特定の立体構造の寿命が延長している、請求項３又は４に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項６】
親ＧＰＣＲと比較して、１個から１０個の置換されたアミノ酸を含む、請求項３から５のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項７】
界面活性剤、カオトロピック剤、及び極端なｐＨのいずれか１つ又は複数から選択される変性条件下において増大した立体構造の安定性を有する、請求項３から６のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項８】
その親よりも少なくとも１℃安定である増大した立体構造の熱安定性を有する、請求項３から７のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項９】
アゴニスト又はアンタゴニスト立体構造の立体構造の熱安定性が増大している、請求項３から８のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項１０】
完全なアゴニスト、部分的なアゴニスト、逆アゴニスト、及びアンタゴニストから選択されるリガンドであって、任意選択で蛍光標識又は放射標識されたリガンドの存在下で、親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造の熱安定性を有する、請求項３から９のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項１１】
前記ＧＰＣＲ変異体が、アデノシン受容体変異体、β−アドレナリン受容体変異体、ニューロテンシン受容体変異体、ムスカリン酸受容体変異体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体変異体、アドレナリン受容体変異体、アナフィラトキシン受容体変異体、アンジオテンシン受容体変異体、アペリン受容体変異体、ボンベシン受容体変異体、ブラディキニン受容体変異体、カンナビノイド受容体変異体、ケモカイン受容体変異体、コレシストキニン受容体変異体、ドーパミン受容体変異体、エンドセリン受容体変異体、遊離脂肪酸受容体変異体、胆汁酸受容体変異体、ガラニン受容体変異体、モチリン受容体変異体、グレリン受容体変異体、糖タンパク質ホルモン受容体変異体、ＧｎＲＨ受容体変異体、ヒスタミン受容体変異体、ＫｉＳＳ１−由来ペプチド受容体変異体、ロイコトリエン及びリポキシン受容体変異体、リゾリン脂質受容体変異体、メラニン濃縮ホルモン受容体変異体、メラノコルチン受容体変異体、メラトニン受容体変異体、ニューロメジンＵ受容体変異体、神経ペプチド受容体変異体、Ｎ−ホルミルペプチドファミリー受容体変異体、ニコチン酸受容体変異体、オピオイド受容体変異体、オプシン様受容体変異体、オレキシン受容体変異体、Ｐ２Ｙ受容体変異体、ペプチドＰ５１８受容体変異体、血小板活性化因子受容体変異体、プロキネチシン受容体変異体、プロラクチン放出ペプチド受容体変異体、プロスタノイド受容体変異体、プロテアーゼ活性化受容体変異体、リラキシン受容体変異体、ソマトスタチン受容体変異体、ＳＰＣ／ＬＰＣ受容体変異体、タチキニン受容体変異体、トレースアミノ受容体変異体、チロトロピン放出ホルモン受容体変異体、ユーロテンシン受容体変異体、バソプレッシン／オキシトシン受容体変異体、オーファンＧＰＣＲ変異体、カルシトニン受容体変異体、コルチコトロピン放出因子受容体変異体、グルカゴン受容体変異体、パラチロイド受容体変異体、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ受容体変異体、ＬＮＢ７ＴＭ受容体変異体、ＧＡＢＡ受容体変異体、メタボトロピックグルタミン酸受容体変異体、及びカルシウムセンサー受容体変異体のいずれかである、請求項３から１０のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項１２】
前記ＧＰＣＲ変異体が、その親受容体と比較して、以下の（ｉ）配列番号１に定義されたシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした位置：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, 及びPhe 338、（ｉｉ）配列番号５に定義されたヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした位置：Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, 及びLys 315、（ｉｉｉ）配列番号９に定義されたラットニューロテンシン受容体の番号付けした位置：Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351
, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, 及びPro 399、並びに（ｉｖ）配列番号１２に定義されたムスカリン受容体の番号付けした位置：Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383, 及びMet 384のいずれか１つ又は複数と対応する位置に少なくとも１つの異なるアミノ酸を有する、請求項３から１０のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項１３】
（ｉ）対応する野生型アドレナリン受容体と比較して、配列番号１に定義されたシチメンチョウβ−アドレナリン受容体の番号付けした以下の位置：Ile 55, Gly 67, Arg 68, Val 89, Met 90, Gly 98, Ile 129, Ser 151, Val 160, Gln 194, Gly 197, Leu 221, Tyr 227, Arg 229, Val 230, Ala 234, Ala 282, Asp 322, Phe 327, Ala 334, 及びPhe 338のいずれか１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するβ−アドレナリン受容体変異体であるか；
（ｉｉ）対応する野生型アデノシン受容体と比較して、配列番号５に定義されたヒトアデノシンＡ２ａ受容体の番号付けした以下の位置：Gly 114, Gly 118, Leu 167, Ala 184, Arg 199, Ala 203, Leu 208, Gln 210, Ser 213, Glu 219, Arg 220, Ser 223, Thr 224, Gln 226, Lys 227, His 230, Leu 241, Pro 260, Ser 263, Leu 267, Leu 272, Thr 279, Asn 284, Gln 311, Pro 313, 及びLys 315のいずれか１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するアデノシン受容体変異体であるか；
（ｉｉｉ）対応する野生型ニューロテンシン受容体と比較して、配列番号９に定義されたラットニューロテンシン受容体の番号付けした以下の位置：Ala 69, Leu 72, Ala 73, Ala 86, Ala 90, Ser 100, His 103, Ser 108, Leu 109, Leu 111, Asp 113, Ile 116, Ala 120, Asp 139, Phe 147, Ala 155, Val 165, Glu 166, Lys 176, Ala 177, Thr 179, Met 181, Ser 182, Arg 183, Phe 189, Leu 205, Thr 207, Gly 209, Gly 215, Val 229, Met 250, Ile 253, Leu 256, Ile 260, Asn 262, Val 268, Asn 270, Thr 279, Met 293, Thr 294, Gly 306, Leu 308, Val 309, Leu 310, Val 313, Phe 342, Asp 345, Tyr 349, Tyr 351, Ala 356, Phe 358, Val 360, Ser 362, Asn 370, Ser 373, Phe 380, Ala 385, Cys 386, Pro 389, Gly 390, Trp 391, Arg 392, His 393, Arg 395, Lys 397, 及びPro 399のいずれか１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するニューロテンシン受容体変異体であるか；
（ｉｖ）対応する野生型ムスカリン受容体と比較して、配列番号１２に定義されたヒトムスカリン受容体の番号付けした以下の位置：Leu 65, Met 145, Leu 399, Ile 383、及びMet 384のいずれか１つ又は複数に対応する位置に異なるアミノ酸を有するムスカリン受容体変異体である、請求項３から１０のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項１４】
請求項３から１３のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１６】
可溶化された形態であるか、他のタンパク質を実質的に含まないか、又は固体支持体に固定化されている、請求項３から１３のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項１７】
結晶化のための、リガンド結合スクリーニング又はアッセイ開発のような創薬のための、あるいはバイオセンサーとしての請求項３から１３のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体の使用。
【請求項１８】
前記ＧＰＣＲ変異体がヒトカンナビノイド受容体でない、請求項３から１３および１６のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、又は、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記ＧＰＣＲ変異体がヒトカンナビノイド受容体でない、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
請求項３から１３、１６および１８のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体の結晶化形態。
【請求項２１】
前記親ＧＰＣＲが、天然のタンパク質を有するＧＰＣＲ、天然のタンパク質の切断型、又は天然のタンパク質又はその断片に対する融合体、あるいは天然のタンパク質と比較して改変を含むＧＰＣＲであり、前記親ＧＰＣＲが、リガンド結合能を保持する、請求項１から３のいずれか一項に記載のＧＰＣＲ変異体。
【請求項２２】
親野生型ヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と比較して少なくとも一つの置換されたアミノ酸を有する、親野生型ヒトＧＰＣＲの変異体であって、
ＧＰＣＲ変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトＧＰＣＲのアゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアゴニスト立体構造を有し、ＧＰＣＲ変異体が加熱される前にアゴニストと接触させられる場合、又は、ＧＰＣＲ変異体がアゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、あるいは、
ＧＰＣＲ変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトＧＰＣＲのアンタゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアンタゴニスト立体構造を有し、ＧＰＣＲ変異体が加熱される前にアンタゴニストと接触させられる場合、又は、ＧＰＣＲ変異体がアンタゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアンタゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、
親野生型ヒトＧＰＣＲと比較して前記ＧＰＣＲ変異体が、増大した立体構造の熱安定性を有する、親野生型ヒトＧＰＣＲの変異体。
【請求項２３】
親野生型ヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と比較して少なくとも一つの置換されたアミノ酸を有する、親野生型ヒトＧＰＣＲの変異体であって、
ＧＰＣＲ変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトＧＰＣＲのアゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアゴニスト立体構造を有し、ＧＰＣＲ変異体が加熱される前にアゴニストと接触させられる場合、又は、ＧＰＣＲ変異体がアゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、あるいは、
ＧＰＣＲ変異体が、熱変性条件下で、親野生型ヒトＧＰＣＲのアンタゴニスト立体構造に対して寿命が延長したアンタゴニスト立体構造を有し、ＧＰＣＲ変異体が加熱される前にアンタゴニストと接触させられる場合、又は、ＧＰＣＲ変異体がアンタゴニストと接触させられる前に加熱される場合のいずれかにおいて、延長した寿命がアンタゴニストリガンド結合能の保持によって表されることによって、
親野生型ヒトＧＰＣＲと比較して前記ＧＰＣＲ変異体が、増大した立体構造の熱安定性を有し、
さらに、以下の工程：
（ａ）親ＧＰＣＲの１つ又は複数の変異体を提供する工程、
（ｂ）親ＧＰＣＲが特定の立体構造にある際に前記親ＧＰＣＲに結合する特定の分類のリガンドを選択する工程、
（ｃ）熱変性条件下におけるリガンド結合能の損失によって表わされるものとして変性を測定することによって、各ＧＰＣＲ変異体が、選択したリガンドの結合について親ＧＰＣＲの立体構造の熱安定性と比較して、前記リガンドの結合について増大した立体構造の熱安定性を有するか否かを測定する工程、及び
（ｄ）選択したリガンドの結合について親ＧＰＣＲと比較して増大した立体構造の熱安定性を有する変異体を選択する工程、
を含む方法であって、
工程（ｃ）においてＧＰＣＲが備える前記特定の立体構造が、工程（ｂ）において選択されるリガンドの分類に対応する方法によって得られうることによって特徴付けられる、ＧＰＣＲ変異体。