(57)【要約】【課題】  ルシフェラーゼの発光基質となるアミノ酸変性ルシフェリン又はルシフェリン誘導体を提供すること。また、これを用いた検出方法を提供すること。【解決手段】  １個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたルシフェリン又はルシフェリン誘導体を含む、ルシフェラーゼ基質。下記の式(I)で表される化合物。【化１】2014082947.tif 000014（式中、Ｒ1は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸である）【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたルシフェリン又はルシフェリン誘導体を含む、ルシフェラーゼ発光基質。
【請求項２】
１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたルシフェリン誘導体が、下記の式(I)で表される請求項１記載のルシフェラーゼ発光基質。
【化１】
2014082947.tif 000012
（式中、Ｒ1は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸である）
【請求項３】
Ｒ1が、Gly-Pro-Met-Asp-（配列番号１）、Phe-Thr-Val-Gly-（配列番号２）、Leu-Gln-Lys-Gln-（配列番号３）、Phe-Leu-Gly-Lys-（配列番号４）、Phe-Val-Ala-Pro-（配列番号５）、Pro-Phe-His-Leu-（配列番号６）、Gly-Asn-Gln-Trp-（配列番号７）、Met-Gly-Lys-Gly-（配列番号８）、およびVal-Gln-Ser-Lys-（配列番号９）からなる群より選択される請求項２記載のルシフェラーゼ発光基質。
【請求項４】
下記の式(I)で表される化合物。
【化２】
2014082947.tif 000013
（式中、Ｒ1は、Gly-Pro-Met-Asp-（配列番号１）、Phe-Thr-Val-Gly-（配列番号２）、Leu-Gln-Lys-Gln-（配列番号３）、Phe-Leu-Gly-Lys-（配列番号４）、Phe-Val-Ala-Pro-（配列番号５）、Pro-Phe-His-Leu-（配列番号６）、Gly-Asn-Gln-Trp-（配列番号７）、Met-Gly-Lys-Gly-（配列番号８）、およびVal-Gln-Ser-Lys-（配列番号９）からなる群より選択されるオリゴアミノ酸である）
【請求項５】
請求項１〜３いずれか記載のルシフェラーゼ発光基質を含む検体と、ルシフェラーゼと反応させ、発光を検出することを特徴とする、ルシフェラーゼ発光基質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸変性ルシフェリンおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルシフェリン/ルシフェラーゼ反応は、極めてエネルギー変換効率の高い反応であり、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして用いる遺伝子発現解析、食品衛生検査などに広く利用されている。
【０００３】
ルシフェラーゼ酵素と反応して発光を生じる基質として、これまでに種々の化合物が開発されてきた。
【０００４】
例えば、特開2005-530485（特許文献１）では、アミノ酸残基を３つ以上有するアミノ酸変性アミノルシフェリンを発光ルシフェリンの前駆体として使用している。すなわち、プロテアーゼ（具体的には、トリプシン、カスパーゼ３）の作用によりアミノ酸変性アミノルシフェリンがカルボアミド基で分解して、アミノルシフェリンが生成し、これがルシフェラーゼと反応して生じる発光を検出することで、プロテアーゼの検出を行っている。
【０００５】
また、Biochemistry 2006, 45, 11103-11112（非特許文献１）では、グリシン-D-アミノルシフェラーゼを用いたルシフェラーゼアッセイについて報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2005-530485公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochemistry 2006, 45, 11103-11112
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ルシフェラーゼの発光基質となるアミノ酸変性ルシフェリン又はルシフェリン誘導体を提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、アミノ酸変性ルシフェリン又はルシフェリン誘導体を用いた発光検出方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、本発明者は、新規なアミノ酸変性ルシフェリン誘導体を製造し、それがルシフェラーゼと反応して、発光を生じることを見出し、本発明を完成させるに到った。
【００１１】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたルシフェリン又はルシフェリン誘導体を含む、ルシフェラーゼ発光基質。
（２）１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたルシフェリン誘導体が、下記の式(I)で表される（１）記載のルシフェラーゼ発光基質。
【００１２】
【化１】
2014082947.tif 000002
【００１３】
（式中、Ｒ1は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸である）
（３）Ｒ1がGly-Pro-Met-Asp-（配列番号１）、Phe-Thr-Val-Gly-（配列番号２）、Leu-Gln-Lys-Gln-（配列番号３）、Phe-Leu-Gly-Lys-（配列番号４）、Phe-Val-Ala-Pro-（配列番号５）、Pro-Phe-His-Leu-（配列番号６）、Gly-Asn-Gln-Trp-（配列番号７）、Met-Gly-Lys-Gly-（配列番号８）、およびVal-Gln-Ser-Lys-（配列番号９）からなる群より選択される（２）記載のルシフェラーゼ発光基質。
（４）下記の式(I)で表される化合物。
【００１４】
【化２】
2014082947.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ1は、Gly-Pro-Met-Asp-（配列番号１）、Phe-Thr-Val-Gly-（配列番号２）、Leu-Gln-Lys-Gln-（配列番号３）、Phe-Leu-Gly-Lys-（配列番号４）、Phe-Val-Ala-Pro-（配列番号５）、Pro-Phe-His-Leu-（配列番号６）、Gly-Asn-Gln-Trp-（配列番号７）、Met-Gly-Lys-Gly-（配列番号８）、およびVal-Gln-Ser-Lys-（配列番号９）からなる群より選択されるオリゴアミノ酸である）
（５）（１）〜（３）いずれか記載のルシフェラーゼ発光基質を含む検体と、ルシフェラーゼと反応させ、発光を検出することを特徴とする、ルシフェラーゼ発光基質の検出方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、新規なアミノ酸変性ルシフェリン又はルシフェリン誘導体が提供された。これらの化合物とルシフェラーゼとの反応により生じる発光は、発光分析方法に用いることができる。例えば、この発光分析方法により、新規なアミノ酸変性ルシフェリン又はルシフェリン誘導体が存在する検体であるか否かを高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】製造例１で製造した化合物（Phe-Leu-Gly-Lys-アミノルシフェリン）のＴｏｆ−Ｍｓスペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
【００１９】
本発明は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたルシフェリン又はルシフェリン誘導体を含む、ルシフェラーゼ基質を提供する。
【００２０】
ルシフェリン又はルシフェリン誘導体に付加される１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸を例示することができ、ルシフェリン又はルシフェリン誘導体に付加される２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸としては、Gly-Pro-Met-Asp-（配列番号１）、Phe-Thr-Val-Gly-（配列番号２）、Leu-Gln-Lys-Gln-（配列番号３）、Phe-Leu-Gly-Lys-（配列番号４）、Phe-Val-Ala-Pro-（配列番号５）、Pro-Phe-His-Leu-（配列番号６）、Gly-Asn-Gln-Trp-（配列番号７）、Met-Gly-Lys-Gly-（配列番号８）、およびVal-Gln-Ser-Lys-（配列番号９）などのオリゴアミノ酸を例示するこができるが、これらに限定されることはない。また、アミノ酸は、L体、D体、ラセミ体のいずれであってもよい。
【００２１】
ルシフェリン又はルシフェリン誘導体は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されても、ルシフェラーゼの作用により発光するものであれば特に限定されないが、好ましくは、甲虫由来のホタル・ルシフェリン（すなわち、多複素式有機酸（Ｓ）−４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）チアゾール−４−カルボン酸の誘導体である、（Ｓ）−４，５−ジヒドロ−２−（６−アミノベンゾチアゾール−２−イル）チアゾール−４−カルボン酸（以下、「アミノルシフェリン」と記す）である。
【００２２】
ルシフェリン又はルシフェリン誘導体は塩の形態であってもよい。塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩などを挙げることができる。
【００２３】
１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸が付加されたアミノルシフェリンは、下記の式(I)で表される。
【００２４】
【化３】
2014082947.tif 000004
【００２５】
（式中、Ｒ1は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸である）
アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのアミノ酸を例示することができるが、これらに限定されることはない。また、アミノ酸は、L体、D体、ラセミ体のいずれであってもよい。
【００２６】
式(I)中、Ｒ1は、Gly-Pro-Met-Asp-（配列番号１）、Phe-Thr-Val-Gly-（配列番号２）、Leu-Gln-Lys-Gln-（配列番号３）、Phe-Leu-Gly-Lys-（配列番号４）、Phe-Val-Ala-Pro-（配列番号５）、Pro-Phe-His-Leu-（配列番号６）、Gly-Asn-Gln-Trp-（配列番号７）、Met-Gly-Lys-Gly-（配列番号８）、およびVal-Gln-Ser-Lys-（配列番号９）からなる群より選択されるとよい。
【００２７】
本発明のルシフェラーゼ基質と反応して、発光を生ぜしめるルシフェラーゼは、特に限定されるわけではないが、好ましくは、甲虫由来のホタル・ルシフェリン（すなわち、多複素式有機酸Ｄ−（−）−２−（６‘ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−△２−チアゾリン−４−カルボン酸）を発光基質とし、これを酸化触媒して光子を発する酵素で、ホタル科、ヒカリコメツキ科、ホタルモドキ科、イリオモテボタル科など発光甲虫由来で発光反応に与る酵素全てを含む。この中には組換えDNA技術や変異技術などにより、酵素タンパク自体の安定性や発光特性などが人為的に改変された酵素も含まれる。
【００２８】
本発明のルシフェリン基質とルシフェラーゼの発光反応は、１０℃〜５０℃の温度で、pH４〜１０の条件下で行うとよい。本発明のルシフェリン基質とルシフェラーゼの発光反応において、発光半減期を１分以上、３０分以上、６０分以上、７時間以上または１０時間以上に制御することができる。本明細書において、「発光半減期」とは、発光量が最大発光量の１／２になるのに要する時間をいう。発光半減期は、経時発光量を測定することにより、求めることができる。ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応の発光量は、公知の方法により測定することができる。例えば、市販のルミノメーターにより発光強度を測定する。
【００２９】
発光量の測定は、所望の期間にわたり、所望の時間間隔で行えばよい。例えば、プロテアーゼ又はプロテアーゼ産生微生物の検出においては、発光反応の開始直後から、１秒〜３０分間の積算発光を測定するとよい。
【００３０】
また、本発明は、式(I)で表される化合物を提供する。
【００３１】
【化４】
2014082947.tif 000005
【００３２】
（式中、Ｒ1は、１個のアミノ酸（但し、グリシンは除く）又は２〜４個のアミノ酸からなるオリゴアミノ酸である）
Ｒ1については、上述した。
【００３３】
式(I)で表される化合物は、これらの化合物を分解・生成する環境からも得られるが、公知の方法を準用して合成できる。
【００３４】
式(I)で表される化合物は、例えば、下記の式(III)で表される化合物と６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールを反応させ、式(IV)で表される化合物を生成させ、さらに、式(IV)で表される化合物とＤ−システイン又はその塩若しくはエステルを反応させ、式(V)で表される化合物を生成させ、脱保護基することで得られる。
【００３５】
【化５】
2014082947.tif 000006
【００３６】
（式中、Ｒ12は、アミノ基が保護されたアミノ酸（但し、グリシンは除く）又はＮ末端のアミノ基が保護されたオリゴアミノ酸であるが、Ｎ末端以外のアミノ基を有する場合には、そのアミノ酸も保護されてもよい）
【００３７】
【化６】
2014082947.tif 000007
【００３８】
（式中、Ｒ12は、アミノ基が保護されたアミノ酸（但し、グリシンは除く）又はＮ末端のアミノ基が保護されたオリゴアミノ酸であるが、Ｎ末端以外のアミノ基を有する場合には、そのアミノ酸も保護されてもよい）
【００３９】
【化７】
2014082947.tif 000008
【００４０】
（式中、Ｒ12は、アミノ基が保護されたアミノ酸（但し、グリシンは除く）又はＮ末端のアミノ基が保護されたオリゴアミノ酸であるが、Ｎ末端以外のアミノ基を有する場合には、そのアミノ酸も保護されてもよい）
これらの化合物のアミノ基の保護基としては、tert-ブトキシカルボニル基(Boc)、ベンジルオキシカルボニル基(Z)、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)などを例示することができる。
【００４１】
式(III)で表される化合物は、アミノ基が保護されたアミノ酸（但し、グリシンは除く）又はＮ末端のアミノ基が保護されたオリゴアミノ酸をN-メチルモルフォリンの存在下でイソブチルクロロホーメートと反応させることにより、製造することができる。
【００４２】
溶剤としては、活性水素基を構造に含まない、エーテル系、ケトン系、石油系溶剤を用いることができる。
【００４３】
エーテル系溶媒としては、分岐もしくは直鎖状エーテル、及び環状エーテルが有効に用いられる。具体的には、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、シクロペンチルメチルエーテル、等が挙げられる。
【００４４】
ケトン系溶剤としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、およびシクロヘキサノン等が挙げられる。
【００４５】
石油系溶剤としては、トルエン、キシレンやその他高沸点の芳香族溶剤等や、ヘキサン、シクロヘキサン等の脂肪族および脂環族溶剤を使用することも可能である。
【００４６】
これらの内、溶解度の高いエーテル系溶媒が好ましい。さらに沸点の低い、ジメチルエーテル、テトラヒドロフランが特に好ましい。
【００４７】
溶剤量は、オリゴアミノ酸を溶解できる量が必要であり、オリゴアミノ酸１に対し１〜１００倍量を用いることができる。
【００４８】
反応温度は低いほうが好ましく、選択した溶媒の凝固温度以上でなるべく低温で行うことができる。具体的には-20〜10℃で行うことが好ましい。
【００４９】
反応促進、反応温度の低下および副生する塩化水素の除去を目的に塩基性触媒（例えば、ピリジン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルフォリン、トリエチルアミン、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム）を添加することができる。
【００５０】
反応時間は適時、溶剤種、溶媒量、反応温度、触媒量、時間程度およびイソブチルクロロホーメートの等量で０．１〜１００時間の間で設定できる。
【００５１】
式 (IV)で表される化合物は、式(III)で表される化合物と６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールを反応させることにより、製造することができる。
【００５２】
溶剤としては、特に制限はないが、水、アルコール系、エーテル系、ケトン系、芳香族炭化水素系溶媒、脂肪族炭化水素系溶剤、ハロゲン化炭化水素系溶媒を用いることができる。
【００５３】
アルコール系溶媒としては、メタノール、１−ブタノール、２−ブタノール、シクロヘキサノール等が挙げられ、ケトン系溶媒としては、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン等が挙げられる。エーテル系溶媒としては、分岐もしくは直鎖状エーテル、及び環状エーテルが有効に用いられ、具体的には、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、シクロペンチルメチルエーテルが挙げられる。また、芳香族炭化水素系溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられ、脂肪族炭化水素系溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等が挙げられ、ハロゲン化炭化水素系溶媒としてはクロロホルム、二塩化炭素、四塩化炭素、塩化エチレン等が挙げられる。これらの中では、その安全性や、後処理において溶媒を除去する際の操作性の観点から、エーテル系、特にジメチルエーテル、テトラヒドロフランが好ましい。
これらの有機溶媒は、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００５４】
溶剤量は、溶解できる量が必要であり、生成物に対し１〜１００倍量を用いることができる。
【００５５】
反応は−２０〜２０℃で行うことができる。
【００５６】
反応時間は制限がなく、０．１〜１００時間の間で設定できる。
【００５７】
式(V)で表される化合物は、式(IV)で表される化合物とＤ−システイン又はその塩若しくはエステルを反応させることにより、製造することができる。
【００５８】
溶剤としては十分に脱気した水を用いることができ、式（ＩＶ）で表される化合物１あたり０．５〜１００倍量用いることができる。反応温度は０〜４０℃で行うことができ、反応間ｐＨを６〜８に維持する。反応時間は０．５〜１００時間とすることができる。
【００５９】
式(V)で表される化合物を脱保護することにより、式(I)で表される化合物を得ることができる。
【００６０】
溶剤としては、ハロゲン化炭化水素系溶媒を用いることができ、クロロホルム、二塩化炭素、四塩化炭素、塩化エチレン等が挙げられる。触媒として、ハロゲン化酢酸を用いることができ、トリフルオロ酢酸が特に好ましい。触媒の濃度はハロゲン化炭化水素系溶媒に対して、０．５〜５０％とすることができ、１０〜３０％が好ましい。溶剤量は、溶解できる量が必要であり、生成物に対し１〜１００倍量を用いることができる。
【００６１】
反応は−２０〜４０℃で行うことができる。反応時間は制限がなく、０．１〜１００時間の間で設定できる。
【００６２】
本発明のルシフェラーゼ基質をルシフェラーゼと反応させ、その発光を検出することにより、ルシフェラーゼ発光基質を検出することができる。
【００６３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼの発光反応は、アデノシン三リン酸(ATP)とMgイオンの存在下、基質であるルシフェリンをルシフェラーゼと反応させることにより生じうる。この発光反応においては、コエンザイムA（CoA）、還元剤（例えば、ジチオトレイトール（DTT）、ピロリン酸、ピロリン酸塩、ジチオエリトルトール、βメルカプトエタノール、２−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノール、グルタチオンなど）、緩衝剤（例えば、Tris-HCl、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳなど）などを添加してもよい。本発明のルシフェラーゼ基質とルシフェラーゼの発光反応も同様の方法で行うことができる。また、ルシフェラーゼ発光基質の検出にあたっては、上記の添加剤の他、界面活性剤などを添加してもよい。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔製造例１〕
Phe-Leu-Gly-Lys-アミノルシフェリンの合成スキームを以下に示す。
【００６５】
【化８】
2014082947.tif 000009
【００６６】
２００ｍｌ三つ口フラスコに、窒素雰囲気下、ＴＨＦ２０ｍｌ、つくばオリゴサービス株式会社製Ｐｈｅ（Ｂｏｃ）ＬｅｕＧｌｙＬｙｓ（Ｂｏｃ）０．３８５０ｇを滴下した。−６〜−１０℃で、東京化成工業株式会社製Ｎ−メチルモルフォリン０．１１７３ｇを滴下し、さらに、東京化成工業株式会社製イソブチルクロロホルメート０．０８７１ｇのＴＨＦ溶液を滴下し、さらに、６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（Aldrich）０．０９９６ｇのＴＨＦ溶液を滴下した。室温で一晩攪拌し、ＴＨＦを留去し、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、５重量％塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、酢酸エチルを留去して、工程２生成物０．４４７４ｇを得た。
【００６７】
５０ｍｌ先細フラスコに、窒素雰囲気下、室温で、無水炭酸ナトリウム０．０５７８ｇ、東京化成工業株式会社製Ｄ−システイン塩酸塩０．０８５４ｇの水溶液を滴下し、工程２生成物０．４４７４ｇのメタノール溶液を滴下し、一晩攪拌後、溶媒を留去し、ジクロロメタンで希釈し、トリフルオロ酢酸１ｍｌを滴下し、溶剤を留去して、粗製生成物０．４０ｇを得た。粗製生成物を０．１ｇをとり、分析用カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  を用いて、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）およびメタノールを用いるＨＰＬＣカラムによって精製した。精製するフラクションを集め、凍結乾燥して工程４生成物を０．０１ｇを得た。工程４生成物は、Ｔｏｆ−Ｍｓにより、７２５．２９７の分子量が検出され、理論値７２５．２９０と一致して、目的物であることが確認された（図１）。
【００６８】
〔実施例１〕
下記の表１の発光試薬を調製した。ルシフェラーゼは、プロメガ社製、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ(ＴＭ)  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いた。
【００６９】
【表１】
2014082947.tif 000010
【００７０】
製造例１で製造したPhe-Leu-Gly-Lys-アミノルシフェリン０．０３２ｍｇに対して、発光試薬１００μLを添加し、ルミノメーター(Berthold社製 LB9506)によって得られる発光反応開始から１０秒間における積算発光強度を測定した。結果を表２に示す（「合成基質」）。対照として、Phe-Leu-Gly-Lys-アミノルシフェリンを添加せず、発光試薬のみの場合の発光強度も測定した（表２の「基質なし」）
【００７１】
【表２】
2014082947.tif 000011
【００７２】
本発明の発光基質は、十分な発光強度で発光観測できることがわかった。
【００７３】
以上のことから、上記ペプチドを付加したルシフェリン又はルシフェリン誘導体は、ルシフェラーゼの発光基質として、発光検出に利用できることがわかった。例えば、測定対象の試料（例えば、ヒト血液、動物血液、ヒト体液、動物体液、細胞など）に含まれる物質との代謝反応などで、上記ペプチド付加ルシフェリン又はルシフェリン誘導体が生じるように設計すれば、その試料中に代謝反応など起こす物質が存在すれば、ルシフェラーゼ発光基質（すなわち、ペプチド付加ルシフェリン又はルシフェリン誘導体）が生成するので、ルシフェラーゼとの反応により、発光が検出される。この発光を検出することにより、代謝反応など起こす物質の存在を検出することができる。また、ペプチド付加ルシフェリン又はルシフェリン誘導体をこの発光検出法における発光基質の標準品として予め用意しておけば、試料からの発光を定量化することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の新規な発光基質は、従来の発光検出方法に広く利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
＜配列番号１＞
配列番号１は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、式(I)で表される化合物中のR1の基の一例であるアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【配列表】
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