【手続補正書】
【提出日】令和3年9月10日(2021.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質に対する応答性の高い細胞を選択する方法であって、
（１ａ）標的物質を含む試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
（１ｂ）蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
（１ｃ）前記複数の細胞のうち、上位５０％以内の前記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する工程と、を備える、方法。
【請求項２】
第一の流路と、
前記第一の流路に隣接する第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、前記第一の流路側に前記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備えるマイクロ流路デバイスを用いて実施する請求項１記載の方法であって、
前記工程１ａが、
（Ａ１）前記第一の流路内の圧力が前記第二の流路内の圧力よりも高くなるように前記第一の流路に前記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、前記第一の流路側の開口部に前記細胞を捕捉する工程と、
（Ａ２）前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に標的物質を含む試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記標的物質を含む試料を接触させる工程と、を備え、
前記工程１ｃの後に、
（１ｄ）前記第二の流路内の圧力が前記第一の流路内の圧力よりも高くなるように前記第二の流路に液体を導入し、前記捕捉された細胞を前記開口部から解放する工程と、
（１ｅ）前記解放された細胞のうち前記選択された任意の細胞を回収する工程と、を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光強度の上昇速度が、所定時間におけるＩｔの時間変化率であり、
前記Ｉｔは、（Ｆｔ−Ｆ０）／Ｆ０であり、
前記Ｆ０は、前記試料を接触させる前の前記細胞の蛍光強度を表し、
前記Ｆｔは、前記試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における前記細胞の蛍光強度を表し、
前記所定時間は、前記試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程１ｃにおいて、前記複数の細胞のうち、上位３０％以内の前記蛍光強度の上昇速度を示した任意の細胞を選択する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
（２ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
（２ｂ）蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
（２ｃ）異なる濃度の前記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程２ａ及び工程２ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
（２ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を前記細胞に接触させる工程と、
（２ｅ）前記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
（２ｆ）前記細胞のうち、前記試料又はいずれかの前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位５０％以内であった任意の細胞を選択する工程と、
（２ｇ）工程２ｅにおいて算出された前記試料の上昇速度を、工程２ｂ及び工程２ｃにおいて算出された前記標準試料の上昇速度と比較して、前記試料中の前記標的物質の濃度を算出する工程であって、前記比較される上昇速度は、工程２ｆにおいて選択された細胞について算出された上昇速度である、工程と、を備え、
工程２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、及び２ｇはこの順に行われ、
工程２ｆは、工程２ｂの後かつ工程２ｇの前に任意の段階で行われる、方法。
【請求項６】
第一の流路と、
前記第一の流路に隣接する第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とをつなぐ連絡部であって、前記第一の流路側に前記細胞を捕捉可能な開口部を有する連絡部と、を備えるマイクロ流路デバイスを用いて実施する請求項５記載の方法であって、
前記工程２ａの前に、前記第一の流路内の圧力が前記第二の流路内の圧力よりも高くなるように前記第一の流路に前記複数の細胞を含む懸濁液を導入し、前記第一の流路側の開口部に前記細胞を捕捉する工程を備え、
前記工程２ａが、前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に前記標準試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記標準試料を接触させる工程を備え、
前記工程２ｄが、前記第一の流路と前記第二の流路との圧力差を維持したまま、前記第一の流路又は前記第二の流路に前記試料を導入し、前記捕捉された細胞に前記試料を接触させる工程を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記蛍光強度の上昇速度が、所定時間におけるＩｔの時間変化率であり、
前記Ｉｔは、（Ｆｔ−Ｆ０）／Ｆ０であり、
前記Ｆ０は、前記試料又は前記標準試料を接触させる前の前記細胞の蛍光強度を表し、
前記Ｆｔは、前記試料又は前記標準試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の任意の段階における前記細胞の蛍光強度を表し、
前記所定時間は、前記試料又は前記標準試料を接触させた後であって、かつ、前記蛍光強度がプラトーに達する前の、任意の二つ段階の間の時間である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程２ｆにおいて、前記細胞のうち、前記試料又はいずれかの前記標準試料について算出された蛍光強度の上昇速度が上位３０％以内であった任意の細胞を選択する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光強度の上昇速度が、Ｉｔの時間変化率の最大値である、請求項３又は７に記載の方法。
【請求項１０】
試料中の未知濃度の標的物質の濃度を決定する方法であって、
（３ａ）既知濃度の標的物質を含む標準試料を複数の細胞に接触させる工程であって、
前記細胞は、前記標的物質の受容体と蛍光指示薬とを有する細胞であり、
前記蛍光指示薬は、前記標的物質と前記受容体との結合の結果蛍光を発する工程と、
（３ｂ）蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
（３ｃ）異なる濃度の前記標的物質を含む１以上の標準試料を用いて、工程３ａ及び工程３ｂの組み合わせを繰り返し、各標準試料について、蛍光強度の上昇速度を算出する工程と、
（３ｄ）未知濃度の標的物質を含む試料を前記細胞に接触させる工程と、
（３ｅ）前記試料を接触させた後の蛍光強度の上昇速度を前記細胞ごとに算出する工程と、
（３ｆ）工程３ｅにおいて算出された前記試料の上昇速度を、工程３ｂ及び工程３ｃにおいて算出された前記標準試料の上昇速度と比較して、前記試料中の前記標的物質の濃度を算出する工程と、をこの順に備える方法。
【請求項１１】
前記標的物質が匂い物質であり、
前記複数の細胞が、昆虫の嗅覚受容体及びカルシウム感受性蛍光タンパク質を有する昆虫細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的物質がボンビカールであり、
前記複数の細胞が、ＢｍＯＲ−３タンパク質及びＧＣａＭＰ６ｓタンパク質を有するＳｆ２１細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。