(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの、肺及び気道の上皮細胞の分化を誘導する方法を提供する。【解決手段】肺及び気道の上皮細胞が富化されている単離された細胞集団。肺野に系列決定された細胞が富化されている単離された細胞集団。前記細胞が、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＰ２、ＧＡＴＡ６、Ｐ６３、ムチン５ａｃ、ムチン２、ムチン５ｂ、ＦＯＸＪ１、アセチル化チューブリン＋、ＣＣ−１０、ｐｒｏ−ＳＰＣ、ＳＰＢ、ムチン１、リゾチーム、レクチンＤＢＡ、ポドプラニン＋、アクアポリン１＋、レクチンＲＣＡ１２０＋、又はそれらの組み合わせを発現する細胞集団。【選択図】図１
2014023519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺及び気道の上皮細胞が富化されている単離された細胞集団。
【請求項２】
肺野に系列決定された細胞が富化されている単離された細胞集団。
【請求項３】
前記細胞がＮＫＸ２．１を発現する、請求項１又は２に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記細胞が、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＰ２、ＧＡＴＡ６、Ｐ６３、ムチン５ａｃ、ムチン２、ムチン５ｂ、ＦＯＸＪ１、アセチル化チューブリン＋、ＣＣ−１０、ｐｒｏ−ＳＰＣ、ＳＰＢ、ムチン  １、リゾチーム、レクチン  ＤＢＡ、ポドプラニン＋、アクアポリン  １＋、レクチン  ＲＣＡ１２０＋、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項１又は２に記載の細胞集団。
【請求項５】
９０％までの肺及び気道の上皮特異的細胞を含む、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
８０％までの肺野に系列決定された細胞を含む、請求項２に記載の細胞集団。
【請求項７】
前記細胞が、気管細胞、気管支細胞、肺胞細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１又は２に記載の細胞集団。
【請求項８】
細胞が、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＳＯＸ２、ｐ６３、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＪ１、又はそれらの組み合わせを発現する、肺野に系列決定された細胞の精製された調製物。
【請求項９】
前側前腸内胚葉細胞からの肺野に系列決定された細胞の誘導を増進する方法であって、
（ａ）前側前腸内胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤又はＴＧＦ−βシグナリング阻害剤を用いて、少なくとも１日培養すること、及び
（ｂ）前記細胞を、Ｗｎｔタンパク質若しくはＣＨＩＲ９９０２１等のその薬理学的アゴニスト、ＢＭＰ因子、ＦＧＦタンパク質、ＥＧＦタンパク質、レチノイン酸、又はそれらの組み合わせの存在下において少なくとも５日間培養すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記細胞を、Ｗｎｔ阻害剤及びＴＧＦ−βシグナリング阻害剤の存在下で培養することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を、マトリゲル及び／又は成熟化培地の存在下で培養することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記成熟化培地が、デキサメタゾン、メチルブチリルｃＡＭＰ、ヒポキサンチン、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）の培養が、ＢＭＰ４の存在下又は非存在下において行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｂ）の培養が、レチノイン酸の存在下又は非存在下において行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｂ）の培養が、デキサメタゾン、メチルブチリルｃＡＭＰ、及びヒポキサンチンの存在下又は非存在下において行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｂ）の培養が、ｎｏｔｃｈ阻害剤の存在下又は非存在下において行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｎｏｔｃｈ阻害剤がガンマ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＨＨ阻害剤を添加することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＨＨ阻害剤がシクロパミンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｗｎｔ阻害剤がＷｎｔ３ａ阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｗｎｔ阻害剤がＩＷＰ２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＢＭＰ阻害剤が、ｎｏｇｇｉｎ若しくはドルソモルフィン、又はその他の薬理学的な選択的ＢＭＰ阻害剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤がＳＢ３４１５４３である、請求項９に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＳＯＸ２、ｐ６３、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＪ１、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項２５】
前記肺野に系列決定された細胞が、特徴付けられていない新規のｐ６３発現上皮、杯状細胞、粘膜下腺上皮、クララ細胞、基底細胞、繊毛細胞、Ｉ型肺胞細胞、ＩＩ型肺胞細胞、又はそれらの組み合わせの集団を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項２６】
前記肺野に系列決定された細胞が、Ｍｕｃ５ａ、Ｍｕｃ２、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項２７】
前記肺野に系列決定された細胞が、Ｍｕｃ５ｂ、Ｍｕｃ２、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項２８】
前記肺野に系列決定された細胞がＣＣ１０を発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項２９】
前記肺野に系列決定された細胞がｐ６３を発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項３０】
前記肺野に系列決定された細胞が、アセチル化チューブリン、ｆｏｘｊ１、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項３１】
前記肺野に系列決定された細胞が、Ｍｕｃ１、ＳＰ−Ｂ、ｐｒｏ−ＳＰ−Ｃ、リゾチーム、レクチン  ＤＢＡ、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項３２】
前記肺野に系列決定された細胞が、ポドプラニン、アクアポリン  １、アクアポリン  ５、Ｔ１α、レクチン  ＲＣＡ１２０、又はそれらの組み合わせを発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＢＭＰ因子がＢＭＰ４である、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＦＧＦタンパク質がＦＧＦ１０又はＦＧＦ７である、請求項９に記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＰ２、ＣＧＲＰ、ＣＣＳＰ、ＦＯＸＪ１、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ｐ６３、ＣＣ１０、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、又はそれらの組み合わせを発現する、肺野に系列決定された細胞の精製された調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月２４日に出願された、米国仮出願番号６１／６７５，０６９、表題「ヒト多能性幹細胞からの肺及び気道の上皮の産生並びにその使用」に対し、優先権を主張し、参照することにより該出願全体を本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肺疾患は主要な死亡原因である。いくつかの肺疾患については、移植が効果的な治療の選択肢であるが、しかしながら、それはドナー臓器の低い利用可能性、移植手順に関連した外科的及び内科的合併症、並びに免疫学的拒絶により妨げられる。それ故、自己細胞から肺組織を再生する可能性は、重要な医学の前進となるであろう。
【発明の概要】
【０００３】
最初の一連の実施形態によれば、基盤技術（platform）は、例えば、嚢胞性線維症、気管食道瘻（tracheoesophagal fistula）、サーファクタント欠乏症候群、乳児呼吸窮迫症候群、呼吸器感染等の疾患についての、患者特異的ｉＰＳ細胞を使用した薬剤スクリーニングを提供する。
【０００４】
第２の一連の実施形態によれば、方法は、終末期疾患肺を置換する移植のために自己のｉＰＳＣ由来の呼吸器細胞をヒト脱細胞化肺マトリックスへ播種することを含み、それ故、ドナー臓器不足及び免疫学的拒絶を回避する。
【０００５】
第３の一連の実施形態によれば、単離された細胞集団は、肺及び気道上皮細胞並びに肺野に系列決定された細胞が富化されている。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＰ２、ＧＡＴＡ６、Ｐ６３、ムチン（Ｍｕｃｉｎ）５ａｃ、ムチン２、ムチン５ｂ、ＦＯＸＪ１、アセチル化チューブリン（ａｃｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｔｕｂｕｌｉｎ）＋、ＣＣ−１０、ｐｒｏ−ＳＰＣ、ＳＰＢ、ムチン１、リゾチーム、レクチン（ｌｅｃｔｉｎ）  ＤＢＡ、ポドプラニン（ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ）＋、アクアポリン（ａｑｕａｐｏｒｉｎ）１＋、レクチン  ＲＣＡ１２０＋、又はこれらの組み合わせを発現する。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は、９０％までの肺及び気道上皮特異的細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は、８０％までの肺野に系列決定された細胞を含む。前記細胞集団は、気管細胞、気管支細胞、肺胞細胞、又はそれらの組み合わせを含む細胞を有する。いくつかの実施形態において、肺野に系列決定された細胞の精製調製物は、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＳＯＸ２、ｐ６３、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＪ１、又はそれらの組み合わせを発現する。
【０００６】
第４の一連の実施形態によれば、前側前腸内胚葉細胞からの肺野に系列決定された細胞の誘導を増進する方法は、（ａ）前側前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞を、少なくとも１日、ＢＭＰ阻害剤又はＴＧＦ−βシグナリング阻害剤と共に培養すること；及び（ｂ）前記細胞を、少なくとも５日間、Ｗｎｔタンパク質又はその薬理学的アゴニスト（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）、ＢＭＰ因子、ＦＧＦタンパク質、ＥＧＦタンパク質、レチノイン酸、又はそれらの組み合わせの存在下で培養することを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、前記細胞の培養は、Ｗｎｔ阻害剤及びＴＧＦ−βシグナリング阻害剤の存在下で起きる。いくつかの実施形態において、前記細胞の培養は、マトリゲル及び／又は成熟化培地の存在下で起きる。該成熟化培地は、デキサメタゾン、メチルブチリルｃＡＭＰ、ヒポキサンチン、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記工程（ｂ）の培養は、ＢＭＰ４の存在下又は非存在下で起きる。いくつかの実施形態において、前記工程（ｂ）の培養は、レチノイン酸、デキサメタゾン、メチルブチリルｃＡＭＰ、ヒポキサンチン、若しくはｎｏｔｃｈ阻害剤の存在下又は非存在下で起きる。多様な実施形態において、ｎｏｔｃｈ阻害剤として、ＤＡＰＴ（ガンマ−セクレターゼ阻害剤）が挙げられる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、前記方法は、ＳＨＨ阻害剤を添加することを更に含む。前記ＳＨＨ阻害剤はシクロパミン（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ）である。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔ阻害剤としては、Ｗｎｔ３ａ阻害剤又はＩＷＰ２が挙げられる。ＢＭＰ阻害剤は、ｎｏｇｇｉｎ若しくはドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、又はその他の選択的薬理学的ＢＭＰ４阻害剤である。前記ＴＧＦ−βシグナリング阻害剤はＳＢ３４１５４３である。
【０００９】
第５の一連の実施形態によれば、細胞は、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＳＯＸ２、ｐ６３、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＪ１、又はそれらの組み合わせを発現する。肺野に系列決定された細胞は、特徴付けされていない新規のｐ６３発現上皮、杯状細胞、粘膜下腺上皮、クララ細胞、基底細胞、繊毛細胞、Ｉ型肺胞細胞、ＩＩ型肺胞細胞、又はそれらの組み合わせの群を含む。いくつかの実施形態において、肺野に系列決定された細胞は、Ｍｕｃ５ａ、Ｍｕｃ２、又はそれらの組み合わせ、Ｍｕｃ５ｂ、Ｍｕｃ２、又はそれらの組み合わせ、ＣＣ１０、ｐ６３、アセチル化チューブリン、ＦＯＸＪ１、又はそれらの組み合わせ、Ｍｕｃ１、ＳＰ−Ｂ、ｐｒｏ−ＳＰ−Ｃ、リゾチーム、レクチン  ＤＢＡ、又はそれらの組み合わせ、ポドプラニン、アクアポリン１、アクアポリン５、Ｔ１α、レクチン  ＲＣＡ１２０、又はそれらの組み合わせも発現する。いくつかの実施形態において、ＢＭＰ因子はＢＭＰ４である。前記ＦＧＦタンパク質は、ＦＧＦ１０又はＦＧＦ７である。
【００１０】
第６の一連の実施形態によれば、肺野に系列決定された細胞の精製調製物は、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＰ２、ＣＧＲＰ、ＣＣＳＰ、ＦＯＸＪ１、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ、ｐ６３、ＣＣ１０、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、又はそれらの組み合わせを発現する細胞を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
以下の図において、説明目的で、多様な実施形態を記述するが、本発明の実施形態は、これらの図で示される詳細により限定されない。本特許出願は少なくとも１つのカラーの図面を含む。
【００１２】
【図１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生したＡＦＥのｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在能力（ａ）ＮＳＧマウスの腎臓被膜下へ移植したＨＥＳ２から５週間後に誘導されたテラトーマのＨ／Ｅ染色。３つの右側のパネルは、神経外胚葉（neurectoderm）（神経ロゼット）、内胚葉（腸上皮）及び中胚葉（軟骨）をそれぞれ示す。（ｂ）免疫不全マウスの腎臓被膜下への、ＮＳで誘導したＡＦＥ細胞（ＨＥＳ２細胞由来）の移植後、５週間で生じた増殖のＨ／Ｅ染色。（ｃ）ＦＯＸＡ２、ＰＡＸ９、ＡＩＲＥ及びＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ（ＳＰ−Ｃ）について染色した、（ｂ）の組織の免疫蛍光解析。
【図２】ｈＰＳＣからのＡＦＥ誘導の概要。
【図３】図上部のスキームに従って分化させた細胞における、ＮＫＸ２．５、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＡ２及びＥＰＣＡＭの発現。
【図４】腹側化ＡＦＥにおけるＳＰ−Ｃの誘導。
【図５】図上部のスキームに従って培養したｈＰＳＣにおける、ＮＫＸ２．１、ｐ６３、ＦＯＸＡ２及びＭｕｃ５ａの発現。
【図６】ＷＦＫＢＥ＋ＲＡ存在下で腹側化したＡＦＥ（図の上部を参照）をＤＣＩ及びマトリゲル中に播種した後に得られた球状コロニーにおける、コロニー形態並びにＮＫＸ２．１、ｐ６３及びＦＯＸＡ２の発現。
【図７】ＮＳ、ＮＳ＞ＳＩ又はＳＩ＞ＮＳと、それに次ぐＷＦＫＢＥ＋ＲＡに曝露し、ＡＦＥを誘導した後の、ＮＫＸ２．１（青）及びＰＡＸ１（赤）の相対的発現（１３日目に解析）。
【図８】図上部に模式的に示したように、ＮＯＧＧＩＮ／ＳＢ、又はＮＯＧＧＩＮ／ＳＢとそれに続くＩＷＰ２／ＳＢのいずれかにより産生したＡＦＥの腹側化後のＮＫＸ２．１及びＦＯＸＡ２の発現。
【図９】ＡＦＥの腹側化：（ａ）パネル上部に模式的に示した２つの条件で産生したＨＥＳ２由来の細胞における、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．５、ＰＡＸ１及びＰ６３の発現（ｎ＝６培養ウェル（２回の独立した実験から）、＊  ＮＯＧＧＩＮ／ＳＢ−４３１５４２と有意に異なる）（ｂ）パネル上部に模式的に示した条件での、ＡＦＥへ分化したＨＤＦ２（上部）及びＨＦＤ９（下部）ｈｉＰＳ細胞におけるＳＯＸ１、ＮＫＸ２．１及びＰＡＸ１  ｍＲＮＡの発現（ｎ＝４〜６培養ウェル（２回の独立した実験から）、＊  ＮＳと有意に異なる）（ｃ）Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＮＳ及びＷＦＫＢＥで順次処理した後の、分化したＨＤＦ９  ｈｉＰＳ細胞におけるＮＫＸ２．１の免疫蛍光。
【図１０】パネル上部に模式的に示した３つの条件で産生したＨＥＳ２由来の細胞における、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．５及びＰＡＸ１の発現（ｎ＝４〜６培養ウェル（３回の独立した実験から）、＊  他の条件と有意に異なる）。
【図１１】腹側化ＡＦＥの肺としての潜在能力。（ａ）パネル上部に示した２つの条件で産生したＨＥＳ２由来の細胞における、ＰＡＸ１、ＮＫＸ２．１、ＦＯＸＰ２、ＧＡＴＡ６及びＦＯＸＪ１の発現（ｎ＝４〜６培養ウェル（複数の実験から）、＊  ＷＦＫＢＥと有意に異なる）。（ｂ）表示した因子の存在下での、腹側化ＡＦＥにおけるＳＰ−Ｃの誘導。（ｃ）ＷＦＫＢＥ＋ＡＴＲＡ（ｄ１１）及びそれに続くＷｎｔ３ａ＋ＦＧＦ１０＋ＦＧＦ７（ｄ１３）で培養したＡＦＥにおける、１３日目のＮＫＸ２．１（緑）の発現（青＝ＤＡＰＩ）。
【図１２】ＷＦＫＢＥ腹側化カクテルへ、ＡＴＲＡの濃度を増加させて加えたときの、ＧＡＴＡ６発現への効果（ｎ＝３）。
【図１３】Ｒｏｃｋらのプロトコールに従う、マウス気管から単離したＮｇｆｒ＋細胞からの培養の、１１及び１７日目の球状コロニー。
【図１４−１】４日目の内胚葉（Ａ）は、４．５日目（Ｂ）及び５日目（Ｃ）の内胚葉と比較して、肺野細胞（Ｎｋｘ２．１＋ＦＯＸＡ２＋）の系列決定について、より高い能力を有する。
【図１４−２】４日目の内胚葉（Ａ）は、４．５日目（Ｂ）及び５日目（Ｃ）の内胚葉と比較して、肺野細胞（Ｎｋｘ２．１＋ＦＯＸＡ２＋）の系列決定について、より高い能力を有する。
【図１５】培養１５日目において、ｐ６３＋ＦＯＸＡ２−ＳＯＸ２−Ｎｋｘ２．１−細胞の群も産生された。これらの細胞は、肺野に系列決定された細胞（ＮＫＸ２．１＋）に隣接する小さな集団として存在するか、又は、培養が低密度であった場合は、ＮＫＸ２．１＋細胞を取り囲む、紡錘状の核を有する線状に並んだ細胞として存在する。
【図１６】培養５５日目に、以下の細胞が産生された：（Ａ）ｃｃ−１０＋細胞；（Ｂ）ムチン２＋細胞；（Ｃ）ＳＰＢ＋ＮＫＸ２．１＋細胞；（Ｄ）アセチル化アルファ−チューブリン発現細胞。
【図１７】培養４８日目に、以下の細胞が産生された：（Ａ）ムチン１＋細胞；（Ｂ）リゾチーム＋細胞；（Ｃ）及び（Ｄ）レクチン−ＤＢＡ発現細胞。
【図１８】培養４８日目に、ＣＣ１０＋  ｐｒｏ−ＳＰ−Ｃ＋  ＳＰ−Ｂ＋細胞群の富化が観察された。（Ａ）＞４０％の細胞が、ＣＣ１０及びｐｒｏ−ＳＰＣダブルポジティブであった；（Ｂ）＞４０％の細胞が、ＣＣ１０及び成熟ＳＰＢダブルポジティブであった。
【図１９】レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の濃度を増加させてＷＦＫＢＥ腹側化カクテルへ添加したときの、Ｎｋｘ２．１及びＦＯＸＡ２発現における効果。腹側化の間のＲＡの用量は重大な意味をもち、５０μＭが最適であると決定した（培養１５日目のＮｋｘ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞の産生量により示される）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
毎年、米国では、４００，０００人もの人々が肺疾患で死亡する。しかしながら、肺は多数の異なる細胞種を含む非常に複雑な臓器であり、肺疾患の再生医療は未成熟である。多くの終末期肺疾患では、移植が有効な治療の選択肢であるが、ドナー臓器の低い利用可能性、並びに外科的、内科的、及び免疫学的合併症により妨げられる。それ故、肺疾患に対する細胞置換治療の新規アプローチが必要とされている。ヒト多能性幹細胞から肺及び気道の上皮細胞が誘導されたことはなかった。ＡＦＥ及びその誘導体を産生する効率的なプロトコールの報告は、Ｇｒｅｅｎらによるものが最初であった。ＬｏｎｇｍｉｒｅらはマウスＮＫＸ２：ＧＦＰレポーター（これはヒトｈＰＳＣには適用できない）を使用し、その効率は最大で２０％であった。Ｍｏｕらは、マウスにおいて、肺野上皮の産生について１０〜１５％、推定に過ぎない近位気道細胞への更なる分化について５％未満の効率を達成したが、それとは対照的に、ヒトにおける本発明の系においては９０％である。
【００１４】
細胞を基盤としたアプローチを使用する治療は極めて有望であるが、実行するのは困難でもある。１つの研究（その結果については議論の余地があるが）を除き、いかなる種類の幹細胞又はその子孫も、肺傷害動物モデルの肺において生着することは未だ可能となっていない。
【００１５】
呼吸器系の幹細胞は多様な応用を有する：（１）組織修復：終末期疾患肺を置換する臓器移植のために、自己ｉＰＳＣ由来の肺及び気道の細胞を脱細胞化した肺マトリックス内へ播種した人工肺を使用する；（２）疾患モデル化：ｈＰＳＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生した肺及び気道の上皮は、先天性及び後天性ヒト肺疾患の優れた研究基盤である；（３）薬剤スクリーニング：肺上皮を産生するために使用されるｈＰＳＣの無制限の自己複製能を利用することにより、十分な数の生物学的に関連する患者特異的細胞を、ハイスループット薬剤スクリーニングのために、産生することが可能である；並びに(４)肺発生のメカニズムの解明：出生後の気管気管支及び肺幹細胞の特徴的性質及び機能への貴重な洞察を与える研究により、ヒトの発生を具体的に調べるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが提供される。
【００１６】
この分野における最初のステップは、幹細胞から肺の様々な細胞種を産生する戦略の開発、及びその根底にあるメカニズムを理解することである。可能性のある代替的なアプローチは、脱細胞化した肺マトリックス内で再構築した組織を使用して、罹患した肺及び気道の、成体幹細胞又はｈＰＳＣ由来細胞のいずれかによる置換を達成することである。ラット肺は穏やかな界面活性剤で灌流することで脱細胞化することができ、胎生期又は新生仔の、気道側の肺細胞懸濁液、及び血管側の内皮細胞を用いて再細胞化できることが最近示された。
【００１７】
ＥＳ細胞
【００１８】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、特定の条件下において多能性状態で維持することが可能である。理論により縛られるものではないが、ＥＳ細胞は全ての体細胞種及び生殖細胞種へ分化することができる。従って、ＥＳを様々な細胞種及び組織へ分化させる適切な条件の開発は、未来の細胞置換治療に対し大いに有望である１０１。発生は原腸形成過程で開始する（この間に、胚盤胞の内部細胞塊の未分化細胞が三胚葉（ここから体の全組織が発生する）へと分化する）。例えば、ＥＳ細胞は、最終的に、腸、肝臓、膵臓、肺、食道、咽頭器、甲状腺、副甲状腺、及び胸腺等を発生する、内胚葉へ分化し得る。或いは、ＥＳ細胞は、最終的に、筋肉、骨、脂肪組織、結合組織、泌尿生殖系、及び心臓血管系等を発生する、中胚葉へ分化し得る。最後に、ＥＳ細胞は、更に最終的に、皮膚、神経系、及び神経堤等を発生する、外胚葉へ分化し得る。比較的単純な手順を使用して成体体細胞を多能性状態（人工多能性細胞、又はｉＰＳ細胞）に初期化できるという最近の発見１０２−１０６は、患者特異的多能性細胞（それは、拒絶の問題、及びｈＥＳ細胞由来組織の使用に関する倫理的問題を打開するであろう）の産生への道を開く。
【００１９】
肺発生
【００２０】
内胚葉からの肺発生は、主に、時間的・空間的に厳密に制御された６つのシグナリング経路の活性化及び阻害の組み合わせにより駆動される：ＢＭＰ／ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、レチノイン酸（ＲＡ）、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＨＨ）及びＮｏｔｃｈ９８，９９，１１６。これらのシグナルは、部分的には周囲の間充織及び血管系から発せられ、また部分的には、発生中の肺組織自身から発せられる。Ｇａｔａ６、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２及びＮＫＸ２．１は、肺及び気管気管支発生についての転写制御因子である９８，９９，１１６。肺は、前側前腸内胚葉（ＦＯＸＡ２＋ＳＯＸ２＋）の腹側面（ＮＫＸ２．１の発現をマーカーとする領域）から発生する。マウスにおいてはＥ９．５で、気管原基及び２つの肺原基が、内胚葉性原始腸管の腹側面から分離する９８，９９。分岐形態形成の複雑な過程を介して、気道が発生する１０８。これに続き、肺胞の形態形成が起きる(部分的には出生後に進行し、規定の偽腺期、嚢状期及び小胞期を経る)９８，９９，１１６。出生後初期発生の間に、広範な再生能を提供する肺及び気管気管支幹細胞も定まる１００，１０７。肺発生及び出生後肺幹細胞の更なる関連する詳細は、必要に応じて本出願において更に議論される。発生のパラダイムに従えば、気管気管支細胞及び肺胞細胞を産生するためには、ｈＰＳＣを初めに内胚葉に分化し、次いで、ＡＦＥへ決定すべきであると推論できる。次に、肺野を誘導し、それに続いて、後期胎生期及び出生後の呼吸器系の細胞種及び構造へと分化させる必要がある。
【００２１】
肺
【００２２】
呼吸器系は、ガス交換に重大な意味をもち、肺胞の複雑な分岐系（同様に分岐した血管系と比肩される）から成る。ヒトにおいて、気管及び気管支は偽重層上皮（繊毛細胞、粘液細胞、分泌（クララ）細胞、神経内分泌細胞及び基底細胞を含む）により裏打ちされる。肺胞は、２種の細胞に裏打ちされる：Ｉ型肺胞上皮細胞及びＩＩ型肺胞上皮細胞（ＡＴＩ細胞及びＡＴＩＩ細胞）。ＡＴＩＩ細胞はサーファクタントを産生する９８，９９。
【００２３】
肺は、気管支及び細気管支の複雑な分岐系からなり、それはガス交換が起きる肺胞で終結する９８，９９。従って、自己細胞から肺組織を再生できれば、大きな医学上の前進となるであろう１００。これを達成するための１つの方法は、多能性幹細胞の、多様な呼吸器上皮細胞への、及び／又は、呼吸器系の推定上の出生後幹細胞への分化であり得る１００，１０１。２種の多能性幹細胞が存在する。先に述べたように、ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊に由来し、ヒトとマウスの両方で、特定の条件において、多能性状態で維持することが可能である１０１。人工多能性状態細胞（ｉＰＳ細胞）は、３〜４遺伝子をレンチウイルス又はレトロウイルスにより発現させることで体細胞を多能性状態へ初期化したものである１０２−１０６。ｉＰＳ技術は、拒絶の問題及びＥＳ細胞由来組織の使用に関連する倫理的問題を打開するであろう、患者特異的多能性細胞の産生へ道を開く１０２。
【００２４】
ＡＦＥ
【００２５】
ＡＦＥは内胚葉で最も前側の部分である。胚発生の間、前側及び咽頭内胚葉の形成は、ボディプランの確立及び多様な臓器系（耳、口蓋扁桃、胸腺、副甲状腺、甲状腺、肺、食道、及び気管、の一部等）の発生における重大な段階である。その形成に続いて、胚体内胚葉は内胚葉下位系譜へ分化が進行する。より後側の内胚葉は中腸及び後腸を生じる。咽頭内胚葉（肺野の前側）は、咽頭嚢と呼ばれる４つの露出部を形成する。それぞれの嚢は、特定の臓器へ発生する(例えば、耳管及び鼓膜のインナーリーフレット（inner leaflet）（第１嚢）、口蓋扁桃（第２嚢）、胸腺（前側第３）、副甲状腺（背側第３及び第４嚢）、並びに甲状腺の傍濾胞Ｃ細胞（第４嚢）)。甲状腺は咽頭の底部から発生する。肺、食道、及び気管は、嚢の遠位のＡＦＥに由来する。
【００２６】
咽頭内胚葉（胸腺を含む）及び肺原基は両方ともＡＦＥに由来する。肺組織への定方向分化は、最初にＥＳ細胞を胚体内胚葉へ分化し、次いで、その最も前側運命へパターン形成することで進行するはずである。中腸及び後腸組織（膵臓、肝臓、腸管）の誘導はより成功しており、一方、ＡＦＥ臓器運命の誘導は、興味の欠如ではなくむしろ困難性から、遅れをとっている。ＡＦＥは、腸管、肝臓、膵臓、胃、食道、肺、咽頭器及び甲状腺も生じる、胚性胚葉である。いくつかの重要な臓器（肺及び胸腺を含む）はＡＦＥに由来するので、ＡＦＥの重要性は大きい。
【００２７】
初めに、高濃度のＡｃｔｉｖｉｎＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）を使用してｈＰＳＣから胚体内胚葉を誘導し、続いて、ＢＭＰ阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ及びドルソモルフィン等）（ＮＳ又はＤＭＳ）及びＴＧＦ−βシグナリング阻害剤（ＳＢ３４１５４３等）存在下で細胞を培養することで、ＡＦＥを産生した。ＮＳで２日間培養した後、細胞を、Ｗｎｔ３ａ又は小分子ＧＳＫ阻害剤、ＢＭＰ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７及びＥＧＦからなる、腹側化条件に供した。これらの条件において、およそ４０％のＮＫＸ２．１＋細胞（肺野への系列決定の指標）を含む、腹側ＡＦＥが得られる。肺及び気道の上皮を、ヒト多能性幹細胞（胚性及び人工多能性状態幹細胞）由来のＡＦＥから産生した。
【００２８】
別段定義されていなければ、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野における当業者により、通常理解されるのと同一の意味を有する。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料も、本発明の実施又は試験において使用することができる。
【００２９】
本明細書で述べる、全ての特許、特許出願及び刊行物並びにその他の参照は、個々の刊行物又は参照が、参照することにより組み込まれると具体的且つ個別に示されたかのように、参照することによりその全体が組み込まれる。本明細書で挙げた刊行物及び参照が先行技術であると認めるものではない。
【実施例】
【００３０】
本発明のより完全な理解を促進するために、以下に実施例を提供する。以下の実施例及び仮想実施例は、本発明を製造及び実行する例示的な態様を説明する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例で開示する特定の実施形態に限定されるものではなく、代替的な方法を用いて同様の結果を得ることができるため、それは単なる例証目的に過ぎない。
【００３１】
本発明の特定の実施形態は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの、肺及び気道の上皮細胞の分化誘導法を対象とする。本発明の実施形態は、肺野に系列決定された細胞（ＮＫＸ２．１＋）に富んだ細胞集団を更に提供する。
【００３２】
特定の実施形態において、ｈＰＳＣ由来のＡＦＥから肺及び気道の上皮を誘導するために、以下の培養条件を開発した。
【００３３】
（１）肺野に系列決定された細胞（ＮＫＸ２．１＋）の生産量を増加するために、初期及び後期内胚葉（即ち、ＡｃｔｉｖｉｎＡを含む培地中で、それぞれ、３、３．５及び４日間培養した）を、肺への特異化の能力について試験した。初期内胚葉は、後期内胚葉（たった１０％のＮＫＸ２．１＋細胞の効率を有する）と比べ、５０〜６０％高い効率で、ＮＫＸ２．１＋細胞を産生した。
【００３４】
（２）肺野に系列決定された細胞（ＮＫＸ２．１＋）の生産量を増加するために、前側化条件（ＮＳ）を改良し、初めにＮＳを１日適用し、その後ＴＧＦ−β及びＷｎｔ阻害（ＳＢ及びＩＷＰ２を使用）の組み合わせを適用することで、前側化を行った。これは、神経又は甲状腺分化の証拠無しに、１５日目に８０％の効率でＮＫＸ２．１＋産生をもたらす。
【００３５】
（３）培養１５日目に、上記条件を用いて、ｐ６３＋ＦＯＸＡ２−ＳＯＸ２−Ｎｋｘ２．１−細胞群も産生した。これらの細胞は、肺野に系列決定された細胞（ＮＫＸ２．１＋）に隣接する小さな集団として存在するか、又は、培養が低密度であった場合は、ＮＫＸ２．１＋細胞を取り囲む、紡錘状の核を有する線状に並んだ細胞として存在した。
【００３６】
（４）培養１５日目に、細胞を穏やかにトリプシン処理し、ＢＭＰ４及びレチノイン酸の有り又は無しで、Ｗｎｔ３ａ又はＧＳＫ阻害剤、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７を含む培養条件で再播種した。１０〜４０日間の更なる培養後、以下の細胞種を観察した：杯状細胞（Ｍｕｃ５ａ＋、Ｍｕｃ２＋）；粘膜下腺上皮（Ｍｕｃ５ｂ＋、ムチン２＋）；クララ細胞（ＣＣ１０＋）；基底細胞（ｐ６３＋）；繊毛細胞（アセチル化チューブリン＋、Ｆｏｘｊ１＋）；ＩＩ型肺胞細胞（Ｍｕｃ１＋、ｐｒｏ−ＳＰ−Ｃ＋、ＳＰ−Ｂ＋、リゾチーム＋、レクチン  ＤＢＡ＋）；及びＩ型肺胞細胞（ポドプラニン＋、アクアポリン１＋、レクチンＲＣＡ１２０＋）。
【００３７】
データは、ＢＭＰ４及びレチノイン酸の添加が、気道基底細胞運命の初期決定を助けることを示した。全体として、＞９０％の細胞が、気道又は肺上皮細胞種に決定された。
【００３８】
（５）培養２５日目に、ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（ｎｏｔｃｈシグナリングを阻害する）を、ＢＭＰ４及びレチノイン酸の有り又は無しで、Ｗｎｔ３ａ又はＧＳＫ阻害剤、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７を含む条件に添加し、２０〜２５日間の更なる培養の後、ＣＣ１０＋  ｐｒｏ−ＳＰ−Ｃ＋  ＳＰ−Ｂ＋細胞群の富化を観察したところ、ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ、Ｗｎｔ３ａ又はＧＳＫ阻害剤、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ７を含む条件において、＞４０％の細胞がトリプルポジティブであった。
【００３９】
（６）培養２５日目に、成熟化成分（デキサメタゾン、メチルブチリルｃＡＭＰ及びヒポキサンチン）を、ＢＭＰ４及びレチノイン酸の有り又は無しで、Ｗｎｔ３ａ又はＧＳＫ阻害剤、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７を含む条件へ添加することで、２０〜２５日間の更なる培養後、ＳＰＢ＋Ｎｋｘ２．１＋細胞集団が富化される。
【００４０】
（７）マトリゲル及び成熟化培地（デキサメタゾン、メチルブチリルｃＡＭＰ及びヒポキサンチン）の存在下での腹側化ＡＦＥの培養は、球状構造を生じた。該球状構造は、様々な近位気道マーカーを発現し、おそらく発生上の気道前駆細胞に由来するものであった。
【００４１】
実施例１：肺野に系列決定された細胞の誘導
【００４２】
本実施例は、ｉＰＳＣのＥＳＣのいずれか（either ESCs of iPSCs）であるｈＰＳＣからの、肺及び呼吸器系細胞種の産生を記述する。呼吸器系の多様な細胞種を産生する能力は、発生上の肺の異常に対する薬剤試験、及び肺発生における薬剤の催奇性効果を試験することを可能にする。
【００４３】
多能性細胞を発生中の肺の最も初期段階へ分化することは、これまでは不可能なことであった。高効率及び高純度で、これらの細胞を肺及び気道に属する初期の細胞へと分化させることに成功した。これらの細胞は、少なくともいくつかの成熟肺及び気道細胞マーカーを発現する細胞へと更に分化した。このモデルは、肺疾患の再生治療のため、並びにヒト肺発生及びヒト肺疾患の根底にあるメカニズムのより良い理解を得るための、新たな道を提示する。
【００４４】
ヒト多能性幹細胞から呼吸器細胞を産生する能力は、呼吸器系のヒト発生生物学を探究する新たな道を開き、発生上の肺異常の治療のための薬剤試験、及び肺発生における薬剤の催奇性効果を試験することを可能にするであろう。適切な後期胎生期、出生後細胞種への分化は、発生における連続的な段階がｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現されることを示唆する（定方向分化と呼ばれる戦略）。肺は内胚葉（より具体的には、腹側前側前腸内胚葉）に由来する。本実施例は、高度に富化したＡＦＥがヒト多能性幹細胞から産生されたことを示す。更に、この組織は、肺原基を生じる肺野に対応するマーカーを発現するように系列決定された。その後、近位（気道）又はより遠位（肺胞）の細胞運命を助ける条件を定めた。重要なことに、ＡＦＥを産生した条件がその後に肺マーカーを発現する潜在能力を決定したことも観察され、このことは、内胚葉発生中の早期の事前系列決定（prespecification）を示唆している。得られた細胞及び組織を機能的に調べるため、及びヒト肺発生メカニズムの理解を得るために、条件を更に最適化した。
【００４５】
本実施例では、肺の内胚葉区画（即ち、気管、気管支及び肺胞の上皮細胞）、及びこれらの構造に関連する推定上の出生後幹細胞をｈＰＳＣから産生する戦略を探索した。更に、初期ヒト肺発生に関与するメカニズムを発見するために、このモデルを使用した。適切な後期胎生期又は出生後細胞への分化は、定方向分化を使用した。肺はＡＦＥの腹側面（ここから気管原基及び２つの肺原基が分離する）から発生する１，２，９８，９９。複雑な分岐の過程３，１０８、その後の肺胞形態形成１，２，９８，９９を介し、気道及び肺胞が発生する。胚体内胚葉の効率的な誘導、並びに後側前腸、中腸及び後腸由来臓器（肝臓、膵臓、及び腸管）への様々な程度での分化は４−９，１０９−１１３、定方向分化を介して達成されているが、当該分野では、肝臓の近位にある内胚葉組織を産生することはできていない１００，１１４。もっともらしい理由として、多能性幹細胞からＡＦＥを効率的に決定することが不可能であったことが挙げられる。更に、ＡＦＥは、腹側ＡＦＥの肺野に対応する細胞へ系列決定することが可能で、培養物が実質的に均一に呼吸器系の細胞からなるような条件を同定した。それ故、これらの条件を更に最適化すること、及びこのモデルを使用し、ＡＦＥの肺への運命決定の根底にあるメカニズムのより良い理解を得ることが可能であった。
【００４６】
発生上のパラダイムに従えば、気管気管支及び肺胞細胞、並びにｈＰＳＣは、初めに内胚葉へ分化し、続いて、ＡＦＥへ系列決定されるはずである。次に、肺野が誘導され、その後、後期胎生期及び出生後呼吸器系の細胞種及び構造体へ分化する必要がある。
【００４７】
腹側前側前腸内胚葉の産生
【００４８】
分化しているＥＳ細胞を高濃度のＡｃｔｉｖｉｎＡへ曝すことからなる、刊行された内胚葉を誘導する戦略は２５−２７、後側に偏った結果をもたらした（おそらく、前腸組織とは対照的に、なぜ中腸及び後腸組織（膵臓、肝臓、腸管）の誘導２５−２７がより成功しているのかを説明している）。しかしながら、胚体内胚葉を、ＮＯＧＧＩＮ（ＢＭＰシグナリングの生理学的阻害剤）及びＳＢ−４３１４５２（ＡｃｔｉｖｉｎＡ／ｎｏｄａｌ及びＴＧＦ−βシグナリングの薬理学的阻害剤）の組み合わせ（ＮＯＧＧＩＮ／ＳＢ−４３１５４２又はＮＳ）へ、続いて曝露することで、前腸マーカーＳＯＸ２の発現、後側マーカーＣＤＸ２の抑制、及び内胚葉マーカーＦＯＸＡ２の維持をもたらすことが、モルフォゲン選別により明らかとなった３１，３２。９０％を超える細胞が、このステージで、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ２を発現した。
【００４９】
ｈＰＳＣからの腹側ＡＦＥ産生プロトコールの概要を、図２に示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化スキーム（図２及び図３に図示）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで起きる肺前駆細胞の階層的及び連続的誘導を再現する。ＡＦＥの他の運命を遮断することで肺野細胞の産生量を高め、更に、肺前駆細胞を成熟化させ、主要なタイプの肺（ＡＴＩ及びＡＴＩＩ）並びに気道上皮細胞（基底細胞、クララ細胞、繊毛細胞及び杯状細胞）をｈＰＳＣから系列決定することを目的とした。
【００５０】
咽頭内胚葉に対する肺野への優先的決定１０
【００５１】
ＮＳ誘導ＡＦＥのＷＦＫＢＥへの曝露は、咽頭及び肺マーカーの両方の発現の増加をもたらした。従って、咽頭運命よりも肺に有利となる条件を決定した。ＷＦＫＢＥ＋ＲＡは肺野へバイアスさせ、一方で、ＷＦＫＢＥは咽頭器運命を助ける。肺への系列決定におけるレチノイン酸の役割は、腹側化ＡＦＥの後側化、及びＴＢＸ１シグナリングの阻害による咽頭嚢形成の阻止を示す。これらの条件において、実質１００％の細胞がＮＫＸ．２．５を発現し、その大部分が、ＦＯＸＡ２及びＥＰＣＡＭも発現した（図３）（腹側ＡＦＥの一群の典型的マーカー）。島状の細胞がＮＫＸ２．１を発現した。ＮＫＸ２．１を発現する細胞の高密度コロニー間に散在して、扁平なＮＫＸ２．５＋ＦＯＸＡ２−細胞が生じた（図３）。これらは血管平滑筋アクチンを発現し、従って、中胚葉性であった（図３）。１９日目までの継続したＷＦＫＢＥ＋ＲＡでの処理は、低レベルの成熟ＡＴＩＩマーカー（ＳＰ−Ｃ）を生じた（図４）。
【００５２】
近位ｖｓ遠位肺運命の誘導
【００５３】
ＷＦＫＢＥ＋ＲＡで継続的に培養した細胞の運命を調べたところ、ＳＰ−Ｃは誘導されなかった。再播種し（１３日〜１５日目）、２３〜３３日目までこれらの条件で継続的に処理したところ、全ての中胚葉性細胞が消失し、管状構造を含む、細胞が高密度に充填したコロニーからなる培養物となった（図５）。これらのコロニーは全体的にＦＯＸＡ２＋であり、一方、外縁部のものを除き、ほとんどの細胞はＮＫＸ２．１を発現した。上記管状構造はムチン（ＭＵＣ２（図示せず）及びＭＵＣ５ａ（図５））を発現した。主に外縁部では、気道基底マーカーｐ６３を発現した（図５）。前記構造のより中心部に向かうと、ｐ６３及びＮＫＸ２．１が共発現し（図５中央のパネル）、ｐ６３＋細胞のＮＫＸ２．１＋細胞への分化を示唆する。
【００５４】
その後、上記細胞を、デキサメタゾン、ブチリルｃＡＭＰ及びイソブチルメチルキサンチン（ＤＣＩ）からなる成熟化培地５０中で３日間培養した。これらの条件で、ＦＯＸＡ２、ＮＫＸ２．１及びｐ６３を発現する大きな球状構造が形成された（図６）。これらの構造は、成体気管から得られるトラキオスフェア（tracheospheres）５１と非常に類似している。このステージの細胞は、完全に呼吸器に運命決定されているが、まだ比較的初期の発生ステージにある。産生に成功した肺野細胞を、脱細胞化したヒト肺足場へ播種した。予備的データは、播種した細胞が足場上に整列し、Ｎｋｘ２．１及びｐ６３を発現することを示す。
【００５５】
ＡＦＥの事前系列決定
【００５６】
ＡｃｔｉｖｉｎＡ誘導後にＮＳを添加することでＡＦＥが決定されるという観察は比較的偏りのない選別に従って為されたが、このプロトコールは発生的に理にかなっている。ほとんどのＡＦＥは、初めに原始線条を通過し、その後結節を離れる細胞に由来する５４。故に、内胚葉のこの部分は、最も長時間、胚盤葉上層のｎｏｄａｌシグナリング領域から最も遠く切り離れている５５。これは、ＡｃｔｉｖｉｎＡへの曝露期間後のＴＧＦ−βシグナリングの遮断が、なぜ内胚葉のこの部分を決定することに関与するかを説明する。その前側遊走の間、ＡＦＥになることを運命付けられた細胞は、Ｎｏｇｇｉｎを発現する領域を通過し５５、これはＢＭＰシグナリングを遮断することが望ましいこと（desireability）の説得力のある説明を与える。興味深いことに、その後、最も前側に運命付けられた細胞は、Ｗｎｔ阻害剤（Ｄｋｋ１）に曝露された５５。これらの細胞は、その後、腸管が形成されるときに腹側に折り重なり、最も前側の内胚葉は最終的に腹側に行き着き、そこで肺原基が起こる５４，５５。
【００５７】
Ｗｎｔシグナリングの阻害が、肺野のより詳細な系列決定をもたらし得るかを試験した。ＮＳ（６日目）、続いてＳＢ＋ＩＷＰ２（Ｗｎｔ阻害剤）（ＳＩ、７日目）を順次適用することで、腹側化後、１３日目におけるＰＡＸ１  ｍＲＮＡ（咽頭内胚葉）のＮＫＸ２．１  ｍＲＮＡに対する比率は増加した。これらの知見と一致して、ＮＫＸ２．１＋細胞の数は、ＮＳとそれに続くＳＩによるＡＦＥ誘導後に、ＮＳ単独の場合よりも多かった（図８）。更に、ＮＯＧＧＩＮ／ＳＢとそれに続くＳＢ＋ＩＷＰ２（ＮＳ＞ＳＩ）の使用によるＡＦＥの誘導後、ＡＦＥを５日目にＮＳのみを使用することで誘導したときよりも、ＤＣＩ存在下の１９で、より多くの球状構造が得られた。より詳細な研究及び定量化が望まれるが、これらのデータは細胞の分化の経緯がそれらの将来の可能性を決定することを示し、おそらくそれは、後でより肺への系列決定をしやすくするエピジェネティック状態に細胞を固定することによる。これらの観察は、呼吸器系譜への定方向分化戦略の開発に重大な意味をもち、内胚葉発生の間のエピジェネティック制御及び事前系列決定に関する基本的な問題を提起する。
【００５８】
呼吸器系細胞の誘導のための条件最適化
【００５９】
ｑＰＣＲ、及び可能であれば、蛍光及び共焦点顕微鏡を使用する。その後の肺への系列決定で最大の可能性を達成するために、ＡＦＥ誘導についての最適化因子を決定した。遠近位決定に関与する因子を解析した。これらが確立されれば、培養で産生される系譜を操作することができる。
【００６０】
幹細胞集団が生着することが説得力をもって示されている認められた肺損傷モデルは現在ないため、免疫不全マウスの腎臓被膜下への移植をｉｎ  ｖｉｖｏアッセイとして使用した。免疫不全マウスの腎臓被膜下へのＮＳ誘導ＡＦＥの移植の後、多くのＳＰ−Ｃ＋管構造及び偽重層上皮を有する構造が観察された（図１ｂ、ｃ）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生したＡＦＥがｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な肺としての潜在能力を有することを示唆し、また逆に、この解析が比較的効率的に、移植した細胞の肺としての潜在能力を明らかにすることを示唆した。この知見も、腎臓被膜下へのＥ１１．５マウスの胎生期肺の移植が、肺胞発生の偽腺期及び細管状期を通じた分化を可能にしたという観察と一致する５６。
【００６１】
この過程の間、移植された血管は内に伸びるホストの血管と結合した５６。更に、最近になって、出生後肺幹細胞集団を、Ｅ１４胎生期肺から産生した細胞懸濁液と混合することで、腎臓被膜の移植後に、成体幹細胞に由来する肺胞形態形成の痕跡を含む構造を生じることが示された５７。
【００６２】
細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在能力が生じるかを決定することができる。従って、特定の実施形態において、以下のことが行われる。１０６細胞を４℃のマトリゲル（４μｌ）中に溶かし、３７℃で凝固させ、免疫不全ＮＳＧマウスの腎臓被膜下へ移植する。５匹のマウスの群を、各条件及び分化ステージについて、それぞれ移植から４週後及び８週後に解析することが可能である。解析は、気道上皮細胞（ＦＯＸＪ１、ＣＣＳＰ、ＣＧＲＰ、ＭＵＣ５ａ、ｐ６３）、肺胞細胞（ＳＰ−Ｃ、Ｔ１α、ＡＱ５）の染色からなる。更に、ＧＣＭ２（副甲状腺）、ＰＡＸ９及びＴＢＸ１（咽頭嚢）、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（Ｃ細胞）、並びにＡＩＲＥ（胸腺）の染色により、他の運命を調べることが可能である。もし成長が観察されなかった場合、他の細胞からの支持が関与している可能性がある。その場合、試験される細胞集団をＥ１４胎生期肺細胞懸濁液と混合するＣｈａｐｍａｎらの解析５７を採用することが可能である。
【００６３】
ＡＦＥから肺野を誘導する因子
【００６４】
事前系列決定。細胞をＮＳ、その後ＳＩ（ＮＳ＞ＳＩ）に連続的に曝露することで、ＡＦＥを誘導するとき、ＮＫＸ２．１のより良い誘導が、１週間後、腹側化後に達成されることをデータは示した。これらのデータは更に、ＡＦＥが形成されるときには肺原基運命はすでに決定されている可能性があることを示した。いくつかの実施形態において、以下のことが行われる。
【００６５】
１．ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞の絶対数及び富化に関するこれらのデータの更なる定量化を行うことが可能である。
【００６６】
２．Ｗｎｔ、ＢＭＰ及びＴＧＦ−βの阻害を組み合わせたＮＳ＞ＳＩ様式が最適であることを決定した。並びに
【００６７】
３．事前系列決定がその後の近位及び遠位肺細胞種への分化にいかに影響するかを決定することが可能である。ＮＳ存在下よりもＮＳ＞ＳＩ存在下においてＡＦＥを誘導した場合にＤＣＩ誘導性の球状構造がより効率的に産生されるという証拠を我々は既に有しているためである。
【００６８】
他の実施形態において、以下のことが行われる。ＡＦＥは、ＮＳ、ＳＩ、ＮＳ＞ＳＩ、ＮＳＩ、又はＳＩ＞ＮＳ存在下において誘導することが可能である。続いて細胞をＷＦＫＢＥ＋ＲＡを使用して腹側化することで、肺原基同等物へと系列決定することが可能である。１３−１５日目に、培養物をＷＦＫＢＥ＋ＲＡの継続（推定上の近位肺）又はＷＦＫ（推定上の遠位肺）に分けることができる。２３日目に、最終成熟化のために、ＤＣＩ条件を適用可能である。これらの培養の複製物を、培養の様々なステージで解析することが可能である。それぞれのステージにおいて、サイトスピン調製物を使用して、細胞数、ＮＫＸ２．１＋、ＦＯＸＡ２＋及びｐ６３＋の細胞画分を定量可能である。更に、投入細胞数の単位あたりのＤＣＩ誘導球状物の数を評価可能である。最後に、本明細書に記載のマーカーについてｑＰＣＲ及び染色を行うことが可能である。
【００６９】
近遠位分化に関与する因子
【００７０】
ＷＦＫＢＥ＋ＲＡ中での培養を継続することでより近位の運命に導き、一方で、１３から１９日目の間で、ＢＭＰ４及びＲＡが除かれた条件へと切り換えることで、より遠位の運命を誘導した（ＳＰ−Ｃの誘導により証明された）。しかしながら、肺発生の間の運命決定はかなり複雑であり、あまりよく理解されていない。分岐形態形成の間、先端部で多能性前駆細胞が再生する１，２，６３。柄部分に残された細胞は気管気管支上皮へと分化した。細管状／嚢状期が開始するとき、遠位細胞は肺胞細胞への分化を開始する１，２。ＡＦＥの腹側化後のＷｎｔ３ａ、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０の適用は、１９日目に多量のＳＰ−Ｃ  ｍＲＮＡを誘導する。より長期の培養によってタンパク質が発現することが見込まれる。これらの条件は偏りのない選別において同定されたが、ＦＧＦ１０及びＷｎｔシグナリングは遠位運命を確立するため、発生的に理にかなっている４５−４９。いくつかの実施形態において、以下を行う。
【００７１】
１．我々の培養の全ての因子が望ましいかの決定、及びそれらの濃度が最適化可能かの決定（多くのモルフォゲンは濃度依存的な効果を示すので）を行う１，６３。
【００７２】
２．Ｗｎｔシグナリングは、遠位運命を確立するのに発生上重要であるので４５−４７、近位条件において、Ｗｎｔを除くことが近位運命を増進する可能性がある。
【００７３】
３．非標準のＷｎｔ（Ｗｎｔ５ａ）も、おそらくＳＨＨ及びＦＧＦ１０シグナリングの制御を介して、肺発生において役割を果たし、確認試験を行うことが可能である６５，６６。
【００７４】
４．発生初期のシグナリングにおいてＮｏｔｃｈを遮断することも、より遠位運命を促進する６７。これはガンマ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを使用することで成された。
【００７５】
５．ＤＡＰＴはｐｒｏ−ＳＰＣ（ＳＰＣの前駆体）発現細胞を増大した。ＲＡシグナリングの下方制御がＡＴ細胞の終末分化に関与する５７。しかしながら、ＲＡの役割は複雑である。ＲＡはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＷｎｔ、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ４の発現に影響し、従って、間接的な効果を有する４４。更に、ＲＡは出生後の肺胞発生を増強するようである６８。最後に、副腎皮質ステロイド、ブチリル−ｃＡＭＰ及びイソブチルメチルヒポキサンチン（ＤＣＩ）が肺の成熟化を増進する５０，６９。この条件は、我々の「近位」条件からトラキオスフェアに類似した構造の発生を誘導した。
【００７６】
６．より近位の運命を決定する条件を洗練した時点で、追加の因子がこれらの近位領域の分化に影響するかを決定した。Ｎｏｔｃｈシグナリングは、クララ細胞運命を助けることで、気管支樹の３つの成熟細胞種間での運命選択を決定し７０、基底細胞の分化を制御する７１。故に、ＤＡＰＴによるＮｏｔｃｈシグナリングの阻害効果は興味深かった。我々は、ＤＡＰＴがＣＣ１０＋ｓｐｂ＋ｐｒｏ−ＳＰＣ＋細胞の富化を助けることを見出した。これは、Ｎｏｔｃｈを内胚葉部分で遮断することが遠位（近位とは逆に）運命を助け、一方、Ｎｏｔｃｈシグナリングを間充織において遮断することで繊毛細胞運命を促進するという文献と一致する。ＳＨＨは、間充織によって媒介されていないであろう直接の効果を介して、神経内分泌細胞の分化に影響する６０。従って、ＳＨＨシグナリングの遮断又は増強の両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化に影響し得る。
【００７７】
７．分岐形態形成を制御する因子を調べることが可能である。ｈＰＳＣ由来細胞の分岐形態形成をモデル化し得る条件の確立は、本分野における大きな前進となる。更に、前駆細胞は成長中の分岐の先端部で再生するので、分岐形態形成の刺激と、それに続く、肺胞分化のための適切な刺激の適用は、成熟細胞の産生量を増加するための道を開き得る。ＥＧＦ及びＨＧＦは両方とも、コラーゲンゲル培養において、乳腺上皮前駆細胞による分岐形態形成を誘導する７２，７３。更に、分岐している乳腺上皮細胞の柄部分で産生されるＴＧＦ−β１は分岐を阻害し、一方、ＴＧＦ−βの阻害は分岐を促進する７２。いくつかの実施形態において、以下を行う。ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＢ−４３１５４２、又はそれらの組み合わせの添加が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）包埋培養において分岐（もしあれば）を増強するかを試験することが可能である。
【００７８】
推定上の出生後肺幹細胞の検出
【００７９】
出生後肺幹細胞
【００８０】
発生が進行するにつれて出生後肺前駆細胞が定まるが、推定上の肺幹細胞の特徴的性質（主に損傷後に機能するようである７８）は不明確である１１，１２，７５，７９−８７。気管支肺胞の接合部での局在により定義される一種の幹細胞（気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣ））が同定されている８１。この細胞はＳＰ−Ｃ（ＡＴＩＩマーカー）、及びＣＣＳＰ（クララ細胞マーカー）を両方とも発現する８１。しかしながら、系譜追跡は、肺胞がＣＣＳＰ＋又はＳＰ−Ｃ＋細胞からは再生されないことを示唆する５７，８４。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで気道及び肺胞細胞を生じることができる、ＣＤ４９ｆ＋（ｉｎｔｅｇｒｉｎβ６）ＣＤ１０４＋ＥｐｃａｍｈｉＣＤ２４ｌｏ表現型を有する肺幹細胞についての証拠が出版されている８６。他の論文でも同様に、稀なα４β６（ＣＤ４９ｆ＋）細胞を肺幹細胞として示し、該細胞を終末細気管支及び肺胞に位置付けた５７。これらの推定上の出生後肺幹細胞は、少なくともＣＤ４９ｆの発現を基底細胞と共通して有する５１。該細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで嚢状及び嚢胞状コロニーを形成することができる。興味深いことに、ＦＧＦ１０がこれらに関与したが、ＢＭＰ−４によって阻害された８６。理論に縛られるものではないが、細気管支のｐ６３＋細胞は、少なくともインフルエンザ感染後、肺胞を修復するために肺の間充織を遊走する８７。ｐ６３＋細胞によって囲まれた、ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋構造が産生された。しかしながら、マウス細気管支において、ほとんどの繊毛細胞はクララ細胞に由来する８４。気管において、クララ様細胞は条件的な通過性の増幅細胞として機能するらしく、一方、ほとんどの再生能は基底細胞に由来する（それは、上皮の３０％を形成し、少なくとも一部の細胞ではＮｇｆｒ及びＣＤ４９ｆを発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいわゆるトラキオスフェアを形成することができる）５１。別のタイプの基底細胞がＣＤ４９ｆ＋Ｓｃａ１＋ＡＬＤＨ＋表現型により同定されており、それは、いわゆる「縁付き」コロニーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成する８５。
【００８１】
我々は、気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣ）に非常に類似した細胞を我々の培養物中に同定した。他の出生後肺幹細胞、又は胎生期幹細胞に類似する、産生された任意の細胞が、再生、増殖及び分化可能かどうかを決定する。患者特異的ｉＰＳＣからのそのような細胞の産生は、肺の再生医療への鍵となる可能性がある（例えば、脱細胞化した肺マトリックス上に播種することによって）。
【００８２】
アプローチ
【００８３】
分化後のＮＫＸ２．１、ＦＯＸＡ２及びｐ６３を発現する球状コロニーが、３日間ＤＣＩを使用することで得られた。興味深いことに、このステージでの刊行された「トラキオスフェア」条件５１の適用では、球状物の形成を誘導せず、一方、我々はこれらの条件を使用して、成体マウスの気管からのトラキオスフェアを産生することができた。更に、より成熟した細胞のマーカー（ムチン５ａを除く）は、これらの構造中にまだ存在していなかった。これらのデータは、それらが比較的初期の前駆細胞から生じ、完全成熟を果たすのに十分な期間培養されていないことを示す。これは、単純に、該細胞をより長期間培養することにより確認されている。前記細胞の再播種及び分化の潜在能力を更に調査する。
【００８４】
上記コロニーを分離し、同様の条件（ＤＣＩ）又は成体気管からのトラキオスフェア産生のための刊行された条件５１のいずれかに再播種した。コロニーを、２Ｄで、ｐ６３、Ｍｕｃ５ａ、ＦＯＸＪ１、アセチル化チューブリン（繊毛細胞）、ＣＣＳＰ（クララ細胞）、及びＣＲＰＰ（神経内分泌細胞）、ＳＰ−Ｃ（ＡＴＩＩ細胞）、Ｔ１α、ＡＱ５（ＡＴＩ細胞）の発現について解析した。いくつかの実施形態において、以下を行う。解析は３Ｄ球状培養において実施することが可能である。その後の再播種により、より成熟なマーカーの発現が現れる可能性がある。或いは、分化の潜在能力は、これらのコロニーの前駆細胞が更に発生したときにのみ獲得される可能性がある。ＤＣＩ又はトラキオスフェア条件に播種する前に、分化している細胞を、２Ｄ培養上で、（近位の）ＷＦＫＢＥ＋ＲＡ又は（遠位の）ＷＦＫ条件により長期間曝露した。いくつかの実施形態において、解析は３Ｄ球状培養において実施可能である。
【００８５】
成体マウス基底幹細胞を維持する刊行されたトラキオスフェア培養系の確立に成功した。１６日目の肺前駆細胞の刊行されたトラキオスフェア条件での培養は、球状物の形成を誘導せず、一方、成熟化成分ＤＣＴの存在下、１６日目の肺野細胞を３Ｄマトリゲル中で培養することで球状物が産生された。ＤＣＩを３日間使用した分化の後、球状コロニーはＮＫＸ２．１、ＦＯＸＡ２及びｐ６３を発現した。
【００８６】
ＡＦＥのＷＦＫＢＥ＋ＲＡへの曝露及び１５−１９日目での再播種の後、管状構造を含み、Ｍｕｃ５ａ陽性で、ｐ６３＋細胞により囲まれたコロニーを得た（図５）。これらの細胞の副画分は、マトリゲル及びＤＣＩ培地に播種した後、球状物を発生した（図６）。辺縁のｐ６３＋ＮＫＸ２．１＋細胞はこれらのコロニーにおいて、より原始的な細胞であった。いくつかの実施形態において、以下を行う。肺の幹細胞に関連する表面マーカー（ＮＧＦＲ、ＣＤ４９ｆ、ＥＰＣＡＭ、ＣＤ２４、ＡＬＤＨ（比色染色ＡＬＤＥＦＬＵＯＲを使用し検出される））について、細胞集団を解析することにより、見込みのある推定上の幹細胞を単離することが可能である５１，８５，８６。これは球状物形成前の培養、及び球状物それ自体のどちらにおいても行うことが可能であり、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法によって行うことができる。理論に縛られるものではないが、コロニー辺縁のｐ６３＋細胞、及び球状物を裏打ちしている細胞は、幹細胞マーカーを発現する（特に、肺幹細胞の同定に関する最近刊行されたデータを考慮すれば、α６β４  ｉｎｔｅｇｒｉｎ（ＣＤ４９ｆ））。興味深いことに、いくつかの推定上の肺幹細胞マーカーは、ヒト乳腺幹細胞を単離するのにも使用される。これらとしては、ＥＰＣＡＭ（しかしながら、ヒト乳腺幹細胞はＥＰＣＡＭ−である）、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４及びＡＬＤＨ１が挙げられる８８。発生中の肺及び成体乳腺は、両者共に分岐形態形成を経る上皮組織であるという、共通点を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、以下を行う。乳腺幹細胞のその他の報告されたマーカーの発現を、本明細書に記載のモデルにおいてモニタリングしてもよい。これらとしては、ｃ−ＫＩＴ、ＣＤ１０、ＣＤ１３３及びＣＤ９０が挙げられる８９。造血幹細胞にも存在するマーカー（ＣＤ３８、ＣＤ３４及びエンドグリン等）を試験する。ＳＬＡＭマーカーも造血幹細胞で使用されるが、その発現は造血系に限定される傾向にある８９。これらのマーカーのいずれかを発現する細胞集団をセルソーティングにより単離し、球状物を産生する条件に播種する。限界希釈解析により、球状物惹起細胞の頻度を明らかとし、球状物の形成が１つの細胞種に依存するか（シングルヒット動態）を決定する。コロニー惹起能に富んだ細胞集団のマーカーを組み合わせて、より大きい富化を達成する。
【００８８】
その他の実施形態において、以下を行う。出生後の推定上の肺幹細胞の増殖のための刊行された条件を、本明細書に記載の系においてｈＰＳＣから産生した細胞へ適用することにより、出生後肺幹細胞と一致する細胞が産生されるかの調査を行う。これは、最終的に推定上の幹細胞マーカーを発現している細胞をソーティングした後、トラキオスフェア及び肺幹細胞についての報告された条件に再播種することにより行われる５１，８５，８６，９０。
【００８９】
肺野系列決定に関与するメカニズム
【００９０】
論拠。その他の実施形態において、以下を行う。開発した高効率及び標準化された分化プロトコールを活用することで、このモデルは、ヒトの初期肺発生に関与するメカニズムを理解するのに使用することができる。このアプローチは、選択的な細胞運命を得るために条件を変更可能であり、従って、マイクロアレイ及びＣｈＩＰ研究における比較のための良い基準を提供するという利点、及び、特定の系譜に決定された細胞の数は理論上限定されないという利点を提供する。これは、マウスの遺伝学的アプローチ及びマウス胚の解剖とは、かなり対照的である。両種のアプローチは高度に補完的である。
【００９１】
ＮＫＸ２．５＋中胚葉の役割
【００９２】
ＡＦＥ産生後、９０％を超える細胞がＦＯＸＡ２＋ＳＯＸ２＋であったが、ＷＦＫＢＥ＋ＲＡ存在下での腹側化及び肺原基系列決定の後、変動的な割合（５から４０％）の細胞がＮＫＸ２．５＋ＥＰＣＡＭ−ＶＳＭＡ＋であった（図３）。系譜追跡調査は、腹側ＡＦＥを囲む間充織もＮＫＸ２．５＋であることを示した９１。従って、これらのデータは、培養物中の混入している中胚葉は、腹側ＡＦＥを囲んでいる中胚葉と同等のものであることを示す。このことは、この中胚葉がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肺系列決定にとって有利であるかという疑問を提起する。再播種後、実質的に中胚葉の細胞は存在しないが、細胞は分化可能であるので（中胚葉の細胞の最小限の混入が、まだ役割を果たしているという可能性はあるが）、この中胚葉は更なる分化には不必要であり得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、以下を行う。中胚葉の役割を確立することが可能であり得る。ＡＦＥの誘導後、並びにＡＦＥのＥＰＣＡＭ＋（内胚葉）及びＥＰＣＡＭ−（中胚葉）集団への腹側化の後、細胞をソーティングする。次いで、これらの細胞を、その後の分化の間、別々に又は様々な比率で一緒に播種する。定量及び解析は、この実施例に先に記載したようにして進める。
【００９４】
もし中胚葉の存在が肺分化に影響すると認められたなら、その後、この中胚葉について遺伝子発現解析を行い、関与している可能性のある可溶性因子を検出する。これは、アフィメトリックスマイクロアレイ中に「存在する」細胞を解析すること、およびＥＰＣＡＭ＋ＡＦＥ細胞と発現を比較することで決定する。理論により縛られるものではないが、リガンドの発現（膜結合性又は可溶性）は中胚葉画分において増加し、一方、推定上のレセプターの発現は、ＡＦＥ画分において高い、又は少なくとも存在する。
【００９５】
肺系列決定の間のゲノムワイド発現解析
【００９６】
これらの実験の目標は、ゲノムワイドに、ＥＳ細胞からの、遠位又は近位の肺に運命決定した細胞への分化経路をチャート化することである。現在そのようなデータは利用可能でないので、これは重要である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、以下を行う。培養の以下のステージでｃＤＮＡを調製する：ＥＳ細胞、胚体内胚葉、ＮＳ又は肺野系列決定のために最適なＮ、Ｓ及びＩの組み合わせのいずれかを使用して産生したＡＦＥ、ＷＦＫＢＥ（咽頭）又はＷＦＫＢＥ＋ＲＡ（肺野）存在下で腹側化後。ＷＦＫＢＥ＋ＲＡ群では、ｃＤＮＡは継続したＷＦＫＢＥ＋ＲＡ（推定上の近位）及びＷＦＫ（推定上の遠位）の存在下で培養した細胞から調製する。すべての集団において（ＥＳ細胞を除く）、内胚葉の細胞のみを比較すること、及びデータが中胚葉細胞の変動する混合により偏っていないことを確実にするために、ＥＰＣＡＭ＋細胞をセルソーティングにより単離する。更に、それぞれのステージで、培養物は広範な品質管理を経る（分化の各ステージの適切なマーカーについてのＩＦ及びｑＰＣＲからなる）。
【００９８】
その他の実施形態において、以下を行う。一般的な標準化の後、データは目的変数なしのクラスタリングを受ける。理論により縛られるものではないが、分化の連続的なステージが連続的にクラスター化する。これらの調査はいくつかの結果をもたらし得る。
【００９９】
特定の実施形態において、以下を行う。分化の間に生じる亜集団の見込みのある単離を可能とする表面マーカーが同定される可能性がある。その明白な科学的重要性に加え、これは、定方向分化のプロトコール開発の大きな前進となるであろう。
【０１００】
いくつかの実施形態において、以下を行う。データは、分化の連続したステージの間に活性化又は阻害される特定のシグナリング経路を示し得る。培養に対してモルフォゲンが添加されるが、内在するシグナリング活性に関しては何も知られていない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、以下を行う。データは、内胚葉及び肺発生の研究に有用な、新規のステージ特異的マーカー及び転写因子を明らかにし得る。そのようなマーカーは、発生ステージのマウス胚において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試験する。
【０１０２】
特定の実施形態において、以下を行う。主要な興味は、ＮＳ、又はＮ、Ｓ及びＩの組み合わせの使用によるＡＦＥの誘導後に、差次的に発現する遺伝子である。これは、発生のこのステージにおいて事前系列決定が起きるか、及びどのように起きるか、を理解する最初の段階である。
【０１０３】
事前系列決定：必須の肺誘導遺伝子で平衡を保つ？それとも保たない？
【０１０４】
理論により縛られるものではないが、ＮＳ又はＮ、Ｓ及びＩの組み合わせ（Ｎ／Ｓ／Ｉ）のいずれかの使用によるＡＦＥの系列決定は、胚体内胚葉の初期発生の間の肝臓及び膵臓の前パターン形成に関する最近刊行された観察と同様に、咽頭及び肺原基の発生に重要な遺伝子における異なるヒストン修飾又はＣｐＧメチル化を付与する９２。
【０１０５】
この研究は２つの方法でアプローチすることが可能であろう。最初のアプローチは、ＮＳとＮ／Ｓ／Ｉとを対比して、それらにより誘導したＡＦＥについてのＣｈｉｐ−Ｓｅｑを行うことであろう。費用が原因で、これは非常に限られた一連のヒストン修飾についてのみ行うことが可能であろう９３。従って、仮説に基づくアプローチがより多くの情報を与え得る。従って、いくつかの実施形態において、以下を行う。我々は、ＮＳ又はＮ／Ｓ／Ｉ存在下での内胚葉誘導の後（図９のプロトコールの７日目）、２つの遺伝子（ＰＡＸ９及びＮＫＸ２．１）のプロモーター領域でのヒストン修飾を通常のＣｈＩＰとそれに続くＰＣＲによって、及びＣｐＧメチル化をバイサルファイトシークエンシングによって調べることができる。ＮＫＸ２．１は肺の樹立について使用され１，２，２０、一方でＰＡＸ９は（咽頭内胚葉の産生には必須でないが）、咽頭内胚葉で発現し３２、ＮＳを使用したＡＦＥの誘導後に高発現する１０。更に、ＰＡＸ９はヒト１４番染色体のＮＫＸ２．１のすぐ下流にあり、その間にある唯一の遺伝子は、ＮＫＸ２．１ホモログのＮＫＸ２．８（肺癌において役割を果たすことが最近示された）である９３。その他の実施形態において、以下を行う。いくつかの実施形態において、この狭い領域内において、高度に差次的に調節されている調節部位が見出される可能性がある。調査されるヒストン修飾は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ４Ｋ４ｍｅ２、及びＨ３Ｋ２７ａｃ（活性化プロモーター）、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びＨ４Ｋ２０ｍｅ３（抑制化プロモーター）である９５，９６。ＮＫＸ２．１プロモーターの詳細な解析がいくつか発表されているが９７、いくつかの実施形態において、ＰＣＲプライマーは（１００−２００ｂｐに及ぶ）、保存された転写結合部位を有するプロモーター領域に集中することが可能である（ｄｃｏｄｅ．ｏｒｇ）。ＮＫＸ２．１については、これらは、２つの選択的な転写開始部位の間、及び（興味深いことに）サーファクタント産生に重要な５’遺伝子（ＳＦＴＡ３）の３’ＵＴＲにある。両部位はＮＫＸ２．１それ自体のための結合部位をいくつか含んでいる。
【０１０６】
その他の実施形態において、以下を行う。ＮＫＸ２．１はアンチセンスの方向で転写される可能性があり、保存された転写結合部位の高密度なクラスターが上記遺伝子の５’末端に存在する（それも包含される）。同様に、その他の実施形態において、ＰＡＸ９における、保存された転写因子結合部位を含む領域を評価する。「ポジティブ」コントロールとして、主に咽頭内胚葉（ＮＳを用いたＡＦＥ誘導、ＷＦＫＢＥ存在下での腹側化）へ分化した細胞、及び肺野（Ｎ／Ｓ／Ｉを用いたＡＦＥ誘導及びＷＦＫＢＥ＋ＲＡ存在下での腹側化）へ分化した細胞を使用する。
【０１０７】
更に他の実施形態において、以下を行う。ＡＦＥがＮ／Ｓ／ＩのＮＳで誘導されたかどうかに依存する差次的なヒストン修飾及び／又はＣｐＧメチル化を、ＰＡＸ９及びＮＫＸ２．１の制御領域において同定する。これが当てはまらない場合には、本明細書に記載するようにして収集したマイクロアレイデータにより導かれた、別の一連の遺伝子を使用し、実験を繰り返す。例えば、咽頭の事前系列決定の間、アンチセンスＮＫＸ２．１転写物の推定上のプロモーターは、「オープン」な立体構造をとる可能性がある（大いに興味深いであろう知見）。例えば、もし広範なＨ３Ｋ４ｍｅ３が見出された場合、ＳＥＴドメインを有するタンパク質（トライソラックス群、ヒストンメチラーゼ）、及び十文字（Jumonji）ファミリータンパク質（ヒストンデメチラーゼ）が集まる９６。
【０１０８】
実施例２：ｈＰＳＣからの肺気道上皮細胞分化の誘導
【０１０９】
本実施例は、ｉＰＳ細胞から、肺の内胚葉区画（即ち、気管、気管支及び肺胞の上皮細胞）、並びにこれらの構造に関連する推定上の出生後幹細胞を産生する戦略を記述する。このアプローチの再生医療への転換の可能性に加え、呼吸器系の多様な一連の細胞種を産生する能力は、発生上の肺の異常についての薬剤試験、及び肺発生についての薬剤の催奇性効果の試験を可能にする。更に、この研究は、出生後の気管気管支及び肺幹細胞の特徴的特性及び機能への有用な洞察を生み、並びにヒト発生を詳細に調査するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを提供する１０７。
【０１１０】
高度に富化したＡＦＥが産生可能であることが本発明者らにより示され、これは前側内胚葉分化の分野における主要な障害を取り除く１１５。更に、我々はＡＦＥを腹側ＡＦＥの肺野に対応する細胞へと系列決定できること、および、中程度のスループットのスクリーニングを介して、肺胞マーカーを発現する細胞が得られる条件を同定できたことを示す１１５。
【０１１１】
ＥＳ細胞の定方向分化の戦略
【０１１２】
本明細書で議論したように、ｉＰＳ細胞を使用した。ｈＥＳ細胞もコントロールとして使用した。いくつかのｉＰＳ株は、分化能に関し、ＥＳ株の正常な変動範囲内に入る１２０。現在使用されているｉＰＳ細胞は、切除可能なＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＭＹＣを含むカセットのレンチウイルスによる形質導入によって産生されている１２１。最近記述されたＰｉｇｇｙＢａｃシステム１２２はマウスで機能する。ｉＰＳ細胞を産生するための新規技術の中で、繰り返しのｍＲＮＡトランスフェクション、及び非組み込み型センダイウイルスによって産生したｈｉＰＳが現在使用されている。外来の遺伝物質が組み込まれないはずなので、このアプローチは安全なｉＰＳ細胞を生む１２２。
【０１１３】
１０６細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤＩｌ２ｒｇ−／−（ＮＳＧ）マウスの腎臓被膜下へ移植した。未分化のＨＥＳ２細胞が、三胚葉全てに由来する細胞を含むテラトーマを産生したのに対し（図１ａ）、ＮＳで処理した細胞は、識別可能な外胚葉又は中胚葉の成分を欠いた成長を生じた（図１ｂ）。偽重層上皮（上部気道上皮の典型）、又は１から３層の核を含むより組織化されていない上皮のいずれかによって裏打ちされた、多数の管腔構造を観察した（図１ｂ）。後者は、肺のＩＩ型肺胞細胞に特異的なマーカー９８，９９である、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃ（ＳＰ−Ｃ）で一貫して染色された（図１ｃ）。残りの細胞は、ほぼ一様にＦＯＸＡ２で染色された。しかしながら、ＦＯＸＡ２が核及び細胞質で発現していた管腔構造を除き、ＦＯＸＡ２は細胞質に限局した（図１ｃ）。ＰＡＸ９を発現する島状の細胞（咽頭嚢）３１，３２、及びＧＣＭＢの発現（副甲状腺）３３又はＡＩＲＥの分離した核内小斑点（髄質胸腺上皮細胞に特異的）３４を示す領域も検出した（図１ｃ；図２）。ＦＯＸＡ２と同様に、ＧＣＭＢ染色は主に細胞質であり、このことは、副甲状腺に非常に特異的ではあるが、前記副甲状腺組織は機能的ではないであろうことを示している。これらの知見は、ＮＳにより誘導した胚体内胚葉の潜在能力が、ＡＦＥに派生するものへとかなり限定されていることを示す。
【０１１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＦＥの腹側化。ＡＦＥは背腹側パターン形成を経て、腹側中胚葉からのＷＮＴ、ＢＭＰ、及びＦＧＦシグナルに応答し、肺原基及び気管の腹側系列決定をもたらす１，２，３５−３７，９８，９９，１４３−１４６。このステージで、背側−腹側におけるＳＯＸ２勾配が生じ、一方、腹側特異的マーカーＮＫＸ２．１（肺及び甲状腺野１，２，３８，９８，９９，１４７）、ＮＫＸ２．５（腹側咽頭内胚葉で一過性に発現する３９，１４８）、並びにＰＡＸ１（内胚葉内で咽頭嚢に特異的に発現する４０，１４９）が誘導された。１３日目まで延長したＮＳでの処理は、ＳＯＸ２の継続的な発現をもたらし、このことは、背側運命を示唆し（図９ａ）、ＢＭＰ４が腹側で発現するのに対し、ＮｏｇｇｉｎがＡＦＥにおける背側で発現するという事実と一致する１，３７，９８，１４６。対照的に、培養７日目にＮＳをＷＮＴ３ａ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０、ＢＭＰ４、及びＥＧＦ（ＷＫＦＢＥ）で置換することは、ＳＯＸ２の低い発現をもたらし、１３日目に腹側マーカーＮＫＸ２．１、ＰＡＸ１及びＮＫＸ２．５を誘導した（ＨＥＳ細胞については図９ａ、ＨＤＦ２及びＨＤＦ９  ｈｉＰＳ細胞については図９ｂ）。更に、ｐ６３（気道前駆細胞マーカー９８）を強く誘導した（図９ａ）。個々の因子の添加は、この転写誘導には十分ではなかった。初期甲状腺マーカー（ＰＡＸ８５３）の発現は観察されず、このことは、ＮＫＸ２．１誘導が、甲状腺ではなく、むしろ肺への運命決定を示すことを示唆している。免疫蛍光法により、３７＋６％の細胞においてＮＫＸ２．１の発現があることが明らかとなった（時折高密度に固まった細胞のコロニーにおいて起きる）（図９ｃ）。
【０１１５】
９日目ではなく７日目で処理した培養でのみ、ＮＫＸ２．１、ＰＡＸ１、及びＮＫＸ２．５を発現する能力を有したため、ＷＦＫＢＥ腹側化刺激のタイミングは重大な意味をもつ。＞９０％の細胞がＳＯＸ２＋ＦＯＸＡ２＋であった。次に、ＮＳへの曝露が、ＷＦＫＢＥに応答した腹側ＡＦＥ運命を達成するのに有利であるかを試験した。７日目にＮＳで処理した培養を、培地のみ又は肝臓（後側前腸）運命を助ける条件における７日目の培養と比較した。ＮＳへの曝露のみが、ＷＦＫＢＥによるその後のＰＡＸ１、ＮＫＸ２．１及びＮＫＸ２．５の上方制御を可能にし（図１０）、このことは、ＡｃｔｉｖｉｎＡで誘導した胚体内胚葉のＮＳ処理が、腹側ＡＦＥへの分化に関与していることを示している。
【０１１６】
ＥＳ／ｉＰＳ由来ＡＦＥのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肺としての潜在能力。ＮＳで誘導したＡＦＥのＷＦＫＢＥへの曝露は、培養１３日目又は１９日目で、肺の終末分化マーカーの発現をもたらさなかった。レポーター遺伝子の系譜追跡調査は、咽頭嚢ではなく、肺野がレチノイン酸（ＲＡ）シグナリングを経験することを示している４２−４４，１５１，１５２。更に、ＲＡは肺原基形成の間に関与する４５，１５３。実際に、ＲＡのＷＦＫＢＥカクテルへの添加は、前側嚢マーカーＰＡＸ１の発現を減少させたが、ＦＯＸＰ２、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、及び繊毛細胞マーカーＦＯＸＪ１を増加させる（肺野運命と咽頭嚢運命の枯渇とを示唆する一連のマーカー）１，２，９８，９９（図１１ａ）。ＳＰ−Ｃの発現は観察されなかった。しかしながら、１９日目までの継続したＷＦＫＢＥ＋ＲＡでの処理は、低レベルのＳＰ−Ｃを産生した（図１１ｂ）。
【０１１７】
ＳＰ−Ｃ発現を最適化するために、ＷＫＦＢＥ及びＲＡの存在下で腹側ＡＦＥを産生した。１１日目に、４８ウェルプレートで、選択された因子の４００通りの二値の組み合わせ（ＦＧＦ１０／７、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ４、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＳＢ−４３１５４２、ＴＧＦ−β１、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ、ＲＡ阻害剤ＤＥＡＢ、ＦＧＦ阻害剤ＳＵ−、ＳＨＨ阻害剤シクロパミン、及びＲＡ）中に、細胞を播種した。１９日目に、ＳＰＣのｑＰＣＲのために、各群４ウェルからなるようウェルをプールした。ウェルの６つの群で、ＳＰＣが誘導された。次に、陽性ウェルのプールに含まれるのと同じ条件をセットアップし、個別の条件で培養した細胞についてｑＰＣＲを行った。これらの組み合わせの中で、Ｗｎｔ３ａ＋ＦＧＦ１０／７のみが一貫して高レベルのＳＰ−Ｃを誘導した（図１１ｂ）（Ｗｎｔ１５４，１５６及びＦＧＦ１０１４７，１５７，１５８シグナリングが、遠位の肺発生に重要であるという考えと一致する知見である）。
【０１１８】
これらの条件において、培養物中で大規模な嚢胞性及び嚢状構造が形成された。培養１３日目の染色により、これらは大部分がＮＫＸ２．１であることが明らかとなった（図１１ｃ）。しかしながら、タンパク質レベルでのＳＰ−Ｃの発現は検出されず、このことは、ＳＰ−Ｃ  ｍＲＮＡ発現細胞の成熟が、ＳＰ−Ｃタンパク質の発現が検出可能な程度にまではまだ十分に進行していないことを示唆している。
【０１１９】
ＡＦＥの肺野系列決定のための条件の確立
【０１２０】
ＡＦＥから推定肺野を誘導する因子。ＡＦＥのＷＦＫＢＥ及びＲＡによる処理は、気管及び肺原基を生じるＡＦＥの後側面のマーカー（ＧＡＴＡ６及びＮＫＸ２．１を含む）の、優先的な誘導をもたらした。これらの条件を、オリジナルのプロトコール（４０％の細胞しかＮＫＸ２．１を発現しなかった）と比べて、８０％までの肺野細胞の効率を有するより効率的な誘導を達成するために洗練した。より前側の領域を犠牲にした、ＡＦＥの肺野のより効率的な誘導は、肺及び気管支樹のより効率的なその後の誘導を可能にする。
【０１２１】
ＷＦＫＢＥの組み合わせの個々の因子はＮＫＸ２．１の誘導には効果がないが、どの組み合わせが、及びどの濃度が最適であり、並びにどの因子が必須かは決定されなかった。例えば、ＧＡＴＡ６の発現はＡＴＲＡの用量に強く依存する（図１２）。ＡＦＥ内で、ＧＡＴＡ６は肺原基が生じる最も後側の領域のマーカーとなる９８，９９，１１６。ＳＨＨは周囲の間充織へのシグナリングを介して、前腸発生及び分岐形態形成に使用されるが５８，５９，１５９−１６１、より後期の発生において、ＳＨＨシグナリングは少なくともいくつかの上皮（神経内分泌）細胞も標的とする６０，１６２。ＳＨＨはＡＦＥにおける前後パターンの形成においても役割を果たす６１，１６２。マウスにおけるＳｈｈの欠失は、咽頭嚢マーカーＰａｘ１の発現を減少させた６１，１６３。更にＳｈｈ−／−マウスにおいて、副甲状腺を形成することが決定づけられている、第３咽頭嚢のより後側部分が、胸腺になることを運命づけられている前側部分を犠牲にして拡大する１６４。従って、シクロパミンを使用してＳＨＨを阻害することで、ＡＦＥ内で、より後側の、肺に系列決定した運命を助けることが可能である。シクロパミンのいかなる効果も、培養における、混入ＦＯＸＦ１間充織の役割の研究を促すであろう１１６。
【０１２２】
２日間のＮＳ使用によるＡＦＥの誘導の後、ＢＭＰ−４、Ｗｎｔ３ａ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０（ＦＧＦＲ２ｂに結合する）、ＥＧＦ、及び複数濃度のＡＴＲＡの、いくつかの組み合わせの効果を試験した。ＦＧＦ９（ＦＧＦＲ２ｃに結合する、及び分岐形態形成にも影響する）９８，９９の効果、並びにいくつかの実施形態においてはシクロパミンを試験する。最初のステージにおいて、ＧＡＴＡ６及びＮＫＸ２．１のｑＰＣＲのためにウェルをプールする。２つの時点で、以下を解析する：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、発生の最初の時期はかなり速く進行するので、培養ステージ開始後３及び５日で解析。更に、いくつかの操作（ＳＨＨシグナリングの遮断等）は、咽頭嚢領域を犠牲として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで肺野を樹立するのに有用であり得るが、しかし、ＳＨＨは肺発生に関与するので、その後の初期発生及び肺野の拡大については有害であり得る９８，９９，１１６，１５８−１６１。
【０１２３】
特定の実施形態において、以下を行う。ＧＡＴＡ６及びＮＫＸ２．１の両方が最も高い条件の群をその後セットアップし、ＧＡＴＡ６及びＮＫＸ２．１の発現について個別に解析し、ヒットを同定及び確認する。
【０１２４】
その他の実施形態において、以下を行う。ヒットを更に解析する。可能な場合は、ｑＰＣＲのデータを蛍光顕微鏡で確認する（例えば、ＮＫＸ２．１の抗体を使用して）。重要なことに、「肝臓の」条件１１０の対応する培養を、ＡＦＥ及び肺特異的マーカーの染色のコントロールの一つとして使用する。甲状腺（ＰＡＸ８、ＴＧ（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＳＨＲ（ＴＳＨレセプター））、咽頭嚢（ＰＡＸ１、ＰＡＸ９、ＴＢＸ１、ＳＩＸ、ＥＹＡ及びＨＯＸＡ３）、咽頭嚢誘導体（ＦＯＸＮ１（胸腺）、ＧＣＭＢ（副甲状腺）、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（傍濾胞Ｃ細胞））、並びに、もちろん、肺及び気管（ｐ６３、ＮＫＸ２．１、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＰ２、ＳＰ−Ｃ、ＣＣＳＰ、ＦＯＸＪ１、ＭＵＣ５ａ）についてのマーカーを試験する。特に、神経外胚葉（ＴＵＢＩＩＩ、ＴＵＪ１及びＰＡＸ６）、中胚葉（ＦＯＸＦ１）、並びに胃（ＯＤＤ１）、肝臓（ＣＥＢＰＡ、ＥＶＸ１、ＦＯＸＡ３）及び膵臓（ＰＤＸ１）等のより後側の内胚葉誘導体について、他の系譜の喪失及び混入も確認する。
【０１２５】
最終的に、より成熟な細胞への分化能を評価する。
【０１２６】
細胞の増殖
【０１２７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト多能性幹細胞の分化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトの発生速度と比べ、非常に速く進行することは大いに注目すべきである。１つの考えられる理由は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、より多くの発生上の時間が細胞の増殖に費やされるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、各発生ステージにおいて「ラテラル（水平）」な増殖よりも迅速な分化に有利に働く条件が経験的に選択されていることである。
【０１２８】
Ｇ−ＣＳＦは心筋細胞の分化培養物の産生を増加させる７４，１６４。いくつかの実施形態において、以下を行う。肺野の誘導条件を最適化した時点で、Ｇ−ＣＳＦの効果を調べる。発生の間の成長に対する有用なホルモン系は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−成長ホルモン（ＧＨ）軸である７５，１６４。その他の実施形態において、ＩＧＦ１、ＧＨ、又は両方の添加が、細胞の産生量を増加させるかを探求することが可能である。このアプローチは、Ｉｇｆシグナリング欠損の変異体において、肺が著しく低形成であるという観察により支持される７５，１６５。
【０１２９】
タイミングの効果
【０１３０】
ＷＦＫＢＥ存在下で腹側ＡＦＥマーカーを発現する可能性は、ＮＳ誘導後の狭い時間枠においてのみ存在する１０。従って、ＷＫＦＢＥ又はこのカクテルの任意の最適化派生物への曝露の長さが、その後の肺又は気管支の分化誘導の効率を決定している可能性がある。いくつかの実施形態において、ＦＧＦ７／１０＋Ｗｎｔ３ａ（ＳＰ−Ｃ）又はＦＧＦ７／１０＋Ｎｏｇｇｉｎ（管状構造）のいずれかにおけるその後の培養の後、腹側化ＡＦＥがＳＰ−Ｃを発現する可能性又は管状構造を形成する可能性を読み取る。
【０１３１】
細胞外マトリックスの役割
【０１３２】
その他の実施形態において、以下を行う。これらの条件を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）存在下での培養によって、更に最適化する６１。フィブロネクチン、マトリゲルに包埋された培養、及びコラーゲンＩ培養を調査する１４１，１６７，１６８。ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＷｎｔ３ａ存在下で、並びにＥＣＭ存在下で、ＳＰ−Ｃの誘導を効率的に再現可能であるかを決定することができる。コラーゲンは、乳腺上皮細胞からの分岐形態形成を可能にする７２。フィブロネクチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分岐形態形成において役割を果たし、Ｗｎｔシグナリングの標的である７７。ＤＣＩ誘導性球状物を「近位」条件から得るのに使用したように、複数のＥＣＭ成分を含むマトリゲルで包埋することも一般的に使用される。もしＥＣＭ包埋培養で良い結果が得られた場合、次いでいくつかの実施形態において、すべてのその後の実験はＥＣＭ存在下で行うことができる。更に、三次元構造の発生（おそらく分岐形態形成を表している）を評価する。
【０１３３】
腹側化ＡＦＥからの気管気管支及び肺胞上皮細胞の系列決定の最適化
【０１３４】
成熟呼吸器細胞を得るための条件の更なる最適化は望ましい。これらの実験の読み取りは、発生の異なるステージでの肺マーカーの発現である（参考文献９８、９９、及び１１６に概説される）。ＦＯＸＡ２、ＮＫＸ２．１及びＧＡＴＡ６は全ての肺の領域のマーカーとなり、呼吸器上皮の発生の先駆因子である。マウスにおいて、ＳＯＸ２、ｐ６３及びＮｋｘ２．５（我々はＡＦＥの腹側化後にすでに同定した）は初期の気管マーカーであり、一方、Ｉｄ２、Ｓｏｘ９、Ｎｍｙｃ及びＩｒｘは遠位の先端部マーカーである。後者は、発生が完了したときに下方制御される。従って、これらのマーカーのヒトオーソログの一過的な発現パターンは、分化のステージに関する情報を与える。分化は遠近方向に進行するので、クララ細胞マーカーＣＣＳＰ、繊毛細胞マーカーＦＯＸＪ１、粘液細胞マーカーＭＵＣ５ａ、及び神経内分泌マーカーcalcitonin gene-related peptide product（ＣＧＲＰ）は柄部に現れる。ＡＴＩＩマーカーであるＳＦＴＰＣ（ＳＰ−Ｃ）、ＳＦＴＰＡ（ＳＰ−Ａ）及びＳＦＴＰＢ（ＳＰ−Ｂ）、並びにＡＴＩマーカーであるＡｑ５及びＴ１αは、終末肺胞分化を示す。ヒトにおいて、偽重層上皮ははるかにより遠位に到達するので９８，９９、気管に関連するマーカーを見出し得る。ｑＰＣＲ並びに（可能であれば）蛍光及び共焦点顕微鏡を使用する。いくつかの実施形態において、以下を行う。細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在能力を決定するために、腎臓被膜下に細胞を移植する。
【０１３５】
細胞外マトリックス
【０１３６】
その他の実施形態において、以下を行う。正しい組織構造の樹立はＥＣＭの支持を使用する１６８。いくつかの実施形態において、ＳＰ−Ｃの誘導が、ＥＣＭ存在下で、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０及びＷｎｔ３ａの存在下において、効率的に再現することが可能であるかを決定する。フィブロネクチン、コラーゲンＩゲル、及びマトリゲルを使用する。コラーゲンは乳腺上皮細胞からの分岐形態形成を可能にする１６６。フィブロネクチンはｉｎ  ｖｉｖｏでの分岐形態形成において役割を果たし、Ｗｎｔシグナリングの標的である１６８。複数のＥＣＭ成分を含むマトリゲルに包埋することも一般的に使用されている１４１。もしＥＣＭ包埋培養において良い結果が得られた場合、次いでいくつかの実施形態において、全てのその後の実験はＥＣＭ存在下で行う。更に、その他の実施形態において、分岐形態形成を表している、三次元構造の発生が観察されるかを決定する。
【０１３７】
最適な因子濃度
【０１３８】
分岐形態形成の間、多能性前駆細胞が先端部で再生する９８，９９，１０８，１７０。柄部に残された細胞は気管気管支上皮へと分化する。細管状／嚢状期が開始するとき、遠位細胞は肺胞細胞への分化を開始する９８，９９。ＡＦＥの腹側化後の、Ｗｎｔ３ａ、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０の適用は、多量のＳＰ−Ｃ  ｍＲＮＡを誘導するが、タンパク質は誘導しないことが示された。これらの条件は偏りのない選別において同定されたが、ＦＧＦ１０及びＷｎｔシグナリングは遠位の運命を確立するため、発生上の理にかなっている１５４−１５８。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、以下を行う。これらの培養において３つ全ての因子が関与しているか、及びそれらの濃度を最適化可能か（多くのモルフォゲンは濃度依存的な効果を示すため）を決定する９８，１７１，１７２。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、以下を行う。どの程度まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遠近の肺分化が影響され得るかを調査する。細胞置換治療のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで最終的に産生され得る成熟細胞の特徴的特性を操作する方法を提供することに加え、マウスの肺発生において為された観察を我々のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトの系において再現することは、この系の妥当性を立証することになるであろう。ＢＭＰ−４は、発生中の肺原基において発現し、ＦＧＦシグナリングを制御し、及びより遠位の運命を促進する９８，１７３−１７５。従って、Ｗｎｔ３ａを取り除き、Ｎｏｇｇｉｎを添加することにより内在性ＢＭＰ−４を遮断することで、ＥＣＭの存在下及びＳＰ−Ｃの欠如下での管形成及び出芽により特徴付けられる、より近位の運命に系列決定し得る。これは、近位の及び遠位の気道マーカーの発現を更に解析することにより、明らかになるはずである。更に、ｓＦＲＰ３又はＤＫＫを使用して内在性Ｗｎｔを阻害することにより、近位運命を更に助け得る。非標準のＷｎｔ（Ｗｎｔ５ａ）も、おそらくＳＨＨ及びＦＧＦ１０シグナリングの制御を介して、肺発生において役割を果たす１７６−１７７。発生初期のシグナリングにおいてＮｏｔｃｈを遮断することも、より遠位の運命を促進する１７７。これはガンマ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴを使用して達成可能である。
【０１４１】
より近位の運命を誘導する条件は同定されているが、より遅い時点で、近位運命を誘導する条件から、よりＳＰ−Ｃ誘導に従う条件へと培養を切り換えることの効果を調査した。ｐｒｏ−ＳＰＣの誘導に有利に働く条件（ＷＦＫを含む培地へのＤＡＰＴの添加）が少なくとも同定された。これは、分岐形態形成とそれに続く肺胞分化という発生上の順序を模倣しているであろう。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、以下を行う。ＳＰ−Ｃ誘導のための最適な条件が同定されたら、最適なタイミングを決定する。ｍＲＮＡ発現のみではなくＳＰ−Ｃタンパク質の発現は、単純に長時間の培養を伴う可能性がある。分化した呼吸器細胞のマーカーの一連の決定は、これらの培養において成された終末分化の度合いも明らかにする。
【０１４３】
その他の実施形態において、以下を行う。ＳＰ−Ｃ発現細胞への終末成熟が、まだ探求されたことのない、異なる条件であるかを調査する。この文脈において調査される、いくつかのシグナリング経路が存在する：グルココルチコイド、ヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）及びＲＡ。ＳＨＨの発現は、終末肺胞分化の間に止まる１６２。従って、ＳＨＨは主に周囲の肺間充織に影響を与えると信じられているが１５９，１６０、ＳＨＨの阻害は終末肺胞分化を促進するかもしれない。同様に、ＲＡシグナリングの下方制御は、ＡＴ細胞の終末分化のために望まれる１７９。しかしながら、ＲＡの役割は複雑である。ＲＡはｉｎ  ｖｉｖｏで、Ｗｎｔ、ＦＧＦ１０及びＢＭＰ４の発現に影響し、従って間接的な効果を有する１５３。更に、ＲＡは出生後の肺胞発生を増強するようである１８０。それ故、シクロパミンによるＳＨＨシグナリングの遮断、及びＢＭＳ４９３によるＲＡシグナリングの遮断は、終末肺胞分化を達成するのに有利である可能性がある。最後に、副腎皮質ステロイドは、間充織への効果を介して肺の成熟を増進し９９、それを調査する。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、以下を行う。もし、より近位の運命を決定する条件を定義することができた場合、次いで、更なる因子がこれらの近位領域の分化に影響するかを決定する。Ｎｏｔｃｈシグナリングは、クララ細胞運命を助けることで、気管支樹の３つの成熟細胞種の中からの運命選択を決定する１８１。故に、ＤＡＰＴによるＮｏｔｃｈシグナリングの阻害効果が調査された。ＳＨＨは、おそらく間充織によって媒介されていないであろう、直接の効果を介して、神経内分泌細胞の分化に影響する１６１。従って、いくつかの実施形態において、ＳＨＨシグナリングの遮断又は増強のいずれかが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化に影響し得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、以下を行う。分岐形態形成を制御する因子を調査する。ｉＰＳ由来細胞の分岐形態形成をモデル化できる条件を確立することは、本分野における大きな前進となる。更に、前駆細胞は成長中の枝の先端部で再生するので、分岐形態形成の刺激と、それに続く肺胞分化のための適切な刺激の適用により、成熟細胞の産生量の増加への道を開くことができる。ＥＧＦ及びＨＧＦの両方は、コラーゲンゲル培養において、乳腺上皮前駆細胞による分岐形態形成を誘導する１６７，１６８。更に、分岐中の乳腺上皮細胞の柄部で産生されるＴＧＦ−β１は分岐を阻害し、一方、ＴＧＦ−βの阻害は分岐を促進する１６７。ＥＧＦ、ＨＧＨ、ＳＢ−４３１５４２又はそれらの組み合わせの添加が、ＥＣＭ包埋培養において、分岐（もしあれば）を増強するかを試験する。
【０１４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生した気管気管支及び肺胞の細胞集団の機能解析
【０１４７】
潜在的な出生後肺幹細胞の検出
【０１４８】
出生後の肺は、損傷後の相当な再生能を有する。しかしながら、損傷後に主に機能すると考えられる推定上の肺幹細胞１８２の特徴的特性は不明瞭である１００，１０７，１８３，１８４。気管支肺胞の接合部でのその局在により定義される一種の幹細胞（気管支肺胞幹細胞（ＢＡＳＣ））が同定されている１８５。この細胞はＳＰ−Ｃ（ＡＴＩＩマーカー）及びＣＣＳＰ（クララ細胞マーカー）の両方を発現する１８５。最近のいくつかの報告は、ＢＡＳＣは気管支肺胞癌の起源の細胞であり得るが、それらは肺胞幹細胞として機能しない可能性を示唆する。最初の報告では、ＢＡＳＣがＣＤ４５−ＣＤ３１−Ｓｃａ１＋ＣＤ３４＋表現型により有望性をもって単離できると主張したが、より最近の観察は、推定上のＢＡＳＣがＣＤ３４及びＳｃａ１が陽性であることに疑問を投げかけた１８６，１８７。肺幹細胞としてのＳＰ−Ｃ＋ＣＣＳＰ＋細胞に反対する最も強い論拠は、肺胞における非常に稀な細胞（もしあれば）のみがＣＣＳＰ発現前駆細胞に由来することを示している、入念な系譜追跡実験から来る。しかしながら、マウスの細気管支において、ほとんどの繊毛細胞はクララ細胞に由来する１８８。気管において、クララ様細胞は条件的な通過性の増幅細胞として機能するらしく、一方、ほとんどの再生能は基底細胞に由来する（それは、上皮の３０％を占め、少なくともその内のいくつかはＮｇｆｒ及びＣＤ４９ｆを発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいわゆるトラキオスフェアを形成することができる）１８９。ＣＤ４９ｆ＋Ｓｃａ１＋ＡＬＤＨ＋の表現型により特定され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいわゆる「縁付き」コロニーを形成する、別のタイプの基底細胞が同定された１９０。肺胞において、ＡＴＩＩ細胞又はそのサブセットは、ＡＴＩ細胞へ分化することが可能である１００，１０７，１８３。ヒトにおいて、偽重層上皮は細気管支レベルにまで到達する９８。故に、ヒトにおいては、気管気管支性と肺胞性というわずか２種類の幹細胞及びそれに対応する出生後幹細胞ニッチが存在し得る。
【０１４９】
出芽中の枝の先端部の細胞は、呼吸器系の全ての上皮細胞を生じることが示されているので、この二分法は発生中には存在しないと考えられる。発生後期においてのみ、これらの細胞は肺胞に運命決定されている１７０。しかしながら、ほとんどの利用可能なデータは、発生が進行するにつれ、異なる前駆細胞が定められることを示唆する１００，１０７，１８３−１８７。それにも関わらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで気道及び肺胞細胞を生じることができる、ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１０４＋ＥｐｃａｍｈｉＣＤ２４ｌｏ表現型を有する肺幹細胞についての証拠が発表されている１９１。これらの推定上の出生後肺幹細胞（その局在は不明）は、それ故、少なくともＣＤ４９ｆの発現を基底細胞と共通して有する１８９，１９０。それらはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、嚢状及び嚢胞状コロニーを形成することができる。興味深いことに、これらはＦＧＦ１０を伴い、しかしＢＭＰ−４により阻害された。これらのコロニーの産生はＨＧＦ（上記モデルにおいて試験することを提案した因子）も伴う１９１。
【０１５０】
本明細書に記載のモデルにおいて、推定上の肺幹細胞を検出するために、２つのアプローチを使用する。第一のアプローチにおいて、ＮＫＸ２．１＋嚢状コロニー（図１１ｃ）の形成後、培養物を再播種した。ＮＫＸ２．１＋又はＳＰ−Ｃ＋コロニーの再生（図１１ｃ参照）が観察される（２５日目以降にＮＫＸ２．１、及び４５日目以降にｐｒｏ−ＳＰＣをそれぞれ観察）。再播種能が観察されたので、いくつかの実施形態において、以下を行う。限界希釈法を行い、これらの構造を惹起する細胞の頻度を決定する。そして、一連の再播種は、これらの細胞の再生能の指標を与える。次の工程では、これらの推定上の幹細胞を、肺の幹細胞に関連する表面マーカー（Ｎｇｆｒ、ＣＤ４９ｆ、Ｅｐｃａｍ、ＣＤ２４、ＡＬＤＨ（比色染色ＡＬＤＥＦＬＵＯＲを使用して検出される））について、細胞集団を解析することにより、見込みをもって単離する１８９−１９１。興味深いことに、いくつかの推定上の肺幹細胞マーカーは、ヒト乳腺幹細胞を単離することにも使用される。これらとして、Ｅｐｃａｍ（ヒト乳腺幹細胞はＥｐｃａｍ−であるが）、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２４及びＡＬＤＨ１が挙げられる１９２。発生中の肺及び成体乳腺は、両方とも分岐形態形成を経る上皮組織であるという共通点を有する。
【０１５１】
従って、いくつかの実施形態において、以下を行う。乳腺幹細胞について報告された他のマーカーの発現をモニタリングする。これらとして、ｃ−ＫＩＴ、ＣＤ１０、ＣＤ１３３及びＣＤ９０が挙げられる１９２。ＣＤ３８、ＣＤ３４及びエンドグリン等の、造血幹細胞に存在するマーカーを試験する。ＳＬＡＭマーカーも造血幹細胞で使用されるが、しかし、それらの発現は造血系に限定される傾向にある１９３。これらのマーカーのいずれかを発現する細胞集団をセルソーティングにより単離し、ＮＫＸ２．１及びＳＰ−Ｃ発現コロニーの産生に最適な条件に播種する。コロニー惹起能に富んだ細胞集団のマーカーを組み合わせて、より高い富化を達成する。精製した推定上の幹細胞を、ｐ６３、ＳＯＸ２、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＡ２及びＮＫＸ２．１、ＦＯＸＪ１、ＳＦＴＰＣ（ＳＰ−Ｃ）、ＭＵＣ５Ａ、ＣＧＲＰ、ＣＣＳＰ等の、肺／気管マーカーの発現について解析する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、以下を行う。出生後の推定上肺幹細胞の増殖についての既知の条件を、本明細書に記載の系において多能性細胞から産生した細胞へ適用することにより、出生後の肺幹細胞と一致する細胞が産生されるかを調査する。この再播種は、推定上の幹細胞マーカーを発現する細胞をソーティングした後、トラキオスフェア及び肺幹細胞について報告された条件において最終的に行う１８９−１９１，１９４。そのようなアプローチの実現可能性を実証する予備実験として、Ｒｏｃｋらのプロトコールを使用して、成体マウスの気管からのトラキオスフェアの産生に成功した（図１３）１８９。
【０１５３】
腎臓被膜下への異種移植
【０１５４】
ＮＳで誘導したＡＦＥを免疫不全マウスの腎臓被膜下へ移植した後、複数のＳＰ−Ｃ＋管状構造、及び偽重層上皮を有する構造を観察した（図１ｃ）。これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生したＡＦＥは、ｉｎ  ｖｉｖｏで有意な肺としての潜在能力を有し、逆に、このアッセイは移植した細胞の肺の潜在能力を比較的効率的に明らかにすることを示す。この知見はまた、腎臓被膜下へのＥ１１．５マウスの胎生期肺の移植が、肺胞発生の偽腺様及び細管状期を介しての分化を可能にしたという観察と一致する１９５。この過程の間、移植された血管は内に伸びるホストの血管と結合した１９５。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、以下を行う。本明細書に記載の方法に従い産生した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの潜在能力はより狭いのか、肺の産生により限定されているかを決定する。試験する時点は、ＷＫＦＢＥ＋ＲＡを使用、又は同定された任意の改良プロトコールを使用して腹側化した後のＡＦＥ、及び分化の連続的なステージである。１０６細胞を４℃のマトリゲル（４μｌ）中に溶かし、３７℃で凝固させ、免疫不全ＮＳＧマウスの腎臓被膜下へ移植した。３−５匹のマウスの群を、各条件及び分化ステージについて、移植後４及び８週でそれぞれ解析する。解析は、気道上皮細胞（ＦＯＸＪ１、ＣＣＳＰ、ＣＧＲＰ、ＭＵＣ５ａ、ｐ６３）、肺胞細胞（ＳＰ−Ｃ、Ｔ１ａ、ＡＱ５）の染色からなる。更に、ＧＣＭＢ（副甲状腺）ＰＡＸ９及びＴＢＸ１（咽頭嚢）、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ（Ｃ細胞）、ＡＩＲＥ（胸腺）に対する染色により、その他の運命を調査する。
【０１５６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの前駆細胞／幹細胞活性に富んだ細胞集団が同定された。いくつかの実施形態において、以下を行う。コラーゲンゲル又はマトリゲルのいずれかに懸濁した後のものも移植する。ヒト乳腺幹細胞がこのアプローチを使用することで定量化可能であるという事実により、このアプローチは正当化される１９６，１９７。更に、もしｉｎ  ｖｉｖｏでの幹細胞活性が観察された場合、増殖物を回収し、二次的レシピエントに移植することにより、自己複製能を評価することが可能である。
【０１５７】
肺損傷モデル
【０１５８】
肺損傷モデル１９７は通常、内在性の前駆細胞からの再生を評価するために使用される１８８−１９０，１９９。肺細胞を用いた肺損傷の治療例は数少ない。精製したＡＴＩＩ細胞の気管内投与は、ブレオマイシン誘導性の炎症及びその後の線維症を防止できた２００。これらの知見と一致して、ｈＥＳ由来のＡＴＩＩ細胞（選択を使用して得られた）は、ブレオマイシン毒性からの生存を改善した２０１。しかしながら、両方のケースにおいて、肺胞における移植細胞の確かな生着の証拠を欠いており、このことは、間接的な効果を示唆している。肺損傷モデルにおいて、最適化されたプロトコールで得られた、任意の成熟細胞集団の潜在能力を試験する試みは有用である。もし十分に高い純度で得られるなら、興味の対象となる細胞は、ＡＴＩＩ細胞、クララ細胞、及び肺幹細胞活性を有するあらゆる細胞種である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、以下を行う。原則として、ブレオマイシンの吸入(肺胞の損傷)又はナフタレンのｉｐ投与（気管気管支のクララ細胞の傷害）によりＮＳＧマウスの肺に傷害を与え、細胞を経口気管内の挿管により２０２，２０３、３、７又は１４日目に注入する。マウスの生存、体重の減少及びその後の増加、肺の質量、及び一連の組織学的解析を行う。
【０１６０】
理論により縛られるものではないが、最良の機能アッセイ法は、脱細胞化した肺マトリックスの再細胞化であろう２０４−２０６。このアプローチは、全ての成熟細胞及び幹細胞の区画を含む呼吸器上皮ばかりでなく、おそらく間充織細胞、加えて血管も伴う。
【０１６１】
実施例３：ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞の富化の最適化
【０１６２】
上記の培養プロトコール（図２及び図３）において、肺野細胞（ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋Ｐａｘ８−Ｐａｘ６−）の富化は４０％を超えることはなかった。故に、ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞のより良い富化を達成するための戦略を開発した。マウスの胚発生の間、初めにｎｏｄａｌ／ａｃｔｉｖｉｎシグナリングから離れるように移動する内胚葉の細胞がＡＦＥとなる。故に、中腸や後腸の内胚葉細胞と比べ、ＡＦＥはＡｃｔｉｖｉｎＡシグナリングに最も短い時間曝露された。初期及び後期内胚葉（４、４．５及び５日目）を、肺野細胞系列決定の能力について試験した。４、４．５及び５日目の内胚葉の産生量は全て＞９０％であったが（図１４、左パネル）、これらの内胚葉細胞からの肺野細胞の富化は、互いに大きく異なった。
【０１６３】
初期内胚葉は、後期内胚葉と比べ、ＮＫＸ２．１＋細胞を４０−６０％高い効率で産生した（図１４（Ａ）と図１４（Ｂ）及び（Ｃ）との対比）。５日目の内胚葉は、〜１０％のＮＫＸ２．１＋細胞しか産生しなかった（図１４（Ｃ））。これらの結果は、ＡｃｔｉｖｉｎＡに曝露した胚様体の、分離のタイミングが重大な意味をもつことを示した。ＤＥを５日より長く誘導したとき、ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞を産生する潜在能力は完全に失われた。第二に、マウスのＡＦＥ形成の間、ＡＦＥになることを運命付けられた細胞は、ｎｏｄａｌ／ａｃｔｉｖｉｎ阻害剤Ｌｅｆｔｙ、及びＢＭＰ４阻害剤Ｎｏｇｇｉｎが発現する区域を通過し、このことはおそらく、なぜＡｃｔｉｖｉｎＡへの曝露期間の後に、ＴＧＦ−β及びＢＭＰシグナリングを遮断することが、この部分の内胚葉を決定するのに使用されるかを説明している。その後に、最も前側に運命付けられた細胞は、Ｗｎｔ阻害剤Ｄｋｋ１に曝される。
【０１６４】
特定時期のＷｎｔシグナリングの阻害が、肺野のより詳細な系列決定をもたらし得るという仮説を試験した。ＡｃｔｉｖｉｎＡで誘導したＤＥを、４日目から５日目までＮＳへ、次いで、５日目から６日目までＳＢ及びＷｎｔ阻害剤ＩＷＰ−２（ＳＩ）へと曝露した。その後、先に記述したように、細胞を１５日目まで、腹側化カクテル、Ｗｎｔ３ａ、ＢＭＰ−４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７及びＥＧＦ、並びにＲＡの存在下（ＷＫＦＢＥ＋ＲＡ）で培養した。ＮＳのみへの曝露と比べ、ＮＳとそれに続くＳＩでは、１５日目のＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞及びＮＫＸ２．１  ｍＲＮＡの画分が増加した（図８）。ＮＳ／ＳＩの順序を逆にすること、又はＳＩのみを使用することは、ＮＫＸ２．１の発現にとっては有害であった。更に、腹側化の間のＲＡの用量が重大な意味をもつことを決定し、５０μＭが最適であることを決定した（図１９）。
【０１６５】
更に、肺野細胞系列決定に対するＦＧＦ７及びＥＧＦの重要性及び寄与を調査した。培養培地からそれぞれの因子、又は両因子を抜くことで、ＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋細胞の産生量が減少しないという結果を示した（データは示さず）。これらの操作（ＲＡの最適用量と共に）は、大部分（８０％）の細胞がＮＫＸ２．１＋ＦＯＸＡ２＋である培養物をもたらした。重要なことに、ＤＥの分離の最適なタイミング及び最適なＲＡの用量は、ｈＰＳＣの具体的な株に依存して変化する可能性があり、それ故、異なるｈＰＳＣに対して試験することが有利である。これらの培養において、神経又は甲状腺分化についての、ｐＰＣＲ又はＩＦでの証拠は観察されなかった。ＮＫＸ２．１は甲状腺及び前脳においても発現するので、このことは重要である。培養１５日目のＩＦによって、成熟肺上皮細胞のマーカーは検出されなかった。しかしながら、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２及びＮＫＸ２．１のいずれも陰性であるがｐ６３を発現する、島状の細胞を観察した（図１５）。培養がより低密度である場合、それらはＮＫＸ２．１＋細胞を取り囲む、紡錘状の核を有する線状に並んだ細胞として存在する（図１５）。これらの細胞の特徴的特性は今のところ不明である。
【０１６６】
より成熟な肺マーカーをタンパク質レベルでは発現しない、肺野を誘導する最適な条件を確立し、１５日目に培養物をＷＦＫＢ＋ＲＡ又はＷＦＫの条件に再播種し、３５日目まで培養を観察した。２３日目以降に、培養物全体はコロニーからなり、そのコロニーは、＞９０％がＦＯＸＡ２＋ＳＯＸ２＋であり、その大部分がＮＫＸ２．１を発現した（ＮＫＸ２．１はより斑状であったが）（左下パネル、図５  ＮＫＸ２．１）。コロニーはＦＯＸＡ２＋ｐ６３＋細胞の縁により囲まれ、このことは、気道の幹細胞である、基底細胞を示唆している（図５、左及び中央のパネル）。これらはＦＯＸＡ２を発現したが、ごく外縁部においてＮＫＸ２．１は薄かった。構造のより中心部に向かって、ｐ６３及びＮＫＸ２．１は共発現した（右上、図５）。コロニー内で、ムチン（ＭＵＣ２（示されていない）及びＭＵＣ５ａ（右下、図５））を発現する管状構造が存在した。遠位マーカー（ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及びＳＰ−Ｄ）、並びにクララ細胞マーカー（ＣＣ−１０）及び繊毛細胞マーカー（アセチル化チューブリン）は、ＩＦ（散在的なＣＣ−１０又はＳＰ−Ｂ陽性細胞は見出し得る）又はｑＰＣＲによって検出されなかった。マウス胚において分岐形態形成が開始すると、ＲＡシグナリングは発生中の肺の最も遠位の区画において減少する。
【０１６７】
更に、構成的に活動性のＲＡシグナリングは遠位の肺の発生を妨げ、近位の気道の発生を助ける。我々は、遠位マーカーＳＰ−ＣのｍＲＮＡ発現を達成するには、ＢＭＰ４は成長因子カクテルから取り除かれるべきであることも示した（ＳＰ−Ｃタンパク質は検出されなかったが）。しかし、これらの培養においては、３５日目に、遠位マーカーを発現する細胞への分化の証拠は観察されなかった。それ故、我々は、デキサメタゾン、ブチリルｃＡＭＰ及びイソブチルメチルキサンチン（ＤＣＩ）（胎生期のマウス肺外植片において肺胞の成熟を誘導する）を添加し、又は添加せずに更に培養した。試験した全ての上皮性肺及び気道マーカーのｍＲＮＡの発現（ＣＣ−１０（クララ細胞）、ＦｏｘＪ１（繊毛細胞）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５Ｃ及びＭＵＣ５ＡＣ（杯状細胞）、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｄ（ＡＴＩＩ）細胞、Ａｃｑ５及びポドプラニン（ＡＴＩ細胞））が５５日目までに急激に増加し（データは示していない）、この増加はＢＭＰ４及びＲＡを欠くときにより顕著であった。ＩＦによって、多量のＳＰ−Ｂ＋細胞、及びＣＣ−１０＋若しくはＭｕｃ２＋の集団、リゾチーム＋、又はレクチン  ＤＢＡ＋細胞を観察し（図１６（Ａ）−（Ｃ）及び図１７（Ｂ）−Ｄ）、これらは全体で培養における大部分の細胞を占めた。これらにはムチン５ＡＣ＋（示されていない）、又はＭｕｃ１＋細胞（図１８（Ａ））の集団が散在していた。
【０１６８】
ｑＰＣＲのデータと一致して、ＳＰ−Ｃ＋細胞は稀であった。アセチル化チューブリンは、コロニーの縁で及びコロニー内の管状構造において、主に検出された（図１６（Ｄ））。全てのこれらのマーカーは、ＤＣＩを用いる及び用いない条件の両方において検出された。ＤＣＩの添加は、ＳＰＢ及びＮｋｘ２．１共発現細胞の集団の系列決定を強化した（図１６（Ｃ））。一貫して、ＤＣＩを加えた条件において、ＳＰＢ  ｍＲＮＡの発現はより高くなった。ＢＭＰ４及びＲＡの存在下で、一貫してより高く発現した唯一のマーカーは、基底細胞マーカーｐ６３であった。実際に、ＢＭＰ４及びＲＡ非存在下で、ＮＫＸ２．１＋ｐ６３＋細胞は、２３日目では稀にしか観察されなかったが、２５日目以降では、いくらかのＮＫＸ２．１＋ｐ６３＋細胞が観察された。
【０１６９】
これらのデータは、ＢＭＰ４若しくはＲＡのいずれか、又は両方が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肺前駆細胞の成熟に対して有害であるが、しかし、別の系譜として定められるであろう推定上の基底細胞の発生を助けることを示唆した。ＢＭＰ４及びＲＡの役割を、それぞれ別々に、分化培養において更に試験した。その結果は、使用した用量（５０ｎＭ）でのＲＡは系譜決定に対し有害ではなく、しかし、ＢＭＰ４はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肺前駆細胞の成熟に対し有害であることを示す。
【０１７０】
最後に、Ｎｏｔｃｈシグナリングの阻害、及びそれが特定の系譜の成熟を助けるかを試験した。Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴを、ＷＦＫＢ＋ＲＡ又はＷＦＫを含む条件において、培養２５日目に添加した。２０から２５日の更なる培養の後、ＣＣ１０＋ｐｒｏ−ＳＰ−Ｃ＋ＳＰ−Ｂ＋細胞群の富化を観察し、＞４０％の細胞が、ＤＡＰＴ＋ＷＦＫを含む条件において、トリプルポジティブであった（図１８）。この条件下で、ムチン２＋細胞及びレクチン  ＤＢＡ＋細胞の富化も観察した。
【０１７１】
ｈＰＳＣ由来の肺前駆細胞の分化は、非常に低い効率で成されてきて、いくつかの近位マーカーを発現する、ほんの数パーセントの細胞しか得られなかった。マウスでは、肺及び甲状腺に運命決定された細胞を単離するために、ＮＫＸ２．１：ＧＦＰレポーターを使用しなければならなかった。本報告は、ｈＰＳＣの多様な肺及び気道細胞への、完全な分化を初めて示すものである。しかしながら、肺胞細胞の終末成熟は、いまだ達成されなかったことは明らかである。それでもなお、上記プロトコールは、系譜決定を更に研究するためのモデルを提供する。
【０１７２】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【外国語明細書】
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