(57)【要約】      （修正有）【課題】六淫外邪による皮膚変化を定量する方法及びこれを用いた皮膚改善物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】皮膚細胞培養システムにおいて、皮膚細胞に六淫外邪の適切な刺激原によって刺激を与え、細胞変化程度を細胞生化学的方法で測定することによって、既存に提示された概念的な六淫外邪の影響を科学的で且つ定量的に表現できるようにした、六淫外邪による皮膚変化を定量する方法、及びこれを用いた皮膚改善物質のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）３９〜５０℃の高温である暑邪（暑）の皮膚刺激原を選定するステップと、
（ｂ）前記選定された刺激原による細胞の変化を測定することができる細胞生化学的方法を、ＴＮＦ-α  ＥＬＩＳＡ、ＰＧＥ2  ＥＬＩＳＡ、インターロイキン発現パターン分析（Interleukin expression pattern analysis）、細胞増殖分析（Cell proliferation assay）、ＦＡＳ分析（FAS analysis）、ＲＴ-ＰＣＲ、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）、メラニン分析（melanin analysis）、カタラーゼ分析（catalase assay）、ＤＣＦＨ-ＤＡ分析（Dichlorofluorescin diacetate assay）、ＤＡＰI染色法（DAPI staining）、β-Ｇａｌ染色法、ＭＴＴ分析、ＬＤＨ分析、遺伝子コメット分析（Comet assay）、及び特定抗体を用いるウエスタンブロット（western blot）からなる群より選択して決定するステップと、
（ｃ）前記決定された細胞生化学的方法によって測定対象の皮膚細胞株の状態を測定するステップと、
（ｄ）前記刺激原によって皮膚細胞株を刺激した後、刺激強度による細胞変化の程度を定量するステップと、
（ｅ）金銀花（Lonicera japonica）抽出物を皮膚細胞株に塗布した後、皮膚細胞株の状態を前記細胞生化学的方法によって測定し定量するステップと、
を含むことを特徴とする暑邪（暑）に起因する皮膚変化を定量する方法。
【請求項２】
１）候補物質が添加された皮膚細胞株を暑邪（暑）の刺激原である３９〜５０℃の高温で刺激するステップと、
２）前記１）の刺激するステップの前後に、候補物質と共に金銀花（Lonicera japonica）抽出物で皮膚細胞株を処理するステップと、
３）前記皮膚細胞株の状態を、ＴＮＦ-α  ＥＬＩＳＡ、ＰＧＥ2  ＥＬＩＳＡ、インターロイキン発現パターン分析（Interleukin expression pattern analysis）、細胞増殖分析（Cell proliferation assay）、ＦＡＳ分析（FAS analysis）、ＲＴ-ＰＣＲ、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）、メラニン分析（melanin analysis）、カタラーゼ分析（catalase assay）、ＤＣＦＨ-ＤＡ分析（Dichlorofluorescin diacetate assay）、ＤＡＰI染色法（DAPI staining）、β-Ｇａｌ染色法、ＭＴＴ分析、ＬＤＨ分析、遺伝子コメット分析（Comet assay）、及び特定抗体を用いるウエスタンブロット（western blot）からなる群より選択される細胞生化学的方法で測定して定量するステップと、
４）候補物質の定量値と金銀花（Lonicera japonica）抽出物の定量値とを比較し、候補物質の効能を判断するステップと、
を含むことを特徴とする皮膚改善物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記皮膚改善物質は、暑邪（暑）による老化、色素沈着、皮膚乾燥、又は皮膚トラブルを改善する効果を有する物質であることを特徴とする請求項２に記載の皮膚改善物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、六淫外邪（six external evils）に起因する皮膚変化を定量する方法、及びこれを用いた皮膚改善物質のスクリーニング（screening）方法に関し、より詳しくは、皮膚細胞培養システムにおいて各外邪刺激に起因する細胞変化を測定する方法であって、培養する皮膚細胞に六淫外邪の適切な刺激原によって刺激を与え、細胞変化程度を細胞生化学的方法で測定することによって、既存に提示された概念的な六淫外邪の影響を科学的且つ定量的に表現できるようにした六淫外邪に起因する皮膚変化を定量する方法、及びこれを用いた皮膚改善物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
六淫外邪は、漢医学において人体に悪い影響を与える外部要素、すなわち、病気の原因として弁別されており、風邪（風）、寒邪（寒）、暑邪（暑）、湿邪（湿）、燥邪（燥）、及び火邪（熱）といった外感病邪の通称である。風、寒、暑、湿、燥、及び火は、一般的に自然界の６種類の異なった気候変化であって六気（ろっき）ともいうが、万物生長の条件として本来は人体に無害である。しかし、気候の変化が非正常的であり、六気の発生が過剰であるか（太過）、又は、不足する（不及）ようになると、発病因子となって人体に侵入し疾病を引き起こすようになるが、このような六気を六淫と呼んで、六邪ともいい、外感病、外邪ともいう。
【０００３】
六淫は、主に顔や皮膚の部位の状態（condition）に変化を引き起こす。顔部位は、外部に常に露出していて、風、寒、及び暑等を含む外部条件の変化に耐えなければならない。皮膚は、人体の障壁としての役割をし、六淫の侵入から人体を保護するための最初の防壁としての働きをする。六淫が人体に侵入すると、皮膚の老化を引き起こし、特に厳しい寒さ、厳しい暑さ、乾燥、及び強い太陽光線等は、皮膚に非常に良くない結果をもたらす。皮膚の生理的老化現象は、必然的に我々の生きて行く環境中の六淫と切り離せない密接な関係を有している。六淫は、皮膚老化現象の外因として作用し、直接的に各種皮膚疾患や五官疾患を引き起こしたり病気を悪化させたりする。
【０００４】
化粧品業界において、種々の漢方化粧品が開発されており、また、加えて、化粧品の製造時には多様な漢方理論が適用されている。しかしながら、漢方化粧品の製造のためにたとえ六淫概念が用いられたとしても、漢方化粧品の素材の効能が科学的に且つ客観的に証明されてはいないのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これにより、本発明者らは、皮膚細胞培養システムを用いて六淫に該当する外部刺激とそれに伴う皮膚細胞変化を細胞生化学的技術で視覚化して定量化し、六淫外邪による皮膚損傷を防御することができる物質をスクリーニングする方法を開発し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
従って、本発明の目的は、六淫外邪による皮膚変化を科学的に表現できる皮膚細胞培養システムを構築し、これにより、六淫外邪による皮膚変化を定量する方法、及びこれを用いて皮膚改善物質をスクリーニングする方法を提供することにある。なお、本発明においては、前記六淫外邪のうち、暑邪（暑）を対象とすることとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明では
（ａ）３９〜５０℃の高温である暑邪（暑）の皮膚刺激原を選定するステップと、
（ｂ）前記選定された刺激原による細胞の変化を測定することができる細胞生化学的方法を、ＴＮＦ-α  ＥＬＩＳＡ、ＰＧＥ2  ＥＬＩＳＡ、インターロイキン発現パターン分析（Interleukin expression pattern analysis）、細胞増殖分析（Cell proliferation assay）、ＦＡＳ分析（FAS analysis）、ＲＴ-ＰＣＲ、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）、メラニン分析（melanin analysis）、カタラーゼ分析（catalase assay）、ＤＣＦＨ-ＤＡ分析（Dichlorofluorescin diacetate assay）、ＤＡＰI染色法（DAPI staining）、β-Ｇａｌ染色法、ＭＴＴ分析、ＬＤＨ分析、遺伝子コメット分析（Comet assay）、及び特定抗体を用いるウエスタンブロット（western blot）からなる群より選択して決定するステップと、
（ｃ）前記決定された細胞生化学的方法によって測定対象の皮膚細胞株の状態を測定するステップと、
（ｄ）前記刺激原によって皮膚細胞株を刺激した後、刺激強度による細胞変化の程度を定量するステップと、
（ｅ）金銀花（Lonicera japonica）抽出物を皮膚細胞株に塗布した後、皮膚細胞株の状態を前記細胞生化学的方法によって測定し定量するステップと、
を含む暑邪（暑）による皮膚変化を定量する方法を提供する。
【０００８】
また、本発明では、前記皮膚変化を定量する方法を用いて皮膚改善物質をスクリーニングする方法を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る六淫外邪に起因する皮膚変化を定量する方法は、皮膚細胞培養システムにおいて、六淫外邪に対応する刺激原を加えた後に細胞変化を科学的に、かつ、定量的に表現することができ、これは、該当する漢薬材の効能によって再確認することができる。
【００１０】
従って、漢方化粧品の効能素材の発掘時に漢方効能を科学的結果によって客観的に表現し、製品の効能を増進させることができる。また、この方法は、化粧品のユーザの皮膚サンプルを得てユーザの皮膚状態の変化を測定する方法に、拡大適用することができるという長所がある。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、
（ａ）３９〜５０℃の高温である暑邪（暑）の皮膚刺激原を選定するステップと、
（ｂ）前記選定された刺激原による細胞の変化を測定することができる細胞生化学的方法を、ＴＮＦ-α  ＥＬＩＳＡ、ＰＧＥ2  ＥＬＩＳＡ、インターロイキン発現パターン分析（Interleukin expression pattern analysis）、細胞増殖分析（Cell proliferation assay）、ＦＡＳ分析（FAS analysis）、ＲＴ-ＰＣＲ、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）、メラニン分析（melanin analysis）、カタラーゼ分析（catalase assay）、ＤＣＦＨ-ＤＡ分析（Dichlorofluorescin diacetate assay）、ＤＡＰI染色法（DAPI staining）、β-Ｇａｌ染色法、ＭＴＴ分析、ＬＤＨ分析、遺伝子コメット分析（Comet assay）、及び特定抗体を用いるウエスタンブロット（western blot）からなる群より選択して決定するステップと、
（ｃ）前記決定された細胞生化学的方法によって測定対象の皮膚細胞株の状態を測定するステップと、
（ｄ）前記刺激原によって皮膚細胞株を刺激した後、刺激強度による細胞変化の程度を定量するステップと、
（ｅ）金銀花（Lonicera japonica）抽出物を皮膚細胞株に塗布した後、皮膚細胞株の状態を前記細胞生化学的方法によって測定し定量するステップと、
を含む、暑邪（暑）に起因する皮膚変化を定量する方法に関するものである。
【００１２】
本明細書で使用する「六淫外邪」という用語は、皮膚に刺激を与えて皮膚老化を誘発する６種類の外部要素、すなわち、風邪（風）、寒邪（寒）、暑邪（暑）、湿邪（湿）、燥邪（燥）、及び火邪（熱）を意味する。
【００１３】
また、本発明で使用する「六淫外邪に起因する皮膚変化」という用語は、六淫外邪への露出前の皮膚状態を基準とし、六淫外邪に露出した時点から変化した全般的な皮膚の変化を含むものであり、好ましくは、六淫外邪による皮膚損傷を意味するもので、例えば、皮膚老化、色素沈着、皮膚乾燥及び皮膚トラブル等をすべて含んでもよいが、これにのみ限定されるものではない。
【００１４】
また、本発明で使用する「皮膚改善物質」とは、六淫外邪による老化、色素沈着、皮膚乾燥、又は皮膚トラブル等を改善する効果を有する物質を意味する。
【００１５】
以下、本発明に係る六淫外邪による皮膚変化を定量する方法を段階別に詳しく説明する。
【００１６】
先ず、六淫外邪の適切な刺激原を選定する。本発明では、東医宝鑑等の漢医書の概念に合うように六淫外邪の適切な刺激原として、風邪は炎症誘発要因、寒邪は低温刺激、暑邪は高温刺激、湿邪は活性酸素種（ROS：Reactive Oxygen Species）刺激、火邪は紫外線刺激等を選定した。これをより詳しく調べてみると、下記の通りである。
【００１７】
１）風邪
風邪に該当する刺激原は、皮膚に炎症を誘発し得る因子であって、ホルムアルデヒドのような大気汚染物質、ダニ及び花粉のようなアレルギー誘発物質、黄砂、ＬＰＳ（bacterial lipopolysaccharide）、ＰＭＡ（phorbol myristate acetate）、及び炎症誘発サイトカイン（cytokine）等が使用されてもよい。本発明では、前記炎症誘発因子を試験物質（又は、培養細胞）に対して０．０００１〜１０重量%に使用してもよい。前記炎症誘発因子の使用量が０．０００１重量%未満の場合には、適切な強度の刺激を誘発できないという問題が発生し、１０重量%を超過する場合には、刺激の強度が強すぎて細胞が全部死んでしまうという問題が発生する。
【００１８】
このように風邪を刺激原とする細胞反応による皮膚変化の定量方法は、当業界で良く知られている通常の方法を経て、ＴＮＦ-α及びＰＧＥ2の生成量変化、又はこれを誘発するＣＯＸ-２タンパク質の生成量及び活性変化を測定することによって、皮膚変化量を測定することができる。また、炎症関連又は皮膚効能関連の生体指標を合理的に活用することもできる。
【００１９】
２）寒邪
寒邪に該当する刺激原は、皮膚に損傷を与えることができる寒さ刺激である。寒さ刺激は、皮膚の生体温度よりも低い温度に設定され、３５℃程度の室温から−４０℃の低温まで必要に応じて適用可能である。設定温度が低温−４０℃よりも低い温度では、刺激の強度が強すぎて細胞が全部死んでしまうという問題が発生し、３５℃よりも高い温度では、正常体温範囲内であるため寒邪刺激としての意味がない。このように寒邪を刺激原とする細胞反応による皮膚変化の定量方法は、当業界で通常的に使用する細胞増殖率変化、細胞代謝変化、及びその他皮膚関連の生体指標を合理的に活用して皮膚変化量を測定することができる。
【００２０】
３）暑邪
暑邪に該当する刺激原は、皮膚に損傷を与えることができる暑さ刺激である。暑さ刺激は、皮膚の生体温度よりも高い温度に設定され、３９℃から５０℃の高温まで必要に応じて適用可能である。設定温度が３９℃よりも低い温度では、正常体温範囲内であるため暑邪刺激としての意味がなく、５０℃よりも高い温度では、刺激の強度が強すぎて細胞が全部死んでしまうという問題が発生する。このように暑邪を刺激原とする細胞反応による皮膚変化の定量方法は、当業界で通常的に使用する細胞損傷変化、細胞代謝変化、及びその他皮膚関連の生体指標を合理的に活用して皮膚変化量を測定することができる。
【００２１】
４）湿邪
本発明では湿邪の刺激原を選定するために、湿邪による皮膚損傷が主に梅雨時期の不純物や汚れ物が停滞して発生することと関連付け、湿邪が強くなった状況を、不純物や汚れ物が皮膚に停滞してエネルギー代謝副産物として生成される活性酸素種の量を増加させることと関連があると見て、湿邪に該当する刺激原として活性酸素種の刺激を選定した。活性酸素種の刺激は、直接的に活性酸素種を処理するだけでなく、活性酸素種を生体で誘発する物質や刺激処理まで含み、例えば、ＦeＣl3又はＦeＣl2のようにペントン反応（fenton reaction）によってラジカルを誘導できる物質を含んでもよく、本発明の一実施例では、Ｈ2Ｏ2刺激を使用しているが、これにのみ限定されるものではない。
【００２２】
前記Ｈ2Ｏ2刺激は、各Ｈ2Ｏ2を０．００１〜１０mM範囲で適用することが好ましい。前記適用量が０．００１mM未満の場合には、刺激の強度が弱くて正常状態と比較することが難しいという問題が発生し、１０mMを超過する場合には、刺激の強度が強すぎて細胞が全部死んでしまうという問題が発生する。
【００２３】
このように湿邪を刺激原とする細胞反応による皮膚変化の定量方法は、当業界で通常的に使用する細胞損傷変化、細胞抗酸化システム変化、及びその他皮膚関連の生体指標を合理的に活用して皮膚変化量を測定することができる。
【００２４】
５）燥邪
燥邪に該当する刺激原は、皮膚に損傷を与えることができる乾燥刺激である。乾燥刺激は、直接的に乾燥空気に露出して処理するだけでなく、これと類似した反応を生体で誘発する物質や刺激処理まで含む。
【００２５】
本発明で使用する乾燥空気は、水分含量６０%未満の空気を意味し、水分含量３５%の乾燥空気を刺激原として使用する場合、露出時間は５分〜２０分の間に限定することができる。このとき、露出時間が５分未満の場合には、乾燥刺激が微弱であり、２０分を超過する場合には、刺激の強度が強すぎて細胞が全部死んでしまう。しかし、具体的な実験条件（水分含量又は露出時間等）は、実験場所の室内湿度測定によって当業者が容易に調節可能である。
【００２６】
このように燥邪を刺激原とする細胞反応による皮膚変化の定量方法は、当業界で通常的に使用する細胞損傷変化、細胞増殖率変化、生体内カルシウム信号伝達システム変化、及びその他皮膚関連の生体指標を合理的に活用して皮膚変化量を測定することができる。
【００２７】
６）火邪
火邪に該当する刺激原は、皮膚に損傷を与えることができる太陽光線刺激が使用可能である。太陽光線刺激は、紫外線Ｂだけでなく、紫外線Ａ、可視光線、及び赤外線刺激を含む。前記太陽光線刺激は、各太陽光線を５〜２００mJ/cm2の範囲で照射することが好ましい。前記照射量が５mJ/cm2未満の場合には、刺激の強度が弱くて正常状態と比較することが難しいという問題が発生し、２００mJ/cm2を超過する場合には、刺激の強度が強すぎて細胞が全部死んでしまうという問題が発生する。
【００２８】
このように燥邪を刺激原とする細胞反応による皮膚変化の定量方法は、当業界で通常的に使用する細胞損傷変化、生体防御システム変化、及びその他皮膚関連の生体指標を合理的に活用して皮膚変化量を測定することができる。
【００２９】
これは、外感（外部刺激としての）六邪に該当するものであり、内感（内部現象としての）六邪の場合は、他のメカニズムと他の刺激として適用可能である。
【００３０】
本発明に記載された六淫外邪は、それぞれ単独でも人体に侵入が可能であり、２種類以上の外邪が同時に侵入することもでき、それぞれ他のものに転換されるため、これを適切な生体指標と適切な代表的漢薬材を用いて適用することができる。例えば、風邪が侵入して熱邪に変わったり（「風熱」と指称する）、寒邪が湿邪として位置付けたり（「寒湿」と指称する）する場合がある。
【００３１】
次に、各刺激原によって刺激原の強度及び適切な細胞生化学的方法を決定する。前記ステップにおいて、刺激原の種類によって特徴的に活用される細胞生化学方法を応用して行う。前記細胞変化反応が、前記六淫外邪、すなわち、風邪、寒邪、暑邪、湿邪、燥邪、及び火邪による変化を回復させる代表的な漢薬材と当該漢薬処方とによって、緩和又は抑制されることを確認することにより、その有意的な差を通じて風邪による皮膚老化を定量することができる。
【００３２】
本発明で定量化のために経る細胞生化学方法は、当業界で良く知られている通常の方法を全部含んでもよい。例えば、風邪による皮膚変化の定量時にはＴＮＦ-αＥＬＩＳＡ、ＰＧＥ2 ＥＬＩＳＡ、又はインターロイキン発現パターン分析（Interleukin expression pattern analysis）等を、また、寒邪による皮膚変化の定量時には細胞増殖分析（Cell proliferation assay）又はＦＡＳ分析（FAS analysis）等を、更に、暑邪による皮膚変化の定量時にはＲＴ-ＰＣＲ又は免疫細胞化学法（immunocytochemistry）等を、更にまた、湿邪による皮膚変化の定量時にはメラニン分析（melanin analysis）、カタラーゼ分析（catalase assay）又はＤＣＦＨ-ＤＡ分析（Dichlorofluorescin diacetate assay）等を、そして、燥邪による皮膚変化の定量時には免疫細胞化学法を、また、火邪による皮膚変化の定量時にはＤＡＰI染色法（DAPI staining）又はβ-Ｇａｌ染色法等を経ることができる。このような分析方法は、サイトカイン分析、抗酸化力分析、細胞毒性分析、細胞増殖分析、特定タンパク質、及び遺伝子変化パターン分析等を含むという点で、共通的特徴を有する。また、本発明では、細胞変化を測定できるＭＴＴ分析、ＬＤＨ分析、遺伝子コメット分析（Comet assay）及び体を用いたウエスタンブロット（western blot）等を応用して、細胞生存率、細胞成長率、細胞膜損傷、ＤＮＡ損傷、及び特定タンパク質発現変化等を測定して皮膚変化を定量化することができる。
【００３３】
本発明で使用する細胞としては、人や動物の皮膚から主に分離され、また、培養できる角質形成細胞、繊維芽細胞、及び脂肪細胞等を含む、単一層培養技術(single-layer cultures)や三次元組織培養技術（3D tissue cultures）を利用できる全ての皮膚細胞株を活用することができる。また、大食細胞株のＲＡＷ２６４．７細胞のように皮膚内免疫を担当できる細胞株も使用可能であり、人の生検組織を活用することもできる。
【００３４】
最後に、六淫外邪を防御する代表漢薬材として、上位ステップで選定した方法の適合性を確認する。
【００３５】
このステップでは、六淫外邪それぞれの刺激原として選定され、測定指標として選定されたものが、漢薬材による効能を確認することができるか否かを測定することによって、対照群と実験群との有意的変化を測定することができる。
【００３６】
本発明で使用する漢薬材は、一般的に通用する漢薬材の薬性及び特徴を有するものだけでなく、東医宝鑑、傷寒論等の漢医学の古典の処方に従うか、又は漢医師が適切な漢方診断に従って処方したものを全て含んでもよい。より具体的に、例えば、白す（Angelica dahurica）、乾薑（Zingiberis officinale）、金銀花（Lonicera japonica）、黄か（Scutellaria baicalensis）、生地黄（Rehmannia glutinosa）、及び知母（Anemarrhena asphodeloides）等があるが、これにのみ限定されるものではない。
【００３７】
また、本発明は、前記六淫外邪による皮膚変化の定量方法を構築し、これを用いて皮膚改善物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【００３８】
本発明に係る皮膚改善物質のスクリーニング方法は、下記のステップを含む。すなわち、
１）候補物質が添加された皮膚細胞株を暑邪（暑）の刺激原である３９〜５０℃の高温で刺激するステップと、
２）前記１）の刺激するステップの前後に、候補物質と共に金銀花（Lonicera japonica）抽出物で皮膚細胞株を処理するステップと、
３）前記皮膚細胞株の状態を、ＴＮＦ-α  ＥＬＩＳＡ、ＰＧＥ2  ＥＬＩＳＡ、インターロイキン発現パターン分析（Interleukin expression pattern analysis）、細胞増殖分析（Cell proliferation assay）、ＦＡＳ分析（FAS analysis）、ＲＴ-ＰＣＲ、免疫細胞化学法（immunocytochemistry）、メラニン分析（melanin analysis）、カタラーゼ分析（catalase assay）、ＤＣＦＨ-ＤＡ分析（Dichlorofluorescin diacetate assay）、ＤＡＰI染色法（DAPI staining）、β-Ｇａｌ染色法、ＭＴＴ分析、ＬＤＨ分析、遺伝子コメット分析（Comet assay）、及び特定抗体を用いるウエスタンブロット（western blot）からなる群より選択される細胞生化学的方法で測定して定量するステップと、
４）候補物質の定量値と金銀花（Lonicera japonica）抽出物の定量値とを比較し、候補物質の効能を判断するステップ。
【００３９】
前記で使用する培養細胞、六淫外邪の刺激原、細胞生化学的方法、及び陽性対照群として使用した漢薬材は、上述した六淫外邪による皮膚変化を定量する方法で使用されたものと同一なものを使用することができる。
【００４０】
このような方法は、単一細胞培養システムだけでなく、人体皮膚まで拡大して適用することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例、参照例及び試験例を参照してより具体的に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではなく、当業界で通常的に周知された変形、置換及び挿入等が可能であり、これに関することも本願発明の範囲に含まれる。
【００４２】
［参考例１］漢薬材抽出物の製造
白す（Angelica dahurica）、乾薑（Zingiberis officinale）、金銀花（Lonicera japonica）、黄か（Scutellaria baicalensis）、生地黄（Rehmannia glutinosa）、及び知母（Anemarrhena asphodeloides）各１kgを７０%のエタノール５リットル(L)でそれぞれ３時間抽出した後、濾過して残余液を減圧濃縮し、各漢薬材の７０%エタノール抽出物を得た。この試料を用いて下記の実験を進行した。
【００４３】
［参照例１］風邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ-ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%-ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を５×１０5cells/wellで６-well細胞培養板に付着させ、１μg/ml濃度のＬＰＳとなるようにして風邪を誘発した。風邪を誘発した実験群に漢薬材として、「▲きょ▼風解表（expelling wind, relieving exterior syndromes）」、「▲きょ▼風湿（expelling wind-dampness）」の特性を有する白す（Angelica dahurica）抽出物（参考例１）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。前記ＬＰＳと白す抽出物を処理せずに培養した細胞株を対照群とし、この対照群を基準として変化したＣＯＸ-２（cyclooxygenase-2）タンパク質発現量とその活性で測定し、風邪による皮膚変化を定量した。
【００４４】
試験物質を処理した翌日、試料を採取して細胞粉砕液を１０%ＳＤＳ-ゲル電気泳動によって展開し、ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane）に移して５%無脂肪牛乳（Non-fat milk）で反応を遮断（blocking）した後、ＣＯＸ-２単一抗体を用いてウエスタンブロットを行い、炎症反応に重要な役割をするＣＯＸ-２タンパク質の発現を濃度計（densitometer）で比較した。その結果を下記表１に示す。
【００４５】
【表１】
2014224825.tif 000002
【００４６】
前記表１の結果において、白す抽出物は、ＬＰＳによる炎症誘発を４０%程度抑制する効果を示した。従って、ＬＰＳのような炎症誘発因子は風邪の刺激原として使用可能であり、また、ＣＯＸ-２のようなタンパク質は細胞変化を測定する指標として活用可能であることが分かった。
【００４７】
［参照例２］寒邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ−ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を２×１０5cells/wellで３．５-well細胞培養皿に付着させ、−１５℃に置いて寒邪を誘発した。寒邪を誘発した実験群に漢薬材として「温中▲きょ▼寒（expelling cold while maintaining warm）」の特性を有する乾薑（Zingiberis officinale）抽出物（参考例１）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。低温処理なしに乾薑抽出物を処理せずに培養した細胞株を対照群とし、この対照群を基準として変化した細胞成長率をＭＭＴ分析で測定し、寒邪による皮膚変化を定量した。
【００４８】
低温処理及び試験物質処理を行った翌日、培養中の細胞を０．５μg/ml濃度のＭＴＴ試薬〔3-(4,5-ジメチル-2-チアゾール)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド, Sigma〕で２時間処理した後に培養液を除去し、残留した紫色の沈殿物をＤＭＳＯ中に溶解し、５６０nmで吸光度を測定した。その結果を下記表２に示す。
【００４９】
【表２】
2014224825.tif 000003
【００５０】
前記表２の結果において、乾薑抽出物は、低温処理による成長減少を効果的に取り戻すことができた。従って、低温処理は寒邪の刺激原として使用でき、また、細胞成長率は細胞変化を測定する指標として活用可能であることが分かった。
【００５１】
［実施例３］暑邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ-ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%-ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を２×１０5cells/wellで３．５-well細胞培養皿に付着させ、−４４℃に置いて暑邪を誘発した。暑邪を誘発した実験群に「清熱解毒（clearing heat and relieving toxicity）」の特性を有する漢薬材である金銀花（Lonicera japonica）抽出物（参考例1）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。
【００５２】
暑邪による皮膚変化を定量した結果は、ＬＤＨ分析（Sigma Aldrich, Product Number TOX-7）を活用して細胞膜安定性反応で測定した。高温処理及び物質処理を行った翌日、培養中の細胞培養液を集めて細胞残屑が完全に沈殿するように遠心分離（１2,000rpm、3分）し、上澄液のみを取り出した。上澄液１００μlを９８-well実験板に入れてＬＤＨ分析混合物（LDH Assay Substrate：Cofactor：Dye solution＝１：１：１）を使用直前に作製し、２００μlずつ試料上澄液と混合した。光を遮断して２０分間反応が進むように置いた後、1N-ＨＣｌ溶液をそれぞれ２５μlずつ入れて反応を終了し、４９０nm及び６９０nmで吸光度を測定した。測定した４９０nm吸光度から６９０nm吸光度を引いて背景を除去し、測定吸光度値を補正した後、その結果を比較した。その結果を下記表３に示した。高温処理なしに金銀花抽出物を処理した対照群を基準として細胞膜損傷率を算出した。
【００５３】
【表３】
2014224825.tif 000004
【００５４】
前記表３の結果において、金銀花抽出物は、高温処理による細胞膜損傷を効果的に減らすことができた。従って、高温処理は暑邪の刺激原として使用可能であり、また、細胞膜損傷率は細胞変化を測定する指標として活用可能であることが分かった。
【００５５】
［参照例４］湿邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ-ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%-ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を１×１０5cells/wellで９８-well細胞培養板に付着させ、１mMのＨ2Ｏ2で処理して湿邪を誘発した。湿邪を誘発した実験群に「清熱燥湿（clearing heat and drying dampness）」の特性を有する漢薬材である黄か（Scutellaria baicalensis）抽出物（参考例１）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。
【００５６】
湿邪による皮膚変化を定量した結果は、ＭＴＴ分析を活用して細胞毒性程度で測定した。Ｈ2Ｏ2処理及び物質処理を行った翌日、培養中の細胞を０．５μg/ml濃度のＭＴＴ試薬〔3-(4,5-ジメチル-2-チアゾール)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド, Sigma〕で２時間処理した後に、培養液を除去して残っている紫色の沈殿物をＤＭＳＯを用いて溶かした。その後、５６０nmで吸光度を測定し、その結果を下記表４に示した。Ｈ2Ｏ2及び黄か抽出物を処理していない対照群を基準として細胞生存率を算出した。
【００５７】
【表４】
2014224825.tif 000005
【００５８】
前記表４の結果において、黄か抽出物は、Ｈ2Ｏ2処理による毒性増加を効果的に保護した。従って、Ｈ2Ｏ2処理は湿邪の刺激原として使用可能であり、また、細胞毒性は細胞変化を測定する指標として活用可能であることが分かった。
【００５９】
［参照例５］燥邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ-ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%-ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を２×１０5cells/wellで４８-well細胞培養板に付着させ、クリーンベンチ（clean bench）の中で培養板の蓋を開けて放置し燥邪を誘発した。燥邪を誘発するクリーンベンチ内の条件として温度２９℃、湿度４５%を基準とするが、実験条件に応じて変動を与えてもよい。乾燥条件に露出させながら「養陰生津（nourishing Yin to produce body fluid）」の特性を有する漢薬材である生地黄（Rehmannia glutinosa）抽出物（参考例１）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。
【００６０】
燥邪による皮膚変化を定量した結果は、ＭＴＴ分析を活用して細胞毒性程度で測定した。乾燥露出処理及び物質処理を行った翌日、培養中の細胞を０．５μg/ml濃度のＭＴＴ試薬〔3-(4,5-ジメチル-2-チアゾール)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイド, Sigma〕で２時間処理した後に、培養液を除去して残っている紫色の沈殿物をＤＭＳＯを用いて溶かした。その後、５６０nmで吸光度を測定し、その結果を下記表５に示した。燥邪及び生地黄抽出物を処理していない対照群を基準として相対的な細胞生存率を算出した。
【００６１】
【表５】
2014224825.tif 000006
【００６２】
前記表５の結果において、生地黄抽出物は、乾燥露出処理による毒性増加を効果的に保護した。従って、乾燥露出処理は燥邪の刺激原として使用可能であり、また、細胞毒性は細胞変化を測定する指標として活用可能であることが分かった。
【００６３】
［参照例６］火邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ-ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%-ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を５×１０5cells/wellで６-well細胞培養板に付着させ、ＵＶＢを照射して火邪を誘発した。火邪を誘発するＵＶＢ条件として４０mJ/cm2を基準とするが、実験条件に応じて変動を与えても良い。紫外線照射とともに「清熱瀉火（clearing heat and purging fire）」の特性を有する漢薬材である知母（Anemarrhena asphodeloides）抽出物（参考例１）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。
【００６４】
火邪による皮膚変化を定量した結果は、遺伝子コメット分析を活用してＤＮＡ損傷程度を測定した。紫外線照射処理及び物質処理を行った翌日、培養中の細胞を集めて細胞２０μlを溶かしたLMagarose ２００μlに添加して、直ちに７５μlをコメットスライドに移した。その後、溶菌液（lysis solution）と新しく用意したアルカリ溶液（NaOH 0.6g/50ml DIW）に順序に浸して処理し電気泳動した。ＳＹＢＲグリーンＩ希釈液５０μlを滴下してＤＮＡを染色させた後、蛍光顕微鏡で４９４nm／５１２nmフィルタで観察し、写真を撮ってその程度を比較した。その結果を下記表６に示した。紫外線Ｂ照射及び知母抽出物を処理していない対照群を基準として相対的なＤＮＡ損傷率を算出した。
【００６５】
【表６】
2014224825.tif 000007
【００６６】
前記表６の結果において、知母抽出物は、紫外線照射処理によるＤＮＡ損傷増加を効果的に保護した。従って、紫外線照射処理は火邪の刺激原として使用可能であり、また、ＤＮＡ損傷は細胞変化を測定する指標として活用可能であることが分かった。
【００６７】
上述した実施例、参照例は、本発明の代表的な一例のみを示したもので、当業者によっていかなる他の形態にも変形が可能である。例えば、風邪の場合には、ＬＰＳの代わりにダニの破砕液で刺激を与えることもでき、また、寒邪、暑邪及び燥邪の場合には、各処理温度が固定されることなく、皮膚温度よりも低温、高温及び乾燥条件で幅広く活用が可能であり、更に、湿邪の場合にも、単純Ｈ2Ｏ2の他、ＲＯＳ生成を誘発する物質代用使用が可能であり、更にまた、火邪の場合にも、紫外線Ａ又は赤外線等が刺激原として可能である。
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月4日(2014.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
［実施例３］暑邪による皮膚変化の定量方法
人間の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞を１０%ＦＢＳ-ＤＭＥＭにおいて、３７℃、５%-ＣＯ2の条件下で培養した。それぞれ細胞株を２×１０5cells/wellで３．５-well細胞培養皿に付着させ、４４℃に置いて暑邪を誘発した。暑邪を誘発した実験群に「清熱解毒（clearing heat and relieving toxicity）」の特性を有する漢薬材である金銀花（Lonicera japonica）抽出物（参考例1）１０μg/mlを同時に処理し、その効果を比較した。