(57)【要約】【課題】標識酵素に対する基質が酵素サイクリング法における基質にもなり得ることに基因する以外の原因に基づく、標識酵素による反応と酵素サイクリング法を組み合わせた測定において生じるブランクを解消する手段を提供する。【解決手段】酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法における、前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物。酵素組成物は、含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されている。酵素組成物は、標識酵素1ユニット当たり、酵素サイクリング法に用いる酵素組成物に含まれる、標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法における、前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物であって、
前記酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されている、前記酵素組成物である。
【請求項２】
前記酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、25ｍAbs以下であるように、低減されている、請求項1に記載の酵素組成物。
【請求項３】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法における、前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物であって、
標識酵素1ユニット当たり、酵素サイクリング法に用いる酵素組成物に含まれる、標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下である酵素組成物。
【請求項４】
標識酵素がホスファターゼであり、酵素サイクリング法に用いる酵素がデヒドロゲナーゼである請求項1〜3のいずれか1項記載の酵素組成物。
【請求項５】
ホスファターゼがアルカリホスファターゼであり、デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである請求項4記載の酵素組成物。
【請求項６】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、
前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物は、
前記酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されている酵素組成物である、
前記測定方法。
【請求項７】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、
前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であることを確認する工程、
前記ブランク値が、50ｍAbsを超える場合、
酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記ブランク値が50ｍAbs以下になるように、前記酵素組成物を精製する工程を含む、前記測定方法。
【請求項８】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、
前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下である酵素組成物を調製する工程、
を含む、前記測定方法。
【請求項９】
前記ブランク値が、25ｍAbs以下である請求項6〜8のいずれか1項記載の測定方法。
【請求項１０】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、
前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物は、
標識酵素1ユニット当たり、酵素免疫測定方法用酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下になる量の酵素組成物である、
前記測定方法。
【請求項１１】
標識酵素がホスファターゼであり、酵素サイクリング法に用いる酵素がデヒドロゲナーゼである請求項6〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
ホスファターゼがアルカリホスファターゼであり、デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである請求項11記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜5のいずれか1項記載の酵素組成物を含む酵素免疫測定または核酸プローブ測定用キット。
【請求項１４】
前記酵素組成物に含有される酵素サイクリング法に用いる酵素がデヒドロゲナーゼである請求項13記載のキット。
【請求項１５】
前記デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである請求項14記載のキット。
【請求項１６】
以下の(1)および(2)をさらに含有する請求項13〜15のいずれか1項記載のキット。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記アルカリホスファターゼの基質である誘導体
【請求項１７】
以下の(3)および(4)をさらに含有する請求項13〜16のいずれか1項記載のキット。
(3)NADHおよび／またはNADPH、
(4)チオNADおよび／またはチオNADP
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素免疫測定法および核酸プローブ測定法を利用し、反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して検出するタンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに関する。特に本発明は、前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物であって、前記酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が規定量以下の酵素組成物を用いることで、ブランクの吸光度上昇に伴う問題を回避した、標的タンパク質および核酸の超高感度及び特異性の高い測定を可能にする方法に関する。さらに本発明は、上記タンパク質と核酸の高感度測定法およびキットに用いることができる酵素サイクリング法用酵素組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質や核酸の高感度測定法としてラジオイムノアッセイ（RIA）法が技術的に確立されているが、検出装置の感度を上げる以外に、現状では10-16mole程度以上の高感度化は技術的に不可能である。RIA法に代わる高感度測定法として、タンパク質の測定には酵素免疫測定法（ELISA法）が、核酸の測定にはPCR法がある。酵素免疫測定法は開発当初の比色法(10-13mole)から蛍光法、発光法へと高感度化（10-15mole）が進められ、専用測定装置の開発・改良も進んでいる。しかし、測定操作が簡便になっただけで感度的には限界に達している。
【０００３】
特許文献1に記載の方法は、酵素免疫測定法を、酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせ、シグナル物質としてチオNAD(P)Hを幾何級数的に増幅することで、比色法によって、高感度にタンパク質または核酸の定量や目視による検出が可能とする方法である。特許文献2には、チオNADサイクリング法を利用するタンパク質及び核酸の超高感度測定法におけるブランクを低減できる標識酵素に対する新規な基質が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2008/117816
【特許文献２】WO2012/128338
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献1に記載の方法においては、標識酵素による反応と酵素サイクリング法を組み合わせた測定において、高感度検出が可能となった。しかし、その一方でブランクの吸光度が上昇するという新たな問題が生じていた。ブランクの吸光度上昇はシグナル／ノイズ比の低下に繋がり高感度検出の妨げとなり、また予期しない吸光度を検出することになり誤った測定結果を与える恐れがある。それに対して、特許文献2は、ブランク値の上昇の原因が、標識酵素に対する基質が酵素サイクリング法における基質にもなり得ることが判明し、これを改善する目的で、酵素サイクリング法における基質になり得ない、またはなりにくい標識酵素に対する基質を開発し、ブランク値を低減できることを提案した。
【０００６】
酵素サイクリング法における基質になり得ない、またはなりにくい標識酵素に対する基質を用いるにも関わらず、依然として、解消できないブランク値の上昇があることが判明した。
【０００７】
具体的には、例えば、標識酵素としてアルカリホスファターゼを用い、反応基質にリン酸エステル誘導体を用いた酵素サイクリング法において、酵素サイクリング法における基質になり得ない、またはなりにくい標識酵素に対するリン酸エステル誘導体を基質として用いた場合にも、ブランクの吸光度上昇が確認された。このブランク値の上昇は、アルカリホスファターゼを用いる標識酵素による反応と、酵素サイクリング反応を別のステップとし、前記酵素サイクリング法に使用する緩衝液として、アルカリホスファターゼの基質となり得るリン酸緩衝液またはピロリン酸緩衝液を用いることで、抑制できるのではないかと本発明者らは考えた。しかし、酵素サイクリング法にリン酸緩衝液またはピロリン酸緩衝液を用いても、上記ブランク値の上昇は、十分に抑制することはできなかった。このブランク値の上昇は、酵素サイクリング法における新たな課題であることが本発明者らの検討で判明した。
【０００８】
【化１】
2014124165.tif 000002
【０００９】
酵素サイクリング法は、１サイクルの酵素反応を複数回繰り返すことにより補酵素として使用されるチオNADの還元体であるチオNADHを反応系内に蓄積させることにより増幅させて検出する方法である。したがって僅かであっても、予期しえない反応が起こったことにより生じたシグナルを酵素サイクリング法が進行することにより増幅し、結果検出可能な吸光度を得ることにブランクの吸光度上昇を招くことになる。
【００１０】
そこで本発明の目的は、標識酵素に対する基質が酵素サイクリング法における基質にもなり得ることに基因する以外の原因に基づく、標識酵素による反応と酵素サイクリング法を組み合わせた測定において生じるブランク値を解消する手段を提供することにある。
即ち、酵素免疫測定法を酵素免疫測定法で用いる標識酵素の生成物を基質とする酵素サイクリング法を組み合わせた方法において、ブランク値の上昇を抑え、かつ、感度を幾何級数的に高めた測定法を提供することである。タンパク質または核酸の高感度測定法検出方法においては、比色法が最も簡便な方法であるが、比色法においては、ブランクにおける吸光度上昇を抑えることが、本発明の目的である。
【００１１】
本発明者らが種々検討した結果、酵素サイクリング法における、例えば、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含有する酵素サイクリング用酵素組成物は、十分に精製されたものとして市販されている物であるにも関わらず、上記のように、そのままの状態では酵素サイクリング法における基質になり得ない、またはなりにくい、標識酵素に対するリン酸エステル誘導体を基質として用いた場合においては、酵素サイクリング法に使用する緩衝液をリン酸塩またはピロリン酸塩緩衝液としても、ブランクの吸光度上昇を生じるものであった。本発明者らは、上記ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含有する酵素サイクリング用酵素組成物が極微量のホスファターゼのような標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素を含有し、この極微量の標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素が、上記ブランク値の上昇の原因ではないかと考え検討した。しかし、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含有する酵素サイクリング用酵素組成物は、例えば、標識酵素がホスファターゼの場合、通常のホスファターゼ活性測定法では、ホスファターゼ活性を検出することはできなかった。
【００１２】
酵素サイクリング反応という増幅をかけて超高感度に測定することを可能とする特殊な反応であるがゆえ、極微量のホスファターゼのような標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の存在によっても、ブランクにおいて検出可能な吸光度を生じ超高感度測定の妨げとなる。さらにはブランク及びバックグラウンドの吸光度が高くなるため、誤った測定結果を与える致命的な欠陥となり得る恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのような酵素サイクリング用酵素組成物におけるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのような酵素サイクリング用酵素の精製度を所定以上に高め、前記酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されていることで、実質的なブランクによる弊害を回避できることを見出して、本発明を完成させた。
【００１４】
さらに本発明者らは、標識酵素1ユニット当たり、酵素サイクリング法に用いる酵素組成物に含まれる、標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下である酵素サイクリング用酵素組成物を用いることによって酵素サイクリング法におけるブランクにおける吸光度上昇を抑制することが出来、実質的なブランクによる弊害を回避できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、測定感度を10-18moles 以上に高め、かつ、偽陽性と判定される恐れを低減した特異性の高い酵素免疫測定法を提供することができ、標的タンパク質や標的核酸の高感度測定が可能である。
さらには本発明の酵素組成物を用いることによりシグナル/ノイズ比が改善され、超高感度検出を可能とする酵素サイクリング反応を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例2で得られた本発明のA3P系Pumilio検量線。
【図２】比較例1で得られたA3P系Pumilio検量線。
【図３】実施例3で得られた本発明のPumilio検量線。
【図４】比較例2で得られたPumilio検量線。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
<酵素組成物>
本発明の酵素組成物は、酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法における、前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物である。
【００１８】
酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法は、特許文献1及び2に詳細に記載されている。
【００１９】
抗体および核酸プローブ−酵素複合体は、特許文献1及び2に記載の方法に準拠して調製できる。
【００２０】
本発明の測定法は酵素複合体とそれに組み合わせた基質で産生された生成物を次の酵素サイクリング反応の基質として用い、チオNAD(P)を補酵素とした酵素サイクリング反応により生成したチオNAD(P)Hの吸収を比色定量するものである。この反応では１種の脱水素酵素で酵素サイクリングを行うため、酵素サイクリング反応の基質としては、還元型基質でも酸化型基質でもよい。
【００２１】
本発明で用いる上記酵素複合体として用いる標識酵素とその基質およびそれに続くサイクリング反応に用いる酵素は、（１）標識酵素との反応生成物が酵素サイクリング反応の基質となること、（２）市販及び汎用されている標識酵素が使用できること、（３）酵素サイクリングのターンオーバー数が大きいこと、（４）酵素サイクリング法用酵素に標識酵素と同様の活性がないこと、これらの条件を満たすものであることが好ましい。
【００２２】
本発明の酵素組成物は、酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されているものである。好ましくは、25ｍAbs以下である。
被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値は、測定方法の条件によって変化する。本発明においてブランク値は、標識酵素による反応に、実施例2に示した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体及び酵素標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を用い、酵素サイクリング法に以下の反応試薬を用いて、Pumilioを含有しない試料について37℃での加温により得られる405 nmのフィルターを使用して測定した吸光度として求められる。
【００２３】
反応試液
0.2 M グリシン緩衝液（pH 8.8）
1.5 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.5 mM 標識酵素基質
20 U/ml酵素サイクリング用酵素
【００２４】
本発明においては、標識酵素がホスファターゼであり、酵素サイクリング法に用いる酵素がデヒドロゲナーゼ(DH)であることができる。さらに、ホスファターゼがアルカリホスファターゼ(ALP)であり、デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることもできる。ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとしては、例えば、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【００２５】
本発明の酵素組成物は、酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されているものである。このような酵素サイクリング用酵素組成物は、既存技術により調製することが出来る。例えば、前記酵素を産生する微生物の培養液からサイクリング用酵素の純度を高める精製を行うことで調製しても良く、また酵素遺伝子を組み込んだ大腸菌等に発現させて回収されたタンパク質を精製することで調製することもできる。
【００２６】
さらには前記調製物には発現宿主由来の成分が含まれることがあり精製操作を行うことにより調製することもできる。精製方法はゲル濾過による分子量に基づく分離、電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーによる電気的性質に基づく分離を行うことにより、目的とする精製度を有する酵素サイクリング用酵素組成物を調製することができる。またアフィニティー精製も適用することができ、酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されている酵素組成物を得ることができるならば手段は問わない。
【００２７】
本発明の酵素組成物は、標識酵素1ユニット当たり、酵素サイクリング法に用いる酵素組成物に含まれる、標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下である酵素組成物であることもできる。酵素サイクリング法に用いる酵素組成物に含まれる、標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、標識酵素1ユニット当たり、0.001ユニット以下であることは、標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の通常の活性測定条件では、酵素活性測定が難しい。何故なら、測定対象である標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、極微量だからである。この点を考慮して、例えば、標識酵素としての活性を、測定対象の酵素とは異なる基質特異性を有する酵素を用いた酵素サイクリング法で増幅させることにより測定することができる。
【００２８】
本発明においては、標識酵素がホスファターゼであり、酵素サイクリング法に用いる酵素がデヒドロゲナーゼ(DH)であることができる。さらに、ホスファターゼがアルカリホスファターゼ(ALP)であり、デヒドロゲナーゼがヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることもできる。ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとしては、例えば、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【００２９】
標識酵素がホスファターゼの場合、酵素組成物のホスファターゼ活性は標識酵素1ユニットに対し0.001ユニット以下であることが好ましい。より好ましくは0.0005ユニット以下である。酵素組成物のホスファターゼ活性が、標識酵素1ユニットに対し0.001ユニットを超えると、酵素サイクリング用の酵素組成物が有するホスファターゼ活性により、標識酵素の基質のリン酸エステル誘導体の加水分解が進行し、結果として酵素作リング反応による増幅過程においても、酵素サイクリング反応の基質を生じ、ブランクにおける吸光度上昇の原因となる。
【００３０】
本発明に使用可能な代表的な標識酵素、基質及び酵素サイクリング用酵素の組合わせの一例として以下のものがあげられるが、もちろんこの組み合わせに限られるわけではない。
【００３１】
サイクリング用の基質としては、酵素の反応速度が速く(基質に対する活性が高い)、低濃度でも反応する(Km値が小さい)ものが好ましい。またデヒドロゲナーゼとして好ましい性質は、補酵素としてチオNAD(P)を用いた場合の反応速度である。多くのデヒドロゲナーゼでは、補酵素としてチオNADを用いた場合の反応速度がNADを用いた場合の数％以内であるのに対し、3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによるアンドロステロンの脱水素反応では、チオNADでの反応速度がNADでの反応速度の約59％もあり、本発明の酵素サイクリング用酵素として、好ましい性質を有している。また反応に組合わせる標識酵素としては汎用されているアルカリホスファターゼ（ALP）を用いることが好ましい。基質としてはアルカリホスファターゼの基質となり、かつ酵素サイクリング法酵素の3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの基質となるアンドロステロン誘導体を生じる、アンドロステロン誘導体の3位リン酸エステルが好適に用いられる。
【００３２】
酵素免疫測定(抗体酵素複合体を用いる酵素活性測定)方法は、例えば、以下の方法であることができる。
抗体酵素複合体の酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、
上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
【化２】
2014124165.tif 000003
(i) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う。
【００３３】
酵素標識核酸プローブを用いる核酸プローブ測定方法は、例えば、以下の方法であることかできる。
酵素標識核酸プローブの酵素としてアルカリホスファターゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼまたはペルオキシダーゼを用い、上記酵素の基質として下記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体を用い、
【化３】
2014124165.tif 000004
(i) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、アルカリホスファターゼの基質として用いる場合には、
式中、Xはリン酸基、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(ii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フルクトシダーゼまたはマンノシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは糖残基であり、糖残基はグルコース、ガラクトース、フルクトースおよびマンノースから成る群から選ばれる1種であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
(iii) 一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体は、ペルオキシダーゼの基質として用いる場合は、
式中、Xは-O-CO-R(但し、R は炭素数1〜6のアルキル基またはフェニル基である)であり、Y1及びY2は共同でメチレン基または酸素原子であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、水素、水酸基、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基であり、
前記酵素反応の反応生成物の定量は、NADHおよび／またはNADPH、チオNADおよび／またはチオNADP、並びにヒドロキシステロイド脱水素酵素(HSD)を用いて、酵素サイクリング反応によりチオNADHおよび／またはチオNADPHを生成させ、生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHの量を測定するか、または生成したチオNADHおよび／またはチオNADPHによる色の変化を計測することで行う。
【００３４】
上記方法においては、アルカリホスファターゼの基質として、上記一般式(1)で表されるアンドロステロン誘導体(式中、Xはリン酸基であり、Y1及びY2は共同でメチレン基であるか、または、Y1は水素であり、Y2は、炭素数1〜6のアルコキシ基、または炭素数1〜6のアルキル基である)を用いることが好ましい。
【００３５】
<目的物質の測定方法(1)>
本発明の目的物質の測定方法(1)は、酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、
前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物は、
前記酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であるように、低減されている酵素組成物である。この酵素組成物は上記本発明の酵素組成物である。
【００３６】
<目的物質の測定方法(2)>
本発明の目的物質の測定方法(2)は、酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、下記工程を含む方法であることができる。
前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であることを確認する工程、
前記ブランク値が、50ｍAbsを超える場合、
酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記ブランク値が50ｍAbs以下になるように、前記酵素組成物を精製する工程を含む。
【００３７】
酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下であることを確認する方法は、前述のように、標識酵素による反応に、実施例2に示した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体及び酵素標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を用い、酵素サイクリング法に以下の反応試薬を用いて、Pumilioを含有しない試料について37℃での加温により得られる405 nmのフィルターを使用して測定した吸光度としてブランク値を求められることで実施できる。
【００３８】
酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物が示すブランク値が、50ｍAbs以下であることが確認できた場合には、そのままの酵素組成物を用いて被検体に含まれる目的物質の測定方法を実施することができる。
【００３９】
それに対してブランク値が、50ｍAbsを超える場合には、酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、前記ブランク値が50ｍAbs以下になるように、前記酵素組成物を精製する。精製方法は、前述のように、ゲル濾過による分子量に基づく分離、電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーによる電気的性質に基づく分離、アフィニティー精製などを単独又は組み合わせて実施する。
【００４０】
<目的物質の測定方法(3)>
本発明の目的物質の測定方法(3)は、酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物に含まれる標識酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、被検体に含まれる目的物質の測定方法におけるブランク値が、50ｍAbs以下である酵素組成物を調製する工程を含む方法である。この場合、酵素組成物を調製する工程は、目的物質の測定方法の実施の度に行う必要はなく、事前に酵素組成物を調製しておくこともできる。酵素組成物を調製は、前述のように、ゲル濾過による分子量に基づく分離、電気泳動またはイオン交換クロマトグラフィーによる電気的性質に基づく分離、アフィニティー精製などを単独又は組み合わせた精製方法を含むものであることができる。
【００４１】
上記測定方法(1)〜(3)において、ブランク値は、好ましくは25ｍAbs以下である。
【００４２】
<目的物質の測定方法(4)>
本発明の目的物質の測定方法(4)は、酵素免疫測定または核酸プローブ測定に用いられる標識酵素による反応生成物を酵素サイクリング法で増幅して増幅物を検出することで被検体に含まれる目的物質の測定方法であって、前記酵素サイクリング法に用いられる酵素組成物は、標識酵素1ユニット当たり、酵素免疫測定方法用酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下になる量の酵素組成物である方法である。標識酵素1ユニット当たり、酵素免疫測定方法用酵素と同じ基質特異性を有する酵素の含有量が、0.001ユニット以下になる量の酵素組成物は、前記本発明の酵素組成物である。
【００４３】
上記本発明の測定方法に用いられる標識酵素及び酵素サイクリング法に用いる酵素は、本発明の酵素組成物と同様である。さらに、標識酵素の基質も本発明の酵素組成物で説明したものと同様のものを使用できる。
【００４４】
本発明は、上記本発明の酵素組成物を含む酵素免疫測定または核酸プローブ測定用キットを包含する。このキットに含まれる酵素組成物に含有される酵素サイクリング法に用いる酵素は、例えば、デヒドロゲナーゼであることができ、さらにデヒドロゲナーゼはヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼであることができる。
【００４５】
本発明のキットは、以下の(1)および(2)をさらに含有することができる。
(1)標的タンパク質抗原に特異的な抗体を標識したアルカリホスファターゼ
(2)上記アルカリホスファターゼの基質である誘導体
【００４６】
本発明のキットは、以下の(3)および(4)をさらに含有することができる。
(3)NADHおよび／またはNADPH、
(4)チオNADおよび／またはチオNADP
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は実施例に限定される意図ではない。
【００４８】
実施例1
（3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3α-HSD）の調製）
3α-HSD遺伝子を組み込んだ大腸菌により発現された3α-HSDを調製した。電気泳動法により本酵素を分析した結果、3α-HSDの40KDaのバンド以外に約50KDaに薄いバンドを確認した。前記酵素溶液をゲル濾過クロマトグラフィー法及びイオン交換クロマトグラフィー法に供し、3α-HSDを含む画分を分取し濃縮した。精製操作後、電気泳動により3α-HSDのバンドのみであることを確認し、酵素サイクリング法用酵素とした。
【００４９】
参考例1（酵素の活性測定）
実施例1にて調製した3α-HSDの40KDaのバンド以外に約50KDaに薄いバンドを確認した酵素組成物について、ホスファターゼ活性について検討した。ホスファターゼ活性の測定には、パラニトロフェニルリン酸（以下、p-NPPと称する）法を用いた。本方法は酵素反応によりp-NPPから生じるパラニトロフェノールを測定することに基づく方法である。
p-NPPを溶解した基質溶液を調製し、被検溶液に添加した。被検溶液を37℃にて15分間静置し、溶液中のパラニトロフェノールの吸収に基づく405nmの吸光度を測定した。
結果、実施例1における精製前の酵素溶液を被検溶液とした場合、405nmにおける吸収は見られなかったが、反応時間を60分間に延長することで僅かではあるが405nmにおける吸光度の上昇が確認された。一方、実施例1にて精製操作を経て調製された酵素サイクリング用酵素では405nmの吸収は確認されず、60分間の反応においても吸収は確認されなかった。本結果より、ゲル濾過クロマトグラフィー法及びイオン交換クロマトグラフィー法に供する前の3α-HSDの40KDaのバンド以外に約50KDaに薄いバンドを確認した酵素組成物についても、ホスファターゼ活性は確認できなかった。
【００５０】
実施例2
（Alkaline phosphatase（ALP）とAndrosterone 3-phosphate（A3P）の系のチオNADサイクリングを検出系とする、Alkaline phosphataseとPumilio（プミリオ）の測定）
【００５１】
Alkaline phosphatase（ALP）とAndrosterone 3-phosphate（A3P）の系のチオNADサイクリング反応系については、特許文献1または2に記載の方法に準拠して調製した。サイクリング反応には実施例1にて調製した3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを使用した。対照として、精製操作に供する前の3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを使用した。
反応試液
0.2 M グリシン緩衝液（pH 8.8）
1.5 mM thio-NAD
1 mM NADH
0.5 mM 5α-Androsterone 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydroxysteroid dehydrogenase
【００５２】
測定試料
0.1、0.5、1、2、5、10、25、50、100、200 ng/ml Pumilio
【００５３】
測定方法
特許文献1または2の方法に準拠して調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜200ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl添加し、室温で1時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、ALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体を2.5μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、1時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.05 % Tween 20含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を100μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して吸光度を測定した。測定結果を表1に示す。吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた近似直線を図1に示す。
【００５４】
【表１】
2014124165.tif 000005
【００５５】
比較例1
実施例1において調製した未精製の3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを反応試液のサイクリング用酵素とした以外は、実施例2と同様の条件で反応を実施した。サイクリング用酵素以外の条件は同一の条件にて反応を実施した。測定結果を表2及び図2に示す。
【００５６】
【表２】
2014124165.tif 000006
【００５７】
表２に示すように、標識酵素としてALP、基質としてA3Pを組み合わせた酵素サイクリング法において、ブランク（0濃度）において0.318Abs(318m Abs)の高い吸光度を生じた。このブランクは、表1に示すように、実施例1において調製した精製3α-HSDを用いることで、表2に比べて、ブランクにおける吸光度が約70mAbs減少した。ブランク値の抑制は本願発明のサイクリング用酵素組成物による効果であることが確認された。
【００５８】
実施例3
（3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphateを用いた1ステップ法によるPumilio（プミリオ）の測定）
特許文献1または2に記載の方法に準拠して検出系を調製した。酵素サイクリング用酵素として、実施例1の方法にて調製した精製3α-HSDを用いた。対照として精製操作をする前の3α-HSDを用い、他の反応試液の構成試薬は同等の条件にて測定を実施した。
反応試液
0.1 Mトリス緩衝液（pH 9.5）
1.5 mM thio-NAD
2.5 mM NADH
0.1 mM 3α-Hydroxy-17β-methoxy-5β-Androstane 3-phosphate
20 U/ml 3α-Hydoroxysteroid dehydrogenase
【００５９】
試料
0.1、0.5、2、5、10、25 ng/ml Pumilio
【００６０】
測定方法
特許文献2の方法に準拠して調製した抗Pumilioモルモットポリクローナル抗体を固定化したマイクロプレートに、精製したPumilio（標準物質）を0〜25 ng/mlの範囲で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50 μl添加し、室温で2時間振とうさせた。次にウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄し、ALP標識抗Pumilioマウスモノクローナル抗体をおよそ0.8μg/mlの濃度で含有する、0.1 % BSA含有TBS（pH 7.5）溶液を50μl加え、4℃で2時間振とうさせた。ウェル内の溶液を吸引除去後、0.5 % Triton X-100含有TBS（pH 7.5）で洗浄、さらにTBSで洗浄した。次に各ウェルに反応試液を50μlずつ添加し、37℃で加温しながらマイクロプレートリーダー（コロナ社製MTP-500）で405 nmのフィルターを使用して吸光度を測定した。測定結果を表3に示す。吸光度変化量を標準物質濃度に対してプロットすることにより得られた近似直線を図3に示す。
【００６１】
【表３】
2014124165.tif 000007
【００６２】
比較例2
実施例1において調製した未精製の3α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを反応試液のサイクリング用酵素とした以外は、実施例3と同様の条件で反応を実施した。サイクリング用酵素以外の条件は同一の条件にて反応を実施した。測定結果を表4及び図4に示す。
【００６３】
【表４】
2014124165.tif 000008
【００６４】
表4に示す結果より、標識酵素にALP、基質に17-OMe5β-A3Pを用いた系のチオNADサイクリングを検出系とするPumilioの測定においては、未精製の3α-HSDを用いる場合、Pumilio濃度0（ng/ml）において0.086Abs(86mAbs)のブランク値を示した。それに対して、表3に示すように、精製された3α-HSDを用いることによりブランク値は0.012Abs(12Abs)に低減でき、約70mAbs抑制することが可能となった。
【００６５】
【表５】
2014124165.tif 000009
【００６６】
上記結果より反応基質にA3Pに代えて17位を置換した17-OMe-5β-A3Pを使用することによりブランク値を約1/4に抑制することが可能となった。特許文献2に記載のように、標識酵素にALPを使用する反応系では17位を修飾した基質を使用してもブランク値を完全には除去することはできないことが確認され、一方、実施例1の方法により調製された3α-HSDを用いることによりさらにブランク値を抑制することが確認された（表3および表4）。
【００６７】
結果、本願発明の酵素組成物を使用することにより、更にブランク値を抑制することが可能となった。よって、標識酵素にALPを使用した酵素サイクリング反応における反応基質の改良に加え、本願発明実施例1の方法によるホスファターゼの含有量が規定量以下の酵素サイクリング法用酵素組成物である3α-HSDを適用することにより、ブランクにおける吸光度の上昇を抑制し得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、高感度かつ簡便な測定が要求される臨床検査分野や食品検査分野において好適に利用可能である。
【図１】
2014124165.tif 000010
【図２】
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【図３】
2014124165.tif 000012
【図４】
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