(57)【要約】【課題】無血清培地にて継代培養することができ、カイコ等の昆虫の体液の他、動物や昆虫由来の血液成分の非存在下で低温処理を行うことなくウイルス感染することができるカイコ培養細胞株を提供すること。【解決手段】研究や産業利用の面で最も実績のあるＢｍＮ４細胞を親株として選択し、無血清培地で培養を試み、継代を続けた結果、無血清培地で半永久的に増殖可能な連続継代性ＢｍＮ４細胞変異株（ＢｍＮ−ＳＦＭ株）を得、かかるＢｍＮ−ＳＦＭ株は、従前必要とされていた低温処理やカイコの体液の添加等の処理を行うことをせずに、ＢｍＮＰＶに容易に感染することができ、親株であるＢｍＮ４細胞株と同等の組換えタンパク質生産能を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地で増殖可能であって、ＢｍＮＰＶ感受性とするために、２〜５℃の低温処理をすることなく、かつ、カイコの体液又は動物の血液を必要とせず、２６℃の温度条件下でＢｍＮＰＶ感受性であることを特徴とするＢｍＮ４細胞変異株。
【請求項２】
ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４１８）であることを特徴とする請求項１記載のＢｍＮ４細胞変異株。
【請求項３】
目的タンパク質をコードするＤＮＡが作動可能なように組み込まれた組換えＢｍＮＰＶに感染していることを特徴とする請求項１又は２記載のＢｍＮ４細胞変異株。
【請求項４】
請求項３記載のＢｍＮ４細胞変異株を培養することを特徴とする目的タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無血清培地に順化したＢｍＮ４細胞変異株や、該ＢｍＮ４細胞変異株を培養することによる目的タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昆虫細胞と核多角体病ウイルス(Nucleopolyhedorovirus: ＮＰＶ)（これ以後「バキュロウイルス」ともいう)とを組み合わせたバキュロウイルス遺伝子発現ベクター系は、大腸菌では困難なタンパク質のフォールディングや翻訳後修飾を行うことができ、膜タンパク質の発現に適しているため、有用タンパク質の発現系として注目されている。
【０００３】
バキュロウイルスは、感染細胞の核内にポリヘドリンというタンパク質からなる多角体を大量に作るが、ポリヘドリン遺伝子の非常に強力なプロモーターにより、その発現量は感染後期には細胞タンパク質の半分近くにも達するといわれている。しかし、多角体はウイルスの増殖そのものには必要ではなく、ポリヘドリンの代わりに目的タンパク質遺伝子を組み込んでも感染や増殖作用に変化はないので、上記ポリヘドリン遺伝子プロモーターの下流に目的タンパク質遺伝子が組み込まれた組換えバキュロウイルスを用いて、ウイルスが感染した昆虫細胞内や昆虫培養細胞株内で目的タンパク質を大量に発現させることが試みられてきた。
【０００４】
哺乳動物細胞では通常約６０回で細胞分裂が終了するため、がん化した細胞株を除いては、連続継代性の哺乳動物培養細胞株は未だ樹立されていない。これに対し、昆虫細胞由来の連続継代性の培養細胞株の樹立については複数報告があり、特に日本では、古くから養蚕が盛んであったため、カイコから樹立した細胞は多数報告されている。中でもカイコ卵巣から樹立されたＢｍＮ４細胞株（例えば、非特許文献１参照）は、ＢｍＮＰＶに高い感受性を示すため、目的遺伝子がＢｍＮＰＶのゲノム上で作動可能なように組み込む作業、即ち組換えバキュロウイルスの作製の際の宿主細胞として、更にこの様にして作製した組換えバキュロウイルスを用いて有用タンパク質を大量に生産するための宿主細胞株として広く産業利用されている。
【０００５】
しかしながら、上記ＢｍＮ４細胞株は、細胞の増殖とＢｍＮＰＶの感染のためには、牛胎児血清（ＦＢＳ）等動物由来の血清成分の培地への添加が不可欠であるとされており、そのため培養に際して、血清成分に混入したタンパク性感染因子によって汚染が生じるおそれがあり、また、血清成分のロット間による作用効果の差が生じるおそれがあった。
【０００６】
ＢｍＮＰＶ感受性のカイコ由来連続継代性細胞株としては、酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含む昆虫細胞培養用培地において培養されるＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｋｅ1細胞（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０５７２）（例えば、特許文献１参照）や、該ＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｋｅ１細胞から連続継代性の培養細胞株をクローニングすることにより作出されたＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｋｅ１７株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１８２９）が報告されているが、かかるＮＩＡＳ−Ｂｍ−Ｋｅ１７株は、ＢｍＮＰＶ感染をより効果的に誘発するためには、２〜５℃における低温処理や、カイコの体液を添加することなどが必要であった（例えば、特許文献２参照）。また、ＢｍＮＰＶ感受性がＢｍＮ４の３倍であるＢｍｅ２１細胞株についての報告もあるが、かかる細胞株も培養やウイルス感染には、１０％ＦＢＳが添加された培地が用いられている（例えば、特許文献３参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−７５１０２号公報
【特許文献２】特開２０１１−６７２０３号公報
【特許文献３】国際公開２００７／１２５９８２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Maeda S. et al.,(1985)  Nature 315, 592-594
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、無血清培地にて継代培養することができ、カイコ等の昆虫の体液の他、動物や昆虫由来の血液成分の非存在下で低温処理を行うことなくウイルス感染することができるカイコ培養細胞株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、インターフェロンの生産に用いられる等、研究や産業利用の面で最も実績のあるＢｍＮ４細胞を親株として選択し、無血清培地で培養を試みた。多くの細胞は継代培養後まもなく死滅し、残りの細胞も数回継代した後死滅したが、数十個の細胞は継代培養で生存することがわかった。しかし、そのほとんどは５０回程度の継代培養後に死滅した。その中で、数個の細胞を２年間にわたり２００回ほど継代を続けた結果、無血清培地で半永久的に増殖可能な連続継代性ＢｍＮ４細胞変異株（ＢｍＮ−ＳＦＭ株）として得ることができた。かかる知見をもとに、同様の実験を繰り返したところ、この方法で本発明において目的とする株を得ることができることを確認した。さらに、かかるＢｍＮ−ＳＦＭ株にＢｍＮＰＶの感染を試みたところ、まったく思いがけず、従前必要とされていた低温処理や、カイコの体液や動物の血液の添加等の処理を行うことをせずに、ＢｍＮＰＶが容易に感染することを確認した。また、目的タンパク質をコードするＤＮＡが作動可能なように組み込まれたＢｍＮＰＶ（以下「組換えＢｍＮＰＶ」ともいう。）を感染させたＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株は、親株であるＢｍＮ４細胞株と同等の組換えタンパク質生産能を有することを確認した。本発明は上記の知見に基づき完成されるに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）無血清培地で増殖可能であって、ＢｍＮＰＶ感受性とするために、２〜５℃の低温処理をすることなく、かつ、カイコの体液又は動物の血液を必要とせず、２６℃の温度条件下でＢｍＮＰＶ感受性であることを特徴とするＢｍＮ４細胞変異株；
（２）ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１４１８）であることを特徴とする上記（１）記載のＢｍＮ４細胞変異株；
（３）目的タンパク質をコードするＤＮＡが作動可能なように組み込まれた組換えＢｍＮＰＶに感染していることを特徴とする上記（１）又は（２）記載のＢｍＮ４細胞変異株；
に関する。
【００１２】
また、本発明は、
（４）上記（３）記載のＢｍＮ４細胞変異株を培養することを特徴とする目的タンパク質の生産方法；
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＢｍＮ４細胞変異株によれば、無血清培地にて継代培養することが可能であり、培養温度にて目的タンパク質をコードするＤＮＡが作動可能なように組み込まれた組換えＢｍＮＰＶに感染させることができ、組換えＢｍＮＰＶに感染した上記ＢｍＮ４細胞変異株は目的タンパク質を産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】親株ＢｍＮ４細胞と本願発明のＢｍＮ−ＳＦＭ細胞の形態を示した図である。Ｒは、Round cellを、Ｓｐは、Spindle-shaped cellを示す。
【図２】ＧＥＮ１プライマー（５´-GTTTCGCTCC-３´）、ＧＥＮ２プライマー（５´-GGTGCGGGAA-３´）、ＧＥＮ３プライマー（５´- CCCGTCAGCA -３´）の３種類のランダムプライマーを用いてＲＡＰＤ  ＰＣＲを行った。各プライマーにおいて、レーン１はＢｍＮ４細胞株，レーン２はＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株，レーン３はＳｆ−９細胞株、レーン４はＮＩＡＳ−ＢｏＭａ−５２９ｂ細胞株，レーン５はＢｍＶＦ細胞株におけるＲＡＰＤ  ＰＣＲの結果を示す。
【図３】ＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶをＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞にそれぞれ感染させ、感染後９６時間経過時の細胞を光学顕微鏡下で観察した図である。図中のバーは５０μｍを示す。
【図４】ＢｍＮＰＶ感染後９６時間経過時におけるＢｍＮＰＶの増殖量を示す図である。縦軸はＰＦＵ／ｍＬを示す。
【図５】ＢｍＮＰＶ感染後９６時間経過時におけるポリヘドリンプロモーターの活性を示す図である。縦軸はルシフェラーゼの相対発光量（Relative Light Unit：ＲＬＵ）／細胞を示す。
【図６】組み換えバキュロウイルス発現系によるｍＩＬ３の細胞外分泌、糖鎖修飾の様子を示す図である。縦軸はタンパク質のサイズ（ｋＤａ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のＢｍＮ４細胞変異株としては、無血清培地で増殖可能であって、ＢｍＮＰＶ感受性とするために、２〜５℃の低温処理をすることなく、かつ、カイコの体液又は動物の血液を必要とせず、２６℃の温度条件下でＢｍＮＰＶ感受性である、無血清培地に順化した細胞変異株であれば特に制限されないが、ＮＩＴＥ  Ｐ−１４１８を特に好適に挙げることができる。なお、ＮＩＴＥ  Ｐ−１４１８は、平成２４年（２０１２年）９月２６日（受託日）付で特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に受託されている。ＢｍＮ４細胞変異株の親株であるＢｍＮ４細胞株は、カイコ卵巣から樹立された連続継代性細胞株であり、細胞増殖やウイルス感染のためには血清培地にて培養を行うことを必要とする。この親株ＢｍＮ４細胞株は、独立行政法人農業生物資源研究所、又はフナコシ株式会社から入手することができる。また、ＢｍＮＰＶは、カイコの幼虫、カイコの蛹及びカイコの培養細胞に感染して、感染した細胞の核内に多角体をつくる核多角体病ウイルス（バキュロウイルス）である。
【００１６】
本発明における無血清培地で増殖可能であるＢｍＮ４細胞変異株の作製方法としては、上記ＢｍＮ４細胞株を前記無血清培地に播種し、２０〜３０℃、好ましくは２３〜２８℃、より好ましくは２５〜２７℃にて培養し、接着性が低調で増殖の悪い細胞を取り除きながら、細胞が培養フラスコ面にコンフルエントに増殖した時点で増殖性のよい細胞をピペッティングで培養フラスコ面から剥離し、新しい培養フラスコに移すことにより継代を行い、親株ＢｍＮ４株と異なる特性を有し、半永久的に増殖可能である細胞として取得することができる。より具体的には、無血清培地でＢｍＮ４細胞株の培養を開始した場合、培養当初、ＢｍＮ４細胞株は血清成分が増殖に必須とされているので増殖速度が顕著に低下するが、その内の数％の細胞株は次第に増殖速度が上昇して、ついには一定速度となり、その中でも数％の細胞株は植継ぎを行う間隔が一定してから相当期間、例えば、増殖速度が上昇し始めた時点から３０〜８０継代後、好ましくは４０〜７０継代後、より好ましくは５０〜６０継代後に、無血清培地で増殖可能である目的の細胞株として樹立することができる。
【００１７】
上記無血清培地としては、ウシ胎児血清、ウシ新生児血清、仔ウシ血清、ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、トリ血清、マウス血清、ラット血清、モルモット血清等の血清を含まない培地であれば特に制限されず、具体的には、Ｓｆ−９００培地（インビトロジェン社製）、Ｓｆ−９００II培地（インビトロジェン社製）、Ｓｆ−９００培地III（インビトロジェン社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ４２０培地（ニチレイ社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ４０５培地（ニチレイ社製）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＸ−Ｉｎｓｅｃｔ培地（サーモフィッシャー社製）、ＥＳＦ９２１／ＥＳＦ  ＡＦ培地（アサヒガラス社製）、ＫＢＭ７１０培地（コージンバイオ社製）、Ｉｎｓｅｃｔ−ＸＰＲＥＳＳ培地（タカラバイオ社製）を挙げることができるが、Ｓｆ−９００II培地が好ましい。
【００１８】
本発明のＢｍＮ４細胞変異株は、上述のとおり２６℃の温度条件下でＢｍＮＰＶ感受性であることが必要であるが、本発明においてＢｍＮＰＶ感受性には、組換えＢｍＮＰＶに感受性であることも含み、ＢｍＮＰＶに感受性であるとは、ＢｍＮＰＶに高い頻度で感染し、ＢｍＮＰＶを増殖できることをいい、具体的には、既に産業利用されているＢｍＮ４細胞株と比較して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上のＢｍＮＰＶ感受性を有する場合を挙げることができる。また、ＢｍＮＰＶ感受性の評価方法としては、例えば実施例２に記載されているとおり、細胞株に感染したＢｍＮＰＶ量をプラークアッセイによって測定する方法を例示することができ、また、実施例３に記載されているとおり、ルシフェラーゼ等のタンパク質の遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを対象とする細胞に感染後、適時に細胞を回収し、ルシフェラーゼ等のタンパク質量をＢｍＮＰＶの感染・増殖量として評価する方法も挙げることができる。
【００１９】
本発明のＢｍＮ４細胞変異株にＢｍＮＰＶや組換えＢｍＮＰＶを感染させる方法としては、例えば、以下の１）と２）の各ステップを備える方法を挙げることができる。
１）上記無血清培地を用いて、本発明のＢｍＮ４細胞変異株をシャーレに播種し、さらにＢｍＮＰＶや組換えＢｍＮＰＶを無菌的にシャーレに添加し、２０〜３０℃、好ましくは２３〜２８℃、より好ましくは２５〜２７℃にて、１５分〜５時間、好ましくは３０分〜３時間、より好ましくは４５分〜２時間ゆっくりと振盪するステップ。なお、ＢｍＮＰＶをＢｍＮ−４変異株の培養液に添加する場合のｍｏｉ（Multiplicity of Infection：感染多重度: 細胞１個に対するウイルスの数）としては、０.１〜１００、好ましくは０．５〜５０、より好ましくは１〜２０、さらに好ましくは５〜１５を挙げることができる。２）その後、添加したウイルス液をアスピレーターによって吸引除去した後、それぞれの細胞培養シャーレへ新鮮培地を添加するステップ。
【００２０】
上記組換えＢｍＮＰＶの作製方法としては、常法によって行うことができるが、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡを、ＢｍＮＰＶ用トランスファーベクター内のポリヘドリンプロモーターやｐ１０プロモーター等の強力なプロモーターを備える発現調節部分の下流に作動可能に連結して組換えトランスファーベクターを作製し、かかる組換えトランスファーベクターと野生型のＢｍＮＰＶとをＢｍＮＰＶ感受性細胞にコトランスフェクションして２〜７日、好ましくは３〜６日、より好ましくは４〜５日培養し、トランスファーベクターＤＮＡとＢｍＮＰＶのＤＮＡとが相同組換えを行なうことによって産生した組換えＢｍＮＰＶを限界希釈法やプラークアッセイ等の公知の方法によって精製する方法を挙げることができる。なお、上記ＢｍＮＰＶのゲノムＤＮＡは直鎖化されたＤＮＡを用いてもよい。また、目的タンパク質にはヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＦＬＡＧタグ等の検出・精製用のタグを付加することもできる。目的タンパク質をコードするＤＮＡが組み込まれた組換えＢｍＮＰＶは多角体の形成能がないことから、野性型のＢｍＮＰＶと区別できる。
【００２１】
上記目的タンパク質としては、生理活性作用のあるタンパク質が好ましく、具体的には、ヒトインターフェロン−α、トリインターフェロン−γ、ブタインターフェロン−γ、ウシインターフェロン−β、ウシインターフェロン−τ、ネコインターフェロン−ω、イヌインターフェロン−α、イヌインターフェロン−γ等のインターフェロン類や、ヒトインターロイキン−１、トリインターロイキン−２、ブタインターロイキン−４等のインターロイキン類や、破傷風毒素断片Ｃ、百日咳主要表面抗原、ＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス）インテグラーゼ、ヒトパピローマウイルスＬ１、インフルエンザＨＡタンパク質等の抗体産生を刺激することができるタンパク質などを挙げることができる。
【００２２】
上記ＢｍＮＰＶ用トランスファーベクターとしては、市販のｐＢＫ２８３（フナコシ社製）を例示することができる。
【００２３】
本発明の目的タンパク質の生産方法としては、本発明のＢｍＮ４細胞変異株と上記組換えＢｍＮＰＶとを用いて行う方法であれば特に制限されず、上記組換えＢｍＮＰＶを本発明のＢｍＮ４細胞変異株に感染させることにより形質転換し、該形質転換ＢｍＮ４細胞変異株を前記無血清培地で培養後、目的タンパク質を調製する方法を挙げることができる。例えば、目的タンパク質が精製用タグを融合した組換えタンパク質として発現している場合に、目的タンパク質が細胞内タンパク質のときは該形質転換ＢｍＮ４細胞変異株を細胞可溶化剤で処理後に、また、目的タンパク質が分泌タンパク質のときは培養液の上清を回収後に、適宜カラム精製を行うことで目的タンパク質を精製することができる。なお、目的タンパク質を含む溶液に塩化ベンザルコニウム、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又は界面活性剤などを添加することにより組換えＢｍＮＰＶを不活化することができる。
【００２４】
本発明のＢｍＮ４細胞変異株は、ＢｍＮＰＶ感受性とするために、２〜５℃の低温処理、例えば４８時間の２〜５℃の低温処理をする必要がないばかりか、ＢｍＮＰＶ感受性とするために、カイコの体液や動物の血液を必要とせず、かつ、少なくとも２６℃の温度条件下においてＢｍＮＰＶ感受性であることが必要とされるが、本発明のＢｍＮ４細胞変異株は、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２９℃、さらに好ましくは２２〜２８℃、特に好ましくは２４〜２７℃の温度条件下においてもＢｍＮＰＶ感受性であり、また、０〜２０℃、好ましくは１〜１０℃、より好ましくは２〜５℃等の低温処理をした場合に上記ＢｍＮＰＶ感受性を有していてもよい。なお、発明のＢｍＮ４細胞変異株は、ＢｍＮＰＶ感受性を維持するために、冷蔵装置が不要であり、低温処理に関する操作が不要であるというメリットがある。
【００２５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
［無血清培地で培養可能な連続継代性の細胞株の樹立］
（親株の培養）
本発明の株を無血清培地で培養可能な連続継代性の細胞株として樹立するにあたり、親株として、発明者らの研究室に保存してあったカイコ卵巣から樹立された連続継代性の培養細胞株であるＢｍＮ４株を用いた。ＢｍＮ４は２６℃にて１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＴＣ−１００培地（SAFC Bioscience社製）で培養した後、無血清培地での継代培養に供した。ＢｍＮＰＶとしては、Ｔ３株を用いた。
【００２７】
（継代培養）
ＢｍＮ４株の細胞を、培養フラスコ（グライナーバイオワン社製tissue culture flask ２５０ｍＬ  Ｎｏ．６５８１７０）を用い、ＴＣ−１００培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）１２ｍＬに１×１０８個播種し、２６℃にて培養を開始した。その後、４日毎に培地の２０％を無血清培地であるＳｆ−９００II培地（インビトロジェン社製）に置換し、合計１０回の置換後、全ての培地を無血清培地であるＳｆ−９００II培地に置換した。その後、２００回程度の継代を行った。
【００２８】
上記無血清培地への置換の過程において、又は置換後に、増殖性の悪い細胞を取り除きながら、細胞が培養フラスコ面にコンフルエントに増殖した時点で継代を行った。継代は、増殖性の悪く接着性が低下した細胞を極めて軽く培養フラスコを叩くことで剥離・除去し、その後、増殖性が良く、接着性の高い細胞を新しい培養フラスコに移すことにより行った。また、細胞の増殖度が低調な場合には、増殖が盛んであった時の培地を保存しておき、条件培地として１０％程度加えた。この様にして無血清培地へと順化する過程の細胞の増殖速度は当初低調であったが、継代５０代以降は増殖速度が徐々に増加し、継代８０代以降は、増殖速度が安定化し、継代を９６時間毎に行うようになった。合計２年間にわたり、２００回以上継代した細胞を、樹立された連続継代性の細胞株としてＢｍＮ-ＳＦＭ株と命名した。この細胞株は付着性であった。親株ＢｍＮ４細胞と本願発明のＢｍＮ−ＳＦＭ細胞を光学顕微鏡で観察し、形態を観察した結果を図１に示す。
【００２９】
図１より明らかなとおり、親株ＢｍＮ４細胞の形態が、長さ平均７４μｍ、幅平均１３μｍの紡錘形、又は平均直径が１６μｍの球形からなるのと同様に、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞の形態は、長さ平均７２μｍ、幅平均２０μｍの紡錘形、又は平均直径が２２μｍの球形からなり、本発明のＢｍＮ−ＳＦＭ細胞は親株ＢｍＮ４細胞よりもやや球形の形態的特徴を有することが確認された。
【００３０】
（ＲＡＰＤ  ＰＣＲ）
ＧＥＮ１プライマー、ＧＥＮ２プライマー、ＧＥＮ３プライマー（北海道システムサイエンス社製）の３種類のランダムプライマーを用いて、ＲＡＰＤ（Ramdom Amplified Polymorphic DNA）ＰＣＲ解析を行い、バンドの出現パターンによる解析を行った。ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株（レーン２）のＤＮＡと、以下の株とのＲＡＰＤ（Ramdom Amplified Polymorphic DNA）ＰＣＲ解析を行った。比較として用いた細胞株は、本願細胞株の親株であるカイコ卵巣由来ＢｍＮ４細胞株（レーン１）、ヨトウガの一種であるツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）卵巣由来Ｓｆ−９細胞株（レーン３）、クワコ脂肪体由来であるＮＩＡＳ−ＢｏＭａ−５２９ｂ株（独立行政法人農業生物資源研究所より供与）（レーン４）、マキュラ様潜在ウイルス（Bombyx mori macula-like virus; ＢｍＭＬＶ）フリー培養細胞株であるＢｍＶＦ(Bombyx mori virus free)細胞株（独立行政法人農業生物資源研究所より供与）（レーン５）である。結果を図２に示す。
【００３１】
図２より明らかなとおり、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株のバンド出現パターンは、ＢｍＮ４株のバンド出現パターンと同一であり、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞株は、親株と同一な遺伝子型を有することが明らかとなった。他のカイコ由来細胞株や同じ鱗翅目に属するヨトウガ由来細胞株とは遺伝子型が異なることも確認された。
【実施例２】
【００３２】
［ＢｍＮＰＶの感染］
まず、ＢｍＮＰＶ  Ｔ３のウイルス粒子からフェノール抽出によりゲノムＤＮＡを抽出し、得られたゲノムＤＮＡ１μｇを４×１０６個のＢｍＮ−ＳＦＭ細胞にセルフェクチン（インビトロジェン社製）を用いてトランスフェクションし、ＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶを得た。次に得られたＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶを用いて、ＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞にそれぞれＢｍＮＰＶの感染を試みた。ＢｍＮ４細胞の場合は１０％ＦＢＳ含有ＴＣ−１００培地を用い、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞の場合は上記Ｓｆ−９００II培地を用いて、それぞれ４×１０６個の細胞をファルコン社製６０ｍｍ細胞培養シャーレへ播種した。ウイルス感染は、ＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶをそれぞれｍｏｉ＝１０となるように、無菌的にそれぞれのシャーレへ添加し、２６℃にて１時間ゆっくりと振盪することにより行った。その後、ウイルス液を吸引除去し、それぞれの新鮮培地を４ｍＬ添加した。新鮮培地を添加した時点をウイルス感染後０時間とした。ＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶ感染後９６時間経過時のそれぞれの細胞を光学顕微鏡下で観察した結果を図３に示す。
【００３３】
(感染細胞の形態)
図３より明らかなとおり、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞はウイルス感染後９６時間において親株であるＢｍＮ４と同様に多角体を形成したことから、ＢｍＮＰＶに対して低温処理等を必要とせずに、容易に感染可能であることが明らかとなった。
【００３４】
（プラークアッセイ）
ＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶを用いて、ＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞のウイルス産生能についてプラークアッセイで検証した。ＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞に、ＦＢＳ不含ＢｍＮＰＶをそれぞれｍｏｉ＝１０となるようにそれぞれ感染させた。感染は前記ＢｍＮＰＶの感染と同様に行った。その後、ウイルス感染後９６時間の培地を回収し、プラークアッセイによりウイルスの力価を測定した。プラークアッセイでは、ウイルス感染後９６時間の培地を１０００万から１億倍に希釈し、培地に含まれるウイルス量を計測した。まず、希釈したウイルス液をＢｍＮ４細胞へ感染させた。次に、感染に用いたウイルス液を完全に除去し、そこへ予め３７℃に保温したトップアガー（１％アガロースを含む培養液）を重層した。その後、およそ１２０時間で光学顕微鏡によりプラーク形成数を計測した。結果を図４に示す。図４中、それぞれのＢｍＮＰＶの力価は３回の独立反復実験の平均値を示しており、グラフ上のバーは標準偏差を示す。
【００３５】
図４より明らかなとおり、無血清培地Ｓｆ−９００II培地で２６℃にて上記ＢｍＮＰＶを感染させたＢｍＮ−ＳＦＭ細胞と、ＦＢＳ含有培地ＴＣ−１００で２６℃にて上記ＢｍＮＰＶを感染させたＢｍＮ４細胞とは、感染後９６時間後のＢｍＮＰＶの増殖量がほぼ同程度であり、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞は無血清培地であるＳｆ−９００II培地において、既に広く産業利用されている親株ＢｍＮ４細胞株と同等のウイルス産生能を有することが確認された。
【実施例３】
【００３６】
（ポリヘドリンプロモーター活性）
ポリヘドリン遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子に代替したＢｍＮＰＶであるＬｕｃ-Ｂｍ(Nakanishi et al.,Journal of Virology 84, 5191-5200, 2010)を用いて、ＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞のポリヘドリンプロモーター活性を測定した。まず、実施例２と同様に、ウイルス粒子からＢｍ−ＬｕｃのゲノムＤＮＡを抽出し、これをＢｍＮ−ＳＦＭへと導入することによりＦＢＳ不含のＬｕｃ-Ｂｍウイルス液を得た。次にＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞に、Ｌｕｃ-Ｂｍをそれぞれｍｏｉ＝１０となるように感染させた。感染の方法は、ウイルスとしてＢｍＮＰＶ-Ｌｕｃを用いたこと以外は上記実施例２と同様に行った。感染後９６時間経過時の細胞を回収し、１０６個の細胞に調製して、Blight-Glo luciferase assay system（プロメガ社製）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼの発光量はｗａｌｌａｃ  ＡＲＶＯｓｘ  １４２０マルチラベルカウンター（パーキンエルマー社製）を用いた。結果を図５に示す。ルシフェラーゼの発光量は３回の独立反復実験の平均値を示しており、グラフ上のバーは標準偏差を示す。
【００３７】
図５より明らかなとおり、感染９６時間後におけるポリヘドリンプロモーター活性は、無血清培地で２６℃にてＬｕｃ-Ｂｍを感染させたＢｍＮ−ＳＦＭ細胞の場合と、血清含有培地で２６℃にてＢｍＮＰＶ-Ｌｕｃを感染させたＢｍＮ４細胞の場合とでほぼ同じであり、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞は、既に広く産業利用されている親株ＢｍＮ４細胞と同等の組換えタンパク質産生能を有することが確認された。
【実施例４】
【００３８】
（組換えバキュロウイルス発現系によるｍＩＬ３の糖鎖修飾及び細胞外分泌）
マウスインターロイキン３タンパク質（ｍＩＬ３）をコードするｃＤＮＡを挿入したＢｍＮＰＶであるＩＬ−Ｂｍ（上記Nakanishi et al. 2010）を用いて、ＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞の糖鎖修飾及び細胞外分泌について検討した。まず実施例２と同様にＩＬ?Ｂｍのウイルス粒子からウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、これをＢｍＮ−ＳＦＭへ導入することでＦＢＳ不含ＩＬ−Ｂｍを調製した。次にＩＬ−ＢｍをＢｍＮ４細胞及びＢｍＮ−ＳＦＭ細胞に、それぞれｍｏｉ＝１０となるように感染させた。感染は、ウイルスとしてＩＬ−Ｂｍを用いたこと以外は上記実施例２と同様に行った。感染直後に１０ｍｇ／ｍＬのツニカマイシン又はネガティブコントロールとしてＤＭＳＯを添加した。感染後７２時間経過時に培養上清と細胞をそれぞれ別々に回収し、培養上清と細胞それぞれに対し、ｍＩＬ３をコードするｃＤＮＡのＮ末端に結合したエピトープタグであるＦＬＡＧタグに対する抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタン解析を行った。結果を図６に示す。図６中、「Ｍ」はモック感染を、「＋」はツニカマイシンを添加した培養上清・細胞を、「−」はＤＭＳＯを添加した培養上清・細胞を示す。
【００３９】
マウスインターロイキン３タンパク質はＮ末端側に存在するシグナルペプチドが認識されて細胞外へと分泌される。また、Ｎ型糖鎖修飾を受けることによって、その分子量が増加することが知られている。図６より明らかなとおり、抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタン解析の結果、マウスインターロイキン３タンパク質はＢｍＮ４だけでなく、ＢｍＮ−ＳＦＭにおいてもウイルス感染細胞外へと細胞外分泌されていることが明らかとなった。このことから、組換えタンパク質の細胞外分泌がＢｍＮ−ＳＦＭにおいてもＢｍＮ４と同様に行われていることが明らかとなった。さらにウエスタン解析によって得られたシグナルの位置を確認すると、感染細胞においても培地上清においても、ネガティブコントロールのサンプルでは、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞においても、ＢｍＮ４細胞においても約２２〜２６ｋＤａのタンパク質のシグナルが検出されているのに対し、Ｎ型糖鎖修飾阻害剤であるツニカマイシンを添加したサンプルでは、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞においても、ＢｍＮ４細胞においても約２０ｋＤａのタンパク質のシグナルが検出され、ツニカマイシンが添加されていることによって糖鎖修飾が阻害されたと考えられた。これらの結果、ＢｍＮ−ＳＦＭ細胞は、ＢｍＮ４細胞と同等の組換えタンパク質の細胞外分泌能と、糖鎖修飾能を有することが明らかとなった。
【図１】
2014082954.tif 000002
【図２】
2014082954.tif 000003
【図３】
2014082954.tif 000004
【図４】
2014082954.tif 000005
【図５】
2014082954.tif 000006
【図６】
2014082954.tif 000007
【配列表】
2014082954000001.app