(57)【要約】【課題】  プリカーサイオンの強度が微弱なＭＳｎ測定や、測定対象のイオン強度が微弱な場合のＭＳ１測定に際しても、サンプルの枯渇を確実に捉えることのできるＭＡＬＤＩ質量分析装置を提供する。【解決手段】  レーザ光の照射により発生したイオンのうち、測定対象以外のイオンを検出する対象外イオン検出手段と、その対象外イオン検出手段による検出結果を用いてサンプルの枯渇状況を判定する判定手段１４を設けることにより、マトリックスと試料を混合したＭＡＬＤＩ用のサンプルから発生するマトリックスイオンやフラグメントイオンなどの測定対象外のイオン量の多寡でサンプルの枯渇の度合いを表す情報として使用し、測定対象イオンやプリカーサイオンの量が微弱であっても、正確な枯渇状況の判定を可能とする。【選択図】図１
2014224732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料とマトリックスとの混合物からなるサンプルにレーザ光を照射することにより発生するイオンのうち、測定対象となるイオンを選択的に分析部に導いてイオン検出器で検出することによって、試料に含まれている成分に係る情報を得るＭＡＬＤＩ質量分析装置において、
上記レーザ光の照射により発生したイオンのうち、上記測定対象以外のイオンを検出する対象外イオン検出手段と、その対象外イオン検出手段による検出結果を用いて上記サンプルの枯渇状況を判定する判定手段を備えていることを特徴とするＭＡＬＤＩ質量分析装置。
【請求項２】
上記判定手段は、上記対象外イオン検出手段による検出結果があらかじめ設定されているしきい値以下になった時点でサンプルが枯渇したと判定するとともに、その判定結果に基づいて測定を停止する制御手段を備えていることを特徴とする請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
【請求項３】
上記分析部の前段にイオントラップを備え、上記対象外イオン検出手段は、レーザ光の照射により発生したイオンをそのイオントラップに一旦導入して測定対象となるイオンを捕捉する際に、当該イオントラップに捕捉されなかったイオンを上記イオン検出器で検出する手段であることを特徴とする請求項１または２に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
【請求項４】
上記分析部の前段にイオントラップを備え、上記対象外イオン検出手段は、イオントラップ中のイオンのうち、プリカー分離のために不要なイオンを当該イオントラップ外に排出する際、その排出されたイオンを上記イオン検出器で検出する手段であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
【請求項５】
上記分析部の前段に偏向電極を備え、上記対象外イオン検出手段は、偏向電極により分析部に導かれずに偏向されたイオンを検出する専用のイオン検出器を備えていることを特徴とする請求項１または２に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
【請求項６】
測定に先立ち、サンプルに対するレーザ光の照射位置を変更しつつ、各照射位置で発生したイオンを検出し、その検出したイオンの量に基づいて測定の際にレーザ光を照射するのに適した位置を選択するスイートスポット探索機能を有し、そのスイートスポット探索機能で用いるイオン量は、上記対象外イオン検出手段によるイオンの検出量を用いることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマトリックス支援レーザ脱離イオン化（以下、ＭＡＬＤＩと称する）質量分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析装置におけるイオン源として、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｉｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法に基づくイオン源が知られている。このＭＡＬＤＩ法に基づくイオン源は、レーザ光を吸収しにくい試料やタンパク質など、レーザ光で損傷を受けやすい試料を分析する際に多用されるイオン源であり、レーザ光を吸収しやすく、かつ、イオン化しやすい物質をマトリックスとして試料にあらかじめ混合したサンプルを作製しておき、そのサンプルにレーザ光を照射することで試料成分をマトリックスとともにイオン化する。
【０００３】
このＭＡＬＤＩ法に基づくイオン源においては、一般に、サンプルは金属製のサンプルプレート上に分画されたウェルと称される領域に滴下されて結晶化された状態で、そのサンプル領域の一部分にパルス状のレーザ光を照射してイオン化を行う。このようなイオン源から発生したイオンは、質量分析部においてｍ／ｚ（質量電荷比）ごとに分離された上でイオン検出器に導かれて検出される。通常はこのようなパルスレーザ光の照射を同じサンプルに対して多数回にわたって行い、その各ショットごとに得られるスペクトルの積算データを取得する。
【０００４】
ここで、同じサンプルに対してレーザ光の照射を繰り返すと、照射領域のサンプル量は徐々に減少し、試料成分のイオンの発生量が少なくなる結果、低品質のスペクトルしか得られなくなる。また、その状態で測定を継続すると、積算データのＳ／Ｎが悪化し、測定時間の増大にも繋がる。
【０００５】
このようなことを避けるため、従来、スペクトルの品質が基準以下になった場合に測定を停止する機能（例えば非特許文献１参照）や、数回ないしは数十回分の１ショットのスペクトルを１次積算し、その１次積算されたスペクトルのうち、基準以下のスペクトルを積算データから除外する手法（例えば特許文献１参照）などの対策が採られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４８５１２７３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社  取扱説明書”ＭＡＬＤＩ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｇｅｔｔｉｎｇ  Ｓｔａｒｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ”９７１５５−９７０１２，Ｒｅｖ．Ｃ，Ｊａｎｕａｒｙ，２００９，頁６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、例えば２段階以上の質量分離を行うＭＳｎ測定（ｎは２以上の整数。以下同様。）において、対象プリカーサイオンの強度が微弱な場合には、前記した従来の技術を適用することは困難である。
【０００９】
すなわち、図５（Ａ）は、ＭＡＬＤＩ質量分析装置によるＭＳ２測定時の１ショットの微量サンプルスペクトルを示し、同図（Ｂ）は、このような１ショット分のスペクトルを１００ショット積算した結果を示すグラフである。１ショットのスペクトルでは数本のイオンが検出されているだけであり、非同期に発生するようなスパイクノイズとの分離も難しい。したがって、前記した非特許文献１に記載の、データのＳ／Ｎやピーク強度から測定の停止を決定する従来の技術を微量サンプルのスペクトルに適用することは困難である。また、前記した特許文献１に記載の技術において、数回〜数十回分の１ショットのスペクトルを１次積算し、基準以下のスペクトルを除外するようにしても、微量サンプルのスペクトルにおけるデータの取捨選択は容易ではない。
【００１０】
同様に、ＭＳ１測定の場合においても、測定対象のイオンの強度が微弱な場合は、サンプルの枯渇を１ショットもしくは数ショット分の積算スペクトルから判定することは困難である。
【００１１】
ここで、ＭＳｎ測定時に規定ショット数ごとにＭＳ１測定を実施し、Ｓ／Ｎの高いＭＳ１スペクトルからサンプルの枯渇の程度を判定する方法が考えられるが、この場合、ＭＳ１測定による測定時間の増大並びにサンプルの浪費が問題となる。
【００１２】
本発明はこのような実情に鑑みてなされたもので、対象とするプリカーサイオンの強度が微弱な場合のＭＳｎ測定や、測定対象のイオン強度が微弱な場合のＭＳ１測定に際しても、サンプルの枯渇を確実に捉えることのできるＭＡＬＤＩ質量分析装置の提供をその課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するため、本発明のＭＡＬＤＩ質量分析装置は、試料とマトリックスとの混合物からなるサンプルにレーザ光を照射することにより発生するイオンのうち、測定対象となるイオンを選択的に分析部に導いてイオン検出器で検出することによって、試料に含まれている成分に係る情報を得るＭＡＬＤＩ質量分析装置において、上記レーザ光の照射により発生したイオンのうち、上記測定対象以外のイオンを検出する対象外イオン検出手段と、その対象外イオン検出手段による検出結果を用いて上記サンプルの枯渇状況を判定する判定手段を備えていることによって特徴づけられる（請求項１）。
【００１４】
ここで、本発明においては、上記判定手段は、上記対象外イオン検出手段による検出結果があらかじめ設定されているしきい値以下になった時点でサンプルが枯渇したと判定するものとし、その判定結果に基づいて測定を停止する制御手段を備えた構成（請求項２）を好適に採用することができる。
【００１５】
本発明において、上記分析部の前段にイオントラップを備えたものにあっては、上記対象外イオン検出手段は、レーザ光の照射により発生したイオンをそのイオントラップに一旦導入して測定対象となるイオンを捕捉する際に、当該イオントラップに捕捉されなかったイオンを上記イオン検出器で検出する手段とする構成（請求項３）を採用することができる。
【００１６】
また、同じく上記分析部の前段にイオントラップを備えたものにあっては、上記対象外イオン検出手段は、イオントラップ中のイオンのうち、プリカー分離のために不要なイオンを当該イオントラップ外に排出する際、その排出されたイオンを上記イオン検出器で検出する手段とする構成（請求項４）を採用することができる。
【００１７】
一方、本発明において、上記分析部の前段に偏向電極を備えたものにあっては、上記対象外イオン検出手段は、偏向電極により分析部に導かれずに偏向されたイオンを検出する専用のイオン検出器を備えた構成（請求項５）とすることができる。
【００１８】
そして、請求項６に係る発明は、以上の各発明における対象外イオン検出手段をスイートスポット探索に利用しようとするもので、測定に先立ち、サンプルに対するレーザ光の照射位置を変更しつつ、各照射位置で発生したイオンを検出し、その検出したイオンの量に基づいて測定の際にレーザ光を照射するのに適した位置を選択するスイートスポット探索機能を有し、そのスイートスポット探索機能で用いるイオン量は、上記対象外イオン検出手段によるイオンの検出量を用いることを特徴としている。
【００１９】
本発明は、質量分析装置において通常では検出されずに除外されるイオン量をモニタすることで、サンプルの枯渇を判定すべき対象イオン量が微弱であっても正確な枯渇判定を可能とするものである。
【００２０】
すなわち、ＭＡＬＤＩ法に基づくイオン源では、サンプルにレーザ光を照射することにより発生するイオンには、対象イオンのほか、マトリックスイオンやフラグメントイオンなどのバルクイオンが多く含まれる。対象イオン量が微弱である場合や、ＭＳｎ測定により検出イオン量が微弱になる場合は、バルクイオン、つまり対象外イオンの方が対象イオンやプリカーサイオンの量よりも支配的になる場合が多い。そのため、前記図５（Ａ）で示したような微量なイオンしか発生せず、対象イオンないしはプリカーサイオンでは枯渇の度合いを判定できない場合でも、バルクイオン（対象外イオン）量をモニタすることで、高いＳ／Ｎのもとにサンプルの枯渇状況を判定することができる。
【００２１】
加えて、レーザ光の１ショットでこの対象外イオン量のモニタと実測定とを同時に行うことができるため、新たなサンプルの消費や測定時間の増大に繋がることもない。
【００２２】
本発明における枯渇状況の判定手段は、対象外イオンの検出量がしきい値を越えたときに枯渇と判定するとともに、その判定結果に基づいて自動的に測定を停止することで、無駄な時間を生じず、また、積算データの実質的なＳ／Ｎの悪化を未然に防止することができる。
【００２３】
本発明において、対象外イオンを検出する検出器は、イオントラップを備えた質量分析装置にあっては、対象イオンを検出するイオン検出器をそのまま用いることができる。すなわち、イオンをイオントラップに導入する際、トラップ可能な最小質量以下のイオンについてはイオントラップを通過させて質量分析部へと向かわせるが、そのイオンを質量分析部に設けられているイオン検出器で検出する。また、同じくイオントラップを備えた質量分析装置においてＭＳｎ測定を行う場合、一旦イオントラップに捕捉したイオンからプリカーサイオンのみを分離するが、その際に不要なイオンはイオントラップから排出して質量分析部へと向かわせるので、そのイオンを同様にイオン検出器で検出することもできる。つまり、イオントラップを備えた質量分析装置においては、言わば、イオン検出器を時分割的に用いて対象イオンと対象外イオンの双方を検出することができる。
【００２４】
一方、質量分析部の前段に偏向電極を備えた質量分析装置にあっては、偏向されたイオンを検出する専用の検出器を設けることになる。すなわち、この種の質量分析装置におけるＭＳ２測定では、イオン源で発生したイオンのうち、プリカーサイオンのみがコリジョンセルへと向かうように、それ以外のイオンは偏向電極により偏向されて排除される。本発明をこの種の質量分析装置に適用する際には、偏向電極で排除された対象外イオンを検出するための専用の検出器を設けるようにする。
【００２５】
請求項６に係る発明は、以上の対象外イオンの検出手段をスイートスポットの探索にも利用しようとするものであり、通常は対象イオンの検出量をモニタしながらレーザ光の照射位置を変化させ、検出量の多いところをスイートスポットと決定するが、対象イオンが微弱である場合など、スイートスポットの探索が困難な場合がある。対象イオンが微弱な場合には、前記した通り、マトリックスイオンなどの対象外イオンが支配的となるため、この対象外イオン量をモニタしてスイートスポットの探索に応用することにより、特に対象イオンが微弱な場合において、従来に比してより正確にスイートスポットを選定することが可能となる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、対象イオンの強度が微弱である場合や、プリカーサイオンの強度が微弱であるサンプルの測定に際しても、サンプルの枯渇を正確に察知することができるので、サンプルが枯渇した状態で測定を継続して積算データのＳ／Ｎを悪化させたり、測定時間を無駄に増大させることを確実に防止することができる。しかも、枯渇状況を判定するための特別なレーザショットを必要とせず、レーザの１ショットで枯渇状況のデータ取得と実測定との双方を併せて行うことができるので、枯渇状況判定のための新たなサンプルの消費や測定時間の増大に繋がることがない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】イオントラップを備えた飛行時間型質量分析装置に本発明を適用した実施例を示す要部構成図。
【図２】図１の質量分析装置で各部に印加される電圧を示すシーケンスチャート。
【図３】図１の実施形態における対象外イオン測定結果の例を示すグラフ。
【図４】イオントラップに代えて偏向電極を有する質量分析装置に本発明を適用した場合の図１同様の要部構成図。
【図５】ＭＡＬＤＩ質量分析装置によるＭＳ２測定時の１ショットの微量サンプルのスペクトルの例を示すグラフ（Ａ）と、当該１ショット分のスペクトルを１００ショット分積算した結果を示すグラフ（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図面を参照しつつ本発明の実施の形態について説明する。
図１は本発明の実施の形態の要部構成図であり、イオントラップを有する飛行時間型のＭＡＬＤＩ質量分析装置に本発明を適用した例を示している。
【００２９】
イオン源１は公知のＭＡＬＤＩ法に基づくイオン源であって、マトリックスと試料の混合物がサンプルプレートの各ウェルに滴下されており、そのウェル上のサンプルに対してレーザ光源を含むレーザ照射光学系２からのパルスレーザ光が照射されることにより、イオンが発生して引き出される。このレーザ照射光学系２のレーザ光源は、制御部１０からの指令により駆動制御される。
【００３０】
イオン源１から引き出されたイオンはイオントラップ３内に導かれる。イオントラップ３は、リング状電極３ａと入口側および出口側のエンドキャップ電極３ｂ，３ｃによって構成され、これらの各電極３ａ，３ｂ，３ｃには、制御部１０からの指令に基づいて高周波電圧印加部１１ａ、電圧印加部１１ｂ，１１ｃから後述するタイミングのもとにそれぞれ所要の電圧が印加される。
【００３１】
イオントラップ３の次段には、フライトチューブなどで形成されるイオンの飛行領域４を有してなる分析部が設けられ、この飛行領域４を挟んでイオントラップ３の反対側にはイオン検出器５が配置されている。イオン検出器５の出力は検出回路１２を介してデータ収集・処理部１３に取り込まれる。このデータ収集・処理部１３によるデータ収集の開始は、測定を必要とするイオンがイオン検出器５に飛来してからであり、そのデータ収集開始は、イオントラップ３の各電極３ａ，３ｂ，３ｃへの電圧印加との関連において制御部１０からの指令に基づいて行われる。
【００３２】
さて、この実施の形態の特徴は、実測定時にイオン検出器５で検出されるイオン、つまり測定対象のイオン以外のイオンを後述のタイミングにより検出し、その検出結果をサンプルの枯渇状況の判定に供する点である。
【００３３】
すなわち、イオン検出器５の出力は検出回路１２を経て判定部１４にも取り込まれ、この判定部１４においてあらかじめ設定されているしきい値と比較され、その判定結果はサンプルの枯渇の度合いを表す情報として制御部１０に取り込まれる。この判定部１４への検出回路１２の出力の取り込みは、後述するように、制御部１０からの指令に基づいて、レーザ光の１ショットごとに、対象イオン以外のバルクイオンがイオン検出器５に到達するときに行われる。なお、判定部１４で用いるしきい値は、制御部１０に接続されている操作部１５をオペレータが操作することにより設定が可能である。
【００３４】
次に、以上のように構成された本発明の実施の形態の動作について、図２に示す電圧シーケンスチャートを参照しつつ説明する。なお、この図２は正イオンを測定する例を示している。
【００３５】
図２のＡのタイミングでサンプルに対してレーザ光を照射することによりイオンが発生する。ＡからＢの間は、出口側エンドキャップ電極３ｃに負の電圧を印加することで、対象イオンのｍ／ｚよりも小さく早くそこに到達したイオンは、イオントラップ３を素通りし、Ｃのタイミングでイオン検出器５によって検出される。そしてＢのタイミングで出口側エンドキャップ電極３ｃに正の電圧を印加することにより、Ｂのタイミングで出口側エンドキャップ電極３ｃに到達していないイオンは、イオントラップ３内に反射され、これらのイオンはＤのタイミングでリング電極３ａに高周波電圧を印加することによってイオントラップ３内に捕捉される。この捕捉されたイオンは、その後、制御部１０からの指令により通常の手順のもとに質量分析に供される。すなわち、イオン検出器５によるこれらのイオンの検出結果は、検出回路１２を介してデータ収集・処理部１３に取り込まれて積算される。
【００３６】
さて、Ｃのタイミングにおけるイオン検出器５の出力は、検出回路１２を介して判定部１４に取り込まれ、あらかじめ設定されているしきい値と比較される。Ｃのタイミングでイオン検出器５により検出されるバルクイオン（上述の場合は、対象イオンのｍ／ｚよりもｍ／ｚが小さいイオン）は、マトリックスイオンやフラグメントイオンなどで構成され、そのイオン量は、イオントラップ内に捕捉されるイオン、つまり対象イオンが微弱であっても、サンプルの枯渇の度合いに比例する。よって、その対象外のイオン量の検出結果が、あらかじめ設定されているしきい値よりも低くなればサンプルが枯渇したと正確に判定することができる。このように、制御部１０では判定部１４によりバルクイオン量がしきい値以下となったと判定された時点で、自動的に質量分析動作を停止する。
【００３７】
以上の実施の形態により、実際にモニタしたバルクイオン量の検出結果を図３に示す。図３のグラフにおいて横軸はタイミングＣにおける検出時間、縦軸は検出イオン量を示し、また、図３（Ａ）はサンプル枯渇前の検出結果を、図３（Ｂ）はサンプル枯渇後の検出結果を示す。図３（Ａ）と図３（Ｂ）の縦軸のスケールは等しい。
（Ａ），（Ｂ）のグラフを比較すると、特にＴ１，Ｔ２で示した時間領域において、（Ａ）では（Ｂ）に比して複数のイオンが検出されているのに対して、（Ｂ）ではイオン由来のピークは検出されずノイズしか検出されていないことが判る。この検出結果から明らかなように、対象イオン量の多寡にかかわらず、対象外イオンであるバルクイオン量をモニタすることによって、正確にサンプルの枯渇を判定することができる。
【００３８】
ここで、ＭＳｎ測定においては、上記のようにイオン源１で発生したイオンを一旦イオントラップ３にトラップした後、そのイオンからプリカーサイオンのみを分離すべく他の不要なイオンをイオントラップ３から排出しているが、その分離の際にイオントラップ３から排出されたバルクイオンをイオン検出器５で検出し、その検出結果を判定部１４の判定に供しても、同等の作用効果を得ることができる。
【００３９】
また、以上の実施の形態は、イオントラップを有する質量分析装置に本発明を適用した例を示したが、イオントラップを有さない質量分析装置にも本発明を適用することができる。その例を図４に要部構成図で示す。
【００４０】
この図４の実施の形態は、イオン源１とイオン検出器５との間に、偏向電極６とコリジョンセル７を設けた構成を有している。この構成においては、通常のＭＳ１測定（積極的に開裂操作を行わない測定）ではイオン源１で発生して引き出されたイオンパケットは飛行領域４を経て、個々のイオンの質量電荷比に応じたタイミングでイオン検出器５によって検出される。ＭＳ２測定の場合には、偏向電極６によってプリカーサイオン以外は偏向されて排除され、プリカーサイオンだけがＭＳ２用のコリジョンセル７内に導かれ、このコリジョンセル７内で中性粒子との衝突を経てイオン検出器５へ向けて飛行し、イオン検出器５による検出結果からＭＳ２スペクトルが得られる。
【００４１】
このような構成の質量分析装置においては、プリカーサイオン分離のために偏向電極６によって排除されたバルクイオンは、イオン検出器５には向かわない。そこで、このような質量分析装置に本発明を適用する際は、偏向電極６により偏向を受けるバルクイオンを検出するための専用の検出器、つまりバルクイオン検出器８を設け、その検出結果をサンプル枯渇判定用のモニタ量として、先の例と同様の判別部１０においてしきい値と比較する。このような構成でも、プリカーサイオンが微量なサンプルであっても、先の例と同様に正確にサンプルの枯渇を判定することができる。
【００４２】
また、以上の本発明の各実施形態において、バルクイオンを検出してそのイオン量の検出結果をサンプルの枯渇の判定に供することで、特に対象イオンないしはプリカーサイオンが微量なサンプルであっても、正確にサンプルの枯渇を判定することができることについて述べたが、同様に対象イオンないしはプリカーサイオンが微量なサンプルに対し、レーザ光を照射するのに適した位置を探索する、いわゆるスイートスポット探索にもバルクイオンの検出結果をパラメータとして用いることで、正確にスイートスポットを探索することができる。
【００４３】
すなわち、スイートスポット探索では、ウェル内のサンプルに対するレーザ光の照射位置を適宜に変化させながら、各位置において対象イオンを検出し、所定のアルゴリズムのもとに、イオン量が多い位置をスイートスポットとして実測定時のレーザ照射位置を決定する。このスイートスポット探索においても、対象イオン量が少ないサンプルにあっては、図５（Ａ）のグラフからも明らかなように、各位置での１ショット分のスペクトルの比較からスイートスポットを決定することは困難である。
【００４４】
そこで、本発明の各実施形態において用いたバルクイオンの検出手段による検出結果を、スイートスポット探索のための情報とすることで、より容易にスイートスポットを決定することができる。具体的には、レーザ光の照射位置を変更しながら、各位置においてバルクイオンを検出し、各位置において発生したバルクイオン量を比較して、例えば最もイオン量が多い位置をスイートスポットと決定すればよい。このようなスイートスポットの探索手法によれば、対象イオンが少ないサンプルでも１ショットのスペクトルでイオンの検出量の違いを明確に示す情報が得られ、スイートスポットの探索をより容易なものとすることができる。
【符号の説明】
【００４５】
１  イオン源
２  レーザ照射光学系
３  イオントラップ
３ａ  リング電極
３ｂ，３ｃ  エンドキャップ電極
４  飛行領域
５  イオン検出器
６  偏向電極
７  バルクイオン検出器
１０  制御部
１１ａ  高周波電圧印加部
１１ｂ，１１ｃ  電圧印加部
１２  検出回路
１３  データ収集・処理部
１４  判定部
１５  操作部
【図１】
2014224732.tif 000003
【図２】
2014224732.tif 000004
【図４】
2014224732.tif 000005
【図５】
2014224732.tif 000006
【図３】
2014224732.tif 000007