(57)【要約】      （修正有）【課題】夾雑物を含む溶液から目的細胞をそのサイズとアフィニティを考慮して分離し、分離後の細胞の解析および培養を可能にする、目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置を提供する。【解決手段】目的細胞５の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルター３と、このマイクロフィルターの一部を構成する基板１表面に、目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子２Ａの修飾表面２を形成する、目的細胞の分離装置。および、前記細胞分離装置に、前記目的細胞および夾雑物となる非目的細胞５’が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞４，４’を反応させ、前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離する、目的細胞の分離方法。【選択図】図２
2014083000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターと、該マイクロフィルターの一部を構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、
（ｂ）そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、
（ｃ）前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
（ｄ）前記マイクロフィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより小さい非目的細胞を除去・回収することで、前記非目的細胞と前記目的細胞を分離し、
（ｅ）さらにリンス液を導入し、
（ｆ）前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、
（ｇ）前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。
【請求項２】
請求項１記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。
【請求項３】
（ａ）目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターとしての微細構造を有する貫通穴フィルターを構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、
（ｂ）そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、
（ｃ）前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
（ｄ）続いて前記貫通穴フィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記貫通穴フィルターのサイズより小さい非目的細胞を除去・回収し、
（ｅ）さらにリンス液を導入し、
（ｆ）前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記貫通穴フィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、
（ｇ）前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。
【請求項４】
請求項３記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記基板の修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。
【請求項５】
請求項１又は３記載の目的細胞の分離方法において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離方法。
【請求項６】
目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面を形成した基板とマイクロフィルターとが一体的に形成され、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞と特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞を含む溶液を導入し、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞を前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞と分離することを特徴とする目的細胞の分離装置。
【請求項７】
請求項６記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が固定化された基板が底面に配置され、該底面上に前記マイクロフィルターが形成されることを特徴とする目的細胞の分離装置。
【請求項８】
請求項６記載の目的細胞の分離装置において、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズが３〜５０μｍであることを特徴とする目的細胞の分離装置。
【請求項９】
請求項６記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置に関するものであり、特に、夾雑物を含む溶液から目的細胞を分離し、分離後の細胞を解析および培養する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の夾雑物を含む溶液からの細胞分離法としては、目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と結合する抗体を用いるもの（イムノアフィニティ）が主流である。具体的には蛍光修飾抗体を用いて染色した細胞を含む懸濁液を微小流路内に導入し、レーザーを用いて細胞の蛍光強度を解析し、強度に応じて細胞を分離・分取するＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）や抗体修飾磁気粒子とその細胞懸濁液を混合し、磁気粒子に補足された目的細胞だけを磁力によって分離するＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）と呼ばれる分離技術が開発され、その装置が市販されている。市販されている装置以外では、抗体修飾したマイクロポスト構造を内部に持つ微小流路を利用したアフィニティ分離（下記非特許文献１参照）や細胞のサイズを用いた分離も行われている（下記非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓ．Ｌ．Ｓｔｏｔｔ  ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ，ｐｐ．１８３９２−１８３９７，１０７（２０１０）
【非特許文献２】Ｓ．Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，ｐｐ．２０３−２１３，１３（２０１１）
【非特許文献３】Ｐ．Ｊ．Ｍａｉｍｏｎｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＡＡＣＲ  ２０１０（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記したそれらの分離法では、（１）細胞の回収率が低い（ＦＡＣＳ）、（２）分離された細胞の純度が低い（ＭＡＣＳ）、（３）細胞生存率が低い（ＦＡＣＳ）、（４）また、細胞検出装置自体が非常に高価である（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ）、（５）ランニングコストが高い（ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ）、（６）細胞の大きさと表面マーカーの発現量を同時に考慮した分離ができない（ＭＡＣＳ）、（７）希少な細胞（レアイベント）の分離が困難である（ＦＡＣＳ）、（８）細胞に結合した磁気粒子を完全に除去することが困難である（ＭＡＣＳ）、などの問題点が指摘されている。
【０００５】
また、目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質の発現量やその細胞サイズに大きなばらつきがある場合には、表面に特異的に発現しているたんぱく質と細胞サイズのどちらか一方に着目した分離法では、分離の効率低下が避けられない。アフィニティと細胞サイズを考慮した細胞分離の両者を組み合わせる試みもわずかにある（上記非特許文献３参照）が、どのような装置構成を採用することが望ましいかは検討されていなかった。
【０００６】
本発明は、上記状況に鑑みて、夾雑物を含む溶液から目的細胞をそのサイズとアフィニティを考慮して捕捉率を高めて分離し、分離後の細胞の解析および培養も可能な、目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕目的細胞の分離方法において、目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターと、このマイクロフィルターの一部を構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、前記マイクロフィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより小さい非目的細胞を除去・回収することで、前記非目的細胞と前記目的細胞を分離し、さらにリンス液を導入し、前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする。
【０００８】
〔２〕上記〔１〕記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする。
〔３〕目的細胞の分離方法において、目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターとしての微細構造を有する貫通穴フィルターを構成する基板表面に目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面の特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、続いて前記貫通穴フィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記貫通穴フィルターのサイズより小さい非目的細胞を除去・回収し、さらにリンス液を導入し、前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記貫通穴フィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする。
【０００９】
〔４〕上記〔３〕記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記基板の修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする。
〔５〕上記〔１〕又は〔３〕記載の目的細胞の分離方法において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする。
【００１０】
〔６〕目的細胞の分離装置において、目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面を形成した基板とマイクロフィルターとが一体的に形成され、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞と特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞を含む溶液を導入し、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞を前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞と分離することを特徴とする。
【００１１】
〔７〕上記〔６〕記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が固定化された基板が底面に配置され、この底面上に前記マイクロフィルターが形成されることを特徴とする。
〔８〕上記〔６〕記載の目的細胞の分離装置において、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズが３〜５０μｍであることを特徴とする。
【００１２】
〔９〕上記〔６〕記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
本発明の目的細胞の分離方法によれば、サイズとアフィニティの両方を考慮した細胞分離が可能であるという特徴を有しており、従来装置（ＦＡＣＳ）と比較すると、ポピュレーションの小さい希少な細胞の分離に利用可能で、また分離の際の細胞懸濁液の送液条件を適切にすることで、細胞に対するダメージを減らし、分離細胞の生存率を高く保つことが可能である点が重要である。加えて、細胞懸濁液の導入後の静置操作による細胞沈降や懸濁液の水位を減少させるための送液操作によって、積極的もしくは強制的に高分子の修飾表面に細胞を接触させることができることから、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を従来法と比較して高効率に回収可能である。
【００１４】
細胞サイズによる分離では、従来法にみられる光学的に細胞サイズを見積もる方法と比較し、力学的にサイズを見積もるため精度の向上が期待できる。加えて、本発明は細胞サイズのみならずその変形能も考慮した分離も可能である。抗体修飾磁気粒子を利用する従来法（ＭＡＣＳ）と比較を行うと、本発明は細胞を分離後に磁気粒子を外す必要がないため、分離後の培養や解析に影響が少ない点やサイズを考慮した分離が可能であることも重要である。
【００１５】
また、本発明の目的細胞の分離装置によれば、実装に関して、小型なシステムあるいは、アレイ・並列化したシステムの両方の構築が可能である。小型なシステムを構築すると細胞診断の“オンサイト化”が、アレイ・並列化した実装を行うと、ハイスループットな細胞分離が実現できる。アレイ・並列化により、分離後の細胞を区画して取り扱うことができ、区画ごとに条件を変えての培養や解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１実施例を示す目的細胞の分離装置の模式図である。
【図２】本発明の第１実施例を示す目的細胞の分離装置を用いた目的細胞の分離方法を示す概念図である。
【図３】本発明の第２実施例を示す細胞分離装置の模式図である。
【図４】本発明の第２実施例を示す細胞分離装置を用いた細胞分離方法を示す概念図である。
【図５】本発明の第３実施例を示す目的細胞分離装置における目的細胞の培養増殖を示す模式図である。
【図６】本発明の更なる実施例を示す可搬型のシステムの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の目的細胞の分離方法は、目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターと、このマイクロフィルターの一部を構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、前記マイクロフィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより小さい非目的細胞を除去・回収することで、前記非目的細胞と前記目的細胞を分離し、さらにリンス液を導入し、前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離する。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１は本発明の第１実施例を示す目的細胞の分離装置の模式図、図２はそれを用いた目的細胞の分離方法を示す概念図である。
これらの図において、１は基板（底面基板、側面基板、マイクロフィルターを形成する基板を含む）、２は基板１の目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面、２Ａは生体高分子、３はマイクロフィルター、４，４′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞（目的細胞）、５は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずマイクロフィルター３のフィルタリングサイズより大きい細胞（目的細胞）、５′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずマイクロフィルター３のフィルタリングサイズより小さい細胞（非目的細胞）、６は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞４，４′や特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たない細胞５，５′を含む溶液である。
【００１９】
図２はその細胞分離装置を用いた細胞分離方法を示す概念図であり、細胞分離には、目的細胞４, ５の直径よりも小さい寸法（例えば３〜５０μｍ）の微細フィルタリング構造を持つ流路構造のマイクロフィルター３と、このマイクロフィルター３の一部を構成する、目的細胞４，４′の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子２Ａが固定化された基板１の生体高分子の修飾表面２を用いる〔図２（Ａ）参照〕。このような細胞分離装置に対して、目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞）４，４′と目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい細胞）５と夾雑物としての非目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞）５′が懸濁された溶液６を導入し〔図２（Ｂ）参照〕、必要に応じて生体高分子の修飾表面２の生体高分子２Ａと目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行う〔図２（Ｃ）参照〕。続いてマイクロフィルター３の下流に陰圧を印加する、もしくは細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、サイズの小さい非目的細胞５′を除去・回収する〔図２（Ｄ）参照〕。さらにリンス液７を導入後〔図２（Ｅ）参照〕、ピペッティング（リンス液７を攪拌する）操作を行うことでマイクロフィルター３に捕捉されていたサイズの大きい目的細胞５をリンス液７中に解放し、このリンス液７を回収することで、サイズの大きい目的細胞５を回収して、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞４, ４′のみを基板１の生体高分子の修飾表面２上に分離することが可能である〔図２（Ｆ）参照〕。また、必要があればトリプシン等の細胞剥離液８を用いて基板１の生体高分子の修飾表面２上から目的細胞４, ４′を離脱させ〔図２（Ｇ）参照〕、その後に、目的細胞４，４′をサイズ毎に回収することも可能である〔図２（Ｈ），（Ｉ）参照〕。
【００２０】
なお、上記した底面の基板及びマイクロフィルターを形成する基板１の生体高分子の修飾表面２Ａには、目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子が修飾されるが、この生体高分子としては、抗体、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーを挙げることができる。
このようにして、サイズによる細胞分離とイムノアフィニティを考慮した細胞分離を組み合わせた細胞分離を行う。
【００２１】
図３は本発明の第２実施例を示す細胞分離装置の模式図、図４はそれを用いた細胞分離方法を示す概念図である。
これらの図において、１１は基板（底面基板、側面基板を含む）、１２は基板１１に形成された後述する目的細胞の直径よりも小さい寸法の穴（マイクロフィルターとしての貫通穴フィルター）、１３は貫通穴フィルター１２が形成された基板１１の表面に形成される目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面、１３Ａは生体高分子（抗体、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー）、１４，１４′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞（目的細胞）、１５は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも大きい細胞（目的細胞），１５′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも小さい細胞（非目的細胞）、１６は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞（目的細胞）１４，１４′および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも大きい細胞（目的細胞）１５や特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも小さい細胞（非目的細胞）１５′が懸濁された溶液である。
【００２２】
図４は本発明の第２実施例の目的細胞分離装置を用いた細胞分離方法を示す概念図であり、細胞分離には、基板１１に形成された目的細胞１４, １５の直径よりも小さい寸法（例えば３〜５０μｍ）の微細構造を持つ貫通穴フィルター１２形式のマイクロフィルターと、目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞）１４, １４′に対する生体高分子１３Ａが固定化された基板１１の生体高分子１３Ａの修飾表面１３を用いる〔図４（Ａ）参照〕。このような細胞分離装置に対して、目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞）１４，１４′、目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず細胞サイズが貫通穴フィルターサイズより大きい細胞）１５、と夾雑物としての非目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず細胞サイズが貫通穴フィルターサイズより小さい細胞）１５′が懸濁された溶液１６を導入し〔図４（Ｂ）参照〕、必要に応じて生体高分子の修飾表面１３の生体高分子１３Ａと目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行う〔図４（Ｃ）参照〕。続いて貫通穴フィルター１２の下流に陰圧、もしくは細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、サイズの小さい非目的細胞１５′を除去・回収する〔図４（Ｄ）参照〕。さらにリンス液１７を導入後、ピペッティング（リンス液１７を攪拌する）操作を行うことで貫通穴フィルター１２に捕捉されていたサイズの大きい目的細胞１５をリンス液１７の中に解放し、このリンス液１７を回収することで、サイズの大きい目的細胞１５を回収して〔図４（Ｅ）参照〕、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞１４，１４′のみを基板１１の生体高分子の修飾表面１２上に分離することが可能である。また、必要があればトリプシン等の細胞剥離液１８を用いて基板１１の生体高分子の修飾表面１３上から目的細胞１４, １４′を離脱させ〔図４（Ｆ）参照〕、その後に、目的細胞１４, １４′をサイズ毎に回収することも可能である〔図４（Ｇ）参照〕。
【００２３】
このようにして、サイズによる細胞分離とアフィニティを考慮した細胞分離を組み合わせた細胞分離を行う。
また、本実施例のマイクロフィルターは、図３に示すような貫通穴フィルター１２形式の構造としたので、よりコンパクトなデバイスとすることができる。
図５は本発明の第３実施例を示す目的細胞分離装置における目的細胞の培養増殖を示す模式図である。
【００２４】
本発明では、さらに、図５に示すように、非目的細胞分離後の目的細胞２１（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ、もしくは細胞サイズがフィルタリングサイズよりも大きい細胞）に対して、培溶液２２を供給することで培養増殖が可能である。加えて、分離された細胞に対して蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応や、分離された細胞をその場で溶解し、ＤＮＡ増幅反応を行うことで、その遺伝子解析が可能となる。その他では、分離された細胞に対して、薬剤を供給することで薬剤反応性試験などの実施が可能である。
【００２５】
本発明は、具体的には血中からの白血球分離など通常の細胞分離（目的細胞のポピュレーションが大きい）への応用のみならず、体性細胞の集団中からの体性幹細胞の分離や血中を循環する腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）、血中を循環する内皮細胞や血中を循環する血管内皮前駆細胞など、生物学的に重要である、“希少な細胞”の分離にも応用できる。
【００２６】
これは、本発明での分離プロセスにて高い回収率を実現できるためである。また、分離後の細胞を培養し増殖させ、目的細胞の生物学的研究の材料・資源として用いることや、分離後の細胞の遺伝子解析や薬剤反応性試験を行うことが可能なため、希少細胞に関する生物学的基礎研究の発展に寄与することや、希少細胞を用いた疾患の診断に応用可能である。
【００２７】
図６は本発明の更なる実施例を示す可搬型のシステムの模式図である。
この図は実装の一例であり、図６（Ａ）に示すように、本発明の細胞分離装置を構成する微小流体チップ３３は、２ｍＬピペットチップ３２（血清用ピペット、Ｎｕｎｃ）を介して電動ピペット（ＢＤバイオサイエンス）３１に接続することができる。この微小流体チップ３３は、図６（Ｂ）に示すように、ピペットチップ３２と接続するためのキャップ部分３３Ａと、マイクロフィルター層３３Ｂ〔いずれもシリコーンゴムの一種であるＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）〕と、このマイクロフィルター層３３Ｂのマイクロフィルター構造を封止するガラス基板（直径１０ｍｍ）３３Ｃからなる。３．５ｍｍのポートを備えるキャップ部分３３Ａはピペットチップ３２とマイクロフィルター層３３Ｂ間のコネクタとして働く。マイクロフィルター層３３Ｂには、図６（Ｃ）に示すように、直径２ｍｍの溶液リザーバーポートがキャップ部分３３Ａのポートに接続されるように作製されている。図６（Ｄ）は微小流体図６（ｃ）の黒点線で囲んだ部分の拡大図であり、チップ３３上のマイクロフィルター層３３Ｂ（幅２５μｍ、深さ７．６μｍ）を示している。この図６（Ｄ）に示されるように、１０μｍと１６．５μｍの蛍光ビーズをマイクロフィルター層３３Ｂで捕捉することに成功した。また、図６（Ｅ）に示すように、微小流体チップ３３内の液体の交換は、所望の溶液を入れた遠心分離管３４に微小流体チップ３３を浸し、続けてピペッティング操作によって陰圧もしくは陽圧を印加することで行われる。
【００２８】
本発明の実用化の見通しと産業上の利用価値について述べると、本発明の細胞分離装置の実装では、図６に示すように小型化して実装を行うことで可搬型のシステムが構築可能であり、例えばＣＤ４陽性細胞数の現場診断や、尿中に含まれる前立腺がん細胞の計数による細胞診断の“オンサイト化”などが期待できる。一方で、本発明の細胞分離装置を９６ウェルなどのマイクロタイタープレート（マルチウェルプレート）のウェル部分に対応するようにアレイ化すると、既存の細胞分析装置（蛍光プレートリーダー等）との適合性が非常に高くなり、例えば、ＣＴＣの血中からの分離からその計数まで一般的な生物学の研究室の装置で行うことができるようになり、波及効果は極めて高い。また、アレイ化によって分離後の培養操作や遺伝子解析・薬剤反応性試験等をデバイス毎に区画化された形で実現することが可能になり、抗がん剤の投与前奏功判定や抗がん剤の創薬などへの強力なツールとなりうる。
【００２９】
本発明は、従来法と比較し、細胞分離においても回収率／純度／生存率の面での向上が期待できる。具体的には細胞の大きさと表面マーカー（特異的に発現しているたんぱく質）発現量を同時に考慮した細胞分離が可能であるため、希少な細胞の分離などへの応用が期待できる。また、分離した細胞をその場で培養することや、遺伝子解析に必要な蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応やＤＮＡ増幅反応のための細胞溶解プロセスもしくは、薬剤反応性試験などの解析を他の反応容器に移すことなくその場で行うことが可能であるため、従来法と比較し、分離後の細胞の培養と解析に用いる場合のロスを減らすことが可能である。
【００３０】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の細胞分離法および細胞分離装置は、回収率／純度／生存率の面での向上が期待できる細胞分離法および細胞分離装置として利用可能である。
【符号の説明】
【００３２】
１，１１    基板
２    基板の生体高分子の修飾表面
２Ａ，１３Ａ    生体高分子
３    マイクロフィルター
４，４′，１４，１４′    特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞（目的細胞）
５, １５    特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい細胞（目的細胞）
５′，１５′  特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞（非目的細胞）
６，１６    特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞や特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たない細胞を含む溶液
７，１７    リンス液
８，１８    細胞剥離液
１２    基板に形成された目的細胞の直径よりも小さい寸法の穴（マイクロフィルターとしての貫通穴フィルター）
１３    貫通穴フィルターが形成された基板の表面に形成される生体高分子の修飾表面
２１    分離後の目的細胞（特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ、もしくは細胞サイズがフィルタリングサイズより大きい細胞）
２２    培溶液
３１    電動ピペット
３２    ピペットチップ
３３    微小流体チップ
３３Ａ    キャップ部分
３３Ｂ    マイクロフィルター層
３３Ｃ    ガラス基板
３４    遠心分離管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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