(57)【要約】【課題】効率よく利用可能なＲＮＡの抽出方法を提供すること。【解決手段】  リボ核酸（ＲＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを担体上に吸着させる工程と、ＲＮＡを吸着させた担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程と、担体に吸着したＲＮＡを、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及びプライマー用オリゴヌクレオチドを含む溶出液中に溶出させる工程と、を含むＲＮＡの抽出方法とする。【選択図】  図１
2014039481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核酸（ＲＮＡ）を含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液および核酸結
合性固相担体を混合して、ＲＮＡを前記担体上に吸着させる工程と、
前記ＲＮＡを吸着させた前記担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程と、
前記担体に吸着したＲＮＡを溶出液中に溶出させる工程と、
を含むＲＮＡの抽出方法であって、
前記溶出液が逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写用プライマーを含むことを特徴とする
抽出方法。
【請求項２】
前記洗浄液が、水または低塩濃度水溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の抽
出方法。
【請求項３】
前記低塩濃度水溶液の塩濃度が１００ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項２に記
載の抽出方法。
【請求項４】
前記溶出液が、ポリメラーゼ、及びＤＮＡ増幅用プライマーを含むことを特徴とする、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抽出方法。
【請求項５】
前記溶出液が、ＢＳＡを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の
抽出方法。
【請求項６】
前記担体に吸着したＲＮＡを４０℃以上７０℃以下で溶出させることを特徴とする、請
求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記溶解液が、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．
２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液であることを特徴とする
、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記担体が、磁性粒子であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項９】
３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液と、
有機溶媒を含まない水または低塩濃度水溶液からなる洗浄液と、
逆転写酵素、及びｄＮＴＰを含む溶出液と、
を含むＲＮＡ抽出キット。
【請求項１０】
前記溶出液が、さらに、ポリメラーゼを含有することを特徴とする、請求項９に記載の
ＲＮＡ抽出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡの抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡
便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomら
の方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に
吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体
に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピ
ック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および
（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程
からなる。ここで（２）の洗浄液としては、カオトロピック剤を溶かし込み、さらに、核
酸の担体からの溶出を防ぐため、従来から、水溶性有機溶媒、特にエタノールを５０〜８
０％程度の割合で含有する水または低塩濃度緩衝液が用いられている。
【０００３】
しかしながら、この水溶性有機溶媒が（３）の工程に残留した場合、抽出液を酵素処理
する際に酵素反応が阻害されるため、通常、エタノールを含む水溶液での洗浄後は、必要
に応じて１００％エタノール、あるいは、さらに揮発性の高いアセトン等で洗浄し、その
後、乾燥させて有機溶媒を系から完全に取り除く操作が行われている。この乾燥は時間を
要するのみでなく、乾燥時間が不十分であればエタノールの残留につながり、過度の場合
には、核酸が乾燥しすぎて固化するため、溶出が困難になり、結果的に核酸回収量の低下
や再現性の低下に繋がることが知られている。このように有機溶媒の使用は、その乾燥の
程度を見極めにくいのみならず、エタノールやアセトンといった有機溶媒は引火性及び揮
発性を有するため、特に操作の自動化を考えた場合には、出火等の危険性も考えられる。
【０００４】
そこで、核酸を担体に吸着させた後、（２）の洗浄工程で、エタノール等の有機溶媒を
全く含まない水または低塩濃度緩衝液で担体を洗浄し、（３）の溶出工程で、５０〜７０
℃で、水または低塩濃度緩衝液で核酸を溶出することによって、リボ核酸（ＲＮＡ）を抽
出する方法が開発された（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−１４６７８３号公開公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率よく利用可能なＲＮＡの抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これまで、Boom法において、核酸を担体に吸着させ、（２）の洗浄工程で、エタノール
等の有機溶媒を事実上含まない水または低塩濃度緩衝液で担体を洗浄した後、（３）の溶
出工程では、５０〜７０℃で、水または低塩濃度水溶液で核酸を溶出することによって、
リボ核酸（ＲＮＡ）が単離されていた（特開平１１−１４６７８３号公開公報）。しかし
ながら、本発明者は、（３）の溶出工程で、逆転写酵素反応溶液などで核酸を溶出するこ
とにより、効率よくその後の逆転写酵素反応ができることを見出し、本発明の完成に至っ
た。
【０００９】
本発明の一実施態様は、ＲＮＡを含む試料に、カオトロピック物質を含有する溶解液お
よび核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを前記担体上に吸着させる工程と、前記ＲＮ
Ａを吸着させた前記担体を、有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄する工程と、前記担体に吸
着したＲＮＡを溶出液中に溶出させる工程と、を含むＲＮＡの抽出方法であって、前記溶
出液が逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写用プライマーを含むことを特徴とする抽出方法
である。前記洗浄液が、水または低塩濃度水溶液であってもよい。前記低塩濃度水溶液の
塩濃度が１００ｍＭ以下であってもよい。前記溶出液が、ポリメラーゼ、及びＤＮＡ増幅
用プライマーを含んでも良い。前記溶出液が、ＢＳＡを含むことが好ましい。前記担体に
吸着したＲＮＡを４０℃以上７０℃以下で溶出させてもよい。前記溶解液が、３〜７Ｍの
グアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．
２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液であってもよい。前記担体が、磁性粒子であってもよ
い。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様は、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活
性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液と、有機
溶媒を含まない水または低塩濃度水溶液からなる洗浄液と、逆転写酵素、及びｄＮＴＰ、
を含む溶出液と、を含むＲＮＡ抽出キットである。前記溶出液が、さらに、ポリメラーゼ
を含有してもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、効率よく利用可能なＲＮＡの抽出方法を提供することが可能になった
。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施例において、異なるＲＮＡ溶出／ＲＴ−ＰＣＴ法によって得られた増幅産物を調べた時の、ＰＣＲサイクル数とＤＮＡ増幅量の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.
), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Pres
s, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston,
D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in M
olecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法
、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装
置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業
者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる
。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施
態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれら
に限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明
細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかであ
る。
【００１５】
＝＝ＲＮＡ抽出用試薬＝＝
本発明にかかるリボ核酸（ＲＮＡ）の抽出方法は、ＲＮＡを含む試料に、カオトロピッ
ク物質を含有する溶解液および核酸結合性固相担体を混合して、ＲＮＡを担体上に吸着さ
せる工程（吸着工程）と、ＲＮＡを吸着させた担体を有機溶媒を含まない洗浄液で洗浄す
る工程（洗浄工程）と、担体に吸着したＲＮＡを逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及びプライマー
用オリゴヌクレオチドを含む溶出液中に溶出させる工程（溶出工程）と、を含む。
【００１６】
ＲＮＡを抽出する試料は、ＲＮＡを含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの
細胞塊などの生体試料、ウイルス、合成ＲＮＡ、一旦単離したＲＮＡに不純物や夾雑物が
混入した試料などであってもよい。
【００１７】
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の
陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、ＲＮＡの固相担
体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシ
アン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム
等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩
またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質
により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの
範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。
【００１８】
溶解液は、このようなカオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の
破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させても
よい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば
特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗ
ｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイル
サルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオ
ン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶
解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させ
ることが好ましい。溶解液は、緩衝液であっても良いが、ｐＨ６〜８の中性であることが
好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非
イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有する
ことが好ましい。
【００１９】
核酸結合性固相担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可逆的
な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限定さ
れない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、あ
るいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁性金
属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核酸と
の可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。
【００２０】
また、これらの核酸結合性固相の形態としては、粒子、フィルター、バッグ、ディッシ
ュ、反応容器等が具体的に挙げられるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出
の効率を考慮すると粒子の形態がより好ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、
０．０５〜５００μｍであってもよく、好ましくは１〜１００μｍであり、特に好ましく
は１〜１０μｍである。
【００２１】
洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物
質を事実上含まないものが用いられ、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低
塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００
ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。また
、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以
上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶
液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に
限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、
リン酸などの塩が好ましく用いられる。
【００２２】
溶出液も、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド
）を含んでいれば、特に限定されない。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラ
ーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいても良く、ＴａｑＭａｎプローブや
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ
用プローブやＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいても良い
。さらに、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有
することが好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアル
コール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。ま
た、逆転写酵素用緩衝液及び／又はＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液となるように、塩を含有
することが好ましい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定さ
れないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素
は特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏ
ｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓ
ｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス
１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写
酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。ＤＮＡポリメラーゼも特に限定され
ないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉ
ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品
がある。
【００２３】
溶出液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良い
が、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を
１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２０
０〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高
い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度が
より好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさ
らに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２
００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜
１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。ＢＳＡまたはゼラチンの濃度は、１
ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応
やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラ
チンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。
ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させても良い。
【００２４】
＝＝ＲＮＡ抽出方法＝＝
具体的には、以下の様にしてＲＮＡを抽出すれば良い。  
まず、溶解工程として、適量の溶解液に、ＲＮＡを抽出する試料及び核酸結合性固相担
体を混合し、ホモジェナイザーやボルテックス・ミキサーなどによって試料を破砕し、Ｒ
ＮＡを担体に吸着させる。
【００２５】
次に、非特異的に担体に吸着した夾雑物を除去するため、ＲＮＡが吸着した担体を、適
量の溶解液で洗浄することが好ましい。洗浄回数は特に限定されないが、１回〜数回洗浄
すればよい。
【００２６】
ここでいう洗浄とは、ＲＮＡの結合した担体を洗浄液と接触させ、再び分離することに
より、担体から、ＲＮＡ以外の非特異的に結合した物質を除去する操作である。具体的な
分離方法は、使用する担体の形態により異なるが、担体がビーズなどの粒子形態である場
合には、遠心分離、ろ過分離及びカラム操作等を用いることができる。担体が磁性体を含
む場合は、磁石等を用いて、簡便に担体を洗浄することができる。
【００２７】
そして、溶出工程として、ＲＮＡが吸着した担体に、適量の溶出液を加え、ボルテック
ス・ミキサーなどによって混合し、ＲＮＡを担体から溶出させる。この際、溶出液を加熱
することにより、ＲＮＡ抽出を促進する。加熱温度は特に限定されないが、４０℃より高
ければ良く、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に
限定されないが、７０℃以下であることが好ましく、６５℃以下であることがより好まし
く、６０℃以下であることがさらに好ましく、６０℃であることが最も好ましい。加熱方
法として、予め加熱した溶出液に担体を加えても良く、溶出液に担体を加えた後で加熱し
ても良い。加熱時間は特に限定されないが、３０秒〜１０分間程度が好ましい。
【００２８】
溶出液には、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマーが含まれているので
、溶出液を、そのまま逆転写反応に用いることができる。この際、溶出に用いたチューブ
をそのまま用いてもよく、新しいチューブに移しても良いが、反応効率の点で、溶出に用
いたチューブをそのまま用いるのが好ましい。また、逆転写反応には、溶出液の一部また
は全部を用いてもよく、一部を用いる場合は、逆転写酵素用に調節したバッファーで希釈
するのが好ましい。逆転写酵素用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用
いても良いが、塩濃度が適正に調節されていることが好ましく、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、
及び逆転写酵素用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。このと
き、担体は、除去してもしなくても構わないが、除去することが好ましい。
【００２９】
逆転写反応は、逆転写酵素に適した条件で行えば良い。そして、逆転写反応の後、増幅
したｃＤＮＡは、ＰＣＲを含むポリメラーゼ反応など、様々な用途に用いることができる
。実施例では、溶出工程の間に逆転写反応を行うようにした。それによって、逆転写反応
のための時間を設けることなく、全体の反応時間短縮の効果が生じる。その場合、核酸の
溶出と逆転写反応を同時に進行させるため、反応温度は、６０℃以上７０℃以下であるこ
とが好ましく、６０℃以上６５℃以下であることがより好ましく、６０℃であることが最
も好ましい。
【００３０】
溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含んでいる場合
は、逆転写反応後の反応液を、直接ＤＮＡポリメラーゼ反応に用いることができる。この
際、逆転写反応に用いたチューブをそのまま用いてもよく、新しいチューブに移しても良
いが、反応効率の点で、逆転写反応に用いたチューブをそのまま用いるのが好ましい。ま
た、ＤＮＡポリメラーゼ反応には、反応液の一部または全部を用いてもよく、一部を用い
る場合は、ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーで希釈するのが好ましい。ＤＮＡ
ポリメラーゼ用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用いても良いが、塩
濃度が適正に調節されていることが好ましく、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮ
Ａポリメラーゼ用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。
【００３１】
ＤＮＡポリメラーゼ反応は、用いるＤＮＡポリメラーゼに適した条件で行えば良い。そ
して、ＤＮＡポリメラーゼ反応の後、増幅したｃＤＮＡは、ライブラリー作製など様々な
用途に用いることができる。
【００３２】
＝＝ＲＮＡ抽出キット＝＝
本発明のＲＮＡ抽出キットは、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活
性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤を含有する中性溶解液と、有機
溶媒を含まない水または低塩濃度水溶液からなる洗浄液と、逆転写酵素、及びｄＮＴＰを
含む溶出液と、を含む。本キットによって、溶出液に、目的の遺伝子に対応する逆転写用
プライマーを添加するだけで、容易に、本発明にかかるＲＮＡ抽出及び逆転写を行うこと
ができる。
【００３３】
また、このキットは、さらにポリメラーゼを含有してもよい。これによって、溶出液に
、目的の遺伝子に対応するＤＮＡ増幅用プライマーを添加するだけで、容易に、本発明に
かかるＲＮＡ抽出、逆転写、及びＤＮＡ増幅を行うことができる。
【００３４】
なお、本キットの溶解液、洗浄液、溶出液などの構成要素は、ＲＮＡ抽出用試薬に記載
のものに準ずる。
【実施例】
【００３５】
（１）溶解工程と洗浄工程
１．５ｍＬエッペンドルフ・マイクロチューブ（Eppendorf microcentrifuge tube）に
入った血清サンプル（インフルエンザＡ型に罹患した患者から採取）１５０μＬに、３５
０μＬの溶解液（７Ｍグアニジン塩酸塩、０．１５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二水素
二水和物（ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ）、２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１５Ｍ  ２ーメル
カプトエタノール］を加えて溶解した。この溶解液に、磁性シリカ粒子（ＮＰＫ−４０１
、東洋紡績社）を２０μＬ添加し、室温で５分間、ボルテックス・ミキサー（Vortex mix
er）で撹拌した。その後、マイクロチューブを磁気スタンド（ＭＧＳ−１０１、東洋紡績
社）に設置して磁気シリカ粒子を集め、上清を除去した。  
次に、マイクロチューブを磁気スタンドから外し、３５０μＬの洗浄液Ｉ（７Ｍグアニ
ジン塩酸塩）を加えて、十分混合した後、再度磁気スタンドに設置して、上清を除去する
ことにより、磁気ビーズを洗浄した。次に、同様にして４５０μＬの洗浄液ＩＩ（５ｍＭ
トリス塩酸緩衝液）で粒子を洗浄した。
【００３６】
（２）逆転写反応溶液への溶出工程（逆転写）（サンプル１）
洗浄工程にて集めた粒子に２０μＬの溶出液Ｉを添加し、粒子を懸濁し、５分間、６０
℃に加熱した後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して、上清を回収した。この加
熱期間中に、粒子からＲＮＡが溶出されるとともに、逆転写反応も起きる。  
上清２μＬを、ＰＣＲ反応容器中の１８μＬのＰＣＲ反応液ＩＩに添加し、下記プライ
マーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、サイクルごとに輝度を測定した。
【００３７】
（３）ＰＣＲ反応液への溶出（サンプル２）
洗浄工程にて集めた粒子に２０μＬの溶出液ＩＩＩを添加し、粒子を懸濁し、５分間、
６０℃に加熱した後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して、上清を回収した。  
この上清を、そのままＰＣＲ反応容器に移し、下記プライマーを用いてリアルタイムＰ
ＣＲを行い、サイクルごとに輝度を測定した。
【００３８】
（４）水への溶出（従来法）（サンプル３）
洗浄工程にて集めた粒子に２０μＬのＤＥＰＣで処理した純水を添加し、粒子を懸濁し
、５分間、６０℃に加熱した後、マイクロチューブを磁気スタンドに設置して、上清を回
収した。  
上清２μＬを、８μＬの逆転写反応液ＩＶに添加し、５分間、５０℃に加熱して、逆転
写反応を行った。  
さらに、反応液２μＬを、ＰＣＲ反応容器中の１８μＬのＰＣＲ反応液Ｖに添加し、下
記プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、サイクルごとに輝度を測定した。
【００３９】
プライマー
Primer F：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C
Primer R：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA
プローブ
TaqMan probe: FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA
【００４０】
【表１】
2014039481.tif 000003
【００４１】
図１に示すように、サンプル１の場合の増幅曲線の立ち上がりサイクル数（Ｃｔ値）は
、サンプル３の場合の増幅曲線より、１．０サイクル早かった。サンプル２の場合のＣｔ
値は、サンプル３の場合の増幅曲線より、４．０サイクル早かった。
【００４２】
このように、本発明によるＲＮＡの抽出方法によって、従来より効率よくＲＮＡを検出
することができる。
【図１】
2014039481.tif 000004
【配列表】
2014039481000001.app