(57)【要約】【課題】多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞、特に神経系細胞に分化させることが可能な細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供する。【解決手段】表面に、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
さらに、カドヘリンファミリーに属するタンパク質、カドヘリンファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、カドヘリンファミリーに属するタンパク質と相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、表面に固定またはコーティングした請求項１記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質が、Ｅ−カドヘリンである請求項２記載の細胞培養基材。
【請求項４】
Ｅ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質と、Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質とを表面に固定またはコーティングした請求項２または３記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質が、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含み、かつＮ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質である請求項１〜４のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記Ｅ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質が、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含み、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質である請求項３〜５のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項７】
Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域と、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である請求項１〜６のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項８】
Ｅ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、Ｅ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域と、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である請求項３〜７のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項９】
表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質、および、カドヘリンファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる２種類以上を、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。
【請求項１０】
神経系細胞誘導培養用である、請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞培養基材。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞を神経系細胞へ分化させる請求項１２記載の多能性幹細胞の分化誘導方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項記載の細胞培養基材上で、分化誘導因子を含む液体培地を用いてＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を培養することを特徴とする神経系細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関し、詳しくは、多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞に分化させることの可能な細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は自己の生命を維持するため、生体の欠失した細胞・組織を速やかに補完・修復する能力を有しており、この能力を「再生能」と呼ぶ。高等動物における「再生能」の例としては、皮膚や血管等の創傷治癒が一般によく知られているが、肝臓や腎臓といった大型の実質臓器においても、組織傷害に対して速やかにその組織恒常性を回復させるべく、細胞の増殖や組織の再構築が起こることが知られている。近年、この生物個体が生来有している「再生能」を利用して、各種疾病や創傷を治癒・改善させる試みが進められており、これらは「再生医療」と呼ばれ、新しい医療技術として注目されている。
【０００３】
「再生医療」を実施するにあたり、中心的な役割を果たすのが「幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」である。一般に「幹細胞」とは、ある特定の、または複数の機能的細胞に分化する能力、及び自らと同じ細胞を繰り返し産生できる自己複製能とを有する未分化な細胞と定義することができる。各種組織・細胞には固有の幹細胞が存在し、例えば、赤血球やリンパ球、巨核球等の一連の血液細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる幹細胞から当該細胞に由来する前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）を経て産生され、骨格筋細胞は、筋衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌｓ）や筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）と呼ばれる幹細胞／前駆細胞から生じる。その他、脳や脊髄等の神経組織に存在し、神経細胞やグリア細胞を産生する神経幹細胞、表皮細胞や毛根細胞を産生する表皮幹細胞、肝細胞や胆管細胞を作る卵円形細胞（肝幹細胞）、心筋細胞を作る心幹細胞等がこれまでに特定されている。
【０００４】
幹細胞又は当該細胞に由来する前駆細胞を用いた再生医療法の一部は既に実用化されており、白血病や再生不良性貧血等、血球系細胞の不足・機能不全に起因する疾患の治療のため、造血幹細胞又は造血前駆細胞を注入移植する方法がよく知られている。ところが、脳や心臓、肝臓等の実質臓器内に存在する幹細胞の場合、生体組織からの採取及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が技術的に困難であり、しかも一般にこれらの幹細胞は増殖能が低い。一方、当該幹細胞を死体組織から回収することも可能であるが、この様にして得られた細胞を医療に用いることは、倫理的に問題がある。そのため、神経疾患や心疾患等を対象とした再生治療を実施するためには、この様な対象組織内に存在する幹細胞以外の細胞を用いて、所望する細胞種を作製する技術の開発が必要である。
【０００５】
この様な観点に基く試みとしては、まず「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」を利用する方法が挙げられる。「多能性幹細胞」とは、試験管内（以下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏと称する）培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。現在、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）が最もよく知られており、様々な研究に利用されている。
【０００６】
ＥＳ細胞は、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離できる。また、当該細胞は、マウス胎児組織に由来する初代培養の線維芽細胞（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；以下、ＭＥＦ細胞）や、ＳＴＯ細胞等の間質系細胞を用いて作製したフィーダー細胞上で、適切な細胞密度を保ち、頻繁に培養液を交換しながら継代培養を繰り返すことにより、未分化幹細胞の性質を保持したまま細胞株として樹立することが可能である。また、ＥＳ細胞の別の特徴としてテロメラーゼを有することが挙げられ、染色体のテロメア長を保持する活性を呈する当該酵素の存在により、ＥＳ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるほぼ無制限な細胞分裂能を有している。
【０００７】
この様にして作製されたＥＳ細胞株は、正常核型を維持しながらほぼ無限に増殖と継代を繰り返すと共に、様々な種類の細胞に分化する能力、すなわち、多分化能を有している。例えば、ＥＳ細胞を動物個体の皮下や腹腔内、精巣内等に移植すると、奇形腫（テラトーマ）と呼ばれる腫瘍が形成されるが、当該腫瘍は神経細胞や骨・軟骨細胞、腸管細胞、筋細胞等、様々な種類の細胞・組織が混ざり合ったものである。また、マウスの場合、ＥＳ細胞を胚盤胞期胚に注入移植したもの又は８細胞期胚と凝集させて作らせた集合胚を偽妊娠マウスの子宮内に移植することにより、体内のすべて、若しくは一部の器官・組織内に、ＥＳ細胞に由来した分化細胞をある割合で含む仔個体、いわゆるキメラマウスを作出することができる。この技術は、所望の遺伝子を人為的に破壊、若しくは改変を加えたマウス個体、いわゆるノックアウトマウスを作製するための基幹技術として頻用されている。
【０００８】
さらに、ＥＳ細胞は、試験管内培養においても、多種多様な細胞種に分化誘導できることが知られている。細胞種によりその詳細な方法は異なるが、ＥＳ細胞を浮遊培養により凝集させ、擬似胚状態の細胞塊、いわゆる胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ；以下、ＥＢと略す）を形成させることによって分化を誘導する方法が一般的に用いられる。この様な方法により、胎児期の内胚葉や外胚葉、中胚葉の性質を有した細胞や、血球細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、脂肪細胞等の分化細胞を作製することができる。この様にしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養下で作製された分化細胞は、臓器・組織中に存在する細胞と、構造的から機能的にほぼ同じ形質を有しており、実験動物を用いた移植実験により、ＥＳ細胞由来細胞が臓器・組織中に定着し、正常に機能することが示されている。
【０００９】
以上、ＥＳ細胞の特性や培養法、及びそのｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化能に関する総説として、複数の参考書籍、例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）（非特許文献１参照）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）（非特許文献２参照）等を参照することができる。
【００１０】
また、ＥＧ細胞は、始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞等のフィーダー細胞上で、白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＬＩＦと略す）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ：以下、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）若しくはフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製することができる（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１，１９９２参照；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：１２３５，１９９６参照）。ＥＧ細胞は、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有しており、分化多能性を有していることが確認されている（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＆  Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。そのため、以下、「ＥＳ細胞」と表記した場合は、「ＥＧ細胞」も含むことがある。
【００１１】
１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎらが初めて霊長類（アカゲザル）からＥＳ細胞を樹立したことにより、多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化が現実味を帯びてきた（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４，１９９５）。続いて同様の方法により、彼らはヒト初期胚からＥＳ細胞株を単離・樹立することに成功した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８）。その後、オーストラリアとシンガポールの研究グループからも同様の報告（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）がなされており、現在、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上のヒトＥＳ細胞株が登録されている。一方、Ｇｅａｒｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト始原生殖細胞からヒトＥＧ細胞株を樹立することに成功している（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８；米国特許第６，０９０，６２２号）。
【００１２】
これらの多能性幹細胞を研究材料若しくは再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞の未分化性及び高い増殖能を保持する方法で継代培養することが不可欠である。一般的にＥＳ／ＥＧ細胞は、ＭＥＦ細胞若しくはその類似細胞（ＳＴＯ細胞など）をフィーダーとして用いることにより、当該細胞の未分化性及び増殖能を維持することができる。培養液に添加する牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；以下、ＦＢＳ）の存在も重要であり、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養に適したＦＢＳを選定し、当該ＦＢＳを通常、１０〜２０％量添加することが肝要である。さらに、マウス胚に由来するＥＳ／ＥＧ細胞の場合、その未分化状態を維持する因子としてＬＩＦが同定されており（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）、培養液中にＬＩＦを添加することにより、より効果的に未分化状態を保つことができる（以上、参考書籍として、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４（非特許文献１）や、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）（非特許文献２）等を参照のこと）。
【００１３】
ところが、これらの古典的なＥＳ／ＥＧ細胞の培養法は、特にヒトＥＳ（又はＥＧ）細胞を、再生医療またはその他の実用的な目的のために使用する場合、適した方法であるとは言えない。その理由として、第一に、ヒトＥＳ細胞はＬＩＦに対する反応性を有しておらず、フィーダー細胞が存在しないと当該細胞は死滅するか又は未分化性を失って異種細胞に分化してしまう（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８）ことが挙げられる。また、フィーダー細胞の使用自体にも問題があり、この様な共培養系は生産コストを高めるとともに培養スケールの拡大を困難にし、しかもＥＳ細胞を実際に使用する際に、ＥＳ細胞をフィーダー細胞から分離・精製する必要が生じてくる。また、将来的にヒトＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を再生医療用、特に細胞移植治療用の細胞ソースとして使用する場合、ＭＥＦ細胞やＦＢＳ等、非ヒト動物に由来する細胞や製品の使用は、ＥＳ細胞が異種動物由来のウイルスに感染する可能性や、異種抗原として認識され得る抗原分子に対する汚染等が危惧され、好ましくない（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：２２８，２００５）。
【００１４】
そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養法を、より洗練され、将来的な実用化に適した方法に改良するため、ＦＢＳ代替品の開発（国際公開番号ＷＯ９８／３０６７９）や、ＭＥＦ細胞の代わりにヒト細胞をフィーダーとして用いる試み（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９３３，２００２；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：１３１，２００３；Ｈｏｖａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．１８：１４０４，２００３；Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８：２１５０，２００３）が精力的に進められている。
【００１５】
また、フィーダーを使用しない培養法の開発も目覚しい。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ及びその共同研究者らは、ＥＳ細胞をマトリゲル又はラミニンでコーティングした培養プレートに播種し、ＭＥＦ細胞の培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を培養液に添加することにより、ヒトＥＳ細胞を未分化かつ分化多能性を保有した状態で長期間培養できることを報告した（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１（非特許文献３）；国際公開番号第０１／５１６１６号（特許文献１）参照）。さらに、同グループは、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２や幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＳＣＦ）を添加した無血清培地を開発することにより、より効果的なＥＳ細胞培養系の構築に成功した（国際公開番号第０３／０２０９２０号（特許文献２）参照）。同様の無血清培地を用いた、フィーダー不要のＥＳ細胞培養系が、イスラエルの研究グループからも報告されている（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：８３７，２００４（非特許文献４）参照）。
【００１６】
また、最近では、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２と、骨形成因子（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）アンタゴニストであるノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を添加することにより、ヒトＥＳ細胞の未分化性を維持する方法も報告された（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：１８５，２００５）。一方、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ：ＧＳＫ）−３阻害剤を培養液に添加するだけで、特に成長因子等の添加をしなくても、フィーダー細胞を使わずにマウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持できることも示されている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１０：５５，２００４（非特許文献５）参照）。
【００１７】
この様に、フィーダー細胞を使用しない多能性幹細胞の培養法に関し、新しい方法が考案されつつあるが、当該細胞の実用化及び産業的な使用のためには、多能性幹細胞の増殖効果及び培養法の至便性を、より一層、高めることが必要である。
【００１８】
マウスＥＳ／ＥＧ細胞の未分化状態を維持し、かつ、その増殖能を高める因子としては、上記のＬＩＦが公知であり、ＬＩＦに類似するＩＬ−６ファミリー分子もその範疇に含まれる（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４５：１６３，１９９４；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：１２３５，１９９６参照）が、その他の例はほとんど報告されていない。最近、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２やＳＣＦを添加した無血清培地が、ヒトＥＳ細胞の増殖能を著明に亢進することが報告された（国際公開番号第０３／０２０９２０号（特許文献２）参照）。
【００１９】
従来はそもそもＥＳ細胞の特性、すなわち、当該細胞の増殖性が他の細胞と比較して旺盛であることから増殖能に係る知見を得る試みは少なく、かつ、再生医療現場のニーズから当該細胞の増殖性を高める必要性がある。
【００２０】
現状における多能性幹細胞の培養に関する課題の１つとして、当該細胞は一般に堅固なコロニーを形成するため、継代培養等の際の取り扱いが困難であることが挙げられる。未分化なＥＳ／ＥＧ細胞は、通常、細胞同士が互いに強く接着した状態を呈し、１つ１つの細胞の境界が不明瞭になるほどの細胞集塊、すなわち、コロニーを形成する。そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞の継代や、分化誘導等の実験に供する際には、トリプシン等のタンパク質分解酵素溶液で処理し、できるだけ短時間でコロニーを分散させる必要がある。しかしながら、その場合、ＥＳ／ＥＧ細胞のコロニーを分散させ、単一細胞とするためには、比較的高濃度のタンパク質分解酵素処理及び／又は激しい機械的撹拌を施す必要があり、これらの操作はＥＳ／ＥＧ細胞の生存性や生着性を著しく低下させる。
【００２１】
さらに、ＥＳ／ＥＧ細胞は、密集した状態で培養を続けると自発的に分化が進んでしまうので、継代時に単一細胞になるまで分散させること、また、コロニーが過度な大きさに成長する前に継代を行なうことが必要である。例えばマウスＥＳ細胞の場合、通常、２〜３日ごとに継代をする必要があるが、その際、適切な方法で継代を行なわないと、未分化状態を逸脱した細胞が集団中に出現して、使用に適さない細胞となってしまう。これは、単にＥＳ／ＥＧ細胞の未分化性を維持する因子、例えば、上記のＬＩＦやＧＳＫ−３阻害剤を十分量添加しただけでは解決できず、過剰なコロニーの成長は、分化形質を有した細胞の出現を誘起する。そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞がコロニーを形成しない状態で、すなわち、細胞が１つずつ分散した状態で増殖させる方法は、ＥＳ／ＥＧ細胞を産業上の利用に供する場合、きわめて有用であると考えられる。しかしながら、この様な試み及び／又は成功例は、これまで皆無であった。
【００２２】
また、近年、胚の破壊を伴わないで、皮膚や臓器の細胞から作製することのできる分化万能性細胞、いわゆる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、誘導多能性幹細胞）が作製された（特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
ｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒトにおいて樹立されている。胚の破壊という倫理面の問題を伴わないで得られることや、ヒトｉＰＳ細胞は、治療対象となる患者由来の細胞を用いて作製された後、各組織の細胞へと分化させることができるため、特に再生医学の領域において、拒絶反応のない移植材料として期待されている。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様の性質を有しており、上記したようなＥＳ細胞と同様の問題を抱えている。
【００２３】
以前、発明者らは、胚性癌腫細胞の一種であり、通常はコロニーを形成して増殖することが知られているＦ９細胞を、Ｅ−カドヘリンをコーティングした培養プレート（Ｎａｇａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）参照）に播種することにより、当該細胞のコロニーが形成されなくなることを見い出した（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２００２．０４．１４〜１６、台北、台湾；第１回日本再生医療学会、２００２．４．１８〜１９．、京都、日本）。すなわち、Ｆ９細胞の細胞接着分子として知られるＥ−カドヘリンを無処理のポリスチレン製培養プレートに固相化した培養プレート（以下、Ｅ−ｃａｄプレート）上において、Ｆ９細胞は分散型の細胞形態を呈した。
【００２４】
Ｆ９細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞の特異マーカーとして知られるアルカリ性フォスファターゼ（ＡＬｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下、ＡＬＰ）やＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−３／４等を発現する等、一部、ＥＳ細胞に似た形質を呈する（Ｌｅｈｔｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３３：１０５，１９８９，Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，３５：３８９，１９９１）。しかしながら、Ｆ９細胞の場合、フィーダー細胞やＬＩＦ等は当該細胞の未分化性を維持するために必要とはされず、その未分化維持機構には差異が認められる。また、ＥＳ細胞は三胚葉への分化能を有しているのに対し、Ｆ９細胞の分化は内胚葉系細胞に限られており、キメラ形成能も有さない。すなわち、Ｆ９細胞は、ある種の実験ではＥＳ／ＥＧ細胞のモデル系として使用される場合もあるけれども、培養法や培養条件に関しては、ＥＳ／ＥＧ細胞と異なる点が多い。
【００２５】
そのため、Ｅ−ｃａｄプレートを、フィーダー細胞を必要としないＥＳ細胞培養法に適用し得るか、また、その様な方法で培養したＥＳ細胞が未分化性及び分化多能性を保持した状態で継代培養し得るか、さらには当該ＥＳ細胞の増殖能を促進し得るか等の点に関しては、科学的根拠に基づいて予測することはできなかった。実際、Ｅ−ｃａｄプレートで培養したＦ９細胞の増殖能は、従来の細胞培養用プレートで培養したＦ９細胞とほぼ同等であり、ＥＳ細胞の増殖能を促進し得ることを類推できる事実は得られなかった。
【００２６】
Ｅ−カドヘリンは、未分化なマウスＥＳ細胞で発現していることが公知であり、また、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたＥＳ細胞では、その細胞間接着が著しく阻害されることが知られている（Ｌａｒｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：３１８５，１９９６）。しかしながら、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養法において、Ｅ−カドヘリンを接着基質として使用する試みは、これまで皆無であった。
【００２７】
上記の効率的な増殖法に加え、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を、研究材料若しくは再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞に対し、所望する外来遺伝子を効率的に細胞内に導入し、発現させるための方法の構築も必要とされる。特にＥＳ細胞を様々な疾患治療等の再生医療に応用していくためには、当該細胞の増殖能や分化能などの細胞特性、又は薬剤感受性などを変えることも１つの手段として考えられ、その実現のためには、適当な外来遺伝子を細胞内に導入し、発現させる方法が好適である。また、マウスＥＳ細胞の場合、その遺伝子を人為的に改変することにより、いわゆるトランスジェニックマウスやノックアウトマウス等の作製ができることも広く公知であり、この場合も効率的な遺伝子導入法はきわめて有用である。
【００２８】
一般的に細胞に外来遺伝子を導入する場合、リン酸カルシウムやＤＥＡＥ−デキストラン、更にはカチオン性脂質製剤等を用いる方法が頻用される。しかし、これらの方法をＥＳ細胞に適用した場合、他の細胞系と比較してその効率は低いことが知られている（Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：５３１，２００４（非特許文献８）参照）。また、外来遺伝子を導入するための方法として、各種ウイルスベクターを用いた方法も報告されている。例えば、レトロウイルス・ベクター（Ｃｈｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０：７４１９，２０００）やアデノウイルス・ベクター（Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ５：５１，２００３）、レンチウイルス・ベクター（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０７７８，２０００；Ａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１６２，２００２；国際公開番号第ＷＯ０２／１０１０５７）、センダイウイルス・ベクター（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：２０３，２００５；日本国特許公開番号第２００４−３４４００１）等が公知である。しかしながら、ウイルスベクターの構築及び作製には比較的煩雑かつ長期の作業を必要とするとともに、用いるウイルスによっては生物学的安全性の問題も懸念され、簡便かつ汎用的な方法とは言えない。
【００２９】
そのため、ＥＳ細胞に外来遺伝子を導入する場合、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法が頻用される。本法は、細胞に電気パルスをかけることにより、細胞膜に一過的に孔を開け、外来遺伝子を細胞内に導入させる方法であり、汎用性が高い。最近では、方法の改良法として、外来遺伝子を細胞核内にまで導入し、その発現効率を著しく向上させる、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎと呼ばれる方法も確立されている（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２６：１５８９，２００４；Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：５３１，２００４（非特許文献８）参照）。ただし、これらの方法は特別な電気パルス発生装置を必要とし、至適条件の設定も難しい。また、細胞をいったんトリプシン等の蛋白分解酵素で処理して単一細胞に分散させる必要もあり、細胞傷害性も比較的高い。
そのため、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の遺伝子導入法において、安価に購入できる、又は簡便に作製できる遺伝子導入剤を用い、細胞を培養器上で培養したままの状態で効率的に外来遺伝子を導入し得る方法は、きわめてその有用性が高いと考えられる。
【００３０】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、神経系の機能を有する細胞を含む分化細胞の無制限な供給源を提供することが可能であり、多くのヒトの疾病の克服のための有望な手段として代表的なものである。胚発生過程において、ニューロンは神経外胚葉前駆体から生じる。これらの外胚葉の前駆細胞の効率的な生産は、様々なサブタイプのニューロンのオンデマンド生産を可能にしうるものである。
【００３１】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から特定系統の神経系細胞を生産するために検討がなされて来た。ＥＳ細胞の神経系分化のプロトコルの多くは、分化開始に当たり、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ；  ＥＢｓ）と呼ばれるものや、球状の神経幹細胞塊といった細胞集団の形成に依存している。特定系統の神経系細胞誘導の研究は初期には有望であるように見られたが、その後の研究により、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から得られた神経細胞の集団は、様々なサブタイプの神経細胞のみならず、未分化細胞といった非神経細胞を含むことが明らかになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】国際公開２００１／５１６１６号
【特許文献２】国際公開２００１／５１６１６号
【特許文献３】国際公開２００７／０６９６６６号
【特許文献４】国際公開２００９／０５７８３１号
【特許文献５】国際公開２００９／０７５１１９号
【非特許文献】
【００３３】
【非特許文献１】Manipulating the Mouse Embryo:A laboratory manual(Hogan et al.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1994
【非特許文献２】Embryonic Stem Cells(Turksen編、HumanaPress,2002)
【非特許文献３】Xu et al.,Nature Biotech.19:971,2001
【非特許文献４】Amit et al.,Biol.Reprod.70:837,2004
【非特許文献５】Sato et al.,Nature Med.10:55,2004
【非特許文献６】Nagaoka et al.,Biotechnol.Lett.24:1857,2002
【非特許文献７】Nagaoka et al.,Protein Eng.16:243,2003
【非特許文献８】Lakshmipathy et al.,Stem Cells 22:531,2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
上記のようなＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞といった分化万能性細胞を、拒絶反応のない移植材料として用いるためには、特定の細胞に分化させる必要がある。分化万能性細胞を任意の細胞に分化させるに当たっては、分化誘導の効率はもとより、分化誘導後の細胞の均一性が求められる。即ち、分化誘導後に、目的外のものに分化した細胞や未分化の細胞など目的の細胞以外の細胞が混入していることは、移植後の癌化の危険性を避けるためにも好ましくない。
例えば、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）の形成や、フィーダー細胞の使用を含む従来の分化誘導方法では、細胞塊（ｃｅｌｌ  ｃｏｌｏｎｙ）が形成され、その中において３種すべての胚葉系統の細胞が誘導されてしまい、目的の細胞のみを高い純度で得ることができないといった問題があった。
【００３５】
そこで本発明の目的は、多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞、特に神経系細胞に分化させることが可能な細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
本発明者等は上記を鑑みて鋭意検討した結果、表面に、特定タンパク質を、固定またはコーティングした細胞培養基材とすることにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３７】
幹細胞の振る舞いの制御や、適切な神経回路の形成は、細胞外の誘導因子と細胞内シグナリングの間の複雑な相互作用に依存している。カドヘリンスーパーファミリーに属するＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンは、ＥＳ細胞の多能性、神経発生それぞれに関与する細胞外接着因子の中で最もよく研究されているものである。最近、Ｅ−カドヘリンが多能性維持、細胞の不均質性の抑制、および、ｉＰＳ細胞生成に重要な役割を果たすことが明らかにされた。さらに、Ｎ−カドヘリンは、網膜発生、体節形成および神経突起成長などの多くの発生プロセスにおいて、重要な分子シグナルを提供することにより、神経システム発生の重要な制御因子として機能している。これらのカドヘリンは、発生段階および細胞タイプに応じて、異なった態様で発現する。マウス（ｍ）ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、高いレベルでＥ−カドヘリンを発現し、これが多能性のマーカーとなりうる。一方、ｍＥＳ細胞の神経分化は、Ｅ−カドヘリンからＮ−カドヘリンへのスイッチ、Ｅ−カドヘリンリプレッサー分子のアップレギュレーション、細胞運動性の増加に関係づけられる。
【００３８】
本発明者等は、Ｎ−カドヘリンの融合タンパク質を細胞外マトリックスとして用いて、Ｐ１９胚性がん種細胞と神経幹細胞の直接分化によって、純度が高い神経細胞の集団を得た。がん種細胞を用いることを避け、分化率を上昇させるために、本発明者等は、フィーダー依存性のｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞を、神経外胚葉前駆体に誘導した。カドヘリンベースの人工細胞外基層上のｍＥＳおよびｉＰＳ細胞は、天然の基層上のものよりも優れた分化全能性を示した。未分化のｍＥＳおよびｉＰＳ細胞の均一な集団は、完全制御された培養条件下において、神経前駆体を発生させるために理想的であった。また、人工の細胞外基層として２種類のカドヘリンファミリータンパク質、最も好適にはＥ−カドヘリン−ＦｃおよびＮ−カドヘリン−Ｆｃの２つの融合タンパク質、を併用することにより、効率的な単層分化誘導が可能となることを見出した。
【００３９】
即ち、本発明は、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関する、以下の［１］〜［１４］である。
【００４０】
［１］表面に、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。
［２］さらに、カドヘリンファミリーに属するタンパク質、カドヘリンファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、カドヘリンファミリーに属するタンパク質と相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、表面に固定またはコーティングした［１］の細胞培養基材。
［３］前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質が、Ｅ−カドヘリンである［２］の細胞培養基材。
［４］Ｅ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質と、Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質とを表面に固定またはコーティングした［２］または［３］の細胞培養基材。
［５］前記Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質が、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含み、かつＮ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質である［１］〜［４］のいずれかの細胞培養基材。
［６］前記Ｅ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質が、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含み、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質である［３］〜［５］のいずれかの細胞培養基材。
［７］Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域と、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である［１］〜［６］のいずれかの細胞培養基材。
［８］Ｅ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質が、Ｅ−カドヘリンまたはＥ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域と、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である［３］〜［７］のいずれかの細胞培養基材。
［９］表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質、および、カドヘリンファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる２種類以上を、固定またはコーティングしたことを特徴とする細胞培養基材。
［１０］神経系細胞誘導培養用である、［１］〜［９］のいずれかの細胞培養基材。
［１１］［１］〜［９］のいずれかの細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
［１２］［１］〜［９］のいずれかの細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。
［１３］多能性幹細胞を神経系細胞へ分化させる［１２］の多能性幹細胞の分化誘導方法。
［１４］［１］〜［９］のいずれかの細胞培養基材上で、分化誘導因子を含む液体培地を用いてＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を培養することを特徴とする神経系細胞の製造方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明により、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞、特に神経系細胞、に分化させることが可能であり、分化後の細胞の選抜にも用いることができる細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することが可能となる。
また、本発明の細胞培養基材上で多能性幹細胞を培養すると、細胞凝集の発生が抑制され、単一細胞の分散を維持させながら培養することができる。これにより、形態観察による分化ステージの把握が容易となる。さらに、本発明により、分化誘導過程において、未分化のまま維持される細胞の発生を抑制し、細胞集団の均質性を維持しながら分化誘導培養することが可能となり、所望の細胞を純度が高い状態で提供しうることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】カドヘリンベースの人工的細胞外基層（ＥＣＭ）のマウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞への影響（Ａ）ｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞の異なる細胞外基層上での培養による、細胞形態とコロニー形成の様子を表す写真図である。０．０１８％タイプＩコラーゲン（左上）上のフィーダー依存性のＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、球形のコロニーを形成した。５μｇ／ｍｌフィブロネクチン（左下）、０．１％ゼラチン（右上）上のＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、分化細胞のように広がった。１０μｇ／ｍｌＥ−カドヘリン基層（左下）上の細胞は、単一細胞に分散した。（Ｂ）Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層へのＥＳ細胞の接着はインテグリン非依存性であった。ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層それぞれに播種された細胞を１５％ＫＳＲ、１５％ＦＢＳ存在下で１６時間培養した。ｍＥＳ細胞の総ＦＡＫ（ｔＦＡＫ）およびリン酸化ＦＡＫ（ｐＦＡＫ）を、モノクローナル抗ＦＡＫ抗体、モノクローナル抗ｐＦＡＫ抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した。（Ｃ）ＦＢＳ非存在下におけるｍｉＰＳ細胞の接着。１５％ＫＳＲ含有未分化培地を用いてＥ−ｃａｄ−Ｆｃ基層上で６時間培養したｉＰＳ細胞は、タイプＩコラーゲン基層上で培養したｉＰＳ細胞よりも接着率が高かった。（Ｄ）種々の培地で４日間培養したｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡写真。細胞はアルカリフォスファターゼ活性を調べるために染色された。上４枚がｍＥＳ細胞、下４枚がｍｉＰＳ細胞である。それぞれ、左上：ゼラチン基層、左下：タイプＩコラーゲン基層、右上：フィブロネクチン、右下：Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層、である。（Ｅ）４種の基層上で４日間培養したｍｉＰＳ細胞のＮａｎｏｇタンパク質発現フローサイトメトリープロファイルである。（Ｆ）ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層上で２日間培養したｍＥＳ細胞（i〜iv）、ｍｉＰＳ細胞（v〜viii）のＳＳＥＡ１タンパク質発現の免疫染色の結果を表す蛍光顕微鏡写真図である。（Ｇ）自発的分化をしたフィーダー非依存性ｍＥＳ細胞（ＥＢ３）と、フィーダー依存性ｉＰＳ細胞の、多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４）、外胚葉マーカー（Ｓｏｘ１）、内胚葉系中胚葉マーカー（Ｇｓｃ、Ｂｒａ）、内胚葉マーカー（Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、Ｇａｔａ６）、中胚葉マーカー（Ｇａｔａ１）の発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果である。
【００４３】
【図２】（Ａ）未分化細胞表層のＥ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンタンパク質の発現パターンを表す、蛍光顕微鏡写真図である。ｍＥＳ細胞（i〜iv）、ｍｉＰＳ細胞（v〜viii）を２日間、ＬＩＦ存在下で培養し、免疫染色により、Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンタンパク質の発現を調べた。Ｐ１９細胞はコントロールとして用いた（下４枚）。バーは、５０μｍを表す。（Ｂ）ウェスタンブロットの結果を表す写真図である。液滴法で４または１０日間分化誘導をおこなったｍＥＳ細胞の総Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの発現を調べた。左端のレーンはコントロールとして用いたｍＥＳ細胞のレーンである。
【００４４】
【図３】ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の融合タンパク質固定化基層への吸着、形態を調べた。（Ａ）ポリスチレン表面への、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＮ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化をＥＬＩＳＡにより調べた結果を表すグラフ図である。（Ｂ）ｍＥＳ細胞の種々の細胞外基層への吸着を示すグラフ図である。左からポリスチレンのみ、０．０１８％タイプＩコラーゲンによってコートされた基層、０．１％ゼラチンによってコートされた基層、１０μｇ／ｍｌＥ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた基層、５μｇ／ｍｌＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた基層、１０μｇ／ｍｌＮ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた基層の順である。（Ｃ）ｍｉＰＳ細胞の種々の細胞外基層への吸着を示すグラフ図である。（Ｂ）と同様の順である。ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞は、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層に対して同様の吸着性を示した（〜８５％）。（Ｄ）ゼラチン基層、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ基層上で培養したＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の形態観察の結果を表す顕微鏡写真図である。Ｐ１９細胞はコントロールとして用いた（上３枚）。バーは５０μｍを表す。
【００４５】
【図４】未分化状態のｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞へのＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層の影響。免疫染色の結果を表す顕微鏡写真図である。ＬＩＦ存在下、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で２日間培養されたｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞には、未分化細胞マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｅ−カドヘリン）の存在し、神経前駆細胞マーカー（Ｎ−カドヘリンおよびネスチン）が存在しないことが示された。
【００４６】
【図５】Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で、均質な培養条件の下、ｍＥＳ細胞とｍｉＰＳ細胞の神経分化を誘導しうることが示された。（Ａ）ｍＥＳ細胞とｍｉＰＳ細胞の神経細胞への分化の手順を示す模式図である。（Ｂ）種々の基層上で培養されたｍＥＳ細胞の増殖を示すグラフ図である。ｍＥＳ細胞を、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチンまたはＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた２４ウェルのディッシュに１×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。各ウェルは、Ｄｋｋ−１およびＬｅｆｔｙ−Ａが添加された神経分化培地が含まれていた。（Ｃ）種々の基層上で培養されたｍｉＰＳ細胞の増殖を示すグラフ図である。ｍｉＰＳ細胞を、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチンまたはＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた２４ウェルのディッシュに１×１０４細胞／ウェルとなるように播種した。各ウェルは、Ｄｋｋ−１およびＬｅｆｔｙ−Ａが添加された神経分化培地を含む。（Ｄ）０．１％ゼラチン基層または１０μｇ／ｍｌＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基礎上で培養されたｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の形態変化を示す明視野顕微鏡写真図である。Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基礎上で培養された細胞では、放射状グリア細胞様への顕著な形態変化が分化誘導培養開始後４日以内に観察された。分化誘導培養開始後１０日以内には、神経突起の成長が観察された。ゼラチン基層上で培養された細胞では、細胞集団が形成され、神経突起成長を示す細胞を含む不均一な集団となった。バーは５０μｍを示す。（Ｅ）分化誘導培養２日後の細胞について、Ｎａｎｏｇ、ＢＬＢＰ、Ｎ−ｃａｄ、Ｓｏｘ２、Ｎｇｎ１マーカーを用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフ図である。未分化ｍＥＳ細胞から得たｍＲＮＡをコントロールとして用いた。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを用いてノーマライズした。グラフは、各細胞について、左から、Ｎａｎｏｇ、ＢＬＢＰ、Ｎ−カドヘリン、Ｓｏｘ２、Ｎｇｎ１の順である。
【００４７】
【図６】免疫細胞化学分析および転写因子の遺伝子発現解析による、原始神経幹細胞への分化の確認である。（Ａ）Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上またはゼラチン基層上で培養されたｍＥＳ細胞の免疫蛍光染色の結果を表す蛍光顕微鏡写真図である。分化誘導開始後４日目のｍＥＳ細胞はＮ−カドヘリンの発現量が少なく、ネスチンをわずかに発現していた。また、βＩＩＩ−チューブリンは全く発現が見られなかった。（Ｂ）Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上またはゼラチン基層上で培養されたｍｉＰＳ細胞の免疫蛍光染色の結果を表す蛍光顕微鏡写真図である。分化誘導開始後４日目のｍｉＰＳ細胞は、多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）の発現量が減少し、Ｎ−カドヘリンの発現量が少なかった。また、わずかにネスチンを発現していた。（Ｃ）分化誘導開始後４日目の細胞について、ＢＬＢＰ、Ｎ−ｃａｄ、Ｓｏｘ２、Ｎｇｎ１、Ｐａｘ６マーカーを用いた半定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を表すグラフ図である。自発的分化したＥＳ細胞をコントロールとして用いた（ＥＢ）。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを用いてノーマライズした。グラフは、各細胞について、左から、ＢＬＢＰ、Ｎ−ｃａｄ、Ｓｏｘ２、Ｎｇｎ１、Ｐａｘ６の順である。
【００４８】
【図７】ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の神経前駆細胞への分化を調べた。（Ａ）分化誘導開始後６日目のｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞についてＢＬＢＰ、Ｎ−ｃａｄ、Ｓｏｘ２、Ｎｇｎ１の発現量を調べたＲＴ−ＰＣＲの結果を表すグラフ図である。蛍光強度は、ＩｍｇａｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて定量化した。自発的分化したＥＳ細胞をコントロールとして用いた（ＥＢ）。（Ｂ）ゼラチン基層またはＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で培養したｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞のネスチン（神経前駆細胞マーカー）発現量を調べたＲＴ−ＰＣＲの結果を表す写真図である。ｄ２は培養開始２日目、ｄ４は４日目、ｄ６は６日目をそれぞれ表す。（Ｃ）上記（Ｂ）のｍＥＳ細胞の結果について、各バンドの蛍光強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いて定量化したものを表すグラフ図である。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを用いてノーマライズした。（Ｄ）上記（Ｂ）のｍｉＰＳ細胞の結果について、各バンドの蛍光強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔを用いて定量化したものを表すグラフ図である。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを用いてノーマライズした。（Ｅ）ゼラチン基層またはＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で６日間分化誘導培養したｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の免疫蛍光染色の結果を表す蛍光顕微鏡写真図である。Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で６日間分化誘導培養したｍＥＳ細胞（i〜vi）、ｍｉＰＳ細胞（vii〜xii）は、ゼラチン基層上で培養したものよりも、Ｎ−カドヘリンおよびネスチンの発現量が高かった。また、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で培養したｍＥＳ細胞はβＩＩＩ−チューブリン（v、vi）の発現量が多かった。Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で培養したｍｉＰＳ細胞（xi、xii）は、Ｎａｎｏｇ発現が見られなかった。一方、ゼラチン基層上で培養したｍｉＰＳ細胞（xvii、xviii）は、コロニー中の一部の細胞が分化せず、多能性マーカーであるＮａｎｏｇを発現していた。バーは５０μｍを表す。
【００４９】
【図８】細胞が凝集した不均質な細胞集団では、Ｎａｎｏｇ発現の消失が同期しなかった。２つの培養条件（低細胞密度、高細胞密度）を、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ基層を用いた培養に適用した。高密度条件下（３５ｍｍ培養皿に２×１０４細胞を播種した）のｍｉＰＳ細胞は凝集を形成し、幾つかの凝集細胞（図中、Ｒｅｇｉｏｎ１とＲｅｇｉｏｎ２）は分化誘導開始後６日後でも分化せずにＮａｎｏｇ発現を保持していた（i〜iv）。低密度条件下（６０ｍｍ培養皿に５×１０３細胞を播種した）は、均質な細胞集団を構成し、分化誘導開始後６日後Ｎａｎｏｇ発現が消失していた（v、vi）。バーは５０μｍを表す。
【００５０】
【図９】神経前駆細胞の、βＩＩＩ−チューブリン発現神経細胞への分化。分化誘導開始後１２日目にｍＥＳ細胞由来神経細胞およびｍｉＰＳ細胞由来神経細胞について、βＩＩＩ−チューブリン染色を行った。２つの異なる培養条件（低密度、高密度）を採用した。（Ａ）Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層、高密度条件下（３５ｍｍ培養皿に２×１０４細胞を播種した）でのｍＥＳ細胞は、基層を全て覆うような神経突起成長が見られ、コンフルーエントな増殖をした。ゼラチン基層、高密度条件下（３５ｍｍ培養皿に２×１０４細胞を播種した）でのｍＥＳ細胞は、細胞凝集から伸張した神経突起が形成された。バーは２００μｍを表す。（Ｂ）低密度条件下（６０ｍｍ培養皿に、５×１０３細胞を播種した。）、ゼラチン基層、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層で培養したｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞はβＩＩＩ−チューブリンを発現した。（Ｃ）Ｐａｘ２、ＭＡＰ２、ＴＨ、ＧＦＡＰの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を表す写真図である。分化誘導開始後８日目（ｄａｙ８）、１０日目（ｄａｙ１０）の、ゼラチン基層上で培養したｍＥＳ細胞、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で培養したｍＥＳ細胞、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で培養したｍｉＰＳ細胞、についてＲＴ−ＰＣＲを行った。コントロールとして、未分化のｍＥＳ細胞（ＵＤ）、自然分化したＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ  ｄ１２）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
［定義］
本明細書中に使用するとき、用語「多能性幹細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞をいう。「多能性幹細胞」は、初期胚より単離されるＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離されるＥＧ細胞を含むが、これに限定されない。本明細書中、「ＥＳ細胞」と表記した場合は「ＥＧ細胞」も含むこともある。
【００５２】
本明細書中に使用するとき、用語「未分化性」とは、多能性幹細胞において、少なくとも１つ以上の未分化マーカー、例えばＡＬＰ活性やＯｃｔ−３／４遺伝子（産物）の発現、または種々の抗原分子の発現により確認することができる未分化な状態を呈する性質を意味する。多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。
【００５３】
本明細書中に使用するとき、用語「分化多能性」とは、様々な種類の細胞に分化する能力をいう。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。
【００５４】
本明細書中に使用するとき、用語「液体培地」とは、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができる液体培地をすべて含む。
【００５５】
本発明の培養基材としては、培養皿（ディッシュ）、９６穴、４８穴などのマイクロプレート、プレートやフラスコ等、従来から細胞培養に用いられているもののいずれをも使用できる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料、またはポリスチレンやポリプロピレン等の有機材料のいずれかからなることができるが、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるものが好ましい。
【００５６】
Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリンを含むカドヘリンファミリーに属するタンパク質を、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、カドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間〜一昼夜、より好ましくは１時間〜１２時間、接触させることで達成できる。また、前もって接着性分子に人為的に抗原性分子を付加・融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。なお、タンパク質を培養基材の固相表面に固定又はコーティングしたものを指して、基層、マトリックス、細胞外基層（ＥＣＭ）と称することがある。
【００５７】
上述の様に作製した培養基材は、多能性幹細胞の通常の培養法にそのまま使用することができる。すなわち、適当数の多能性幹細胞を、通常用いられる液体培地又は細胞培養液に懸濁し、それを当該培養基材上に播種ないし添加すればよい。その後の液体培地の交換や継代も、従来法と同様に行なうことができる。
【００５８】
本明細書中に使用するとき、用語「同種親和性の結合」とは、細胞接着において、細胞−細胞又は細胞−基材間の接着性分子を介した結合において、同じ種類の接着性分子同士が結合又は会合することによりなされているものを意味する。
【００５９】
本明細書中に使用するとき、用語「フィーダー細胞」とは、支持細胞とも称され、単独では生存・培養できない細胞を培養する際に、あらかじめ培養され、培地中に不足する栄養分や増殖因子の補給などの役割を担う別の細胞をいう。「フィーダー細胞」には、ＭＥＦ細胞や、ＳＴＯ細胞等の間質系細胞を含むが、これに限定されない。
【００６０】
本明細書中に使用するとき、用語「分散状態」とは、細胞が培養基材表面に接着した状態で生育している場合において、明確なコロニーを形成せず、個々の細胞が他の細胞と接触していない、または、一部接触していても、その接触領域がごく小さい状態を意味する。
【００６１】
本明細書中に使用するとき、用語「遺伝子」とは遺伝物質を指し、転写単位を含む核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、天然由来又は人為的に設計された配列であり得る。また、遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムやｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ／ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等の機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。
【００６２】
本発明の上記効果や他の利点および特徴を、以下の好適な実施態様の詳細な説明において詳述する。
【００６３】
［細胞培養基材］
本発明の細胞培養基材は、表面に、Ｎ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、Ｎ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種以上を、固定またはコーティングしたことを特徴とするものである。
また、本発明の細胞培養基材は、さらに、上記のＮ−カドヘリン以外のカドヘリンファミリーに属するタンパク質、カドヘリンファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、カドヘリンファミリーに属するタンパク質と相同性を有するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる１種類以上を、表面に固定またはコーティングしたものであることが好ましい。
上記Ｎ−カドヘリン以外のカドヘリンファミリーに属するタンパク質としては、Ｅ−カドヘリンが好ましい。
【００６４】
カドヘリンとは、接着結合又はアドヘレンス・ジャンクション（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれるＣａ２＋依存性の細胞間接着・結合に関与する接着分子であり、Ｅ（上皮）型、Ｎ（神経）型、Ｐ（胎盤）型の３種が例として知られている。これらのカドヘリン分子は、７００〜７５０アミノ酸残基からなる膜結合型糖タンパク分子であり、その細胞外領域には、約１１０アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣ）ドメインと呼ばれる領域が５個存在する。例えば、ヒトＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号１に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５７〜２６２、２６５〜３７５、３７８〜４８６、４８７〜５９５、５９６〜７００に相当する（数値は配列番号１に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。また、マウスＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号２に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５９〜２６４、２６７〜３７７、３８０〜４８８、４８９〜５９７、５９８〜７０２に相当する（数値は配列番号２に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。これらのＥＣドメインは、異なるカドヘリン分子種の間で相同性を有しており、特にＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２）の相同性が高い。この様な類似の構造を呈するカドヘリン分子としては、現在、５０種類以上のものが知られており、これらの分子を総称してカドヘリン・ファミリーと呼ぶ。以上、カドヘリンに関する総説としては、Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：６１９，１９９５；Ｍａｒｒｓ  ＆  Ｎｅｌｓｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５：１５９，１９９６；Ｙａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：１１９，１９９７；Ｙａｇｉ  ＆  Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１１６９，２０００；Ｇｕｍｂｉｎｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４８：３９９，２０００、等を参照のこと。
【００６５】
Ｎ−カドヘリンは、カルシウム依存性細胞接着分子に属する  １４０ｋＤ程度のタンパク質である。Ｎ−カドヘリンは同種のカドヘリンの相互作用およびカテニンを介したアクチン細胞骨格との結合により細胞接着において重要な役割を担っており、発生分化段階に関与している。Ｎ−カドヘリンは神経、心筋、骨格筋、血管内皮など様々な組織に発現する。Ｎ−カドヘリンは、網膜発生、体節形成および神経突起成長などの多くの発生プロセスにおいて、重要な分子シグナルを提供することにより、神経システム発生の重要な制御因子として機能していることが報告されている（Ｍｉｙａｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４５；６３１−５、Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００８：６５；３８０９−２１）。
【００６６】
Ｅ−カドヘリン（別名、カドヘリン−１）は、肝臓や腎臓、肺等の内臓臓器の実質細胞やケラチノサイト等の上皮細胞に広く発現し、その細胞間接着を担う重要な接着分子であることが知られている（総説として、Ｍａｒｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：２２７，１９９３；Ｍａｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６０：７６３，１９９５；Ｅｌ−Ｂａｈｒａｗｙ  ＆  Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．４３：２２４，１９９８；Ｎｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：７７，１９９９）。また、Ｅ−カドヘリンは、未分化なマウスＥＳ細胞にも強く発現しており、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたＥＳ細胞は、細胞間接着が著しく阻害されることが知られている（Ｌａｒｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：３１８５，１９９６）。また、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の公的な遺伝子発現データベースに登録されている情報から、Ｅ−カドヘリン遺伝子がヒトＥＳ細胞株でも発現していることが確認できる。
【００６７】
カドヘリンファミリーに属するタンパク質を作製する方法としては、特にこれを限定しないが、分子生物学的手法を用いてリコンビナント・タンパク質を作製・精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、多能性幹細胞のカドヘリンファミリーに属するタンパク質を、生体組織・細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。
【００６８】
カドヘリンファミリーに属するタンパク質に関し、そのリコンビナント・タンパク質を作製するための方法、及び当該分子をコードする遺伝子を取得する方法は、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、上記で挙げた参考書籍を参照することができるが、特にこれを限定しない。Ｅ−カドヘリンを例とした場合、Ｅ−カドヘリン遺伝子は、既にヒト、マウス、ラット等の動物で単離・同定され、その塩基配列が、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能である（アクセス番号：（ヒト）ＮＭ＿００４３６０；（マウス）ＮＭ＿００９８６４；（ラット）ＮＭ＿０３１３３４）。そのため、当業者であれば、Ｅ−カドヘリン遺伝子に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。また、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡは、理化学研究所ジーンバンク（日本・筑波）やＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ＲｅｓＧｅｎ等からも購入することができる。使用するカドヘリンファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子としては、多能性幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましく、例えば、マウスＥＳ細胞を用いて本発明を実施する場合、マウスのＥ−カドヘリンｃＤＮＡの使用が望ましい。しかし、異種動物由来のもの、即ち、ヒトやサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、又は鳥類（例えば、ニワトリ等）、又は両生類（例えば、アフリカツメガエル等）由来のＥ−カドヘリンｃＤＮＡも使用することができる。Ｎ−カドヘリン（ＮＣＢＩアクセス番号：ヒトＮＭ＿００１７９２、マウスＮＭ＿Ｍ３１１３１、Ｍ２２５５６等）など、他のカドヘリンについても同様である。
【００６９】
カドヘリンファミリーに属するタンパク質のリコンビナント・タンパク質を作製するための好適な方法の一例は、当該分子をコードする遺伝子を、ＣＯＳ細胞や２９３細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞に導入し、発現させることを特徴としている。好ましくは、当該遺伝子は、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。また、転写・発現させる遺伝子は、さらにポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、ＳＶ（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０ウイルスやサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ  Ｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。
【００７０】
上記のリコンビナント・タンパク質を作製するために用いる遺伝子は、当該分子をコードする遺伝子の全長領域を含むものである必要はなく、部分的な遺伝子配列であっても、その部分配列がコードするタンパク質またはペプチド分子が、本来の当該分子と同程度、又はそれ以上の接着活性を有するものであればよい。例えば、本発明の好適な事例に用いられるＥ−カドヘリンの場合、細胞外領域をコードする、Ｎ末端側から６９０〜７１０アミノ酸残基を含む部分配列から作製されるリコンビナント・タンパク質、すなわちＥＣ１〜ＥＣ５ドメインを含むタンパク質を使用することができる。また、一般的にカドヘリン分子は、最もＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１）が、当該分子の結合特異性、すなわち、同種親和性を規定している（Ｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６１：１４７，１９９０）ため、少なくともＥＣ１を含み、それ以外のドメインの１個又は数個を除いたタンパク質分子を作製、使用することも可能である。さらには、上記のタンパク質分子と、アミノ酸レベルで８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を示し、かつ、接着活性を有するタンパク質も使用することができる。
【００７１】
また、上記のリコンビナント・タンパク質は、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質として作製することも可能である。例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域やＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タンパク質、ＭＢＰ（Ｍａｎｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、アビジン・タンパク質、Ｈｉｓ（オリゴ・ヒスチジン）タグ、ＨＡ（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）タグ等との融合タンパク質として作製し、プロテインＡ／Ｇカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、リコンビナント・タンパク質の精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にＦｃ融合タンパク質は、ポリスチレン等を材料とした培養基材に吸着する能力が高まるため、本発明の実施において好適である。
【００７２】
イムノグロブリンのＦｃ領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離・同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む塩基配列の配列情報は、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号：ＡＪ２９４７３０、ＡＪ２９４７３１、ＡＪ２９４７３２、及びＡＪ２９４７３３として登録されている。したがって、当業者であれば、Ｆｃ領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｆｃ領域部分をコードするｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。この場合、使用するＦｃ領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインＡ／Ｇとの結合性が強いヒトＩｇＧ１やＩｇＧ２、又はマウスＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等のＦｃ領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Ｆｃ領域に変異を導入することによりプロテインＡとの結合性を高める方法も知られており（Ｎａｇａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）、当該法により遺伝子改変を加えたＦｃタンパク質も使用することもできる。
【００７３】
なお、本発明を実施するための好適に用いられるＥ−カドヘリンの場合、当該リコンビナント・タンパク質の作製法の一例として、発明者らの既報告論文を挙げることができる（Ｎａｇａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）。
【００７４】
また、マウス又はヒトのＥ−カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、ヒトＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列及びＨｉｓタグ配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ  Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ社）が市販されており、マウス又はヒト由来のＥ−カドヘリン・タンパク質として使用することもできる（Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質）。
Ｎ−カドヘリンなど、他のカドヘリンについてもＥ−カドヘリンと同様にして融合タンパク質を作製することができる。
【００７５】
細胞培養用の培養基材としては、例えば、ディッシュ（培養皿とも称する）、シャーレやプレート（６穴、２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴、９６００穴などのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート等）、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピンナーフラスコ、フォロファイバー、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、蛋白質やペプチド等に対する吸着性が高いポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の材料や、又は吸着性を高める処理、例えば親水処理や疎水処理等を施した材料の使用が好適である。また、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。そのための好適な器材の一例としては、主に大腸菌等の培養に頻用される、細胞培養用の処理を特にしていないポリスチレン製ディッシュ及び／又はプレート（以下、無処理ポリスチレン製プレートと称する）を挙げることができ、当該培養基材は一般に市販されている。
【００７６】
本発明で開示される方法の実施において、Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質、Ｎ−カドヘリンまたはＮ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質の全部または一部を含む融合タンパク質を、上記の培養基材固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。接着性分子がタンパク質性やペプチド性の分子、又は糖鎖を含む高分子化合物等である場合、プレート等の培養基材固相表面に当該分子の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去することにより、簡便に当該分子を吸着させることができる。さらに具体的には、例えば、蒸留水やＰＢＳ等を溶媒とする接着性分子の溶液を、ろ過、滅菌した後、プレート等の培養基材に接触させ、数時間から一昼夜放置するだけで、当該接着性分子が固定又はコーティングされた細胞培養用基材が得られる。好ましくは、蒸留水やＰＢＳ等で数回洗浄し、ＰＢＳ等の平衡塩溶液等で置換してから使用する。Ｎ−カドヘリン以外のカドヘリン、融合タンパク質についても同様にして固定またはコーティングすることができる。
【００７７】
また、接着性分子に前もって人為的に抗原性分子が付加・融合させている場合は、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもでき、接着性分子を効率的に基材表面に修飾することができるため、より好ましい。この場合、特異抗体を前もって培養基材表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって固定又はコーティングしておく必要がある。例えば、接着性分子にＩｇＧのＦｃ領域タンパク質を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、培養基材に前もって修飾しておく抗体としては、ＩｇＧのＦｃ領域を特異的に認識するものを使用することができる。接着性分子に各種タンパク質やタグ配列ペプチドを融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、融合させた分子に特異的な抗体を、培養基材に前もって修飾することにより、使用することができる。
【００７８】
本発明の実施において、カドヘリンファミリーに属するタンパク質、および、カドヘリンファミリーに属するタンパク質の全部または一部の領域を含む融合タンパク質からなる群から選ばれる２種類以上を組み合わせて用いてもよい。その場合、各々のタンパク質の溶液を混合し、その混合溶液を上述の方法に基き、修飾すればよい。
【００７９】
上記のカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質溶液の濃度は、当該タンパク質の吸着量及び／又は親和性、さらには当該タンパク質の物理学的性質によって適宜、検討する必要があるが、Ｅ−カドヘリンやＮ−カドヘリンの細胞外領域にＦｃ領域を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ程度までの濃度範囲とし、好ましくは、０．１〜２００μｇ／ｍＬ程度、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは３〜２０μｇ／ｍＬである。
【００８０】
本発明の細胞培養基材は、後述するように、種々の多能性幹細胞の未分化性を維持したままの培養や、分化誘導因子を加えて、多能性幹細胞を分化させる培養や、多能性幹細胞を分化させた細胞群から、所望の細胞を選抜、濃縮する培養方法に好適に用いることができる。
【００８１】
［細胞培養方法］
本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とするものである。
【００８２】
本発明の実施において、分子生物学や組換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＆  Ｓｔｒｉｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００３）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第３版（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ａｎｔｉｂｏｉｄｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．＆  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７）等を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＳｉｇｍａ社やＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社等の市販業者から入手可能である。
【００８３】
また、多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生・細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。
【００８４】
マウス及びヒトの多能性幹細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することにより、これらの多能性幹細胞を使用し得る。また、その他の動物種に関しても、例えばサル（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４，１９９６）やラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８，１９９４；Ｌｏｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開番号第９９／２７０７６号）、ニワトリ（Ｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２３３９，１９９６；米国特許第５，３４０，７４０号；米国特許第５，６５６，４７９号）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５６３，１９９４；Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１０８９，１９９７）等に関してＥＳ細胞又はＥＳ細胞様細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従って、本発明に用いられるＥＳ細胞を作製することができる。
【００８５】
ＥＳ細胞とは、胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。マウス由来ＥＳ細胞としては、Ｅ１４、Ｄ３、ＣＣＥ、Ｒ１、Ｊ１、ＥＢ３等、様々なものが知られており、一部はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社やＣｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社等から購入することも可能である。ヒト由来ＥＳ細胞は、現在、全世界で５０種以上が樹立されており、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上の株が登録されている。その一部はＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社やＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから購入することが可能である。
【００８６】
ＥＳ細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもＥＳ細胞を作製することが可能である（Ｍｕｎｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：９８９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：７４０，２００１；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１６６９，２００４）。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞（ｃｙｔｏｐｌａｓｔｓやｏｏｐｌａｓｔｏｉｄｓと称される）に、所望する動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にＥＳ細胞を作製する方法も考案されている（国際公開番号第９９／４５１００号；第０１／４６４０１号；０１／９６５３２号；米国特許公開第０２／９０７２２号；０２／１９４６３７号）。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからＥＳ細胞を作製する試み（米国特許公開第０２／１６８７６３号；Ｖｒａｎａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１９１１−６）や、ＥＳ細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したＥＳ細胞を作る方法も報告されている（国際公開番号第００／４９１３７号；Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１５５３，２００１）。本発明で使用されるＥＳ細胞は、この様な方法により作製されたＥＳ細胞又はＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。
【００８７】
ＥＧ細胞は、始原生殖細胞と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞、Ｓｌ／Ｓｌ４−ｍ２２０細胞等のフィーダー上で、ＬＩＦ及びｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、又はフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製されたものであり（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１，１９９２；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：１２３５，１９９６）、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有している（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＆  Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。ＥＳ細胞の場合と同様、ＥＧ細胞と体細胞を融合させて作製したＥＧ細胞（Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６５１０，１９９７；Ａｎｄｒｅｗら）やＥＧ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも、本発明の方法に使用することができる。
【００８８】
ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。上記特許文献３，４，５に記載された方法により作製することができる。また、ｉＰＳ細胞は、上記特許文献記載の方法以外にも多数の変法による作製方法が知られている。国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。この他に、上記初期化因子の一つないし複数を使用せずに、他の因子を用いたり、初期化因子に変えて、または、加えて、別の物質や遺伝子を使用する方法が知られているが、ｉＰＳ細胞の定義に入るものであればいずれの方法により作製されたものであっても使用することができる。
【００８９】
本発明で用いるｉＰＳ細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。体細胞は、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。
【００９０】
また、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞やＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞のみに限らず、哺乳動物の胚や胎児、臍帯血、又は成体臓器や骨髄等の成体組織、血液等に由来する、ＥＳ／ＥＧ細胞に類似した形質を有するすべての多能性幹細胞が含まれる。例えば生殖細胞を特殊な培養条件下で培養することにより得られるＥＳ様細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞ときわめて良く似た形質を呈しており（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１９：１００１，２００４）、多能性幹細胞として使用することができる。その他の例としては、骨髄細胞から単離され、三胚葉すべての系譜の細胞に分化能を有する多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ／ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰＣ）を挙げることができる。また、毛根鞘細胞やケラチノサイト（国際公開番号第０２／５１９８０号）、腸管上皮細胞（国際公開番号第０２／５７４３０号）、内耳細胞（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：１２９３，２００３）等を特別な培養条件下で培養することにより得られた多能性幹細胞や、血液中の単核球細胞（又はその細胞核分に含まれる幹細胞）をＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）＋ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）処理（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：２４２６，２００３）、又はＣＲ３／４３抗体処理（Ａｂｕｌｊａｄａｙｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  １９：３５５，２００３）することにより作製される多能性幹細胞等に関しても、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質を有する幹細胞であればすべて含まれる。この場合、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質とは、当該細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や当該細胞特異的な遺伝子の発現、さらにはテラトーマ形成能やキメラマウス形成能といった、ＥＳ／ＥＧ細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
【００９１】
本発明の実施において、多能性幹細胞は、上記本発明の細胞培養基材に播種される。多能性幹細胞の培養方法や培養条件は、当該培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件は、上記の参考書籍、すなわち、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）や、参考文献（Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎら、米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することができるが、特にこれらに限定されない。
【００９２】
多能性幹細胞を培養するための液体培地としては、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができるものであれば、すべて使用可能である。その具体例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられ、通常、２ｍＭ程度のグルタミン及び／又は１００μＭ程度の２−メルカプトエタノールを添加して使用する。また、ＥＳ細胞培養用培地として市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）や、ＥＳ  ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴＸ−ＷＥＳ（Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社）等も用いることができる。これらの培地にはＦＢＳを５〜２５％程度添加することが好ましいが、無血清培養することも可能で、例えば、１５〜２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を代用することができる。また、ＭＥＦ細胞の培養上清やｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、ＳＣＦ等を添加した培地を使用してもよく、その詳細な方法は公知である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１；国際公開番号第０１／５１６１６号；国際公開番号第０３／０２０９２０号；Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７，２００４）。
【００９３】
上記の多能性幹細胞を培養するための液体培地には、多能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有する物質・因子を添加することが望ましい。具体的な物質・因子としては、特にこれを限定しないが、マウスＥＳ／ＥＧ細胞の場合、ＬＩＦが好適である。ＬＩＦは既報告論文（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）や、ＮＣＢＩの公的なＤＮＡデータベースにアクセス番号Ｘ１３９６７（ヒトＬＩＦ）、Ｘ０６３８１（マウスＬＩＦ）、ＮＭ＿０２２１９６（ラットＬＩＦ）等で公知のタンパク質性因子であり、そのリコンビナント・タンパク質は、例えばＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）の商品名で購入することができる。また、ＧＳＫ−３阻害剤を培養液に添加することにより、特に他の成長因子・生理活性因子等の添加をしなくても、マウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持することができる（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１０：５５，２００４）。この場合、ＧＳＫ−３の活性を阻害できる作用を有した物質であれば、すべて使用可能であり、例えばＷｎｔファミリー分子（Ｍａｎｏｕｋｉａｎ  ＆  Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８４：２０３，２００２；Ｄｏｂｌｅ  ＆  Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１６：１１７５，２００３）等を挙げることができる。
【００９４】
本発明の実施において、従来の方法に基づき継代維持した多能性幹細胞を、上記の方法により作製された培養基材に播種し、かつ、上記の培養条件・方法に基いて培養することにより、当該細胞を分散した状態で、しかも当該細胞が本来有する未分化な状態を保持したまま継代培養することが可能である。この様な状態で培養した多能性幹細胞は、細胞分裂の際に物理的な抑制がかからないため、及び／又は細胞間接触に起因する細胞増殖抑制機構が作用しないため、及び／又は細胞の生存性が高まり、死細胞数が減少するため、細胞の著しい増加や増殖が認められる。一つの事例として、本発明の方法によりマウスＥＳ細胞を培養した場合、従来の方法で培養した場合と比較して、少なくとも１．２５倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上の増殖能を呈することが可能である。また、当該条件で４代ほど継代すると、従来法と比べて少なくとも３倍、好ましくは１０倍以上の細胞を回収することが可能である。増殖能は、単位時間における細胞数の増加率や倍化速度等の指標で表すことができ、その計測・算出方法としては、一般の細胞を用いた実験で使用され、公知となっている方法であれば、いずれも用いることができる。
【００９５】
上述のように、多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。また、好ましくは、多能性幹細胞のその他の特性、例えば、テロメアーゼ活性の維持やテラトーマ形成能、又はキメラ形成能等の性質のうち、少なくとも１つを有していることが望ましい。これらの性質・特性を調べる方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、上記の参考書籍、即ち、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれらに記載の方法には限定されない。
【００９６】
また、未分化状態の多能性幹細胞は、以下に記載する少なくとも１つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも１つ、好ましくは複数のマーカー分子の存在が確認できる細胞と定義することもできる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫組織化学的染色法や免疫電気泳動法の様な、免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、未分化状態の多能性幹細胞に結合する、マーカー特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に使用することができる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカーとしては、例えばＡＬＰ活性や、Ｏｃｔ−３／４またはＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２等の遺伝子産物の発現が利用できる。また、各種抗原分子も用いることができ、マウスＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−１、ヒトＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−３やＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＧＣＴＭ−２等が未分化マーカーとして挙げられる。これらの未分化マーカーの発現は、ＥＳ細胞が分化することにより低減、消失する。
【００９７】
あるいは、未分化状態の多能性幹細胞マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカー・タンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的方法により確認できる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカー・タンパク質（例えば、Ｏｃｔ−３／４やＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２、Ｎａｎｏｇ等）をコードする遺伝子の核酸配列は既知であり、ＮＣＢＩの公共データベース等において利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。
【００９８】
［分化誘導方法］
本発明の多能性幹細胞の分化誘導方法は、上記本発明の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする。
【００９９】
多能性幹細胞の分化誘導のための培養方法や培養条件は、上記本発明の細胞培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の分化誘導培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。また、液体培地については上記したものと同様のものを使用することができる。
【０１００】
分化誘導因子（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒとも称される）は、多能性幹細胞の分化を誘導する為に、培地に添加されるペプチド、ホルモン、サイトカイン、タンパク質、糖タンパク質などの化合物であり、分化させたい細胞のタイプや、分化のステージに応じて様々な種類の分化誘導因子が用いられる。本発明においては、既知の方法やプロトコルに従い、目的の細胞に応じて公知の分化誘導因子を液体培地に添加することができる。
【０１０１】
例えば、肝細胞への分化を例にとると、肝細胞は、ＥＳ細胞をＭｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ（内胚葉系中胚葉系細胞）、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（内胚葉系細胞）、Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ（肝前駆細胞）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（肝細胞）という順で分化させて得ることができる。肝細胞への分化には、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｎｏｄａｌ、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、塩基性繊維芽細胞増殖因子）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、肝細胞増殖因子）、ＯＳＭ（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ）、ＤＥＸ（ｄｅｘａｍｔｈａｓｏｎｅ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−α）といった分化誘導因子が用いられるが、公知の文献等記載の技術に従い、これら以外の因子を用いてもよい。肝細胞以外の細胞についても、それぞれの細胞への分化に必要な分化誘導因子を用いることにより、分化を誘導することができる。
【０１０２】
また、神経系細胞への分化誘導スキームの一例を図５（Ａ）に示す。
【０１０３】
カドヘリンファミリーに属するタンパク質による細胞接着は、Ｃａ２＋依存性であるため、分化誘導後、細胞培養基材から、肝細胞を引き剥がす方法として、キレート剤を用いることが好ましい。キレート剤は公知のものをいずれも使用することができ、細胞に悪影響を与えないものが好ましい。
【０１０４】
多能性幹細胞への遺伝子導入法としての利用
本発明の別の態様として、本発明記載の方法は、所望する外来遺伝子を、多能性幹細胞の細胞内に効率的に導入する方法として使用することができる。導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、例えば増殖因子や受容体、酵素、転写因子等の天然の蛋白質や、例えば、遺伝子工学的手法を用いて改変、作製した、人工的な蛋白質である。また、導入遺伝子としては、リボザイムやｓｉＲＮＡ等の機能的ＲＮＡでも良い。更には、外来遺伝子として、遺伝子の導入効率または発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子も利用可能である。
【０１０５】
好適な実施態様の１つとして、導入する外来遺伝子は、遺伝子の転写及び発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。又、この場合、当該遺伝子は、更にポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。多能性幹細胞において外来遺伝子の転写および発現を可能にするプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスやＣＭＶ、ラウス肉腫ウイルス等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられる。また、目的の如何によっては、ある種の細胞／組織又はある分化段階の細胞で特異的に遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆる細胞／組織特異的プロモーター配列や分化段階特異的プロモーター、或いはＲＮＡの発現に適したＰｏｌ．ＩＩＩプロモーター等も使用できる。これらプロモーターの塩基配列は、ＮＣＢＩ等の公共のＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、所望の遺伝子配列を利用した遺伝子ベクターを作製することが可能である。また、これらのプロモーターを利用可能なベクターが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社や、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｍｂｉｏｎ社等から購入可能である。
【０１０６】
上記の遺伝子（ベクター）の導入のための方法としては、特にこれを制限せず、例えばリン酸カルシウムやＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション法を挙げることができる。また、遺伝子導入対象の細胞が細胞内に取りこむことが可能であり、かつ、細胞毒性の低い脂質製剤、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ社）等を用いて、目的とする遺伝子とリポソーム−核酸複合体を形成させた上でトランスフェクションする方法も好適である。更には、レトロウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターに目的の遺伝子を組み込み、その組み換えウイルスを細胞に感染させる方法等も使用可能である。この場合、ウイルスベクターとは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの全長若しくは一部を欠損・変異させた核酸配列に、目的とする遺伝子を組み込み、発現することができる様にした構築物である。
【０１０７】
本発明の方法により増殖させた多能性幹細胞の利用
本発明に係る増殖方法により増殖させた多能性幹細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収法を用いることにより、未分化な状態を維持した多能性幹細胞を、効率的かつ多量に得ることができる。また、本発明に係る遺伝子導入法により、所望する遺伝子を導入・発現させた多能性幹細胞を効率的かつ多量に得ることができる。この様にして得られた多能性幹細胞を、以下、本発明により調製された多能性幹細胞と呼ぶ。
【０１０８】
多能性幹細胞の回収法としては、多能性幹細胞の一般的な継代培養法において用いられる、公知の酵素消化による方法が挙げられる。その具体例としては、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、ＰＢＳを用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄し、適当なタンパク質分解酵素を含む溶液（例えば、トリプシンやディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を含む溶液）を加え、３７℃で適当時間、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは３〜１０分間程度培養した後、上記のＥＳ細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、酵素を用いない方法も使用することができ、例えば、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、ＰＢＳを用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄した後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を終濃度０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭになる様に添加し、３７℃で適当時間、好ましくは１〜６０分間、好ましくは１０〜３０分間程度処理して細胞を剥離させ、更にＥＳ細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、ＥＤＴＡの代わりにエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）溶液を、同様の方法で用いることもできる。
【０１０９】
また、本発明は、本発明により調製された多能性幹細胞から適当な分化誘導処理により作製した分化細胞をも提供する。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。
【０１１０】
外胚葉由来の細胞とは、神経組織、松果体、副腎髄質、色素体および表皮組織といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。中胚葉由来の細胞とは、筋組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、心臓組織、血管組織、血液組織、真皮組織、泌尿器および生殖器といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。内胚葉由来の細胞とは、消化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓および膵臓といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明により調製された多能性幹細胞、及び／又は当該細胞から作製した分化細胞は、各種生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価や活性評価に有用である。例えば、多能性幹細胞や種々の分化細胞の機能調節に関する物質や薬剤、及び／又は多能性幹細胞や種々の分化細胞に対して毒性や障害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。特に現状では、ヒト細胞を用いたスクリーニング法はほとんど確立しておらず、本発明により調製された多能性幹細胞に由来する各種分化細胞は、当該スクリーニング法を実施するための有用な細胞ソースとなる。
【０１１２】
さらに、本発明は、本発明で開示された方法により調製された多能性幹細胞を用いてキメラ胚またはキメラ動物を作製する方法、及び作製したキメラ胚またはキメラ動物をも提供する。キメラ胚またはキメラ動物を作製する方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれを限定しない。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。
【０１１４】
本発明の実施例において行った実験方法は以下の通りである。
【０１１５】
＜培地＞
フィーダー依存性ｍＥＳ細胞系統（ＳＴ１）およびＮａｎｏｇ−ＧＦＰ発現ｍｉＰＳ細胞系統（ＡＰＳ０００１  ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７）は、通常の方法により、ゼラチンコートされた３５ｍｍカルチャーディッシュ内でマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤環境下培養した。ＳＴ１細胞は、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ミリポア社製）１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ギブコ社、インビトロフェン社製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（シグマケミカル社製）、１０００ユニット／ｍｌ  ＬＩＦを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ、シグマアルドリッチ社製）上で維持した。ｍｉＰＳ細胞は、ＤＭＥＭ（高グルコース、ピルビン酸無添加、シグマ社製）、１５％ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、および１０００ユニット／ｍｌ  ＬＩＦを添加した培地中で培養した。培地は全て、５０μｇ／ｍｌ  ペニシリン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含む。ｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞は３日ごとに培地を交換して継代培養した。マウス胎性がん種細胞系統（Ｐ１９）およびフィーダー非依存性ｍＥＳ細胞（ＥＢ３細胞系統）は、細胞間接着、ｍＲＮＡ発現解析のコントロールとして用いた。Ｐ１９、ＥＢ３細胞の培養条件は先行文献（Ｙｕｅ  ＸＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１０；  ３１：５２８７−９６、Ｈａｑｕｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１；  ３２：  ２０３２−４２）に記載の通りであった。
【０１１６】
＜天然基層、人工基層の作製＞
ゼラチン化した表面を作製するため、組織培養皿を０．１％ゼラチンで３７℃、３０分間処理した。Ｅ−カドヘリン−Ｆｃ（Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ）およびＮ−カドヘリン−Ｆｃ（Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ）融合タンパク質の発現、精製、ポリスチレン製培養皿上への固定化方法は、先行文献（Ｙｕｅ  ＸＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１０；  ３１：５２８７−９６、Ｎａｇａｏｋａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ  ２００６；  １．  ｅ１５）に記載の通りに行った。簡潔に説明すると、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃコートされた表面を作製するために、精製された融合タンパク質を１０μｇ／ｍｌに希釈し、希釈溶液をそれぞれ非処理ポリスチレン製培養皿上に加え、３７℃で１時間インキュベートした。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層を作製するために、最適な濃度のＥ−ｃａｄ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を非処理のポリスチレン製培養皿に加え、３７℃で１時間インキュベートした。固定化処理後のポリスチレン表面をＰＢＳで１度洗浄し、０．２５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で３７℃、２時間インキュベートして、細胞の非特異的吸着を抑制した。
【０１１７】
＜細胞接着、増殖アッセイ＞
ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の種々の細胞外基層（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ，  ＥＣＭ）への吸着、増殖は、ＭＴＴアッセイにより測定した。簡潔に説明すると、２４ウェルのマイクロプレートを、各接着分子によって、３７℃、１時間処理し、コートした。細胞をコンフルエントになる密度（１×１０４  細胞／ウェル）で、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞用培地を含む該プレートに時間をずらして播種した。４時間後、培地と非吸着細胞を除去し、ＤＭＥＭ基本培地で洗浄した。そして、非分化培地中で培養した。５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を各ウェルに加え、３７℃で４時間培養した。マイクロプレートリーダーで、６３０ｎｍを参照波長として５７０ｎｍの波長により吸着を測定した。
【０１１８】
＜アルカリフォスファターゼアッセイ＞
接着分子コートされた１２ウェルプレート上で、非分化培地中４日間培養したｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）活性を、測定キット製品添付の説明書に準拠して測定した（シグマ社製、ロイコサイト  アルカリフォスファターゼキット、８５Ｌ３Ｒ）。
【０１１９】
＜フローサイトメトリー＞
培養したｍｉＰＳ細胞をアキュターゼにより回収し、分析した。分離した１×１０６細胞／ｍｌを、冷却ＰＢＳに懸濁し、遠心して酵素を除去した。その後、Ｎａｎｏｇ発現細胞をフローサイトメータ（グアバテクノロジーズ社製、ミリポア社）により分析した。
【０１２０】
＜分化誘導＞
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞用の基礎分化培地は、Ｇｒａｓｇｏｗ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ、シグマ社製）、ステージ特異的分化誘導因子および１０％（ｖ／ｖ）ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、インビトロジェン社製）を加え、ＤＭＥＭ、ＬＩＦ、ＦＢＳを加えなかった以外は上記と同様の組成であった。分化誘導開始前に、ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞を、１０μｇ／ｍｌ  Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃコートプレート上で培養し、フィーダー細胞を除去した。単層分化誘導のために、ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞を、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃコートされたプレート表面、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃコートされたプレート表面、または、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃおよびＮ−ｃａｄ−Ｆｃが共固定化されたプレート表面上に播種した。細胞は分化誘導前に非分化培地上で２４時間培養した。単層プロトコルを用いた神経分化誘導は、１０ｎｇ／ｍｌ  ＤＫＫ−１および５００ｎｇ／ｍｌ  Ｌｅｆｔｙ−Ａ、が添加されたＫＳＲ分化培地で５日間培養することにより行った。６〜１２日経過後から、細胞を、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、プロメガ社製）が添加された基礎分化培地中で培養した。培地は２日ごとに交換した。増殖および形態変化は毎日観察した。分化は、アクソン（ＡＸＯＮ）形成観察、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫染色を通して確認した。
【０１２１】
胚様体（ＥＢｓ）への自発的分化は、液滴法を用いて行った。簡潔に説明すると、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃコートされた培養皿上の細胞をアキュターゼにより分離し、ＬＩＦ無添加の非分化ＥＳ、ｉＰＳ細胞培地で希釈した。その後、６００細胞を含む２０μｌ液滴を、ポリスチレン製ペトリ皿の蓋上に垂らした。３日後、５日後に、胚様体を含む５つの液滴を０．１％ゼラチンコート３５ｍｍ培養皿上に移し、ＬＩＦ非存在下でさらに１日培養した。４日後、６日後に、ｍＲＮＡ発現解析のためにＥＢｓを回収した。液滴法を用いた神経分化のために、分化誘導開始後１日〜５日後まで液滴として神経分化培地を使用した以外は、同様の方法を用いた。ＥＢｓをその後、ゼラチンコート培養皿に移し、ｂＦＧＦ存在下でさらに５日間培養した。細胞増殖および形態変化は毎日観察した。分化誘導開始後各時間経過ごとに、細胞を回収し、ステージ特異的マーカーを用いた解析を行った。
【０１２２】
＜免疫蛍光染色＞
細胞をＭｉｌｄｆｏｒｍ  ２０Ｎ（８％ホルムアミド）で１５分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を用いて５分間透化処理した。固定された細胞をＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で１時間ブロックした。１次抗体は、マウス抗Ｅ−カドヘリン抗体（ＢＤトランスダクションラボラトリーズ社製）、ラビット抗マウスＮ−カドヘリン（Ｈ−６３、サンタクルスバイオテクノロジー社製）、抗マウスＳＳＥＡ１抗体（サンタクルスバイオテクノロジー社製）ラビット抗ヒトＯｃｔ３／４抗体（サンタクルスバイオテクノロジー社製）、ラビット抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体（ＩＢＬ社製）、マウス抗ニューロン特異的βＩＩＩチューブリン抗体（Ｔｕｊ−１、Ｒ＆Ｄシステム社製）、およびマウス抗ＧＦＡＰ抗体（ＧＡ５、セルシグナリング社製）を用いた。２次抗体は、ゴート抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＴＲＩＴＣ抗体（サンタクルス社製）、抗ラビットＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５結合抗体（セルシグナリング社製）、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ結合抗マウスＣｙ３  Ｆ（ａｂ’）２  ２次抗体（インビトロジェン社製）、および、抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合抗体（インビトロジェン社製）を用いた。
【０１２３】
＜ＲＴ−ＰＣＲ＞
総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ反応液（インビトロジェン社製）を用いて抽出した。ＲＮＡを、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  （Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素（インビトロジェン社製）を用いてオリゴＴプライマーが結合したｃＤＮＡに逆転写した。０．２ｍＭ  ｄＮＴＰを含むＰＣＲバッファー、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（タカラ社製）を使用してＰＣＲを行った。プライマーおよびＰＣＲ条件は表１に示す。それぞれのマーカーのＲＮＡ量は、ＰＣＲ産物の蛍光シグナルからＩｍａｇｅＱｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（ｖｅｒ．５．２、モルキュラーダイナミクス社製）によって計算した。
【０１２４】
【表１】
2014082956.tif 000002
【０１２５】
＜ウェスタンブロット＞
細胞中の総タンパク質をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、およびプロテアーゼインヒビターカクテル、ｐＨ７．４）により抽出し、細胞破砕液を１５０００×ｇで１５分間、４℃下、遠心した。サンプルを７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離し、ポリビニリデンジフロリドメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、ミリポア社製）に転写した。１次抗体として、マウス抗Ｅ−カドヘリン抗体（ＢＤトランスダクション社製）、ラビット抗ヒトＮ−カドヘリン抗体（サンタクルスバイオテクノロジー社製）、マウス抗ＦＡＫ抗体（ＢＤトランスダクション社製）、マウス抗ｐＦＡＫ抗体（ＢＤトランスダクション社製）、および、マウス抗βアクチン抗体（シグマ社製）、を用いた。メンブレンをセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合２次抗体（１：１００００希釈、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社製）と１時間反応させた。ＨＲＰ活性は、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ミリポア社製）を使用して製品説明書に従って測定した。
【０１２６】
＜統計分析＞
データは標準偏差（ＳＤ）で表す。統計分析は、２つのサンプルについてスチューデントｔ−テストにより行った。ｐ値が０．０５未満のものについて統計的に重要であると判断した。
【０１２７】
（結果）
＜フィーダー依存性マウスＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞の多能性＞
神経分化誘導に先立ち、まず、Ｅ−カドヘリン基層の、フィーダー依存性ｍＥＳ細胞（ＳＴ１）、ｍｉＰＳ細胞への影響を確認した。種々のＥＣＭ上でのｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞の培養は、細胞形態と形状の様々な変化をもたらした（図１Ａ）。ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞はともに、タイプＩコラーゲン上では、ＭＥＦフィーダー層上の典型的な未分化細胞に比べてコンパクトな球状コロニーを形成した。それに対して、フィブロネクチンやゼラチン上の未分化細胞は、あまりコンパクトではないコロニーを形成した（図１Ａ）。Ｅ−カドヘリン基層上の細胞は、単一細胞ごとに分散した。フィーダー無しの人工ＥＣＭ上のＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の接着メカニズムが、インテグリン非依存性であるかを調べるために、インテグリン活性を測定した。ゼラチンやＥ−ｃａｄ−Ｆｃ上で培養することで活性化されたＦＡＫのリン酸化状態をウェスタンブロットによって調べた（図１Ｂ）。ゼラチン上では、ＦＡＫのＴｈｙ−３９７のリン酸化レベルは、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層上のｍＥＳ細胞よりも高かった。ＦＡＫのリン酸化レベルは、血清含有培地ではわずかに高かった。これはおそらくＦＢＳ培地中に、細胞外マトリックス分子（フィブロネクチンなど）が存在するためであると考えられる。これらの結果はＥＳ細胞のＥ−カドヘリン基層への初めの接着は、インテグリンには依存していないことを示唆している。Ｅ−カドヘリン基層レーンの活性化ＦＡＫのかすかなバンドは、Ｅ−カドヘリンへの接着から生じた、伸張する細胞の機械的なストレスによるものと思われる。また、Ｅ−カドヘリン基層上のｉＰＳ細胞の接着効率は、血清フリー条件でも影響を受けなかった。これは、血清フリー培地条件下での自発的増殖や分化へのカドヘリンベース基層適用が好適であることを示唆するものである（図１Ｃ）。
これらの結果から、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、Ｅ−カドヘリンベースの細胞外基層上ではより優れた分化多能性を呈することが考えられた。未分化マーカーとして広く用いられているアルカリフォファターゼ（ＡＰ）活性が陽性であるＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞コロニーの形態を観察した。タイプＩコラーゲン上では、陽性のコロニーの割合が高かったが、フィブロネクチンやゼラチン上で培養された細胞では陽性のコロニーは少なかった（図１Ｄ）。興味深いことに、Ｅ−カドヘリン基層上の単一細胞に分散したものがＡＰ活性を示した。４日間培養したｍｉＰＳ細胞のＮａｎｏｇ−ＧＦＰタンパク質発現のフローサイトメトリーは、ＡＰ染色と同様の結果を示した。Ｅ−カドヘリン基層上（〜７７％）、コラーゲン上（〜７１％）ではＮａｎｏｇ−ＧＦＰ発現細胞の割合が高く、ゼラチン（〜６７％）、フィブロネクチン（〜５４％）上では低かった（図１Ｅ）。
未分化ｍＥＳ細胞のマーカーとして用いられているステージ特異的胚性抗原１タンパク質発現の免疫化学分析は、ゼラチンおよびＥ−ｃａｄ−Ｆｃ基層でのＡＰ染色、Ｎａｎｏｇ発現と同様の結果であった（図１Ｆ）。上記のデータはフィーダー依存性ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の未分化状態は、カドヘリンベース基層上で長期に渡り維持することができることを示唆している。また、ｍｉＰＳ細胞は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層上で継代培養しても分化多能性を維持していることも示された。ＭＥＦ上で１３代継代培養のｍｉＰＳ細胞を、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層上で培養し、未分化培地の存在下で、さらに７代継代した。これらの２０代継代のｉＰＳ細胞について、ＬＩＦ非存在下、３日間液滴培養し、ゼラチンコート培養皿に移して胚様体（ＥＢｓ）形成を誘導した。ゼラチン上の細胞をさらに２日間培養し、系統特異的マーカーにより、これらの細胞の自発的分化能を確認し、多能性を調べた。ＬＩＦ非存在下のｉＰＳ細胞由来のＥＢｓは、外胚葉マーカー（Ｓｏｘ１）、内胚葉系中胚葉マーカー（ＧｏｏｓｅｃｏｉｄおよびＢｒａｎｃｈｙｕｒｙ）、内胚葉マーカー（Ｓｏｘ１７、Ｆｏｘａ２およびＧａｔａ６）、および中胚葉マーカー（Ｇａｔａ１）を発現し、未分化ｉＰＳ細胞マーカー（Ｏｃｔ３／４）の発現量が減っていた（図１Ｇ）。この結果は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ上では、３つ全ての肺葉系への分化多能性を損なうこと無くｍｉＰＳ細胞を維持することが可能であることを示唆している。
【０１２８】
＜ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞でのＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの発現＞
これまで、Ｅ−カドヘリンからＮ−カドヘリンへのスイッチが、ｍＥＳ細胞の神経分化と関連づけられることが報告されている（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＨＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ：  ２００７；  １８：  ２８３８−５１）。カドヘリンベースのＥＣＭを確立するために、ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の分化過程におけるＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンの発現パターンを評価した。未分化のｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞の免疫染色により評価した（図２Ａ）。細胞の大多数は、細胞表面にＥ−カドヘリンのみを発現していた。それに対して、未分化のｍＥＳ細胞とｍｉＰＳ細胞は、細胞表面においてＮ−カドヘリン発現が見られなかった。Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンを発現するＰ１９細胞系統をポジティブコントロールとして用いた。Ｅ−カドヘリンからＮ−カドヘリンへのスイッチを観察するために、ＤＫＫ−１およびＬｅｆｔｙ−Ａ存在下、液滴法によって神経分化を誘導した。総Ｅ−カドヘリンおよびＮ−カドヘリンタンパク質を、全細胞破砕液のウェスタンブロットによって解析した（図２Ｂ）。Ｎ−カドヘリンタンパク質は未分化細胞には見られず、分化誘導開始後４日後の細胞からは検出され、１０日後の細胞ではその量が増えていた。それに対して、Ｅ−カドヘリンタンパク質は未分化細胞では検出されたが、神経分化培地の存在下ではその発現量が著しく減少していた。Ｅ−カドヘリンとＮ−カドヘリンの発現は、培養開始後４〜６日間はオーバーラップしていた。未分化ｍＥＳ細胞および未分化ｍｉＰＳ細胞の接着というＥ−カドヘリンの機能、神経分化というＮ−カドヘリンの機能を考慮した結果、カドヘリンスーパーファミリー２種の融合タンパク質（Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン）それぞれ単独またはそれらの組みあわせによって、ｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞からの均質な神経前駆体の誘導を試みることに想到した。
【０１２９】
＜Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン共固定化基層＞
まず、ＥＬＩＳＡを用いて、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質をポリスチレン表面に固定化するのに最適な濃度を検討した。それぞれの融合タンパク質のポリスチレン表面への吸着は濃度依存的に増加し、１０μｇ／ｍｌで単層形成濃度（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）に達した。また、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ基層へのＥＳ細胞の吸着率も濃度依存的であることを確認し、５μｇ／ｍｌのＥ−ｃａｄ−Ｆｃにより固定化したＥ−ｃａｄ−Ｆｃ基層がＥＳ細胞の吸着率が高いこと（約８５％）を見出した。次に、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの濃度を５μｇ／ｍｌに固定して、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃおよびＮ−ｃａｄ−Ｆｃ混合液の単層形成濃度を調べた。その結果、５μｇ／ｍｌのＥ−ｃａｄ−Ｆｃと５μｇ／ｍｌのＮ−ｃａｄ−Ｆｃが、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＮ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化（以下、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃとも称する）に最適であった（図３Ａ）。
【０１３０】
＜共固定化基層への細胞吸着と増殖＞
融合タンパク質（Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ）ベースのＥＣＭｓの性能を確認するために、未分化培地中、分化誘導培地中におけるＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の融合タンパク質ベースのＥＣＭｓへの吸着能を調べた。ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は、ゼラチン、コラーゲン、１０μｇ／ｍｌのＥ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた表面のそれぞれに対して同様の効率で吸着した（図３Ｂ、Ｃ）。しかし、分化過程において表面からの剥離が見られた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。一方で、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた表面は未分化細胞の吸着をサポートすることはなかった（図３Ｂ）。ニューロスフェア状に分化した神経系細胞は、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃでコートされた表面に吸着し、神経突起の成長が見られた（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。神経突起成長は、βＩＩＩ−チューブリンの発現により確認した。そこで、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化表面を、ｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞の培養、神経系への分化に用いた。ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞のＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層への吸着能を調べた。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞のＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層への吸着率は約８０％であり（図３Ｂ、Ｃ）、全ての細胞は単一細胞分散形態を示した（図３Ｄ）。ゼラチンコートされた表面上では、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞ともに、凝集コロニーを形成した。神経分化プロトコルにおいて、ＥＣＭとしてＮ−カドヘリンを用いることにより、固定化されたＮ−カドヘリン基層の神経分化初期段階への影響を評価した。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞について、未分化特異的マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｅ−カドヘリン）、神経分化特異的マーカー（Ｎ−カドヘリン、ネスチン）の発現を調べた。従来技術の細胞外基層であるコラーゲンＩコート基層を、コントロールとして用いた。ＬＩＦ存在下で、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で２日分化誘導培養した未分化ＥＳ細胞、未分化ｉＰＳ細胞は、Ｎ−カドヘリン、ネスチンを発現しなかった。一方、殆ど全ての細胞は多能性マーカーであるＯｃｔ３／４、Ｅ−カドヘリン（図４Ａ、Ｂ）、およびＮａｎｏｇ（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）を発現した。
【０１３１】
＜ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の神経前駆細胞への分化＞
単層形成培地条件を用いた神経分化誘導の模式図を図５Ａに示す。主に、ニューロン発生に着目し、そのためにｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞を神経分化培地存在下で１２日間培養した。神経分化培地存在下、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上のこれらの細胞の生存率および増殖能をＭＴＴアッセイにより調べた。ｍＥＳ細胞の成長曲線（図５Ｂ）およびｍｉＰＳの成長曲線（図５Ｃ）から、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上では、ゼラチン、コラーゲン、またはフィブロネクチンでコートされた培養皿上よりも、増殖能が高いことが示された。この結果は、人工の細胞外基層によって、効率良く分化細胞を作製しうることを示唆している。加えて、ｍＥＳ細胞およびｍｉＰＳ細胞の神経分化培地への曝露は、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上で単一細胞分散したｍＥＳ細胞（図５Ｄ）、ｍｉＰＳ細胞（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）の顕著な形態変化を誘導した。カドヘリンベースのＥＣＭを用いることで、分化の各段階を通じて細胞集団の均質性を維持することができ、分化誘導開始１０日後以内には、神経突起の発生が見られた。神経分化の進行を確認するため、原始外胚葉マーカー、原始神経幹細胞マーカー、神経幹細胞マーカー、神経前駆細胞マーカーの分化ステージ特異的マーカーを調べた。最後に、ニューロンおよびグリア細胞の形態的特徴および遺伝的特徴を有する細胞を確認した。ＮａｎｏｇとＯｃｔ３／４を発現するｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞は原始外胚葉に誘導され、脳型脂肪酸結合タンパク質（ＢＬＢＰ）を発現した。Ｓｏｘ２のｍＲＮＡ転写量は、分化誘導開始後２日以内にＮａｎｏｇ発現の減少に伴って上昇した（図５Ｅ）。この段階に分化した細胞はＮ−カドヘリンおよびニューロジェニン（Ｎｇｎ１）の発現量が低かった。これらの細胞はその後、分化誘導開始後４日以内に、低レベルの中間フィラメントタンパク質であるネスチンとＮ−カドヘリンを発現し、球状の形態を示す原始神経幹細胞（ＮＳＣｓ）に誘導された（図６Ａ、図６Ｂ）。原始的なＮＳＣ様の形態を有する細胞は、ＢＬＢＰおよびＰａｘ６の発現量が上昇し、放射状グリア細胞の形態を思わせるような、スピンドル様の形態に変化した（図５Ｄ、図６Ｃ）。ＢＬＢＰの発現は、初めは多くの細胞で見られるものの、分化誘導開始後６日以内に急速に消失した（図７Ａ）。さらに、Ｎ−カドヘリン、Ｎｇｎ１、Ｓｏｘ２の発現量が、原始外胚葉に比較して上昇した。これらの結果は全て、ＥＳ細胞（Ｏｃｔ３／４＋、Ｎａｎｏｇ＋、Ｓｏｘ２＋、Ｎｅｓｔｉｎ−、Ｎｇｎ１−）から、神経外胚葉前駆細胞（Ｎ−ｃａｄ＋、Ｎｅｓｔｉｎ＋、Ｎｇｎ１＋、ＢＬＢＰ−）への変化が６日以内に完了したことを示唆している。比較試験のため、ゼラチン基層またはＥ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上のｍＥＳ細胞（図７Ｂ、７Ｃ）、ｍｉＰＳ細胞（図７Ｂ、図７Ｄ）について、ネスチン発現の時間経過分析を行った。ゼラチン基層上の細胞と比較すると、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上の細胞は、神経前駆細胞への分化過程の全てに渡り、ネスチンｍＲＮＡ転写量が高かった。また、免疫蛍光染色の結果は、ネスチンとＮ−カドヘリン発現の結果が、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層とゼラチン基��では同様であった。それに対して、内胚葉マーカー（肝細胞核因子；ＨＮＦ４α）と中胚葉マーカー（Ｇａｔａ１）は、分化誘導開始後６日以内の細胞では検出されなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。ｍｉＰＳ細胞由来の神経前駆細胞の時間経過に伴うＮａｎｏｇ発現量減少を観察し、神経系統への選択的な分化が見られるかを調べた。Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上の均質な細胞集団では、Ｎａｎｏｇ発現は著しく減少した。分化したｍｉＰＳ細胞では、６日以内にＮａｎｏｇ発現は検出できなくなった（図７Ｅ）。対照的に、ゼラチン基層上の凝集した細胞では、Ｎａｎｏｇ発現が見られた。これはＹｉｎ  ＱＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３；２１（２）：１８３−６により報告された、未分化ＥＳ細胞マーカーの消失が、細胞集団内で非同時的であり、いくつかの細胞集団は神経分化誘導を受けず未分化の状態を維持することがあるという知見をサポートするものである。同様の現象が、Ｅ−／Ｎ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上でｍｉＰＳ細胞を培養し、均質な集団を作製した場合にも見られた。Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現は、コンパクトな細胞凝集内において顕著であり、神経前駆細胞様の形態を有する非凝集細胞の単一層と明確に区別しうるものであった。これは、未分化な細胞の混入を排除しうるという、均質な培養条件の優位性を示すものである（図８）。
【０１３２】
＜神経分化＞
ｍＥＳ細胞由来、ｍｉＰＳ細胞由来の神経前駆細胞をｂＦＧＦ存在下で培養し、神経の特徴を有する細胞を誘導した。神経前駆細胞の神経細胞への誘導は２つの方法によって確認した。まず、分化誘導開始後１２日後の細胞形態を観察した。次に、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、チロシンヒドロキシアーゼ（ＴＨ）、βＩＩＩ−チューブリン（Ｔｕｊ）、グリア細胞マーカー（ＧＦＡＰ）といった神経細胞マーカーをＲＴ−ＰＣＲにより解析した。神経様の形態を有する細胞が、分化誘導開始後８日以内に現れ始め、１２日には大勢を占めた（図５Ｄ）。神経前駆細胞が、ニューロン形成とそれに続くグリア形成前駆体を経るかを調べるために、単層分化誘導過程全体において、ニューロン形成とグリア形成を評価した。その結果、βＩＩＩ−チューブリン＋ニューロンの数は、１２日まで増加した。一方、ＧＦＡＰ発現グリア細胞は検出できなかった。これは、神経発生はグリア発生よりも早い段階で起こるという見解に合致する（図９Ａ）。また、ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞を、低密度培養条件下において分化誘導した（図８参照）。ｍＥＳ細胞、ｍｉＰＳ細胞はともに、高密度条件下で培養したものよりも短い神経突起を有するβＩＩＩ−チューブリン発現神経細胞に分化した（図９Ｂ）。分化誘導開始後１０日以内では、ＭＡＰ２、Ｐａｘ６およびＴＨの転写量が多く、ＧＦＡＰ転写は見られなかった。これは、グリア細胞よりも、神経細胞サブタイプの方が優勢であったことを示している（図９Ｃ）。ゼラチン基層上の細胞と比べて、カドヘリンベースの基層上の細胞はより長い神経突起の成長が見られた。これは細胞間の接触または細胞の集団は、神経突起の成長に必須ではないことを支持している（Ｇａｖａｌｌａｒｏ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１１；１２：１８９−９７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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