(57)【要約】【課題】  乳癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異に基づくタンパク質検出することによる、被験者における乳癌の存在を検出する方法、被験者における乳癌を診断する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。【解決手段】  被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、請求項１に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
【請求項３】
前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
【請求項４】
下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
【請求項５】
下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
【請求項６】
下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
【請求項７】
下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
【請求項８】
前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記被験者が乳癌患者である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＧＦＲ４における変異の存在を検出することによる、被験者における乳癌の存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）は受容体チロシンキナーゼの１種であり、ＦＧＦＲのリガンドしては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が知られている。ＦＧＦＲファミリーには、４つの受容体型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４の存在が知られている。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメインを有する膜貫通タンパク質から構成される。細胞外ドメインは２つ又は３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ二量体、ＦＧＦ、及びヘパリングリカン又はプロテオグリカンの複合体において細胞表面で起こる二量体化によって活性化される、単量体チロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦについては、２２種の既知のＦＧＦが存在し、それぞれが１つ又は複数のＦＧＦＲと結合する能力を有する。ＦＧＦがＦＧＦＲに結合することで受容体チロシンキナーゼが活性化され、下流にシグナル伝達が行われる。ＦＧＦＲの発現部位や時期の差異によって、細胞遊走や細胞増殖などの複雑な生体機能を制御している。
【０００３】
ＦＧＦＲファミリーのうち、ヒトのＦＧＦＲ４遺伝子については現在までに３つのスプライシングバリアント（ＦＧＦＲ４遺伝子バリアント１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００２０１１．３）、バリアント２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２２９６３．２）、バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿２１３６４７．１））の存在が知られている。このうち、バリアント１及びバリアント３はＦＧＦＲ４のアイソフォーム１をコードし、バリアント２はＦＧＦＲ４のアイソフォーム２をコードする。ＦＧＦＲ４アイソフォーム１は全長８０２アミノ酸、アイソフォーム２は全長７６２アミノ酸からなり、アイソフォーム１とアイソフォーム２はその膜貫通ドメイン内の領域において異なるものの、細胞外ドメイン及び細胞膜内ドメインにおいて同一のアミノ酸配列を有する。
【０００４】
ＦＧＦＲのチロシンキナーゼドメインは細胞膜内ドメインに存在し、種々の癌においてＦＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける点変異が癌の活性化に関与していることが確認されている。このうち、ＦＧＦＲ４については、横紋筋腫において、チロシンキナーゼドメイン内の点変異が見いだされており、これら点突然変異の導入が、ＦＧＦＲ４の恒常的な活性化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され、癌化及び細胞増殖を引き起こしていることが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、これまでに乳癌において、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメイン内の点変異が存在しているとの報告は無い。
【０００６】
乳癌は、女性における罹患数が最も多い癌であり、罹患率は依然として増加傾向にある。乳癌の治療には、手術、放射線治療、化学療法（抗癌剤）、ホルモン療法などが組み合わせで用いられることが多いが、治癒率の改善のためには乳癌の早期診断及び発見が望ましい。
【０００７】
乳癌の原因として考えられている因子の１つに、エストロゲン受容体（ＥＲ）やプロゲステロン受容体（ＰＲ）などのホルモン受容体がある。ホルモン受容体陽性の乳癌においては、女性ホルモン（エストロゲン）が受容体に結合し、細胞増殖が促進される。このようなタイプの乳癌に対しては、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤やアロマターゼ阻害剤によるホルモン療法が有効と考えられている。また乳癌の別の要因として、上皮細胞増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）が存在し、ＨＥＲ２の過剰発現によって乳癌の細胞増殖が促進されることが確認されている。このようなＨＥＲ２陽性の乳癌患者に対しては、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）のような分子標的薬が治療法の１つとして用いられている。
【０００８】
しかし、近年の研究によって、ＥＲやＰＲのホルモン受容体やＨＥＲ２のいずれにも関連せずに発症するタイプの乳癌が存在することが確認されており、このようなタイプの乳癌はトリプルネガティブ乳癌と呼ばれている。トリプルネガティブ乳癌は、その治療においてホルモン療法やＨＥＲ２標的薬の使用が効果を奏さず、治療が難しい乳癌である。それ故、トリプルネガティブ乳癌については、より早期に診断し発見することによって、より良い治療法の組み合わせを選択することが望ましい。
【非特許文献１】「（ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）, （英国）、２００９年、１１巻、p.３３９５−３４０７」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
乳癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異を有するタンパク質を検出することによる、被験者における乳癌の存在を検出する方法、被験者における乳癌を診断する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、チロシンキナーゼドメイン内に変異を有するＦＧＦＲ４が、乳癌患者から得た検体に存在すること（実施例１〜４）、これらの変異ＦＧＦＲ４遺伝子を発現させるためのレンチウイルスベクターを作製し（実施例５〜６）、変異ＦＧＦＲ４遺伝子の感染細胞が腫瘍形成能を有し、該遺伝子が癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例７〜８）。本発明者は、これらの知見から、これらの変異ＦＧＦＲ４遺伝子の乳癌の検出法を構築し、そのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供し、これらの変異ＦＧＦＲ４遺伝子を検出することにより、ＦＧＦＲ４阻害薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］に関する。
［１］被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
［２］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、［１］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
［３］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
［４］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［５］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［６］前記変異がＦＧＦＲ４アイソフォーム１の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異である、［２］に記載の方法。
［７］前記変異が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異である、［６］に記載の方法。
［８］ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［４］に記載の方法。
［９］配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［８］に記載の方法。
［１０］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。 
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［１１］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。 
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［１２］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］前記被験者が乳癌患者である、［１２］に記載の方法。
【００１２】
また、本発明は、以下の［１４］〜［１８］に関する。
［１４］被験者における乳癌を診断する方法であって、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［１５］前記変異が被験者から得た試料から検出された場合に、前記被験者が乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１４］に記載の方法。
［１６］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［１４］に記載の方法。
［１７］前記変異が被験者から得た試料から検出された場合に、前記被験者がトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１６］に記載の方法。
［１８］前記被験者が乳癌患者である、［１６］又は［１７］に記載の方法。
【００１３】
また、本発明は、以下の［１９］〜［２１］に関する。
［１９］被験者における乳癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ遺伝子における領域を増幅できるように設計した、プライマーセット。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［２０］以下の（１）〜（６）からなる群より選択される、［１９］に記載のプライマーセット：
（１）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０４から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（２）配列番号１の塩基番号１から１６０４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（３）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（４）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８４から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（５）配列番号３の塩基番号１から１４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（６）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［２１］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［１９］又は［２０］に記載のプライマーセット。
【００１４】
また、本発明は、以下の［２２］〜［２３］に関する。
［２２］被験者における乳癌の存在を検出するためのプローブであって、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計した、プローブ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［２３］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２２］に記載のプローブ。
【００１５】
また、本発明は、以下の［２４］〜［２５］に関する。
［２４］被験者における乳癌の存在を検出するための検出用キットであって、前記［１９］又は［２０］に記載のプライマーセット或いは前記［２２］に記載のプローブの少なくとも１つを含む、検出用キット。
［２５］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２４］に記載の検出用キット。
【００１６】
また、本発明は、以下の［２６］〜［３２］に関する。
［２６］被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、前記［１９］又は［２０］に記載のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、方法。
［２７］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［２６］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［２８］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［２６］又は［２７］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のの１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［２９］被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、前記［２２］に記載のプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、方法。
［３０］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［２９］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［３１］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［２９］又は［３０］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［３２］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２６］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
【００１７】
また、本発明は、以下の［３３］〜［３７］に関する。
［３３］被験者における乳癌を診断する方法であって、前記［２６］〜［３１］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［３４］前記変異が被験者から得た試料から検出された場合に、前記被験者が乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［３３］に記載の方法。
［３５］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［３３］に記載の方法。
［３６］前記変異が被験者から得た試料から検出された場合に、前記被験者がトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［３５］に記載の方法。
［３７］前記被験者が乳癌患者である、［３５］又は［３６］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の検出方法は、被験者における乳癌（特にはトリプルネガティブ乳癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、乳癌患者に対してＦＧＦＲ阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の検出方法に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法は、被験者における乳癌の存在を検出する方法であり、被験者から得た試料中の線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）のチロシンキナーゼドメインにおける変異の存在を検出する工程を含む。
【００２０】
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞組織、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料等を用いるが、好適には生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特には、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
【００２１】
現在まで、ＦＧＦＲ４には２つのアイソフォーム、アイソフォーム１及び２が存在することが知られている。ＦＧＦＲ４アイソフォーム１は全長８０２アミノ酸からなるＦＧＦＲ４であり、例えば、野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ４アイソフォーム２は全長７６２アミノ酸からなるＦＧＦＲ４であり、例えば、野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム２は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ４のアイソフォーム１及び２は、その細胞膜内領域において共通のチロシンキナーゼドメインを有する。本明細書中で使用される場合、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメインとは、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１のアミノ酸第４５４〜７６４位、アイソフォーム２のアミノ酸第４１４〜７２４位にそれぞれ対応する、３１１アミノ酸からなる領域を意味する。野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム１及び２のチロシンキナーゼドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。
【００２２】
本発明の方法における検出対象となる変異（「検出対象変異」とも称する）は、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメイン内の変異であり、具体的には、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異である。本検出対象変異の代表的な例としては、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異が挙げられる。本検出対象変異は、ＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域における変異に起因し、従って、本発明の方法において遺伝子変異の存在を検出してもよい。このような遺伝子変異の代表的な例としては、配列番号１３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の２４４番目のアラニンからグアニンへの変異又は２４６番目のシトシンからアラニンへの変異が挙げられる。
【００２３】
前述の検出対象変異は、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１においては５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異に対応し、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２においては４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異に対応する。また、これらの変異にそれぞれ対応するＦＧＦＲ４遺伝子における変異としては、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異が挙げられる。
【００２４】
本発明の方法における検出対象変異のより具体的な例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異が挙げられる。また、これらに対応するＦＧＦＲ４遺伝子における変異の例としては、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異、配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異が挙げられる。
【００２５】
本明細書中、前記ＦＧＦＲ４におけるアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）への変異をＮＤ−ＦＧＦＲ４、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）の変異をＮＫ−ＦＧＦＲ４とも称する。本発明の方法においては、検出対象変異を有するタンパク質（「変異型タンパク質」とも称する）又は検出対象変異を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（「変異型ポリヌクレオチド」とも称する）のいずれを検出対象としてもよい。変異型タンパク質の例としては、ＮＤ−ＦＧＦＲ４については、配列番号６又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、ＮＫ−ＦＧＦＲ４については、配列番号８又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、変異型ポリヌクレオチドの例としては、ＮＤ−ＦＧＦＲ４については、配列番号５又は配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＮＫ−ＦＧＦＲ４については、配列番号７又は配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
本発明の検出方法において変異型ポリヌクレオチドの存在を検出する場合、本検出工程は、被験者から得た試料のゲノムＤＮＡ中の変異型ポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、変異型ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施できる。ゲノムＤＮＡの抽出、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は当該分野で公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。
【００２７】
本検出工程は、当該分野で公知の遺伝子変異解析方法を使用することができる。例えば、本検出工程は、被験者から得た試料由来の核酸（例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡ等）に対して公知の核酸増幅方法（ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ  ＴＭＡ  ｓｙｓｔｅｍ）等）を用いて、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異に対応する部分を含む領域（「検出対象変異領域」とも称する）を増幅させる工程を含み、増幅後、この増幅産物について配列決定を行うことによって変異の有無を確認することができる。このような配列決定法としては、ダイレクトシーケンス法等の当該分野で公知の方法を使用することができる。
【００２８】
前述の核酸増幅方法に用いられるプライマーは、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるものであれば、特には限定されず、変異型ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。プライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用してできる。また、増幅産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００２９】
核酸増幅方法を用いる別の公知の遺伝子変異解析方法として、ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型解析法）、ＴａｑＭａｎ法、アレル特異的プライマーＰＣＲ（ＡＳＰ−ＰＣＲ）法、ＳＳＣＰ法等のＰＣＲに基づく方法も使用可能である。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲにより検出対象変異領域を増幅した後、変異に基づき制限酵素認識部位に変化が生じる場合に、その制限酵素処理後の核酸断片の差異を電気泳動により解析する。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端に蛍光物質（ＦＡＭ、ＶＩＣ等）、３’末端にクエンチャー（消光）物質で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に添加する方法である。本方法では、検出対象変異領域に対してＴａｑＭａｎプローブをハイブリダイズさせ、プライマーからのＰＣＲ反応を行うと、伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが分解され、それにより蛍光物質がプローブより遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光物質から蛍光が発し、これにより目的の変異が検出される。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、３’末端に検出対象変異部位を有するようにプライマーを設計し、ＰＣＲによる核酸増幅の有無を検出する方法である。ＳＳＣＰ法では、検出対象変異領域をＰＣＲ増幅した後、一本鎖ＤＮＡに分離し、これを非変性ゲルでの電気泳動により分離する。変異によりＤＮＡの高次構造が変化し、これがゲル上の移動度の差異を反映する。
【００３０】
また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プローブハイブリダイゼーションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＤＮＡチップ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、融解曲線解析法等が挙げられる。ＤＮＡチップ法では、検出対象変異領域を含むＤＮＡを基板上に配置し、被験者由来の核酸をＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無を確認する。Ｉｎｖａｄｅｒ法では、検出対象変異部位の前後にハイブリダイズする２種の核酸（Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ及びシグナルプローブ）を被験者由来の核酸に反応させた後、形成されるＤＮＡの三重鎖構造を認識するＣｌｅｖａｓｅ酵素を作用させ、シグナルプローブ中のＦｌａｐを遊離させる。次いで、Ｆｌａｐが検出用ＦＲＥＴ  Ｐｒｏｂｅとハイブリダイズし、これに同酵素が再度作用し、ＦＲＥＴ  Ｐｒｏｂｅから遊離された蛍光物質の蛍光を検出する。融解曲線解析法は、検出対象変異領域に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、温度上昇に伴う蛍光の変化を測定して融解曲線を作成する。これにより、変異の有無に伴う融解温度の変化を確認する。
【００３１】
また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プライマーエクステンションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、検出対象変異部位に隣接するプライマーと蛍光標識したｄｄＮＴＰを用い、プライマーから一塩基のみを伸長させて取り込まれた塩基を検出する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、プライマー伸長反応において、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、ポリメラーゼの反応によりｄＮＴＰが取り込まれるとピロリン酸が生じる。生じたピロリン酸をルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光ピークパターンから塩基配列を決定する。
【００３２】
当業者であれば、使用する遺伝子変異解析方法に基づいて、使用されるプライマー及びプローブを適宜設計することができ、特に限定されることはないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００３３】
本発明の検出方法においては、被験者から得た試料中の変異型タンパク質の存在を検出してもよく、例えば、変異型タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施できる。このような抗体の作製及び抗体を用いたタンパク質の検出は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００３４】
本発明の方法において、検出対象変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者が乳癌に罹患している可能性が高いと判定できる。また、後記実施例に示されるように、当該変異はトリプルネガティブ乳癌患者において高い割合で確認されるため、本発明の方法において、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者がトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いとも判定できる。トリプルネガティブ乳癌とは、乳癌原因遺伝子であるエストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲ）、プロゲステロン受容体（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＲ）、上皮細胞増殖因子受容体２型（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２；ＨＥＲ２）の過剰発現がいずれも認められないタイプの乳癌である。それゆえ、確立した治療方針がなく予後不良であり、アンメットメディカルニーズが非常に高い癌種である。従って、本発明の方法においては、乳癌患者を被験者として、当該被験者におけるトリプルネガティブ乳癌の存在を検出してもよい。また、当該変異陽性の乳癌を有する被験者（患者）は、ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適用対象となり得る。
【００３５】
本発明の検出方法は、被験者における乳癌（より詳細には、トリプルネガティブ乳癌）の診断方法に使用することができる。本発明の診断方法は、本発明の検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者が乳癌又はトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。
【００３６】
《本発明のプライマーセット、プローブ、検出用キット》
本発明のプライマーセットは、被験者における乳癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
【００３７】
好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域、あるいは配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。
【００３８】
本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下（１）〜（６）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０４から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（２）配列番号１の塩基番号１から１６０４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（３）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（４）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８４から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（５）配列番号３の塩基番号１から１４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（６）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００３９】
より好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号１３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の２４４番目、２４６番目又はそれら両方の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含み、具体的な態様としては、以下（１）〜（３）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１３の塩基番号１から２４３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２４５から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（２）配列番号１３の塩基番号１から２４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２４７から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（３）配列番号１３の塩基番号１から２４３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２４７から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００４０】
本発明のプライマーセットは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、本発明のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を含んでもよい。
【００４１】
本発明のプローブは、被験者における乳癌の存在を検出するためのプローブであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域にハイブリダイズすることができるように設計したプローブである。本発明のプローブは、変異型ポリヌクレオチド又はその相補鎖中の検出対象変異領域にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
【００４２】
好ましくは、本発明のプローブは、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異、あるいは配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異を含む領域にハイブリダイズするように設計される。
【００４３】
本発明のプローブは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、被験者から得た試料中の核酸に本発明のプローブをハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。
【００４４】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００４５】
前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマー及びプローブは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００４６】
本発明のプライマーセット及びプローブは、例えば、化学合成法によって当業者に容易に製造することができ、また、検出方法に応じて、蛍光標識等で標識化してもよい。
【００４７】
本発明の検出用キットは、被験者における乳癌又はトリプルネガティブ乳癌の存在を検出するためのキットであり、好ましくは、本発明のプライマーセット又は本発明のプローブの少なくとも１つを含む。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、前述の本発明の検出方法において使用することもできる。例えば、本発明の検出方法は、本発明のプライマーセットを用いて検出対象変異領域を増幅する工程を含んでもよく、本発明のプローブを検出対象変異領域にハイブリダイズさせる工程を含んでよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
【００４９】
［実施例１］  乳癌臨床検体におけるＮＤ変異ＦＧＦＲ４（ＮＤ−ＦＧＦＲ４）ポリヌクレオチドの発見
乳癌患者組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｂｒ０３１検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
【００５０】
次に、配列番号１５及び配列番号１６のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２；東洋紡社株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃３０秒、５２℃３０秒、６８℃３０秒を３５サイクル）を行った。その後、前述ＰＣＲ産物をカラム（ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｙｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて精製した。その後、配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを用いて、上記で得た精製ＰＣＲ産物を鋳型として、シークエンス反応を実施した（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。
【００５１】
この結果、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ_００２０１１．３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿２１３６４７．１）のコーディング領域（配列番号１）における１６０３番目、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２２９６３．２）のコーディング領域（配列番号３）における１４８３番目にそれぞれ対応する位置での、アラニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換が見いだされた。この変異は、アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号２）における５３５番目、アイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号４）における４９５番目にそれぞれ対応するアミノ酸位置での、アスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）への変異に相当する。このＦＧＦＲ４における変異をＮＤ−ＦＧＦＲ４とも称する。
【００５２】
［実施例２］  乳癌臨床検体におけるＮＫ変異ＦＧＦＲ４（ＮＫ−ＦＧＦＲ４）ポリヌクレオチドの発見
乳癌患者組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｂｒ０３６検体ＲＮＡに対して、実施例１と同様の方法を用いてｃＤＮＡを合成した。
【００５３】
次に、得られたｃＤＮＡを鋳型として、実施例１と同じプライマー及び反応条件でＰＣＲを行った。その後、実施例１と同様に、ＰＣＲ産物をカラムを用いて精製した後、同じプライマーを用いてＰＣＲ産物についてシークエンス反応を実施した。
【００５４】
この結果、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１のコーディング領域（配列番号１）における１６０５番目、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２のコーディング領域（配列番号３）における１４８５番目にそれぞれ対応する位置での、シトシン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換が見いだされた。この変異は、アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号２）における５３５番目、アイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号４）における４９５番目にそれぞれ対応するアミノ酸位置での、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）への変異に相当する。このＦＧＦＲ４における変異をＮＫ−ＦＧＦＲ４とも称する。
【００５５】
［実施例３］  乳癌サンプルにおけるＮＤ−ＦＧＦＲ４の検出
乳癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）１４９サンプルに対して、実施例１と同じ方法を用いて、ＮＤ−ＦＧＦＲ４変異の有無を確認した。
【００５６】
その結果、サンプルＢｒ０３１及びＢｒ０３２において、前述のＮＤ−ＦＧＦＲ４変異が見出された。非常に興味深いことに、これらＮＤ変異陽性乳癌検体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、上皮細胞増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）の強発現を認めないトリプルネガティブ乳癌検体であった。
【００５７】
以上から、上記方法により、乳癌臨床検体由来の試料中のＮＤ−ＦＧＦＲ４の存在を検出することができ、ＮＤ−ＦＧＦＲ４の陽性患者を選択できることが示された。
【００５８】
［実施例４］  乳癌サンプルにおけるＮＫ−ＦＧＦＲ４の検出
乳癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）１４９サンプルに対して、実施例１と同じ方法を用いて、ＮＫ−ＦＧＦＲ４変異の有無を確認した。
【００５９】
その結果、サンプルＢｒ０３６、Ｂｒ０８２及びＢｒ１４５において、前述のＮＫ−ＦＧＦＲ４変異が見出された。非常に興味深いことに、これらＮＫ変異陽性乳癌検体も、前述と同様に、トリプルネガティブ乳癌検体であった。
【００６０】
以上から、上記方法により、乳癌臨床検体由来の試料中のＮＫ−ＦＧＦＲ４の存在を検出することができ、ＮＫ−ＦＧＦＲ４の陽性患者を選択できることが示された。
【００６１】
［実施例５］  野生型及び変異体ＦＧＦＲ４のクローニング
ＮＤ−ＦＧＦＲ４及びＮＫ−ＦＧＦＲ４変異をそれぞれ含むＦＧＦＲ変異体のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、ＦＧＦＲ４（アイソフォーム１）をクローニングした。配列番号１９（制限酵素サイトとして、ＳｐｅＩを含む）及び配列番号２０（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）のプライマーにて、全長ＦＧＦＲ４（ＵｌｔｉｍａｔｅTM  ＯＲＦＣａｒｄ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ  ＩＯＨ１３３７１：ライフテクノロジーズ社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした（ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬ）。
【００６２】
次に、ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬを鋳型に、配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社）にて、ＮＤ変異（Ｎ５３５Ｄ）を導入した（Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬ）。作製したＮ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号５及び配列番号６にそれぞれ示す。同様に、ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬを鋳型に、配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法にて、ＮＫ変異（Ｎ５３５Ｋ）を導入した（Ｎ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬ）。作製したＮ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示す。
【００６３】
［実施例６］  野生型及び変異体ＦＧＦＲ４のレンチウイルス発現ベクターの作製
ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬをＳｐｅＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＳｐｅＩ、ＳａｌＩ消化したレンチウイルス発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５−ＴＯＰＯ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＳｐｅＩ−ＳａｌＩサイトにクローニングした（ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３と命名）。同様の手法にて、Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬ及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ  ＸＬから、各レンチウイルス発現ベクターＮ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３をそれぞれ構築した。
【００６４】
上記、ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３、Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３、及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３をそれぞれ３μｇ、パッケージング用プラスミド９μｇ（ＶｉｒａＰｏｗｅｒTM  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）と共に、トランスフェクション試薬（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２０００；ライフテクノロジーズ社）を用いて、２９３ＦＴ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レンチウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）及びＢｌａｓｔｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続け、野生型ＦＧＦＲ４、Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４、及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４をそれぞれ安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（それぞれ、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３と命名）を取得した。
【００６５】
［実施例７］  変異体ＦＧＦＲ４の足場非依存的増殖亢進作用の検討
９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３を、それぞれ１ウェル当り３×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）および６日後（Ｄａｙ６）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏTM  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｄａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントが増加しなかったのに対して、Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｄａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントの増加が確認された。以上から、ＮＤ−ＦＧＦＲ４及びＮＫ−ＦＧＦＲ４を有する変異体ＦＧＦＲ４は足場非依存的細胞増殖を亢進させる作用を有することが明らかとなった。
【００６６】
［実施例８］  変異体ＦＧＦＲ４の腫瘍形成能の検討
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を検討するため本細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍形成能を検討した。Ｎ５３５Ｄ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３及びＮ５３５Ｋ−ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に３ｘ１０6個ずつ接種し８日観察したところ腫瘍形成が確認された。以上から、ＮＤ−ＦＧＦＲ４及びＮＫ−ＦＧＦＲ４は癌の原因遺伝子であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の検出方法は、被験者における乳癌（特にはトリプルネガティブ乳癌）を検出に有用である。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の検出方法に用いることができる。
【配列表】
2014087258000001.app