(57)【要約】      （修正有）【課題】コリン型プラズマローゲンに作用することができ、またリゾホスファチジルコリンに作用してリゾホスファチジン酸を安価に製造することができ、さらに取り扱いやすい微生物から得られるホスホリパーゼＤ、ポリヌクレオチド、ホスホリパーゼＤの製造方法の提供。【解決手段】ホスホリパーゼＤは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の３位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む。（ａ）特定な配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド。（ｂ）特定な配列からなるアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。（ｃ）特定な配列からなるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリパーゼＤであって、前記ホスホリパーゼＤは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の３位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、ホスホリパーゼＤ：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド；又は
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。
【請求項２】
リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、ｐＨ５．６で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、ｐＨ４．４からｐＨ７．２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す、請求項１に記載のホスホリパーゼＤ。
【請求項３】
リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、３７℃から８０℃の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す、請求項１又は２に記載のホスホリパーゼＤ。
【請求項４】
コリン型プラズマローゲンを基質とした場合に、トリトンＸ−１００（濃度０％）の非存在下、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、前記条件での加水分解活性（相対活性）が、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して８０％以下、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して７０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン（ＬＰＬＳ−ＰＣ）に対して１５％以下、スフィンゴミエリン（ＳＭ）に対して１０％以下、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）に対して１％以下であり、トリトンＸ−１００（濃度０．１％）の存在下、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、前記条件での加水分解活性が、リゾホスファチジルコリンに対して５％以下、ホスファチジルコリンに対して６０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン、スフィンゴミエリン及びグリセロール−３−ホスホコリンに対して２％以下である基質特異性を有する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のホスホリパーゼＤ。
【請求項５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が５０，０００〜６０，０００の範囲内である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載のホスホリパーゼＤ。
【請求項６】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のホスホリパーゼＤ。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のホスホリパーゼＤをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する微生物からホスホリパーゼＤを産生させる工程を含む、ホスホリパーゼＤの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の３位リン酸ジエステルを加水分解してコリンなどを遊離させる作用を有する新規なホスホリパーゼＤ、前記ホスホリパーゼＤをコードするポリヌクレオチド、前記ホスホリパーゼＤの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リゾリン脂質は、酵素であるホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂなどの加水分解作用によって、基質であるリン脂質から生成される化合物であり、細胞内で代謝に深く関わっていることが知られている。
【０００３】
特にリゾホスファチジルコリンに作用する酵素であるリゾホスホリパーゼＤは、別名オートタキシン（ＡＴＸ：Autotaxin）として知られ、癌細胞の運動性を促進するだけでなく、ホストの血管形成を促進することにより癌の形成に深く関与することが知られている。オートタキシンにより生成されるリゾホスファチジン酸が信号の役割をしていることも知られている。
【０００４】
そして、血清、血漿中のリゾホスファチジルコリンは動脈硬化と相関があり、リゾホスファチジン酸は発毛を促進する効果があることも発見されている。
【０００５】
動脈硬化と相関がある血清、血漿中のリゾホスファチジルコリンを定量する方法として酵素法が知られているが、微生物由来酵素が見つかっていないため、従来は酵素を高コストで製造しているものと考えられる。また、従来のリゾホスファチジン酸の製造方法も、高コストな天然物からの抽出法である。
【０００６】
また、アルツハイマー型認知症とコリン型プラズマローゲンの血中濃度とは相関があるので、コリン型プラズマローゲンに作用するホスホリパーゼＤが発見されれば、体外診断薬酵素として利用可能であると期待されている。しかし、コリン型プラズマローゲンに作用するホスホリパーゼＤはこれまで発見されていない。
【０００７】
特許文献１に記載の酵素は、ラット由来のものであり、大量生産が難しく、活性も極めて低い。また、選択性が低くスフィンゴミエリンにも作用するため定量性が低いと予想される。そこで、安全で安価な微生物由来の酵素で、活性及び選択性が高い酵素が開発できれば、体外診断薬用酵素への応用が期待できると考えられる。
【０００８】
特に微生物由来ではBacillus cereus, Clostridiumperfringens, Actinomadura sp.の酵素が知られている。前二者は病原性微生物であり、Actinomadurasp.は放線菌であるが、これらの酵素のアミノ酸配列は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００２／０５３５６９号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 51 (9),2515-2524, 1987  Purification and Properties ofPhospholipase D from Actinomadura sp. Strain No. 362
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、トリトンＸ−１００の非存在下ではリゾホスファチジルコリンに作用し、トリトンＸ−１００の存在下ではリゾホスファチジルコリンに作用しない酵素であることを利用して、コリン型プラズマローゲンを選択的に測定することが可能であり、取り扱いやすい微生物から得られるホスホリパーゼＤ、ポリヌクレオチド、ホスホリパーゼＤの製造方法を提供することを目的とするものである。さらに、上記の性質を利用して、リゾホスファチジン酸を安価に製造することもできるホスホリパーゼＤ、ポリヌクレオチド、ホスホリパーゼＤの製造方法を提供することも目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記のような新規なホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）を得ることを目的として、このような酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有するホスホリパーゼＤを見出した。
【００１３】
［ホスホリパーゼＤ］
本発明に係るホスホリパーゼＤは、リン脂質（リゾリン脂質も含む）のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断する酵素であり、特にコリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の３位リン酸ジエステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有するものである。さらに本発明に係るホスホリパーゼＤは、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む。
【００１４】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド；又は
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。
【００１５】
前記ホスホリパーゼＤの好ましい形態は、リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、ｐＨ５．６で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、ｐＨ４．４からｐＨ７．２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
【００１６】
前記ホスホリパーゼＤの好ましい形態は、リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、３７℃から８０℃（より好ましくは３７℃から７５℃）の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示す。
【００１７】
前記ホスホリパーゼＤの好ましい形態は、コリン型プラズマローゲンを基質とした場合に、トリトンＸ−１００（濃度０％）の非存在下、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、前記条件での加水分解活性（相対活性）が、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して８０％以下、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して７０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン（ＬＰＬＳ−ＰＣ）に対して１５％以下、スフィンゴミエリン（ＳＭ）に対して１０％以下、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）に対して１％以下であり、トリトンＸ−１００（濃度０．１％）の存在下、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、前記条件での加水分解活性が、リゾホスファチジルコリンに対して５％以下、ホスファチジルコリンに対して６０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン、スフィンゴミエリン及びグリセロール−３−ホスホコリンに対して２％以下である基質特異性を有する。なお、ＰＣの一例はＰＯＰＣである。またグリセロホスホコリンは、グリセロール−３−ホスホコリンの略称であり、グリセロール−３−ホスホコリンは、別称として、グリセロ−３−ホスホコリン、ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリンとも呼ばれる。
【００１８】
前記ホスホリパーゼＤの好ましい形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が５０，０００〜６０，０００の範囲内である。
【００１９】
前記ホスホリパーゼＤの好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
【００２０】
［ポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、前記ホスホリパーゼＤをコードする。
【００２１】
前記ポリヌクレオチドの好ましい形態は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む。
【００２２】
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【００２３】
前記ポリヌクレオチドの好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
【００２４】
［ホスホリパーゼＤの製造方法］
本発明に係るホスホリパーゼＤの製造方法は、前記ポリヌクレオチドを有する微生物からホスホリパーゼＤを産生させる工程を含む。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質（例えばリゾホスファチジルコリン）に対して加水分解作用を有する基質特異性の高い新規なホスホリパーゼＤを提供することが可能になる。また、このホスホリパーゼＤを微生物によって効率よく生産する方法を提供することができる。また、このホスホリパーゼＤはリゾホスファチジルコリンの分析に利用できるだけでなく、トリトンＸ−１００の存在下（特に濃度０．１％以上）ではリゾホスファチジルコリンに対する活性が著しく抑制されるため、リン脂質の混合試料中のコリン型プラズマローゲンの分析も効率よく行うことができる。また、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の分解反応を産業的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）培養液から得られた精製画分（ホスホリパーゼＤ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】ｐＨ５．６、６５℃、トリトンＸ−１００（Triton X-100）の濃度が０％又は０．１％となる反応条件において、ホスホリパーゼＤのＰＬＳ−ＰＣに対する酵素活性を１００％とした場合の他の基質（ＬＰＣ、ＰＯＰＣ、ＬＰＬＳ−ＰＣ、ＳＭ、ＧＰＣ）に対するホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【図３】ｐＨ７．５、６５℃、トリトンＸ−１００（Triton X-100）の濃度が０％となる反応条件において、ホスホリパーゼＤのＰＬＳ−ＰＣに対する酵素活性を１００％とした場合の他の基質（ＬＰＣ、ＰＯＰＣ、ＬＰＬＳ−ＰＣ、ＳＭ、ＧＰＣ）に対するホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフ、及び、ｐＨ７．５、６５℃、トリトンＸ−１００（Triton X-100）の濃度が０．１％となる反応条件において、ホスホリパーゼＤのＰＯＰＣに対する酵素活性を１００％とした場合の他の基質（ＬＰＣ、ＰＬＳ−ＰＣ、ＬＰＬＳ−ＰＣ、ＳＭ、ＧＰＣ）に対するホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【図４】リゾホスファチジルコリンを基質とし、ｐＨ５．６、６５℃におけるホスホリパーゼＤの酵素活性を１００％とした場合の他の温度におけるホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【図５】リゾホスファチジルコリンを基質とし、ｐＨ５．６、６５℃におけるホスホリパーゼＤの酵素活性を１００％とした場合の他のｐＨにおけるホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【図６】ｐＨ５．６で３０分間保温後のホスホリパーゼＤの４℃における残存活性を１００％とした場合の他の温度におけるホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【図７】４℃で１２時間保温後のホスホリパーゼＤのｐＨ７．２における残存活性を１００％とした場合の他のｐＨにおけるホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【図８】トリトンＸ−１００（Triton X-100）の濃度が０％におけるホスホリパーゼＤのリゾホスファチジルコリンに対する酵素活性を１００％とした場合の他の濃度におけるホスホリパーゼＤの相対活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
［酵素］
本明細書において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われる。それにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
【００２８】
本明細書において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、細胞融合又は遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、及び遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
【００２９】
［ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）］（ＥＣ３．１．４．４）
本発明に係るホスホリパーゼＤは、リン脂質及びその加水分解物であるリゾリン脂質のリン酸ジエステル結合のうちグリセロール骨格とは反対側の結合を切断して、ホスファチジン酸とアルコール（コリンなど）を生成する酵素である。特に本発明に係るホスホリパーゼＤは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の３位リン酸ジエステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有するものである。
【００３０】
すなわち、本発明に係るホスホリパーゼＤは、基質としてコリン型プラズマローゲン又はリゾホスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine、ＬＰＣ）を用いる場合、以下の反応式で示す加水分解反応を触媒する。
【００３１】
【化１】
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上記のように、本発明に係るホスホリパーゼＤは、コリン型プラズマローゲンを加水分解して、アルケニルエーテル脂質（化合物１）とコリンとを生成させる。
【００３２】
また本発明に係るホスホリパーゼＤは、リゾホスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine、ＬＰＣ）を加水分解して、リゾホスファチジン酸（Lysophosphatidic acid、LPA）とコリンとを生成させる。
【００３３】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、従来のホスホリパーゼＤとは異なった次のような特有の基質特異性を有する。すなわち、コリン型プラズマローゲン（ＰＬＳ−ＰＣ）を基質とした場合に、トリトンＸ−１００（濃度０％）の非存在下、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、前記条件での加水分解活性（相対活性）が、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して８０％以下、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して７０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン（ＬＰＬＳ−ＰＣ）に対して１５％以下、スフィンゴミエリン（ＳＭ）に対して１０％以下、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）に対して１％以下である。またトリトンＸ−１００（濃度０．１％）の存在下、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、前記条件での加水分解活性（相対活性）が、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して５％以下、ホスファチジルコリン（ＰＣ）に対して６０％以下、コリン型リゾプラズマローゲン（ＬＰＬＳ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）及びグリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）に対して２％以下である。なお、ＰＣの一例はＰＯＰＣである。
【００３４】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の３位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含むものである。
【００３５】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド；又は
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。
【００３６】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、例えば、コリン型プラズマローゲン又はリゾリン脂質との反応条件下においては、約１０〜９０℃（好ましくは２５〜９０℃）の範囲内で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約３５〜８０℃の範囲内であり、より好ましくは５０〜７０℃の範囲内であり、さらにより好ましくは約６５℃である。
【００３７】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、例えば、リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、ｐＨ５．６で６５℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、３７℃から８０℃（より好ましくは３７℃から７５℃）の範囲内で５０％以上の加水分解活性（相対活性）を示すことが好ましい。
【００３８】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、基質であるコリン型プラズマローゲン又はリゾリン脂質に作用させる場合、例えば、緩衝液として酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）を用い、６５℃の温度の反応条件下におくと、酵素活性が最大に近くなる。緩衝液としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ＨＥＰＥＳなども使用することができる。
【００３９】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、例えば、リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、ｐＨ５．６で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％としたときに、ｐＨ４．４からｐＨ７．２の範囲内で５０％以上の加水分解活性を示すことが好ましい。至適ｐＨは、ｐＨ５からｐＨ６付近とすることができる。
【００４０】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が５０，０００〜６０，０００（Ｄａ）の範囲内を示すことが好ましい。例えば、ストレプトマイセス属由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約５４ｋＤａを示すものが得られている。
【００４１】
本発明に係るホスホリパーゼＤの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端の１位から３０位までの配列はシグナル配列であると考えられる。
【００４２】
本発明に係るホスホリパーゼＤは、ＰＬＤ活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１個若しくは複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、及び／又は付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本明細書において、置換、欠失、挿入、及び／又は付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、ＰＬＤ活性を有する限り、上記の酵素（ＰＬＤ）に含まれる。
【００４３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（タンパク質）も、ＰＬＤ活性を有する限り、上記の酵素（ＰＬＤ）に含まれる。ＰＬＤは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
【００４４】
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
【００４５】
ＰＬＤの供給源は特に限定されるものではないが、ＰＬＤは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくはストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）が挙げられる。また、近縁の菌株、例えば、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）及びストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）なども、ＰＬＤ活性を有する酵素が得られる可能性がある。これらの菌株は近縁であることから同種の活性のＰＬＤが得られやすいものと考えられる。
【００４６】
例えば、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５）は適当な栄養培地で液体培養することにより、上記の酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをＰＬＤ酵素製剤として製造することができる。
【００４７】
ＰＬＤ酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ＰＬＤを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然又は人為的変異株や、ＰＬＤ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもＰＬＤの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のＰＬＤを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。さらにメタゲノム解析によって得られた遺伝子や全合成された遺伝子であっても、上記ＰＬＤ活性を有し、９０％以上の配列相同性を示せば、当業者に周知の手法で遺伝子を組換え、ＰＬＤの生産に利用できる。
【００４８】
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４を用いたＰＬＤ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
【００４９】
この菌は栄養培地で液体培養することにより、上記の酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したり、又はこの処理物を固定化したりするなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、上記の酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、有機酸（例えば、酢酸やクエン酸等）又はその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第一鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜３７℃であることが好ましい。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌又は振とうしながら行うことができる。
【００５０】
ＰＬＤは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、上記酵素（ＰＬＤ）は、ＨＰＬＣ分析及びゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定できる。
【００５１】
本発明に係るＰＬＤは、トリトンＸ−１００の非存在下ではリゾホスファチジルコリンに作用し、トリトンＸ−１００の存在下ではリゾホスファチジルコリンには作用しないという性質を有する。この性質を利用して、コリン型プラズマローゲンを選択的に測定することが可能である。しかもこの酵素は、取り扱いやすい微生物から効率よく得ることができる。さらに、上記性質を利用すればリゾホスファチジン酸を安価に製造することもできる。
【００５２】
このように、本発明に係るＰＬＤは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質（例えばリゾホスファチジルコリン）に対して加水分解作用を有する基質特異性の高い新規な酵素である。またこのＰＬＤは、リゾホスファチジルコリンの分析に利用することができるだけではなく、特に０．１％以上の濃度のトリトンＸ−１００の存在下ではリゾホスファチジルコリンに対する活性が著しく抑制されるため、リン脂質の混合試料中のコリン型プラズマローゲンの分析も効率よく行うことができる。さらに、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の分解反応を産業的に利用することもできる。
【００５３】
［ＰＬＤをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のＰＬＤをコードするものである。このポリヌクレオチドは、好ましくは、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【００５４】
上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。上記のＰＬＤをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から１６１７位までの塩基配列（塩基数１６１７ｂｐ）を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすることができ、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＰＬＤの好ましい形態を構成する。なお、配列番号１の１位から３位までのｔｔｇは開始コドン（レアコドン）として翻訳されていると推定される。
【００５５】
上記のＰＬＤをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸を含み、かつＰＬＤ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、及び／又は付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記の微生物、好ましくはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、さらに好ましくはストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングを用いることができる。
【００５７】
また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成して得ることもできる。また、上記の塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記ＰＬＤをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列又はその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のＰＬＡ１をコードするポリヌクレオチドを単離することができる。
【００５８】
さらに、上記の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＰＬＤをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。同様に、環境中から抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＰＬＤをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。
【００５９】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、又は１００個の連続した配列を１つ又は複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００６０】
さらに、上記のＰＬＤをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＰＬＤ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上記で説明したとおりである。
【００６１】
また、上記のＰＬＤをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつＰＬＤ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定及び検索についても、上記で説明したとおりである。
【００６２】
上記のＰＬＤをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種又は異種の宿主中で発現され得る。
【００６３】
［ホスホリパーゼＤの製造方法］
本発明では、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質（例えばリゾホスファチジルコリン）に対して加水分解作用を有する酵素を製造する方法が提供される。酵素の製造方法においては、上記で説明したポリヌクレオチドを有する微生物から上記の酵素を産生させる工程を含んでいる。本発明による方法では、上記で説明したＰＬＤが得られる。上記のポリヌクレオチドを有する微生物は、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）のように微生物自体が天然に有するものであってもよく、あるいは、変異してポリヌクレオチドを有するものであってもよく、あるいは、ポリヌクレオチドが導入されて有するものであってもよい。
【００６４】
ポリヌクレオチドの導入においては、ベクター、形質転換体などが利用され得る。このベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むものである。また、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することにより、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質に対して加水分解作用を有する能力を保有する形質転換体を作製することができる。
【００６５】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。
【００６６】
微生物中で、ＰＬＤをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。この時使用するシグナル配列は上記のＰＬＤのものでもその他のものでもよい。
【００６７】
形質転換の対象となる宿主は、上記のＰＬＤをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、ＰＬＤ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
【００６８】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。
【００６９】
得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤（ＰＬＤ）の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したＰＬＤを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してＰＬＤ酵素製剤を製造することができる。
【００７０】
宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンを含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。
【００７１】
［ＰＬＤの利用］
以上のようにして生産され得るＰＬＤは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質（例えばリゾホスファチジルコリン）と特異的に反応する酵素である。そのため、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の分析に用いることができ、簡易比色定量などを行うことができる。例えば、血清中などに存在するコリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質を正確に定量することが可能になる。また、育毛成分としての利用が期待できるリゾホスファチジン酸を安価に製造することもできる。
【００７２】
また本発明に係るＰＬＤを用いると、次のような（１）〜（３）の手順でコリン型プラズマローゲンとＰＣとリゾホスファチジルコリンとを選択的に測定することが可能となる。
【００７３】
（１）コリン型プラズマローゲン、ＰＣ、リゾホスファチジルコリンなどを含む混合溶液を、コリン型プラズマローゲンには作用しないホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）で処理する。
【００７４】
（２）コリン型プラズマローゲンはそのまま残存する。ＰＣはリゾホスファチジルコリン又はグリセロール−３−ホスホコリンに変換される。リゾホスファチジルコリンはそのまま残存するか、グリセロール−３−ホスホコリンに変換される。
【００７５】
（３）コリン型プラズマローゲンのみが残存する場合、本発明に係るＰＬＤにより定量することが可能である。コリン型プラズマローゲンとリゾホスファチジルコリンとが共存する場合、トリトンＸ−１００（特に濃度０．１％以上）の存在下で酵素反応を行えば、コリン型プラズマローゲンのみを定量することが可能である。
【００７６】
さらに本発明に係るＰＬＤを用いると、次のような（４）〜（６）の手順でコリン型プラズマローゲンとリゾホスファチジルコリンとを選択的に測定することが可能となる。
【００７７】
（４）コリン型プラズマローゲン、リゾホスファチジルコリンなどを含む混合溶液に対して、トリトンＸ−１００の非存在下（濃度０％）及びトリトンＸ−１００の存在下（特に濃度０．１％以上）の２通りで酵素反応を行う。
【００７８】
（５）トリトンＸ−１００の非存在下ではコリン型プラズマローゲン及びリゾホスファチジルコリンの両方の合計として定量され、トリトンＸ−１００の存在下ではコリン型プラズマローゲンのみが定量される。
【００７９】
（６）トリトンＸ−１００の非存在下で定量された量からトリトンＸ−１００の存在下で定量された量を差し引くことにより、リゾホスファチジルコリンを定量することが可能である。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８１】
［ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来酵素の精製］
ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４を培養し、その培養上清について、硫安分画、陰イオン交換、疎水相互作用、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。以下に詳細を示す。
【００８２】
（ａ）培養
３％トリプチックソイ培地（べクトン・ディンキンソン社製）６００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。予め平板培地に生育したストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＮＡ６８４のコロニーを適当量とり、３％トリプチックソイ培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で４８時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収した。
【００８３】
（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、８０％（ｗ／ｖ）飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で溶解し透析して粗酵素液を得た。
【００８４】
（ｃ）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液に終濃度で１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ  トリス−塩酸（Tris-HCl）緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム（内径２６ｍｍ、高さ３８ｍｍ、東ソー社製）にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウム（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【００８５】
（ｄ）Ｍｏｎｏ  Ｑ
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ  Ｑ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【００８６】
（ｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化した「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００」（２４ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でサイズ排除クロマトグラフィーを行い、活性画分を溶出させた。
【００８７】
以上のようにして、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomycessp.）ＮＡ６８４株より、精製酵素を得た。なお、精製酵素が単一であることは、分子量測定において単一のバンドが測定されたことで確認した。また、この酵素は、ゲル濾過クロマトグラフィー分析によって５４ｋＤａのポリペプチドの単量体として機能していると推定された。
【００８８】
表１にＰＬＤ精製における収量、収率等を示す。
【００８９】
【表１】
2014082991.tif 000003
［ＰＬＤの分子量の測定］
（分子量）
上記によって得た精製酵素（ＰＬＤ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析した。
【００９０】
図１は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。図の左側のレーンは、分子量マーカー（Ｍ）であり、図の右側のレーンは、溶出画分（ＰＬＤ）のバンドを示す。図１に示すように、溶出画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素を構成するポリペプチドの分子量は約５４，０００であった。なお、分子量の単位はＤａ（ダルトン）である。よって、ｋＤａ表記では、この酵素を構成するポリペプチドの分子量は約５４ｋＤａとなる。
【００９１】
［ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）由来酵素（ＰＬＤ）の性質の測定］
（酵素活性（ＰＬＤ活性）：基質特異性）
本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行った。この方法を、以下、「酵素活性標準測定方法」という。この方法では、リゾホスファチジルコリンを基質として用いた場合を例示する。基質（ＬＰＣ）８００μＭと、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＰＬＤ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を６５℃にて５分間酵素反応させた。反応後、ただちに１００℃、５分間の熱失活を行い、酵素反応を停止させた。反応液を２１，８００×ｇ、１分間の遠心分離にかけ、室温まで冷却した。そこに２００μＬの呈色試薬「０．０３％  ４−アミノアンチピリン、０．０２％  Ｎ，Ｎ−ビス（４−サルフォブチル）−３−メチルアニリン、５Ｕ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ、０．７５Ｕ／ｍＬ  コリンオキシダーゼ、５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）」を加え、３７℃、１０分間の呈色反応を行った。反応後、５５０ｎｍの吸光度を測定し、検量線から遊離したコリン濃度を算出した。なお、１分間に１μｍｏｌのコリンを遊離する酵素量を１Ｕ（ユニット）と定義した。
【００９２】
図２は、基質として次に示すものを用いたときの酵素活性を示すグラフである。このグラフでは、ＰＬＳ−ＰＣ（コリン型プラズマローゲン）に対する活性を１００％としたときの相対活性を示している。なお、反応液組成は、精製酵素（ＰＬＤ）試料（１０ｖ／ｖ％）、基質（８００μＭ）、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）、トリトンＸ−１００（０％又は０．１％）でｐＨ５．６、６５℃である。
【００９３】
図３は、基質として次に示すものを用いたときの酵素活性を示すグラフである。このグラフでは、トリトンＸ−１００が０％でＰＬＳ−ＰＣ（コリン型プラズマローゲン）に対する活性を１００％としたときの相対活性と、トリトンＸ−１００が０．１％でＰＯＰＣを１００％としたときの相対活性とを示している。なお、反応液組成は、精製酵素（ＰＬＤ）試料（１０ｖ／ｖ％）、基質（８００μＭ）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（５０ｍＭ）、トリトンＸ−１００（０％又は０．１％）でｐＨ７．５、６５℃である。
【００９４】
本明細書における基質について以下に示す（表２も参照）。
【００９５】
ＬＰＣ：Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン
ＰＯＰＣ：１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＰＬＳ−ＰＣ：１−（１Ｚ−オクタデセニル）−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＬＰＬＳ−ＰＣ：上記ＰＬＳ−ＰＣのリゾ体
ＳＭ：卵黄由来スフィンゴミエリン
ＧＰＣ：グリセロール−３−ホスホコリン
【００９６】
【表２】
2014082991.tif 000004
図２及び図３のグラフより、上記の精製酵素は、基質特異的に作用し、ＰＬＤ活性を示すことが確認された。
【００９７】
具体的には、図２のグラフから、ＰＬＤの加水分解活性は、ｐＨ５．６、６５℃、トリトンＸ−１００濃度０％、ＰＬＳ−ＰＣを基質としたときの活性を１００％とすると、ＬＰＣに対して７０〜８０％、ＰＯＰＣに対して６０〜７０％、ＬＰＬＳ−ＰＣに対して１０〜２０％、ＳＭに対して５〜１０％、ＧＰＣに対して０〜２％であった。
【００９８】
また図２のグラフから、ＰＬＤの加水分解活性は、ｐＨ５．６、６５℃、トリトンＸ−１００濃度０．１％、ＰＬＳ−ＰＣを基質としたときの活性を１００％とすると、ＬＰＣに対して３〜５％、ＰＯＰＣに対して５０〜６０％、ＬＰＬＳ−ＰＣに対して０〜１％、ＳＭに対して０〜５％、ＧＰＣに対して０〜５％であった。
【００９９】
また図３のグラフから、ＰＬＤの加水分解活性は、ｐＨ７．５、６５℃、トリトンＸ−１００濃度０％、ＰＬＳ−ＰＣを基質としたときの活性を１００％とすると、ＬＰＣに対して７０〜８０％、ＰＯＰＣに対して２０〜３０％、ＬＰＬＳ−ＰＣに対して０〜２％、ＳＭに対して０％、ＧＰＣに対して０％であった。
【０１００】
また図３のグラフから、ＰＬＤの加水分解活性は、ｐＨ７．５、６５℃、トリトンＸ−１００濃度０．１％、ＰＯＰＣを基質としたときの活性を１００％とすると、ＬＰＣに対して５〜１０％、ＰＬＳ−ＰＣに対して６０〜７０％、ＬＰＬＳ−ＰＣに対して０％、ＳＭに対して０％、ＧＰＣに対して０％であった。
【０１０１】
（酵素学的性質）
上記の精製酵素（ＰＬＤ）の酵素学的性質について検討した。
【０１０２】
（１）作用温度
基質（ＬＰＣ）８００μＭと、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６、各温度）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＰＬＤ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各温度条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１０３】
図４は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が６５℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図４のグラフに示されるように、この酵素は、２５〜８５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は６５℃付近（例えば５０〜７０℃）であった。
【０１０４】
（２）作用ｐＨ
基質（ＬＰＣ）８００μＭと、酢酸−酢酸ナトリウム、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ又はＨＥＰＥＳから選ばれる緩衝液（各ｐＨ、温度３７℃）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＰＬＤ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて５分間、酵素反応させた。その後の熱失活、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１０５】
図５は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが５．６である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図５のグラフから分かるように、この酵素は、ｐＨ４．４からｐＨ７．２という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは５．６付近（例えばｐＨ５．０〜６．０）であった。
【０１０６】
（３）温度安定性
基質（ＬＰＣ）８００μＭと、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６、各温度）５０ｍＭとの溶液にｐＨ５．６、各温度で３０分間保温した精製酵素（ＰＬＤ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を６５℃にて５分間反応させ、酵素反応を行った。その後の熱失活、呈色反応は「酵素活性標準測定方法」に従って行い、残存活性を測定した。図６は、種々の温度における残存活性を４℃における残存活性を基準（１００％）としたときの相対活性として示したグラフである。図６のグラフから分かるように、この酵素は６５℃までは完全に安定で７０℃においても８０％以上の高い残存活性を示した。
【０１０７】
（４）ｐＨ安定性
基質（ＬＰＣ）８００μＭと、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６、各温度）５０ｍＭとの溶液に４℃、各ｐＨで１２時間保温した精製酵素（ＰＬＤ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を６５℃にて５分間反応させ、酵素反応を行った。その後の熱失活、呈色反応は「酵素活性標準測定方法」に従って行い、残存活性を測定した。図７は、種々のｐＨにおける残存活性をトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）における残存活性を基準（１００％）としたときの相対活性として示したグラフである。図７のグラフから分かるように、この酵素はｐＨ５．５から９．５までは完全に安定でｐＨ５の酸性域においても８０％高い残存活性を示した。
【０１０８】
（５）トリトンＸ−１００（Triton X-100）の影響
基質（ＬＰＣ）６４０μＭと、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、３７℃）８０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＰＬＤ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらにトリトンＸ−１００を０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％添加して、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各温度条件にて５分間、酵素反応させた。その後の熱失活、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１０９】
図６は、トリトンＸ−１００を添加していない条件を１００％としたときの、各濃度でトリトンＸ−１００を添加した相対活性の結果である。
【０１１０】
［精製酵素の内部アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、目的とする酵素を切り出し、ゲル内消化を行った。そして、得られたサンプルについて質量分析計（ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。これにより、内部アミノ酸配列は、配列番号３、４に示すものであることが確認された。
【０１１１】
ここで、配列番号３は、配列番号２の３１位から４０位、配列番号４は、配列番号２の４８３位から４９１位までに示される配列となっている。
【０１１２】
［プライマーの作製］
プライマー（primer）の作製にあたっては、上記の内部アミノ酸配列（配列番号３、４）から、「Sense primer」と「Anti sense primer」を設計した。縮重コドンに関しては、Streptomyces属におけるコドン使用頻度が高いコドンを選択し、プライマー設計を行った。また、コドン使用頻度が同等のものに関しては、混合塩基プライマーとした。これにより、配列番号５に示すSense primer 1（以下「Ｓ１」ともいう）が得られた。また、配列番号６に示すAntisense primer 1（以下「Ａ１」ともいう）が得られた。ここで、配列中のｓはｃ又はｇ、ｗはａ又はｔ、ｙはｃ又はｔをそれぞれ表す。
【０１１３】
［ＰＣＲによるＰＬＤ遺伝子の解析］
Streptomyces sp.ＮＡ６８４を、ＹＥＭＥ培地（０．３％酵母エキス、０．５％ペプトン、０．３％麦芽エキス、１％グルコース、３４％シュークロース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％グリシン）３０ｍｌを用いて２８℃で４日間培養し、集菌した。次いで、この菌体を、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）および１ｍｇ／ｍｌリゾチームからなる溶液５ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩処理した。次に、これに７５０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５ｍｇのproteinase Kを添加し、５５℃で２時間処理した。この溶液にクロロホルム７．５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を５ｍｌ分取した。この水相に３ｍｌのイソプロパノールを添加混合してＤＮＡを回収し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液５００μｌに溶解した。これに、ＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μｌ加え攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。これにフェノール／クロロホルム混合液５００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。この水相に３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）５０μｌおよびエタノール１ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液２００μｌに溶解した。
【０１１４】
(Streptomyces sp.ＮＡ６８４由来ＰＬＤ遺伝子のコア領域のクローニング）
上記ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。上記実施例で得た鋳型染色体ＤＮＡ６０ｎｇ、１×KOD FX Neo Buffer、４００μＭ  ｄＮＴＰｓ、プライマー各３００ｎＭ、およびKOD FX Neo  ０．４ユニットに、蒸留水を全量２０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
【０１１５】
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６８℃、１分２０秒；
ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；
ステップ４；６８℃、２分。
【０１１６】
ＰＣＲによって、約１３００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。このＰＣＲ反応液についてアガロース電気泳動を行い、目的の１３００ｂｐのバンド部分を切り出し、Ａ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ反応を行った後、ｐGEM-T Easy Vector SystemI（Promega）を用いて、ｐGEM-T Easy Vectorに結合させ、大腸菌を形質転換した。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．４％、ｐＨ７．２）で培養し、Miniｐｒｅｐ DNA Purification Ｋｉｔ（TaKaRa製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。続いて、ｐGEM-T Easy Vectorベクターに由来するＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号７に示す。
【０１１７】
（Streptomyces sp.ＮＡ６８４由来ＰＬＤ遺伝子のコア領域周辺のクローニング）
上記の実施例で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、インバースＰＣＲによりその上流側と下流側を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０１１８】
上記実施例で得た染色体ＤＮＡをSacＩで完全消化し、Ligationhigh Ver.2（Toyobo社製）により自己閉環化させた。これを鋳型にして、ホスホリパーゼＤの部分遺伝子配列に基づいて作製したインバースプライマーＩＳ１（配列番号８）とインバースプライマーＩＡ１（配列番号９）とを用いて、Inverse ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。鋳型ＤＮＡ ２０ｎｇ、１×KOD FX Neo Buffer、プライマー各３００ｎＭ、およびKOD FX Neo  ０．４ユニットに、蒸留水を全量２０μｌとなるように添加した。ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
【０１１９】
ステップ１；９４℃、２分；
ステップ２；９８℃、１０秒；
ステップ３；６８℃、４分；
ステップ２からステップ３を２０サイクル繰り返す；
ステップ４；６８℃、２分。
【０１２０】
約３５００ｂｐの特異的な増幅産物が得られた。このＰＣＲ反応液についてアガロース電気泳動を行い、目的の３５００ｂｐのバンド部分を切り出し、Ａ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ反応を行った後、ｐGEM-T Easy Vector SystemI（Promega）を用いて、ｐGEM-T Easy Vectorに結合させ、大腸菌にクローニングし、塩基配列を決定した。
【０１２１】
以上の結果から、酵素ＰＬＤのアミノ酸配列は、配列番号２に記載された配列であり、ＰＬＤを発現する遺伝子配列は、配列番号１に記載された配列であることが確認された。ただし、塩基配列においては、数個（例えば１〜１０個程度など）の塩基が他の塩基に置換されている可能性がある。また、アミノ酸配列においても、数個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
アルツハイマー型認知症とコリン型プラズマローゲンの血中濃度とは相関があるので、コリン型プラズマローゲンに作用する本発明に係るホスホリパーゼＤは、アルツハイマー型認知症の体外診断薬酵素として利用できることが考えられる。
【０１２３】
また、血清、血漿中のリゾホスファチジルコリンは動脈硬化と相関があるので、このリゾホスファチジルコリンを定量する体外診断薬用酵素として本発明に係るホスホリパーゼＤを利用できることが考えられる。
【０１２４】
さらに、本発明に係るホスホリパーゼＤがリゾホスファチジルコリンに作用して生成されるリゾホスファチジン酸は発毛を促進する効果があることから、本発明に係るホスホリパーゼＤは育毛成分として利用できることも考えられる。
【受託番号】
【０１２５】
受託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
受託機関のあて名：日本国  〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
受託の日付：２０１１年１月２６日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１０１５
【配列表フリーテキスト】
【０１２６】
配列番号１：ＰＬＤ遺伝子
配列番号２：ＰＬＤ（ポリペプチド）の全長
配列番号３：ＰＬＤの内部配列
配列番号４：ＰＬＤの内部配列
配列番号５：プライマーＳ１
配列番号６：プライマーＡ１
配列番号７：ＰＬＤ遺伝子（解析結果）
配列番号８：プライマーＩＳ１
配列番号９：プライマーＩＡ１
【図２】
2014082991.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014082991.tif 000011
【図１】
2014082991.tif 000012
【配列表】
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