【手続補正書】
【提出日】令和3年1月6日(2021.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレアーゼのターゲット部位を同定するための方法であって、
（ａ）二本鎖核酸ターゲット部位を切断するヌクレアーゼを提供し、ターゲット部位の切断が、切断された核酸鎖をもたらすこと；
（ｂ）ヌクレアーゼが候補ヌクレアーゼターゲット部位において候補核酸分子を切断し、切断された核酸鎖を形成するのに好適な条件下で、候補核酸分子のライブラリーと（ａ）のヌクレアーゼを接触させること、ここで各候補核酸分子は、候補ヌクレアーゼターゲット部位と定常挿入配列とを含む配列のコンカテマーを含む、および
（ｃ）切断された末端に隣接する未切断のヌクレアーゼターゲット部位を、単一のリードスルーにおいて、切断された核酸鎖の末端から直接シーケンシングし、それによってヌクレアーゼのターゲット部位を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）の前に、候補核酸分子上の切断された末端に核酸アダプターをライゲーションすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
直接シーケンシングするステップが、核酸アダプターから行うことである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼのターゲット部位を同定することが、切断されたハーフ部位の配列からターゲット部位のコンピュータによる再構築を要求しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
切断された末端が、平滑に切断された末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
切断された末端が、５’オーバーハングを有するスタッガードに切断された末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ライゲーションが、５’リン酸依存的なライゲーション反応である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
５’オーバーハングを埋めて、平滑末端を形成することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
候補核酸分子のライブラリーが、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２個の異なる候補ヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレアーゼが、疾患と関連した遺伝子内の特異的なヌクレアーゼターゲット部位を切断する治療用ヌクレアーゼである、および／または方法が、治療用ヌクレアーゼが特異的なヌクレアーゼターゲット部位を切断し、かつ１０よりも多く、５よりも多く、４よりも多く、３よりも多く、２よりも多く、１よりも多く、または全く追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
治療用ヌクレアーゼが特異的なヌクレアーゼターゲット部位を切断し、かつ１０よりも多く、５よりも多く、４よりも多く、３よりも多く、２よりも多く、１よりも多く、または全く追加のヌクレアーゼターゲット部位を切断しない治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）のヌクレアーゼが、ＲＮＡ分子との複合体を形成するＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼであり、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体が、ＲＮＡ分子の配列に相補的な核酸配列に特異的に結合し、任意にヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡ分子が、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、任意に、ｓｇＲＮＡが、ターゲット配列に相補的である１５〜２５、１９〜２１、または２０ヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヌクレアーゼターゲット部位が、［ｓｇＲＮＡ相補配列］−［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）］構造を含み、ヌクレアーゼはターゲット部位をｓｇＲＮＡ相補配列内で切断し、任意に、ｓｇＲＮＡ相補配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヌクレアーゼが非特異的核酸切断ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヌクレアーゼが、切断ドメイン二量体化時にターゲット配列を切断する核酸切断ドメインを含む；および／または、ヌクレアーゼが、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含む；および／またはヌクレアーゼが、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
結合ドメインが、ジンクフィンガーを含み、任意に結合ドメインが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５つのジンクフィンガーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
結合ドメインが、転写活性化因子様エレメント（ＴＡＬＥ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヌクレアーゼが転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ヌクレアーゼが有機化合物を含み、任意に有機化合物が抗生物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
有機化合物が、ダイネミシン、ネオカルジノスタチン、カリケアミシン、エスペラミシン、ブレオマイシン、エンジイン、またはそれらの誘導体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヌクレアーゼがホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
複数個のヌクレアーゼからコンセンサスターゲット部位を特異的に切断するヌクレアーゼを選択する方法であって、
（ａ）同じコンセンサス配列を切断する複数個の候補ヌクレアーゼを提供すること；
（ｂ）ステップ（ａ）の候補ヌクレアーゼのそれぞれについて、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法を用いて、コンセンサスターゲット部位とは異なる候補ヌクレアーゼによって切断されたヌクレアーゼターゲット部位を同定すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において同定されたヌクレアーゼターゲット部位に基づいてヌクレアーゼを選択すること、
を含む、前記方法。
【請求項２４】
ステップ（ｃ）において選択されたヌクレアーゼが、最高の特異性でコンセンサスターゲット部位を切断するヌクレアーゼであり、任意に、
（ｉ）最高の特異性でコンセンサスターゲット部位を切断するヌクレアーゼが、コンセンサス部位とは異なる最低数のターゲット部位を切断する候補ヌクレアーゼである、または
（ｉｉ）最高の特異性でコンセンサスターゲット部位を切断する候補ヌクレアーゼが、ターゲットゲノムの文脈中で、コンセンサス部位とは異なる最低数のターゲット部位を切断する候補ヌクレアーゼである、および／または候補ヌクレアーゼが、コンセンサスターゲット部位以外のいずれのターゲット部位も切断せず、任意でステップ（ｃ）において選択された候補ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼの治療有効濃度で対象のゲノム中のコンセンサスターゲット部位以外のいずれのターゲット部位も切断しないヌクレアーゼである、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｃ）において選択されたヌクレアーゼとゲノムを接触させることをさらに含み、任意にゲノムが、脊椎動物、哺乳類、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムである、および／またはゲノムが任意に生細胞内にあり、任意にゲノムが対象内にある、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
コンセンサスターゲット部位が、疾患または障害と関連したアレル内にあり、任意に（ｉ）コンセンサスターゲット部位の切断が、疾患または障害の処置または予防をもたらす、または（ｉｉ）コンセンサスターゲット部位の切断が、疾患または障害の症状の緩和をもたらす、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
疾患がＨＩＶ／ＡＩＤＳであり、およびアレルが任意にＣＣＲ５アレルである；または疾患が増殖性疾患であり、およびアレルが任意にＶＥＧＦＡアレルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｃ）の前に、アダプターにハイブリダイゼーションするＰＣＲプライマーおよび定常挿入配列にハイブリダイゼーションするＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ反応によって、切断された核酸鎖の断片を増幅することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２９】
複数個の核酸分子を含む核酸分子のライブラリーであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼターゲット部位および１０〜８０ヌクレオチドの定常挿入配列を含む配列のコンカテマーを含み、候補ヌクレアーゼターゲット部位が、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）によって切断され得る、前記ライブラリー。
【請求項３０】
候補ヌクレアーゼターゲット部位が、［ｓｇＲＮＡ相補配列］−［ＰＡＭ］構造を含むＣａｓ９ヌクレアーゼターゲット部位であり、ｓｇＲＮＡ相補配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドを含む、請求項２９に記載のライブラリー。