(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタミン酸受容体またはニューロキニン２（ＮＫ２）受容体が媒介もしくは関連する大うつ病性障害および不安障害からなる群より選択される障害を治療または予防するための医薬組成物の調製方法。【解決手段】鳥類の受精卵を使用し、該内容物を卵殻から分離する工程、前記内容物を濾過して残渣を得る工程、溶媒を加えまたは加えずに前記内容物または残渣を混合してスラリーを調製する工程、前記スラリーと水溶液を一定時間混合する工程、上記水溶液を固形物から分離する工程、上記水溶液を凍結乾燥して受精卵分離物を得る工程を含む方法からなる水性受精卵分離物、およびその使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大うつ病性障害および不安障害からなる群より選択される障害を治療または予防するための医薬組成物を調製するための、鳥類の受精卵分離物の使用。
【請求項２】
前記鳥類の受精卵分離物が、
（i）少なくとも１個の鳥類の受精卵の内容物を卵殻から分離する工程、
（ii）任意で実施する、前記内容物を濾過して残渣を得る工程、
（iii）前記内容物または残渣を容器内で合わせる工程、
（iv）溶媒を加えまたは加えずに、前記内容物または残渣を混合してスラリーを調製する工程、
（v）前記スラリーと水溶液を一定時間混合する工程、
（vi）固形物を含まない水溶液を得るために、上記の混合液を清澄化する工程、
（vii）上記の水溶液を固形物から分離する工程、
（viii）上記の水溶液を凍結する工程、および
（ix）上記の水溶液を凍結乾燥して鳥類の受精卵分離物を得る工程
を含む方法により調製される水性分離物である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記鳥類の受精卵分離物が、
（i）少なくとも１個の鳥類の受精卵の内容物を卵殻から分離する工程、
（ii）任意で実施する、前記内容物を濾過して残渣を得る工程、
（iii）前記内容物または残渣を容器内で合わせる工程、
（iv）溶媒を加えまたは加えずに、前記内容物または残渣を混合してスラリーを調製する工程、
（v）前記スラリーと疎水性溶媒を一定時間混合する工程、
（vi）固形物を含まない溶液を得るために、上記の混合液を清澄化する工程、
（vii）上記の溶液を固形物から分離する工程、
（viii）疎水性溶媒部分を水性溶媒部分から完全に分離する工程、および
（ix）前記疎水性溶媒部分を濃縮して鳥類の受精卵溶媒分離物を得る工程
を含む方法により調製される溶媒分離物である請求項１に記載の使用。
【請求項４】
障害が、大うつ病性障害である請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
障害が、不安障害である請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記鳥類の受精卵分離物が、鳥類の受精卵から分離され凍結乾燥された胚、卵白アルブミンおよび透明な嚢を含む請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ニューロキニン２（ＮＫ２）受容体が関連する疾患または症状（ただし、記憶障害を除く）を治療または予防するための医薬組成物を調製するための、鳥類の受精卵分離物の使用。
【請求項８】
ＮＫ２受容体が関連する疾患または症状が、うつ病、不安障害、過敏性・炎症性腸症候群、炎症性気道疾患または尿失禁である請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記ＮＫ２受容体が関連する疾患または症状が、大うつ病性障害である請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記鳥類の受精卵分離物が、鳥類の受精卵から分離され凍結乾燥された胚、卵白アルブミンおよび透明な嚢を含む請求項７〜９のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願の参照）
本願は、２００８年１月１１日に出願した米国仮出願６１／０２０，５４１号および２００８年３月３日に出願した米国仮出願６１／０３３，１８４号の利益を主張するものである。上記出願におけるすべての教示を本明細書に引用して援用する。
【０００２】
本発明は、受精卵分離物に関し、該受精卵分離物には本願明細書に記載のいずれかの方法により調製されたものも含まれる。また、本発明は、メンタルヘルス疾患の治療のための該受精卵分離物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
大うつ病性障害（大うつ病、臨床的うつ病、単極性うつ病および単極性障害としても知られている）は、一般の人々の間で非常に多くみられる。北米の最新のデータによれば、成人における大うつ病の生涯リスクは１４．５％であり、１年間の罹患率は８．１％であった。（２００４年度薬物使用および保健に関する全国調査の結果より：全国調査結果；９／８／２００５改訂；米国保健社会福祉省薬物乱用・精神衛生管理庁応用研究室）。
【０００４】
最新の治療を行った場合、うつ病エピソードの平均持続期間は約１６週間であり、これよりも長い約６〜８ヶ月を示唆するデータもあるが、それでも前抗うつ療法時代の約１８ヶ月に比べるとはるかに短くなっている（Ｋｅｎｄｌｅｒ，  ＭｃＬｅｏｄ，  Ｐａｔｔｅｎ）。
【０００５】
抗うつ薬は、うつ病の治療や患者の苦痛の軽減に対してこれまで大きな成果を挙げてきた。うつ病患者は、機能障害に陥っていることが多く、またこのうつ病に起因すると考えられる薬物乱用などの病的な障害を合わせ持つことも多い。うつ病の蔓延は、保健サービスの利用増大につながり、社会構造および社会経済に壊滅的な影響を及ぼしうる。
【０００６】
うつ病の原因は完全には解明されていないが、モノアミン合成およびモノアミン活性の異常がうつ病の原因であるという説が、過去数十年間にわたって有力である。この説は、モノアミン活性、特にセロトニン活性および／またはノルアドレナリン活性の増強をもたらす薬物治療が効果を上げていることからも裏付けられる。しかし、どの抗うつ薬も、うつ病患者の一部に対してのみ有効であり、しかもその有効性も部分的であることが多い。学術研究の場で行われる、厳選した標本（被験者）を用いた比較対照試験においても、現行の治療法が効果を示すのは、患者の約６０％のみであり、症状の完全寛解に至るのはその約半数にすぎない。残遺症状が再発の強力な兆候であることを考えると、この事実は重大である。また、うつ病に関連して他の生理学的変化も生じる。このことは、膜結合型や細胞内の情報伝達を媒介するセカンドメッセンジャーの機能を含む複数の病因的要素がさらに複雑に相互作用していることを示唆している。このようなことから、視床下部−脳下垂体−副腎（ＨＰＡ）系（うつ病の在宅患者の２０〜４０％でこの系の活性化がみられる）、甲状線系（うつ病と判定された患者の５〜１０％は、検知されていない甲状線機能障害を有する）、成長ホルモン、プロラクチンなどのホルモン系経路の研究、ならびに炎症反応の役割、およびインターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子などの炎症性マーカーの役割に関する研究が行われるようになった。
【０００７】
大うつ病性障害の患者の多くは、幾分かの症状の再発を経験し、２０〜３０％は、慢性(定義は、症候群レベルのうつ症状が２年以上続くこと（慢性うつ病の治療（論説）））
経過をたどる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
すべてのうつ病の患者にとって、再発を防いで回復するためには薬物療法の継続が欠かせない。また、多くのうつ病の患者にとって、再発を防いでさらに心理社会的な回復を確かなものにするためには、薬物による維持療法が必須である。しかし、抗うつ療法を効果的に行うには、患者が適切な量の薬物の服用を適切な期間継続することが重要な要素の１つであるが、往々にしてこれは容易ではない。多くの患者が、服用によって実際に身体的作用が起こることや、身体的作用が起こるかもしれないという想像から、現行の抗うつ薬の服用に恐怖感を抱いている。また、いわゆる天然の健康増進物質や非薬物療法を好む患者もいる。抗うつ薬を服用する覚悟をしている患者でも、様々な副作用を経験することで、服用を遵守しなくなったり、治療を中止してしまう場合が多々ある。例えば、選択的セロトニン再吸収阻害剤（ＳＳＲＩ）には、多くの副作用があり、一般的に胃腸障害、頭痛、睡眠障害、深刻な性機能障害などを引き起こす。ほとんどの抗うつ薬には、少なくともいくつかの深刻な副作用があるので、臨床医が効果的に多くの患者を治療するのには限界がある。
【０００９】
うつ病は、全般性不安障害などの不安障害、性機能不全、季節性情動障害、社会不安障害（社会恐怖症とも言われる）、双極性障害、痴呆などを含む他の障害および／または症
候群と関連している場合がある。
【００１０】
現行の治療法では効果が限られていること、多くの場合受け入れがたい副作用があること、うつ症状を引き起こしうるまたはうつ病の経過に影響を与えうる生理学的要因が存在することから、うつ病という主要な公衆衛生問題に対処するためには、新規の薬理作用を有する新規化合物を継続して探索する必要があることが広く認知されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
当該技術分野の当業者は、以下に記載の図が単に本発明を説明するためのものであることを理解するだろう。これらの図は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００１２】
【図１】本発明の実施形態による、１個の卵から摘出した胚の写真である。
【図２】本発明の実施形態による凍結乾燥した１つの胚の写真である。
【図３】本発明の実施形態による凍結乾燥した胚の写真である。
【図４】本発明の実施形態による凍結乾燥して粉砕した胚の写真である。
【図５】本発明の実施形態による複数の胚のスラリーの写真である。
【図６】本発明の実施形態による受精卵分離物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。
【図７】本発明の実施形態による受精卵分離物の分析結果を表す。
【図８】放射性標識ＣＧＰ ３９６５３とＮＭＤＡグルタミン酸受容体のアゴニスト部位（イオンチャネル型）との結合に対する種々の濃度（μｇ／ｍＬ）の受精卵分離物サンプル＃２０上層分離物の効果（特異的結合のパーセンテージとして）を示したグラフ、ならびにＮＭＤＡおよびサンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉを示す。
【図９】放射性標識カイニン酸とカイニン酸グルタミン酸受容体のカイニン酸部位（イオンチャネル型）との結合に対する種々の濃度（μｇ／ｍＬ）の受精卵分離物サンプル＃２０上層分離物の効果（特異的結合のパーセンテージとして）を示したグラフ、ならびにカイニン酸およびサンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉを示す。
【図１０】放射性標識α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾール−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）とＡＭＰＡ受容体のＡＭＰＡ部位（イオンチャネル型）との結合に対する種々の濃度（μｇ／ｍＬ）の受精卵分離物サンプル＃２０上層分離物の効果（特異的結合のパーセンテージとして）を示したグラフ、ならびに（＋／−）ＡＭＰＡＨＢｒおよびサンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉを示す。
【図１１】放射性標識ＭＤＬ−１０５，５１９とＮＭＤＡグルタミン酸受容体のストリキニーネ非感受性であるグリシン部位（イオンチャネル型）との結合に対する種々の濃度（μｇ／ｍＬ）の受精卵分離物サンプル＃２０上層分離物の効果（特異的結合のパーセンテージとして）を示したグラフ、ならびにＭＤＬ−１０５，５１９およびサンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉを示す。
【図１２】ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）とＮＫ２受容体との結合に対する種々の濃度（μｇ／ｍＬ）の受精卵分離物サンプル＃２０上層分離物の効果（特異的結合のパーセンテージとして）を示したグラフ、ならびにニューロキニンＡおよびサンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における、メンタルヘルス疾患を治療するための受精卵分離物およびその使用について説明する。
【００１４】
受精卵分離物−調製
本発明の１つの態様において、少なくとも１つの胚から粉末状サンプルを調製する方法、または１個の受精卵の内容物の一部もしくは内容物全体から粉末状サンプルを調製する方法を提供する。少なくとも１個の受精卵を、受精した日から約３〜１５日間、より好ましくは約３〜５日間または約６〜１２日間、さらに好ましくは約７〜９日間の範囲で培養する。一般的に、受精卵は、血管形成が始まり、かつ／または胚が発達して肉眼で確認できるようになるまでの期間培養する。受精卵は、例えば鳥類や爬虫類などの様々な種類に由来してもよく、または卵生哺乳類に由来してもよい。一般的に、胚または胚に付随する血管を摘出することが可能であれば、いずれの卵も適当である。卵は、鳥類の卵が好ましく、ニワトリ、ガチョウ、アヒルなど、卵の生産を目的として飼育されている任意の鳥から得ることができる。入手のしやすさや大量生産が可能であることなどから、ニワトリの卵が好ましい。胚が発達できるような温度で卵を長期間維持することができれば、どのような環境下で培養を行ってもよい。培養に好適な温度は、約２０〜６０℃、より好ましくは約２５〜５５℃、さらに好ましくは約３５〜４５℃の範囲である。卵を一定期間培養した後、任意の適当な方法により、卵殻表面に存在する微生物相を減らすための処理を行うか、または殺菌を行ってもよい。その方法としては、エタノールなどの溶媒、例えば約５０〜９５％のエタノール溶液で卵殻を洗浄した後放置して、溶媒を蒸発または乾燥させる方法、または紫外線（ＵＶ）源の下で適当な時間卵を回転させる方法などが挙げられる。いずれの溶媒も、卵に対してさらに別の操作を加える前に蒸発していることが好ましい。次いで、卵内の内容物を得るために卵を割る。卵は、無菌環境下において、手作業でまたは適当な機器を用いて割ってもよい。この操作、および／または以上や以下に記載の操作の大部分もしくは全操作は、例えば５℃程度の冷却下で行ってもよい。
【００１５】
本発明の１つの態様において、ステンレス製容器などの容器、好ましくは滅菌および／または冷却した容器に卵内容物を回収する。容器に回収された卵内容物、または卵内にある内容物を、例えばメッシュ上に載せて濾過工程を行ってもよい。メッシュの目開きは、約０．５〜４ミリメートル、より好ましくは約１ミリメートルであるのがよい。メッシュは滅菌されていることが好ましい。
【００１６】
卵内容物および／または割れた卵殻の一部もしくは全部を直接メッシュ上に載せてもよい。卵内容物および／または割れた卵殻の一部もしくは全部を上記のメッシュ上に載せて、メッシュから液が実質的に落ちなくなるまで、一定時間濾過する。濾過工程前、その工程中またはその工程後に、卵内容物から割れた卵殻を取り除いてもよい。濾過工程後、固形残渣、または固形物および半固形物の混合した残渣は、胚、血管結合組織、卵白の大部分または全量、カラザの大部分または全量、および透明な嚢を含み得る。半固形残渣は、
固形物だけでなく、例えば卵白のようなゼラチン状物質などの粘性物質を含み得る。残渣または半固形残渣を、緩衝液、滅菌脱イオン水または任意の適当な塩溶液などの適切な溶媒で少なくとも１回洗浄してもよい。例えば、滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いることができる。
【００１７】
１個の卵から回収した残渣または１個以上の卵からまとめて回収した残渣を、次いで本明細書に記載の方法に従って凍結乾燥してもよい。
【００１８】
本発明の別の態様において、卵白部分および／または胚を、他の卵内容物から実質的に分離してもよい。卵白部分は、デカンテーションなどの任意の適当な方法、または吸引により他の卵内容物から実質的に分離することができる。胚は、手作業または当業者が選択する他の適当な方法によって、卵白部分から実質的に分離することができる。図１に、１個の卵から摘出し緩衝液で洗浄した１つの胚の例を示す。当業者は、胚を一度に卵白部分や他の卵内容物から実質的に分離できることを理解するだろう。例えば、ピンセットなどの適当な器具を用いて、胚を卵白部分や他の卵内容物から手作業で分離してもよい。場合によっては、胚を他の卵内容物の一部である卵黄嚢から手作業で剥がしてもよい。
【００１９】
胚を卵白部分や他の卵内容物から実質的に分離した後、胚を緩衝液、滅菌脱イオン水または任意の適当な塩溶液などの適切な溶媒で少なくとも１回洗浄してもよい。例えば、滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いることができる。
【００２０】
卵内容物を濾過工程に供した場合、下記方法における卵内容物に関する記載は、残渣に関する記載に実際あてはまることが理解されるだろう。また、以上および以下に記載の操作のうち、いずれかの操作に従って、１個の受精卵を割って卵殻を取り除き、卵殻を取り除いた卵全体を凍結して凍結乾燥することで、本発明の受精卵分離物を調製できることも理解されるだろう。さらに、以上および以下に記載の操作のうち、いずれかの操作に従って、２個以上の受精卵を割って卵殻を取り除き、卵殻を取り除いた受精卵全体を合わせて混合してスラリーを調製し、これを凍結して凍結乾燥することも可能である。
【００２１】
少なくとも１つの凍結可能な容器に卵内容物または胚を入れる。容器としては、例えば試験管、ペトリ皿、ビーカー、ステンレストレーまたはプラスチック容器が挙げられる。卵内容物または胚を卵殻から分離した後速やかに、例えば約２時間以内、より好ましくは約１時間以内、さらに好ましくは約０．５時間以内またはできるだけ速やかにこれらを凍結することが好ましい。卵内容物または胚が凍結するのに要する時間にもよるが、凍結温度は、約−５０〜１０℃、より好ましくは約−４０〜５℃、さらに好ましくは約−３５〜−２５℃の範囲にあることが望ましい。卵内容物または胚を、少なくとも約６時間、より好ましくは少なくとも約１２時間、さらに好ましくは少なくとも約２４時間凍結することが好ましい。一定時間経過した後に、凍結した卵内容物または凍結胚を凍結乾燥してもよい。卵内容物または胚は、凍結乾燥工程前に完全に凍結していてよい。図２および図３に、凍結乾燥した胚の例を示す。
【００２２】
あるいは、ビーカーやプラスチック容器などの適当な容器に凍結した卵内容物もしくは非凍結の卵内容物、または凍結した胚もしくは非凍結の胚を集めてこれを混合し、必要であれば適当な溶媒を加えて混合して、スラリーを調製してもよい。溶媒は、混合した卵内容物または胚を湿らせ、実験室にある標準の冷凍庫で凍結できるよう水性であることが好ましい。溶媒としては、水および水性緩衝液などが好ましい。スラリー状にするためには、卵内容物および／または胚を混合するのが好ましい。例えばハンドミキサーなどを用いた適当な方法で、卵内容物または胚を混合するかまたはホモジナイズすることができる。次いで、得られたスラリーを上記と同様に凍結して凍結乾燥することができる。凍結乾燥は、終温度が好ましくは約−８０〜−１０℃、より好ましくは約−６５〜−１５℃、さらに好ましくは約−４０〜−２０℃の範囲で、かつ約５００ミリトル（ｍｉｌｌｉｔｏｒｒ）または当業者が設定する他の適切な値の圧力下で行う。凍結乾燥工程において、上記の終温度が、好ましくは約１〜６時間、より好ましくは約２〜５時間、さらに好ましくは約３〜４時間の範囲で保たれる。凍結乾燥工程は、全体で一般的に約１５〜４５時間、より一般的には約２５〜３５時間、さらに一般的には約２８〜３２時間かけて行われる。
【００２３】
本発明の別の態様において、凍結乾燥した卵内容物、胚またはスラリーを分散および／または粉砕し、必要であれば実質的に均質な粉末にしてもよい。粉砕工程前に、またはその工程後に、個々にまたはいくつかをまとめて凍結乾燥した卵内容物を合わせて、実質的に均質な粉末にしてもよい。例えばコーヒーミルやハンマーミルなどの適当な機器を使用して機械的に、またはガラス棒などの適当な器具を使用して手作業で、粉砕を行うことができる。図４に、凍結乾燥後粉砕した胚の例を示す。粉末を保存前および／または使用前に滅菌してもよい。滅菌方法は、凍結乾燥したいずれの構成成分にも悪影響を及ぼさないことが望ましい。
【００２４】
本明細書に記載のすべての方法に関連して、調製した粉末または濃縮物を保存する前に、微生物の増殖を抑制するためにこれらに防腐剤を混合してもよい。また、この代わりにまたはこれに加えて、凍結乾燥前や濃縮前を含む製造過程の他の段階において、防腐剤を加えてもよい。適当な防腐剤としては、０．５％ｗ／ｗ安息香酸ナトリウムや０．２％ｗ／ｗソルビン酸カリウムなどの一般的な食品防腐剤が挙げられる。その他にも適当な防腐剤が当業者によって選択されるだろう。
【００２５】
本明細書に開示された方法によって調製した粉末を実質的な気密性を有する適当な容器に保存してもよい。容器としては、ビニール袋、樽、プラスチック容器、ボトル、およびそれらの組み合わせなどが好ましい。例えば、制御管理下にある無菌環境下で、粉末を不正開封防止セキュリティシール付の滅菌ポリエチレン／ポリプロピレンボトルへ詰めることができる。窒素などの実質的に乾燥した不活性ガス存在下で粉末を保存してもよい。粉末を室温以下の温度、例えば約１０〜２５℃、より好ましくは約１５〜２０℃の範囲の温度で保存することが好ましい。長期間保存する場合は、粉末を約−１０℃以下、より好ましくは−２０℃以下の温度で保存することが好ましい。粉末を実質的に乾燥した環境下で一定期間保存してもよい。粉末を真空パックしてもよい。
【００２６】
本発明の別の実施形態において、上記と同様にしてスラリーを調製する。または、少なくとも１個の受精卵の内容物または胚を卵殻から分離して適切な容器に集めることによりスラリーを調製することもできる。この工程の間、分離した卵内容物または胚を冷却してもよい。冷却するために、例えば容器を氷上に置いてもよい。卵内容物または胚を、上記の方法で混合することにより、スラリーを調製することができる。図５に、胚のスラリーの入った容器の例を示す。スラリーを上記と同様にして凍結乾燥してもよく、スラリーの一部または全量を以下の抽出操作に供してもよい。
【００２７】
スラリーを水溶液と一定時間混合することによって、水性抽出操作を実施できる。水溶液は、水、水性緩衝液またはその他の水性溶媒を含んでもよい。水溶液が水を含む場合、その水は使用前に蒸留されていることが好ましく、さらに脱イオン化されていることがより好ましい。例えば、水を逆浸透（ＲＯ）処理してもよい。スラリーと水溶液を、例えば約５〜６０分間、より好ましくは約１０〜４５分間、さらに好ましくは約１５〜４０分間の範囲で一定時間撹拌することによりこれらを混合できる。溶液中に含まれる実質的に親水性である分子がいずれも水溶液に溶解するように、水溶液がスラリーの内容物に十分に接することが望ましい。水溶液はスラリーと実質的に同量であってよいが、スラリーの１．５倍量または２倍量、さらに３倍量であってもよい。混合工程の間、混合液を多少温めてもよい。混合した後、遠心分離や濾過などの適当な方法を用いて、混合液中の固形物を実質的にすべて除去することにより、水溶液を実質的に清澄化できる。次いで、清澄化した水性部分を凍結および凍結乾燥して粉末を得るが、必要に応じて本明細書に記載の方法に従ってこの粉末を滅菌してもよい。
【００２８】
本発明の別の態様において、前述のいずれかの方法によって調製したスラリーを実質的に疎水性の溶媒と混合してもよい。実質的に疎水性の溶媒は冷却されていることが好ましい。疎水性溶媒としては、例えば、エーテル、クロロホルム、ヘキサン、石油エーテル、アセトニトリルなどが好ましい。例えばエーテル、特にジエチルエーテルを使用することができる。スラリーをこのような疎水性溶媒と、上記と同様に一定時間混合する。当該技術分野の当業者にとっては当然のことであるが、実質的に疎水性の溶媒を使用する方法では、いずれの工程もドラフト内またはこれと類似の装置内で行い、溶媒を直火または熱源から離しておく必要がある。混合工程が終了した後、遠心分離や濾過などの適当な方法によって、混合液の固形部分を溶媒部分から実質的に取り除くことができる。溶媒部分は、疎水性溶媒部分を実質的に含むが、水性部分を含んでいてもよい。溶媒部分を分液漏斗またはこれと本質的に同等の装置に移して、疎水性溶媒部分と水性部分を分離させることができる。上層が疎水性溶媒部分である場合は、上層を上部からサイフォン式で吸い上げるか、または下層である水層を除去した後分液漏斗から回収することができる。あるいは、下層である水性部分を凍結することによって、上層のエーテルベースの層をデカントしてもよい。この水性部分を、複数回、例えば３回程度疎水性溶媒で抽出してもよい。このとき疎水性溶媒は水性部分と実質的に同量であってよいが、水性溶媒の１．５倍量または２倍量、さらに３倍量であってもよい。さらには、これ以外の容量比であってもよい。
【００２９】
抽出工程が終了した後、疎水性の分離物をすべて集めて、適当な方法によって濃縮してもよい。濃縮した分離物は、密封バイアル瓶などの外気を実質的に遮断するような適当な容器に入れて、例えば５℃程度の室温より低い温度で保存してもよい。
【００３０】
本発明の別の態様において、上記のいずれかの方法によって調製したスラリーを抽出操作の前に清澄化してもよい。好ましい清澄化工程としては、ふるい、濾紙、フィルターパッドなどのフィルターを使用した濾過方法が挙げられる。清澄化工程として、他に遠心分離法も挙げられる。濾過工程で生じた濾液にＳｕｐｅｒｆｌｏｗ  ＤＥ（登録商標）などの濾過助剤を加えて、さらに清澄化を行ってもよい。得られた濾液の一部を凍結乾燥に適した容器に入れて凍結することができる。また、得られた濾液の一部を、上記と同様に疎水性溶媒と混合してもよく、これにより形成される水層と疎水性層を本明細書の記載に従って分離、濃縮して保存することもできる。
【００３１】
本明細書に記載の様々な方法により調製された受精卵分離物は、それぞれの方法を繰り返すかつ／または組み合わせることにより、効力の高い製剤を調製することができる。例えば、同一の試料に対して、水性溶媒および／または疎水性溶媒による抽出を繰り返すことにより、活性化合物を濃縮することができる。
【００３２】
受精卵分離物−使用
本明細書に記載の方法により調製された受精卵分離物、または本発明を知る当業者が容易に想到できる類似した方法により調製された受精卵分離物は、メンタルヘルス疾患に苦しむ患者の治療に用いることができる。メンタルヘルス疾患は、抑うつ性気分障害を含み、例えば大うつ病性障害、気分変調性障害、双極性障害のうつ病相および一般的な病状に起因するうつ病、具体的には痴呆または統合失調情動障害、薬物誘発性うつ病および季節性情動障害、不安障害（全般性不安障害、社会恐怖症、パニック障害など）および性機能不全に関連するうつ病が挙げられる。当該技術分野の当業者には十分に理解されるところであるが、うつ病や不安障害などの疾患の治療は、これらに関連するとされる上記した他の疾患および／または症候群の治療に有用な場合がある。一実施形態において、患者はヒトである。
【００３３】
本明細書に詳細に記載している通り、本発明の受精卵分離物が、特定のリガンドとその受容体との結合に対して拮抗作用を示すことが判明している。具体的には、本発明の受精卵分離物が、主要な４つのグルタミン酸受容体において、グルタミン酸と置き換わる能力を有することが分かっている。さらに、この受精卵分離物は、神経伝達物質ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）の受容体、ニューロキニン２（ＮＫ２受容体）において、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）と置き換わることも可能である。これは、本発明の発明者らが知る限りにおいて、これら２つの受容体群が単一物質により拮抗作用を受けることが示された初めての事例である。
【００３４】
グルタミン酸（グルタミン酸塩）は、ヒトの脳内に存在する最も興奮性の高い物質の１つである。多くの疾患および症状が、１以上のグルタミン酸受容体の活性化を介して、またはこの活性化に関連して起こることが知られている。このような疾患および症状としては、うつ病（例えば、Ｐａｕｌ，  Ｔｏｒｏ，  Ｍａｔｈｅｗ  ２００５，  Ｋｒｙｓｔａｌ，  Ｓａｎａｃｏｒａ  ２００３，  Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎ，  ＭｃＮａｌｌｙを参照）、大うつ病（例えば、Ｍａｅｎｇ，  Ｃｈｏｕｒｂａｊｉ，  Ｍａｔｈｅｗ  ２００８を参照）、不安障害（例えば、Ｒｏｒｉｃｋ−Ｋｅｈｎを参照）、アルツハイマー病（例えば、Ｗａｌｔｏｎ，  Ｋｏｃｈ，  Ｈｙｎｄを参照）、てんかん（例えば、Ｋｅｗ，  Ｖｉｎｃｅｎｔを参照）、統合失調症（例えば、ＭｃＣｕｌｌｕｍｓｍｉｔｈ，  Ｌｅｗｉｓ，  ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  Ｊａｖｉｔｔを参照）、脳卒中／虚血後の脳細胞機能の障害（例えば、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｋｅｗを参照）、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）（例えば、Ｍａｔｈｅｗ  ２００８，  Ｍｉｌｌｅｒを参照）、ラチリズム（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，  Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈを参照）、自閉症（例えば、Ｃｈｅｚを参照）、精神遅滞（例えば、Ｂｏｗｉｅを参照）、認知障害（例えば、Ｃｈｅｏｎを参照）、双極性うつ病（例えば、Ｍａｔｈｅｗ  ２００８を参照）および躁病（例えば、Ｋｒｙｓｔａｌを参照）などが挙げられる。さらに、ケタミンやリルゾールなどのグルタミン酸受容体のアンタゴニストは、うつ病（Ｍａｔｈｅｗ  ２００８）、大うつ病（Ｍａｅｎｇ，  Ｍａｔｈｅｗ  ２００８，  Ｚａｒａｔｅ  ２００４，  Ｓａｎａｃｏｒａ  ２００７）、筋萎縮性側索硬化症（Ｍａｔｈｅｗ  ２００８，  Ｍｉｌｌｅｒ）および双極性うつ病（Ｍａｔｈｅｗ  ２００８，  Ｚａｒａｔｅ  ２００５）の治療に利用できることが示されている。１以上のグルタミン酸受容体の活性化を、グルタミン酸と受容体との結合を阻害することによって、抑制すると、１以上のグルタミン酸受容体が媒介もしくは関連する症状または疾患が軽減または解消される。本明細書に記載の通り、本発明の受精卵分離物が１以上のグルタミン酸受容体に結合することが判明していることから、本発明の受精卵分離物は１以上のグルタミン酸受容体が関連または媒介する疾患および症状の治療に用いることができる。
【００３５】
従って、本発明の別の態様は、受精卵分離物を用いて、グルタミン酸受容体が関連もしくは媒介する疾患または症状を治療する方法を特徴とする。該方法は、必要とする患者に治療上有効な量の受精卵分離物を投与する工程を含む。このようなグルタミン酸受容体の中には、イオンチャネル型グルタミン酸受容体が含まれており、例えばα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾール−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体、カイニン酸受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体が挙げられる。グルタミン酸受容体が関連もしくは媒介する疾患または症状としては、うつ病、大うつ病、不安障害、アルツハイマー病、てんかん、統合失調症、脳卒中／虚血後の脳細胞機能の障害、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、ラチリズム、自閉症、精神遅滞、認知障害、双極性うつ病および躁病などが挙げられる。
【００３６】
また、多くの疾患および症状が、ＮＫ２受容体の活性化を介して、またはこの活性化に関連して起こることが知られている。このような疾患または症状としては、うつ病（例えば、Ｄａｂｌｅｈ，  Ａｈｌｓｔｅｄｔ，  Ｍｉｃｈａｌｅ，  Ｌｏｕｉｓ，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｓａｌｏｍｅ，  Ｈｏｌｍｅｓ，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｈｕｓｕｍを参照）、不安障害（例えば、Ａｈｌｓｔｅｄｔ，  Ｍｉｃｈａｌｅ，  Ｌｏｕｉｓ，  Ｇｒｅｉｂｅｌ，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｗａｌｓｈ，  Ｓａｌｏｍｅ，  Ｈｏｌｍｅｓを参照）、過敏性・炎症性腸症候群（例えば、Ａｈｌｓｔｅｄｔ，  Ｌｅｃｃｉ，  Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ，  Ｔｏｕｌｏｕｓｅを参照）、炎症性気道疾患（例えば、Ｂａｉを参照）および尿失禁（例えば、Ａｈｌｓｔｅｄｔ，  Ｒｉｚｚｏを参照）などが挙げられる。さらに、ｓａｒｅｄｕｔａｎｔ（ＳＲ  ４８９６４）などのＮＫ２受容体のアンタゴニストは、抗うつ様作用（Ｓａｌｏｍｅ，  Ｄａｂｌｅｈ，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｍｉｃｈａｌｅ，  Ｌｏｕｉｓ）および抗不安作用（Ｔｅｉｘｅｉｒａ，  Ｓａｌｏｍｅ，  Ｇｒｉｅｂｅｌ，  Ｍｉｃｈａｌｅ，  Ｌｏｕｉｓ）の増強に利用できることが動物モデルにおいて示されており、ヒトに対する試験も行われている。ＮＫ２受容体の活性化を、ＮＫ２の内因性リガンド、例えばＮＫＡと受容体との結合を阻害することによって、抑制すると、ＮＫ２受容体が媒介もしくは関連する症状または疾患が軽減または解消される。本明細書に記載の通り、本発明の受精卵分離物がＮＫ２受容体に結合することが判明していることから、本発明の受精卵分離物はＮＫ２受容体が関連または媒介する疾患および症状の治療に用いることができる。
【００３７】
従って、本発明の別の態様は、受精卵分離物を用いて、ＮＫ２受容体が関連もしくは媒介する疾患または症状を治療する方法を特徴とする。該方法は、必要とする患者に治療上有効な量の受精卵分離物を投与する工程を含む。ＮＫ２受容体が関連もしくは媒介する疾患または症状としては、うつ病、不安障害、過敏性大腸症候群および尿失禁などが挙げられる。
【００３８】
１以上のグルタミン酸受容体およびＮＫ２受容体が関連もしくは媒介する疾患または症状の治療に用いられる受精卵分離物は、受精卵から分離され凍結乾燥された胚、卵白アルブミンおよび透明な嚢を含み得る。あるいは、該受精卵分離物を、受精卵の卵黄を実質的に含まないように調製することができる。受精卵分離物は、本明細書に記載の方法に従って、または当業者に公知の類似した方法により調製することができる。グルタミン酸受容体もしくはＮＫ２受容体が関連もしくは媒介する疾患または症状を治療する方法において、患者はこの治療と同時に精神療法による治療を受けていてもいなくてもいずれでもよい。
【００３９】
本発明の別の態様は、必要とする患者に受精卵分離物を投与することを含むメンタルヘルス疾患の治療法に関し、このような目的のための該受精卵分離物の使用にも関する。
【００４０】
本明細書に記載の受精卵分離物を製剤化して、様々な剤形として投与することができる。剤形としては、経口（頬側、舌下を含む）、直腸内、経鼻、局所（頬側、舌下、経皮を含む）、膣内、直腸内、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内を含む）などの投与経路に適したものが挙げられる。特に、経口投与に適した剤形が好ましい。他の好ましい剤形としては、坐剤などの膣内または直腸内投与に適した剤形が挙げられる。
【００４１】
受精卵分離物の経口投与製剤は、カプセル剤、錠剤、微粒子剤、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性の液体を用いた液剤または懸濁剤、食用の泡状物質またはホイップ、水中油型乳剤または油中水型乳剤などの、種々の単位で提供することができる。受精卵分離物は、経口摂取可能で毒性のない薬学的に許容される適切な不活性担体と組み合わせることができる。カプセル剤の場合には、ゼラチンシースなどの適切なカプセル基材を用いて、受精卵分離物を単独でまたは毒性のない薬学的に許容される適切な不活性担体と組み合わせてカプセル化することができる。錠剤およびカプセル剤に関しては、例えば、適切な担体として、デンプン、マンニトールなどの食用の炭水化物、香料、防腐剤、分散剤、結合剤、着色剤およびヒュームドシリカなどが挙げられるが、これらに限定されない。このような製剤を、製剤技術分野の当業者に公知の方法に従って、受精卵分離物が持続放出（徐放）されるように製造することもできる。
【００４２】
治療上の有効量は患者によって異なるが、１日あたり約２００〜６，０００ｍｇ、約５００〜４，０００ｍｇ、約７５０〜３，５００ｍｇ、約８００〜３，０００ｍｇ、または約１，０００〜２，５００ｍｇの範囲が挙げられる。例えば、約２，０００ｍｇ／日であってもよい。
【００４３】
「治療」とは、本発明の受精卵分離物を投与している患者の疾患または症状を改善することを意味する。「治療」は、疾患または症状を緩和することを含む。また、その緩和の程度は当技術分野で公知の標準試験法を用いて判定することができる。また、「治療」は、予防療法または維持療法などによって、疾患もしくは症状の発症または再発を防ぐことも含む。
【００４４】
本発明の別の態様は、グルタミン酸受容体に有効量の受精卵分離物を接触させることを含む、グルタミン酸受容体の活動を抑制する方法を特徴とする。この方法は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、例えばＡＭＰＡ受容体、カイニン酸受容体、ＮＭＤＡ受容体を用いることにより実施できる。
【００４５】
また、本発明は、ＮＫ２受容体に有効量の受精卵分離物を接触させることを含む、ＮＫ２受容体の活動を抑制する方法を特徴とする。
【００４６】
グルタミン酸受容体またはＮＫ２受容体の活動の抑制は、例えば、それぞれの内因性リガンド（例えば、グルタミン酸受容体に対してはグルタミン酸、ＮＫ２受容体に対してはＮＫＡ）または市販の外因性リガンド（グルタミン酸受容体に対してはＡＭＰＡ、ＮＭＤＡ、カイニン酸、ＣＧＰ３９６５３またはＭＤＬ−１０５，５０９、ＮＫ２受容体に対してはｓａｒｅｄｕｔａｎｔ）の受容体への結合を阻害することにより実施できる。このような結合を阻害する方法およびこの結合阻害を検出する方法は、当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。グルタミン酸受容体またはＮＫ２受容体の活動は、１００％抑制することもできるが、１００％未満（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％）の抑制にとどめることもできる。グルタミン酸受容体またはＮＫ２受容体の活動を抑制する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞、細胞溶解液または細胞の一部（例えば、関連する受容体のみ）を含む試料を用いて）でもｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、ヒト患者に対して）でも実施することができる。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態において、受精卵分離物は、メンタルヘルス疾患の治療に有用かもしれない他の化合物と共に製剤化することができる。例えば、受精卵分離物は、モノアミン酸化酵素阻害薬などの、セロトニン分解を阻害するとされている化合物と共に製剤化することができる。
【００４８】
本発明の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかになるだろう。しかし、ここでは単なる例示目的で、好ましい実施形態のみを記載している。本発明においては、他の異なる実施形態が可能であり、また本発明のいくつかの詳細部分について、本発明から逸脱することなく種々の自明な点に関して変更が可能であることは理解されるだろう。従って、以下の説明および実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものとみなすべきではない。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
８〜９日目の雌ニワトリの受精卵を選択した。受精卵ごと７０％エタノールで殺菌し、ドラフト内に置いて７０％エタノールを蒸発させた。これらの受精卵を割って、内容物を滅菌済みの１．０ｍｍメッシュに通した。卵殻と濾液は廃棄した。固形および液状のいずれの残渣も回収し、氷上で冷却した。この残渣を５℃でホモジナイズした。このホモジネート（スラリー）をステンレス製の滅菌トレーへ注ぎ、凍結乾燥した。得られた乾燥物を、粉砕機を用いて粉砕した。得られた粉末に、防腐剤である０．５％ｗ／ｗ安息香酸ナトリウムおよび０．２％ｗ／ｗソルビン酸カリウムを加えて混合した。完成した粉末を２〜８℃（短期）または−２０℃（長期）で保存した。
【００５０】
（実施例２）
雌ニワトリの受精卵から、下記の方法によってニワトリの８日胚を摘出した。
（i）２４個の褐色卵を得た。
（ii）上記の卵を割ったところ、２４個のうち２２個のみが受精しており、発達した胚を含んでいた（受精率９１．６％）。
（iii）胚を摘出して、滅菌ＰＢＳで軽く２回洗浄し、それぞれ５０ｍＬ試験管に入れて直ちに−２０℃で凍結した。
（iv）次いで１０本の試験管を真空凍結乾燥機（棚温度：−４０℃、コンデンサー温度：−５２℃）に入れて凍結乾燥した。
（v）凍結乾燥サイクルが終了したところで、試験管内の胚をそれぞれ滅菌ガラス棒で粉砕し、得られた粉末（１．７ｇ）を包装した。
（vi）残った１２つの胚を小さなビーカーに集め、ハンドミキサーを用いて少量の水と混合した。
（vii）得られたスラリーを直ちに凍結して上記と同様に凍結乾燥した。
【００５１】
結果
乾燥後、粉末（１．７ｇ）を分散し、ガラス棒を用いて均質化した（ロット番号Ａとした）。この粉末の胚１つあたりの収量は０．１７ｇであった。
乾燥したスラリー（１．６ｇ）を分散し、ガラス棒を用いて均質化した（ロット番号Ｂとした）。この粉末の胚１つあたりの収量は０．１４ｇであった（水分量は不明）。
【００５２】
（実施例３）
６０個の受精卵（８日胚）を得た。水性分離物とエーテル分離物の調製方法について以
下に説明する。
すべての受精卵に７０％（ｖ／ｖ）エタノールを噴霧して卵殻表面を殺菌し、層流式のドラフト内に卵を置いてアルコールを蒸発させた。卵を割り、胚と、胚に付随し、透明な水様性内容物を含む透明な嚢とを、卵黄の残りの部分および血管成分から注意深く分離した。次いでこれらの試料、すなわち胚および透明な嚢をすべて、あらかじめ氷上で冷却したビーカーに集めた。摘出が終了した後、これらの試料を上記と同じハンドミキサーを用いて混合し、スラリーを得た。
得られたスラリー（約２００ｍＬ）を同量ずつ半分に分けて、一方を水性抽出用に、もう一方をエーテル抽出用に用いた。
【００５３】
水性分離物
１００ｍＬのスラリーに１００ｍＬのＲＯ水を加えて、これを室温で３０分間撹拌した。
この液を遠心分離によって清澄化し、上層にある水層を回収した（２００ｍＬ、固形分１．１％）。次いでこの水層を凍結し、続いて凍結乾燥した。得られた乾燥粉末の重量は、１．０ｇであった。
【００５４】
エーテル分離物
１００ｍＬのスラリーにあらかじめ冷却したエーテルを１００ｍＬ加えた。この混合液を室温で振とうさせて、次いで遠心分離した。５℃で１５分間遠心分離した後、上部の水／エーテル層を分液漏斗に移した。上層にあるエーテル層をサイフォン式で回収するか、または−２０℃で一定時間冷凍して下層にある不透明な水層を凍結させ、この温度で凍結しない上層にある透明な黄色のエーテル層をデカントして回収した。
下層にある水層を上記と同様に、同量のエーテルで再度抽出し、これを３回繰り返した。次いで、得られたエーテル分離物をＲｏｔａｖａｐ（登録商標）を用いて少量（約１ｍＬ）になるまで濃縮乾燥した。この試料を５℃で保存した。
【００５５】
（実施例４）
４２０個の受精卵（８〜９日胚）に７０％（ｖ／ｖ）エタノールを噴霧して卵殻表面を可能な限り殺菌し、ドラフト内に卵を置いてアルコールを蒸発させた。
卵を割ったところ、４２０個のうち６２個が未受精卵であった（受精率８５．２％）。胚と、胚に付随し、透明な水様性内容物を含む透明な嚢とを、卵黄の残りの部分および血管成分から注意深く分離した。これらの試料、すなわち胚および透明な嚢をすべて、あらかじめ氷上で冷却したビーカーに集めた。この摘出した試料（約２Ｌ）を５℃で保存した。
【００５６】
水性分離物
摘出が終了した後、この試料をハンドミキサーを用いて混合し、スラリーを得た。得られたスラリー（約２Ｌ）を金属ふるい（ＭＥＳＨ  Ｎｏ．２０）に通した。さらに濾液を紙製のフィルターパッドとＤＥ６０００を用いて清澄化した。フィルターパッドに残った固形物は廃棄した。濾液にＳｕｐｅｒｆｌｏｗ  ＤＥ（登録商標）を加えて、これをフィルターパッドに通し、さらに清澄化した。濾過はすべて、ベンチスケールレベルでブフナー漏斗を使用して行った。得られた濾液の大部分（約１，２００〜１，３００ｍＬ）をトレーに取り、凍結乾燥用に直ちに凍結した（固形分１．９％）。残りの濾液５００ｍＬを１Ｌのボトルに入れて、あらかじめ冷却した同量のエチルエーテルと混合し、２層に分離するまで５℃で保存した。
【００５７】
エーテル分離物
５００ｍＬのスラリーにあらかじめ冷却したエーテルを５００ｍＬ加え、この混合液を室温で振とうした後、遠心分離した。５℃で１５分間遠心分離した後、上部の水／エーテル層を分液漏斗に移した。上層にあるエーテル層をサイフォン式で回収するか、または−２０℃で一定時間冷凍して下層にある不透明な水層を凍結させ、上層にある透明な黄色のエーテル層をデカントして回収した。
下層にある水層を上記と同様に、３００ｍＬのエーテルで再度抽出し、分離物をあらかじめ冷却した丸底フラスコに集めた。次いで、得られたエーテル分離物をＲｏｔａｖａｐ（登録商標）を用いて少量になるまで濃縮乾燥した。この試料を５℃で保存した。
【００５８】
（実施例５）
受精卵分離物Ａ
受精卵分離物Ａを調製するために、雌ニワトリから得られた８〜９日胚の受精卵を、卵ごと７０％エタノールで殺菌し、ドラフト内に置いてエタノールを蒸発させた。これらの受精卵を割って、内容物を滅菌済みの１．０ｍｍメッシュに通した。卵殻と濾液は廃棄した。胚、透明な嚢および卵白の全量または大部分を含んだ、固形物と半固形物および／または液状部分からなる残渣を氷上で冷却し、５℃でホモジナイズした。このホモジネート（スラリー）をステンレス製の滅菌トレーへ注ぎ、凍結乾燥した。得られた乾燥物を、粉砕機を用いて粉砕し、分離物Ａを得た。分離物Ａに防腐剤である安息香酸ナトリウム（０．５％ｗ／ｗ）およびソルビン酸カリウム（０．２％ｗ／ｗ）を加えて混合した。完成した粉末を２〜８℃（短期）または−２０℃（長期）で保存した。
【００５９】
ＨＰＬＣ解析
受精卵分離物Ａを含む完成した粉末を、高速（または高圧）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、多波長吸光検出器で定量を行った。２１５ｎｍの吸光度を測定した。ファルマシア製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬサイズ排除カラム（１０ｍｍ i.d.×３００ｍｍ）を用いて分画を行った。カラムの分画範囲は１０〜６００ｋＤａであった。カラムの平衡化は、２０ｍＭリン酸塩＋０．３Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５で行った。流速０．５ｍＬ／分で試料の分析を行った。図６に代表的なクロマトグラムを示す。
【００６０】
分析証明書
また、分離物Ａを含む完成した粉末に対して標準分析を実施し、純度、ならびにタンパク質、脂質、灰分、水分および様々な不純物の含量を測定した。図７に代表的な結果を示す。
【００６１】
製剤Ａカプセル剤
製剤Ａのカプセル剤を調製するために、幾何級数的希釈を用いて、分離物Ａを含む完成した粉末４０００．０ｇ（＋／−２％）、安息香酸ナトリウム（０．５％ｗ／ｗ）およびソルビン酸カリウム（０．２％ｗ／ｗ）をヒュームドシリカ４０ｇ（＋／−２％）と混合した。この混合物をふるいにかけ、さらに混和とふるい分けを繰り返して製剤Ａを得た。Ｍｉｎｉ−Ｃａｐ３００＃０の白いカプセルを用いて、製剤Ａ混合物が１カプセルあたり５０５ｍｇ充填されるようにカプセル化し、製剤Ａカプセル剤を調製した。
【００６２】
（実施例６）
大うつ病性障害（ＭＤＤ）およびそれに関連した疾患／症状の治療における製剤Ａに対する検討
固定用量の製剤Ａを用いて、ＭＤＤなどの精神障害、ならびにそれに関連した疾患および症状の治療における効果および安全性を検討した。本検討には、不安障害の症状の軽減、生活の質の改善、および性機能不全症状の改善に対する製剤Ａの効果を評価することが含まれる。
【００６３】
評価方法に関する説明
ハミルトンうつ病評価尺度−１７項目−「ＨＡＭ−Ｄ」または「ＨＡＭ−Ｄ １７」
この尺度は、北米で患者に対して用いられる代表的なうつ病の評価尺度である。合計点は以下のように解釈される：非常に重度、＞２３点；重度、１９〜２２点；中程度、１４〜１８点；軽度、８〜１３点；うつ病とは言えない、０〜７点。
【００６４】
ハミルトン不安評価尺度−１４項目−「ＨＡＭ−Ａ」
この評価尺度は、患者の不安障害の程度を評価するものである。点数レベルは以下のように解釈される：＜１７点、軽度；１８〜２４点、軽度〜中程度；２５〜３０点、中程度〜重度。
【００６５】
モントゴメリー／アスベルグうつ病評価尺度−「ＭＡＤＲＳ」
この尺度は、北米で患者に対して用いられる代表的なうつ病の評価尺度である。ある研究によれば、以下の平均点は、全般重症度と関連している：非常に重度、４４点；重度、３１点；中程度、２５点；軽度、１５点；回復済、７点。
【００６６】
ベックうつ評価尺度−「ＢＤＩ」
この尺度は、自己評価ツールとして一般的に用いられている抑うつ症状の評価尺度である。合計点は、２１項目の各点数の単なる総和である。通常、＜９点はうつ病ではないか、または極微のうつ病であることを示し、１０〜１８点は軽度から中程度のうつ病を示し、１９〜２９点は中程度から重度のうつ病を示し、＞３０点は重度のうつ病を示す。しかし、０〜４点の場合、うつ病の否認が示唆され、４０〜６３点の場合、うつ病の誇張または演技性もしくは境界性人格障害が示唆される。
【００６７】
アリゾナ性経験尺度−「ＡＳＥＸ」
この尺度は、性衝動を数値化した５項目からなる評価尺度であり、性的興奮度、膣潤滑／ペニス勃起、オルガスムへの到達能力およびオルガスムからの充足感を評価する。
合計点の範囲は５〜３０であり、点数が高いほど重度の性機能不全であることを示す。
【００６８】
精神健康調査票に基づく評点法−「ＧＨＱ」
生活の質の程度の評価には、簡易型３６（ＳＦ−３６）を用いてもよい。この調査票は、集中力、不安感、自信のなさ、自尊心の低さ、不幸感およびうつ病などの問題を評価するものである。点数は以下の通りである：左から右に向けて０、１、２、３と表示するリッカート法（Ｌｉｋｅｒｔ  Ｓｃａｌｅ）を用いた。１２項目、各項目０〜３点。点数の範囲は０〜３６点。点数は調査対象の母集団ごとに変化する。１１〜１２点程度は一般的である。＞１５点は苦痛を感じていることを裏付けるものである。＞２０点は深刻な問題および精神的ストレスを抱えていることを示唆する。
【００６９】
精神障害の診断・統計マニュアル第４版−「ＤＳＭ−IV  ＴＲ」
このマニュアルは、北米でメンタルヘルス専門家が用いる標準的な診断マニュアルである。このマニュアルでは、精神障害が包括的に分類されており、精神障害を診断する上で広く容認されている基準を、できる限り入手できる経験的な証拠に基づいて提供している。
ＨＡＭ−Ｄの点数を結果変数として反復測定分散分析を行うことにより主要効果を求めた。副次的効果の尺度として、ＣＧＩ−ＳおよびＣＧＩ−Ｉ、ＭＡＤＲＳ、ＳＦ３６、ＢＤＩ、ＨＡＭＡ、ＡＳＥＸを用いた。
【００７０】
試験内容の説明
カナダオンタリオ州のトロントにあるマウント・サイナイ病院（ＭＳＨ）で非盲検試験を行った。メディア広告を通じて、およびＭＳＨの外来患者プログラムや他の臨床施設からの紹介により患者を集めた。
【００７１】
このプロトコールは、製剤Ａの潜在的な抗うつ活性を検討する非盲検の予備的研究を示すものである。この予備的研究の目標は、製剤Ａに、他の試験で十分にその存在が確立されているプラセボ効果のレベルを越えてＭＤＤを有意に改善する効果があること、ならびに製剤Ａが本研究の患者集団に対して許容される治療であることを証明することである。この予備的研究の第２の目的は、不安障害の症状の軽減および生活の質の改善に対する製剤Ａの効果を評価することである。
【００７２】
各患者に対して、ＤＳＭ−IV  ＴＲの基準およびＨＡＭ−Ｄを用いてＭＤＤであるかどうかスクリーニングを行った。エントリーした患者に対して８週間の製剤Ａ非盲検試験を実施した。さらに、患者に対して、全般的な基準であるＣＧＩ重症度（ＧＣＩ−Ｓ）およびＣＧＩ改善度（ＣＧＩ−Ｉ）による評価も行った。副作用については、Ｕｄｖａｌｇ  ｆｏｒ  Ｋｌｉｎｉｓｋｅ  Ｕｎｄｅｒｓｏｇｅｌｓｅｒ（ＵＫＵ）副作用評価尺度（Ｌｉｎｇｊａｅｒｄｅ）を用いて体系的に評価した。抑うつ症状の副次的な尺度として、モントゴメリー／アスベルグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）およびベックうつ評価尺度（ＢＤＩ）を自己評価ツールとして用いた。生活の質の程度については、簡易型３６（ＳＦ−３６）を用いて評価した。不安障害については、１４項目からなるＨＡＭ−Ａを用いて評価した。
【００７３】
この固定用量による非盲検試験において、患者はうつ病の標準的な治療手引きに基づいて治療を受けた。治験責任医師は、初回（ベースライン）および２、４、６、８週目（Ｗ）の診察時に評価尺度を用いてうつ病の重症度を判定した。患者は、診察と診察の間の週にも来院し、うつ病および薬の忍容性を評価するための簡単な臨床評価を受けた（Ｖ）。
【００７４】
製剤Ａの投与量
製剤Ａの投与量は、１日あたり約２，０００ｍｇ（約５００ｍｇの製剤Ａのカプセル剤を２つずつ、１日２回服用）であった。
【００７５】
患者の組入れ基準
本試験に参加する患者は、下記の基準（i）〜（vi）を含むいくつかの組入れ基準を満たす必要があった。
（i）ＤＳＭ−IV  ＴＲにおける単一エピソードまたは再発性の大うつ病基準を満たす臨床診断がなされること。
（ii）１７項目からなるハミルトンうつ病評価尺度（ＨＡＭ−Ｄ １７項目）における初回（ベースライン）の合計点が１８点以上であること。
（iii）既に大うつ病と診断され、薬物治療の追加または変更が必要である１８〜６５才の男女。治療内容は、臨床医が患者ごとに適切な医療基準を判断し、もっぱらそれに基づいて決定された。ただし、８週間の試験中、用量の増加は認めないものとする。
（iv）英語の読み書き能力があること。
（v）書面のインフォームド・コンセントに署名していること。
（vi）スクリーニング時の妊娠検査結果が陰性であること。
【００７６】
除外基準
患者が下記の基準（i）〜（xiii）を含むいくつかの除外基準に該当する場合、本試験から除外した。
（i）ＤＳＭ−IV  ＴＲにおいて、ＭＤＤ以外のうつ病を含む他の臨床診断がなされた場合（単一エピソード／再発性ではなく、例えば、慢性うつ病および／または難治性うつ病の場合は除外した）。
（ii）自殺のリスクが有意である（ＨＡＭＤの自殺に関する項目において＞１点）と判断された場合、または有意な自傷行為の可能性を示唆する病歴を有する場合。
（iii）製剤Ａ以外の抗うつ薬による薬物治療を受けている場合。
（iv）被験者が、うつ病に用いられる天然の健康製品を服用しており、服用中止ができないまたは服用中止を望まない場合。
（v）妊娠中の女性、授乳中の女性、１２か月以内に妊娠する予定のある女性、または避妊が不十分であった女性。
（vi）臨床的に深刻な臓器疾患（例えば心血管疾患、肝疾患、腎疾患、内分泌系疾患、消化器疾患、代謝系疾患や他の全身性疾患）を患っている場合。
（vii）観察期間中に電気ショック療法（ＥＣＴ）を受ける予定がある場合。
（viii）重大な神経疾患（すなわちパーキンソン病、ハンチントン舞踏病）、脳血管疾患（すなわち脳卒中）、代謝系疾患（すなわちビタミンＢ１２欠乏症）、自己免疫疾患（すなわち全身性エリテマトーデス）、ウイルスなどによる感染症（すなわち肝炎、単核球症、ヒト免疫不全症）または癌を患っている場合。
（ix）臨床的または無症状性の甲状腺機能低下症／甲状腺機能亢進症（例えば、ＴＳＨレベルの上昇）である場合。
（x）鶏肉アレルギーまたは卵アレルギーを持っている場合。
（xi）被験者が精神療法を受けているか、試験期間中に精神療法を始めた場合。
（xii）被験者が血液検査や尿検査によるスクリーニングにおいて、臨床的に重大な意味を持つ異常値を示した場合。
（xiii）被験者の症状が休薬期間に著しく悪化した場合。
【００７７】
試験デザイン
本試験は、製剤Ａによる単独療法の効果および安全性を実証する目的で設計された非盲検無作為試験であり、２５人の患者が参加し、１ヶ所で実施された。
この試験は、８週間の評価期間から構成されており、必要な場合、これに先立って２週
間の抗うつ薬の休薬期間を設けた。
【００７８】
スクリーニング
医師および／または治験コーディネーターが、被験者に対して試験、治療の特徴、およびその他の選択肢について十分に説明した後、被験者がインフォームド・コンセントの書面に署名し、医師がＤＳＭ−IV  ＴＲを用いた臨床診断とＨＡＭ−Ｄ １７を実施した。次いで、基準を満たした被験者は、精神疾患の病歴および併用療法に関する医学的審査を受けた後、健康診断を受けた。さらに、治験コーディネーターによって、初回（ベースライン）の臨床検査が行われ、尿（通常検査および顕微鏡検査）、ＣＢＣ（全血算）、白血球百分率および血小板数、電解質、ビリルビン、ＢＵＮ、クレアチニン、ＴＳＨ、肝臓機能検査、血清クレアチニンおよびＥＣＧなどが測定された。女性患者に対する妊娠判定はｈＣＧ血液検査により行われた。妊娠している患者および臨床検査で臨床的に重大な意味を持つ異常値を示した患者は除外された。
【００７９】
０週目
初回の診察（０週目）に再来院した患者に対して、医師が製剤Ａによる単独療法を実施した。うつ病であり、効果のない現行の抗うつ薬を服用中である患者には、製剤Ａへの変更を提案した。
【００８０】
翌週以降
初回評価と製剤Ａ療法の開始（Ｖ１とＶ２）に続いて、患者は８週間（Ｗ２〜Ｗ８、Ｖ３〜Ｖ６）を通して毎週決められた通りに来院した。別の抗うつ薬を服用中に試験への参加を決めた患者には、８週間の治験を始める前に１〜２週間の休薬期間を設けた。休薬期間の長さは医師の臨床上の判断に従った。この間、患者は、休薬開始１週間後に来院して精神科医の診察を受け、週の半ばには治験コーディネーターからの電話によるモニタリングを受けた。このように休薬期間中にうつ病が悪化する可能性があることは認識されている。しかし、以前の薬に効果がないか部分的にしか効果がない場合、この休薬期間中、被験者を注意深く観察し、必要に応じて適切な治療が行われる限りにおいては、１〜２週間の遅れにより抑うつ的な落ち込みが顕著に誘導されるといったリスクは、本試験のプロトコールと通常の治療とで実質的に変わらない。製剤Ａが特定の患者にとって有効な抗うつ薬でなければ、患者が不必要に長い期間うつ病を患う可能性がある。しかし、うつ病は通常、うつ病と診断されるまたは治療が開始される何か月も前から発症している慢性疾患である。したがって、引き続いて行われる８週間の製剤Ａによる治療（潜在的に有効な薬物治療）は、患者を注意深く観察していれば、標準的な治療と実質的に異なるものではない。さらに、既に述べた通り、標準的な治療は約６０％の患者にしかに有効でないため、同様に再評価や薬物の変更を必要とすることが多い。
【００８１】
Ｖ２（Ｖ１（Ｗ０）と組み合わせてもよい）〜Ｖ６（Ｗ８）において、監督精神科医（治験責任医師）および／または治験コーディネーターにより以下の測定が行われた：
−体重
−身長
−バイタルサイン
−ハミルトンうつ病評価尺度（１７項目）（ＨＡＭ−Ｄ １７）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  １９６７）。
−臨床全般印象尺度（ＣＧＩ−Ｓ、ＣＧＩ−Ｉ）（Ｇｕｙ）
−モントゴメリー／アスベルグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）
−ベックうつ評価尺度（ＢＤＩ）（１０）
−生活の質（ＳＦ−３６）（Ｗａｒｅ）
−ハミルトン不安評価尺度（ＨＡＭＡ）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  １９５９）
−Ｕｄｖａｌｇ  ｆｏｒ  Ｋｌｉｎｉｓｋｅ  Ｕｎｄｅｒｓｏｇｅｌｓｅｒ（ＵＫＵ）評価尺度（Ｌｉｎｇｊａｅｒｄｅ）（副作用の報告）（Ｖ２以外）
−服薬遵守（Ｖ２以外）
【００８２】
試験期間中の診察時間は約１時間で、初回のみ２時間を要する場合があった。
【００８３】
試験期間中、被験者の抑うつ状態が悪化した場合、治験責任医師が判定して最善の臨床的アプローチを決定した。必要と判断された場合は、製剤Ａの服用を中止して、別の抗うつ薬による治療を行った。これは、もっぱらうつ病の治療におけるベストプラクティス、および患者にとっての臨床上の最善の利益に基づいてなされた臨床的決断であった。
【００８４】
医師および治験コーディネーターが患者をサポートするためにコンタクトを取ることは容認されていたが、概して、このような患者とのコンタクトは、病気の経過および治療に関する患者側からの質問に答えることに限定されていた。正式な精神療法を行うことは認められていなかった。
【００８５】
統計的手法
ＨＡＭ−Ｄ １７の点数を結果変数として反復測定分散分析を行うことにより主要効果を調べた。有意な経時的効果により、仮説が裏付けられる。予測されるサンプルサイズは患者２５人で、これは標準偏差の０．６５倍に相当するＨＡＭ−Ｄ １７の点数の変化を検出できるサイズであった（１標本両側検定、Ｐ＜０．０５）。ＨＡＭ−Ｄ−１７の点数の標準偏差は、４．５〜６．５であると報告されているため、本試験のデザインにおいては、５２点の点数幅に対して検出力８０％で平均４．３点程度の小さな変化も検出できる。組入れ基準により、参加者のＨＡＭ−Ｄ １７の点数は、それぞれ１７点を超えていた。フランクによる寛解基準では、ＨＡＭ−Ｄ １７の点数は９点以下であった。本試験では、より堅実で一般に認められている、７点以下を基準として用いた。４．３点という効果量は、１７点を超える点数が１０点未満に変化するような臨床上の改善を十分に検出できる精度であった。うつ病の治験においてプラセボ反応の出現率は３０〜５０％と予想されており、良好な結果は統計的にこれに基づくものであった。本試験におけるプラセボ反応の出現率は４０％であると仮定した。必要に応じて、反応した被験者および寛解した被験者の分析を行った。
【００８６】
結果
合計２３人の患者が試験に参加した。３人の被験者（＃１０４、＃１０５および＃１１８）には治療が施されなかったため、この３人の結果は分析可能でないと考えた。少なくとも１用量の製剤Ａを服用した２０人の被験者のうち、１６人は８週間の試験を完了した。残り４人の被験者は８週間の試験を完了しなかったが、少なくとも１用量の製剤Ａを服用したので、この４人の結果は分析可能であると考えた。この４人の被験者が試験を完了しなかった理由には、服薬および／または診察時間を遵守できなかったこと、結果に対する苛立ちが抑えられなかったこと、および被験者が国外へ移動したことが挙げられる。
少なくとも１用量の製剤Ａを服用した２０人の被験者の結果を、以下の表に示す。
【００８７】
【表１】
2014224144.tif 000002
【００８８】
【表２】
2014224144.tif 000003
【００８９】
【表３】
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【００９０】
【表４】
2014224144.tif 000005
【００９１】
【表５】
2014224144.tif 000006
【００９２】
【表６】
2014224144.tif 000007
【００９３】
反応率および反応の程度
以下の定義を用いて、製剤Ａを用いた治療に対する各被験者の反応を評価した。「反応した被験者」すなわち「反応したことのある被験者」とは、ハミルトンうつ病評価尺度（ＨＡＭ−Ｄの点数）において、ベースラインの点数と比べて少なくとも５０％の改善が試験期間中のいずれかの時点で見られた被験者である。「臨床的に反応が見られた被験者」は、「反応した被験者」の基準を満たし、治験責任医師によって良好な臨床結果を有すると判定された被験者である。「試験完了時に反応の見られた被験者」は、試験の終了時（最後の診断時）に反応基準を満たした被験者である。「寛解」とは、ＨＡＭ−Ｄの点数が８点未満に減少することを言う。
【００９４】
上記の試験より、少なくとも１用量の製剤Ａを服用した２０人の被験者のうち１５人（７５％）が「反応したことのある被験者」で、１４人（７０％）は「臨床的に反応が見られた被験者」であることが示された。さらに、８週間の試験を完了した１６人の被験者のうち、「反応したことのある被験者」は１３人（８１．３％）で、「臨床的に反応が見られた被験者」は１２人（７５％）であった。さらに、試験を完了した１６人の被験者全体のＨＡＭ−Ｄの点数（「反応しなかった被験者」を含む）は有意に低下し、その低下率は５６．０８％であった。８週間の試験を完了した「反応したことのある被験者」のＨＡＭ−Ｄの点数の低下率は６８．１％で全体の低下率より高く、これは、「反応したことのある被験者」に必須の最小の低下率である５０％を十分に越える数値であった。
【００９５】
２人の被験者の反応が周囲の環境の影響を受けたことは、注意すべき事項である。被験者＃１１４は、「臨床的に反応が見られた被験者」に含まれないが、２週目まで反応を示し、このときのＨＡＭ−Ｄの点数は、製剤Ａの服用により５０％を超える減少を示した。しかし、外部要因がマイナスに働いた。被験者＃１１４は、健康上の問題（製剤Ａとの関連性はない）から身体障害保険を申請したが、このとき職場で困難な状況に遭遇した。このような環境要因は、製剤Ａに対する被験者＃１１４の良好な情動反応を完全に打ち消すものであった。
【００９６】
ＨＡＭ−Ｄの点数の５０％減少という厳密な基準では、被験者＃１０６は８週目の時点では「反応した被験者」と判定されなかった。なぜなら、その時点でのこの被験者の点数は１２点で、初回時の点数である２１点からは、５０％減少にわずかに満たなかったからである。しかし、８週間の試験期間における被験者＃１０６の点数は、４点（２週目）、８点（４週目）および１０点（６週目）であり、試験期間を通じて確かに反応を示していた。実際、試験期間中、被験者＃１０６は治験責任医師により「臨床的に反応が見られた被験者」であると判定されており、延長試験（実施例７を参照）にも参加して、その際にも１点、１１点、７点および９点が記録されている。延長試験の開始後、被験者＃１０６は、製剤Ａに対する良好な反応を打ち消すような家庭内の大混乱に直面した。この混乱が収まった時点で、この被験者の製剤Ａに対する反応性は維持されていた。どのような薬物治療も、周囲の環境による衝撃を完全には相殺できない。しかし、製剤Ａは、被験者＃１０６に対し、このような環境による心的外傷を緩和した可能性がある。
【００９７】
寛解率
「反応したことのある被験者」すべてが寛解したわけではなく、「寛解した被験者」すべてが８週間の試験終了時までその状態を維持していたわけではなかった。１５人の「反応したことのある被験者」のうち９人（６０％）は、８週間の試験期間中いずれかの時点で寛解していた。この寛解を達成した９人の被験者のうち７人（７７．８％；すべての試験参加者に対する割合としては４６．７％）は、８週間の試験終了時まで寛解を維持した。
【００９８】
以下の表は、寛解した試験参加者、および寛解を維持した試験参加者をすべて示したものである。チェックマークは、被験者が寛解したか寛解を維持したことを示し、Ｘマークは、被験者が寛解しなかったか、試験開始後８週目まで寛解を維持していなかったことを示す。
【００９９】
【表７】
2014224144.tif 000008
【０１００】
さらに、１人を除いてすべての「反応したことのある被験者」が主な副次的効果（不安感の減少）を体感した。これらの結果は、製剤Ａが大うつ病性障害および不安障害の治療に有効であることを示す。さらに、この薬物に起因する重大な副作用はなかった。また、試験に参加した被験者において体重の増加や性機能の減退は見られなかった。
【０１０１】
（実施例７）
実施例６の試験における良好な効果および安全性結果から、延長試験が必要となった。実施例６の試験から１０人の被験者が延長試験に参加した。延長試験は、実施例６の試験の被験者のうち、８週間の試験終了時に「臨床的に反応が見られた被験者」に対してのみ行われた。製剤Ａを、実施例６と同様に投薬した。また、延長試験の被験者に対する分析は１０ヶ月間にわたって１ヶ月毎に実施された。以下の表は、延長試験の被験者のＨＡＭ−Ｄの点数を示す。
【０１０２】
【表８】
2014224144.tif 000009
【０１０３】
１０人の被験者のうち４人は、試験を継続する上での除外基準に該当したため延長試験から離脱した。延長試験の結果より、試験の被験者がすべて定義に違うことなく、製剤Ａに「反応した被験者」であることがわかった。１０人の「臨床的に反応が見られた被験者」のうちの６人（６０％）は、延長試験の開始時に寛解状態にあった。１０人の被験者のうち８人（８０％）は、最終評価日に寛解状態にあった。そのうち２人は、先の８週間の試験においては「臨床的に反応が見られた被験者」であったが、延長試験の開始までは寛解したことがなかった被験者であった。「臨床的に反応が見られた被験者」と判定されて延長試験に参加した被験者のうち、１人（＃１１３）だけが、延長試験に参加した後再発した。実施例６の試験および延長試験における良好な効果および安全性結果から、延長試験が必要である。
【０１０４】
（実施例８）
上述の実施例に記載の通り、製剤Ａは、実証に基づく治療的効果を有する。製剤Ａの作用機序を調べるために検討を行った。具体的には、放射性リガンドとその受容体との結合における製剤Ａによる阻害効果、または放射性標識酵素の関連標的タンパク質に対する作用における製剤Ａによる阻害効果を判定するための検討を行った。製剤Ａによる阻害の程度（製剤Ａによる各受容体における特異的結合の阻害率（％））を求めた。結合能および酵素活性の阻害試験は、２つの異なる濃度の製剤Ａ（１．０μｇ／ｍＬおよび１０．０μｇ／ｍＬ）を用いて各試料に対する二重測定（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で行った。これらの濃度の製剤Ａは、製剤Ａのカプセル剤の内容物をジメチルスルホキシドに溶解し、この溶液を１．０μｇ／ｍＬまたは１０．０μｇ／ｍＬの濃度になるように希釈することにより調製した。これらの希釈溶液を分離物Ａと呼ぶ。次いで、以下の表に記載の受容体および酵素を用いて、放射性リガンド結合アッセイを行った。各濃度における分離物Ａの特異的結合に対する平均阻害率（％）を求めた。以下の表に実験結果を示す。
【０１０５】
【表９】
2014224144.tif 000010
【０１０６】
【表１０】
2014224144.tif 000011
【０１０７】
一般に、結合阻害率または酵素活性阻害率が２０％以下である場合、試験化合物が個々
の受容体結合部位または標的タンパク質に対して阻害活性を持たないことが示唆される。一般に、結合阻害率または酵素活性阻害率が２０％より大きい場合、試験化合物が個々の受容体結合部位または酵素部位に対して阻害活性を持つことが示唆される。上記の結合阻害実験は、分離物Ａが主要な４つのイオンチャネル型グルタミン酸受容体においてグルタミン酸と置き換わることを示した。分離物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、放射性標識ＡＭＰＡとＡＭＰＡ受容体との結合は２９．０５％阻害された。分離物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、放射性標識カイニン酸とカイニン酸受容体との結合は２２．３８％阻害された。分離物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、放射性標識ＣＧＰ ３９６５３とＮＭＤＡ受容体のアゴニスト部位との結合は３４．５９％阻害された。分離物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、放射性標識ＭＤＬ−１０５，５１９とＮＭＤＡ受容体のグリシン部位（ストリキニーネ非感受性）との結合は２７．４５％阻害された。さらに、分離物Ａ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、ニューロキニンＡとＮＫ２受容体との結合は３２．１５％阻害された。この５つの受容体に関しては、さらに結合阻害実験における詳細データを以下の表に示す。
【０１０８】
【表１１】
2014224144.tif 000012
【０１０９】
イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ＮＫ２受容体およびニューロキニン１（ＮＫ１）受容体を用いて、さらに受容体結合アッセイを行った。単一濃度の比較対照実験を行い、製剤Ａのカプセル剤の内容物から調製された様々な分離物が、種々のグルタミン酸受容体およびＮＫ２受容体のリガンド結合に拮抗しうるどうかを評価した。このアッセイにおいて、ＡＭＰＡ受容体、カイニン酸受容体、ＮＭＤＡ受容体のアゴニスト結合部位およびグリシン結合部位（ストリキニーネ非感受性）、ならびにＮＫ２受容体に対する検討を行った。製剤Ａのカプセル剤の内容物を種々の溶媒に溶解し、以下に詳細に説明する４つの異なる方法で抽出を行った。このような抽出操作により複数の受精卵分離物が得られた。それぞれを、サンプル＃１９上層分離物、サンプル＃１９下層分離物、サンプル＃２０上層分離物、サンプル＃２０下層分離物、Ｘ画分分離物およびサンプル＃２分離物と呼ぶ。
これらの分離物をそれぞれ放射性リガンド結合アッセイに供した。
【０１１０】
製剤Ａのカプセル剤から内容物１０３ｍｇを量りとり、サンプル＃１９を調製した。水（１０．３ｍＬ）を加えて、１分間攪拌した。次いで、この溶液に酢酸エチル３０ｍＬを加えて、再度１分間攪拌した。次いで、これをＢｅｃｋｍａｎ製の卓上遠心機で遠心した。その結果、３つの画分に分かれた。上層（有機相）および下層（水相）画分をそれぞれ回収し、中間の画分を廃棄した。上層と下層の画分をそれぞれ乾燥させた。下層（水相）画分を水２．０６ｍＬで再構成した。透明でないこのサンプルを、微量遠心機を用いて１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を回収し、これをサンプル０８５４２６−４（サンプル＃１９下層分離物）として受容体結合実験に用いた。上層（有機相）画分を２０％アセトニトリル水溶液１．２４５ｍＬで再構成した。透明でないこのサンプルを、微量遠心機を用いて１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を回収し、これをサンプル０８５４２６−３（サンプル＃１９上層分離物）として受容体結合実験に用いた。サンプル＃１９に対するコントロール液も調製した。コントロール液は２０％アセトニトリル水溶液からなり、これをサンプル０８５４２６−５として受容体結合実験に用いた。
【０１１１】
製剤Ａのカプセル剤から内容物２４９．７ｍｇを量りとり、サンプル＃２０を調製した。これにメタノール：ジクロロメタン（１：１）１０ｍＬを加えて攪拌した。次いで、この溶液にジクロロメタン１０ｍＬを加えて、再度攪拌した。次いで、これをＢｅｃｋｍａｎ製の卓上遠心機で３，５００ｒｐｍ、１５分間遠心した。その結果、３つの画分に分かれた。上層と下層の有機相画分をそれぞれ回収し、中間の画分を廃棄した。上層と下層の画分をそれぞれ乾燥した後１００％メタノール水溶液２．４９ｍＬで再構成した。上層のメタノール画分は半透明で、下層のジクロロメタン画分は溶解しなかった。いずれのサンプルも微量遠心機を用いて１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。各サンプルの上清を回収し、上層のメタノール画分から得られた上清をサンプル０８５４２６−６（サンプル＃２０上層分離物）として、下層のジクロロメタン画分から得られた上清をサンプル０８５４２６−７（サンプル＃２０下層分離物）として、これらを受容体結合実験に用いた。サンプル＃２０に対するコントロール液も調製した。コントロール液は１０％メタノール水溶液からなり、これをサンプル０８５４２６−９として受容体結合実験に用いた。
【０１１２】
サンプルＸ画分は以下のように調製した。製剤Ａのカプセル剤から内容物１２１ｍｇを量り取り、水１０ｍＬを加えた。次いで、この溶液にジクロロメタン１０ｍＬを加えて攪拌した。水相画分と有機相画分をそれぞれ回収した。この水相画分にジクロロメタン１０ｍＬを加えて攪拌し、再度液液分離を行って、水相画分と有機相画分をそれぞれ回収した。２回の液液分離で得られた有機相画分と水相画分をそれぞれ合わせて、各画分を乾燥して重量を測定した。水相画分および有機相画分の重量はそれぞれ、１１６．４ｍｇおよび１．３ｍｇであった。有機相画分を１０％メタノール水溶液１．３ｍＬで再構成し（０．１ｍｇ／ｍＬに相当）、これをサンプル０８５４２６−８（Ｘ画分分離物）として結合実験に用いた。サンプルＸ画分に対するコントロール液も調製した。コントロール液は１０％メタノール水溶液からなり、これをサンプル０８５４２６−９（サンプル＃２０のコントロール液と同じ）として受容体結合実験に用いた。
【０１１３】
サンプル＃２は以下のように調製した。製剤Ａのカプセル剤の内容物から一部（１．８ｍｇ）を量りとり、０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む４０％ＰＥＧ水溶液（３．６ｍＬ）を加えて（０．５ｍｇ／ｍＬに相当）攪拌した。この調製物をサンプル０８５４２６−１（サンプル＃２分離物）として受容体結合実験に用いた。サンプル＃２に対するコントロール液も調製した。コントロール液は０．２５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む４０％ＰＥＧ水溶液からなり、これをサンプル０８５４２６−２として受容体結合実験に用いた。
【０１１４】
受容体結合実験の結果（各分離物の最大濃度で二重測定（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）を行った結果である）を以下の表に示す。
【０１１５】
【表１２】
2014224144.tif 000013
【０１１６】
サンプル＃２０上層分離物の存在下、放射性標識ＡＭＰＡとＡＭＰＡ受容体との結合は９７％阻害された。サンプル＃２０上層分離物の存在下、放射性標識カイニン酸とカイニン酸受容体との結合は１０１％阻害された。サンプル＃２０上層分離物の存在下、放射性標識ＣＧＰ ３９６５３とＮＭＤＡ受容体のアゴニスト部位との結合は１１０％阻害された。サンプル＃２０上層分離物の存在下、放射性標識ＭＤＬ−１０５，５１９とＮＭＤＡ受容体のグリシン部位（ストリキニーネ非感受性）との結合は９２％阻害された。さらに、Ｘ画分分離物は、ニューロキニンＡとＮＫ２受容体との結合を５５％阻害した。これは、本発明の発明者らが知る限りにおいて、グルタミン酸受容体およびＮＫ２受容体が単一物質により拮抗作用を受けることが示された初めての事例である。
【０１１７】
さらに、上記のグルタミン酸受容体およびＮＫ２受容体のリガンド結合ならびに該受容体の活性化が、上記と同様に調製されたサンプル＃２０上層分離物により拮抗されるかどうかを確認するために、用量応答実験を行った。０．１、０．３、１．０、３．０、１０、３０および３００μｇ／ｍＬの＃２０上層分離物（抽出前のサンプル＃２０に含まれる製剤Ａの量を基準として）の存在下、ＡＭＰＡ受容体、カイニン酸受容体、ＮＭＤＡ受容体のアゴニスト部位およびグリシン部位（ストリキニーネ非感受性部位）ならびにＮＫ２受容体との結合がどの程度阻害されるかを評価した。
【０１１８】
図８は、ＮＭＤＡ受容体のアゴニスト部位（イオンチャネル型）に対するアッセイ結果を示す。サンプル＃２０上層分離物は、濃度依存的にＣＧＰ ３９６５３のＮＭＤＡ受容体のアゴニスト部位への結合能を阻害した。すなわち、サンプル＃２０上層分離物の濃度が高いほど結合が阻害され、該分離物の濃度が低いほど結合が阻害されなかった。ＮＭＤＡのＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、１．１１×１０−５μｇ／ｍＬおよび９．０２×１０−６Ｍであった。サンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、５．７８μｇ／ｍＬおよび４．６９Ｍであった。
【０１１９】
図９は、カイニン酸受容体に対するアッセイ結果を示す。サンプル＃２０上層分離物は、濃度依存的にグルタミン酸カイニン酸のカイニン酸受容体への結合能を阻害した。すなわち、サンプル＃２０上層分離物の濃度が高いほど結合が阻害され、該分離物の濃度が低いほど結合が阻害されなかった。カイニン酸のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、１．７７×１０−８μｇ／ｍＬおよび１．０８×１０−８Ｍであった。サンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、１２．０μｇ／ｍＬおよび７．３２Ｍであった。
【０１２０】
図１０は、ＡＭＰＡ受容体に対するアッセイ結果を示す。サンプル＃２０上層分離物は、濃度依存的にＡＭＰＡのＡＭＰＡ受容体への結合能を阻害した。すなわち、サンプル＃２０上層分離物の濃度が高いほど結合が阻害され、該分離物の濃度が低いほど結合が阻害されなかった。（＋／−）ＡＭＰＡ ＨＢｒのＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、３．５４×１０−８μｇ／ｍＬおよび３．００×１０−８Ｍであった。サンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、１１．７μｇ／ｍＬおよび９．９１Ｍであった。
【０１２１】
図１１は、ＮＭＤＡ受容体のグリシン（ストリキニーネ非感受性）部位に対するアッセイ結果を示す。サンプル＃２０上層分離物は、濃度依存的にＭＤＬ−１０５，５１９のＮＭＤＡ受容体のグリシン（ストリキニーネ非感受性）部位への結合能を阻害した。すなわち、サンプル＃２０上層分離物の濃度が高いほど結合が阻害され、該分離物の濃度が低いほど結合が阻害されなかった。ＭＤＬ−１０５，５１９のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、２．８×１０−８μｇ／ｍＬおよび２．３６×１０−８Ｍであった。サンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、２１．９μｇ／ｍＬおよび１８．４Ｍであった。
【０１２２】
図１２は、ＮＫ２受容体に対するアッセイ結果を示す。サンプル＃２０上層分離物は、濃度依存的にニューロキニンＡのＮＫ２受容体への結合能を阻害した。すなわち、サンプル＃２０上層分離物の濃度が高いほど結合が阻害され、該分離物の濃度が低いほど結合が阻害されなかった。ニューロキニンＡのＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、６．８４×１０−１０μｇ／ｍＬおよび５．７６×１０−１０Ｍであった。サンプル＃２０上層分離物のＩＣ５０およびＫｉはそれぞれ、４．１５×１０２μｇ／ｍＬおよび３．４９×１０２Ｍであった。
【０１２３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014224144.tif 000021
【図９】
2014224144.tif 000022
【図１０】
2014224144.tif 000023
【図１１】
2014224144.tif 000024
【図１２】
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