(57)【要約】      （修正有）【課題】工業的生産性に優れ、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、効率よく逆転写反応を行なうことができる変異型逆転写酵素およびそれをコードする核酸、変異型逆転写酵素の製法、逆転写方法、逆転写反応キットならびに検出キットを提供する。【解決手段】野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列において、F303、L432、V433およびI434からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基に置換された変異型逆転写酵素、それをコードする核酸、前記核酸を保持する細胞を培養して得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する変異型逆転写酵素の製法、前記変異型逆転写酵素を用いてRNAからcDNAを合成する逆転写方法、前記変異型逆転写酵素を含有する逆転写反応キットならびに前記変異型逆転写酵素とマーカーの検出用試薬とを含有する検出キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列において、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする変異型逆転写酵素。
【請求項２】
（ａ）配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）４３２位のロイシン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｃ）配列番号：２の４３３位のバリン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｄ）配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有する請求項１に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項３】
配列番号：２に示される配列において、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基および５２４位のアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されている請求項１または２に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項４】
前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基それぞれに対応する残基を除くアミノ酸残基の保存的置換を有するアミノ酸配列である請求項１〜３のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。
【請求項５】
前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、
（１）配列番号：２に示される配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基を除く配列中に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有し、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、または
（２）配列番号：２に示される配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基を除く配列に対する配列同一性が少なくとも８０％であり、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
である請求項１〜４のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（Ａ）  請求項６に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（Ｂ）  前記工程（Ａ）で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含むことを特徴とする変異型逆転写酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法。
【請求項９】
逆転写反応を行なうためのキットであって、請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット。
【請求項１０】
生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型逆転写酵素に関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子解析、疾患などの検査、有用遺伝子のクローニングなどに有用な、変異型逆転写酵素、それをコードする核酸、前記変異型逆転写酵素を用いる逆転写方法、逆転写反応キットおよび検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素は、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する活性（以下、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）を有している。前記逆転写酵素のなかでは、高い触媒活性および正確性を有することから、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（以下、「ＭＭＬＶ逆転写酵素」という）およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（以下、「ＡＭＶ逆転写酵素」という）が、例えば、遺伝子解析、疾患などの検査、遺伝子のクローニングなどに汎用されている。
【０００３】
前記逆転写酵素のうち、ＭＭＬＶ逆転写酵素は、遺伝子工学的手法により、大腸菌内で可溶性タンパク質として容易に生産させることができる。しかしながら、ＭＭＬＶ逆転写酵素は、ＡＭＶ逆転写酵素と比べ、ｃＤＮＡ合成時における反応速度が小さいという欠点がある。
【０００４】
ところで、ＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が前記二次構造によって妨げられるため、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが望まれる。しかしながら、野生型逆転写酵素は、熱安定性が低く、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような温度では、失活してしまうことがある。そこで、耐熱性を向上させた変異型逆転写酵素が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００５】
しかしながら、前記変異型逆転写酵素は、工業的生産性が低いという欠点がある。そこで、工業的生産性に優れ、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性の高い逆転写酵素が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５０４１６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、工業的生産性に優れ、高い熱安定性を有し、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性の高い変異型逆転写酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる、核酸および前記変異型逆転写酵素の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、かつ汎用性が高い逆転写反応キットおよび検出キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、効率よく逆転写反応を行なうことができる逆転写方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列において、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする変異型逆転写酵素、
〔２〕（ａ）配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）４３２位のロイシン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｃ）配列番号：２の４３３位のバリン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｄ）配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有する前記〔１〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔３〕配列番号：２に示される配列において、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基および５２４位のアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されている前記〔１〕または〔２〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔４〕前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基それぞれに対応する残基を除くアミノ酸残基の保存的置換を有するアミノ酸配列である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、
〔５〕前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、
（１）配列番号：２に示される配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基を除く配列中に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有し、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、または
（２）配列番号：２に示される配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基を除く配列に対する配列同一性が少なくとも８０％であり、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、
〔６〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸、
〔７〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（Ａ）  前記〔６〕に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（Ｂ）  前記工程（Ａ）で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含むことを特徴とする変異型逆転写酵素の製造方法、
〔８〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法、
〔９〕逆転写反応を行なうためのキットであって、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット、ならびに
〔１０〕生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の変異型逆転写酵素は、工業的生産性に優れ、高い熱安定性を有し、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いという特徴を有する。また、本発明の核酸および本発明の変異型逆転写酵素の製造方法は、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の逆転写反応キットおよび検出キットは、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いという特徴を有する。また、本発明の逆転写方法は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】製造例１で得られたＷＴ発現プラスミドｐＥＴ−ＭＲＴの構造を示す概略説明図である。
【図２】試験例２において、被験試料と比活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図３】試験例２において、被験試料と５０℃での熱処理後の残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図４】試験例３において、被験試料と熱処理後の残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図５】（Ａ）は試験例４において、可溶性画分２．７μＬ相当量のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を示すグラフ、（Ｂ）は試験例４において、可溶性画分０．９μＬ相当量のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．変異型逆転写酵素
本発明の変異型逆転写酵素は、逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列において、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする。
【００１２】
本発明の変異型逆転写酵素は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有しているので、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素と比べて高い残存活性を有する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を有し、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高い。したがって、本発明の変異型逆転写酵素によれば、鋳型となるＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合であっても、反応温度を高くすることができ、二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。また、本発明の変異型逆転写酵素は、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素または他の変異型逆転写酵素と比べて、例えば、大腸菌の細胞などの細胞内での発現レベルが向上している。したがって、本発明の変異型逆転写酵素は、工業的生産性に優れている。
【００１３】
なお、本明細書において、「野生型」とは、人為的に変異が導入されていない自然発生のもの、「変異型」とは、人為的に変異が導入されたものを意味する。また、本明細書において、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして算出した値をいう。
【００１４】
前記逆転写酵素活性は、以下のステップ１）〜６）：
１）  反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15（ｐ（ｄＴ）15換算濃度）、および０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ〕中で逆転写酵素を３７℃でインキュベーションするステップ、
２）  前記ステップ１）で得られた産物２０μＬを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
３）  前記ステップ２）後のガラスフィルターを、冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去するステップ、
４）  前記ステップ３）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントするステップ、
５）  前記ステップ４）で得られた放射活性に基づき、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（以下、「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出するステップ、および
６）  前記ステップ５）で算出されたｄＴＴＰ取り込み量に基づき、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ
を行なうことによって測定することができる。
【００１５】
配列番号：２の１位〜６７１位は、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列である。なお、配列番号：２の６７２位〜６７７位は、６つのヒスチジン残基からなるＨｉｓタグである。本明細書において、前記「配列番号：２に対応するアミノ酸配列」とは、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列または配列番号：２に示される配列との配列同一性が５０％以上であり、かつ野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素と同じ条件下に逆転写酵素活性を示す野生型逆転写酵素のアミノ酸配列をいう。前記配列同一性は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％、特に好ましくは１００％である。
【００１６】
本発明の変異型逆転写酵素においては、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基に対応するアミノ酸残基、配列番号：２の４３２位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基、配列番号：２の４３３位のバリン残基に対応するアミノ酸残基および配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基に対応するアミノ酸残基の全て、これらのうちの３つのアミノ酸残基、これらのうちの２つのアミノ酸残基またはいずれか１つのアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基に置換されている。なかでも、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、配列番号：２の４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
【００１７】
前記配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基に対応するアミノ酸残基は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を、配列番号：２の配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントしたときに、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基に相当する位置に存在するアミノ酸残基である。前記「配列番号：２の４３２位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基」は、は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を、配列番号：２の配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、前記と同様の条件でアラインメントしたときに、配列番号：２の４３２位のロイシン残基に相当する位置に存在するアミノ酸残基である。「配列番号：２の４３３位のバリン残基に対応するアミノ酸残基」は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を、配列番号：２の配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、前記と同様の条件でアラインメントしたときに、配列番号：２の４３３位のバリン残基に相当する位置に存在するアミノ酸残基である。また、前記「配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基に対応するアミノ酸残基」は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を、配列番号：２の配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、前記と同様の条件でアラインメントとしたときに、配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基に相当する位置に存在するアミノ酸残基をいう。
【００１８】
「正電荷アミノ酸残基」とは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨが６．０〜９．５）において、正に荷電しているアミノ酸残基をいう。前記正電荷アミノ酸残基としては、例えば、アルギニン残基、リジン残基などが挙げられる。これらの正電荷アミノ酸残基のなかでは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨが６．０〜９．５）において、正に荷電しており、かかるｐＨ条件下で高い熱安定性を確保することができることから、好ましくはアルギニン残基およびリジン残基である。
【００１９】
本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、
（ａ）配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）４３２位のロイシン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｃ）配列番号：２の４３３位のバリン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｄ）配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基に対応する残基のリジン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有することが好ましい。
【００２０】
本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保する観点から、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかが、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
【００２１】
前記「配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域」（以下、「領域T24-P474」ともいう）は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列を、配列番号：２の配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、前記と同様の条件でアラインメントとしたときに、配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基の領域に相当する領域である。
【００２２】
前記負電荷アミノ酸残基としては、例えば、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基が挙げられる。前記負電荷アミノ酸残基は、当該負電荷アミノ酸残基が前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されたポリペプチドが、逆転写酵素活性を発現することができるのであれば、形状の変化をもたらす位置に存在する残基であってもよい。前記負電荷アミノ酸残基の具体例としては、配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基、配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基、配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基、配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基、配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの負電荷アミノ酸残基のなかでは、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、配列番号：２に示される配列において、配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基、配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基、配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基、配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基および配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基が好ましい。
【００２３】
前記非極性アミノ酸残基としては、例えば、アラニン残基、グリシン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、システイン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基などが挙げられる。これらの非極性アミノ酸残基のなかでは、側鎖のサイズが小さく、かつ置換によりもたらされる形状の変化が小さいと考えられることから、好ましくはアラニン残基である。
【００２４】
本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、
（Ｉ）配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、アルギニン残基、リジン残基、セリン残基またはスレオニン残基、好ましくはアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
（ＩＩ）配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、アルギニン残基、リジン残基、セリン残基またはスレオニン残基、好ましくはアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
（ＩＩＩ）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、アルギニン残基、リジン残基、セリン残基またはスレオニン残基、好ましくはアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
（ＩＶ）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアルギニン残基またはリジン残基、好ましくはアルギニン残基への置換、および
（Ｖ）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアスパラギン残基、好ましくはアラニン残基への置換、
からなる群より選択された少なくとも１つを有することが好ましい。なお、逆転写酵素として、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有しない逆転写酵素が望まれる場合、本発明の変異型逆転写酵素は、前記（Ｖ）の置換を有することが好ましい。
【００２５】
配列番号：２に対応するアミノ酸配列は、本発明の目的を妨げない範囲で、配列番号：２の３０３位のフェニルアラニン残基、配列番号：２の４３２位のロイシン残基、配列番号：２の４３３位のバリン残基および配列番号：２の４３４位のイソロイシン残基それぞれに対応する残基を除くアミノ酸残基の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。前記保存的置換としては、例えば、特定のアミノ酸残基と、疎水性、電荷、ｐＫａ、立体構造上における特徴などの点で当該特定のアミノ酸残基に類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換などが挙げられる。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、以下のグループＩ〜ＶＩのいずれかに属する１つのアミノ酸残基を同じグループに属する他のアミノ酸残基に置換することなどが挙げられる。
グループＩ：グリシン残基およびアラニン残基
グループＩＩ：バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基
グループＩＩＩ：アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基
グループＩＶ：セリン残基およびスレオニン残基
グループＶ：アルギニン残基およびリジン残基
グループＶＩ：フェニルアラニン残基およびチロシン残基
【００２６】
また、本発明においては、前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列は、本発明の目的を妨げない範囲で、
（１）配列番号：２に示される配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基を除く配列中に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有し、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、または
（２）配列番号：２に示される配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基を除く配列に対する配列同一性が少なくとも８０％であり、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
であってもよい。
【００２７】
前記「１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」は、逆転写酵素活性を示す範囲の個数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を意味する。前記「１個もしくは数個」とは、１〜３０個をいう。前記「１個もしくは数個」は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個をいう。
【００２８】
前記配列同一性は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、少なくとも８０％であり、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。
【００２９】
以上説明したように、本発明の変異型逆転写酵素は、工業的生産性に優れ、高い熱安定性を有し、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いことから、遺伝子解析、疾患などの検査、有用遺伝子のクローニングなどに有用である。
【００３０】
２．変異型逆転写酵素をコードする核酸
本発明の核酸は、本発明の変異型逆転写酵素をコードする核酸である。本発明の核酸は、前記変異型逆転写酵素をコードしているので、当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる。
【００３１】
前記核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の核酸は、例えば、配列番号：１に対応する塩基配列からなる核酸に対して、
−  配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基の正電荷アミノ酸残基への置換、
−  配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、領域T24-P474に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかの正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基への置換
などの変異を生じさせるように部位特異的変異を導入することによって得ることができる。
【００３３】
配列番号：１の１位〜２０１３位は、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸の塩基配列である。なお、配列番号：１の２０１４位〜２０３４位は、６つのヒスチジン残基からなるＨｉｓタグをコードする核酸の塩基配列である。前記「配列番号：１に対応する塩基配列」は、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素をコードする核酸の塩基配列または配列番号：２に示される配列との配列同一性が５０％以上であり、かつ野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素と同じ条件下に逆転写酵素活性を示す逆転写酵素をコードする核酸の塩基配列である。
【００３４】
核酸への部位特異的変異の導入は、例えば、前記変異を生じるように設計された非ＰＣＲ用プライマーを用いた非ＰＣＲ法、前記変異を生じるように設計されたＰＣＲ用プライマーを用いたＰＣＲ法などによって行なうことができる。
【００３５】
以上説明したように、本発明の核酸は、本発明の変異型逆転写酵素をコードしているので、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができることから、本発明の変異型逆転写酵素の工業生産に有用である。
【００３６】
３．変異型逆転写酵素の製造方法
本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の核酸を用いて当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより得ることができる。本発明には、かかる変異型逆転写酵素の製造方法も包含される。
【００３７】
本発明の製造方法は、前述した変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（Ａ）  本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（Ｂ）  前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含むことを特徴とする方法である。
【００３８】
まず、本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る〔「工程（Ａ）」〕。
【００３９】
前記核酸を保持する細胞は、例えば、前記核酸を含む遺伝子導入用キャリアを用いて宿主細胞を形質転換することなどによって得られる。
【００４０】
前記宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの細菌の細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのなかでは、変異型逆転写酵素の精製が容易であり、変異型逆転写酵素を大量に生産することができることから、細菌の細胞が好ましく、大腸菌の細胞がより好ましい。前記大腸菌の細胞としては、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４１】
前記遺伝子導入用キャリアは、生物学的なキャリアであってもよく、非生物キャリアであってもよい。生物学的なキャリアとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどのベクターが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、非生物キャリアとしては、例えば、金粒子、デキストラン、リポソームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる遺伝子導入用キャリアは、用いられる宿主細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、宿主細胞として大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）の細胞を用いる場合、ｐＥＴ系プラスミドベクターを用いることができる。この場合、変異型逆転写酵素を大量に発現させることができ、しかも変異型逆転写酵素を容易に精製することができる。
【００４２】
前記ベクターは、タンパク質を細胞外に分泌させる分泌ベクターであってもよく、タンパク質を細胞内に蓄積する細胞内発現用ベクターであってもよい。また、前記ベクターは、変異型逆転写酵素の精製をより容易にするためのエレメント、例えば、Ｈｉｓタグ、細胞外分泌シグナルなどを含有していてもよい。
【００４３】
前記遺伝子導入用キャリアが、前記生物学的なキャリアであるベクターである場合、当該遺伝子導入用キャリアは、ベクターのクローニングサイトに前記核酸を挿入し、プロモーターの制御下に作動可能に連結させることにより作製することができる。なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸によりコードされるポリペプチドの発現が、プロモーターなどのエレメントによる制御下に生物学的活性を示す状態で発現するように連結されていることを意味する。
【００４４】
一方、前記遺伝子導入用キャリアが、前記非生物キャリアである場合、当該遺伝子導入用キャリアは、必要に応じて、前記核酸を、プロモーターの制御下に作動可能に連結させて得られた核酸構築物を、当該非生物キャリアに担持させることによって作製することができる。なお、かかる核酸構築物は、複製開始起点、ターミネーターなどの遺伝子の発現に必要なエレメントを適宜含有してもよい。
【００４５】
宿主細胞への遺伝子導入用キャリアの導入は、用いられた遺伝子導入用キャリアの種類、宿主細胞の種類などに応じた方法で行なうことができる。かかる形質転換法としては、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、パーティクルガン法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４６】
前記工程（Ａ)において、前記核酸を保持する細胞の培養条件は、用いられた宿主細胞の種類などによって異なることから、一概には決定することができないので、用いられた宿主細胞の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記核酸が誘導可能なプロモーターの制御下に作動可能に連結されている場合、かかるプロモーターの種類に応じた発現誘導条件下に、前記核酸を保持する細胞を培養すればよい。
【００４７】
つぎに、前記工程（Ａ）で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する〔「工程（Ｂ）」〕。
【００４８】
前記培養物において、変異型逆転写酵素が細胞外に分泌されている場合、培養物を遠心分離や濾過などに供して培養上清を回収し、培養上清中の変異型逆転写酵素を精製して単離することができる。かかる精製を行なう方法としては、遠心分離、超遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４９】
一方、前記培養物において、変異型逆転写酵素が細胞内に蓄積されている場合、工程（Ｂ）において、培養物を遠心分離などに供して細胞を回収し、細胞の破砕物から変異型逆転写酵素を単離することができる。この場合、例えば、前記細胞を超音波破砕法、溶菌法、凍結破砕法などによって破砕した後、得られた破砕物から得られた無細胞抽出物中の変異型逆転写酵素を精製して単離することができる。
【００５０】
例えば、後述の実施例に記載の手法のように、宿主細胞として大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）の細胞を用い、遺伝子導入用キャリアとしてｐＥＴ系プラスミドベクターを用いた場合、細胞内で変異型逆転写酵素を大量に発現させることができ、しかも回収された細胞を破砕した後、破砕物から得られた抽出物を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびニッケルアフィニティークロマトグラフィーに供することにより、変異型逆転写酵素を容易に精製することができる。
【００５１】
以上説明したように、本発明の変異型逆転写酵素の製造方法は、本発明の核酸が用いられているので、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができることから、本発明の変異型逆転写酵素の工業生産に有用である。
【００５２】
４．逆転写方法
本発明の逆転写方法は、本発明の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴としている。本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素の熱安定性と比べて高い熱安定性を有している。そのため、本発明の逆転写方法によれば、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制される温度を含む幅広い温度範囲で逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の逆転写方法は、種々のＲＮＡを鋳型として用いることができ、しかも効率よく逆転写反応を行なうことができる。
【００５３】
本発明の逆転写方法では、前記変異型逆転写酵素と、ＲＮＡと、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを、逆転写反応用緩衝液中でインキュベーションすることにより逆転写反応を行なうことができる。
【００５４】
逆転写反応における反応温度は、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などによって異なることから、一概には決定することができないので、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが野生型逆転写酵素の至適反応温度で二次構造を形成しにくいＲＮＡである場合、当該至適反応温度に設定することができる。また、前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが野生型逆転写酵素の至適反応温度で二次構造を形成しやすいＲＮＡである場合、野生型逆転写酵素の至適反応温度よりも高い温度、例えば、４５〜６５℃となるように設定することができる。
【００５５】
逆転写反応の際の反応系中における逆転写酵素の濃度は、本発明の逆転写方法の用途などによって異なることから、一概には決定することができないので、前記用途などに応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写酵素の濃度は、通常、０．００１〜０．１μＭである。
【００５６】
逆転写反応の際の反応系中におけるオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、通常、０．１〜１０μＭである。
【００５７】
逆転写反応の際の反応系中における４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて異なることから、一概には決定することができないので、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて適宜設定することが好ましい。前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、通常、０．０１〜１μＭである。
【００５８】
前記逆転写反応用緩衝液は、用いられる変異型逆転写酵素の種類に応じて、適宜選択することができる。前記逆転写反応用緩衝液は、２価の陽イオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有してもよい。また、前記逆転写反応用緩衝液は、本発明の目的を妨げない範囲で、必要に応じて、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）、安定化剤（例えば、グリセロール、トレハロースなど）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなど）などの成分を含有していてもよい。
【００５９】
前記逆転写反応用緩衝液中における２価の陽イオンの濃度は、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なることから、一概には決定することができないので、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記２価の陽イオンの濃度は、通常、１〜３０ｍＭである。
【００６０】
前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なることから、一概には決定することができないので、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、通常、６．０〜９．５である。
【００６１】
以上説明したように、本発明の逆転写方法は、本発明の変異型逆転写酵素が用いられているので、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いことから、遺伝子解析、疾患などの検査、有用遺伝子のクローニングなどに有用である。
【００６２】
５．逆転写反応キット
本発明の逆転写反応キットは、逆転写反応を行なうためのキットであって、本発明の変異型逆転写酵素を含有することを特徴としている。本発明の逆転写反応キットは、高い熱安定性を有する本発明の変異型逆転写酵素を含有しているので、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制される温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の逆転写反応キットは、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができるので、汎用性が高い。本発明の逆転写反応キットは、本発明の変異型逆転写酵素を含有しているので、工業的生産性にも優れる。
【００６３】
本発明の逆転写反応キットは、前記変異型逆転写酵素に加えて、逆転写反応を行なうのに必要な試薬を含有していてもよい。かかる試薬としては、例えば、逆転写反応のテンプレートとして用いられるＲＮＡ、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒などが挙げられる。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
【００６４】
本発明の逆転写反応キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液としては、前記変異型逆転写酵素のｐＨ安定性に応じたｐＨを有する緩衝液が挙げられる。
【００６５】
また、前記逆転写反応を行なうのに必要な試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、前記試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。これにより、ユーザーが、各試薬を逆転写反応に適した量となるように混合する必要がなくなるので、取り扱いが容易である。
【００６６】
以上説明したように、本発明の逆転写反応キットは、本発明の変異型逆転写酵素が用いられているので、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いことから、遺伝子解析、疾患などの検査、有用遺伝子のクローニングなどの際の逆転写反応を行なうのに好適である。
【００６７】
６．検出キット
本発明の検出キットは、生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、前記変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴としている。本発明の検出キットは、高い熱安定性を有する前記変異型逆転写酵素を含有しているので、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制される温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の検出キットは、種々の試料に対して用いることができ、汎用性が高い。また、本発明の検出キットは、本発明の変異型逆転写酵素を含有しているので、工業的生産性にも優れる。
【００６８】
前記マーカーとしては、生体中に含まれるウイルスまたは細菌に特有の塩基配列、疾患に特有の塩基配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。なお、本明細書において、「ウイルスまたは細菌に特有の塩基配列」とは、ウイルスまたは細菌には存在するが、生体には存在しない塩基配列をいう。また、「疾患に特有の塩基配列」とは、疾患に罹患した生体には存在するが、疾患に罹患していない正常な生体には存在しない塩基配列をいう。
【００６９】
前記ウイルスとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ノロウイルス、ウエストナイルウイルスなどが挙げられる。また、前記細菌としては、例えば、食中毒の原因となるバチルス・セレウス、サルモネラ、腸管出血性大腸菌、ビブリオ、カンピロバクター、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などが挙げられる。前記疾患としては、癌、糖尿病、心臓病、高血圧、感染症などが挙げられる。
【００７０】
前記マーカーの検出用試薬としては、例えば、前記マーカーとなるＲＮＡに相補的であり、かつ蛍光物質または放射性物質が結合したプローブ、二本鎖核酸に特異的にインターカレートする蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイドなど）などが挙げられる。
【００７１】
本発明の検出キットは、前記変異型逆転写酵素および前記マーカーの検出用試薬に加えて、例えば、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒、陽性対照となるＲＮＡ、陰性対照となるＲＮＡなどを含有していてもよい。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
【００７２】
本発明の検出キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液は、前記逆転写反応キットにおける保存用緩衝液と同様である。
【００７３】
また、前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液などの試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、かかる試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、前記逆転写反応キットの場合と同様の観点から、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。
【００７４】
以上説明したように、本発明の検出キットは、本発明の変異型逆転写酵素が用いられているので、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行なうことができることから、汎用性が高く、被験試料として用いられるＲＮＡの種類を問わず、ウイルスもしくは細菌に特有の塩基配列または疾患に特有の塩基配列を高い精度で検出することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００７６】
製造例１
野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（以下、単に、「ＷＴ」ともいう）をコードするＤＮＡ（配列番号：１）をｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドに挿入して、ＷＴ発現プラスミドｐＥＴ−ＭＲＴを得た。ＷＴ発現プラスミドは、Ｃ末端に（Ｈｉｓ）6が付加されたＨｉｓタグポリペプチドとしてＷＴを発現する。製造例１で得られたＷＴ発現プラスミドｐＥＴ−ＭＲＴの構造を図１に示す。
【００７７】
実施例１
製造例１で得られたｐＥＴ−ＭＲＴと、Ｖ４３３Ｒ用プライマー対と、部位特異的変異用キット〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製、商品名：ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＴＭ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ〕とを用い、ｐＥＴ−ＭＲＴに含まれるＷＴをコードするＤＮＡに対し、配列番号：２の４３３位のバリン残基からアルギニン残基への置換を生じさせる点変異を導入して、変異体発現プラスミドを得た。得られた変異体発現用プラスミドに含まれるＤＮＡに所定の点変異が導入されたかどうかを、ＤＮＡシークエンサー〔（株）島津製作所製、商品名：ＤＳＱ−２０００〕によって確認した。なお、「Ｖ４３３Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。Ｖ４３３Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、表１に示すとおりである。なお、表１中、下線部は、ｐＥＴ−ＭＲＴに含まれるＷＴをコードするＤＮＡとミスマッチである配列を示す。
【００７８】
得られた変異体発現プラスミドを用いて宿主細胞である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた細胞を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス〔組成：１質量％トリプトン、０．５質量％酵母エキス、１質量％塩化ナトリウムおよび残部水〕中、３７℃で培養して、形質転換細胞を得た。
【００７９】
つぎに、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス３ｍＬに、形質転換細胞を播種し、振盪させながら３７℃で１６時間インキュベーションし、培養液を得た。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス３ｍＬに、前記培養液２ｍＬを添加し、前記形質転換細胞を３７℃で２時間インキュベーションした。その後、０．５Ｍイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液２００μＬを添加し、前記形質転換細胞を３０℃で４時間インキュベーションすることにより、タンパク質を発現させた。
【００８０】
得られた培養物を５８４０×ｇで１０分間の遠心分離に供して細胞を回収した。回収された細胞を緩衝液Ａ〔組成：２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２．０ｍＭジチオスレイトールおよび１０体積％グリセロール、ｐＨ７．２〕２０ｍＬに懸濁し、超音波処理に供して破砕した。得られた破砕物を２００００×ｇで２０分間の遠心分離に供し、上清を回収した。回収された上清を、前記緩衝液Ａで平衡化された陰イオン交換樹脂〔東ソー（株）製、商品名：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ〕を充填したカラム（２．５×１２ｃｍ）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。前記カラムを前記緩衝液Ａで洗浄して前記カラムから非吸着のタンパク質を除去した後、緩衝液Ｂ〔組成：３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２．０ｍＭジチオスレイトールおよび１０体積％グリセロール、ｐＨ７．２〕を用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出し、逆転写酵素活性を示す画分を得た。
【００８１】
得られた画分を、緩衝液Ｃ〔組成：２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２．０ｍＭジチオスレイトールおよび１０体積％グリセロール、ｐＨ７．２〕で平行化されたヒスチジンタグ結合タンパク質精製用プレパックカラム〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍＬ〕に供した。前記カラムを緩衝液Ｄ〔組成：８０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２．０ｍＭジチオスレイトールおよび１０体積％グリセロール、ｐＨ７．２〕で洗浄して前記カラムから非吸着のタンパク質を除去した後、緩衝液Ｅ〔組成：５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２．０ｍＭジチオスレイトールおよび１０体積％グリセロール、ｐＨ７．２〕を用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出し、逆転写酵素活性を示すアフィニティー精製画分を得た。得られた画分を緩衝液Ｆ〔組成：２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２．０ｍＭジチオスレイトールおよび５０体積％グリセロール、ｐＨ７．２〕に対して透析し、配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｒ）を得た。
【００８２】
実施例２〜４
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｖ４３３Ｋ用プライマー対（実施例２）、Ｉ４３４Ｒ用プライマー対（実施例３）またはＩ４３４Ｋ用プライマー対（実施例４）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基がリジン残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｋ）（実施例２）、配列番号：２に示される配列中の４３４位のイソロイシン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）（実施例３）または配列番号：２に示される配列中の４３４位のイソロイシン残基がリジン残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｋ）（実施例４）を得た。なお、「Ｖ４３３Ｋ」は配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基に対応するアミノ酸残基のリジン残基への置換、「Ｉ４３４Ｒ」は配列番号：２に示される配列中の４３４位のイソロイシン残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換および「Ｉ４３４Ｋ」は配列番号：２に示される配列中の４３４位のイソロイシン残基に対応するアミノ酸残基のリジン残基への置換を示す。各プライマー対を構成するプライマーは、表１に示されるとおりである。
【００８３】
比較例１および２
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｌ３０４Ｒ用プライマー対（比較例１）またはＬ３０４Ｋ用プライマー対（比較例２）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、配列番号：２に示される配列中の３０４位のロイシン残基がアルギニン残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型逆転写酵素（Ｌ３０４Ｒ）（比較例１）または配列番号：２に示される配列中の３０４位のロイシン残基がリジン残基に置換されたアミノ酸配列を有する変異型逆転写酵素（Ｌ３０４Ｋ）（比較例２）を得た。なお、「Ｌ３０４Ｒ」は配列番号：２に示される配列中の３０４位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換および「Ｌ３０４Ｋ」は配列番号：２に示される配列中の３０４位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基のリジン残基への置換を示す。各プライマー対を構成するプライマーは、表１に示されるとおりである。
【００８４】
比較例３
実施例１において、変異体発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換する代わりに、製造例１で得られたＷＴ発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換したことを除き、実施例１と同様に操作を行ない、ＷＴを得た。
【００８５】
【表１】
2014082936.tif 000002
【００８６】
試験例１
被験試料として、実施例１、２、３もしくは４または比較例１もしくは２で得られた変異型逆転写酵素を含有する透析画分を、ドデシル硫酸ナトリウム変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）に供した。その結果、実施例１〜４および比較例１および２で得られた変異型逆転写酵素を含有する透析画分は、いずれも、７５ｋＤａの単一のバンドを示した。
【００８７】
試験例２
（１）逆転写酵素活性および比活性の測定
被験試料として、実施例１、２、３もしくは４、比較例１もしくは２で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴを含有する透析画分を用いて逆転写反応を行なった。逆転写反応に用いられた反応液の組成は、３０ｎＭ変異型逆転写酵素またはＷＴ、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕および０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕である。逆転写反応に用いられた反応液の容量は７２μＬである。逆転写反応は、前記反応液を３７℃でインキュベーションすることによって行なった。
【００８８】
インキュベーション開始から２．５分間、５．０分間または７．５分間経過後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回行なった。
【００８９】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出した。つぎに、ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて初期反応速度を算出し、逆転写酵素活性を算出した。なお、逆転写酵素活性における１ユニットは、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量として定義した。
【００９０】
また、既知量のウシ血清アルブミンの標品と、タンパク質定量試薬〔ナカライテスク（株）製、商品名：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ＣＢＢ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕とを用いてブラッドフォード法に準じて作成された検量線に基づいて、透析画分に含まれる変異型逆転写酵素またはＷＴの量を調べた。
【００９１】
その後、実施例１、２、３もしくは４、比較例１もしくは２で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴを含有する透析画分の逆転写酵素活性と、比較例１もしくは２で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴの量とから、比活性を算出した。
【００９２】
試験例２において、被験試料と比活性との関係を調べた結果を図２に示す。図中、レーン１は実施例１で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｒ）、レーン２は実施例２で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｋ）、レーン３は実施例３で得られた変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）、レーン４は実施例４で得られた変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）、レーン５は比較例１で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ３０４Ｒ）、レーン６は比較例２で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ３０４Ｋ）およびレーン７は比較例３で得られたＷＴを示す。
【００９３】
図２に示された結果から、実施例１〜４で得られた変異型逆転写酵素は、いずれも一般的に実用上十分であると考えられる比活性（４００００ユニット／ｍｇ）を有していることがわかる。これに対し、比較例１および２で得られた変異型逆転写酵素の比活性は、いずれも著しく低く、実用上不向きであることがわかる。
【００９４】
（２）残存活性の測定
実施例１、２、３もしくは４で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴを、当該変異型逆転写酵素またはＷＴの濃度が３０ｎＭとなるように、インキュベーション用溶液〔組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕２００μＬに添加した。得られた混合物を、４８℃または５０℃で１０分間インキュベーションすることにより、実施例１、２、３もしくは４で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴに熱処理を施した。つぎに、熱処理後の変異型逆転写酵素または熱処理後のＷＴを含有する混合物を、氷上で３０〜６０分間インキュベーションした。
【００９５】
つぎに、熱処理後の変異型逆転写酵素または熱処理後のＷＴを、当該熱処理後の変異型逆転写酵素または熱処理後のＷＴの濃度が３０ｎＭとなるように、前記反応液に添加し、得られた混合物を３７℃でインキュベーションして逆転写酵素反応を行なった。
【００９６】
インキュベーション開始から２．５分間、５．０分間または７．５分間経過後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、氷上で冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、氷上で冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄することにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回、エタノール水溶液による洗浄は１回行なった。
【００９７】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノスティックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、液体シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいてｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
【００９８】
ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて初期反応速度を算出した。つぎに、熱処理を行なっていない場合の初期反応速度（「初期反応速度Ａ」という）と、熱処理を行なった場合の初期反応速度（「初期反応速度Ｂ」という）とから、残存活性を算出した。前記残存活性は、式（Ｉ）：
［残存活性（％）］＝初期反応速度Ｂ／初期反応速度Ａ×１００        （Ｉ）
で表わされる式に基づいて算出した。
【００９９】
試験例２において、被験試料と５０℃での熱処理後の残存活性との関係を調べた結果を図３に示す。図中、レーン１は実施例１で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｒ）、レーン２は実施例２で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｋ）、レーン３は実施例３で得られた変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）、レーン４は実施例４で得られた変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）およびレーン５は比較例３で得られたＷＴを示す。
【０１００】
図３に示された結果から、実施例１で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｒ）、実施例２で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｋ）、実施例３で得られた変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）および実施例４で得られた変異型逆転写酵素（Ｉ４３４Ｒ）の５０℃での熱処理後の残存活性（レーン１〜４）は、ＷＴの５０℃での熱処理後の残存活性（レーン５）と比べて高いことがわかる。また、実施例１〜４で得られた変異型逆転写酵素それぞれの５０℃での熱処理後の初期反応速度と比較例３で得られたＷＴの５０℃での熱処理後の初期反応速度とを比較した結果を表２に示す。
【０１０１】
【表２】
2014082936.tif 000003
【０１０２】
表２に示された結果から、実施例１〜４で得られた変異型逆転写酵素それぞれの５０℃での熱処理後の初期反応速度は、比較例３で得られたＷＴの５０℃での熱処理後の初期反応速度と比べて大きい傾向にあることがわかる。また、４８℃での熱処理を行なった場合、実施例で得られた変異型逆転写酵素それぞれの４８℃での熱処理後の初期反応速度は、比較例３で得られたＷＴの４８℃での熱処理後の初期反応速度と比べて大きい傾向にあった（例えば、表３参照）。
【０１０３】
【表３】
2014082936.tif 000004
【０１０４】
以上の結果から、配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を、アルギニン残基、リジン残基などの正電荷アミノ酸残基に置換することにより、ＷＴと比べて熱安定性を向上させることができることがわかる。
【０１０５】
実施例５
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｅ２８６Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。また、「Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｅ２８６Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＥ２８６Ｒ〔５’−ｃｔｇａｇｇｃｃａｇａａａａｃｇｔａｃｔｇｔｇａｔｇｇｇｇｃａ−３’（配列番号：１５）〕およびプライマーＥ２８６Ｒ＿ＣＰ〔５’−ｔｇｃｃｃｃａｔｃａｃａｇｔａｃｇｔｔｔｔｃｔｇｇｃｃｔｃａｇ−３’（配列番号：１６）〕である。
【０１０６】
実施例６
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１０８Ａ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｄ１０８Ａ」は、配列番号：２に示される配列中の１０８位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を示す。また、「Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｄ１０８Ａ、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｄ１０８Ａ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＤ１０８Ａ〔５’−ａａｃｃａｇｇｇａｃｔａａｔｇｃｔｔａｔａｇｇｃｃｔｇｔｃｃａ−３’（配列番号：１７）〕およびプライマーＤ１０８Ａ＿ＣＰ〔５’−ｔｇｇａｃａｇｇｃｃｔａｔａａｇｃａｔｔａｇｔｃｃｃｔｇｇｔｔ−３’（配列番号：１８）〕である。
【０１０７】
実施例７
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１０８Ｒ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｄ１０８Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の１０８位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。また、「Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｄ１０８Ｒ、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｄ１０８Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＤ１０８Ｒ〔５’−ａａｃｃａｇｇｇａｃｔａａｔｃｇｔｔａｔａｇｇｃｃｔｇｔｃｃａ−３’（配列番号：１９）〕およびプライマーＤ１０８Ｒ＿ＣＰ〔５’−ｔｇｇａｃａｇｇｃｃｔａｔａａｃｇａｔｔａｇｔｃｃｃｔｇｇｔｔ−３’（配列番号：２０）〕である。
【０１０８】
実施例８
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ１１７Ａ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｅ１１７Ａ」は、配列番号：２に示される配列中の１１７位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を示す。また、「Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｅ１１７Ａ、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｅ１１７Ａ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＥ１１７Ａ〔５’−ｔｃｃａｇｇａｔｃｔｇａｇａｇｃａｇｔｃａａｃａａｇ−３’（配列番号：２１）〕およびプライマーＥ１１７Ａ＿ＣＰ〔５’−ｃｔｔｇｔｔｇａｃｔｇｃｔｃｔｃａｇａｔｃｃｔｇｇａ−３’（配列番号：２２）〕である。
【０１０９】
実施例９
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ１１７Ｒ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｅ１１７Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の１１７位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。また、「Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｅ１１７Ｒ、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｅ１１７Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＥ１１７Ｒ〔５’−ｔｃｃａｇｇａｔｃｔｇａｇａｃｇｔｇｔｃａａｃａａｇ−３’（配列番号：２３）〕およびプライマーＥ１１７Ｒ＿ＣＰ〔５’−ｃｔｔｇｔｔｇａｃａｃｇｔｃｔｃａｇａｔｃｃｔｇｇａ−３’（配列番号：２４）〕である。
【０１１０】
実施例１０
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１２４Ａ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｄ１２４Ａ」は、配列番号：２に示される配列中の１２４位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を示す。また、「Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｄ１２４Ａ、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｄ１２４Ａ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＤ１２４Ａ〔５’−ａｃａａｇｃｇｇｇｔｇｇａａｇｃｃａｔｃｃａｃｃｃｃａｃｃｇｔ−３’（配列番号：２５）〕およびプライマーＤ１２４Ａ＿ＣＰ〔５’−ａｃｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇａｔｇｇｃｔｔｃｃａｃｃｃｇｃｔｔｇｔ−３’（配列番号：２６）〕である。
【０１１１】
実施例１１
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１２４Ｒ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）を得た。なお、「Ｄ１２４Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の１２４位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。また、「Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ」は、Ｄ１２４Ｒ、Ｅ２８６ＲおよびＶ４３３Ｒを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｄ１２４Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＤ１２４Ｒ〔５’−ａｃａａｇｃｇｇｇｔｇｇａａｃｇｃａｔｃｃａｃｃｃｃａｃｃｇｔ−３’（配列番号：２７）〕およびプライマーＤ１２４Ｒ＿ＣＰ〔５’−ａｃｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇａｔｇｃｇｔｔｃｃａｃｃｃｇｃｔｔｇｔ−３’（配列番号：２８）〕である。
【０１１２】
実施例１２
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｄ５２４Ａ」は、配列番号：２に示される配列中の５２４位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を示す。また、「Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。なお、Ｄ５２４Ａ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＤ５２４Ａ〔５’−ｃａｃａｃｃｔｇｇｔａｃａｃａｇｃｔｇｇａａｇｃａｇｔｃｔｃ−３’（配列番号：２９）〕およびプライマーＤ５２４Ａ＿ＣＰ〔５’−ｇａｇａｃｔｇｃｃｔｃｃａｇｃｔｇｔｇｔａｃｃａｇｇｔｇｔｇ−３’（配列番号：３０）〕である。
【０１１３】
実施例１３
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１０８Ａ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｄ１０８Ａ、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１４】
実施例１４
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１０８Ｒ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｄ１０８Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１５】
実施例１５
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ１１７Ａ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｅ１１７Ａ、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１６】
実施例１６
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ１１７用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｅ１１７Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１７】
実施例１７
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１２４Ａ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｄ１２４Ａ、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１８】
実施例１８
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｄ１２４Ｒ用プライマー対とＥ２８６Ｒ用プライマー対とＶ４３３Ｒ用プライマー対とＤ５２４Ａ用プライマー対とを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、「Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ」は、Ｄ１２４Ｒ、Ｅ２８６Ｒ、Ｖ４３３ＲおよびＤ５２４Ａを有する多重変異体を意味する。得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１９】
試験例３
実施例１、２、５〜１８で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴを、当該変異型逆転写酵素またはＷＴの濃度が３０ｎＭとなるように、インキュベーション用溶液２００μＬに添加した。得られた混合物を、４６℃、４８℃、５０℃または５２℃で１０分間インキュベーションすることにより、実施例１、２、５〜１８で得られた変異型逆転写酵素または比較例３で得られたＷＴに熱処理を施した。つぎに、熱処理後の変異型逆転写酵素または熱処理後のＷＴを含有する混合物を、氷上で３０〜６０分間インキュベーションした。
【０１２０】
つぎに、熱処理後の変異型逆転写酵素または熱処理後のＷＴを、当該熱処理後の変異型逆転写酵素または熱処理後のＷＴの濃度が３０ｎＭとなるように、前記反応液に添加し、得られた混合物を３７℃でインキュベーションして逆転写酵素反応を行なった。
【０１２１】
その後、インキュベーション開始から２．５分間、５．０分間または７．５分間経過後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、氷上で冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、氷上で冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄することにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回、エタノール水溶液による洗浄は１回行なった。
【０１２２】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノスティックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、液体シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいてｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
【０１２３】
ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて初期反応速度を算出した。つぎに、前記残存活性を前記式（Ｉ）で表わされる式に基づいて算出した。
【０１２４】
試験例３において、被験試料と４６℃、４８℃、５０℃または５２℃での熱処理後の初期反応速度との関係を調べた結果を表４に示す。また、試験例３において、被験試料と熱処理後の残存活性との関係を調べた結果を図４に示す。図中、レーン１は実施例１で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｒ）、レーン２は実施例２で得られた変異型逆転写酵素（Ｌ４３３Ｋ）、レーン３は実施例５で得られた変異型逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン４は実施例６で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン５は実施例７で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン６は実施例８で得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン７は実施例９で得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン８は実施例１０で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン９は実施例１１で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ）、レーン１０は実施例１２で得られた変異型逆転写酵素（Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）、レーン１１は実施例１３で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）、レーン１２は実施例１４で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１０８Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）、レーン１３は実施例１５で得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）、レーン１４は実施例１６で得られた変異型逆転写酵素（Ｅ１１７Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）、レーン１５は実施例１７で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ａ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）、レーン１６は実施例１８で得られた変異型逆転写酵素（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｖ４３３Ｒ／Ｄ５２４Ａ）およびレーン１７は比較例３で得られたＷＴを示す。また、図中、斜線バーは４６℃での熱処理後の残存活性、格子バーは４８℃での熱処理後の残存活性、黒色バーは５０℃での熱処理後の残存活性および白色バーは５２℃での熱処理後の残存活性を示す。
【０１２５】
【表４】
2014082936.tif 000005
【０１２６】
表４に示された結果から、実施例１、２、５〜１８で得られた変異型逆転写酵素の４６℃での熱処理後の初期反応速度、４８℃での熱処理後の初期反応速度、５０℃での熱処理後の初期反応速度および５２℃での熱処理後の初期反応速度のいずれもが、比較例３で得られたＷＴにものよりも著しく大きいことがわかる。また、図４に示された結果から、実施例１、２、５〜１８で得られた変異型逆転写酵素の４６℃での熱処理後の残存活性、４８℃での熱処理後の残存活性、５０℃での熱処理後の残存活性および５２℃での熱処理後の残存活性のいずれもが、比較例３で得られたＷＴにものよりも著しく高いことがわかる。特に、比較例３で得られたＷＴは、５２℃での熱処理によって完全に失活しているのに対し、実施例１、２、５〜１８で得られた変異型逆転写酵素は、５２℃での熱処理によっても十分な逆転写酵素活性を有していることがわかる。
【０１２７】
したがって、配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基に対応するアミノ酸残基を、アルギニン残基、リジン残基などの正電荷アミノ酸残基に置換し、かつ配列番号：２に示される配列中の１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基および５２４位のアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を、アルギニン残基などの正電荷アミノ酸残基またはアラニン残基などの非極性アミノ酸残基に置換することにより、ＷＴと比べて熱安定性を格段に向上させることができることがわかる。
【０１２８】
なお、４３３位のバリン残基に対応するアミノ酸残基を正電荷アミノ酸残基に置換する代わりに、４３４位のイソロイシン残基に対応するアミノ酸残基を正電荷アミノ酸残基に置換した場合にも、同様の傾向が見られる。
【０１２９】
以上の結果から、配列番号：２に示される配列中の４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を正電荷アミノ酸残基に置換し、かつ配列番号：２に示される配列中の１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基および５２４位のアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、ＷＴと比べて著しく高い熱安定性を有する変異型逆転写酵素が得られることがわかる。
【０１３０】
試験例４
実施例１〜１８において、本発明の変異型逆転写酵素（実施例１〜１８）を宿主細胞内で発現させた場合、ＷＴを宿主細胞内で発現させた場合よりも分画が容易である傾向が見られた。そこで、本発明の変異型逆転写酵素（実施例１〜１８）を宿主細胞内で発現させたときに生産される目的タンパク質および夾雑タンパク質の発現パターンを調べた。
【０１３１】
実施例１および２と同様の操作を行なうことにより、Ｖ４３３Ｒ変異体発現プラスミドおよびＶ４３３Ｋ変異体発現プラスミドを得た。また、実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｅ３０２Ｋ用プライマー対を用いたことを除き、Ｅ３０２Ｋ変異体発現プラスミドを得た。つぎに、Ｖ４３３Ｒ変異体発現プラスミド（実施例１９）、Ｖ４３３Ｋ変異体発現プラスミド（実施例２０）、製造例１で得られたＷＴ発現プラスミド（比較例４）またはＥ３０２Ｋ変異体発現プラスミド（比較例５）を用いて宿主細胞である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた細胞を、ＩＰＴＧ誘導が不要である自動発現誘導システム〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製、商品名：Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〕を用い、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス３ｍＬ中で振盪させながら３０℃で１６時間インキュベーションすることにより、タンパク質を発現させた。得られた培養物を５８４０×ｇで１０分間の遠心分離に供して細胞を回収した。回収された細胞を緩衝液Ａ２０ｍＬに懸濁し、超音波処理に供して破砕した。得られた破砕物を２００００×ｇで２０分間の遠心分離に供し、上清を回収することにより、変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｒ）を含有する可溶性画分（実施例１９）、変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｋ）を含有する可溶性画分（実施例２０）、ＷＴを含有する可溶性画分（比較例４）または変異型逆転写酵素（Ｅ３０２Ｋ）を含有する可溶性画分（比較例５）を得た。
【０１３２】
得られた各可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。試験例４において、可溶性画分２．７μＬ相当量のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図５（Ａ）、可溶性画分０．９μＬ相当量のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図５（Ｂ）に示す。図中、レーン１はＷＴを含有する可溶性画分（比較例４）、レーン２は変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｒ）を含有する可溶性画分（実施例１９）、レーン３は変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｋ）を含有する可溶性画分（実施例２０）、レーン４は変異型逆転写酵素（Ｅ３０２Ｋ）を含有する可溶性画分（比較例５）を示す。
【０１３３】
図５（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｒ）を含有する可溶性画分および変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｋ）を含有する可溶性画分における各変異型逆転写酵素に相当する７５ｋＤａのバンドの強度は、ＷＴを含有する可溶性画分および変異型逆転写酵素（Ｅ３０２Ｋ）を含有する可溶性画分における７５ｋＤａのバンドの強度と比べて高いことが示された。これに対し、変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｒ）を含有する可溶性画分および変異型逆転写酵素（Ｖ４３３Ｋ）を含有する可溶性画分における夾雑タンパク質のバンドの強度は、ＷＴを含有する可溶性画分および変異型逆転写酵素（Ｅ３０２Ｋ）を含有する可溶性画分における夾雑タンパク質のバンドの強度と同程度であることが示された。かかる７５ｋＤａのバンドの強度の違いは、発現プラスミドの作製に用いられたベクターの種類の如何を問わず、同様である。また、実施例３〜１８で得られた各変異型逆転写酵素についても、同様の傾向が見られる。
【０１３４】
したがって、本発明の変異型逆転写酵素は、他の夾雑タンパク質からの分離が容易であり、工業的生産性に優れることが示唆される。
【０１３５】
実施例２１〜２４
実施例１において、プライマー対としてＶ４３３Ｒ用プライマー対を用いる代わりに、Ｆ３０３Ｒ用プライマー対（実施例２１）、Ｆ３０３Ｋ用プライマー対（実施例２２）、Ｌ４３２Ｒ用プライマー対（実施例２３）またはＬ４３２Ｋ用プライマー対（実施例２４）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｒ）（実施例２１）、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｋ）（実施例２２）、変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｒ）（実施例２３）または変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｋ）（実施例２４）を得た。なお、「Ｆ３０３Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の３０３位のフェニルアラニン残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。「Ｆ３０３Ｋ」は、配列番号：２に示される配列中の３０３位のフェニルアラニン残基に対応するアミノ酸残基のリジン残基への置換を示す。「Ｌ４３２Ｒ」は、配列番号：２に示される配列中の４３２位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換を示す。「Ｌ４３２Ｋ」は、配列番号：２に示される配列中の４３２位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基のリジン残基への置換を示す。Ｆ３０３Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＦ３０３Ｒ（５’−ｇａｃａａｃｔａａｇｇｇａｇｃｇｃｃｔａｇｇｇａｃｇｇｃａｇ−３’）（配列番号：３１）およびプライマーＦ３０３Ｒ＿ＣＰ（５’−ｃｔｇｃｃｇｔｃｃｃｔａｇｇｃｇｃｔｃｃｃｔｔａｇｔｔｇｔｃ−３’）（配列番号：３２）である。Ｆ３０３Ｋ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＦ３０３Ｋ（５’−ｇａｃａａｃｔａａｇｇｇａｇａａａｃｔａｇｇｇａｃｇｇｃａｇ−３’）（配列番号：３３）およびプライマーＦ３０３Ｋ＿ＣＰ（５’−ｃｔｇｃｃｇｔｃｃｃｔａｇｔｔｔｃｔｃｃｃｔｔａｇｔｔｇｔｃ−３’）（配列番号：３４）である。Ｌ４３２Ｒ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＬ４３２Ｒ（５’−ｃｃａｔｇｇｇａｃａｇｃｃａｃｇｔｇｔｃａｔｔｃｔｇｇｃｃｃ−３’）（配列番号：３５）およびプライマーＬ４３２Ｒ＿ＣＰ（５’−ｇｇｇｃｃａｇａａｔｇａｃａｃｇｔｇｇｃｔｇｔｃｃｃａｔｇｇ−３’）（配列番号：３６）である。Ｌ４３２Ｋ用プライマー対を構成するプライマーは、プライマーＬ４３２Ｋ（５’−ｃｃａｔｇｇｇａｃａｇｃｃａａａａｇｔｃａｔｔｃｔｇｇｃｃｃ−３’）（配列番号：３７）およびプライマーＬ４３２Ｋ＿ＣＰ（５’−ｇｇｇｃｃａｇａａｔｇａｃｔｔｔｔｇｇｃｔｇｔｃｃｃａｔｇｇ−３’）（配列番号：３８）である。
【０１３６】
変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｒ）（実施例２１）、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｋ）（実施例２２）、変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｒ）（実施例２３）および変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｋ）（実施例２４）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、いずれも７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１３７】
また、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｒ）（実施例２１）、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｋ）（実施例２２）、変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｒ）（実施例２３）および変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｋ）（実施例２４）の５０℃での熱処理後の初期反応速度および残存活性を試験例２（２）と同様の操作を行なうことによって測定した。その結果、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｒ）（実施例２１）、変異型逆転写酵素（Ｆ３０３Ｋ）（実施例２２）、変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｒ）（実施例２３）および変異型逆転写酵素（Ｌ４３２Ｋ）（実施例２４）の５０℃での熱処理後の初期反応速度が平均１．９ｎＭ／ｓであったことから、ＷＴの５０℃での熱処理後の初期反応速度よりも高い傾向があることがわかった。
【０１３８】
以上の結果から、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２に示される配列中の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基、からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を、アルギニン残基、リジン残基などの正電荷アミノ酸残基に置換することにより、ＷＴと比べて熱安定性を向上させることができることがわかる。
【０１３９】
また、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２に示される配列中の３０３位のフェニルアラニン残基、４３２位のロイシン残基、４３３位のバリン残基および４３４位のイソロイシン残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を、アルギニン残基、リジン残基などの正電荷アミノ酸残基に置換し、かつ配列番号：２に示される配列中の１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基および５２４位のアスパラギン酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つの残基に対応するアミノ酸残基を、アルギニン残基などの正電荷アミノ酸残基またはアラニン残基などの非極性アミノ酸残基に置換すると、得られる変異型逆転写酵素の熱安定性は、ＷＴの熱安定性と比べて格段に向上する。
【０１４０】
以上説明したように、本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を有していることから、高い反応温度での反応に用いた場合であっても、高い逆転写酵素活性を発現する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素によれば、テンプレートとして用いられるＲＮＡが二次構造を形成しやすい配列を含む場合であっても、逆転写反応の際の反応温度を高い温度に設定することで、二次構造の形成を抑制し、かつ逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の変異型逆転写酵素は、用いられるＲＮＡ含有試料に制限されることのない汎用性の高い分析用試薬（例えば、逆転写反応キット）、ウイルス、細菌、疾患などの検出用試薬（例えば、検出キット）などとして有用であることが示唆される。また、本発明の変異型逆転写酵素は、工業的生産性に優れている。
【０１４１】
処方例１
以下、逆転写反応キットの例を示す。
（逆転写反応キット）
−  実施例１で得られた変異型逆転写酵素
−  １０×逆転写酵素緩衝液
〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、
２０ｍＭジチオスレイトール〕
−  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
−  １０μＭ（標準ＲＮＡ増幅用）プライマー水溶液
−  標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
【０１４２】
処方例２〜２４
処方例１において、実施例１で得られた変異型逆転写酵素を用いる代わりに、実施例２〜２４で得られた各変異型逆転写酵素を用いることにより、処方例２〜２４の逆転写反応キットが得られる。
【０１４３】
処方例２５
以下、検出キットの例を示す。
（検出キット）
−  実施例１で得られた変異型逆転写酵素
−  １０×逆転写酵素緩衝液
〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、
２０ｍＭジチオスレイトール〕
−  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
−  １０μＭ  ＲＶ−Ｒ２６プライマー水溶液
−  標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
−  大腸菌ＲＮＡ溶液（１．０μｇ／μＬ）
【０１４４】
処方例２６〜４８
処方例２５において、実施例１で得られた変異型逆転写酵素を用いる代わりに、実施例２〜２４で得られた各変異型逆転写酵素を用いることにより、処方例２６〜４８の検出キットが得られる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４５】
配列番号：３は、プライマーＶ４３３Ｒの配列である。
配列番号：４は、プライマーＶ４３３Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：５は、プライマーＶ４３３Ｋの配列である。
配列番号：６は、プライマーＶ４３３Ｋ＿ＣＰの配列である。
配列番号：７は、プライマーＩ４３４Ｒの配列である。
配列番号：８は、プライマーＩ４３４Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：９は、プライマーＩ４３４Ｋの配列である。
配列番号：１０は、プライマーＩ４３４Ｋ＿ＣＰの配列である。
配列番号：１１は、プライマーＬ３０４Ｒの配列である。
配列番号：１２は、プライマーＬ３０４Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：１３は、プライマーＬ３０４Ｋの配列である。
配列番号：１４は、プライマーＬ３０４Ｋ＿ＣＰの配列である。
配列番号：１５は、プライマーＥ２８６Ｒの配列である。
配列番号：１６は、プライマーＥ２８６Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：１７は、プライマーＤ１０８Ａの配列である。
配列番号：１８は、プライマーＤ１０８Ａ＿ＣＰの配列である。
配列番号：１９は、プライマーＤ１０８Ｒの配列である。
配列番号：２０は、プライマーＤ１０８Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：２１は、プライマーＥ１１７Ａの配列である。
配列番号：２２は、プライマーＥ１１７Ａ＿ＣＰの配列である。
配列番号：２３は、プライマーＥ１１７Ｒの配列である。
配列番号：２４は、プライマーＥ１１７Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：２５は、プライマーＤ１２４Ａの配列である。
配列番号：２６は、プライマーＤ１２４Ａ＿ＣＰの配列である。
配列番号：２７は、プライマーＤ１２４Ｒの配列である。
配列番号：２８は、プライマーＤ１２４Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：２９は、プライマーＤ５２４Ａの配列である。
配列番号：３０は、プライマーＤ５２４Ａ＿ＣＰの配列である。
配列番号：３１は、プライマーＦ３０３Ｒの配列である。
配列番号：３２は、プライマーＦ３０３Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：３３は、プライマーＦ３０３Ｋの配列である。
配列番号：３４は、プライマーＦ３０３Ｋ＿ＣＰの配列である。
配列番号：３５は、プライマーＬ４３２Ｒの配列である。
配列番号：３６は、プライマーＬ４３２Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：３７は、プライマーＬ４３２Ｋの配列である。
配列番号：３８は、プライマーＬ４３２Ｋ＿ＣＰの配列である。
【図１】
2014082936.tif 000006
【図２】
2014082936.tif 000007
【図３】
2014082936.tif 000008
【図４】
2014082936.tif 000009
【図５】
2014082936.tif 000010
【配列表】
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