【手続補正書】
【提出日】令和3年3月18日(2021.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無細胞ＤＮＡ断片を含むヒト対象の生体試料を分析することにより前記ヒト対象における腫瘍由来変異を特定する方法であって、前記方法が、
分析される前記生体試料から鋳型ＤＮＡ断片を得ることであって、前記生体試料が、正常細胞及び腫瘍細胞又は癌関連細胞に起源をもつＤＮＡ断片を含み、前記鋳型ＤＮＡ断片が、無細胞ＤＮＡ断片の少なくとも一部を含む、得ることと、
前記鋳型ＤＮＡ断片を使用して分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを調製することであって、前記鋳型ＤＮＡ断片からの前記配列決定用ライブラリの重複率が５％未満である、調製することと、
コンピュータシステムで分析可能なＤＮＡ分子の前記配列決定用ライブラリを配列決定して、第１の配列リードを得ることであって、前記第１の配列リードは第１の配列から成る、得ることと、
前記コンピュータシステムで前記ヒト対象の複数の血液細胞由来のＤＮＡ分子の第２の配列リードを得ることであって、前記第２の配列リードは第２の配列から成る、得ることと、
前記コンピュータシステムで、前記無細胞ＤＮＡ断片の前記第１の配列の一部をフィルタリングすることによって、前記ヒト対象の前記複数の血液細胞由来の第２の配列中にも存在する、前記無細胞ＤＮＡ断片中の腫瘍由来変異を検出することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記血液細胞が白血球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを配列決定することが、ペアエンド配列決定を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを配列決定することが、ランダム配列決定を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを配列決定することが、大規模並列配列決定を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト対象の前記複数の血液細胞からＤＮＡ分子を配列決定して、第２の配列リードを得ることを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の血液細胞からＤＮＡ分子を配列決定することが、ペアエンド配列決定を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の血液細胞からＤＮＡ分子を配列決定することが、ランダム配列決定を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の血液細胞からＤＮＡ分子を配列決定することが、大規模並列配列決定を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
無細胞ＤＮＡ断片を含むヒト対象の生体試料を分析することにより前記ヒト対象における体細胞変異を特定する方法であって、前記方法が、
（ａ）分析される前記生体試料から鋳型ＤＮＡ断片を得ることであって、前記生体試料が、正常細胞、及び潜在的に腫瘍細胞又は癌に関連付けられる細胞に起源を持つＤＮＡ断片を含み、前記鋳型ＤＮＡ断片が、無細胞ＤＮＡ断片の少なくとも一部を含む、得ることと、
（ｂ）前記鋳型ＤＮＡ断片を使用して分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを調製することであって、前記鋳型ＤＮＡ断片から分析可能なＤＮＡ分子の前記配列決定用ライブラリの重複率が５％未満である前、調製することと、
（ｃ）分析可能なＤＮＡ分子の前記配列決定用ライブラリを配列決定して、配列リードを得ることと、
（ｄ）前記ヒト対象のバフィーコート試料由来のＤＮＡ分子の配列リードを受け取ることと、
（ｅ）（ｃ）及び（ｄ）の配列リードを分析して、腫瘍由来として、無細胞ＤＮＡ断片に存在するが前記ヒト対象のバフィーコート試料由来のＤＮＡ分子には存在しない、一塩基変異体を決定することと、
を含む、方法。
【請求項１１】
（ｃ）及び（ｄ）の配列リードを分析して一塩基変異体を決定することが、（ｃ）の配列リードを、（ｄ）の配列リードと比較して、一塩基変異体を有する複数の座位を検出することを含み、
前記複数の座位の各々において、（ｄ）の配列リードに比べて一塩基変異体を有する（ｃ）の配列リードの数がカットオフ値を上回り、前記カットオフ値が１よりも大きい、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
コンピュータシステムで、前記ヒト対象を、前記無細胞ＤＮＡ断片に存在する一塩基変異体に基づいて癌を有すると特定することを更に含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記コンピュータシステムで、前記ヒト対象中の癌レベルを、前記無細胞ＤＮＡ断片に存在する一塩基変異体に少なくとも部分的に基づいて特定することを更に含む。請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記コンピュータシステムで、腫瘍ＤＮＡの分率濃度を、前記無細胞ＤＮＡ断片に存在する一塩基変異体に少なくとも部分的に基づいて決定することを更に含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
無細胞ＤＮＡ断片を含むヒト対象の生体試料を分析することにより前記ヒト対象における１以上の腫瘍由来変異を特定する方法であって、
分析される前記生体試料から鋳型ＤＮＡ断片を得ることであって、前記生体試料が、正常細胞、及び潜在的に腫瘍細胞又は癌に関連付けられる細胞に起源を持つＤＮＡ断片を含み、前記鋳型ＤＮＡ断片が前記無細胞ＤＮＡ断片の少なくとも一部を含む、得ることと、
前記鋳型ＤＮＡ断片を使用して分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを調製することであって、前記鋳型ＤＮＡ断片から分析可能なＤＮＡ分子の前記配列決定用ライブラリの重複率が５％未満である、調製することと、
分析可能なＤＮＡ分子の配列決定用ライブラリを配列決定して、第１の配列リードを得ることと、
前記ヒト対象由来の生得的試料からの配列決定ＤＮＡ分子から得られた第２の配列リードから生得的ゲノムを決定することと、
前記生体試料から１以上の潜在的配列変異体を特定することと、
ここで、前記１以上の潜在的配列変異体を特定することが、
前記第１の配列リードのためのゲノム位置を決定し、
１以上の座位に位置付けられた１以上の第２の配列リードにおいて前記１以上の潜在的配列変異体を検出することと、を含み、
前記１以上の潜在的配列変異体の前記１以上の第１の配列リードと、前記１以上の座位での生得的ゲノムとの比較に基づいて、前記ヒト対象において前記１以上の腫瘍由来変異を特定することと、
を含む、方法。
【請求項１６】
前記１以上の座位の各々において、前記生得的ゲノムに対する配列変異体を有する前記１以上の第１の配列リードの数が、カットオフ値を上回り、前記カットオフ値が１よりも大きい、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１以上の座位の各々における前記１以上の潜在的配列変異体が、参照ゲノムに対する前記１以上の第１の配列リードで検出される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記１以上の潜在的配列変異体が、一塩基変異体を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生得的試料が、血液細胞、白血球細胞、口腔細胞、毛包、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１以上の生得的変異体を検出することを更に含み、前記１以上の生得的変異体を検出することが、
前記生得的試料から得られた第２の配列リードのゲノム位置を決定することと、
参照ゲノムに対する１以上の座位での１以上の生得的変異体を検出すること、
を含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１以上の腫瘍由来変異を非同義変化に関連すると特定することを更に含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生得的ゲノムがヒトゲノムの一部である、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１以上の潜在的配列変異体の、前記生得的ゲノムとの比較に基づいて、前記ヒト対象における前記１以上の腫瘍由来変異を特定することが、前記１以上の潜在的配列変異体から前記生得的ゲノムの生得的変異体を差し引くことを含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒト対象の前記生得的試料由来の配列決定ＤＮＡ分子から得られた前記第２の配列リードから前記生得的ゲノムを決定することが、同型接合座位又は２つのアレルを有する異型接合座位の決定を含むコンセンサス配列を決定することを含む、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
無細胞ＤＮＡ断片を含むヒト対象の生体試料を分析することにより前記ヒト対象における体細胞変異を特定する方法であって、
前記生体試料中の複数のＤＮＡ断片の各々について１以上の配列リードを受け取り、それによって複数の配列リードを受け取ることであって、前記生体試料が、正常細胞、及び潜在的に腫瘍細胞又は癌に関連付けられる細胞に起源を持つＤＮＡ断片を含む、受け取ることと、
第１のアライメント手段を使用して前記複数の配列リードを参照ヒトゲノムにアラインして、前記複数の配列リードのゲノム位置を決定することと、
前記配列リードを前記ヒト対象のコンセンサス配列と比較して、前記ヒト対象の一部の組織において体細胞変異を潜在的に有するものとして候補座位の第１のセットを特定することと、ここで、
前記候補座位の第１のセットの各座位において、前記コンセンサス配列に対する配列変異体を有する前記配列リードの数がカットオフ値を上回り、前記カットオフ値が１よりも大きく、
前記の候補座位の第１のセットの各候補座位について、
前記候補座位にアラインし、かつ前記配列変異体を有する前記配列リードのそれぞれについて、
１以上の部位で対応する分析可能なＤＮＡ分子のメチル化状態を決定し、
前記メチル化状態に基づいて前記配列リードを破棄するかどうかを決定することと、ここで、メチル化されないメチル化状態は、メチル化されるメチル化状態よりも、配列リードを破棄するより高い可能性を提供し、それによって残った配列リードの数を得る、
残った配列リードの数を候補閾値と比較することと、
残った配列リードの数と候補閾値との比較に基づいて前記候補座位を破棄するかどうかを決定することと、ここで、前記候補閾値より少ない残った配列リードの数は、前記候補閾値よりも大きい残った配列リードの数よりも、前記候補座位を破棄する高い可能性を提供する、
前記残った候補座位を用いて体細胞変異を有するとしてフィルタリングされた座位のセットを特定することと、を含む、方法。
【請求項２６】
無細胞ＤＮＡ断片を含むヒト対象の生体試料を分析することにより前記ヒト対象における体細胞変異を特定する方法であって、
前記生体試料中の複数のＤＮＡ断片の各々について１以上の配列リードを受け取り、それによって複数の配列リードを受け取ることであって、前記生体試料が、正常細胞、及び潜在的に腫瘍細胞又は癌に関連付けられる細胞に起源を持つＤＮＡ断片を含む、受け取ることと、
第１のアライメント手段を使用して前記複数の配列リードを参照ヒトゲノムにアラインして、前記複数の配列リードのゲノム位置を決定することと、
前記配列リードを前記ヒト対象のコンセンサス配列と比較して、前記ヒト対象の一部の組織における体細胞変異を潜在的に有するものとして候補座位の第１のセットを特定することと、ここで、
前記の候補座位の第１のセットの各座位において、前記コンセンサス配列に対する配列変異体を有する前記配列リードの数がカットオフ値を上回り、前記カットオフ値が１よりも大きく、
前記候補座位の第１のセットの各候補座位について、
前記候補座位とアラインし、かつ前記配列変異体を有する前記配列リードのそれぞれについて、
前記配列リードの端部がアライメントする位置に対応する終結位置を決定することと、
前記終結位置を複数の癌特異的又は癌関連終結位置と比較すること、
前記比較に基づいて、前記配列リードを破棄するかどうかを決定することと、ここで、癌特異的又は癌関連終結位置でない終結位置は、癌特異的又は癌関連終結位置である終結位置よりも、前記配列リードを廃棄する高い可能性を与え、それにより、残った配列リードの数を得る、
前記残った配列リードの数を候補閾値と比較することと、
前記残った配列リードの数の前記候補閾値との前記比較に基づいて、前記候補座位を破棄するかどうかを決定することと、ここで、前記候補閾値より少ない前記残った配列リードの数は、前記候補閾値よりも大きい前記残った配列リードの数よりも、前記候補座位を破棄する高い可能性を提供することと、
前記残った候補座位を使用して、体細胞変異を有するものとして前記フィルタリングされた座位のセットを特定することと、を含む、方法。
【請求項２７】
前記ヒト対象の一部の組織において体細胞変異を有するものとして前記フィルタリングされた座位のセットを特定することが、
癌に関連付けられるヒストン修飾に関連付けられることが既知である領域の群を特定することと、
潜在的に体細胞変異を有するものとして特定された候補座位の第２のセットのそれぞれについて、
前記候補座位が、前記領域の群のうちの１つにあるかどうかを判定することと、
前記候補座位が前記領域の群のうちの１つにあるかどうかに基づいて、前記候補座位を廃棄するかどうかを判定することと、ここで、前記領域の群のうちの１つにない前記候補座位は、前記領域の群のうちの１つにある前記候補座位よりも、前記候補座位を廃棄する高い可能性を提供する、
前記残った候補座位を使用して、体細胞変異を有するものとして前記フィルタリングされた座位のセットを特定することと、をさらに含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒト対象に相当する前記コンセンサス配列が、ヒト対象の特定の集団のための参照ゲノムである、請求項２５〜２７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
腫瘍細胞又は癌関連細胞由来の無細胞ＤＮＡ断片が、前記生体試料中の前記無細胞ＤＮＡ断片の５０％未満を含む、請求項２５〜２８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アライメントされた配列リードが、前記参照ヒトゲノムの少なくとも５％を含む、請求項２５〜２９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも２５ｘのシーケンシング深度が使用される、請求項１〜３０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記生体試料が血漿又は血清を含む、請求項１〜３１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト対象の前記生体試料が、尿、腹水、腹膜液、唾液、脊髄液、及び大便試料からなる群より選択される試料の１以上を含む、請求項１〜３１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法を実施するコンピュータシステムを制御するための、複数の教示を格納するコンピュータ可読媒体。
【請求項３５】
少なくともプロセッサ及びメモリを更に含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法を実施するための手段を含むコンピュータシステム。