(57)【要約】【課題】さらなる改善された小胞調製物に加え、その製造のための方法を提供すること。【解決手段】髄膜炎菌のｍｌｔＡホモログのノックアウトにより、免疫原性外膜タンパク質を豊富に含み、かつ通常の産生手順によって調製されるＯＭＶよりも高い殺菌力価を伴って干渉効果的抗体応答を惹起し得る小胞を自発的に放出する細菌が得られる。したがって、本発明は、そのｍｌｔＡ遺伝子のノックアウト変異を有する細菌を提供する。本発明はまた、（ｉ）ペプチドグリカンを含む細胞壁を有する；および（ｉｉ）ＭｌｔＡタンパク質の溶解性トランスグリコシラーゼ活性を有するタンパク質を発現しない細菌を提供する。本発明はまた、本発明の細菌の培養中、培地中に放出される小胞を含む組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用されるすべての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、免疫処置目的のための小胞調製物の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対する免疫処置に対する種々のアプローチの１つは、外膜小胞（ＯＭＶ）を使用することである。血清群Ｂに対する有効なＯＭＶワクチンが、ノルウェー国立公衆衛生院（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ）によって作製されており［例えば、参考文献１］、このワクチンは、安全であり、ＭｅｎＢ疾患を予防するが、該ワクチンを作製するために用いられる相同な菌株に対するその有効性は限定的である。
【０００４】
「ＲＩＶＭ」ワクチンは、６種類の異なるＰｏｒＡサブタイプを含有するＯＭＶを主成分とする。これは、フェーズＩＩ臨床試験において、小児に免疫原性であることが示されている［２］。
【０００５】
参考文献３には、６５ｋＤａのタンパク質複合体を保持するＯＭＶを主成分とする血清群Ｂ髄膜炎菌の異なる病原性血清型に対するワクチンが開示されている。参考文献４には、遺伝子操作された髄膜炎菌株由来のＯＭＶであって、少なくとも１種類のクラス１外膜タンパク質（ＯＭＰ）を含むがクラス２／３  ＯＭＰは含まないＯＭＶを含むワクチンが開示されている。参考文献５には、その表面ループ内に変異を有するＯＭＰおよび髄膜炎菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の誘導体を含むＯＭＶを含むＯＭＶが開示されている。
【０００６】
血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに加え、小胞は、他の細菌でも調製されている。参考文献６には、血清群Ａの髄膜炎菌に対するＯＭＶ系ワクチンの調製方法が開示されている。参考文献７および８には、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の小胞が開示されている。参考文献９には、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ由来の小胞調製物が開示されている。小胞はまた、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ［１０，１１］、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ［１２，１３］、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ［１２，１３］、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ［１４］、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ［１５］、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ［１６および２１］およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ［１７］から調製されている。
【０００７】
ＯＭＶが非相同な菌株に対して干渉効果（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を惹起できないことは、特に、ほとんどのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ単離菌が、広い保護対象範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を提供することが予測され得る少数の保存された保護的表面抗原（もしＯＭＶ内に存在する場合）を共有するため、充分理解されていない。この惹起できないことの考えられ得る説明の１つは、保存された抗原がその保護的作用を奏することを妨げる可変性の免疫優性表面抗原の存在であり、免疫優性超可変タンパク質（例えば、ＰｏｒＡなど）の存在は、広く文献に記載され、実証されている。他の考えられ得る説明は、ＯＭＶ調製のための方法が保護的外膜タンパク質を希釈する細胞質性および／または内膜タンパク質の夾雑物混入をもたらすこと、または抗原が界面活性剤抽出によって失われることである。
【０００８】
ＯＭＶ有効性を改善するための種々の提案がなされている。特許文献１（参考文献１８）には、トランスフェリン結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）および／またはＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼを加えたＯＭＶを含む組成物が開示されている。特許文献２（参考文献１９）には、種々のタンパク質を加えたＯＭＶを含む組成物が開示されている。特許文献３（参考文献２０）には、改変されたｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから得た膜小胞の調製物が開示されている。特許文献４（参考文献２１）には、ｎｓｐＡ発現が、同時ｐｏｒＡおよびｃｐｓノックアウトにより上方調節されるはずであることが教示されている。さらに、ＯＭＶ産生のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのノックアウト変異型が特許文献４〜６（参考文献２１〜２３）に開示されている。発現パターンを変化させることによりＯＭＶを改善するこれらの試みとは対照的に、特許文献７（参考文献２４）は、ＯＭＶ調製のための方法を変えることに着目し、ＮｓｐＡなどの抗原がデオキシコレートなど界面活性剤の使用を回避することにより小胞抽出中に保持され得ることが教示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第００／２５８１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／５２８８５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９８／５６９０１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／０９７４６号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０６２３７８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／０１４４１７号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００４／０１９９７７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、さらなる改善された小胞調製物に加え、その製造のための方法を提供することである。特に、本発明の目的は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の重要な細菌の免疫原性成分を保持する小胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ペプチドグリカン（ムレイン層）分解に関与する経路の破壊により、小胞をその培地中に放出する細菌が得られ、これらの小胞は、免疫原性外膜タンパク質を豊富に含み、広範な殺菌性免疫応答を惹起し得るという驚くべき知見に基づく。小胞は、（例えば、超音波処理およびサルコシル抽出［２５］によって）完全体の細菌を破壊することにより調製され得るＯＭＶとは異なり、細菌細胞を破壊することさえなく、例えば、小胞を細菌から遠心分離などのプロセスによって分離することにより簡単に調製され得る。
【００１２】
特に、本発明者らは、髄膜炎菌のｍｌｔＡホモログ（「ＧＮＡ３３」または「ＮＭＢ００３３」［２６］ともいう）のノックアウトにより、免疫原性外膜タンパク質を豊富に含み、通常の産生手順によって調製されるＯＭＶよりも高い殺菌力価を伴って広く干渉効果的抗体応答を惹起し得る小胞の自発的放出がもたらされることを見出した。この有効性の増強は、２つの理由で、驚くべきことである。第１は、ＮＭＢ００３３タンパク質は、以前に、殺菌抗体の生成に高度に有効性であること（例えば、参考文献１９６の表１を参照）、および強力なワクチン候補であること（例えば、参考文献２７の表２を参照）が報告されており、参考文献２８において、小胞生成のために上方調節すべきであることが推奨されており、そのため、その低下は、演繹的に殺菌性有効性を増大させるのではなく低下させることが予測され得る。第２は、該ノックアウト菌株は、細胞膜の正しいトポロジー構成をもたず、通常のＯＭＶ（例えば、ＰｏｒＡ、ＰＩＢ、クラス４およびクラス５外膜タンパク質）の主な構成成分タンパク質は、以前に、培地中に放出されることが報告されていた［２５］。本発明者らは、ここに、以前に報告されていた放出が、個々のタンパク質の分泌に関与しないが、その代わり、外膜タンパク質が小胞の形態で放出されることを見出した。このような小胞は、先行技術の手段によって調製されるＯＭＶと比べ、好都合である。それは、これが、培地中に自発的に放出され、したがって、ＯＭＶを調製するために通常使用される複雑で時間のかかる破壊および精製方法を伴わずに、簡単かつ効率的に調製され得るからである。
【００１３】
したがって、本発明は、そのｍｌｔＡ遺伝子のノックアウト変異を有する細菌を提供する。該細菌はまた、好ましくは、少なくとも１つのさらなる遺伝子、例えば、ｐｏｒＡ遺伝子および／またはｐｏｒＢ遺伝子および／またはｌｐｘＡ遺伝子のノックアウト変異を有する。
【００１４】
本発明はまた、（ｉ）ペプチドグリカンを含む細胞壁を有し；かつ（ｉｉ）ＭｌｔＡタンパク質の溶解性トランスグリコシラーゼ活性を有するタンパク質を発現しない、細菌を提供する。細菌は、好ましくは変異型細菌であり、すなわち、細菌は、ＭｌｔＡタンパク質を発現する野生型種の変異株である。細菌はまた、好ましくは、少なくとも１種類のさらなるタンパク質、例えば、ＰｏｒＡタンパク質および／またはＰｏｒＢタンパク質および／またはＬｐｘＡタンパク質を発現しない。
【００１５】
好ましい本発明の細菌は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓなどのナイセリア属であり、したがって、本発明は、そのｇｎａ３３遺伝子のノックアウト変異を有する細菌である髄膜炎菌を提供する。好ましい髄膜炎菌は、ｇｎａ３３−ｌｐｘＡ−ＰｏｒＡ−である。
【００１６】
本発明はまた、本発明の細菌の培養の間に培地中に放出される小胞を含む、組成物を提供する。この組成物は、好ましくは、生菌および／または完全体の細菌を全く含まない。この組成物は、ワクチン調製物に使用され得る。
【００１７】
本発明はまた、本発明の細菌を増殖させた培地を０．２２μｍフィルターを通した濾過後に得られ得る濾液中に存在する小胞を含む、組成物を提供する。この組成物は、ワクチン調製物に使用され得る。
【００１８】
本発明はまた、ＭｉｎＤ、ＦｔｓＡおよび／またはホスホエノールピルベートシンターゼのうちの少なくとも１つ（すなわち、１、２または３つ）を含まない、髄膜炎菌小胞を提供する。本発明はまた、ＮＭＢタンパク質０１２６、ＮＭＢタンパク質０１５４、ＮＭＢタンパク質０１５７、ＮＭＢタンパク質０１７１、ＮＭＢタンパク質０２１９、ＮＭＢタンパク質０３５９、ＮＭＢタンパク質０３８７、ＮＭＢタンパク質０４２６、ＮＭＢタンパク質０５９５、ＮＭＢタンパク質０６１７、ＮＭＢタンパク質０６１８、ＮＭＢタンパク質０６３１、ＮＭＢタンパク質０７５７、ＮＭＢタンパク質０７６３、ＮＭＢタンパク質０８７５、ＮＭＢタンパク質０８７６、ＮＭＢタンパク質０９４３、ＮＭＢタンパク質０９４６、ＮＭＢタンパク質０９５７、ＮＭＢタンパク質１１３１、ＮＭＢタンパク質１２５２、ＮＭＢタンパク質１３２３、ＮＭＢタンパク質１３４１、ＮＭＢタンパク質１４４５、ＮＭＢタンパク質１４９７、ＮＭＢタンパク質１５７４、ＮＭＢタンパク質１５７６、ＮＭＢタンパク質１８６９、ＮＭＢタンパク質１９３４、ＮＭＢタンパク質１９３６、ＮＭＢタンパク質２０９６および／またはＮＭＢタンパク質２１０１のうちの少なくとも１つを含まない髄膜炎菌小胞を提供する。本発明はまた、リボソームを実質的に含まない髄膜炎菌小胞を提供する。本発明はまた、いかなるアミノ酸ｔＲＮＡシンセターゼも実質的に含まない髄膜炎菌小胞を提供する。本発明はまた、クレブズ回路由来のいかなる酵素も実質的に含まない髄膜炎菌小胞を提供する。このような小胞はまた、ＭｌｔＡを含まない（ノックアウト変異のため）が、外膜タンパク質は含む。該小胞は、３量体外膜タンパク質を含み得る（図１３）。
【００１９】
本発明はまた、以下の４７種類のタンパク質：ＮＭＢ００３５、ＮＭＢ００４４、ＮＭＢ００８６、ＮＭＢ００８８、ＮＭＢ０１０９、ＮＭＢ０１２４、ＮＭＢ０１３８、ＮＭＢ０１８２、ＮＭＢ０２０４、ＮＭＢ０２７８、ＮＭＢ０２９４、ＮＭＢ０３１３、ＮＭＢ０３４５、ＮＭＢ０３４６、ＮＭＢ０３８２、ＮＭＢ０４６０、ＮＭＢ０４６１、ＮＭＢ０５５０、ＮＭＢ０５５４、ＮＭＢ０６２３、ＮＭＢ０６３４、ＮＭＢ０６６３、ＮＭＢ０７０３、ＮＭＢ０７８７、ＮＭＢ０８７３、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ１０３０、ＮＭＢ１０５３、ＮＭＢ１０５７、ＮＭＢ１１２６、ＮＭＢ１２８５、ＮＭＢ１３０１、ＮＭＢ１３３２、ＮＭＢ１４２９、ＮＭＢ１４８３、ＮＭＢ１５３３、ＮＭＢ１５６７、ＮＭＢ１６１２、ＮＭＢ１７１０、ＮＭＢ１８７０、ＮＭＢ１８９８、ＮＭＢ１９４９、ＮＭＢ１９６１、ＮＭＢ１９７２、ＮＭＢ１９８８、ＮＭＢ２０３９およびＮＭＢ２０９１を含む髄膜炎菌小胞を提供する。
【００２０】
本発明はまた、以下の１９種類のタンパク質：ＮＭＢ００４４、ＮＭＢ００８６、ＮＭＢ０２０４、ＮＭＢ０２７８、ＮＭＢ０２９４、ＮＭＢ０３１３、ＮＭＢ０３４５、ＮＭＢ０３４６、ＮＭＢ０４６０、ＮＭＢ０５５０、ＮＭＢ０８７３、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ１０３０、ＮＭＢ１０５７、ＮＭＢ１４８３、ＮＭＢ１８７０、ＮＭＢ１８９８、ＮＭＢ１９６１および／またはＮＭＢ２０９１の１つ以上（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個）を含む髄膜炎菌小胞を提供する。以下の表４も参照のこと。
【００２１】
本発明はまた、本発明の小胞の第１の組と、本発明の小胞の第２の組とを含む組成物であって、上記の第１の組と第２の組とが異なる、髄膜炎菌株から調製される組成物を提供する。本発明はまた、（ａ）第１の髄膜炎菌株から本発明の小胞を調製する工程；（ｂ）第２の髄膜炎菌株から本発明の小胞を調製する工程；および（ｃ）（ａ）および（ｂ）の小胞を合わせる工程；を包含する、小胞混合物を調製するための方法を提供する。異なる菌株由来の小胞を合わせることにより、臨床株の対象範囲が改善され得る。
【００２２】
本発明はまた、（ｉ）ＭｌｔＡ−細菌を培地中で、該細菌が小胞を上記培地中に放出するように培養する工程；および（ｉｉ）小胞を上記培地から収集する工程；を包含する、細菌小胞を調製するための方法を提供する。ＭｌｔＡ−細菌は、好ましくは、ΔＭｌｔＡノックアウト変異型である。小胞は、サイズ分離（例えば、小胞が通過することは許容するが、インタクトな細菌が通過することは許容しないフィルターを用いる濾過）によって回収され得、これは、小さい小胞よりも細胞を優先的にペレット化する遠心分離（例えば、低速遠心分離）後に簡便に行なわれ得る。
【００２３】
（ペプチドグリカン代謝）
ペプチドグリカン（ムレイン、ムコペプチドまたはグリコサミノペプチドとしても知られている）は、ほとんどの細菌の細胞壁に見出されるヘテロポリマーである。ペプチドグリカンは、主に、細菌の細胞壁の機械的強度および細胞の形状の維持を担う成分である。グラム陽性細菌において、これは、細胞壁の主要成分である。グラム陰性菌では、これは、細胞質膜と外膜と間の層として存在し、Ｂｒａｕｎリポタンパク質によって外膜に共有結合されている。
【００２４】
ペプチドグリカンは、主に直鎖のヘテロ多糖主鎖からなり、これは、「幹」ペプチドによって架橋されて格子構造を形成している。これは、たいへん大きなポリマーであるため、単一の巨大な共有結合された分子とみなされ得る。大腸菌では、糖主鎖がＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）残基が交互になって形成されている。ＭｕｒＮＡｃ残基は、幹テトラペプチドに連結され得る。主鎖間の架橋は、通常、１つの幹ペプチド内のＤ−アラニンと別のペプチド内のｍｅｓｏ−ＤＡＰ間に直接形成される。大腸菌の構造は、グラム陰性菌に典型的であるが、グラム陽性細菌においては、より多くの差異があり、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓでは、ムラミン酸残基の３０〜５０％がアセチル化されておらず、幹ペプチドは、多くの場合、ｍｅｓｏ−ＤＡＰの代わりにＬ−リシンおよびＤ−グルタメートの代わりにイソグルタミンを有し、架橋が幹ペプチド間に存在し得る。
【００２５】
大腸菌ペプチドグリカン生合成における最初の段階は、細胞質内に存在するＧｌｃＮＡｃのＵＤＰ誘導体の形成である。一部のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、ＰＥＰ：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエノールピルビルトランスフェラーゼによって触媒されるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）の反応においてＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃに変換される。さらに、細胞質内では、アミノ酸がＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃに逐次的付加され、末端Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンを含む「パーク（Ｐａｒｋ）ヌクレオチド」として知られるＵＤＰ−ＭｕｒＮＡｃ−ペンタペプチドが形成される。次いで、パークヌクレオチドは、細胞質内膜内のバクトプレノール一リン酸塩に輸送され、ここで、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡＣもまた付加され、バクトプレノール−二糖−ペンタペプチドサブユニットが作製される。次いで、二糖−ペンタペプチドサブユニットは、ペリプラズム領域内に輸送され、バクトプレノール−ピロリン酸塩が膜内に残留する。ペリプラズム内では、輸送されたサブユニットが伸長中のペプチドグリカン内に挿入される。
【００２６】
細胞分裂を可能にするためには、形状の変化、および大きな複合体の移入（ｉｍｐｏｒｔ）／移出（ｅｘｐｏｒｔ）（例えば、コンジュゲーション中）、次いでペプチドグリカン分解が起こらなければならない。大腸菌では、この分解は、ムレイン加水分解酵素［２９］と呼ばれる酵素によって引き起こされ、この酵素としては、ファミリーとして、溶解性トランスグリコシラーゼ［ｍｌｔＡ、ｍｌｔＢ、ｍｌｔＣ、ｍｌｔＤ、ｓｌｔ７０、ｅｍｔＡ）、エンドペプチダーゼ（ｐｂｐ４、ｐｂｐ７、ｍｅｐＡ）およびアミダーゼ（ａｍｉＣ）が挙げられる。リゾチームなどのムラミダーゼは、ＭｕｒＮＡｃ残基とＧｌｃＮＡｃ残基間の同じβ−（ｌ−４）−グリコシド結合を切断する。しかしながら、ムラミダーゼとは異なり、トランスグリコシラーゼは、該グリコシド結合を切断すると同時に、１，６−アンヒドロムラモイル（ａｎｈｙｄｒｏｍｕｒａｍｏｙｌ）残基（ＡｎｈＭｕｒＮＡｃ）の形成を伴う。
【００２７】
標準的なペプチドグリカンの同化作用経路および異化作用経路は、このように、充分特性付けされており、これは、細菌間で起こる軽微な差異および変更である。該酵素は、充分特性付けされており、タンパク質は、新たな細菌のゲノム配列が公表された場合、経路に関与すると直ちにアノテーション（ａｎｎｏｔａｔｅ）される。したがって、当業者は、任意の所与の細菌についてペプチドグリカン代謝経路に関与する酵素を容易に決定することができ、関与する酵素を容易に同定することができ、これらの酵素をコードする遺伝子を容易に同定することができる。
【００２８】
本発明は、膜結合溶解性トランスグリコシラーゼをコードするｍｌｔＡ遺伝子のノックアウトに基づく。ＭｌｔＡファミリーは、ＩＮＴＥＲＰＲＯ（登録「ｉｐｒ００５３００」）およびＰＦＡＭ（登録「ＭｌｔＡ」または「ＰＦ０３５６２」）において認識され、ＰＦＡＭ記録には、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｉｅｘｎｅｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓなどの多様な細菌のＭｌｔＡタンパク質が列挙されている。
【００２９】
ＭｌｔＡノックアウトに好ましい細菌は、ナイセリア属であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが最も好ましい細菌である。血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＭｌｔＡ遺伝子は、文献において「ＧＮＡ３３」と称され［２５，２６，１９６］、配列の一例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号「ＡＦ２２６３９１．１」を有する。血清群ＡのＭｌｔＡ遺伝子（「ＮＭＡ０２７９」）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿２８３１１８．１を有する。髄膜炎菌のＭｌｔＡのアラインメントされた多型形態が、参考文献３０の図７および１８に見られ得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２つの完全ゲノム配列が利用可能である［３１，３２］。したがって、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの任意の所与の株について、当業者は、ｍｌｔＡ遺伝子を同定することができよう。髄膜炎菌に関して、ノックアウトされたｍｌｔＡ遺伝子は、好ましくは、野生型株において、本明細書おける配列番号１と細孔の配列同一性を有する遺伝子である。ＭｌｔＡは、髄膜炎菌のリポタンパク質である［２６］。
【００３０】
ｍｌｔＡのノックアウトは、ビルレンス、異常細胞分離、異常細胞形態学、未分裂隔壁、二重隔壁、細胞クラスター化および外膜の共有の低減をもたらし得る［２５］。しかしながら、同時にノックアウト変異は、驚くべきことに、免疫原性であり、外膜タンパク質を豊富に含む小胞を自発的に生成させ得る細菌をもたらすことがわかった。
【００３１】
（細菌）
小胞が調製される細菌はグラム陽性であり得るが、好ましくは、グラム陰性である。細菌は、モラクセラ属、赤痢菌属、シュードモナス属、トレポネーマ属、ポルフィロモナス属またはヘリコバクター属（好ましい種に関する上記参照）由来であり得るが、好ましくは、ナイセリア属由来である。好ましいナイセリア属種は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである。
【００３２】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、任意の血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹが使用され得るが、血清群Ｂ由来の小胞を調製することが好ましい。関連する場合、髄膜炎菌は、任意の血清型（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型（Ｐ１．２；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．９；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．１５；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４；など）および任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ３，３，７；Ｌ１０；など）であり得、好ましい細菌としては、Ｂ：４：Ｐ１．４；Ｂ：４：Ｐ１．１５；Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６が挙げられる。髄膜炎菌は、任意の適当な系統、例えば、超侵襲性および超ビルレント系統、例えば、任意の以下の７種の超ビルレント系統：亜群Ｉ；亜群ＩＩＩ；亜群ＩＶ−１；ＥＴ−５複合体；ＥＴ−３７複合体；Ａ４クラスター；系統３由来のものであり得る。これらの系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって同定されているが、Ｍｕｌｔｉ  Ｌｏｃｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）もまた、髄膜炎菌の分類に用いられており［参考文献３３］、例えば、ＥＴ−３７複合体は、ＭＬＳＴによるＳＴ−１１複合体であり、ＥＴ−５複合体はＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３はＳＴ−４１／４４であるなどである。
【００３３】
血清群Ｂにおいて好ましい株は、ＭＣ５８、２９９６、Ｈ４４７６および３９４／９８である。しかしながら、本発明の一部の実施形態において、髄膜炎菌は、ＭＣ５８株ではなく、ＢＺ２３２株ではない。
【００３４】
ｍｌｔＡのノックアウトを有することに加え、該細菌は、他の遺伝子（１つまたは複数）の１つ以上のノックアウト変異を有し得る。発熱活性を低減させるため、例えば、該細菌は低い内毒素（ＬＯＳ／ＬＰＳ）レベルを有するべきであり、これは、ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成され得る。好適な変異型細菌は既に知られており、例えば、変異型ナイセリア属［３４，３５］および変異型Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ［３６］である。髄膜炎菌のｌｐｘＡ変異型が好ましい。グラム陰性菌由来のＬＰＳ枯渇外膜の調製方法が参考文献３７に開示されている。
【００３５】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、好ましいさらなるノックアウトは、ＰｏｒＡクラスＩ外膜タンパク質である。好都合には、かかるノックアウトは、免疫優性超可変株特異的ＰｏｒＡタンパク質を示さず、それにより、レシピエントの免疫応答は他の抗原に焦点が合わされる。具体的な一態様において、本発明は、ＭｌｔＡのノックアウト変異およびＰｏｒＡのノックアウト変異の両方を含む細菌であるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを提供する。該細菌はまた、さらなるノックアウト変異、例えば、ＬＯＳ／ＬＰＳ合成経路において（例えば、ｌｐｘＡ）、免疫優性可変タンパク質、ＰｏｒＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣなどを担持し得る。
【００３６】
特定の内因性遺伝子のノックアウトを有することに加え、該細菌は、内因性でない１つ以上の遺伝子を発現し得る。例えば、本発明では、対応する野生型株に関して新しい遺伝子を発現する組換え株が使用され得る。ＰｏｒＡ発現をノックアウトすることが好ましいが、択一的なアプローチでは、髄膜炎菌が多くのＰｏｒＡサブタイプ（例えば、ＰｏｒＡサブタイプ：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５，２；Ｐ１．１９，１５；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．１２，１３；およびＰ１．７ｈ，４［例えば、参考文献３８，３９］の２、３、４、５または６つ）を発現するように操作することが可能である。このような様式の非内在遺伝子の発現は、種々の手法、例えば、染色体挿入（多数のＰｏｒＡ遺伝子を導入するのに用いる場合［４０］）、ノッキング（ｋｎｏｃｋｉｎ）変異、染色体外ベクターから（例えば、プラスミドから）の発現などによって達成され得る。
【００３７】
特定のタンパク質の発現の下方調節に加え、該細菌は、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７［１９］、タンパク質７４１［４１］、ＴｂｐＡ［１８］、ＴｂｐＢ［１８］、スーパーオキシドジスムターゼ［１８］などの免疫原を過剰発現し得る（対応する野生型株と比べて）。
【００３８】
該細菌はまた、参考文献１６、２１〜２４および／または４２〜４３に開示されているノックアウトおよび／または過剰発現変異の１つ以上を含み得る。下方調節および／またはノックアウトに好ましい遺伝子としては、（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａＩＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［１６］；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＰｏｒＡ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［２１］；（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ［４２］；および（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢおよび／またはＳｙｎＣ［４３］が挙げられる。
【００３９】
髄膜炎菌の組成物には、参考文献４４の選択基準が使用され得る。
【００４０】
好ましい小胞は、以下の亜型：Ｐ１．２；Ｐ１．２，５；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．５，ｃ；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．７ｈ，４；Ｐ１．９；Ｐ１．１５；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４の１つを有する髄膜炎菌から調製される。髄膜炎菌は、好ましくは、血清群Ｂである。
【００４１】
また、小胞は、エシェリキア属、例えば、大腸菌種から調製され得る。大腸菌株は、伝統的には、共生性または病原性のうちのいずれかに分類されており、病原性株は、さらに、腸内株または腸管外株に下位分類される。また、分類は「Ｋ」抗原に基づくものであり得る。もっともよく研究されている「Ｋ」抗原は「Ｋ１」であり、これは、新生児髄膜炎を引き起こす大腸菌株のビルレンスの主な決定基であると考えられている。本発明の小胞は、任意のこれらの大腸菌株から調製され得るが、好ましくは、病原性株、例えば、腸管外病原性（「ＥｘＰＥＣ」［４５］）株、尿路病原性（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）（ＵＰＥＣ）株または髄膜炎／敗血症関連（ＭＮＥＣ）株から調製される。病原性株のゲノム配列は、データベースにおいて受託番号ＡＥ００５１７４、ＢＡ０００００７およびＮＣ−００４４３１で入手可能である。ｍｌｔＡノックアウトの使用ではなく、大腸菌Ｔｏｌ−Ｐａｌ複合体［４６］の成分、例えば、ｔｏｌＡ、ｔｏｌＱ、ｔｏｌＢ、ｐａｌおよび／またはｔｏｌＲの１つ以上をノックアウトすることが好ましい場合があり得る。ｔｏｌＲのノックアウトが好ましい。髄膜炎菌は、Ｔｏｌ−Ｐａｌ系のホモログを有しない。
【００４２】
（小胞組成物）
本発明は、本発明の細菌によって培地中に自発的に放出される小胞を提供する。このような小胞は、同じ細菌から人工的に調製され得る小胞（例えば、参考文献２５の「ΔＧＮＡ３３」髄膜炎菌から調製されるサルコシル抽出ＯＭＶ）とは明白に異なる。このような小胞はまた、微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＶ［４７］）および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［６４］）とは明白に異なるが、本発明の小胞は、サルコシル抽出ＯＭＶよりはＭＶおよびＮＯＭＶとより類似しているようである。該小胞はまた、ＭＶとして放出される前は細菌に付着された状態である外膜突起であるブレブと明白に異なる［４８，４９］。
【００４３】
本発明の小胞は５０〜１００ｎｍの直径を有し（電子顕微鏡検査による）、これは、人工髄膜炎菌のＯＭＶ（直径約２７０ｎｍ［５０］）のものより小さい。この直径は、熱変性させた人工ＯＭＶのもの（約１０５ｎｍ［５０］）とほぼ同じであるが、本発明の小胞は抗原性を保持しているのに対し、熱変性させた人工ＯＭＶはその抗原性を喪失している。またさらに、本発明の小胞は（ＭＶ、ＯＭＶおよびＮＯＭＶと異なり）、細胞質内夾雑物を実質的に含まない。
【００４４】
本発明の小胞は、好ましくは、全タンパク質に対して測定したとき２０重量％以下のＬＯＳ／ＬＰＳを含有する（すなわち、重量基準で、ＬＯＳ／ＬＰＳよりも少なくとも４倍多くのタンパク質が存在しなければならない）。最大ＬＯＳ／ＬＰＳレベルは、好ましくは、２０％よりもさらに少なく、例えば、１５％、１０％、５％またはそれ未満である。
【００４５】
出発培養物とは異なり、本発明の小胞含有組成物は、一般的に、生菌であれ死菌であれ、完全体の細菌を実質的に含まない。本発明の小胞のサイズは、これが、０．２２μｍフィルター（例えば、濾過滅菌に典型的に用いられるもの）を通す濾過によって、完全体の細菌から容易に分離され得ることを意味する。したがって、本発明は、完全体の細菌は遅滞させるが、小胞の通過は許容するフィルター、例えば０．２２μｍフィルターを通して本発明の細菌から培地を濾過することを含む、本発明の小胞の調製方法を提供する。小胞は、標準的な０．２２μｍフィルターを通過するが、他の物質によってすぐに詰まり得るため、標準的な滅菌フィルター（例えば、０．２２μｍフィルター）で終わる漸減孔径の一連のフィルターを通す逐次的な濾過滅菌工程を行なうことが好ましい。前述のフィルターの例は、０．８μｍ、０．４５μｍなどの孔径を有するものであり得る。濾液を、例えば超遠心分離によって、さらに処理してもよい。
【００４６】
本発明の小胞は、脂質およびタンパク質を含有する。髄膜炎菌小胞のタンパク質内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）が分析されており、小胞内のタンパク質の実質的にすべてが、バイオインフォマティクス分析によって外膜タンパク質に分類されている。小胞内に見られる外膜タンパク質としては、ＰｉｌＥ；ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ；ＰｏｒＡ；ＦｒｐＢ；ＰｌＢ；などが挙げられる。以前にプロテオミクスによって分析された［５１］人工ＯＭＶとは異なり、本発明の小胞は、ＭｉｎＤ、ＦｔｓＡおよびホスホエノールピルベートシンターゼなどのタンパク質が欠損していることがわかった。該小胞はまた、ＭｌｔＡも欠損している。
【００４７】
本発明の小胞は、人工的な破壊が必要とされないため、培養細菌の破壊によって調製される小胞と比べると好都合である。簡単なサイズに基づく分離を用い、化学的処理などをなんら必要とすることなく、細菌と小胞を分離することができる。より簡単な方法であることに加え、これによって、先行技術のＯＭＶ調製方法において用いられる界面活性剤などによって引き起こされる変性のリスクが回避される。
【００４８】
上記のように、本発明の小胞は、細菌の増殖中に自発的に形成され、培地中に放出される天然に存在する膜小胞である微小胞（ＭＶ）および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」）に類似したものであり得る。ＭＶは、ナイセリア属をブイヨン培地中で培養し、完全体の細胞をブイヨン培地から分離し（例えば、濾過によって、または細胞のみがペレット化され、より小さい小胞はペレット化されない低速遠心分離によって）、次いで、細胞枯渇培地中に存在するＭＶを回収する（例えば、濾過、ＭＶの差次的沈殿または凝集、ＭＶがペレット化される高速遠心分離によって）ことにより得られ得る。ＭＶの生成における使用のための菌株は、一般的に、培養中に生成されるＭＶの量に基づいて選択され得る。参考文献５２および５３には、高ＭＶ生成を伴うナイセリア属が記載されている。
【００４９】
（小胞の組合せ）
本発明は、最適な細菌からの免疫原性小胞の生成を可能にする。該細菌は、典型的には、選択した出発株の変異によって作製されたものである。目的の多数の出発株が多数ある場合では、本発明は、各株からの小胞の調製方法を提供し、その異なる小胞を合わせ得る。この組合せストラテジーは、株対株の差異が、単一の株では、通常、臨床的に有用な保護がもたらされないことを意味する細菌（例えば、血清群Ｂ髄膜炎菌）に特に有用である。
【００５０】
したがって、本発明は、ｎ種の異なる細菌株から調製されるｎ組の本発明の小胞の混合物を含む組成物を提供する。ｎの値は１、２、３、４、５などであり得る。異なる菌株は、同じまたは異なる血清群であり得る。血清群の好ましい混合物としては、Ａ＋Ｂ；Ａ＋Ｃ；Ａ＋Ｗ１３５；Ａ＋Ｙ；Ｂ＋Ｃ；Ｂ＋Ｗ１３５；Ｂ＋Ｙ；Ｃ＋Ｗ１３５；Ｃ＋Ｙ；Ｗ１３５＋Ｙ；Ａ＋Ｂ＋Ｃ；Ａ＋Ｂ＋Ｗ１３５；Ａ＋Ｂ＋Ｙ；Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５；Ａ＋Ｃ＋Ｙ；Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ；Ｂ＋Ｃ＋Ｗ１３５；Ｂ＋Ｃ＋Ｙ；Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ；Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｗ１３５；Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｙ；Ｂ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ；およびＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙが挙げられる。
【００５１】
本発明はまた、ｎ種の異なる細菌株から調製される本発明の小胞を備えるキットを提供する。小胞はキット内に、例えば、混合物として、または個々もしくは逐次の同時使用のために一緒に使用されることが必要とされるまで別々に維持および保存され得る。
【００５２】
本発明はまた、ｎ種の異なる細菌株の各々に由来するｎ組の本発明の小胞を調製すること；およびｎ組の小胞を合わせることを含む方法を提供する。異なる組は、キット内で、または混合物で合わせ得る。
【００５３】
本発明はまた、患者の免疫処置のための医薬の製造における第１の細菌株に由来する小胞の使用であって、該医薬が、第２の細菌株に由来する小胞とともに、個々または逐次的に同時投与される小胞の使用を提供する。
【００５４】
本発明はまた、患者の免疫処置のための医薬の製造における第１の細菌株に由来する小胞の使用であって、患者が、第２の細菌株に由来する小胞で予備免疫処置されている、小胞の使用を提供する。
【００５５】
該細菌は、好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、より好ましくは血清群Ｂのものである。異なる菌株は、種々の基準に従って選択され得る。基準の例としては、サブタイプおよび／または血清亜型［例えば、参考文献４７］；免疫型；株の地学的起源；臨床株の局所有病率；超ビルレント系統（例えば、亜群Ｉ、ＩＩＩおよびＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスターならびに系統３；Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｐｅ（ＭＬＳＴ）［５４］の１つ以上）が挙げられる。
【００５６】
菌株の好ましい選択基準は、１つより多いＰｏｒＢ血清型（クラス２または３  ＯＭＰ）の選択；１つより多いＰｏｒＡ血清亜型（クラス１  ＯＭＰ）の選択；１つより多い異なる免疫型（リポ多糖またはリポオリゴ糖）の選択；３種の異なるＮＭＢ１８７０バリアント［５５］の１つより多くの選択である。ＮＭＢ１８７０は本発明の小胞において見られ、明白に異なるバリアントを示し、ワクチン接種用の良好な候補抗原である［５５〜５７］。２または３種の異なるＮＭＢ１８７０バリアントを含む小胞の組合せは、特に好都合である。
【００５７】
異なる髄膜炎菌株から選択されることに加え、小胞は、異なる病原体から選択され得る。したがって、本発明は、ｎ種の異なる細菌種から調製されるｎ組の本発明の小胞の混合物を含む組成物を提供する。同様に、本発明は、ｎ種の異なる細菌種から調製される本発明の小胞を備えるキットを提供し、ｎ種の異なる細菌種の各々に由来するｎ組の本発明の小胞を調製する工程を含む方法を提供する。
【００５８】
（ＭｌｔＡ発現）
本発明の細菌は、機能的ＭｌｔＡ酵素活性を有しない。ＭｌｔＡタンパク質発現の抑制は、主に２つの様式：内因性ｍｌｔＡ遺伝子（その制御領域を含む）の除去もしくは破壊によりＭｔＡ−株をもたらすこと；またはＭｌｔＡ＋株におけるＭｌｔＡ発現の抑制により達成され得る。ＭｌｔＡ−株を用いることが好ましい。
【００５９】
ＭｌｔＡ−株は、慣用のノックアウト技術によって構築され得る。遺伝子ノックアウトのための手法はよく知られており、髄膜炎菌のノックアウト変異型は、以前に報告されている［例えば、参考文献２５および５８〜６０］。ノックアウトは、好ましくは、コード領域の少なくとも一部分の欠失（好ましくは、同遺伝子系欠失）によって達成されるが、任意の他の適当な手法、例えば、プロモーターの欠失または変異、開始コドンの欠失または変異なども使用され得る。該細菌は、ノックアウトされた遺伝子の代わりにマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含有するものであり得る。
【００６０】
内因性ｍｌｔＡ遺伝子の発現の抑制を用いる場合、アンチセンス阻害および阻害性ＲＮＡなどの手法が使用され得るが、これらの手法は、より典型的には真核生物宿主で使用される。得られる細菌において、ノックアウトされたタンパク質をコードするｍＲＮＡが実質的に非存在である、および／またはその翻訳が実質的に阻害される（例えば、抑制の非存在下で見られ得る発現レベルの１％未満まで）。
【００６１】
ノックアウトまたは発現の抑制の代替法として、内因性ｍｌｔＡ遺伝子の部位特異的変異誘発が使用され得る。参考文献６１には、髄膜炎菌のＭｌｔＡの変異型が開示されており、残基Ｇｌｕ２５５、Ｇｌｕ３２３およびＡｓｐ３６２を変異させ、次いで、ＭｌｔＡ触媒活性について試験している。Ｅ２５５Ｇ変異型は５０％の活性低下を示し、Ｅ３２３Ｇ変異型は７０％の活性低下を示した。ＭｌｔＡコード領域内の特定の残基の変異誘発は、したがって、コード領域をノックアウトすることなく、溶解性グリコシド転移酵素の酵素活性をノックアウトするための手法として使用され得る。
【００６２】
いずれの手法（または手法の組合せ）を選択しても、得られる細菌は、ＭｌｔＡ酵素活性を実質的に含まない。
【００６３】
（薬学的組成物）
本発明は、（ａ）本発明の小胞および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明はまた、本発明の小胞を薬学的に受容可能なキャリアと混合する工程を含む、かかる組成物の調製方法を提供する。
【００６４】
典型的な「薬学的に受容可能なキャリア」には、それ自体、該組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアが含まれる。好適なキャリアは、典型的には、ゆっくり代謝される大きな巨大分子、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、および脂質会合体（例えば、油滴またはリポソーム）である。かかるキャリアは当業者によく知られている。ワクチンはまた、希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどを含有し得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、スクロースなどを存在させてもよい。無菌で発熱因子無含有のリン酸緩衝生理食塩水（例えば、ｐＨ７．４）は、典型的なキャリアである。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な論考は、参考文献６２にて得られ得る。
【００６５】
本発明の組成物は、典型的には、乾燥形態（例えば、凍結乾燥されたもの）ではなく、水性形態（すなわち、溶液または懸濁液）である。また、水性組成物は、凍結乾燥形態（例えば、凍結乾燥Ｈｉｂ結合体ワクチン、凍結乾燥髄膜炎菌結合体ワクチンなど）からの他のワクチンの再構成に好適である。本発明の組成物がかかる即時調合再構成に使用される場合、本発明は、２つのバイアルを備え得るか、または１つの充填済みシリンジおよび１つのバイアルを備え得る（ここで、シリンジの水性内容物は、注射前にバイアルの乾燥内容物を再活性化させるために用いられる）キットを提供する。
【００６６】
本発明の組成物はバイアルにおいて提示され得るか、または充填済みシリンジにおいて提示され得る。シリンジは針を備えていても備えていなくてもよい。組成物は、単位投薬形態または反復投薬形態でパッケージングされ得る。シリンジは、一般的に単回用量の組成物を含むが、バイアルは、単回用量または反復用量を含む。したがって、反復投薬形態では、バイアルは、前充填シリンジよりも好ましい。
【００６７】
有効投薬容量は常套的に確立され得るが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば筋肉内注射では、約０．５ｍｌの容量を有する。ＲＩＶＭ  ＯＭＶ系ワクチンが、０．５ｍｌ容量で［６３］筋肉内注射によって大腿または上腕に投与された。同様の用量が、他の送達経路に使用され得、例えば、噴霧化用の鼻腔内ＯＭＶ系ワクチンは、約１００μｌまたは約１３０μｌ／スプレー［６４］の容量を有し得、４回のスプレー投与により、合計用量約０．５ｍｌが与えられる。
【００６８】
該組成物のｐＨは、好ましくは、６〜８の間、より好ましくは６．５〜７．５の間（例えば、約７または約７．４）である。ＲＴＶＭ  ＯＭＶ系ワクチンのｐＨは７．４であり［６５］、ｐＨ＜８（好ましくは、＜７．５）が本発明の組成物に好ましい。好適なｐＨは、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸塩緩衝液またはヒスチジン緩衝液の使用によって維持され得る。本発明の組成物は、一般的に緩衝液を含む。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を［６６］、例えば１〜１０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭで用いることが好ましい。ＲＩＶＭ  ＯＭＶ系ワクチンではｐＨは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を用いることにより維持される。該組成物は、無菌および／または発熱因子無含有のものであり得る。本発明の組成物は、ヒトに関して等張性のものであり得る。
【００６９】
本発明の組成物は免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防用（すなわち、感染を予防するため）または治療用（すなわち、感染を処置するため）のうちのいずれかであり得るが、典型的には予防用である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効性な量の抗原（１種類または複数種）、ならびに必要に応じて任意の他の成分を含む。「免疫学的に有効性な量」により、個体への該量の投与が、単回用量または一連の用量の一部のうちのいずれかとして、処置または予防に有効であることが意図される。この量は、処置対象の健康状態および体調、年齢、処置対象の個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方物化、医療状況に対する処置する医師の評価、および他の関連する要素に応じて異なる。該量は、常套的な試験により決定され得る比較的広い範囲内である（ｆａｌｌ  ｉｎ）ことが期待される。本発明の組成物の抗原含量は、一般的に、１回用量あたりのタンパク質の量で示される。約０．９ｍｇタンパク質／ｍｌの１回用量がＯＭＶ系鼻腔内ワクチンに典型的である［６４］。ＭｅＮＺＢ（登録商標）ＯＭＶ系ワクチンは、１ミリリットルあたり２５〜２００μｇのタンパク質（例えば、４５〜９０μｇ／ｍｌ、または５０±１０μｇ／ｍｌ）を含有する。本発明の組成物は、好ましくは、細菌１株あたり１００μｇ／ｍｌ未満のＯＭＶを含む。
【００７０】
髄膜炎菌は身体の種々の領域を冒すため、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は、注射可能物質として、液状の溶液または懸濁液のうちのいずれかとして調製され得る。該組成物は、肺投与用、例えば、微粉末またはスプレーを用いて吸入器として調製され得る。該組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製され得る。該組成物は、経鼻、経耳または眼投与用、例えば、スプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉剤として調製され得る［例えば、参考文献６７および６８］。
【００７１】
本発明の組成物は、特に、反復投薬形式でパッケージングされる場合、抗菌剤を含み得る。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗菌剤が一般的にワクチンにおいて見られるが、水銀無含有の保存剤を用いるか、保存剤を全く用いないかのうちのいずれかが好ましい。
【００７２】
本発明の組成物は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）（Ｔｗｅｅｎ  ８０など）を含み得る。界面活性剤は、一般的に、低レベル（例えば、＜０．０１％）で存在させる。
【００７３】
本発明の組成物は、張性を付与するためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌの濃度が典型的である。塩化ナトリウムの濃度は、好ましくは、７．５ｍｇ／ｍｌより大きい。
【００７４】
本発明の組成物は、一般的に、他の免疫調節剤と併せて投与される。特に、組成物は、通常、１種類以上のアジュバントを含み、本発明は、本発明の小胞をアジュバントと、例えば薬学的に受容可能なキャリア中で混合する工程を含む、本発明の組成物の調製方法を提供する。好適なアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００７５】
（Ａ．無機質含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した無機質含有組成物としては、無機塩類、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩などが挙げられる。本発明は、無機塩類、例えば、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など［例えば、参考文献６９の第８および９章を参照］、または異なる無機質化合物の混合物などを含み、これらの化合物は任意の適当な形態が採用され（例えば、ゲル、結晶質、非晶質など）、吸着性であることが好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方物化され得る［７０］。
【００７６】
典型的なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ４／Ａｌモル比（０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌを含む）を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムでの吸着が、例えば、５０〜１００μｇ  Ａｌ３＋／結合体／用量で使用され得る。リン酸アルミニウムが使用され、アジュバントに抗原が吸着されないことが所望される場合、これは、遊離リン酸塩イオンを溶液中に含めることにより（例えば、リン酸塩緩衝液の使用によって）有利である。
【００７７】
ＲＩＶＭワクチンは、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムアジュバントのうちのいずれかに対する吸着に関して試験され、リン酸アルミニウムアジュバントが、より優れた結果をもたらすことがわかった［６５］。ＭｅＮＺＢ（登録商標）、ＭｅｎＢｖａｃ（登録商標）およびＶＡ−ＭＥＮＩＮＧＯＣ−ＢＣ（登録商標）製品は、すべて水酸化アルミニウムアジュバントを含むものである。
【００７８】
アルミニウムアジュバントの典型的な用量は約３．３ｍｇ／ｍｌ（Ａｌ３＋濃度として示す）。
【００７９】
（Ｂ．油性エマルジョン）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した油性エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９［参考文献６９の第１０章；また、参考文献７１も参照］（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ  ８５、マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に処方物化）などが挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた使用され得る。
【００８０】
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献６９の第２２章］）
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート）由来のものが市販品として得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製処方物（例えば、ＱＳ２１など）、ならびに脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭなど）が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）として市販されている。
【００８１】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されたものである。これらの手法を用いた具体的な精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は参考文献７２に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールを含み得る［７３］。
【００８２】
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを用い、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特異な粒子を形成することができる［参考文献６９の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質もまた含む。任意の公知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献７３〜７５にさらに記載されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、余分な界面活性剤を含まないものであり得る［７６］。
【００８３】
サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献７７および７８に見られ得る。
【００８４】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。このような構造は、一般的に、ウイルス由来の１種類以上のタンパク質を、任意選択でリン脂質と合わせて、または配合されて含有する。これらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に、天然ウイルスゲノムを全く含まない。ウイルス系タンパク質は、組換えにより産生させたもの、または完全体ウイルスから単離したものであり得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適したこのようなウイルス系タンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、コートタンパク質など）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献７９〜８４にさらに論考されている。ビロソームは、例えば、参考文献８５にさらに論考されている。
【００８５】
（Ｅ．細菌または微生物の誘導体）
本発明における使用に適したアジュバントとしては、細菌または微生物の誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体などが挙げられる。
【００８６】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６アシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態は参考文献８６に開示されている。３ｄＭＰＬのかかる「小粒子」は、０．２２μｍ膜を通して滅菌濾過されるのに充分小さい［８６］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドのリン酸塩誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる［８７，８８］。
【００８７】
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献８９および９０に記載されている。
【００８８】
本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸塩結合によってグアノシンに連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【００８９】
ＣｐＧは、ヌクレオチド修飾／アナログ（例えば、ホスホチオエート修飾など）を含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献９１、９２および９３には、考えられ得るアナログ置換、例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果が、参考文献９４〜９９にさらに論考されている。
【００９０】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴに指向されるものであり得る［１００］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど）か、またはＢ細胞応答の誘導により特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１０１〜１０３に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【００９１】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識のために接近可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がその３’末端で結合され、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成していてもよい。例えば、参考文献１００および１０４〜１０６を参照のこと。
【００９２】
細菌のＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、該タンパク質は、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来するものである。粘膜用アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献１０７に記載されており、非経口用アジュバントとしてのものは参考文献１０８に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡおよびＢの両方のサブユニットを含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは、無毒化変異を含み、好ましくは、Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは無毒化ＬＴ変異型、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などである。アジュバントとしてのＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の使用は、参考文献１０９〜１１６をみるとよい。アミノ酸置換に関する数値符号は、好ましくは、参考文献１１７に示すＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくものであり、引用により、その全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【００９３】
（Ｆ．ヒト免疫調整剤）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調整剤としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１１８］など）［１１９］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などが挙げられる。
【００９４】
（Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤）
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［１２０］または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る［１２１］。
【００９５】
（Ｈ．ミクロ粒子）
ミクロ粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生分解性で非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）とポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から形成されるミクロ粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）が好ましく、任意選択で、負に帯電した表面（例えば、ＳＤＳで）または正に帯電した表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン系界面活性剤で）を有するように処理する。
【００９６】
（Ｉ．リポソーム（参考文献６９の第１３および１４章））
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献１２２〜１２４に記載されている。
【００９７】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明における使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［１２５］が挙げられる。かかる処方物は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤をオクトキシノール［１２６］との組合せで、ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤を少なくとも１種類のさらなる非イオン系界面活性剤、例えば、オクトキシノール［１２７］との組合せでさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
【００９８】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献１２８および１２９に記載されている。
【００９９】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル（ｎｏｒ）ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１００】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献１３０および１３１にさらに記載されているＩｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる。
【０１０１】
本発明はまた、上記のアジュバントの１種類以上の態様の組合せを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１３２］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１３３］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（任意選択で＋ステロール）［１３４］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンの組合せ［１３５］；（６）１０％スクワラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、サブミクロンエマルジョンにミクロ流動化されたもの、またはより大きな粒径のエマルジョンを生成させるためにボルテックスされたもののうちのいずれかであるＳＡＦ；（７）２％スクアレンと、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１種類以上の細菌の細胞壁成分とを含有するＲｉｂｉ（登録商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（登録商標））；ならびに（８）１種類以上の無機塩類（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬなど）が本発明において使用され得る。
【０１０２】
免疫刺激剤として作用する他の物質は、参考文献６９の第７章に開示されている。
【０１０３】
アルミニウム塩アジュバントの使用は特に好ましく、抗原は、一般的に、かかる塩に吸着される。本発明の組成物において、一部の抗原を水酸化アルミニウムに吸着させることが可能であるが、リン酸アルミニウムと会合する他の抗原を有することが可能である。しかしながら、一般に、単一の塩、例えば水酸化物またはリン酸塩を用いることが好ましいが、両方ではない。すべての小胞が吸着される必要はなく、すなわち、一部または全部が溶液中で遊離状態であり得る。
【０１０４】
（処置方法）
本発明はまた、本発明の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。免疫応答は、好ましくは保護的であり、好ましくは抗体が関与する。該方法により、既にＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して初回抗原刺激した患者において、追加免疫応答が惹起され得る。ＯＭＶに関する皮下および鼻腔内初回抗原刺激／追加免疫レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）は、参考文献１３６に開示されている。
【０１０５】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的使用のためのものである場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、よちよち歩きの幼児または乳児）または１０代の若者であり、ワクチンが治療用途のものである場合、ヒトは、好ましくは成人である。小児を対象とするワクチンはまた、例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために成人に投与され得る。
【０１０６】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の小胞を提供する。医薬は、好ましくは、哺乳動物免疫応答を惹起することができるものであり（すなわち、免疫原性組成物である）、より好ましくはワクチンである。
【０１０７】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明の小胞の使用を提供する。
【０１０８】
本発明はまた、患者の免疫処置のための医薬の製造における本発明の小胞の使用であって、患者が、以下：ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；無細胞性または細胞性百日咳抗原；結合体されたＨｉｂ莢膜糖鎖；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原；結合体された髄膜炎菌莢膜糖鎖；および／または結合体された肺炎球菌莢膜糖鎖の少なくとも１つで予備免疫処置されている使用を提供する。
【０１０９】
このような使用および方法は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって引き起こされる疾患、例えば、細菌性（または、より具体的には、髄膜炎菌性）髄膜炎または敗血症の予防および／または処置のためのものである。
【０１１０】
治療処置の有効性を確認する方法の一例は、本発明の組成物の投与後のナイセリア属感染のモニタリングを伴う。予防的処置の有効性を確認する方法の一例は、該組成物の投与後の小胞の抗原に対する免疫応答のモニタリングを伴う。本発明の組成物の免疫原性は、これを試験被験体（例えば、１２〜１６ヶ月齢の小児または動物モデル［１３７］）に投与し、次いで、標準的なパラメータ（例えば、血清中殺菌抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）など）を測定することにより決定され得る。このような免疫応答は、一般的に、該組成物投与のおよそ４週間後に測定され、該組成物の投与前に測定した値と比較する。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。１回より多い用量の該組成物が投与される場合、１回より多い投与後測定が行なわれ得る。
【０１１１】
好ましい本発明の組成物は、許容され得る（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）割合のヒト被験体に対するセロプロテクションの基準よりも優れた患者において、抗体力価を付与（ｃｏｎｆｅｒ）し得る。それより上では宿主が抗原に対してセロコンバージョンされたとみなされる関連抗体力価を有する抗原はよく知られており、かかる力価は、ＷＨＯなどの機関によって公表されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意な試料の８０％より多く、より好ましくは９０％より多く、さらにより好ましくは９３％より多く、最も好ましくは９６〜１００％がセロコンバージョンされる。
【０１１２】
本発明の組成物は、一般的に、直接患者に投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙腔に対して）によって、または経直腸、経口、経膣、局所、経皮、鼻腔内、眼、経耳、肺もしくは他の粘膜投与によってなされ得る。大腿または上腕に対する筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）によるものであり得るが、無針注も代替的に使用され得る。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
【０１１３】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは反復投与スケジュールであり得る。反復投与は、初回免疫処置スケジュールおよび／または追加免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。初回投与スケジュールの後に追加免疫投与スケジュールが行なわれ得る。初回投与間（例えば、４〜１６週間の間）、および初回抗原刺激と追加免疫間の好適なタイミングは、常套的に決定され得る。ＯＭＶ系ＲＩＶＭワクチンは、３または４回投与の初回スケジュールを用い、０、２および８または０、１、２および８ヶ月時点でのワクチン接種により試験した。ＭｅＮＺＢ（登録商標）を、６週間隔で３回投与にて投与する。このようなスケジュールは、本発明に従って使用され得る。各投与段階で得られる小胞調製物は、同じかまたは異なり得る。
【０１１４】
本発明の方法において、第１の用量を時間点ゼロで与え、次いで、第２および第３の用量が、次の２ヶ月の間に与えられ得、第４の用量が時間点ゼロの後、１１〜１３ヶ月の間に与えられ得る。第１、第２および第３の用量は、互いのものと同じ血清亜型を有する小胞を含み得、第４の用量は、最初の３回の用量のものと異なる血清亜型を有する小胞を含み得る。第４の用量は、最初の３回の用量のものと異なる血清亜型を有する小胞のみを含有し得るか、または１つは最初の３回の用量のものと異なる血清亜型を有し、１つ同じ亜型を有する２つの型の小胞を含有し得る。第１、第２および第３の用量は、好ましくは、６〜８週の間の間隔で与えられる。第４の用量は、好ましくは、時間点ゼロの約１年後に与えられる。患者は、好ましくは、４回の投与の各々で同じ量のワクチンを受ける。
【０１１５】
上記のように、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓサブタイプおよび／または血清亜型［例えば、参考文献４７］の１種類より多くに由来する小胞の、個々の、または混合状態でのうちのいずれかでの投与を伴い得る。
【０１１６】
本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために使用され得る。
【０１１７】
一般に、本発明の組成物は、被験体に投与された後、血清中殺菌抗体応答を誘導することができる。このような応答は、マウスにおいて簡便に測定され、ワクチン有効性の標準的な指標である［例えば、参考文献１９６の巻末の注１４を参照］。血清中殺菌活性（ＳＢＡ）は、補体によって媒介される細菌の死滅を測定するものであり、ヒトまたは仔ウサギの補体を用いてアッセイされ得る。ＷＨＯ基準では、レシピエントの９０％超において、ワクチンは、ＳＢＡの少なくとも４倍上昇を誘導することが求められる。ＭｅＮＺＢ（登録商標）は、第３の用量の投与の４〜６週間後、ＳＢＡの４倍上昇を惹起する。
【０１１８】
狭い保護をもたらすのではなく、本発明の組成物は、血清群Ｂの１つより多い超ビルレント系統に対する殺菌抗体応答を誘導し得る。特に、これらは、好ましくは、以下の３種類の超ビルレント系統：（ｉ）クラスターＡ４；（ｉｉ）ＥＴ５複合体；および（ｉｉｉ）系統３のうちの２種または３種に対する殺菌性応答を誘導するものであり得る。さらに、これらは、超ビルレント系統である亜群Ｉ、亜群ＩＩＩ、亜群ＩＶ−１またはＥＴ−３７複合体のうちの１種類以上に対する、および他の系統、例えば超侵襲性系統に対する殺菌抗体応答を誘導し得る。これは、必ずしも該組成物が、これらの超ビルレント系統の血清群Ｂ髄膜炎菌の１つ１つの菌株に対して殺菌抗体を誘導し得るのではなく、むしろ、例えば、ある特定の超ビルレント系統の血清群Ｂ髄膜炎菌のより多くの（ｍｏｒｅ）菌株の４種類のうちの任意の所与の群について、該組成物によって誘導された抗体が、該群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上）に対して殺菌性であることを意味する。好ましい菌株の群としては、以下の国々：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵの少なくとも４カ国で単離された菌株が挙げられる。該血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８またはより大きい、好ましくは少なくとも２１４）の殺菌力価を有し、例えば、血清は、参考文献１９６に記載のように、１／１０２４に希釈したとき、特定の一菌株の試験細菌の少なくとも５０％を死滅させることができる。
【０１１９】
好ましい組成物は、以下：（ｉ）クラスターＡ４、菌株９６１−５９４５（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／または菌株Ｇ２１３６（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体、菌株ＭＣ５８（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または菌株４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３、菌株３９４／９８（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／または菌株ＢＺ１９８（Ｂ：ＮＴ：−）に由来する血清群Ｂ髄膜炎菌の菌株に対する殺菌性応答を誘導し得るものである。より好ましい組成物は、菌株９６１−５９４５、４４／７６および３９４／９８に対する殺菌性応答を誘導し得るものである。
【０１２０】
菌株９６１−５９４５およびＧ２１３６は、ともにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ参照菌株である［同一著者の参考文献１３８の６３８および１００２］。菌株ＭＣ５８は、広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５）、参考文献３２において配列決定された菌株である。菌株４４／７６は、広く使用され、キャラクタライズされており（例えば、参考文献１３９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ参照菌株の１つである［同一著者の参考文献１３８の２３７；参考文献３３の表２の第３２列］。菌株３９４／９８は、１９９８年にニュージーランドで最初に単離され、この菌株を用いた研究がいくつか発表されている（例えば、参考文献１４０および１４１）。菌株ＢＺ１９８は別のＭＬＳＴ参照菌株である［同一著者の参考文献１３８の４０９；参考文献３３の表２の第４１列］。
【０１２１】
（さらなる抗原性成分）
本発明の抗原性小胞を含有することに加え、本発明の組成物は、さらなる非小胞抗原を含み得る。例えば、該組成物は、以下のさらなる抗原の１種類以上：
−  Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖鎖抗原、例えば、血清群Ｃ由来の参考文献１４２に開示されオリゴ糖または参考文献１４３のオリゴ糖など。ＶＡ−ＭＥＮＩＮＧＯＣ−ＢＣ（登録商標）製品は血清群Ｃの多糖を含有する。
【０１２２】
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖鎖抗原［例えば、参考文献１４４〜１４６；参考文献１５３の第２２および２３章］。
【０１２３】
−  Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、不活化ウイルスなど［例えば、１４７、１４８；参考文献１５３の第１５章］。
【０１２４】
−  Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原、例えば、表面および／またはコア抗原など［例えば、１４８、１４９；参考文献１５３の第１６章］。
【０１２５】
−  Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、１５０］。
【０１２６】
−  百日咳菌由来の抗原、例えば、百日咳ホロ毒素（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の糸状血球凝集素（ＦＨＡ）など、任意選択でペルタクチンおよび／または凝集原２および３との組合せでもある［例えば、参考文献１５１および１５２；参考文献１５３の第２１章］。
【０１２７】
−  ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイドなど［例えば、参考文献１５３の第１３章］。
【０１２８】
−  破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイドなど［例えば、参考文献１５３の第２７章］。
【０１２９】
−  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来の糖鎖抗原［例えば、参考文献１５３の第１４章］。
【０１３０】
−  Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、参考文献１５４］。
【０１３１】
−  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、１５５〜１６１］。
【０１３２】
−  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、１６２］。
【０１３３】
−  Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１６３］。
【０１３４】
−  ポリオ抗原（１種類または複数種）［例えば、１６４、１６５；参考文献１５３の第２４章］、例えば、ＩＰＶなど。
【０１３５】
−  狂犬病抗原（１種類または複数種）［例えば、１６６］、例えば、凍結乾燥不活化ウイルスなど［例えば、１６７、ＲａｂＡｖｅｒｔ（登録商標）］。
【０１３６】
−  麻疹、耳下腺炎および／または風疹抗原［例えば、参考文献１５３の第１９、２０および２６章］。
【０１３７】
−インフルエンザ抗原（１種類または複数種）［例えば、参考文献１５３の第１７および１８章］、例えば、血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質など。
【０１３８】
−  Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１６８］。
【０１３９】
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のタンパク質抗原（Ｂ群連鎖球菌）［例えば、１６９、１７０］。
【０１４０】
−  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の抗原（Ａ群連鎖球菌）［例えば、１７０、１７１、１７２］。
を含み得る。
【０１４１】
糖鎖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）抗原を用いる場合、これは、好ましくは、免疫原性を増強するためにキャリアに結合体させる。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、髄膜炎菌および肺炎球菌の糖鎖抗原のコンジュゲーションがよく知られている。
【０１４２】
毒性のタンパク質抗原は、必要な場合は、無毒化するのがよい（例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の無毒化［１５２］）。
【０１４３】
ジフテリア抗原を該組成物中に含める場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、破傷風抗原を含める場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含めることが好ましい。同様に、百日咳抗原を含める場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含めることが好ましい。したがって、ＤＴＰの組合せが好ましい。
【０１４４】
糖鎖抗原は、好ましくは、結合体の形態である。結合体のための好ましい輸送タンパク質は、細菌の毒素またはトキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなど）である。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７変異型［１７３〜１７５］は、それ自体がジフテリアトキソイドであるため特に好ましいキャリアである。他の好適な輸送タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［１７６］、合成ペプチド［１７７，１７８］、熱ショックタンパク質［１７９，１８０］、百日咳タンパク質［１８１，１８２］、サイトカイン［１８３］、リンホカイン［１８３］、ホルモン［１８３］、増殖因子［１８３］、種々の病原体由来抗原に由来する多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１８４］（例えば、Ｎ１９など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来プロテインＤ［１８５，１８６］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［１８７］、ニューモリシン［１８８］、鉄分取込みタンパク質［１８９］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来毒素ＡまたはＢ［１９０］などが挙げられる。
【０１４５】
好ましい組成物は、上記の髄膜炎菌小胞に加え、髄膜炎菌の血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの１種類以上（すなわち、１、２、３または４種類）に由来する結合体された莢膜糖鎖を含む。小胞が血清群Ｂに由来する場合、このアプローチは、以下の血清群：Ｂ＋Ａ；Ｂ＋Ｃ；Ｂ＋Ｗ１３５；Ｂ＋Ｙ；Ｂ＋Ｃ＋Ｗ１３５；Ｂ＋Ｃ＋Ｙ；Ｂ＋Ｗ１３５＋Ｙ；Ｂ＋Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５；Ｂ＋Ａ＋Ｃ＋Ｙ；Ｂ＋Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ；Ｂ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ；およびＢ＋Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙが包含されることを許容する。２つの好ましい組合せでは、血清群Ｂ小胞に加え、血清群Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙまたは血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙのうちのいずれかに由来する結合体抗原が使用される。一般に、ｘ種類の血清群（１種類または複数種）で小胞および残りの（５−ｘ）種類の血清群の結合体糖鎖を選択することにより、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの５種類すべてを包含することが可能である。
【０１４６】
また、特定の髄膜炎菌のタンパク質抗原（好ましくは、血清群Ｂ由来）が、小胞組成物を補足するために添加され得る。特に、参考文献４１および１９１〜１９９に開示されたものなどのタンパク質抗原が添加され得る。少数の規定の抗原（１０種類より少ない（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２）精製抗原の混合物）が添加され得る。本発明での使用に好ましいさらなる免疫原性ポリペプチドは、参考文献１９９に開示された：（１）「ＮａｄＡ」タンパク質；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；および（５）「２８７」タンパク質である。他の考えられ得る補足の髄膜炎菌抗原としては、トランスフェリン結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡやＴｂｐＢ）および／またはＣｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ［１８］が挙げられる。他の考えられ得る補足の髄膜炎菌抗原としては、ＯＲＦ４０（「Ｈｓｆ」または「ＮｈｈＡ」としても知られる［２００，２０１］）、ＬｃｔＰ［２０２］およびＥｘｂＢ［２０２］が挙げられる。他の考えられ得る補足の髄膜炎菌抗原としては、以下のアミノ酸配列：参考文献１９１の配列番号６５０；参考文献１９１の配列番号８７８；参考文献１９１の配列番号８８４；参考文献１９２の配列番号４；参考文献１９３の配列番号５９８；参考文献１９３の配列番号８１８；参考文献１９３の配列番号８６４；参考文献１９３の配列番号８６６；参考文献１９３の配列番号１１９６；参考文献１９３の配列番号１２７２；参考文献１９３の配列番号１２７４；参考文献１９３の配列番号１６４０；参考文献１９３の配列番号１７８８；参考文献１９３の配列番号２２８８；参考文献１９３の配列番号２４６６；参考文献１９３の配列番号２５５４；参考文献１９３の配列番号２５７６；参考文献１９３の配列番号２６０６；参考文献１９３の配列番号２６０８；参考文献１９３の配列番号２６１６；参考文献１９３の配列番号２６６８；参考文献１９３の配列番号２７８０；参考文献１９３の配列番号２９３２；参考文献１９３の配列番号２９５８；参考文献１９３の配列番号２９７０；参考文献１９３の配列番号２９８８の１つ以上を含むタンパク質、または（ａ）前記配列に対して５０％またはそれ以上同一性（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）を有する；および／または（ｂ）前記配列由来の少なくともｎ個の連続するアミノ酸である断片を含むアミノ酸配列を含む（ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０もしくはそれより大きい）である）ポリペプチドが挙げられる。（ｂ）の好ましい断片は、関連する配列に由来するエピトープを含む。これらのポリペプチドの１つより多く（例えば、２、３、４、５、６個）が含まれ得る。また、髄膜炎菌抗原トランスフェリン結合タンパク質および／またはＨｓｆタンパク質が添加されてもよい［２０３］。
【０１４７】
このような規定の髄膜炎菌抗原によるＯＭＶの補足は、ＯＭＶが血清亜型Ｐ１．７ｂ，４髄膜炎菌または血清亜型Ｐ１．７，１６髄膜炎菌に由来する場合、特に有用である。これらの両方の血清亜型に由来するＯＭＶの混合物の補足が好ましい。
【０１４８】
また、本発明のもの以外の方法で調製される（例えば、先行技術において開示された細菌膜の破壊を伴う方法によって調製される）本発明の小胞ではない小胞（例えば、ＯＭＶ、ＭＶ、ＮＯＭＶなど）を添加することも可能である。
【０１４９】
組成物中の抗原は、典型的には、各々、少なくともｌμｇ／ｍｌの濃度で存在させる。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、該抗原に対する免疫応答を惹起するのに充分なものである。
【０１５０】
本発明の組成物においてタンパク質抗原を用いる代わりに、該抗原をコードする核酸を使用してもよい。本発明の組成物のタンパク質成分は、したがって、タンパク質をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態）で置き換えられ得る。
【０１５１】
（新しい髄膜炎菌のタンパク質）
血清群Ｂ髄膜炎菌のゲノム配列は、参考文献３２に報告されている。ゲノムの最初の（ｉｎｉｔｉａｌ）アノテーションは、＞２０００個の遺伝子すべてに認められていない。例えば、ＮＭＢ１８７０の開始コドンは、その後、再割り当てされている［４１，５５］。本発明者らは、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７の開始コドンもまた、再割り当てされるはずであることを見出した。
・  ＮＭＢ０９２８の最初の配列を図６（配列番号３）に示す。本発明者らは、ＮＭＢ０９２８の真の開始コドンは、図６の残基２４のメチオニンをコードするＡＴＧであると考える。新しい開始コドン（配列番号６）では、ＮＭＢ０９２８は、リポ−ボックスモチーフ（下線）を有するシグナルペプチドを特徴とする、表面発現（ｅｘｐｏｓｅｄ）タンパク質の典型的な形跡（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を提示する。
・  ＮＭＢ０１０９の最初の配列を図７（配列番号４）に示す。本発明者らは、ＮＭＢ０１０９の真の開始コドンは、図７の残基３９のＭｅｔをコードするＡＴＧであると考える。（配列番号７）
・  ＮＭＢ１０５７の最初の配列を図８（配列番号５）に示す。本発明者らは、ＮＭＢ１０５７の真の開始コドンは、図８の残基１４のＶａｌをコードするＧＴＧであると考える。（配列番号８）
したがって、本発明は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号６に対して少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび／または配列番号６由来の少なくとも７個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続するアミノ酸である断片からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、Ｎ末端システイン残基（好ましくは、配列番号６のＣｙｓ−１９に対応する）を有し、Ｎ末端システインは、好ましくは脂質化されている。好ましいポリペプチドは、そのＮ末端の３０個のアミノ酸内にアミノ酸配列ＭＴＨＩＫＰＶＩＡＡＬＡＬＩＧＬＡＡ（配列番号９）を含まない。
【０１５２】
本発明はまた、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号７に対して少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび／または配列番号７由来の少なくとも７個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続するアミノ酸である断片からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、そのＮ末端の２０個のアミノ酸内にアミノ酸配列ＭＬＫＣＧＴＦＦＩＴＲＨＩＰＲＧＣＲＲＦＦＱＰＮＱＡＲＱＴＥＩＹＱＩＲＧＴＶ（配列番号１０）を含まない。
【０１５３】
本発明はまた、（ａ）配列番号８のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号８に対して少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび／または配列番号８由来の少なくとも７個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続するアミノ酸である断片からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、Ｎ末端システイン残基（好ましくは、配列番号８のＣｙｓ−Ｇｌｎに対応する）を有し、Ｎ末端システインは、好ましくは脂質化されている。他の好ましいポリペプチドは、そのＮ末端の２０個のアミノ酸内にアミノ酸配列ＭＰＣＭＮＨＱＳＮＳ（配列番号１１）を含まない。
【０１５４】
ポリペプチドは、種々の手段によって、例えば、化学合成（少なくとも一部）、プロテアーゼを用いた長鎖ポリペプチドの消化、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの精製（例えば、組換え発現またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養物から）などによって調製され得る。大腸菌宿主における異種発現は、好ましい発現経路である。
【０１５５】
本発明のポリペプチドは、固相支持体に結合または固定化させてもよい。本発明のポリペプチドは、検出可能な標識、例えば、放射能標識、蛍光標識またはビオチン標識を含み得る。これは、イムノアッセイ手法において特に有用である。
【０１５６】
ポリペプチドは、種々の形態（例えば、天然状態、融合体、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、ジスルフィド結合など）を採用し得る。ポリペプチドは、好ましくは、髄膜炎菌のポリペプチドである。
【０１５７】
ポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な、もしくは実質的に単離された形態（すなわち、他のナイセリア属もしくは宿主細胞のポリペプチドを実質的に含まない）、または実質的に単離された形態で調製される。一般に、該ポリペプチドは、非天然環境で提供され、例えば、その天然環境から分離される。ある特定の実施形態では、主題のポリペプチドは、対照と比べてポリペプチドが富化された組成物中に存在する。したがって、精製されたポリペプチドが提供される。ここで、精製されたとは、該ポリペプチドが、他の発現ポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、ここで、実質的に含まないとは、５０％未満、通常３０％未満、より通常的には１０％未満の組成物が、他の発現ポリペプチドで構成されることを意味する。
【０１５８】
用語「ポリペプチド」は、任意の鎖長のアミノ酸ポリマーをいう。該ポリマーは、直鎖または分枝であり得、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって分断されていてもよい。該用語はまた、天然で、または介在；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（例えば、標識成分でのコンジュゲーションなど）によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、アミノ酸の１種類以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸など）、ならびに当該技術分野で知られた他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義に含まれる。ポリペプチドは、単一の鎖または会合した鎖として存在し得る。
【０１５９】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなるものであり得、または追加の何かを含むもの、例えばＸ＋Ｙであり得る。
【０１６０】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１６１】
語句「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まないものであり得る。必要に応じて、語句「実質的に」は、本発明の定義で省略されている場合がある。
【０１６２】
２つのアミノ酸配列間の配列同一性割合に対する言及は、アラインメントしたとき、該割合のアミノ酸は、この２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性の割合は、当該技術分野で知られたソフトウエアプログラム（例えば、参考文献２０４のセクション７．７．１８に記載されたものなど）を用いて決定され得る。好ましいアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム（ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２でのアフィンギャップ検索を用いる）によって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムはよく知られており、参考文献２０５に開示されている。
【０１６３】
４桁の数の「ＮＭＢ」タンパク質に対する言及は、血清群Ｂ髄膜炎菌のプロトタイプ菌株のゲノム配列に基づいて割り当てられた参考文献３２の標準的な命名法を示す。公の配列データベースは、これらのＮＭＢ配列を含む。任意の所与の髄膜炎菌について、当業者は、例えば、プライマー、プローブなどを設計するために、プロトタイプ菌株のＮＭＢｎｎｎｎ  ＯＲＦのデータベースおよび／または遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ）環境由来の既存の配列を用いることにより、ＮＭＢｎｎｎｎ配列に相当する遺伝子を容易に疑いなく見出すことができる。
【０１６４】
用語「ＧＮＡ３３」、「ＮＭＢ００３３」および「ｍｌｔＡ」は、髄膜炎菌に関する場合、互換的に使用され得る。
本願発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）ペプチドグリカンを含む細胞壁を有し；かつ（ｉｉ）ＭｌｔＡタンパク質の溶解性トランスグリコシラーゼ活性を有するタンパク質を発現しない、細菌。
（項目２）
細菌であって、そのｍｌｔＡ遺伝子のノックアウト変異を有する、細菌。
（項目３）
少なくとも１つのさらなる遺伝子のノックアウト変異もまた有する、項目２に記載の細菌。
（項目４）
ナイセリア属またはエシェリキア属である、項目１〜３のうちのいずれか１項に記載の細菌。
（項目５）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓである、項目４に記載の細菌。
（項目６）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが、血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５または血清群Ｙに由来する、項目５に記載の細菌。
（項目７）
ｇｎａ３３−ｌｐｘＡ−ＰｏｒＡ−髄膜炎菌である、項目５または項目６に記載の細菌。（項目８）
大腸菌である、項目４に記載の細菌。
（項目９）
病原性大腸菌である、項目８に記載の細菌。
（項目１０）
前記病原性大腸菌が、腸管外病原性細菌、尿路病原性細菌または髄膜炎／敗血症関連細菌である、項目９に記載の細菌。
（項目１１）
Ｔｏｌ−Ｐａｌ複合体のタンパク質を発現しない、病原性大腸菌。
（項目１２）
ｔｏｌＲ−株である、項目１１に記載の大腸菌。
（項目１３）
項目１〜１２のうちのいずれか１項に記載の細菌の培養の間に培地中に放出される小胞を含む、組成物。
（項目１４）
生菌および／または完全体の細菌を全く含まない、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
項目１〜１２のうちのいずれか１項に記載の細菌を増殖させた培地を０．２２μｍフィルターに通す濾過後に得られ得る濾液中に存在する小胞を含む、組成物。
（項目１６）
項目５〜７のうちのいずれか１項に記載の細菌を培養することにより得られ得る、髄膜炎菌小胞。
（項目１７）
ＭｉｎＤ、ＦｔｓＡおよび／またはホスホエノールピルベートシンターゼタンパク質のうちの少なくとも１つを含まない、項目１６に記載の髄膜炎菌小胞。
（項目１８）
リボソームを実質的に含まない、項目１６に記載の髄膜炎菌小胞。
（項目１９）
いかなるアミノ酸ｔＲＮＡシンセターゼも実質的に含まない、項目１６に記載の髄膜炎菌小胞。
（項目２０）
クレブズ回路由来のいかなる酵素も実質的に含まない、項目１６に記載の髄膜炎菌小胞。（項目２１）
ＮＭＢ００３５、ＮＭＢ００４４、ＮＭＢ００８６、ＮＭＢ００８８、ＮＭＢ０１０９、ＮＭＢ０１２４、ＮＭＢ０１３８、ＮＭＢ０１８２、ＮＭＢ０２０４、ＮＭＢ０２７８、ＮＭＢ０２９４、ＮＭＢ０３１３、ＮＭＢ０３４５、ＮＭＢ０３４６、ＮＭＢ０３８２、ＮＭＢ０４６０、ＮＭＢ０４６１、ＮＭＢ０５５０、ＮＭＢ０５５４、ＮＭＢ０６２３、ＮＭＢ０６３４、ＮＭＢ０６６３、ＮＭＢ０７０３、ＮＭＢ０７８７、ＮＭＢ０８７３、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ１０３０、ＮＭＢ１０５３、ＮＭＢ１０５７、ＮＭＢ１１２６、ＮＭＢ１２８５、ＮＭＢ１３０１、ＮＭＢ１３３２、ＮＭＢ１４２９、ＮＭＢ１４８３、ＮＭＢ１５３３、ＮＭＢ１５６７、ＮＭＢ１６１２、ＮＭＢ１７１０、ＮＭＢ１８７０、ＮＭＢ１８９８、ＮＭＢ１９４９、ＮＭＢ１９６１、ＮＭＢ１９７２、ＮＭＢ１９８８、ＮＭＢ２０３９、およびＮＭＢ２０９１である４７種類のタンパク質を含む、項目１６に記載の髄膜炎菌小胞。
（項目２２）
項目１６〜２１のうちのいずれか１項に記載の髄膜炎菌小胞を含む、薬学的組成物。
（項目２３）
（ｉ）項目１６〜２１のうちのいずれか１項に記載の髄膜炎菌小胞の第１の組と、（ｉｉ）項目１６〜２１のうちのいずれか１項に記載の髄膜炎菌小胞の第２の組とを含む、組成物であって、該第１の組と該第２の組とは、異なる髄膜炎菌株から調製される、組成物。（項目２４）
アジュバントを含む、項目１３、項目１４、項目１５、項目２２または項目２３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
（項目２５）
細菌小胞を調製するための方法であって、
（ｉ）項目１〜１２のうちのいずれか１項に記載の細菌を培地中で、該細菌が小胞を該培地中に放出するように培養する工程；および
（ｉｉ）該小胞を該培地から収集する工程；
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１Ａ】図１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＡＦ４０５０４．１［３２］から得られる血清群Ｂ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株ＭＣ５８のゲノム配列由来の膜結合溶解性ムレイントランスグリコシラーゼＡ（ｍｌｔＡ）のアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】図１は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＡＦ４０５０４．１［３２］から得られる血清群Ｂ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株ＭＣ５８のゲノム配列由来の膜結合溶解性ムレイントランスグリコシラーゼＡ（ｍｌｔＡ）のアミノ酸配列（配列番号１）およびヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２】図２は、本発明の小胞の２Ｄ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】図３は、標準的なタンパク質（下）およびΔｍｌｔＡ株の培養上清みの遠心分離ペレット（上）のゲル濾過の結果を示す。ｙ軸は、２８０ｎｍにおける吸光度を示す。
【図４】図４は、本発明の小胞の電子顕微鏡検査を示す。
【図５】図５は、本発明の小胞のウェスタンブロット分析を示す。６種類の異なる抗体（Ａ〜Ｆ）を用いてブロットを染色した：Ａ＝デオキシコレート抽出によってＮＺ株から調製されたＯＭＶに対して生成させたマウス血清；Ｂ＝ΔＧＮＡ３３ノックアウト変異型に対して生成させたマウス血清；Ｃ＝マウス抗ＰｏｒＡＰ１．４モノクローナル；Ｄ＝マウス抗ＮＭＢ２１３２血清；Ｅ＝マウス抗ＮＴＭＢ１０３０血清；Ｆ＝マウス抗ＮＭＢ１８７０血清。
【図６】図６〜８は、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７のアミノ酸配列を示す。
【図７】図６〜８は、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７のアミノ酸配列を示す。
【図８】図６〜８は、ＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７のアミノ酸配列を示す。
【図９】図９〜１１は、開始コドンがシフトされたＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図９〜１１は、開始コドンがシフトされたＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７のアミノ酸配列を示す。
【図１１】図９〜１１は、開始コドンがシフトされたＮＭＢ０９２８、ＮＭＢ０１０９およびＮＭＢ１０５７のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、野生型またはΔＧＮＡ３３細菌によって培養上清み液中に放出されたタンパク質の比較である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：培地対照；レーン３：ＯＤ６２０ｎｍ＝０．５のΔＧＮＡ３３培地（６．５ｍｌの培地に相当）の高速遠心分離によって回収した２０μｇのタンパク質；レーン４：ＯＤ６２０ｎｍ＝０．５の野生型ＭＣ５８培地６．５ｍｌから高速遠心分離によって回収したタンパク質。
【図１３】図１３は、野生型ＭＣ５８全抽出物（レーン２および４）およびΔＧＮＡ３３ノックアウト変異型によって放出された小胞（レーン３および５）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン２および３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前に９５℃で変性しなかったタンパク質；レーン４および５は９５℃で変性。
【図１４】図１４および１５は、菌株３９４／９８から調製された小胞の１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１５において、水平軸はｐＩ３〜１０までであり、垂直軸は１０〜２００ｋＤａまでである。
【図１５】図１４および１５は、菌株３９４／９８から調製された小胞の１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１５において、水平軸はｐＩ３〜１０までであり、垂直軸は１０〜２００ｋＤａまでである。
【図１６】図１６および１７は、ｔｏｌＲ  ＥｘＰＥＣノックアウト菌株から調製された小胞の１ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１７】図１６および１７は、ｔｏｌＲ  ＥｘＰＥＣノックアウト菌株から調製された小胞の１ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１８】図１８〜２０は、ΔｍｌｔＡノックアウト髄膜炎菌由来の小胞の１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１９】図１８〜２０は、ΔｍｌｔＡノックアウト髄膜炎菌由来の小胞の１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２０】図１８〜２０は、ΔｍｌｔＡノックアウト髄膜炎菌由来の小胞の１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６６】
（発明の実施の形態）
（髄膜炎菌のΔｍｌｔＡノックアウト菌株の調製）
ｍｌｔＡ遺伝子が対立遺伝子交換によって抗生物質カセットで置き換えられた髄膜炎菌株を調製した。
【０１６７】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株ＭＣ５８を、プラスミドｐＢＳＵＤＧＮＡ３３ＥＲＭで形質転換した。このプラスミドは、上流および下流に対立遺伝子交換のためのフランキング領域、切断型ｍｌｔＡ遺伝子、ならびにｅｒｍＣ遺伝子（エリスロマイシン耐性をコードする）を含有する。−８６７から＋７５までの位置の上流フランキング領域（開始コドンを含む）および＋１２６８から＋１７４４までの位置の下流フランキング領域（停止コドンを含む）を、ＭＣ５８から、プライマーＵ３３ＦＯＲ、Ｕ３３ＲＥＶ、Ｄ３３ＦＯＲおよびＤ３３ＲＥＶ［２５］を用いることにより増幅した。標準的な手法を用いることにより、断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）内にクローン化し、大腸菌ＤＨ５を形質転換した。すべてのサブクローニングが完了したら、自然状態でコンピテントなナイセリア属株ＭＣ５８を、ＧＣ寒天プレート上で一晩増殖させた数個のコロニーを選択し、これをｌμｇのプラスミドＤＮＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）２０μｌと混合することにより形質転換した。混合物をチョコレート寒天プレート上にスポッティングし、６時間３７℃で５％ＣＯ２にてインキュベートし、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈し、７μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＧＣ寒天プレート上にスプレッドした。染色体ｍｌｔＡ遺伝子の対立遺伝子交換をＰＣＲによって確認し、ＭｌｔＡ発現の欠如は、ウェスタンブロット分析によって確認した。
【０１６８】
参考文献２５に報告されているように、ΔｍｌｔＡノックアウト菌株は、正しいトポロジー構成の細胞膜を有さず、異常細胞分離、異常細胞形態学、未分裂隔壁、二重隔壁、細胞クラスター化、外膜の共有および低下したビルレンスを有する。また、参考文献２５では、ノックアウト菌株は、種々の膜タンパク質、例えば、ＰｏｒＡ、ＰＩＢ、クラス４およびクラス５外膜タンパク質を培養上清み中に放出することが報告されている。
【０１６９】
また、ΔｍｌｔＡノックアウトは、ＭｅＮＺＢ（登録商標）製品が作製される菌株であるニュージーランド菌株３９４／９８（ｌｉｎ３；Ｂ：４：Ｐ１．４）からも行なわれた。
【０１７０】
（放出されたタンパク質の分析）
ΔｍｌｔＡ株をＧＣ培地中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気においてＯＤ６００ｎｍ０．５まで増殖させた。菌体を、３５００×ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。上清み（すなわち、培地）を、０．２２μｍ孔径フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、細胞無含有濾液を、高速遠心分離（２００，０００×ｇ、９０分間）に供した。この遠心分離によりペレットの形成がもたらされ、培地１リットルあたりタンパク質は約８〜１２ｍｇであった。かかるペレットは、野生型ＭＣ５８細菌を同様に処理した場合は見られず、したがって、ペレット形成はΔｍｌｔＡノックアウトの成果である。ペレットを、さらなる分析のためにＰＢＳ（遠心分離２００，０００×ｇ、３０分間）で２回洗浄した。
【０１７１】
第１の分析では、該ペレット由来の材料をＰＢＳ中に再懸濁し、ＰＢＳ中で平衡化させておいたＳＭＡＲＴ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でランさせるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＰＣ３．２／３０ゲル濾過カラムに適用した。流速を４０μｌ／分とし、溶出液を２８０ｎｍでモニターした。カラムを、２０μｇのＢｌｅｕデキストラン（２，０００ｋＤａ）、１０μｇのフェリチン（４４０ｋＤａ）、１４０μｇのウシ血清アルブミン（６５ｋＤａ）および２００μｇのリボヌクレアーゼＡ（１５ｋＤａ）で較正した。図３に示されるように、タンパク質の大部分が、２，０００ｋＤａよりも実質的に大きい分子量に相当する主要ピークにおいて溶出された。この結果は、種々のタンパク質が会合していることを示す。
【０１７２】
第２の分析では、高分子量ピークに存在する材料を、ネガティブ染色電子顕微鏡検査に供した。この分析により、約５０〜１００ｎｍの直径を有する良好に組織化された膜小胞の存在が明らかになった（図４）。
【０１７３】
これらの実験は、ｍｌｔＡ遺伝子の欠失により、細菌膜の正常な合成（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を撹乱されること、およびこれにより、球状で均質な小胞に合成される膜構造が、培養上清み中に自発的に放出されることを示す。
【０１７４】
図１２は、野生型またはΔＧＮＡ３３細菌の増殖後の培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、異なるタンパク質放出特性を示す。
【０１７５】
（小胞の分析）
ΔｍｌｔＡ由来小胞を、「通常の」界面活性剤抽出方法によって調製した髄膜炎菌小胞と比較した。
【０１７６】
髄膜炎菌株ＭＣ５８、ＮＺ３９４／９８およびＮＺ９８／２５４、ならびにそのそれぞれの同遺伝子系ΔｍｌｔＡ変異型を、２０ｍｌまたは２００ｍｌのＧＣ培地中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気においてＯＤ６２０ｎｍ０．５まで増殖させた。菌体を、３５００×ｇでの１０分間の遠心分離によって回収した。小胞（「ＤＯＭＶ」）を野生型細菌から、参考文献２０６に記載の界面活性剤抽出によって調製した。本発明の小胞（「ｍＯＭＶ」）は、ノックアウト菌株から、０．２２μｍ孔径フィルターを通して濾過した後、濾液を高速遠心分離（２００，０００ｇ、９０分間）し、小胞含有ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し（遠心分離２００，０００ｇ、３０分間）、次いで、ＰＢＳで再懸濁することにより調製した。
【０１７７】
ｍＯＭＶおよびＤＯＭＶの両方を、変性一次元電気泳動によって分析した。簡単には、２０μｇの小胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、１２．５％ゲルのクマシーブルー染色によって可視化した。変性（２％ＳＤＳ）および半変性（０．２％ＳＤＳ、ジチオトレイトールなし、加熱なし）条件を一次元電気泳動に用いた。タンパク質の量（２０μｇ）は、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として用いて測定した。
【０１７８】
小胞を、２％ＳＤＳを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中、９５℃で３分間変性させた。次いで、２０μｇのタンパク質を１２，５％アクリルアミドゲル上に負荷し、これを、クマシーブルーＲ−２５０で染色した。また、２次元電気泳動を、７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、２％（ｗ／ｖ）（３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−ｌ−プロパン−スルホネート）、６５ｍＭジチオトレイトール、２％（ｗ／ｖ）アミドスルホベタイン−１４、２ｍＭトリブチルホスフィン、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび２％（ｖ／ｖ）キャリア両性電解質を含有する再膨潤緩衝液により、１２５ＵＩの最終容量にした２００μｇのタンパク質に対して行なった。タンパク質を一晩、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（７ｃｍ；ｐＨ勾配３〜１０、非線形）上に吸着させた。次いで、タンパク質を２次元的に分離した。１次元では、ＩＰＧｐｈｏｒ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
Ｆｏｃｕｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔを用いて行ない、逐次的に、１５０Ｖを３５分間、５００Ｖを３５分間、１，０００Ｖを３０分間、２，６００Ｖを１０分間、３，５００Ｖを１５分間、４，２００Ｖを１５分間、および最後に５，０００Ｖを１２ｋＶｈに達するまで適用した。２次元では、ストリップを平衡化し、タンパク質を線形９〜１６．５％ポリアクリルアミドゲル（１．５ｍｍ厚、４×７ｃｍ）上で分離した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０で再度染色した。２６６個のタンパク質スポットがＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色後に見られた（図２）。
【０１７９】
次いで、１Ｄおよび２Ｄゲルを、質量分析による分析のためのゲル内タンパク質消化および試料調製に供した。タンパク質スポットをゲルから切り出し、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム／アセトニトリル５０／５０（Ｖ／Ｖ）で洗浄し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心分離機を用いて乾燥した。乾燥させたスポットを、２時間３７℃で、１２μｌの０．０１２μｇ／μｌシークエンスグレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（５ｍＭ）中）にて消化させた。消化後、５μｌの０．１％トリフルオロ（ｔｒｉｆｌｕｏａｃｅｔｉｃ）酸を添加し、ペプチドを脱塩し、ＺＩＰ−ＴＩＰ（Ｃ１８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。試料を、２μｌの５ｇ／ｌ  ２，５−ジヒドロキシ安息香酸（５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酸）にて、質量分析計Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ  ３８４（４００μｍ、Ｂｒｕｋｅｒ、ブレーメン，ドイツ）に溶出し、室温で風乾させた。３３７ｎｍ  Ｎ２レーザーおよび陽イオンリフレクタモードに設定されたＳＣＯＵＴ  ３８４  マルチプローブイオン源を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを得た。加速電圧およびリフレクタ電圧を、それぞれ１９ｋＶおよび２０ｋＶに設定した。典型的には、各スペクトルは、１００回のレーザーショットを平均することにより測定した。スペクトルは、４種類の標準的なペプチド、アンギオテンシンＩＩ（１，０４６．５４Ｄａ）、サブスタンスＰ（１，３４７．７４Ｄａ）、ボンベシン（１，６１９．８２Ｄａ）およびＡＣＴＨ１８−３９  Ｃｌｉｐヒト（２，４６５．２０Ｄａ）の組合せを用いて外部較正し、試料に隣接する位置上にスポッティングした。タンパク質の同定を、Ｍａｓｃｏｔソフトウエアを用い、コンピュータ処理フィンガープリントにより、７００〜３０００Ｄａの質量範囲のペプチドの実験で得られたモノアイソトピック値の自動および手作業の両方での比較によって行なった。
【０１８０】
ＭＣ５８  ΔｍｌｔＡ変異型の結果を図１８に示す。単に１Ｄゲル上の２０個の切り出したバンドから、２５種類の特異なタンパク質が同定され、そのうちの２４種類（９６％）が、ＰＳＯＲＴアルゴリズムによって外膜タンパク質であると予測された（以下の表１）。２Ｄゲル上の１７０種類のタンパク質スポットは、５１種類の特異なタンパク質に相当し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって明白に同定された（表１）。４４／５１の同定タンパク質は、ゲノムアノテーションによって外膜画分に割り当てられた［３２］。残りの７種類のタンパク質を、オリジナルアノテーションにおいて考えられ得るエラーについて分析した。４種類のタンパク質（仮想タンパク質ＮＭＢ１８７０、ＮＭＢ０９２８およびＮＭＢ０ｌ０９、ならびにグルタミルトランスペプチダーＮＭＢ１０５７）は、参考文献３２に記載のもの（例えば、ＮＭＢ１８７０のもの）由来の異なる開始コドンを用い、参考文献５５に割り当てられた開始コドンを用いて、外膜タンパク質に分類することができた。
【０１８１】
１Ｄおよび２Ｄの電気泳動実験の組合せにより、ＭＣ５８  ΔｍｌｔＡ変異型由来小胞において合計６５種類のタンパク質が同定された。これらのうち、６種類のタンパク質が１Ｄおよび２Ｄの両方のゲルで同定され、１４種類および４５種類が、それぞれ１Ｄおよび２Ｄゲルで特異的であった（表１）。またさらに、６５種類の同定タンパク質のうち６１種類が、現行のアルゴリズムによって膜関連タンパク質であると予測され、ΔｍｌｔＡ小胞（ｍＯＭＶ）は大部分が、おそらく排他的に膜タンパク質で構成されていることを示していた。
【０１８２】
菌株ＮＺ３９４／９８のΔｍｌｔＡノックアウトを、同様に、１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図１４および１５）。表２は、一方または両方のゲルにおいて同定された６６種類のタンパク質を、予測される該タンパク質の位置とともに示す。この場合も、大部分のタンパク質が膜関連であると予測された。表１および２に共通する４７種類のタンパク質を表３に示す。
【０１８３】
ＮＺ９８／２５４  ΔｍｌｔＡ変異型の結果を図１９に示す。６６種類のタンパク質がこれらの２つのゲルから同定され、そのうちの５７種類が外膜画分に割り当てられた。したがって、この場合も、ｍＯＭＶは外膜タンパク質内で高度に富化されている。５７種類のタンパク質のうち４６種類は、ＭＣ５８由来ｍＯＭＶにおいても同定されていた。
【０１８４】
比較のため、図２０にＮＺ９８／２５４  ＤＯＭＶの結果を示す。プロテオミクス分析により、１３８種類のタンパク質が明らかになり、そのうち４４種類のみが外膜画分に割り当てられた。残りの９４種類のタンパク質は、細胞質内画分および内膜画分に属した。これらの４４種類の膜タンパク質のうち、３２種類は、同遺伝子系株由来のｍＯＭＶ内に見られる５７種類の外膜タンパク質においても見られた。
【０１８５】
ｍＯＭＶは大部分が外膜タンパク質によって構成されており、したがって、ＤＯＭＶタンパク質の約７０％は細胞質内タンパク質または内膜タンパク質のうちのいずれかである。ＤＯＭＶはｍＯＭＶと、細胞質内タンパク質の比率に関してだけでなく、その外膜タンパク質の種々のプロフィールに関しても異なる。ＤＯＭＶ内に見られる４４種類の外膜タンパク質のうち、３２種類だけがｍＯＭＶにおいても見られた。
【０１８６】
ＭＣ５８およびＮＺ９８／２５４の両方に由来するｍＯＭＶ内に見られるが、ＮＺ９８／２５４由来のＤＯＭＶには見られない１９種類のタンパク質を以下の表４に列挙する。
【０１８７】
細菌の全細胞抽出物を以下のようにして調製した。細菌細胞をＰＢＳで洗浄し、細菌のペレットを８ｍｌのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）に再懸濁した。２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２０００単位のベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）を添加し、菌体を４℃で、Ｂａｓｉｃ
Ｚ  ０．７５Ｖ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（「ワンショットヘッド（ｏｎｅ  ｓｈｏｔ  ｈｅａｄ）」を備える）（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌｔｄ）により２サイクルで破壊し、未破壊菌体を８０００×ｇにて４℃での１０分間の遠心分離によって除去した。この抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ΔＧＮＡ３３細菌によって生成された小胞のタンパク質抽出物と比較した。図１３に示されるように、ポーリン（ｐｏｒｉｎｓ）ＰｏｒＡおよびＰｏｒＢ（これらであることはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦシーケンシングによって確認）は、野生型細菌の外膜（レーン２および４）およびΔＧＮＡ３３ノックアウト変異型の小胞（レーン３および５）にも見られる。またさらに、これらのタンパク質は、小胞内で、安定なトリマーとして保持されるが、これは、半天然状態下、低濃度のＳＤＳ（０．２％）を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中でモノマーに分解されない（電気泳動前に加熱なし；レーン２および３）が、９５℃では変性する（レーン４および５）。
【０１８８】
界面活性剤抽出ＯＭＶにおけるＬＰＳレベルは、典型的には、タンパク質に対して５〜８重量％である［２０７］。Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイで試験した場合、小胞の内毒素含量は、界面活性剤抽出ＯＭＶに見られるものより約２倍高かった。
【０１８９】
最後に、増殖培養物における小胞の収量を評価した。初期の指数関数的増殖培養物（ＯＤ６２０ｎｍ＝０．５）の培養上清み中の細胞１グラム（湿潤重量）あたり２０ｍｇまでのＯＭＶ関連タンパク質が回収され得ることがわかった。
【０１９０】
（小胞免疫原性）
ΔｍｌｔＡ由来小胞は、外膜タンパク質内で高度に富化されているため、一群の広いＭｅｎＢ臨床用単離物を死滅させることができる殺菌抗体を惹起するその能力を調べた。
【０１９１】
試験のために選択した菌株は３９４／９８であった。この株は、ＭｅＮＺＢ（登録商標）ＯＭＶ系ワクチンが調製される菌株であり、それにより、典型的な先行技術方法による本発明のΔｍｌｔＡ小胞と野生型株から調製されたＯＭＶとの直接比較が補助されるため選択した。
【０１９２】
１０μｇの各型の小胞を水酸化アルミニウムアジュバント（３ｍｇ／ｍｌ）に吸着させ、５週齢マウスでＣＤｌ雌マウス（１群あたり５〜１０匹のマウス）に注射した。小胞を腹腔内に第０日および第２１日に与えた。分析用の血液試料を第３４日に採取し、プールした赤ちゃんウサギの血清を補体源として用いて、１１種類の異なる亜型（４種類の主な超ビルレント系統を含む）に対応する１５種類の異なる血清群Ｂ株に対するＳＢＡについて試験した。血清殺菌力価は、時間０での対照１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）と比べて、反応混合物との細菌の６０分間のインキュベーション後、ＣＦＵ／ｍｌの５０％減少をもたらす血清希釈度と定義した。典型的には、陰性対照抗体とともに補体の存在下でインキュベートした細菌は、６０分間のインキュベーション中、ＣＦＵ／ｍｌの１５０〜２００％増加を示した。力価は以下の通りであり、＝５０％細菌の死滅をもたらす血清希釈度の逆数で示す。
【０１９３】
【化１】
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結果は、ΔｍｌｔＡ由来小胞に由来する血清は、化学的抽出によって調製されるＯＭＶと少なくとも同等に殺菌的有効性であり、通常、より良好であった（相同な菌株を除く）ことを示す。本発明の小胞は、したがって、典型的なＯＭＶよりもはるかに良好な菌株交差（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）反応性をもたらす。またさらに、１：１０２４希釈度を殺菌性有効性の閾値とみなすと、本発明の小胞は、菌株の８７％に対して有効であったのに対し、人工ＯＭＶは４０％有効であるにすぎなかった。
【０１９４】
したがって、一群の１５種類の異なる血清群Ｂ株について試験した場合、ｍＯＭＶはＤＯＭＶよりも補体依存性抗体死滅の惹起に関して良好である。抗ｍＯＭＶマウス血清は、相同な菌株に対して、および１４種類のさらなる菌株（１０種類の異なるＰｏｒＡサブタイプを含む）に対して高殺菌活性を示した。対照的に、ＤＯＭＶに対して生成させたマウス血清は、２つのＰｏｒＡサブタイプに属する６種類のＭｅｎＢ株に対してのみ高殺菌力価を示す。これらの結果は、抗ｍＯＭＶ血清の保護は、最も高存在度の外膜タンパク質の１つであり、殺菌抗体の最も強力な誘導物質であるＰｏｒＡに対する殺菌抗体の惹起に起因しただけでなく、ｍＯＭＶにおいてＤＯＭＶよりも高量で存在する他の殺菌性抗原にも起因したことを示す。
【０１９５】
（ウェスタンブロット）
ΔｍｌｔＡ由来小胞が、保存された保護的抗原を含有することを確認するため、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でランさせ、ＰＤＦフィルター上に移し、保護的で高度に保存されていることが以前に示されている６種類のタンパク質抗原（「２８７」、「９５３」、「７４１」（ＧＮＡ１８７０）および「ＮａｄＡ」を含む）に対する特異的抗血清を用いてイムノブロットした。
【０１９６】
小胞を、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、１０％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に分離した。タンパク質分離後、ゲルを４８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３９ｍＭグリシン（ｐＨ９．０）、２０％（ｖ／ｖ）メタノールで平衡化し、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）半乾燥電気泳動用転移細胞を用いてニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ニトロセルロース膜を、０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含む１０％（ｗ／ｖ）スキムミルク含有ＰＢＳでブロックした。
【０１９７】
図５に示されるように、６種類のタンパク質はすべて、小胞内で高存在度であった。対照的に、同６種類のタンパク質は、ＤＯＭＶ内にはあまり存在しなかった。
【０１９８】
結論として、ΔｍｌｔＡ由来小胞は、主に外膜タンパク質によって構成されているが、ＤＯＭＶは、多くの細胞質内タンパク質が夾雑している。マウスの免疫処置に用いる場合、ΔｍｌｔＡ由来小胞に対して生成させた血清は、ＤＯＭＶよりも高く広い菌株対象範囲を示した。
【０１９９】
（腸管外病原性大腸菌）
ＥｘＰＥＣ  ＣＦＴ０７３のノックアウト菌株を、ｔｏｌＲ遺伝子の同遺伝子系欠失（カナマイシン耐性マーカーでの置き換え）によって調製した。ノックアウト菌株をＯＤ６００ｎｍ０．４まで増殖させ、次いで、培養物を遠心分離した。上清みを、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、ＴＣＡを用いて濾液を沈殿させた。次いで、ペレットをＴｒｉｓ緩衝液中に再懸濁した。
【０２００】
同じ増殖および精製手順を、ノックアウトなしの親菌株に対して使用し、２つの最終調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１６に示す。右側のバンドはノックアウト菌株のものであり、数個のタンパク質バンドの富化を示す。
【０２０１】
さらなるｔｏｌＲノックアウトＥｘＰＥＣ株を菌株ＤＨ５ａ、５３６およびＩＨＥ３０３４から調製した。小胞は先のようにして調製し、ＴＣＡ沈殿物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図１７に示す。
【０２０２】
ノックアウト変異型は、高量の小胞をもたらし、これらの小胞をプロテオミクス分析、例えば、小胞内の表面発現タンパク質の１Ｄおよび２ＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにトリプシン消化、続いて放出されたペプチドの配列分析に供した。
【０２０３】
本発明は、一例として記載したにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内で変形がなされ得ることは理解されよう。
【０２０４】
【表１】
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【０２０５】
【表２】
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【０２０６】
【表３】
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【０２０７】
【表４】
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（参考文献（その内容は、本明細書により参考として援用される））
【０２０８】
【表５】
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2014039566.tif 000009
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図４】
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【図５】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2014039566.tif 000029
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2014039566.tif 000032
【配列表】
2014039566000001.app
【外国語明細書】
2014039566000001.pdf