(57)【要約】【課題】簡易な装置によって、生体組織切片の検査が可能な検査方法を提供する。【解決手段】  生体組織切片を含む試験片の検査方法であって、基板と、基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、基板及び増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、保護層の上面に検査対象となる試験片を載置する工程（ｂ）、光増強素子に対して、上面から又は裏面から励起光を照射する工程（ｃ）、及び、試験片からの発光を受光して発光スペクトルを測定する工程（ｄ）を有する。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織切片を含む試験片の検査方法であって、
基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、
前記保護層の上面に検査対象となる前記試験片を載置する工程（ｂ）、
前記光増強素子に対して、上面から又は裏面から励起光を照射する工程（ｃ）、
及び、前記試験片からの発光を受光して発光スペクトルを測定する工程（ｄ）を有することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）が、所定方向に走査しながら前記励起光を前記光増強素子に対して照射する工程であり、
前記工程（ｄ）によって得られた発光スペクトルの強度分布を二次元マッピングする工程（ｅ）を有することを特徴とする請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記試験片からの発光が、ラマン散乱光又は蛍光であることを特徴とする請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記保護層は、前記多数の金属微粒子に関連して配向性を有する無機物質、又は配向性を有する有機物の重合体で構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項５】
前記保護層は、ハロゲン元素を含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検査方法に関し、より詳細には、生体組織切片を含む試験片の検査方法であって、生体組織由来の発光スペクトルを高感度で分析できる検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光を用いた生体分子イメージングを医療応用する方法としては、蛍光色素で染色し、目的とする細胞や生体組織切片に特異的に蓄積した色素からの蛍光を測定する方法が行われている。
【０００３】
また、蛍光ではなく、細胞や生体組織切片のラマン分光を、スペクトルの波長を選択して各部位ごとに測定しマッピングすれば、蛍光色素で染色する必要もなく、且つ、組織を切り取らなくても、細胞の状態を直接評価することが可能になる。
【０００４】
ラマン分光を高感度で測定する方法としてＴＥＲＳ（Tip-Enhanced Raman Scattering）法、誘導ラマン分光法、共鳴ラマン法などの方法が知られている（例えば非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】藤田  他、「プラズモニクスで映し出す細胞内の分子」、ＯＰＴＲＯＮＩＣＳ、オプトロニクス社、平成２０年５月、第３４１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体組織の検査は、当該部位に何らかの異常が存在しているか否かを判断する際に利用されることが多い。例えば、手術中において、対象となる部位を取り出して検査できる程度の大きさにスライスした後、蛍光色素で染色をした上で励起光を照射して、色素からの発光状態を病理医が観察する。このとき、当該部位に異常が存在するかどうか等の検査は、経験豊富で判定に習熟した病理医による組織診断が必要であり、検査可能な数が限られていた。それゆえスペクトルを利用した、より迅速で簡便であり且つ正確な診断方法が求められていた。
【０００７】
通常の非共鳴ラマン分光を用いた測定では、感度が低いため信号が弱く、画像を得るための必要十分な信号を得るには長い測定時間を要する。従って、限られた測定時間内に二次元画像を求める場合には、測定対象となるエリアを狭める必要がある。すなわち、検査を行う者が、予め測定対象エリアを狭い範囲内に特定した上で、当該領域に対して励起光の照射と、ラマンスペクトルの検出を行うことになる。このため、特定した測定対象エリア外に病変箇所が存在する場合には、かかる病変状態を見落とす可能性が高くなってしまう。
【０００８】
ラマン分光を高感度で測定する方法として、上記のＴＥＲＳ法が存在するが、この方法では、測定対象エリアが極めて狭くなってしまうので、前記の課題が発生してしまう。また、誘導ラマン分光法や共鳴ラマン法によれば、検査に必要な装置が大型化する上、高価な装置が必要となる。また特定のスペクトルのみが増幅されるなどの方法上の制約がある。
【０００９】
誘導ラマン分光法、共鳴ラマン法、及びＴＥＲＳ法では、いずれも広範囲を測定するには信号が微弱であるため、測定対象エリアを極めて狭く設定する必要がある上、その限られた領域（□１ｍｍ以下）を測定するにも、場合によっては数時間程度の長い時間を要する。組織診断には数ｃｍ以上の領域を観察する必要があるので、この方法によれば、実用に耐えないほど非常に時間がかかってしまう。誘導ラマン分光などの非線形ラマン分光法では、効率的な誘導ラマン散乱を誘起するためにパルスレーザや高ＮＡレンズを必要とするため装置が大型化し、また一度に取得できる測定領域の制限が問題となる。そのため、ラマン分光スペクトルを高感度で且つ広いエリアを迅速に測定できる方法が望まれていた。
【００１０】
また、上記の方法とは別に、従来、局在表面プラズモン効果を用いて最表面のラマンスペクトルや蛍光スペクトルを測定する方法が存在する。この方法は、局在表面プラズモン効果を実現させるための素子を準備し、この素子上に検査対象となる試験片を載置した状態で光を照射し、試験片からの発光をスペクトル分析する方法である。局在表面プラズモン効果により、試験片からの発光が増強される。
【００１１】
しかし、この方法によれば、局在表面プラズモン効果を実現させるための素子は、表面に銀微粒子などが塗布されている。従って、生体物質を検査対象とする場合、この生体物質を素子上に載置すると、生体物質に含まれるハロゲン化物イオンと銀微粒子などが化学反応して変質し、銀微粒子の脱離や溶解などが生じて、光増強効果が得られなくなるという問題がある。つまり、従来は局在表面プラズモン効果を利用して、生体物質の検査は行えないと考えられていた。
【００１２】
本発明は、上記の課題に鑑み、簡易な装置によって、生体組織切片の検査が可能な検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の検査方法は、生体組織切片を含む試験片の検査方法であって、
基板と、前記基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層と、前記基板及び前記増強電磁場形成層の上層に形成された保護層とを有する光増強素子を準備する工程（ａ）、
前記保護層の上面に検査対象となる前記試験片を載置する工程（ｂ）、
前記光増強素子に対して、上面から又は裏面から励起光を照射する工程（ｃ）、
及び、前記試験片からの発光を受光して発光スペクトルを測定する工程（ｄ）を有することを特徴とする。
【００１４】
本発明の方法では、基板の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子が分散配置された増強電磁場形成層を備える構成であるため、局在表面プラズモン効果を利用することができる。このため、エバネッセント波を利用した表面プラズモン効果とは異なり、基板に対する光の入射角度に関する厳しい制限がなく、自由度が担保される。
【００１５】
また、本発明の方法では、増強電磁場形成層の上層に形成された保護層の上面に検査対象となる試験片が載置される。このため、試験片として生体組織切片のような生体物質を含む場合においても、この試験片は保護層に直接接触するのみであり、金属微粒子が直接試験片と長時間接触し続けるということがない。このため、金属微粒子がハロゲン化物イオンに直接長時間晒され続けることにより、ハロゲン化物イオンと金属微粒子などが化学反応して変質するということがない。この結果、金属微粒子として光の増強効果の高いＡｇを用いることが可能となる。なお、本発明の構成においては、金属微粒子としてＡｇを用いるのが好適であるが、他の金属材料（例えばＡｕ）を用いても構わない。
【００１６】
本発明のように局在表面プラズモン効果を利用する場合、増強電磁場形成層を構成する多数の金属微粒子の近傍箇所にのみ、その光の増強効果が作用する。試験片は、増強電磁場形成層の上層に形成された保護層の上面に載置されるが、増強電磁場形成層の上層に形成された保護層を介してその表面まで強い増強効果が及ぶため、金属微粒子から遠く離れた保護層の上面に載置された試験片に対して光増強作用を及ぼすことができる。よって、試験片としての生体組織由来の強い発光を得ることができる。
【００１７】
これにより、ラマン散乱光を利用したスペクトル分析が行えるため、ラマンスペクトルから生体組織の診断が可能になる。つまり、本方法によれば、異常が存在している場合のスペクトルデータと異常が存在していない場合のスペクトルデータを予め準備しておき、測定されたスペクトルデータとこれらを比較することで、生体組織の診断ができるため、経験豊富で判定に習熟した病理医でなくても、組織診断が行える。
【００１８】
また、本発明の手法は、試験片からのラマン散乱光だけでなく、蛍光のスペクトル分析にも利用できる。
【００１９】
この場合、局在表面プラズモン効果を利用できるため、発光増強効果が極めて高い。この結果、従来、通常状態では光らず、蛍光物質とは認識されていなかった物質の蛍光増強効果が利用できるので、蛍光物質の導入を行うことなく生体組織の蛍光スペクトル分析が可能になる。
【００２０】
また、本発明の検査方法は、
前記工程（ｃ）が、所定方向に走査しながら前記励起光を前記光増強素子に対して照射する工程であり、
前記工程（ｄ）によって得られた発光スペクトルの強度分布を二次元マッピングする工程（ｅ）を有することを特徴とする。
【００２１】
この方法によれば、発光増強効果が極めて高いため、短時間で発光スペクトルの検出が可能である。この結果、生体切片試料の観察において、顕微ラマン計測装置を用いて広範囲の二次元マッピングを低倍率の対物レンズを用いて高速に行うことができる。また、従来よりも広いエリアのマッピングが可能になる。つまり、感度が高いため信号が強く、広い観測領域の画像を得るために必要十分な信号を得るには短い測定時間ですむからである。従って、限られた測定時間内に二次元画像を求める場合でも測定エリアを広くできる。
【００２２】
よって、異常が存在している場合のマッピング像と異常が存在していない場合のマッピング像を予め準備しておき、測定されたスペクトルデータに基づくマッピング像とこれらを比較することで、生体組織の診断ができるため、経験豊富で判定に習熟した病理医でなくても、組織診断が行える。
【００２３】
なお、前記保護層は、前記多数の金属微粒子に関連して配向性を有する無機物質、又は配向性を有する有機物の重合体で構成されているものとしても構わない。
【００２４】
この構成により、増強電磁場形成層における局在表面プラズモン効果に起因した増強電磁場を、高効率で保護層の表面に伝達させることが可能となり、保護層の表面に載置された試験片を高効率で発光させることができる。
【００２５】
また、前記保護層は、ハロゲン元素を含有するものとしても構わない。
【００２６】
この構成により、増強電磁場形成層における局在表面プラズモン効果に起因した増強電磁場を、更に高効率で保護層の表面に伝達させることが可能となる。なお、この構成は、保護層を有しない構成において露出した金属微粒子にハロゲン化物イオンを直接接触させる場合とは異なり、保護層としてハロゲン元素を含有した材料を用いるというものであるので、上記の構成と同様に、ハロゲン化物イオンによる金属微粒子へのダメージを防御する機能は担保される。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、簡易な装置によって、生体組織切片の検査が実現できる。特に、短時間で広範囲にわたるイメージングが可能になると共に、習熟した病理医でなくても生体組織切片の診断が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明のセンサの構造を模式的に示す図面である。
【図２】本発明の検査方法を説明するための概念図である。
【図３】本発明のセンサの性能を検証するための測定装置の概念図である。
【図４】センサに対してローダミン６Ｇ色素を担持させたときの、保護層の厚みと光増強度の関係をプロットした結果を示すグラフである。
【図５】センサに対してフクシン色素を担持させたときの、保護層の厚みと光増強度の関係をプロットした結果を示すグラフである。
【図６】実施例２と比較例１の受光部で受光された光のスペクトル分布を比較したグラフである。
【図７】実施例３と比較例２の各センサに励起光を照射した際に受光部で受光された光のスペクトル分布を比較したグラフである。
【図８】実施例４と比較例３の各センサに励起光を照射した際に受光部で受光された光のスペクトル分布を比較したグラフである。
【図９】実施例５と実施例１の各センサに励起光を照射した際に受光部で受光されたラマンスペクトルを示すグラフである。
【図１０】試験片としてのラット心臓組織切片の顕微鏡像である。
【図１１】実施例６及び比較例４において、受光部で受光されたラマンスペクトルを示すグラフである。
【図１２】実施例６において得られたラマンマッピング像である。
【図１３】試験片としての食道の迷走神経切片の顕微鏡像である。
【図１４】実施例７において得られた蛍光マッピング像である。
【図１５】実施例８と実施例９の各センサに励起光を照射した際に受光部で受光されたラマンスペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
［第１実施形態］
本発明の第１実施形態につき、図面を参照して説明する。なお、各図において図面の寸法比と実際の寸法比は必ずしも一致しない。
【００３０】
〈センサ構造〉
図１は、本発明の検査方法に利用されるセンサの構造を模式的に示す図面である。センサ１は、基板７、増強電磁場形成層９及び保護層１１を備えて光増強素子を構成している。そして、検査対象となる試験片５を保護層１１の上面に載置して、検査を行う。
【００３１】
基板７の材質は特に限定されるものではなく、例えば、ガラス、セラミックス、樹脂などを用いることができる。なお、後述するように、センサ１の作製工程において加熱処理（例えば１００℃以上の加熱）が行われる場合には、例えばガラス、ポリイミド樹脂などの耐熱性を有するものであることが好ましい。
【００３２】
増強電磁場形成層９は、基板７の表面上に互いに独立して多数の金属微粒子１０が分散配置されて構成されている。基板７の表面上における金属微粒子１０の配列方法については、二次元的にランダムに配列された構成であっても、規則的に配列された構成であっても構わない。
【００３３】
増強電磁場形成層９を構成する金属微粒子１０としては、例えばＡｇを好適に用いることができるが、励起光の照射により励起されて局在表面プラズモン効果を実現し得るものであれば、Ａｕ、Ａｌ、Ｃｕなどの他の材料を利用することもできる。また、この金属微粒子１０の形状としては、例えば扁平な半球形状、平板状の形状など、形状異方性を有するものを好適に用いることができる。なお、多数の金属微粒子１０は、いずれも均一の大きさ及び形状を備えていることが望ましいが、大きさや形状に多少のばらつきがあっても構わない。
【００３４】
また、金属微粒子１０の粒径としては、励起光の波長以下の大きさであることが好ましい。ここで、本明細書において「粒径」とは、顕微鏡法による投影面積円相当径をいう。具体的には、次のようにして求められる。センサ１の表面における任意に選ばれる領域について、長さ２μｍの線分が長さ６ｃｍに拡大（倍率３００００倍）されるよう観察される走査型電子顕微鏡の視野領域（例えば１．５μｍ×２μｍ）を撮像領域として、センサ１における当該領域の二次電子像を得る。このとき、明るさの指標（２５６段階）が１００程度以上の金属微粒子の各々について、金属微粒子１０の面積と同一面積の真円の直径が当該金属微粒子１０の粒径として得られる。
【００３５】
なお、金属微粒子１０の粒径は、例えば５〜３００ｎｍの範囲内であり、厚みは例えば５〜７０ｎｍの範囲内である。また、増強電磁場形成層９を構成する金属微粒子１０の密度は、例えば１０８〜１０１１個／ｃｍ２程度とすることができる。
【００３６】
このような増強電磁場形成層９の形成方法の一例としては、基板７の表面に金属微粒子１０の前駆体が適宜の溶媒に分散された分散液をスピンコート法により塗布して加熱する方法を用いることができる。また、別の方法としては、基板７の表面に金属微粒子１０の前駆体をディッピングして加熱する方法、基板７の表面に金属微粒子１０を真空蒸着する方法、基板７の表面に金属微粒子１０をスパッタ蒸着する方法などを用いることができる。
【００３７】
そして、センサ１において、隣接する金属微粒子１０間において露出される基板７の表面を含む増強電磁場形成層９の上層には保護層１１が形成されている。保護層１１を構成する材料としては、例えば酸化ケイ素、酸化チタン、酸化セリウム、酸化ボロン、酸化リン、酸化マグネシウム、酸化カルシウム、酸化アルミニウム、酸化ガリウム、酸化ゲルマニウム、酸化亜鉛などを用いることができる。
【００３８】
保護層１１の平均厚さは、例えば５０〜２５０ｎｍであることが好ましい。特に、保護層１１の厚さが８５ｎｍ以上であることにより、試験片５が生体物質のようなハロゲン化物イオン（例えばＣｌ−）を含有する場合であっても、金属微粒子１０に対する十分な耐性（保護機能）が得られる。
【００３９】
このようなセンサ１は、例えば以下の方法により作製される。まず、基板７の表面上に金属ナノ粒子膜を形成し、これを加熱処理することにより粒状性を変化させ、これにより、粒径が所定範囲内にある金属微粒子１０による増強電磁場形成層９を形成する。このとき、形成すべき金属微粒子１０の粒径は、加熱処理条件を適宜変更することにより調整できる。
【００４０】
次に、隣接する金属微粒子１０間において露出される基板７の表面部分を含む増強電磁場形成層９の表面上に、蒸着法により、金属微粒子１０を起点として保護層を厚さ方向に成長させることにより柱状組織構造を有する保護層１１を形成する。保護層１１の厚さは、成長条件、時間を適宜変更することにより調整できる。また、保護層１１の形成方法としては、高周波（ＲＦ）スパッタ蒸着法、電子線蒸着法、又は電子サイクロトロン共鳴（ＥＣＲ）スパッタ蒸着法などの方法を適宜選択して利用できる。
【００４１】
〈センサ１の使用方法〉
次に、本実施形態のセンサ１を用いて試験片５の検査を行う方法について説明する。図２は、検査方法を説明するための概念図である。なお、ここでは、試験片５が載置されたセンサ１に対して励起光を照射し、試験片５から放射されるラマン散乱光を受光してスペクトル分析を行う方法について説明する。
【００４２】
本実施形態では、検査に際し、センサ１の上方、すなわち試験片５が載置された側から励起光を照射するための光源部４１及び、試験片５からの発光を受光するための受光部４３を利用する。光源部４１は、励起光源５０、フィルタ５１、ミラー６１を備える。受光部４３は、フィルタ５３、分光器５５及び光検出器５６を備える。また、図２においては、光源部４１からの光を透過し、試験片５からの発光を反射するハーフミラー６２を備える構成としている。また、集光レンズ５２は、光源部４１からの励起光の集光や試験片５からの発光を集光する目的で設置されている。図２に示す装置構成は、あくまで一例であって、この構成に限定されるものではない。
【００４３】
試験片５を保護層１１上に載置した状態で、光源部４１から励起光をセンサ１に向けて入射させる。入射された光により、センサ１の増強電磁場形成層９において生成したプラズモン電場が、保護層１１の上面に載置された試験片５に伝搬する。これにより、試験片５に対して強い励起光が及ぼされ、試験片５から高い出力のラマン散乱光が放射される。このラマン散乱光は、ハーフミラー６２で反射されて受光部４３にて受光される。受光部４３の分光器５５によって波長分解されて、光検出器５６によって受光された光のスペクトル分布が得られる。
【００４４】
試験片５として生体組織切片を含む生体物質を想定する。増強電磁場形成層９によって形成された増強電磁場は、電磁場伝搬性を有する保護層１１を介して、試験片５、すなわち生体組織の分子種を選択的に励起し、これにより生体組織由来のラマン信号が選択的に得られる。このようにして生じる増強ラマン散乱光は増強電磁場形成層９と光学的に強く結合しているため、増強電磁場形成層９はこの散乱光を受光部４３に効率よく導き、もってこれらの相乗効果により強いラマン信号を与える。
【００４５】
〈センサ１の性能についての説明〉
以下、センサ１が備える増強電磁場形成層９によって、光増強効果が実現できる点につき、実施例を参照しながら説明する。
【００４６】
（実施例１）
まず、実施例１のセンサ１の作製方法につき説明する。基板７として数ｃｍ角の大きさのスライドガラスを用い、このスライドガラスの表面上に、Ａｇを１０ｎｍ程度の厚みで蒸着させて金属微粒子１０を形成するためのＡｇ膜を形成した。その後、約１００℃のホットプレート上で、Ａｇ膜が形成された基板７を数分間加熱処理することにより、Ａｇ膜の粒状性を変化させて増強電磁場形成層９としての多数の金属（Ａｇ）微粒子１０によるＡｇ微粒子単層膜を形成した。得られたＡｇ微粒子単層膜における金属微粒子１０の粒径は、５０〜１５０ｎｍの範囲内にあり、厚さは平均で約２０ｎｍであり、金属微粒子１０の密度はおおよそ５×１０９個／ｃｍ２であった。
【００４７】
その後、ＲＦスパッタ装置「ＲＦＳ−２００型」（Ｕｌｖａｃ社製）を用いて、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）をターゲットとして下記条件でスパッタを行うことにより、隣接する金属微粒子１０間において露出される基板７の表面部分を含む増強電磁場形成層９の表面上に保護層１１を形成することでセンサ１を作製した。なお、保護層１１の厚さは、スパッタ時間を適宜に変更することにより調整した。
【００４８】
スパッタ条件は以下のとおりである。
・ターゲットから増強電磁場形成層９の表面までの離間距離：４５ｍｍ
・雰囲気：Ａｒ  ３．０Ｐａ（放電時）
・放電出力：１００Ｗ
・ＲＦ周波数：１３．６ＭＨｚ
・保護層１１の成長速度：８．５ｎｍ／分
【００４９】
次に、実施例１として作製されたセンサ１に対する性能検証方法について説明する。ここでは、センサ１が光増強効果を有することを示す目的で、蛍光の増強効果の検証を行う。すなわち、センサ１に対し、保護層１１の表面上にローダミン６Ｇ色素（Ｒｈ６Ｇ：発光量子収率およそ１）の希薄エタノール溶液を３０００回転でスピンコートすることにより、色素分子を保護層１１の表面上に担持させた。センサ１の表面に担持される色素分子の密度とスピンコートに用いた溶液の色素濃度との関係は、ローダミン６Ｇ色素の濃度が１μＭである場合に、色素分子の担持量が３×１０１１個／ｃｍ２である。
【００５０】
なお、発光量子収率Φとは、分子に吸収された光子数と蛍光により放出された光子数の比で定義される（数１参照）。ここでｋｆが電子励起状態にある分子の蛍光遷移速度定数であり、ｋｎｒが無輻射遷移速度定数（単位時間当たりに消光を起こす速さ）である。
（数１）
Φ＝ｋｆ／（ｋｆ＋ｋｎｒ）
【００５１】
励起された分子のすべてが蛍光によって基底状態に戻れば、発光量子収率は１となり、この値に近い発光量子収率を持つ物質を「発光量子収率の高い物質」と呼ぶ。しかし、実際には、無輻射遷移によって１とはならない。無輻射遷移とは、蛍光を発しないで基底状態に戻る遷移である。発光量子収率が低い色素とはｋｆ＜ｋｎｒである色素のことである。なお、ｋｆ＜＜ｋｎｒの条件ではほとんど発光せず、このような条件を満たす色素を非発光性色素と呼ぶ。
【００５２】
センサ１に対して励起光を照射して試料（色素分子）から発せられる光の強度を図３に示す測定装置により測定した。図３は、センサ１の性能を検証するための測定装置の概念図である。励起光源５０としてのダイオードレーザ及びフィルタ５１によって光源部４１を構成し、光源部４１からセンサ１に対して光を入射させ、保護層１１の表面上に担持させた色素分子からの光を受光部４３によって受光する。受光部４３は、集光レンズ５２、フィルタ５３、受光ヘッド５４及び光検出器５５（電子冷却型ダイオードアレイ検出器）によって構成した。
【００５３】
より詳細には、励起光源５０としては、出力１ｍＷ未満の緑色ダイオードレーザ（波長５３２ｎｍ）を用い、この励起光源５０からの射出光を、フィルタ５１を介して非集光（エネルギー密度約３０ｍＷ／ｃｍ２）又は反集光（エネルギー密度約１０ｍＷ／ｃｍ２以下）励起光としてセンサ１に対して、約４５°の角度で入射させる。そして、センサ１に担持された色素分子による９０°の角度方向に散乱される光を、集光レンズ５２によって、光検出器５５の受光ヘッド５４にフィルタ５３を介して集光した。
【００５４】
図３に示す測定装置による測定結果を図４に示す。図４において、縦軸は発光の増強度（単位：倍）を示しており、増強効果がないガラス基板上に担持された同じ量の色素について同じ方法で測定された発光強度に対する相対比率に対応する。
【００５５】
また、試料としてローダミン６Ｇ色素に代えて非発光性のフクシン色素（発光量子収率＜＜０．０１）を用い、保護層１１の表面上に３×１０１２個／ｃｍ２の密度で担持させ、上記と同様の方法により発光強度を測定した。この測定結果を図５に示す。
【００５６】
図４及び図５によれば、色素自体の発光量子収率とは関係なく、保護層１１の膜厚を２００ｎｍ以上としても高い発光増強率が維持されていることが分かる。特に、発光量子収率が０．０１未満、すなわち非発光性の色素に対しては、数千倍以上の光増強率が確保されていることが分かる。これにより、金属微粒子１０の上層に、所定の膜厚の保護層１１を形成しても、その上面にまで発光増強効果を伝搬できることが分かる。
【００５７】
すなわち、本発明のセンサ１によれば、分子発光双極子と双極子型表面プラズモン（局在表面プラズモン）の相互作用により、結果的に色素の輻射遷移速度ｋｆ（上記数１参照）が大きくなる。これにより、ｋｆ＞＞ｋｎｒとなるため、上式の発光量子収率が大きくなり、もともとは発光量子収率が０．０１以下の非発光性物質（ｋｆ＜＜ｋｎｒ）である色素でも光を強く発するようになることが分かる。
【００５８】
なお、別の検証として、励起光源５０として、ダイオードレーザに代えて出力１ｍＷ未満のＨｅ−Ｎｅレーザ（波長６３２．８ｎｍ）を用いた他は、図３と同じ配置でローダミン６Ｇ色素のラマン散乱強度を保護層１１の厚さの関数として測定した。この結果、保護層１１の膜厚が２００ｎｍを超えても、色素分子が直接に金属微粒子１０に表面に吸着した場合に得られた信号と変わらない大きさの増強ラマン信号（増強度は約１０５倍）が得られた。
【００５９】
このように増強効果が保護層１１の膜厚程度分を伝搬する理由の一つとしては、以下の点が考えられる。蒸着により配向性を持った誘電体で形成された柱状の保護層１１中では、プラズモン電場が乱されず、損失を受けずに保護層１１の表面にまで達する。従って、保護層１１の厚さをある程度大きくした場合であっても、金属微粒子１０に生ずる電磁場（局在表面プラズモン）が保護層１１の表面に伝達される。
【００６０】
つまり、図２に示すように、保護層１１の表面に生体物質からなる試験片５を載置して励起光を照射することで、試験片５に対して増強電磁場の影響が及び、これにより、試験片５を構成する物質、すなわち生体組織由来のスペクトルを強く含む光が放射される。受光部４３でこの発光を受光してスペクトル分布を得ることで、生体組織の分析が行える。
【００６１】
（実施例２）
実施例１と同様の方法により作製されたセンサ１に対し、フクシン色素で標識した抗体ＩｇＧの水溶液を滴下した。より詳細には、保護層１１の上面にフクシン色素で標識した抗体ＩｇＧの水溶液を滴下した。
【００６２】
（比較例１）
基板７に対し、実施例２と同様にフクシン色素で標識した抗体ＩｇＧの水溶液を滴下した。
【００６３】
そして、実施例２及び比較例１のそれぞれの素子に対し、図３に示す測定装置によって励起光を入射させて、受光部４３で得られた光のスペクトル分布を調べた結果を図６に示す。なお、図６において、横軸は光の波長、縦軸は発光強度を表している。
【００６４】
図６を参照すると、実施例２の構成によれば、非発光性の標識物質であるフクシン色素は、増強電磁場形成層９によって生じる局在プラズモンとの保護層１１を介した相互作用で発光量子収率が向上し、それに伴ってフクシン色素が発する光の光量が著しく増加していることが分かる。これに対し、比較例１の構成によれば、発光の増強効果はない。これにより、本発明のセンサ１が極めて高い発光増強効果を有していることが分かる。
【００６５】
（実施例３）
実施例１と同様の方法により作製されたセンサ１の保護層１１の上面に、低発光量子収率を有する自家発光性の生体高分子コラーゲンの水溶液をスピンコートした。
【００６６】
（比較例２）
基板７に対し、実施例３と同様に、低発光量子収率を有する自家発光性の生体高分子コラーゲンの水溶液をスピンコートした。
【００６７】
（実施例４）
実施例１と同様の方法により作製されたセンサ１の保護層１１の上面に、低発光量子収率を有する自家発光性のリボフラビンの水溶液をスピンコートした。
【００６８】
（比較例３）
基板７に対し、実施例４と同様に、低発光量子収率を有する自家発光性のリボフラビンの水溶液をスピンコートした。
【００６９】
実施例３及び比較例２のそれぞれの素子に対し、図３に示す測定装置によって励起光を入射させて、受光部４３で得られた光のスペクトル分布を調べた結果を図７に示す。同様に、実施例４及び比較例３のそれぞれの素子に対し、図３に示す測定装置によって励起光を入射させて、受光部４３で得られた光のスペクトル分布を調べた結果を図８に示す。なお、図７及び図８において、横軸は光の波長、縦軸は発光強度を表している。
【００７０】
図７を参照すると、実施例３の構成によれば、低発光量子収率を有する自家発光性の生体高分子コラーゲンは、増強電磁場形成層９によって生じる局在プラズモンとの保護層１１を介した相互作用で発光量子収率が向上し、それに伴って生体高分子コラーゲンが発する光の光量が著しく増加していることが分かる。これに対し、比較例２の構成によれば、発光の増強効果はなく、自家発光性の生体高分子コラーゲンからの発光を受光することによる分析が困難であることが示唆される。
【００７１】
同様に、図８を参照すると、実施例４の構成によれば、低発光量子収率を有する自家発光性のリボフラビンは、増強電磁場形成層９によって生じる局在プラズモンとの保護層１１を介した相互作用で発光量子収率が向上し、それに伴ってリボフラビンが発する光の光量が著しく増加していることが分かる。これに対し、比較例３の構成によれば、発光の増強効果はなく、自家発光性のリボフラビンからの発光を受光することによる分析が困難であることが示唆される。
【００７２】
〈別構成のセンサ１の性能についての説明〉
センサ１が有する保護層１１に予めハロゲン元素を含有させても構わない。保護層１１に対してハロゲン元素を含有させる方法としては、保護層１１が形成されたセンサ１に対してハロゲン化物塩の水溶液に浸漬する方法を用いることができる。例えば、ハロゲン化物塩水溶液の濃度が０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌの場合には、５〜３０分間程度の室温浸漬により最大の効果を得ることができるが、水溶液の濃度がそれより高い場合、あるいは逆に低い場合には、その濃度に応じて浸漬時間を調整することにより同等の効果を得ることができる。なお、保護層１１におけるハロゲン元素の含有割合は、０．００２質量％〜０．０５質量％であることが好ましい。
【００７３】
なお、上記ハロゲン化物塩の具体例としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）などのアルカリ金属塩や、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
【００７４】
このように予めハロゲン化物塩水溶液にセンサ１を浸漬させた場合においても、多数の金属微粒子１０はその周囲及び上方を保護層１１で覆われているため、ハロゲン化物イオンが直接金属微粒子１０に接触して、金属微粒子１０がハロゲン化物イオンと反応して基板７から離脱してしまうということがない。そして、このように保護層１１に予めハロゲン元素を含有させることで、後述の実施例に示すように、光増強効果を更に高めることができる。
【００７５】
（実施例５）
実施例１と同様の方法を用い、ＲＦスパッタ装置による処理時間を調整して、厚さが１００ｎｍの保護層１１を有するセンサ１を作製した。その後、塩化物イオンの濃度が０．２〜０．３ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウム水溶液中に、増強電磁場形成層９及び保護層１１が形成された基板７を約３０分間浸漬させ、その後、純水で洗浄して乾燥することにより、保護層１１中にハロゲン化物イオンを含有させて、本実施例のセンサ１とした。この方法で得られた光増強素子における保護層に含有されたハロゲン元素の含有割合は正確には決定することが難しいが、およそ０．０１質量％のオーダーと推定される。そして、このセンサ１の保護層１１の上面に、ローダミン６Ｇ色素の希薄エタノール溶液を３０００回転でスピンコートすることにより、色素分子を保護層１１の表面上に３×１０１１個／ｃｍ２の密度で担持させた。
【００７６】
なお、比較のために、塩化ナトリウム水溶液に浸漬させなかった以外は同様の方法でセンサ１についても作製した。なお、このセンサ１は実施例１の素子に対応する。
【００７７】
そして、実施例５及び実施例１のセンサ１に対し、励起光を照射して試料（色素分子）から発せられるラマン散乱光の強度を、ダイオードレーザ５０に代えて出力１ｍＷ未満のＨｅ−Ｎｅレーザ（波長６３２．８ｎｍ）を励起光源として用いた他は、図３と同じ測定装置により測定した。この結果を図９に示す。なお、図９のグラフでは、縦軸はラマン散乱強度（ｃｐｓ）を示し、横軸はラマンシフト（ｃｍ−１）を示す。
【００７８】
図９では、実施例５と実施例１のそれぞれのセンサ１に対して、ラマン散乱光の強度を比較した。これは、ラマン散乱光自体の強度が蛍光の強度よりも小さいため、両者の光増強効果を比較する上での比較のしやすさを考慮して行われたものである。ハロゲン化物イオンを浸漬した実施例５の方が、ハロゲン化物イオンを浸漬しなかった実施例１よりも顕著なラマン信号が観測されており、光の増強効果が更に高いことが示唆される。
【００７９】
図９における、ハロゲン化物イオンを浸漬しなかった実施例１のセンサ１においても、図４及び図５を参照して上述したように、発光強度を極めて高くする効果は得られている。またハロゲン化物イオンを浸漬した実施例５では、実施例１よりも更に発光増強効果が高くなっていることが示唆される。
【００８０】
なお、実施例５では、塩化物イオンの濃度が０．２〜０．３ｍｏｌ／Ｌである塩化ナトリウム水溶液を浸漬させたが、これに代えて、塩化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである塩化カリウム水溶液を浸漬させて形成した素子、臭化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである臭化ナトリウム水溶液を浸漬させて形成した素子、ヨウ化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌであるヨウ化カリウム水溶液を浸漬させて形成した素子、塩化物イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである塩化カルシウム水溶液を浸漬させて形成した素子についても、同様の測定を行った結果、実施例５と同様に高いラマン散乱光を受光できた。一方、塩化ナトリウム水溶液の代わりに硫酸イオンの濃度が０．２ｍｏｌ／Ｌである硫酸ナトリウム水溶液を浸漬させて形成した素子について同様の測定を行ったところ、受光したラマン散乱光の強度は低いものであった。このことから、保護層１１にハロゲン元素を添加した場合に、光増強効果を更に高められることが分かる。
【００８１】
〈センサ１を用いた検査例〉
以下、上述したセンサ１の使用方法に基づいて行った試験片５の検査結果について説明する。
【００８２】
（実施例６）
本発明のセンサ１を用い、この保護層１１の上面に試験片５としてのラット心臓組織（８週齢、雌、組織切片厚５μｍ）を載置し、図２と同様の方法によって、光源部４１より励起光を照射して試験片５からのラマンスペクトルを測定した。より詳細には、ラット心臓組織をＯＣＴ−ｃｏｍｐｏｕｎｄにより凍結固定した組織切片を試験片５とし、センサ１の保護層１１の上面に載置した。なお、図１０は、試験片５としてのラット心臓組織切片の顕微鏡像である。
【００８３】
計測条件は以下のとおりである．
・計測装置：Ｒａｍａｎ−１１（ナノフォトン社製）
・励起光：波長５３２ｎｍ、出力９１．１ｍＷ／ｍｍ２（７３ｍＷ／Ｌｉｎｅ）
・励起光照射領域：  図１０内の測定領域３０（走査範囲は約７４０μｍ×３７０μｍ）
・対物レンズ：Ｘ１０、ＮＡ０．３（オリンパス社製）
【００８４】
なお、光源部４１から照射される励起光は、シリンドリカルレンズと対物レンズによってライン状とし、試験片５の面上に焦点を合わせて照射した。直線形状に照射された試験片５からのラマン散乱光は、同じ対物レンズを介して集光され、一次元のラマン像を二次元のＣＣＤイメージセンサ（Ｐｉｘｉｓ  ４００ＢＲ、電子冷却−７０℃、１３４０×４００ピクセル；Princeton Instruments社, Trenton, NJ, US）により取得した。二次元のラマン散乱像は、直線形状にした励起光を走査することにより取得した。一つの一次元像は、幅約７４０μｍ、スリット幅は７０μｍであり、１秒の計測時間を要し、２００本走査することにより約７４０μｍｘ３７０μｍの範囲におけるラマンスペクトル像（二次元マッピング像）を得た。
【００８５】
なお、ライン照射型ラマン散乱分光顕微鏡の構造は、例えばHarada. Y. et al., 2008, Proc. SPIE, vol. 6853, 685308に記載がある．
【００８６】
（比較例４）
基板７の上面に試験片５としてのラット心臓組織（８週齢、雌、組織切片厚５μｍ）を載置し、実施例６と同様に、光源部４１より励起光を照射してラマンスペクトルを得た。
【００８７】
実施例６及び比較例４におけるスペクトル結果を、図１１に示す。図１１によれば、基板７の上面に直接試験片５を載置した比較例４に比べて、光増強素子を含むセンサ１の上面に試験片５を載置した実施例６の方が、明瞭なラマンスペクトルが計測できていることが分かる。このように、センサ１を用いることで、通常のラマン分光スペクトルよりも明瞭なスペクトルが得られるため、短時間の測定が可能になる。
【００８８】
なお、図１１中に矢印３１で示したピークは、心筋細胞のミトコンドリアに含まれるチトクロームＣに帰属されるピークである。７５４ｃｍ−１のピーク強度によってコントラスト差をつけ、センサ１上の心筋細胞のラマンマッピングを行った結果を図１２に示す。図１０の光学顕微鏡像との比較から、図１２のラマンマッピング像が組織の形を反映していることが分かる。
【００８９】
すなわち、本方法によれば、明瞭なラマンスペクトルが計測されることから、励起光を走査して得られたラマンマッピング像にも、明瞭なコントラストが得られるので、このラマンマッピング像に基づいて、試験片５としての生体組織の診断が可能になる。また、上述したような極めて短時間での励起光照射によってラマンスペクトルの検出が可能となるため、短時間で広範囲のラマンマッピング像が得られる。これにより、限られた測定時間内に二次元画像を求める場合でも測定対象領域を広くできる。
【００９０】
（実施例７）
本発明のセンサ１を用い、この保護層１１の上面に試験片５としての食道の迷走神経（有髄線維：組織切片厚５μｍ）を載置し、実施例４と同様の方法及び装置によって、光源部４１より励起光を照射して、試験片５からの蛍光スペクトル及び二次元の蛍光マッピング像を測定した。なお、図１３は、試験片５としての食道の迷走神経切片の顕微鏡像である。
【００９１】
計測条件は以下のとおりである．
・計測装置：Ｒａｍａｎ−１１（ナノフォトン社製）
・励起光：波長５３２ｎｍ、出力３００ｍＷ／ｍｍ２（５０ｍＷ／Ｌｉｎｅ）
・励起光照射領域：  図１３内の測定領域３２（走査範囲は約１０００μｍ×５００μｍ）
・対物レンズ：Ｘ１０、ＮＡ０．３（オリンパス社製）
【００９２】
二次元の蛍光像はライン状にした励起光を走査することにより取得した。一つの一次元像は、幅約７４０μｍ、スリット幅は約７０μｍであり、１０秒の計測時間を要し、１００本走査することにより約７４０μｍ×４６０μｍの範囲における蛍光スペクトル像（二次元マッピング像）を得た。より詳細には、図１３内の測定領域３２内において、励起光を走査し、波長が５６０〜６３０ｎｍの蛍光スペクトルを積分し、強度によりコントラスト差をつけて二次元マッピングを行った。この結果得られた蛍光マッピング像を図１４に示す。図１３の光学顕微鏡像との比較から、図１４の蛍光マッピング像が組織の形を反映していることが分かる。
【００９３】
実施例７によれば、ラマン散乱光のみならず、蛍光によるスペクトル分析によっても、短時間で広範囲の二次元マッピング像を得られることが分かる。特に、センサ１が有する高い発光増強効果によって、従来蛍光物質と認識されていなかった物質についても、励起光の照射による蛍光を得ることができるため、標識を行うことなく検査が可能な生体組織の部位が格段に拡がる。
【００９４】
ただし、本発明の方法は、試験片５に色素を標識して励起光を照射して蛍光スペクトルを測定する方法に用いることを排除するものではない。この場合においても、発光増強効果が高いため、図４及び図５を参照して上述したように、非発光性の色素を標識色素として用いることができる。
【００９５】
［第２実施形態］
本発明の第２実施形態について図面を参照して説明する。
【００９６】
本実施形態は、第１実施形態で説明したセンサ１が備える保護層１１を、結晶性（配向性）を有する有機物の重合体で構成した点のみが異なり、他は共通である。
【００９７】
なお、この有機物の重合体としては、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル系重合体、ポリビニルアルコールなどを利用することができる。この場合、保護層１１の形成方法としては、保護層形成液をスピンコート法、デイップコート法、スプレーコート法、スリットコート法、バーコート法などを用いて基板７に滴下又は塗布することで実現できるが、スピンコート法は厚さが最も均一な保護層１１を形成する方法として好適に用いることができる。
【００９８】
なお、この保護層１１にハロゲン元素を含有させる場合、保護層形成液としては、溶媒中に所定の重合体およびハロゲンの金属塩を溶解させることにより、或いは溶媒中に所定の重合体が溶解されてなる重合体溶液と、溶媒中にハロゲンの金属塩が溶解されてなる金属塩溶液とを混合することにより、調製することができる。
【００９９】
保護層形成液を調製するための溶媒としては、用いられる重合体および金属塩に応じて適宜選択される。具体的には、用いられる重合体および金属塩を溶解し得るものであればよい。例えば、重合体としてポリビニルアルコール等の水溶性のものを用いる場合には、溶媒として水を用いることができる。また、重合体として水に不溶な重合体例えばポリメチルメタクリレートを用いる場合には、重合体溶液を調製するための溶媒として例えばシクロヘキサノンを用いると共に、金属塩溶液を調製するための溶媒として水とアセトンとの混合溶媒を用い、重合体溶液と金属塩溶液とを混合することによって、保護層形成液を調製することができる。
【０１００】
保護層形成液中における重合体の含有割合は、上記塗布方法と目的とする保護膜の厚さとの組合せによって決定される。例えばスピンコート法（３０００ｒｐｍ）を用いてポリビニルアルコール膜をその水溶液から形成する場合において、膜厚を１００ｎｍに調整するために必要な重合体の含有割合は約４．５質量％である。保護層形成液中における金属塩の割合は、目的とする保護層１１中のハロゲン元素の含有割合や、保護層形成液中の重合体の含有割合に応じて設定される。
【０１０１】
（実施例８）
実施例１と同様の方法で、基板７上に増強電磁場形成層９としての多数の金属（Ａｇ）微粒子１０によるＡｇ微粒子単層膜を形成した。
【０１０２】
また、純水中に、５質量％のポリビニルアルコール（和光純薬工業（株）製、重合度約５００）、及び０．２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムが溶解されてなる保護層形成液を調製した。その後、スピンコート法によって、基板７の表面に、調製した保護層形成液を塗布して約６０℃で乾燥すると共に結晶化を促すことにより、基板７の表面部分を含む増強電磁場形成層９の表面上に保護層１１を形成することでセンサ１を作製した。なお、保護層１１は、結晶度が５０％以上で厚さが１１０ｎｍであった。
【０１０３】
そして、この保護層１１の上面に、ローダミン６Ｇ色素の希薄エタノール溶液を３０００回転でスピンコートすることにより、色素分子を保護層１１の表面上に３×１０１１個／ｃｍ２の密度で担持させた。
【０１０４】
（実施例９）
保護層形成液を、以下のようにして調製されたものに変更したこと以外は、実施例８と同様にして光増強素子を製造した。すなわち、シクロヘキサノン（和光純薬工業（株）製）中に３質量％のポリメチルメタクリレート（和光純薬工業（株）製）が溶解されてなる重合体溶液を調製した。一方、純水とアセトンとが質量比で１：１の割合で混合されてなる混合溶媒中に、２０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムが溶解されてなる金属塩溶液を調製した。そして、重合体溶液と金属塩溶液とを容量比９：１で混合することにより、保護層形成液を調製した。
【０１０５】
そして、図７と同様の方法により、実施例８及び実施例９のセンサ１に対し、励起光を照射して試料（色素分子）から発せられるラマン散乱光の強度を測定した。この結果を図１５に示す。図７と同様に、図１５のグラフにおいても、縦軸はラマン散乱強度（ｃｐｓ）を示し、横軸はラマンシフト（ｃｍ−１）を示す。図１５のグラフより、保護層１１を有機物の重合体で構成した場合であっても、強いラマン散乱信号が確認できており、保護層１１の上面に光増強効果が伝搬できていることが分かる。
【０１０６】
つまり、本実施形態のように、センサ１を有機物の重合体で構成した保護層１１を有する構成とし、この保護層１１の上面に、試験片５としての生体組織を載置して光源部４１から励起光を照射して、試験片５からのラマン散乱光又は蛍光のスペクトルを分析することで、第１実施形態と同様に試験片５の診断を行うことが可能である。
【０１０７】
なお、実施例８及び実施例９では、いずれも保護層１１にハロゲン元素を含有した構成としたが、保護層１１として、ハロゲン元素を含有せずに有機物の重合体で構成しても構わない。
【０１０８】
［別実施形態］
上記の各実施形態において、センサ１を、高反射層および誘電体層を更に具えた多層構造を有する構成としてもよい。このような構造のものにおいては、基板７の表面上に高反射層および誘電体層がこの順で形成され、誘電体層の表面上に増強電磁場形成層９が形成される。
【０１０９】
また、図２を参照して説明したように、上記実施形態では、センサ１の保護層１１の上面に試験片５を載置して、この試験片５側から励起光を照射したが、センサ１の裏面側（基板７側）から励起光を照射して、試験片５からのラマン散乱光又は蛍光のスペクトルを得るものとしても構わない。
【符号の説明】
【０１１０】
１      ：    センサ
５      ：    試験片
７      ：    基板
９      ：    増強電磁場形成層
１０      ：    金属微粒子
１１      ：    保護層
３０      ：    励起光照射領域
３１      ：    チトクロームＣに帰属されるスペクトルピーク
３２      ：    励起光照射領域
４１      ：    光源部
４３      ：    受光部
５０      ：    励起光源
５１      ：    フィルタ
５２      ：    集光レンズ
５３      ：    フィルタ
５４      ：    受光ヘッド
５５      ：    分光器
５６      ：    光検出器
６１      ：    ミラー
６２      ：    ハーフミラー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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