【手続補正書】
【提出日】令和3年8月23日(2021.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と他の薬剤とが結合した、抗体―薬剤イムノコンジュゲートであって、
抗体が、以下の特性を有することを特徴とする抗体である、
イムノコンジュゲート；
（１）Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP)に特異的に結合する
（２）制御性Ｔ細胞の免疫抑制機能に対する阻害活性を有する、
（３）抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を有する、及び
（４）in vivoで抗腫瘍活性を有する。
【請求項２】
GARPが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる分子である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
前記抗体が、
（１）配列番号１においてアミノ酸番号366乃至377、407乃至445及び456乃至470に記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号１においてアミノ酸番号54乃至112及び366乃至392に記載のアミノ酸配列
、
（３）配列番号１においてアミノ酸番号352乃至392に記載のアミノ酸配列、又は
（４）配列番号１においてアミノ酸番号18乃至112に記載のアミノ酸配列、
に結合する、請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
前記抗体が、GARPへの結合に対して、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（３）配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（４）配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号31に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する抗体と競合阻害活性を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
腫瘍が癌である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である、請求項５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
前記抗体が、
（１）配列番号２においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号２においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号２においてアミノ酸番号99乃至107に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号３においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号３
においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号３にお
いてアミノ酸番号91乃至101に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（２）配列番号４においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号４においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号４においてアミノ酸番号99乃至112に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号５においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号５
においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号５にお
いてアミノ酸番号91乃至100に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（３）配列番号25においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号25においてアミノ酸番号69乃至78に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号25においてアミノ酸番号118乃至125に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配
列番号27においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号27においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号27においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（４）配列番号29においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号29においてアミノ酸番号69乃至77に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号29においてアミノ酸番号117乃至128に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配
列番号31においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号31においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号31においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
を有する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８】
前記抗体が、
（１）配列番号２においてアミノ酸番号１乃至118に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号３においてアミノ酸番号１乃至112に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
（２）配列番号４においてアミノ酸番号１乃至123に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号５においてアミノ酸番号１乃至111に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
（３）配列番号25においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、又は
（４）配列番号29においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
を有する、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
前記抗体の定常領域がヒト由来定常領域である、請求項１乃至８のいずれか１項に記載
のイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記抗体が、
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（３）配列番号25においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（４）配列番号29においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化されている、請求項１乃至10のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
前記抗体が、
（ａ）配列番号33においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号35においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号41においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列、
（ｄ）（ａ）乃至（ｃ）の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｅ）（ａ）乃至（ｃ）の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに
（ｆ）配列番号37においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号39においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号43においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
（ｉ）（ｆ）乃至（ｈ）の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び
（ｊ)（ｆ）乃至（ｈ）の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列にお
いて１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する、請求項11に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗体が、
（１）配列番号33においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号37においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
（２）配列番号35においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号39においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、又は
（３）配列番号41においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
を有する、請求項11又は12に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記抗体が、
（１）配列番号33においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、
配列番号35においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配
列番号41においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、からなる
群から選択される重鎖、並びに
（２）配列番号37においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
配列番号39においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配
列番号43においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、からなる
群から選択される軽鎖、
を有する、請求項11乃至13のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
前記抗体が、
（１）配列番号33においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及
び配列番号37においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
（２）配列番号35においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及
び配列番号39においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
（３）配列番号41においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及
び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
を有する、請求項11乃至14のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１６】
前記抗体が、Ｎ−結合への糖鎖付加、Ｏ−結合への糖鎖付加、Ｎ末のプロセッシング、Ｃ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、Ｎ末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される１又は２以上の修飾を含む、請求項１乃至15のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
重鎖のカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失している、請求項16に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
２本の重鎖の双方でカルボキシル末端において１つのアミノ酸が欠失している、請求項17に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている、請求項16乃至18のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている、請求項１乃至19のいずれか１項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
薬剤が、放射性物質又は薬理作用を有する化合物である、請求項１乃至20のいずれか１
項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
放射性物質が、インジウム（１１１In）、テクネチウム（９９ｍTc）、イットリウム（９０Y）、又はヨード（１３１I）である、請求項21に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２３】
請求項１乃至22に記載のイムノコンジュゲートの少なくとも一つを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍治療用である請求項23に記載の医薬組成物。 
【請求項２５】
腫瘍が癌である請求項24に記載の医薬組成物。 
【請求項２６】
癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である請求項25に記載の医薬
組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、GARPに特異的に結合し、抗体依存性細胞傷害活性を介してTregの機能を阻害する活性を示す抗体を見出して本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗体；
（ａ）Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP)に特異的に結合する
（ｂ）制御性Ｔ細胞の免疫抑制機能に対する阻害活性を有する、
（ｃ）抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を有する、及び
（ｄ）in vivoで抗腫瘍活性を有する。
（２）GARPが配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる分子である上記（１）に記載の抗体。
（３）（ａ）配列番号１においてアミノ酸番号366乃至377、407乃至445及び456乃至470のアミノ酸配列部分
（ｂ）配列番号１においてアミノ酸番号54乃至112及び366乃至392のアミノ酸配列部分
（ｃ）配列番号１においてアミノ酸番号352乃至392のアミノ酸配列部分、又は
（ｄ）配列番号１においてアミノ酸番号18乃至112のアミノ酸配列部分
に結合する上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）GARPへの結合に対して、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（ｄ）配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号31に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する抗体と競合阻害活性を有する上記（１）乃至（３）のいずれか一項に記載の抗体。
（５）腫瘍が癌である上記（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の抗体。
（６）癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である上記（５）に記載の抗体。
（７）（ａ）配列番号２においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号２においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号２においてアミノ酸番号99乃至107に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号３においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号３においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号３においてアミノ酸番号91乃至101に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（ｂ）配列番号４においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号４においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号４においてアミノ酸番号99乃至112に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号５においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号５
においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号５にお
いてアミノ酸番号91乃至100に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
（ｃ）配列番号25においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号25においてアミノ酸番号69乃至78に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号25においてアミノ酸番号118乃至125に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配
列番号27においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号27においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号27においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
（ｄ）配列番号29においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、
配列番号29においてアミノ酸番号69乃至77に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列
番号29においてアミノ酸番号117乃至128に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配
列番号31においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号31においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号31においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
を有する上記（１）乃至（６）のいずれか１項に記載の抗体。
（８）（ａ）配列番号２においてアミノ酸番号１乃至118に記載のアミノ酸配列からなる
重鎖可変領域及び配列番号３においてアミノ酸番号１乃至112に記載のアミノ酸配列から
なる軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号４においてアミノ酸番号１乃至123に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号５においてアミノ酸番号１乃至111に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
（ｃ）配列番号25においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、又は
（ｄ）配列番号29においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可
変領域及び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽
鎖可変領域、
を有する上記（１）乃至（７）のいずれか１項に記載の抗体。
（９）定常領域がヒト由来定常領域である上記（１）乃至（８）のいずれか１項に記載の抗体。
（10）（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
（ｃ）配列番号25においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
（ｄ）配列番号29においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及
び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、を有
する上記（１）乃至（９）のいずれか１項に記載の抗体。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
６)−５  ヒトキメラ抗体のヒトGARPに対する結合性評価
実施例６)−４で作製したc151D及びc198DとヒトGARPとの解離定数測定は、Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience社製) を使用し、固定化したProtein Aに抗体をリガンドとして捕捉 (キャプチャー) し、抗原（リコンビナントヒトGARP：R＆D Systems社）をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてHBS-EP+ (GE Healthcare Bioscience社製)、センサーチップとしてProtein Aセンサーチップ(GEヘルスケアバイオサイエンス (株) ) を用いた。
チップ上に1μg/mLのヒトキメラ化抗体を10μL/minで20秒間添加した後、抗原の希釈系列溶液 (8〜128nM) を流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き480秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、Glycine 1.5 (GE Healthcare Bioscience社製) を流速20μl/分で30秒間添加した。
データの解析には1：1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数(KD；KD＝kd/ka) を算出した。
結果を表１に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
h198D-L4タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列（配列番号42）において、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702からなるヌクレ
オチド配列であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至387からなるヌク
レオチド配列であり、定常領域をコードするのはヌクレオチド番号388乃至702からなるヌクレオチド配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号42において、CDRL1をコード
するヌクレオチド番号130乃至162からなるヌクレオチド配列、CDRL2をコードするヌクレ
オチド番号208乃至228からなるヌクレオチド配列及びCDRL3をコードするヌクレオチド番
号325乃至351からなるヌクレオチド配列を有する。
また、h198D_L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号43]において、シグナル配列が切
除された成熟軽鎖はアミノ酸番号21乃至234からなるアミノ酸配列であり、可変領域はア
ミノ酸番号21乃至129からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号130乃至234
からなるアミノ酸配列である。
更に、配列番号42及び43の配列は、それぞれ図36及び26にも記載されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
７)−９−３  ヒト化抗ヒトGARP抗体h198D_H3L4発現ベクターの構築
実施例７)−９−１と同様に、配列表の配列番号40に示されるh198D-_H3タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号58乃至1407に示されるh198D-H3タイプ重鎖をコードする配列を含むDNA断片と配列表の配列番号42に示されるh198D-L4タイプ軽鎖のヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド番号61乃至702に示されるh198D-L4タイプ軽鎖をコードする配列を
含むDNA断片を合成した (GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。
合成したDNA断片を用い、BioWa社及びLonza社のPotelligent(R) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じて、MACA-1983a発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「DGV-h198D-H3L4-GS」と命名した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
７）−１１  ヒト化抗ヒトGARP抗体のヒトGARPに対する結合性評価
実施例７)−１０で作製したヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1、h151D-H4L4及びh198D-H3L4とGARPとの解離定数測定は、Biacore T200 (GEヘルスケアバイオサイエンス (株)) を使用し、固定化したProtein Aに抗体をリガンドとして捕捉 (キャプチャー) し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてHBS-EP+ (GEヘルスケアバイオサイエンス (株) )、センサーチップとしてProtein Aセンサーチップ(GEヘルスケアバイオサイエンス (株)) を用いた。
チップ上に1μg/mLのヒトキメラ化抗体を10μL/minで20秒間添加した後、抗原の希釈系列溶液 (8〜128nM) を流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き480秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、Glycine 1.5 (GEヘルスケアバイオサイエンス (株)) を流速20μl/分で30秒間添加した。
データの解析には1：1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数(KD；KD＝kd/ka) を算出した。