【手続補正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ配列において標識されたヌクレオチドを検出する方法であって、
ａ）核酸鋳型と、プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成するように該鋳型にハイブリダイズできるプライマーと、チオール含有化合物を含む開裂試薬とを用意するステップと；
ｂ）反応混合物を生じるように、該プライマーおよび鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップであって、該第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、核酸塩基および糖を含み、該糖は、３’−Ｏ上に開裂可能な保護基を含み、該開裂可能な保護基は、メチレンジスルフィドを含み、該デオキシヌクレオシドトリホスフェートはさらに、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して該核酸塩基と結合している第１の検出可能な標識を含む、ステップと；
ｃ）修飾されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を生じるように、該反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップであって、該第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが組み込まれる、ステップと；
ｄ）該修飾されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体において該デオキシヌクレオシドトリホスフェートの該第１の検出可能な標識を検出するステップと；
ｅ）該修飾されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から該開裂可能な保護基および該検出可能な標識を除去するような条件下で、該開裂試薬を導入するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法がさらに、ステップｂ）の繰り返し中に第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップを含み、該第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、第２の検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チオール含有化合物がジチオベースの基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記チオール含有化合物が、システイン、システアミン、ジチオ−コハク酸およびジチオトレイトールからなる群より選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記チオール含有化合物が、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジンからなる群より選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基が、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基とは異なる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵの類似体を表す、少なくとも４種の異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基の決定を可能にする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ配列において標識されたヌクレオチドを検出する方法であって、
ａ）核酸鋳型と、プライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を形成するように該鋳型にハイブリダイズできるプライマーと、チオール含有化合物を含む開裂試薬と、開裂スカベンジャー試薬とを用意するステップと；
ｂ）反応混合物を生じるように、該プライマーおよび鋳型に、ＤＮＡポリメラーゼおよび第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップであって、該第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、核酸塩基および糖を含み、該糖は、３’−Ｏ上に開裂可能な保護基を含み、該開裂可能な保護基は、メチレンジスルフィドを含み、該デオキシヌクレオシドトリホスフェートはさらに、開裂可能なオキシメチレンジスルフィド含有リンカーを介して該核酸塩基と結合している第１の検出可能な標識を含む、ステップと；
ｃ）修飾されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体を生じるように、該反応混合物を、ＤＮＡポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応を可能にする条件に供するステップであって、該第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが組み込まれる、ステップと；
ｄ）該修飾されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体において該デオキシヌクレオシドトリホスフェートの該第１の検出可能な標識を検出するステップと；
ｅ）該修飾されたプライマー／鋳型ハイブリダイゼーション複合体から該開裂可能な保護基および該検出可能な標識を除去するような条件下で、該開裂試薬を導入するステップと；
ｆ）該開裂スカベンジャー試薬を導入するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
前記方法がさらに、ステップｂ）の繰り返し中に第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップを含み、該第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、第２の検出可能な標識を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記チオール含有化合物がジチオベースの基を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記チオール含有化合物が、システイン、システアミン、ジチオ−コハク酸およびジチオトレイトールからなる群より選択される化合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記チオール含有化合物が、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸ナトリウム塩、ジチオブチルアミン、メソ−２，５−ジメルカプト−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアジパミド、２−メルカプト−エタンスルホネート、およびＮ，Ｎ’−ジメチル，Ｎ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）−ヒドラジンからなる群より選択される化合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基が、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基とは異なる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵの類似体を表す、少なくとも４種の異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基の決定を可能にする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法がさらに、ステップｂ）の繰り返し中に第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを添加するステップを含み、該第２のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、第２の開裂可能なオキシメチレンジスルフィドリンカーを介して結合している第２の検出可能な標識を含み、該第２の検出可能な検出可能な標識が、前記第１の検出可能な検出可能な標識とは異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵの類似体を表す、少なくとも４種の異なって標識された３’−Ｏメチレンジスルフィドでキャッピングされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート化合物の混合物が使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出するステップが、前記組み込まれた第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの核酸塩基の決定を可能にする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬と、説明書と、チオール含有化合物を含む開裂試薬とを含む、キット。
【請求項２１】
緩衝液をさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
開裂スカベンジャーをさらに含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のＤＮＡ配列決定試薬が、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型およびヌクレオチドを含む群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１または９に記載の方法であって、ここで、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートは、下記：
【化４１】
2021000139.tif 000001
の構造を有し：
ここで、Ｄは、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基、ジスルフィドアリル、およびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、環外アミン、プロパルギルアミン、およびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される結合基であり；Ｃは、
【化４２】
2021000139.tif 000002
および
【化４３】
2021000139.tif 000003
からなる群から選択される開裂可能な部位のコアであり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基であり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり；そしてＬａｂｅｌは、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される標識である、
方法。
【請求項２５】
請求項１または９に記載の方法であって、ここで、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、下記：
【化５１】
2021000139.tif 000004
の構造を有し、
ここで、Ｄは、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基、ジスルフィドアリル、およびジスルフィド置換アリル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり、Ａは、結合基であり、ここで、前記結合基Ａは、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミンおよびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される化学基であり；Ｃは、開裂可能な部位のコアであり、ここで、前記開裂可能な部位のコアは、
【化５２】
2021000139.tif 000005
および
【化５３】
2021000139.tif 000006
からなる群から選択され、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基であり；そしてＬ１およびＬ２は、接続基であり、ここで、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−および−ＣＯ（ＣＨ２）ｘ−からなる群から選択され、ここで、ｘは０〜１０であり、ここで、Ｌ２は−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ＝Ｎ、および−Ｎ＝Ｎ−、アルキル、アリール、分枝鎖アルキル、分枝鎖アリールならびにそれらの組合せからなる群から選択され、そしてここで、Ｌａｂｅｌは、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される検出可能な標識である、
方法。
【請求項２６】
請求項１または９に記載の方法であって、ここで、前記第１のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、下記：
【化６１】
2021000139.tif 000007
の構造を有し、
ここで、Ｄは、ジスルフィドアルキル、ジスルフィド置換アルキル基からなる群から選択され；Ｂは、核酸塩基であり；Ａは、プロパルギル、ヒドロキシメチル、環外アミン、プロパルギルアミンおよびプロパルギルヒドロキシルからなる群から選択される結合基であり；Ｃは、
【化６２】
2021000139.tif 000008
および
【化６３】
2021000139.tif 000009
からなる群から選択される開裂可能な部位のコアであり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して選択されるアルキル基であり；Ｌ１およびＬ２は、接続基であり、ここで、Ｌ１は、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２）ｘ−、−ＣＯＮＨ−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−、および−ＣＯ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−からなる群から選択され、ここで、ｘは、０〜１０であり；そしてＬａｂｅｌは、フルオロフォア色素、エネルギー移動色素、質量タグ、ビオチンおよびハプテンからなる群から選択される、
方法。