(57)【要約】【課題】蛍光分子が所定の深度範囲内に位置しているか否かに制限されない深度情報を、より広い深度範囲内で確定することができ、蛍光マーカの不必要な照射を可能な限り回避した深度分解の顕微鏡法を提示すること。【解決手段】３Ｄ高解像度局在顕微鏡法のための方法では、励起工程および撮像工程を複数回繰り返して、複数の単一画像を生成し、生成された複数の単一画像において、発光する蛍光マーカの隔離された像から、それぞれ対応する蛍光マーカの、光学的分解能を超える精度を有する位置情報を確定し、このように確定した位置情報から、高解像度の全体画像を生成し、励起放射線を試料内に、第１の光シート４として照射し、第１の光シートが撮像方向に沿って、焦点面に対して非対称な強度分布を有しており、単一画像において、発光する蛍光マーカの隔離された像を、その輪郭１３に関して分析し、この輪郭から、対応する蛍光マーカの焦点面からの距離に関する情報を導出する。【選択図】      図３
2014224814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄ高解像度局在顕微鏡法のための方法であって、
−  励起工程において、試料（２）を励起放射線（４）で照射することによって、該試料（２）内に蛍光マーカを励起して発光させ、
−  撮像工程において、該試料（２）を、撮像光学系（３、１４）を用いて、撮像方向（９）に沿って単一画像内に撮像し、該単一画像が発光する蛍光マーカ（１１）の像を含んでおり、該撮像光学系（３）が焦点面（７）と光学的分解能とを有しており、
−  該励起工程および該撮像工程を複数回繰り返し、それにより複数の単一画像を生成し、該励起工程を、該発光する蛍光マーカ（１１）の少なくとも一部について、該発光する蛍光マーカの像が該単一画像のそれぞれにおいて隔離されるように行い、
−  生成された複数の該単一画像において、該発光する蛍光マーカ（１１）の隔離された像から、それぞれ対応する蛍光マーカの、該光学的分解能を超える精度を有する位置情報を確定し、
−  このように確定した該位置情報から、高解像度の全体画像を生成する方法において、
−  該励起放射線を該試料（２）内に、第１の光シート（４、４．１）として照射し、該第１の光シートが、撮像方向（９）に沿って、該焦点面に対して非対称な強度分布（１７、１７．１）を有しており、
−  該単一画像において、該発光する蛍光マーカ（１１）の隔離された該像を、その輪郭（１３）に関して分析し、該輪郭（１３）から、対応する該蛍光マーカ（１１）の該焦点面（７）からの距離に関する情報を導出することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記撮像工程において、前記試料（２）を、前記焦点面（７）と共役な平面（１６）上に位置する検出器（１５）上に撮像することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記強度分布（１７、１７．１）が、前記焦点面の外部に位置する最大値（１８、１８．１）を有していることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の光シート（４．１）と重複しない第２の光シート（４．２）を照射することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の光シート（４．２）が、前記焦点面（７）に関して、前記第１の光シート（４．１）に対して対称に位置しており、前記撮像工程において、前記試料（２）を、一方が前記焦点面（７）と共役な平面（１６．１）の前方に位置しており、他方が前記焦点面（７）と共役な平面（１６．２）の後方に位置している、２つの検出器（１５．１、１５．２）上に撮像することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
２枚の光シート（４．１、４．２）が、その波長スペクトルについて互いに異なっていることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
第２の光シート（４．２）の強度分布（１７．２）が前記焦点面（７）に対して対称である、前記第２の光シート（４．２）を照射することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの第２の光シート（４．２）を照射し、
光シート（４．１、４．２）が、前記撮像工程において、互いに対して光シート厚さの半分ずらされていることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３Ｄ高解像度局在顕微鏡法のための方法に関する。この方法では、励起工程において、試料を励起放射線で照射することによって、試料内で蛍光マーカを励起して発光させ、撮像工程において、撮像光学系を用いて試料を撮像方向に沿って単一画像内に撮像する。単一画像は発光する蛍光マーカの像を含んでおり、撮像光学系は、焦点面と光学的分解能とを有している。励起工程および撮像工程を複数回繰り返すことにより、複数の単一画像を生成する。発光する蛍光マーカの少なくとも一部について、蛍光マーカの像が各単一画像内で隔離されるように励起工程を行い、生成された複数の単一画像において、発光する蛍光マーカの隔離された像から、それぞれ対応する蛍光マーカの、光学的分解能を超える精度を有する位置情報を確定する。このように確定した位置情報から、高解像度の全体画像を生成する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術では、顕微鏡法における回折限界を克服するための様々な方法が考案されている。特許文献１または特許文献２より、ＰＡＬＭ（ｐｈｏｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と略される方法が知られており、この方法では、試料を撮像するために、光学的放射線を用いて活性化可能なマーキング物質が使用される。活性化された状態でのみ、マーキング物質は特定の蛍光放射線を放出することができる。マーキング物質の活性化されていない分子は、励起放射線を照射した後でも、規定された特性を有する蛍光放射線を全く発しないか、または少なくとも顕著には発しない。そのため、活性化放射線は、一般に切替信号と呼ばれている。ＰＡＬＭ法では、活性化されたマーキング分子の少なくともいくつかが、隣接する活性化されたマーキング分子から、このマーキング分子の少なくともいくつかが顕微鏡の光学的分解能を尺度として分離される程度に、または後ほど画像処理法によって分離可能である程度に、隔てられるように切替信号が印加される。これを、蛍光マーカを隔離すると言い、この工程は隔離工程とも呼ばれている。その際、蛍光マーカの全体集合の内の部分集合が隔離されていれば十分である。試料は、次のように撮像される。少なくともいくつかの蛍光マーカが隔離されて発光している、試料の単一画像を得る。次に、各蛍光マーカについて、記録された放射線分布の中心を確定するが、この放射線分布は、解像度に限定され、もちろん点状であるとは限らない。このように、光学的分解能が本来可能とする精度よりも高い精度で、蛍光マーカの位置が数学的に局在化される。この工程は、局在化工程と呼ばれる。
【０００３】
隔離工程および局在化工程は繰り返し行われ、その結果、複数の単一画像が得られる。理想的には、各蛍光マーカが、少なくとも１つの単一画像内で一度は隔離されている。単一画像から確定される位置情報によって、光学的分解能を超えた精度を有する個々の蛍光マーカのそれぞれの位置情報を含んだ全体画像を生成することができる。光学的分解能を上回る精度を有するこのような画像は、高解像度であると形容される。
【０００４】
蛍光マーカを隔離するために、ＰＡＬＭ原理では統計効果が利用される。所与の強度を有する切替信号によって、蛍光放射線を放出するように活性化可能な蛍光マーカの場合には、切替信号の強度を調節することによって、光学的分解能内で少なくともいくつかの隔離された蛍光マーカを励起して蛍光放射線を放出させることができる、十分な部分領域が撮像される試料内に存在するように、試料の所与の表面領域に存在する蛍光マーカが活性化される確率が低くなるように取り計らうことができる。このように活性化された試料を励起すると、蛍光マーカが隔離されて発光する。
【０００５】
ＰＡＬＭ原理は、活性化、すなわち、切替信号の印加に関してさらに発展した。したがって、例えば、蛍光を発しない長寿命の状態と、蛍光を発する短寿命の状態とを有する分子の場合には、励起放射線からスペクトル的に逸脱した活性化放射線による個別の活性化が完全に不要である。むしろ、試料がまずは高強度の励起放射線で、分子の大部分が蛍光を発することができない長寿命の状態（例えば、三重項状態）になるように照射される。残された、そしてまだ蛍光を発している分子が、次に少なくとも部分的に隔離される。
【０００６】
一方で、ＰＡＬＭ原理は、技術文献において例えばＳＴＯＲＭ（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）等の、他の略称でも呼ばれるようになった。本明細書では、蛍光マーカをまずは隔離してから局在化することによって高解像度を達成する、全ての顕微鏡技術を同定するために、略称ＰＡＬＭを使用する。ＰＡＬＭ法には、励起のために高い位置解像度が必要にならないという利点がある。容易な広範囲照射が可能である。
【０００７】
ＰＡＬＭ原理は、二次元において、あるいは横方向に、すなわち、撮像方向に交差する方向に高解像度を達成する。というのは、局在化は、投影において撮像方向に直交する平面上に隔離された蛍光マーカに対してのみ行うことができるからである。撮像方向に沿って、つまり深度方向に、相前後して位置する蛍光マーカは、ＰＡＬＭ原理そのものでは区別することができない。そのため、初期に実験的に実施されたＰＡＬＭ法では、使用される撮像光学系の被写界深度よりも著しく小さい、明確に定義された深度範囲からのみ蛍光マーカが励起されることを確実にするために、ＴＩＲＦ（Ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）照射が使用されていた。
【０００８】
その間にも、従来技術ではさらなる方法および手法が生み出された。これらは、第３の空間方向、つまり撮像に関して深度方向にも、蛍光マーカを隔離および局在化する３Ｄ局在顕微鏡法を達成している。
【０００９】
非特許文献１には、画像内に目標とする非点収差の歪みを生じさせる弱い円柱レンズが配置された、ＰＡＬＭ原理のための撮像放射線経路が記載されている。これにより、蛍光マーカが、試料の撮像の点画像退色関数（Ｐｕｎｋｔｂｉｌｄｖｅｒｗａｓｃｈｕｎｇｓｆｕｎｋｔｉｏｎ）の対称点を示す焦点面の上方または下方に位置すると同時に、各蛍光マーカの像がカメラ上で楕円形に歪む。歪みの向きおよび大きさから、発光する蛍光マーカの深度位置に関する情報を得ることができる。この方法の欠点は、双極性分子の場合にも、その局所的な周囲および向きが、その蛍光マーカが深度位置と関係が無いにもかかわらず、発光する蛍光マーカの画像の歪みを引き起こし得ることである。その場合、このような発光する蛍光マーカには、その空間位置に応じて、誤った深度値が与えられる。
【００１０】
非特許文献２が、別の手法を追求している。この手法では、発光する蛍光マーカが放出する光子が自らと干渉させられる。このために、発光する蛍光マーカを同時に観察するための、４π構成で取り付けられた２つの対物レンズが使用される。特殊な３方向ビーム・スプリッタを用いて、そのようにして得られる部分放射線経路からの放射線を干渉させる。得られた画像のそれぞれがカメラを用いて検出され、これらの画像の強度比から深度位置に関する情報を知ることができる。
【００１１】
非特許文献３では、および非特許文献４によれば、試料の画像を独立して検出される２つの部分画像に分割する、１：１ビーム・スプリッタが撮像放射線経路内に設置される。加えて、両方の部分放射線経路が、例えば光学的最小解像度の半分または全体において深度方向に隔てられた２つの対物面を撮像するように、一方の部分放射線経路内のビーム・スプリッタの後方に、光路長の差が設けられている。これらの２つの対物面の間に位置する蛍光マーカの深度位置は、この蛍光マーカの２つの部分画像を（例えば、点画像退色の幅に関して）分析することによって得られる。この方法は、２つの高解像度の部分画像と、これらの２つの部分画像のサブ・ピクセル精度の重畳とを必要とする。この手法の、調節の手間を大幅に低減した発展形態が、特許文献３より知られている。
【００１２】
局在顕微鏡法での深度分解の原理では、撮像の点画像退色関数（以下ではＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）とも略される）の意識的な歪みが追求される。このような手法が、例えば特許文献４に記載されているが、この発明は、試料の撮像の際に、深度に依存した画像歪みが生じるように変更を加えている。例えば、理想的には楕円形である点画像退色関数を一種のヘリックス構造に変更することによって、発光する点の撮像のために、エアリー・ディスクの代わりに、撮像された発光する点の深度位置によってその相対位置が決まる２つの隣接するローブが生じる。
【００１３】
３Ｄ局在顕微鏡法において深度情報を得るための原理が、特許文献５に記載されている。この発明は、励起放射線および切替放射線のうちの少なくとも一方のために、例えば非特許文献５に記載されている、いわゆる光シート照射を使用している。試料は前後して、軸方向に互いに対してずらされているが部分的に重なる２枚の光シートを介して照射される。両方の光シート位置において蛍光放射線を放出する分子は、必然的に両方の光シート位置の重複範囲に位置している。そのため、適切なフィルタリングが行われる。このように、深度の選択性を、光シートの厚さを超えて著しく高めることができる。重複範囲の厚さは、フィルタリングの基準となる。この手法の欠点は、局在化のために２倍の数の単一画像を撮影しなければならないことである。つまり、各光シート位置について、従来のＰＡＬＭ撮像の際に必要であった数の単一画像が必要である。また、光シートのずれの正確な調節、および特に調節位置の再現性が、重複範囲の厚さにとって、したがって深度分解にとっても重要である。最後に、フィルタリングされた重複範囲の内部では、概して有意義な分解が行われなくなる。それにより、重複範囲は深度情報に関して、実質的に測定の不明瞭さを定義している。重複範囲の外部に位置する蛍光マーカを、その深度位置に関して特定することができないので、重複範囲よりも広い範囲の検出には、究極的に試料全体を走査する必要がある。
【００１４】
その上、ＰＡＬ顕微鏡法では、蛍光マーカは多くの場合、非常に限られた回数の活性化サイクルおよび励起サイクルのうちの少なくとも一方しか受けることができないので、蛍光マーカの不必要な照射は不都合となり得る。この意味では、高解像度の撮像に利用されない全ての照射が不必要である。この点についても、重複する光シートの原理を改良することができる。というのは、この原理では、重複範囲の外側に位置しているためにその深度位置が検出されない蛍光マーカが照射されるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０１２７６９２号
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２００６０２１３１７号明細書
【特許文献３】独国特許出願公開第１０２００９０６０４９０号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１２／０３９６３６号
【特許文献５】独国特許出願公開第１０２０１００４４０１３号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】ビー  ホワン他（Ｂ．Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９、Ｓｅｉｔｅ  ８１０，２００８
【非特許文献２】シュテンゲル他（Ｓｈｔｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．），ＰＮＡＳ  １０６，Ｓｅｉｔｅ  ３１２５，２００９
【非特許文献３】トプラク他（Ｔｏｐｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｎｏｌｅｔ．  ７，Ｓｅｉｔｅｎ  ３２８５−３２９０，２００９
【非特許文献４】ジュエッテ他（Ｊｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，Ｓｅｉｔｅ  ５２７，２００８
【非特許文献５】ピー  ケラーおよびイー  シュテルツァー（Ｐ．Ｋｅｌｌｅｒ  ｕｎｄ  Ｅ．Ｓｔｅｌｚｅｒ），“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃａｎｎｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｈｅｅｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，Ｖｏｌ．１９，Ｓｅｉｔｅｎ  １−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、蛍光分子が所定の深度範囲内に位置しているか否かに限定されない深度情報を、より広い深度範囲内で確定することができるという点で、特許文献５の顕微鏡方法を発展させるという課題に基づいている。さらに、本発明は、蛍光マーカの不必要な照射を可能な限り回避した深度分解の顕微鏡法を提示するという課題に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、この課題が冒頭に挙げた種類の方法によって解決される。この方法は、撮像方向に沿って焦点面に対して非対称な強度分布を有する第１の光シートとして、励起放射線を試料に照射し、単一画像において、発光する蛍光マーカの隔離された像を、その輪郭に関して分析し、この輪郭から、対応する蛍光マーカの焦点面からの距離に関する情報を導出することを特徴とする。
【００１９】
本明細書では、蛍光マーカを、局在顕微鏡法に適した、つまり個々の蛍光マーカを光学的分解能に関して隔離して発光させるために使用することができる、蛍光発光体として解釈する。その際、蛍光マーカという概念は、試料内の構造が相応する物質でマークされる場合を含み、また、試料には適した蛍光特性が既に自然に備わっている場合をも含むこととする。
【００２０】
本発明は、深度方向に依存した点画像退色関数を作成するための光シート顕微鏡法を使用する。つまり、本発明は、特許文献５において使用されている光シートを、点画像退色関数が深度方向に依存するように撮像を構成するために用いる。これは、点画像退色関数（ＰＳＦ）の軸方向依存性とも呼ばれる。光シートがその強度分布に関して焦点面に対して非対称であることによって、点画像退色関数の軸方向依存性が生じる。本発明者らの認識によれば、光シート顕微鏡法における点画像退色関数は、光シートが焦点面に対して対称に位置しているときのみ、軸対称となる。それに対して、光シートが焦点面に対して軸方向に非対称、例えば変位していれば、対称性の破れが起こる。光シート顕微鏡の点画像退色関数は、常に励起と検出との組合せであるので、焦点面に関する光シートの非対称性によって点画像退色関数もまた非対称に変形する。その際、点画像退色関数の強度分布の重心が、ちょうど光シートの重心もまた焦点面に対して非対称である方向に、例えば光シートが焦点面に対してずらされている方向に変位している。この非対称性に基づいて、発光する蛍光マーカの隔離された像がその輪郭に関して分析され、これを元に蛍光マーカの軸方向位置、すなわち深度位置が一義的に決定される。このために、各発光する蛍光マーカの隔離された像の外形、すなわち輪郭を分析する。好ましくは、この分析の際に、隔離された像の強度分布の幅を評価する。
【００２１】
焦点面に対する光シートの強度分布の非対称性が大きいほど、蛍光マーカの軸方向の局在化がより容易になる。というのは、点画像退色関数の非対称性は、焦点面に対する光シートの強度分布の非対称性とともに高まるからである。
【００２２】
画像分析には、従来技術では非対称の点画像退色関数を評価するために用いられていたアルゴリズムと、原理的には同じアルゴリズムを用いることができる。この例としては、非特許文献４から知られているアルゴリズムが挙げられる。通常、このようなアルゴリズムは、撮像光学系の予め定められた点画像退色関数を出発点としている。この関数は、上述の特許文献４からも知られているように、理論的または実験的に、既知の寸法の発光する点に基づいて確定することができる。
【００２３】
本発明による方法では、撮像工程において、焦点面と共役な平面に位置する検出器上に試料を撮像することが有利である。そうすれば、所与の光シートの構成に対する点画像退色関数の非対称性が最大となる。
【００２４】
焦点面に対する光シートの非対称な強度分布は、技術的には特に容易であるが、対称な光シートを生成し、これを強度分布の最大値が焦点面の外部に位置するように配置することによって実現することができる。もちろん、これを対称ではない強度分布のために行ってもよい。
【００２５】
対称性を破るための別の可能な手段は、第１の光シートだけでなく第２の光シートをも用いて照射し、撮像工程において試料がその上に撮像される２つの検出器を使用することである。その際、一方の検出器が、焦点面と共役な平面の前方に位置しており、他方の検出器が、焦点面と共役な平面の後方に位置している。
【００２６】
その場合、第１および第２の光シートを、焦点面に対して互いに対称にずらすことさえ可能である。それぞれを個別に観察すれば、これらの光シートは焦点面に対して非対称である。この場合、点画像退色関数は、全体的分析については対称であるが、焦点面と共役な平面の上方あるいは下方の平面にカメラを割り当てることによって、一義的な軸方向の局在化が再び可能になる。同時に、より広い軸方向の範囲を観察することができる。
【００２７】
この両方の構成について、２つの対向する検出対物レンズを有するように撮像光学系を構成すれば、特に高い光子収量を達成することができる。その場合、２つの完全な検出放射線経路が必要になるものの、対物レンズによって検出される光子をビーム・スプリッタによって２つの検出器上に分割しなければならないことによりカメラ１台につき光子の半分しか画像の生成に利用されなくなる、ということが回避される。
【００２８】
非対称な点画像退色関数は、複数の光シートを用いて、光シート同士を重複させずに、ある光シートを他の光シートよりも焦点面の近くに配置することによっても、作成することができる。その際、「重複する」という概念は、光シートの境界を定義するための、所定の強度低下に関連している。通常の境界は、例えば１／ｅの強度低下である。他の定義も同様に可能である。例えば、第２の光シートが焦点面に位置しており、第１の光シートが焦点面の上方または下方に、第２の光シートに重複せずに位置している。このように、深度方向においてさらに拡大された非対称な点画像退色関数を得ることができ、それによって、より広い深度範囲にわたって軸方向の局在化が行われる。もちろん、この変形例については、さらに多くの光シートを用いてもよい。重複する光シートを用いた上述の原理との違いは、輪郭の分析によって、検出が重複範囲に限定されないことであり、とりわけ重複範囲へのフィルタリングが行われないことである。
【００２９】
特許文献５の構想とのさらなる違いは、本発明で使用される全ての光シートが単一画像の検出時間に関して同時に照射されることであり、フィルタリングに必要となるような交互の照射が行われないことである。第１の光シートのみを用いて照射し、２つの対向する検出対物レンズと後続の検出放射線経路、すなわち検出器とを有する撮像光学系を使用することによって、同様の効果を得ることができる。ここでは、両方の検出対物レンズの焦点面が一致していないことが重要である。
【００３０】
非対称なＰＳＦを作成するという幾何学的な手段の他、一実施形態では、これに加えて波長を使用してもよい。試料を第１の光シートおよび第２の光シートで照射し、撮像光学系を用いて、スペクトル的に分離された２つのチャンネル内で放射線を検出すれば、各色チャンネルが光シートの一方に割り当てられるので、一義的な軸方向の分解が可能である。しかし、蛍光マーカが２つのスペクトル的に異なる種類を含んでいる、または２つのスペクトル的に異なる励起スペクトルおよび放射スペクトルを有していることが前提となる。
【００３１】
複数の光シートを使用する場合は、これらが軸方向に可能な限り継ぎ目なく互いに続いていることが有利である。そのため、少なくとも第２の光シートを用いる際に、光シートが撮像方向において互いに対して光シート厚さの半分ずれていることが好ましい。
【００３２】
以下では本発明を、図面を参照しながら例示的により詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】光シート顕微鏡の発展形態として構成された、３Ｄ高解像度局在蛍光顕微鏡法のための顕微鏡の概略斜視図。
【図２】焦点面に対する図１の顕微鏡における光シートの位置（上部）、およびそれによって作成される点画像退色関数（下部）を明確化するための概略図。
【図３】焦点面に対する図１の顕微鏡における光シートの位置（上部）、およびそれによって作成される点画像退色関数（下部）を明確化するための概略図。
【図４】図３の上部と似ているが、光シートの強度分布が概略的に記載された図。
【図５】図５ａは図３の下部の図に対応する点画像退色関数の図であり、図５ｂは図５ａの非対称な点画像退色関数の、局在顕微鏡法におけるエアリー・ディスクのサイズに対する影響の図。
【図６】図１の局在顕微鏡の変更構成であり、２枚の光シートが使用される構成の概略断面図。
【図７】図４と似ているが、図６の顕微鏡に関する図。
【図８】図６に似た図であり、２枚の光シートを用いる局在顕微鏡の別の変更例の図。
【図９】図７と対応しているが、図８の顕微鏡に関する図。
【図１０】図６に似た図であり、同様に２枚の異なる光シートを用いて動作する光シート顕微鏡の別の実施形態の図。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
異なる図面において、機能的または構造的に一致する要素には、説明の繰り返しを避けるために、一貫して同一の符号が付されている。
図１は、試料２を、蛍光放射線を放出するように励起して撮像する顕微鏡１を概略的に示している。顕微鏡１は、ＰＡＬＭ法を実施するために形成されている。試料２は、対物レンズ３によって広範囲に、（図１には特に示されていない）検出器上に撮像される。試料２内の蛍光放射線の励起および活性化のうちの少なくとも一方は、励起装置５から到来する活性化放射線および励起放射線のうちの少なくとも一方がその中に延びる、光シート４を用いて行われる。以下の説明では、上述の本明細書の導入部分において、蛍光を発しない長寿命の状態と蛍光を発する短寿命の状態とを有する分子の例で説明したように、これに限定するわけではないが例示的に、活性化および励起が同じ波長の放射線を用いて行われることを前提とする。そのため、以下で部分的に励起放射線のみについて述べている場合にも、それによって切替放射線をも指していることがある。
【００３５】
試料２は、対物レンズ３によって検出装置６上に撮像される。その際、対物レンズ３は、対物レンズ３および検出装置６の具体的な構成によって決まる、被写界深度範囲によって既知の方法で取り囲まれた焦点面７を規定する。
【００３６】
光シート顕微鏡としての顕微鏡１の構成については、試料２の励起が光シート４によって、基本的に撮像方向９に直交する励起方向８に沿って、試料２に沿って撮像されることが重要である。これは、照射方向が撮像方向と交差し、概して撮像方向に直交して延びる、光シート顕微鏡の特徴である。
【００３７】
図１の顕微鏡では、光シート４は焦点面７に対して非対称である。この非対称性の効果が、図２および図３に示されている。これらの図面はそれぞれ２つの部分を含んでいる。上部には、光シート４の試料２内への入射、および試料２内の発光する蛍光マーカの撮像が、概略的に断面図で示されている。図面のその下方の部分には、それぞれの図面の上部においても断面として選択されている、ｘ／ｚ平面上の点画像退色関数の断面がそれぞれ示されている。
【００３８】
図２は、光シート４が焦点面７に対して対称に位置している、従来技術における状態を示している。図２および図３の図示では、発光していない蛍光マーカ１０および発光している蛍光マーカ１１が記載されている。これらの蛍光マーカは、ＰＡＬＭ原理に基づいて、もちろん、光シート４が照射されて通過する試料２の体積内にのみ存在している。光シート４の外部の試料２の体積内では、蛍光マーカ１０は励起されていない。
【００３９】
図２の下部は、この構成において得られるＰＳＦを明確化している。ＰＳＦは、その輪郭１３およびその強度分布に関しても、焦点面７に対して対称である。
この状態は、光シート４が図３に示されたように焦点面７に対して非対称に照射される場合に変化する。ここでは、光シート４は焦点面７の上方に位置している。光シートがその中心面に関して対称であるということは例示に過ぎず、必須ではない。重要なことは、焦点面７に関して非対称であるということである。この焦点面７に対する光シート４の非対称性によって、ＰＳＦもまた非対称になるが、これが図３の下部の非対称な輪郭１３によって示されている。ＰＳＦはその輪郭１３においても、その強度分布においても、焦点面７に対して変位している。
【００４０】
この非対称なＰＳＦは、図１の顕微鏡を用いて実施される顕微鏡法において、ＰＡＬＭ原理による深度分解、つまり３Ｄ局在顕微鏡法のために利用される。
図４は、図３の上部あるいは下部に似た断面図、すなわちｘ／ｚ平面における断面を概略的に示している。ここでは、光シート４の強度推移が記載されている。光シート４が、焦点面７に対して非対称に位置する強度分布１７を有していることが分かる。強度分布１７はそれ自体においては対称であるものの、強度分布１７の最大値１８は焦点面７の外部に位置している。それにより、図３の下部に図示された非対称なＰＳＦがもたらされる。このような非対称なＰＳＦは、強度分布１７自体が非対称である一実施形態においても得ることができる。
【００４１】
３Ｄ局在顕微鏡法では、試料が複数の単一画像内に撮像される。この単一画像の生成パラメータは、発光する蛍光マーカ１１の少なくともいくつかが、単一画像において基本的に対物レンズ３および検出装置６によって規定される光学的分解能に関して隔離されるように、既知の方法で構成される。各隔離された蛍光マーカの輪郭は、ＰＳＦの非対称性に基づいて、発光する蛍光マーカ１１の深度位置によって決まる。このことが、図５ａおよび図５ｂに視覚化されている。図５ａは、ｘ／ｚ平面における非対称なＰＳＦを示している。このＰＳＦは、焦点面７に対して非対称である。発光する蛍光マーカは、通常のデカルト表記で図１の記載内容に対応したｘ／ｙ平面である、ｙ／ｚ方向に位置する平面に直交するように撮像される。
【００４２】
撮像は究極的には図５ａのＰＳＦの断面を表すので、撮像された蛍光マーカの輪郭はｚ座標によって決まる。この断面の結果が、図５ｂに３つの異なるｚ座標について示されている。ｚ座標が増加するにつれて、図５ｂに例示的に円形で示された輪郭の直径が増加する。深度位置に応じて、エアリー・ディスク２０の直径２２が異なっている。エアリー・ディスクの中心２１は、発光する蛍光マーカの位置のｘ座標およびｙ座標を与える。輪郭の直径２２から、ｚ座標が導出される。このために、本明細書の概要部分で既に説明したように、ＰＳＦの実際の輪郭１３が、その既知の点放射体の局在化および寸法に関するシミュレーションおよび測定のうちの少なくとも一方によって確定される。
【００４３】
図５ａは、ＰＳＦの非対称性に応じて、直径２２、つまりエアリー・ディスク２０の輪郭による、一義的な深度割り当てがまだ可能ではない場合があり得ることを示している。したがって、例えば、位置ｚ２の上方に位置する場所は、深度位置ｚ１での直径に対応するエアリー・ディスク２０の直径２２を与えるかもしれない。そのため、好ましい実施形態では、輪郭、例えば直径２２に加えて、エアリー・ディスク２０の輝度分布がさらに評価されることが意図される。図５ａは、これによって、エアリー・ディスク２０の分析から、概して深度位置を一義的に指定し得ることを示している。というのも、ＰＳＦの強度分布２３も非対称であるからである。
【００４４】
好ましくは、ＰＳＦの輪郭１３の内部のこの非対称な強度分布が、中心２１の決定の際にも考慮される。
図６は、図１の顕微鏡あるいは図３／４の照射状況および検出状況の発展形態を示しており、図６では符号４．１を付された非対称な第１の光シートに加えて、図６の実施形態では例示的に焦点面７に対して配置された第２の光シート４．２が照射される。このように照射される試料２は、検出装置６において、チューブ・レンズ４を介して、焦点面７と共役な面１６に配置された検出器１５上に撮像される。
【００４５】
つまり、焦点面７に関して非対称な第１の光シート４．１に加えて、第２の光シート４．２がさらに照射される。これにより、全体として、図７に概略的に図示されたような強度分布が生じる。２枚の光シートは、それぞれ最大値が１８．１および１８．２である、強度分布１７．１あるいは１７．２を有している。第２の光シートの強度分布１７．２は、強度分布１７．１と区別するために破線で示されている。両方の光シート４．１および４．２を合わせた全体の強度分布は、やはり焦点面７に対して非対称である。したがって、一義的な軸方向の局在化、それとともに３Ｄ局在顕微鏡法が実現される、非対称なＰＳＦが同様に生じる。しかし、検出される深度範囲はより広い。好ましい撮像においては、光シートが互いに継ぎ目なく接している。これは、両方の光シートを焦点面７と一致しない平面に対して軸方向にずらすことによって実現され、その際、このずれは、それぞれ対応する光シートの厚さの半分と一致する。
【００４６】
図６において実現されたＰＳＦの非対称性は、代替の構成では、焦点面７に対して非対称な唯一の光シートを照射し、それと同時に、２つの対向する対物レンズ３および検出装置６を用いて観察することによって達成することができる。その際、両方の検出対物レンズ３の一方は、光シートの平面に焦点を合わせ、他方は、この平面に対して軸方向にずらされている。この技術的により煩雑な構成には、光子収量を高めることができるという追加の利点がある。というのは、対向する方向に送信されるため通常は検出装置６によって検出することができない光子を、もう１つの検出対物レンズによって集めることができるからである。
【００４７】
図８は、再び２枚の光シート４．１および４．２を用いて動作する顕微鏡１の代替構成を示しているが、この光シートは互いに対称に位置している。第１の光シート４．１および第２の光シート４．２は、それぞれ個別には焦点面７に対して非対称である。この構成では、焦点面７と共役な平面１６．１あるいは１６．２に対向する方向に、２つの検出器１５．１および１５．２をずらす必要がある。このような検出器を設けるための可能な手段は、好ましくは無端放射線経路として形成されている対物レンズ３からの放射線経路を、１：１ビーム・スプリッタ１９を用いて分割するとともに、共役な平面１６．１あるいは１６．２において放射線を集束する２つのチューブ・レンズ１４．１および１４．２を使用することである。
【００４８】
共役な平面１６．１および１６．２に対する検出器１５．１および１５．２のずれは、焦点面７に対する光シート４．１あるいは４．２の中心のずれと厳密に一致する。対物レンズ３の焦点面７に対して非対称に位置する光シート４．１および４．２のそれぞれが、非対称なＰＳＦを形成する。検出器１５．１および１５．２を、共役な平面１６．１および１６．２に対して相応に方向付けることによって、一義的な局在化が可能になる。それにより、軸方向に検出される範囲は、図６の構成の場合と同様に拡大されている。
【００４９】
光シート４．１および４．２の強度分布が図９に示されている。第１の光シート４．１についても強度分布１７．１が非対称であり、図９では破線で記載された第２の光シート４．２についても強度分布１７．２が非対称であることが分かる。最大値１８．１あるいは１８．２は、焦点面７の外部にそれぞれ位置している。その強度分布が図７に示された図６の構成の場合と同様に、軸方向に分解可能な範囲が拡大されている。
【００５０】
図８の構成は、対物レンズ３によって集められた放射線がビーム・スプリッタ１９によって２つに分割されるので、検出器１５．１および１５．２の１つにつき、光子数の半分のみしか画像生成に利用することができないという不都合がある。その結果が、信号対雑音比の悪化である。それとともに、局在化の精度が低下する。この不都合を、２つの対向する検出対物レンズ３を備えた発展形態において解消することができる。この場合、ビーム・スプリッタは必要ではないが、２つの完全な検出放射線経路が必要になる。
【００５１】
図６または図８による複数の光シートの原理は、もちろん、３枚、４枚、またはそれ以上の光シートに拡大することができる。それにより、図８の構成を使用すれば、場合によっては必要な検出器の数が増加する。さらに、検出器が１つ追加されるごとにビーム・スプリッタおよびチューブ・レンズが加えて必要になる。
【００５２】
さらなる光シート、すなわち、第１の光シート４．１に加えて複数の光シートを使用する際は、さらなる光シート同士が同じ厚さである必要はなく、特に第１の光シートと同じ厚さである必要はない。
【００５３】
非対称なＰＳＦを適切な光シートの照射によって作成するという、前述の生体測定的な手段以外に、別の実施形態では、対称性の破れに適した検出波長／励起波長を追加的に使用するという手段がある。図１０に示したように、焦点面７に対してそれぞれ非対称に配置された光シート４．１および４．２を用いて、試料を照射する。やはり試料２を２枚の非対称な光シート４．１および４．２を用いて照射するが、今回は、光シートはその波長に関して互いに異なっており、それにより、試料２内のスペクトル的に異なる蛍光体を励起する。このためには、試料２が、蛍光特性に関して互いに異なる２種類の蛍光マーカでマーキングされていることが前提となる。代替として、蛍光マーカがスペクトル的に異なるように励起し、また、スペクトル的に異なる蛍光放射線を放出する場合は、同一の蛍光マーカを用いることができる。図１０は、この異なる蛍光マーカあるいは異なるように励起される蛍光マーカを、ここでは本明細書において全般的に採用されている符号体系に従って、末尾の．１および．２で区別している。発光する蛍光マーカ１１．１は光シート４．１による照射を受けて、発光する蛍光マーカ１１．２は光シート４．２による照射を受けて生じる。対物レンズ３による撮像後、発光する蛍光マーカ１１．１および１１．２のスペクトルに対応する二色性のスプリッタとして形成されたビーム・スプリッタ１９によって、放射線が分割される。
【００５４】
両方の光シート４．１および４．２は、それぞれ非対称なＰＳＦを形成する。この割り当ては波長によって行われるので、深度範囲が全体として、１枚の光シートの使用に比べて再び２倍になる。
【００５５】
ここで説明した実施形態では、光シートが焦点面７に対して基本的に平行に照射されるような光シートの強度分布であることを前提としている。これはもちろん必須ではない。この場合、各光シートの強度分布１７の最大値１８を参照することが実用的である。しかし、最大値１８が位置するこの平面は、必ずしも焦点面７に対して平行である必要はなく、対物レンズ３が検出する画像範囲の外側に交差点が配置されている限り、焦点面７に交差してもよい。このような構成の場合、ＰＳＦの非対称性は、各単一画像におけるｘ座標およびｙ座標のうちの少なくとも一方によって決まる。このことは、深度情報の確定の際には当然考慮すべきである。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態では、複数の光シートが生成される。このための以下の複数の可能な手段がある。
２つの側面、すなわち第１の側面の光シートおよび第２の側面の光シートの照射の場合に、ミラー配置を変化させることによって、光シートの軸方向のずれを容易に調節することができる。
【００５７】
別の変形例では、励起装置５内のビーム・スプリッタが使用される。放射線経路から１：１ビーム・スプリッタを介して放射線部分を分離し、次に角度を変えて、あるいは放射線を少しずらして、再び放射線経路内に結合する。この分離されて再び結合される放射線部分を操作することによって、２枚の光シートを生成することが可能になる。
【００５８】
ＰＡＬＭ顕微鏡法における検出器の典型的な露光時間は、１０から２００ｍｓの間である。例えば、＜１ｍｓの継続時間の素早い多重式の場合、複数の光シートを用いた準同時的な照射を実現することができる。そのため、照射の同時性という概念は、本明細書では、撮像工程における検出時間に関連している。準同時的な照射のための適切な高速の切替を、検流計スキャナ、共鳴スキャナ、ＭＥＭＳスキャナ、または音響光学偏向器（ＡＯＤ；Ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｆｌｅｃｔｏｒ）を用いて達成することができる。この準同時的な照射には、両方の光シートの強度が自動的に同じ輝度になる、あるいは両方の光シートの強度を、各照射位置の継続時間にわたって調節することができるという利点がある。
【００５９】
音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ；Ａｃｏｕｓｔｏ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ）およびスキャナを利用すれば、軸方向に構造化された、すなわち光シートを超える照射を実現することができる。この光シートは軸方向に連続的にスキャンされ、同時に強度がフィルタを用いて、例えば正弦状に変調される。このように、軸方向にストライプ状の照射が生じる。ストライプの間隔とともに光シートの間隔が、変調周波数を介して制御される。全ての光シートの輝度が同等であり、光シートの間隔、すなわちストライプの間隔を非常に厳密に調節することができる。このように、任意の数の、好ましくは互いに対して等距離に位置する光シートを生成することができる。
【００６０】
別の変形例では、直線偏光が複屈折性結晶を用いて均等に分割される。この分割は、入射角度を介して良好に制御することができる。このように、結晶を用いて２枚の光シートを生成することができる。複数の複屈折性結晶を用いることによって、任意の偶数の光シートを設けることができる。
【００６１】
別の変形例では、セグメント・ミラーが使用される。各ミラー・セグメントは互いに対して平行ではなく、小さい角度を付けて配置されている。適切な撮像光学系が、２つの空間的に分離された光線を生成する。ミラー・セグメントの角度は撮像光学系とともに、光シートの軸方向の空間的な分離の程度を決定する。このように、光シートの任意の小さい間隔をも安定して設けることができる。個々のミラー・セグメントの角度を変更するとともに光シートの軸方向のずれを調節することができる電動式のミラー・セグメントが、従来技術では、例えば天文学および補償光学において知られている。
【００６２】
適切な偏光依存性のビーム・スプリッタによって、λ／２板との組合せにおいて、中間の光シートを生成することができるが、この光シートの出射角度がビーム・スプリッタの種類に依存している。
【００６３】
別の変形例では、空間光変調器を用いて、照射放射線経路内で放射線経路の位相および振幅が操作される。複雑な振幅分布を調節することによって、複数の光シートを生成することができる。同様に、一発展形態では、全空間方向での光シートのスキャンが行われる。
【００６４】
別の変形例では、互いに対して９０°の位相跳躍を有する二分割された位相板が、二重の光シートを生成する。
【符号の説明】
【００６５】
１…顕微鏡、２…試料、３…撮像光学系、４…励起放射線、４…光シート、４．１…第１の光シート、４．２…第２の光シート、５…撮像方向、６…検出装置、７…焦点面、８…励起方向、９…撮像方向、１０…蛍光マーカ、１１…蛍光マーカ、１３…輪郭、１４…撮像光学系、１５…検出器、１５．１…検出器、１５．２…検出器、１６…平面、１６．１…平面、１６．２…平面、１７…強度分布、１７．１…強度分布、１８…最大値、１８．１…最大値。
【図１】
2014224814.tif 000003
【図２】
2014224814.tif 000004
【図３】
2014224814.tif 000005
【図４】
2014224814.tif 000006
【図５】
2014224814.tif 000007
【図６】
2014224814.tif 000008
【図７】
2014224814.tif 000009
【図８】
2014224814.tif 000010
【図９】
2014224814.tif 000011
【図１０】
2014224814.tif 000012