(57)【要約】【課題】標的に対して高い薬剤活性を示し、かつ毒性が低い医薬を製造するのに好適に用いることができる分子複合体を提供する。【解決手段】モルテン・グロビュール状態を形成可能な蛋白質と、化学療法剤と、により形成される蛋白質−化学療法剤複合体を提供する。この蛋白質−化学療法剤複合体を、モルテン・グロビュール状態が形成された蛋白質と、化学療法剤とを共存させる工程を含む方法により製造する。化学療法剤としては、抗癌剤などを使用する。モルテン・グロビュール状態を形成可能な蛋白質としては、α−ラクトアルブミンなどを使用する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルテン・グロビュール状態を形成可能な蛋白質と、化学療法剤と、により形成される、蛋白質−化学療法剤複合体。
【請求項２】
前記化学療法剤が抗癌剤である、請求項１に記載の蛋白質−化学療法剤複合体。
【請求項３】
前記抗癌剤が、アドリアマイシン、パクリタキセル、ダウノマイシン、アクラシノマイシン、ピラルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン、ボルテゾミブ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メソトレキセート、５−ＦＵ、シクロフォスファミド、ブスルファン及びメルファランよりなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項２に記載の蛋白質−化学療法剤複合体。
【請求項４】
前記抗癌剤がアドリアマイシン又はパクリタキセルである、請求項２又は３に記載の蛋白質−化学療法剤複合体。
【請求項５】
前記蛋白質が、α−ラクトアルブミン、アポミオグロビン、β２ミクログロブリン及びミルクリゾチームよりなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の蛋白質−化学療法剤複合体。
【請求項６】
前記蛋白質がα−ラクトアルブミンである、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の蛋白質−化学療法剤複合体。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の蛋白質−化学療法剤複合体を有効成分として含有する医薬。
【請求項８】
モルテン・グロビュール状態を形成可能な蛋白質と、抗癌剤と、により形成される蛋白質−抗癌剤複合体を有効成分として含有する医薬。
【請求項９】
モルテン・グロビュール状態が形成された蛋白質と、化学療法剤とを共存させる工程を含む、蛋白質−化学療法剤複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛋白質−化学療法剤複合体及びその製造方法、並びに当該蛋白質−化学療法剤複合体を有効成分として含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌治療の一つの手法としては、抗癌剤を投与することによって、癌細胞の増殖を抑制し死滅を促す化学療法が知られている。
【０００３】
また近年、ヒトα−ラクトアルブミンとオレイン酸とにより形成された分子複合体（ＨＡＭＬＥＴ：Human α-lactalbumin made lethal to tumor cells）について報告がある（例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１参照）。ＨＡＭＬＥＴは、癌細胞の細胞死を選択的に誘導する作用を示すことが報告されており、この抗癌活性を利用した医薬の創製が試みられている。また、これまでの研究において、ＨＡＭＬＥＴ中のヒトα−ラクトアルブミンは、天然型のフォールディング状態とは異なり、二次構造は保持されているが三次構造が失われた状態であるモルテン・グロビュール状態（ＭＧ状態）を形成していることが示唆されている。また従来、オレイン酸などの不飽和脂肪酸には、癌細胞の細胞死を誘導する働きがあることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００１−５２４４９１号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／０８８８６９号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci USA.2000 Apr 11;97(8):4221-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗癌剤は、癌細胞の増殖を抑制又は死滅させる効果が高い反面、癌細胞だけでなく正常細胞に対しても作用して副作用を誘発しやすい。一方、抗癌剤の投与による副作用は極力抑えることが望ましく、そのためには、少ない投与量で高い抗癌活性（癌細胞に対する細胞死誘導活性）を発現するとともに、正常細胞に対しては細胞死誘導作用の影響が極力少ない医薬を開発することが求められている。このことは、抗癌剤に限らず、例えば抗菌剤や抗ウイルス薬などの他の化学療法剤に対しても同様のことが言える。
【０００７】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、標的に対して高い薬剤活性を示すとともに毒性が低い医薬を製造するのに好適に用いることができる新規な分子複合体を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＨＡＭＬＥＴにおいては、ヒトα−ラクトアルブミンが、オレイン酸を癌細胞内に運ぶキャリアとして機能し、オレイン酸によって抗癌作用が発現されているという仮説の下、α−ラクトアルブミンなどの蛋白質によって抗癌剤を癌細胞内に運ばせることに着目した。そして、蛋白質と化学療法剤とを用いて分子複合体を作製することを試みた。その結果、化学療法剤がα−ラクトアルブミンなどの特定の蛋白質と共に分子複合体を形成するとともに、得られた分子複合体が、化学療法剤を単独で投与する場合に比べて、標的に対しては高い薬剤活性を示す一方、正常細胞に対しては毒性が低いか又は同程度であることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明により以下の蛋白質−化学療法剤複合体及びその製造方法、並びに医薬が提供される。
【０００９】
（１）モルテン・グロビュール状態を形成可能な蛋白質と、化学療法剤と、により形成される、蛋白質−化学療法剤複合体。
（２）上記（１）において、化学療法剤が抗癌剤である、蛋白質−化学療法剤複合体。
（３）上記（２）において、抗癌剤が、アドリアマイシン、パクリタキセル、ダウノマイシン、アクラシノマイシン、ピラルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン、ボルテゾミブ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メソトレキセート、５−ＦＵ、シクロフォスファミド、ブスルファン及びメルファランからなる群より選ばれる少なくとも一種である、蛋白質−化学療法剤複合体。
（４）上記（３）において、抗癌剤がアドリアマイシン又はパクリタキセルである、蛋白質−化学療法剤複合体。
（５）上記（１）〜（４）において、蛋白質が、α−ラクトアルブミン、アポミオグロビン、β２ミクログロブリン及びミルクリゾチームよりなる群から選ばれる少なくとも一種である、蛋白質−化学療法剤複合体。
（６）上記（５）において、蛋白質がα−ラクトアルブミンである、蛋白質−化学療法剤複合体。
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の蛋白質−化学療法剤複合体を有効成分として含有する医薬。
（８）モルテン・グロビュール状態が形成された蛋白質と、化学療法剤とを共存させる工程を含む、蛋白質−化学療法剤複合体の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の蛋白質−化学療法剤複合体は、化学療法剤を単独で投与する場合に比べて、標的に対しては高い薬剤活性を示す一方、毒性については、低いか又は殆ど変わらない。したがって、本発明の蛋白質−化学療法剤複合体によれば、少ない投与量で高い治療効果を得ることができる。また、投与量を少なくできることから、副作用を極力抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アドリアマイシン及びHLA-ADM複合体の吸収スペクトルを示す図。
【図２】HLA-ADM複合体のマウス白血病由来株化細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
【図３】HLA-ADM複合体のマウス由来繊維芽細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
【図４】HLA-ADM複合体のヒト白血病由来細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
【図５】HLA-ADM複合体のヒト由来末梢血単核球細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
【図６】HLA-Paclitaxel複合体のマウス白血病由来株化細胞に対する細胞死誘導活性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の蛋白質−化学療法剤複合体は、モルテン・グロビュール状態を形成可能な蛋白質（以下、「特定蛋白質」ともいう。）と化学療法剤との分子複合体である。以下、本発明の蛋白質−化学療法剤複合体について詳細に説明する。
【００１３】
［特定蛋白質］
本発明における特定蛋白質は、フォールディング状態を変化させることにより、蛋白質の立体構造が形成されている状態(天然状態)と、立体構造が完全に失われた状態との間の中間状態として、蛋白質構造の少なくとも一部において三次構造は失われているが二次構造は安定に維持されている状態、所謂モルテン・グロビュール状態（ＭＧ状態）を形成する。ＭＧ状態と天然状態とは可逆的であり、天然状態の蛋白質を変性させることによりＭＧ状態が形成される。このような特定蛋白質としては、特に限定しないが、α−ラクトアルブミン、アポミオグロビン、β２ミクログロブリン及びミルクリゾチームよりなる群から選ばれる少なくとも一種であることが好ましく、α−ラクトアルブミンであることが特に好ましい。
【００１４】
特定蛋白質は、ＭＧ状態を形成可能である限り、その由来等は特に限定せず、ヒト由来であってもよいし、例えばウシ、ヒツジ、ヤギなどのヒト以外のその他の動物由来であってもよい。また、天然源から精製したものでもよいし、大腸菌や酵母等を用いて遺伝子工学的に発現させたものでもよい。特定蛋白質は、市販品としても入手することができる。また、特定蛋白質は、ＭＧ状態を形成可能である限り、天然型の蛋白質の断片を用いてもよい。例えばα−ラクトアルブミンは、主に母乳に含まれる分子量１．４万程度の球状蛋白質であるが、５３番目から１０３番目のアミノ酸配列を有する断片（分子量６，０００程度）、又は、α−ラクトアルブミンの１番目から４０番目のアミノ酸配列を有する断片と、１０４番目から１２３番目のアミノ酸配列を有する断片とをジスルフィド結合で連結した断片（分子量７，０００程度）において、オレイン酸と結合することにより天然型のα−ラクトアルブミンと同様にＭＧ状態を形成することが知られている。本発明の特定蛋白質としては、このようなＭＧ状態を形成可能な断片についても使用することができる。また更に、特定蛋白質は、生物学的に活性で安定である限り、天然蛋白質のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加及び挿入から選択されるいずれか、又はこれらを組み合わせた変異を有するものであってもよい。変異体である場合、相同性は少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。なお、「生物学的に活性で安定である」とは、天然型のアミノ酸配列に変異が加えられた状態において、フォールディング状態が変異前と変わらない、より具体的には、ＭＧ状態の形成能を保持していることを意味する。
【００１５】
［化学療法剤］
本発明の分子複合体を得るために使用する化学療法剤は、感染症、悪性腫瘍、自己免疫疾患などを対象とする化学療法に用いられているか、又は有用であることが示唆されている化合物であればよく、例えば抗癌剤、抗菌剤、抗真菌薬、抗ウイルス剤などが挙げられる。これらの中でも、化学療法剤としては抗癌剤を用いることが好ましく、その具体例としては、例えばアドリアマイシン、ダウノマイシン、ミトキサントロン等の抗癌性抗生物質；パクリタキセル、エトポシド、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン等の植物アルカロイド；メソトレキセート、５−ＦＵ等の代謝拮抗剤；アクラシノマイシン、ピラルビシン等のアントラサイクリン系抗癌剤；シクロフォスファミド、ブスルファン、メルファラン等のアルキル化剤；シスプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤；ボルテゾミブ等の分子標的薬；等が挙げられる。使用する抗癌剤として、より好ましくは、アドリアマイシン、パクリタキセル、ダウノマイシン、アクラシノマイシン、ピラルビシン、ミトキサントロン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、イリノテカン、ボルテゾミブ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メソトレキセート、５−ＦＵ、シクロフォスファミド、ブスルファン及びメルファランよりなる群から選ばれる少なくとも一種であり、特に、アドリアマイシン又はパクリタキセルであることが好ましい。アドリアマイシン及びパクリタキセルは、現在、癌治療の化学療法に用いられているか又は有用であることが示唆されている種々の抗癌剤の中でも疎水性が高い化合物であり、ＭＧ状態の蛋白質と共存させるだけで、当該蛋白質と容易に複合体を形成することができる点で有意である。また、一旦複合体が形成された後では、当該複合体を生理的条件下に戻した場合でも、その複合体構造を維持することができ、構造安定性が高い点においても優れている。
【００１６】
［蛋白質−化学療法剤複合体の製造］
本発明の蛋白質−化学療法剤複合体を得るための方法は特に限定しないが、例えば特定蛋白質のフォールディング状態を変化させて特定蛋白質をＭＧ状態に変性し（変性工程）、そのＭＧ状態が形成された蛋白質と化学療法剤とを、適当な溶媒の存在下で共存させ（共存工程）、好ましくは撹拌することにより行うことができる。このとき、特定蛋白質の変性処理をまず行い、その変性状態の特定蛋白質を含む溶液中に化学療法剤を添加することにより、ＭＧ状態の特定蛋白質と化学療法剤とを共存させてもよいし、あるいは、変性前の（天然状態の）特定蛋白質と化学療法剤とを適当な溶媒の存在下で混合した後、その得られた溶液を用いて、上記変性工程による特定蛋白質の変性処理を行うことにより、ＭＧ状態の特定蛋白質と化学療法剤とを共存させてもよい。
【００１７】
上記蛋白質−化学療法剤複合体の製造に際し、変性前又は変性後の特定蛋白質と化学療法剤とを混合する際の両者の混合割合は、特定蛋白質１モルに対して、化学療法剤の合計量が１〜６０モルとなる割合が好ましく、1０〜３０モルとなる割合がより好ましい。なお、化学療法剤としては、上記例示の化合物を一種単独で使用してもよいし、これら２種の混合物を使用してもよい。
【００１８】
特定蛋白質を変性する方法は特に限定せず、例えば酸処理、熱処理、変性剤の添加、脱カルシウム処理などの各種方法を一種単独で又は２種以上を組み合わせて行うことができる。ここで、酸処理の場合、例えばα−ラクトアルブミンについては、ｐＨ１．５〜３．０で行うことが好ましく、ｐＨ２．０が特に好ましい。アポミオグロビンについては、ｐＨ３．５〜４．５で行うことが好ましく、ｐＨ４．０が特に好ましい。β２ミクログロブリンについては、ｐＨ３．１〜４．２で行うことが好ましく、ｐＨ３．６が特に好ましい。ミルクリゾチームについては、ｐＨ１．５〜２．５で行うことが好ましく、ｐＨ２．０が特に好ましい。また、熱処理の場合、加熱温度は、４５〜７０℃であることが好ましく、５０〜６５℃であることがより好ましい。このときの加熱時間は、好ましくは５〜６０分であり、より好ましくは１０〜３０分である。
【００１９】
変性剤としては、蛋白質の変性処理に際し通常用いられるものであればよく、例えば尿素、グアニジン塩酸塩などを挙げることができる。また、脱カルシウム処理は、ＥＤＴＡなどのカルシウムキレート剤を用いて行うことができる。
変性方法としては、上記の中でも、ＭＧ状態の形成を容易に行うことができる点で酸処理が好ましく、特に高温下での酸処理により行う（若しくは、酸処理と熱処理とを併用する）ことが好ましい。この場合、変性後に化学療法剤と共存させる際に、ＭＧ状態の特定蛋白質の表面に露出した疎水的部分と、化学療法剤との結合（疎水結合）がより強くなり、複合体形成の促進化かつ構造の安定化を図ることができ好適である。
【００２０】
このようにして、本発明の蛋白質−化学療法剤複合体を含有する溶液が得られる。この溶液はそのまま医薬の調製に供してもよく、当該溶液から本発明の蛋白質−化学療法剤複合体を、例えば限外ろ過、脱溶媒処理などの方法により単離した後、これを医薬の調製に供してもよい。また、単離した蛋白質−化学療法剤複合体を、ゲルろ過、透析、膜分離、遠心分離などの通常用いられる方法で精製した後、その精製物を医薬の調製に供してもよい。
【００２１】
［医薬］
本発明の医薬は、上述した本発明の蛋白質−化学療法剤複合体、好ましくは蛋白質−抗癌剤複合体を有効成分として含有する。例えば蛋白質−抗癌剤複合体については、癌細胞に選択的に作用して癌細胞の細胞死を誘導する。したがって、当該蛋白質−抗癌剤複合体は、特に癌細胞の細胞死誘導薬の有効成分として、又は癌細胞の細胞死誘導薬を製造するために使用することができる。上記細胞死誘導薬による治療の対象となる疾患としては、例えば大腸癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、子宮癌などの固形腫瘍；白血病やリンパ腫などの血液悪性腫瘍；等が挙げられる。なお、本発明の医薬が対象とする疾患はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化の形態は特に限定せず、例えば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、座薬などが挙げられる。製剤化する場合には、上記蛋白質−化学療法剤複合体を有効成分として含むほか、医薬上許容される添加物を含むものであってもよい。このような添加物としては特に限定しないが、例えば薬剤担体、賦形剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、等張剤、希釈剤、結合剤などが挙げられ、具体的には、例えば水、生理食塩水、医薬上許容される有機溶媒、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリン酸、医薬上許容される界面活性剤、生体内で許容される生理的ｐＨの緩衝液等が挙げられる。添加物は、剤型や使用部位に応じて上記の中から適宜選択され又はそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の医薬には、本発明の蛋白質−化学療法剤複合体が、治療上有効な量含有される。好ましい範囲の有効成分量は剤型等によっても異なるが、製剤全体に対して、例えば０．１重量％〜１００重量％の範囲にすることができる。
【００２４】
上記医薬の投与方法としては、剤型や使用部位に応じて、経口投与又は非経口投与、あるいはそれらの組み合わせとすることができる。非経口投与の経路としては、例えば静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、経鼻などが挙げられる。
【００２５】
上記医薬の有効投与量は、期待される治療効果が得られるように適宜設定すればよく、一般に、剤型、投与方法、患者の症状、年齢、体重、投与スケジュールなどを考慮して設定される。成人を対象とする場合の一日当たりの有効成分量としては、体重１ｋｇ当たり例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇとなるように設定することができる。投与の間隔は、例えば１日１回〜数回、数日で１回などとすることができる。なお、有効投与量及び投与間隔はこれらに制限されるものではない。投与対象としては、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００２７】
［実施例１］
＜αラクトアルブミン−アドリアマイシン複合体の調製＞
ヒトα−ラクトアルブミン（市販品）１．５ｍｇをチューブに測り取り、これに超純水５００μｌを加えて溶解した。次いで、得られたヒトα−ラクトアルブミン水溶液に、２ｍｇ／ｍｌアドリアマイシン溶液を５００μｌ添加した。なお、２ｍｇ／ｍｌアドリアマイシン溶液は、アドリアマイシン（市販品）を生理食塩水に溶解して調製したものを用いた。次いで、得られた溶液を、１Ｎ塩酸でｐＨ２に調製し、６０℃で２０分間、ヒートブロックに静置した。静置している間は、１，２分おきにボルテックスミキサーで溶液を撹拌した。溶液を室温まで冷ました後、その溶液に超純水を約１０ｍｌ加え、２，５００Ｇ、２０℃、１０分の条件で遠心分離方式による限外ろ過を行った。この限外ろ過操作を３回繰り返した後、ろ過膜上の蛋白質含有溶液に２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液を約１０ｍｌ加え、２，５００Ｇ、２０℃、１０分の条件で遠心分離方式による限外ろ過を行った。この限外ろ過操作を４〜５回繰り返した後、ろ過膜上の蛋白質含有溶液を１５ｍｌチューブに移し、液体窒素で凍結した。その後、凍結乾燥機で凍結乾燥を行うことにより、赤色粉末（αラクトアルブミン−アドリアマイシン複合体）を得た。
【００２８】
＜吸収スペクトルの測定＞
上記で得られたαラクトアルブミン−アドリアマイシン複合体（HLA-ADM複合体）の吸収スペクトルを測定した。測定試料は、上記赤色粉末をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解して調製した。その測定結果を図１に示す。なお、ここでは、アドリアマイシンをPBSに溶解して調製した試料を用意し、これについても吸収スペクトルを測定した。その結果についても図１に併せて示す。
図１に示すように、上記赤色粉末（ＨＬＡ−ＡＤＭ、図中の実線）では、アドリアマイシンを単独の場合（ＡＤＭ、図中の一点鎖線）に比べて、吸収スペクトルが長波長側にシフトした。このことから、上記得られた赤色粉末では、アドリアマイシンが疎水的環境下にある、つまりα−ラクトアルブミンとアドリアマイシンとが複合体を形成していることが分かった。
【００２９】
＜癌細胞に対する細胞死誘導活性の評価（１）＞
上記得られたHLA-ADM複合体の癌細胞に対する細胞死誘導活性について評価した。評価は、CellQuanti-MTT Cell Viability Assay Kit（BioAssay Systems社製)を使用して、以下のようにして行った。まず、マウス白血病由来株化細胞（L1210）を、RPMI-1640培地（シグマ社製）に混濁し、２×106細胞cells／mlの細胞混濁液を調製した。この細胞混濁液を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり９０μｌずつ分注し、更に、下記のとおり調製した試料溶液を１０μｌずつ各ウェルに加えて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で静置した。試料溶液を加えた時点から３０分後に、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）を１０μｌずつ各ウェルに加え、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で静置した。試料溶液を添加してから７２時間後に、ＭＴＴ溶液を２０μｌずつ各ウェルに添加し、更に、ＭＴＴ溶液を添加してから３時間後に、Solubilization Solutionを１３０μｌずつ各ウェルに添加した。その後、Solubilization Solutionを添加してから３０分後に、プレートリーダにより５７０ｎｍの吸収を測定した。
【００３０】
（試料溶液の調製）
まず、上記で得られたHLA-ADM複合体の試料約０．３ｍｇをチューブに測り取り、これに生理食塩水１００μｌを加えて溶解した。この複合体溶液を、超純水を用いて更に１０倍希釈し、その希釈した溶液の吸光度を測定することにより、試料中におけるアドリアマイシンの濃度を測定した。なお、ここでは、１ｃｍセルを使用した場合の４８５ｎｍの吸収（ピークの吸収）が、アドリアマイシン１Ｍあたり１．２５×１０４であるとして、濃度計算を行った。活性評価に用いる試料溶液としては、アドリアマイシン濃度が異なる６種類の試料（0.1、0.25、0.5、1、2.5、5［μＭ］）を調製し、それぞれについて上記方法により活性測定を行った。その結果を図２に示す。なお、図２の横軸は、活性測定に用いた試料溶液中のアドリアマイシン濃度を示し、縦軸は、５７０ｎｍでの吸光度を示す。また、controlとして、PBSを試料溶液として用いた測定結果についても併せて図２に示す。
【００３１】
［比較例１］
HLA-ADM複合体の代わりに、アドリアマイシンを用いた以外は、上記実施例１と同様の方法により、癌細胞に対する細胞死誘導活性を測定した。その結果を図２に併せて示す。
［癌細胞に対する細胞死誘導活性の評価結果］
図２に示す結果から、HLA-ADM複合体は、マウス白血病由来細胞に対し、アドリアマイシン単独を投与する場合に比べて細胞死誘導活性が高いことが分かった。
【００３２】
＜正常細胞に及ぼす影響についての評価（１）＞
活性評価に用いる細胞を、マウス白血病由来株化細胞（L1210）に代えて、マウス由来繊維芽細胞（Balb c3T3 cell）を用いた点、及び試料溶液の濃度を1、2.5、5、10、25、50［μＭ］の６種類に変更した点以外は、上記実施例１及び比較例１と同様にして、細胞死誘導活性を評価した。それらの結果を図３に示す。なお、図３の横軸及び縦軸は図２と同じである。
図３に示す結果から、HLA-ADM複合体は、マウス由来正常細胞に対し、アドリアマイシンを単独で投与する場合に比べて細胞死誘導活性が低いことが分かった。
【００３３】
＜癌細胞に対する細胞死誘導活性の評価（２）＞
活性評価に用いる細胞を、マウス白血病由来株化細胞（L1210）に代えて、ヒト白血病由来細胞（K562 cell）を用いた点、試料溶液を添加してからＭＴＴ溶液を添加するまでの時間を７２時間から４８時間に変更した点、及び試料溶液の濃度を、10、30、100、300、1000［μg/ml］の５種類とした点以外は、上記実施例１及び比較例１と同様にして、細胞死誘導活性を評価した。それらの結果を図４に示す。なお、図４の横軸は、活性測定に用いた試料溶液中のアドリアマイシン濃度を示し、縦軸は、試料溶液としてPBSを用いたとき（アドリアマイシン濃度＝０μg/ml）の全細胞数に対する各試料溶液での生細胞数の割合［％］を示す。
図４に示す結果から、HLA-ADM複合体は、ヒト白血病由来細胞に対し、アドリアマイシンを単独で投与する場合に比べて細胞死誘導活性が高いことが分かった。
【００３４】
＜正常細胞に及ぼす影響についての評価（２）＞
活性評価に用いる細胞を、マウス白血病由来株化細胞（L1210）に代えて、ヒト由来の末梢血単核球細胞を用いた点、試料溶液を添加してからＭＴＴ溶液を添加するまでの時間を７２時間から４８時間に変更した点、及び試料溶液の濃度を、10、30、100、300、1,000、3,000、10,000、30,000［μg/ml］の８種類とした点以外は、上記実施例１及び比較例１と同様にして、細胞死誘導活性を評価した。その結果を図５に示す。なお、図５の横軸及び縦軸は図４と同じである。
図５に示す結果から、HLA-ADM複合体は、ヒト由来の抹消血単核球細胞に対しては、アドリアマイシン単独とほぼ同様の細胞死誘導活性を示すことが分かった。
【００３５】
［実施例２］
＜αラクトアルブミン−パクリタキセル複合体の調製及び活性測定＞
アドリアマイシンに代えてパクリタキセルを用いた点以外は、上記実施例１と同様の方法により、αラクトアルブミン−パクリタキセル複合体（HLA-Paclitaxel複合体）を調製した。また、得られたHLA-Paclitaxel複合体を用いて、試料溶液の濃度を、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1［μg/ml］の６種類とした点以外は、上記実施例１と同様の方法により、癌細胞に対する細胞死誘導活性を測定した。活性測定は、マウス白血病由来株化細胞（L1210）を用いて行った。その測定結果を図６に示す。なお、図６の横軸は、活性測定に用いた試料溶液中のパクリタキセル濃度を示し、縦軸は、試料溶液としてPBSを用いたとき（パクリタキセル濃度＝０μg/ml）の全細胞数に対する各試料溶液での生細胞数の割合［％］を示す。
【００３６】
［比較例２］
HLA-Paclitaxel複合体に代えて、パクリタキセルを用いた以外は、上記実施例２と同様の方法により、癌細胞に対する細胞死誘導活性を測定した。その結果を図６に併せて示す。
［癌細胞に対する細胞死誘導活性の評価結果］
図６に示す結果から、HLA-Paclitaxel複合体についても、マウス白血病由来細胞に対し、パクリタキセルを単独で投与する場合に比べて細胞死誘導活性が高いことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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