(57)【要約】【課題】  使用可能期間が十分に長い餌料用クロレラ及び餌料用クロレラを製造する方法を提供する。【解決手段】  ｐＨ調整剤の添加操作が終了すると、クロレラの細胞自体に影響を及ぼすことなく、クロレラの各細胞間に残存する残留水を更に分離除去する固液分離操作を実施して残留水分を調整することによって、クロレラの塊であるペレット、すなわち餌料用クロレラを得る（ステップＳ７）。固液分離の条件、すなわち遠心分離の条件又は真空脱水の条件は、ペレットの乾質量／湿質量の値が略１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下、好ましくは略２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように設定する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類に与える動物性プランクトンの餌料として使用する餌料用クロレラにおいて、
クロレラを培養した液体培地と当該液体培地にて培養されたクロレラとを固液分離してなり、残留水分が乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整してあることを特徴とする餌料用クロレラ。
【請求項２】
更に残留水分が、乾質量／湿質量の値で２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整してある請求項１記載の餌料用クロレラ。
【請求項３】
適宜量のｐＨ調整剤が添加してある請求項１又は２記載の餌料用クロレラ。
【請求項４】
魚類に与える動物性プランクトンの餌料として使用する餌料用クロレラを製造する場合、
適宜組成の液体培地でクロレラを培養し、得られた培養液を濃縮して濃縮クロレラを得、得られた濃縮クロレラについて更に固液分離する操作をこの順に実施するに際して、
濃縮クロレラを更に固液分離するに際して、残留水分が乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整する
ことを特徴とする餌料用クロレラの製造方法。
【請求項５】
前記濃縮クロレラに適宜量のｐＨ調整剤を添加し、その後、更に固液分離する請求項４記載の餌料用クロレラの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物性プランクトンの餌料として使用する餌料用クロレラ、及び該餌料用クロレラを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類は健康志向に合致する食材であるのに加え、人口増加に伴って蛋白質源を確保するための貴重な資源であるので、多くの国々で魚類の養殖が行われている。魚類の養殖方法としては、漁場で捕獲した稚魚を水槽内に入れ、この稚魚に給餌して成魚へ成長させて出荷する畜養という方法と、親魚から採取した卵を受精・孵化させ、得られた仔魚に給餌して成魚まで成長させて出荷する方法とが行われている。しかし、前者の養殖方法では、稚魚の捕獲量が増大するに従って漁場における漁業資源の枯渇を招来する虞があるため、世界的に規制が強化されつつある。そのため、後者の養殖方法が注目されているが、後者の養殖方法にあっては、孵化させた仔魚をいかに高い歩留まりで成魚まで成育させ得るかが重要である。
【０００３】
仔魚の歩留まりを高めるためには仔魚に与える餌料が重要であるが、仔魚の餌料としては、シオミズツボワムシ（Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ  Ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）（以後、単にワムシともいう。）及びミジンコ等、生きた状態の動物性プランクトンが不可欠であった。なかでもワムシが仔魚の餌料として多く用いられているが、このワムシを培養するために用いる餌料として従来より、海洋性植物プランクトンであるナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、パン酵母、又は濃縮クロレラが単一又は相互に組み合わせて用いられていた。
【０００４】
しかし、前述したナンノクロロプシスにあっては、光合成培養でしか増殖させることができないため生産性が低いという問題があった。また、パン酵母にあってはワムシの成育に必要な栄養素が不足することから、ワムシの大量へい死を招来する。
【０００５】
これに対して淡水性のクロレラにあっては、暗培養が可能であるため生産性が高く、またパン酵母に比べて蛋白質含有量が高いため餌料価値も高いので、ワムシの餌料として好適である。
【０００６】
そこで、本出願人は、クロレラにビタミンＢ１２を含有させてなる濃縮クロレラ（製品名「生クロレラＶ−１２」）、またクロレラに高度不飽和脂肪酸を更に含有させてなる濃縮クロレラ（製品名「スーパー生クロレラＶ−１２」）を開発している（非特許文献１及び特許文献１参照。）。
【０００７】
更に、このような濃縮クロレラを用いて、ワムシを高密度に大量培養する技術も開発されている（特許文献２参照。）。
【０００８】
なお、前述した濃縮クロレラの濃度は、略１３５ｇ（乾質量）／Ｌである。
【０００９】
しかしながら、濃縮クロレラは５℃前後の温度で冷蔵保存した場合であっても、餌料として使用し得る使用可能期間が６週間程度と比較的短いという問題があった。クロレラの保存性を向上させるためには、濃縮クロレラを凍結する方法、又はクロレラを乾燥末にする方法が考えられるが、凍結物を解凍する際、又は乾燥末が膨潤する際にクロレラの細胞内物質が細胞外へ溶出してしまう。また、加熱して乾燥末にする場合にあっては、ワムシの成育に必要な主栄養成分である蛋白質に変性を来し易い。このように、いずれの方法にあっても餌料価値が著しく低下するため、これらの方法を適用することは困難であった。
【００１０】
一方、本出願人は後記する特許文献３において、濃縮クロレラを冷蔵保存すると、そのｐＨが経時的に低下するという知見に基づいて、炭酸水素ナトリウムといった制酸剤を添加することによって、濃縮クロレラの使用可能期間を延長させる技術を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第３０９６６５４号公報
【特許文献２】特許第２６６８１０７号公報
【特許文献３】特開平１０−２９５２８５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】IsaoMaruyama,et al.”Uptake of Vitamin B12 by Various Strains ofUnicellular Algae Chlorella”,Nippon Suisan Gakkaishi,55(10),1785-1790(1989)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、制酸剤を添加するだけでは、使用可能期間の延長効果が十分ではなかった。
【００１４】
本発明は斯かる事情に鑑みてなされたものであって、使用可能期間が十分に長い餌料用クロレラ、及び該餌料用クロレラを製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（１）本発明に係る餌料用クロレラは、魚類に与える動物性プランクトンの餌料として使用する餌料用クロレラにおいて、クロレラを培養した液体培地と当該液体培地にて培養されたクロレラとを固液分離してなり、残留水分が乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整してあることを特徴とする。
【００１６】
本発明の餌料用クロレラにあっては、クロレラを培養した液体培地と当該液体培地にて培養されたクロレラとを固液分離してなり、残留水分が乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整してある。ここで、固液分離は遠心分離機又は真空脱水機を用いて実施することができ、遠心分離又は真空脱水の条件を調整することにより、遠心分離又は真空脱水によって得られるクロレラの塊であるペレットに残留する水分が、ペレットの乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるようにしてある。
【００１７】
得られたペレットの乾質量／湿質量の値が１８０ｇ／ｋｇ未満であった場合、固液分離が不十分であるため、保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができず、使用可能期間を十分に延長させることができない。一方、ペレットの乾質量／湿質量の値が２５０ｇ／ｋｇを超えた場合、固液分離が過度に行われたために、クロレラの細胞内の水分の一部が外へ放出されてしまい、それに伴ってクロレラの細胞壁が損傷してしまうため、保存中のクロレラの生残率が低い。
【００１８】
これに対して本発明に係る餌料用クロレラのように、得られたペレットの乾質量／湿質量の値が１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下であった場合、所要の固液分離が行われるため、クロレラの各細胞間に残存する残留水を可及的に低減することができ、これによって保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができる。一方、過度な固液分離操作が回避されるため、クロレラの細胞に損傷が生じず、保存中のクロレラの生残率も高い。従って、かかる餌料用クロレラの使用可能期間は十分に長い。
【００１９】
（２）本発明に係る餌料用クロレラは、更に残留水分が、乾質量／湿質量の値で２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整してあることを特徴とする。
【００２０】
本発明の餌料用クロレラにあっては、更に残留水分が、乾質量／湿質量の値で２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整してあるため、長期間保存した場合であってもより高い生残率を維持することができる。
【００２１】
（３）本発明に係る餌料用クロレラは、適宜量のｐＨ調整剤が添加してあることを特徴とする。
【００２２】
本発明の餌料用クロレラにあっては、適宜量のｐＨ調整剤が添加してあるため、保存中にｐＨが低下することを更に抑制することができ、これによって餌料用クロレラの使用可能期間を更に延長させることができる。ここで、ｐＨ調整剤としては制酸剤又は緩衝剤を用いることができるが、制酸剤を用いた場合の方がｐＨ調整作用が大きいため好適である。制酸剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム等を用いることができるが、安全性の観点から炭酸水素ナトリウムを用いるのが好適である。
【００２３】
（４）本発明に係る餌料用クロレラの製造方法は、魚類に与える動物性プランクトンの餌料として使用する餌料用クロレラを製造する場合、適宜組成の液体培地でクロレラを培養し、得られた培養液を濃縮して濃縮クロレラを得、得られた濃縮クロレラについて更に固液分離する操作をこの順に実施するに際して、濃縮クロレラを更に固液分離するに際して、残留水分が乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように調整することを特徴とする。
【００２４】
本発明の餌料用クロレラの製造方法にあっては、適宜組成の液体培地でクロレラを培養し、得られた培養液を濃縮して濃縮クロレラを得、得られた濃縮クロレラについて更に固液分離する操作をこの順に実施する。ここで、液体培地としては単細胞微細藻類が増殖し得る組成のものであればよい。また、濃縮操作は連続遠心機によって実施することができ、濃縮クロレラの固液分離操作は、遠心分離機又は真空脱水機を用いて実施することができる。
【００２５】
この固液分離操作において、遠心分離又は真空脱水の条件を調整することにより、遠心分離又は真空脱水によって得られるペレットに残留する水分が、ペレットの乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるようにする。
【００２６】
前同様、固液分離操作の条件が、ペレットの乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ未満にした場合、固液分離が不十分であるため、保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができず、使用可能期間を十分に延長させることができない。一方、固液分離操作の条件が、ペレットの乾質量／湿質量の値で２５０ｇ／ｋｇを超えた場合、固液分離が過度に行われるために、クロレラの細胞内の水分の一部が外へ放出されてしまい、それに伴ってクロレラの細胞壁が損傷してしまうため、保存中のクロレラの生残率が低い。
【００２７】
これに対して、固液分離操作の条件が、ペレットの乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下であった場合、所要の固液分離が行われるため、クロレラの各細胞間に残存する残留水を可及的に低減することができ、これによって保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができる。一方、過度な固液分離操作が回避されるため、クロレラの細胞に損傷が生じず、保存中のクロレラの生残率も高い。従って、かかる餌料用クロレラの使用可能期間は十分に長い。
【００２８】
（５）本発明に係る餌料用クロレラの製造方法は、前記濃縮クロレラに適宜量のｐＨ調整剤を添加し、その後、更に固液分離することを特徴とする。
【００２９】
本発明の餌料用クロレラの製造方法にあっては、濃縮クロレラに適宜量のｐＨ調整剤を添加し、その後、更に固液分離する。ｐＨ調整剤としては、制酸剤又は緩衝剤を用いることができるが、制酸剤を用いた場合の方がｐＨ調整作用が大きいため好適である。制酸剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム等を用いることができるが、安全性の観点から炭酸水素ナトリウムを用いるのが好適である。
【００３０】
このように、更に固液分離する前の十分に流動性を有する濃縮クロレラにｐＨ調整剤を添加するため、濃縮クロレラ中のｐＨ調整剤の濃度を容易に均一化することができる。従って、固液分離して得られるペレット内においても、ｐＨ調整剤の濃度は均一である。一方、濃縮クロレラの体積は培養液の体積より小さいため、ｐＨ調整剤の使用量を可及的に少なくすることができる。ところで、このようにｐＨ調整剤を添加することによって、保存中にｐＨが低下することを更に抑制することができ、これによって餌料用クロレラの使用可能期間を更に延長させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に係る餌料用クロレラの製造手順を示すフローチャートである。
【図２】炭酸水素ナトリウムを添加していない餌料用クロレラについて、保存後のクロレラの生残率を測定した結果を示すグラフである。
【図３】炭酸水素ナトリウムを添加した餌料用クロレラについて、保存後のクロレラの生残率を測定した結果を示すグラフである。
【図４】冷蔵保存中における餌料用クロレラの生残率の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図５】冷蔵保存中における餌料用クロレラの染色率の変化を測定した結果を示すグラフである。
【図６】冷蔵保存中における餌料用クロレラのｐＨの変化を測定した結果を示すグラフである。
【図７】本発明例２の餌料用クロレラを用いてワムシを培養した結果を示すグラフである。
【図８】対照例３の餌料を用いてワムシを培養した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以後、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図１は本発明に係る餌料用クロレラの製造手順を示すフローチャートである。
スラント上又は保存液中に保存したクロレラを坂口フラスコといった培養容器内の液体培地に植菌し、当該クロレラの至適温度、例えば２８℃で１０日程度振盪培養する、前培養を実施する（ステップＳ１）。
【００３３】
ここで、液体培地としては単細胞微細藻類が増殖し得る組成のものであればよく、例えばグルコース、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、アーノンＡ５溶液（Ａｒｎｏｎ‘ｓ  Ａ５）、及び尿素にて構成することができる。なお、前培養は１段だけでなく、後述する本培養に応じて、培養液の容量を段階的に拡大する多段培養を行ってもよい。
【００３４】
前培養によって種培養液が得られると、所要容量の前記液体培地が入った培養タンクに種培養液を投入し、クロレラの至適温度で３日程度撹拌培養する、本培養を実施する（ステップＳ２）。このとき、適宜のタイミングでドコサヘキサエン酸といった高度不飽和脂肪酸を培養液に添加して、高度不飽和脂肪酸をクロレラに取り込ませるようにしてもよい。これによって、仔魚の成育に必要な高度不飽和脂肪酸が餌料用クロレラからワムシに取り込まれ、当該ワムシから仔魚に取り込まれるようになるため好適である。また、液体培地には前述した組成に加えて更にビタミンＢ１２を添加しておくと、かかる環境で培養された餌料用クロレラを取り込んだワムシの増殖が促進されるため好適である。
【００３５】
本培養が終了すると、培養液を例えば連続遠心分離機に供給して、該連続遠心分離機によって液体培地を除くことによってクロレラを濃縮する（ステップＳ３）。このとき、濃縮に先立って、培養液を爆気するとよい。これによって取り込まれたグルコースや高度不飽和脂肪酸が細胞内で効率よく代謝され、ドコサヘキサエン酸といった高度不飽和脂肪酸を含む高タンパク質な細胞へと変化させることができる。
【００３６】
次いで、濃縮したクロレラを予め用意した洗浄液内へ投入し、撹拌することによってクロレラを洗浄する（ステップＳ４）。洗浄液としては井水、水道水又は蒸留水等を用いることができる。また、洗浄液として、このような水に塩類、糖類又は糖アルコール、静菌剤等を適宜濃度となるように溶解させた溶液を用いてもよい。溶液の濃度は、例えばクロレラの浸透圧に応じて定めることができるが、これに限られない。
【００３７】
適宜時間撹拌した後、再び前同様の濃縮操作を実施して濃縮クロレラを得る（ステップＳ５）。更に、ステップＳ４の洗浄操作とステップＳ５の濃縮操作とを２〜３回程度繰り返して、液体培地を可及的に除去した濃縮クロレラを得る。
【００３８】
次に、このようにして得られた濃縮クロレラに必要に応じて、適宜量のｐＨ調整剤を添加する（ステップＳ６）。これによって、後述するように餌料用クロレラの保存中に当該餌料用クロレラのｐＨが急激に低下することを抑制することができる。ｐＨ調整剤としては制酸剤又は緩衝剤を用いることができるが、制酸剤を用いた場合の方がｐＨ調整作用が大きいため好適である。ここで、制酸剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム等を用いることができるが、安全性の観点から炭酸水素ナトリウムを用いるのが好適である。なお、炭酸水素ナトリウムを用いる場合、１ｋｇの濃縮クロレラに対して略３ｇ〜略１５ｇになるように添加する。
【００３９】
ｐＨ調整剤の添加操作が終了すると、クロレラの細胞自体に影響を及ぼすことなく、クロレラの各細胞間に残存する残留水を更に分離除去する固液分離操作を実施して残留水分を調整することによって、クロレラの塊であるペレット、すなわち餌料用クロレラを得る（ステップＳ７）。この餌料用クロレラはペースト状をなしている。
【００４０】
かかる固液分離操作は、遠心分離機又は真空脱水機を用いて実施することができる。ここで、固液分離の条件、すなわち遠心分離の条件又は真空脱水の条件は、ペレットの乾質量／湿質量の値が略１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下、好ましくは略２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように設定する。
【００４１】
得られたペレットの乾質量／湿質量の値が１８０ｇ／ｋｇ未満であった場合、固液分離が不十分であるため、保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができず、使用可能期間を十分に延長させることができない。一方、ペレットの乾質量／湿質量の値が２５０ｇ／ｋｇを超えた場合、保存中のクロレラの生残率が低い。これは、固液分離が過度に行われたために、クロレラの細胞内の水分の一部が外へ放出されてしまい、それに伴ってクロレラの細胞壁に損傷を受けるためであると考えられる。
【００４２】
これに対して、得られたペレットの乾質量／湿質量の値が略１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下であった場合、所要の固液分離が行われるため、クロレラの各細胞間に残存する残留水を可及的に低減することができ、従って保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができる。一方、過度な固液分離操作が回避されるため、クロレラの細胞に損傷が生じず、従って保存中のクロレラの生残率も高い。
【００４３】
更に好適には、遠心分離の条件又は真空脱水の条件を、得られたペレットの乾質量／湿質量の値が２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になるように設定する。これによって、より長期間保存した場合であっても高い生残率を維持することができる。
【００４４】
ここで、本発明においてペレットを含む試料の乾質量／湿質量の値は次のようにして求める。すなわち、恒量した恒量管内に略１ｇの試料を投入して、恒量管及び試料を精秤し、精秤された値から恒量管の恒量を減じることによって、試料の湿質量を求める。次に、適宜量の純水を恒量管内へ入れて試料を洗浄した後、遠心分離機を用いて試料を遠心分離し、上清を廃棄する。次で、恒量管及び試料を１０５°で１８時間、常圧乾燥することによって水分を除去した後、恒量管及び試料をデシケータ中に格納して室温まで冷却させる。室温まで冷却すると、恒量管及び試料を精秤し、精秤された値から恒量管の恒量を減じることによって、試料の乾質量を求める。このようにして得られた乾質量と湿質量との比から、湿質量１ｋｇ当たりの乾質量の質量（ｇ）を求める。
【００４５】
このようにして更なる固液分離操作が終了すると、図１に示したように、得られた餌料用クロレラを所定質量ずつ成形・包装し又は適宜の容器内に充填するパッケージングを行い（ステップＳ８）、それらを５℃以下の温度で氷結しないように保存する（ステップＳ９）。
【００４６】
このように本発明に係る餌料用クロレラにあっては、前述したように固液分離操作の条件が、ペレットの乾質量／湿質量の値で１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下になしてあるので、所要の固液分離が行われ、クロレラの各細胞間に残存する残留水を可及的に低減することができ、これによって保存中にｐＨの低下を十分に抑制することができる。一方、過度な固液分離操作が回避されるため、クロレラの細胞に損傷が生じず、保存中のクロレラの生残率も高い。従って、かかる餌料用クロレラの使用可能期間は十分に長い。
【００４７】
また、ｐＨ調整剤を添加した場合は、保存中のｐＨ低下を更に抑制することができ、使用可能期間を更に延長させることができる。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）
次に、比較試験を行った結果について説明する。
【００４９】
暗培養基礎培地２００ｍｌを入れた５００ｍｌ容坂口フラスコに、保存スラントからクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）を植菌して、２８℃、暗状態で振盪培養した。なお、暗培養基礎培地の組成は次の通りである。グルコースが２０ｇ／Ｌであり、リン酸カリウムが０．５ｇ／Ｌであり、硫酸マグネシウムが０．５ｇ／Ｌであり、尿素が１．５ｇ／Ｌであり、Ｆｅ・ＥＤＴＡが１．２ｍｇ／Ｌであり、アーノンＡ５（１０倍濃縮）が０．３ｍｌ／Ｌである。ここで、アーノンＡ５溶液（１０倍濃縮）の組成は、Ｈ３ＢＯ３が２８．６ｇ／Ｌであり、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１８．１ｇ／Ｌであり、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏが２．２ｇ／Ｌであり、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏが０．８ｇ／Ｌであり、Ｎａ２ＭｏＯ４が０．２１ｇ／Ｌであり、濃硫酸が１０滴である。
【００５０】
前述した培養は、ブドウ糖検査用試験紙（例えば、ダイアスティックス：バイエル薬品株式会社製）を用いて、培地中のグルコースを測定し、グルコースが全て資化されるまで行った。グルコースが全て資化されると、培養液の全量を暗培養基礎培地を入れた１０Ｌジャーファーメンタに投入して、前同様、２８℃でグルコースが全て資化されるまで通気撹拌培養を行った。
【００５１】
グルコースが全て資化されると、培養液の全量を１００Ｌジャーファーメンタに投入して、前同様、２８℃でグルコースが全て資化されるまで通気撹拌培養を行った。なお、このときの液体培地の組成は次の通りである。グルコースが８０ｇ／Ｌであり、リン酸カリウムが２ｇ／Ｌであり、硫酸マグネシウムが２ｇ／Ｌであり、尿素が６ｇ／Ｌであり、Ｆｅ・ＥＤＴＡが４．８ｍｇ／Ｌであり、アーノンＡ５溶液（１０倍濃縮）が１．２ｍｌ／Ｌである。次に、グルコースが全て資化されたタイミングで、ドコサヘキサエン酸（例えばＤＨＡ６０ＦＡ：兼松食品株式会社製）を例えば１．５ｇ／Ｌとなるように培養液中へ投入して高度不飽和脂肪酸をクロレラに取り込ませた。
【００５２】
このようにして培養が終了すると、培養液を十分に爆気した後、ドラバル型遠心分離機（例えば、サイトウ式遠心分離機Ｙ−２５０／２型：斉藤遠心機工業株式会社製）を用いて連続的に遠心分離することによってクロレラを濃縮した。次いで、水道水を用いてクロレラを洗浄した後に再び濃縮する操作を３回繰り返し、スラリー状の濃縮クロレラを得た。次いで、この濃縮クロレラにビタミンＢ１２を３７０μｇ／Ｌ加えた。なお、得られた濃縮クロレラの乾質量／湿質量の値は１００ｇ／ｋｇであった。
【００５３】
この濃縮クロレラについて遠心分離機を用いて、２５００〜９８００ｒｐｍで１０分〜３０分遠心分離することによって更に固液分離し、乾質量／湿質量の値が１５０ｇ／ｋｇ、２００ｇ／ｋｇ、２５０ｇ／ｋｇ、２６０ｇ／ｋｇである餌料用クロレラをそれぞれ調製した。
【００５４】
そして、各餌料用クロレラを３〜５℃の温度で数週間保存期間を異ならせて冷蔵保存し、保存後のクロレラの生残率をそれぞれ測定した。なお、生残率は、冷蔵保存前の餌料用クロレラ及び冷蔵保存後の餌料用クロレラについてそれぞれ、平板寒天培地上に生育したコロニーの出現数を測定して算出した。平板寒天培地の組成は、酵母エキスが２．５ｇ／Ｌであり、ペプトンが５．０ｇ／Ｌであり、ブドウ糖が１．０ｇ／Ｌであり、寒天が１５．０ｇ／Ｌである。この平板寒天培地に餌料用クロレラを塗布し、２５℃の温度で７日間培養後のコロニー数を計測した。なお、対象例として濃縮クロレラについても同様に、冷蔵保存後の生残率を測定した。
【００５５】
また、前述した濃縮クロレラに炭酸水素ナトリウム（重炭酸ナトリウム（食添用）：東ソー株式会社製）を１ｋｇの濃縮クロレラに対して５ｇになるように添加・溶解させた以外は前同様の操作を行って、乾質量／湿質量の値が１５０ｇ／ｋｇ、２００ｇ／ｋｇ、２５０ｇ／ｋｇ、２６０ｇ／ｋｇである餌料用クロレラをそれぞれ調製し、これらの餌料用クロレラについても前同様、冷蔵保存に対する生残率を測定した。
【００５６】
図２は、炭酸水素ナトリウムを添加していない餌料用クロレラについて、保存後のクロレラの生残率を測定した結果を示すグラフであり、縦軸は生残率を、横軸は餌料用クロレラの乾質量／湿質量の値をそれぞれ示している。また、図３は、炭酸水素ナトリウムを添加した餌料用クロレラについて、保存後のクロレラの生残率を測定した結果を示すグラフである。なお、両図中、白抜き菱形印は４週間冷蔵保存した結果を、白抜き四角印は６週間冷蔵保存した結果を、白抜き三角印は８週間冷蔵保存した結果を、バツ印は１０週間冷蔵保存した結果を、星印は１２週間冷蔵保存した結果を、白抜き丸印は１４週間冷蔵保存した結果をそれぞれ示している。
【００５７】
図２から明らかなように、炭酸水素ナトリウムを添加しない場合、乾質量／湿質量の値が１５０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラにあっては、５０％以上の生残率が維持できるのは保存期間が４週間程度までが限度であり、保存期間が６週間以上では殆ど生存していなかった。
【００５８】
これに対して、乾質量／湿質量の値が略１８０ｇ／ｋｇ以上の餌料用クロレラでは、保存期間が６週間でも５０％以上の生残率であり、更に乾質量／湿質量の値が略２２０ｇ／ｋｇ以上の餌料用クロレラでは、保存期間が１０週間でも５０％以上の生残率であった。
【００５９】
一方、乾質量／湿質量の値が２６０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラにあっては、いずれの保存期間であっても、乾質量／湿質量の値が２５０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラの生残率より低下していた。これは、固液分離が過度に行われたために、クロレラの細胞内の水分の一部が外へ放出されてしまい、それに伴ってクロレラの細胞壁に損傷を受けたためであると考えられる。このような餌料用クロレラにあっては、外力によって各細胞が容易に破裂するため、例えば動物性プランクトンに給餌すべく動物性プランクトンの水槽に投入された際の衝撃によって各細胞が破裂する虞がある。そのため、餌としては不適であると考えられる。
【００６０】
また、図３から明らかなように、炭酸水素ナトリウムを添加した場合、全ての餌料用クロレラについて、いずれの保存期間であっても、炭酸水素ナトリウムを添加しない場合に比べて生残率が上昇していたが、乾質量／湿質量の値が１５０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラにあっては、５０％以上の生残率が維持できるのは保存期間が６週間程度までが限度であり、保存期間が８週間以上では殆ど生存していなかった。
【００６１】
これに対して、乾質量／湿質量の値が略１８０ｇ／ｋｇ以上の餌料用クロレラでは、保存期間が８週間でも５０％以上の生残率であり、更に乾質量／湿質量の値が略２２０ｇ／ｋｇ以上の餌料用クロレラでは、保存期間が１２週間でも５０％以上の生残率であった。
【００６２】
一方、乾質量／湿質量の値が２６０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラにあっては、いずれの保存期間であっても、乾質量／湿質量の値が２５０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラの生残率より低下していた。
【００６３】
以上の結果より、炭酸水素ナトリウムの有無に拘わらず、餌料用クロレラは乾質量／湿質量の値で略１８０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下であることが好ましく、乾質量／湿質量の値で略２２０ｇ／ｋｇ以上２５０ｇ／ｋｇ以下であることが更に好ましいことが分かる。
【００６４】
（実施例２）
次に、冷蔵保存中における餌料用クロレラの生残率、染色率及びｐＨの変化をそれぞれ測定した結果について説明する。
【００６５】
実施例１で説明した操作と同様の操作を実施して乾質量／湿質量の値が１３５ｇ／ｋｇの濃縮クロレラを得た。この濃縮クロレラから一部を分取して対照例１の試料とした。残りの濃縮クロレラに炭酸水素ナトリウムを前同様の濃度になるように溶解させた後、その一部を分取して、３３００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって乾質量／湿質量の値が２５０ｇ／ｋｇの餌料用クロレラを得、これを本発明例１の試料とした。また、残りの濃縮クロレラを対照例２の試料とした。
【００６６】
これらの試料をチャック付きのポリ塩化ビニル製の容器に詰めて、５℃の温度で冷蔵保存した。そして、経時的に各容器からその一部を分取して、クロレラの生残率、染色率及びｐＨを測定した。なお、生残率は前同様の方法によって測定した。また、染色率は、分取した試料を顕微鏡下で計数できる程度に水で希釈した後に、０．５％のローズベンガル溶液を適量添加し、染色されたクロレラの細胞及び全細胞をそれぞれ計数して、染色された細胞の割合を求めるローズベンガル染色法によって行った。この方法では死細胞が選択的に染色される。一方、ｐＨは、濃縮クロレラについてはそのままの状態のものをｐＨメータにて直接測定し、餌料用クロレラについては乾質量／湿質量の値が濃縮クロレラと同じになるように純水を加えて均一化させたものをｐＨメータにて測定した。
【００６７】
図４は冷蔵保存中における餌料用クロレラの生残率の変化を測定した結果を示すグラフであり、図５は冷蔵保存中における餌料用クロレラの染色率の変化を測定した結果を示すグラフであり、図６は冷蔵保存中における餌料用クロレラのｐＨの変化を測定した結果を示すグラフである。なお、これらの図中、白抜き菱形印は対照例１を、白抜き四角印は対照例２を、白抜き三角印は本発明例１をそれぞれ示している。
【００６８】
図４から明らかなように、炭酸水素ナトリウムを添加しない対照例１にあっては、保存期間が３週間を経過すると生残率が急速に低下し、保存期間が５週間程度で生残率が２０％を下回っていた。また、炭酸水素ナトリウムを添加した対照例２にあっては、対照例１に比べて保存期間が長い領域にグラフがシフトしているものの、保存期間が４週間を経過すると生残率が急速に低下し、保存期間が７週間で生残率が２０％程度であった。これに対して、本発明例１にあっては、生残率が経時的に緩やかに低下しており、保存期間が１２週間の場合であっても生残率は５０％以上であった。
【００６９】
また、図５から明らかなように、対照例１及び２、並びに本発明例１のいずれにあっても、ローズベンガルで染色された死細胞の染色率の変化は、図４に示した各生残率の変化にそれぞれ相対応していた。
【００７０】
一方、図６から明らかなように、炭酸水素ナトリウムを添加しない対照例１にあっては、保存直後からｐＨが急速に低下し、保存期間が１週間でｐＨ５．３程度まで低下していた。そして、保存期間が５週間を過ぎると、ｐＨは５．０を下回っていた。また、炭酸水素ナトリウムを添加した対照例２にあっても、保存直後からｐＨが低下し、保存期間が１週間でｐＨ６．１程度まで低下していた。そして、保存期間が４週間を過ぎるとｐＨは６．０を下回り、保存期間が７週間を過ぎるとｐＨは５．５を下回っていた。これに対して、本発明例１にあっては、ｐＨが経時的に緩やかに低下するものの、保存期間が１２週間の場合であってもｐＨは６．４程度に維持されており、保存期間が１８週間まではｐＨ６．０以上に維持されていた。
【００７１】
（実施例３）
次に、クロレラの生残率が動物性プランクトンの増殖に与える影響について検討した結果について説明する。
【００７２】
動物性プランクトンとしてはＳ型のシオミズツボワムシを用いた。また、餌料として本発明例２では、実施例１で説明した操作と同様の操作を行って炭酸水素ナトリウムを添加した餌料用クロレラを用いた。なお、この餌料用クロレラの乾質量／湿質量の値は２５０ｇ／ｋｇである。一方、対照例３の餌料として、実施例２の対照例２で説明した炭酸水素ナトリウムを添加した濃縮クロレラを用いた。なお、この濃縮クロレラの乾質量／湿質量の値は１３５ｇ／ｋｇである。
【００７３】
これらの餌料を本発明例２では５℃の温度で６週間〜２０週間冷蔵保存し、また対照例３では５週間〜９週間冷蔵保存した。冷蔵保存前後の両餌料におけるクロレラの生残率及び餌料の色を次表に示した。なお、クロレラの生残率は実施例１で説明した方法と同じ方法によって求めた。
【００７４】
【表１】
2014087274.tif 000003
【００７５】
３００ｍｌ容のフラスコ複数本にそれぞれ２００ｍｌの人工海水（のり糸状体用：九州積水工業株式会社製）を入れておき、各フラスコに１００個体ずつワムシを分注した。一日一回の給餌で、給餌量はワムシ１００個体当たり乾質量で５８μｇとし、２８℃の温度で４日間振盪培養して、増殖したワムシの密度を経時的に計測した。
【００７６】
図７は本発明例２の餌料用クロレラを用いてワムシを培養した結果を示すグラフであり、また、図８は対照例３の餌料を用いてワムシを培養した結果を示すグラフである。両図において、縦軸はワムシの密度を、横軸は培養期間をそれぞれ示している。なお、図７中、白抜き菱形印は０週間冷蔵保存したクロレラ、すなわち製造直後のクロレラを用いた結果を、白抜き四角印は６週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、白抜き三角印は９週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、バツ印は１２週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、星印は１５週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、白抜き丸印は１８週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、プラス印は２０週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を示している。これに対して、図８中、白抜き菱形印は０週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、白抜き四角印は５週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、白抜き三角印は６週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、バツ印は７週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、星印は８週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を、白抜き丸印は９週間冷蔵保存したクロレラを用いた結果を示している。なお、図７及び図８におけるこれら各冷蔵保存後のクロレラの生残率は前記表１に示してある。
【００７７】
図７及び図８から明らかなように、餌料として餌料用クロレラ及び濃縮クロレラのいずれを用いた場合であっても、クロレラの生残率が略５０％以上である場合、保存期間の長短に拘わらず、ワムシの増殖は順調であった。
【００７８】
これに対して、クロレラの生残率が略５０％を下回るに従って、ワムシの増殖阻害がより強く発生していた。
【００７９】
一方、クロレラの生残率が略５０％以上である場合、増殖したワムシの最大密度は、対照例３に比べて本発明例２の方が相対的に高く、本発明例２では１２００個体／ｍｌを超える結果も得られた。
【００８０】
また、図７から明らかなように、本発明例２では保存期間が１２週間の場合であっても、ワムシを順調に増殖させることができた。
【００８１】
（実施例４）
次に、本発明に係る餌料用クロレラを用いて培養したワムシによって魚類を飼育した結果について説明する。
【００８２】
飼育試験はマダイ（Ｒｅｄ  ｓｅａ  ｂｒｅａｍ）の仔魚を用いて行った。６００Ｌ容の丸型ポリカーボネート製の複数の水槽にそれぞれ５００Ｌの濾過海水を貯留し、体長が２．５±０．０６ｍｍの孵化仔魚を１．０×１０４尾づつ収容させた。各水槽の仔魚に、１日２回、１回当たりワムシの密度が８〜１５個体／ｍｌになるようにワムシを給餌して、２０日間飼育した。なお、飼育時の水温は２０℃〜２５℃に調整し、濾過海水は毎日全量を交換した。飼育試験の結果を次表に示す。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
表中、本発明例３は、前述した実施例３の本発明例２で説明した餌料用クロレラであって５℃の温度で１２週間冷蔵保存したものを用いて培養したワムシを仔魚に給餌した結果を示している。なお、この餌料用クロレラの乾質量／湿質量の値は２５０ｇ／ｋｇであり、前述した如く炭酸水素ナトリウムが添加してある。
【００８５】
一方、比較例は、前述した如く調整した濃縮クロレラを保存せずに与えて培養したワムシを仔魚に給餌した結果を示している。この濃縮クロレラの乾質量／湿質量の値は１３４ｇ／ｋｇであり、炭酸水素ナトリウムが添加してある。
【００８６】
表に示したように、本発明例３及び比較例ともそれぞれ２つの水槽を用いて仔魚の飼育試験を行って、仔魚の体長、生残率及び活力を測定した。なお、体長は５０尾の仔魚について測定した結果を、また活力は１００尾の仔魚について、それぞれ網ですくって、３０秒間空中に露出させた後に再び水槽へ戻し、その生残率を測定することによって行った。
【００８７】
表から明らかなように、仔魚の体長、生残率及び活力のいずれにおいても、本発明例３と比較例との間に有意差は見られなかった。従って、１２週間冷蔵保存した餌料用クロレラであってもワムシの餌料として十分使用できることが分かる。
【符号の説明】
【００８８】
Ｓ１    ステップＳ１
Ｓ２    ステップＳ２
Ｓ３    ステップＳ３
Ｓ５    ステップＳ５
【図１】
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【図２】
2014087274.tif 000006
【図３】
2014087274.tif 000007
【図４】
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【図５】
2014087274.tif 000009
【図６】
2014087274.tif 000010
【図７】
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【図８】
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