(57)【要約】      （修正有）【課題】ＭＫ２を阻害し、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び治療のための薬剤の提供。【解決手段】次の一般式（１）で表される化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするＭＫ２阻害剤。2014009192.tif 000006［式中、Ｒ1及びＲ4は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基又はＣ1-3アルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基又はＣ1-3アルキル基を示し、Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ハロゲン原子又はＣ1-3アルキル基を示す］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）：
【化１】
2014009192.tif 000005
［式中、
Ｒ1及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基又はＣ1-3アルキル基を示し、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基又はＣ1-3アルキル基を示し、
Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ハロゲン原子又はＣ1-3アルキル基を示す］
で表される化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするＭＫ２阻害剤。
【請求項２】
前記化合物が、
（Ｅ）−４−（（２−（５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル）ヒドラゾノ）メチル）−３，６−ジブロモベンゼン−１，２−ジオール、又は
（Ｅ）−２−（（２−（５Ｈ−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル）ヒドラゾノ）メチル）ベンゼン−１，４−ジオール、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物である、請求項１に記載のＭＫ２阻害剤。
【請求項３】
請求項1又は２に記載のトリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のトリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物、及び医薬として許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、虚血再還流障害、歯周炎を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＫ２阻害剤として有用なトリアジノインドール誘導体に関する。より詳細には、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤として有用なトリアジノインドール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の病的状態は炎症に関連しているものが多いが、現状では炎症状態に対する原因療法はほとんど存在していない。しかし、炎症状態に関連する疾患に罹患した患者に対し、炎症を緩和・軽減する療法を行うことができれば、病的状態は解消する方向に向かうと考えられる。したがって、炎症性疾患に於いて、炎症全体の軽減に寄与しうる新しい治療薬の創製が望まれている。
【０００３】
炎症状態は、炎症性サイトカイン調節の不具合と密接に関連している。そのため、炎症性サイトカインの発現を阻害することは、炎症状態の軽減のために有用な治療法となりうる。近年、炎症性サイトカインの発現阻害作用を有する薬剤の創製を目指し、多数のｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）阻害薬（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬）の開発が行われているが、現時点において、臨床開発に成功したｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬は存在しない。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬の開発が困難な理由としては、副作用の発現と有効性の経時的な減弱が挙げられる。
【０００４】
欠損により胎性致死に至るｐ３８ＭＡＰＫ（非特許文献１）の下流には、多数のシグナル伝達分子が存在しており、その阻害により様々な副作用が引き起こされる可能性がある。実際、臨床試験において肝毒性や中枢毒性などが発現しており（非特許文献２）、それらの副作用の発現により開発が中止されている。
【０００５】
また、ｐ３８ＭＡＰＫは、炎症性サイトカイン産生を亢進するシグナル伝達系と、抑制するシグナル伝達系を併せ持っており、これにより自身で活性化した炎症性サイトカインの産生亢進を終息させていると考えられている（非特許文献３）。そのため、ｐ３８ＭＡＰＫの阻害薬は、炎症性サイトカイン産生亢進時には抗炎症的に作用するが、炎症性サイトカイン産生の終息期には、むしろ炎症状態の終息を遅延させる可能性がある。事実、臨床開発が行われたｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬の中には、投与開始初期には有効性が認められたものの、経時的に効果が減弱したため、開発が中止されたものが存在する（非特許文献４）。
【０００６】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２；ＭＡＰＫＡＰＫ２、以下「ＭＫ２」と略す）は、ｐ３８ＭＡＰＫがシグナルを伝達する多数の分子のうち、炎症性サイトカインの産生に重要な役割を果たすセリンスレオニンキナーゼである（非特許文献１）。ＭＫ２の欠損マウスは、易感染性であることを除けば正常マウスとの違いが無く（非特許文献５）、ヘテロの欠損においても代表的な関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＣＩＡ）モデルへの耐性があることが報告されている（非特許文献６）。更に、ＬＰＳ誘発敗血症モデルマウスの検討では、ＭＫ２欠損により炎症性サイトカイン、とりわけ関節リウマチにおいて重要な役割を果たす腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ；ＴＮＦ−α）の産生に寄与することが明らかとなっている（非特許文献５）。
【０００７】
以上から、ＭＫ２阻害薬は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬の問題点である副作用発現と経時的な効果の減弱を回避できると推察される。ＭＫ２阻害薬は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害薬と同様に炎症性疾患の治療に幅広く利用できると考えられる。特に、疾患に対するＭＫ２との関与が報告されている、関節リウマチ（非特許文献６）、乾癬（非特許文献７）、変形性関節症（非特許文献８）、喘息（非特許文献９）、アテローム性動脈硬化症（非特許文献１０）、パーキンソン病（非特許文献１１）、虚血再還流障害（非特許文献１２、１３）、歯周炎（非特許文献１４）などの治療・予防に効果を発揮すると考えられる。
【０００８】
トリアジノインドール骨格を有する化合物には、血小板凝集抑制効果や降圧効果（非特許文献１５）、アルツハイマー治療薬としての効果（特許文献１）が開示されている。しかし、いずれの文献においてもＭＫ２阻害効果に関する記載も示唆もない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００４／６３１９６号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Duraisamy S et.al, Expert Opin Ther Targets., 12: 921-936 (2008).
【非特許文献２】Dambach DM et.al, Curr Top Med Chem., 5(10): 929-39 (2005).
【非特許文献３】Gaestel M et.al, Nat Rev Drug Discov., 8(6):480-99 (2009).
【非特許文献４】Cohen SB et.al, Arthritis Rheum., 60(2):335-44 (2009).
【非特許文献５】Kotlyarov A et.al, Nat CellBiol., 1: 94-97 (1999).
【非特許文献６】Hegen M et.al,  J Immunol., 177: 1913-1917 (2006).
【非特許文献７】Johansen C et.al,  J Immunol. , 176(3):1431-8 (2006).
【非特許文献８】Jones SW et. al, Osteoarthritis Cartilage., 17(1):124-31 (2009).
【非特許文献９】Gorska MM et. al, J Exp Med., 204(7):1637-52 (2007).
【非特許文献１０】Jagavelu K et.al, Circ Res., 101(11):1104-12 (2007).
【非特許文献１１】Thomas T et.al, J Neurochem., 105(5):2039-52 (2008).
【非特許文献１２】Wang X et.al, J Biol Chem., 277(46):43968-72 (2002).
【非特許文献１３】Shiroto K et.al, J Mol Cell Cardiol., 38(1):93-7 (2005).
【非特許文献１４】Li Q et.al, J Pharmacol Exp Ther., 336(3):633-42 (2011).
【非特許文献１５】A Monge et.al, Eur. J. Med. Chem., 26：179-188 (1991).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＭＫ２を阻害し、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎等の予防及び治療効果に優れた医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記実情に鑑み、本発明者らは、鋭意検討した結果、下記一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体がＭＫ２を阻害することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の発明に関する。
［１］次の一般式（１）：
【００１４】
【化１】
2014009192.tif 000002
【００１５】
［式中、
Ｒ1及びＲ4は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基又はＣ1-3アルキル基を示し、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基又はＣ1-3アルキル基を示し、
Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、ハロゲン原子又はＣ1-3アルキル基を示す］
で表される化合物、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とするＭＫ２阻害剤。
【００１６】
［２］前記化合物が、
（Ｅ）−４−（（２−（５H−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル）ヒドラゾノ）メチル）−３，６−ジブロモベンゼン−１，２−ジオール、又は
（Ｅ）−２−（（２−（５H−［１，２，４］トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−イル）ヒドラゾノ）メチル）ベンゼン−１，４−ジオール、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物である、前記［１］に記載のＭＫ２阻害剤。
【００１７】
［３］前記［１］又は［２］に記載のトリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分とする関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤。
【００１８】
［４］前記［１］又は［２］に記載のトリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物、及び医薬として許容される賦形剤、希釈剤又は担体を含む、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、虚血再還流障害、歯周炎を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の、トリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物は、これを有効成分とするＭＫ２が関連する疾患、例えば、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明における用語の定義は以下の通りである。
【００２１】
本明細書中で使用するとき、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「Ｃ1-3アルキル基」とは、直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜３の飽和炭化水素基を示す。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
【００２３】
一般式（１）中、Ｒ1、Ｒ4におけるハロゲン原子としては、臭素原子が好ましい。
【００２４】
本発明のトリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物は、本発明のトリアジノインドール誘導体のみならず、その医薬として許容される塩、それらの各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形を有する物質、及びこれらの物質のプロドラッグとなる物質を包含している。
【００２５】
本発明の一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体として許容される塩としては、無機塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、バリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等）が挙げられる。
【００２６】
本発明の一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体やその医薬として許容される塩の溶媒和物としては、水和物や各種の溶媒和物（例えば、エタノールなどのアルコールとの溶媒和物等）が挙げられる。
【００２７】
本発明のトリアジノインドール誘導体は、公知の方法、例えば、ＷＯ２００２／０８９８０９号パンフレット又はＷＯ２００４／０６３１９６号パンフレット等の文献に記載の方法又は類似の方法を用いて製造することができる。すなわち、一般式（２）で表されるヒドラゾン誘導体と、一般式（３）で表されるアルデヒド誘導体を反応させることにより、本発明の一般式（１）で表される化合物を製造することができる。製造方法を下記反応工程図に示すが、製造法はこれに限定されるものではない。
【００２８】
【化２】
2014009192.tif 000003
【００２９】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8は、前記の一般式におけるものと同義である。］
【００３０】
工程１は、化合物（２）と化合物（３）との縮合反応を行い、化合物（１）を製造する工程である。溶媒としては特に制限は無いが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、メタノール、エタノール等を使用することができる。反応温度は、−３０〜１５０℃であり、好ましくは０℃〜１２０℃である。反応時間は１０分間〜２４時間であり、好ましくは３０分間〜１２時間である。反応は、マイクロウェーブ照射下に実施してもよい。本発明化合物（１）は、反応後、常法に従って処理することによって得られ、更に必要に応じて再結晶、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製手段を用いて精製することができる。
【００３１】
本発明のＭＫ２が関連する疾患、例えば関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体、その塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有するものであって、医薬組成物として使用することができる。その場合、本発明の化合物を単独で用いてもよいが、通常は医薬として許容される担体、及び／又は希釈剤を配合して使用される。
【００３２】
医薬組成物の投与形態は、特に限定されないが、治療目的に応じて適宜選択することができる。例えば、経口剤、注射剤、坐剤、吸入剤等のいずれでもよい。これらの投与形態に適した医薬組成物は、公知の製剤方法を利用することによって製造できる。
【００３３】
経口用固形製剤を調製する場合は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体に医薬として許容される賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法を利用して、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。添加剤は、当該分野で一般的に使用されているものでよい。例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。矯味剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００３４】
経口用液体製剤を調製する場合は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法を利用して内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。矯味剤としては、例えば、上記に挙げられたものでよく、緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３５】
注射剤を調製する場合は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法を利用して皮下、筋肉及び静脈内注射剤を製造することができる。ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。
【００３６】
坐剤を調製する場合は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体に公知の坐剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等、更に必要に応じて界面活性剤（例えば、ツイーン（登録商標））等を加えた後、常法を利用して製造することができる。
【００３７】
軟膏剤を調製する場合は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体に通常使用される基剤、安定化剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００３８】
一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体は、上記以外に、常法により吸入剤、点眼剤、点鼻剤とすることもできる。
【００３９】
上記以外に、常法を利用して適宜好ましい製剤とすることもできる。
【００４０】
本発明の一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体の投与量は年齢、体重、症状、投与形態及び投与回数等によって異なるが、通常は成人に対して一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体として１日あたり０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇを、１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、化合物Ａ及びＢはＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ社より入手可能であり、本試験においては購入したものをそのまま用いた。
【００４２】
［実施例１］緩衝液の調製
【００４３】
［Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒの調製］
Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ，０．００３％Ｂｒｉｊｉ−３５，０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０）を調製した。
【００４４】
［Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＫ２）の調製］
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＫ２）（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），０．００３％Ｂｒｉｊｉ−３５，０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０，２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，１１．５μｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ，３．９μｍｏｌ／Ｌ  ＦＬ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  １２）を調製した。
【００４５】
［Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐ３８α）の調製］
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐ３８α）（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５），０．００３％Ｂｒｉｊｉ−３５，０．００４％Ｔｗｅｅｎ−２０，２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，１ｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ，３．９μｍｏｌ／Ｌ  ＦＬ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ８）を調製した。
【００４６】
［Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの調製］
Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３），０．０２％Ｂｒｉｊｉ−３５，１１．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ，０．１６％ＣＲ−３，５．６％ＤＭＳＯ）を調製した。
【００４７】
［実施例２］ＭＫ２阻害作用の測定
３８４ウェルプレートに被験物質のＤＭＳＯ溶液を１μＬずつ加えた。Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに最終濃度が３０ｎｇ／ｍＬとなるようにＭＫ２酵素溶液を加えた。この３０ｎｇ／ｍＬ  ＭＫ２酵素溶液を先の３８４ウェルプレートに１５μＬずつ加え、２８℃で１５分間プレインキュベートした。３８４ウェルプレートにＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＫ２）を１０μＬずつ加え混和後、２８℃で３０〜４０分間インキュベートした。次いでＴｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを４５μＬずつ添加して混和し、これをＬａｂＣｈｉｐ  ＥＺ  ｒｅａｄｅｒ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて解析した。なお、被験物質の濃度は予備検討結果をもとに阻害率５０％となる濃度（ＩＣ50値）が含まれるように設定した。
【００４８】
［実施例３］ｐ３８αＭＡＰＫ阻害作用の測定  
３８４ウェルプレートに被験物質のＤＭＳＯ溶液を１μＬずつ加えた。Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに最終濃度が１２０ｎｇ／ｍＬとなるようにｐ３８αＭＡＰＫ酵素溶液を加えた。この１２０ｎｇ／ｍＬ  ｐ３８αＭＡＰＫ酵素溶液を先の３８４ウェルプレートに１５μＬずつ加え、２８℃で１５分間プレインキュベートした。３８４ウェルプレートにＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐ３８α）を１０μＬずつ加え混和後、２８℃で６０分間インキュベートした。次いでＴｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを４５μＬずつ添加して混和し、これをＬａｂＣｈｉｐ  ＥＺ  ｒｅａｄｅｒ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、以下の条件で測定、解析した。なお、被験物質の濃度は予備検討結果をもとに阻害率５０％となる濃度（ＩＣ50値）が含まれるように設定した。
【００４９】
ＬａｂＣｈｉｐ  ＥＺ  ｒｅａｄｅｒ  システムのソフトウェアによって反応液中の蛍光標識ペプチド基質のピーク全体におけるリン酸化された蛍光標識ペプチド基質のピークの割合を百分率で算出した（変換率）。ＤＭＳＯのみの変換率を１００％としたときの各被験薬物溶液の変換率を百分率で算出し、１００より減じて阻害率とした。次に阻害率５０％を挟む２点から阻害率５０％となる濃度（ＩＣ50値）を算出した。結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2014009192.tif 000004
【００５１】
＜結果＞
化合物ＡおよびＢは強いＭＫ２阻害活性を有していた。以上のことから、これらの化合物は関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤として有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、一般式（１）で表されるトリアジノインドール誘導体、若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物が、優れたＭＫ２作用を有していることを初めて見出し、関節リウマチ、乾癬、変形性関節症、喘息、アテローム性動脈硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー症、虚血再還流障害、歯周炎の予防及び／又は治療剤を提供するものである。