(57)【要約】【課題】ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結合タンパク質を特定し、がん細胞の低酸素環境適応に関わる新規薬剤標的分子を提供する。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）の物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法。（ａ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する物質（ｂ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する物質【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗がん物質をスクリーニングするためのｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの使用。
【請求項２】
抗がん物質が低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する物質である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）の物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法。
（ａ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する物質
（ｂ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する物質
【請求項４】
前記（ｂ）の物質が、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質であることを特徴とする請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記（ａ）または（ｂ）の物質が、低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する物質であることを特徴とする請求項３または４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと被験物質とを接触させる工程と、
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現している細胞に被験物質を接触させる工程と、
前記細胞のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を測定する工程と、
ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を確認可能な細胞に被験物質を接触させる工程と、
前記細胞のｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を測定する工程と、
ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を低下させる被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現する野生型細胞、ならびにｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦの高発現細胞に、被験物質を接触させる工程と、
各細胞を低酸素環境で培養し細胞増殖を評価する工程と、
前記高発現細胞の増殖と比較して前記野生型細胞の増殖を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
内因性のｐ５４ｎｒｂを発現する野生型細胞およびｐ５４ｎｒｂの高発現細胞に被験物質を接触させる工程と、
各細胞を低酸素環境で培養しＩＧＦ−２の発現を評価する工程と、
前記高発現細胞のＩＧＦ−２発現と比較して前記野生型細胞のＩＧＦ−２の発現を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと結合する物質を有効成分として含有することを特徴とするがん治療薬。
【請求項１２】
低酸素環境において、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと結合し、かつｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とするがん治療薬。
【請求項１３】
内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する核酸を有効成分として含有することを特徴とするがん治療薬。
【請求項１４】
ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦに結合させるためのｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはそのアナログ化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗がん物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がん克服は人類の大きな課題であり、その化学療法剤の開発は現在も精力的に行われている。しかしながら、がん細胞選択的に効果を示す医薬品の創製には至っていないのが現状である。近年、腫瘍内部は血管新生により誘導された血管網が無秩序に存在し、その血管構造も脆弱であることから、部分的な低酸素環境が存在することが知られている。また、低酸素環境のがん細胞はその代謝系を変化させ低酸素状況に対応するとともに、活発に血管新生促進因子やがん転移に関与する因子の産生を行うため、がんの増悪に大きく寄与していると考えられている。また、血液がんにおいても、骨髄のニッチと呼ばれる特殊な低酸素環境に白血病幹細胞が隠れて存在すると考えられている。
【０００３】
一方、がん細胞の低酸素適応において重要な役割を担う転写因子としてＨＩＦ−１α（Hypoxia Inducible Factor-1α）が知られている。低酸素環境は腫瘍特異的な環境であり、生理条件下において低酸素環境はほとんど存在しないことから、ＨＩＦ−１αまたはその関連分子を標的とする化合物の探索研究が数多く行われている（非特許文献１、２参照）。しかしながら、がん細胞の低酸素適応機構の全容は明らかにされていないため、これら以外を標的とする薬剤開発はほとんど行われていない。以上のことから、既存の化合物とは作用メカニズムが異なる医薬品の創製、およびがんの低酸素適応に関わる新規薬剤標的分子の開拓は重要な課題である。
【０００４】
このような背景のもと、本発明者らはこれまでに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する化合物として、海綿由来のフラノセスタテルペンｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１（下記式(I)参照）を見出し、さらにｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と同等以上の活性を示すアナログ化合物を見出した（特許文献１参照）。また、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１は、低酸素環境下で発現誘導される増殖因子ＩＧＦ−２（insulin like growth factor 2）の発現を転写レベルで阻害すること、さらにＩＧＦ−２が低酸素環境下でのがん細胞の増殖に大きく寄与していることを明らかにした（非特許文献３参照）。しかしながら、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結合タンパク質については、これまで不明であった。
【０００５】
【化１】
2014039509.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２０１１／１３８９５６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Pharmacol. Ther., 113, 229, 2007
【非特許文献２】Mol. Cancer Ther., 3, 647,2004
【非特許文献３】Chem Med Chem, 5, 1919, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結合タンパク質を特定し、がん細胞の低酸素環境適応に関わる新規薬剤標的分子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］抗がん物質をスクリーニングするためのｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの使用。
［２］抗がん物質が低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する物質である前記［１］に記載の使用。
［３］以下の（ａ）または（ｂ）の物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法。
（ａ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する物質
（ｂ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する物質
［４］前記（ｂ）の物質が、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質であることを特徴とする前記［３］に記載のスクリーニング方法。
［５］前記（ａ）または（ｂ）の物質が、低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する物質であることを特徴とする前記［３］または［４］に記載のスクリーニング方法。
［６］ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと被験物質とを接触させる工程と、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［３］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［７］内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現している細胞に被験物質を接触させる工程と、前記細胞のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を測定する工程と、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［３］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［８］ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を確認可能な細胞に被験物質を接触させる工程と、前記細胞のｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を測定する工程と、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を低下させる被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［３］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［９］内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現する野生型細胞、ならびにｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦの高発現細胞に、被験物質を接触させる工程と、各細胞を低酸素環境で培養し細胞増殖を評価する工程と、前記高発現細胞の増殖と比較して前記野生型細胞の増殖を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［３］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［１０］内因性のｐ５４ｎｒｂを発現する野生型細胞およびｐ５４ｎｒｂの高発現細胞に被験物質を接触させる工程と、各細胞を低酸素環境で培養しＩＧＦ−２の発現を評価する工程と、前記高発現細胞のＩＧＦ−２発現と比較して前記野生型細胞のＩＧＦ−２の発現を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［３］〜［５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［１１］ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと結合する物質を有効成分として含有することを特徴とするがん治療薬。
［１２］低酸素環境において、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと結合し、かつｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とするがん治療薬。
［１３］内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する核酸を有効成分として含有することを特徴とするがん治療薬。
［１４］ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦに結合させるためのｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはそのアナログ化合物の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のスクリーニング方法によれば、がん細胞の増殖を阻害する物質を選択することができる。それゆえ、本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、がん治療薬の有効成分として有用である。本発明のスクリーニング方法により得られる物質は、特に低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害することができるので、内部に低酸素環境が存在する固形がんおよび骨髄の低酸素環境に存在する血液がんの治療薬の有効成分として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１結合タンパク質の解析に用いた配列番号１７で表される塩基配列（ｐ５４ｎｒｂ／ＬＥＤＧＦ結合配列）を含むオリゴヌクレオチド結合ビーズの構造を示す図である。
【図２】ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１結合タンパク質候補を解析した実験の概要および結果を示す図である。
【図３】ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１結合タンパク質候補をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す図である。
【図４】ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞およびＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞の各種タンパク質発現量をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す図であり、（Ａ）は低酸素培養条件における結果、（Ｂ）は通常培養条件における結果である。
【図５】低酸素培養条件または通常培養条件において培養したｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞およびＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞の状態を顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）は野生型ＤＵ１４５細胞（Control）、（Ｂ）はｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞、（Ｃ）はＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞の観察結果である。
【図６】低酸素培養条件または通常培養条件において培養したｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞、ＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞およびｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１処理細胞（ポジティブコントロール）の細胞増殖阻害率を算出した結果を示す図である。
【図７】ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１に対する結合能を評価するための実験に使用したプローブの構造を示す図である。
【図８】ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦのｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１に対する結合能をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す図であり、（Ａ）は抗ｐ５４ｎｒｂ抗体を用いた結果、（Ｂ）は抗ＬＥＤＧＦ抗体を用いた結果である。
【図９】ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１およびアナログｆ１３の低酸素環境選択的癌細胞増殖阻害活性を示す図であり、（Ａ）はｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結果、（Ｂ）はアナログｆ１３の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の作用メカニズムに関して、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１が、ヒトＩＧＦ−２（insulin-like growth factor-2）遺伝子のＰ３プロモーター領域と核タンパク質との複合体形成を低酸素環境選択的に阻害することにより、ＩＧＦ−２遺伝子の発現を抑制して、低酸素環境選択的ながん細胞の増殖阻害効果を示すことを報告している（非特許文献３）。今回本発明者らは、これらの知見に基づいて、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１結合タンパク質を特定すべく実験を行った（実施例参照）。その結果、低酸素環境下においてｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と結合することにより、上記ヒトＩＧＦ−２遺伝子のＰ３プロモーター領域に存在する特定の塩基配列との結合が阻害される核タンパク質として、ｐ５４ｎｒｂ（non-POU domain-containing octamer-binding protein）およびＬＥＤＧＦ（PC4 and SFRS1-interacting protein）を特定した。さらに、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子をノックダウンしたがん細胞は、低酸素環境下で増殖が阻害されることを確認した。
【００１３】
今回得られた知見から、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦに結合し、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと上記ヒトＩＧＦ−２遺伝子のＰ３プロモーター領域に存在する特定の塩基配列、具体的には配列番号１７で表される塩基配列との結合を阻害する物質は、がん治療薬の有効成分となり得ることがわかった。また、当該物質をスクリーニングにより選択すれば、がん治療薬の有効成分として有用な物質を見出すことができると考えられた。また、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する物質も、がん治療薬の有効成分として有用であると考えられた。さらに、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦはがん細胞の低酸素環境適応研究の標的分子として有用であると考えられた。
【００１４】
〔ｐ５４ｎｒｂについて〕
ｐ５４ｎｒｂは、ショウジョウバエの視力（M. Heisenbergら, J. Comp. Physiol.,（1972）80, 119-136）や求愛行動（S. J. Kulkarniら, Genetics,（1988）118, 267-285）に関与するタンパク質のヒトホモログであり、そのアミノ酸配列情報からｍＲＮＡやＤＮＡに結合することが予測され（Y. S. Yangら, Mol. Cell. Biol.,（1993）13, 5593-5603）、実際にｍＲＮＡのスプライシング制御（S. Kameokaら, EMBO J.,（2004）23, 1782-1791）や転写制御に関わることが明らかにされた。転写制御に関しては、数多くの遺伝子の転写制御に関わることが報告されている。例えば、prolyl-4-hydroxylase α1遺伝子（C. Zhangら, Biochim. Biophys. Acta., （2008） 1783, 1517-1528）、cyclooxygenase-2遺伝子（X. Yangら, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., （2008） 35, 1204-1208）、CYP17遺伝子（M. B. Sewerら, Endocrinology, （2002） 143, 1280-1290）などのプロモーター領域で形成される転写因子複合体中にｐ５４ｎｒｂが検出されている。また核内受容体であるretinoid X receptor (RXR)やthyroid hormone receptor (TR)（M. Mathurら, Mol. Cell. Biol., （2001）21, 2298-2311）が形成するタンパク質複合体中にもｐ５４ｎｒｂが検出されていることから、ＲＸＲやＴＲが転写制御している遺伝子の発現に関与することが示唆される。また、細胞周期に関与しているmitotic regulator Pin1遺伝子の転写時には、ｐ５４ｎｒｂがリン酸化されるという報告があることから、ｐ５４ｎｒｂの機能発現は、リン酸化および脱リン酸化により制御されていることが示唆される（C. Bruelleら, Biochem. Cell Biol., （2011） 89, 423-433）。しかしながらこれまでに、ｐ５４ｎｒｂがＩＧＦ−２遺伝子の転写制御や低酸素環境におけるがん細胞の増殖や代謝を制御するという報告はない。
【００１５】
〔ＬＥＤＧＦについて〕
ＬＥＤＧＦはクロマチンおよび転写因子ＰＣ４に結合することから、転写制御因子として機能していることが発見当初から予想されていた（H. Geら, EMBO J., （1998） 17, 6723-6729）。その後、水晶体上皮細胞（lens epithelial cell）の酸化ストレスからの防御因子として再発見され、lens epithelium-derived growth factor（LEDGF）と呼称されるようになった（D. P. Singhら, Biochem. Biophys. Res. Commun., （2000） 267, 373-381）。実際にＬＥＤＧＦが転写制御する遺伝子にはストレス応答タンパク質が多く、ＬＥＤＧＦを高発現させた場合に、anti-oxidant protein 2A（N. Fatmaら, J. Biol. Chem., （2001） 276, 48899-48907）、heat shock protein 27（D. P. Singhら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., （1999） 40, 1444-1451）、involucrin（E. Kuboら, J. Mol. Biol., （2002） 320, 1053-1063 ）などが発現誘導されることが報告されている。また最近、ＬＥＤＧＦはＨＩＶの感染成立に必須の宿主因子であることが報告されており（P. Cherepanovら, J. Biol. Chem., (2003) 278, 372-381、M. Lianoら, Science, （2006） 314, 461-464）、ＨＩＶに対する新しい薬剤標的として注目されている（F. Christら, Nat. Chem. Biol., （2010）6, 442-448）。一方、ＬＥＤＧＦの機能は、small ubiquitin-related like modifier（SUMO）化により制御されることが、ＨＳＰ２７遺伝子の発現解析により報告されている（M. T. D. Buenoら, J. Mol. Biol., （2010） 399, 221-239）。しかしながら、ＬＥＤＧＦに関してもｐ５４ｎｒｂと同様に、低酸素環境でのがん細胞の増殖や代謝を制御するという報告はない。
【００１６】
〔ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの新規用途〕
上述のように、本発明者らは、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦに結合し、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質、およびｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する物質は、がん治療薬の有効成分となり得るとの知見を得た。すなわち、ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦの用途として、抗がん物質をスクリーニングするための標的分子としての用途が新たに見出された。
【００１７】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを用いて抗がん活性を有する物質（抗がん物質）をスクリーニングする方法を提供する。抗がん活性は、がん細胞の増殖阻害活性であることが好ましく、低酸素環境選択的ながん細胞の増殖阻害活性であることがより好ましい。ここで低酸素環境とは、ＨＩＦ−１αの発現が検出される酸素濃度環境を意味し、例えば、培養細胞を酸素濃度５％未満で培養する環境と同等の環境である。好ましくは細胞培養における酸素濃度が約３％以下であり、より好ましくは約２％以下であり、さらに好ましくは約１％以下である。例えば、固形がんの内部や血液がんが存在する骨髄中には部分的な低酸素環境が存在することが知られている。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法の標的分子であるｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦは、どのような生物由来であってもよく、特に限定されない。好ましくは哺乳動物由来である。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。各種動物のｐ５４ｎｒｂのアミノ酸配およびそれをコードする遺伝子（ｍＲＮＡ）の塩基配列は、例えば表１に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から取得することができる。ヒトのｐ５４ｎｒｂはアイソフォーム１および２の２種類が知られており、いずれのアイソフォームも標的分子として好適に用いることができる。好ましくはアイソフォーム１である。
【００１９】
【表１】
2014039509.tif 000003
【００２０】
また、各種動物のＬＥＤＧＦのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子（ｍＲＮＡ）の塩基配列は、例えば表２に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から取得することができる。ヒトのＬＥＤＧＦはアイソフォーム１および２の２種類が知られており、いずれのアイソフォームも標的分子として好適に用いることができる。好ましくはアイソフォーム２である。
【００２１】
【表２】
2014039509.tif 000004
【００２２】
本発明のスクリーニング方法を適用する被験物質は特に限定されない。例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿などが挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が好ましい。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法では、（ａ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する物質、または（ｂ）ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する物質が選択される。（ｂ）の物質は、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合することにより、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質であることが好ましい。配列番号１７で表される塩基配列（以下、「ｐ５４ｎｒｂ／ＬＥＤＧＦ結合配列」と記す。）は、少なくともヒトＩＧＦ−２遺伝子のＰ３プロモーター領域中に存在し、ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦと結合可能な塩基配列であることが確認されている。配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸は、本発明のスクリーニング方法に用いる場合、１本鎖でも２本鎖でもよく、ＤＮＡでもＲＮＡでもこれらのハイブリッドでもよい。また、配列番号１７で表される塩基配列との結合の有無が確認できる限り、配列番号１７で表される塩基配列以外の塩基配列が付加されていてもよい。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法によって選択された物質は、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と同様に、低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害することができるので、抗がん剤の有効成分として有用である。対象のがんは特に限定されず、例えば、肺癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、脳腫瘍、血液腫瘍などが挙げられる。なかでも、内部に低酸素環境を有する固形がんおよび骨髄の低酸素環境に存在する血液がんを対象とすることが好ましい。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法の第１の実施形態は、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと被験物質とを接触させる工程と、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
本実施形態のスクリーニング方法に用いるｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦは、天然タンパク質および組換えタンパク質のいずれでもよい。天然タンパク質は内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを発現している細胞（例えば、がん細胞等）の細胞抽出物等から公知の精製方法（例えば、アフィニティーカラム等）を用いて取得することができる。ｐ５４ｎｒｂの組換えタンパク質は、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子の塩基配列に基づき公知の遺伝子組み換え技術を用いてｐ５４ｎｒｂ発現ベクターを構築し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入して培養し、細胞抽出物を調製してアフィニティーカラム等の公知の精製方法により取得することができる。例えば、ヒトｐ５４ｎｒｂのアイソフォーム１（NP_031389、配列番号１）は、ヒトｐ５４ｎｒｂ遺伝子（NM_007363、配列番号２）を用いて構築された組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して発現させ、取得することができる。また、ｐ５４ｎｒｂの組換えタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することもできる。この方法で行う場合には、例えば上記ヒトｐ５４ｎｒｂのアイソフォーム１をコードするＤＮＡ断片と、公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、大腸菌、小麦胚芽細胞、ウサギ網膜細胞の無細胞抽出液を用いる系）を用いることができる。ＬＥＤＧＦの組換えタンパク質も同様に、ＬＥＤＧＦ遺伝子の塩基配列に基づき公知の遺伝子組み換え技術を用いてＬＥＤＧＦ発現ベクターを構築し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入して培養し、細胞抽出物を調製してアフィニティーカラム等の公知の精製方法により取得することができる。例えば、ヒトＬＥＤＧＦのアイソフォーム２（NP_150091、配列番号３）は、ヒトＬＥＤＧＦ遺伝子（NM_033222、配列番号４）を用いて構築された組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して発現させ、取得することができる。また、ＬＥＤＧＦの組換えタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて製造することもできる。この方法で行う場合には、例えば上記ヒトＬＥＤＧＦのアイソフォーム２をコードするＤＮＡ断片と、公知のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系（例えば、大腸菌、小麦胚芽細胞、ウサギ網膜細胞の無細胞抽出液を用いる系）を用いることができる。
【００２６】
内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを発現している細胞または、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現ベクターが導入された宿主細胞の培養は、通常酸素条件（例えば５％ＣＯ２、９５％空気）で行ってもよいが、低酸素条件（例えば１％Ｏ２、５％ＣＯ２、９４％Ｎ２）で行うことが好ましい。低酸素条件で培養した細胞から調製したｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを用いることにより、低酸素環境においてｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する物質をスクリーニングすることができる。
【００２７】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと被験物質とを接触させる方法は特に限定されず、例えば、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの溶液に被験物質を添加する方法や、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを固相化したプレート等に被験物質溶液を重層する方法、被験物質を固相化したプレート等にｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを重層する方法等が挙げられる。接触時間、接触温度等は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない、または例えば下記式(II)で示されるｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１のアナログｆ１３等のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦ結合活性を有しない化合物を接触させる陰性対照群、ならびにｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１を接触させる陽性対照群を設けることが好ましい。
【００２８】
【化２】
2014039509.tif 000005
【００２９】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する方法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法で分子間相互作用を測定するＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いる方法が挙げられる。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ上にｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを固定化し、被験物質との結合親和性を算出する。そして、被験物質が、アナログｆ１３とｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦとの結合親和性より強力な結合力を示す場合に、当該被験物質をｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質として選択することができる。ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と同等の結合親和性を示す被験物質が好ましく、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１より強力な結合親和性を示す被験物質がより好ましい。
【００３０】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する他の方法としては、例えば、化合物アレーを用いる方法が挙げられる。スライドガラス上にトリフルオロメチルジアジリンを利用して約２０００種類の被験物質を固定化した化合物アレーに、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを滴下して、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合した被験物質を選択することができる。ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと被験物質が結合しているか否かを確認する方法は特に限定されないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質として取得したｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦや、放射標識アミノ酸を利用して、無細胞転写翻訳系で発現させた放射標識ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを用いて、化合物アレー上の蛍光または放射線をスキャナーで検出することにより確認することができる。
【００３１】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する他の方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡを用いる方法が挙げられる。９６穴マルチウェルプレートの底面に被験物質を固定化し、そこにｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを添加する。ウェルを洗浄後、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦに対する抗体を用いて、ウェル底面のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの存在の有無を確認する。ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの存在が確認されたウェルに固定化した被験物質を、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質として選択することができる。
【００３２】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する他の方法としては、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと被験物質とを接触させた後に、例えば、後述の実施例１で用いたｐ５４ｎｒｂ／ＬＥＤＧＦ結合配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチドを結合させた磁性ビーズ（図１参照）をさらに接触させる方法が挙げられる。ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと当該磁性ビーズの２本鎖オリゴヌクレオチドとの結合を阻害した場合に、当該被験物質をｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質として選択することができる。ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦが磁性ビーズの２本鎖オリゴヌクレオチドと結合しているか否かを確認する方法は特に限定されないが、例えばｐ５４ｎｒｂに対する抗体またはＬＥＤＧＦに対する抗体を用いて確認することができる。この方法において、低酸素条件で培養した細胞由来のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦを使用することにより、低酸素環境においてｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合し、かつｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質を選択することができる。
【００３３】
本実施形態では、上記のように、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する工程において、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合し、かつｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質を、同時に選択することが可能である。また、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合する被験物質を選択する工程の後に、当該被験物質がｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦと結合することにより配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害することを確認する工程をさらに設けてもよい。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法の第２の実施形態は、内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現している細胞に被験物質を接触させる工程と、前記細胞のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を測定する工程と、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる被験物質を選択する工程を含むスクリーニング方法である。内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現している細胞は特に限定されないが、培養細胞が好ましい。培養細胞は、初代培養細胞でもよく、細胞株でもよい。内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現している細胞株としては、例えば、ＤＵ１４５（ヒト前立腺がん細胞）、ＨＥＫ−２９３Ｔ（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部がん細胞）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト肺粘液性類表皮がん細胞）、Ｎｅｕｒｏ２Ａ（マウス神経芽腫細胞）、ＲＩＮｍ５Ｆ（ラットインスリノーマ由来細胞）などが挙げられ、これらはいずれも本発明のスクリーニング方法の第２の実施形態に好適に用いることができる。
【００３５】
内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現している細胞に被験物質を接触させる方法は、細胞に被験物質が接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、細胞の培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。被験物質を接触させない陰性対照群を設けることが好ましい。
【００３６】
細胞のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦのタンパク質量は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。細胞のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦのｍＲＮＡ量は、公知の方法で細胞からＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。
【００３７】
ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる被験物質を選択する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない細胞（陰性対照群）のｐ５４ｎｒｂもしくはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して、被験物質を接触させた細胞のｐ５４ｎｒｂもしくはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量が減少している場合に、当該被験物質を選択することができる。被験物質がｐ５４ｎｒｂもしくはＬＥＤＧＦのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して５０％以下に減少させる被験物質が好ましく、２５％以下に減少させる被験物質がより好ましい。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法の第３の実施形態は、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を確認可能な細胞に被験物質を接触させる工程と、前記細胞のｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を測定する工程と、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を低下させる被験物質を選択する工程を含むスクリーニング方法である。ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を確認可能な細胞としては、例えば、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片の下流にレポーター遺伝子を融合したベクターが導入された細胞が挙げられる。宿主細胞は特に限定されないが、例えば、ＤＵ１４５（ヒト前立腺がん細胞）、ＨＥＫ−２９３Ｔ（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部がん細胞）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト肺粘液性類表皮がん細胞）、Ｎｅｕｒｏ２Ａ（マウス神経芽腫細胞）、ＲＩＮｍ５Ｆ（ラットインスリノーマ由来細胞）などが挙げられる。
【００３９】
ヒトｐ５４ｎｒｂ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を配列番号５に示した。ヒトｐ５４ｎｒｂ遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片として、配列番号５で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を有するＤＮＡ断片を好適に用いることができる。ｐ５４ｎｒｂ遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片はこれらに限定されるものではなく、他の生物由来のｐ５４ｎｒｂ遺伝子のプロモーター領域を有するＤＮＡ断片を用いてもよい。
ヒトＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を配列番号６に示した。ヒトＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片として、配列番号６で表される塩基配列と同一または実質的に同一な塩基配列を有するＤＮＡ断片を好適に用いることができる。ＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片はこれらに限定されるものではなく、他の生物由来のＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター領域を有するＤＮＡ断片を用いてもよい。
配列番号５または６で表される塩基配列と実質的に同一な塩基配列を有するＤＮＡ断片としては、例えば、配列番号５または６で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性がある塩基配列を有し、配列番号５または６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と同質のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片であればどのようなものでもよい。
【００４０】
レポーター遺伝子は、一般に用いられているものであれば特に限定されないが、安定かつ活性の定量が容易なものが好ましい。例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００４１】
ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を確認可能な細胞に被験物質を接触させる方法は、細胞に被験物質が接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、細胞の培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。被験物質を接触させない陰性対照群を設けることが好ましい。
【００４２】
ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性は、レポーター遺伝子の発現量により測定することができる。レポーター遺伝子の発現量は、レポーター遺伝子がコードするタンパク質（レポーター遺伝子産物）に応じて適宜選択される。例えば、レポーター遺伝子がルシフェラーゼをコードする場合、導入細胞を適当な方法により溶解し、この細胞溶解液の上清中に基質となるルシフェリンを添加した後、市販の検出器を用いて発光量を測定し、レポーター遺伝子の発現量とする。他のレポーター遺伝子を用いた場合も、公知の方法でレポーター遺伝子産物量を測定することができる。
【００４３】
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦ遺伝子のプロモーター活性を低下させる被験物質を選択する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない陰性対照群におけるｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦのプロモーター活性と比較して、被験物質を接触させた場合にｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦのプロモーター活性が低下している場合に、当該被験物質を選択することができる。被験物質がｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦのプロモーター活性を低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のプロモーター活性と比較して５０％以下に低下させる被験物質が好ましく、２５％以下に低下させる被験物質がより好ましい。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法の第４の実施形態は、内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現する野生型細胞、ならびにｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦの高発現細胞と被験物質をそれぞれ接触させる工程と、各細胞を低酸素環境で培養し細胞増殖を評価する工程と、前記高発現細胞の増殖と比較して前記野生型細胞の増殖を阻害する物質を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
【００４５】
内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現する野生型細胞としては、例えば、ＤＵ１４５（ヒト前立腺がん細胞）、ＨＥＫ−２９３Ｔ（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部がん細胞）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト肺粘液性類表皮がん細胞）、Ｎｅｕｒｏ２Ａ（マウス神経芽腫細胞）、ＲＩＮｍ５Ｆ（ラットインスリノーマ由来細胞）などが挙げられる。また、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦの高発現細胞は、例えば、内因性のｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦを発現する野生型細胞にｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦの組換え発現ベクターが導入された細胞が挙げられる。高発現細胞は、ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦの両方を同時に高発現する細胞でもよく、どちらか一方を高発現する細胞でもよい。ｐ５４ｎｒｂ発現ベクターは、例えば配列番号２で表されるヒトｐ５４ｎｒｂ遺伝子に基づいて公知の遺伝子組み換え技術を用いて構築することができる。また、ＬＥＤＧＦ発現ベクターは、例えば配列番号４で表されるヒトＬＥＤＧＦ遺伝子に基づいて公知の遺伝子組み換え技術を用いて構築することができる。組換え発現ベクターの宿主細胞への導入および発現確認は公知の方法を用いて行うことができる。
【００４６】
各細胞に被験物質を接触させる方法は特に限定されない。例えば、細胞の培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。また、被験物質を接触させない陰性対照群およびｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１を接触させる陽性対照群を設けることが好ましい。
低酸素環境で細胞を培養する方法は特に限定されず、例えば、１％Ｏ２、５％ＣＯ２、９４％Ｎ２、３７℃に設定した培養装置内で培養する方法が挙げられる。培養時間は用いる培養器具、細胞の種類、播種細胞数等に応じて適宜設定することができる。
細胞増殖を評価する方法は特に限定されず、例えば、生細胞数を顕微鏡でカウントする方法、ＭＴＴアッセイ法、トリパンブルー色素排除試験法、細胞内ＡＴＰ測定法、Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ代謝活性試験法（ＱＢｌｕｅアッセイ法）、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ法などが挙げられる。
【００４７】
高発現細胞の増殖と野生型細胞の増殖を比較して野生型細胞の増殖の程度が低い場合に、当該被験物質を野生型細胞の増殖を阻害する物質として選択することができる。被験物質が高発現細胞の増殖と比較して野生型細胞の増殖を阻害する程度は特に限定されないが、例えば、高発現細胞より増殖を５０％以下に低下させる被験物質が好ましく、２５％以下に低下させる被験物質がより好ましい。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法の第５の実施形態は、内因性のｐ５４ｎｒｂを発現する野生型細胞およびｐ５４ｎｒｂの高発現細胞に被験物質を接触させる工程と、各細胞を低酸素環境で培養しＩＧＦ−２の発現を評価する工程と、前記高発現細胞のＩＧＦ−２発現と比較して前記野生型細胞のＩＧＦ−２の発現を阻害する物質を選択する工程を含むスクリーニング方法である。内因性のｐ５４ｎｒｂを発現する野生型細胞およびｐ５４ｎｒｂの高発現細胞には、上記第４の実施形態と同様の細胞を使用することができる。
【００４９】
各細胞に被験物質を接触させる方法は特に限定されない。例えば、細胞の培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。また、被験物質を接触させない陰性対照群およびｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１を接触させる陽性対照群を設けることが好ましい。
低酸素環境で細胞を培養する方法は特に限定されず、例えば、１％Ｏ２、５％ＣＯ２、９４％Ｎ２、３７℃に設定した培養装置内で培養する方法が挙げられる。培養時間は用いる培養器具、細胞の種類、播種細胞数等に応じて適宜設定することができる。
【００５０】
ＩＧＦ−２の発現を評価する方法は特に限定されず、培地中のＩＧＦ−２を定量する方法、細胞から抽出したＩＧＦ−２ｍＲＮＡを定量する方法などが挙げられる。ＩＧＦ−２を定量する方法としては、例えば、第２の実施形態で例示した公知のタンパク質量測定方法が挙げられる。ＩＧＦ−２ｍＲＮＡを定量する方法としては、例えば、第２の実施形態で例示した公知のｍＲＮＡ量測定方法が挙げられる。
【００５１】
高発現細胞のＩＧＦ−２の発現量と野生型細胞のＩＧＦ−２の発現量を比較して野生型細胞のＩＧＦ−２の発現量が少ない場合に、当該被験物質を野生型細胞のＩＧＦ−２の発現を阻害する物質として選択することができる。被験物質が高発現細胞のＩＧＦ−２の発現と比較して野生型細胞のＩＧＦ−２の発現を阻害する程度は特に限定されないが、例えば、高発現細胞よりＩＧＦ−２の発現を５０％以下に低下させる被験物質が好ましく、２５％以下に低下させる被験物質がより好ましい。
【００５２】
〔がん治療薬〕
上記本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、がん細胞の増殖を阻害することができるので、がん治療薬の有効成分として有用である。本発明のスクリーニング方法により得られる低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する物質は、内部に低酸素環境が存在する固形がんおよび骨髄の低酸素環境に存在する血液がんの治療薬の有効成分として特に有用である。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を、がん治療薬として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
【００５４】
本発明は、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと結合する物質を有効成分として含有するがん治療薬を提供する。また、本発明は、低酸素環境において、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと結合し、かつｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦと配列番号１７で表される塩基配列からなる核酸との結合を阻害する物質を有効成分として含有するがん治療薬を提供する。このようながん治療薬の具体例としては、例えば、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１を有効成分として含有するがん治療薬、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１のアナログ化合物を有効成分として含有するがん治療薬等が挙げられるが、これらに限定されない。ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１のアナログ化合物は、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と同等の活性を示すものが好ましく、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１より強い活性を示すものがより好ましい。
【００５５】
また、本発明は、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦに結合させるためのｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはそのアナログ化合物の使用を提供する。本発明には、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはそのアナログ化合物を動物の体内においてｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦに結合させて、ｐ５４ｎｒｂおよび／またはＬＥＤＧＦの活性を低下させるためのｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはそのアナログ化合物の使用方法が含まれる。
【００５６】
本発明は、内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する核酸を有効成分として含有するがん治療薬を提供する。内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する核酸としては、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチジーンオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡを細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチジーンオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の二重鎖ＤＮＡと三重鎖核酸を形成するヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチジーンオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
【００５７】
ｐ５４ｎｒｂ遺伝子としては、表１に記載されたアクセッション番号のｐ５４ｎｒｂ遺伝子が挙げられ、ＬＥＤＧＦ遺伝子としては、表２に記載されたアクセッション番号のＬＥＤＧＦ遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の塩基配列は、公知のデータベース（ＮＣＢＩ等）から容易に取得することができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチジーンオリゴヌクレオチドは、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子またはＬＥＤＧＦ遺伝子の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。
【００５８】
ｐ５４ｎｒｂ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、配列番号７、８または９で表される塩基配列からなるｓｉＲＮＡが好ましい。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ＬＥＤＧＦ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとしては、配列番号１０、１１または１２で表される塩基配列からなるｓｉＲＮＡが好ましい。これらは単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明者らは、ヒト前立腺がん細胞ＤＵ１４５にｐ５４ｎｒｂ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列番号７、８、９）またはＬＥＤＧＦ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（配列番号１０、１１、１２）を導入することにより、それぞれｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦの発現が抑制されると共に、低酸素環境選択的に細胞の増殖が阻害されることを実証している（実施例２参照）。
【００５９】
内因性のｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制する核酸は、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
【００６０】
本発明のがん治療薬の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり有効成分として０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度がより好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
【００６１】
本発明のがん治療薬は、他のがん治療用薬剤と併用して用いることができる。他のがん治療用薬剤は特に限定されないが、例えば、化学療法剤、免疫療法剤またはホルモン療法剤と併用して用いることが好ましい。また、本発明のがん治療薬は、放射線療法と併用して用いることができる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
〔実施例１：ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１結合タンパク質候補の同定〕
（１）核タンパク質画分の調製
ヒト前立腺がん細胞ＤＵ１４５を低酸素条件（１％Ｏ２、５％ＣＯ２、９４％Ｎ２）または通常培養条件（５％ＣＯ２、９５％空気）で培養し、Ｍｉｌｏｓｅｖｉｃらの方法（Proteomics, (2009) 9, 1230-1240）により、粗核タンパク質画分を調製した。次に、別途調製した、ｐ５４ｎｒｂ／ＬＥＤＧＦ結合配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチド（800 pmol）を結合させた磁性ビーズ（4 mg, Dynabeads M-280, invitrogen社）（図１参照）を粗核タンパク質画分と混和することにより、ｐ５４ｎｒｂ／ＬＥＤＧＦ結合配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチドに親和性を持つ核タンパク質を結合させた。次に、溶出緩衝液［10mM Tris-HCl (pH 7.4), 1M NaCl, 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1% glycerol］でオリゴヌクレオチドに結合した核タンパク質を溶出した後、脱塩カラム（PD-10, GEヘルスケア社）を用いて、結合緩衝液［10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1% glycerol］に置換して、調製した核タンパク質画分を以下の実験に使用した。
【００６４】
（２）実験１（図２参照）
低酸素条件で培養したＤＵ１４５細胞の核タンパク質画分（50μg）を、ｐ５４ｎｒｂ／ＬＥＤＧＦ結合配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチド（200 pmol）を結合させた磁性ビーズ（1 mg）と室温で１時間、転倒混和した。次に、磁石（DynaMag Spin, invitrogen社）を用いて磁性ビーズを沈殿させ、沈殿した磁性ビーズを結合緩衝液で３回洗浄した。そして、磁性ビーズに結合しているタンパク質をプロテアーゼ処理により加水分解後、質量分析装置で解析した。
（３）実験２（図２参照）
低酸素条件で培養したＤＵ１４５細胞の核タンパク質画分（50μg）にｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１（100μM）を添加し、実験１と同様に解析を行った。
（４）実験３（図２参照）
低酸素条件で培養したＤＵ１４５細胞の核タンパク質画分（50μg）に、上記式(II)で示されるｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１のアナログｆ１３（100μM）を添加し、実験１と同様に解析を行った。なお、アナログｆ１３は、低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害する活性を有しない化合物である。
（５）実験４（図２参照）
通常培養条件で培養したＤＵ１４５細胞の核タンパク質画分（50μg）を使用して、実験１と同様に解析を行った。
【００６５】
（６）実験１〜４の結果
実験１〜４の解析の概要と結果を図２に示した。図２に示したように、実験１では１０５種類のタンパク質が、実験２では５６種類のタンパク質が、実験３では９４種類のタンパク質が、実験４では５４種類のタンパク質が、それぞれ検出された。これらの中から、実験１および実験３で検出され、実験２および実験４では検出されないタンパク質を検索した結果、３２種類のタンパク質が選択された。さらに、この中からリボソームタンパク質、ポリメラーゼ、ヒストンタンパク質などの一般的な核タンパク質を除外した結果、high mobility group protein HMG-I/HMG-Y（Gene ID: 3159）、PC4 and SFRS1-interacting protein（LEDGF, Gene ID: 11168）、non-POU domain-containing octamer-binding protein（p54nrb, Gene ID: 4841）およびactivated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15（Gene ID: 10923）の４種類のタンパク質がｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１結合タンパク質候補として選択された。
【００６６】
（７）ウエスタンブロッティングによる確認
実験１〜４でそれぞれ得られたオリゴヌクレオチド結合磁性ビーズに結合した核タンパク質中に、上記４種類のタンパク質が存在するか否かを確認するために、各タンパク質に対する抗体を用いて、定法に従いウエスタンブロッティングを行った。
結果を図３に示した。図３から明らかなように、high mobility group protein HMG-I/HMG-Y（図中、Anti-HMG-I/HMG-Y）およびactivated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15（図中、Anti-RNA poly/p15）は、全てのサンプルで検出された。一方、non-POU domain-containing octamer-binding protein（図中、Anti-p54nrb）およびPC4 and SFRS1-interacting protein（図中、Anti-LEDGF）は、実験１および実験３のオリゴヌクレオチド結合磁性ビーズに結合した核タンパク質では検出され、実験２および実験４のオリゴヌクレオチド結合磁性ビーズに結合した核タンパク質では検出されなかった。
以上の結果から、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結合タンパク質は、ｐ５４ｎｒｂ（non-POU domain-containing octamer-binding protein）またはＬＥＤＧＦ（PC4 and SFRS1-interacting protein）であることが強く示唆された。
【００６７】
〔実施例２：遺伝子ノックダウンによるｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦの機能解析〕
ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現をｓｉＲＮＡで低下させたＤＵ１４５細胞が、ＩＧＦ−２を発現するか否か、また低酸素環境選択的な増殖阻害を受けるか否かを検討した。
【００６８】
（１）遺伝子ノックダウン細胞の作製
用いたｓｉＲＮＡの塩基配列を表３に示した。ポジティブコントロールにはｌａｍｉｎ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用い、ネガティブコントロールには無作為に作成した配列のｓｉＲＮＡを用いた。ＤＵ１４５細胞（5×104 cells / 2 mL / well）を通常培養条件で３７℃、２４時間前培養後、牛胎児血清を含まないＲＰＭＩ１６４０に置換し、６０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ポジティブコントロール以外は３種類のｓｉＲＮＡを各２０ｎＭ）をリポフェクション法（Gene Silencer, Genlantis社）により導入して、各遺伝子を一過的にノックダウンしたＤＵ１４５細胞を作製した。
【００６９】
【表３】
2014039509.tif 000006
【００７０】
（２）タンパク質発現量の確認
ｓｉＲＮＡを導入した細胞を低酸素培養条件または通常培養条件で３７℃、４８時間培養し、各細胞におけるｐ５４ｎｒｂ、ＬＥＤＧＦ、ｌａｍｉｎ、ＩＧＦ−２、β−ａｃｔｉｎの発現量をウエスタンブロッティング法により確認した。
結果を図４（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は低酸素培養条件における結果であり、（Ｂ）は通常培養条件における結果である。図４（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞およびＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞は、低酸素培養条件および通常培養条件のいずれの条件においても、それぞれ標的遺伝子産物の発現が抑えられた。また、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞では低酸素条件で誘導されるＩＧＦ−２の産生が抑えられるのに対し、ＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞では低酸素条件で誘導されるＩＧＦ−２の産生に変化は見られなかった。なお、ネガティブコントロールの細胞は、野生型のＤＵ１４５細胞と同じ表現型を示し、ｌａｍｉｎ遺伝子のノックダウン細胞は、ｌａｍｉｎの発現が低下する以外は、野生型ＤＵ１４５細胞と同じ表現型を示した。また、ＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞は、ｐ５４ｎｒｂの発現には影響を与えず、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞は、ＬＥＤＧＦの発現に影響を与えなかった。
【００７１】
（３）低酸素培養条件における細胞増殖阻害率
作成したｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞およびＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞について、低酸素培養条件における増殖を観察し、通常培養条件における増殖と比較した。すなわち、作成した各ノックダウン細胞および野生型ＤＵ１４５細胞を、９６穴マルチウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し、通常培養条件で３７℃、４時間前培養した。次に、それぞれの細胞を通常培養条件または低酸素培養条件で３７℃、２４時間培養した。２４時間培養後、[3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyltetrazolium Bromide] MTT法により生存細胞を比色定量し、各ノックダウン細胞の定量値と野生型ＤＵ１４５細胞の定量値を比較することにより、各ノックダウン細胞の細胞増殖阻害率を算出した。なお、ポジティブコントロールとしてｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１（100μM）を用いた。
【００７２】
結果を図５および図６に示した。図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は培養終了時の各細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（Ａ）は野生型ＤＵ１４５細胞（Control）、（Ｂ）はｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞、（Ｃ）はＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞である。図５から明らかなように、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞およびＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞は、低酸素培養条件において、野生型ＤＵ１４５細胞（Control）と比較して細胞数が非常に少ないことが観察された。
図６は、通常培養条件および低酸素培養条件における各ノックダウン細胞およびポジティブコントロールの細胞増殖阻害率を示すグラフである。図６から明らかなように、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞およびＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞は、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１を添加したポジティブコントロールと同様に、低酸素培養条件における細胞増殖を顕著に阻害することが示された。
【００７３】
以上の結果から、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦの発現を抑制することにより、低酸素環境選択的にがん細胞の増殖を阻害できることが明らかとなった。なお、ｐ５４ｎｒｂ遺伝子ノックダウン細胞は、低酸素培養条件においてＩＧＦ−２の産生が阻害されることにより、低酸素環境選択的な増殖阻害を受けることが示唆され、ＬＥＤＧＦ遺伝子ノックダウン細胞は、ＩＧＦ−２産生には依存しない未知のメカニズムにより、低酸素環境選択的な増殖阻害を受けることが示唆された。
【００７４】
〔実施例３：ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦのｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１に対する結合能の確認〕
（１）プローブ
図７に示す２種類のプローブ分子（ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１プローブおよびダミープローブ）を用いて、ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦがｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と直接結合するか否かを確認した。プローブ分子は、光親和性基としてｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅを有するビオチンリンカーにｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはダミー化合物が結合している（図７参照）。
【００７５】
（２）実験方法
低酸素培養条件または通常培養条件で培養したＤＵ１４５細胞の核タンパク質画分（10μg、実施例１参照）と、各プローブ分子（1.5 nmol）を混合し、氷上、１５分間静置した。次に、ＵＶランプ（BLAK-RAY B-100A, UVP社）を用いて、氷上、１０分間、ＵＶ（365 nm）を照射した後、ストレプトアビジンを結合した磁性ビーズ（2 mg, Dynabeads M-280, invitrogen社）を添加し、室温で１時間転倒混和することにより、プローブ分子を磁性ビーズに結合させた。次に、磁石（DynaMag Spin, invitrogen社）を用いて磁性ビーズを沈殿させ、上清を回収した後、磁性ビーズを結合緩衝液［10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM KCl, 5mM MgCl2, 1% glycerol］で３回洗浄した。洗浄後、磁性ビーズにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー［50mM Tris-HCl (pH6.8), 1% SDS, 1% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol］を５０μＬ添加し、１００℃で５分間煮沸することによりプローブ分子に結合しているタンパク質を回収した。一方、回収した上清は限外ろ過（Amicon Ultra 10kDa, Millipore社）で濃縮した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーと１：１で混合し、１００℃で５分間煮沸した。調製した各サンプル中に、ｐ５４ｎｒｂまたはＬＥＤＧＦが含まれているか否かを確認するために、各タンパク質に対する抗体を用いて、定法に従いウエスタンブロッティングを行った。
【００７６】
（３）実験結果
結果を図８（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）は抗ｐ５４ｎｒｂ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、（Ｂ）は抗ＬＥＤＧＦ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果である。図８（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、ｐ５４ｎｒｂについては、低酸素培養条件でのみｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１プローブと結合することが明らかとなった。また、ｐ５４ｎｒｂはダミープローブを用いた場合にも検出されたが、その親和性はｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１プローブよりも弱く、上清にも検出された。一方、ＬＥＤＧＦについては、通常培養条件または低酸素培養条件で培養したＤＵ１４５細胞由来の核タンパク質ともにｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１プローブと直接結合することが明らかとなった。
【００７７】
以上の検討を総合的に判断して、低酸素環境選択的にがん細胞に対して増殖阻害効果を示すｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結合タンパク質は、ｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦであると決定した。したがって、低酸素環境においてｐ５４ｎｒｂおよびＬＥＤＧＦの少なくとも一方に結合する物質は、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１と同様に低酸素環境選択的にがん細胞に対して増殖阻害効果を示す物質であると考えられる。
【００７８】
〔参考例：ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１およびアナログｆ１３の低酸素環境選択的癌細胞増殖阻害活性〕
ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１およびアナログｆ１３をＥｔＯＨに溶解し、所定の濃度に調製した。一方、ＤＵ１４５細胞浮遊液２００μＬ（1×104 cells / well）を９６穴マルチウェルプレートに分注し、通常培養条件で３７℃、４時間前培養した。それぞれの細胞を低酸素培養条件または通常培養条件で３７℃、１２時間培養した後、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１またはアナログｆ１３のＥｔＯＨ溶液を２μＬ添加し、同じ培養条件でさらに２４時間培養した。２４時間培養後、ＭＴＴ法により生存細胞を比色定量し、無処理のＤＵ１４５細胞の定量値と比較することにより、細胞増殖阻害率を算出した。
【００７９】
結果を図９（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）はｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１の結果、（Ｂ）はアナログｆ１３の結果である。図９から明らかなように、ｆｕｒｏｓｐｉｎｏｓｕｌｉｎ−１は低酸素環境選択的がん細胞増殖阻害活性を有していること、アナログｆ１３は低酸素環境選択的がん細胞増殖阻害活性を有していないことを確認した。
【００８０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2014039509.tif 000014
【図９】
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【配列表】
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