(57)【要約】【課題】哺乳類対象における臓器移植における移植片対宿主病または移植片拒絶反応の予防または処置に有用な医薬を提供する。【解決手段】本発明は、哺乳類対象における臓器移植における移植片対宿主病または移植片拒絶反応の予防または処置に有用な医薬を調製するためのチモシンα1の使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象における、臓器移植における移植片対宿主病または移植片拒絶反応の予防または処置に有用な医薬を調製するための、チモシンα1の使用。
【請求項２】
哺乳類対象がヒト患者である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
患者が細胞、組織または臓器のレシピエントである、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
移植のための細胞、組織または臓器が、幹細胞、造血幹細胞、骨髄、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、小腸、角膜または皮膚からなる群から選択される、請求項３記載の使用。
【請求項５】
患者が骨髄機能破壊的前処置中である、請求項１記載の使用。
【請求項６】
患者が骨髄機能非破壊的前処置中である、請求項１記載の使用。
【請求項７】
チモシンα1が、移植前および／または移植後の予め決定した時間枠内で、医薬的に有効な量で患者に投与される、請求項１記載の使用。
【請求項８】
チモシンα1が、プレドニソロン、メチルプレドニソロン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、FK506、サリドマイド、アザチオプリン、ダクリズマブ、インフリキシマブ、MEDI-205、abx-cblまたはATGからなる群から選択される免疫抑制剤を組み合せて投与される、請求項１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植片対宿主病の処置のための医薬を調製するためのチモシンα1の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドナーとの組織適合性を示さないドナーからレシピエントへの骨髄移植または輸血または臓器移植において、ドナーのリンパ球はレシピエントに移動する。レシピエントがドナーリンパ球を拒絶できなければ、ドナーリンパ球はレシピエントの身体内に受容され、増殖し、組織を攻撃して疾患を誘導する。
【０００３】
白血病罹患患者、末期の腎臓、心臓、肺または肝臓不全の、臓器移植は、該処置においてかなり一般的に使用される。例えば、種々の型、例えば腎臓、心臓、肺、肝臓、骨髄、膵臓、角膜、小腸および皮膚(例えば、表皮)の同種移植片(患者自身または移植片の宿主/レシピエント以外のドナーから集めた臓器移植片)は、現在定期的に行われている。異種移植片(非ヒト動物から集めた臓器移植片)、例えばブタ心臓弁は臨床的に使用され、その機能不全のヒト対応物と置き換えられる。
【０００４】
臓器移植の成功を確実にするために、該患者と同一の双子または患者近親者からの移植片を得ることが望ましい。この理由は、臓器移植が、宿主において様々な免疫応答を誘起し、移植の拒絶および移植片対宿主病(以後、「GVHD」と示す)をもたらすためである。
【０００５】
免疫応答は、同種抗原の認識を介してT細胞によりまず開始され、移植拒絶における主な標的は、クラスIおよびクラスII主要組織適合性複合体(MHC)抗原の非自己対立形質である。急性拒絶反応において、ドナーの抗原提示細胞、例えば樹状細胞および単球は、同種移植片から局所リンパ節に遊走して、そこでレシピエントのCD4+TＨ細胞により外来物質として認識され、TＨ細胞増殖を刺激する。TＨ細胞増殖の後に、移植片に遊走して浸潤し、移植片拒絶反応を媒介するエフェクター細胞の集団(細胞毒性CD8+T細胞およびCD4+T細胞を包含する)が生成される(Noelle et al. (1991) FASEB 5(13):2770)。
【０００６】
急性拒絶反応はT細胞依存過程であるが、様々なエフェクター機構が移植破壊に参画する。サイトカインの放出および細胞間の相互作用により、CD4+T細胞、CD8+細胞毒性T細胞を包含するリンパ球の様々なアセンブリ、抗体形成B細胞および他の前炎症性白血球は、抗同種移植片応答に動員される。抗原提示移植細胞は、細胞毒性CD8+T細胞により直接破壊される。活性化されたCD4+T細胞は、CD8+T細胞およびB細胞両方の活性化に重要であるインターロイキン-2(以後、「IL-2」と示す)を産生する。さらに、CD4+T細胞は、他のサイトカイン、例えば同種移植片の破壊にも関与するIFN-γおよびIL-4を産生する。さらに、インターフェロン-γ(以後、「IFN-γ」と示した)は、移植組織上でクラスIおよびクラスIIのMHC分子の高い発現を誘導し、同種反応性エフェクター細胞による攻撃をより容易にさせる。IFN-γは、マクロファージ活性を増強させ、移植片に対する非特異的損傷を引き起こす遅延型過敏性反応および炎症をもたらす多くの炎症性細胞に影響する。これらの反応は、移植後の最初の数週間で起こりうる早期急性拒絶の主要原因であることがわかる。処置されなければ、急性拒絶反応は、数日で移植の破壊をもたらす急速かつ重症な過程へと進行する。
【０００７】
一方、ドナー由来のTリンパ球が、一般的にヒト白血球抗原(HLA)と示される一組の遺伝子マーカーを基にした差違を認識する場合、その新しい身体、即ち患者の身体への攻撃を開始する。大部分の患者およびドナーは、HLAマーカーに対して出来る限り密接に一致される。多くのマイナーマーカーは、患者およびドナーが同一双子である場合を除いて、ドナーおよび患者の間で異なる。移植前に、ドナーおよびレシピエントの広範囲のタイプ分けを行い、ドナーおよびレシピエントが免疫学的に密接であることを確実にする。このタイプ分けにも関わらず、検出出来ない免疫学的差違、およびドナー移植片内のT-リンパ球が検出出来る免疫学的差違が存在する。結果として、ドナーT-リンパ球が患者の身体の攻撃を開始して、GVHDをもたらす。
【０００８】
GVHDの2つの形態：急性および慢性GVHDが存在する。通常、急性GVHDは移植後の最初の3ヶ月において発生する。ドナーの骨髄中に存在するT細胞は、移植時に患者の皮膚、肝臓、胃および／または腸を攻撃する。急性GVHDの最も速い兆候は、通常、手、足および顔上に現れる皮膚発疹である。皮膚発疹以外には、重度のGVHD罹患患者は、胃や腸に対してドナーT細胞が攻撃するため、筋痙攣を伴う大量の水様または血性下痢を起こす。黄疸(皮膚および眼の黄色化)は、GVHD疾患が肝臓を含む通常の兆候である。多くの臓器が関与すればするほど、症状は悪化し、GVHD疾患が悪化する。
【０００９】
骨髄移植の場合において、特にGVHDは、移植患者の生存にとって別の障害である［Storb (1984) "Pathophysiology and prevention of graft-versus-host." In Advances in Immunobiology: Blood cell antigen and bone marrow transplantation, McCullogh and Sandier, editors, Alan, Inc., N.Y., p.337］。GVHDに罹患した大多数の人は、GVHDの結果として死亡する［Weiden et al(1980) "graft-versus-host disease in allogeneic marrow transplantation", in Biology of Bone-Marrow Transplantation, Gale and Fox, editors, Academic Press, N.Y., p37］。
【００１０】
チモシンα1は、医療分野では十分知られた化合物である。
【００１１】
この化合物は、いくつかのイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイ(1972; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 1800-1803)において、免疫調節特性を示す胸腺抽出物中に存在する酸性ペプチドである。
【００１２】
チモシンα1の通常の使用は既に知られている。
【００１３】
WO2004087067は、骨髄移植により処置される免疫不全宿主における、アスペルギルス・フミガタスによる感染の予防のためのチモシンα1の使用に関する。
【００１４】
ヒト非小細胞肺癌(「NSCLC」)を事前に接種されたヌードマウスへのチモシンα1の皮下投与により、腫瘍体積が有意に低下した。
【００１５】
また、メチルコラントレン誘発性繊維肉腫を有するマウスにおける肺の転移もまた、チモシンα1により低下され、局所肉腫増殖ならびにリンパ肉腫細胞の肝臓および肺転移が、チモシンα1により処置されたたBALB/cマウスにおいて有意に低下された。
【００１６】
GVHDの予防または処置のための医薬を調製するためのチモシンα1の使用は、当分野ではよく知られていない。
【００１７】
患者をGVHDから保護するために、様々な免疫抑制剤が用いられている。現在、同種移植片拒絶反応は、免疫抑制剤、例えばシクロスポリンA、アザチオプリン、プレドニソロンおよびメチルプレドニソロンを包含するコルチコステロイド、シクロホスファミドおよびFK506を用いて制御される。シクロスポリンAは、最も強力かつ最も高頻度で使用される免疫抑制剤であって、臓器移植手術の分野において大変革をもたらした。他の免疫抑制剤、例えば、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、15-デオキシスパガリン、ミゾリビン（mimoribine）、ミソプロストール、OKT3および抗IL-2受容体抗体は、臓器移植拒絶反応の処置および／または予防に使用されてきた［Briggs, Immunology letters, 29(1-2), 89-94, 1991; FASEB 3:3411, 1989］。新規免疫抑制剤の開発は、患者の生存において実質的改善をもたらしてきたが、これらの薬剤は、副作用、例えば腎毒性および／または肝毒性の高い罹患率に関係する。
【００１８】
例えば、シクロスポリンAは、治療用量で使用した場合であっても、毒性および副作用を伴う。FK506は、イン・ビトロでの活性化誘発性IL-2の転写およびイン・ビボでの移植片拒絶反応を阻害する場合に、シクロスポリンAよりも約10〜100倍強力であるが、また副作用、例えば神経毒性および腎毒性も示す。即ち、改善された毒性プロファイルを有するGVHDの処置および予防のための必要性がいまだ存在する。
【００１９】
本発明で、チモシンα1が、哺乳類対象における臓器移植において移植片対宿主病または移植片拒絶反応を阻害または処置するための有用な薬剤であることが判った。
【００２０】
従って、本発明の目的は、哺乳類対象、例えば細胞、組織または臓器を受容するヒト患者における臓器移植後の移植片対宿主病または移植片拒絶反応の予防または処置に有用な医薬を調製するためのチモシンα1の使用である。
【００２１】
本発明の細胞、組織または臓器は、幹細胞、造血幹細胞、骨髄、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、小腸、角膜または皮膚を含む群から選択され得る。
【００２２】
本発明のチモシンα1は、骨髄機能破壊的前処置または骨髄非破壊的前処置療法中の対象に投与され得る。
【００２３】
本発明のチモシンα1は、移植前および／または移植後の予め決定した猶予時間内で、所望によりプレドニソロン、メチルプレドニソロン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、FK506、サリドマイド、アザチオプリン、ダクリズマブ(Daclizumab)、インフリキシマブ、MEDI-205、abx-cbl またはATGを含む群から選択された免疫抑制剤と組合せて、医薬的に有効な量で患者に投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】チモシンα1は、骨髄前駆体からpDCを増殖させて、トリプトファン代謝を活性化する。  (A) C57BL6、TLR9-/-またはIFN-αβR-/-マウスの骨髄から得て、チモシンα1(+)またはスクランブルペプチド()の存在下でGM-CSF/IL-4(GM-DC)またはFLT3L(FL-DC)と共に培養した、DCでのCD11c、CD11bおよびB220の表面発現。ダブルポジティブ細胞のパーセントを示す。
【００２５】
(B) 24時間、非オプソニン化アスペルギルス分生子(5×105/mL)を用いて血清不含培地(1×106 細胞/mL)で培養したGM-DCまたはFL-DCによるサイトカイン産生(ELISA)。IDO阻害剤である1-MTを2μMにて添加した。データは、3つの独立した実験からの結果を統合したものである。アッセイの検出限界(pg/mL)は、IL-12p70については＜16であり、IL-10については＜12であった。
【００２６】
(C) (A)と同様に得たDCにおいて増加したIDOの機能および発現。細胞を、免疫ブロッティングによりIDOのタンパク質発現およびキヌレニン産生について評価した。ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、IDOタンパク質発現MC24形質転換体と偽形質転換されたMC22細胞の各々から構成される(図には示さず)。
データは、3つの実験のうちの代表的な実験の3サンプルの平均±SEである。
【００２７】
【図２】チモシンα1誘発性IDO+DCは、イン・ビトロのTreg細胞を活性化する。  (A)アスペルギルスをパルスしたチモシンα1処理GM-DCまたはFL-DCにより活性化したIFN-.-/IL-10産生の膵臓CD4+T細胞の頻度。1-MTは選択培養物に存在した。プレートをAID-EliSpot Reader System (Amplimedical)上で読んだ。値は、細胞の連続2倍希釈物を反復して計算した3-5回の実験からのサンプルの106細胞あたりの平均±SEである。(*) P＜0.05、分生子暴露細胞と非暴露細胞；(**) P＜0.05、チモシン暴露細胞と非暴露細胞。
【００２８】
(B)単独(-)または(A)と同様にして培養したCD4+細胞の表現型分析。数字はダブルポジティブ細胞の％を示す。
【００２９】
【図３】チモシンα1処理DCは、実験用HSCTにおけるアスペルギウスから保護する。  致死的放射線照射したC57BL/6マウスに、2×108アスペルギルス分生子/80μl生理食塩水の気管内投与二週間前のBALB/cマウスから得た2×106のT細胞枯渇化同種異系骨髄細胞を与えた。移植後1日および7日、マウスに、チモシンα1下で生育したアスペルギルスパルスGM-DCまたはFL-DCを腹腔内投与した。
【００３０】
感染に対する寛容を、感染3日後または死亡時の、MST(メディアン生存時間の日数)および肺内の真菌増殖(μg/臓器グルコサミン含量、棒線は標準誤差を示す）に関して評価した(A)。また、図に示されるのは、ドナーT細胞の存在下における、炎症性肺病理学(B)、GVHD反応性の発生(C)および感染に対する感受性(D)である。(B)非処理(なし)または各種DCを与える3日前に、アスペルギルス分生子を用いて感染させたマウスの肺から、過ヨウ素酸シッフ染色した断片を作成した。チモシンα1で処理したGM-DCまたはFL-DCを与えたマウスは、その肺で気管支壁損傷および炎症性応答の所見がなく炎症性細胞の回復性の浸潤物が見られないことを特徴とするが、対照的に、非処理マウスまたはGM-DC処理マウスの肺においては、気管支壁損傷および壊死、並びに十分でない炎症性細胞動員の重度の兆候が観察された。倍率×200。(*)P ＜0.05、DCを与えたマウスvs非処理マウス。(C)移植片とともに、様々な数のドナーT細胞を単独で、または各種DCと一緒に与えた代表的なマウスについての病理スコア。全身性GVHDの程度を、5つの臨床的パラメーター:体重損失、ハンチング(hunching)、活性、毛質および皮膚完全性(最高値インデックス=10)の変化をまとめたスコアシステムにより評価した。(*)P＜0.05、T細胞＋チモシンα1-GM-DCを与えたマウスとT細胞＋非処理GM-DCを与えたマウス。(D）(C)と同様に処理したマウスにおける感染に対する生存率。
【００３１】
【図４】チモシンα1誘発性DCはイン・ビボでの抗真菌Th1/Treg応答にプライムする。図2の説明と同様に処理したマウスにおける感染3日後の炎症性/Th/Tregのパターン。
【００３２】
(A)TNF-a/IL-10 レベルを、肺ホモジネートにおいて特異的ELISAにより評価し、IFN-./IL-4産生を、アスペルギルスをパルスしたDCと共培養したTLN CD4+T細胞において評価した。棒線は標準誤差を示す。IL-10またはTGF-βを産生するTLN CD4+CD25+T細胞を、ELISPOTアッセイにより計測した。結果を、2×105細胞あたりのサイトカイン産生細胞(±SE)の平均数として表した。*P＜0.05、DC処理マウスと非処理マウス。(**)P ＜0.05、チモシンα1処理DCと非処理DC。
【００３３】
(B)全RNAを、処理または非処理(なし)マウスのTLNから新たに精製したCD4+T細胞から抽出した。各細胞集団において様々なmRNAの発現をRT-PCRにより決定した。ハウスキーピング遺伝子の発現、Gapdh mRNAを内部コントロールとして使用した。示したデータは、3つの実験の代表的な結果である。
【００３４】
(C) 様々な型のDCを用いて注射したマウス、または注射しないマウス(なし)の肺またはTLNから単離した細胞の表現型分析。(-)は非感染、非処理マウスを示す。CD4+T細胞を、PE結合抗CD25(PC61)およびFITC結合抗CD69(クローンHI.2F3)mAbと連続して反応させた。数字は、分析した全細胞にわたりポジティブ細胞の％を示す。無関係のAbを用いる細胞のコントロール染色を使用して、バックグランド蛍光値を得た。ヒストグラムは、4つの独立した試験のうちの1つの代表的なものである。
【００３５】
【図５】チモシンα1誘発性Treg細胞は同種反応性を阻害する。  (A)移植マウスのTLNからのマウスCD4+Tリンパ球を、照射同種異系脾臓細胞、分生子またはコンカナバリンAを用いて刺激した自己移植脾臓DCで刺激した。T細胞増殖を、5日のMLRアッセイで評価し、最後の8時間にわたりH3チミジン導入により測定した。(*)P＜0.05、移植マウスとドナーマウス。(**)P＜0.05、T細胞および／またはDC処理マウスと非処理マウス。(***) P＜0.05、チモシンα1処理DCと非処理DC。(BおよびC)FL-DC(a)またはチモシンα1-GM-DC(b)を与えたレシピエントマウスからのTLN CD4+CD25+T細胞の存在下における、アスペルギルス分生子をパルスした自己移植膵臓DC(B)または同種異系(BALB/c)膵臓DC(C)に対する、レシピエントマウスから精製したCD4+CD25-T細胞による増殖活性およびIFN-.産生。示したデータは、3つ内の1つの独立した実験からの代表的な結果である。(*) P ＜0.05、アスペルギルス特異的または同種抗原特異的反応活性と非刺激細胞。(**) P ＜0.05、チモシンα1処理DCと非処理DC。(D)腹膜好中球(PMN)を、FL-DC処理マウス(a)またはチモシンα1-GM-DC処理マウス(b)からの肺のCD4+CD25+T細胞の存在下、60分間(酸化体産生のため、nmのO2-/106細胞として表す)、または24時間(サイトカイン産生のため、ELISA pg/mL)、休止分生子に暴露した。(*)P ＜0.05、分生子暴露PMNと非暴露PMN。(**) P＜0.05、非暴露PMNとTreg暴露PMN。(***) P＜0.05、CD25+a)とCD25+b)Treg。
【００３６】
【図６】チモシンα1はヒトDCの動員およびTh1/Treg抗真菌プライミングを促進する。  (A)チモシンα1の存在における、GM-CSF/IL-4(GM-DC)またはFLT3L(FL-DC)を用いる異なるドナーの末梢CD14+細胞から得たDC上でのCD11c、CD1aおよびCD123の表面発現。ポジティブ細胞のパーセントを示した。
【００３７】
(B)T細胞が枯渇したハプロタイプ同一のHSCTの7人のレシピエントからの、チモシンα１に暴露した(+)または暴露していない(-)GM-DCまたはFL-DCによる分生子の食作用。データは、平均±SEであり、内在化％として表した(図内の数字)。(*) P＜0.05、チモシンα1-処理細胞と非処理細胞。
【００３８】
(C)非オプソニン化アスペルギルス分生子(5×105/mL)またはザイモサン(10μg/mL)またはCpG-B ODN 2006(2μg/mL)を用いて24時間血清不含培地(1×106 細胞/mL)中で培養した健康なドナーからのチモシンα1誘発性DCによるサイトカイン産生(ELISAによるpg/mL）。示したデータは、3つの独立した試験からの結果を集めたものであり、平均±SDを示す。アッセイの検出限界(pg/mL)は、IL-12p70については＜3、IL-10については＜5、およびIFN-a.については＜3 ng/mLであった。
【００３９】
(D)Aと同様にアスペルギルスをパルスした.a1処理DCに対する応答における、健康なドナーからの末梢血アスペルギルス特異的CD4+T細胞クローンによるサイトカイン産生。棒線は標準誤差を示す。アッセイの検出限界(pg/mL)は、IL-4およびIFN-については＜0.5であった。*P＜0.05、分生子刺激化細胞と非刺激細胞。(**) P＜0.05、チモシンα1暴露細胞と非暴露細胞。
【００４０】
(E)健康なドナーまたは移植した患者からの真菌パルスDCまたは非パルスDC各々の異なるタイプに応答するアスペルギルス特異的または同種反応Ｔ細胞クローンの頻度。増殖しているクローンを、DCを用いる刺激2日後の特異性について評価した。(*) P＜0.05、GM-DCと末梢血細胞(-)。(**) P ＜ 0.05、HSCT-DCと全て他のDC。nd, 実施せず。
【００４１】
下記実施例は、本発明をさらに説明するものである。
【００４２】
導入部
チモシンα1は、TLR9(Blood. 2004;103:4232-4239)を包含するトル様レセプター(TLR)によるシグナル伝達によりヒトおよびマウスDCにおいて成熟およびサイトカイン産生を促進する天然胸腺ペプチド(Expert Opin. Biol. Ther. 2004;4:559-573)である。IL-12およびIL-10産生DCのバランスに影響を与えることによって、チモシンα1は、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)(Blood. 2004;103:4232-4239)に対する保護免疫性を誘導できる免疫調節剤として作用する。TLR9刺激もまた、自己分泌I型IFNシグナル伝達経路(J. Immunol. 2005;175:5601-5605; Eur. J. Immunol. 2005;36:8-11)を含む機構を介してIDO活性化へをもたらし、そして真菌類に対するIDO依存性の保護免疫の重要な成分であるCD4+CD25+細胞(J. Immunol. 2004;173:4433-4442)のpDC媒介性生成を促進できる(J. Immunol. 2005;174:2910-2918; J Immunol. 2006;176:1712-1723)。本発明では、DCによる免疫と寛容とのバランスおよびTreg細胞の生成におけるチモシンα1の活性を評価した。通常のDCとpDCの両方を増殖することが知られているGM-CSF/IL-4(GM-DC)またはFLT3リガンド（FL-DC) (J. Immunol. 2005;174:6592-6597)のいずれかを、チモシンα1とともに用いて、またはチモシンα1を使用せずに用いて、骨髄(マウス)または末梢血(ヒト)前駆体から、DCを得た。アスペルギルス・フミガタスおよび同種抗原に対するイン・ビトロおよびイン・ビボでのIDO発現およびTh1/Tregプライミングを仲介する能力について、DCを分析した。様々なDC集団によるプライミングおよび寛容における特異性および相補性を見出した。しかし、TLR9およびI型IFNRシグナル伝達経路を介するIDO依存性の寛容原性プログラムを活性化することにより、チモシンα1は、DC分化中に作用して、炎症および寛容のバランスを変化させた。
【００４３】
材料および方法
マウス
メスの8〜10週齢の同系交配のBALB/cおよびC57BL6マウスを、Charles River/Harlan Breeding Laboratories (Calco, Italy)から得た。C57BL6バックグラウンドの同型接合性TLR9-/-またはIFN-αβR-/-マウスを、ペルジャ大学の動物施設(Perugia University, Perugia)において、特定病原体不含条件下で生育させた。動物および動物の飼育方法は、国内法および政策基準に沿って行った。
【００４４】
ドナーおよび患者
ヒト末梢血単核細胞を、記入されたインフォームド・コンセントにより、健康なドナーおよびT細胞枯渇ハプロ型同一性HSCTである7人のレシピエントから得た。ドナータイプ分類により、移植およびGVHDを記載のとおりに評価した（Blood. 2005;106:4397-4406)。実験用HSCTモデルの致死的に放射線を浴びた（8 Gy)C57BL6マウスに、BALB/cマウス由来のT細胞枯渇化骨髄細胞を用いて注射した(Blood. 2003;102:3807-3814)。GVHDに対して、精製したドナーCD3＋T脾臓細胞を移植片に加えた(Science. 2002;295:2097-2100)。個々のマウスを、処置群の知識なしに各GVHD基準について(図3に対する説明を参照されたい)、週毎に0-2に分類した。
【００４５】
アスペルギルス・フミガタス感染
アスペルギルス・フミガタスの菌株、培養条件および感染を、Blood. 2004;103:4232-4239に記載のとおりに行った。マウスを2.5%アバーティン(avertin)で麻酔した(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)。肺内の真菌増殖の定量化をキチンアッセイによって行い、結果を一対の肺あたりのグルコサミンμgとして表し、PAS染色をBlood. 2004;103:4232-4239に記載のとおり行った。
【００４６】
試薬
チモシンα1およびこのスクランブルペプチド(ｓチモシンα1)(両方をSciClone Pharmaceuticals, Inc. San Mateo, CAから得た)を、精製した内毒素を含まない滅菌凍結乾燥アセチル化ポリペプチド(Blood. 2004;103:4232-4239)として供給した。この凍結乾燥粉末を滅菌水中にとかした。
【００４７】
DCサブセットの生成および培養
GM-DCまたはFL-DCを、rGM-CSF(Schering-Plough, Milan, Italy)およびrIL-4(Peprotech, Inalco, Milan, Italy)またはFLT3-L(Immunex Corporation, Seattle, WA)の存在において、イスコフ改変培地中で7-9日間培養した健康なドナーまたは移植患者(HSCT後1ヶ月)由来の精製したCD14+単球から得た(Blood. 2004;103:4232-4239)。DC回収率は、移植患者からの培養物において20-30%低下した。マウスGM-DCまたはFL-DCを、記載されるように(Blood. 2004;103:4232-4239)、7-9日骨髄細胞から得た。チモシンα1およびsチモシンα1を、20 ng/mLにて該培養物に添加した。DC（90-95% CD8-、5-10% CD8+および1-5% B220+細胞からなる＞99% CD11c+)を、CD11c MicroBeads およびMidiMacs (Miltenyi Biotech)を用いて磁性活性化ソーティングにより脾臓(spDC)から精製した。DC集団を、CD8またはB220 MicroBeads (Miltenyi Biotech)を用いて、CD8-、CD8+およびB220+画分にさらに分離した。DCを、記載されるとおりに、生存性非オプソニン化アスペルギルスの分生子またはサッカロマイセス・セレヴィシエ由来のザイモサン(Sigma)またはCpG-ODN 2006を用いて血清不含イスコフ培地中で24時間パルスした。食作用は記載のとおりに為された(Blood. 2004;103:4232-4239)。写真を、AxioVision Software Rel. 3.1(Carl Zeiss, Milan, Italy)を用いる高解像度の顕微鏡カラーカメラAxioCamを用いて撮影した。
【００４８】
フローサイトメトリー
DCを、PharMingenからのコンジュゲートmAbを用いて、CELLQuestTM softwareを備えたFACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson, Mountain View, CA)により抗原発現について分析した(Blood. 2004;103:4232-4239)。
【００４９】
IDO発現および機能分析
IDO発現および機能活性を、Nat. Immunol. 2002;3:1097-1101., Generation, purification and activity of T reg cells に記載したとおりに評価した。脾臓CD4+T-細胞を、フローサイトメトリーまたはELISPOTアッセイの前に5-7日間、分生子をパルスしたDCと共に共培養した。1-MT(Sigma-Aldrich)を2μMで使用した。CD4+CD25+およびCD4+CD25-細胞(FACS分析で＞90% 純粋)を、肺およびTLNから磁性細胞分類によって分離した(J. Immunol. 2006;176:1712-1723)。Treg細胞阻害について、5×104TLNのTreg細胞を3×105CD4+CD25-細胞に加え（いずれも移植マウス由来）、H3-チミジン標識の前に5日間、3×104の自己移植系アスペルギルス分生子をパルスしたspDCまたは1.5×105のナイーブドナーマウスからの同種異系spDCを用いて刺激した。精製した腹膜CD11b+Gr-1+PMN(FACS分析で＞98%純粋)(2×106)を、酸化体産生について60分間またはサイトカイン産生について24時間、4×105 CD4+CD25+の存在において休止分生子に暴露した(J. Immunol. 2006;176:1712-1723)。
【００５０】
サイトカインおよびELISPOTアッセイ
サイトカイン含量を、酵素結合免疫吸着剤アッセイにより評価した(Endogen Human Elisa Kits, R&D Systems and Euroclone, Milan, Italy)。サイトカイン産生細胞を数えるため、分生子をパルスしたDCと共に5日間共培養された精製脾臓CD4+T細胞に対して、AID EliSpot Assay kits (Amplimedical, Buttigliera Alta, Turin, Italy)を用いた(Blood. 2003;102:3807-3814)。1-MTを2μMで使用した。
【００５１】
養子免疫伝達、真菌攻撃および保護の評価
マウスに、HSCTの1日後を開始日として、一週間の間隔で2回、DCの腹腔内注射を与え、最後のDC投与の1週間後に感染させた。3日後に、肺ホモジネート、特異的なMiltenyi Biotec isolation kitを用いて精製したCD4+T細胞(FACS分析で＞98%)、CD4+CD25-(＞98%)またはCD4+CD25+(＞82%)を、炎症性および抗炎症性(肺ホモジネート中のTNF-a/IL-10)のパターン、アスペルギルスパルスDC(Blood. 2003;102:3807-3814)を用いて刺激されたCD4+細胞によるTh1(IFN-.)またはTh2(IL-4)のサイトカイン産生、CD25+IL-10+TGF-β+Treg細胞の頻度、リンパ球増殖およびRT-PCRによる遺伝子発現について評価した。増殖のため、TLN CD4+Tリンパ球を、H3-チミジン標識前に5日間、105細胞/ウェルの照射同種異系脾臓細胞または分生子または10μg/mL Con Aをパルスした自己移植系spDCとともに播種した(105細胞/ウェル)。
【００５２】
アスペルギルス特異的ヒトT細胞クローンおよびリンパ球増殖の生成
アスペルギルス特異的ヒトCD4+T細胞クローンを、放射線照射 (20Gy) したフィーダー自己移植末梢血細胞に限界希釈濃度で加えた末梢血CD4+CD45RA+T細胞から作成して、分生子をパルスしたDCまたは同種異系DCを用いて刺激した(Blood. 2005;106:4397-4406)。増殖クローンを、H3-チミジン標識(Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK)または2日後の上清中のサイトカイン含量により、真菌パルスDC、同種異系DC、自己移植系照射細胞(ネガティブコントロールとして)および0.5% フィトヘムアグルチニン(ポジティブコントロールとして)に対する特異性について評価した(Blood. 2005;106:4397-4406)。
【００５３】
逆転写酵素(RT)-PCR
RNA抽出物、cDNAの合成およびPCR、遺伝子特異的プライマーの配列、アニーリング温度および増殖サイクルを、J Immunol. 2006;176:1712-1723に記載したとおりに行った。増殖効果を、GAPDHについて評価し、正規化した。
【００５４】
統計学的分析
Student paired t testを使用して、実験群における有意値を決定した(有意をP＜0.05として規定した)。生存データを、マン・ホイットニーU検定を用いて分析した。イン・ビボ群は６匹の動物で構成した。
【００５５】
実施例１
チモシンα1は骨髄前駆体由来のpDCを増殖させ、トリプトファン異化を活性化する。
どのようにチモシンα1がマウスDCの表現型分類および機能特性に影響するかを評価するために、骨髄細胞を、チモシンα1またはコントロールであるスクランブルペプチドの存在下において、GM-CSF/IL4またはFLT3Lを含有する培地中で７-９日間培養した。成熟後、フローサイトメトリーおよび光学顕微鏡により細胞を分析した(図1A)。FLT3Lとは違い、GM-CSF/IL-4処理単独では、FACS分析でのB220+CD11c+細胞の％および光学顕微鏡を用いる形態学試験から明らかなように、高分画のpDCの出現は認められなかった。しかし、B220+CD11c+DCの数がより高いことおよび通常のCD11b+CD11c+細胞の回収率が若干低下したことから明らかなように、チモシンα1は、細胞の全収量に影響しなかったが、GM-DC中のpDCの出現を大きく増加させた。
【００５６】
チモシンα1は造血に影響することが知られているが、B220+CD11c+細胞の増殖は、チモシンα1単独にて観察されなかった。B220+CD11c+細胞は、チモシンα１で処理したFL-DCにおいても、またコントロールペプチドで処理したGM-DCにおいても増加しなかった。チモシンα1によるpDCの増殖は、TLR9-/-またはIFN-αβR-/-マウスからのGM-DCにおいて観察されず、チモシンα1の効果がTLR9およびI型IFNRシグナル伝達に依存することが示唆された。
【００５７】
実施例２
チモシンα１は骨髄DCによるIL-12の誘導およびpDC.16によるIL-10の誘導を促進する。
チモシンα1は、アスペルギルス分生子に対するGM-DCによるIL-12およびIL-10の放出と、FL-DCによるIL-10（IL-12よりも強い）の放出を誘導した(図1B)。真菌に対するDCによるIL-10の産生は、IDO依存的経路により制御される(J Immunol. 2005;174:2910-2918)；現行の設定では、チモシンα１に対するIL-10産生は、いずれの集団でもTLR9-/-またはIFN-αβR-/-マウス由来の細胞では生じず、IDO阻害剤1-メチル-DL-トリプトファン(1-MT)を培地に添加することによって同様に遮断された(図1B)。FL-DCおよびGM-DCにおけるチモシンα1による機能的IDOの誘導を、免疫ブロット分析およびDCによるトリプトファンのキヌレニンへの変換に関する酵素活性の評価により確認した。ここでも、IDOタンパク質の誘導およびチモシンα1による機能は、TLR9-/-またはIFN-αβR-/-マウス由来のDCでは観察されなかった(図1C)。
【００５８】
実施例３
チモシンα1誘発性IDO+DCはイン・ビトロでTreg細胞を活性化する
潜在的な調節活性と、DCによるIDO発現およびIL-10産生とを関連づけるために、脾臓CD4+Tリンパ球によるアスペルギルス分生子に対するイン・ビトロでの抗原特異的Th1/T reg プライミングを誘導する、チモシンα1誘発性DCの相対能力を試験した。図2Aは、チモシンα1が、GM-DCによるIFN-.-/IL-10 産生CD4+T細胞のプライミング、およびFL-DCによるIL-10産生細胞のプライミングを増加させたことを示す。IDO遮断と同様に、チモシンα1-GM-DC由来のB220+CD11c+の喪失により、Treg細胞活性化が消失した（データを示していない)。1-MTによるIDO遮断は、IL-10産生CD4+細胞の活性化を防止したが、IFN-.産生細胞に対する効果を示さなかった。これは、IDOが、IL-10産生T細胞についてのプライミングに因果的かつ選択的に関与することを示唆している。TLR9刺激は、IDOを活性させ(J. Immunol. 2005;175:5601-5605)、また、pDC媒介性のCD4+CD25+Treg細胞の生成(J. Immunol. 2004;173:4433-4442)、即ち、フォークヘッド転写因子Foxp3や細胞毒性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)のようなTreg活性に関するマーカーを発現するCD4+CD25+T細胞の発生、を促進する。細胞蛍光分析により、CD4+CD25+T細胞が、DCを用いる共培養により増殖したことが判った(図2B)。しかしながら、チモシンα1誘発性DCの存在下で培養した場合、CD4+CD25+T細胞の大部分が細胞内Foxp3および表面CTLA-4について陽性に染色された。この効果はIDO遮断によりうちけされた。また、FL-DCは、低い程度であるが、Foxp3+Treg細胞を誘導した。トリプトファン異化がFLT3Lにより増強されることを示唆する図1Cのデータと一致して、1-MTは、FL-DCと共に共培養したFoxp3+CTLA4+CD25+T細胞の増殖を妨げるようである。従って、イン・ビトロでのCD4+CD25+Treg細胞の発生は、DCのトリプトファン異化作用に関与するメカニズムを介して起こり、チモシンα1により促進されるようである。
【００５９】
実施例4
チモシンα1前処理GM-DCは、HSCTにおいてアルペルギルス症から宿主を保護する。
真菌をパルスしたDCは、実験的HSCT.7において強力な真菌ワクチンとして作用する。なぜなら、HSCT24,25ならびに抗真菌免疫において、炎症と寛容のバランスをとるための調節が絶対に必要だからである(J. Immunol. 2005;174:2910-2918)。
【００６０】
チモシンα1処理DCが、HSCTの実験的設定においてイン・ビボでのプライミングおよび寛容に影響するかどうかを試験した。移植マウスに、アスペルギルス分生子を用いて感染させた真菌パルスDCを注射し、肺内の生存、真菌増殖、および炎症性病理を追跡した。膵臓DCと同様に、FL-DCでは、5×105（5×104では効果がなかった）のDCの移植後にマウスが感染を免れて真菌増殖を制御し(図3A)、用量依存的に感染に対する耐性を与えたが、GM-DCでは効果がなかった。逆の効果が、GM-DCで処理したマウスで観察された。即ちマウスは、真菌増殖に関する有効な制御にもかかわらず生存できなかった。しかし、チモシンα1処理GM-DCの移植より生じた完全な保護に示されるように、FL-DCのワクチン性に影響しないチモシンα1処理は、GM-DCのワクチン性を劇的に増加させた(図3A)。FL-DCには、収集直後の膵臓CD8+、CD8-およびB220+LyC6+pDC.20の混合物と等価な集団が含まれる。様々なサブセットのDCのワクチンへの関与を分析するために、FL-DCまたは膵臓細胞集団から精製した画分を、単独で、または組み合せて、HSCTにおけるアスペルギウス症に対する保護を誘導する能力について試験した。その結果、広範囲の真菌増殖および伝搬からわかるように、CD8-またはCD8+DC単独では感染に対する耐性が付与されないことが示された。しかしながら、2つのサブセットを組合せた場合に保護が観察され、脾臓またはFL-DC培養物から精製したpDCで観察された保護と類似していた(データは示していない)。従って、機能的に異なる活性の組合せが、HSCTにおけるアスペルギウス症の実験的設定でのFL-DCおよびチモシンα1処理GM-DCのイン・ビボでの保護作用に関与するようであった。
【００６１】
実施例５
チモシンα1によるGM-DCの前処理は、免疫毒性を鈍化させる免疫成分を生成させる。
組織病理学により、GM-DC処理マウスの肺においては局所的な炎症性細胞動員および反応が高いが、チモシンα1処理GM-DCまたはFL-DCを注射したマウスでは低いことが明らかとなった(図3B)。これらの知見から、重度の炎症性毒性は移植したGM-DCと関連するようであり、GM-DCのチモシンα1前処理により緩和されることが示唆された。DCの免疫毒性およびチモシンα1によるその順化の可能性を明らかにするため、様々なDC集団を、移植片と共に様々なドナーT細胞数を受容するマウスに注射した。
【００６２】
マウスを、GVHDの評価のために非感染とするか、あるいは感染に対する感受性評価のために感染させた。幹細胞移植後のGVHDの開始は、宿主APCによる直接的な抗原提示に依るが(Science. 1999;285:412-415; Nat Med. 2004;10:510-517)、ドナーAPCによる間接的な抗原提示もまた説明されている(Nat Med. 2004;10:987-992)。先の結果(Science. 2002;295:2097-2100)と一致して、GVHDの重症度は、注射されたT細胞の数に依存し、GVHDの兆候は5×105または1×105のT細胞の注射後それぞれ10日または30日以内で観察される。GM-DCの同時投与は、105のT細胞によるGVHDの誘導を大きく促進させるが、FL-DCと同様に、チモシンα1処理GM-DCはこの効果を完全に抑制した(図3C)。感染に対する感受性に関して、生存率は、ドナーT細胞単独で注射してもGM-DCと共に注射しても変化しなかった。これに対して、FL-DCを与えたマウスと同様に、チモシンα1処理GM-DCを注射したマウスは感染を免れた(図3D)。併せると、これらの結果は、spDCと同様に、FL-DCは、HSCTレシピエントにおける養子免疫伝達後の抗真菌保護の誘導に完全に有効であることを示唆した。これに対して、GM-DCは、炎症およびGVHDの促進を含む免疫毒性を有し、これはイン・ビトロでチモシンα1により開始される調節作用の影響を受けやすい宿主における活性である。
【００６３】
実施例６
チモシンα1誘発性DCは抗真菌Th1/Treg応答をプライムする。
チモシンα1処理DCがTreg細胞をイン・ビボで誘導するかを調べるために、肺ホモジネート中のTNF-a/IL-10産生、TLN CD4+T細胞によるIFN-./IL-4産生、およびTLN CD4+T細胞におけるIFN-.をコードする遺伝子、Th2-特異的転写ファクターGATA-3、およびFoxp3の発現レベルを評価した。機能的に異なるTreg集団がアスペルギウス症罹患マウスの肺およびTLNにおいて見出されるので（J. Immunol. 2006;176:1712-1723)、肺およびTLNにおけるCD4+CD25+T細胞の存在も評価した。その結果、様々な群で異なるパターンのTNF-a/IL-10産生が示された。非処理またはGM-DCを注射したマウスでは、TNF-aが高くIL-10が低かったが、FL-DCを注射したマウス、および特にチモシンα1処理GM-DCを投与したマウスでは反対であった(図4A)。CD4+T細胞による実際のIFN-./IL-4産生の評価から、チモシンα1処理GM-DCを投与されたマウス、またはその処理によらずFL-DCを投与されたマウスにおいては、IFN-.の量がより高く、IL-4の量が低いことが明らかとなった (図4A)。PCR分析は、ng mRNA発現が常に存在していることを示した；Gata3 mRNAは、非処理またはチモシンα1に暴露されていないFL-DCにより処理されたマウスにおいて検出され、Foxp3 mRNAは、チモシンα1暴露に関係なくFL-DCを与えたマウスまたはチモシンα1処理GM-DCを与えたマウスにおいて発現していた(図4B)。グルココルチコイド誘発性TNF受容体(GITR)の発現レベルを評価したところ、実験群間において顕著な差違なく広範囲に発現することがわかった。細胞蛍光分析により、CD4+CD25+T細胞の数が、チモシンα1非処理またはチモシンα1処理にかかわらず、いずれの型のDCを注射したマウスのTLNおよび肺内でも増加したことが明らかとなった(図4C)。驚くべきことに、ある種の示差的な局在化が観察され、即ち、チモシンα1処理GM-DCは肺においてTLNよりもTregを多く誘導し、チモシンα1処理FL-DCではその反対であった。チモシンα1処理GM-DCまたはFL-DCを与えたマウスから回収したCD4+CD25+T細胞は、非処理GM-DCを与えたマウスから回収した細胞により観察されたように、CD69活性化マーカーについて陽性に染色されなかった(図4C)。流入領域リンパ節への遊走および占有が移植片受容に必要とされるという概念と一致して、FL-DCまたはチモシンα1処理GM-DCを与えたマウスから回収したCD25+T細胞は、CD62Lマーカーについても陽性に染色された。TLNのTreg細胞は、多数のIL-10またはTGF-β産生細胞を含有したが(図4A)、一方で肺のTreg細胞は、TGF-β産生細胞よりもIL-10産生細胞を多く含有した。
【００６４】
併せると、これらの結果から、チモシンα1に暴露したGM-DCは、イン・ビボでの養子免疫伝達に対して、炎症性/Th1応答を保護的Th1/Treg応答に変更することを示唆された。しかしながら、誘導されたTreg細胞が様々な区画に存在するという知見は、異なるTreg集団間の可能性ある表現型および機能的相違と関連し得る。このことは、アスペルギルスに暴露されたマウスの肺およびTLNにおいて協調的に活性化された機能的に異なるTreg集団間で役割の差違が生じる(J. Immunol. 2006;176:1712-1723)、という知見と一致するであろう。あるいは、同族認識によるリンパ節における活性化およびプライミングの第一レベルの後に、活性化されたTreg細胞は、感染組織に移行（trafficking）して局所で炎症性応答を制御しうるエフェクターTreg細胞となるのかもしれない。
【００６５】
実施例７
抗真菌Treg細胞は同種反応性および炎症を阻害する。
CD25+Treg細胞の抑制活性を評価するために、異なるDCサブセットを与えたマウス由来のTLN細胞を、同種異系脾臓細胞、アスペルギルス分生子または有糸分裂促進物質に対する増殖性応答について評価した。その結果、T細胞を単独で、またはGM-DCと共に与えたマウスにおいて、（アスペルギルス特異的ではなく）同種異系の増殖が観察された。これに対して、FL-DCまたはチモシンα1処理GM-DCを与えたマウスにおいて、同種反応活性は低下したが、病原体特異的反応性は、ドナーコントロールと比較して低い程度ではあったが、回復した(図5A)。有糸分裂促進物質に対する応答はDC処理マウス間で同程度であったので、これらの結果から、Treg細胞は、同種異系および病原体特異的Th1反応性の両方に直接影響を与えることが示唆された。この問題を解明するために、TLNから精製したCD4+CD25+T細胞を、対応するCD4+CD25-T細胞の、アスペルギルス特異的または同種抗原特異的な増殖およびIFN-.産生を遮断する能力について評価した。CD4+CD25+T細胞は同種抗原およびアスペルギルスに対して低応答性であったが、同種反応活性および抗原特異的応答はいずれも、FL-DCまたはチモシンα1処理GM-DCを与えたマウス由来のCD4+CD25+T細胞の存在下で低下した(図5B)。肺のTreg細胞は肺のアスペルギウス症において強力な抗炎症性活性を有するので(J. Immunol. 2006;176:1712-1723)、好中球の抗真菌エフェクター活性、例えばTNF-aおよび酸化体産生、に対する肺のCD4+CD25+T細胞の抑制活性もまた試験した(J. Immunol. 2006;176:1712-1723)。なぜなら、これらの機能はTreg細胞の抑制活性に非常に感受性があるためである。いずれの機能も、肺Treg細胞、特にチモシンα1処理GM-DCにより誘導されたTreg画分により顕著に阻害された(図5B)。
【００６６】
実施例８
チモシンα1は、ヒトDCの動員およびTh1/Treg抗真菌プライミングを促進する。
チモシンα1がヒトDCのTh1/Tregプライミング能に影響し得るかを評価するために、チモシンα1の存在下、健康なドナーからのCD14+細胞からGM-DCまたはFL-DCを得た。マウスDC培養物と同様に、チモシンα1は、GM-CSF/IL-4処理培養物中のCD1a+DCの動員を低下させながら、CD123+pDCの動員を促進した。
【００６７】
FLT3-L培地においては、かかる効果は観察されなかった(図6A)。チモシンα1は、食作用に関して、GM-DCまたはFL-DCの微生物検出を有意に変化させた(GM-DCにおいて30〜56%の食作用、またFL-DCにおいて32〜58%の食作用)。しかしながら、驚くべきことに、チモシンα1は、移植1ヶ月後の患者から得たGM-DCおよびFL-DCの両方の食作用もまた促進した(図6B)。機能的活性に関して、チモシンα1は、イン・ビトロで、炎症性IL-12産生GM-DCを、FL-DCと同様に増加したレベルのIL-10を産生する寛容原性pDCへと変換させ(図6C)、IL-10産生CD4+T細胞をプライムした(図6D)。I型IFN産生pDCは、寛容の誘導および維持に加えてチモシンα1の寛容原性効果に関与することが知られているので、アスペルギルス分生子またはザイモサン(GM-DCについてのポジティブコントロールを意図する)またはCpG ODN(FL-DCについてのポジティブコントロール)に対するIFN-aの産生を比較した。IFN-aは、主にFL-DCまたはチモシンα1処理GM-DCにより産生された(図6C)。最後に、チモシンα1処理が、真菌または同種抗原特異的T細胞反応性を活性化するDCの能力を変化させ得るかどうかを試験した。図6Eは、チモシンα1が、DCにより誘導される抗原特異的T細胞応答も、いずれの型のDCの同種刺激能も、変化させないことを示す。実際、真菌特異的T細胞反応性の誘導は、移植患者由来のDCにおいては全く存在しなかった。従って、これらのデータは、炎症性DCを利用することによって、チモシンα1が、造血細胞移植における同種反応活性の非存在下に、抗真菌Th1/Treg細胞プライミングの成功のための要件を満たし得ることを示している。
【００６８】
上記実施例において報告された得られた結果から、チモシンα1が、GM-DCにおいてIDO機能に適するpDC分画を増殖すること、およびIDO+pDCが実験的HSCTにおいて殺菌免疫および同種抗原の寛容を媒介するために必要かつ十分であることが示された。
【００６９】
これは、チモシンα1が、生理および反生理状態において末梢寛容の誘導および維持に関与する天然のホルモンとして作用することを示すものである。
【００７０】
本発明は、臓器移植における移植片対宿主病または移植片拒絶反応を予防または処置される患者へ、調剤するための、または調剤する場合に使用するための、治療用包装に関するものであって、１以上の単位用量を含んでおり、各単位用量は、ある量のチモシンα1、および所望によりある量の免疫抑制剤を含む。
【００７１】
本発明は、包装材料および該包装材料内に含まれたチモシンα1、および所望により免疫抑制剤を含む製造物品に関するものであって、ここで該チモシンα1は臓器移植における移植片対宿主病または移植片拒絶反応の予防または処置のために治療上有効であって、そして該包装材料には、チモシンα1が臓器移植における移植片対宿主病または移植片拒絶反応の予防または処置に使用されるということを示す標識が含まれる。
【００７２】
本発明において、チモシンα1、および所望により免疫抑制剤は、別々の形態で、または活性成分と所望により医薬上許容し得る希釈剤または賦形剤とを含む単一形態で、投与され得る。
【００７３】
本発明において、チモシンα1および免疫抑制剤が別形態で投与される場合(即ち、2つの異なる投与)、該活性成分は、連続的に(即ち、同時に)、または上記した標識にて示唆された投薬スケジュールに従って連続的に投与され得る。
【００７４】
本発明の使用において、用語「処置」または「処置すること」とは、その通常の意味を有し、これには、GVHDの進行または活性化を防止すること、予防すること、緩和すること、阻害すること、改善すること、不完全すること、抑制すること、遅延させること、または進行もしくは活性化を逆転させること、またはGVHDの重症度の低下が含まれる。
【００７５】
本発明の使用において、用語「有効量」とは、目的とする結果を果たし得る化合物の量を指すものである。例えば、GVHDを処置することを目的として投与される有効量のチモシンα1、および所望により免疫抑制剤とは、その進行を、予防、阻止、緩和、改善、停止、抑制、遅延または逆転させるため、またはGVHDの重症度を低下させるために必要とされる量であって、この投与されるべき一日用量は、かかりつけ医の判断に従って、対象の体重、年齢および患者の一般的条件に依拠する。
【００７６】
また、本発明は、医薬用担体との関連において、活性成分として、チモシンα1および所望により免疫抑制剤を含む医薬製剤を用いる方法を包含する。当業者は、かかる製剤およびその製造を知っている［例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,(16th ed.1980)を参照されたい］。
【００７７】
製剤は、活性成分の単位用量形態で製造され得る。用語「単位用量形態」とは、ヒト対象のための単位用量として適切な物理的に分離された単位を指すものであって、各単位用量は、適切な医薬賦形剤と関連して、所望の治療効果をもたらすように計算された、予め決定された量のチモシンα1、および所望により免疫抑制剤を含んでいる。
【００７８】
チモシンα1、および所望により免疫抑制剤は、医薬上許容し得る担体または賦形剤を組合せた医薬組成物の形態で投与してもよく、この割合および特性は、選択された担体および／または賦形剤中の該化合物の溶解性および化学特性、選択された投与経路および標準的薬務によって決定される。
【００７９】
医薬組成物は、医薬分野においてよく知られた方法で調製される［例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(16th ed. 1980)を参照されたい］。
【００８０】
担体または賦形剤は、ビヒクルまたは活性成分のための媒介手段として働き得る固体、半固体または液体材であってよい。適切な担体または賦形剤は、当業者には十分知られている。医薬組成物は、経口、吸入、非経口または局所使用に適しており、錠剤、カプセル、エアロゾル、吸入、座薬、溶液、懸濁液、リポソーム等の形態で患者に投与され得る。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月7日(2014.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類対象における、幹細胞、造血幹細胞、または骨髄の移植における移植片対宿主病の予防または処置のための、チモシンα1を含む医薬組成物。
【請求項２】
哺乳類対象がヒト患者である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
対象が骨髄機能破壊的前処置中である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
対象が骨髄機能非破壊的前処置中である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項５】
チモシンα1が、移植前および／または移植後の予め決定した時間枠内で、医薬的に有効な量で対象に投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
チモシンα1が、プレドニソロン、メチルプレドニソロン、シクロホスファミド、シクロスポリンA、FK506、サリドマイド、アザチオプリン、ダクリズマブ、インフリキシマブ、MEDI-205、abx-cblまたはATGからなる群から選択される免疫抑制剤と組み合せて投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
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