(57)【要約】【課題】糖鎖の効率的な化学合成技術を開発することを課題とする。【解決手段】下記式（Ｉａ）で表される糖誘導体及びそれを用いた糖鎖の合成方法。2014224055.tif 000046【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉａ）
【化１】
2014224055.tif 000038
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4aは保護されていてもよい水酸基を示し、Ｒ5aは同一又は異なって保護されていてもよい水酸基又は保護されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ6aは同一又は異なって水素原子又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体。
【請求項２】
下記式（Ｉｂ）
【化２】
2014224055.tif 000039
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4bは保護された水酸基を示し、Ｒ5bは同一又は異なって保護された水酸基又は保護されたアミノ基を示し、Ｒ6bは同一又は異なって水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体に、下記式（ＩＩ）
【化３】
2014224055.tif 000040
〔式中、Ｒ5b、Ｒ6bは前記と同義であり、Ｒ7は水素原子又は水酸基であり、Ｒ7の何れか一方は水素原子、他方は水酸基を示す。〕で表される糖誘導体を反応させることを特徴とする、下記式（ＩＩＩ）
【化４】
2014224055.tif 000041
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体の合成方法。
【請求項３】
下記式（Ｉｂ）
【化５】
2014224055.tif 000042
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4bは保護された水酸基を示し、Ｒ5bは同一又は異なって保護された水酸基又は保護されたアミノ基を示し、Ｒ6bは同一又は異なって水酸
基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体に、下記式（ＩＩ）
【化６】
2014224055.tif 000043
〔式中、Ｒ5b、Ｒ6bは前記と同義であり、Ｒ7は水素原子又は水酸基であり、Ｒ7の何れか一方は水素原子、他方は水酸基を示す。〕で表される糖誘導体を反応させ、下記式（ＩＩＩ）
【化７】
2014224055.tif 000044
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体を合成し、
Ｒ3で示される水酸基の保護基の脱保護を行い、遊離の水酸基の立体反転反応を行うことを特徴とする、下記式（ＩＶ）
【化８】
2014224055.tif 000045
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規糖供与体及び同糖供与体を用いた効率的な糖鎖の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質医薬品では、タンパク上の糖鎖構造により、その活性が異なる。その代表的な例として抗体医薬品におけるポテリジェント技術が知られている（非特許文献１）。抗体のFc領域に結合する複合型糖鎖の根元部分のフコース残基を欠落させることによりADCC活性（抗体依存性細胞障害活性）が増強され、抗腫瘍効果が高まる。結果として使用する抗体医薬品の量の低減、高価な医薬品の使用量が減ることで医療費の抑制につながる革新的技術の一つとして注目を浴びている。しかし、現在の製法では糖鎖構造を完全に制御することができない。また、特許切れに伴う後続品の糖鎖構造の違いが予期せぬ副作用を生む可能性があるなど、糖鎖を均一化する必要性が叫ばれている（非特許文献２）。
【０００３】
この様な背景からタンパク質の糖鎖修飾法が開発、すなわち、鶏卵由来の糖鎖を化学修飾し、糖転移活性を有する酵素（endo-M）によりタンパク上へ糖鎖を導入する技術で、糖転移効率も定量的に進行する例も報告され（非特許文献３）、均一糖鎖構造を有する糖タンパク質合成も次世代技術として現実味を帯びてきた。従って、均一構造の糖鎖を大量に合成すれば、均一糖鎖構造を有する糖タンパク質合成が可能になる。有機合成化学による糖鎖合成はその一翼を担う技術である。特許文献１には、保護基を使用した糖鎖の化学合成方法について、記載されている。しかしながら、糖鎖合成の多段階にわたる合成工程、グリコシル化における立体選択性の制御が困難で副生成物ができるために単離精製の手間がかかる。従って、これまでも本発明者等を含め、多くの糖鎖合成法が開発、比較的容易に糖鎖合成が可能になってきたものの、バイオ医薬品関連糖鎖をグラムスケールで供給した例はない。
【０００４】
LacdiNAc型複合型糖鎖9糖は、抗体医薬品においてポテリジェント効果を発揮する複合型糖鎖と極めて類似した骨格である。
現在までに、LacdiNAc糖鎖の合成研究は行われているものの、その報告は限られている。近年、非特許文献４において、NakaharaらはLacdiNAc構造を有するアスパラギン結合型糖鎖の合成を報告している。
【０００５】
本発明者らはまず、ブロック合成法による非還元末端にガラクトースを有する複合型糖鎖Aの効率的合成を目指した。その結果、3糖供与体Bと3糖受容体Cのカップリング反応の立体選択性は低く、α・βの立体異性体の混合物が生じることをHPLCにて確認した（下記スキーム）。
【０００６】
【化１】
2014224055.tif 000002
【０００７】
そこでNakaharaらはStep-wiseに合成するルートへと変更し複合型糖鎖の全合成を達成、その方法をLacdiNAc合成へと応用した（下記スキーム）。なお、Nakaharaらは、β−マンノシド結合の構築はCrichらの方法を用いて構築している。
【０００８】
【化２】
2014224055.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０００８６１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】設楽  哲也；YAKUGAKU ZASSHI 129(1)3-9(2009)
【非特許文献２】バイオ医薬品開発における糖鎖技術：シーエムシー出版，2011
【非特許文献３】東京化成工業（株）ホームページ[online]、インターネット＜URL:http://www.tcichemicals.com/ja/jp/support-download/tcimail/application/122-23.html＞
【非特許文献４】Hagiwara et al., J. Org. Chem. (2011) 76, 5229-5239
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような背景において、糖鎖の効率的な化学合成法を開発することにより、糖鎖の大量供給を可能にすると考えられるが、このような方法は開発されていなかった。
【００１２】
そこで、本発明は、糖鎖の大量供給を可能にする、糖鎖の効率的な化学合成技術を開発することを課題とする。具体的には、水酸基の保護基の導入を最低限に押さえるとともに、立体および位置選択的なグリコシル化反応法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記技術を開発するために鋭意検討を行った。
糖鎖の化学合成において糖と糖をつなぎあわせるグリコシル化反応をおこなう際に、糖部分を保護する必要がある。本発明では、糖残基に導入する保護基のパターンを最適化することで、立体かつ位置選択的にグリコシル化反応を進行させることに成功し、その結果、水酸基の保護、脱保護工程を大幅に短縮し、複合型糖鎖の効率的構築に成功した。すなわち、上記の課題に合致した糖鎖の効率的な化学合成技術が達成されることを知見し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１５】
＜１＞  下記式（Ｉａ）
【００１６】
【化３】
2014224055.tif 000004
【００１７】
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくは
アセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4aは保護されていてもよい水酸基を示し、Ｒ5aは同一又は異なって保護されていてもよい水酸基又は保護されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ6aは同一又は異なって水素原子又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体。
【００１８】
＜２＞  下記式（Ｉｂ）
【００１９】
【化４】
2014224055.tif 000005
【００２０】
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4bは保護された水酸基を示し、Ｒ5bは同一又は異なって保護された水酸基又は保護されたアミノ基を示し、Ｒ6bは同一又は異なって水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体に、下記式（ＩＩ）
【００２１】
【化５】
2014224055.tif 000006
【００２２】
〔式中、Ｒ5b、Ｒ6bは前記と同義であり、Ｒ7は水素原子又は水酸基であり、Ｒ7の何れか一方は水素原子、他方は水酸基を示す。〕で表される糖誘導体を反応させることを特徴とする、下記式（ＩＩＩ）
【００２３】
【化６】
2014224055.tif 000007
【００２４】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体の合成方法。
【００２５】
＜３＞  下記式（Ｉｂ）
【００２６】
【化７】
2014224055.tif 000008
【００２７】
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4bは保護された水酸基を示し、Ｒ5bは同一又は異なって保護された水酸基又は保護されたアミノ基を示し、Ｒ6bは同一又は異なって水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体に、下記式（ＩＩ）
【００２８】
【化８】
2014224055.tif 000009
【００２９】
〔式中、Ｒ5b、Ｒ6bは前記と同義であり、Ｒ7は水素原子又は水酸基であり、Ｒ7の何れか一方は水素原子、他方は水酸基を示す。〕で表される糖誘導体を反応させ、下記式（ＩＩＩ）
【００３０】
【化９】
2014224055.tif 000010
【００３１】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体を合成し、
Ｒ3で示される水酸基の保護基の脱保護を行い、遊離の水酸基の立体反転反応を行うことを特徴とする、下記式（ＩＶ）
【００３２】
【化１０】
2014224055.tif 000011
【００３３】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体の合成方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、糖鎖の効率的な化学合成方法、及び同方法に用いる特定の保護基のパターンを有する新規糖供与体が提供される。
本発明では、LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖9糖骨格の構築を達成した。
一般に用いられる保護基のパターンの３糖を、４カ所遊離水酸基がある糖受容体３糖に対してグリコシル化反応を行ったところ、１２糖、９糖、６糖など、１０種類を越える複雑な混合物を与えたのに対し、本発明の保護基のパターンを用いた糖供与体３糖を用いた場合、９糖を単一の化合物として与えた。この９糖は抗体医薬品においてポテリジェント効果を発揮する複合型糖鎖と極めて類似した骨格である。
したがって、本発明により、水酸基の保護、脱保護工程を大幅に短縮し、従来よりも簡便に目的糖鎖を得ることができる。
本発明の方法は、無駄な保護脱保護過程を省略、簡便かつ均一な糖鎖を得ることができるため、バイオ医薬品製造のボトルネックである均一糖鎖構造の供給を可能にする技術である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、糖供与体5及び糖受容体6との反応によって得られた９糖画分のＨＰＬＣ解析結果を示す図である。
【図２】図２は、糖供与体50及び糖受容体6との反応によって得られた９糖画分のＨＰＬＣ解析結果を示す図である。
【図３】図３は、糖供与体51及び糖受容体6との反応によって得られた９糖画分のＨＰＬＣ解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本明細書において用いた略号を説明する。
Ac : Acetyl group
Asn : Asparagine
Bn : Benzyl group
COSY : Correlation spectroscopy
CSA : 10-camphorsulfonic acid 
CsOAc : cesium acetate
DAST : N, N-diethylaminosulfur trifluoride
oC : degrees Celsius
DIPEA : N, N-diisopropylethylamine
DMF : N, N-dimethylformamide
DMAP : 4-dimethylaminopyridine
DBU : 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undeca-7-ene
DTBMP : 2,6-di-tert-butyl methyl pyridine
EDA : ethylenediamine
Gal : D-galactose
GalNAc : N-acetylgalactosamine
GlcNAc : N-acetylglucosamine
HSQC : Heteronuclear single quantum correlation 
Man : D-Mannose
MeOTf : methyltrifluroromethanesulfonate
MS : molecular sieves
NBS : N-bromosuccinimide
NIS : N-iodosuccinimide
Phth : Phthaloyl
Ph : Phenyl
Py : pyridine
r. t. : room temerature
TBAF : tetrabutylammonium fruoride
TBDMS : tert-buthyldimethylsilyl
TBDPS : tert-buthyldiphenylsilyl
Tf : (trifluoromethyl)sulfonyl
THF : tetrahydrofuran
TMSN3 : trimethylsilylazide
TMSOTf : trimethylsilyltrifruoromethanesulfonate
TLC : Thin layer chromatography
【００３７】
（１）LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖の合成戦略
本発明者らは、LacdiNAc糖鎖を有する複合型糖鎖の効率的合成について、下記スキームに示すような合成戦略をたてた。まず大きな糖鎖を効率よく構築できるブロック合成法により糖鎖構築を行うこととした。さらに共通の合成シントンを利用することで合成工程の軽減を行うこととした。また分岐部分を糖水酸基の反応性の差を利用した位置選択的グリコシル化反応を利用することで9糖骨格を1段階で合成、保護脱保護工程の省略を目指した。一方、複合型糖鎖合成の共通の問題であるβ−マンノシド結合の構築は水酸基の反転反応を用いることとした。
具体的には目的の糖鎖を、共通シントンから成るガラクトシルキトビオースブロックとキトビオシルマンノースブロックの2つのブロックに分けて合成後、4か所の水酸基に対する位置選択的グルコシル化反応によって9糖骨格を構築し、水酸基の反転反応によって分岐のβ−ガラクトースをβ−マンノースへ、非還元末端側のキトビオース構造をLacdiNAc構造へと導くことにより目的の糖鎖を得ることとした。9糖の構築に用いる単糖ユニットはグルコサミン、マンノース、ガラクトースの3つである。それぞれの単糖誘導体を合成後、2残基のグルコサミンを縮合することでキトビオース誘導体を合成する。キトビオー
スに対し、マンノース誘導体を結合することでキトビオシルマンノースを合成する。
【００３８】
LacdiNAc構造は目的糖鎖構築後、グルコサミン残基4位水酸基を反転することで導く。なお、ガラクトサミンを用いない理由はガラクトサミンが高価であることと、できる限り共通のユニットを利用するためである。一方、キトビオースに対し、ガラクトース誘導体を結合することでガラクトシルキトビオースブロックを合成する。天然型のマンノース残基ではなくガラクトース残基を用いる理由としては、β−マンノース結合の構築が困難なためである。それに対し、β−ガラクトシド結合は隣接基を利用することで容易にβ-結合が構築できるため、目的糖鎖9糖の構築後に2,4位水酸基を反転させることでβ−マンノースへと変換するルートを考案した。次に、ガラクトース残基2,3,4,6位を遊離としたガラクトシルキトビオース3糖に対し、マンノシルキトビオース3糖を反応させ、3位と6位にのみ3糖を結合させる位置選択的グリコシル化反応による9糖合成を行う。ガラクトース6位は1級水酸基であり、3位は4位アキシャル水酸基の隣の水酸基との間の水素結合により他の2級水酸基より反応性が高いと考えている。反応性の差を利用することにより、無駄な保護・脱保護工程を省けると考えた。最後に、水酸基の反転反応によるLacdiNAc構造とβ−マンノース結合への変換を同時に行い目的糖鎖とする。以上のルートは難しい立体の構築や高価な原料の使用を避けること、また保護脱保護を省略、ブロック合成により、目的糖鎖の効率的な糖鎖構築が可能になる。
【００３９】
【化１１】
2014224055.tif 000012
【００４０】
本発明者らは、前述の合成戦略に基づいて、種々の実験による検討の結果、特定の保護基のパターンを用いた糖供与体３糖を用いて、糖受容体３糖と反応させることによって、LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖9糖を単一の化合物として与えることを知見した。本発明は、同知見に基づいてなされたものである。
【００４１】
（２）糖供与体
本発明は、前述の合成方法等に用いることができる、特定の保護基のパターンを用いた新規糖供与体に関する。具体的には、下記式（Ｉａ）
【００４２】
【化１２】
2014224055.tif 000013
【００４３】
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4aは保護されていてもよい水酸基を示し、Ｒ5aは同一又は異なって保護されていてもよい水酸基又は保護されていてもよいアミノ基を示し、Ｒ6aは同一又は異なって水素原子又は水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体［以下、化合物（Ｉａ）と称することがある］に関する。
【００４４】
Ｒ4aで示される保護されていてもよい水酸基の保護基及びＲ4bで示される保護された水酸基の保護基としては、通常グリコシル化反応に利用される活性基や水酸基の保護基であれば特に制限されないが、チオエーテル型保護基、トリクロロアセトイミド型保護基、ハロゲン等が挙げられる。ここで、チオエーテル型保護基としては、フェニルチオ基、チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基等が挙げられる。トリクロロアセトイミド型保護基としては、トリクロロアセトイミド基等が挙げられる。ハロゲンとしては、Cl,Br,I,F等が挙げられる。
【００４５】
Ｒ5aで示される保護されていてもよいアミノ基の保護基及びＲ5bで示される保護されたアミノ基の保護基としては、通常ペプチド合成の際に利用されるアミノ基の保護基であれば特に制限されないが、ウレタン型保護基、アシル型保護基、アルキル型保護基、チオエーテル型保護基、イミノ型保護基等が挙げられる。ここで、ウレタン型保護基としてはベンジルオキシカルボニル、置換ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル等のアラルキルオキシカルボニル基；ｔ−ブトキシカルボニルに代表されるアルキルオキシカルボニル基；トリフェニルホスフィノエチルオキシカルボニル、メチルスルフェニルエチルオキシカルボニル等の置換アルキルオキシカルボニル基；アリルオキシカルボニルに代表されるアルケニルオキシカルボニル基；フェノキシカルボニル等のアリールオキシカルボニル基等が挙げられる。アシル型保護基としては、アセチル基、フタロイル等のアルカノイル基；ｏ−ニトロフェニルチオアセチル基等のアリールチオアセチル基等が挙げられる。アルキル型保護基としてはベンジル、ベンズヒドリル、トリフェニルメチル基等のアラルキル基が挙げられる。チオエーテル型保護基としては、トリフェニルメチルチオ、ジニトロフェニルチオ、トリクロロフェニルチオ等のアラルキルチオ基又は置換フェニルチオ基が挙げられる。また、イミノ型保護基としては、置換ベンジリデン基等が挙げられる。
保護されたアミノ基としては、好ましくは炭素数２〜６のアルカノイルアミド、フタルイミド等が挙げられる。
【００４６】
Ｒ5aで示される保護されていてもよい水酸基の保護基及びＲ5bで示される保護された水
酸基の保護基、Ｒ6a及びＲ6bで示される水酸基の保護基としては、エーテル系保護基、エステル系保護基、アシル系保護基等が挙げられる。当該エーテル系保護基としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、有機シリル基、トリチル基等が挙げられる。カルバメート系保護基としてはアリルオキシカルボニル基等が挙げられる。アシル系保護基としては、アセチル基等のアルカノイル基；ｏ−ニトロフェニルチオアセチル基等のアリールチオアセチル基等が挙げられる。アシル系保護基として好ましくは、炭素数２〜６のアルカノイル基である。
【００４７】
本発明においては、糖供与体のＲ1、Ｒ2、Ｒ3において特定の保護基パターンを用いることで、位置選択的グリコシル化反応を行うことを可能とした。Ｒ5a及びＲ5b、Ｒ6a及びＲ6bで示される水酸基の保護基としては、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3で示される水酸基の保護基と同じであっても異なっていてもよい。
【００４８】
化合物（Ｉａ）は、例えば、次のようにして合成することができる。
3糖供与体(5)を例として、化合物（Ｉａ）の合成方法を記載する。
4,6位にベンジリデン基を導入した化合物(45)を出発原料にピリジン存在下、1.5当量の塩化ピバロイルと反応させることで3位選択的にピバロイル基を導入し、4,6位にベンジリデン基、3位にピバロイル基を有するマンノース誘導体(7)を合成する。
マンノース誘導体(7)とキトビオース誘導体(48)とのカップリング反応を行い、新規キトビオースシルマンノース供与体を合成する。3糖供与体(5)の合成は、ジクロロメタン中、キトビオース供与体(48)とマンノース受容体(7)を、TMSOTfをプロモーターとして反応させることで行う。反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、 (5)を得る。
【００４９】
（３）LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖の中間体としての糖誘導体の合成方法
さらに、本発明は、LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖の中間体としての糖誘導体の合成方法に関する。
具体的には、下記式（Ｉｂ）
【００５０】
【化１３】
2014224055.tif 000014
【００５１】
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4bは保護された水酸基を示し、Ｒ5bは同一又は異なって保護された水酸基又は保護されたアミノ基を示し、Ｒ6bは同一又は異なって水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体［以下、化合物（Ｉｂ）と称することがある］に、下記式（ＩＩ）
【００５２】
【化１４】
2014224055.tif 000015
【００５３】
〔式中、Ｒ5b、Ｒ6bは前記と同義であり、Ｒ7は水素原子又は水酸基であり、Ｒ7の何れか一方は水素原子、他方は水酸基を示す。〕で表される糖誘導体を反応させることを特徴とする、下記式（ＩＩＩ）
【００５４】
【化１５】
2014224055.tif 000016
【００５５】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体［以下、化合物（ＩＩＩ）と称することがある］の合成方法に関する。
【００５６】
化合物（ＩＩ）は、例えば、次のようにして、製造することができる。
3糖受容体(6)を例として、化合物（ＩＩ）の合成方法を記載する。
まず、公知化合物から化合物(8)を調製する。NIS/TfOHをプロモーターとして用い、CH2Cl2中、-20℃で2時間、キトビオース受容体(8)及びチオグリコシド(9')のカップリングを行い、トリサッカライド(6')を得る。NaOMe/MeOHを用い、THF中、0℃でトリサッカライド(6')の脱アセチル化を行い、ガラクトシルキトビオース受容体(6)を得る。（Matsuo et al., J. CARBOHYDRATE CHEMISTRY, 18(7), 841-850 (1999)）
【００５７】
化合物（Ｉｂ）である糖供与体を、化合物（ＩＩ）である糖受容体を反応させ、化合物（ＩＩＩ）を得る。
化合物（Ｉｂ）と化合物（ＩＩ）との反応は、化合物（Ｉｂ）及び化合物（ＩＩ）をそれぞれジクロロメタン、クロロホルム、エーテル、トルエン、ジクロロエタン等の溶媒に懸濁し、これらを混合し、NIS, AgOTf等の活性化剤を加え、-78℃〜40℃、好ましくは-40
℃〜-20℃で、10分〜72時間、好ましくは1〜12時間反応させる。常法により、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて洗浄、乾燥濃縮することにより、化合物（ＩＩＩ）を得る。
本合成方法を行った後、所望により、通常の脱保護反応を用いて、保護基を脱保護することも可能である。また、通常の保護反応を用いて、保護基を導入することも可能である。また、通常の有機合成手法を用いて、置換基を導入することも可能である。例えば、Ｒ5bで示される保護されたアミノ基を、アセチルアミノ基等に置換することも可能である。通常の洗浄、濃縮、精製を行うことも可能である。このような化合物も本発明の範囲に包含される。
【００５８】
（４）LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖の合成方法
さらに、本発明は、LacdiNAc構造を有する複合型糖鎖の合成方法に関する。
具体的には、下記式（Ｉｂ）
下記式（Ｉｂ）
【００５９】
【化１６】
2014224055.tif 000017
【００６０】
〔式中、Ｒ1はピバロイル基を示し、Ｒ2は互いに一緒になってベンジリデン基を示し、Ｒ3は水素原子、又はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基であり、Ｒ3の何れか一方は水素原子、他方はtert-ブチルジフェニルシリル基若しくはアセチル基で保護された水酸基を示し、Ｒ4bは保護された水酸基を示し、Ｒ5bは同一又は異なって保護された水酸基又は保護されたアミノ基を示し、Ｒ6bは同一又は異なって水酸基の保護基を示し、ｎは１〜３の整数を示す。〕で表される糖誘導体に、下記式（ＩＩ）
【００６１】
【化１７】
2014224055.tif 000018
【００６２】
〔式中、Ｒ5b、Ｒ6bは前記と同義であり、Ｒ7は水素原子又は水酸基であり、Ｒ7の何れか一方は水素原子、他方は水酸基を示す。〕で表される糖誘導体を反応させ、下記式（ＩＩＩ）
【００６３】
【化１８】
2014224055.tif 000019
【００６４】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体を合成し、
Ｒ3で示される水酸基の保護基の脱保護を行い、遊離の水酸基の立体反転反応を行うことを特徴とする、下記式（ＩＶ）
【００６５】
【化１９】
2014224055.tif 000020
【００６６】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5b、Ｒ6b、Ｒ7、ｎは前記と同義である。〕で表される糖誘導体［以下、化合物（ＩＶ）と称することがある］の合成方法に関する。
【００６７】
化合物（ＩＩＩ）は、前述と同様に、化合物（Ｉｂ）である糖供与体を、化合物（ＩＩ）である糖受容体を反応させて得ることができる。
Ｒ3で示される水酸基の保護基の脱保護反応は、Ｒ3で示される水酸基の保護基の脱保護に適した常法により、行うことができる。
【００６８】
遊離の水酸基の立体反転反応は、Ｒ3が水酸基である化合物（ＩＩＩ）をジクロロメタン、ピリジン、クロロホルム、エーテル、トルエン、ジクロロエタン等の溶媒に懸濁し、Tf2O等の活性化剤を加え、-78℃〜40℃、好ましくは0℃〜20℃で、10分〜72時間、好ましくは1〜12時間反応させる。常法により、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて洗浄、乾燥濃縮することにより、化合物（ＩＶ）を得る。
【００６９】
本合成方法を行った後、所望により、通常の脱保護反応を用いて、保護基を脱保護することも可能である。また、通常の保護反応を用いて、保護基を導入することも可能である。また、通常の有機合成手法を用いて、置換基を導入することも可能である。例えば、Ｒ5bで示される保護されたアミノ基を、アセチルアミノ基等に置換することも可能である。通常の洗浄、濃縮、精製を行うことも可能である。このような化合物も本発明の範囲に包含される。
【実施例】
【００７０】
以下に実施例を挙げて本発明の詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
実施例に記載した物性値の測定法および装置は、次の通りである。
1H-NMR スペクトルは、JEOL-JNM-ECA300 MHZ型、JEOL-JNM-ECA400 MHZ型、JEOL-JNM-ECA600 MHZ型核磁気共鳴装置を用い、特に断りのない限り重クロロホルム溶液でテトラメチルシランを内部標準として測定し、ケミカルシフトはδ値で、カップリング定数はHzで示した。図に示すように1H NMRの解析では便宜的に、還元末端の糖をaとし、非還元末端側へ行くに従いb,c,dとアルファベットで表記することとした。
【００７２】
【化２０】
2014224055.tif 000021
【００７３】
質量分析は、島津製作所製SHIMAZU/KRATOSマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置KOMPACT MALDI IV tDE を用いて測定した。
薄層クロマトグラフィー(TLC)には、MERCK silica gel 60 F254CEを使用した。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、MERCK Silica Gel 60(0.040-0.063 mm) あるいは、KANTO CHEMICAL Silica Gel 60N (spherical,neutral) 0.040-0.063 mmを用いた。
ゲル濾過クロマトグラフィーはBIO-RAD Bio-Beads(登録商標) S-X1(200-400mesh)を使用した。
【００７４】
１．新規供与体を用いた位置選択的グリコシル化反応
前述のように、3糖供与体Bと3糖受容体Cのカップリング反応を用いて、位置選択的グリコシル化反応を行った結果、目的とする化合物以外に複数の9糖異性体が生成した。この際、種々の脱離基や溶媒を検討したが化合物を単一で得る決定的な条件は得られなかった。そこで本発明者らは、Freiser-Reidらが提唱したarmed-disarmed効果に着目した。すなわち、糖供与体の保護基パターンを変えることで反応性を変化させ、選択性の向上を目指すこととした。
【００７５】
（保護基パターンを変えた糖供与体のデザイン）
保護基のパターンを変える位置として、グリコシル化反応において、反応に与える影響力が最も強いと考えられる、すなわち反応点であるマンノース残基に着目した。以下にマンノースの保護基パターンを変えた3種類の化合物を示す。4,6位をベンジリデン基、3位をピバロイル基で保護したマンノース誘導体(7)、4,6位にAc基を有するマンノース誘導体(43)、4,6位をベンジリデン基、3位をベンジル基で保護したマンノース誘導体(44)をデザインした。アシル基系の保護基は電子的効果を、ベンジリデン基には環固定効果を、さらに保護基の導入位置による電子的効果の違いを期待した。
【００７６】
【化２１】
2014224055.tif 000022
【００７７】
（保護基パターンの異なるマンノース誘導体の合成）
先に述べたコンセプトに基づきデザインしたマンノース誘導体をそれぞれ合成した。4,6位にベンジリデン基、3位にピバロイル基を有するマンノース誘導体(7)の合成は、4,6位にベンジリデン基を導入した化合物(45)を出発原料にピリジン存在下、1.5当量の塩化ピバロイルと反応させることで3位選択的にピバロイル基を導入した。収率は81%だった。(7)の構造は1H NMRスペクトルにて、5.3ppmにベンジリデン基由来のピークを確認したこと、1.0ppm付近にピバロイル基由来の9H分のピークを確認したこと、また、3位のHの低磁場シフトから決定した。4,6位ベンジリデン基、3位ベンジルマンノース誘導体(44)の合成は、(45)に対し、酸化ジブチルスズによるスズ化、続けてTBABr、BnBrを用いて反応させることで3位に位置選択的にBn基を導入した。収率は96%だった。3位ベンジルマンノース誘導体(44)の構造は1H NMRスペクトルにて、4.5ppmにベンジル基由来の2H分のピークを観測したことにより決定した。また、得られた(44)をアセチル化することで、2位のプロトンが低磁場シフトしたことからもその構造を確認した。4,6位diAcマンノース誘導体(43)の合成は、(44)の2位に対し、2,6-lutidine存在下、TBDPOTfと反応させることでTBDPS基を導入、(46)とした後に、酸加水分解することでベンジリデン基を除去した。その後、4位
および6位のAc化、HF・Py.を用いたTBDPS基の除去を行い、(43)を得た。(44)から4工程で収率39%だった。(43)の構造は、4位と6位に相当するプロトンの低磁場シフトならびに2.0ppm付近に2つのAc基に由来する6H分のピークを確認したことから決定した。
以上、保護基パターンを変えた3種類のマンノース誘導体(7), (43), および(44)を合成した。
【００７８】
【化２２】
2014224055.tif 000023
【００７９】
（新規キトビオシルマンノース供与体の合成）
先に合成した3種類のマンノース誘導体(7), (44), (43)とキトビオース誘導体(48), (25), (49)とのカップリング反応を行い、新規キトビオースシルマンノース供与体の合成を検討した。3糖供与体(5)の合成は、ジクロロメタン中、キトビオース供与体(48)とマンノース受容体(7)を、TMSOTfをプロモーターとして反応させることで行った。反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、収率23%で(5)を得た。(5)の構造は1H NMRスペクトルにより、1.0ppm付近にピバロイル基由来の9プロトン分のピークを確認したこと、5.0ppm付近にベンジリデン基のメチンのピークを観測したこと、およびキトビオース由来の1位のピークを観測したこと、またMALDI-TOF MSにて目的とする分子イオンピークを観測したことから構造を確認した。一方、3位をベンジル基で保護した3糖供与体(50)の合成は、キトビオース供与体(25)とマンノース受容体(44)を上記と同様の条件で反応させ、反応終了後、反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィーにて精製することで得た。収率は70%だった。(50)の構造は、1H NMRスペクトルにより、5.0ppm付近にベンジリデン基のメチンのピークを、またキトビオース由来のグルコサミンの1位のプロトンを観測したピークを観測したことから、糖受容体と供与体が結合したことを、またMALDI-TOF MSにて目的とする分子イオンピークを観測したことから構造を確認した。新規3糖供与体(51)の合成は、キトビオース供与体(49)と4,6位にAc基を有するマンノース受容体(43)を用いて合成した。反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィーにて精製後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製、収率61％で目的とした3糖供与体(51)を得た。(51)の構造は、1H NMRスペクトルより、2.0ppm付近のAc基由来のピークが2つ、またキトビオース由来のグルコサミンの1位のプロトンを観測したことから、またMALDI-TOF MSにて目的とする分子イオンピークを観測したことから構造を決定した。
【００８０】
【化２３】
2014224055.tif 000024
【００８１】
（新規供与体を用いた位置選択的グリコシル化反応の検討）
電気吸引性の置換基を導入した最も反応性を低くした(5)を用い、2,3,4および6位が遊離のガラクトシルキトビオース(6)と反応させた。反応条件は今まで行ってきた条件と同様に-78℃でNIS、AgOTfを用いた。しかし、この条件では糖供与体が活性化されず、反応温度を室温にしたところ、反応の進行を確認した。反応混合物をゲルろ過クロマトグラフィーで精製し収率78%で9糖画分を得た。得られた9糖画分をHPLCにより解析した。その結果を図１に示す。観測されたピークは1つであった。得られた化合物を1H NMRにて解析した結果、糖供与体と糖受容体が3,6位にα結合した目的とする構造の9糖(4)であることがわかった。次に4,6位をベンジリデン基、3位を電子供与性のBn基で保護した(50)を用いて反応を行った。NIS、AgOTfを用いて-78℃から-20℃に昇温することで反応させた。得られた反応混合物はゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、収率94%で9糖画分を得た。得られた9糖画分をHPLCにより解析した結果を図２に示した。最後に4,6位を電子吸引性の保護基であるAc基、3位を電子供与性の保護基であるBn基で保護した(51)を用いたグリコシル化反応を行った。NIS、AgOTfを用いて-78℃から-20℃に昇温することで反応させた。得られた反応混合物はゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、収率58%で9糖画分を得た。得られた9糖画分をHPLCにより解析した結果を図３に示した。
【００８２】
【化２４】
2014224055.tif 000025
【００８３】
（9糖（4）の構造解析）
単一で得られた(4)のNMRの解析結果について説明する。化合物(4)の、糖供与体と糖受容体の結合位置を決めるために分岐部分のガラクトース残基のAc化を行い(54)とし（下記スキーム）、NMRを測定した。
【００８４】
【化２５】
2014224055.tif 000026
【００８５】
まずHSQCスペクトルによりガラクトース1位のHを決定した。その後H-H COSYスペクトルにて、ガラクトースの2,3,4位のHを決定した。さらにTOCSYスペクトルにて、COSYスペクトルで決定したHが正しいかを確認した。結果として、分岐部分のガラクトース2,4位の低磁場シフトが確認され3位と6位に糖供与体が結合したことが明らかとなった。またnon-decouplingのHSQCでマンノースとガラクトースの1JC-Hが175Hzおよび172Hzであったことから、立体はα結合であることを決定した。
【００８６】
armed-disarmed効果に着目し、糖供与体のマンノース残基の保護基パターンを変えた3糖を3種類合成し、それぞれガラクトシルキトビオースと反応させた。結果として糖供与体(5)と糖受容体(6)を用いた場合で高い立体および位置選択性を実現することができた。この高い選択性は電子吸引基であるピバロイル基により、アノメリック効果が強調され、立体選択性が向上したと考えている。また、ベンジリデン基でマンノースがイス型の配座で固定され、2位置換基がアキシャルに立つことにより、2位置換基であるキトビオースが立体障害となり、高い位置選択性を与えたと考察した。
【００８７】
２．水酸基反転反応によるLacdiNAc構造とβ-マンノシド結合の構築
β−マンノシド結合はN-型糖鎖のコア構造に含まれる重要な結合である。β−マンノシド結合を構築する方法の1つに水酸基の反転反応がある。Matsuoらはβ−ガラクトシルキトビオース誘導体の3,6位にマンノース誘導体を導入後、β−ガラクトース残基の2,4位2つの水酸基をTf化、水酸基の立体を反転することでβ−マンノシド結合を構築、アスパラギン結合型糖鎖の共通コア5糖の効率的構築に成功している。そこで、我々はこの方法を参考に、5糖よりもさらに立体的に込み合った状態の9糖に対し、非還元末端側のグルコサミン残基4位とβ−ガラクトース残基の2,4位、合わせて4つの水酸基の同時立体反転反応に挑戦することとした。
【００８８】
（水酸基の同時立体反転反応によるLacdiNAc構造とβ−マンノシド結合の構築）
まず9糖誘導体(4)をHF・Py.を用いて、非還元末端側4位のTBDPS基を除去、PTLCにより精製し、収率49%で(55)を得た。(55)の構造は1H NMRを測定した結果、1.0ppm付近に観測されていたTBDPS基由来のピークの消失を確認したこと、またMALDI-TOF MSにより目的化合物の分子イオンピークを確認したことから決定した。得られた9糖脱TBDPS体(55)に対し、4つの水酸基の同時立体反転を行った。まず始めにトリフルオロメタンスルホン酸無水物とピリジンを用いて水酸基のトリフラート化を行った。Tf2Oを飽和重曹水にて反応停止した後、溶媒を除去、トルエンによる共沸を行い真空乾燥した。その後、得られた残渣をトルエンに溶解させ、超音波存在下、酢酸セシウムと18-クラウン-6と反応させた。反応混合物をPTLCによって精製した後、1H NMRスペクトルを測定した結果、3:1の混合物であった。得られた混合物の画分をHPLCにより分析した結果からも3:1の混合物であることを確認した。分取用のHPLCにより各ピークを分取しそれぞれNMRスペクトルを測定した。そ
の結果、主生成物として得られたのは化合物が、4つの水酸基が反転した目的物(2)であることが明らかとなった。収率は28%だった。(2)の構造は以下のように決定した。まず、HSQCスペクトルにより、分岐部分のマンノースの1位を決定した。決定した1位からH-H COSYスペクトルにてプロトンの相関をたどり、マンノースの2位、3位、4位を決定した。2位および4位の低磁場シフトが観測されたため分岐部分の水酸基が反転され、β-マンノシド結合を構築したことを確認した。LacdiNAc構造は、1H NMRスペクトルにて5.6ppmにガラクト配座に特徴的なピークを2プロトン分確認したことにより決定した。さらにMALDI-TOF MSにより目的とする分子イオンピークを観測したことからも構造を確認した。なお、副生成物は2.0ppm付近に観測されたAc基のピークが3つであったことと、MALDITOF MSによる分析結果により、3つの水酸基が反転反応し、2位の水酸基が脱離したデオキシ糖であると結論づけた。このことから副生成物が生成した原因を考察した。脱離体が得られたことから、SN2反転反応とE2脱離反応が競合して起きたと考えた。アンチ脱離が優先するため5位のプロトンが引き抜かれ、4位のTf体が脱離したと考えている。
【００８９】
【化２６】
2014224055.tif 000027
【００９０】
4つの水酸基の反転反応を用いて、28%（2mg）と低収率ながらも、希少構造であるLacdiNAcと困難な結合様式のβ-マンノシド結合を構築することに成功した。Tf化における反応終点の見極めをする条件を確立すれば、収率の改善は十分に行えると考えている。以上、ここまでで目的とする9糖の構築を達成した。
【００９１】
＜合成例１＞マンノース供与体の合成
既知化合物(7)の合成は文献の方法に従って合成した。
ベンジリデン体(44)(500g, 1.4mmol)をピリジン１５mLに溶解した。アルゴン気流下、ピバロイルクロリドl(340μg, 2.8mmol)を室温で滴下、１６時間撹拌した。反応液を氷零後、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルに溶解、酢酸エチル層を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane：EtOAc，4 : 1) にて精製、(7) (518mg, 88%)を得た。
【００９２】
【化２７】
2014224055.tif 000028
【００９３】
Rf =0.25 (Hexane : EtOAc = 4 : 1)
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ : 5.616(1H, s, PhCH), 5.59(1H, d, H-1), 5.59(1H, dd, J
= H-3), 4.33(H, ddd, H-5), 4.31(1H, d, H-6), 4.25(1H, dd, H-6), 4.19(1H, dd, H-2), 3.86(1H, dd, H-4), 2.31(1H, brs, OH), 1.24(9H, s,( C=O(CHMALDI-TOF-MS Calcd for C24H28NaO6S m/z [M+Na]+ : 467.15 found : 467.79.
【００９４】
＜合成例２＞２糖TBDPS体の合成
【００９５】
【化２８】
2014224055.tif 000029
【００９６】
化合物(22)(206mg, 0.21mmol) をジクロロエタン (5mL)に溶解し、室温にて2,6-lutidine (111μL, 1.0mmol) と TBDPSOTf (200μL, 0.52mmol)を加えた。反応液を３０分間撹拌した後、反応液を氷冷、炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルに溶解、酢酸エチル層を1M塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane：EtOAc，4 : 1) にて精製、(48a)(249mg, 98%)を得た.
【００９７】
Rf = 0.50(Toluene : EtOAc = 10 : 1), Rf = 0.30(Hexane : EtOAc = 4 : 1).
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ : 7.72-6.50(38H, Ar), 5.24(1H, d, J = 8.4Hz, H-1a) , 5.12(1H, d, J = 9.2 Hz, H-1b), 4.76(1H, d, H-1a), 4.74-4.31(8H, m), 4.18(1H, dd, J = 8.8 Hz), 4.11-3.96(5H, m), 3.82(1H, d, J = 12.8 Hz), 3.71(1H, J = 9.6 Hz), 3.571-3.47(3H, m), 3.41(1H, dd, J = 3.6 Hz, J = 11.2 Hz), 3.31(1H, dd, J = 2.4 Hz, J = 9.6 Hz), 0.97((CH3)3CSiPh2).
13C NMR (150MHz, CDCl3) δ : 96.81, 85.61, 80.95, 76.42, 75.21, 74.58, 73.09, 72.96, 72.77, 72.39, 67.95, 56.66, 55.23, 27.03.
MALDI-TOF-MS : calcd for C72H69N5O12SiNa(M+Na)+ m/z: 1246.46, found:1247.43.
【００９８】
＜合成例３＞ヘミアセタール(48c)の合成
【００９９】
【化２９】
2014224055.tif 000030
【０１００】
化合物(48a)(250mg, 0.20mmol)をTHF (3mL)に溶解、Ph3P (94mg, 0.35mmol) と水 (0.1mL)を加え、４０℃にて一晩撹拌した。反応液にAmberlystを加え40℃で７日間撹拌、樹脂を除いた後に溶媒を減圧留去した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane：EtOAc，3 : 1) にて精製、(48c)(238g, 98%)を得た。
【０１０１】
＜合成例４＞２糖供与体(48)の合成
【０１０２】
【化３０】
2014224055.tif 000031
【０１０３】
化合物(48c)(39mg, 0.032mmol) のジクロロメタン溶液(1.0mL) に、2,2,2-Trifluoro-N-phenylacetimidoyl Chloride (14・L, 0.12mmol) を加えた後に 、さらに
K2CO3 (9mg, 0.10mmol)を加えた１時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane：EtOAc，3 : 1, TEA0.1%) にて精製、(48) (40mg, 92%)を得た。
Rf = 0.6 (Toluene : EtOAc = 3 : 1), 0.27(Hexane : EtOAc = 3 : 1).
【０１０４】
＜合成例５＞３糖供与体(5)の合成
【０１０５】
【化３１】
2014224055.tif 000032
【０１０６】
化合物(48) (110mg, 0.080mmol)，7 (71mg, 0.16mmol)，AW-300 の混合物にジクロロメタン (15mL) を加えアルゴン気流下-78℃で撹拌した.反応液にTMSOTf (5・L, 0.024mmol)を加え15min撹拌した。反応液にトリエチルアミンを加え反応を停止した。反応液を酢酸エチルにて希釈した後、セライトろ過、酢酸エチル層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をBio-Beads S-X1（Toluene：EtOAc １：１）にて精製、化合物(5)(30mg, 23%)を得た。
【０１０７】
Rf = 0.53 (Toluene : EtOAc = 10 : 1), Rf = 0.45 (Hexane : EtOAc = 3 : 1).
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ : 7.79-6.47(38H, Ar), 5.37(1H, s, PhCH), 5.14(1H, d, J
= 8.4 Hz, H-1 c), 5.03(1H, s, H-1a), 4.90(1H, dd, J1,2 = 3.2 Hz, H-3c), 4.88(1H, d, J = 8.8 Hz, H-1b), 4.91(1H, dd, J3,2 = 3.6 Hz), 4.74-4.19(8H, d, CH2-Ph), 4.24(1H, dd, J = 1.6 Hz), 4.13-3.93(6H, m), 3.82(1H, m), 3.54-3.46(3H, m), 3.38-3.30(2H, m), 3.11(1H, dd, J = 2.4 Hz, J = 10.0 Hz), 2.94(1H, dd, J = 10.0 Hz), 1.14(9H, s, (CH3)3CC=O), 0.96((CH3)3CSiPh2).
MALDI-TOF-MS : calcd for C96H96N2O18SiNa(M+Na)+ m/z: 1647.80, found:1648.74.
【０１０８】
＜合成例６＞３糖供与体(6)の合成
【０１０９】
【化３２】
2014224055.tif 000033
【０１１０】
CH2Cl2（5mL）中、NIS (1.05g, 4.67mmol), TfOH (130μL, 1.46mmol)及びモレキュラーシーブス（3.0g, type 4A）の混合液を0℃で30分撹拌した。その後、-78℃で冷却した。この混合液に、CH2Cl2（10mL）中、グリコシル供与体(9')(0.76g, 2.01mmol)及びグリコシル供与体(8)(1.53g, 1.55mmol)の溶液を、10分間かけて滴下して加えた。反応液を-20℃で、2時間撹拌した。反応を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液により停止させた。反応液をEtOAcにて希釈し、セライトろ過した。ろ過物をNa2S2O5水溶液、鹹水にて洗浄した。溶液をMgSO4にて乾燥し、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Toluene：EtOAc ４：１）にて精製、化合物(6')(1.77g, 86%)を得た。
【０１１１】
Rf = 0.26 (Toluene:EtOAc = 4:1)
[α]D+8 c (c1.0, CHCl3)
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ : 5.29(1H, d, J = 8.6 Hz, H-1b), 5.26(1H, dd, J = 0.7 Hz, J = 3.4 Hz, H-4c), 5.15(1H, dd, J = 0.7 Hz, J = 3.4 Hz, H-4c), 5.15(1H, d, J
= 9.5 Hz, H-1a), 5.14(1H, dd, J = 10.5 Hz, H-2c), 4.62(1H, d, J = 8.1 Hz, H-1c), 2.04, 1.99, 1.962, 1.958(3H×4, s, Ac)
13C NMR (125MHz, CDCl3) δ : 100.45(C-1 c), 97.09(C-1b), 85.62(C-1a)
Anal. Calcd for C70H69O21N5 : C, 63.87; H, 5.28; N 5.32
Found: C, 64.13; H, 5.31; N, 5.39
【０１１２】
攪拌した化合物(6')(134mg, 0.102mmol)のTHF:MeOH(2:3, 5mL)溶液に、1M NaOMe/MeOH(100μL)を0℃で加えた。混合液を1時間撹拌し、Amberlyst 15 (H+)レジンにて中和し、減圧濃縮した。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3:MeOH 50:1〜20:1）にて精製、化合物(6)(103mg, 88%)を得た。
Rf = 0.33 (CHCl3:MeOH = 15:1)
[α]D+24 c (c1.0, CHCl3)
1H NMR (500MHz, CDCl3) δ : 5.32(1H, d, J = 7.9 Hz, H-1b), 5.16(1H, d, J = 9.5 Hz, H-1a)
13C NMR (125MHz, CDCl3) δ : 102.95(C-1 c), 97.08(C-1b), 85.63(C-1a), 73.76(C-3c), 62.67(C-6c)
Anal. Calcd for C62H61O17N5 : C, 64.86; H, 5.35; N 6.10
Found: C, 64.33; H, 5.36; N, 6.11
【０１１３】
＜実施例１＞９糖(4)の合成
【０１１４】
【化３３】
2014224055.tif 000034
【０１１５】
化合物(5)(24mg, 0.015mmol),(6)(8mg, 0.0068mmol)のジクロロメタン溶液を、-78℃にてNIS (5mg, 0.189mmol), AgOTf (4mg, 0.0126mmol)とモレキュラーシーブス4Aの混合物に加えた。 反応液を-20℃に昇温後、7時間撹拌した。反応液にトリエチルアミンを加え、反応を停止後、酢酸エチルにて希釈、セライトろ過した。酢酸エチル層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をBio-Beads S-X1（Toluene：EtOAc １：１）にて精製、９糖(4)(19.8mg, 78%)を得た。
ゲルろ過後、HPLCにて解析した結果、単一のピークを与えた。
【０１１６】
Rf : 0.22 (Toluene : EtOAc = 5 : 1)
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ : 7.86-6.43(114H, m, Ar), 5.38, 5.33(1H, s, PhCH), 5.16-5.05(3H, m), 4.93-3.06(55H, m), 2.97-2.86(3H, m), 2.71(1H, J = 10.2Hz), 1.14, 1.10(9H, s, (CH3)3CC=O), 0.95, 0.94(9H, s, (CH3)3CSiPh2).
MS(MALDI-TOF) calcd for C242H241N9O57Si2Na(M+Na)+ m/z: 4199.59, found: 4201.80.
【０１１７】
＜実施例２＞９糖脱シリル体(55)の合成
【０１１８】
【化３４】
2014224055.tif 000035
【０１１９】
化合物(4)(16mg, 0.0038mmol) をピリジン(500μL)に溶解、０℃にて70%フッ化水素ピリジン溶液 (100μL)を加え、４０℃にて９時間撹拌した。さらに70%フッ化水素ピリジン溶液 (100μL)を加13時間撹拌した。反応液を酢酸エチルにて希釈、酢酸エチル層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をPTLCにて精製（Toluene：EtOAc，2 : 1) 化合物(55) (6.9mg, 49%)を得た。
【０１２０】
Rf : 0.20 (Toluene : EtOAc = 3 : 1)
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ : 7.87-6.70(96H, m, Ar), 5.38, 5.33(1H, s, PhCH), 5.26(1H, d, J = 8.4Hz), 5.23(1H, d, J = 7.8Hz), 5.21(1H, d, J = 8.4Hz), 5.13(1H, d, J = 8.4Hz), 4.97-4.65(10H, m), 4.61-4.42(19H, m), 4.35-4.01(21H, m), 3.86-3.55(1
5H, m), 3.51-3.31(13H, m), 3.25-3.18(4H, m), 3.10(1H, d, J = 9.6Hz), 2.99(1H, dd, J = 3.0Hz), 2.93(1H, dd, J = 4.8Hz), 2.84(1H, d, J = 4.8Hz), 1.11, 1.07(9H, s,
(CH3)3CC=O).
MS(MALDI-TOF) calcd for r C210H205N9O53Na(M+Na)+ m/z: 3723.35, found: 3723.35.
【０１２１】
＜実施例３＞化合物(2)の合成
【０１２２】
【化３５】
2014224055.tif 000036
化合物(55) (17mg, 0.0046mmol)をジクロロメタンに溶解後(2.0mL)、ピリジン(79μL, 0.98mmol)を加えた。10℃にて、Tf2O (39μL, 1.68mmol)を加え、9h 室温にて撹拌した。反応液を酢酸エチルにて希釈、酢酸エチル層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をトルエン(700μL)に溶解、CsOAc (10mg, 0.052mmol) と18-crown-6 (14mg, 0.052mmol)を加え、超音波下30時間反応させた。反応液を酢酸エチルにて希釈、酢酸エチル層を、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水にて順位洗浄、硫酸ナトリウムにて有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残査をHPLCにて精製、化合物(2) (9mg, 51%)を得た。
【０１２３】
Rf : 0.22 (Toluene : EtOAc = 5 : 1)
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ : 7.87-6.70(96H, m, Ar), 5.59(2H, d, J = 3.0Hz, H-4f, H-4i), 5.31(1H, d, H-1, J = 9.0Hz), 5.30 5.29(1H, s, PhCH), 5.26(1H, d, J = 9.0Hz), 5.19(1H, d, J = 7.8Hz), 5.11(1H, d, J = 8.4Hz), 5.08(1H, d, J = 3.0Hz, H-2c), 4.91-4.78(7H, m), 4.82(1H, dd, J = 10.2Hz, H-4c), 4.74(1H, dd, J = 3.0Hz), 4.63-3.99(47H, m), 3.87(1H, bs), 3.81(1H, bd, J = 3.0Hz), 3.69-3.25(27H, m), 3.15(1H, d, J = 9.6Hz), 3.05(1H, dd, J = 9.0Hz), 2.90(1H, m, J = 3.0Hz), 2.77(1H, dd, J = 10.2Hz), 2.69(1H, dd, J = 10.2Hz), 2.02, 1.99, 1.97, 1.93(3H, s, CH3C=O), 1.05, 1.00(9H, s, (CH3)3CC=O).
MS(MALDI-TOF) calcd for r C218H213N9O57Na(M+Na)+ m/z: 3891.39, found: 3891.20.
【０１２４】
＜実施例４＞９糖の合成
【０１２５】
【化３６】
2014224055.tif 000037
【０１２６】
無水CH2Cl2(3mL)中、トリサッカライド供与体(30mg, 0.021mmol)、トリサッカライド受容体(10.5mg, 0.009mmol)、NIS(7mg, 0.032mmol)、AgOTf(6mg, 0.021mmol)及び乾燥モレキュラーシーブス4Aの混合液を-78℃にて、アルゴン気流下、攪拌した。得られた混合液を-20℃にて7時間撹拌し、TEA添加により反応を停止した。反応液をEtOAcにて希釈し、セライトろ過した。有機層を、NaS2O3、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、鹹水にて連続的に洗浄し、無水Na2SO4にて乾燥し、減圧濃縮した。粗生成物をBio-Beads S-X1にてToluene - EtOAcを用いて、クロマトグラフにより分離し、9糖からなるフラクションを得た。9糖のフラクションをPTLC(Toluene : EtOAc = 3 : 1)上で、クロマトグラフにより分離した(17mg, 50%)。
【０１２７】
Rf : 0.25 (Toluene : EtOAc = 3 : 1)
1H NMR (600MHz, CDCl3) δ : 7.85-6.63(94H, m, Ar), 5.58(1H, d, J = 3.6Hz), 5.30,
5.28(1H, s, PhCH), 5.26-5.19(3H, m), 5.14(1H, d, J = 9.6Hz), 4.96, 4.79(1H, dd,
J = 3.0Hz), 4.93(1H, d, J = 8.4Hz), 4.88(1H, d, J = 12.0Hz), 4.58-4.45(13H, m),
4.37-3.87(30H, m), 3.74-3.26(26H, m), 3.14(1H, d, J = 3.6Hz, J = 9.6Hz), 3.01(1H, bd, J = 9.0Hz), 2.97(1H, dd, J = 3.0Hz, J = 9.6Hz), 2.90(1H, m), 2.77(2H, m),
2.34(1H, d, (1H, d, J = 3.6Hz), 1.99, 1.92(3H, s, CH3CO), 1.02, 0.95(9H, s, (CH3)3CSiPh2).
MS(MALDI-TOF) calcd for C242H241N9O57Si2Na(M+Na)+ m/z: 4199.59, found: 4199.88
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明は、タンパク質製剤、糖鎖アフィニティーリガンド、酵素活性測定キット、糖鎖分析用標準品等に利用できる。
【図１】
2014224055.tif 000047
【図２】
2014224055.tif 000048
【図３】
2014224055.tif 000049