(57)【要約】      （修正有）【課題】グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）などのグリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する新規な酵素およびその製造方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、前記特定のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチドまたは前記特定のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチドを含む、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、酵素：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
【請求項２】
グリセロール−３−ホスホコリンを基質としたときに、ｐＨ７．２で４０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、２０℃から６０℃の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示す、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
グリセロール−３−ホスホコリンを基質としたときに、ｐＨ７．２で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ５からｐＨ８の範囲内で１０％以上の加水分解活性を示す、請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
グリセロール−３−ホスホコリンを基質としたときに、ｐＨ７．２で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンに対して９０％以上、グリセロール−３−リン酸に対して２０％以下、グリセロール−３−ホスホグリセロールおよびグリセロール−３−ホスホイノシトールに対して１％以下、グリセロール−３−ホスホセリンに対してほぼ０％、リゾホスファチジルコリンに対して４０％以下、リゾホスファチジルエタノールアミンに対して３％以下、リゾホスファチジン酸に対して１％以下、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルグリセロールに対してほぼ０％、コリン型リゾプラズマローゲンに対して５％以下、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンに対して１％以下、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲンに対してほぼ０％、ホスファチジルエタノールアミンに対して０．５％以下、ホスファチジルセリンに対して０．１％以下、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸およびスフィンゴミエリンに対してほぼ０％である基質特異性を有する、請求項１から３のいずれかに記載の酵素。
【請求項５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が６０，０００〜７０，０００の範囲内である、請求項１から４のいずれかに記載の酵素。
【請求項６】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項１から５のいずれかに記載の酵素。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する、請求項７または８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素を製造する方法であって、
請求項７から９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有する微生物から該酵素を産生させる工程を含む、酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する新規な酵素およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、リン脂質、リゾリン脂質およびグリセロール−３−ホスホジエステルに様々な生理作用があることがわかり、これら化合物とこれらに関連のある酵素が注目されている。グリセロール−３−ホスホジエステルは、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂなどの酵素の作用によって、リン脂質から生成する化合物で、細胞内で代謝に深く関わっていると考えられる。例えば、グリセロール−３−ホスホコリン（以下「ＧＰＣ」ともいう）は母乳に含まれる安全な成分で、門脈を通過できるため、ホスファチジルコリンに比べて遙かに体内吸収量が高い。また、ＧＰＣは中枢作用と末梢作用を有する。中枢作用としては、アルツハイマー型認知症患者の認知機能の改善、学習能力の向上（ラット弁別学習）、及び、ストレスホルモンの分泌を抑制する効果があることがわかっている。末梢作用としては、成長ホルモン分泌促進作用、肝機能障害改善作用、血圧低下作用があることがわかっている。また、ＧＰＣはアセチルコリンと同様に血管弛緩作用により、血管を拡張し血圧を下げることがわかっている。さらに、激しい運動後、ＧＰＣによって血清コリン濃度減少を抑制することで、競技パフォーマンス低下を改善させる効果が期待できる。また、ＧＰＣは、傷害時の修復能向上が期待され、激しい運動により傷ついた筋肉細胞の修復を促進するといった優れた効果を示すことがわかっている（非特許文献１）。また、グリセロール−３−ホスホコリンは、認知症予防などが期待されている（特許文献１）。このように、グリセロール−３−ホスホコリンは多くの生理活性を有する物質である。そして、グリセロール−３−ホスホコリンを含め、グリセロール−３−ホスホコリン以外にもグリセロール−３−ホスホジエステルには多くの生理活性があることが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００７／０１０８９２号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】BIO INDUSTRY、２９巻、２号、２０１２
【非特許文献２】Glycerylphosphocholine phosphocholine phosphodiesterase activity is reduced in multiple sclerosisplaques, Janzen, L.; Tourtellotte, W.W.; Kanfer J.N.; Exp. Neurol. 109, 243-246(1990)
【非特許文献３】Properties of aZn(2+)-glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase from bovine brain membranes,Sok D.E.; Neurochem. Res. 21, 1193-1199 (1996)
【非特許文献４】Somecharacteristics of sn-glycero 3-phosphocholine diesterases from rat brain,Abra, R.M.; Quinn, P.J.; Biochim. Biophys. Acta 431, 631-639 (1976)
【非特許文献５】Aphosphodiesterase in rat kidney cortex that hydrolysesglycerylphosphorylinositol, Dawson, R.M.C.; Hemington, N.; Biochem. J. 162,241-245 (1977)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
グリセロール−３−ホスホジエステル類のうち、ＧＰＣ（グリセロール−３−ホスホコリン）やグリセロ−３−ホスホエタノールアミン（以下「ＧＰＥ」ともいう）は、生理活性や疾患との関連などにおいて重要な分析対象物質である。したがって、これらの物質を選択的に、簡便かつ迅速に定量測定できれば、非常に有効な測定法となる。しかしながら、従来の技術では、煩雑な前処理をともなうＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳなどを用いた分析法しかなく、分析に時間とコストを要していた。さらに、正確な定量も困難な状況であった。そして、これまでにこの目的に適した酵素は見出されていなかったため、従来の技術ではＧＰＣやＧＰＥを定量する方法が無かった。
【０００６】
グリセロール−３−ホスホジエステルに作用し、グリセロールと、リン酸又はホスホコリン、ホスホエタノールアミンなどのリン酸エステル化合物とを生成する酵素は、ホスホリパーゼＣと呼ばれる触媒作用を示す酵素と類似する酵素である。ホスホリパーゼＣ（以下「ＰＬＣ」ともいう）は、リン脂質又はその加水分解物（リゾリン脂質など）におけるリン酸基のグリセロール側の結合を加水分解する作用を有する。そのような酵素のなかでも、基質特異的に作用する酵素は、分析など、産業上の利用に特に有用である。そして、グリセロホスホコリンに特異的に作用することによって種々の可能性が期待される。
【０００７】
ホスホリパーゼＣに似たような触媒作用を示す酵素として、glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase（EC 3.1.4.38）とglycerophosphoinositol inositolphosphodiesterase(EC3.1.4.43)が知られているが、ＧＰＥなど、ＧＰＣ以外のグリセロ−３−ホスホジエステルに作用する酵素の存在は知られていない（酵素データベース「ＢＲＥＮＤＡ」より）。また、非特許文献２にはヒト由来の酵素、非特許文献３にはウシ由来の酵素、非特許文献４にはドブネズミ（英語名ラット）由来の酵素、非特許文献５にはハツカネズミ由来の酵素が開示されている。また、非特許文献５では、ドブネズミ（英語名ラット）Rattus norvegicus由来glycerophosphoinositol inositolphosphodiesteraseが報告されている。しかしながら、これらの酵素はＧＰＣあるいはＧＰＩに選択的に作用するが、すべて動物臓器由来のもので、得られる酵素の力価や生産量が低いことや倫理上の問題などの課題が多く、産業利用は極めて困難である。さらに、金属イオン要求性のため使用において限定的となる（制約を受ける）可能性もある。
【０００８】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する新規な酵素およびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記のような新規な酵素を得ることを目的として、該酵素を生産する微生物を検索した結果、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物から新規な性質を有する酵素を見出した。
【００１０】
［酵素］
本発明に係る酵素は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
【００１１】
上記の酵素の好ましい形態は、グリセロール−３−ホスホコリンを基質としたときに、ｐＨ７．２で４０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、２０℃から６０℃の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示す。
【００１２】
上記の酵素の好ましい形態は、グリセロール−３−ホスホコリンを基質としたときに、ｐＨ７．２で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ５からｐＨ８の範囲内で１０％以上の加水分解活性を示す。
【００１３】
上記の酵素の好ましい形態は、グリセロール−３−ホスホコリンを基質としたときに、ｐＨ７．２で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンに対して９０％以上、グリセロール−３−リン酸に対して２０％以下、グリセロール−３−ホスホグリセロールおよびグリセロール−３−ホスホイノシトールに対して１％以下、グリセロール−３−ホスホセリンに対してほぼ０％、リゾホスファチジルコリンに対して４０％以下、リゾホスファチジルエタノールアミンに対して３％以下、リゾホスファチジン酸に対して１％以下、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリンおよびリゾホスファチジルグリセロールに対してほぼ０％、コリン型リゾプラズマローゲンに対して５％以下、エタノールアミン型リゾプラズマローゲンに対して１％以下、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲンに対してほぼ０％、ホスファチジルエタノールアミンに対して０．５％以下、ホスファチジルセリンに対して０．１％以下、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸およびスフィンゴミエリンに対してほぼ０％である基質特異性を有する。
【００１４】
上記の酵素の好ましい形態は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合の分子量が６０，０００〜７０，０００の範囲内である。
【００１５】
上記の酵素の好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
【００１６】
［ポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、請求項１から６のいずれかに記載の酵素をコードする。
【００１７】
上記のポリヌクレオチドの好ましい形態は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【００１８】
上記のポリヌクレオチドの好ましい形態は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物に由来する。
【００１９】
［酵素の製造方法］
本発明に係る酵素の製造方法は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素を製造する方法であって、上記のポリヌクレオチドを有する微生物から該酵素を産生させる工程を含む。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する基質特異性の高い新規な酵素を提供することが可能になる。特に、グリセロ−３−ホスホコリン及びグリセロ−３−ホスホエタノールアミンに対して高い基質特性を発現する酵素を提供することができる。さらに、該酵素を微生物によって効率よく生産する方法を提供することができる。また、グリセロール−３−ホスホジエステルを効率よく分析することができる。また、グリセロール−３−ホスホジエステルの分解反応を産業的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）培養液から得られた精製画分（ＧＰＣ−ＣＰ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。
【図２】ＧＰＣを基質とした場合の酵素活性を基準（１００％）とした、ＧＰＣ−ＣＰの基質特異性（加水分解活性の相対比較）を示すグラフである。
【図３】反応温度が４０℃である場合の酵素活性を基準（１００％）とした、種々の温度でのＧＰＣ−ＣＰの相対活性を示すグラフである。
【図４】ｐＨが７．２である場合の酵素活性を基準（１００％）とした、種々のｐＨでのＧＰＣ−ＣＰの相対活性を示すグラフである。
【図５】ｐＨが７．２、３０分間の条件で種々の温度で処理した後のＧＰＣ−ＣＰについての相対活性を示すグラフである。
【図６】温度が４℃、３時間の条件で種々のｐＨで処理した後のＧＰＣ−ＣＰについての相対活性を示すグラフである。
【図７】金属イオン又はＥＤＴＡを添加したときのＧＰＣ−ＣＰについての相対活性を示すグラフである。
【図８】化学物質を添加したときのＧＰＣ−ＣＰについての相対活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
［酵素］
本明細書において、酵素とは、精製酵素に限定されず、粗精製物、固定化物なども含む。酵素の精製は、例えば、微生物の培養液を用いて、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどの、当業者に周知の方法を用いて行われる。それにより、種々の精製度の酵素（ほぼ単一までに精製された酵素を含む）が得られ得る。
【００２３】
本明細書において、微生物とは、野性株、変異株（例えば、紫外線照射などにより誘導されたもの）、あるいは、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝子工学的手法により誘導される組換え体などのいずれの株であってもよい。組換え体などの遺伝子操作された微生物は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような、当業者に公知な技術を用いて容易に作成され得る。微生物の培養液とは、微生物菌体を含む培養液、および遠心分離などにより微生物菌体を除いた培養液の両方を意味する。
【００２４】
［ＧＰＣ−ＣＰ］
グリセロホスホコリン  コリンホスホジエステラーゼ（Glycerophosphocholine cholinephosphodiesterase [EC 3.1.4.38]、以下「ＧＰＣ−ＣＰ」ともいう）は、ホスホリパーゼＣに類似した酵素活性を示す酵素である。本発明によれば、新規なＧＰＣ−ＣＰが得られる。ホスホリパーゼＣは、リン脂質及びその加水分解物（リゾリン脂質、グリセロホスホジエステル）に作用し、ホスホジエステル部位におけるグリセロール側のホスホエステル結合を加水分解する作用を有するものである。本発明によるＧＰＣ−ＣＰでは、リン脂質やリゾリン脂質に対する活性は高くなく、それらが加水分解したグリセロホスホジエステル化合物に対して特異的に加水分解活性を有する。グリセロホスホジエステルに対してＧＰＣ−ＣＰが作用すると、グリセロールと、リン酸又はホスホコリン、ホスホエタノールアミンなどのリン酸エステル化合物とを生成する。そして、さらに、本発明によるＧＰＣ−ＣＰは、グリセロール−３−ホスホジエステルのうちでもＧＰＣに特異的に作用する。
【００２５】
ＧＰＣ（グリセロール−３−ホスホコリン）の化学式を以下に示す。なお、グリセロホスホコリンは、グリセロール−３−ホスホコリンの略称である。また、グリセロール−３−ホスホコリンは、別称として、グリセロ−３−ホスホコリン、ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリンがある。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
ＧＰＣ−ＣＰは、以下の反応を触媒することができる酵素である。すなわち、ＧＰＣは、ＧＰＣ−ＣＰにより加水分解されて、グリセリンとホスホコリンとが生成する。
【００２８】
【化２】
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【００２９】
本発明における酵素は基質特異的な作用を有する。本発明では、ＧＰＣ（グリセロール−３−ホスホコリン）に対して特異的に作用する酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）が得られる。また、本発明におけるＧＰＣ−ＣＰは、ＧＰＥ（グリセロール−３−ホスホエタノールアミン）に対しても高い活性を示す。そして、このＧＰＣ−ＣＰは、それ以外のグリセロホスホ化合物（グリセロホスホジエステル）に対する活性はそれほど高くない。ところで、ＧＰＥに作用する酵素は、グリセロホスホエタノールアミン  エタノールアミンホスホジエステラーゼ（ＧＰＥ−ＥＰ）とも呼ぶことができる。したがって、本発明における酵素は、ＧＰＣ−ＣＰとＧＰＥ−ＥＰの両方の性質を有する。なお、ＧＰＥのみに作用する酵素はＧＰＥ−ＥＰとなる。
【００３０】
グリセロール−３−ホスホジエステル（以下「ＧＰＸ」ともいう）は、リン脂質（グリセロールリン脂質）やリゾリン脂質の加水分解によって得られる化合物である。グリセロールリン脂質中のグリセロール基のα位（ｓｎ−１位）の脂肪酸エステル結合を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）と称し、グリセロール基のβ位（ｓｎ−２位）の脂肪酸エステル基を加水分解する酵素をホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）と称する。また、ホスホリパーゼＡ１活性及びホスホリパーゼＡ２活性を併有する酵素をホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）と称する。すなわち、ＰＬＢは、α位とβ位の両方に酵素活性を有する。したがって、ＧＰＣ−ＣＰは、ホスホリパーゼＡ１、Ａ２、Ｂを利用して、あるいは化学反応等により得られたグリセロ−３−ホスホジエステルに反応し得る。
【００３１】
本発明における酵素は、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素であって、以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを含むものである。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド；または
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、かつ該加水分解活性を示すポリペプチド。
【００３２】
上記の酵素は、例えば、上記のようにＧＰＣと酵素との反応条件下においては、約４〜７０℃の範囲内で作用し得る。至適温度は、この範囲内にあり得る。好ましくは約２０〜６５℃の範囲内であり、より好ましくは３０〜６０℃の範囲内であり、さらにより好ましくは約４０℃である。
【００３３】
上記の酵素は、例えば、ＧＰＣを基質としたときに、ｐＨ７．２で４０℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、２０℃から６０℃の範囲内で４０％以上の加水分解活性を示すことが好ましい。また、３０℃から６０℃の範囲内で７０％以上の加水分解活性を示すことがさらに好ましい。
【００３４】
上記の酵素は、例えば、緩衝液として、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を用い、３７℃の温度条件にて、上記のグリセロ−３−ホスホコリンと酵素とを反応条件下におくと、ＧＰＣ−ＣＰ活性を示し得る。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、酢酸−酢酸Ｎａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨなども使用することができる。
【００３５】
上記の酵素は、例えば、ＧＰＣを基質としたときに、ｐＨ７．２で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、ｐＨ５からｐＨ８の範囲内で１０％以上の加水分解活性を示すことが好ましい。また、ｐＨ６からｐＨ８の範囲内で２０％以上の加水分解活性を示すことがさらに好ましい。至適ｐＨは、ｐＨ７．２付近（例えばｐＨ６．５〜７．５の範囲内）とすることができる。
【００３６】
上記の酵素は、例えば、上記のようにグリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）を基質としたときに、ｐＨ７．２で３７℃にて５分間の条件での加水分解活性を１００％とした場合に、該条件での加水分解活性が、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）に対して９０％以上、グリセロール−３−リン酸（ＧＰＡ）に対して２０％以下、グリセロール−３−ホスホグリセロール（ＧＰＧ）およびグリセロール−３−ホスホイノシトール（ＧＰＩ）に対して１％以下、グリセロ−３−ホスホセリン（ＧＰＳ）に対してほぼ０％、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して４０％以下、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）に対して３％以下、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に対して１％以下、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）に対してほぼ０％、コリン型リゾプラズマローゲン（Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＣ）に対して５％以下、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＥ）に対して１％以下、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲン（ＰｌｓＰＥ、ＰｌｓＰＣ）に対してほぼ０％、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対して０．５％以下、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して０．１％以下、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）に対してほぼ０％である基質特異性を有する。また、好ましくは、さらに大豆由来のホスファチジルコリン（ＰＣ（ｓｏｙ））に対して０．５％以下、ＰＡＦに対してほぼ０％である基質特異性を有する。ここで、加水分解活性がほぼ０％とは、例えば１％以下、０．１％以下、あるいは検出限界以下を意味するものであってよい。また、ＰＣの一例はＤＰＰＣであり、ＰＡの一例はＤＭＰＡであり、ＰＳの一例はＰＯＰＳであり、ＰＧの一例はＰＯＰＧであり、ＰＥの一例はＤＰＰＥである（略称については後述の表３参照）。上記の酵素では、このような基質特異性を有することが好ましいものである。
【００３７】
上記の酵素は、電気泳動条件などにより若干変化し得るが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が６０，０００〜７０，０００（Ｄａ）の範囲内を示すことが好ましい。例えば、ストレプトマイセス属由来の天然の酵素では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量が約６６ｋＤａを示すものが得られている。
【００３８】
上記の酵素、すなわちＧＰＣ−ＣＰの一態様は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるものである。
【００３９】
上記の酵素は、ＧＰＣ−ＣＰ活性を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２に記載内のアミノ酸配列に対して、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８２年，１０巻，ｐｐ．６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８３年，１００巻，ｐｐ．４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９年；ＰＣＲ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１年，ｐｐ．２００）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより、タンパク質の構造を改変することができる。本明細書において、置換、欠失、挿入、および／または付加することができるアミノ酸残基数は、通常５０以下、例えば３０以下、あるいは２０以下、好ましくは１６以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは０〜３である。また、アミノ酸の変異は、人工的に変異させた酵素のみならず、自然界において変異した酵素も、同様の活性を有する限り、上記の酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）に含まれる。
【００４０】
配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（タンパク質）も、ＧＰＣ−ＣＰ活性を有する限り、上記の酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）に含まれる。ＧＰＣ−ＣＰは、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
【００４１】
タンパク質の相同性の（ホモロジー）検索は、例えばＵｎｉｐｒｏｔ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベース、またはＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。タンパク質の活性の確認は、上記に記載の手順を利用して行い得る。
【００４２】
ＧＰＣ−ＣＰの供給源は特に限定されるものではないが、ＧＰＣ−ＣＰは、微生物などの生体細胞から得ることができる。そのような微生物としては、例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が挙げられる。好ましくは、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）が挙げられる。また、近縁の菌株、例えば、ストレプトマイセス・アトラタス（Streptomyces atratus）なども、ＧＰＣ−ＣＰ活性を有する酵素が得られる可能性がある。また、Streptomyces sindenesis、Streptomyces badius、Streptomyces globisporus、Streptomyces pluricolorescens、Streptomyces rubiginosohelvolus、Streptomyces albovinaceus、Streptomyces anulatus、Streptomyces flavofuscus、Streptomyces microflavus、Streptomyces griseorubiginosus、Streptomyces puniceus、Streptomyces floridae、Streptomyces griseolus、Streptomyces halstedii、Streptomyces flavovirens、Streptomyces flavogriseus、Streptomyces pulveraceus、Streptomyces gelaticus、Streptomyces albus subsp. albusなども、ＧＰＣ−ＣＰ活性を有する酵素が得られる可能性がある。また、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）、ストレプトマイセス・チャッタノゲンシス（Streptomyces chattanoogensis）およびストレプトマイセス・リディカス（Streptomyces lydicus）なども、ＧＰＣ−ＣＰ活性を有する酵素が得られる可能性がある。これらの菌株は近縁であることから同種の活性のＧＰＣ−ＣＰが得られやすいものと考えられる。
【００４３】
例えば、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３９２）は適当な栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理したものをＧＰＣ−ＣＰ酵素製剤として製造することができる。
【００４４】
ＧＰＣ−ＣＰ酵素製剤の製造に用い得る微生物はストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株に限られるものではなく、ストレプトマイセス属に属し、かつ、ＧＰＣ−ＣＰを生産し得る微生物であってもよい。また、それらの生物種の天然または人為的変異株や、ＧＰＣ−ＣＰ活性の発現に必要な遺伝子断片を人為的に取り出し、それを組み入れた他の生物種であってもＧＰＣ−ＣＰの製造に用いることができる。また、ストレプトマイセス属に属さなくても、上記のＧＰＣ−ＣＰを生産し得る微生物であれば、それを用いることもできる。
【００４５】
ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を用いたＧＰＣ−ＣＰ酵素製剤を例に挙げて、その製造について説明する。
【００４６】
この菌は栄養培地で液体培養することにより該酵素を菌体外に分泌するので、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理する、あるいはこの処理物を固定化するなどして酵素製剤を製造することができる。さらに具体的に説明すると、まず、この菌を適当な培地、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類を含む培地中で培養し、該酵素を分泌させる。ここで炭素源としては、澱粉および澱粉加水分解物、グルコース、シュークロースなどの糖類、グリセロールなどのアルコール類、および有機酸（例えば、酢酸およびクエン酸）またはその塩（例えば、ナトリウム塩）などが挙げられる。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉などの有機窒素源および硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの無機窒素化合物挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、リン酸１カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、硫酸第１鉄などが挙げられる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．４〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。窒素源の濃度は、例えば０．１〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．４〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。好ましい培地組成として、具体的には、麦芽エキス１％、グルコース０．４%が挙げられるが、これに限定されるものではない。培養温度は、上記の酵素が安定であり、そして培養される微生物が十分に生育できる温度であることが好ましく、例えば、２０〜４０℃であることが好ましい。培養時間は、上記酵素が十分に生産される時間であることが好ましく、例えば、１〜７日間程度であることが好ましい。培養は、好ましくは、好気的な条件下で、例えば、通気攪拌または振とうしながら行うことができる。
【００４７】
ＧＰＣ−ＣＰは、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）；陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー；キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、上記微生物の培養上清を回収した後、硫安沈殿、さらに陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、及び／又は、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。これにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ほぼ単一バンドにまで精製することができる。すなわち、上記酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）は、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析により、単量体と推定できる。
【００４８】
［ＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチド］
本発明におけるポリヌクレオチドは、上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするものである。このポリヌクレオチドは、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【００４９】
上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であり得る。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であり得る。上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の１位から１９４１位までの塩基配列を有する。配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードすることができ、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、ＧＰＣ−ＣＰの好ましい形態を構成する。
【００５０】
上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドとしては、上記のような配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸を含み、かつＧＰＣ−ＣＰ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた挙げられる。当業者であれば、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（上述）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
【００５１】
ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載した塩基配列情報に基づいて、目的とする遺伝子を、上記の微生物、好ましくは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングを用いることができる。あるいは遺伝子の取得には、次世代シーケンスなどによるゲノム解析により得られた情報からインシリコスクリーニングにてＯＲＦ、遺伝子を探索する手法を用いることができる。
【００５２】
また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成して得ることもできる。また、上記の塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来する上記ＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドを取得することもできる。例えば、上記塩基配列もしくはその一部の塩基配列を用いてプローブを設計し、他の生物から調製したＤＮＡに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。
【００５３】
さらに、上記の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている配列情報を用いてホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーを設計することもできる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含むすべてのＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）もしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。同様に、環境中から抽出したＤＮＡあるいはＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、上記ＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドを種々の生物から単離することもできる。
【００５４】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号１に記載の塩基配列中の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、４０個、６０個、または１００個の連続した配列を１つまたは複数選択してプローブを設計し、例えばＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（例えば、洗浄条件：４２℃、０．５×ＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。より具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの条件であるが、これらの条件に特に制限されるものではない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度など複数の要素があり、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５５】
さらに、上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつＧＰＣ−ＣＰ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）検索は、上記で説明したとおりである。
【００５６】
また、上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、なおより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつＧＰＣ−ＣＰ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドもまた挙げられる。塩基配列の配列同一性の決定および検索についても、上記で説明したとおりである。
【００５７】
上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子組換え技術を用いて、同種もしくは異種の宿主中で発現され得る。
【００５８】
［酵素の製造方法］
本発明では、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する酵素を製造する方法が提供される。酵素の製造方法においては、上記で説明したポリヌクレオチドを有する微生物から該酵素を産生させる工程を含んでいる。本発明による方法では、上記で説明したＧＰＣ−ＣＰが得られる。上記のポリヌクレオチドを有する微生物は、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）のように微生物自体が天然に有するものであってもよく、あるいは、変異してポリヌクレオチドを有するものであってもよく、あるいは、ポリヌクレオチドが導入されて有するものであってもよい。
【００５９】
ポリヌクレオチドの導入においては、ベクター、形質転換体などが利用され得る。このベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むものである。また、ポリヌクレオチド又はベクターを宿主に導入することにより、グリセロール−３−ホスホジエステルに対して加水分解作用を有する能力を保有する形質転換体を作製することができる。
【００６０】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年参照）。特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」を参照して行うことができる。
【００６１】
微生物中で、ＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドを発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターやファージベクターにこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのために、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターをＤＮＡ鎖の５’側上流に組み込むことが好ましい。また、転写・翻訳を制御するユニットにあたるターミネーターをＤＮＡ鎖の３’側下流に組み込むことが好ましい。より好ましくは、上記プロモーターとターミネーターの両方をそれぞれの部位に組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用される微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターが用いられる。これらの各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関しては、「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版」、特に放線菌に関しては、「ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（Ｋｉｅｓｅｒら、ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、２０００年）」などに詳細に記述されており、その方法を利用することが可能である。また、必要に応じてシグナル配列を用いることで細胞外に効率的に分泌生産させることができる。この時使用するシグナル配列は上記のＧＰＣ−ＣＰのものでもその他のものでもよい。
【００６２】
形質転換の対象となる宿主は、上記のＧＰＣ−ＣＰをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換されて、ＧＰＣ−ＣＰ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。例えば、細菌、放線菌、枯草菌、大腸菌、酵母、カビなどが挙げられる。より具体的には、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発がされている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発がされている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主・ベクター系の開発がされているカビなどが挙げられる。遺伝子組換えの操作の容易性からは大腸菌が好ましく、遺伝子の発現の容易性からは放線菌が好ましい。
【００６３】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、例えば、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ３１５，５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、これらを利用してもよい。また、小麦胚芽由来の無細胞たんぱく合成系などインビトロ発現系を用いてもよい。
【００６４】
得られた形質転換体は、上記のように酵素製剤（ＧＰＣ−ＣＰ）の製造に用いることができる。具体的には、形質転換体を適当な栄養培地で液体培養して、発現したＧＰＣ−ＣＰを細胞外に分泌させ、その培養上清を凍結乾燥、塩析、有機溶媒などにより処理してＧＰＣ−ＣＰ酵素製剤を製造することができる。
【００６５】
宿主細胞に依存して培養条件は変動し得るが、培養は、同業者が通常用いる条件下で行われ得る。例えば、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属のような放線菌を宿主として用いる場合、チオストレプトンなどの抗生物質を含むトリプチックソイ培地（例えば、ベクトン・ディッキンソン社製）が用いられ得る。形質転換体により産生された酵素は、上述のようにしてさらに精製され得る。
【００６６】
［ＧＰＣ−ＣＰの利用］
以上のようにして生産され得るＧＰＣ−ＣＰは、グリセロール−３−ホスホコリン及びグリセロホスホエタノールアミンと特異的に反応する酵素である。そのため、グリセロール−３−ホスホコリン及びグリセロホスホエタノールアミンの分析に用いることができ、定量などを行うことができる。
【００６７】
また、ＰＬＡ１（ホスホリパーゼＡ１）、ＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）、及び、ＰＬＢ（ホスホリパーゼＢ）から選ばれる１種以上の酵素と組み合わせることにより、リン脂質やリゾリン脂質から、リン酸、ホスホコリンやホスホエタノールアミンなどを生成することが可能である。これらは、肥料や生理活性物質となり得るもので、これらを積極的に生産させることにも利用可能である。さらには、モノグリセリド、グリセリンを生成させることも可能である。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６９】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）由来酵素の精製］
ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を培養し、その培養上清について、硫安分画、陰イオン交換、疎水相互作用、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。以下に詳細を示す。
【００７０】
（ａ）培養
ＩＳＰ２培地「１％麦芽エキス（べクトン・ディッキンソン社製）、０．４％酵母エキス（日本製薬（株）製）、０．４%グルコース（和光純薬工業（株）製）、ｐＨ７．２」５００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍｌずつ分注して、さらに０．１〜１ｍＭ  程度のＴｗｅｅｎ  ８０などの生化学用界面活性剤を添加した後、１２１℃で１５分間蒸気殺菌を行った。予め平板培地に生育したストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株のコロニーを適当量とり、ＩＳＰ２培地５ｍＬを入れたφ１８試験管（１８×１８０ｍｍ）に接種し、２８℃で良好な生育が得られるまで振とう培養した。この培養液を先の滅菌した培地１００ｍＬに１ｍｌずつ接種し、２８℃で４８時間振とう培養した。遠心分離機を用いて、この培養液から上清（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収した。
【００７１】
（ｂ）硫安分画
上記（ａ）で回収した培養上清に、３０％飽和量となるように硫酸アンモニウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収、除去した。得られた上澄み液に硫酸アンモニウムを８０％飽和量となるように加え、生じた沈殿を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）により回収した。この沈殿を可溶化し、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で透析し、粗酵素液を得た。
【００７２】
（ｃ）ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー
上記（ｂ）で得られた粗酵素液を、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」にアプライした。同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【００７３】
（ｄ）ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ  カラムクロマトグラフィー
上記（ｃ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液と、１Ｍ 硫安（ｐＨ８．０）とを加えた。これを、同緩衝液で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＦＦ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、硫安（１Ｍから０Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【００７４】
（ｅ）ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  カラムクロマトグラフィー
上記（ｄ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎ（ザルトリウス社製）を用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。これを、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「ＨｉＴｒａｐ  Ｑ」（５ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【００７５】
（ｆ）Ｍｏｎｏ  Ｑ  カラムクロマトグラフィー
上記（ｅ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた。２０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ  Ｑ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウム（０Ｍから１Ｍまで）のリニアグラジェントにより、活性画分を溶出させた。
【００７６】
（ｇ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ  カラムクロマトグラフィー
上記（ｆ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮した。これに、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液と、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）とを加えた。同緩衝液で予め平衡化した「Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００ＧＬ」（２４ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させた。
【００７７】
（ｈ）Ｍｏｎｏ  Ｐ  カラムクロマトグラフィー
上記（ｇ）で得られた活性画分を集め、Ｖｉｖａ  ｓｐｉｎを用い濃縮脱塩した。これに、２５ｍＭビス−トリス緩衝液（ｐＨ６．３）を加えた。２５ｍＭ ビス−トリス緩衝液（ｐH６．３）で予め平衡化した「Ｍｏｎｏ  Ｐ」（１ｍｌ）カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライし、同緩衝液でカラムを洗浄した後、Ｐｏｌｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のｐＨリニアグラジエントにより、活性画分を溶出させた。この時、溶出位置から酵素の等電点は４．８〜５付近と予想された。
【００７８】
以上のようにして、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株より、精製酵素を得た。なお、精製酵素が単一であることは、分子量測定において単一のバンドが測定されたことで確認した。また、この酵素は、ＨＰＬＣ分析およびゲル濾過クロマトグラフィー分析によっても単量体と推定された。
【００７９】
表１に、ＧＰＣ−ＣＰ精製における収量、収率等を示す。
【００８０】
【表１】
2014082990.tif 000005
【００８１】
なお、上記の表中、「３０−８０％硫安分画」は（ｂ）硫安分画における遠心分離による回収後、「透析」は（ｂ）硫安分画における透析後の値である。
【００８２】
［ＧＰＣ−ＣＰの分子量の測定］
（分子量）
上記によって得た精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル）により分子量を解析した。
【００８３】
図１は、この溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果を示す電気泳動写真である。図の左側のレーンは、分子量マーカー（Ｍ）であり、図の右側のレーンは、溶出画分（ＧＰＣ−ＣＰ）のバンドを示す。図１に示すように、溶出画分において、単一のバンドが観察され、精製酵素（ポリペプチド）の分子量は約６６，０００であった。なお、分子量の単位はＤａ（ダルトン）である。よって、ｋＤａ表記では、この酵素の分子量は約６６ｋＤａとなる。
【００８４】
ここで、既知のＧＰＣ−ＣＰ酵素の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ウシ脳由来が１１０ｋＤａ、ラット脳由来が２３０ｋＤａ、マウス脳由来が７４ｋＤａであることが知られている。したがって、既知のＧＰＣ−ＣＰとは異なる酵素であることが確認された。
【００８５】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）由来酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）の性質の測定］
（酵素活性（ＧＰＣ−ＣＰ活性）：基質特異性）
本実施例において、酵素活性の測定は、基本的には、以下のように行った。この方法を、以下、「酵素活性標準測定方法」という。この方法では、ＧＰＣ（グリセロホスホコリン）を基質として用いた場合を例示する。
【００８６】
基質（ＧＰＣ）０．８ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２、温度３７℃）５０ｍＭの溶液に、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。「酵素活性標準測定方法」では基質量を０．８ｍＭとしている。ただし、ＧＰＣ以外の基質の場合（ＧＰＸなど）は、可溶化のため、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．５％（ｗ／ｖ）、反応液に加えた。この反応液を５分間（又は１０分間）、３７℃の温度条件にて撹拌し、酵素反応を行った。酵素反応の時間は酵素活性の度合に応じて適宜選択した。その後、アルカリホスファターゼ処理（ＡＰ処理）として、酵素反応液５μＬに、ＡＰを１μＬ、ＡＰ緩衝液（ｐＨ９．６、温度５６℃）を９４μＬ加え、合計１００μＬにし、１０分間、５６℃の温度条件にて撹拌し、酵素反応を停止させた。次に、呈色反応として、酵素反応停止後の液（ＡＰ反応液）にＢｉｏｍｏｌ  Ｇｒｅｅｎ  （ＢＭＧ）を加えて呈色液を調製し、２０分、室温で撹拌することにより、呈色反応を行った。ＢＭＧの呈色液は、ＡＰ反応液２５μＬにＢＭＧ２２５μＬを加えて合計２５０μＬにする呈色液、又は、ＡＰ反応液７５μＬにＢＭＧ１５０μＬを加えて合計２２５μＬにする呈色液、のいずれかを、酵素活性の度合に応じて適宜選択した。そして、ＢＭＧによる呈色液について波長６２０ｎｍでの吸光度を吸光度測定機により測定した。ＢＭＧでは、遊離したリン酸が呈色し、定量される。
【００８７】
表２（表２Ａ〜表２Ｅ）に、上記の各反応における反応液組成を示す。
【００８８】
【表２Ａ】
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【００８９】
【表２Ｂ】
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【００９０】
【表２Ｃ】
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【００９１】
【表２Ｄ】
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【００９２】
【表２Ｅ】
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【００９３】
グラフ中の基質の詳細
ＤＰＰＣ：  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）
ＰＣ（ｓｏｙ）：  大豆ホスファチジルコリン（L-α-phosphatidylcholine）（シグマアルドリッチ社製）
ＤＰＰＥ：  １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
ＰＩ：  Ｌ−α−ホスファチジルイノシトール（L-α-Phosphatidylinositol）
ＰＯＰＳ：  Ｌ−α−ホスファチジルセリン（L-α-Phosphatidylserine）
ＰＯＰＧ：  １，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１−ｒａｃ−グリセロール）（1,2-Diacyl-sn-glycero-3-phospho-(1-rac-glycerol)）
ＤＭＰＡ：  １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート（1,2-Dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphate）
ＰＡＦ：  β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-phosphatidylcholine
ＳＭ：  卵黄由来スフィンゴミエリン（Sphingomyelinfrom chiken egg yolk）
ＰｌｓＰＣ：  コリン型リゾプラズマローゲン
ＰｌｓＰＥ：  エタノールアミン型リゾプラズマローゲン
ＬＰＣ：  ＰＣのリゾ体（表３参照）
ＬＰＥ：  ＰＥのリゾ体（表３参照）
ＬＰＩ：  ＰＩのリゾ体（表３参照）
ＬＰＳ：  ＰＳのリゾ体（表３参照）
ＬＰＧ：  ＰＧのリゾ体（表３参照）
ＬＰＡ：  ＰＡのリゾ体（表３参照）
Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＣ：  上記ＰｌｓＰＣのリゾ体
Ｌｙｓｏ−ＰＬｓＰＥ：  上記ＰｌｓＰＥのリゾ体
ＧＰＣ：  グリセロ−３−ホスホコリン
ＧＰＡ：  グリセロ−３−リン酸
ＧＰＳ：  グリセロ−３−ホスホセリン
ＧＰＧ：  グリセロ−３−ホスホグリセロール
ＧＰＥ：  グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＧＰＩ：  グリセロ−３−ホスホイノシトール
なお、相対活性が低いもの（１％以下）は、酵素反応を１０分間行い、それ以外は酵素反応の時間を５分間とした。
【００９４】
表３に、基質の正式名称及び入手先、酵素反応における相対活性の結果の詳細を示す。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
具体的には、ＧＰＣ−ＣＰの加水分解活性は、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）を基質としたときの活性を１００％とすると、グリセロール−３−ホスホエタノールアミン（ＧＰＥ）に対して９０％以上、グリセロール−３−リン酸（ＧＰＡ）に対して２０％以下、グリセロール−３−ホスホグリセロール（ＧＰＧ）およびグリセロール−３−ホスホイノシトール（ＧＰＩ）に対して１％以下、グリセロ−３−ホスホセリン（ＧＰＳ）に対してほぼ０％であった。また、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）に対して４０％以下、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）に対して３％以下、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に対して１％以下、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）およびリゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）に対してほぼ０％、であった。また、コリン型リゾプラズマローゲン（Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＣ）に対して５％以下、エタノールアミン型リゾプラズマローゲン（Ｌｙｓｏ−ＰｌｓＰＥ）に対して１％以下、エタノールアミン型およびコリン型プラズマローゲン（ＰｌｓＰＥ、ＰｌｓＰＣ）に対してほぼ０％、であった。また、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対して０．５％以下、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に対して０．１％以下、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）に対してほぼ０％であった。また、大豆由来のホスファチジルコリン（ＰＣ（ｓｏｙ））に対して０．５％以下、ＰＡＦに対してほぼ０％であった。なお、ＰＣの一例はＤＰＰＣであり、ＰＡの一例はＤＭＰＡであり、ＰＳの一例はＰＯＰＳであり、ＰＧの一例はＰＯＰＧであり、ＰＥの一例はＤＰＰＥであり、これらがグラフで示されている。
【００９７】
ここで、表３において、「自作」とあるのは、自作で基質を作製したものである。自作で作製した基質は、いわゆるグリセロホスホジエステル（以下「ＧＰＸ」ともいう）である。このグリセロホスホジエステルは、ｓｎ−１に脂肪酸を有するリゾリン脂質に、ホスホリパーゼＡ１を作用させることにより得られる。グリセロホスホジエステルは、次の化学式に示す構造を有する。
【００９８】
【化３】
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【００９９】
上記のグリセロホスホジエステル（ＧＰＸ）における置換基Ｘは、表４に示される構造のものである。
【０１００】
【表４】
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【０１０１】
上記のグリセロホスホジエステル（ＧＰＸ）の調製は次のように行った。まず、８ｍＭのリゾリン脂質（ＬＰＸ）に、２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加え、１％（ｖ／ｖ）でホスホリパーゼＡ１を添加し、終夜（ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）で酵素反応を行って、基質を１００％反応させた。その後、１００℃に加熱して酵素を失活させ、遠心分離（１５ｋｒｐｍ、５ｍｉｎ）を行って、上清液を回収した。これをクロロホルム・メタノール（２／１、体積比）抽出し、水層を回収した。これを乾燥により水分を除去後、反応液と等量の２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を加えて溶解させた。
これにより、ＧＰＸ含有液が得られた。酵素活性測定には１０％（体積比）のＧＰＸ含有液を用いた。表５に、ＰＬＡ１による酵素反応の反応組成を示す。
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
（酵素学的性質）
上記の精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）の酵素学的性質について検討した。
【０１０４】
（１）作用温度
基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２、各温度）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各温度条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１０５】
図３は、種々の反応温度での酵素活性を、反応温度が４０℃である場合の活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図３のグラフに示されるように、この酵素は、２０〜６５℃で活性を発揮し、そして反応の至適温度は４０℃付近（例えば３５〜６０℃）であった。
【０１０６】
（２）作用ｐＨ
基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸Ｎａ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、又は、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨから選ばれる緩衝液（各ｐＨ）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液を各ｐＨ条件にて温度３７℃、５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１０７】
各ｐＨ条件は次の通りである。
酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液：ｐＨ４．１、ｐＨ４．４、ｐＨ５、ｐＨ５．６。
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液：ｐＨ５．６、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７．２。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液：ｐＨ７．２、ｐＨ８、ｐＨ８．８、ｐＨ９。
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液：ｐＨ９、ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５。
【０１０８】
図４は、種々の反応ｐＨでの酵素活性を、反応ｐＨが７．２である場合の酵素活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図４のグラフから分かるように、この酵素は、ｐＨ４からｐＨ９という広い範囲で活性を発揮し、そして、反応の至適ｐＨは、７付近（例えば６．５〜７．２）であった。
【０１０９】
（３）温度安定性
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２、各温度）５０ｍＭに、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、各温度で３０分間保温した。基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）５０ｍＭとの溶液に、各温度での処理後の酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ７．２、温度３７℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１１０】
図５は、ｐＨ７．２、各温度での処理後の酵素の活性を、温度処理を行わずに３７℃で酵素反応したときの活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図５のグラフに示されるように、この酵素は、４℃から６０℃までの温度での処理後では、活性が確認された。特に５５℃以下の処理後では、処理前の４０％以上の活性が維持されていた。
【０１１１】
（４）ｐＨ安定性
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、酢酸−酢酸Ｎａ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、又は、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨから選ばれる緩衝液（各ｐＨ）５０ｍＭに、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を２０％（ｖ／ｖ）となるように加え、各ｐＨで４℃条件下、３時間処理した。その後、基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）５０ｍＭとの溶液に、各ｐＨでの処理後の酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ７．２、温度３７℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１１２】
図６は、種々のｐＨでの処理後の酵素の活性を、ｐＨ１０．２でｐＨ処理を行って酵素反応したときの活性を基準（１００％）とする相対活性として示したグラフである。図６のグラフに示されるように、この酵素は、少なくともｐＨ４から１０．２までのｐＨ処理後においても活性が確認された。
【０１１３】
（５）金属イオンおよびＥＤＴＡの影響
基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらに各種金属イオン又はＥＤＴＡを２ｍＭ添加して、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ７．２、温度３７℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１１４】
図７は、添加物（金属イオン及びＥＤＴＡ）を添加していない条件（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたときの、各種添加物を添加した相対活性の結果である。上記の酵素は、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＥＤＴＡ、の存在下では、金属イオンを添加していない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等の活性を示した。また、Ｍｎ２＋の存在下では、若干活性が低下する傾向が見られ、Ｆｅ２＋ではその傾向が大きくなった。また、Ｃｏ２＋の存在下では、活性の低下がさらに見られた。また、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋の存在下では活性が大きく低下し、活性阻害が見られた。
【０１１５】
ここで、既知のＧＰＣ−ＣＰ酵素（ウシ脳由来、ラット脳由来、マウス脳由来）は、イオン要求性であることが分かっている。これに対し、上記の酵素はイオン非存在下においても活性を有しており、さらにＥＤＴＡ存在下でも活性を維持している。よって、上記の酵素は金属イオン非要求性と考えられる。
【０１１６】
（６）化学物質の影響
基質（ＧＰＣ）８ｍＭと、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）５０ｍＭとの溶液に、精製酵素（ＧＰＣ−ＣＰ）を１０％（ｖ／ｖ）となるように加え、さらに各種化学物質を２ｍＭ添加して、合計量５０μＬとなる反応液を調製した。この反応液をｐＨ７．２、温度３７℃の条件にて５分間、酵素反応させた。その後のＡＰ処理、呈色反応は、「酵素活性標準測定方法」に従って行い、酵素活性を測定した。
【０１１７】
図８は、化学物質を添加していない条件（ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としたときの、各種化学物質を添加した相対活性の結果である。上記の酵素は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２−ＭＥ（２−メルカプトエタノール）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）の存在下では、化学物質を添加していない場合（ｃｏｎｔｒｏｌ）とほぼ同等の活性を示した。ＩＡＡ（ヨードアセタミド）の存在下では、わずかながら活性が低下する傾向が見られた。また、ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）の存在下では活性低下の傾向が大きくなった。
【０１１８】
（７）等電点
Ｇｅｎｅｔｙｘを用いて酵素のアミノ酸配列に基づいて酵素の等電点を予測した結果、酵素の等電点は５．８であった。
【０１１９】
［精製酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、エレクトロブロッティングを行い、目的とする酵素をＰＶＤＦ膜に転写した。これをプロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。解析から、この精製酵素のＮ末端アミノ酸配列は、配列番号３に示すものであることが確認された。
【０１２０】
［精製酵素の内部アミノ酸配列の解析］
上記の精製酵素について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、目的とする酵素を切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行った。そして、得られたペプチドサンプルについて質量分析計（ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により内部アミノ酸配列の解析を行った。これにより、内部アミノ酸配列は、配列番号４、５、６に示すものであることが確認された。
【０１２１】
ここで、配列番号４は、配列番号２の４８２位からに示される配列となっている。また、配列番号５は、配列番号２の５７６位からに示される配列となっている。また、配列番号６は、配列番号２の４６６位からに示される配列となっている。なお、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるデノボアミノ酸配列解析ではＬｅｕとＩｌｅとが判別できないため、これらのアミノ酸が一部一致していない箇所がある。
【０１２２】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株の染色体ＤＮＡの分離］
ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株を、２．５M塩化マグネシウム５０μｌ、２０％グリシン０．６２５ｍｌＹＥＭＥ培地（トリプトン０．５％、酵母エキス０．５％、麦芽エキス０．３％、グルコース１％、スクロース３４％）５０ｍｌを用いて２８℃で３日間培養し、集菌した。
【０１２３】
次いで、この菌体を、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ７．５）および１ｍｇ／ｍｌリゾチームからなる溶液５ｍｌに懸濁し、３７℃で一晩処理した。これに、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを７５０μｌ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを５ｍｇ添加し、５５℃で２時間処理した。この溶液にクロロホルム７．５ｍｌを加えて攪拌し、遠心分離により水相を５ｍｌ分取した。
【０１２４】
この水相に３ｍｌのイソプロパノールを添加混合してＤＮＡ画分を回収し、１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液５００μｌに溶解した。これに、ＲＮａｓｅＡを２０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１時間処理した後、０．８ＭのＮａＣｌを含む１３％ＰＥＧ溶液を５００μｌ加え攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。これにフェノール／クロロホルム混合液５００μｌを加えて攪拌し、遠心分離により、水相を５００μｌ分取した。
【０１２５】
この水相に３Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）５０μＬおよびエタノール１ｍｌを添加混合し、ＤＮＡを回収した。
【０１２６】
このＤＮＡを７０％（ｖ／ｖ）エタノールに１０分間浸漬した後、１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる溶液２００μｌに溶解した。
【０１２７】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子のコア領域のクローニング］
ＧＰＣ−ＣＰのＮ末端および内部アミノ酸配列とストレプトマイセス属の使用コドンに基づいて、プライマーを設計した。
【０１２８】
プライマー（primer）の作製にあたっては、上記の３つの内部アミノ酸配列（配列番号４〜６）をピックアップした。これらの内部アミノ酸配列（ペプチド）の一文字表記を下記に示す。
【０１２９】
配列番号４のペプチド：  ＬＴＦＳＡＧＤＱＡＧＡＡＦ
配列番号５のペプチド：  ＨＬＴＶＴＮＡＹ
配列番号６のペプチド：  ＡＰＹＶＤＧＡＡＤＬＳＴＧＫ
配列番号４のペプチドについては「ＧＤＱＡＧＡＡＦ」の配列を基にプライマーを設計した。また、配列番号５のペプチドについては「ＴＶＴＮＡＹ」の配列を基にプライマーを設計した。また、配列番号６のペプチドについては「ＰＹＶＤＧＡＡＤ」の配列を基にプライマーを設計した。
【０１３０】
Ｎ末端アミノ酸配列情報を「Sense primer」とし、内部アミノ酸配列情報を「Antisense primer」とした。縮重コドンに関しては、Streptomyces属におけるコドン使用頻度が高いコドンを選択し、プライマー設計を行った。また、コドン使用頻度が同等のものに関しては、混合塩基プライマーとした。また、質量分析では分別が難しいＬｅｕとＩｌｅを除外した。これにより、センスプライマー（Sense primer）として、ＰＣＲ用の縮重オリゴヌクレオチドプライマーＳ１（配列番号７）を設計した。また、３種のアンチセンスプライマー（Antisense primer）として、配列番号４から設計した「ｐｒｉｍｅｒ  Ａ１−１」（配列番号８）と、配列番号５から設計した「ｐｒｉｍｅｒ  Ａ１−２」（配列番号９）と、配列番号６から設計した「ｐｒｉｍｅｒ  Ａ１−３」（配列番号１０）とを設計した。ここで、配列中のｓはｃまたはｇを表している。
【０１３１】
次に上記のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
【０１３２】
上記［ストレプトマイセス・サングリエリＡ１４株の染色体ＤＮＡの分離］で得た鋳型染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、２×ＫＯＤ  ＦＸ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μＬ、プライマー各３００ｎＭ、およびＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。
【０１３３】
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
【０１３４】
ステップ１：９４℃、２分；
ステップ２：９８℃、１０秒；
ステップ３：６８℃、９０秒；
ステップ２からステップ３を３０サイクル繰り返す；
ステップ４：６８℃、２分。
【０１３５】
配列番号７〜１０のプライマーを用いたＰＣＲによって、約１５００ｂｐの特異的な増幅産物を得た。
【０１３６】
このＰＣＲ反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、目的の１５００ｂｐのバンド部分を切り出し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＳｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに結合させ、大腸菌を形質転換した。形質転換株をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．４％、ｐＨ７．２）で培養し、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ製）を用いてＤＮＡシーケンス用のプラスミドを抽出・精製した。
【０１３７】
続いて、ベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ）に由来するＴ７プライマーおよびＳＰ６プライマーを用いて自動シークエンサーによって、挿入断片の塩基配列を決定した。この塩基配列を、配列番号１１に示す。
【０１３８】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子のコア領域下流側のクローニング］
上記［ストレプトマイセス・サングリエリＡ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子のコア領域のクローニング］で決定した遺伝子配列の周辺領域の配列を明らかにするために、ゲノムウォーキングによりその下流側を含むＤＮＡ断片を増幅した。上記で得た染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで完全消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて消化断片に、Cassette， Pst 1（タカラバイオ社製、製品コード：3871）を連結させた。これを鋳型にして、ＧＰＣ−ＣＰの部分遺伝子配列（配列番号１１）に基づいて作製したセンスプライマー「Sense-Gw1」（配列番号１２）と「Sense2-Gw2」（配列番号１３）、アンチセンスプライマー「Antisense1」（Pst 1-Cassette primer1）（配列番号１４）と「Antisense2」（Pst 1-Cassette primer2）（配列番号１５）を用いて、２段階のＰＣＲを行うことでＧＰＣ−ＣＰの下流側を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０１３９】
ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
【０１４０】
鋳型ＤＮＡ３０ｎｇ、２×ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、およびＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。
【０１４１】
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
【０１４２】
ステップ１：９４℃、２分；
ステップ２：９８℃、１０秒；
ステップ３：６８℃、２分；
ステップ２からステップ３を２５サイクル繰り返す；
ステップ４：６８℃、２分。
【０１４３】
このＰＣＲによって、約７５０ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）にてクローニングし、塩基配列を決定した。
【０１４４】
解析によって得た塩基配列を配列番号１６に示し、アミノ酸配列を配列番号１７に示す。この塩基配列及びアミノ酸配列は、コア領域の下流側の配列である。
【０１４５】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子のコア領域上流側のクローニング］
上記［ストレプトマイセス・サングリエリＡ１４株の染色体ＤＮＡの分離］で得た染色体ＤＮＡをＳａｃＩＩで完全消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）により自己閉環化させた。これを鋳型にして、ＧＰＣ−ＣＰの部分遺伝子配列（配列番号１１）に基づいて作製したセンスプライマー「ｐｒｉｍｅｒ  ＩｎｖＮ３Ｓ」（配列番号１８）とアンチセンスプライマーＡＮ１「ｐｒｉｍｅｒ  ＩｎｖＮ３Ａ」（配列番号１９）とを用いて、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲを行った。
【０１４６】
ＰＣＲの反応液組成は次のとおりである。
【０１４７】
鋳型ＤＮＡ３０ｎｇ、２×ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２５μｌ、プライマー各３００ｎＭ、およびＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  １ユニットに、蒸留水を全量５０μｌとなるように添加した。
【０１４８】
ＰＣＲ反応条件は次のとおりである。
【０１４９】
ステップ１：９４℃、２分；
ステップ２：９８℃、３０秒；
ステップ３：６８℃、２分；
ステップ２からステップ３を２５サイクル繰り返す；
ステップ４：６８℃、７分。
【０１５０】
このＰＣＲによって、約６００ｂｐの特異的な増幅産物が得られ、これをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）にてクローニングし、塩基配列を決定した。
【０１５１】
解析によって得た塩基配列を配列番号２０に示し、アミノ酸配列を配列番号２１に示す。この塩基配列及びアミノ酸配列は、コア領域の上流側の配列である。
【０１５２】
［ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子の塩基配列の決定］
上記［ストレプトマイセス・サングリエリＡ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子のコア領域のクローニング］で決定した塩基配列と併せて上記で決定した塩基配列に基づいて、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来ＧＰＣ−ＣＰ遺伝子を含む領域の塩基配列を決定した（配列番号２２）。この配列（配列番号２２）からシグナル領域（配列の１位〜１３位）を除外し、成熟部分酵素部分を抽出した塩基配列（１９４１ｂａｓｅ）を決定した（配列番号２３の上段）。さらに、構造遺伝子部分についてその塩基配列からアミノ酸配列を推定した（配列番号２３の下段、配列番号２４）。
【０１５３】
配列解析の結果から、ＧＰＣ−ＣＰをコードする構造遺伝子は１，９４１ｂｐのヌクレオチドからなり、６４６残基のアミノ酸をコードしていることが明らかとなった。配列番号２１のアミノ酸配列が分泌シグナル配列である。
【０１５４】
上記にて決定したストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来の精製酵素のＮ末端および内部アミノ酸配列が、上記の推定アミノ酸配列中に存在し、ほぼ完全に一致していた。
【０１５５】
すなわち、配列番号２４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列に示される配列となっている。また、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の４８２位からに示される配列となっている。また、配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の５７６位からに示される配列となっている。また、配列番号６のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の４６６位からに示される配列となっている。
【０１５６】
また、ストレプトマイセス・サングリエリ（Streptomyces sanglieri）Ａ１４株由来の精製酵素（すなわちＧＰＣ−ＣＰ）は、この推定アミノ酸配列のアミノ酸組成に基づいて計算したところ、７０，４００の分子量を有することが推定された。
【０１５７】
［ＧＣＰ−ＣＰ及びその発現遺伝子のシーケンス］
上記のように、ＧＣＰ−ＣＰのアミノ酸配列及びその発現遺伝子の決定を行ったが、シーケンスを２回行ったところ、若干異なる結果が得られている。配列番号２５に、そのＧＰＣ−ＣＰの発現遺伝子の塩基配列を示す。配列番号２６に対応コドンを示す。配列番号２７にＧＰＣ−ＣＰのアミノ酸配列を示す。
【０１５８】
配列番号２５の塩基配列は、配列番号１の塩基配列とは、１９１５位が異なっている（ａとｇ）。また、配列番号２７のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列とは、６３９位が異なっている（ＳｅｒとＧｌｙ）。また、配列番号２６の対応コドンでも同様の位置が異なっている。なお、この解析は、配列番号１６における１６６位の「ａ」が「ｇ」に置き換わって確認されたことに起因している。
【０１５９】
したがって、本発明における酵素においては、ＧＰＣ−ＣＰの発現遺伝子が配列番号２５の塩基配列であってもよく、ＧＰＣ−ＣＰが配列番号２７のアミノ酸配列であってもよい。もちろん、この塩基配列及びアミノ酸配列は、一つの塩基及びアミノ酸が置換されただけのものであるため、配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列の配列同一性及び相同性が８０％以上の範囲内に含まれ、また、３個以下で置換された範囲内に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
本発明によれば、新規なＧＰＣ−ＣＰおよびその製造方法が提供される。このＧＰＣ−ＣＰは、グリセロール−３−ホスホコリンと特異的に反応するため、その定量が可能である。また、グリセロール−３−ホスホエタノールアミンの定量にも用いることができる。ＧＰＣ−ＣＰを用いた定量では、比色定量が可能になり、簡単に定量を行うことができる。グリセロール−３−ホスホコリンなどのグリセロール−３−リン酸エステル化合物は、医薬品、食品および化粧品などの配合物質として有用である。なかでも、グリセロール−３−ホスホコリン（ＧＰＣ）は認知症予防などが期待されている。したがって、ＧＰＣ−ＣＰは、体外診断薬用酵素、グリセロール−３−ホスホコリン定量用酵素として使用可能である。例えば、血清中などの体内液に存在するＧＰＣなどの物質を簡単に正確に定量することが可能になる。
【受託番号】
【０１６１】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−１３９２
【配列表フリーテキスト】
【０１６２】
配列番号１：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子
配列番号２：ＧＰＣ−ＣＰ（ポリペプチド）
配列番号３：ＧＰＣ−ＣＰのＮ末端配列
配列番号４：ＧＰＣ−ＣＰの内部配列
配列番号５：ＧＰＣ−ＣＰの内部配列
配列番号６：ＧＰＣ−ＣＰの内部配列
配列番号７：プライマーＳ１
配列番号８：プライマーＡ１−１
配列番号９：プライマーＡ１−２
配列番号１０：プライマーＡ１−３
配列番号１１：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子（解析結果）
配列番号１２：プライマーＧｗ１
配列番号１３：プライマーＧｗ２
配列番号１４：カセットプライマー１
配列番号１５：カセットプライマー２
配列番号１６：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子（解析結果）
配列番号１７：ＧＰＣ−ＣＰの末端配列
配列番号１８：インバースＰＣＲプライマーＳｅｎｓｅ（ＩｎｖＮ３Ｓ）
配列番号１９：インバースＰＣＲプライマーＡｎｔｉｓｅｎｓｅ（ＩｎｖＮ３Ａ）
配列番号２０：インバースＰＣＲの解析結果（塩基配列）
配列番号２１：インバースＰＣＲの解析結果（アミノ酸配列）
配列番号２２：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子（解析結果）
配列番号２３：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子（成熟酵素発現部位）
配列番号２４：ＧＰＣ−ＣＰ（ポリペプチド解析結果、成熟酵素部分）
配列番号２５：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子
配列番号２６：ＧＰＣ−ＣＰ発現遺伝子（コドン）
配列番号２７：ＧＰＣ−ＣＰ（ポリペプチド）
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【配列表】
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