(57)【要約】      （修正有）【課題】癌治療の分野にあり、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACI)を用いた処置のために癌患者の適性を評価するためのE2F1活性の使用を提供する。【解決手段】癌患者からの生物学的試料をE2F1高活性についてアッセイする工程を含む、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いた処置のために癌患者の適性を評価する方法。E2F1高活性について陽性とアッセイされた癌患者を選択する工程を含む、HDACIを用いた処置のために癌患者を選択する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者からの生物学的試料をE2F1高活性についてアッセイする工程を含む、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いた処置のために癌患者の適性を評価する方法。
【請求項２】
E2F1高活性について陽性とアッセイされた癌患者を選択する工程を含む、HDACIを用いた処置のために癌患者を選択する方法。
【請求項３】
癌患者を処置する方法であって、患者をHDACIで処置する工程を含み、患者の癌がE2F1高活性について陽性とアッセイされている、方法。
【請求項４】
癌が、網膜芽細胞腫、乳癌、肺癌(例えば、非小肺癌または小細胞肺癌)、唾液腺腫瘍、膵臓癌、多形神経膠芽腫、およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択されてもよい、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
1つまたは複数の生物学的試料が、癌患者から単離された組織、細胞、体液、およびその単離物など、ならびに被験体に存在する組織、細胞、および流体などを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
E2F1高活性について陽性とアッセイされた癌を有する癌患者の処置のための医用薬剤の製造におけるHDACIの使用。
【請求項７】
生物学的試料におけるE2F1活性の評価に使用するための1種類または複数の種類の試薬を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法において使用するためのキット。
【請求項８】
(a)試料中のマーカータンパク質またはマーカー核酸を検出することができる標識された化合物または薬剤;
(b)試料中のマーカータンパク質またはマーカー核酸のレベルを確かめるための手段(例えば、タンパク質もしくはその断片に結合する抗体、またはタンパク質をコードするDNAもしくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチドプローブ);
(c)キットを用いて得られた結果を解釈するための説明書;
(d)緩衝剤;
(e)防腐剤;
(f)タンパク質安定化剤;
(g)検出可能な標識(例えば、酵素または基質)の検出において使用するための成分;および
(h)ソフトウェア、例えば、患者の処置を選択するためのソフトウェア
からなる群より選択される1種類または複数の種類の成分を含む、請求項7記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は癌治療の分野にあり、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACI)を用いた処置のために癌患者の適性を評価するためのE2F1活性の使用を提供する。
【０００２】
本文において引用された全ての文献(「本明細書において引用された文献」)および本明細書において引用された文献において引用または参照された全ての文献は、全ての目的のために、その全体が参照により組み入れられる。
【０００３】
本文において引用された様々な文献などはどれも本発明に関する先行技術と認められない。
【背景技術】
【０００４】
背景
最近、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACI)が有望な化学療法剤として浮上し、細胞周期の停止の誘導、分化の刺激、およびアポトーシスの誘発を含む広範囲の抗腫瘍活性を誘導することができる(1-3)。これらの薬剤、特に、トリコスタチンA(TSA)およびスベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)の効力がインビトロ実験および進行中の臨床試験によって立証されている(4-9)。腫瘍および正常組織においてDNA損傷を引き起こすことが多い従来の化学療法剤とは異なり、HDACIは強力な腫瘍選択性を示し、正常組織に対する毒性は低い(2)。しかしながら、この腫瘍選択の機構は理解されていない。だが、最近の研究によって、腫瘍におけるHDACIの感受性は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)を伴うデスレセプター経路の活性化(10,11)、またはトランスフォームした細胞における酸化的損傷の優先的な誘導(12)によって媒介される可能性があることが分かっている。
【０００５】
HDACIの治療効果は、遺伝子プロモーターにあるヌクレオソームヒストンのアセチル化状態の変化を介した、クロマチン構造および転写活性の調節によって媒介される可能性がある。クロマチンリモデリングに加えて、HDACI活性は、腫瘍サプレッサーp53などの成長および分化に重要な非ヒストンタンパク質とも関連しているかもしれない(13)。しかしながら、HDACIは腫瘍および正常組織においてヒストンの過剰アセチル化を誘導する。従って、ヒストン/クロマチン調節による遺伝子発現パターンの変化は、HDACIの癌選択性を付与する主要な機構でないかもしれない。または、HDACIの腫瘍選択性は、発癌性トランスフォーメーションに関連するクロマチン修飾と結び付いている可能性がある。クロマチンが修飾されると、その結果として、発癌シグナル伝達と共役する生得的な腫瘍抑制機構である、腫瘍形成中は通常抑制されるアポトーシスプログラムが活性化される(14)。結果として、発癌傷害を有する癌細胞は、HDAC阻害剤の細胞傷害作用に対して感受性が高い。
【０００６】
このような発癌損傷の1つはRb/E2F1経路にある。多くのヒト腫瘍において、Rb腫瘍抑制遺伝子が損なわれていることが報告されている(15)。Rb腫瘍サプレッサーは、E2F転写因子の活性を調節することによって増殖および生存を調節する。E2F転写因子ファミリーは、細胞周期制御全体において重要な役割を果たしている。E2F転写因子ファミリーのメンバーは、S期への進入および進行に必要な遺伝子の発現を調節することによって細胞増殖を制御する(59-60)。
【０００７】
低リン酸化Rbは転写因子E2Fに結合し、転写因子E2Fを隔離して、増殖関連遺伝子を抑制する。Rbを不活性化すると、E2F1活性が増大し、その後に、細胞周期進行に必要な遺伝子がトランス活性化して、細胞が異常増殖する(16)。Rbの破壊は主に網膜芽細胞腫において起こるのに対して、Rbの不活性化は、p16(INK4)の消失またはサイクリンD1およびCdk4の過剰発現などの、この調節機構の他の成分が変化することによって、多くの腫瘍タイプにおいて引き起こされ得る。さらに、E2F1発現の増大は、乳癌、非小細胞肺癌、および唾液腺腫瘍を含む、いくつかのタイプのヒト腫瘍でも観察されている(17-19)。従って、様々な機構を介したE2F1活性の活性化によって、腫瘍細胞は細胞周期調節を回避し、無秩序に増殖することが可能になる。従って、正常なRb-E2F機能の破壊は、最も頻繁に起こる悪性トランスフォーメーション変化の1つとみなされている(20)。異常な発癌トランスフォーメーションを防ぐフェールセーフ機構(14)として、E2F1にも、アポトーシス誘導による腫瘍サプレッサー機能が備わっている。この機構を介して、Rb-E2F経路に変異がある細胞は死および排除の素因を有する。実際には、調節解除されたE2F活性が、アポトーシス促進性遺伝子の発現を調節することによってアポトーシスを誘発することができる(21,22)。これらには、p19ARF (23,24)またはChk2(25)の誘導、およびその後のp53依存性アポトーシス経路の活性化が含まれる。E2F1はまた、p73(26,27)、カスパーゼ(28)、およびBcl-2ファミリーのアポトーシス促進性BH3-onlyタンパク質(29)の発現も誘導し、従って、p53非依存性機構を介してアポトーシスを誘導する。悪性増殖が可能となるために、癌遺伝子に関連するアポトーシス機能は破壊または不活性化される。従って、腫瘍特異的介入を実現するために、癌遺伝子誘導性アポトーシスを十分に活性化する治療法が、概念的に実施可能なように思われる。
【発明の概要】
【０００８】
概要
本研究において、本発明者らは、HDACIが、発癌Rb/E2F1経路を活性化することによってアポトーシスを促進し、E2F1活性の高い、またはRbが不活性化した癌細胞がHDACI誘導性細胞死に対して高感受性であることを証明する。本発明者らは、アポトーシス促進性Bcl-2ファミリーメンバーであるBimが、このアポトーシスプロセスの重要なメディエーターであることを示す。本発明者らの結果は、HDACIの腫瘍選択性の機構上の説明となり、HDACIが、調節解除されたRb-E2F1経路を有する腫瘍を優先的に死滅させる可能性があることを示唆する。
【０００９】
本発明者らはまた、E2F1活性の影響を受ける、HDAC阻害剤SAHAに対するアポトーシスネットワークの転写応答を調べ、HDACI誘導性細胞死に関与するさらなるE2F1標的としてASK1を同定した。下流アポトーシスシグナル伝達経路の調節におけるASK1の立証された役割とは反対に、本発明者らは、ASK1誘導が、E2F1アポトーシス活性の正のフィードバック調節によってSAHA誘導性アポトーシスに寄与することを示す。
【００１０】
用語集
本項は、以下に示した単語および句(ならびにその適切な文法上の変化)の解釈の手引きとなることを目的とする。本明細書で使用するある特定の単語および句(ならびにその適切な文法上の変化)の解釈のさらなる手引きは、本明細書の他の項においてさらに見られるかもしれない。
【００１１】
本明細書で使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含む。例えば、用語「薬剤」は、その混合物を含む複数の薬剤を含み、「核酸配列」についての言及は、一般的に、1つまたはそれ以上の核酸配列および当業者に公知のその均等物などへの言及を含む。
【００１２】
数値に関して用いられる、本明細書で使用する用語「約」は、例えば、数値の±50％、好ましくは±20％、より好ましくは±10％、さらにより好ましくは±5％、最も好ましくは±1％を意味する。必要に応じて、単語「約」は本発明の定義から省かれてもよい。
【００１３】
用語「抗体」は、抗原にある特定のエピトープに結合することができる免疫グロブリン分子を意味する。抗体はポリクローナル混合物からなってもよく、天然でモノクローナルでもよい。さらに、抗体は、天然の供給源または組換え供給源に由来する免疫グロブリン全体でもよい。本発明において使用する抗体は、様々な形で、例えば、抗体全体として、または抗体フラグメントとして、または相補性決定領域などの他の免疫学的に活性な抗体フラグメントとして存在してもよい。同様に、抗体は、機能的な抗原結合ドメインを有する抗体フラグメント、すなわち、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインとして存在してもよい。また、抗体フラグメントは、Fv、Fab、F(ab) 2、scFv(単鎖Fv)、dAb(シングルドメイン抗体)、二重特異性抗体、ダイアボディ、およびトリアボディからなる群より選択されるが、これに限定されない形で存在してもよい。
【００１４】
本明細書で使用する「アレイ」は、合成または生合成により調製することができる、意図的に作られた分子(例えば、プローブ)収集物を含む。アレイの中の分子は互いに同一でもよく、異なってもよい。アレイは、様々な形式、例えば、可溶性分子ライブラリー;樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体につながれた化合物のライブラリーをとることができる。用語「アレイ」は、とりわけ、本質的に任意の長さ(例えば、長さが1〜約1000ヌクレオチドモノマー)の核酸を支持物にスポットすることによって調製することができる核酸ライブラリーを含む。本明細書で使用する用語アレイおよびマイクロアレイは同義に使用することができる。
【００１５】
用語「癌患者」は、抗癌処置を必要とする任意の患者を含む。この用語は、癌に罹患していると疑われる個体、または癌の素因があると疑われる個体、または以前に癌に罹患した可能性のある個体、または現在、癌に罹患している可能性のある個体を含んでもよい。
【００１６】
用語「相補的な」は、ヌクレオチド間または核酸間の、例えば、2本の二本鎖DNA分子間の、またはオリゴヌクレオチドプライマーと、配列決定もしくは増幅しようとする一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間の、ハイブリダイゼーションまたは塩基対合を意味する。相補的ヌクレオチドは、一般的に、AおよびT(もしくはAおよびU)またはCおよびGである。2本の一本鎖RNAまたはDNA分子は、一方の鎖のヌクレオチドが最適にアラインメントおよび比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失があり、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約80％、通常、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約90％〜95％、より好ましくは他方の鎖のヌクレオチドの約98〜100％と対になった時に相補的であるといわれる。または、相補性は、RNA鎖またはDNA鎖がその相補物と選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする時に存在する。典型的に、少なくとも14〜25ヌクレオチドの領域にわたって少なくとも約65％の相補性、好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約90％の相補性がある時に、選択的ハイブリダイゼーションは生じる。
【００１７】
本明細書で使用する用語「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味する。従って、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物はXだけからなってもよく、1つまたは複数のさらなる成分を含んでもよい。
【００１８】
本明細書で使用する用語「ヒストンデアセチラーゼ」および「HDAC」は、ヒストンのN末端にあるリジン残基のE-アミノ基からアセチル基を除去する酵素ファミリーのいずれか1つを意味することが意図される。特に文脈によって規定されていない限り、用語「ヒストン」は、処置しようとする任意の種に由来する、H1、H2A、H2B、H3、H4、およびH5を含む任意のヒストンタンパク質を意味することが意図される。好ましいヒストンデアセチラーゼには、クラスI酵素およびクラスII酵素が含まれる。好ましくは、HDACは、哺乳動物またはヒトのHDACである。ヒトHDACには、HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10、およびHDAC-11が含まれる。
【００１９】
用語「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」、「ヒストンデアセチラーゼの阻害剤」、および「HDACI」は同義に用いられ、ヒストンデアセチラーゼと相互作用し、その酵素活性を阻害することができる化合物を含む。「ヒストンデアセチラーゼ酵素活性を阻害する」は、ヒストンデアセチラーゼがヒストンからアセチル基を除去する能力を弱めることを意味する。
【００２０】
当業者であれば、ヒストンデアセチラーゼ、例えば、ヒストンデアセチラーゼ1、2、3、4、5、6、7、7A、アイソフォームa、7B、アイソフォームb、および8の公知の構造(およびアミノ酸配列)に基づいて適切な化合物を選択することができる。NCBI-データベースAAH00301、XP004370、AAH00614、NP006028、NP005465、NP006035、AAF63491、NP056216、NP057680、およびNP060956を参照されたい。このような化合物の例は、抗体、好ましくは、ヒストンデアセチラーゼと特異的に反応するモノクローナル抗体である。デアセチラーゼ阻害剤には、例えば、酪酸ナトリウム、酪酸フェニル、およびトリコスタチンAが含まれる。薬理学的半減期の長い前記阻害剤の誘導体が特に好ましい(Brettman and Chaturvedi, J. Cli. Pharmacol. 36 (1996), 617-622)。投与のために、1つの態様において、ヒストンデアセチラーゼは、適切な薬学的担体と組み合わされてもよい。適切な薬学的担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン、例えば、油/水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体は従来の方法によって処方することができ、適切な用量で被験体に投与することができる。適切な組成物の投与は、様々なやり方、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、または皮内投与によって行われてもよい。もちろん、投与経路は、疾患の性質、および薬学的組成物に含まれる化合物の種類に左右される。投与計画は、主治医および他の臨床要因によって決められる。医療分野において周知なように、どの患者の投与量も、患者の大きさ、体表面積、年齢、性別、投与しようとする特定の化合物、投与時間および投与経路、疾患の種類、身体全体の健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に左右される。
【００２１】
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、2本の一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して、安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション」はまた三本鎖ハイブリダイゼーションを意味してもよい。結果として生じる(通常)二本鎖のポリヌクレオチドは「ハイブリッド」である。安定したハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の比率は「ハイブリダイゼーションの程度」と本明細書において呼ばれる。
【００２２】
ハイブリダイゼーション条件は、典型的に、約1M未満、より通常は約500mM未満および約200mM未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は5℃と低くてもよいが、典型的には22℃超、より典型的には約30℃超、好ましくは約37℃を超える。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下、すなわち、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズする条件下で行われる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況の下で異なる。断片が長いほど、特異的ハイブリダイゼーションのためにハイブリダイゼーション温度が高くなる必要があり得る。塩基組成および相補鎖の長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションストリンジェンシーに影響を及ぼし得るので、任意のパラメータ単独での絶対尺度よりパラメータの組み合わせの方が重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびpHで、特定の配列の熱融点(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に相補的なプローブの50％が標的配列に平衡状態でハイブリダイズする(特定のイオン強度、pH、および核酸組成の下での)温度である。
【００２３】
典型的に、ストリンジェントな条件には、pH7.0〜8.3で少なくとも0.01M〜1M以下のNaイオン濃度(または他の塩)の塩濃度および少なくとも25℃の温度が含まれる。例えば、5×SSPE(750mM NaCl, 50mMリン酸Na, 5mM EDTA, pH7.4)および25〜30℃の温度の条件が対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。ストリンジェントな条件については、例えば、Sambrook, Fritsche and Maniatis. 「Molecular Cloning A laboratory Manual」 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)およびAnderson「Nucleic Acid Hybridization」 1st Ed., BIOS Scientific Publishers Limited (1999)を参照されたい。これらは、前記の全ての目的のために、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２４】
用語「標識された」は、例えば、プローブに関して、検出可能な物質をプローブにカップリングする(すなわち、物理的に連結する)ことによるプローブの直接標識、ならびに直接標識された別の試薬との反応性によるプローブの間接標識を含むことが意図される。間接標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いて一次抗体を検出すること、およびDNAプローブを蛍光標識ストレプトアビジンを用いて検出できるようにDNAプローブをビオチンで末端標識することが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用する「mRNA」には、プレmRNA転写物、転写物プロセシング中間体、翻訳の準備ができた成熟mRNAおよび遺伝子の転写物、またはmRNA転写物に由来する核酸が含まれるが、これに限定されない。転写物プロセシングには、スプライシング、エディティング、および分解が含まれてもよい。本明細書で使用する、mRNA転写物に由来する核酸は、核酸合成のためにmRNA転写物またはその部分配列が最終的に鋳型として役立った核酸を意味する。従って、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたcRNA、cDNAから増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNAなどは全てmRNA転写物に由来し、このように得られた産物の検出は、試料中の元の転写物の存在および/または量を示す。従って、mRNAに由来する試料には、遺伝子のmRNA転写物、mRNAから逆転写されたcDNA、cDNAから転写されたcRNA、遺伝子から増幅されたDNA、増幅されたDNAから転写されたRNAなどが含まれるが、これに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用する用語「核酸」およびポリヌクレオチドなどの等価な用語は、プリン塩基およびピリミジン塩基、または他の天然ヌクレオチド塩基、化学修飾もしくは生化学修飾されたヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはペプチド核酸(PNA)などの任意の長さのヌクレオチド重合体を意味する。核酸は二本鎖でもよく、一本鎖でもよい。一本鎖核酸への言及には、センス鎖またはアンチセンス鎖への言及が含まれる。ポリヌクレオチドのバックボーンは、RNAまたはDNAに典型的に見られ得るような糖およびリン酸基、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド配列は非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。用語ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド、およびデオキシヌクレオチドは、一般的に、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチド、またはその類似体の相補物、断片、および変種を含む。
【００２７】
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーション技術または増幅技術において用いられ得る一本鎖分子である。一般的に、オリゴヌクレオチドは、長さが約15〜約100の任意の整数のヌクレオチドでもよいが、それより長いヌクレオチドでもよい。
【００２８】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は同義に用いられ、天然に生成されたか、または合成により生成されたかは関係なく、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によってつながれた任意のアミノ酸重合体(ジペプチドまたはそれより大きな重合体)を意味する。本発明のポリペプチドは、炭水化物基などの非ペプチド成分を含んでもよい。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、ポリペプチドが産生される細胞によってポリペプチドに付加されてもよく、細胞タイプによって異なる。ポリペプチドは、アミノ酸バックボーン構造の点で本明細書において定義される。炭水化物基などの置換基は一般的に指定されないが、それでもなお存在してもよい。
【００２９】
用語「患者」はヒト患者または他の哺乳動物を意味し、本発明の方法を用いて患者を検査または処置することが望ましい任意の個体を含む。本発明の範囲内にある適切な哺乳動物には、霊長類、家畜動物(例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ)、実験動物(例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター)、コンパニオンアニマル(例えば、ネコ、イヌ)、および捕獲された野生動物(例えば、キツネ、シカ、ディンゴ)が含まれるが、これに限定されない。
【００３０】
用語「プローブ」は、特異的な目的とする標的分子、例えば、ヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を意味する。プローブは当業者によって合成されてもよく、適切な生物学的調製物から得られてもよい。標的分子を検出するために、プローブは標識専用に設計されてもよい。プローブとして使用することができる分子の例には、RNA、DNA、タンパク質、抗体、および有機分子が含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、プローブは表面に固定化されてもよい。核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)が用いられる場合、別の核酸鎖に塩基特異的に結合することができてもよい。ハイブリダイゼーションは、相補核酸鎖間、またはマイナーなミスマッチ領域を含む核酸鎖間で生じてもよい。このようなプローブには、Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991); Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999)に記載のペプチド核酸、および他の核酸類似体および核酸ミメティクスが含まれる。
【００３１】
本明細書で使用する「固体支持体」、「支持体」、および「支持物」は同義に用いられ、剛性または半剛性の表面を有し得る材料または材料群への言及を含む。多くの態様において、固体支持体の少なくとも1つの表面は実質的に平らであるが、ある態様では、異なる化合物の合成領域を、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、エッチングされた溝などを用いて物理的に切り離すことが望ましい場合がある。他の態様によれば、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何学構造の形をとってもよい。支持体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、ならびに磁鉄鉱が含まれる。例示的な支持物については米国特許第5,744,305号も参照されたい。
【００３２】
本明細書で使用する用語「処置」は、いかなるやり方であっても、疾患状態または症状を治す任意のおよび全ての方法、疾患の確立を阻止する任意のおよび全ての方法、または疾患もしくは他の望ましくない症状の進行を阻止、妨害、遅延、もしくは逆転する任意のおよび全ての方法を意味する。用語「処置」は、とりわけ、(i)癌または癌再発の阻止または阻害、(ii)症状または癌細胞の軽減または排除、および(iii)問題になっている癌の実質的または完全な排除を含む。処置は予防的または治療的になされてもよい。処置は、1種類の薬剤または薬剤の組み合わせ(2種類を超える薬剤)を用いた処置を伴ってもよい。「薬剤」は、例えば、処置のための化合物または他の手段、例えば、放射線治療または外科手術を指すために本明細書において広範囲に用いられる。
【００３３】
本開示全体を通じて、本発明の様々な局面は範囲の形で提示することができる。範囲の形での説明は単なる便宜および簡略のためのものであることが理解されるはずであり、本発明の範囲に対する変更のできない限定として解釈してはならない。従って、範囲の説明は、可能性のある全ての部分範囲ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したとみなされるはずである。例えば、1〜6などの範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内にある個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示したとみなされるはずである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００３４】
特別の定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】HDACIであるSAHAおよびTSAは、E2F1を介した細胞死を促進する。(a)p53ヌルHCT116-ER-E2F1発現細胞または対照ER発現細胞を4-OHTで処理した、または4-OHTで処理しなかった。サイクリンEおよびp73の発現をイムノブロット分析で評価した。(b)ER-E2F1発現細胞または対照細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で1μM SAHA(左パネル)または100nM TSA(右パネル)で処理した。48時間後に、細胞を採取し、FACSを用いて細胞死をPI染色で評価した。3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示した。(c)コロニー形成アッセイ法。6ウェルプレート1ウェルあたり1000個のER-E2F1発現細胞および対照細胞を48時間プレーティングし、その後に、示したように24時間処理した。細胞を洗浄し、新鮮なDMEMを添加した。15日後に、コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。代表的なプレートを示した。(d)示したようにE2F1またはLacZを含有するアデノウイルスに感染させたSaos-2細胞およびHCT116細胞を100nM TSAで24時間処理し、細胞死をFACSで分析した。
【図２】HDACIはE2F1標的遺伝子を選択的に活性化する。(a)ER-E2F1発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で、100nM TSAで示した時間にわたって、または1μM SAHAで24時間処理した。E2F1標的遺伝子ならびにp21およびGAPDHのmRNAレベルをRT-PCRで検出した。(b)細胞を(a)において処理した。E2F1標的遺伝子産物の発現を、ウエスタンブロットで、Bim、Puma、カスパーゼ-3、およびp73に対する抗体を用いて評価した。(c)Saos-2細胞およびIMR90細胞にAd-E2F1またはAd-LacZを24時間感染させ、その後さらに24時間、100nM TSAで処理した。Bim、p73、Puma、およびE2F-1の発現を、ウエスタンブロットで、対応する抗体を用いて評価した。
【図３】E2F1過剰発現時のHDACI誘導性アポトーシスに対するBim特異的siRNAの影響。(a)ER-E2F1を非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはBim特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、さらに24時間、4-OHT、SAHA、またはその両方で処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。ヨウ化プロピジウム染色後に、細胞死をフローサイトメトリーで分析した(右パネル)。sub-G1にある細胞のパーセントを示した。(b)ER-E2F1を非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはBim特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、さらに48時間、4-OHT、100nM TSA、またはその両方で処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。細胞死は(a)と同様に評価した。グラフは、3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示す(右パネル)。(c)Bimまたは対照siRNAで処理したSaos-2細胞にAd-E2F1またはAd-LacZを24時間感染させ、その後さらに24時間、100nM TSAで処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。細胞死は(a)と同様に評価した。グラフは、3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示す(右パネル)。
【図４】SAHAはBimプロモーターへのE2F1の動員を促進する。(a)推定E2F結合部位を含有するヒトBimプロモーターの模式図。示した領域を単離し、pGL3レポーターコンストラクトにクローニングした。(b)pGL3-basic, Bim-1415/-205または-2415/-1333ルシフェラーゼコンストラクト、およびレニラ(renillia)ルシフェラーゼコンストラクトを、漸増量のE2F1発現ベクター(0ng、20ng、および40ng)と共にHCT116細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、相対ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した後の倍誘導として示した。表示したデータは3回の独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。(c)左パネル、E2F1-REエレメントを含有するヒトBimプロモーターの模式図。右パネル、E2F1とBimプロモーターの結合をChIPで分析した。示したように処理したER-E2F1発現細胞からの架橋クロマチンを抗E2F1抗体、非特異的IgGで免疫沈降させ、次いで、Bimプロモーター断片を、E2F1-RE含有領域に隣接するプライマーを用いてPCR増幅した。正の対照(インプットDNA)増幅を示した。
【図５】Rb不活性化はBim発現を増強し、HDACI誘導性アポトーシスに対する感受性を増加させる。(a)U20S細胞にAd-E1AまたはAd-LacZを24時間感染させ、さらに48時間、SAHA(1μM)で処理した。細胞死をFACS分析で測定し(右パネル)、Bimおよびp73のレベルを、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した(左パネル)。(b)正常IMR90細胞および形質転換IMR90-E1A細胞を、示した濃度のSAHAで処理し、細胞増殖を、示した時間にわたって評価した。(c)E1Aの発現は、SAHAおよびTSAに応答した、Bimのアップレギュレーションおよびアポトーシスの増強をもたらす。IMR90細胞およびIMR90-E1A細胞をSAHA(2.5μM)およびTSA(300nM)で48時間処理した。細胞死をFACS分析で測定し(左パネル)、Bimおよびp73のレベルを、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した(右パネル)。(d)Bim siRNAまたは対照siRNA(NC siRNA)でトランスフェクトしたIMR90-E1A細胞をTSA(800nM)で24時間処理した。Bimおよびβ-アクチンの発現を、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した。アポトーシスをFACS分析で評価した。(e)Saos-2細胞をE2F1 siRNAまたは負の対照siRNA(NC siRNA)でトランスフェクトし、TSA(150nM)またはSAHA(1μM)で処理した。E2F1、Bim、およびPARPの発現を、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した。NS、ローディング対照としての非特異的バンド。アポトーシスはFACS分析で評価した。
【図６】SAHAおよびE2F1に関連する細胞死応答およびアポトーシス遺伝子の発現分析。(A).ER-E2F1発現細胞または対照ER発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で1μM SAHAで処理した。48時間後に、細胞を採取し、活性抗カスパーゼ-3について染色した。活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセントを示した。(B).E2F1によって調節されるアポトーシス遺伝子。4-OHTで処理したER-E2F1細胞およびER細胞におけるE2F1依存性遺伝子を示す、Cluster and Tree Viewerで図示したマイクロアレイ分析。赤色は、未処理対照(黒色)と比較してアップレギュレーションしていることを示す。(C).4-OHTの存在下または非存在下でのER-E2F1細胞におけるSAHA応答遺伝子。囲みの中の遺伝子は、Bで特定した推定E2F1標的である。
【図７】E2F1はASK1 mRNAおよびASK1タンパク質の蓄積を誘導する。(A).p53ヌルHCT116細胞に、空のレトロウイルス(-)、ER-E2F1野生型発現レトロウイルス(wt)、またはER-E2F1-E132(E132)を感染させ、細胞を未処理のままにしたか(-)、示した期間にわたってOHTで処理した。ASK1 mRNAおよびASK1タンパク質の発現レベルを、それぞれ、RT-PCR(左パネル)およびウエスタンブロット(右パネル)で分析した。(B)U-20S細胞は血清飢餓によってG0(0時)に48時間同調されており、次いで、血清刺激の後に細胞周期に再進入した。対応する細胞周期分布を示した(左パネル)。タンパク質を、細胞周期に放された後、異なる時間で細胞から抽出した。E2F1、ASK1、およびサイクリンEをウェスタンブロッティングで分析した(右パネル)。(C).対照アデノウイルス(-)またはE1A発現アデノウイルス (+)に感染させたU20S細胞およびIMR90細胞におけるASK1、p73およびα-チューブリンタンパク質のウエスタンブロット分析。
【図８】E2F1はASK1プロモーターに結合し、活性化する。(A)ヒトASK1プロモーターの模式図。本研究において使用した推定E2F結合部位および欠失コンストラクトを示した。(B)HCT116細胞を、PGL3-basic, E2F1(50ngまたは100ng)と、ASK1プロモーター(-1000/+125)含有ルシフェラーゼレポーターコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、相対ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した後の倍誘導として示した。(C)E2F1 DNA結合領域のマッピング。HCT116細胞を、示したASK1プロモーター欠失を含有するルシフェラーゼレポーターコンストラクトおよび100ngのE2F1でトランスフェクトした。(D)ER-E2F1発現細胞およびER-E132発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で16時間処理した。ChIPアッセイ法を、抗E2F1抗体または非特異的IgGを用いて行った。-273〜+125のASK1プロモーター領域をPCR増幅した。
【図９】ASK1はRb不活性化を介してE2F1標的遺伝子発現を調節する。(A)ER-E2F1発現細胞を、非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはASK1特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、4-OHTで処理した。ASK1、Bim、サイクリンE、およびp73の発現をウェスタンブロッティングで分析した。(B)HCT116細胞を、Bimプロモーター含有ルシフェラーゼレポータープラスミドと、E2F1、Rb、またはASK1発現ベクターで同時トランスフェクトした。さらに、Rb過剰発現の存在下または非存在下での、E2F1を介したBimプロモーター活性化に対するASK1の効果を確かめるために、ASK1発現プラスミドをE2F1と同時トランスフェクトした。
【図１０】SAHAは、E2F1を介したASK1誘導を促進する。(A)ER-E2F1発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で、1μM SAHAで24時間処理した。ASK1およびBimタンパク質レベルをウェスタンブロッティングで評価した。(B)ER-E2F1発現細胞を(A)と同様に処理し、ChIPでE2F1抗体を用いて分析した。ASK1プロモータープライマーを用いたE2F1-ChIPのPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。(C)IMR90細胞およびIMR90-E1A細胞をSAHAで24時間処理した。ASK1およびα-チューブリンのレベルをウェスタンブロッティングで評価した。(D)U20S細胞を2.5μM SAHAで、示した時間にわたって処理した。ASK1発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。U20S細胞をNC siRNAおよびE2F1 siRNAで24時間トランスフェクトし、(C)と同様に処理した。E2F1、ASK1、およびα-チューブリンのレベルをウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。
【図１１】ASK1発現の抑制は、E2F1活性化時のSAHA誘導性アポトーシスを阻害する。(A)ER-E2F1発現細胞をNC siRNAおよびASK1 siRNAでトランスフェクトし、4-OHTの存在下または非存在下でSAHAで処理した。細胞死はFACS分析で測定した。3回の独立した実験の結果の平均を標準偏差と共に示した。(B)細胞を(A)において処理した。ASK1、Bim、リン酸化p38、p38、リン酸化JNK、JNKのレベルをウェスタンブロッティングで分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
本発明者らは、E2F1活性の高い、またはRbが不活性化した細胞が、調節解除されたRb-E2F1経路を有する腫瘍におけるHDACI誘導性細胞死に対して高感受性であることを発見した。
【００３７】
従って、本発明の第1の局面は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いた処置のために癌患者の適性を評価する方法を提供する。この方法は、患者からの生物学的試料をE2F1高活性についてアッセイする工程を含む。
【００３８】
このアッセイ法は、例えば、E2F1標的遺伝子(例えば、ccne1およびccne2)の発現の測定、またはE2F1活性を高くすることができるCdk4高発現の測定に基づいてもよい。次いで、アッセイ法の結果は、適切な処置法を患者に割り振るために(任意に、他のデータなどと共に)用いられてもよい。本願の本発明者らによって発見されたように、高いE2F1レベルは、癌細胞がHDACI感受性である可能性が高く、従って、このような患者にはHDACIが適している可能性があることを示している。このような患者には、他の抗癌剤を用いた処置、放射線療法などを含む、さらなる癌処置が選択されてもよい。
【００３９】
逆に、生物学的試料のE2F1活性が正常範囲の患者は、このような患者にはHDACIが有効な可能性が低いので、HDACI処置が適するとみなされない患者とみなされるかもしれない。
【００４０】
本発明の第2の局面は、HDACIによる処置のために癌患者を選択することを提供する。この方法は、E2F1高活性について陽性とアッセイされた患者を選択する工程を含む。
【００４１】
本発明の第3の局面は、癌患者をHDACIで処置する方法を提供する。ここで、患者の癌はE2F1高活性について陽性とアッセイされている。
【００４２】
本発明の第4の局面は、E2F1高活性について陽性とアッセイされた癌を有する癌患者の処置のための医用薬剤の製造におけるHDACIの使用を提供する。
【００４３】
本発明の第5の局面は、本発明の第1の局面、第2の局面、第3の局面、または第4の局面のいずれかの方法において使用するためのキットを提供する。キットは、生物学的試料におけるE2F1活性を評価するのに使用するための1種類または複数の種類の試薬を含む。
【００４４】
1つの態様において、キットは、以下からなる群より選択される1種類または複数の種類の試薬を含む:
(a)試料中のマーカータンパク質またはマーカー核酸を検出することができる標識された化合物または薬剤;
(b)試料中のマーカータンパク質またはマーカー核酸のレベルを確かめるための手段(例えば、タンパク質もしくはその断片に結合する抗体、またはタンパク質をコードするDNAもしくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチドプローブ);
(c)キットを用いて得られた結果を解釈するための説明書;
(d)緩衝剤;
(e)防腐剤;
(f)タンパク質安定化剤;
(g)検出可能な標識(例えば、酵素または基質)の検出において使用するための成分;および
(h)ソフトウェア、例えば、患者の処置を選択するためのソフトウェア。
【００４５】
本発明の方法は様々な癌患者および様々な癌タイプに関して役立ち得ると想定される。例えば、癌は、1つの態様において、網膜芽細胞腫、乳癌、肺癌(例えば、非小肺癌または小細胞肺癌)、唾液腺腫瘍、膵臓癌、多形神経膠芽腫、およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択されてもよい。
【００４６】
本発明が役立ち得る癌の他の例には、皮膚癌、骨癌、前立腺癌、肝臓癌、肺癌、脳癌、喉頭癌、胆嚢癌、直腸癌、副甲状腺癌、甲状腺癌、副腎癌、神経組織癌、頭部および頚部の癌、結腸癌、胃癌、気管支癌、腎臓癌、基底細胞癌、潰瘍型および乳頭型の扁平上皮癌、転移性皮膚癌腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫、骨髄腫、巨細胞腫瘍、胆石、島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性のリンパ急性腫瘍および顆粒球性腫瘍、ヘアリー細胞腫瘍、腺腫、過形成、髄様癌、クロム親和細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節細胞腫、過形成角膜神経腫瘍、マルファン体型腫瘍、ウィルムス腫瘍、セミノーマ、卵巣腫瘍、平滑筋腫腫瘍、子宮頚部形成異常および上皮内癌、神経芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所皮膚病変、菌状息肉腫、横紋筋肉腫およびカポジ肉腫などの肉腫、骨原性および他の悪性高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増加症、腺癌、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫、類表皮癌、ならびに他の癌腫および肉腫が含まれ得る。リンパ腫の例には、例えば、小リンパ球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、大B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、およびバーキットリンパ腫が含まれる。
【００４７】
アッセイすることができる生物学的試料には、癌患者から単離された組織、細胞、体液およびその単離物など、ならびに被験体に存在する組織、細胞、および流体などが含まれる(すなわち、試料はインビボにある)。従って、インビボ方法およびインビトロ方法が本発明において想定される。
【００４８】
本発明の方法において1つまたは複数の生物学的試料が用いられてもよい。従って、アッセイ法は、癌患者からの複数の試料に対して行われてもよい。
【００４９】
試料の例には、全血、血液流体(例えば、血清および血漿)、リンパ液および嚢胞液、痰、糞便、涙、粘液、毛、皮膚、腹水、嚢胞液、尿、乳頭滲出物、乳首吸引物、生検試料および剖検試料などの組織の切片、組織学用に採取された凍結切片、保管所の試料、外植片、ならびに患者組織に由来する初代細胞培養物および/または形質転換細胞培養物などが含まれる。
【００５０】
1つの態様において、試料は「乳房関連」体液でもよい。これは、患者の体内にあるときに乳房細胞と接触する、もしくは乳房細胞を通過する流体、または乳房細胞から流れ出た細胞、核酸、もしくはタンパク質が通過することができる流体である。乳房関連体液の例には、血液流体、リンパ液、嚢胞液、および乳首吸引物が含まれる。
【００５１】
患者からの試料はアッセイされる前に、処理されてなくてもよく、処理されもよく、希釈されてもよく、または濃縮されてもよい。
【００５２】
当業者であれば、E2F1高活性についてアッセイするために、様々な方法、例えば、E2F1標的遺伝子(例えば、ccne1およびccne2)またはCdk4の発現測定による方法を使用できることを理解するだろう。
【００５３】
例えば、E2F1活性は、発現(例えば、mRNAレベルまたはタンパク質レベルでの発現)がE2F1活性を示す、少なくとも1種類の遺伝子の発現レベルを(定性的または定量的に)測定することによってアッセイすることができる。好ましくは、複数の種類の(例えば、少なくとも2種類、3種類、4種類、5種類、8種類、10種類、または15種類の)遺伝子の発現レベルが測定される。
【００５４】
前述のように、Rbが不活性化するとE2F1活性が増大する。従って、E2F1活性を評価する方法の1つは、Rbのレベルまたは活性を評価することであろう。またはもしくはさらに、E2F1活性を示すために、E2F1活性と正または負の相関関係のある他のマーカーがアッセイされてもよい。発現がE2F1活性と相関関係があり得るマーカーの例には、E1A、p16(INK4)、サイクリンD、Cdk4、Cdk6、サイクリンE1、サイクリンE2が含まれる。
【００５５】
マーカーのレベルは、当技術分野において公知の任意の手段によって求めることができる。レベルは、例えば、マーカー遺伝子から転写された核酸のレベルを測定することによって求めることができる。またはもしくはさらに、マーカー遺伝子から転写されたmRNAから翻訳された特定のタンパク質のレベルを求めることができる。さらに別の態様において、直接生成された(すなわち、触媒された)もしくは間接的に生成された、または対応するマーカータンパク質によって「消費」された代謝産物のレベルを求めることができる。
【００５６】
マーカーレベルを求めるための例示的なアッセイ法は、個体の試料を得る工程、および試料と、マーカータンパク質またはマーカー核酸(例えば、mRNA、ゲノムDNA、またはcDNA)を検出することができるプローブ(例えば、抗体、オリゴヌクレオチド)を、適切な条件下で、およびマーカーおよびプローブが相互作用および結合するのに十分な時間、接触させる工程、従って、反応混合物において除去および/または検出することができる複合体を形成する工程を伴う。従って、本発明の検出方法は、インビトロならびにインビボで、例えば、生物学的試料において、mRNA、タンパク質、cDNA、またはゲノムDNAを検出するのに使用することができる。
【００５７】
これらのアッセイ法は様々なやり方で実施することができる。例えば、このようなアッセイ法を実施する方法の1つは、マーカーまたはプローブを固体支持体上に固定する工程、および反応の終わりに、固相上に固定された標的マーカー/プローブ複合体を検出する工程を伴う。このような方法の1つの態様において、マーカーの存在、量および/または濃度についてアッセイしようとする個体の試料が固体支持体上に固定されてもよい。別の態様において、逆の状況が可能である。この状況では、プローブを固体支持体(例えば、ナイロン膜またはチップ)に固定することができ、個体の試料をアッセイ法の非固定化成分として反応させることができる。1つの態様において、プローブはマイクロアレイ上に固定化されてもよい。
【００５８】
前述のアプローチを用いたアッセイ法を実施するために、非固定化成分が固体支持体に添加され、これに第2の成分が固定される。反応が完了した後、形成された複合体が全て固体支持体上に固定化されたままになるような条件下で、複合体化しなかった成分が(例えば、洗浄によって)除去されてもよい。固体支持体に固定されたマーカー/プローブ複合体の検出は多くの方法で達成することができる。
【００５９】
好ましい態様において、プローブは、固定されないアッセイ法成分である場合、アッセイ法の検出および読み取りのために、検出可能な標識で直接的または間接的に標識することができる。いずれの成分(マーカーまたはプローブ)もさらに操作することも標識することもなく、例えば、蛍光エネルギー転移法を用いて、マーカー/プローブ複合体の形成を直接的に検出することも可能である(例えば、Lakowicz et al., 米国特許第5,631,169号;Stavrianopoulos, et al.,米国特許第4,868,103号を参照されたい)。
【００６０】
特定のマーカー遺伝子の発現レベルは、例えば、試料中に存在するmRNA(またはそれに由来するポリヌクレオチド)の量を求めることによって達成することができる。
【００６１】
mRNAレベルを検出および定量するための多くの技法は、mRNAと、mRNA(またはそれに由来するポリヌクレオチド)にハイブリダイズすることができる核酸分子(プローブ)を接触させる工程を伴う。核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも7、10、15、17、18、20、25、30、40、50、100ヌクレオチド残基のポリヌクレオチドでもよい。プローブには、オリゴヌクレオチド、cDNA、またはRNAが含まれ得るが、これに限定されない。プローブは、蛍光標識または化学発光標識などの検出可能な標識を含有してもよい。ある核酸と別の核酸とのハイブリダイゼーションを伴う、マーカー発現の評価方法が用いられる場合、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われることが好ましい。
【００６２】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ法を実施する方法は当技術分野において十分に開発されてきた。ハイブリダイゼーションアッセイ法の手順および条件は用途に応じて異なり、Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed. Cold Spring Harbor, N. Y, 1989); Berger and Kimmel Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987); Young and Davis, P.N.A.S, 80: 1194 (1983)において言及される方法を含む公知の一般的な結合方法に従って選択される。繰り返して、および制御してハイブリダイゼーション反応を実施するための方法および装置は、米国特許第5,871,928号、同第5,874,219号、同第6,045,996号、および同第6,386,749号、同第6,391,623号に記載されている。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。
【００６３】
本発明は、ある特定の好ましい態様では、リガンド間のハイブリダイゼーションのシグナル検出を意図する。米国特許第5,143,854号;同第5,578,832号;同第5,631,734号;同第5,834,758号;同第5,936,324号;同第5,981,956号;同第6,025,601号;同第6,141,096号;同第6,185,030号;同第6,201,639号;同第6,218,803号;および同第6,225,625号、米国特許出願第60/364,731号、ならびにPCT出願第PCT/US99/06097号(WO99/47964として公開)を参照されたい。これらもそれぞれ全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６４】
シグナル検出および強度データの処理のための方法および装置は、例えば、例えば、米国特許第5,143,854号、同第5,547,839号、同第5,578,832号、同第5,631,734号、同第5,800,992号、同第5,834,758号;同第5,856,092号、同第5,902,723号、同第5,936,324号、同第5,981,956号、同第6,025,601号、同第6,090,555号、同第6,141,096号、同第6,185,030号、同第6,201,639号;同第6,218,803号;および同第6,225,625号、米国特許出願第60/364,731号、ならびにPCT出願PCT/US99/06097(WO99/47964として公開)に開示される。これらもそれぞれ全ての目的のために全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
核酸レベルまたはタンパク質レベルを求める任意の方法を本発明において使用することができる。本明細書に記載の例は限定を目的としない。
【００６６】
1つの形式では、mRNAを固体支持体上に固定化し、例えば、単離されたmRNAをアガロースゲル上で流し、ゲルからのmRNAをフィルターなどの固体支持体に転写することによって、プローブと接触させる。次いで、ノザンハイブリダイゼーションによって、1種類または複数の種類のマーカーに相当する核酸プローブをフィルターにハイブリダイズさせ、マーカーに由来するRNAの量を求める。このような測定は目視によるものでもよく、例えば、デンシトメーターを用いた機械によるものでもよい。別の形式では、プローブを固体支持体上に固定し、例えば、Affymetrix遺伝子チップアレイにおいて、核酸とプローブを接触させる。
【００６７】
本発明はまた、ある特定の好ましい態様では、試料調製法も意図する。例えば、遺伝子発現分析の前または遺伝子発現分析と同時に、試料は様々な機構によって増幅されてもよい。これらの機構の一部は、PCR(例えば、RT-PCR)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)などの増幅法を用いることがある。試料はアレイ上で増幅されてもよい。例えば、米国特許第6,300,070号および米国特許出願第09/513,300号を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
本発明の1つの態様において、マーカータンパク質レベルが求められる。本発明のマーカータンパク質レベルを求めるための好ましい薬剤は、このようなタンパク質またはその断片に結合することができる抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。
【００６９】
適切な抗体は、当業者に周知の技法を用いて作成することができ、例えば、米国特許第4,011,308号;同第4,722,890号;同第4,016,043号;同第3,876,504号;同第3,770,380号;および同第4,372,745号に開示される。好ましくは、モノクローナル抗体が用いられる。モノクローナル抗体は、一般的に、Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497の方法またはその改変版を用いて調製される。
【００７０】
試料が、ある特定の抗体に結合するタンパク質を含有するかどうか確かめるために、様々な形式を使用することができる。このような形式の例には、酵素イムノアッセイ(EIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫測定法(ELISA)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光法が含まれるが、これに限定されない。このような用途では、一般的に、抗体またはタンパク質を固体支持体に固定化することが好ましい。適切な支持体には、抗原または抗体を結合することができる任意の支持体が含まれる。1つの態様において、マーカーに由来するタンパク質レベルは、結合部位が、固定化されたマーカータンパク質特異的抗体、好ましくは、マーカータンパク質特異的モノクローナル抗体を含む抗体マイクロアレイを構築することによって求めることができる。異なるマーカータンパク質に特異的な抗体を利用することによって、1種類を超えるマーカータンパク質のレベルを、1つのマイクロアレイを用いて求めることができる。
【００７１】
さらに、マーカータンパク質の検出に好ましいインビボ技法には、マーカータンパク質に対する標識抗体を被験体に導入することが含まれる。例えば、抗体は、標準的な画像化法を用いて被験体における存在および位置を検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【００７２】
本発明は、好ましい一部の態様では、アレイを含む固体支持体を使用してもよい。(タンパク質を含む)ポリマーアレイ合成に適用することができる方法および技法が非常に多くの刊行物において述べられており、従って、当業者に問題を投げかけないはずである。
【００７３】
特定の態様での合成法について述べている特許には、米国特許第5,412,087号、同第6,147,205号、同第6,262,216号、同第6,310,189号、同第5,889,165号、および同第5,959,098号が含まれる。前記の特許の多くにおいて核酸アレイが述べられているが、同じ技法がポリペプチド(例えば、抗体)アレイに適用されてもよい。
【００７４】
好ましい態様において、マーカーレベルを求めるためにポリヌクレオチドマイクロアレイが用いられる。この方法で、1種類を超えるマーカーの発現状態を同時に評価することができる。
【００７５】
マイクロアレイは、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、次いで、このようなプローブを固体支持体または表面に固定化することによって調製することができる。例えば、プローブは、DNA配列、RNA配列、またはDNAおよびRNAのコポリマー配列を含んでもよい。プローブのポリヌクレオチド配列はまた、DNA類似体および/もしくはRNA類似体、またはその組み合わせを含んでもよい。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列はゲノムDNAの完全な断片または部分的な断片でもよい。プローブのポリヌクレオチド配列はまた、合成ヌクレオチド配列、例えば、合成オリゴヌクレオチド配列でもよい。プローブ配列は、インビボで酵素的に合成されてもよく、インビトロで酵素的に(例えば、PCRによって)合成されてもよく、インビトロで非酵素的に合成されてもよい。
【００７６】
当業者であれば、正の対照プローブ、例えば、標的ポリヌクレオチド分子にある配列に相補的であり、ハイブリダイズすることが公知のプローブ、および/または負の対照プローブ、例えば、標的ポリヌクレオチド分子にある配列に相補的でなく、ハイブリダイズしないことが公知のプローブをアレイに含めることが望ましい場合があることも理解するだろう。
【００７７】
本発明は、様々な目的で、例えば、プローブ設計、データ管理、分析、および計器の操作のために様々なコンピュータプログラム製品およびソフトウェアを使用してもよい。米国特許第5,593,839号、同第5,795,716号、同第5,733,729号、同第5,974,164号、同第6,066,454号、同第6,090,555号、同第6,185,561号、同第6,188,783号、同第6,223,127号、同第6,229,911号、および同第6,308,170号を参照されたい。
【００７８】
E2F1活性を評価することに加えて、処置を選択する場合、他の要因、例えば、性別、年齢、以前の癌病歴、良性乳房疾患、遺伝性要因(癌の家族歴)、肥満、少ない身体活動、閉経後ホルモン補充療法の使用、経口避妊薬の使用、電離放射線への曝露、食餌療法の実施、またはアルコール摂取も考慮に入れてもよい。
【００７９】
本発明の1つの局面において、キットが提供される。キットは、生物学的試料におけるE2F1活性の評価において使用するための1種類または複数の種類の試薬を含む。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして販売促進されてもよく、配布されてもよく、販売されてもよい。
【００８０】
キットは、試料中のマーカータンパク質またはマーカー核酸を検出することができる標識された化合物または薬剤、および試料中のマーカータンパク質またはマーカー核酸のレベルを求めるための手段(例えば、タンパク質もしくはその断片に結合する抗体、またはそのタンパク質をコードするDNAもしくはmRNAに結合するオリゴヌクレオチドプローブ)を含んでもよい。キットはまた、キットを用いて得られた結果を解釈するための説明書を含んでもよい。
【００８１】
抗体をベースとするキットの場合、キットは、例えば、(1)マーカータンパク質に結合する第1の抗体(例えば、固体支持体に取り付けられた第1の抗体)、任意に、(2)マーカータンパク質または第1の抗体に結合し、任意に、検出可能な標識に結合している第2の異なる抗体を含んでもよい。
【００８２】
オリゴヌクレオチドをベースとするキットの場合、キットは、例えば、(1)核酸マーカーにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、および/または(2)マーカー核酸分子の増幅に有用な一対のプライマーを含んでもよい。キットはまた、例えば、以下:緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質安定化剤の1つまたは複数を含んでもよい。キットは、さらに、検出可能な標識(例えば、酵素または基質)を検出するのに使用するための1種類または複数の種類の成分を含んでもよい。
【００８３】
キットはまた、アッセイし、試験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含有してもよい。キットの各成分は1つ1つの容器に入れられてもよく、様々な容器は全て、キットを用いて行われるアッセイ法の結果を解釈するための説明書と共に1つの包装容器の中にあってもよい。
【００８４】
本発明のキットは、任意に、本発明の方法を実施するのに有用なさらなる成分を含んでもよい。一例として、キットは、相補核酸をアニーリングするのに、または抗体と、抗体が特異的に結合するタンパク質を結合させるのに適した流体(例えば、SSC緩衝液)、1つまたは複数の試料区画、本発明の方法の性能について述べている教材などを含んでもよい。
【００８５】
1つの態様において、キットは、マイクロアレイ、例えば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは抗体マイクロアレイを含んでもよい。
【００８６】
1つの態様において、キットは、ソフトウェア、例えば、患者の処置を選択するためのソフトウェアを含む。このようなソフトウェアは、E2F1活性と相関関係があり得る様々なマーカーの発現レベルを含み、任意に、患者についての臨床情報、例えば、患者の年齢なども含む、データ構造を受け取るコンピュータシステムプロセッサの説明書を含んでもよい。
【００８７】
「E2F1高活性」によって、本発明者らは、E2F1活性が正常レベルのE2F1活性より高い場合を含む。E2F1活性の「正常レベル」は、非癌試料または良性試料におけるE2F1活性レベルを含む。1つの態様において、癌患者からの生物学的試料におけるE2F1活性は、非癌試料または良性試料におけるE2F1活性の平均、中央値、最頻値レベルと比較されてもよい。
【００８８】
癌患者からの生物学的試料におけるE2F1活性レベルは定性的または定量的に評価されてもよい。次いで、E2F1活性の正常レベルとの定性比較または定量比較を行うことができる。
【００８９】
癌患者からの生物学的試料におけるE2F1活性レベルを評価する場合、1つまたは複数の正の対照または負の対照(例えば、良性試料または非癌試料)におけるE2F1活性レベルも評価してよい。1つまたは複数の対照は、患者の個々のデータと同時に、またはほぼ同じ時間に得られたデータを含んでもよく、保存された数値または数値セット、例えば、コンピュータまたはコンピュータ可読媒体に保存された数値または数値セットでもよい。
【００９０】
1つの態様において、E2F1活性の定量評価が行われてもよい。1つの態様において、E2F1活性レベルは、所定のカットオフレベルを超えている場合に高いとみなされてもよい。1つの態様において、所定のカットオフレベルは、良性細胞または正常組織のE2F1活性の最頻値、中央値、または平均レベルと比較して少なくとも10％、30％、50％、80％、100％、150％、200％、150％、300％高い。1つの態様において、所定のカットオフレベルは、正常なE2F1活性レベルと比較して、E2F1活性レベルについて統計的に有意なp値(例えば、0.05未満のp値)を有するように選択される。
【００９１】
E2F活性が高いかどうかを評価することに加えて、さらなる試験が実施されてもよい。このようなさらなる試験によって、癌に関するさらなるデータが得られてもよい。このようなさらなるデータは、例えば、患者に適した処置法の選択において役立つかもしれない。1つまたは複数のさらなる試験は、E2F高活性について評価される1つもしくは複数の生物学的試料、または1つもしくは複数の異なる生物学的試料に対して実施されてもよい。
【００９２】
様々なHDACIが当技術分野において公知である。HDACIには、短鎖脂肪酸(例えば、酪酸)、ヒドロキサム酸(例えば、SAHAおよびトリコスタチン)、エポキシケトン(例えば、トラポキシン)、ベンズアミド、および様々な他の種々の化学ファミリーを含む広範囲の化合物が含まれる。使用することができるHDACIの例には、トリコスタチンA(TSA)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、酪酸フェニル、スクリプタイド、アピシジン、プロキサミド、デプシペプチド、ピバロイルオキシメチルブチレート(AN-9とも知られる)、シクロステレタミド、特に、シクロステレタミドA、シクロステレタミドG、デヒドロシクロステレタミドD、およびデヒドロシクロステレタミドEが含まれる。HDACIのさらなる例は当業者に公知であり、本発明でも使用することができる。例えば、HDACIおよびHDACIが使用され得る方法は、WO05105066、WO05105055、WO05097747、WO05092899、WO05066151、WO05059167、WO05055928、WO05030705、WO05030704、およびWO05030239に開示されている。
【００９３】
本発明の実施は、特別の定めのない限り、当業者の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術の従来法を使用する。このような技法は文献において十分に説明されている。参照のための教科書の例には、以下:Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2000)が含まれる。
【００９４】
本発明が容易に理解され、実際に実行に移され得るように、今から、特定の好ましい態様を以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【００９５】
発明の実施のための形態
実施例
実験手順
細胞培養および化学薬品
p53ヌル結腸癌HCT116細胞は、Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, MD)の厚意により提供された。正常ヒト肺線維芽細胞IMR90、骨肉腫U20S細胞、およびSaos-2細胞はATCCからのものであった。IMR90-E1A形質転換細胞は、Dr. Claudio Brancolini (University of Di Udine, Italy)の厚意により提供された。全ての細胞培養試薬および培地はInvitrogenからのものであった。TSAはCell Signaling Technologiesから購入し、SAHAはAlexis Biochemicals (San Diego, CA)からのものであった。E2F1過剰発現細胞を作成するために、293細胞を、pBabe.Haemagglutininエピトープ(HA)ERまたはpBabe.HA.ER-E2F1発現ベクター(30)でトランスフェクトし、ウイルス上清を使用して、p53ヌルHCT116細胞に感染させた。2μg/mlピューロマイシンを用いて感染細胞を選択し、個々のクローンを単離し、選択条件下で増殖させた。ER-E2F1を活性化するために、1〜3μMの4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)を組織培地に添加した。
【００９６】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析
トリゾル試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびQiagen RNAease Miniキットを製造業者の説明書(Valencia, CA)に従って使用して、全RNAを抽出した。全ての実験について、ユニバーサルヒト参照RNA(UHR)(Stratagene, La Jolla, CA)を使用して、薬物処理試料用および未処理試料用の参照プローブを作成した。実験試料からの30μgの全RNAまたは等量のUHRを、Superscript II逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、それぞれ、Cy5およびCy3で標識した。マイクロアレイハイブリダイゼーション、画像プロセス、およびデータ標準化は以前に述べられた通りであった(61)。次いで、相対発現パターンを得るために、各時点のlog2比を各遺伝子について未処理細胞(0時)と比べて標準化した。220種類のアポトーシス関連遺伝子の遺伝子発現値を抽出し、Eisen et al(62)によって開発されたクラスタリングプログラムおよび表示プログラム(rana.stanford.edu/sofrware)を用いて分析した。
【００９７】
アデノウイルス感染
アデノウイルスAd-E2F1は、Dr. Joseph Navins (Duke University, Durham, NC)から入手し、Ad-E1Aは、Dr. Andrew Turnell (University of Birmingham, Birmingham, UK)から入手した。細胞を50％コンフルエンスまで増殖させ、組換えアデノウイルスに感染させた。感染の24時間後、細胞を、示した時間にわたって薬物処理した。
【００９８】
DNA含有量のフローサイトメトリー分析
細胞を採取し、70％エタノールで固定した。固定した細胞をRNase(100μg/ml)で処理した後に、ヨウ化プロピジウム(50μg/ml)で染色した。染色した細胞のDNA含有量を、FACScalibur(Becton Dickinson Instrument, San Jose, CA)で蛍光標示式細胞分取(FACS)によって分析した。CellQuestソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて、細胞周期画分を定量した。
【００９９】
カスパーゼ活性
カスパーゼ-3活性を測定するために、細胞を、Cytofix/Cytoperm溶液(BD PharMingen)で指示通りに固定し、次いで、FITC結合ウサギ抗活性カスパーゼ-3モノクローナル抗体(BD PharMingen)で染色した。フローサイトメトリーによって、カスパーゼ-3検出が陽性の細胞を定量した。
【０１００】
コロニー形成アッセイ法
6ウェルプレート1ウェルあたり1000個の細胞を24〜48時間プレーティングし、その後に、4-OHTの存在下または非存在下で、100nM TSAまたは1μM SAHAで処理した。24時間後、薬物を除去し、新鮮な培地に再プレーティングした。12日後に、コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。
【０１０１】
ウェスタンブロッティング
細胞をこそぎ落とし、収集し、溶解した。タンパク質試料(50μg)をSDS/PAGEで分離し、immobilonメンブレン(Millipore, Bedford, MA)に転写した。以下のタンパク質に対する抗体を使用した:E2F1、ASK1、p73、PARP、サイクリンE、α-チューブリン、およびβ-アクチン(Santa Cruz Biotechnology)、Bim(BD Pharmingen)、カスパーゼ-3(Cell Signaling Technologies)、リン酸化p38、p38、リン酸化JNK、JNK(Cell Signaling Technologies)。シグナルは、増強した化学発光シグナルによってX線フィルム(Kodak, Rochester, NY)で検出した。
【０１０２】
逆転写-PCR
各試料から1マイクログラムの全RNAを、One Step RT-PCRキット(Clontech)を製造業者のプロトコールに従って使用して、逆転写とPCRにかけた。選択した遺伝子をPCR分析のために分析した。PCRは20〜30サイクル行い、各サイクルは、94℃1分の変性段階、および58℃2分のアニーリング段階、および72℃2分の重合段階からなった。PCR産物を、臭化エチジウム含有2.0％アガロースゲルで分離し、紫外線の下で写真撮影した。プライマー配列は、請求に応じて、入手可能である。
【０１０３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ法
ヒトBimプロモーターエレメント-1415/-205および-2415/-1333、ならびにヒトASK1プロモーターエレメント-1000/+125、-1000/-256、および-273/+125を包含するゲノムDNAをpGL3-ルシフェラーゼコンストラクト(Promega, Madison, WI)にクローニングした。ルシフェラーゼアッセイ法は、Dual Luciferase system(Promega)を用いて行った。HCT116細胞を、24ウェルプレート1ウェルあたり5×104細胞の密度でプレーティングした。Bimプロモータールシフェラーゼコンストラクトおよび対照コンストラクトを、E2F1発現ベクター、ASK1発現ベクター、またはRb発現ベクターと共に、HCT116細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、Dual Luciferase systemを用いて、ルシフェラーゼ活性を分析した。
【０１０４】
クロマチン免疫沈降(ChIP)
ChIPアッセイ法は、E2F1(31)について以前に述べられたように行った。簡単に述べると、4-OHTの存在下または非存在下でSAHA処理したER-E2F1発現細胞を、1％ホルムアルデヒドを用いて室温で10分間架橋した。125mMグリシンを添加することによって、ホルムアルデヒドを不活性化した。平均サイズが500bpのDNA断片を含むクロマチン抽出物を、抗E2F1ポリクローナル抗体(C20, Santa Cruz)を用いて免疫沈降した。DNAをフェノール:クロロホルム:IAA(Ambion)で抽出した。回収したDNAを、HotStarTaq Master Mix Kit(Qiagen)を用いてPCR増幅した。各反応において、約20ngのインプットおよびChIP試料を鋳型として使用した。最初に、反応混合物を95℃で15分間融解し、その後に、94℃/30秒、60℃/30秒、72℃/30秒を27サイクル、および72℃5分の最終伸張を行った。プライマー配列は、請求に応じて、入手可能である。Bim用のPCRプライマーは、
2014087343.tif 000002
(フォワード)および
2014087343.tif 000003
(リバース)であった。
【０１０５】
RNA干渉
Bim特異的siRNAおよび負の対照siRNAは、Cell Signaling Technologiesから購入した。SMARTpool(登録商標)E2F1 siRNA、ASK1 siRNA、および負の対照siRNAは、Dharmacon, Inc.(Lafayette, CO)から購入した。Lipofectamine 2000を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞をsiRNA存在下でトランスフェクトした。
【０１０６】
結果
E2F1過剰発現はヒト癌細胞においてHDACI誘導性細胞死を促進する
E2F1活性化は、p53依存機構およびp53非依存機構の両方を介してアポトーシスを誘導する。前者は、主に、p19ARF/Mdm2経路を介し、十分に特徴付けられている(24,25,32,33)。p53に依存しないE2F1アポトーシス活性の調節を調べるために、本発明者らは、p53ヌルHCT116細胞を使用して、エストロゲン受容体(ER)の4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)応答性リガンド結合ドメインと融合したE2F1を安定に発現する細胞株を樹立した(30)。ER-E2F1融合タンパク質は4-OHTの非存在下では細胞質内で不活性に維持され、4-OHTが添加された後にはER-E2F1の核への移行が可能となることで活性化される(30,34)。予想したとおり、ER-E2F1発現細胞に4-OHTを添加すると、真の2つのE2F1標的であるサイクリンEおよびp73の発現が著しく増大した(図1a)(26,27,35)。
【０１０７】
E2F1活性化が、細胞のHDACI誘導性細胞死に対する感受性の増加を誘導するかどうか調べるために、本発明者らは、ER-E2F1発現HCT116 p53ヌル細胞(ER-E2F1)およびER結合ドメインのみを発現する対照細胞(ER)において、4-OHTの存在下または非存在下でHDACIであるSAHAまたはTSAで処理した後に、細胞周期プロファイルをFACS(fluorescence-activated cell sorter)によって分析した。ER-E2F1発現細胞では、4-OHTのみまたはSAHAのみでは、それぞれ、約13％および23％の、細胞死を示すsub-G1細胞が誘導された。4-OHTおよびSAHAを両方とも添加するとsub-G1細胞が著しく増加した(75％)。このことは、強力な協力作用性細胞死応答を示している(図1b,左パネル)。しかしながら、この協力作用は、対照ER発現細胞では見られなかった。同じ結果がTSA処理細胞において得られた(図1b,右パネル)。さらに、コロニー形成アッセイ法によって確かめられたように(図1c)、4-OHTによるE2F1活性化は、TSAまたはSAHAによって誘導される増殖阻害を大きく促進した。これらの結果から、E2F1過剰発現は、HDACIに応答した細胞死および増殖阻害を増強したことが分かる。
【０１０８】
HDACI誘導性アポトーシスに及ぼすE2F1過剰発現の影響を、異なる系およびさらなる細胞タイプを用いて調べるために、本発明者らは、p53欠損骨肉腫Saos-2細胞およびp53正常HCT116細胞を、E2F1発現アデノウイルス(Ad-E2F1)または対照アデノウイルス(Ad-LacZ)に感染させ、TSA処理後の細胞死応答をモニタリングした。図1dに示したように、それぞれの場合において、TSA処理後の細胞死はAd-E2F1感染によって有意に高まった。対照的に、Ad-LacZ感染細胞については、このような応答は観察されなかった。これらの結果はER-E2F1発現細胞からのデータと一致し、図1b〜cと共に、E2F1過剰発現が、HDACI誘導性細胞死に対する感受性を増加させ、この細胞死増強がp53の状態に依存しないことを示している。
【０１０９】
HDACIによるE2F1アポトーシス促進性標的の選択的活性化
本発明者らは、HDACIがE2F1を介した細胞死を促進し得ると考えた。このために、本発明者らは、E2F1によって調節される遺伝子のHDACIに対する応答を調べようという考えを起こした。この目的を達するために、本発明者らはマイクロアレイスクリーニング法を使用した。BCL2L11は、アポトーシス促進性BH3-only Bcl2ファミリーメンバーであるBim(36,37)および最近同定されたE2F1標的(29)をコードし、E2F1活性化時にSAHAまたはTSAによって著しく誘導されることが発見された(データ示さず)。このマイクロアレイデータを確認し、他のE2F1アポトーシス促進性標的が関与しているかどうか調べるために、本発明者らは、RT-PCRを使用して、4-OHTの存在下または非存在下でTSAまたはSAHAで処理したER-E2F1発現細胞において、CCNE、p73、カスパーゼ-3、ならびにBH3-onlyタンパク質、例えば、Puma、Noxa、およびBimを含む多数の公知のE2F1標的の発現を調べた(図2a)。経時的分析から、ER-E2F1発現細胞に4-OHTを添加すると、CCNE転写物およびp73転写物が強力に誘導され、これらより少ない程度で、カスパーゼ-3転写物、Bim転写物、Puma転写物、およびNoxa転写物が誘導されたことが分かった。これらの遺伝子のうち、4-OHTによって誘導されるBim発現およびカスパーゼ-3発現は、TSA処理またはSAHA処理によってさらにアップレギュレートされた(図2a)。しかしながら、対照的に、CCNE転写物ならびに他の密接に関連するBH3-only転写物PumaおよびNoxaの発現は著しくアップレギュレートされなかった。興味深いことに、4-OHTによって誘導されるp73発現は、TSAおよびSAHAによって逆説的に低下した。予想したとおり、典型的なHDACI応答であるp21活性化がTSAおよびSAHAによって誘導され、この活性化は4-OHTの存在下ではさらに増加しなかった。これらの知見から、HDAC阻害は、E2F1が標的遺伝子特異的に転写を活性化する能力を変えることが示唆される。
【０１１０】
これらの転写変化によってタンパク質発現が変化するかどうかを確かめるために、本発明者らは、Bim、Puma、カスパーゼ3、およびp73のイムノブロット分析を行った。図2bは、ER-E2F1処理が、TSAのみ、SAHAのみ、または4-OHTのみで処理した細胞と比較してBimタンパク質レベルを増大させたことを示す。カスパーゼ-3タンパク質レベルはmRNAレベルがかなり増大したこととは対照的に、TSAおよびSAHAによって著しく増大しなかった。Pumaタンパク質レベルは、mRNA分析と一致して影響を受けず、E2F1依存性p73誘導はTSA処理およびSAHA処理によって低下した。従って、本発明者らが調査した、公知のE2F1アポトーシス促進性標的の中で、Bimが、mRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方でHDACIによって発現が実質的にアップレギュレートされる主要なE2F1アポトーシス促進性標的であるように思われる。この観察は、正常ヒト線維芽細胞IMR90細胞および骨肉腫Saos-2細胞においてAd-E2F1を用いてさらに裏付けられた。両方の場合とも、Ad-E2F1感染細胞をTSA処理すると、Bim発現がAd-LacZ感染細胞と比較して著しく増大した(図2c)。対照的に、p73およびPumaは影響を受けなかった。まとめると、これらの結果は、HDACIがE2F1アポトーシス促進性標的Bimを選択的に活性化することを示唆している。興味深いことに、この観察は、p73を選択的に誘導する、DNA損傷によるE2F1活性化とは対照的である(31,38)。ミトコンドリアを介したアポトーシスにおけるBimの公知の役割と一致して、本発明者らは、E2F1活性化時のSAHA処理またはTSA処理後に、カスパーゼ-3活性の活性化の増大、PARP切断の増大、およびミトコンドリア膜電位の破壊を観察した(図S1)。一貫して、カスパーゼ3阻害剤は、このアポトーシスを部分的にブロックした(図S1)。
【０１１１】
BimはE2F1活性化時のHDACI選択性の付与において機能的に重要である
E2F1活性化時のHDACI誘導性アポトーシスにおけるBimの役割を明確にするために、本発明者らは、RNA干渉を使用してBim発現をサイレンシングし、Bimの生物学的効果を分析した。この目的のために、本発明者らは、ER-E2F1発現細胞をBim特異的siRNAでトランスフェクトし、4-OHTの存在下または非存在下で、SAHAで24時間処理した。対照として、細胞を、関係のないsiRNAでトランスフェクトした。ER-E2F1発現細胞のウエスタンブロット分析から、負の対照siRNA(NC siRNA)処理細胞と比較して、Bim特異的siRNAはE2F1依存性Bim発現を90％超低下させ、SAHAによって誘導されるBim発現増大をほぼ完全に止めたことが分かった(図3a,左パネル)。結果として、Bim siRNAで処理したER-E2F1発現細胞は、対照siRNA処理細胞(49％)と比較して、4-OHT存在下でSAHA誘導性アポトーシスの著しい低下を示した(18％)(図3a,右パネル)。従って、siRNAトランスフェクションによってBim誘導をサイレンシングすると、SAHAに応答したE2F1によるアポトーシス増強が効果的に抑制された。同様の結果がTSA処理細胞でも得られた(図3b)。同様に、Bim発現をサイレンシングすると、Ad-E2F1感染Saos-2細胞におけるTSAに対する細胞死応答が低下した(図3c)。これらの一致する結果から、Bim誘導は、E2F1活性化時のHDACIに応答したアポトーシス増強を媒介することが分かる。
【０１１２】
HDACIは、Bim遺伝子プロモーターへのE2F1動員を増大させることによってBim転写を誘導する
Bimを含むBH3-onlyタンパク質はE2F1の直接標的であることが提案されている。しかしながら、ヒトBimプロモーターにおける機能的なE2F1結合部位はこれまで特定されていない。ヒトBimプロモーター転写開始部位上流の2.5kb塩基対にわたるゲノム配列の配列分析によって、転写開始部位から-1270/-1263、-1734/-1727、-2112/-2105、および-2245/-2238の位置に、コンセンサスE2F結合モチーフ[TTT(C/G)GCGC]に類似した4つの部位が存在することが明らかになった(図4a)。ヒトBimプロモーターがE2F1に応答するかどうか確かめるために、本発明者らは、Bimプロモーター領域-1415/-205にわたるゲノムDNA断片および-2415/-1333にわたるゲノムDNA断片を単離した。これらの2つのゲノムDNA断片は、それぞれ、1個および3個の推定E2F1結合部位を含有する。プロモーター活性分析のために、2つの断片をpGL3-ルシフェラーゼレポーターコンストラクトにクローニングした。次いで、コンストラクトを、空のベクター(pcDNA3.1)または漸増量のE2F1発現プラスミドと標準化対照と共にHCT116細胞に同時トランスフェクトした。48時間後に、相対ルシフェラーゼ活性を測定した。結果から、E2F1は、-1415/-205を含有するレポーターコンストラクトのプロモーター活性を30倍まで誘導できることが分かる。このことは、E2F1がBim-1415/-205プロモーターを活性化できることを示唆している。対照的に、Bim-2415/-1333プロモーターはE2F1に応答しなかった(図4b)。従って、-1415/-205の中にある推定E2F1結合部位(TTTGGCGG)がBimプロモーターの機能的E2F1応答配列であるように思われ、E2F1-REと名付けた。
【０１１３】
E2F1がインビボでE2F1-REに結合することを確認するために、本発明者らは、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ法を、抗E2F1抗体およびE2F1-REを含むPCRプライマーを用いて行った(図4c,上パネル)。結果から、Bim E2F1-REにおけるE2F1の占有は、ER-E2F1発現細胞において4-OHT非存在下で容易に検出できることが分かる。このことは、E2F1がBimプロモーターに内因的に結合することを示している。SAHA処理によって、Bimプロモーターへの内因性E2F1の動員が促進された。4-OHT存在下では、BimプロモーターへのE2F1の結合は有意に増大し、この結合はSAHAによってさらに著しく増大した(図4c,下パネル)。バックグラウンドを上回るシグナルは、非特異的IgGを用いて見られなかった。従って、BimがE2F1の直接の標的であることと一致して、本発明者らの研究から、ヒトBimプロモーターの機能的E2F1結合部位が特定され、HDAC阻害後のBimプロモーターにおけるE2F1の占有増大がBim発現のアップレギュレーションと関連することがさらに証明された。
【０１１４】
Rb不活性化はBim発現およびHDACIに対する感受性増加を誘導する
次に、本発明者らは、内因性E2F活性の調節解除に起因する、HDAC阻害に対するアポトーシス応答を調べた。E1Aオンコプロテインタンパク質はRbファミリーメンバーに結合し、不活性化し(39,40)、内因性E2F1を活性化する(41,42)。Bim発現およびHDACIに対する細胞応答に及ぼすRb不活性化の影響を確かめるために、本発明者らは、Rb野生型U20S細胞を、E1A発現アデノウイルスまたは対照アデノウイルスに感染させた。図5aは、Ad-E1A感染U20S細胞がBimおよびp73を多量に発現し、SAHA処理後に、Bimはさらに増加したが、p73は増加しなかったことを示している。一貫して、E1A発現U20S細胞は、Ad-LacZ感染U20S細胞と比較してSAHA処理に対する感受性がかなり高かった(図5a,右パネル)。
【０１１５】
E2F1-Bim介入の腫瘍選択性を確かめるために、本発明者らは、正常二倍体ヒト線維芽細胞IMR90細胞およびE1Aを安定に発現する形質転換IMR90細胞において、増殖およびアポトーシスに及ぼすHDACIの影響を比較した。用量反応研究から、SAHAは、正常IMR90細胞および形質転換IMR90細胞の増殖を実質的に阻害することが分かった(図5b)。しかしながら、正常IMR90細胞は、基本的に、アポトーシス誘導においてSAHAおよびTSAに応答しなかったが(<10％)、E1A形質転換IMR90細胞における同じ処理によって強力なアポトーシスが誘導された(約60％)(図5c,左パネル)。この観察は、異なる細胞株を用いた以前の報告と一致しており(12)、HDACIの腫瘍選択性が、細胞増殖ではなくアポトーシスを調節する経路において起こることを示唆している。IMR90-E1A細胞における高いE2F1活性と一致して、これらの細胞においてBimおよびp73がアップレギュレートされ、SAHA処理およびTSA処理の後に、Bimレベルはさらに劇的に増大した。対照的に、Bim誘導は、正常IMR90細胞においてTSAおよびSAHAによってほとんど誘導されなかった(図5c,右パネル)。p73発現もSAHAによって低下した。この観察はE2F1過剰発現細胞と一致している。さらに、IMR90-E1A細胞においてBimをsiRNAによってノックダウンすると、TSAおよびSAHAに応答したアポトーシス誘導が有意に低下した(図5d)。従って、内因性E2F1活性を増大させる正常IMR90細胞での癌遺伝子E1A発現は、少なくとも部分的にBimを誘導することによって、これらの細胞のSAHA誘導性アポトーシスに対する感受性を増加させた。
【０１１６】
さらに、本発明者らは、TSA処理またはSAHA処理後のアポトーシス応答およびBim誘導における内因性E2F1の明確な役割を調べるために、Rb欠損Saos-2細胞を使用した。Saos-2細胞を、E2F1特異的siRNAまたは負の対照siRNAでトランスフェクトした。図5eは、Saos-2細胞においてE2F1を枯渇させることによって、TSA処理またはSAHA処理後にBim発現が実質的に低下し、PARP切断が阻害されたことを示す。一貫して、SAHAおよびTSAによって誘導されるアポトーシスは、E2F1 siRNA処理細胞において実質的に低下した(図5e,右パネル)。これらの結果は、内因性E2F1が、HDACIに応答したBimおよびアポトーシスの力強い誘導に必要なことを明らかに証明している。
【０１１７】
SAHAおよびE2F1によって調節されるアポトーシス転写ネットワーク
以前の研究において、本発明者らは、HDACIがE2F1依存性アポトーシスを活性化し、E2F1の標的であるBimがこのプロセスにおいて重要な役割を果たしていることを報告した。このゲノムプログラムを完全に特徴づけ、HDAC阻害に応答したE2F1依存性アポトーシスに関与している可能性のあるさらなる分子事象を特定するために、本発明者らは、DNAマイクロアレイ分析およびE2F1誘導性HCT116 p53ヌル細胞株(63)を使用した。この細胞系において、E2F1はエストロゲン受容体(ER)結合ドメイン(64)と融合しており、ER-E2F1は、ERリガンドである4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)によって活性化される。以前に述べられたように(63)、および本明細書の図1Aに示したように、HDAC阻害剤SAHAは、4-OHTによるE2F1活性化時に、著しく増大したアポトーシスを誘導した。
【０１１８】
E2F1活性化の結果としてのSAHA誘導性アポトーシスの一因となるアポトーシスプログラムを確かめるために、本発明者らは、19k遺伝子アレイに示されている、十分にアノテーションされた220種類のアポトーシス関連遺伝子に焦点を当てた。本発明者らは、ER-E2F1発現細胞またはER結合ドメインのみを含有する空のベクターを発現する細胞(ER)において、4時間、8時間、および24時間にわたって経時的に、4-OHTよって活性化されたアポトーシス遺伝子を規定することから始めた。各時点からの遺伝子発現データをクラスター分析し、Tree viewソフトウェア(62)において表示した。図6Bに示したように、220種類のアポトーシス関連遺伝子のうち42種類がER-E2F1細胞において4-OHT処理後に発現増大を示したが、ER細胞では発現増大を示さなかった。このことは、これらのアポトーシス遺伝子がE2F1によって潜在的に調節されることを示している。E2F1によって調節されるアポトーシス遺伝子の中で、BCl2L11、TP73、CASP3は、以前から知られていたE2F1標的であり、E2F1によって強力にアップレギュレートされた。さらに、本発明者らは、RUNX3、ATM、TP53BPL、RPS6KA1もE2F1によって実質的に活性化されることを初めて発見した。
【０１１９】
次に、E2F1アポトーシス活性を反映するSAHA応答遺伝子を同定するために、本発明者らは、4-OHTの存在下および非存在下で、SAHA処理によって共通しておよび選択的に活性化されるアポトーシス遺伝子の発現パターンを比較した。4-OHTの存在に関係なく、49種類の遺伝子が少なくとも1つの時点でSAHAによってアップレギュレートされることが発見された(図6C)。以前に述べられたように、本発明者らは、SAHAが、アポトーシスプログラムに関与する複数の遺伝子を強力に活性化することを発見した。これらの中には、Bcl2-ファミリーメンバー(BCl2L11、BNIP3L、BCL10)、APAF1、およびCASP3などの内因性アポトーシス経路に関与しているものがある(65)。さらに、受容体を介した死経路(death pathway)に属する遺伝子(TNFRSF1B、TNFRSF10D、およびTNFSF13)もまた、より少ない程度とはいえSAHAによって誘導された。これらのうち、15種類は、図6Cに示したE2F1標的である。本発明者らは、SAHAがE2F1アポトーシスプログラムを活性化するのであれば、E2F1活性化時にSAHAによって発現をさらに誘導することができる遺伝子セットが発見されるはずだと考えた。実際には、クラスター分析から、4-OHTによるE2F1活性化時に、SAHAによって発現が著しく増強された遺伝子サブセットが明らかになった(図6C、クラスターA)。特に、図6CのクラスターAでは、アポトーシス刺激キナーゼ(ASK1)をコードし、E2F1単独では弱く誘導されるように見えたMAP3K5が、E2F1活性化時にSAHAによって強力にアップレギュレートされた。同じクラスターには、本発明者らの以前の研究(63)において述べられたBCl2L11(Bim)およびCASP3があった。これらの観察は、(1)SAHAはE2F1アポトーシス活性を標的遺伝子特異的に活性化する、(2)ASK1はE2F1によって調節される標的であり、その発現はSAHAによって活性化することができる、という2つの結論を裏付けている。
【０１２０】
外因性E2F1および内因性E2F1は両方ともASK1発現を調節する
遺伝子発現分析から得られた結果を確認するために、RT-PCR実験を行って、ER-E2F1を発現するHCT116細胞、ERを発現するHCT116細胞、またはERと融合したDNA結合に欠損のあるE2F1変異体(E132)を発現するHCT116細胞におけるASK1 mRNAレベルを調べた。マイクロアレイデータと一致して、E2F1を4-OHTで活性化するとASK1 mRNAレベルが増大したが、ER発現細胞またはER-E132発現細胞では増大しなかった(図7A、左パネル)。一貫して、ASK1タンパク質は、ER-E2F1発現細胞において4-OHT後に蓄積した(図7A、右パネル)。ASK1発現が内因性E2F1と関連するのかどうか調べるために、本発明者らは、血清飢餓によってヒト骨肉腫細胞U20SをG0/G1期で止めた(図7B、左パネル)。血清飢餓U20S細胞が血清添加の後に細胞周期に再び進入した時に、E2F1発現が上昇した(図7B、右パネル)。E2F1高活性に対応して、本発明者らは、細胞がS期に進入した時に、真のE2F1標的であるp73およびサイクリンEと共にASK1発現が増大することを検出した。従って、ASK1発現は内因性E2F1発現と相関関係がある。この結論をさらに裏付けるために、本発明者らはまた、オンコプロテインE1A発現アデノウイルス(Ad-E1A)を用いて、U20S細胞およびIMR90細胞を感染させた。E1AはRbファミリーメンバーに結合し、不活性化し(59,66)、内因性E2F1を活性化する(67,68)。従って、E1A過剰発現細胞はE2F1活性が高く、従って、E2F1標的遺伝子の発現が増大している。実際には、本発明者らは、Ad-E1A感染によって、U20S細胞およびIMR90細胞においてASK1およびp73がアップレギュレーションされることを発見した(図7C)。これらの観察は、内因性E2F1の活性化がASK1発現を誘導できることを示唆している。
【０１２１】
ASK1はE2F1の直接の標的である
E2F1によるASK1誘導が転写レベルで調節されるかどうかを確かめるために、ASK1プロモーターを単離し、ルシフェラーゼレポータープラスミドにサブクローニングした。図8Aは、レポーターコンストラクト用の、推定E2F結合部位を含むASK1遺伝子プロモーター領域ならびに欠失変異体を示す。図8Bから分かるように、1.0kbのASK1遺伝子5'近接領域のプロモーター活性は、漸増量のE2F1プラスミドによって著しく活性化することができる。次に、誘導を媒介する潜在的なE2F結合領域を確かめるために、本発明者らは、様々な欠失変異体を使用してASK1プロモーター活性を測定した。-1000から-256の領域を含有する欠失コンストラクトはE2F1に応答しなかった(図8C)。対照的に、E2F1は、-273/+125プロモーターを12倍まで活性化することができる。このことは、-273/+125の中にある推定E2F1結合部位がASK1プロモーターの機能的E2F1応答エレメントであることを示唆している。
【０１２２】
インビボでのASK1遺伝子プロモーターへのE2F1の動員を調べるために、本発明者らは、ER-E2F1発現細胞またはDNA結合に欠損のある変異体(ER-E132)を発現する細胞を使用して、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ法を行った。4-OHT非存在下では、抗E2F1は、ER-E2F1発現細胞およびER-E132発現細胞の両方において、E2F1モチーフを含有する-273から+125のASK1遺伝子プロモーターの近接領域を免疫沈降したが、対照IgGは免疫沈降しなかった(図8D)。このことから、内因性E2F1はASK1プロモーターに結合することが分かる。ER-E2F1を活性化する4-OHT存在下では、ER-E2F1細胞においてASK1プロモーターへのE2F1の動員が実質的に増大したが、結合変異体ER-E132の活性化は、ASK1プロモーターへのE2F1の動員を増大しなかった。これらの結果を考慮して、本発明者らは、E2F1がASK1転写を活性化し、ASK1がE2F1の直接標的であると結論付けている。
【０１２３】
ASK1は正のフィードバック機構によってE2F1活性を調節する
E2F1活性はpRbによって負の調節を受ける。pRb過剰リン酸化はRbを不活性化し、E2F1活性を増大させる。最近、ASK1はpRBと物理的に相互作用し、不活性化することが示されている(69)。この観察は、E2F1によってASK1が誘導されるとpRBが阻害され、従って、E2F1活性の正のフィードバックループが生じ得るという可能性を高める。この可能性を考慮して、本発明者らは、siRNAによるASK1ノックダウンによってE2F1標的の活性化が損なわれるかどうかを確かめた。ER-E2F1発現細胞において、4-OHTによってE2F1を活性化すると、ASK1ならびに他のE2F1標的であるp73、Bim、およびサイクリンEが誘導された。本発明者らは、siRNAによってASK1を枯渇させると、4-OHTによる誘導が妨げられるだけでなく、p73、Bim、およびサイクリンEの誘導も実質的に損なわれることを発見した(図9A)。この結果は、E2F1を介したASK1誘導がE2F1活性の正のフィードバック作用を可能にし、E2F1標的遺伝子の十分な誘導につながることを示唆している。
【０１２４】
ASK1がRbを阻害することによってE2F1活性を活性化するかどうかを調べるために、本発明者らは、E2F1応答性Bimプロモーターを使用して、E2F1/Rbを介したBimプロモーター活性調節に及ぼすASK1の影響を試験した。ルシフェラーゼレポーターアッセイ法では、異所性のE2F1発現がBimプロモーターを活性化し、予想したとおり、このE2F1機能はpRBの同時発現によって阻害された(図9B)。さらに、ASK1発現プラスミドを導入すると、E2F1を介したBimプロモーター活性化に及ぼすRbの負の作用が逆転した(図9B)。従って、これらの結果は、E2F1によってASK1が誘導されるとRbが不活性化し、それによって、正のフィードバックループを介してE2F1活性が増大するという結論を裏付けている。
【０１２５】
SAHAはE2F1を介したASK1誘導を促進する
図6に示したマイクロアレイ分析から、Bimと同様にASK1はE2F1によって弱い調節を受けるが、この調節は、SAHAによるHDAC阻害後に著しく増強できることが分かる。この観察は、ER-E2F1発現細胞におけるウエスタンブロット分析によってさらに確認された(図10A)。E2F1活性化時のSAHAによるASK1誘導の増大がASK1プロモーターへのE2F1動員増大と関連するかどうか調べるために、本発明者らはChIPアッセイ法を行った。実際には、4-OHT存在下でのSAHA処理により、E2F1とASK1プロモーターの結合は著しく増大した(図10B)。
【０１２６】
内因性E2F1がSAHAによるASK1誘導に必要であるかどうか調べるために、本発明者らは、IMR90細胞と、E1Aオンコプロテインを安定に発現するIMR90細胞を比較した。IMR90-E1A細胞のE2F1活性が高いことと一致して、これらの細胞は、IMR90細胞と比較して高レベルのASK1を発現し、SAHA処理後にASK1発現はさらに誘導された(図10C)。SAHA誘導性ASK1発現におけるE2F1の明確な役割を確かめるために、本発明者らは、E2F1 siRNAを使用してU20S細胞におけるE2F1発現を阻害し、SAHA処理後のASK1発現に及ぼすE2F1の影響を調べた。図10Dから、SAHAはU20S細胞およびE2F1 siRNA処理細胞においてASK1発現を経時的に誘導したが、対照siRNAはASK1誘導を効率的に止めなかったことが分かる。まとめると、これらの結果から、外因性E2F1および内因性E2F1は両方ともSAHAに応答したASK1誘導に必要であることが分かる。
【０１２７】
E2F1-ASK1活性化はSAHAによるアポトーシス誘導に寄与する
次に、本発明者らは、高E2F1活性に起因するSAHA誘導性アポトーシスにおけるASK1の役割を調べた。この目的のために、本発明者らは、ASK1 siRNAを使用して、ER-E2F1発現細胞におけるASK1発現を低下させ、E2F1活性化時のSAHA処理後のアポトーシスレベルが著しく低いことを観察した(図11A)。E2F1活性の正のフィードバック調節に及ぼすASK1の役割と一致して、本発明者らは、ASK1が枯渇すると、SAHAに応答してBimが著しく減少することを発見した(図11B)。本発明者らは、E2F1-Bim経路がHDACI誘導性細胞死において重要な役割を果たしていることを以前に証明している。従って、siRNAによってASK1発現を阻害すると、Bim誘導を損なわせることによってSAHAアポトーシス応答を弱めることができる。この観察は、ASK1-E2F1フィードバックモジュールが有効にかみ合っていることが、少なくとも部分的にE2F1-Bim活性を増大させることによって、HDACIに応答したアポトーシスを促進するのに必要であることを示唆している。
【０１２８】
ASK1タンパク質は、胚線維芽細胞およびクロム親和細胞腫細胞においてアポトーシスにつながるJNKおよびp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)ファミリーを含む、数種類の細胞内シグナル伝達経路とつながっている(70,71)。異所性E2F1発現がASK1を活性化し、SAHA誘導性アポトーシスを促進することを考慮して、本発明者らは、E2F1活性化およびSAHA処理後のJNK-p38活性化を調べた。SAHAに応答したJNKおよびp38 MAPKの活性化を、JNK活性化またはp38活性化を検出するリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロットによってモニタリングした(図11B)。ER-E2F1発現細胞において、本発明者らは、E2F1活性化後、SAHA処理後、または両方の後にリン酸化p38レベルの増大もリン酸化JNKレベルの増大も一貫して観察しなかった。このことは、アポトーシス増大がJNKの増加によるものでもなくp38の活性化によるものでもないことを示している。
【０１２９】
考察
HDAC阻害剤は、癌細胞に対して選択的な活性があるために有望な化学療法剤とみなされている。しかしながら、これらの化合物の腫瘍選択性の基盤は未解決問題の1つである(2)。本明細書に記載の結果から、HDACIの標的としてRb/E2F1発癌経路が立証され、HDACIはE2F1アポトーシス機能を活性化することによって効率的にアポトーシスを誘発することが証明された。重要なことに、本発明者らは、Bimをこのプロセスの不可欠なメディエーターとして特定した。Rb/E2F経路が多くの癌タイプにおいて頻繁に調節解除され、HDACIがE2F1高活性の腫瘍細胞を優先的に死滅させることは、HDACI抗腫瘍作用の選択性のための一組の分子的条件を規定する。まとめると、本発明者らは、pRbが欠損し、E2F1経路アップレギュレーションが確認された腫瘍には、HDAC阻害剤に対して特異的な感受性があると断定する。
【０１３０】
オンコプロテインMycと同様に、E2F1は、細胞周期の進行を刺激し、増殖を誘発する癌遺伝子として機能するだけでなく、アポトーシス誘導による腫瘍サプレッサー機能も備わっている。このフェールセーフ機構は正常細胞の異常な発癌トランスフォーメーションを防ぐ。この機構は、癌細胞では、悪性増殖を可能にするために厳しく制御されているか、無能力化されている。従って、腫瘍特異的介入を実現するために、癌遺伝子誘導性アポトーシスを完全に回復する、または活性化する治療アプローチは概念的に実施可能なように思われる。従って、DNAを傷つけることなく、HDACを阻害することによってE2F1を介した腫瘍サプレッサー機能を誘発することは、癌を特異的に死滅させる魅力的な戦略であるかもしれない。この戦略を用いた治療上の恩典は明白である。すなわち、腫瘍細胞を選択的に死滅させ、正常組織を温存する。
【０１３１】
本発明者らは、HDACIによって誘発されるE2F1誘導性アポトーシスの重要なメディエーターとしてBimを同定した。マイクロアレイおよびRT-PCRを用いて出された、以前に同定されたE2F1アポトーシス促進性標的のうち、Bimは、E2F1活性化時にHDACIによってmRNAレベルおよびタンパク質レベルの両方で劇的に増大することが見出された。さらに、RNAiによるBim発現サイレンシングは、E2F1過剰発現細胞においてHDACIによって誘導される細胞死増強を効率的に抑止した。このことは、これらの細胞を強力なアポトーシスに追い込むためには、Bimがアップレギュレーションされるだけで十分であることを示している。Bimは、Bcl-2ファミリーのアポトーシス促進性BH3ドメイン-onlyメンバーであり、Baxを活性化することによって内因性アポトーシス経路を誘発することができる(36,43,44)。一貫して、E2F1過剰発現細胞においてHDACI処理を行うと、カスパーゼ3活性およびPARP切断が著しく増大し、ミトコンドリア膜電位が破壊される。しかしながら、本発明者らは、以前に同定されていない他のE2F1標的の誘導もアポトーシス感受性増大に寄与し得るという可能性を排除していない。だがそれにもかかわらず、Bim siRNAによってアポトーシス感受性増大がほぼ完全に抑止されたことは、Bimがこのプロセスにおいて中心的な役割を果たしていることを実際に示している。
【０１３２】
PumaおよびNoxaなどの他のBH3-onlyタンパク質も以前に同定されたE2F1標的であるが、HDAC阻害による影響を受けないことは、興味深い観察である(29)。HDACIによるE2F1標的遺伝子の選択的活性化を決定する分子的基礎は分かっていない。E2F1活性は、PCAFのヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)活性を介した、117、120、および125にあるリジン残基のアセチル化の増大によって調節できることが以前に報告されている(45,46)。従って、選択的なE2F1標的活性化はE2F1アセチル化の増大と関連しているのかもしれない。なぜなら、p53およびp73などの転写因子のアセチル化はアポトーシス促進性標的の選択的活性化につながることが知られていたからである(47,48)。しかしながら、本発明者らは、これらの3つのリジンをアルギニンに変えたアセチル化欠損変異体ER-E2F1がBimならびにHDACIに対するアポトーシス応答をトランス活性化する能力を妨げないことを発見した(データ示さず)。従って、このようなHDACI作用は、E2F1アセチル化それ自体の結果である可能性は低い。原則的に、E2F1と物理的に関連するタンパク質のアセチル化、またはHATの動員増大、その後の、影響を受けるプロモーターのヒストンのアセチル化によるものであるかもしれない。
【０１３３】
以前に、DNA損傷は、選択的なp73誘導(31,38)またはChk2-p53ネットワーク活性化(25)によって、E2F1を介したアポトーシスを促進することが研究から分かっている。DNA損傷によって誘導されるアポトーシスとはかなり対照的に、本発明者らは、HDACIによるE2F1アポトーシス機能の活性化はp73またはp53を必要としないが、アポトーシス促進性のBcl-2ファミリーメンバーBimを力強く活性化することによって進行することを証明している。p53標的であり、DNA損傷誘導性アポトーシスに関与する、Puma、Noxa、およびBidなどの他のBH-3 onlyメンバー(49-52)とは異なり、Bimがp53標的であるという証拠はない。その代わり、Bim発現は、ホスファチジルイノシトール3-OHキナーゼ(PI3K)/プロテインキナーゼB(PKB)/Akt(53,54)またはERK/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路(55-57)を介して増殖因子シグナルによって厳しく調節され、サイトカイン除去によって誘導されるアポトーシスに関与する。従って、Bimは、BH-3 onlyタンパク質の他のメンバーとは分けられているように思われ、癌遺伝子誘導性アポトーシスの重要なメディエーターとして現れたのに対して、Puma、Noxa、およびBidは、主に、DNA損傷およびp53を介したアポトーシス応答に関与している。実際には、Bimが損なわれると、癌遺伝子Myc誘導性腫瘍形成が促進されることが最近報告されたが(58)、BimがMycの直接の標的であるかどうかは明らかでない。まとめると、Bimは、癌遺伝子誘導性アポトーシスの重要なメディエーターのように思われる。従って、p53が損なわれている腫瘍では、Bimを介したアポトーシス経路は、フェールセーフのホメオスタシス機構を実現するために発癌損傷をつなぐための鍵であり得ると予想される。さらに、本発明者らの結果から、HDACIは、癌細胞におけるp53変異による化学療法抵抗性に供する可能性は低いことが分かる。
【０１３４】
要約すると、本発明者らは、E2F1発現を増大させるか、またはRbを不活性化すると、HDACI誘導性アポトーシスが強力に増強することを示す証拠を有する。重要なことに、これは正常細胞対形質転換細胞において証明されており、HDACI腫瘍選択性の潜在的な機構を強く裏付けている。さらに、Bimは、現在用いられているアセチル化ヒストンと相対する、HDACI応答を決定することができるより有効な予測マーカーであるかもしれない。なぜなら、HDACIは、腫瘍組織および正常組織の両方でヒストンの過剰アセチル化を誘導するからである。HDACIを使用して、E2F1を介するが、p53とは独立したアポトーシスが促進されることから、DNAを傷つけることなく癌遺伝子誘導性アポトーシスを回復することが癌特異的療法の実施可能な戦略であるという概念の証拠が得られる。
【０１３５】
このプロセスに関与する可能性のある、さらなる遺伝子エレメントを同定するために、本発明者らは、HDACI阻害剤SAHAのゲノムに対する応答を調べ、220種類のアポトーシス関連遺伝子の遺伝子発現変化に焦点を当てた。本発明者らの研究は、HDACIが、内因性アポトーシス経路および受容体を介したアポトーシス経路の両方に関与する複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすことを示した以前の結果と合致している(65)。SAHA応答における可能性のあるE2F1の役割と一致して、以前の研究または本研究によって同定された多数のE2F1標的、例えば、BCl2L11(Bimをコードする)、CASP3、APAF1、TNFRSF10D、MAP3K5(ASK1をコードする)がSAHAによって活性化される。重要なことに、4-OHTによるE2F1活性化時に、Bim、カスパーゼ3、およびASK1の誘導はSAHAによってさらに増大する。従って、以前に同定されたBimおよびカスパーゼ3に加えて、ASK1は、E2F1活性化に起因するHDACI応答増大に産物が関与する可能性のある別の標的遺伝子であるように思われる。
【０１３６】
本発明者らは、RNA干渉ならびにドミナントネガティブE2F変異体を使用して、ASK1がE2F1の直接の標的であり、E2F1活性がSAHAによるASK1誘導に必要とされることを本明細書で示す。ASK1は、アポトーシスにつながる複数のシグナル伝達経路に関与する(70,71)。ASK1を介したアポトーシスは、一部の細胞系では、アポトーシス促進性p38およびJNKシグナル伝達経路のリン酸化および活性化によって媒介されることが報告されている。実際には、本発明者らは、E2F1活性化時のSAHAに応答したp38またはJNKのリン酸化増大を観察しなかった。このことは、ASK1のアポトーシス機能における従来の役割が、このプロセスに寄与しないことを示唆している。重要なことに、本発明者らは、RNA干渉によるASK1ノックダウンが、Bim、p73、およびサイクリンEを含む他のE2F1標的の誘導を損ねたことを示す。従って、本発明者らは、ASK1誘導の重要な機能がE2F1活性のフィードバック調節にあることを提案する。
【０１３７】
E2F1活性は、Rb、p16、およびcdk活性を含む様々な上流成分を介して調節される。さらに、E2F1活性はまた、E2F1の標的遺伝子を介したフィードバック機構によって調節される可能性がある。例えば、E2F1はcdk阻害剤p27の発現を誘導して、cdk活性およびRb過剰リン酸化を阻害することによってE2F1転写活性の負のフィードバック調節を起こすことが示されている(72)。ASK1がRb機能を阻害するという以前の報告と一致して(69)、本発明者らは、E2F1によるBimプロモーター活性化のRbを介した抑制がASK1過剰発現によって逆転できることを示す。本発明者らは、E2F1によるASK1誘導が、Rbを阻害することによってE2F1の正のフィードバック調節となることを提案する。従って、E2F1は、その標的遺伝子を介した正のフィードバック機構および負のフィードバック機構によって調節することができる。ASK1ノックダウン後の、SAHAによるBim誘導の抑制およびアポトーシス誘導の阻害は、ASK1誘導がE2F1-Bimアポトーシスネットワークを増強することによってSAHA誘導性細胞死に寄与することを示唆している。E2F1を介したアポトーシスにおけるASK1の役割をさらに評価する必要があるが、本発明者らのデータから、ASK1およびBimが同時に誘導されることは、アポトーシス誘導に重要な持続的Bim誘導をE2Fが支える機構の効率のよさを反映していることが示唆される。
【０１３８】
本発明は一例としてしか説明されておらず、本発明の範囲および精神の中にありながら、変更が加えられてもよいことが理解されるだろう。
【０１３９】
参考文献
2014087343.tif 000004
2014087343.tif 000005
2014087343.tif 000006
2014087343.tif 000007
2014087343.tif 000008
【図１】
2014087343.tif 000009
【図２】
2014087343.tif 000010
【図３】
2014087343.tif 000011
【図４】
2014087343.tif 000012
【図５】
2014087343.tif 000013
【配列表】
2014087343000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月28日(2013.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
【図１】HDACIであるSAHAおよびTSAは、E2F1を介した細胞死を促進する。(a)p53ヌルHCT116-ER-E2F1発現細胞または対照ER発現細胞を4-OHTで処理した、または4-OHTで処理しなかった。サイクリンEおよびp73の発現をイムノブロット分析で評価した。(b)ER-E2F1発現細胞または対照細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で1μM SAHA(左パネル)または100nM TSA(右パネル)で処理した。48時間後に、細胞を採取し、FACSを用いて細胞死をPI染色で評価した。3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示した。(c)コロニー形成アッセイ法。6ウェルプレート1ウェルあたり1000個のER-E2F1発現細胞および対照細胞を48時間プレーティングし、その後に、示したように24時間処理した。細胞を洗浄し、新鮮なDMEMを添加した。15日後に、コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。代表的なプレートを示した。(d)示したようにE2F1またはLacZを含有するアデノウイルスに感染させたSaos-2細胞およびHCT116細胞を100nM TSAで24時間処理し、細胞死をFACSで分析した。
【図２】HDACIはE2F1標的遺伝子を選択的に活性化する。(a)ER-E2F1発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で、100nM TSAで示した時間にわたって、または1μM SAHAで24時間処理した。E2F1標的遺伝子ならびにp21およびGAPDHのmRNAレベルをRT-PCRで検出した。(b)細胞を(a)において処理した。E2F1標的遺伝子産物の発現を、ウエスタンブロットで、Bim、Puma、カスパーゼ-3、およびp73に対する抗体を用いて評価した。(c)Saos-2細胞およびIMR90細胞にAd-E2F1またはAd-LacZを24時間感染させ、その後さらに24時間、100nM TSAで処理した。Bim、p73、Puma、およびE2F-1の発現を、ウエスタンブロットで、対応する抗体を用いて評価した。
【図３】E2F1過剰発現時のHDACI誘導性アポトーシスに対するBim特異的siRNAの影響。(a)ER-E2F1を非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはBim特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、さらに24時間、4-OHT、SAHA、またはその両方で処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。ヨウ化プロピジウム染色後に、細胞死をフローサイトメトリーで分析した(右パネル)。sub-G1にある細胞のパーセントを示した。(b)ER-E2F1を非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはBim特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、さらに48時間、4-OHT、100nM TSA、またはその両方で処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。細胞死は(a)と同様に評価した。グラフは、3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示す(右パネル)。(c)Bimまたは対照siRNAで処理したSaos-2細胞にAd-E2F1またはAd-LacZを24時間感染させ、その後さらに24時間、100nM TSAで処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。細胞死は(a)と同様に評価した。グラフは、3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示す(右パネル)。
【図４】SAHAはBimプロモーターへのE2F1の動員を促進する。(a)推定E2F結合部位を含有するヒトBimプロモーターの模式図。示した領域を単離し、pGL3レポーターコンストラクトにクローニングした。(b)pGL3-basic, Bim-1415/-205または-2415/-1333ルシフェラーゼコンストラクト、およびレニラ(renillia)ルシフェラーゼコンストラクトを、漸増量のE2F1発現ベクター(0ng、20ng、および40ng)と共にHCT116細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、相対ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した後の倍誘導として示した。表示したデータは3回の独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。(c)左パネル、E2F1-REエレメントを含有するヒトBimプロモーターの模式図。右パネル、E2F1とBimプロモーターの結合をChIPで分析した。示したように処理したER-E2F1発現細胞からの架橋クロマチンを抗E2F1抗体、非特異的IgGで免疫沈降させ、次いで、Bimプロモーター断片を、E2F1-RE含有領域に隣接するプライマーを用いてPCR増幅した。正の対照(インプットDNA)増幅を示した。
【図５】Rb不活性化はBim発現を増強し、HDACI誘導性アポトーシスに対する感受性を増加させる。(a)U20S細胞にAd-E1AまたはAd-LacZを24時間感染させ、さらに48時間、SAHA(1μM)で処理した。細胞死をFACS分析で測定し(右パネル)、Bimおよびp73のレベルを、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した(左パネル)。(b)正常IMR90細胞および形質転換IMR90-E1A細胞を、示した濃度のSAHAで処理し、細胞増殖を、示した時間にわたって評価した。(c)E1Aの発現は、SAHAおよびTSAに応答した、Bimのアップレギュレーションおよびアポトーシスの増強をもたらす。IMR90細胞およびIMR90-E1A細胞をSAHA(2.5μM)およびTSA(300nM)で48時間処理した。細胞死をFACS分析で測定し(左パネル)、Bimおよびp73のレベルを、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した(右パネル)。(d)Bim siRNAまたは対照siRNA(NC siRNA)でトランスフェクトしたIMR90-E1A細胞をTSA(800nM)で24時間処理した。Bimおよびβ-アクチンの発現を、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した。アポトーシスをFACS分析で評価した。(e)Saos-2細胞をE2F1 siRNAまたは負の対照siRNA(NC siRNA)でトランスフェクトし、TSA(150nM)またはSAHA(1μM)で処理した。E2F1、Bim、およびPARPの発現を、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した。NS、ローディング対照としての非特異的バンド。アポトーシスはFACS分析で評価した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明の実施は、特別の定めのない限り、当業者の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術の従来法を使用する。このような技法は文献において十分に説明されている。参照のための教科書の例には、以下:Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Third Edition (2000)が含まれる。
以下、図面について説明する。
図１．HDACIであるSAHAおよびTSAは、E2F1を介した細胞死を促進する。(a)p53ヌルHCT116-ER-E2F1発現細胞または対照ER発現細胞を4-OHTで処理した、または4-OHTで処理しなかった。サイクリンEおよびp73の発現をイムノブロット分析で評価した。(b)ER-E2F1発現細胞または対照細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で1μM SAHA(左パネル)または100nM TSA(右パネル)で処理した。48時間後に、細胞を採取し、FACSを用いて細胞死をPI染色で評価した。3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示した。(c)コロニー形成アッセイ法。6ウェルプレート1ウェルあたり1000個のER-E2F1発現細胞および対照細胞を48時間プレーティングし、その後に、示したように24時間処理した。細胞を洗浄し、新鮮なDMEMを添加した。15日後に、コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。代表的なプレートを示した。(d)示したようにE2F1またはLacZを含有するアデノウイルスに感染させたSaos-2細胞およびHCT116細胞を100nM TSAで24時間処理し、細胞死をFACSで分析した。
図２．HDACIはE2F1標的遺伝子を選択的に活性化する。(a)ER-E2F1発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で、100nM TSAで示した時間にわたって、または1μM SAHAで24時間処理した。E2F1標的遺伝子ならびにp21およびGAPDHのmRNAレベルをRT-PCRで検出した。(b)細胞を(a)において処理した。E2F1標的遺伝子産物の発現を、ウエスタンブロットで、Bim、Puma、カスパーゼ-3、およびp73に対する抗体を用いて評価した。(c)Saos-2細胞およびIMR90細胞にAd-E2F1またはAd-LacZを24時間感染させ、その後さらに24時間、100nM TSAで処理した。Bim、p73、Puma、およびE2F-1の発現を、ウエスタンブロットで、対応する抗体を用いて評価した。
図３．E2F1過剰発現時のHDACI誘導性アポトーシスに対するBim特異的siRNAの影響。(a)ER-E2F1を非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはBim特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、さらに24時間、4-OHT、SAHA、またはその両方で処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。ヨウ化プロピジウム染色後に、細胞死をフローサイトメトリーで分析した(右パネル)。sub-G1にある細胞のパーセントを示した。(b)ER-E2F1を非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはBim特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、さらに48時間、4-OHT、100nM TSA、またはその両方で処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。細胞死は(a)と同様に評価した。グラフは、3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示す(右パネル)。(c)Bimまたは対照siRNAで処理したSaos-2細胞にAd-E2F1またはAd-LacZを24時間感染させ、その後さらに24時間、100nM TSAで処理した。Bimの発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。細胞死は(a)と同様に評価した。グラフは、3回の独立した実験の結果の平均と標準偏差を示す(右パネル)。
図４．SAHAはBimプロモーターへのE2F1の動員を促進する。(a)推定E2F結合部位を含有するヒトBimプロモーターの模式図。示した領域を単離し、pGL3レポーターコンストラクトにクローニングした。(b)pGL3-basic, Bim-1415/-205または-2415/-1333ルシフェラーゼコンストラクト、およびレニラ(renillia)ルシフェラーゼコンストラクトを、漸増量のE2F1発現ベクター(0ng、20ng、および40ng)と共にHCT116細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、相対ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した後の倍誘導として示した。表示したデータは3回の独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。(c)左パネル、E2F1-REエレメントを含有するヒトBimプロモーターの模式図。右パネル、E2F1とBimプロモーターの結合をChIPで分析した。示したように処理したER-E2F1発現細胞からの架橋クロマチンを抗E2F1抗体、非特異的IgGで免疫沈降させ、次いで、Bimプロモーター断片を、E2F1-RE含有領域に隣接するプライマーを用いてPCR増幅した。正の対照(インプットDNA)増幅を示した。
図５．Rb不活性化はBim発現を増強し、HDACI誘導性アポトーシスに対する感受性を増加させる。(a)U20S細胞にAd-E1AまたはAd-LacZを24時間感染させ、さらに48時間、SAHA(1μM)で処理した。細胞死をFACS分析で測定し(右パネル)、Bimおよびp73のレベルを、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した(左パネル)。(b)正常IMR90細胞および形質転換IMR90-E1A細胞を、示した濃度のSAHAで処理し、細胞増殖を、示した時間にわたって評価した。(c)E1Aの発現は、SAHAおよびTSAに応答した、Bimのアップレギュレーションおよびアポトーシスの増強をもたらす。IMR90細胞およびIMR90-E1A細胞をSAHA(2.5μM)およびTSA(300nM)で48時間処理した。細胞死をFACS分析で測定し(左パネル)、Bimおよびp73のレベルを、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した(右パネル)。(d)Bim siRNAまたは対照siRNA(NC siRNA)でトランスフェクトしたIMR90-E1A細胞をTSA(800nM)で24時間処理した。Bimおよびβ-アクチンの発現を、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した。アポトーシスをFACS分析で評価した。(e)Saos-2細胞をE2F1 siRNAまたは負の対照siRNA(NC siRNA)でトランスフェクトし、TSA(150nM)またはSAHA(1μM)で処理した。E2F1、Bim、およびPARPの発現を、示したタンパク質に対する抗体を用いたイムノブロットで評価した。NS、ローディング対照としての非特異的バンド。アポトーシスはFACS分析で評価した。
図６．SAHAおよびE2F1に関連する細胞死応答およびアポトーシス遺伝子の発現分析。(A).ER-E2F1発現細胞または対照ER発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で1μM SAHAで処理した。48時間後に、細胞を採取し、活性抗カスパーゼ-3について染色した。活性カスパーゼ-3陽性細胞のパーセントを示した。(B).E2F1によって調節されるアポトーシス遺伝子。4-OHTで処理したER-E2F1細胞およびER細胞におけるE2F1依存性遺伝子を示す、Cluster and Tree Viewerで図示したマイクロアレイ分析。赤色は、未処理対照(黒色)と比較してアップレギュレーションしていることを示す。(C).4-OHTの存在下または非存在下でのER-E2F1細胞におけるSAHA応答遺伝子。囲みの中の遺伝子は、Bで特定した推定E2F1標的である。
図７．E2F1はASK1 mRNAおよびASK1タンパク質の蓄積を誘導する。(A).p53ヌルHCT116細胞に、空のレトロウイルス(-)、ER-E2F1野生型発現レトロウイルス(wt)、またはER-E2F1-E132(E132)を感染させ、細胞を未処理のままにしたか(-)、示した期間にわたってOHTで処理した。ASK1 mRNAおよびASK1タンパク質の発現レベルを、それぞれ、RT-PCR(左パネル)およびウエスタンブロット(右パネル)で分析した。(B)U-20S細胞は血清飢餓によってG0(0時)に48時間同調されており、次いで、血清刺激の後に細胞周期に再進入した。対応する細胞周期分布を示した(左パネル)。タンパク質を、細胞周期に放された後、異なる時間で細胞から抽出した。E2F1、ASK1、およびサイクリンEをウェスタンブロッティングで分析した(右パネル)。(C).対照アデノウイルス(-)またはE1A発現アデノウイルス (+)に感染させたU20S細胞およびIMR90細胞におけるASK1、p73およびα-チューブリンタンパク質のウエスタンブロット分析。
図８．E2F1はASK1プロモーターに結合し、活性化する。(A)ヒトASK1プロモーターの模式図。本研究において使用した推定E2F結合部位および欠失コンストラクトを示した。(B)HCT116細胞を、PGL3-basic, E2F1(50ngまたは100ng)と、ASK1プロモーター(-1000/+125)含有ルシフェラーゼレポーターコンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、相対ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、レニラルシフェラーゼ活性に対して標準化した後の倍誘導として示した。(C)E2F1 DNA結合領域のマッピング。HCT116細胞を、示したASK1プロモーター欠失を含有するルシフェラーゼレポーターコンストラクトおよび100ngのE2F1でトランスフェクトした。(D)ER-E2F1発現細胞およびER-E132発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で16時間処理した。ChIPアッセイ法を、抗E2F1抗体または非特異的IgGを用いて行った。-273〜+125のASK1プロモーター領域をPCR増幅した。
図９．ASK1はRb不活性化を介してE2F1標的遺伝子発現を調節する。(A)ER-E2F1発現細胞を、非特異的対照siRNA(NC siRNA)またはASK1特異的siRNAで48時間トランスフェクトし、次いで、未処理のままにしたか(-)、4-OHTで処理した。ASK1、Bim、サイクリンE、およびp73の発現をウェスタンブロッティングで分析した。(B)HCT116細胞を、Bimプロモーター含有ルシフェラーゼレポータープラスミドと、E2F1、Rb、またはASK1発現ベクターで同時トランスフェクトした。さらに、Rb過剰発現の存在下または非存在下での、E2F1を介したBimプロモーター活性化に対するASK1の効果を確かめるために、ASK1発現プラスミドをE2F1と同時トランスフェクトした。
図１０．SAHAは、E2F1を介したASK1誘導を促進する。(A)ER-E2F1発現細胞を、4-OHTの存在下または非存在下で、1μM SAHAで24時間処理した。ASK1およびBimタンパク質レベルをウェスタンブロッティングで評価した。(B)ER-E2F1発現細胞を(A)と同様に処理し、ChIPでE2F1抗体を用いて分析した。ASK1プロモータープライマーを用いたE2F1-ChIPのPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動で分析した。(C)IMR90細胞およびIMR90-E1A細胞をSAHAで24時間処理した。ASK1およびα-チューブリンのレベルをウェスタンブロッティングで評価した。(D)U20S細胞を2.5μM SAHAで、示した時間にわたって処理した。ASK1発現をウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。U20S細胞をNC siRNAおよびE2F1 siRNAで24時間トランスフェクトし、(C)と同様に処理した。E2F1、ASK1、およびα-チューブリンのレベルをウェスタンブロッティングで分析した(左パネル)。
図１１．ASK1発現の抑制は、E2F1活性化時のSAHA誘導性アポトーシスを阻害する。(A)ER-E2F1発現細胞をNC siRNAおよびASK1 siRNAでトランスフェクトし、4-OHTの存在下または非存在下でSAHAで処理した。細胞死はFACS分析で測定した。3回の独立した実験の結果の平均を標準偏差と共に示した。(B)細胞を(A)において処理した。ASK1、Bim、リン酸化p38、p38、リン酸化JNK、JNKのレベルをウェスタンブロッティングで分析した。