(57)【要約】【課題】癌、前癌性障害又は感染症を治療するためのＣＤ４０アゴニストを提供する。【解決手段】本発明は、ＣＤ４０のアゴニストが局所的に投与され、対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される、癌、前癌性障害又は感染症を治療するためのＣＤ４０アゴニストの使用に関する。随意に、ＣＤ４０アゴニストは徐放製剤で処方される。随意に、ＣＴＬ活性化ペプチドがさらに投与される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌、前癌性障害又は感染症を治療するための医薬であって、前記医薬が局所的に投与され対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される医薬を製造するためのＣＤ４０のアゴニストの使用。
【請求項２】
ＣＤ４０のアゴニストが腫瘍内に投与されない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＣＤ４０のアゴニストが皮下に投与される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ＣＤ４０のアゴニストが皮内に投与される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
腫瘍流入領域リンパ節へのターゲティングが、リンパ管造影法の実行において知られているように、リンパ静脈注射を通してＣＤ４０のアゴニストを投与することにより実施される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ＣＤ４０のアゴニストが、抗ＣＤ４０抗体若しくはその断片、ペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機分子である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ＣＤ４０のアゴニストが、抗ＣＤ４０抗体であり、この抗体は好ましくは、ヒト、ヒト化、キメラ又は脱免疫化抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
全身的に投与されるＣＤ４０のアゴニストの量の２５％から５０％が局所的に投与され、腫瘍流入領域リンパ節に標的される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ＣＤ４０のアゴニストが単一用量として投与される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＣＤ４０のアゴニストが最大で３０μｇ投与される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ＣＤ４０のアゴニストが徐放製剤で処方される、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ＣＴＬ活性化ペプチド及び／又は第２の刺激化合物、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
第２の刺激化合物がＣＴＬＡ４遮断抗体である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＣＤ４０のアゴニストが局所的に投与され、腫瘍流入領域リンパ節に標的される、癌、前癌性障害又は感染症を治療するための方法。
【請求項１５】
腫瘍流入領域リンパ節がＣＤ４０のアゴニストの投与後に除去されることになる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、前癌性障害又は感染症を治療するためのＣＤ４０アゴニストであって、局所的に投与され、対象の腫瘍流入領域リンパ節（単数又は複数）に標的されるＣＤ４０アゴニストの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの腫瘍はヒトの免疫系による監視を免れる。癌患者では、腫瘍細胞を除去する免疫系特異的機序に量的及び／又は質的欠損が明らかに存在する。これらの機序の１つは、ウイルスが感染した又は癌細胞に形質転換された細胞を認識して死滅させることが可能な細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により提供される。Ｔヘルパー細胞はヘルパーシグナルをＣＴＬに直接提供する（ＩＬ−２の分泌により）ことはなく、むしろＴヘルパー細胞は、Ｔヘルパー細胞の不在下でＣＴＬを活性化することが可能な部分的にのみ特徴付けられた細胞表面及び／又は可溶性分子を誘発するシグナルを樹状細胞（ＤＣ）に提供することが現在では知られている。Ｔヘルパー細胞によりＤＣに提供されるシグナルは、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用により媒介される。この新しい知見は、癌免疫療法に特有の機会を提供してきた。
【０００３】
ＣＤ４０アゴニスト剤を使用する研究によれば、ＣＤ４０受容体を刺激すると抗腫瘍活性に付随する効果のカスケードを誘発することが報告されている。たとえば、抗原提示細胞上のＣＤ４０受容体を刺激すると、前記細胞の成熟、抗原提示機能、共刺激潜在能力及び前記細胞の免疫調節サイトカイン放出が増強されることが明らかにされている（Ｌｅｅら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９９、９６（４）：１４２１−６；Ｃｅｌｌａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６、１８４（２）：７４７−５２）。これらの免疫刺激性及び直接抗腫瘍効果の重要性は、ＣＤ４０アゴニスト抗体が腫瘍増殖を妨げ腫瘍耐性を逆転させることが明らかにされている動物モデルにおいて例証されている（Ｄｉｅｈｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９９、５（７）：７７４−９；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、６０（１２）：３２２２５−３１）。その上、抗ＣＤ４０アゴニストモノクローナル抗体を全身投与又は腫瘍内注入すれば、腫瘍流入領域リンパ節においてＤＣが活性化される。これらの活性化されたＤＣに誘発されて、腫瘍流入領域リンパ節にのみ属し、ＤＣ媒介活性化の直接の結果として、この時点で腫瘍流入領域リンパ節から遊走する不活性ないわゆる「落ち着いている」腫瘍特異的Ｔ細胞の集団は全身を循環する殺腫瘍性エフェクター細胞になり、腫瘍根絶を媒介する（ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏら、２００２；ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏら、２００４）。
【０００４】
したがって、ＣＤ４０アゴニストの使用は理論上は極めて有望であると思われるが、ヒト臨床試験でのその使用は、毒性と、もっとも重要なのは、発熱、悪寒、及び生命を危うくすることがあり用量制限的である血管効果に特徴付けられるサイトカイン放出症候群と関連付けられてきた（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００７、２５：８７６−８８３）。したがって、癌の治療であって、前記治療がＣＤ４０アゴニストを用いる既知の治療よりも毒性の少ない治療のためにＣＤ４０アゴニストを使用する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
腫瘍流入領域リンパ節（単数又は複数）にＣＤ４０アゴニストを選択的に標的することは、局所投与の一種であり、古典的な全身投与と比べていくつかの利点があることを発明者らは実証した。これは、たとえば、腫瘍の近傍へのＣＤ４０アゴニストの皮下又は皮内注射により実現される局所投与ではあるが、それでも全身性抗腫瘍応答を誘発することになる。いかなる理論にも縛られたくはないが、ＣＤ４０アゴニストを腫瘍流入領域リンパ節に選択的に送達することにより、腫瘍流入領域リンパ節に存在する「落ち着いている」Ｔ細胞が活性化され、局所的Ｔ細胞応答を全身性殺腫瘍性Ｔ細胞応答に変化させることになると本発明者らは予想している（上記参照）。さらに、本発明の決定的に重要な構成要素として、全身投与と比べて用量をかなり低く抑えることができるので、この特定の投与方式に付随する毒性効果は少なくなる。実際、非常に低量のＣＤ４０アゴニストでも、本明細書において後で定義される目的の抗腫瘍効果を誘発するのに使用することが可能であろう。
【０００６】
したがって、第１の態様では、対象において癌、前癌性障害又は感染症を治療するための医薬であって、局所的に投与され前記対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される医薬の製造のためのＣＤ４０のアゴニストの使用が提供される。
【０００７】
ＣＤ４０アゴニスト
本発明の文脈内では、ＣＤ４０アゴニストは、下で定義されるアッセイのうちのどれにおいてもＣＤ４０を発現している対象の細胞、組織又は生体と接触すると、対象のＣＤ４０分子に特異的に結合し、１つ又は複数のＣＤ４０活性を少なくとも約５％増加する又は増強する又は誘発する分子である。一部の実施形態では、アゴニストは１つのＣＤ４０活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は８５％以上活性化する。一部の実施形態では、その活性化はＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）の存在下で生じる。一部の実施形態では、アゴニストの活性は、全血液白血球表面分子上方調節アッセイを使用して測定される。別の実施形態では、アゴニストの活性は、ＩＬ−１２放出を測定する樹状細胞アッセイを使用して測定される。別の実施形態では、アゴニストの活性は、そのＣＴＬの活性化能力を評価することにより測定される。ＣＴＬ活性化は、蛍光的に標識されたモノクローナル抗体及びフローサイトメトリーを使用してＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ６９などの細胞表面マーカーを評価し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトリチウム取込み試験においてその特異的抗原に対する増殖能を決定し、細胞内サイトカイン染色又はＥＬＩＳＡを用いてサイトカイン産生を解析することにより解析することが可能である。別の実施形態では、アゴニストの活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを使用して測定される。この実施形態では、ＰＢＭＣ若しくはリンパ組織切片の四量体染色によってＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞活性を評価することにより、又はＣＤ４、ＣＤ８並びにインターフェロンガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＴＮＦアルファを含む異なるサイトカインについて同時に染色するＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の細胞内サイトカイン染色により、又は異なった濃度のカラーＣＦＳＥを用いて染色され、特異的標的ペプチドを若しくは無関係なペプチドを充填された静脈内注射される脾臓標的細胞を利用するｉｎ  ｖｉｖｏ細胞障害性アッセイにより、アゴニストの活性が測定される。
【０００８】
ＣＤ４０のアゴニストの活性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタン免疫ブロット法、又は樹状細胞若しくはＴ細胞上の免疫化学若しくはＲＮＡ発現アッセイなどの他の技術により試験することが可能である。
【０００９】
好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストはアゴニストＣＤ４０抗体である。本発明のＣＤ４０アゴニストは、従来の作製及びスクリーニング技術により作製可能である。ラット及びハムスター抗マウスＣＤ４０モノクローナル抗体（「Ｍａｂ」）はそれぞれ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−７７（１９９８）に記載されており、市販されている（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｉｎｃ．、ＣＡ）。下に記載されている実験において使用されるＦＧＫ４５と命名された抗マウスＣＤ４０抗体は、Ｒｏｌｉｎｋ．Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５、３１９−３３０（１９９６）により記載されている。好ましい実施形態では、ヒト対象を治療するために、抗ヒトＣＤ４０抗体又はヒトＣＤ４０抗体が使用される。そのようなヒト抗体は、当技術分野で公知の、Ｇ．Ｋｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５：２５６：４９５−４９７）により記載されている技術に従って作製することが可能である。本明細書で使用されているように、用語「ヒト抗体」とは、可変及び定常ドメイン配列がヒト配列に由来する抗体のことである。ヒトＣＤ４０抗体は、ＷＯ０３／０４０１７０に詳細に記載されている。ヒト抗体は、ヒト患者において非ヒト抗体の使用に付随する免疫原性及びアレルギー応答を最小化すると予想されるので、本発明の使用においてはかなりの利点を提供する。
【００１０】
抗体は、細胞上で発現される又はヒト血漿若しくは尿から精製される陰性ＣＤ４０或いは、真核生物又は原核生物系において発現される組換えＣＤ４０又はその断片のいずれかを用いて齧歯類（たとえば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット）を免疫することにより作製することが可能である。他の動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒト免疫グロブリンを発現しているトランスジェニックマウス及びヒトＢリンパ球を移植された重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスは、免疫化のために使用することが可能である。ハイブリドーマは、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５：２５６：４９５−４９７により記載されているように、免疫動物由来のＢリンパ球と骨髄腫細胞（たとえば、Ｓｐ２／０及びＮＳＯ）を融合することにより従来の手法で作製することが可能である。さらに、抗ＣＤ４０抗体は、ファージディスプレイシステムにおいてヒトＢリンパ球由来の組換え一本鎖Ｆｖ又はＦａｂライブラリーのスクリーニングにより作製することが可能である。
【００１１】
ヒト対象を治療するために、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、好ましくは、キメラ、脱免疫化、ヒト化又はヒト抗体であると考えられる。そのような抗体は、免疫原性を減少させ、したがって、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を回避することが可能である。抗体は、ＩｇＧ４、ＩｇＧ２、又は抗体依存性細胞障害性（Ｓ．Ｍ．Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９１：１７３：１４８３−１４９１）及び補体媒介細胞溶解（Ｙ．Ｘｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４：２６９：３４６８−３４７４；Ｖ．Ｌ．Ｐｕｌｉｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６；１５６：２８４０−２８５０）を増大しない他の遺伝的突然変異ＩｇＧ若しくはＩｇＭであることが好ましい。
【００１２】
キメラ抗体は、当技術分野で公知の組換え方法により作製してもよく、動物可変領域及びヒト定常領域を有している。ヒト化抗体は通常、ヒトペプチド配列の程度がキメラ抗体よりも大きい。ヒト化抗体では、抗原結合及び特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが動物由来であり、動物抗体に相当するアミノ酸配列を有しており、前記分子の残りの部分のほぼすべて（一部の場合には、可変領域内のフレームワーク領域の小部分を除いて）がヒト由来であり、アミノ酸配列がヒト抗体に一致している（Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８；３３２：３２３−３２７；Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．Ｃ．Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５５３０１０１号を参照）。
【００１３】
脱免疫化抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９８／０１４７３に記載されているように、Ｔ及びＢ細胞エピトープが除去されている抗体である。脱免疫化抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて適用されると免疫原性を減少させた。
【００１４】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン発現ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してヒト抗体ＶＨ、ＶＬ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ’）２の断片を作製し、これらの断片を使用してキメラ抗体を作製するための技術に類似する技術を使用して全ヒト抗体を構築することによるものを含むいくつかの異なる方法により作製することが可能である。代わりに、これらの断片を単独でアゴニストとして使用してもよい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンゲノムを有するトランスジェニックマウス中で作製することも可能である。そのようなマウスは、Ａｂｇｅｎｉｘ．Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、及びＭｅｄａｒｅｘ．Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｎｄａｌｅ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手可能である。
【００１５】
重鎖と軽鎖のＦｖ領域が連結されている単一ペプチド鎖結合分子を作製することも可能である。一本鎖抗体（「ＳｃＦｖ」）及びその構築法は、米国特許第４９４６７７８号に記載されている。代わりに、Ｆａｂを類似の手段により構築し発現することが可能である（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１９９５；１８４：１２３−１３８）。全体的又は部分的ヒト抗体のすべてが全体的マウスＭＡｂよりも免疫原性は少なく、その断片及び一本鎖抗体も免疫原性が少ない。したがって、これらの種類の抗体はすべて、免疫又はアレルギー応答を誘発する可能性は少ない。したがって、これらの種類の抗体は、特に反復又は長期投与が必要な場合には、全体的動物抗体よりもヒト対象におけるｉｎ  ｖｉｖｏ投与により適している。さらに、抗体断片のサイズが小さいほうが、腫瘍治療などの急性疾患徴候におけるより良好な用量蓄積に決定的に重要である可能性がある組織バイオアベイラビリティーを改善するのに役立つ可能性がある。好ましいヒト抗ＣＤ４０抗体はＷＯ２００５／０６３２８９に広範に記載されている。
【００１６】
抗ＣＤ４０抗体の可変領域の分子構造に基づいて、分子モデリング及び合理的分子設計を使用すれば、抗体の結合領域の分子構造を模倣しＣＴＬを活性化する分子を作製しスクリーニングすることができるであろう。これらの小分子は、ペプチド、ペプチド模倣薬、オリゴヌクレオチド、又は他の有機化合物であることが可能である。模倣分子は癌の治療のために使用することが可能である。代わりに、当分野で一般的に使用されている大規模スクリーニング法を使用すれば、化合物のライブラリーから適切な分子を単離することができるであろう。一実施形態では、いくつかのＣＤ４０アゴニストは、同時に又は順次使用される。
【００１７】
投与
本発明は、ＣＤ４０アゴニストが対象、好ましくはヒト対象に投与される方法にある。ＣＤ４０アゴニストは好ましくは局所的に投与され、対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される。重要なのは、ＣＤ４０アゴニストの局所投与が実施されることである。換言すれば、本発明は、ＣＤ４０アゴニストの全身投与に向けられてはいない。好ましくは、本発明は、対象にＣＤ４０アゴニストを局所的に投与する特定の方法を定義している。ＣＤ４０アゴニストの局所投与は、好ましくは対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される。さらに好ましい実施形態では、腫瘍流入領域リンパ節に標的される局所投与は、腫瘍流入領域リンパ節の近傍に又はその内部にＣＤ４０アゴニストを投与することにより実現される。この文脈では、「近傍に」は好ましくは、腫瘍流入領域リンパ節から約数ｃｍ又は数ｃｍ以内を意味する。この文脈では、「近傍に」は好ましくは腫瘍流入領域リンパ節の部位から離れても数ｃｍ以内を意味する。ＣＤ４０アゴニストそれ自体は腫瘍流入領域リンパ節に直接投与されない。しかし、ＣＤ４０アゴニストの投与は、投与されたＣＤ４０アゴニストが好ましくは腫瘍流入領域リンパ節中に選択的に送達されるものである。ＣＤ４０アゴニストは、好ましくは腫瘍流入領域リンパ節に間接的に投与される、又は選択的に投与される、又は標的される。すなわち、ＣＤ４０アゴニストは腫瘍流入領域リンパ節に直接的に投与されるのではなく、ＣＤ４０アゴニストの投与法により、好ましくは最初に投与されるＣＤ４０アゴニストの少なくとも３０％が腫瘍流入領域リンパ節に到達することになる。好ましくは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％である。腫瘍流入領域リンパ節におけるＣＤ４０アゴニストの存在は、好ましくは生検への免疫染色又は６８０〜７００ｎｍの範囲の蛍光基（たとえば、ＡＬＥＸＡ−ｆｌｏｕｒ基）で標識された特定のＣＤ４０アゴニスト抗体（好ましくは、実施例において同定されたＦＧＫ４５）であって、対象に注射され、手術中蛍光的に標識された抗体はカメラを用いて検出することが可能である（カメラ誘導手術）前記抗体のバイオイメージングにより評価される。
【００１８】
好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは腫瘍内に投与されることはない。腫瘍はそれぞれ異なり（すなわち、血管新生、組織分布、浸透圧等）、したがって、化合物の腫瘍内投与は標準化することができず、治療効果は予測不可能であることがあるために、腫瘍内投与は必ずしも好ましいものではない。
【００１９】
好ましい実施形態では、ＣＤ４０のアゴニストは、皮下又は皮内注射を介して局所的に投与され対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される。さらに好ましくは、皮下又は皮内注射は対象の腫瘍流入領域リンパ節に直接実施される。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、注射位置は、腫瘍とそれにもっとも近い腫瘍流入領域リンパ節間領域に、又は腫瘍流入領域リンパ節に直にある。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストはリンパ管に投与される。さらに好ましいリンパ管は、足背にあるリンパ管である。このさらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０のアゴニストは、リンパ管造影法を実施する際に使用されるのに類似する技術を使用する前記対象のリンパ節への傍大動脈注射により、局所的に投与され対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される（Ｇｕｅｒｍａｚｉら、Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈ．２００３：２３：１５４１−１５６０  ａｎｄ  Ｆｏｌｌｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．２００３：９８：２０２８−２０３８）。リンパ管造影法という方法論により、薬物、この場合はＣＤ４０アゴニストの投与は足背において実施され、その後、薬物はリンパチャネルを選択的に進んで、これらのリンパ管が流れ込むリンパ節に入る。足背における投与（Ｆｏｌｌｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．２００３：９８：２０２８−２０３８）の場合には、薬物は、骨盤のリンパ節をその後傍大動脈節を選択的に目指すことになる。これは、本明細書において後に定義される婦人科腫瘍の治療のための有利な投与法である。
【００２２】
したがって、本発明は、足背への注射、骨盤のリンパ節への注射（直接的に又は足背への注射の結果として間接的に）、傍大動脈注射（直接的に又は足背への注射を介して若しくは骨盤のリンパ節への注射を介して間接的に）を包含する。
【００２３】
本発明の文脈内では、皮下注射は好ましくは、腫瘍の近傍への皮下注射を意味し、前記腫瘍は好ましくは皮下又は皮内局在性を有する。本発明の文脈内では、皮内注射は好ましくは、腫瘍のすぐ近傍への皮内注射を意味し、前記腫瘍は好ましくは皮下又は皮内局在性を有する。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０のアゴニストは、局所的に投与され、リンパ静脈注射を通じて腫瘍流入領域リンパ節に標的される。これは、リンパ管造影法の分野の当業者などの当業者に既知の技術である。
【００２４】
ＣＤ４０アゴニストを１つ又は複数の腫瘍流入領域リンパ節（単数又は複数）に順次又は同時に、好ましくは皮下に局所的に投与し標的することが本発明ではさらに包含されている。ＣＤ４０アゴニストを１つの腫瘍流入領域リンパ節に、好ましくは皮下に、皮内に及び／又はリンパ管造影法でのようにいくつかの直接リンパ静脈注射により局所的に投与して標的することも本発明により包含されている。
【００２５】
腫瘍流入領域リンパ節への局所投与及び標的化にはいくつかの利点がある。先ず第１に、この方法はＣＤ４０アゴニストを、腫瘍流入領域リンパ節に存在するＤＣにほぼ直接送達することになる。そのような活性化されたＤＣは今度は、当業者には既知のＣＴＬを活性化することになる。第２に、これは局所投与であるために、毒性は減少されると予想される。このことは実施例において特に実証されている。第３に、本明細書において実証されるように及び本明細書において広範に説明されるように、この局所投与は比較的低用量のＣＤ４０アゴニストの使用を可能にする。第４に、驚くべきことに、これは局所投与であるが、免疫系の全身的活性化が実施例において実証されている。
【００２６】
本明細書において同定されるＣＤ４０のアゴニストを使用すれば、好ましくは治療効果を生じる。治療効果は、抗腫瘍及び／又は抗感染性効果であり得る。抗腫瘍効果は、好ましくは、
全身免疫系の活性化又は誘発：末梢血中の腫瘍特異的活性化ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の検出可能及び／若しくは前記細胞の増加、又は少なくとも治療１週間後のその増加若しくはこれらＴ細胞により産生されるサイトカインの増加、並びに／或いは
腫瘍細胞の増殖の抑制、並びに／或いは
腫瘍細胞死の誘発又は誘発の増加、並びに／或いは
腫瘍重量又は増殖の増加の抑制又は予防又は遅延、並びに／或いは
少なくとも１カ月、数カ月又はそれ以上の患者生存の延長（治療を受けなかった又はアイソタイプ対照を用いて治療された患者と比べて）
として確認される。
【００２７】
少なくとも治療１週間後の末梢血中の腫瘍特異的活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の顕著な増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％以上であり得る。腫瘍細胞の増殖の抑制は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上であり得る。腫瘍細胞死の誘発は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上であり得る。腫瘍増殖は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上抑制され得る。ある種の実施形態では、腫瘍重量増加は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上抑制され得る。ある種の実施形態では、腫瘍増殖は、少なくとも１週間、１カ月、２カ月以上遅延され得る。
【００２８】
本明細書において同定されるＣＤ４０のアゴニストの使用は、好ましくは抗感染性効果を生じる。抗感染性効果は好ましくは、
全身免疫系の活性化又は誘発：特に感染因子に対して又は感染細胞に対して向けられる末梢血中の特異的活性化ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞（すなわち、本明細書では感染特異的活性化ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋細胞と呼ばれる）の検出可能及び／若しくは前記細胞の増加、又は少なくとも治療１週間後のその増加若しくはＴ細胞により産生されるサイトカインの増加、並びに／或いは
感染細胞の又は感染因子の増殖の抑制、並びに／或いは
感染細胞又は感染因子の死の誘発又は誘発の増加、並びに／或いは
感染細胞又は感染因子の数の増加の抑制又は予防又は遅延、並びに／或いは
少なくとも１カ月、数カ月以上の患者生存の延長（治療を受けなかった又はアイソタイプ対照を用いて治療された患者と比べて）
として確認される。
【００２９】
少なくとも治療１週間後の末梢血中の感染特異的活性化ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の顕著な増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％以上であり得る。感染細胞（又は感染因子）の増殖の抑制は、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上であり得る。感染細胞（又は感染因子）の死の誘発は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上であり得る。感染細胞の数の増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％以上抑制され得る。
【００３０】
ＣＤ４０のアゴニストの効果が定量化される各実施形態では、アッセイは、治療を受けていない対象又は治療前の同一対象との比較により実施してもよいし、免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体を用いて治療された対象と比較して実施してもよい。一部の実施形態では、腫瘍はＣＤ４０陽性である。一部の実施形態では、腫瘍はＣＤ４０陰性である。腫瘍は固形腫瘍でも、リンパ腫などの非固形腫瘍でも可能である。本発明を使用して治療することが可能な腫瘍又は感染の一部の種類は、本明細書において後で広範に同定される。
【００３１】
本発明のアゴニストの投与量は、下に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験及びアッセイからの、又は動物実験からの又はヒト臨床試験からの外挿により容易に決定することが可能である。腫瘍流入領域リンパ節に標的されたＣＤ４０の所与のアゴニストの１回分を局所投与すれば、さらに高用量の同一アゴニストの全身投与を使用するのと同じ抗腫瘍効果を誘発することが可能であることを本発明者らは実証した。したがって、本発明は、比較的低用量のＣＤ４０アゴニストの使用を可能にする。「比較的低い」は好ましくは、全身的に投与されるＣＤ４０のアゴニストの用量（量）のほぼ２〜２０％を意味する。比較的低いは、ほぼ３０から６０％、４０から７０％、又は５０％から８０％のアゴニストを意味してもよい。比較的低いは、ほぼ２０から４０％、１５から３０％、又は１０％から２０％のアゴニストを意味してもよい。「比較的低い」は好ましくは、全身的に投与されるＣＤ４０のアゴニストの用量（量）の２〜２０％を意味する。比較的低いは、３０から６０％、４０から７０％、又は５０％から８０％のアゴニストを意味してもよい。比較的低いは、２０から４０％、１５から３０％、又は１０％から２０％のアゴニストを意味してもよい。好ましい実施形態では、少なくも２０μｇ、好ましくは少なくとも３０μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも１００μｇのＣＤ４０アゴニストの用量が単回投与で局所的に投与され腫瘍流入領域リンパ節に標的される。さらに好ましい実施形態では、多くて１００μｇ、多くて９０μｇ、多くて８０μｇ、多くて７０μｇ、多くて６０μｇ、多くて５０μｇ、多くて４０μｇ、多くて３０μｇ、多くて２０μｇの単回投与が局所的に投与され、腫瘍流入領域リンパ節に標的される。３０μｇのＣＤ４０アゴニストの単回投与を用いて非常に良好な結果が得られた。
【００３２】
ＣＤ４０アゴニストを用いて治療することが可能な対象には、癌、前癌性障害又は感染症に罹っていると診断された対象が挙げられるが、これに限定されることはない。癌の例には、脳癌、肺癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、結腸癌、婦人科腫瘍（たとえば、子宮肉腫、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫若しくは外陰部の癌腫、ＨＰＶ由来癌）、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌（たとえば、甲状腺、副甲状腺若しくは副腎の癌）、軟組織の肉腫、白血病、骨髄腫、多発性骨髄腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、慢性若しくは急性白血病、小児の固形腫瘍、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱の癌、肝癌、腎癌、腎臓若しくは尿管の癌（たとえば、腎細胞癌、腎盂の癌腫）、又は中枢神経系の腫瘍（たとえば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫若しくは下垂体腺腫）、神経膠腫又は線維肉腫が挙げられる。感染症の例には、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＴＬＶ  Ｉ、ヘルペスウイルス８型（カポジ肉腫因子）、ＥＢＶ又はＨＩＶ感染などの癌をもたらし得る感染が挙げられる。
【００３３】
本明細書において使用されるように、用語「対象」とは、好ましくは、交差反応するＣＤ４０を発現するヒト又は非ヒト哺乳動物（たとえば、霊長類、カニクイザル若しくはアカゲザル）のことである。好ましくは、治療を受ける対象はヒトである。
【００３４】
好ましい実施形態では、ＣＤ４０のアゴニストの単回投与は、局所的に施され腫瘍流入領域リンパ節に標的される。先行技術では、通常、ＣＤ４０アゴニストの数回連続全身投与が使用されて、所与の効果を得ている（たとえば、ＷＯ２００５／０６３２８９参照）。これは、対象にとっては至極不便で煩わしい。さらに、毒性は通常、極めて高い。実施例において実証されるように、驚くべきことに、局所的に投与され腫瘍流入領域リンパ節に標的されるＣＤ４０アゴニストの単回投与が、免疫系の全身性活性化を誘発して特定の抗腫瘍性又は抗感染性応答を得るだけの活性があることを発明者らは発見した。さらに、ＣＤ４０アゴニストのこの投与に伴う毒性効果は比較的少ない又は全くなかった。
【００３５】
さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは、いわゆる徐放製剤又は徐放媒体で処方される。そのような製剤は遅延放出又は放出制御の製剤とも名付けられている。放出制御製剤は、その活性成分の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％を制御された形態で、すなわち、ＣＤ４０アゴニストを１日、１週間、２週間、３週間、１カ月、又はそれより長い期間のうちに放出する製剤である。放出速度は、デキストラン分子及び架橋剤と製剤内部の含水量間の比により調整することが可能であり、治療化合物への要求される曝露期間に応じて適合させることが可能である。好ましい架橋剤はメタクリル酸である。この種の製剤はいくつかの利点があり、すなわち、先ず、そのような種類の製剤で投与されるとＣＤ４０アゴニストはこの製剤から放出されると長時間にわたり送達されることになるので、ＣＤ４０アゴニストの投与を繰り返す必要がなくなると予想される。そのような長時間は、使用される徐放製剤の種類に応じて１日から、１週間、１カ月から数カ月まで変化してよい。第２に、極めて低い局所量のＣＤ４０アゴニストが検出可能だと予想されるので、毒性はさらに減少すると予想される。そのような低局所量は、同一抗体を用いた全身治療に必要とされる用量の１０分の１でよいと予想される。そのような「低」量はどんな毒性も誘発するとは予想されないが、本明細書において定義される抗腫瘍又は抗感染性効果を誘発するには機能的であると予想される。本発明は特定の種類の徐放製剤に限定されない。ミネラルオイル（たとえば、モンタニド  ＩＳＡ  ５１）又は多（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）又はポリマーベース製剤などの数種類の徐放製剤がすでに知られている。ポリマーベース製剤の例は、ＷＯ２００５／１１０３７７に記載されている荷電ポリマーを含むゲル組成物又はＷＯ０２／１７８８４若しくはＷＯ２００５／０５１４１４若しくは米国特許第３７１０７９５号に記載されているデキストランハイドロゲルを含む組成物である。好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは、３０％、４０％、５０％、６０％含水量を含むデキストランハイドロゲルを用いて処方される。さらに好ましくは、含水量は４５％と５５％の間の範囲であり、さらに好ましくはほぼ５０％である又は５０％である。好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０μｇのＣＤ４０アゴニストがそのようなデキストランハイドロゲルに処方される。ＣＤ４０アゴニストが５μｇで５０％の含水量を有するデキストランハイドロゲルは、実験の部において魅力的であることが分かった。すなわち、前記デキストランハイドロゲルは可能なもっとも緩徐な製剤を示しているように思われ、血清中ではＣＤ４０アゴニストは検出可能ではなく、Ｔ細胞応答への効果は検出可能であった（実験の部参照）。
【００３６】
別のさらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは、ＤＣにより特異的に認識されることになる化合物に連結される又は融合される又は会合される又は混合される。この方法であれば、リンパ節内部のＤＣへのＣＤ４０アゴニストのターゲティングはさらに改善されると予想される。そのような化合物の例は、ＤＣ上のＤＣ−ＳＩＧＮ  Ｃ型レクチンのリガンドであり、このリガンドはＤＣの表面上に存在するＤＣ−ＳＩＧＮに結合することになる。別の例は、ＤＣ上のＤＥＣ−２０５分子のリガンドである。（Ｂｏｚｚａｃｃｏ，Ｌ．、Ｔｒｕｍｐｆｈｅｌｌｅｒ，Ｃ．、Ｓｉｅｇａｌ，Ｆ．Ｐ．、Ｍｅｈａｎｄｒｕ，Ｓ．、Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｍ．、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｍ．Ｃ．、Ｐｉｐｅｒｎｏ，Ａ．Ｇ．、ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．（２００７）．ＤＥＣ−２０５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  Ｉ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０４、１２８９−１２９４）
【００３７】
他の分子／治療
ある実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは別の分子及び／又は別の治療と一緒に（同時に又は順次）使用される。別の治療の例には、化学療法、放射線療法などの別の古典的癌治療が挙げられる。別の分子の例には、シスプラチンなどのＤＮＡ複製阻害剤並びに／又はペプチド、好ましくはＣＴＬ活性化ペプチド及び／若しくはＴヘルパー活性化ペプチド並びに／又は別の化合物が挙げられる。
【００３８】
好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは、免疫系を刺激することができる別の化合物又は分子、すなわち免疫刺激性化合物であって、今後第２の刺激化合物と名付けられる別の化合物又は分子と組み合わせて使用される。前記第２の刺激化合物による免疫系、好ましくは全身免疫系の活性化又は誘発は、本明細書において前で定義済みである。好ましい第２の化合物は抗体である。好ましい抗体には、ＣＴＬＡ４−遮断抗体、抗ＯＸ４０活性化抗体及び抗４１ＢＢ活性化抗体が挙げられる。ＣＤ４０アゴニストと第２の刺激化合物は同時に投与されてもよいし順次投与されてもよい。さらに好ましくは、ＣＤ４０アゴニストと第２の刺激化合物は単一組成物に、さらに好ましくは本明細書において前で定義された徐放製剤に処方される。実施例において実証されるように、これらの２つ又はそれ以上の化合物の使用により、Ｔ細胞の相乗的活性化が可能になる。ヒトにおいて使用することが可能な好ましいＣＴＬＡ４−遮断抗体は、Ｃａｍａｃｈｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００９）、２７：１０７５−１０８１に記載されている。
【００３９】
ＣＤ４０抗体と組み合わせて使用されるＣＴＬ活性化ペプチドは、ＷＯ９９／６１０６５に広範に記載されている。ＣＴＬ活性化ペプチド又はＴヘルパー活性化ペプチドは、好ましくは腫瘍由来又はウイルス由来ペプチドである。ＣＴＬ活性化ペプチド又はＴヘルパー活性化ペプチドは、いかなる長さにも限定されるものではない。しかし、そのようなペプチドは、１９から４５までのアミノ酸を含む長さを有するのが好ましい。前記アミノ酸配列は、好ましくは、全体的に又は部分的に腫瘍細胞により発現されるタンパク質由来である。ペプチド内部に含まれるタンパク質由来の隣接するアミノ酸配列の長さは、好ましくは、１９〜４５、２２〜４５、２２〜４０、２２〜３５、２４〜４３、２６〜４１、２８〜３９、３０〜４０、３０〜３７、３０〜３５、３２〜３５、３３〜３５、３１〜３４アミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、ペプチドは、タンパク質のうちの２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５又は４５を超える隣接するアミノ酸残基を含む。好ましいＣＴＬ活性化ペプチド又はＴヘルパー活性化ペプチドは、癌がＨＰＶ関連癌である及び／又は感染がＨＰＶ感染である場合には、ＨＰＶタンパク質由来である。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、ＣＴＬ活性化ペプチド又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ２、Ｅ６及びＥ７、ｐ５３、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連タンパク質、又は他の任意の腫瘍関連若しくは腫瘍特異的タンパク質又は任意の感染性関連若しくは感染性特異的タンパク質のアミノ酸配列由来の９〜４５アミノ酸長の隣接するアミノ酸配列のどれからでもなる。ＨＰＶセロタイプ１６Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に描かれている。ＨＰＶセロタイプ（抗原型）１８Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に描かれている。ヒトｐ５３のアミノ酸配列は、配列番号７に描かれている。
【００４１】
好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ２、Ｅ６又はＥ７由来である。実験の部では、異なる腫瘍関連タンパク質由来の２つのペプチドが、本発明の文脈において使用される適切なペプチドの例として使用されている。すなわち、１つのペプチドは長い合成ＣＥＡペプチドとして同定されており、複数の異なる上皮腫瘍型で過剰発現されている癌胎児性抗原（ＣＥＡ）由来であり、第２のペプチドは、長い合成ＨＰＶペプチドであり、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質由来である。さらに好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ２、Ｅ６又はＥ７由来であり、ＷＯ０２／０７０００６に開示されている。好ましくは、ＨＰＶ  Ｅ２、Ｅ６又はＥ７タンパク質の完全長アミノ酸配列から選択される隣接アミノ酸配列を含む又はそれらからなるＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、セロタイプ１６、１８、３１、３３又は４５などの高リスクＨＰＶセロタイプ由来であり、さらに好ましくはＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７セロタイプ１６、１８、３１又は３３のアミノ酸配列由来であり、もっとも好ましくはセロタイプ１６又は１８由来で、このうち１６がもっとも好ましい。
【００４２】
Ｅ２由来の好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸４６〜７５、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸５１〜７０、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸６１〜７６、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸１５１〜１９５、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸３１６〜３３０、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸３１１〜３２５、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸３２６〜３５５、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸３４６〜３５５、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質のアミノ酸３５１〜３６５からなる、又はそれらを含む。
【００４３】
Ｅ６由来の好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１〜３２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１１〜３２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３〜２２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１９〜５０、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸２９〜３８、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸３７〜６８、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸４１〜６５、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸５２〜６１、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸５１〜７２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５〜８０、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸５５〜８６、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸６１〜８２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１〜９５、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸７３〜１０５、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸８５〜１０９、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１１２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸９１〜１２２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１０１〜１２２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１０９〜１４０、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２１〜１４２、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９〜１３８、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２７〜１４０、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２７〜１５８、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１２９〜１３８、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１３７〜１４６、ＨＰＶ  Ｅ６タンパク質のアミノ酸１４９〜１５８からなる、又はそれらを含む。
【００４４】
Ｅ７由来の好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３２、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸１〜３５、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸１１〜１９、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸２１〜４２、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸２２〜５６、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜７７、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸３５〜５０、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸５０〜６２、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸４３〜７７、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１〜７２、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸６４〜９８、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質のアミノ酸７６〜８６からなる、又はそれらを含む。
【００４５】
別の好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ｐ５３タンパク質、好ましくはヒトｐ５３由来である。ｐ５３由来の好ましいＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドは、ｐ５３タンパク質のアミノ酸８６〜１１５、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１０２〜１３１、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１０１〜１１０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１１２〜１２０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１１３〜１２０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１１３〜１２２、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１１７〜１２６、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１４２〜１７１、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１４９〜１５７、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１５４〜１６３、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１５４〜１６４、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１５６〜１６３、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１５６〜１６４、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１５７〜１８６、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１７２〜１８１、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１９０〜２１９、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１９６〜２０５、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２０５〜２１４、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２２４〜２４８、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２２５〜２５４、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２４１〜２７０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２５７〜２８６、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２２９〜２３６、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２６４〜２７２、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２７３〜３０２、ｐ５３タンパク質のアミノ酸２８３〜２９１、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３０５〜３３４、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３１１〜３１９、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３１１〜３２０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３１２〜３１９、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３２２〜３３０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３４０〜３４８、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３５３〜３８２、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３６０〜３７０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３６３〜３７０、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３６３〜３７２、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３６９〜３９３、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３７３〜３８１、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３７４〜３８２、ｐ５３タンパク質のアミノ酸３７６〜３８６からなる、又はそれらを含む。
【００４６】
本発明は、そのアミノ酸配列が本明細書において同定される配列の１つと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％の同一性を有し、このペプチドがＨＰＶ  Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７又はｐ５３タンパク質ではないＣＴＬ活性化又はＴヘルパー活性化ペプチドをさらに包含する。好ましくは、ペプチドは同定されている配列の１つとのその同一性により定義され、本明細書において前で同定された長さを有する。同一性は、確実に最大数の同一アミノ酸が得られるように両方の配列を整列した後に２つの配列間の同一アミノ酸の数を明確にすることにより計算される。
【００４７】
本発明において使用されるそのような長さのペプチドは容易に合成され得る。最近当技術分野では、ペプチドを作製する多くの方法が知られている。本発明は、作製されたペプチドが所与の配列のどれでもを含み、それらからなり又はそれらと重複し、本明細書において前で定義された必要な活性を有している限り、どのような形態の作製されたペプチドにも限定されることはない。ペプチドは単一ペプチドとして存在してもよいし、融合タンパク質に組み込まれていてもよい。ペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸の欠失又は置換により、追加のアミノ酸又は官能基を用いたＮ−及び／若しくはＣ−終端での伸長によりさらに改変されてもよく、これによりＴ細胞をターゲティングするバイオアベイラビリティーが改善され得る、又はアジュバント若しくは（同時）刺激性機能を提供する免疫調節物質が含まれ得る若しくは放出され得る。Ｎ−及び／又はＣ−終端での随意の追加のアミノ酸は、好ましくは、そのアミノ酸が由来するタンパク質のアミノ酸配列中の対応する位置には存在しない。代わりに、腫瘍細胞は治療を受ける対象から単離されてもよく、ＣＴＬ活性化ペプチドはこれらの腫瘍細胞から同定され、続いて短い又は長い合成ペプチドとして処方されてもよい。
【００４８】
さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０アゴニスト及び随意にＣＴＬ活性化ペプチド及び／又はＴヘルパー細胞活性化ペプチドは、組成物として処方される。好ましくは、組成物は医薬組成物である。そのような医薬組成物は、好ましくは医薬賦形剤及び／又は免疫モジュレータをさらに含む。どんな既知の不活性な薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤でも組成物に添加され得る。医薬の製剤、及び薬学的に許容可能な賦形剤の使用は当技術分野では既知であり習慣的であり、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００５，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。
【００４９】
本発明において使用されるＣＤ４０アゴニスト及び随意にＣＴＬ活性化ペプチドは、好ましくはわずか３５％から減少して０％まで；３５、２０、１０、５又は０％ＤＭＳＯを含む生理学的に許容可能な水溶液（たとえば、ＰＢＳ）に可溶性である。そのような溶液では、ＣＤ４０アゴニストは、好ましくはｍｌあたり少なくとも０．５、１、２、４、６、８又は１０ｍｇＣＤ４０アゴニストの濃度で可溶性である。そのような溶液では、ＣＴＬ活性化ペプチドは、好ましくはｍｌあたり少なくとも０．５、１、２、４、又は８ｍｇペプチドの濃度で可溶性である。
【００５０】
どんな既知の免疫モジュレータも、本明細書に定義される組成物に添加してよい。好ましくは、免疫モジュレータはアジュバントである。さらに好ましくは、組成物は、本明細書において前で定義されたペプチド及び少なくとも１つのアジュバントを含む。アジュバントは、モンタニド若しくはＰＢＳ中に処方される、フロイント不完全アジュバント、モンタニドＩＳＡ５１（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）、モンタニド７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）又はＴＬＲリガンドなどの水中油型エマルジョンであることが可能である。この種の医薬は単回投与として投与してよい。代わりに、ＣＤ４０アゴニスト及び随意に本明細書において前で定義されたＣＴＬ活性化ペプチド及び／若しくはアジュバントの投与は必要であれば繰り返してよく、並びに／又は異なるＣＤ４０アゴニスト及び／若しくは異なるＣＴＬ活性化ペプチド及び／若しくは異なるアジュバントを順次投与してよい。
【００５１】
特に好ましいアジュバントは、トール様受容体（ＴＬＲ）を介して作用することが知られているアジュバントである（Ｋａｗａｉ  ＆  Ｓ．Ａｋｉｒａ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｏ  ＮＦ−κＢ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．１３，ｐ．４６０−４６９，２００７）。自己免疫系を活性化することができるアジュバントは、ＴＬＲ１〜１０を含むトール様受容体（ＴＬＲ）を介して及び／又はＲＩＧ−１（レチノイン酸誘導性遺伝子−１）タンパク質を介して及び／又はエンドセリン受容体を介して特によく活性化されることが可能である。ＴＬＲ受容体を活性化することができる化合物、並びにその改変物及び誘導体は、当技術分野では十分に実証されている。ＴＬＲ１は、細菌性リポタンパク質及びそのアセチル化型により活性化され得る。ＴＬＲ２は、さらに、グラム陽性菌糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、線毛、外膜タンパク質、細菌由来若しくは宿主由来熱ショックタンパク質、及びマイコバクテリアリポアラビノマンナンにより活性化され得る。ＴＬＲ３は、特にウイルス起源のｄｓＲＮＡにより、又は化合物ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）により活性化され得る。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主由来又は細菌性起源由来の熱ショックタンパク質、ウイルス外被又はエンベロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、オリゴ糖を含有するヒアルロン酸及びフィブロネクチンにより活性化され得る。ＴＬＲ５は、細菌鞭毛又はフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を用いて活性化され得る。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアリポタンパク質及びＢ群連鎖球菌熱不安定性可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ）又はブドウ球菌モデュリン（ｍｏｄｕｌｉｎｓ）により活性化され得る。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリン及び誘導体により活性化され得る。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ又はクロマチン−ＩｇＧ複合体により活性化され得る。特にＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する自己免疫応答を媒介するのに重要な役割をはたしており、これらの受容体を活性化することができる化合物は本発明における使用のために特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡ  ＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニストを誘発するｄｓＲＮＡ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡを含む合成的に作製される化合物を含むが、これらに限定されることはない。別の好ましい実施形態では、アジュバントは、本明細書において前で定義されたペプチドに物理的に連結されている。ペプチドを含むＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープへのアジュバント及び同時刺激性化合物又は官能基の物理的連結により、抗原を内部に取り込み、代謝し、表示する抗原提示細胞、特に樹状細胞の同時刺激によって増強された免疫応答が提供される。別の好ましい免疫改変化合物は、Ｔ細胞接着阻害剤であり、さらに好ましくは、ＢＱ−７８８などのエンドセリン受容体の阻害剤である（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ  ＲＪら，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，ＰＮＡＳ（１９９４）９１：４８９２）。ＢＱ−７８８は、Ｎ−シス−２，６−ジメチルピペリジノカルボ���ル−Ｌ−ガンマ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかし、ＢＱ−７８８のどんな誘導体又は改変ＢＱ−７８８化合物も、本発明の範囲内に包含されている。
【００５２】
さらに、本発明において使用される医薬中に存在するＣＤ４０アゴニスト及び随意にＣＴＬ活性化ペプチドと組み合わせた、ＷＯ９９／６１０６５及びＷＯ０３／０８４９９９に記載されているＡＰＣ（同時）刺激性分子の使用は好ましい。特に、４−１−ＢＢ及び／若しくはＣＤ４０リガンド、又は機能的断片及びその誘導体の他にも類似のアゴニスト活性を有する合成化合物の使用は、好ましくは、対象の最適な免疫応答の開始をさらに刺激するために、治療を受ける対象に、別々に又は医薬中に存在するＣＤ４０アゴニスト及び随意にＣＴＬ活性化ペプチドと組み合わせて施される。
【００５３】
好ましい実施形態では、アジュバントは、エキソソーム、樹状細胞、モノホスホリルリピドＡ及び／又はＣｐＧ核酸を含む。
【００５４】
したがって、好ましい実施形態では、医薬は、ＣＤ４０アゴニスト及び随意にＣＴＬ活性化ペプチドそれ自体又は本明細書において前で定義された組成物中に存在するＣＤ４０アゴニスト及び随意にＣＴＬ活性化ペプチド、並びに水中油エマルジョン（モンタニドＩＳＡ５１、モンタニドＩＳＡ  ７２０）からなる群から選択されるアジュバント、トール様受容体を介して作用することが知られているアジュバント、ＡＰＣ同時刺激性分子、エキソソーム、樹状細胞、モノホスホリルリピドＡ及びＣｐＧ核酸を含む。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、専門の抗原提示細胞又は樹状細胞によるＣＴＬ活性化ペプチドの提示を促進するために、ペプチドを含む組成物又は医薬は、ＤＣ活性化剤をさらに含む。
【００５６】
当技術分野では既知であり習慣的である投与法は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２１ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００５、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記載されている。ＣＤ４０アゴニストの投与は本明細書において広範に説明されてきた。本発明において使用されるＣＴＬ活性化ペプチド及び／又は他のどんな分子の投与も、ＣＤ４０アゴニストと同じ方法で（同時に又は順次）実施され得る。代わりに、ＣＴＬ活性化ペプチド及び／又は他のどんな分子も、静脈内若しくは皮下、又は筋肉内投与に適するように処方され得るが、たとえば、注射による粘膜投与又は真皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）及び／若しくは皮膚内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与などの他の投与経路を企図することが可能である。
【００５７】
本発明において使用される少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、随意に少なくとも１つのＣＴＬ活性化ペプチド及び／又は少なくとも１つの他の分子若しくはアジュバントの投与は単回投与として実施され得ることは本発明によりさらに包含されている。代わりに、本発明において使用される少なくとも１つのＣＤ４０アゴニスト、随意に少なくとも１つのＣＴＬ活性化ペプチド及び／又は少なくとも１つの他の分子若しくはアジュバントの投与は、必要であれば繰り返してよい。
【００５８】
したがって、追加の態様では、癌、前癌性障害又は感染症を治療するための方法であって、ＣＤ４０のアゴニストが局所的に投与され対象の腫瘍流入領域リンパ節に標的される方法が提供される。この方法のそれぞれの特徴は、すでに本明細書において前で広範に定義されている。好ましくは、この方法では、腫瘍流入領域リンパ節はＣＤ４０のアゴニストの投与後除去されることになる。この文脈では、「後」とは、７日又は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８日以上を意味し得る。腫瘍流入領域リンパ節は、通常、原発腫瘍及び転移した腫瘍細胞を含有する可能性があるリンパ節を除去することを目的とする外科的処置の一部として除去される。この方法は、腫瘍流入領域リンパ節に存在する腫瘍特異的Ｔ細胞をＣＤ４０活性化ＤＣにより活性化させることが可能であるために魅力的である。この活性化の結果として、腫瘍特異的Ｔ細胞は、この腫瘍流入領域リンパ節が除去される前に腫瘍流入領域リンパ節から末梢に遊走することになる。この方法では、癌は、本明細書において前で定義されたのと同じ意味を与えられる。好ましくは、そのような方法では、腫瘍は手術により除去されていた。
【００５９】
本文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用はその非限定的意味で使用されて、この単語に続く品目が含まれることを意味するが、特に言及されていない品目が排除されているわけではない。さらに動詞「なる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本明細書において定義されているＣＤ４０アゴニスト又はＣＴＬ活性化ペプチドが特に同定されているＣＤ４０アゴニスト又はＣＴＬ活性化ペプチド以外の追加の成分（単数又は複数）を含んでいてよく、前記追加の成分（単数又は複数）は本発明に特有の特徴を変更しないことを意味する「基本的に〜からなる」で置き換えられ得る。さらに、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈がその要素のうちの唯一の要素が存在することを明確に要求しなければ、その要素のうちの２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。用語「ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」又は「約（ａｂｏｕｔ）」は、数値と関連して使用される場合（ほぼ１０、約１０）、好ましくはその値は、その値の１０プラス又はマイナス１％の所与の値であり得ることを意味する。
【００６０】
本明細書に引用されている特許及び参考文献はすべて、これによって参照によりその全体が組み込まれているものとする。
【００６１】
以下の実施例は、説明目的のためだけに提供されており、いかなる点でも本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】全身抗ＣＤ４０投与により、腫瘍流入領域リンパ節中の部分的に活性化された腫瘍特異的ＣＴＬは増殖し全身的に広がる。全身性アゴニスト抗ＣＤ４０抗体処置された（図１ａ）又は無処置（図１ｂ）の、血液、脾臓、腫瘍流入及び非流入領域リンパ節中の四量体で染色された腫瘍特異的ＣＴＬ。
【図２】ＦＧＫ（アゴニスト抗ＣＤ４０抗体）の異なる投与法を用いた、右側腹部にＡＲ６腫瘍のあるマウスの生存曲線。腫瘍流入領域の皮下に単回投与の３０μｇＦＧＫを注射されたマウスの生存は、無処置マウスと比べて著しく増強されている（ｐ＝０．００２）。非流入領域に単回投与の３０μｇＦＧＫを皮下に注射されても、有益な効果は観察されない（腫瘍流入対非流入領域、ｐ＝０．０３）。腫瘍流入領域に、静脈内に高用量（１００μｇＦＧＫを３回）を受けていたマウスと低用量皮下注射を受けたマウスとの間で生存の有意差は観察されなかった。
【図３】血清中で測定された異なる投与法後の抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ）の毒性。Ａ：抗ＣＤ４０処置の開始後１日目及び３日目のマウス由来血清中で測定されたＡＬＡＴ及びＡＳＡＴ。ＢとＣ：抗ＣＤ４０処置の開始後１日目及び３日目のマウス由来血清中のＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６それぞれのサイトカイン濃度。
【図４】処置開始後３日目に単離された、異なる器官の低温貯蔵切片のＨ＆Ｅ染色。
【図５】群あたり８マウスでの、抗体なし（無処置）又は１）３日間連続での用量１００μｇの静脈内注射、２）腫瘍流入領域での皮下へのモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）中１５０μｇ、３）反対側の側腹部の非腫瘍流入領域での１５０μｇとして抗ＣＤ４０アゴニスト抗体（ＦＧＫ４５）のいずれかを用いた樹立皮下触知同系ＡＲ６（Ａｄ５  Ｅ１誘発）腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの生存曲線。
【図６】処置開始後の９日目に解析され、処置されない（無処置）又は図５に記載されている静脈内（ＦＧＫ静脈内）若しくは腫瘍流入領域での皮下（ＦＧＫ皮下）に注射される抗ＣＤ４０アゴニスト抗体を用いて処置された、のいずれかの腫瘍を担うマウスの末梢静脈血中でのアデノ−Ｅ１−特異的ＣＴＬの検出。血液試料は処置開始９日後に回収された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が示されている。
【図７】図５に記載されている異なる処置プロトコール後の血清中の抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ）の毒性。ＡＬＡＴ（ａ）及びＡＳＡＴ（ｂ）は、抗ＣＤ４０処置の開始後１、３、７及び２１日目にマウス由来の血清において測定された。
【図８ａ】処置されない（無処置）又は図５に記載されている（ＦＧＫ静脈内）若しくは皮下同側性腫瘍流入領域（ＦＧＫ皮下）における抗ＣＤ４０アゴニスト抗体を用いて処置された、のいずれかの腫瘍を担うマウスの末梢静脈血中でのアデノ−Ｅ１−特異的ＣＴＬの検出。血液試料は処置開始１１日後に回収された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が示されている。
【図８ｂ】無処置の試料のフローサイトメトリーの例。
【図８ｃ】抗ＣＤ４０高用量静脈内処置の試料のフローサイトメトリーの例。
【図８ｄ】抗ＣＤ４０低用量徐放同側性処置の試料のフローサイトメトリーの例。
【図８ｅ】抗ＣＤ４０低用量徐放対側性処置の試料のフローサイトメトリーの例。
【図９】マウスは、含水量の異なる、異なる用量のデキストラン粒子及び抗ＣＤ４０（ＦＧＫ−４５）を含む異なる製剤を用いて処置された。Ａ：抗ＣＤ４０の血清濃度は、２、４、６及び８日目にＥＬＩＳＡにより解析された。Ｂ：末梢静脈血中のＥ１Ａ  ＴＣＲ−Ｔｇ  ＣＴＬの検出は、２、４、６、８、１０、１４及び２２日目に解析された。血液試料はブースト後異なる時間で回収された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が経時的に示されている。  使用された用量は；モンタニド中３０μｇ抗ＣＤ４０抗体（四角形で示されている、３０モンタニド），７０％Ｈ２Ｏを含有するデキストラン粒子中３０μｇ抗ＣＤ４０抗体（三角形で示されている、３０  ７０％Ｈ２Ｏ）、５０％Ｈ２Ｏを含有するデキストラン粒子中３０μｇ抗ＣＤ４０抗体（アステリスク及び薄灰色の線で示されている、３０  ５０％Ｈ２Ｏ）、及び７０％Ｈ２Ｏ、６０％Ｈ２Ｏ、５０％Ｈ２Ｏを含有するデキストラン粒子の混合物中３０μｇ抗ＣＤ４０抗体（アステリスク及び黒線で示されている、３０混合物）、７０％Ｈ２Ｏを含有するデキストラン粒子中５μｇ抗ＣＤ４０抗体（円で示されている、５  ７０％Ｈ２Ｏ）、５０％Ｈ２Ｏを含有するデキストラン粒子中５μｇ抗ＣＤ４０抗体（黒の実線で示されている、５  ５０％Ｈ２Ｏ）、及び７０％Ｈ２Ｏ、６０％Ｈ２Ｏ、５０％Ｈ２Ｏを含有するデキストラン粒子の混合物中５μｇ抗ＣＤ４０抗体（シングル縞と薄灰色の線で示されている、５混合物）。
【図１０】腫瘍流入領域において皮下注射される、モンタニド中の抗ＣＤ４０抗体とＣＴＬＡ−４遮断抗体間の相乗作用を示す実験。末梢静脈血中のＥ１Ａ  ＴＣＲ−Ｔｇ  ＣＴＬの検出は、４、７、１０及び１８日目に解析された。血液試料はブースト後異なる時間で回収された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が経時的に示されている。
【図１１】照射された腫瘍細胞を用いたブースト後の経時的な血液中で四量体を用いて染色された腫瘍特異的ＣＴＬ。坦腫瘍マウスは５群に分けられた。マウスの１群は、腫瘍と腫瘍流入領域リンパ節（Ｔ＋ＬＮ）二重切除前に徐放製剤の局所的抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ−４５）を用いて前処置され、マウスの残りの群は、腫瘍と腫瘍流入領域リンパ節切除前は無処置のままであった。残りの４群のうち、群２及び３のマウスはその腫瘍を切除され（Ｔ）、群４及び５のマウスは腫瘍と腫瘍流入領域リンパ節を切除された（Ｔ＋ＬＮ）。群２及び４のマウスは手術直後局所的な徐放製剤の抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ−４５）を受け、群３及び５のマウスは無処置のままであった。手術の１２日後、マウスは照射された腫瘍細胞を用いたブーストを受けた。腫瘍細胞に対するＣＴＬ応答は、四量体染色により血液中で解析された。血液試料はブースト後異なる時間で回収された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が経時的に示されている。
【図１２ａ】皮下又は静脈内のいずれかに注射される、抗ＣＤ４０と組み合わせた合成長ペプチドを用いたワクチン接種後のＴ細胞応答。図１２aは脾臓中のＨＰＶ  Ｅ７四量体に陽性なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。マウスは、同一モンタニドデポー中３０μｇ抗ＣＤ４０又は静脈内への３回の１００μｇ抗ＣＤ４０（０、１、２日）のいずれかと組み合わせたモンタニド中ＨＰＶ  Ｅ７由来の合成長ペプチドを接種された。マウスは、抗ＣＤ４０抗体を添加することなく、１４日後にモンタニド中同一ペプチドをブーストされた。Ｔ細胞応答は、四量体染色により脾臓中で解析された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が示されている。細胞内サイトカイン染色も実施された。両方ともブースト接種の１０日後に実施された。群あたり５マウスが処置された。
【図１２ｂ】皮下又は静脈内のいずれかに注射される、抗ＣＤ４０と組み合わせた合成長ペプチドを用いたワクチン接種後のＴ細胞応答。図１２ｂはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＰＶ  Ｅ７ペプチド刺激後にＩＦＮ−γ産生が陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。マウスは、同一モンタニドデポー中３０μｇ抗ＣＤ４０又は静脈内への３回の１００μｇ抗ＣＤ４０（０、１、２日）のいずれかと組み合わせたモンタニド中ＨＰＶ  Ｅ７由来の合成長ペプチドを接種された。マウスは、抗ＣＤ４０抗体を添加することなく、１４日後にモンタニド中同一ペプチドをブーストされた。Ｔ細胞応答は、四量体染色により脾臓中で解析された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が示されている。細胞内サイトカイン染色も実施された。両方ともブースト接種の１０日後に実施された。群あたり５マウスが処置された。
【図１２ｃ】皮下又は静脈内のいずれかに注射される、抗ＣＤ４０と組み合わせた合成長ペプチドを用いたワクチン接種後のＴ細胞応答。図１２ｃはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＰＶ  Ｅ７ペプチド刺激後にＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生に二重陽性なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。マウスは、同一モンタニドデポー中３０μｇ抗ＣＤ４０又は静脈内への３回の１００μｇ抗ＣＤ４０（０、１、２日）のいずれかと組み合わせたモンタニド中ＨＰＶ  Ｅ７由来の合成長ペプチドを接種された。マウスは、抗ＣＤ４０抗体を添加することなく、１４日後にモンタニド中同一ペプチドをブーストされた。Ｔ細胞応答は、四量体染色により脾臓中で解析された。ＰＢＭＣは単離され、ＣＤ８及び四量体を用いて染色された。四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が示されている。細胞内サイトカイン染色も実施された。両方ともブースト接種の１０日後に実施された。群あたり５マウスが処置された。
【図１２ｄ】皮下又は静脈内のいずれかに注射される、抗ＣＤ４０と組み合わせた合成長ペプチドを用いたワクチン接種後のＴ細胞応答。図１２ｄはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＥＡペプチド刺激後にＩＦＮ−γ産生に陽性なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。マウスは、同一モンタニドデポー中３０μｇ抗ＣＤ４０又は静脈内への３回の１００μｇ抗ＣＤ４０（０、１、２日）のいずれかと組み合わせたモンタニド中ＣＥＡ由来の合成長ペプチドを接種された。マウスは、抗ＣＤ４０抗体を添加することなく、１４日後にモンタニド中同一ペプチドをブーストされた。細胞内サイトカイン染色も実施された。両方ともブースト接種の１０日後に実施された。群あたり５マウスが処置された。
【図１２ｅ】皮下又は静脈内のいずれかに注射される、抗ＣＤ４０と組み合わせた合成長ペプチドを用いたワクチン接種後のＴ細胞応答。図１２ｅはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＥＡペプチド刺激後にＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生に二重陽性なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示す。マウスは、同一モンタニドデポー中３０μｇ抗ＣＤ４０又は静脈内への３回の１００μｇ抗ＣＤ４０（０、１、２日）のいずれかと組み合わせたモンタニド中ＣＥＡ由来の合成長ペプチドを接種された。マウスは、抗ＣＤ４０抗体を添加することなく、１４日後にモンタニド中同一ペプチドをブーストされた。細胞内サイトカイン染色も実施された。両方ともブースト接種の１０日後に実施された。群あたり５マウスが処置された。
【図１３】抗ＣＤ４０処置後の血清中のサイトカイン濃度。マウスは処置されない（無処置）又は抗ＣＤ４０（モンタニド中３０μｇ）を皮下に若しくは静脈内に注射された（０、１、２日目に１００μｇを３回）。処置開始後１、３、７及び１２日目に、血清試料は収集され、サイトカイン濃度についてマルチプレックスアッセイにより解析された。群あたり、４マウスが処置された。ａ：経時的な血清中のＩＬ−２濃度。ｂ：経時的な血清中のＧＭ−ＣＳＦ濃度。
【実施例】
【００６３】
本明細書のそれぞれの実施例では、抗ＣＤ４０活性化抗体は本明細書において同定された通りに使用された。
【００６４】
（例１）
＜腫瘍流入領域における低用量抗ＣＤ４０活性化治療は、抗腫瘍ＣＴＬ応答を生み出すのに高用量全身治療と同程度に効果的であり、毒性は減少する＞
アデノウイルスＥ１誘発腫瘍細胞を使用するマウスモデルでは、弱い腫瘍特異的ＣＴＬ応答が生み出される。これらのＣＴＬは腫瘍流入領域リンパ節で持続し、腫瘍を除去することはできない。腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞は、腫瘍流入領域リンパ節で腫瘍抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）により刺激される。これらのＤＣは、トール様受容体に送達される危険信号などの危険信号の欠如のために活性化されない（ＴＬＲ、Ｇ．Ｊ．ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏ、らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３、６７５３−６７５９、２００４）。活性化抗ＣＤ４０抗体を全身的に注射することにより、樹状細胞は活性化され、ＣＴＬを刺激する。腫瘍特異的ＣＴＬは増殖を開始し、腫瘍流入領域リンパ節を離れ、腫瘍を除去する（Ｖａｎ  Ｍｉｅｒｌｏら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９、５５６１；Ｇ．Ｊ．ｖａｎ  ＭｉｅｒｌｏらＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３、６７５３−６７５９、２００４）。（図１）。
【００６５】
抗ＣＤ４０抗体の全身注射は、腫瘍流入領域でＤＣを活性化するだけではなく、全身においてＤＣの他にもＢ細胞、マクロファージ及び他のいくつかの細胞型も活性化する。患者において、抗ＣＤ４０抗体の全身注射は、サイトカイン放出症候群及びリンパ球数、血小板、Ｄ−ダイマーの異常を引き起こす（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら（２００７）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．Ｍａｒ  １；２５（７）：８７６−８３）。全身的の代わりに腫瘍流入領域に局所的に抗ＣＤ４０抗体を投与することにより、有効性を失うことなく用量を減らすことが可能であると本発明者らは仮定した。本発明者らは、数日間、腫瘍抗原提示ＤＣ上でＣＤ４０シグナル伝達を連続して刺激するために、皮下注射には徐放系（モンタニドＩＳＡ  ５１、Ｓｅｐｐｉｃ  Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。本発明者らが使用した用量は、マウス実験において全身的に使用された用量の１０分の１である。本発明者らは、３０μｇの抗ＣＤ４０抗体を腫瘍流入領域の、腫瘍と腫瘍流入領域リンパ節間の皮下に注射した。本発明者らが使用した腫瘍モデルは材料及び方法に記載されている。
【００６６】
図２に示されるように、高用量抗ＣＤ４０抗体を静脈内注射で受けたマウスの生存は、低用量を腫瘍流入領域において皮下注射で受けたマウスに匹敵していたが、用量の違いは１０倍である。どちらかの投与方法を通してＣＤ４０抗体を受けたマウスは、無処置のマウス又は非流入領域（反対側の側腹部）に低用量ＦＧＫを受けたマウスと比べて腫瘍クリアランスの著しい増加を示した。
【００６７】
腫瘍流入領域に徐放エマルジョンで投与されたこの１０分の１の濃度により、治療化合物の用量は、必要な部位、すなわち腫瘍流入領域リンパ節で十分高いことが可能であったが、全身レベルは低く保たれ、これにより毒性は大幅に減少した。
【００６８】
異なった投与経路及び異なった用量の毒性効果を実証するために、３種の異なるアッセイを用いて全身毒性が測定された（図３及び７）。ＡＬＡＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及びＡＳＡＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）レベルが決定された。これらの酵素は肝細胞に存在している。肝臓が損傷を受けると、これらの酵素は血流中の死滅しかけている肝細胞から放出され、したがって肝臓毒性の尺度としての働きをする。ＩＬ−１ｂ及びＩＬ−６は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と呼ばれる有害事象に関与するサイトカインであり、血清中のこれらのサイトカインの上昇は全身毒性の徴候である。図３ａ、ｂ、ｃ及び図７ａとｂは、皮下の局所投与により静脈内全身投与よりも毒性が低くなることを明白に示している。
【００６９】
本発明者らは、組織切片に基づいて毒性レベルを評価するために処置開始後３日目にマウス由来の異なる器官も調べた。図４では、ＦＧＫの高用量全身投与により、肝臓、肺臓及び腎臓に重度の症状が生じたことを示している。器官は、重篤な浮腫、組織損傷及び生理学的器官構造の喪失を示している。ＦＧＫの低用量皮下投与を受けたマウスの器官は、無処置マウス由来の器官と比べて毒性の軽い徴候しか示していない。重要なことであるが、高用量全身投与と低用量皮下投与間の毒性の差は著しい。
【００７０】
材料及び方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６ｋｈマウスが飼育され、ＬＵＭＣの動物施設で管理された。
腫瘍細胞
Ａｄ５Ｅ１ＡプラスＥＪ−ｒａｓにより形質転換されたマウス胚細胞が、８％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、５０μＭ  ２−ＭＥ、グルタミン、及びペニシリンを補充したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で培養された。
腫瘍実験
ＣＤ４０陰性Ｅ１Ａ発現腫瘍細胞（１×１０７）が、生後７週間から１３週間のオスマウスの側腹部に２００μｌのＰＢＳ中で皮下注射された。腫瘍サイズは、週２回キャリパーを用いて三次元で測定された。処置は、腫瘍接種の８〜１８日後で、触知可能腫瘍が存在する時に開始された。無用の苦しみを回避するため、マウスは腫瘍サイズが１ｃｍ３を超えると屠殺された。
処置
刺激性の抗ＣＤ４０Ａｂを産生しているＦＧＫ−４５融合細胞はＡ．Ｒｏｌｉｎｋ（Ｂａｓｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。マウスは、２００μｌ  ＰＢＳ中静脈内に与えられる１００μｇの抗ＣＤ４０ｍＡｂ（処置の０、１及び２日目）を受けた。皮下注射は腫瘍流入領域で実施された（側腹部の皮膚下、腫瘍と腫瘍流入領域リンパ節の間、２００μｌモンタニドエマルジョン）。エマルジョンは、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍｌ  ＦＧＫとモンタニドＩＳＡ  ５１（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）の１対１の溶液をボルテックス上で３０分間混合することにより作製された。最終投与量は３０μｇのＦＧＫであった。
四量体染色：
ＡＰＣ−コンジュゲートＥ１Ａ２３４−２４３負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体を使用して、ＣＤ８ａ染色と組み合わせて腫瘍特異的ＣＴＬを染色し、解析はフローサイトメトリーにより実施した。
ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色：
マウス組織の凍結切片は、Ｇｏｏｇｌｅを通じてアクセス可能なＩＨＣ  ｗｏｒｌｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋに記載されている方法に従って染色された。Ｈ＆Ｅ染色プロトコールは、Ｒｏｙ  Ｅｌｌｉｓ、Ｄｉｖｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｑｕｅｅｎ  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｗｏｏｄｖｉｌｌｅ  Ｒｏａｄ、Ｗｏｏｄｖｉｌｌｅ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ、５０１１の染色プロトコールであった。
ＡＬＡＴ及びＡＳＡＴ解析：
ＡＳＡＴ及びＡＬＡＴは、ＩＦＣＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）推奨に従って測定された。試薬はＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＦＲＧ）製である。ＡＳＡＴのカタログ番号１１８７６８４８及びＡＬＡＴのカタログ番号１１８７６８０５である。試験原理は、ＡＳＡＴ又はＡＬＡＴ濃度の上昇に伴うＮＡＤＨの減少に依拠している。ＮＡＤＨは測光法で測定される。両酵素は、Ｐ８００  Ｍｏｄｕｌａｒの完全自動化ラボラトリーシステム（Ｒｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定される。これらの測定値のＣＶは２％より下である。
マルチプレックスアレー：
血清試料は、心臓穿刺を用いて１、３、７及び２１日目に収集された。血清は、製造元のプロトコールを使用して、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｉｋｉｎｅ  ２３−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌを使用してＩＬ−１、ＩＬ−６の存在について解析された。
【００７１】
（例２）
＜腫瘍流入領域におけるさらに高用量の抗ＣＤ４０抗体を用いた腫瘍実験（図５）＞
腫瘍クリアランス及び減少した毒性により測定される機能的効果を維持しつつ、抗ＣＤ４０抗体の用量を局所的に増加することが可能かどうかを本発明者らは決定した。増加した用量、すなわち１５０μｇのＦＧＫ−４５を、腫瘍流入領域又は腫瘍の反対側の側腹部（非流入領域）に皮下投与した。生存は、１００μｇのＦＧＫを３回用いて静脈内注射されたマウスと比較された。興味深いことに、高用量のＦＧＫが注射されても処置されたマウス間の生存における差は観察できなかった。抗体が腫瘍流入領域に注射されたかどうかが実際重要であった低用量ＦＧＫ（モンタニド中３０μｇ）とは対照的であった（図２参照）。これにより、注射が非流入領域での局所的（皮下注射）なものであるとしても、高用量の抗体であれば確実に十分な量の抗体が全身分布を通して末梢へ到達することが実証される。これは、抗ＣＤ４０の用量が高いので、注射が腫瘍流入領域リンパ節の近くでなくても、十分に高い濃度が腫瘍流入領域リンパ節に到達して腫瘍特異的応答が活性化されるという事実により説明される。
【００７２】
結論として、全身毒性を防ぐためには、抗ＣＤ４０抗体腫瘍流入領域リンパ節までを局所的に送達するだけではなく、用量が全身分布ではなく、確実に局所的組織のみに取り込まれる程度であることも重要である。
【００７３】
（例３）
＜皮下腫瘍を有するマウスの血液試料への四量体染色（図６及び８）＞
血液試料は抗ＣＤ４０処置開始後９日目（図６）又は１１日目（図８）に得られた。腫瘍特異的ＣＴＬの数は、無処置の又は処置を受けた坦腫瘍マウス間で比較された。処置を受けたマウスは、高用量抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ−４５）を静脈内に（１００μｇを３回）又は腫瘍流入領域に若しくは反対側の側腹部（非流入領域）に、低用量を皮下に（モンタニド中３０μｇ）のいずれかを受けた。処置されないマウスに比べて反対側の側腹部（非流入領域）に抗ＣＤ４０を皮下で処置されたマウスの血液中では、四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の増加は検出できなかった。重要なことには、全身抗ＣＤ４０処置を受けたマウス又は腫瘍流入領域に抗ＣＤ４０を皮下で受けていたマウスでは、四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞の明瞭な集団を実証することができた。これにより、低用量抗ＣＤ４０を用いる皮下処置が局所的処置であるとしても（前記処置は、腫瘍流入領域に与えられない場合、この用量では効果的ではない）、この処置は全身性免疫応答：すなわち、末梢血液中で検出可能な腫瘍特異的ＣＴＬの誘発を引き起こしたことが証明される。
【００７４】
皮下に処置を受けた群と静脈内に処置を受けた群間の四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞のレベル差は、静脈内に処置を受けた群において抗ＣＤ４０の毒性が増強されたことにより説明することができた。この差は、処置後１週間で血液中のリンパ球の数の重度の異常を引き起こし、正常レベルを回復するのにもう１週間かかった（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅらでも、もっと低い程度で記載されている）。
【００７５】
材料及び方法
四量体染色：
ＡＰＣ−コンジュゲートＥ１Ａ２３４−２４３負荷Ｈ−２Ｄｂ四量体を使用して、ＣＤ８ａ染色と組み合わせて腫瘍特異的ＣＴＬを染色し、解析はフローサイトメトリーにより実施した。
【００７６】
（例４）
＜抗ＣＤ４０抗体を用いた免疫治療のための徐放製剤としてのデキストランベース微粒子＞
デキストランベース微粒子は、特に抗体などのより大きなタンパク質の徐放に適合した徐放製剤を形成する。例１の材料及び方法に記載されているように、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ−４５）を含有するデキストランベース微粒子を、本マウスモデルを用いる実験において徐放製剤として使用した。１×１０６のＥ１Ａ  ＴＣＲ  Ｔｇ  ＣＤ８  Ｔ細胞を、Ｅ１Ａ発現腫瘍を担うマウスの静脈内に注射し、続いて抗ＣＤ４０含有微粒子を注射した。低投与量、デキストラン粒子中５μｇ抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ）での５０％含水量のもっとも遅い放出製剤では、血清中の抗ＣＤ４０抗体濃度は検出できなかった（図９ａ）が、それでも血液中の活性化されたＣＴＬは測定可能である（図９ｂ）ことが分かった。
【００７７】
これらのデータから、徐放系としてのデキストランベース微粒子の使用により、腫瘍特異的Ｔ細胞応答に影響を与えることなく、腫瘍流入領域に皮下注射される抗ＣＤ４０の用量を減らすことが可能であることが示されている。さらに、減少させた濃度を使用すれば、血液中の抗ＣＤ４０抗体の濃度は減少し、全身毒性も減少することになると示唆される。
【００７８】
材料及び方法
処置の追加：
抗ＣＤ４０抗体を含有するデキストランベース粒子は、すでに記載されている通りに調製された（Ｏ．Ｆｒａｎｓｓｅｎ、Ｌ．Ｖａｎｄｅｒｖｅｎｎｅｔ、Ｐ．Ｒｏｄｅｒｓ、ａｎｄ  Ｗ．Ｅ．Ｈｅｎｎｉｎｋ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｈｙｄｏｇｅｌｓ；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ．）。マウスは２００μｌ  ＰＢＳ中様々な濃度のデキストラン粒子を用いて処置され、皮下注射は腫瘍流入領域において実施された（側腹部の皮膚の下、腫瘍と腫瘍流入領域リンパ節の間）。
マウスの追加
Ｈ−２Ｄｂ制限Ｅ１Ａ２３４−２４３アデノウイルスエピトープに特異的なＴＣＲ（Ｅ１Ａ  ＴＣＲ−Ｔｇ）を発現しているマウスが飼育され、ＬＵＭＣの動物施設で管理された。
トランスジェニックＣＴＬ解析：
ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＢＤ  Ｉｍａｇリンパ球濃縮キットを用いてＥ１Ａ  ＴＣＲ  Ｔｇマウス由来の脾臓及びリンパ節から単離された。１００万個のＣＤ８  Ｔ細胞が腫瘍を担うマウスの静脈内に注射された。血液中のＣＴＬ応答の動態はフローサイトメトリーにより測定された。
血清中の抗体検出：
血清中の抗ＣＤ４０抗体濃度は、抗ラット抗体を使用してＥＬＩＳＡにより決定された。
【００７９】
（例５）
＜腫瘍流入領域における徐放デポーでの免疫活性化抗体間の相乗作用＞
腫瘍流入領域における徐放デポーでの投与は、抗ＣＤ４０以外の他の免疫活性化抗体に適している。異なる免疫活性化抗体を組み合わせれば、ＣＴＬ応答の質及び／又は量が増強される可能性がある。腫瘍特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の１×１０６ＣＤ８  Ｔ細胞を坦腫瘍マウスに注射した。次に、抗ＣＤ４０抗体ＦＧＫ−４５とＣＴＬＡ−４遮断抗体（９Ｈ１０）をモンタニド製剤で組み合わせて、血液中の末梢ＣＴＬ応答の動態を解析した（図１０）。それぞれの抗体のみを用いた処置と比べて、抗ＣＤ４０と抗ＣＴＬＡ−４抗体の組合せを用いた処置を受けたマウスでは血液中の腫瘍特異的ＣＴＬの数が増強されていた。これにより、異なる抗体間に相乗作用があることが示唆され、１つの徐放製剤での複数の免疫刺激抗体の組合せが支持されている。
【００８０】
（例６）
＜抗ＣＤ４０局所的処置前の腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節の外科的除去は抗腫瘍ＣＴＬ応答を抑制する＞
病院では、腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＬＮ）は、一般に治療の一部として外科的に切除される。腫瘍と腫瘍流入領域ＬＮの両方が局所的免疫活性化抗体治療の成功に必要であり、したがって、治療は腫瘍と腫瘍流入領域ＬＮ切除前に開始するほうがよいと本発明者らは仮定した。
【００８１】
これを実証するために、５群のマウスに腫瘍細胞を接種した。腫瘍が触知できるようになると、群１をモンタニド中の局所的抗ＣＤ４０で処置した。１２日後、すべてのマウスが手術を受けた。群１、２及び３のマウスでは腫瘍及び腫瘍流入領域ＬＮが切除され、群４及び５のマウスでは腫瘍のみが切除された。群２及び４のマウスは切除直後に抗ＣＤ４０を受けた。群３及び５のマウスは、抗ＣＤ４０を全く受けなかった。手術の１２日後、すべてのマウスが反対側の側腹部に照射された腫瘍細胞のブースト接種を受けた。血液試料は定期的に採取され、四量体染色により抗腫瘍ＣＴＬ応答を解析した。
【００８２】
図１１に示されるように、腫瘍及び腫瘍流入領域ＬＮ切除前に抗ＣＤ４０を受けたマウスでは良好なＣＴＬ応答があるが、他の群ではどのマウスにも良好な応答はない。したがって、腫瘍流入領域リンパ節がまだ存在する時にこの種の処置を実施することが重要であり得る。
【００８３】
材料及び方法
マウスは、ケタミン及びキシラジン（ＰＢＳ中１対１対２、１００マイクロリットル腹腔内）で麻酔をかけられた。腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節は単離され、創傷は創傷クリップで閉じられた。５日後、クリップは外された。マウスはブースト接種を受けた。
【００８４】
（例７）
以前本発明者らは、予防接種設定において抗ＣＤ４０活性化抗体の添加がペプチドに対するＣＴＬのプライミングにプラス効果を及ぼすことを公表している（ＤｉｅｈｌらＮａｔ  Ｍｅｄ．１９９９  Ｊｕｌ；５（７）：７７４−９）。したがって、局所的に与えられる単回徐放製剤での抗ＣＤ４０とＣＴＬエピトープを含有する長ＨＰＶ由来ペプチド（ＢｉｊｋｅｒらＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｏｃｔ  １５；１７９（８）：５０３３−４０）の組合せが、別々の徐放製剤でＣＴＬエピトープと組み合わせた以前使用された抗ＣＤ４０の全身投与に類似する効果をＴ細胞プライミングに及ぼすかどうか試験した。マウスには、モンタニド中３０μｇ抗ＣＤ４０及びＨＰＶ長ペプチドが皮下に注射された、又は１００μｇ抗ＣＤ４０を３回の静脈内注射と同時にモンタニド中ＨＰＶ長ペプチドの皮下注射を受けた。Ｔ細胞応答は、処置を受けたマウスの脾臓におけるブースターペプチド接種の１０日後に測定された。抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ−４５）の低用量局所的徐放製剤を使用するほうが、高用量静脈内注射よりもペプチド接種のアジュバントとして効果的であることを本発明者らは明らかにしている。長合成ＨＰＶペプチドでも長合成ＣＥＡペプチドでも、応答は、高用量静脈内注射と比べて、抗ＣＤ４０抗体（ＦＧＫ−４５）の低用量局所的徐放製剤を用いて処置されたマウスにおいてはＣＤ８＋Ｔ細胞の量と質の両方で増強されていた（図１２ａ、ｂ、ｃ）。
【００８５】
この知見をＣＴＬエピトープを含有する他の長ペプチドにも拡張することが可能かどうかを決定するため、いくつかの上皮癌において過剰発現されているもう１つの腫瘍関連タンパク質であるＣＥＡ由来の長ペプチドを使用して同一実験が実施された。このペプチドを使用して同一知見が実証された（図１２ｄ及びｅ）。
【００８６】
結論として、長合成ＨＰＶペプチドでも長合成ＣＥＡペプチドでも、応答は、高用量静脈内注射と比べて、抗ＣＤ４０抗体の低用量局所的徐放製剤を用いて処置されたマウスにおいてはＣＤ８＋Ｔ細胞の量と質の両方で増強されていた。
【００８７】
（例８）
サイトカインは、病原体若しくは腫瘍に対するより良好な免疫応答に寄与する、又は特異的Ｔ細胞の生存を改善することが可能である。予防接種及び癌治療などの治療設定において、サイトカインは時にアジュバントとして患者に与えられる。そのような免疫ブーストサイトカインの例は、ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦである。腫瘍流入領域に皮下注射された低用量徐放製剤、又は高用量静脈内注射のいずれかでの、抗ＣＤ４０活性化抗体（ＦＧＫ−４５）を用いた処置後のマウスの血清中のこれらのサイトカインの濃度を本発明者らは決定している（例１〜３において前で記載されている）。ＩＬ−２（図１３ａ）でもＧＭ−ＣＳＦ（図１３ｂ）でも、高用量静脈内注射と比べて、長時間後でも、低用量徐放処方された抗ＣＤ４０抗体を用いた処置後のマウスでそのレベルが強く上昇していることを本発明者らは明らかにしている。これにより、治療後の有益なサイトカインの誘発に関しては、腫瘍流入領域における低用量での抗ＣＤ４０の局所的送達は抗ＣＤ４０の全身投与よりも優れていることが再び示されている。
【００８８】
材料及び方法
ペプチド接種：
各ペプチドの４０ｎｍｏｌ（ＨＰＶ  Ｅ７：
2014224150.tif 000002
又はＣＥＡ：
2014224150.tif 000003
（ＣＴＬエピトープは太字で示されている））が、ＰＢＳとモンタニドの１対１エマルジョンで２００μｌ皮下に注射された。マウスの１つの群は、ペプチドと同じモンタニド製剤での３０μｇの抗ＣＤ４０活性化抗体も受けた。マウスの第２の群は、０日目に皮下に注射されるモンタニドデポー中のペプチド及び１００μｇ抗ＣＤ４０活性化抗体の同時注射を静脈内に受けた。これに続いて、１及び２日目に１００μｇ抗ＣＤ４０の追加の注射を静脈内に受けた。１４日後、マウスは、反対側の側腹部にＰＢＳとモンタニドの１対１エマルジョンで注射される、各ペプチドの４０ｎｍｏｌからなるブースト接種を２００μｌ皮下に受けた。今回、抗ＣＤ４０抗体は与えられなかった。
細胞内サイトカイン染色：
脾細胞が単離され、５μｇ／ｍｌの合成長ペプチドを用いて一晩刺激された。染色には、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットが使用された。試料はフローサイトメトリーにより解析された。使用されたフローサイトメトリー抗体は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＩＦＮ−γ及び抗ＴＮＦ−αであり、すべてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製であった。
多重アッセイ：
血清試料は、１、３、７及び２１日目に心臓穿刺を用いて収集された。血清は、製造元のプロトコールを使用して、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｉｋｉｎｅ  ２３−Ｐｌｅｘ  Ｐａｎｅｌを使用してＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦの存在について解析された。
【図２】
2014224150.tif 000004
【図６】
2014224150.tif 000005
【図７】
2014224150.tif 000006
【図８ｂ】
2014224150.tif 000007
【図８ｃ】
2014224150.tif 000008
【図８ｄ】
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【図８ｅ】
2014224150.tif 000010
【図１１】
2014224150.tif 000011
【図１２ａ】
2014224150.tif 000012
【図１２ｂ】
2014224150.tif 000013
【図１２ｃ】
2014224150.tif 000014
【図１２ｄ】
2014224150.tif 000015
【図１２ｅ】
2014224150.tif 000016
【図１３】
2014224150.tif 000017
【図１】
2014224150.tif 000018
【図３】
2014224150.tif 000019
【図４】
2014224150.tif 000020
【図５】
2014224150.tif 000021
【図８ａ】
2014224150.tif 000022
【図９】
2014224150.tif 000023
【図１０】
2014224150.tif 000024
【配列表】
2014224150000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年9月11日(2014.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身的免疫反応を誘導することにより、対象における癌、前癌性障害又は感染の治療用医薬を製造するためのＣＤ４０のアゴニストの使用であって、
該医薬が、ＣＤ４０のアゴニストが１００μｇを超えない投与量で、該対象の該腫瘍又は癌、該前癌性障害又は該感染を流出するリンパ内またはその近傍に局所的に投与され、
ここで、該対象が腫瘍又はガンを有する時は、該ＣＤ４０のアゴニストが腫瘍内に投与されず、
ここでＣＤ４０のアゴニストが、抗ＣＤ４０抗体である、
上記使用。
【請求項２】
前記ＣＤ４０のアゴニストが皮下に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＣＤ４０のアゴニストが皮内に投与される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
腫瘍流入領域リンパ節へのターゲティングが、リンパ静脈注射を通してＣＤ４０のアゴニストを投与することにより実施される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記抗ＣＤ４０抗体が、ヒト、ヒト化、キメラ又は脱免疫化抗体である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＣＤ４０のアゴニストが単一用量として投与される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＣＤ４０のアゴニストが最大で９０μｇ投与される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記ＣＤ４０のアゴニストが徐放製剤で処方される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記ＣＤ４０のアゴニストが、ＣＴＬ活性化ペプチド及び／又は第２の刺激化合物と組み合わせて用いられる、請求項１から８までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記第２の刺激化合物がＣＴＬＡ４遮断抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＣＴＬ活性化ペプチドが腫瘍由来もしくはウィルス由来のぺプチドの２２〜４５アミノ酸からなる合成された長いペプチドである、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＣＴＬ活性化ペプチドがＨＰＶ  Ｅ７の２２〜４５アミノ酸からなる合成された長いペプチドである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＣＴＬ活性化ペプチドがＨＰＶ  Ｅ７タンパクのアミノ酸４３〜７７からなる、ＨＰＶ  Ｅ７由来の合成された長いペプチドである、請求項１２に記載の使用。