(57)【要約】【課題】非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをピキア・パストリス（Pichia pastoris）等のメタノール資化性酵母で生産するための直交翻訳系を提供する。非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをピキア・パストリス等のメタノール資化性酵母で生産するための方法も提供する。【解決手段】ａ）非天然アミノ酸と；ｂ）メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；ｃ）セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてＯ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むメタノール資化性酵母細胞。【選択図】図６
2014039554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非天然アミノ酸と；
ｂ）メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
ｃ）セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてＯ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
を含むメタノール資化性酵母細胞。
【請求項２】
非天然アミノ酸がｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ＤＭＮＢ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光活性化可能な架橋基を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；糖置換システイン；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
Ｏ−ＲＳが核酸から発現され、前記核酸がゲノムに組込まれた前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
核酸がＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座でゲノムに組込まれている請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
Ｏ−ＲＳが誘導的プロモーターから発現される請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
Ｏ−ＲＳが構成的プロモーターから発現される請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
Ｏ−ｔＲＮＡが核酸から発現され、前記核酸がゲノムに組込まれた前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするか又は含むポリヌクレオチドを含む請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
核酸がＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座でゲノムに組込まれている請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
Ｏ−ｔＲＮＡが高レベル構成的プロモーターから発現される請求項１に記載の細胞。
【請求項１２】
プロモーターがＰＧＫ１プロモーターを含む請求項９に記載の細胞。
【請求項１３】
Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡが非真核生物に由来する請求項１に記載の細胞。
【請求項１４】
Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡが大腸菌に由来する請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドがＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
該当ポリペプチドがＨＳＡ、ヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、ヒト表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、剥離毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、発熱外毒素Ｂ、発熱外毒素Ｃ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ／ｃキット、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＥＦ）、���ＶＥＧＦ１６５、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、ＣＤ４４、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、ヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ＢＰ３２０抗原、ヒトカスパーゼ３、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質（ｈＳＢＰ）、ヒトエンドスタチン、又はｇｐ１２０を含む請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
核酸がゲノムに組込まれている請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
核酸がシングルコピーとしてゲノムに組込まれている請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
組込みが非必須遺伝子をコードする遺伝子座で遺伝子置換により行われる請求項１７に記載の細胞。
【請求項２０】
非必須遺伝子がＡＯＸ１である請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
細胞がメタノール利用表現型を示し、メタノール利用表現型がｍｕｔＳである請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
核酸がマルチコピーとしてゲノムに組込まれている請求項１７に記載の細胞。
【請求項２３】
細胞がメタノール利用表現型を示し、メタノール利用表現型がＭｕｔ＋である請求項１７に記載の細胞。
【請求項２４】
該当ポリペプチドが誘導的プロモーターから発現される請求項１５に記載の細胞。
【請求項２５】
誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
該当ポリペプチドが構成的プロモーターから発現される請求項１５に記載の細胞。
【請求項２７】
構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
メタノール資化性酵母細胞がCandida細胞、Hansenula細胞、Pichia細胞、又はTorulopsis細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項２９】
メタノール資化性酵母細胞がPichia pastoris細胞である請求項１に記載の細胞。
【請求項３０】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドをメタノール資化性酵母細胞で生産する方法であって、
ａ）ｉ）非天然アミノ酸と；
ｉｉ）メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
ｉｉｉ）Ｏ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
ｉｖ）該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む該当核酸
を含むメタノール資化性酵母細胞を準備する段階と；
ｂ）セレクターコドンに応答して該当ポリペプチドの翻訳中に該当核酸の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産する段階を含む前記方法。
【請求項３１】
非天然アミノ酸を準備する段階が、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ＤＭＮＢ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光活性化可能な架橋基を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；糖置換システイン；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を準備する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｏ−ＲＳを準備する段階がプロモーターの下流でＯ−ＲＳをコードするＯ−ＲＳポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階と、コードされるＯ−ＲＳを発現させる段階を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階が、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座にポリヌクレオチドを組込む段階を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｏ−ＲＳを準備する段階が誘導的プロモーターからＯ−ＲＳを発現させる段階を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
Ｏ−ＲＳを準備する段階が構成的プロモーターからＯ−ＲＳを発現させる段階を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞がアンバーサプレッサーｔＲＮＡ、オーカーサプレッサーｔＲＮＡ、オパールサプレッサーｔＲＮＡ、又は４塩基コドン、レアコドンもしくは非コーディングコドンを認識するｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを含み、前記Ｏ−ｔＲＮＡが高レベル構成的プロモーターの転写制御下のＯ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドによりコードされ、前記Ｏ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドがゲノムに組込まれている請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
Ｏ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階が、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座に前記ポリヌクレオチドを組込む段階を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
高レベル構成的プロモーターがＰＧＫ１プロモーターを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドをコードする該当核酸を準備する段階が、ＨＳＡ、ヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、ヒト表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、剥離毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、発熱外毒素Ｂ、発熱外毒素Ｃ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ／ｃキット、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、ヒト血���内皮増殖因子（ｈＶＥＧＥＦ）、ｈＶＥＧＦ１６５、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、ＣＤ４４、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、ヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ＢＰ３２０抗原、ヒトカスパーゼ３、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質（ｈＳＢＰ）、ヒトエンドスタチン、又はｇｐ１２０をコードする核酸を準備する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
該当核酸を準備する段階がプロモーターの転写制御下の核酸を細胞のゲノムに組込む段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
核酸をゲノムに組込む段階が、核酸をシングルコピーとしてゲノムに組込む段階を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
核酸をゲノムに組込む段階が、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座に核酸を組込む段階を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
核酸を準備する段階が、核酸をマルチコピーとしてゲノムに組込む段階を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
核酸をゲノムに組込む段階が、核酸をＡＯＸ１の遺伝子座５’に組込む段階を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
プロモーターが誘導的プロモーターである請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
誘導的プロモーターがＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーターを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
プロモーターが構成的プロモーターである請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
構成的プロモーターがＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーターである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
メタノール資化性酵母細胞を準備する段階がCandida細胞、Hansenula細胞、Pichia細胞、又はTorulopsis細胞を準備する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項５２】
メタノール資化性酵母細胞を準備する段階がPichia pastoris細胞を準備する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項５３】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）中で培養する段階と、培養液を振盪フラスコで増殖させ、ポリペプチドの発現を誘導する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を培養する段階がCandida細胞、Hansenula細胞、Pichia細胞、又はTorulopsis細胞を培養する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を培養する段階がPichia pastoris細胞を培養する段階を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、ペーストのコンシステンシーに達するまで培養液を増殖させてポリペプチドを産生させる段階を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
産生されるポリペプチドが硫酸化されている請求項３０に記載の方法。
【請求項５８】
産生されるポリペプチドがグリコシル化されている請求項３０に記載の方法。
【請求項５９】
産生されるポリペプチドがジスルフィド結合を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項６０】
産生されるポリペプチドが１０ｍｇ／Ｌまでの濃度で前記細胞から発現される請求項３０に記載の方法。
【請求項６１】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、
ａ）ＹＰＤ培地に適切なPichia pastoris株のコロニーを接種し、第１の培養液を作製する段階と；
ｂ）第１の培養液を振盪フラスコに入れ、振盪フラスコを２９℃〜３０℃の温度にて２８０ｒｐｍの速度で振盪し、飽和付近まで増殖させる段階と；
ａ）緩衝グリセロール酵母エキス培地（ＢＭＧＹ）１リットルに第１の培養液を接種し、第２の培養液を作製する段階と；
ｂ）ＯＤ６００が８．０になるまで第２の培養液を増殖させる段階と；
ｃ）第２の培養液を１５００×ｇで５分間遠心し、ペレットを形成する段階と；
ｄ）１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）２００ｍｌにペレットを再懸濁し、第３の培養液を作製する段階と；
ｅ）その後、２４時間おきに第３の培養液にメタノールを終濃度０．５％まで１２０〜１４４時間添加し、ポリペプチドの発現誘導を維持する段階
を含む請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮出願第６１／００７，３４１号、発明の名称「メタノール資化性酵母ピキア・パストリスにおけるインビボ非天然アミノ酸発現（IN VIVO UNNATURAL AMINO ACID EXPRESSION IN THE METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS）」、発明者Travis Youngら、出願日２００７年１２月１１日の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を全目的で本明細書に援用する。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国エネルギー省、材料科学部からの助成番号ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４６０５１として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質化学、例えば翻訳生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをピキア・パストリス（Pichia pastoris）等のメタノール資化性酵母で生産するための組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
異種直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）により高い効率と高い忠実度で非天然アミノ酸をポリペプチドに部位特異的に組込むことができる（Deiters, et al. (2003) "Adding Amino Acids with Novel Reactivity to the Genetic Code of Saccharomyces cerevisiae." J Am Chem Soc 125:11782-11783（非特許文献１）; Wang, et al. (2001) "Expanding the Genetic code of Escherichia coli" Science 292:498-500（非特許文献２）; Chin, et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code." Science 301:964-7（非特許文献３））。これらのＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はそのコグネイト非天然アミノ酸を認識するが、それらが使用されている系に内在するｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ又はアミノ酸とは有意に交差反応しない。今日までに、この技術により、大腸菌、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、及び哺乳動物細胞で合成された蛋白質にユニークな立体的及び／又は化学的性質を有する３０種類を越える各種非天然アミノ酸の遺伝的にコードされた組込みが可能になっている（Xie, J, et al. (2006) "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code." Nature Rev Mol Cell Biol 7:775-782（非特許文献４）; Wang, L, et al. (2005) "Expanding the genetic code." Agnew Chem Int Edit 44:34-66（非特許文献５）; Liu, et al. (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells." Nature Methods 4:239-244（非特許文献６））。この技術は生物学的性質を強化し、毒性を低減し、及び／又は半減期を延長した治療用蛋白質の開発及び大規模生産に特に有用であると思われる。
【０００５】
大腸菌及び出芽酵母発現システムは異種蛋白質を合成するために広く使用されており、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の大規模合成に応用することができる（"Adding Amino Acids with Novel Reactivity to the Genetic Code of Saccharomyces Cerevisiae." J Am Chem Soc 125:11782-11783（非特許文献１）; Wang, et al. (2001) "Expanding the Genetic code of Escherichia coli." Science 292:498-500（非特許文献２））。
【０００６】
しかし、これらの発現システムのうちで、望ましい生物学的活性を示すために硫酸化、グリコシル化又は翻訳後修飾を必要とすることが多い組換え哺乳動物蛋白質の生産に好適なものは皆無である。更に、これらの宿主のうちで治療用蛋白質の生産に最適なものも皆無であり、大腸菌で産生された蛋白質は通常、高濃度の発熱性化合物（例えば内毒素）を含有しており、出芽酵母で合成された蛋白質は潜在的に抗原性のα１，３グリカン結合を含んでいる可能性がある。
【０００７】
他方、Pichia pastoris等のメタノール資化性酵母は異種蛋白質の組換え発現システム用として魅力的な候補であるとみなされている（Lin-Cereghino,et al.(2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66（非特許文献７））。メタノール資化性酵母はその真核細胞内機構により、生物学的に活性な哺乳動物蛋白質を合成するために必要な翻訳後フォールディング、プロセシング及び修飾イベントの多くを実施することができる。出芽酵母で発現される蛋白質と異なり、P. pastoris等のメタノール資化性酵母により産生される蛋白質は異種発現される糖蛋白質の下流プロセシングを妨げる恐れのある高マンノース型グリカン構造を含んでいる可能性が低い。
更に、メタノール資化性酵母で合成される蛋白質は発熱性及び抗原性化合物を含まない。
【０００８】
メタノール資化性酵母発現システムは大規模蛋白質合成に特に有用である。例えば、酵母P. pastorisは出芽酵母、細菌、昆虫又は哺乳動物系の１０〜１００倍のレベルで組換え蛋白質の発現を可能にする。更に、P. pastoris等のメタノール資化性酵母は単純な規定塩類培地で容易に培養することができ、バキュロウイルス発現システムや哺乳動物組織培養に必要な高価な培地添加物や装置が不要である。更に、P. pastorisは遺伝子操作が可能であり、出芽酵母用に開発されている多数の分子微生物学技術をP. pastoris用に応用することができる。
【０００９】
複雑な翻訳後修飾を含む生物学的に活性な異種蛋白質を生産することが可能な低コスト発現システムで非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むための新規ストラテジーが必要とされている。メタノール資化性酵母で合成されたポリペプチドに非天然アミノ酸を組込むように機能するＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対及び発現システムの開発が当分野で必要とされている。以下の開示から明らかなように、本明細書に記載する発明はこれら及び他の必要を満たすものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Deiters, et al. (2003) "Adding Amino Acids with Novel Reactivity to the Genetic Code of Saccharomyces cerevisiae." J Am Chem Soc 125:11782-11783
【非特許文献２】Wang, et al. (2001) "Expanding the Genetic code of Escherichia coli" Science 292:498-500
【非特許文献３】Chin, et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code." Science 301:964-7
【非特許文献４】Xie, J, et al. (2006) "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code." Nature Rev Mol Cell Biol 7:775-782
【非特許文献５】Wang, L, et al. (2005) "Expanding the genetic code." Agnew Chem Int Edit 44:34-66
【非特許文献６】Liu, et al. (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells." Nature Methods 4:239-244
【非特許文献７】Lin-Cereghino,et al.(2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ユニークな官能基を有する非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むことにより、立体的、化学的又は生物学的性質を強化又は新規にした蛋白質を作製することが可能になった。このような蛋白質は治療又は医薬用途に利用できるので、複雑な翻訳後修飾を含む生物学的に活性な異種蛋白質を生産することが可能な低コスト発現システムで生産できるならば有益であろう。本発明はメタノール資化性酵母（例えばPichia pastoris）発現システムで非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むために有用な方法と組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１側面において、本発明はメタノール資化性酵母（例えばPichia pastoris）で合成されたポリペプチドに非天然アミノ酸を組込むための組成物を提供する。前記組成物は非天然アミノ酸と、メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてＯ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むメタノール資化性酵母細胞からなる。メタノール資化性酵母細胞としては、例えばCandida細胞、Hansenula細胞、Torulopsis細胞、又はPichia細胞（例えばPichia pastoris細胞）が挙げられる。メタノール資化性酵母細胞は場合により例えば本明細書に記載する非天然アミノ酸のいずれかを含むことができる。
【００１３】
細胞のＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡは場合によりゲノムに組込まれた核酸から発現させることができる。例えば、場合により例えばＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座に、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、Ｏ−ｔＲＮＡをコードするか又は含む核酸を組込むことができる。場合により、Ｏ−ＲＳは誘導的プロモーター（例えばＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーター）から発現させることができる。場合により、Ｏ−ＲＳは構成的プロモーター（例えばＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーター）から発現させることができる。Ｏ−ｔＲＮＡは場合により高レベル構成的プロモーター（例えばＰＧＫ１プロモーター）から発現させることができる。メタノール資化性酵母細胞のＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡは場合により非真核生物（例えば大腸菌）に由来する。
【００１４】
メタノール資化性酵母細胞は場合により該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むことができ、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。該当ポリペプチドをコードする核酸は場合によりシングルコピーとしてゲノムな組込むことができ、組込みは場合により非必須遺伝子（例えばＡＯＸ１）をコードする遺伝子座で遺伝子置換により行い、その結果、ｍｕｔＳメタノール利用表現型を有する細胞を得ることができる。場合により、該当ポリペプチドをコードする核酸をマルチコピーとしてゲノムに組込み、Ｍｕｔ＋メタノール利用表現型を有する細胞を得ることができる。核酸によりコードされる該当ポリペプチドとしては限定されないが、場合により本明細書に記載する蛋白質及びポリペプチドのいずれかが挙げられる。該当ポリペプチドは場合により誘導的プロモーター（例えばＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーター）から発現される。場合により、該当ポリペプチドは構成的プロモーター（例えばＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーター）から発現させることができる。
【００１５】
別の側面において、本発明は選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをメタノール資化性酵母細胞で生産するための方法を提供する。これらの方法は、非天然アミノ酸と、メタノール資化性酵母において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、Ｏ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む該当核酸を含むメタノール資化性酵母細胞を準備する段階を含む。メタノール資化性酵母細胞は場合によりCandida細胞、Hansenula細胞、Torulopsis細胞、又はPichia細胞（例えばPichia pastoris細胞）とすることができる。前記方法は更にセレクターコドンに応答して該当ポリペプチドの翻訳中に該当核酸の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産する段階を含む。非天然アミノ酸を準備する段階は、場合により本明細書に記載する非天然アミノ酸のいずれかを準備する段階を含むことができる。
【００１６】
Ｏ−ＲＳを準備する段階は、場合によりプロモーターの下流でＯ−ＲＳをコードするＯ−ＲＳポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階と、コードされるＯ−ＲＳを発現させる段階を含むことができる。Ｏ−ＲＳポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階は、場合によりＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座にポリヌクレオチドを組込む段階を含むことができる。Ｏ−ＲＳは場合により誘導的プロモーター（例えばＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーター）又は構成的プロモーター（例えばＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーター）から発現させることができる。
【００１７】
Ｏ−ｔＲＮＡを準備する段階は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ、オーカーサプレッサーｔＲＮＡ、オパールサプレッサーｔＲＮＡ、又は４塩基コドン、レアコドンもしくは非コーディングコドンを認識するｔＲＮＡを準備する段階を含む。Ｏ−ｔＲＮＡを準備する段階は、場合により高レベル構成的プロモーターの下流でＯ−ｔＲＮＡをコードするＯ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階と、Ｏ−ｔＲＮＡを発現させる段階を含むことができる。Ｏ−ｔＲＮＡポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階は、場合によりＡＲＧ４遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座にポリヌクレオチドを組込む段階を含むことができる。Ｏ−ｔＲＮＡは場合によりＰＧＫ１プロモーターから発現させることができる。
【００１８】
該当ポリペプチドをコードする該当核酸を準備する段階は、限定されないが、本明細書に記載する蛋白質及びポリペプチドのいずれかを場合によりコードする核酸を準備する段階を含むことができる。該当核酸を準備する段階は、場合により該当核酸を誘導的プロモーター（例えばＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、又はＦＬＤ１プロモーター）、又は構成的プロモーター（例えばＹＰＴ１プロモーター又はＧＡＰプロモーター）の転写制御下に置く段階を含むことができる。該当核酸を準備する段階は更に前記核酸を細胞のゲノムに組込む段階を含むことができる。該当核酸は場合により例えばＡＯＸ１遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＡＲＧ４遺伝子、ＡＯＸ２遺伝子、又はＭＥＴ２遺伝子をコードする遺伝子座でシングルコピーとしてゲノムに組込むことができる。場合により、該当核酸を例えばＡＯＸ１遺伝子の遺伝子座５’でマルチコピーとして細胞のゲノムに組込むことができる。
【００１９】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階は場合により、適切に作製したメタノール資化性酵母細胞（例えばCandida細胞、Hansenula細胞、Torulopsis細胞、又はPichia細胞、例えばPichia pastoris）を１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）中で培養する段階と、培養液を振盪フラスコで増殖させ、ポリペプチドの発現を誘導する段階を含むことができる。場合により、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階は、ペーストのコンシステンシーに達するまで酵母培養液を増殖させる段階を含むことができる。生産されるポリペプチドは場合によりジスルフィド結合を含んでいてもよいし、硫酸化されていてもよいし、及び／又はグリコシル化されていてもよい。産生されるポリペプチドは場合により１０ｍｇ／Ｌまでの濃度で培養液から発現させることができる。
【００２０】
選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをPichia pastorisで生産する段階は、ＹＰＤ培地に適切なPichia pastoris株のコロニーを接種し、第１の培養液を作製する段階と、第１の培養液を振盪フラスコに入れ、２９℃〜３０℃の温度にて２８０ｒｐｍで振盪し、飽和付近まで増殖させる段階と、第１の培養液を使用し、緩衝グリセロール酵母エキス培地（ＢＭＧＹ）１リットルに接種し、第２の培養液を作製する段階を含むことができる。前記方法はＯＤ６００が８．０になるまで第２の培養液を増殖させる段階と、第２の培養液を１５００×ｇで５分間遠心し、ペレットを形成する段階と、１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）２００ｍｌにペレットを再懸濁し、第３の培養液を作製する段階を含む。最後に、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをPichia pastorisで生産する方法は、その後、２４時間おきに第３の培養液にメタノールを終濃度０．５％まで１２０〜１４４時間添加し、ポリペプチドの誘導を維持する段階を含む。
【００２１】
キットも本発明の特徴である。例えば、キットは非天然アミノ酸と本発明のメタノール資化性酵母細胞を含むことができる。細胞は場合によりそのゲノムに組込まれたＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸及び／又はＯ−ＲＳをコードする核酸を含むことができ、例えばＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡは上記プロモーターのいずれかの転写制御下にある。キットは本発明の細胞を使用するためのコンポーネントを含むことができ、例えば、１個以上のセレクターコドンを含み、該当ポリペプチドをコードする核酸をメタノール資化性酵母細胞のゲノムに組込むための説明書が挙げられる。キットはキットコンポーネントを保持するための容器と、キットで提供される細胞を使用して本発明の任意方法を実施するための説明書、例えば選択位置に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産するための説明書を含むことができる。
【００２２】
当業者に自明の通り、本発明により提供される方法、キット及び組成物は単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。例えば、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産するために、本明細書に記載する方法で本発明のメタノール資化性酵母細胞を使用することができる。上記の代用又は追加として、例えば硫酸化ポリペプチド、グリコシル化ポリペプチド、及び／又は１個以上のジスルフィド結合を含むポリペプチドを１０ｍｇ／Ｌまでの濃度で生産するためにこれらの方法を使用することができる。本明細書に記載する本発明の特徴の他の組合せも当業者に認識されよう。
【００２３】
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形の不定冠詞及び定冠詞はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）」と言う場合には、場合により２個以上のＲＳ分子の組合せを含み、「核酸」又は「細胞」と言う場合には、場合により実際問題として核酸の多数のコピー又は多数の細胞を含む。
【００２４】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味を有する。本発明の試験の実施には本明細書に記載するものに類似又は等価の任意方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料と方法は本明細書に記載するものである。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用される。
【００２５】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分又は所定の相互特異性の側面を有する成分、例えばＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で特異的にアミノアシル化する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を意味する。
【００２６】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離された成分、あるいは特定分子もしくは生物又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００２７】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。所定側面において、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードさせるための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。別の側面において、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質を有する第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることもできる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面において、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面において、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を意味する。
【００２８】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のＯ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００２９】
非真核生物：本明細書で使用する「非真核生物」なる用語はモネラ界（別称原核生物界）に属する生物を意味する。非真核生物（例えば原核生物）はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌（始原細菌という場合もある）亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
【００３０】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。
直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対）の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
【００３１】
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ：本明細書で使用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、Ｏ−ＲＳと呼ぶシンテターゼと同一又は相同である。
【００３２】
直交ｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは例えば（１）天然に存在するｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体ｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体ｔＲＮＡと相同であるか、（５）直交ｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）直交ｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。Ｏ−ｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより非天然アミノ酸を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のＯ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドにほぼ任意の非天然アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００３３】
ポリペプチド：ポリペプチドは必ずしもそうでなくてもよいが、一般に共有ペプチド結合により結合した任意長のアミノ酸残基（天然又は非天然又はその組み合わせ）の任意オリゴマーである。ポリペプチドは任意起源に由来することができ、例えば天然に存在するポリペプチド、組換え分子遺伝技術により作製されたポリペプチド、細胞もしくは翻訳系に由来するポリペプチド、又は無細胞合成手段により作製されたポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドはそのアミノ酸配列（例えばその成分アミノ酸残基の一次構造）により特徴付けられる。本明細書で使用するポリペプチドのアミノ酸配列とは全長配列に限定されず、部分配列でも完全配列でもよい。更に、ポリペプチドは特定生理活性の有無により限定されない。本明細書で使用する「蛋白質」なる用語はポリペプチドと同義である。「ペプチド」なる用語は限定されないが、例えば２〜２５アミノ酸長の短いポリペプチドを意味する。
【００３４】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにＯ−ＲＳはコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３５】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００３６】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００３７】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００３８】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。
例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に誘導体化ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンを有する）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンを有する誘導体化ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００３９】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは一般にポリペプチドの翻訳中に終止コドンに応答してアミノ酸の組込み（即ち「読み飛ばし」）を可能にすることにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。所定側面において、本発明のセレクターコドンはサプレッサーコドンであり、例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等である。
【００４０】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。
【００４１】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種類の標準天然アミノ酸の１種又は希少天然アミノ酸（例えばセレノシステイン又はピロリジン）以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をコードする遺伝子をPichia pastorisゲノムに組込む準備として構築したプラスミドを示す。
【００４３】
【図２】ｐ−アセチルフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｐａＲＳ）とｔＲＮＡＣＵＡ３コピーを含むポリヌクレオチドをコードする遺伝子をPichia pastorisゲノムに組込む準備として構築したプラスミドを示す。
【００４４】
【図３】ｐ−アセチルフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｐａＲＳ）とｔＲＮＡＣＵＡを発現するPichia pastoris株におけるＨＳＡの発現をモニターするためにメタノール誘導条件下で実施した実験の結果を示す。
【００４５】
【図４】非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）のＨＳＡへの組込みを確認するために実施した液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析実験の結果を示す。
【００４６】
【図５】ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）のＨＳＡへの組込みを確認するために実施したＭＡＬＤＩ質量分析実験の結果を示す。
【００４７】
【図６】本発明で利用される各種プラスミドの模式図である。
【００４８】
【図７ａ】非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンがセレクターコドンに応答してアミノ酸３７位でＨＳＡに組込まれる忠実度と特異性を測定するために実施した実験の結果を示す。
【図７ｂ】非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンがセレクターコドンに応答してアミノ酸３７位でＨＳＡに組込まれる忠実度と特異性を測定するために実施した実験の結果を示す。
【図７ｃ】非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンがセレクターコドンに応答してアミノ酸３７位でＨＳＡに組込まれる忠実度と特異性を測定するために実施した実験の結果を示す。
【００４９】
【図８】最適化アンバー抑圧についてｐＡｐａＲＳを比較するために実施した実験の結果を示す。
【００５０】
【図９】ＰＡＯＸ２、ＰＹＰＴ１、ＰＩＣＬ１、ＰＦＬＤ１、ＰＧＡＰ、又はＰＡＯＸ１で誘導したａａＲＳによるアンバー抑圧レベルを測定するために実施し、培地中のｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ濃度によりアッセイした実験の結果を示す。
【００５１】
【図１０】図１０ａはＡＢＴ−５１０ペプチドとｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａのオキシムライゲーションの模式図である。図１０ｂは結合の程度を測定するために実施したＭＡＬＤＩ質量分析の結果を示す。
【００５２】
【図１１】P. pastorisでｐＡｐａ以外の非天然アミノ酸（例えば構造３〜９）をｒＨＳＡＥ３７Ｘに組込むために本発明の直交翻訳系を使用できることを実証するために実施した実験を示す。
【００５３】
【図１２】ｐＰＩＣ３．５ｋ及びｐＲＥＡＶカセットをＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳに組込むのに成功したか否かを調べるために形質転換体４株で実施したＰＣＲの結果を示す。
【００５４】
【図１３】１回の形質転換からのＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳの別個のクローン４株におけるｐＡｐａＲＳ−Ｈｉｓ６ｘのウェスタンブロットを示す。ｐＡｐａＲＳ蛋白質は検出できなかった。
【００５５】
【図１４】ｒＨＳＡＥ３７ＸがＭｕｔ＋突然変異体でより強く発現されるか否かを調べるために実施した実験の結果を示す。
【００５６】
【図１５】各種P. pastoris遺伝子プロモーターを増幅するために実施したＰＣＲの結果を示す。
【００５７】
【図１６】プロモーター誘導によるｐＡｐａＲＳ産生の関数としてｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａのアンバー抑圧を示す図９の結果の棒グラフである。
【００５８】
【図１７】ＢＳＡ標準又は試験蛋白質発現からの未精製ｒＨＳＡＷＴ培地２５μｌを泳動させた蛋白質ゲルを示す。
【００５９】
【図１８】図１１ｆのレーン２からのｒＨＳＡＥ３７ＤＭＮＢ−Ｃ蛋白質をキモトリプシンで消化後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明はメタノール資化性酵母（例えばPichia pastoris）における非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドの生産を容易にする。非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドは新規な生物学的性質、毒性低減、活性強化、及び／又は半減期延長を示す治療剤として利用することができる。メタノール資化性酵母（例えばPichia pastoris）におけるＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対の使用はこのような蛋白質の生産に関して他の直交システム（例えば大腸菌や出芽酵母）に勝るいくつかの有益な利点がある。第１に、酵母（例えばP. pastoris）の真核細胞内構造により、生物学的活性のために複雑な翻訳後修飾（例えばグリコシル化、ジスルフィド結合形成、硫酸化、アセチル化、プレニル化及び蛋白分解プロセシング）を必要とする非天然アミノ酸（ＵＡＡ）を組込んだ蛋白質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）やヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）等の哺乳動物蛋白質）の合成が可能になる。従って、細菌系では最終的に不活性な抱合体となる多数の蛋白質がメタノール資化性酵母（例えばP. pastoris）では生物学的に活性な分子として生産される。第２に、メタノール資化性酵母（例えばP. pastoris）で生産されたＵＡＡを組込んだ蛋白質は特に治療用に意図された蛋白質の効力を妨げる可能性のある高濃度の発熱物質（例えばリポ多糖類）や抗原（例えば高マンノース型オリゴ糖）を含まない。第３に、P. pastorisにおける外来遺伝子の遺伝子操作には多数の定着技術及び方法（例えば遺伝子ターゲティング、高頻度ＤＮＡ形質転換、機能的相補によるクローニング）を利用できる（Lin-Cereghino, et al., (2002) "Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris." Curr Opin Biotechnol 13:329-332）。内在性の誘導的プロモーター及び選択マーカーを利用できるため、このメタノール資化性宿主により産生可能なＵＡＡを組込んだ蛋白質の範囲の柔軟性が増す。
【００６１】
これらの利点に加え、P. pastoris等のメタノール資化性酵母はＵＡＡを組込んだ複雑な蛋白質の低コストで大規模な合成にも好適である。メタノール資化性酵母（例えばP. pastoris）は単純な規定塩類培地で容易に培養され、例えばバキュロウイルス発現システムや哺乳動物組織培養に必要な高価な培地添加物や装置が不要である。
P. pastoris等のメタノール資化性酵母は非常に高い細胞密度まで増殖することができ、理想的な条件下では細胞懸濁液がペーストのコンシステンシーになる点まで増殖することができる。その特徴的な増殖速度により、組換えP. pastoris株は異種蛋白質（例えばＵＡＡを組込んだ蛋白質）を高レベル（例えば出芽酵母の１０〜１００倍のレベル）で生産することができる。メタノール資化性酵母（例えばP. pastoris）は遺伝子操作が容易であり、組換え蛋白質生産が経済的であり、一般に真核蛋白質に付随する翻訳後修飾を実施できるため、ＵＡＡを組込んだ異種蛋白質の発現に有利なシステムである。
【００６２】
直交翻訳系成分
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質をメタノール資化性酵母で合成するための新規組成物及び方法の理解は直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に付随する活性を理解することにより更に深められる。これらのポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みは所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して蛋白質に組込むように直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を適応させることにより実施される。これらの直交成分は宿主細胞（例えばP. pastoris細胞）の翻訳機構の内在成分又は天然アミノ酸と交差反応しない。本明細書に記載する１例で使用される直交成分としては、Ｏ−ＲＳ（例えば大腸菌チロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳ）と、宿主細胞（例えばP. pastoris）で直交対として機能するＯ−ｔＲＮＡ（例えば突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサー）が挙げられる。
【００６３】
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種類の遺伝的にコードされるαアミノ酸以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。２０種類の天然アミノ酸の構造については、例えばL. Stryer著Biochemistry, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York参照。本発明の非天然アミノ酸は側鎖基が天然アミノ酸と異なるが、非天然アミノ酸は蛋白質を構成する２０種類のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。本発明で利用される非天然アミノ酸としては、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン、ｐ−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ＤＭＮＢ−セリン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、Ｏ−プロパルギル−Ｌ−チロシン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体；グルタミンアミノ酸の非天然類似体；フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体；セリンアミノ酸の非天然類似体；スレオニンアミノ酸の非天然類似体；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ；光活性化可能な架橋基を有するアミノ酸；スピン標識アミノ酸；蛍光アミノ酸；新規官能基を有するアミノ酸；別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸；金属結合性アミノ酸；金属含有アミノ酸；放射性アミノ酸；フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸；ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸；グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸；ケト含有アミノ酸；ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸；重原子置換アミノ酸；化学分解性又は光分解性アミノ酸；延長側鎖を有するアミノ酸；毒性基を含むアミノ酸；糖置換アミノ酸（例えば糖置換セリン等）；炭素結合糖含有アミノ酸；糖置換システイン；酸化還元活性アミノ酸；α−ヒドロキシ含有酸；アミノチオ酸含有アミノ酸；α，αジ置換アミノ酸；βアミノ酸；スルホチロシン、４−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸が挙げられる。
【００６４】
本発明は場合により複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、本発明は更に別のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識する。例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等の多数の異なるセレクターコドンを遺伝子（例えばベクター核酸及び／又は相補核酸のコーディング配列）に導入することができる。これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対がメタノール資化性酵母細胞の環境でその直交性を保持する限り、このようなＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は各種起源の任意のものに由来することができる。
【００６５】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳ、非天然アミノ酸、セレクターコドン、並びに１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の作製に適した直交翻訳系を作製及び／又はその特異性を改変するための方法は一般に例えば国際公開番号ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝子コードの拡張（EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）に記載されている。これらの各出願の開示内容全体を本願に援用する。各々その開示内容全体を本願に援用するWang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Deiters et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005); Chin et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9026-9027；及び国際公開番号ＷＯ２００６／０３４３３２（出願日２００５年９月２０日）も参照。その他の詳細は米国特許第７，０４５，３３７号、第７，０８３，９７０号、第７，２３８，５１０号、第７，１２９，３３３号、第７，２６２，０４０号、第７，１８３，０８２号、第７，１９９，２２２号、及び第７，２１７，８０９号に記載されている。
【００６６】
メタノール資化性酵母における異種蛋白質の発現と精製
４種類の公知メタノール資化性酵母属（例えばHansenula，Pichia，Candida，及びTorulopsis）は代謝経路が共通であるため、メタノールを単独炭素源として利用することができる。メタノール誘導に転写調節応答し、酵素のいくつかは迅速に高レベルで合成される。これらの遺伝子の発現を制御するプロモーターは最強で最も厳密に調節される酵母プロモーターであるため、メタノール資化性酵母は組換え蛋白質の大規模生産用宿主として非常に魅力的になっている。これらのメタノール資化性酵母の細胞は迅速に高密度まで増殖させることができ、培地の単純な操作により産物発現レベルを調節することができる。これまでにP. pastoris、P. methanolica、P. angusta（別称Hansenula polymorpha）及びCandida boidiniiで発現システムが開発されており、これらのシステムは例えばHouard, et al. (2002) "Engineering of non-conventional yeasts for efficient synthesis of macromolecules: the methylotrophic genera." Biochimie 84:1089-1093; Gellison (2002) Hansenula Polymorpha: Biology and Applications, 1st Ed., Wiley-VCH, NY；米国特許第６，６４５，７３９号、Gellisen (2000) "Heterologous protein production in methylotrophic yeasts." Applied Microbiology and Biotechnology 54:741-750に更に詳述されている。これらのシステムの多くは市販されており、例えば学術及び産業研究室用としてArtes BiotecnologyからHansenulaキット、InvitrogenからPichiaキットが市販されている。
【００６７】
好ましい１態様では、異種蛋白質をメタノール資化性酵母P. pastorisから発現精製する。例えば「メタノール資化性酵母における株構築方法及びストラテジー」の欄で後述するように、その調節特性がこの目的に好適なアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターから外来遺伝子をP. pastorisで発現させることができる。ＡＯＸ１プロモーターは大半の炭素源（例えばグリセロール、グルコース、又はエタノール）で酵母の増殖中に強く抑制されるが、メタノールで増殖中には高度に誘導される（Tschorp et al. (1987) "Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris." Nucl Acids Res 15:3859-3876）。ＰＡＯＸ１により調節される遺伝子によりコードされる蛋白質の発現は一般にメタノール上で増殖させたP. pastoris細胞における総可溶性蛋白質の≧３０％に達することができる。組換え蛋白質を生産するためには、まずＰＡＯＸ１の制御下の発現株を抑制性炭素源で増殖させてバイオマスを作製（例えば培養密度を最大化）した後に、単独エネルギー源としてメタノール含有培地（例えばＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、又はＢＭＭ）に転換し、外来遺伝子の発現を誘導する。
【００６８】
他方、所定の蛋白質をコードする異種遺伝子の発現にはメタノールにより誘導されないプロモーターも有利な場合がある。この発現システムにおけるＡＯＸ１プロモーターの代替プロモーターはP. pastoris ＧＡＰ、ＦＬＤ１、ＡＯＸ２、ＩＬＣ１及びＹＰＴ１プロモーターである。これらのプロモーターの調節、これらのプロモーターから外来遺伝子を発現させるために有益であると思われる環境、及びP. pastorisにおけるこれらのプロモーターによる外来蛋白質の発現に関する更に詳細は例えばSears, et al. (1998) "A Versatile Set of Vectors for Constitutive and Regulated Gene Expression in Pichia pastoris." Yeast 14:783-790; Vassileva, et al. (2001) "Expression of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the GAP promoter." J Biotechnology 88:21-35; Shen, et al. (1998) "A strong nitrogen-source regulated promoter for controlled expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris." Gene 216:93-102; Lin-Cereghino,et al. "Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris." Genetic Engineering Principles and Methods, Vol.23 1st Ed. Ed. Jane K. Setlow, Springer, NY:(2005)に記載されている。
【００６９】
P. pastoris又は他のメタノール資化性酵母における異種蛋白質の発現は振盪フラスコ培養で実施することができるが、発酵槽では例えば乾燥細胞重量＞１００ｇ／Ｌ、湿潤細胞重量＞４００ｇ／Ｌ、＞５００ ＯＤ６００単位／ｍｌの超高密度の細胞密度を達成するようにｐＨ、通気及び炭素源供給速度等のパラメーターを制御できるので、このシステムで発現される蛋白質レベルは一般に発酵槽培養のほうが著しく高い（例えばLin-Cereghino, et al. (2002) "Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris" Curr Opin Biotechnol 13:329-332参照）。P. pastoris発現システムの顕著な特徴は発現株が振盪フラスコ培養から高密度発酵槽培養に規模拡大し易いことである。
【００７０】
異種蛋白質（例えばＰ−ＡＯＸ１の転写制御下の遺伝子によりコードされる蛋白質）をP. pastoris又は他のメタノール資化性酵母の発酵槽培養で発現させるためには一般に３段階法が使用される。第１段階では、非発酵性ＰＡＯＸ１抑制性炭素源を含む単純な規定培地で培養P. pastoris又は他のメタノール資化性酵母発現株を培養し、細胞増殖させる。第２段階は増殖を制限する速度でグリセロールを培養液に供給して培養液のバイオマスを更に増加し、誘導用の細胞を作製する遷移相を構成する。第３段階では、細胞を代謝性メタノールに生理的に順化させ、組換え蛋白質を合成させるような速度でメタノールを培養液に加える。その後、所望の増殖速度と蛋白質発現速度に達するまでメタノール供給速度を周期的に上方修正する（Lin-Cereghino, et al. "Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris." Genetic Engineering Principles and Methods, Vol.23 1st Ed. Ed. Jane K. Setlow, Springer, NY:(2005)）。
【００７１】
P. pastorisを増殖させることができる培地は廉価で、十分に規定されており、炭素源（例えばグリセロール及び／又はメタノール）、ビオチン、塩類、微量成分、及び水から構成される。培地は発熱物質と毒素を含まないため、人体用の薬剤の生産に適合可能である。
【００７２】
P. pastoris又は他のメタノール資化性酵母で発現される組換え蛋白質は細胞内でも細胞外でも産生させることができる。この酵母は内在蛋白質を低レベルでしか分泌しないので、分泌される組換え蛋白質は培地中の蛋白質の大半を構成することができる。
従って、組換え蛋白質を培地に加えると、蛋白質精製の第１段階として機能することができ、苛酷な酵母溶解プロトコルに従う必要がなくなり、内在P. pastoris蛋白質による組換え蛋白質の汚染の可能性が避けられる。他方、蛋白質安定性及びフォールディング要件により、培地への異種蛋白質の分泌は一般にその天然宿主により通常分泌される蛋白質のみに限定される。しかし、既製発現カセットにより実施者が培地への分泌を可能にするようにその天然分泌シグナル、出芽酵母α因子プレプロペブチド、又はP. pastoris酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナルをコードする配列とインフレームで該当遺伝子をクローニングできるキットが入手可能であり、例えばオリジナルピキア発現キット（Invitrogen）、マルチコピーピキア発現キット（Invitrogen）、ピキア蛋白質発現システム（Research Corporation Technologies）が挙げられる。P. pastorisから細胞内組換え蛋白質を回収する技術は多数のものが開発されている（Shepard, et al. (2002) "Recovery of intracellular recombinant proteins from the yeast Pichia pastoris by cell permeabilization." J Biotechnology 99:149-160；米国特許第６，８２１，７５２号）。
【００７３】
一般蛋白質精製方法
種々の蛋白質精製法が当分野で周知であり、メタノール資化性酵母で発現されるＵＡＡを組込んだ蛋白質の精製分析に適用することができる。これらの技術及びポリペプチド分析に必要な他の技術としては、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag, et al. (1996) Protein Methods,2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY;及びWalker (1998) Protein Protocols CD-ROM版 Humana Press, NJ;とその引用文献に記載されているものが挙げられる。
【００７４】
メタノール資化性酵母における株構築方法及びストラテジー
該当遺伝子を高度に誘導性のメタノール資化性酵母プロモーターの制御下に置く核酸構築物を構築するためには大腸菌での複製に適したシャトルベクターが一般に使用される。
メタノール資化性酵母ではプラスミドが比較的不安定であるため、通常では発現構築物を直鎖化し、例えばPichia細胞、Hansenula細胞、Candida細胞、又はTorulopsis細胞に形質転換し、ゲノムに組込む。組込みは一般に部位特異的であるが、Hansenula polymorphaでは高頻度の不均一組込みが認められている（Agaphonov, et al. (2005) "Defect of vacuolar protein sorting stimulates proteolytic processing of human urokinase-type plasminogen activator in the yeast Hansenula polymorpha." FEMS Yeast Reseach 5:1029-1035）。メタノール資化性酵母の一般分子操作（例えば形質転換、遺伝子ターゲティング、機能的相補によるクローニング、入手可能な選択マーカーの使用等）に関するその他の詳細は例えばPeberdy, Ed. (1991) Applied Molecular Genetics of Fungi. Cambridge University Press, UK; Hansenula Polymorpha: Biology and Applications, 1st Ed., Wiley-VCH; Higgins and Cregg. Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology), 1st Ed. Humana Press: New Jersey (1998) とその引用文献に記載されている。
【００７５】
好ましい１態様では、メタノール資化性酵母P. pastorisで異種遺伝子を発現させる。P. pastorisにおける大半の外来遺伝子の発現は、発現ベクターへの該当遺伝子の導入  P. pastorisゲノムへの発現ベクターの導入、及び外来遺伝子により発現される蛋白質の産生用の推定発現株の分析の基本的な３段階により実施することができ、その手法については「メタノール資化性酵母における株構築方法及びストラテジー」の欄で上述した通りである。幸いにも、P. pastorisの分子遺伝子操作技術（例えばＤＮＡ形質転換、遺伝子ターゲティング、遺伝子置換、及び機能的相補によるクローニング）は出芽酵母について記載されている技術と同様である。他方、出芽酵母とは対照的にP. pastorisではプラスミドが不安定であるので、該当蛋白質をコードする発現構築物を相同組換えによりP. pastorisゲノムに組込む。P. pastorisの分子遺伝子操作プロトコルは例えばCregg, et al. (1985) "Pichia pastoris as a host system for transformations." Molec Cell Biol 5:3376-3385; Lin-Cereghino, et al. "Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris." Genetic Engineering Principles and Methods,Vol.23 1st Ed. Ed. Jane K. Setlow, Springer, NY:(2005); Higgins and Cregg. Pichia Protocols(Methods in Molecular Biology),1st Ed.Humana Press:New Jersey (1998); Lin-Cereghino, et al. (2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66とその引用文献に詳細に記載されている。
【００７６】
種々のP. pastoris宿主株及び発現ベクターが入手可能である。ほぼ全てのP. pastoris発現株はＮＲＪＡＬ−Ｙ１１１４３０（Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL）に由来する。大半の発現株は適切な相補的マーカーを含む発現ベクターの選択を可能にする１個以上の栄養要求性マーカーを有する。宿主株はＡＯＸ１、ＡＯＸ２、又は両者の欠失によりメタノール代謝能が異なる場合がある。実際に、ＡＯＸ１及び／又はＡＯＸ２に突然変異を有する株は野生型株よりも外来蛋白質の良好な産生株となる場合がある（Cregg. et al. (1987) "High level expression and efficient assembly of hepatitis B antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris." Bio/Technology 5:479-485; Chiruvolu, et al. (1997) "Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastoris in fed-batch fermentation." Enzyme Microb Technol 21:277-283）。しかし、ａｏｘ１−株もＡＯＸ１プロモーターから高レベルの外来蛋白質の発現を誘導する能力を維持する。所定の組換え蛋白質の発現がより有益になるようなプロテアーゼ欠損宿主株を含む宿主株に関するより詳細な情報は例えばBrierley, et al. (1998) "Secretion of recombinant insulin-like growth factor-1 (IGF-I)." Methods Mol Biol 103:149-177; White, et al. (1995) "Large-scale expression, purification, and characterization of small fragments of thrombomodulin: the roles of the sixth domain and of methionine 388." Protein Eng 8:1177-1187から入手可能である。
【００７７】
大半のP. pastoris発現ベクターは大腸菌で維持するための複製起点と、一方又は両方の生物で機能的な選択マーカー（例えばＡＲＧ４，ＨＩＳ４，ＡＤＥ１，ＵＲＡ３，ＴＲＰ１並びにP. pastorisで選択可能な所定の抗生物質（例えばZeocin（登録商標）やGeneticin（登録商標））及び／又は大腸菌で選択可能な多数の抗生物質耐性マーカーのいずれかを含む大腸菌／P. pastorisシャトルベクターとして設計されている。一般に、発現ベクターは５’ＡＯＸ１プロモーター配列と転写終結用のＡＯＸ１由来配列を含み、その間にマルチクローニングサイトが位置する。ＡＯＸ１プロモーターは多数の外来蛋白質を発現させるために使用するのに成功しているが、例えば食料品生産のように、このプロモーターの使用が適切ではないと思われる状況もある。この発現システムにおけるＡＯＸ１プロモーターの代替プロモーターはP. pastoris ＡＯＸ２、ＩＣＬ１、ＧＡＰ、ＦＬＤ１、及びＹＰＴ１プロモーターである。上記プロモーターのいずれかを含む発現ベクターの一般図と可能なベクター成分のリストも例えばLin-Cereghino, et al. "Expression of foreign genes in the yeast Pichia pastoris." Genetic Engineering Principles and Methods, Vol.23 1st Ed. Ed. Jane K. Setlow, Springer, NY:(2005) 及びLin-Cereghino, et al. (2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66に記載されている。更に、多数のベクターのＤＮＡ配列がInvitrogenウェブサイト（www.invitrogen.com）に掲載されており、個別に又はP. pastoris発現キットとしてInvitrogenから販売されている。
【００７８】
一般分子クローニング方法及び技術
例えば「メタノール資化性酵母における株構築方法及びストラテジー」の欄で上述したように該当遺伝子を発現構築物にクローニングするために核酸を単離、クローニング、及び増幅する手順は文献に詳細に記載されており、例えば該当遺伝子を提供し、メタノール資化性酵母（例えばP. pastoris）で発現させるために本発明で使用することができる。これらの技術の更に詳細はBerger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook, et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook"); The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc. (Rapley); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al. eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (2007年補遺版) ("Ausubel"); PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis, et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Chen, et al. (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press; in Viljoen, et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer;及びDemidov and Broude (eds) (2005) DNA Amplification: Current Technologies and Applications. Horizon Bioscience, Wymondham, UKに記載されている。例えばその後の核酸単離のための例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な参考文献としては、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New Yorkとその引用文献; Payne, et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)及びAtlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton,FLが挙げられる。
【００７９】
細胞からプラスミド又は他の該当核酸を精製するためのキットも多数市販されている（例えばEasyPrep（登録商標）、FlexiPrep（登録商標）（いずれもPharmacia Biotech製品）；StrataClean（登録商標）（Stratagene製品）；QIAprep（登録商標）（Qiagen製品）参照）。単離及び／又は精製した任意核酸を更に操作して他の核酸を作製し、細胞にトランスフェクションするために使用し、発現の目的で生物に感染させるために関連ベクターに導入し、及び／又は同等の操作を行うことができる。典型的なクローニングベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを構成する。Sambrook, Ausubel及びBerger参照。更に、Operon Technologies Inc.（Huntsville, AL）等の各種販売会社からほぼ任意核酸を特別注文又は標準注文することができる。
【００８０】
該当蛋白質及びポリペプチド
本発明はメタノール資化性酵母（例えばP. pastoris）により合成された蛋白質に非天然アミノ酸を組込むための組成物と方法を提供する。本発明は生物学的性質を強化し、毒性を低減し、及び／又は半減期を延長した治療用蛋白質の開発及び大規模生産に特に有用であると思われる。本明細書に記載する方法と組成物を使用することにより最も有益に発現されるこのような治療用、診断用、及び他のポリペプチドの例としては限定されないが、ＨＳＡ、ヒト中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、α１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃキットリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα、ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、ＭＣＰ−１、ヒト表皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、剥離毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ２１、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子（ｈＩＧＦ）、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩ、ヒトインターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、ヒトオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、発熱外毒素Ｂ、発熱外毒素Ｃ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ／ｃキット、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ）、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４蛋白質、ＶＣＡＭ−１蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＥＦ）、ｈＶＥＧＦ１６５、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、ＣＤ４４、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）、破傷風毒素Ｃフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）、ヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ、ＢＰ３２０抗原、ヒトカスパーゼ３、Ｂ型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質（ｈＳＢＰ）、ヒトエンドスタチン、又はｇｐ１２０が挙げられる。
【００８１】
キット
キットも本発明の特徴である。例えば、キットは非天然アミノ酸と本発明のメタノール資化性酵母細胞を含むことができる。細胞は場合によりそのゲノムに組込まれたＯ−ｔＲＮＡをコードする核酸及び／又はＯ−ＲＳをコードする核酸を含むことができ、例えばＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡは上記プロモーターのいずれかの転写制御下にある。キットは本発明の細胞を使用するためのコンポーネントを含むことができ、例えば、１個以上のセレクターコドンを含み、該当ポリペプチドをコードする核酸をメタノール資化性酵母細胞のゲノムに組込むための説明書が挙げられる。キットはキットコンポーネントを保持するための容器と、キットで提供される細胞を使用して本発明の任意方法を実施するための説明書、例えば選択位置に１個以上の非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産するための説明書を含むことができる。
【００８２】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により特許請求の範囲に記載する発明を限定するものではない。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【実施例１】
【００８３】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質のPichia pastoris発現システムの構築
非天然アミノ酸（ＵＡＡ）をポリペプチドに組込むには、遺伝的にコードされる直交ｔＲＮＡＣＵＡ（ＯｔＲＮＡ）／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）対の進化により、蛋白質を構成する２０種類の天然αアミノ酸の現在のレパートリーに「２１番目のアミノ酸」を追加する必要がある。M. jannaschii ｔｙｒＲＳの特異性をチロシンから大腸菌発現システムでＯ−ＲＳとして使用するための該当非天然アミノ酸に変更するために指向的進化を利用する。同様に、大腸菌ｔｙｒＲＳ又はｌｅｕＲＳの特異性を夫々チロシン又はロイシンから出芽酵母発現システムでＯ−ＲＳとして使用するための該当非天然アミノ酸に変更することができる。突然変異体ライブラリーの半合理的設計により、３０種類を上回るアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを出芽酵母と大腸菌でその対応する非天然アミノ酸について進化させることに成功している（Xie, et al. (2005) "An expanding genetic code." Methods 36:227-38; Xie, et al. (2006) "A chemical toolkit for proteins:an expanded genetic code." Nat Rev Mol Cell Biol 7:775-82）。このインビボ部位特異的手法により、化学的ｔＲＮＡアミノアシル化又は固相合成の効率を越えるレベルで新規化学官能基の蛋白質組込みが可能になった。今日までに、ユニークな化学反応基としては、光解離性基、グリコシル化アミノ酸、光架橋基、ケトン官能基、金属キレート基、及びＩＲプローブが検討されている（Xie, et al. (2005) "An expanding genetic code." Methods 36:227-38; Wang, et al. (2006) "Expanding the genetic code." Annu Rev Biophys Biomolec Struct 35:225-249）。本研究ではユニークなケトン残基であるｐ−アセチルフェニルアラニンと、アジド残基であるｐ−アジドフェニルアラニンに着目する（Zhang, et al. (2003) "A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo." Biochemistry 42:6735-46）。これらの残基を蛋白質に組込むと、例えばオキシム又はヒドラジドライゲーションにより小分子、ペプチド、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の部位特異的結合が可能になる。
【００８４】
これまでに、進化型直交シンテターゼを使用して非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質のインビボ発現は大腸菌、出芽酵母、及び哺乳動物細胞で報告されている（Lie, et al. (2007) "The genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells." Nature Methods 4:239-244）。
非天然アミノ酸を組込んだ多数の組換え発現蛋白質をこのような大腸菌及び出芽酵母発現システムで生産することができるが、これらのシステムは硫酸化蛋白質、グリコシル化蛋白質、又は複雑なジスルフィド架橋を含む蛋白質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）やヒト中性エンドペプチダーゼないしネプリライシン（ＮＥＰ））を合成することができない。ＨＳＡとＮＥＰはいずれも複雑なジスルフィド結合を含み、生物学的に活性なＮＥＰの産生にはグリコシル化が必要であるため、大腸菌又は出芽酵母でこれらの蛋白質を高収率で発現させることはできない。
【００８５】
非天然アミノ酸を組込んだＨＳＡ又はＮＥＰ変異体を発現させるためには、新規インビボＵＡＡ発現システムを異種蛋白質発現改善に適応させる必要がある。例えば、Pichia pastoris発現システムは硫酸化、グリコシル化、又は高度に架橋した哺乳動物蛋白質を首尾よく産生できることが繰返し実証されている（Lin-Cereghino, et al. (2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66）。出芽酵母で産生される蛋白質とは対照的に、P. pastorisで産生される蛋白質は下流のプロセシングを妨げる恐れのある高マンノース型グリカン構造を含む可能性が低く、更にP. pastorisで産生される蛋白質は潜在的に抗原性のα１，３グリカン結合を含まない。更に、P. pastorisにおける組換え蛋白質発現レベルは出芽酵母における発現レベルよりも数桁高くすることができる（Lin-Cereghino, et al. (2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66）。
進化型ＵＡＡシンテターゼを出芽酵母からP. pastorisに移すと、非天然アミノ酸を組込んだ機能的哺乳動物蛋白質（例えばＨＳＡやＮＥＰ）の発現を強化することができる。
【００８６】
P. pastorisではプラスミドが相対的に不安定性であるため、該当蛋白質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））と、ＯＲＳとＯ−ｔＲＮＡ（例えば夫々アセチルフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｐａＲＳ）とｔＲＮＡＣＵＡ）をコードするＤＮＡ構築物をマルチコピーピキア発現キット（Invitrogen）及び他の文献（Lin-Cereghino, et al. (2000) "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris." FEMS Microbiol Rev 24:45-66）に記載されているように各々組換えによりPichia pastorisゲノムに組込んだ。構築物をJames Cregg研究所の寄贈品であるPichia pastoris株ＧＳ２００のゲノムに導入した。ＧＳ２００はアルギニンとヒスチジンを含有しない培地では増殖することができない。ＨＩＳ４遺伝子を含むＨＳＡ構築物をＧＳ２００ゲノムのＡＯＸ１遺伝子座に組込み、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡをコードし、ＡＲＧ４遺伝子を含む構築物をＧＳ２００のＡＲＧ４遺伝子座に組込んだ。
【００８７】
ａｏｘ１：：ＨＳＡ遺伝子置換と５’ＡＯＸ１遺伝子挿入の２種類の方法によりＨＳＡ突然変異体ＨＳＡ−Ｇｌｕ３７ＴＡＧのゲノム組込みを実施した。この突然変異体をPichia pastorisでの発現に選択したのは、例えばセレクターコドンＴＡＧに応答して突然変異体蛋白質に組込まれる非天然アミノ酸はＨＳＡ蛋白質の一重目の螺旋で溶媒に接触可能であるので、その後のインビトロ結合反応が可能になるためである。国立衛生研究所、哺乳動物遺伝子コレクション（アクセション番号ＢＣ０２３０３４）から野生型ＨＳＡ（ＷＴ ＨＳＡ）のヌクレオチド配列を入手し、QuikChange（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）に記載されている方法に従って作製した上記突然変異体の作製に備えてｐＹＥＳ２．１ベクターにクローニングした。突然変異体ＨＳＡ対立遺伝子及びＷＴ  ＨＳＡを各々ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位の間でｐＰＩＣ３．５ｋに再クローニングし、ＷＴ及び突然変異体の両者のＨＳＡ発現をＡＯＸ１プロモーター及びターミネーターの転写制御下に置いた（図１）。ＨＳＡの２４アミノ酸哺乳動物「プレプロ」リーダー配列（例えばアミノ酸配列ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ）はP. pastoris分泌シグナルに適合可能であり、培地への蛋白質の放出を可能にする。このプレプロ配列は成熟ＨＳＡには存在しない（Yeh, et al. (1992) "Design of Yeast-Secreted Albumin Derivatives for Human Therapy:Biological and Antiviral Properties of a Serum Albumin-CD4 Genetic Conjugate." Proc Natl Acad Sci USA 89:1904-8）。
【００８８】
各々ＨＩＳ４とGeneticin（登録商標）Ｒ（ＧｅｎＲ）マーカーをコードするｐＰＩＣ３．５ｋ−ＨＳＡ構築物をＳａｃＩで直鎖化し、５’ＡＯＸ１遺伝子座への挿入を誘導し、ＧｅｎＲＨｉｓ＋ａｒｇ−Ｍｕｔ＋表現型を有するＧＳ２００形質転換体を得るか、又はＢｇｌＩＩで直鎖化し、ａｏｘ１：：ＨＳＡ遺伝子置換を誘導し、ＧｅｎＲＨｉｓ＋ａｒｇ−ｍｕｔＳ表現型を有するＧＳ２００形質転換体を得た。得られたフラグメントを使用し、コンピテントＧＳ２００細胞をエレクトロポレーションにより形質転換した。
【００８９】
マルチコピーピキア発現キット（Invitrogen）及び他の文献（例えばSears, et al. (1998) "A Versatile Set of Vectors for Constitutive and Regulated Gene Expression in Pichia pastoris." Yeast 14:783-790及びBecker, et al.(1991) "High Efficiency Transformation of yeast by electroporation." Methods Enzymol Ed. Jon Abelson, et al. 194:182-187参照）に記載されている標準方法を使用して酵母細胞をエレクトロコンピテントにした。ｐＰＩＣ３．５ｋ−ＨＳＡカセットをそのゲノムに保有するPichia pastoris形質転換体をヒスチジン不含再生デキストロースベース（ＲＤＢ）寒天プレートでヒスチジン原栄養性について選択した。次に０．２５〜４．０ｍｇ／ｍＬ Geneticin（登録商標）を添加した酵母エキスペプトンデキストロース（ＹＰＤ）寒天プレートで形質転換体をGeneticin（登録商標）耐性についてスクリーニングした。ａｏｘ１：：ＨＳＡ遺伝子置換からの形質転換体は０．２５ｍｇ／ｍＬ Geneticin（登録商標）を添加したＹＰＤプレートで増殖し、ＨＳＡ−Ｇｌｕ２７ＴＡＧカセット１コピーがゲノムに存在していることが分かったが、５’ＡＯＸ１挿入からの形質転換体は２．５ｍｇ／ｍＬ Geneticin（登録商標）を添加したＹＰＤプレートで増殖し、ＨＳＡ−Ｇｌｕ２７ＴＡＧカセットのマルチコピーがゲノムに存在していることが分かった。ａｏｘ１：：ＨＳＡ遺伝子置換からのＨＳＡ−Ｇｌｕ３７ＴＡＧ形質転換体１株と、５’ＡＯＸ１挿入からのＨＳＡ−Ｇｌｕ３７ＴＡＧ形質転換体１株を釣菌し、エレクトロコンピテントにした。ＷＴ ＨＳＡ（ｍｕｔＳａｒｇ−表現型）１コピーを保有するＧＳ２００クローンを発現対照用に凍結した。
【００９０】
ｐ−アセチルフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｐａＲＳ）とｔＲＮＡＣＵＡをコードするインサートを含むようにPeter Schultz研究所からの最適化出芽酵母発現プラスミドであるｐＰＲ１−ＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡＣＵＡからプラスミドｐＲＥＡＶを構築した（図２）。この直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／直交ｔＲＮＡ対は大腸菌に由来し、非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンを出芽酵母発現システムに組込むために従来最適化されている（Chen, S. et al. (2007) "An Improved System for the Generation and Analysis of Mutant Proteins Containing Unnatural Amino Acids in Saccharomyces cerevisiae." Journal Molec Bio 371:112-22）。
【００９１】
ｐＰＲ１−ＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡＣＵＡはｔＲＮＡＣＵＡのタンデムコピー３個をコードする。ｐＲＥＡＶを構築するために、ｐＰＲ１−ＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡＣＵＡベクターを鋳型として使用してＰＣＲを実施し、２ｕ起点とＴＲＰマーカーをコードするベクター上の領域のすぐ外側に配置された制限部位ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを含むｐＰＲ１由来プラスミドを作製した。ＡＲＧ４（アクセション番号ＡＦ３２１０９７）をJames Cregg研究所の寄贈品であるプラスミドｐＢＬＡＲＧからＰＣＲにより増幅し、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挟まれたＡＲＧ４をコードするフラグメントを作製した。ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＡＲＧ４フラグメントを上記ｐＰＲ１由来ベクターにライゲーションし、２ｕ起点とＴＲＰマーカーに置換した。次にＡｆｌＩＩ及びＡｓｃＩ制限部位をＰＣＲによりＡＤＨ１プロモーターの外側でこの構築物に導入した。ｐＡｐａＲＳをコードするＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩインサートをＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ消化により直鎖化したｐＰＩＣ３．５Ｋプラスミドにクローニングし、ｐＡｐａＲＳ発現をＡＯＸ１プロモーター及びターミネーターの転写制御下に置いた。ｐＡｐａＲＳをコードする遺伝子であるＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ１転写ターミネーターを含むフラグメントをこのｐＰＩＣ３．５Ｋ由来構築物から増幅し、ＡｆｌＩＩ及びＡｓｃＩ制限部位に挟まれたＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ−ＴＡＯＸ１フラグメントを作製した。ＡｆｌＩＩ／ＡｓｃＩで消化した上記ｐＰＲ１誘導体にこのフラグメントをライゲーションし、ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳを作製した（図２）。最終ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ構築物は大腸菌ｐＵＣ  ｏｒｉを含み、ｐＡｐａＲＳをコードする遺伝子をＡＯＸ１プロモーター及び転写ターミネーターの制御下に置き、ｂｌａ（例えばβ−ラクタマーゼ、ＡＲＧ４及びｔＲＮＡＣＵＡ３コピーをコードする遺伝子）をＰＧＫ１プロモーターの転写制御下に置く（図２）。
【００９２】
次にｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳをＡａｔＩＩ消化により直鎖化し、直鎖化構築物を使用し、突然変異体ＨＳＡ対立遺伝子を保有する先に単離したエレクトロコンピテントＧＳ２００株２株を形質転換した。アルギニン不含ＲＤＢプレートでアルギニン原栄養性について形質転換体を選択し、０〜２．５ｍｇ／ｍＬ Geneticin（登録商標）を添加したＹＰＤプレートで上記のようにGeneticin（登録商標）耐性について再スクリーニングした。次にこれらの株を下記後続実験で使用し，ＨＳＡ発現レベルとPichia pastorisにおける突然変異体ＨＳＡ蛋白質への非天然アミノ酸ｐＡｐａの組込みをモニターした。
【００９３】
形質転換体（例えばＭｕｔ＋単離株２０株とｍｕｔＳ単離株２０株）をメタノール誘導条件下で１２０〜１４４時間増殖させた。ＧＳ２００ ＨＳＡ−３７ＴＡＧ ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ ｍｕｔＳ単離株１株とＧＳ２００ ＨＳＡ−３７ＴＡＧ ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ Ｍｕｔ＋単離株１株は各々高レベルの突然変異体ＨＳＡを発現することが判明し、ＨＳＡ対立遺伝子でＯ−ｔＲＮＡによりコードされるセレクターコドンのアンバー抑圧が予想されるので、これらの単離株を更に分析することにした。変性ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で遠心した培地の２０ｕｌサンプルのゲル電気泳動によりＨＳＡ発現をモニターした。ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを泳動させ、クーマシー染色して可視化した処、非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）の存在下のみでＨＳＡ発現が認められた（図３）。ｍｕｔＳ単離株からの蛋白質収率は約１０〜１２ｍｇ／ｍｌであり、Ｍｕｔ＋単離株からの収率は１０〜１５ｍｇ／ｍｌであった。
【００９４】
セレクターコドンに応答して非天然アミノ酸ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）を蛋白質に組込むように構築した株でこれらの実験を繰返した。大腸菌に由来し、出芽酵母発現システムで非天然アミノ酸ｐＡｚｐａを組込むように既に最適化されたｐ−アジドフェニルアラニンシンテターゼ（ｐＡｚｐａＲＳ）が従来記載されている（Chen, S. et al. (2007) "An Improved System for the Generation and Analysis of Mutant Proteins Containing Unnatural Amino Acids in Saccharomyces cerevisiae." Journal Molec Bio 371:1 12-22）が、これをＥａｇＩとＮｃｏＩで予め消化しておいたｐＲＥＡＶにクローニングした。この構築物を従来記載されているようにＡａｔＩＩで直鎖化し、ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  Ｍｕｔ＋株に形質転換した。得られた形質転換体を上記のように分析した処、ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｚｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋単離株１株は非天然アミノ酸ｐＡｚｐａを組込んだ高レベルのＨＳＡを発現することが判明したため、この単離株をその後の実験に使用することにした。この単離株はｐＡｚｐａを添加した培地のみで突然変異体ＨＳＡ蛋白質を発現した。
【００９５】
ＨＳＡへの非天然アミノ酸ｐＡｐａの組込みを確認するために、マルチコピーピキア発現キット（Invitrogen）に記載されている方法を多少変更して使用し、ＨＳＡ発現規模を拡大するように調製物を作製した。要約すると、ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋のコロニー１株と、ＧＳ２００  ＨＳＡ−ＷＴ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳのコロニー１株を各々独立して液体ＹＰＤ培地でほぼ飽和まで増殖させた。これらの２種類の培養液を使用し、緩衝グリセロール酵母エキス培地（ＢＭＧＹ）各１Ｌに接種し、２９〜３０℃で振盪下に増殖させた。１６〜２０時間後に培養液は各々約８．０の光学密度（ＯＤ６００）に達していたので、１５００×ｇで５分間遠心した。１：９比の緩衝複合メタノール培地（ＢＭＭＹ）：緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）２００ｍｌに細胞ペレットを再懸濁した。２４時間おきにメタノールを１：９  ＢＭＭＹ：ＢＭＭに終濃度０．５％まで添加し、誘導を維持した。１４４時間にわたって２４時間おきに両者培養液から２０ｕｌずつ分取した。経時的に分取したサンプルを遠心して細胞をペレット化し、蛋白質含量を分析するために上清をＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。Pichia pastoris発現システムで３日間メタノール誘導後に、クーマシー染色したポリアクリルアミドゲル上にＨＳＡの分子量に対応するバンドが一般に認められる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサンプルを泳動させ、クーマシー染色して可視化した処、５日間メタノール誘導後に、ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋株から発現されるＨＳＡの力価は１０〜１２ｍｇ／Ｌに達したが、野生型ＨＳＡでは２５〜３０ｍｇ／Ｌであった。
【００９６】
ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋より発現されるｐＡｐａを組込んだ突然変異体ＨＳＡ蛋白質と、ＷＴ  ＨＳＡ蛋白質を標準精製技術により精製した（例えばSumi, et al. (1999) "Purification of recombinant human serum albumin:efficient purification using STREAMLINE." Bioseparation 8:195-200; Wantanabe, et al. (2001) "In vitro and in vivo properties of recombinant human serum albumin from Pichia pastoris purified by a method of short processing time." Pharm Res 18:1775-1781参照）。要約すると、ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋とＧＳ２００  ＨＳＡ−ｗｔ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳの培養液を３０００×ｇで１０分間遠心した。各培養液の上清を回収し、８０％まで硫酸アンモニウムの添加により各々から蛋白質を沈殿させた後に１０，０００×ｇで２０分間遠心した。得られたペレットをバッファーＡ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２５ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ＝８．５）＋Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼインヒビターカクテルに再可溶化し、バッファーＡ＋Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼインヒビターカクテルで一晩透析し、ＭｏｎｏＱアニオン交換カラムでＦＰＬＣにより精製した。０−８０％バッファーＢ（バッファーＡ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）の直線勾配を使用して画分を溶出させ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥでＨＳＡの有無について分析した。２０％〜３０％バッファーＢで溶出した画分はＨＳＡを含有していることが判明したので、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．６）で透析し、サイズ排除カラムで更に精製した。サイズ排除カラムで精製中に画分を分取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによりＨＳＡに有無について分析した。
ＰＢＳ（ｐＨ＝７．６）１３ｍｌ〜１５．５ｍｌで溶出した画分はＨＳＡを含有していることが判明したので、濃縮し、Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムで精製した。水中４０−４６％アセトニトリル，０．１％トリフルオロ酢酸の直線勾配を使用して画分を溶出させ、分取し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥでＨＳＡの有無について分析した。水中４２−４５％アセトニトリル，０．１％トリフルオロ酢酸でＣ８カラムから溶出した画分はＨＳＡを含有していることが判明した。
【００９７】
ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋により発現されるＨＳＡへのｐＡｐａの組込みを確認するために、蛋白質をトリプシン消化後に液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を図４に示す。図４は過酢酸で酸化したペブチドＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫの三重荷電前駆体イオン（ｍ／ｚ＝８４７．７６５）の部分注釈付きタンデム質量スペクトルを示す。Ｅ＊は成熟ＨＳＡのＥ３７のｐＡｐａによる置換を表す。観測されるフラグメントイオン系列により置換が明白に裏付けられる。
【００９８】
ＧＳ２００  ＨＳＡ−３７ＴＡＧ  ｐＲＥＡＶ−ｐＡｐａＲＳ  Ｍｕｔ＋により発現されるＨＳＡへのｐＡｐａの組込みを確認するために更に実験を行った。ＷＴ  ＨＳＡとアミノ酸３７位にｐＡｐａを組込んだＨＳＡを各々１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝４．７）中でアミノオキシ基を含む１．１ｋＤａペブチドの存在下にインキュベートした。次にサンプルを上記のようにＣ８逆相ＨＰＬＣカラムで精製し、未反応の１．１ｋＤａペブチドを除去し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法により分析した。ｐＨ＝４．７でアミノオキシ基はケトンと直交ライゲーションを生じ、オキシムライゲーションを形成することが知られている（Dirksen, et al. (2006) "Nucleophilic catalysis of oxime ligation." Angew Chem Int Ed Engl 45:7581-4）。従って、アミノ酸３７位にｐＡｐａ（例えば、アミノ酸３７位に溶媒接触可能なケト基）を組込んだ突然変異体ＨＳＡ蛋白質は上記１．１ｋＤａペブチドとオキシムライゲーションを形成すると予想された。ＭＡＬＤＩ分析の結果によると、ｐＡｐａを組込んだＨＳＡのみが約１ｋＤａの質量増加を示す（図５）。他方、ＷＴ  ＨＳＡの質量は変化せず、突然変異体ＨＳＡ蛋白質への非天然アミノ酸ｐＡｐａの部位特異的組込みが更に確認された。
【実施例２】
【００９９】
メタノール資化性酵母Pichia pastorisの遺伝子レパートリーの拡張
非天然アミノ酸による蛋白質突然変異誘発の有用性を増すために、メタノール資化性酵母Pichia pastorisにおける組換え発現システムを開発した。８種類の非天然アミノ酸に特異的なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／サプレッサーｔＲＮＡ（ａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ）対を真核転写制御因子間に挿入し、P. pastorisゲノムに安定的に組込んだ。メタノール資化性酵母からの突然変異体蛋白質の収率は１５０ｍｇ  ｌ−１を上回り、出芽酵母で報告されている収率よりも一桁以上良好であった。更に、ケトアミノ酸（ｐ−アセチルフェニルアラニン，図１１，構造１）を組込んだヒト血清アルブミン突然変異体をこのシステムで効率的に発現させることができ、スロンボスポンジンペプチドミメティックと選択的に高収率で結合できることを示す。この手法によると、既存システムでは発現が実際的でない非天然アミノ酸との複合蛋白質を高収率で生産できると思われる。
【０１００】
最近、本発明者らは新規性質を有する多様な非天然アミノ酸（フルオロフォア、金属イオンキレート基、フォトケージド基、光架橋基、ＮＭＲ、結晶構造分析及びＩＲ用プローブ、並びに翻訳後修飾アミノ酸）を原核生物と真核生物の両者で遺伝的にコードさせることが可能な手法を開発した１−３。これはナンセンス又はフレームシフトコドンに応答して所望の非天然アミノ酸を選択的に挿入するように意図された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／サプレッサーｔＲＮＡ（ａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ）対の進化により達成される。これまでに、４０種類を越える非天然アミノ酸を大腸菌、出芽酵母、及び数種類の哺乳動物細胞株の遺伝子レパートリーに追加するためにこの手法が利用されている１，２，４。これらのシステムにおける直交性は、（翻訳における機能を維持しながら）宿主アミノアシル化機構と移植されるａａＲＳ／ｔＲＮＡ対の間に交差アミノアシル化が生じないように別個のｔＲＮＡ因子を有する直交ａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を宿主生物に移植することにより達成される。現在のシステムでは、大腸菌５ではMethanococcus jannaschiiチロシルＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対から誘導され、出芽酵母２，６又は哺乳動物細胞４では大腸菌チロシル又はロイシルＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対から誘導されるａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を使用した場合にこれは最も成功することが立証されている。その後、該当非天然アミノ酸を認識し且つ２０種類の標準アミノ酸の１種を認識しないように直交ａａＲＳの特異性を改変するために指向的進化を使用する。
【０１０１】
細菌宿主で容易に発現されない蛋白質を大量生産するようにこの手法を拡張するためには、低コストで拡張性があり、複雑な翻訳後修飾蛋白質を生産できる組換えシステムが望ましい。このような宿主の１例は大腸菌と同等の収率で哺乳動物蛋白質を産生することが可能なPichia pastorisである７。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、破傷風毒素Ｃフラグメント（ＴＴＣ）、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の治療用蛋白質は高密度発酵で発現レベルが＞１０ｇ  ｌ−１であった８−１１。P. pastorisがこのような収率で蛋白質を産生できるのは、最も高度に制御される最強の公知プロモーターの１種であるそのアルコールオキシダーゼ１プロモーター（ＰＡＯＸ１）によると考えられる１２。更に、P. pastorisは大腸菌で発現される治療用蛋白質を汚染する可能性のある内毒素を含まず、出芽酵母のように抗原性のα１，３グリカン結合を生じない１３。更に、抗炎症性抗体における重要な糖結合であるシリル化の制御を含め、P. pastorisにおけるグリコシル化パターンを調節することが可能になった１４。これらの理由から、本発明者らは非天然アミノ酸をP. pastorisで遺伝的にコードさせるための手法の開発に着手した。本願では、この宿主で発現される組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）に８種類の非天然アミノ酸を高い収率と忠実度で部位特異的に導入したことを報告する。
【０１０２】
結果
２遺伝子カセット発現システムの設計。P. pastorisで自律的に複製するプラスミドは相対的に不安定である１５ため、該当標的遺伝子とａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対を２個の異なるプラスミドでカセット内にコードさせ、安定的にゲノムに組込んだシステムを考案した。二重栄養要求株ＧＳ２００（ａｒｇ４，ｈｉｓ４）を蛋白質発現用宿主株として使用し、該当遺伝子を市販ｐＰＩＣ３．５ｋプラスミド（ＨＩＳ４，ＧｅｎＲ）に挿入した（図６ａ）１６。短命な治療用ポリペプチドの血清半減期を延長する融合蛋白質又はペプチドバイオコンジュゲートを作製するのに有用であるため、ｒＨＳＡをモデル蛋白質として使用した１７−１９。大腸菌と出芽酵母におけるｒＨＳＡの発現は蛋白質の複雑なジスルフィド架橋により実際的ではない。ＰＣＲ突然変異誘発法によりＧｌｕ３７ＴＡＧ突然変異体ｒＨＳＡ（ｒＨＳＡＥ３７Ｘ）を作製し、ＡＯＸ１プロモーター及びターミネーター下で発現させ、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡＥ３７Ｘを作製した。Ｇｌｕ３７は溶媒接触可能な螺旋に含まれるので、この部位に導入した化学的に反応性の非天然アミノ酸（即ちｐ−アセチルフェニルアラニン，図１１，構造１）とペプチドの結合を容易にし、比較的嵩高な基を組込んだ場合にも天然蛋白質構造及びフォールディングの妨害を最小にできると考えられる。ＨＳＡの２４アミノ酸哺乳動物「プレプロ」リーダー配列（図６ｅ）はP. pastorisにおける発現に完全に適合可能であり、培地への成熟蛋白質の放出を可能にする２０。蛋白質発現の陽性対照として、野生型ｒＨＳＡ（ｒＨＳＡＷＴ）を使用して同様にｐＰＩＣ３．５ｋ−ＨＳＡＷＴを作製した。このプラスミドを５’ＡＯＸ１プロモーターで直鎖化すると、カセットの１コピー以上のゲノム組込みが可能になり、一般にコピー数が多いほど標的蛋白質の総収率も高くなる２１。このような組込みではＡＯＸ１遺伝子は無傷のままであり、酵母はメタノールを迅速に利用する能力（Ｍｕｔ＋表現型）を維持する。あるいは、ＡＯＸ１カセットのいずれかの側の直鎖化により遺伝子置換を実施し、ＡＯＸ１遺伝子をｐＰＩＣ３．５ｋベクターで置換することもできる１６。ＡＯＸ１をもたない酵母はメタノール利用に弱いほうのＡＯＸ２遺伝子に依存し、表現型はｍｕｔＳである。ｒＨＳＡの発現は一般にｍｕｔＳ酵母で実施される２２ので、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ＨＳＡＥ３７Ｘを直鎖化してＡＯＸ１遺伝子に代用し、ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ（ＨＩＳ４，ａｒｇ４，ＧｅｎＲ，ｍｕｔＳ）を得た。成功した形質転換体はヒスチジン不含最少培地プレートと、０．２５ｍｇ  ｍｌ−１までのアミノグリコシド抗生物質ゲネチシンを含有するリッチ培地プレートで正常に増殖した。
【０１０３】
直交ａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対をゲノムに組込むために、先に開発した出芽酵母での組換え過剰発現用のｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡベクター２３（図６ｂ）を改変した。先に出芽酵母２４で進化させたｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ，図１１，構造１）に特異的なアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｐＡｐａＲＳ）をＨｉｓ６タグと共にアルコール脱水素酵素１プロモーター（ＰＡＤＨ１）及びターミネーター（ＴＡＤＨ１）の間に挿入し、その発現をアッセイした。５’ＣＣＡをもたないコグネイト大腸菌ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡを３個のタンデム反復配列としてホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＰＧＫ１）の背後に挿入した。転写後プロセシングを助長するために、先述したようにｔＲＮＡを酵母サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子ＳＵＰ４に由来する領域で挟んだ２３。真核下流プロセシングによりｔＲＮＡ機能に必要な５’ＣＣＡを付加する。ｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡの２μ起点とオロチジン５−リン酸脱炭酸酵素（ＵＲＡ３）マーカーをアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）コーディング領域で置換し、組換え真核ＡＲＧ４ベクター（ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ）（図６ｃ）を得た。このカセットは真核複製起点をもたないので、このカセットの複製はゲノム組込みの場合のみに可能である。ＡＲＧ４コーディング領域におけるｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳの直鎖化とその後のＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘへの形質転換により、完全に原栄養性のP. pastoris  ＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，ｍｕｔＳ）を得た。陽性対照として、ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳベクターを同様にＧＳ２００−ＨＳＡＷＴにクローニングし、完全に原栄養性のｍｕｔＳ，ｒＨＳＡＷＴを発現するP. pastoris株を得た。
【０１０４】
P. pastorisにおけるアンバー抑圧。ＧＳ２００−ＨＳＡＷＴ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳから単離したクローンはメタノール誘導条件下で増殖させた場合に２〜３日後にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルでクーマシー染色により検出可能な全長ｒＨＳＡＷＴを産生した。他方、ＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳからのクローンは主炭素源としてメタノールとｐＡｐａアミノ酸補充下に６日間増殖させた場合に全長ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａを産生することができなかった。全構築物のゲノムの組込みをゲノムＰＣＲ（図１２）により確認した処、ｔＲＮＡＣＵＡの転写は出芽酵母における同一カセットの転写の約１．５倍であることがノーザンブロット分析により判明した（図７ａ）。他方、Ｈｉｓ６ｘタグではウェスタンブロットによりｐＡｐａＲＳを検出できなかった（図１３）。これらの結果から、アンバー抑圧の欠如はｐＡｐａＲＳの組込み不良に関係があることが分かった。従って、強力なＰＡＯＸ１プロモーターでｐＡｐａＲＳの発現を誘導するようにｐＲＥＡＶを更に改変し、強化型コザックコンセンサス配列（ＡＣＣＡＴＧＧ）２５をｐＡｐａＲＳ遺伝子の５’末端に付加した。更にＡＤＨ１ターミネーター（ＴＡＤＨ１）をＡＯＸ１ターミネーター（ＴＡＯＸ１）で置換し、ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（図６ｄ）を得た。ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘに形質転換し、上記と同一の表現型を有するＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳを得た。この形質転換からのクローンはメタノールとｐＡｐａアミノ酸の存在下のみに、ｒＨＳＡＷＴを保有する同一クローンの約１０〜２０％のレベルで全長ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａを産生した。メタノール誘導から２〜３日後にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより蛋白質が検出可能になり、２４時間おきに０．５％までメタノール補充下の発現から６日後にピークを示した（図７ｂ）。ｐＲＥＡＶカセット、ｐＰＩＣ３．５ｋカセット、メタノール補充、又はｐＡｐａアミノ酸を含まない酵母はクーマシー染色により検出可能な蛋白質を産生することができなかった。ｐＡｐａアミノ酸の不在下では蛋白質発現が生じないことから、ｐＡｐａＲＳ／ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡ対と内在アミノアシル化機構の間に交差アミノアシル化は生じないと判断される。ｒＨＳＡＥ３７ＸへのｐＡｐａの部位特異的組込みをトリプシン消化、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより確認した（図７ｃ）。観測されたフラグメントイオンから、この非天然アミノ酸は残基３７に特異的に組込まれたと判断される。
【０１０５】
発現の最適化。ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの発現を最適化する目的で、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡＥ３７ＸをＡＯＸ１遺伝子の５’領域の遺伝子座に挿入する（こうしてＡＯＸ１遺伝子の完全性を維持する）ことによりＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ）迅速メタノール利用（Ｍｕｔ＋）突然変異体を作製した。このようなゲノム挿入により多量化が可能になり、ＧｅｎＲと該当遺伝子のタンデムコピーが得られる７。得られたクローン１．０ｍｇ  ｍｌ−１までのゲネチシンに耐性を示したが、上記ｍｕｔＳクローンはゲネチシンが０．２５ｍｇ  ｍｌ−１を越えると死滅し、カセットのマルチコピーの組込みに一致した７，１６。単離したクローンからの全長ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ発現をメタノールとｐＡｐａアミノ酸の存在下で分析した処、ｍｕｔＳクローンに比較して約１．５〜２．０倍の蛋白質が産生されることが分かった（図１４）。ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの収率を更に増すために、ｐＲＥＡＶベクターでｐＡｐａＲＳ転写を誘導する能力について（ＰＡＯＸ１を含む）６種類の異なるプロモーターを比較した。転写産物ｍＲＮＡレベルと、ｐＡｐａＲＳ蛋白質レベルと、総ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ収率をアッセイした。酵母ＧＴＰ結合蛋白質Ｉ（ＹＰＴ１）２６，２７及びグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）１２，２８に由来する２種類の構成的プロモーターと、アルコールオキシダーゼＩＩ（ＡＯＸ２）２９、ホルムアルデヒド脱水素酵素Ｉ（ＦＬＤ１）１２、イソクエン酸リアーゼＩ（ＩＣＬ１）１２に由来する３種類のメタノール誘導性プロモーターをそれらのメタノール誘導適合性に基づいて選択した。２個のリプレッサー結合配列の一方を欠失させることによりプロモーターを強化する短縮型ＰＡＯＸ２を使用した。シンテターゼの過剰産生が酵母に有害な場合又はｒＨＳＡＥ３７Ｘの産生から細胞エネルギーを奪う場合には、多少弱いＰＹＰＴ１及びＰＧＡＰプロモーター２６を使用すると有用であると思われる。全プロモーターをその５’非翻訳領域と共にP. pastorisゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した（図１５）。配列確認後に、各プロモーターをＰＡＯＸ１の代わりにｐＡｐａＲＳの５’側でｐＲＥＡＶベクターに挿入し、先に作製したＭｕｔ＋  ＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘに形質転換した（図８ａ）。ターミネーターはＴＡＯＸ１のままとした。６日間メタノール誘導後にＰＰｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＡｐａＲＳ発現レベルをノーザンブロットとウェスタンブロットによりモニターし、ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳと比較した（図８ｂ〜ｄ）。P. pastorisの固有の発現変動により、クローン２株をウェスタンブロット分析に選択し、産生能の高いほうのクローンをノーザンブロットにより分析した。ＰＦＬＤ１はｍＲＮＡレベルでＰＡＯＸ１よりも４倍良好なｐＡｐａＲＳ転写を誘導し、５倍のｐＡｐａＲＳ蛋白質を産生した。ＰＧＡＰ、ＰＹＰＴ１、ＰＩＣＬ１、及びＰＡＯＸ２はいずれもＰＦＬＤ１よりもｐＡｐａＲＳ発現が低かった。この結果と一致し、培地へのｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ発現により測定した場合に総アンバー抑圧はＰＦＬＤ１−ｐＡｐａで最高であった（図９）。最大収率は＞１５��ｍｇ  ｌ−１であり、即ちｒＨＳＡＷＴ収率（３５２ｍｇ  ｌ−１）の約４３％であった（図１６，１７）。
【０１０６】
ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａとのオキシムライゲーション。この改変型ｒＨＳＡが生理活性ペプチドのキャリヤーとして有用であることを立証するために、ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａのユニークなケト側鎖と抗血管新生ペプチドＡＢＴ−５１０のオキシムライゲーションを実施した（図１０）。このスロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−Ｉ）プロペルジンタイプ１反復配列ミメティックはヒトで強力な抗腫瘍活性を示すが、静脈内投与した場合に腎クリアランスが速い３０−３２。６番目のＬ−ノルバリン残基の代わりにユニークなε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンＵＡＡを有する９アミノ酸ペプチドミメティックを合成した。ＴＳＰ−１の既知構造−活性関係によると、この位置の修飾は生物学的活性を有意に変化させないと予想される３３。ｐＨ＜５のとき、アミノオキシ基はｐＡｐａのケト基と選択的なオキシムライゲーションを生じ、ＡＢＴ−５１０ペプチドをｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの残基３７と共有結合させる（図１０ａ，上段）。従来の結合プロトコルは効率的なライゲーションのためにアニリン触媒を使用していた３４，３５が、７５μＭ  ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａと３０倍過剰のペプチドを使用して一晩反応させると、ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａとのオキシムカップリングはアニリンを使用せずに約７７％進行した。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法によりペプチドによるｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの誘導体化の程度を確認した（図１０ｂ）。同一条件下でｒＨＳＡＷＴ（残基３７のグルタミン酸）をアミノオキシ修飾ＡＢＴ−５１０ペプチドで処理した場合にはＭＡＬＤＩ質量分析法により結合は観測されなかった。
【０１０７】
遺伝子レパートリーへの８種類のＵＡＡの追加。この新規に作製された組換え発現システムの汎用性を立証するために、出芽酵母法により進化させた非天然ａａＲＳをｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１に挿入した。ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ，光架橋基，図１１，構造３）２、ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚａｐａ，光架橋基，化学反応性，図１１，構造４）３６、ｐ−（プロパルギルオキシ）フェニルアラニン（ｐＰｐａ，化学反応性，図１１，構造５）３６、ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ，構造／機能プローブ，図１１，構造６）２、及びｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ，重原子，図１１，構造７）２に特異的なａａＲＳを最適化ｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１ベクターでいずれもＰＦＬＤ１の後方に挿入した（図１１ａ，ｂ）。比較のために、野生型大腸菌チロシルＲＳ（ｗｔ，図１１，構造２）も新規発現ベクターに挿入した。ＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘ（ＨＩＳ４，ａｒｇ４，ＧｅｎＲ，Ｍｕｔ＋）に形質転換後、ｒＨＳＡＥ３７Ｘの３７位のアンバー突然変異を抑圧するその能力についてｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１−ｐＡｐａＲＳを保有する株と選択したクローンを比較した。抑圧効率はｐＡｐａ及びｐＡｚａｐａ突然変異体で同等（ｒＨＳＡＷＴの効率の４０〜４５％）であり、ｐＩｐａ以外の他の全突然変異体はｒＨＳＡＷＴの効率の＞２５％を発現した。コグネイトアミノ酸の不在下で蛋白質発現は認められず、この新規システムの高度の直交性が立証された（図１１ｃ）。
【０１０８】
最近、出芽酵母で蛋白質に他の非天然アミノ酸を組込むために第２の直交大腸菌ロイシル由来ＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対（ａａＲＳをＬｅｕＲＳと呼ぶ）を作製した３７，３８。
この直交対に由来する非天然ＬｅｕＲＳを新規P. pastoris発現システムに適応させるために、ｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１プラスミドのｔＲＮＡ領域を改変した。ＰＰＧＫ１の下流の既存のｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡカセットを切除し、先述したように、５’ＣＣＡをもたず、ＳＵＰ４セグメントにより分離されたｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡの３個のタンデム反復配列に対応するコーディング領域で置換し、ｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１を作製した。４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルセリン（ＤＭＮＢ−Ｓ，フォトケージドセリン，図１１，構造８）３７と２−アミノ−３−（５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１スルホンアミド）プロパン酸（ダンシルアラニン，ダンシルフルオロフォア，図１１，構造９）３８に特異的なＬｅｕＲＳ突然変異体をＰＦＬＤ１の後方に挿入し、ｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１−ＬｅｕＲＳ（図１１ｄ〜ｆ）を作製した。Ｍｕｔ＋  ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘに形質転換後に、選択したクローンを使用し、対応する変異体ＨＳＡＥ３７Ｘを発現させた（図１１ｆ）。ＤＭＮＢ−Ｓに特異的なＬｅｕＲＳ突然変異体はＤＭＮＢ−Ｓのシステインアナログ（ＤＭＮＢ−Ｃ）を受容することが最近示されており、これらの発現実験では合成し易いことからこのアナログを使用している。コグネイトアミノ酸の不在下でも少量の全長蛋白質が産生されたが、トリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果、対応する非天然アミノ酸の存在下におけるシステムの高い忠実度が確認された（図１８）。抑圧効率は３日間発現後にｒＨＳＡＥ３７ＤＭＮＢ−ＣではｒＨＳＡＷＴの効率の約３７％であり、ｒＨＳＡＥ３７ｄａｎｓｙｌではｒＨＳＡＷＴの効率の２３％であった。
【０１０９】
考察
出芽酵母で非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の発現を最適化しようとする従来の試みの結果、モデルシステムで８〜１５ｍｇ  ｌ−１の最大収率が得られたが、これは本発明で開発されたP. pastorisシステムで実証された収率よりも一桁以上低い。Ｗａｎｇ研究所の研究の結果、酵母におけるナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）経路のノックダウンにより蛋白質発現を２倍まで増加できることが最近明らかになった３９。ｔＲＮＡＣＵＡ転写を誘導するためにＳＮＲ５２に由来するプロモーターの使用と組合せると、出芽酵母で従来産生された約１５ｍｇ  ｌ−１という突然変異体蛋白質収率の３００倍の収率に達することができた３９。このように、ＮＭＤ経路のＵＰＦ１遺伝子のノックダウンとＳＮＲ５２−ｔＲＮＡＣＵＡプロモーターシステムの使用を組合せると、P. pastorisにおける収率を更に増加することができる。更に、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ研究所における研究の結果、P. pastorisからのｒＨＳＡＷＴの収率は標準振盪フラスコよりも流加発酵で発現させた場合のほうが一桁以上良好（＞１０ｇ  ｌ−１）であることが判明した１０。
【０１１０】
結論として、本発明者らはメタノール資化性酵母への非天然アミノ酸の生合成的組込み方法を拡張した。２種類のａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対がP. pastorisで直交性であることが判明したため、ｒＨＳＡＥ３７Ｘの残基３７のアンバーコドンに応答して８種類の異なる非天然アミノ酸を組込んだ突然変異体蛋白質を発現させるために使用した。この汎用性レベルから、この発現システムは出芽酵母で現在進化中のシンテターゼと共に多数の他の非天然アミノ酸に利用でき、本明細書に記載する非天然アミノ酸又はａａＲＳ／ｔＲＮＡＣＵＡ対に限定されないと予想される。この新規システムは収率と忠実度が高いため、ユニークな生物学的及び薬理的性質を有する治療用蛋白質を有用な量で得られると考えられる。例えば、蛋白質を部位特異的にペグ化又は架橋するためにはオキシムライゲーションや銅触媒１，３−シクロ付加反応（「クリックケミストリー」）等の化学反応を利用することができ、放射性同位体と結合させるためには金属イオン結合性アミノ酸を組込むことができ、夫々ＨＳＡ等のキャリヤー蛋白質又は抗体等のターゲティング蛋白質とペブチド又は毒素コンジュゲートを形成することができる。更に、上記ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ−ＡＢＴ−５１０コンジュゲートはインビトロ抗血管新生アッセイで現在試験中である。グルコーゲン様ペブチド１ミメティック（ＧＬＰ−１）や副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ペブチドを含む他の迅速に清澄化されたペブチドにも、内在非免疫原性キャリヤーとしてのｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの使用を拡大する試みが現在進行中である。
【０１１１】
方法
ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡの構築。ｒＨＳＡ遺伝子は哺乳動物遺伝子コレクション（ＮＩＨ）遺伝子アクセションＢＣ０３４０２３から入手した。ｐＰＩＣ３．５ｋ直鎖化１６に適合できるように、プライマー（ＩＤＴ）として、ＢｇｌＩＩ（７８１）にはＢｇｌＩＩ  １Ｆ，５’−ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧ−３’及びＢｇｌＩＩ  １Ｒ，５’−ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＴ  ＧＧＧ−３’を使用し、ＢｇｌＩＩ（８１７）にはＢｇｌＩＩ  ２Ｆ，５’−ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  Ｇ−３’及びＢｇｌＩＩ  ２Ｒ，５’−ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  Ｃ−３’を使用し、改変Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発（Stratagene）プロトコル４０によりｒＨＳＡからＢｇｌＩＩ部位を除去し、ｒＨＳＡＷＴを作製した。改変Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅプロトコルと、プライマーとしてＧｌｕ３７  Ｆ’，５’−ＧＡＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＡ  Ｔ−３’及びＧｌｕ３７  Ｒ’，５’−ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＴＴＣ  ＡＣＴ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧ−３’を使用して３７番目のＧｌｕ残基をアンバーコドンＴＡＧで置換し、ｒＨＳＡＥ３７Ｘを作製した。プライマーとしてＨＳＡフォワード，５’−ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＴＡＡ  ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ−３及びＨＳＡリバース，５’−ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＴ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＣＡＧ  Ｃ−３’を使用してｒＨＳＡＷＴとｒＨＳＡＥ３７ＸｒＨＳＡＷＴを増幅し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で消化し、同様に消化したｐＰＩＣ３．５ｋベクター（Invitrogen，ベクターマップはｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｐｉｃ３．５ｋｐａｏ  ｍａｎ．ｐｄｆで閲覧可能）にライゲーションし、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡＷＴ又はｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡＥ３７Ｘを作製した。構築物をＤＮＡシーケンシングにより確認し、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Invitrogen）で増幅した。
【０１１２】
ｐＲＥＡＶの構築。プライマーとしてｐＥＳＣ  Ｆ，５’−ＴＡＣ  ＣＡＣ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＣＧＴ−３’及びｐＥＳＣ  Ｒ，５’−ＧＴＧ  ＡＧＧ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  Ｇ−３’を使用し、ＴＲＰ及び２μ起点領域を除いてｐＡｐａＲＳを保有するｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡベクター２３をＰＣＲにより増幅し、制限部位ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを付加し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（ＮＥＢ）で消化した。プライマーとしてＡＲＧ４  Ｆ  ｎｅｗ，５’−ＡＡＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＧＧＴ−３’及びＡＲＧ４  Ｒ  ｎｅｗ，５’−ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＣＧＧ  ＴＴＴ  ＡＣ−３’を使用してＡＲＧ４コーディング領域をｐＢＬＡＲＧ（Ｋｅｃｋ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡのＪａｍｅｓ  Ｃｒｅｇｇ研究所の寄贈品）から増幅し、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同様に消化したｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡ  ＰＣＲ産物にライゲーションし、組換え真核ＡＲＧ４ベクターｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳを作製した。ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳを作製するために、ＡＯＸ１プロモーター及びターミネーター配列をｐＰＩＣ３．５ｋから誘導した。プライマーとしてＫＥＴＯ−Ｋｏｚ−Ｆ，５’−ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  Ｃ−３’及びＫｅｔｏＲＳ  Ｒ  ６ｘＨｉｓ，５’−ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＴＡＣ−３’を使用してｐＡｐａＲＳを増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化し、同様に消化したｐＰＩＣ３．５ｋにライゲーションし、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｐＡｐａＲＳを作製した。プライマーとしてｐＥＳＣ−ＡＯＸ−ＫＥＴＯ  Ｆ，５’−ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＴ  ＴＣＣ−３’及びｐＥＳＣ−ＡＯＸ−ＫＥＴＯ  Ｒ，５’−ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＣＧ−３’を使用し、ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ−ＴＡＤＨ１領域を除いてｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳをＰＣＲにより増幅し、制限部位ＡｓｃＩ及びＡｆｌＩＩを付加した。プライマーとしてｐＰＩＣ−ｋｅｔｏ  ＡＯＸ５  Ｆ，５’−ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＴＧＡ  ＡＡＣ−３’及びｐＰＩＣ−ｋｅｔｏ  ＡＯＸＴＴ  Ｒ，５’−ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＡ  ＡＴＣ  ＴＴＣ−３’を使用してｐＰＩＣ３．５ｋ−ｐＡｐａＲＳからＰＡＯＸ１−ｐＡｐ���ＲＳ−ＴＡＯＸ１コーディング領域を増幅し、ＡｓｃＩとＡｆｌＩＩ（ＮＥＢ）で消化し、同様に消化したｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ  ＰＣＲ産物にライゲーションし、ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳを作製した。サイズマッピングとシーケンシングにより構築物を確認した。
【０１１３】
P. pastorisへのカセットの形質転換。Ｋｅｃｋ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＪａｍｅｓ  Ｃｒｅｇｇ研究所の寄贈品である二重栄養要求株ＧＳ２００（ｈｉｓ４，ａｒｇ４）を宿主P. pastoris株として使用した。酵母コンピテンシー、形質転換、及び培地組成に関するプロトコルはマルチコピーピキア発現キット−バージョンＦ１６（Invitrogen，ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｐｉｃｈｍｕｌｔｉ＿ｍａｎ．ｐｄｆでマニュアルを閲覧可能）に記載されている。要約すると、ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ（ＨＩＳ４，ａｒｇ４，ＧｅｎＲ，ｍｕｔＳ）を作製するために、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ  ２０μｇをＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ）で直鎖化し、エタノール沈殿により１０μｌまで濃縮し、２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｆｉｓｈｅｒ）で新たにコンピテントになった８０μｌのＧＳ２００に加え、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ）でP. pastoris設定（２０００Ｖ，２５μＦ，２００Ω）下にエレクトロポレーションした。細胞を１Ｍ冷ソルビトール１ｍｌで回収した。
Ｌ−アルギニン（ａｒｇ）４ｍｇ  ｍｌ−１を添加した再生デキストロースバクト寒天（ＲＤＢ）プレート（１５ｃｍ）に回収した細胞２５０μｌを撒き、３０℃でインキュベートした。３日後に、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地１ｍｌを加えた９６ウェル２ｍｌブロック（Ｎｕｎｃ）にコロニーを釣菌し、一晩増殖させた（２９．２℃，３００ｒ．ｐ．ｍ．）。培養液を１００倍に希釈し、ゲネチシン（Invitrogen）０．２５ｍｌ−１を添加したＹＰＤ寒天プレートに１〜２μｌレプリカを撒き、３０℃でインキュベートした。４日後に、コロニーＧ３は良好な増殖を示したので、釣菌し、コンピテントにした。回収した細胞をＬ−ヒスチジン（ｈｉｓ）とａｒｇを含まないＲＤＢプレートに撒いた以外はコンピテントＧ３で上記プロトコルを使用して形質転換を実施し、ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳとＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，ｍｕｔＳ）を作製した。３日後に、９６ウェル２ｍｌブロックにコロニーを釣菌し、０．２５ｍｇ  ｍｌ−１ゲネチシンに対する耐性について上記のように再スクリーニングした。同様にＧＳ２００−ｒＨＳＡＷＴ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，ｍｕｔＳ）を作製し、コロニーＦ２を単離した。ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳをＧＳ２００に形質転換させることによりＧＳ２００−ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（ｈｉｓ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，ｍｕｔＳ）を作製したが、ｈｉｓ４ｍｇ  ｍｌ−１を添加したＲＤＢプレートに撒き、ゲネチシン耐性についてそれ以上スクリーニングしなかった。
【０１１４】
試験蛋白質発現。全蛋白質発現実験はマルチコピーピキア発現キット１６に記載されているｍｕｔＳのプロトコルに従った。要約すると、ゲネチシン０．２５ｍｇ  ｍｌ−１を添加したプレートからＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ、ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ又はＧＳ２００−ｒＨＳＡＷＴ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳのコロニー１４株を釣菌し、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）（２９．２℃，３００ｒ．ｐ．ｍ．）１０ｍｌ中でほぼ飽和（ＯＤ６００〜１２〜１８）まで増殖させた。培養液を１５００ｇ（１０分間）で遠心し、２ｍＭ  ｐＡｐａアミノ酸（ＳｙｎＣｈｅｍ）を添加した緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）２ｍｌに再懸濁した。０．５％となるように２４時間おきにメタノールを補充しながら６日間増殖を続けた。蒸発を考慮して培地又は滅菌水２００μｌ（培養液容量の１０％）を２４時間おきに加えた。２４時間おきに培地５０μｌを取出し、３０００ｇ（５分間）で遠心により細胞を分離した。清澄化培地２５μｌをＳＤＳローディングバッファー１２．５μｌに加え、１分間９５℃に加熱し、４−２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Invitrogen）上で泳動させた（１５０Ｖ  １時間）。３日後にＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ及びＧＳ２００−ｒＨＳＡＷＴ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ発現における６６．５ｋＤａのバンドがクーマシー染色（４０％メタノール，１０％酢酸，５０％水，０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））により明白に検出可能になり、６日後にピークを示した。ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳのクローンＧ３−２とＧＳ２００−ｒＨＳＡＷＴ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳのＦ２−ｗｔが最高の発現を示したのでその後の比較に使用した。ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳからのクローンでクーマシー染色により発現を示したものは皆無であった。アンバー抑圧がｐＡｐａに特異的であることを確認するために、ＧＳ２００、Ｇ３、ＧＳ２００−ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ、Ｇ３−２、及びＦ２−ｗｔからのクローンを２ｍＭ ｐＡｐａと０．５％メタノールの存在下又は不在下で上記のように発現させた（図７ｂ）。
【０１１５】
ｔＲＮＡノーザンブロット。Ｇ３−２及びＧＳ２００のP. pastorisクローン２株と、ＳＣＹ４−ｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１＋２ＳＵＰ４−ｔＲＮＡ及びＳＣＹ４の出芽酵母クローン２株を夫々の発現条件下で増殖させ、Purelink miRNA Isolation Kit（Invitrogen）に同梱のプロトコルと試薬によりマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を回収した。各サンプルからのＲＮＡ  ２μｇを６％ Novex TBE-Ureaゲル（Invitrogen）２枚にロードし、１８０Ｖで１時間泳動させた。０．５×ＴＢＥバッファー（Invitrogen）中でＸＣｅＩｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Invitrogen）と同梱プロトコルを使用してＲＮＡをＢｉｏｄｙｎｅ  Ｂナイロンメンブレン（Pall Life Science）に転写した。メンブレンをUV Stratalinker 2400（Stratagene）で自己架橋させた。North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit（Pierce）に同梱のプロトコルと試薬を使用してハイブリダイゼーションと検出を行った。要約すると、ｔＲＮＡｓｅｒに特異的なビオチン化プローブ：ｔＲＮＡｓｅｒ  ｃｅｒｅ  １，５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＧＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｔ−３’、ｔＲＮＡｓｅｒ  ｃｅｒｅ  ２，５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＧＡＡ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  Ｇ−３’、ｔＲＮＡｓｅｒ  ｐｉｃｈ  １，５−／５Ｂｉｏｓｇ／ＣＴＧ  ＣＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＣＧＴ  Ａ−３’、ｔＲＮＡｓｅｒ  ｐｉｃｈ  ２，５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＣＡ  ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  Ｃ−３’の存在下で第１のブロットをインキュベートし、ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡに特異的なビオチン化プローブ：ｔＲＮＡ  ５’ｂｉｏｔ，５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＧＧ−３’及びｔＲＮＡ  ３’ｂｉｏｔ，５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣ−３’の存在下で第２のブロットをインキュベートした。プローブを５５℃で一晩インキュベートし、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートに結合させ、ルミノール／エンハンサー安定性ペルオキシド溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で検出した（図７ａ）。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ）を使用してバンド密度により相対ｔＲＮＡ量を測定した。
【０１１６】
ｒＨＳＡＥ３７Ｘの拡張発現、精製及び質量分析。ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの拡張発現のために、試験発現プロトコルを改変した。ＹＰＤでの飽和Ｇ３−２培養液２０ｍｌをＢＭＧＹ  １Ｌに接種し、ＯＤ６００〜１２〜１８まで増殖させた（〜２４ｈ，２９．２℃，３００ｒ．ｐ．ｍ．）。培養液を１５００ｇで遠心し、１０％  ＢＭＭＹと２ｍＭ  ｐＡｐａを添加した緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）２００ｍｌに再懸濁した。６日間増殖（メタノール及び容量補充下に２９．２℃，３００ｒ．ｐ．ｍ．）後に、培養液を３０００ｇで遠心し、細胞を捨て、培地を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に流した。４℃で５０％飽和（５８．２ｇ）までゆっくりと撹拌下にＮＨ４ＳＯ４を添加することにより培地を硫安（ＮＨ４ＳＯ）沈殿させ、２０，０００ｇで２０分間遠心し、再び７５％飽和（３１．８ｇ）までＮＨ４ＳＯ４を加え、２０，０００ｇで２０分間遠心した。２回目の沈殿はｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａを含有していたので、ＦＰＬＣバッファーＡ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２５ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ），ｐＨ＝８．５）に再懸濁させた。再可溶化した蛋白質をＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ精製装置（Amersham Biosciences）（２０−３５％バッファーＢ（バッファーＡ＋１Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出）でＭｏｎｏＱ  ５／５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、一緒にし、３０ＭＷＣＯ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）によりＰＢＳで透析し、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ精製装置（０．５ｍｌ  ｍｉｎ−１のＰＢＳ中に１４分後に溶出）でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、一緒にし、Ｄｙｎａｍａｘ  ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ）（水中４０−４６％  ＭｅＣＮ，０．１％  ＴＦＡで溶出）でＣ８  Ｖｙｄａｃ  ＨＰＬＣカラム（３００ｍｍ，２００Å，５μｍ，Ｇｒａｃｅ）により精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析し、ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａを含有する画分を瞬間凍結し、凍結乾燥して白色粉末とした。同様にＦ２−ｗｔからｒＨＳＡＷＴの精製を行った。
【０１１７】
トリプシン消化，ナノＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ。精製したｒＨＳＡＥ３７Ｘを還元条件（１０ｍＭ  ＴＣＥＰ，１ＭグアニジニウムＨＣｌ，１００ｍＭトリエタノールアミンＨＣｌ，ｐＨ＝７．８）下に一晩トリプシンで消化した。消化物を逆相固相抽出法（Ｓｅｐ−Ｐａｋ，Ｃ１８，Ｗａｔｅｒｓ）により精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥したペプチドを氷上で過ギ酸（濃ギ酸９部＋３０％  Ｈ２Ｏ２  １部）４１の存在下に１時間インキュベートすることによりシステインからシステイン酸及びメチオニンからメチオニンスルホンへの酸化を実施した。過剰のメルカプトエタノールの添加と水で２０倍に希釈することにより反応をクエンチした。ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐハイブリッド質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）を装着したＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してナノＲＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実施した。トリプシン消化物を通気カラム装置４２のプレカラム（４ｃｍ，１００μｍ  ｉ．ｄ．，５μｍ，Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｃ１８，Ｃｏｌｕｍｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）に流速〜２μｌ  ｍｉｎ−１でロードした。１０分間のロード／洗浄時間後に、プレカラムを分析用カラム（１０ｃｍ，７５μｍ  ｉ．ｄ．，５μｍ  Ｃ１８）に交換することにより溶出を開始した。クロマトグラフィープロファイルは４０分間〜１００ｍｌ  ｍｉｎ−１で１００％溶媒Ａ（０．１％酢酸水溶液）→５０％溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％酢酸）とした。先ず高分解能Ｏｒｂｉｔｒａｐスキャン（ｍ／ｚ５００〜２，０００）を記録した後に１０データ依存性ＭＳ／ＭＳスキャン（相対衝突エネルギー＝３５％；３Ｄａ単離窓）を記録するように質量分析計をプログラムしたトップテンスキームに従ってデータ依存性ＭＳ／ＭＳ獲得を実施した。変動修飾としてｐＡｐａによる蛋白質同定用にＭＡＳＣＯＴ（Matrixscience, London, UK）を使用して生データをSwissProt 51.6データベースで検索した。
【０１１８】
Ｍｕｔ＋表現型の創製。ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，Ｍｕｔ＋）を作製するために、ｐＰＩＣ３．５ｋ−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ  ２０μｇをＳａｃＩ又はＳａｌＩ（ＮＥＢ）で直鎖化し、先述したように新たにコンピテントになったＧＳ２００に形質転換した。細胞を１Ｍ冷ソルビトール１ｍｌに回収し、ａｒｇ  ０．４ｍｇ  ｍｌ−１を添加したＲＤＢプレートに撒いた。ＹＰＤ  １ｍｌを加えた２ｍｌ  ９６ウェルブロックにコロニーを釣菌し、飽和まで（２９．２℃，３００ｒ．ｐ．ｍ．）増殖させ、１００倍に希釈し、ゲネチシン０〜３．０ｍｇ  ｍｌ−１を添加したプレートにレプリカを撒いた。ゲネチシン１．０ｍｇ  ｍｌ−１まで生存したクローン１Ｄ１２をコンピテントにし、先述したようにｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳで形質転換し、Ａｒｇ又はＨｉｓを含まないＲＤＢプレートに撒いた。１ｍｌ  ９６ウェルブロックにコロニーを釣菌し、飽和まで増殖させ、１００倍に希釈し、ゲネチシン１．０ｍｇ  ｍｌ−１プレートで再スクリーニングした。生存クローン１４株を釣菌し、ｐＡｐａアミノ酸とメタノールの存在下でｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ発現について試験した。一貫性のために、上記のようなｍｕｔＳプロトコルを使用した。
クローンＫ５は最大の蛋白質発現を示したため、試験発現でＧ３−２と比較した（図１４）。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２（Ａｄｏｂｅ）を使用してバンド密度により蛋白質の相対量を測定した。
【０１１９】
ｐＲＥＡＶ−ＰＰｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＡｐａＲＳの構築。夫々以下のプライマー：ＰＡＯＸ２  Ｆ，５’−ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＴＡ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  Ｃ−３’及びＰＡＯＸ２  Ｒ，５’−ＣＧＴ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＴＧＴ  ＴＴＧ  ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＡＡＧ  ＴＣＧ−３’；ＰＹＰＴ１  Ｆ，５’−ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＡＧ−３’及びＰＹＰＴ１  Ｒ，５’−ＣＧＴ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＣ  ＴＧＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＴ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＡＴＴ  ＧＧＧ  Ｃ−３’；ＰＩＣＬ１  Ｆ，５’−ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＡＧＣ  ＴＴＧ−３’及びＰＩＣＬ１  Ｒ，５’−ＣＧＴ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＴＡＣ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧ−３’；ＰＦＬＤ１  Ｆ，５’−ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＡＡＴ  ＧＧ−３’及びＰＦＬＤ１  Ｒ，５’−ＣＧＴ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＡＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  Ｇ−３’；ＰＧＡＰ１  Ｆ，５’−ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＣＴＴ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＧＡＡ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＣＣＴ  ＣＧＴ  Ｃ−３’及びＰＧＡＰ１  Ｆ，５’−ＣＧＴ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＣ−３’（図１５）を使用してＰＡＯＸ２、ＰＹＰＴ１、ＰＩＣＬ１、ＰＦＬＤ１、ＰＧＡＰの５種類のプロモーターをゲノムＤＮＡ（P. pastoris  ＧＳ２００）から別々にＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅フラグメントをＡｆｌＩＩとＮｃｏＩ（ＮＥＢ）で消化し、（アガロースゲル精製によりＰＡＯＸ２コーディング領域の除去後に）同様に消化したｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳにライゲーションし、ｐＲＥＡＶ−ＰＰｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＡｐａＲＳを作製した。配列確認後、（先に構築したｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳを含む）プラスミドをＡａｔＩＩで直鎖化し、新たにコンピテントになったＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ（クローン１Ｄ１２）に形質転換し、先述したようにＡｒｇ又はＨｉｓ不含ＲＤＢプレートに撒き、ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＰｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＡｐａＲＳ（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，Ｍｕｔ＋）を作製した。生存クローンを０．７５及び１．０ｍｇ  ｍｌ−１でゲネチシン耐性についてスクリーニングした。ＢＭＧＹを加えた１ｍＬ  ９６ウェルプレートに各プロモーターに対応するクローン４８株を釣菌し、飽和まで増殖させた（２９．２℃，２４ｈ，３００ｒ．ｐ．ｍ．）。飽和培養液を１５００ｇで１０分間遠心し、細胞をＢＭＭＹ  ２００μＬ＋２ｍＭ  ｐＡｐａアミノ酸に再懸濁した。６日（補充下に２９．２℃，３００ｒ．ｐ．ｍ．���後に、３０００ｇで１０分間遠心することにより培地を清澄化し、９６ウェルピンツールを使用して清澄化培地１〜２μＬを０．４５ミクロンニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にスポットした。標準ウェスタンブロット法４３を使用してメンブレンをＨＳＡ抗体［１Ａ９］ＨＲＰコンジュゲート（Ａｂｃａｍ）でプローブし、ＥＣＬ  ＨＲＰ化学発光検出試薬及びプロトコル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により検出した。各プロモーターに対応する最高発現度のクローン２株（ＡＯＸ２：Ａ６，Ｂ７；ＹＰＴ１：Ｄ１１，Ｂ７；ＩＣＬ１：Ｅ５，Ｈ３；ＦＬＤ１：Ｅ１１，Ｆ３；ＧＡＰ：Ｂ７，Ｂ１０；及びＡＯＸ１：Ｅ３，Ｅ７）を平行試験発現に選択した（図８）。
【０１２０】
ｐＡｐａＲＳノーザンブロット。最高発現度のＡＯＸ２，Ｂ７；ＹＰＴ１，Ｄ１１；ＩＣＬ１，Ｈ３；ＦＬＤ１，Ｅ１１；ＧＡＰ，Ｂ７；及びＡＯＸ１，Ｅ３を試験発現条件下で６日間増殖させた。細胞３×１０８個（ＯＤ６００＝１．０で２．５ｍｌ）を採取し、ＲｉｂｏＰｕｒｅ−Ｙｅａｓｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）試薬及びプロトコルにより全ＲＮＡを単離した。各ＲＮＡサンプル１３μｇを２％ホルムアルデヒドゲル（２％アガロース，２０ｍＭ  ＭＯＰＳ，８ｍＭ酢酸ナトリウム，２．２ｍＭホルムアルデヒド，ｐＨ＝７．０）にロードした。ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘホルムアルデヒドロード色素（Ａｍｂｉｏｎ）３容量をＲＮＡ１容量と混合し、６５℃まで１５分間加熱し、５分間氷冷後、ロードした。ゲルを電気泳動（５０Ｖで２時間）させ、１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの臭化エチジウム染色により均等なローディングを確認した（図８ｃ，上段）。ＲＮＡを標準ブロット装置により１０×ＳＳＣバッファー（１．５Ｍ塩化ナトリウム，０．１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ＝７．０）中でＢｉｏｄｙｎｅ  Ｂナイロンメンブレン（Pall Life Science）に吸着させた。メンブレンを２×ＳＳＣバッファーでリンスし、乾燥し、ＵＶ Stratalinker 2400（Stratagene）で自己架橋させた。North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit（Pierce）に同梱のプロトコルと試薬を使用してハイブリダイゼーションと検出を行った。要約すると、４００〜５００μｇのビオチン化プローブ：ｋｅｔｏＲＳ３  ｂｉｏｔ  ５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＴＡＡ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  Ｃ−３’及びｋｅｔｏＲＳ４  ｂｉｏｔ  ５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＴＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  Ｇ−３’を５５℃で一晩インキュベートし、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートに結合させ、ルミノール／エンハンサー安定性過酸化物溶液（Pierce）で検出した（図８ｃ，下段）。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２を使用してバンド密度により相対ｍＲＮＡ力価を測定した。
【０１２１】
ｐＡｐａＲＳウェスタンブロット。クローンＡＯＸ２：Ａ６，Ｂ７；ＹＰＴ１：Ｄ１１，Ｂ７；ＩＣＬ１：Ｅ５，Ｈ３；ＦＬＤ１：Ｅ１１，Ｆ３；ＧＡＰ：Ｂ７，Ｂ１０；及びＡＯＸ１：Ｅ３，Ｅ７を試験発現条件下で培養し、ペレット化し（３０００ｇ，１０分間）、ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）２ｍｌ＋１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール及びＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ）プロテアーゼインヒビタータブレットで溶解させた。サンプルを２０，０００ｇで清澄化し、溶解液１５μｌを４−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた（１：１５ｈ，１５０Ｖ）。トビンの転写バッファー（２４ｍＭトリス塩基，１９２ｍＭグリシン，２０％エタノール）中でＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤセミドライ転写セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して蛋白質を０．４５ミクロンニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した（２ｈ，２０Ｖ，１００ｍＡｍｐ）。ゲル上の残留蛋白質をクーマシー染色し（図８ｂ，上段）、均等なローディングを確認した。標準ウェスタンブロット法４３と抗Ｈｉｓ６ｘ−ＨＲＰ標識抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してメンブレンをブロットし、ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＨＲＰ化学発光検出試薬及びプロトコルにより検出した（図８ｂ，下段）。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２を使用してバンド密度により相対発現率を測定した。
【０１２２】
ｒＨＳＡＥ３７Ｘ−ＡＢＴ−５１０オキシムライゲーション。６番目のＬ−ノルバリン残基の代わりにε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを使用してＡＢＴ−５１０ペプチドミメティックを合成した（Ａｎａｓｐｅｃ）（配列：Ａｃ−Ｓａｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｄ−ａｌｏＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（Ａｏａ）−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＥｔ  ＭＷ＝１０９７．３  Ｄａ）。オキシムライゲーションバッファー（１．５Ｍ塩化ナトリウム，５００ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ＝４．４）２００μｌ中で７５μＭ  ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ又はｒＨＳＡＷＴ（１．０ｍｇ）にペプチド２．２５ｍＭ（０．５ｍｇ）を加え、一晩３７℃でインキュベートした。反応混合物をＤｙｎａｍａｘ  ＨＰＬＣ（Ｒａｉｎｉｎ）（水中４０−４６％アセトニトリル，０．１％で溶出）でＣ８  Ｖｙｄａｃ  ＨＰＬＣカラム（３００ｍｍ，２００Å，５μｍ，Ｇｒａｃｅ）により精製した。画分を分取し、一緒にし、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析した。シナピン酸マトリックスと共にリニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＩＩ（Ｂｕｒｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）計器を使用して無傷の蛋白質質量測定を実施した。Ｅ３７ｐＡｐａ突然変異によるｒＨＳＡＷＴ＋ペプチドとｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ＋ペプチドの−６０Ｄａの質量差（９０５Ｄａ−６０Ｄａ＝８４５Ｄａ）を使用し、ライゲーション効率を測定した（〜７７％）。蛋白質による処理前後でｒＨＳＡＷＴの質量は殆ど変わらなかった。
【０１２３】
ｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１−（シンテターゼｔｙｒ）構築及び形質転換：プライマーとしてＫＥＴＯ−Ｋｏｚ−Ｆ及びＫｅｔｏＲＳ  Ｒ  ６ｘＨｉｓ（上記）を使用してチロシン（ｗｔ）、ｐＢｐａ、ｐＡｚａｐａ、ｐＰｐａ、ｐＭｐａ、及びｐＩｐａに特異的な非天然ａａＲＳをＰＣＲにより増幅し、ＮｃｏＩとＥａｇＩ（ＮＥＢ）で消化し、（アガロースゲル精製によりｐＡｐａＲＳ領域の除去後に）同様に消化したｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１−ｐＡｐａＲＳにライゲーションした。配列確認後、先述したようにプラスミドをＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘクローン１Ｄ１２に形質転換し、ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１−（シンテターゼｔｙｒ）（ＨＩＳ４，ＡＲＧ４，ＧｅｎＲ，Ｍｕｔ＋）を作製した。各形質転換からクローン１２株を選択し、先述したように９６ウェルフォーマットでドットブロットによりスクリーニングした。各々から最良産生株（ｔｙｒ，Ａ９；ｐＢｐａ，Ｂ７；ｐＡｚａｐａ  Ｃ９；ｐＰｐａ，Ｄ６；ｐＭｐａ，Ｅ６；及びｐＩｐａ，Ｆ６）を選択し、試験発現でＦＬＤ１，Ｅ１１と比較した（図１１ｃ）。
Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２を使用してバンド密度により相対蛋白質収率を測定した。
【０１２４】
ｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１−（シンテターゼｌｅｕ）構築及び形質転換：ｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１を作製するために、５’ＣＣＡをもたず、ＳＵＰ４セグメントにより分離されたｔＲＮＡＬｅｕ５ＣＵＡの３個のタンデム反復配列に対応するセクションをを合成し（ＤＮＡ２．０）、プライマーとしてＬｅｕ  ｔＲＮＡ  Ｆ，５’−ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  Ｇ−３’及びＬｅｕ  ｔＲＮＡ  Ｒ，５’−ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＴＴＴ  Ｇ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。得られた６４３ｂｐ産物をＮｈｅＩとＭｌｕＩ（ＮＥＢ）で消化し、（アガロースゲル精製によりチロシルｔＲＮＡの除去後に）同様に消化したｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１−ｐＡｐａＲＳにライゲーションし、ｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１−ｐＡｐａＲＳを作製した。プライマーとしてＬｅｕＲＳ  Ｆ，５’−ＡＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＴＡＣ  ＣＧＣ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ−３’及びＬｅｕＲＳ  Ｒ，５’−ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＧＣＣ  ＡＡＣ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＴＧ−３’を使用してＤＭＮＢ−Ｓ及びダンシル非天然アミノ酸に特異性を有するａａＲＳを増幅し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ（ＮＥＢ）で消化し、（アガロースゲル精製によりｐＡｐａＲＳコーディング領域の除去後に）同様に消化したｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１−ｐＡｐａＲＳにライゲーションし、ｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１−ＤＭＮＢ−Ｓ又はｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１−ダンシルを作製した（図１１ｄ）。配列確認後、プラスミドをＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ（クローン１Ｄ１２）に形質転換し、上記のように９６ウェルドットブロットフォーマットでスクリーニングした。緩衝最少メタノール（ＢＭＭ）培地中で誘導後３日間試験発現条件下に増殖させた場合にクローンＡ：Ａ５（ＤＭＮＢ−Ｓ）及びＢ：Ｇ１２（ダンシル）が成功産生株と同定された。比較のためにｒＨＳＡＷＴをＢＭＭＹ中で３日間発現させた（図１１ｆ）。上記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりダンシル及びＤＭＮＢ−Ｓ（アミノ酸アナログ）の組込みを更に確認した（図１８）。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ２により相対バンド密度を測定した。
【０１２５】
図面の説明
図６：真核生物におけるアンバー抑圧用ベクターであり、マーカー（栗色）、複製起点（黒）、標的蛋白質（オレンジ色）、制御因子（緑色）、及びサプレッサーｔＲＮＡ（「ｔＲＮＡ（ＣＵＡ）」，淡青色）を示す。（ａ）P. pastorisへのインビボマルチコピー組込み及び発現用の市販ｐＰＩＣ３．５ｋシャトルベクター１６のマップ。ｒＨＳＡＥ３７Ｘ（オレンジ色）をＡＯＸ１プロモーター及びターミネーター間にサブクローニングする。（ｂ）ＰＡＤＨ１制御下のｐＡｐａＲＳ／ｔＲＮＡｔｙｒＣＵＡ対を保有する出芽酵母の最適化アンバー抑圧ベクター２３。ｔＲＮＡＣＵＡ反復配列はＳＵＰ４遺伝子に由来する領域（図示せず）により分離され、ＰＰＧＫ１により誘導される。（ｃ）ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳを作製するように２μ真核起点とＴＲＰマーカーをＡＲＧ４で置換した改変型ｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１＋３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡプラスミド。（ｄ）ＰＡＤＨ１とＴＡＤＨ１をＡＯＸ１に対応するもので置換し、ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳを作製した。（ｅ）ｒＨＳＡＥ３７Ｘの最初から６１個のアミノ酸。プレプロリーダーペプチド（青，緑）は培地へのｒＨＳＡＥ３７Ｘの放出を可能にし、輸送中に開裂され、アスパラギン酸から開始する成熟蛋白質（ｒＨＳＡ，オレンジ色）を生じる。成熟ｒＨＳＡの３７番目の残基（Ｘ，赤）はアンバーコドンに応答して組込まれた非天然アミノ酸を表す。
【０１２６】
図７：P. pastorisにおけるｐＡｐａによるアンバー抑圧。（ａ）ノーザンブロット（下段ゲル）を使用して出芽酵母＋ｐＰＲ１−ＰＰＧＫ１−３ＳＵＰ４−ｔＲＮＡ（レーン１）とP. pastoris＋ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳ（レーン２）におけるサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ転写をアッセイした。陰性対照として、レーン３及び４は夫々ベクターを導入しない出芽酵母及びP. pastoris株である。上段ゲルは内在セリンｔＲＮＡのノーザンブロットを示し、全サンプルで等量のｍｉＲＮＡが作製されることを実証する。（ｂ）システムの忠実度をアッセイするために、６日間増殖からの清澄化培地２５μｌを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、クーマシー染色した。レーン２はＧＳ２００であり；レーン３はＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘであり；レーン４はＧＳ２００−ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳであり；レーン５〜７はＧＳ２００−ＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳであり；レーン８はＧＳ２００−ＨＳＡＷＴ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳである。両方のベクターを導入し、メタノールとｐＡｐａアミノ酸（ｐＡｐａＡＡ）の存在下で増殖させた酵母のみでアンバー抑圧が生じる。（ｃ）成熟ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの残基３７に非天然アミノ酸ｐＡｐａ（Ｅ＊で示す）を組込んだトリプシン処理ペプチドのＭＳ／ＭＳ断片化（上段）。観測されるフラグメントイオン系列により置換が明白に裏付けられる。配列イオンを標準命名法４４で表す。
【０１２７】
図８：最適化アンバー抑圧に関するｐＡｐａＲＳプロモーターの比較。（ａ）プロモーター領域（緑，赤輪郭）の変動を示すｐＲＥＡＶ−ＰＰｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＡｐａＲＳの直線マップ。ゲノムＤＮＡからプロモーターをＰＣＲ増幅した（図１２）。（ｂ）各々ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７ＸをｐＲＥＡＶ−ＰＰｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＡｐａＲＳで形質転換したクローン２株を主炭素源としてのメタノールの存在下に６日間増殖させ、溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した（上段ゲル）。ゲルをクーマシー染色し、均等なローディングを確認した。溶解液をｐＡｐａＲｓ−Ｈｉｓ６ｘについてウェスタンブロットにより分析した（下段ゲル）。（ｃ）ｂで大半の蛋白質を産生したクローンをｐＡｐａＲＳ  ｍＲＮＡ転写についてノーザンブロットにより分析した（下段ゲル）。１８ｓ及び２８ｓリボソームＲＮＡのバンドを臭化エチジウムで染色し（上段ゲル）、ＲＮＡ完全性と均等なローディングを確認した。（ｄ）染色したバンドの密度の２回平均により測定したｂの棒グラフ。誤差線は分散を表す。
【０１２８】
図９：培地中でｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａによりアッセイしたＰＡＯＸ２、ＰＹＰＴ１、ＰＩＣＬ１、ＰＦＬＤ１、ＰＧＡＰ、又はＰＡＯＸ１で誘導したａａＲＳによるアンバー抑圧レベル。各プロモーターシステムからのクローン２株を主炭素源としてのメタノールとｐＡｐａアミノ酸の存在下に個々に６日間増殖させた。清澄化培地２５μｌを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、クーマシー染色した。ＢＳＡ対照によるバンド密度（図１７）によりｒＨＳＡＷＴ（レーン１５）を計算した処、３５１．６ｍｇ  ｌ−１であった。密度によると、ＰＦＬＤ１（レーン９及び１０の平均）は４３％ないし１５１．２ｍｇ  ｌ−１の蛋白質を発現した（図１６）。
【０１２９】
図１０：ＡＢＴ−５１０ペプチドとｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａのオキシムライゲーション。（ａ）ライゲーションの模式図。ＡＢＴ−５１０ペプチドは６番目の残基としてε−（２−（アミノオキシ）アセチル）−Ｌ−リジンを有する。７５μＭ  ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ（青）を２．２５ｍＭペプチドの存在下に３７℃で一晩インキュベートすると、オキシム結合が形成される（右上）。同一条件下でｒＨＳＡＷＴ（赤）と反応は生じない。（ｂ）ＭＡＬＤＩ質量分析により結合の程度を示す。ペプチドをケト含有ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａ（青）の存在下にインキュベートすると、ｒＨＳＡＷＴ（赤）の存在下でインキュベートした場合に比較して９０５Ｄａの質量シフトを生じ、ｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａの約７７％がＡＢＴ−５１０と結合していると判断される。
【０１３０】
図１１：遺伝子レパートリーへの８種類の非天然アミノ酸の追加。（ａ）大腸菌チロシルＲＳ遺伝子（オレンジ色）とチロシルサプレッサーｔＲＮＡカセット（ｔＲＮＡ（ＣＵＡ），淡青色）を含む最適化ｐＲＥＡＶ−ＰＦＬＤ１ベクターの模式図。（ｂ）特異的な大腸菌チロシルＲＳを有する６種類の非天然アミノ酸（１，３〜７，本文に記載）とチロシン（２）の構造。（ｃ）非天然アミノ酸１，３〜７とその対応するａａＲＳの存在下（＋）及び不在下（−）におけるｒＨＳＡＥ３７Ｘ（ここで、Ｘは非天然アミノ酸として定義される）の発現。未精製清澄化培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、クーマシー染色した。レーン２は野生型（ｗｔ）チロシルＲＳによるｒＨＳＡＥ３７Ｙ発現である。レーン１５はｒＨＳＡＷＴの発現である。（ｄ）大腸菌ロイシルＲＳ遺伝子（ＬｅｕＲＳ，オレンジ色）とロイシルサプレッサーｔＲＮＡカセット（ｌｅｕ−ｔＲＮＡ（ＣＵＡ），淡青色，赤輪郭）を含む最適化ｐＲＥＡＶｌｅｕ−ＰＦＬＤ１ベクターの模式図。（ｅ）特異的大腸菌ロイシルａａＲＳを有するＤＭＮＢ−Ｃ及びダンシル非天然アミノ酸（８，９，本文に記載）の構造。（ｆ）非天然アミノ酸８，９とその対応するＬｅｕＲＳの存在下（＋）及び不在下（−）におけるｒＨＳＡＥ３７Ｘの発現。各蛋白質発現からの未精製清澄化培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、クーマシー染色した。レーン４は同じく３日後のｒＨＳＡＷＴの発現である。
【０１３１】
図１２：非天然アミノ酸抑圧システムの３成分のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅であり、ｐＰＩＣ３．５ｋ及びｐＲＥＡＶカセットをＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳに組込むのに成功したことを示す。１回の形質転換からクローン４株を選択し、１〜４とした。予想ＰＣＲ産物はｒＨＳＡ  １８５１ｂｐ、ｐＡｐａＲＳ  １３１７ｂｐ、及びｔＲＮＡカセット１１００ｂｐであった。クローン２にｐＡｐａＲＳ増幅が生じないのは技術的アーチファクトであると思われる。
【０１３２】
図１３：１回の形質転換からのＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＤＨ１−ｐＡｐａＲＳのクローン４株におけるｐＡｐａＲＳ−Ｈｉｓ６ｘのウェスタンブロット。ｐＡｐａＲＳ蛋白質は検出できなかった。
【０１３３】
図１４：ＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（Ｍｕｔ＋）培養液（レーン１）又はＧＳ２００−ｒＨＳＡＥ３７Ｘ／ｐＲＥＡＶ−ＰＡＯＸ１−ｐＡｐａＲＳ（ｍｕｔＳ）培養液（レーン２）からの清澄化培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、クーマシー染色した。Ｍｕｔ＋クローンはバンド密度により測定した場合に約１．５〜２．０倍の量のｒＨＳＡＥ３７Ｘを発現する。
【０１３４】
図１５：５種類の異なるプロモーターに特異的なプライマーを使用し、その対応するプロモーターをゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。臭化エチジウム染色したゲルを示し、ＰＣＲ産物の両側に１ｋｂ＋ラダーを示す。ＰＣＲの予想長はＰＡＯＸ２  ３４２ｂｐ、ＰＹＰＴ１  ５０８ｂｐ、ＰＩＣＬ１  ６８３ｂｐ、ＰＦＬＤ１  ５９７ｂｐ、及びＰＧＡＰ  ４９３ｂｐである。
【０１３５】
図１６：図９の棒グラフであり、プロモーター誘導によるｐＡｐａＲＳ産生の関数としてｒＨＳＡＥ３７ｐＡｐａのアンバー抑圧を示す。図９に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のクーマシーバンド密度により蛋白質産生を測定した。ｒＨＳＡＷＴを図１７に示すように定量した。
【０１３６】
図１７：ＢＳＡ標準又は試験蛋白質発現からの未精製ｒＨＳＡＷＴ培地２５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。レーン７はｒＨＳＡＷＴ試験蛋白質発現培地の１倍希釈液とした。ＢＳＡ標準バンド密度（レーン１〜４）をプロットし、直線フィットした。
ｒＨＳＡＷＴバンドの密度（２×レーン７及びレーン８）は平均で８３．３３又は３５１．５５ｍｇ  ｍｌ−１であった。同一ｒＨＳＡＷＴサンプルの百分率として非天然蛋白質（他の図ではｒＨＳＡＥ３７Ｘ）の収率を求めた。
【０１３７】
図１８：消化でトリプシンの代わりにキモトリプシンを使用した以外は方法のセクションに記載したように図１１ｆのレーン２からのｒＨＳＡＥ３７ＤＭＮＢ−Ｃ蛋白質をトリプシン消化後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析した。最上段クロマトグラム（黒）は２４．４５分〜６０．０５分に泳動したＬＣ−ＭＳ／ＭＳの合計イオンカウント数（ＴＩＣ）を示す。３段目（緑）と４段目（青）のクロマトグラムはキモトリプシン処理ペプチドＸＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦに対応する夫々２＋及び３＋荷電種のイオン抽出であり、ここでＸ（ｒＨＳＡの３７番目の残基）はＤＭＮＢ−Ｃ（ピーク下総面積「ＭＡ」＝２２４５８２２０４）である。５段目（芥子色）と６段目（紫）のクロマトグラムはキモトリプシン処理ペプチドＸＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦに対応する夫々２＋及び３＋荷電種のイオン抽出であり、ここでＸはロイシンのイソロイシンである（ピーク下総面積「ＭＡ」＝２００２９３９７）。次のように計算を行った：百分率Ｅ３７ＤＭＮＢ−Ｃ＝２２４５８２２０４／（２２４５８２２０４＋２００２９３９７）＊１００＝９１．８％及び百分率Ｅ３７Ｌ＝２００２９３９７／（２２４５８２２０４＋２００２９３９７）＊１００＝８．２％。Ｘにおける他の天然アミノ酸の組込みに対応する測定可能な量のイオン種は検出されなかった。
【０１３８】
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44. Roepstorff, P. & Fohlman, J. Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom 11,601(1984).
【０１３９】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用する全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で本明細書に援用し、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で本明細書に援用すると個々に記載しているものとみなす。
【図１】
2014039554.tif 000003
【図２】
2014039554.tif 000004
【図３】
2014039554.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2014039554.tif 000008
【図７ａ】
2014039554.tif 000009
【図７ｂ】
2014039554.tif 000010
【図７ｃ】
2014039554.tif 000011
【図８】
2014039554.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2014039554.tif 000021
【図１８】
2014039554.tif 000022
【配列表】
2014039554000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月1日(2013.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非天然アミノ酸と；
ｂ）メタノール資化性酵母細胞において直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
ｃ）セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてＯ−ＲＳにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
を含むメタノール資化性酵母細胞。
【外国語明細書】
2014039554000001.pdf