(57)【要約】【課題】高濃度のアシル化ステロール配糖体の製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】アシル化ステロール配糖体を製造する方法であって、原料である米ぬかを二酸化炭素を用いた超臨界抽出操作で処理する第一段階抽出操作、二酸化炭素とエタノールを用いた超臨界抽出操作で処理する第二段階抽出操作からなることを特徴とする製造方法。【選択図】図１
2014009191.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化ステロール配糖体を製造する方法であって、原料である米ぬかを二酸化炭素を用いた超臨界抽出操作で処理する第一段階抽出操作、二酸化炭素とエタノールを用いた超臨界抽出操作で処理する第二段階抽出操作からなることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
クロロホルムを含有しないアシル化ステロール配糖体含有組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米ぬか由来のアシル化ステロール配糖体の抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アシル化ステロール配糖体は、ステロイド骨格の3位に結合した糖がアシル化されている化合物である。このようなアシル化ステロール配糖体は大豆や玄米、発芽玄米などから得ることができる（特許文献１、特許文献２参照）。特許文献１の発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体は、糖尿病性神経障害の改善効果を有している。また特許文献２の大豆由来のアシル化ステロール配糖体は、DNA合成酵素の阻害作用を有している。
【０００３】
これらのアシル化ステロール配糖体を得るためには、例えば特許文献１の発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体の場合は、発芽玄米を精白する際に得られる米ぬかから極性の低いクロロホルムや極性の高いメタノールなどの有機溶媒を用いてアシル化ステロール配糖体画分を抽出し（非特許文献１参照）、吸着クロマトグラフィー、さらには高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて調製している。
また、特許文献２の大豆由来のステロール配糖体の場合は、大豆（Glycine max L.）にn-ヘキサンを加えてn-ヘキサン抽出物を得た後、n-ヘキサンを留去し、クロロホルムを加え、クロロホルム抽出物を得て、さらにクロマト分離、HPLC操作を行って抽出する。
上記抽出方法を用いても（HPLC操作前）、発芽玄米由来のアシル化ステロール配糖体の場合、乾燥物あたり 2.7%の含有量のものしか得られていない。またいずれもクロロホルムなどの溶媒を使用することが抽出効率をあげるための必須条件であり、クロロホルムを抽出溶媒として使用した場合、そのクロロホルムが抽出物に残存する。さらに溶媒抽出の場合、抽出溶媒中に米ぬかや大豆に含有される脂質がアシル化ステロール配糖体と同様の挙動を示すため、アシル化ステロール配糖体と脂質の分離がはなはだ困難であり、溶媒抽出だけではアシル化ステロール配糖体の純度（含有率）を10%以上に高めることが難しかった。
また比較的豊富に入手可能な米ぬかからアシル化ステロール配糖体を高濃度に得る方法は知られていない。
【０００４】
このような抽出困難な物質の抽出方法として超臨界抽出法が提案されている。超臨界流体は液体の密度に近く、気体の拡散係数に近いことから、種々の物質に浸透し、目的とする物質を溶解して抽出する能力に優れており、近年、臨界温度が31.1℃、 臨界圧力が7.34MPaである二酸化炭素を溶媒とした抽出方法が実生産レベルにて利用されている。例えば、コーヒー豆からのカフェイン除去などがそうである。
また、抽出に使用した二酸化炭素は回収し再利用することができ、環境の観点からも有機溶剤に比べ、好ましい。
このような超臨界二酸化炭素は目的物質を比較的変質させることなく抽出できる。しかし、極性の低い物質の抽出には有効であるが、極性の高い物質の抽出には不向きである。そこで、極性を有する物質を抽出する場合、エントレーナー(溶解補助溶媒) として、極性を有する溶媒、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、1-プロパノール、1-ブタノールなどが使用される場合がある。食品用途原料の抽出では、水或いはエタノールが望ましいが、粉末化或いは純度を高めるために濃縮、濃縮乾固或いは減圧乾固する場合、沸点の低いエタノールがより好ましいと言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2009/110612号
【特許文献２】特開2011−213609号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jordi Folch et.al. ：J．Biol．Chem.，226，497-505， 1957
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は米ぬかからアシル化ステロール配糖体を抽出する方法を提供することを課題とする。またクロロホルムの残存しないアシル化ステロール配糖体含有組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の構成である。
（１）アシル化ステロール配糖体を製造する方法であって、原料である米ぬかを二酸化炭素を用いた超臨界抽出操作で処理する第一段階抽出操作、二酸化炭素とエタノールを用いた超臨界抽出操作で処理する第二段階抽出操作からなることを特徴とする製造方法。
（２）クロロホルムを含有しないアシル化ステロール配糖体含有組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって米ぬかから高濃度のアシル化ステロール配糖体を含有する組成物を得る方法が提供される。また本発明の製法はクロロホルムを使用しない方法である。したがってアシル化ステロール配糖体含有組成物中にクロロホルムが残留する危険がまったくないアシル化ステロール配糖体の濃度の高い組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の方法の模式図である。
【図２】本発明で得られたアシル化ステロール配糖体含有組成物を分析するためのHPLCの溶出溶媒のグラジエント曲線とHPLCチャートを示す（標準品のグラジエントプログラムによる溶出パターン）。溶出時間5分直前にアシル化ステロール配糖体が溶出される。
【図３】原料である米ぬか中のアシル化ステロール配糖体含有組成物を分析したHPLCチャートを示す。画分Aは脂質、画分Bは極性の高い化合物を示すが、これらは原料中の成分含量比率が高いため、この2画分を減らすことがアシル化ステロール配糖体の純度改善に大きく寄与するものと考えられる。
【図４】本発明で得られたアシル化ステロール配糖体含有組成物を分析したHPLCチャートを示す。図１の1 stepにおいて画分A、2 stepにおいて画分B、この2画分を減らすことでアシル化ステロール配糖体純度を改善することができた。
【図５】比較例の溶媒抽出によって得たアシル化ステロール配糖体にクロロホルムが残留していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下本発明の実施形態を更に詳細に説明する。
原料の米ぬかは、玄米を精白する工程で副産物として得られる米ぬかを用いる。米ぬかには胚芽由来の脂質が比較的大量に含有されている。このため米ぬかを保管する際に脂質の酸化臭気が発生し、アシル化ステロール配糖体含有組成物に残留するため、可能な限り精白直後のものを原料とする。また可能な限り、低温で乾燥した環境で保管しなければならない。
【００１２】
第一段階抽出
抽出操作の概要を模式図として図１に示す。
図中1stepの抽出操作をまず実施する。
アシル化ステロール配糖体を抽出するために米ぬかから、超臨界二酸化炭素抽出装置によって脂質を除去する。一般的に実施されている二酸化炭素の超臨界条件で容易に米ぬかから脂質のみが選択的に除去される。適切な抽出条件は、例えば、抽出時間1〜5時間、抽出圧力10〜50MPaおよび抽出温度32〜70℃である。好ましくは抽出時間1〜3時間、抽出圧力15〜40MPaおよび抽出温度35〜50℃であり、より好ましくは抽出時間2時間、抽出圧力25MPa付近および抽出温度40℃付近である。あらかじめ脱水した米ぬかであれば同様に操作を行うことで、第二段階の抽出をより効率的に行うことができる。
【００１３】
第二段階抽出
第一段階抽出が終了した米ぬかは図１に示す2stepによって抽出される。米ぬかは、低級アルコール（例えばエタノール）を添加した超臨界二酸化炭素で抽出され、適切な抽出条件として例えば抽出時間0.5〜5時間、抽出圧力10〜50MPaおよび抽出温度32〜70℃の条件で抽出する。好ましくは抽出時間1〜3時間、抽出圧力15〜40MPaおよび抽出温度35〜60℃であり、より好ましくは抽出時間2時間、抽出圧力25MPa付近および抽出温度40℃付近である。この条件で米ぬか中に含有されるアシル化ステロール配糖体を抽出する。
得られた抽出液は、減圧乾固させてアシル化ステロール配糖体含有組成物とする。この組成物中にアシル化ステロール配糖体は10重量％以上含有されている。低級アルコールとしてエタノールを使用することが好ましい。エタノールは安全性の面からも好ましく、食品や医薬品を製造する際に有機溶媒として最適であり、残留することもほとんどなく、他の有機溶媒と比較して安全性も高い。この組成物をカラムクロマトグラフィーや分取型HPLCにかけてさらにアシル化ステロール配糖体含有率を高めた組成物を得るための原料とすることもできる。
【００１４】
＜アシル化ステロール配糖体の分析・確認方法＞
各ステップでの試料中のアシル化ステロール配糖体含有量は以下に示す分析方法で測定する。
１）前処理
・前処理方法
(1)  50mLの蓋付ガラスチューブに試料粉末を約1.0g秤取する。
(2)  次いで、クロロホルム：メタノール＝2：1（容量比）の混合溶液（以下クロメ      タ）を10mL加え、ボルテックスにて約90秒間、よく懸濁・分散させた後、遠心分離      （室温、1500G、10分）し、上澄液を回収する。
(3)  (2)の操作をさらに2回繰り返し、フィルター濾過（目開き：0.45μm）をし、その    濾液を分析用試料溶液とする。（得られた試料溶液は成分濃度に応じて適宜希釈を行    う。希釈液はクロメタ）
・濃縮乾固品（アシル化ステロール配糖体抽出物）の前処理方法
(1)  得られた濃縮乾固品を適量秤取し、クロメタを加え、50mLメスフラスコにてメス    アップする。
(2)  (1)で得られた溶液は成分濃度に応じて適宜希釈し、分析用試料溶液とする。
【００１５】
・  分析方法
ア）HPLCによる分析
HPLC分析条件は次のとおり
分析装置：HPLC
移動相Ａ：メタノール：水 = 95：5 (v/v)
移動相Ｂ：クロロホルム = 100 (v/v)
ポンプ：Model 582 solvent delivery system
分析カラム：LiChrospher Si60 (5μm) HPLC-Cartridge (LiChroCART125-4:MERCK)
検出器：荷電化粒子検出器 (コロナ ダイオネクス社)
Injection Volume：20μL
カラムオーブン：40℃（FLO社 model 502）
分析時間：40min
脱泡装置：uniflows Degasys Ultimate DV3003
流速 ：1mL/min
イ）グラジエント条件
以下に示すとおり
(1)0-15分
移動相A：1% → 25%、移動相B：99% → 75%
(2)15-20分
移動相A：25% → 90%、移動相B：75% → 10%
(3)20-25分
移動相A：90%、移動相B：10%
(4)25-30分
移動相A：90% → 1%、移動相B：10% → 99%
(5)30-40分
移動相A：1%、移動相B：99%
（6）標準品
アシル化ステロール配糖体の標準品として、Esterified Steryl Glucoside          （Larodan Fine Chemicals AB製、フナコシ社販売）を用いる。標準品2mgはアン        プル開封後、窒素乾固させクロメタで200μg/mLの濃度となるように溶解し、段階      希釈して100、50、25、12.5及び 6.25μg/mLの濃度系列とし、検量線を作成する。
標準品のグラジエントプログラムによる溶出パターンを図２に示す。
【００１６】
なお、抽出に用いる米ぬか量、使用する二酸化炭素量、エタノール量の関係について説明する。
目的とする一定の抽出温度、抽出圧力条件に到達した後の二酸化炭素の供給量が、第一段階抽出及び第二段階抽出において、約1：1〜約1：450（ぬか：二酸化炭素の重量比）の範囲にあり、好ましくは約1：100〜約1：300、より好ましくは約1:250 である。
また、第二段階抽出における二酸化炭素とエタノールの抽出供給比は目的とする一定の抽出温度、圧力条件に到達した後、その供給重量比は約50：1〜約5：1、好ましくは約30：1〜10：1、より好ましくは約20：1である。
【００１７】
＜実施例１＞
米ぬかからのアシル化ステロール配糖体抽出例（低濃度アシル化ステロール配糖体含有米ぬかからの抽出例）
米ぬかにはアシル化ステロール配糖体は含有されていないと考えられていたが、本発明者が検討したところ、発芽玄米ぬかや大豆よりも低濃度であるが含有されており、このような低濃度のアシル化ステロール配糖体であっても、本発明の方法によって高濃度に抽出できることを確認した。
【００１８】
第一段階抽出
玄米を精白機にかけて、米の精白度が90〜99%になるようにして得た米ぬか40.9g（水分含量：約8.9%）を採取し、これを超臨界抽出装置（三菱化工機(株)製） の耐圧容器（抽出槽、0.5L容器）に移した。次いで抽出溶媒として二酸化炭素を用いて40℃、25MPa、2時間の条件で抽出した。抽出液は回収槽に移して回収することで、余分な脂質を除去した残留物を得た。
【００１９】
第二段階抽出
上記の第一段階抽出において得られた残留物を約18g採取し、次に抽出溶媒として二酸化炭素を用いて、昇温・昇圧操作を行い、40℃、25MPaに達した後、これにエタノール（99.5%）を3.95g/分の流速で供給し、約2時間抽出槽に通し（抽出）、次いで別の耐圧容器回収槽（分離槽）中に抽出液（エタノール抽出液）を回収した。得られたエタノール抽出液はナスフラスコに移し、エバポレーターにより濃縮乾固し、アシル化ステロール配糖体を含有する濃縮乾固品を得た。
【００２０】
上記の分析方法でHPLC分析をしたところ、アシル化ステロール配糖体を濃縮乾固品中にEsterified Steryl Glucoside換算で10.02重量%含有していることが確認できた。                                                    
【００２１】
＜比較例＞
有機溶媒を用いた特許文献１に基づく従来方法による米ぬかの抽出例を以下に示す。
[方法]
抽出手順
二段階抽出により抽出する。
第一段階抽出
50mLの蓋付ガラスチューブに実施例１と同じ米ぬか4gを秤量した。次いでヘキサン30mLを加え、室温で15分間攪拌し、遠心分離（室温、1500G×10分）した後、上澄みのヘキサン層を回収した。これを2回繰り返し、残渣をドラフト内で1時間風乾し十分に乾燥させた。
第二段階抽出
第１ステップで得た米ぬか4gの残渣を、各々エタノール（99.8%）、エタノールと蒸留水の混合液（エタノール：水＝2：1および1：1 、以下エタ水）及びクロホルム−メタノール（クロメタ）混合液で抽出する。溶媒を 20mL加え室温で15分間攪拌後、遠心分離（室温、1500G×10分）し上澄みを50mLの蓋付ガラスチューブに移した。この操作を3回繰り返し、得られた3回分の抽出液を抽出溶媒50mLにメスアップした。この50mLにメスアップした抽出液の重量を測定し、1.5mLバイアルに1mL移し、室温で1時間、窒素乾固処理を行った後、24時間凍結乾燥し、濃縮乾固品を得た。
濃縮乾固品中のアシル化ステロール配糖体を実施例と同様に分析したところ、エタノール抽出品においては2.2重量%、クロメタ抽出品においては3.2重量%含有していることが確認できた（エタ水抽出品においてはアシル化ステロール配糖体は確認できなかった）。
なお、比較例では、抽出にクロロホルムを使用するが、純度は上昇するが、この場合にはクロロホルムが残留する。
【００２２】
クロロホルムを使用した比較例の組成物は24時間真空凍結乾燥をおこなっても、クロロホルムが残留することを確認した。
【００２３】
＜参考例＞
クロロホルム残留確認試験
（１）分析用試料の調製
１）ヘッドスペース測定用バイアルビンにアシル化ステロール配糖体抽出物（クロメタ混合液より抽出した濃縮乾固品）を5.8mg秤量した。
２）秤量後、さらに4.5mLの蒸留水をバイアルビンに加えて付属のゴム栓で蓋をした後、アルミのキャップでかしめて密閉した。
３）密閉したバイアルビンは超音波洗浄機により内部のアシル化ステロール配糖体抽出物を完全に懸濁させ分析に供した。
【００２４】
（２）クロロホルム分析条件
＜使用機器＞
GC：GC-2010（GAS CHROMATOGRAPH;SHIMADZU）
MS：GCMS-QP2010（GAS CHROMATOGRAPH MASS SPECTROMETER;SHIMADZU）
ヘッドスペースサンプラー（HS）：TurboMatrix 40（Parkin Elmer）
＜ヘッドスペース条件＞
加温60℃（20分）→ 振とう（10分）→ 平衡化（1.5分）→ 加圧（0.5分）→ 注入（0.30分）
＜GC条件＞
カラム：Stabilwax（30m×0.25mm, 0.25μm; restek）
カラム昇温条件：40℃（5分）→ 6℃/分 → 70℃ → 30℃/分 → 180℃（5分）
＜MS条件＞
インターフェース温度：220℃
イオン源温度：210℃
イオン化電圧：70eV
イオン化電流：300μA
キャリアーガス：He（コンスタントプレッシャー）
測定モード：scan
モニターイオン：定量イオン（確認イオン）
クロロホルム 83（85）
【００２５】
上記条件で、比較例の試料のクロロホルム残留を確認したGC-MSのチャートを図５に示す。試料中にはクロロホルムが5.22μg/gの濃度で残留していることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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