(57)【要約】【課題】新規の抗炎症剤及び毛髪のはり・こし改善剤の提供。【解決手段】ツバキ属植物エキスを含有する抗炎症剤を提供する。【選択図】図１
2014080409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツバキ属（Camellia）植物エキスを含有する抗炎症剤。
【請求項２】
ツバキ属植物がツバキ（Camellia Japonica L）である、請求項１に記載の抗炎症剤。
【請求項３】
毛髪のはり・こし改善剤である、請求項１又は２記載の抗炎症剤。
【請求項４】
毛髪のくせ毛改善剤である、請求項１又は２記載の抗炎症剤。
【請求項５】
毛髪のキューティクル改善剤である、請求項１又は２記載の抗炎症剤。
【請求項６】
炎症がインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−８からなる群から選ばれる炎症性サイトカインの産生に起因する、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗炎症剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツバキ属（Camellia）植物エキスを含有する抗炎症剤、特に毛髪のはり・こし改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、頭皮ケアへの関心が高まっている。頭皮状態については、これまでフケ・カユミを中心に多くの研究がなされてきたが、毎日の洗髪習慣の定着とともにフケ・カユミの悩みは減少し、消費者の間では毛髪を育む場としての頭皮環境の改善に対する期待が増している。健康な毛髪を育むには頭皮の健康が重要であるという考えは広く一般に受け入れられているが、頭皮状態と毛髪物性の具体的な関係性についてはよく解明されていない部分が多い。
【０００３】
皮脂成分由来の刺激性物質を想定した過酸化スクワレンは毛胞上皮細胞でIL-1などの炎症性因子の発現を亢進し、さらに、それらの炎症性因子はキューティクルで特異的に発現するKAP5.1遺伝子の発現を抑制することが示されている（非特許文献１：江浜ほか, 第６９回ＳＣＣＪ研究討論会講演要旨集, 2011, p. 18-19）。キューティクルの曲げ剛性は毛髪のはり・こしに大きく寄与し（非特許文献１：曽我部敦ほか, J Soc Cosmet Chem Jpn, 2002. 36(3): p. 207-2165）、またKAP5.1の遺伝子発現は毛髪のヤング率すなわちはり・こしと相関することが示されている（非特許文献２：相馬勤ほか, フレグランスジャーナル, 2010. 38(2): p. 27-32.4）。KAP5ファミリー蛋白質はキューティクルでケラチン繊維の間を埋めるように存在してS-S結合や水素結合を介してケラチン繊維同士を繋ぎとめ、曲げ剛性に寄与すると推定されている。
【０００４】
以上の結果を合わせて、頭皮に炎症が生じると、毛髪、特にキューティクルの構成成分の産生が遺伝子レベルで阻害される結果、毛髪の強度・はり・こしが低下するというメカニズムの存在が示唆されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】江浜ほか, 第６９回ＳＣＣＪ研究討論会講演要旨集, 2011, p. 18-19
【非特許文献２】曽我部敦ほか, J Soc Cosmet Chem Jpn, 2002. 36(3): p. 207-216
【非特許文献３】相馬勤ほか, フレグランスジャーナル, 2010. 38(2): p. 27-32.
【非特許文献４】Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jun 9;106(23):9292-7
【非特許文献５】Am J Hum Genet. 2010 Apr 9;86(4):632-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な抗炎症剤及び毛髪のはり・こし改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、炎症等の頭皮トラブルのある被験者では毛髪の曲げ剛性（はり・こしを反映）が低下していることを見出し、頭皮の炎症を想定した培養系の実験で、オレイン酸または過酸化スクワレン等の皮脂由来刺激物質が表皮細胞で炎症に関わるサイトカイン類の発現を亢進し、それらが器官培養毛におけるはり・こしに寄与するKAP5.1をはじめ、各種毛髪形成因子の発現を低下させることを検証した。さらに、本発明者は毛髪形成に重要な役割を果たす遺伝子であって、その遺伝子変異が極度のくせ毛症状を呈するAutosomal-Dominant Woolly Hairと密接な関連が示されている遺伝子（KRT74）やキューティクル形成不全の原因となる遺伝子（Sox-21）の発現が炎症性サイトカインの存在により抑制されることも見出しした。KRT74についてはProc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jun 9;106(23):9292-7（非特許文献４）、Sox-21についてはAm J Hum Genet. 2010 Apr 9;86(4):632-8（非特許文献５）を参照のこと。
【０００８】
そして、ツバキ属植物エキスが表皮における炎症因子亢進を抑制することを見出し、頭皮炎症による毛髪形成能低下を予防・改善するヘアケア薬剤の提供に至った。
【０００９】
即ち、本願は以下の発明を提供する。
（１）ツバキ属植物エキスを含有する抗炎症剤。
（２）ツバキ属植物がツバキ（Camellia Japonica L）である、（１）の抗炎症剤。
（３）毛髪のはり・こし改善剤である、（１）又は（２）の抗炎症剤。
（４）毛髪のくせ毛改善剤である、（１）又は（２）の抗炎症剤。
（５）毛髪のキューティクル改善剤である、（１）又は（２）の抗炎症剤。
（６）抗炎症剤としてのツバキエキスの使用。
（７）抗炎症剤の調製のためのツバキエキスの使用。
（８）ツバキ属植物がツバキ（Camellia Japonica L）である、（６）又は（７）の使用。
（９）炎症の抑制を必要とする対象者にツバキエキスを適用することを含む、炎症を抑制する方法。
（10）炎症がインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−８からなる群から選ばれる炎症性サイトカインの産生に起因する、（１）〜（５）の抗炎症剤、（６）〜（８）の使用、又は（９）の方法。
（11）毛髪のはり・こし改善剤としてのツバキ属植物エキスの使用。
（12）毛髪のくせ毛改善剤としてのツバキ属植物エキスの使用。
（13）毛髪のキューティクル改善剤としてのツバキ属植物エキスの使用。
（14）ツバキ属植物がツバキ（Camellia Japonica L）である、（11）〜（13）の使用。
（15）毛髪のはり・こし改善剤の調製のためのツバキエキスの使用。
（16）毛髪のくせ毛改善剤の調製のためのツバキエキスの使用。
（17）毛髪のキューティクル改善の調製のためのツバキエキスの使用。
（18）ツバキ属植物がツバキ（Camellia Japonica L）である、（15）〜（17）の使用。
（19）毛髪のはり・こしの改善を必要とする対象者にツバキ属植物エキスを適用することを含む、毛髪のはり・こしの改善方法。
（20）毛髪のくせ毛改善の改善を必要とする対象者にツバキ属植物エキスを適用することを含む、毛髪のくせ毛改善方法。
（21）毛髪のキューティクル改善を必要とする対象者にツバキ属植物エキスを適用することを含む、毛髪のキューティクル改善方法。
（22）ツバキ属植物がツバキ（Camellia Japonica L）である、（19）〜（21）の方法。
【発明の効果】
【００１０】
従来にない新規の毛髪のはり・こし改善剤、毛髪のくせ毛改善剤及び／又は毛髪のキューティクル改善が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】IL-1αの毛髪形成因子の発現への影響を示す。
【図２】IL-1βの毛髪形成因子の発現への影響を示す。
【図３】IL-8の毛髪形成因子の発現への影響を示す。
【図４】ツバキエキスによる炎症性サイトカイン（IL-1α）の発現の抑制効果を示す。
【図５】ツバキエキスによる炎症性サイトカイン（IL-8）の発現の抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明でいう「炎症」とは、何らかの内因性又は外因性の刺激を受けることで免疫応答が働き、それによって生体に出現した症候をいい、例えば肌に生じた場合、肌荒れ、かさつき、痒み、などといった症状が現われる。また、特に頭皮に炎症が生じた場合、頭皮の赤み、かさつき（乾燥）、吹き出物、フケなどの症状が現れるだけでなく、その影響で抜け毛、薄毛化、細毛化、さらに毛髪のはり、こしの衰えといった症状も現われる。本発明でいう炎症とは主として炎症性サイトカインといった炎症性物質、例えばインターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−８などの過剰産生を伴う炎症状態をいう。
【００１３】
毛髪にはり・こし感を与えたり、やわらかくするなど毛髪の硬さをコントロールすることは頭髪化粧品の重要な機能の一つである。本来「毛髪のはり・こし」は毛髪が束になった状態の官能表現であり、毛髪一本一本の物性だけでなく、毛髪密度・毛髪径・毛髪曲率・毛髪の表面状態に起因する毛髪間相互作用（毛髪間の摩擦など）を５つの基本的因子が複合的に作用して毛髪のはり・こしを決めると考えられている。（Hough, P.A., et. al. J Soc Cosmet Chem (1976)）その中でも特に毛髪繊維そのものの力学特性、特に曲げ剛性・ねじり剛性といった力学が大きく影響を及ぼすと考えられている。特に、毛髪の曲げ剛性は一般に曲げのヤング率という値で評価できる。即ち、ヤング率が高いほど毛髪にはり・こしがあるといえる。本発明でいう毛髪のはり・こしの改善は主として頭皮の炎症により及ぼされる毛髪のはり・こしの衰えを改善するものであり、外的要素に起因するダメージ、例えばパーマ剤やブリーチ剤処理、紫外光暴露、大気汚染物質暴露、コーミング摩擦など、毛髪に対する直接的なダメージに起因する毛髪のはり・こしの衰えの改善とは区別される。
【００１４】
美しい髪を実現するためには、はり・こしの衰え以外にも、ツヤの低下、パサツキ、うねりやくせ毛といった髪悩みを解決するヘアケアが求められている。毛髪の最表面はうろこ状の硬い組織であるキューティクルに覆われている。キューティクルはその剛性により、毛髪繊維のはり・こしに寄与するだけでなく、その表面形状が触感を左右し、またその光学特性がツヤの見え方にも大きく影響する。さらに、毛髪内部のコルテックス中の水分やタンパク質を保つうえでも、キューティクルがきちんと整っていることが重要である。従って、外的な要因によるキューティクルのダメージを防ぐとともに、キューティクルの健やかな形成を促すことがはり・こしやツヤ、パサツキ等の髪悩みの改善に有効であると考えられる。くせ毛は毛髪がカーブした状態をいい、一般に毛髪全体がウェーブのかかった状態にみえる波状毛、髪がねじれた状態にある捻転毛、髪の表面に凹凸があり、毛質がボコボコとした状態にみえる連球毛、毛が硬くみた目でチリチリとした縮毛などがある。
【００１５】
本発明の抗炎症剤は、毛髪のはり・こしをよくしたり、くせ毛を直したり、さらには健全なキューティクル形成を促すことによるツヤ改善、パサツキ改善、といった効果を奏することができる。
【００１６】
本発明で用いられるツバキは、ツバキ科ツバキ属に属する植物であれば特に限定されないが、ヤブツバキ（Camellia japonica L.)、ユキツバキ（Camellia japonica subsp.rusticana (HONDA) Kitamura)、リンゴツバキ（Camellia japonica var.macrocapra Masamune)、ヤマトウツバキ（Camellia reticulate f. Simplex Sealy)、ポリオドンタ （Camellia polyodonta How)、セミセラータ（Camellia semiserata Chi)、ピタルディ （Camellia pitardii Cohen Stuart)、ピタルディ・ユンナニカ（Camellia pitardii var.yunnanica Sealy)、ホンコンツバキ（Camellia hongkongensis Seem）、サルウィンツバキ（Camellia saluenensis Stapf ex Bean）、チェキアンオレオーサ（Camellia chekiangoleosa Hu）などが挙げられ、なかでも、ヤブツバキ（Camellia japonica L.)、ヤマトウツバキ（トウツバキ）（Camellia reticulate f. Simplex Sealy）が最も好ましい。
【００１７】
抽出する部位は特に限定されず、種子、葉、花、開花前の蕾、樹皮、根、蜜、花粉などが利用されるが、花が特に好ましい。
【００１８】
抽出方法としては、メタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール、水、あるいはそれらの混液を用いて浸漬抽出する他、加熱抽出、超音波抽出、マイクロウェーブ抽出、水蒸気蒸留、超臨界抽出、圧搾などの方法を用いることができる。得られた抽出物は、分画、脱ガム、脱酸、脱臭、カラム精製などの精製を行うこともできる。また、エタノール、プロパノール、水、１,３−ブチレングリコール、プロピレングリコールなど化粧品に一般的に用いられる溶媒、あるいはそれらの混液に溶解した形態で使用することもできる。
抽出物（エキス）は水溶性のエキスあるいはその乾固物、圧搾油などの形体で供給される。
【００１９】
本発明に用いるツバキエキスは例えば以下に列挙される市販品をそのまま用いることができる。
SFE Aqua Extract of Camellia Japonica Seed (Greentek 21 Co. Ltd)
Campo Citisu (Campo Research and Development Systems)
Natulal Jeju Organic Camellia Extract (BioSpectrum Inc.)
椿油（大島椿株式会社、左藤椿株式会社、株式会社本島椿など）
クロピュアヤマトウツバキ（クローダ  ジャパン株式会社）
Camellia Japonica Flower Water (ChanelPB) 
椿花抽出液BG-50（香栄興業株式会社）
Camellia Japonica Flower Extract (Bioland Ltd.) 
Camellia Japonica Flower Extract (Carrubba Inc.) 
Camellia Japonica Leaf Extract ies (IES Labo.) 
HSE-Herbal Skin Enhancer Green TEA (Color Techniques) 
SFE Camellia Leaf (Greentek2l Co.Ltd) 
VT-230 Extract of Camellia (Vege-Tech Company) 
【００２０】
エキス製造例として、ヤブツバキ（Camellia japonica L.）の乾燥花１kgを50％エタノール10Lに浸漬し、室温にて一週間精置し、得られたエキスを濾過し、エタノールを濃縮乾固し、乾固物を50％の1,3-ブチレングリコール水溶液10Lに溶解し、５℃にて澱引き・濾過してツバキ花エキス約10Lを得ることが挙げられる。
【００２１】
本発明の抗炎症剤や毛髪はり・こし改善剤に用いるツバキエキスの配合量は、炎症剤又は毛髪はり・こし改善剤全量に対して、通常、乾燥固型分として0.0001〜10.0重量％、好ましくは0.001〜5.0重量％である。0.0001重量％未満では十分な抗炎症効果や毛髪のはり・こし改善効果が得られず、また、10.0重量％を超えると製剤上の問題が生じるため好ましくない。
【００２２】
本発明の抗炎症剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の抗炎症剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明の抗炎症剤中には、活性成分としてのツバキエキス以外に、例えば、医薬的に許容される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、化粧品等に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２４】
本発明の抗炎症剤は好ましくは毛髪はり・こし改善剤として使用できる。本発明の毛髪はり・こし改善剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、液状、乳液、軟膏、クリーム、ゲル、エアゾールなど、外用に適用可能な剤型のものであればいずれでもよい。
【００２５】
本発明の毛髪はり・こし改善剤においては、必須成分である上記生薬に加えて、必要に応じて、かつ本発明の所期の効果を損なわない限り、化粧品、医薬部外品、医薬品等において一般的に用いられる、各種の油性又は水性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種の薬剤等を配合することができる。
【００２６】
例えば、高級脂肪酸、固形パラフィン、流動パラフィン、シリコーン油、スクワラン、モノオレイン酸グリセリル、オリーブ油、イソプロピルミリステート、高級アルコール等の油分；グリセリン、ヒアルロン酸、プロピレングリコール、マルチトール、アテロコラーゲン、乳酸ナトリウム等の保湿剤；マルメロ粘質物、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム等の増粘剤；ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、ビタミンＥアセテート、センブリ抽出物、塩化カルプロニウム、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤；セリン、メチオニン、アルギニン等のアミノ酸類；ビタミンＢ６、ビタミンＥ類、ビオチン、パントテン酸類等のビタミン類；ニコチン酸、ニコチン酸メチル、ニコチン酸トコフェロール等のニコチン酸エステル類；セファランチン等の皮膚機能亢進剤；エストラジオール等の女性ホルモン剤；グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アズレン等の消炎剤；ヒノキチオール等の抗菌剤；メントール等の清涼剤；サリチル酸、亜鉛類、乳酸類等；クエン酸等の有機酸類を配合することができる。
【００２７】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
１．炎症と毛髪のはり・こしとの関係
１−１）頭皮観察および毛髪物性測定
事前にインフォームドコンセントを得た20代〜50代の頭皮および顔面に皮膚疾患のない日本人女性101名（各年代20〜31名）を対象に以下の測定・観察を実施した。被験者は予め前日の晩に洗髪したうえで、頭髪の分け目をピンで固定して頭皮を露出し24℃、45%の恒温恒湿室で40分間安静の後、皮脂量（Sebumeter SM815、C+K社）および角層水分量（SKICON 200、I.B.S.社）を測定した。さらに専門の評価者が被験者の頭皮全体を直接観察し、頭皮の赤み・かさつき（乾燥）・吹き出物・フケなどの頭皮トラブルの有無と出現頻度によりその程度をスコア１（なし）、スコア２（若干あり）、スコア３（あり）の３段階に評価・分類した。
【００２９】
また、各被験者について頭頂部付近の毛髪を根元からカットして採取し、一定条件で洗浄後、各被験者から任意に抽出した15本の毛髪について1本ずつ、温度24℃・湿度50%環境下で、根元寄りの５cmの区間の１％伸張時の荷重（KES−Ｇ1−SH 高感度毛髪引張り試験機、カトーテック社）および曲げ応力（KES-FB2-SH 一本曲げ試験機、カトーテック社）を測定した。同一毛髪の短径および長径をSK-2000毛髪直径計測システム（カトーテック社）により５mm間隔で計測し、その平均値をそれぞれその毛髪の短径および長径として１％伸張時の引張り応力、および曲げ剛性のヤング率を算出した。
【００３０】
各計測値は、頭皮トラブルのスコア別に平均値と標準偏差を算出し、一元配置分散分析により、有意水準を0.05として群間の有意差検定を行った。頭皮トラブルの程度の評価・分類の結果、被験者全体でスコア１は34名（33.7%）、スコア２は35名（34.7%）、スコア３は32名（31.7%）という分布になり、その分布に年代間の差は認められなかった。そこで、被験者全体を頭皮トラブル程度別の３群に分けて比較を行った。
【００３１】
皮膚生理指標については、頭皮トラブルの程度が高いほど角層水分量は低い傾向で、また皮脂量は有意に高いことが示された。一方、毛髪については頭皮トラブルスコア別で短径、長径、扁平率に有意差はなかったが、１％伸張時の引張り応力は頭皮トラブルの程度が高いほど低く、すなわち毛髪の強度が弱いことが示唆された。また、毛髪のはり・こしに大きく寄与することが知られる曲げ剛性のヤング率（Hough, P.A., et. al. J Soc Cosmet Chem, 1976. 27: p. 571-578、Swift, J.A., Int J Cosmet Sci, 1995. 17(6): p. 245-53）も、頭皮トラブルの程度が高いほど値が低く、はり・こしが弱いことが示唆された。
【００３２】
１−２）炎症性サイトカイン（IL-1α、IL-1β、IL-8）の亢進
細胞培養
ヒト表皮角化細胞（Epidercell NHEK(F)；正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞）はクラボウ社より購入し、EPILIFE-KG2（Cascade Biologies社）中で培養した。外毛根鞘細胞（outer root sheath cell; ORS）は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた細胞をK-SFM培地（Invitrogen）中で培養した。いずれもサブコンフルエントに達した状態で実験に用いた。
【００３３】
市販のスクワレンにUVA（25W/m2, 6hr）を照射して生成した過酸化スクワレン含有物（過酸化物含有量約１％、終濃度50〜400μＭ）をサブコンフルエントに達したヒト表皮角化細胞、あるいは外毛根鞘細胞に添加した。
【００３４】
１−３）RNA発現量の定量
炎症惹起試薬添加の３〜６時間後にMagNA（商標） Pure LC HS キットおよびMagNA Pure（商標）機器（Roche Diagnostics社、日本国、東京都）を用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたmRNAから逆転写酵素SuperScriptII(Invitrogen)のキットを用いてcDNAを調製し、LightCycler FastStart DNA master SYBR green Iキット（Roche Diagnostics社）を用いてリアルタイム定量PCRに供した。
【００３５】
リアルタイム定量PCRは、製造業者の取扱説明書にしたがって、LightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、10分間の活性化ステップ、それに続く95℃で15秒の変性、60℃で10秒のアニーリング、72℃で10秒の伸長からなるサイクル40回であった。使用したプライマーは下記に示す。
【００３６】
GAPDH
Forward：5’- GAGTCAACGGATTTGGTCGT -3’ （配列番号１)
Reverse：5’- TGGGATTTCCATTGATGACA -3’ （配列番号２)
IL8
Forward：5’- AGACAGCAGAGCACACAAGCTTCTAGGAC -3’ （配列番号３)
Reverse：5’- CACTCCTTGGCAAAACTGCACCTTCACAC -3’ （配列番号４)
IL-1α
Forward：5’- GGTCAGCACCTTTTAGCTTCCTGAGCAA -3’ （配列番号５)
Reverse：5’- CCGTGAGGTACTGATCATTGGCTCGAA -3’ （配列番号６)
IL-1β
Forward：5’- GGCCATGGACAAGCTGAGGAAGATGCTG -3’ （配列番号７)
Reverse：5’- TGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCC -3’ （配列番号８)
【００３７】
各プライマーの最終濃度は20μlの総反応容量中で0.2〜0.25μＭとした。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）遺伝子を対照遺伝子として使用した。増幅させたフラグメントの特異性は融解曲線分析によって確認した。各遺伝子の発現レベルは、PCR産物の指数関数的増幅期において初期鋳型量AのPCR産物YがPCRのサイクル数Xに対してY=Ax2Xを満たしながら増幅されるものと仮定して、一定量のPCR産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。
【００３８】
毛包上皮細胞である外毛根鞘細胞に皮脂成分由来の過酸化脂質である過酸化スクワレンを作用させたところ、炎症性サイトカインであるIL-1α、IL-1β、IL-8の遺伝子発現が薬剤無添加コントロールに比較して４〜６倍に亢進した（添加６時間後）（データーは示さない）。
【００３９】
２．器官培養毛における毛髪形成因子の遺伝子発現に及ぼす影響の解明
炎症性サイトカインが器官培養毛における毛髪形成因子の遺伝子発現に及ぼす影響を調べるため、毛髪形成因子としてKAP-1、Sox-21，KRT74の発現について調べた。Sox-21はキューティクルの形成に関与し（The disruption of Sox21-mediated hair shaft cuticle differentiation causes cyclic alopecia in mice. Kiso M, Tanaka S, Saba R, Matsuda S, Shimizu A, Ohyama M, Okano HJ, Shiroishi T, Okano H, Saga Y., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jun 9;106(23):9292-7.）、またKRT74はその遺伝子変異が極度のくせ毛症状を呈するAutosomal-Dominant Woolly Hairと密接な関連が見出されている（Autosomal-dominant woolly hair resulting from disruption of keratin 74 (KRT74), a potential determinant of human hair texture. Shimomura Y, Wajid M, Petukhova L, Kurban M, Christiano AM., Am J Hum Genet. 2010 Apr 9;86(4):632-8.）。
【００４０】
細胞培養
器官培養毛包はヒト頭皮より取り出した毛包をPhilpott らの方法（Philpott, M.P., et. al. J Cell Sci, 1990. 97 ( Pt 3): p. 463-71.）に従って調製し、実験に供した。単離した器官培養毛にIL-1α、IL-1β、IL-8を終濃度が各10μMとなるように添加した。薬剤無添加コントロールを含め、各薬剤条件につき10〜20本の器官培養毛を用いた。
【００４１】
mRNA発現量の定量
各種炎症性サイトカイン添加の16時間後に同一培養条件下の器官培養毛をまとめてISOGEN（ニッポンジーン）を入れたPlastic Pestle (KONTES glass Company)のチューブに移し、凍結融解後、付属のペストルでホモジネートし、ISOGENのマニュアルに従いトータルRNAを抽出した。得られたトータルRNAは上記と同様に逆転写反応を行ってｃDNAを調製し、LightCycler FastStart DNA master SYBR green Iキット（Roche Diagnostics社）を用いてリアルタイム定量PCRに供した。
【００４２】
リアルタイム定量PCRは、上記と同様の条件で行い、いずれも製造業者の取扱説明書にしたがって、LightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、10分間の活性化ステップ、それに続く95℃で15秒の変性、60℃で10秒のアニーリング、72℃で10秒の伸長からなるサイクル40回であった。使用したプライマーは、GAPDHについて上述のとおりであり、KAP5.1, Sox21及びKRT74については以下に示す。
【００４３】
KAP5.1
Forward：5’- TCTCTTCCCAAGTCAACTGC -3’ （配列番号９)
Reverse：5’- AGAGTGTTGGACAGGCAAAG -3’ （配列番号１０)
Sox21
Forward：5’- GGGCCCGGTTTGTATGTA -3’ （配列番号１１）
Reverse：5’- GTCTGAAATGATCCTGCGAAT -3’ （配列番号１２）
KRT74
Forward：5’- CAGATCAAGGTGCTGAACGA -3’ （配列番号１３）
Reverse：5’- GCCGGTTAATCTCCACTTCA -3’ （配列番号１４）
【００４４】
各プライマーの最終濃度は20μlの総反応容量中で0.2〜0.25μＭとした。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（GAPDH）遺伝子を対照遺伝子として使用した。増幅させたフラグメントの特異性は融解曲線分析によって確認した。各遺伝子の発現レベルは、PCR産物の指数関数的増幅期において初期鋳型量AのPCR産物YがPCRのサイクル数Xに対してY=Ax2Xを満たしながら増幅されるものと仮定して、一定量のPCR産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。各遺伝子の発現レベルは、上述のとおりに一定量のPCR産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。
【００４５】
その結果を図１〜３に示す。毛髪形成因子の遺伝子KAP5.1、Sox21、KRT74は全てサイトカインIL-1α、IL-1β、IL-8によりその発現が低下することがわかる。
【００４６】
３．考察
頭皮観察および毛髪物性測定の結果から、視感判定による頭皮トラブル程度が高い群では角層水分量が低く、顔面等で見られるいわゆる肌荒れ状態であることが示唆された。また頭皮トラブル群で皮脂量が高かったことから、皮脂成分由来の過酸化脂質やオレイン酸等の刺激物質が原因となって頭皮で炎症が惹起された結果、赤みやフケ・吹き出物等のトラブルが発生したことが推定される。同時に頭皮トラブル程度が高い群で毛髪強度などが低かったことから、我々は頭皮および毛包上皮細胞で炎症が生じた結果サイトカイン類が放出されて毛髪を形成する毛球部に作用し、毛髪形成などに関わる遺伝子発現に悪影響を及ぼして毛髪強度などが低下するのではないかと考えた。
【００４７】
この作業仮説に基づき培養実験モデルでの検証を試みたところ、皮脂成分由来の刺激性物質を想定した過酸化スクワレンは毛胞上皮細胞でIL1などの炎症性因子の発現を亢進し、さらに、それらの炎症性因子はキューティクルで特異的に発現するKAP5.1遺伝子の発現を抑制することが示された。キューティクルの曲げ剛性は毛髪のはり・こしに大きく寄与し（曽我部敦ほか, J Soc Cosmet Chem Jpn, 2002. 36(3): p. 207-216）、またKAP5.1の遺伝子発現は毛髪のヤング率すなわちはり・こしと相関することが示されている（相馬勤ほか, フレグランスジャーナル, 2010. 38(2): p. 27-32）。KAP5ファミリー蛋白質はキューティクルでケラチン繊維の間を埋めるように存在してS-S結合や水素結合を介してケラチン繊維同士を繋ぎとめ、曲げ剛性に寄与すると推定されている。
さらに頭皮の炎症に起因する各種炎症性因子が、KAP5.1以外の毛髪形成に関わる因子に及ぼす影響についても検討を進めたところ、キューティクルで発現し毛髪ケラチンやケラチン関連タンパク（KAPｓ）を調節して、正常なキューティクル形成に必須であることが報告されているSOX21、およびその遺伝子変異が極度のくせ毛症状を呈するAutosomal-Dominant Woolly Hairと密接な関連が見出されているKRT74についても、それぞれ炎症因子により発現が低下することを確認した。ケラチン74蛋白は、内毛根鞘（IRS）に特異的に発現するタイプII ケラチンであり、細胞骨格の主成分である(Langbein L, Schweizer J : Keratins of the human hair follicle. Int Rev Cytol 2005 ; 243: 1-78.）。変異型のケラチン74蛋白では細胞内のケラチン線維の構築が破壊されてしまうことから（Shimomura Y, Wajid M, Petukhova L, et al :Autosomal-dominant woolly hair resulting from disruption of keratin 74 (KRT74), a potential determinant of human hair texture. Am J Hum Genet 2010 ; 86 : 632-638.）正常な毛髪形成が阻害される結果、極度のくせ毛状態を呈することが推定されている。
【００４８】
以上の結果を合わせて、頭皮に炎症が生じると、毛髪、特にキューティクルの形成に関与する因子の産生が遺伝子レベルで阻害される結果、毛髪の強度、即ちはり・こしが低下するというメカニズムの存在が示唆された。また、健全なキューティクル形成が阻害されることにより、キューティクルの物性が大きく寄与するツヤ、触感、パサツキなどの低下も同時に引き起こされることが充分考えられる。さらに、IRSにおける細胞骨格形成が阻害されることによりくせ毛形成が誘導される可能性も示唆された。
【００４９】
４．ツバキエキスによるサイトカイン発現レベルの抑制効果
ツバキエキスによる炎症性サイトカインの発現抑制効果を以下のとおりにして調べた。
【００５０】
細胞培養
ヒト表皮角化細胞（Epidercell NHEK(F)；正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞）はクラボウ社より購入し、EPILIFE-KG2（Cascade Biologies社）中で培養した。ツバキ花エキスによる炎症性サイトカイン発現亢進の抑制効果を調べるため、上記肌荒れ惹起薬剤過酸化脂質含有スクワレン添加（過酸化物含有量約１％、終濃度100μＭ））の前日からツバキ花エキスを溶かした培地に交換して培養した（培養中のエキス終濃度は0.1〜0.5%）。
【００５１】
mRNA発現量の定量
炎症惹起試薬添加の６時間後にMagNA（商標） Pure LC HS キットおよびMagNA Pure（商標）機器（Roche Diagnostics社、日本国、東京都）を用いてmRNAを抽出した。得られたmRNAはQuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit(QIAGEN)を用いて、直接リアルタイム定量ＰＣＲに供した。
【００５２】
リアルタイム定量PCRは、上記のとおり製造業者の取扱説明書にしたがって、LightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、10分間の活性化ステップ、それに続く95℃で15秒の変性、60℃で10秒のアニーリング、72℃で10秒の伸長からなるサイクル40回であった。使用したプライマーは上述のとおりである。各遺伝子の発現レベルは、上述のとおりに一定量のPCR産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。
【００５３】
その結果を図４及び５に示す。ツバキエキス単体では炎症因子の誘導に影響は及ぼさないが、ツバキエキスの添加により、過酸化脂質により誘導されるサイトカインIL-1α、IL-8の発現が濃度依存的に有意に抑制されることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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