(57)【要約】      （修正有）【課題】段状通路の中を流れる粒子の能力に基づき粒子を分離する装置を提供する。【解決手段】より小さな粒子とより大きな粒子を分離する装置であって、少なくとも、粒子のいくつかは分離段部に境界されるより幅が狭い通路を通り抜けることができず、結果的に粒子が分離される。装置の少なくとも１つの段の前縁部の横幅は段が存在する通路の全幅より有意に大きく、高度で急速なサンプル処理量を可能にする。装置および方法は、多種多様なタイプの粒子を分離するのに用いることが可能である。例として、それらは血中循環腫瘍細胞をヒト血液サンプルから分離することに用いることが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
より小さな粒子とより大きな粒子を分離する装置であって、
間隙を形成する本体とカバーとを有し、
前記間隙は、当該間隙の注入口領域および排出口領域を分離する分離エレメントを含み、
前記分離エレメントは前記間隙の表面と共にチャネルを画成し、
前記チャネルは、分離部分を経由して前記注入口領域と前記排出口領域を流体連通させ、
前記分離部分における全幅と、
前記分離エレメントと前記間隙の表面との間の距離により定義される高さと
を有するものであり、
前記本体、前記カバー、および前記分離エレメントのうちの少なくとも１つは、その内部に配置され、且つ前記チャネルの前記分離部分を実質的に完全に横切って延長する前縁部を有する分離段部を備え、それにより前記チャネルは前記前縁部の前記注入口側にある上流部分および前記前縁部の前記排出口側にある実質的に薄層状（ｌａｍｅｌｌａｒ）の下流部分に分割されるものであり、
前記上流部分の高さは、より大きな粒子およびより小さな粒子の両方の通過を容易にするのに十分な高さであり、
前記下流部分の高さは、前記より小さな粒子の通過を容易にするのに十分大きく、且つ前記より大きな粒子の通過を阻止するのに十分に小さいものであり、
前記前縁部の横幅（ｂｒｅａｄｔｈ）は、前記分離領域における前記チャネルの全幅より実質的に大きいものであり、
それにより、前記チャネルに前記粒子を通過させて、前記分離段部を横断する能力に基づいて粒子を回収することにより、前記粒子を分離することができるものである
装置。
【請求項２】
請求項１記載の装置において、前記チャネルの上流部分は実質的に薄層状である、装置。
【請求項３】
請求項１記載の装置において、前記前縁部の横幅は前記より大きな粒子の特徴的寸法の少なくとも１００倍である装置。
【請求項４】
請求項１記載の装置において、前記前縁部の横幅は前記分離領域の前記チャネルの全幅の少なくとも１００倍である装置。
【請求項５】
請求項１記載の装置において、前記前縁部の横幅は前記分離領域の前記チャネルの全幅少なくとも１，０００倍である装置。
【請求項６】
請求項１記載の装置において、前記前縁部の横幅は前記分離領域の前記チャネルの全幅の少なくとも１０，０００倍である装置。
【請求項７】
請求項１記載の装置において、前記下流部分の高さは血中循環腫瘍細胞の通過を阻止するものである装置。
【請求項８】
請求項１記載の装置において、前記下流部分の高さはヒト赤血球の通過を容易にするものである装置。
【請求項９】
請求項１記載の装置において、前記下流部分の高さはヒト胎児幹細胞様細胞の通過を阻止するものである装置。
【請求項１０】
請求項１記載の装置において、前記本体、前記カバー、および前記分離エレメントのうちの少なくとも１つは、その内部に配置され、且つ前記分離段部の前記注入口側の前記チャネルを実質的に完全に横切って延長する集束段部を備え、前記チャネルは当該集束段部のその排出口側より前記注入口側においてより大きな高さを有するものである装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の装置において、前記集束段部は実質的に前記チャネルを垂直に横切って延長するものである装置。
【請求項１２】
請求項１記載の装置において、前記本体、前記カバー、および前記分離エレメントのうちの少なくとも１つは、前記分離部分内に連続的に配置される複数の分離段部を備えるものであり、前記分離段部の各々は、
ａ）前記分離部分を実質的に横切って延長し、前記分離部分における前記チャネルの全幅より実質的に大きい横幅（ｂｒｅａｄｔｈ）を有する前縁部を有し、
ｂ）前記分離段部の前記前縁部を基準として前記チャネルを上流部分および実質的に薄層状の下流部分に分割するものであり、前記分離段部の直後に位置する前記下流部分のチャネルの高さは、前記分離段部の直前に位置する前記上流部分のチャネルの高さより小さいものである、
装置。
【請求項１３】
請求項１記載の装置において、前記前縁部は角度の付いた形状を有するものである装置。
【請求項１４】
請求項１記載の装置において、前記前縁部は湾曲形状を有するものである装置。
【請求項１５】
請求項１記載の装置において、前記前縁部は波形形状を有するものである装置。
【請求項１６】
請求項１記載の装置において、前記前縁部は陥入した形状を有するものである装置。
【請求項１７】
請求項１記載の装置において、前記前縁部は不規則な形状を有するものである装置。
【請求項１８】
請求項１記載の装置において、前記分離段部が下流部分を定義する前記段の部分に対し実質的に垂直であるその注入口側で上流の面を有する、装置。
【請求項１９】
請求項１記載の装置において、前記分離エレメントは前記本体および前記カバーの少なくとも１つに一体化しているものである装置。
【請求項２０】
請求項１記載の装置において、この装置は、さらに、
前記チャネルの高さを維持するための支持体、前記チャネル内に配列され、前記分離エレメントと間隙の表面との間で延びている前記支持体を有するものである、装置。
【請求項２１】
より大きなおよびより小さな粒子を分離する方法であって、
請求項１記載の装置の前記注入口においてより大きな粒子およびより小さな粒子の流体懸濁液を提供工程と、
前記チャネルを通過するように流体を促す工程と、
ｉ）前記排出口領域にあるより小さな粒子と、
ｉｉ）前記分離段部の前記前縁部の上流にあるより大きな粒子と
の少なくとも１つを回収する工程と、
を有する方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法において、前記より大きな粒子は血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）であり、より小さな粒子は血液球である方法。
【請求項２３】
請求項２１記載の方法において、血液細胞が赤血球である、方法。
【請求項２４】
脊椎動物の対象における腫瘍の発生を診断する方法であって、
前記対象から採取した血液サンプルを請求項１記載の装置の前記注入口領域に提供する工程であって、前記薄層状部分の高さは血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のサイズより小さいもである、前記提供する工程と、
前記サンプルを前記装置のチャネルに通過させる工程と、
前記通過させる工程の後、前記分離段部の前記前縁部の上流側に位置する前記装置の部分において所定の細胞が存在するかどうか分析する工程であって、少なくとも１つの細胞の存在は腫瘍が対象に生じているという徴候である、前記分析する工程と
を有する方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法において、さらに、
前記サンプルを前記チャネルに通過させる工程の後に前記分離段部の前記前縁部の上流に存在した少なくとも１つの細胞の腫瘍細胞の特徴を評価する診断テストを行う工程を有するものである方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、前記診断テストは組織特異抗体との結合である方法。
【請求項２７】
請求項２５記載の方法において、前記診断テストは腫瘍特異性抗体との結合である方法。
【請求項２８】
請求項２５記載の方法において、前記診断テストは前記前縁部の上流に存在する少なくとも１つの細胞から採取される核酸の分析を含むものである方法。
【請求項２９】
請求項２５記載の方法において、前記診断テストは細胞の増殖能の評価である方法。
【請求項３０】
請求項２５記載の方法において、前記診断テストは細胞の形態の顕微鏡観察である方法。
【請求項３１】
腫瘍に苦しむ対象のための腫瘍治療の有効性を評価する方法であって、
請求項２２の方法を用いた治療の前後に対象から得た血液サンプルからＣＴＣを単離する工程と、
サンプルから単離したＣＴＣの少なくとも１つの特性を比較する工程であって、それにより血液サンプルから分離したＣＴＣの特性における違いが治療の有効性の指標であるものである、前記比較する工程と
を有する方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法において、前記特徴はサンプルにおける血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）濃度である方法。
【請求項３３】
脊椎動物の対象において血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）量を減少させる方法であって、
請求項１記載の装置の前記注入口で対象から採取される血液を提供する工程であって、薄層状部分の高さが血中循環腫瘍細胞のサイズより小さいものである、前記提供する工程と、
血液を前記チャネルを通過するように促して血液から血中循環腫瘍細胞を除去する工程と、
前記排出口領域で前記血中循環腫瘍細胞を除去した血液を回収する工程と、
前記血中循環腫瘍細胞を除去した血液を対象に戻す工程と
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
数十マイクロメートル（生物学的細胞の寸法）から数ナノメートル（いくつかの生体高分子の寸法）までの範囲の寸法の構造エレメントを有する生物学的細胞および他の小さな粒子の操作を目的とする機械的な装置の記載がなされてきた。例えば、米国特許第５９２８８８０号明細書、米国特許第５８６６３４５号明細書、米国特許第５７４４３６６号明細書、米国特許第５４８６３３５号明細書、および米国特許第５４２７９４６号明細書では、細胞および生体分子を取り扱う装置が記載されている。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ０３／００８９３１では、粒子および細胞の分離、識別、選別および操作のための微細構造が記載されている。
【０００２】
米国特許第７９９３９０８号明細書は、細胞および他の粒子をそれらのサイズに基づいて分離するマイクロスケール装置を記載する。当該特許で記載される装置はカバーおよび本体により形成される間隙の２つの領域の間に挿入される段状分離エレメントを含み、装置内における粒子の分離は、初期段階において１つの領域に存在する粒子が段状分離エレメントを横断して他の領域に到達する能力により影響される。本明細書において開示される事項は、当該装置の改良装置として考えられる。
【０００３】
本明細書において開示する事項は、粒子または細胞の混合集団から生物学的細胞、細胞小器官、および他の粒子を分離および操作するのに用いることが可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、より小さな粒子およびより大きな粒子を分離する装置に関するものである。前記装置は間隙を形成する本体とカバーとを含む。前記間隙は、当該間隙の注入口領域および排出口領域を分離する分離エレメントを含む。前記分離エレメントは、前記間隙の１若しくはそれ以上の平面と共にチャネルを画成し、前記チャネルは、分離部分を経由して前記注入口および前記排出口領域を流体連通させる。前記チャネルは、前記分離部分における全幅と、前記分離エレメントと前記間隙の表面との間の距離により定義される高さとを有する。前記本体、前記カバー、および前記分離エレメントのうちの少なくとも１つは、その内部に配置され、且つ前記チャネルの前記分離部分を実質的に完全に横切って延長する前縁部を有する分離段部を備える。前記チャネルは、前記前縁部の前記注入口側にある上流部分および前記前縁部の前記排出口側にある実質的に薄層状（ｌａｍｅｌｌａｒ）の下流部分に分割される。前記上流部分の高さは、より大きな粒子およびより小さな粒子両方の通過を容易にするのに十分な高さである。前記下流部分の高さは、前記より小さな粒子の通過を容易にするために十分に大きく、且つ前記より大きな粒子の通過を阻止するのに十分に小さい。前記前縁部の横幅（ｂｒｅａｄｔｈ）は、（通常分離段部のそれと同じ幅であり、分離段部の前縁部が通常その段の幅より長いことを意味する）前記分離領域における前記チャネルの全幅より実質的に大きい。前記チャネルに前記粒子を通過させて、前記分離段部を横断する能力に基づいて前記粒子を回収することにより、前記粒子を分離することが可能である。
【０００５】
１実施形態において、チャネルの上流の部分は実質的に薄層状であり、互いに実質的に平行である２つの幅広面により画成されることを意味する。
【０００６】
前縁部の横幅は、実質的に前記より大きな粒子の特徴的寸法より大きい（例えば、少なくとも１００倍）ことがあり、そのような多くの粒子は前縁部を通過するバルク流体の流れを実質的に阻止することなく前縁部で捕捉することが可能である。前記前縁部の横幅はまた、分離領域（またはチャネル内の分離段部の幅）で、チャネルの全幅より大幅に（例えば、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、１００００、または１０００００倍）大きい可能性がある。例として、前記下流部分（すなわち、分離段部の前縁部のチャネルの部分）の高さは、選択された細胞型（例えば、血中循環腫瘍細胞またはヒト胎児幹細胞様細胞）の通過を阻止するのに十分小さく、且つ選択された細胞型（例えば、ヒト赤血球）が通過するのに十分に大きくなるように、またはこれらの組合せとなるように選択することができる。
【０００７】
任意の分離段部の前縁部は、角度の付いた形状、湾曲形状、波形形状、陥入した形状、または不規則な形状を有することが可能である。前記分離段部は、その注入口側において、前記チャネルの下流部分を画成する段の部分に対してほぼ垂直である上流面を有することが可能である。
【０００８】
前記分離エレメントは、前記本体および前記カバーの少なくとも１つに一体化してよい。また、前記分離エレメントは前記本体と前記カバーとの間に挿入される独立した部材であってもよい。前記装置は、前記チャネルの高さを維持するために、１若しくはそれ以上の支持体を有することが可能である。そのような支持体は前記チャネル内に配置されることが可能であり、例えば、前記分離エレメントと前記間隙の表面との間に延長させることが可能である。
【０００９】
本開示はまた、より大きな粒子およびより小さな粒子を分離する方法に関するものである。これらの方法は、本明細書において記載される装置の入口において、より大きな粒子およびより小さな粒子の流体懸濁液を提供することを含む。流体はチャネルを通過するように促され、ｉ）排出口領域にあるより小さな粒子（例えば、赤血球）、およびｉｉ）分離段部の前縁部の上流にあるより大きな粒子（例えば、血中循環腫瘍細胞）の少なくとも１つを回収することが可能である。
【００１０】
本開示はまた、脊椎動物の対象における腫瘍の発生を診断する方法に関するものである。これらの方法はｉ）対象から採取した血液サンプルを本明細書において記載される装置の注入口領域に提供する工程（チャネルの下流部分の薄層状部分の高さはＣＴＣのサイズより小さい）と、前記サンプルを前記装置のチャネル通過させる工程と、前記通過させる工程の後、前記装置の分離段部の前縁部の上流部分において細胞が存在するかどうかを分析する工程を含む。少なくとも１つの細胞の存在は、対象において腫瘍が生じているという徴候である。１若しくはそれ以上の診断テストを用いて、サンプルをチャネルに通過させる工程の後に前記分離段部の前記前縁部の上流に存在した少なくとも１つの細胞の腫瘍細胞の特徴を評価することが可能である。そのようなテストの例には、細胞またはその抽出物を組織特異的または腫瘍特異的抗体と結合させること、前縁部の上流で存在したそのような細胞から得た核酸を解析すること、または細胞の増殖能を評価することが含まれる。
【００１１】
本開示はさらに、腫瘍に苦しむ対象のための腫瘍治療の有効性を評価する方法に関するものである。これらの方法は、本明細書において記載される方法を用い、治療の前後に対象から得た血液サンプルからＣＴＣを単離することを含む。サンプルから単離したＣＴＣの少なくとも１つの特性をサンプル間で比較する。血液サンプルから単離したＣＴＣの特性（例えば、ＣＴＣ濃度または数）の違いは、治療の有効性の指標である。
【００１２】
本開示はまた、脊椎動物の対象においてＣＴＣ量を減少させる方法に関する。そのような方法は、ｉ）本明細書において記載される装置の注入口で対象から採取される血液を提供する工程（そこでチャネルの下流の部分の薄層状部分の高さはＣＴＣのサイズより小さい）と、ｉｉ）血液をチャネルを通過するように促してＣＴＣを除去する工程と、ｉｉｉ）排出口領域でＣＴＣを除去した血液を回収する工程と、ｉｖ）ＣＴＣを除去した血液を対象に戻す工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
前述の概要および以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面とともに読むことにより、よりよく理解される。これらの図面は本開示を図示する目的で含まれる。本開示は示される正確な配置および手段に限定されるものではない。
【図１Ａ】図１は図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄから成り、集束段部１０および分離段部１１を含む２つの一体化した、長方形の平板形の段を有する先行技術分離エレメント１を図示する。この種類の分離エレメントを有する装置は、例えば米国特許第７９９３９０８号明細書で開示される。図１Ａは、集束段部１０の正面２０の長方形の形がその幅広面４０に隣接して見られることができ、分離段部１１の正面２１の長方形の形がその幅広面４１に隣接して見られることができる分離エレメント１の正面図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは図１Ａに示される分離エレメント１の側面図であり、集束と分離段部（１０および１１、それぞれ）との間の高さの違いを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１Ａおよび１Ｂに示される分離エレメント１の立体図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本明細書において記載される装置のカバー４と本体２との間の間隙により定義される流体チャネルに配置されている分離エレメント１の断面図である。図１Ｄにおいて、流体チャネルの下流の部分の高さ（ｈ１）、流体チャネルの上流の部分の高さ（ｈ０）、および流体チャネル自体の高さ（ｈｃ）が示される。下流の部分の高さ（ｈ１）は分離段部１１とカバー４との間の距離により定義され、上流の部分の高さ（ｈ０）は集束段部１０とカバー４との間の距離により定義される。
【図２Ａ】図２は図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃから成り、長方形の平板形の集束段部１０および平板形を有する分離段部１１を有するが、波形形状面２１および前縁部３１を有する分離エレメント１を図示する。図２Ａは、分離段部１１の正面２１の波形形状がその幅広面４１に隣接して見られることができる分離エレメント１の正面図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは図２Ａに示される分離エレメント１の側面図であり、（１０および１１、それぞれは）集束と分離段部との間の高さの違いを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａおよび２Ｂに示される分離エレメント１の立体図である。
【図３Ａ】図３は図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃから成り、長方形の平板形の集束段部１０および平板形を有する分離段部１１を有するが、不規則な面および前縁部を有する分離エレメント１を図示する。図３Ａは分離エレメント１の正面図であり、集束段部１０の正面の長方形の形がその幅広面４０に隣接して見られることができ、分離段部１１の面の不規則な形がその幅広面４１に隣接して見られることができる。
【図３Ｂ】図３Ｂは図３Ａに示される分離エレメント１の側面図であり、（それぞれ１０および１１の）集束と分離段部との間の高さの違いを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ａおよび３Ｂに示される分離エレメント１の立体図である。
【図４Ａ】図４は図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃから成り、長方形の集束段部１０およびその上、および（ＢＦＦと比較して）その前縁部から下流に３つの段を有する分離エレメント１を図示する。第１の分離段部１１、第２の分離段部１２、および第３の分離段部１３の各々は、Ｖ字形の前縁部を有する（それぞれ前縁部３１、３２、および３３）。バルク流体の流れＢＦＦの方向が示される。図４Ａは、分離エレメント１の正面図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは図４Ａに示される分離エレメント１の側面図であり、段の間で高さの違いを示す。段１１〜１３下流の分離エレメント１のくぼんだ部分は、分離エレメント１から外へ排出可能な段１０〜１３の全てを横断した材料を経由して排出口通路の一部を形成する。図４Ｃは、本明細書において記載される装置のカバー４と本体２との間の間隙により定義される流体チャネルに配置されている分離エレメント１の断面図である。
【図４Ｃ】図４Ｃにおいて、流体チャネルの一連の下流の部分の高さ（それぞれｈ３、ｈ２、およびｈ１）、流体チャネルの上流の部分の高さ（ｈ０）、および流体チャネル自体の高さ（ｈｃ）が示される。第３の下流の部分の高さ（ｈ３）は、第３の分離段部１３とカバー４との間の距離により定義される。第２の下流の部分の高さ（ｈ２）は、第２の分離段部１２とカバー４との間の距離により定義される。第１の下流の部分の高さ（ｈ１）は、第１の分離段部１１とカバー４との間の距離により定義される。上流の部分の高さ（ｈ０）は、集束段部１０とカバー４との間の距離により定義される。
【図５Ａ】図５は図５Ａおよび５Ｂから成り、分離エレメント１に完全に全域にわたり延びる湾曲した移行面２０を有する集束段部１０およびその上、および（ＢＦＦと比較して）集束段部１０から下流に３つの分離段部を有する分離エレメント１を図示する。第１の分離段部１１、第２の分離段部１２、および第３の分離段部１３の各々は、湾曲した前縁部を有し、（その幅と同じである集束段部１０の前縁部３０の長さとは異って）分離段部１１〜１３の各々の前縁部の横幅がその幅より大きいことを意味する。バルク流体の流れＢＦＦの方向が示される。図５Ａは、分離エレメント１の正面図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは図５Ａに示される分離エレメント１の側面図であり、段の間で高さの違いを示す。段１１〜１３下流の分離エレメント１のくぼんだ部分は、分離エレメント１から外へ排出可能な段１０〜１３の全てを横断した材料を経由して排出口通路の一部を形成する。
【図６Ａ】図６は図６Ａおよび６Ｂから成り、長方形の集束段部１０およびその上、および（ＢＦＦと比較して）その前縁部から下流に３つの分離段部を有する分離エレメント１を図示する。第１の分離段部１１、第２の分離段部１２、および第３の分離段部１３の各々は、蛇行する前縁部を有する。バルク流体の流れＢＦＦの方向が示される。図６Ａは、分離エレメント１の正面図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは図６Ａに示される分離エレメント１の側面図であり、段の間で高さの違いを示す。
【図７Ａ】図７は（互いと比較し、ほぼ一定の比率で描かれる）図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄから成り、太線で示される流体チャネルにおいて（Ｂがチャネルの幅の５倍に等しい）等しい横幅を有する４つの段の構成を図示する。バルク流体の流れ（ＢＦＦ）の方向が示され、段の高さは段の上流から下流側まで増加し、それは図において流体チャネルを横断して伸びる線で示される。図７Ａのにおいて、段の高さは、比較的上流の位置の流体チャネルの半分を横断し、比較的下流の位置の流体チャネルの残り半分を横断し上昇し、それらの２つの位置の間の段面の延長をともなう。延長した段面の長さ（Ｌ）は図７Ａの流体チャネルの幅（Ｗ）の４倍に等しく、５Ｗと等しい段の合計Ｂを生じる。
【図７Ｂ】図７Ｂにおいて、段は、上流の位置と下流の位置との間で延びる２つの部分を有する。ＢＦＦの方向における段面拡張の長さはわずか２Ｗであるが、そのような２つの拡張がある。その結果、図７Ｂにおける面の総横幅は、２ｘ２Ｗ＋Ｗ、または５Ｗである。
【図７Ｃ】同様に、図７Ｃにおいて示される段は、上流と下流の位置との間（すなわち、長さＷの４段面拡張）で延びる４ｘＷ＋Ｗ、または５ＷのＢで示される３つの部分を有する。
【図７Ｄ】図７Ｄにおいて示される段は、上流と下流の位置との間（すなわち、長さＷ／２の８段面拡張）で延びる８ｘＷ／２＋Ｗ、または５ＷのＢで示される５つの部分を有する。注目すべきは、等しいＢを有する段のＬは、段の陥入の増加に伴い減少することである。これは、段の粒子分離機能性の小型化が段の面の複雑さ（Ｂ／Ｌ）を増やすことにより達成されることが可能であることを図示する。
【図８】図８は、本明細書において記載されるように、一般的な顕微鏡スライドとほぼ等しいサイズを有するよう構築された粒子分離装置の実施形態である。注入口および排出口領域５２および５８が示され、チャネルの分離部分５５は注入口および排出口領域５２および５８の間で広がる。
【図９】図９は、本明細書において記載される分離装置を用いて捕捉されたＰＣ３前立腺がん細胞の膨張画像である。画像において、ほとんどまたは全く細胞は集束段部１０に存在しないが、第１の分離段部１１および第２の分離段部１２の上、またはそれらから（図においてバルク流体の流れは左から右である）上流に認めることが可能である。
【図１０Ａ】図１０は、図１０Ａおよび１０Ｂから成る。これらの各々は、本明細書において記載される分離装置を用いて捕捉されたＰＣ３前立腺がん細胞の膨張画像である。各々の画像において、ほとんどまたは全く細胞は集束段部１０に存在しないが、第１の分離段部１１、第２の分離段部１２、および第３の分離段部１３の上、またはそれらから（図においてバルク流体の流れは左から右である）上流に認めることが可能である。
【図１０Ｂ】図１０は、図１０Ａおよび１０Ｂから成る。これらの各々は、本明細書において記載される分離装置を用いて捕捉されたＰＣ３前立腺がん細胞の膨張画像である。各々の画像において、ほとんどまたは全く細胞は集束段部１０に存在しないが、第１の分離段部１１、第２の分離段部１２、および第３の分離段部１３の上、またはそれらから（図においてバルク流体の流れは左から右である）上流に認めることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は通路を通過する能力に基づき粒子を分離する装置に関するものである。装置における分離エレメント１により画成された段状通路５５を通過させることにより粒子（例えば液体またはガス状の流体において浮遊する粒子、または真空中の粒子）を移動させる。段状通路５５は本体２とカバー４とにより形成される間隙５０の部分を接続し、分離エレメント１は間隙５０内、間隙５０の注入口領域および排出口領域（それぞれ５２および５８）に存在する。分離エレメント１は別々の要素であってもよく、または、本体２およびカバー４のうちの１つに取着、または一体化されていてもよい。
【００１５】
段状通路５５は、間隙５０の注入口領域５２と排出口領域５８とを流体連通させ、また少なくとも１つの分離通路１０１を含み、当該分離通路１０１は、（第１の）分離段部１１の面４１と本体２またはカバー４の面などの（第１の）分離通路１０１の別の部分との間の距離により画定される狭い寸法を有する。流体中の粒子の一部のみが、分離通路１０１へ移動することが可能である。結果的に、粒子の一部は段状通路５５の全長を通過することが可能であるが、他の粒子は分離通路１０１の上流などの装置内に保持されることとなる。粒子の分離はこのように達成される。粒子の動きは、例えば、流体の流れ、重力、振動、またはこれらの任意の組合せにより促すことが可能である。
【００１６】
例えば、（図１に図示する）米国特許第７９９３９０８号明細書で開示される類似装置とは対照的に、本明細書において記載される装置の分離段部の少なくとも１つの前縁部３１および移行面４１は分離段部の幅より実質的に大きな（例えば、少なくとも１．５、２、１０、２５、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍で）横幅（ｂｒｅａｄｔｈ）を有する（すなわち、分離段部１１が配置される段状通路５５の幅より大きい）。分離段部１１を通過し流れているバルク流体における粒子の分離は段の前縁部および面２１においてほとんどの場合生じる傾向にあるため、分離段部１１および通路の幅と比較して当該前縁部および面の横幅を増加させることでいくつかの有利な効果を奏することが可能である。
【００１７】
分離段部１１を通過して流動するバルク流体中の粒子は、少なくとも１寸法において、当該分離段部１１の上方の分離通路１０１の高さ（すなわち、分離通路の狭い寸法）より小さい寸法であるサイズを必然的に有する（さもなければ、粒子はバルク流体とともに当該通路を通過することができない）。同様に、分離段部１１の上方の分離通路１０１の高さより大きい寸法を有する粒子は、分離段部１１の前縁部３１または移行面２１、またはその近位でバルク流体とともに流動を停止し、そこで蓄積する傾向がある。分離段部１１が内部に配置されている通路の全幅を越えて移行面２１および前縁部３１の横幅を増加させることにより、複数の粒子を前縁部３１に、または、（例えば、面が傾斜を有する場合）移行面２１に沿った別の場所に集合させることを可能にする。このように、前縁部が分離通路１０１の全幅より大きい横幅を有する装置は、分離段部１１の前縁部３１で、またはその近位で、１若しくはそれ以上のサイズに基づいて分離された粒子を捕捉するのに用いられることが可能である。分離段部１１の前縁部３１の横幅を増加させることで、装置を目詰りさせることなくサイズに基づいて分離されたより多くの数の粒子をその移行面２１で捕捉することが可能となる。分離段部の横幅の比率が分離段部における前縁部の両端を結んだ通路の幅より実質的に大きい（例えば、少なくとも１．５倍、およびより望ましくは２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍より大きい）ことが望ましい。
【００１８】
分離通路１０１の幅より大きい横幅を有する前縁部２１に対応するためには、前縁部２１および分離段部１１の移行面３１は、分離通路１０１の最も狭い幅を直線状に横断してはならない。前縁部は、（例えば、その最も狭い幅以外の方向で通路１０１を斜めに横断して延びる）一直線であってもよく、またはそのような複数の直線部分から構成されてもよい（図４および７を参照）。前縁部２１はまた形状を湾曲（図５を参照）、陥入（図２、３、および６を参照）、蛇行（図３を参照）させることが可能であり、これにより分離通路１０１の幅と比較してその横幅（および対応する分離段部１１および移行面２１）が増加する。このような前縁部の形状により、分離段部１１が分離通路１０１の幅に亘って直線状に延長する先行技術の装置と比較して、装置の捕捉能を増加させることが可能である。
【００１９】
１実施形態において、段の前縁部は非常に湾曲し（例えば、図６中の分離段部１１〜１３において示される陥入のような多くの陥入を有する）、そのため、その横幅は段が含まれる通路の全幅より有意に大きい。例として、図４、５、および６は、通路内に収容可能な、実質的に長方形の横断面を有する４段の分離エレメント１を図示する。図４、５、および６において、分離エレメント１は分離通路１０１の幅（すなわち、バルク流体の流れ（ＢＦＦ）に対して垂直方向の幅）と等しい全幅を有する。これらの図の各々の分離エレメント１は、（先行技術装置における段のように）分離通路１０１を直線状に横断して延び、それ故通路の全幅と等しい横幅を有する集束段部１０を含む。
【００２０】
図４において、分離段部１１〜１３の各々の前縁部は分離通路１０１の全幅より大きい横幅を有する。各々の段のＶ字形の前縁部の頂点が直角である場合、（ピタゴラスの方程式の応用により）各々の段の前縁部の長さは平方根の２倍（２で割った通路の幅の二乗）に等しい（すなわち、分離通路１０１の幅が１つの単位であるならば、各々の段の横幅は約１．４の単位である）。
【００２１】
図５において、各々の分離段部１１〜１３の前縁部の横幅は、各々の段の前縁部の湾曲のために、分離通路１０１の全幅より大きい。
【００２２】
図６において、各々の段の湾曲および陥入のために、分離段部１１〜１３の各々の前縁部の横幅は、さらにより長い。
【００２３】
図４〜６に示される配置は、例示を目的とするものである。段前縁部は、無数の幾何学的形状を有することが可能である。それらの図に示される形は、単に前縁部の複雑さ（特に「褶曲」または陥入）を増加させることにより、任意の段の前縁部の横幅が段の存在する通路の全幅を大きく超える原因となることがありえるという概念を図示する。図４〜６に示される分離エレメントの別の実施形態において、分離エレメントには集束段部１０が存在せず、分離段部１１〜１３は、分離エレメント１が配置される実質的に長方形の分離通路１０１〜１０３の３つの隣接した壁に一体化している。
【００２４】
分離段部を通過することができない粒子は、分離段部の前縁部に沿って、バルク流体の流れの方向に促される。つまり、例えば、集束段部を通過することができるが、図６に示される装置の分離段部を通過することができない粒子は、バルク流体の流れにより分離段部の中央の陥入の方向へ、およびそれらの段の周辺端部の方向へ促される傾向がある。図示しないが、図４および５に図示される分離段部の前縁部の形は（すなわち、Ｖ字形で湾曲した段の頂点が段の端から下流に位置するように）それらの図に示されるＢＦＦの方向と比較して逆にすることが可能である。段は、それらの前縁部に沿って選択された場所で粒子の蓄積を容易にするまたは促進するため、このように形成されることが可能である。
【００２５】
前縁部３１において、または分離段部１１の移行面２１に沿って捕捉された粒子（すなわち、バルク流体中の、いくつかだが、すべてではない粒子が段を通過し流体の流れとともに移動することができる段）が段を通過し、そこまたはそれらが捕らえられた場所で（すなわち、バルク流体をともなうそれらの移動が停止または実質的に阻止された位置で）流体の流れを塞ぐ傾向がある。捕捉された粒子が段状通路のかなりの部分（例えば、>０．０１％、>０．１％、>１％、>１０％、>５０％、>９０％、または>９９％）を通過して流体の流れを塞ぐ場合、これは分離通路１０１の処理能力（すなわち、選択した液体の段全域にわたる圧力低下で単位時間内に幅が狭い通路に通過させることが可能な流体の量）を低下させ、有意な能力減退となりうる。
【００２６】
少なくとも１つの分離段部１１の前縁部３１の横幅を増加させることにより、（すなわち、分離通路１０１が含まれるスペースの全幅と比較して）、捕捉された粒子は分離通路１０１の流量範囲のより少ないパーセンテージを個々に占め、流れ閉塞を減少させ、ほぼ持続的な処理能力を維持する装置の能力を増大させる。処理能力がほぼ一定に維持される限り、装置全域にわたる圧力低下はほぼ一定で維持されなければならないため、持続的な処理能力は複雑または高額な流体の流れ制御装置の必要性を減少させることが可能である。したがって、非常に幅広い段前縁部３１は、かなりの数の捕捉される粒子を有するサンプルのために処理能力の減少を経験する装置の傾向を有意に減少させることが可能である。そのような装置はまた、有意な処理能力の低下を示すことなく、より多くの数のサイズ分離した粒子を捕えることが可能である。
【００２７】
米国仮特許出願第６０／３０６２９６号、第６１／１２５１６８号、第６１／２３６２０５号、および第６１／２６４９１８号において、および、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２２６８９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００２４２１号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６３５０号、および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８１７２号において開示される対象と、本明細書において記載される対象は相補的であり、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
定義
本明細書において用いられるように、次の各々の条件は本章においてそれに関連した意味を有するものである。
【００２９】
本明細書において記載されるように分離エレメント１が配置される通路の中を流れる流体のため、通路の「高さ」は、分離エレメント１が間に挿入される通路の表面間の最小距離である。例えば、図１Ｄおよび４Ｃの各々において、分離エレメント１は、本体２とカバー４との間に挿入される。本体２とカバー４の平行面の間の最小距離は通路の高さ（ｈｃ）を定義する。また、分離エレメント１の集束段部１０の上方の通路の高さ（ｈ０）と、分離段部１１、１２、および１３の上方の分離通路１０１、１０２、および１０３の高さ（ｈ１、ｈ２、およびｈ３）は、それぞれこれらの図において見ることができる。「高さ」寸法が本明細書において記載される装置の操作の間、重力に対し垂直方向であることは重要ではない。
【００３０】
「集束」段部は、分離段部の注入口側のチャネルに配置されている（好ましくは、チャンネルの大部分、またはチャネルを完全に横切って延びる）段に過ぎない。集束段部は原則的に流体の流れがチャネル通過し、分離段部により画成される幅が狭い通路部分の方向に流動するように向かわせて、ほとんどまたは全く局所的な流体の流れが起こらない「死容積」の潜在的領域を減少させる。チャネルは、傾斜した集束段部を備えるなど、集束段部の注入口側においてより大きな高さを有する必要がある、または集束段部は複数の段を含む、より階段様の形態を有することが可能である。本明細書において記載される装置は集束段部を含む必要はないが、分離段部の包含は死容積の最小化（および分離段部を越えて通過させることを目的とする粒子の死容積内における保持）が望ましい実施形態において重要である。
【００３１】
本明細書において記載される分離エレメント１が配置される通路の「幅（ｗｉｄｔｈ）」は、通路を通過するバルク流体の流れの方向に対して垂直な方向（すなわち、段の形状により誘導される局所的な流れの方向転換を無視した、バルク流体の流れの全体的な一般的方向）、および通路の対向する面との間の通路の高さに対して垂直な方向における最小距離である。例えば、通路の幅は、多種多様な形状の段を含む４つの通路の各々に関して、図７において「Ｗ」として示される。さらに例として、図１Ｄおよび４Ｃにおいて示される段状通路５５の幅寸法は、図から垂直に延びる。段の「幅」は、段が配置される通路の幅と同じ方向にあると考えられる。このように、通路の全幅にわたり完全に延びる段の幅は、（たとえ段の前縁部の横幅が、例えば、前縁部の湾曲または陥入により段の幅より有意に大きい場合でも）通路の幅と等しい。
【００３２】
分離段部１１の前縁部３１の「横幅（ｂｒｅａｄｔｈ）」は前縁部３１の長さであり、段の湾曲に沿って測定される。前縁部３１が非可撓性コードとして想定される場合、前縁部の横幅は、コードがピンと張られたときのコードの長さである。このように、湾曲または陥入した段の前縁部の横幅は、段の幅より有意に大きいことがありうる。これは図７Ａ〜７Ｄに図示され、当該図においては、長さ５Ｗを有する４つの前縁部３１が多種多様な形態で構成され、各々の前縁部はそれらが配置されている段状通路５５の幅（Ｗ）を大幅に超える。
【００３３】
段の「幅広面」は、段が存在する場所に対し基準面より地形的により高い高度に存在する段の部分である。本明細書において記載した段の幅広面は、平面であるがそうである必要はない。
【００３４】
段の「移行面」は、その幅広面および基準面に架橋する段の部分である。移行面は、望ましくは滑らかまたは平面な曲線を有し、基準面および幅広面４１に対して垂直な面である可能性があり、図１において移行面２１として示される。移行面はまた傾斜した平面（図６における移行面２０を参照）または湾曲させることが可能である（図５における移行面２０を参照）。
【００３５】
例えば図１で示すように、段の「前縁部」３１は、その幅広面４１がその移行面２１に交わる段の部分である。
【００３６】
通路の「流量範囲」は、通路における流体の流れの方向に対し垂直な平面でとった通路の断面である。
【００３７】
詳細な説明
本開示は、分離エレメント１の分離段部１１と分離エレメントが配置される間隙５０の表面との間での分離により画成される最小限の寸法（高さ）を有する分離通路１０１の中を通し流れるそれらの能力に基づき粒子を分離する装置に関するものである。装置には、本体２およびカバー４により作られる間隙５０に配置されている分離エレメント１が含まれる。間隙５０の中において、分離エレメント１は、間隙の注入口領域５２を間隙の排出口領域５８から分離させる。注入口および排出口領域は分離エレメント１および本体２およびカバー４の一方または両方により画成される段状通路５５を経由して流体連結にある。分離エレメント１を形成する分離段部１１の１若しくはそれ以上は、１若しくはそれ以上の分離通路１０１を画成する。注入口と排出口領域との間で流れる流体は段状通路５５を通過し、少なくとも第１の分離通路１０１までの通過を含む。
【００３８】
動作において、間隙５０の注入口領域５２の粒子は、段状通路５５に移動し、それらが可能である場合、分離通路１０１に移動する。分離通路１０１の粒子は、間隙５０の排出口領域５８に移動することが可能である。分離通路１０１に向かい、またはそれに沿って移動できない細胞は、排出口領域５８に到達しない。このように、排出口領域５８に到達することができる粒子は、排出口領域５８に到達することができない粒子から分離される。２つの粒子の集団を装置から別々に回収することが可能である。例えば、排出口領域５８から抜き取られる液体の流れで、排出口領域５８の粒子は、（例えば、排出口を経由して、または排出口領域５８を経由して挿入されるカテーテルにより）回収されることが可能である。排出口領域５８へ向かい分離通路１０１を通過することができない粒子は、それらを逆方向で、段状通路５５を通り注入口領域５２方向にフラッシングすることにより回収することが可能である。そのような粒子は注入口領域５２から抜き取ることが可能である。あるいは、排出口領域５８へ向かい分離通路１０１を通過することができない粒子は、装置中に残される、または装置を分解することにより回収することが可能である。
【００３９】
本明細書において説明する装置は多種多様な応用において使用することが可能である。粒子を粒子の混合集団から分離することに加え、例えば、本装置は分離した粒子集団の１若しくはそれ以上を同定、または操作する応用において用いることが可能である。これまでに粒子分離のために使われてきた装置と比較して、装置の構造と操作は分離する粒子による目詰まりに抵抗性を持つ。
【００４０】
例として、装置は、ヒトまたは他の脊椎動物の対象の血液に存在する血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離するような、細胞の混合懸濁液から腫瘍細胞を単離するために用いることが可能である。装置はまた、妊娠している（または以前妊娠していた）女性の血液から胎児の細胞を単離するのに用いることが可能である。装置はさらに、実質的に、それらのサイズ、それらの圧縮性、またはこれらの組合せに基づき、懸濁液中の他のものと区別されることが可能な任意の細胞を細胞の混合懸濁液から単離するのに用いられることが可能である。
【００４１】
以下に装置の部材と部分を個別に詳細に説明する。
【００４２】
本体およびカバー
装置はそれらの間で間隙５０を形成する本体２およびカバー４を有する。一部が分離エレメント１により形成される間隙５０の一部は、段状通路５５である。段状通路５５はまた本体２の表面、カバー４の表面、またはこれらの組合せにより形成され、それは分離エレメント１の１若しくはそれ以上の段状表面（例えば、３１および３２）に対向する。装置の構造を単純化するために、カバー４または本体２の凹部に一体形成された分離エレメント１に段状通路を画成する表面のほとんどまたは全てを形成、または機械加工することが可能である。また、当該凹部は平面により囲まれているため、本体２またはカバー４に対向する表面は、本体２とカバー４の平面との間に接触させて間隙５０を形成し、その内部で分離エレメント１を包囲するためにもう一方の平面となればよい。
【００４３】
挿入された分離エレメント１を有する本体２およびカバー４の一般的な構成はこの参照により本明細書に組み込まれる文献において説明され、実質的に本明細書において記載される任意の配置が本明細書において記載される装置に用いられることが可能である。それらの文書において開示されない分離エレメント１の要素は、本明細書において記載される。
【００４４】
本体２、カバー４、またはその両方により、流体がそれを通し間隙５０に導入されるまたは間隙５０から抜き取られる注入口を画成することが可能である。例えば、本体２は、注入口領域５２に流体連通している注入口を画成する。注入口に導入する流体は注入口領域５２から流入され、（間隙が密封されるため）すでにそこにある段状通路に入り、そして、それから第１の通路５１および第２の通路５２に入り、そして排出口領域５８に入り流体を置換する。粒子が中間に存在する通路または領域を通り流れることが可能である場合、流体中で浮遊する粒子はこれらの領域および通路の１つにおいて下流領域または通路に運び込まれることが可能である。同様に、本体２で形成された排出口を経由して排出口領域５８からの流体の抜き取りが、排出口領域５８と流体連結した通路から、およびそれと流体連結した通路および領域から流体の流れを誘導することを可能にする。
【００４５】
開口部位はカバーまたは本体を通して延びる単純な穴であり、また開口部位に流体の流れ装置の接続を容易にするために、それらはそれらに関連した材料固定具（バリ、リング、ハブ、または他の接続金具）を有することが可能である。本体２、カバー４、またはその両方は間隙５０の注入口領域５２において注入口を画成し、間隙５０の排出口領域５８における排出口を画成し、または注入口と排出口の両方を画成する。流体は、注入口を通して注入口領域５２に導入される。流体は、排出口を通して排出口領域５８から抜き取られる。注入口領域５２への流体の連続導入、および排出口領域５８からの流体の連続した抜き取りまたは排出は、装置を通し流体に連続流を生じさせる可能性がある。同様に、排出口領域５８からの流体の連続した抜き取り、および同時に起こる注入口領域５２への流体の流入または導入は、連続流を生じさせる可能性がある。
【００４６】
間隙
それらが組み立てられる場合、本体２およびカバー４が間隙５０を形成する。間隙５０は、注入口領域５２、排出口領域５８、および注入口領域５２と排出口領域５８との間に挿入された分離領域を有する。分離エレメント１は分離領域中に配置され、本体２、カバー４、または両方ともと共に、段状通路５５を画成する。段状通路５５は、分離エレメント１において少なくとも第１の分離段部１１により画成される第１の分離通路１０１を少なくとも含む。段状通路５５は多数の追加的な分離段部を含むことが可能であり、それぞれは間隙においてさらなる分離通路を画成することが可能である。好ましくは、注入口および排出口領域５２および５８を接続する唯一の流体管路は段状通路５５であるが、その段状通路を複数の段状通路に分離すること、直列に配置すること、平行に配置すること、またはこれらのいくつかの組合せであることが可能である。同様に、本明細書において記載される複数の装置は、（例えば、選択したサイズ範囲で選択的に粒子を捕捉するために）直列に、または（例えば、細胞捕捉能力を向上させるために）平行に操作されることが可能である。
【００４７】
装置の操作において、少なくとも、間隙５０の注入口領域５２、排出口領域５８、および段状通路は、流体で満たされる。好ましくは、操作の間、全ての間隙５０が流体で満たされる。１実施形態において、注入口領域５２および排出口領域５８をつなぐ唯一の流体管路は段状通路である。注入口領域５２に存在する粒子は、段状通路５５に入ることが可能である。間隙（すなわち、本体、カバー、および分離エレメントの１若しくはそれ以上により形成されるように）は、注入口領域から段状通路の方へ（または反対の）バルク流体の流れの方向に次第に先細になるように作られることが可能である。そのような間隙の形には段状通路の方へ粒子の流れを集中させること、望ましい範囲の中で形成された領域を通し（例えば、実質的に持続的な）流体直線流速を維持すること、それを通し通過している粒子の観察を容易にすること、または他の有益な結果を有することが可能である。
【００４８】
それらが第１の分離通路１０１の高さ（すなわち、狭い寸法）により排除されない限り、または第１の分離通路１０１を通してのそれらの挙動がその通路をふさぐ粒子により阻止されない限り、段状通路５５に存在する粒子は入ることができ、第１の分離通路１０１通過することが可能である（例えば、細胞は第１の分離通路１０１の前縁部３１で、またはその上流で固定される。）。第１の分離通路１０１を通過する粒子は、排出口領域５８に入ることができ、それから回収されることが可能である。装置を通した流体の流れ、細胞の固有の運動性、またはその２つの組合せにより、装置内の粒子の移動を誘導させることが可能である。時間経過とともに、第１の通路５１に入ることができない粒子は、注入口領域５２において分離される、第１の分離通路１０１を横断することができる粒子は、段状通路５５において、または、それの上流において分離される、第１の分離通路１０１に入ることができるが、それを通過し自由に移動できない粒子は、第１の分離通路１０１において分離される、そして、第１の分離通路１０１を通り移動することができる粒子は、排出口領域５８において（または排出口領域５８から抜き取られる、または放出される流体において）分離される。
【００４９】
このように分離される粒子は、（本明細書において記載されるいくつかを含む、任意の多種多様な既知の方法を用い）それらのそれぞれの場所から回収されることが可能である。例として、カテーテルを装置の領域または通路（例えば、注入口領域５２または第１の分離通路１０１）に挿入することが可能であり、カテーテルの内腔で吸引を誘導することにより、その中に存在している粒子を抜き取ることが可能である。さらに例として、注入口領域５２または第１の分離通路１０１の１若しくはそれ以上に存在する粒子を集めるために、バックフラッシュ（すなわち、注入口領域５２の方向における排出口領域５８からの流体の流れ）が用いられることが可能である。
【００５０】
分離エレメント
本明細書において記載される装置の分離エレメント１は、これまでに米国特許第７９９３９０８号明細書において、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０６６４９７において、または他のどこかにおいて記載されるそれらと実質的に同一でありえるが、さらなる特徴を含む。本明細書において記載される装置の分離エレメント１は、分離段部が存在する通路の全幅よりもかなり大きい（例えば、１．５ｘ、２ｘ、３ｘ、４ｘ、５ｘ、２０ｘ、１０ｘ、１００ｘ、５０ｘ、１，０００ｘ、５００ｘ、１０，０００ｘ、または１００，０００ｘより大きい）横幅で前縁部３１を有する少なくとも１つの分離段部１１を含む。言い換えれば、分離エレメント１の少なくとも１つの段の前縁部の形は、その前縁部の横幅が段の全幅よりかなり大きいようなものである。さらに言い換えれば、その輪郭に沿って形成される段の前縁部の横幅は、（すなわち、段の端がその最短の線をたどるかどうかに関わらず）段の端の２つの終点の間で最も短い直線距離より大きい。例として、前縁部は湾曲すること（図５を参照）、陥入すること（図６を参照）、角度を持つこと（図４を参照）、蛇行すること（図３を参照）、不規則であること（図５を参照）が可能である。通路幅に対する段横幅の比の上限は、段を作成するのに用いられる製造方法の許容範囲および段を通過する粒子のサイズによってのみに実質的に制限される。
【００５１】
装置の操作において、段状通路５５は、注入口領域５２から排出口領域５８まで、粒子が移動する、流体が流れる、またはその両方の開口部である。分離エレメント１は段状構造を有し、それは段状通路５５の少なくとも１つの側面の段階状の形状を画成する。分離エレメント１は、少なくとも１つの分離段部を有し、それは複数の分離段部（例えば、図６〜８における１１〜１３）を有する可能性がある。装置が組み立てられる場合、注入口領域５２から排出口領域５８まで段状通路５５を横断するために、流体は一部において対応する分離段部１１により画成される分離通路１０１の中を流れる必要がある。
【００５２】
本明細書において記載される装置の操作において、異なるサイズを有する粒子の混合物は、段状通路５５の中を流れさせることが可能であり、少なくとも１つの分離通路１０１を含む。分離通路１０１の狭い寸法（すなわち、高さ）を上回る特徴的サイズを粒子の通過は分離通路を境界する分離段部１１の前縁部３１で、またはその近位で妨げられ、そのような粒子は分離通路１０１を通過することよりもむしろ前縁部３１で、またはその近位で蓄積する傾向がある。分離通路１０１が分離段部１１の全ての横幅全域にわたり阻害粒子により完全に塞がれない限り、阻害細胞の前後またはそれを通過した流体および粒子の流れを継続することが可能である。本明細書において記載される対象の進展は、少なくとも１つには、先行技術装置より阻害粒子により汚染および目詰りの影響を受けにくい装置を設計する試みの結果として生じた。好ましくは、粒子の予想される混合物のために分離段部１１前縁部３１の横幅が選択され、望ましいまたは予測できる粒子の数が部分でとどまる場合、粒子の通過が妨げられる分離通路１０１の部分は、そのような部分を通して流体流動はほぼ妨げられない（すなわち、多くて５０％、２０％、１０％、５％、１％、０．３３％、または０．１％またはそれ以下の）十分な流量範囲を有する。
【００５３】
段状通路５５の中で第１の分離通路１０１の方へ流体の流れを偏向させる役割を果たし、第１の分離段部１１の上流で「死角」を満たすため、分離エレメントにおける分離段部を支えるための構造的に強固な基礎を提供するため、またはこれらのいくつかの組合せのため、分離エレメント１は（図１〜６に図示されるように）集束段部１０を含むことが可能である。分離は集束段部を含む必要はない。
【００５４】
分離エレメント１の段は多種多様な任意の形を有することが可能である。（例えば、図１において示される装置の）１実施形態において、集束段部１０および第１の分離段部１１は、共通の「階段型」段構造、すなわち、直角で交差する２つの平面の表面を有する。つまり、第１の分離段部１１の移行面２１およびその幅広面４１のように、集束段部１０の移行面２０および集束段部１０の幅広面４０は直角に交わる。あるいは、例えば、段の移行面および幅広面は、９０〜１８０度で斜めに交わることが可能である。段の移行面および幅広面はまた０〜９０度で斜めに交わることが可能であり、突出部をつくる。本明細書において記載される装置の場合、少なくとも一つの分離段部１１は湾曲または望ましくは陥入した前縁部３１および移行面２１を有し、そのため、段の横幅は段の幅より有意に大きい。
【００５５】
９０〜１８０度で斜めに交わる移行面および幅広面を有する段は、多種多様なサイズを有する粒子の通過を塞ぐことが可能である（すなわち、それらは段の幅広面により画成される通路の狭い寸法と段から上流のスペースの狭い寸法との間の中間のサイズを有する。）。段の移行面の異なる位置においてわずかに異なるサイズを有する粒子の通路を停止することにより、９０〜１８０度の角度で交わる、移行面および幅広面を有する段は、９０度以下の角度で交わる移行面および幅広面を有する段よりも大きな角度において段の幅広面により画成される通路の目詰まりを妨ぐ場合がある。
【００５６】
当技術分野で認められたように、段の幅広平面により画成される通路を塞ぐ粒子による段を通過した流体の流れの目詰まりはまた、段の幅を増やすことにより減少、または避けることが可能である。粒子により覆い隠される流量範囲のみの流体の流れを各々の粒子が塞ぐため、より広い段ではより多くの数の塞いでいる粒子により必然的に目詰まりが生じる。しかしながら、特に大幅な拡張が多数の粒子に対応するために要求される場合、または小型化が望まれる場合、段の幅を増加することは必ずしも実際的ではない。
【００５７】
本明細書において開示される対象の重要な観点は、阻害粒子に対応する分離段部１１の能力が段の幅の増加を伴わず、有意に増加させることが可能であるということの本発明者による認知である。分離段部１１の幅の増加よりむしろ（または、これに加えて）、その粒子保持能力を、例えば段の直線性を減少させることにより、（粒子の障害物を生じる）段の前縁部３１の横幅の増加させることにより、増大させることが可能である。
【００５８】
例として、長方形の横断面を有する流体チャネルでは、横断し直接（すなわち、側面に対し直角で）延びるチャンネルの段は、単にチャンネルの幅と等しい横幅の前縁部を有する（図１を参照）。段の形状が半円である場合、半円の中心が半円の最上流の端から下流にあるように延びる半円の弧で、段の前縁部の横幅は半円の周長と同等であり、それはパイをチャンネルの幅と乗じ、２で割った数字（すなわち、チャンネルの幅のおよそ１．５７倍）である。同様に、円または楕円の弧のような、Ｖ字形のような（すなわち、Ｖの文字のような）、ジグザグのような、蛇行曲線のような、または不規則な線のような形状をした前縁部（図２〜６を参照）を有する段は、長方形の横断面を有する流体チャンネルに垂直に交差して延びる段の境界の横幅よりもより長い横幅の値を有する。そのような形状を持つ前縁部を有する段を本明細書において記載される装置において使用することが可能である。
【００５９】
１実施形態において、前縁部３１の横幅が段の全幅および／または段により画成される分離通路１０１の幅より大幅に大きい（例えば、１．５、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、または１０００倍より大きい）ように、分離段部１１の前縁部３１は形成される。例えば、それぞれ波形形状の不規則な端を有する段を表す図２および３に図示されるように、その前縁部が波形形状または非常に不規則な端形を有するような段を形成することにより、これは達成されることが可能である。図２において、分離段部１１は、その移行面２１において指形の突起物を有する平面な平板である。指形の突起物の周長により形成される段の前縁部３１の横幅は、図２Ａにおいて明らかに認めることが可能であるように、段の幅より実質的に大きい。同様に、図３に図示される分離段部１１の前縁部の波形形状および不規則性は、図３Ａにおいて明らかに認めることが可能であるように、前縁部の横幅を段の全幅より大幅に大きくさせる。
【００６０】
複数の段は、同様または異なった形状をした前縁部を有することが可能である。例えば、図４〜６は分離エレメント１を図示し、そこで集束段部１０は任意の粒子の通過を必ずしも妨げるというわけではではなく各々の分離段部１１〜１３とは異なり形成される。これらの図において分離段部１１〜１３は同一または相似形を有するが、それらはそうである必要はない。分離段部１１の前縁部３１の形に関わらず、段により境界される分離通路１０１を通し細胞または他の粒子の通過にとり重要なことは、各々の分離段部１１により画成される狭い寸法（高さ、例えば、図１Ｄにおけるｈ１）である。分離段部１１により画定される狭い寸法を通過することができない粒子は、（それが変形することができ、段の中の圧力低下がそのような変形を誘発するのに十分でない限り）段を横断しない。
【００６１】
変形可能な細胞（すなわち、分離段部により画成される通路の中においてフィットするが通過はしないよう変形することが可能な細胞）を捕捉し、分離段部を通過するのに十分に小さいまたは十分に変形可能である細胞からそれらを分離するために、これにより画成される次第に狭くなっている通路を有する一連の分離段部、（すなわち、これにより画成される幅が狭い通路がそれを通してバルク流体の流れの方向に狭くなるように）傾斜した幅広面を有する分離段部、またはこれらの組合せが用いられることが可能である。
【００６２】
各々対応する分離通路１０１の機構および狭い寸法を用い処理を行うことが予期されるサンプルの粒子構成を考慮すると、各々の分離段部１１の横幅は、段で予想した粒子の蓄積に基づいて選択されることが可能である。分離段部１１の横幅は、対応する分離通路１０１の狭い寸法より有意に（例えば、１０、１，０００、または１００，０００倍）大きくなるよう選択されることが可能である。例として、母体血液からの胎児様細胞の分離の場合、対応する通路の狭い寸法の少なくとも約１，０００（千）および望ましくは１０，０００（１万）倍の横幅が望ましいものと考えられる。比較的大きい横幅を有する分離段部１１は分離通路１０１の目詰まりを制限しつつ分離通路１０１の中において粒子の蓄積を可能にする。
【００６３】
装置の１つの分離段部１１（図１〜３および７）に関して、３つの分離段部１１（図４〜６）に関して本明細書において記載したが、実質的に多数（例えば、２、４、１０、または１００段）の分離段部１１が装置に含まれることが可能であり、各々の分離段部１１が各々の段状通路５５の中で対応する分離通路１０１を画成し、特徴的な狭い寸法を有する。
【００６４】
材料および構築の方法
装置の少なくとも１つの分離段部１１の前縁部３１が本明細書において記載されるように構築されることが可能な限り、本明細書において記載される装置を作成するのに用いられる材料および方法は、これまでに米国特許第７９９３９０８号明細書において、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０６６４９７において、または他のどこかにおいて記載されるそれらと実質的に同一でありえる。例えば、波形形状を有する前縁部３１のような、その幅より有意に大きい横幅を有する。つまり、方法は、少なくとも１つの（例えば、段が存在する装置の範囲内の通路の幅より大きい）段の全幅より大きい横幅の前縁部の３１を有する分離段部１１を有する装置を作成することが可能である必要がる。
【００６５】
分離可能な粒子
本明細書において記載される装置は、実質的に、これまでに米国特許第７，９９３，９０８号明細書において、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０６６４９７において記載されるそれらと同一の種類の粒子を分離するのに用いられることが可能である。本明細書において記載される装置の分離通路１０１を通過するそれらの能力に影響を及ぼす粒子の特質には、粒子のサイズ、形状、表面特性、および変形能が含まれる。
【００６６】
重要な実施形態において、装置は、（同じ細胞型の対応する非腫瘍細胞より有意に大きい傾向がある）腫瘍細胞を非腫瘍細胞から分離するのに用いられる。腫瘍細胞が、卵巣、前立腺、および乳がんのような固形がん、単一の腫瘍と考えられる腫瘍の場合でさえ、多くの個々のヒト（ならびに他の脊椎動物）の血流を循環することが知られている。血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出および／または列挙は、腫瘍の存在、性質（例えば、ステージまたはグレード）、悪性度、および治療への反応の重要な指標である可能性がある。さらに、ＣＴＣの単離は、罹患した腫瘍の種類の同定を可能にする。これらの特徴は、腫瘍の転移の診断、治療、および予防のため有意に重要である可能性がある。
【００６７】
１実施形態において、個々の対象（例えば、ヒト）から得られる血液は、ＣＴＣを血液から分離するために本明細書において記載される装置を用いて処理される。分離したＣＴＣは、個々の対象に特有の重要な診断、治療的、および予防的な情報を得るため、任意の既知の方法により回収され、分析されることが可能である。ＣＴＣが腫瘍形成の初期に存在すると考えられているため、ＣＴＣの検出および特性評価は、腫瘍の発生および転移を予防するための早期の有効な介入を可能にすることできる。
【００６８】
実質的に単離した細胞の使用が可能である任意の診断法を、本明細書において記載される装置から得られる細胞を用い行うことが可能である。そのような方法の例は、そのような細胞またはそれらから準備した抽出物と抗体製剤との親和性を評価すること、そのような細胞中に含まれる核酸を評価すること、または選択した培地の存在下で成長する細胞の能力、または他の細胞と相互作用する細胞の能力を評価することを含む。このように本明細書において記載される装置を用いて得られる細胞は、遺伝子発現、遺伝的変化、バイオマーカー表示、または細胞の他の形態的または生化学的特徴（またはそのような特徴に変更）を評価するのに用いられることが可能である。
【００６９】
別の実施形態において、本明細書において記載される装置は、血液循環内皮細胞（ＣＥＣｓ）を患者からとられる血液サンプルのようなそのような細胞を含むサンプルから分離するのに用いられる。（正常ＣＥＣｓと比較して）膨張したサイズを有するＣＥＣｓはまた、装置で適切な狭通路寸法（ｎａｒｒｏｗ  ｐａｓｓａｇｅｗａｙ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を選択することにより、分離することができる。例として、正常ＣＥＣｓから膨張したＣＥＣｓを分離するのに選択された狭通路寸法を有する装置を用いることができる。さらに例として、すべてのＣＥＣ（または膨張したＣＥＣｓのみ）を通常血液中に存在する細胞から分離するため選択された狭通路寸法を有する装置が用いられることが可能である。ＣＥＣｓは、ヒトにおいて外傷の存在または発生を示すことが知られ、膨張したＣＥＣｓの存在は特に急性または切迫心筋梗塞のような特定の疾患の兆候となりうる（例えば、Ｄａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．４：１２６ｒａ３３を参照）。それらの起源の組織を特定するために、本明細書において記載される方法、および／または従来の方法により（例えば、免疫学的細胞表面マーカーの検出により）解析され、これによりそれらの血中循環を誘導させた外傷のタイプや体における位置をさらに示すように、本明細書において記載される装置を用いて単離するＣＥＣｓは回収されることが可能である。例として、心臓起源の膨張したＣＥＣｓの単離は、患者が心筋梗塞の発生の危険を最近経験したか、現在それを経験しているか、または差し迫っているかを示す。
【００７０】
流体置換装置
本明細書において記載される装置は、実質的に米国特許第７９９３９０８号明細書、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０６６４９７、または他のマイクロ流体装置に関連する文献において以前に記載されるそれらと同じタイプの流体置換装置を用い操作されることが可能である。
【００７１】
装置を用いて
本明細書において記載される装置の使用および操作は、この参照により本明細書に組み込まれる文献においてこれまでに記載されるものと実質的に同じである。本明細書において記載される装置は、その分離段部１１における細胞の捕捉に起因する目詰り、流れ／処理能力の低下、および他の好ましくない現象に対するより少ない感受性を示す有意な利点を有する。
【実施例１】
【００７２】
これより以下の実施例に関して本開示の対象を記載する。これらの実施例は説明を行う目的でのみ提供され、対象はこれらの実施例に限定されるものではなく、むしろ、本明細書において提供する教育の結果として明白となるすべてのバリエーションを含む。
【００７３】
１実施形態において、段状通路は２．５センチメートルの全幅を有し、８．０センチメートルの横幅を有する波形形状の前縁部を有する第２の段６２を含む。第２の段６２と対向カバー４との間の第２の通路５２の狭い寸法は、１０マイクロメートルである。
【００７４】
（例えば、その中に含まれる選択された腫瘍細胞数を有するヒト血液１０ミリリットルの）細胞の懸濁、その後に続いて腫瘍細胞を溶解させない洗浄溶液が段状通路に通される場合、実質的に全ての血液球は装置を通過し、ほとんどまたは全ての腫瘍細胞はそれの中で保持される。
【００７５】
表１  部材リスト
１  分離エレメント
２  本体
４  カバー
１０  集束段部
１１（第１）分離段部
１２  第２分離段部
３２  第２分離段部の前縁部
１３  第３分離段部
２０  集束段部の移行面
２１  （第１）分離段部の移行面
２２  第２分離段部の移行面
２３  第３分離段部の移行面
３０  集束段部の前縁部
３１  （第１）分離段部の前縁部
３２  第２分離段部の前縁部
３３  第３分離段部の前縁部
４０  集束段部の幅広面
４１  （第１）分離段部の幅広面
４２  第２分離段部の幅広面
４３  第３分離段部の幅広面
５０  本体およびカバーにより形成される間隙
５２  間隙の注入口領域
５３  チャネルの上流部分
５４  間隙の注入口および排出口領域を接続するチャネル
５５  チャネルの分離部分
５６  チャネルの下流部分
５８  間隙の排出口領域
６０  集束段部により境界される分離部分の一部
６１（第１）分離段部により境界される分離部分の一部
６２  第２分離段部により境界される分離部分の一部
６３  第３分離段部により境界される分離部分の一部
１０１  （第１）分離通路
１０２  第２分離通路
１０３  第３分離通路
【００７６】
表２  略語リスト
ＢＦＦ  バルク流体の流れ
ｈｃ  チャネルの高さ
ｈ０  集束段部により境界される部分におけるチャネルの高さ
ｈ１  （第１）分離段部により境界される部分におけるチャネルの高さ
ｈ２  第２分離段部により境界される部分におけるチャネルの高さ
ｈ３  第３分離段部により境界される部分におけるチャネルの高さ
Ｗ  分離部分におけるチャネルの全幅
Ｌ  分離部分の長さ
Ｂ  分離段部の前縁部の横幅
Ｄ  Ｂ／Ｌ比
Ｗ  分離段部の幅
本明細書において挙げられるあらゆる特許、特許出願および公開の開示は、この参照によりその全体が本明細書において組み込まれる。
【００７７】
特定の実施形態に関して対象が本明細書において開示されるが、この対象の他の実施形態およびバリエーションが対象の真の趣旨および範囲から逸脱しない範囲で他の当業者により考案されうることは明らかである。添付の請求項はすべてのそのような実施形態および等価的バリエーションを含む。
【図１Ａ】
2014224800.tif 000002
【図１Ｂ】
2014224800.tif 000003
【図１Ｃ】
2014224800.tif 000004
【図１Ｄ】
2014224800.tif 000005
【図２Ａ】
2014224800.tif 000006
【図２Ｂ】
2014224800.tif 000007
【図２Ｃ】
2014224800.tif 000008
【図３Ａ】
2014224800.tif 000009
【図３Ｂ】
2014224800.tif 000010
【図３Ｃ】
2014224800.tif 000011
【図４Ａ】
2014224800.tif 000012
【図４Ｂ】
2014224800.tif 000013
【図４Ｃ】
2014224800.tif 000014
【図５Ａ】
2014224800.tif 000015
【図５Ｂ】
2014224800.tif 000016
【図６Ａ】
2014224800.tif 000017
【図６Ｂ】
2014224800.tif 000018
【図７Ａ】
2014224800.tif 000019
【図７Ｂ】
2014224800.tif 000020
【図７Ｃ】
2014224800.tif 000021
【図７Ｄ】
2014224800.tif 000022
【図８】
2014224800.tif 000023
【図９】
2014224800.tif 000024
【図１０Ａ】
2014224800.tif 000025
【図１０Ｂ】
2014224800.tif 000026
【外国語明細書】
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2014224800000002.pdf
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