(57)【要約】【課題】抗アデノ中和抗体の存在下でも癌細胞にアデノウイルスベクターを高効率に導入することができ、優れた抗癌活性を有する遺伝子治療剤を提供する。【解決手段】本発明は、アデノウイルスベクターを感染させた免疫細胞を含む、癌に対する遺伝子治療剤、ならびにアデノウイルスベクターと免疫細胞を用いた癌に対する遺伝子治療剤の製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスベクターを感染させた免疫細胞を含む、癌に対する遺伝子治療剤。
【請求項２】
アデノウイルスベクターのファイバー領域がコードするファイバータンパク質が、免疫細胞の表面に発現しているレセプターに結合するものである、請求項１記載の遺伝子治療剤。
【請求項３】
アデノウイルスベクターがアデノウイルス５型ベクターである、請求項１または２記載の遺伝子治療剤。
【請求項４】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルス５型ベクターのファイバー領域をアデノウイルス３５型ベクターのファイバー領域に改変したものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子治療剤。
【請求項５】
免疫細胞が表面にＣＤ４６を発現している、請求項４記載の遺伝子治療剤。
【請求項６】
免疫細胞がγδＴ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項記載の遺伝子治療剤。
【請求項７】
癌が前立腺癌である、請求項１〜６のいずれか１項記載の遺伝子治療剤。
【請求項８】
免疫細胞にアデノウイルスベクターを感染させることを含む、癌に対する遺伝子治療剤の製造方法。
【請求項９】
アデノウイルスベクターが、アデノウイルス５型ベクターのファイバー領域をアデノウイルス３５型ベクターのファイバー領域に改変したものであり、免疫細胞がγδＴ細胞である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に対する遺伝子治療剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、転移性前立腺癌の主な治療法は内分泌療法や抗癌剤療法である。しかし、これらの治療法では最終的に治療効果が得られない症例が存在するため、これらの治療法に代わる新たな治療戦略が切望されている。癌に対する遺伝子治療研究は長年にわたり行われており、新たな癌治療のツールとして着目されている。
【０００３】
泌尿器科領域においては、前立腺癌に対するＡｄ５ベクター（アデノウイルス５型ベクター）を用いた遺伝子治療の報告が散見されるが、その治療効果は当初の予想を下まわる。その理由の一つとして、第１の障壁は前立腺癌細胞のＣＡＲ（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が減弱していることが挙げられる。Ａｄ５ベクターはＣＡＲをレセプターとするため、標的細胞への遺伝子導入効率が十分でないと考えられる。その障壁を乗り越えるために、非特許文献１では、Ａｄ５ベクターのファイバー領域を３５型に改変した、Ａｄ５／Ｆ３５が開発された。Ａｄ５／Ｆ３５はＣＡＲではなく、ＣＤ４６をレセプターとする。確かに、Ａｄ５／Ｆ３５の登場は、標的細胞の遺伝子導入効率を改善したが、依然としてその導入効率には改善の余地が残っている。
【０００４】
第２の障壁は、ヒトにおける抗アデノ５型中和抗体保有率が４５〜６６％と高い点である。ファイバー領域の改変によりＡｄ５／Ｆ３５がＣＡＲ発現の低い癌細胞に感染できても、ほとんどの抗アデノ５型中和抗体は遺伝子を保持しているヘキソン領域を認識するため、Ａｄ５／Ｆ３５では抗アデノ５型中和抗体よる遺伝子導入阻害を回避しきれない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】H. Mizuguchi, T. Hayakawa. Gene, 285, 69-77 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
抗アデノ中和抗体の存在下でも癌細胞にアデノウイルスベクターを高効率に導入することができ、優れた抗癌活性を有する遺伝子治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討の結果、アデノウイルスベクターと免疫細胞の親和性が非常に高いこと、さらに、アデノウイルスベクターを感染させた免疫細胞により、抗アデノ中和抗体の存在下においても、高効率に目的遺伝子を癌細胞へ導入可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）アデノウイルスベクターを感染させた免疫細胞を含む、癌に対する遺伝子治療剤。
（２）アデノウイルスベクターのファイバー領域がコードするファイバータンパク質が、免疫細胞の表面に発現しているレセプターに結合するものである、（１）記載の遺伝子治療剤。
（３）アデノウイルスベクターがアデノウイルス５型ベクターである、（１）または（２）記載の遺伝子治療剤。
（４）アデノウイルスベクターが、アデノウイルス５型ベクターのファイバー領域をアデノウイルス３５型ベクターのファイバー領域に改変したものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（５）免疫細胞が表面にＣＤ４６を発現している、（４）記載の遺伝子治療剤。
（６）免疫細胞がγδＴ細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（７）癌が前立腺癌である、（１）〜（６）のいずれかに記載の遺伝子治療剤。
（８）免疫細胞にアデノウイルスベクターを感染させることを含む、癌に対する遺伝子治療剤の製造方法。
（９）アデノウイルスベクターが、アデノウイルス５型ベクターのファイバー領域をアデノウイルス３５型ベクターのファイバー領域に改変したものであり、免疫細胞がγδＴ細胞である、（８）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、抗アデノ中和抗体の存在下でも、癌細胞にアデノウイルスベクターを高効率に導入することができ、優れた抗癌活性を有する遺伝子治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＢＭＣ中のγδＴ細胞純度を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１ＢはγδＴ細胞におけるＣＡＲおよびＣＤ４６の発現率を示すグラフである。
【図２】図２は、γδＴ細胞に対するＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰの添加量と感染率の関係およびＮＫＧ２Ｄ発現率を示すグラフである。
【図３】図３は、感染開始からの経過時間と感染率の関係を示すグラフである。
【図４】図４は、ＰＣ３細胞における、ＣＡＲ、ＣＤ４６、ＭＩＣ  Ａ／Ｂの発現数を示すグラフである。
【図５】図５は、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉの存在下および不在下におけるＡｄ５／Ｆ３５の感染率を示すグラフである。
【図６】図６は、ＰＢＭＣまたはＮＫ細胞にＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰを感染させ、ＰＣ３と共培養を行い、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉ存在下で感染率をγδＴ細胞の場合と比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の遺伝子治療剤においては、アデノウイルスベクターを癌細胞に導入するためのキャリア細胞として、免疫細胞を用いることを特徴とする。免疫細胞としては、末梢血免疫細胞が挙げられる。免疫細胞として、癌に対して高い親和性を示すものや、用いるアデノウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターのファイバー領域がコードするファイバータンパク質が結合しうるレセプターを表面に発現しているものが好ましく用いられる。アデノウイルスベクターのファイバー領域は、アデノウイルスゲノムのファイバータンパク質をコードする領域をさす。
【００１２】
免疫細胞の具体例としては、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）、抗原提示細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、単球、ナイーブ細胞、活性化細胞、記憶細胞およびそれらの始原細胞または前駆細胞、ならびにこれらの混合細胞などが挙げられる。本発明においてはキャリア細胞として、Ｔ細胞を用いるのが好ましい。特にγδＴ細胞は癌細胞に対し高い親和性を示すことから好ましい。また、γδＴ細胞は、他の血液細胞と同様にＣＤ４６を発現しており、アデノウイルス３５型が発現するファイバーを結合させることができる。免疫細胞としては、治療剤を投与する患者に由来する免疫細胞、すなわち患者から採取した検体に由来するものを用いるのが好ましい。
【００１３】
γδＴ細胞はγδ型Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞である。γδＴ細胞はサイトカインを産生することで抗腫瘍効果を発揮するほか、ＴＣＲによりペプチド以外の抗原を認識して傷害することが知られている。また、正常細胞が癌化して腫瘍細胞となることによって発現するＦａｓ、ＭＩＣＡ、ＴＲＡＩＬ−レセプター（ＴＲＡＩＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＴＲＡＩＬ−Ｒという）等細胞膜表面タンパク質にγδＴ細胞が有するＦａｓリガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＲＡＩＬを介して結合し、傷害することが知られている（例えば、Cancer Immunol Immunother 2007;56(8):1285-1297およびJ Immunol 2005;175:2144-2155）。
【００１４】
γδＴ細胞は、例えば以下の方法に調製することができる。まず、採血により末梢血を得る。採血する方法としては、真空採血管等による全血採取を利用することができる。採血量は患者の末梢血に含まれるγδＴ細胞の割合、γδＴ細胞の培養可能期間、投与数などを考慮し、患者の負担とならない程度に設定することが好ましい。例えば、１４日間の培養期間で、投与するγδＴ細胞として１０９個程度のγδＴ細胞を得たい場合には、培養開始時のγδＴ細胞数を３×１０５〜１×１０６個程度確保できるように採血量を設定することが好ましい。多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接末梢血単核球を取得することが可能である。
【００１５】
例えば密度勾配遠心法により末梢血単核球を得る。末梢血単核球を培養液ＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン）中に懸濁する。ここで末梢血単核球を懸濁した液を細胞懸濁液という。なお、ここで示した培養液以外にも、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地（ＩＭＥＭ）等の細胞の培養に使用される市販の培養液を使用してもよい。
【００１６】
また、必要に応じて血清を０．１〜２０％添加してもよい。血清として、例えば、牛胎児血清（ＦＣＳ）、ＡＢ血清または自己血漿等を使用してもよい。得られた細胞懸濁液をフラスコ、バッグまたはプレートに播種する。フラスコ、バッグまたはプレート中に播種された末梢血単核球に濃度が０．０５〜１００μＭ、好ましくは０．１〜３０μＭとなるようにビスホスホネートを添加する。ここで、使用されるビスホスホネートとしては、例えばパミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、それらの塩および／またはそれらの水和物が挙げられる。例えば、パミドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、アレンドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物であれば１〜３０μＭ、ゾレドロン酸、その塩および／またはそれらの水和物では０．１〜１０μＭにすることが好ましい。
【００１７】
更に、上記培養液にＩＬ−２を濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは１００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加する。ＩＬ−２を添加した後３４〜３８℃、より好ましくは３７℃で、好ましくは２〜１０％ＣＯ２、より好ましくは５％ＣＯ２存在下で培養する。この際、培養する細胞数に応じ、培養液を適宜添加する。更に、培養液の増加に伴い、ＩＬ−２の濃度が５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは１００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜添加する。培養期間としては７日間以上であれば高純度でγδＴ細胞を含む細胞群が得られるが、γδＴ細胞の細胞数を増やすには、１４日間程度培養することが好ましい。
【００１８】
キャリア細胞は、遺伝子組換え技術によって改変し、例えば標的癌細胞と結合しやすくなるようキャリア細胞の細胞表面に人為的に特定タンパク質等を発現させてもよいし、キャリア細胞にセンダイウイルスを感染させる等の処置を行ってもよい。
【００１９】
アデノウイルスベクターとしては、従来遺伝子導入に用いられるウイルスベクターを使用することができる。例えば、アデノウイルス５型ベクター（Ａｄ５ベクター）、アデノウイルス２型ベクター（Ａｄ２ベクター）、アデノウイルス３５型ベクター（Ａｄ３５ベクター）などが挙げられる。
【００２０】
ヒトアデノウイルス５型は、約３６ｋｂの２本鎖直鎖状ＤＮＡをゲノムとして持つ。カプシドは直系約８０ｎｍの正二十面体構造をとり、エンベロープを持たないウイルスである。ウイルス粒子から突出するファイバータンパク質の先端が細胞表面のレセプター（ＣＡＲ）に結合して吸着／感染する。
【００２１】
本発明においては、アデノウイルスベクターを遺伝子工学的に改変したものも、アデノウイルスベクターに含まれる。例えば、アデノウイルスベクターのファイバー領域を、キャリア細胞として用いる免疫細胞の表面に発現しているレセプターに結合するファイバータンパク質を有する別のウイルスのファイバー領域に改変したものを使用できる。
【００２２】
本発明においては、アデノウイルスベクターとして、アデノウイルス５型ベクターのファイバー領域をアデノウイルス３５型ベクターのファイバー領域に改変したもの（Ａｄ５／Ｆ３５）が特に好ましく用いられる（H. Mizuguchi, T. Hayakawa. Gene, 285, 69-77 (2002)）。アデノウイルス３５型のファイバーは、ＣＤ４６との親和性が高いため、細胞表面にＣＤ４６を発現している免疫細胞をキャリア細胞として用いる場合に特に好適である。本発明者らは、Ａｄ５／Ｆ３５とγδＴ細胞の親和性が非常に高いことを見出した。そして、キャリア細胞として、ＣＤ４６を発現しているγδＴ細胞を用いることにより、抗アデノ５型中和抗体によるＡｄ５／Ｆ３５の遺伝子導入の阻害を回避でき、抗アデノ中和抗体の存在下においても、Ａｄ５／Ｆ３５を用いて高効率に目的遺伝子を癌細胞へ導入可能であることを見出した。
【００２３】
ウイルスベクターのファイバー領域の、別のウイルスベクターのファイバー領域への改変は、当業者に公知の標準的な技術によって実施できる。例示として、Ａｄ５／Ｆ３５の調製方法について以下に記載する。
【００２４】
アデノウイルス３５型のファイバータンパク質をコードする遺伝子およびそのアミノ酸配列は既に公知であり、Mei, Y.F. et al., Virology 206 (1), 686-689, 1995: Dmitry M. et al., J. Virology, Mar. 2000, 2567-2583; NCBI U10272; NCBI AAA66361.1 などに記載されている。ファイバータンパク質は、shaftと knobから構成され、通常これらから構成されるファイバータンパク質をコードする遺伝子を用いる。ファイバータンパク質をコードする遺伝子に限られず、ファイバータンパク質と同様の標的細胞への接着性を有するその変異体をコードする遺伝子であってもよい。このような変異体としては、ファイバータンパク質のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってファイバータンパク質と同様の標的細胞への接着性を有するタンパク質が挙げられる。また、ファイバータンパク質をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ファイバータンパク質と同様の標的細胞への接着性を有するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。ストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子としては、例えば、６×ＳＳＰＥ、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６５℃、１２時間反応させるという条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うことによりハイブリダイズする遺伝子が挙げられる。
【００２５】
ファイバータンパク質またはこれらの変異体をコードする遺伝子は、既に周知の方法により容易に得ることができる。例えば、周知の遺伝子情報に基づいてＰＣＲ法等を利用して得ることができる。これらの方法は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。また、上記した変異体をコードする遺伝子あるいはストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子は、例えば部位特異的突然変異誘発法、通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができる。
【００２６】
これらのアデノウイルス３５型のファイバータンパク質もしくはその変異体をコードする遺伝子を、非増殖型アデノウイルス５型のファイバータンパク質をコードする遺伝子と置換し、発現可能なように非増殖型アデノウイルス５型に組み込む。そのためには、例えば、アデノウイルス３５型のファイバータンパク質もしくはその変異体をコードする遺伝子の両端にアデノウイルス５型と同様の遺伝子を接続してヒト胎児腎細胞由来の２９３細胞中で相同組換えを行う。
【００２７】
アデノウイルスベクターは、好ましくは少なくとも１つの治療用遺伝子を含む。この治療用遺伝子は、好ましくはｃＤＮＡの形態であり、このベクターの感染性にも複製にも有害に影響しない任意の位置に挿入される。好ましくは、この治療用遺伝子は、Ｅ３タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列に代わって、Ｅ３領域に挿入される。
【００２８】
治療用遺伝子は、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルでその効果を発揮する遺伝子であってもよい。アデノウイルスに挿入される治療用遺伝子としては、アポトーシスを開始し得る因子、アンチセンスまたはリボザイム、細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子、またはＦａｓ遺伝子などが挙げられる。
【００２９】
他の治療用遺伝子としては、免疫刺激遺伝子、血管新生阻害遺伝子、および自殺遺伝子が挙げられる。免疫刺激遺伝子としては、サイトカイン（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ１２、ＩＬ１８、およびｆｌｔ３）、免疫細胞との相互作用を刺激するタンパク質（Ｂ７、ＣＤ２８、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＴＡＰ）、腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００（ｐｍｅｌ−１７）、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、チロシナーゼ関連タンパク質２、メラニン細胞刺激ホルモンレセプター、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、βカテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ８、ＫＩＡ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２Ｒ１７０１、αフェトプロテイン、テロメラーゼ触媒性タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児性タンパク質、ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、テロメラーゼ逆転写酵素、およびＰＳＭＡ）、阻害性シグナルをブロック（ＣＴＬＡ４遮断）する抗体、およびケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ３α、ＣＣＲ７リガンド、およびカルレティキュリン）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３０】
血管新生阻害遺伝子としては、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＴｒｐＲＳフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチンフラグメント、ＰＥＤＦ、バソスタチン、細胞外マトリックスタンパク質の種々のフラグメント、および増殖因子／サイトカインインヒビターをコードする遺伝子が挙げられる。細胞外マトリックスタンパク質の種々のフラグメントとしては、アンギオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブリノーゲンＥフラグメント、トロンボスポンジン、ツムスタチン、カンスタチン、およびレスチンが挙げられる。増殖因子／サイトカインのインヒビターとしては、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、ｓＦｌｔ−１、ｓＦｌｋ、ｓＮＲＰ１、アンギオポイエチン／ｔｉｅのアンタゴニスト、ｓＴｉｅ−２、ケモカイン（ＩＰ−１０、ＰＦ−４、Ｇｒｏ−β、ＩＦＮ−γ（Ｍｉｇ）、ＩＦＮα、ＦＧＦ／ＦＧＦＲアンタゴニスト（ｓＦＧＦＲ）、エフリン／Ｅｐｈのアンタゴニスト（ｓＥｐｈＢ４およびセフリンＢ２）、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、およびＩＧＦ−１が挙げられる。
【００３１】
自殺遺伝子は、ジフテリアＡ毒素の発現のように、それ自体で細胞死をもたらし得るタンパク質、またはこのタンパク質の発現が、特定の薬物に対して細胞を感受性にするタンパク質（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の発現は、抗ウイルス化合物に対して細胞を感受性にする）をコードする遺伝子である。他の自殺遺伝子としては、カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＡ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、チトクローム Ｐ４５０（ｃｙｔ−４５０）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ニトロレダクターゼ（ＮＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶ−ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３２】
治療用遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、適切なプロモーターの制御下に挿入されることが好ましい。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーターまたはＥ３プロモーター）、異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、およびＡｐｏＡＩプロモーターなどが挙げられる。
【００３３】
好ましくはアデノウイルスベクターは、治療対象となる癌の種類に応じて、癌特異的プロモーターを有する。例えば、卵巣癌に対しては１Ａ１．３Ｂプロモーター、脳腫瘍、悪性グリオーマなどに対してはミッドカインプロモーター、精巣癌に対してはβ―ＨＣＧプロモーター、扁平上皮癌に対してはＳＣＣＡ１プロモーターおよびＳＣＣＡ２プロモーター、大腸癌に対してはＣＥＡプロモーター、前立腺癌に対してはＰＳＡプロモーター、肝癌に対してはＡＦＰプロモーターを使用することができる。他の公知の癌特異的プロモーター、例えば、種々の悪性腫瘍に対してプロモーター活性を発揮し、広い作用スペクトラムを有するｃｏｘ−２プロモーターや、その他オステオカルシンプロモーター等の各種癌特異的プロモーターを使用してもよい。ミッドカインプロモーターは、脳腫瘍、悪性グリオーマのほか種々の悪性腫瘍に対して使用可能である。
【００３４】
使用する各プロモーター配列の長さ等については、癌特異的プロモーター活性が得られる限りにおいて特に限定されるものではない。１Ａ１．３Ｂプロモーターは、ＷＯ０３／０２５１９０およびCancer Research 63, 2506-2512, 2003の記載にしたがって設計および調製し、ウイルスゲノムに挿入することができる。ミッドカインプロモーター、β―ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーターについては、それぞれ、ＷＯ０２／１０３６８、ＷＯ０１／９０３４４、ＷＯ００／６００６８の記載にしたがって設計および調製し、ウイルスゲノムに挿入することができる。
【００３５】
例えば、アデノウイルスベクターを作製する場合、アデノウイルスの増殖に必須の遺伝子である初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの上流に癌特異的プロモーターを挿入するか、あるいは、初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂプロモーターと置換することにより構築することができる。
【００３６】
アデノウイルスベクターとともに、その他の遺伝子導入用ウイルスベクター、例えば、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、ＨＩＶウイルス（エイズウイルス）等のレンチウイルスやマウス白血病ウイルス等のレトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などを併用してもよい。
【００３７】
本発明の遺伝子治療剤は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、治療対象となる癌の種類としては、例えば、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮癌（子宮頚部癌、皮膚癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌等）、消化器癌（大腸癌、膵癌、肝癌、胃癌等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌などが例示される。また、血液細胞にも感染可能なアデノウイルスを使用することで、本発明の遺伝子治療剤は血液性悪性腫瘍にも適用可能である。
【００３８】
アデノウイルスをキャリア細胞に感染させる方法は、常法に従って行えばよく特に限定されるものではない。例えばキャリア細胞としての免疫細胞をデイッシュに播き、これにアデノウイルスベクターをすべての細胞に感染可能な量で添加し、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２、３７℃、牛胎児血清ＦＣＳ（−）、ＲＰＭＩ培地の条件下で６時間〜３６時間程度培養し感染させる方法が簡便である。アデノウイルスベクターの添加量は特に制限されないが、例えば、１００〜５００ｐｆｕ／ｍＬ、好ましくは２００〜４００ｐｆｕ／ｍＬである。
【００３９】
キャリア細胞に対するアデノウイルスベクターの感染量および感染時間は、治療対象の腫瘍の大きさや種類、キャリア細胞の種類や投与量、使用するアデノウイルスベクターの種類、遺伝子治療剤の投与方法などに応じて最適な量と時間を選択すればよい。特に限定されないが、一例として、キャリア細胞としてγδＴ細胞を用いる場合、腹腔内投与では約５〜２５０ｖｐ／ｃｅｌｌでおよそ６〜２４時間、腫瘍内投与では約５〜５００ｖｐ／ｃｅｌｌでおよそ１２−２４時間に設定することができる。
【００４０】
キャリア細胞にアデノウイルスベクターを感染させ、本発明の遺伝子治療剤を調製する場合、使用時まではアデノウイルスベクターを感染させない状態でキャリア細胞を保存しておいてもよい。他方、アデノウイルスベクターを感染させ放射線照射したキャリア細胞を凍結し、これを医療現場で解凍して使用するという製品形態にする場合は、ウイルス感染させたキャリア細胞を保存しておくことが好ましい。キャリア細胞の保存は、例えば液体窒素中または−１５０℃程度の温度にて保存することができる。一方、アデノウイルスベクターは、例えば−８０℃程度の温度にて保存することができる。
【００４１】
使用時には、前記の方法によりアデノウイルスベクターをキャリア細胞に感染させ、得られたウイルス感染キャリア細胞を、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに本発明の癌遺伝子治療剤となし、哺乳動物（例えば、ヒトやサルなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなど）に投与することができる。
【００４２】
本発明の遺伝子治療剤は、非経口剤として投与することが好ましい。非経口剤としての投与は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法、ｅｘ  ｖｉｖｏ法のいずれであってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ法の場合、腫瘍の大きさや種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて用量（換言すれば、ウイルス感染キャリア細胞の投与量）を調節し、例えば、静注、点滴静注、腫瘍内注射、腹腔注射のような腔内注射などによって投与することができるが、キャリア細胞は、腫瘍内注射の方法により投与することが好ましい。このような注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に生理食塩水、細胞培養液等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えてもよい。これら製剤中のウイルス感染キャリア細胞の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。
【００４３】
本発明の遺伝子治療剤は、数回にわたり患者に投与してもよいし、複数回のクールに分け、一クール当たりの投与回数、投与間隔などを任意に設定してもよい。
【００４４】
ウイルス感染キャリア細胞の投与量は、腫瘍の大きさや種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて決定すればよいが、通常の場合、１回のキャリア細胞の投与量をおよそ１０７細胞数以上１０１０細胞数以下に、キャリア細胞によるアデノウイルスベクターの１回の投与量をおよそ１０９ウイルス粒子以上１０１４ウイルス粒子以下に設定することができる。ウイルス感染キャリア細胞は、例えば、１〜６回投与される。複数回投与する場合は、連日あるいは２、３日おきに投与することが好ましい。
【００４５】
アデノウイルスベクターは、細胞間相互作用によりキャリア細胞から標的癌細胞へと感染し、癌細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を殺傷する作用を発揮することができる。ウイルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、本発明のキャリア細胞を用いると細胞間相互作用により標的癌細胞に直接的に感染が成立することによって頻回投与が可能となり、強力な抗腫瘍効果が期待できる。
【００４６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
実施例１  ヒトγδＴ細胞の準備
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を比重法により末梢血より分離し、分離後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬）に、１０％自己血清、１μＭのゾレドロン酸、１００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した培地で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を開始した。培養開始３日後、培地の３／４を、２ｍＭのＬ−グルタミン（和光純薬）および１００ ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加したＡｌｙＳ５０５Ｎ培地（細胞科学研究所）に換え、これを３日ごとに行った(Suzuki T, Terao S, Acharya B, Naoe M, Yamamoto S, Okamura H and Gotoh A, Anticancer Res. 30:4509-4513, 2010)。
【００４８】
培養１４日目にγδＴ細胞の状態およびＡｄレセプターの発現をフローサイトメーターで確認した。本培養条件によって、ＰＢＭＣ中のγδＴ細胞純度は９０％以上の割合にまで増殖した（図１Ａ）。また、ＣＡＲは全く発現していないが、Ａｄ５／Ｆ３５のレセプターＣＤ４６は９０％以上の発現が確認できた（図１Ｂ）。よって、γδＴ細胞はＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰが感染し得ることがわかった。
【００４９】
実施例２  γδＴ細胞へのＡｄ５／Ｆ３５ベクターの感染（キャリア細胞の調製）
γδＴ細胞にＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰを１００、３００、５００ｐｆｕ／ｍＬ添加し、３７℃で４８時間感染させた。Ａｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰは、Ａｄ５ファイバー領域を３５型アデノウイルスベクターのファイバー領域に改変し、ＧＦＰ遺伝子を挿入したウイルスである。ＧＦＰの発現をフローサイトメーターで確認し感染率を評価した。その結果、３００〜５００ｐｆｕ／ｍＬでＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰの感染が見られ、ＮＫＧ２Ｄの大きな低下も見られなかった（図２）。ＮＫＧ２ＤはγδＴ細胞が活性化している時に発現が上昇し、癌細胞を攻撃する際に大きな役割を果たす。
【００５０】
Ａｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰは３００ｐｆｕ／ｍＬでγδＴ細胞に十分感染することが確認できたため、次に経時変化を観察し、最適な感染時間を求めた。Ａｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰは３００ｐｆｕ／ｍＬに固定し、感染開始から４時間ごとに抗アデノウイルス抗体（ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉ；Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ、日本製薬）を１０％になるよう添加し感染を止めてサンプルとした。その結果、感染開始から１６時間後が最も感染率が良いことが確認できた（図３）。
【００５１】
以上の結果から、γδＴ細胞へのＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰ感染条件は３００ｐｆｕ／ｍＬ、１６時間とした。
【００５２】
実施例３  癌細胞とγδＴ細胞の共培養
次に、γδＴ細胞と癌細胞の共培養を行い、癌細胞への遺伝子導入効率に関する検討を行った。
【００５３】
Ａｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰを３００ｐｆｕ／ｍＬで１６時間感染させたγδＴ細胞に、１０％ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉを添加し１時間培養した後、培地で２回洗浄したものをキャリア細胞とした。
【００５４】
癌細胞は前立腺癌細胞株ＰＣ３を用いた。ＰＣ３細胞はＣＡＲを全く発現していないが、ＣＤ４６は発現していた。また、ＮＫＧ２ＤのリガンドであるＭＩＣ  Ａ／Ｂの発現も確認できた（図４）。
【００５５】
そこで、ＰＣ３とキャリア細胞を１対２０の割合でシャーレに入れ、一方にはｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉを入れ、もう一方には入れないで５％ＣＯ２、３７℃で４８時間共培養を行った。その結果、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉを入れなかった方ではほぼ１００％のＰＣ３にＧＦＰの発現が見られた。一方、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉを入れた方では６０％近くのＰＣ３にＧＦＰの発現が見られた（図５）。
【００５６】
γδＴ細胞がＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣ  Ａ／Ｂを介して癌細胞（ＰＣ３）を攻撃する際、細胞障害性物質（パーフォリンやグランザイム等）と共にＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰも癌細胞に注入すると考えられる。細胞死を回避した癌細胞はそのままＧＦＰを発現するが、細胞死を迎えた癌細胞からはＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰが放出される。その際、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉが培地中に存在すると放出されたＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰを失活させるが、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉが存在しなければＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰは周囲の癌細胞に感染することが出来る。よって、今回得られた結果より、本発明は抗アデノ中和抗体の存在下においてもＡｄベクターを高効率に癌細胞へデリバリー可能であること、ウイルス感染細胞に対する殺細胞効果だけでなく、周囲の非感染細胞への波及効果も期待できると考えられる。
【００５７】
一方、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉ存在下でＰＣ３にＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰを直接感染させようとしても全く感染しないことがわかっている。すなわち、本発明により、キャリア細胞を介することにより、抗アデノ中和抗体を回避してアデノウイルスベクターを癌細胞に導入することが可能になるといえる。
【００５８】
実施例４  癌細胞とその他免疫細胞の共培養
γδＴ細胞以外の免疫細胞も、同様にキャリア細胞となり得るかを検討した。
ＰＢＭＣ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等のリンパ球、単球混在。γδＴ細胞は約５％）またはＮＫ細胞（γδＴ細胞と同様に強い抗腫瘍活性を持つことが知られている。ＰＢＭＣより磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）にて単離した）をγδＴ細胞の時と同条件（３００ｐｆｕ／ｍＬ、１６時間）でＡｄ５／Ｆ３５−ＧＦＰを感染させ、キャリア細胞とした。
【００５９】
ＰＣ３とキャリア細胞を１対２０の割合で共培養を行い、ｇｌｏｖｅｎｉｎ−Ｉ存在条件下でデリバリー効率を比較した。
【００６０】
その結果、ＰＢＭＣでは、２．３３％であり、ＮＫ細胞では感染率は８．８６％であった（図６）。
【００６１】
以上より、γδＴ細胞は最も高効率にＡｄベクターを癌細胞へデリバリーするキャリア細胞となり得ることが示された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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