【手続補正書】
【提出日】令和3年6月25日(2021.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するために遺伝子操作された酵母株であって、
ウシコラーゲンをコードする最適化ＤＮＡ配列を含むベクターを含み、前記ＤＮＡ配列は配列番号２と少なくとも９０％同一である、前記酵母株。
【請求項２】
前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項３】
前記ベクターが、ウシコラーゲンのためのプロモーターのためのＤＮＡ配列をさらに含み、前記プロモーターが、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーター、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘発双方向性プロモーター、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーター、ＣＨＯヒストンプロモーター、ＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーター及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項４】
前記ベクターが、抗生物質耐性をコードする選択マーカー又は栄養要求性マーカーのためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載の酵母株。
【請求項５】
前記抗生物質耐性をコードする選択マーカーが、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの抗生物質に対する耐性をコードする、請求項４に記載の酵母株。
【請求項６】
前記ベクターが、エレクトロポレーション、化学的形質転換、及び交配からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入される、請求項１に記載の酵母株。
【請求項７】
非ヒドロキシル化ウシコラーゲンの製造方法であって、請求項１に記載の酵母株を、ウシコラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で増殖させることを含む前記方法。
【請求項８】
前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記期間が２４時間〜７２時間である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ヒドロキシル化ウシコラーゲンを産生するように遺伝子操作された酵母株であって、
ウシコラーゲンをコードする最適化ＤＮＡ配列を含む第１のベクター、ここで、前記ＤＮＡ配列が配列番号２と少なくとも９０％同一である、及び
Ｐ４ＨＡ１をコードするＤＮＡ配列及びＰ４ＨＢをコードするＤＮＡ配列を含む第２のベクターを含み、
前記ベクターは前記酵母株に挿入されている、前記酵母株。
【請求項１２】
前記酵母が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１に記載の酵母株。
【請求項１３】
前記第１のベクター、前記第２のベクター又はこれらの組み合わせが、抗生物質耐性又は栄養要求性マーカーをコードする、選択マーカーのためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１１に記載の酵母株。
【請求項１４】
前記ベクターが、エレクトロポレーション、化学的形質転換、及び交配からなる群から選択される方法によって酵母に挿入される、請求項１１に記載の酵母株。
【請求項１５】
ヒドロキシル化ウシコラーゲンの製造方法であって、請求項１１に記載の酵母株を、ウシコラーゲンを産生するのに十分な期間、培地中で増殖させることを含む前記方法。
【請求項１６】
前記期間が２４時間〜７２時間である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のベクター、前記第２のベクター又はこれらの組み合わせが、抗生物質耐性又は栄養要求性マーカーをコードする、選択マーカーのためのＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
オールインワン・ベクターであって、
（ｉ）  ウシコラーゲンをコードする最適化ＤＮＡ配列、ここで当該ＤＮＡ配列は配列番号２と少なくとも９０％同一である；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１、Ｐ４ＨＢ、及びこれらの組み合わせを含むヒドロキシル化酵素をコードするＤＮＡ配列；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む選択マーカー用のＤＮＡ配列；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製開始点のためのＤＮＡ配列；
（ｖ）ゲノムに組み込むための酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列；及び
（ｖｉ）モジュラークローニングを可能にする、上記のＤＮＡ配列内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限部位、
を含む前記オールインワン・ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
参照による取り込み
本明細書で言及されたすべての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個々に示されて参照により取り込まれているかのように、参照によりその全体が本明細書に同程度に取り込まれており、特に、参照による取り込みがある明細書の同じ文章、段落、ページまたはセクションに現れる開示が参照される。

以下の態様を包含し得る。
［１］  非ヒドロキシル化コラーゲンを産生するために遺伝子操作された酵母株であって、
（ｉ）酵母株；及び
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列；コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列；コラーゲンターミネーターのＤＮＡ配列；選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列；細菌及び酵母から選択される複製起点のＤＮＡ配列；及び前記酵母ゲノムと相同性を含有するＤＮＡ配列を含むベクターを含み、かつ
前記ベクターが前記酵母株に挿入されているか、またはエピソームに保持されている前記酵母株。
［２］  前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［３］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン、海洋生物、細菌及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［４］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然コラーゲンＤＮＡ、操作されたコラーゲンＤＮＡ及びコドン最適化コラーゲンＤＮＡから選択される、上記［３］に記載の酵母株。
［５］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーターのＤＮＡ、ＰＤＦ脱抑制プロモーターのＤＮＡ、ＰＣＡＴ脱抑制化プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘発双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＣＨＯヒストンプロモーターのＤＮＡ、ＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［６］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１］に記載の酵母株。
［７］  前記抗生物質が、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［６］に記載の酵母株。
［８］  前記ベクターが、エレクトロポレーション、化学的形質転換、及び交配からなる群から選択される方法によって前記酵母に挿入される、上記［１］に記載の酵母株。
［９］  非ヒドロキシル化コラーゲンの製造方法であって、
（ｉ）上記［１］に記載の酵母株を提供すること；及び
（ｉｉ）前記株を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させること
を含む前記方法。
［１０］  前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［９］に記載の方法。
［１１］  前記培地が、緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）、緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）、及び酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）からなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１２］  前記期間が２４時間〜７２時間である、上記［９］に記載の方法。
［１３］  前記酵母が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［１２］に記載の方法。
［１４］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１５］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群より選択される、上記［９］に記載の方法。
［１６］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［９］に記載の方法。
［１７］  ヒドロキシル化コラーゲンを産生するように遺伝子操作された酵母株であって、
（ｉ）酵母株、
（ｉｉ）コラーゲンのＤＮＡ配列、コラーゲンプロモーターのＤＮＡ配列、ターミネーターのＤＮＡ配列、選択マーカーのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのプロモーターのＤＮＡ配列、前記選択マーカーのターミネーターのＤＮＡ配列、細菌及び／または酵母の複製起点のＤＮＡ配列、前記酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ配列を含むベクター（かつ前記ベクターは前記酵母株に挿入されている）、及び
（ｉｉｉ）Ｐ４ＨＡ１のＤＮＡ配列、Ｐ４ＨＢのＤＮＡ配列、及びプロモーターの少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む第２のベクター（かつ前記ベクターは前記酵母株に挿入されている）を含む、前記酵母株。
［１８］  前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［１９］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２０］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、天然のコラーゲンＤＮＡ、操作されたコラーゲンＤＮＡ及び最適化されたコラーゲンＤＮＡから選択される、上記［１９］に記載の酵母株。
［２１］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＡＯＸ１メタノール誘発プロモーターのＤＮＡ、ＰＤＦ脱抑制プロモーターのＤＮＡ、ＰＣＡＴ脱抑制プロモーターのＤＮＡ、Ｄａｓ１−Ｄａｓ２メタノール誘発双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ、ＣＨＯヒストンプロモーターのＤＮＡ、ＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２２］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２１］に記載の酵母株。
［２３］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２４］  前記抗生物質が、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［２３］に記載の酵母株。
［２５］  前記ベクターが、エレクトロポレーション、化学的形質転換、及び交配からなる群から選択される方法によって酵母に挿入される、上記［１７］に記載の酵母株。
［２６］  ヒドロキシル化コラーゲンの製造方法であって、
（ｉｉｉ）上記［１７］に記載の酵母株を提供すること；及び
（ｉｖ）前記株を、コラーゲンを産生するのに十分な時間、培地中で増殖させること
を含む前記方法。
［２７］  前記酵母株が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２８］  前記媒体が、ＢＭＧＹ、ＢＭＭＹ、及びＹＰＤからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［２９］  前記期間が２４時間〜７２時間である、上記［２６］に記載の方法。
［３０］  前記酵母が、アルクスラ属、キャンディダ属、コマガタエラ属、ピキア属、ハンゼヌラ属、オガタエア属、サッカロミセス属、クリプトコッカス属及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記［２９］に記載の方法。
［３１］  前記コラーゲンのＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜コラーゲン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３２］  前記プロモーターのＤＮＡが、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３３］  前記選択マーカーのＤＮＡが、抗生物質耐性ＤＮＡのＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群より選択される、上記［２６］に記載の方法。
［３４］  オールインワン・ベクターであって、
（ｉ）プロモーター及びターミネーターを含むコラーゲン産生に必要なＤＮＡ；
（ｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＢからなる群から選択されるヒドロキシル化酵素のＤＮＡ；
（ｉｉｉ）プロモーター及びターミネーターを含む選択マーカー用のＤＮＡ；
（ｉｖ）酵母及び細菌の複製開始点のＤＮＡ；
（ｖ）ゲノムに組み込むための酵母ゲノムと相同性を有するＤＮＡ；及び
（ｖｉ）モジュラークローニングを可能にする、上記のＤＮＡ内の５’、３’、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置の制限部位、
を含む前記オールインワン・ベクター。
［３５］  前記コラーゲンの産生に必要なＤＮＡ配列が、ウシ、ブタ、カンガルー、ワニ、クロコダイル、ゾウ、キリン、シマウマ、ラマ、アルパカ、子羊、恐竜及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワン・ベクター。
［３６］  前記プロモーターのＤＮＡ配列が、ＰＨＴＸ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡ及びＰＧＣＷ１４−ＰＧＡＰ１構成性双方向性プロモーターのＤＮＡからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワン・ベクター。
［３７］  前記選択マーカーのＤＮＡ配列が、抗生物質耐性のＤＮＡ及び栄養要求性マーカーのＤＮＡからなる群から選択される、上記［３４］に記載のオールインワン・ベクター。
［３８］  前記抗生物質が、ハイグロマイシン、ゼオシン、ジェネテシン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、上記［３７］に記載のオールインワン・ベクター。