(57)【要約】【課題】制限しない一実施形態における、メチシリン耐性細菌を含む、抗生物質耐性細菌の迅速な検出のための方法、組成物、およびキットを提供する。【解決手段】  本発明は、概して、試料中の抗生物質耐性細菌の検出に関する。具体的には、本発明は、試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および他のメチシリン耐性の細菌を検出し、分析する方法、組成物、およびキットを提供する。【選択図】図１
2014023539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
（ａ）第１の組のプライマーを提供する工程であって、前記第１の組のプライマーは、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｂ）第２の組のプライマーを提供する工程であって、前記第２の組のプライマーは、架橋領域の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｃ）第３の組のプライマーを提供する工程であって、前記第３の組のプライマーは、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程と、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物中の前記試料と合わせる工程と、
（ｅ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程と、
（ｆ）前記ｍｅｃＡ、架橋領域、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の、それぞれの出現のサイクル数を決定する工程と、
を含み、
前記サイクル数は、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを示す、方法。
【請求項２】
前記第１の組のプライマーは、配列番号１０〜１１のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の組のプライマーは、配列番号２〜８のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の組のプライマーは、配列番号１３〜１４、および１８〜１９のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅反応は、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
（ｇ）前記試料を、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なプライマーと接触させる工程と、
（ｈ）前記ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を増幅させる工程と、
（ｉ）前記増幅したヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を検出する工程と、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢから選択される成員である、遺伝子の少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子は、ｎｕｃである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子は、Ｓａ４４２である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
（ａ）ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
（ｂ）架橋領域のポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
（ｃ）黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する工程であって、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程と、
を含み、
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチド、前記架橋領域のポリヌクレオチド、および前記ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中にすべて存在する場合、ＭＲＳＡは、前記試料中に存在する、
方法。
【請求項１１】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程は、前記試料上で増幅反応を行う工程を含み、前記増幅反応は、第１の組のプライマーを使用し、前記第１の組のプライマーの大半は、前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の組のプライマーは、配列番号１０〜１１のうちの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程は、前記試料上で増幅反応を行う工程を含み、前記増幅反応は、第２の組のプライマーを使用し、前記第２の組のプライマーの大半は、前記ｏｒｆＸポリヌクレオチドの少なくとも１部に相補的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の組のプライマーは、配列番号２〜８のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程は、前記試料上で増幅反応を行う工程を含み、前記増幅反応は、第３の組のプライマーを使用し、前記第３の組のプライマーの大半は、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の組のプライマーは、配列番号１３〜１４、および１８〜１９のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢから選択される成員である遺伝子の少なくとも一部である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｎｕｃである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、Ｓａ４４２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、
（ｄ）前記試料を、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるプライマーに接触させる工程と、
（ｅ）前記ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を増幅させる工程と、
（ｆ）前記増幅したヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を検出する工程と、
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列は、ハウスキーピング遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列は、βグロビン遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の工程は、同時に実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の工程は、任意の順序で連続して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の工程は、前記試料の同一のアリコート中で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の工程は、前記試料の異なるアリコート中で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在し、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するが、前記架橋領域のポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、非メチシリン耐性ブドウ球菌を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２８】
試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
（ａ）第１の組のプライマーを提供する工程であって、前記第１の組のプライマーは、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｂ）第２の組のプライマーを提供する工程であって、前記第２の組のプライマーは、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｃ）第３の組のプライマーを提供する工程であって、前記第３の組のプライマーは、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程と、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の前記試料と合わせる工程と、
（ｅ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程と、
（ｆ）前記ｍｅｃＡ、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸおよび黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程と、
を含み、
前記サイクル数は、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを示す、
方法。
【請求項２９】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の出現から、少なくとも４サイクル離れたサイクルで出現する場合、前記試料は、ＭＲＳＡおよびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の両方を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の３サイクル内で出現する場合、前記試料は、ＭＳＳＡおよび非メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
試料中の細菌を特定する方法であって、
（ａ）ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
（ｂ）ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
（ｃ）黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する工程であって、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程と、
を含み、
前記試料中に存在する（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせは、前記試料中の細菌を特定する、
方法。
【請求項３２】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチド、および前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に共に存在し、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド、および前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸが、前記試料中に共に存在し、前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を含むが、ＭＲＳＡは含まない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチド、および前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に共に存在し、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、非メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含むが、ＭＲＳＡを含まない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチド、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド、および前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドのうちの１つのみが、前記試料中に存在する場合、前記試料は、ＭＲＳＡを含まない、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料は、細菌、単一菌株からの細菌、または２つ以上の菌株からの細菌の混合物を含んでいない可能性がある、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料は、体液、鼻腔用スワブ、および組織から選択される成員である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程、および、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程はすべて、前記試料の個別のアリコート中で行われる増幅反応である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程、および、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するかどうかを判断する前記工程のうちの２つ以上は、前記試料中の同一のアリコート中で行なわれる増幅反応である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
試料中のＭＲＳＡを特定するキットであって、
（ａ）ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第１の組のプライマーと、
（ｂ）ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第２の組のプライマーと、
（ｃ）黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第３の組のプライマーであって、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、架橋配列ではない、第３の組のプライマーと、
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択される少なくとも１つの成員と、
を備える、キット。
【請求項４１】
試料中のＭＲＳＡを特定するキットであって、
（ａ）ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第１の組のプライマーと、
（ｂ）架橋配列の少なくとも一部に相補的である、第２の組のプライマーと、
（ｃ）黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第３の組のプライマーであって、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、架橋配列ではない、第３の組のプライマーと、
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択される少なくとも１つの成員と、
を備える、キット。
【請求項４２】
試料中の抗生物質耐性細菌の菌株を検出する方法であって、
（ａ）第１の組のプライマーを提供する工程であって、前記第１の組のプライマーは、遺伝子の少なくとも一部から、第１の増幅産物を生成することが可能であり、前記遺伝子は、抗生物質耐性を与える、工程と、
（ｂ）第２の組のプライマーを提供する工程であって、前記第２の組のプライマーは、架橋領域の少なくとも一部から、第２の増幅産物を生成することが可能である、工程と、
（ｃ）第３の組のプライマーを提供する工程であって、前記第３の組のプライマーは、細菌の菌株に特異的なポリヌクレオチド配列の少なくとも一部から、第３の増幅産物を生成することが可能である、工程と、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の前記試料と合わせる工程と、
（ｅ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程と、
（ｆ）前記第１、第２、および第３の増幅産物のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程と、
を含み、
前記サイクル数は、抗生物質耐性細菌の菌株が、前記試料中に存在するかどうかを示す、方法。
【請求項４３】
前記遺伝子は、バンコマイシンへの耐性を与える、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記遺伝子は、メチシリンへの耐性を与える、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記細菌の菌株に特異的なポリヌクレオチド配列は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記架橋領域は、配列番号２〜８から選択される成員であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００７年４月１９日に出願された、米国仮特許出願第６０／９０７，８４８号の出願日遡及の利益を主張し、参照することにより、すべての目的で、この特許の内容全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、概して、試料中の抗生物質耐性細菌の検出に関する。具体的には、本発明は、試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および他のメチシリン耐性細菌を検出し、分析する方法、組成物、およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
抗生物質耐性細菌の新菌株および新種は、病院および他の医療施設において、次第によく見られるようになってきた。そのような細菌によって引き起こされる感染の治療の選択肢は、望ましくない副作用をもたらす費用のかかる薬物治療に限定されることが多い。抗生物質耐性は、黄色ブドウ球菌、エルスコビアツルバタ、アルカノバクテリウム・ヘモリティクム、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・ガロリティカス、ストレプトコッカス・ルテティエンシス、バチルス・サーキュランス、パエニバチルス、ロドコッカス、エンテロコッカス、クレブシエラ、ならびにクロストリジウム属およびエガセラ・レンタに属する嫌気性細菌を含む、多くの細菌、および他の多くの病原菌の菌株において検出されている。
【０００４】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、世界中の病院において、重大な疫学的問題として発生する抗生物質耐性細菌の種類の一例である。ＭＲＳＡ菌株は、ブドウ球菌感染を治療するために最も一般的に使用されるペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、およびモノバクタムを含む、ベータラクタムに耐性である。したがって、ＭＲＳＡ感染は、中毒性があり費用のかかる抗生物質（バンコマイシンおよびリネゾリド等）でのみ治療することができ、主に、これらのマイナスの副作用のため、通常、最後の砦としてのみ使用される。ＭＲＳＡの進化における近年の発達は、そのような最後の砦である抗生物質に、少なくとも部分的に耐性である菌株の出現である。これらの部分的に耐性の菌株が、完全に耐性になると、これらの菌株によって引き起こされる感染の効果的な治療はなくなるであろう。
【０００５】
初期の検出および治療は、常に進化する抗生物質耐性細菌の菌株の伝達を緩和するための主要な手段である。そのような細菌を検査する従来の方法は、結果を得るまでに少なくとも２〜４日要し、それだけの期間があれば、感染が拡大する機会としては十分である。したがって、抗生物質耐性細菌の検出のための、迅速で正確な方法、組成物、およびキットは、これらの送達および進化の速さを最小限にするために不可欠である。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本発明は、制限しない一実施形態における、メチシリン耐性細菌を含む、抗生物質耐性細菌の迅速な検出のための方法、組成物、およびキットを提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供する。本態様の方法には、（ｉ）プライマーが、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第１の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉ）プライマーが、架橋領域の少なくとも一部に相補的である、第２の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉｉ）プライマーが、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第３の組のプライマーを提供する工程であって、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程、（ｉｖ）第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の試料と合わせる工程、（ｖ）複数のサイクルの増幅反応を、反応混合物で実施する工程、および（ｖｉ）ｍｅｃＡ、架橋領域、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程が含まれる。本態様では、サイクル数は、ＭＲＳＡが、試料中に存在するかどうかを示す。
【０００８】
別の態様では、本発明は、試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供する。本態様の方法には、（ｉ）ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、（ｉｉ）架橋領域のポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、および（ｉｉｉ）ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程が含まれる。本態様では、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない。本態様では、ｍｅｃＡポリヌクレオチド、架橋領域のポリヌクレオチド、およびブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドのすべてが、該試料中に存在する場合、ＭＲＳＡは、該試料中に存在する。
【０００９】
さらに別の態様では、本発明は、試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供する。本態様の方法には、（ｉ）ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第１の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉ）ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第２の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉｉ）ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第３の組のプライマーを提供する工程であって、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列はｏｒｆＸポリヌクレオチドではない工程、（ｉｖ）第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物中の試料と合わせる工程、（ｖ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程、および（ｖｉ）ｍｅｃＡ、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸおよび黄色ブドウ球菌特定的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程が含まれる。本態様では、サイクル数は、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを示す。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、試料中の細菌を特定する方法を提供する。本方法には、（ｉ）ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、（ｉｉ）ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、および（ｉｉｉ）ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程であって、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない工程が含まれる。本態様では、試料中に存在する（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせは、試料中の細菌を特定する。
【００１１】
一態様では、本発明は、試料中のＭＲＳＡを特定するキットを提供する。そのようなキットには、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第１の組のプライマー、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第２の組のプライマー、架橋配列ではないブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の、少なくとも一部に相補的な第３の組のプライマー、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択される少なくとも１つの成員が含まれる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、試料中のＭＲＳＡを特定するキットを提供し、そのようなキットは、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第１の組のプライマー、架橋配列の少なくとも一部に相補的な第２の組のプライマー、架橋配列ではないブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第３の組のプライマー、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択される少なくとも１つの成員を含むことができる。
【００１３】
一態様では、本発明は、試料中の抗生物質耐性細菌の菌株を検出する方法を提供する。本方法は、（ｉ）抗生物質耐性を与える遺伝子の少なくとも一部から、第１の増幅産物を生成することが可能な第１の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉ）架橋領域の少なくとも一部から、第２の増幅産物を生成することが可能な第２の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉｉ）細菌の菌株に特異的なポリヌクレオチド配列の少なくとも一部から、第３の増幅産物を生成することが可能な第３の組のプライマーを提供する工程、（ｉｖ）第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の該試料と合わせる工程、（ｖ）複数のサイクルの増幅反応を、反応混合物で実施する工程、および（ｖｉ）第１、第２、および第３の増幅産物のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程を含むことができる。本態様では、サイクル数は、抗生物質耐性細菌の菌株が、試料中に存在するかどうかを示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の分析に使用するプライマーおよびプローブの配列の一覧表である。
【図２】本発明の方法を使用する、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の検出、ならびにこれらの識別の結果を図示する。
【図３】メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−ＣｏＮＳ）、およびメチシリン感受性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＳ−ＣｏＮＳ）の検出、ならびにこれらの識別の結果を図示する。
【図４】本発明の安定化ＰＣＲ反応混合物のリアルタイムＰＣＲ分析の結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
特に記載がない限り、本明細書に使用する、すべての専門的および科学的用語は、本発明が属する当該技術の当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書に記載するすべての出版物は、出版物に記載され、現在記載する本発明に関連して使用し得る、機器、製剤、および方法論を記載し、開示する目的で、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本明細書および付属の請求項に使用する、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかに違うことが分かる場合を除き、複数形の言及を含むことに留意する。したがって、例えば、「ポリメラーゼ」への言及は、そのような薬剤の１つまたは混合物を指し、「方法」への言及には、同等の工程および当業者に周知の方法等への言及が含まれる。
【００１７】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの媒介値、および表示範囲内の任意の他の表示値または媒介値は、本発明内に含まれることを理解するものとする。これらのより小範囲での上限および下限は、表示範囲の具体的に除外された任意の制限を条件として、単独に、より小範囲に含まれ得、本発明内にも含まれる。表示範囲が、１つまたは複数の制限値を含む場合、これらの含まれた制限値の両方のいずれかを除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００１８】
以下の説明では、多くの具体的な詳細を説明し、本発明のより完全な理解を提供する。しかしながら、本発明は、１つ以上のこれらの具体的な詳細がなくても実施し得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、当業者に周知の特性および手順は、本発明を不明瞭にするのを回避するために、記載していない。これらの付加的な特性も、本発明によって含まれることは、当業者には明らかであろう。
略語
【００１９】
「ＭＲＳＡ」は、「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌」を指す。
【００２０】
「ＭＳＳＡ」は、「メチシリン感受性黄色ブドウ球菌」を指す。
【００２１】
ＳＣＣ：ｏｒｆＸは、ＳＣＣｍｅｃ挿入カセットとブドウ球菌ゲノムのｏｒｆＸ領域との間の領域を指す。この領域は、「架橋領域」とも呼ばれる。
定義
【００２２】
「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチド（つまり、ＤＮＡ）鋳型で二本鎖が形成されると、伸展した二重鎖（二本鎖）が形成されるように、核酸合成の開始点として機能し、鋳型に沿って一端から伸展することが可能な、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを指す。本発明のプライマーは、検出可能に標識化し得るかまたは標識化し得ない。
【００２３】
「プローブ」は、概して、検出可能に標識化され、ハイブリダイゼーションによって相補的な核酸配列を特定するために使用される、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドである。本発明で使用するプライマーおよびプローブは、同一または異なる配列を有し得る。
【００２４】
「菌株」は、特定可能な相違によって、同一種の他の細菌と異なる細菌種の一部である。
【００２５】
本明細書に使用する、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド分子」という用語と交換可能に使用される。さらに、これらの記載した用語のすべては、遺伝子の一部、または全遺伝子を指し得、「遺伝子」という用語は、本明細書において、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド分子」、および「核酸」という用語と、交換可能に使用される。
【００２６】
「ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列」は、ｍｅｃＡ遺伝子の一部またはすべてをコード化する配列を含む、ポリヌクレオチドを指す。
概要
【００２７】
本発明は、抗生物質耐性細菌を検出し、分析する方法を提供する。本発明は主に、抗生物質メチシリンに耐性の細菌に関して記載するが、本発明の方法および組成物を使用して、制限しない一実施例においてバンコマイシンを含む、広範囲の抗生物質耐性の細菌を検出することができることを理解されたい。本発明に含まれる分析および組成物の柔軟性は、部分的には、細胞の、抗生物質耐性を提供する遺伝子を獲得する能力における柔軟性に起因する。そのような遺伝子の獲得は、プラスミド、トランスポゾン、インテグロン、および原型挿入因子によって促進されることが多い。細菌は、抗生物質耐性を周知の方法で獲得するため、本発明の方法および組成物を、当該技術において周知の方法を使用して、さまざまな抗生物質に耐性の異種の細菌および細菌株を検出するように適応させ得ることは理解されるであろう。抗生物質耐性の獲得に関する情報は、例えば、Ｔｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５８：１−６、Ｈａｎｄｗｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．２４４６−２４５３、Ｌａｕｎａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．１０５４−１０６２で見ることができ、これらのすべては、すべての目的のために、および特に細菌の抗生物質耐性の獲得に関する教示のために、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００２８】
一態様では、本発明は、試料中のメチシリン耐性細菌の存在を検出するためのサイクル閾値アッセイを提供する。さらなる態様では、そのようなアッセイを使用して、検出されたメチシリン耐性細菌が、黄色ブドウ球菌（「Ｓブドウ球菌」）であるかどうかを判断することもできる。さらに、本発明は、黄色ブドウ球菌の異なる菌株を識別し、試料中に存在する菌株が、以前に特定および／または配列されなかった、発生中の菌株であるかどうかを判断する方法およびアッセイを提供する。
【００２９】
一態様では、本発明のサイクル閾値アッセイは、細菌ゲノム内の３つの異なる座位を対象とした増幅反応を使用する。ＭＲＳＡの検出の１つの例示的な態様では、これらの３つの異なる座位は、（ｉ）ｍｅｃＡ遺伝子、（ｉｉ）ＳＣＣｍｅｃ挿入カセットとｏｒｆＸ遺伝子との間の架橋領域、および（ｉｉｉ）ｏｒｆＸではない、黄色ブドウ球菌特異的遺伝子である。別の例示的な実施形態では、メチシリン感受性ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の領域が増幅され、この領域は、挿入カセットが挿入されるが、その挿入カセットを有さない位置周辺のｏｒｆＸ遺伝子の領域である（この領域は、本明細書において、「ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ」とも称される）。これらの例示的な実施形態では、それぞれの座位の増幅産物が出現するサイクルは、ＭＲＳＡが、試料中に存在するかどうかを示す。本明細書に使用する、増幅産物が「出現する」サイクルは、概して、増幅産物を検出可能なサイクルを指し、例示的な実施形態では、産物は、当該技術において周知であり、本明細書でさらに記載する方法を使用して、増幅産物を検出するのに十分な濃度を蓄積する、第１のサイクル数で、「出現する」。さらなる実施形態では、サイクル数は、存在するＭＲＳＡの菌株、および任意の他の非ｍｅｃ耐性ブドウ球菌が、試料中に存在するかどうかに関する情報を提供することもできる。
【００３０】
本発明の方法を使用して、臨床試料（例えば、鼻汁、全血、血清、プラズマ、脳脊髄液、尿、リンパ液、および気道、腸管、および尿生殖器のさまざまな外分泌物、涙、唾液、乳液等の体液、ならびに、白血球、悪性組織、羊水および絨毛膜絨毛）、環境試料、微生物培養、微生物コロニー、組織、および細胞培養を含むが、これらに限定されない、さまざまな発生源から得た試料から、細菌を検出することができる。試料は、食物、表面（床、テーブル等）、および浮遊微小粒子（花粉および埃を含むがこれらに限定されない）から得てもよい。本発明に使用する試料は、純試料または不純試料であり得る。本発明に使用する試料は、細菌の２つ以上の異なる菌株からの混合物を含み得る。
【００３１】
一実施形態では、試料が得られると、ポリヌクレオチド配列は、試料から直接分析され得る。別の実施形態では、ＤＮＡ等のポリヌクレオチドを、まず、当該技術において周知の方法を使用して試料から抽出し、次いで、本発明のアッセイに使用する。
サイクル閾値アッセイ
【００３２】
本発明は、サイクル閾値アッセイを使用して、抗生物質耐性細菌を検出し、分析する方法を提供する。一般的に、本発明のサイクル閾値アッセイは、複数のサイクルの増幅反応を使用し、他の共増幅された断片に対する特定の増幅産物が出現するサイクルは、試料中に存在する細菌株および細菌種における情報を提供することができる。また、サイクル閾値アッセイは、メチシリン耐性細菌の菌株等を含むが、これに限定されない、特定の抗生物質耐性菌株の存在における情報を提供することができる。本発明のサイクル閾値アッセイを、主に、リアルタイムＰＣＲに関して、本明細書に記載するが、他の鋳型ベースの増幅反応を、当該技術において周知であり、本明細書にさらに記載する方法を使用して、本発明に従う使用のために適応させ得ることは理解されるであろう。
【００３３】
「検出し、分析する」という用語には、特定の細菌種または細菌株の存在を確認すること、ならびに、異なる細菌種と細菌株とを識別することが含まれる。該用語には、試料中の異なる細菌種または細菌株の濃度または相対濃度を判断することも含まれる。
【００３４】
一態様では、増幅反応は、細菌ゲノムの少なくとも３つの異なる座位からのヌクレオチド断片が増幅されるように、提供される。それぞれの座位からの断片が出現するサイクル数を測定して、単一の細菌種（単一菌株）を含む試料と、異なる細菌種および／または菌株の混合物を含む試料とを識別することが可能である。概して、試料が、異なる細菌株または細菌種の混合物を含む場合、および異なる菌株または種が、これらの相対的な濃度において、少なくとも１０倍の倍数の差異を有する場合は、１つ以上の細菌種または細菌株において認められる座位からの増幅産物は、単一の細菌種または細菌株においてのみ認められる座位からの増幅産物から、著しく離れた（４サイクル以上）サイクル数で出現する。しかしながら、単一種または単一菌株のみが、試料中に存在する場合（濃度において、１０倍未満の倍数の差異を有する細菌株または細菌種の混合物がある場合）は、すべての座位からの増幅産物は、複数のサイクルの増幅サイクルと実質的に同一の（３サイクル以内）時点で出現する。
サイクル閾値アッセイ：ＭＲＳＡ
【００３５】
一態様では、本発明のサイクル閾値アッセイを使用して、試料中のＭＲＳＡを検出し、分析する。本明細書に使用する「ＭＲＳＡ」という用語は、機能的ｍｅｃＡ遺伝子を含むブドウ球菌カセット染色体ｍｅｃ（ＳＣＣｍｅｃ）元素を獲得することによって抗生物質メチシリンの効果に耐性である、黄色ブドウ球菌の任意の菌株または亜株を指す。例示的なＭＲＳＡＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＣ＿０２７４５に記載する。
【００３６】
メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の菌株は、ｍｅｃＡ遺伝子を保有するブドウ球菌カセット挿入（ＳＣＣｍｅｃ）元素の獲得により、ＭＲＳＡ菌株になることが明らかになっている。このカセットは、概して、他のブドウ球菌および非ブドウ球菌から得られるが、これに限定されるわけではない。ｍｅｃＡ遺伝子は、特定のブドウ球菌株のメチシリン耐性特性を提供する。ｍｅｃＡ遺伝子は、細胞がβラクタム抗生物質に曝露されるときに、正常なＰＢＰの生合成機能を引き継ぐ、βラクタム耐性ペニシリン結合タンパク質（ＰＢＰ）をコード化する。
【００３７】
１つの例示的な実施形態では、本発明は、（ｉ）ｍｅｃＡ遺伝子座、（ｉｉ）黄色ブドウ球菌特異的遺伝子座位、および（ｉｉｉ）ＳＣＣｍｅｃ領域の３′端部とｏｒｆＸ遺伝子との間の「架橋領域」の座位からの、ポリヌクレオチド配列の増幅（本明細書で「断片」とも称される）の方法および組成物を提供し得る。本実施形態では、試料が、架橋領域のプライマーのいずれかによって、検出不可能なＭＲＳＡ菌株を含む場合（つまり、以前に特定および／または配列されなかった、新たに発生する菌株である）、ｍｅｃＡ増幅産物および黄色ブドウ球菌に特異的な増幅産物は、サイクル数と同一または実質的に同一で、（例えば、それぞれの方向で３サイクル以上離さず）出現する。
【００３８】
ｍｅｃＡ断片およびブドウ球菌特異的遺伝子断片が、実質的に異なるサイクル数（例えば、いずれか一方に４サイクル以上離れている）で出現する場合は、これは、試料が、黄色ブドウ球菌および別のメチシリン耐性細菌の両方を含み、これらの濃度において、少なくとも１０倍の差異を有する、混合された細菌試料であることを示す。出現のサイクル数におけるこの差異は、概して、細菌集団の両方から増幅されるｍｅｃＡ断片の結果であり、黄色ブドウ球菌特異的遺伝子断片は、黄色ブドウ球菌からのみ増幅され得る。
【００３９】
別の例示的な実施形態では、本発明のサイクル閾値アッセイは、（ｉ）ｍｅｃＡ遺伝子座、（ｉｉ）黄色ブドウ球菌特異的遺伝子座位、および（ｉｉｉ）ＳＣＣｍｅｃ元素を含まない、ＭＳＳＡ細菌のＳＣＣｍｅｃ挿入部位周辺のｏｒｆＸ領域（本明細書では、「ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ領域」と呼ぶ）からの断片の増幅の方法および組成物を提供する。本実施形態では、ブドウ球菌特異的断片が、ＭＳＳＡｏｒｆＸ領域断片よりも４サイクル以上早く出現する場合は、これは、試料がＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ細菌の両方の混合物を含み、これらの濃度において、少なくとも１０倍の差異を有することを示す。その根拠は、ｏｒｆＸ遺伝子断片が、ＭＳＳＡ細菌からのみ増幅された配列を反映し、ブドウ球菌特異的断片が、組み合わされたＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ細菌から増幅された配列を反映することである。
【００４０】
別の実施形態では、ブドウ球菌特異的断片が、実質的に、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ遺伝子断片と同一のサイクル（つまり、いずれかの方向に３サイクル以上離れない）で出現する場合は、試料が、ＭＲＳＡを含まない代わりに、ＭＳＳＡ細菌および非ｍｅｃ耐性ブドウ球菌の混合物を含むことを示す。これは、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ増幅産物およびブドウ球菌特異的増幅産物の両方が、試料中のＭＳＳＡにのみ由来するためである。また、試料中のｍｅｃ耐性細菌の濃度が、試料中のＭＳＳＡ細菌の濃度よりも、少なくとも１０倍異なる場合は、ｍｅｃＡは、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸおよびブドウ球菌特異的断片からの個々の集団から増幅されるため、ｍｅｃＡは、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸおよびブドウ球菌特異的断片から、少なくとも４サイクル離れたサイクル数で出現する。
【００４１】
ＭＳＳＡおよび非メチシリン耐性ブドウ球菌が、同様の濃度で試料中に存在する珍しい場合では、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸおよびブドウ球菌特異的断片の両方は、ＭＳＳＡのみに由来する増幅された配列を反映し、互いから実質的に同一のサイクル数（例えば、３サイクル以上離れない）で出現するはずである。また、ｍｅｃＡ断片が、同様の濃度の非メチシリン耐性ブドウ球菌のみに由来する増幅された配列を反映するため、他の２つの断片と実質的に同一のサイクル数（例えば、３サイクル以上離れない）でも出現するはずである。
【００４２】
本発明に従い、サイクル数分析は、手動で、またはそのような目的のために設計された器具およびソフトウエアを使用して実施し得る。本発明のサイクル数分析を実施するための手動化および自動化方法は、当該技術において周知であり、本明細書にさらに記載する。
【００４３】
一実施形態では、サイクル閾値アッセイ内のすべての増幅反応は、試料の同一のアリコート中で実施される。別の実施形態では、１つ以上の増幅反応が、試料の異なるアリコート中で実施される。
【００４４】
以下は、抗生物質耐性細菌を検出するために、サイクル閾値アッセイ、ならびに本明細書に記載する他のアッセイに使用することができる、プライマーの特質をより詳細に記載する。
ｍｅｃＡを対象としたプライマー
【００４５】
一態様では、ブドウ球菌ゲノムのｍｅｃＡ領域を対象としたプライマーを、本発明のサイクル閾値アッセイに提供する。本明細書に使用する、特定の領域、またはポリヌクレオチド配列を「対象とした」プライマーは、概して、特定の領域、またはポリヌクレオチド配列を増幅することが可能なプライマーを指す。一実施形態では、そのようなプライマーは、特定のゲノム領域またはポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする、および／またはこれらにアニールすることができる。これらのプライマーは、特定のゲノム領域、またはポリヌクレオチド配列に完全に相補的であり得る、もしくは、これらは、より少ない相補性を有するにも関わらず、それでもなお、適切な領域にアニール／ハイブリダイズし、増幅反応の開始点となることが可能である。本発明のプライマーは、ハイブリダイゼーション反応におけるプローブとしても使用し得る。
【００４６】
一実施形態では、本発明のｍｅｃＡプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５２５９３に記載されているとおり、ｍｅｃＡ遺伝子にハイブリダイズすることができる。さらなる実施形態では、本発明のｍｅｃＡプライマーは、配列番号１０〜１１で示す配列を有する。
【００４７】
一実施形態では、本発明に従い使用したｍｅｃＡ領域を対象としたプライマーは、配列番号１０〜１１と１００％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、プライマーは、配列番号１０〜１１と、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性を有する。
ＳＣＣｍｅｃとｏｒｆＸとの間の架橋領域を対象としたプライマー
【００４８】
一態様では、本発明の方法は、ＳＣＣｍｅｃの３′末端と、ｏｒｆＸ遺伝子の隣接する結合領域との間の架橋領域を対象としたプライマーを使用する。
【００４９】
高度な多型性が、ＳＣＣｍｅｃの３′末端およびｏｒｆＸ遺伝子の隣接する結合領域の両方に存在し、それが、ＭＲＳＡの少なくとも３９個の異なる菌株の分化の原因となることは理解されるであろう。例えば、ＭＲＳＡのタイプＩＩＩの菌株は、ＳＣＣｍｅｃに独自のヌクレオチド配列を有し、タイプＩＩは、Ｈｕｌｅｔｓｋｙら（米国特許第２００５００１９８９３号）によって、さらに詳しく記載される、ＳＣＣｍｅｃの右終端部への１０２ヌクレオチドの挿入を有する。ＭＲＳＡの異なる菌株に関する配列情報は、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  （２００１），  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５：１３２３−１３３６、Ｈｉｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９６），  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２：１１７−１２９、およびＭａ  ｅｔ  ａｌ，（２００２），  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４６：１１４７−１１５２、ならびに、Ｈｕｌｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，（米国特許第２００５００１９８９３号）で、見つけることができ、これらのすべては、すべての目的のため、および、特に、ＭＲＳＡの異なる菌株の配列に関する教示のために、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
したがって、本発明は、最も広い宿主域の菌株（タイプＩ−ＩＶ）および新たに発生する菌株を含む、ＭＲＳＡの異なる菌株における架橋領域を検出することが可能な、プライマーのバッテリー（本明細書において、架橋プライマーとも称される）の使用を検討する。
【００５１】
架橋領域を対象とした例示的なプライマーを、配列番号２〜８で示す。一実施形態では、少なくとも２つの架橋プライマーを、本発明のアッセイに使用する。さらなる実施形態では、少なくとも５つの架橋プライマーを、本発明のアッセイに使用する。またさらなる実施形態では、約３〜約３０、約５〜約２５、約７〜約２０、約９〜約１５、および約１０〜約１２個の架橋プライマーを、本発明に従い、使用する。
【００５２】
一実施形態では、架橋領域を対象としたプライマーは、配列番号２〜８と、１００％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、プライマーは、配列番号２〜８と、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性を有する。
ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸを対象としたプライマー
【００５３】
本明細書に記載する一態様では、本発明は、ＳＣＣｍｅｃ元素を含まないＭＳＳＡ細菌で独自に見られる、ＳＣＣｍｅｃ挿入部位周辺のｏｒｆＸ領域を対象としたプライマーセットを使用して、座位を増幅させるアッセイを提供する。この領域は、本明細書において、「ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ」とも称される。ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸを含むＤＮＡ断片を増幅することが可能な例示的なプライマーを、配列番号２および２４で示す。
黄色ブドウ球菌特異的座位を対象としたプライマー
【００５４】
ＭＲＳＡ等の急速に進行する細菌の従来の検出方法の主要な弱点は、１つまたは２つの座位の増幅が、特に試料が、標的細胞の新たに発生する菌株を含むときに、偽陰性を生じる得ることである。１つの例示的な態様では、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的座位を含む３つの異なる座位の増幅を介し、そのような偽陰性を回避する方法および組成物を提供する。一実施形態では、黄色ブドウ球菌特異的座位は、細菌ゲノムのｏｒｆＸまたは架橋領域内ではない。黄色ブドウ球菌特異的遺伝子の例には、ｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢが含まれるが、これらに限定されない。ｎｕｃポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ断片を増幅することが可能な例示的なプライマーは、配列番号１８および１９で示す。Ｓａ４４２ポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ断片を増幅することが可能な例示的なプライマーを、配列番号１３および１４で示す。
【００５５】
一態様では、第３の黄色ブドウ球菌特異的座位の増幅により、ＭＲＳＡの最も広宿主域の菌株だけでなく、新たに発生する菌株を含む、ＭＲＳＡの他の菌株も検出する、サイクル閾値アッセイの精度を依然として保持しながら、ＳＣＣｍｅｃとｏｒｆＸとの間の架橋領域を対象としたプライマー（例えば、配列番号２〜８のプライマー）の使用をより少なくすることが可能になる。架橋プライマーを単独に使用して、そのような高精度を達成することは、膨大な数の付加的な架橋プライマーの使用を必要とする可能性があり、その結果、多重ＰＣＲ反応の有効性および効率を減少し得る。
内部対照として使用するプライマー
【００５６】
本発明は、ＰＣＲ反応成分（つまり、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド等）の能力を確認し、ＤＮＡ抽出法が、偽陰性をもたらし得るいかなるＰＣＲ阻害物も含まないことを確認するための、内部対照も含み得ることを理解されるものとする。したがって、本発明は、細菌ゲノムの標的領域に無関係のポリヌクレオチド配列の増幅を含む、アッセイを提供する。例えば、ハウスキーピング遺伝子に関連したもの、またはβグロビン等のよく特徴付けられた遺伝子等のヒトポリヌクレオチド配列を、本発明のアッセイに、内部対照として使用し得る。内部対照として使用し得る例示的なプライマーを、配列番号１６および１７で示す。
【００５７】
一実施形態では、そのような内部対照の座位の増幅反応を、本発明のサイクル閾値アッセイの他の増幅反応と同一の試料のアリコート中で実施する。別の実施形態では、内部対照増幅反応を、サイクル閾値アッセイの他の増幅反応と異なる試料のアリコート中で実施する。
サイクル閾値アッセイ：バンコマイシン
【００５８】
メチシリン耐性細菌の検出および分析について上述のとおり、本発明は、バンコマイシンを含む、他の抗生物質耐性細菌の検出および分析の同様の方法および組成物を含む。
【００５９】
多くの種類の抗生物質耐性の場合のように、バンコマイシン耐性は、機能的ｖａｎ遺伝子を含む元素の細菌ゲノム内への挿入により与えられる。本発明のサイクル閾値アッセイを使用して、ｖａｎ遺伝子の少なくとも一部を含む、細菌ゲノム領域の検出を介して、バンコマイシン耐性である細菌を検出および分析することができる。１つの例示的な実施例では、本発明のサイクル閾値アッセイは、ｖａｎ遺伝子領域を増幅することが可能なプライマーを使用する。そのようなプライマーは、本明細書に記載し、当該技術において周知の方法に従い、設計される。１つの例示的な実施例では、そのようなプライマーは、ｖａｎ遺伝子の一部に相補的であり得る。別の例示的な実施例では、そのようなプライマーは、ｖａｎ遺伝子領域の外側のポリヌクレオチド配列に相補的であり得るにも関わらず、ｖａｎ遺伝子領域を増幅することが可能である。ｖａｎ遺伝子領域は、当該技術において周知であり、バンコマイシン耐性は、例えば、ｖａｎＡ、ｖａｎＢ１、およびｖａｎＢ２を含む、多くの遺伝子によって与えられる。
【００６０】
さらなる実施形態では、本発明のサイクル閾値アッセイは、ｖａｎ、ならびに細菌ゲノム内の他の２つの座位を増幅することが可能なプライマーを使用する。そのような実施形態において増幅された他の２つの座位には、ｖａｎ領域と挿入ポイントとの間の架橋領域、ならびに、種および／または菌株に特異的な細菌ゲノム領域が含まれ得る。例示的な架橋領域のポリヌクレオチド配列については、Ｌａｕｎａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００６）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ５０（３）：１０５４−６２を参照し、これは、すべての目的のために、および特にバンコマイシン耐性細菌の菌株における標的ポリヌクレオチド配列の開示のために、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれ、これらの一部は、配列番号２５〜３８として図１に記載される。図１に記載するプライマーの配列に相補的なプライマーは、本明細書に開示する、サイクル閾値アッセイ、および本発明の三重座位アッセイに使用し得る。一部の実施形態では、そのようなプライマーは、図１に記載する配列（配列番号２５〜３８）と、１００％の配列同一性を有する。さらなる実施形態では、プライマーは、配列番号２５〜３８と、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性を有する。
【００６１】
本発明の方法に従い、増幅することが可能な別の座位は、獲得したバンコマイシン耐性を有する特定の細菌種または細菌株に特異的な遺伝子座位である。例えば、バンコマイシン耐性は、黄色ブドウ球菌、オルスコビア・ツルバタ、アルカノバクテリウム・ヘモリティクム、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・ガロリティカス、ストレプトコッカス・ルテティエンシス、バチルス・サーキュランス、パエニバチルス、ロドコッカス、エンテロコッカスの菌株、ならびにクロストリジウム属、およびエガセラ・レンタに属する嫌気性細菌内で検出されている。本発明のサイクル閾値アッセイには、これらの菌株に特異的な遺伝子および座位を増幅することが可能なプライマーが含まれ得る。したがって、菌株特異的座位を対象としたプライマーを、架橋領域およびｖａｎ遺伝子を対象としたプライマーと共に、本明細書に記載のサイクル閾値アッセイを使用して、試料中のバンコマイシン耐性細菌の存在を検出し、試料中のバンコマイシン耐性細菌種および／または細菌株を特定することができる。
三重座位アッセイ
【００６２】
本発明の三重座位アッセイは、サイクル閾値アッセイについて本明細書に記載する増幅反応と同様の増幅反応を使用する。本発明の三重座位アッセイでは、３つの異なる座位を対象としたプライマーを、増幅反応に使用して、３つの座位のうちのどれが、試料中に存在するかを判断する。検出された座位の組み合わせは、抗生物質耐性細菌の菌株が、試料中に存在するかどうかの情報を提供する。さらなる実施形態では、検出された座位の組み合わせは、異なる細菌株および／または細菌種が、試料中に存在するかどうかの情報も提供する。
【００６３】
一態様では、本発明の三重座位アッセイは、（ｉ）抗生物質耐性を与える遺伝子を含む領域、（ｉｉ）抗生物質耐性を与える遺伝子と、その遺伝子を含む元素が一般的に挿入されるゲノム内の地点との間の「架橋領域」、および（ｉｉｉ）菌株特異的遺伝子を含む領域、を増幅する。
【００６４】
１つの例示的な態様では、本発明は、ＭＲＳＡと試料中の細菌を保有する他のｍｅｃＡ遺伝子とを識別するのに使用し得る、三重座位アッセイを提供する。本発明の三重座位アッセイは、偽陰性または偽陽性結果をもたらす可能性がより低いため、試料中のＭＲＳＡを検出するために従来使用されていた方法よりも利点を有する。また、本発明のアッセイは、新たに出現するＭＲＳＡの菌株を特定し、これらの菌株を、他の黄色ブドウ球菌種と識別することが可能である。
【００６５】
一態様では、本発明の三重座位アッセイは、（１）ｍｅｃＡ領域の少なくとも一部、（２）ｏｒｆＸ配列の少なくとも一部、および（３）ｏｒｆＸではないブドウ球菌特異的遺伝子の少なくとも一部である、細菌ゲノムの３つの異なる座位を増幅させる、方法および組成物が含まれる。一実施形態では、これらの座位からのポリヌクレオチド配列を、細菌ゲノムのこれらの領域を対象とした、本明細書に記載するプライマー等のプライマーを使用して増幅させる。別の実施形態では、３つの座位の１つ以上の増幅産物を、これらの領域にハイブリダイズすることが可能なプローブを使用して検出する。そのようなプローブは、増幅反応に使用するプライマーと同一または異なる配列を有し得、当該技術において既知の方法を使用して、これらの座位の存在を検出するために使用することができる。
【００６６】
一態様では、本発明の三重座位アッセイで検出された３つの座位の組み合わせは、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうか、ｍｅｃＡを保有する非黄色ブドウ球菌が試料中に存在するかどうか、およびＭＳＳＡが試料中に存在するかどうかの情報を提供する。さらなる態様では、三重座位アッセイは、試料中に存在するＭＲＳＡの菌株が、新たに出現した菌株であるかどうか特定する。
【００６７】
アッセイで調べた３つの座位の、本発明の１つの例示的な態様に従い、２つのＤＮＡ配列（ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列を含む第１の配列、および架橋領域を含む第２の配列）を増幅させる。両配列の検出は、試料中に存在する黄色ブドウ球菌が、ＳＣＣｍｅｃおよびｍｅｃＡ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌を含み、メチシリンに耐性である可能性が高いことを示す。ｍｅｃＡ配列のみの検出は、試料が、ｍｅｃＡ遺伝子を保有する非黄色ブドウ球菌の１つ以上の菌株を含み、メチシリン耐性である可能性が高いことを示す。架橋配列のみの検出は、ｍｅｃＡ遺伝子（つまり、ＭＳＳＡ）を含む、ＭＲＳＡタイプのＳＣＣｍｅｃを含まない黄色ブドウ球菌が、試料中に存在することを示す。以下の表１は、本発明の本態様による三重座位アッセイの、起こり得る結果の概要の一部を示す。
【表１】
2014023539.tif 000003
【００６８】
図１に見られるように、「Ａ」、「Ｃ」、または「Ｄ」の結果の場合には、明確な結論が得られ、さらなる分析は不要であり、「Ａ」の結果の場合には、試料がＭＲＳＡを有すると推定することができる。「Ｃ」または「Ｄ」の結果の場合には、試料は、ＭＲＳＡを含まない可能性が高いと推定することができる。しかしながら、Ｂの結果の場合には、いかなる精度でも推論することはできない。そのような不明瞭な結果の場合には、本明細書に記載する、サイクル閾値アッセイを使用して、試料中に存在する細菌をさらに特定することができる。
【００６９】
別の例示的な態様では、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列、ｏｒｆＸ遺伝子ではない黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列（本明細書において、「ＳＡ」とも称される）、およびＳＣＣｍｅｃ元素を含まないメチシリン感受性黄色ブドウ球菌内に見られ得る、ＳＣＣｍｅｃの統合部位周辺のｏｒｆＸ遺伝子のｏｒｆＸポリヌクレオチド配列（本明細書において、「ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ」とも称される）の座位を増幅する方法および組成物を提供する。第３の配列の非検出を伴う最初の２つの配列の検出は、試料が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（つまり、ＭＲＳＡ）を含むことを示す。ｍｅｃＡ配列の非検出を伴うＳＡ特異的配列およびＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ配列の検出は、試料が、非メチシリン耐性である黄色ブドウ球菌（つまり、ＭＳＳＡ）を含むことを示す。ｍｅｃＡおよびＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ配列の検出、ならびに、ＳＡ配列の欠失は、試料が、変異したＭＳＳＡを含み、黄色ブドウ球菌以外のメチシリン耐性細菌をも含むことを示す。領域のうちのひとつの増幅産物の検出、および他の２つの領域からの増幅産物の欠失は、試料が、ＭＲＳＡを含まないことを示す。
【００７０】
本発明の三重座位アッセイにおける、それぞれの座位の増幅反応は、同一の管内（つまり、試料の単一のアリコートを使用して）、または、２つ以上の個別の管内（つまり、試料の第２のおよびまたは第３のアリコートを使用して）で、実施し得る。１つの例示的な実施例では、３つの配列のすべての増幅を、同一の管内で同時に（つまり、多重反応として）実施する。
【００７１】
以下の表２は、本発明の本態様によりアッセイの、起こり得る結果の概要の一部を提示する。
【表２】
2014023539.tif 000004
【００７２】
表２に見られるように、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」、「Ｆ」、または「Ｇ」の結果の場合には、明確な結論が得られ、さらなる分析は不要であり、「Ａ」の結果の場合には、試料がＭＲＳＡを含むことを推測することができる。「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」、「Ｆ」、または「Ｇ」の結果の場合には、試料が、ＭＲＳＡを含む可能性が高いことを推測することができる。しかしながら、Ｈの結果の場合には、混合試料は、ＭＳＳＡおよび、ｍｅｃＡ遺伝子を保有する１つ以上の細菌株を含むことは明らかであるが、メチシリン耐性細菌が、ＭＲＳＡ、非黄色ブドウ球菌、または両方を反映するかどうかは不明である。Ｈの結果等の不明瞭な結論の場合には、本発明のサイクル閾値アッセイを使用して、試料中に存在する細菌を特定することができる。
【００７３】
一実施形態では、本発明の三重座位アッセイを使用して、試料中の細菌の異なる株を識別することができる。図２に示すとおり、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ細菌を、架橋領域、ｍｅｃＡ遺伝子領域、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列（本実施形態では、ｎｕｃ遺伝子）、およびヒトベータグロビンポリヌクレオチド配列（内部対照として使用される）を対象とした増幅反応の産物の検出に基づき、識別することができる。ＭＲＳＡ試料中では、４つの増幅産物のすべてが検出された。一方、ＭＳＳＡ試料中では、黄色ブドウ球菌特異的および内部対照のヒトベータグロビンポリヌクレオチドのみが検出された。
【００７４】
同様に、図３は、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−ＣｏＮＳ）とメチシリン感受性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＳ−ＣｏＮＳ）を識別するアッセイの結果を示す。さらに、これらの実験では、増幅反応は、架橋領域、ｍｅｃＡ遺伝子領域、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列（本実施形態では、ｎｕｃ遺伝子）、およびヒトベータグロビンポリヌクレオチド配列（内部対照として使用する）を対象とした。この場合、ＭＲ−ＣｏＮＳを含む試料で、ｍｅｃＡ遺伝子ポリヌクレオチド配列および内部対照ポリヌクレオチド配列が検出され、ＭＳ−ＣｏＮＳを含む試料中で、内部対照ポリヌクレオチド配列のみが検出された。したがって、本発明のアッセイは、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、およびＭＳ−ＣｏＮＳ細菌とを識別する能力を提供する。
三重座位アッセイの利点
【００７５】
本明細書に記載するとおり、本発明の三重座位アッセイは、抗生物質耐性細菌を検出する従来の方法よりも正確である。特に、三重座位アッセイは、二重座位または単一座位アッセイと比較すると、偽陽性および陰性結果をもたらすことが非常に少ない。
【００７６】
一般的に、ｍｅｃＡ遺伝子および黄色ブドウ球菌特異的染色体配列の検出に基づく二重座位アッセイ（例えば、Ｒｅｉｓｃｈｌｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３８：２４２９―２４３３を参照）は、ｍｅｃＡ遺伝子が、黄色ブドウ球菌およびＣｏＮＳ種の両方に広く分布するため、ＭＲＳＡを、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−ＣｏＮＳ）と識別する上で、問題に直面することが多い。９０％以上の鼻腔用スワブがブドウ球菌（通常、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）を含み、７０〜８０％のＣｏＮＳが、ＭＲ−ＣｏＮＳであるため（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  （２００６），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４４：２２９−２３１、Ｄｉｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ，（２００１），  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ３２（Ｓｕｐｐｌ．  ２）：Ｓ１１４−Ｓ１３２）、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳを含む多くの混合群の試料は、誤ってＭＲＳＡと特定され得る。その結果、二重座位アッセイは、低陽性予測値（ＰＰＶ）を有する、高確率の偽陽性ＭＲＳＡにより特徴付けられ、通常、混合細菌群を潜在的に含む標本に適用することができない。
【００７７】
単一座位アッセイは、二重座位アッセイにおける上述の難点を克服することが示唆されている。単一座位アッセイは、一般的に、黄色ブドウ球菌特異的ｏｒｆＸ遺伝子に隣接して挿入される、ＳＣＣｍｅｃ元素の右端の検出に基づく（例えば、Ｈｕｌｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，  （２００４）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２：１８７５−１８８４を参照）。しかしながら、ＭＲＳＡの新しい菌株は、この接合の両側に、突然変異で絶えず発生する（Ｈａｎｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４），  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ４８：２８５−９６、Ｓｕｎｄｓｆｊｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４），ＡＰＭＩＳ，１１２：８１５−８１３７、Ｗｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５），Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．，２４：１−５）。そのようなものとして、ＭＲＳＡの単一座位アッセイは、偽陰性によって特徴付けられる。さらに、単一座位アッセイは、ｍｅｃＡ遺伝子を含むＳＣＣｍｅｃ元素と、ｍｅｃＡ遺伝子を保有しないＳＣＣｍｅｃとを識別することができない。
【００７８】
Ｈｉｒａｍａｔｓｕら（米国特許第６，１５６，５０７号）は、ＳＣＣｍｅｃ挿入がない場合の、ＳＣＣｍｅｃの統合部位周辺のｏｒｆＸ遺伝子の増幅を検出するように設計された、単一座位アッセイを記載する。Ｈｉｒａｍａｔｓｕらのアッセイでは、陰性所見は、ＭＲＳＡの存在を示すと解釈される。陰性所見は、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡのいずれも含まない患者の試料からも得ることが出来るため、陰性結果に基づくアッセイは、ＭＲＳＡの存在を判断するのに不十分な方法である。さらに、Ｈｉｒａｍａｔｓｕらが指摘するように、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合物を含む患者の試料は、これらの試験において陽性結果をもたらし、誤ってＭＲＳＡが存在しないと解釈され得る。また、研究により、Ｈｉｒａｍａｔｓｕの単一座位アッセイは、Ｉ−Ｖ以外のＳＣＣｍｅｃタイプを含むＭＲＳＡ菌株を反映する臨床試料から、正確にＭＲＳＡを検出できなかったため、臨床妥当性に欠けることが明らかになった（例えば、Ｈａｎｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４），  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ４８：２８５−９６、Ｓｕｎｄｓｆｊｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５），ＡＰＭＩＳ，  １１２：８１５−８１３７，２００４、Ｗｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００５），Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．，２４：１−５を参照）。
【００７９】
単一座位アッセイの別の弱点は、そのようなアッセイが、ｍｅｃＡ遺伝子を保有するＳＣＣｍｅｃ元素（ＭＲＳＡ）を含む細菌かｍｅｃＡ遺伝子を保有しないＳＣＣｍｅｃ元素（複数のＭＳＳＡ菌株に存在するＳＣＣｃａｐ等）を含む細菌かを識別することができず、したがって、偽陽性を生じる得ることである。したがって、ｍｅｃＡ遺伝子を含まないＳＣＣ元素を保有するＭＳＳＡを含む試料の単一座位アッセイは、偽陽性を生じ得る。偽陽性所見の可能性は、感染対策プログラムの一部として患者を検査する信頼性のある方法としての、単一座位アッセイの臨床的有用性を損ねる。実際に、単一座位アッセイを使用する多くの研究は、擬似−ＭＲＳＡとして、偽陽性を表すＭＳＳＡの臨床例を報告する（Ｒｕｐｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２００６，  ４４：２３１７、Ｄｅｐｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０００，  ４６：６１７−６２０、Ｃｏｒｋｉｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００４，  ５４：２２９−２３１、Ｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｃｌｉｎｉ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２９：１１２８−１１３２、Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．  ４２：５５７８−５５８１）。
【００８０】
三重座位アッセイおよびサイクル閾値アッセイの両方を含む、本発明の方法は、ＭＲＳＡ等の抗生物質耐性細菌を検出する従来の方法よりも、精度が向上したことを示す。実施例３に図示するように、本発明の三重座位アッセイは、上述、ならびに実施例１および２に記載した単一または二重座位アッセイのいずれよりも大幅に向上した精度を表し、９９．６％の感度および９７．４％の特異性であることを示した。
増幅および検出の方法
【００８１】
本発明のサイクル閾値および三重座位アッセイの両方には、ゲノムの選択した領域を増幅することが可能なプライマーを使用する、増幅反応が含まれる。「増幅することが可能」という用語は、細菌ゲノムの選択した領域を含む増幅産物を生成することが可能なプライマーを記載する。選択した領域を増幅することが可能なプライマーには、標的領域内の配列に相補的であるプライマーが含まれる。選択した領域を増幅することが可能なプライマーには、標的領域の少なくとも一部に重なる領域に相補的であるプライマー、ならびに標的領域の外側の領域に相補的であるにもかかわらず、標的領域を含む増幅産物を生成することが可能なプライマーも含まれる。そのようなプライマーは、当該技術において確立されている方法を使用して設計し得ることを理解されたい。
【００８２】
本発明のアッセイに使用する増幅方法には、ポリヌクレオチド配列の標的部分を増幅することが可能な任意の方法が含まれる。そのような増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および分枝ＤＮＡシグナル増幅（ｂＤＮＡ）を含むが、これらに限定されない、増幅方法が含まれる。
【００８３】
一実施形態では、ＰＣＲを、本発明のアッセイの増幅方法として使用する。ＰＣＲは、相補的核酸鎖にハイブリダイズし、標的ＤＮＡ内で増幅される領域に隣接する、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、特異的ＤＮＡ配列の酵素合成の試験管内技術である。（１）鋳型変性、（２）プラマーアニーリング、および（３）ＤＮＡポリメラーゼによるアニールしたプライマーの拡張を含む、一連の反応工程は、特異的断片の末端が、プライマーの５′末端によって定義される、特異的断片の指数関数の蓄積をもたらす。
【００８４】
本明細書に使用する、「ＰＣＲ」という用語には、誘導型の反応が含まれ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ等を含むが、これらに限定されない。反応体積は、約１００ナノリットル（ｎｌ）〜約５００マイクロリットル（μｌ）、約２００ｎｌ〜約２５０μｌ、約５００ｎｌ〜約２００μｌ、約１μｌ〜約１００μｌ、約１０μｌ〜約８０μｌ、約２０μｌ〜約６０μｌ、約５〜約３０μｌ、約１０〜約２５μｌ、約３０μｌ〜約４０μｌの範囲であってもよい。
【００８５】
「リアルタイムＰＣＲ」は、反応の進行に応じて反応産物の量、つまり単位複製配列が、監視されるＰＣＲ方法を指す。主に反応産物を監視するために使用する検出化学によって、多くの異なる形態のリアルタイムＰＣＲがあり、例えば、Ｇｅｌｆａｎｄら、米国特許第５，２１０，０１５号（「Ｔａｑｍａｎ（登録商標）」、Ｗｉｔｔｗｅｒら、米国特許第６，１７４，６７０号および第６，５６９，６２７号（ＳＹＢＥＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ等の挿入染料）、Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号（分子指標）があり、これらのすべては、すべての目的により、および特にリアルタイムＰＣＲに関する教示で参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。他の例示的な検出化学には、サソリプライマー、サンライズプライマー、およびエクリプスプローブが含まれるが、これらに限定されない。リアルタイムＰＣＲの検出化学は、Ｍａｃｋａｙら、（２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ，  ３０：１２９２−１３０５で検討され、これは、すべての目的のため、および特にリアルタイムＰＣＲの異なる検出化学の開示のため、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８６】
「多重ＰＣＲ」は、複数の配列が、同一の反応混合物内で同時に増幅されるＰＣＲを指す（多色リアルタイムＰＣＲ）。概して、そのような方法では、増幅されるそれぞれの配列に異なるプライマーを使用する。
【００８７】
「定量ＰＣＲ」は、試料または標本中の１つ以上の特異的標的配列の存在量を測定するように設計されたＰＣＲを指す。定量ＰＣＲには、そのような標的配列の絶対定量および相対定量の両方が含まれる。定量測定は、標的配列と別個に、またはそれと一緒に分析し得る、１つ以上の参照配列を使用して行う。参照配列は、試料または標本に内因性または外因性であり得、後者の場合では、１つ以上の競合鋳型を含み得る。典型的な内因性参照配列には、βアクチン、ＧＡＰＤＨ、β２ミクログロブリン、リボソームＲＮＡ等の遺伝子の転写物の断片が含まれる。定量ＰＣＲの技術は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる、以下の文献に例示されるとおり、当該技術の当業者に周知である。すなわち、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：１１２−１２６、Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １７：９４３７−９４４７、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１：２６８−２７９、Ｄｉｖｉａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９２）  Ｇｅｎｅ，１２２：３０１３−３０２０。
【００８８】
本発明の方法において、一般的に使用される増幅方法は、反応のそれぞれのサイクルにおける鋳型の増幅の開始点として、プライマーを使用する。そのような反応では、プライマーは、鋳型（本明細書において「標的」とも称される）ポリヌクレオチド上の相補的部位にアニールし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を使用して、鋳型ポリヌクレオチドの配列に沿って、プライマーを伸展させる。プライマーは、典型的に、約５〜約５０、約１０〜約４０、約１２〜約３０、約２０〜約２５個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーの長さは、典型的に、プライマーが、最適な選択で、標的ポリヌクレオチド配列に結合するように、選択される。
【００８９】
概して、プライマーは、「順方向」プライマーおよび「逆方向」プライマーに相補的である鋳型ポリヌクレオチドの領域との間に位置する関心対象の増幅と共に、これらのプライマーを含む組として使用される。適切なＰＣＲプライマーの組の設計および選択は、当該技術の当業者に周知のプロセスである。特異的な組のプライマー選択の自動化法も、当該技術においても周知であり、例えば、米国特許出願第２００３００６８６２５号を参照されたい。一実施形態では、一組の増幅プライマーは、２つのプライマーとの間の距離（つまり、増幅の長さ）が、少なくとも５塩基対であるように、選択することができる。別の実施形態では、プライマーは、距離が、約５〜約５０、約１０〜約４０、および約２０〜約３０の塩基対であるように選択される。一実施形態では、リアルタイムＰＣＲ方法から生じた単位複製配列は、約５０〜約４００ｂｐ、約７５〜約３００、約１００〜約２００、および約１８０〜約４００ｂｐである。
【００９０】
一態様では、増幅反応の産物は、標識プライマーを使用して検出される。別の態様では、そのような産物は、鋳型核酸の特定の領域を対象としたプローブを使用して検出される。本発明のさらに別の態様では、アッセイは、分子指標ベースのアッセイである。分子指標は、均一溶液中の特異的核酸の存在を報告する、ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブである。これらが、標的物に結合するとき、内部消光されたフルオロフォアの蛍光を修復する立体配座の再構成を行う（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １６：４９）。本発明のアッセイに使用し得る例示的なプローブ配列を、配列番号１、９、１２、１５、および２０で示す。
キット
【００９１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載するアッセイを実施するためのコンポーネントを含む、キットを提供する。
【００９２】
一実施形態では、本発明は、リアルタイム増幅アッセイに使用するための反応混合物含む、キットを提供する。そのような反応混合物は、１つ以上の容器（ＰＣＲ機械で使用する管等）内で反応を実施するためのすべてのコンポーネントを含む、安定化した混合物であってもよい。例示的な実施形態では、そのような安定化した反応混合物には、プライマー、蛍光標識されたプローブが含まれる。さらなる実施形態では、そのような混合物は、室温で保管できるように、安定化される。
【００９３】
本発明のキットには、抗生物質耐性細菌を検出し、分析するための本発明のアッセイに使用するプライマーを含み得ることを理解するものとする。一実施形態では、本発明のキットには、ＭＲＳＡの特定に使用するプライマーが含まれる。本発明のキットは、必要に応じて、本発明の１つ以上の単位のキットを含み得るパックとして提供され得る。パックには、キットの使用手順が添付され得る。パックには、実験補遺の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって定められた形状の容器に関連する通知も提供され得、その通知は、機関による組成物の形状の承認を反映する。
【００９４】
本発明のキットは、本明細書に記載するとおり、ｍｅｃＡおよび架橋領域からポリヌクレオチド配列を増幅するプライマーを含み得る。キットは、黄色ブドウ球菌特異的遺伝子のポリヌクレオチド配列を増幅するプライマー、および例えば、ヒト遺伝子をコード化し得る、内部対照として使用する領域を増幅するプライマーも含み得る。キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、マグネシウム、バッファ、および安定剤を含むがこれらに限定されない、ＰＣＲ反応の他のコンポーネントも含み得る。
【００９５】
一実施形態によれば、本発明のキットには、上述のとおり、ＰＣＲ反応のコンポーネントを含む混合物が含まれる。さらなる実施形態では、そのような混合物は、少なくとも５０％脱水される。脱水は、オーブン加熱、凍結乾燥、および真空脱水除去を含むが、これらに限定されない、当該技術において周知の任意の方法により達成され得る。さらなる実施形態によれば、本発明の増幅プライマーおよびプローブの少なくとも１つは、脱水前に、そのようなＰＣＲ反応混合物に組み込まれる。
【００９６】
さらに別の実施形態によれば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤を含む反応成分、ならびに本発明のアッセイに使用される反応プライマーおよびプローブのすべては、少なくとも５０％脱水され、少なくとも４０日間分解せずに、室温で保管することができる、使用準備済みの混合物を形成し得る。そのような混合物は、マイクロ管、マイクロ管ストリップ、またはマルチウェルプレート内で保管し得る。そのような脱水成分を含むキットは、キャリーオーバーの二次汚染または実験誤差のリスクの減少により、訓練および経験が浅い検査技師による使用が可能となる。さらに、本発明のキットは、ドライアイスで梱包する必要なく輸送することができ、それにより、より簡単な配達が可能になる。
【００９７】
本発明のキットの安定化された反応混合物の保存性能の例を、図４に示す。これらの実験では、室温で保管した反応混合物を、５週間および１０週間の保管期間後に分析し、−２０℃で保管した試料と比較した。図４Ａは、ＲＮａｓｅ−Ｐ遺伝子増幅からの結果を示し、図４Ｂは、ヒトベータグロビン遺伝子増幅からの結果を示す。両方の増幅反応では、安定化された（室温保管）混合物は、５週間および１０週間の両方の時点で、−２０℃で保管された反応混合物と同様の結果を示した。
本発明の範囲に含まれる実施形態および組み合わせ
【００９８】
一態様では、本発明は、試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供する。本態様では、該方法には、（ｉ）プライマーが、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第１の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉ）プライマーが、架橋領域の少なくとも一部に相補的である、第２の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉｉ）プライマーが、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列はｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、第３の組のプライマーを提供する工程、（ｉｖ）第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物中の試料と合わせる工程、（ｖ）複数のサイクルの増幅反応を、反応混合物で実施する工程、および（ｖｉ）ｍｅｃＡ、架橋領域、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル数を判定する工程が含まれる。本態様では、サイクル数は、ＭＲＳＡが、試料中に存在するかどうかを示す。
【００９９】
上記に従い、本発明は、第１の組のプライマーが、配列番号１０〜１１のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む方法をさらに提供する。
【０１００】
上述のいずれかに従い、本発明は、第２の組のプライマーが、配列番号２〜８のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む方法をさらに提供する。
【０１０１】
上述のいずれかに従い、本発明は、第３の組のプライマーが、配列番号１３〜１４、および１８〜１９のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む方法をさらに提供する。
【０１０２】
上述のいずれかに従い、本発明は、増幅反応が、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である方法をさらに提供する。
【０１０３】
上述のいずれかに従い、本発明は、試料を、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なプライマーと接触させる工程、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を増幅する工程、および増幅したヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を検出する工程の付加的工程を含む方法をさらに提供する。
【０１０４】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、ｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢから選択された成員である遺伝子の少なくとも一部である方法をさらに提供する。
【０１０５】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、ｎｕｃ遺伝子の少なくとも一部である方法をさらに提供する。
【０１０６】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、Ｓａ４４２遺伝子の少なくとも一部である方法をさらに提供する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供する。本態様では、該方法には、（ｉ）ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、（ｉｉ）架橋領域のポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、および（ｉｉｉ）ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程が含まれる。本態様では、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない。本態様では、ｍｅｃＡポリヌクレオチド、架橋領域のポリヌクレオチド、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドのすべてが、試料中に存在する場合、ＭＲＳＡは、試料中に存在する。
【０１０８】
上記に従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程に試料上の増幅反応を実施する工程が含まれる方法をさらに提供する。この増幅反応は、第１の組のプライマーを使用し、第１の組のプライマーの大半は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。
【０１０９】
上述のいずれかに従い、第１の組のプライマーには、配列番号１０〜１１のうちの少なくとも１つが含まれる。
【０１１０】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程に試料上の増幅反応を実施する工程が含まれ、増幅反応は、第２の組のプライマーを使用し、第２の組のプライマーの大半は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、方法をさらに提供する。
【０１１１】
上述のいずれかに従い、本発明は、第２の組のプライマーが、配列番号２〜８のうちの少なくとも１つを含む、方法をさらに提供する。
【０１１２】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程に試料上の増幅反応を実施する工程が含まれ、増幅反応は、第３の組のプライマーを使用し、第３の組のプライマーの大半は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である、方法をさらに提供する。
【０１１３】
上述のいずれかに従い、本発明は、第３の組のプライマーが、配列番号１３〜１４、および１８〜１９のうちの少なくとも１つを含む、方法をさらに提供する。
【０１１４】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、ｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢから選択される成員である、遺伝子の少なくとも一部である、方法をさらに提供する。
【０１１５】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、ｎｕｃである、方法をさらに提供する。
【０１１６】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、Ｓａ４４２である、方法をさらに提供する。
【０１１７】
上述のいずれかに従い、本発明は、試料を、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的なプライマーと接触させる工程、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を増幅する工程と、増幅したヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列を検出する工程の付加的工程を含む、方法をさらに提供する。
【０１１８】
上述のいずれかに従い、本発明は、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列が、ハウスキーピング遺伝子の少なくとも一部を含む、方法をさらに提供する。
【０１１９】
上述のいずれかに従い、本発明は、ヒト遺伝子ポリヌクレオチド配列が、βグロビン遺伝子の少なくとも一部を含む、方法をさらに提供する。
【０１２０】
上述のいずれかに従い、本発明は、３つのポリヌクレオチド配列のすべてが、同時に検出される、方法をさらに提供する。
【０１２１】
上述のいずれかに従い、本発明は、３つのポリヌクレオチド配列のそれぞれが、試料中に存在するかどうかを判断する工程は、任意の順序で連続して達成される、方法をさらに提供する。
【０１２２】
上述のいずれかに従い、本発明は、３つのポリヌクレオチド配列のそれぞれが、試料中に存在するかどうかを判断する工程は、試料の同一のアリコート中で達成される、方法をさらに提供する。
【０１２３】
上述のいずれかに従い、本発明は、３つのポリヌクレオチド配列のそれぞれが、試料中に存在するかどうかを判断する工程は、試料の異なるアリコート中で達成される、方法をさらに提供する。
【０１２４】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドが試料中に存在し、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが試料中に存在するが、架橋領域のポリヌクレオチドは試料中に存在しない場合、試料は、非メチシリン耐性ブドウ球菌を含む、方法をさらに提供する。
【０１２５】
さらに別の態様において、上述のいずれかに従い、本発明は、試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供する。本態様では、該方法には、（ｉ）第１の組のプライマーが、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第１の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉ）第２の組のプライマーが、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、第２の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉｉ）第３の組のプライマーが、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、第３の組のプライマーを提供する工程、（ｉｖ）第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の試料と合わせる工程、（ｖ）複数のサイクルの増幅反応を、反応混合物で実施する工程、および（ｖｉ）ｍｅｃＡ、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程が含まれる。本態様では、サイクル数は、ＭＲＳＡが、試料中に存在するかどうかを示す。
【０１２６】
上述のいずれかに従い、本発明は、３つの組のプライマーのすべてが増幅反応において増幅産物を生成し、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の出現から少なくとも４サイクル離れたサイクルで発現する場合、試料は、ＭＲＳＡおよびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）の両方を含む、方法をさらに提供する。
【０１２７】
上述のいずれかに従い、本発明は、３つの組のプライマーのすべてが、増幅反応において増幅産物を生成し、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の出現から少なくとも３サイクル離れたサイクルで発現する場合、試料は、ＭＳＳＡおよび非メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む、方法をさらに提供する。
【０１２８】
さらに別の態様において、上述のいずれかに従い、本発明は、試料中の細菌を特定する方法を提供する。この方法には、（ｉ）ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、（ｉｉ）ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程、および（ｉｉｉ）黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、試料中に存在するかどうかを判断する工程であって、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドは、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程が含まれる。本態様では、試料中に存在する（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせが試料中の細菌を特定する。
【０１２９】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドおよびブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドの両方が、試料中に存在し、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、試料中に存在しない場合、試料は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む、方法をさらに提供する。
【０１３０】
上述のいずれかに従い、本発明は、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドおよびＭＳＳＡ−ｏｒｆＸの両方が、試料中に存在し、ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、試料中に存在しない場合、試料は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を含むが、ＭＲＳＡは含まない、方法をさらに提供する。
【０１３１】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドおよびＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドの両方が、試料中に存在し、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、試料中に存在しない場合、試料は、非メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含むが、試料は、ＭＲＳＡを含まない、方法をさらに提供する。
【０１３２】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチド、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドのうちの１つのみが、試料中に存在する場合、試料は、ＭＲＳＡを含まない、方法をさらに提供する。
【０１３３】
上述のいずれかに従い、本発明は、試料が、細菌、単一菌株からの細菌、または１つ以上の菌株からの細菌の混合物を含み得ない、方法をさらに提供する。
【０１３４】
上述のいずれかに従い、本発明は、試料が、体液、鼻腔用スワブ、および組織から選択された成員である、方法をさらに提供する。
【０１３５】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判断する工程、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判断する工程、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判断する工程のすべてが試料の個々のアリコート中で実施される増幅反応である、方法をさらに提供する。
【０１３６】
上述のいずれかに従い、本発明は、ｍｅｃＡポリヌクレオチドが試料中に存在するかどうか判断する工程、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが試料中に存在するかどうか判断する工程、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが試料中に存在するかどうか判断する工程のうちの２つ以上が試料の同一のアリコート中で実施する増幅反応である、方法をさらに提供する。
【０１３７】
別の態様では、上述のいずれかに従い、本発明は、試料中のＭＲＳＡを特定するキットをさらに提供し、そのようなキットは、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第１の組のプライマー、架橋配列の少なくとも一部に相補的な第２の組のプライマー、架橋配列ではない黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第３の組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択される少なくとも１つの成員を含むことができる。
【０１３８】
別の態様では、上述のいずれかに従い、本発明は、試料中のＭＲＳＡを特定するキットをさらに提供する。そのようなキットには、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第１の組のプライマー、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第２の組のプライマー、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、架橋配列ではない、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な第３の組のプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択された少なくとも１つの成員が含まれる。
【０１３９】
一態様では、上述のいずれかに従い、本発明は、試料中の抗生物質耐性細菌株を検出する方法をさらに提供する。この方法は、（ｉ）抗生物質耐性を与える遺伝子の少なくとも一部から第１の増幅産物を生成することが可能な、第１の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉ）架橋領域の少なくとも一部から第２の増幅産物を生成することが可能な、第２の組のプライマーを提供する工程、（ｉｉｉ）細菌株特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部から第３の増幅産物を生成することが可能な、第３の組のプライマーを提供する工程、（ｉｖ）第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物の試料と合わせる工程、（ｖ）複数のサイクルの増幅反応を、反応混合物で実施する工程、および（ｖｉ）第１、第２、および第３の増幅産物のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程、を含むことができる。本態様では、サイクル数が、抗生物質耐性細菌の菌株が、試料中に存在するかどうかを示す。
【０１４０】
上述のいずれかに従い、本発明は、第１の組のプライマーを使用して増幅された遺伝子がバンコマイシンへの耐性を与える方法をさらに提供する。
【０１４１】
上述のいずれかに従い、本発明は、第１の組のプライマーを使用して増幅された遺伝子がメチシリンへの耐性を与える方法をさらに提供する。
【０１４２】
上述のいずれかに従い、本発明は、増幅された細菌株特異的ポリヌクレオチド配列が黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列である、方法をさらに提供する。
【０１４３】
上述のいずれかに従い、本発明は、増幅された架橋領域には、配列番号２〜８から選択された成員であるポリヌクレオチド配列が含まれる、方法をさらに提供する。
【０１４４】
本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非制限的な実施例を参照することによってより理解され得る。以下の実施例は、本発明の所望の実施形態をより完全に説明するために提示するが、決して本発明の広範囲を制限するように解釈されてはならない。
【０１４５】
本発明は、具体的な実施形態を参照して開示するが、本発明の他の実施形態および変形が、本発明の忠実な精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることは明らかである。
【０１４６】
本出願において引用するすべての特許明細書、特許出願書、および他の出版物は、参照することにより、その全体が組み込まれる。
【実施例】
【０１４７】
概して、本明細書に使用する命名および本発明に使用する実験手順には、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術、および組み換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  （１９８９）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）、Ｐｅｒｂａｌ，  「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）、米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号、および第５，２７２，０５７号に示される方法論、「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｅｓ，  Ｂ．Ｄ
．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８４）、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）を参照し、これらのすべては、本明細書に完全に示されるかのように、参照することにより、本明細書に組み込まれる。他の一般的な参考文献を、本書において提供する。その中の手順は、当該技術において周知であると考えられ、読者の利便性のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
実施例１：純粋培養試料を使用する、単一および二重座位アッセイ
【０１４８】
ＭＲＳＡを検出する単一座位ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを、Ｈｕｌｅｔｓｋｙら（米国特許第２００５００１９８９３号および米国特許第２００６０２５２０７８号）に基づく方法を使用して、実施した。このアッセイは、ＳＣＣｍｅｃ：ｏｒｆＸの右先端接合部のハイブリダイゼーションのための複数のプライマーおよび二重標識プローブを使用する。ヒトβグロビンの検出を、内部対照として加えた。黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ領域（配列番号１）に相補的な二重標識プローブを使用した。順方向プライマーは、ブドウ球菌ｏｒｆＸ領域（配列番号２）に相補的であり、６つの逆方向プライマーは、ＳＣＣｍｅｃ元素内のＭＲＥＪ配列に相補的である。「ＭＲＥＪ」は、「多型右端接合部（ｐｏｌｙ−Ｍｏｒｐｈｉｃ  Ｒｉｇｈｔ  Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」を指す。Ｈｕｌｅｓｋｙらの米国特許第２００５００１９８９３号では、ＭＲＥＪは、突然変異する傾向がある、ＳＣＣｍｅｃカセットの右端に向かう配列であり、多くの異なるＭＲＳＡ菌株は、これらのゲノムのこの領域において変化を示す。ＳＣＣｍｅｃ遺伝子のタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、およびｖ（配列番号３〜配列番号８）を使用した。Ｈｕｌｅｔｓｋｙら（２００４）のＭＲＥＪのタイプｉｖ（ｍｅｃｉｖ５１１）へのハイブリダイゼーション用のプライマーの代わりに、それぞれ、ｍｅｃｉｖ５１１の配列に重複する、わずかに異なる２つのプライマー（配列番号７および配列番号８）を使用した。この変更は、ＭＲＥＪのタイプＩＶの同等の検出を提供したが、非特異的バックグラウンド増幅を減少させた。１つのプローブ（配列番号１５）、順方向プライマー（配列番号１６）、および逆方向プライマー（配列番号１７）から成る内部対照アッセイを、ヒトβグロビンを検出するために加えた。
【０１４９】
二重座位アッセイでは、Ｒｅｉｓｃｈｌら（２０００）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３８：２４２９−２４３３に記載されるとおり、ＭＲＳＡを検出するｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを実施した。このアッセイは、プライマーおよびプローブを使用して、黄色ブドウ球菌特異的遺伝子Ｓａ４４２およびｍｅｃＡ遺伝子を検出する。ヒトβグロビンの検出を、内部対照として加えた。二重標識プローブを、黄色ブドウ球菌特異的遺伝子Ｓａ４４２の検出に、配列番号１２で示す配列と共に使用した。二重標識プローブを、ｍｅｃＡの検出に、配列番号９で示す配列と共に使用した。ブドウ球菌特異的遺伝子Ｓａ４４２（配列番号１３〜１４）に相補的な順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用した。ｍｅｃＡ遺伝子（配列番号１０〜１１）に相補的な順方向プライマーおよび逆方向プライマーを使用した。１つのプローブ（配列番号１５）、順方向プライマー（配列番号１６）、および逆方向プライマー（配列番号１７）から成る内部対照アッセイを、ヒトβグロビンを検出するために、加えた。
【０１５０】
単一および二重座位アッセイの両方では、上述のプライマーを、標準のｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物（ＡＢ遺伝子からのＡｂｓｏｌｕｔｅ（登録商標）ＱＰＣＲＭＩＸ）に加え、周知のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＳ−ＣｏＮＳ、およびＭＲ−ＣｏＮＳの菌株のＤＮＡ試料で試験した。それぞれのアッセイを、１５０個の純粋培養試料（５０個のＭＲＳＡ、５０個のＭＳＳＡ、２５個のＭＲ−ＣｏＮＳ、および２５個のＭＳ−ＣｏＮＳ）で試験した。増幅および検出反応を、以下の標準ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルに従い、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００システムリアルタイムＰＣＲ装置を使用して、行った。
１．酵素活性およびＤＮＡ変性に対して、９５℃で１５分間
２．それぞれ以下の３工程を含む、５０増幅サイクル：
工程１−９５℃で１０秒
工程２−５６℃で３０秒
工程３−７２℃で１５秒（工程３の最後に、４つの蛍光染料のそれぞれに対する測定値を取った）
【０１５１】
単一座位アッセイは、５１個のＳＣＣ：ｏｒｆＸ陽性結果をもたらし、そのうち４９個は、ＭＲＳＡ（真陽性）であり、２個は、ＭＳＳＡ（偽陰性）であった。単一座位アッセイは、９９個のＳＣＣ:ｏｒｆＸ陰性結果をももたらし、そのうち１個は、ＭＲＳＡ（偽陰性）であり、４８個は、ＭＳＳＡ（真陰性）、２５個は、ＭＲ−ＣｏＮＳ（真陰性）、および２５個は、ＭＳ−ＣｏＮＳ（真陰性）であった。単一座位アッセイは、純粋培養試料を検出する上で、９８％の感度、９８％の特異性、９６．１％の陽性予測値、および９９％の陰性予測値をもたらした。
【０１５２】
二重座位アッセイは、５０個のＳａ４４２陽性ｍｅｃＡ陽性結果をもたらし、そのうち５０個は、ＭＲＳＡ（真陽性）であった。二重座位アッセイは、４８個のＳａ４４２陽性ｍｅｃＡ陰性結果をももたらし、４８個すべてがＭＳＳＡ（真陰性）であった。このアッセイは、２５個のＳａ４４２陰性ｍｅｃＡ+結果ももたらし、２５個のすべてがＭＲ−ＣｏＮＳ（ＭＲＳＡに対して真陰性）であった。二重座位アッセイは、２７個のＳａ４４２陰性ｍｅｃＡ陰性結果ももたらし、そのうち２５個は、ＭＳ−ＣｏＮＳ（真陰性）であり、そのうち２個は、ＭＳＳＡであった（ＭＲＳＡに対して真陰性であるが、Ｓａ４４２遺伝子を含むはずであるＭＳＳＡに対して偽陰性である）。二重座位アッセイは、純粋培養試料を検出する上で、１００％の感度、１００％の特異性、１００％の陽性予測値、および１００％の陰性予測値をもたらした。
【０１５３】
上述の結果は、本発明に従って使用するプライマーを上手く使用し、ブドウ球菌の異なる種および菌株に対するゲノムの標的領域を増幅し得ることを示す。
実施例２：臨床患者の試料を使用してＭＲＳＡを、ＭＳＳＡ、ＭＳ−ＣｏＮＳおよびＭＲ−ＣｏＮＳと識別する上での、単一および二重座位アッセイの精度の限界の実証
【０１５４】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、上述の実施例１に記載する単一座位アッセイおよび二重座位アッセイを使用して、混合群を含む培養したスワブから得られた患者のＤＮＡの４６０個の試料で実施した。反応を、上述のとおり、標準ｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物（ＡＢ遺伝子からのＡｂｓｏｌｕｔｅ（登録商標）ＱＰＣＲ  Ｍｉｘ）および上述の標準ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用して、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００システムリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実行する増幅および検出と共に、行った。 
【０１５５】
すべての実行は、２つのＮＴＣ試料（鋳型対照ではない）、および周知のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、およびＭＲ−ＣｏＮＳ対照を含んだ。臨床試料をプレート化し、黄色ブドウ球菌を疑うコロニーについてのみ、翌日にｑＲＴ−ＰＣＲを、実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲのためにコロニーをサンプリングする際に使用するのと同一の細胞針を使用して、すべての試料を混合群に対して分析した。すべての試料は、従来の方法（ＣＮＡのプレーティング）、マンニトールおよびクロモアガーＭＲＳＡプレート（Ｈｙ−ｌａｂｓ、Ｉｓｒａｅｌ）、目視検査、スライド凝縮反応（Ｐａｓｔｏｒｅｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ならびに、ＮＨ+ＮａＣｌ+ＯＸＡおよびＤＮａｓｅプレート上のプレーティングメッキ法によっても分析した。
【０１５６】
３３８個の試料（患者の重複物（１２２）を除外）を分析し、そのうちの２１９個は、ＭＲＳＡを含み、そのうちの３７％は、他のグラム陽性細菌も含み、６％は、グラム陰性細菌も含み、ならびに３２％は、グラム陽性およびグラム陰性の両方をも含んだ。１１９個の非ＭＲＳＡ試料のうちの、８個は、ＭＳ−ＣｏＮＳであり、１６個は、ＭＲ−ＣｏＮＳであり、５個は、非ブドウ球菌であり、９０個は、ＭＳＳＡであった。９０個のＭＳＳＡのうち、４２％は、他のグラム陽性細菌も含み、２％は、グラム陰性細菌を含み、２１％は、グラム陽性およびグラム陰性の両方を含んだ。ＭＳＳＡ含有試料のうちの、４９％は、ＭＲ−ＣｏＮＳも含んだ。これらの割合は、鼻腔用スワブの混合群の真の割合を示すのではなく、多くの試料が、オキサシリン含有プレートに由来するため、オキサシリン耐性細菌に偏った、ｑＲＴ−ＰＣＲに対してサンプルされた混合群を示すことに留意されたい。そのような混合物の比率は、直接のスワブ分析においてより高いと予測される。
【０１５７】
すべてのＮＴＣおよび対照を、両方のアッセイのすべての実行で正確に検出した。
【０１５８】
単一座位アッセイは、混合培養で、不十分な精度を示した。単一座位アッセイは、２１６個のＳＣＣ：ｏｒｆＸ−陽性結果をもたらし、そのうちの２０３個は、ＭＲＳＡ（真陽性）であり、１３個は、ＭＳＳＡ（偽陽性）であった。単一座位アッセイは、１２２個のＳＣＣ：ｏｒｆＸ−陰性結果をももたらし、そのうちの１６個は、ＭＲＳＡ（偽陰性）であり、７７個は、ＭＳＳＡ（真陰性）であり、１６個は、ＭＲ−ＣｏＮＳ（真陰性）であり、８個は、ＭＳ−ＣｏＮＳ（真陰性）であり、５個は、非ブドウ球菌（真陰性）であった。単一座位アッセイは、混合培養試料を検出する上で、わずか８９．１％の特異性、および８６．９％の陰性予測値をもたらした。結果を、以下の表４に要約する。
【表３】
2014023539.tif 000005
【０１５９】
上記の表２に要約するとおり、二重座位アッセイは、混合培養で、不十分な精度を示した。二重座位アッセイは、２６４個のＳａ４４２陽性ｍｅｃＡ陽性結果をもたらし、そのうちの２１８個は、ＭＲＳＡ（真陽性）であり、４６個は、ＭＳＳＡ（偽陽性）であった。偽陰性のうちの、４４個は、培養試験により、ＭＲ−ＣｏＮＳと合わせたＭＳＳＡであることが判断され、２個は、恐らく、非機能的にするように変異されたｍｅｃＡ遺伝子を有するＭＲＳＡに由来する、ｍｅｃＡ陽性ＭＳＳＡであることが分かった。そのような細菌は、遺伝子的にはＭＲＳＡであるが、表現型でＭＳＳＡである。二重座位アッセイは、３６個のＳａ４４２−陽性ｍｅｃ４−陰性結果をももたらし、１つは、ＭＲＳＡ（偽陰性）であり、３５個は、ＭＳＳＡ（真陰性）であった。二重座位アッセイは、１６個のＳａ４４２−陰性ｍｅｃＡ−陽性結果ももたらし、１６個すべては、ＭＲ−ＣｏＮＳ（ＭＲＳＡに対して真陰性）であった。二重座位アッセイは、２２個のＳａ４４２−陰性ｍｅｃＡ−陰性結果ももたらし、そのうちの９個は、ＭＳＳＡ（真陰性）であり、そのうちの８個は、ＭＳＣｏＮＳ（真陰性）であり、５個は、非ブドウ球菌（真陰性）であった。二重座位アッセイは、混合培養試料を検出する上で、わずか６１．４％の特異性および８２．６％の陽性予測値を生じた。
実施例３：三重座位およびサイクル閾値アッセイの優れた精度の実証
【０１６０】
１７オリゴヌクレオチド（配列番号１〜１７）を含む、三重座位高密度多重ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ混合物が開発された。この多重アッセイ混合物を、スワブから得た同一の４６０人の患者のＤＮＡ試料で試験した。反応を、上述の標準ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用して、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００システムリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施した増幅および検出と共に実行した。
【０１６１】
本発明の方法は、結果を分析し、偽陰性および偽陽性結果を実質的に減少させる２工程プロセスを提供する。第１の工程は、４つの分類に従い、結果を分類することである：
１．３個のすべての座位で陽性＝ＭＲＳＡ
２．Ｓａ４４２で陰性＝ＭＲＳＡではない
３．Ｓａ４４２で陽性、およびｍｅｃＡで陰性＝ＭＲＳＡではない
４．Ｓａ４４２で陽性、ｍｅｃＡで陽性、およびＳＣＣ;ｏｒｆＸで陰性＝工程２に進む
【０１６２】
第１の工程分析によると、２０３個の試料が第１の分類の基準を満たした。２０２個を、正確にＭＲＳＡとして特定し、１個の試料は、３つの座位のすべてで陽性であったが、偽陽性であることが発見され、実際、ＭＳＳＡ（ＳＣＣ：ｏｒｆＸ−陽性Ｓａ４４２−陽性ｍｅｃＡ−陰性）およびＭＲ−ＣｏＮＳ（ｍｅｃＡ−陽性）の２つの種の混合物であることを示す。
【０１６３】
３８個の試料は、第２の分類の基準を満たし、すべてがＭＲＳＡではないと正確に特定された。３６個の試料は、分類３の基準を満たした。恐らくはプライマーまたはプローブの部位で突然変異したｍｅｃＡ遺伝子を有するＭＲＳＡ菌株により、陰性ｍｅｃＡ反応がもたらされた結果偽陰性であると発見された１つを除くすべてが、ＭＲＳＡではないと正確に特定された。
【０１６４】
６１個の試料は、第４の分類の基準を満たし、これらは、本発明に規定される第２の工程分析、つまり、Ｓａ４４２のサイクル閾値とｍｅｃＡのサイクル閾値との比較にかけられた。１８個については、２つのアッセイのサイクル閾値（ＣＴ：試料が、最初に検出されるサイクル−標的遺伝子の濃度を反映する）は、お互い、３つのＣＴ値内であり、ｍｅｃＡ遺伝子およびＳａ４４２遺伝子の陽性信号が同一の有機体に由来するかまたは、混合物である場合、両方の有機体は、同一の濃度であることを示唆する。これらの１８個のうち、１６個はＭＲＳＡであり、２個はＭＳＳＡであったが、これらのすべてがＭＲＳＡだと公表されていた。４３個については、２つのアッセイのサイクル時間は、３つのＣＴを上回り、これらの試料がＭＲＳＡを含まない代わりに、陽性ｍｅｃＡ検出が１つの種を反映し、陽性Ｓａ４４２検出は、異種を反映したことを示唆する。予想したとおり、４３個のこれらの試料のすべては、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳを反映する混合物を含むことが証明された。
【０１６５】
組み合わせたアッセイは、混合培養試料からＭＲＳＡを検出する上で、９９．６％の感度、９７．４％の特異性、９８．６％の陽性予測値、および９９．１％の陰性予測値をもたらし、したがって、ＭＲＳＡ等の抗生物質耐性細菌を検出するために従来使用する二重座位および単一座位アッセイのどちらと比べても、本発明のアッセイの精度および特異性が高くなっていることを示す。
実施例４：環境温度−安定したｑＲＴ−ＰＣＲ混合物を使用する三重座位アッセイ
【０１６６】
バッファｘｌ（１０ｍＭトリスｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ）、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物、１．５単位〜２．５単位のホットスタート好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および安定化剤を含む、環境温度ｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を開発した。２５マイクロリットルの混合物を、ＰＣＲマイクロ管に入れ、それぞれのミイクロ管内で、水和を、少なくとも５０％まで減少させた。マイクロ管を、実質的に、環境温度で保管した。
【０１６７】
１７個のオリゴヌクレオチドを含む、三重座位高濃度多重ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ（上述の実施例３に記載するとおり）を、環境温度ｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を含むマイクロ管に加えた。多重分析混合物を、スワブからプレート化した、２０個の周知の患者ＤＮＡの試料および４個の対照試料で試験した。反応を、上述の標準ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用して、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００システムリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施した増幅および検出と共に、実行した。
【０１６８】
このアッセイの結果を、表４に示す。予測通り実施した２４個のアッセイのすべては、関心対象の的確な遺伝子標的を検出した。上述実施例３に記載した結果の分析のための本発明の２工程プロトコルに続き、ＭＲＳＡを含む試料と、ＭＲＳＡを含まない試料とを、１００％の精度で識別することが可能であった。結果は、本発明のアッセイを使用する、環境安定化したキットの臨床患者の試料からの、ＭＲＳＡの特定および非ＭＲＳＡ細菌からのＭＲＳＡの識別の有用性を示す。
【表４】
2014023539.tif 000006
実施例５：ＭＲＳＡと、ＭＳＳＡ、ＭＳ−ＣｏＮＳ、およびＭＲ−ＣｏＮＳとの識別
【０１６９】
周知のブドウ球菌ＤＮＡを含む、合計２９個の実験試料を調製した。これらの試料はいずれも、ＭＲＥＪタイプｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、またはｖの検出の単一座位アッセイを使用して検出することが可能な、ＳＣＣ：ｏｒｐＣ遺伝的子マーカーを含むブドウ球菌ＤＮＡを含まない。ＳＣＣ：ｏｒｆＸは、本明細書において、「架橋領域」とも称される。
【０１７０】
それぞれ、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を含む、試料１〜４は、４つの異なる対数濃度のうちの１つにおいて、Ｓａ４４２遺伝子で陽性であり、ｍｅｃＡポリヌクレオチドで陰性であることが分かった。
【０１７１】
それぞれ、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−ＣｏＮＳ）を含む、試料２〜８は、４つの異なる対数濃度のうちの１つにおいて、ｍｅｃＡポリヌクレオチドで陽性であり、Ｓａ４４２ポリヌクレオチドで陰性であることが分かった。
【０１７２】
周知のブドウ球菌ＤＮＡの混合物を含む、試料９〜１３は、ＭＳＳＡの固定濃度およびＭＲ−ＣｏＮＳの５つの異なる対数濃度レベルのうちの１つを反映する。
【０１７３】
周知のブドウ球菌ＤＮＡの混合物を含む、試料１４〜１８は、ＭＲ−ＣｏＮＳの固定濃度およびＭＳＳＡの５つの異なる対数濃度レベルのうちの１つを反映する。
【０１７４】
周知のＭＲＳＡを含む、試料１９〜２２は、４つの異なるログ濃度レベルのうちの１つにおいて、Ｓａ４４２ポリヌクレオチドで陽性であり、ｍｅｃＡポリヌクレオチドで陽性であることが分かった。
【０１７５】
周知のＭＲＳＡを反映する、試料１９〜２２を複製した試料２３〜２６は、４つの異なるログ濃度レベルのうちの１つにおいて、Ｓａ４４２遺伝子で陽性であり、ｍｅｃＡ遺伝子で陽性であることが分かった。
【０１７６】
３つの付加的な周知の単離されたＭＲＳＡを反映した、試料２７〜２９のすべては、最適使用濃度で、Ｓａ４４２ポリヌクレオチドで陽性であり、ｍｅｃＡポリヌクレオチドで陽性であることが分かった。
【０１７７】
７個の付加的な試料を対照として調製した。
【０１７８】
試料３０〜３１は、Ｓａ４４２ポリヌクレオチド、ｍｅｃＡポリヌクレオチド、およびＳＣＣ：ｏｒｆＸの３つの遺伝子座位のすべてで陽性であることが分かった、周知のＭＲＳＡ  ＤＮＡの２つの異なる濃度レベルを反映した。
【０１７９】
試料３２〜３３は、試料３０および３１を複製した。
【０１８０】
ＭＲ−ＣｏＮＳからの周知のＤＮＡを含む、試料３４は、ｍｅｃＡ遺伝子で陽性であり、Ｓａ４４２ポリヌクレオチドで陰性であることが分かった。
【０１８１】
周知のＭＲＳＡＤＮＡの試料を含む、試料３５は、Ｓａ４４２遺伝子で陽性であり、ｍｅｃＡ遺伝子で陽性であり、ＳＣＣ:ｏｒｆＸで陰性であることが分かった。
【０１８２】
試料３６は、ＤＮＡを含まなかった。
【０１８３】
ｑＲＴ−ＰＣＲ増幅および検出を、前述の標準ｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物、反応プロトコル、および装置により、本発明の三重座位高濃度アッセイを使用して、実験試料および対照試料で実施した。
【０１８４】
実験試料および対照試料のすべては、全く予想通りに実施され、ＳＣＣ：ｏｒｆＸ、Ｓａ４４２ポリヌクレオチド、およびｍｅｃＡポリヌクレオチドである場合では、陽性または陰性所見を示した。
【０１８５】
試料の２１個（アイテム９〜２９、および３５）を、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド（Ｓａ４４２等）、およびｍｅｃＡポリヌクレオチドの陽性所見を反映するが、ＳＣＣ：ｏｒｆＸ陰性ＭＲＳＡ（アイテム１９〜２９、および３５）、または異なる濃度でのＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合物（アイテム９〜１８）に由来する、ＳＣＣ：ｏｒｆ遺伝子領域の証拠に対して陰性を反映するように設計した。本発明のプロトコルは、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド（Ｓａ４４２等）およびｍｅｃＡ遺伝子で陽性であるが、ＳＣＣ：ｏｒｆＸで陰性であることが分かった試料の第２の工程分析プロセスを、つまり、試料がＭＲＳＡを含むのか、または２つの非ＭＲＳＡ種の混合物を反映するのかどうかを判断するために、黄色ブドウ球菌特異的マーカー検出のサイクル閾値を、ｍｅｃＡ検出のサイクル時間と比較するプロセスを、提供する。
【０１８６】
第２のプロトコル工程分析を、第２の工程分析を必要とする２１個の実験試料で実施した。Ｓａ４４２遺伝子の検出、およびｍｅｃＡ遺伝子の検出は、ＭＲＳＡを含むすべての試料に対して、互いの３ＣＴ以内で生じることが分かった。したがって、本発明のプロトコルを使用して、ＭＲＳＡを含む実験試料の１００％が正確に特定された。Ｓａ４４２遺伝子の検出、およびｍｅｃＡ遺伝子の検出は、ＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳを含む混合された実験試料、ならびに、同一濃度のＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳを含む２つの試料（アイテム１２および１５）を除く、ＭＲＳＡを含まない混合された実験試料のすべてにおいて、４ＣＴもしくはより広い間隔で生じることが分かった。
【０１８７】
要約すると、本発明のプロトコルは、Ｈｕｌｅｔｓｋｙらの単一座位アッセイを使用して検出不可能な、非定型変異体のＳＣＣ：ｏｒｆＸ領域を有する、ＭＲＳＡを含む試料からのＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳを含む、混合試料を識別する上で、１００％の精度であることが分かった。
【０１８８】
異種を識別するこのアッセイからの結果を、図２および図３に図示する。図２に示すとおり、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ細菌は、架橋領域（本明細書において、ＳＣＣ:ｏｒｆＸとも称される）、ｍｅｃＡ遺伝子領域、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列（本実施形態では、ｎｕｃ遺伝子）、およびヒトベータグロビンポリヌクレオチド配列（内部対照として使用）を対象とした増幅反応の産物の検出に基づき、互いから識別される。ＭＲＳＡ試料中では、４個の増幅産物のすべてが検出された。反対に、ＭＳＳＡ試料中では、黄色ブドウ球菌特異的および内部対照ヒトベータグロビンポリヌクレオチドのみが検出された。
【０１８９】
同様に、図３は、増幅反応が、架橋領域、ｍｅｃＡ遺伝子領域、ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列（本実施形態では、ｎｕｃ遺伝子）、およびヒトベータグロビンポリヌクレオチド配列（内部対照として使用）を対象としたアッセイの結果を示す。この場合、ＭＲ−ＣｏＮＳを含む試料では、ｍｅｃＡ遺伝子ポリヌクレオチド配列、および内部対照ポリヌクレオチド配列が検出され、ＭＳ−ＣｏＮＳを含む試料では、内部対照ポリヌクレオチド配列のみが検出された。したがって、本発明のアッセイは、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、およびＭＳ−ＣｏＮＳ細菌を識別する能力を提供する。
実施例６：ＱＲＴ−ＰＣＲ反応混合物および多重アッセイの保存安定性
【０１９０】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび二重蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを組み込む、多重アッセイＱＲＴ−ＰＣＲ混合物の性能および保存安定性を確立するために、実験を実施した。
【０１９１】
環境温度のｑＲＴ−ＰＣＲ混合物を、上記の実施例４に記載するとおりに、調製した。
【０１９２】
順方向および逆方向プライマー（配列番号２１および２２）、および５′端部に加えられたＨＥＸ蛍光標識、および３′端部（配列番号２３）に加えられたＢＨＱ１蛍光消光標識を有するプローブから成る、ヒトβグロビンを対象とした、プライマー・プローブの１つの組を、調製し、精製した。順方向プライマー、逆方向プライマー、および５′端部でＦＡＭ、および３′端部でＴＡＭＲＡで標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブから成る、ヒトＲＮａｓｅ−Ｐ遺伝子を対象とした第２のプライマー・プローブの組を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．社（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＮａｓｅ−Ｐ検出試薬キット、パート番号４３１６８３１）から購入した。
【０１９３】
４つのプライマーおよび２つのプローブのすべてを、水分減少プロセス前に、環境温度のｑＲＴ−ＰＣＲ混合物に加えた。これらのプライマーおよびプローブを、対照となるように−２０℃で保管した、環境温度のｑＲＴ−ＰＣＲ混合物のコンポーネントのすべてを含む、第２のマイクロ管にも加えた。
【０１９４】
５週間後、脱水ＰＣＲ混合物および二本鎖プライマー・プローブアッセイを含む、室温で保管した管を再脱水し、対照混合物を含む第２の管を、冷蔵室から取り出し、解凍した。まず、９５℃の１５分間の保持サイクルのプロトコルに従い、１００ｎｇのヒトＤＮＡを、それぞれの管に加え、混合物をＣｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ６０００システムリアルタイムＰＣＲ装置内で増幅させた。これに続いて、３つの工程で、それぞれ５０サイクル行った。工程１は、９５℃で１５秒間、工程２は、５５℃で２０秒間、および工程３は、７２℃で３０秒間であった。
【０１９５】
第１段階の実験を、ＰＣＲ反応の直後に行い、以下のとおりであった。ヒトβヘモグロビンを標的とするプライマー・プローブアッセイは、以下の結果をもたらした。−２０℃で保管された試料は、２３．３０のＣＴ値をもたらし、室温で保管された試料は、２３．４６のＣＴ値をもたらした。ヒトＲＮａｓｅ−Ｐを標的とするプライマー・プローブアッセイは、以下の結果をもたらした。−２０℃で保管された試料は、２５．７９のＣＴ値をもたらし、室温で保管された試料は、２６．０８のＣＴ値をもたらした。
【０１９６】
第２段階の実験は、５週間後に行った。手順は、室温で保管された２つの管、および−２０で保管された１つの管を、該実験で使用したことを除き、上述の手順と同一である。３つの管のそれぞれに、１００ｎｇのヒトＤＮＡを加え、次いで、上述のとおり、それぞれを増幅させた。
【０１９７】
第２段階の実験結果は、以下の通りであった。ヒトβヘモグロビンを対象とするプライマー・プローブアッセイは、以下の結果をもたらした。−２０℃で保管された試料は、２５．４２のＣＴ値をもたらし、室温で保管された２つの試料は、２５．４６および２６．０６のＣＴ値をもたらした。ヒトＲＮａｓｅ−Ｐを対象とするプライマー・プローブアッセイは、以下の結果をもたらした。−２０℃で保管された試料は、２３．０９のＣＴ値をもたらし、室温で保管された２つの試料は、２３．５０および２３．６５のＣＴ値をもたらした。
【０１９８】
１０週間後、室温で放置された本発明の安定化された混合物と、−２０℃で保管された同等の混合物との有効性における差異は、１サイクル未満であった。これらの結果を、図４に図示する。結果は、多重リアルタイムＰＣＲのＰＣＲ混合物の室温での実用性および安定性を明確に示す。
実施例７：高濃度の三重座位ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ、および単一および混合細菌試料内のＭＲＳＡの検出、ならびに、ＭＲＳＡを、ＭＳＳＡ、ＭＲ−ＣｏＮＳ、およびＭＳＳＡ＆ＭＲ−ＣｏＮＳの混合試料と識別する、三重座位にわたるサイクル閾値の比較
【０１９９】
４つの組のプライマーおよびプローブを含む、三重座位多重ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ混合物を、合計１２個のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜２、９〜１１、１５〜１７、１８〜２０、および２４）に対して、開発した。増幅プライマーおよび二重標識プローブの１つの組を、ｍｅｃＡ遺伝子（配列番号９〜１１）を増幅し、検出するように設計した。プライマーおよび二重標識プローブの第２の組を、黄色ブドウ球菌特異的ｎｕｃ遺伝子（配列番号１８〜２０）を増幅し、検出するように設計した。プライマーおよび二重標識プローブの第３の組を、ＳＣＣｍｅｃ元素（配列番号１〜２、および２４）を含まないＭＳＳＡ内で増幅され得るように、黄色ブドウ球菌内のＳＣＣｍｅｃ元素の挿入部位周辺のｏｒｆＸ遺伝子の領域を増幅し、検出するように設計した。プライマーおよび二重標識プローブの第４の組を、ヒトβグロビンを増幅および検出して、対照アッセイとなるように設計した（配列番号１５〜１７）。
【０２００】
本発明の三重座位多重ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ、およびバッファｘｌ（１０ｍＭトリスｐＨ８．３、５０、Ｍ  ＫＣｌ）、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ混合物、１．５単位〜２．５単位のホットスタート好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、および安定化剤を含む、環境温度のｑＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を、開発した。２５マイクロリットルの混合物を、マイクロ管に入れ、水和を、それぞれのマイクロ管内で、少なくとも５０％まで減少させた。マイクロ管を、実質的に、環境温度で保管した。
【０２０１】
この環境温度多重アッセイ混合物を、周知のＤＮＡ試料、ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＳ−ＣｏＮＳ、およびＭＲ−ＣｏＮＳ菌株で試験した。該アッセイを、以下のＤＮＡ試料のそれぞれの２つの試料で試験した：
１．純ＭＲＳＡ
２．純ＭＳＳＡ
３．純ＭＲ−ＣｏＮＳ
４．対照としてのβグロビンおよびＭＳ−ＣｏＮＳの混合試料
５．ＭＳＳＡおよびＭＳ−ＣｏＮＳの混合試料
６．等濃度のＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合試料
７．等濃度のＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、およびＭＲ−ＣｏＮＳの混合試料
８．１：１０比の濃度のＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合試料
９．１０：１比の濃度のＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの混合試料
１０．等濃度のＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合試料
１１．１：１０比の濃度のＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合試料
１２．１０：１比の濃度のＭＳＳＡおよびＭＲ−ＣｏＮＳの混合試料
【０２０２】
反応を、上述の標準ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用して、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＲｏｔｏｒＧｅｎｅ３０００システムリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施される増幅および検出と共に実行した。
【０２０３】
本発明の方法は、結果を分析して、実質的に、偽陰性および偽陽性結果を減少させる、２工程プロセスを提供する。第１の工程は、５つの分類に従い、結果を分類することである
（表２に提示するとおり、１＝ｍｅｃＡ、２＝ｎｕｃ、３＝ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ）：
１．１＋２で陽性、３で陰性＝ＭＲＳＡであり、ＭＳＳＡではない
２．２＋３で陽性、１で陰性＝ＭＳＳＡであり、ＭＲＳＡではない
３．１で陽性、２＋３で陰性＝ＭＲ−非黄色ブドウ球菌であり、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡのいずれでもない
４．３つのすべてで陰性、対照で陽性＝ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＭＲ−非黄色ブドウ球菌のいずれでもない
５．１＋２＋３で陽性＝分析工程２に進み、異なる単位複製配列のＣＴ値と比較する
【０２０４】
第１の工程分析に基づき、アッセイを、２４個の試料のすべてで予測したとおりに実施し、関心対象の正確な遺伝子標的を検出した。予測したとおり、３個の座位のすべてを、ＭＳＳＡおよび１つ以上のメチシリン耐性細菌を含む、すべての試料中で検出し、これらは、本発明によって規定された第２の工程分析、つまり、３個の標的遺伝子のそれぞれのサイクル閾値（ＣＴ：陽性と考えられ、標的遺伝子の濃度を反映するサイクル）の比較にかけられる。
【０２０５】
予測したとおり、ｎｕｃアッセイおよびＭＳＳＡ−ｏｒｆＸのサイクル閾値は、ＭＳＳＡを含むが、ＭＲＳＡは含まない混合試料のすべてで、互いの３つのＣＴ以内であり、ｎｕｃ遺伝子の陽性信号が、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ領域としての同一のＭＳＳＡ有機体に由来し、個別のＭＲＳＡ有機体に由来しないことを示唆する。同様に、ｎｕｃアッセイおよびＭＳＳＡ−ｏｒｆＸのサイクル閾値は、不等濃度のＭＳＳＡおよびＭＲＳＡを含む混合試料のすべてで（試料８、９）、４つのＣＴまたは、互いより高く、ｎｕｃ遺伝子の陽性信号が陽性ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸ信号を生成するＭＳＳＡ有機体およびＭＲＳＡ有機体の組み合わせに由来することを示唆する。
【０２０６】
結果分析のための本発明の２工程プロトコルに続き、不等濃度のＭＲＳＡを含む試料と、ＭＲＳＡを含まない試料（試料８、９）とを、１００％の精度で識別することが可能であった。結果は、不等濃度の純試料および混合試料の両方において、本発明の三重座位アッセイおよびプロトコルの非ＭＲＳＡ細菌からのＭＲＳＡの特定およびＭＲＳＡの識別の実用性を示した。
【０２０７】
明確にするために、個別の実施形態の文脈に記載された、本発明の特定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせても提供し得ることを理解されたい。反対に、１つの実施形態の文脈に簡潔に記載された、本発明の様々な特徴は、個別に、または任意の適切な副次的組み合わせで、提供し得る。
【０２０８】
本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されるが、多くの代替、修正、および変形が当業者に明らかであることは、明白である。したがって、付属の請求項の精神および広範囲に含まれる、そのような代替、修正、および変形のすべてを包括することを意図する。本明細書に記載する、すべての出版物、特許明細書、および特許出願書は、それぞれの個別の出版物、特許明細書、または特許出願書が、参照することにより組み込まれるように、具体的、且つ個別に示すような同一の範囲で、参照することにより、これらの全体が本明細書に組み込まれる。また、本出願における、いかなる参照の引用または特定も、そのような参照が、本発明の先行技術として得られることの承認として解釈されるべきではない。
【図１】
2014023539.tif 000007
【図２】
2014023539.tif 000008
【図３】
2014023539.tif 000009
【図４】
2014023539.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月25日(2013.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
（ａ）第１の組のプライマーを提供する工程であって、前記第１の組のプライマーは、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｂ）第２の組のプライマーを提供する工程であって、前記第２の組のプライマーは、架橋領域の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｃ）第３の組のプライマーを提供する工程であって、前記第３の組のプライマーは、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程と、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物中の前記試料と合わせる工程と、
（ｅ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程と、
（ｆ）前記ｍｅｃＡ、架橋領域、および黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル閾数をあるならば決定する工程と、を含み、
前記サイクル閾数は、ＭＲＳＡが試料中に存在するかどうかを示す、
方法。
【請求項２】
前記第１の組のプライマーは、配列番号１０〜１１のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の組のプライマーは、配列番号２〜８のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第３の組のプライマーは、配列番号１３〜１４、および１８〜１９のうちの少なくとも１つに従う配列を有する複数のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｎｕｃ、Ｓａ４４２、およびｆｅｍＢから選択される成員である、遺伝子の少なくとも一部である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドの一部、前記架橋領域のポリヌクレオチドの一部、および前記ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドの一部が、前記試料中にすべて存在する場合、ＭＲＳＡは、前記試料中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドが、前記試料中に存在し、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在するが、前記架橋領域のポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、（ｉ）ＭＲＳＡの異型株、および（ｉｉ）非メチシリン耐性ブドウ球菌およびＭＳＳＡの混合物から選択されるメンバーを含み、任意選択において、３以下のサイクル閾数は、前記試料が前記ＭＲＳＡの異型株を含むことを示し、３超のサイクル閾数は、前記試料が前記混合物を含むことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試料中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および／またはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を検出する方法であって、
（ａ）第１の組のプライマーを提供する工程であって、前記第１の組のプライマーは、ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｂ）第２の組のプライマーを提供する工程であって、前記第２の組のプライマーは、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、工程と、
（ｃ）第３の組のプライマーを提供する工程であって、前記第３の組のプライマーは、黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であり、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、ｏｒｆＸポリヌクレオチドではない、工程と、  （ｄ）前記第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の前記試料と合わせる工程と、
（ｅ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程と、
（ｆ）前記ｍｅｃＡ、ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸおよび黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程と、
を含み、
前記サイクル数は、ＭＲＳＡおよび／またはＭＳＳＡが試料中に存在するかどうかを示す、
方法。
【請求項９】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の出現から、少なくとも４サイクル離れたサイクルで出現する場合、前記試料は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列が、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチド配列の３サイクル内で出現する場合、前記試料は、ＭＳＳＡおよび非メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチド、および前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に共に存在し、前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含み、あるいは、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドおよび前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、試料中に共に存在し、前記ｍｅｃＡポリヌクレオチドが試料中に存在しない場合、前記試料は、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）を含むがＭＲＳＡを含まない、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍｅｃＡポリヌクレオチド、および前記ＭＳＳＡ−ｏｒｆＸポリヌクレオチドが、前記試料中に共に存在し、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチドが、前記試料中に存在しない場合、前記試料は、非メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含むが、ＭＲＳＡを含まない、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料は、体液、鼻腔用スワブ、および組織から選択される成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法における試料中のＭＲＳＡを特定するキットであって、
（ｇ）ｍｅｃＡポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、前記第１の組のプライマーと、
（ｈ）架橋配列の少なくとも一部に相補的である、前記第２の組のプライマーと、
（ｉ）黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、前記第３の組のプライマーであって、前記黄色ブドウ球菌特異的ポリヌクレオチド配列は、架橋配列ではない、第３の組のプライマーと、
（ｊ）ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ、マグネシウム、および安定剤から選択される少なくとも１つの成員と、
を備える、キット。
【請求項１５】
試料中の抗生物質耐性細菌の菌株を検出する方法であって、
（ａ）第１の組のプライマーを提供する工程であって、前記第１の組のプライマーは、遺伝子の少なくとも一部から、第１の増幅産物を生成することが可能であり、前記遺伝子は、抗生物質耐性を与える、工程と、
（ｂ）第２の組のプライマーを提供する工程であって、前記第２の組のプライマーは、第一の細菌の菌株に特異的なポリヌクレオチド配列の少なくとも一部から、第２の増幅産物を生成することが可能である、工程と、
（ｃ）第３の組のプライマーを提供する工程であって、前記第３の組のプライマーは、第二の細菌の菌株に特異的なポリヌクレオチド配列の少なくとも一部から、第３の増幅産物を生成することが可能である、工程と、
（ｄ）前記第１、第２、および第３の組のプライマーを、反応混合物内の前記試料と合わせる工程と、
（ｅ）複数のサイクルの増幅反応を、前記反応混合物で実施する工程と、
（ｆ）前記第１、第２、および第３の増幅産物のそれぞれの出現のサイクル数を判断する工程と、
を含み、
前記サイクル閾数は、抗生物質耐性細菌の菌株が、前記試料中に存在するかどうかを示す、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014023539000001.app
【外国語明細書】
2014023539000001.pdf