(57)【要約】【課題】標本における隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、視野範囲外を含む広い範囲における標本の反応の画像を解像度を落とさずに取得する。【解決手段】対物レンズ１１と、走査光学ユニット９と、対物レンズ１１の光軸に対して交差する方向に標本Ｓを移動可能なステージ１と、標本Ｓの反応を検出する光検出器１３と、標本Ｓの輝度情報およびレーザ光の走査位置情報を互いに対応付けて記憶するフレームメモリ４３と、標本Ｓ上の観察範囲を設定し、ステージを固定した状態でレーザ光を走査可能な複数のサブ領域に観察範囲を分割する観察範囲指定部と、連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、照射領域の走査順序をサブ領域ごとに決定する走査順序決定部と、全ての走査可能範囲に対してステージ１を順次移動させ、決定された走査順序に従ってレーザ光を走査させる制御部４９とを備えるレーザ走査型顕微鏡１００を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部と、
前記標本が載置され、前記対物レンズの光軸に対して交差する方向に前記標本を移動可能なステージと、
レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、
該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、
前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージを固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、
前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、
全ての前記走査可能範囲に対して前記ステージを順次移動させ、前記順序決定部により決定された前記走査順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項２】
レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、
該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部と、
前記標本が載置され、前記対物レンズの光軸に対して交差する方向に前記標本を移動可能なステージと、
レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、
該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、
前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージを固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、
前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の本走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、
該順序決定部により決定される前記本走査順序に従ってレーザ光を走査させる本検出に先立ち、全ての前記走査可能範囲に対して前記ステージを順次移動させ、前記本検出における走査よりも短時間で各前記走査可能範囲の略全体に光を照射する簡易検出を行い、該簡易検出において前記検出部により検出される前記標本の反応が少なくとも一部で所定の閾値を超えた前記走査可能範囲について、前記ステージを再度移動させて、前記本走査順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記制御部が、前記走査部により、互いに空間的に隣接する前記照射領域に順にレーザ光を走査させることによって前記簡易検出を行う請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記走査可能範囲の略全体に１度に照明光を照射可能な広範囲照明光源を備え、
前記制御部が、前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照明光を照射させて前記簡易検出を行う請求項２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照射する照明光が、空間的に隣接する他の前記走査可能範囲に照射されるのを制限する照射領域制限部を備える請求項４に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記順序決定部が、空間的に互いに隣接する前記走査可能範囲に時間的に連続して照明光が照射されないように、前記広範囲照明光源により照明光を照射する前記走査可能範囲の照射順序を決定し、
前記制御部が、前記順序決定部により決定された前記照射順序に従って前記ステージを移動させて前記簡易検出を行う請求項４または請求項５に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記標本の画像を構築する画像構築部を備え、
前記記憶部が、前記ステージの位置座標に関する座標情報を前記輝度情報および前記走査位置情報に対応付けて記憶し、
前記画像構築部が、前記記憶部に記憶された前記輝度情報を前記走査位置情報に基づいて配置して前記走査可能範囲の２次元的な画像を構築し、該走査可能範囲の画像を前記座標情報に従って配列して前記観察範囲の２次元的な画像を構築する請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項８】
標本が載置される標本ステージと、
レーザ光源から発せられたレーザ光を前記標本に照射する対物レンズおよび該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部とを備える顕微鏡本体と、
前記標本ステージに対して、前記対物レンズの光軸に交差する方向に前記顕微鏡本体を移動可能に支持する顕微鏡ステージと、
レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、
該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、
前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージに対して前記顕微鏡本体を固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、
前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、
全ての前記走査可能範囲に対して前記顕微鏡ステージにより前記顕微鏡本体を順次移動させ、前記順序決定部により決定された前記照射領域の順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項９】
標本が載置される標本ステージと、
レーザ光源から発せられたレーザ光を前記標本に照射する対物レンズおよび該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部とを備える顕微鏡本体と、
前記標本ステージ上の標本に対して、前記対物レンズの光軸に交差する方向に前記顕微鏡本体を移動可能に支持する顕微鏡ステージと、
レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、
該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、
前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージに対して前記顕微鏡本体を固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、
前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の本走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、
該順序決定部により決定される前記本走査順序に従ってレーザ光を走査させる本検出に先立ち、全ての前記走査可能範囲に対して前記顕微鏡ステージにより前記顕微光本体を順次移動させ、前記本検出における走査よりも短時間で各前記走査可能範囲の略全体に光を照射する簡易検出を行い、該簡易検出において前記検出部により検出される前記標本の反応が少なくとも一部で所定の閾値を超えた前記走査可能範囲について、前記顕微鏡本体を再度移動させて前記本走査順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１０】
前記制御部が、前記走査部により、互いに空間的に隣接する前記照射領域に順にレーザ光を走査させることによって前記簡易検出を行う請求項９に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１１】
前記走査可能範囲の略全体に１度に照明光を照射可能な広範囲照明光源を備え、
前記制御部が、前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照明光を照射させて前記簡易検出を行う請求項９に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１２】
前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照射する照明光が、空間的に隣接する他の前記走査可能範囲に照射されるのを制限する照射領域制限部を備える請求項１１に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１３】
前記順序決定部が、空間的に互いに隣接する前記走査可能範囲に時間的に連続して照明光が照射されないように、前記広範囲照明光源により照明光を照射する前記走査可能範囲の照射順序を決定し、
前記制御部が、前記順序決定部により決定された前記照射順序に従って前記顕微鏡ステージにより前記顕微鏡本体を移動させて前記簡易検出を行う請求項１１または請求項１２に記載のレーザ走査型顕微鏡。
【請求項１４】
前記標本の画像を構築する画像構築部を備え、
前記記憶部が、前記顕微鏡本体の位置座標に関する座標情報を前記輝度情報および前記走査位置情報に対応付けて記憶し、
前記画像構築部が、前記記憶部に記憶された前記輝度情報を前記走査位置情報に基づいて配置して前記走査可能範囲の２次元的な画像を構築し、該走査可能範囲の画像を前記座標情報に従って配列して前記観察範囲の２次元的な画像を構築する請求項８から請求項１３のいずれかに記載のレーザ走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、標本上でレーザ光を２次元的に走査させ、光照射による標本の反応を検出して２次元的な輝度情報を取得するレーザ走査型顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。標本にレーザ光を照射すると、照射領域の反応が周囲の領域にも及ぶ場合がある。そのため、標本上の空間的に隣接する領域を順に走査していくと、隣接する直前の照射領域の反応が現在の照射領域の反応に影響し誤検出してしまうという問題がある。
【０００３】
特許文献１に記載のレーザ走査型顕微鏡は、標本上の空間的に隣接する領域を連続走査しないように空間的に離れた領域を順次走査させて各照射領域の反応を検出していくことで、標本における照射領域間の反応の影響を排除して、個々の照射領域の輝度を正しく検出することとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２７６００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、標本の光刺激の反応を観察する場合等においては標本における広い範囲の反応の画像を解像度を落とさずに取得したいという要望があるが、特許文献１に記載のレーザ走査型顕微鏡では、標本における顕微鏡の視野範囲内の領域の画像しか取得することができないという不都合がある。
【０００６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本における隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、視野範囲外を含む広い範囲における標本の反応の画像を解像度を落とさずに取得することができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部と、前記標本が載置され、前記対物レンズの光軸に対して交差する方向に前記標本を移動可能なステージと、レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージを固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、全ての前記走査可能範囲に対して前記ステージを順次移動させ、前記順序決定部により決定された前記走査順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【０００８】
本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光が走査部により走査されて対物レンズにより標本に照射され、これにより生じる標本の反応が検出部により検出される。そして、検出された標本の反応に相当する輝度情報と走査部によるレーザ光の走査位置情報とが互いに対応付けられて記憶部に記憶される。したがって、記憶部に記憶された輝度情報と走査位置情報とに基づいて標本の２次元的な画像を取得することができる。
【０００９】
この場合において、観察範囲分割部により観察範囲を分割した走査可能範囲ごとに、順序決定部により決定された走査順序に従って制御部が走査部によりレーザ光を走査させることで、空間的に隣接する照射領域に時間的に連続してレーザ光が照射されることがない。したがって、レーザ光が照射された照射領域の反応が空間的に隣接する周囲の照射領域に及ぶ場合でも、現在レーザ光を照射した照射領域の反応に対してその直前にレーザ光を照射した照射領域の反応が影響するのを防ぐことができる。
【００１０】
また、ステージを移動させて観察範囲内の全ての走査可能範囲についてレーザ光を走査させて標本の反応を検出することで、走査可能範囲外、すなわち、視野範囲外を含む観察範囲全体における標本の２次元的な画像を取得することができる。
したがって、標本における空間的に隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、視野範囲外を含む広い範囲における標本の反応の画像を解像度を落とさずに取得することができる。
【００１１】
本発明は、レーザ光源から発せられたレーザ光を標本に照射する対物レンズと、該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部と、前記標本が載置され、前記対物レンズの光軸に対して交差する方向に前記標本を移動可能なステージと、レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージを固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の本走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、該順序決定部により決定される前記本走査順序に従ってレーザ光を走査させる本検出に先立ち、全ての前記走査可能範囲に対して前記ステージを順次移動させ、前記本検出における走査よりも短時間で各前記走査可能範囲の略全体に光を照射する簡易検出を行い、該簡易検出において前記検出部により検出される前記標本の反応が少なくとも一部で所定の閾値を超えた前記走査可能範囲について、前記ステージを再度移動させて、前記本走査順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【００１２】
本発明によれば、本検出により、標本上の互いに空間的に隣接しない照射領域にレーザ光を照射していく場合（これをマッピングスキャンという。）は、標本における空間的に隣接する照射領域間の影響が低減するものの、レーザ光が時間的に連続して照射される照射領域間の距離が離れている分だけ走査可能範囲全体にレーザ光を照射するのに時間がかかる。
【００１３】
そこで、簡易検出により、本検出における走査よりも短時間で走査可能範囲の略全体に光を照射して、標本の反応が大きい走査可能範囲を予め短時間で選別し、選別した走査可能範囲についてのみ本検出によりマッピングスキャンを施すことで、空間的に隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、標本における反応が大きい走査可能範囲をより短時間で効率的に観察することができる。
【００１４】
標本の反応が大きい走査可能範囲の選別は、走査可能範囲内のいずれか１つの照射領域における反応が所定の閾値を超えるか否か、または、走査可能範囲内の複数の照射領域における反応の平均が所定の閾値を超えるか否かを判定することとすればよい。
【００１５】
上記発明においては、前記制御部が、前記走査部により、互いに空間的に隣接する前記照射領域に順にレーザ光を走査させることによって前記簡易検出を行うこととしてもよい。
【００１６】
レーザ光の走査により、標本上の互いに空間的に隣接する照射領域に順にレーザ光を照射していく場合（これをラスタスキャンという。）は、マッピングスキャンと比較して、空間的に隣接する照射領域間の影響を受けるものの、レーザ光が時間的に連続して照射される照射領域間の距離が近接している分だけ走査可能範囲全体にレーザ光を短時間で照射することができる。
【００１７】
上記発明においては、前記走査可能範囲の略全体に１度に照明光を照射可能な広範囲照明光源を備え、前記制御部が、前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照明光を照射させて前記簡易検出を行うこととしてもよい。
【００１８】
広範囲照明光源により走査可能範囲の略全体に照明光を１度に照射する場合は、標本上をマッピングスキャンする場合と比較して、空間的に隣接する照射領域間の影響を受けるものの、照明光を走査しない分だけマッピングスキャンやラスタスキャンよりも走査可能範囲全体に照明光を短時間で照射することができる。
【００１９】
上記発明においては、前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照射する照明光が、空間的に隣接する他の前記走査可能範囲に照射されるのを制限する照射領域制限部を備えることとしてもよい。
【００２０】
このように構成することで、照射領域制御部により、広範囲照明光源から発せられた照明光が本来の照射対象である走査可能範囲のみに照射される。したがって、他の走査可能範囲に照明光が漏れて生じる反応を、本来の照射対象である走査可能範囲の反応の一部であると誤検出してしまうのを防ぐことができる。これにより、標本における反応が大きい走査可能範囲をより精度よく選別することができる。
【００２１】
上記発明においては、前記順序決定部が、空間的に互いに隣接する前記走査可能範囲に時間的に連続して照明光が照射されないように、前記広範囲照明光源により照明光を照射する前記走査可能範囲の照射順序を決定し、前記制御部が、前記順序決定部により決定された前記照射順序に従って前記ステージを移動させて前記簡易検出を行うこととしてもよい。
【００２２】
このように構成することで、広範囲照明光源から発せられた照明光が、空間的に隣接する走査可能範囲に時間的に連続して照射されることがない。したがって、広範囲照明光源により照明光が照射された走査可能範囲の反応が空間的に隣接する周囲の走査可能範囲に及ぶ場合でも、現在照明光を照射した走査可能範囲の反応に対してその直前に照明光を照射した走査可能範囲の反応が影響するのを防ぐことができる。これにより、標本における空間的に隣接する走査可能範囲間の影響を低減しつつ、標本における反応が大きい走査可能範囲をより精度よく選別することができる。
【００２３】
上記発明においては、前記標本の画像を構築する画像構築部を備え、前記記憶部が、前記ステージの位置座標に関する座標情報を前記輝度情報および前記走査位置情報に対応付けて記憶し、前記画像構築部が、前記記憶部に記憶された前記輝度情報を前記走査位置情報に基づいて配置して前記走査可能範囲の２次元的な画像を構築し、該走査可能範囲の画像を前記座標情報に従って配列して前記観察範囲の２次元的な画像を構築することとしてもよい。
このように構成することで、画像構築部により、全ての走査可能範囲の２次元的な画像をステージの座標順に整列させた観察範囲全体２次元的な画像を取得することができる。
【００２４】
本発明は、標本が載置される標本ステージと、レーザ光源から発せられたレーザ光を前記標本に照射する対物レンズおよび該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部とを備える顕微鏡本体と、前記標本ステージに対して、前記対物レンズの光軸に交差する方向に前記顕微鏡本体を移動可能に支持する顕微鏡ステージと、レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージに対して前記顕微鏡本体を固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、全ての前記走査可能範囲に対して前記顕微鏡ステージにより前記顕微鏡本体を順次移動させ、前記順序決定部により決定された前記照射領域の順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【００２５】
本発明によれば、観察範囲分割部により観察範囲を分割した走査可能範囲ごとに、順序決定部により決定された走査順序に従って制御部が走査部によりレーザ光を走査させることで、レーザ光が照射された照射領域の反応が空間的に隣接する周囲の照射領域に及ぶ場合でも、現在レーザ光を照射した照射領域の反応に対してその直前にレーザ光を照射した照射領域の反応が影響するのを防ぐことができる。
【００２６】
また、制御部が顕微鏡ステージにより顕微鏡本体を移動させて観察範囲内の全ての走査可能範囲についてレーザ光を走査させて標本の反応を検出することで、走査可能範囲外、すなわち、視野範囲外を含む観察範囲全体における標本の２次元的な画像を取得することができる。
したがって、標本における空間的に隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、視野範囲外を含む広い範囲における標本の反応の画像を解像度を落とさずに取得することができる。
【００２７】
本発明は、標本が載置される標本ステージと、レーザ光源から発せられたレーザ光を前記標本に照射する対物レンズおよび該対物レンズにより照射されるレーザ光を前記標本上で走査させる走査部とを備える顕微鏡本体と、前記標本ステージ上の標本に対して、前記対物レンズの光軸に交差する方向に前記顕微鏡本体を移動可能に支持する顕微鏡ステージと、レーザ光が照射されることにより生じる前記標本の反応を検出する検出部と、該検出部により検出された前記標本の反応に相当する輝度情報および前記走査部によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶する記憶部と、前記標本上で観察する観察範囲を設定し、前記ステージに対して前記顕微鏡本体を固定した状態で前記走査部によりレーザ光を走査可能な複数の走査可能範囲に前記観察範囲を分割する観察範囲分割部と、前記標本上に時間的に連続して照射されるレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないように、前記走査部により走査させる前記照射領域の本走査順序を前記走査可能範囲ごとに決定する順序決定部と、該順序決定部により決定される前記本走査順序に従ってレーザ光を走査させる本検出に先立ち、全ての前記走査可能範囲に対して前記顕微鏡ステージにより前記顕微光本体を順次移動させ、前記本検出における走査よりも短時間で各前記走査可能範囲の略全体に光を照射する簡易検出を行い、該簡易検出において前記検出部により検出される前記標本の反応が少なくとも一部で所定の閾値を超えた前記走査可能範囲について、前記顕微鏡本体を再度移動させて前記本走査順序に従って前記走査部によりレーザ光を走査させる制御部とを備えるレーザ走査型顕微鏡を提供する。
【００２８】
本発明によれば、簡易検出後に本検出を行うことで、空間的に隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、標本における反応が大きい走査可能範囲をより短時間で効率的に観察することができる。
【００２９】
上記発明においては、前記制御部が、前記走査部により、互いに空間的に隣接する前記照射領域に順にレーザ光を走査させることによって前記簡易検出を行うこととしてもよい。
【００３０】
上記発明においては、前記走査可能範囲の略全体に１度に照明光を照射可能な広範囲照明光源を備え、前記制御部が、前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照明光を照射させて前記簡易検出を行うこととしてもよい。
【００３１】
上記発明においては、前記広範囲照明光源により前記走査可能範囲に照射する照明光が、空間的に隣接する他の前記走査可能範囲に照射されるのを制限する照射領域制限部を備えることとしてもよい。
【００３２】
上記発明においては、前記順序決定部が、空間的に互いに隣接する前記走査可能範囲に時間的に連続して照明光が照射されないように、前記広範囲照明光源により照明光を照射する前記走査可能範囲の照射順序を決定し、前記制御部が、前記順序決定部により決定された前記照射順序に従って前記顕微鏡ステージにより前記顕微鏡本体を移動させて前記簡易検出を行うこととしてもよい。
【００３３】
上記発明においては、前記標本の画像を構築する画像構築部を備え、前記記憶部が、前記顕微鏡本体の位置座標に関する座標情報を前記輝度情報および前記走査位置情報に対応付けて記憶し、前記画像構築部が、前記記憶部に記憶された前記輝度情報を前記走査位置情報に基づいて配置して前記走査可能範囲の２次元的な画像を構築し、該走査可能範囲の画像を前記座標情報に従って配列して前記観察範囲の２次元的な画像を構築することとしてもよい。
このように構成することで、画像構築部により、全ての走査可能範囲の２次元的な画像を顕微鏡本体の座標順に整列させた観察範囲全体の２次元的な画像を取得することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、標本における隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、視野範囲外を含む広い範囲における標本の反応を観察することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す概略構成図である。
【図２】図１の制御プログラム部を示すブロック図である。
【図３】観察範囲指定部によりモニタに表示される観察可能領域とＲＯＩ作成ツールを示す図である。
【図４】図３の観察可能領域に表示されている観察範囲を複数のサブ領域に分割した様子を示す図である。
【図５】６４×６４ピクセルのサブ領域における走査順序を示す図である。
【図６】視野範囲に１つ目のサブ領域を配置した様子を示す図である。
【図７】図６のサブ領域をマッピングスキャンする様子を示す図である。
【図８】視野範囲に２つ目のサブ領域を配置した様子を示す図である。
【図９】図８のサブ領域をマッピングスキャンする様子を示す図である。
【図１０】本発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡により、１つ目のサブ領域をラスタスキャンする様子を示す図である。
【図１１】２つ目のサブ領域をラスタスキャンする様子を示す図である。
【図１２】蛍光の輝度が所定の閾値を超えるサブ領域を選別した様子を示す図である。
【図１３】図１２の選別した１つ目のサブ領域をマッピングスキャンする様子を示す図である。
【図１４】図１２の選別した２つ目のサブ領域をマッピングスキャンする様子を示す図である。
【図１５】本発明の第３実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡を示す概略構成図である。
【図１６】（ａ）はＬＣＯＳにより制限しない場合のレーザ光源の照射範囲を示す図であり、（ｂ）はＬＣＯＳによりレーザ光源の照射範囲をサブ領域に一致させた状態を示す図である。
【図１７】本発明の第２実施形態の変形例にレーザ走査型顕微鏡を示す概略構成図である。
【図１８】本発明の第３実施形態の変形例にレーザ走査型顕微鏡を示す概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００は、図１に示すように、標本Ｓが載置されるステージ１と、レーザ光を発生する光源ユニット３と、光源ユニット３から発せられたレーザ光を反射する反射ミラー５と、反射ミラー５により反射されたレーザ光を透過するダイクロイックミラー７と、ダイクロイックミラー７を透過したレーザ光を標本Ｓ上で走査させる走査光学ユニット（走査部）９と、走査光学ユニット９により走査されたレーザ光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生する蛍光を集光する対物レンズ１１と、対物レンズ１１により集光された蛍光を検出する光検出器（検出部）１３とを備えている。
【００３７】
ステージ１は、対物レンズ１１の光軸に対して直交するＸＹ方向に移動可能に設けられている。これにより、ステージ１を移動させるだけで、走査光学ユニット９により標本Ｓ上でレーザ光を走査可能な範囲をＸＹ方向に移動させることができるようになっている。
【００３８】
光源ユニット３は、互いに波長が異なるレーザ光を発するレーザ光源３１Ａ，３１Ｂと、一方のレーザ光源３１Ａから発せられたレーザ光を反射する反射ミラー３３と、反射ミラー３３により反射されたレーザ光の光路と他方のレーザ光源３１Ｂから発せられたレーザ光の光路とを合成するダイクロイックミラー３５と、ダイクロイックミラー３５により光路が合成された各レーザ光の発生のＯＮ／ＯＦＦ、レーザ光の強度および波長成分等を制御する音響光学素子３７とを備えている。
【００３９】
ダイクロイックミラー３５は、レーザ光源３１Ａから反射ミラー７を介して入射されるレーザ光を音響光学素子３７に向けて反射する一方、レーザ光源３１Ｂからのレーザ光を透過して音響光学素子３７に入射させるようになっている。
音響光学素子３７としては、例えば、ＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ、音響光学素子）やＡＯＭ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）が用いられる。
【００４０】
ダイクロイックミラー７は、反射ミラー５からのレーザ光を透過させて走査光学ユニット９に入射させる一方で、対物レンズ１１により集光されて走査光学ユニット９を介して戻る標本Ｓからの蛍光を反射して、レーザ光の光路から分岐させるようになっている。
【００４１】
走査光学ユニット９は、互いに直交する２方向に光を偏向するＹ方向スキャナ９ＡとＸ方向スキャナ９Ｂとを備えている。この走査光学ユニット９は、対物レンズ１１により照射されるレーザ光をこれらのスキャナ９Ａ，９Ｂによって標本Ｓ上で２次元的に走査させることができるようになっている。
【００４２】
光検出器１３としては、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ：Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ）が用いられる。この光検出器１３は、レーザ光が照射されることにより生じる標本Ｓの反応として、標本Ｓにおいて発生した蛍光を検出するようになっている。また、光検出器１３は、検出した蛍光の輝度に相当する輝度信号を出力するようになっている。
【００４３】
また、レーザ走査型顕微鏡１００には、ユーザからの指示が入力される入力装置１５と、光検出器１３から出力された輝度信号をＡ／Ｄ変換するＡ／Ｄ変換器１７と、Ａ／Ｄ変換された輝度信号や入力装置１５に入力された指示等を処理したり標本Ｓへのレーザ光の照射等を制御したりするＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）１９と、走査光学ユニット９を駆動させるスキャナ駆動部２１と、ステージ１を移動させるステージ駆動部２３と、入力装置１５に入力された指示や標本Ｓの画像等を表示するモニタ２５とが備えられている。
【００４４】
入力装置１５は、例えば、図示しないキーボード、マウス（ポインティングデバイス）、ＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）等により構成されている。この入力装置１５には、ユーザが走査条件やレーザ光の出力条件等の指示を入力することができるようになっている。また、入力装置１５は、ユーザが所望の観察範囲を指定することができるようになっている。
【００４５】
ＰＣ１９は、光源ユニット３から発生させるレーザ光の出力を制御するレーザ出力制御部４１と、Ａ／Ｄ変換された輝度信号等を記憶するフレームメモリ（記憶部）４３と、レーザ光の走査の設定や画像取得等を行う制御プログラム部４５と、走査光学ユニット９を駆動する駆動波形データを記憶する駆動波形メモリ４７Ａ，４７Ｂと、スキャナ駆動部２１およびステージ駆動部２３等を制御する制御部４９とを備えている。
【００４６】
レーザ出力制御部４１は、入力装置１５から送られてくるレーザ光の出力条件を保存するメモリ４１ａを有している。このレーザ出力制御部４１は、メモリ４１ａに保存した出力条件を読み出して、ＡＯＴＦ３７によりレーザ光の発生のＯＮ／ＯＦＦを制御することができるようになっている。
【００４７】
フレームメモリ４３は、Ａ／Ｄ変換器１７から送られてくる輝度信号と共に、走査光学ユニット９によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報を互いに対応付けて記憶するようになっている。また、フレームメモリ４３は、ステージ１の位置座標に関する座標情報を輝度信号および走査位置情報に対応付けて記憶するようになっている。
駆動波形メモリ４７ＡはＹ方向スキャナ９Ａの駆動波形データを記憶し、駆動波形メモリ４７ＢＸ方向スキャナ９Ｂの駆動波形データを記憶するようになっている。
【００４８】
制御プログラム部４５は、図２に示すように、入力装置１５から走査条件が入力される走査条件入力部５１と、標本Ｓ上の観察範囲を指定する観察範囲指定部（観察範囲分割部）５３と、走査光学ユニット９により走査させるレーザ光の照射領域の走査順序を決定する走査順序決定部５５と、標本Ｓの画像を構築する画像構築部５７とを備えている。
【００４９】
走査条件入力部５１には、走査条件として、例えば、画像化領域（例えば、５１２×５１２ポイント）を決定するためのＸＹスキャンサイズ、Ａ／Ｄ変換器１７における検出信号のサンプリング間隔を決めるサンプリングスピード、視野範囲内の一照射領域当たりのデータ取得時間などが入力される。
【００５０】
観察範囲指定部５３は、例えば、図３に示すように、モニタ２５上に観察可能領域５３ＡとＲＯＩ作成ツール５３Ｂ（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、関心領域）を表示させるようになっている。ユーザは、入力装置１５のマウス等を操作して、モニタ２５上の観察可能領域５３ＡとＲＯＩ作成ツール５３Ｂにより観察範囲を指定することができるようになっている。また、観察範囲指定部５３は、ユーザが指定した観察範囲を標本Ｓに対して設定するようになっている。
【００５１】
ＲＯＩ作成ツール５３Ｂとしては、マウスの左ボタンのダウン位置とアップ位置とを対角線にした長方形のＲＯＩを作成する「Ｒｅｃｔａｎｇｌｅ  ＲＯＩ」と、マウスによるボタンクリック位置を頂点として、各頂点をクリック順に直線で結んだ多角形のＲＯＩを作成する「Ｐｏｌｙｇｏｎ  ＲＯＩ」とがある。「Ｐｏｌｙｇｏｎ  ＲＯＩ」では、マウスの左ボタンをダブルクリックすると打点終了となるようになっている。
【００５２】
また、観察範囲指定部５３は、観察範囲を設定すると、図４に示すように、ステージ１を固定した状態で走査光学ユニット９によりレーザ光を走査可能な複数のサブ領域（走査可能範囲）によりその観察範囲を分割するようになっている。
【００５３】
走査順序決定部５５は、標本Ｓ上に時間的に連続して照射するレーザ光の照射領域が互いに空間的に隣接しないようなランダムな走査順序をサブ領域ごとに決定するようになっている。走査順序の決定には、例えば、乱数を用いる。
【００５４】
照射領域のランダムな走査順序は、例えば、図５に示すように決定される。すなわち、１つのサブ領域を同じ大きさの８つの分割領域Ａ〜Ｈに分割する。そして、ＡＣＥＧＢＤＦＨの順に各分割領域の左上の照射領域を照射する。一巡したらＸライン方向に１つ隣の照射領域を同じようにＡＣＥＧＢＤの順序で照射する。１ライン分が完了したら各分割領域の２ライン目の各照射領域を同じように照射する。つまり、分割領域Ａ〜Ｈを一定の順序で同じ規則に従ってレーザ光を照射するように決定される。
【００５５】
図５は、６４×６４ピクセルのサブ領域における走査順序を示している。各マスの数字が走査順序を示す。図５の例では、１番目に照射された照射領域の隣は９番目に照射されるので、隣どうしの照射領域のレーザ照射の時間間隔はピクセル８個分のデータ取得時間となる。
【００５６】
また、走査順序決定部５５は、決定した走査順序により互いに空間的に隣接する照射領域がないかを確認し、ある場合は他の照射領域と入れ替える処理を行うようになっている。また、走査順序決定部５５は、決定した走査順序に従った各照射領域の座標を走査位置情報としてフレームメモリ４３に送るとともに、その座標の時間変化を駆動波形データに変換して駆動波形メモリ４７Ａ，４７Ｂに送るようになっている。
【００５７】
画像構築部５７は、フレームメモリ４３に記憶されている輝度信号を走査位置情報としての各照射領域の座標に従い配置し、サブ領域の２次元的な画像を構築するようになっている。また、画像構築部５７は、構築したサブ領域の画像をフレームメモリ４３に記憶されているステージ１の座標情報に従って配列して張り合せ、観察範囲全体の２次元的な画像を構築するようになっている。
【００５８】
制御部４９は、観察範囲指定部５３により分割された全てのサブ領域に対して、空間的に隣接する順に視野範囲に配置するようにステージ１を順次移動させる移動データを設定し、移動データに従ってステージ駆動部２３によりステージ１を移動させるようになっている。
【００５９】
移動データは、例えば、観察範囲内でサブ領域をＸ方向に隣接する順に移動して１ライン終了したらＹ方向にラインをずらし、各ラインをＸ方向に隣接する順に移動していくというものであってもよい。また、制御部４９は、設定した移動データに従ったステージ１の座標の時間変化を座標情報としてフレームメモリ４３に送るようになっている。
【００６０】
また、制御部４９は、サブ領域ごとに、駆動波形メモリ４７Ａ，４７Ｂに記憶されている各照射領域の走査順序を読み出し、その走査順序に従ってスキャナ駆動部２１により走査光学ユニット９を駆動させるようになっている。
【００６１】
スキャナ駆動部２１は、制御部４９の制御によりスキャナ９Ａ，９Ｂを揺動させてレーザ光を走査させるようになっている。
ステージ駆動部２３は、制御部４９の制御によりステージ１を移動させるようになっている。
【００６２】
このように構成されたレーザ走査型顕微鏡１００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００により標本Ｓを観察するには、まず、ユーザがステージ１に標本Ｓを載置し、入力装置１５を操作して観察範囲指定部５３により観察範囲を指定する。
【００６３】
ユーザが、例えば、図３に示すように、「Ｐｏｌｙｇｏｎ  ＲＯＩ」によって観察範囲を指定すると、観察範囲指定部５３により、標本Ｓに対してその観察範囲が設定され、図４に示すように、設定した観察範囲が複数のサブ領域に分割される。
【００６４】
次いで、ユーザが入力装置１５に各サブ領域の走査条件を入力すると、入力装置１５から制御プログラム部４５の走査条件入力部５１にその走査条件が送られる。すると、走査順序決定部５５により、図５に示すように、サブ領域内の隣り合う照射領域に連続してレーザ光を照射しないランダムな走査順序が決定される。また、サンプリングスピードと一照射領域当たりのデータ取得時間により、一照射領域当たりのサンプリング回数が算出される。本実施形態では、一照射領域当たりのサンプリング回数は１回に設定される。
【００６５】
次いで、走査順序決定部５５により、決定した走査順序に従った各照射領域の座標が走査位置情報としてフレームメモリ４３に送られるとともに、座標の時間変化が駆動波形データに変換されて駆動波形メモリ４７Ａ，４７Ｂに送られて記憶される。
【００６６】
また、制御部４９により、観察範囲指定部５３により分割された全てのサブ領域に対して、空間的に隣接する順にステージ１を順次移動させる移動データが設定され、その移動データに従ったステージ１の座標の時間変化が座標情報としてフレームメモリ４３に送られる。
【００６７】
次に、入力装置１５にユーザから走査開始の指示が入力されると、制御部４９の制御により、図６に示すように、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させて１つ目のサブ領域が視野範囲に配置される。そして、制御部４９により、駆動波形メモリ４７Ａ，４７Ｂの駆動波形データが読み出されてスキャナ駆動部２１が制御され、駆動波形データに従ってＹ方向スキャナ９ＡおよびＸ方向スキャナ９Ｂが揺動させられる。これと同時に、制御部４９により、レーザ出力制御部４１が制御され、光源ユニット３からレーザ光が射出される。
【００６８】
光源ユニット３から発せられたレーザ光は、反射ミラー５により反射されてダイクロイックミラー７を透過し、走査光学ユニット９のＹ方向スキャナ９ＡおよびＸ方向スキャナ９Ｂにより偏向されて、対物レンズ１１により標本Ｓ上の照射領域に照射される。
【００６９】
そして、走査順序決定部５５によりランダムに決められた走査順序に従った照射領域の座標の時間変化を示す駆動波形データに従ってスキャナ９Ａ，９Ｂが揺動角度を変化させることにより、互いに隣接しない照射領域にレーザ光が順に照射される。これにより、図７に示すように、標本Ｓ上でレーザ光が２次元的に走査される。以下、標本Ｓ上の互いに空間的に隣接しない照射領域にレーザ光を照射していく走査をマッピングスキャンという。
【００７０】
レーザ光が照射されることにより、標本Ｓの各照射領域において蛍光が発せられると、その蛍光は、対物レンズ１１により集光され走査光学ユニット９を介してダイクロイックミラー３５によりレーザ光の光路から分岐され、光検出器１３により検出される。
【００７１】
光検出器１３により蛍光が検出されると、その蛍光の輝度に相当する輝度信号が光検出器１３から出力され、Ａ／Ｄ変換器１７によりＡ／Ｄ変換されてフレームメモリ４３に送られる。フレームメモリ４３に送られた各照射領域の輝度信号は、走査順序決定部５５から送られてきた走査順序に従った各照射領域の座標を示す走査位置情報に対応付けられて記憶される。
【００７２】
次いで、画像構築部５７により、フレームメモリ４３に記憶された輝度信号が、対応付けられている照射領域の座標に従って配置されてサブ領域の画像が構築される。構築され画像はモニタ２５に表示される。
【００７３】
この場合において、サブ領域ごとに走査順序決定部５５により決定されたランダムな走査順序に従ってマッピングスキャンすることで、空間的に隣接する照射領域に時間的に連続してレーザ光が照射されることがない。したがって、レーザ光が照射された照射領域の反応が隣接する周囲の照射領域に及ぶ場合でも、現在レーザ光が照射された照射領域からの蛍光の検出に対してその直前にレーザ光が照射された照射領域の蛍光の検出が影響するのを防ぐことができる。これにより、各照射領域の輝度を正しく検出した高解像度の画像を得ることができる。
【００７４】
１つ目のサブ領域のマッピングスキャンが終わると、制御部４９の制御により、図８に示すように、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させて、１つ目のサブ領域に隣接する２つ目のサブ領域が視野範囲に配置される。そして、２つ目のサブ領域について、図９に示すように、制御部４９により１つ目のサブ領域と同様にしてマッピングスキャンされ、画像構築部５７により画像が構築される。同様にして、３つ目のサブ領域、４つ目のサブ領域というように全てのサブ領域が視野範囲に順次配置されてマッピングスキャンが行われる。
【００７５】
全てのサブ領域においてマッピングスキャンが行われて画像が構築されると、画像構築部５７により、フレームメモリ４３に記憶されているステージ１の座標情報に従って全てのサブ領域の画像が配列されて貼り合せられる。これにより、サブ領域外、すなわち、視野範囲外を含む観察範囲全体の２次元的な画像を構築される。構築された観察範囲の画像はモニタ２５に表示される。ユーザは、この観察範囲全体の画像を見て標本Ｓを観察することができる。
【００７６】
以上説明したように、本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００によれば、サブ領域ごとにマッピングスキャンして画像を構築するとともに、各サブ領域の画像を貼り合せて観察範囲全体の画像を構築することで、標本Ｓにおける空間的に隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、視野範囲外を含む広い範囲における標本Ｓの反応の画像を解像度を落とさずに取得することができる。
【００７７】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００は、制御部４９が、マッピングスキャンによる本検出に先立って、マッピングスキャンよりも短時間でサブ領域の略全体にレーザ光を照射可能な簡易検出により反応があるサブ領域を選別し、選別したサブ領域のみをマッピングスキャンにより本検出する点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００７８】
制御部４９は、走査順序決定部５５により決定される走査順序（本走査順序）に従ったマッピングスキャンにより本検出を行うようになっている。
また、制御部４９は、スキャナ駆動部２１を制御して、走査光学ユニット９により互いに空間的に隣接する照射領域に順にレーザ光を走査させていくラスタスキャンによって簡易検出を行うようになっている。
【００７９】
マッピングスキャンは、標本Ｓにおける空間的に隣接する照射領域間の影響が低減するものの、レーザ光が時間的に連続して照射される照射領域間の距離が離れている分だけサブ領域の全体を走査させるのに時間がかかる。これに対し、ラスタスキャンは、レーザ光を時間的に連続して照射していく照射領域が隣接している分だけ、マッピングスキャンよりも短時間でサブ領域の略全体にレーザ光を照射することができる。
【００８０】
ラスタスキャンは、例えば、サブ領域内で１ラインごとにＸ方向にレーザ光を走査して、１ライン終了したらＹ方向にラインをずらしていくこととすればよい。また、ラスタスキャンによる簡易検出は、マッピングスキャンによる本検出と同一の波長のレーザ光を使用することとすればよい。
【００８１】
また、制御部４９は、全てのサブ領域に対してステージ１を順次移動させて簡易検出を行うようになっている。そして、制御部４９は、簡易検出において、光検出器１１３により検出される標本Ｓのいずれか１つの照射領域からの蛍光の輝度が所定の閾値を超えたか否かを判定するようになっている。
【００８２】
また、制御部４９は、蛍光の輝度が所定の閾値を超えているサブ領域を、反応があるサブ領域として選別するようになっている。そして、制御部４９は、選別したサブ領域のみについて、ステージ１を再度移動させてマッピングスキャンにより本検出を行うようになっている。所定の閾値は、例えば、ユーザが入力装置１５に入力して予め設定しておくこととすればよい。
【００８３】
このように構成されたレーザ走査型顕微鏡１００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００により標本Ｓを観察する場合は、まず、簡易検出を行う。ユーザがステージ１に標本Ｓを載置してから、制御部４９によりステージ１が移動して１つ目のサブ領域が視野範囲に配置されるところまでは第１実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００８４】
１つ目のサブ領域が視野範囲に配置されると、制御部４９によりスキャナ駆動部２１が制御されて、図１０に示すように、走査光学ユニット９によってサブ領域全体がラスタスキャンされる。ラスタスキャンにより標本Ｓにおいて発生した蛍光が光検出器１３により検出されると、その蛍光の輝度に相当する輝度信号がＡ／Ｄ変換器１７を介してフレームメモリ４３に送られ、各照射領域の座標に対応付けられて記憶される。
【００８５】
１つ目のサブ領域のラスタスキャンが終わると、制御部４９の制御より、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させて、１つ目のサブ領域に隣接する２つ目のサブ領域が視野範囲に配置される。そして、図１１に示すように、２つ目のサブ領域について、１つ目のサブ領域と同様にしてラスタスキャンされて標本Ｓからの蛍光が検出される。同様にして、全てのサブ領域が視野範囲に順次配置されて、ラスタスキャンによって蛍光が検出される。
【００８６】
次に、本検出を行う。まず、制御部４９により、各サブ領域について、いずれか１つの照射領域からの蛍光の輝度が所定の閾値を超えているか否かが判定され、図１２に示すように、観察範囲中で反応があるサブ領域が選別される。図１２は、選別した２つのサブ領域を例示してそれぞれ「反応ありＡ」，「反応ありＢ」で示している。
【００８７】
次いで、制御部４９により、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させ、図１３に示すように、反応がある１つ目のサブ領域（反応ありＡ）が視野範囲に配置される。そして、そのサブ領域について、制御部４９により、走査順序決定部５５によってランダムに決定された走査順序に従ってマッピングスキャンが行われ、画像構築部５７により画像が構築される。
【００８８】
１つ目のサブ領域のマッピングスキャンが終わると、制御部４９により、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させ、図１４に示すように、蛍光の輝度が所定の閾値を超えた２つ目のサブ領域（反応ありＢ）が視野範囲に配置される。そして、２つ目のサブ領域について１つ目のサブ領域と同様にしてマッピングスキャンが行われ画像が構築される。このようにして、選別した全てのサブ領域について、マッピングスキャンによる本検出が行われ画像が構築される。
【００８９】
全てのサブ領域において本検出が行われて画像が構築されると、画像構築部５７により、ステージ１の座標情報に従って全てのサブ領域の画像が配列されて観察範囲全体の２次元的な画像を構築される。ユーザは、この観察範囲全体の画像を見て標本Ｓを観察することができる。
【００９０】
以上説明したように本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００によれば、ラスタスキャンによる簡易検出により標本Ｓの反応があるサブ領域を予め短時間で選別し、選別したサブ領域についてのみマッピングスキャンによる本検出を施すことで、空間的に隣接する照射領域間の影響を低減しつつ、標本Ｓにおける反応が大きいサブ領域をより短時間で効率的に観察することができる。
【００９１】
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００は、図１５に示すように、サブ領域の全体に１度にレーザ光を照射するワイドフィールド光源ユニット１０３（以下、ワイド光源ユニット１０３という。）を備え、制御部４９が、ラスタスキャンに代えてワイド光源ユニット１０３によるレーザ光の照射により簡易検出を行う点で第２実施形態と異なる。
以下、第２実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００９２】
ワイド光源ユニット１０３は、サブ領域の略全体に１度に照射可能なレーザ光を発生するレーザ光源（広範囲照明光源）１３１と、レーザ光源１３１から発せられたレーザ光をパターン照射するＬＣＯＳ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｏｎ  Ｓｉｌｉｃｏｎ、照射領域制限部）１３２とを備えている。
【００９３】
ＬＣＯＳ１３２は、レーザ光源１３１から発せられたレーザ光が、空間的に隣接する他のサブ領域に照射されるのを制限するようになっている。レーザ光源１３１から発せられるレーザ光の照射範囲を制限しない場合は、例えば、図１６（ａ）に示すように、視野範囲の全域がレーザ光の照射範囲になるが、ＬＣＯＳ１３２により、図１６（ｂ）に示すように、レーザ光の照射範囲をサブ領域に制限することができる。これにより、視野範囲内であってもサブ領域外においてレーザ光が照射されることにより反応が生じて、その反応を誤検出してしまうのを防ぐことができる。
【００９４】
走査光学ユニット９と対物レンズ１１との間の光路上には、ワイド光源ユニット１０３から発せられたレーザ光の光路を合成するダイクロイックミラー（光路合成部）１３３が挿脱可能に設けられている。ダイクロイックミラー１３３を光路に挿入するとワイド光源ユニット１０３により標本Ｓにレーザ光を照射し、光路からダイクロイックミラー１３３を外すと光源ユニット３により標本Ｓにレーザ光を照射することができるようになっている。
【００９５】
ＰＣ１９には、ワイド光源ユニット１０３を制御するワイドフィールド照明制御部１４９（以下、ワイド照明制御部１４９という。）が備えられている。
制御部４９は、マッピングスキャンによる本検出に先立って、ワイド光源ユニット１０３によりサブ領域の全体に１度にレーザ光を照射するワイド照明により簡易検出を行うようになっている。
【００９６】
このように構成されたレーザ走査型顕微鏡２００の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００により標本Ｓを観察する場合は、まず、簡易検出を行う。ユーザは、ステージ１に標本Ｓを載置し、レーザ光の光路からダイクロイックミラー１３３を外すとともに対物レンズ１１を低倍に設定する。
【００９７】
次いで、光源ユニット３からレーザ光を発生させて、制御部４９によりスキャナ駆動部２１を制御して、走査光学ユニット９により標本Ｓ上でレーザ光をラスタスキャンさせる。そして、光検出器１３により蛍光を検出してその輝度信号を画像構築部５７により画像化し、ラスタスキャン画像を取得する。
【００９８】
次いで、観察範囲指定部５３によりモニタ２５上に観察可能領域５３ＡおよびＲＯＩ作成ツール５３Ｂが表示され、観察可能領域５３Ａにラスタスキャン画像が重畳して表示される。ユーザが、低倍で取得したラスタスキャン画像を参照して「Ｐｏｌｙｇｏｎ  ＲＯＩ」により観察範囲を指定すると、観察範囲指定部５３により標本Ｓに対してその観察範囲が設定され、その観察範囲が複数のサブ領域に分割される。以下、入力装置１５にユーザから走査開始の指示が入力されるところまでは第１実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００９９】
次に、ユーザは、対物レンズ１１を高倍に切り替え、レーザ光の光路にダイクロイックミラー１３３を挿入して、入力装置１５に走査開始の指示を入力する。すると、制御部４９の制御により、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させて、１つ目のサブ領域が視野範囲に配置される。
【０１００】
次に、ワイド照明制御部１４９により、ワイド光源ユニット１０３からレーザ光が発せられる。ワイド光源ユニット１０３から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー１３３により反射されて対物レンズ１１により標本Ｓのサブ領域の略全体に１度に照射される。
【０１０１】
ワイド照明によれば、標本上をマッピングスキャンする場合と比較して空間的に隣接する照射領域間の影響を受けるものの、レーザ光を走査しない分だけマッピングスキャンやラスタスキャンよりもサブ領域全体にレーザ光を短時間で照射することができる。
【０１０２】
ワイド照明により標本Ｓにおいて発生した蛍光が光検出器１３により検出されると、その蛍光の輝度に相当する輝度信号がＡ／Ｄ変換器１７を介してフレームメモリ４３に送られ、各照射領域の座標に対応付けられて記憶される。
【０１０３】
１つ目のサブ領域がワイド照明されると、制御部４９の制御により、ステージ駆動部２３がステージ１を移動させて、隣接する各サブ領域が視野範囲に順次配置され、各サブ領域について１つ目のサブ領域と同様にしてワイド照明されて蛍光が検出される。
次に、本検出を行う。本検出は第２実施形態と同様であるので説明を省略する。
【０１０４】
以上説明したように本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００によれば、ワイド照明により、レーザ光を走査しない分だけ、反応があるサブ領域をラスタスキャンよりも早く特定することができる。これにより、簡易検出をより迅速に行うことができる。
【０１０５】
本実施形態においては、広範囲照明光源としてレーザ光源１３１を例示して説明したが、これに代えて、例えば、水銀ランプを採用することとしてもよい。
また、本実施形態においては、照射領域制限部としてＬＣＯＳ１３２を例示して説明したが、これに代えて、ＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ：登録商標）や光学絞りを採用することとしてもよい。
【０１０６】
また、本実施形態においては、簡易検出する際に隣接するサブ領域に順にワイド照明していくこととしたが、これに代えて、例えば、走査順序決定部５５が、空間的に互いに隣接するサブ領域に時間的に連続してレーザ光が照射されないように、ワイド光源ユニット１０３によりレーザ光を照射するサブ領域の照射順序を決定し、制御部４９が、走査順序決定部５５により決定された照射順序に従ってステージ１を移動させて簡易検出を行うこととしてもよい。
【０１０７】
このようにすることで、ワイド光源ユニット１０３から発せられたレーザ光が、空間的に隣接するサブ領域に時間的に連続して照射されることがない。したがって、ワイド光源ユニット１０３によりレーザ光が照射されたサブ領域の反応が空間的に隣接する周囲のサブ領域に及ぶ場合でも、現在レーザ光を照射したサブ領域の反応に対してその直前にレーザ光を照射したサブ領域の反応が影響するのを防ぐことができる。これにより、標本Ｓにおける空間的に隣接するサブ領域の影響を低減しつつ、標本Ｓにおける反応が大きいサブ領域をより精度よく選別することができる。
【０１０８】
上記第２実施形態および第３実施形態は以下のように変形することができる。
第２実施形態および第３実施形態においては、簡易検出により反応があったサブ領域を選別する際に、サブ領域内のいずれか１つの照射領域からの蛍光の輝度が所定の閾値を超えるか否かを判定することとしたが、第１変形例としては、サブ領域内の複数の照射領域における蛍光の輝度の平均が所定の閾値を超えるか否かを判定することとしてもよい。
【０１０９】
また、第２実施形態および第３実施形態においては、全てのサブ領域を簡易検出してから各サブ領域について反応がある否かを判定することとしたが、第２変形例としては、サブ領域ごとに簡易検出した後に続けてそのサブ領域について反応があるか否かを判定することとしてもよい。そして、反応がない場合は次のサブ領域に移動し、反応があった場合はそのままそのサブ領域においてマッピングスキャンを行ってから次のサブ領域に移動することとしてもよい。
【０１１０】
上記第１〜第３実施形態は以下のように変形することができる。
上記各実施形態においては、検出部として光検出器１３を例示し、レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生する蛍光を標本Ｓの反応として検出することとしたが、第１変形例としては、例えば、図１７および図１８に示すように、検出部として、レーザ光が照射された標本Ｓの電流値を標本Ｓの反応として検出する電流値検出器１１３を採用することとしてもよい。図１７は第１実施形態および第２実施形態のレーザ走査型顕微鏡１００に電流値検出器１１３を適用した構成を示し、図１８は第３実施形態のレーザ走査型顕微鏡２００に電流値検出器１１３を適用した構成を示している。
【０１１１】
電流値検出器１１３は、ステージ１上の標本Ｓに挿入されて標本Ｓの電流値を検出し、検出した電流値を電流値信号に変換してＡ／Ｄ変換器１７に送るようになっている。この場合、標本Ｓにレーザ光を照射しながら電流値検出器１１３により電流値を検出することとすればよい。
【０１１２】
電流値検出器１１３により検出された電流値信号は、光検出器１３により検出される輝度信号と同様に、Ａ／Ｄ変換器１７によりＡ／Ｄ変換されて、走査光学ユニット９によりレーザ光が走査される位置に関する走査位置情報に対応付けられてフレームメモリ４３に記憶され、画像構築部５７により各照射領域の座標に従い配置されて画像構築されることとすればよい。
【０１１３】
例えば、図１８に示す第３実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡２００においては、簡易検出の際に、標本Ｓのサブ領域にワイド照明しながら電流値検出器１１３により標本Ｓの電流値を検出することとすればよい。また、制御部４９により、その電流値信号が所定の閾値を超えているか否かを判定し、電流値信号が所定の閾値を超えているサブ領域を選別することとすればよい。
【０１１４】
本変形例においては、標本Ｓの１箇所に電流値検出器１１３を挿入し１つの部位に対して電流値を計測することとしているが、複数箇所に電流値検出器１１３を挿入して、複数の部位に対して電流値の計測を行うこととしてもよい。
【０１１５】
また、上記各実施形態においては、ステージ１を移動させることとしたが、第２変形例としては、対物レンズ１１および走査光学ユニット９等を有する顕微鏡本体をステージ１に対して対物レンズ１１の光軸に直交する方向に移動可能に支持する顕微鏡ステージ（図示略）を採用し、ステージ１を移動させる代わりに顕微鏡ステージによりステージ１に対して顕微鏡本体を移動させることとしてもよい。
【０１１６】
顕微鏡ステージは、例えば、図示しない定盤上に固定される固定板と、固定板に対してＸＹ方向に互いに直交する方向に移動可能な２つの可動板とを板厚方向に積層状態に備え、可動板上に顕微鏡本体を搭載することができるようになっていてもよい。この場合、定盤上にステージ１と顕微鏡ステージを搭載し、顕微鏡ステージ上に顕微鏡本体を搭載して、ステージ１を固定した状態で、顕微鏡ステージにより顕微鏡本体をＸＹ方向に移動させることとすればよい。
【０１１７】
このようにすることで、顕微鏡ステージの移動により、ステージ１に対して対物レンズ１１の位置を水平面上で移動させることができる。したがって、上記各実施形態においてステージ１を移動させる代わりに顕微鏡ステージを移動させることで、上記各実施形態と同様の操作を実現することができる。この場合、画像構築部５７は、ステージ１の座標に代えて、顕微鏡本体の位置座標を座標情報として各サブ領域の画像を配列して観察範囲の２次元画像を構築することとすればよい。
【０１１８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【０１１９】
１    ステージ（標本ステージ）
９    走査光学ユニット（走査部）
１１    対物レンズ
１３    光検出器（検出部）
４３    フレームメモリ（記憶部）
４９    制御部
５３    観察範囲指定部（観察範囲分割部）
５５    走査順序決定部（順序決定部）
５７    画像構築部
１００，２００    レーザ走査型顕微鏡
１３１    レーザ光源（広範囲照明光源）
１３２    ＬＣＯＳ（照射領域制限部）
Ｓ    標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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