(57)【要約】      （修正有）【課題】視野全体の収差および像ボケ等の画像劣化を補正できる蛍光顕微鏡構成および補正工程を提供する。【解決手段】蛍光顕微鏡は、光源１０２と、対物レンズ１０９と、二次元センサ１１６と、二次元センサに接続されたコンピュータ１０１と、を備え、コンピュータは、視野内の異なる位置で取得した２つ以上の点分布関数を保存し、これを用いて、視野内の対応する領域の蛍光画像をデコンボリューションすることで画像を補正する。【選択図】図１
2014164004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
対物レンズと、
二次元センサと、
フローチップと、
前記二次元センサに接続されたコンピュータと、
を備え、
前記コンピュータは、２つ以上の観察位置で取得された点像分布関数を保存し、前記二次元センサで取得した前記フローチップの蛍光画像を、前記２つ以上の異なる点像分布関数を用いてデコンボリューションして補正すること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項２】
請求項１において、
前記コンピュータ内に保存された２つ以上の点像分布関数は、
観察視野の座標値と
対物レンズの光軸方向の位置情報と
点像分布関数を規定する２つ以上の数値配列と
を含んでおり、
点像分布関数の座標位置の間隔は実質一定である
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項３】
請求項１において、
前記コンピュータは、点像分布関数を取得するときに、
前記対物レンズと前記フローセルのフォーカス位置を動かしながら前記基板の点像分布画像を連続的に取得し、
前記取得した画像を2つ以上に分割し、
分割区分内の複数発光点像を平均して平均化発光点像を作成し、
前記平均化発光点像の強度を規格化してこれを点像分布関数とし、
前記点像分布関数の座標値と前記フォーカス位置を保存する
ように制御することを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項４】
請求項１において、
前記コンピュータは、前記蛍光画像を補正するときに、
前記蛍光画像が取得されたときの前記対物レンズと前記フローセルのフォーカス位置を規定し、
前記蛍光画像を、２つ以上の区画で分割し、
同じ区画かつ前記規定されたフォーカス位置と同じフォーカス位置で取得された点像分布関数を用いて区画毎にデコンボリューションし、
前記デコンボリューション後の区画画像を再結像して補正蛍光画像とする、
ように制御することを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項５】
請求項１において、
前記点像分布関数は、
回折限界以下のサイズの２つ以上の発光点が格子状に配置された基板を前記顕微鏡で取得した蛍光像の画素強度分布によって求められること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項６】
請求項５において、
前記基板は、
透明基板と、
透明基板上に成膜された遮光幕薄膜と、
薄膜に設けられた２つ以上の格子状にならんでおり、回折限界以下のサイズの開口と、
前記開口内の透明基板上に塗布された発光物質と、
を有して構成させることを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項７】
請求項６において、
前記開口のサイズは200-300ナノメートルであること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項８】
請求項５において、
前記発光物質は顕微鏡観察に使用される蛍光体であることを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項９】
請求項１において、
4種のフィルタを備え、
前記蛍光画像は、対物レンズで集めた光が前記フィルタを透過して前記二次元センサで取得された4枚の蛍光画像であること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１において、
４つの二次元センサと、
3枚の二色鏡を備え、
前記蛍光画像は、対物レンズで集めた光が前記二色鏡で４つの光路に分けられて前記二次元センサで取得された4枚の蛍光画像であること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１において、
点像分布関数を取得する際の二次元センサの画素サイズは、フローチップの蛍光画像を取得するときの二次元センサの画素サイズよりも小さいこと
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１２において、
点像分布関数を取得する際の二次元センサには、観察視野平面と平行に二次元センサを駆動させるステージを備えること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１３】
請求項１において、
前記コンピュータ内に保存された２つ以上の点像分布関数が、
同じ構成の異なる蛍光顕微鏡にて取得されたものであり、
画像を補正する工程にて、異なる蛍光顕微鏡にて取得された点像分布関数を初期値として推定する工程を含むことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１４】
請求項５において、
前記発光点の格子方向が前記二次元センサの画素格子に対して傾いた状態で前記基板を蛍光検出すること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【請求項１５】
請求項１５において、
前記傾いた状態とは、その傾き角が０より大きく5度以下であること
を特徴とする蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光顕微鏡に関し、例えば、核酸やタンパク質等を分離分析する際に用いる。
【背景技術】
【０００２】
次世代DNAシーケンサは、広視野蛍光顕微鏡を基礎として作られる（非特許文献１、非特許文献２）。蛍光体が取り込まれたDNA断片をより多くパラレルに蛍光検出するためには、フォーカスずれによる像ボケや収差の少ない蛍光像を取得する必要がある。上記のような蛍光像では、DNA断片から発せられる蛍光をよりはっきした蛍光スポットとして検出できるので、DNA断片の認識精度が向上する。
【０００３】
蛍光顕微鏡の像ボケや収差を補正する手段として、蛍光顕微鏡の点像分布関数と測定画像をデコンボリューションする方法がある。特許文献１は、対物レンズを光軸方向に移動させて（フォーカスをずらして）取得したボケ画像を点像分布関数でデコンボリューションして補正することで、観察対象の3次元像を得る方法を開示している。特許文献２は、共焦点蛍光顕微鏡における像ボケを点像分布関数でデコンボリューションして補正する方法を開示している。共焦点蛍光顕微鏡は、観察視野が狭い欠点がある。特許文献３は、ブランドデコンボリューションの手法を利用して、点像分布関数を変化させてボケ画像をデコンボリューションする工程を繰り返すことで補正する方法を開示している。
【０００４】
点像分布関数を取得する方法には、非特許文献３が示すように、基板上にランダムに固定された回折限界以下の大きさの蛍光ビーズ像から取得する方法がある。同じく非特許文献３には、サンプル基板上に回折限界程度に集光させたレーザスポットの像から点像分布関数を取得する方法が記載されている。特許文献１、特許文献２、特許文献３では、同一視野内で同じ点像分布関数を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2006-518050号公報
【特許文献２】特開2010-39323号公報
【特許文献３】特開平11-272866号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】D. R. Bentley et al., Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry, Nature 456, 53-59 (2008)
【非特許文献２】R. Drmanac et al., Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays, Science 327, 78-81 (2010).
【非特許文献３】James B. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Third Edition, Springer, Chapter 23.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
次世代DNAシーケンサでは、広視野蛍光顕微鏡の収差や像ボケのために、DNA断片の蛍光体が発する蛍光を蛍光スポットとして認識できなかったり、間違ったDNA断片の蛍光スポットと誤認識したりする問題がある。特に、広視野になるほど視野の端で上記問題は顕著である。収差は主に、用いる対物レンズと結像レンズの性能、およびそれらレンズの空間的配置の光軸からのずれに起因する。収差は装置毎に異なる。像ボケは、収差の他に、対物レンズの焦点面とサンプル基板の発光面の位置ずれによって生じる。
【０００８】
収差や像ボケは、点像分布関数を用いたデコンボリューションによって補正することができる。しかしながら、収差や像ボケは、視野内の位置によって異なるため、視野内の位置によって適した点像分布関数を用いなければ、像全体の収差や像ボケを良好に除去することはできない。
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するためのものであり、視野全体の収差および像ボケ等の画像劣化を補正できる蛍光顕微鏡構成および補正工程を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は特許請求の範囲に記載の構成を採用する。その具体的一例の蛍光顕微鏡は、光源と、対物レンズと、二次元センサと、前記二次元センサに接続されたコンピュータと、を備え、前記コンピュータは、２つ以上の観察位置で取得された点像分布関数を保存し、二次元センサで取得した蛍光画像を、観察位置近傍で取得した前記２つ以上の点像分布関数を用いてデコンボリューションして補正することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、視野内の異なる2カ所以上で取得した点像分布関数を用いて、測定蛍光画像をデコンボリューションすることで、１つの点像分布関数でデコンボリューションするときよりも優れた蛍光画像補正効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】次世代DNAシーケンサに組み込まれた実施例１の蛍光顕微鏡の構成図。
【図２】点像アレイ基板。(a)上から見た構成、(b)AA’断面図。
【図３】実施例１の点像分布関数の取得方法のフローチャート。
【図４】図３のフローチャートの内容の一部を図示。
【図５】実施例１の点像分布関数を使った収差・像ボケ補正方法のフローチャート。
【図６】図５のフローチャートの内容の一部を図示。
【図７】サンプル蛍光画像の補正例。
【図８】実施例１の色間ピクセルずれ補正のための座標変換係数取得方法のフローチャート。
【図９】実施例１の色間ピクセルずれ補正方法のフローチャート。
【図１０】点像アレイ基板の例。(a)上から見た構成、(b)AA’断面図。
【図１１】点像アレイ基板の例。(a)上から見た構成、(b)AA’断面図。
【図１２】点像アレイ基板の例。(a)上から見た構成、(b)AA’断面図。
【図１３】制御用PC101に保存された定義ファイル1301内の点像分布関数の記述例。
【図１４】次世代DNAシーケンサに組み込まれた実施例２の蛍光顕微鏡の構成図。
【図１５】実施例２における点像分布関数の取得方法のフローチャート。
【図１６】実施例２における点像分布関数を使った収差・像ボケ補正方法のフローチャート。
【図１７】実施例２における色間ピクセルずれ補正のための座標変換係数取得方法のフローチャート。
【図１８】実施例２における色間ピクセルずれ補正方法のフローチャート
【図１９】実施例３における点像アレイ基板を測定するときの蛍光顕微鏡構成図。
【図２０】実施例４におけるブラインドデコンボリューションによる補正方法のフローチャート
【図２１】実施例５における本実施例における点像分布画像の一部
【図２２】(a) 図21の直線BB’上の４つ点像に関する、X軸方向の画素強度プロファイル。(b) X座標のシフト量を補正して(a)の点像の強度プロファイルを重ねたプロット
【図２３】(a) 実施例５における点像アレイ基板の形態。(b)点像アレイ基板201eの点像分布画像
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００１４】
（顕微鏡の構成）
図1は、次世代DNAシーケンサに組み込まれた蛍光顕微鏡の構成図である。蛍光顕微鏡の構成は、照射系と検出系に分けられる。
【００１５】
光が進む経路の順番に、照射系の構成を説明する。光源102から発せられる光は、コンデンサレンズ107で平行光束となり、フィルタキューブ108に入射する。バンドパスフィルタ103で特定の波長帯域のみが透過し、その他の帯域は反射する。透過した光は、ダイクロイックミラー113で反射したのち、対物レンズ109によって、フローチップ114上に検出視野領域よりも大きな領域に集光する。
【００１６】
次に検出系の構成を説明する。集光された光源からの光によって、フローチップ114上に固定された4種蛍光体のうち、上記特定の波長帯域に励起波長帯をもつ蛍光体1種類が励起される。励起された反応スポット上の蛍光体からの発光は、ダイクロイックミラー113を透過したのち、バンドパスフィルタ120で励起光の散乱成分を取り除いた後、結像レンズ121によって二次元センサ116上に蛍光スポットとして結像する。フィルタキューブ108は4セット用意されている。フィルタキューブ108を自動的に切り替えて、励起および検出波長帯を変更することで、4種蛍光体を順次検出することができる。フィルタキューブ108にはF1-F4の4種がある。フィルタキューブFiが蛍光体Fli（i=1-4）を最も高感度で検出するように、フィルタキューブ内のダイクロイックミラー113とバンドパスフィルタ103とバンドパスフィルタ120の透過率特性は設計されている。
【００１７】
（DNA配列解読方法）
DNA配列の解読方法を説明する。フローチップ上には予め、同一DNA断片が密集した反応スポットが高密度に配置されている。DNA断片を増幅して、同一断片を密集させる方法は、D. R. Bentley et al., Nature 456, 53-59 (2008)に記載されている。DNA配列解読を以下の手順で行う：
１)4種蛍光体が標識された核酸塩基をフローチップ上に流す。ポリメラーゼの伸長反応により、反応スポット上のDNA断片に相補的な核酸塩基が取り込まれる。
２)蛍光顕微鏡で、反応スポットに取り込まれた4種蛍光体を蛍光検出する。ここで4枚のサンプル蛍光画像が生成する。サンプル蛍光画像を解析して、反応スポット毎に伸長された塩基種を同定する。
３)ステージ115を動かして、次の検出視野に移動して、２）を繰り返す。
４）３）をフローチップ全領域に関して繰り返す。
【００１８】
１) - ４)の操作を100回繰り返すことで、反応スポットあたり100塩基の塩基配列を決定することができる。伸長反応方法は、特許文献WO2004/018497A2に記載されている。上記の方法では、フローチップに試薬を導入するための送液機構が必要だが、図１ではこれを省略している。２)の操作には、4枚のサンプル蛍光画像を制御用PC101に保存して、蛍光画像を補正したのちに、蛍光スポットを抽出する作業が必要である。蛍光スポットとは、反応スポットの蛍光像である。反応スポット上に蛍光体Fliが存在するときは、フィルタキューブFiで取得したサンプル蛍光像に上記反応スポットの蛍光スポットが見られる。以下、点像分布関数の取得方法と画像補正方法を記す。
【００１９】
（点像分布関数の取得方法）
図２は、点像分布関数を取得するための点像アレイ基板201aの形態である。点像アレイ基板201aには、透明基板202上に直径200 nmの開口204が設けられた遮光性薄膜207があり、遮光性薄膜207の上に蛍光体層203が塗布されている。蛍光体層203には、DNA配列解読に使う4種蛍光体が高濃度で混ぜられている。
【００２０】
蛍光体層203を除いたナノ開口アレイ基板の構造の作成方法を説明する。透明基板202表面にスパッタにてクロムを厚さ１００ｎｍ程度になるように成膜し，遮光性薄膜207を形成させる。遮光性薄膜207には、アルミニウムのような金属膜が用いられる。アルミニウム以外の材質として，銀，金，クロム，炭化シリコンなどを用いても良い。遮光性薄膜207上に，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ技術により直径200ｎｍの開口204を10μｍの間隔で格子状に複数形成する。開口の直径は、顕微鏡の分解能（〜500 nm）以下であればよく、好ましくは分解能の半分程度（200-300 nm）である。
【００２１】
図３は、点像分布関数の取得方法のフローチャートである。図４はフローチャートの内容の一部を図示したものである。図４の（a）はフローチップ114上の全観察領域とそれぞれの観察視野401の関係を、(b)は各視野での点像分布像の取得方法を、(c)は点像分布像の模式図を、（d）は平均化像分布関数の模式図をそれぞれ表わしている。図３のフローチャートにしたがって、観察視野401毎に点像分布像が取得され、像内の位置によって異なる点像分布関数が取得される。分割数のNは大きいほど画像補正の精度が増す。フローチップ上の観察視野401領域が1mm^2、結像倍率20倍、二次元センサのサイズ2048×2048画素、センサの画素サイズ6.5μm（したがって、フローチップ上の1画素サイズは325nm）であれば、Nは8以上（すなわち、8×8分割以上）が好ましい。本発明の次世代DNAシーケンサでは、フローチップの全観察領域をX方向80mm、Y方向60mmとした。点像分布関数は、ΔX=15mmでX方向に５カ所、ΔY=10mmでY方向に5カ所の合計25カ所で取得された。画像補正の際は、サンプル蛍光画像にXY座標の最も近い視野で取得された点像分布関数を用いる。点像分布関数の測定を、上記よりも細かい間隔で行ってもよい。本実施例では、点像分布関数として、平均化点像分布の画素値を規格化した値を用いている。これを図１３に示した。制御用PC101に保存された定義ファイル1301には、区画の座標の値とともに、点像分布関数を表わす規格化された配列値（画素値）が入力されている。他にも、点像分布を正規分布関数やベッセル関数等でフィッティングして得られる係数を点像分布関数の情報として定義ファイル1301に保存してもよい。この場合、フィッティングに使用する共通の関数式も定義ファイルに記載される必要がある。定義ファイルの特徴は、図１３のように、一定の間隔を持った複数のX,Y座標値と点像分布関数のセットが複数収められていることである。このような点像分布関数のセットはDNAシーケンサ装置毎に異なる。したがって、制御用PCの定義ファイル内保存された点像分布関数の数値は装置毎に異なる。点像分布関数を用いて、サンプル蛍光画像を補正する方法を以下に示す。
【００２２】
（画像補正方法）
点像分布関数をつかった画像補正工程は、収差・像ボケ補正工程と色間ピクセルずれ補正工程にわけられる。
【００２３】
図５は、点像分布関数を使った収差・像ボケ補正方法のフローチャートである。図６はフローチャートの内容の一部を図示したものである。図６の(a)はフローチップ114上の全観察領域と観察視野401の関係を、(b)は各視野での反応スポット601の模式図を、(c)はサンプル蛍光画像602から補正画像604を取得する概念図をそれぞれ表わしている。図５に従って、サンプル蛍光画像を補正した例を図７に示す。サンプル蛍光画像602の蛍光スポット603は対物レンズのフォーカスずれのために画像全域でボケている。画像の端では、像面歪曲のためにボケ量が大きい。加えて、画像の端では、ディストーション、コマ収差、非点収差等の影響により、蛍光スポットが楕円形になっている。図７には、同じ視野で所得した、4×4分割した平均化点像分布画像も示されている。この点像分布画像の点像分布関数を用いて、サンプル画像を補正した結果が図７の一番下に示されている。補正画像では、鮮明な蛍光スポットが得られている。サンプル蛍光画像と補正画像の隣に示す２つグラフは、それぞれの同一位置での断面A-A’の強度プロファイルである。補正前のサンプル蛍光画像のプロファイルで見られる２つの山（図の２つ黒矢印）は、補正画像のプロファイルでは３つの山（図の３つの黒矢印）に分離されている。このように、上記の画像補正方法によって、サンプル蛍光画像で分離されていない蛍光スポットを分離して正しく認識できるようになる。図７の例では、4×4分割を用いたが、さらに細かい分割でもかまわない。なお、点像分布関数をデコンボリューションすることによる画像補正方法として、Lucy-Richardson法やIterative Back Projection法などを用いることができる。また、使用するセンサや露光条件等により、画像にノイズが多く含まれる場合には、画像補正の前にノイズ除去処理を施す。
【００２４】
色間ピクセルずれは、異なるフィルタキューブ108で同一視野のサンプル蛍光画像を取得した時の座標ずれである。これは、ダイクロイックミラー113やバンドパスフィルタ120のウェッジ角が0度ではないことや、色収差によって起こる。色間ピクセルずれがあると、同じ反応スポット上の異なる蛍光体による蛍光スポットは、検出される座標が異なる。このために色間で反応スポットを誤認識する可能性がある。
【００２５】
図８は色間ピクセルずれ補正のための座標変換係数取得方法のフローチャートである。本実施例では、図８のフローチャートに従って、色間ピクセルずれ補正のための座標変換係数（a, b, c, d, e, f）を取得する。第一のステップは、点像分布関数のピーク位置を求めることである。点像分布関数のピーク位置は、正規分布関数やベッセル関数で点像分布をフィッティングして求められる。そのほか、各点像分布内の最大強度を示す画素位置をピーク位置の座標としてもかまわない。フローチャートに従って取得された座標変換係数は、定義ファイルに保存される。
【００２６】
図９は色間ピクセルずれ補正方法のフローチャートである。本実施例では、このフローチャートに従って、サンプル蛍光画像の全画素を座標変換した補正画像を作成することができる。
【００２７】
（点像アレイ基板の形状）
点像アレイ基板は、図２の構造の他に、図10〜12に示すような構造でもかまわない。
【００２８】
図10は図２の蛍光体層203を除いた点像アレイ基板の開口204に発光粒子205を閉じ込めた点像アレイ基板201bである。発光粒子205には、直径50nmの蛍光ビーズを用いた。蛍光ビーズは、200nm直径の開口に複数個入る。蛍光ビーズには、DNA配列解読で使用する蛍光体4種が混入している。発光粒子205は、開口径よりも小さく、観察波長帯域で発光する粒子であれば良い。蛍光ビーズの他には、量子ドットを用いてもよい。
【００２９】
図11は格子状に並べた接着層1101の上に発光層1102を塗布した点像アレイ基板201cである。発光層1102にはDNA配列解読で使用する4種蛍光体を用いたが、量子ドットや観察波長帯域で発光する分子であればよい。点像アレイ基板201cの作製方法を説明する。透明基板202には合成石英を用いて、半導体技術により直径200nmの円形にチタン層を格子状に形成した。オゾンアッシングにより、チタンを酸化チタンにしたのち、Poly(vinylphosphonic acid) (PVPV)を酸化チタン表面に塗布した。PVPAは酸化チタンに特異的に吸着する。石英には吸着しない。その後、PVPAをビオチン化して、ストレプトアビジンをビオチンに結合させて接着層1101を作成した。接着層1101の表面にはストレプトアビジンが結合している。その後、ビオチン化した4種蛍光体をビオチン-ストレプトアビジン-ビオチンのサンドイッチ構造により接着層1101表面に固定することで、発光層1102を作製した。接着層1101および発光層1102の作成方法は、上記以外でも構わない。
【００３０】
図12は接着層1101の上に発光粒子205を固定した点像アレイ基板201dである。接着層1101は図11の点像アレイ基板201cと同様に作成される。発光粒子205に、ビオチン化した直径200nmの蛍光ビーズを用いることで発光粒子205を接着層1101に固定することができる。蛍光ビーズの他には、量子ドットや、観察波長帯域で発光する粒子を用いることができる。蛍光粒子205のサイズは顕微鏡の分解能以下であればよく、好ましくは200-300nmである。
【実施例２】
【００３１】
本実施例は、4台の二次元センサを用いて、4種蛍光体を同時に検出することを特徴とする。図１４は実施例２の蛍光顕微鏡の構成図である。３つのダイクロイックミラー1401,1402,1403と４つの二次元センサ116a,116b,116c,116dを用いて、4種蛍光体の蛍光を同時に検出することができる。バンドパスフィルタ103は4種蛍光体の励起波長帯域の光を透過させるような透過率特性を持っている。すなわち、バンドパスフィルタ103は、２つ以上の分離した波長帯域で励起光を透過させる。フローチップ114上の反応スポット上の4種蛍光体Fl1,Fl2,Fl3,Fl4は、励起光により同時に励起されて4種蛍光シグナルを発する。4種蛍光シグナルのうち、ダイクロイックミラー1401で蛍光体Fl1,Fl2の蛍光成分を反射させて、蛍光体Fl3,Fl4を透過させる。反射光路のうち、蛍光体Fl1の蛍光成分は、ダイクロイックミラー1402で反射して、蛍光体Fl1の発光波長帯域のみを透過させるバンドパスフィルタ120bを透過したのち、結像レンズ121bによって、二次元センサ116b上に蛍光スポットとして結像する。同様に蛍光体Fl2の蛍光成分はダイクロイックミラー1402と蛍光体Fl2のみを透過させるバンドパスフィルタ120bを透過して結像レンズ121aによって二次元センサ116a上に、蛍光体Fl3の蛍光成分はダイクロイックミラー1403で反射して、蛍光体Fl3のみを透過させるバンドパスフィルタ120dを透過して結像レンズ121dによって二次元センサ116d上に、蛍光体Fl4の蛍光成分はダイクロイックミラー1403を透過して、蛍光体Fl4のみを透過させるバンドパスフィルタ120cを透過して結像レンズ121cによって二次元センサ116c上に、それぞれ蛍光スポットとして結像する。ここで、4種蛍光体の発光波長帯域は、Fl1,Fl2,Fl3,Fl4の順に長波長となる。４つの二次元センサ116a,116b,116c,116dは制御用PC101 によって同期しながら画像を取得するので、4種蛍光体の蛍光スポットは4枚の画像上で同時に検出される。
【００３２】
図１５は実施例２における点像分布関数の取得方法を、図１６は、実施例２における点像分布関数を使った収差・像ボケ補正方法を、図１７は、実施例２における色間ピクセルずれ補正のための座標変換係数取得方法を、図１８は実施例２における色間ピクセルずれ補正方法をそれぞれ示している。実施例２における画像補正は、図１５−図１８のフローチャートに従って実施される。DNA配列解読方法は実施例１と同じである。
【００３３】
本実施例では、4種蛍光体のシグナルを同時に検出することができるので、DNA配列解読時間を短縮する固有の効果がある。
【実施例３】
【００３４】
図19は、点像アレイ基板201を蛍光測定するときの構成である。DNA配列解読の際の構成や方法は実施例１と同じである。DNA配列解読の際に用いる二次元センサよりも画素サイズの小さい二次元センサ1901とこれにXY駆動部1902を付加した構成で点像分布像を取得することを特徴とする。
【００３５】
DNA配列解読に用いる蛍光顕微鏡の二次元センサの分解能（フローチップ面での1画素のサイズ）は、反応スポットサイズの半分から同等サイズであればよい。例えば、反応スポットサイズが直径１μmであれば、二次元センサの1画素のフローチップ面でのサイズは、0.5μmから1μm程度になるように二次元センサの画素サイズおよび結像倍率を設計すれば良い。二次元センサの1画素のサイズが大きすぎると（例えば5μm），空間分解能が低下するので，近接する２つのスポットの分離がより困難になる。結像倍率を大きくして、二次元センサの1画素のサイズを小さくすると、観察視野が小さくなるので、１視野で検出できる反応スポット数が少なくなる。したがって、スループットが低下する。
【００３６】
一方、点像アレイ基板201を測定するときの二次元センサは、蛍光顕微鏡の光学分解能の2倍程度の分解能を有することが望ましい。例えば、光学分解能が0.3-0.4μmであれば、二次元センサのフローチップ面での1画素サイズは0.15-0.20μm程度が望ましい。これによって、点像分布の広がりを複数画素で検出できるので、より正確な点像分布関数を求めることができる。
【００３７】
上記の例のように、二次元センサ1画素のサイズの最適値は、DNA配列解読の場合の方が、点像アレイ基板を測定するときの場合よりも大きくなることがある。このような場合、点像アレイ基板201を測定するときの二次元センサには、DNA配列解読で使用される二次元センサよりも、小さい画素サイズのものを用いた方が良い。一般的には、画素サイズの小さい二次元センサはセンサ部分の面積も小さいために、点像分布画像を撮像するときの視野領域は、DNA配列解読での視野領域よりも小さくなる。そこで、XY駆動部1902を用いて、二次元センサ1901をXY平面上に動かして隣接する複数視野を撮像することで、DNA配列解読で観察される視野領域全体の点像分布関数を取得できる。ここで、Z軸は検出系（対物レンズ109や結像レンズ121）の光軸と平行である。XY平面はZ軸に垂直な平面である。X軸とZ軸を図19に図示した。
【００３８】
本実施例では、図３のフローチャートにしたがって点像分布関数を取得した。ただし、1回あたり複数毎の点像分布画像を取得する点が異なる。例えば、DNA配列解読での視野領域が1mm×1mmで、点像分布画像を取得する際の視野領域が0.5mm×0.5mmであれば、0.5mmずつXとY方向にXY駆動部1902で二次元センサ1901を動かして、隣接する４つの点像分布画像を取得する。4枚の点像分布画像を並べた画像を、図３における点像分布画像とする。ただし，得られる平均化点像分布画像の画素数は，DNA配列解読で用いる二次元センサで取得される画像の画素数と異なる。そこで，上記２つの画像の画素数が同じになるように，ビニング等の信号処理で平均化点像分布画像を圧縮した後、その点像分布関数を図１３のように定義ファイルに保存する。
【００３９】
本実施例は、実施例２の４つの二次元センサをXY駆動部1902付き二次元センサ1901に変更して実施することもできる。
【００４０】
本実施例は、点像分布関数を取得する際に、より高分解能の二次元センサを用いることで、点像分布関数の決定精度を高める効果がある。
【実施例４】
【００４１】
実施例１，２，３に記載の画像補正方法は、装置ごとに点像分布関数を取得し、光学系に起因する画像歪みを補正していた。装置ごとの光学系の性能ばらつきが少ない場合には、ある装置にて計測した点像分布関数を元に、他の装置にて取得した画像を補正することができる。これにより、装置ごとの点像分布計測作業を省き、生産効率を上げることができる。
【００４２】
図２０に画像補正のフローを示す。装置Aにて図３の方法を用いて計測範囲内各点の点像分布関数を計測する。次に、装置Bにて取得された画像を、装置Aにて取得した点像分布関数を初期値として、ブラインドデコンボリューションを施し、装置Bの点像分布関数を推定し、補正する。装置Aにて取得された点像分布関数を初期値として用い、反復処理を実施する過程において、装置Aで点像分布関数を取得した時のｚと、装置Bにてサンプル蛍光画像を取得した時のｚの違いも補正できる。なお、初期値にガウス関数を用いる等、事前情報なしにて、本手法を実施することも可能だが、デコンボリューションでの点像分布推定にて局所解に陥る可能性が高くなるという欠点がある。
【００４３】
本実施例に記載の画像補正方法は実施例１，２，３に記載のいずれの光学系、点像アレイ基板を用いても実施可能である。
【実施例５】
【００４４】
本実施例は、点像アレイ基板を観察視野に対して傾けて点像分布画像を取得することを特徴とする。
【００４５】
図21は本実施例における点像分布画像の一部である。点像アレイ基板201を観察視野に対してθ度傾けて点像分布画像を取得した。このため、点像の格子配置は観察視野のXY軸に対してθ度傾いている。図ではθ=4.1度である。白い格子線で区切られた区画は画素を、画像周囲の数値は座標をそれぞれ表わしている。図22(a)は、図21の直線BB’上の４つの点像に関する、X軸方向の画素強度プロファイルである。ただし、画素値はY方向の3点の移動平均値である。点像のY座標は、点像分布画像をY方向に3点の移動平均処理をした後、直線BB’上で画素値が最も大きな値を示す画素位置である。実質的には、この座標位置が点像のピークの画素位置（または中心位置）である。４つの点像の強度プロファイルは、Y座標の値が大きくなるに従い、強度のピークがX座標の右へ（X座標が大きくなる方向へ）シフトしている。これは、点像の格子配置がθ=4.1度傾いているためである。図22(b)は、X座標のシフト量を補正して図22(a)の点像の強度プロファイルを重ねたプロットである。このように、傾いた点像のX座標シフトを補正して、強度プロファイルを重ねることで、データ点の多い強度プロファイルを得られる。X軸方向にも同様の操作を行うことで、X軸方向に複数の点像を重ねたY軸断面の強度プロファイルを取得することができる。このように強度プロファイルのデータ点を多くすることで、フィッティングで得られる点像分布関数の決定精度が高める効果がある。この方法は、前記実施例のいずれとも組み合わせられる。傾き角度θは、0<θ<5°が好ましい。0と45度以外で90度以下の任意の角度を選ぶことができる。
【００４６】
X座標シフトの補正方法を示す。点像分布画像は予めY方向に移動平均処理がされているとする。上記では、3点の移動平均画像を取得したが、2点以下または4点以上の移動平均でも構わない。点像のY座標位置は、移動平均画像の画素値に閾値を設けて、閾値以上となる画素領域の最大値を示す座標として求められる。点像アレイ基板の格子間隔、結像倍率、傾き角θから画像中の点像分布の間隔を計算して、点像の座標位置を求めても構わない。各点像を関数でフィッティングして求まるピーク位置を座標位置としても構わない。この様にしても求められるY座標の値を用いて、補正後のX座標X’を、X’=X-Y×tanθとして求められる（Xは補正前のX座標。Yはピーク位置のY座標。）。上記、XをY、YをXとすれば、Y方向のY座標シフトの補正も同様に行える。図22では、(a)のX軸の値をそれぞれ、X’に変換した後に、４つの強度プロファイルを同一のグラフにプロットして(b)を求めた。
【００４７】
点像アレイ基板201の傾きθの求め方を示す。点像アレイ基板201をステージ115に載せたときの傾きを測定してθを求める場合や点像分布画像を解析してθを求める場合がある。点像分布画像を解析して求める場合を示す。点像分布関数をX方向またはY方向の一般的な微分フィルタによるフィルタ処理をして、点像領域内のゼロクロス点の座標を、点像のピーク位置（または中心位置）として小数点第一位以下の精度（0.1画素の精度）で求める。ここで、微分フィルタには、Prewittオペレータ、Sobelオペレータ、Savitzky-Golay平滑化微分フィルタ等を用いることができる。求めた複数点のXY座標をX方向またはY方向の列毎に一次関数（y=ax+b）でフィッティングして、その傾き（a）をtanθとして求める。上記θの算出は、点像分布画像をN×N分割して，分割区画毎に行われるのが望ましい。収差の影響により、像がゆがむため、区画毎に傾きθが異なる場合がある。図23（a）は本実施例における点像アレイ基板201eの形態である。図に示すように、開口204の他に、開口の格子配置と平行な長方形開口231を設けることを特徴とする。長方形開口231に図２で示すように蛍光体層203が塗布されている。図23(b)に示すように、点像分布画像上で、長方形開口231は、長方形の蛍光像として検出される。傾き角度θは、上記長方形開口像のエッジを検出することで求められる。エッジの位置は、微分フィルタで2回フィルタ処理したときのゼロクロス点により求められる。その後、エッジ位置の座標を上記同様に一次関数でフィッティングしたときの傾きからtanθを求め、傾き角度θを決定できる。上記長方形開口を用いることで、より多くのエッジ位置のデータ点を用いられるので、より正確に角度θを求められる効果がある。
【００４８】
以上、本発明の例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解される。各実施例を適宜組み合わせることも、本発明の範囲である。
【符号の説明】
【００４９】
101  制御用PC
102  光源
103  バンドパスフィルタ
107  コンデンサレンズ
108  フィルタキューブ
109  対物レンズ
113、1401,1402,1403  ダイクロイックミラー
114  フローチップ
115  ステージ
116、1901、116a,116b,116c,116d  二次元センサ
120  バンドパスフィルタ
121  結像レンズ
201、201b、201c、201d、201e  点像アレイ基板
202  透明基板
203  蛍光体層
204  開口
205  発光粒子
207  遮光性薄膜
401  観察視野
402  点像分布画像
403  平均化点像分布画像
601  反応スポット
602  サンプル蛍光画像
603  蛍光スポット
1101  接着層
1102  発光層
1301  定義ファイル
1902  XY駆動部
231  長方形開口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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