(57)【要約】      （修正有）【課題】がん化と深くかかわるヒトbZIP、JUNのbZIP領域と結合する30残基以下の短いペプチドを提供する。【解決手段】JUNの35残基長のbZIP領域中、N末端側の28残基長部分とロイシンジッパー構造を形成して会合することを想定し、JUNの当該領域と疎水結合、水素結合、塩橋が最大で、かつ自身がαヘリックス構造を安定化させるように調整した特定のアミノ酸配列からなるペプチド。ペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に鎖状分子を結合させ、該鎖状分子のペプチドと結合していない側の末端を基板材料と結合する結合基を有するように修飾し、ペプチドが基板と結合するように改変されたペプチドを含む高分子材料。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端およびＣ末端が電荷を持たないように修飾された請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に鎖状分子を結合させ、該鎖状分子のペプチドと結合していない側の末端を基板材料と結合する結合基を有するように修飾し、ペプチドが基板と結合するように改変された請求項１に記載のペプチドを含む高分子材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト bZIPのJUNのロイシンジッパー領域中の28残基長部分の配列と同一の配列をもつ28残基長のペプチドとロイシンジッパー構造を形成して会合する28残基長のペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、遺伝子配列に基づいてタンパク質を合成し、それを生体中で必要なさまざまな化学反応に利用している。そのタンパク質の機能の中で最も重要なものは、他の物質（タンパク質も含む）を認識する機能である。このタンパク質の分子認識機能は、遺伝子の発現、すなわち遺伝子の読み出しとタンパク質の合成の制御にも用いられている。タンパク質の分子認識機能を担うのが、一群の転写因子と呼ばれるタンパク質である。
【０００３】
この中でもっともよく研究されているのが、塩基性ロイシンジッパー転写因子である（以下英語名である basic leucine zipper transcription factor にちなんで、bZIPと略記する）。ヒトについては、現在までに100種類以上のbZIPが知られている。bZIPは、ロイシンジッパー領域とDNA結合領域、および機能領域をもつ。二つのbZIPのロイシンジッパー領域は、ロイシンジッパー構造で結合（あるいは会合）し、それぞれのDNA結合領域の組み合わせに応じて、特定のDNA領域に結合する。その結果、それぞれの機能領域のもつ機能に従って、結合したDNA領域近傍の遺伝子の発現を制御する。
【０００４】
bZIPの結合の組み合わせは、それほど特異的ではなく、JUNとFOSという２種類のbZIPの場合、JUNとFOSが対を作る場合もあれば、JUN同士で対を作ることもある。そのほかFOSは、JUNと類似するJUNB、JUNDと対を作ることもある。この組み合わせに応じて、結合するDNA領域が異なり、さまざまな遺伝子発現を制御しているのである。
【０００５】
bZIPのほとんどは、そのロイシンジッパー構造の形成にかかわるロイシンジッパー領域のアミノ酸配列において、７残基ごとにロイシン残基が現れることを特徴としている。二つのbZIPそれぞれのロイシンジッパー領域がロイシンジッパー構造を形成して対を作るときには、その両者のロイシンジッパー領域がαヘリックス構造を形成し、かつ双方のロイシン残基の側鎖が疎水結合することにより、二つのαヘリックス構造が互いに高次の二重らせん構造を構成して会合する。二つのαヘリックス構造が会合し、ロイシンジッパー構造を形成しているとき、これを構成する二つのペプチドのＮ末端側からＣ末端側への向きは同じである。すなわち、Ｃ末端側同士、およびＮ末端側同士が結合する並行な会合である。ただし、反並行な会合もあり得る。
【０００６】
７残基ごとに現れるとされるロイシン残基が常にロイシンであるわけではなく、稀にイソロイシンまたはアラニンのような他の疎水性側鎖を有するアミノ酸である場合があり、さらに、大変稀には、親水的な側鎖をもつアミノ酸である場合もあり得る。bZIPの温度変化に対する会合、解離の仕組み、およびその熱力学特性については、さまざまな研究がなされてきたが、その中でも、酵母由来のGCN4と呼ばれる２種類のペプチドに関する研究が多数存在する。非特許先行文献１には、GCN4を改変した30残基長の２種類のペプチドが開示されている。
【０００７】
bZIPは、細胞内の状態を制御している２千種類以上あるとされる転写因子の一部である。したがって、がん細胞は、本来の細胞分裂の制御機構が暴走した状態である、という通説に従えば、転写因子による制御の乱れが細胞のがん化にかかわることが想定される。実際に上述のJUNおよびFOSは、細胞のがん化に深く関係しているとされ、多くのがん細胞ではこれら二つのbZIPが大量に発現していることが知られている。
【０００８】
JUNは、本来は本来細胞分裂と深くかかわる転写因子であり、受精卵が胚を形成するまでの細胞分裂、および組織が損傷をうけて修復する際の細胞分裂にかかわっている。よって細胞分裂をしていない通常細胞では、JUNの発現量は非常に少ない。がん細胞は細胞分裂が暴走した状態であるので、細胞分裂にかかわるJUNが大量に発現していることは、細胞のがん化と整合する。
【０００９】
このような中で、ぞれぞれのbZIPとロイシンジッパー構造を形成して特異的に結合しうるペプチドを開発する意義が二つ生まれる。まず一つ目の意義は、がん診断である。たとえば、JUNと特異的に結合するペプチドをプローブとして利用し、生体組織から取り出された溶液中のJUNの濃度を測定することにより、その生体組織ががん化しているかどうかを判断する根拠となり得る。治療法の異なる種類のがんがあり、それぞれのがんが異なるbZIPの大量発現を伴っているならば、多種のbZIPそれぞれに結合するペプチドを作り、それらにより多種のbZIPのそれぞれの濃度を測定することにより、がんの種類の特定が可能になる。
【００１０】
二つ目の意義は、がん治療である。非特許先行文献２に開示されているように、がん化した細胞において大量発現したbZIPが特定されれば、そのbZIPは必ずやそれ自身、あるいはそのほかの大量発現しているbZIPと対を作り、遺伝子発現制御を暴走させていると想定される。このため、大量発現しているbZIPと対をつくり得るペプチドを投与し、大量発現しているbZIPと投与されたペプチドを結合させると、この対は、DNA結合能力がないため、転写因子として働かず、よって大量発現しているbZIPの機能を無力化できる。すなわち、がん化した細胞の正常化がはかられるのである。
【００１１】
JUNのように大量発現とがん化が関連していることが知られているbZIPについては、がん診断で利用するそのbZIPに結合するペプチドと、治療目的で投与する同じbZIPに結合するペプチドは、結合するロイシンジッパー領域については同じ、あるいは同様の配列でよい。よって、いずれの目的に対しても、特定のbZIPと一定の特異性をもって結合するペプチドは有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Marti D.N., Jelesarov I., Bosshard H.R..,(2004) Interhelical Ion Pairing in Coiled Coils: Solution Structure of a Heterodimeric Leucine Zipper and Determination of pKa Values of Glu Side Chains. Biochemistry 39,pp12804-12818
【非特許文献２】Grigoryan G., Reink A.W., Keating A.E.,(2009) Design of protein-interaction specificity gives selective bZIP-binding peptides. Nature 456, pp859-865
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ヒトbZIPのJUNの35残基長のロイシンジッパー領域中のN末端側の28残基長の配列と同一の配列をもつ28残基長のペプチドと、0℃においてロイシンジッパー構造を構成して会合する28残基長のペプチドであって、双方のペプチドがほぼ同様の濃度で合計濃度が125mg/Lのとき、15℃において50％以上会合し、40℃においてはほぼ全体が解離していることを特徴とする28残基長のペプチドを提供すること目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者が、非特許先行文献１に開示されているGCN4を改変した30残基長の２種類のペプチドについて再実験を行ったところ、濃度125mg/L、pH 7.4（7.5mM リン酸バッファーによる）、イオン強度100mM（NaClによる）の条件で、会合および解離の遷移中央温度は、65℃であった。これらGCN4を改変した30残基長のペプチドは、双方ともに、７残基ごとに現れるロイシン残基を４残基有している。よってロイシンジッパー構造を形成する正味の領域は、（７×４＝）28残基である。さらに配列を詳しく見ると、比較的類似した７残基長の部分配列が４回繰り返す構造になっている。
【００１５】
２種類のペプチドのうち、全体で負電荷をもペプチド（ペプチドＡ）は、７残基長の-EVAQLEQ-をもとに、これに１ヶ所または２ヶ所改変した配列が４回繰り返す28残基長の配列を有している。一方、全体で正電荷をもつペプチド（ペプチドＢ）は、７残基長の-KVAQLKQ-をもとに、これに１ヶ所ないし３ヶ所改変した配列が４回繰り返す28残基長の配列を有している。とくに、リジン残基(K)は、同様に側鎖が正電荷をもつアルギニン残基(R)に置換されているところが多い。そこで、ロイシンジッパーのロイシンを５番目の残基とするこの７残基長の部分配列を、ひとつのユニットとして考えることができることが判明した。すなわち、GCN4を改変した30残基長のペプチドＡおよびペプチドＢは、それぞれ４ユニットからなる、（７×４＝）28残基長の配列を基本としている。
【００１６】
この２種類のペプチドＡおよびＢについては、非特許先行文献１に開示されているように、核磁気共鳴法によって、水溶液中でロイシンジッパー構造を形成して会合していることが判明している。これによれば、ペプチドＡの第１のユニットと、ペプチドＢの第１のユニットがそれぞれ会合し、以下、第２のユニット同士、第３のユニット同士、第４のユニット同士が会合して、ロイシンジッパー構造を形成していることが判明している。それぞれのユニットの会合においては、まずもっとも主要な結合は、双方のユニット５番目のロイシンの側鎖間の疎水結合である。
【００１７】
続いて、ペプチドＡの各ユニットの１番目のグルタミン酸残基(E)の負の電荷をもつ側鎖が、ペプチドＢの各ユニットの６番目のリジンまたはアルギニン残基の正の電荷をもつ側鎖と静電的な相互作用により結合し、同じく、ペプチドＡの各ユニットの６番目のグルタミン酸の側鎖と、ペプチドＢの各ユニットの１番目のリジンまたはアルギニン残基の側鎖と静電的な相互作用により結合している。各ユニットの会合において、２番目の残基であるバリン(V)の側鎖が他方のバリンの側鎖と、疎水的な相互作用により結合し、また双方のＮ末端側から３番目のユニットの２番目のアスパラギンの側鎖は、他方のユニットのアスパラギン(N)と水素結合をしている。
【００１８】
本発明者は、非特許文献１に開示されているGCN4の改変型のロイシンジッパー構造の詳細に基づき、ヒトbZIPのJUNの35残基長のロイシンジッパー領域中N末端側の28残基長の領域に着目し、この領域とロイシンジッパー構造を構成して最も強く結合し得る28残基長のロイシンジッパー領域のアミノ酸配列を開発した。そして、この配列を有するペプチド（anti-JUN）が実験によってJUNの28残基長の領域を切り出したペプチド（JUN28）とロイシンジッパー構造を形成して会合することを実証した。
【００１９】
しかしながら、非特許文献１の配列番号１の配列を有するペプチドは、JUN28との合計濃度が500mg/Lの高濃度の条件下においても、安定に50%以上会合している温度が10℃以下と低く、がん診断用ペプチドプローブとして利用するために十分な特性を持たなかった。さらに、非特許文献１の配列番号１の配列を有するペプチドは、それ自身の２分子が会合してホモダイマーを作りやすいことも判明した。そこで、本発明者は、より低濃度で、かつより高温においても安定してJUN28と会合することができ、かつホモダイマー形成が起こらないペプチドを発明した。
【００２０】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドに関する。
【００２１】
本発明者は、JUN28の配列中塩基性アミノ酸残基（アルギニンおよびリジン）の数が酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸およびグルタミン酸）の数より多く、全体として塩基性になっていることに着目し、これに結合するanti-JUN28として、酸性のグルタミン酸を多く含有し、塩基性アミノ酸を含有せず、全体としては酸性になるようにし、ついで会合に関わるアミノ酸残基（ロイシン、グルタミン酸、バリンおよびアスパラギン）以外のすべての残基を、もっとも安定にαヘリックスを形成することが知られているアラニンとすることにより、会合時の安定性を高めた配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを開発した。
【００２２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、ヒトbZIPのJUNのロイシンジッパー領域中の28残基長部分（配列番号２）を切り出した28残基長のペプチドJUN28と、15℃で、２種類のペプチドの合計濃度が125mg/Lの条件において、それぞれのペプチドの半数以上が会合する。
【００２３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端が電荷を持たないように修飾されていることが好ましい。
【００２４】
たとえば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端側をアセチル化し、Ｃ末端側をアミド化することにより、Ｎ末端の正電荷、およびＣ末端の負電荷が取り除かれる。その結果、Ｎ末端及びＣ末端が電荷を持たないように修飾されたペプチドは、JUNと並行に会合することが阻害されない。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に鎖状分子を結合させ、該鎖状分子のペプチドと結合していない側の末端を基板材料と結合する結合基を有するように修飾し、ペプチドが基板と結合するように改変された請求項１に記載のペプチドを含む高分子材料に関する。
【００２６】
本発明に係る配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを、ヒトbZIPのJUN濃度測定用に利用するに当たっては、濃度測定用基板上に結合を阻害しない程度の長さの鎖状分子を配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に結合させ、さらに当該鎖状分子のペプチドと結合していない側の末端を、基板との結合能を有する結合基を持つように修飾し、これによって配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドが基板に結合し、固定されるように改変された高分子材料を構成することが可能となる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のペプチド（配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチド）は、ヒトbZIPのロイシンジッパー領域中のＮ末端側28残基長の部分とロイシンジッパー構造を作って会合する能力を有する28残基長のペプチドである。本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端を修飾し、修飾されたペプチドを基板に固定することにより、ヒトの生体組織から取り出された溶液中のbZIP JUNと基板に固定された本発明のペプチドと有意に結合させ、その濃度を測定ことが可能となる。
【００２８】
背景技術として述べたがん診断という一つ目の意義に関連して、JUNは、がん化した細胞中で大量発現していることが知られているため、本発明のペプチドは、JUNの測定に利用されることにより、がん診断に応用できる。背景技術で述べたがん治療という二つ目の意義に関連して、JUNが大量発生して細胞分裂が暴走しているがん化した細胞に、本発明のペプチドを修飾した誘導体を投与することにより、JUNの転写因子としての機能を無効化することが期待できる。
【００２９】
本発明のペプチドは、JUNのみならず、JUNと相同のJUNBまたは JUNDとの結合も、JUNとの結合よりは弱いものの可能であり、これらの測定にも応用し得る可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列（JUN28）とが、ロイシンジッパー構造を形成して会合した際のアミノ酸間の相互作用を推定したアミノ酸間の相互作用の推定図である。
【図２】配列番号１に記載のペプチドの125mg/Lの濃度の溶液と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドの125mg/Lの溶液を、等量混合した場合における円二色性（CD）分光測定の波長222nmの温度変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明のペプチドおよび高分子材料について、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されない。
【００３２】
本発明のペプチドとしては、配列番号１に示される28残基長のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端の正電荷を除去するためにアセチル化修飾を行い、Ｃ末端の負電荷を除去するためにアミド化修飾を行ったペプチドを使用した。
【００３３】
JUN28ペプチドとしては、配列番号２に示される28残基長のアミノ配列を有し、Ｎ末端をアセチル化修飾し、Ｃ末端をアミド化修飾したペプチドを使用した。
【００３４】
図１では、さらに、配列番号１に記載のペプチド（anti-JUN）と、配列番号２に記載のペプチド（JUN28）がロイシンジッパー構造を形成して会合していることを想定した場合、どのアミノ酸残基が両ペプチドの会合にかかわっているかを矢印によって示している。
【００３５】
本発明のペプチド（anti-JUN）が、JUN28（ヒトbZIPのJUNのロイシンジッパー領域中の28残基長の部分配列を切り出したペプチド）と会合および解離を可逆的に行うことは、以下の実験により実証された。溶液条件は、ヒトの生理的な条件に近い条件が選ばれた。
【００３６】
［実施例］
１．実験法
１−１．ペプチド合成および溶液の調整
配列番号１および配列番号２に示されるペプチドの合成と、それらペプチドのＮ末端およびＣ末端の修飾は、シグマアルドリッチジャパン合同会社に依頼し、いずれも凍結乾燥された純度95%以上の合成品が得られた。２種類のペプチドは、まず純水中に溶解させて4g/Lの濃度に調整され、次にリン酸バッファーおよびNaCl溶液と混合され、最終的に各ペプチドの濃度が1g/Lで、pHが7.4、リン酸バッファーの濃度が7.5mM、NaClによるイオン強度が100mMになるように調整された。
【００３７】
１−２．円二色性（CD）分光測定
測定対象のペプチドの組み合わせにそって、２種類のペプチドの1g/L溶液をそれぞれ500μLずつ混合し、次に、7.5mMリン酸バッファーおよびNaCl 100mMの溶液と混合して８倍に希釈し、２種類のペプチドの濃度合計が125mg/Lで7.5mMリン酸バッファー、pH 7.4、イオン強度 100mM (NaCl)の溶液を得た。この溶液400μLをCD分光器用角型石英セルに入れ、円二色性分光測定を行った。
【００３８】
１−３．円二色性分光測定結果に基づく各種熱力学特性の計算法
円二色性分光測定では、波長222nm のCD値であるθ222を、溶液中のペプチドまたはタンパク質のαヘリックスの含有度を測定するために用いる。ロイシンジッパー構造が形成されているときには、２種類のペプチドは、会合していると同時に両者がαヘリックス構造を形成している。解離している状態では、ロイシンジッパー構造が変性していることにより、２種類のペプチドは、両方ともαヘリックス構造をほとんど形成せず、他のランダムコイル構造に変性したり、または部分的にβストランド構造に変性したりする。
【００３９】
円二色性測定では、波長222nmにおけるCD値（θ222）は、αヘリックス構造である場合は大きな負値になり、ランダムコイル構造ではほぼ０であり、βストランド構造では、αヘリックス構造に比べて半分程度の絶対値をもつ負値になる。低温において２種類のペプチドが会合してロイシンジッパー構造を形成しているときのθ222は、絶対値の大きな負値であり、解離するとαヘリックス構造の他の構造への変性により絶対値の小さな負値に変化する。このため、温度依存性のあるθ222の値を、会合してロイシンジッパー構造を形成している状態と、解離している状態との二状態のみからなる変性を仮定して解析することができる。
【００４０】
GCN4を改変した30残基長の２種類のペプチドに関する実験結果から、２種類のペプチドの合計濃度が125mg/Lの場合、θ222の値が-15mdeg となる温度が状態遷移中央温度であることが判明した。
【００４１】
２．実験結果
図２は、配列番号１に記載のペプチド（anti-JUN）の125mg/Lの濃度の溶液と、配列番号２に記載のペプチド（JUN28）の125mg/Lの溶液を、等量混合した場合における円二色性分光測定の波長222nmの温度変化を示すグラフである。図２から、anti-JUNとJUN28とが15℃において50％以上会合してロイシンジッパー構造を形成し、40℃程度において完全に解離していることが確認された。このように、図２から、配列番号１に記載のペプチド（anti-JUN）は、JUN28と十分な強度で結合することが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のペプチド（配列番号１に記載のペプチド）は、ヒトbZIPのJUNと結合する可能性が高く、ヒトの生体組織中から取り出された溶液中のJUNの濃度測定に利用することが想定される。本発明のペプチドは、がん化した細胞に誘導体として投与されることによって、細胞の正常化を目指した治療目的で利用することも想定される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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