(57)【要約】【課題】本発明は、免疫アッセイにおいて高い検出感度を実現する、親水性ポリマー層を有する物質固定化用担体をばらつきなく提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、プラスチック表面を有する基体と、該基体のプラスチック表面に配置された親水性ポリマー層とを含み、親水性ポリマー層が、少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含み、親水性ポリマー層の算術平均粗さが１０ｎｍ以上であり、親水性ポリマー層の厚さが２０ｎｍ以上である、前記物質固定化用担体に関する。【選択図】図１
2014224710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
プラスチック表面を有する基体と、該基体のプラスチック表面に配置された親水性ポリマー層とを含み、
親水性ポリマー層が、少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含み、
親水性ポリマー層の算術平均粗さが１０ｎｍ以上であり、
親水性ポリマー層の厚さが２０ｎｍ以上である、
前記物質固定化用担体。
【請求項２】
親水性ポリマー鎖が、ポリアルキレングリコール鎖である、請求項１記載の物質固定化用担体。
【請求項３】
活性反応基が(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基である、請求項１または２記載の物質固定化用担体。
【請求項４】
基体のプラスチック表面の水接触角が６５°以下である、請求項１〜３のいずれか１項記載の物質固定化用担体。
【請求項５】
免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体の製造方法であって、
プラスチック表面を有する基体を準備する工程、
基体のプラスチック表面に、少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含む親水性ポリマー層を配置する工程、
親水性ポリマー層の算術平均粗さを測定する工程、
親水性ポリマー層の厚さを測定する工程、および
親水性ポリマー層の算術平均粗さが１０ｎｍ以上であり、親水性ポリマー層の厚さが２０ｎｍ以上である物質固定化用担体を選択する工程
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アッセイに用いるための固相担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法の一種である酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）は、創薬、診断、環境計測、食品を含む幅広い分野で利用されている。典型的なＥＬＩＳＡは、（１）抗体または抗原の固定化（固相化）、（２）標的物質の結合、（３）酵素標識抗体の結合、（４）酵素反応、（５）光学的検出（吸収、蛍光、発光）、の５つの工程からなる。標識用酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどが用いられる。ＥＬＩＳＡは数ある免疫測定法のなかでも特に感度が高い。しかし、実際には固相担体への生体分子の非特異吸着が原因で期待する感度が得られないことも多い。特に酵素標識抗体のような複合体は固相担体に吸着しやすく、これがＥＬＩＳＡにおけるノイズの主な原因となっている。このような非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキング処理が試みられるが、その効果は限定的と言わざるを得ない。そこで、生体分子の非特異吸着を効果的に防ぐポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）などの親水性ポリマーに注目が集まっている。すなわち、抗体または抗原の固定化を、親水性ポリマー鎖を介して行うことによって、固相担体への生体分子の非特異吸着を防ぐ試みがなされている。
【０００３】
特許文献１には、ＰＥＧリンカーを介して核酸やタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧリンカーを有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧリンカーの末端に核酸やタンパク質を結合させる、というものである。この方法によってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
【０００４】
一般的に、プラスチックは成型し易く、輸送上、廃棄上の問題が小さいという利点があることから、バイオアッセイ用担体としても好ましく用いられる。特許文献２には、ＥＳ細胞から均一な大きさの胚様体を複数個同時に形成する胚様体形成用マルチウェルプレートが記載されており、当該マルチウェルプレートの作製に際し、ポリスチレン樹脂の９６穴マルチウェルプレートに酸素プラズマ処理を行いマルチウェルプレート表面に濡れ性を付与し、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーをコーティングする技術が開示されている。しかし、当該技術によって得られる水溶性ポリマーコーティングは、タンパク質などの生体関連物質の非特異吸着を抑制するには不十分であった。
【０００５】
特許文献３には、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基を有するＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層が表面に配置された、免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体が記載されている。しかし、親水性ポリマー層の表面粗さや層厚に関しては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４３７１５号公報
【特許文献２】特開２０１０−９４０４５号公報
【特許文献３】特開２０１３−１１４７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、プラスチック表面に親水性ポリマー層を配置して免疫アッセイ用担体を製造する場合、同様の手順によって親水性ポリマー層を配置した場合でも、また、同じプラスチック材料を原料とする同一の製品名で販売されているプラスチック基体を用いた場合でも、プラスチック基体の製造ロットなどにより、プラスチック基体の表面処理の程度などが異なり、その結果、親水性ポリマー層の微小な凹凸にばらつきが生じ、親水性ポリマー層配置後の免疫アッセイにおけるＳ／Ｎ比にばらつきが出るという問題があることを見出した。
【０００８】
本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、ＥＬＩＳＡ等の免疫アッセイにおいて高い検出感度をばらつきなく安定的に実現する、親水性ポリマー層を有する物質固定化用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、プラスチック表面に配置した、末端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含む親水性ポリマー層が微小な凹凸を有し、特定の算術平均粗さと厚さを有する親水性ポリマー層が、免疫アッセイにおいて優れたＳ／Ｎ比を実現し、高い感度をもたらすことを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体であって、
プラスチック表面を有する基体と、該基体のプラスチック表面に配置された親水性ポリマー層とを含み、
親水性ポリマー層が、少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含み、
親水性ポリマー層の算術平均粗さが１０ｎｍ以上であり、
親水性ポリマー層の厚さが２０ｎｍ以上である、
前記物質固定化用担体。
（２）親水性ポリマー鎖が、ポリアルキレングリコール鎖である、（１）記載の物質固定化用担体。
（３）活性反応基が(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基である、（１）または（２）記載の物質固定化用担体。
（４）基体のプラスチック表面の水接触角が６５°以下である、（１）〜（３）のいずれかに記載の物質固定化用担体。
（５）免疫アッセイに用いるための物質固定化用担体の製造方法であって、
プラスチック表面を有する基体を準備する工程、
基体のプラスチック表面に、少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含む親水性ポリマー層を配置する工程、
親水性ポリマー層の算術平均粗さを測定する工程、
親水性ポリマー層の厚さを測定する工程、および
親水性ポリマー層の算術平均粗さが１０ｎｍ以上であり、親水性ポリマー層の厚さが２０ｎｍ以上である物質固定化用担体を選択する工程
を含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の物質固定化用担体を用いて免疫アッセイを行うことにより高い検出感度をばらつきなく安定的に実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例で製造した物質固定化用担体のＡＦＭ画像、親水性ポリマー層の算術平均粗さ（Ｒａ）、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）、層厚（親水性ポリマー層の厚さ）および免疫アッセイにおけるＳ/Ｎ比を、物質固定化用担体の製造に用いた基体ごとに示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（基体）
本発明において、基体の形状は特に限定されない。例えば、板状体、マルチウェルプレートやマイクロプレート（複数の凹部が形成された板状体）、粒子、スライド、プレート、フィルム、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の基体を用いることができる。基体の材料としては、プラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。
【００１４】
基体は、プラスチック表面を有する。プラスチック表面は、プラスチックを含む表面をさし、好ましくはプラスチックからなる表面をさす。基体がマルチウェルプレートなどの板状または略板状の場合、好ましくは少なくとも親水性ポリマー層を配置する側の表面がプラスチック表面であることが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。最も好ましくは基体全体がプラスチックからなるものを準備する。
【００１５】
プラスチックの具体例としては、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系重合体；ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン系共重合体、ＡＢＳ樹脂などのスチレン系樹脂；ポリメチル（メタ）アクリレート、ポリエチル（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリルなどのアクリル系樹脂；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブテン、環状ポリオレフィンなどのポリオレフィン系樹脂；ポリエチレンテレフタレート、エチレングリコール−テレフタル酸−イソフタル酸共重合体、ポリブチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリウレタン系樹脂；エポキシ系樹脂；ナイロン６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン６１２、ナイロン１１、ナイロン１２、ナイロン４６などのポリアミド樹脂；メチルペンテン樹脂；フェノール樹脂；メラミン樹脂；エポキシ樹脂；フッ素樹脂などが挙げられる。これらは、単独でもよいし、二種以上混合して用いてもよい。ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレンおよびポリエチレンは、親水性ポリマー層を配置しやすいため特に好ましい。
【００１６】
親水性ポリマー層を配置するプラスチック表面は、６５°以下の水接触角を有することが好ましく、４０〜５５°の水接触角を有することがより好ましい。当該範囲の水接触角を有するプラスチック表面に親水性ポリマー層を配置することにより、免疫アッセイにおいて優れたＳ／Ｎ比を達成でき、高感度のアッセイを実現できる。なお、本発明において水接触角とは、２３℃において測定される水接触角をさす。
【００１７】
（親水性ポリマー層）
基体のプラスチック表面には、親水性ポリマー層が配置される。親水性ポリマー層は少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含む。親水性ポリマー鎖は、炭素成分を含み、ポリマーの主鎖もしくは側鎖に親水性の官能基を含むポリマーのことを指す。親水性ポリマー鎖は、水溶性や水膨潤性を有する、炭素酸素結合を含む水溶性ポリマーであることが好ましい。親水性ポリマーは、恒常的に水溶性や水膨潤性を有するものであってもよいし、光、温度、ｐＨなどの所定の刺激により水溶性や水膨潤性を示すものであってもよい。免疫アッセイに使用する観点から、生体毒性の低いもの採用することが好ましい。
【００１８】
親水性ポリマー鎖の具体例としては、ポリアルキレングリコール鎖、ポリビニルピロリドン鎖、ポリプロピレングリコール鎖、ポリビニルアルコール鎖、ポリエチレンイミン鎖、ポリアリルアミン鎖、ポリビニルアミン鎖、ポリ酢酸ビニル鎖、ポリアクリル酸鎖、ポリ（メタ）アクリルアミド鎖、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド鎖等のヒドロゲルポリマー鎖、これらと他のモノマーとの共重合体や、グラフト重合体などが挙げられる。中でもポリアルキレングリコール鎖は生体適合性に優れているので好適に用いることができる。ポリアルキレングリコール鎖は次式：
−（（ＣＨ２）ｎ−Ｏ）ｍ−
（ｎはアルキレン鎖の炭素数を表し、ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｎは、通常１〜１０の整数であり、好ましくは１〜４の整数である。ｍは４以上であることが好ましい。ポリアルキレングリコール鎖の数平均分子量は好ましくは２５０００以下、より好ましくは１００００以下、さらに好ましは１０００以下である。数平均分子量が増すと粘度が増すため取扱いが難しく、高密度での配置が難しくなるからである。ポリアルキレングリコール鎖のうち、次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは上記と同義であり、重合度を示す整数である）
で表されるポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）が特に好ましい。
【００１９】
親水性ポリマー鎖の少なくとも一端には、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの活性反応基が直接的または間接的に連結されていることが好ましい。このような活性反応基としては、被固定化物質と共有結合を形成することが可能な、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの活性反応基は、親水性ポリマー鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、親水性ポリマー鎖に直接的に連結されていてもよいし、親水性ポリマー鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した活性反応基として、間接的に連結されていてもよい。被固定化物質への反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基およびスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。これらの活性反応基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。親水性ポリマー層には活性反応基が付加されていない親水性ポリマー鎖や、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００２０】
親水性ポリマー層は、基体表面に化学的または物理的に固定された官能基との共有結合により基体に固定化できる。例えば、プライマー層を用いて基体のプラスチック表面に官能基を導入し、この官能基に親水性ポリマー鎖を連結させることにより、プラスチック表面に親水性ポリマー層を配置することができる。
【００２１】
プライマー層は、少なくともポリシロキサンを含む層により形成することができる。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、シラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。シラノール化合物の縮合はシラノール化合物の分子間で起こる反応である。基体表面のプラスチック分子が反応性の官能基を有してない場合には、シラノール化合物と基体表面のプラスチック分子との間では反応は起こらない。すなわち、シラノール化合物および形成されたポリシロキサンは基体表面のプラスチック分子とは化学的に反応せずに、単に物理的に吸着しているだけである。このようなシラノール化合物のプラスチック表面への物理吸着力は、モノマーでは極めて弱いが、ある程度縮合が進み、ポリマー（ポリシロキサン）となれば強くなる。シラノール化合物を適度に縮合することによって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。
【００２２】
（プライマー層の形成方法）
ポリシロキサンを含むプライマー層は、例えば、特開２０１３−１１４７９号公報に記載される方法により形成することができる。具体的には、基体のプラスチック表面においてシラノール化合物を重合させる工程により形成可能である。該工程は、好ましくは、ケイ素化合物を加水分解してシラノール化合物を生成する工程と、生成したシラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を基体の表面上に接触させる工程とを含む。ケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランまたは３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。加水分解の条件は特に限定されないが、例えば次の方法が可能である。まず、ケイ素化合物に希塩酸を添加する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は２〜４とする。
【００２３】
次いでシラノール化合物を基体表面に適用し、縮合重合によりポリシロキサンを形成する。シラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解する。シラノール化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができるが、これらに限定されない。塩基の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。アルコールはエタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。このシラノール化合物溶液を基体のプラスチック表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）が好ましい。以上の操作によって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が物理吸着によって形成される。
【００２４】
形成されたポリシロキサンは、側鎖上に親水性ポリマーの官能基、例えばポリアルキレングリコールのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基、あるいは、そのような官能基に変換可能な官能基を有することが好ましい。そのような官能基としては、例えば、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでもグリシジル基又はエポキシ基が好ましい。
【００２５】
（親水性ポリマー層の配置）
プライマー層等により官能基が導入されたプラスチック表面に、親水性ポリマーを反応させて親水性ポリマー鎖を配置する。このとき触媒量の濃硫酸を含む親水性ポリマーを接触させる。ここで、親水性ポリマーとして数平均分子量が１０００を超えるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる場合はあらかじめ加熱融解しておく。必要に応じて、ＰＥＧをｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどで希釈して用いてもよい。このＰＥＧ溶液をプラスチック表面に接触させ、加熱する。加熱温度は６０〜１００℃の範囲で設定できるが、プラスチックの耐熱性を加味すると８０℃前後（７５℃〜８５℃）が好ましい。加熱時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定できるが、加熱温度が８０℃前後の場合は１０〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、プライマー層にＰＥＧ鎖が共有結合する。このとき、ＰＥＧ鎖の結合密度はプライマー層の被覆密度に依存する。
【００２６】
最後に、親水性ポリマー鎖の一端に、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの活性反応基を直接的または間接的に連結させる。活性反応基の導入方法は特に限定されない。(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基およびスクシンイミジルオキシカルボニル基を、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として導入する方法の好ましい実施形態は次の通りである。一端がプライマー層を介して基体表面に固定されたＰＥＧ鎖の他端に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）または炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。
【００２７】
【化１】
2014224710.tif 000003
【００２８】
上記の反応は、水分をほとんど含まない有機溶媒中で実施される必要がある。一般にプラスチックは有機溶剤に対する耐性が低いため、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、またはこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１重量％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定することが好ましく、ＣＤＩ濃度が０．５Ｍ前後（０．４〜０．６Ｍ）のときは１０分間〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、活性反応基が共有結合されたＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層が配置される。
【００２９】
本発明者らは、上記のようにしてプラスチック表面に配置された、少なくとも一端に活性反応基を有する親水性ポリマー鎖を含む親水性ポリマー層の算術平均粗さ（Ｒａ）が１０ｎｍ以上であり、親水性ポリマー層の厚さが２０ｎｍ以上である場合に、免疫アッセイにおいて優れたＳ／Ｎ比が得られ、高い検出感度を実現できることを見出した。したがって、基体のプラスチック表面に親水性ポリマー層を配置することにより得られた物質固定化用担体において、親水性ポリマー層の算術平均粗さと厚みを測定し、上記範囲を満たすものを選択することにより、用いる基体に固有のばらつきに左右されることなく、免疫アッセイに用いるための優れた物質固定化用担体を得ることができる。
【００３０】
親水性ポリマー層の算術平均粗さは、１０ｎｍ以上、好ましくは１５ｎｍ以上、さらに好ましくは１７．５ｎｍ以上であり、好ましくは２２ｎｍ以下、さらに好ましくは１９．５ｎｍ以下である。算術平均粗さ（Ｒａ）は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定した値をさす。より具体的には、ＪＩＳ  Ｂ０６０１  ’２００１で規定される算術平均粗さ（Ｒａ）をさす。
【００３１】
親水性ポリマー層はまた、二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）が、１２ｎｍ以上、好ましくは２０ｎｍ以上であり、さらに好ましくは２３ｎｍ以上であり、好ましくは３５ｎｍ以下、さらに好ましくは２５ｎｍ以下である。二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）も、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定した値をさし、より具体的には、ＪＩＳ  Ｂ０６０１  ’２００１で規定される二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）をさす。
【００３２】
親水性ポリマー層が、このような範囲の算術平均粗さまたは二乗平均平方根粗さを有する親水性ポリマー層が基体上に配置された物質固定化用担体を選択することにより、物質の非特異吸着、特にタンパク質の非特異吸着を抑制でき、免疫アッセイにおいて優れたＳ／Ｎ比、すなわち優れた感度が得られる。
【００３３】
（被固定化物質）
親水性ポリマー層の厚さは、２０ｎｍ以上、好ましくは２５ｎｍ以上であり、好ましくは３５ｎｍ以下、さらに好ましくは３０ｎｍ以下である。親水性ポリマー層の厚さ（層厚）は、分光エリプソメーター（ＪＯＢＩＮ  ＹＶＯＮ社製、ＵＶＩＳＥＬ）を用いて測定した値をさす。
【００３４】
本発明の物質固定化用担体には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原または抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。「標的物質と結合する抗原または抗体」が被固定化物質である実施形態（後述するサンドイッチ法または直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（後述する間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）または抗体（抗体断片を含む）である。
【００３５】
被固定化物質および／または標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００３６】
被固定化物質は、親水性ポリマー鎖が有する活性反応基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、親水性ポリマー鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００３７】
（被固定化物質の固定化）
被固定化物質の固定化は例えば、当技術分野で公知の方法により実施できる。例えば、本発明の物質固定化用担体と、被固定化物質を溶解した溶液とを接触させ、該溶液を乾燥濃縮して被固定化物質を物質固定化用担体の親水性ポリマー鎖末端に共有結合させる。必要に応じてさらに、未反応の親水性ポリマー鎖末端の反応性活性基と、アミノ基含有低分子化合物とを接触させ、親水性ポリマー鎖末端の反応性活性基を不活性化する。
【００３８】
アミノ基を含有する低分子化合物としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。
【００３９】
（免疫アッセイ）
本発明の物質固定化用担体を用いた免疫アッセイは、当技術分野で公知の方法で実施できる。具体的には、本発明の物質固定化用担体と、測定対象試料とを、該担体上の被固定化物質に、該測定対象試料中の標的物質の量に相関した量の抗原または抗体（ここで該抗原または抗体とは、測定対象試料中の標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能抗原または検出可能抗体等を指す）が抗原抗体反応により結合する条件において接触させる工程と、前記工程において被固定化物質に結合した抗原または抗体を検出する工程とを含む。免疫アッセイは、例えば、サンドイッチ方式、直接競合方式、間接競合方式等の任意の態様とすることができる。
【００４０】
本発明の物質固定化用担体を用いた免疫アッセイにおいて抗原または抗体を検出する手段は特に限定されず、任意の標識物質により直接的または間接的に標識された抗原または抗体を用いることができる。標識物質としては、酵素（ＥＬＩＳＡ法）、核酸（イムノＰＣＲ）、電気化学発光物質（電気化学発光法）、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等の、増幅された検出シグナルを生成することができる標識物質が挙げられる。本発明の担体を用いる免疫アッセイは、安全性および簡便性を考慮すると、標識物質として酵素を用いる、酵素活性に基づいて検出を行う酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。標識物質として用いることができる酵素は特に限定されないが、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼが挙げられる。酵素活性による検出の方法としては、酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等を用いた検出方法が挙げられ、なかでも化学発光基質を用いた検出方法が好ましい。化学発光基質を用いた検出は、一般に、発色基質を用いた検出よりも感度が高いため、酵素反応に要する時間を短縮することができる。特に、フェムトグラムのレベルの微量な標的物質の検出に使用される高感度な化学発光基質を用いれば、感度の点で相乗効果を得ることができる。本発明の物質固定化用担体と化学発光基質とを組み合わせれば、迅速かつ高感度でダイナミックレンジの広いＥＬＩＳＡを達成できる。
【００４１】
（免疫アッセイ用キット）
本発明の物質固定化用担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分としては、免疫アッセイの種類に応じて、被固定化物質に抗原抗体反応により結合した標的物質と抗原抗体反応により結合する、直接的または間接的に検出可能な抗原または抗体や、被固定化物質と抗原抗体反応により結合する、直接的または間接的に検出可能な抗原または抗体（直接的または間接的に検出可能な標的物質を含む）が例示できる。更に、免疫アッセイに必要な成分としては、間接的な検出に用いるための、前記間接的に検出可能な抗原または抗体と結合可能な標識物質や、検出用試薬（例えば標識物質が酵素である場合には酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等）が挙げられる。該キットは更に、被固定化物質を物質固定化用担体に固定化するために用いられる試薬（例えば糖類や非イオン性界面活性剤が溶解された、被固定化物質を溶解するための緩衝液）を含んでもよい。
【００４２】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）免疫アッセイのための物質固定化用担体の製造
３．６ｇのＧＰＴＳ（３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン；モメンティブ・パフォーマンスマテリアル製）をとり、ここに７００μｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を加え、５分間攪拌する。この溶液を１５６ｇ（２００ｍｌ）の２−プロパノール（純正化学）に加えた後、１０００μｌのトリエチルアミン（和光純薬）を加える。上記の溶液を１００μｌずつ各種ポリスチレン製９６穴プレートに加え、２時間１５分静置にて反応を行った。９６穴プレートとして、以下の４種を用いた。
【００４４】
Ｐｏｌｙｓｏｒｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
Ｎｕｎｃｌｏｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
ＢＤ３５１１７２（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＢＤ３５３０７５（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｐｏｌｙｓｏｒｐ（登録商標）は、ポリソープ処理と呼ばれる疎水処理を行ったポリスチレン製プレートであり、Ｎｕｎｃｌｏｎ（登録商標）は、コロナ表面処理を行ったポリスチレン製プレートであり、ＢＤ１１７２（登録商標）は、未処理のポリスチレン製プレートであり、ＢＤ３５３０７５（登録商標）は、プラズマ処理を行ったポリスチレン製プレートである。
【００４５】
各９６穴プレートの反応前の水接触角を測定したところ、以下のとおりであった。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
反応後に、上記溶液を取り除き１００μｌの純水にて洗浄を行い、プレートを８０℃のオーブンで１５〜６０分間加熱し、乾燥させた。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ４００を各ウェルに１００μｌずつ分注し、８０℃のオーブンで４５分間反応を行った後、純水１００μｌにて洗浄を行った。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製し、これを各ウェルに１０μｌずつ分注した。そのまま室温で２０分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、８０℃のオーブンで１５分間加熱し、乾燥させた。
【００４８】
（実施例２）親水性ポリマー層表面のＲａ測定
親水性ポリマー（ＰＥＧ）層の算術平均粗さは、原子間力顕微鏡としてＤｉｇｉｔａｌ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ社製ＮａｎｏＳｃｏｐｅ ＩＩＩａを用い、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ３０００ステージシステムを使用し、以下の条件で測定を行った。
・走査モード：タッピングモード
・探針 ：シリコンカンチレバー
・走査範囲 ：１０μｍ×１０μｍ
・走査速度 ：０．９７９Ｈｚ
・ピクセル数：５１２×５１２
・測定環境 ：室温、大気中
【００４９】
二乗平均平方根粗さ（Ｒｑ）も同様に、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定した。より具体的には、ＪＩＳ  Ｂ０６０１  ’２００１で規定される条件で測定した。
【００５０】
結果を図１に示す。
【００５１】
（実施例３）親水性ポリマー層の厚さ測定
親水性ポリマー（ＰＥＧ）層の厚さ（層厚）は、分光エリプソメーターとして、ＪＯＢＩＮ  ＹＶＯＮ社製ＵＶＩＳＥＬを用いて行い、測定角度は７５°、ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｒａｎｇｅは１．５−６．５ｅＶの範囲で０．０５ｅＶ毎に測定を行った。
【００５２】
測定は２回行った。結果を図１に示す。
【００５３】
（実施例４）免疫アッセイ評価
１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）に抗ＢＳＡ抗体を加えた（終濃度５μｇ／ｍｌ）。１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）にリゾチーム溶液を加えた（終濃度５μｇ／ｍｌ）。実施例１で作製した各９６穴プレートに５０μｌの抗ＢＳＡ抗体溶液（１〜６列）と５０μｌのリゾチーム溶液（７〜１２列）を分注し、１０分間静置した。その後、ウェル内のバッファーを取り除き、終濃度が１０ｍＭジグリコールアミンになるように調整したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を５０μｌ加え、１０分間静置した後ウェル内のバッファーを取り除いた。次に、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体の終濃度が１μｇ／ｍｌとなるように調製したリン酸緩衝溶液５０μｌを各ウェルに加え１０分間静置した。その後、ウェル内のバッファーを全て取り除き、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００のリン酸緩衝溶液を２００μｌ加え、５分間静置した後、再びバッファーを全て取り除いた。各ウェルにＳＡＴ−３（同仁化学）（終濃度１ｍＭ）と過酸化水素水（終濃度０．５ｍＭ）を含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）を５０μｌ加え、１０分間静置した後、０．５Ｍ硫酸水溶液を１００μｌ加えた。その後、マイクロプレートリーダーにて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。
【００５４】
抗ＢＳＡ抗体溶液を入れた系の吸光度を、リゾチーム溶液を入れた系の吸光度で割った値を、Ｓ／Ｎ比として算出した。結果を図１に示す。
【００５５】
４種のポリスチレン製９６穴プレートに、同様の処理により、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基を有するＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層を配置した結果、親水性ポリマー層の算術平均粗さおよび厚さにより、Ｓ／Ｎ比が異なることが示された。すなわち、特定の範囲の算術平均粗さおよび厚さを有する担体を選択することにより、免疫アッセイにおいてＳ／Ｎ比が２０以上、さらにはＳ／Ｎ比が３０以上の優れた感度が得られることが示された。また、基体として、表面が特定の範囲の水接触を有するものを選択することも、親水性ポリマー層形成後のＳ／Ｎ比に影響を及ぼすことが示された。
【００５６】
したがって、本発明により、基体ごとのばらつきに左右されることなく、免疫アッセイにおいて優れた感度を有する担体を安定して提供できることが示された。
【図１】
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