【手続補正書】
【提出日】令和3年9月29日(2021.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用因子の毒性を予測する方法であって、
非ヒト動物を致死量以下の用量の作用因子と接触させるステップ；
前記動物を屠殺するステップ；
１つまたは複数の細胞試料を提供するステップであって、各細胞試料が前記動物からの組織から得られる、ステップ；
前記１つまたは複数の細胞試料のそれぞれの試験アリコートおよび前記作用因子と接触していない細胞試料の対照アリコートを提供するステップ；
各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
前記試験アリコート中の透過化された前記細胞をＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
前記対照アリコート中の前記透過化された細胞を前記ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；および
各アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ
を含み、前記対照アリコート中の前記細胞において測定された量と比較した、前記試験アリコート中の前記細胞において測定された前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量の増加は、前記作用因子が、前記細胞が得られた前記動物の前記組織に対して有毒であることを示す、方法。
【請求項２】
前記対照アリコート中の前記細胞が、前記作用因子と接触していない非ヒト動物からの細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物が哺乳動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物が、非ヒト霊長類または齧歯類である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記動物が、注射、吸入、局所投与、または経口投与によって前記作用因子と接触する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記作用因子が、１種または複数の化合物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記作用因子が抗がん剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記作用因子が化学療法剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記作用因子が、小型有機分子、小型無機分子、ペプチド、タンパク質、タンパク質類似体、酵素、核酸、核酸類似体、抗体、抗原、ホルモン、脂質、多糖、増殖因子、ウイルス、細胞、生物活性剤、医薬製剤、またはそれらの組合せもしくはプロドラッグである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記作用因子が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、またはエアロゾルを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
環境の毒性を決定する方法であって、
細胞の試料の試験アリコートを、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルから選択される１つまたは複数の作用因子を含む環境に曝露するステップ；
前記細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが、前記環境に曝露されていない、ステップ；
各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
前記試験アリコート中の透過化された前記細胞をＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
前記対照アリコート中の透過化された前記細胞を前記ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；および
前記試験アリコート中および前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ
を含み、前記対照アリコート中の前記細胞において測定された量と比較した、前記試験アリコート中の前記細胞において測定された前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量の増加は、前記試験アリコート中の前記細胞が曝露された前記環境の前記１つまたは複数の作用因子が、前記試料の細胞に対して有毒であることを示す、方法。
【請求項１２】
環境中の毒性作用因子の存在を決定する方法であって、
細胞の試料の試験アリコートを環境に曝露するステップ；
前記細胞の試料の対照アリコートを提供するステップであって、前記対照アリコートが、前記環境に曝露されていない、ステップ；
各アリコート中の前記細胞を透過化するステップ；
前記試験アリコート中の透過化された前記細胞をＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
前記対照アリコート中の透過化された前記細胞を前記ＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；および
前記試験アリコート中および前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ミトコンドリア外膜透過化（ＭＯＭＰ）の量を測定するステップ
を含み、前記対照アリコート中の前記細胞において測定された量と比較した、前記試験アリコート中の前記細胞において測定された前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量の増加は、前記試験アリコート中の前記細胞が曝露された前記環境が、ガス、微粒子、放射線、電磁放射線、およびエアロゾルから選択される１つまたは複数の毒性作用因子を含むことを示す、方法。
【請求項１３】
透過化された前記細胞が、前記ＢＨ３ドメインペプチドと３時間またはそれ未満接触する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；
前記対照アリコート中の前記細胞におけるＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰパーセントの値を決定するステップ；および
前記試験アリコートについてデルタパーセントプライミングの値を決定するステップであって、デルタパーセントプライミングが、前記試験アリコートにおいて決定されたＭＯＭＰパーセントの値と、前記対照アリコートにおいて決定されたＭＯＭＰパーセントの値との差である、ステップ
をさらに含み、２０パーセントを超えるデルタパーセントプライミングは、前記細胞が得られた前記動物の前記組織に対して前記作用因子が有毒であることを示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、ジギトニンまたはサポニンを用いて透過化される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＢＨ３ドメインペプチド誘導型ＭＯＭＰの量が、
ｉ）前記細胞を電位差測定用色素と接触させ、前記電位差測定用色素の発光を測定すること；
ｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の放出を測定すること；および
ｉｉｉ）ミトコンドリア膜間腔からの分子の保留を測定すること
のうち１つまたは複数によって測定される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電位差測定用色素が、５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨージド（ＪＣ−１）、ジヒドロローダミン１２３、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）、またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ミトコンドリア膜間腔からの前記分子が、チトクロームｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、配列番号１〜１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。