(57)【要約】      （修正有）【課題】血管新生の阻害プロセス又は内因性アポトーシスプロセスの活性化の誘導のための経口医薬組成物の提供。【解決手段】針葉樹であるピナセアエ属由来のアビエス・シビリカ植物の抽出物；ここで、該抽出物は、セスキテルペノイド（３〜６重量％）；中性ジテルペノイド（１１〜１５重量％）；ジテルペン酸（２３〜２８重量％）；トリテルペン酸（８〜１６重量％）；不飽和及び飽和脂肪酸（０．１〜０．３重量％）；フェノール化合物（０．１〜０．２重量％）；残余であるモノテルペルペノイドを含み、ここで、総テルペンに対する酢酸ボルニル含量が少なくとも１０．０％であり、（ii）薬学的に許容される担体又は希釈剤を含み、該組成物は、80〜100mg/kg体重の用量で毎日投与される経口医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の活性な医薬組成物アビシリンを用いることによって血管新生阻害が治療上有効な作用である、腫瘍及び他の疾患を治療及び予防するための医薬であって、活性成分、薬学的に許容される担体及び賦形剤を含み、該活性成分が、ピナセアエ（Pinaceae）属由来の針葉樹由来のテルペン（イソテルペノド）、これらのテルペンは総重量に対してパーセンテージ基準で以下の成分：
セスキテルペノイド（3〜6％）；
中性ジテルペノイド（11〜15％）；
ジテルペン酸（23〜28％）；
トリテルペン酸（8〜16％）；
不飽和及び飽和脂肪酸（0.1〜0.3％）；
フェノール化合物（0.1〜0.2％）；
残余であるモノテルペルペノイド
を含み、ここで、割合での総テルペンに対する酢酸ボルニル含量が少なくとも10.0％であり、
該組成物がヒトを含む哺乳動物に有効量で経口的に投与されることを特徴とする、医薬。
【請求項２】
溶液、錠剤、ゼラチンカプセル剤、丸剤、シロップ、懸濁液、粉剤、エマルション、顆粒、ミクロスフェアもしくはナノスフェア又は医薬の活性成分の制御された放出に有用な他の投薬剤形でよい医薬組成物アビシリンによって表される、様々な起源の腫瘍疾患を治療するための、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
血管新生阻害を誘導するための、並びに直接的な抗腫瘍、抗再発及び抗転移の効果、及び内因性アポトーシス形の関連した活性化を起すための請求項１又は２記載の医薬であって、該医薬組成物は、腫瘍疾患に罹患したヒトを含む哺乳動物に80〜100 mg/kg体重の用量で毎日経口的に投与される、医薬。
【請求項４】
前記医薬組成物アビシリンが、他の薬学的に活性な物質（抗生物質、細胞増殖抑制剤及びその他）と共に用いられる、請求項１、２又は３記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、医薬、並びに化学及び医薬産業、特に、血管新生阻害、内因性アポトーシスの誘導、腫瘍細胞増殖の減速、及び抗再発及び抗転移抗体の活性化を含む抗腫瘍プロセスを誘導する非毒性の複数の活性剤、すなわち、針葉樹由来のテルペン（イソプレノイド）に基く経口投与用の医薬組成物アビシリンであって、以下の成分：モノテルペノイド、セキステルペノイド、中性ジテルペノイド、ジテルペン酸、トリテルペン酸、フェノール化合物、及び不飽和及び飽和脂肪酸を含む組成物を用いて、そのプロセスのカスケードを誘導することによって、様々な起源の癌疾患を治療するための抗腫瘍薬の開発に関する。
【０００２】
更に、本発明は、血管新生疾患に関連した多数の疾患、目の新血管新生（レチノパシー又は年齢依存的斑点誘発）によって引き起こされた原発性疾患を治療するために、及び慢性及び急性の腎疾患（糸球体腎炎）の場合のメサンギウム細胞増殖疾患、乾癬、進行性アテローム、動脈再狭窄、糖尿病、リウマチ様関節炎、慢性喘息、子宮内膜症、自己免疫疾患、動脈性又は移植後のアテローム性動脈硬化症、及び多数の他の疾患を治療するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
化学療法、ホルモン医薬又は生物応答修飾剤として分類されるほとんどの抗腫瘍薬の使用の分析は、そのほとんどが腫瘍リンパ節退縮を亢進し、同時に転移に影響を与えないことを示しているが、これは、癌患者の死の最も頻繁な原因である。
【０００４】
原発腫瘍のみならずその転移の成長を阻害する可能性は、新しい種類の抗腫瘍薬、すなわち、Dr. Judas Folkman (Folkman, J., Tumor Angiogenesis Therapeutic Implication, N. Engl., J. Med, 1971; 285; 1182-6) によって1971年に最初に提案された抗血管新生薬において発見された。抗血管新生薬は、慣用的な抗腫瘍化学療法剤において多数の利点、すなわち、選択的作用、減少した副作用のリスク、薬物耐性及び減少した毒性を有している。
【０００５】
腫瘍血管新生を妨害することによる抗血管新生薬は、腫瘍成長を遅くし、停止させ、転移を阻害する。
【０００６】
このプロセスを実施するためには多数の方法が存在する。それは、この場合は、適切には、特定の制御的メカニズムを有する直接的な細胞の損傷ではなく、むしろ、これは非常に多数の細胞標的を有する通常の内皮細胞の活性の調節、すなわち、増殖及び/又は転移の阻害、細胞分化の妨害、血管由来成長因子（チロシンキナーゼ受容体CHR-1）、血管内皮成長因子（VEGF）及びアンジオポエチン/TIF受容体系に対する作用、VEGFR-2及びVEGF血管新生増殖因子及びその特異的受容体の阻害、及びマトリックスメタロプロテイナーゼの阻害、であるからである。
【０００７】
内皮細胞の正常な機能的反応性は、その機能が身体の他の細胞系によって同様に決定される理由のため、それ自体、影響を受けやすい。
【０００８】
この多数の標的は、多数の可能性のある抗血管新生阻害剤を前進させた。しかし、先行技術の抗血管新生薬について、必要な利点のうちのいくつかが知られているのみである。
【０００９】
例えば、アバスチンは最も有望な抗腫瘍薬であることが知られている；これは、血管内皮増殖因子（VEGF）との選択的結合を介して血管新生を減少させ及び腫瘍成長を阻害することができる、抗血管新生効果を有するモノクローナル抗体薬理学的群の薬物である（米国特許第60542297号；米国特許第6639055号）。
【００１０】
しかしながら、アバスチンの臨床的効果（化学療法のみによって治療された患者の13.6〜17.7ケ月の増加に対して、転移性直腸癌を有する患者の15.6〜20.3ケ月の総生存期間を増加させる）は、より有効な医薬の研究を促す。胃腸穿孔、出血、動脈血管塞栓症及び他の疾患の複雑療法において使用されるベバシツマブ、すなわちアバスチン活性物質、に対する症状及び副作用の目立つリストがある場合には、なおさらである。
【００１１】
理論的には、新血管新生-亢進化学シグナルを妨害する血管新生阻害剤は、一般的なプロセスがあるので、任意の種類の腫瘍に対して効力があると期待された。
【００１２】
アバスチンの臨床試験の結果はこれらの理論的予想が誤りであることを証明する。
【００１３】
血管新生の阻害を亢進することができ及び癌を治療するために有用な、VEGP/VEGF受容体及び/又はアンジオポエチン/TIE受容体系の機能に影響を与える公知の組合せ及び組成物も知られている（ロシア特許第2292221号, C2, June 20, 2001）。これらの複数の化合物は、抗血管新生作用の複数のステップのメカニズムの別個の局面のみに影響を与え、それによって、抗腫瘍薬の効率の向上にほとんど影響を与えない。アンジオポエチン/Tie2受容体系に対する効果は、減少した腫瘍の成長の減速のみを示すことが研究された（Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999）。
【００１４】
アントラニル酸及びチオアントラニル酸Ｎ−アクリルアミドは、新血管新生疾患及び血管新生に関連した、VEGFチロシンキナーゼ受容体Fit-1の活性を阻害することが知られている。その使用は治療的効力がほとんどない。
【００１５】
本発明の最も適切な技術は生物活性スペクトルに関し、その起源は内皮細胞増殖を効果的に阻害し、すなわち、血管新生阻害を示す、抗腫瘍薬であるパクリタキセル（タキソール）からなる（Klauber, N., et al., Cancer Res., 57, 81-86, 1997）。
【００１６】
タキソールは、複雑な構造のジテルペノイド、すなわち、太平洋イチイの木から1971年に単離されたタキサンに基いて最初に開発された。現在では、タキソール及びそのアナログの完全な合成法が知られている（米国特許第5488116号, Jan. 2006; ロシア特許第2196581号, May 4, 2000）。ドセタキソール（タキソテレ）は、タキソールの半合成アナログであり、ヨーロッパのイチイの木（taxus baccata）から単離され、Ｒ−テトラオールは、ピナスシビリカ（Pinus sibirica）種、及び/又はピナスセンブラ（Pinus cembra）、及び/又はアビエス（Abies）種、及び/又はラリックス（Larix）種の針葉樹由来のガリポの天然のテルペノイド複合体を用いて（ロシア特許第2051900 C1, January 10, 1996)、天然物由来の活性成分の単離又は半合成経路によって（ロシア特許第2196581 C2, May 4, 2000)、あるいはカンファーと混合したラブダノイドジテルペン酸画分を用いて、Ｒ−テトラオール構造を生成するために得られた混合物をガンマ放射線に曝露することによって得られた。
【００１７】
上記の特定の方法によって調製された上記の化合物は、以下：すべての医薬に固有のある程度の毒性（好中球減少、線維性好中球減少、感染、嘔吐、下痢、口内炎、無力症、神経（運動）及び血液系合併症などを引き起こす）及び低効力の欠点を有し、これらの欠点は、より効率的な治療法を提供するための他の活性剤とかかる血管新生阻害剤との組合せスキームに対する研究へと癌学者を駆り立てる。
【００１８】
先行技術の抗血管新生テルペノイド薬のこれらの欠点は、その調製について提案された複数のステップのスキームに起因するかもしれない。これらのスキームは、部分的又は完全な合成に基づいて純粋形態での分離した活性物質を単離することを目的としている。これは、様々な種類の毒性の出現を助け、必要な複数の活性を医薬から奪う。
【００１９】
従って、血管新生を阻害するための複数の標的及び多数の従来医薬の存在にもかかわらず、従来医薬に固有であるすべての利点を有するが、その必然的な欠点がない、抗血管新生医薬組成物が求められており、これらの医薬組成物は、以下の点が期待されている：
−毒性がない：
−症状がない；
−毒性を低減し、（必要ならば）組み合わせて使用した時に抗腫瘍性細胞毒性薬の効力を亢進する；
−直接的な抗腫瘍活性を有する；
−抗再発及び抗転移効果を起こす；
−耐性、特にアポトーシスに対する耐性を引き起こさない；
−新血管新生阻害選択性を示し、腫瘍における新血管新生を中止する；並びに
−場合により、免疫調節、疼痛緩和、抗菌、抗炎症、及び血管新生剤の複数の活性スペクトルにおける他の種類の活性；
−細胞アポトーシスを誘導することができる。
【００２０】
上記のリストは、従来の方法及び医薬に存在する多くの欠点の点から、求められる結果に近づくために必要な条件を使い果たすものではない。
【００２１】
かかる複数の活性効果又は腫瘍増殖プロセスを同時に引き起こすことができる抗血管新生剤は、知られてもいなし、従来技術から明らかでもない。
【発明の概要】
【００２２】
発明の概要
本発明の目的は、従来の医薬の今なお現存している欠点がなく、すなわち、長期間の使用において有毒な副作用を起こさず、症状がなく、及び（特にアポトーシスに対して）耐性を起こさない、そして細胞分裂停止薬と併用した時にその効力を増加するだけでなくその毒性の減少を助ける、抗血管新生抗腫瘍薬を用いて、新血管新生を選択的に阻害し又は完全に停止するための医薬を研究し及び開発することである。更に、本方法は、すべての従来の血管新生遮断薬における多数の利点を有し、すなわち細胞アポトーシスを誘導することができる直接的な抗腫瘍効果を有し、抗再発及び抗転移活性を有し、同時に免疫調節、抗菌、創傷治癒、抗炎症、疼痛緩和及び他の活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、アビシリン下での腫瘍細胞の生存率曲線を示す。
【図２】図２は、アビシリンが、1 mg/mL〜0.125 mg/mLの濃度範囲で内皮細胞を殺したことを示す。
【図３】図３は、2つの無細胞毒性濃度（0.0625 mg/mL及び0.031 mg/mL）について、内皮細胞増殖の20％阻害が観察されたことを示す。
【図４】図４は、0.25 mg/mL〜0.031 mg/mLのアビシリン濃度の範囲について（創傷部位の測定と共に）SVEC-4-10マウス内皮細胞プールの転位阻害として評価した、アビシリンの抗転位効果を示す。
【図５】図５は、0.25 mg/mL〜0.031 mg/mLのアビシリン濃度の範囲について（創傷部位の測定と共に）SVEC-4-10マウス内皮細胞プールの転位阻害として評価した、アビシリンの抗転位効果を示す。
【図６】図６は、管状構造に対するアビシリンの効果を示す。内皮細胞による管状構造の形成を阻害するアビシリンの能力は、アビシリンが0.125 mg/mL〜0.015 mg/mLの範囲で阻害することを確認した。
【図７】図７は、試験した濃度でのアビシリンが、マトリゲルでの血管新生を用量依存的に阻害したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
理論的には、天然テルペノイドの複合体は、複数の成分及び複数の活性を有し、従来の血管新生阻害法に固有の欠点がなく、上記の必要な利点のいくつかを有すると期待される。
【００２５】
本発明の発明者らは、その科学的研究の過程において、免疫調節、抗炎症、創傷治癒、疼痛緩和及び抗菌活性を有し、神経伝達物質合成疾患（ロシア特許第2244928, February 19, 2003）を有する病状（特に癌）の大脳皮質における神経終末の特定のホルモン伝達物質を活性化することもできる、テルペノイド物質アビシル（ロシア特許第2054945, June 28, 1995; ロシア特許第2198653, March 29, 2002に記載）が、細胞毒性活性、並びにアポトーシス誘導、抗再発、抗転移性及び抗腫瘍活性を示す有効な血管新生阻害剤である、という発見に驚いた。
【００２６】
アビシルテルペノイド物質は、新規医薬の基材、すなわち、経口投薬形態、すなわち20％油溶液を示し、医薬活性の新しいスペクトル及び血管新生疾患、特に悪性腫瘍増殖と関連した病理プロセスを停止する新しい機会を有する、複数活性のテルペノイド医薬組成物アビシリンで、として役立っている。
【００２７】
テルペノイド医薬アビシリンの複数活性は、同一のモノテルペン化合物が豊富であるピナセアエ（Pinaceae）属の代表における環境的な影響に対する生物的保護を提供する、収量及び合成を誘導する原料を含む天然化学テルペン複合体の使用によって達成される。分離した最も効力のある物質を有する天然テルペン複合体の過剰（原料からの直接的な抽出又は誘導した本来の活性による）は、上記の従来の抗血管新生薬に固有ものとしての最終産物の使用における毒性効果を生じなかった。高い治療効果は、最高の効果に因るだけでなく、医薬組成物アビシリンのすべての活性物質の効果の相乗に因り、すなわち、これは、ピナセアエ属の針葉樹からのテルペン（イソプレノイド）であり、以下を含む：
セスキテルペノイド（3〜6％）；
中性ジテルペノイド（11〜15％）；
ジテルペン酸（23〜28％）；
トリテルペン酸（8〜16％）；
不飽和及び飽和脂肪酸（0.1〜0.3％）；
フェノール化合物（0.1〜0.2％）；
残余であるモノテルペルペノイド
を含み、ここで、総テルペンに対する酢酸ボルニル含量が割合で少なくとも10.0％であり、ヒマワリ種子オイルに溶解されている。
【００２８】
更に、血管新生阻害効果を有する抗腫瘍テルペノイド医薬組成物アビシリンの開発は、基本的に新しく提案された戦略に基いている。この戦略は、環境的影響に対して針葉樹自体を保護するためにそこで合成された針葉樹からの内因性テルペノイド化合物を用いて、ヒト又は動物の体における正常な生理学的プロセスの調節において不均衡（misbalance）を妨害することができるそれ自体の内因性物質の骨格（brain）構造によって、産生を開始することから成る。
【００２９】
血管新生阻害効果を有する複数活性の抗腫瘍経口医薬アビシリンは、一般的な毒性について試験した。
【００３０】
本発明の好ましい態様では、一般的な毒性試験から進めて、アビシリンは、80〜100 mg/kg体重の用量で経口的に投与される（実施例１）。
【００３１】
本発明の別の好ましい態様は、腫瘍細胞に対する選択的細胞毒性効果を誘導する方法、及び1000 μg/mLの用量でアビシリンを用いて、アポトーシス様メカニズムによって腫瘍細胞を殺す方法である。この用量について、AnV+PI-、AnV+PI+及びAnV-PI+に陽性な細胞の最大の割合は、ジャーカット細胞株について見出され、86.6％であった（実施例２）。
【００３２】
本発明の更にもう１つの態様は、移植可能固形腫瘍：黒色腫B-16、Ca-755、LLC、CC-5、CAC及び肉腫M-1の必要なキットを用いて明らかにされた、10〜100 mg/kg体重の用量で2〜11日間、経口投与での、アビシリンの抗腫瘍活性を誘導するための方法である（実施例３）。
【００３３】
様々な起源の腫瘍疾患の治療を示す本発明の好ましい態様は、液剤、錠剤、カプセル剤、丸薬、シロップ、懸濁液、粉剤、エマルション、顆粒、ミクロスフェア又はナノスフェア、又は医薬の活性成分の制御された放出を達成するために有用である他の投薬剤形の形態でよい、医薬組成物アビシリンの使用から成る。
【００３４】
移植可能な腫瘍CAC、Ca-755及び黒色腫B-16について研究された従来の医薬シスプラチンと一緒のアビシリンの投与は、アビシリンの使用からの相乗効果の到達可能性のみならず、２つの医薬の治療的重要性の増加を証明した。
【００３５】
本発明の好ましい態様は、インビトロ及びインビボ実験でアビシリンを用いることによって、抗血管新生メディエータの優性に対して、血管新生促進メディエータと抗血管新生メディエータとの本来のバランスを置き換える方法である（実施例４）。
【００３６】
更に、本発明のもう1つの好ましい態様は、80〜100 mg/kg体重の用量で経口投与による抗再発及び抗転移効果を誘導するための医薬アビスリンの使用である（実施例５）。
【００３７】
以下の実施例１〜５は、本発明の好ましい実施態様を説明したものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
実施例１
ロシア連邦標準（GOST）12.1.007-76の物質ハザードカテゴリＩＶに医薬を分類させる、最高可能用量の10,000 mg/kgでの急性毒性を決定するに際し、動物の死は観察されなかった。
【００３９】
各々165±3 g及び163±3 gの平均体重を有する非血統雄性及び雌性ラットで亜慢性実験を行った。試験した医薬は、雄性ラットに対しては100、500又は1,000 mg/kgの用量で、雌性ラットに対しては100及び1,000 mg/kgの用量で14日間、毎日1回、胃内に投与した。
【００４０】
実験の結果によれば、試験した用量でのアビシリンは、試験動物の総合的な兆候（体重増加、行動反応、食餌及び水取り込み）;末梢血の細胞組成；排泄、吸収、タンパク質-合成、及び肝臓の糖類機能；血清コレステロールレベル；並びに、心血管、排泄及び神経系の機能状態において信頼できる変化を起こさなかった。
【００４１】
1,000 mg/kgの用量、すなわち推奨される治療的用量の10倍の用量でのアビシリンの使用は、試験動物によっては、胃腸粘膜の弱い局所的な炎症を引き起こす。
【００４２】
従って、試験した用量でのアビシリン投与の一般的な毒性試験は、その使用が体の臓器又は組織に構造的疾患を引き起こさないことを示している。
【００４３】
実施例２  腫瘍細胞に対するアビシリンの細胞毒性及びアポトーシス誘導活性
以下の腫瘍細胞株についてインビトロで試験を行った：ジャーカット（T-細胞リンパ芽球性白血病）、ラジ（B-細胞白血病）、K562（慢性骨髄性白血病）、U937（骨髄球性白血病）、Mel P（黒色腫）、T47D（乳癌）、SKOV-3（卵巣癌）、及びPC-3(前立腺癌）。
【００４４】
細胞株は、10％ ウシ胎児血清、２ mM/mL グルタミン、0.1 mg/ml ゲンタマイシン、ビタミン、ピルビン酸ナトリウム及びアミノ酸を含む、完全RPMI-1640培地で、37℃でCO2雰囲気下で増殖させた。
【００４５】
試験では、アビシリンは、以下の濃度で使用した：300 μg/mL、500 μg/mL、800 μg/mL及び1,000 μg/mL。1％ DMSO（ジメチルスルホキシド）を希釈剤として使用した。
【００４６】
アビシリン細胞毒性は、MTTアッセイを用いて比色分析法によって測定した。5ｘ104細胞/mLの濃度の腫瘍細胞をザルスタット（Saarsted）平底96-ウェルプレートに接種し、試験濃度 20μLのアビシリンを各ウェルに加え、プレートを標準的な温度及び圧力下で72時間インキュベートした（各アビシリン濃度は3点で試験した）。使用した対照は、アビシリン無しの3つのウェルであり、3つのウェルに20 μLの1％DMSOを加えた。5時間インキュベーション後に、20 μLのMTT溶液（Sigma Chemical Ｃo., U.S.A.）を各ウェルに加えた、インキュベーションが終了後、1000 rpmで2〜3分間プレートを遠心することによって細胞を沈殿させた。上清を注意深く回収し、各ウェルに200 μLのホルマザン結晶用の溶媒であるDMSO（ICN Biochemicals, Inc.）を加えた。細胞を再懸濁し、37℃で10分間インキュベートし、Uniplan AIFR-01免疫酵素反応リーダー（ロシア）で、540 nmの波長で、溶液の光学密度（OD）を測定した。MTTは、生きた細胞によって代謝され、水不溶性ホルマザンに変化し、それによって、生存細胞の量に比例して溶液の光学密度が変化する。プール中の死細胞の量が少なくとも50％である場合には、腫瘍細胞は試験した医薬に感受性であるとみなした。すべての実験は3点で行った。生存率は、(実験の平均OD/対照の平均OD）x 100％として決定した。
【００４７】
アポトーシス細胞は、ヨウ化プロピジウム（PI）生染色と組み合わせた、FITC-複合化アネキシンVを用いて、二重染色によって検出した。
【００４８】
アネキシンV-FITC及びPI染色細胞は、以下の基準によって評価した。
アネキシンV陰性/PI陰性（AnV-PI-）生細胞、アネキシンV陽性/PI陰性（AnV+PI-）初期アポトーシス細胞、及びアネキシンV陽性/PI陽性（AnV+PI+）遅延アポトーシス又はネクローシス細胞。対照は、同一条件下だがアビシリンの非存在下でのインキュベートした腫瘍細胞から成り、腫瘍細胞は、同一条件下だが、アビシリンの代わりに1％DNSO溶液を含む条件下でインキュベートした。
【００４９】
実験データの統計的処理のためにスタティスティカ6.0ソフトウェアを使用した。スチューデント試験は、平均値を比較するために使用した（偏差は、ｐ<0.05のときに有意とみなした）。
【００５０】
この試験は、アビシリンによる腫瘍細胞のインキュベーションがジャーカット、ラジ及びPC-3細胞株に対してその細胞毒性を示す、ことを示している。アビシリン下での腫瘍細胞の生存率曲線を図１に示す。
【００５１】
アビシリンの最も目立った細胞毒性は、ジャーカット細胞株に対するものであり、1,000 μg/mLのアビシリン濃度では、41.8％であった。アビシリン濃度が増加すると、生腫瘍細胞のパーセンテージ量は減少し、またその逆であった。
【００５２】
U937、K562、T47D、SKOV-3、及びMel P腫瘍細胞に対するアビシリン活性の試験において細胞毒性は観察されなかった。
【００５３】
アビシリン誘導アポトーシスは、ジャーカット、ラジ、PC-3及びU937細胞株で、300 μg及び1,000 μgのアビシリン濃度について、アネキシンV/PI二重生体染色法を用いて測定した。
【００５４】
アビシリンは、アポトーシス様メカニズムによってアッセイした株の腫瘍細胞死を誘導することが見出された（表１）。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
特筆すべきは、増加するアビシリン濃度に反応してアポトーシス細胞数の相当の増加が見られた。AnV+PI-、AnV+PI+及びAnV+PI-AnV-PI-に陽性の細胞の、全体での最大の割合は、ジャーカット細胞株について検出され、1,000 μg/mLのアビシリン濃度について86.6％であった。
【００５７】
従って、実験データは、腫瘍細胞に対するアビシリンの選択的細胞毒性、及びアポトーシス様メカニズムによってこれらの細胞の死を誘導し、それによって抗血管新生剤の使用による抗腫瘍療法の機会を相当に増加させるアビシリンの能力を示している。
【００５８】
更に、本発明のこの特徴は、公知の複数活性のテルペノイド物質アビシル及び医薬組成物の適用分野を、局所的投与及び適用での使用のために推奨されたそれらに基づいて、広げる。これは、従来の効果のスペクトル（抗菌、免疫調節、抗炎症、創傷治癒、及び疼痛緩和効果の組合せ）は、驚くべき及び治療上顕著な効果、すなわちアポトーシス様メカニズムによってある腫瘍細胞株に対する細胞毒性効果によって補足されるからである。
【００５９】
このことは、従来の組成物アビシル及び本発明の組成物アビシリンに、腫瘍疾患の外科的処置の効率を亢進することができる薬剤としての使用を推奨させる。
【００６０】
実施例３  移植可能腫瘍における経口医薬組成物アビシリンの抗腫瘍活性
アビシリンの抗腫瘍活性は、新規な抗腫瘍性物質を選択するために使用した必須動物腫瘍モデルのリストに含まれるマウスの移植可能腫瘍、すなわち、黒色腫B-16、扁平上皮ルイス肺癌（LLC）、乳腺癌Ca-755、ステージ5子宮頸部癌CC-5、直腸腺癌（CAC）及び多形性細胞肉腫M-1で試験した。
【００６１】
実験動物は、BDF（C BI/6 x DBA/2）及びF（C D1/6 x CBA/2）第1世代ハイブリッドマウス；CBA/2、BALB/c及びDBA/2株マウス（雄及び雌）、各動物は20〜25 gの体重；非-血統雌性ラット、各動物は200〜250 gの体重、であった。このマウス及びラットは、Russian Academy of Medicinal SciencesのBlokhin Russian Oncologic Centerの実験動物部から購入し、通常の食餌ローテーションで維持した。
【００６２】
アビシリンを10、100、150、500及び2,500 mg/kgの用量で油液の形態で経口的（per os）に投与した。医薬溶媒としてヒマワリ種子油を用いた。
【００６３】
テルペノイド医薬アビシリンが広範なスペクトルのアルキル化化学療法剤の群から選ばれる抗腫瘍薬と組み合わせて有用であるか否かについても試験した。シスプラチンはBristol-Myers Squibbから購入し、実験で使用した。
【００６４】
アビシリンは、10日間毎日、あるいは以下のスケジュール：2日目及び6日目又は2日目又は11日目での投与で、経口的に動物に投与した。処置は、固形腫瘍（Ca-775、CAC、黒色腫B-16、LLC、CC-5又はM1）を移植後48時間に開始した。組合せ処置では、アビシリンは、腫瘍移植後48時間から始めて、10日間毎日、50 mg/kgの用量で経口的にマウスに投与し；抗腫瘍薬シスプラチンは、5 mg/kgの用量で腹腔内（ip）に1回投与した。上記の腫瘍を有する動物は死ぬまで監視した。上記医薬の抗腫瘍効果は、対照動物に対する実験動物におけるパーセンテージ腫瘍成長阻害（TGI、％）から判断した。
【００６５】
上記医薬の毒性は、対照動物の死に対するマウスの初期死によって、及びその臓器（脾臓、肝臓及びその他）及び初期値に対する体重の変化の症状によって記録された。
【００６６】
非処置対照に対する抗腫瘍効果の統計的有意性は、フィッシャ-スチューデント試験によって決定された。比較群との差は、ｐが0.05以下の場合に統計的に信頼できるとみなされた。
【００６７】
アビシリン抗腫瘍活性の試験の結果は、以下の表２に示される。
【００６８】
【表２】
2014224148.tif 000003
【００６９】
この試験は、アビシリンが、10及び100 mg/kgの用量で10日間投与した時に、移植可能な黒色腫B-16のみに対する短期間の中程度の抗腫瘍効果を有することを示した：それぞれ、TGI=66％（実験の13日目）及び63％（7日目、p<0.05）；また、2,500 mg/kgの用量で5日間隔で2回投与した時には、実験の7日目には、移植可能な黒色腫B-16のみに対する短期間の中程度の抗腫瘍効果を有することを示した（TGI=62％）。しかし、該医薬は、500 mg/kgの用量で10日間投与した時又は10日間の間隔で2回、2,500 mg/kgの用量で投与した時には、有効でなかった。
【００７０】
乳腺癌Ca-755では、10 mg/kgの用量（TGIは実験の7日目で59％）、及び100 mg/kgの用量（TGIは7日目で62％、10日目で65％）で、統計的に有意な効果が検出された。連続して、抗腫瘍活性は全身的に減少した。
【００７１】
扁平上皮ルイス肺癌（LLC）において、本願発明の医薬の抗腫瘍効果は、腫瘍移植後7日目に経口投与のための100 mg/kg及び150 mg/kgの用量で検出された：それぞれ、TGI=56％及び57％（p<0.05）。同一腫瘍において、アビシリンは、10日の間隔で2,500 mg/kgの用量で投与した時に中程度の抗腫瘍効果を示した：TGI=実験の13日目に60％。
【００７２】
マウスの初期子宮頸癌（CC-5）の最大腫瘍成長阻害（TGI=61％）は、150 mg/kgの用量で投与の7日目に観察された（TGI=61％）。これは、本医薬の5倍の経口投与後である。
【００７３】
マウスの直腸腺癌（CAC）では、アビシリンは、10日の投与スケジュールで、50 mg/kg及び100 mg/kgの用量で有効ではなかった。しかし、本医薬は、10日の投与で、500 mg/kgの用量での処置の7日目に弱い腫瘍効果を示し（TGI=26％）、5日の間隔で、2回の注入のスケジュールで、2,500 mg/kgの用量での処置の28日目に弱い腫瘍効果を示した（TGI=26％）。
【００７４】
移植可能なラット肉腫M-1において、アビシリンは、実験の7日目に100 mg/kgの用量で5回投与した直後、中程度の抗腫瘍効果を示した：TGI=54％（p<0.05）。本医薬を2,500 mg/kgの用量で2回投与した場合にも（腫瘍移植後2日目及び11日目）、抗腫瘍効果は処置の開始から7日目及び16日目に観察された（それぞれ、TGI=68％、53％）。
【００７５】
試験した用量でのアビシリンで処置した移植可能腫瘍を有する実験動物はいずれも、アビシリン毒性の兆候を示さなかった。移植可能な腫瘍に対する抗腫瘍活性に関する実験で見られたアビシリンの治療的用量は、5日間の毎日の経口投与について100 mg/kgであった。
【００７６】
マウスにおける直腸腺癌（CAC）、乳線癌Ca-775及び黒色腫B-16に対するアビシリンの抗腫瘍活性も、従来の抗腫瘍医薬シスプラチンとの併用で試験した、ここで、両医薬はその単独療法で使用される治療的用量の半分に匹敵する用量で投与した（表３）。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
表３のデータは、直腸腺癌（CAC）が、アビシリン、シスプラチンのその単独療法において非感受性であることを明確にした。これらの医薬の組合せ投与では、治療的効果が21日間に観察された（TGI=38〜62％）。
【００７９】
移植可能な乳腺癌Ca-755については、アビシリンとシスプラチンとの併用は、15日間で累積的な抗癌作用をもたらした：TGI=7日後に86％に対して91％、11日後に62％に対して83％、14日後に52％に対して66％、18日後に43％に対して54％、及び22日後に39％に対して49％。更に、2つの医薬の併用は、実験動物の寿命を最大20％延ばした。
【００８０】
マウスにおける移植可能黒色腫B-16に対するアビシリン及びシスプラチンの組合せ投与は、シスプラチン単独療法に対してこの腫瘍に対する有利な抗腫瘍効果を示さなかった。
【００８１】
試験した6個の固形腫瘍の内、5個の移植可能な固形腫瘍に対するアビシリンの中程度の抗腫瘍効果、及びアビシリンとシスプラチンとの組合せ投与に対するある腫瘍（CAC、Ca-755）の亢進した感受性は、アビシリンが、他の抗腫瘍薬と併用した組合せ療法において悪性腫瘍を治療するために有用であることを示唆する根拠を提供する。
【００８２】
従って、実験的試験は、複数の活性のテルペノイド医薬アビシリンが経口的に投与された時に、移植可能固形腫瘍（Ca-755、黒色腫B-16、LLC、CC-5及び肉腫M-1）に対して中程度の抗腫瘍活性を有する、ことを示す。
【００８３】
更に、治療用量の半分でのアビシリン及びシスプラチンの組合せ投与は、移植可能な固形腫瘍を有する動物についての実験において抗腫瘍効果を亢進する、ことを見出した。
【００８４】
移植可能な固形腫瘍を有する動物への毎日の経口投与のための治療的アビシリン用量は、100 mg/kgであった。
【００８５】
アビシリンは、500 mg/kgの用量で10日間毎日投与するか、又は4日もしくは9日の間隔で2,500 mg/kgの用量で2回投与するかにかかわらず、5,000 mg/kgの累積的用量の毒性の兆候を引き起こさなかった。
【００８６】
実施例４  インビトロ及びインビボでのアビシリンの抗血管新生活性
アビシリンの抗血管新生活性を、SV-40-ウイルス-形質転換マウスSVEC-4-10内皮細胞プールで研究した[Walter-Yohrling，J. et al.，Clin. Cancer Res. 2004; 10: 2179-2189]。
【００８７】
10 mg/mLの濃度を有するアビシリンのストック溶液（10％DMSO/PBS）を実験日の範囲内でDosage Forms Laboratory of the Institute for Experimental Tumor Diagnostics and Therapy, Russian Oncologic Center, Russian Academy of Medical Sciencesにおいて調製した。ストック溶液は、1％PBSで希釈して実験に必要な濃度にした。
【００８８】
各実験を少なくとも4回繰り返した。
【００８９】
アビシリンの抗血管新生活性は、以下の方法を用いてインビトロ及びインビボで証明され得る。
（1）内皮細胞に対するアビシリンの細胞毒性性効果は、高濃度で接種したSVEC-4-10細胞株で24時間、本医薬をインキュベートすることによって得られた。
我々のデータによれば、アビシリンは、1 mg/mL〜0.125 mg/mLの濃度範囲で内皮細胞を殺した（図２）。FD50は0.21 mg/mLであった。
（2）アビシリンの抗増殖効果は、低濃度で接種したbFGF-活性化SVEC-4-10内皮細胞の増殖活性に対するアビシリンの効果を試験して評価した。
アビシリンは、1 mg/mL〜0.125 mg/mLの濃度範囲でSVEC-4-10内皮細胞の増殖を阻害することが分かった（IC50=0.09 mg/mL）。
2つの無細胞毒性濃度（0.0625 mg/mL及び0.031 mg/mL）について、内皮細胞増殖の20％阻害が観察された（図３）。
（3）アビシリンの抗転位効果は、0.25 mg/mL〜0.031 mg/mLのアビシリン濃度の範囲について（創傷部位の測定と共に）SVEC-4-10マウス内皮細胞プールの転位阻害として評価した（図４、５）。
内皮細胞の創傷内転位（in-wound migration）の89％阻害は、0.25 mg/mLのアビシリン濃度について観察された。無細胞毒性濃度（及び0.031 mg/mL）では、アビシリンは内皮細胞の創傷内転位を阻害しない。
（4）管状構造に対するアビシリンの効果
内皮細胞による管状構造の形成を阻害するアビシリンの能力は、アビシリンが0.125 mg/mL〜0.015 mg/mLの範囲で阻害すると確認した。
この試験は、アビシリンが0.125 mg/mLの濃度で管形成を部分的に阻害したことを示した。観察された管は短く、開いており、他の管への接触によって閉じられない。0.0625、0.031及び0.15 mg/mLのアビシリン濃度に関しては、管形成の阻害は観察されなかった（図６）。
【００９０】
（5）マトリゲル移植片における血管新生に対するアビシリンの効果
アビシリンの抗血管新生活性を、bFGF血管新生プロモーターを添加したマトリゲル移植片におけるその管新生阻害能としてインビボで試験した。アビシリンを2、1及び0.2 mg/mLの濃度で毎日7日間、経口的に投与した。
【００９１】
この試験は、試験した濃度でのアビシリンが、マトリゲルでの血管新生を用量依存的に阻害したことを示した（図７）。最大阻害は、2及び1 mg/mLのアビシリン濃度について観察され；0.2 mg/mLについては、マトリゲル移植片での新血管新生の部分的阻害が観察された。マトリゲル移植片の、ヘマトキシリン-及びエオジン-染色組織学的切除は、アビシリンを与えられたマウスでの内皮細胞及び間質要素の用量依存的減少を示した。
【００９２】
従って、アビシリンは、インビボ及びインビトロでの抗血管新生活性を有することが示された。これらの実験で得られたデータは、悪性腫瘍の血管新生を阻害することができる薬剤としてクレームされた方法で用いるためのアビシリンの好適性から成る、適合された有意を有し、そして、抗腫瘍効果及び抗血管新生効果を同時に有するような複数の活性の非毒性剤を調製するための方法は、なおさら未だ知られておらず、当該分野では自明ではない。
【００９３】
実施例５  アビシリンの抗再発及び抗転移効果
悪性血管新生の転移及び再発を阻害するための方法の実験的開発は、C57BL6株マウス及びBDF1第1世代ハイブリッドを採用した、各動物は20〜25 gの体重であり、皮下にルイス肺癌を移植されている。このマウスは、Experimental Animals Laboratory Division of the Russian Oncologic Center, Russian Academy of Medical Sciencesから購入し、通常の食餌ローテーションで維持した。すべての実験方法は、動物を含む試験の国際的な優れた慣行に従って行った。
【００９４】
アビシリンは、60〜400 mg/mLの投薬剤形で油溶液の形態で経口的に投与した。本医薬の溶媒としてヒマワリ種子油を使用した。対照群及び処置群はそれぞれ7〜10匹の動物を含んだ。
【００９５】
2005年に公表されたManual of Experimental (Preclinical) Study of Novel Pharmacological Substancesに記載の推奨に従って、アビシリンの抗腫瘍、抗再発及び抗転移活性を確認した。
【００９６】
スチューデント試験をデータ処理のために使用した。マウスの皮膚の切開上に施された縫合糸（stitch）下への1ｘ105ルイス肺癌細胞の移植手段によって再発を誘導した後、誘発された腫瘍の出現の割合及び時間、及びその進行の動態に対するアビシリンの効果を試験した。
【００９７】
100 mg/mL及び400 mg/mLの用量での10日間のアビシリンの経口投与は、明確な抗再発効果を引き起こした。例えば、腫瘍細胞移植後に400 mg/mLの用量でのアビシリンを投与された動物群では、14日後に7匹の動物のうち2匹のみに再発が見られ、一方、100 mg/mLの用量でのアビシリンを投与された動物群では、12日後に7匹の動物のうち3匹のみに再発が見られた。更に、誘発された他の動物では、90日より長い観察期間中、再発は見られなかった。
【００９８】
誘起された再発の成長及び転移に対する経口アビシリン投与（60、120及び360 mg/mLの用量で10日間）の効果の試験は、アビシリン投与が、誘起したルイス肺癌の出現及び成長の動態を阻害するのみならず、120 mg/mLの用量で投与した時に再発腫瘍の転移を46％減少させたことを示した（表４）。処置動物及び対照動物を33日目に殺した時に転移がそれらの動物のすべてにおいて見られたのにもかかわらず、転移癌を有する肺の平均質量は、対照動物における449.7±146.1 mgに比べて、241.0±36.0mgであった。
【００９９】
ルイス肺癌の自然に起こる再発及び転移に対するアビシリンの効果（60、100又は120 mg/mLの用量で投与した；経口的に；5倍；原発腫瘍リンパ節の切除の前、後又は前後に）は、その投与スケジュールに依拠する（表５）。
【０１００】
本医薬を60 mg/mLの用量で投与した事象では、最良の効果は、切除の後のアジュバント療法によって得られた。実験の27日目までに、再発が試験群のマウスの3/7で見られ、これに対して、対象群ではその6/7で見られた。外科手術前療法及び組合せ（外科手術前後）スケジュールは、いずれもほとんど効果がなかった。しかし、120 mg/mLの用量でのアビシリン投与は、外科手術前投与スケジュールにおいて最も効果があった。ルイス肺癌の転移に対するこの治療法の効果を評価するために、動物を実験の35日目に殺した後、アビシリンを60 mg/mLの用量で使用した時に外科手術後（アジュバント）療法もまた最も効果的であるとのデータを得た。このスケジュールに従ってアビシリンを投与した（原発腫瘍の切除後5日に、経口的に、60 mg/mLの用量）動物では、45％の転移阻害がみとめられた（試験動物での転移癌を有する肺の平均質量は、対照動物での709.4±237.3 mgと比較して、393.3±160.0 mgであった）。
【０１０１】
【表４】
2014224148.tif 000005
【０１０２】
【表５】
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【０１０３】
クレームされた、決められたスケジュール及び経口投薬形態での複数の活性のテルペノイド医薬アビシリンの使用方法は、必要とされる結果に到達する、すなわち、ルイス肺癌の誘起された再発を阻害し、再発腫瘍に転移を抑制する（様々な実験では25〜46％）、ことが、実験データから分かる。最良の効果は、100〜120 mg/kgの用量で次の7〜10日間、本医薬の経口投与によって得られた。原発腫瘍の外科的切除後のアジュバント療法でのアビシリン活性試験は、ルイス肺癌の自然発生的な出現及び進行を阻害する能力を示した。原発腫瘍の外科的切除後、5日間、60 mg/kgの用量での本医薬の使用は最も効率的であった。120 mg/kgの用量では、本医薬は外科手術前の投与においてより効率的であった。5倍のアビシリンの外科手術後の投与は、原発腫瘍の外科的切除を助ける、ルイス肺癌転移の45％阻害をもたらした。
【０１０４】
従って、クレームされた、決められたスケジュール及び経口投薬形態での複数活性のテルペノイド医薬アビシリンの経口投与法は、悪性腫瘍の進行の血管新生プロセスを阻害し、そして、
−抗再発及び抗転移効果を起こし；
−何の症状もなく；
−細胞毒性及びアポトーシス誘導効果を引き起こし；
−マウスの移植可能腫瘍の所要の株において抗腫瘍活性を有し；
−毒性を減少し、シスプラチンと併用した時に細胞毒性抗腫瘍薬（シスプラチン）の治療的効率を亢進し；
−耐性を引き起こさず；
−新血管新生の阻害に選択的であり；
−治療的用量を超える10倍の用量での経口投与において毒性効果を有さない、
驚くべき機会を提供する。
【０１０５】
更に、本医薬は、従来の複数の活性のテルペノイド物質アビシル及び医薬の使用分野を、腫瘍疾患の外科的処置の効率を亢進することができる薬剤として局所的投与及び適用について推奨されたものに基づいて広げる。
【０１０６】
医薬アビシリンの高い治療効果の別の原因は、そのアビシル物質の従来知られた複数の活性、すなわち、免疫調節、抗菌、創傷治癒、抗炎症、及び疼痛緩和活性の組合せであり、この物質は、大脳皮質の神経終末の特定の内因性体液メディエータの合成を更に刺激することができる。
【０１０７】
悪性腫瘍の封じ込めのための提案された方法は、意図した目的を達成するための機会を与え、この目的は、従来の医薬の欠点のない、すなわち長期間、有毒な副作用がなく、何の症状もなく、耐性（特に、アポトーシスに対する耐性）を引き起こさず、そして、複合療法で使用した時に細胞増殖抑制剤の効力を亢進するのみならず、その毒性の減少を助ける、抗血管新生抗腫瘍医薬アビシリンを用いて新血管新生の選択的な阻害又は停止のための薬剤を明らかにし及び開発することから成る。更に、該医薬は、従来の血管新生阻害剤のすべてを超えるいくつかの利点を有し、すなわち、直接的な抗腫瘍効果を有し、細胞アポトーシスを誘導することができ、抗再発及び抗転移効果をもたらし、同時に免疫調節、抗菌、創傷治癒、抗炎症、疼痛緩和及びその他の効果を有する。
【図１】
2014224148.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年8月8日(2014.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生の阻害プロセス又は内因性アポトーシスプロセスの活性化の誘導のための経口医薬組成物であって、
（i）ピナセアエ（Pinaceae）属由来のアビエス・シビリカ（Abies Sibirica）植物の抽出物；
ここで、該抽出物は、以下の成分：
セスキテルペノイド（３〜６重量％）；
中性ジテルペノイド（１１〜１５重量％）；
ジテルペン酸（２３〜２８重量％）；
トリテルペン酸（８〜１６重量％）；
不飽和及び飽和脂肪酸（０．１〜０．３重量％）；
フェノール化合物（０．１〜０．２重量％）；
残余であるモノテルペルペノイド
を含み、ここで、総テルペンに対する酢酸ボルニル含量が少なくとも１０．０％である、
（ii）薬学的に許容される担体又は希釈剤
を含み、
該組成物は、80〜100 mg/kg体重の用量で毎日投与される、経口医薬組成物。
【請求項２】
腫瘍疾患の進行において、細胞増殖抑制、抗再発及び抗転移効果を示す、請求項１記載の経口医薬組成物。
【請求項３】
溶液、錠剤、ゼラチンカプセル剤、丸剤、シロップ、懸濁液、粉剤、エマルション、顆粒、ミクロスフェア又はナノスフェアである、請求項１記載の経口医薬組成物。
【請求項４】
請求項１記載の経口医薬組成物と、抗生物質又は細胞増殖抑制剤との組合せ医薬。