(57)【要約】【課題】本発明は、多価Ｆａｂフラグメントを作製する方法を提供する。【解決手段】Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含む遺伝子構築体と、ＩｇＧの軽鎖部分からなる遺伝子構築体との哺乳類細胞における共発現により三量体Ｆａｂフラグメントを生成させる方法を提供する。本発明の方法により生成される分子の利用も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価Ｆａｂフラグメントを作製する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、
を宿主細胞中で共発現させるステップを含む方法。
【請求項２】
前記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（１）の遺伝子構築体が、ヒトＩｇＧ由来のヒンジ領域をコードする配列をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選ばれる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒンジ領域をコードする前記配列が、前記遺伝子構築体における前記Ｆａｂフラグメントと前記コラーゲン様ペプチドとの間に位置する請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記（１）の遺伝子構築体が、一本鎖Ｆｖをコードする配列をさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記（２）の遺伝子構築体が、ヒトＩｇＧ1のカッパ軽鎖を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記多価Ｆａｂフラグメントを、ヒトＩｇＧのカッパ軽鎖に結合するリガンドで精製するステップをさらに含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により作製される多価Ｆａｂフラグメント。
【請求項１０】
少なくとも多価Ｆａｂフラグメントのコラーゲン様ドメインにより結合される、請求項９に記載の多価Ｆａｂフラグメントを３つ含む三量体多価Ｆａｂフラグメント。
【請求項１１】
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と、
を含む多価抗体フラグメント。
【請求項１２】
前記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選ばれる請求項１１に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１３】
前記（１）のアミノ酸配列が、ヒトＩｇＧ由来のヒンジ領域のアミノ酸配列を含む請求項１１に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１４】
前記ヒトＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選ばれる請求項１３に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１５】
前記ヒンジ領域が、前記アミノ酸配列における前記Ｆａｂフラグメントと前記コラーゲン様ペプチドとの間に位置する請求項１３または１４に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１６】
前記（１）のアミノ酸配列が、一本鎖Ｆｖの配列をさらに含む請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１７】
前記（２）のアミノ酸配列が、ヒトＩｇＧ1のカッパ軽鎖配列を含む請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１８】
前記多価抗体フラグメントが二重特異性である請求項１６に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項１９】
前記多価抗体フラグメントのリガンドがヒトＣＤ３である請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項２０】
前記多価抗体フラグメントのリガンドがヒトＣＤ３およびヒト上皮成長因子受容体である請求項１８に記載の多価抗体フラグメント。
【請求項２１】
請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の多価抗体フラグメントを３つ含む三量体多価抗体フラグメント。
【請求項２２】
請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の多価抗体フラグメントをコードする核酸。
【請求項２３】
宿主細胞に導入される、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の多価抗体フラグメントを発現する発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
リガンドの生物活性を調節する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と、
を含む多価抗体フラグメントを培養するステップを含む方法。
【請求項２６】
被験体における自己免疫疾患を治療する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と、
を含む有効量の多価抗体フラグメントを、それを必要としている被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項２７】
前記多価抗体フラグメントのリガンドがヒトＣＤ３である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
リガンドを検出する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と
（３）標識と、
を含む三量体多価抗体フラグメント複合体をリガンドと共に培養するステップ、ならびに
前記三量体多価抗体フラグメント複合体の結合を検出するステップ、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多価抗体フラグメント（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）およびその作製方法に関する。当該多価抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチド（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｆｕｓｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むアミノ酸配列と、ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメイン（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）を含むアミノ酸配列とを含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
機能的親和力（アビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ））は、多数の抗原決定基を有する抗原の総和的な結合強度の尺度である。抗原結合パートナーの重合は、標的細胞に非常に接近して一群の特定の同じリガンドに結合するそれらの有効性（または価数）を著しく高め、その結果としてより強い標的結合強度、低い解離速度、およびリガンドの調節を延長すると共に生物学的効果を促進することのできる架橋効果をもたらす。
【０００３】
一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、短いリンカーペプチドで連結される。ｓｃＦｖの主な欠点は、対応する二価の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と比べ、多価結合によるアビディティーの増大を妨げる産物の一価性（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｃｙ）にある。アビディティーを高めるため、ｓｃＦｖの多量体化についていくつかのストラテジーが開発されている。
【０００４】
プロコラーゲンのＣ−プロペプチド、コレクチンファミリータンパク質のコイルドコイルネックドメイン（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｎｅｃｋ  ｄｏｍａｉｎ）、ＦａｓＬのＣ−末端部およびバクテリオファージＴ４フィブリチンフォルドンドメイン（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ｆｉｂｒｉｔｉｎ  ｆｏｌｄｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）を含む三量体化ドメインを用いた三価一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）融合タンパク質の組み換え体の作製が報告されている。自己三量体化およびＣ−あるいはＮ−末端方向からの異種融合タンパク質の増殖の能力を持つ短いαヘリックスコラーゲン様ペプチド（ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）がまた、特許文献１において報告されている。この特許文献１で用いられた異種融合ドメインはｓｃＦｖ抗体フラグメントとして示された。しかしながら、治療応用のための多価の点で、ｓｃＦｖは欠点がある。
【０００５】
ＩｇＧのＦｃフラグメントへの結合によるプロテインＡまたはＧコンジュゲートレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できることから結果として精製スキームの第１ステップで生成物の均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）が９８％以上となる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子とは異なり、治療応用に供する多量体ｓｃＦｖ融合体の精製は、利用できる市販のアフィニティーカラムがないため、困難な作業である。多価ｓｃＦｖは、それらが構築される特定の可変ドメインに応じて安定性が著しく異なったものとなる（非特許文献４、非特許文献５）。キメラ抗ＣＤ２０一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質の多量体化は可変ドメインの交換（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）を介してなされ、このことが異種抗体の変異を生じさせることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
ＣＦＹ１９６は、ヒト免疫グロブリンＤのヒンジ部由来のリンカーと融合したｍＡｂ  １Ａ６１６のヒト化のＦａｂフラグメント、およびヒト転写因子ＡＴＦαのコイルドコイル配列由来の四量体化ドメインからなる（非特許文献７）。しかし、ＡＴＦαは血漿由来タンパク質ではなく、治療応用の可能性を大幅に制限し得る免疫反応のリスクに関連している可能性がある。
【０００７】
特許文献２は、ＧＰＰトリプレットを含む自己三量体化コラーゲン様スキャホールド（ｓｅｌｆ−ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）と融合した抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  Ｎ末端が３つの一本鎖ペプチドから構成される三量体抗体フラグメントを形成する能力があることを証明している。しかし、これらコラーゲン様スキャホールド融合体の三量体ｓｃＦｖの下流精製（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、三量体ｓｃＦｖを効率的に精製するためのアフィニティーレジンがないことから、煩雑であった。加えて、上記三量体ｓｃＦｖの低いタンパク質発現量および熱的不安定性は、バイオ療法への利用に適していなかった。よって、新たな形式の三量体コラーゲンスキャホールド抗体を設計する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第１７９８２４０号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０１７６２４７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６４１，８７０号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１３／５８８，７５２号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２０８，０２０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，４７５，０９２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，５８５，４９９号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８４６，５４５号明細書
【特許文献９】米国特許第５，９０８，６２６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，２２３，４０９号明細書
【特許文献１１】国際公開第９２／１８６１９号
【特許文献１２】国際公開第９１／１７２７１号
【特許文献１３】国際公開第９２／２０７９１号
【特許文献１４】国際公開第９２／１５６７９号
【特許文献１５】国際公開第９３／０１２８８号
【特許文献１６】国際公開第９２／０１０４７号
【特許文献１７】国際公開第９２／０９６９０号
【特許文献１８】国際公開第９０／０２８０９号
【特許文献１９】国際特許出願第９１／００９０６号
【特許文献２０】国際公開第９１／１０７４１号
【特許文献２１】国際特許出願第９２／０３９１８号
【特許文献２２】国際特許出願第９２／０３９１７号
【特許文献２３】国際公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号
【特許文献２４】欧州特許出願第１８４，１８７号明細書
【特許文献２５】欧州特許出願第１７１，４９６号明細書
【特許文献２６】欧州特許出願第１７３，４９４明細書
【特許文献２７】国際特許出願第８６／０１５３３号
【特許文献２８】米国特許第４，８１６，５６７明細書
【特許文献２９】欧州特許出願第１２５，０２３明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｏｐｐｅ，Ｈ．Ｊ．，Ｐ．Ｎ．Ｂａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．”Ａ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔｈｒｅｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂｕｎｄｌｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３４４（２−３）：１９１−１９５；
【非特許文献２】Ｆｒａｎｋ，Ｋａｍｍｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１  ”Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０８（５）：１０８１−１０８９
【非特許文献３】Ｈｏｌｌｅｒ，Ｎ．，Ａ．Ｔａｒｄｉｖｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．”Ｔｗｏ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｆａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ．”Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２３（４）：１４２８−１４４０
【非特許文献４】Ｊｕｎｇ，Ｓ．，Ａ．Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．”Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９４（１）：１６３−１８０
【非特許文献５】Ｗｏｒｎ，Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）．”Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．”Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０５（５）：９８９−１０１０
【非特許文献６】Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｇ．Ｊ．Ｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．”Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−Ｆｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １４（１２）：１０２５−１０３３
【非特許文献７】Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）．”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｆａｂ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＩＣＡＭ−１．”Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４７（５）：１５０３−１５０８
【非特許文献８】Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］
【非特許文献９】Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）
【非特許文献１０】Ｆａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｅｌｆ−ｔｒｉｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．”ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２（１１）：３７９５−３８０４
【非特許文献１１】Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）”Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８（５）：１０８１−１０８９
【非特許文献１２】Ｐｅｒｓｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，１４９６０−１４９６７
【非特許文献１３】Ｐｅｒｓｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１３：８９３−９０２
【非特許文献１４】Ｍｏｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２９７５７−２９７６５
【非特許文献１５】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４
【非特許文献１６】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０
【非特許文献１７】Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１）
【非特許文献１８】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６
【非特許文献１９】Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９
【非特許文献２０】Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ  （Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７）
【非特許文献２１】Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ＲＧＤＷＸＥ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｉｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａｖ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６（５）：１４７５−１４８８
【非特許文献２２】Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ
【非特許文献２３】Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２
【非特許文献２４】Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６
【非特許文献２５】Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３
【非特許文献２６】Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２
【非特許文献２７】Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５
【非特許文献２８】Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１
【非特許文献２９】Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４
【非特許文献３０】Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６
【非特許文献３１】Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８
【非特許文献３２】Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０
【非特許文献３３】Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７
【非特許文献３４】Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７
【非特許文献３５】Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２
【非特許文献３６】Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９
【非特許文献３７】Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１
【非特許文献３８】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５
【非特許文献３９】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０
【非特許文献４０】Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４
【非特許文献４１】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６
【非特許文献４２】Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３
【非特許文献４３】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３
【非特許文献４４】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６
【非特許文献４５】Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８
【非特許文献４６】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５
【非特許文献４７】Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９
【非特許文献４８】Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）
【非特許文献４９】Ｌｉ，Ｊ．，Ｊ．Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．”Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａ  ｎｏｎ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ．”  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６（６）：８８０−８９１．
【非特許文献５０】Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｃ．Ａｎａｓｅｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．”Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｒｅ  ｎｏｎ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９（７）：３６１３−３６２１
【非特許文献５１】Ｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）“Ｏｒａｌ  ＣＤ３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＡＰ＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２（６）：６２７−６３５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
多価ｓｃＦｖは、それらが構築される特定の可変ドメインに応じて安定性が著しく異なったものとなり、かつキメラ抗ＣＤ２０一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ融合タンパク質の多量体化は可変ドメインの交換（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）を介してなされ、これにより異種抗体の変異がもたらされることが報告されている。ＩｇＧのＦｃフラグメントへの結合によるプロテインＡまたはＧコンジュゲートレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できることから結果として精製スキームの第１ステップで生成物の均一性が９８％以上となる免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子とは異なり、治療応用に供する多量体ｓｃＦｖ融合体の精製は、利用できる市販のアフィニティーカラムがないため、困難な作業である。
【００１１】
さらに、これらコラーゲン様スキャホールド融合体の三量体ｓｃＦｖの下流精製は、上記三量体ｓｃＦｖを効率的に精製するためのアフィニティーレジンがないことから、煩雑であった。加えて、上記三量体ｓｃＦｖの低いタンパク質発現レベルおよび熱的不安定性は、バイオ療法への利用に適していなかった。
【００１２】
よって、新たな形式の三量体コラーゲンスキャホールド抗体を設計する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、新たな形式の三量体コラーゲンスキャホールド抗体を設計する必要があるため、真核細胞中で新規な多価Ｆａｂフラグメントを作製する方法を提供する。
【００１４】
当該方法は、Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、を宿主細胞（例えば真核細胞）中で共発現させるステップを含み得る。
【００１５】
本発明の実施形態は、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、
を宿主細胞（例えば真核細胞）中で共発現させるステップを含む、真核細胞中で多価Ｆａｂフラグメントを作製する方法を含む。
【００１６】
１実施形態において、前記（１）の遺伝子構築体は、ヒトＩｇＧ由来のヒンジ領域をコードする配列をさらに含む。
【００１７】
１実施形態において、ヒトＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選ばれるものである。
【００１８】
１実施形態において、ヒンジ領域をコードする配列は、遺伝子構築体におけるＦａｂフラグメントとコラーゲン様ペプチドとの間に位置する。
【００１９】
１実施形態において、前記（１）の遺伝子構築体は、一本鎖Ｆｖをコードする配列をさらに含む。
【００２０】
１実施形態において、前記（２）の遺伝子構築体は、ヒトＩｇＧ１のカッパ軽鎖を含む。
【００２１】
本発明の実施形態は、前記多価Ｆａｂフラグメントを、ヒトＩｇＧのカッパ軽鎖に結合するリガンドで精製するステップをさらに含む。
【００２２】
本発明の実施形態は、上記方法により作製される多価Ｆａｂフラグメントを含む。
【００２３】
別の実施形態は、少なくとも多価Ｆａｂフラグメントのコラーゲン様ドメインにより結合される、多価Ｆａｂフラグメントを３つ含む三量体多価Ｆａｂフラグメントを含む。
【００２４】
さらなる実施形態は、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と、
を含む多価抗体フラグメントを包含する。
【００２５】
１実施形態において、前記（１）のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ由来のヒンジ領域のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
１実施形態において、前記ヒンジ領域は、前記アミノ酸配列における前記Ｆａｂフラグメントと前記コラーゲン様ペプチドとの間に位置する。
【００２７】
１実施形態において、前記（１）のアミノ酸配列は、一本鎖Ｆｖの配列をさらに含む。
【００２８】
１実施形態において、前記（２）のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ1のカッパ軽鎖配列を含む。
【００２９】
１実施形態において、多価抗体フラグメントは二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。
【００３０】
上述した実施形態の多価抗体フラグメントのリガンドは、ヒトＣＤ３、またはヒトＣＤ３およびヒト上皮成長因子受容体であってよい。
【００３１】
別の実施形態は、タンパク質の実施形態をコードする核酸、タンパク質の実施形態を発現する発現ベクター、または発現ベクターおよび／もしくは核酸を含む宿主細胞である。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、リガンドの生物活性を調節する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と、
を含む多価抗体フラグメントを培養するステップを含む。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態は、被験体における自己免疫疾患を治療する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と、
を含む有効量の多価抗体フラグメントを、それを必要としている被験体に投与するステップを含む。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態は、リガンドを検出する方法であって、
（１）Ｆａｂフラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列と
（３）標識と、
を含む三量体多価抗体フラグメント複合体をリガンドと共に培養するステップ、ならびに
前記三量体多価抗体フラグメント複合体の結合を検出するステップ、
を含む。
【００３５】
本発明は、Ｔ細胞媒介性免疫疾患、特に自己免疫疾患の症状を、抗ＣＤ３抗体フラグメントの使用により治療、予防または改善する方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、ヒトＣＤ３複合体内のイプシロンサブユニットと特異的に結合する抗体の投与を提供する。かかる抗体はＴ細胞受容体／アロ抗原相互作用を調節し、よって、自己免疫疾患に関連するＴ細胞媒介性細胞傷害性を制御する。さらに、本発明は、非修飾抗ＣＤ３抗体に比べ、修飾抗ＣＤ３抗体がエフェクター機能およびＴ細胞活性化の低減または排除を示す、抗ＣＤ３抗体の修飾を提供する。サイトカイン放出症候群は、例えば頭痛、吐き気、嘔吐、発熱、筋肉痛、関節痛および震えなどが現れ、例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの血清中のレベルの上昇によって引き起こされ得る。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、上述した従来の問題を全て解決できる多価抗体フラグメントが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本発明の実施形態による抗体フラグメント分子のそれぞれ異なる形式の略図を示している。形式Ａ：ＦａｂＣＳＡであって、重鎖フラグメントがヒンジ領域および自己三量体化できるコラーゲン様ペプチドと融合された、Ｆａｂフラグメントからなる三量体抗体フラグメントである。形式Ｂ：ＦａｂＣＳＡ−ｓｃＦｖであって、自己三量体化できるコラーゲン様ペプチドのＮ−およびＣ−末端にそれぞれ位置するＦａｂフラグメントおよび一本鎖抗体からなる三量体二重特異性抗体フラグメントである。形式Ｃ：ＦａｂＣＳＡ−ｓｄＡｂであって、自己三量体化できるコラーゲン様ペプチドのＮ−およびＣ−末端にそれぞれ位置するＦａｂフラグメントおよびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる三量体二重特異性抗体フラグメントである。
【図２】図２は、本発明の実施形態に基づいた、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでの連続クロマトグラフィーによって培地から精製したｈ１４５ＦａｂＣＳＡ分子の構造的特性評価を示している。（Ａ）ゲルろ過によるｈ１４５ＦａｂＣＳＡ種の分離。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムから溶出したサンプルを濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラムにロードした。（Ｂ）それぞれ異なるピーク画分（Ａ中、ピーク１から３に番号が付されている）およびサンプルの負荷を、非還元（レーン２、４、６、および８）、ならびにサンプルをＤＴＴ５０ｍＭで７５℃１０分処理した還元（レーン３、５、７、および９）条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。（Ｃ）Ｂにおいて表示された矢印で示されているタンパク質バンドに対応する構造の略図。点線は推定ジスルフィド結合を示す。同量のタンパク質を含む全てのサンプルを、４〜１２％ＳＤＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で、ランニングバッファーとしてＭＥＳを用い、電気泳動した。ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液でゲルを染色した。
【図３】図３は、本発明の実施形態に基づいた、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでの連続クロマトグラフィーによって培地から精製したｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ分子の構造的特性評価を示している。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムから溶出したサンプルを濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラムに負荷した。上方右側のパネル：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００で分離したそれぞれ異なるピーク画分（ピーク１から３に番号が付されている）を非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体および単量体に対応するタンパク質バンドがそれぞれ矢印で示されている。全てのサンプルを、４〜１２％ＳＤＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で、ランニングバッファーとしてＭＥＳを用い、電気泳動した。ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液でゲルを染色した。
【図４】図４は、非還元（レーン２、３および４）、ならびにサンプルをＤＴＴ５０ｍＭで７５℃１０分処理した還元（レーン５、６および７）条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（図３におけるピーク２）、低−Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（プロテインＡカラムで精製したもの）、およびムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）の純度分析を示している。同量のタンパク質を含む全てのサンプルを、４〜１２％ＳＤＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で、ランニングバッファーとしてＭＥＳを用い、電気泳動した。Ｍ，ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）分子量スタンダード。
【図５】図５は、本発明の実施形態に基づいた、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（図３中のピーク２から分離）、低−Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（二量体）、および単量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（図３中のピーク３から分離）の精製したヒトＴリンパ球に対する結合親和力を示している。
【図６】図６は、本発明の実施形態に基づいた、抗マウスＣＤ３抗体−１４５−２Ｃ１１および三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ（図２Ａ中のピーク２から分離）の精製したマウス脾臓Ｔリンパ球に対する結合親和力を示している。
【図７】図７は、本発明の１実施形態に基づいた、２つの独立した競合置換結合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ）を示している。ＣＤ３（＋）Ｔ細胞受容体を発現するジャーカット細胞を、それぞれ抗ＣＤ３抗体−精製ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体（黒丸）、およびＯＫＴ３（白丸）の段階希釈液と共に４℃で１時間培養した。飽和量のＦＩＴＣコンジュゲートＯＫＴ３を加え、さらに１時間培養した。細胞を洗浄し、結合したＦＩＴＣコンジュゲートＯＫＴ３をフローサイトメトリーで定量化した。値は最大蛍光強度の抑制率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）として表してあり、これは抗ＣＤ３抗体の事前ブロッキングなしに、ＦＩＴＣコンジュゲートＯＫＴ３を加えることで得られた平均蛍光強度として定義される。
【図８】図８は、精製したＯＫＴ３、低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体に応じたＴ細胞増殖を示している。ヒトＰＢＭＣを３人の健常ドナーから採取し、ＯＫＴ３(黒丸)、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（白丸）またはｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（白三角）の段階対数希釈液と共に６６時間個別に培養し、さらに６時間ＢｒｄＵ１０μＭでパルスした。化学発光免疫測定法を用いＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより細胞増殖を測定して、ＤＮＡ合成時におけるＢｒｄＵの取り込みを定量化した。各ポイントは３人のドナーの平均±標準偏差を表している。
【図９】図９は、精製したＯＫＴ３、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体により誘導されたサイトカインの放出を示している。ヒトＰＢＭＣを３人の健常ドナーから採取し、ＯＫＴ３（黒丸）、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（白丸）またはｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（白三角）の段階対数希釈液と共に個別に培養した。培養上清中のＩＬ−２および表示されている残りのサイトカインのレベルをＥＬＩＳＡにより２４および７２時間の時点で測定した。各ポイントは３人のドナーの平均±標準偏差を表している。
【図１０】図１０は、精製したＯＫＴ３、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体による混合リンパ球反応の抑制を示している。レスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）ＰＢＭＣとマイトマイシンＣで処理したスティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）ＰＢＭＣとを混合したものを、それぞれ異なる濃度のＯＫＴ３（黒丸）、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（白四角）またはｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（白三角）の存在下で５日間共培養し、さらに１６時間ＢｒｄＵでパルスした。ＢｒｄＵ−ＥＬＩＳＡにより細胞増殖を測定した。抗体の非存在下でレスポンダーＰＢＭＣとマイトマイシンＣで処理したスティミュレーターＰＢＭＣとを混合したものを、それぞれ黒四角および黒三角で示した。抗体の非存在下における未処理のスティミュレーターＰＢＭＣの細胞増殖を白丸で示している。
【図１１】図１１は、精製したｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（三量体）、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（二量体）およびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（単量体）によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３の調節／コーティングの定量化を示している。ＣＤ３調節のデータは、未処理ＣＤ５陽性Ｔ細胞の表面におけるＴＣＲ−ＣＤ３複合体の割合として、処理ＣＤ５陽性Ｔ細胞の表面におけるＴＣＲ−ＣＤ３複合体のパーセンテージを表している。ＣＤ３コーティングは、ＦＩＴＣコンジュゲートＯＫＴ３により検出されなかったＴＣＲ−ＣＤ３複合体の割合として示されている。
【図１２】図１２は、本発明に基づいた、マウスにおける精製ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体の血中クリアランスを示している。雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスにｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体２５μｇを静脈注射した。血液サンプルをそれぞれ異なる時間に採取した。血漿中に残る抗体レベルを、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトカッパ軽鎖を検出抗体として用い、抗ヒトＦｄを塗布したＥＬＩＳＡプレートにより測定した。結果は、各時点における３匹の平均をとったものである。
【図１３】図１３は、本発明の実施形態に基づいた、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウス疾患モデルに対する異なる抗マウスＣＤ３抗体の生物学的効果を示している。（Ａ）ＥＡＥマウスに対する異なる生物製剤の有効性。溶媒（ハムスター対照ＩｇＧ)、１４５−２Ｃ１１(ハムスターＩｇＧ）および精製した三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡのグループについて、（矢印で示された）５日間連続して１日１回それぞれ投与量レベル１．０、０．１および１．０μｇ／マウスでマウスに静脈注射した。インターフェロン−β１ａ（陽性対照）グループについては、全治療期間にわたり１日１回、投与量レベル１００００ユニット／マウスでマウスに腹腔内注射した。結果は、２つの独立した実験からの代表的実験の各グループ（ｎ＝１０）の平均±標準偏差として示されている。（Ｂ）ＥＡＥマウスへのｈ１４５−２Ｃ−１１  ＩｇＧおよび三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療に対するＴｒｅｇ細胞集団のフローサイトメトリー。最後の静脈注射の１日後、溶媒（ハムスター対照ＩｇＧ）、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧおよび三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡグループの各々から３匹のマウスの脾臓リンパ細胞を個別に準備し、次いでフローサイトメトリーを行うべくＬＡＰ−ＡＰＣおよびＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。Ｔｒｅｇ集団の測定は、ＬＡＰ＋細胞にゲートをかけた。データは３つの実験における１匹の代表的なマウスからのものである。
【図１４】図１４ＡおよびＢは、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧおよびｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体のＳＬＥマウスモデルに対する治療効果を示している。
【図１５】図１５は、単回用量５０μｇとして異なる抗マウスＣＤ３抗体を静脈注射した後のマウスの血清サイトカインレベルに関する経時的研究を示している。マウスをグループ分けし、精製した１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧ（薄灰色の四角）、低Ｆｃ結合抗マウスＣＤ３抗体−１４５ＩｇＧ−ＡＡ（濃い灰色の四角）、またはｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体（白四角）５０μｇを静脈内投与した。０（プレブリード（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ））、０．５、２４、および１４４時間の時点で血液（１００μｌ／マウス）を採取した。サイトカインのレベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。各ポイントは３つのウェルの平均±標準偏差を表している。ＰＢＳ（黒四角）を対照として用いた。
【図１６】図１６は、非単一（Ａ）または単一安定クローン（Ｂ）由来のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ分子の構造的特性評価を示している。各培地をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでの連続クロマトグラフィーによって精製した。（Ａ）ゲルろ過による非単一クローン由来のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ種の分離。上方右側のパネル：それぞれ異なるピーク画分（ピーク１から３に番号を付してある）を、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ジスルフィド結合三量体（Ｔ）、非ジスルフィド結合三量体（Ｍｔ）、および単量体（Ｍｍ）の構造に対応するバンドの位置が矢印で示されている。（Ｂ）ゲルろ過による安定クローン由来のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ種の分離。非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりピーク画分を分析した。ジスルフィド結合三量体（Ｔ）および非ジスルフィド結合三量体（Ｍｔ）の構造に対応するバンドの位置が矢印で示されている。全てのサンプルを、ＭＥＳをランニングバッファーとして用い、４〜１２％ＳＤＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅタンパク質染色液でゲルを染色した。
【図１７】図１７は、図１６Ｂに示された非ジスルフィド結合体およびジスルフィド結合三量体の両方を含む三量体のピーク画分から得られた、三量体二重特異性抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖとＥＧＦＲ（＋）細胞−Ａ４３１、ＷｉＤｒ、ＨＣＴ１１６、およびＣＤ３（＋）ジャーカットＴ細胞との結合のフローサイトメトリー分析を示している。
【図１８】図１８は、ヒトＰＢＭＣにより、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞に対する三量体二重特異性抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの細胞傷害性を示している。様々な三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの濃度下、刺激ヒトＰＢＭＣをそれぞれ異なるＥ／Ｔ比でＡ４３１細胞と共に（Ａ）、または一定の比１０：１でＷｉＤｒまたはＨＣＴ１１６細胞と共に（Ｂ）培養した。
【図１９】図１９は、三量体二重特異性ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖによるＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞の再誘導された溶解（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ）の微速度写真を示している。Ａ４３１細胞をＰＫＨ２６で染色前（ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ）のヒトＴリンパ球と、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ  １μｇ／ｍｌの非存在下（上図）、または存在下（下図）で、表示されている時点（時間：分）まで共培養し、微速度顕微鏡により画像をそれぞれ記録した。共培養１３時間後にＴ細胞によるＡ４３１細胞のアポトーシスの完了が観察されたことに注目されたい。
【図２０】図２０は、ＨＣＴ１１６結腸がんＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおける三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖのインビボでの有効性を示している。０日目、２つのグループ−７６３ＩｇＧおよびＰＢＳ対照に、ヒトＰＢＭＣの非存在下、５×１０６ＨＣＴ１１６細胞を皮下接種した。残りの３つのグループには、５×１０６ＨＣＴ１１６細胞および５×１０６健康ドナー由来非刺激ヒトＰＢＭＣの混合物を０日目に皮下接種し、続いて１日目にＰＢＳ溶媒対照（１００μｌ）、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ５０μｇおよび１５μｇを尾静脈注射し、連続１０日間行った。表示されたｎの数の動物からなる各群より得られた腫瘍成長曲線が示されている。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ群と非刺激ヒトＰＢＭＣ対照グループの投与の間の統計的有意差（Ｐ＜０．００１）が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下の詳細な説明において、説明の目的で、開示される実施形態が十分に理解されるよう、多数の具体的詳細が記載される。しかしながら、これら具体的詳細がなくとも１つまたはそれ以上の実施形態が実施され得ることは明らかであろう。別の場合では、図を簡潔とするため、周知の構造および装置は概略的に示される。
【００３９】
本開示は、宿主細胞（例えば、真核細胞）中で多価抗体フラグメントを作製する方法であって、
（１）抗体フラグメントの重鎖部分およびインフレーム融合コラーゲン様ペプチドを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、
（２）ヒトＩｇＧの軽鎖可変領域およびカッパ軽鎖定常ドメインを含むアミノ酸配列をコードする遺伝子構築体と、
を発現させるステップを含む方法を包含する。
【００４０】
前記（１）の遺伝子構築体は、ＩｇＧのヒンジ領域および／またはｓｃＦｖをさらに含んでいてもよい。
【００４１】
上述の本方法において記載される多価抗体フラグメントは、次いで三量体構築体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に会合してもよい。
【００４２】
本開示は、多価抗体フラグメントをコードする核酸と、宿主細胞に導入されると多価抗体フラグメントを発現する発現ベクターとを包含する。本開示はまた、多価抗体フラグメントを発現する発現ベクターを含む宿主細胞をも包含する。
【００４３】
本開示は、３つの多価抗体フラグメントを含む三量体をリガンドと共に培養するステップを含む、リガンドの生物活性を調節（つまり、抑制または増大）するための方法およびキットを包含する。
【００４４】
本開示はまた、Ｔ細胞媒介性免疫疾患、特に自己免疫疾患の症状を、多価抗ＣＤ３抗体フラグメントの投与により治療、予防または改善する方法をも提供する。
【００４５】
定義
１．抗体フラグメント
本開示の多価抗体フラグメントには、”抗体領域（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｇｉｏｎ）”、”抗体ドメイン（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｏｍａｉｎ）”または”抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）”とも称される１つまたは複数の”抗体フラグメント”が含まれる。本明細書で述べられる”抗体フラグメント”は、完全（ｉｎｔａｃｔ）抗体の一部、例えば完全抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメント、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（米国特許第５，６４１，８７０号明細書（特許文献３）、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］（非特許文献８）を参照）、一本鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体が含まれる。
【００４６】
抗体のパパイン分解は、”Ｆａｂ”フラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を示す呼び名の、残りの”Ｆｃ”フラグメントとを生じる。Ｆａｂフラグメントは、全てのＬ鎖と、Ｈ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)および１本の重鎖の第１の定常ドメイン(ＣＨ1)とを含み得る。軽鎖の定常領域はラムダまたはカッパ型のいずれかであってよい。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価である、つまりそれは単一の抗原結合部位を有する。
【００４７】
ＦｄまたはＦｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ1ドメインからなる抗体重鎖フラグメントである。
【００４８】
抗体のペプシン処理は、二価抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合を有するＦａｂフラグメントにほぼ相当し、かつ抗原を架橋させる能力も備える単一の大きいＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じさせる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステイン等の、ＣＨ1ドメインのカルボキシ末端に数個の残基をさらに有する点で、Ｆａｂフラグメントとは異なる。
【００４９】
本発明の多価抗体フラグメントは、重鎖の一部、軽鎖（もしくはその一部）、または重鎖の一部および軽鎖もしくはその一部の両方を含み得る。
【００５０】
抗体フラグメントには一本鎖Ｆｖが含まれ得る。”ｓＦｖ”または”ｓｃＦｖ”とも略される”一本鎖Ｆｖ”は、一本鎖ポリペプチド鎖をなすようにつながったＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。１実施形態において、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合にとって好ましい構造を形成できる、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの説明については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）（非特許文献９）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５を参照されたい（以下参照）。
【００５１】
”シングルドメイン”抗体（ｓｄＡｂ）は、その相補性決定領域がシングルドメインポリペプチドの一部である抗体である。例には、重鎖抗体、軽鎖が自然欠損している抗体、従来の４鎖抗体由来のシングルドメイン抗体、改変抗体および抗体由来のもの以外のシングルドメインスキャホールドが含まれる。シングルドメイン抗体は、当該技術分野のいずれのものであってもよいし、またはそれ以外のシングルドメイン抗体であってもよい。シングルドメイン抗体は、限定はされないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含む任意の種由来のものとすることができる。
【００５２】
”二重特異性抗体”は、少なくとも２つの異なる抗原に対し結合特異性を有する抗体である。
【００５３】
本発明の実施形態におけるＦｄ−ＣＳは、本発明の抗体Ｆｄフラグメント、続いてヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、およびコラーゲン様ペプチドからなる融合ポリペプチド鎖である。
【００５４】
”単量体”という用語は、本明細書では、単一のコラーゲン様ペプチドを有する多価抗体フラグメントの実施形態を説明するのに用いられ得る。１実施形態において、”単量体”は、重鎖と軽鎖が会合している多価抗体フラグメントを表すのに用いられ得る。当該”単量体”は、多価抗体フラグメントの”三量体化”構造とは区別される。
【００５５】
１実施形態における多価抗体フラグメントは二重特異性のものである。１実施形態において、本発明の単量体構造は、単に抗体フラグメントのみならず、２つ以上の抗原結合ドメインを有していてよく、かつ２種以上の抗原を結合させることができる。例えば、本発明の多価抗体フラグメントの単一の単量体構造は、単量体構造のＮ末端にＦａｂ領域を有すると共に、単量体構造のＣ末端にｓｃＦｖ領域を有し得る。
【００５６】
２．ヒンジ領域
本発明の実施形態のタンパク質は、任意で”ヒンジ領域”を含む。１実施形態において、ヒンジ領域はおよそ４〜１５アミノ酸長の配列である。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧのヒンジ領域またはグリシンリンカーであり得る。１実施形態において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域である。
【００５７】
Ｆａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｅｌｆ−ｔｒｉｅｒｉｚｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．”ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２（１１）：３７９５−３８０４（非特許文献１０）によりすでに証明されているように、コラーゲン様ペプチド、（ＧＰＰ）１０は単独で非共有結合した三量体融合タンパク質の形成を促すことができる。よって、”ヒンジ領域”は任意であり、たとえ存在するとしても、融合ペプチドに対し三量体化の効果は有さない。
【００５８】
３．コラーゲン様ペプチド
コラーゲンは、哺乳動物において最も豊富なタンパク質である。コラーゲンは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａの繰り返しのトリプレット配列を有する１つまたは複数の三重らせん領域（コラーゲンドメインまたはコラーゲン”スキャホールド”）を含む細胞外基質タンパク質であり、ＸａａおよびＹａａは任意のアミノ酸残基であり、プロリン（アミノ酸コード、ＰまたはＰｒｏ）は最も高い頻度で組み込まれる残基である。Ｙａａ位置において、通常Ｐｒｏは酵素修飾されて４−ヒドロキシプロリン（アミノ酸コード、ＯまたはＨｙｐ）になり、これによってＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐがコラーゲン中で最も多く、同時に最も安定化作用のあるトリプレットとなる。かかるトリプレットの存在により、３本のコラーゲンポリペプチド鎖（α鎖）が折り畳まれて三重らせん構造を形成できるようになる。コラーゲン様ペプチドの説明は、米国特許出願第１３／５８８，７５２号明細書（特許文献４）のコラーゲン様ドメインについての記述に見出すことができ、当該出願は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明のコラーゲン様ポリペプチドは、別個の三量体化ドメインを要さずに、単独でＦａｂフラグメントの重鎖部分を三量体化して三価構造にすることができる。本発明のコラーゲン様ポリペプチドは、少なくとも５、少なくとも１０のＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＰｒｏまたはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐトリプレットの連続的な繰り返し配列を少なくとも１つ含む。本発明のコラーゲン様ペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＰｒｏもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐモチーフおよび／または他のＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａモチーフを含んでいてもよく、ＸａａおよびＹａａは任意のアミノ酸残基である。本発明のコラーゲン様ペプチドは、完全な繰り返しＧｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａトリプレットを含んでいてもよいが、Ｇｌｙの第１の位置またはＹａａの第３の位置の残基が欠失し、短い欠陥（ｓｈｏｒｔ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）によって中断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）されてもよく、これは多くの天然に存在するコラーゲンおよびコラーゲン様ドメインを含むタンパク質に見られる。
【００５９】
コラーゲン多量体構造の安定性は、三量体の融解温度を測定することによって決定することができる。多くの研究が、Ｇ−Ｐ−Ｘ１リピートの融解温度／安定性を検証している。Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）”Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｔｒｉｐｌｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０８（５）：１０８１−１０８９（非特許文献１１）；Ｐｅｒｓｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，１４９６０−１４９６７（非特許文献１２），Ｐｅｒｓｉｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１３：８９３−９０２（非特許文献１３）、およびＭｏｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２９７５７−２９７６５（非特許文献１４）。これらの研究を基に、各種繰り返し構造の安定性を予測することができる。
【００６０】
４．リンカー
リンカーは、抗体フラグメントとコラーゲン様ペプチド領域との間、または結合ドメインとコラーゲン様ペプチド領域との間に任意で配置され得る短いペプチド配列である。ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できる、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、いずれの場合でも、リンカーは４から１０アミノ酸の間の長さである。
【００６１】
本発明の多価抗体フラグメントは、結合ドメインにおいてリガンドを結合させることができる。リガンドは、本発明の実施形態の結合ドメインと共に複合体を形成する生体分子である。リガンドは、ある特定の機能的親和力で分子間力により結合ドメインと結合することができる。１実施形態において、多価抗体フラグメントのリガンドに対する機能的親和力は１０−６Ｍより大きい。１実施形態において、多価抗体フラグメントのリガンドに対する機能的親和力は１０−８Ｍより大きい。１実施形態において、多価抗体フラグメントのリガンドに対する機能的親和力は１０−１０Ｍより大きい。特定の実施形態では、可溶性三量体または六量体融合タンパク質のリガンドに対する機能的親和力（またはアビディティー）は、１０−７Ｍから１０−１２Ｍの間、１０−８Ｍから１０−１１Ｍの間、１０−７Ｍから１０−１０Ｍの間、１０−８Ｍから１０−１０Ｍの間、および１０−９Ｍから１０−１０Ｍの間である。
【００６２】
１実施形態において、多価抗体フラグメントから構成される三量体または六量体タンパク質は可溶性タンパク質である。可溶性タンパク質は、生理的条件下で溶け易いタンパク質である。１実施形態では、多価抗体フラグメントの可溶性三量体または六量体構築体は分泌タンパク質である。分泌融合タンパク質は、細胞より分泌されるタンパク質である。タンパク質の分泌は、抗体ドメインを含むポリペプチド上にシグナル配列またはシグナルペプチドを持つことにより、対象とすることができる。
【００６３】
シグナル配列は次の配列を含み得る。
【００６４】
ＭｅｔＧｌｕＴｈｒＡｓｐＴｈｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕＴｒｐＶａｌＬｅｕＬｅｕＬｅｕＴｒｐＶａｌＰｒｏＧｌｙＳｅｒＴｈｒＧｌｙ（配列番号：１１）
【００６５】
シグナルペプチドは、発現、会合、および／または分泌過程で切断され得る。マウス骨髄腫ＮＳ０細胞は、組み換えコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質の産生、および本発明の融合タンパク質の発現に適した発現系である。さらに、ＣＨＯおよびＣＨＯ−Ｓ細胞が、組み換えコラーゲンまたはコラーゲン様タンパク質の産生、および本発明の融合タンパク質の発現に用いられ得る。
【００６６】
本発明の実施形態の会合した三量体は、３つの単量体、つまり第１、第２および第３の多価抗体フラグメントを含む（多価抗体フラグメント複合体を形成する）。１実施形態において、上記第１、第２および第３の多価抗体フラグメントは実質的に同じものであって、相互に少なくとも７５％（例えば、７５％以上１００％以下の任意の数、例として７５％、７６％…９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する。３つの同じ多価抗体フラグメントにより形成される複合体はホモ三量体である。３つの多価抗体フラグメントは機能的等価であり得る。”機能的等価”とは、共通のポリペプチドのポリペプチド誘導体、例えば、１つまたは複数の点変異、挿入、欠失、切断を有するタンパク質、融合タンパク質、またはこれらの組み合わせ、三重らせんコイルを形成する能力、およびリガンドへの結合のような異種ドメインの活性を実質的に保持するタンパク質のことをいう。１実施形態では、第１の単量体多価抗体フラグメント構造の３つのコピー、および第２の多価抗体フラグメント構造の３つのコピーである。１実施形態では、第１の多価抗体フラグメント構造の２つのコピー、第２の多価抗体フラグメント構造の２つのコピー、および第３のポリペプチド構造の２つのコピーであってよい。
【００６７】
同一性パーセントは、例えば、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４（非特許文献１５））に記述され、かつＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラムバージョン６．０を用い、配列情報を比較することによって決定することができる。ＧＡＰプログラムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２，１９８１（非特許文献１７））が修正した、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０（非特許文献１６））のアライメント法を利用する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータには、（１）ヌクレオチドについての単項比較マトリックス（同一に対し１、非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９（非特許文献１９）に記述されている、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６（非特許文献１８）の加重比較マトリックス、（２）各ギャップにつき３．０のペナルティ（ｐｅｎａｌｔｙ）および各ギャップ中の各シンボルにつき０．１０の追加のペナルティ、ならびに（３）最後のギャップについてはペナルティなし、が含まれる。
【００６８】
本明細書で用いられる用語”コンセンサス配列”は、関連配列のファミリーにおいて最も高い頻度で現れるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列のことをいう(例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  １９８７（非特許文献２０）、またＲｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ＲＧＤＷＸＥ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｉｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａｖ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６（５）：１４７５−１４８８（非特許文献２１）図９を参照)。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置は、ファミリーにおけるその位置に最も高い頻度で現れるアミノ酸によって占められる。２つのアミノ酸が同等の頻度で現れる場合は、どちらもコンセンサス配列に含まれ得る。
【００６９】
異種のポリペプチド、核酸、または遺伝子は、天然では会合しない別のポリペプチド、核酸、または遺伝子と会合するポリペプチド、核酸、または遺伝子である。２つの融合ドメインまたは配列は、天然に存在するタンパク質または核酸においてそれらが互いに近接していない場合、互いに対して異種である。
【００７０】
”単離”ポリペプチド（もしくは多価抗体フラグメント）またはタンパク質複合体とは、天然で会合される分子が実質的に含まれないポリペプチドまたはタンパク質複合体のことをいい、つまり、それは乾燥重量で少なくとも７５％（すなわち、７５％以上１００％以下の任意の数）純度である。純度は任意の適した標準的手法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析で測定することができる。本発明の実施形態の単離ポリペプチドまたはタンパク質複合体は、天然源から精製され、組み換えＤＮＡ技術によって作製され得る。
【００７１】
三量体化されて三量体多価抗体フラグメントを形成する３つの単量体抗体フラグメントは、隣接していなくてもよい（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）。別の実施形態では、三量体化されて三量体多価抗体フラグメントを形成する３つの単量体抗体フラグメントは隣接している、つまり単一の翻訳生成物として翻訳される。
【００７２】
一方、６つの結合ドメインのうち２またはそれ以上が互いに同じであるとき、従来の抗体または受容体に比べ、タンパク質複合体は１つの結合パートナー（例えば抗原）に特異な１〜３個の結合ドメインを持つことができ、従来の抗体または受容体はかかるドメインを１つまたは２つしか持たない。言い換えると、抗原に対して一価または二価のみの従来の抗体または受容体とは異なり、タンパク質複合体は、二、三、四、五、または六価であり得る。結果として、従来の抗体または受容体よりも高い親和力を持つように作製することができる。より高い親和力のために、所望の目標、例えば治療効果を達成するのに、従来の抗体に比べより少量のタンパク質複合体およびより短い培養時間が要求され、これによって治療コストが低減すると共に副作用（例えば、望ましくない免疫反応）が最小限に抑えられることとなる。
【００７３】
また一方、６つのドメインのうち２つまたはそれ以上が互いに異なるとき、本発明のタンパク質複合体は、２〜６個の異なる結合パートナーに特異的な２〜６個の結合ドメインを有し得る。異なる特異性の多数の結合パートナー部位を１つのユニットにまとめることによって、多数の結合パートナーをまとめる能力を備えることとなり、このため治療、組織再建、および活性タンパク質機構（例えばマルチサブユニット酵素）の組み立てにおいて、ナノメートルレベルで望ましく使用できる。
【００７４】
本発明の実施形態のタンパク質複合体は、細胞毒素、治療薬、または放射性イオンのような治療成分にコンジュゲートされ得る。細胞毒素または細胞毒性薬には、細胞に有害な任意の物質が含まれる。例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン（１−ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、例えばメイタンシノール（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）（米国特許第５，２０８，０２０号明細書（特許文献５）参照）、ＣＣ−１０６５（米国特許第５，４７５，０９２号明細書（特許文献６）、米国特許第５，５８５，４９９号明細書（特許文献７）、および米国特許第５，８４６，５４５号明細書（特許文献８）参照）ならびにそのアナログまたはホモログが含まれる。治療薬には、限定はされないが、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ＣＣ−１０６５、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）とロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン、（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびメイタンシノイド）が含まれる。
【００７５】
本発明の実施形態において考えられる放射性イオンには、限定はされないが、１１１インジウム、１１３インジウム、９９レニウム、１０５レニウム、１０１レニウム、９９Ｍテクニチウム、１２１Ｍテルリウム、１２２Ｍテルリウム、１２５Ｍテルリウム、１６５ツリウム、１６７ツリウム、１６８ツリウム、１２３ヨード、１２５ヨード、１２６ヨード、１３１ヨード、１３３ヨード、８１クリプトン、３３キセノン、９０イットリウム、２１３ビスマス、７７臭素、１８フッ素、９５ルテニウム、９７ルテニウム、１０３ルテニウム、１０５ルテニウム、１０７水銀、２０３水銀、６７ガリウム、６８ガリウム、３５硫黄、および１４炭素が含まれる。
【００７６】
コンジュゲートは、コンジュゲートを宿主に投与することによって、所定の生物学的反応を修飾するのに用いることができる。薬物成分は古典的な化学治療薬に限定されると解されるべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を備えるタンパク質またはポリペプチドであってもよい。かかるタンパク質には、例として、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素もしくはジフテリア毒素のような毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベータのようなタンパク質、または、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（”ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（”ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（”ＩＬ−６”）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（”ＧＭ−ＣＳＦ”）、顆粒球コロニー刺激因子（”Ｇ−ＣＳＦ”）もしくはその他の成長因子のような生物学的反応修飾物質が含まれ得る。
【００７７】
さらなる実施形態において、多価抗体（またはその三量体複合体）は、蛍光剤または放射性薬剤のような標識薬剤（つまり、”マーキング薬剤”）にコンジュゲートまたは結合され得る。マーカータンパク質には、限定はされないが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、および高感度緑色蛍光タンパク質が含まれる。マーカータンパク質を含む本発明の実施形態の多価抗体は、診断および分子イメージングに用いることができる。本発明の実施形態において、マーカータンパク質または放射性イオン、あるいは他の融合成分を含む多価抗体フラグメントは、多価抗体フラグメントおよび特定の分子のイメージングに必要な他の試薬を含むキット中に包装されてもよい。これら試薬には、限定はされないが、生体サンプルの作製に用いる試薬、およびマーカータンパク質の可視化に用いる試薬が含まれ得る。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態において、多価抗体フラグメント（またはその三量体複合体）は、ポリマーにコンジュゲートされ得る。かかるポリマーには、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびポリオキシエチル化ポリオールが含まれる。
【００７９】
本発明の実施形態はまた、先ほど述べた多価抗体フラグメントをコードする配列または該配列の相補体を含有する単離核酸も包含する。核酸とは、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログのことをいう。ＤＮＡまたはＲＮＡアナログはヌクレオチドアナログから合成されたものであってもよい。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、１実施形態では二本鎖ＤＮＡである。”単離核酸”とは、その構造が、天然に存在する任意の核酸の構造とも、または天然に存在する任意のゲノム核酸のフラグメントの構造とも同一でない核酸である。よってこの用語は、例えば（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部分の配列を有するが、天然に存在する生物のゲノムにおける分子のその部分に隣接する２つのコーディング配列が両側にはないＤＮＡ、（ｂ）得られる分子が天然に存在する任意のベクターまたはゲノムＤＮＡとも同一にならないような形で、原核生物または真核生物のベクターまたはゲノムＤＮＡに取り込まれる核酸、（ｃ）例えばｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製されたフラグメントまたは制限フラグメントのような分離された分子、および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、つまり融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列、を包含する。上述した核酸は本発明のポリペプチドを発現するのに用いることができる。この目的のために、適した調節配列に核酸を操作可能に連結させて発現ベクターを生成することができる。
【００８０】
ベクターとは、それが連結された別の核酸を運ぶ能力のある核酸分子のことをいう。ベクターは自己複製し得る、または宿主ＤＮＡに組み込まれ得る。ベクターの例には、プラスミド、コスミド、またはウィルスベクターが含まれる。本発明のベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形式の核酸を含む。ベクターは、発現されるべき核酸配列に操作可能に連結した１つまたは複数の調節配列を含む。１実施形態において、発現ベクターはｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【００８１】
”調節配列”には、プロモーター、エンハンサー、またはその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列には、組織特異的な調節および／または誘導性配列のみならず、ヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するものも含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどといった要素によって決まる。発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、本発明のポリペプチドを生成することができる。上述した核酸を含む宿主細胞もまた本発明の実施形態の範囲内に含まれる。例には、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞、昆虫細胞（例えばショウジョウバエＳ２細胞もしくはバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞（例えばマウス骨髄腫ＮＳ０細胞）が含まれる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ（非特許文献２２）を参照されたい。
【００８２】
本発明の単量体構造をコードする配列に、同定および精製を可能にするヌクレオチドまたはタンパク質配列が含まれていてもよい。かかる配列には、ヌクレオチドまたはタンパク質配列を精製または同定するための制限酵素認識部位、標識、スペーサー、およびその他の手段が含まれ得る。多くの場合、かかる配列はヌクレオチド中に含まれ、かつ長さが４〜６アミノ酸の短いアミノ酸配列をコードする。それらは多価抗体フラグメントのドメインの間に人工産物として現れることが多いが、本発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えることはない。
【００８３】
多価抗体フラグメントを作製するため、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能とする条件下にて培地中で宿主細胞を培養し、培養細胞または細胞の培地からポリペプチドを精製することができる。コラーゲン様ペプチドを含むペプチドは、親和性標識（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇｓ）がない場合、精製することが難しい場合がある。本発明の多価抗体フラグメントにおいては、Ｆａｂ領域が精製に役立つ。あるいは、本発明の核酸は、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用い、インビトロで転写および翻訳され得る。
【００８４】
本発明の実施形態のタンパク質複合体を作製するため、上述した第１、第２および第３の融合ポリペプチドをそれぞれコードする第１、第２および第３の核酸を含む宿主細胞を、これら３つの核酸によりコードされるポリペプチドの発現、および発現されたポリペプチド間の三重らせんコイルの形成を可能にする条件下にて培地中で培養し、培養細胞または細胞の培地からタンパク質複合体を精製することができる。宿主細胞は、プロリン残基をヒドロキシル化する酵素活性を含む真核細胞である。
【００８５】
宿主細胞は任意の原核または真核細胞であってよい。本発明の実施形態のタンパク質は、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞（アフリカミドリザル腎細胞  ＣＶ−１  ｏｒｉｇｉｎ  ＳＶ４０細胞；Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５〜１８２（非特許文献２３））中で発現され得る。他の適した宿主細胞は当業者には既知である。
【００８６】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、宿主細胞中に導入することができる。本明細書において、”形質転換”および”トランスフェクション”という用語は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で承認されている様々な技術を指すことが意図されており、それにはリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション（ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。
【００８７】
ヒトにおけるインビボでの使用では、本発明の実施形態の多価抗体フラグメントはヒト由来のものである。例えば多価抗体フラグメントは、ヒト由来のコラーゲン様ドメインにインフレームで融合された配列を含み得る。コラーゲンドメインを有する多くのコラーゲン様タンパク質は血中で極めて安定であることから、当該多価抗体フラグメントも同様に血中で構造的完全性を保つはずである。さらに、ヒンジ領域およびＦｃドメインは、ヒトＩｇＧまたはヒト化抗体から得ることができる。
【００８８】
本発明の実施形態は、Ｔ細胞媒介性免疫疾患、特に自己免疫疾患の症状を、多価抗ＣＤ３抗体フラグメントの使用により治療、予防または改善する方法をも提供する。具体的には、本発明の方法は、ヒトＣＤ３複合体内のイプシロンサブユニットと特異的に結合する多価抗体フラグメントまたは抗体の投与を提供する。かかる抗体および抗体フラグメントは、Ｔ細胞受容体／アロ抗原相互作用を調節し、よって、自己免疫疾患に関連するＴ細胞媒介性細胞傷害を制御する。さらに、本発明は、非修飾抗ＣＤ３抗体と比較して、修飾抗ＣＤ３抗体がエフェクター機能およびＴ細胞活性化の低減または除去を示す、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ３抗体フラグメントの修飾を提供する。
【００８９】
自己免疫疾患とは、免疫システムが健全な生体組織を誤って攻撃して破壊し、これにより組織損傷を引き起こす疾患のことをいう。自己免疫疾患には、限定はされないが、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、１型糖尿病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、混合性結合組織疾患、進行性全身性強皮症、抗リン脂質抗体症候群、乾癬、強皮症、糸球体腎炎、皮膚筋炎、橋本甲状腺炎およびグレーブス病が含まれる。
【００９０】
エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を通しての抗体被覆粒子の食作用および崩壊、抗体Ｆｃフラグメントとナチュラルキラー細胞のような活性化されたエフェクター細胞のＦｃγ受容体との架橋結合による、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通しての抗体被覆標的細胞の溶解、細胞膜の破壊、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦαを含む炎症性メディエータの放出、ならびに免疫グロブリン産生のコントロールによって示され得る。
【００９１】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する抗原またはアゴニスト抗体でのＴ細胞の刺激によるＴ細胞増殖を測定することで示され得る。ＴＣＲ活性化は、特定のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の誘導、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）の分解、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、および細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を含むシグナル伝達経路の開始をもたらし得る。これら初期のイベントが核に伝達され、結果として、Ｔ細胞のクローン性増殖、セル表面における活性化マーカーのアップレギュレーション、エフェクター細胞への分化、細胞毒性またはＩＬ−２のようなサイトカイン分泌の誘導、アポトーシスの誘導が生じる。
【００９２】
サイトカイン放出症候群は、例えば頭痛、吐き気、嘔吐、発熱、筋肉痛、関節痛および震えなどが現れ、例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの血清中のレベルの上昇によって引き起こされる可能性がある。
【００９３】
上述したタンパク質複合体は、異種結合ドメインの特異性に応じて、自己免疫疾患、炎症疾患、代謝疾患、線維症疾患、がん、および心血管疾患を含む様々な疾患を治療するのに用いることができる。これら疾患の具体的な症状には頭痛、吐き気、嘔吐、発熱、筋肉痛、関節痛および震えが含まれ、例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの血清中のレベルの上昇によって引き起こされる可能性がある。よって、本発明は、例えばそれを必要とする被験体に有効量の本発明のタンパク質複合体を投与して疾患を治療することにより、このような疾患を治療する方法を特徴とする。治療されるべき被験体は、当該疾患により特徴付けられる状態を有している、またはそのような状態になるリスクがあると見なされ得る。本方法は、単独で、または他の薬物もしくは治療法と併用して実施することができる。
【００９４】
１実施形態は、Ｔ細胞受容体／アロ抗原相互作用により引き起こされる、または悪化する疾患を治療するのに用いられ、よって、自己免疫疾患に関連するＴ細胞媒介性細胞傷害を制御する。別の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者におけるＣＤ３の生物活性、ＣＤ３シグナル伝達のレベル、またはＴ細胞受容体／アロ抗原相互作用を調節するのに用いられる。１実施形態において、本発明は、未結合ＣＤ３またはＣＤ３シグナル伝達のレベルを低下させる。
【００９５】
本発明のタンパク質複合体の多重特異性という特徴のために、これを用いて通常は互いに会合しない分子または細胞を架橋させることができる。この特徴は、細胞療法（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）に特に有用である。１例において、本発明の多価Ｆａｂ抗体フラグメントはＣＤ３を１つのドメインに結合させることができ、一方で別のドメインはＥＧＦＲと結合する。
【００９６】
細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、本発明のタンパク質複合体により細胞傷害性Ｔ細胞の表面上にエフェクター抗原としてのＣＤ３抗原を結合させることによって起こり得る。他のリンパ系細胞結合性エフェクター抗原（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）には、ヒトＣＤ１６抗原、ＮＫＧ２Ｄ抗原、ＮＫｐ４６抗原、ＣＤ２抗原、ＣＤ２８抗原、ＣＤ２５抗原、ＣＤ６４抗原、およびＣＤ８９抗原が含まれる。これらエフェクター抗原との結合は、単球、好中性顆粒球、および樹状細胞のようなエフェクター細胞の活性化につながる。そして、これら活性化された細胞は、標的細胞に対して細胞傷害またはアポトーシスの効果をもたらす。
【００９７】
”治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”という用語は、疾病、疾病の症状、疾病に続発する病状、本発明のタンパク質のリガンドにより悪化する疾病、または病気にかかり易い素因を治癒する、緩和する、軽減する、治す、予防する、または改善することを目的とした、被験体への組成物を投与として定義される。”有効量”とは、治療を受ける被験体において例えば上述したような医学的に望ましい結果を生じさせることのできる組成物の量のことである。
【００９８】
１つのインビボアプローチでは、治療用組成物（例えば本発明のタンパク質複合体を含む組成物）が被験体に投与される。通常、該複合体は薬学的に許容される担体（例えば生理食塩水）中に懸濁され、経口でもしくは静脈内注射により投与される、または皮下、筋肉、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内もしくは肺内に注射もしくは移植される。
【００９９】
必要な投与量は、投与経路の選択、剤形の性質、被験体の疾病の性質、被験体の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与されている他の薬物、ならびに主治医の判断によって決まる。適した投与量は０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。適した投与量は０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。より詳細には０．１〜１００、０．１〜７５、０．１〜５０、０．１〜２５、０．１〜１０、０．５〜１００、０．５〜７５、０．５〜５０、０．５〜２５、０．５〜１０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、もしくは１〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与量には、１〜１０、１０〜１００、１０〜７５、１０〜５０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、２５〜１００、２５〜５０、５０〜１００、または７５〜１００ｍｇ／ｋｇが含まれ得る。あるいは、投与量は１〜２、３〜４、５〜６、７〜８、または９〜１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１００】
本発明の実施形態の治療用組成物は、約１から１０週間の間、例えば２から８週間の間、または約３から７週間の間、さらには約４、５、もしくは６週間、毎日、週に１回、２回、３回またはそれ以上、投与することができる。使用できる組成物の種類および各種投与経路のそれぞれ異なる効率を考慮すると、必要とされる投与量の変動が予想される。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも高い投与量を要することが予想される。これら投与量のレベルの変動は、当該分野においてよく理解されているように、至適化のための標準的な実験によって調整することができる。適した運搬媒体（例えば高分子微粒子または埋め込み型装置）内への組成物のカプセル封入は、特に経口デリバリーにおいて、運搬の効率を向上させることができる。
【０１０１】
薬学的に許容される担体には、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、ならびに等張および吸収遅延剤が含まれる。具体的には、これらの物質には、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファー、ならびに、塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調節に用いる物質が含まれ得る。医薬組成物のｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基によって調節することができる。
【０１０２】
薬学的に許容される担体および有効量の本発明の実施形態のタンパク質複合体を含有する医薬組成物もまた、本発明の実施形態の範囲に入る。医薬組成物は、上に挙げた疾患を治療するのに用いることができる。薬学的に許容される担体には、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤が含まれる。医薬組成物は、従来の方法を用い、それぞれ異なる投与経路に合った剤形に処方することができる。
【０１０３】
本発明の実施形態の組成物の有効性はインビトロとインビボの両方において評価することができる。インビボ試験では、組成物を動物（例えばマウスモデル）に注射することができ、そしてその治療効果を評価する。その結果に基づいて、適切な投与量の範囲と投与経路を決定できる。
【０１０４】
本明細書において、”〜に対する（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ）”および”〜に特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  ｔｏ）”という用語は、本発明の融合タンパク質が抗体ドメインを含み、抗体または抗体のフラグメントがそのリガンドに対し少なくとも１０−６Ｍの機能的親和力を有することを意味する。
【０１０５】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、添付の図面および以下の記述において示される。本発明の他の特徴、目的および長所は、当該記述および図面、ならびにクレームから明らかとなるであろう。
【０１０６】
ＩＩ．実施形態の構成
Ａ．抗体フラグメント
１実施形態による本発明の多価抗体フラグメントの単量体は、単一の抗体フラグメント（結合ドメイン／領域もしくは抗原結合フラグメントを含む）または２つ以上の抗体フラグメントを有し得る。多価抗体フラグメントを表すモノマーの抗体フラグメントの例には、限定はされないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）ＶＬまたはＶＨドメインが含まれる。
【０１０７】
１実施形態では、抗体フラグメントはＦａｂフラグメントである。
【０１０８】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、組み換え法を用い、これらをＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する１本のタンパク質鎖とさせることのできる合成リンカーにより、連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（非特許文献２４）、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（非特許文献２５））。このような一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）もまた、抗体の”抗原結合フラグメント”という用語に包含される。これらの抗体フラグメントは当業者に知られる従来の手法を用いて得ることができ、かつ、当該フラグメントは実用に供することのできるよう、完全（ｉｎｔａｃｔ）抗体と同じ方式で選別される。
【０１０９】
１実施形態において、抗体フラグメントはｓｃＦｖである。
【０１１０】
１実施形態において、多価抗体は２つの抗体フラグメント、ＦａｂおよびｓｃＦｖを含む。
【０１１１】
ＦｄまたはＦｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる抗体重鎖フラグメントである。
【０１１２】
抗体はモノクローナル抗体であってよい。１実施形態において、抗体は、組み換え技術、例えばファージディスプレイまたはコンビナトリアル手法により作製することができる。抗体を生成するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル手法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号明細書（特許文献１０）；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／１８６１９号パンフレット（特許文献１１）；Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９１／１７２７１号パンフレット（特許文献１２）；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／２０７９１号パンフレット（特許文献１３）；Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／１５６７９号パンフレット（特許文献１４）；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９３／０１２８８号パンフレット（特許文献１５）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０１０４７号パンフレット（特許文献１６）；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９２／０９６９０号パンフレット（特許文献１７）；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第９０／０２８０９号パンフレット（特許文献１８）；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２（非特許文献２６）；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５（非特許文献２７）；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（非特許文献２８）；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４（非特許文献２９）；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６（非特許文献３０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（非特許文献３１）；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０（非特許文献３２）；Ｇａｒｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７（非特許文献３３）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７（非特許文献３４）、およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２（非特許文献３５）を参照されたく、これらすべての内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）。１実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体を産生するよう遺伝子操作を受けたマウスで作られた抗体）、または非ヒト抗体、例えば齧歯動物（マウスもしくはラット）、ヤギ、霊長類（例えばサル）、もしくはラクダの抗体である。１実施形態において、非ヒト抗体は齧歯動物（マウスまたはラット抗体）である。齧歯動物抗体を作製する方法は当該技術分野において既知である。
【０１１３】
ヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウスを用いて生成することができる。目的の抗原で免疫化されたこれらトランスジェニックマウス由来の脾細胞は、ヒトタンパク質由来のエピトープに対し特異的親和性があるヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作製するのに用いられる（例えば、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．国際特許出願第９１／００９０６号（特許文献１９）；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．国際特許出願第９１／１０７４１号（特許文献２０）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．国際特許出願第９２／０３９１８号（特許文献２１）；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．国際特許出願第９２／０３９１７号（特許文献２２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（非特許文献３６），Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１（非特許文献３７）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（非特許文献３８）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０（非特許文献３９）；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４（非特許文献４０）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ  ２１：１３２３−１３２６（非特許文献４１）を参照）。
【０１１４】
ヒトモノクローナル抗体の１例は、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）(ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）)であって、旧名はＡＢＸ−ＥＧＦで、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的な完全ヒトモノクローナル抗体である。パニツムマブは、ＥＧＦＲを発現する、結腸または直腸の転移性がんに罹患する患者を治療するのに用いられる。
【０１１５】
抗体は、可変領域、またはその一部、例えばＣＤＲが、非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて作製されたものであってよい。キメラ、ＣＤＲ−グラフト、およびヒト化抗体が使用可能である。非ヒト生物、例えばラットまたはマウスで作製されてから、ヒトにおける抗原性を低下させるために例えば可変フレームワークまたは定常領域が修飾された抗体は、本発明の範囲に入る。
【０１１６】
キメラ抗体は、当該技術分野において公知である組み換えＤＮＡ技術によって作製することができる。例えば、マウス（またはその他の種の）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素により消化して、マウスＦｃをコードする領域を除去し、そしてヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の相当部分で置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号パンフレット（特許文献２３）；Ａｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１８４，１８７号明細書（特許文献２４）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ、欧州特許出願第１７１，４９６号明細書（特許文献２５）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１７３，４９４号明細書（特許文献２６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際特許出願第８６／０１５３３号（特許文献２７）；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書（特許文献２８）；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願第１２５，０２３号明細書（特許文献２９）；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（非特許文献４２）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３（非特許文献４３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６（非特許文献４４）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８（非特許文献４５）；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５（非特許文献４６）；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９（非特許文献４７）；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９（非特許文献４８）を参照）。
【０１１７】
ヒト化またはＣＤＲグラフト抗体は、少なくとも１つまたは２つ、ただし通常は３つ全ての（重および／または軽免疫グロブリン鎖の）レシピエントＣＤＲが、ドナーＣＤＲで置き換えられることとなる。抗体が非ヒトＣＤＲの少なくとも１部で置き換えられてもよいし、あるいは、ＣＤＲのいくつかだけが非ヒトＣＤＲで置き換えられてもよい。ヒト化抗体またはそのフラグメントの結合に要されるＣＤＲの数だけ置き換えればよい。ドナーは齧歯動物の抗体、例えばラットまたはマウス抗体であってよく、かつレシピエントはヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。一般に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは”ドナー”と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは”アクセプター”と呼ばれる。１実施形態において、ドナー免疫グロブリンはヒト以外（例えば齧歯動物）である。アクセプターのフレームワークは、天然に存在する（例えばヒト）フレームワークまたはコンセンサスフレームワーク、あるいは、それと約８５％もしくはそれ以上、または９０％、９５％、９９％もしくはそれ以上同一な配列である。
【０１１８】
１実施形態において、リガンドまたは抗原はＣＤ３である。１実施形態において、リガンドまたは抗原はＥＧＦＲである。１実施形態において、二重特異性構造は、抗ＣＤ３領域および抗ＥＧＦＲ領域の両方を有する。
【０１１９】
１実施形態において、Ｆａｂは抗ＣＤ３であり、かつ次の構造の１つまたは複数を有していてよい。
【０１２０】
ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ中に含まれる結合領域
抗体フラグメントの結合領域は抗ＣＤ３抗体に由来するものであってよいし、重鎖および軽鎖の両方を含んでいてもよい。例えば、ハムスター抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）由来の重鎖可変領域は、次のとおりである。
【０１２１】
ＡｓｐＧｌｕＶａｌＧｌｎＬｅｕＧｌｎＧｌｕＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＬｅｕＶａｌＧｌｎＰｒｏＧｌｙＬｙｓＳｅｒＬｅｕＬｙｓＬｅｕＳｅｒＣｙｓＧｌｕＡｌａＳｅｒＧｌｙＰｈｅＴｈｒＰｈｅＳｅｒＧｌｙＴｙｒＧｌｙＭｅｔＨｉｓＴｒｐＶａｌＡｒｇＧｌｎＡｌａＰｒｏＧｌｙＡｒｇＧｌｙＬｅｕＧｌｕＳｅｒＶａｌＡｌａＴｙｒＩｌｅＴｈｒＳｅｒＳｅｒＳｅｒＩｌｅＡｓｎＩｌｅＬｙｓＴｙｒＡｌａＡｓｐＡｌａＶａｌＬｙｓＧｌｙＡｒｇＰｈｅＴｈｒＶａｌＳｅｒＡｒｇＡｓｐＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｓｎＬｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕＧｌｎＭｅｔＡｓｎＩｌｅＬｅｕＬｙｓＳｅｒＧｌｕＡｓｐＴｈｒＡｌａＭｅｔＴｙｒＴｙｒＣｙｓＡｌａＡｒｇＰｈｅＡｓｐＴｒｐＡｓｐＬｙｓＡｓｎＴｙｒＴｒｐＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号１２）
【０１２２】
ハムスター抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）由来の軽鎖可変領域は、次のとおりである。
【０１２３】
ＡｓｐＩｌｅＧｌｎＭｅｔＴｈｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＳｅｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏＡｌａＳｅｒＬｅｕＧｌｙＡｓｐＡｒｇＶａｌＴｈｒＩｌｅＡｓｎＣｙｓＧｌｎＡｌａＳｅｒＧｌｎＡｓｐＩｌｅＳｅｒＡｓｎＴｙｒＬｅｕＡｓｎＴｒｐＴｙｒＧｌｎＧｌｎＬｙｓＰｒｏＧｌｙＬｙｓＡｌａＰｒｏＬｙｓＬｅｕＬｅｕＩｌｅＴｙｒＴｙｒＴｈｒＡｓｎＬｙｓＬｅｕＡｌａＡｓｐＧｌｙＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＡｒｇＡｓｐＳｅｒＳｅｒＰｈｅＴｈｒＩｌｅＳｅｒＳｅｒＬｅｕＧｌｕＳｅｒＧｌｕＡｓｐＩｌｅＧｌｙＳｅｒＴｙｒＴｙｒＣｙｓＧｌｎＧｌｎＴｙｒＴｙｒＡｓｎＴｙｒＰｒｏＴｒｐＴｈｒＰｈｅＧｌｙＰｒｏＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓ（配列番号１３）
【０１２４】
ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ中に含まれる結合領域
ヒト化ムロモナブ−ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３抗体）の重鎖可変領域は次のとおりである。
【０１２５】
ＡｓｐＧｌｎＶａｌＧｌｎＬｅｕＶａｌＧｌｎＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＶａｌＶａｌＧｌｎＰｒｏＧｌｙＡｒｇＳｅｒＬｅｕＡｒｇＬｅｕＳｅｒＣｙｓＬｙｓＡｌａＳｅｒＧｌｙＴｙｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｒｇＴｙｒＴｈｒＭｅｔＨｉｓＴｒｐＶａｌＡｒｇＧｌｎＡｌａＰｒｏＧｌｙＬｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｕＴｒｐＩｌｅＧｌｙＴｙｒＩｌｅＡｓｎＰｒｏＳｅｒＡｒｇＧｌｙＴｙｒＴｈｒＡｓｎＴｙｒＡｓｎＧｌｎＬｙｓＶａｌＬｙｓＡｓｐＡｒｇＰｈｅＴｈｒＩｌｅＳｅｒＡｒｇＡｓｐＡｓｎＳｅｒＬｙｓＡｓｎＴｈｒＡｌａＰｈｅＬｅｕＧｌｎＭｅｔＡｓｐＳｅｒＬｅｕＡｒｇＰｒｏＧｌｕＡｓｐＴｈｒＧｌｙＶａｌＴｙｒＰｈｅＣｙｓＡｌａＡｒｇＴｙｒＴｙｒＡｓｐＡｓｐＨｉｓＴｙｒＣｙｓＬｅｕＡｓｐＴｙｒＴｒｐＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＰｒｏＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号１４）
【０１２６】
ヒト化ムロモナブ−ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３）の軽鎖可変領域は次のとおりである。
【０１２７】
ＡｓｐＡｓｐＩｌｅＧｌｎＭｅｔＴｈｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＳｅｒＳｅｒＬｅｕＳｅｒＡｌａＳｅｒＶａｌＧｌｙＡｓｐＡｒｇＶａｌＴｈｒＩｌｅＴｈｒＣｙｓＳｅｒＡｌａＳｅｒＳｅｒＳｅｒＶａｌＳｅｒＴｙｒＭｅｔＡｓｎＴｒｐＴｙｒＧｌｎＧｌｎＴｈｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓＡｌａＰｒｏＬｙｓＡｒｇＴｒｐＩｌｅＴｙｒＡｓｐＴｈｒＳｅｒＬｙｓＬｅｕＡｌａＳｅｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｓｐＴｙｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＩｌｅＳｅｒＳｅｒＬｅｕＧｌｎＰｒｏＧｌｕＡｓｐＩｌｅＡｌａＴｈｒＴｙｒＴｙｒＣｙｓＧｌｎＧｌｎＴｒｐＳｅｒＳｅｒＡｓｎＰｒｏＰｈｅＴｈｒＰｈｅＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｎＩｌｅＴｈｒ（配列番号１５）
【０１２８】
Ｆａｂにおいて、重鎖はヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含み得る。この配列の１例は次のとおりである。
【０１２９】
ＡｌａＳｅｒＴｈｒＬｙｓＧｌｙＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅＰｒｏＬｅｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＳｅｒＬｙｓＳｅｒＴｈｒＳｅｒＧｌｙＧｌｙＴｈｒＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｙＣｙｓＬｅｕＶａｌＬｙｓＡｓｐＴｙｒＰｈｅＰｒｏＧｌｕＰｒｏＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＴｒｐＡｓｎＳｅｒＧｌｙＡｌａＬｅｕＴｈｒＳｅｒＧｌｙＶａｌＨｉｓＴｈｒＰｈｅＰｒｏＡｌａＶａｌＬｅｕＧｌｎＳｅｒＳｅｒＧｌｙＬｅｕＴｙｒＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＶａｌＶａｌＴｈｒＶａｌＰｒｏＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｅｕＧｌｙＴｈｒＧｌｎＴｈｒＴｙｒＩｌｅＣｙｓＡｓｎＶａｌＡｓｎＨｉｓＬｙｓＰｒｏＳｅｒＡｓｎＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｓｐＬｙｓＬｙｓＶａｌＧｌｕＰｒｏＬｙｓＳｅｒＣｙｓＡｓｐＬｙｓＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号１６）
【０１３０】
Ｆａｂにおいて、ＩｇＧ１のカッパ軽鎖定常ドメインが、軽鎖可変領域のＣ末端に加えられてよい。カッパ軽鎖定常ドメインの１例は次のとおりである。
【０１３１】
ＡｒｇＴｈｒＶａｌＡｌａＡｌａＰｒｏＳｅｒＶａｌＰｈｅＩｌｅＰｈｅＰｒｏＰｒｏＳｅｒＡｓｐＧｌｕＧｌｎＬｅｕＬｙｓＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｌａＳｅｒＶａｌＶａｌＣｙｓＬｅｕＬｅｕＡｓｎＡｓｎＰｈｅＴｙｒＰｒｏＡｒｇＧｌｕＡｌａＬｙｓＶａｌＧｌｎＴｒｐＬｙｓＶａｌＡｓｐＡｓｎＡｌａＬｅｕＧｌｎＳｅｒＧｌｙＡｓｎＳｅｒＧｌｎＧｌｕＳｅｒＶａｌＴｈｒＧｌｕＧｌｎＡｓｐＳｅｒＬｙｓＡｓｐＳｅｒＴｈｒＴｙｒＳｅｒＬｅｕＳｅｒＳｅｒＴｈｒＬｅｕＴｈｒＬｅｕＳｅｒＬｙｓＡｌａＡｓｐＴｙｒＧｌｕＬｙｓＨｉｓＬｙｓＶａｌＴｙｒＡｌａＣｙｓＧｌｕＶａｌＴｈｒＨｉｓＧｌｎＧｌｙＬｅｕＳｅｒＳｅｒＰｒｏＶａｌＴｈｒＬｙｓＳｅｒＰｈｅＡｓｎＡｒｇＧｌｙＧｌｕ
Ｃｙｓ（配列番号１７）
【０１３２】
１実施形態において、多価抗体フラグメントはｓｃＦｖを含む。このようなｓｃＦｖの１つの配列は以下に示される、ＥＧＦＲに対するものである（７６３ｓｃＦｖ）。
【０１３３】
ＡｓｐＩｌｅＧｌｎＭｅｔＴｈｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＳｅｒＳｅｒＬｅｕＳｅｒＡｌａＳｅｒＶａｌＧｌｙＡｓｐＡｒｇＶａｌＴｈｒＩｌｅＴｈｒＣｙｓＧｌｎＡｌａＳｅｒＧｌｎＡｓｐＩｌｅＳｅｒＡｓｎＴｙｒＬｅｕＡｓｎＴｒｐＴｙｒＧｌｎＧｌｎＬｙｓＰｒｏＧｌｙＬｙｓＡｌａＰｒｏＬｙｓＬｅｕＬｅｕＩｌｅＴｙｒＡｓｐＡｌａＳｅｒＡｓｎＬｅｕＧｌｕＴｈｒＧｌｙＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＳｅｒＧｌｙＴｈｒＡｓｐＰｈｅＴｈｒＰｈｅＴｈｒＩｌｅＳｅｒＳｅｒＬｅｕＧｌｎＰｒｏＧｌｕＡｓｐＩｌｅＡｌａＴｈｒＴｙｒＰｈｅＣｙｓＧｌｎＨｉｓＰｈｅＡｓｐＨｉｓＬｅｕＰｒｏＬｅｕＡｌａＰｈｅＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｈｒＬｙｓＶａｌＧｌｕＩｌｅＬｙｓＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｎＶａｌＧｌｎＬｅｕＧｌｎＧｌｕＳｅｒＧｌｙＰｒｏＧｌｙＬｅｕＶａｌＬｙｓＰｒｏＳｅｒＧｌｕＴｈｒＬｅｕＳｅｒＬｅｕＴｈｒＣｙｓＴｈｒＶａｌＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＶａｌＳｅｒＳｅｒＧｌｙＡｓｐＴｙｒＴｙｒＴｒｐＴｈｒＴｒｐＩｌｅＡｒｇＧｌｎＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｕＴｒｐＩｌｅＧｌｙＨｉｓＩｌｅＴｙｒＴｙｒＳｅｒＧｌｙＡｓｎＴｈｒＡｓｎＴｙｒＡｓｎＰｒｏＳｅｒＬｅｕＬｙｓＳｅｒＡｒｇＬｅｕＴｈｒＩｌｅＳｅｒＩｌｅＡｓｐＴｈｒＳｅｒＬｙｓＴｈｒＧｌｎＰｈｅＳｅｒＬｅｕＬｙｓＬｅｕＳｅｒＳｅｒＶａｌＴｈｒＡｌａＡｌａＡｓｐＴｈｒＡｌａＩｌｅＴｙｒＴｙｒＣｙｓＶａｌＡｒｇＡｓｐＡｒｇＶａｌＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｈｅＡｓｐＩｌｅＴｒｐＧｌｙＧｌｎＧｌｙＴｈｒＭｅｔＶａｌＴｈｒＶａｌＳｅｒＳｅｒ（配列番号９）
【０１３４】
Ｂ．ヒンジ領域
本発明の融合タンパク質は”ヒンジ領域”を含んでいてもよい。１実施形態において、ヒンジ領域はおよそ４〜１５アミノ酸長の配列である。ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧのヒンジ領域またはグリシンリンカーであり得る。１実施形態において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２のヒンジ領域である。
【０１３５】
１実施形態において、“ヒンジ領域”は次の配列のうちの１つを有する。
【０１３６】
ＧｌｕＰｒｏＬｙｓＳｅｒＧｌｙＡｓｐＬｙｓＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号１８)、または、
【０１３７】
ＧｌｕＰｒｏＬｙｓＳｅｒＣｙｓＡｓｐＬｙｓＴｈｒＨｉｓＴｈｒＣｙｓＰｒｏＰｒｏＣｙｓＰｒｏ（配列番号１９)、または、次のうちの１つ。
【０１３８】
【表１】
2014124186.tif 000002
【０１３９】
１実施形態において、”ヒンジ領域”にはグリシンリンカーが含まれる。
【０１４０】
グリシンリンカー（Ｇ−ｌｉｎｋｅｒ）の例には次のものが含まれ得る。
【０１４１】
（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２４）。最もよく用いられるｓｃＦｖのリンカーは、グリシンおよびセリン残基の１５アミノ酸の組み合わせを含む。
【０１４２】
米国特許第５，９０８，６２６号明細書（特許文献９）：ペプチドリンカーで連結されたインターフェロン−βと免疫グロブリンＦｃを有するハイブリッドにおいて示されているＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２５）。
【０１４３】
ｓｃＦｖ−ＲＧ３から得られるＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＧＧＳ（配列番号２６）。
【０１４４】
リンカーは、本発明の多価抗体フラグメントにおける他の部分にも用いることができる。
【０１４５】
Ｃ．コラーゲン様ペプチド
コラーゲン様ペプチドについての記述は、米国特許出願第１３／５８８，７５２号明細書（特許文献４）のコラーゲン様ドメインの説明において見ることができ、当該出願はその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本発明のコラーゲン様ペプチドには、ＧＰＰまたはＧＰＯモチーフおよび／もしくは三量体化モチーフまたはその他の構造が含まれ得る。例えば、そのようなコラーゲン様ペプチドの１つは次の配列を有していてもよい。
【０１４６】
ＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＰｒｏＰｒｏ（配列番号２７）
【０１４７】
Ｄ．リンカー
リンカーは、抗体フラグメントとコラーゲン様ペプチド領域の間、または結合ドメインとコラーゲン様ペプチド領域の間に任意で配置され得る短いペプチド配列である。ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できる、ＶＨとＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーも含む。いくつかの実施形態では、いずれの場合でも、リンカーは４から１０アミノ酸の間の長さであり、かつ次の配列を有し得る。
【０１４８】
Ａｌａａｌａａｌａｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ（配列番号２８）またはｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ（配列番号２９）
【０１４９】
グリシンリンカー（Ｇ−ｌｉｎｋｅｒ）：（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２４）。最もよく用いられるｓｃＦｖのリンカーは、グリシンおよびセリン残基の１５の組み合わせを含む。
【０１５０】
参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５，９０８，６２６号明細書（特許文献９）発明の名称”Ｈｙｂｒｉｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β  ａｎｄ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｃ  ｊｏｉｎｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｒ（ペプチドリンカーで連結されたインターフェロン−βと免疫グロブリンＦｃを有するハイブリッド）”において見られるＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２５）。
【０１５１】
グリシン−アラニンリンカー：ＧＧＡＧＡＧＡＧ（配列番号３０）
【０１５２】
グリシン−アルギニンリンカー：ＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＧＧＳ（配列番号２６）
【０１５３】
特定の実施形態は、図１に示される三量体としての形式Ａ〜Ｃを含む。形式Ａ:ＦａｂＣＳＡであって、自己三量体化できるコラーゲン様ペプチドのＮ−末端にＦａｂフラグメントを有する三量体抗体フラグメントである。形式Ｂ：ＦａｂＣＳＡ−ｓｃＦｖであって、自己三量体化できるコラーゲン様ペプチドのＮ−およびＣ−末端にそれぞれＦａｂフラグメントおよび一本鎖抗体フラグメントを有する三量体二重特異性抗体フラグメントである。形式Ｃ：ＦａｂＣＳＡ−ｓｄＡｂであって、自己三量体化できるコラーゲン様ペプチドのＮ−およびＣ−末端にそれぞれＦａｂフラグメントおよびシングルドメイン抗体を有する三量体二重特異性抗体フラグメントである。特に、形式Ａ〜Ｃは３つの単量体を含み、各単量体はＦａｂ領域に重鎖および軽鎖を有している。
【０１５４】
以下の具体例は、説明にすぎず、いかなる方式においてもこの開示以外のものを限定はしないと解されるべきである。詳述はしなくとも、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を最大限利用できると考えられる。本明細書に引用されるすべての刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの構築
以下に記載するのは、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの重鎖のポリペプチド配列（配列番号１）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号２）である。ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの重鎖のコーディング領域は、Ｎ−からＣ−末端へ、シグナルペプチド（下線）（配列番号１１）、ハムスター抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）由来の重鎖可変領域（太字）（配列番号１２）、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域（斜字体）（配列番号１６）を含み、そして（ＧＰＰ）１０コラーゲン様ドメイン（二重下線）（配列番号３１）が続くものであった。この合成配列（配列番号２）をオーバーラッピングＰＣＲにより作製した。
【０１５６】
2014124186.tif 000003
【０１５７】
2014124186.tif 000004
【０１５８】
以下に記載するのは、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの軽鎖のポリペプチド配列（配列番号３）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号４）である。ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの軽鎖のコーディング領域は、Ｎ−からＣ−末端へ、シグナルペプチド（下線）（配列番号１１）、ハムスター抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）由来の軽鎖可変領域（太字）（配列番号１３）を含み、そしてヒトＩｇＧ１のカッパ軽鎖定常ドメイン（斜字体）（配列番号１７）が続くものであった。この合成配列（配列番号４）はオーバーラッピングＰＣＲにより作製した。
【０１５９】
2014124186.tif 000005
【０１６０】
2014124186.tif 000006
【０１６１】
次いで、哺乳類細胞における抗体発現のために、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの重鎖および軽鎖挿入物（ｉｎｓｅｒｔｓ）をｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の二重発現（ｄｕａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクター中にクローニングした。以下に記載するのは、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの重鎖のポリペプチド配列（配列番号５）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６）である。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの重鎖のコーディング領域は、Ｎ−からＣ−末端へ、シグナルペプチド（下線）（配列番号１１）、ヒト化ムロモナブ−ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３）の重鎖可変領域（太字)（配列番号１４）、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域（斜字体）（配列番号１６）を含み、そして（ＧＰＰ）１０コラーゲン様ドメイン（二重下線）（配列番号３１）が続くものであった。この合成配列（配列番号６）はオーバーラッピングＰＣＲにより作製した。
【０１６２】
2014124186.tif 000007
【０１６３】
2014124186.tif 000008
【０１６４】
以下に記載するのは、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの軽鎖のポリペプチド配列（配列番号７）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号８）である。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの軽鎖のコーディング領域は、Ｎ−からＣ−末端へ、シグナルペプチド（下線）（配列番号１１）、ヒト化ムロモナブ−ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３）の軽鎖可変領域（太字）（配列番号１５）を含み、そしてヒトＩｇＧ１のカッパ軽鎖定常ドメイン（斜字体）（配列番号１７）が続くものであった。この合成配列（配列番号８）はオーバーラッピングＰＣＲにより作製した。
【０１６５】
2014124186.tif 000009
【０１６６】
2014124186.tif 000010
【０１６７】
続いて、哺乳類細胞における抗体発現のため、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの上記重鎖および軽鎖挿入物をｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の二重発現（ｄｕａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクター中にクローニングした。以下に記載するのは、７６３一本鎖Ｆｖ、７６３ｓｃＦｖのポリペプチド配列（配列番号９）およびそれをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１０）である。７６３ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨをコードするｃＤＮＡを、公開されたヌクレオチド配列（米国特許第６，２３５，８８３号明細書）に基づき、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標)、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）の対応するｃＤＮＡからのプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。ＶＬおよびＶＨ鎖と配列番号９中で下線が引かれたグリシンリンカー（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２４）とを連結することによって、７６３のｓｃＦｖ  ＰＣＲ融合を生じさせた。
【０１６８】
抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ二重特異性抗体、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖを次のようにして生成した。７６３ｓｃＦｖをコードするｃＤＮＡ配列を、ＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩ部位におけるｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの重鎖のＣ−末端にインフレームでクローニングして、ｈＯＫＴ３Ｆａｂの重鎖からなる重鎖構築体、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、（ＧＰＰ）１０コラーゲン様ドメイン（配列番号３１）を作り、これに７６３ｓｃＦｖが続いた。次いで、哺乳類細胞における抗体発現のため、上述の重鎖構築体およびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの軽鎖構築体（配列番号８）をｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の二重発現ベクター中にクローニングした。
【０１６９】
2014124186.tif 000011
【０１７０】
2014124186.tif 000012
【０１７１】
テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＧＡ０３１およびｈＯＫＴ３−γ１（Ａｌａ−Ａｌａ）とも称される）に類似する構造特徴を有する低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡを構築すべく、ｈＯＫＴ３の重鎖および軽鎖の可変領域をｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来ヒトＩｇＧ１発現ベクター中にクローニングし、その中で重鎖定常領域のアミノ酸２３４および２３５における野生型ロイシン残基は２つのアラニン残基で置換された。低Ｆｃ結合抗マウスＣＤ３抗体−１４５ＩｇＧ−ＡＡを構築すべく、ハムスター抗マウスＣＤ３抗体（１４５−２Ｃ１１）の重鎖および軽鎖の可変領域をマウスＩｇＧ２ａ発現ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）中にクローニングし、その中で重鎖定常領域のアミノ酸２３４および２３５における野生型ロイシン残基は２つのアラニン残基で置換された。パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標)）に類似する構造特徴を有する抗ヒトＥＧＦＲ抗体−７６３ＩｇＧを構築すべく、パニツムマブの重鎖および軽鎖の可変領域をｐＳｅｃＴａｇ２／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来ヒトＩｇＧ２発現ベクター中にクローニングした。
【０１７２】
実施例２
ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ、１４５ＩｇＧ−ＡＡ、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ、７６３ＩｇＧおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの発現および精製
ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ、１４５ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡの発現構築体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を用いて、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）のメーカーの使用説明書にしたがってマウス骨髄腫ＮＳ０細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）にトランスフェクトした。ハイグロマイシＢ（４００μｇ／ｍｌ）による選択の後、安定なクローンを振とうフラスコ内で、初期播種密度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、化学的組成の明らかな培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）であるＨｙＱＣＤＭ４ＮＳ０（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で培養した。その培養物を５日間３７℃で１３０ｒｐｍに維持した。Ａｍａｘ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイス（Ａｍａｘａ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）を使用し、メーカーの使用説明書にしたがって、エレクトロポレーションにより、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ、および７６３ＩｇＧの発現構築体を用いてＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にそれぞれトランスフェクトした。ハイグロマイシンＢ（４００μｇ／ｍｌ）による選択の後、安定なクローンを振とうフラスコ内で、初期播種密度３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、化学的組成の明らかな培地であるＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で培養した。その培養物を１２日間３７℃で１３０ｒｐｍに維持した。グルコース溶液３０ｍｇ／ｍｌの添加によりグルコースを２ｍｇ／Ｌにコントロールした。
【０１７３】
ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖを精製すべく、ろ過した培地各々約１Ｌを、流速６０ｍｌ／ｈで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（０．０１Ｍのリン酸バッファー、０．００２７ＭのＫＣｌ、０．１４ＭのＮａＣｌ）で平衡化したＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ベッドボリュームで５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。同じバッファーで洗浄した後、それら組み換え抗体をリン酸ナトリウムバッファー５０ｍＭ、ｐＨ２．５で溶出した。ＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターし、ピーク画分を集め、重炭酸ナトリウム１．０Ｍで中和してｐＨ７．５にした。次いで、中和されたサンプルを、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０膜を備えるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用い限外ろ過により濃縮した。５ミリリットルの濃縮液を、線流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。
【０１７４】
ｈ１４５ＩｇＧ−ＡＡ、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ、および７６３  ＩｇＧを精製すべく、ろ過した培地各々約１Ｌを、流速６０ｍｌ／ｈで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（０．０１Ｍのリン酸バッファー、０．００２７ＭのＫＣｌ、０．１４ＭのＮａＣｌ）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（ベッドボリュームで５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。同じバッファーで洗浄した後、それら組み換え抗体をリン酸ナトリウムバッファー５０ｍＭ、ｐＨ２．５で溶出した。ＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターし、ピーク画分を集め、重炭酸ナトリウム１．０Ｍで中和してｐＨ７．５にした。中和されたサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して透析した。
【０１７５】
ＭＥＳをランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とし４〜１２％いずれかのＮｕＰＡＧＥビス−トリスポリアクリルアミドゲルを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）でタンパク質を染色した。Ｂｅｎｃｈ  Ｍａｒｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を分子量スタンダードとして用いた。
【０１７６】
結果：ｈ１４５ＦａｂＣＳＡのクロマトグラフィーおよび構造的特性評価
図２は、本発明の実施形態に基づいた、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでの連続クロマトグラフィーによって培地から精製したｈ１４５ＦａｂＣＳＡ分子の構造的特性評価を示している。（Ａ）ゲルろ過によるｈ１４５ＦａｂＣＳＡ種の分離。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムから溶出したサンプルを濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラムにロードした。（Ｂ）それぞれ異なるピーク画分（Ａ中、ピーク１から３に番号が付されている）およびサンプル負荷を、非還元(レーン２、４、６、および８）、ならびにサンプルをＤＴＴ５０ｍＭで７５℃１０分処理した還元（レーン３、５、７、および９）条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。（Ｃ）Ｂに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された種に対応する構造の略図。
【０１７７】
これら結果は、本発明のコラーゲン様ペプチドが抗マウスＣＤ３Ｆｄフラグメントを三量体化させる能力を持ち、かつ完全Ｆａｂフラグメントが真核細胞内で会合し、安定な三量体として分泌され得ることを証明した。
【０１７８】
結果：ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡのクロマトグラフィーおよび構造的特性評価
図３は、本発明の実施形態に基づいた、Ｓｕｐｅｒｄｅｘクロマトグラフィーにより単離したｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ分子の構造的特性評価を示している。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラムから溶出したサンプルを濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲルろ過カラムにロードした。上方右側のパネル：非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより異なるピーク画分（ピーク１から３に番号が付されている）を分析した。ピーク２はｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体を含有する主画分であり、一方ピーク３の画分は単量体を含有している。ピーク１に示される主要な上方のバンドは、三量体の鎖間ジスルフィド結合された二量体であると思われる。
【０１７９】
この場合も同様に、これら結果は、本発明のコラーゲン様ペプチドが抗ヒトＣＤ３Ｆｄフラグメントを三量体化させる能力を持ち、かつ完全Ｆａｂフラグメントが真核細胞内で会合し、安定な三量体として分泌され得ることを証明した。
【０１８０】
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ、およびＯＫＴ３の純度分析
図４は、非還元（レーン２、３および４）、ならびにサンプルをＤＴＴ５０ｍＭで７５℃１０分処理した還元（レーン５、６および７）条件下での、図３におけるピーク２画分からのｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ、低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ、およびＯＫＴ３抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度分析を示している。等量のタンパク質を含む全てのサンプルを、ランニングバッファーとしてＭＥＳを用い４〜１２％ＳＤＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ液でゲルを染色した。Ｍ，ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）分子量スタンダード。
【０１８１】
非還元条件下、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの主要バンドがジスルフィド結合したＦａｂ三量体として現れ（レーン２）、一方、変性条件下で非ジスルフィド結合Ｆｄ−Ｃｓおよび軽鎖が分離されていた（レーン５）。ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびＯＫＴ３抗体は、通常のＩｇＧ１の形式となっており、２つの重鎖および２つの軽鎖を含んでいる（非還元条件下のレーン３および４、還元条件下のレーン６および７）。
【０１８２】
実施例３
ＣＤ３結合活性の決定
ネガティブセレクション用のＰａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＣＡ）により、メーカーの使用説明書にしたがってＰＢＭＣからヒトＴ細胞（１×１０６／ｍｌ)を単離した。それら細胞をＦｃブロッカー（２μｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ）により４℃で３０分処理してから、精製した低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体および単量体の段階希釈液と共に４℃で３０分培養した。洗浄後、それら細胞をヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４℃で３０分間染色し、フローサイトメトリーにより抗体のＴ細胞への結合を検出し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した。図５に示されるように、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ(計算されたＫＤ＝０．０２ｎＭ)は、二価の対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ-ＡＡ（計算されたＫＤ＝０．１５ｎＭ）よりも７．５倍大きいヒトＴリンパ球への結合強度を示した。一価形態のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡは、弱く、有意でないＣＤ３＋ヒトＴ細胞への結合親和力を示した。
【０１８３】
１４５−２Ｃ１１ハムスターＩｇＧと比較した、精製したｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体のマウス脾臓Ｔリンパ球への結合親和力を決定するのにも、この実験を行った（図６）。この場合も同様に、三量体１４５ＦａｂＣＳＡ（計算されたＫＤ＝４ｎＭ）は、親（ｐａｒｅｎｔａｌ）ハムスターＩｇＧ、１４５−２Ｃ１１（計算されたＫＤ＝１５ｎＭ）より３．７５倍大きいマウスＴリンパ球への結合強度を示した。
【０１８４】
実施例４
競合置換結合（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ）アッセイ
ＯＫＴ３およびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡはＣＤ３ε鎖上の同じエピトープを認識するため、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡはＯＫＴ３のＴ細胞への結合を競合的に阻害することができる。ヒトＴ細胞の細胞表面におけるＣＤ３分子への結合についてのｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡおよびＯＫＴ３の活性を、飽和濃度のフルオレセインコンジュゲートＯＫＴ３をコンペティターとして、抗体置換アッセイを用いフローサイトメトリー分析により比較した。下記の手順は全て４℃で行った。ＣＤ３（＋）ジャーカットＴ細胞、クローンＥ６−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２）を、細胞の総数１×１０６で、０．１ｍｌの染色バッファー（２％ウシ胎仔血清および０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）中に懸濁させた。それら細胞をｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡまたはＯＫＴ３  ＩｇＧの段階希釈液と共に１時間培養した。固定された、飽和量（０．２５μｇ／ｍｌ、フローサイトメトリーにより決定）のＦＩＴＣコンジュゲートＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を直接添加した。１時間の培養後、それら細胞を染色バッファーで洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）システムでフローサイトメトリーを行うことにより免疫蛍光を分析した。そのデータは最大蛍光強度の阻害率（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）として示され、それはブロッキングｍＡｂの非存在下Ｔ細胞をＯＫＴ３−ＦＩＴＣで染色することにより得られた平均蛍光強度として定義されるものである。最大蛍光強度の半分（ＩＣ５０）を阻害するのに要される各ｍＡｂの濃度を計算した。
【０１８５】
ＩＣ５０値の比較によって、ジャーカットＴ細胞を用い同じ阻害効果を達成するのに、ＯＫＴ３はｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡよりおよそ２倍高い濃度を必要とすることが示された（図７、２つの独立した実験が示されている）。これらの結果は、アビディティー効果のために、ヒト化三価ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡが、その親マウスＩｇＧ形（ｐａｒｅｎｔａｌ  ｍｕｒｉｎｅ  ＩｇＧ  ｆｏｒｍ）、ＯＫＴ３よりも結合強度が強いことを示した。
【０１８６】
実施例５
Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞活性化におけるＯＫＴ３、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡを比較する試験を、細胞増殖アッセイにより行った。３人の健常なドナーから採取したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｌ中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで黒色９６ウェル平底組織培養プレートにＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの１０倍段階希釈液の存在下播種し、３７℃で６６時間置いた。続いて、細胞をさらに６時間ＢｒｄＵ１０μＭでパルスした。培地を除去した後、細胞を固定し、ＤＮＡをＦｉｘＤｅｎａｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を用い１ステップで変性させた。その後、細胞をペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体（抗ＢｒｄＵ  ＰＯＤ、Ｆａｂフラグメント）と共に１．５時間、室温で培養した。マイクロプレートルミノメーター（Ｈｉｄｅｘ，ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて化学発光検出および定量化を行った。図８に示される各ポイントは３人のドナーの平均±標準偏差を表している。
【０１８７】
図８における結果は、ＯＫＴ３が、非常に低い濃度のときでさえ、Ｔ細胞増殖を有意に誘導したことを示した。低Ｆｃ結合ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡもまた、誘導作用が弱いものであるが、比較的高い抗体濃度でＴ細胞増殖を誘導した。これらの結果は、Ｌｉらによって先に出版された著作物（Ｌｉ，Ｊ．，Ｊ．Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）．”Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａ  ｎｏｎ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６（６）：８８０−８９１．（非特許文献４９））と一致している。一方、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡにより誘導された検出可能なＴ細胞増殖はなかった。よって、非ＦｃのｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体は、異なる抗ＣＤ３抗体形式の中で最も弱いＴ細胞増殖の誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）である。
【０１８８】
実施例６
サイトカイン測定
３人の健常なドナー由来のヒトＰＢＭＣを、ＯＫＴ３、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの１０倍段階希釈液の存在下、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地０．１ｍｌ中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで３７℃で播種した。培養上清中のＩＬ−２および残りのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γ）のレベルを、ヒトサイトカイン免疫測定キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を用い、２４および７２時間の時点でそれぞれ測定した。
【０１８９】
マウスＯＫＴ３の細胞分裂活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、ＦｃＲ−ポジティブ細胞への結合を介した広範囲のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）−ＣＤ３の架橋結合によって生じる。よって近年、Ｆｃ受容体への結合を変えることにより抗ＣＤ３の細胞分裂を促進しない形態（ｎｏｎ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｆｏｒｍｓ）を開発する試みがなされている。ＯＫＴ３、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡおよび三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡのサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γ）を誘導する能力を測定した。予期したように、ＯＫＴ３  ＩｇＧは非常に少ない用量でサイトカイン産生を著しく誘導した。テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）（ＭＧＡ０３１およびｈＯＫＴ３−γ1（Ａｌａ−Ａｌａ）とも称される）に類似する構造特徴を有する低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡもまた、作用は弱いものの、比較的高い抗体濃度でサイトカイン産生を誘導した。これらの結果は、Ｌｉによって先に出版された著作物（Ｌｉ，Ｊ．，Ｊ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）（非特許文献４９））と一致している。一方、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡは、１００μｇ／ｍｌまでの濃度において検出可能なＩＬ−２およびＩＦＮ−γを誘導しない。ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡと比べ、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの１０μｇ／ｍｌ以上の濃度におけるＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の誘導レベルはより低かった。これら結果は、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡが、異なる抗ＣＤ３抗体形式の中で最も弱い細胞分裂促進であることを示した（図９）。
【０１９０】
実施例７
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
一方向混合リンパ球反応における免疫抑制を次のように評価した。ヒトＰＢＭＣを２人の健康ドナーから得た（スティミュレーターおよびレスポンダー）。スティミュレーターまたはレスポンダー細胞を完全培地（１０％ヒトＡＢ血清、２ｍＭグルタミン、５０ｎＭ２−メルカプトエタノール、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン各１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌが添加されたＲＰＭＩ  １６４０）中にてマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５μｇ／ｍｌで、５％ＣＯ２を含有する加湿空気中において３０分３７℃で処理し、続いてＲＰＭＩ  １６４０培地中で３回洗浄した。レスポンダー細胞を単独で、またはマイトマイシンＣで処理したスティミュレーターもしくはマイトマイシンＣレスポンダー細胞と１：１の割合で混合し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで完全培地２００μｌ中で培養した。レスポンダー細胞の播種後速やかに、精製したｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ、またはＯＫＴ３を異なる濃度で培養物に加えた。５日後、培養細胞をＢｒｄＵ１０μＭでパルスし、２４時間後に回収した。５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）細胞増殖アッセイを行った。培地を除去した後、細胞を固定し、ＦｉｘＤｅｎａｔを用い１ステップでＤＮＡを変性させた。その後、細胞をペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体（抗ＢｒｄＵ  ＰＯＤ、Ｆａｂフラグメント）と共に１．５時間室温で培養した。マイクロプレートルミノメーター（Ｈｉｄｅｘ，ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて化学発光検出および定量化を行った。
【０１９１】
三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡが、ＣＤ３（＋）Ｔ細胞に対する結合アビディティーの増大により、親（ｐａｒｅｎｔａｌ）ＯＫＴ抗体および低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡを上回る免疫抑制活性を示し得るか否かを判定するため、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞分裂活性化について抗体の試験を行った。抗体処理をせずに５日間培養した混合ＰＢＭＣ培養物（マイトマイシンＣで処理したスティミュレーター＋レスポンダー）中で、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）がＴ細胞活性化の同種刺激の結果として生じた（図１０、黒四角）。混合ＰＢＭＣ培養物をＯＫＴで処理すると、０．１から１．０ｎｇ／ｍｌの低い濃度レベルでＴ細胞増殖が刺激された（図１０、黒丸）。抗体濃度が１０ｎｇ／ｍｌより高くなると、ＯＫＴ３の免疫抑制は有意となる。低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡは有意なＴ細胞活性化の抑制を示さなかった（図１０、白四角）。これとは対照的に、ＭＬＲにおけるｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ三量体の作用（ｐｏｔｅｎｃｙ）は有意なものであり、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度でバックグラウンドレベルに達した（図１０、白三角）。これらの結果は、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡがインビトロで分裂促進性の低下を示すと同時に、Ｔ細胞増殖の強力な免疫抑制剤であることを示した。
【０１９２】
実施例８
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）調節
健康ドナー由来のＰＢＭＣを２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中に播種し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中で様々な量のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（三量体）、ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡ（二量体）、およびｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ（単量体）と共に培養した。２４時間培養した後、細胞を回収し、ＦＩＴＣコンジュゲートＯＫＴ３または抗ＴＣＲα／β  ｍＡｂ  ＩＰ２６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。染色した細胞を、Ｔ細胞に対し、フィコエリトリンコンジュゲート抗ＣＤ５  ｍＡｂ  ＵＣＨＴ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で対比染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ３調節およびコーティングの計算を先に記載されたように行った（Ｃｏｌｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｃ．Ａｎａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）．”Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｒｅ  ｎｏｎ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９（７）：３６１３−３６２１．（非特許文献５０））。
【０１９３】
【数１】
2014124186.tif 000013
ここで、Ｆは染色した細胞の平均蛍光を表す。
【０１９４】
図１１において、三価ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡにより達成されるＴＣＲ−ＣＤ３複合体の調節およびコーティングの組み合わせは、０．１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの抗体濃度において、低Ｆｃ結合抗ヒトＣＤ３抗体−ｈＯＫＴ３ＩｇＧ−ＡＡよりも大きい。ＴＣＲに対する低い架橋活性のために、一価ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡは、対応する各濃度において、はるかに低いＴＣＲコーティングおよび調節を示した。これら結果は、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡの結合強度の改善がＴＣＲ調節の程度の向上をもたらすことを証明した。
【０１９５】
実施例９
薬物動態アッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙｓ）
ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ血中クリアランスを評価するため、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス１５匹（無作為に５つのグループに分けた)に、単回投与量レベル（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｌｅｖｅｌ）２５μｇ／マウス、投与容積（ｄｏｓｅ  ｖｏｌｕｍｅ）０．１ｍｌ／マウスで、精製したｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体を静脈内投与した。０、２、５、１５、３０分、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、および９６時間の時点で順次マウスから血液（１００μｌ／マウス）を採取し、ＥＤＴＡでコートしたチューブへ移した。ＥＬＩＳＡを用い、各時点の血漿サンプル中の残存ｈ１４５ＦａｂＣＳＡを、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ標準物質の段階希釈の標準曲線への内挿によって定量化した。抗ヒトＦｄおよび西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトカッパ軽鎖をそれぞれ捕捉および検出抗体として用いた。３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジンをペルオキシダーゼ基質として用いた。マウスにおけるｈ１４５ＦａｂＣＳＡの薬学動態プロファイルが図１２に示されている。
【０１９６】
非コンパートメントモデルの動態（Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を決定した。血漿中の免疫反応性濃度は二相性を示して低下し、最終消失相半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）（ｔ１／２）は８．８５時間であった。
【０１９７】
実施例１０
生体内分布
精製したｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体をヨード−１３１で放射性標識し、雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス３０匹における１３１Ｉ−ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの生体内分布を評価した。５匹のマウスのグループにｈ１４５ＦａｂＣＳＡを静脈内投与した（比放射能：１．２μＣｉ／μｇ；３０μＣｉ／マウス）。ｈ１４５ＦａｂＣＳＡの分析の時点は、０．５、１、２、６、２４、および４８時間とした。これら選択された時点に安楽死させ、組織のグラム当たりの注入用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）を決定した。１３１Ｉ−ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体は４８時間までに急速な血中クリアランスを示し、大部分が除去された（表１）。しかしながら、１３１Ｉ−ｈ１４５ＦａｂＣＳＡは脾臓内局在を示し、０．５時間で３３．７６±１．５６％ＩＤ／ｇ、２４時間で最大の４２．０９±１．６４％ＩＤ／ｇに達した。
【０１９８】
【表２】
2014124186.tif 000014
【０１９９】
実施例１１
実験的自己免疫性脳脊髄炎マウス疾患モデル
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、広く用いられている多発性硬化症のマウスモデルである。この試験では、まひの調節に対するｈ１４５ＦａｂＣＳＡの治療効果を調べるために、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）誘導マウスＥＡＥを用いた。６から８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｗａｎ）に、ヒト型結核菌Ｈ３７ＲＡ  ５００μｇを含有する完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）内のエマルジョン２００μＬ中のＭＯＧ（３５−５５）２００μｇを皮下免疫した。免疫した直後に、百日咳毒素５００ｎｇをマウスに腹腔内投与し、４８時間後に再度投与した。次の基準を用いて臨床ＥＡＥスコアを評価した。０＝無症状、０．５＝遠位部の虚弱（ｄｉｓｔａｌ  ｗｅａｋ）または尾の痙攣（ｓｐａｓｔｉｃ  ｔａｉｌ）、１＝尾の完全な下垂（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｌｉｍｐ  ｔａｉｌ）、１．５＝尾の下垂および後肢虚弱（ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｗｅａｋｎｅｓｓ）(ケージの格子から足が滑り出る)、２．０＝片側の部分的な後肢まひ（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｐａｒｔｉａｌ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ）、２．５＝両側の部分的な後肢まひ（ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｐａｒｔｉａｌ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ）、３．０＝完全な両側の後肢まひ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｌａｔｅｒａｌ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ）、３．５＝完全な後肢および片側の部分的な前肢まひ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ａｎｄ  ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｐａｒｔｉａｌ  ｆｏｒｅｌｉｍｂ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ）、４．０＝瀕死状態（ｍｏｒｉｂｕｎｄ）ならびに５＝死亡。全部で４０匹のマウスを、マウス１０匹ずつ４つのグループ（溶媒：ハムスターＩｇＧアイソタイプ対照、治療：１４５−２Ｃ１１ＩｇＧおよびｈ１４５ＦａｂＣＳＡ（三量体）、ならびに陽性対照：インターフェロン−β１ａ）のそれぞれに割り当てた。治療はＥＡＥの最初の臨床兆候が発症した時に開始し、まひの調節に対する異なる被験物質の効果を試験した。溶媒、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧおよびｈ１４５ＦａｂＣＳＡのグループでは、連続５日間１日１回、それぞれ投与量レベル１．０、０．１および１．０μｇ／マウスでマウスに静脈注射した。インターフェロン−β１ａのグループでは、全治療期間にわたり１日１回、投与量レベル１０，０００ユニット／マウスでマウスに腹腔内注射をした。
【０２００】
初めに、０．２μｇ／マウスをこえる投与量レベルで１４５−２Ｃ−１１  ＩｇＧ治療したＥＡＥマウスは、治療後１日で死亡率が５０％になった。巨視的解剖観察（Ｇｒｏｓｓ  ｎｅｃｒｏｐｓｙ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）によって、全ての死亡マウスに、深刻な無制御の全身炎症反応（ｍａｊｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）またはサイトカインストームを示す、脾腫があったことがわかった。よって、１４５−２Ｃ−１１グループの実験投与量レベルを１マウス当たり０．１μｇに減らした。三量体１４５ＦａｂＣＳＡのグループでは、投与量レベル１．０μｇ／マウスで治療を行った。これらの結果は、三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡが、免疫付与の全ての段階で比較的低いレベルのまひを生じさせることを示した（図１３Ａ参照）。詳細に言うと、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡで治療したマウスは、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧで治療したマウスまたは対照治療グループに比してより程度の低いまひを示し、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療グループと１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧ治療グループの間で統計的により低いまひを示した。最終的に、未治療グループが完全な両側の後肢まひと同程度に重症な症状を示したのに対し、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療グループにより示された最高レベルのまひは片側の後肢まひ（つまり臨床基準２）よりも重くないものであった。
【０２０１】
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の誘導は、自己免疫疾患の免疫療法における主要な目的の１つである。経口投与されるＣＤ３特異抗体についての過去の研究は、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＡＰ＋Ｔｒｅｇ細胞が誘導されたことを証明している（Ｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）“Ｏｒａｌ  ＣＤ３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＬＡＰ＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２（６）：６２７−６３５（非特許文献５１））。ｈ１４５−２Ｃ−１１  ＩｇＧおよび三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療後のＥＡＥマウスにおけるＴｒｅｇ集団の比較を行った。最後の静脈注射の１日後、溶媒（ハムスター対照ＩｇＧ）、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧおよび三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡグループの各々から３匹のマウスの脾臓リンパ細胞を個別に準備し、次いでフローサイトメトリーのためにＬＡＰ−ＡＰＣおよびＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。脾細胞を、フローサイトメトリーのためにＬＡＰ−ＡＰＣおよびＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。Ｔｒｅｇ集団の決定は、ＬＡＰ＋細胞にゲートをかけた。
【０２０２】
これら結果は、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療後、ＣＤ４＋ＬＡＰ＋Ｔ細胞集団が、アイソタイプＩｇＧ対照および１４５−２Ｃ−１１グループと比べて増加したことを示した（図１３Ｂ参照）。特に、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療グループでは、ＣＤ８＋ＬＡＰ＋Ｔ細胞を示し得る、ＣＤ４−ＬＡＰ＋Ｔ細胞集団も増加した。
【０２０３】
実施例１２
マウスモデルにおける全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)
自然発症紅斑性狼瘡（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｌｕｐｕｓ）に罹患したＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスに対する１４５−２Ｃ１１ＩｇＧおよびｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体の抗ＣＤ３抗体の治療効果を調べた。自然紅斑性狼瘡（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｌｕｐｕｓ）を発症した約６週齢の雌性ＮＺＢ／Ｗ  Ｆ１マウスを、１２週間にわたって隔週ごと５日間６コース、静脈注射により５μｇのアイソタイプＩｇＧ対照、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧまたはｈ１４５ＦａｂＣＳＡ（三量体）で治療した。図１４Ａに示されるように、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡで治療したマウスはアイソタイプＩｇＧ対照で治療したマウスよりも長期間生存し、１４５−２Ｃ１１およびアイソタイプＩｇＧ対照に比べ、三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡがＳＬＥマウスモデルの治療においてより効果的であることが示された。
【０２０４】
実施例１３
二本鎖（ｄｓＤＮＡ）に対するマウス血清抗体の測定
紅斑性狼瘡が活動性のときは、大量の血清抗ｄｓＤＮＡ抗体が存在する。よって、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体試験によって、ＳＬＥマウスモデルにおける疾患の進行を測定した。抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の検出のために、上述した治療グループからのマウス血清のＥＬＩＳＡを次のように測定した。９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレートにウシ血清由来メチル化ウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）５０μｌ（蒸留水中で５０μｇ／ｍｌ）を塗布し、３７℃で１時間培養した。次いで、ｄｓＤＮＡ５０μｌ（１０μg／ｍｌ）をＰＢＳ中に加える前に、リン酸緩衝生理食塩水で各ウェルを３回洗浄した。ｄｓＤＮＡは、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）１Ｕ／ｍｇでウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を３０分３７℃で処理することによりを準備した。４℃で一晩培養した後、プレートをＰＢＳで４回洗浄した。そして非特異的結合が生じないようこれらを２％ＢＳＡ１００μｌ（Ｓｉｇｍａ）の入ったＰＢＳで処理し、１時間３７℃で培養してから、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ(ＰＢＳ−Ｔ)（Ｓｉｇｍａ）で５回洗浄した。試験血清サンプルをＰＢＳ−Ｔで８００倍希釈し、５０μlのアリコートをウェルに２連で（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）加えた。１時間３７℃で培養した後、プレートをＰＢＳ−Ｔで６回洗浄した。全ＩｇＧ抗体の検出のため、５０００倍希釈したＨＲＰコンジュゲートラット抗マウス抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｃｅｓ）５０μｌ／ウェルを加え、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳ−Ｔで７回洗浄した後、テトラメチルベンゼン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が１ｍｇ／ｍｌで入ったクエン酸リン酸緩衝液１００μｌ／ウェルで反応を起こし、１Ｎ  ＨＣｌ  ５０μｌ／ウェルを加えることにより停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーにより４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０２０５】
図１４Ｂに示されるように、ｈ１４５ＦａｂＣＳＡ治療マウスにおける抗ｄｓＤＮＡ自己抗体のレベルは、対照のアイソタイプＩｇＧグループにおけるそれに比べて有意に低く、１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧで治療した動物の大部分に比べても低いようであった。これらの結果は、三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡがＳＬＥマウスモデルの治療において有効であり、治療の時間的経過を通して疾患の進行はなかったことを示した。
【０２０６】
実施例１４
インビボでの前炎症性サイトカイン分析
すでに抗マウスＣＤ３抗体、１４５−２Ｃ１１の投与は、Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ１７Ａを含む特定のサイトカインの誘導と関連付けられている。単回用量５０μｇの異なる抗ＣＤ３抗体の静脈注射後におけるマウスの血清前炎症性サイトカインレベルについての経時的試験（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ｓｔｕｄｙ）を行って、非Ｆｃのｈ１４５ＦａｂＣＳＡ(三量体)が非細胞分裂促進性（ｎｏｎ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を伴う治療効果に有用かを評価した。マウスをグループ分けし、５０μｇの精製した１４５−２Ｃ１１  ＩｇＧ（淡い灰色の四角）、低Ｆｃ結合抗マウスＣＤ３抗体−１４５ＩｇＧ−ＡＡ（濃い灰色の四角）、またはｈ１４５ＦａｂＣＳＡ三量体（白四角）を静脈内投与した。血液（１００μｌ／マウス）を０（プレブリード）、０．５、２４、および１４４時間の時点で採取した。ＥＬＩＳＡを使ってサイトカインのレベルを測定した。各ポイントは、３種のウェルの平均±標準偏差を表している。ＰＢＳ（黒四角）を対照として用いた。
【０２０７】
結果が図１５に示されている。予期どおりに、１４５−２Ｃ１１グループにおいて最も多くのサイトカインが有意に産生された。低Ｆｃ結合の１４５ＩｇＧ−ＡＡは、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の中程度の一時的な誘導をもたらす。非Ｆｃのｈ１４５ＦａｂＣＳＡ（三量体）の投与は、無視できるレベルのサイトカイン誘導を示した。これらの結果は、最初の注射の後に三量体ｈ１４５ＦａｂＣＳＡはインビボでサイトカイン産生を誘導しないということを示した。
【０２０８】
実施例１５
三価二重特異性抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖのクロマトグラフィーおよび構造特性評価
本発明の多価抗体フラグメントは、どちらか一方の末端におけるコラーゲンスキャホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）による２つの異なる抗体フラグメントの融合によって二重特異性抗体を作るのに特に適している。三価二重特異性抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖは、ＣＤ３およびＥＧＦＲの両方を標的とするものであり、そのようなモダリティ（ｍｏｄａｌｉｔｙ）の使用を実証するために創出された。図１６は、非単一（Ａ）または単一安定クローン（Ｂ）由来のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ分子の構造的特性評価を示している。各培地をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでの連続クロマトグラフィーによって精製した。（Ａ）ゲルろ過による非単一クローン由来のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ種の分離。上方右側のパネル：それぞれ異なるピーク画分（ピーク１から３に番号を付してある）を、非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ジスルフィド結合三量体（Ｔ）、非ジスルフィド結合三量体（Ｍｔ）、および単量体（Ｍｍ）の構造が示されている。（Ｂ）ゲルろ過による安定クローン由来のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ種の分離。ピーク画分を非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ジスルフィド結合三量体（Ｔ）および非ジスルフィド結合三量体（Ｍｔ）の構造が示されている。
【０２０９】
これら結果により、真核細胞の発現系において、本発明のコラーゲン様ペプチドがＮ−末端のＦｄフラグメントおよびＣ−末端のｓｃＦｖフラグメントを同時に三量体化する能力を持つことが実証された。さらに、軽鎖は三量体化されたポリペプチド鎖のＦｄ部分と会合し、図１Ｂに示される構造形式を有する完全Ｆａｂ三量体を形成することができる。
【０２１０】
実施例１６
ＥＧＦＲ（＋）およびＣＤ３（＋）細胞に対する三量体二重特異性抗体−ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの結合特異性
各抗原へのｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの結合をフローサイトメトリーで確認した。Ａ４３１、ＷｉＤｒ、およびＨＣＴ１１６細胞（ＥＧＦＲポジティブ）およびジャーカットＴ細胞（ＣＤ３ポジティブ、図１７）で強い反応度が観察された。
【０２１１】
実施例１７
細胞傷害性アッセイ
蛍光ベースＥｕ  ＴＤＡ非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用い、刺激ヒトＰＢＭＣをエフェクターとして、異なるＥＧＦＲを持つ（ＥＧＦＲ−ｂｅａｒｉｎｇ）腫瘍細胞株に対する三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの細胞毒性を比較した。１人の健康ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ（または０．２ｎｇ／ｍｌ）のＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中、ＯＫＴ３を塗布した（２μｇ／ｍｌ）プレート中の増殖細胞により７２時間刺激した。約１×１０６の標的細胞を、メーカーの使用説明書にしたがってＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ  Ｒｅａｇｅｎｔで標識した。細胞をＰＢＳで３回洗浄してから、完全培地（ＣＭ）中に濃度５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＥｕ３＋標識標的細胞を再懸濁させた。標的細胞のアリコート１００μｌ（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を９６ウェルＶ底滅菌マイクロタイタープレートのウェルに加えた。等容量のエフェクターＰＢＭＣを各ウェルに加え、それぞれＡ４３１細胞については５０：１から２．５：１、ＷｉＤｒおよびＨＣＴ１１６細胞については一定の１０：１のエフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）比とした。マイクロプレートを５％ＣＯ２の加湿フード内で２時間３７℃で培養した。全てのアッセイは３連で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行った。培養後、プレートを再度遠心分離機にかけ、放出されたＥｕ３＋の測定のために上清を回収した。放出されたＥｕ３＋を検出すべく、上清の２０μｌアリコートを平底９６ウェルマイクロプレートのウェルに移し、増強試薬（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の２００μｌアリコートを各ウェルに加えた。
【０２１２】
回転式振とう機で室温にて１５分混合した後、時間分解蛍光計（Ｈｉｄｅｘ，ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で蛍光を測定した。特異的細胞傷害性のパーセンテージを（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として算出した。自然放出は、エフェクター細胞の代わりにＣＭ１００μｌで標的細胞を培養することによって決定し、最大放出は溶解バッファー（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）１００μｌで標的を培養することによって決定した。
【０２１３】
三量体二重特異性ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの、Ａ４３１、ＷｉＤｒおよびＨＣＴ１１６細胞株を含む異なるＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の溶解を促す能力を、ヒトＰＢＭＣによって評価した。図１８は、Ｅ／Ｔ比の異なるＡ４３１細胞（Ａ）、および一定のＥ／Ｔ比１０：１のＷｉＤｒまたはＨＣＴ１１６細胞（Ｂ）に対する、各種濃度の三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの特異的細胞傷害性を示している。刺激ヒトＰＭＢＣの存在下におけるＥＧＦＲ過剰発現Ａ４３１腫瘍細胞の溶解が、用量およびＥ／Ｔ比依存的に三量体二重特異性ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖにより特異的に惹起された（図１８Ａ）。この結果、ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの濃度レベル０．０５μｇ／ｍｌ、Ｅ／Ｔ比２０：１で特異的細胞傷害性が最大〜８０％となった（黒四角）。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの非存在下では、刺激ヒトＰＭＢＣは単独でＡ４３１細胞を有効に殺傷することはできなかった。一定のＥ／Ｔ比１０：１で三量体ＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖと共にＷｉＤｒまたはＨＣＴ１１６細胞株のどちらかを培養することによっても、同様の結果が得られた（図１８Ｂ）。これらの結果は、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖがヒトＰＢＭＣ（恐らくは細胞傷害性Ｔ細胞）によるＥＧＦＲを持つ腫瘍細胞の溶解を有効に誘導し得ることを実証した。
【０２１４】
実施例１８
経時的顕微鏡検査
図１９における経時的顕微鏡写真は、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖによる腫瘍細胞溶解へのヒト細胞傷害性Ｔリンパ球の再誘導（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）をさらに実証している。三価ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖは、ＣＤおよび標的抗原−ＥＧＦＲをそれぞれ同時に結合させることにより、Ｔ細胞と腫瘍細胞を一時的に結合させることができる。このことはＴ細胞活性化を惹起し、続いて架橋された腫瘍細胞への攻撃が起こる。攻撃された腫瘍細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を起こす。遊離Ｔ細胞は新たに別の腫瘍細胞に向かい、別のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖと架橋することによって殺傷することができる。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの非存在下では、ヒトＴリンパ球は腫瘍細胞Ａ４３１の増殖に影響しなかった。図１９下図において、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの存在下、ヒトＴリンパ球とＡ４３１細胞とは架橋していた。Ｔリンパ球は活性化され、腫瘍細胞を攻撃し始めた。１３時間の培養時間において、腫瘍細胞の大部分がアポトーシス経路で溶解に至った。ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの非存在下では、２４時間の共培養時間の後でも、Ａ４３１細胞とＴリンパ球との間に架橋は観察されなかった（図１９上図）。
【０２１５】
実施例１９
腫瘍異種移植マウスモデル
抗腫瘍活性を評価するためのインビボ試験を、８から１０週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＪＮａｒｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｗａｎ）で行った。０日目に１人の健康ドナー由来の非刺激ヒトＰＢＭＣ（エフェクター）をＨＴＣ１１６腫瘍細胞（ターゲット）と予め混合し、次いで混合した細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。１：１と低い細胞の（エフェクター対ターゲット）比を用いた。表示されている用量のｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖまたはＰＢＳ溶媒対照を、１日目から開始し１０日間連続で１日１回尾静脈注射により投与した。腫瘍の進行を外部キャリパー測定器によって週に２回測定し、腫瘍体積を標準的な半楕円体（ｈｅｍｉｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）の式:(長さ×幅２）／２を用いて計算した。
【０２１６】
結果が図２０に示されている。図２０は、ＨＣＴ１１６結腸がんＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおける三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの抗腫瘍効果を示している。ヒトＰＢＭＣの非存在下、２つのグループのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに５×１０６ＨＣＴ１１６細胞を皮下接種した（抗ＥＧＦＲ  ７６３  ＩｇＧおよびＰＢＳ対照）。残りの３つのグループには、５×１０６ＨＣＴ１１６細胞および健康ドナー由来の５×１０６非刺激ヒトＰＢＭＣの混合物を皮下注射した。０日目にＨＣＴ１１６細胞を接種した後、１日目から連続１０日間、ＰＢＳ溶媒対照（１００μｌ）、三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖ５０μｇおよび１５μｇを尾静脈注射で投与した。ｎで示された動物の数の各グループから導き出された腫瘍成長曲線が示されている。
【０２１７】
三量体ｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖグループと非刺激ヒトＰＢＭＣ対照グループの投与の間の統計的有意差（Ｐ＜０．００１）が示されている。これら結果は、ヒトＰＢＭＣの存在下でｈＯＫＴ３ＦａｂＣＳＡ７６３ｓｃＦｖの二重特異性抗ＣＤ３×ＥＧＦＲ抗体が腫瘍増殖を有効に低減し得ることを示した。
【０２１８】
開示された実施形態に対し様々な変更および変化を加え得ることは、当業者には明らかであろう。発明の詳細および実施例は単に例示として見なされることが意図されており、本開示の真の範囲は以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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