(57)【要約】      （修正有）【課題】ハイドロコルチゾン等の１１βヒドロキシステロイドの製造に有用な新規ステロイド１１β水酸化酵素を提供する。【解決手段】以下の（ａ１）、（ｂ１）または（ｃ１）の蛋白質。（ａ１）特定のアミノ酸配列を含む蛋白質。（ｂ１）特定のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。（ｃ１）特定のアミノ酸配列との配列一致性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。【選択図】図１
2014124179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ１）、（ｂ１）または（ｃ１）の蛋白質。
（ａ１）配列番号４３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ１）配列番号４３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。（ｃ１）配列番号４３のアミノ酸配列との配列一致性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）または（ｄ２）のＤＮＡ。
（ａ２）配列番号４２の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ２）配列番号４２の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ２）配列番号４２の塩基配列との配列一致性が９０％以上の塩基配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ２）配列番号４２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載のＤＮＡと、該ＤＮＡがコードする蛋白質が宿主生物または宿主細胞内で発現可能な発現制御領域とを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項２もしくは請求項３に記載のＤＮＡ、または請求項４に記載の組換えベクターを宿主生物または宿主細胞に導入した形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載の蛋白質または請求項５に記載の形質転換体もしくはその処理物に１１−デオキシステロイド化合物を接触させることで１１βヒドロキシステロイド化合物を生成させ、該１１βヒドロキシステロイド化合物を回収することを特徴とする、１１βヒドロキシステロイド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ステロイド１１β水酸化酵素およびそれを用いたハイドロコルチゾン等の１１βヒドロキシステロイドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬として有用なハイドロコルチゾンやプレドニゾロンまたはそれらの置換誘導体の製造方法としては、１７α，２１−ジヒドロキシプレグネ−４−エン−３，２０−ジオン（以下、「コンパウンドＳ」という）やその置換誘導体にカビなどの微生物を作用させ、その１１β位を水酸化する方法（特許文献１）や、酵母などを宿主とし、ステロール７位還元酵素遺伝子、ステロール側鎖切断酵素遺伝子、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素遺伝子、ステロイド１７α位水酸化酵素遺伝子、ステロイド２１位水酸化酵素遺伝子、および／または、ステロイド１１β位水酸化酵素遺伝子を発現する組換え生物の培養において安価炭素源から当該有用物質を効率よく発酵生産する方法（特許文献２）が知られている。
【０００３】
これまでにステロイド１１β水酸化反応（以下、単に「１１β水酸化反応」と称することがある。）に関与している酵素の遺伝子配列を特許文献１記載のカビなどから取得することも試みられてきたが、当該蛋白質のアミノ酸配列解析が困難であり、さらに、当該蛋白質は哺乳類由来の１１β水酸化酵素（CYP11B1）とはアミノ酸配列が大きく異なること
が予想され、その他の微生物では当該反応を触媒する酵素の遺伝子が取得されていないことから、１１β水酸化反応に関与している酵素の遺伝子配列の取得は困難であった（非特許文献１、および非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭62-118897号公報
【特許文献２】特表2004-528827号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Janig, R. G. et al. Steroid 11β-hydroxylation by a fungal microsomal cytochrome P450, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. (1992) 43(8); pp.1117-1123
【非特許文献２】Suzuki, K. et al. Purification of cytochrome P-450(P-450lun) catalyzing steroid 11β-hydroxylation in Curvularia lunata, Biochimica et Biophysica Acta (1993) 1203(2); pp.215-223
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１に記載の方法では、当該カビが含有する他の酵素活性が基質に作用することで副産物が生じることにより、基質をコンパウンドＳとする１１β水酸化反応の収率が不十分（モル収率で86%）であり、精製工程の負荷がかかるという問題があった。
また、特許文献２に記載の方法では、１１β水酸化酵素の活性が不十分であり、１１β水酸化反応の基質となるコンパウンドＳ（文献中では１１−デオキシコルチゾル）が副産物として残存するため、収率悪く、精製工程の負荷がかかるという問題があった。
そこで、本発明は、新規ステロイド１１β水酸化酵素およびそれを用いたハイドロコルチゾン等の１１βヒドロキシステロイドの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。すなわち、ステロイド１１β水酸化活性を有する微生物であるクルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata（C. lunata））MCI-1688株の染色体DNAの配列を独自に解読し、その中から、他の微生物由来の、
ステロイド１１β水酸化酵素とはタイプの異なる、ステロイド１１α水酸化酵素遺伝子に相同性を示す配列について解析を行ない、候補配列を絞り込んだ。続いて、その中から１１β水酸化活性が誘導される培養条件において転写量が増加している配列を取得したこと等により、新規な１１β水酸化酵素の遺伝子配列を取得することに成功した。そして、当該遺伝子がコードする蛋白質の活性を確認し、この酵素がハイドロコルチゾンなどの１１βヒドロキシステロイドの合成反応を効率よく触媒することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下の（ａ１）、（ｂ１）または（ｃ１）の蛋白質。
（ａ１）配列番号４３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ１）配列番号４３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。（ｃ１）配列番号４３のアミノ酸配列との配列一致性が９０％以上のアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。
［２］［１］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
［３］以下の（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）または（ｄ２）のＤＮＡ。
（ａ２）配列番号４２の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ２）配列番号４２の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｃ２）配列番号４２の塩基配列との配列一致性が９０％以上の塩基配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ２）配列番号４２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［４］［２］または［３］に記載のＤＮＡと、該ＤＮＡがコードする蛋白質が宿主生物または宿主細胞内で発現可能な発現制御領域とを含む組換えベクター。
［５］［２］もしくは［３］に記載のＤＮＡ、または［４］に記載の組換えベクターを宿主生物または宿主細胞に導入した形質転換体。
［６］［１］に記載の蛋白質、または［５］に記載の形質転換体もしくはその処理物に１１−デオキシステロイド化合物を接触させることで１１βヒドロキシステロイド化合物を生成させ、該１１βヒドロキシステロイド化合物を回収することを特徴とする、１１βヒドロキシステロイド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新規な１１β水酸化酵素の遺伝子配列を提供することができ、微生物等を宿主として１１β水酸化酵素活性を有する遺伝子組換え体も提供することができる。また、当該遺伝子を有する遺伝子組換え微生物の培養菌体をコンパウンドＳなどに作用させることで、その１１β位が水酸化された反応物を効率よく生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各遺伝子の転写量推移；誘導剤添加区  ○、誘導剤非添加区  ●で示した。Ｃｖ値が低い方がｍＲＮＡレベルは高いと考える。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１２】
＜本発明の蛋白質およびＤＮＡ＞
本発明の蛋白質は、以下の（ａ１）、（ｂ１）または（ｃ１）の蛋白質である。
（ａ１）配列番号４３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ１）配列番号４３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。ここで、数個とは、具体的には２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下である。
（ｃ１）配列番号４３のアミノ酸配列との配列一致性（同一性）が９０％以上、好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質。
【００１３】
上述の本発明の蛋白質は、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質であり、本発明の蛋白質をコンパウンドＳなどに作用させることで、その１１β位が水酸化された反応物を効率よく生産することができ、従来のカビ菌体を用いた同様の反応に比べ副産物の蓄積が大幅に削減され、反応収率も従来の酵素と比較して顕著に向上させることができる。ステロイド１１β水酸化活性は、例えば、後述の実施例に記載したような、コンパウンドS
をハイドロコルチゾンへ変換する能力によって確認することができる。
【００１４】
また、本発明の蛋白質は、いずれも小胞体型Ｐ４５０に分類されるが、このタイプのＰ４５０が水酸化酵素としての機能を発現するには当該酵素への電子供与蛋白質であるＮＡＤＰＨ：チトクロムＰ４５０還元酵素の存在も必要である。従って、通常であれば、Ｐ４５０遺伝子を酵母等で遺伝子組換えにより発現させる場合、同時に同種微生物由来のＮＡＤＰＨ：チトクロム Ｐ４５０還元酵素などの当該Ｐ４５０へ電子伝達可能なＮＡＤＰＨ
：チトクロム Ｐ４５０還元酵素をコードする遺伝子の遺伝子組換えも必要になると考え
られる。しかしながら、驚くべきことに、後述する本発明のＤＮＡをサッカロミセス・セレビシエにおいて遺伝子組換えにより発現させる場合はその必要性が無く、本発明のＤＮＡのみでも機能発現が可能である。これは、C.lunata由来のＮＡＤＰＨ：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０酸化還元酵素遺伝子から予想されるアミノ酸配列がサッカロミセス・セ
レビシエの同酵素遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列と配列一致性が高いことにより、サッカロミセス・セレビシエの当該蛋白質（NCP1p）がその機能を代替することによる
と考えられる。これにより、哺乳動物由来の１１β水酸化酵素を用いる場合に比べて組換え操作を簡略化できるという効果も有する。
【００１５】
本発明の蛋白質は、後述する本発明のＤＮＡを適当な宿主において発現させ、菌体から精製することによって得ることができる。また、C. lunataなどの微生物から精製するこ
とによって得ることもできる。
【００１６】
また、本発明のＤＮＡは、上記蛋白質をコードするＤＮＡであり、具体的には、以下の（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）または（ｄ２）のＤＮＡである。
（ａ２）配列番号４２の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ２）配列番号４２の塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。ここで数個とは、具体的には６０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは１５個以下である。
（ｃ２）配列番号４２の塩基配列との配列一致性（同一性）が９０％以上、好ましくは９５％以上の塩基配列を含み、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ２）配列番号４２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ステロイド１１β水酸化活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
本発明の（ｂ２）のＤＮＡは、当業者であれば、配列番号４２に記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄＥｄｔ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）ＰＣＲ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．２００（１９９１））等を用いて適宜置換、欠失、及
び／または付加変異を導入することにより得ることが可能である。
【００１８】
また、本発明の（ｄ２）のＤＮＡは、配列番号４２の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部をプローブとして用いて、ステロイド１１β水酸化活性を有する微生物から調製したＤＮＡに対し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等によりストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズするＤＮＡを得ることによっても取得できる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの「一部」とは、プローブとして用いるのに十分な長さのＤＮＡのことであり、具体的には１５ｂｐ以上、好ましくは５０ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上のものである。
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、ストリンジェントな条件としては、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件下で洗浄する条件を挙げることができる。
【００１９】
なお、本発明のＤＮＡは、例えば、C. lunataなどの微生物のｃＤＮＡライブラリーを
鋳型としたＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法によって単離することができる。また、本発明のＤＮＡは、本発明者らによりその塩基配列が明らかになったため、配列番号４２に基づく化学合成等によって得ることもできる。
【００２０】
＜本発明の組換えベクター＞
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（「本発明のＤＮＡ」と称する場合がある。「本発明のＤＮＡ」は、前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）、及び（ｄ２）を含むものである。）を後述する宿主生物または宿主細胞（以下、「宿主」と称する場合がある。）にて発現させるため本発明のＤＮＡを発現ベクターに導入することにより、組換えベクターを作成し、当該ベクターで宿主を形質転換することでステロイド１１β水酸化活性を宿主に付与することが可能である。ここで、組換えベクターは、本発明のＤＮＡと、本発明のＤＮＡがコードする蛋白質（本発明の蛋白質）が宿主内で発現可能となるような発現制御領域（例えば、プロモーター）とを含む組換えベクターを意味する。
本発明の組換えベクターは、通常、宿主に適したプロモーターの下流に本発明のＤＮＡの５'末端側が連結されて挿入されたベクターである。また、本発明のＤＮＡの３'末端側にターミネーター配列が付加されてもよい。
本発明の組換えベクター作製に用いる発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プラスミドベクター、シャトルベクター、およびファージベクターなどが挙げられる。
【００２１】
発現ベクターやプロモーターの種類は後述する宿主に応じて適宜選択できる。以下、具
体的に、各宿主における好ましい発現ベクター、プロモーター、ターミネーターなどの例を挙げるが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００２２】
宿主をエシェリヒア属細菌とする場合、プラスミドベクターとしては、pBR322、pUC18
、pHSG298、pUC118、pSTV28、pTWV228、pHY300PLK（タカラバイオ）、pKK223-3が挙げら
れる。また、ファージベクターとしては、（λFixIIベクター（Stratagene社製等）等を
挙げることができる。
また、プロモーターとしては、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ pＬ、pＲなどに由来するプロモーターなどが挙げられる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどが挙げられる。
【００２３】
宿主をバチルス属細菌とする場合、ベクターとしては、pUB110系プラスミド、pC194系
プラスミドなどを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーターなどが利用できる。
【００２４】
宿主をシュードモナス属細菌とする場合、ベクターとしては、シュードモナス属細菌で確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、TOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必
要な遺伝子を含む）pKT240(Gene, 26, 273-82(1983))を挙げることができる。また、プロモーター及びターミネーターとしては、エシェリヒア属細菌で用いられるtacプロモータ
ーなど、及び、エシェリヒア属細菌由来５ＳリボゾーマルＲＮＡターミネーターなどを挙げることができる。
【００２５】
宿主をコリネ型細菌とする場合、ベクターとしては、pAJ43(Gene 39,281 (1985))、pCS11(特開昭57-183799号公報)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターを挙げることができる。また、エシェリヒア・コリ−コリネ型細菌のシャトルベクターとしては、例えば、pCRY30(特開平3-210184号公報)、pCRY21(特開平2276575号公報)、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KEおよびpCRY3KX、pCRY2およびpCRY3(特開平1-191686号公報)、pAM330（特開昭58-67679号公報）、 pHM1519（特開昭58-77895号公報）、pAJ655、pAJ611およびpAJ1844（特開昭58-192900号公報）、 pCG1（特開昭57-134500号公
報）、 pCG2（特開昭58-35197号公報）、 pCG4およびpCG11（特開昭57-183799号公報）等を挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌（エシェリヒア・コリ）で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００２６】
宿主をサッカロミセス属酵母とする場合、ベクターとしては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドやpESCベクター（STRATAGENE）およびpAURベクター（タカラバイオ）などが挙げられる。また、酵母で使用できるベクターは、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,423-488(1992)などに詳細に記載されている。
プロモーターとしては、フォスフォグリセレートキナーゼをコードするPGK1遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするADH1遺伝子、あるいはジェネラルアミノ酸パーミアーゼをコードするGAP1遺伝子等の恒常的発現プロモーターを利用できるほか、GAL1/GAL10 (Johnston, M. et al., (1984) Mol. Cell. Biol. 4(8), 1440-1448)等の誘導型プロ
モーターを利用することもできる。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、エノラーゼ、メタロチオネインなどのプロモーターも使用可能である。
【００２７】
宿主をシゾサッカロミセス属酵母とする場合、ベクターとしては、サッカロミセス属酵母と同様にYRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドやｐAUR224ベクター（タカラバイオ）などが挙げられる。プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするAD
H1遺伝子、ウィルスのSV40プロモーター等の恒常的発現プロモーターを利用できるほか、インベルターゼをコードするinv1遺伝子プロモーター (グルコース存在下で抑制)や熱シ
ョック蛋白質をコードするhsp16遺伝子プロモーター等の誘導型プロモーターなどを利用
することもできる。このほか、nmt1プロモーター（チアミン存在下で抑制）やctr4プロモーター（銅存在下で抑制）なども使用可能である。
宿主をピキア属酵母とする場合、染色体挿入型のベクターが用いられ、例としてはpPICZベクターやpGAPZベクター（いずれもライフテクノロジーズジャパン）などが挙げられる。
プロモーターとしては、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードするGAP
遺伝子等の恒常的発現プロモーターを利用できるほか、アルコールオキシダーゼをコードするAOX1遺伝子等の誘導型プロモーターなどを利用することもできる。
また、宿主をアスペルギルス属糸状菌とする場合、染色体挿入型のベクターを使用することが一般的であるが、AMA1配列を有するARp1などのように細胞内で自立複製可能なプラスミドベクターなども使用される。後者の例として、pPTRIIベクターやpAUR316（いずれ
もタカラバイオ）が挙げられる。プロモーターとしては、エノラーゼをコードするenoA遺伝子やペプチド鎖伸長因子をコードするtef1遺伝子等の恒常的発現プロモーターを利用できるほか、アルコール脱水素酵素をコードするalcA遺伝子のほか、α−アミラーゼをコードするamyB遺伝子等の誘導型プロモーターも利用できる。
さらに、宿主を植物細胞または植物体とする場合、染色体挿入型のベクターを使用することが一般的であるが、タバコモザイクウィルスなどのウィルスベクターも使用される。さらには、一過性発現を目的とする際は、当該植物細胞又は植物体内で複製する必要が無いため、植物細胞又は植物体にＤＮＡを導入できればよく、植物細胞又は植物体で複製できなくても導入に用いるアグロバクテリウム属細菌において複製可能なプラスミドベクターも使用される。プロモーターとしてはカリフラワーモザイクウィルスの３５Sプロモー
ターやユビキチンをコードするUbi遺伝子等の恒常的発現プロモーターなどを利用するこ
とができる。
【００２８】
上述したものの他に、プロモーターを連結した本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを、宿主の染色体中に直接導入する相同組換え技術（例えば、Bio/Technol. 9, 1382-1385（1991））や、トランスポゾンや挿入配列等を用いて導入する技術も用いるこ
とができ、これらの技術により遺伝子導入する際に用いる配列等も本発明の組換えベクターに含まれる。従って、本発明の組換えベクターは、宿主において、本発明の蛋白質を発現させ得るものであればよく、宿主への遺伝子の導入の方法は特に限定されない。
【００２９】
＜本発明の形質転換体＞
本発明によれば、さらに、本発明のＤＮＡまたは本発明の組換えベクターを宿主に導入した形質転換体が提供される。このような本発明の形質転換体もしくはその処理物を後述する本発明の製造方法に用いると、該形質転換体により、１１βデオキシステロイド化合物を反応の原料として１１βヒドロキシステロイド化合物を生産することが可能になる。
【００３０】
本発明のＤＮＡ又は本発明の組換えベクターを導入する宿主としては、以下のような生物または細胞が例示される。
【００３１】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などのエシェリヒア（Escherichia）属細菌
；バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）などのバチルス
（Bacillus）属細菌；セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）などのセラチ
ア（Serratia）属細菌；シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）などのシュードモナス（Pseudomonas）属
細菌；コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバク
テリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタム（Brevibacterium lactofermentum）などのコリネ型細菌；ロドコッカス・エリス
ロポリス（Rhodococcus erythropolis）などのロドコッカス（Rhodococcus）属細菌；ラ
クトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）などのラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）などのストレプトミ
セス（Streptomyces）属細菌；サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）などのサーマス（Thermus）属細菌；ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）などのストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌；放線菌（Actinomycetes）属細
菌。
【００３２】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などのアスペルギルス（Aspergillus）属カビ；モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）、モルティエレラ・バイニエリ（Mortierella bainieri）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）などのモルティエレラ（Mortierella
）属カビ；フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）などのフザリウム（Fusarium）属カビ；クルブラリア・ルナタ（Curvularia lunata）などのクルブラリア（Curvularia）属カビ。
アラビドシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）、グリシン・マックス（Glycine max）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、オリゼ・サティーバ（Oryzae sativa）、ソラナム・ツベロサム（Solanum tuberosum）、ソラナム・リコペルシカム（Solanum lycopersicum）、ジー・メイ
（Zea mays）などの植物または植物細胞。
【００３３】
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属酵母；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・ファリノサ（Pichia farinosa）などのピキア（Pichia）属酵母；キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）などのキャンディダ（Candida）属酵
母；シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのシゾサッカロミ
セス（Schizosaccharomyces）属酵母；ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lypolitica）などのヤロウィア（Yarrowia）属酵母；デバリオマイセス・ニルソニ（Debaryomyces nilssonii）などのデバリオマイセス属酵母；ロドトルラ・グルティニス（Rhodotorula glutinis）などのロドトルラ属酵母；リポマイセス・リポフェラス（Lipomyces lipoferus
）などのリポマイセス属酵母；クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）などのクリイベロマイセス属酵母；ロドスポリジウム・トルロイディス（Rhodosporidium toruloides）などのロドスポリジウム属酵母；トルロプシス・コリキュロサ（Torulopsis colliculosa）などのトルロプシス属酵母。
【００３４】
これらの中では酵母が好ましく、代謝工学的手法が用いやすいことからサッカロミセス属酵母が特に好ましい。サッカロミセス属酵母の中でも、his3、leu2、trp1、ura3などの栄養要求性の遺伝型であることが望ましく、例えば、以下の株が例示される。
サッカロミセス・セレビジエYPH499株（MATa ura3 lys2 ade2 trp1 his3 leu2）（ATCC204679：American Type Culture CollectionまたはSTRATAGENEより入手できる）、サッカロミセス・セレビジエFY1679-6ｃ株（MATα ura3 leu2 trp1 his3）（Euroscarf社から入手できる）、サッカロミセス・セレビジエX2181-1B株（MATalpha his2 gal1 trp1 ade1 MAL SUC）（ATCC204822：American Type Culture Collectionより入手できる）、サッカロミセス・セレビジエINVSc1株（MATa/MATα his3Δ1/his3Δ1 leu2/leu2 trp1-289/trp1-289 ura3-52/ura3-52）（ライフテクノロジーズジャパン社より入手できる）を用いることができる。あるいは、サッカロミセス・セレビシエKA311A株（MATa his3 leu2 trp1 ura3
）（Mol. Cell Biol. 13, 307-3083（1993））も用いることができ、KA311A株は、独立行政法人産業総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：FERM P-19053として寄託されている。また、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）FY1679-28c株（JP2004-528827 A1）、FY1679-18b株（JP2004-528827 A1）、YPH500株(ATCC204680)も用いることができる。
【００３５】
また、本発明の形質転換体（好ましくは酵母）は、本発明のＤＮＡ、即ち、本発明の蛋白質である１１β水酸化酵素をコードする遺伝子の導入に加えて、以下に説明する他の酵素をコードする遺伝子も同じ形質転換体（好ましくは酵母）に導入することで、グルコースやエタノールなどの安価な原料からハイドロコルチゾンのような有用な１１βヒドロキシステロイド化合物を効率よく自律的に発酵生産するプロセスの構築が可能になる。
【００３６】
他の酵素としては、ステロール側鎖切断酵素遺伝子が導入されていることが好ましい。必要に応じて、さらに、ステロール７位還元酵素遺伝子、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素遺伝子、ステロイド１７α位水酸化酵素遺伝子、およびステロイド２１位水酸化酵素遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも一種が導入されていてもよい。
【００３７】
本発明の形質転換体において、これらの他の酵素の活性を得るためには、これらの他の酵素の遺伝子を＜本発明の組換えベクター＞の項で例示した発現ベクター等に挿入して、後述する方法にて宿主を形質転換すればよい。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子と共に、導入することができる他の酵素の遺伝子を以下に例示する。
【００３８】
ステロール７位還元酵素遺伝子は、Journal of Biological Chemistry 1996, 271, 10866-10873記載のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のもの、あるいはApplied and Environmental Microbiology 2007, 73, 1736-1741記載のモルティエレラ（Mortierella）属カビ由来ものが用いられる。
【００３９】
ステロール側鎖切断酵素遺伝子としては、ステロール側鎖の２０位及び２２位との結合を切断する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられ、例えば、WO2010/079594
国際公開パンフレットに記載の酵素蛋白質（CYP204A1やCYPSS204A）や、ウシ、ヤギ、ウ
マ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、あるいはヒトなど動物由来のCYP11A1蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
【００４０】
ステロール３位酸化酵素／異性化酵素遺伝子は、ウシ、マウス、ラット、ヒト、あるいは植物由来３β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素（3βHSD）やストレプトミセス（Streptomyces）属細菌由来コレステロール酸化酵素が好ましい。
【００４１】
ステロイド１７α位水酸化酵素蛋白質、ステロイド２１位水酸化酵素蛋白質、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素遺伝子は、例えば、Molecular and Cellular Endocrinology
1990, 73, 73-80に記載のものが用いられる。
【００４２】
ステロイド１７α位水酸化酵素遺伝子は、例えば、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c17が好ましい。
【００４３】
また、ステロイド２１位水酸化酵素遺伝子は、ウシ、マウス、ラット、あるいはヒト由来シトクロムP450c21が好ましい。
【００４４】
また、必要に応じて、上述の他の酵素の活性に必要な電子伝達系を構成する蛋白質などの遺伝子も導入することがさらに好ましい。具体的には、本発明の蛋白質をコードする遺
伝子、あるいは、本発明の蛋白質をコードする遺伝子および上述の他の酵素に加えて、該酵素蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質のそれぞれをコードする遺伝子も同時に宿主微生物に導入すること、または、人工的にこれらの蛋白質を該酵素活性が維持されるよう遺伝子工学的に融合した蛋白質を創製し導入することが好ましい。
【００４５】
ここで、電子伝達活性を有するフェレドキシン蛋白質、および該フェレドキシン蛋白質への電子伝達活性を有するフェレドキシン還元酵素蛋白質は両者の活性を有する1種の蛋
白質でもよい。例えば、Bacillus megateriumのP450-BM3遺伝子のP450還元酵素ドメイン
を酵素蛋白質（P450 2C11）に連結し、人工的に作製した融合蛋白質を利用できる（Helvig, C. and Capdevila, J. H., Biochemistry, (2000）39, 5196−5205)。
【００４６】
フェレドキシン還元酵素は、例えば以下の中から選択される。
ホウレン草由来のフェレドキシンレダクターゼ、
シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシンレダクターゼ、
動物由来のアドレノドキシンレダクターゼ、
ノボスフィンゴビウム  サブテラニウム（Novosphingobium subterraneum）由来フェレドキシンレダクターゼ、
ノボスフィンゴビウム  アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由
来フェレドキシンレダクターゼ、
エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンレダクターゼやフェレドキシンレダクターゼ、
アシネトバクター  エスピー（Acinetobacter sp.）  ＡＤＰ１株由来  フェレドキシン
レダクターゼ、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来  アドレノドキシンレダクターゼ様蛋白質（arh1p）、
またはその他のフェレドキシンレダクターゼ。
【００４７】
フェレドキシンは、例えば以下の中から選択される；
ホウレン草由来のフェレドキシン、
シュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）由来プチダレドキシン、
動物由来のアドレノドキシン、
ノボスフィンゴビウム  サブテラニウム（Novosphingobium subterraneum）由来フェレドキシン、
ノボスフィンゴビウム  アロマティシボランス（Novosphingobium aromaticivorans）由
来フェレドキシン、
エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）由来フラボドキシンやフェレドキシン、
アシネトバクター  エスピー（Acinetobacter sp.）  ＡＤＰ１株由来  フェレドキシン
、
サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来  フェレドキシン様蛋白質（yah1p）、
またはその他のフェレドキシン型蛋白質。
【００４８】
さらに、ステロイド１８位水酸化酵素としてはヒト由来シトクロムＰ４５０１１Ｂ２などが挙げられ、３−オキソステロイド−Δ１−脱水素酵素としてはピメロバクター  シンプレックス（Pimelobacter simplex）やロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来の３−オキソステロイド−Δ１−脱水素酵素などが利用可能である。
【００４９】
上述した酵素をコードする遺伝子、またはそれを含む組換えベクターによる上記宿主への形質転換法としては、コンピテントセル法［Journal of Molecular Biology, Vol.53, 
p.159 (1970)］、酢酸リチウム法[Ito, H. et al. J. Bacteriol., Vol.153, p.163 (1983)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, p.1929 (1978)]、エレクトロポレーション法（Fromm ME,et al.,(1986) Nature 319(6056):791-793）等による形質転換法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Genetics, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29,
p.80 (1975)］、細胞融合法［M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)］
、アグロバクテリウム法［Luis, H-E., et al. Nature, Vol.303, p.209 (1983)］, パーティクルボンバードメント法［Klein, T.M., et al. Nature, Vol.327, p.70 (1987)］等を用いることができる。これらの方法から、宿主生物に適した方法を適宜選択すればよい。
【００５０】
また、上述の酵素をコードする遺伝子に加えて、さらに１１β水酸化反応により生じた１１βヒドロキシステロイド化合物に作用する酵素をコードする遺伝子を導入すれば、誘導体化した１１βヒドロキシステロイド化合物も製造することができる。したがって、上述の遺伝子に加えて、ステロイド１８位水酸化酵素やステロイド１位酸化酵素などの遺伝子を導入してもよい。
【００５１】
なお、形質転換体の作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。
【００５２】
また、上述した本発明の形質転換体の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
【００５３】
培養は用いる宿主の種類に応じて適当な方法を選択できるが、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、宿主の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても宿主が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。さらに、宿主を植物細胞とする場合は、種類によっては光を照射することが好ましい。
形質転換で得られた植物体を栽培する場合は、土壌に移植して栽培することも、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む水溶液を用いた水耕栽培をすることもできる。窒素源としては各種硝酸塩やアンモニウム塩等が使用可能であり、無機塩として例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。栽培においては、光の照射が必要だが、植物体の種類や生育状態に応じて光の波長、強度、周期を変えるとよい。温度についても植物が生育する範囲であれば特に制限無く、土壌または水耕栽培における水溶液のｐＨについても植物が生育する範囲であれば特に制限はない。水耕栽培における水溶液のｐＨについては酸またはアルカリを添加することで調節できる。
このようにして培養または栽培された本発明の形質転換体を、後述する１１βヒドロキシステロイド化合物の製造方法に供することができる。あるいは、後述する製造方法において、１１βヒドロキシステロイド化合物の製造と並行して、本発明の形質転換体の培養を行なうこともできる。
【００５４】
＜１１βヒドロキシステロイド化合物の製造方法＞
本発明の蛋白質（１１β水酸化酵素）、または、上述の本発明の形質転換体もしくはその処理物を１１−デオキシステロイド化合物に接触させ、１１βヒドロキシステロイド化合物を生成させ、該１１βヒドロキシステロイド化合物を回収することにより、１１βヒドロキシステロイド化合物を製造することができる。
ここで、１１−デオキシステロイド化合物としては、１７α，２１−ジヒドロキシプレグネ−４−エン−３，２０−ジオン（コンパウンドＳ）、１１−デオキシコルチコステロン、プロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、およびそれらの誘導体などが挙げられる。誘導体としては、１７α，２１−ジヒドロキシプレグネ−４−エン−３，２０−ジオン  ２１−アセテート、または、１７α，２１−ジヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオンなどが挙げられる。これらの中では、コンパウンドＳ、またはその誘導体が好ましい。
１１βヒドロキシステロイド化合物としては、ハイドロコルチゾン、コルチコステロン、１１β−ヒドロキシプロゲステロン、２１−デオキシコルチゾルおよびそれらの誘導体などが挙げられる。誘導体としてはハイドロコルチゾン  ２１−アセテート、プレドニゾロンなどが挙げられる。これらの中では、ハイドロコルチゾン、またはその誘導体が好ましい。
【００５５】
一方、上述の１１β水酸化酵素をコードする遺伝子の導入に加えて、他の酵素をコードする遺伝子も同じ形質転換体（好ましくは酵母）に導入することで、グルコースやエタノールなどの安価な原料からハイドロコルチゾンのような有用な１１βヒドロキシステロイド化合物を効率よく自律的に発酵生産するプロセスを構築する場合において、ハイドロコルチゾンを製造するときは、本発明の１１β水酸化酵素をコードする遺伝子のほかに、少なくともステロール側鎖切断酵素、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素、ステロール７位還元酵素、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素、ステロイド１７α位水酸化酵素、およびステロイド２１位水酸化酵素をコードする遺伝子をそれぞれ導入した宿主を用いて製造することが好ましい。
【００５６】
コルチコステロンを製造するときは、本発明の１１β水酸化酵素をコードする遺伝子のほかに、少なくともステロール側鎖切断酵素、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素、ステロール７位還元酵素、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素、およびステロイド２１位水酸化酵素をコードする遺伝子をそれぞれ導入した宿主を用いて製造することが好ましい。
【００５７】
１１β−ヒドロキシプロゲステロンを製造するときは、本発明の１１β水酸化酵素をコードする遺伝子のほかに、少なくともステロール側鎖切断酵素、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素、ステロール７位還元酵素、およびステロイド３位酸化酵素／異性化酵素をコードする遺伝子をそれぞれ導入した宿主を用いて製造することが好ましい。
【００５８】
２１−デオキシコルチゾルを製造するときは、本発明の１１β水酸化酵素をコードする遺伝子の他に、少なくともステロール側鎖切断酵素、フェレドキシン、フェレドキシン還元酵素、ステロール７位還元酵素、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素、およびステロイド１７α位水酸化酵素をコードする遺伝子をそれぞれ導入した宿主を用いて製造することが好ましい。
【００５９】
形質転換体の処理物としては、形質転換体である微生物菌体や植物細胞（以下、「微生物菌体等」という。）あるいは植物体を超音波、粉砕、圧擦等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られる、本発明の蛋白質を含有する抽出物、該抽出物に更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られる本発明の蛋白質を含む画分や、上記微生物菌体等を担体に固定化したものなどが挙げられる。
【００６０】
形質転換体である微生物菌体等の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に形質転換体である微生物菌体等を固定化させる方法により行うことができる。例えば、微生物菌体等を担体に固定化する場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）等で洗浄された微生物菌体等を使用することができる。
【００６１】
本発明の蛋白質（ステロイド１１β水酸化酵素）、または本発明のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された形質転換体もしくはその処理物に接触させる際の条件については、目的とする１１βヒドロキシステロイド化合物を得ることができれば特に制限はないが、以下のような条件とすることが好ましい。用いる本発明の形質転換体の宿主が微生物や細胞である場合は、上述の培養方法と同等に培地中で接触させることができる。基質である１１−デオキシステロイド化合物の濃度は、０．０１％〜１０％が好ましく、０．１％〜２％がより好ましい。反応温度は１５〜４０℃が好ましく、２５℃〜３５℃がより好ましい。反応ｐＨはｐＨ４〜ｐＨ１０が好ましく、ｐＨ５〜ｐＨ９がより好ましい。１１β水酸化反応には酸素が必要であることから好気条件が好ましい。
【００６２】
さらに、１１β水酸化反応には還元力の供給が必要であるため、生物が生育状態にある条件が好ましく、宿主が微生物や植物細胞である場合には培養（即ち、生育）と並行して１１β水酸化反応を進行させることも好ましい。この還元力とは、具体的には電子やエネルギーである。ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の化合物で供給するためにグルコース脱水素酵素またはグルコース６リン酸脱水素酵素、および、グルコースなどを共存させてＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを再還元することで還元力である電子やエネルギーをステロイド１１β水酸化反応に供給したり、電子メディエーター存在下で電力を供給することにより直接還元力である電子やエネルギーをステロイド１１β水酸化反応に供給したりすることで、培養と並行して１１β水酸化反応を進めることも好ましい。
【００６３】
培地中や植物体に蓄積したハイドロコルチゾンなどの１１βヒドロキシステロイド化合物を回収する方法は特に限定されず、当業者に公知の分離または精製のための手法を用いることができる。例えば、溶媒抽出、晶析、樹脂吸着、カラムクロマトグラフィー等により行うことができる。
また、ここで、回収物としては、培地中や植物体に蓄積した１１βヒドロキシステロイド化合物を単離、精製したものに限定されず、菌体を分離した培地や、目的とする１１βヒドロキシステロイド化合物を含有する培地や植物体そのものも含まれる。
【００６４】
また、回収されたハイドロコルチゾンなどの１１βヒドロキシステロイド化合物からは、各種の誘導体を公知の方法で製造することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００６６】
（実施例１）
クルブラリア・ルナタ ＭＣＩ１６８８株におけるステロイド１１β位水酸化活性を誘導
する培養条件
クルブラリア・ルナタＭＣＩ１６８８をＰＤＡ寒天培地（ポテトデキストロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ））上に塗布し、２８℃で９日間培養したのち、同寒天培地上に生育したクルブラリア・ルナタＭＣＩ１６８８株を２ｍＬのＧＰＣＳＬ−ＩＩ液体培地(１０％（
ｗ／ｖ）グルコース、２%（ｗ／ｖ）ポリペプトン（日本製薬）、０．５%（ｗ／ｖ）コー
ンスティープリカー（シグマーアルドリッチ社）)２本に植菌し、２８℃で往復振盪培養
（３００ｒｐｍ）した。培養３日間経過したものを種培養液として、それぞれ全量を３００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ５０ｍＬのＧＰＣＳＬ−ＩＩ培地に植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍの旋回振盪で本培養を開始した。本培養２４時間後、一方の培養液にのみ１１β水酸化活性の誘導剤として２０ｍｇの２０−ヒドロキシメチル−１，４−プレグナジエン−３−オン（ＡＣＲＯＳ社）粉末を加え（誘導剤添加区）、もう1本には何も加えず（
誘導剤非添加区）、２８℃で１５０ｒｐｍの旋回振盪培養を継続した。その４時間後、各々の本培養液から２ｍＬずつをそれぞれ２本の試験管に採取し、そこへ１１０μLの１．
７%（ｗ／ｖ） コンパウンドＳ（シグマーアルドリッチ社）のメタノール溶液を加え、さらに２８℃にて３００ｒｐｍで往復振盪することで培養を継続した。２０時間後、各培養液に４ｍＬの酢酸エチルを添加してよく混合し、２，０００×ｇ、３０秒間、室温にて遠心分離した。その上層を別の容器に移し、遠心濃縮器にて溶媒を留去して得られた固形分に１．５ｍＬのメタノールを添加して残渣を溶解した。さらにこのメタノール溶液にメタノールを添加し、４０倍に希釈しHPLC分析（分析条件Ａ；以下記載）に供した。なお、同時にハイドロコルチゾン（シグマーアルドリッチ社）およびコンパウンドＳの標品についても分析し、その溶出時間を確認した。
【００６７】
分析条件Ａ
カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ φ４．６×１５０ｍｍ（ナカライテスク社）
カラム温度；４０℃
検出方法；２５４ｎｍの吸光度
試料注入量；５μl
溶離液；メタノール／水＝５０／５０
溶離液流速；１ｍＬ／分
分析時間；２５分.
【００６８】
当該分析の結果、ハイドロコルチゾン（１０．８分）、及び、コンパウンドＳ（２０．５分）と同じ溶出時間にピークを確認し、特にハイドロコルチゾンに該当するピークの面積値からハイドロコルチゾンの濃度を計算した（表１）。その結果、誘導剤添加区にてハイドロコルチゾン蓄積が増加し、当該菌株の１１β水酸化活性が誘導することが確認された。
【００６９】
【表１】
2014124179.tif 000003
【００７０】
（実施例２）
クルブラリア・ルナタ  ＭＣＩ１６８８株の染色体ＤＮＡ配列における１１β水酸化酵素遺伝子配列候補の絞込み
発明者らが独自で解読したクルブラリア・ルナタ  ＭＣＩ１６８８株の染色体ＤＮＡ配列から推定される各種アミノ酸配列のうち、国際公開ＷＯ２００２０４６３８６に配列番号２として記載されているアスペルギルス・オクラセウス  ＡＴＣＣ１８５００株由来ステロイド１１α水酸化酵素のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列およびそのアミノ酸配列をコードする核酸配列をプログラムＴＢＬＡＳＴＮ  ２．２．１９を用いて検索した。この相同性評価に用いた条件はプログラム付帯のデフォルト値を用いた。
【００７１】
分析の結果、Ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅが１．０ｅ−１０より低い合計５種類の推定アミノ酸配列（Ｐ４５０Ａ１〜Ａ５）が候補として挙がり、これらの配列についてさらなる絞込みを行った。これらの推定アミノ酸配列はそれぞれチトクロムＰ４５０蛋白質に特徴的な部分アミノ酸配列を有していることから、Ｐ４５０Ａ１（配列番号１）、Ｐ４５０Ａ２（配列番号２，３）、Ｐ４５０Ａ３（配列番号４）、Ｐ４５０Ａ４（配列番号５）、Ｐ４５０Ａ５（配列番号６）とした。このうち、Ｐ４５０Ａ２のアミノ酸配列についてはＰ４５０Ａ２−１（配列番号２）およびＰ４５０Ａ２−２（配列番号３）の２つのアミノ酸配列が同一蛋白質の異なる部分配列であると考えられる。その理由は、それぞれをコードする核酸配列が染色体上で極めて近接していること、転写における読み取り方向が同一であること、また、配列検索に用いたステロイド１１α水酸化酵素アミノ酸配列の異なる部分に相同性を示すことからである。
【００７２】
【表２】
2014124179.tif 000004
【００７３】
（実施例３）
染色体ＤＮＡ配列における遺伝子領域の推定
クルブラリア・ルナタ  ＭＣＩ１６８８株の染色体ＤＮＡ配列より、上記５種類の推定アミノ酸配列をコードする遺伝子領域を含むＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号７〜１１に記載した。
【００７４】
これらのＤＮＡ配列を検索配列としてＢＬＡＳＴＸ２，２，２７プログラムを用いて公共の蛋白質データベースに対し、デフォルトの条件にて相同性高い蛋白質の検索を実施した。
【００７５】
この検索により抽出された既知のアミノ酸配列は、クルブラリア・ルナタ  ＭＣＩ１６８８株の染色体ＤＮＡ配列より見出された推定チトクロムＰ４５０蛋白質５種類それぞれと最も相同性が高い既知のアミノ酸配列と考えられるため、これら得られた配列との比較を参考に翻訳開始コドン及び終止コドンの染色体ＤＮＡ配列上における位置をイントロンの存在可能性も考慮しながら推定した。配列によっては、開始コドンが明瞭でないもの、エキソンと思われる領域に終止コドンが見出されるものが含まれ、完全に予測することは
困難だったが、上記の推定アミノ酸配列から以下のＰ４５０Ａ１〜Ａ５の５種類のＤＮＡ配列を１１β水酸化酵素のＤＮＡ配列候補とした（配列番号１２〜１６）。
【００７６】
（実施例４）
クルブラリア・ルナタ  ＭＣＩ１６８８株の染色体ＤＮＡ配列における１１β水酸化酵素ＤＮＡ配列候補のさらなる絞込み
クルブラリア・ルナタＭＣＩ１６８８をＰＤＡ寒天培地上に塗布し、２８℃で９日間培養したのち、同寒天培地上に生育したクルブラリア・ルナタＭＣＩ１６８８株を２ｍＬのＧＰＣＳＬ−ＩＩ液体培地(１０％（ｗ／ｖ）グルコース、２%（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５%（ｗ／ｖ）コーンスティープリカー)６本に植菌し、２８℃で往復振盪培養（３００ｒｐｍ）した。培養３日間経過したものを種培養液として、それぞれ全量を３００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ５０ｍＬのＧＰＣＳＬ−ＩＩ培地（計６本）に植菌し、２８℃、１５０ｒｐｍの旋回振盪で本培養を開始した。本培養２４時間後、うち４本の培養液に１１β水酸化活性の誘導剤として２０ｍｇの２０−ヒドロキシメチル−１，４−プレグナジエン−３−オン粉末を加え（誘導剤添加区）、もう２本には何も加えず（誘導剤非添加区）、２８℃で１５０ｒｐｍの旋回振盪培養を継続した。誘導剤添加した直後、誘導剤添加区と誘導剤非添加区のフラスコ1本ずつの振盪培養を停止し、氷上で１５分冷却後、遠
心分離（２，０００ｘｇ、４℃、１０分）により、菌体画分を集めた。この画分を２０ｍLの０．９%（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液に懸濁し、再度遠心分離により菌体画分を集め、−８０℃で凍結保存した。誘導剤添加区については誘導剤添加後１．４時間及び２．７時間にそれぞれ１本のフラスコの培養を停止し、同様の処理により菌体画分−８０℃で凍結保存した。さらに、誘導剤添加してから４時間後には残りの誘導剤添加区および非添加区のフラスコ１本ずつについても上記と同様に培養を停止して、菌体を−８０℃で凍結保存した。
【００７７】
凍結保存した菌体にメタルコーンを加えてビーズショッカー（安井器械社製）にて回転速度１７００ｒｐｍで２０秒間（４℃）の菌体破砕処理を行った。このあと、メタルコーンを取り除いた処理物について、ＩＳＯＧＥＮキット(ニッポンジーン社)を用いて、添付のマニュアルインストラクションに従い総ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡ画分を１００μＬのＤＥＰＣ処理水（ジエチルピロカーボネート処理水）に溶解した。このうち４２．５μＬを別に取り分け、これに５μＬの１０×ＤＮａｓｅＩ ｂｕｆｆｅｒと２．５μＬ
の５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮａｓｅＩ水溶液(タカラバイオ社)を添加し、混合後３７℃で２時間インキュベートすることで染色体ＤＮＡの共存を排除した。ＤＮａｓｅＩ処理後、再度ＩＳＯＧＥＮキットを用いて総ＲＮＡを抽出し、最終的に０．５μｇ／μＬとなるようＤＥＰＣ処理水に溶解した。
【００７８】
６種類の０．５μｇ／μＬ  ＲＮＡ水溶液２μＬをそれぞれ鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）により逆転写反応を行うことで、６種それぞれのｃＤＮＡ水溶液を２０μＬずつ調製した。逆転写反応の条件はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）添付のマニュアルインストラクションに従い、プライマーとして同キット付属のＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒを用いた。
【００７９】
誘導剤添加区の菌体から得られた４種類（誘導剤添加直後、１．４時間後、２．７時間後、４時間後）のｃＤＮＡ調製液をそれぞれ８μＬずつ混合した。このｃＤＮＡ混合液１μＬを鋳型として、それぞれＰ４５０Ａ１からＰ４５０Ａ５の推定Ｎ末端およびＣ末端部位をコードするＤＮＡ配列を基に作成したフォワードプライマーおよびリバースプライマーを５ｐｍｏｌｅｓずつ、２倍濃度のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘを１２．５μＬ、およびこれらに水を加えて合計２５μＬとして、１サイクルが９８℃  １０秒→５０℃  １５秒→７２℃  ９０秒からなる反応を３０サイクル実施した。
【００８０】
使用プライマー
P450A1
P450A1-F1: ATGGATACCCAGACTGTCGAGCTG（配列番号１７）
P450A1-R1: CTACACTACTACTCTCTTGAAAGC（配列番号１８）
P450A2
P450A2-F1: ATGATTATTGAGCTCTTCTCATC（配列番号１９）
P450A2-R1: CTACACCAGTATACTCGGTTCTCC（配列番号２０）
P450A3
P450A3-F1: ATGGCCGGAGACGAAGTGAG（配列番号２１）
P450A3-R1: TCACCCATCACTAGACGTCCAC（配列番号２２）
P450A4
P450A4-F1: ATGGGGATCCCTTATGTCTTGC（配列番号２３）
P450A4-R1: TTACCATAGCACATCTTGCGTTG（配列番号２４）
P450A5
P450A5-F1: ATGGGCAACTTTTTTGACAACTC（配列番号２５）
P450A5-R1: TTAAATCTTTGGGTTTGCGAGGTC（配列番号２６）
【００８１】
それぞれのＰＣＲ反応液についてアガロースゲル用いた電気泳動で分析したところ、Ｐ４５０Ａ１およびＰ４５０Ａ３のプライマーペアを添加したＰＣＲ反応液において約１．５ｋｂｐ付近の移動度にＤＮＡの増幅を確認した。その一方で、Ｐ４５０Ａ２、Ｐ４５０Ａ４、及び、Ｐ４５０Ａ５のプライマーペアを用いたＰＣＲ反応液の電気泳動ではＤＮＡの増幅を確認できなかった。上記得られた結果より、候補配列をさらにＰ４５０Ａ１及びＰ４５０Ａ３に絞り込んだ。
【００８２】
（実施例５）
Ｐ４５０Ａ１及びＰ４５０Ａ３の転写レベル解析による誘導効果の確認
さらに、上記において調製したｃＤＮＡ溶液それぞれ１０μＬに１９０μＬのＤＥＰＣ処理水を加えて２０倍に希釈し、うち２μＬをリアルタイムＰＣＲの鋳型試料とした。これにそれぞれ５ｐｍｏｌｅｓのＰ４５０Ａ１、Ｐ４５０Ａ３、アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、及び、４０ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子特異的なプライマー（以下、それぞれＰ４５０Ａ１−Ｆ４及びＰ４５０Ａ１−Ｒ４、Ｐ４５０Ａ３−Ｆ４及びＰ４５０Ａ３−Ｒ４、ａｃｔｉｎ−Ｆ２及びａｃｔｉｎ−Ｒ２、ＧＡＰＤＨ−Ｆ１及びＧＡＰＤＨ−Ｒ１、そして、４０Ｓ−Ｆ２及び４０Ｓ−Ｒ２）、１μＬのＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ(
ロシェ・ダイアグノスティクス社)、２０ｎｍｏｌｅｓの塩化マグネシウム水溶液、及び
、ＤＥＰＣ処理水を加えて液量１０μＬとして、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ロシェ・ダイアグノスティクス社）を用いてリアルタイムＰＣＲによる発現レベルの解析を実施した。
【００８３】
使用プライマー
P450A1
P450A1-F4: GTTTTGCGATTCACTGGACCTAC（配列番号２７）
P450A1-R4: GAAGGGTAGAATGCGTTGTCTTG（配列番号２８）
P450A3
P450A3-F4: CTATACCAGAAGGCATCCATTTCC（配列番号２９）
P450A3-R4: GCCTCATACTCTTCTCTCGGTCTC（配列番号３０）
アクチン
actin-F2: GACCGTATGCAGAAGGAAATCAC（配列番号３１）
actin-R2: AAGGTGGAGAGCGAAGCAAG（配列番号３２）
グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素
GAPDH-F1: ATGCACGCGATTGACACGTCCTC（配列番号３３）
GAPDH-R1: CTAAGCGTTGCCATCAATCTTG（配列番号３４）
４０ＳリボゾームＲＮＡ
40S-F2: ATCACGTTGACGCCTCTGG（配列番号３５）
40S-R2: CTCGTCCTGCTCAAGAACACC（配列番号３６）
【００８４】
なお、ＰＣＲプログラムについては対象の遺伝子によって以下のとおりとし、転写量は２次微分最大法によりＣｖ値を求めた。
９５℃・１０秒→５７℃・１０秒→７２℃・６秒（Ｐ４５０Ａ１、Ｐ４５０Ａ３、及び、アクチン）
９５℃・１０秒→５４℃・１０秒→７２℃・６秒（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）
９５℃・１０秒→５７℃・１０秒→７２℃・４秒（４０ＳリボゾームＲＮＡ）
【００８５】
【表３】
2014124179.tif 000005
【００８６】
アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、及び、４０ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子の転写レベルは誘導剤非添加区試料において誘導剤添加区試料よりやや高い値となっているが、Ｐ４５０Ａ１およびＰ４５０Ａ３遺伝子の転写レベルは誘導剤添加直後に同等またはＰ４５０Ａ１については高い転写レベルであった。この結果より、Ｐ４５０Ａ１およびＰ４５０Ａ３は誘導剤添加により転写が誘導されるが、その誘導効果はＰ４５０Ａ１においてＰ４５０Ａ３における効果より高いと示唆された。
【００８７】
（実施例６）
絞り込んだ配列候補遺伝子の取得
ｐＵＣ１１８プラスミド（タカラバイオ社製）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（タカラバイオ社）で処理して得られたＤＮＡをさらにＢＡＰＣ７５（タカラバイオ社製）による脱リン酸化処理を施した。これにより得られたＤＮＡを含む水溶液とＰ４５０Ａ１のＰＣＲ反応液を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社）を加えて連結反応を行った。同様に、ｐＭＷ１１９プラスミド（ニッポンジーン社製）を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ社）で処理して得られたＤＮＡについてさらにＢＡＰＣ７５により脱リン酸化処理を施したＤＮＡを含む水溶液とＰ４５０Ａ３のＰＣＲ反応液を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を加えて連結反応を行った。それぞれ得られた反応液を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換したのち、その形質転換溶液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナト
リウム塩（シグマーアルドリッチ社）を含有するＬＢ寒天培地（１％Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％  Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１％  塩化ナトリウム、２％  寒天）に塗布し、一晩３７℃でインキュベートした。その結果、形質転換されたと思われるＥ．ｃｏｌｉのコロニーがＬＢ寒天培地上に出現していた。これらのコロニーについて、それぞれ５ｐｍｏｌｅｓのＤＮＡプライマーＭ１３−Ｆ１及びＭ１３−Ｒ１、２ｎｍｏｌｅｓのｄＮＴＰ、１μＬの１０倍濃縮Ｅｘｔａｑバッファー（タカラバイオ社製）、０．０５μＬのＥｘｔａｑ水溶液（タカラバイオ社）、及び水を加えて合計１０μＬから成るＰＣＲ反応液を調製し、サーマルサイクラーを用いてコロニーＰＣＲを実施した。
M13-F1: GGTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号３７）
M13-R1: CGGATAACAATTTCACACAGG（配列番号３８）
【００８８】
その反応における温度変化プログラムは、９５℃、１分に引き続き、１サイクルが９５℃、３０秒→５０℃、３０秒→７２℃、１．５分から成る反応を３０サイクル、そして７２℃、２分で終了するとした。このコロニーＰＣＲの結果、それぞれの形質転換体コロニーについて、約１．５ｋｂｐのＤＮＡが増幅されたことを確認したので、それぞれコロニーはｐＵＣ１１８−Ｐ４５０Ａ１またはｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ３というベクターを有すると考えられた。さらにこれらそれぞれのコロニーを２ｍＬのＬＢ液体培地（１％  Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％  Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１％  塩化ナトリウム）に植菌し、３７℃、３００ｒｐｍ（往復振盪）で一晩培養し、生育した菌体を遠心分離により集め、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。これらのプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｑｕｉｃｋ  ｓｔａｒｔ  ｋｉｔ（ベックマンコールター社製）によるＰＣＲ反応（９６℃、３０秒に引き続き、９６℃、２０秒→５０℃、２０秒→６０℃、４分を３０サイクル実施する温度プログラム用いた）を実施し、ＤＮＡシークエンサーＣＥＱ８０００によりＤＮＡ配列を解析した。なお、ｐＵＣ１１８−Ｐ４５０Ａ１のＤＮＡ配列解析に用いたプライマーは、Ｍ１３−Ｆ１、Ｍ１３−Ｒ１、及び、Ｐ４５０Ａ１−Ｆ３であり、ｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ３のＤＮＡ配列解析に用いたプライマーは、Ｍ１３−Ｆ１、Ｍ１３−Ｒ１、Ｐ４５０Ａ３−Ｆ３、及び、Ｐ４５０Ａ３−Ｒ４であった。
P450A1-F3: AAGACGTATATGCCGCCATGTGAC（配列番号３９）
P450A3-F3: TTCGACCAACCTGACAACGTTCTC（配列番号４０）
P450A3-R4: GCCTCATACTCTTCTCTCGGTCTC（配列番号４１）
【００８９】
このＤＮＡ配列解析の結果、Ｐ４５０Ａ１およびＰ４５０Ａ３をコードするｃＤＮＡ配列はそれぞれ、配列番号４２，４４と決められた。
さらに、上記ｃＤＮＡ配列より、Ｐ４５０Ａ１およびＰ４５０Ａ３の推定アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４３，４５と推定された。
【００９０】
（実施例７）
Ｐ４５０Ａ１及びＰ４５０Ａ３の発現用ベクター調製
（１）ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１の作成
サッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃ株のＮＣＰ１（ＮＡＤＰ−チトクロムＰ４５０還元酵素）遺伝子を取得するために、以下の操作を行った。まず、サッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃ株をＹＰＤ寒天培地（１％  Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２％  ペプトン、２％  グルコース、２％  寒天）上に接種し、３０℃で３日間生育させた。当該寒天培地上に生育したサッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃを２ｍＬのＹＰＤ液体培地（１％  Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２％  ペプトン、２％  グルコース）に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで一晩旋回振盪培養した。培養後、５，０００×ｇ、３分、室温の遠心分離
で沈殿画分を取得し、この沈殿画分を懸濁緩衝液（０．１Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）に懸濁したところにガラスビーズを加え、冷却しながら激しく振盪することにより菌体破砕を行った。そこへ１０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．０）で飽和したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）溶液を添加し、さらに振盪することで蛋白質を変性させた。これを１８，０００×ｇ、５分、室温で遠心分離後、上層の液を別に移し、さらに等量のクロロホルムを添加した。振盪後、１８，０００×ｇ、５分、室温で遠心分離し、上層の液をさらに別に移した。その液に３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液、及び、エタノールを添加したのち、１８，０００×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離することで核酸画分を沈殿させた。この沈殿に７０％エタノール水溶液を添加し、再度振盪後、１８，０００×ｇ、５分間、４℃で遠心分離し、上清を除いた。得られた沈殿を乾燥したのち、水を添加することでサッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃの染色体ＤＮＡ水溶液を調製した。このＤＮＡ５ｎｇに、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーＮＣＰ１−Ｆ１およびＮＣＰ１−Ｒ１、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ
Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、及び、水を加えて合計５０μＬとすることでＰＣＲ反応液を調製し、９８℃・１０秒→５０℃・１５秒→７２℃・１０秒の３０サイクルから成るＰＣＲ反応を行った。
NCP1-F1: GGGCCCAAAAAAATGCCGTTTGGAATAGAC（配列番号４６）
NCP1-R1: AAGCTTACCAGACATCTTCTTGG(含HindIII) （配列番号４７）
【００９１】
反応終了後の液をアガロース電気泳動で分析したところ、約２ｋｂｐのＤＮＡが増幅していることを確認した。予め制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、ＢＡＰＣ７５を用いて脱リン酸化処理して調製したｐＵＣ１１８プラスミドベクター処理物にＰＣＲ反応液を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を添加して、連結反応を行った。その後、当該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地に塗布した。この寒天培地を３７℃で一晩インキュベートして得られたコロニーについて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン
ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し一晩３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔにより、プラスミドＤＮＡを取得した。このプラスミドを制限酵素ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重切断したところ、アガロース電気泳動で２．１ｋｂｐおよび３．２ｋｂｐのＤＮＡを検出したことからｐＵＣ１１８−ＮＣＰ１の作成を確認した。
【００９２】
（２）ｐＫＩＭ−ＵＲＡの作成
プラスミドベクターｐＭＷ１１９  ＤＮＡ５ｎｇを鋳型として、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｐＭＷ−Ｆ１及びｐＭＷ−Ｒ１、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、及び、水を加えて合計５０μＬとすることでＰＣＲ反応液を調製し、９８℃・１０秒→５５℃・５秒→７２℃・５秒が３０サイクルから成るＰＣＲ反応を行った。
pMW-F1: CTACGGGGTCTGACGCTC（配列番号４８）
pMW-R1: ACGTTTTCCAATGATGAGCAC（配列番号４９）
【００９３】
これにより得られた０．８ｋｂｐのＰＣＲ反応産物を制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）で処理すると、０．４５ｋｂｐおよび０．３８ｋｂｐのＤＮＡが得られるが、このうち、０．４５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。プラスミドベクターｐＭＷ１１９  ＤＮＡを制限酵素ＦｓｐＩで処理して得られる２．９ｋｂｐと１．３ｋｂｐのＤＮＡのうち、前者と上記０．４５ｋｂｐのＤＮＡを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を添加して、連結反応を行った。その後、当該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン
ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地に塗布した。この寒天培地を３７℃で一晩インキュベ
ートして得られたコロニーについて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し一晩３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔにより、プラスミドＤＮＡを取得した。得られたプラスミドを制限酵素ＡａｔＩＩ及びＳｃａＩで二重処理したところ、予想通り２．９ｋｂｐ及び０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が確認されたことから、ｐＭＷ１１９よりマルチクローニングサイトを除去した形のプラスミドｐＭＷ１１９ｄを構築した。次に、このｐＭＷ１１９ｄを制限酵素ＡａｔＩＩ及びＳｃａＩで二重処理したのち、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）による末端平滑化を施して得られる２．９ｋｂｐ及び０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片のうち、２．９ｋｂｐのＤＮＡを取得した。一方、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ（アジレント社）を制限酵素ＭｌｕＩ及びＳｃａＩによる処理後にＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた末端平滑化処理して得られる６．２ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐのＤＮＡのうち、６．２ｋｂｐ断片を取得し、これに上記の２．９ｋｂｐＤＮＡを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を添加して、連結反応を行った。その後、当該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地に塗布した。この寒天培地を３７℃で一晩インキュベートして得られたコロニーについて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し一晩３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔにより、プラスミドＤＮＡを取得した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩ処理したところ、予想通り９．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られたことから、ｐＥＳＣ−ＵＲＡのｐＵＣｏｒｉをｐＭＷ１１９由来のｐＳＣ１０１ｏｒｉに置き換えたプラスミドｐＥＳＣ−ＳＣ１０１−ＬＥＵを構築した。
１ｎｇのｐＥＳＣ−ＵＲＡ（アジレント社）ＤＮＡを鋳型に、それぞれ１０ｍｏｌｅｓのプライマーＥＳＣＵＲＡ−Ｆ１およびＥＳＣＵＲＡ−Ｒ１に加え、２５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、及び、水を加えて合計５０μＬとすることでＰＣＲ反応液を調製し、９８℃・１０秒→５５℃・５秒→７２℃・６秒が３０サイクルから成るＰＣＲ反応を行った。
ESCURA-F1: GGGCCACAGCTTTTCAATTCAATTCATC（配列番号５０）
ESCURA-R1: GGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGC（配列番号５１）
【００９４】
これにより得られた１．１ｋｂｐのＰＣＲ反応産物を、別途ｐＭＷ１１９を制限酵素ＳｍａＩで処理した後、ＢＡＰＣ７５で脱リン酸化処理したＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を添加して、連結反応を行った。その後、当該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地に塗布した。この寒天培地を３７℃で一晩インキュベートして得られたコロニーについて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し一晩３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔにより、プラスミドＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩで処理したところ、予想通り１．１ｋｂｐ及び４．２ｋｂｐのＤＮＡを確認し、ｐＭＷ１１９−ＵＲＡ３を構築した。このｐＭＷ１１９−ＵＲＡ３を制限酵素ＳｍａＩで処理して得られる１．１ｋｂｐ及び４．２ｋｂｐのＤＮＡのうち、１．１ｋｂｐのＤＮＡを、ｐＥＳＣ−ＳＣ１０１−ＬＥＵを制限酵素ＮａｅＩ及びＰｆｌＦＩ（それぞれＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）による処理後にＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔによる末端平滑化処理して得られる６．５ｋｂｐのＤＮＡと混合しＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を添加して、連結反応を行った。その後、当該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地に塗布した。この寒天培地を３７℃で一晩インキュベートして得られたコロニーについて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し一晩３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔにより、プラスミ
ドＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ社）で処理したところ、予想通り３．１ｋｂｐ及び４．５ｋｂｐのＤＮＡが生成を確認し、プラスミドベクターｐＫＩＭ−ＵＲＡを構築した。
【００９５】
（３）ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１の作成
ｐＵＣ１１８−ＮＣＰ１のＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理して得られたＤＮＡ断片を、予め同制限酵素で処理し、抽出・精製されたｐ−ＫＩＭ−ＵＲＡプラスミド断片と混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を添加して、連結反応を行った。その後、当該反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地に塗布した。この寒天培地を３７℃で一晩インキュベートして得られたコロニーについて、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地２ｍＬに植菌し一晩３７℃、３００ｒｐｍ（往復振盪）の培養を行い、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔにより、ｐ−ＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１のプラスミドＤＮＡを取得した。
【００９６】
（４）ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１への11β水酸化酵素遺伝子配列候補の挿入
１ｎｇ  ｐＵＣ１１８−Ｐ４５０Ａ１を鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｐ４５０Ａ１−Ｆ６、及び、ｐ４５０Ａ１−Ｒ１、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ社製）、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５２℃・５秒→７２℃・８秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
P450A1-F6: GCGGCCGCAAAAAAATGGATACCCAGACTGTCG(含NotI) （配列番号５２）
【００９７】
一方、ｐＭＷ１１９プラスミド（ニッポンジーン社製）を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ社）で処理して得られたＤＮＡについてさらにＢＡＰＣ７５により脱リン酸化処理を施したＤＮＡを含む水溶液と上記のＰＣＲ反応液を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を加えて連結反応を行った。その反応液を持ってＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。同寒天培地上に生育したコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）およびＳａｃＩ（タカラバイオ社製）により同時処理したのち、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分析したところ、予想通り１．５ｋｂｐおよび４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片の存在が確認できたことから、想定どおりのｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ１プラスミドが作成された。さらに、ｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ１をＮｏｔＩおよびＳａｃＩで制限酵素処理を施し、Ｐ４５０Ａ１遺伝子断片を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡを取得し、同様にＮｏｔＩおよびＳａｃＩで制限処理を施したｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１プラスミドのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を加えて連結反応を行った。その反応液を持ってＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したコロニーを取得した。これらのコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを抽出することで、Ｐ４５０Ａ１遺伝子がＧａｌ１０プロモーターの下流に機能する形で挿入されたｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ１プラスミドを取得した。
【００９８】
また、１ｎｇ  ｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ３を鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｐ４５０Ａ３−Ｆ７、及び、ｐ４５０Ａ３−Ｒ１、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５５℃・１５秒→７２℃・８秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
P450A3-F7: GCGGCCGCAAAAAAATGGCCGGAGACGAAG(含NotI) （配列番号５３）
【００９９】
一方、ｐＭＷ１１９プラスミド（ニッポンジーン社製）を制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ社）で処理して得られたＤＮＡについてさらにＢＡＰＣ７５により脱リン酸化処理を施したＤＮＡを含む水溶液と上記のＰＣＲ反応液を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を加えて連結反応を行った。その反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。同寒天培地上に生育したコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩおよびＳａｃＩにより同時に処理したのち、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分析したところ、予想通り１．６ｋｂｐおよび４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片の存在が確認できたことから、想定どおりのｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ３（Ｆ７）プラスミドが作成されたと考えた。ｐＭＷ１１９−Ｐ４５０Ａ３（Ｆ７）をＮｏｔＩおよびＳａｃＩで制限酵素処理を施し、Ｐ４５０Ａ３遺伝子断片を含む約１．６ｋｂｐのＤＮＡを取得し、同様にＮｏｔＩおよびＳａｃＩで制限処理を施したｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１プラスミドのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ
Ｍｉｘ＞を加えて連結反応を行った。その反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したコロニーを取得した。これらのコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地２ｍＬに植菌し、３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを抽出することで、Ｐ４５０Ａ３遺伝子がＧａｌ１０プロモーターの下流に機能する形で挿入されたｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ３プラスミドを取得した。
【０１００】
（実施例８）
１１β水酸化活性による遺伝子の確認
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１株（ライフテクノロジーズジャパン社製）を、ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ１、または、ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ３を用いて酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＤ−Ｕ寒天培地上に塗布し、３０℃で２日間インキュベートしたところ、コロニーの生育が見られた。なお、ＳＤ−Ｕ寒天培地の組成は以下のとおり。
２％  グルコース
０．６７％  酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）（Ｄｉｆｃｏ)
０．０１％  Ｌ−アルギニン
０．０１％  Ｌ−システイン
０．０１％  Ｌ−スレオニン
０．０１％  Ｌ−グルタミン酸
０．０１％  Ｌ−リジン
０．０１％  Ｌ−ロイシン
０．０１％  Ｌ−トリプトファン
０．００５％  Ｌ−ヒスチジン
０．００５％  Ｌ−アスパラギン酸
０．００５％  Ｌ−イソロイシン
０．００５％  Ｌ−メチオニン
０．００５％  Ｌ−フェニルアラニン
０．００５％  Ｌ−プロリン
０．００５％  Ｌ−セリン
０．００５％  Ｌ−チロシン
０．００５％  Ｌ−バリン
１．５％  寒天
【０１０１】
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（Ｐ４５０Ａ１）株、および、同ＩＮＶＳｃ１（Ｐ４５０Ａ３）株をそれぞれ１００ｍＬ三角フラスコに仕込んだ１０ｍＬのＳＤ０．２５−Ｕ培地（上記ＳＤ０．２５−Ｕ寒天培地組成において寒天を除いた液体培地）に植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で一晩培養した。その後、１．１ｍＬの２０％  ガラクトース水溶液を培養液に添加し、さらに３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で２４時間培養を継続した。培養終了後、１５ｍＬ容コニカルチューブ（日本ベクトン・ディッキンソン社）に培養液を全量移し、２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離し、上清を除いた後、１ｍＬの水を添加し懸濁後、再度２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離して菌体を洗浄した。続いて、菌体を１ｍＬのＳＧ溶液（ＳＤ０．２５−Ｕ培地の０．２５％  グルコースを２％  ガラクトースに置き換えたもの)で懸濁し、さらに２μＬの１．７％  
コンパウンドＳのメタノール溶液を加え、２８℃、２８０ｒｐｍの往復振盪で反応させた。２４時間後、反応液に２ｍＬの酢酸エチルを加えてよく混合し、２，０００×ｇ、室温で３０秒間遠心分離した。その上層を別の容器に移し、遠心濃縮器にて溶媒を留去して得られた固形分に０．５ｍＬのメタノールを添加して溶解した。さらにこのメタノール溶液にメタノールを添加し、４０倍に希釈しＨＰＬＣ分析（分析条件Ａ）に供したところ、サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（Ｐ４５０Ａ１）株を用いた反応ではハイドロコルチゾン（シグマーアルドリッチ社）と保持時間の一致する吸光度ピークが確認されたが、同ＩＮＶＳｃ１（Ｐ４５０Ａ３）株では確認できなかった。
【０１０２】
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（Ｐ４５０Ａ１）株をそれぞれ２本の３００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ５０ｍＬのＳＤ０．２５−Ｕ培地（上記ＳＤ０．２５−Ｕ寒天培地組成において寒天を除いた液体培地）に植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で一晩培養した。その後、５．５ｍＬの２０％  ガラクトース水溶液を培養液に添加し、さらに３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で２４時間培養を継続した。培養終了後、５０ｍＬ容コニカルチューブ（日本ベクトン・ディッキンソン社）に培養液を全量移し、２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離し、上清を除いた。それぞれ菌体に１０ｍＬの水を添加して懸濁後、２本を合一し、再度２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離して菌体を洗浄した。続いて、菌体を２０ｍＬのＳＧ溶液（ＳＤ０．２５−Ｕ培地の０．２５％  グルコースを２％  ガラクトースに置き換えたもの)で懸濁した。予め５０μＬの１．７％コ
ンパウンドＳのメタノール溶液を加えておいた２０本の１５ｍＬ容コニカルチューブにその酵母懸濁液をそれぞれ１ｍＬ加え、２８℃、２８０ｒｐｍの往復振盪で反応させた。２４時間後、反応液に２ｍＬの酢酸エチルを加えてよく混合し、２，０００×ｇ、室温にて３０秒間遠心分離した。その上層を別の容器に移し、遠心濃縮器にて溶媒を留去して得られた固形分に１．０ｍＬのメタノールを添加して溶解し、ＨＰＬＣ分析（分析条件Ａの試料注入量を２０μＬに置き換えたもの）に４２回供し、ハイドロコルチゾンと同じ保持時間の溶出液を分取し合一した溶液約３５ｍＬが得られた。これをさらに遠心濃縮器（ＥＹＥＬＡ）にてメタノールを留去した１８ｍＬの溶液に３６ｍＬの酢酸エチルを加えてよく混合し、２，０００×ｇ、室温にて３０秒間遠心分離した。その上層を別の容器に移し、遠心濃縮器にて溶媒を留去して得られた２．４ｍｇの固形分に０．６ｍＬのメタノール−
ｄを添加して溶解し、プロトンＮＭＲを測定したところ、ＮＭＲのプロファイルはハイドロコルチゾン標品のそれと一致したことから、Ｐ４５０Ａ１はステロイド１１β水酸化酵素であると判断された。
【０１０３】
（実施例９）
ＮＣＰ１の効果確認
１ｎｇ  ｐＵＣ１１８−Ｐ４５０Ａ１を鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｐ４５０Ａ１−Ｆ８、及び、ｐ４５０Ａ１−Ｒ７、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ社製）、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５２℃・５秒→７２℃・８秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
P450A1-F8: GCGAATTCAAAAAAATGGATACCCAGACTG (含EcoRI) （配列番号５４）
P450A1-R7: GGTAGATCTACACTACTACTCTCTTGAAAG (含BglII) （配列番号５５）
【０１０４】
上記のＰＣＲ反応液をＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）およびＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社）で制限酵素処理を施し、Ｐ４５０Ａ１遺伝子断片を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡを取得し、同様にＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで制限処理を施したｐＫＩＭ−ＵＲＡプラスミドのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を加えて連結反応を行った。その反応液を持ってＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したコロニーを取得した。これらのコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩにより同時に処理したのち、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分析したところ、予想通り１．５ｋｂｐおよび７．６ｋｂｐのＤＮＡ断片の存在が確認できたことから、想定どおりのＡ１遺伝子がＧａｌ１０プロモーターの下流に機能する形で挿入されたｐＫＩＭ−ＵＲＡ−Ｐ４５０Ａ１プラスミドを取得した。
【０１０５】
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１株をｐＫＩＭ−ＵＲＡ−Ｐ４５０Ａ１を用いて酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＤ−Ｕ寒天培地上に塗布し、３０℃で２日間インキュベートしたところ、コロニーの生育が見られ、これをサッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−Ｐ４５０Ａ１）とした。
【０１０６】
サッカロミセス・セレビシエＩＮＶＳｃ１（ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−Ｐ４５０Ａ１）株、および、同ＩＮＶＳｃ１（ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ１）株をそれぞれ３００ｍＬ三角フラスコに仕込んだ４０ｍＬのＳＤ０．２５−Ｕ培地に植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で一晩培養した。その後、４．４ｍＬの２０％  ガラクトース水溶液を培養液に添加し、さらに３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で２４時間培養を継続した。培養終了後、５０ｍＬ容コニカルチューブに培養液を全量移し、２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離し、上清を除いた後、１０ｍＬの水を添加し懸濁後、再度２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離して菌体を洗浄した。続いて、菌体を８ｍＬのＳＧ溶液で懸濁し、菌体懸濁液から１ｍＬずつをそれぞれ６本の試験管に採取し、そこへ５０μLの１%（ｗ／ｖ） コンパウンドＳのメタノール溶液を加え、さらに２８℃にて２８０ｒｐｍの往復
振盪で反応させた。１、２、４、７、１１、２２時間後、それぞれの菌株について１本の試験管反応液に２ｍＬの酢酸エチルを加えてよく混合し、室温、２，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。その上層を別の容器に移し、遠心濃縮器にて溶媒を留去して得られた固形分に０．５ｍＬのメタノールに溶解した。さらにこのメタノール溶液にメタノールを添加し、１０倍に希釈しＨＰＬＣ分析（分析条件Ａ）に供した。分析の結果、ハイドロコル
チゾンに該当するピークの面積値から各反応時間におけるハイドロコルチゾンの濃度を計算した（下表）。その結果、Ｐ４５０Ａ１のみを過剰発現するサッカロミセス・セレビシエ  ＩＮＶＳｃ１（ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−Ｐ４５０Ａ１）株においても１１β水酸化によるハイドロコルチゾンの蓄積が確認できた。
【０１０７】
【表４】
2014124179.tif 000006
【０１０８】
（実施例１０）
他のサッカロミセス・セレビシェ株におけるＰ４５０Ａ１の組換え発現
サッカロミセス・セレビシエ  ＦＹ１６７９−６ｃ株（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ、ドイツ）、および、サッカロミセス・セレビシエ  ＹＰＨ４９９株（ライフテクノロジーズジャパン社）を宿主として、酢酸リチウム法によりｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ１で形質転換し、それぞれＳＤ−ＵＲＡ寒天培地（２％  グルコース、０．６７％  酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）（Ｄｉｆｃｏ）、１．９２ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈｏｕｔ
Ｕｒａｃｉｌ（シグマーアルドリッチ社）、２％  寒天）に形質転換液を塗布し、３０℃で２日間インキュベートした結果、それぞれの宿主にｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ｐ４５０Ａ１が導入されたＣＹ８５２株、及び、ＣＹ８５１株が得られた。さらにこれらについて２クローンずつを別の同寒天培地上にレプリカし、２日間インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したＣＹ８５２株、及び、ＣＹ８５１株の２クローンをそれぞれ別個に２ｍＬのＳＤ−ＵＲＡ培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで旋回振盪培養した。一晩経過したのち、それぞれの培養液をさらに２００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ０．１ｍＭのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含む同培地２０ｍＬに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの旋回振盪培養を行った。８時間後に５０ｍＬ容コニカルチューブに培養液全量を移し、５，０００×ｇ、５分、室温の遠心分離により菌体を回収し、１ｍＬの水酸化菌体反応液（６７ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、１％  ガラクトース、２．７％  グリセロール）に再懸濁した。これに最終濃度５０ｍｇ／ＬになるようにコンパウンドＳを加えて、３０℃、２００ｒｐｍの旋回振盪により反応を約２０時間実施した。反応終了後、反応液１ｍＬに酢酸エチルを１ｍＬ添加し、激しく混和したのち１８，０００×ｇ、３０秒、室温の遠心分離を行い、上層を別のポリプロピレン製チューブに移し、窒素気流下で酢酸エチルを留去した。これを再度繰返して得られた残渣をまとめて回収したのち、２００μＬアセトニトリルを添加し、激しく振盪することでこれを溶解した。得られたアセトニトリル溶液を試料として、以下の条件で分析した（分析条件Ｂ）。
分析機器；ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣ（ウォーターズ）カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣＲ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ  φ２．１×１００ｍｍ
カラム温度；４０℃
【０１０９】
【表５】
2014124179.tif 000007
分析時間；５分
試料注入量；２μＬ
検出方法；吸光度２４０ｎｍ
【０１１０】
分析の結果、ＣＹ８５２及びＣＹ８５１のそれぞれ２クローンにおいて、ハイドロコルチゾンの蓄積を確認した。
【０１１１】
【表６】
2014124179.tif 000008
【０１１２】
（実施例１１）
哺乳類由来ステロイド１１β水酸化酵素ＣＹＰ１１Ｂ１との比較
ＧｅｎＢａｎｋにＡＡＨ９６２８５．１として登録されたアミノ酸配列を参考に、ヒト由来ＣＹＰ１１Ｂ１をコードする遺伝子配列を以下のとおり合成し、ｐＵＣ５７に挿入した形でｐＵＣ５７−ＣＹＰ１１Ｂ１を取得した（配列番号５６：ヒト由来ＣＹＰ１１Ｂ１コード領域は塩基番号４３２〜１９４３であり、他はｐＵＣ５７ベクター部分）。なお、配列番号５６の塩基番号４３２〜１９４０に相当するアミノ酸配列を配列番号５７に示す。
【０１１３】
ウシ由来ＡＤＸをコードする遺伝子配列については牛腎臓由来ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写した後、このｃＤＮＡを鋳型として合成し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡに挿入した形で取得した。それぞれの遺伝子配列を同一のｐＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドに挿入したが、この場合、遺伝子産物をミトコンドリアにて機能させることを意図して、それぞれの蛋白質のＮ末端にサッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃ株由来ＣＯＸ４蛋白質のミトコンドリア移行シグナル配列が付加するようにＤＮＡ配列を設計した。
【０１１４】
サッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃ株の染色体ＤＮＡ  １ｎｇを鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｃｏｘ４−Ｆ、及び、ｃｏｘ４−Ｒ、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液Ａを調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５０℃・１５秒→７２℃・１０秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
【０１１５】
cox4-F:AGTACTAGTATGCTTTCACTACGTCAATCGAT （配列番号５８）
cox4-R:GCTGGTACCGGGTTTTTGCTGAAGCAGAT （配列番号５９）
【０１１６】
また、１ｎｇ  ｐＵＣ５７−ＣＹＰ１１Ｂ１を鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｍｍ１１Ｂ１−Ｆ、及び、ｍ１１Ｂ１−Ｒ、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液Ｂを調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５０℃・１５秒→７２℃・９０秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
【０１１７】
mm11B1-F: ACCCTACTAGTATGGGTACCCGCGCCGCGCG (含KpnI) （配列番号６０）
m11B1-R: TCCAGAATTCTTAGTTAATGGCACGAAAGG (含SacI) （配列番号６１）
【０１１８】
上記のＰＣＲ反応液ＡをＳｐｅＩ（タカラバイオ社）およびＫｐｎＩ（タカラバイオ社）で、ＰＣＲ反応液ＢをＫｐｎＩおよびＳａｃＩ（タカラバイオ社）で制限酵素処理を施し、それぞれｃｏｘ４シグナル配列を含む約０．１ｋｂｐのＤＮＡ、および、ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子断片を含む約１．４ｋｂｐのＤＮＡを取得し、同様にＳｐｅＩおよびＳａｃＩで制限処理を施したｐＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を加えて連結反応を行った。その反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したコロニーを取得した。これらのコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＳｐｅＩおよびＫｐｎＩおよびＳａｃＩにより同時に処理したのち、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分析したところ、予想通り０．１ｋｂｐおよび１．４ｋｂｐおよび６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片の存在が確認できたことから、想定どおりのｃｏｘ４−ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子がＧａｌ１０プロモーターの下流に機能する形で挿入されたｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｃｏｘ４−ＣＹＰ１１Ｂ１プラスミドを取得した。
【０１１９】
サッカロミセス・セレビシエ  Ｓ２８８ｃ株の染色体ＤＮＡ  １ｎｇを鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｃｏｘ４−３Ｆ、及び、ｃｏｘ４−２Ｒ、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液Ｃを調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５０℃・１５秒→７２℃・１０秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
【０１２０】
cox4-3F: AGTGGATCCATGCTTTCACTACGTCAATCGAT (含BamHI) （配列番号６２）
cox4-2R: GGGTTTTTGCTGCAGCAGAT (含PstI)  （配列番号６３）
【０１２１】
ウシ由来Ａｄｘをコードする遺伝子については牛腎臓由来のＲＮＡ＜Ｂｏｖｉｎｅ  Ｋｉｎｄｅｙ  ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡ（クロンテック社製）＞を鋳型として、逆転写反応キット＜Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）＞の取扱説明書に記載された反応条件に従い逆転写反応によってｃＤＮＡを得た後、このｃＤＮＡ  １ｎｇを鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーＡＤＸ−Ｆ、及び、ＡＤＸ−３Ｒ、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液Ｄを調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５０℃・１５秒→７２℃・３０秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転することにより、シグナルペプチド部分を除くＡｄｘに該当する遺伝子部分を増幅した。
【０１２２】
ADX-F:AGTACTAGTATGCTTTCACTACGTCAATCGAT  （配列番号６４）
ADX-3R:GCTGGTACCGGGTTTTTGCTGAAGCAGAT  （配列番号６５）
【０１２３】
上記のＰＣＲ反応液ＤをＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）およびＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社）で制限酵素処理を施し、Ａｄｘ遺伝子断片を含む約０．４ｋｂｐのＤＮＡを取得し、同様にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限処理を施したｐＥＳＣ−ＵＲＡプラスミドのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを加えて連結反応を行った。その反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したコロニーを取得した。これらのコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、３００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより同時に処理したのち、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分析したところ、予想通り０．４ｋｂｐおよび６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片の存在が確認できたことから、想定どおりのＡｄｘ遺伝子がＧａｌ１プロモーターの下流に機能する形で挿入されたｐＥＳＣ−ＵＲＡ−Ａｄｘプラスミドを取得した（配列番号６６：配列上、Ａｄｘ遺伝子は塩基番号２９４６〜３３３５である）。なお、配列番号６６の塩基番号２９４６〜３３３２に相当するアミノ酸配列を配列番号６７に示す。
【０１２４】
１ｎｇ  ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−Ａｄｘを鋳型ＤＮＡとして、それぞれ１０ｐｍｏｌｅｓのプライマーｃｏｘ４−４Ｆ、及び、ＡＤＸ−３Ｒ、２５μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ、さらに、水を添加して、総量５０μＬのＰＣＲ反応液Ｅを調製し、１サイクルが９８℃・１０秒→５０℃・１５秒→７２℃・３０秒から成る温度プログラムを３０サイクル運転した。
【０１２５】
cox4-4F: AGTCTGCAGCAAAAACCCAGCAGCTCAGAAGATAAAA（配列番号６８）
ADX-3R: GTAAAAGCTTTTATTCTATCTTTGAGGAGTTC（配列番号６９）
【０１２６】
上記のＰＣＲ反応液ＣをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで、ＰＣＲ反応液ＥをＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理を施し、それぞれｃｏｘ４シグナル配列を含む約０．１ｋｂｐのＤＮＡとＡｄｘ遺伝子断片を含む約０．４ｋｂｐのＤＮＡを取得し、同様にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限処理を施したｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｃｏｘ４−ＣＹＰ１１Ｂ１プラスミドのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを加えて連結反応を行った。その反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換後、その細胞懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたのち、同寒天培地上に生育したコロニーを取得した。これらのコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリン  ナトリウム塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍの往復振盪培養で一晩培養することにより得られた菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ並びにＨｉｎｄＩＩＩにより同時に処理したのち、反応液をアガロースゲル電気泳動にて分析したところ、予想通り０．１ｋｂｐおよび０．４ｋｂｐおよび８．１ｋｂｐのＤＮＡ断片の存在が確認できたことから、想定どおりのＡｄｘ遺伝子がＧａｌ１プロモーターの下流に機能する形で挿入されたｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｃｏｘ４−ＣＹＰ１１Ｂ１−ｃｏｘ４−Ａｄｘプラスミドを取得した。
【０１２７】
ＦＹ１６７９−６ｃを宿主として、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｃｏｘ４−ＣＹＰ１１Ｂ１−ｃ
ｏｘ４−Ａｄｘをそれぞれ導入する形質転換をエレクトロポレーション法により行い、その細胞懸濁液をＳＤ−ＵＲＡ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間インキュベートした結果、ＦＹ１６７９−６ｃ  （ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｃｏｘ４−ＣＹＰ１１Ｂ１−ｃｏｘ４−Ａｄｘ）（以後、ＣＹ５４２）が得られた。ＳＤ−ＵＲＡ寒天培地上に生育したＣＹ５４２およびＣＹ８５２を２ｍＬのＳＤ−ＵＲＡ培地に、またＦＹ１６７９−６ｃを２ｍｇ／Ｌ
ウラシルを添加したＳＤ−ＵＲＡ培地に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで旋回振盪培養した。一晩経過したのち、それぞれの培養液をさらに２００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ２０ｍＬのグルコースの濃度を０．２５％に減少させたＳＤ-ＵＲＡ培地（ＦＹ１６７
９−６ｃ培養には２ｍｇ／Ｌ  ウラシルをさらに添加）に植菌し、また終濃度１ｍＭになるようＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏを加え、３０℃、２００ｒｐｍの旋回振盪培養を行った。８時間後にそれぞれの培養液に２ｍＬの２０％ガラクトース水溶液を加え培養を継続し、さらにその２０時間後、１％コンパウンドＳのエタノール溶液を０．１ｍＬ添加し、培養を２４時間継続した。この際、培養期間０時間、４時間、８時間において２００μＬずつサンプリングを行った。これらの培養液に酢酸エチルを１ｍＬ添加し、激しく混和したのち１８，０００×ｇ、３０秒、室温の遠心分離を行い、上層を別のポリプロピレン製チューブに移し、窒素気流下で酢酸エチルを留去した。これを再度繰返して得られた残渣に、２００μＬアセトニトリルを添加し、激しく振盪することでこれを溶解した。得られたアセトニトリル溶液を試料として、分析条件Ｂで培養液に含まれるハイドロコルチゾンとコンパウンドＳの濃度を測定した。その結果、下表のとおり、Ｐ４５０Ａ１を導入したＣＹ８５２においては、ＣＹＰ１１Ｂ１を導入したＣＹ５４２よりも良好なコンパウンドＳのハイドロコルチゾンへの変換が確認された。
【０１２８】
【表７】
2014124179.tif 000009
なお、ＣＹ８５２株のコンパウンドＳを基質とする１１β水酸化反応におけるハイドロコルチゾンのモル収率は９５％であった。
【０１２９】
（実施例１２）
ステロイド基質の検討
サッカロミセス・セレビシエ  ＩＮＶＳｃ１（ｐＫＩＭ−ＵＲＡ−ＮＣＰ１−Ａ１）株を３００ｍＬ容三角フラスコに仕込んだ４０ｍＬのＳＤ０．２５−Ｕ培地に植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で一晩培養した。その後、４．４ｍＬの２０％ガラクトース水溶液を培養液に添加し、さらに３０℃、１８０ｒｐｍの旋回振盪で２４時間培養を継続した。培養終了後、５０ｍＬ容コニカルチューブに培養液を全量移し、２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離し、上清を除いた後、１０ｍＬの水を添加し懸濁後、再度２，０００×ｇ、３分、室温で遠心分離して菌体を洗浄した。続いて、菌体を８ｍＬのＳＧ溶液で懸濁し、酵母懸濁液から１ｍＬずつを４本の試験管に採取し、そこへ６０μＬの２５％  メチル−β−シクロデキストリン（和光純薬工業）水溶液、及び、５０μＬの２％  １１−デオキシコルチコステロン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）のメタノール溶液、１％
１７α−ヒドロキシプロゲステロン（ナカライテスク）のメタノール溶液、２％  プロ
ゲステロン（和光純薬工業）のメタノール溶液、または、１％  ４−コレステン−３−オン（和光純薬工業）のメタノール溶液を加え、２８℃、２８０ｒｐｍの往復振盪で反応させた。２４時間後、反応液に２ｍＬの酢酸エチルを加えてよく混合し、室温、２，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。その上層を別の容器に移し、遠心濃縮器にて溶媒を留去して得られた固形分に０．５ｍＬのメタノールに溶解した。さらにこのメタノール溶液をメタノールで１０倍に希釈したものをＨＰＬＣ分析の試料とした（分析条件Ｃ：下に示した）。その結果、１１−デオキシコルチコステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、プロゲステロンを加えたものにおいてはそれぞれの１１−β水酸化物と同一の保持時間に吸光度ピークが確認されたが、４−コレステン−３−オンにおいては確認できなかった。このことから、プロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、および、コンパウンドＳはＰ４５０Ａ１による１１β水酸化反応の基質となるが、４−コレステン−３−オンを基質とした場合は極めて反応速度が遅いということが示唆された。
【０１３０】
分析条件Ｃ
使用カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ φ４．６×１５０ｍｍ（ナカライテスク、日本）
カラム温度；４０℃
検出方法；２５４ｎｍの吸光度
試料注入量；５μＬ
溶出条件
【０１３１】
【表８】
2014124179.tif 000010
【０１３２】
それぞれを基質として用いた場合の１１β水酸化反応について、添加した基質量とそれぞれの１１β水酸化物の蓄積濃度を表９に記す。
【０１３３】
【表９】
2014124179.tif 000011
【０１３４】
さらに、同様に調製した酵母懸濁液２ｍＬに、２０μＬの１％  ハイドロコルチゾン  メタノール溶液を添加して、上記と同様に反応し、抽出した画分について分析条件ＣでＬＣ分析したところ、わずかながらハイドロコルチゾン由来と思われる変換物（未同定）の蓄積をクロマトグラム上で確認したが、ほとんどのハイドロコルチゾンが残存していた。これにより、Ｐ４５０Ａ１の酵素によりハイドロコルチゾンが分解されないことを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明のＤＮＡを酵母等に遺伝子組換えして得られる形質転換体をコンパウンドＳ等の１１−デオキシステロイド化合物と接触させることによりハイドロコルチゾン等の有用物質が効率よく製造できる。また、当該ＤＮＡのほか、ステロール７位還元酵素遺伝子、ステロール側鎖切断酵素遺伝子、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素遺伝子、ステロイド１７α位水酸化酵素遺伝子、および／または、ステロイド２１位水酸化酵素遺伝子を酵母等に導入することにより得られる形質転換体を用いて、安価な炭素源からハイドロコルチゾン等の１１β位が水酸化された有用物質を効率よく発酵生産することができる。
【０１３６】
当該遺伝子を用いた組換え微生物によるコンパウンドＳの１１β水酸化反応については、収率および反応速度等において実用化に近いレベルである。一方で、本発明のＤＮＡのほかに、ステロール７位還元酵素遺伝子、ステロール側鎖切断酵素遺伝子、ステロイド３位酸化酵素／異性化酵素遺伝子、ステロイド１７α位水酸化酵素遺伝子、および／または、ステロイド２１位水酸化酵素遺伝子を酵母等に導入することにより得られる形質転換体を用いて、安価な炭素源からハイドロコルチゾン等の１１β位が水酸化された有用物質を効率よく発酵生産する方法においては、従来のＣＹＰ１１Ｂ１等に比べて当該遺伝子産物の１１β水酸化活性高いことから有用である。
【図１】
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【配列表】
2014124179000001.app