(57)【要約】【課題】本発明は、非誘導型のＬＰＡに対する抗体の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、ＫＬＨなどで修飾を行っていないＬＰＡを抗原として、これに対し特異的に結合する抗体を産生する抗体産生細胞を選択し、該抗体産生細胞から、ＬＰＡに対する特異性の高い抗体を産生せ、取得したことに基づくものである。さらに、得られた抗体の抗体重鎖可変領域、抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を決定した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＰＡに対する抗体であって、非誘導体型ＬＰＡを抗原として作製した抗ＬＰＡ抗体又はその機能的断片。
【請求項２】
前記抗体が、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１４７７のＤＴ４０細胞クローンから産生されることを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３】
抗体重鎖及び抗体軽鎖の相補性決定領域１〜３（CDR1〜CDR3）が、各々、配列番号１（重鎖CDR1）、配列番号３（重鎖CDR2）、配列番号５（重鎖CDR3）、配列番号７（軽鎖CDR1）、配列番号９（軽鎖CDR2）、配列番号１１（軽鎖CDR3）であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項４】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、各々、配列番号１３及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項５】
ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項６】
ヒト抗体であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項７】
請求項３に記載の抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2、重鎖CDR3、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2又は軽鎖CDR3をコードする核酸。
【請求項８】
請求項４に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする核酸又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に対する抗体、及び該抗体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、様々な物質が機能し、各々がその役割を果たすことで、生命活動が維持されている。なかでもリン脂質及びその誘導体には、僅かな量で重要な機能を担っているものを少なくなく、その機能制御が疾患の治療につながることが期待されている。
例えば、リゾリン脂質であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ；Lysophosphatidic acid、モノアシルグリセロール−３−リン酸）及びその誘導体は、いくつかの受容体を介して重要な機能を発揮する脂質メディエーターの１つである。ＬＰＡには、アシル基の長さ及び飽和度が異なるいくつかの分子種が存在する。例えば、ＬＰＡ（２０：４）と記載される分子種は、アシル基に炭素が２０個、不飽和結合が４つ含まれる分子を表し、ＬＰＡ（１６：０）はアシル基に炭素数が１６個含まれ不飽和結合が含まれない分子のことである。
ＬＰＡは細胞増殖促進作用を有し、組織傷害などによって、活性化された血小板から多量に放出され傷害の治癒のために働くことなどが知られており、血液、唾液などの体液中に見出されている。
【０００３】
LＰＡは、Ｇタンパク質と共役して細胞内情報伝達を担っており、いくつかのＧタンパク質共役受容体の存在が知られている。
主な受容体として、これまでに、ＬＰＡ１（vzg-1, EDG2）、ＬＰＡ２（EDG4）、ＬＰＡ３（EDG7）、ＬＰＡ４（GPR23, P2Y9）、ＬＰＡ５（GPR92）などが同定されている。
ＬＰＡ受容体は発生分化の過程や種々の疾患に関与していると考えられている。例えば、ＬＰＡ１はその欠損マウスにおいて嗅覚神経の発達異常が確認されており、ＬＰＡ２は大腸癌など、癌の悪性化に関与していることが示唆されている。このようなＬＰＡ受容体に関する知見から、ＬＰＡは多くの生命機能に重要な役割を果たしていると考えられる（非特許文献１）。
【０００４】
ＬＰＡのような重要な生体分子の機能解析を行う上で欠かせないツールの一つとして抗体が挙げられる。とりわけ、近年では、疾患の治療において抗体の果たす役割には目覚ましいものがあり、抗体医薬の分野は急激な進歩を遂げている。生体内において、抗体は、特定の抗原と結合して、様々な生体内防御反応、例えば、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性や、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を惹起して、癌細胞など生体において異物として認識される物の除去を行っている。このような抗体の能力に着目し、抗体医薬の研究が精力的に行われるようになってきた。多種多様な疾患の治療に対して抗体医薬を利用するためには、あらゆるタイプの疾患原因抗原に対し、迅速かつ簡便に、そして、所望の結合特性を備えた抗体を大量に供給する技術が必要となる。
【０００５】
従来、所望の物理的、生理的特徴を備えた抗体群を調製する技術として、モノクローナル抗体の作製技術が用いられていた。モノクローナル抗体を作製する場合、一般的には、生体内免疫によって生じたＢ細胞をミエローマと融合させるハイブリドーマ法が用いられる。しかし、この方法には、生体内免疫の利用によって生じる免疫寛容の他、最終的な所望の抗体を取得するまでに時間と労力が掛かることなど、多くの問題が存在している。このようなモノクローナル抗体作製技術の課題を克服した方法として、ＡＤＬｉｂ法（特許文献１及び非特許文献２）及びＡＤＬｉｂ法をさらに改良した方法（特許文献２）が知られている。ＡＤＬｉｂ法は、あらゆるタイプの抗原に対して、所望の結合特性を備えた抗体を大量かつ簡便に調製することが可能な技術である。この方法は、自律的に抗体遺伝子の多様化が進行したニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞によって構築される抗体ライブラリーから、所望の抗体を選択的に取得する技術である。ＡＤＬｉｂ法は、インビトロ系の利点である免疫寛容の回避が可能である点、迅速にＩｇＭ型の完全抗体が得られる点において、従来の技術と比較して優れている。
【０００６】
ＬＰＡはその機能の重要性及び疾患との関連性から、これまでも抗体を調製する試みが行われてきた。しかしながら、ＬＰＡなどの脂質は免疫源となりにくく、通常は、キーホールリンペット（KLH）など、免疫性を高めるような担体を抗原に結合させて、動物個体に免疫して、調製される場合が多い（特許文献３）。このような方法では、担体自体に抗体が作成されることが多く、目的の抗原を認識する抗体が取得できた場合でも、抗原に対する親和性は比較的弱くなる。
そのため、ＬＰＡなどの脂質に対する有効な抗体を取得するためには、担体などと結合した複合物を動物個体に免疫するのではなく、試験管内抗体作成法で非誘導体型の脂質そのものに対する抗体を直接調製する必要がある。しかし、現状において、試験管内抗体作成法による非誘導体型のＬＰＡに対する抗体は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許４２１４２３４号
【特許文献２】ＷＯ２００８／０４７４８０
【特許文献３】特表２０１０−５３０２１８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Choiら, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 50:157-186 2010
【非特許文献２】Seoら, Nature Biotech., 23:731-735,2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、非誘導体型のＬＰＡに対する抗体を提供するものである。
さらに、本発明は、該抗体を含む  組成物、あるいは、医薬若しくは医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、KLHなどの担体に結合させるために人工的な修飾を施した誘導体型ＬＰＡではなく、非誘導体型のＬＰＡを抗原として使用して抗体の作製を行ったところ、特異性の高い抗ＬＰＡ抗体を取得し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明の以下の（１）〜（８）である。
（１）ＬＰＡに対する抗体であって、非誘導体型ＬＰＡを抗原として作製した抗ＬＰＡ抗体又はその機能的断片。
（２）前記抗体が、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１４７７のＤＴ４０細胞クローンから産生されることを特徴とする上記（１）に記載の抗体又はその機能的断片。
（３）抗体重鎖及び抗体軽鎖の相補性決定領域１〜３（CDR1〜CDR3）が、各々、配列番号１（重鎖CDR1）、配列番号３（重鎖CDR2）、配列番号５（重鎖CDR3）、配列番号７（軽鎖CDR1）、配列番号９（軽鎖CDR2）、配列番号１１（軽鎖CDR3）であることを特徴とする上記（１）又は（２）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（４）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、各々、配列番号１３及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（５）ヒト化抗体又はキメラ抗体であることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（６）ヒト抗体であることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の抗体又はその機能的断片。
（７）上記（３）に記載の抗体の重鎖CDR1、重鎖CDR2、重鎖CDR3、軽鎖CDR1、軽鎖CDR2又は軽鎖CDR3をコードする核酸。
（８）上記（４）に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする核酸又は軽鎖可変領域をコードする核酸。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗体は、非誘導体型のＬＰＡを抗原として作製されたものである。従って、免疫原性を高めるための担体等を認識することがないため、既存の抗ＬＰＡ抗体に比べて特異性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の抗ＬＰＡ抗体を産生するＤＴ４０細胞クローンを抗体産生細胞ライブラリーから選択するために行ったELISAの結果を示す。縦軸は、O.D.450値の測定結果である。「培地のみ」は、培地のみを96穴wellに添加したコントロールの結果である。番号は、ELISAに用いた細胞のクローン番号を示す。■ＬＰＡは、ＬＰＡを抗原とした結果であり、□ｃＰＡは、対照のｃＰＡを抗原とした結果である。
【図２】図２は、図１の番号６のクローンから産生される抗体について、ＬＰＡに対する特異性を確認した結果である。対照抗原として、Cyclic-PA (cPA)、Glucosylceramide (GlcCer)、Lyso-GlcCer (LGC)、Galactosylceramide (GalCer)、Sphingosine (Sph)、Sphingomyelin (Spm)、Sphingosine-1-phosphate (S1P)、Ceramide (Cer)を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、ＬＰＡに対する抗体であって、非誘導体型ＬＰＡを抗原として作製したＬＰＡ抗体又はその機能的断片である。
本発明のＬＰＡに対する抗体（抗ＬＰＡ抗体）は、KLHなどの免疫原性を高める担体と一体化されることなく調製されるものであり、以下のような方法で調製することができる。
例えば、磁気ビーズ（例えばDynal社のM450-Epoxyなど）に抗原であるＬＰＡを結合させ、ＬＰＡが種々の配向性で結合した磁気ビーズを抗体ライブラリー（あるいは抗体を表面に提示した抗体産生細胞ライブラリー）と接触させたのち、ＬＰＡと特異的に結合する抗体（又は所望の抗体を提示した細胞クローン）をスクリーニングし、所望の抗体を取得することができる。ＬＰＡなどの脂質を磁気ビーズに結合するための詳細な方法は、特開２０１０−２８６４８１又はＵＳ−２０１０−０３１１６０８を参照のこと。また、抗体ライブラリーとしては、抗体を細胞表面に提示している細胞集団からなる抗体産生細胞ライブラリーなどが適している。このような抗体産生細胞ライブラリーとしては、ＤＴ４０細胞を用いてＡＤＬｉｂ法によって調製した抗体産生細胞ライブラリーを使用してもよい。ＡＤＬｉｂ法は、自律的に抗体遺伝子の多様化が進行したニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞によって構築される抗体ライブラリーから所望の抗体を選択的に取得する技術であり、この技術に使用すれば、あらゆるタイプの抗原に対して、所望の結合特性を備えた抗体を大量かつ簡便に調製することが可能となる（詳細は、WO2008/047480及びSeoら, Nature Biotech., 23:731-735,2005を参照のこと）。
【００１５】
本発明の抗ＬＰＡ抗体には、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１４７７として寄託されている抗体の他、抗体重鎖の相補性決定領域（CDR）のCDR1が配列番号１、CDR2が配列番号３、CDR3が配列番号５で表されるアミノ酸配列からなり、及び／又は、抗体軽鎖の相補性決定領域（CDR）のCDR1が配列番号７、CDR2が配列番号９、CDR3が配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる抗体が含まれる。
さらに、本発明のＬＰＡ抗体には、抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなり、及び／又は、抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる抗体も含まれる。
また、本発明の抗体の機能的断片には、Fab又はF(ab’)2などの抗体断片、又は、単一鎖抗体などが含まれ、本発明の抗体の一部をなすポリペプチド（あるいは、ポリペプチド複合体）であって、ＬＰＡと特異的に結合するものも本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明の抗ＬＰＡ抗体には、遺伝子組換え抗体が含まれる。遺伝子組換え抗体としては、特に限定はしないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体で、例えば、トリ由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結した抗体などを挙げることができ、キメラを作製する場合、そのように連結した抗体が得られるよう、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。抗体産生Ｂ細胞を用いた簡便なキメラ抗体の作製方法としては、例えば、特開２０１１−１０３８７６などを参考にすることができる。ここで、トリ（ニワトリ）由来抗体の可変領域として、重鎖可変領域は、例えば、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましく、軽鎖可変領域は、例えば、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。キメラ抗体の作製方法としては、例えば、本発明のキメラ重鎖又はキメラ軽鎖をベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、組換型の抗体を調製することもできる。
【００１７】
本発明のキメラ抗体には、ヒト（型）化抗体が含まれる。ヒト型化抗体は、フレームワーク領域はヒト由来で、CDRは本発明の抗体由来のものである。ヒト型化抗体は、まず、前述の本発明のCDRを有する抗体の可変領域からそのCDRをヒト可変領域に移植し、重鎖及び軽鎖可変領域を再構成した後、これらヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結することで作製することができる。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（例えば、Nature,321,522-525 1986;J.Mol.Biol.,196,901-917 1987;Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033 1989等を参照のこと）。ここで、本発明の抗体のCDR配列としては、限定はしないが、例えば、重鎖CDR1、2及び3として、各々、配列番号１、３及び５に示されるアミノ酸配列が、軽鎖CDR1、2及び3として、各々、配列番号７、９及び１１に示されるアミノ酸配列が挙げられる。
ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖を宿主細胞内において発現させるために、ヒト型化抗体重鎖又はヒト型化抗体軽鎖をベクターに挿入してもよい。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択することができる。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、宿主細胞内で抗体を再構築させて、組換型の抗体を調製することもできる。
ヒト抗体（完全ヒト抗体）とは、可変領域の抗原結合部位である超過変領域（Hyper Variable region)、可変領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ただし、超可変部位は他の動物由来（例えば、トリ由来）であってもよい。ヒト抗体は、公知の技術により当業者であれば容易に作製することができる。
【００１８】
本発明の抗体の機能的断片としては、本発明の抗ＬＰＡ抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域等）、scFv、diabody（ｓｃＦｖ二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化可変領域）、並びに、CDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fabの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、FabをコードするDNAを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でFabを発現させることで実施することができる。
また、F(ab’)2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。F(ab’)2は、抗体分子ペプシンで処理して断片を取得する他、後述するFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Fabと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。
Fab’は、上記F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’も、Fab等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。
【００１９】
scFvは、１本の重鎖可変領域（VH）と１本の軽鎖可変領域（VL）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、VH−リンカー−VLないしはVL−リンカー−VLポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、又は、一方が異なる抗原結合活性であってもよい。diabodyは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したscFvを発現するcDNAを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。
dsFvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体の重鎖可変領域、及び軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。
CDRを含むペプチドは、重鎖又は軽鎖のCDR（CDR1〜3）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体の重鎖又は軽鎖のCDRをコードするDNAを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００２０】
本発明の抗体又はその機能的断片は、これらを有効成分とした医薬又は医薬組成物として使用することができる。このような本発明の医薬は、ＬＰＡの機能に関連する疾患（例えば、創傷、炎症、線維症、免疫性疾患）の治療又は予防のために使用することができる。
本発明の医薬の有効成分としては、上述の本発明の抗体又はその機能的断片のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。塩としては、例えば、酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
【００２１】
本発明の医薬は、有効成分である本発明の抗体又はその機能的断片自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である抗体又はその機能的断片の他、１又は２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。本発明の医薬の有効成分としては、発明の抗体又はその機能的断片の２種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
医薬組成物の種類は特に限定されず、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。注射剤の場合には、本発明の抗体又は機能的断片を適宜の水性媒体、例えば、生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させて使用してもよく、さらに、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に適宜の水性媒体に溶解して用いることができる。
【００２２】
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質あるいは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００２３】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２４】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜４００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【００２５】
本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。担体として、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００２６】
本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明の医薬組成物がキットとして供給される場合、該組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
キット中に含まれる試薬は、構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料によって構成される。
【００２７】
さらに、本発明には、ＬＰＡの機能に関連する疾患の予防又は治療方法が含まれる。
ここで「治療」とは、例えば、生体内におけるＬＰＡ量の過剰に起因して発症する疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該疾患の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする処置のことである。
また、「予防」とは、例えば、生体内におけるＬＰＡ量の過剰に起因して発症する疾患等に罹患するおそれがある哺乳動物について、該疾患の発症又は罹患を予め阻止することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
【００２８】
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００２９】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
１．細胞培養及び抗体産生細胞ライブラリーの作製
ＤＴ４０細胞の培養及びＤＴ４０細胞からなる抗体産生細胞ライブラリーの作製は、WO2008/047480、及びSeoら, Nature Biotech., 23:731-735,2005に記載の方法に従って行った。
具体的には、ＤＴ４０細胞は、CO2恒温槽にて、5%CO2、39.5℃で培養した。培地は、IMDM培地（Invitrogen社）を用い、10%FBS、1%ニワトリ血清、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、2-メルカプトエタノール(55μM)を加えて使用した。また、ＤＴ４０細胞の抗体ライブラリーを作製するために使用したトリコスタチンＡ（和光純薬）は、メタノールに5mg/mLとなるように溶解したものをストックとし、適宜培地に希釈した。
【００３１】
２．ＬＰＡを結合させた磁気ビーズの作製
２−１．フォトアフィニティーリンカーの固定化とブロッキング
磁気ビーズ(Dynal社 M450-Epoxy)を200μLとり、磁気スタンドにたて、数分間の静置後、上清を除去した。Coupling Buffer（CB:0.1M NaHCO3-dioxane(1:1)）200μLを磁気ビーズに添加し、ボルテックスをかけて懸濁し、スピンダウンした後、磁気スタンドにたて、上清を除去した。これを3回行った。フォトアフィニティーリンカー（Ｎ−（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカシル）−４−（３−トリフルオロメチル−３Ｈ−ジアジリン−イル）−ベンズアミド）をCB 200μLに溶解し、洗ったビーズと混ぜた。遮光し、37℃下、 150回転 o/n で反応させた。CB 200μLで3回洗い、Blocking Solution（1M ethanolamine in 0.1M Tris-HCl pH 8.0 buffer）200μLを加えて懸濁した。遮光し、37℃下、 150回転 2時間反応させた。エタノール 200μLで3回、精製水 200μLで2回、メタノール 200μLで2回洗った。エタノール 200μLに懸濁して、ガラスのシャーレ上に100μLずつ薄く広げた。
２−２．化合物（ＬＰＡ（18:1））の固定化
ＬＰＡ 1mg/mLをエタノール 200μLに溶解し、シャーレ上に薄く広げられた磁気ビーズ（フォトアフィニティーリンカーが結合している）に満遍なく添加した。遮光し、37℃のホットプレートに乗せ、30分間エタノールをとばした。さらに、遮光下、減圧下で30分間程度乾燥した。その後、UVクロスリンカーを使用して、4J/cm2の強度のUVを照射した。UV照射後、シャーレにメタノール 200μLを添加し、チップで擦りとるように、ビーズを回収した。これを５回繰り返した。回収したビーズは磁気スタンドに立てて静置した。回収された磁気ビーズは、メタノール 200μLで10回、エタノール 200μLで2回洗浄し、最終的に、200μLのエタノールに懸濁した。
ＬＰＡを磁気ビーズに結合させる方法については、特開2010-286481又はUS-2010-0311608を参照のこと。
【００３２】
３．抗体の作製
３−１．抗体セレクションための細胞培養
Selection Buffer(1%BSA in PBS) 1mLに、上記２で調製した抗原付き磁気ビーズ5μLを懸濁し、磁気スタンドに立てた。2分間放置し、上清を除去した。これを3回繰り返し、最終的に、1mLの Selection Bufferに懸濁し、細胞と混ぜるまで氷上に置いた。
上記１で作製したＤＴ４０細胞からなる抗体産生細胞ライブラリー40mL（1×108cell）をチューブに回収し、1000回転(192 x g)10分4℃で遠心し、上清を除去した。次にSelection Buffer(1%BSA in PBS) 10mLで沈殿した細胞を懸濁した。懸濁した細胞を15mLチューブに移し、遠心後、上清を除去した。Selection Buffer 1mLで沈殿した細胞を懸濁し、マイクロチューブに移した。3500回転(1100 x g)5分4℃で遠心し、上清を除去した。Selection Bufferで洗浄済みの抗原付き磁気ビーズ5×106個と細胞を混合し、4℃で30分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。反応後、よく混ぜ、磁気スタンドに立て、氷上で5分間静置させた。次に、上清を除去し、Selection Buffer 1mLで懸濁し、磁気スタンドに立て、氷上で3分間静置させた。これを5回繰り返した。その後、抗原付き磁気ビーズと細胞の混合物をSelection Buffer 0.5mLで懸濁し、37℃で温めておいた培地 30mLに添加した。混合物をピペットでよく懸濁し、96穴プレートの２レーン目から300μL/ウェルとなるように添加した。初めの1レーンの1ウェルは空けておき、その下7ウェルにバックグラウンド用コントロールとして培地を300μLずつ入れた。その後、96穴プレートを39.5℃で 1週間 CO2インキュベートで培養した。
【００３３】
３−２．ELISAによる抗体のセレクション
ターゲット抗原(LPA)とコントロール抗原(cPA: cyclic-phosphatidic acid)を、それぞれエタノールで0.5μg/mLになるように希釈し、100μLずつ96穴ポリソーププレート（Nunc社）に加え、エタノールを蒸発させ、イムノプレートを作成させた。エタノールの蒸発後、Blocking Buffer（1%BSA in PBS） 200μLを加えて、室温で30分間以上ブロッキングさせた。その後、Blocking Bufferを除去し、Wash Buffer(PBS) 200μLで3回洗浄した。洗浄後、Wash Bufferをよく切り、上記３−１の培養上清(ＤＴ４０細胞から産生される抗体が含まれる) 100μLずつを、ターゲット抗原のwellとコントロール抗原のウェルに添加し、室温で1時間反応させた。その後、培養上清を除去し、Wash Buffer 200μLで5回洗浄した。次に、二次抗体(anti Chicken IgM-HRP)をBlocking Bufferで10,000倍希釈した溶液100μLを各ウェルに添加し、室温で45分間反応させた。反応後、二次抗体の液を捨て、Wash Buffer 200μLで5回洗浄し、ウェル中の液を十分に除去した。次に、TMB+(Dakocytomation社 : TMB+ Substrate-Chomogen, Ready To Use, Non-Flammable S1599) 100μLを、5秒間毎、各レーンに添加していき、室温で3分反応させた。その後、1N硫酸100μLをTMB+の時と同様に、5秒ごとに各レーンに入れ、450nmの吸光度を測定した。
ELISAの結果、O.D.450値が1.0以上の抗体産生細胞クローンを、数クローン取得することができた（図１）。
【００３４】
さらに、得られた細胞クローン（図１の番号６のクローン）から産生される抗体のＬＰＡに対する特異性を確認するために、以下の脂質・化合物を対照抗原として、番号６のクローンの培養上清に対してELISAを行った。
Cyclic-PA (cPA)、Glucosylceramide (GlcCer)、Lyso-GlcCer (LGC)、Galactosylceramide (GalCer)、Sphingosine (Sph)、Sphingomyelin (Spm)、Sphingosine-1-phosphate (S1P)、Ceramide (Cer)
その結果、番号６の細胞クローンから産生される抗体は、対照抗原にはほとんど反応せず、ＬＰＡに特異的に反応することが確認できた。この番号６のＤＴ４０細胞クローンを「ADLib L2-1」と名付けた。
ADLib L2-1は、２０１２年１２月７日付で、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（〒２９２−０８１８）、ＮＩＴＥ  特許微生物寄託センター（NPMD）に、受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−１４７７として寄託された。
【００３５】
４．ADLib L2-1細胞クローンから産生される抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列解析
上記番号６の細胞クローンを培養し、2×106cellsを回収した。トリゾール法によりRNAを抽出し、100μLに溶出して-80℃で保存した。次に、保存したRNAを使用して、RT-PCRを行った。RT-PCRは以下の抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を増幅するためのプライマーセットを用いて、Invitrogen Superscript III one-step RT-PCRを使用し、使用説明書に従って行った。
Lv-Fw（軽鎖用上流プライマー）：5’-GACACACAGCTGCTGGGATTCC-3’（配列番号１７）
Lv-Rv（軽鎖用下流プライマー）：5’- TCCTCCTTTGACGGTGGGAAGAG-3’ （配列番号１８）
Hv-Fw（重鎖用上流プライマー）：5’- GACCAGTCGGCTCCGCAACCATG-3’ （配列番号１９）
Hv-Rv（重鎖用下流プライマー）：5’- GACGGTGTAGACGGAGTCGGAGG-3’ （配列番号２０）
増幅されたDNA断片をアガロースゲルで電気泳動をし、700bp付近のバンドを切り出し、切り出したゲルからDNAを抽出した。抽出したDNAの塩基配列は、Macrogen社に依頼して配列決定を行った。
その結果、重鎖可変領域をコードする核酸配列は配列番号１４であり、軽鎖可変領域をコードする核酸配列は配列番号１６であった。また、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１３であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５であることが分かった。
さらに、Kabatら((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth edition U. S. Department of Health and Human Services,U. S. Government Printing Office)によって定義されるCDRアミノ酸配列配が明らかとなった。抗体重鎖のCDR1、CDR2、CDR3は、各々、配列番号１、３及び５であり、抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3は、各々、配列番号７、９及び１１であった。また、各CDRをコードする核酸配列は、重鎖のCDR1、CDR2、CDR3は、各々、配列番号２、４及び６であり、抗体軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3は、各々、配列番号８、１０及び１２であった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、KLHなどの担体で修飾を行っていない非誘導型ＬＰＡに対する抗体を提供する。この抗体はＬＰＡに対する特異性が高く、ＬＰＡの検出に有用である。また、本発明の抗体は安価で提供することが可能であることから、ＬＰＡが関連する生命現象の機能解析に有効である。
【図１】
2014124153.tif 000002
【図２】
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【配列表】
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