(57)【要約】【課題】結核菌を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、および当該プローブを用いた結核菌の検出方法を提供すること。【解決手段】結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子中の特定領域の配列、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブ、および前記プローブと前記ｒＲＮＡの一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと前記ｒＲＮＡの一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いたｒＲＮＡ検出方法により、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、５に記載の配列のいずれか、またはそれらの相補配列からなる、試料中に存在する結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子中の特定塩基配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
試料中に含まれる結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）を用いて、以下（１）から（５）の工程によりＲＮＡを増幅し、当該増幅の過程でまたは当該増幅後、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、当該特定塩基配列を検出する、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出方法。
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
【請求項３】
第一のプライマーが配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
第二のプライマーが配列番号１４に記載の配列中３’末端から連続する１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程の前に、
前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項３または４に記載の検出方法。
【請求項６】
配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号２、４、５に記載の配列のいずれか、またはそれらの相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、高感度かつ特異的に結核菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブおよび当該プローブを用いた結核菌の検出方法
に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は結核菌によって発症する感染性疾患である。感染性疾患の診断には感染起因菌の迅速で確実な同定が必要であることから、結核菌同定検査は臨床上極めて重要である。
【０００３】
従来、結核菌の同定検査は培養法により行われていたが、核酸増幅法を利用した迅速同定検査法が開発され、短時間で結核菌を同定することが可能となった。利用されている核酸増幅法の一例として、ＰＣＲ法（特許文献１から３参照）があげられる。しかしＰＣＲ法は、急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
【０００４】
一定温度で核酸を増幅する方法も知られている。そのような方法として、ＬＡＭＰ法（非特許文献１参照）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献４および５参照）、ＴＭＡ法（特許文献６参照）等が報告されている。これらの核酸増幅方法では、核酸増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させたオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより、増幅された核酸を検出するが、これらの検出法は操作が煩雑であり、再現性良く定量できないという課題がある。
【０００５】
簡便にＲＮＡを増幅および検出する方法としては、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素および必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、ＲＮＡポリメラーゼによって標的となるＲＮＡの特定塩基配列を含むＲＮＡを合成し、当該ＲＮＡを引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とする連鎖反応を行なう方法がある（特許文献７および非特許文献２参照）。この方法では、インターカレーター性蛍光色素で標識され、標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素が相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、蛍光特性の変化を検出するものであり、簡便、一定温度、かつ一段階でＲＮＡ増幅および検出を同時に実施することが可能である。
【０００６】
以上の各方法は、いずれもオリゴヌクレオチドプローブを使用して核酸を増幅するものであるが、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子においては、結核菌に特異的な領域にダイマーやループ等の高次構造を形成しやすい箇所が含まれているため（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＢＸ８４２５７６の８９００８番目から８９０１７番目までの領域）、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子を高感度かつ特異的に検出するプローブを設計することは極めて困難である。中でも比較的低温の一定温度（４０から５０℃が好ましい）条件下で標的とするＲＮＡの増幅検出を行なうことが可能な増幅方法を利用する場合、プローブが高次構造を形成しやすくなるため、プローブを設計することは特に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】米国特許第４９６５１８８号明細書
【特許文献４】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献５】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献６】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献７】特開２０００−０１４４００号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｈａｉ  Ｈ．Ｔ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２，１９５６−１９６１（２００４）
【非特許文献２】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、臨床上重要な結核菌を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ、および当該プローブを用いた結核菌の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明の第一の態様は、配列番号２、４、５に記載の配列のいずれか、またはそれらの相補配列からなる、試料中に存在する結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子中の特定塩基配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブである。
【００１２】
また本発明の第二の態様は、試料中に含まれる結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定塩基配列を、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマー（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）を用いて、以下（１）から（５）の工程によりＲＮＡを増幅し、当該増幅の過程でまたは当該増幅後、前記第一の態様に記載のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、当該特定塩基配列を検出する、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出方法である。
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
【００１３】
また本発明の第三の態様は、
第一のプライマーが配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである、前記第二の態様に記載の検出方法である。
【００１４】
また本発明の第四の態様は、第二のプライマーが配列番号１４に記載の配列中３’末端から連続する１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである、前記第三の態様に記載の検出方法である。
【００１５】
また本発明の第五の態様は、
第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程の前に、
前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記第三または第四の態様に記載の検出方法である。
【００１６】
また本発明の第六の態様は、
配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチドと、
配列番号２、４、５に記載の配列のいずれか、またはそれらの相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブと、
を含む、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出試薬である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、喀痰、胃液、血液、尿、便、体腔液、組織、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液等の生体由来試料から抽出された核酸を試料として、またはかかる試料をそのまま試料として、試料中に結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子の特定塩基配列が存在するか否か、さらには存在量を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブである。なお、前記試料をそのまま測定試料とする場合、および試料から核酸を抽出したものを測定試料とする場合のいずれの場合においても、結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅し、その過程でまたはその後に検出する場合には、後述する増幅のための酵素の活性を妨害する物質等を除去等しておくことが好ましい。
【００１９】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子の特定塩基配列の存在等を検出するものであるが、特定塩基配列は結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子に特異的に見出される塩基配列であり、かつ、特にｒＲＮＡにおいては、高次構造を取りにくい領域に存在する塩基配列である。前述のように、１６Ｓ  ｒＲＮＡ上で結核菌に特異的であり、かつ、高次構造を取りにくい領域は極めて限られる。なお、ｒＲＮＡを増幅して検出する場合には、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同な塩基配列ということもできる。言い換えれば、ＲＮＡの増幅工程を実施する場合には、特定塩基配列またはその相補的配列のＲＮＡ転写産物が増幅される（産生される）ことになり、該ＲＮＡ転写産物を転写するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列下流の相同鎖または相補鎖に特定塩基配列を有することになる。
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２、４または５に記載の配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドプローブであるが、ストリンジェントな条件で前記プローブにハイブリダイゼーション可能な配列からなるオリゴヌクレオチドプローブも本発明のプローブに含まれる。ストリンジェントな条件とは、既知の条件から選定可能で、特に限定されるものではないが、例えば、４２℃における５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム等が共存する条件下でハイブリダイズ可能であることを意味する。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いた検出は、例えば電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法により行なうことができる。その他にも、前記プローブを例えば検出可能な標識物質と結合等し、ハイブリダイゼーション法により検出を行なうことも可能である。標識物質としては例えば酵素、蛍光色素、放射性同位元素、発光色素等、公知のものを使用することができる。なお簡便な検出操作を可能とする、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ（米国特許５９２５５１７号、米国特許６１０３４７６号）、ＴａｑＭａｎプローブ（米国特許５２１００１５号、米国特許５４８７９７２号）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（特許３４３７８１６号）、サイクリングプローブ（米国特許５０１１７６９号、米国特許５４０３７１１号）、インターカレーター性蛍光色素標識プローブ（特許文献７および非特許文献２参照）が、好ましい本発明のオリゴヌクレオチドプローブとして例示できる。中でもインターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、後述する増幅工程の過程で検出を行なうことができるため、後述するオリゴヌクレオチドＤＮＡ、プライマー、酵素および酵素基質等を含む試薬類とともに容器に投入するだけで増幅工程と検出工程を実施することが可能なため、特に好ましい。前記特に好ましい態様では、上記の試薬等を予め容器に投入しておき、一定量の試料を分注するという操作のみで本発明を迅速に実施可能であり、しかも、例えば蛍光色素が発する信号を外部から検出可能なように容器の一部を透明な材料で構成しておけば、試料を分注した後に容器を密閉し、試料間のコンタミネーションを防止することもできる。
【００２２】
インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されず、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、シアニンやヘミシアニン等のシアニン色素、メチルレッド等のアゾ色素またはこれらの誘導体を使用することが例示できる。例えばオキサゾールイエローは、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加する色素である。このような色素は、オリゴヌクレオチドプローブの末端、リン酸ジエステル部または塩基部分に適当なリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合すれば良い。なお、増幅工程の過程で検出を行なう場合、オリゴヌクレオチドは、その３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で当該水酸基を修飾しておくことが好ましい。
【００２３】
通常、試料中に結核菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子の特定塩基配列が存在下としても、その存在量は微量である。従って本発明は、前記したようなオリゴヌクレオチドプローブを使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子を検出する工程（以下「検出工程」ということがある）に加え、１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子の特定塩基配列を増幅する工程（以下「増幅工程」ということがある）を実施することを含むものである。増幅工程に採用し得る核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法またはＴＭＡ法を例示できるが、本発明のオリゴヌクレオチドプローブが高次構造を取りにくい領域に存在する特定塩基配列に向けられたものであることから、一定温度（比較的低温）で簡便かつ迅速に実施可能なＴＲＣ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が好ましい。
【００２４】
特に好ましい増幅工程は、特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用い（ここで前記第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加している）を使用し、以下（１）から（５）の各ステップを行なうものである。
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程。
【００２５】
前述した増幅工程は、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により進行する。これらの酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用しても良く、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用しても良い。例えば、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素と二本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ合成酵素を組み合わせて使用することが例示できる。もっとも、この三つの活性を有する逆転写酵素とＲＮＡ合成酵素に、必要に応じてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素をさらに添加する等しても良い。三つの活性を有する逆転写酵素として、例えばＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素またはこれらの誘導体、中でもＡＭＶ逆転写酵素またはその誘導体が特に好ましい。ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼまたはこれらの誘導体が例示できる。
【００２６】
前述した増幅工程を進行させるためには、試料と前記各酵素に加えて、さらに、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸およびリボヌクレオシド−三リン酸を添加し、必要に応じて反応効率を調節するためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および糖等を添加し、適当な条件下で酵素反応を進行させる。例えばＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合、３５から６５℃の範囲、好ましくは４０℃から５０℃の範囲で反応温度を設定すれば良い。
【００２７】
前述した増幅工程において、第一のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡと相同の配列を含み、第二のプライマーにプロモーター配列が付加されている場合、ＲＮＡ転写産物は鋳型となるＲＮＡの相補的配列を含むことになる。プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始し得る配列であれば良く、種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的な公知のプロモーター配列を使用することができる。例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等の分子生物学的実験で通常用いられるプロモーター配列が特に制限なく使用できる。なおプロモーター配列に加えて、さらに、エンハンサー配列等の転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
【００２８】
前述した増幅工程によって配列番号２、４または５のいずれかに示した配列またはその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブによる検出対象となる特定塩基配列を増幅するための第一および第二のプライマーの組み合わせとして、配列番号７に記載の配列からなる第一のプライマーと配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなる第二のプライマーの組み合わせを例示することができるが、好ましくは配列番号７に示した配列からなる第一のプライマーと配列番号１４に示した配列中の３’末端から連続する１６塩基以上からなる第二のプライマーの組み合わせである。
【００２９】
前記した増幅工程を実施する場合、第一または第二のプライマーのいずれか一方にプロモーター配列を付加しておけば良いが、第一のプライマーにプロモーター配列を付加する場合には、第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程（前記したステップ（１））の前に、または当該ステップと同時に、前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行なうのが好ましい。このように特定塩基配列の５’末端部位で切断しておくことで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、ｃＤＮＡの３’末端を伸長させることで効率的に合成でき、結果として効率的に機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成することができるからである。切断方法としては、当該部位を特異的に切断できれば特に限定されないが、結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドＤＮＡ（以下、「切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ」とする）を添加してＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖を形成させ、当該２本鎖中のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法が、切断特異性および簡便性から好ましい。また切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために、例えばアミノ化等、適当な修飾を行なっておくことが好ましい。第一のプライマーが配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチドである場合の、切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして、配列番号１０に示した配列からなるオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００３０】
増幅工程をさらに実施する場合、検出工程は、増幅の過程でまたは増幅の後、前記したように配列番号２、４または５のいずれかに示した配列またはその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを用い、ＲＮＡ転写産物を検出すれば良い。また増幅の過程で検出工程を実施する、即ちＲＮＡの増幅とＲＮＡ転写産物の検出を同時に実施するためには、オリゴヌクレオチドプローブとして、前記したインターカレーター性蛍光色素標識プローブを使用することが特に好ましい。
【００３１】
増幅工程を実施する本発明の結核菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出は、好ましくは切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーとして配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、第二のプライマーとして配列番号１３に記載の配列中の連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、そして、インターカレーター性蛍光色素で標識した配列番号２、４または５のいずれかに示した配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して実施される。さらに好ましくは、切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡとして配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーとして配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであって、その５’末端にプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）、第二のプライマーとして配列番号１４に記載の配列中の３’末端から連続する１６塩基以上からなるオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素で標識した配列番号２、４または５のいずれかに示した配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施される。
【発明の効果】
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に見出される、結核菌に特異的な配列（特定塩基配列）を検出することが可能である。しかもこのオリゴヌクレオチドプローブは、４０℃から５０℃という、比較的低温条件でもダイマーやループ等の高次構造を形成しにくいため、温度変化を必要としないＲＮＡを特異的に増幅する増幅方法を用いて増幅工程を実施し、その過程で特定塩基配列を検出する際に特に有効である。
【００３３】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブとして、特に好ましくはインターカレーター性蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドの存在下で増幅工程を行ない、その過程で蛍光強度を経時的に検出すれば、有意な蛍光増加が認められた任意の時間で検出を終了することが可能であり、増幅に要する時間を加えても、なお結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡを３０分程度で終了することが可能である。
【００３４】
このように、本発明によれば、試料中に含まれる結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその遺伝子を迅速、高感度かつ特異的に検出することが可能となる。
【実施例】
【００３５】
以下実施例により本発明の実施の形態を説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  インターカレーター性蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドの調製
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを非特許文献２に記載の方法を参照して作製した。
【００３７】
配列番号１に記載の配列の５’末端から１３番目のＧと１４番目のＡ、配列番号２に記載の配列の５’末端から１２番目のＧと１３番目のＡ、配列番号３に記載の配列の５’末端から４番目のＧと５番目のＣ、配列番号４に記載の配列の５’末端から１６番目のＣと１７番目のＧ、配列番号５に記載の配列の５’末端から１７番目のＧと１８番目のＣ、配列番号６に記載の配列の５’末端から１１番目のＴと１２番目のＡとの間のリン酸ジエステル部分に、リンカーを介してチアゾールオレンジを結合させたチアゾールオレンジで標識したオリゴヌクレオチドを調製した。
【００３８】
実施例２  結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用オリゴヌクレオチドの評価
表１に示した組み合わせのインターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチド（以下、「ＩＮＡＦプローブ」と記載する）、第一のプライマー、第二のプライマーおよび切断用オリゴヌクレオチドを用いて、（１）から（５）に示す方法でＲＮＡの検出を行ない、検出性能と特異性について評価を行なった。
【００３９】
（１）結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ、および非結核性抗酸菌Ｍ．ｓｈｉｎｊｕｋｕｅｎｓｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡについては、それぞれ１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をクローニングし、インビトロ転写した後、精製により作製した（以下、「標準ＲＮＡ」と記載する）。
【００４０】
（２）ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、結核菌１６Ｓ  ｒＲＮＡは１０3コピー／５μＬ、Ｍ．ｓｈｉｎｊｕｋｕｅｎｓｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡは１０9コピー／５μＬまたは１０7コピー／５μＬとなるように希釈し、これらを試料として用いた。
【００４１】
（３）以下の組成の反応液２０μＬを市販の０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４２】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
１９ｍＭ  塩化マグネシウム
６１．７ｍＭ  塩化カリウム
０．０１％  コール酸ナトリウム
各０．３ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．４ｍＭ  ＩＴＰ
０．０８から０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡ
（３’末端の水酸基をアミノ基で修飾）
０．５から１μＭ  第一のプライマー
（各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモータ配列（配列番号９）を付加したもの）
０．５から１μＭ  第二のプライマー
２０から５０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ
（実施例１で調製したもの）
１０．５％  ＤＭＳＯ
（４）上記の反応液を４６℃で５分間保温後、予め４３℃で２分間保温した酵素液（組成は以下に記載）５μＬを添加した。
【００４３】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２３％  グリセロール
０．４Ｍ  トレハロース
３３．３ｍＭ  塩化カリウム
５．１から６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス製）
７１から１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン製）
０．０５ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
０．０１％  アジ化ナトリウム
０．００３％  青色１号
（５）引き続きＰＣＲチューブを直接検出可能な温調機能付き蛍光分光光度計に供し、４６℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長５００ｎｍ、蛍光波長５４０ｎｍ）を経時的に２０分間検出した。
【００４４】
表１に、結核菌に対する検出性能評価および非結核性抗酸菌（Ｍ．ｓｈｉｎｊｕｋｕｅｎｓｅ）に対する特異性評価の結果を示す。検出性能評価については結核菌のＲＮＡ試料を検出し、酵素添加時を０分として反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った比）が１０分以内に１．３５以上の場合を陽性とし、「（＋）」と表記した。１０分以内に蛍光強度比１．３５以上とならなかった場合は陰性とし、「（−）」と表記した。ただし条件［３］のみ、蛍光強度比１．１０以上の場合を陽性、１．１０未満の場合を陰性とした。
【００４５】
特異性評価については、非結核性抗酸菌のＲＮＡ試料を検出した際の２０分後の蛍光強度比が１．３５以上の場合を偽陽性とし、「（＋）」と表記した。２０分後の蛍光強度比が１．３５未満の場合を陰性とし、「（−）」と表記した。ただし条件［３］のみ、蛍光強度比１．１０以上の場合を偽陽性、１．１０未満の場合を陰性とした。
【００４６】
【表１】
2014124112.tif 000002
【００４７】
表１の結果より、条件［２］、［４］または［５］の組み合わせが結核菌に対する検出性能が良く、さらに非結核性抗酸菌の高濃度ＲＮＡに対して交差反応性を示さない組み合わせであることが分かる。条件［２］のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）は、条件［１］のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号１に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）の５’末端側を１塩基削ったものであり、条件［３］のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）と１５塩基が同じ配列である。また、条件［４］のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）および条件［５］のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号５に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）は、条件［６］のオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号６に示した配列からなるオリゴヌクレオチド）と１８塩基が同じ配列である。このように、似通った配列のオリゴヌクレオチドプローブであっても検出性能と特異性が大きく変化すること、即ち結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡを特異的かつ高感度に検出するためには、極めて厳密な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが必須であることが分かる。
【００４８】
実施例３  結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットおよび切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡの検討１
表２に示した組み合わせのＩＮＡＦプローブ、第一のプライマー、第二のプライマーおよび切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡを用いて、実施例２と同様にして結核菌標準ＲＮＡの検出（１００コピー／テスト、ｎ＝３）を行ない、検出率を調査した。１１分以内に蛍光強度比１．２０以上の場合を陽性、１．２０未満の場合を陰性とした。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2014124112.tif 000003
【００５０】
表２から、条件［７］、［１０］から［１１］、［１３］から［１４］、［１６］から［１７］（配列番号１４、１７から１８、２０から２１、２３から２４に示した配列からなる第二のプライマー）では、１００コピー／テストで検出率１００％となり、これらの第二のプライマーを用いれば結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡを良好に検出できることが分かる。
【００５１】
実施例４  結核菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットおよび切断用オリゴヌクレオチドＤＮＡの検討２
表３に示したオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、実施例２と同様にして結核菌と非結核性抗酸菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）混合時における結核菌の検出性能（結核菌５００コピー／テスト＋Ｍ．ａｖｉｕｍ  ０コピー／テストまたは５×１０6コピー／テスト）を調査した。８分以内に蛍光強度比１．２０以上の場合を陽性、１．２０未満の場合を陰性とした。結果を表３に示す。
【００５２】
【表３】
2014124112.tif 000004
【００５３】
表３から、条件［１９］および［２０］（配列番号２１および２４に示した配列からなる第二のプライマー）では非結核性抗酸菌混合時に結核菌を検出できないが、条件［１８］（配列番号１８に示した配列からなる第二のプライマー）では非結核性抗酸菌混合時においても結核菌を検出することができる。配列番号２１および２４に示した配列からなるオリゴヌクレオチドは３’末端から２番目および３番目に非結核性抗酸菌の配列とミスマッチがある一方、配列番号１８に示した配列からなるオリゴヌクレオチドは３’末端にミスマッチがある。非結核性抗酸菌混合時における結核菌検出には、３’末端へのミスマッチが重要であることがわかる。
【配列表】
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