(57)【要約】【課題】  液滴の塗布位置を絶対的な位置関係で認識し、カメラを用いずにコンパクトにかつ、簡易な機構により液滴をジェットする方式により微生物を微小液滴として、媒体上に着弾させる方法および装置を提供する。【解決手段】  本発明の液滴吐出装置は、微生物を媒体上に吐出して微生物を分離および／または配列する液滴吐出装置であって、微生物を分散させた液体を保持する保持容器と、前記保持容器に連通し前記液体を液滴として媒体上に吐出する吐出口と、前記吐出口に近接して、光計測用の光ファイバーの開口部を装備し、液滴を吐出する前記媒体上の目標地点を光ファイバーの開口部から受光した光により確定し、液滴をジェットする方式によって前記媒体上に吐出することを特徴とする。【選択図】  図１
2014082975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を媒体上に吐出して微生物を分離および／または配列する液滴吐出装置であって、
微生物を分散させた液体を保持する保持容器と、前記保持容器に連通し前記液体を液滴として媒体上に吐出する吐出口と、前記吐出口に近接して、光計測用の光ファイバーの開口部を装備し、液滴を吐出する前記媒体上の目標地点を光ファイバーの開口部から受光した光により確定し、液滴をジェットする方式によって前記媒体上に吐出することを特徴とする液滴吐出装置
【請求項２】
光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、並行又は直交しない角度になるように前記光ファイバーと前記吐出口が装備されていることを特徴とする請求項１に記載の液滴吐出装置
【請求項３】
光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、吐出口と媒体表面との間で交差する角度になるように前記光ファイバーと前記吐出口が装備されていることを特徴とする請求項２に記載の液滴吐出装置
【請求項４】
前記光計測が、蛍光、反射光、透過光及び偏光のいずれかの光を計測するによって行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の液滴吐出装置
【請求項５】
前記光計測が、1本の光ファイバーで行われることを特徴とする請求項４記載の液滴吐出装置
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液滴をジェットする方式であるインクジェットまたはジェットディスペンサーを用いた微生物をスクリーニングするための装置あるいは、微生物をソーティングするための装置に係り、微生物を個別に分離および／または配列する手段および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界の存在する微生物は膨大な種類および数存在し、これらの中から、医薬品開発、食品・化成品などの材料製造開発、バイオエタノール、バイオレメディエーションなどの利用のために、有用微生物の探索が行われている。その探索（スクリーニング）プロセスは、微生物採取、前処理（不純物分離、濃縮、希釈、培養液への分散）、培地上への配置、培養、アッセイなどを含む。これらのプロセスは、ほとんどが手作業によって行われており、非常に多くの人手、時間および費用を要する。
【０００３】
この問題に対して、短時間に、多数の微生物の分離操作を実現できる方法として、インクジェットやディスペンサーを用いて、微生物を個別に、微小液体に含ませて塗布する方法がある（特許文献１）。この方法では、１フェムトリットルから１マイクロリットル程度の微小液滴をその液滴に近似の大きさの収納スペースに配置すること、すなわち、媒体である凹凸を形成した平板の凹部分に液滴を配列することが必要である。
印刷装置などで汎用されているインクジェットでは、基本的には紙や平板板などの平坦な面に、塗布する液滴の全体の配置において、相対的位置が正確となるように塗布できているが、液滴の塗布位置を、特定の位置から開始し、液滴の塗布配置全体の相対的位置を正確にできる方法は何ら先行する技術がない。故に、媒体の凹凸が規則正しく配列配置されていたとしても、その凹凸の末端の部分の位置情報が得られず、かつ、その位置情報に基づいて、液滴の塗布の開始点を定めることができなければ、液滴を凹凸の凹部分に塗布し配置することができない。逆に、凹凸部分の末端の部分の位置決めができ、その末端の凹部分を塗布開始点と設定できれば、インクジェットなどを用いることにより、塗布される液滴全体の相対的位置が規則正しく設定できるので、結果として、媒体の全体の凹部分に規則正しく、液滴を配列することができる。
【０００４】
インクジェットやジェットディスペンサーの塗布の位置の正確さを実現するために、液滴の形状および液滴の飛行軌跡の観察により液滴が目標物に着弾したときの目標位置とのずれを補正する方法が開示されている（特許文献２）。この方法によれば、飛行する液滴を観察するためにカメラを備えているが、そのカメラは、高速で飛行する液滴を捉えるための機能と機構を備える必要がある。具体的には、液滴が吐出されるタイミングに同期してシャッターを制御することや、高速で空間を飛行する液滴の画像を捉えるために、カメラを連写すること、および、短時間で画像情報を得る必要があるので、カメラの露出時間が短くなるため、カメラの感度が必要であり、このような機能や機構を備えた画像撮影装置は、カメラと液滴を吐出するジェットディスペンサーやインクジェットなどの吐出開始の制御信号を同期する配線と制御回路があり、複雑な機構となる上に、カメラの撮影の露出時間が短いので、シャッターの制御を高速かつタイミングに合わせるための同期制御が精密に行うことができる機械機構と電子制御機構の組み合わせとなり複雑であり、それら複雑な仕組みの一部分でも不具合が発生すると、全体としての機能は損なわれ、結果として、実際作動に伴う誤動作や故障の発生頻度も高くなる。また、液滴の画像情報である画像データはデータ量が多く、パソコンなどの目的のために情報処理するための装置およびソフトウェアも必要となり、演算処理能力の高い装置が必要となり、解析するソフトウェアも作成が必要となる。光学機構を備えるカメラは、インクジェットやディスペンサーの塗布装置部分に比較して、装置容積が大きく、実際の液滴の飛行経路からは、一定距離を離して、配置されている。また、液滴塗布する装置全体の装置空間をカメラが大きく占有するため、装置構成全体が大きくなる問題がある。また、逆に、カメラの占有が大きいので、塗布できる範囲が制限される場合がある。
【０００５】
微小液滴の塗布方法ではないが、凹凸形状に対応して塗布する目的において、ディスペンサーの塗布制御にカメラでの画像解析を利用する方法が開示されている（特許文献３）。この方法においてもディスペンサーでの塗布をカメラで観察して、その観察画像をフィードバックして制御している。しかし、この方法は、微小液滴の制御に対応した方法ではなく、また、カメラによる画像解析を用いることは、インクジェットでの方法と同じ方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１３７２８８号公報
【特許文献２】特開２００５−２０５３１７号公報
【特許文献３】特開２００９−１７２４５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記先行技術の問題点を解決するために、液滴の塗布位置を絶対的な位置関係で認識し、カメラを用いずにコンパクトにかつ、簡易な機構により液滴をジェットする方式により微生物を微小液滴として、媒体上に着弾させる方法および装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、光計測用の光ファイバーを用いることによって、上記課題を解決した微生物を分離および／または配列する液滴吐出装置を完成した。
すなわち、本発明は、以下の特徴を有する液滴吐出装置である。
【０００９】
〔１〕  微生物を媒体上に吐出して微生物を分離および／または配列する液滴吐出装置であって、
微生物を分散させた液体を保持する保持容器と、前記保持容器に連通し前記液体を液滴として媒体上に吐出する吐出口と、前記吐出口に近接して、光計測用の光ファイバーの開口部を装備し、液滴を吐出する前記媒体上の目標地点を光ファイバーの開口部から受光した光により確定し、液滴をジェットする方式によって前記媒体上に吐出することを特徴とする液滴吐出装置。
〔２〕  光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、並行又は直交しない角度になるように前記光ファイバーと前記吐出口が装備されていることを特徴とする前記〔１〕に記載の液滴吐出装置。
〔３〕  光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、吐出口と媒体表面との間で交差する角度になるように前記光ファイバーと前記吐出口が装備されていることを特徴とする前記〔２〕に記載の液滴吐出装置。
〔４〕  前記光計測が、蛍光、反射光、透過光及び偏光のいずれかの光を計測するによって行われることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の液滴吐出装置。
〔５〕  前記光計測が、1本の光ファイバーで行われることを特徴とする前記〔４〕の液滴吐出装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、微生物スクリーニングや微生物ソーティングを行う装置において、高性能カメラとその撮影同期のための機構および画像解析システムが不要で、簡略な装置構成で微小液滴を絶対的な位置関係で媒体上に着弾させることができる。
特に、凹凸形状を持つ媒体の凹部分に微小液滴を確実に着弾させることができる。
また、同じ装置構成で微生物が増殖や反応しているかどうかの微生物の評価を行うことができる。
さらには、装置の液滴吐出口から液滴が吐出されたことが確認できる装置とすることもできる。
【００１１】
カメラでの液滴観察を行う場合であれば、液滴吐出部分の移動機構および固定機構に加えて、カメラの移動機構および／または固定機構が必要であったこと対して、光ファイバーを用いることで、液滴吐出部分の移動機構および固定機構が光ファイバーの移動機構および固定機構の役割を果たすこととなり、装置構成が簡略化され、より省スペースで、経済的にも好ましい装置構成とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ジェットディスペンサーを用いた微生物を媒体上に吐出して微生物を分離および／または配列する液滴吐出装置を示す図。
【図２】凹凸部分を有する媒体の斜視図。
【図３】凹凸部分を有する媒体の断面図。
【図４】媒体の凸部分の透過光計測を説明する模式図。
【図５】媒体の凹部分を透過光計測して凹部分であることを検出することを説明する模式図。
【図６】媒体を液滴吐出口に位置合わせを行い、媒体の凹部分に液滴を吐出することを説明する模式図。
【図７】媒体の凸部分の蛍光標識を検知することを説明する模式図。
【図８】媒体を液滴吐出口に位置合わせを行い、媒体の凹部分に液滴を吐出することを説明する模式図。
【図９】媒体の凸部分の反射光計測を説明する模式図。
【図１０】媒体の凹部分を反射光計測して、凹部分であること（反射がない）を検出することを説明する模式図。
【図１１】媒体を液滴吐出口に位置合わせを行い、媒体の凹部分に液滴を吐出することを説明する模式図。
【図１２】ベンゼン雰囲気下で保持した媒体の蛍光計測と対照の蛍光計測結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の液滴吐出装置は、微生物を分散させた液体を保持する保持容器と、前記保持容器に連通し前記液体を液滴として媒体上に吐出する吐出口と、前記吐出口に近接して、光計測用の光ファイバーの開口部を装備し、液滴を吐出する前記媒体上の目標地点を光ファイバーの開口部から受光した光により確定し、液滴をジェットする方式によって前記媒体上に吐出することにより、正確に吐出液滴を絶対的な位置関係で媒体上に着弾させることができる。
【００１４】
本発明の液滴吐出装置に用いられる液滴をジェットする方式は、微生物を分散させた液体を保持する保持容器から、連通した吐出口を有する従来からあるインクジェット方式またはジェットディスペンサー方式等の液滴をジェットする方式を用いることができる。インクジェット方式の具体例としては、特許文献１に記載されている装置を挙げることができる。インクジェットの駆動の方式としては、ピエゾなどの圧電素子による駆動の方式や、加熱部の急速加熱によるバブル発生のバブルを利用したジェット方式などを挙げることができるが、液滴を加熱することのないピエゾ方式の方が好ましい。
ジェットディスペンサーは、コンプレッサーやボンベからの圧力を有するガスにより液体を保持する保持容器内の圧力を高め維持しながら、電磁弁を短時間解放する方式などを挙げることができる。ジェットディスペンサーは、保持容器内圧力と電磁弁の解放時間と吐出口の開口径とにより、吐出する液滴容量を変化させることができ、液滴を加熱することのないので好ましい。
【００１５】
前記の液滴吐出装置を用いれば、吐出口から、高速で多数の微小な液滴を媒体上に吐出することができる。吐出される液滴の体積は、通常、１フェムトリットル（ｆｌ）から１マイクロリットル（μｌ）が好ましく、さらに好ましくは１ピコリットル（ｐｌ）から１００ナノリットル、最も好ましくは１０ピコリットルから１０ナノリットルに制御して吐出するのが良い。液滴の体積（粒径）は、吐出口のノズルの内径および圧力発生部材により液体にかかる圧力等を制御することにより制御し得る。
【００１６】
本発明の液滴吐出装置から吐出される液滴の標的となる媒体は、平板状の形状のものが用いられる。平板の形状としては、矩形であることが好ましいが、円盤、楕円盤形状でも、三角形等の多角形の形状でもよい。
材質は、ガラス、セラミックス、金属、シリコン、石英、プラスチック等を用いることができる。その中でも滅菌処理に対応できる材質であることが好ましく、蒸気滅菌処理を行えるガラスやプラスチックであることが好ましく、あるいは、ガンマ線滅菌処理であればガンマ線を透過できるプラスチックであることが好ましく、あるいは、乾熱滅菌では、150℃程度の加熱処理ができるガラスや金属や石英やセラミックスが好ましい。
【００１７】
媒体の表面形状は、凹凸形状でもよく、個々の液滴が着弾後に独立して液滴を保持できるのであれば凹凸形状がない平坦な状態でもよい。本発明においては、前記液滴吐出装置から前記媒体上に高速で多数の液滴を吐出することができるので、凹凸形状の媒体上には、規則的又は不規則に多数の凹部形状が設けられている。媒体上の凹部の個数は、媒体の大きさ、凹部形状間の間隔、凹部形状の大きさによって、任意に設けることができるが、通常は数千個以上である。
媒体の凹凸形状を規則正しい幾何学形状に設ける場合の一例を示すとリソグラフィー技術などを利用することができ、媒体中の凹部分とその隣の凹部分の間隔は、媒体中の他の凹部分とその隣の凹部分の間隔と同じに作製することができる。
凹凸形状がない平坦な媒体上に液滴を吐出する場合には、媒体として、引用文献１に記載した疎水性（撥水性）領域と親水性領域とを有する媒体、帯電領域と非帯電領域とを有する媒体及び所定のパターンに形成された電極を有する媒体のいずれかを用いることができる。
【００１８】
前記液滴吐出装置から前記媒体上への液滴の吐出は、吐出ヘッドおよび媒体の少なくとも一方を任意の方向に独立して移動させることによって吐出すればよいが、通常は、吐出ヘッドおよび媒体の少なくとも一方を直交する２方向に独立して移動させることによって行われる。
【００１９】
代表的には、いわゆるＸ−Ｙプロッターである。その実施形態の１例としては、吐出ヘッドをＸ方向に、媒体をＹ方向に移動させる構成を例示することができるが、吐出ヘッドをＹ方向に、媒体をＸ方向に移動させてもよい。もちろん、吐出ヘッド４および媒体１のいずれか一方をＸおよびＹの２方向に移動させてもよい。Ｘ−Ｙプロッターの構成は周知であるので、詳細な説明は省略する。
【００２０】
本発明の液滴吐出装置は、前記吐出口に近接して、光計測用の光ファイバーの開口部を装備している。そして、前記光ファイバーは、光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、並行又は直交しない角度になるように装備されていることを特徴とする。
【００２１】
さらには、光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、吐出口と媒体表面との間で交差する角度になるように前記光ファイバーと前記吐出口が装備されてもよい。
この場合、装置の液滴吐出口から液滴が吐出されたことが、光ファイバーの光計測により確認できるという特徴を併せ持つことができる。
【００２２】
本発明の液滴吐出装置の光計測で計測される光は、蛍光または反射光または透過光または偏光がある。
【００２３】
蛍光を光計測する場合は、励起光を媒体に照射し、その励起光により発生する蛍光を、光ファイバーで拾い計測する。反射光を光計測する場合は、反射光を起こす光源の光を媒体に照射して、その照射光を反射した反射光を光ファイバーで拾い計測する。
透過光を光計測する場合は、光ファイバー側から見て、媒体の反対側に光源を置き、媒体を照射した光が媒体を透過した光である透過光を光ファイバーで拾い計測する。
【００２４】
偏光を光計測する場合は、光ファイバー側から見て、媒体の反対側に光源と偏光フィルターを置き、偏光フィルターを透過して偏光となった光を媒体に照射する。その偏光と直交するように偏光フィルターを光ファイバーの光の入射口に敷設することにより媒体を照射する偏光は光ファイバーで検出されなくなるが、媒体の表面や凹部分に、複屈折特性の物質が存在すれば、光源側からの光の偏光面が変化して、光ファイバー側の偏光フィルターを通過し、結果として、光ファイバーで透過光を拾い計測することができる。
【００２５】
本発明は、インクジェットまたはジェットディスペンサーの吐出機構の吐出口の近傍に、光ファイバーの開口部を備え、その光ファイバーで媒体上の標識又は媒体の凹部若しくは凸部を光学的に計測することにより、正確に媒体上に吐出液滴を着弾させることを特徴とする。
【００２６】
インクジェットまたはジェットディスペンサーの吐出機構の吐出口の近傍に光ファイバーを固定しており、光ファイバーの光軸と、インクジェットまたはディスペンサーの液滴吐出口の相対位置は、あらかじめ決定されているので、光ファイバーで媒体の凹部分の位置を計測できれば、相対位置の情報を利用して、簡単に、液滴吐出口が正確に、凹部分に液滴を着弾できる位置に液滴吐出口を移動することができる。そして、適切な位置に液滴吐出口を移動することにより、液滴を吐出して、凹部分に微小液滴を正確に着弾させることができる。
【００２７】
媒体が凹凸形状の平板である媒体の場合は、光ファイバーで媒体上の標識又は媒体の凹部若しくは凸部を光学的に計測することにより、正確に吐出液滴を凹位置に着弾させることができる。
すなわち、媒体の凹位置を光学的に直接計測することにより、あるいは、媒体の凹位置から一定の間隔を空けた媒体の凸形状の一部分に、光信号の変化を起こすように標識をあらかじめ敷設したうえで、その標識部分を光ファイバーで光計測することにより、正確に吐出液滴を凹位置に着弾させることができる。
標識により凹位置を認識させる方法の場合は、標識と凹凸部分の相対位置に関する情報があれば、凹凸部分の位置情報が、標識を検出し認識することにより判定できる。
【００２８】
前記標識とは、光ファイバーを利用した光計測を行えるように光を光強度・照度・屈折・偏光など物理的に変化させることや蛍光物質のように光エネルギーを変換して波長変化させることを起こすことができる目印である。
【００２９】
光計測の方法が蛍光である場合には、いずれの材質の媒体を用いることができるが、媒体に自家蛍光が少ないガラスや金属を用いることが望ましく、媒体上に蛍光を発する蛍光物質を標識として敷設しておく。ここで、蛍光物質を敷設する手段としては、媒体表面に蛍光物質を塗布する、蛍光物質のシートを貼付する、蛍光物質を溶解した液を噴霧する、あるいは、インクや接着剤などに蛍光物質を混練して印刷または塗布する等がある。媒体表面の標識としての蛍光物質は、点として敷設してよく、あるいは、線形状で敷設してもよく、あるいは、幾何学模様として敷設してもよく、あるいは、凹凸の凸部分面の全面に敷設してもよい。
また、媒体が透明な素材で構成され、励起光を吸収することなく、あるいは、蛍光波長の光を透過する材料であれば、蛍光物資は、光ファイバーの端面から見れば、裏面側の媒体表面に敷設してもよい。
さらに、光を透過できる素材で媒体であって、蛍光の励起波長および蛍光波長が透過できる媒体であれば、反射光だけでなく、透過光を用いて蛍光が計測できる。
【００３０】
光計測の方法が反射光とする場合は、媒体の表面を鏡面状あるいは、乱反射する状態にすることにより、反射光の信号差を生じさせることで光計測される。
媒体の表面が金属など光反射しやすい素材または表面が鏡面処理されている媒体である場合は、媒体の一部分の表面を荒らして、入射光が散乱するようにして標識とすることができ、逆に、媒体がセラミック等のように媒体の表面に入射する光が散乱するような表面状態であれば、標識部分を鏡面処理、金属のメッキ処理あるいはスパッターなどにより蒸着処理を行って、光反射が効率よくできるように処理し標識とすることができる。表面処理により鏡面又は乱反射面とすることができれば、前記したいずれの材質の媒体も使用することができる。
【００３１】
透過光を光計測とする場合であれば、光を透過できる素材で媒体を構成すれば、透過光を検出する方法、すなわち、媒体を透過する光の強度を指標として標的部分を検出することができる。
また、媒体が光透過する素材であり、特定の屈折率を保持する素材で構成されていれば、媒体に入射した光の屈折を利用して、標的部分を検出することができる。
そして、透過光に可視光を用いる場合には、媒体に透過性があるプラスチック、ガラス、石英等を用いることが望ましい。また、透過光に紫外光を用いる場合には、媒体に透過性のある石英を用いることが好ましい。
【００３２】
凹凸部分の凹部分と凸部分の透過光強度の差異を検知することにより、凹部分の末端の位置情報を判断できる。
また、媒体が光透過する素材であり、特定の屈折率を保持する素材で構成されていれば、媒体に入射した光の屈折を利用して、凹凸部分を検出することができる。媒体の凹凸部分の反対側から入射した光は、媒体の表面から媒体の内部へ光が屈折率を持って入射し進行するが、凹凸部分の媒体の素材の厚みの差により、媒体内部から媒体外部へ出る光の経路が変化するので、その差を検出することで、凹凸部分を検出できる。
【００３３】
凹凸部分がない平坦な表面の媒体を用いることもできる。例えば、媒体の平坦な表面に印刷を行い、媒体の表面に光を透過しない部分を造ることにより、液滴の着弾する部分を区切ることができる。印刷の代わりに、フォトマスクとレジストを用いることで、金属の蒸着を行えば、透過光を用いて検出することもできるし、あるいは、反射光を用いることもできる。
【００３４】
偏光を光計測とする場合であれば、媒体を透過する光を偏光とし、媒体の標識として、媒体の表面に偏光フィルムや偏光板などの偏光特性を有する物質を用いることができる。より具体的には、媒体を透過する光の偏光面と、媒体表面の標識部分に敷設した物質の偏光面が直交するように設定すれば、標識部分のみが、光が透過しない、あるいは、透過する光の強度が弱まることにより、標識部分を検出することができる。
【００３５】
光計測のための光源は、ＬＥＤやレーザーダイオードやハロゲンランプや水銀ランプや電球であってよく、媒体に対して照射でき、かつ、光ファイバーで標識又は凹部分と凸部分の光学信号の差異が検出できればよい。
【００３６】
光を吐出ノズル側から媒体に照射する場合は、光源の光は、光ファイバーを通して照射することが好ましく、照射する光と検出する光を１本の光ファイバーで通して行うことが好ましい。
【００３７】
また、光ファイバーの端面は、集光光学系が備わっていることが好ましい。
端面の集光光学系により、光ファイバーを通す光を端面外側で集光することができ、その端面と焦点の間の距離である焦点距離が定められ、光ファイバー端面と対象物である媒体との距離を変えることによる光信号変化を利用して、光ファイバー端面と媒体との距離を計測することができる。
予め光ファイバーの端面と液滴吐出口の相対的な空間位置の情報を得ておけば、光ファイバーと媒体の距離の計測情報を基に、液滴吐出口と媒体との距離を把握することができる。
【００３８】
光ファイバーの光軸方向と液滴の吐出方向が、吐出口と媒体表面との間で交差する角度になるように前記光ファイバーと前記吐出口を装備することにより、光ファイバーの光軸を通過する液滴が、光ファイバーで計測している光を受けることにより計測中の光線が不連続になり、その光信号を光ファイバーで捉えることにより、液滴が吐出されていることを検知できる。
【００３９】
本発明は、本発明の光ファイバーの光計測機能を、液滴吐出機能と独立に利用することもでき、媒体のひとつひとつの凹部分で、スクリーニング対象の微生物が増殖や反応しているかどうかの微生物の評価を蛍光や反射光や透過光の光信号の差異を利用して行うこともできる。
微生物細胞をソーティングするために、微生物を個別に凹凸を保持した媒体に並べ、その微生物の特性を光計測で評価することもできる。
【００４０】
以下、添付の図面を参照して、本発明の一実施形態に係る液滴吐出装置についてジェットディスペンサーの例により詳細に説明する。
【００４１】
図１は、ジェットディスペンサーを用いた微生物を媒体上に吐出して微生物を分離および／または配列する液滴吐出装置１００の概略斜視図である。図１に示すように、ディスペンサーヘッド部１と空気圧をヘッド部に伝えるチューブ２４とヘッド部１の電磁弁制御用コード２５と電磁弁開閉制御器２３から構成されるディスペンサーは、微小液滴を吐出する吐出ノズル２を備え、光ファイバー３は、その光軸中心に集光する光学系である光ファイバー端の集光装置４に接続されており、前記集光装置４は、ディスペンサーのディスペンサーヘッド部１に敷設して配置している。
【００４２】
ディスペンサーヘッド部１には、吐出される液が充填されており、電磁弁開閉制御器２３により、ディスペンサーヘッド部１に組み込まれている電磁弁を開閉することにより、チューブ２４の空気圧でもって液滴として吐出される。
ディスペンサー１の吐出ノズル２の吐出口から光ファイバーの光軸との間の距離は１０ｃｍ以内が望ましく、さらには２ｃｍ以内が望ましく、さらには５ｍｍ以内が望ましいが、液滴を塗布する媒体に、ディスペンサーの吐出出口が液滴を吐出でき、上述したように媒体の標識を光ファイバーが検出できることができれば、どのような距離であってもよい
【００４３】
ディスペンサーヘッド部１と光ファイバー端の集光装置４は、ＸＹＺ移動ロボット５に連結している。ディスペンサーヘッド部１と光ファイバー端の集光装置４をＸ軸方向およびＺ軸方向にロボット５で移動させ、かつ、媒体６は、Ｙ軸方向にロボット５で移動させることにより、ＸＹＺ軸の移動を行う。図では、ディスペンサーヘッド部１と光ファイバー端の集光装置４が一体の装置として、ロボット５により移動するように図示されているが、別々に移動するように構成されてもよい。
【００４４】
ディスペンサー１はパーソナルコンピューター（ＰＣ：図示せず）との通信として、ＰＣとの制御および情報の通信２２ができ、ディスペンサーによる液滴吐出の制御が行われる。ＸＹＺ移動ロボット５もＰＣとの制御および情報の通信２２ができ、ディスペンサーヘッド部１と光ファイバー端の集光装置４をＸ軸およびＺ軸の移動制御が行われる。
【００４５】
媒体を照射する励起光を光ファイバーに送る光源器かつ媒体側からの光ファイバー導波光の検出器２１は、光ファイバー３に対して特定波長の光を送り出して、光ファイバー端の集光装置４を介して媒体に対して光を照射する。その照射により発生した蛍光は、光ファイバー端の集光装置４を介して、光ファイバー３に送り出され、媒体を照射する励起光を光ファイバー３に送る光源器２１かつ媒体側からの光ファイバー導波光の検出器２１まで導かれる。媒体を照射する励起光を光ファイバーに送る光源器かつ媒体側からの光ファイバー導波光の検出器２１は光ファイバー３を介して導かれた蛍光の強度を測定する。
【００４６】
その蛍光強度信号は、ＰＣとの制御および情報の通信２２によりデジタル情報として、ＰＣに送信される。また、ＰＣとの制御および情報の通信２２を介して、媒体を照射する励起光を光ファイバーに送る光源器かつ媒体側からの光ファイバー導波光の検出器２１の制御が行われる。
【００４７】
図２は、媒体の一例として、矩形の平板に凹凸形状を有する媒体の例を示す。図２にあるように、媒体６は、凹部分７が、規則正しく配列するように形成された平板である。
図３には、媒体の断面部分を示す図で、図２中の点線８における媒体６の凹凸形状断面９を示した。
【００４８】
図４、図５および図６は透過光を計測する方法について説明している。
図４に示したが、光源１０からの光源光１１は、媒体９の凸部分あるいは凸部分と同じ厚みの部分に照射して、その透過光である凸部分を透過した光１２を光ファイバー３に連結した光ファイバー端の集光装置４で集光して検知する。光源１０としては、図４にはＬＥＤを例示したが、限定されるものではなく、半導体レーザーやハロゲンランプや水銀ランプや蛍光灯などの光源も利用できる。
【００４９】
図５に示すように、媒体を並行移動して光源１０からの光照射部分を凹部分が照射されるように移動すれば、凹部分を透過した光１３として、透過する光強度は相対的に上昇して、光信号として照度が向上したことが検知でき、光ファイバー３の光軸が媒体の凹部分の範囲内であることが検知できる。
図５のように、凹部分の位置が検知できれば、次に、光ファイバー３の光軸位置からディスペンサーの吐出ヘッド２の吐出口位置の間隔の長さ分だけ、図６のように媒体９を移動させることにより、液滴の吐出口に媒体の凹部分位置を合せることができ、凹部分に着弾できるように液滴１４を吐出できる。
【００５０】
媒体は、リソグラフィー技術などを利用して、凹凸形状を規則正しい幾何学形状とすることができ、媒体中の凹部分とその隣の凹部分の間隔は、媒体中の他の凹部分とその隣の凹部分の間隔と同じに作製することができる。このような媒体では媒体の凹凸の一番端の凹部分が検知できれば、一定の移動距離で媒体を移動させていけば、液滴の吐出口が凹部分に一致するように、媒体を移動させることができ、１回の移動に伴い、１滴の液滴を吐出して、次に、１回の移動を行い、１滴の液滴を吐出することを、凹部分の数だけ繰り返し操作すれば、媒体の凹部分に液滴を正しく吐出し着弾させることができる。
【００５１】
媒体が幾何学的に規則正しい凹凸形状でなくても、媒体を一定の長さの距離を小刻みに移動させながら、凸部分の透過光強度と凹部分の透過光強度を計測することにより、凹部分と凸部分を識別することができ、凹部分の位置を検知して、光ファイバーの光軸とディスペンサーの液滴吐出口との距離の長さ分を媒体を移動させることにより、正確に、凹部分に着弾させることができ、続いて、液滴を吐出するためには、直前の移動した距離分を媒体を元の位置方向に移動させて、透過光を計測する操作を繰り返すことで、順番に、凹部分に液滴を着弾させ、媒体全体の凹部分に液滴を着弾させることができる。
【００５２】
媒体が光透過しない材料であっても、図７に示したように、媒体の凸部分あるいは、凸部分と同じ厚みの部分に、光学的に識別可能な標識を敷設することにより、凹部分の位置の検知が可能となる。
標識は、光ファイバーを用いて光学的に計測できる光信号を発することができるものであれば何でもよく、図７では、蛍光物質を標識として、蛍光特性を有する標識物１７を媒体に塗布している例を示している。図７では、標識の蛍光物質を励起させるための励起光１５を光ファイバー４から照射し、その励起光で発生した蛍光１６を光ファイバーで検知している。
媒体の標識部分と、一番端の凹部分との距離があらかじめ設定あるいは計測できていれば、まず、光ファイバーの光軸が凹部分の範囲に収まるように、媒体の標識部分と、一番端の凹部分との距離分を媒体移動させ、続いて、光ファイバーの光軸とディスペンサーの液滴吐出口との距離分を媒体移動させることにより、図８のように、液滴吐出口は、一番端の凹部分に着弾できる液滴１４を吐出ができる状態となる。その隣の凹部分には、媒体が幾何学的な一定パターンの凹凸形状であれば、隣り合う凹部分間の距離分を媒体移動させれば、隣の凹部分に、液滴吐出口を配置することができる。
【００５３】
媒体表面の標識としての蛍光物質は、点として敷設してよく、あるいは、線形状で敷設してもよく、あるいは、幾何学模様として敷設してもよく、あるいは、凹凸の凸部分面の全面に敷設してもよい。
【００５４】
凹部分が媒体に規則正しく、例えば、行列状態で配置していれば、その端の凹部分は、上述のように透過光などを検出することにより、位置情報を検出できる。
あるいは、規則正しく行例として配列した凹部分以外に、標識として凹部分を媒体に形成してもよい。
【００５５】
媒体が幾何学的規則正しい凹凸形状でなくても、凹部分の周辺の凸部分の面に、光計測できる標識を配置できれば、光ファイバーの光軸を移動させながら、光計測を行うことで、隣り合う凹部分を渡りながら、媒体の凹部分に液滴を吐出し着弾させることができる。
【００５６】
図9及び図１０および図１１には、反射光を計測する場合について示している。光を反射する特性を有する標識物１８を媒体に敷設し標識とすれば、その部分に光ファイバー３から送られた光が、光ファイバー端の集光装置４を介して、媒体に対して照射する光１９となり、反射特性を有する標識物１８に照射されて、反射光２０として、光ファイバー端の集光装置４を介して拾われ計測される。続いて、反射光を計測しながら、媒体を移動させると、媒体の一番端側の凹部分と光ファイバーの光軸とが一致するように移動することとなり、図１０のように光ファイバー端の集光装置４を介して媒体に対して照射する光１９が媒体を通過するようになり、結果として反射光が計測されなくなる。続いて、光ファイバーの光軸とディスペンサーの液滴吐出口との距離分を媒体移動させることにより、図１１のように、液滴吐出口は、一番端の凹部分に着弾できる液滴１４を吐出ができる状態となる。
その隣の凹部分には、媒体が幾何学的な一定パターンの凹凸形状であれば、隣り合う凹部分間の距離分を媒体移動させれば、隣の凹部分に、液滴吐出口を配置することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、本発明の実施例を例示するが、本発明はこの例に限定されるものではない。
【００５８】
（実施例１）
ディスペンサーとして武蔵エンジニアリング製のジェットディスペンサーＣｙｂｅｒＪｅｔ２を用いて、そのディスペンサーヘッドの移動には、ＸＹＺ移動ロボットとして、武蔵エンジニアリング社製のＸＹＺ駆動の卓上ロボットＳＨＯＴＭＡＳＴＥＲ−ＤＳを用いた。
ディスペンサーヘッド部をロボットに固定している治具を介して、光ファイバーの集光端面を固定する治具を固定して、ディスペンサーヘッド部と光ファイバーを一体とすることにより、ジェットディスペンサーの吐出口に光ファイバーの開口部を近接させた。
【００５９】
光ファイバーは、日本板硝子社製の蛍光検出器ＦＬＥ１１００に接続し、励起光の導光と蛍光の導光を1本の光ファイバーで行った。用いた装置の励起光波長は４７０ｎｍ、検出蛍光波長は５３０ｎｍである。光ファイバーの先端に光ファイバー端の集光装置が接続されているものを用いた。
【００６０】
励起光の光源はＬＥＤであるので、その波長スペクトルは励起光波長である４７０ｎｍを中心として長波長側と短波長側に広がりを持っており、蛍光検出装置の検出蛍光波長付近まで波長のスペクトルの裾野部分が微弱な光であるが広がっている。実際の装置計測では、光の反射が起きる面に光ファイバー端の集光装置の焦点を近接すると、微小な信号を捉えることができ、反射する物体の有無で微小な信号変化を捉えることができる。この微小信号変化を検出することで、蛍光検出装置であるが、媒体の反射特性の差異がある部分が検出できる。
【００６１】
５ｃｍの正方形形状の透明ガラス素材に、横８０個、縦８０個の合計６４００個の穴を形成させて、媒体とした。媒体の1個の穴の大きさは、直径４００μｍ、中央深さ２００μｍであり、穴と穴の間の距離は２００μｍとした。
【００６２】
媒体の標識には、シリコン系接着剤に青色励起して蛍光を発するリボフラビンを練りこみ調製したものを用いて、媒体の一番端の凹部分の穴中央から２００μｍ離れた位置に４００μｍ直径の円形状として付着させ、硬化させた。
【００６３】
アクリル板を加工して、５ｃｍ角のガラス製の媒体を固定するガイドとして作製し、ＸＹＺ移動ロボットの可動ステージにあるねじ穴を利用して固定した。
【００６４】
ＸＹＺ移動ロボットの制御と媒体を照射する励起光を光ファイバーに送る光源器かつ媒体側からの光ファイバー導波光の検出器の光信号計測の動作は、パーソナルコンピューターのプログラムにより制御した。
【００６５】
ＸＹＺ移動ロボットの駆動制御の命令送信のシリアル通信とロボットとディスペンサーヘッド部とを連結している部分の位置情報の受信のシリアル通信を行うために、シリアル通信RS２３２Cのケーブルを用いて、パーソナルコンピューターの通信端子とロボットの通信端子の間を接続した。また、光信号情報をパーソナルコンピューターに、シリアル信号を送信するために、シリアル通信RS２３２Cのケーブルを用いて、パーソナルコンピューターの通信端子と蛍光検出器の通信端子の間を接続した。
【００６６】
ロボットアームの移動速度は、毎秒２００ｍｍの速度とした。
【００６７】
パーソナルコンピューターのプログラムで、ロボットとディスペンサーヘッド部とを連結している部分を、媒体の標識の存在位置付近に移動させ、そこから、１０μｍのステップでＸ軸方向に移動させながら、光ファイバーにより光信号を検出しつつ、光信号情報と位置情報の対となったデータを取得した。次に、光信号の変化が観測された位置情報を基に基づいて、光信号の変化が観測された位置情報にＸ軸方向の移動を行った。次に、Ｙ軸方向に１０μｍピッチで、移動させながら、光信号の計測を行い、光信号の変化が起きた位置情報を得た。以上の動作により媒体の標識位置のＸＹ位置情報が得られた。
【００６８】
標識と位置情報を基に、媒体の一番端に位置する凹部分に移動させて、ジェットディスペンサーを駆動して、１個の液滴に１細胞の微生物を含ませるように液滴を吐出し、媒体中の一番端の凹部分に液滴を着弾させた。続いて、媒体上の隣の凹部分の位置で液滴を吐出できるように、Ｘ軸方向に移動させ、同様に、液滴を吐出し、この繰り返し操作を行い、Ｘ軸方向の１行中の媒体中の凹部分の数を吐出するまで繰り返した。続いて、Ｙ軸方向に移動させて、Ｘ軸の逆方向に移動させつつ、凹部分に液滴を吐出し、その操作をＸ軸方向の１行中の媒体中の凹部分の数を吐出するまで繰り返した。この操作の繰り返しを行い、媒体上のすべての行の凹部分に液滴を吐出できるまで繰り返した。この一連の操作により、媒体上の凹部分に、液滴を配列することができた。
【００６９】
（実施例２）
実際の微生物分離操作は、実施例１に記載した方法を用いた。液滴として吐出する対象の微生物溶液は、無機塩を含む緩衝液に、フルクトースおよびテトラクロロ金(III)酸を混合した溶液に土壌を懸濁し、１０μｍのフィルター濾過を行ったものを用いた。
【００７０】
無機塩を含む緩衝液は、滅菌蒸留水中に、5％の溶液A、20％の溶液B、0.1％のSS溶液、0.05％のポリペプトン及び0.025％の乾燥酵母エキスを含む溶液である。溶液Aの組成は、５００ミリリットル溶液中に、硫酸アンモニウム２０ｇ、硫酸マグネシウム２．４６５ｇ、硫化鉄7水和物０．０２７８ｇ、塩化カルシウム2水和物０．１４７ｇ、および塩化ナトリウム５ｇを溶解したものである。溶液Bは、リン酸２ナトリウム1水素１２水和物３５．８ｇおよびリン酸１カリウム２水素１３．６１ｇを含む５００ミリリットルの水溶液である。SS溶液の組成は、５００ミリリットル容積中に、硫酸亜鉛７水和物０．２０１ｇ、モリブデン酸アンモニウム４水和物０．０１５ｇ、硫酸銅５水和物０．０２ｇ、塩化コバルト６水和物０．０４ｇおよび硫酸マンガン５水和物０．１４９ｇを含む水溶液である。
【００７１】
上記の試料を顕微鏡観察して、微生物の数を計数することにより、液中の微生物の濃度を推定した。ジェットディスペンサーで吐出する直径４００μｍの１個の液滴の容積中に１個の微生物細胞が含有するように調製したうえで、ジェットディスペンサーで媒体に対して液滴を吐出した。６４００個の凹部分がある媒体への液滴の吐出は、３０分で完了した。
【００７２】
媒体に液滴を吐出したあと、２日間、室温で保持した後、本発明のシステムで反射光として光計測した。媒体の凹部分の光計測結果において、信号が他の凹部分と差がある凹部分が検出できた。
【００７３】
その凹部分には、テトラクロロ金（III）酸を還元し金属の金に変換できる微生物が存在すると考えられ、その凹部分から取り出した液を、無機塩、フルクトース、テトラクロロ金(III)酸を含有する滅菌処理した培地に接種して、５日間、室温で、維持いたところ、微生物の増殖とともに、テトラクロロ金(III)酸が還元されて金のナノ粒子として析出したことを示す紫色の呈色が観察された。
【００７４】
本発明により、金イオンを還元する微生物が短時間で分離できた。
【００７５】
（実施例３）
油分汚染土壌を実施例２で用いた組成と同じ無機塩緩衝液で懸濁して土壌懸濁液を調製し、１０μｍのフィルター濾過を行った。無機緩衝液を用いて、濾過液の１０倍希釈列の希釈試料を作製して、蛍光染色試薬アクリジンオレンジで染色して、溶液中の微生物数をオリンパスBX６０蛍光顕微鏡で観察することにより計数した。
【００７６】
ジェットディスペンサーで吐出する直径４００μｍの１個の液滴の容積中に１個の微生物細胞が含有する菌濃度に濾過液を無機塩緩衝液で希釈調製して、ジェットディスペンサーで媒体に対して液滴を吐出した。
【００７７】
ガラス製の媒体に、６４００の液滴を塗布した後、密封できるプラスチック容器であるアネロパック角型ジャーの中に、液滴を配列したガラス製媒体を入れ、さらに、ベンゼン溶液を小さいガラス容器に入れて蓋を行い密封し、室温条件で５日間保持した。ベンゼンは蒸気圧が低く、密封した容器内では気化して、媒体の凹部分の液滴にベンゼンが溶解すると考えられる。対照は、同様に液滴を塗布したガラスの媒体を、アネロパック角型ジャーの中にベンゼンを入れずに密封したものとした。
【００７８】
密封し５日経過後に蓋を開けて、ガラス製媒体を取り出し、光ファイバーでの蛍光検出を媒体上の６４００個の液滴に対して行った。微生物は細胞内にリボフラビンをビタミン成分として生合成して内包しており、青色光により青緑色の蛍光を発生させる。土壌中の微生物の中で、ベンゼンを有機物として分解利用できる微生物が存在すれば、ベンゼンを利用して増殖し、細胞数を増やす。微生物の細胞数が増加すれば、青色光照射により青緑色の蛍光信号が強く発生すると考えられる。
【００７９】
蛍光計測例として、30個の液滴の蛍光計測した結果を図１２に示した。対照と比較して、ベンゼン雰囲気下で密閉した媒体中の凹部分の蛍光強度が高いことが計測され、媒体中の凹部分に微生物が増殖していることが示された。すなわち、汚染土壌中にベンゼンを有機物として利用できる微生物が内在することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明を用いることにより、高価であり、かつ、装置空間を占有し、かつ、ディスペンサーやインクジェットの稼働範囲を制限する高性能カメラ撮影が不要となり、微生物のスクリーニングや微生物のソーティングを簡略な機構で実現することが可能となり、微生物のスクリーニング装置や微生物のソーティング装置のコストを低減でき、あるいは、コンパクト・省スペース化が図れる。
【００８１】
そのような効果により、汎用的に微生物の探索を進めることができ、微生物機能の有効利用が拡大することにより、製造プロセスなどで革新的な微生物利用が期待され、あるいは、今まで未知であった生理活性成分が容易に、短期間で探索ができ、様々な疾病治療に有効な医薬品開発や、バイオ燃料やバイオプラスチック製造技術開発に貢献することが期待される。
【００８２】
さらに、簡易な機械構成により微生物ソーティングに適用が考えられ、複雑な微生物が関与する発酵プロセスやバイオレメディエーションや排水処理の管理場面において、微生物のソーティングが、処理現場近くで対応できる可能性があり、適正な処理により処理期間の短縮などにより経済的にメリットを生じると考えられる。
【符号の説明】
【００８３】
１：ディスペンサーヘッド部
２：吐出ノズル
３：光ファイバー
４：光ファイバー端の集光装置
５：ＸＹＺ移動ロボット
６：媒体
７：媒体の凹部分
８：媒体の断面部分を示す点線
９：凹凸形状の媒体の断面
１０：光源
１１：光源の光
１２：凸部分を透過した光
１３：凹部分を透過した光
１４：吐出した液滴
１５：励起光
１６：蛍光
１７：蛍光特性を有する標識物
１８：反射特性を有する標識物
１９：照射光
２０：反射光
２１：媒体を照射する励起光を光ファイバーに送る光源器かつ媒体側からの光ファイバー導波光の検出器
２２：PCとの制御および情報の通信
２３：電磁弁開閉制御器
２４：空気圧をヘッド部に伝えるチューブ
２５：電磁弁制御用コード
１００：液滴吐出装置
【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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