【手続補正書】
【提出日】令和3年2月1日(2021.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代Ｔリンパ球に核酸を導入する方法であって、
（ｉ）該初代Ｔリンパ球を自然免疫系の阻害薬である化合物と接触させること、該化合物は、ピセタノール、ゲフィチニブ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、グリベンクラミド、Ｐｅｐｉｎｈ−ＭｙＤ、ＯｘＰＡＰＣ、ＣＬＩ−０９５、ポリミキシンＢ、Ｈ−８９、クロロキン、又はバフィロマイシンＡ１であり； 及び
（ｉｉ）該初代Ｔリンパ球を該核酸を含むレンチウイルスベクターと接触させることを含み、
該初代Ｔリンパ球と該化合物との接触が、該初代Ｔリンパ球とレンチウイルスベクターとの接触の前に行われ；かつ、これにより該核酸が該初代Ｔリンパ球中へと導入される、前記方法。
【請求項２】
前記初代Ｔリンパ球は、ヒト初代Ｔリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該初代Ｔリンパ球と前記化合物との接触が、前記初代Ｔリンパ球と前記ウイルスベクターとの接触の３時間前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記レンチウイルスベクターは、１．５〜２．５の感染効率（ＭＯＩ）で前記初代Ｔリンパ球と接触する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が、(i) 長さ１０キロベース（ｋｂ）よりも長く；(ii) 長さ９ｋｂ〜長さ２０ｋｂであり；及び/又は(iii) キメラ抗原受容体をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸がキメラ抗原受容体をコードする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、前記初代Ｔリンパ球が、前記レンチウイルスベクターと接触する前に、前記初代Ｔリンパ球を、Ｔ細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と接触させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記作用因子が、抗体または抗原結合フラグメントであり、任意に該抗体または抗原結合フラグメントがＣＤ３及び／またはＣＤ２８へ特異的に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターと接触させる前に、前記作用因子を前記初代Ｔリンパ球と２４時間接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記レンチウイルスベクターと接触させると同時に、及び/又はその後に、前記初代Ｔリンパ球を前記化合物と接触させることを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクター及び前記化合物と接触させることを、少なくとも６時間同時に行う、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、前記初代Ｔリンパ球を形質転換試薬及びサイトカインと接触させることを含み、任意に(i) 該形質転換試薬がジエチルアミノエチル−デキストラン、又はプロタミンスルファートであり、及び/又は(ii) 前記サイトカインが、インターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記初代Ｔリンパ球がヒト初代Ｔリンパ球であり、前記形質転換試薬が、ジエチルアミノエチル−デキストランであり、かつ前記核酸がキメラ抗原受容体をコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記初代Ｔリンパ球がヒト初代Ｔリンパ球であり、前記形質転換試薬がプロタミンスルファートであり、かつ前記核酸がキメラ抗原受容体をコードする、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本明細書に説明する方法の一実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ベクター、例えば、ウイルスベクターを用いた導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に、当該導入と同時に、または当該導入の後に、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に３０分間、６０分間、２時間または３時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）と同時に、かつその後２時間、４時間、または６時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に３０分間、６０分間、２時間または３時間、かつ導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）と同時にその後２時間、４時間または６時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５  ２−ＡＰ）と接触させられる。具体的な実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、それぞれ１〜２０μＭまたはｍＭの濃度で使用する。別の実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、それぞれ２．５〜１０μＭまたはｍＭの濃度で使用する。さらに別の実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、それぞれ４〜８μＭまたはｍＭの濃度で使用する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
別の具体的な実施形態において、当該化合物は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する。別の具体的な実施形態において、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する当該化合物は、ＢＸ７９５（例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭまたは１０μＭのＢＸ７９５）である。別の具体的な実施形態において、当該化合物は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する。別の具体的な実施形態において、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する当該化合物は、２−アミノプリン（２−ＡＰ）（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭまたは１０ｍＭの２−ＡＰ）である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）２−ＡＰ（例えば、２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰ）と接触させ、それにより核酸をＴリンパ球中へと導入することを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法である。具体的な実施形態において、当該初代Ｔリンパ球を２−ＡＰと当該接触させることは、当該Ｔリンパ球を当該ウイルスベクターと接触させることの前に（例えば、９０分前、２時間前、または３時間前に）及び／または同時に生じる。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法であり、この中で、ヒト初代Ｔリンパ球を２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰと接触させることは、９０分間生じ、それに次いで、ヒト初代Ｔリンパ球をウイルスベクター及び２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰと同時に５時間接触させ、それにより核酸はＴリンパ球中へと導入される。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、２−ＡＰの非存在下での（図４Ａ）または増大する濃度の２−ＡＰの存在下での（２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度における図４Ｂ）レンチウイルス導入効率を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭまたはそれより高い濃度の２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５ｍＭ〜１ｍＭ、１ｍＭ〜３ｍＭ、２ｍＭ〜４ｍＭ、３ｍＭ〜５ｍＭ、４ｍＭ〜６ｍＭ、５ｍＭ〜７ｍＭ、６ｍＭ〜８ｍＭ、７ｍＭ〜９ｍＭ、８ｍＭ〜１０ｍＭ、９ｍＭ〜１１ｍＭ、１０ｍＭ〜１２ｍＭ、１１ｍＭ〜１３ｍＭ、１２ｍＭ〜１４ｍＭまたは１３ｍＭ〜１５ｍＭの濃度の２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用いて、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランの存在下で、２４時間刺激され、それに次いで、当該リンパ球の２−ＡＰを用いた５時間の処理、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で、当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰを用いてさらに５時間処理される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で、抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用いて２４時間刺激され、それに次いで、当該リンパ球の５時間の処理、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で、当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に２．５〜１０ｍＭの２−ＡＰを用いてさらに５時間処理される。