(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに、微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて反応液を得る工程、及び、前記反応液から、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを採取する工程からなる光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法であって、
前記微生物が、デポダスカス（Ｄｅｐｏｄａｓｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、又は、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である
ことを特徴とする光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−ラクタム系抗生物質やジヒドロピリジン系化合物等の医薬品の合成中間体として有用な光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは、医薬品の合成中間体として有用である。光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法としては、光学活性な化合物から合成する方法や、プロキラルな化合物から出発して不斉合成又は光学分割する方法等が知られている。このような方法として、特開平６−１４１８７６号公報には、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元する活性を有する酵素の存在下、このＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元して光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピノリジノールを製造する方法が開示されている。しかしながら、この方法は、工業的な培養やその後の操作が困難なカビを酵素源として使用しており、また、その基質仕込濃度及び基質から生成物への転換率が低く、実用に耐えるものではなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記に鑑み、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを立体選択的に還元する酵素反応によるより効率的な光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに、微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて反応液を得る工程、及び、上記反応液から、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを採取する工程からなる光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法であって、上記微生物が、デポダスカス（Ｄｅｐｏｄａｓｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、又は、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００５】
本発明においては、まず、基質であるＮ−ベンジル−３−ピロリジノンに、微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて反応液を得る。
上記Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンは、特開昭５４−１６４６６号公報に開示されている方法で合成することができる。すなわち、ベンジルアミンとアクリル酸エチルとをマイケル付加させることにより得られるβ−アラニン誘導体に、塩基の存在下クロロ酢酸エチルを反応させる。得られる化合物を金属ナトリウム存在下で環化させ、Ｎ−ベンジル−４−カルボエトキシ−３−ピロリドンを得る。このものを塩酸により脱炭酸してＮ−ベンジル−３−ピロリジノンを得ることができる。
【０００６】
本発明においては、上記微生物として、デポダスカス（Ｄｅｐｏｄａｓｃｕｓ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ロードスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属、又は、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を用いる。これらの微生物は、上記Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンの３位のカルボニル基を立体選択的に還元する。
【０００７】
上記微生物の具体例としては特に限定されず、例えば、デポダスカス・テトラスペルマ（Ｄｅｐｏｄａｓｃｕｓ ｔｅｔｒａｓｐｅｒｍａ）ＣＢＳ  ７６５．７０、デバリオマイセス・ハンセニー・バラエティ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎｉｉ ｖａｒ． ｈａｎｓｅｎｉｉ）ＩＦＯ  ０７２８、クリプトコッカス・アルビダス・バラエティ・アルビタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｉｄｕｓ ｖａｒ． ａｌｂｉｄｕｓ）ＩＦＯ  ０３７８、ピキア・メンブランファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＦＯ  ０１８９、ロードスポリディウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ  ０４１３、トリコスポロン・ファーメンタンス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  １０６７５、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ  １３８６７、、コマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＩＦＯ  ０９４８、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＩＦＯ  １４７６、チゴサッカロマイセス・バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｌｉ）ＩＦＯ  ０５１９等を挙げることができる。これらの微生物は一般に、入手又は購入が容易な保存株から得ることができる。また、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせてより本反応に有利な性質を有する菌株を得ることもできる。また、これら微生物から組換えＤＮＡ、細胞融合等の遺伝子工学、生物工学的手法により誘導されるものであってもよい。
【０００８】
上記微生物は、栄養成分を含む培地を使用して培養することができる。上記培地としては、通常、寒天培地等の固体培地や液体培地等が用いられる。上記微生物を大量に培養する場合には、液体培地が好適に用いられる。上記培地には、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、又は、これらの混合物等の炭素源や、硫酸アンモニウム、りん酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の窒素源を混合することができる。更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合することもできる。
上記微生物の培養は通常一般の条件により行うことができ、例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜４５℃にて、好気的に１０〜９６時間培養する。
【０００９】
上記Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに上記微生物を作用させる場合においては、通常、上記微生物の培養液をそのまま反応に使用することもできるが、上記培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、上記培養液を遠心分離等により処理して得られる懸濁液を使用することが好ましい。
【００１０】
上記菌体の処理物としては特に限定されず、例えば、菌体の乾燥物、界面活性剤又は有機溶媒処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体又は菌体からの抽出酵素標品等を挙げることができる。
上記培養物の処理物としては特に限定されず、例えば、培養物の濃縮物、乾燥物、界面活性剤又は有機溶媒処理物、溶菌酵素処理物等を挙げることができる。更に、培養菌体、培養物より酵素を精製し、これを使用してもよい。
【００１１】
上記Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンに上記微生物の菌体、培養物又はそれらの処理物を作用させて反応させる際には、上記Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノンを反応初期に一括して添加してもよく、分割して添加してもよい。また、この場合の反応温度は、通常１５〜５０℃、好ましくは、２０〜４０℃であり、ｐＨは、２．５〜９．０である。
【００１２】
反応液中の上記菌体の量は上記菌体の反応の接触能力に応じて適宜使用すればよい。また、基質濃度は、０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。より好ましくは、０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ）である。
反応は、通常、振盪又は通気撹拌しながら行なう。反応時間は基質濃度、微生物量及びその他の反応条件によって適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。上記反応を促進させるために、反応液にグルコース等のエネルギー源を１〜５％の割合で加えると優れた結果が得られるので好ましい。
【００１３】
また、一般に生物学的方法による還元反応に必要とされている還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドりん酸（ＮＡＤＰＨ）等の補酵素成物を添加することにより、反応を促進させることができる。具体的には、反応系にこれらを添加してもよく、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等を生成する反応システムを反応系に添加してもよい。例えば、ぎ酸脱水素酵素がぎ酸から二酸化炭素と水とを生成する際にＮＡＤからＮＡＤＨを生成する反応や、グルコース脱水素酵素がグルコースからグルコノラクトンを生成する際にＮＡＤからＮＡＤＨ又はＮＡＤＰからＮＡＤＰＨを生成する反応を利用することができる。また、トリトン（半井化学社製）、スパン（関東化学社製）、ツイーン（半井化学社製）等の界面活性剤を添加してもよい。
【００１４】
本発明においては、次に、反応液から、生成物である光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを採取する。
上記Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを反応液から採取する方法としては特に限定されず、一般的な単離法等を採用することができる。例えば、反応液に酢酸エチル等の有機溶媒を加えて抽出し、得られる抽出液を無水硫酸ナトリウム等で脱水後、減圧下で有機溶媒を除去することにより、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの粗精製物を得ることができる。この場合においては、抽出効率を高めるために、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類を加えてもよい。また、必要に応じて、この粗精製物を、蒸留、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により更に純粋な光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールとすることもてきる。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に５ｍｌずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。
【００１７】
培地組成：
グルコース                  ４        ％
酵母エキス                  ０．３    ％
ＫＨ2 ＰＯ4                 ０．１    ％
（ＮＨ4 ）3 ＨＰＯ4         ０．６５  ％
ＮａＣｌ                    ０．１    ％
ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ        ０．８    ％
ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ        ０．０６  ％
ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ        ０．０９  ％
ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ        ０．００５％
ＭｎＳＯ4 ・４〜６Ｈ2 Ｏ    ０．０１  ％
水道水
ｐＨ７．０
【００１８】
これらの液体培地に表２に示す微生物を１白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振盪培養した。次に、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、水洗後、各菌体を１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁させて下記の反応液成分として使用した。
【００１９】
反応液組成：
（１）上記菌体懸濁液                                      １ｍｌ
（２）グルコース                                        ２０ｍｇ
（３）Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン                    １０ｍｇ
【００２０】
上記の（１）〜（３）を試験管に分注して混合し、振盪しながら３０℃で２０時間反応させた。反応後、各反応液に３．５ｍｌの酢酸エチルを加えてよく混合した。この有機層の一部をガスクロマトグラフィーに供し、Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール量を分析した。また、その光学純度をＨＰＬＣにより測定した。
【００２１】
ガスクロマトグラフィー測定条件：カラム; ＵｎｉｐｏｒｔＢ、１０％ＰＥＧ−２０Ｍ、４．０ｍｍＩＤ×１．０ｍ、カラム温度；２００℃、キャリヤーガス; 窒素、検出；ＦＩＤ
【００２２】
ＨＰＬＣ分析条件：カラム；Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ダイセル化学工業社製）、溶離液；ｎ−ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン＝９９／１／０．１、検出；２５４ｎｍ、流速；１ｍｌ／分、溶出時間；（Ｒ）体６．１分、（Ｓ）体７．９分
表１に生成物への変換率と生成物の光学純度をまとめた。
【００２３】
【表１】
0003703928.tif 000002
【００２４】
実施例２
下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１０ｍｌ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。
【００２５】
培地組成：
肉エキス            １．０％
ペプトン            １．０％
酵母エキス          ０．５％
ＮａＣｌ            ０．３％
水道水
ｐＨ７．０
【００２６】
この液体培地に、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ  １３８６７を１白金耳接種して、３０℃で２４時間振盪培養した。次に、この培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、水洗後、菌体を１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）２ｍｌに懸濁させて実施例１に示した反応液成分として使用した。２０時間反応後、実施例１と同様に生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率は８１％、光学純度は（Ｓ）１００％ｅｅであった。
【００２７】
実施例３
表３に示した微生物を実施例１と同様に培養した。次に、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、水洗後、各菌体を１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁させて下記の反応液成分として使用した。
【００２８】
反応液組成：
（１）上記菌体懸濁液                                  ０．５ｍｌ
（２）グルコース                                      ５．４ｍｇ
（３）ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド          ０．２７５ｍｇ
（４）グルコース脱水素酵素（天野製薬社製）            ２．８４ｕｎｉｔｓ
（５）Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン                  １ｍｇ
【００２９】
上記の（１）〜（５）を試験管に分注して混合し、振盪しながら３０℃で２０時間反応させた。反応後、実施例１と同様に生成物への変換率と生成物の光学純度を測定しその結果を表２にまとめた。
【００３０】
【表２】
0003703928.tif 000003
【００３１】
実施例４
表３に示した微生物を実施例１と同様に培養した。次に、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、水洗後、各菌体を１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに懸濁させて下記の反応液成分として使用した。
【００３２】
反応液組成：
（１）上記菌体懸濁液                                  ０．５ｍｌ
（２）グルコース                                      ５．４ｍｇ
（３）ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド          ０．２６ｍｇ
（４）グルコース脱水素酵素（天野製薬社製）            ２．８４ｕｎｉｔｓ
（５）Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン                  １ｍｇ
【００３３】
上記の（１）〜（５）を試験管に分注して混合し、振盪しながら３０℃で２０時間反応させた。反応後、実施例１と同様に生成物への変換率と生成物の光学純度を測定しその結果を表３にまとめた。
【００３４】
【表３】
0003703928.tif 000004
【００３５】
実施例５
実施例２と同様に、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ  １３８６７を培養した。得られた菌体を１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）２ｍｌに懸濁させて実施例３に示した反応液成分として使用した。２０時間反応後、実施例１と同様に生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率は７８％、光学純度は（Ｓ）１００％ｅｅであった。
【００３６】
実施例６
実施例２と同様に、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ  １３８６７を培養した。得られた菌体を１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）２ｍｌに懸濁させて実施例４に示した反応液成分として使用した。２０時間反応後、実施例１と同様に生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率は７８％、光学純度は（Ｓ）１００％ｅｅであった。
【００３７】
実施例７
実施例２に示した組成からなる液体培地を調製し、５００ｍｌ容坂口フラスコに１００ｍｌ分注したものを２５本用意し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この各々に、実施例２と同様にして培養したミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）ＩＦＯ  １３８６７の培養液２ｍｌを無菌的に接種して、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液より遠心分離により菌体を集菌し１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００ｍｌに懸濁した。これにＮ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｇとグルコース１０ｇを加えて３０℃で２４時間撹拌して反応させた。反応液のｐＨは６Ｎ苛性ソーダ水溶液で６．５に保った。反応後、反応液を酢酸エチル２．５Ｌで抽出し、水層をさらに酢酸エチル１Ｌで抽出した。有機層をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去した。残渣を蒸留して（Ｓ）−Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール３ｇを得た。収率６０％、光学純度９９．８％ｅｅ、沸点１３２−１３７℃／３ｍｍＨｇ、旋光度［α］Ｄ20−３．７７°（ＣＨ3 ＯＨ、Ｃ＝５）。 1Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3 ）：１６３−１．７６（１Ｈ，ｍ）、２．０９−２．２１（１Ｈ，ｍ）、２．２６−２．３７（１Ｈ，ｍ）、２．５１−２．６４（２Ｈ，ｍ）、２．７５−２．８５（１Ｈ，ｍ）、３．３８（１Ｈ，ｂｒｓ）、３．６１（２Ｈ，ｓ）、４．２４−４．３３（１Ｈ，ｍ）、７．１９−７．３７（５Ｈ，ｍ）。
【００３８】
実施例８
実施例１に示した組成からなる液体培地を調製し、５００ｍｌ容坂口フラスコに５０ｍｌ分注したものを５０本用意し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この各々に、実施例１と同様にして培養したトリコスポロン・ファーメンタンス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  １０６７５の培養液１ｍｌを無菌的に接種して、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液より遠心分離により菌体を集菌し１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００ｍｌに懸濁した。これにＮ−ベンジル−３−ピロリジノン５ｇとグルコース１０ｇ、還元型ニコチンアミドアデニン・ジヌクレオチドりん酸（興人社製）２７５ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬社製）１４２０ｕｎｉｔｓを加えて３０℃で４８時間撹拌して反応させた。反応液のｐＨは６Ｎ苛性ソーダ水溶液で６．５に保った。反応後、反応液を酢酸エチル２．５Ｌで抽出し、水層をさらに酢酸エチル１Ｌで抽出した。有機層をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／メタノール＝２／１）に供して精製し（Ｓ）Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール２．５ｇを得た。収率４９％、光学純度９６％ｅｅ、沸点１３２−１３７℃／３ｍｍＨｇ、旋光度［α］Ｄ20−３．７３°（ＣＨ3 ＯＨ、Ｃ＝５）。 1Ｈ−ＮＭＲ  δ（ＣＤＣｌ3 ）：１．６３−１．７６（１Ｈ，ｍ）、２．０９−２．２１（１Ｈ，ｍ）、２．２６−２．３７（１Ｈ，ｍ）、２．５１−２．６４（２Ｈ，ｍ）、２．７５−２．８５（１Ｈ，ｍ）、３．３８（１Ｈ，ｂｒｓ）、３．６１（２Ｈ，ｓ）、４．２４−４．３３（１Ｈ，ｍ）、７．１９−７．３７（５Ｈ，ｍ）。
【００３９】
実施例９
実施例１に示した組成からなる液体培地を調製し、５００ｍｌ容坂口フラスコに５０ｍｌ分注したものを５０本用意し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この各々に、実施例１と同様にして培養したトリコスポロン・ファーメンタンス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＡＴＣＣ  １０６７５の培養液１ｍｌを無菌的に接種して、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液より遠心分離により菌体を集菌し１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）５００ｍｌに懸濁した。これを氷冷下ブラウンの細胞破砕器により菌体を破砕後、遠心分離により得られた上清を無細胞抽出液とし、下記の反応液成分として使用した。
【００４０】
反応液組成：
（１）上記無細胞抽出液                                ０．５ｍｌ
（２）グルコース                                      ５．４ｍｇ
（３）ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド          ０．２６ｍｇ
（４）グルコース脱水素酵素（天野製薬社製）            ２．８４ｕｎｉｔｓ
（５）Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノン                  １ｍｇ
【００４１】
上記の（１）〜（５）を試験管に分注して混合し、振盪しながら３０℃で２０時間反応させた。反応後、実施例１と同様に生成物への変換率と生成物の光学純度を測定したところ、変換率は１９％、光学純度は（Ｓ）９６％ｅｅであった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法は、上述の構成からなるので、光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールを効率的に、かつ、工業的規模で生産することが可能である。また、本発明により得られる光学活性Ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールは、光学純度が高いものであり、β−ラクタム系抗生物質やジヒドロピリジン系化合物等の医薬品として有用な化合物の重要中間体である。