(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特性を有するグリセロールキナーゼ。
（１）ＡＴＰの存在下にグリセロールに作用して、グリセロール−３−リン酸とＡＤＰを生成する作用を有する。
（２）グリセロールキナーゼ濃度１Ｕ／ｍｌにおいて、７０℃、１０分間の熱処理で、８０％以上の活性を保持すること。
（３）等電点が４．４±０．５であること。
（４）グリセロールキナーゼが安定化剤の非存在下、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持すること。
（５）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が、５００００±５０００であること
（６）生産菌がフラボバクテリウム属に属する菌である
【請求項２】
請求項１に記載されたグリセロールキナーゼを製造する方法であって、フラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からグリセロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼの製造法。
【請求項３】
フラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼ生産菌がフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８）株である請求項２記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は７０℃、１０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持することを特徴とするグリセロールキナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ）およびフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するグリセロールキナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からグリセロールキナーゼを採取してなるグリセロールキナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来技術】
グリセロールキナーゼはグリセロールを基質としてグリセロール１モルおよびＡＴＰ１モルから１モルのＡＤＰおよび１モルのグリセロール−３−リン酸を生成する反応を触媒する酵素（酵素番号２．７．１．３０）として知られており（酵素ハンドブック３４１〜３４２頁、（株）朝倉書店、１９８２年発行）、また、グリセロールキナーゼ生産菌としては従来からストレプトマイセス・キャナス（特開昭５５−１６２９８７号公報）、セルロモナス・エスピー（特開昭５６−１２１４８４号公報）、バチルス・ステアロサーモフィラス（特開昭５３−２６３８９号公報）、アルスロバクター・エスピー（特開昭５９−２６８８号公報）などが知られており、臨床診断薬の分野で使用されている。
【０００３】
また、本発明者らは臨床診断薬分野において優れたグリセロールキナーゼをスクリーニングしたところセラチア・マセセンス・ＩＦＯ−３７３６株、シュードモナス・フルオレッセンス・ＩＦＯ−３９２５株、シュードモナス・プチダ・ＩＦＯ−１２６５３株を後述する参考例の培地にて培養したところ、それぞれ、０．５Ｕ／ｍｌ、０．８Ｕ／ｍｌ、１．３０Ｕ／ｍｌの培養力価でグリセロールキナーゼを生産することを見い出したが、いずれもＫｍ値や熱安定性に優れるものではなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
グリセロールキナーゼは従来、臨床診断薬分野、例えばリパーゼまたはグリセリドの存在下にグリセロール−３−リン酸オキシダーゼやグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせてグリセリドまたはリパーゼ活性の測定試薬に使用され、その他同様の酵素反応によりグリセロールの測定試薬などに使用されてきた。
【０００５】
しかし、近年、臨床診断薬分野では試薬を凍結乾燥品ではなく、液状で製品とすることが求められており、液状化試薬に対応できるような保存安定性の優れたグリセロールキナーゼや工業生産に対応できるような熱安定性の優れたグリセロールキナーゼの開発が望まれていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、熱安定性が優れ、さらに、好適には液状化試薬に対応できる安定性の優れたグリセロールキナーゼおよびその工業的生産の可能な製造法を求めて鋭意研究を重ねた結果、静岡県田方郡大仁町の畑土壌から単離したフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株と同定した微生物が安定性の優れたグリセロールキナーゼの生産能を有することを初めて見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので、７０℃、１０分の熱処理で８０％以上の活性を保持する熱安定性の良いグリセロールキナーゼ、また好適には安定化剤を添加せず、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持する保存安定性の良いグリセロールキナーゼおよびフラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からグリセロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼの製造法である。
【０００８】
以下に本発明について詳細に説明する。
まず、本発明のグリセロールキナーゼ生産菌について、フラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼを生産する能力を有する微生物であれば何ら限定されるものではなく、グリセロールキナーゼ生産能を有する変種や変異株であってもよく、好ましくはフラボバクテリウム属に属するＧＫ−５４株が挙げられる。本菌株の菌学的性質を示すと次の通りである。
【０００９】
なお、本菌株の同定に当たっては、同定実験は医学細菌同定の手引（第２版）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（３巻）に準じて行い、実験結果を医学細菌同定の手引（第２版）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．２，Ｖｏｌ．３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに対比して同定を行った。
【００１０】
生育の特徴
普通寒天平板培地
線上に良好に生育する。表面は滑らか。縁は丸い。黄色〜オレンジ色を呈する。不透明。光沢あり。
普通寒天斜面培地
線上に良好に生育する。表面は滑らか。縁は丸い。黄色〜オレンジ色を呈する。不透明。光沢あり。
液体培地
生育良好で一様に生育する。
リトマスミルク培地およびＢＣＰ培地
リトマスを還元しないが、液化および凝固が観察された。
ＤＮＡのＧＣｍｏｌ％
３５．７±１．０％（ＨＰＬＣ）
主たるイソプレノイドキノン
ＭＫ−６
形態の特徴
単独で端の丸いまっすぐな長桿菌で大きさは０．４〜０．７Ｘ１．８〜２．５μｍ。運動性はない。芽胞非形成。
0003649765.tif 000002
0003649765.tif 000003
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以上のように本菌株の主性状はグラム陰性の桿菌で非運動性であり、カタラーゼ、オキシダーゼ、フォスファターゼ陽性でグルコースを酸化的に分解し、酸を産生し、ＧＣｍｏｌ％は３５．７±１．０％、キノンタイプはＭＫ−６、芽胞非形成であり、これらの主性状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１，Ｖｏｌ．２，Ｖｏｌ．３に対比した結果、フラボバクテリウム属に属する微生物と判明した。そこで、フラボバクテリウム属の中から本菌株と似た４菌種を選び本菌株と比較した。
Ａ；フラボバクテリウム・ブレブ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）。
Ｂ；フラボバクテリウム・グレウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ）。
Ｃ；フラボバクテリウム・インドロゲネス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ）。
Ｄ；フラボバクテリウム・メニンゴセプティクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）。
【００１１】
0003649765.tif 000006
性状の比較から本菌株はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムに属すると判断された。さらに、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼイション法によりＤＮＡ相同性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）測定を行った。測定方法はマイクロプレートを用いて蛍光法により分光光学的に定量測定を行った。また、ハイブリダイゼイションの反応温度はＧＣ含量からＤＮＡの融解温度を計算し４０℃で行った。比較対象として以下の菌株を用いて行った。
Ｎｏ．１株：フラボバクテリウム・ブレブＩＦＯ−１４９３株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅＩＦＯ−１４９３：タイプカルチャー）。
Ｎｏ．２株：フラボバクテリウム・グレウムＩＦＯ−１５０５４株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｅｕｍ  ＩＦＯ−１５０５４：タイプカルチャー）。
Ｎｏ．３株：フラボバクテリウム・インドロゲネスＩＦＯ−１４９４４株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＩＦＯ−１４９４４：タイプカルチャー）。
Ｎｏ．４株：フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＩＦＯ−１２５３５株：タイプカルチャー（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍＩＦＯ−１２５３５：タイプカルチャー）
ＤＮＡ相同性（％）
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以上の結果から本菌株は、ＤＮＡ相同性がフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＩＦＯ−１２５３５株：タイプカルチャー（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ  ＩＦＯ−１２５３５：タイプカルチャー）と判断基準である７０％以上であることから前記知見と合わせて同種と判定し、本菌株をフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株と同定命名し、工業技術院生命工学技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８として寄託したものである。
【００１２】
次いで、フラボバクテリウム属に属するグリセロールキナーゼ生産菌からのグリセロールキナーゼの精製および、諸性質の検討を行った。
本発明を実施するにあたり、その培養形態としては液体培養、個体培養いずれも可能であるが工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。また使用する培養源としては一般に微生物培養に用いられる炭素源、窒素源、無機塩及びその他の微量栄養源の他、フラボバクテリウム属に属する微生物の利用できる栄養源であればすべて使用できる。
【００１３】
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、サッカロース、キシロース、マルトース、グリセロール、デキストリン、でんぷん、アミノ酸等の他、脂肪酸、油脂、有機酸などが単独でまたは組み合わせて用いられる。窒素源としては、例えば無機窒素源、有機窒素源のいずれも使用可能であり、無機栄養源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ソーダ、塩化アンモニウム等が挙げられる。また有機窒素源としては、例えば大豆、米、トウモロコシ、小麦等の粉、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、バクトソイトン等が挙げられる。
【００１４】
無機塩及び微量栄養素としては、例えばリン酸、マグネシュウム、カリウム、鉄、カルシウム、亜鉛等の塩類の他ビタミン、非イオン性界面活性剤、消泡剤等の菌の生育やグリセロールキナーゼの生産を促進するものであれば必要に応じて使用できる。
培養は好気的条件で、培養温度は菌が発育し、グリセロールキナーゼが産生する範囲であればよく、通常１５℃〜３７℃、好ましくは２５℃〜３５℃である。培養時間は条件により異なるがグリセロールキナーゼが最も産生される時間まで培養すればよく、通常２４〜１００時間程度である。
【００１５】
グリセロールキナーゼは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。グリセロールキナーゼの抽出法を例示すればまず培養物を固液分離し、得られた湿潤菌体をリン酸緩衝液やトリス−塩酸緩衝液などの溶液に分散し、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて、粗製のグリセロールキナーゼ含有液を得る。
【００１６】
粗製のグリセロールキナーゼ含有液から公知のタンパク質や酵素などの単離、精製手段を用いて精製グリセロールキナーゼを得る。例えば、粗製のグリセロールキナーゼ含有液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈澱法、硫安、食塩などによる塩析法などを適用してグリセロールキナーゼを沈澱させ、回収する。
【００１７】
さらに、この沈澱物を必要に応じ透析、等電点沈澱を行った後、電気泳動法などで単一の帯を示すまで、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィーなどにより精製する。また、これらの方法を適当に組み合わせることによりグリセロールキナーゼの精製度が上がる場合は適宜組み合わせて行うことができる。
【００１８】
これらの方法によって得られる酵素は安定化剤として、各種の塩類、糖類、タンパク質、脂質、界面活性剤などを加えあるいは加える事なく、限外濾過濃縮、凍結乾燥の方法により、液状または固形のグリセロールキナーゼを得ることができ、また、適宜凍結乾燥を行ってもよく、この場合安定化剤としてサッカロース、マンニトール、食塩、アルブミンなどを０．５〜１０％程度添加してもよい。
【００１９】
つぎに本発明で得られるグリセロールキナーゼの理化学的性質及び酵素活性測定法を述べる。
グリセロールキナーゼの活性測定法
０．２Ｍのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を０．２ｍｌ、５％のグリセロールを０．１ｍｌ、０．１ＭのＡＴＰを０．０２ｍｌ、０．１ＭのＭｇＣｌ2を０．０４ｍｌ、４５Ｕ／ｍｌのペルオキシダーゼ（シグマ社製）を０．１ｍｌ、０．３％の４−アミノアンチピリンを０．１ｍｌ、０．２５％のフェノールを０．１ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌのグリセロホスフェイトオキシダーゼ（旭化成社製）を０．２ｍｌ、および蒸留水を０．１４ｍｌよりなる反応液１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．５％のＳＤＳを２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１ｃｍセルを用いて波長５００ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また、盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素液使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルのグリセロホスフェイトを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
【００２０】
【数１】
0003649765.tif 000008
【００２１】
理化学的性質
（１）酵素作用：基質としてグリセロールを用いた酵素作用を以下に示す。
【００２２】
【化１】
0003649765.tif 000009
【００２３】
（２）基質特異性：グリセロールに基質特異性を示す。各種基質に対する特異性は表１の通りである。
【００２４】
【表１】
0003649765.tif 000010
【００２５】
（３）Ｋｍ値：３．９ｘ１０-2±０．５ｘ１０-2ｍＭ（グリセロールに対して）、５．３ｘ１０-2±０．５ｘ１０-2ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（４）等電点：４．４±０．５（キャリアー−アンホラインを用いた電気泳動法にて）
（５）分子量：１４５０００±５０００（ＴＳＫ  Ｇ−３０００ＳＷによるゲル濾過法にて）、５００００±５０００（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて）
（６）至適ｐＨ
前記酵素活性測定法にしたがって至適ｐＨを求めたもので、その結果を図１に示した。ｐＨ４．５〜６．５の範囲は１００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６．５〜７．５の範囲は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．５の範囲は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１．０の範囲は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合の活性値を示すもので、至適ｐＨは７．５〜８であった。
（７）ｐＨ安定性
１００ｍＭ各種緩衝液（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を３７゜Ｃ、６０分間処理し、その残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果を図２に示す。ｐＨ０．５〜４．０は１００ｍＭのクラークアンドルブス緩衝液、ｐＨ３．５〜７．０は１００ｍＭの酢酸緩衝液、ｐＨ６．５〜８．０は１００ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８．０〜９．０は１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０は１００ｍＭのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。ｐＨ３〜１１の範囲で最も良好な安定性を示した。
（８）至適温度
前記酵素活性測定法に従って、温度を３７゜Ｃ〜９５゜Ｃの範囲で変化させて至適温度を求めた結果は図３に示すとおりであり、本酵素の至適温度は８０゜Ｃであった。
（８）熱安定性
１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）（グリセロールキナーゼ１Ｕ／ｍｌ）を各温度で１０分間加熱処理した後の残存活性を前記酵素活性測定法に従って測定した。その結果、図４に示すとおり少なくとも６０゜Ｃまで１００％安定で、７０℃、１０分間の処理では８０％以上の残存活性を保持していた。
（９）金属イオンの影響
各種金属イオン（１ｍＭ）の本酵素活性への影響について調べた結果は表２に示すとおりで、カルシウムイオンによる弱い阻害がみられた。
【００２６】
【表２】
0003649765.tif 000011
【００２７】
（１０）Ｎ末端アミノ酸配列
Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−
（１１）保存安定性
液状化試薬の対応を目的として、０．０５％のＮａＮ3（防腐剤）を含む、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、本発明グリセロールを０．８Ｕ／ｍｌの濃度となるように調製し、３７℃で２日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後に残存活性を前記活性測定法で測定した結果、それぞれ、９４％、９１％、８１％、７１％、６０％の活性を保持していた。このことから、本酵素は安定化剤（例えばＢＳＡや糖類）の非存在下、３７℃、２週間で８０％以上の活性を保持していた。
【００２８】
以上の結果から、本発明グリセロールキナーゼと従来から知られているグリセロールキナーゼとの性質を比較すると、次のようになる。
（ＡＴＰに対するＫｍ値）
本酵素：０．０５３ｍＭ
ストレプトマイセス・キャナス由来：０．２ｍＭ
セルロモナス・エスピー由来：０．４３ｍＭ
アルスロバクター・アルトロシアネウス由来：３．７ｍＭ
（熱安定性）
本酵素：７０℃１０分間の熱処理で８０％以上の活性を保持していた。
【００２９】
セルロモナス・キャナス由来：ｐＨ７．５、４５℃、１５分間の処理で、９６％の残存活性を保持する。７０℃の処理では完全に失活する。
アルスロバクター・アルトロシアネウス由来：ｐＨ７．０、１５分間の処理で４５℃以下の温度で安定。
バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃、１０分間の熱処理で１０％の残存活性であった（図５）。
（至適温度）
本酵素：８０℃
セルロモナス・エスピー由来：５０℃付近
アルスロバクター・エスピー由来：５０℃付近
バチルス・ステアロサーモフィラス由来：６５℃±５℃
上記のように本発明グリセロールキナーゼは従来より知られている酵素とは明かに異なる性質を持っており、特に熱安定性に関しては最も優れた安定性を保持していた。
【００３０】
【実施例】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【００３１】
【実施例１】
フラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４株を１．０％のグリセロール、３．０％の肉エキス、０．５％のバクトソイトン（ディフコ社製）からなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行い、種培養液を得た。
【００３２】
種培養液を上記と同一組成培地に消泡剤を加えた培地（ｐＨ７．０）２０ｌのジャーファーメンター４基にそれぞれ２本ずつ添加し、２８℃で２２時間培養した。培養終了後、培養物を４０００ｒｐｍで遠心し、菌体３．０Ｋｇを回収した。
この菌体に１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％のトリトンＸ−１００、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）を含む、０．１％のリゾチーム溶液９ｌを加え、３７℃で９０分間反応させて可溶化を行った。その後、これを４０００ｒｐｍで２０分間遠心し、不溶物を除去してその上清９ｌ（７２０００Ｕ）を得た。
【００３３】
ついでこの上清に５．０％の硫酸プロタミン９０ｍｌを加えて沈澱物を遠心除去し、さらにその上清を５０℃で３０分間加熱し、沈澱物を遠心除去した。その遠心上清を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、Ｑ−セファロース（２．７×３０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（２９０００Ｕ）を回収した。
【００３４】
この酵素溶液に２．５Ｍの濃度となるように塩化ナトリウムを溶解し、オクチルセファロース（２．６×２０ｃｍ）（ファルマシア社製）の疎水クロマトグラフィーを行った。溶出は２．５Ｍ〜０Ｍの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより行い、０Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分（２５０００Ｕ）を回収した。ついでこの酵素液を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ハイドロキシアパタイト（１．６×２６．５ｃｍ）（ペンタックス社製）クロマトグラフィーを行った。溶出は５〜０．２Ｍのリン酸緩衝液によるリニアグラジエントにより行い、０．１〜０．１２Ｍのリン酸緩衝液の溶出画分（１６３００Ｕ）を回収した。
【００３５】
ついでこの酵素液を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて一夜透析し、ＤＥＡＥ−セファロース（１．６×２０ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムによるリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分（１２０００Ｕ）を回収し、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に一夜透析後、ＢＳＡを１％となるように添加して、凍結乾燥し、精製グリセロールキナーゼ（１２０００Ｕ、９．９Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３６】
このようにして得られたグリセロールキナーゼの理化学的性質は前記した通りである。
【００３７】
【参考例１】
セラチア・マセセンス・ＩＦＯ−３７３６株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行った。
培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。
【００３８】
その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（７０Ｕ）を得た。次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（６７Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（６７Ｕ、２５Ｕ／ｍｇ）を得た。
理化学的性質
（１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対する本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８）株と同じであった。
（２）Ｋｍ値：２．４ｘ１０-2±０．５ｘ１０-2ｍＭ（グリセロールに対して）、５．０ｘ１０-1±０．５ｘ１０-1ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液）
【００３９】
【参考例２】
シュードモナス・フルオレッセンス・ＩＦＯ−３９２５株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行った。
【００４０】
培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（１３０Ｕ）を得た。
次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（１１４Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（１１４Ｕ、３０Ｕ／ｍｇ）を得た。
理化学的性質
（１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対する本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８）株と同じであった。
（２）Ｋｍ値：２．０ｘ１０-2±０．５ｘ１０-2ｍＭ（グリセロールに対して）、２．４±０．５ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液）
【００４１】
【参考例３】
シュードモナス・プチダ・ＩＦＯ−１２６５３株を２．０％のグリセロール、２．０％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌの三角フラスコに１５０ｍｌずつ分注したものに植菌した後、２８℃、３０時間培養を行った。
培養終了後、培養物を８０００ｒｐｍで遠心し、菌体３０ｍｇを回収した。得られた菌体を１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁し、超音波破砕によって可溶化を行った。その後、可溶化液を１６０００ｒｐｍで遠心し、不溶物を除去した上清２９ｍｌ（１９０Ｕ）を得た。
【００４２】
次いで、遠心上清を８ｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液に一夜、透析した後、Ｑ−セファロース（２ｘ８ｃｍ）（ファルマシア社製）イオン交換クロマトグラフィーを行った。溶出は塩化ナトリウムの０〜０．５Ｍのリニアグラジエントにより行い、０．２〜０．３Ｍの塩化ナトリウム溶出画分（１１０Ｕ）を回収し、粗製グリセロールキナーゼ（１１０Ｕ、３０Ｕ／ｍｇ）を得た。
理化学的性質
（１）酵素作用および基質特異性：グリセロールに対する本酵素の酵素作用および基質特異性はフラボバクテリウム・メニンゴセプティクムＧＫ−５４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８６８）株と同じであった。
（２）Ｋｍ値：２．０ｘ１０-2±０．５ｘ１０-2ｍＭ（グリセロールに対して）、２．０±０．５ｍＭ（ＡＴＰに対して）
（３）至適ｐＨ：７．５（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ緩衝液）
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性の良いグリセロールキナーゼおよびその微生物学的製造法を提供できるものであり、本酵素を用いるグリセライドやリパーゼ活性などの測定のための有用かつ熱安定性の良い液状化試薬を可能とする測定用酵素を提供できた。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のグリセロールキナーゼの至適ｐＨ曲線を示す。
【図２】図２は本発明のグリセロールキナーゼのｐＨ安定曲線を示す。
【図３】図３は本発明のグリセロールキナーゼの至適温度曲線を示す。
【図４】図４は本発明のグリセロールキナーゼの熱安定曲線を示す。
【図５】図５は本発明のグリセロールキナーゼおよびバチルス・ステアロサーモフィラス由来グリセロールキナーゼの熱安定曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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