(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応担体に固定した標的ポリヌクレオチドと、該標的ポリヌクレオチドと相補的であり異なる蛍光体で各々標識された複数種類の標識プローブとをハイブリダイゼーションさせて、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションした前記標識プローブを検出するポリヌクレオチド検出方法であって、前記反応担体の表面を微小領域に分割計測して、該微小領域毎に前記異なる蛍光体に由来する蛍光の蛍光強度を検出することを特徴とするポリヌクレオチド検出方法。
【請求項２】
前記複数種類の標識プローブと前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション体の前記異なる蛍光体間の距離が２０００塩基長以内であることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド検出方法。
【請求項３】
前記蛍光体に由来する蛍光の蛍光強度を検出し、一定の蛍光強度の蛍光を発する微小領域の数を計数することにより、前記標的ポリヌクレオチドの量を定量することを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、疾病の原因となるウイルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレオチド、あるいは生物中の特定の遺伝情報を担うポリヌクレオチドの有無およびその変異を検出することが容易に可能なポリヌクレオチド検出法、並びに当該方法に使用する反応担体、反応装置、及び検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
「Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ｖｏｌ．８０，  ｐ２７８−２８２（１９８３）」において、標的となるポリヌクレオチド  （ＤＮＡまたはＲＮＡ）  試料を直接固相に捕捉した後、あるいは標的ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を含む他のポリヌクレオチドプローブを固相に固定したハイブリダイゼーション反応を用いて標的ポリヌクレオチドを固相に捕捉した後、標識物を結合した標識ポリヌクレオチドを会合させることを特徴とするポリヌクレオチド検出法が開示されている。
【０００３】
この方法は、１）  電気泳動により分子量分離したポリヌクレオチド断片試料をニトロセルロース膜に転写して固定した後に、当該ニトロセルロース膜を放射性同位元素で標識したポリヌクレオチドプローブを含む溶液に浸して会合反応を行ない、２）  反応後、未反応の標識プローブを膜から洗い流した後に、膜に結合した残留標識プローブの量をオートラジオグラフィーにより検出することで標的ポリヌクレオチドの有無を判定する方法である。
【０００４】
また、血液や排泄物等の試料中の細菌やウイルス等の外来性の標的ポリヌクレオチドを検出する方法が、特開昭５８−３１９９８に開示されている。
この方法は、１）  精製した試料中のポリヌクレオチドを加熱等により変性させて一本鎖とした後、これを、ニトロセルロース膜に固定し、次に、２）  検査したい細菌やウイルスのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を持つ放射性同位元素標識されたポリヌクレオチドプローブを反応させた後、この膜を洗浄し、後に膜に結合した残留標識プローブの量をオートラジオグラフィーにより検出することで標的ポリヌクレオチドの有無を判定する方法である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の双方の検出法において標識に用いられている放射性同位元素は、作業者の放射線被爆を最小限に抑えなければならないうえにトレーサー量しか用いることができず、プローブ当りの比放射活性を高くすることが困難である上に、ニトロセルロース膜に吸着した標識プローブから放射線のバックグラウンドが生じやすく、検出に長時間を要し、かつ検出感度が不足する場合が多い。そのため定量的測定が困難で、ほとんどが標的ポリヌクレオチドの有無の判定かせいぜいオートラジオグラムのフィルムの黒化の程度を判定する半定量的測定が行なわれるにすぎず、近時の産業界の要請に対しきれていない面があった。さらにオートラジオグラフィーを用いるため検出の自動化が困難であり、加えて上記のごとく作業者の放射線被爆への考慮の必要があり、臨床フィールドで多量の検体について測定するには不都合な面が指摘されていた。
【０００６】
そこで、本発明は、放射性同位元素の標識を必要とせずに、高感度で精度が高く定量的な測定が可能で、かつ自動化により単位時間あたりの測定サンプル数を多くすることで臨床フィールドで多量の検体を検査することが可能なポリヌクレオチド検出法及び当該方法を用いた検出装置の提供を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題につき鋭意検討した結果、下記  （１）〜（７）  に示した発明により、当該課題を解決し得ることを見出した。すなわち本発明は、
（１）反応担体に固定した被測定物であるポリヌクレオチド鎖と当該ポリヌクレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を結合した標識プローブを会合させ、会合した標識プローブの量を検出するポリヌクレオチド検出法において、上記会合反応を行なった反応担体表面の全てあるいは一部を微小領域に分割し、当該微小領域毎の標識物由来の信号の強度を検出して、強い信号を示す微小領域の数を計測することを特徴とするポリヌクレオチド検出法、
（２）  被測定物であるポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を結合した標識プローブとして、被測定物であるポリヌクレオチド鎖内の異なる部位に会合し得る複数のポリヌクレオチド鎖の標識体を用いることを特徴とする  （１）  記載のポリヌクレオチド検出法、
（３）  標識プローブとして用いる複数のポリヌクレオチド鎖の標識物が各々異なる蛍光体であることを特徴とする  （２）  記載のポリヌクレオチド検出法、
（４）  複数の標識プローブを被測定物であるポリヌクレオチド鎖に会合した場合の当該ポリヌクレオチド鎖内における標識物間の距離が２０００塩基長以内であることを特徴とする  （２）  又は  （３）  記載のポリヌクレオチド検出法、
（５）  平板上に、被測定物であるポリヌクレオチド鎖を含む試料を添加するための試料添加部、会合反応を行なうための被測定物であるポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド鎖を固定した反応部、及び反応残液を排出するための反応残液排出部として適宜形状の凹部をそれぞれ設け、かつ当該試料添加部と当該反応部及び当該反応部と当該反応残液排出部がそれぞれ当該試料添加部、当該反応部、及び当該反応残液排出部最大限各部の最深部を結ぶ線と同じ深さの溝で連結されたことを特徴とする反応担体、
（６）    （５）  記載の反応担体、当該反応担体における試料添加部に添加された試料若しくは洗浄液を当該試料添加部から反応部及び反応残液排出部の方向に、又はそれと逆方向に出し入れできるように当該反応担体を揺り動かす機構、試料若しくは洗浄液を当該反応担体の反応液添加部に添加する機構、並びに当該反応担体の反応残液排出部から反応残液若しくは洗浄液を排出する機構を有することを特徴とする  （１）  〜  （４）  記載のポリヌクレオチド検出法に使用する反応装置、
（７）  少なくとも一種以上の励起光を発射する光源と、当該光源から発射された励起光のビーム径を拡大するビームエクスパンダー、ビーム径が拡大された励起光を一定方向に曲折させるとともに試料が発する蛍光を透過させることのできる鏡、当該鏡によって曲折させた励起光を鏡と集光レンズを同期させて試料への励起光の照射位置を調節しかつ試料が発する蛍光を前記ビーム径が拡大された励起光を一定方向と曲折させるとともに試料が発する蛍光を透過することのできる鏡に照射するための機構、及び蛍光検出機構、並びに当該蛍光検出機構からの信号を標識プローブの存在位置として識別し計数する装置からなることを特徴とする  （１）  〜  （４）  記載のポリヌクレオチド検出法に使用する蛍光検出装置、を提供するものである。
【０００８】
先ず、本発明ポリヌクレオチド検出法について説明する。
被測定物として本発明方法に供されるポリヌクレオチド鎖の種類は特に限定されず、例えば、疾病の原因となるウイルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレオチドはもちろん、生物中の特定の遺伝情報を担うポリヌクレオチドの有無を調べる場合には内在性のポリヌクレオチドを被測定物とすることができる。
【０００９】
また、かかるポリヌクレオチドはＤＮＡであるとＲＮＡを問わず、その調製方法としては、具体的被測定対象の種類に応じた公知の方法を用いることができる。
被測定ポリヌクレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を結合した標識プローブにおいて、「相補的」とは、当該標識プローブが少なくとも被測定ポリヌクレオチド鎖に結合可能な程度に相互に水素結合をする組合せの塩基が存在することをいい、かかる条件が満たされる限りにおいて必ずしもすべての塩基同士が相互に水素結合をする組合せである必要はない。また、当該標識プローブとして用いられるポリヌクレオチドの長さは、被測定ポリヌクレオチドとして何を用いるか、すなわちどの程度の長さのポリヌクレオチドを標識プローブとして用いれば目的のポリヌクレオチドを検出可能であるかによって決定され、その限りにおいて特に限定されるものではない。そして当該標識プローブとして用いられるポリヌクレオチドは、ホスファイトトリエステル法  （Ｎａｔｕｒｅ，  ３１０，  １０５（１９８４））、ホスホアミダイド法（Ｍｃ  Ｂｒｉｄｅ，  Ｌ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｍ．  Ｈ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ｖｏｌ．２４，  ｐｐ．２４５−２４８  （１９８３））等の通常公知の方法によって化学合成することが可能であり、また生物の特定遺伝子部分をＰＣＲ法  （Ｓａｉｋｉ，  Ｒ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．３７，  ｐ１７０（１９８５））  等の通常公知の方法により増幅して得ることもできる。
【００１０】
ここで用いられる標識物は、後述する微小分割を行なって被測定物であるポリヌクレオチドの検出が可能であれば特に限定されるものではない。そして、特に検出感度及び安全性の点から好ましくは、蛍光分析用の蛍光色素を挙げることができる。用いられる蛍光色素の種類は特に限定されず、例えばＢ−フィコエリスリンやＲ−フィコエリスリン等のフィコビリプロテイン；ローダミン、フルオレッセイン、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール、フタロシアニン等とこれらの誘導体；ならびにこれら蛍光体を含むポリマーを用いることができる。ただし、フィコビリプロテインは熱安定性や変性剤に対する安定性に問題があるため、あらかじめ標的ポリヌクレオチドに会合したプローブにビオチン−アビヂンあるいは、ハプテン−抗−ハプテン抗体等を用いて標識する必要がある。また、蛍光体を含むポリマーは、特定の色素を公知方法によりポリマーに感作して得ることもできるが、市販品を直接用いることもできる。
【００１１】
これらの蛍光色素の標識プローブとするポリヌクレオチドへの結合方法は特に限定されるものではない。例えば、アミノ基導入試薬を用いて核酸塩基に直接蛍光体標識をする方法や特開昭６１−４４３５３号開示の方法、すなわち、ポリヌクレオチドの蛍光体標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換え、この官能基を蛍光体結合させることにより蛍光体標識を実現し、ポリヌクレオチドの任意の位置に標識物を導入する方法等を採用することができる。
【００１２】
ポリヌクレオチド鎖の反応担体への結合方法は、公知の方法、例えば当該担体の表面に官能基を結合させて、次いでこの官能基を活性化させ、当該活性化官能基に結合する他の官能基を予め導入したポリヌクレオチド鎖を接触させる方法により実行される。例えば、反応担体上の官能基とポリヌクレオチド鎖は、アミド結合を介して担体表面のカルボキシル基と結合させることができる。
【００１３】
かかる場合、被測定ポリヌクレオチドを直接反応担体上に固定することも可能であるが、捕捉用プローブを予め調製してこれを固定して用いるのが被測定ポリヌクレオチドを選択的に固定できるという点において好ましい。
このようにして、反応担体に固定した被測定物であるポリヌクレオチド鎖と前記の当該ポリヌクレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を結合した標識プローブを通常の条件で会合させて、以下のポリヌクレオチド検出過程に供するが、被測定物であるポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を結合した標識プローブとして、被測定物であるポリヌクレオチド鎖内の異なる部位に会合し得る複数のポリヌクレオチド鎖の標識体を用いることが、標識プローブの被測定物であるヌクレオチド鎖への非特異的結合が発する信号を、当該複数の標識プローブの非特異的吸着により生ずる信号から区別し得るという点において好ましい。さらに、検出精度を考慮すれば複数の標識プローブを被測定物であるポリヌクレオチド鎖に会合した場合の当該ポリヌクレオチド鎖内における標識物間の距離が少なくとも２０００塩基長以内であること、さらに６００〜７００塩基長以内であることが好ましい。
【００１４】
さらに上記の標識プローブを用いる場合において、標識物が各々異なる蛍光体を用いることが、さらに検出を容易にするうえで好ましい。かかる場合用いられる蛍光体の組合せはフルオレッセイン系とローダミン系、あるいはフィコビリタンパク質とローダミン系であることが好ましく、より具体的にはフルオレッセインとスルホローダミン１０１、あるいはフィコエリスリンとスルホローダミン１０１等の組合せを好適なものとして挙げることができる。
【００１５】
なお、反応担体の形状等は、本願発明方法の実施に適する限りにおいて特に限定されるものではないが、平板上に、被測定物であるポリヌクレオチド鎖を含む試料を添加するための試料添加部、会合反応を行なうための被測定物であるポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド鎖を固定した反応部、及び反応残液を排出するための反応残液排出部として適宜形状の凹部をそれぞれ設け、かつ当該試料添加部と当該反応部及び当該反応部と当該反応残液排出部がそれぞれ当該試料添加部、当該反応部、及び当該反応残液排出部最大限各部の最深部を結ぶ線と同じ深さの溝で連結されたことを特徴とする反応担体を好ましいものとして例示できる。本例示反応担体については後記実施例にて詳細に説明する。
【００１６】
本願発明方法の大きな特徴は、上記会合反応の後、当該反応を行なった反応担体の表面又は一部を微小領域に分割し、当該微小領域毎の標識物由来の信号の強弱を検出して、強い信号を示す微小領域の数を計測することにある。
すなわち、測定対象を微小領域に分割することによって、反応担体から生ずる背景光の影響を最低限に押さえることが可能になり、その結果相対的に検出感度を上げることが可能になる。特に複数の標識プローブを用いる場合には、複数の標識物同士の会合する被測定ポリヌクレオチドにおける距離が十分に近接、すなわち前記のごとく２０００塩基長以内であれば、複数の標識物由来の信号が同時に当該微小領域において検出され、非特異的に標識プローブが吸着して、単一の標識プローブ由来の信号のみ検出される微小領域と明確に区別することが可能であり、当該非特異的吸着に依存するゴーストに伴う感度の低下を防ぐことが可能である。
【００１７】
上記微小領域分割は、ポリヌクレオチドの検出の際に一次元あるいは二次元の検出器、すなわちダイオードアレー検出器やＣＣＤ二次元検出器の各ピクセルとして分割測定する手段、若しくはレーザーを二次元的にスキャンし一定時間おきにデータを取り込む手段により行なうことができる。
なお、この微小領域は、可能な限り微小であることが検出感度を上げるという点において好ましいが、標識物として用いられる物質の性質に応じておのずから限界がある。例えば、蛍光物質を標識物とする場合には、光の波長より小さい領域に分割することはできない。
【００１８】
以上述べた本発明測定法の概念図を図１及び図２に示した。
微小領域毎の標識物由来の信号の強弱の検出手段は、標識物として用いる物質の種類に応じて選択される。例えば、標識物として蛍光色素を用いる場合には、前記の反応担体、当該反応担体における試料添加部に添加された試料若しくは洗浄液を当該試料添加部から反応部及び反応残液排出部の方向に、又はそれと逆方向に出し入れできるように当該反応担体を揺り動かす機構、試料若しくは洗浄液を当該反応担体の反応液添加部に添加する機構、並びに当該反応担体の反応残液排出部から反応残液若しくは洗浄液を排出する機構を有することを特徴とする反応装置；少なくとも一種以上の励起光を発射する光源と、当該光源から発射された励起光のビーム径を拡大するビームエクスパンダー、ビーム径が拡大された励起光を一定方向に曲折させるとともに試料が発する蛍光を透過させることのできる鏡、当該鏡によって曲折させた励起光を鏡と集光レンズを同期させて試料への励起光の照射位置を調節しかつ試料が発する蛍光を前記ビーム径が拡大された励起光を一定方向と曲折させるとともに試料が発する蛍光を透過することのできる鏡に照射するための機構、及び蛍光検出機構、並びに当該蛍光検出機構からの信号を標識プローブの存在位置として識別し計数する装置からなることを特徴とする蛍光検出装置による、検出を好ましい検出手段として採用し得る。なお、かかる反応装置及び蛍光検出装置については、後記実施例において詳述する。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２０】
【実施例１】
本発明反応担体
図３は、本発明反応担体の一実施態様である。
平板上に、反応部９１、試料添加部９２、及び反応残液排出部９３が設けられ、反応部９１と試料添加部９２及び反応部９１と反応残液排出部９３が溝部分によって連結されている。
【００２１】
かかる反応担体の素材は、反応部における標識信号を検出可能な限りにおいて特に限定されるものではない。例えば標識物として蛍光色素を用いる場合には、光学的に平坦な素材、例えば、ガラス、シリコンウエハー、又は光学的に平坦な構造を有するプラスチックを用いるのが好ましい。これら反応担体の上面部９４は試料添加部、反応部、反応残液排出部中の反応液の保持の目的で提状にフッ素樹脂、例えばポリテトラフルオルエチレンでコーティングされている。
【００２２】
各部を連結する溝は、通常各部を直線上に連結し、各部の最深部と等しい深さであるが、反応液等の流出速度等を調節するために、当該最深部よりも深くしたり、浅くしたりすることも可能であり、さらに蛇行させることも可能である。
反応部９１には、使用に際して若しくは予め、前記した、反応部９１の表面に官能基を結合させて、次いで、この官能基を活性化させ、当該活性化官能基に結合する官能基を予め導入した被測定ポリヌクレオチド鎖を接触させる方法に代表される公知方法により被測定ポリヌクレオチド鎖が固定される。なお、かかる固定化の実行に際して、担体中の他の部分はテープ等でマスクをするのが好ましい。
【００２３】
試料添加部９２には、例えば次記実施例２における反応装置によって、標識プローブを含む試料が添加され、本発明反応担体を揺り動かして当該試料を溝を介して反応部９１に移行させ、反応後生じる反応残液を前記同様溝を介して反応残液排出部９３に移行させ、当該反応残液排出部９３における反応残液を例えば巻き取り式のろ紙等によって排出・除去を行ない得る。
【００２４】
ところで、本発明反応担体における反応部等及び溝の形状は、試料添加後、当該試料を前記した反応・排出工程に付することができる限りにおいて特に限定されない。例えば、反応部等と溝全体が一つの溝にとり込まれる形状も許容される。
【００２５】
【実施例２】
本発明反応装置
図４は、本発明反応装置の一実施態様である。ポリヌクレオチド同士の会合反応は、当該装置を用いて以下の手順で行なうのが好ましい。
まず、試料を容器１にいれ、これを容器保持ステージ２にセットする。標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保持ステージ２にセットする。容器ステージには各反応容器毎に専用の使い捨てピペットチップ３が装着されている。容器１中の試料等は加熱機４により必要に応じて加熱され、試料等を変性させ１本鎖オリゴヌクレオチドにすることができる。容器保持ステージ２は円盤状で、ステッピングモーター５で回転させることができ、任意の容器を自動ピペット６の位置にセットすることができる。自動ピペット６はＸ軸  （左右軸）  ステージ７とＺ軸  （縦軸）  ステージ８によりＸ軸方向と縦軸  （Ｚ軸）  方向に移動することができる。まず、自動ピペット６をＸ軸方向に移動させ、ピペットチップ３をセットする。
【００２６】
次に、容器１中の試料を吸い上げ、反応担体ステージ９にセットした第１のプローブを固定した実施例１に記載した反応担体１０の試料添加部に添加し、反応部に試料溶液を導入する。使用済みのピペットチップはチップ破棄箱５０に捨てられる。反応担体ステージ９はＹ軸方向  （紙面の手前方向）  に移動できる構造になっており、複数の反応担体の添加部に順次試料溶液を添加できる。さらに、反応担体ステージ９は内部に加熱器を持つ構造で、反応担体を一定温度に保ことができる。当該温度は用いる試料と標識プローブの組合せに応じて適宜設定することができる。反応担体ステージ９はステッピングモーター１１で上下に傾けることができる構造になっている。かかる傾斜角度は、企図する反応時間に応じ適宜決定されるが、通常１５〜３０°程度が好ましい。この機構を用いて、一定時間おきに反応担体を傾け試料溶液を反応部に出し入れすることで反応液をゆるやかに攪拌する。反応後、反応残液を実施例１記載の反応担体の反応残液排出部  （図３の９３記載）  にろ紙１２をあてがい排出する。ろ紙１２の形態は特に限定されないが、ロール状のものが、連続使用が可能であり交換が容易という点で好ましい。そして、本実施例におけるろ紙１２は、ローラー１３で容易に供給することができる。また、試料等の反応中はろ紙は反応担体からはなれているが、反応残液排出時にはローラー１４が反応担体上の反応残液排出部に移動する。
【００２７】
ろ紙を退避させた後、標識プローブを実施例１記載の反応担体反応部に添加する。操作は上記試料添加方法と同様である。試料反応と同様な方法で担体ステージを傾斜させることで反応液をゆるやかに攪拌する。未反応標識プローブ残液を実施例１記載の反応担体の反応残液排出部  （図３の９３記載）  にろ紙１２をあてがい排出する。ろ紙をあてがったままの状態で、Ｚ軸ステージ１５に装着した洗浄液ノズル１６を反応担体の添加部に移動しポンプ１７を用いてバルブ１９を介してつながれている洗浄液保持容器１８に入れた洗浄液を添加する。洗浄液は予め４２〜６５℃に加温しておく。洗浄液は反応部を通過し、ろ紙により排出される。そして使用済みのろ紙はろ紙破棄箱５１に捨てられる。なお、洗浄液保持容器１８は単数でもよいが、複数の洗浄液保持容器がバルブ１９を介して連結されていてもよい。
【００２８】
【実施例３】
本発明検出装置
標識物として、蛍光色素を用いた場合には、本実施例に示す検出装置を用いて反応担体上の蛍光体結合部を検出するのが好ましい。
（１）  図５は、本発明検出装置の一実施態様を示したものである。
レーザー光源１０１  の光は、ビームエキスパンダー１０２  でビーム径を拡張し、ダイクロイックミラー１０３  で反射される。ダイクロイックミラー１０３  はレーザー光源１０１  の波長の光を反射し、他の波長の光を８０％以上透過する物を使用する。ダイクロイックミラー１０３  で反射された光は、サーボモーター１０５  で角度を変えられるミラー１０４  で反射され、さらに、ミラー１０４  と直交する方向に角度を変えられるミラー１０６  で反射された後、集光レンズ１０８  で集光され、反応担体１０９  上の特定領域を照射する。ここで、ミラー１０４  とミラー１０６  はお互いに直交する方向に角度が変えられるので、反応担体上をＸ−Ｙ方向に走査することが出来る。反応担体表面の蛍光体が存在する部位にレーザースポットがあたるとその部位から蛍光が発生する。蛍光は集光レンズ１０８  、ミラー１０６  、ミラー１０４  の順に進行し、ダイクロイックミラー１０３  を通過する。バンドパスフィルター１１０  を通過した後、光電子増倍管１１１  で検出される。検出された信号は、マイクロプロセッサー１１２  に取り込まれ、サーボモーター１０５、  １０７からの角度情報と同期させて処理することで、反応担体表面の各位置における蛍光強度を算出する。この方法で、背景光に由来する微弱蛍光を発する部位と蛍光プローブ由来の強い蛍光を発する部位を区別することが出来る。一定の蛍光度を持つ位置１カ所には１個の蛍光標識プローブがあると考えられるので、蛍光を発している部位を計数することで標的ポリヌクレオチドの量を定量することが出来る。
【００２９】
なお、当該蛍光測定装置において、光電子増倍管の前に集光レンズ及びピンホールを設け、ピンホール位置を共焦点位置とする光学系、すなわち共焦点顕微鏡方式にすれば、位置分解能及び感度を向上させることができ、より高感度に標的ポリヌクレオチドを検出することができる。
（２）  図７は２種類の蛍光色素を用いた本発明検出装置の一実施態様を示したものである。
【００３０】
反応担体はレーザー光で照射される。レーザー発振器１４１  及び１４２  から出たレーザー光はレーザー光１４２  の波長の光を反射しレーザー光源１４１  の波長の光を透過するダイクロイックミラー１５１  で合成された後、レンズ１５２  及び１５３  からなるビームエキスパンダーでビーム径を拡張させ、リング状のミラー１５５で反射され集光レンズ１５４  で集光されて、反応担体の反応部に照射される。レーザーで励起されることにより標識プローブより発した蛍光は、集光レンズ１５４  で集められ、リング状ミラー１５５  の中心部の素通り部分を通過し、さらに一方のレーザー光由来の蛍光を反射し、かつ他方のレーザー光由来の光を透過するダイクロイックミラー１５６  で蛍光を分離する。これらの蛍光はバンドパスフィルター１５７、  １５８によりそれぞれの蛍光成分のみを取りだし、結像レンズ１５９、  １６０により高感度ＣＣＤカメラ１６１、  １６２で撮像する。高感度ＣＣＤカメラでとられた信号は画素ごとに画像処理用マイクロプロセッサー１６４  で処理し反応担体上の蛍光発光位置を特定する。２種類の蛍光色素の蛍光発光位置の一致する場合は標的ＤＮＡに標識プローブがハイブリダイゼーションしていると判断し、この位置を計数し標的ＤＮＡの分子数とする。いずれか一方の蛍光団由来の蛍光しか検出されない部位には標識プローブが非特異的に吸着しているとみなし計数の対象から除外する。また、図７において１６３  はカメラコントローラーであり、１６５  は出力装置である。
【００３１】
なお、当該蛍光検出装置においても前記  （２）  記載の蛍光検出装置と同様、共焦点光学系を有する測定装置とすることができる。
【００３２】
【実施例４】
ポリヌクレオチドの検出  （１）
（１）  本実施例においては、検出の対象となる標的ポリヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのＤＮＡを用いた。
そして、当該バクテリオファージλのＤＮＡに対して、２種類のプローブを用いて、かかる標的ポリヌクレオチド試料を検出した。
【００３３】
第一のプローブとなるポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド鎖であって、標的となるバクテリオファージλのＤＮＡの塩基配列の６６０１番から６８７５番の各塩基に対して、相補的に結合するポリヌクレオチド鎖である。第二のプローブとなるポリヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド鎖であって、標的バクテリオファージλのＤＮＡ上の異なる部位に結合し得るポリヌクレオチド鎖である。そして、第一のプローブの５’末端には、反応担体に固定化するためのアミノ基が導入されている。第二のプローブの５’末端と２７番、５７番、８９番、１３０番、１６２番のチミン残基に蛍光体Ｂ−フィコエリスリン導入のためにビオチンを結合させている。
（２）  ▲１▼そして、上記の標的ポリヌクレオチド試料である、バクテリオファージλのＤＮＡは、宝酒造社製のλＤＮＡ（バクテリオファージλ  ｃＩ８５７  Ｓａｍ  ７由来）を用いた。
▲２▼    第一のプローブとなるポリヌクレオチド鎖は、ホスホアミダイド法に従い合成した。そして、この合成の最終段階において、Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−オキシ−β−シアノチエル−Ｎ，  Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホアミダイドを反応させてアミノ基を５’末端に導入した。
▲３▼    第二のプローブは、以下の様に合成した。
【００３４】
配列番号２に示す塩基配列のポリヌクレオチドを４０塩基長ないし６０塩基長のオリゴヌクレオチドに分割し、それぞれホスホアミダイド法で化学合成した。その際、１〜２０番目のポリヌクレオチドの合成の最終段階において、Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，  Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホアミダイドを反応させてアミノ基を１番目のヌクレオチドの５’末端に導入した。また、その他のポリヌクレオチドにおいて、２７番、５７番、８９番、１３０番、１６２番の本来チミジンが残存する部位に、チミジンの代りにウリジンの５位にアミノ基を導入した  （式１）  記載のアミノ化チミジンの５’水酸基を４，  ４’−ジメトキシトリチル基保護したヌクレオチドを導入して、それぞれのポリヌクレオチドの合成を完了した。
【００３５】
【化１】
0003616107.tif 000002
【００３６】
なお、  （式１）  のアミノ化チミジンは、「Ｇｅｏｆｆｒｅｙ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ｖｏｌ．８２，  ｐｐ．９６８−９７２，（１９８５）」の方法に従い調製した。
そして、それぞれ合成したアミノ基を有するポリヌクレオチドを、配列番号２に示す塩基配列に従い、Ｔ４  リガーゼを用いそれぞれを連結して、６個のアミノ基を有するポリヌクレオチドを得た。次いで遊離のアミノ基をトリフルオロアセチル化し、３’の水酸基をクロロ−Ｎ，  Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフインで活性化し、これにスルホスクシンイミジル６−  （ビオチンアミド）  ヘキサノエート  （ＰＩＥＲＣＥ（イリノイ州  ＵＳＡ）製）  を公知の条件で反応させて、各々のアミノ基をビオチン化して、所望のビオチン化プローブを得た。
【００３７】
（３）  標的ポリヌクレオチドの捕捉用のプローブである５’末端をアミノ化した配列番号１に示す塩基配列を有する第一のプローブの反応担体への固定は窒素気流中で以下の様に行なった。
まず、ガラス製の実施例１に示す反応担体の表面を十分に洗浄し、３−  （２−アミノエチルアミノプロピル）  トリメトキシシラン３２ｍｍｏｌ／Ｌを反応部９１に作用させて、当該反応部にアミノ基を導入した。このアミノシラン化した反応担体を、２．５％グルタルアルデヒド水溶液で活性化して、反応部９１以外の部分をテープでマスクした後、当該反応部に第一のプローブを１０ｐｍｏｌ添加し、室温で３時間反応させた。次にテープをはがして未反応部分を５０ｍＭのエタノールアミンでマスクした。この反応担体を、０．５％ＳＤＳ、  １００μｇ／ｍｌキャリヤーＤＮＡ  （変性サケスペルマＤＮＡ）  ５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、５０％ホルムアミド、０．５  ％ＮａＣｌを含むｐＨ７の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  からなるハイブリダイゼーションバッファー中で保存した。
【００３８】
（４）  ハイブリダイゼーション反応は、実施例２に示す装置を用いて、以下の手順に従い行なった。
試料となるバクテリオファージλのＤＮＡの濃度は、モル分子吸光係数＝５．１８×１０８  Ｍ−１・ｃｍ−１として求めた。キャリアーＤＮＡとして加えた  １００μｇ／ｍｌの変性サケスペルマＤＮＡを含む各種濃度のバクテリオファージλＤＮＡを容器９１にいれ、容器保持ステージ９２にセットした。当該試料は、加熱器４により９５℃に加熱され、バクテリオファージλＤＮＡを変性して一本鎖状態とした。次に容器１中の試料を１０μｌ  吸い上げ反応担体ステージ９にセットした前記  （３）  において調製した反応担体１０の試料添加部  （図３の９２記載）  に添加し、当該反応担体１０をステッピングモーター１１で約３０°傾斜させて、反応部  （図３の９１記載）  に試料溶液を導入した。そして３０秒毎に反応担体１０を傾け試料溶液を反応部に出し入れすることで、当該試料溶液をゆるやかに攪拌した。なお、反応担体ステージ９は、内部に加熱器を有し、本実施例においては、６５℃に設定した。４時間後に、反応残液を反応担体９の反応残液排出部  （図３の９３記載）  にロール状のろ紙１２を用いて排出させた。
【００３９】
ろ液を排出させた後、前記  （２）  で調製したビオチン化プローブ１×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ〜１×１０−９ｍｏｌ／Ｌを１０μｌ  を反応担体反応部に添加した。操作は上記試料添加方法と同様である。試料反応と同様な方法で担体ステージを傾斜させることで反応液をゆるやかに攪拌した。４時間後、未反応ビオチン化プローブ残液を反応担体の反応残液排出部  （図３の９３記載）  にろ紙１２をあてがい排出した。ろ紙をあてがったままの状態で、Ｚ軸ステージ１５に装着した洗浄液ノズル１６を反応担体の添加部に移動しポンプ１７を用いて洗浄液を添加した。
【００４０】
すなわち、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム５ｍｇ／ｍｌ、牛血清アルブミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  を含む０．３Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２５分間洗浄した後、さらに、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３Ｍ  テトラメチルアンモニウム、トリス塩酸  （ｐＨ８．０）  溶液で５８℃で３０分間洗浄した。次に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍｇ／ｍｌ（ミリリットル）  牛血清アルブミン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ（リットル）  のＮａＣｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ（リットル）  のリン酸緩衝液  （ｐＨ７．４）  で洗浄した。
【００４１】
次に、ストレプトアビジン化Ｂ−フィコエリスリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．製）    （濃度約１×１０９  ｍｏｌ／Ｌで０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、０．１５ＭＮａＣｌを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈）  を添加した。操作方法は上記試料添加法と同じである。３７℃で１時間反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍｇ／ｍｌ  牛血清アルブミン、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  のＮａＣｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ  のリン酸緩衝液  （ｐＨ７．４）  で洗浄し、反応担体上に捕捉されたビオチン化プローブをＢ−フィコエリスリンで標識した。この操作により反応担体上に捕捉した標的ポリヌクレオチドであるバクテリオファージλＤＮＡを、蛍光体であるＢ−フィコエリスリンで標識した。
【００４２】
（５）  反応の終了した反応担体上の蛍光体結合部を検出するには、ＹＡＧレーザー  （５３２ｎｍ）とホトンカウンティング可能な光電子増倍管を用いた実施例３の検出装置で測定した。レーザー光源１０１  の光は、ビームエキスパンダー１０２  でビーム径を拡張し、ダイクロイックミラー１０３  で反射される。当該検出装置は本実施例においては、ダイクロイックミラー１０３  として５３２ｎｍ  の光を反射し、５７５ｎｍ  以上の光を８０％以上透過する物を使用した。
【００４３】
反応担体上の標識試料により生じた蛍光を前記ダイクロイックミラー１０３  を通じて透過させ、光電子増倍管１１１  で信号として検出して、これをマイクロプロセッサー１１２  で処理して、サーボモーター１０５  ・  １０７  からの角度情報と同期させて処理することで、反応担体表面の各位置における蛍光強度を算出した。そして、かかるデータをもとに検量線を作成した。
【００４４】
結果を図６に示す。
なお、同様な操作により反応担体上に標的ポリヌクレオチドであるバクテリオファージλを捕捉し、蛍光体であるＢ−フィコエリスリンで標識し、従来の検出法として蛍光光度計を用いホトンカウンティングモードで蛍光強度を測定した結果も○で示す。その結果本発明によれば標的ポリヌクレオチドであるバクテリオファージλを従来法に比べ一桁以上高感度で測定できることが判明した。すなわち、蛍光測定領域を微小な領域に区切って測定することによる背景光除去による高感度変化が確認された。
【００４５】
【実施例５】
ポリヌクレオチドの検出  （２）
（１）  本実施例においては、実施例４と同様に、検出の対象となる標的ポリヌクレオチド試料として、パクテリオファージλのＤＮＡを用いた。
そして、当該バクテリオファージλのＤＮＡに対して３種類のプローブを用いて、かかる標的ポリヌクレオチド試料を検出した。
【００４６】
標的ポリヌクレオチドの捕捉用の第一のプローブとしては、実施例４と同様に配列番号１に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド鎖を用いた。また、第一の標識用プローブとして用いられるポリヌクレオチドとして配列番号３で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを、第二の標識用プローブとして用いられるポリヌクレオチドとして配列番号４で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いた。標的ポリヌクレオチドであるバクテリオファージλのＤＮＡ上で第三の標識プローブとして用いられるポリヌクレオチドは第二の標識プローブとして用いられるポリヌクレオチドの３’末端側に隣接する配列である。
【００４７】
第二の標識用プローブとして用いられるポリヌクレオチドの５’末端には、ポリＴスペーサーを介してスルホローダミン１０１  様蛍光団が結合している。本実施例においては、かかる蛍光団として、スルホローダン１０１  様色素と思われる蛍光色素を直径が０．０２μｍ  で表面にカルボキシル基を有する粒子ポリマーを用いた。かかる粒子ポリマーとしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＩＮＣ．製のＣａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌａｆｅｘ  ｒｅｄ  （５８０／６０５）を用いた。そして、当該スルホローダミン１０１様蛍光団を含む粒子による第２のプローブの標識は以下の方法で行った。
すなわち、ポリヌクレオチドの合成最終段階に、Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−６−オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，  Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホアミダイトを反応させて５’末端にアミノ基を導入し、これに水溶性カルボジイミドで当該粒子のカルボキシル基を活性化して結合させた。そして、結合後、弱アルカリ条件下で未反応のカルボキシル基を再生した。
【００４８】
第三の標識用プローブとして用いられるポリヌクレオチドの３’末端にポリＴスペーサーを介してフルオレッセイン様蛍光団が結合している。本実施例においては、当該蛍光色素を含む直径０．０２μｍ  の表面にカルボキシル基を有する粒子ポリマーを用いた。かかる粒子ポリマーとして、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＩＮＣ．製のＣａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌａｔｅｘ  Ｙｅｌｌｏｗ−ｇｒｅｅｎ  （４９０／５１５）を用いた。そして当該フルオレッセイン蛍光団を含む粒子による第３のプローブの標識は以下の方法で行った。すなわち、ポリヌクレオチドの合成後に、アナリティカルバイオケミストリー記載のラリー    イー．  モリソン等の方法  （Ｌａｒｒｙ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １８３，  ｐｐ．２３１−２４４（１９８９））  に従い、ターミナル  デオキシヌクレオチジル    トランスフェラーゼを用いて８−  （６−アミノヘキシル）  アミノアデノシンを結合して、ポリヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入し、これと水溶性カルボジイミドで当該カルボキシル基を活性化した粒子ポリマーを結合させ当該蛍光団を導入した。そして、結合後、弱アルカリ条件下で未反応のカルボキシル基を再生した。
【００４９】
調製したこれら第二第三の標識プローブは、０．０５％ＳＤＳ、  １００μｇ／ｍｌのキャリヤーＤＮＡ  （変性サケスペルマＤＮＡ）  を含む実施例４と同様のｐＨ７のハイブリダイゼーションバッファーに懸濁して保存した。
（２）  ハイブリダイゼーション反応は、実施例２に示す装置を用いて、実施例４に記載した方法に従い行なった。なお前記、第二、第三の標識プローブは予め混合して、一回のピペット操作で同時に添加した。
【００５０】
（３）  反応担体表面に捕捉された蛍光プローブの位置を、実施例３  （２）  記載の検出装置で測定した。
レーザー発振器１４１  及び１４２  から出たレーザー光は４８８ｎｍ  の光を反射し５９０ｎｍ  の光を透過するダイクロイックミラー１５１  で合成された後、レンズ１５２  及び１５３  からなるビームエキスパンダーでビーム径を拡張させ、リング状のミラー１５５  で反射され集光レンズ１５４  で集光されて、反応担体の反応部に照射される。本発明においてはレーザーとしてＡｒ  レーザーで励起した可変波長色素レーザー  （波長５９０ｎｍ）と、Ａｒ  レーザー  （波長４８８ｎｍ）を用いた。レーザーで励起されることにより標識プローブより発した蛍光は、集光レンズ１５４  で集められ、リング状ミラー１５５  の中心部の素通り部分を通過し、さらに５１０ｎｍ  の光を反射し６１０ｎｍ  の光を透過するダイクロイックミラー１５６  でフルオレッセイン様蛍光団由来の蛍光とスルホローダミン１０１  様蛍光団由来の蛍光を分離した。これらの蛍光はバンドパスフィルター１５７、  １５８によりそれぞれの蛍光成分のみを取りだし、結像レンズ１５９、  １６０により高感度ＣＣＤカメラ１６１、  １６２で撮像した。高感度ＣＣＤカメラでとらえた信号は画素ごとに画像処理用マイクロプロセッサー１６４  で処理し反応担体上の蛍光発光位置を特定した。各画素は反応担体表面の約３５０ｎｍ  四方に相当する。フルオレッセイン様蛍光団由来の蛍光発光位置とスルホローダミン１０１  様蛍光団由来の蛍光発光位置の一致する場合は標的ＤＮＡに標識プローブがハイブリダイゼーションしていると判断し、この位置を計数し標的ＤＮＡの分子数とした。いずれか一方の蛍光団由来の蛍光しか検出されない部位には標識プローブが非特異的に吸着しているとみなし計数の対象から除外した。
【００５１】
上記方法に基づいて各種濃度のバクテリオファージλの量を測定した結果を図８に示す。ここで、●は２種の蛍光プローブが同一位置に検出される場合のみを示している。本発明によればバクテリオファージλが高感度に検出できることがわかる。なお、○は同様な操作により反応担体上に標的ポリヌクレオチドであるバクテリオファージλを捕捉し、スルホローダミン１０１  様蛍光団及びフルオロレッセイン様蛍光団で標識し、従来の検出量である蛍光光度計にセットしホトンカウンティングモードで蛍光強度を測定した結果である。
【００５２】
【発明の効果】
本発明により、放射性同位元素の標識を必要とせずに、高感度で精度が高く、定量的な測定が可能で、かつ自動化により単位時間あたりの測定サンプル数を多くすることで臨床フィールドで多量の検体を検査することが可能なポリヌクレオチド検出法、及び当該方法を用いた検出装置が提供される。
【配列表】
配列番号  ：１
配列の長さ：２７５
配列の型  ：核酸
鎖の数        ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列    他の構造体を含む合成ポリヌクレオチド
配列の特徴：１    ＮＨ２（ＣＨ２）６  付加
0003616107.tif 000003
配列番号  ：２
配列の長さ：２００
配列の型  ：核酸
鎖の数        ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列    他の構造体を含む合成ポリヌクレオチド
配列の特徴：２７，  ５７，  ８９，  １３０，  １６２    ビオチン付加
0003616107.tif 000004
配列番号  ：３
配列の長さ：６５
配列の型  ：核酸
鎖の数        ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列    他の構造体を含む合成ポリヌクレオチド
配列の特徴：１  スルホローダミン１０１  様蛍光団を含む粒子
0003616107.tif 000005
配列番号  ：４
配列の長さ：６５
配列の型  ：核酸
鎖の数        ：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列    他の構造体を含む合成ポリヌクレオチド
配列の特徴：１  フルオレッセイン様蛍光団を含む粒子
0003616107.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の蛍光測定法と本発明に基づく蛍光測定法の概念図。
【図２】本発明による方法の反応の概念図。
【図３】本発明反応担体の模式図。
【図４】本発明反応装置の構成図。
【図５】本発明測定装置の概念図。
【図６】実施例１による測定結果。
【図７】２種類の蛍光色素を用いた本発明測定装置の概念図。
【図８】実施例２による測定結果。
【図１】
0003616107.tif 000007
【図２】
0003616107.tif 000008
【図３】
0003616107.tif 000009
【図４】
0003616107.tif 000010
【図５】
0003616107.tif 000011
【図６】
0003616107.tif 000012
【図７】
0003616107.tif 000013
【図８】
0003616107.tif 000014