(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
介在タンパク質配列（ＩＶＰＳ）及びターゲットタンパク質の二つの構成要素を含む融合タンパク質であって、
改質されていてもよいＩＶＰＳがターゲットタンパク質領域中または近傍に挿入され；
該ＩＶＰＳは−ＯＨまたは−ＳＨ側鎖を持つアミノ酸残基をＣ末端に有するスプライスジャンクションを伴っており；
予め決定した条件の変化により切除またはスプライスされることにより融合タンパク質を生じさせることを特徴とする前記融合タンパク質。
【請求項２】
ＩＶＰＳがターゲットタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端に融合していることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＩＶＰＳが、酵素であるターゲットタンパク質を実質的に不活化させるようにターゲットタンパク質領域中に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ターゲットタンパク質領域からのＩＶＰＳのスプライシングにより、ターゲットタンパク質の活性が実質的に回復することを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＩＶＰＳが、ホーミングエンドヌクレアーゼに対して相同性をもつエンドヌクレアーゼをコードすることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＩＶＰＳのエンドヌクレアーゼ機能が実質的に不活化されていることを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
スプライシングがトランススプライシングを含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＩＶＰＳがＣＩＶＰＳ１、ＣＩＶＰＳ２またはＣＩＶＰＳ３からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＩＶＰＳがターゲットタンパク質のセリン、トレオニンまたはシステイン残基の直前に挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＩＶＰＳがそのアミノ末端にセリン、トレオニンまたはシステイン残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＩＶＰＳがそのカルボキシ末端にセリン、トレオニンまたはシステイン残基を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
改質が、−ＯＨまたは−ＳＨ側鎖を有する少なくとも１つのアミノ酸残基において行われることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
改質が、翻訳後に、または翻訳と同時に行われる側鎖の化学誘導体化であることを特徴とする請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
予め決定した条件変化が、温度、ｐＨ、光、リン酸化及びグルコシル化からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
基質に対して親和性を有する結合タンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
基質がＩＶＰＳに対する抗体であることを特徴とする請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
（ａ）ターゲットタンパク質をコードするＤＮＡと、制御可能なＩＶＰＳをコードするＤＮＡとを結合させて融合ＤＮＡを形成し；
（ｂ）前記融合ＤＮＡを発現させて、改質ターゲットタンパク質を産生する
段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質の製造法。
【請求項１８】
（ａ）ターゲットタンパク質、基質に対して親和性を持つ結合タンパク質および制御可能なＩＶＰＳを含む請求項１に記載の融合タンパク質を形成し；
（ｂ）融合タンパク質と結合タンパク質が結合する基質とを接触させ；
（ｃ）ＩＶＰＳの切断が起きる条件下に基質に結合した融合タンパク質をおき、次いで結合タンパク質からターゲットタンパク質を分離し；
（ｄ）ターゲットタンパク質を回収する
段階を含むことを特徴とするターゲットタンパク質の精製法。
【請求項１９】
（ａ）ターゲットタンパク質と制御可能なＩＶＰＳを含む請求項１に記載の融合タンパク質を形成し；
（ｂ）融合タンパク質とＩＶＰＳが結合する基質とを接触させ；
（ｃ）ＩＶＰＳの切断が起きる条件下に基質に結合した融合タンパク質をおき、次いでＩＶＰＳからターゲットタンパク質を分離し；
（ｄ）ターゲットタンパク質を回収する
段階を含むことを特徴とするターゲットタンパク質の精製法。
【請求項２０】
基質がＩＶＰＳに対する抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
（ａ）ＩＶＰＳを選択し；
（ｂ）場合によってはＩＶＰＳを改質し、予め決定した条件を変化させることの結果として切除またはスプライシングが起こるような融合タンパク質を形成するように、ＩＶＰＳをターゲットタンパク質の領域中または近傍に挿入し；
（ｃ）融合タンパク質において、そのような制御が提供されているか否かを決定する
段階を含むことを特徴とするＩＶＰＳを制御可能にする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、改質タンパク質及びその製造法に関する。より具体的には、本発明の改質タンパク質は、ターゲットタンパク質及び、予め決定した条件下で切除または切断し得る制御可能な介在タンパク質配列(CIVPS)を含む。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
成熟タンパク質の産生には、DNAからRNA、タンパク質への情報の流れが含まれる。その情報を妨げるDNA及びRNA要素を正確に切除することは、既に報告されている[M.Belfort, Annu.Rev.Genet.24:363(1990)；T.R.Cech,Annu.Rev.Biochem.59:543(1990)；Hunterら,Genes Dev.3:2101(1989)］。近年、介在タンパク質配列の正確な切除についての証拠が、Saccharomyces cerevisiae由来のTFPI対立遺伝子［Hirataら，J.Biol.Chem.265:6726(1990)；Kaneら,Science 250:651(1990)］及びMycobacterium tuberculosis由来のrec Ａ遺伝子［Davisら,J.Bact.173:5653(1991)；Davisら,Cell 71:1(1992)］に関しても報告された。これらは、各々成熟タンパク質を産生するために除去しなければならない内部フレーム内ペプチドセグメントを含んでいる。各Tfp１及びRecＡの発現により、２種類のペプチド、即ち、一方は介在タンパク質配列(IVPS)を表し、他方は外部タンパク質配列(EPS)の連結産生物を表すペプチドが生じる。この翻訳後プロセシング事象(post-translational processhing event)は、「タンパク質スプライシング」と呼称されてきた。同様に、好高熱性の原始Thermococcus litoralis由来のVent DNAポリメラーゼ遺伝子は、２個のフレーム内IVPSを含んでいる［Perlerら,PNAS 89:5577(1992)］。
【０００３】
研究への応用とは別にIVPSまたはタンパク質スプライシングを使用する方法の開発に於ける大きな障害は、IVPSの活性及びスプライシング事象を制御することが不可能である点にある。
【０００４】
従って、IVPSを用いるターゲットタンパク質を改質するための、特にIVPSの活性が制御可能な、便利な手段を提供する方法が望ましい。その活性が実質的に不活化されるようにターゲットタンパク質を特異的に改質し得る方法を得るのも望ましい。不活化改質タンパク質の活性を回復させるために使用し得る方法を得るのが望ましい。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、予め決定した条件下でスプライシングなしに切断またはタンパク質スプライシングにより切除し得るIVPSとターゲットタンパク質とを含む改質タンパク質に関する。このような予め決定した条件(predetermined condition)は、使用したIVPSに依存し、例えば、温度上昇、pH条件の変化、光への暴露、脱リン酸化、またはアミノ酸残基の脱グリコシル化を包含し得る。IVPSは、ターゲットタンパク質にIVPSを挿入することによってまたは、ターゲットタンパク質のアミノ若しくはカルボキシ末端でターゲットタンパク質とIVPSを融合することによってターゲットタンパク質と結合し得る。従って、制御可能な介在タンパク質配列(CIVPS)と称されるこれらのIVPSは、スプライシングまたは切断反応を制御するのに有用である。本発明はさらに、CIVPSの産生、選択及び試験方法にも関する。
【０００６】
好ましい態様の一つでは、CIVPSをコードするDNA配列は、両方のコード配列が連続する読み取り枠を形成するように、ターゲットタンパク質をコードするDNA配列に挿入するか、またはこれと結合させる。その後、この融合DNAの発現を利用して改質ターゲットタンパク質を産生する。もう一つの実施態様では、このようにして産生された改質タンパク質を、CIVPSを切除するか切断する予め決定した条件にかける。特定の実施態様に於いては、ターゲットタンパク質を実質的に不活化させるターゲットタンパク質領域にCIVPSを挿入し、そしてCIVPSの切除によりターゲットタンパク質の活性を回復させる。
【０００７】
好ましいCIVPSとしては、T.litoralisから得られるCIVPS１及び２(Vent IVPS１及び２または、IVS１及び２とも称される)並びに、Pyrococcus種から得られるCIVPS３［Deep Vent IVPS１またはIVS１とも称される］が挙げられる。これらのCIVPSは、温度上昇時に改質タンパク質から除去、即ち、タンパク質スプライシングを介して除去し得る。
【０００８】
本発明により、特定のCIVPSアミノ酸残基及び少なくとも第１の下流アミノ酸残基はスプライシング反応を調節し、且つこれらの残基の改質によりスプライシング反応が減少するかまたは停止することも知見された。これらの残基は、他のIVPSに保存されることが知見された。このような残基の改質を使用して、IVPSをCIVPSに転換させ得る。
【０００９】
本発明により、特定の状況下では、完全スプライシング反応は必要でないか、または望ましくないことが知見された。このような状況下では、CIVPSを改質してスプライシングなしに切断し、ターゲットタンパク質からCIVPSの分離または切断を制御し得る。
【００１０】
本発明のCIVPS及び改質タンパク質の潜在的な用途は多様である。これらの例としては、例えば、ターゲットタンパク質の酵素活性の制御、アフィニティークロマトグラフィーによるCIVPSに特異的な抗体を使用する改質タンパク質の精製、及び宿主細胞に毒性であるタンパク質の産生が挙げられる。
【００１１】
本発明のCIVPSは、さらに、CIVPSに融合したターゲットタンパク質を含む改質タンパク質を産生するタンパク質精製方法で使用し得る。所望により、３部分融合は、CIVPSがターゲットタンパク質と基質(結合タンパク質)、例えばMBPに対する親和性を有するタンパク質との間にある場合に産生し得る。次いで改質タンパク質は、CIVPSまたは結合タンパク質が特異的親和性を有する基質と、例えばアフィニティークロマトグラフィーを使用して接触させる。高度に精製したターゲットタンパク質は、例えばCIVPSとターゲットタンパク質の間の切断を開始する予め決定した条件にCIVPSをかけることによって、カラムから遊離し得る。あるいは、融合タンパク質は上記の如く精製し得、次いでターゲットタンパク質は、CIVPSを予め決定した条件にかけることによって融合物から放出してもよい。
【００１２】
詳細な説明
本発明は、改質タンパク質及びその製造方法に関する。改質タンパク質は、制御可能な介在タンパク質配列(CIVPS)及びターゲットタンパク質を含み、CIVPSは、例えば温度上昇、pH条件の変化、光分解によるアミノ酸残基不ブロック化、脱リン酸化、脱グリコシル化または他の手段などの予め決定した条件下で、タンパク質スプライシングなしに切断またはタンパク質スプライシングにより切除し得る。所望により、改質タンパク質をこれらの条件にかけ得る。CIVPSは実質的にターゲットタンパク質活性を不活化する領域にも挿入し得る。
【００１３】
介在タンパク質配列(IVPS)は、前駆体タンパク質内に見出される内部フレーム内ペプチドセグメントであり、ネイティブタンパク質を形成するためにタンパク質スプライシングを介して除去または切り出される。IVPSは、Saccharomyces cerevisiae由来のTFPI対立遺伝子［Hirataら，上掲；Kaneら,上掲］及びMycobacterium tuberculosis由来のrec Ａ遺伝子［Davisら，上掲(1991)；Davisら，上掲(1992)］中に存在することが報告されている。これらの文献は、本明細書中参照として含まれる。
【００１４】
本発明のCIVPSは、ネイティブのIVPSの固有の特性(例えば、温度の上昇)によりまたは、IVPSを制御すべき反応にかける改質により切除または切断が制御され得る任意の介在タンパク質配列を含む。
【００１５】
好高熱性原始Thermococcus litoralis由来のVent DNAポリメラーゼ遺伝子は、発現したポリメラーゼの動力学的及び生化学的特性に影響することなく、DNAレベルで欠失し得る２つのフレーム内IVPS、即ちIVPS１(CIVPS1)及びIVPS２(CIVPS２)［Perlerら，上掲］を含む。両方のIVPSを含むVent DNAポリメラーゼ遺伝子の正しいプロセシングは、ネイティブの原始T.litoralisで起こる。さらに、IVPS1を欠失する発現構築物の正しいプロセシングは、真正細菌のE.coli［Perlerら，上掲］、真核生物のバキュロウイルスに感染した昆虫細胞及びin vitro転写/翻訳系［Hodgesら，Nucleic Acids Research，20：6153(1992)］内で観察されている。さらに、ウサギ網状赤血球及びE.coli in vitro転写/翻訳系は、IVPS２配列を正しく除去して、成熟ポリメラーゼを産生する。理論に結び付けるつもりはないが、Vent及びDeep Vent IVPSは自己スプライシングすると考えられる。
【００１６】
Vent DNAポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列表中配列番号:１として記載した。CIVPS１のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド1773〜3386である。CIVPS２のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド3534〜4703である。CIVPS１及びCIVPS２は、1990年４月24日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託し、ATCC受託番号40795号を受けたファージNEB619から得ることができる。
【００１７】
第３のIVPS(CIVPS3、即ち、DV IVPS1)は、好熱性の原始細菌、Pyrococcus種(単離物GB-D)のDNAポリメラーゼ遺伝子中に本発明者によって発見された。Pyrococcus DNAポリメラーゼは、時折Deep Vent DNAポリメラーゼと称される。Deep Vent DNAポリメラーゼのヌクレオチド配列は、配列表中配列番号:2として記載した。CIVPS３のヌクレオチド配列は、1839〜3449である。CIVPS３は、1991年10月1日にATCCに寄託し、受託番号68723を受けたプラスミドpNEB＃720から得ることができる。
【００１８】
本発明により、上記CIVPS１、CIVPS２及びCIVPS３は、温度上昇時に改質タンパク質から切除し得る。例えば、CIVPSは37℃以下の温度では低減した速度で切除されるが、約42℃〜80℃の温度ではより効率的に切除し得る。好ましい切除温度は、約42℃〜60℃である。予め決定した条件は、ターゲットタンパク質が変性しないか、熱不活化を受けない温度を実験的に考慮すると最も好ましい。改質タンパク質を予め決定した条件に、１分未満〜数時間かけ得る。特定の状態では、ターゲットタンパク質の熱感受性に依存して、温度を下げながらインキュベーション時間を長くするのが好ましい。
【００１９】
さらに、異なる改質タンパク質は、種々の温度でスプライシング効率に違いを示し得る。必要により、各改質タンパク質の単離及びスプライシングの最適温度は、実験的に決定し得る。CIVPSが目的温度よりも低すぎる温度でスプライスする場合、CIVPSを改質し得るか、ターゲットタンパク質中のその位置を最適スプライシング温度が上昇するように変化させ得る。改質タンパク質がin vivoでスプライスせず、無傷の改質タンパク質の収量を確実に増加させるために、宿主細胞を増殖して、改質タンパク質をより低い温度(例えば、12℃〜30℃)で精製し得る。これは、スプライシング要素を突然変異させて、スプライシング温度を最適温度例えば30℃〜37℃から42℃〜50℃にシフトさせ、その結果、生理学温度でのスプライシングのレベルを減少させることによっても達成し得る。
【００２０】
他のIVPSは、例えば、コード容量(coding capacity)が知見されたタンパク質よりもかなり大きく、成熟タンパク質に存在しないタンパク質配列をコードする遺伝子類を識別することにより単離し得る。IVPSを含むタンパク質は、成熟タンパク質がIVPSを含む前駆体のＮ-末端及びＣ-末端配列を依然として有するという点で「プレ-プロ(pre-pro)」前駆体を有するタンパク質と区別し得る。さらに、IVPSは、特定のタンパク質ファミリー（例えばDNAポリメラーゼ)中に保存されるという特質(motifs)が存在しないことにより検出され得る。このような特質が存在しないということは、IVPSがその特質を妨害することを示している［Perlerら，上掲］。挿入がマーカータンパク質活性を減少させるように、疑わしいタンパク質配列をマーカータンパク質、例えばβ-ガラクトシダーゼ中に挿入することにより、目的のIVPSをスクリーニングし得る。得られた改質タンパク質は、マーカータンパク質活性の増加に関して特定の時間間隔で評価し得る。実施例１〜３参照。一度識別できたら、IVPSをコードするDNAを単離し、通常のDNA増幅方法を使用して増幅し得る。
【００２１】
IVPSは、以下の特性：
(１)ＨＯエンドヌクレアーゼまたは他のホーミングエンドヌクレアーゼとの類似性、
(２)アミノ酸配列(Ala/Val)HisAsn(Ser/Cys/Thr)(配列番号:45)
をいくらか有する領域の存在及び、成熟タンパク質で観察されるよりも大きな読み取り枠によっても識別し得る。
【００２２】
本発明のCIVPSは、スプライシング反応が制御され得るように改質されたIVPSも含む。図１(配列番号:30，配列番号:31，配列番号:32，配列番号:33，配列番号:34，配列番号:35，配列番号:36，配列番号:37，配列番号:38及び配列番号:39)に示されているように、IVPSをスプライシングする公知のタンパク質の並んだスプライス部位から幾つかの類似点が明らかになる。特に、-OH及び-SH側鎖は、下流スプライス部位でジペプチドHis-Asnにより先行した両方のスプライス部位のＣ-末端側の残基上に見出される。
【００２３】
理論に結び付けるつもりはないが、ヒドロキシ/スルフヒドリル基は、スプライシング反応に関係し、これらの残基の改質はスプライシング反応を調節すると考えられる。このような改質は、挿入がマーカータンパク質活性を減少させるように、マーカータンパク質、例えばβ-ガラクトシダーゼに改質CIVPSを挿入することにより評価し得る。得られた改質タンパク質は、次いで、マーカータンパク質活性が増加する制御条件下で特定の時間間隔で評価し得る。実施例１〜３参照。さらに、ウエスタンブロット分析を使用して、スプライシング及び切断産生物を評価し得る。実施例８を参照。同定後、CIVPSをコードするDNAを単離し、標準DNA増幅方法を使用して増幅し得る。
【００２４】
本発明により、CIVPS２のセリン1082の単一アミノ酸の変化は、タンパク質スプライシング反応を遅延させるかまたは遮断(block)することが知見された。特に、トレオニン置換変異体は、野生型酵素のポリメラーゼ活性の10%を示したが、システイン及びアラニン置換変異体は検出可能な活性を与えなかった。しかしながら、他のスプライス部位での切断に対応する反応生成物が観察された。この種は、スプライス部位でセリンとシステインを置き換えた変異体中に蓄積したが、セリンがトレオニンまたはアラニンと置き換えた時には変化がなかった。野生型CIVPS２は、スプライシング反応時にカルボキシ末端スプライス部位での切断で予想される大きさの種の蓄積を示したが、セリン1082がトレオニン、システインまたはアラニンに変えられた時もこの産生物の蓄積は減少したけれども依然として観察された。Ｓ1082Ａ変異体(variant)はタンパク質スプライシングの証拠を示さなかったが、この産生物を産生した。
【００２５】
カルボキシ-末端スプライス部位に於ける突然変異の誘発、即ちトレオニン1472(T1472)残基とセリンとのアミノ酸置換により、野生型と同一のスプライシングパターンが生じた。T1472とアラニン、グリシンまたはイソロイシンとの置換は検出可能なスプライシングを与えなかった。アスパラギン1471をアラニンと置換すると、スプライシングは観察されなかったが、アミノスプライス部位での切断の証拠が観察された。以下の表１は、CIVPS２に於ける切断及びスプライシングでのアミノ酸置換の効果をまとめたものである。
【００２６】
【表１】
0003662948.tif 000002
従って、CIVPSスプライス部位での切断は、タンパク質スプライシングなしに達成され、ターゲットタンパク質からCIVPSの分離を制御できた。特定の状況では、このような活性が望ましい。これらの状況では、本発明のCIVPSは、自己タンパク質分解性タンパク質、例えば、自己タンパク質分解性プロテアーゼなど、例えばレトロウイルスプロテアーゼ[例えば、HIV-1 プロテアーゼ：Louisら,Eur.J.Biochem.,199:361(1991)及びDebouckら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:8903-8906(1987)]も包含し得る。当業者には他のこのようなタンパク質も公知である。Krausslichら,Ann.Rev.Biochem.,701-754(1988)参照。このようなタンパク質は、開示の方法に従って、タンパク質分解活性が予め決定した条件下で誘導し得るように改質し得る。
【００２７】
スプライス部位アミノ酸を含むCIVPSアミノ酸の改質は、種々の方法で実施し得る。例えば、改質すべきアミノ酸残基を取り囲む配列を変更して、生物学的リン酸化部位を作り出し、特異的なキナーゼ及びホスファターゼに対する基質とする。プロテインキナーゼの例としては、例えばカゼインキナーゼII、cAMP依存性プロテインキナーゼ、cdc2及びpp60c-src[Pearson及びKemp,Methods in Enzymology 200:62(1991)]が挙げられる。ホスファターゼの例としては、例えばタンパク質ホスファターゼ2A、λホスファターゼ及びエルシニア(Yersinia)由来のyopホスファターゼ[Tonks,Current Opinion in Cell Biology,2:1114(1990)]が挙げられる。
【００２８】
実施例６Ｃに記載の如くCIVPS２を例として使用すると、アルギニン残基を位置1079で置換して、コンセンサスカルモジュリン依存性プロテインキナーゼII部位を作り出す[XRXXS*；Pearsonら,上掲]。タンパク質スプライシング反応は、リン酸化度によって調節され得、ホスホセリンを作り出し、スプライシングをブロックするためにキナーゼを、リン酸を除去するためにホスファターゼを使用し、野生型セリンを回復し、タンパク質スプライシングする。
【００２９】
さらに、重要なスプライス部位残基は、改質が逆転するまでスプライシング反応がブロックされるように、化学的に改質され得る。これは、例えば、異常なアミノ酸突然変異誘発［Norenら，Science 244：182(1989)；Ellmanら，Methods in Enzymology 202：301(1991)］を使用することにより実施し得る。この方法を使用して、スプライシング反応に含まれるアミノ酸１個を翻訳時に、側鎖の側鎖官能基が化学的または光分解的に除去し得る基によって「マスク」される合成誘導体と置換し得る。例えば、実施例７に記載の如く、CIVPS２のセリン1082を以下の如く本方法により改質した。アンバー停止コドンをセリン1082に対応する位置でVentポリメラーゼ遺伝子に導入した(実施例６Ｄ参照)。この遺伝子を、野生型遺伝子のタンパク質スプライシングを指示することが既に示されたin vitro転写/翻訳系［Ellmanら，上掲］に添加した。このコドンを介して読み取るtRNAの非存在下では、切頭産物だけが予想された。化学的にO-(o-ニトロベンジル)セリンでアミノアシル化したアンバーサプレッサーtRNAをこの系に添加したときには、このコドンの先では連続的な翻訳が可能であり、その結果、改質セリンの部位特異性組み込み(incorporation)が得られた。予想通り、完全長前駆体だけが観察され、これは、スプライシング反応がブロックされたことを示している(図９)。o-ニトロベンジル基は350nmでの短時間の照射により除去可能なので［Pillai，Synthesis１(1990)］、ブロックされた前駆体は、照射後には通常スプライスすると考えられる。ブロックされた前駆体は、可視光に暴露されるとセリンを放出し、インキュベートするとスプライシング反応が起きるので、スプライスされた産生物がはっきりと知見される(図１０)。
【００３０】
この戦略は、CIVPS2の下流スプライス部位に見られるトレオニン1472並びに、側鎖の化学官能基がスプライシングに必要であるか、その位置に嵩高い基を導入することによりスプライシングを立体的に妨害する他の任意の残基に適用し得る。ブロック基は、保護すべき側鎖の化学的性質だけでなく、(化学的または光分解的)脱ブロックの望ましい方法に基づいて選択し得る。例えば、タンパク質スプライシングの他の例(図１)に存在するシステイン基は、例えば、ジスルフィド交換(例えば、ジチオジピリジンを用いる)または遷移金属イオン(例えば、Ｈg2+)との錯体形成を使用してブロックし得るチオール側鎖を有する。Corey及びSchultz,J.Biological Chemistry 264:3666(1989)参照。得られたブロック化前駆体は、次に、各々金属キレート化剤の添加または温和な還元によりスプライシングするために活性化し得た。
【００３１】
IVPS１及びIVPS２は各々、エンドヌクレアーゼ、即ち、I-Tli-II及びI-Tli-Iをコードする。さらにDV IVPS１は、IVPS１がVent DNAポリメラーゼ遺伝子に挿入したのと同位置でDV DNAポリメラーゼに挿入し、Vent IVPS１遺伝子と62%の相同であるエンドヌクレアーゼI-PspIもコードする。Tfp１、M.tuberculosis rec Ａ、Vent及びDeep Vent DNAポリメラーゼ中のIVPS読み取り枠は、ホーミングエンドヌクレアーゼ、イントロンを欠失する対立遺伝子を切断し得るイントロン-コード化タンパク質の種類と似たタンパク質配列を有する[Hirataら,上掲,Kaneら,上掲,Davisら,上掲,Perlerら,上掲]。
【００３２】
特定の宿主細胞は、CIVPSの遺伝子産物に対して耐性がないので、場合により、エンドヌクレアーゼ機能を不活化するのが好ましい。本発明により、タンパク質スプライシングは、CIVPSエンドヌクレアーゼ機能が不活化された時に起きることが明らかになった。このような不活化は、例えば、ランダム突然変異誘発、欠失または挿入不活化または特定部位の突然変異誘発を含む種々の方法で達成し得る。エンドヌクレアーゼ機能は、部位特異的突然変異誘発により不活化されるのが好ましい。I-Tli-Iは、特徴的なドデカペプチドモチーフ対中の他の「ホーミングエンドヌクレアーゼ」と似た配列を共有する［Cummingsら,Curr.Gent.16:381(1989)］。実施例６Ｂに見られるように、エンドヌクレアーゼ活性は、これらのモチーフの一種内の単一残基のオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発により不活化された(アスパラギン酸1236からアラニンへ)。別の残基の置換は、タンパク質スプライシングに影響を及ぼすことなくエンドヌクレアーゼ活性を減少または除去し得た。エンドヌクレアーゼ機能の不活化により、改質タンパク質を保持する構築物の安定性を増加させることが明らかになった。
【００３３】
本発明で使用し得るターゲットタンパク質としては、例えば、酵素、毒素、細胞毒素、糖タンパク質及び成長因子が挙げられる。このような多くのタンパク質は当業者には公知である。このようなタンパク質のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、多くのコンピューターデータベース、例えば、GenBank、EMBL及びSwiss-Protにより容易に得られる。あるいは、ターゲットタンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、当業界で日常的な方法を使用して決定し得る。
【００３４】
実質的にターゲットタンパク質活性を不活化するのが望ましい場合、このような活性を不活化する領域にCIVPSを挿入する。このような領域は当業者には公知であり、例えば、結合部位、酵素活性部位、タンパク質の保存モチーフ、例えばDNAポリメラーゼ及び二量化または多量化部位(multimerization sites)が挙げられる。あるいは、CIVPSをランダムに挿入し、所望の活性レベルが得られるまで各改質タンパク質の活性を測定し得る。このような改質タンパク質は、ネイティブのタンパク質と比較して活性が約50%減少しているのが好ましい。約75%減少しているのがより好ましく、99%以上減少しているのが最も好ましい。
【００３５】
CIVPSは、任意の多くの方法によりターゲット遺伝子に挿入し得る。好ましくは、適正なタンパク質スプライシングを確実にするためにCIVPSが切除される場合、CIVPSの切除によりそのアミノ酸がスプライス部位に残るので、適正なスプライス部位残基の直前にCIVPSを挿入することが重要である。これは、好適なスプライス部位アミノ酸の直前にCIVPSを挿入するか、またはCIVPSが好適なアミノ酸を一緒に「持ってくる（bring）」ようにCIVPSを改質することによって達成し得る。
【００３６】
例えばCIVPS１、２または３は、好適なスプライス部位アミノ酸、例えばセリン、トレオニンまたはシステイン残基の直前、最も好ましくはセリンまたはトレオニンの直前に挿入し得る。図１を参照。このような部位は、殆どのターゲットタンパク質で便利に利用し得る。
【００３７】
ターゲットタンパク質が毒素であるような特定の状態では、第２の制御を加えることによりタンパク質スプライシングをさらに制御することが望ましい。これは、例えばCIVPSが通常先行せず、スプライシング反応を遅延させ得るようなそれほど最適でないアミノ酸の前にCIVPSを挿入することにより達成し得る。
【００３８】
上記の如く、CIVPSが好適な下流アミノ酸を一緒に「持ってくる」場合、ターゲットタンパク質内の任意の部位に挿入し得る。これは、所望の下流のアミノ酸のコドンを有するCIVPS DNAの作製により達成し得る。このようなDNAの産生方法を以下に詳述する。このDNAは次いで、ターゲットDNA内の任意の部位に挿入し得る。得られた改質タンパク質のタンパク質スプライシング時には、CIVPSによりもたらされた過剰の残基は後方に残存する。従って、最終産生物の活性が重要である場合、当業者は、過剰の残基が、活性に悪影響を及ぼすようなターゲットタンパク質領域内に絶対残存しないように製造段階を取らねばならない。
【００３９】
CIVPSは、標準法[例えば、Hunkapillerら，Nature 310:105(1984)]及び市販のタンパク質合成機を使用して、任意の所望の部位に挿入した、CIVPSを含む、ターゲットタンパク質の第１のアミノ酸配列を化学的に合成することにより、ターゲットタンパク質に挿入またはターゲットタンパク質に融合し得る。
【００４０】
あるいは、CIVPSをコードするDNA配列は、両方のコード配列が連続読み取り枠を形成するようにターゲットタンパク質をコードするDNA配列に挿入または融合される。これは、当業者には公知の種々の方法を利用して実施し得、その幾つかを以下に記載する。
【００４１】
例えば、CIVPS DNAを、ターゲット遺伝子内でブラント切断し且つ枠内にある任意の制限酵素部位に挿入する。これは、第１に、その３'末端にトレオニンコドン(Vent IVPS２)またはセリンコドン(Deep Vent IVPS１若しくはVent IVPS１)をもつCIVPS DNAフラグメントを合成することにより実施し得る。次いで、このフラグメントを制限エンドヌクレアーゼによりブラント末端に切断した線状プラスミドにフレーム内で結合する。lacZ DNA配列、例えば、EcoRV部位を使用して、残基375(アスパラギン酸)と376(イソロイシン)との間にVent IVPS２またはDeep Vent IVPS１を挿入し得る。図２参照。しかしながら上記の如く、この方法を使用してCIVPSを切除する場合、過剰の残基がスプライス部位に残存し、従って、CIVPSが挿入される場所に応じて、得られたタンパク質はネイティブのタンパク質と同一機能または構造を持たなくてもよい。
【００４２】
CIVPS DNAは、ターゲット遺伝子と適合性の制限部位を作り出すためにCIVPSの両方の末端または一方の末端の近くにサイレント突然変異(アミノ酸残基を維持する)を起こすことによっても挿入し得た。例としてCIVPS２を使用すると、サイレント突然変異により、BspEI制限部位は５'末端の近くに作り出され得、SpeI制限部位はその３'末端の近くに作り出され得る。新しい制限部位と重複し、且つasp 594またはthr 595のいずれかに於けるlacZターゲット遺伝子の開始により連続するPCRプライマーを使用して、BspE1及びSpeI制限部位と適合性のlacZフラグメントを作製し得る。次いで、CIVPSをlacZコード領域内のアスパラギン酸コドン(残基 594)とトレオニンコドン(残基 595)の間に挿入する。DNAフラグメントは、CIVPS及びターゲット遺伝子の両方から、CIVPSの末端と重複する挿入部位のその末端とのPCRにより合成され得、従って同一制限部位を含む。好適な制限エンドヌクレアーゼ処理後、適合性末端を有するDNAフラグメントを連結して融合遺伝子を作製し得る。CIVPSの切除後には過剰残基は全く残らないので、スプライシング発生時にネイティブのポリペプチドが形成するだろう。作り出された制限部位がCIVPS内に１個及びターゲット遺伝子内に１個であると、多重フラグメントの連結及び複雑なスクリーニング方法を回避し得るので好ましい。
【００４３】
ターゲット遺伝子配列を保持するプラスミドベクターが比較的小さい場合、例えば、約５kb未満である場合、線状型プラスミドをPCRを使用して作製し、次いで線状プラスミドをCIVPS遺伝子に連結する。この方法を使用して、CIVPS遺伝子を以下の如くターゲット遺伝子の任意の位置に挿入し得る。第１に、ターゲット遺伝子を含むプラスミドDNAを、挿入部位(例えば、CIVPS１、２及び３に関してはセリン若しくはトレオニンコドン)で開始するプライマー対または、CIVPSが好適な下流アミノ酸を持ってくる場合には任意のコドンを使用するPCRにより合成し得る。次に、(任意にセリンまたはトレオニンを含む)CIVPS遺伝子を(セリンまたはトレオニンコドンを含まない)線状プラスミドDNAに連結し得る。必要なスプライス部位アミノ酸(セリンまたはトレオニン)を、CIVPSフラグメントまたはターゲット遺伝子のいずれかの上に配置し得る。内在性セリンまたはトレオニンの上流に配置する際に必要なアミノ酸をCIVPSフラグメント上に有する利点は、コード領域にセリンまたはトレオニンが欠失しているので、(CIVPS挿入物を含まない)自己連結ベクターDNAがターゲット遺伝子の欠陥産物だけを発現し得るということである。これは、融合タンパク質がスプライスして機能性産物を産生する場合に、融合構築物に関する表現型の選択を助長し得る。
【００４４】
改質タンパク質をコードする融合DNAは、好適な発現ベクター、即ち、挿入したタンパク質-コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入し得る。種々の宿主-ベクター系を使用してタンパク質-コード配列を発現し得る。これらの例としては、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物または、バクテリオファージDNA、プラスミドDNA若しくはコスミドDNAで形質転換したバクテリアが挙げられる。使用した宿主-ベクター系に依存して、多数の好適な転写及び翻訳要素のうちの任意のものを使用し得る。例えば、改質真核生物タンパク質を発現する際、好適な真核生物ベクター及び宿主細胞を使用すると都合がよい。融合DNAの発現により、本発明の改質タンパク質が産生する。
【００４５】
一度得られたら、公知方法を好適に組み合わせて、改質タンパク質を分離し且つ精製し得る。これらの方法としては、例えば、塩析及び溶媒沈殿などの溶解性を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の違いを利用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の違いを利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的な親和性を利用する方法、逆相高性能液体クロマトグラフィーなどの疎水性の違いを利用する方法及び等電点電気泳動などの等電点の違いを利用する方法が挙げられる。
【００４６】
所望により、改質タンパク質を、CIVPSが除去される予め決定した条件にかけ得る。このような条件は、使用するCIVPSに依存する。例えば、CIVPS１、２及び３は、改質タンパク質を高温、42℃〜80℃、最も好ましくは42℃〜60℃にかけることにより除去し得る。これは、公知方法、例えば、水浴または熱発生レーザーを使用して実施し得る。インキュベーション時間は１分未満から数時間以上を変動し得る。上記の如く、特定の状態では、ターゲットタンパク質の熱感受性に依存して、温度を下げながらインキュベーション時間を延長するのが望ましい。さらに、in vivoスプライシングが望ましい場合、宿主生物の増殖と適合する温度が好ましい。
【００４７】
本発明により、改質タンパク質が無毒性であるように毒性ターゲットタンパク質を改質するためにCIVPSを使用することにより宿主細胞に対して非常に毒性のタンパク質を産生し得る。これは、例えば、CIVPSを毒性に関与する領域に挿入することにより実施し得る。単離後、無毒性改質タンパク質を、CIVPSを除去し、得られた毒性を単離し得るような予め決定した条件にかけ得る。
【００４８】
タンパク質が宿主細胞に対して非常に毒性が高い場合、「トランスプライシング(transplicing)」と称される方法を使用してそのタンパク質を産生するのが望ましい。この方法を使用すると、毒性タンパク質は、別個の宿主細胞中にCIVPSを挿入することにより改質されている２つ以上の部分(pieces)内で産生する。例えば、ターゲットタンパク質のカルボキシ末端にCIVPSのアミノ末端フラグメントが挿入されるターゲットタンパク質のアミノ部分を含む第１の改質タンパク質を産生し、その後、ターゲットタンパク質のアミノ末端にCIVPSの残りのフラグメントが挿入されるターゲットタンパク質の残りの部分を含む第２の改質タンパク質を産生し得る。あるいは、重複CIVPSフラグメントを使用し得る。次いで、各改質タンパク質を宿主細胞から単離し、CIVPSのスプライシングに好適な条件下、一緒にインキュベートする。これにより連結したターゲットタンパク質が得られる。ターゲットタンパク質を２個の異なる宿主に分割することにより、微小画分でさえも宿主に悪影響を与えるin vivoスプライスする可能性はない。さらに、CIVPS全体を第１の改質タンパク質のスプライス部位の一方の側に挿入し、残りのターゲットタンパク質フラグメントをスプライシング混合物に添加した。
【００４９】
本発明のIVPSは、「タンパク質連結」で使用し、非天然アミノ酸残基、構造プローブ、識別エピトープ若しくはタグ(tags)または、他の決定子(determinants)をターゲットタンパク質に添加し得る。例えば、ターゲットタンパク質をIVPSのアミノ末端に融合し得る。停止コドンを、IVPSのカルボキシ末端の直後に配置し得る。次いで融合すべきペプチドを混合物に添加し得る。天然のスプライシング機構を非常に厳密に模倣するためには、このペプチドのアミノ末端はセリン、トレオニンまたはシステインであってもよい。次いで、産生物のスプライシングへ質量作用により増大されたスプライシング反応を進行し得る。
【００５０】
上記反応は、ターゲットタンパク質のアミノ末端にカルボキシ末端で融合したIVPSから構成される出発物質を用いて起きるようにもし得る。特定のCIVPS内で開始するセリン残基に先行するように工学的に作製されたメチオニンでの開始が、E.coli内でアミノ末端セリン残基を残すように翻訳を起こさせる。次いで、このターゲットタンパク質のアミノ末端に融合すべきペプチドを添加し、スプライシングを進行させた。添加されるペプチド上のカルボキシ末端残基に関しては公知の要件がないので、このような試みは好ましい。さらに、今回の実験的証拠から、上流スプライス部位の切断は連結反応に先行して起こることが示唆されており、この試みが天然の反応機構に非常に近いことを示している。ターゲットペプチドをペプチドに添加し、融合タンパク質を翻訳し易くすることが可能であった。
【００５１】
本発明は、他のタンパク質の誘導または分化などの特定の条件下、または細胞周期の特定の部分の間にターゲットタンパク質の効果を研究するためにも使用し得る。例えば、特定のタンパク質をコードする遺伝子の染色体コピーをCIVPSを含むバージョンと置き換え得る。細胞周期の特定点、分化または他の所望の点で、細胞を加熱すると前駆体がスプライスし、活性ターゲットタンパク質はこの時点でのみ存在する。
【００５２】
本発明のCIVPSを使用して、CIVPSに対して特異的な抗体を持つアフィニティクロマトグラフィーを使用することにより改質タンパク質を単離することもできる。例えば、標準法を使用してCIVPSに対して結合親和性を持つモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生し得る。これらの抗体は、アフィニティクロマトグラフィー精製法で使用し、改質タンパク質を単離し得る。精製後、所望により、改質タンパク質をCIVPSを切除する予め決定した条件にかけ得る。
【００５３】
上記の如く、CIVPSスプライス部位での切断は、タンパク質スプライシングなしに実施でき、ターゲットタンパク質からCIVPSの分離を制御し得る。従って、このようなCIVPSは融合タンパク質精製系で使用し得る。
【００５４】
融合タンパク質精製系は当業者には公知である［欧州特許出願第0 286 239号及びN.M.Sassenfeld、TIBTECH,8:88-93(1990)参照］。通常、このような系では、結合タンパク質とターゲットタンパク質はプロテアーゼ認識部位を持つリンカーで結合されている。次いで、融合物は、結合タンパク質に対して親和性を持つ基質上のアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。結合タンパク質とターゲットタンパク質を、次に、プロテアーゼ、例えば第Ｘａ因子と接触させることにより分離する。これらの系では、非常に精製されたターゲットタンパク質を得るために、プロテアーゼはターゲットタンパク質並びに汚染の可能性から分離せねばならず、従って、追加の精製段階にかける。プロテアーゼの代わりにCIVPSを使用することにより、本発明の方法は、現在使用されているタンパク質融合精製系に含まれるこれら及び他の問題を避けることができる。
【００５５】
本発明の方法により、基質（結合タンパク質）に対して親和性を持つタンパク質とターゲットタンパク質の間にCIVPSがある融合タンパク質を含む改質タンパク質が形成する。このような融合タンパク質を形成する方法は、当業者には公知である［欧州特許出願第0 286 239号及びJ.Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,p.17.29-17.33参照]。
【００５６】
本発明の方法で使用し得る結合タンパク質としては、例えば、糖結合タンパク質、例えばマルトースまたはアラビノース結合タンパク質、レセプター結合タンパク質、アミノ酸結合タンパク質及び金属結合タンパク質が挙げられる。他の結合タンパク質は当業界で公知である［欧州特許出願第0 286 239号及びN.M.Sassenfeld,TIBTECH,上掲、参照］。
【００５７】
次いで改質タンパク質を、結合タンパク質が特異的親和性を有する基質と、例えばアフィニティクロマトグラフィーを用いて接触させる。
【００５８】
非常に精製されたターゲットタンパク質を、例えば、CIVPSとターゲットタンパク質の間で切断が開始するような予め決定した条件にCIVPSをかけることにより、カラムから遊離し得る。あるいは、精製融合タンパク質を、上記の如くカラムから溶離且つ遊離し得る。
【００５９】
【実施例】
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、本発明を理解しやすくするためのものであり、限定するものではない。
【００６０】
上記及び下記引用の参照文献は、すべて本明細書中参照として含まれる。
【００６１】
実施例１
ターゲット遺伝子コドンの間の平滑部位に挿入するためのＩＶＰＳカセットの合成
ｌａｃＺコード領域（ｌａｃＺ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）又は他の任意のターゲット遺伝子にＩＶＰＳをフレーム内挿入（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）するためのＤＮＡフラグメント又はカセットは、第１の下流外部タンパク質配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ＥＰＳ）コドンを用いて又は用いずにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造し得る。天然の（ｎａｔｉｖｅ）下流残基は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１及びＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ１の場合のセリン、又はＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の場合のトレオニンである。ＩＶＰＳ２は、トレオニン又はシステインに先行していれば、程度は低いが、スプライスできることが判明した。理論に拘束されたくはないが、全てのＩＶＰＳは、セリン、トレオニン又はシステインのいずれかに先行していれば、ある程度までスプライスできると考えられる。下流のセリン又はトレオニンを含むカセットは、セリン又はトレオニンに先行する位置を含めて、ターゲット遺伝子内の任意の所望位置に挿入することができる。この構築では、セリン又はトレオニンをターゲット遺伝子から欠失させ、これをカセット上の入来残基で置換し得る。下流のセリン、トレオニン又はシステインを有していないカセットは、ターゲット遺伝子内のセリン、トレオニン又はシステインより前に挿入し得る。
【００６２】
下記のプロトコルは、第１の下流ＥＰＳコドンを含む、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰ３）及びＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰ２）（エンド+及びエンド-バージョン）用カセットの製造を説明するものである。
【００６３】
ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）に、２ｍＭの硫酸マグネシウムと、４００μＭの各ｄＮＴＰと、０．９μＭの各プライマーと、４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたものからなる。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）を用いて、９４℃で３０秒、４８℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルに３０回かけることにより実施した。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１は、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む４．８ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントを有するｐＮＥＢ＃７２０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７２３）から合成した。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２は、ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列の１．９ｋｂ  ＥｃｏＲ１フラグメント（２８５１−４７６６）を有するｐＶ１５３−２から合成した。ＩＶＰＳ２にはｐＮＥＢ６７１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８４４７）を使用することもできる。ｐＡＭＱ２９は、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２コード領域内にアミノ酸置換（アスパラギン酸１２３６をアラニンに）を有する、ｐＶ１５３−２のエンドヌクレアーゼ欠失誘導体である。プライマー５’−ＡＧＴＧＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴ−３’（配列番号：３）（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）、３５３４−３５５６、Ａ３５４２のＣへの置換）及び５’−ＡＧＴＡＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧ−３’(配列番号：４）（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２／Ｔｈｒ逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）、４６８５−４７０６）を用いて、３’末端にトレオニンコドンを有するエンド+又はエンド-Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２フラグメント（１１７３ｂｐ）を合成した。プライマー５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号：５）（ＤＶ  ＩＶＰＳ正方向、１８３９−１８６２）及び５’−ＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：６）（ＤＶ  ＩＶＰＳ１／Ｓｅｒ逆方向、３４２８−３４５２）を用いて、３’末端にセリンコドンを有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）ＩＶＰＳ１フラグメント（１６１４ｂｐ）を合成した。Ｃ末端セリン又はトレオニンを欠失したＩＶＰＳフラグメントの形成には、最後の３つのヌクレオチドを欠失した逆方向プライマーを使用し得る。
【００６４】
ＰＣＲ試料はフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３Ｍ  ＮａＡｃ及び７０％エタノール中で−２０℃で一晩沈殿させ、ミクロ遠心機（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で１０分間、１０Ｋで遠心分離して回収し、乾燥し、各々を３０μｌの蒸留水に再懸濁し、１％アガロースゲル上に配置して６０ボルトで１５時間電気泳動にかけた。ＰＣＲ増幅フラグメントを含むゲル切片を１％低融点（ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ）アガロースゲル中に配置して８０ボルトで２時間電気泳動にかけた。０．５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中６５℃で３０分間インキュベートし、フェノール、フェノール−クロロホルム（１：１混合物）及びクロロホルムで抽出し、０．６Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）及び５０％イソプロパノール中で−２０℃で一晩沈殿させることにより、低融点アガロースゲルからＤＮＡフラグメントを回収した。ＤＮＡを遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１５．５μｌの蒸留水に再懸濁した。
【００６５】
ＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントのリン酸化を、２μｌの１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、１５．５μｌの精製ＤＮＡと、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰと、２０μｌ中５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを用いて３７℃で６０分間実施した。試料を６５℃の水浴中で１０分間加熱した。８０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えた後、試料をフェノール、フェノール−クロロホルム（１：１混合物）及びクロロホルムで逐次抽出した。ＤＮＡを２．５Ｍ  ＮＨ4Ａｃ及び７０％エタノール中で−７０℃で３．５時間沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋで遠心分離してペレット化し、冷７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、蒸留水（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１  ＤＮＡの場合は２０μｌ、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳエンドＤＮＡの場合は１０μｌ）に再懸濁した。
【００６６】
実施例２
β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドのような制限酵素直線化プラスミド（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ）へのＩＶＰＳのフレーム内挿入
この実施例では、２つのコドンの間でターゲット遺伝子内に平滑切断（ｂｌｕｎｔ  ｃｕｔ）を形成する制限酵素部位にカセットを挿入することによって、ＩＶＰＳカセットをターゲット遺伝子にクローニングする方法を説明する。カセットは、必要であれば、Ｃ末端セリン、システイン又はトレオニンを有し得る。このプロトコルは、制限酵素がターゲット遺伝子ベクターを１回又は２回切断する場合に最も効果的である。具体例として、ｌａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位への挿入を説明する（図２）。
【００６７】
ＥｃｏＲＶ直線化ｐＡＨＯ５の調製
ｐＡＨＯ５は、ｔａｃプロモーターの下流のｐＡＧＲ３のポリリンカー内でＢａｍＨＩ部位とＳｍａＩ部位との間に挿入されたｐＲＳ４１５（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ  ５３：８５−９６（１９８７））からの３．３１ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＤｒａＩフラグメント上に完全なｌａｃＺ遺伝子配列を有する。ｔａｃプロモーターは、ｌａｃＩq遺伝子の産物によって抑制され得且つイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導され得る転写制御エレメントである。５．９ＫｂベクターｐＡＨＯ５（ＮＥＢ）は更に、ｔａｃプロモーター及びポリリンカーの上流の転写終結配列と、大腸菌ｌａｃＩq遺伝子とを有する。ｐＡＨＯ５は２つのＥｃｏＲＶ認識配列を含んでいる。ＥｃｏＲＶは開裂部位に平滑末端を残す。ＥｃｏＲＶ開裂部位の１つは、３７５番目のコドン（アスパラギン酸）と３７６番目のコドン（イソロイシン）との間のｌａｃＺコード領域内で切断を行い、ＩＶＰＳフラグメントのフレーム内挿入用部位として予定される。もう１つの部位は大腸菌ｌａｃＩq遺伝子内で３．２ｋｂ下流に位置する。該プラスミドを部分的に切断して、ＥｃｏＲＶ部位のうちの１つだけが開裂されている分子を幾つか産生する。これらの直線プラスミドを精製する。ＩＶＰＳカセットはいずれかのＥｃｏＲＶ部位にランダムにクローニングする。従って、得られた組換え体は、配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と固有のＥｃｏＲＶ部位への挿入とのためにスクリーニングする必要がある。ＤＮＡは、１５μｇのｐＡＨＯ５ＤＮＡを１００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液２中４０単位のＥｃｏＲＶ（ＮＥＢ）と共に３７℃で６０分間インキュベートすることにより部分的に消化した。ＥｃｏＲＶを失活するために試料を６５℃で１０分間加熱した後、２０μｌの染料添加アガロースゲルを試料に加えた。１％低融点アガロースゲルでの電気泳動によりＤＮＡフラグメントを分離した。直線化ｐＡＨＯ５プラスミドＤＮＡを実施例１と同様に低融点アガロースゲルから回収し、４４．６μｌの蒸留水に再懸濁した。
【００６８】
ＥｃｏＲＶ直線化ｐＡＨＯ５の脱リン酸化を、２μｇのＤＮＡと４単位の子牛腸アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）との存在下で、５０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液２中５０℃で６０分間実施した。０．５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えた後、試料を６５℃の水浴中で３０分間加熱し、フェノール、フェノール−クロロホルム（１：１混合物）及びクロロホムで抽出した。ＤＮＡを０．７５Ｍ  ＮＨ4Ａｃ及び７０％エタノール中で２時間沈殿させ、実施例１と同様に回収し、２０μｌの蒸留水に再懸濁した。
【００６９】
ＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子の構築
脱リン酸化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡとリン酸化ＩＶＰＳフラグメントとの連結を、２０μｌ倍容で、８．６μｌの蒸留水と、２μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、４μｌの０．１μｇ／μｌ脱リン酸化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡと、前述のように調製した５μｌのＩＶＰＳ  ＤＮＡ（０．２５μｇのＶｅｎｔＩＶＰＳ２、０．４μｇのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１又は０．２５μｇのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２エンド-）と、１６０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えて１６℃で１５時間実施した。
【００７０】
１００μｌのコンピテントＲＲ１細胞と１０μｌの連結反応試料とを氷上で３０分間混合し、４２℃で２分間加熱し、氷上で５分間冷却し、０．８ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リットル  トリプトン、５ｇ／リットル酵母抽出物、１０ｇ／リットルＮａＣｌ、１ｇ／リットル  デキストロース、１ｇ／リットルＭｇＣｌ2６Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．２、２５℃）を加え、３０℃で４５分間インキュベートして、大腸菌株ＲＲ１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢプレートに試料をプレーティングした。３０℃で一晩のインキュベーション後に、プレート当たり約１５０〜３００のコロニーが観察された。
【００７１】
コロニーのハイブリダイゼーションを使用して、組換えプラスミドを有するクローンをスクリーニングした。実施例１で説明したＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２正方向プライマー及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１正方向プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［Ｙ−32Ｐ］で放射性標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。コロニーを採取してニトロセルロース上に配置し、下記の各溶液中で５分間処理した：１０％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（２回）及び２×ＳＳＣ（２回）。ニトロセルロースフィルターを室温で１時間乾燥し、真空下８０℃で２時間焼成し、６×ＳＳＣに５分間浸漬し、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液中で４２℃で２時間洗浄した。６×ＮＥＴ、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）、０．５％ＳＤＳ及び２５μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で４時間処理した後、フィルターを放射性標識オリゴマープローブと共に同一条件で１６時間インキュベートし、次いで６×ＳＳＣ中で、室温で１５分間の洗浄３回と、４２℃で２分間の洗浄２回と、５０℃で２分間の洗浄２回とにかけ、その後オートラジオグラムを撮った。３６個のクローンが、対応するオリゴマープローブにハイブリダイズしていた。
【００７２】
実施例１で説明したＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２正方向プライマー（又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１正方向プライマー）と、挿入部位から３９２ｎｔ下流のｌａｃＺコード配列（１４１７−１４４０、１４３７にＧ：Ｔ不適合を有する）に対して相補的なｌａｃＺ逆方向プライマー（５’−ＡＧＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号：７））とを用いて、ポジティブクローンから抽出したプラスミドＤＮＡのＰＣＲ増幅により挿入位置の決定を行うために、ポジティブクローンを更に分析した。１４個のクローンからのＰＣＲ反応で、対応するＤＮＡフラグメントが産生された。クローンｐＶＴ１３３、１３８、１３９、１４１、１４２及び１４４は１．４ＫｂのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２挿入物を含んでおり、ｐＶＴＥ  ８３４、８３６、８３９及び８４１はＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（エンド-）挿入物を含んでおり、いずれも約１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを産生する。クローンｐＤＶＳ７１２、７４２、７４５及び７４６は１．６ＫｂのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１挿入物を有し、約２．０ＫｂのＤＮＡフラグメントを産生する。
【００７３】
ＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子の発現
前記クローンを、誘導物質ＩＰＴＧとの融合（修飾）タンパク質を発現する能力について更に調べた。
【００７４】
クローンは、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中でＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃で培養した。非誘導細胞（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ）から溶解物を調製するために、１．５ｍｌの培養液をペレット化し、１００μｌの尿素溶解緩衝液（ｕｒｅａ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁し、１０分間沸騰させた。ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加えた後、培養物を３０℃で更に４時間増殖させた。１．５ｍｌの培養液の細胞をペレット化し、２時間及び４時間の誘導後に２５０μｌの尿素溶解緩衝液で溶解した。クーマシーブルー染色ゲルでタンパク質生成物を分析した。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２−ｌａｃＺ融合構築物のうちの３つ（ｐＶＴ１３９、１４２及び１４４）並びに４つのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（エンド-）−ｌａｃＺ融合構築物の全ては、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質について予想された大きさである約１６２〜１６５ＫＤａの主産物を発現した。４つのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ｌａｃＺ融合クローンはいずれも、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質について予想された大きさである１７３〜１７８ＫＤａのより大きい産物を発現した。
【００７５】
Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ（ＮＥＢ）又はβ−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に対する抗体を用いるウェスタンブロットにより、ｐＶＴ１４２及び１４４並びにｐＶＴＥ８３６及び８３９に由来するＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２融合タンパク質のアイデンティティを更に分析した。試料を、予備染色したマーカー（ＢＲＬ）を用いて４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス由来）でプローブし、アルカリホスフェート結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。試験した４つのクローン全部から得られた約１６０ＫＤａのバンドは両方の血清と反応し、クーマシーブルー染色バンドと同じ位置に移動する。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１融合も調べた。β−ガラクトシダーゼ及びＩ−ＰｓｐＩ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１のタンパク質生成物）に対する血清を用いてｐＤＶＳ７１２及び７４２のウェスタンブロット分析を行ったところ、クーマシーブルー染色バンドと同じ約１６８〜１７５ＫＤａに予想された主バンドが得られた。
【００７６】
実施例３
β−ガラクトシダーゼ−ＩＶＰＳ融合におけるタンパク質スプライシングの熱制御
前述の構築物（ｌａｃＺ  ＥｃｏＲＶ部位に挿入したＩＶＰＳ）は誘導後に融合（改質）タンパク質を産生した。ＩＶＰＳタンパク質は、高温でのインキュベーションによって、連結ターゲットタンパク質（活性β−ガラクトシダーゼ）と遊離ＩＶＰＳエンドヌクレアーゼとを形成するために、融合タンパク質から切り出すことができる。
【００７７】
スプライシングは温度誘導によって制御できる：粗抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ活性は温度シフトに応答して増加する。
【００７８】
ＲＲ１（大腸菌宿主）及びｐＡＨＯ５含有ＰＲ１（実施例２で説明した非融合β−ガラクトシダーゼ親プラスミド）又は融合構築物ｐＶＴ１４２（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２もしくはＣＩＶＰＳ２）、ｐＶＴＥ８３６（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１エンド-）もしくはｐＤＶＳ７１２（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１もしくはＣＩＶＰＳ３）の培養物から下記のステップに従って粗抽出物を調製した。単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で一晩インキュベートし、１リットルのＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン）中３０℃でＯＤ600nmが約０．５になるまで継代培養し、０．３ｍＭのＩＰＴＧで３０℃で２時間誘導した。細胞を遠心分離し、１００ｍｌのＬＢに再懸濁し、４℃で３分間超音波処理し、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を回収し、−２０℃で貯蔵した。
【００７９】
粗抽出物の７．５ｍｌアリコートを４２℃又は５０℃の水浴中でインキュベートした。１ｍｌアリコートを、ｐＶＴ１４２及びｐＶＴＥ８３６抽出物の場合は１時間後、２時間後及び１２時間後に採取し、ｐＤＶＳ７１２、ｐＡＨＯ５又はＲＲ１抽出物の場合は０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後及び１６時間後に採取した。
【００８０】
Ｍｉｌｌｅｒらの方法［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７２），Ｃｏｌｄ  Ｓｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。アッセイ緩衝液は、Ｚ緩衝液を２．７μｌ／ｍｌの２−メルカプトエタノールと混合することによって調製した。基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を４ｍｇ／ｍｌでアッセイ緩衝液に溶解した。処理した抽出物又は非処理抽出物０．１ｍｌを、０．９ｍｌのアッセイ緩衝液と１滴の０．１％ＳＤＳとが入っている試験管に移し、２８℃で５分間インキュベートした。ブランクには０．１ｍｌのＬＢ培地を使用した。４ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧを０．２ｍｌ加えてアッセイ反応を開始させた。適当な黄色が発色した時点で、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3を加えて反応を停止させた。インキュベーション時間を記録し、活性をスペクトロホトメーターでＯＤ420nm及びＯＤ550nmで測定した。熱処理した抽出物からの酵素活性は次のように計算した。インキュベーション後の活性をゼロ時点の活性で除算し、比に１００を掛けてパーセンテージを出した。酵素活性の比較の結果、熱処理は最初の２時間のインキュベーションではＲＲ１又はＲＲ１／ｐＡＨＯ５抽出物からの活性に作用しないことが判明し、３つのＩＶＰＳ−ＬａｃＺ融合構築物ｐＶＴ１４２、ｐＶＴＥ８３６及びｐＤＶＳ７１２は全て４２℃への温度シフトに応答して非処理試料の１４３％から２２１％ヘの酵素活性の増加を示した（図３）。β−ガラクトシダーゼ活性の増加は、ＩＶＰＳの切り出しと２つのβ−ガラクトシダーゼ半体の連結とに起因するものであり、活性な酵素をより多く形成した。スプライシングはウェスタンブロット分析によって確認した。ＲＲ１細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、染色体遺伝子の発現に由来する。一晩のインキュベーションは、すべての試料からの酵素活性を低下させた。これはおそらく、β−ガラクトシダーゼの熱失活に起因する（図３）。
【００８１】
スプライシングは温度誘導によって制御できる：クーマシーブルー染色及びウェスタンブロットによるタンパク質の分析
ＲＲ１細胞におけるＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合タンパク質合成の分析は、β−ガラクトシダーゼの染色体発現によって複雑になる。そこで、分析を容易にするために、すべての構築物を、β−ガラクトシダーゼを合成しない大腸菌宿主に移した。
【００８２】
ＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合クローンからの粗細胞抽出物の調製、及び熱処理した試料のウェスタンブロット分析は下記のように実施した。
【００８３】
融合構築物とｌａｃＺ発現ベクターｐＡＨＯ５とを、既述の標準的形質転換手法によってｌａｃＺ欠失大腸菌株ＥＲ２２６７（ＮＥＢ）に導入した。
【００８４】
プラスミド含有細胞の場合はアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ加えたＬＢ培地中で３０℃で、ＥＲ２２６７（５０ｍｌ）、ＥＲ２２６７／ｐＡＨＯ５（５０ｍｌ）、ｐＶＴ１４２又はｐＤＶＳ７１２プラスミドの培養物（各々１リットル中）を増殖させた。ＯＤ600nmが０．４８〜０．５５に到達した時点で、誘導物質ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで培養物に加え、該培養物を２３℃で更に３時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＬＢ培地５０ｍｌ（ＥＲ２２６７又はｐＡＨＯ５担持ＥＲ２２６７の場合）又は１００ｍｌ（ｐＶＴ１４２又はｐＤＶＳ７１２担持ＥＲ２２６７）に再懸濁し、４℃で３分間超音波処理し、７０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を−２０℃で貯蔵した。各抽出物の５ｍｌアリコート３つを２３℃、４２℃又は５０℃で１６時間インキュベートしサンプリングした。０．９ｍｌのアリコートを１、２、３、４、６時間インキュベートした後１．５ｍｌミクロ遠心管に移した。非処理抽出物又は処理した抽出物５μｌを１０μｌの水及び５μｌの５×試料緩衝液（０．３１Ｍ  トリス−Ｃｌ、ｐＨ６．８／１０％ＳＤＳ／２５％２−メルカプトエタノール／５０％グリセロール／０．００５％ブロモフェノールブルー）と混合し、１０分間沸騰させた。
【００８５】
各試料５μｌを４／２０％ＳＤＳポリアクリルアミド上に配置し、１００ボルトで３〜４時間電気泳動させた。β−ガラクトシダーゼに対する抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）とエンドヌクレアーゼＩ−Ｔｌｉ−ＩもしくはＩ−ＰｓｐＩに対する抗体（ＮＥＢ）とを用いて、Ｐｒｏｍｅｇａの手順でウェスタンブロットを行った。その結果、構築物ｐＶＴ１４２及びｐＤＶＳ７１２の両方から２３℃でＩＰＴＧ誘導した後の細胞中には、辛うじて痕跡量のエンドヌクレアーゼしか存在しないことが判明した。これは、切り出し活性があったとしても不十分なものであることを意味する。しかしながら、ＥＲ２２６７／ｐＶＴ１４２抽出物をより高い温度４２℃又は５０℃にシフトした後では、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ前駆体からの切り出しエンドヌクレアーゼと同じ大量のＩＶＰＳ２生成物（Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ、約４２ＫＤａ）が蓄積された（図４）。４２℃又は５０℃で処理したｐＤＶＳ７１２／ＥＲ２２６７抽出物についても類似のパターンが観察され（図４）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１生成物Ｉ−ＰｓｐＩについて予想された約６０ＫＤａの生成物が蓄積された。
【００８６】
β−ガラクトシダーゼに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析では、ＩＶＰＳドメインの切り出しが、中断されたβ−ガラクトシダーゼのＮドメインとＣドメインとの連結又は再結合に結びついていることが判明した。どちらの融合構築物の熱処理試料も、完全長のβ−ガラクトシダーゼと同じ大きさの１１４ＫＤａの生成物を含んでいた（図４）。しかしながら、この生成物はｐＶＴ１４２試料中には少量しか蓄積されなかった。これは、該融合タンパク質からのスプライシングが前述の条件下では効果がないことを意味する。
【００８７】
融合タンパク質を、８０℃までの高温でスプライスする能力についてさらに調べた。種々の温度での初期反応速度を比較した。抽出物を１．５ｍｌミクロ遠心管内の３００μｌアリコート中で４２℃、５０℃、６５℃又は８０℃でインキュベートした。１５分、３０分、１時間、２時間及び４時間後に各加熱抽出物試料から２０μｌを採取し、４０μｌの水及び２０μｌの５×試料緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。ウェスタンブロット分析の結果、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は６５℃及び８０℃でスプライスできることが判明したが、１１４ＫＤ生成物の蓄積によって測定したところではスプライシング効率は６５℃での方が大きかった。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の切り出しは６５℃では有効であったが、８０℃では抑止されると思われる。蓄積が見られなかった理由は、８０℃では経時的にβ−ガラクトシダーゼが熱変性し沈殿することにあり得る。
【００８８】
実施例４
β−アガラーゼＩをコードするプラスミドのようなＰＣＲ産生線状プラスミドへのＩＶＰＳのフレーム内挿入
実施例２では、実施例１で形成したＩＶＰＳカセットを制限酵素直線化プラスミドに挿入する方法を説明した。この方法は、ターゲット遺伝子内の適当な制限酵素部位の使用可能性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）によって制限される。環状プラスミド上の互いに反対向きのプライマーを使用するＰＣＲ増幅は、任意の位置で任意のプラスミドを直線化させ、ＰＣＲ反応の能力によってのみ制限される。ターゲットプラスミドが直線状になれば、該プロセスは本質的に、制限酵素によって形成された線状プラスミドについて実施例２で述べたものと同じである。
【００８９】
実施例２で述べたように、ターゲット遺伝子へのＩＶＰＳカセットの挿入は、ＩＶＰＳフラグメントと線状プラスミドとの連結によって達成できる。この実施例では、ＰＣＲプラマーを用いて、セリン又はトレオニンコドンの直前で直線化したプラスミドを形成する。このようにすると、ＩＶＰＳを切り出し２つのターゲットタンパク質半体を連結した時に、ターゲットタンパク質中に余計なアミノ酸が残らない。挿入部位のセリン又はトレオニンは、ＩＶＰＳフラグメント上又はターゲット遺伝子上に配置し得る。セリン又はトレオニンがＩＶＰＳカセット上に存在する場合は、下流ＥＰＳの第１残基をコードする３つのヌクレオチドを欠失させて、ターゲット遺伝子ＰＣＲプライマーを構築し得る。ＩＶＰＳカセットがセリン又はトレオニンコドンを欠く場合は、互いに反対向きの接し合うＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲを用いて、セリン又はトレオニンコドンの部位で直線化されたターゲットプラスミドを合成する。
【００９０】
この実施例では、実施例２に記載の手順で、２つのＩＶＰＳエレメント、即ちＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１をβ−アガラーゼＩコード遺伝子内にクローニングする方法を説明する［Ｙａｐｈｅ，Ｗ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：９８７−９９３（１９５７）］。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１は２９０アミノ酸β−アガラーゼＩ遺伝子の１０８番目のコドンであるセリンの前に挿入し、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２はβ−アガラーゼＩ遺伝子の１３３番目のコドンであるトレオニンの前に挿入する。
【００９１】
３’末端にセリンコドン（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１の場合）又はトレオニンコドン（Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の場合）を含むＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントを実施例１と同様に調製した。ｌａｃプロモーターの配向でベクターｐＵＣ１８内のβ−アガラーゼＩ遺伝子配列を含む３．８Ｋｂの組換えプラスミドであるｐＡＧ６ａ１（ＮＥＢ）をＰＣＲ鋳型として用いて、線状プラスミドＤＮＡフラグメントを合成した。プライマーａｇａＳ１０８．ｒｖ（５’−ＧＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：８））及びａｇａＳ１０８．ｆｗ（５’−ＧＧＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号：９））はそれぞれ１０８番目のコドンのＤＮＡ配列５’及び３’に対して相補的である。プライマーａｇａＴ１３３．ｒｖ（５’−ＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：１０））及びａｇａＴ１３３．ｆｗ（５’−ＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴ−３’（配列番号：１１））はそれぞれ１３３番目のコドンの配列５’及び３’に対して相補的である。各プライマー対を用いて、セリン又はトレオニンコドンを欠失した線状プラスミドＤＮＡフラグメントを合成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）に、２ｍＭ硫酸マグネシウムと、４００μＭの各ｄＮＴＰと、０．５μＭの各プライマーと、２０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたもので構成した。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーを用いて、９４℃で３０秒、４５℃で３０秒及び７２℃で５分のサイクルに３０回かけて実施した。ＰＣＲ試料はフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３Ｍ  酢酸Ｎａ及び５０％イソプロパノール中で沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離して回収し、乾燥し、１００μｌの蒸留水に再懸濁した。次いでＤＮＡ試料を１％低融点アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ＰＣＲ合成フラグメントを実施例１と同様に回収した。
【００９２】
ＰＣＲ合成フラグメントとリン酸化ＩＶＰＳフラグメント（実施例１）との連結を、２０μｌ倍容中で、９．５μｌの蒸留水と、２μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、４μｌの０．０１μｇ／μｌ  ＰＣＲ合成プラスミドＤＮＡと、４μｌのＩＶＰＳ  ＤＮＡ（０．２０μｇのＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２もしくは０．３２μｇのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１）と、０．５μｌの４００，０００Ｍ／ｍｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えて、１６℃で１２時間実施した。連結試料での大腸菌株ＲＲ１の形質転換を実施例２と同様に実施した。アルカリ溶解法（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｌｙｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出するために、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地で形質転換体を培養した。０．８％アガロースゲル上での電気泳動と、その後の臭化エチジウムでの染色とによって、プラスミドＤＮＡをｐＡＧ６ａ１と比較した。組換えプラスミドｐＡＧ１０８Ｓ１８はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１挿入物を含み、ｐＡＧ１３３Ｔ２２、２６、３１及び３５はいずれもＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２挿入物を含んでいる。
【００９３】
ＩＶＰＳ−β−アガラーゼＩ融合遺伝子の発現
クローンを、融合タンパク質を発現する能力について更に調べた。ｐＡＧ１０８Ｓ１８又はｐＡＧ１３３ｔ３５を有するＲＲ１細胞を、デキストロースを含まず１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１リットルの改良ＬＢ培地で、ＯＤ600nmが約０．５になるまで３０℃で培養した。誘導物質ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加えた後、培養物を冷却し、２５℃で更に４時間増殖させた。細胞を遠心分離し、５０ｍｌのＬＢ培地に再懸濁した。粗抽出物を実施例３と同様に調製した。これらのクローンから発現された融合（改質）タンパク質を検出するために、Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ（ＮＥＢ）、Ｉ−ＰｓｐＩ（ＮＥＢ）及びβ−アガラーゼＩ（ＮＥＢ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。試料を、４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で、予備染色したマーカー（ＢＲＬ）を用いて電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス由来）でプローブし、アルカリホスファターゼ結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。抗ＰｓｐＩ血清及び抗β−アガラーゼＩ血清はどちらも、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（約６０ＫＤａ）−β−アガラーゼＩ（約３０ＫＤａ）融合タンパク質（図５）について予想された大きさの、ｐＡＧ１０８Ｓ１８／ＲＲ１から発現された９０〜９５ＫＤａ産物と反応した。抗Ｉ−Ｔｌｉ−Ｉ血清及び抗β−アガラーゼＩ血清はどちらも、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（４２ＫＤａ）−β−アガラーゼＩ融合タンパク質（図５）について予想された大きさにほぼ等しい、ｐＡＧ１０８Ｓ１８／ＲＲ１からの７０〜７５ＫＤａ産物と反応した（図５）。
【００９４】
実施例５
サイレント置換を介する新しい制限酵素部位の形成によるターゲト遺伝子内へのＩＶＰＳの挿入
以上の実施例では、第１の下流ＥＰＳコドンを有する又は有していない、完全なＩＶＰＳ配列を含むＩＶＰＳカセットを、平滑な直線化プラスミドに挿入した。ＩＶＰＳ又はターゲット遺伝子の末端の近傍でサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（アミノ酸残基を保持する）によって制限部位を形成することもできる。
【００９５】
ＩＶＰＳの末端の近傍での制限部位の形成
ターゲット遺伝子内の任意の位置へのＩＶＰＳの挿入を容易にするために、サイレント突然変異（アミノ酸残基を保持する）によってＩＶＰＳの両端に制限部位を形成することができる。新しい制限部位の形成後に、これらの酵素でＩＶＰＳを切断する。ターゲット遺伝子プラスミドはＰＣＲで形成する。制限部位はＩＶＰＳ内にあるため、ＩＶＰＳを完全にし且つターゲット遺伝子内に適合性クローニング部位を形成するためには、欠失しているＩＶＰＳ配列をそれぞれのターゲット遺伝子ＰＣＲプライマーの５’末端に含ませなければならない（図６）。
【００９６】
例えば、Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２におけるサイレント突然変異は、プライマーＶｅｎｔ  ＩＶＳ２正方向ＢｓｐＥＩ（５’−ＡＧＴＧＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴ−３’（配列番号：１２））を用いて５’末端にＢｓｐＥＩ部位を形成することができ、プライマーＶｅｎｔ  ＩＶＳ２逆方向ＳｐｅＩ（５’−ＡＴＴＧＴＧＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡ−３’（配列番号：１３））を用いて３’末端にＳｐｅＩを形成することができる。次に、これは例えば、ｌａｃＺコード領域内のアスパラギン酸コドン（残基５９４）とトレオニンコドン（残基５９５）との間に挿入し得る。線状ターゲット遺伝子プラスミドは、実施例４で説明したように、ＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩ部位、ＩＶＰＳの残部、並びにｌａｃＺと一致する領域を含むプライマーで、プライマーｌａｃＺ１／ＢｓｐＥＩ逆方向（５’−ＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＣＡＣＴＡＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＡＡ−３’（配列番号：１４））及びプライマーｌａｃＺ２／ＳｐｅＩ正方向（５’−ＧＣＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＣＡＡＴＡＣＧＣＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧＣＣＡＧＴＴＣＴ−３’（配列番号：１５））を用いて、ＰＣＲにより形成できる。ＤＮＡフラグメントはＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子の両方からＰＣＲによって合成する。ＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子プライマーは両方とも新しい制限部位を含んでいる。適当な制限エンドヌクレアーゼで切断した後で、融合遺伝子を形成すべく、適合性末端を有するＤＮＡフラグメントを連結することができる。ＩＶＰＳの切り出し後に余分の残基が残ることはないため、スプライシングが起これば生来のβ−ガラクトシダーゼポリペプチドが形成されると予想される。
【００９７】
挿入部位の近傍の制限部位でのＩＶＰＳの挿入
別の一般的な方法では（図７）、ターゲット遺伝子（例えばトレオニン又はセリンコドン）内の挿入部位の近傍の制限部位を使用して、ターゲット遺伝子に適合した末端を有するＩＶＰＳを挿入することができる。挿入部位又はその近傍のサイレントヌクレオチド置換によって制限部位を形成するか、又は生来の制限部位を使用し得る。線状ターゲット遺伝子プラスミドは、挿入部位の近傍の制限部位で開始しながら実施例４と同様にＰＣＲで形成する。ＩＶＰＳは、適合性制限部位とターゲット遺伝子配列の残り（制限部位と挿入部位との間の配列）を含むプライマーを用いて合成する。両端が挿入部位で該配列と重なり合うＩＶＰＳ  ＤＮＡフラグメントを合成し、適当な酵素で切断し、次いで同じ酵素で切断したベクターに連結し得る。
【００９８】
例えば、サイレント突然変異によりＳａｌＩ部位（残基４７８〜４７９）及びＸｂａＩ部位（残基４８１〜４８２  セリン−アルギニン）を形成することによって、ｌａｃＺ遺伝子内の残基４７９（アスパラギン酸）と４８１（セリン）との間にＩＶＰＳエレメントを挿入することができる。これは、プライマーｌａｃＺ３  Ｓａｌ逆方向（５’−ＡＧＧＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号：７））及びｌａｃＺ４  Ｘｂａ正方向（５’−ＣＣＴＴＣＴＡＧＡＣＣＧＧＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＡＧＧ−３’（配列番号：１６））を用いて、実施例２に記載のターゲットプラスミドｐＡＨＯ５のＰＣＲにより達成し得る。次に、プライマーＶｅｎｔ  ＩＶＳ２正方向ＳａｌＩ（５’−ＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＴＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：１７））及びＶｅｎｔ  ＩＶＳ２逆方向ＸｂａＩ（５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣ−３’（配列番号：１８））を用いて、ＰＣＲによりＩＶＰＳ２フラグメントを形成する。ＤＮＡフラグメントはＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子の両方からＰＣＲによって合成する。ＩＶＰＳ及びターゲット遺伝子プライマーは両方とも新しい制限部位を含む。都合の悪いことに、このベクターは単一ＸｂａＩ及びＳａｌＩ部位を含む（図７）。  従って、ターゲット遺伝子ベクターＰＣＲ生成物は、部分的消化を生起する条件下で切断しなければならない。次いで、必要な線状プラスミドをアガロースゲルから単離する。適当な制限エンドヌクレアーゼで切断した後、融合遺伝子を形成するために、適合性末端を有するＤＮＡフラグメントを連結することができる。ＩＶＰＳの切り出し後に余分な残基が残ることはないため、スプライシングが起これば、生来のβ−ガラクトシダーゼポリペプチドが形成されると予想される。通常は、前述のようなクローニングプロセスを容易にするために、ターゲット遺伝子及びベクター内で非反復部位を選択又は形成することが重要である。
【００９９】
実施例６
Ａ．  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼでのＩＶＰＳ２のスプライシングに関する実験を容易にするために、Ｔ７プロモーター構築物ｐＶ１７４−１Ｂ１を改質したものを形成した。この改質構築物ｐＡＮＧ５（図８）は、ｐＶ１７４−１Ｂ１と同じＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ前駆体をコードする。本明細書で検討しているような突然変異体の形成を簡単にするために、多数のサイレント突然変異を、特に上流及び下流スプライス部位に導入した。変化は下記の通りである：
１．ベクタ−主鎖内のＸｍａＩ及びＰｐｕＭＩ部位の破壊。ＸｍａＩ部位はまずＴ７発現ベクタ−ｐＡＩＩ１７をＸｍａＩで切断し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで修復し、次いで平滑末端を再連結することによって除去した。プラスミドをＸｍａＩによる開裂に対する耐性についてスクリーニングした。得られたベクタ−からＰｐｕＭＩ部位を同様に除去し、今度はＰｐｕＭＩ開裂に対する耐性についてスクリーニングした。最終ベクタ−をｐＡＭＬ１と命名した。このベクタ−は、ポリメラーゼ遺伝子内の単一のＸｍａＩ及びＰｐｕＭＩ部位の使用を可能にした。
【０１００】
２．制限部位を形成するためのサイレント塩基変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｂａｓｅ  ｃｈａｎｇｅ）の導入。この変化は、Ｋｕｎｋｅｌの方法に従い［Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ，Ｊ．Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＲ．Ａ．Ｚａｋｏｕｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４：３６７−３８２（１９８７）］、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を用いて導入した。ｆ１ヘルパーファージＩＲ１での重感染により２つのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）誘導体内に一本鎖鋳型を形成した［Ｅｎｅａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２２：２２−２２６（１９８２）］。第１のフラグメントは、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ切断Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結したｐＶ１７４−１Ｂ１からのＢｓａＡＩ〜ＢａｍＨＩフラグメント（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ配列のヌクレオチド３７１４〜５８３７を表す）を含んでいた。第２のフラグメントは、ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ切断Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結したＣｌａＩ〜ＳｓｐＩフラグメント（ヌクレオチド８１６〜４４０８）を含んでいた。
【０１０１】
ＢｓａＡＩ／ＢａｍＨＩ構築物に、下記の３つのオリゴヌクレオチドで同時に突然変異を与えた：
５’−ＧＣＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＴＧＣＧＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：１９）（ＡｇｅＩ  ｎｔ４６６９〜４６７４）、
５’−ＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＴＧ−３’（配列番号：２０）（アンバー１７０３オーカー）、
５’−ＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣ−３’（配列番号：２１）（Ｄ１２３６Ａ）。
【０１０２】
改質塩基には下線を引き、変化は括弧内に示した。Ｄ１２３６Ａを形成するためのオリゴヌクレオチドは、スクリーニングに使用するためのＢｓａＩ部位を形成するためのサイレント塩基変化も含んでいた。得られた単離体をｐＡＭＮ２と命名した。
【０１０３】
ＣｌａＩ／ＳｓｐＩ構築物に、下記の４つのオリゴヌクレオチドで同時に突然変異を与えた：
５’−ＧＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＣＧＧ−３’（配列番号：２２）（ＳａｌＩ  ｎｔ３８６３〜３４６８）、
５’−ＣＧＴＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＣＡＣＴＴＴＣ−３’（配列番号：２３）（ＢｓａＢＩ  ｎｔ３５５４〜３５６３）、
５’−ＧＴＣＣＡＣＣＴＴＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＣ−３’（配列番号：２４）（ＢｓｔＢＩ  ｎｔ３６０８〜３６１３）、
５’−ＣＣＧＣＡＴＡＡＡＧＧＡＣＣＴＴＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：２５）（ＰｐｕＭＩ  ｎｔ３５１７〜３５２３）。
【０１０４】
マークは前述の通りである。スクリーニングも前述のように行い、得られた構築物をｐＡＭＯ２２と命名した。
【０１０５】
ＢｓａＡＩ／ＢａｍＨＩ構築物にも下記のオリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号：２６）（ＢｓａＢＩブロッキングｎｔ５６４１）
で突然変異を与え、ｄａｍメチル化部位の付加に起因するＢｓａＢＩ開裂に対する耐性についてスクリーニングした。得られた構築物をｐＡＭＷ３と命名した。
【０１０６】
最後に、ｐＶ１７４−１Ｂ１の開始コドンにおけるＮｄｅＩ部位を、部分的ＮｄｅＩ開裂と、クレノウでの末端修復と、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いる再環化とによって失活させた。プラスミドを適当なＮｄｅＩ部位の消失についてスクリーニングした。この種の構築物の１つをｐＡＫＣ４と命名した。
【０１０７】
ｐＡＮＧ５構築物は前記部分から組み立てた：
１．ｐＡＫＣ４からのＸｂａＩ／ＣｌａＩ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼの翻訳開始及びアミノ末端）、
２．ｐＡＭＯ２２からのＣｌａＩ／ＮｄｅＩ（よりアミノ末端ポリメラーゼ＋ＩＶＰＳ２のアミノ末端領域）、
３．ｐＡＭＮ２からのＮｄｅＩ／ＮｓｉＩ（ＩＶＰＳ２のカルボキシル末端領域、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼのカルボキシル末端領域）、
４．ｐＡＭＷ３からのＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩ（ポリメラーゼの最後の５つのアミノ酸＋下流領域）、
５．ｐＡＭＬ１からのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ（Ｔ７プロモーター、複製起点、アンピシリン耐性）。
【０１０８】
ｐＡＮＧ５と親ｐＶ１７４−１Ｂ１とを比較すると、後述のようにｐＡＮＧ５含有株の生存率の方が高いという点を除いて、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＩ−ＴｌｉＩ産生のパターンは同じである。これは、ＲＮＡ又はＤＮＡレベルでのスプライシングと対照的に、タンパク質レベルでスプライシングが生じた場合に予想されることである。
【０１０９】
Ｂ．  大腸菌におけるＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現の研究過程で、ＩＶＰＳ１及びＩＶＰＳ２の欠失後に発現及び細胞生存率が大幅に増加することが判明した。この増加は、それぞれＩＶＰＳ１及びＩＶＰＳ２の遺伝子産物であるＩ−ＴｌｉＩＩ及びＩ−ＴｌｉＩの毒性作用を表すか、又はスプライシング反応自体の毒性作用を表す。エンドヌクレアーゼ及びスプライシング活性は非依存的であり得、スプライシングに影響を与えずにエンドヌクレアーゼを失活させると推論された。ｐＡＮＧ５の構築で述べたＡへの単一アミノ酸置換を、Ｉ−ＴｌｉＩのアミノ近位ドデカペプチドモチーフ内の保存残基内で行った（変更残基Ｄ１２３６）。これらの構築物はＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを発現したが、Ｉ−ＴｌｉＩ活性は検出されなかった。ｐＶ１７４−１Ｂ１と異なり、ＢＬ２１（ＤＥ３）のようなＴ７発現株は３７℃でもｐＡＮＧ５に良く耐えた。ウェスタンブロットによるタンパク質スプライシングの分析及びパルス−チェイス分析では、ｐＡＮＧ５とｐＶ１７４−１Ｂ１との間にタンパク質スプライシングの差は認められなかった。即ち、完全長の前駆体の産生、並びにその後の成熟ポリメラーゼと大きさがＩ−ＴｌｉＩに対応するタンパク質の形成に差は見られなかった。
【０１１０】
Ｃ．  カセット置換突然変異誘発を用いてチロシン１０７９をアルギニンで置換することにより、共通のカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ部位（ＸＲＸＸＳ＊；Ｐｅｒｓｏｎら、前出の文献）を構築した。要約すれば、ｐＡＮＧ５を非反復部位ＢｓａＢＩ及びＰｐｕＭＩで切断し、下記の二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）（配列番号：２７）を挿入して、所望の変化を導入した。
【０１１１】
５’−ＧＴＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡ−３’
３’−ＧＡＡＧＣＡＣＧＣＣＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＴ−５’。
【０１１２】
正しい構築物をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１１３】
Ｄ．  ブロックされたアミノ酸を付加するためのアンバー終止コドンの導入を、
５’−ＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＡＴＡＡ−３’
３’−ＧＡＡＡＴＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＴ−５’
内でのカセット置換突然変異誘発によって実施した。
【０１１４】
同様にして、ＡｇｅＩ及びＳｍａＩで切断したｐＡＮＧ５中に下記の二本鎖（配列番号：２９）を配置することにより、チロシン１４７２をアンバー終止コドンで置換した：
５’−ＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＧＡＣＧＧＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴＡＣＣＣ−３’
３’−      ＡＡＧＡＡＡＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＡＡＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡＴＧＧＧ−５’
最後に、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がアンバーコドン（ＴＡＧ）内で終わるため、ｐＡＭＮ２（既述）からの適当な制限フラグメントをｐＡＮＧ５内の対応する部位に挿入して、前記終結コドンをオーカーコドン（ＴＡＡ）に変える。
【０１１５】
実施例７
ＣＩＶＰＳ２のスプライス部位へのＯ−（ｏ−ニトロベンジル）セリンの導入によるタンパク質スプライシングの制御
光活性化可能な（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ）タンパク質スプライシングを明らかにするために、ｐＶ１７４．１Ｂ１を用いて２つのベクターを構築した。第１の構築物ｐＡＮＹ５（「野生型」とも称する）は下記のようにアミノ酸レベルで記述できる：ｐＶ１７４．１Ｂ１  Δ１−１０６３、Δ１５４４−１７０２、Ｖ１５４２Ｍ、Ｖ１５４１Ｍ、１５４３オパール（ＴＧＡ）。この構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で翻訳された時に、４５．３ｋＤａのエンドヌクレアーゼ（Ｉ−ＴｌｉＩ）をスプライスして１０．５ｋＤａの連結反応生成物を形成する５５．８ｋＤａの前駆体タンパク質を産生するように設計されている。第２の構築物ｐＡＯＤ１（「アンバー変異体」とも称する）は、下記のようにアミノ酸レベルで記述できる：ｐＶ１７４．１Ｂ１  Δ−１０６３、Δ１５４４−１７０２、Ｖ１５４２Ｍ、Ｖ１５４１Ｍ、１５４３オパール（ＴＧＡ）、Ｓ１０８２アンバー（ＴＡＧ）。この構築物は、標準的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳条件で２．２ｋＤａのアンバーフラグメントを生成するように設計されているが、ｏ−ニトロベンジルセリンで化学的にアミノシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡでｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応を補充すると、光活性化可能セリンを取り込むだろう。位置１０８２のセリンが「ブロック」されていると、前駆体はスプライスすることができない。強い３５０ｍ光で照射すると、ｏ−ニトロベンジル基が放出され［Ｐｉｌｌａｉ、前出の文献］、セリンの求核性ヒドロキシル側鎖が遊離し、タンパク質がスプライスできるようになる。
【０１１６】
アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（３’末端ＣＡ残基を欠く）は、文献［Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献、Ｎｏｒｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：８３（１９９０）］に記載のように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでＦｏｋＩ直線化ｐＹＰｈｅ２プラスミド鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）転写を行うことによりミリグラムスケールで合成した。αアミンをＢＰＯＣ、ＣＢＺ又はＢＯＣのような官能基で保護したセリン誘導体は市販されている（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）。Ｎ−ブロックされたセリンは、ｏ−ニトロベンジルブロミドのような試薬を用いて標準的アルキルハロゲン化物置換反応を行うことにより、Ｎ−ブロックされたＯ−（ｏ−ニトロベンジル）セリンに変換できる。次いで、完全にブロックされたセリンを、文献［Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献］に記載のように５’−ホスホデオキシリボシチジリル−（３’−５’）−リボアデノシン（ｐｄＣｐＡ）に結合した。次いで、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いてアミノアシル化ダイマーを切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）サプレッサーｔＲＮＡに連結して、完全長のアミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡを得た。
【０１１７】
３μｇの塩化セシウム精製プラスミドＤＮＡと、３μｌの１００ｍＭ酢酸マグネシウムと、１μｌの１００ｍＭ酢酸カルシムと、７．５μｌの低分子量混合物［Ｅｌｌｍａｎら、前出の文献］（カルシウム又はメチオニン無含有）と、１μｌの［35Ｓ］−メチオニン（１０μＣｉ／μｌ、１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と、１μｌの３ｍｇ／ｍｌリファムピシンと、総量を３０μｌにするのに必要な量の水とを氷上で混合することにより、「野生型」構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を実施した。前記反応物質を３７℃で３分間インキュベートし、その間に、大腸菌Ｄ１０から調製したＳ−３０抽出物［Ｅｌｌｍａｎら、前出の文］のアリコートを解凍した。８．５μｌのＳ−３０抽出物を加えた後、１．５μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（３００Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を加え、これらの反応物質を３７℃で６０分間インキュベートした。試料を１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ）上で電気泳動にかけ、オートラジオグラフィーによってタンパク質を可視化した（図９）。
【０１１８】
「アンバー変異体」のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を、「野生型」で説明したように、但し反応物質に３．５μｌの化学的にアミノアシル化したｏ−ニトロベンジルセリン−ｔＲＮＡamberを約３μｇ／μｌの濃度で補充して実施した。サプレッサーｔＲＮＡをＳ−３０抽出物の添加の直前に反応に加えた。
【０１１９】
図９は、「野生型」（ｐＡＮＹ５）又は「アンバー変異体」（ｐＡＯＤ１）構築体でプライムしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応の１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。レーン１は、５５．８ｋＤａ前駆体と、「野生型」構築体からｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現された、切り出された４５．３ｋＤａのＩ−ＴｌｉＩエンドヌクレアーゼとを示している。レーン２は、添加ｔＲＮＡに起因する翻訳の阻害が存在しないことを示すために、１３．５μｇの完全長の無変化アンバーサプレッサーｔＲＮＡを加えた「野生型」反応を示している。レーン３及び４は、完全長の非アシル化サプレッサーｔＲＮＡ（１０．５μｇ）を加えた又は加えていない「アンバー変異体」のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現の結果を示している。これらの反応はいずれも、予想通りに、完全長の前駆体分子又はスプライス生成物を産生しない。これは、サプレッサーｔＲＮＡが細胞抽出物中でいずれの内因性アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによってもアミノアシル化されないことを意味する。分子量約５２ｋＤａのバンドは明らかに、アンバー変異体のすぐ下流の二次的翻訳開始部位によるものである。レーン５は、「アンバー変異体」に化学的にアミノアシル化したｏ−ニトロベンジルセリン−ｔＲＮＡamberを加えた場合の結果を示している。前駆体タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されるが、スプライス生成物（即ちＩ−ＴｌｉＩ）は見えない。
【０１２０】
前駆体タンパク質の位置１０８２に部位特異的に挿入したセリンからｏ−ニトロベンジル基を光化学的に除去して、調節スプライシングを行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応の６μｌアリコートを０．５μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１０μｇ／μｌ）で処理して翻訳を停止させ、ＧＥモデル＃ＲＳＫ６Ｂタニングランプ（ｔａｎｎｉｎｇ  ｌａｍｐ）からの強力（２７５Ｗ）可視光により１０ｃｍの距離で１０分間照射し、４μｌの水で希釈し、その後３７℃で６０分間インキュベートしてスプライシングを生起させた。得られたスプライス生成物を１０〜２０％トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの電気泳動によって可視化し、次いでオートラジオグラフィーを行った（図１０）。
【０１２１】
図１０は、化学的にブロックした前駆体（レーン５、図９）を３５０ｎｍの光に露光した結果を示している。レーン１〜４は、「野生型」反応（レーン１、図９）を下記のように処理した対照である。レーン１は３７℃で６０分インキュベートしたもの、レーン２は０．５μｌのＲＮａｓｅ（１０μｇ／μｌ）を加えて３７℃で６０分間インキュベートしたもの、レーン３は３５０ｎｍの光で１０分間照射し３７℃で６０分間インキュベートしたもの、レーン４はＲＮａｓｅで前述のように処理し、３５０ｎｍの光で１０分間処理し、３７℃で６０分間インキュベートしたものである。レーン５〜８は、「ブロックした」前駆体をそれぞれレーン１〜４と同様に処理した結果を示している。「ブロックした」前駆体を照射すると、ＩーＩＶＰＳ２でコードされるＩ−ＴｌｉＩ（４５．３ｋＤａ）エンドヌクレアーゼが切り出される（レーン７〜８及びレーン５〜６参照）。
【０１２２】
実施例８
ターゲット遺伝子への改質ＩＶＰＳのフレーム内挿入及びペプチド結合開裂の熱制御
この実施例では、ＩＶＰＳ（ＣＩＶＰＳ）カセットの改質方法及びターゲット遺伝子への挿入方法を説明する。具体例として、第１の天然下流残基（セリン）の置換又は欠失によるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（又はＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）の改質と、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位への改質カセットのフレーム内挿入とを取り上げる。
【０１２３】
ＩＶＰＳカセットの改質
一般的に、ＩＶＰＳカセットは残基の置換及び欠失、又はＩＶＰＳの一端もしくは両端への残基の付加によって改質できる。このような改質ＩＶＰＳカセットを用いた改質又は融合タンパク質は、特定のペプチド結合部位におけるスプライシング（ペプチド連結）又は開裂といった種々の触媒活性を示し得る。
【０１２４】
既述のように、カルボキシルスプライス部位の第１の下流残基は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）及びＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ１の場合のセリン、又はＶｅｎｔ  ＩＶＰＳ２の場合のトレオニンである。ＣＩＶＰＳ１、ＣＩＶＰＳ２及びＣＩＶＰＳ３のアミノスプライス部位における第１のＩＶＰＳ残基はセリンである。システイン残基は、酵母ＴＦＰ１及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＲｅｃＡのスプライス部位に発見された（Ｈｉｒａｔａら、前出の文献；Ｋａｎｅら、前出の文献；Ｄａｖｉｓら、前出の文献）。スプライス部位のセリン、トレオニン又はシステイン残基は、タンパク質のスプライシング及び開裂に不可欠と考えられている。既述の実施例は、第１の下流残基を有するＩＶＰＳがタンパク質のスプライシングに関する情報を含むのに十分であることを明らかにした。しかしながら、これらの残基は種々のＩＶＰＳコンテクストで異なる機能を果たし得る。Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ２（ＣＩＶＰＳ２）内で、天然残基、例えばセリンをトレオニン又はシステインで置換すると、スプライシングが低下し、開裂活性が変化した（Ｈｏｄｇｅｓら、前出の文献参照）。
【０１２５】
ターゲット遺伝子コドンの間の平滑部位にフレーム内挿入するための改質ＩＶＰＳカセットの合成
ｌａｃＺコード領域又は他の任意のターゲット遺伝子にフレーム内挿入するためのＩＶＰＳカセットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製できる。下記のプロトコルは、それぞれＣＩＶＰＳ３、ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ、ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ及びＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓと称する、カルボキシル末端コドン、セリン、トレオニン又はシステインを有する又は有していない４つのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１カセットの製造を説明するものである。
【０１２６】
プライマー５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号：５）（ＤＶ  ＩＶＰＳ正、１８３９〜１８６２）と、下記の４つの逆プライマーのうちの１つとを用いて、ｐＮＥＢ＃７２０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６８７２３）からカセットを合成した。鋳型として使用したｐＮＥＢ＃７２０は、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入したＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む４．８ＫｂのＢａｍＨＩフラグメントを有する。逆プライマー５’−ＧＣＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：４０）及び５’−ＧＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：４１）（３４２８〜３４５２）を用いて、それぞれＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ及びＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓフラグメント（１６４１ｂｐ）を形成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）に、２ｍＭの硫酸マグネシウムと、４００μＭの各ｄＮＴＰと、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡと、０．９μＭの各プライマーと、４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを加えたものを含む。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラーを用いて９４℃で３０秒、４８℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルに２０回かけて実施した。プライマー５’−ＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＧ−３’（配列番号：４２）（３４２５〜３４４９）を使用して、前述のＰＣＲで、但し増幅を３０サイクル実施して、ＣＩＶＰＳ３フラグメント（１６１１ｂｐ）を合成した。プライマー５’−ＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：６）（３４２８〜３４５２）を用いて実施例１と同様にＩＶＰＳ１／Ｓｅｒフラグメント（１６１４ｂｐ）を合成した。
【０１２７】
ＰＣＲ試料をフェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３μＭ  ＮａＡｃ及び５０％イソプロパノール中−２０℃で６時間沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離し、乾燥し、各々を２０μｌの蒸留水に再懸濁し、１％低融点アガロースゲル上に配置して８０ボルトで６時間電気泳動にかけた。０．４ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、６５℃で３０分間インキュベートし、フェノール及びクロロホルムで抽出し、０．３μＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）及び５０％イソプロパノール中−２０℃で一晩沈殿させることにより、低融点アガロースゲルからＤＮＡフラグメントを回収した。ＤＮＡを遠心分離し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、１０μｌの蒸留水に再懸濁した。
【０１２８】
ＩＶＰＳ１  ＤＮＡフラグメントのリン酸化を、４μｌの１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、３μｌの精製ＤＮＡと、４μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰと、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）とを用いて４０μＬ中３７℃で６０分間実施した。試料を６５℃の水浴中で１０分間加熱した。８０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を加えた後、試料をフェノール及びクロロホルムで逐次抽出した。ＤＮＡを２．４μＭ  ＮＨ4Ａｃ及び７０％エタノール中で−７０℃で一晩沈殿させ、ミクロ遠心機で１０分間１０Ｋｒｐｍで遠心分離してペレット化し、冷７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、２０μｌの蒸留水に再懸濁した。ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒフラグメントのリン酸化を前述のように実施した。
【０１２９】
ベクターｐＡＨＯ５中の大腸菌ｌａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＶ部位へのＣＩＶＰＳ３カセットのフレーム内挿入
ＰＣＲ合成ＣＩＶＰＳカセットは、ターゲット遺伝子を有する直線化ベクターとの連結によってターゲットコード領域に挿入できる。線状プラスミドベクターは、前述のような制限酵素またはＰＣＲ合成によって調製し得る。ｐＡＨＯ５は、ｔａｃプロモーターの下流のｐＡＧＲ３（ＮＥＢ）のポリリンカー内でＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ部位の間に挿入されたｐＲＳ４１５（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ，５３：８５−９６（１９８７））からの３．１ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＤｒａＩフラグメント上に完全なｌａｃＺ遺伝子配列を有する。ｔａｃプロモーターは、ｌａｃＩq遺伝子の産物によって抑制され得且つイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導され得る転写制御エレメントである。ｐＡＨＯ５は２つのＥｃｏＲＶ認識配列を含む。ＥｃｏＲＶは開裂部位に平滑末端を残す。ＥｃｏＲＶ開裂部位の１つはｌａｃＺコード領域内で３７５番目のコドン（アスパラギン酸）と３７６番目のコドン（イソロイシン）との間を切断する。
【０１３０】
１５μｇのｐＡＨＯ５  ＤＮＡを、１００μｌの１×ＮＥＢ緩衝液２中で４０単位のＥｃｏＲＶ（ＮＥＢ）と共に３７℃で６０分間インキュベートすることにより、ＤＮＡを部分的に消化した。ＥｃｏＲＶを失活させるべく試料を６５℃で１０分間加熱した後、２０μｌの染料添加アガロースゲルを試料に加えた。１％低融点アガロースゲル上での電気泳動によってＤＮＡフラグメントを分離した。実施例８の方法で低融点アガロースゲルから直線化ｐＡＨＯ５プラスミドＤＮＡを回収し、蒸留水に再懸濁した。
【０１３１】
ＣＩＶＰＳ−ｌａｃＺ融合遺伝子の構築
ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ−ｌａｃＺ融合の構築は実施例２で説明した。ＣＩＶＰＳ３−ｌａｃＺ融合は、リン酸化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡをリン酸化ＩＶＰＳ１フラグメントに連結することによって行った。該反応は、２０μｌ倍容中で、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、０．１μｇのｐＡＨＯ５  ＤＮＡと、０．５μｇのＩＶＰＳ１  ＤＮＡと、１６０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えて１６℃で１５時間実施した。１００μｌのコンピテントＲＲ１細胞と１０μｌの連結試料とを氷上で３０分間混合し、４２℃で２分間加熱し、氷上で５分加熱冷却し、０．８ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リットル  トリプトン、５ｇ／リットル酵母抽出物、１０ｇ／リットルＮａＣｌ、１ｇ／リットル  デキストロース、１ｇ／リットルＭｇＣｌ2６Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．２、２５℃）を加え、３０℃で４５分間インキュベートして、大腸菌株ＲＲ１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢプレートに試料をプレーティングした。３０℃で一晩のインキュベーション後に、プレート当たり約１５０〜３００のコロニーが観察された。
【０１３２】
ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ−ｌａｃＺ及びＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓ−ｌａｃＺ融合を、０．１μｇのＥｃｏＲＶ直線化ｐＡＨＯ５  ＤＮＡと０．７ｇのＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ又はＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓフラグメントとの連結によって行った。大腸菌株ＥＲ２２５２（ＮＥＢ）の形質転換を前述のプロトコルで実施した。
【０１３３】
コロニーのハイブリダイゼーションを用いて、組換えプラスミドを有するクローンをスクリーニングした。前述のＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３正方向プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで放射性標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用した。コロニーを採取してニトロセルロースに移し、下記の各溶液中で５分間処理した：１０％ＳＤＳ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．５Ｍ  ＮａＣｌ（２回）及び２×ＳＳＣ（２回）。ニトロセルロースフィルターを室温で１時間乾燥し、真空下８０℃で２時間焼成し、６×ＳＳＣに５分間浸漬し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳの溶液中で４２℃で２時間洗浄した。６×ＮＥＴ、５×デンハート及び０．５％ＳＤＳ中で４２℃で４時間処理した後、フィルターを放射性標識オリゴマープローブと共に同一条件下で一晩インキュベートし、次いで２×ＳＳＣ中で、４２℃で１５分間の洗浄４回と、５０℃で２分間の洗浄２回とにかけ、その後オートラジオグラフィーを行った。
【０１３４】
オリゴマープローブにハイブリダイズしたポジティブクローンを、誘導物質ＩＰＴＧで融合タンパク質を発現する能力について更に調べた。クローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中でＯＤ600nmが０．５に達するまで３０℃で培養した。ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加えた後、培養物を３０℃で更に４時間増殖させた。０．１ｍｌの細胞を０．１ｍｌの尿素溶解緩衝液と共に１０分間沸騰させることにより粗溶解物を調製した。前述のポジティブクローンからの融合タンパク質のアイデンティティを、β−ガラクトシターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＩ−ＰｓｐＩ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３のタンパク質生成物、ＮＥＢ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。予備染色マーカー（ＢＲＬ）を用いて４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で試料を電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス由来）でプローブし、アルカリホスフェート結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３−ｌａｃＺ融合クローンは、両抗体と反応する１７３〜１７８ＫＤａの産物を発現した。この大きさは、ＣＩＶＰＳ３−β−ガラクトシターゼ融合タンパク質（図１１）について予想された大きさである。クローンｐＤＶ７及びｐＤＶ１５はＣＩＶＰＳ３挿入物を含む。ｐＤＶ３０２、３０６及び３０７はＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセットを有し、ｐＤＶＴ３１９、３２１及び３２３はＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセットを含む。ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ挿入物を含むｐＤＶＳ７１２及び７４２は既に実施例２で説明した。
【０１３５】
改質ＣＩＶＰＳ３カセットを用いるＣＩＶＰＳ３−β−ガラクトシターゼ中での特定ペプチド結合開裂の熱制御
カルボキシル末端でセリンを置換するためのトレオニン又はシステインを有するカセットを含むＤＶＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）−β−ガラクトシターゼ融合は、融合タンパク質中の特定ペプチド結合点で熱制御可能な開裂を示す。前述の構築物（ｌａｃＺ  ＥｃｏＲＶ部位に挿入したＣＩＶＰＳ３カセット）は、ＩＰＴＧでの誘導後に融合タンパク質を産生する。２５℃で増殖した細胞から調製した細胞抽出物をより高い温度（４２℃又は６５℃）で処理し、β−ガラクトシターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はＩ−ＰｓｐＩ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＣＩＶＰＳ３の産物）に対する抗体を用いてウェスタンブロットで分析した（図１１及び図１２）。ＩＶＰＳ１／Ｓｅｒ融合タンパク質は、高温でインキュベートすると、タンパク質スプライシングを起こして連結タンパク質と遊離ＩＶＰＳエンドヌクレアーゼとを生成し得る。連結反応活性は観察されなかったが、４２℃ではＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ又はＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセットを有する融合タンパク質が主にアミノスプライス部位で開裂し、６５℃では両方の融合タンパク質がカルボキシルスプライス部位でより大きい開裂活性を示した。
【０１３６】
ＣＩＶＰＳ３−ｌａｃＺ融合クローンからの細胞抽出物の調製を下記の方法で実施した。種々の大腸菌宿主内で最初に構築した融合構築物の全てを、実施例８で述べた標準的形質転換手順で、β−ガラクトシターゼを合成しないｌａｃＺ欠失大腸菌株ＥＲ１９９１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）中に導入した。ｐＤＶ７、ｐＤＶＣ３０２、ｐＤＶＴ３３２又はｐＤＶＳ７１２クローンからの単コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１．５ｍｌのＬＢ培地に接種し、ＯＤ600nmが約０．５になるまで３０℃でインキュベートし、１．５ｍｌの０．６ｍＭ  ＩＰＴＧ、１００μｇアンピシリン／ｍｌＬを加えることにより０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで２５℃で５時間誘導した。３ｍｌの細胞を遠心分離し、０．５ｍｌのＬＢに再懸濁し、４℃で１分間超音波処理し、４℃で５分間６，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を回収し、−２０℃で貯蔵した。
【０１３７】
細胞抽出物を室温で急速解凍した後、４２℃又は６５℃で熱処理した。４８μｌの抽出物を１２μｌの５×試料緩衝液（０．３１  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８／１０％ＳＤＳ／２５％２−メルカプトエタノール／５０％グリセロール／０．００５％ブロモフェノールブルー）と混合し、１０分間沸騰させて、非処理対照試料を調製した。４８μｌアリコートを１．５ｍｌミクロ遠心管に移し、４２℃の水浴中で３０、６０、１２０もしくは２４０分間、又は６５℃の水浴中で１５、３０、６０もしくは１２０分間インキュベートした。各々を１２μｌの５×試料緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。
【０１３８】
処理した試料を、Ｉ−ＰｓｐＩ（ＮＥＢ）（図１１及び図１２）又はβ−ガラクトシターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（図１２）に対する抗体を用いてウェスタンブロットで分析し、各試料５μｌを４／２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上に配置して１００ボルトで４時間電気泳動にかけた。ウェスタンブロットはＰｒｏｍｅｇａの手順に従って実施した。
【０１３９】
結果は、融合タンパク質前駆体が主要物質（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｐｅｃｉｅ）であり、４つの融合構築物全部から２５℃でＩＰＴＧ誘導した後の細胞中には極めて微量のＩ−ＰｓｐＩエンドヌクレアーゼしか存在していないことを示した。これは、低温ではスプライシング及び切り出し活性が不十分であることを意味する。しかしながら、ｐＤＶＳ７１２（ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ−β−ガラクトシターゼ融合）抽出物をより高い温度４２℃又は６５℃にシフトすると、ＣＩＶＰＳ３生成物Ｉ−ＰｓｐＩ（約６０ＫＤａ）が多量に蓄積された（図１１及び図１２）。ＩＶＰＳドメインの切り出しは、中断されたβ−ガラクトシターゼのＮドメイン及びＣドメインの連結に結びついており、完全長のβ−ガラクトシターゼと同じ大きさである１１６ＫＤａの生成物を産生した（図１２）。約１３０ＫＤａ（アミノスプライス部位での開裂に対応する）の別の主産物（ＩＶＰＳ１−Ｃ−ＥＰＳ）も観察された。
【０１４０】
他の３つの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）の融合タンパク質（ＣＩＶＰＳ３、ＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓ及びＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセットを有する）は低温での安定性がより大きかった。非処理抽出物からは、スプライス部位での開裂に対応するＩ−ＰｓｐＩ又は他の産物が極めて少量しか検出されなかった（図１１）。ＣＩＶＰＳ３／Ｓｅｒ融合と対照的に、これら３つの融合構築物の熱処理した試料では連結タンパク質は観察されなかった（図１２）。ｐＤＶ７（ＣＩＶＰＳ３−β−ガラクトシターゼ融合）試料は、６５℃では、Ｉ−ＰｓｐＩと単一スプライス部位での開裂に対応する生成物とを微量しか産生しなかった。これは、いずれのスプライス部位でも切り出しが十分でないことを意味する（図１１、レーン１〜３）。ＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓカセットを含むｐＤＶＣ３０２は、４２℃で中庸量のＩ−ＰｓｐＩ及びＣＩＶＰＳ３−Ｃ−ＥＰＳ種の蓄積を示した（図１１、レーン５）。Ｉ−ＰｓｐＩ、Ｃ−ＥＰＳ及びカルボキシルスプライス部位での開裂に対応する約１１０ＫＤａの生成物（Ｎ−ＥＰＳ−ＣＩＶＰＳ３）の収率は６５℃で増加したが、ＣＩＶＰＳ−Ｃ−ＥＰＳ種は減少した（図１１、レーン４〜６；図１２）。この結果は、融合タンパク質及び／又はＣＩＶＰＳ−Ｃ−ＥＰＳ生成物からのカルボキシルスプライス部位でのペプチド結合開裂が促進されたことを意味する。ｐＤＶＴ３２１（ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒカセットを有する）は、４２℃で処理すると、主要生成物ＣＩＶＰＳ３−Ｃ−ＥＰＳ以外のＩ−ＰｓｐＩ又はＣ−ＥＰＳを極めて少量しか示さなかった（図１１、レーン８；図１２）。このデータは、４２℃では、アミノスプライス部位でペプチド結合の効果的な開裂が得られるが、カルボキシルスプライス部位では該開裂が得られないことを意味する。６５℃で見られた少量のＩ−ＰｓｐＩの蓄積は、カルボキシルスプライス部位での開裂が促進されたことを意味する（図１１、レーン９）。
【０１４１】
要約すれば、前記データは、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＣＩＶＰＳ３）のカルボキシルスプライス部位で単一の天然残基セリンを置換すると、融合タンパク質のプロセシングが変化し、温度によってより良く制御できるようになることを立証している。ＣＩＶＰＳ３／Ｔｈｒ−β−ガラクトシターゼ融合タンパク質は（そして程度はより低いがＣＩＶＰＳ３／Ｃｙｓ融合タンパク質も）高温の時にだけ、アミノスプライス部位で特定ペプチド結合を開裂した。
【０１４２】
実施例９
ＭＩＰの構築及び精製
アフィニティクロマトグラフィーによるＣＩＶＰＳ融合体の精製
ＭＢＰ融合タンパク質へのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１のクローニング
本発明の実施態様の１つでは、ＣＩＶＰＳと、容易に精製できるセグメント、例えば結合タンパク質と、対象となっているタンパク質又はペプチド、即ちターゲットタンパク質とを含む三部型融合体（ｔｈｒｅｅ−ｐａｒｔ  ｆｕｓｉｏｎ）を形成することができる。これらの部分の順序は変えることができる。この種の融合体の利点は精製が容易なことにある。前駆体タンパク質を精製すれば、対象となっているペプチドを、改質ＣＩＶＰＳで誘導した単方向タンパク質開裂によって融合体から分離することができる。上述の実施例では、ＣＩＶＰＳ部位の１つを改変してその部位のスプライシング又は開裂を低下又は防止すると、別の部位の開裂がスプライシングより促進されることを明らかにした（詳細な説明、並びに実施例８参照）。これは、融合体から対象ペプチドの分離を可能にするものである。
【０１４３】
この実施例は、結合タンパク質であるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と、ＣＩＶＰＳ３と、パラミオシンペプチドとを含む前述のような三部型融合体が、非スプライス前駆体としてアミロース樹脂で簡単に精製できることを明かにする。この実施例では、連結なしで開裂生成物のみを生成するためにスプライシングを妨害すべく開裂をＣＩＶＰＳの片側に制限する試みは行わなかった。
【０１４４】
Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１挿入物（ＣＩＶＰＳ３）の合成
上述の実施例と同様に、但し下記の点を変えて、ＰＣＲによりＣＩＶＰＳ３カセットを合成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、２００Ｍの各ｄＮＴＰと、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、４０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００リットル中２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを含んでいた。増幅は、Ｐｅｒｋｅｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーを用いて、９４℃で３０秒、５０℃で３秒及び７２℃で２分のサイクルに２０回かけて実施した。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１はｐＮＥＢ＃７２０から合成した。
【０１４５】
正方向プライマーは、２つのフランキングＫｐｎＩ部位を含む、ＤＶ  ＩＶＰＳ１の５’末端と同じ３’末端の２６／２７塩基からなるプライマー９６−６、５’−ＧＧＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣＣＡ−３’（配列番号：４３）であった。３’ＫｐｎＩ部位は、アミノ酸残基を変えずに制限部位を形成するサイレント置換を含む。Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１逆方向プライマーであるプライマー９６−７、５’−ＣＣＧＣＴＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号：４４）は、３’末端にＢａｍＨＩ部位を有する。３’末端の２３／２４塩基はＤＶ  ＩＶＰＳ１の３’末端と相同であり、ＢａｍＨＩ部位を形成するための単一塩基置換を有する。プライマー９６−６及び９６−７を使用してＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１カセット（１．６ｋｂ）を合成した。
【０１４６】
ＰＣＲ試料を１：１でクロロホルムと混合し、上方水性層を１％低融点アガロースゲル上に配置して電気泳動にかけた。ゲルから１．６ｋｂバンドを切り取り、６５℃でインキュベートした。ゲルの融解後、０．２５ｍｌのＴＥ緩衝液（（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を６５℃で加え、試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合物）で抽出した。ＤＮＡを０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び２倍容のイソプロパノール中で−２０℃で３０分間沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、乾燥し、６０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１４７】
ｐＰＲ１００２、即ちｐＭＡＬ−ｃ２−パラミオシンΔＳａｌプラスミドの調製ｐＭＡＬ−ｃ２−パラミオシンΔＳａｌ融合プラスミドであるｐＰＲ１００２は、パラミオシンΔＳａｌ欠失と称する、Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓパラミオシン遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントに結合した、ｔａｃプロモーター制御下のｍａｌＥ遺伝子を含む７．２ｋｂのベクターである（Ｓｔｅｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４５：３９１７−３９２３（１９９０））。４μｇずつの２つのｐＰＲ１００２試料を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む２０μｌの１×ＮＥＢ緩衝液＃２中で６単位×ＸｍｎＩ（ＮＥＢ）により３７℃で２時間直線化した。該反応物質を１％低融点アガロースゲルにかけた。７．２ｋｂバンドを切り取り、前述のようにゲルから精製し、４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１４８】
ｐＭＩＰ１７の構築
ｐＰＲ１００２とＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１との連結を、１４．５μｌの蒸留水と、２．５μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、１μｇ／μｇの開裂ｐＰＲ１００２  ＤＮＡと、前述のように調製した５μｌの０．２μｇ／μｌ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１と、８００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）とを加えた２５μｌ容中で１６℃で１６時間実施した。
【０１４９】
１００μｌのコンピテントＥＲ２２５２細胞と５μｌの連結試料とを、０．１Ｍ  ＣａＣｌ2と１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸Ｎａ）との１：２混合物１００μｌ中で混合し、４２℃で３分間加熱し、氷中で５分間冷却し、０．１ｍｌのＬＢ培地（１０ｇ／リットルのトリプトン、５ｇ／リットルの酵母抽出物、１０ｇ／リットルのＮａＣｌ、１ｇ／リットルのデキストロース、１ｇ／リットルのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．２、２５℃）を加え、３０℃で３０分間インキュベートすることにより、大腸菌株ＥＲ２２５２を氷上で５分間形質転換した。形質転換細胞３００μｌをペレット化し、１００μｌの上清に再懸濁し、ＬＢａｍｐプレートにプレーティングした。３０℃で一晩のインキュベーション後に、約１６０のコロニーが観察された。
【０１５０】
ＰＣＲ増幅を用いて、組換えプラスミドを有するコロニーのスクリーニングを行った。個々のコロニーを採取してウェル数９６のマイクロタイター皿内の１００μｌの蒸留水に入れ、５分間沸騰させて細胞を溶解した。ＰＣＲ混合物は、５０μｌの反応混合物中Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラセーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー（同上）と、２．５μｌの細胞溶解物と、２単位のＶｅｎｔ  Ｅｘｏ  ＤＮＡポリメラセーゼとを含んでいた。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーを用いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒及び７２℃で２分のサイクルに３０回かけることにより実施した。１０μｌの各反応混合物を１％アガロースゲル上で電気泳動させた。ポジティブクローンはＩＶＰＳ１（１．６ｋｂ）に対応するバンドを有していた。１つのポジティブプラスミドをｐＭＩＰ１７と命名した。
【０１５１】
ＭＩＰの発現：ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−パラミオシンΔＳａｌ融合
ｐＭＩＰ１７を含むポジティブクローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中でＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃で培養した。非誘導細胞から溶解物を調製するために、１．０ｍｌの培養液をペレット化し、５０μｌのタンパク質試料緩衝液（１２５ｍＭトリス、７００Ｍｍ  β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、１５％グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）に再懸濁した。誘導培養物からの試料は下記のように調製した。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加えた後、培養物を３０℃で更に２０時間増殖させた。誘導後５時間目及び２０時間目の０．５ｍｌ培養物からの細胞をペレット化し、１００μｌの５×タンパク質試料緩衝液に再懸濁した。予備誘導した５時間目の試料を−２０℃で１６時間凍結し、２０時間目の試料を−７０℃で１５分凍結した。前駆体の収率を増加させるために、培養物を１２℃〜２０℃で誘導し、前駆体の量をクーマシーブルー染色ゲルで決定した。全ての試料を５分間沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動と、クーマシーブルー染色か、又はＩ−ＰｓｐＩに対する抗体（ＮＥＢ）を用いるウェスタンブロットとを順次行ってタンパク質生成物を分析した。試料は４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｐｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）上で予備染色マーカー（ＢＲＬ）を用いて電気泳動させ、ニトロセルロースに移し、抗血清（マウス抗−Ｉ−ＰｓｐＩ）でプローブし、アルカリホスフェート結合抗マウス第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。クーマシーブルー染色ゲル及びウェスタンブロットの両方で、予想した主要バンドが約１３２ｋＤａに観察された（データ示さず）。
【０１５２】
アミロース及びＭｏｎｏＱカラムでのＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１パラミオシンΔＳａｌ融合体の大規模精製
単コロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４×１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、ＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃でインキュベートした。これらの培養物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４×１リットルのＬＢ培地に接種し、ＯＤ600nmが０．５になるまで３０℃でインキュベートした。次いで培養物を１２℃にし、１ｍＭ  ＩＰＴＧで一晩誘導した。細胞をペレット化し、カラム緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ７．４、２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離し、透明な培養溶解物をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）にかけた。融合タンパク質を（製造業者の指示に従って）マルトースで溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで調べた（図１３）。アミロース樹脂溶離物を、ＦＰＬＣ  ＭｏｎｏＱアニオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーにより更に精製した。カラムを０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中０．２〜１．０ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶離した。タンパク質は０．４〜０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶離した。
【０１５３】
６つのタンパク質バンドを、ＭＢＰ、Ｉ−ＰｓｐＩ及びパラミオシンに対する抗体を用いてウェスタンブロットで同定した。見掛け分子量１８０ｋＤａ及び１３２ｋＤａの２つのバンドは前記３種類の抗体の全てと反応した。完全長の前駆体は１３２ｋＤａの筈である。分子量がより大きいバンドはスプライシング中間体と考えられ、類似の高分子量物質が全てのＣＩＶＰＳ構築物について見られた。切り出されたＩ−ＰｓｐＩは６０ｋＤａで泳動し、Ｉ−ＰｓｐＩ抗体に認識されただけであった。また、スプライスされた生成物（ＭＢＰ−パラミオシンΔＳａｌ、７２ｋＤａ）は、ＭＢＰ及びパラミオシン抗体と反応する血清に認識されただけであった。約１０３ｋＤａのバンドはＭＢＰ及びＩ−ＰｓｐＩ抗体とだけ反応した。このバンドは、ＩＶＰＳのＣ末端での単一開裂の産物を表す。約８９ｋＤａのバンドはＩ−ＰｓｐＩ及びパラミオシン抗血清とだけ反応した。該バンドはＩＶＰＳのＮ末端での単一開裂の産物を表す（図１３）。
【０１５４】
ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−パラミオシンΔＳａｌ融合体の切り出し及び連結
前駆体（１３２ｋＤａ）を含む幾つかのＭＩＰ関連ポリペプチドと、泳動速度の遅い物質（見掛け分子量１８０ｋＤａ）と、単一スプライス部位での開裂生成物（１３０ｋＤａ及び８９ｋＤａ）と、少量のスプライスされた生成物及び切り出された生成物（７２ｋＤａ及び６０ｋＤａ）とを含むアミロース樹脂及びＭｏｎｏＱ調製物を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で３７℃で２時間熱処理した。１３２ｋＤａの前駆体及び１８０ｋＤａの泳動速度の遅い物質は経時的に減少し、７２ｋＤａのスプライスされた生成物及び６０ｋＤａの切り出されたＩ−ＰｓｐＩは増加した（図１３）。
【０１５５】
これらの結果は、三部型ＣＩＶＰＳ融合体を精製できるだけでなく、単一開裂生成物を得ることもできることを意味する。ＣＩＶＰＳ部位を更に操作すると、連結を伴わないいずれかのスプライス部位の開裂が促進され得る。
【０１５６】
実施例１０
ＭＩＰ融合におけるＣＩＶＰＳの改変
置換可能なスプライス部位カセットを有するＭＩＰの構築
この実施例では、両方のスプライス部位に置換可能カセットを有し、ＣＩＶＰＳがカセット置換によって改変された、ＭＩＰ融合体（実施例９参照）を構築した。また、２つの事例で、改質ＣＩＶＰＳが主に単一スプライス部位で熱誘導的に開裂できるという事実も明らかにする。
【０１５７】
実施例９では、３つの部分、即ちＣＩＶＰＳ、精製の容易な結合ドメイン（ＭＢＰ）及び対象となっている遺伝子（パラミオシンΔＳａｌ）で形成できる三部型融合体ＭＩＰを説明した。精製融合タンパク質のスプライシングでは２種類の主要産物、連結タンパク質ドメイン、ＭＢＰ−パラミオシンΔＳａｌ及び切り出されたＣＩＶＰＳ（又はＩ−ＰｓｐＩ）が得られた。ＣＩＶＰＳにおける改変のなかには、連結反応の抑制と１つのスプライス部位での開裂の増加とを誘起し得るものがあり、その結果、改質ＣＩＶＰＳにより触媒された特定ペプチド結合部位での開裂によって、融合タンパク質から対象ペプチドが分離されるのであろうと推論された。実施例８では、１つのスプライス部位の開裂がＣＩＶＰＳ３の改変（Ｔｈｒ又はＣｙｓによるＣ末端Ｓｅｒの置換）によって促進され得、これらの変化がもう１つの部位のスプライシング又は開裂を低下又は防止することを明らかにした。制御可能なスプライシング又は開裂活性の好ましい特性での改変に関してスクリーニングを行うためには、スプライス部位に種々の変異を導入し分析しなければならない。これは、各改変を有する完全ＣＩＶＰＳカセットの合成によって達成し得る。しかしながらこの操作は、ＰＣＲ時に余分の変異を導入する可能性がある。
【０１５８】
本発明者は、スプライス部位の周りで短い範囲にわたるＤＮＡだけを置換することによって前記操作を容易にする手法を開発した。該実施例では、実施例９で形成した元のＭＩＰ融合体を、各スプライス部位を挟む２つの非反復制限部位を有するように修飾する方法を説明する。制限消化後のカセット置換では、スプライス部位の１つにおける２つの非反復制限部位の間の短い範囲のＤＮＡを別の短いＤＮＡカセットで置換することができる。この実施例では、実施例９で説明したｐＭＩＰ１７融合体を、各接合部位に２つの非反復制限部位を有するように、即ちアミノスプライス部位にフランキング配置するＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位と、カルボキシルスプライス部位にフランキング配置するＢａｍＨＩ部位及びＳｔｕＩ部位とを有するように改変した（図１４参照）。
【０１５９】
スプライス部位カセットを有するＭＩＰ融合体は２つのステップで構築した。まず、ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩ部位を次のように導入した。４μｇのｐＭＩＰ１７（実施例９）を１×ＥｃｏＲＩ緩衝液（ＮＥＢ）中で５０μｌ中０．５単位のＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）により３７℃で１０分間消化した。１％アガロースゲルで電気泳動により分離した後、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ  １０１）を用いて直線化ｐＭＩＰ１７プラスミドＤＮＡ（８．８Ｋｂ）を精製した。精製ｐＭＩＰ１７  ＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡと、４０単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）とを加えた１×ＢａｍＨＩ緩衝液（ＮＥＢ）中３７℃で３時間消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを０．３Ｍ  酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）及び５０％２−プロパノール中で−２０℃で２時間沈殿させた。ＤＮＡをミクロ遠心機で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して回収し、乾燥し、２０μｌの無菌水に再懸濁した。
【０１６０】
ベクターとの連結の前に、２つの相補オリゴマーＭＩＰ３０１Ｆ（５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＣ−３’（配列番号：４６））及びＭＩＰ３０２Ｒ（５’−ＡＡＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧ−３’（配列番号：４７））をアニールさせて二本鎖リンカーＭＩＰ３０１Ｆ／ＭＩＰ３０２Ｒを形成した。５０ｐｍｏｌのオリゴマーＭＩＰ３０１Ｆ及びＭＩＰ３０２Ｒを１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で６８℃で１５分間インキュベートし、２０℃〜３０℃にゆっくりと冷却した。１μｇのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＭＩＰ１７  ＤＮＡを、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）及び２５ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ３０１Ｆ／ＭＩＰ３０２Ｒを加えた３５μｌの１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で１６℃で１４時間にわたり連結反応させた。
【０１６１】
得られた構築物をｐＭＩＰ１８と命名した。上流ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位を次の方法でｐＭＩＰ１８に導入した。２μｇのｐＭＩＰ１８を、１００μｌの１×緩衝液２（ＮＥＢ）、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ及び２０単位のＫｐｎＩ（ＮＥＢ）中で３７℃で４時間消化した。電気泳動で分離した後、線状ｐＭＩＰ１８ＤＮＡをＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１）で精製した。ベクターと連結する前に、２つの相補オリゴマーＭＩＰ５２１Ｆ（５’−ＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号：４８））及びＭＩＰ５２２Ｒ（５’−ＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＡＡＡＡＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＴＡＣ−３’（配列番号：４９））をアニールさせて二本鎖リンカーＭＩＰ５２１Ｆ／ＭＩＰ５２２Ｒを形成した。５０ｐｍｏｌのオリゴマーＭＩＰ３０１Ｆ及びＭＩＰ３０２Ｒを１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で７５℃で１５分間インキュベートし、２０℃〜３０℃にゆっくりと冷却した。０．２μｇの消化ｐＭＩＰ１８を、３５μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、８０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）及び２５ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ５２１Ｆ／ＭＩＰ５２２Ｒ中で室温で３時間連結反応させた。いずれの場合も、連結ＤＮＡ試料を用いて大腸菌株ＥＲ２２５２（ＮＥＢ）を形質転換した。最終構築物ｐＭＩＰ２１は、各スプライス部位に２つの非反復制限部位を含む。Ｎ末端スプライス部位を包囲するＸｈｏＩ部位及びＫｐｎＩ部位と、Ｃ末端スプライス部位を包囲するＢａｍＨＩ部位及びＳｔｕＩ部位とが存在する（図１４）。
【０１６２】
改質ＭＩＰ２１融合タンパク質の発現とスプライシング活性とを調べるためにウェスタンブロット分析を行った。ｐＭＩＰ２１含有ＥＲ２２５２を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中３０℃でＯＤ600nmが０．５になるまで培養した。次いで培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで３０℃で３時間誘導した。４．５ｍｌの培養物をペレット化し、０．５ｍｌのＬＢ培地に再懸濁し、氷上で超音波処理した。透明上清を４／２０％のポリアクリルアミドゲル上で１００ボルトで４時間電気泳動させた。ウェスタンブロットを抗ＭＢＰ血清でプローブした。結果は、改質ＭＩＰ２１融合体からのスプライシング活性がＭＩＰ１７のそれと区別できないものであることを示している。
【０１６３】
スプライス部位カセット置換によるＭＩＰ２１の改変
改変ＭＩＰ融合構築物ｐＭＩＰ２１では、アミノスプライス部位カセットがＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位の間に８つのアミノ酸残基を含んでおり、カルボキシルスプライス部位カセットがＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩ部位の間の６つのアミノ酸残基をコードする配列を含んでいる。スプライス部位は、Ｎ末端ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩカセット又はＣ末端ＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットを置換することによって変えることができる。Ｃ末端カセット置換の場合は、ｐＭＩＰ２１をまずＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩで消化する。元のＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットを、所望の変異を含む相補プライマーで置換する。この実施例では、２つの異なる部位カセットでＭＩＰ２１  ＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩカセットを置換した。
【０１６４】
下記のカセット置換実施例では、Ａｌａ535をＬｙｓで置換するか、又はＨｉｓ536をＬｅｕで置換した。
【０１６５】
残基Ａｌａ535をＬｙｓで置換するためには、相補オリゴマーＭＩＰ３０３Ｆ（５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：５０））及びＭＩＰ３０４Ｒ（５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＡＴＡＧＡＧＧ−３’（配列番号：５１））を使用した。Ｈｉｓ536をＬｅｕで置換するためには、相補オリゴマーＭＩＰ３１１Ｆ（５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：５２））及びＭＩＰ３１２Ｒ（５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧ−３’（配列番号：５３））を使用した。これら２対の相補オリゴマーを前述のように処理して二本鎖リンカーを形成した。どちらのリンカーも、ｐＭＩＰ２１のＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ開裂後にカルボキシルスプライス部位を置換するための適合性末端を含む。２μｇのｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを加えた１×ＢａｍＨＩ緩衝液（ＮＥＢ）中４０単位のＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）で３７℃で４時間消化し、クロロホルムで抽出し、０．３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）及び５０％２−プロパノール中で−２０℃で２時間沈殿させた。ミクロ遠心機で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＮＡを回収し、乾燥し、８８μｌの無菌水に再懸濁した。次いで、ＢａｍＨＩ消化ｐＭＩＰ２１  ＤＮＡを１００μｌの１×緩衝液２（ＮＥＢ）中４０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）で３７℃で３時間消化し、クロロホルムで抽出し、０．３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）及び５０％２−プロパノール中−２０℃で一晩沈殿させた。ミクロ遠心機で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＤＮＡを回収し、乾燥し、３０μｌの無菌水に再懸濁した。０．１μｇのＢａｍＨＩ−ＳｔｕＩ消化ＤＮＡを、４０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）の存在下で、１０μｌの１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中６ｐｍｏｌのリンカーＭＩＰ３０３Ｆ／ＭＩＰ３０４Ｒ又はＭＩＰ３１１Ｆ／ＭＩＰ３１２Ｒと２３℃で６時間連結させた。連結ＤＮＡを用いて大腸菌ＲＲ１を形質転換した。ｐＭＩＰ２３はＡｌａ535からＬｙｓへの置換を含み、ｐＭＩＰ２８はＨｉｓ536からＬｅｕへの置換を含む。修飾ＭＩＰ融合体ＭＩＰ２３及びＭＩＰ２８の発現を、前述のように抗ＭＢＰ抗体を用いるウェスタンブロット分析で調べた。その結果、どちらの融合構築物でもスプライシング活性がブロックされていることが判明した。しかしながら各改変は、一方のスプライス部位のみの開裂活性を増加させた。ＭＩＰ２３におけるＡｌａ535からＬｙｓへの置換はカルボキシルスプライス部位の開裂活性を急増させ、ＭＩＰ２８におけるＨｉｓ536からＬｅｕへの置換は強度のアミノスプライス部位開裂を示した。
【０１６６】
改質ＭＩＰ融合タンパク質の精製及び熱誘導可能な開裂活性
融合タンパク質の発現を低温で誘発し、ＭＩＰ融合タンパク質をアミロース樹脂カラムで精製した。ｐＭＩＰ２３又はｐＭＩＰ２８を含有するＲＲ１を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた１リットルのＬＢ培地中３０℃でＯＤ600nmが０．５になるまで培養した。培養物を氷上で約１５℃に冷却した後、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで加え、培養物を１２℃〜１４℃で更に１２時間増殖させた。細胞をペレット化し、−７０℃で即座に冷凍し、−２０℃で貯蔵した。ペレットをカラム緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で別個に超音波処理し、遠心分離した。各ＭＩＰ融合体からの透明溶解物をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）にかけ、洗浄し、マルトースで溶離した（実施例９と同様）。
【０１６７】
ＭＩＰ２３の精製試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ６．０）／５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で４℃で透析した。次いで試料を４℃、３７℃、５０℃及び６５℃で１時間インキュベートし、４／２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させ、その後クーマシーブルーで染色した（図１５のＡ）。ゲルは、温度を上げると、ＭＩＰ２３が元の構築物のように連結生成物（ＭＩＰ）又は切り出し生成物（Ｉ）を形成せずに、Ｃ末端開裂生成物（ＭＩ、１０３ｋＤ及びＰ、２９ｋＤ）を蓄積することを示している。
【０１６８】
精製ＭＩＰ２８試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ６．０）／５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で４℃で１．５時間透析した。次いで試料を４℃、４２℃、５０℃及び６５℃で１時間インキュベートし、１／５倍容の５×タンパク質試料緩衝液（１２５ｍＭトリス、７００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、１５％グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）と混合した。タンパク質生成物を４／２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、次いでクーマシーブルーで染色した（図１５）。データは、これらの条件下ではスプライシング活性が完全にブロックされることを示した。アミノスプライス部位の開裂活性は温度の増加に対応して増加し、６５℃でより多くのＭＢＰ（Ｍ、４３ｋＤ）及びＣＩＶＰＳ３−パラミオシンΔＳａｌ（ＩＰ、８９ｋＤ）が得られた。
【０１６９】
これらの結果は、スプライス部位カセット置換法を使用して融合構築物のスプライス部位を改変することができ、このような改変がスプライシング及び開裂活性に著しい効果を与え得ることを示している。このデータは更に、ＣＩＶＰＳの連結及び完全切り出しの不在下で１つのスプライス部位のみにおける開裂が観察される構築物の一例を示している。
【０１７０】
実施例１１
ＭＩＣの構築及び精製
ＣＩＶＰＳ融合体における外来遺伝子の置換
精製を容易にするための結合ドメインと、スプライシングドメイン（ＣＩＶＰＳ３）と、ターゲットタンパク質（パラミオシン）とを含む三部型融合タンパク質（ＭＩＰ）を、実施例９と同様に構築した。この構築物を精製し、熱活性化によってスプライスできることを明らかにした。この系が種々のターゲットタンパク質を受容する能力を調べるために、ＭＩＰ構築物中のパラミオシンをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅキチナーゼ遺伝子由来のキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）で置換した［Ｋｕｒａｎｄａ及びＲｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２６６（２９）：１９７５８−１９７６７（１９９１）］。この第２のタンパク質融合体がスプライスして連結生成物及び切り出し生成物の両方を形成する能力は、該融合方法を別の外来タンパク質に使用できることを立証するものである。更に、キチン結合ドメインはタンパク質精製用の別の結合タンパク質として使用できる。
【０１７１】
キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）の合成
上述の実施例と同様の手順で、但し下記の点を変えて、ＰＣＲによりキチン結合ドメインを合成した。ＰＣＲ混合物は、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と、２００μＭの各ｄＮＴＰと、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、２０ｎｇのプラスミドＤＮＡと、１００μｌ中１単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとを含んでいた。増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラーを用いて９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で３０秒のサイクルに２０回かけて実施した。キチン結合ドメインは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅキチナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＴ３０から合成した［Ｋｕｒａｎｄａ及びＲｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２６６（２９）：１９７５８−１９７６７（１９９１）］。
【０１７２】
正方向プライマーであるプライマー９９−０２、５’−ＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＣＡＴ−３’（配列番号：５４）は５’末端にＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ（配列番号：５５））を有する。該プライマーの３’末端の２２塩基は、キチナーゼ遺伝子のキチン結合ドメインの５’末端と同じである。逆方向プライマーであるプライマー９９−０３、５’−ＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：５６）は５’末端にＰｓｔＩ部位（ＣＴＧＣＡＧ（配列番号：５７））を有する。該プライマーの３’末端の２６塩基は、キチナーゼ遺伝子のキチン結合ドメインの３’末端のアンチセンス鎖と同じである。プライマー９９−０２及び９９−０３を用いてキチン結合ドメインカセット（２７０ｂｐ）を合成した。
【０１７３】
ＰＣＲ試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合物）で抽出し、ＤＮＡを０．５ＭのＮａＣｌ及び２倍容のイソプロパノール中で−２０℃で３０分間沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、乾燥し、４０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に最懸濁した。２０μｌの再懸濁ＤＮＡと、２１μｌの蒸留水と、５μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液＃２と、４０単位のＰｓｔＩ（ＮＥＢ）と、２０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）とでの消化を５０μｌ容で３７℃で２時間実施した。該反応物質を１．８％の低融点アガロースゲル上に配置して電気泳動にかけた。ゲルから０．２５ｋｂ  ＰｓｔＩ／ＳｔｕＩ消化生成物を切除し、ゲルが融解するまで６５℃でインキュベートした。０．２５ｍｌのＴＥ緩衝液を６５℃で加え、試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合物）で抽出した。ＤＮＡを０．５Ｍ  ＮａＣｌ及び２倍容のイソプロパノール中で−２０℃で３０分間沈殿させ、遠心分離し、乾燥し、４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１７４】
ｐＭＩＰ２１の調製
ＰｓｔＩ／ＳｔｕＩ二重消化により、実施例１０に記載のｐＭＩＰ２１の残りからパラミオシンコード領域を分離する。５μｇずつのｐＭＩＰ２１試料を６０単位のＰｓｔＩ（ＮＥＢ）及び３０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）と、５μｌのＮＥＢ緩衝液＃２と、３４μｌの蒸留水とで、５０μｌ容中３７℃で２時間消化した。該反応物質を１％低融点アガロースゲルにかけた。８．１ｋｂバンドを切除して前述のようにゲルから精製し、４０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【０１７５】
ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ融合体（ＭＩＣ）の構築
ＭＩＰ２１中のパラミオシンを下記のようにキチン結合ドメインで置換して、ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ構築体（ＭＩＣ）を形成した。１μｌの８．１ｋｂ  ｐＭＩＰ２１フラグメントと１０μｌのキチン結合ドメイン（どちらも前述のように調製）とを、９．５μｌの蒸留水、２．５μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）及び８００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）と混合し、２５μｌ容中１６℃で４時間インキュベートした。
【０１７６】
大腸菌株ＲＲ１  ｔｏｎＡ（ＮＥＢ）を、（１）１００μｌのコンピテントＲＲ１  ｔｏｎＡ細胞と、５μｌの連結試料と、０．１Ｍ  ＣａＣｌ2及び１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  酢酸Ｎａ）の１：２混合物１００μｌとを氷上で５分間混合し、（２）４２℃で３分間加熱し、（３）氷中で５分間冷却し、（４）ＬＢａｍｐプレートにプレーティングすることによって形質転換した。３０℃で一晩のインキュベーション後に、約２００のコロニーが観察された。
【０１７７】
アルカリ溶解物ミニプレパレーション（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）  ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出の文献）を用いて、キチン結合ドメインを含む組換えプラスミドを有するクローンのスクリーニングを行った。ＰｓｔＩ及びＳｔｕＩで消化すると、ポジティブクローンはキチン結合ドメインに対応するバンドとベクターに対応するバンドとを有していた。１０μｌのミニプレパレーション  ＤＮＡと、２．５μｌのＮＥＢ緩衝液＃２と、８．５μｌの蒸留水と、４０単位のＰｓｔＩ（ＮＥＢ）と、２０単位のＳｔｕＩ（ＮＥＢ）とを２５μｌ容中で３７℃で２時間混合することにより制限酵素消化を実施した。
【０１７８】
ＭＩＣ融合体の発現
ＭＩＣ構築を確認するために、小規模タンパク質調製物をクーマシーブルー染色ゲル及びウェスタンブロットで分析した。ポジティブクローンを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中３０℃でＯＤ600が約０．５になるまで培養した。非誘導細胞から溶解物を調製するために、１．５ｍｌの培養液をペレット化し、２５μｌの５×タンパク質試料緩衝液（１２５ｍＭトリス、７００ｍＭ  β−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、１５％グリセロール及び１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）に再懸濁した。誘導細胞からのタンパク質試料は下記のように調製した。培養物を１２℃に冷却した後、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加え、培養物を１２℃で更に５時間増殖させた。２時間の誘導後に１．５ｍｌの試料を採取し、５時間の誘導後に３ｍｌの試料を採取した。試料をペレット化し、５０μｌの５×タンパク質試料緩衝液に再懸濁し、−２０℃で１６時間冷凍し、次いで解凍し、５分間沸騰させた。タンパク質生成物をクーマシーブルー染色ゲルと、抗ＭＢＰ抗体（ＮＥＢ）を用いるウェスタンブロットとによって分析した。予備染色マーカー（ＢＲＬ）を用いて試料を４〜２０％ＳＤＳゲル（ＩＳＳ，Ｄａｉｃｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、抗ＭＢＰ抗体でプローブし、アルカリホスフェート結合抗ウサギ第二抗体を製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示通りに使用して検出した。クーマシーブルー染色ゲル及びウェスタンブロットの両方で、ＭＩＣ融合タンパク質について予想された主バンドが約１１０ｋＤａに観察された。
【０１７９】
アミロース及びＭｏｎｏＱカラムでのＭＩＣの大規模精製
単コロニーを用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた３×１０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３０℃で一晩インキュベートした。該培養物を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた３×１リットルのＬＢ培地に接種し、３０℃でＯＤ600が０．５になるまでインキュベートした。次いで培養物を１２℃にし、１ｍＭ  ＩＰＴＧで一晩誘導した。細胞をペレット化し、カラム緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離し、透明培養溶解物をアミロース樹脂（ＮＥＢタンパク質融合及び精製システム）にかけた。融合タンパク質を（製造業者の指示通りに）マルトースで溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。アミロース樹脂溶解物を、ＦＰＬＣ  ＭｏｎｏＱアニオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのクロマトグラフィーで更に精製した。カラムを０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中０．２〜１．０Ｍ  ＮａＣｌの直線ＮａＣｌ勾配で溶離した。タンパク質は０．４〜０．６Ｍ  ＮａＣｌで溶離した。ＭＩＣ及びＭＩＰタンパク質融合生成物はアミロース樹脂及びＭｏｎｏＱ樹脂の両方で同様に精製された。
【０１８０】
ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ融合体の切り出し及び連結
ＭＩＣのアミロース精製試料を２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、ｐＨ６．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。次いで試料を４℃、３７℃、５０℃及び６５℃で１時間熱処理し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで調べた（図１６）。ゲルは、４℃試料中に約１１０ｋＤａのＭＩＣ前駆体が多量に存在することを示しているが、該前駆体は熱誘導後に減少する。前駆体の減少に伴い、約５３ｋＤａの大きさの連結生成物ＭＢＰ−ＣＢＤ（ＭＣ）、及び約６０ｋＤａの大きさの切り出し生成物Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（Ｉ＝Ｉ−ＰｓｐＩ）の蓄積が温度上昇に伴って観察された。ゲルは更に、約１０３ｋＤａの開裂生成物ＭＢＰ−Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１（ＭＩ）及び約７０ｋＤａのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＩＶＰＳ１−ＣＢＤ（ＩＣ）と同じ大きさのバンドが存在していることを示している。
【０１８１】
以上、本発明を好ましい実施態様を含めて詳細に説明してきたが、これらの実施態様は当業者により、本明細書の開示に基づいて、「特許請求の範囲」に記載の本発明の思想及び範囲を逸脱することなく様々に変形され得るであろう。
【０１８２】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：5837塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：
配列：
【０１８３】
【表２】
0003662948.tif 000003
【０１８４】
【表３】
0003662948.tif 000004
【０１８５】
【表４】
0003662948.tif 000005
【０１８６】
【表５】
0003662948.tif 000006
配列番号：2
配列の長さ：4707塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：
ハイポセティカル：なし
アンチセンス：なし
フラグメント型：N-末端
配列の特徴：
特徴を表す記号：CDS
存在位置：363..4298
配列
【０１８７】
【表６】
0003662948.tif 000007
【０１８８】
【表７】
0003662948.tif 000008
【０１８９】
【表８】
0003662948.tif 000009
【０１９０】
【表９】
0003662948.tif 000010
【０１９１】
【表１０】
0003662948.tif 000011
【０１９２】
【表１１】
0003662948.tif 000012
【０１９３】
【表１２】
0003662948.tif 000013
配列番号：3
配列の長さ：23塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGTGTCTCCG GAGAAAGTGA GAT                                      23
配列番号：4
配列の長さ：22塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGTATTGTGT ACCAGGATGT TG                                       22
配列番号：5
配列の長さ：24塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGCATTTTAC CGGAAGAATG GGTT                                        24
配列番号：6
配列の長さ：25塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCTATTATGT GCATAGAGGA ATCCA                                     25
配列番号：7
配列の長さ：24塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGGGTCGACA GATTTGATCC AGCG                                      24
配列番号：8
配列の長さ：20塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GAGAACTTTG TTCGTACCTG                                            20
配列番号：9
配列の長さ：21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GGTATTATTT CTTCTAAAGC A                                          21
配列番号：10
配列の長さ：20塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GTTGTTTGTT GGTTTTACCA                                            20
配列番号：11
配列の長さ：20塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
ATGGCAAATG CTGTATGGAT                                             20
配列番号：12
配列の長さ：23塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGTGTCTCCG GAGAAAGTGA GAT                                          23
配列番号：13
配列の長さ：26塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
ATTGTGTACT AGTATGTTGT TTGCAA                                       26
配列番号：14
配列の長さ：37塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCCTCCGGAG ACACTATCGC CAAAATCACC GCCGTAA                            37
配列番号：15
配列の長さ：38塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCCACTAGTA CACAATACGC CGAACGATCG CCAGTTCT                           38
配列番号：16
配列の長さ：26塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCTTCTAGAC CGGTGCAGTA TGAAGG                                        26
配列番号：17
配列の長さ：36塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCCGTCGACC CTAGTGTCTC AGGAGAAAGT GAGATC                            36
配列番号：18
配列の長さ：33塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCCTCTAGAA TTGTGTACCA GGATGTTGTT TGC                                33
配列番号：19
配列の長さ：23塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCAAAGAACC GGTGCGTCTC TTC                                          23
配列番号：20
配列の長さ：20塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGCAACAGAG TTACCTCTTG                                              20
配列番号：21
配列の長さ：33塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CAGTTTCCAG CTCCTACAAT GAGACCTACG AGC                               33
配列番号：22
配列の長さ：20塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GTAGTGTCGA CCCCATGCGG                                               20
配列番号：23
配列の長さ：28塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CGTTTTGCCT GATTATTATC TCACTTTC                                     28
配列番号：24
配列の長さ：22塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GTCCACCTTC GAAAAAAGAT CC                                            22
配列番号：25
配列の長さ：21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCGCATAAAG GACCTTAAAG C                                             21
配列番号：26
配列の長さ：23塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GAGGAAGAGA TCATCATCAT AGC                                           23
配列番号：27
配列の長さ：40塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GTCCTTCGTG CGGACAGTGT CTCAGGAGAA AGTGAGATAA                        40
配列番号：28
配列の長さ：40塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GTCCTTTATG CGGACTAGGT CTCAGGGAGAA AGTGAGATAA                         40
配列番号：29
配列の長さ：61塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCGGTTCTTT GCAAACAACA TCCTGGTACA CAATTAAGAC GGCTTTTATG CCACAATACC
C                                                                    61
配列番号：30
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０１９４】
【表１３】
0003662948.tif 000014
配列番号：31
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０１９５】
【表１４】
0003662948.tif 000015
配列番号：32
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０１９６】
【表１５】
0003662948.tif 000016
配列番号：33
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０１９７】
【表１６】
0003662948.tif 000017
配列番号：34
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０１９８】
【表１７】
0003662948.tif 000018
配列番号：35
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０１９９】
【表１８】
0003662948.tif 000019
配列番号：36
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０２００】
【表１９】
0003662948.tif 000020
配列番号：37
配列の長さ：22アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０２０１】
【表２０】
0003662948.tif 000021
配列番号：38
配列の長さ：23アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０２０２】
【表２１】
0003662948.tif 000022
配列番号：39
配列の長さ：23アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【０２０３】
【表２２】
0003662948.tif 000023
配列番号：40
配列の長さ：25塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCAATTATGT GCATAGAGGA ATCCA                                   25
配列番号：41
配列の長さ：25塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GGTATTATGT GCATAGAGGA ATCCA                                   25
配列番号：42
配列の長さ：25塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
ATTATGTGCA TAGAGGAATC CAAAG                                    25
配列番号：43
配列の長さ：42塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GGTACCCGTC GTGCTAGCAT TTTACCGGAA GAATGGGTAC CA                   42
配列番号：44
配列の長さ：27塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCCGCTATTA TGTGCATAGA GGGATCC                                    27
配列番号：45
配列の長さ：4アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の特徴
特徴を表す記号：ペプチド
存在位置：1
他の情報：/ノート＝"位置1のＸaa＝(Ala/Val)"
配列の特徴
特徴を表す記号：ペプチド
存在位置：4
他の情報：/ノート＝"位置4のＸaa＝(Ser/Cys/Thr)"
配列
【０２０４】
【表２３】
0003662948.tif 000024
配列番号：46
配列の長さ：29塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GATCCCTCTA TGCACATAAT TCAGGCCTC                                29
配列番号：47
配列の長さ：29塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AATTGAGGCC TGAATTATGT GCATAGAGG                                 29
配列番号：48
配列の長さ：35塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GCTCGAGGCT AGCATTTTAC CGGAAGAATG GGTAC                           35
配列番号：49
配列の長さ：35塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCATTCTTCC GGTAAAATGC TAGCCTCGAG CGTAC                             35
配列番号：50
配列の長さ：25塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GATCCCTCTA TAAGCATAAT TCAGG                                        25
配列番号：51
配列の長さ：21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCTGAATTAT GCTTATAGAG G                                            21
配列番号：52
配列の長さ：24塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GATCCCTCTA TGCACTGAAT TCAGG                                       24
配列番号：53
配列の長さ：21塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCTGAATTCA GTGCATAGAG G                                           21
配列番号：54
配列の長さ：32塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
GTCAGGCCTC TCAGACAGTA CAGCTCGTAC AT                               32
配列番号：55
配列の長さ：6塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
AGGCCT                                                            6
配列番号：56
配列の長さ：35塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CCCCTGCAGT TAAAAGTAAT TGCTTTCCAA ATAAG                             35
配列番号：57
配列の長さ：6塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖
配列
CTGCAG                                                             6
【図面の簡単な説明】
【図１】目的のタンパク質スプライス部位のアミノ酸配列（配列番号:30，配列番号:31，配列番号:32，配列番号:33，配列番号:34，配列番号:36，配列番号:37，配列番号:38及び配列番号:39)を示す図である。アミノ末端(上)及びカルボキシ末端(下)スプライス部位は矢印で示されたスプライス部位で示され、保存された類似のアミノ酸はボックスで示されている。
【図２】β-ガラクトシダーゼ遺伝子のEcoRV部位へのIVPSの挿入を示す図である。Deep Vent IVPS１(CIVPS３)またはVent IVPS２(CIVPS２)のいずれかのPCR産物を、EcoRV消化pAHO５のAspとβ-ガラクトシダーゼのIIe残基との間に連結して、改質β-ガラクトシダーゼ産物を産生した。
【図３】改質β-ガラクトシダーゼのスプライシングにより活性β-ガラクトシダーゼが産生することを示すグラフである。42℃に於ける表示IVPS-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現する宿主由来の粗な抽出物のインキュベーションにより、経時的に酵素活性が増加するが、宿主(RR1)のみまたは未改質β-ガラクトシダーゼ構築物(pAHO５)との42℃に於けるインキュベーションでは、酵素活性は増加しないことを示す。
【図４】温度制御したタンパク質スプライシング実験結果を示すウエスタンブロットを示す。CIVPS２及びCIVPS３をβ-ガラクトシダーゼのEcoRVにクローン化した。CIVPSタンパク質(各々、I-TliI及びI-PspI)またはβ-ガラクトシダーゼに対する血清を用いる細胞抽出物のウエスタンブロット実験から、改質β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質(レーン１、４、７、10)を検出する。42℃(レーン２、５、８、11)または50℃(レーン12）に於ける抽出物の処理(６時間)から、遊離CIVPSタンパク質及び未改質β-ガラクトシダーゼがスプライシング及び産生する(残留セリンまたはトレオニン残基を除く。実施例２＆３参照)。pAHO５由来の未改質β-ガラクトシダーゼはレーン６である。レーン３＆９は、サイズマーカーを含む。
【図５】β-アガラーゼに対する血清を用いる細胞抽出物のウエスタンブロット実験により、改質β-アガラーゼ融合タンパク質の検出を示す図である。
レーン１＆４：サイズマーカー；
レーン２＆５：β-アガラーゼ標準；
レーン３：CIVPS２-β-アガラーゼ融合物；
レーン６：CIVPS３-β-アガラーゼ融合物。
【図６】サイレント突然変異によるIVPS内での新しい制限部位(BspEI及びSpeI)の作製によるIVPS２(CIVPS２)のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子への挿入を示す図である。
【図７】ターゲット遺伝子内のサイレント突然変異による新しい限部位(XbaI及びSalI)の作製によるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子へのDeep Vent IVPS１(CIVPS３)またはVent IVPS２(CIVPS２)のいずれかの挿入を示す図である。
【図８】  pANG５のプラスミドマップを示す図である。
【図９】  CIVPS２の上流スプライシング部位に於ける化学的ブロック化セリンのサプレッサーtRNA-媒介取り込みを示すSDS-PAGEのオートラジオグラムを示す図である。
【図１０】化学的ブロック化前駆体タンパク質の可視光照射により開始したCIVPS２のスプライシング反応を示すSDS-PAGEのオートラジオグラムを示す図である。
【図１１】温度制御したタンパク質スプライシング及び切断を示すゲルを示す図である。Deep Vent IVPS１(CIVPS３)カセットをβ-ガラクトシダーゼのEcoRV部位にクローン化した。ウエスタンブロット分析を使用して、pDV7(CIVPS３カセット、レーン1-3)、pDVC302(CIVPS３/Cys カセット、レーン4-6)、pDVT321(CIVPS３/Thrカセット、レーン7-9)及びpDVS712(CIVPS３/Serカセット、レーン10-12)の細胞抽出物を試験した。CIVPS３タンパク質(I-PspI)(NEB)に対する抗体で、融合タンパク質並びに、遊離CIVPS３、N-EPS-CIVPS３及びCIVPS３-C-EPS(スプライス部位の一つでの切断由来)の切断産生物を検出する。未処理抽出物は、レーン１、４、７及び10である。42℃(レーン２、５、８及び11)または65℃(レーン３、６、９及び12)に於ける抽出物の処理(２時間)により、種々の効率でスプライシング及び/または切断活性が増加した。
【図１２】温度制御したタンパク質スプライシング及び切断を示すウエスタンブロットを示す図である。I-PspI及びβ-ガラクトシダーゼ(C-EPSドメイン)(Promega)に対する抗体を使用するウエスタンブロット分析を使用して、pDVC302(レーン1-3)、pDVT321(レーン4-6)及びpDVS712(レーン7-9)の融合構築物を試験した。42℃(レーン２、５及び８)または65℃(レーン３、６及び９)での抽出物の処理(２時間)により、スプライシング(pDVS712)または切断した。pDVS712抽出物に於けるタンパク質スプライシングにより、遊離CIVPS３タンパク質、I-PspI及び未改質β-ガラクトシダーゼ(残留セリンを除く)が産生した。レーン１は、サイズマーカーを含む。
【図１３】クーマシーブルー染色及びイムノブロットにより調べたアミロース及びMonoQカラム上のMIP前駆体の精製を示す図である。部分ＡとＢとの間の図は、分枝状分子MIP＊を含む各バンドの提案構物を示す。黒塗りボックスはMBPドメインを示し、白抜きボックスはIVPSドメインを、灰色ボックスはパラミオシン△SaIドメインを示す。プラス(＋)は、サンプルが37℃で120分熱処理したことを、マイナス(−)はサン プルを熱処理しなかったことを示す。
部分Ａ：クーマシーブルー染色ゲル。全体：MIP培養物由来の粗な上清。F.T.：アミロース樹脂を素通り。アミロース溶離液(−)：アミロース樹脂で精製したMIP調製物。アミロース溶離液(＋)：レーン４のアミロース溶離液を37℃で120分処理して、スプライシングを誘導した。MonoＱ：MonoＱ精製サンプル。MonoＱ上でのクロマトグラフィー後、MBP-CIVPS３(MI)の回収率は多様であるが、通常低い。略号は以下の通りである。MIP＊：見かけの分子量180kDaの分枝状分子(moleculer mass branched molecule)；MIP：132kDa前駆体；単一スプライス部位切断産生物(MI,MBP-CIVPS３；IP，CIVPS３-パラミオシン △Sal；Ｍ，MBP)；及びスプライス化産生物(MP，MBP-パラミオシン △Sal及びI，CIVPS3＝PI-PspI)。
部分Ｂ：イムノブロット。部分Ａ由来のMonoＱサンプルを上記の如く熱処理し、三重に電気泳動させた。MIP-関連タンパク質は、抗-MBP血清、抗-パラミオシン血清及び抗-PI-PspI(抗-CIVPS３)血清との免疫反応により同定した。
【図１４】  MIP21融合物中の置換可能なスプライス部位カセットを示す図である。pMIP21は、各スプライス部位とフランキングする２個のユニークな制限部位を含む。スプライス部位は矢印で示されている。スプライス部位の周囲のアミノ酸残基が示されている。スプライス部位は、アミノ末端XhoI−KpnIカセットまたはカルボキシ末端BamHI-StuIカセットのいずれかを別のDNAカセットと置き換えることにより変更し得る。
【図１５】改質MIP融合物由来の単一スプライス部位での熱誘導可能な切断を示すゲル電気泳動図を示す。融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより精製した。
図１５のＡは、MIP23融合物由来のＣ-末端スプライス部位での切断を示す図である。精製融合タンパク質サンプルは、４℃、37℃、50℃または65℃で１時間インキュベートした。産生物を4/20% SDS-PAGE、次いでクーマシーブルー染色で分析した。MIP23融合タンパク質(MIP)由来のＣ-末端スプライス部位の切断から、MBP-CIVPS(MI)及びパラミオシン△SaI(PI)が産生した。
図１５のＢは、MIP28融合物由来のＮ-末端スプライス部位での切断を示す図である。精製タンパク質サンプルは、４℃、42℃、50℃または65℃で１時間インキュベートした。産生物を4/20% SDS-PAGE、次いでクーマシーブルー染色で分析した。MIP28融合タンパク質(MIP)由来のＮ-末端スプライス部位の切断から、MBP(Ｍ)及びCIVPS-パラミオシン△SaI(IP)が産生した。サイズ標準(キロダルトン)を左側に示した。
【図１６】  MIC融合物の熱誘導可能な切断を示すゲル電気泳動図を示す。精製融合タンパク質サンプルは、４℃、37℃、50℃または65℃で１時間インキュベートした。産生物を4/20% SDS-PAGE、次いでクーマシーブルー染色で分析した。MIC融合タンパク質(MIC)のインキュベーションから、連結産物、MBP-CBD(MC)及び切除産生物、Deep-Vent IVPS１(I=I-PspI)が産生した。切断産物、MBP-Deep-Vent IVPS１(MI)及びDeep-Vent IVPS１-CBD(IC)は、すべてのサンプル中に存在し、この熱処理では変化しない。
【図１】
0003662948.tif 000025
【図２】
0003662948.tif 000026
【図３】
0003662948.tif 000027
【図４】
0003662948.tif 000028
【図５】
0003662948.tif 000029
【図６】
0003662948.tif 000030
【図７】
0003662948.tif 000031
【図８】
0003662948.tif 000032
【図９】
0003662948.tif 000033
【図１０】
0003662948.tif 000034
【図１１】
0003662948.tif 000035
【図１２】
0003662948.tif 000036
【図１３】
0003662948.tif 000037
【図１４】
0003662948.tif 000038
【図１５】
0003662948.tif 000039
【図１６】
0003662948.tif 000040