(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上に一種以上の免疫活性物質が化学的又は物理的に担持され、更にその上に他の免疫活性物質及び／又は免疫反応に関与する成分が保護成分の共存下に被覆され、脱水乾燥されたことを特徴とする、多層被覆免疫反応試薬。
【請求項２】
免疫活性物質が抗原又は抗体である請求項１の多層被覆免疫反応試薬。
【請求項３】
免疫活性物質が検出可能な物質により標識された抗原又は抗体である請求項１の多層被覆免疫反応試薬。
【請求項４】
検出可能な物質が酵素、蛍光物質又は発光物質である、請求項３の多層被覆免疫反応試薬。
【請求項５】
保護成分が水溶性ゼラチンであることを特徴とする請求項１の多層被覆免疫反応試薬。
【請求項６】
担体が、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ナイロン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル又はこれらを主成分とする共重合体からなるポリマー粒子であることを特徴とする請求項１の多層被覆免疫反応試薬。
【請求項７】
担体が、磁性物質を含有する担体であることを特徴とする請求項１の多層被覆免疫反応試薬。
【請求項８】
担体上に一種以上の免疫活性物質が化学的又は物理的に担持され、更にその上に他の免疫活性物質及び／又は免疫反応に関与する成分を保護成分の共存下にスプレーコート又は粉体コートし、脱水乾燥することを特徴とする、多層被覆免疫反応試薬の製造方法。
【請求項９】
造粒乾燥装置を用いてスプレーコート又は粉体コートすることを特徴とする、請求項８の多層被覆免疫反応試薬の製造方法。
【請求項１０】
造粒乾燥装置を用いて脱水乾燥することを特徴とする、請求項８の多層被覆免疫反応試薬の製造方法。
【請求項１１】
造粒乾燥装置が転流動装置であることを特徴とする、請求項９又は１０の多層被覆免疫反応試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫活性物質が単層又は多層被覆された担体及びその製造方法に関するものである。更に詳しくは、免疫反応を利用して例えば人体の体液中の微量物質を定量的かつ選択的に測定する免疫学的診断方法に用いられる試薬及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清や尿等の生体試料に含まれる微量物質（例えば、インスリン、甲状腺刺激ホルモン等の甲状腺マ−カ−、ＩｇＥ、ＨＢｓＡｇ等の感染症マ−カ−、ＣＡ１９−９のような癌性糖鎖抗原等の癌マ−カ−等）を検出したり、その濃度を測定する方法として、従来より免疫測定法が広く用いられている。免疫測定法における抗原とそれに対応する抗体が結合する反応（抗原抗体反応）は極めて低濃度でも生じ、しかも特異性が高い。従って、この反応の特徴を生かすことで、抗原や抗体等の濃度測定が可能となる。抗原抗体反応を利用した免疫測定法として、これまで数多くの方法が開発されているが、中でも抗原か抗体のいずれか一方を検出可能な物質で標識（ラベル）して使用する標識免疫測定法が盛んに実施されている。
【０００３】
免疫測定法の中で現在最も普及しているのが、酵素を標識として用いた酵素免疫測定（Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  、以下ＥＩＡと略す）である。ＥＩＡは、例えばその代表的な例としてサンドイッチ法と呼ばれる方法について述べれば、まず第一抗体を担体（例えば磁性ビ−ズ）に結合させ、固相の状態（固定化抗体）に、他方、酵素と第二の抗体を結合させることによって酵素で標識した抗体（酵素標識抗体）を準備しておき、次にこれら固定化抗体及び標識抗体を含む溶液に、被測定物質即ち測定されるべき抗原を含む血清、尿等の試料を添加し、抗原抗体反応を生じさせ、この後、測定されるべき抗原を介して担体と結合した酵素標識抗体と結合していない酵素標識抗体を分離（Ｂ／Ｆ分離）し、担体上の酵素量を測定するのである。
【０００４】
この際使用される担体は、例えばセルロ−ス等のペ−パ−ディスク（特開昭６１−２１９８６３号公報参照）や毛細管含有多孔質（特開昭５９−９００５６号、特開昭６１−２２８３５４号公報参照）、更には磁気感応性担体等である。磁気感応性担体とは、例えば、球状化した熱可塑性樹脂の表面に一般に磁性体と呼ばれるフェライト等の磁気応答性粉体を担持させ、その表面をポリマ−で被覆したもの（特開昭６１−１６７８６６号公報参照）であるが、磁気感応性担体を使用した場合には、振動磁界を作用させて反応液を攪拌し、測定感度を高めることが可能である。
【０００５】
担体上に抗体や抗原を固定化する方法としては、カップリング剤を用いた化学結合による方法や各種物理吸着による方法が一般的であり、このようにして担体上に固定化した抗体等と酵素等を結合させた標識抗体と共に適当な反応容器に添加した後、製剤化することで免疫反応試薬は製造されている。
【０００６】
ところで、免疫測定に必要な成分、例えば抗体や抗原を固定化した担体と標識抗体又は標識抗原等を含む溶液は、溶液状態のままでは一般的に保存安定性が悪く、溶液状態では製剤とは成り得ないため、その保存安定化のために脱水乾燥するのが一般的である。脱水乾燥には種々の方法があるが、従来は真空凍結乾燥法が最も安全で優れた方法とされてきた。
【０００７】
このような例として、例えばモノクロ−ナル抗体とゼラチン等を含有する溶液を真空凍結乾燥することによって抗原結合活性を保持した安定な製剤を製造する技術（特開平５−６５２３３  号公報参照）や、ＥＩＡ用の試薬をゼラチンより成る成型用キャリヤ−マトリクックス内に内封させ凍結乾燥する技術（特表平  ７−５００４１７  号公報参照）等が知られている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、真空凍結乾燥法は製造コストが高くなり、また真空凍結乾燥工程がバッチ処理のためスケ−ルアップが難しく、凍結乾燥機を含めた大規模な製造施設が必要となり、更に真空凍結乾燥の対象となる溶液を容器へ分注し、凍結し、真空乾燥し、室温へ復帰させ、真空状態を解除する等の一連の製造工程に時間がかかる等の理由から、大量生産には不向きである、等の課題がある。
【０００９】
また、このような試薬を免疫測定装置で使用するには、いわゆるオールインワンタイプと呼ばれる、反応容器に試料を添加するのみで免疫反応を生じさせることができるよう、反応に必要な成分の全てが製剤化されており、脱水乾燥された成分に緩衝液等を添加し復水した後、被検液を添加し反応を起こさせるのが好ましい。
【００１０】
オールインワンタイプの試薬は、必要成分を溶液状態で１つの反応容器に分注し真空凍結対象物とすることで製造し得るが、溶液中に混在する各種必要成分同士が互いに接触、混合したままの状態で製剤化されることになる。このため、真空凍結乾燥工程中、最初の凍結工程で溶液の局所濃縮は完全には避けられず、接触して存在する各種必要成分同士が作用し合って試薬性能に悪影響する場合もある。即ち、抗原又は抗体を固定化した担体に対し、酵素標識抗体等の非特異的な吸着が起こり、測定の際のバックグランドの上昇による感度悪化が起こったり、標識酵素部分と他の成分が相互作用することにより、酵素活性、即ちレスポンスの低下を招き、保存安定性に支障が出る場合もある。
【００１１】
これを回避するために、各成分同士の接触をなるべく減らす手段として、各成分溶液毎に分注後、凍結して、その上にさらに次の成分溶液を分注する、いわゆる多段分注を用いる製法もあるが、製造工程が複雑になり、時間を要することから実用的ではない。他にも、真空凍結乾燥するために容器に固定化担体を含む溶液等を分注する工程は、一般に長時間を要し、生産効率を高めるのが難しいという課題がある。
【００１２】
以上のような真空凍結乾燥法とは別に、固相化された試薬の安定剤として牛血清アルブミンなどを用いて、抗原や抗体を結合させた担体から成る試薬を自然乾燥、通気乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等によって製剤化する方法が提案されている（特公平５−６６９８５号公報参照）。
【００１３】
この方法は、抗体や抗原を固定化した担体だけを脱水乾燥し、安定化させるというものであり、免疫測定装置で使用するのに好適なオールインワンタイプの試薬を提供し得ないという課題がある。また、この方法に類似した方法として、担体上に固定化された免疫活性物質（抗体や抗原）を、安定化剤として糖類（乳糖、ショ糖、デキストリン等）及び蛋白質（ウシ血清アルブミン、水溶性ゼラチン等）を含む溶液中に浸漬し、次いでこれを自然乾燥する方法（特公平５−４１９４６号公報参照）や、磁性粒子（特開平３−１１５８６２号等参照）に結合させた抗原や抗体を含む免疫反応用の試薬溶液中に、ゼラチンを存在させることにより安定保存を可能にする方法（特開平５−１８０８３６号公報参照）等も知られているが、これらの方法も固定化された試薬部分のみの安定化に関するものである。
【００１４】
前記、ゼラチンを存在させることにより安定保存を可能にする方法では試薬が溶液状態のため凍結して保存する必要があり、また試薬を使用する際に、凍結物の解凍・融解操作等が必要になるなどの実用上の課題がある。
【００１５】
マイクロプレ−ト等の担体に抗体等を固定化した後、保護剤としての各種アルブミンやゼラチン含有水溶液で処理し乾燥させる方法（特開昭５９−２０６７６１号、特開昭６１−２４１６６５号公報参照）や診断試験用スライドに感作ラテックス粒子を含むコラ−ゲン分解物、糖類溶液を付着させた後、室温で自然乾燥する方法（特開平１−１１４７５７号公報）も知られているが、上記同様に免疫反応試薬の一部分を乾燥させ安定化しただけであり、その他の必要成分についてはなおも課題が残されていた。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
かかる現状を鑑み、本発明者らは、担体、特に磁性粒子などを用いる免疫反応試薬の製剤化について鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。本発明は、一種又は二種以上の免疫活性物質及び／又は免疫反応に関与する成分をゼラチン等を主成分とする保護成分の共存下、担体上に単層又は多層被覆し、脱水乾燥したことを特徴する免疫反応試薬である。また本発明は、一種又は二種以上の免疫活性物質及び／又は免疫反応に関与する成分をゼラチン等を主成分とする保護成分の共存下、担体上に単層又は多層被覆し、脱水乾燥することを特徴する免疫反応試薬の製造法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、免疫反応試薬として必要な成分を、担体上に、できるだけ成分同士が互いに接触しない状態で被覆し、更に真空凍結乾燥機を用いずに、大量かつ迅速に脱水乾燥することによって試薬性能を良好に保持したまま保存安定化するものである。
【００１８】
従って本発明によれば、この必要成分を担体上に保存安定化させ、この担体を、乾燥状態で反応容器に迅速簡便に分注することによって最終試薬形態としての製剤化を容易に可能にすることができ、これにより、短時間で大量安価な試薬製造が可能となり、さらに凍結保存不要で、室温または冷蔵で長期保存が可能な安定性に優れた試薬が提供できる。
【００１９】
本発明は、例えば、磁性粒子等の担体表面に、抗体、抗原又はレクチンを固定化し、通常のブロッキング処理を行い、ゼラチン等を主成分とする保護液に浸漬し、必要に応じて余分な保護液を除去した後、当該単一層で被覆された担体を造粒機を用いる等して乾燥空気等を給気しながら遠心流動させて脱水乾燥させるものである。そして本発明では、その後さらに、ゼラチン等を主成分とする保護液に溶解した、酵素標識抗体等の免疫反応に必要なその他の活性成分や無機塩等の免疫反応に関与する成分を、順次、当該担体上にスプレ−コ−トすることによって多層被覆すると同時に前記同様にして脱水乾燥することができる。なおこの場合、各成分同士の接触を避けるため、必要に応じて各成分層の間に隔膜となる層を形成することも可能である。
【００２０】
ここで無機塩等、粉体として取り扱うことのできる免疫反応に関与する成分は、微粉末化した後、適当なバインダ−を使用することにより、上記同様にして、多層被覆した固定化用担体上に更に粉体コ−トして被覆することができる。バインダ−としては、ゼラチンやハイドロキシプロピルセルロ−ス（ＨＰＣ）を例示することができる。また本発明では、単に無機塩等の免疫反応に関与する成分の単一層で担体を被覆したり、このような免疫反応に関与する成分と免疫活性成分或いは二種以上の免疫反応に関与する成分で担体を多層被覆したりすることができる。
【００２１】
このようにして調製した免疫反応試薬は、磁性粒子等の担体の表面に、例えば、免疫反応に必要な成分が固定化され、更にその上に他の成分が被覆された多層被覆した担体となる。このように本発明の担体は、その上に抗体や標識抗体などの免疫反応に必要な免疫活性物質の全てが被覆（固定化及び／又は被覆）されていることから、必要な数の担体を適当な大きさのプラスチックカップ等の反応容器中に入れて密封等するだけで、必要成分が１個のカップ内に入った、オールインワンタイプの免疫反応試薬を提供することができる。この作業は、脱水乾燥状態のビーズを、その乾燥状態を維持したままカップ中に分注する装置（乾式分注機）により、迅速・簡便に最終試薬形態にすることができ、短時間で大量に試薬製造を行うことができる。
【００２２】
本発明で使用する担体は、ガラス、シリカ等の無機物質から成る粒子、各種合成高分子化合物から成るプラスチック粒子、セルロ−ス誘導体の粒子等、免疫測定に用いられる担体であればいかなるものであっても制限無く使用できるが、特に球状の担体が好ましい。例えばポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ナイロン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル又はこれらを主成分とする共重合体等若しくは混合物等の、熱可塑性樹脂製の担体が例示できる。担体の平均粒径についても特に制限は無いが、例えば０．１  〜２０ｍｍ程度ものを使用することが例示できる。
【００２３】
本発明では、特に、磁気感応成分を含有する担体が好ましい担体として例示できる。担持される磁気感応性成分としては、例えばマンガン・亜鉛フェライト等の、いわゆるソフトフェライトや四酸価鉄を主成分とするマグネタイト等が例示でき、その粒径は０．０１〜１０μｍ程度の粉体を用いることができる。これら磁気感応性成分は、前述の熱可塑性樹脂から成る担体の作製時に混合して内部に含有させるか、あるいは表面に担持させる等すれば良く、表面に担持させる方法としては吸着による方法、熱融着による方法等を例示することができる。
【００２４】
磁気感応性粉体の担体への含有量（担持量）は、担体流動のために作用させる磁界の強度、担体の流動性の程度により適宜決定することができるが、一般的にはビ−ズ重量の１％〜８０％、好ましくは５〜４０％程度である。
【００２５】
なお本発明では、単なる鉄やステンレスのボ−ルのようなものを担体自体、又は担体の核として用いることもできる。
【００２６】
本発明の担体は、前述のように、免疫活性成分を化学的又は物理的に固定化したものであることができる。担体上に免疫活性成分、即ち抗体、抗原又はレクチンを固定化する方法としては、具体的に、各種物理吸着による方法やカップリング剤等を用いる化学結合による方法等を利用できる（生化学実験法１１、東京化学同人（１９８９）１９６〜２５１頁）。特に好ましくは、担体の表面に化学蒸着法等によりポリパラキシリレン膜を形成させ（特開平２−１４７８６１号公報参照）、この膜表面に他の化学的処理を行うことなく抗原、抗体又はレクチンを吸着固定化し、表面の未吸着領域をウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）等で塞ぐこと（以下「ブロッキング」という）により担体への非特異的吸着を十分に抑えた担体を用いることができる。
【００２７】
このようにして調製された担体を、ゼラチン等を主成分とした、安定化のための保護液に浸漬し、その後、必要に応じて余分に付着したゼラチン保護液等を遠心脱水、吸引濾過等の適当な手段により除去し、遠心流動方式の、いわゆる造粒機を用いて脱水乾燥する。ここで、付着した余分な保護液を遠心脱水、吸引濾過等の適当な手段を用いて除去することは、以後の造粒乾燥装置を用いた脱水乾燥工程において担体同士の凝集等を防止し、円滑に脱水乾燥を行うために好ましい。
【００２８】
安定化のための保護液にゼラチンを用いる場合、アルカリ処理ゼラチン又は酸処理ゼラチンが好ましい。またゼラチンを主成分とする保護液は、脱水乾燥した試薬を復水する際、速やかに再溶解し、免疫反応に影響を与えないことが好ましいため、水に対する溶解性に優れた水溶性ゼラチンが特に好ましい。
【００２９】
水溶性ゼラチンは、コラ−ゲンを部分加水分解処理し、必要に応じて精製して得ることができる。本発明で使用するゼラチンの濃度は０．５  〜３０  ｗ／ｖ％が好ましいが、保護作用や経済性の面から５  〜１５  ｗ／ｖ％が特に好ましい。なお本発明においては、必要に応じてゼラチンと塩類、緩衝剤、アミノ酸類、糖類、ＢＳＡ等の蛋白成分など他の物質を併用することができる。またこれらは、好ましくは中性付近にｐＨ調整された緩衝液であることが好ましく、防腐剤としてアジ化ナトリウム等を適量含有しても良い。なお、酵素標識した抗体又は抗原を免疫活性物質として含有させる場合であって、当該酵素の活性発現にＭｇ２＋やＺｎ２＋などが必要となる場合には、これらの塩、例えば塩化マグネシウムや塩化亜鉛等を適量含有していても良い。ここで標識酵素は、例えばアルカリフォスファタ−ゼ（ウシ小腸由来）、ペルオキシダ−ゼ（西洋ワサビ由来）、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ（大腸菌由来）等、通常の酵素免疫測定法に用いられるものであれば特に制限はない。また、標識用の発光物質としてはアクリジニウム誘導体系の化学発光物質等、発光免疫測定に用いられるものであれば制限はない。
【００３０】
本発明で用いる免疫活性物質中、抗原又は抗体は、測定されるべき対象物により適宜選択される。抗原としては例えば、尿や血清等から分離抽出されたホルモン等であり、更にはその分解物やその成分の合成ポリペプチド等である。抗体としては例えば、ハイブリド−マを用いて細胞培養やマウス腹水から採取したモノクロ−ナル抗体や、抗原を各種動物に感作して得られる抗血清を精製したポリクロ−ナル抗体又は遺伝子組換え生物に産生させた抗体等であり、更にそれらを酵素分解したＦ（ａｂ´）２  、Ｆａｂ´、Ｆａｂ等である。
【００３１】
抗原を用いるか抗体を用いるかは、本発明の免疫反応用試薬をどのような測定系で用いるかにより適宜決定される。即ち、いわゆるサンドイッチ法を採用した抗原の測定用試薬であれば、免疫活性物質としては当該抗原に対する固定化抗体と標識抗体等が例示でき、いわゆる競合法を採用した抗原の測定用試薬であれば、免疫活性物質としては当該抗原に対する固定化抗体と標識した当該抗原等が例示できる。
【００３２】
本発明で使用する造粒乾燥装置は、いわゆる転流動装置であり、市販の、例えばニュ−／マルメライザ−（不二パウダル（株）製）やグラニュレックス（フロイント産業（株）製）等の装置を用いることができる。
【００３３】
造粒乾燥装置に担体を投入し、ビ−ズが遠心流動状態なるような適当な回転速度でスリット板を回転させる場合、必要に応じて攪拌羽を組み合わせて回転させ、給気しながら脱水乾燥を行うと効率的である。給気は乾燥空気が良いが、乾燥空気の相対湿度は好ましくは６５％以下、より好ましくは２５％以下である。また、空気に代えて、窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス、若しくはこれらの混合ガスを用いることも可能である。給気量は造粒機に入れたビ−ズの量や給気するガスの相対湿度、攪拌羽の回転速度、排気量等の諸条件によって適宜決定すれば良いが、０．５  ｍ３  〜５  ｍ３  ／分程度が好ましい。また、給気するガスの温度は４  〜６０℃、好ましくは３５℃以下が良い。
【００３４】
上述のようにして調製した、免疫活性物質又は免疫反応に関与する成分が被覆された担体上への、更なる他の免疫活性物質や免疫反応に関与する成分の被覆は、上記同様の造粒機を用いてスプレ−コ−トするか、又は粉体コ−トすることにより行えば良い。スプレ−コ−トする場合には、コ−トするための対象物である、例えば酵素標識抗体等を上記同様のゼラチンを主成分とする保護液中に入れ、空気または不活性ガス、若しくはそれらの混合ガスを用いて造粒機中で遠心流動している上記担体に対してスプレー（噴霧）することで行えば良い。スプレー速度等の条件は、装置の種類、調製規模や諸条件によって適宜決定すれば良いが、例えばスプレ−速度はビ−ズ１ｋｇ当たり２  〜１０ｍｌ／分であり、スプレ−する液量はビ−ズ１ｋｇ当たり３０〜３００  ｍｌ程度が好ましい。
【００３５】
スプレ−する液の組成は免疫活性物質を含有した水溶性ゼラチン等であるが、必要に応じてその他の成分を含有する溶液を使用することもできる。また例えば、抗体を固相化した担体の上に水溶性ゼラチン１  〜３０ｗ／ｖ  ％含有水溶液をスプレ−コ−トしてゼラチン保護膜を増加させ、その上にＢＳＡ１  〜１０  ｗ／ｖ％及びゼラチン１  〜１０％ｗ／ｖ  ％含有水溶液をスプレ−コ−トし、更にその上に例えば酵素標識抗体をスプレーコートする等により、第一抗体を固定化した部分と標識した第二抗体をコ−トした層との間にＢＳＡ含有層を形成させることもできる。
【００３６】
必要に応じて、上述のごとく固定化抗体及び標識された第二抗体で多層被覆した担体の上に、更に検体中の血清成分による測定妨害を低減するための各種成分を含有した溶液をスプレ−コ−トしたり、検体中の血清成分の免疫測定への影響を低減するための無機塩、例えば塩化ナトリウム等を適量粉体コ−トすることが例示できる。また、免疫測定に必要な成分で被覆した抗体表面を免疫測定に影響しない成分で更に被覆することも可能である。これは、最外殻に保護膜を形成させ、内部保護や相互汚染を防止するために効果的である。
【００３７】
粉体コ−トは、まず無機塩を数〜数十ミクロン程度の粒子径に微粉末化し、水溶性ゼラチン５  〜２０ｗ／ｖ  ％含有水溶液等をバインダ−として担体上に表面にスプレ−しながら微粉末化無機塩を添加（パウダ−フィ−ド）することにより実施できる。
【００３８】
以上のようして調製した担体は、例えば密閉性があり吸湿することがない適当なプラスチック製カップ等の反応容器に適当数を入れ、乾燥空気中でシ−ルすれば長期保存可能な製剤化が可能である。その使用時には、サンドイッチ法の場合、カップのシ−ルを破り、希釈溶液を用いて適当に希釈された検体（患者血清や尿など）を一定量、カップ内に注入し、例えば、通常３７℃±１  ℃の恒温環境下、カップ内の液を攪拌しながら一定時間反応させ、Ｂ／Ｆ分離のための洗浄操作を行い、例えば、アルカリフォスファタ−ゼで酵素を標識として使用した場合には発色基質である４−メチルウムベリフェリルフォスフェ−ト等の蛍光基質の溶液を分注し、蛍光量の経時変化を測定し、既知濃度の検量線と比較することで検体中の測定対象物の濃度を検出し診断することになる。
【００３９】
本発明の担体は、担体上に多層被覆する場合、各被覆段階での中間製造物が脱水乾燥され安定化されているためバルクとして管理が可能であり、製造を断続的に行うことが可能で、製造プロセスを容易にできる。また本発明の担体は、プラスチック製カップ等に乾燥した状態でスピ−ディに分注することができるため、湿式分注に比べ分注速度ははるかに大きく、大量製造に適する。このカップを乾燥空気中などでシ−ルするだけで、真空凍結乾燥法によらない風乾方式による製剤化、即ちカップ試薬の製造が可能である。
【００４０】
担体そのものがバルク試薬として脱水乾燥され保存安定化しているため、乾式分注し、カップシ−ルする装置さえあれば、時と場所を選ばずにオールインワンタイプの製剤を製造することが可能である。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の免疫反応用試薬及びその製造方法は、以下の如き効果を有する。（１）本発明では、抗体又は抗原を固定化した担体を、抗原又は抗体結合活性を安定に保持した状態で真空凍結乾燥機を用いることなく迅速・簡便に脱水乾燥し保存安定化できる。（２）本発明では、担体に固定化した免疫活性物質のみならず、免疫反応試薬として必要な他の成分（例えば標識抗体又は標識抗原）や免疫反応に関与する成分を、上記（１）の乾燥物と同一容器中に、抗原又は抗体結合活性を安定に保持した状態で真空凍結乾燥機を用いずに迅速・簡便に脱水乾燥し保存安定化できる。（３）本発明では、免疫反応試薬として必要な各成分を、互いに非接触状態で脱水乾燥できるため、標識酵素された抗体等の担体への非特異的吸着等が原因となるバックグランド上昇による測定感度の悪化や当該抗体と他の成分との相互作用による酵素活性、即ち、レスポンスの低下等を防ぐことができる。（４）本発明では、真空凍結乾燥機ではなく造粒乾燥装置を用いる試薬製造であるため試薬製造のスケ−ルアップが容易であり、小規模施設で簡単、短時間且つ低コストで性能が均一な試薬を大量生産できる。（５）本発明では、必要成分が全て脱水乾燥され、反応容器に安定化した状態で封入されているため、凍結保存等の必要がなく、使用する際に解凍作業が不要で室温での流通をも可能となる。（６）本発明では、免疫測定装置にセットする反応容器等に必要成分の全てを封入されたオールインワンタイプの試薬を供給できる。（７）本発明では、オールインワンタイプの試薬であれば、免疫測定装置等を用いて測定する場合に、溶解液や被検液を添加することにより担体に被覆された成分等が速やかに復水し、溶液状態に戻り、免疫反応を良好に行うことができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  （担体の製造）
エチレン−酢酸ビニル共重合体（東ソ−（株）製）に平均粒子径約０．２  ミクロンの四三酸化鉄を成分とするマグネタイト（チタン工業（株）製）を１２ｗ／ｗ  ％の割合で均一に練り込み、ペレットにした後、球状化して平均粒径１．５  ｍｍの磁気感応性物質を含有した球状担体を製造した。
【００４４】
この担体３  ｋｇに、真空蒸着装置（パラテックコ−ティング社製）を用いてジクロロパラキシリレン（第三化成（株）製）６０ｇを化学蒸着した。以下、このようにして作製した厚さ約５  ミクロンのポリモノクロロパラキシリレンのコ−ティング膜層を有する球状担体を用いて実験を行った。
【００４５】
（担体への抗体の固定化）
前記担体約１０万個を３５０  ｍｌの２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０  ）に懸濁し、抗ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）モノクロ−ナル抗体を２５ｍｇを加え、２５℃で３  時間振盪した。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）で３  回洗浄した後、１ｗ／ｖ％牛血清アルブミン含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）中に５３℃で１６時間懸濁し、ブロッキングを行った。
【００４６】
（造粒乾燥装置を用いた本発明の担体の製造）
ブロッキングした担体約１０万個を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）で３  回洗浄した後、１０ｗ／ｖ  ％ゼラチン溶液（ｐＨ７．０  ）（新田ゼラチン（株）製の水溶性ゼラチン  Ｔｙｐｅ  Ｕ  を使用）に浸漬し、２５℃で３０分間静置後、遠心脱水した。このゼラチン処理した担体を造粒乾燥装置（不二パウダル（株）製ＮＱ−ＬＡＢＯ）を用いて脱水乾燥した。脱水乾燥の操作は、送風温度３２〜３５℃、送風速度０．５  ｍ３  ／分、スリット回転板の回転速度２００  ｒｐｍ、排気による造粒乾燥ケ−スの内部圧  −３０ｍｍＨ２  Ｏで５  分間である。
【００４７】
脱水乾燥した担体に、更にゼラチンコ−トを行うために２５ｗ／ｖ  ％ゼラチン溶液をスプレ−コ−トし、脱水乾燥を約２  分間行った。スプレ−操作は、ゼラチン溶液１５ｍｌをスプレ−速度０．５  ｍｌ／分で約３０分間行った。その他、造粒乾燥装置の操作条件はスリット回転板の回転速度を３００  ｒｐｍに変更した以外は上記脱水乾燥と同様である。このようにしてゼラチンコ−トした担体にＢＳＡ含有溶液をスプレ−コ−トした後、脱水乾燥を約２  分間行った。スプレ−操作は７ｗ／ｖ％ＢＳＡ含有１ｗ／ｖ％ゼラチン溶液（ｐＨ７．０  ）１２ｍｌをスプレ−速度０．５  ｍｌ／分で約２４分間行った。造粒乾燥装置の操作条件は、送風温度２４〜２７℃、送風速度０．５  ｍ３  ／分、スリット回転板の回転速度３００  ｒｐｍ、排気による造粒乾燥ケ−スの内部圧は  −３０ｍｍＨ２  Ｏである。
【００４８】
ＢＳＡ含有層を被覆した担体内、約９  万個に酵素標識抗体である、先に担体に固相化した抗体とは異なるエピト−プを認識する抗ＴＳＨモノクロ−ナル抗体−アルカリフォスファタ−ゼ結合体（アルカリフォスファタ−ゼ標識抗ＴＳＨモノクロ−ナル抗体）を含有するゼラチン溶液をスプレ−コ−トした。この操作は濃度１００  ｍＡ（波長２８０  ｎｍにおける吸光度が０．１  に相当する濃度）のアルカリフォスファタ−ゼ標識抗ＴＳＨモノクロ−ナル抗体及び７５ｍＭの塩化マグネシウム、２．５  ｍＭの塩化亜鉛を含有した１２．５ｗ／ｖ  ％ゼラチン溶液（ｐＨ７．０  ）１５ｍｌをスプレ−速度０．５  ｍｌ／分で約３０分間行った。その他、造粒乾燥装置の操作条件は、上記ＢＳＡ含有層形成時と同様であった。
【００４９】
（ＴＳＨの酵素免疫測定）
前記のようにして製造した担体の１２個を、予め、塩化ナトリウム２  ｍｇ、塩化マグネシウム１５０  ｎｍｏｌｅ、塩化亜鉛５  ｎｍｏｌｅを添加しておいた直径１０ｍｍ、高さ２０ｍｍのポリプロピレン製カップに入れ、これに既知濃度のＴＳＨを含む標準血清溶液  １００μｌと０．０１（ｗ／ｖ）％トリトンＸ１００  （Ｔｒｉｔｏｎ  ＸＸ−１００  ）５０μｌとを混合した液を１カップ当たり１５０  μｌ分注し、マグネチックスタ−ラ−を用いて３７℃で４０分間、担体を攪拌させながら反応させた。
【００５０】
反応液を除去した後、０．０４（ｗ／ｖ）％ツィ−ン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）と０．０１  （ｗ／ｖ）％トリトンＸ１００  とを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．０  ）で１０回洗浄した後、アルカリフォスファタ−ゼの基質溶液である１  ｍＭの４−メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）溶液（ｐＨ１０．０）を２２０  μｌを添加し、３７℃で反応させた。
【００５１】
基質溶液添加１０秒後から１００  秒間の、酵素による４ＭＵＰの加水分解生成物  （４ＭＵ）の生成速度（レ−ト）を励起波長３６０  ｎｍ、蛍光波長４５０  ｎｍで測定した。結果を第１図に示す。
【００５２】
図１から、本発明の担体を用いることで感度の高い免疫測定を実施できることが分かる。ちなみに図１においてｙ切片とその２ＳＤ（標準偏差）から計算されるＴＳＨの最小検出感度は０．００５  μＩＵ／ｍｌであった。
【００５３】
実施例  ２
実施例１のようにして製造した担体の１２個を、予め塩化ナトリウム２  ｍｇ、塩化マグネシウム１５０  ｎｍｏｌｅ、塩化亜鉛５  ｎｍｏｌｅを加えて乾燥させておいた直径１０ｍｍ、高さ２０ｍｍのポリプロピレン製カップに入れ、乾燥空気中でシ−ルして密閉した。
【００５４】
この密閉したカップを恒温インキュベ−タ−に入れ、４０℃で７  日間の加速劣化（苛酷）試験を行った（この試験は通常、冷蔵状態で約１年以上の保存に相当することを意味する）。また、同時に比較として４  ℃での同様の保存安定性試験を行った。評価は一定量（５０μＩＵ／ｍｌ）のＴＳＨを含有する標準ヒト血清を用いて実施例１と同様にして行った。冷蔵（４  ℃）保存した場合を対照とし、保存経過日数０  日目の測定値を１００  として、それに対する４０℃で７  日間保存した場合等の測定値の百分率（％）で残存力価（抗体活性保持率）（％）を算出した。
【００５５】
結果を表１に示す。なお、残存力価（％）は次式を用いて計算した。
残存力価（％）＝７  日目のレ−ト／０  日目のレ−ト×１００
ここで保存温度４  ℃で０  日目のレ−トと保存温度４０℃で０  日目のレ−トは同じであった。また、ＴＳＨを含まない標準血清溶液について上記と同様の方法で測定し、評価した。その結果、４０℃、一週間の加速劣化（苛酷）試験後も保存経過日数０  日目と比較してレ−トの増加は見られず、バックグランドは変化がなく安定しており、酵素標識抗体の担体への非特異的吸着の増加等は観察されなかった。
【００５６】
【表１】
0003624543.tif 000002
【００５７】
実施例  ３
実施例１と同様に抗体を固相化しＢＳＡでブロッキングした担体約９  万個を、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）で３  回洗浄した後、１０ｗ／ｖ％ゼラチン溶液  （ｐＨ７．０  ）に浸漬処理し、遠心脱水した後、造粒乾燥装置を用いて脱水乾燥した。脱水乾燥の条件は、送風温度２６〜３２℃、送風速度０．５  ｍ３  ／分、スリット回転板の回転速度３００  ｒｐｍ、排気による造粒乾燥ケ−スの内部圧力は−１００ｍｍＨ２  Ｏで１５分間である。
【００５８】
脱水乾燥した担体にＢＳＡ含有溶液をスプレ−コ−トした。スプレ−操作は７ｗ／ｖ％ＢＳＡ及び１ｗ／ｖ％ゼラチン含有５  ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）１５ｍｌをスプレ−速度０．５  ｍｌ／分、送風温度２６〜３２℃、送風速度０．５  ｍ３      ／分、スリット回転板の回転速度３００  ｒｐｍ、排気による造粒乾燥ケ−スの内部圧力は−１００ｍｍＨ２  Ｏである。スプレ−終了後、引き続き脱水乾燥を約２  分間行った。
【００５９】
ＢＳＡ層を被覆した担体にアルカリフォスファタ−ゼ標識抗ＴＳＨモノクロ−ナル抗体を含有したゼラチン溶液をスプレ−コ−トした。この操作は、波長２８０  ｎｍにおける吸光度が０．１  に相当する濃度のアルカリフォスファタ−ゼ標識抗ＴＳＨモノクロ−ナル抗体及び０．１  Ｍの塩化マグネシウム、８ｗ／ｖ％ゼラチン、２．５ｗ／ｖ％ポリエチレングリコ−ル４０００を含有した０．４  Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）１５ｍｌをスプレ−速度０．５  ｍｌ／分、送風温度２６〜３２℃、送風速度０．５  ｍ３  ／分、スリット回転板の回転速度３００  ｒｐｍ、排気による造粒乾燥ケ−スの内部圧力は−１００ｍｍＨ２  Ｏの条件で行った。スプレ−後、引き続き脱水乾燥を２  分間行った。  酵素標識抗体をコ−トした担体に隔膜層を形成させるためにゼラチン溶液のスプレ−コ−トした。この操作は２０ｗ／ｖ  ％ゼラチン含有０．１  Ｍトリス塩酸緩衝液  （ｐＨ８．０  ）２１ｍｌをスプレ−速度０．５  ｍｌ／分、送風温度２６〜３２℃、送風速度０．５  ｍ３  ／分、スリット回転板の回転速度３００  ｒｐｍ、排気による造粒乾燥ケ−スの内部圧力は−１００ｍｍＨ２  Ｏの条件で行った。スプレ−後、引き続き脱水乾燥を３  分間行った。
【００６０】
隔膜層を形成させた担体に無機塩成分としての塩化ナトリウム微粉末（平均粒子径約４５ミクロン）を粉体コ−トした。この操作はバインダ−として２０ｗ／ｖ  ％ゼラチン含有０．１  Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０  ）をスプレ−速度３．６  ｍｌ／分で上記担体ビ−ズにスプレ−しながら、塩化ナトリウム微粉末１３ｇを約５  分間かけて逐次添加しながら行った。造粒乾燥装置の条件は上記隔膜層形成時と同様であった。
【００６１】
実施例  ４
実施例３のようにして製造した担体を１２個ずつ、直径１０ｍｍ、高さ２０ｍｍのポリプロピレン製カップに入れ、乾燥空気中でシ−ルすることにより密閉し、実施例２と同様にそれぞれ４  ℃と４０℃の温度で７  日間保存した。
【００６２】
結果を表２に示す。その結果、４０℃、７  日間保存した後でもバックグランドの増加がなく、保存安定性に優れていることが分かる。
【００６３】
【表２】
0003624543.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１で製造した本発明の担体を用いてＴＳＨの酵素免疫測定を行った時の、ＴＳＨ濃度とレ−ト（４ＭＵの生成速度）の関係を示した図である。
【図１】
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