(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡサンプルのターゲット配列内の少なくとも１つの鎖にハイブリダイズする１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して複製しかつ該複製に引き続き前記ターゲットを検出することを含むＤＮＡサンプル内のターゲットＤＮＡ配列を複製及び検出する方法において、該複製法を行う前に、
（ａ）ＤＮＡサンプルを少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと、ジデオキシヌクレオシドをＤＮＡサンプル内のＤＮＡの３′末端に共役結合させるために充分な温度及び時間接触させ、かつ
（ｂ）処理したＤＮＡサンプルを少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼから分離する
ことを特徴とする、ＤＮＡサンプル内のターゲットＤＮＡ配列を複製および検出する方法。
【請求項２】
ＤＮＡサンプルが３７℃以上の高めた温度に曝した組織又は細胞培養内に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（a）の前に、ＤＮＡサンプルを固定し、パラフィン化し、次に解パラフィン化する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（a）の間に、ＤＮＡサンプルを２種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
工程（a）の間に、ＤＮＡサンプルを４種の異なるジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡサンプルの反対の鎖及びターゲットＤＮＡ配列の側面にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、アニーリング／伸長及び変性ステップの間のサーマル・サイクリングによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法及び該増幅後にターゲット配列の検出を行うことを含む二本鎖ＤＮＡサンプル内のターゲット配列を増幅及び検出する方法において、増幅法を行う前に
（ａ）ＤＮＡサンプルを少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと、ジデオキシヌクレオシドをＤＮＡサンプル内のＤＮＡの３′末端に共役結合させるために充分な温度及び時間接触させ、次に
（ｂ）処理したＤＮＡサンプルを少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼから分離する
ことを特徴とする、二本鎖ＤＮＡサンプル内のターゲット配列を増幅及び検出する方法。
【請求項７】
ＤＮＡサンプルが３７℃以上の高めた温度に曝した組織又は細胞培養内に存在する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（a）の前に、ＤＮＡサンプルを固定し、パラフィン化し、次に解パラフィン化する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
工程（a）の間に、ＤＮＡサンプルを２種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
工程（a）の間に、ＤＮＡサンプルを４種の異なるジデオキシヌクレオシド三リン酸と接触させる、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本願の発明は、ＤＮＡ複製／検出アッセイ、特に直接的in situ ＰＣＲ増幅／検出アッセイにおけるバックグラウンド信号を減少させる方法及びキットに関する。より詳細には、本発明は、パラフィン化した組織又は細胞培養内のＤＮＡを直接的in situ ＰＣＲ増幅／検出アッセイにおいて増幅する場合発生するプライマー・インデペンデント(Primer-independent)バックグラウンド信号を減少又は実質的に排除するためのキット及び装置に関する。
発明の背景
病原体又はその他のターゲットを検出するための診断アッセイは、ＤＮＡ試料に添加されかつ固定ＤＮＡサンプルにハイブリダイズせしめられる標識したＤＮＡプルーブを使用して来た。該アッセイにおける感度の増大は、ＤＮＡ試料の増幅により達成することができる。
比較的最近、ＤＮＡ増幅における重大な改良が提供された。これはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術として公知であり、一般的に次のように記載することができる。該技術は、ＤＮＡ試料内のＤＮＡ特異的ターゲットＤＮＡ配列を複製又は増幅するための試験管内酵素合成方法である。該技術は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡ試料の反対側の鎖及びターゲットＤＮＡ配列において重要な領域の側面にハイブリダイズする２種のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。ターゲット配列の指数関数的増幅は、鋳型の変性、プライマーアニーリング及びアニールしたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長からなり、一般にサーマルサイクルステップと称されるステップの繰り返しシリーズにより得られる。このようなＰＣＲ技術は、末端が使用されたオリゴヌクレオチドプライマーの５′末端によって定義されるターゲット配列を、約１０9までの倍率で増幅することを可能にする。該ＰＣＲ技術は、例えば米国特許明細書第４,６８３,１９５号、第４,６８３,２０２号、第４,８００,１５９号及び第４,９６５,１８８号に記載されている。
in situ ＰＣＲは、標準ＰＣＲ技術の比較的新しい変形である。in situ ＰＣＲにおいては、ＤＮＡサンプルは、典型的には形態学的に認識可能な細胞を有する固定組織のスライスである。ＰＣＲ増幅生成物は、どの細胞がターゲットＤＮＡ配列を含有するかを示すそれらのオリジンの部位に残り、かつ該部位で検出することができる。
一旦、ＤＮＡサンプルはＰＣＲ増幅処理において物理的に増幅されると、所望のターゲット遺伝子配列の存在又は不在の検出を種々多様の同位体又は非同位体検出方法により実施することができる。このようなＰＣＲターゲット配列を検出するための最も好ましいかつ有利な方法の１つは、ＤＮＡサンプルを、増幅したＤＮＡ内に組み込まれることになる、標識した分子、例えば標識したオリゴヌクレオチドプライマー又は標識したデオキシヌクレオチドの存在下で増幅することである。この方法は一般に直接的in situ ＰＣＲ検出と称される。一般に、標識した分子は、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ又はｄＵＴＰのヌクレオチド類似体に組み込まれかつ直接的にＰＣＲ増幅生成物に組み込まれる。標識は、一般に小さな分子様ビオチン、ホースラディッシェ(horseradish)型ペルオキシダーゼ、ジゴキシゲニン、32Ｐ及び同種のものである。これらの標識を含有するＰＣＲ増幅生成物は、直接的に又は該標識に対する抗体に結合した酵素を用いて検出することができる。これらの酵素は、任意の多くの異なったリポータ分子、例えば同位体、蛍光又は比色分析リポータ分子を発生させることができる。
直接的in situ ＰＣＲ検出の大きな利点の１つは、多くの標識を、特に標識したヌクレオチドを使用すれば、増幅生成物の多くの異なった部位に組み込むことができることにある。このことは一般に発生される信号を増大し、従って検出限界を低下させる。直接的in situ ＰＣＲのもう１つの利点は、ＤＮＡプローベ、ＤＮＡハイブリダイゼーション又は洗浄ステップが不必要であるために、検出手順が著しく簡略化されることにある。
選択的に、未標識ＰＣＲ増幅生成物は、間接的にそれ自体標識を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡプローブで検出することができる。この方法は、様々にin situ ＰＣＲハイブリダイゼーション、間接的ＰＣＲ検出、又はプルーブベースドＰＣＲ検出と称される。この方法は、数回の付加的ステップを必要とするという欠点を有する。また極めて少ない信号が発生されるので、検出限界はしばしば不利な影響を受ける。しかしながら、この方法は、直接的in situ ＰＣＲよりも良好な特異性を提供する。それというのも、最も非特異性の増幅生成物は該プローブにはハイブリダイズしないからである。
従って、直接的in situ ＰＣＲ法が大いに推奨されかつ多くの事例において選択される方法であると見なされる。しかしながら、直接的in situ ＰＣＲ検出における重要な制限は、非特異的ＰＣＲ増幅生成物は特異的増幅生成物から識別不能であることにある。大量の非特異的生成物が生産されると、偽陽性（false positive）が発生されることがある。また、非特異的生成物の生成は、たとえ再現可能な量であっても、バックグラウンドレベルを上昇せしめ、そのため最低検出レベルに不利に影響する。直接的in situ ＰＣＲ検出を使用して得られを結果の品質は、ＰＣＲ増幅反応自体の品質に左右される。対照的に、プローブベースドＰＣＲ検出は、非特異的生成物の存在に対して著しく感度が低い。
ＰＣＲ技術の発見以来、溶液相ＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅反応の特異性に影響を与える多数の因子が同定された。これらの因子の内で、以下の原因が非特異性問題を有する：非最適化ＰＣＲプロトコール、プライマー非特異性、プライマーオリゴマー化及びプライマー・インデペンデント非特異性。非最適化ＰＣＲプロトコールに基づく問題に対する１つの解決手段は、ＰＣＲプロトコール及びサーマル・サイクリング・パラメータを最適化することである。プライマー非特異性の問題の１つの解決手段は、異なったヌクレオチド配列を有するプライマーの選択である。プライマー非特異性の問題並びにプライマーオリゴマー化の問題のもう１つの解決手段は、Chou et al. Nucleic Acid Reserch, Vol. 20, No. 7 1717-1723(1992)に記載されたいわゆるホット・スタート技術である。この技術では、全ＰＣＲ反応混合物を一旦構成したら、但しサーマル・サイクリングの前に、全時間比較的高温に保持する。このことは、さもなければ低温で起こり得る非特異的プライマーアニーリング及び伸長を阻止する。ホット・スタート技術は、プライマー非特異性及びプライマーオリゴマー化に基づく非特異的信号の低下においてin situ ＰＣＲと共に大きな価値を有することが立証された［Nuovo et al.,Amer. Journal of Pathology, Vol. 139, No. 6, 1239-1244（Dec. 1991）参照］。
しかしながら、これまで同定された非特異的信号の第４の原因、即ちプライマー・インデペンデント増幅は、プライマーの不在で観察される現象であり、かつホット・スタート技術によっては解決不能である。このプライマー・インデペンデント非特異性の問題は、様々な研究者により観察されており、これらの研究者は、該問題はin situ ＰＣＲにおける増幅したターゲット配列の直接的検出が適当な技術とは考えられ得ないほど重大であるという結論を出している。
従来、プライマー・インデペンデント非特異性の問題は、そのことが特に厄介な問題をなすin situ ＰＣＲ増幅に関して説明されて来たが、このようなプライマー・インデペンデント非特異性はまた、別のＤＮＡ複製法、例えば溶液相ＰＣＲ増幅においても、また唯一の単一オリゴヌクレオチドプライマーを使用し、該プライマーを染色体ＤＮＡにアニーリングしかつ標識したオリゴヌクレオチドの組み込みと共にin situ伸長するプライムド(primed) in situ伸長（ＰＲＩＮＳ）複製技術においても問題となり得ると見なすのが適当であろう。種々のＤＮＡ複製／増幅法において、プライマー・インデペンデント非特異的生成物の生成は、アッセイ処理の検出段階において一連の問題を惹起する。それというのも、非特異的生成物は、バックグラウンドレベルを、偽陽性が発生され、またアッセイの最低もしくは低い検出レベルに不利に影響するほど高いにレベルに著しく上昇せしめるからである。
従って、本発明の目的は、ＤＮＡ複製／増幅プロセスに曝されるＤＮＡサンプル中のターゲットＤＮＡ配列の複製もしくは増幅及び検出のための過程においてプライマー・インデペンデント非特異的生成物の生成を減少又は実質的に排除する方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、ＰＣＲ増幅法、特にin situ ＰＣＲ増幅法、より特別に直接的in situ ＰＣＲ増幅及び検出法においてプライマー・インデペンデント非特異的生成物の生成を減少又は実質的に排除する方法を提供することである。
本発明の要約
本発明は、ＤＮＡ複製又は増幅法によりＤＮＡサンプル内のターゲットＤＮＡ配列を複製又は増幅及び検出ための処理過程でプライマー・インデペンデント非特異的生成物の生成により惹起されるプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンド信号を減少させる方法及びキットを提供し、本発明は、
（ａ）ターゲットＤＮＡ配列を、デオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡサンプルのターゲット配列内の少なくとも１つの鎖にハイブリダイズする１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法により複製し、かつ複製に引き続きターゲット配列の検出を行う、又は
（ｂ）ターゲット配列を、ＤＮＡサンプルの反対の鎖及びターゲットＤＮＡ配列の側面にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用した、アニーリング／伸長及び変性ステップの間のサーマル・サイクリングによるＰＣＲ増幅法により増幅しかつ該増幅後にターゲット配列の検出を行う、又は
（ｃ）ＤＮＡサンプルのために、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシヌクレオシド三リン酸のそれぞれ、及びＤＮＡサンプルの反対の鎖及びターゲットＤＮＡ配列の側面にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの１組を用意し、その際、前記４種のデオキシヌクレオシド三リン酸の少なくとも１つを標識しておき、かつＤＮＡサンプルの反対の鎖への変性、変性した鎖へのプライマーのアニーリング、及びアニールしたプライマーの、標識したターゲットＤＮＡ配列を造るターゲットＤＮＡ配列を指数関数的に増幅するＤＮＡポリメラーゼによる伸長からなるＰＣＲサイクリングステップの繰り返しシリーズを可能にする条件下で増幅することにより、ターゲットＤＮＡ配列を直接的in situ ＰＣＲ及び検出法により増殖することよりなり、
前記プライマー・インデペンデント非特異的生成物及びバックグラウンドを減少又は実質的に排除する方法は、ＤＮＡサンプルを複製／増幅工程の前に前処理することよりなり、該前処理は、複製／増幅工程の前に、ＤＮＡサンプルを少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと、ジデオキシヌクレオシドをＤＮＡサンプル内の３′末端に共役結合させるために充分な温度及び時間接触させ、かつ次いで処理したＤＮＡサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼから分離することよりなる。
本発明の詳細な説明
プライマー・インデペンデント非特異性の問題の研究過程で、高いプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドは、ＤＮＡサンプルとしパラフィン化した組織を使用すると日常的に観察されるが、パラフィン化処理を行わない細胞懸濁液内では観察されないことが判明した。更に、このような高いプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドは、凍結した組織切片においても観察されなかった。この凍結した組織切片は、同様にパラフィン化処理はされないが、他の組織調製ステップ、例えばセクショニング及びマウンティング、フォルマリン固定及びプロテアーゼ消化ステップの殆どの処理を受ける。時折、高いＰＣＲバックグラウンドは、細胞懸濁液で観察されたが、これは常に前記のホット・スタート技術により又はプライマーを抑制することによりブロックすることができた。このことは、細胞懸濁液内のバックグラウンド問題はプライマー非特異性であり、プライマー・インデペンデント非特異性ではないことを示す。
この証拠により、パラフィン化又は解パラフィン化処理に含まれるステップの１つはプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンド問題の原因であるという確信に至った。また、パラフィン化ステップを省略すれば、プライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドを作り出すためには高めた温度だけが充分であることが判明した。外陰及び扁桃の生検材料の組織切片をシランスライドに載せ、１０％の緩衝ホルマリン中に４〜１５時間固定し、かつそれぞれの組織からの切片を乾燥炉内で６５℃で４時間加熱した場合に観察された。この加熱ステップ後に、プライマー・インデペンデント信号は、それぞれの組織に対して任意のプロテアーゼ消化時間で明白であった。しかしながら、該組織を６５℃に加熱しなければ、該組織はプライマー・インデペンデント非特異的ＰＣＲバックグラウンドを呈示しなかった。プライマーの不在における非特異的信号の存在は、ＤＮＡギャップのＤＮＡポリメラーゼ媒介修復が起こり得ることを示唆する。
別の制御実験は、問題は明らかにサンプル内のＤＮＡから起源していることを立証した。ＲＮＡを基礎としたin situ ＰＣＲは、如何なるバックグラウンド問題をも立証しなかった。また、バックグラウンドは、サンプルのＤＮＡが予めデオキシリボヌクレアーゼ処理によって排除されていれば出現しなかった。また、これはサンプルを延長したプロテアーゼ処理にかければ消滅した。細胞は、組織とは異なり、一般にはパラフィン化されず、かつこのバックグラウンド問題は一般に細胞では観察されない。しかしながら、時折、細胞も組織と同様に処理するのが望ましい。パラフィン化を行う場合には、これらのパラフィン化した細胞は、プライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドを呈示する。
プライマー・インデペンデントバックグラウンド問題はＤＮＡサンプルを高めた温度に曝すことにより惹起されることが発見された際、ＰＣＲ増幅処理の前に、ＤＮＡサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼで前処理し、その後処理したＤＮＡサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼから分離すれば、観察されるプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンド問題は実質的に排除されるか又は減少せしめられることが判明した。
以下の説明に拘束されるものでないが、プライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンド問題及びその自明でない解決手段は以下に説明することができると思われる。前述のプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンド問題の原因は、ＤＮＡ配列に多くの一本鎖切断部位を形成する、二本鎖ＤＮＡサンプルの一本鎖の分離を含むと見なされる。前記切断部位は、ＰＣＲ増幅処理過程でＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシヌクレオシド三リン酸のための重合開始部位として働く３′末端ヒドロキシル末端ヌクレオチドを有する。２′，３′−ジデオキシヌクレオチドの、相応する三リン酸からの、切断部位におけるＤＮＡ鎖の３′末端への付加は、そのＰＣＲ増幅処理過程での後からの伸長を阻害するものと見なされる。
本発明により解決されるプライマー・インデペンデント非特異的に基づくバックグラウンド問題は、特に固定され、パラフィン化されかつ解パラフィン化されたＤＮＡサンプルを使用する際に存在するが、該解決手段は、少なくとも約３７℃の高めた温度に曝されたＤＮＡサンプル、より特別には約４５℃〜約６５℃、有利には５０℃以上の高めた温度に約１０分〜約１６時間曝されたＤＮＡサンプルを使用する際に生じるバックグラウンド問題のためにも適用することができる。
また、プライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドの問題に対する該解決手段は、直接的in situ ＰＣＲ増幅においてだけでなく、種々のＰＣＲ増幅法並びに別のＤＮＡ複製法、例えばプライマー・インデペンデント非特異的バックグラウンドが問題であるＰＲＩＮＳ複製法においても適用可能である。
本発明による前処理方法においては、複製もしくは増幅すべきＤＮＡサンプルを少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡサンプル内の３′末端にジデオキシヌクレオシドを共役結合させるために充分な時間及び温度で接触させる。温度は約２０℃程度の低さであってもよいが、少なくとも約３７℃ないし約７２℃の温度で少なくとも約１分間以上、より有利には約５５℃以上の温度で約１〜１５分間が有利である。本発明の有利な１実施態様では、ＤＮＡサンプルをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼとサーマルサイクリング操作で接触させる、その際これらの成分は２つの段階の間のサーマルサイクリング中に接触せしめられる。好ましくは、この前処理法のサーマルサイクリング段階は、約３７℃〜約７２℃の温度で約１０秒〜約１分間の第１の段階と、約８０℃〜約１０５℃、有利には約９４℃の温度で約１０秒〜約１分間の第２の段階とからなる。このようなサーマルサイクリングシーケンスを前処理方法で使用する場合には、これらの２つの段階の間で一般に約１〜約１０サイクルを使用すべきである。
本発明による前処理方法は、単一のジデオキシヌクレオシド三リン酸、例えばｄｄＴＴＰを使用して実施することができるが、所望であれば２種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸、例えばｄｄＡＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＣＴＰ並びにｄｄＴＴＰを使用することもできる。本発明による前処理方法において単一のジデオキシヌクレオシド三リン酸を使用する場合には、該反応混合物はまた、切断部位内のギャップが、１つの位置になるまで塞がれ、それによりジデオキシヌクレチドが切断部位の３′末端に付加されるように、別の３種のデオキシヌクレオチドを含有すべきである。本発明による前処理法において２種以上のジデオキシヌクレオシドを使用する場合には、該反応混合物はまたジデオキシヌクレオチドとして存在しない別のデオキシヌクレオチドを使用するべきである。所望であれば、該反応混合物は、常に、以下の実施例における場合と同様に４種の全てのデオキシヌクレオチドを含有することができる。
前記の前処理で使用するためのキットは、少なくとも１種のジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼからなる。該キットは、２種以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸を有することができる。このようなキットは好ましくはジデオキシチミジン三リン酸及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼからなる。該キットは、更に４種のデオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ，ｄＣＰＴ,ｄＧＰＴ，ｄＴＴＰからなっていてもよい。
本発明による前処理方法は、任意の適当なＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ及び同種のものを使用することができる。本発明による任意の前処理方法で使用するために選択されるＤＮＡポリメラーゼは、一般にジデオキシヌクレオシド三リン酸の最大量がジデオキシヌクレオシド三リン酸の最低濃度で最低回数で組み込まれるように選択すべきである。また、最適なＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、ＤＮＡサンプル内の任意の一本鎖断片を造るか又は伸長することを回避するために如何なるエキソヌクレアーゼ活性を有するべきでない。このようなＤＮＡポリメラーゼの例としては、AmpliTag(R)ＤＮＡポリメラーゼ、ストッフェル・フラグメント（パーキン・エルマー社からNo．N808-0038として市販）を挙げることができる。
ＤＮＡサンプルとジデオキシヌクレオシド三リン酸とをＤＮＡポリメラーゼの存在下に、ジデオキシヌクレオシドをＤＮＡサンプル内の３′末端に共役結合させるために充分な時間及び温度で反応させた後に、処理したＤＮＡをジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼから分離する。任意の好適な分離技術を使用することができる。例えば、in situ ＰＣＲ増幅のために固定ＤＮＡサンプルを使用する場合には、処理したサンプルを洗浄により分離することができる。しかしながら、その他の増幅法、例えば溶液ＰＣＲのためには、ＤＮＡサンプルを適当な脱塩法により沈殿させるか又はＤＮＡサンプルを任意の別の適当な分離法、例えばアルコールでの沈殿により又は種々のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換、逆相及びサイズ排除クロマトグラフィーにより分離することが必要になる。
ＤＮＡサンプルは、任意の適当な生物サンプル、例えば全ての細胞、例えば植物、動物、バクテリア、真菌類及び微生物細胞、並びにビールス及び染色体スプレッド(spread)由来のものであってよい。
本発明を以下の実施例により説明するが、但し制限するものではない。実施例においては、ｂｃｌ−２遺伝子のサンプル調製、増幅及び検出のために以下の方法を使用した。
組織調製
パラフィンに包埋した肝臓、外陰、扁桃及びリンパ腺組織の４つのμＭ切片をシラン被覆ガラススライドに載せた。これらの組織サンプルを１０％の中性に緩衝したホルマリン内で６時間か又は８時間固定した。０．０１ｎＨＣｌ中で２ｍｇ／ｍｌのペプシンを使用して室温でプロテアーゼ消化を行った。所定の変数への調整を同一の反応条件下で比較できるように、３つの連続切片をそれぞれのスライドに載せた。これらの切片をキシレン内で５分間解パラフィン化し、１００％のエタノール中で５分間洗浄し、次いで空気乾燥した。
in situ ＰＣＲ
解パラフィン化及び１５分間の最適なプロテアーゼ消化後に、それぞれのスライドに以下の反応混合物（２５μｌ）を加えた：ＰＣＲ緩衝剤II２．５μｌ（GeneAmp(R) kit，パーキン・エルマー社）、ＭｇＣｌ2４．５μｌ（２５ｍＭストック溶液）、ｄＮＴＰ溶液４．０μｌ（ストック溶液８００μＭ）、２％ウシの血清アルブミン１．０μｌ、ジゴキシゲニンｄＵＴＰ溶液０．４μｌ（１ｍＭストック溶液）＋／− ｂｃｌ−２遺伝子のための以下に同定したｂｃｌ−２プライマー１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１）及びｂｃｌ−２プライマー２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２）１μｌ（それぞれストック溶液２０μＭ）＋水１１μｌ（又はプライマーを省略した場合には１３μｌ）、Ｔａｑポリメラーゼ０．６μｌ。この溶液をスライドに加え、２小滴のマニキュア液で止めた１枚の大きなポリプロピレンカバースリップでカバーし、かつアルミニウム箔“ボード”に移した。このボートを、８０℃に加熱したサーマル・サイクラーのアルミニウムブロックの上に置いた。この温度で、カバースリップに加熱した鉱油１ｍｌを塗付した。該ＤＮＡを９４℃で３分間変性させ、引き続き５５℃で２分間及び９４℃で１分間の２０サイクルの変性を行った。カバースリップを取り除いた後に、キシレン及び１００％エタノール中での連続した５分間洗浄を実施し、かつ該スライドを空気乾燥した。ＰＣＲ生成物内に組み込まれたジゴキシゲニンの検出は、アルカリ性ホスファターゼ共役したアンチジゴキゲニン標識した抗体を用いて１：５０希釈で行った。アルカリ性ホスファターゼベースの比色検出法を適用し、その際、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）の存在下に帯紫青色の沈殿物を陽性の細胞のマーカーとして生じる色素原ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を使用した。対比染色（核のファーストレッド）は、核及び細胞質を淡いピンク色に染色した。試験を３重に実施かつ信号のためのスコアリングシステムは以下の通りであった：０、１＋＝細胞陽性２５％未満、２＋＝細胞陽性２５〜５０％及び３＋＝細胞陽性５０％より大。以下のプライマーを使用した：
0003719445.tif 000002
in situ ＰＣＲ増幅の例を、先ずジデオキシヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼを用いた前処理を行わずに実施し（例１及び２）、次いで同じＰＣＲ増幅の例を、本発明に基づき先ずジデオキシヌクレオシド三リン酸前処理を行った後に繰り返した（例３及び４）。該例におけるジデオキシヌクレオシド三リン酸前処理は、以下のようにして実施した。組織切片のプロテアーゼ消化後かつそのin situ ＰＣＲ増幅の前に、組織切片を、ＰＣＲ緩衝剤２．５μｌ、ＭｇＣｌ2４．５μｌ（２５ｍＭストック溶液）、ｄＮＴＰ溶液４．０μｌ（ストック溶液８００μＭ、即ち４種のデオキシヌクレオチドのそれぞれ２００μｌ）、ジデオキシチミジン三リン酸２．５μｌ（１,０００μＭストック溶液）、２％ウシの血清アルブミン１．０μｌ、＋水９．７μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（５単位／μｌ）０．８μｌを含有する溶液内で５５℃で３０分間インキュベートした。処理した組織サンプルを、次いでジデオキシチミジン三リン酸及びＴａｑポリメラーゼから蒸留水で洗浄することにより分離した。その後、前処理したサンプルのＰＣＲ増幅及び検出を、前述と同一の方法で、但し如何なるプライマーも不在で実施した。前記例の結果は、以下の表に示す。
0003719445.tif 000003
前記表のデータから、ジデオキシ前処理は、ジデオキシ前処理を実施しない場合に発生したプライマー・インデペンデント非特異的信号（３＋値）を排除する（０値）ことは明白である。
本発明の前記の記載から、当業者にとっては、本発明の思想から逸脱することなく種々の変更を行うことができることは自明なことであろう。従って、本発明は前記に説明した特殊な実施例に限定されるものではない。
配  列  リ  ス  ト
（１）  一般的情報：
（i）出願人：ローレンス・Ａ.ハフ
（ii）発明の名称：ＤＮＡ複製／検出アッセイにおけるバックグラウンド信号を減少させる方法
（iii）配列の番号：２
（iv）通信住所：
（A）住所：パーキン・エルマー社
（B）通り：64ダンバリーロード
（C）町：ウイルトン
（D）州：コネチカット
（E）国：Ｕ.Ｓ.Ａ.
（F）郵便番号：06897
（v）コンピュータ読取りフォーム：
（A）媒体タイプ：ディケット、3.50インチ1.44mb記憶容量
（B）コンピュータ：AST Premium II 368/25（IBM コンパーチブル）
（C）オペレーティングシステム：MS-D0D 5.0
（D）ソフトウエア：ワードパーフェクト5.1
（vi）通常出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）優先権主張データ：
（A）出願番号：ナシ
（B）出願日：ナシ
（VIII）弁護士／代理人情報：
（A）名前：ジョーン・Ｒ.ウォール
（B）登録番号：33044
（C）証明書／事件番号：BT-4374
（ix）遠距離通信情報：
（A）電話：（203）762-1449
（B）テレックス：（203）762-1588
（2）  SEQ ID NO:１に関する情報
（i）配列特性：
（A）長さ：２２塩基
（B）タイプ；核酸
（C）鎖：１本
（D）トポロギー：線状
（ii）分子タイプ：別の核酸
（xi）配列記載：SEQ ID NO:１
0003719445.tif 000004
（2）  SEQ ID NO:２に関する情報
（i）配列特性：
（A）長さ：２２塩基
（B）タイプ；核酸
（C）鎖：１本
（D）トポロギー：線状
（ii）分子タイプ：別の核酸
（xi）配列記載：SEQ ID NO:２
0003719445.tif 000005