(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのラセミトランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）−ラクタム：
【化１】
0003703719.tif 000018
（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ７アルキル、２，２，２−トリフルオロエチルまたはメトキシエトキシエチルであり、そして、Ｒ１は水素または、ベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、およびアセチルからなる群から選択される保護基である）の微生物による加水分解分割のための方法であって、該方法が以下：
ラセミラクタムＩを、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中の微生物に添加して、光学的にエンリッチな以下の式ＩｂまたはＩＩａの化合物：
【化２】
0003703719.tif 000019
（ここで、ＲおよびＲ１は上記のように定義される）を得る工程；ならびに
式Ｉｂのカルボン酸エステルを加水分解し、式ＩＩａの化合物を得る工程、
を包含し、ここで、
ラセミトランスラクタムＩの分割により、光学的にリッチな酸ＩＩａが得られ、
該微生物は、
【表１】
0003703719.tif 000020
に列挙される微生物である、
方法。
【請求項２】
式Ｉのラセミトランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）−ラクタム：
【化３】
0003703719.tif 000021
（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ７アルキル、２，２，２−トリフルオロエチルまたはメトキシエトキシエチルであり、そして、Ｒ１は水素または、ベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、およびアセチルからなる群から選択される保護基である）の微生物による加水分解分割のための方法であって、該方法が以下：
ラセミラクタムＩを、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中の微生物に添加して、光学的にエンリッチな以下の式ＩｂまたはＩＩａの化合物：
【化４】
0003703719.tif 000022
（ここで、ＲおよびＲ１は上記のように定義される）を得る工程；ならびに
式Ｉｂのカルボン酸エステルを加水分解し、式ＩＩａの化合物を得る工程、
を包含し、
微生物を用いてラセミトランスラクタムＩの分割によって、光学的にリッチなカルボン酸エステルＩｂが得られ、続いて光学的にリッチな酸であるＩＩａが得られ、
ここで、該微生物は、
【表２】
0003703719.tif 000023
に列挙される微生物である、
方法。
【請求項３】
前記微生物は、微生物はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉのラセミトランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）−ラクタム：
【化５】
0003703719.tif 000024
（ここで、ＲはＣ１〜Ｃ７アルキル、２，２，２−トリフルオロエチルまたはメトキシエトキシエチルであり、そして、Ｒ１は水素または、ベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、およびアセチルからなる群から選択される保護基である）の酵素による加水分解分割のための方法であって、該方法が以下：
ラセミラクタムＩを、緩衝液、溶媒、またはそれらの混合物中の酵素に添加して、光学的にエンリッチな以下の式ＩｂまたはＩＩａの化合物：
【化６】
0003703719.tif 000025
（ここで、ＲおよびＲ１は上記のように定義される）を得る工程；ならびに
式Ｉｂのカルボン酸エステルを加水分解し、式ＩＩａの化合物を得る工程、
を包含し、
ここで、酵素を用いてラセミトランスラクタムＩの分割によって、光学的にリッチなカルボン酸エステルＩｂが得られ、続いて光学的にリッチな酸であるＩＩａが得られ、
ここで、該酵素は、
【表３】
0003703719.tif 000026
0003703719.tif 000027
または
【表４】
0003703719.tif 000028
に列挙される酵素である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
トランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）ラクタムおよびトランス−２−（カルボキシエチル）ラクタムは、米国特許第５，７６７，１１５号に開示されたコレステロール低化剤である、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）−プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンの合成における中間体である。
【０００２】
米国特許第５，６１８，７０７号は、ケト中間体（４−（４−フルオロ−ベンゾイル）酪酸またはそのフェニルオキサゾリジノン結合体）の、アゼチジノンの調製に使用される対応するヒドロキシ中間体への立体選択的な微生物学的還元を開示する。このプロセスに使用される好ましい微生物は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓである。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明のプロセスは、式Ｉのラセミトランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）ラクタム：
【０００４】
【化３】
0003703719.tif 000002
（ここでＲは、Ｃ1〜Ｃ7アルキル、２，２，２−トリフルオロエチルまたはメトキシエトキシエチルであり、そしてＲ1は水素、またはベンジル、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）およびアセチルからなる群から選択される保護基である）の微生物によるまたは酵素による加水分解分割に関し、このプロセスにより、光学的にエンリッチ（ｅｎｒｉｃｈ）な式ＩｂまたはＩＩａの化合物：
【０００５】
【化４】
0003703719.tif 000003
が得られる。
【０００６】
式Ｉｂのカルボン酸エステルが得られるとき、このプロセスはさらに、式ＩＩａの酸を得るために、得られた式Ｉｂの化合物の加水分解を包含する。得られた３Ｒ，４Ｓラクタム酸は、１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンの調製における中間体として有用である。
【０００７】
分割は、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒の混合物中での微生物（環境供給源（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｏｕｒｃｅ）および培養コレクション（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））から得られる）の使用、あるいは、緩衝液、溶媒またはそれらの混合物中の酵素の使用を包含し、これらにラセミトランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）ラクタムを添加し、その結果、所望の立体化学のエステルまたは酸基を有する化合物が形成され、蓄積され、単離され得る。この分割は使用される微生物または酵素に依存して、直接的（ｄｉｒｅｃｔ）であるか、または減算的（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）のいずれかである。
【０００８】
以下の属からなる群から選択される微生物は、直接的分割において有用であることが見出された：
【０００９】
【化５】
0003703719.tif 000004
以下の属からなる群から選択される微生物は、減算的分割において有用であることが見出された：
【００１０】
【化６】
0003703719.tif 000005
本発明の分割における使用に適した市販の酵素としては、以下：
【００１１】
【化７】
0003703719.tif 000006
が挙げられる。
【００１２】
好ましい酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の加水分解酵素（Ｔｏｙｏｂｏ  ＬＰＬ  ３１１  Ｔｙｐｅ  Ａ、Ｔｏｙｏｂｏ  ＬＩＰ−３０１／ＬＩＰ  ３００、Ｔｏｙｏｂｏ  ＬＰＬ７０１、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＣｈｉｒａｚｙｍｅTM  Ｌ６）である。
【００１３】
特に、本発明は、トランス−１−（４−フルオロフェニル）−３（アルコキシカルボニルエチル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンの直接的分割に関し、この分割は、上記化合物を、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒の混合物中の微生物（特に、ここで、上記微生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓまたはａｌｌｉａｃｅｕｓ、あるいはＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓである）に添加する工程、得られた混合物をインキュベートする工程、ならびに式ＩＩａの化合物：
【００１４】
【化８】
0003703719.tif 000007
（ここで、Ｒ1は、上記に定義される通りである）を単離する工程を包含する。
【００１５】
特に、本発明はまた、トランス−１−（４−フルオロフェニル）−３（アルコキシカルボニルエチル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンの減算的分割に関し、この分割は、前記化合物を、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒との混合物中の微生物（特に、ここで、微生物はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種である）、あるいは、溶媒、緩衝液またはそれらの混合物中の酵素（特に、ここで、酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来の加水分解酵素である）に添加する工程、得られた混合物をインキュベートする工程、ならびに式Ｉｂ：
【００１６】
【化９】
0003703719.tif 000008
（ここで、ＲおよびＲ1は、上記に定義される通りである）の化合物を単離する工程を包含する。式Ｉｂの化合物は、次いで、加水分解されて、カルボン酸エステル基Ｒを除去し、式ＩＩａの化合物を得る。
【００１７】
（詳細な説明）
本発明の加水分解分割は、以下の反応スキームに要約される：
【００１８】
【化１０】
0003703719.tif 000009
このスキームは、微生物または酵素を使用した直接的加水分解を実施するための方法を示し、ここで、ラセミラクタムエステルＩは加水分解され、鏡像異性的にエンリッチされた酸（３Ｒ，４Ｓ）−ＩＩａを生成し、これは、未反応のカルボン酸エステル（３Ｓ，４Ｒ）−Ｉａから容易に分割される。あるいは、ラセミラクタムエステルＩの減算的分割は、酸ＩＩｂおよび鏡像異性的にエンリッチされたカルボン酸エステル（３Ｒ，４Ｓ）−Ｉｂを生成し、このカルボン酸エステルは、続いて、加水分解され、（３Ｒ，４Ｓ）−ＩＩａを生成する。続いて、鏡像異性的にエンリッチされた（３Ｒ，４Ｓ）−ＩＩａは、当該分野で公知の手順を使用して、例えば、５，７６７，１１５の方法Ｈに記載されるように、式ＩＩａの酸を対応する酸クロリドに変換し、この酸クロリドを４−フルオロフェニル誘導体と反応させ、そしてこのケトンをアルコールに還元することにより、１−（４−フルオロフェニル）３（Ｒ）−［３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−（４−フルオロフェニル）−プロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノンを合成するために使用される。
【００１９】
加水分解分割は、ラセミトランス−２−（アルコキシカルボニルエチル）ラクタムＩを、微生物を含む、培地、培地および緩衝液、培地および溶媒、または培地および緩衝液と溶媒との混合物、あるいは酵素を含む、溶媒、緩衝液、またはそれらの混合物に添加することによって実施される。バイオコンバージョン（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は、約２０℃から約４０℃の間の範囲の温度で実施され得；微生物反応は好ましくは、周囲温度から３０℃で実施され、そして酵素反応は、好ましくは周囲温度から３７℃で実施される。反応の初期ｐＨ値は、約ｐＨ５．０から約９．０の間の範囲内、好ましくはｐＨ７．０に調整される。
【００２０】
微生物反応におけるラセミトランスラクタムエステルＩの初期濃度は、約０．５ｇ／ｌから約５ｇ／ｌの間を変化し得、そして好ましくは０．５ｇ／ｌである。微生物による加水分解の継続時間は、約１８〜約９６時間を変化し得、そして好ましくは、約４８時間である。
【００２１】
酵素媒介反応におけるトランスラクタムエステルＩの初期濃度は、約５ｍｇ／ｍｌから約２００ｍｇ／ｍｌの間を変化し得、そして好ましくは２５ｍｇ／ｍｌである。酵素による加水分解の継続時間は、約２４から約１９２時間を変化し得る。
【００２２】
適切な発酵培地、緩衝液および溶媒は当業者に公知である。発酵培地は典型的に、酵母抽出物、栄養ブロス、デキストロース（セレロース（ｃｅｒｅｌｏｓｅ））、ジャガイモデキストリン、大豆粉、ペプトン、および当該分野で公知の他の成分などの成分を使用した炭素および窒素源またはそれらの混合物を含む。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ７で０．１Ｍ）、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）、ビス−トリス（ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］−メタン）、ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジン−ジエタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシ−メチル）アミノメタン）およびＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）緩衝液（例えば、ｐＨ７で０．１Ｍ）である。典型的な溶媒は、アセトニトリル、アセトン、エチルエーテル、イソプロパノール、ｔ−ブタノール、イソアミルアルコール、ｐ−ジオキサン、イソプロピルエーテル、ジメチルスルホキシド、ｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）、トルエン、テトラヒドロフランおよびＣＨ2Ｃｌ2である。好ましくは、微生物による分割は、発酵培地中で実施され、そして酵素による分割は、好ましくは、共溶媒を伴う緩衝液中で実施される。酵素による分割に好ましい共溶媒はＴＢＭＥである。
【００２３】
加水分解の終了時、光学的にエンリッチされた酸またはエステルが、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ＴＢＭＥ、ＣＨ2Ｃｌ2などの有機溶媒を使用して抽出され得る。樹脂への吸着、クロマトグラフィー、および当該分野で公知の他の物理的方法もまた、光学的にエンリッチされた酸またはエステルの単離に使用され得る。
【００２４】
式Ｉｂのカルボン酸エステルは、当該分野で周知の方法を使用して、例えば、米国特許第５，７６７，１１５号に記載されるように、ＬｉＯＨなどの適切な塩基を用いた処理によって、式ＩＩａの対応する酸へと加水分解され得る。
【００２５】
以下の実施例は、本発明の加水分解における微生物および酵素の評価、ならびにミリグラム量での式ＩＩａおよびＩｂの化合物の調製を例示する。
【００２６】
（実施例１）
酸ＩＩａを生成するのに使用するための、ラセミトランスラクタムメチルエステルＩの微生物による加水分解を同定するための一般方法を、以下に記載する。
【００２７】
酵母、糸状菌、および細菌の種培養物を、２５ｍｌまたは５０ｍｌのＹＰＤ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストロース；ｐＨ５．５）、ＳＩＭ６（３．５％の大豆粉、５％のジャガイモデキストリン、０．５％のセレロース、２ｍｇ／ｌの塩化コバルト、０．５％の炭酸カルシウム；ｐＨ６．０）およびＮＹＣ（０．８％の栄養物質ブロス、２％の酵母抽出物、２％のセレロース；ｐＨ７．０）の培地のそれぞれを含む１２５ｍｌまたは３００ｍｌのフラスコ中で７２時間、３０℃で攪拌（１７５〜２５０ｒｐｍ）しながら増殖させ、その後、３０℃で攪拌（２５０ｒｐｍ）した状態でインキュベートしたフラスコ発酵（酵母および糸状菌用の２５ｍｌのＹＰＤ／１２５ｍｌフラスコまたは細菌用２５ｍｌのＮＹＣ／１２５ｍｌフラスコ）に播種した。全ての発酵において、培地のｐＨを、播種前に調整したが、培養増殖および基質の加水分解の間は制御しなかった。微生物による分割を、エタノール（２５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した０．５ｇ／ｌのラセミトランスラクタムメチルエステルＩを、培養物に直接添加することによって開始し、続いて２４時間の増殖させた。発酵ブロスのサンプルを、基質との２４〜７２時間のインキュベーションの後に、ＴＢＭＥで抽出し、そして逆相ＨＰＬＣによって分析した。選択的な加水分解により酸ＩＩａを生成することを立証する好ましい培養物を、表１に要約する。
【００２８】
（表１：微生物を使用するラセミトランスラクタムメチルエステルの直接の分割）
【００２９】
【表１】
0003703719.tif 000010
（実施例２）
ベンジル保護したラセミトランスラクタムメチルエステルＩの微生物による加水分解から誘導される酸ＩＩａのミリグラム量を、以下に記載されるように調製した。
【００３０】
酸ＩＩａを生成するためのメチルエステルＩ（０．５ｇ／ｌ）の微生物による分割を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ株ＡＴＣＣ＃２４８３９を利用する複数のフラスコ発酵を使用して、実施例１に記載のように実施した。４８時間のインキュベーションの後に、各培養物の発酵ブロスをプールし、その後、この発酵ブロスから細胞を分離するために遠心分離した。細胞ペレットを乳鉢および乳棒を使用して、液体窒素中で微粉砕し、その後、ＴＢＭＥ（１〜２の体積／湿重量）で３回に分けて抽出した。発酵ブロスを、ＴＢＭＥで別々に抽出した。ＴＢＭＥ抽出液は、（３Ｒ，４Ｓ）−酸および（３Ｓ，４Ｒ）−エステル（各９９％以上のエナンチオマー過剰）の両方を含んだ。無水ＭｇＳＯ4をＴＢＭＥ抽出液に添加し、残りの水を除去し、この抽出液を濾過し、濾液をエバポレートにより濃縮した。抽出液濃縮物を、複数の１０〜２０ＧＦシリカプレート（２０ｃｍ×２０ｃｍ×１０００ミクロン）を利用する分取用薄層クロマトグラフィーによる精製に供し、そしてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（５０：５０）溶液で展開した。所望の産物と共遊走する物質を、各シリカプレートから切り出し、プールし、そしてＴＢＭＥを用いてシリカから溶出した。この溶出液をエバポレートし、（３Ｒ，４Ｓ）−酸ＩＩａ：１７０ｍｇ，収率１７％；８６％のエナンチオマー過剰；［α］D25＝−１３．０°（ｃ＝０．１２３、エタノール）を得た。
【００３１】
（実施例３）
エステルＩｂを生成するのに使用するための、ベンゼンで保護したラセミトランスラクタムメチルエステルＩの微生物による分割を同定する一般方法を、以下に記載する。
【００３２】
酵母、糸状菌、および細菌の種培養物を、２５ｍｌまたは５０ｍｌのＹＰＤ（１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のデキストリン；ｐＨ５．５）、ＳＩＭ６（３．５％の大豆粉、５％のジャガイモデキストロース、０．５％のセレロース、２ｍｇ／ｌの塩化コバルト、０．５％の炭酸カルシウム；ｐＨ６．０）およびＮＹＣ（０．８％の栄養物質ブロス、２％の酵母抽出物、２％のセレロース；ｐＨ７．０）の培地のそれぞれを含む１２５ｍｌまたは３００ｍｌのフラスコ中で７２時間、３０℃で攪拌（１７５〜２５０ｒｐｍ）しながら増殖させ、その後、３０℃で攪拌（２５０ｒｐｍ）した状態でインキュベートしたフラスコ発酵（酵母および糸状菌用の２５ｍｌのＹＰＤ／１２５ｍｌフラスコまたは細菌用２５ｍｌのＮＹＣ／１２５ｍｌフラスコ）に播種した。全ての発酵において、培地のｐＨを、播種前に調整したが、培養増殖および基質の加水分解の間は制御しなかった。微生物による分割を、エタノール（２５ｍｇ／ｍｌ）に溶解した０．５ｇ／ｌのラセミトランスラクタムメチルエステルＩを、培養物に直接添加することによって開始し、続いて２４時間の増殖させた。発酵ブロスのサンプルを、基質との２４〜７２時間のインキュベーションの後に、ＴＢＭＥで抽出し、そして逆相ＨＰＬＣによって分析した。光学的にエンリッチなエステルＩｂを得る培養物を、表２に要約する。
【００３３】
（表２：微生物を使用するラセミトランスラクタムメチルエステルの減算的（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）分割）
【００３４】
【表２】
0003703719.tif 000011
（実施例４）
ベンジル保護したラセミトランスラクタムメチルエステルＩ（０．５ｇ／ｌ）の加水分解から誘導されるメチルエステルＩｂのミリグラム量を、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ種  ＡＴＣＣ＃１９０７１を利用する複数のフラスコ発酵を使用して実施例３に記載したように調製した。４８時間のインキュベーションの後に、各フラスコの発酵ブロスをプールし、その後、この発酵ブロスから細胞を分離するために遠心分離した。細胞ペレットを超音波処理により粉砕し、その後、ＴＢＭＥ（１〜２の体積／湿重量）で３回に分けて抽出した。発酵ブロスを、ＴＢＭＥで別々に抽出した。無水ＭｇＳＯ4をＴＢＭＥ抽出液に添加し、残りの水を除去し、この抽出液を濾過し、濾液をエバポレートにより濃縮した。抽出液濃縮物を、複数の１０〜２０ＧＦシリカプレート（２０ｃｍ×２０ｃｍ×１０００ミクロン）を利用する分取用薄層クロマトグラフィーによる精製に供し、そしてＥｔＯＡｃ：ヘキサン（５０：５０）溶液で展開した。所望の産物と共遊走する物質を、各シリカプレートから切り出し、プールし、そしてＴＢＭＥを用いてシリカから溶出した。この溶出液をエバポレートし、（３Ｒ，４Ｓ）−エステル：３６０ｍｇ，収率３６％；９９％以上のエナンチオマー過剰；［α］D25＝−７．５°（ｃ＝０．１３３、エタノール）を得た。
【００３５】
（実施例５）
光学的にエンリッチな酸およびエステルを生成するのに使用するための、ベンジル保護されたラセミトランスラクタムメチルまたはトリフルオロメチルエステルＩの酵素による分割を同定するための一般方法を、以下に記載する。
【００３６】
酵素スクリーニング反応を、１．０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含む０．６ｍｌのＴＢＭＥの２相系を使用して実施した。酵素（典型的に、５０〜２００ｍｇまたは１００〜２００μＬ）をこの懸濁液に添加し、次いで１４．４ｍｇのメチルエステルを添加した。この混合物を、室温で攪拌（３５０ｒｐｍ）した。これらの反応条件からのいくつかの違い（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を、表３に示されるように評価した。物質を遠心分離により相を分離することによって回収し、そして産物および未反応の出発物質を、キラルＨＰＬＣにより分析した。ラセミトランスラクタムメチルエステルＩの選択的な加水分解により、酸ＩＩｂおよびエステルＩｂが得られることを示す酵素を、表３に要約する。
【００３７】
（表３．光学的にエンリッチなエステルＩｂおよび酸ＩＩｂを得るための、ベンジル保護ラセミトランスラクタムメチルエステルＩの酵素による分割）
【００３８】
【表３】
0003703719.tif 000012
0003703719.tif 000013
★条件：エステル（５０ｍｇ）、酵素（５０ｍｇ）、ＴＢＭＥ／リン酸緩衝液（ｐＨ７）（１ｍＬ：１ｍＬ）、３００ｒｐｍ、ＲＴ。
＃条件：エステル（１９ｍｇ）、酵素（１ｍｇ）、テトラヒドロフラン／０．５ＭのＭＯＰＳ緩衝液ｐＨ７．０（０．２／１．０ｍＬ）。
【００３９】
類似の手順を、ベンジル保護したラセミトランスラクタムトリフルオロエチルエステルＩを使用して実施した。酵素反応を、１．０ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を含む１．０ｍｌのＴＢＭＥの２相系を使用して実施した。約５０ｍｇの酵素および５０ｍｇのエステルを、この懸濁液に添加し、そして１８６時間まで、室温で攪拌（３００ｒｐｍ）により混合した。物質を遠心分離により相を分離することによって回収し、そして産物および未反応の出発物質を、キラルＨＰＬＣにより分析した。ラセミトランスラクタムトリフルオロエチルエステルＩの選択的な加水分解により、酸ＩＩｂおよびエステルＩｂが得られることを示す酵素を、表４に要約する。
【００４０】
（表４．光学的にエンリッチなエステルＩｂおよび酸ＩＩｂを得るための、ベンジル保護ラセミトランスラクタムトリフルオロエチルエステルＩの酵素による分割）
【００４１】
【表４】
0003703719.tif 000014
（実施例６）
ベンジル保護したラセミトランスラクタムメチルエステルの酵素による分割から誘導されるエステルＩｂのミリグラム量を、以下に記載するように調製した。
【００４２】
【化１１】
0003703719.tif 000015
ＴｏｙｏｂｏＬＰＬ−３１１（Ａ型）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）（２０２ｍｇ）を、室温で、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）（８ｍＬ）中に溶解した。ラセミメチルエステル（１９９．５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）のＴＢＭＥ（８ｍＬ）溶液を添加した。２相の混合物を、３７℃で１８７時間、２５０ｒｐｍで振盪した。この反応混合物を、０．５ＭのＨ2ＳＯ4（１ｍＬ）で酸性化し、水（１５ｍＬ）で希釈し、そして２本の遠心管に配置した。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を、各管に添加し、そしてこの管を振盪し、次いで３０００ｒｐｍで０．５時間、遠心分離した。有機相を除去し、そして抽出／遠心分離を２回繰り返した。合わせた有機抽出物を、エバポレートし、そして粗産物をシリカゲルカラム（Ｓｅｌｅｃｔｏ  ３２−６３メッシュ；２０ｇ）に配置し、そして３０％（３００ｍＬ）および５０％（４００ｍＬ）のＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶出した（約２０ｍＬの収集分画）。分画４〜６を合わせて、エバポレートし、（３Ｒ，４Ｓ）−メチルエステルを得た：８９ｍｇ、４４．６％；９５．１％のエナンチオマー過剰；［α］D25＝−１４．１５°（Ｃ＝０．８９、エタノール）。分画１１〜１９から（３Ｓ，４Ｒ）−酸を得た：３９ｍｇ、２０．２％、８４．５％のエナンチオマー過剰；［α］D25＝＋１４．８７°（０．３９、エタノール）。
【００４３】
（実施例７）
ベンジル保護したラセミトランスラクタムトリフルオロメチルエステルの酵素による分割、続くトリフルオロエチルエステルの加水分解から誘導される酸ＩＩａのミリグラム量を、以下に記載するように調製した。
【００４４】
（工程１：）
【００４５】
【化１２】
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ＴｏｙｏｂｏＬＰＬ−３１１（Ａ型）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）（３６５ｍｇ）を、室温で、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）（１６ｍＬ）中に溶解した。ラセミトリフルオロエチルエステル（４２８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のＴＢＭＥ（１６ｍＬ）溶液を添加した。２相の混合物を、３７℃で７．７５時間、２５０ｒｐｍで振盪し、次いで冷蔵庫に一晩保存した。この反応混合物を、０．５ＭのＨ2ＳＯ4（１ｍＬ）で酸性化し、水（５０ｍＬ）で希釈し、そして４本の遠心管に配置した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を、各管に添加し、そしてこの管を振盪し、次いで３０００ｒｐｍで０．５時間、遠心分離した。有機相を除去し、そして抽出／遠心分離を２回繰り返した。合わせた有機抽出物を、エバポレートし、そして粗産物をシリカゲルカラム（Ｓｅｌｅｃｔｏ  ３２−６３メッシュ；３５ｇ）に配置し、そして３０％（４５０ｍＬ）および５０％（６００ｍＬ）のＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶出した（約２０ｍＬの収集分画）。分画５〜７を合わせて、エバポレートし、（３Ｒ，４Ｓ）−エチルエステルを得た：１９１ｍｇ、４４．６％；９９．０％のエナンチオマー過剰；［α］D25＝−９．３１°（Ｃ＝１．８８、エタノール）。分画１８〜３６から（３Ｓ，４Ｒ）−酸を得た：１００ｍｇ、２７．９％、８８．３％のエナンチオマー過剰；［α］D25＝＋１５．９６°（０．９９、エタノール）。
【００４６】
（工程２：）
【００４７】
【化１３】
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（３Ｒ，４Ｓ）−トリフルオロエチルエステル（１８１ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）（９９．０％ｅｅ）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解し、そして氷浴中で０℃まで冷却した。ＬｉＯＨ（５２．５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そしてこの混合物を０℃で３．２５時間攪拌し、この時のＨＰＬＣにより完全な加水分解を示した。この反応混合物を、０．５ＭのＨ2ＳＯ4（１２ｍＬ）で酸性化し、そしてＥｔＯＡｃ（２×１５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、飽和ＮａＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）し、濾過し、そしてエバポレートした：１４６ｍｇ、９６．４％；９８．２％エナンチオマー過剰。
【００４８】
粗産物のサンプルを、５０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタンで溶出する分取用のＴＬＣ（Ａｎａｌｔｅｃｈ  Ｕｎｉｐｌａｔｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ＧＦ；２０×２０ｃｍ；１０００μｍ）により精製した：［α］D25＝−１６．５２°（ｃ＝０．６６、エタノール）。