(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド配列またはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドによってコードされ、E2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能なタンパク質；または
（ｃ）E2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能な（ａ）または（ｂ）の断片；
を含み、細胞の天然環境で会合し得るポリペプチドを含まない、実質的に単離された形態のポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、E2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能なDP−１ポリペプチドまたはその断片であり、前記DP−１ポリペプチドはSDSポリアクリルアミドゲル上の見かけ分子量が約46,000であり、かつ配列番号２の残基84−204を含む配列で示されるDNA結合ドメインを含むタンパク質、または配列番号１に示すヌクレオチド配列もしくはその相補的にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドによってコードされるその変異体として定義される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
組換え発現法により調製された、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
顕示標識をもつか、及び／または固相に固定された、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつE2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能なポリペプチドをコードする、実質的に単離された形態のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、複製可能な組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリペプチドと結合可能な抗体。
【請求項９】
顕示標識をもつ、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体である、請求項８または９に記載の抗体。
【請求項１１】
試料中の請求項１または２に記載のポリペプチドの存在または不在を検出するためのイムノアッセイであって、
（ａ）請求項８〜10のいずれか１項に記載の抗体を供給し；
（ｂ）試料を該抗体と共に、抗体−抗原複合体の形成を可能とする条件下でインキュベートし；そして
（ｃ）該抗体−抗原複合体を検出する
ことを含むイムノアッセイ。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸番号160−220のアミノ酸を含む配列番号２のポリペプチド断片、またはE2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能なその断片。
【請求項１３】
増殖性またはウイルス性疾患を治療するための推定上の化学療法剤を同定するためのスクリーニングアッセイ方法であって、
（Ａ）以下の成分：
（ｉ）請求項１（ａ）−（ｃ）または請求項２に記載のDP−１ポリペプチド；
（ii）（ａ）E2F−１タンパク質；
（ｂ）配列番号２のタンパク質と機能性トランス活性化複合体を形成することが可能な（ａ）の断片；または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む融合タンパク質；および
（iii）推定上の化学療法剤；
を成分（ｉ）および（ii）が成分（iii）の不在下で複合体を形成する条件下で接触させ、そして
（Ｂ）成分（iii）がどの程度まで該複合体の活性を破壊または阻止できるかを測定する；
ことを含むスクリーニングアッセイ方法。
【請求項１４】
前記DP−１ポリペプチドが、SDSポリアクリルアミドゲル上の見かけ分子量が約46,000であり、かつ配列番号１のヌクレオチド304−666で示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列によってコードされる配列で示されるDNA結合ドメインを含むポリペプチド、またはE2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能なその断片である、請求項13に記載のアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な転写因子、その産生ならびに使用に関する。
細胞周期中に起こる分子的現象（event）は、遺伝子発現が細胞周期の進行と同時に起こりうるように、転写装置に調和させる必要がある。最近、DRTE1またはE2Fと呼ばれる転写因子が同定され、この因子は癌抑制遺伝子すなわち腫瘍サプレッサー遺伝子である網膜芽腫感受性遺伝子のタンパク質産物pRbに結合することが示された（例えば、WagnarおよびGreen,Nature352,189−190,1991参照）。細胞性転写因子DRTF1/E2Fは、細胞周期制御において鍵となる構成要素（key component）として機能すると広く信じられている。なぜなら、この転写因子は重要な細胞周期調節タンパク質、例えば、網膜芽腫遺伝子産物（pRb）、p107、サイクリン、およびサイクリン依存性キナーゼ等と結合するからであり、さらにまた、その転写活性がある種のウイルス性癌タンパク質、例えば、アデノウイルスEla、SV40大型Ｔ抗原、およびヒトパピローマウイルスE7タンパク質等によって変調されるからである。
転写因子DRTF1/E2Fは、細胞周期現象を転写装置に調和させるのに重要な役割を果たしていると考えられる。なぜなら、哺乳動物細胞の細胞周期進行中に、この転写因子は細胞増殖の重要な調節物質であることが知られている複数の分子との一連の周期的相互作用を経るからである。例えば、G1期からＳ期への進行を負に調節し、そしてしばしば癌細胞中では修飾されている網膜芽腫サプレッサー遺伝子産物（pRb）は、DRTF1/E2Fに結合する。同様に、pRb関連タンパク質p107は、DRTF1/E2FとのＳ期複合体として主に存在する。pRbおよびp107は両方とも、DRTF1/E2Fの転写活性を抑制する。この事は、細胞増殖を調節するのに根本的に重要であるらしい。なぜなら、DRTF1/E2F結合部位（E2F部位）は増殖に関与する種々の遺伝子、例えば、ｃ−mycおよびp34cdc2等の制御領域に存在するからである。さらに、癌細胞より単離された対立遺伝子によってコードされる変異体Rbタンパク質は、DRTF1/E2Fと結合せず、よってE2F部位依存性転写活性化を妨げることはできない。DRTF1/E2Fの別の重要な特徴は、ある種のウイルス性癌タンパク質（例えば、アデノウイルスのE1a、SV40の大型Ｔ抗原、およびヒトパピローマウイルスのE7等）がpRbおよびp107を不活性な転写因子から隔離することによってDRTF1/E2Fの活性を変調することである。この効果は、これらウイルス性タンパク質の中に、組織培養細胞の形質転換および増殖コントロールの克服のために必要な領域を要求する。したがって、これらの癌タンパク質がDRTF1/E2Fを調節する能力は、それらが細胞増殖コントロールの正常な作用機構を狂わす手段となっているかもしれず、また逆にpRbによる転写抑制は、pRbが仲介する負の増殖コントロールの基礎であるかもしれない。
pRbおよびp107の持つ転写制御特性を他の細胞周期現象と調和させるための可能性のある作用機構が、DRTF1/E2F複合体中のサイクリンＡおよびcdc2関連サイクリン依存性キナーゼp33cdk2の同定によって示唆された。サイクリンＡは、Ｓ期からの進行に必要で、この進行はサイクリン依存性キナーゼp33cdk2をDRTF1/E2Fに補充するサイクリンＡの能力によっておそらく仲介され得るであろう機能である。これらのデータを考え合わせると、DRTF1/E2Fはその主な役割が細胞周期現象をpRb、p107、サイクリンおよびcdk等の分子を介して転写装置に中継する転写因子であり、こうして遺伝子発現が細胞周期の進行と同時になり、それと調和することを確実にすることが示唆される。
より最近になって、E2Fの特性を有する転写因子がクローン化され、配列決定された（Helinら、Cell70（1992）,337−350およびKaelinら、Cell70（1992）,351−364）。
今回、本発明者らは、驚くべきことに、E2Fと呼ばれるタンパク質が、Helinら、およびKaelinらによってクローン化された因子と、cDNA配列が配列番号２として以下に示される新規なタンパク質とから成る因子の複合体であることを見いだした。このタンパク質（E2F）をコードするcDNA配列を配列番号１として以下に示す。上記の新規タンパク質は、発明者らによってDP−１と呼ばれる。いかなる特定の理論によっても縛られたくないが、Helinら、およびKaelinらによってクローン化された因子は、DP−１と二量体化しうると考えられる。本明細書の実施例に提示される証拠が、DP−１およびHelinらのタンパク質（E2F−１と呼ばれる）は転写の制御に関与する複合体を形成することを示す。
また、E2F−１は、関連転写因子成分のファミリーのメンバーであることが判明した。このファミリーのメンバーは、DP−１と相互作用して、一連の上記転写因子を形成すると考えられている。
【図面の簡単な説明】
図１は、F9 EC細胞由来のDP−１タンパク質のアフィニティー精製の結果を示す。
図２は、DP−１がE2F複合体におけるDNA結合ポリペプチドであることを示す。
図３は、DP−１の配列特異的DNA結合を示す。
図４は、DP−１とE2F−１との比較を示す。
図4bおよび図4cにおけるDP−１配列は、それぞれ配列番号11および13に対応し、図4bおよび図4cにおけるE2F−１配列は、それぞれ配列番号12および14に対応する。
図５は、DP−１がE2F部位依存性転写をin vivoで活性化することを示す。実験に用いた構築物および得られた結果を要約するものである。
図６は、DP−１およびE2F−１が同一のタンパク質複合体中にin vivoで存在することを示す。
図７は、DP−１およびE2F−１が１つの複合体としてE2F部位に結合することを示す。
図８は、酵母細胞におけるDP−１とE2F−１との相互作用を示す。
図９は、ショウジョウバエ細胞においてDP−１とE2F−１の間に、機能的共同作用があることを示す。
図10は、DP−１がF9 EC細胞においてE2F部位依存性転写に寄与していることを示す。
図11は、DP−１およびE2F−１が酵母細胞におけるE2F部位依存性転写を活性化することを示す。
よって本発明は、配列番号１、または配列番号１の相補体（complement）と選択的にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチドの連続配列を含有する、実質的に単離された形態のポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のDNA、および配列番号１と選択的にハイブリダイズすることが可能なその断片を含む。本発明の別な態様は、配列番号２のタンパク質をコードするDNAまたはその断片を提供する。
上記のポリヌクレオチドはRNAであってもよい。また、このポリヌクレオチドは、その内部に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドへの多数の異なるタイプの修飾が、当分野の技術で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の3'および／または5'末端へのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。本発明の目的のためには、ここに記述されるオリゴヌクレオチドは、当分野の技術で利用可能な任意の方法によって修飾されうることが理解されるはずである。このような修飾は、治療方法に用いられる本発明のオリゴヌクレオチドのin vivo活性または寿命を増大させるために実施することができる。
配列番号１のDNAと選択的にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、一般的には少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、60または100もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドからなる領域にわたって、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80または90％、そしてより好ましくは少なくとも95％、配列番号１のDNAと相同性である。このようなポリヌクレオチドを、これ以後、本発明のポリヌクレオチドと称することにする。
本発明のポリヌクレオチドは、身体の自然環境のもとではそれらと結合しているかもしれない他のポリヌクレオチドを含まない形態で存在するならば、実質的に単離された形態にある。このポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの意図された目的を妨げな担体または希釈剤と混合することが可能で、この混合後もなお実質的に単離されていると見なされることが理解されるであろう。
本発明のポリヌクレオチドは、プライマー（例えば、PCRプライマー）、およびプローブ〔例えば、放射性または非放射性標識を用いる従来の手段によって顕示（revealing）標識で標識化されたプローブ〕の作成に使用することができる。または、このポリヌクレオチドをベクター中にクローン化することも可能である。このようなプライマー、プローブおよび配列番号１のDNAの他の断片は、長さが少なくとも15、好ましくは少なくとも20、例えば少なくとも25、30、または40ヌクレオチドであり、そしてこれらもまた本明細書で用いられる「本発明のポリヌクレオチド」という表現に包含される。
DNAポリヌクレオチドのような本発明のポリヌクレオチドは、組換えによって、合成によって、または当業者にとって利用可能な任意の手段によって作成可能である。このポリヌクレオチドは、ここに開示する技法を参考にしてクローン化することも可能である。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドおよびその相補体を含有する２本鎖ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の別な態様は、本発明のポリヌクレオチド、特にDNAまたはRNAポリヌクレオチドの複製および発現のためのベクターを提供する。これらのベクターは、複製起点、場合により上記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターの調節物質を備えた、例えばプラスミド、ウイルスまたはファージベクターでありうる。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子（例えば、細菌のプラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳類のベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子）を含有することが出来る。ベクターは、例えばRNAの産生のために、または宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するため、in vitroで使用できる。ベクターは、例えば遺伝子治療法において、in vivoで使用するために適合させることも可能である。
本発明の別な態様は、本発明のポリヌクレオチドの複製および発現のための配列番号１のDNAまたはそのオープンリーディングフレームを含むベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、上記ベクターと適合するように選択され、例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞でありうる。
本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスRNAの産生を提供するため、アンチセンス方向に上記のベクター内に挿入することも可能である。アンチセンスRNAまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドは、合成的手段によって作成することも可能である。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞における配列番号２のタンパク質のレベルをコントロールする方法に使用できる。このような方法は、DP−１  mRNAのタンパク質への翻訳を阻止する、またはそのレベルを低下させるのに有効な量のアンチセンスポリヌクレオチドを細胞内に導入する過程を含む。その細胞は、癌細胞のように、制御されない状態で増殖している細胞でありうる。
本発明はさらに、哺乳動物の転写因子として機能することが可能な、配列番号２、その相同体、およびその配列の断片ならびにその相同体のタンパク質を提供する。特に、本発明は以下のものを含有する実質的に単離された形態のポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２のタンパク質；または
（ｂ）その対立遺伝子変異体または種相同体（species homologue）；または
（ｃ）（ａ）に少なくとも70％相同なタンパク質；または
（ｄ）E2F−１タンパク質またはその関連ファミリーメンバーと複合体を形成することが可能な、（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片；または
（ｅ）少なくとも15アミノ酸からなる、（ａ）から（ｃ）のいずれかの断片。
この定義の範囲内にあるすべてのポリペプチドは、以後、本発明のポリペプチドと称する。
本発明のポリペプチドは、身体の自然環境のもとではそれらと結合しているかもしれない他のポリペプチドを含まない形態で存在するならば、実質的に単離された形態にある。このポリペプチドは、このポリペプチドの意図された目的を妨げない担体または希釈剤と混合することが可能で、この混合後もなお実質的に単離されていると見なされることが理解されるであろう。
本発明のポリペプチドは、実質的に精製された形態で存在することも可能である。その場合、この形態は一般的に、調製物中のポリペプチドの90％以上（例えば95％、98％または99％）が本発明のポリペプチドである調製物中にこのポリペプチドを含有する。
本発明のポリペプチドの対立遺伝子変異体は、ネズミ科動物において天然に存在する変異体であって、配列番号２のタンパク質と実質的に同様な方法で遺伝子発現を調節するために機能する変異体である。同様に、配列番号２のタンパク質の種相同体は、別の動物種（ヒトを含む）に天然に存在する対応タンパク質であって、その種において、配列番号２のDP−１タンパク質がネズミ科動物において果たすのと同等の機能を果たす対応タンパク質である。任意の１動物種内において、相同体は数個の対立遺伝子変異体として存在することがあり、これらはすべて配列番号２タンパク質の相同体であると見なされる。対立遺伝子変異体および種相同体は、ここに記述する配列番号２のタンパク質を産生するための手順にしたがって、例えば対立遺伝子変異体を有する齧歯動物または他の種由来の適切な細胞源を用いてその手順を実施することにより、得ることができる。上記のタンパク質は進化の過程で保存されてきたように思われるので、対立遺伝子または種変異体をコードするクローンを得るために、本発明のポリヌクレオチドをプローブとして用いて齧歯動物または他の細胞から作成されたライブラリーを釣り上げることも可能であろう。それらのクローンは、本発明のポリペプチドを同定するための、従来の技法によって操作することが可能である。そして次に、そのポリペプチドをそれ自体は公知の組換えまたは合成技法によって産生することが可能である。好ましい種相同体は、哺乳動物または水陸両生動物の種相同体である。
配列番号２に少なくとも70％相同なタンパク質は、配列番号２のタンパク質と、少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、60または100もしくはそれ以上の連続するアミノ酸からなる領域にわたって、好ましくは少なくとも80％または90％、より好ましくは少なくとも95％、相同である。タンパク質の相同性を測定する方法は当分野の技術において周知であり、本文において、相同性はアミノ酸同一性〔時々「ハードホモロジー」（hard homology）と称される〕に基づいて計算されることが当業者には理解されるであろう。
一般的に、E2F−１タンパク質と複合体を形成することが可能な、配列番号２の断片、またはその対立遺伝子変異体、またはその種相同体は、長さが少なくとも10、好ましくは少なくとも15、例えば少なくとも20、25、30、40、50または60アミノ酸であろう。
断片がE2F−１タンパク質と複合体を形成するかどうかは、E2F−１タンパク質および断片を、E2F−１タンパク質とDP−１が通常トランス活性化転写因子を形成する条件下に置き、複合体が形成されたかどうかを確認することによって決定することが可能であろう。この決定は、例えば、その複合体がin vitroでE2F結合部位と結合する能力を測定することによって、または、その推定上の複合体の分子量をSDS−PAGE等の方法によって測定することによって行うことができる。
好ましい断片には、E2F−１またはその関連ファミリーメンバーと、トランス活性化複合体を形成することが可能な断片が含まれる。本明細書の実施例には、DP−１タンパク質の機能を分析する多数の方法が記述されている。これらの方法は、あるポリペプチドがE2F−１タンパク質とトランス活性化複合体を形成できるかどうかを評価するために、適合させることが可能である。例えば、断片を、図10に示されるDP−1/E2F−１複合体によって活性化されるように適合させたレポーター遺伝子構築物の存在下で、E2F−１に添加することができる。このような実験から、そのポリペプチド断片が必要な活性を有するかどうかを判定できるだろう。
本発明のポリペプチドは、顕示標識によって標識化することができる。顕示標識は、そのポリペプチドの検出を可能とする任意の適切な標識でありうる。適切な標識は、放射性同位体（例えば125I）、酵素、抗体およびビオチン等のリンカーを含む。本発明の標識化ポリペプチドは、試料中のDP−１タンパク質の量を測定するためのイムノアッセイ等の診断処置に使用できる。
本発明のポリペプチドまたは標識化ポリペプチドは、例えばイムノアッセイ皿の壁などの、固相に固定することもできる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば２本鎖DNAポリヌクレオチド）を提供する。このようなポリヌクレオチドは、組換え複製ベクターに組み込むことができる。このベクターはDNAを複製するのに使用できる。好ましくは、ベクター中のDNAは、コード配列の発現を宿主細胞によってもたらすことが可能な制御配列に、機能しうる形で連結される。「機能しうる形で連結される（operably linked）」という表現は、記述された複数の構成要素が、意図された方法で機能することを可能にする関係で存在している並置をいう。コード配列に「機能しうる形で連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法で連結される。このようなベクターを前述のように適切な宿主細胞中に導入して、本発明のポリペプチドの発現をもたらすことが可能である。
したがって、本発明は別な側面において、本発明のポリペプチドを調製する方法を提供する。この方法は、前述のように発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現をもたらす条件下で培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することを含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を提供する。本発明はさらに、配列番号２のタンパク質または本発明のポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する方法を提供する。モノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技法により免疫原として上記のタンパク質またはそのペプチド断片を使用して調製することができる。ポリクローナル抗体もまた、宿主動物（例えば、ラットまたはウサギ）に本発明のペプチドを接種し、免疫血清を回収することを含む従来の手段によって調製することができる。
抗原結合活性を保持している本発明のモノクローナル抗体の断片、例えばFv、Ｆ（ab'）およびＦ（ab2）’断片は、本発明の別な側面を形成する。さらに、本発明のモノクローナル抗体を分析し（例えば、そのような抗体を発現する遺伝子のDNA配列解析によって分析し）、そして、例えばEP−Ａ−0239400（Winter）に開示されている方法にしたがって、本発明の抗体の相補性決定領域を有するヒト化抗体を作成することができる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドと共に担体または希釈剤を含有する組成物を提供する。このような組成物には医薬組成物が含まれ、この場合上記担体または希釈剤は製薬上許容されるものである。
本発明はさらに、本発明の抗体またはその断片と共に担体または希釈剤を含有する組成物を提供する。このような組成物には医薬組成物が含まれ、この場合上記担体または希釈剤は製薬上許容されるものである。
製薬上許容される担体または希釈剤は、経口、直腸、鼻、局所（頬および舌下を含む）、膣または腸管外（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内および硬膜上を含む）投与に適する製剤に使用される単体または希釈剤を含む。これらの製剤は、単位剤形として好都合に提供することができ、製薬技術において周知の任意の方法によって調製することができる。このような方法は、有効成分を、１つまたは複数の補助成分を構成する担体と会合させる過程を含む。一般的に、これらの製剤は有効成分を均一に、かつ密接に液体担体または微細に分割した固体担体またはその両方に会合させ、次に必要であれば生成物を成形して調製される。
例えば、腸管外投与に適する製剤は、以下のものを含む。すなわち、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および該製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性無菌注射液；および、懸濁化剤ならびに増粘剤、およびポリペプチドを標的の血液成分または１つあるいは複数の臓器に向けるように設計されたリポソーム又は他の微粒子系を含むことができる、水性および非水性無菌懸濁液である。
本発明のペプチド、本発明のペプチドに対する抗体またはその断片、および上記の組成物は、ヒトを含む哺乳動物における増殖性疾患を含む症状の治療、調節または診断に使用することができる。このような症状は、１つまたは複数の転写因子（例えば、Helinらによってクローン化されたE2F因子、または配列番号２のタンパク質、またはE2F−１タンパク質、または関連ファミリーメンバー等）の異常な（例えば、常軌を逸した高レベルまたは低レベルの）および／または迷入性の（例えば、遺伝子配列の突然変異による）発現に伴う症状を含む。これらの症状はまた、その遺伝子産物が配列番号２のタンパク質によって調節される遺伝子の異常な発現によってもたらされる症状をも含む。上記のペプチド、抗体、その断片、および組成物を用いた症状の治療または調節は、通常そのような治療を必要とする受容者に有効量のポリペプチド、抗体、その断片または組成物を投与することを含む。
本発明のポリペプチドの好ましい１群は、配列番号２のアミノ酸第160〜220番の領域に基づくポリペプチドである。上記タンパク質のこの領域は、Helinら（同上）によって記述されるE2F−１タンパク質の類似領域に対し約40％の相同性を有し、また両領域とも推定上のα−ヘツドリックス領域である。いかなる特定の学説に縛られることも望まないが、本発明者らはE2Fと本発明のタンパク質とのヘテロ二量化は、これらの相同領域によって仲介されると信じる。したがって、本発明の好ましい態様は、E2F−１−配列番号２タンパク質複合体の形成を破壊させることにより転写因子の活性化を阻止する方法に使用するための、上記の領域に基づく本発明のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。
本発明はまた、上記の効果を達成するために、配列番号２の上記領域に標的を定めた抗体およびその断片を提供する。
本発明はさらに、試料中の本発明のポリペプチドの存在または不在を検出するためのイムノアッセイを提供する。このイムノアッセイは：
（ａ）本発明の抗体を供給し；
（ｂ）試料を該抗体と共に、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；そして
（ｃ）該抗体−抗原複合体を検出する
ことを含む。
本発明の別の側面において、本発明は、増殖性またはウイルス性疾患を治療するための推定上の化学療法剤を同定するための新規なアッセイを提供する。このアッセイは、E2F−１タンパク質またはその誘導体、本発明のポリペプチド、および推定上の化学療法剤を接触させ、該化学療法剤によるE2F−１−配列番号２タンパク質複合体の形成阻止の程度を測定することを含む。このアッセイにおいては、該化学療法剤の不在下においてアッセイの条件下でE2F−１および配列番号２タンパク質がヘテロ二重体を形成するように、それぞれ十分な量が提供されるならば、完全なE2F−１および／または配列番号２タンパク質を使用する必要はないであろう。このように、本発明は、増殖性疾患を治療するための推定上の化学療法剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、
（Ａ）以下の成分：
（ｉ）本発明のポリペプチド、
（ii）（ａ）E2F−１タンパク質、または
（ｂ）該タンパク質の対立遺伝子変異体または種相同体、または
（ｃ）DNA結合領域において少なくとも70％の相同性を有するE2F−１ファミリーのメンバー、または
（ｄ）配列番号２のタンパク質と機能性トランス作用複合体を形成することが可能な、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の断片；または
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）を含む融合タンパク質；および
（iii）推定上の化学療法剤；
を上記成分（ｉ）および（ii）が成分（iii）の不在下で複合体を形成する条件下で接触させ、そして
（Ｂ）成分（iii）がどの程度まで該複合体を破壊することができるかを測定する
ことを含む。このアッセイでは、上記の３成分の任意の１つまたは複数を、例えば放射性または比色定量標識で標識し、アッセイの結果を測定可能なものとすることができる。推定上の化学療法剤は、本発明のペプチドを含む。
E2F−１タンパク質の変異体、相同体および断片は、DP−１タンパク質の変異体、相同体および断片の定義に対応する方法で定義される。
上記（ｉ）と（ii）との複合体は、例えば、in vitroでE2FDNA結合部位に結合するその能力によって測定できる。または、そのアッセイは、レポーター遺伝子に連結したE2F結合部位を含有するプロモーターを活性化する該複合体の能力を測定するin vivoアッセイであってもよい。このin vivoアッセイは、例えば、酵母、昆虫、水陸両生動物または哺乳動物細胞におけるアッセイを示している実施例を参照して、実施することができる。
かかるアッセイによって測定されうる候補治療剤としては、
（ａ）配列番号２のタンパク質
（ｂ）上記タンパク質の対立遺伝子変異体または種相同体；または
（ｃ）（ａ）に対して少なくとも70％相同なタンパク質の10個以上のアミノ酸から成る断片を挙げることができる。
本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドをコードする核酸を担うベクターは、遺伝子治療法に使用することができる。このような遺伝子治療は、細胞（例えば、癌細胞）の制御されない増殖を治療するのに用いうる。遺伝子治療の方法は、治療を必要とする患者の細胞に、DP−１  mRNAからDP−１タンパク質への翻訳を阻止または減少させるための本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、またはDP−１とE2F−１もしくは関連ファミリーメンバーとの結合を妨げるポリペプチドを細胞内で発現できる、有効量のベクターを送達（デリバリー）することを含む。
そのベクターは、適切にはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、癌細胞を標的とするのに適切な、当分野の技術で利用可能な任意のベクターでありうる。例えば、Huberら［Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991）88,8039］は、肝癌、乳房、結腸または皮膚細胞の形質転換のためにアンフォトロフィック（amphotrophic）なレトロウイルスの使用を報告している。Culverら［Science（1992）256;1550−1552］もまた、Ramら［Cancer Research（1993）53;83−88］同様、ウイルス特異的（virus−directed）酵素プロドラッグ療法におけるレトロウイルスベクターの使用を記述している。Englehardtら［Nature Genetics（1993）4;27−34］は、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス産物（CFTR）を細胞へ送達するのに、アデノウイルスに基づくベクターの使用を記述している。
配列番号２のタンパク質は、細胞中で細胞質と核の両方に分布していることが判明した。タンパク質が細胞質から核へ運ばれるためには、そのタンパク質のプロセシング〔例えば、リン酸化またはタンパク質分解クリッピング（clipping）等〕が起こるのが普通である。リン酸化を阻止する化合物は当分野の技術で公知である。タンパク質分解クリッピングを阻止する化合物には、クリッピングに関与する酵素を阻止するようにアンタゴニストとして作用する本発明のペプチドが含まれうる。したがって、本発明は別な側面において、配列番号２のタンパク質の細胞質から細胞核への輸送を阻止する方法に使用するための、リン酸化またはタンパク質分解クリッピングを阻止する化合物を提供する。
以下に述べる実施例は、マウス源由来の本発明の新規タンパク質およびDNAの単離ならびに特徴付けを記述する。しかし、他の源、例えばヒトまたは他の哺乳動物も、本発明の範囲内にあり、また、上記タンパク質のヒトまたは他の哺乳動物における相同体は類似の方法で単離可能である。
実施例
セクションＡ
F9  EC細胞由来のDRTF1/E2Fのアフィニティー精製
アフィニティー精製したDRTF1/E2F（約5x1010個のF9  EC細胞由来の約５μｇ）中のポリペプチドを、図１（トラック２）に示すようにSDSゲル電気泳動により分離し、クーマシーブルーで染色した；トラック１は分子量基準を示す。アフィニティー精製したDRTF1/E2F中のDNA結合ポリペプチドを、競合する野性型（トラック５）または変異型（トラック６）のE2F結合部位の不在下で（トラック４）、または存在下で、アデノウイルスE2Aプロモーター遠位E2A部位（結合部位の詳細は図に示されている）に架橋することによってアッセイした；分子量基準をトラック３に示す。p46ポリペプチドが示されている；上部の括弧は、分子量約55,000で、これもまたE2F部位に特異的に結合するペプチドの別の１群を示す。
方法:DRTF1/E2Fを、F9  EC細胞より調製した全細胞抽出物から、ShivjiおよびLa Thangue（1991）Mol.Cell.Biol.11,1686−1695が記述するように、アデノウイルスE2Aプロモーター（−71から−50）より取った野性型E2F部位を含有するアフィニティーマトリックスを用いてアフィニティー精製した。その際、結合活性を、変異型E2F結合部位（ヌクレオチド−62から−60において変異させた）を含有するマトリックスにアプライすることを含む、１つの付加的工程を含めた。平均で、約5.0μｇのタンパク質が、約1010個のF9  EC細胞から調製した全細胞抽出物より精製された。DRTF1/E2FのE2F部位へのUV架橋は、約50ngのアフィニティー精製タンパク質を用いて実施した。競合は、約100倍モル過剰の野性型（−71から−50）または変異型（ヌクレオチド−62から−60において変異させた）オリゴヌクレオチドを用いて実施した。
マウスDP−１をコードするcDNAのヌクレオチド配列
アフィニティー精製したDRTF1をTCAを用いて沈降させ、SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、p46を電気溶出させた;p46の純度を、電気泳動ならびに溶出させた物質の少量を銀染色することにより確認した。p46をリシルエンドペプチダーゼで切断し、ペプチドをAquapore AX−300およびRP−300を連続して0.1％TFA中で１％/minのアセトニトリル勾配で使用する高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ピークフラクションを477A/120A気−液パルスシークエンサー（Applied Biosystems社）で自動化エドマン分解により配列決定した。
１組の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、ペプチド６（75から91）およびペプチド５（235から249）のアミノ酸配列に基づいて以下のように合成した：すなわちペプチド６のＣ末端領域（PNTHFV）（配列番号３）、5'CGCGGATCCCC（ACGT）AA（CT）AC（ACGT）CA（CT）TT（CT）GT3'（配列番号４）およびペプチド５のＣ末端領域（AQESQN）（配列番号５）、アンチセンス鎖、5'CGCGGATCCA（AG）（AG）TT（CT）TG（ACGT）（CG）（AT）−（CT）TC（CT）TG（ACGT）GC3'（配列番号６）である；これらのオリゴヌクレオチドは両方とも5'末端にリンカー配列を含んでいた。ペプチド５のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、F9  EC細胞RNAからcDNAを合成するのに使用し、このcDNAを次にペプチド６およびペプチド５プライマーの両方と共に、PCRに使用した。PCR産物をサブクローン化し、配列決定を行い、DP−１  RNAから誘導したcDNAをペプチド21および３の存在によって同定した。ペプチド21および３とは、p46から誘導したペプチドをマイクロシークエンシング（microsequencing）して得られた別の２つのペプチドで、ペプチド６と５の間に位置するものである。上記のcDNA断片を、数個のマウスcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用した。DP−１  cDNAクローンは頻繁に再配列されており、図に示した最終ヌクレオチド配列は、あるF9  EC細胞ライブラリーより単離したcDNAから得たものである。
DP−１はDRTF1/E2F中のDNA結合ポリペプチドで、pRbとin vivoで結合する。
ペプチド15（DP−１アミノ酸残基235から249に相当する）およびペプチド（DP−１アミノ酸残基３から15に相当する）をKLHに結合し、ウサギを免疫感作するのに使用した。抗体の作成およびイムノブロッティングを標準的手順により実施した。ゲル遅延アッセイにより、約5.0ngのアフィニティー精製DRTF1/E2Fまたは約5.0μｇのf9  EC粗細胞抽出物を、野性型E2Aプロモーター（−96から68）またはE2Aプロモーター配列−71から−50を含有するオリゴヌクレオチドを用いて、約100倍モル過剰の−62/−60〔−62、−61および−60の位置で突然変異させたE2A配列−71から−50（ref.23）〕の存在下でアッセイした。抗ペプチドＡ血清または前免疫血清をプレインキュベーション期間中に添加した。JM全細胞抽出物からのpRbの免疫沈降を、標準的手順により実施した。IF8免疫沈降物におけるpRbの存在を、イムノブロッティングにより確認した。結果は図２に以下のように示されている：
ａ）  DP−１はアフィニティー純化DRTF1/E2F中に存在する：アフィニティー精製DRTF1/E2Fおよび抗ペプチド15（アミノ酸残基235から249）を用いたイムノブロット。p46およびp55との反応性は、免疫血清（Ｉ、トラック２）にのみ存在し、前免疫血清（PI、トラック３）には存在しなかった。この活性は特異的であった。なぜなら、それはペプチド15によって競合的に阻止されたが、非関連ペプチドであるペプチド１によっては阻止されなかったからである（トラック５と６を比較されたい）。p46はp55（トラック３に示す）の誘導体のようである。なぜなら、抗ペプチドＡ（下記参照、DP−１のＮ未満領域より誘導された）はp55のみを検出したからである（データはここに示していない）。分子量基準はトラック１に示され、＊印は非特異的反応を示す。
ｂ）  DP−１はアフィニティー純化DRTF1/E2F  DNA結合複合体中に存在する：アフィニティー精製DRTF1/E2FおよびアデノウイルスE2Aプロモーター（−96から＋68）を用いて、免疫（トラック３から６）または前免疫（トラック２）抗ペプチドＡの存在下で、非関連ペプチド１（トラック４および６）またはペプチド15（トラック５）も共に存在させて、ゲル遅延を実施した。結合反応の特異性は、100倍モル過剰の野性型E2F結合部位（E2Aプロモーター−71から−50）を反応に含有させることによって確認された（トラック６）；他の反応はすべて100倍過剰の変異型部位を含有した。
ｃ）  DP−１はF9  EC細胞抽出物中のDRTF1/E2F  DNA結合複合体の中に存在する:E2F結合部位（E2Aプロモーター配列−71から−50）を有するF9  EC全細胞抽出物（DRTF1/E2Fは複合体a,bおよびｃとして分割される）を用いて、前免疫（トラック２）または免疫（トラック３）抗ペプチドＡ血清の存在下で、ゲル遅延を実施した。スーパーシフト（super shift）は、結合反応にペプチドＡを含有させることにより防止された（重複するトラック７および８を９および10と比較されたい）。
ｄ）  DP−１はpRbとin vivoで結合する:JM細胞抽出物からの免疫沈降を、抗pRbモノクローナル抗体IF8または対照モノクローナル抗体A7を用いて実施した。免疫沈降物を1.0％デオキシコール酸塩で処理し、界面活性剤で放出させた物質をDRTF1/E2F活性について、上記のようにゲル遅延によってアッセイした。DRTF1/E2F結合活性は、抗pRb免疫沈降物にのみ検出された（トラック２と３を比較されたい）；抗pRbを枯渇させたJM細胞抽出物は、pRb複合体のレベルを減少させた（トラック４と５を比較されたい、複合体はａと表示）。界面活性剤で放出させたDRTF1/E2Fを、さらに抗ペプチドＡとの反応性についてアッセイした。免疫血清はスーパーシフトを生じたが、前免疫血清では生じなかった（トラック６と７を比較されたい；＊印で示してある）。
DP−１は、配列特異的なDNA結合タンパク質である
DP−1cDNAの領域をPCRで増幅し、pGEX−2T（14）にサブクローニングした。GST−DP−184-204ならびにGST−cdk2を、Bandara et al.（1991）Nature,352,249−251に既に記載されているようにして、グルタチオン−セファロース上でアフィニティ精製した。ゲル遅延を、上述のようにして、E2Aプロモーター、あるいはE2A配列の−82から−50までを含むオリゴヌクレオチドを用いて行った。変異型の結合部位は、ヌクレオチド−62、−61、ならびに−60が変化していた。約5.0μｇのGST融合タンパク質を用いて、紫外線による架橋を実施した。
ａ）図示のGST融合タンパク質であり、DP−１タンパク質配列のアミノ酸残基84から204までを含むGST−DP−184-204を発現させ、均質となるまでアフィニティ精製した。トラック１はアフィニティ精製したDP−184-204を示し、トラック２は標準分子量マーカーを示す。
ｂ）DP−１は、E2F結合部位と結合する：アフィニティ精製したGST−DP−184-204（約1.0μｇ）を、E2Aプロモーター（トラック２）、又はE2Fプロモーター配列の−82から−50までを含むオリゴヌクレオチド（WT及びMTの結合部位の詳細については図の下部に記載）（トラック５）若しくはE2Fプロモーター配列の−82から−50までを含み、E2F部位が変異型であるオリゴヌクレオチド（トラック８）のいずれかとともにインキュベートした。対照のGST融合タンパク質であるGST−cdk2（約1.0μｇ）は結合活性を有しておらず（トラック３、６および９）、トラック１、４および７は、タンパク質を含んでいない。
ｃ）DP−１のDNAへの架橋：アフィニティ精製したGST−DP−184-204（トラック４）あるいはGST−cdk2（トラック３）を、E2Aプロモーター配列の−82から−50まで（トラックの下側に図示）とともにインキュベートした。架橋の後、ポリペプチドをSDSゲル電気泳動で分離させた。架橋したGST−DP−184-204を括弧で示す。トラック２では融合タンパク質を加えておらず、トラック１には分子量の標準を示す。
ｄ）アフィニティ精製精製したDRTF1/E2F中のDP−１の結合特性：精製したGST−DP−184-204あるいは対照の融合タンパク質GST−cdk2のE2Aプロモーターとの結合を、単独で（トラック５および6;約1.0μｇ）、あるいはアフィニティ精製したDRTF1/E2Fの存在下のいずれかで（トラック３および４、約5.0μｇ）調べた。同量のアフィニティ精製したDRTF1/E2Fの結合活性をトラック２において単独で調べ、E2Aプロモーターをトラック１に示す。GST−DP−184-204とDRTF1/E2Fとの結合の特徴が、両者を一緒にして調べた場合には異なることに注意されたい（トラック２、３および５を比較のこと）。
DP−１とE2F−１との比較
両者の比較を、以下のように図４に示す。
ａ）DP−１とE2F−１の線図。図には、両者のDNA結合ドメイン（DP−１のアミノ酸残基84から204、ならびにE2F−１のアミノ酸残基89から191、ref.24を参照のこと）と、有意な類似性を有する領域（DAP−１のアミノ酸残基163−236、ならびにE2F−１のアミノ酸残基162−226）の位置が示してある。類似領域が、DNA結合領域の外側の配列も含んでいることに注意されたい。
ｂ）アミノ酸配列の相互対照:DP−１の配列（上側）とE2F−１の配列（下側）の類似領域の比較。縦棒は、アミノ酸残基が同一であること（太線）、あるいは類似していること（細線）を示す。
ｃ）DP−１の類似領域とE2F−１の類似領域は、両親媒性のαへリックスを形成している。DP−１の類似領域（右側、アミノ酸167−183）とE2F−１の類似領域（左側、アミノ酸166−182）を、ヘリックス輪として示す。
DP−１は、インビボで、E2F部位依存性の転写を活性化する
図５（構築物は、ａに図示）に示すように、SAOS−２細胞に、2.0若しくは6.0μｇのpG4、または2.8若しくは8.8μｇのpG−B9（DP−１発現ベクター）を、p3xWT（5.0μｇ）、p3xMT（5.0μｇ）又はpCMVcat（0.5μｇ）とともにコトランスフェクションした。
p3xWTならびにp3xMTレポーター構築物は、アデノウイルスのE2Aプロモーターから取り出した３つの野性型のE2F結合部位あるいは３つの変異型のE2F結合部位（−71から−50で、ヌクレオチド−62、−61及び−60で変異）のいずれかを、最小の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの上流側の位置に含んでおり、これらの構築物は、すでに記載されている。pCMVcatは、ヒトサイトメガロウイルスの即時型遺伝子から取り出したエンハンサーならびにプロモーター領域（−301から＋72）を含んでいる。pG−B9は、DP−１タンパク質のアミノ酸残基63から429までの配列を含んでおり、pG4mpoly IIのGal4DNA結合ドメインを、DP−１のcDNAであるB9で置換することによって調製した。SAOS−２細胞へのトランスフェクションを行い、CAT活性を測定し、TLCプレートをリン光イメージャーによって定量した。
DP−１をコードしているcDNAの単離
F9  EC全細胞抽出物からのDRTF1の精製を、野性型あるいは変異型のいずれかの結合部位を含むDNA結合部位のアフィニティマトリクスに順次適用し、ゲル遅延によってDNA結合活性を調べる（26）という緊縮性の高い方法を使用することによって行った。DNA結合部位は、親和性の高いE2F結合部位を含む領域を、アデノウイルスのE2Aプロモーターから取り出した（−71から−51）。この方法によって、インビトロで、結合部位依存的に転写を効率的に活性化しうる一群のポリペプチド（図１、トラック２）が定常的に精製された。アフィニティ精製物質中のポリペプチドのいくつかは、野性型のE2F部位とは特異的に結合したものの、変異型のE2F部位とは結合しなかった（図１、トラック５と６を比較のこと）。特異的結合を示したポリペプチドのうち最も多量に存在していたポリペプチドは、見かけ分子量が約46kDであった（図１、トラック２、p46と表示）。その後、このp46を切り出し、リシルエンドペプチターゼで消化し、得られたペプチドを精製して配列決定した。10個のペプチドについてのアミノ酸配列が得られた。我々は、これらのペプチドのうち２個をコードしているDNA配列を予測していたので、これらの配列を、F9  ECのRNA由来のcDNA断片を増幅するにあたってのオリゴヌクレオチドプライマーとして使用した。クローニングされたcDNA断片を用いて、いくつかのマウスcDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、F9  ECのcDNAライブラリーから、p46の完全なコード配列を示すクローン（以下ではDP−１と称する）が最終的に単離された。
DP−１の分子特性
2.4kbのcDNA断片から、DP−１の完全なコード配列を決定した。このcDNAは、429個のインフレームのアミノ酸残基をコードするオープン・リーディング・フレームを有しており、その中には、p46の配列決定によって得られたペプチドのうち８つが含まれていた。このcDNA配列は、おそらく開始メチオニンを有しており、これは、このメチオニンのすぐ上流側にインフレームの終止コドンが存在しているからである。さらに、このメチオニンを挟み、包含している一連のヌクレオチドは、効率的な翻訳開始シグナルとなるはずである。これまで単離されたうちで最長のcDNAのクローンは、この想定上の開始メチオニンから、5'方向に55ヌクレオチド延在している。しかし、F9  EC細胞のRNAを用いたプライマー伸長分析で、転写開始部位が250ヌクレオチド上流であることが示されているので、このクローンは、転写開始部位までは延在していない。このcDNAは、約1.1kbの3'側未翻訳配列も含んでおり、その一部を示す。
ポリアデニル化したF9  ECのRNAのノーザン分析によって、DP−１転写物のサイズが約2.6kbであることが推定された。DP−１のRNAは、多種の異なった細胞で構成的に発現されており、また、in situハイブリダイゼーションによって調べると、マウスの胚の発生の間に多岐にわたる組織で構成的に発現されていることが観察された。F9  EC細胞の分化の間、DP−１のRNAは、F9  EC幹細胞が分化するにつれて、周辺的に負に調節されていることが見いだされた。サザン分析によって、DP−１が単一の遺伝子によってコードされていることが示された。
とりあえずアクセス可能なタンパク質のデータベース（Leads and Swiss）で相同性を調べたところ、DP−１と他の全てのタンパク質との間に有意な類似性を見つけることはできなかった。しかし、我々は、DP−１のDNA結合ドメインのうちの狭い領域が、やはりE2F部位に結合する最近特徴付けされたタンパク質であるE2F−１（後述）のDNA結合ドメインのうちの同様な領域と、有意な類似性を有していることがわかった。
DP−１の特徴づけ
DP−１がDRTF1/E2Fの構成成分であることを確認し、DP−１がDRTF1/E2FのDNA結合複合体中に存在しているのかどうかを決定するために、DP−１タンパク質の異なる領域に対して、いくつかの抗ペプチド抗血清を作製した（図２）。アフィニティ精製したDRTF1/E2Fを抗ペプチド15で免疫ブロッティングしたところ、見かけ分子量が46kDならびに55kDの２種のポリペプチドが示された（図2a、トラック２）。反応がペプチド15によって競合的に阻害されるのに対し、非関連ペプチドであるペプチド１によっては阻害されないので（図2a、トラック５と６を比較のこと）、双方のポリペプチドとも、抗血清によって特異的に認識されていた。
別の抗ペプチド血清（抗ペプチドＡ）がゲル遅延検定に及ぼす影響を測定することによって、DP−１がDRTF1/E2F  DNA結合複合体の一部であることを確認した。なお、抗ペプチド15は変性タンパク質とのみ反応するため、こうした検定には使用できなかった。抗ペプチドＡをアフィニティ精製したDRTF1/E2Fとともにインキュベートしたところ、免疫血清ではスーパーシフトがはっきりしていたのに対し、前免疫血清でははっきりしていなかった（図2b、トラック２と３を比較のこと）。このスーパーシフトは特異的であった。何故ならば、ペプチドＡを含むものによって競合的に阻害されるのに対し、非関連のペプチド１を含むものによって阻害されないためである（図2b、トラック４と５を比較のこと）。こうしたゲル遅延条件で分離された結合活性がいずれもE2F結合部位に対して特異的であったので（図2b、トラック４−６を比較のこと）、これらの結果から、DP−１がDRTF1/EF  2DNA結合活性の一部であることがわかる。
抗ペプチド抗体によっても、全細胞抽出物中で、スーパーシフトが生じた。F9  EC細胞抽出物中では、DRTF1は、DRTF1a、ｂ、およびｃと称される一連のDNA−タンパク質複合体として分離される。前免疫血清ではなく抗ペプチドＡを加えると、スーパーシフトが生じ、それとともに、DRTF1a、ｂ、およびｃが減少した（図2c、トラック２および３を比較のこと）、こうした現象は、ペプチドＡで競合させることができた（図2c、トラック７および８をトラック９および10と比較のこと）。同様の効果が、HeLaを含む他種の細胞に由来する多岐にわたる全細胞抽出物で示された。このことから、DP−１が、当初F9  EC細胞抽出物で規定され、HeLa細胞抽出物中でも特徴づけされているDNA結合活性であるDRTF1/E2Fの構成成分であることが示唆された。
DP−１は、インビボで、網膜芽腫の遺伝子産物と会合する
DRTF1/E2Fは、インビトロならびにインビボで、pRbと結合する。DP−１がインビボでpRbと会合するかどうかを決定するために、高レベルのDRTF1/E2F−pRb複合体を含有するヒト白血病細胞株JMから調製した全細胞抽出物からの抗pRbモノクローナル抗体IF8を用いて免疫沈降実験を行った。免疫沈降の後、免疫複合体を穏やかな界面活性剤で処理することによって、DRTF1/E2F  DNA結合活性をpRbから遊離させた。こうした条件下では、DRTF1/E2F  DNA結合活性は、pRb免疫沈降物のみから遊離され、対照抗体の免疫沈降物からは遊離されなかった（図2d、トラック２および３を比較のこと）。pRbと会合したDRTF1/E2F中にDP−１が存在することを、抗ペプチドＡで界面活性剤によって遊離された物質を処理すると、DRTF1/E2Fがスーパーシフトすることによって確認した（図2d、トラック６と８を比較のこと、＊で表示）。このことから、DP−１が、インビボでpRbと会合することが実証された。
DP−１はE2F部位と特異的に結合し、新規なDNA結合ドメインを有している
DP−１がE2F部位と配列特異的に結合しうるのかどうかを決定するために、DP−１をコードしている配列の領域を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質として発現させ、アフィニティ精製し、DNA結合活性について調べた。これまでに、DNA結合活性を保持していると決定された最小の領域は、DP−１タンパク質のアミノ酸残基84から204までの配列を含んでいる（図3a、GST−DP−184-204）。GST−DP−184-204がアデノウイルスのE2Aプロモーターと結合したのに対し、非関連のGST融合体（GST−cdk2）は結合しなかった（図3b、トラック２と３を比較のこと）。また、GST−DP−184-204は、変異型のE2F部位に対してより、野性型のE2F部位に対して効率的に結合したので、DNA結合活性は、E2F部位に対して特異的であった（図3b、トラック５から８を比較のこと）。このように、DP−１は、全細胞抽出物中のDRTF1/E2F、ならびにアフィニティ精製DRTF1/E2F中のp46と類似したDNA結合特異性を有している。対照のGST融合タンパク質は、DNA結合活性を何ら有していなかった（図3b、トラック６から９を比較のこと）。DP−1/DNA複合体の移動度が抗GST血清によって変化したので、DNA結合複合体中にGST−DP−184-204が存在することが確認された。さらに、GST−DP−184-204は、E2F部位と特異的に架橋させることができるという特性も、p46と共通であった（図3c、トラック３と４を比較のこと）。したがって、DP−１は、E2F部位と配列特異的に結合し、このDNA結合特異性に寄与しているのがDRTF1/E2F中のポリペプチドである可能性が高い。
DNA結合ドメインをさらに細かく画定しようとしても、うまくいかなかった。すなわち、DP−１のこの領域は、配列特異的認識を可能とする最小量のタンパク質に近い可能性が高く、したがって、おそらく、DNA結合ドメインを画定している。結局、この領域は、これまで特定されているいずれのDNA結合構造とも関連性がなく、したがって、新たなグループのDNA結合ドメインである。E2F−１のDNA結合ドメイン内に存在する領域と有意な類似性を有し、42％のアミノ酸残基が同一で70％が類似している（図5b）狭い領域（DP−１のアミノ酸残基160から200）が見いだされた（図4a）。二次構造を推定したところ、これらの領域が２つのαヘリックスを有しており、その一方が両親媒性であることが示唆された（図4cにヘリックスの輪として図示）。DP−１とE2F−１の同一のDNA配列と結合するため、この類似領域が、E2F結合部位を構成しているDNA配列の認識に関与している可能性が高い。
この知見は、酵母の細胞周期の間に転写を調節している２種の別のDNA結合タンパク質が、潜在的な類似性を有していることによっても支持される。すなわち、SWI4ならびにcdc10によってコードされている、酵母の出芽ならびに分裂の細胞周期調節タンパク質は、いずれもE2F部位と似たDNA配列と結合し、これらのタンパク質のDNA結合ドメイン内に、上述のDP−1/E2F−１のαヘリックス領域と共通の特徴を有する領域を含んでいる（図4c）。以上のことからすると、このSWI4/cdc10のタンパク質ドメインも、DNA配列の認識に関与している可能性がある。
DP−１とE2F−１との間のもう一つの類似領域が、DNA結合ドメインの外側に見いだされ（DP−１のアミノ酸残基210から240、同一のアミノ酸残基は41％、図4b）、この領域も、前述の領域同様、両親媒性のαヘリックスを形成している可能性がある。この領域も、DNA結合活性に寄与している可能性がある。
DP−184-204は、タンパク質二量体化の作用領域も含んでいる可能性がある。何故ならば、GST−DP−184-204をアフィニティ精製したDRTF1/E2Fに加えると、GST−DP−184-204あるいはアフィニティ精製したDRTF1/E2F単独の場合より移動速度の遅いタンパク質−DNA複合体が生じるのに対し、対照のGST融合タンパク質を加えてもほとんど影響がなかったからである（図3d）。この移動速度の遅い複合体は、GST−DP−184-204が、DP−184-204中に含まれる二量体化ドメインを介して、アフィニティ精製したDRTF1/E2F中の別のタンパク質と相互作用した結果生じたものである可能性が高い。この領域でDP−１とE2F−１との間でタンパク質配列が類似性を有していることからは、E2F−１が、こうした二量体化の相手として強力な候補であることが示唆される。
DP−１は、インビボで転写を活性化する
E2Aプロモーターの遠位のE2F部位（−71から−50）は、最小の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの上流側に位置させると、各種の細胞、たとえばSAOS−２ならびにF9  EC細胞で活性化配列として機能する。DP−１が、E2F部位を介して、転写をトランス活性化しうるか否かを決定するために、DP−１のコード配列（アミノ酸残基63から429）の発現が、３つの野性型E2F結合部位あるいは３つの変異型E2F結合部位のいずれかによってそれぞれ誘導されるレポーター構築物p3xWTならびにp3xMT（図5a）の転写活性に及ぼす影響を調べた。SAOS−２細胞では、pG−B9をp3xWTとともに用いてコンランスフェクションしたところ、p3xWTの転写活性が刺激されたのに対し、プラスミドpG4では影響がなかった（図5b）。同一トランスフェクション条件でも、p3xMTあるいはpCMVcatの活性は有意な影響を受けなかったので、pG−B9による転写の活性化は、野性型のE2F部位に依存性であった（図5bおよびｃ）。このことから、DP−１が、野性型のE2F部位を介して転写を特異的に活性化していることが示された。
このように、DP−１は、各種の細胞ならびに組織から調製された抽出物中で調べられているDRTF1/E2F複合体中に存在する配列特異的なDNA結合タンパク質である。
pRbもp107も、細胞周期依存的にDRTF1/E2Fと結合し、この相互作用によって、DRTF1/E2Fの転写活性が低減する。これらの複合体は、転写活性を有する遊離形態のDRTF1/E2Fとともに、非同調培養の組織培養細胞の抽出物で分離されうるものである。
DP−１タンパク質の驚くべき特徴は、このタンパク質が、DRTF1/E2Fと類似した特性を有する最近記載されたタンパク質であるE2F−１と類似した編成を有していることである。すなわち、これらのタンパク質のDNA結合ドメインならびに類似領域は、タンパク質のそれら以外の部分が極めて異なっているにもかかわらず、極めて似た位置に位置している（図4a）。E2F−１に対する抗体によって、DP−１も含んでいる複合体がスーパーシフトするので、E2F複合体中には、DP−１とE2F−１がともに存在している可能性が高い。こうしたことから想起されるのは、他の転写因子活性、たとえばAP−１に存在するような、極めて異なったタンパク質同士が関連ドメインを介して相互作用するという状況である。しかし、DP−１が、E2F結合部位上で形成されるすべてのDRTF1/E2F複合体中に存在しているのに対し、E2F−１は、抗体スーパーシフト実験で、必ずしもすべての複合体中に存在しているわけではないことが示されたので、DP−１には２種類の相手が存在しており、おそらく、こうした複合体では、E2F−１と似た別のポリペプチドがDP−１とともに存在しているものと考えられる。
セクションＢ
哺乳動物細胞の細胞周期の調節では、細胞転写因子DRTF1/E2Fが重要な役割を果していることが、いくつかのセルラインの証拠から示唆されている。たとえば、DRTF1/E2FのDNA結合活性は、細胞周期が進行する間に定期的に誘導されており、そのピークはＳ期の間であり（Mudryj et al.,1992;Shirodkar et al.,1992）、分化の間は負に調節されている（La Thangue and Rigby,1987）。この結合活性は、細胞が増殖する際に必要とされる特定の遺伝子、たとえばDHFR、DNAポリメラーゼα及びp34cdc2の転写活性と相関しており、これらの遺伝子のプロモーターには、DRTF1/E2F結合部位が含まれている（Blake and Azizkhan,1989;Means et al.,1992;Dalton,1992）。さらに、細胞周期のG1期からＳ期への進行を負に調節し、腫瘍細胞では往々にして変異している網膜芽腫抑制遺伝子産物が、DRTF1/E2Fと結合する（Bandara and La Thangue,1991;Chellapan et al.,1991）。この相互作用の機能的な帰結として、pRbによって、DRTF1/E2Fが転写を活性化することが阻害される（Zamanian and La Thangue,1992）。細胞周期の制御に関与していると考えられるいくつかの他の分子、たとえばRbに関連したp107、サイクリンＡおよびＥ、並びにp33ckd2も、細胞周期が進行する間に、DRTF1/E2Fと会合する（Bandara et al.,1991,1992;Mudryj et al.,1991;Devoto et al.,1992;Lees et al.,1992）。こうした観察結果を総合すると、DRTF1/E2Fによって細胞周期の現象が転写装置と結合され、細胞周期が進行する間の適正な時点に、細胞が遺伝子の発現に適切な変化を確実に生じさせるようになっていることを示唆する。
DRTF1/E2Fの重要性は、ウイルスの癌タンパク質の作用機構についての研究からも立証されている。すなわち、特定の癌タンパク質、たとえばアデノウイルスのE1a、SV40の大型Ｔ抗原及びヒトパピローマウイルスのE7は、pRbならびに他の関連タンパク質を封鎖して、DRTF1/E2Fを転写に関して不活性な形態から活性の形態へと転化することによって、DRTF1/E2Fの活性を調節している（Zamanian and La Thangue,1992;Hiebert et al,1992;Zamanian and La Thangue,1993）。この効果では、これらウイルスの癌タンパク質中の、細胞の不死化ならびにトランスフォーメーションにとって必要であることが既に示されている各種の領域が必要とされるので（Bandara and La Thangue,1991;Zamanian and La Thangue,1992）、DRTF1/E2Fはこうした過程で重要な役割を果たしている可能性が高い。
DRTF1/E2Fと相互作用を生じる細胞タンパク質の特定に関しては進歩がみられるものの、最近まで、その分子の詳細についてはほとんどわかっていなかった。現在では、ともにDRTF1/E2FのDNA結合成分である２つの別個のポリペプチドが分子的に特徴づけされている。第一のE2F−１と称されるポリペプチドは、そのＣ末端領域によってpRbと直接結合する能力を有していることから単離された（Helin et al.,1992;Kaelin et al.,1992）。これに対し、DP−１は、分化過程の間にDRTF1/E2Fがダウンレギュレートされるような細胞系であるF9胚癌（embryonal carcinoma、EC）の幹細胞から生化学的にDRTF1を精製した後に、DRTF1/E2FのDNA結合活性の一成分として見いだされたものである（La Thangue and Rigby,1987;La Thangue et al.,1990）。DP−１をコードしているcDNAは、アフィニティ精製したDP−１からのアミノ酸配列も得た後に単離されたものである（Girling et al.,1993）。
E2F−１とDP−１の双方とも、各ポリペプチドが配列特異的に、ホモ二量体としてE2Fモチーフと結合することを可能とする領域を含んでいる（Helin et al.,1992;Kaelin et al.,1992;Girling et al.,1993）。DNA結合ドメインは、これまでに画定されているいずれのDNA結合構造とも密接には関連していないものの、酵母の細胞周期を調節している転写因子のいくつかと多少の関連性を有している（La Thangue and Taylor,1993）。しかし、DP−１とE2F−１との間の機能上の関係性ははっきりしないままであった。本研究で、我々が示すように、DP−１とE2F−１は、インビボで、E2F結合部位を認識する複合体として存在している。さらに、インビトロでの検定によって、DP−１とE2F−１が、効率的かつ選択的に複合体としてE2F部位と結合し、その相互作用に際しては、この二種のタンパク質間の類似領域が必要であることが立証された。さらに、ショウジョウバエならびに酵母細胞中でDRTF1/E2Fを再構築したところ、DP−１とE2F−１がE2F部位依存性の転写活性化に際して相乗的に相互作用していることが示唆された。こうしたデータから、DP−１とE2F−１は機能的に相互作用しうるものであり、哺乳動物の細胞では、そうした相互作用が生理学的に関連している可能性が高いことが示唆される。
DP−１とE2F−１は、HeLa細胞中で複合体として存在している
DP−１は、発達によって調節を受け、細胞周期によって調節を受けているマウスのDRTF1/E2F複合体中に存在するDRTF1/E2Fの構成成分であり、したがって、DRTF1/E2FのDNA結合活性の一般的な構成成分である可能性が高い。さらに、本発明の発明者が、両生類ならびにショウジョウバエで密接に関連したタンパク質が発現されることを観察していることからすると、DP−１は、保存遺伝子の産物である。このように、DP−１は、DRTF1/E2Fにほぼ常在する、進化上保存されたDNA結合成分であるようである。pRbと直接結合する能力を有することによって単離されたE2F−１も、E2F部位と配列特異的に相互作用する（Helin et al.,1992;Kaelin et al.,1992）。双方のタンパク質とも、配列特異的なDNA結合活性に必要であることがすでに示されているドメインと重複する短い類似領域を含んでいる（Girling et al.,1992）。
DP−１ならびにE2F−１がHeLa細胞抽出物中で複合体として存在しているのかどうかを、各タンパク質を特異的に認識する抗体を使用して調べた。我々は、まず、ゲル遅延によって、DP−１がHeLa細胞のDRTF1/E2Fの構成成分であるかどうかを決定した。抗DP−１抗血清の影響が、結合反応に、相同であって非関連性ではないペプチドが存在すると競合されたので、F9胚癌（EC）細胞抽出物の場合と同様、抗DP−１ペプチド抗血清は、HeLa細胞のDRTF1/E2Fを特異的に阻害した（図6a、トラック２から５をトラック６から８と比較のこと）。抗DP−１抗血清を使用してHeLa細胞抽出物からDRTF1/E2Fを免疫沈降させ、続いてこの免疫沈降物を遊離させて抗E2F−１モノクローナル抗体で免疫ブロッティングした。抗E2F−１モノクローナル抗体で免疫沈降物を免疫ブロッティングすると、E2F−１に関して予測される分子量を有するポリペプチドが得られたので（図6c、トラック４、矢印で表示）、抗DP−１によって免疫沈降したDRTF1/E2FのDNA結合活性（図6b、トラック４と７を比較のこと）は、E2F−１タンパク質を含んでいた。免疫沈降を相同なペプチドの存在下で行った場合には、E2F−１は存在していなかったので（図6c、トラック３と４を比較のこと）、E2F−１の存在は、抗DP−１活性に依存性であった。このように、DP−１とE2F−１は、HeLa細胞抽出物中で複合体として存在している。
DP−１とE2F−１は、インビトロで、DNA結合へテロ量体中で相互に作用する
DP−１とE2F−１の双方とも、配列特異的なDNA結合ドメインを各タンパク質の類似した位置に有しており（DP−１ではアミノ酸残基84から204まで、E2F−１ではアミノ酸残基89から191まで、Girling et al.,1993）、このDNA結合ドメインは、DNA結合ドメインの外側まで（DP−１ではアミノ酸残基249まで）延在する類似領域を含んでいる。これまでの研究（Helin et al.,1992;Kaelin et al.,1992;Girling et al.,1993）と同じく、DP−１とE2F−１の双方とも、E2F部位がアデノウイルスのE2Aプロモーターの状況にあっても（図7a、トラック２および３）、単一のE2F部位であっても（図7a、トラック６で露出が増大していることで示されている。データ示さず）、E2F部位とそれぞれ単独で結合することができた。DP−１のDNA結合活性は、E2F−１のDNA結合活性より多少低かったが、その理由は現在のところ定かではない。しかし、双方のタンパク質が同じ結合反応中に存在していると、E2F部位へのDNA結合活性が増大することが示された（図7a、トラック２および３をトラック４と、トラック６および７をトラック８と比較されたい）。このDNA結合活性は、２種のDNA結合活性の相加効果から予測されるよりはるかに高く、このことから、DP−１とE2F−１が協同してE2F部位を相乗的に認識していることが示唆された。
DP−１とE2F−１の双方がDNA結合複合体中に存在することは、それぞれのタンパク質に特異的な抗血清を使用することによって確認された。抗E2F−１ペプチド抗血清がDNA結合複合体をスーパーシフトさせたのに対し（図7a、トラック８と10を比較のこと）、抗DP−１ペプチド抗血清はDNA結合活性を阻害した（図7a、トラック11と12を比較のこと）。しかし、抗DP−１抗血清の効果は、さほど劇的ではなく、その理由はさだかではないが、この抗体に対するエピトープが、DP−１のDNA結合ドメインに近接して位置していて、利用可能であったことと関連している可能性がある（Girling et al.,1993）。
この検定を使用して、E2F−１とともにDNA結合複合体を生成するうえで必要なDP−１中の領域を決定した。すなわち、DP−１の各種の誘導体をGST融合タンパク質として発現させ、トロンビンで開裂させ、E2Fとの相互作用について検定した。DP−１のこれらの誘導体は、野性型タンパク質の端部を切り取ったものとしたので、こうした誘導体がE2F−１と相互に作用して機能的DNA結合活性を生成しえた場合には、生じたDNA結合複合体は、DP−１の場合より小型で、したがって、より移動速度が速いはずである。また、移動速度の速い複合体が一種のみ示された場合には、２種のタンパク質のヘテロ二量体が生じたというのが、もっとも有力な説明だということになる。実際、DP−184-249あるいはDP−184-204をE2F−１（GST−E2F−189-437）と混合すると、E2F−１単独（図7b、トラック１をトラック２および３と比較のこと）、あるいはE2F−1/DP−１（図7a）より移動速度の速いDNA結合複合体が形成され、DP−１のこれらの２種の誘導体がE2F−１と相互作用しうるものであり、二量体を形成しているらしいことが示唆された。この場合も、E2F−1/DP−184-249複合体のDNA結合活性は、E2F−１単独（図7b、トラック１を２および３と比較のこと）、あるいはDP−184-249より高かった。ちなみに、DP−184-249は、この検定で用いた条件ではDNA結合活性が低かったものの（データ示さず）、E2F部位を特異的に認識することができる（Girling et al.,1993）。E2F−1/DP−184-204反応のDNA結合活性は、E2F−1/DP−184-249より低く、DP−１のアミノ酸残基204と249の間の、E2F−１と有意な類似性を示す（Girling et al.,1993）領域が、DNA結合活性にも影響を及ぼしていることが示唆された。DP−184-249とDP−184-204が有する相乗的なDNA結合活性は、非開裂GST融合タンパク質をE2F−１と混合した場合にも示されたものの、サイズが大きいのでDNA結合複合体の移動速度の上昇は生じなかった（図7b、トラック１をトラック４および５と比較のこと）。この領域を、Ｎ末端（DP−1146-249）あるいはＣ末端（DP−184-166）のいずれかからこれ以上欠失させると、得られた誘導体は、GST融合タンパク質としても（図7b、トラック１をトラック６および７と比較のこと）、開裂させても（データ示さず）、E2F−１とともにDNA結合複合体を形成することはなく、DP−184-204が、これまで規定された中で、E2F−１とともにDNA結合複合体を生成しうる最小の領域であることが示唆された。
E2F−1/DP−184-249複合体の、アデノウイルスのE2Aプロモーターの遠位のE2F部位から誘導した一連の結合部位（La Thangue te al.,1990;Shivji and La Thangue,1991）に対するDNA結合特異性を分析したところ、E2F−１単独の場合のE2F部位とのDNA結合特異性（図7c、トラック３から６をトラック８から11と比較のこと）、さらにはF9  ECの細胞抽出物で画定されたDRTF1/E2F部位とのDNA結合活性（図7c、トラック13から16を比較のこと）と極めて類似していることが示された。
DP−１とE2F−１との間の相互作用をさらに特徴づけするために、我々は、インビトロで転写され、翻訳されたE2F−１ポリペプチドが、DP−１のGST融合タンパク質と結合しうるような検定を用いた。GST融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズで集め、結合したE2F−１ポリペプチドを遊離させてから、E2F−１がDP−１と相互作用する能力を調べた。GST−DP−184-249ならびにGST−DP−184-204と結合したE2F−１の量は、GSTビーズ単独によって結合されたE2F−１の量より有意に多く（図7d、トラック２とトラック３および６と比較のこと）、DP−184-249とDP−184-204の双方とも、E2F−１と相互作用しうるものであり、この結果は、DP−184-249とDP−184-204がDNA結合ヘテロマーを形成する能力を有していることと合致していた（図7b）。DP−1146-249もE2F−１と結合したのに対し、DP−184-166は結合しなかった（図7d、トラック２をトラック４および５と比較のこと）。したがって、DP−1146-249は、これまでの結果からして二量体化ドメインである可能性の高いドメインを含んでおり、DP−1146-249は、このドメインによってE2F−１と相互作用しうるものの、このヘテロ二量体はDNAと結合するうえで十分なアミノ酸配列を欠いている。複合体がDNAと結合するには、DP−184-249のもっと別の情報が必要である。したがって、これらのデータからは、DP−１のE2F−１との類似領域（アミノ酸163から236）が二量体化ドメインを含んでおり、DNA結合活性のためには、さらにＮ末端側の配列が必要であることが示唆される。これらのデータのまとめを、図7eに示す。
DP−１とE2F−１は、酵母細胞中で相互に作用する
DP−１とE2F−１が、インビボで直接相互作用するかどうかを決定するために、我々は、DP−１から誘導されたものと、E2F−１から誘導されたものの２種のハイブリッドタンパク質を合成する発現ベクターを利用する、既に記載されている（Fields and Song,1989）酵母細胞での検定システムを採用した。第一に、DP−１をコードする配列を、細菌のLexAタンパク質のDNA結合ドメインと融合して、pLEX.DP−１を作製し、第二に、E2F−１をコードする配列であるpGAD.E2F−１を、酵母のGal4タンパク質の酸性転写活性化ドメイン（AAD）と融合した。pLEX.DP−１がLexA結合部位によって誘導されたレポーター構築物を活性化しなかったのに対し、p53タンパク質から取り出したトランス活性化ドメインを含むハイブリッドタンパク質は、レポーター構築物を活性化できた（図８）。しかし、pLEX.DP−１とpGAD.E2F−１を一緒に発現させると、LexAレポーター構築物の転写活性は、pLEX.DP−１あるいはpGAD.E2F−１のいずれかを単独で発現させた場合と比べて相当増大（約75倍）した（図８）。この結果を、本論文に示したこれまでの結果と組み合わせると、DP−１とE2F−１が、インビボで直接相互作用することが強力に示唆される。
DP−１は、インビボで、E2F部位依存性の転写を調節する
各種の哺乳動物細胞（たとえば、F9  EC、SAOS−２、および3T3）ならびに成育条件で、DP−１タンパク質のレベルを上げても、E2F部位依存性レポーターの転写活性を有意に刺激することはできなかった（データ示さず）。したがって、DP−１とE2F−１が機能的に相互作用するのかどうかを調べるためには、我々はもっと別のアプローチをとる必要があった。
（ａ）ショウジョウバエの検定
第一のアプローチでは、これまでも哺乳動物の転写因子の活性を調べるために使用されてきた細胞系であるショウジョウバエのSL2細胞（Courey and Tjian、1988）での適当な検定を開発した。この細胞は、ゲル遅延によって調べた場合の内在的なE2F部位DNA結合活性が極めて低いので、こうした検定に特に適当であった（データ示さず）。DP−１とE2F−１の機能的な相互作用を調べるために、我々は、３つのE2F部位によって誘導されるレポーター構築物であるp3xWT（図9a、Zamanian and La Thangue,1991）の転写活性に、各タンパク質が単独で、あるいは、双方のタンパク質が一緒に発現した場合に及ぼす効果を測定した。すなわち、E2F−１が量依存的にp3xWTを活性化しえたのに対し（図9bおよびｃ、レーン１と２を比較のこと）、DP−１はそうではなく（図9bおよびｃ、レーン３と４を比較のこと）、この結果は、哺乳動物細胞でのE2F−１ならびにDP−１の挙動と類似していた（Helin et al.,1992;Kaelin et.,1993;データ示さず）。しかし、DP−１とE2F−１を一緒に発現させると、それぞれの単独の場合と比べて、はるかに高いE2F部位依存性の転写活性化が示された（図9bおよびｃ、レーン１、３、および５を比較のこと）。さらに、DP−１のレベルを上昇させると、より多くのE2F部位依存性の転写が生じ（図9bおよびｃ、レーン１、５、および６を比較のこと）たので、相乗効果は滴定可能であり、また、Gal4タンパク質から誘導され非関連性のDNA結合タンパク質と共に発現させても何ら有意な結果が生じなかったので（図9bおよびｃ、レーン５および６と７および８を比較のこと）、この相乗効果は特異的であった。また、p3xMTを用いて実施した同様の実験によって、この活性化が野性型のE2F部位に特異的であることが示された（データ示さず）。したがって、E2F部位依存性の転写では、DP−１とE2F−１が機能的に相互作用しており、この相互作用は相乗的であると考えられる。
（ｂ）F9  EC細胞での検定
別のアプローチでは、内在的なDRTF1/E2F転写活性を損ないうるようなDP−１の「ドミナントネガティブ」（“dominant negative"）誘導体を設計した。Ｎ末端領域とＣ末端領域の双方のアミノ酸配列が欠損したDP−173-340を調製した。すなわち、高レベルのE2F部位依存性の転写活性を含むF9  EC細胞（Zamanian and La Thanque,1992）でDP−173-340を発現させると、p3xWTの活性が明らかに低減し（図10c、トラック１および２をトラック７および８と比較のこと、定量の結果は下側に図示）、この効果は、変異型のE2F部位を有するレポーターp3xMTの活性もpCVcatの活性も影響を受けなかったことから、野性型のE2F部位に特異的であった。これまでの結果からすると、DP−173-340のこうした効果についての有力な説明は、DP−173-340がE2F−１を封鎖して、転写を活性化しえないヘテロマーが形成され、それにより、関与しうるE2F−１の量が限定されるというものであった。E2F−１をDP−173-340の存在下で発現させると、「ドミナントネガティブ」な活性が克服され、E2F部位依存性の転写活性が部分的に修復された（図10c、トラック７および８をトラック９および10と比較のこと）。E2F−１がE2F転写活性を修復する能力を有していることは、DP−173-340がE2F−１を封鎖して不活性な転写複合体とする考え方と一致し、哺乳動物の細胞でDP−１とE2F−１との間の相互作用が生じているという考え方と適合するものである。
DP−１とE2F−１は、酵母細胞中で、E2F部位依存性の転写を活性化する
次に、DP−１とE2F−１が、酵母細胞中でのE2F部位依存性の転写の際に機能的に相互作用しうるかどうかを決定するために、DP−１とE2F−１を調べた。この目的で、アデノウイルスのE2Aプロモーターから取り出したE2F結合部位によって、酵母のcyc1プロモーターが誘導されている構築物を使用した。p4xWT  CYC1では、４つのE2F結合部位がcyc1プロモーターを誘導しており（図11a）、転写をp4xMT  CYC1の活性の約12倍活性化している（データ示さず）。この転写活性は、さらに、E2F−１発現ベクターpGAD.E2F−１を導入した際にも刺激可能であった。すなわち、pGAD.E2F−１は、p4xWT  CYC1の転写活性を、DP−１の発現ベクターであるpLEX.DP−１が同一のレポーター構築物に対して有していた低い効果と比較して、約10倍増大させた（図11b）。しかし、E2F−１とDP−１を同時に発現させると、p4xWT  CYC1の活性はさらに増大し、通常、基準となるp4xWT  CYC1の活性の約50倍となった（図5b）。p4xMT  CYC1の活性は、E2F−１の発現ベクターによっても、DP−１の発現ベクターによっても有意な影響を受けなかった（データ示さず）。こうしたことから、DP−１とE2F−１は、片方ずつ単独で存在する場合より同時に存在する場合の方が、E2F部位依存性の転写を効率よく活性化することが示され、E2F部位依存性の転写の際には、DP−１とE2F−１が相乗的に相互作用していることが再度示唆された。
DP−１とE2F−１は、哺乳動物細胞中で相互作用する
これまでの研究で、F9  EC細胞では、DP−１が、DRTF1/E2FのDNA結合活性の普遍的成分であることが示された。何故ならば、E2F部位上で見いだされるDNA結合複合体は、いずれも、抗DP−１抗体によって阻害されるためである（Girling et al.,1993）。同一の状況がHeLa細胞の抽出物についても存在しており、HeLa細胞の抽出物でも、すべてのDRTF1/E2FのDNA結合複合体が、抗DP−１抗体の影響を受けている（図6a）。こうした観察結果からすると、そして、こうした観察を他種の細胞について行われた研究（Bandara et al.、作成中）と考えあわせると、我々は、DP−１が、転写因子DRTF1/E2Fにほぼ常時存在している構成成分であると考える。
こうした観察結果に鑑みて、我々は、DP−１が、もう一方のE2F部位DNA結合タンパク質であるE2F−１（Helin et al.,1992;Kaelin et al.,1992）と相互作用しうるのかどうかを決定し、さらに、こうした相互作用が、生理学的条件の下で生じるのかどうかをはっきりさせることが重要であると考えた。我々の結果では、HeLa細胞抽出物中で、DP−１とE2F−１が複合体として存在することが示されており、このことは、DRTF1/E2Fの全DNA結合活性のうち、少なくとも一部がDP−１とE2F−１を含むヘテロマー複合体である可能性が高いことを意味している。抗E2F−１抗体を使用してゲル遅延検定でのDNA結合活性に影響を及ぼす試みがうまくいかなかったので（データ示さず）、今のところ、DRTF1/E2FのDNA結合活性のうち、どのくらいの部分がDP−１とE2F−１の複合体であるのかはわかっていない。また、E2F−１でなく、他のタンパク質がDP−１と結合している可能性も除外することができない。実際、アフィニティ精製したDRTF1/E2F中の分子量の異なる（45から55,000）数種のポリペプチドが、E2F部位と特異的に結合することができるので（Shivji and La Thangue,1991;Girling et al.,1993）、E2F−１以外のタンパク質がDP−１と結合している可能性もありそうだ。
インビトロならびに酵母細胞中でのDP−１とE2F−１との間の物理的相互作用
我々は、DP−１とE2F−１のDNA結合特性をゲル遅延検定で研究することによって、DP−１とE2F−１が直接相互作用しうるものであることを明確にした。DP−１とE2F−１は、粗製細胞抽出物中のDRTF1/E2Fが有しているDNA結合特異性とまさしく同一のDNA結合特異性を有するヘテロマーDNA結合体を形成した（La Thangue et al.,1990）。さらに、このヘテロマーのDNA結合部位は、DP−１あるいはE2F−１が単独で有するDNA結合活性より相当高いことが示され、DP−１とE2F−１が相乗的に相互作用することが示唆された。E2F−１とともにDNA結合複合体を形成するうえで必要なDP−１の領域の分子的分析により、この２種のタンパク質の間の類似領域が、さらにＮ末端側のドメインとともに必要とされていることが示された。この類似領域は、DP−１とE2F−１とが互いに結合することを可能としており、したがって、二量体化ドメインを構成している可能性が高い。
我々は、こうした観察結果を、転写因子のモジュール編成を利用した検定（Fields and Song,1989）を使用することによって、酵母細胞で確認した。すなわち、DP−１を細菌のLexADNA結合ドメインと結合し、そしてこれとは別の分子で、E2F−１を、酵母のGal4タンパク質の酸性転写活性化ドメインと結合した。この検定では、２種のハイブリッドタンパク質の間の物理的相互作用が生じた場合にのみ、機能的な活性化ドメインがLexA依存性のプロモーターに補充される。２種のハイブリッドタンパク質を一緒に発現させると、LexA依存性のレポーターが強力に活性化された。したがって、DP−１とE2F−１は、酵母細胞中に物理的に相互作用しうるものであった。さらに、この結果から、LexAによってDNA結合特異性が提供されるので、DP−１とE2F−１は、DNAと結合することなく相互に作用することができ、かくして、E2F結合部位とは独立に生じるものであることが示唆された。
DP−１とE2F−１による、インビボでの転写の相乗作用
我々は、ショウジョウバエならびに酵母の細胞で、DP−１とE2F−１との間の相互作用がE2F部位依存性の転写にどのような機能的帰結を及ぼすのかを検討した。我々がこうしたアプローチをとったのは、野性型のDP−１を哺乳動物の細胞に導入することによって転写を活性化しようという試みが、理由ははっきりしないものの、内在的なDP−１タンパク質のレベルに関連している可能性のある理由から、部分的にしかうまくいかなかったからである。
ショウジョウバエの細胞で行った検定でも、酵母細胞で行った検定でも、DP−１とE2F−１は、E2F部位依存性の転写に際して、両者が一緒に発現されると、いずれかのタンパク質が単独に発現された場合よりも転写の活性化がより効率的であったので、両者が相乗的に相互作用していることが示唆された。こうした効果の説明としては、DP−1/E2F−１ヘテロ二量体のDNA結合活性は、いずれかのホモ二量体より安定であって、したがって、転写活性化の効率が高いのだという説明が有力である。この考え方は、DP−１とE2F−１が相乗的に相互作用していることを示唆している、本研究でさきに示したインビトロでのDNA結合データと完全に一致する。しかし、我々は、DP−1/E2F−１ヘテロ二量体中の潜在的な転写活性化ドメインの活性化をはじめとする他の要因が影響している可能性を除外することはできないし、実際、最近の実験では、こうした可能性が正しいらしいことが示唆されている（Zamanian and La Thangue、未発表データ）。
結論を述べると、我々が実証したように、DP−１とE2F−１は、転写因子であるDRTF1/E2F中で、相互に作用してDNA結合複合体を生成し、このDNA結合複合体は、それぞれのホモ二量体より好適な状態である。E2F−１はpRbと結合することができるので（Helin et al.,1992;Kaelin et al.,1992）、こうした複合体中では、pRbによって認識される領域がE2F−１によって提供されることにより、この特定のE2F部位DNA結合活性の転写活性が、pRbによって調節されることが可能となっているらしい。他の分子がE2F−１のかわりに（そしておそらくはE2F−１との関連で）DP−１とヘテロ二量体を形成し、E2F/DRTF1と相互作用を生じることが知れている他のタンパク質、たとえばp107（Zamanian and La Thangue,1993）によって認識される領域を提供し、その結果、こうした分子によるE2F部位依存性の転写の調節が可能となっていることもありうる。したがって、我々は、共通の構成成分としてDP−１を有する別個のヘテロ二量体がE2F部位を認識することによって、異なった分子、たとえばpRbならびにp107が、それぞれの生物学的活性を転写装置と統合して、E2F/DRTF1によって作動されている遺伝子を調節することが可能となっていると考える。
材料および方法
細胞抽出物の調製、ゲル遅延、ならびに免疫化学的技法
細胞抽出物を、既に記載されているようにして（La Thangue et al.,1990）調製した。抗DP−１の存在下での、F9  EC細胞抽出物ならびにHeLa細胞抽出物（約6.0μｇ）でのゲル遅延を、既に記載されているようにして（Girling et al.,1993）実施し、HeLa細胞抽出物からの抗DP−１を用いた免疫沈降を、標準的な手順によって実施した。免疫沈降物を１％DOCならびに1.5％NP40で処理し、界面活性剤によって遊離された物質を、ゲル遅延によってDRTF1/E2Fについて検定し、抗E2F−１モノクローナル抗体SQ41（Kaelin et al.,1992）を用いた免疫ブロッティングによってE2F−１の存在について検定した。抗DP−１抗体、抗ペプチドＡ、ならびに抗ペプチド18は、既に記載されている（Girling et al.,1993）。ウサギ抗E2F−１抗血清（抗血清134）を、E2F−１のアミノ酸配列の315から323であるペプチドに対して生成した。DNAとの結合に際しての特異性を調べるにあたって使用する結合部位の配列は、アデノウイルスE2Aプロモーターから誘導し（−71から−50）、以下のとおりであった。野性型、TAGTTTTCGCGCTTAAATTTGA（配列番号７）;62/60、TAGTTTTCGATATTAAATTTGA（配列番号８）;63、TAGTTTTCTCGCTTAAATTTGA（配列番号９）;64、TAGTTTTAGCGCTTAAATTTGA（配列番号10）。図2a（トラック１から４）では、アデノウイルスのE2Aプロモーター（−96から＋68）を使用し、それ以外の事例では、いずれも、E2Aプロモーターの遠位のE2F部位（−71から−50の配列）を使用した。ゲル遅延検定では、約100倍過剰量の競合結合部位を使用した。
融合タンパク質ならびにインビトロでの翻訳
DP−１ならびにE2F−１を、既に記載されているようにして（Girling et al.,1993）GST融合タンパク質として発現させ、発現したGST融合タンパク質から遊離させた。ゲル遅延検定では、アデノウイルスのE2Aプロモーターから取り出した結合部位（−71から−50）とともに、約100倍過剰量の競合結合部位を使用した。野生型のE2F−１をコードする配列を転写し、網状赤血球溶解液（Promega）を使用してさらに翻訳し、35Sメチオニンで放射標識した。二量体化検定（図2d）では、GST−DP−１融合タンパク質をE2F−１ポリペプチドとともに30℃にて30分間インキュベートし、グルタチオン−アガロース（Sigma）を用いて集め、NP40の0.1％PBSA溶液で繰り返し洗浄した。結合したE2F−１ポリペプチドを、SDSサンプル緩衝液中での変性によって遊離させ、10％ポリアクリルアミドゲルで分離した。
酵母での検定
pBTM116は、酵母のADH1プロモーターの制御下にある完全なLexAコード配列（１から202）を含んでいる。pLEX.DP−１は、pBTM116中のLexAコード配列の下流側に、DP−１のコード配列（アミノ酸59からＣ末端まで）を含んでいる。pBTM126は、LexAのDNA結合ドメインの下流側に、野生型のマウスp53のコード配列（アミノ酸１から346）を有している。pGAD.L6は、酵母のADH1プロモーターの制御下にあるGal4転写活性化ドメイン（アミノ酸残基768−881）を含むpGAD2F（Chien et al.,1991）の誘導体である。pGAD.E2F−１は、Gal4活性化ドメインの下流側に、完全なE2F−１のコード配列（アミノ酸１−437）を含んでいる。p4xWT  CYC1ならびにp4xMT  CYC1は,pLGΔ178（Guarente and Mason,1983）から誘導した。野生型のE2F部位は、アデノウイルスのE2Aプロモーターの−71から−50の領域から取り出し、変異部位は、ヌクレオチド−62から−60を変異させた（La Thangue et al.,1990）。酵母での相互作用の検定（図３）に際しては、２コピーの78bpオリゴヌクレオチドを有し、各コピーがGAL1−lacZの転写開始部位の上流側にLexA二量体の２つのco1E1オペレーターまたは４つの結合部位を含んでいる組込みプラスミドを含む酵母CTY10−5d株（MATa  ade2  trp1−901  leu2−3,112  his3−200  gal4  gal80  URA3::lexAop−lacZ）を、図示の発現ベクターで形質転換した。酵母でのE2F部位依存性の転写の検定（図５）に際しては、p4xWT  CYC1あるいはp4xMT  CYC1を有する酵母W3031a株（MATa  ade2−100  tryp1−１  leu2−３  112  his3−11  ura3）を使用し、図示の発現ベクターで形質転換した。中間対数期の培養のβ−ガラクトシダーゼ活性を、既に記載されているようにして（Johnson et al.,1986）定量した。β−ガラクトシダーゼ活性は、少なくとも３つの独立した形質転換体について測定した。
ショウジョウバエの組織培養細胞のトランスフェクション
レポーター構築物は、いずれもpBLcat2由来であり、これらは既に記載されているものである（Zamanian and La Thangue,1992）。白い四角と黒い四角は、それぞれ野生型と変異型のE2F結合部位を示す。pDP−１は、完全なDP−１タンパク質をコードしており、pG4mpoly IIは、Gal4のDNA結合部位をコードしている（Webster et al.,1989）。pE2F−１は、pCMV  RBAP−１として既に記載されているものである（Kaelin et al.,1982）。細胞は、リン酸カルシウム法でトランスフェクションして、その40から45時間後に回収し、各トランスフェクションごとに、pBluescript  KSを用いて、最終DNA濃度を一定に保った。いずれのトランスフェクションも、内部対照としてpCMVβ−galを含むものとした。CAT活性の検定、トランスフェクション効率についての補正、ならびにTLCプレートの定量は、既に記載されている（Zamanian and La Thangue,1992）。
哺乳動物細胞のトランスフェクション
レポーター構築物は、いずれも、pBLcat2由来であり、これらの構築物は既に記載されている（Zamanian and La thangue,1992）。白い四角と黒い四角は、それぞれ野生型と変異型のE2F結合部位を示す。プラスミドpDP−173-340は、pG4Mpoly IIのGal4配列（Webster et al.,1989）の下流側に融合させた、野生型DP−１配列のアミノ酸73−340の範囲のタンパク質をコードしている。pCMV  E2F−１は、pCMV  RBAP−１として既に記載されている（Kaelin et al.,1982）。F9  EC細胞の培養とそのトランスフェクションについても、既に記載されている（Zamanian and La Thangue,1992）。各トランスフェクションごとに、pBluescript  KSを用いて最終DNA濃度を一定に保った。いずれのトランスフェクションも、内部対照としてpCMVβーgalを含むものとした。CAT活性の検定、ならびにTLCプレートの定量は、既に記載されている（Zamanian and La Thangue,1992）。
図面の詳細な説明
図６
DP−１とE2F−１は、インビボで、同一タンパク質複合体中に存在する
ａ）DP−１は、HeLa細胞抽出物中で形成されたDRTF1/E2F  DNA結合複合体中に存在する：ゲル遅延を行い、その際、F9  ECならびにHeLaの全細胞抽出物（ゲル遅延検定では、DRTF1は、３つの別々の複合体ａ、ｂならびにｃに分離する、図示）を、アデノウイルスのE2Aプロモーターから取り出したE2F結合部位（ヌクレオチド−71から50）とともに、前免疫（PI;トラック２および６）あるいは免疫（I;トラック３から５ならびに７から９）抗DP−１（ペプチドＡ）抗血清の存在下で、非関連性のペプチド１（トラック４および８）あるいはペプチドＡ（トラック５および９）のいずれかを加えて使用した。F9  ECの細胞抽出物でも、HeLaの細胞抽出物でも、DRTF1/E2F  DNA結合複合体のすべてが抗DP−１抗体によって影響を受けた。
ｂ）抗DP−１は、DRTF1/E2FのDNA結合活性を免疫沈降させる:HeLa細胞抽出物からの免疫沈降を、相同ペプチドＡ（トラック２から４）、あるいは非関連性のペプチド１（トラック５から７）の存在下で抗DP−１を用いて行った。免疫沈降物を１％デオキシコール酸（DOC）ならびに1.5％NP40で処理し、界面活性剤によって放出された物質を、DRTF1/E2FのDNA結合活性について調べた。免疫沈降後のHeLa細胞抽出物も示す（Sn;トラック２および５）。界面活性剤処理を行わなかった場合には、DNA活性は放出されなかった（ｃで示す；トラック３および６）。
ｃ）DP−１免疫沈降物の抗E2F−１による免疫ブロッティング：ペプチドＡ（トラック３）あるいはペプチド１（トラック４）のいずれかの存在下で行われた抗DP−１の免疫沈降物を、抗E2F−１モノクローナル抗体SQ41で免疫ブロッティングした。トラック４に存在するE2F−１ポリペプチドを矢印で示す。陽性対照として、トラック２で約100ngのE2F−１融合タンパク質GST−E2F−189-437を免疫ブロッティングした。トラック１は、標準分子量を示す。
図７
DP−１とE2F−１は、複合体としてE2F部位に結合する
ａ）DP−１とE2F−１は、E2F部位へのDNAの結合にあたって、相乗的に相互作用する:GST−DP−159-410（約25ng）あるいはGST−E2F−189-437（約50ng）を、単独で（トラック２、３、６、および７）、あるいは一緒にして（トラック４および８）、アデノウイルスのE2Aプロモーター（トラック１から４）、あるいはE2Aプロモーターから取り出した遠位E2F部位（トラック５から８）との結合性について調べた。トラック１ならびに５は、結合部位のみの場合を示す。露光を増大させると、トラック６でDNA結合複合体が現れたことに注意されたい（データ示さず）。複合体のE2F部位特異性を、適当な競合実験を行うことによって確認した（データ示さず）。GST−E2F−189-437を単独で用いた場合（トラック９）、あるいは、GST−E2F−189-437とGST−DP−159-410を一緒に用いた場合（トラック10、11、ならびに12）に、抗E2F−１（トラック９および10）あるいは抗DP−１（トラック11および12;抗ペプチド18;Girling et al.,1993）が有する影響を調べた。また、トラック11および12の反応物質は、非関連性のペプチド（トラック11）あるいは相同ペプチド（ペプチド18、トラック12）のいずれかを含んでいる。
ｂ）DP−１とE2F−１は、DNA結合ヘテロマーを形成する:GST−E2F−189-437（約50ng）を、対照のGST融合タンパク質（約300ng;トラック１）、DP−184-249あるいはDP−184-204（約150ng、トロンビンによる開裂によって放出されたもの；トラック２および３）、GST−DP84-249、GST−DP−184-204、GST−DP−1146-249あるいはGST−DP−184-166（約300ng、開裂なし；トラック４、５、６および７）とともにインキュベートした。
ｃ）E2F−189-437/DP−184-249ヘテロマーの配列特異性:GST−E2F−189-437（約50ng;トラック２から６）又はGST−E2F−189-437と、DP−184-249（それぞれ50ngおよび150ng、トラック７から11）とによって形成された複合体のDNA配列特異性を、アデノウイルスのE2Fプロモーターから取り出した遠位のE2F部位の野性型あるいは変異型の誘導体（約100倍過剰モル量の図示の競合結合部位）と競合させることによって決定した。比較の目的で、F9  EC細胞抽出物での同様の実験を示す（トラック12から16）。モノマーならびにヘテロマーのDNA結合複合体の双方とも、F9  EC細胞のDRTF1/E2Fに対して極めてよく似た配列特異性を有していた。トラック１は、プローブ単独の場合を示す。競合結合部位の詳細については、材料および方法の項に記載してある。
ｄ）DP−１は二量体化ドメインを含んでいる:DP−１の図示の領域をGST融合タンパク質として発現させ（トラック３−６）、約２μｇを、翻訳された野性型のE2F−11-437を含んでいる網状赤血球溶解液５μｇとともにインキュベートした。GST融合タンパク質あるいはGSTタンパク質単独（トラック２）をグルタチオン−アガロースビーズで集め、結合したE2F−１ポリペプチドを放出させた。トラック１は、E2F−１ポリペプチドを有する溶解液を示す。DP−1146-249がE2F−１と結合することに注意されたい。
ｅ）データについてのまとめ、ならびにDP−１の分子特性。DNA結合ドメインのＣ末端側の境界は、破線で示す領域内に存在することはわかっているが、未画定である。
図８
DP−１とE2F−１は、酵母細胞中で相互に作用する
結果についてのまとめ。発現ベクターならびにレポーター構築物の詳細については、蒸気の通りである。
図９
ショウジョウバエのSL2細胞中での、DP−１とE2F−１の機能的相乗作用
ａ）構築物についてのまとめ:p3xWTならびにp3xMTについては、すでに記載されている（Zamanaian and La Thangue,1992）。pDP−１ならびにpE2F−１は全長のタンパク質を含んでおり、pG4Mpoly IIは、Ga14のDNA結合ドメインを含んでいる。
ｂ）およびｃ）。SL2細胞を、p3xWTならびに図示の発現ベクターでトランスフェクションした。各処理での発現ベクターの量は以下の通りとした:E2F−１については50ng（レーン１、５、６、７、および８）又は500ng（レーン２）、DP−１については５μｇ（レーン３および５）又は10μｇ（レーン４および６）、そしてpG4Mpoly IIについては3.7μｇ（レーン７）又は7.0μｇ（レーン８）。全ての値はp3xWT単独を恣意的に1.0とした場合の相対値であり、少なくとも３回の独立した実験を代表する値である。ｂ）は生データの例を示し、ｃ）にこうしたデータを定量的に示す。
図10
DP−１は、F9  ＥＣ細胞中で、E2F部位依存性の転写に寄与している
ａ）構築物についてのまとめ。
ｂ）F9  EC細胞を、p3xWTならびに図示の発現ベクターでトランスフェクションした。いずれの処理も二重反復して行い、転写効率についての補正を行った。全ての値はp3xWT単独の活性を恣意的に1.0とした場合の相対値であり、少なくとも３回の独立した実験を代表する値である。DP−173-340が内在的なDRTF1/E2F活性を阻害しており、E2F−１がこの影響を救済し得ることに注意されたい。データをグラフとして図の下部に示す。
図11
DP−１とE2F−１は、酵母細胞中で、E2F部位依存性の転写を活性化する
ａ）構築物の概要
ｂ）p4xWT  CYC1ならびに図示のエフェクター発現ベクターを有する酵母（S.cerevisiae）のW3031a株中で、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。全ての値はp4xWT  CYC1の活性を恣意的に1.0とした場合の相対値であり、少なくとも３回の独立した実験を代表する値である。
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【図１０ａ】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図６（ｂ）】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図４ａ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ｂ】
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【図３ｄ】
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【図４ｃ】
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【図５ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｃ】
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【図７（ｄ）】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｃ）】
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【図７（ａ）】
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【図７（ｂ）】
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【図７（ｃ）】
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【図９（ｂ）】
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【図７（ｅ）】
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【図９（ｃ）】
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【図８】
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【図９（ａ）】
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【図１０ｂ】
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【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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