(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有する蛋白質。
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３０，０００ダルトンであり、
（２）肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有し、
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、
（４）ＭＫＮ４５またはＡ５４９細胞株を培養したときに、その培養上清に存在する。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質を発現するヒト癌細胞株を培養し、その培養上清から該蛋白質を単離することを特徴とする蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規な蛋白質およびそれをコードするＤＮＡに関し、詳細には肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦ活性化因子）のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有する新規な蛋白質（以下、本蛋白質を「ＨＡＩ−ＩＩ」と称することもある）およびそれをコードする遺伝子、該遺伝子を含有してなる発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を用いたＨＡＩ−ＩＩの産生方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＨＧＦ活性化因子（特開平5-103670号、同6-141859号、同6-153946号、および同6-153966号各号公報参照；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を一本鎖から二本鎖へ変換する活性を有する因子）の正の活性制御としてその前駆体の活性化をトロンビンが担うことが既に報告されていたが、負の制御因子としてその生理活性を阻害する生体由来のプロテアーゼインヒビターは知られていなかった。そのため、ＨＧＦ活性化因子が生体内でどのように制御されているかは不明であった。また、ＨＧＦ活性化因子が作用する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性をも間接的に影響を及ぼす可能性があり、ＨＧＦのin vivoでの作用機構解析のためにも生体由来のプロテアーゼインヒビターの単離、同定が求められていた。
【０００３】
このプロテアーゼインヒビター、並びにプロテアーゼインヒビターに対する抗体を用いることでＨＧＦ活性化因子のin vivoでの生理作用とその作用解析や、ＨＧＦの活性化の制御機構の解析等を従来と異なる面から行うことが可能となる。
【０００４】
さらに、ＨＡＩ−ＩＩの生体における詳細な機能、あるいは肝障害時におけるＨＡＩ−ＩＩの働き等を調べるためには多量のＨＡＩ−ＩＩを必要とする。しかしながら、現在に至るまでＨＡＩ−ＩＩを取得する方法としては、ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞等のヒト癌細胞株の培養上清を材料として、その中に微量に存在するＨＡＩ−ＩＩを精製するしかなかった。この方法は、人的、時間的、価格的に必ずしも最良の方法ではなく、また、微量なＨＡＩ−ＩＩのみを安定に取り出すことは困難を極める。そこで、ＨＡＩ−ＩＩの安定かつ大量取得のために、発現系の構築が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を指標に種々の培養細胞株をスクリーニングし、ヒト癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞等の上皮様細胞株）の培養上清中にその活性を持つ物質が存在することを見い出した。さらに、その阻害活性の本体を明らかにすべく、ＭＫＮ４５細胞の培養上清から種々のカラムクロマトグラフィーを用いてその精製を試みた。その結果、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による分子量が約３０，０００ダルトン付近の新規の蛋白質を見い出し、これをプロテインシークエンサーで分析することにより、この蛋白質のアミノ末端アミノ酸配列を得た。またこの蛋白質を蛋白質分解酵素で分解し生成するペプチドを分離した後、各ペプチドを上記と同様にしてアミノ酸配列分析することにより部分アミノ酸配列を決定した。更に、この部分アミノ酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定し、そのオリゴヌクレオチドをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、本蛋白質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
また、本発明者らは、この蛋白質を組換えＤＮＡ技術により安定かつ大量に取得するため種々の検討をした結果、この目的に有用な、この蛋白質をコードする発現ベクターを新たに構築し、この蛋白質の発現を可能にした。すなわち、この蛋白質の一部または全部のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、動物細胞発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ等のプラスミドベクターあるいは酵母、大腸菌等における発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した蛋白質発現用プラスミドを作製し、該プラスミドで宿主細胞を形質転換することにより得られる形質転換体が優れたＨＡＩ−ＩＩ産生能を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明の要旨は、下記の理化学的性質（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３０，０００ダルトンであり、（２）肝細胞増殖因子活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有し、（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、（４）ＭＫＮ４５またはＡ５４９細胞株を培養したときに、その培養上清に存在する蛋白質、および、前記蛋白質を発現するヒト癌細胞株を培養し、その培養上清から該蛋白質を単離することを特徴とする蛋白質の製造方法に存する。
【０００８】
なお、配列表の配列番号４に示す塩基配列は他の相補的な塩基配列を省略し一本鎖のみを記載した。この遺伝子より組み換えＤＮＡ技術により、例えば配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有する当該蛋白質を発現することができる。この時、当該蛋白質をコードするｍＲＮＡから翻訳される蛋白質はシグナル配列を含んでいるが、細胞から分泌される場合にはシグナル配列が切断され配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列の２８番目のアラニン残基以降のアミノ酸配列を有する当該蛋白質が産生される。シグナル配列として、他の蛋白質のシグナル配列を利用することもできる。また、宿主細胞内にシグナル配列のない成熟型蛋白質を発現させる場合は、当該蛋白質をコードする遺伝子として配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち８２番目のグアニン残基から以降の塩基配列を有する遺伝子をベクターのＡＴＧコドンにつなげて使用すればよい。さらに本発明においては、ＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を損なわない範囲内で、一部のアミノ酸もしくは核酸を除去、変更あるいは追加する等の改変を行ったもの、即ち「実質的に同一なアミノ酸配列」および「実質的に同一な塩基配列」を有するものも本発明に含まれる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに詳細に説明するに、本発明のプロテアーゼインヒビター活性を有する新規な蛋白質は、以下のような精製段階を経ることにより得られる。例えば、ヒト癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞、Ａ５４９細胞（それぞれ財団法人がん研究振興財団（Japanese Cancer Research Resources Bank）に登録番号JCRB0254、JCRB0076として登録）等の上皮様細胞株）を無血清培地で数日培養して、その培養上清を回収して細胞を除去後、濃縮して、ヘパリン−セファロースカラム(ファルマシア社製等)に供する。その素通り画分をＣｏｎＡ−セファロースカラム(ファルマシア社製等）に供し、吸着画分と素通り画分に分離する。素通り画分をＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製等）等の疎水クロマトグラフィーに供する。得られた当該タンパク質を含む画分をＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフィー（ポリマーラボラトリー社製等）に供し、その後、ハイドロキシアパタイトカラム（三井東圧化学社、生化学工業社等）に供す。その後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（旭化成社製ＧＳ５２０等）に供し、当該蛋白質を得ることができる。必要に応じて、逆相カラムクロマトグラフィー等を精製のステップに組み込むこともできる。
【００１０】
精製された本発明の蛋白質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約３０，０００ダルトンで、糖鎖、アミノ酸残基の修飾、Ｃ末端側の変異の相違と思われる数本のフラグメントもしくはスメアーなバンドとして泳動する。当該蛋白質はＨＧＦ活性化因子と反応させることで、ＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を有する。また、本発明の蛋白質は下記実施例２の表１に記載のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明の新規蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片は次のようにして得ることができる。上記のようにして精製した新規蛋白質を気相プロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ社製等）で分析することにより、アミノ末端アミノ酸配列を決定することができる。更に、当該蛋白質をリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ等）で分解し、生成するペプチド断片を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＹＭＣ社製等）で分離した後、各ペプチド断片を上記と同様にしてアミノ酸配列分析すれば、蛋白質内部のアミノ酸配列を知ることができる。
【００１２】
こうして決定したアミノ酸配列からＤＮＡ塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチドを合成してプローブとして使用する。当該蛋白質をコードする遺伝子をスクリーニングするｃＤＮＡライブラリーとしてはヒト由来の肝臓ｃＤＮＡライブラリー、脾臓ｃＤＮＡライブラリー、胎盤ｃＤＮＡライブラリー等（クローンテック社製等）が利用できる。その他当該蛋白質を発現している細胞株および組織材料から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作成してもよい。
【００１３】
このようなｃＤＮＡが組み込まれたλファージを大腸菌に感染させ（Maniatisらの方法：「モレキュラークローニング」）、これを培養する。形成されたプラークを当該蛋白質の一部のアミノ酸配列から推定される塩基配列から作成したオリゴヌクレオチドをプローブとしてプラークハイブリダイゼイション法に従って選択することにより、容易に目的とする当該蛋白質のアミノ酸配列を有し、なおかつ当該蛋白質のアミノ酸配列のプローブ以外の領域に相当する塩基配列をも有する、異なるλファージクローンをいくつか得ることができる。
【００１４】
更に、上記スクリーニング陽性のプラークからManiatisらの方法によりファージを増殖させ、そのものからグリセロールグラディエント法に従ってＤＮＡを精製し適切な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等のプラスミドベクターあるいはＭ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９等の一本鎖ファージベクターにｃＤＮＡをサブクローニングし、Sangerらのジデオキシ法に従って目的ｃＤＮＡフラグメントの塩基配列を決定することができる。得られたクローンの塩基配列を解析し、それらを統合することにより当該蛋白質の一部をコードするｃＤＮＡ群によって配列表の配列番号４に示す当該蛋白質の全アミノ酸配列のすべてに対応する遺伝子を得ることができる。
【００１５】
また、本ｃＤＮＡの塩基配列の一部をプローブとして使用し、ＰＣＲ法を用いることにより、各種ｃＤＮＡライブラリーから、本ｃＤＮＡの全てを含む遺伝子、本ｃＤＮＡの一部の塩基配列が欠失した遺伝子、本ｃＤＮＡに他の塩基配列が挿入された遺伝子もしくは本ｃＤＮＡの一部の塩基配列が他の塩基配列に置換された遺伝子なども得ることができる。このような塩基配列の欠失、付加あるいは置換等の部位特異的変異は、Method in Enzymol., 217, 218-227（1993）、同217, 270-279（1993）等に記載の方法により容易に行うことができる。
【００１６】
このようにして得られるｃＤＮＡ群をその塩基配列の順番が本蛋白質のアミノ酸配列に従う形でつなぎ、当該蛋白質の全領域を含むＤＮＡ断片とし、これをｐＣＤＬ−ＳＲα２９６等のプラスミドのプロモーターの下流に翻訳開始コドンＡＴＧとフェーズを合わせて、蛋白質発現用プラスミドを構築し、当該プラスミドで形質転換された動物細胞の宿主内等で当該蛋白質を発現させることができる。続いて常法に従い精製し、発現された当該蛋白質を得ることができる。
【００１７】
すなわち、上記のようにして得られる各種ｃＤＮＡをｐＭＥ１８Ｓ等のプラスミドのプロモーターの下流に挿入して、蛋白質発現用プラスミドを構築し、当該プラスミドで形質転換された動物細胞の宿主等で、当該蛋白質、当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が欠失した蛋白質、当該蛋白質に他のアミノ酸配列が挿入された蛋白質もしくは当該蛋白質の一部のアミノ酸配列が他のアミノ酸配列に置換された蛋白質を発現させることができる。具体的には、動物細胞としてＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスＦＭ３Ａ細胞等を用いて発現させることが可能である。これらの動物細胞等を宿主とする場合は、シグナル配列として、配列表の配列番号４に示すＤＮＡ塩基配列、すなわち当該蛋白質の遺伝子の１から８１番目の塩基配列もしくは既存のシグナル配列を使用することにより、当該蛋白質が細胞外に分泌生産、もしくは細胞膜表面上に生産されることが期待される。
【００１８】
動物細胞を宿主とした発現用プラスミドは次のように構築される。
プロモーターとしては全ての既存のプロモーターが使用可能であるが、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはメタルチオネイン遺伝子のプロモーターが使用できる。このプロモーター下流に上記シグナル様配列を含む当該蛋白質の遺伝子の全てを含むＤＮＡ、本遺伝子の一部の塩基配列が欠失したＤＮＡ、本遺伝子に塩基配列が挿入されたＤＮＡもしくは本遺伝子の一部の塩基配列が別の塩基配列に置換されたＤＮＡを転写方向にしたがって挿入する。また当該蛋白質の発現ベクター構築の際には該プロモーターの下流に当該蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片を２〜３個結合したものを挿入してもよい。また当該蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ断片の５’上流側にＳＶ４０などのプロモーターを結合したＤＮＡ断片を単位としたものを転写方向を揃えて２〜３個結合してベクターに挿入してもよい。
【００１９】
この当該蛋白質をコードする遺伝子の下流にはポリアデニル化部位を付加する。例えば、ＳＶ４０  ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子またはメタルチオネイン遺伝子由来のポリアデニル化部位が当該蛋白質をコードする遺伝子の下流に付加することが可能である。またプロモーターと当該蛋白質をコードする遺伝子を結合したＤＮＡ断片を２〜３個結合する場合には、各単位の当該蛋白質をコードする遺伝子の３’側にそれぞれポリアデニル化部位を存在させることもできる。この発現ベクターを用いて動物細胞例えばＣＨＯ細胞を形質転換する際に、薬剤耐性遺伝子を使用し、目的とする発現細胞を選択することが可能である。
【００２０】
薬剤耐性遺伝子としては、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子（ジャーナルオブモレキュラバイオロジー（J. Mol. Biol.）159巻601頁（1982））、抗生物質Ｇ−４１８耐性を与えるＮｅｏ遺伝子（ジャーナルオブモレキュラアプライドジェネティクス（J. Mol. Appl. Genet.）1巻327頁（1982））、ミコフェノール酸耐性を与える大腸菌由来のＥｃｏｇｐｔ遺伝子（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）78巻2072頁（1981））、抗生物質ハイグロマイシン耐性を与えるｈｐｈ遺伝子（ モレキュラセルバイオロジー（Mol. Cell. Biol.）5巻410頁（1985））等が挙げられ、各耐性遺伝子の５’上流側にはプロモーター、例えば前述のＳＶ４０由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺伝子の３’下流側には、前述のポリアデニル化部位が含まれる。
【００２１】
当該蛋白質の発現ベクターにこれらの耐性遺伝子を挿入する場合、当該蛋白質をコードする遺伝子のポリアデニル化部位下流に順方向あるいは逆方向に挿入すればよい。これらの発現ベクターは、形質転換体を得る際に選択マーカー遺伝子を含む別のプラスミドを二重形質転換する必要がない。また当該蛋白質の発現ベクターにこれらの選択マーカー遺伝子が挿入されていない場合には、形質転換体の選択のマーカーを有するベクター例えばｐＳＶ２ｎｅｏ（ジャーナルオブモレキュラアプライドジェネティクス（J. Mol. Appl. Genet.）1巻327頁（1982））、ｐＭＢＧ（ ネイチャー（Nature）294巻228頁（1981））ｐＳＶ２ｇｐｔ（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）78巻2072頁（1981））、ｐＡｄ-Ｄ２６-１（ジャーナルオブモレキュラバイオロジー（J. Mol. Biol.）159巻601頁（1982））などを当該蛋白質をコードする遺伝子の発現ベクターと共に形質転換し、薬剤耐性遺伝子の表現形質により形質転換体を容易に選択できる。
【００２２】
発現ベクターの動物細胞への導入は、リン酸カルシウム法（ヴァイロロジー（Virology）52巻456頁（1973））、エレクトロポレーション法（ジャーナルオブメンブレンバイオロジー（J. Membr. Biol.）10巻279頁（1972））等により行うことができる。
【００２３】
形質転換された動物細胞の培養は、常法により浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地としては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜１０％血清の存在下もしくは適当量のインシュリン、トランスフェリン等の存在下、もしくは無血清下にて培養する。さらに当該蛋白質を、酵母や大腸菌、例えば、Saccharomyes cerevisiae株や Escherichia coli YA-21株等の微生物を使用して生産することも出来る。
【００２４】
当該蛋白質を発現している細胞は、その培養上清中、もしくは細胞表面上に当該蛋白質を発現することから、この組換え体の培養上清もしくは細胞を用いて当該蛋白質の分離精製を行うことが可能である。具体的には、生産された当該蛋白質を含む培養上清もしくは細胞抽出液を各種クロマトグラフィー、例えば、ヘパリン−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース、ハイドロキシアパタイト等を組み合わせたクロマトグラフィーにて精製することにより当該蛋白質を単離精製することができる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明に関わるプロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白質はＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を持つため、in vivoまたはin vitroでのＨＧＦ活性化因子の調節因子として、また、間接的にはＨＧＦの活性の調節因子として、さらにはそれら因子の機能解析の道具、手段として、当該蛋白質に対する抗体、当該蛋白質をコードする遺伝子も含めて使用される。
【００２６】
また、当該蛋白質をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを動物細胞に導入することにより、今まで困難であった生物学的活性のある当該蛋白質の一部または全部あるいは当該蛋白質様蛋白質を、大量、安定かつ容易に生産することが可能となる。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例により、本発明をさらにより詳細に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限り、以下の実施例によって限定されるものではない。
【００２８】
実施例１ ＭＫＮ４５細胞の培養上清を用いての当該蛋白質の精製
ＭＫＮ４５細胞［内藤ら、癌と化学療法、5、89（1978）；免疫生物研究所から入手］をローラーボトル８５０の５％ＦＢＳを含むｅＲＤＦ培地中に播種して、コンフルエントな状態になるまで増殖させた。増殖後、ＦＢＳを含む培養液を除去後、無血清ｅＲＤＦ培地で２度洗浄した。洗浄用培地を除去後、無血清ｅＲＤＦ培地５００ｍｌを加えて３〜６日間３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、培養液を回収して、新しい無血清ｅＲＤＦ培地５００ｍｌを加えて再度インキュベーションした。これを数回繰り返して、回収した培養上清をＹＭ３０限外濾過膜（アミコン社製）にて約２０倍にまで濃縮した。
【００２９】
この濃縮液をヘパリン−セファロースカラム（ＰＢＳで平衡化）に供し、その素通り画分を回収した。このヘパリンカラム素通り画分を、ＣｏｎＡ−セファロースカラム（ＰＢＳで平衡化）に供し、素通り画分と、２００ｍＭ  α−メチルＤ−マンノシドを含むＰＢＳ溶液での溶出画分に分離した。ＣｏｎＡ素通り画分をＹＭ３０を用いて濃縮、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）溶液へ緩衝液置換を行い、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（東ソー社製；１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、１Ｍ硫酸アンモニウムから０Ｍへの直線濃度勾配溶出を行い、目的のプロテアーゼインヒビター活性が存在する画分を回収した。
【００３０】
当画分を０．０５％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）に透析後、ＤＥＡＥ（０．０５％ＣＨＡＰＳを含む２０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、０Ｍから５００ｍＭ  ＮａＣｌへの直線濃度勾配溶出を行い、目的のプロテアーゼインヒビター活性が存在する画分を回収した。当画分を０．０５％ＣＨＡＰＳを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に透析して、ＨＣＡ  Ａ−４００７カラム（三井東圧化学社製）（０．０５％ＣＨＡＰＳを含む５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化）を用いたＨＰＬＣに供し、その素通り画分を回収した。当画分をＧＳ−５２０（０．０５％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで平衡化）に供し、活性画分（約４０〜２０ｋＤａ付近の画分）を回収した。マイナーバンドを除去するため、当画分をＹＭＣ  ｐａｃｋＣ４カラム（ＹＭＣ社製）に供し、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル／イソプロピルアルコール（３／７）濃度１０％から５０％まで４０分間の直線濃度勾配溶出を行い、活性画分を１Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ８）にて中和後、減圧下で乾燥させた。乾燥後、０．０５％ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳに溶解して、精製蛋白質を得た。
【００３１】
実施例２ 当該蛋白質のアミノ末端アミノ酸配列および部分アミノ酸配列の決定
実施例１に従って精製し、逆相ＨＰＬＣで溶出させたプロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白質を、中和せずに減圧下で乾燥させた。これを、５０％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）６０μｌに溶解し、ポリブレン処理したグラスフィルターに添加し、Applied Biosystems社製４７０Ａシークエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端領域のアミノ酸配列を決定した。フェニルヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定は、三菱化学社製ＭＣ  ｇｅｌ  ＯＤＳ  ＩＨＵ（０．４６ｘ１５ｃｍ）カラムを用い、酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）、０．０１％ＳＤＳ、３８％アセトニトリル）による単一溶媒溶出法を流速１．２ｍｌ／分、温度４３℃で行い、ＰＴＨアミノ酸の検出は２６９ｎｍの吸光度で行った。
【００３２】
この結果、表１に示すＮ末端アミノ酸配列を同定した。
次に、同じく実施例１に従って精製し、逆相ＨＰＬＣで溶出させたプロテアーゼインヒビター活性を有する蛋白質を、４Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）１００μｌに溶解し、これにリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタープロテアーゼＩ）を添加して３７℃で８時間反応させた。生成したペプチド混合物はＹＭＣ  ｐａｃｋ  Ｃ８カラム（ＹＭＣ社）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分離して各ペプチド断片を得た。２つのペプチドについて気相プロテインシークエンサー（Applied  Biosystems社製  model470A）を用いてアミノ酸配列分析を行ったところ、表1に示す配列が見い出された。
【００３３】
【表１】
表１ ペプチドのアミノ酸配列
Ｎ末端：Ala-Asp-Arg-Glu-Arg-Ser-Ile-His-Asp-Phe-Xaa-Leu-Val-Ser-Lys（配列表の配列番号１）
部分アミノ酸配列
１：Lys-Val-Val-Gly-Arg-Xaa-Arg-Ala-Ser-Met-Pro-Arg-Trp-Trp-Tyr-Asn-Val-Thr-Asp-Gly-Ser-Xaa-Gln-Leu-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly（配列表の配列番号２）
２：Ala-Thr-Val-Thr-Glu-Asn-Ala-Thr-Gly-Asp-Leu-Ala-Thr-Ser-Arg-Asn-Ala-Ala-Asp-Ser-Ser-Val-Pro-Ser-Ala-Pro（配列表の配列番号３）
（配列中、Xaaは未決定のアミノ酸を示す。）
【００３４】
実施例３ Ａ５４９細胞の培養上清を用いての当該蛋白質の精製とアミノ酸配列解析
Ａ５４９細胞［財団法人がん研究振興財団（Japanese Cancer Research Resources Bank)」から入手］を実施例1と同様に培養して培養上清を調製した。その培養上清を用いて実施例１と同じ操作によって、ＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を持つ蛋白質を得た。この蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、ＭＫＮ４５細胞由来のものと同じ分子量を示した。また、この蛋白質のＮ末端領域のアミノ酸配列を実施例１と同様の方法で決定した。この結果、その配列はＭＫＮ４５細胞由来と同じであった。このことより、当該蛋白質はＭＫＮ４５由来の蛋白質と同じである可能性が示された。
【００３５】
実施例４ 当該蛋白質のＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を測定する方法とその活性
測定しようとするサンプル１〜１０μｌを、２〜５ｎｇ血清由来ＨＧＦ活性化因子を含むＰＢＳ、０．０５％  ＣＨＡＰＳ溶液３０〜４０μｌに添加した。３７℃で３０分間インキュベーション後、５〜１０μｇの一本鎖ＨＧＦを添加し、さらに２時間インキュベーションを継続した。この混合液を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。電気泳動後、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（ＣＢＢ）で染色し、一本鎖ＨＧＦと二本鎖ＨＧＦの割合を比較することで、活性を検出した。
【００３６】
精製した当該蛋白質数１０ｎｇと５ｎｇ血清由来ＨＧＦ活性化因子をＰＢＳ、０．０５％ＣＨＡＰＳ溶液３０〜４０μｌ中で３７℃で３０分間インキュベーションした後、１０μｇ一本鎖ＨＧＦを添加し、さらに２時間インキュベーションを継続した。この混合液を、還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、電気泳動後、ＣＢＢで染色した。結果を図１に示す。図中、１はＨＧＦ活性化因子と当該蛋白質を無添加の場合を、２はＨＧＦ活性化因子を添加、当該蛋白質無添加の場合を、３はＨＧＦ活性化因子と当該蛋白質を添加した場合の結果を表す。当該蛋白質の添加により、ＨＧＦ活性化因子のＨＧＦを一本鎖から二本鎖に変換する活性が抑制された。
【００３７】
実施例５ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＭＫＮ４５細胞の培養上清とＡ５４９細胞の培養上清より実施例１と２に従って精製されたプロテアーゼインヒビター活性を持つ当該蛋白質の見かけ上の分子量を求めるため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。最終的に精製された当該蛋白質を１２．５％のポリアクリルアミド・スラブゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、非還元下で供した。分子量マーカーとしては、分子量マーカー「第一」III Laemmli法用(第一化学薬品社製)を用いた。電気泳動後、銀染色試薬（関東化学社製）を用いて発色させた。当該蛋白質と標準分子量マーカーの蛋白質との泳動距離の相対的比較により、ＭＫＮ４５細胞の培養上清とＡ５４９細胞の培養上清から得られた当該蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上のみかけの分子量として約３０，０００ダルトン前後に糖鎖、アミノ酸残基の修飾または末端領域の相違によるものと思われる数本のフラグメントもしくはスメアーなバンドを示した。
【００３８】
実施例６ 当該蛋白質をコードする遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
実施例２によって得られた、当該蛋白質の部分アミノ酸配列（配列表の配列番号２）に含まれる、Lys-Val-Val-Gly-Arg-Xaa-Arg および Xaa-Gln-Leu-Phe-Val-Tyr-Gly-Glyの配列をもとに、XaaがCysであろうとの予測をたてて、以下に示す二種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
プライマー１：5'-AAGGTNGTNGGNMGNTGYMG-3'（配列表の配列番号：５）
プライマー２：5'-CNCCGTANACGAANARYTGRC-3'（配列表の配列番号：６）
（配列中、N=TまたはG、M=AまたはC、Y=TまたはC、R=AまたはGを示す。）
次に、ＭＫＮ４５細胞株よりトータルＲＮＡをアナリティカルバイオケミストリー(Anal. Biochem.）162卷156頁（1987）に記載の方法に従って調製し、これをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに供すことによりｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡを取得した。
【００３９】
得られたｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として用い、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polymerase chain reaction、羊土社、林 件志 編、1995年2月5日発刊「ＰＣＲ法の最新技術」p44-p52参照）を行った。このＲＴ−ＰＣＲにて得られた反応液をポリアクリルアミド電気泳動法にて解析した結果、約８５ｂｐのＤＮＡ断片が検出された。そこでこのＤＮＡ断片をポリアクリルアミドより抽出後、フェノールクロロホルム処理およびエタノール沈殿を行いＤＮＡ断片を回収後、ダイデオキシ法にて塩基配列を決定した。さらに、このＤＮＡ断片はモレキュラークローニング（コールドスプリングハーバーラボラトリー、1982年）に記載の方法に従って32Ｐ標識し、これをスクリーニング用プローブとした。
【００４０】
スクリーニング用のライブラリーとしては、ＭＫＮ４５細胞株のｐｏｌｙ−（Ａ）＋ＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ラムダＺＡＰＩＩ（ストラテジーン社製）をベクターとしたファージライブラリーを作製した。大腸菌はＸＬ−Ｂｌｕｅ（ストラテジーン社製）を用い、約１０万プラークとなるように上記のファージを感染させた。
【００４１】
ＮＺＹ培地で一晩生育させた後、ジーンスクリーニングプラス（デュポン社製）にトランスファーさせた。そのメンブレンを０．１Ｍ水酸化ナトリウム／０．５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が染み込んだ濾紙上に２分間静置し、続いて１．５Ｍ塩化ナトリウム／０．５Ｍトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）が染み込んだ濾紙上で５分間静置した。この一連の処理を更に２回繰り返した後、２ｘＳＳＣ（２倍ＳＳＣ）で洗浄し、乾いた濾紙上で風乾した。次にこのメンブレンに１２０ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射を行うことにより、メンブレンに移したＤＮＡの固定を行った。こうして処理したメンブレンを５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液５０ｍｌに浸漬し、６５℃で２時間保持した。
【００４２】
次に、上記の32Ｐで標識したプローブ５ｎｇ／ｍｌ、鮭精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ、５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）、１Ｍ塩化ナトリウムおよび１％ＳＤＳよりなる溶液４０ｍｌに浸漬し、６５℃で１６時間保持した。その後、このメンブレンを２ｘＳＳＣで室温５分間、０．１ｘＳＳＣで室温３０分間２回の順に洗浄した後、オートラジオグラフィーを行い、当該蛋白質ｃＤＮＡを含むと考えられる２２個のポジティブクローンを得た。各ポジティブクローンから、東洋紡社ライフサイエンスカタログ（p114-115）およびストラテジーン社製マニアルに従ってエキシジョン法（東洋紡社ライフサイエンスカタログ、p114-115）を行い、プラスミドの構築を行った。
【００４３】
次に、このプラスミドＤＮＡを取得後、制限酵素ＥｃｏＲＩにて切断し、アガロース電気泳動により、最長の当該蛋白質ｃＤＮＡが挿入されたクローンを選択した。次にこのクローンが有するプラスミド（ｐＨＡＩ−ＩＩ）について塩基配列を解析することにより、当該蛋白質をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した（配列表の配列番号４）。
【００４４】
施例７ 当該蛋白質発現プラスミドの調製
実施例６によって得られた当該蛋白質ｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＨＡＩ−ＩＩ）１０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル電気泳動により当該蛋白質ｃＤＮＡを含む約１．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を分離および抽出した。得られた当該蛋白質ｃＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端にした後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行い、１０μｌの水に溶解した。
【００４５】
一方、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ（メディカルイミュノロジー、20卷27頁（1990））は制限酵素ＸｈｏＩで切断後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端にした。この後、フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行い、４００μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2溶液に溶解した。さらにバクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡、ＢＡＰ−１０１）１ｕｎｉｔを添加し、６５℃下３０分の反応を施し脱燐酸化処理を行った。次にこの反応液からフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈澱により制限酵素ＸｈｏＩで切断されたｐＭＥ１８Ｓベクターを精製し、１０μｌの水に溶解した。
【００４６】
このｐＭＥ１８ＳベクターのＤＮＡ断片０．０１μｇと前述の平滑末端化されたＨＡＩｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片０．１μｇを含む溶液２０μｌ（６６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭジチオトレイトール、６６μＭ  ＡＴＰ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡ＬＧＡ−１０１）存在下で１４℃で１２時間反応させ、両ＤＮＡ断片の結合反応を行った。
【００４７】
次に、この反応液１０μｌを用いて大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造）を形質転換し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含む培地上で培養することにより数十個のアンピシリン耐性株を得た。これらの組換え体をManiatisらの方法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、86頁〜96頁（1982））に従い解析することにより、発現ベクターｐＭＥ１８Ｓのプロモーターとポリアデニレーション部位の中間に存在する制限酵素ＸｈｏＩ切断部位に当該蛋白質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド、ｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩ−ＩＩプラスミドを得ることが出来た。その構造を図２に示す。
【００４８】
実施例８ 当該蛋白質を発現する細胞株の取得
実施例７で作製された発現ベクターｐＭＥ１８Ｓの制限酵素ＸｈｏＩ切断部位に当該蛋白質ｃＤＮＡが挿入されたプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩ−ＩＩをManiatisらの方法（「モレキュラークローニング」、コールドスプリングハーバーラボラトリー、86頁〜96頁（1982））に従い組換え体の大腸菌から回収、精製し当該蛋白質発現プラスミドＤＮＡを大量に得た。
【００４９】
一方、ＣＯＳ細胞をＦＢＳ（牛胎児血清）が１０％入ったｅＲＤＦ培地中でセミコンフルエントな状態になるまで培養した。次にシャーレから培地を除きそこにＤＮＡ溶液を滴加するが、ＤＮＡ溶液は予め次に示す手順に従って調製した。まず直径９ｃｍのシャーレ一枚につき３００μｌの２ｘＨＥＢＳ溶液（２ｘＨＥＢＳ溶液；１．６％塩化ナトリウム、０．０７４％塩化カリウム、０．０５％燐酸水素二ナトリウム１２水塩、０．２％デキストロース、１％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０５））と１０μｇのプラスミドＤＮＡを加え、滅菌水で５７０μｌに合わせた溶液を、エッペンドルフ遠心管中に準備する。次に該ＤＮＡ溶液に３０μｌの２．５Ｍの塩化カルシウム溶液を滴加しながらボルテックスミキサーを用い数秒間激しく混和する。これを室温で３０分間放置するが、その間およそ１０分おきにボルテックスミキサーで混和する。
【００５０】
この様にしてできたＤＮＡ溶液を、前述の細胞にかけて室温で３０分間静置した。その後ＦＢＳが１０％入ったｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）９ｍｌをシャーレに入れて３７℃、５％ＣＯ2存在下で４〜５時間培養した。次にシャーレから培地を除き５ｍｌの１ｘＴＢＳ＋＋溶液（１ｘＴＢＳ＋＋溶液；２５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、０．６ｍＭ燐酸水素二ナトリウム、０．０８ｍＭ塩化カルシウム、０．０８ｍＭ塩化マグネシウム）で細胞を洗浄し、１ｘＴＢＳ＋＋溶液を除去した後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）を１０％含む１ｘＨＥＢＳ溶液を５ｍｌ細胞にかけて室温で１〜２分間静置した後上清を除去した。その後５ｍｌの１ｘＴＢＳ＋＋溶液で細胞を再び洗浄しＦＢＳが１０％入ったｅＲＤＦ培地１０ｍｌをシャーレに入れて３７℃  ５％ＣＯ2存在下で培養し、４８時間が経過した時点で培地を回収した。回収した培養上清を２０倍に濃縮して、ＨＧＦ活性化因子に対する阻害活性を測定したところ、阻害活性が確認された。
【００５１】
【配列表】
0003669062.tif 000002
【００５２】
0003669062.tif 000003
【００５３】
0003669062.tif 000004
【００５４】
0003669062.tif 000005
0003669062.tif 000006
0003669062.tif 000007
【００５５】
0003669062.tif 000008
【００５６】
0003669062.tif 000009
【００５７】
【図面の簡単な説明】
【図１】本願蛋白質のＨＧＦ活性化因子のプロテアーゼ活性を阻害する活性を測定した結果を表す図である。
【図２】プラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ＨＡＩ−ＩＩの構造を表す図である。
【図１】
0003669062.tif 000010
【図２】
0003669062.tif 000011