(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、腫瘍または該腫瘍の周囲の組織中にＤＮＡまたはＲＮＡ配列を直接注入することによって、腫瘍細胞または該腫瘍細胞の周囲の組織をインビボで形質転換するための組成物であって、以下：
細胞表面分子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列であって、該腫瘍細胞または該腫瘍細胞の周囲の組織を形質転換するために有効な量の、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、および
該配列のためのビヒクルであって、該ビヒクルは該腫瘍細胞または該腫瘍細胞の周囲の組織への該配列のインビボ送達を容易にするウイルスベクターである、ビヒクル、
を含み、
ここで、該ＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、該哺乳動物に対して外因性であり、そして該腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激する分子をコードする、
組成物。
【請求項２】
哺乳動物において、腫瘍または該腫瘍の周囲の組織中にＤＮＡまたはＲＮＡ配列を直接注入することによって、腫瘍細胞または該腫瘍細胞の周囲の組織をインビボで形質転換するための組成物であって、以下：
該哺乳動物において免疫原性であるタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列であって、該腫瘍細胞または該腫瘍細胞の周囲の組織を形質転換するために有効な量の、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、および
該配列のためのビヒクルであって、該ビヒクルは該腫瘍細胞または該腫瘍細胞の周囲の組織への該配列のインビボ送達を容易にするウイルスベクターである、ビヒクル、
を含み、
ここで、該ＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、クラスＩ組織適合性遺伝子およびクラスＩＩ組織適合性遺伝子からなる群から選択される１つのメンバーである、
組成物。
【請求項３】
哺乳動物における腫瘍に関連する悪性疾患を処置するための、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、前記哺乳動物と同じ種から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、前記哺乳動物とは異なる種から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ビヒクルがレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
これは１９９１年６月２８日出願の米国特許出願番号０７／７２４，５０９の一部継続出願であり、さらにそれは１９８９年３月３１日出願の米国特許出願番号０７／３３１，３３６の一部継続出願（現在、放棄）である。
技術分野
本発明は、細胞の部位特異的な点滴注入または細胞の部位特異的形質転換による疾患の治療、およびそのためのキットに関する。またこの発明は、生体中へのリコンビナント遺伝子の導入によって動物の免疫システムを調節する方法に関する。
背景技術
多くの後天的および先天的な疾患に対する効果的な治療は現代の医学にとってもまだ大きな挑戦課題として残されている。治療薬を生体の特定の部位に運ぶ能力は、たとえば、局所的な疾患の治療にとって非常に重要なものである。また、治療薬を循環器系を経由して灌流させることができれば、たとえば、先天的および後天的な疾患または癌の治療に効果的である。
たとえば、抗腫瘍剤またはトキシンを腫瘍部位のすぐ近くに確実に投与できることは望ましいことである。同様に、たとえば、糖尿病患者の血液中にインスリンを灌流させることも望ましいことである。しかしながら、多くの治療薬に関して、特定部位への投与または全身的投与のいずれにおいても満足できる方法はない。
加えて、多くの疾患において、局所的または全身的に、欠陥のある内因性遺伝子の発現、外因性遺伝子の発現、あるいは内因性遺伝子の抑制、を起こさせることができれば望ましいが、これらもまた、まだ達成されていない課題である。
特に、アテローム性動脈硬化症の発病はつぎの３つの基本的な生物学的なプロセスで特徴づけられる。これらは：１）血管内膜の平滑筋細胞の増殖とマクロファージの堆積；２）平滑筋細胞の増殖による大量の結合組織マトリックスの生成；３）細胞の中およびそれをとりまく結合組織中での脂質の蓄積（基本的にはコレステロールエステルおよびフリーのコレステロールの形で）、である。
最初に起こる事象は内皮細胞の損傷で、これは内皮の浸透膜の干渉となって現れ、内皮表面の非凝血特性が変化し、内皮の凝血促進特性が昴進する。単球が内皮細胞間を遊走し、スカベンジャー細胞として活発になり、マクロファージに分化する。
ついでマクロファージは、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ），線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、および形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）を合成し、分泌する。これらの成長因子は、アテローム性動脈硬化プラクの中の線維芽細胞および平滑筋細胞の遊走および増殖を強力に刺激する。さらに、血小板は損傷した内皮細胞および活性化されたマクロファージとの相互作用で成長因子の生産および血栓の生成をもたらす。
冠動脈系の疾患の臨床管理における２つの大きな問題としては、急性の心筋虚血における血栓の生成および冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄がある。この両者とも、内皮の損傷、活性化されたマクロファージおよび血小板による成長因子群の放出といった一般的な細胞事象が関与する。冠動脈形成術を行うと、アテローム性動脈硬化プラクを破壊し、内皮を除去することになる。この血管の外傷は、血小板凝集およびＰＴＣＡ部位での血栓生成を促進する。血小板やマクロファージからさらにマイトジェンが放出されると、平滑筋細胞の増殖および単球の浸潤によって再狭窄にいたる。
この問題は、抗血小板剤を使用する経験医学診療では予防できず、ＰＴＣＡ患者の１／３で起こっている。再狭窄の解決策は、血小板凝集の防止、血栓生成の防止、ならびに平滑筋細胞の増殖抑制である。
血栓の生成はまた、冠状症候群の安定から不安定への移行における決定的な細胞現象である。この病因には、多くの場合急性の内皮細胞の損傷あるいはプラクの破壊が関与し、内皮細胞の付着部の機能不全を促進し、下層のマクロファージフォーム細胞を露出させることになる。これによって、循環している血小板の付着、凝集、および血栓生成の機会が生まれる。
組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）のような血栓溶解剤の静脈内注射によって、急性の心筋梗塞患者の約７０％において血栓を溶解するという結果が得られている。にもかかわらず、約３０％の患者では再灌流ができず、また梗塞を起こした動脈でいったん再灌流をした患者の約２５％が、２４時間以内に血栓の再発を経験している。したがって、再血栓に対する効果的な治療法は現代の医学界における重要な課題として残されている。
上述のように、再血栓に対する効果的な治療法のみが現在残されている唯一の重要な課題というわけではない。不安定なアンギーナ、心筋梗塞や慢性の組織虚血といった、その他の虚血性の症状の治療、あるいは後天性及び遺伝性の疾患や癌などの治療も重要な課題である。これらの疾患は、抗凝固剤、血管拡張剤、血管形成剤、成長因子剤や成長抑制剤などの、患者に対する適切な投与によって治療することができる。このように、これらの診療分野すべてにおいて効果的な治療法が切望されている。
さらに、動物の免疫システムを調節できることは望ましいことである。特に、感染から守る免疫的防御を与えるためのワクチンの開発に関しては多大の努力が払われてきた。しかしながら、多くの患者に簡単に投与できる安全なワクチンについては問題が多いし、多くの病気（たとえばＡＩＤＳのような）に対しては安全で効果的なワクチンは今のところ得られていない。さらに、時には、移植の拒絶を防ぐために、動物の免疫反応を特別に抑えることも望まれている。移植の拒絶を抑えるための努力は、全体の免疫反応を抑える薬の開発をもたらしたが、これは移植の抗原だけを特別に抑えるものではなく、このような薬剤は常に効果的というわけではない。したがって、動物の免疫システムを調節する方法の必要性が残されている。
発明の開示
したがって、本発明の一つの目的は、治療薬の部位特異的な投与のための新規な方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、治療薬を患者の血流の中で灌流させる方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、外因性遺伝子を患者の体内で発現させる方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、欠陥内因性遺伝子を患者の体内で発現させる方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、患者の体内の内因性遺伝子の発現を抑制する方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、患者の体内の損傷した細胞を部位特異的に置き換える方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、治療薬の部位特異的な投与または患者の血流内への灌流、のいずれかによって疾患を治療する方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、患者の体内で、外因性遺伝子の発現、欠陥のある内因性遺伝子の発現、または内因性遺伝子の発現の抑制、のいずれかを引き起こすことによって疾患を治療する方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、患者の体内の損傷した細胞を部位特異的に置き換えることによって疾患を治療する方法を提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、患者の体内へ正常または形質転換した細胞を部位特異的に点滴注入するキットを提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、生体内で細胞を部位特異的に形質転換するキットを提供するものである。
本発明のもう一つの目的は、動物の免疫システムを調節する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、外来分子に対する感作性を動物に与えるために動物の免疫システムを調節する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、微生物やウイルスによる感染を防ぐために、タンパク質を拒絶するための動物の免疫システムを刺激する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、外来分子の受け入れを動物に許容させるために、動物の免疫システムを調節する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、移植を拒絶する傾向を減ずるために、動物の免疫システムを調節する方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、全身的投与によって、生体中で細胞を形質転換させる新規なキットを提供することにある。
以下の詳細な説明で明らかになる本発明のこれらのおよびその他の目的は、本発明者らが下記のことを達成することによって、明らかにされたものである：ａ）（ｉ）患者への正常細胞（形質転換されていない）または形質転換された細胞の部位特異的な点滴注入、または（ｉｉ）患者の細胞の部位特異的な形質転換、のいずれかからなる方法；および、ｂ）カテーテルを含むキットであって、（ｉ）正常細胞または形質転換された細胞の部位特異的な点滴注入、あるいは、（ｉｉ）細胞の部位特異的形質転換、のためのもの。
正常な細胞の部位特異的な点滴注入は損傷した細胞を置き換えるために使用でき、一方形質転換された細胞の点滴注入は欠陥のある内因性遺伝子または外因性遺伝子のいずれかの発現、あるいは内因性遺伝子産物の抑制、のために利用できる。患者の血管壁への細胞の点滴注入は血流中への治療薬の確実な灌流に使用することができる。
本発明者はまた、生体中で動物の細胞を形質転換させることによって、動物の免疫システムを調節することが可能であることを見いだした。特に、リコンビナント遺伝子を併用し、部位特異的または全身的な投与によって動物の細胞を形質転換させることによって、そのリコンビナント遺伝子がコードしている分子に動物が感作するように動物の免疫システムを調節することが可能である。あるいは、リコンビナント遺伝子を併用し、特に動物の免疫システムを特異的に決定する部位、（たとえば胸腺）、の細胞を形質転換させることによって、そのリコンビナント遺伝子がコードしている分子に対する免疫反応を抑制するように動物の免疫システムを調節することが可能である。
【図面の簡単な説明】
本発明およびこれに付随する多くの利点は、添付図面を参照しながら下記の詳細な説明を理解するにつれ容易により完全な理解、評価に到達できるものである。
図１および図２は本発明のカテーテルを、外科手術的または経皮的に細胞を血管内に移植するため、または患者の血管に存在する細胞を生体内で形質転換するために、使用する方法を示したものである。
図３は目的細胞の溶解％とそのエフェクター：ＣＴＬ細胞の目標比；を示す。
図４はウェスタン・ブロット分析の結果を示す。
本発明を実施するための最良の形態
ここで、実施態様の１つでは、先天性の疾患、全身的な疾患、心血管系の疾患、特定の器官の疾患、あるいは腫瘍などの疾患の治療に、本発明の、正常細胞または形質転換細胞の点滴注入、または細胞の形質転換の方法を使用している。
本法において点滴注入される細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、および実質細胞などがある。これらの細胞は治療効果ないしは診断効果を有するタンパク質で、天然に存在するかまたはリコンビナント遺伝子物質に由来するタンパク質を産生するものである。
つぎに図を参照すると、ここでは、同一または対応する部位には、すべての図において同一の番号を付している。図１では、米国特許４，６３６，１９５に開示されているデザインのカテーテルを用いた本発明の実施態様を示している（この特許をここにレファレンスとして援用する）。このカテーテルは正常または遺伝子的に変換した細胞を血管の壁に供給したり、細胞の局所的形質転換のためにベクターを導入するために使うことができる。図において５がその血管壁である。図では膨張可能のバルーン手段１および２を膨らませることによって、カテーテル部４が所定の位置に保持されているところを示している。バルーン手段１および２の間の部分に点滴注入口手段３が備えられている。このカテーテルにはさらにガイドワイヤ手段６を備えることもできる。図２は同様のカテーテルの使用が示されているが、このカテーテルには１個の膨張可能バルーン手段２と複数の点滴注入口手段３が備えられている点が図１のカテーテルと異なる。このカテーテルは最大１２個の独立した点滴注入口手段３を備えることができるが、図では５個備えているところを示している。
器官への供給のケースでは、このカテーテルは組織への補給を行う主要動脈に導入される。リコンビナント遺伝子またはベクターを含んだ細胞は、動脈循環を一時的に閉塞した後、中央の点滴注入口を通して導入される。このようにして、細胞またはベクターＤＮＡは毛細管循環を通して、大量の実質組織に移入される。リコンビナント遺伝子もまた、ダブルのバルーンカテーテル手法を目的の器官のすぐ近くの動脈循環に使用して、脈管中に導入することができる。このようにすれば、リコンビナント遺伝子を、関与する組織を灌流する循環系の中に直接分泌させたり、その器官の中で直接合成させることができる。
１つの実施態様では、治療薬は血管細胞によって分泌され、病気に冒されている特定の器官に供給されている。たとえば、虚血性心筋症は冠循環系に脈管形成性の因子を導入することによって治療することができる。このアプローチはまた、脈管形成性の因子が脳やその他の組織の循環を改善できるような末梢血管や大脳血管の疾患に使用することができる。真性糖尿病はグルコース反応性のインスリン分泌細胞を門脈の循環、（そこでは通常肝臓に他の組織より高いインスリン濃度が見られる）に導入することによって治療することができる。
治療薬の局所的濃度を高めるためのほか、本法はリコンビナント遺伝子を実質組織に供給するためにも使用することができる。なぜならば、本法では高濃度のウイルス性ベクターやその他のベクターを特定の循環系に供給することができるからである。このアプローチを用いて、器官に特異的なタンパク質不全もまた治療することができる。たとえば、肝臓で、α−アンチトリプシンインヒビター不全や高コレステロール血症は、α−アンチトリプシンまたはＬＤＬ受容遺伝子を導入することによって治療することができる。さらに、このアプローチは悪性疾患の治療にも利用することができる。手術不能の腫瘍の循環系に対するリコンビナントトキシン遺伝子の分泌は治療効果をもたらす。例としては、切除不能の聴覚腫瘍やあるいはある種の血管腫がある。
臨床的状況においては、これらの治療用リコンビナント遺伝子は関与器官において循環供給される細胞の中に導入される。これらの細胞の導入場所としては動脈系および毛細血管系が好ましいが、静脈系でもよい。
局所的な血管損傷の治療の場合、本発明は、その局所にこの症状を改善するタンパク質を発現させる。１つの実施態様では、それらの部位に血管細胞が認められたので、それらを治療薬を運ぶキャリヤとして利用した。
本発明はこのように、その１つの様相においては、内皮およびその他の血管細胞の遺伝子的な変換、あるいは体細胞の遺伝子治療によって治療薬剤（すなわち、タンパク質、成長因子群）を損傷した局所に運ぶ。細胞への遺伝子移植を成功させるためには、４つの条件を満たさなければならない。第１に、細胞に移植しようとする遺伝子を同定し、単離しなければならない。第２に、発現させようとする遺伝子はクローン化され、遺伝子操作ができるようになっていなければならない。第３には、遺伝子は発現可能またはその機能が発揮されるような形で細胞に導入されなければならない。第４に、遺伝子的に変換された細胞は、それが必要とされる血管部位に正しく存在させなければならない。
本発明によれば、変換された細胞もしくは適当なベクターは、外科的、経皮的に、または静脈内に導入され、患者の血管壁の１部分に付着させる。あるいは、患者の血管壁に存在するいくつかの細胞を、望ましい遺伝子材料を用いて、または直接ベクターを適用して、形質転換させる。場合によっては、血管表面から失われたまたは損傷した細胞を置き換えるために、これらの方法を用いて、遺伝子的に変換されていない血管細胞を導入することもできる。
本発明によって、どのような血管も、すなわち動脈、静脈、毛細血管系も治療することができる。これらの血管は、ヒト、あるいはほ乳動物類の体内のいずれの器官の中、あるいはその近辺のものでもよい。
血管への正常なまたは遺伝子的に変換された細胞の導入
以下、本発明の実施態様を説明する。
Ｉ．  組織培養中での内皮またはその他の血管細胞の確立
最初に、１つの細胞系が確立され、液体窒素の中に貯蔵される。低温貯蔵に先だって、一定量を取り出し、希望する遺伝子材料を含んだベクター、ウイルスその他に感染もしくは形質移入させる。
内皮またはその他の血管細胞を、すでに発表されているＪ．Ｗ．Ｆｏｒｄ他，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，１７，４０（１９８１）の手法を用いて、酵素学的に血管の一部から取り出す。血管を切除し、ステンレススチールのロッドの上に反転して置き、Ｃａ++およびＭｇ++を含まないＨａｎｋのバランス塩溶液（ＢＳＳ）、に０．１２５％のＥＤＴＡを加えた溶液の０．１％トリプシン溶液中で、ｐＨ８、３７℃で１０分間、インキュベートする。
細胞群（０．４から１．５ｘ１０6）は遠心分離によって回収され、１０％牛胎児血清、２５μｇ/ｍｌの内皮細胞成長補助液（ＥＣＧＳ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウォルサム、マサチューセッツ州）、１５Ｕ/ｍｌのヘパリン、および５０μｇ/ｍｌのゲンタミシンを含んだ培養液１９９（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁させる。細胞を、ゼラチン（蒸留水中２ｍｇ/ｍｌ）をプレスコートした７５ｃｍ2の組織培養フラスコに加える。細胞群は交会に達するまで、２日ごとに上記培養液が与えられる。
培養２週間後、ブタの内皮を培養する場合には、ＥＣＧＳおよびヘパリンを培養液から除外する。もし、血管の平滑筋細胞あるいは線維芽細胞を培養する場合には、ＥＣＧＳおよびヘパリンは培養過程から完全に除外する。細胞のアリコートは、約１０6個の細胞を０．５ｍｌの氷冷胎児子ウシ血清中に氷の上で再懸濁させることによって、液体窒素の中で貯蔵する。１０％のＤＭＳＯを含む同量の氷冷胎児子ウシ血清を加え、細胞を冷やしたスクリューキャップ式のコーニング冷凍チューブに移す。これらの細胞は、長期間の液体窒素中での貯蔵の前に、３時間−７０℃の冷凍庫に移される。
その後この細胞は、希望する遺伝子材料を含んだベクターに感染させる。
ＩＩ．正常または外因性タンパク質を発現している細胞の脈管系への導入。
Ａ．関連タンパク質を発現している細胞のカテーテル法による導入。
患者は、無菌手法を厳密に適用して、外科的にまたは経皮的にカテーテルを挿入できるように準備する。目標とする血管の静脈切開を行うか、あるいは適当な麻酔処理の後、目標とする血管の中に針を挿入する。血管（５）を穿刺し、米国特許４，６３６，１９５のようなカテーテル（これはＵＳＣＩ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，マサチューセッツ州から入手可能。この米国特許の開示をここに援用する）、をもし必要なら蛍光透視ガイドのもとで、ガイドワイヤ手段（６）により、血管（５）の中に進ませる（図１）。このカテーテル手段（４）は、感染した内皮細胞を動脈の別々の部位に導入するようにデザインされている。このカテーテルは、遠位および近位のバルーン手段（２）および（１）を有し、（それぞれのバルーンの手段は、たとえば長さ約３ｍｍ，幅約４ｍｍである）、バルーン手段の間には一定の長さのカテーテル手段がある。バルーンの間のカテーテル手段は、点滴注入口部（３）につながる１つの口部を有する。遠位および近位のバルーン手段が膨らまされると、血管の中に１つの中央スペースが形成され、口部を通して感染された細胞を点滴注入することができる。
解剖学的標識点により血管の部位が特定され、血管の裸化を行うために、近位のバルーン手段（２）を膨らませ、内皮を機械的外傷（たとえば、血管の中に部分的に膨らませたバルーンカテーテルを強制的に通過させる）または機械的外傷と少量のディスパーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ペプシン、キモトリプシン、またはカテプシンなどの蛋白分解酵素の組み合わせ、あるいはこれらの蛋白分解酵素だけを用いた培養により、裸化する。蛋白分解酵素のほか、リパーゼも使用できる。血管の当該部位はまた、ＮＰ−４０、TritonＸ１００、デオキシコール酸塩、あるいはＳＤＳなどの弱い洗浄剤による処理によっても裸化できる。
裸化の条件は、細胞移入のためには基本的に内皮を完全に落とすか、直接感染の場合は約２０から９０％、好ましくは５０から７５％、の細胞を血管壁から落とすように調整する。ある場合には、細胞の除去をしなくてもよいこともある。ついでカテーテルを、点滴注入口（３）が裸化された内皮の部位にくるように進める。つぎに動脈の特定の部位に、感染、または形質移入した、あるいは正常な細胞を３０分間点滴注入する。もし、血管がある程度の虚血を許容できる器官を灌流している場合、たとえば骨格筋、は遠位の灌流は特に問題にはならないが、もし必要ならば外部シャントで、あるいは遠位の灌流ができるカテーテルを使用して回復させることができる。感染した内皮細胞を点滴注入した後、バルーンカテーテルをはずし、動脈穿刺部位および皮膚切開箇所を修復する。もし、遠位の灌流が必要ならば、遠位灌流ができるようにデザインされた別のカテーテルを使用する。
Ｂ．リコンビナント遺伝子の血管壁の細胞への直接導入、または生体中の特定の循環系による灌流；器官壁または器官の細胞の感染または形質移入。
上記と同様の外科的手法が用いられる。感染した細胞を使うかわりに、形質導入したウイルス性ベクター（１０5から１０6個/ｍｌ）または運搬ベクターに複合化したＤＮＡのような高力価の希望する遺伝子材料を、ダブルバルーンカテーテル手法を用いて、器官壁に直接点滴注入する。このベクターは、感染の効果を高めるために、血清およびポリブレン（１０μｇ/ｍｌ）を含んだ培養液の中に注入される。カテーテルによってできたデッドスペース中で、充分な時間（０．２から２時間またはそれ以上）培養した後、この培養液は脱気され、燐酸緩衝生理塩液で静かに洗浄し、そして動脈循環を回復させる。術後の回復のためにも同様の手順が適用される。
器官の表面は機械的な裸化のみでも、あるいは少量のディスパーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、またはカテプシンなどの蛋白分解酵素との組み合わせ、またはこれらの蛋白分解酵素だけを用いた培養、によっても準備することができる。裸化の条件は器官壁からの細胞脱落が適当になるように調節される。
ウイルス性ベクターまたはＤＮＡ−ベクター複合体は、精製ウイルスまたは自原性の血清を含んだ複合体を用いて、ダルベッコの改変イーグル培地に滴下注入する。または、目標細胞に対するウイルス粒子の付着性を強化して感染効果を高めるために、ポリブレン（１０μｇ/ｍｌ）、ポリ−Ｌ−リジン、デキストランサルフェートのような粘着性の物質、または生理学的に適当なポリカチオン性物質、またはウイルスあるいはベクターの被膜糖蛋白に対するハイブリッド抗体や器官壁中あるいは器官から灌流する組織中の関連する目標に対するハイブリッド抗体を含んだ複合体を用いる。ウイルスあるいはベクターの被膜糖蛋白や関連する目標細胞に対するハイブリッド抗体は、２つの方法のいずれかで作られる。異なるエピトープに対する抗体は化学的に架橋することができる（Ｇ．Ｊｕｎｇ，Ｃ．Ｊ．Ｈｏｎｓｉｋ，Ｒ．Ａ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，およびＨ．Ｊ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４４７９（１９８６）；Ｕ．Ｄ．Ｓｔａｅｒｚ，Ｏ．Ｋａｎａｇａｗａ，およびＭ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，６２８（１９８５）；およびＰ．Ｐｅｒｅｚ，Ｒ．Ｗ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｔｉｔｕｓ，およびＤ．Ｍ．Ｓｅｇａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６３，１６６（１９８６））、またはハイブリッドハイブリドーマを用いて生物学的にカップリングされる（Ｕ．Ｄ．ＳｔａｅｒｚおよびＭ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，１４５３（１９８６）；およびＣ．ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＡ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５，５３７（１９８３））。カテーテルの中央スペースの中で、０．２から２時間またはそれ以上培養した後、この培養液は脱気され、燐酸緩衝生理塩液で静かに洗浄し、そして循環を回復させる。
異なったカテーテルデザイン（図２参照）を用いて、異なった点滴注入プロトコールを使用することもできる。この２番目のアプローチでは、単一のバルーン手段（２）のカテーテルで、部分的に裸化された動脈部分の中にレトロウイルスを高圧で運搬できるような複数の口部手段（３）を有するものを使用する。器官の表面は上記のように準備され、同様の粘着性分子を使用して、欠陥ベクターを導入する。この場合、高圧運搬システムの使用は、ベクターと隣接する血管組織中の細胞との相互作用を最適なものとするのに役立つ。
本発明はまた、感染の効果を高めるために、成長因子をカテーテルによって局所的にまたは全身的に使用する方法も提供している。レトロウイルスベクターのほかに、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、あるいはその他のウイルス性ベクターも本法の手法に適したベクターである。
また、器官の中または組織の中で細胞の形質転換を行わせることも可能である。器官または組織細胞の直接形質転換は、２つの方法のいずれかで行うことができる。第１の方法では高圧による形質導入が用いられる。高圧によって、ベクターは血管壁を通して回りの組織中に移行する。第２の方法では、キャピラリーベッドの中への注入（これは浸潤させるために損傷を受けた後でもよい）によって、とりまく組織を直接感染させる。
ベクターや細胞の点滴注入のために必要な時間は本発明のうちどの方法を使用するかによって異なる。細胞やベクターを血管中に点滴注入するのに適当な時間は０．０１から１２時間であり、好ましくは０．１から６時間、最も好ましくは０．２から２時間である。あるいは、ベクターや細胞の高圧点滴注入を行う場合は、より短時間が好ましい。
本発明で使用する細胞の入手：
”遺伝子的材料”という用語は、一般的にタンパク質をコードするためのＤＮＡを指す。またＲＮＡについても、ＲＮＡウイルスまたはＲＮＡをベースとしたその他のベクターとともに使用されるときには、この用語を適用する。
形質転換は、直接感染、形質導入、または他の取り込み方法によって外因性遺伝子を細胞の中に組み込むプロセスである。
”ベクター”という用語は、広く知られており、よく使われることば”クローニングビヒクル”と同義である。ベクターは非染色体の二重らせんＤＮＡで、完全なレプリコンからなり、単細胞有機物の中におかれたときに、たとえば形質転換のプロセスによって、複製される。ウイルス性ベクターには、レトロウイルス類、アデノウイルス類、ヘルペスウイルス、パポウイルス、または変性天然ウイルス類がある。ベクターはまた、ＤＮＡと細胞によって取り込むことができる化学品または物質の処方品も意味する。
もう１つの実施態様では本発明は遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。この目的を達成するためには４つのアプローチを使うことができる。これらにはアンチセンス剤の使用が含まれ、ｍＲＮＡに対して相補的な合成オリゴヌクレオチド（Ｍａｈｅｒ  ＩＩＩ，Ｌ．Ｊ．およびＤｏｌｎｉｃｋ，Ｂ．Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５３，２１４−２２０（１９８７）およびＺａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３，４１４３−４１４６，（１９８６））、またはこの遺伝子の逆相補体を発現するプラスミド（Ｉｚａｎｔ，Ｊ．Ｈ．およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５−３５２，（１９８５）；Ｃｅｌｌ，３６，１０７７−１０１５（１９８４））、のいずれかを使用する。さらに、リボザイムと呼ばれる触媒的ＲＮＡｓは特にＲＮＡシーケンスを分解させることができる（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ、３２８，５９６−６００，（１９８７），Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．およびＧｅｒｌａｃｋ，Ｗ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、３３４，５８５−５９１，（１９８８））。第３のアプローチは、”細胞内免疫化”であり、細胞内タンパク質の類似体が特にそれらの機能を阻害する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．，Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．およびＭｃｋｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５，４５２−４５４（１９８８））もので、以下に詳細に示す。
第１のアプローチは特に細胞内の転写を除去するのに使用できる。転写の除去はＳ１ヌクレアーゼ分析で確認することができ、結合タンパク質の発現は機能分析で確認される。転写ファクタｍＲＮＡのプロセシングおよび翻訳の阻害に単一らせんオリゴヌクレオチド類似体を使用することができる。要約すれば、目的遺伝子のコード鎖に相補的な合成オリゴヌクレオチドまたはチオールから誘導されたアナログ（２０−５０ヌクレオチド）が準備される。これらのアンチセンス剤はｍＲＮＡの異なる領域ごとに準備される。それらは、遺伝子の５’非翻訳領域、翻訳開始サイトおよびそれに続く２０−５０の塩基対、中央のコード領域、または３’非翻訳領域、に相補的なものである。アンチセンス剤は活性化の前に形質導入された細胞と一緒に培養される。どの領域がこれらの遺伝子の発現を阻止するのにより効果的かを確認するために、メッセンジャーＲＮＡの異なる部位に対するアンチセンス剤の競合物質の効果を比較する。
ＲＮＡはまた、自動触媒的にはたらいて自己融解を起こさせたり、特に相補的ＲＮＡシーケンスを分解させる機能を有している（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８，５９６−６００（１９８７），Ｈａｓｅｌｏｆｆ，Ｊ．およびＧｅｒｌａｃｋ，Ｗ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、３３４，５８５−５９１，（１９８８），およびＨｕｔｃｈｉｎｓ，Ｃ．Ｊ．，他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，３６２７−３６４０（１９８６））。ＲＮＡ開裂がうまくゆくための条件としては、ハンマーヘッド構造とその構造のフランキング部位についた保存ＲＮＡシーケンスがある。この触媒的領域の隣接領域は特定のＲＮＡに対して相補的であり、したがってリボザイムが特定の細胞ｍＲＮＡｓを目標とする。特定の目標遺伝子の生産を阻止するためには、この遺伝子をコードするｍＲＮＡをリボサイムを使用して分解してやればよい。要約すれば、ＲＮＡ転写の中のどのようなＧＵＧシーケンスもリボザイムを使用した分解の目標になりえる。これらはＤＮＡシーケンス分析で確認され、ＲＮＡ転写にまたがるＧＵＧサイトがその特異的分解のために使用される。５’非翻訳領域の中のサイト、コード領域のサイト、および３’非翻訳領域の中のサイトが、この転写を分解するのにより効果的かどうかを決定するための目標とされる。ＧＵＧサイトの上流の２０塩基対の相補的シーケンスをコードする合成オリゴヌクレオチド、ハンマーヘッド構造とこのサイトの下流の−２０塩基対の相補的シーケンスが、ｃＤＮＡの関係サイトに挿入される。このようにして、リボザイムは同じ細胞区画を内因性メッセージとして目標にする。特別のエンハンサーの下流に挿入されたリボザイムは、特定の細胞の中で高い発現を示すものを作り出す。これらのプラスミドは、ネオマイシン耐性プラスミドｐＳＶ２−Ｎｅｏまたは選択的マーカーとともにエレクトロポレーションおよび同時形質導入によって、関係する目的細胞に導入される。これらの転写の発現はノーザン・ブロットおよびＳ１ヌクレアーゼ分析によって確認される。確認されると、ｍＲＮＡの発現をＳ１ヌクレアーゼプロテクションによって、これらの転写の発現が目的ｍＲＮＡおよびそれを規制する遺伝子の定常レベルを下げているかどうか評価する。タンパク質のレベルもまた確認する。
遺伝子はまた、活性化に必要な領域を欠いた変異転写を用意することによって阻害される。要約すれば、その領域を確定した後、機能を刺激できないような変異型を合成する。この切形遺伝子を、ネオマイシン耐性遺伝子を含んだプラスミドのＳＶ−４０エンハンサーの下流に挿入する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４２２−１４２７（１９８０）（別の転写ユニットの中）。このプラスミドを細胞の中に導入し、Ｇ４１８を使って選別する。この遺伝子の変異型の存在は、Ｓ１ヌクレアーゼ分析および免疫沈降法によって確認される。これらの細胞中の内因性タンパク質の機能は２つの方法によって評価される。第１は、正常な遺伝子の発現を確認する。第２は、これらのタンパク質の既知の機能を評価する。もし、この細胞間阻害型変異株がその宿主に対して毒性がある場合には、メタロチオネインプロモーターのような誘導性のコントロールエレメントに導入する。安定した株を単離したあと、細胞をＺｎまたはＣｄとともに培養しこの遺伝子を発現させる。そのあと宿主細胞に対する影響を評価する。
特定の遺伝子を不活性化させるもう１つのアプローチは、その他の活性の機能や発現と拮抗するリコンビナントタンパク質を過剰に発現させることである。たとえば、もしＴＰＡの発現を減らしたい場合（たとえば、播種性の血栓溶解の診療手段において）には、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを過剰に発現させればよい。
近年の生化学および分子生物学の発展により、”リコンビナント”ベクター、たとえばその中のレトロウイルスおよびプラスミドが、外因性のＲＮＡまたはＤＮＡをそれぞれ含むもの、を作ることが可能になった。特殊なものでは、リコンビナントベクターが非相同のＲＮＡまたはＤＮＡ（これはリコンビナントベクターによる形質転換ができる有機体では通常生成されないポリペプチドをコードしたＲＮＡまたはＤＮＡという意味であるが）を含むことも可能になった。リコンビナントＲＮＡまたはＤＮＡベクターの生産についてはよく知られており、詳細を説明するまでもない。しかし、参考のためにこのプロセスについて簡単に述べておく。
たとえば、レトロウイルスまたはプラスミドベクターは、開裂により連結可能な末端部をもつ直鎖ＲＮＡまたはＤＮＡにすることができる。これらの末端部は相補的な同様の連結可能な末端部を有する外因性ＲＮＡまたはＤＮＡと結びつき、完全なレプリコンおよび希望する発現特性を有して生物学的機能を発揮できるリコンビナントＲＮＡまたはＤＮＡ分子となる。
ＲＮＡおよびＤＮＡの組換えには、別々のＲＮＡまたはＤＮＡの隣りあった末端フラグメントを連結しやすいように調整するなど、種々の手法がある。
本発明で使用する外因性、すなわちドナーである、ＲＮＡまたはＤＮＡは適当な細胞群から得ることができる。公知の手法を使って、ベクターを作り、治療薬タンパク質の生体中発現が可能な形質転換細胞を得る。形質転換細胞は、目的細胞を、目的細胞の中にＲＮＡまたはＤＮＡを取り込み形質転換できるような処方のＲＮＡまたはＤＮＡに接触させることにより得ることができる。そのような処方には、たとえば、レトロウイルス類、プラスミド類、リポソーム組成物、またはポリ−Ｌ−リジン，ＤＥＡＣ−デキストランのようなポリカチオン性の物質および目的リガンドなどが含まれる。
このように本発明は、治療薬または診断薬を、局所的または全身的な目的のために、血管の局所に送り込む方法として、細胞の遺伝子的変換を利用する方法を提供するものである。これらの細胞中で発現されるリコンビナントタンパク質の範囲は広くかつ種類が多い。これには、血栓症および再狭窄症、脈管形成の治療のためのｔＰａ、または再血管形成の目的のための成長因子、および血管収縮または血管けいれんを改善するための血管作用性因子、などのタンパク質を発現するベクターを使用する遺伝子変換も含まれる。この手法はまた、遺伝的疾患、または後天的な病気、局所的あるいは全身的な疾患に対する遺伝子的な治療におよぶものである。本発明はまた、細胞が失われた特定の部位に正常な細胞を導入する、たとえば、血管形成手術やカテーテル処置の間に損傷した内皮を置き換える、ためにも使用できる。
たとえば、虚血性疾患（血栓症）の治療においては、ｔＰＡまたはその修飾物、ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどをコードする遺伝子的材料が、細胞を形質転換するために使用される。虚血性器官（たとえば、心臓、腎臓、大腸、肝臓、など）疾患の治療においては、形質転換成長因子ａ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子ｓ（ＴＧＦ−β）、アンジオジェニン、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、酸性フィブロブラスト成長因子または基本フィブロブラスト成長因子のような側副枝再生剤（ｒｅｃｏｌｌａｔｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）をコードする遺伝子的材料を使用することができる。血管運動系の疾患の治療においては、血管拡張剤または血管収縮剤をコードする遺伝子的材料を使用することができる。これらには、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板誘導成長因子またはエンドセリンが含まれる。糖尿病の治療においては、インスリンをコードする遺伝子的材料を使用することができる。
本発明はまた、悪性疾患の近接部に形質転換した細胞を置くことによって悪性疾患を治療するのに利用することができる。この用途では、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン、またはコレラトキシンをコードする遺伝子的材料が使われる。
実施例の１つでは、本発明は腫瘍細胞に対する免疫反応を刺激するかあるいは腫瘍細胞の成長を抑制するか、または生体中での遺伝子的変性による転位のいずれかによる悪性疾患の治療法を提供する。このアプローチは、腫瘍細胞をインビトロで増殖、変性、選択する点がこれまでの方法と異なる。
本実施例によれば、本法はＤＮＡシーケンスまたはＲＮＡシーケンス（リコンビナント遺伝子も含む）を生体内の腫瘍細胞に次のような方法で送ることに使用される。（１）レトロウイルスまたはウイルスベクターをビヒクルとして、（２）ＤＮＡまたはＲＮＡ/リポソームをビヒクルとして、（３）ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを含んだ化学処方品で、そのシーケンスを目的細胞に運搬しやすいようなキャリヤ分子と結合させたものを利用して、または（４）細胞媒介の遺伝子移送を利用して遺伝子を生体内の特定の部位に送る、たとえば、インビトロで形質転換された血管平滑筋細胞や内皮細胞をビヒクルとして使用し腫瘍部位へリコンビナント遺伝子を送る。
本実施例は１面では、本発明は癌に対する防御方法を提供するために免疫システムに依拠し、悪性疾患のための補助的治療法として重要な役割を果たすものである。免疫療法はすでに悪性疾患の治療のための補助的アプローチとして有用なことが認められている。細胞溶解性Ｔ細胞およびリンフォカインの両方とも腫瘍細胞の破壊を容易にすることができ、サイトカインまたは腫瘍浸透リンパ球の投与が、腫瘍の退行を推し進める戦略として効果のあることが、動物モデルおよび人体実験で認められている。たとえば、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）および腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ）は腫瘍性の細胞を溶解し、部分的または完全に腫瘍を撃退できることが知られている。悪性細胞の中でサイトカイン遺伝子の発現もまた腫瘍の退行を促すものである。
本発明は、生体中の腫瘍細胞にリコンビナント遺伝子を直接導入する方法によって、腫瘍に対する遺伝子導入の新しいアプローチを提供するものであるが、従来の遺伝子導入法がインビトロでの腫瘍細胞の変性に重点を置き、そしてその変性された細胞を移入するという点が本法とは対照的である。従来のアプローチでは、生体内で活動する細胞とは異なる成長条件のもとで細胞の選択が行われるという点が不都合であり、またそれぞれの悪性疾患ごとに細胞種を確立しなければならず、したがって、ヒトの病気に対する適用がきわめて難しいものであった。
本実施例で使用される遺伝子は、細胞内の、分泌された、または細胞表面の分子が患者にとって外因性のものであり、かつ、（１）患者に免疫原性のあるもの、（２）腫瘍に対して拒絶、退行、またはその両方を誘導するもの、（３）腫瘍の細胞に対して毒性のあるもの、をコードしたＤＮＡシーケンス（または対応するＲＮＡシーケンスのものでもよい）を含んだものである。
本発明で使用できるＤＮＡシーケンス（または対応するＲＮＡシーケンス）を含んだベクターとしては、そのようなＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを含んだ真核性発現ベクターである。外因性ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを宿主の中で発現させる手法はすでに知られている。たとえば、ここにレファレンスとして援用する、Ｋｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８７）８４，２１５０−２１５４、を参照されたい。
このベクターは、上記のように、レトロウイルスまたはその他のウイルスベクター（すなわち、ウイルスベクター）に入れて、ＤＮＡまたはＲＮＡ/リポソーム複合体、または細胞媒介の遺伝子トランスファー、によって患者に投与することができる。さらに、このベクターが非ウイルス性の形として存在する場合は、ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを含んだ化学処方品で、そのシーケンスを宿主細胞に運搬しやすいようなキャリヤ分子と結合させたものを利用して投与することができる。そのようなキャリヤ分子としては、そのベクターが供給される先の細胞に対して特異的な抗体、または目的細胞に結合したレセプターと反応し得る分子である。
本発明に基づいて、細胞媒介の遺伝子トランスファーを使用することができる。この方法の場合、リコンビナント遺伝子の生体への供給は、宿主から取り出された細胞への遺伝子的材料の導入および細胞培養での変性、そして遺伝子的に変換された細胞の宿主への導入、によることになる。本実施例で使用可能な典型的な細胞系パッケージは、Ｄａｎｏｓ，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８８）８５：６４６０、に記載されており、ここにレファレンスとして援用する。
本発明に基づいた分子をコードするＤＮＡシーケンスまたはＲＮＡシーケンスは患者、これはヒトあるいはヒトでない動物でもよい、に局所的にあるいは全身的のいずれかで投与する。全身的投与の場合、非ウイルス性のＤＮＡまたはＲＮＡ化学処方品で、宿主細胞に運搬しやすいようなキャリヤ分子と結合させたものを利用して行うのが望ましい。これらの投与は、ＩＶまたはＩＭ注射、または公知の手段を使った皮下注射、または本発明によるカテーテルの使用などで行うことができる。
本発明で用いられるレトロウイルスビヒクルは、天然のレトロウイルスから誘導したウイルス粒子で、本発明に基づいて、天然のレトロウイルスを遺伝子的に変換し複製欠陥とし、必要なリコンビナント遺伝子を発現させるようにしたものである。いったんウイルスが遺伝子的材料を細胞に供給すると、それ以外の感染性のウイルスを発生させることなく、外因性のリコンビナント遺伝子を細胞に導入する。
その他のウイルスベクターでは、使用されるウイルス粒子は、その他の天然ウイルスから誘導されたもので、天然のレトロウイルスを遺伝子的に変換し複製欠陥とし、必要なリコンビナント遺伝子を発現させるようにしたものである。そのようなウイルスベクターはアデノウイルス、乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルスなどから誘導される。
本発明のシーケンスはまた、ＤＮＡまたはＲＮＡ/リポソーム複合体として投与することもできる。そのような複合体は、脂肪粒子、脂質（これらは遺伝子材料に結合する）、ＤＮＡまたはＲＮＡ（これらは疎水性の被膜を提供する）、の混合物であり、遺伝子材料を細胞に送り込む。この組成物は遺伝子トランスファーのための非ウイルス性ベクターを提供するものである。本発明で用いられるリポソームは、ＤＯＰＥ（ジオレイル・フォスファチジル・エタノールアミン）、ＣＵＤＭＥＤＡ（Ｎ−（５−コレストラム−３−β−オール３−ウレサニル）−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン）を含んだものを使用できる。
上に述べたように、本発明にはその他の非ウイルス性のベクターも使用することができる。これらには、キャリヤ分子（たとえば、抗体またはレセプターリガンド）と結合させたＤＮＡまたはＲＮＡの化学処方品があり、これらは宿主細胞の生物学的特性を変えるための宿主細胞への送り込みを容易にする。ここで用いる”化学処方品”という用語は、核酸化合物をタンパク質や脂質、またはその誘導物のキャリヤ分子にカップリングさせるための核酸変性物を指す。そのようなキャリヤ分子としては、宿主細胞に対して特異的な抗体またはレセプターリガンド、すなわち、宿主細胞に結合したレセプターと反応し得る分子である。
この分子として本発明で使用できるものには下記のものがある：（１）免疫刺激剤をコードした遺伝子で、クラスＩ組織適合性遺伝子、クラスＩＩ組織適合性遺伝子、バクテリア遺伝子（ミコバクテリア（ＰＰＤ）遺伝子および熱ショックタンパク質をコードした遺伝子など）、ウイルス性グリコプロテイン（水胞性口内炎ウイルスＧタンパク質、インフルエンザ血球凝集素およびヘルペスウイルスグリコプロテインβなど）をコードする遺伝子、マイナー組織適合性抗原、リゾチームや牛血清アルブミンのような外部タンパク質、およびＥＩＡ、Ｐ５３（変異種）ならびにｔａｘを含む発ガン性遺伝子；（２）免疫および成長刺激剤/抑制剤で、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、３、６または８を含む刺激剤のような分化の誘発剤、ＴＮＦ−αまたはβ、ＴＧＦ−β（１、２または３）、ＩＬ−１のような抑制剤/誘発剤、溶解性成長因子レセプター（ＰＤＧＦ，ＦＧＦレセプター）、成長因子またはレセプターに対するリコンビナント抗体、成長因子の相似体（ＰＤＧＦ，ＦＧＦ）、インターフェロン（α、βまたはγ）および粘着性分子；または（３）トキシンまたは逆選択性マーカー（チミジンキナーゼ、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンまたは薬剤感受性タンパク質など）。
このＤＮＡ/ＲＮＡシーケンスは患者として同種のソースから入手するのが望ましいが、これは絶対的に要求されることではなく、本発明ではこの実施態様において、患者の異なったソースからから得たＤＮＡシーケンスを使用する方法を提供している。本発明の好ましい実施態様では、免疫刺激剤をコードした遺伝子およびトキシンまたは逆選択性マーカー（上記の（１）および（３）に対応するもの）は、患者が属する種とは異なった種から選ばれている。免疫および成長刺激剤/抑制剤（上記の（２）に対応するもの）は、もう１つ別の好ましい実施態様に基づいて、患者の種と同一の種から得られた遺伝子を採用している。
本発明をＡＩＤＳの治療に使用する場合、溶解性ＣＤ４またはその誘導物をコードする遺伝子材料を使用することができる。遺伝子的な疾患の治療の場合（たとえば成長ホルモン欠乏）にはその必要とする物質をコードする遺伝子的材料（たとえばヒト成長ホルモン）を使用することができる。これらすべての遺伝子材料は、本分野の技術に習熟した当業者ならば容易に入手することができる。
もう１つの別の実施態様において、本発明は患者の病気を治療するキットを提供するが、このキットはカテーテル、ならびに酵素または弱性の洗浄剤のいずれかを含み、カテーテルは血管の中に挿入できるようになったものであり、かつ、前記血管の中に挿入できるようになったバルーンエレメントを備え、かつ、カテーテル部を血管の中に正しく保持できるように、血管の壁に対して膨らませることができるようになっている主カテーテル部、ならびに主カテーテル部に備えられた血管の中に溶液を供給するための手段、を含み、酵素または弱性の洗浄剤を含んだ溶液は生理学的に許容される溶液である。この溶液は、ディスパーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ペプシン、キモトリプシンなどの蛋白分解酵素を含む。弱性の洗浄剤として、この溶液はＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、デオキシコール酸塩、あるいはＳＤＳなどを含む。
あるいは、このキットには生理学的に許容される溶液として、ヘパリン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェート、ポリカチオン性物質のような薬剤、または二価の抗体を含んだものでもよい。この溶液はまた、ベクター類または細胞類（正常または形質転換されたもの）を含んでもよい。さらに別の実施例では、このキットはカテーテルおよび酵素または弱性の洗浄剤を含んだ溶液と、ヘパリン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェート、ポリカチオン性物質のような薬剤、または二価の抗体を含んだ溶液（この溶液にはベクター類または細胞類を含んでもよい）の両方を含んだものでもよい。
このキットは、１個のバルーンと中央の遠位灌流口を備えたカテーテル、ならびに特定の器官への細胞の導入、またはキャピラリーベッドへのベクターの導入、あるいはこのキャピラリーベッドによって灌流される特定の器官や組織への細胞の導入を行うのに許容される溶液を含んでもよい。
あるいは、このキットは、間隔を開けて設けられ、血管に挿入できるようにした２つのバルーンエレメントを有し、血管の中に１つのチャンバ（室）を形成できるように、また主カテーテルを所望の位置に保持できるように、この両方のエレメントとも血管の壁に対して膨らませることができるようになっている１つの主カテーテル部を含んだものでもよい。この場合、チャンバへ溶液を供給する手段は、２つのバルーンの間に設ける。このキットは血管の中へ溶液を送り出すための複数の出口手段を備えたカテーテルとしてもよい。
このように、本発明は患者の疾患を治療する方法として、器官の壁に付着している細胞、または患者のこの器官から灌流される細胞に外因性の治療性タンパク質を発現させようとするもので、このタンパク質が疾患を治療し、または診断目的に有用なものとなる。本発明方法は虚血性疾患、血管運動系疾患、糖尿病、悪性疾患、ＡＩＤＳ，または遺伝子的疾患の治療に用いることができる。
本発明では、外因性治療性タンパク質として、ｔＰＡまたはその修飾物、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、酸性フィブロブラスト成長因子、塩基性フィブロブラスト成長因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板から誘導された成長因子、エンドセリン、インスリン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン、コレラトキシン、溶解性ＣＤ４またはその誘導物、および成長ホルモンなどを疾患治療のために使用できる。
本法では診断効果を持つ外因性タンパク質もまた使用できる。たとえば、β−ガラクトシダーゼのようなマーカープロテインを細胞遊走をモニタするために使用できる。
外因性の治療性タンパク質を発現させる細胞類は内皮細胞類が好ましい。
本発明のその他の特性は以下の参考実施例の説明を通して明らかになると思われるが、これらの実施例は本発明の説明のためであって、本発明を限定するものではない。
下記の報告データは、内皮細胞の移植および遺伝子移植の可能性を示すものであり；内皮細胞はカテーテル法により安定的に動脈壁にｉｎ  ｓｉｔｕ移植され、リコンビナントマーカープロテイン、β−ガラクトシダーゼを生体内で発現している。
ブタのじゅく腫形成はヒトのそれと近似性があるので、動物モデルとして、近交のブタ系列、ユカタン・ミニピッグ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウィルミントン、マサチューセッツ州）が選ばれた（１）。最初の内皮細胞系は、８カ月の雌ミニピッグの内部頸静脈から確立された。この種の内皮細胞としての同定は、この細胞群が組織培養においてブタの内皮に特有の成長特性および形態学的特性を示したことにより確認された。この内皮細胞はまた、線維芽細胞やその他の間葉細胞群（２）とは対照的に、アセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）のレセプターを発現した。
ＡＣＬＤＬレセプター発現の分析を行ったところ、蛍光ＡＣＬＤＬの取り込みで判断して、培養した細胞の９９％以上がこのレセプターを含んでいた。
２系列の独立したβ−ガラクトシダーゼ−発現内皮細胞系を、ネズミの両栄養性β−ガラクトシダーゼ−形質導入レトロウイルスベクター（ＢＡＧ）で感染させた後単離した。このベクターは複製欠陥でβ−ガラクトシダーゼおよびネオマイシン耐性遺伝子（３）の両方を含んだものである。Ｇ−４１８の存在下での成長能力の点から、このベクターを含んだ細胞種が選ばれた。組織化学的染色により、選ばれた細胞群の９０％以上がβ−ガラクトシダーゼを合成した。また、これらの遺伝子的に変性された細胞群の内皮特性も蛍光ＡＣＬＤＬ取り込みの分析で確認された。ＢＡＧレトロウイルスによる感染も、さらにサザン・ブロット分析により立証されたが、それによれば完全なプロウイルスＤＮＡがほぼ１ゲノムあたり１コピー存在することが明かとなった。
この近交の同系種からとられた内皮細胞群は、２匹以上のミニピッグの研究に供することができ、９項目の異なった実験課題で試験を行った。通常の麻酔処理のもとで、大腿および回腸動脈を露出し、カテーテルを器官に導入した（図１）。動脈壁の内膜組織を、少し膨らませたバルーンカテーテルを強制的に器官内に通し、機械的に裸化した。動脈をヘパリン化した生理食塩水で洗浄し、中性プロテアーゼおよびディスパーゼ（５０Ｕ/ｍｌ）とともに培養した。これにより、残っていた管腔内皮細胞も除去された。残った酵素は、カテーテルバルーンをしぼませ器官の区画中を血液が流れるようにした後、血漿中でα２グロブリンにより急速に不活化した。β−ガラクトシダーゼを発現した培養内皮細胞群を、２バルーンで中央に１個の点滴注入口を持った特別にデザインされた（図１）動脈カテーテル（ＵＳＣＩ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，マサチューセッツ州）を使用して導入した。
これらのバルーンが膨らまされた時、動脈の中に保護されたスペースができ、その中に点滴注入口３を通して細胞が注入される（図１）。β−ガラクトシダーゼを発現するこれらの内皮細胞群は、裸化された器官への付着を容易にするため３０分間培養される。そのあとカテーテルが取り除かれ、動脈支流が結さつされ、切開部が閉じられた。
β−ガラクトシダーゼ−発現内皮を接種された動脈部分を、２−４週間後取り除いた。Ｘ−ｇａｌクロマゲンを用いた染色の後の動脈標本の全体検査で、複数の青色着色区域が見られ、感染していない内皮を植え付けた動脈との比較において、β−ガラクトシダーゼ活性を示している。光学顕微鏡では主として実験的に植え付けた器官の内膜の内皮細胞にβ−ガラクトシダーゼ着色が記録されている。
対照的に、β−ガラクトシダーゼを含まない内皮細胞を受け取ったコントロール区画では同様の着色はなんら認められなかった。β−ガラクトシダーゼ着色は、しばしば深部の内膜組織に認められ、これは植え付けた内皮が以前に損傷した器官壁に捕らえられるか、または移入することを示唆している。局所的な血栓症が最初の２つの実験課題で観察された。この複雑化は、その後の研究で内皮細胞移植手順に先だってアセチルサリチル酸を投与し、また接種の時にヘパリン抗凝血剤を使用することによって抑えることができた。血栓が形成されるケースでは、β−ガラクトシダーゼ着色が器官壁から血栓の表面に至る範囲の内皮細胞に見られた。
生体での遺伝子移植に関する第１の関心は、遺伝子的に生成された細胞からの、複製能力のあるレトロウイルスの生産である。これらのテストにおいては、複製欠陥のレトロウイルスを使用することで、この問題を最小にすることができた。これらの細胞系統では、試験管中で２０回継代させた後でもヘルパーウイルスはまったく検出されなかった。感染の確度が高いことと宿主細胞ゲノムに対する同化が安定しているという理由で欠陥ウイルスを使用したが、遺伝子移植におけるこのアプローチはその他のウイルスベクターでも利用可能である。
２番目の関心は、生体中におけるリコンビナント遺伝子の発現寿命に関するものである。現在の研究では、器官の中での内皮細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現は血管への導入後６週間までは安定している。
これらのテストは、遺伝子的に変換された内皮細胞は、動脈カテーテル法によってユカタン・ミニピッグの血管壁に導入可能であることを示している。したがって本法は、遺伝子的に変換された内皮をベクターとして用い、血管系の疾患の局所的な生化学的治療に使用可能である。
バルーンによる血管形成とか病気の器官への移植組織の挿入といった血管系疾患における現在の介入的な方法がもたらす大きな合併症は、アテローム硬化プラークの破壊ならびに局所的な組織の外傷部位での血栓形成（５）である。部分的には、内皮細胞損傷がこの合併の媒介となっている（６）。本データは、介入が存在するときに局所的な血栓症を抑えるために、遺伝子的に変換された内皮細胞の使用が可能であることを示している。
この手法は、不安定な狭心症や心筋梗塞を含めて、その他の虚血性疾患治療にも使用可能である。たとえば、組織プラスミノーゲンアクチベーターやウロキナーゼの遺伝子を発現する細胞を導入することで抗血栓効果を得ることができる。この手法はまた、慢性的な組織虚血症の治療にも有用である。たとえば、重症の虚血組織、たとえば心筋、に側副枝血管の生成を刺激するための脈管形成または成長因子（７）を形成させるのがそれである。最後に、全身的な先天性疾患のための体細胞の遺伝子取り替えも、この内皮細胞遺伝子移植手法を応用すれば可能である。
本発明のもう一つの方向は、リコンビナント遺伝子を使って、生体内で動物の細胞の形質転換をおこなうことにより、動物の免疫システムを調節する方法に関する。この形質転換は、非部位特異的または全身的に行うか、あるいは部位特異的のいずれかで行われる。もし形質転換が全身的に行われるかまたはその免疫システムの特異性を与える部位以外の所、たとえば、胸腺、で行われる場合には、リコンビナント遺伝子がコードする分子に動物が感作されるように、その免疫システムを調節する。あるいは、もし形質転換が部位特異的に行われ、かつその免疫システムの特異性を決定する部位で局部的、たとえば、胸腺、に行われる場合には、リコンビナント遺伝子がコードする分子を動物が許容するように、その免疫システムを調節する。
”感作される”という用語は、その免疫システムが、生体内形質転換の方が形質転換前にくらべて、ＤＮＡでコードされたその分子に対して強い反応を示すことを意味する。
”許容する”という用語は、その免疫システムが、形質転換後の方が形質転換前にくらべて、リコンビナント遺伝子にコードされた分子に対して弱い反応を示すことを意味する。このようにして、免疫システムを調節して、ＤＮＡにコードされた分子に対して、抵抗か許容のいずれかを与えるようにすることができる。
抵抗を与えるのが望ましい分子の例としては次のものがあげられる：細胞表面分子、たとえば、腫瘍抗原（がん胎児性抗原）、原生動物抗原（ニューモシスティス）、ウイルス性抗原（ＨＩＶｇｐ１２０およびｇｐ１６０、Ｈ．インフルエンザ抗原、およびＨＢｓ抗原）、ライム病抗原、細菌性抗原、および移植抗原（クラスＩまたはＩＩ）、ｒａｓまたはその他の発ガン性遺伝子でｅｒｂ−Ａまたは、ｎｅｕを含む；細胞質タンパク質、たとえばｒａｆ癌遺伝子、ｓｒｃ癌遺伝子、およびａｂｌ癌遺伝子；核タンパク質、たとえばＥｌＡ癌遺伝子、変異ｐ５３癌遺伝子、ｔａｔ、ｔａｘ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、肝炎コア抗原、ＥＢＮＡおよびウイルス遺伝子；および分泌タンパク質、たとえばエンドトキシン、コレラトキシン、ＴＮＦ、および破骨細胞活性化因子。
抵抗（許容）を与えるのが望ましい分子の例としてはつぎのものがあげられる：細胞表面分子、たとえば、成長因子レセプター、インスリンレセプター、甲状腺ホルモン、移植抗原（クラスＩまたはＩＩ）、血液型抗原、およびＬＤＬレセプター；細胞質タンパク質、たとえばチトクロームＰ４５０、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ジストロフィン、ネオマイシン耐性遺伝子、および細菌性熱ショックタンパク質；核タンパク質、たとえば網膜芽細胞腫およびトランスドミナントｒｅｖ；および分泌タンパク質、たとえば小人用成長ホルモン、糖尿病用インスリン、アデノシン脱アミノ酵素。
リコンビナント遺伝子の中の核酸、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその誘導体の起源はどのようなものでもよい。すなわち、核酸は天然のソースから分離されたものでも、合成したものでもよい。
リコンビナント遺伝子は動物の細胞の中に従来からあるベクターを使って導入される。それらのベクターとしては、ウイルス性ベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡに複合化されたカチオン性の脂質（ＤＮＡまたはＲＮＡ/リポソーム）およびＤＥＡＥ、デキストラン、およびポリブレンなどのＤＮＡまたはＲＮＡとポリカチオンの複合体がある。
上述のようにリコンビナント遺伝子は、リコンビナント遺伝子にコードされた分子に抵抗を与えるために、細胞の中に部位特異的に導入される。適当な部位としては、たとえば、血管系またはいずれの特定組織または器官の内皮細胞または細網内皮細胞がある。形質転換に使用するベクターおよびリコンビナントを含んだ製剤の形態は形質転換を行う組織によって異なったものとなる。内皮細胞を転換する場合の適当な製剤についてはこの明細書の他の箇所で述べている。さらに、経口またはその他の投与方法（たとえば、内視鏡法）に適する製剤は粘膜抵抗を与えるために使用できるであろう。そのような製剤には、ベクターおよび遺伝子以外に、洗浄剤、ゼラチン、カプセルまたはその他の供給用ビヒクルなどを、劣化防止および粘膜表面への供給を容易にするために含ませることができる。
あるいは、リコンビナント遺伝子は部位特異的に、免疫システムの特異性を決定する部位に導入される。胸腺はそのような部位である。（Ａ．Ｍ．Ｐｏｓｓｅｌｔ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ．２４９，ｐ．１２９２（１９９０）参照）。このように、リコンビナント遺伝子を部位特異的に胸腺に導入してやると、その免疫システムは遺伝子にコードされた分子を許容するように調節される。このようにして、移植の拒絶は抑制される。部位特異的に腫瘍を転換するために使用した上記と同じ製剤と手法を、胸腺にリコンビナント遺伝子を導入するのにも使用できる。特に、転換のための製剤は胸腺または腫瘍部あるいは胸腺や腫瘍部の血液供給系に直接注入することができる。
本法は、どのような動物、たとえば鶏；または牛、馬、猫、犬、猿、キツネザルあるいは人間などのほ乳動物にも適用することができる。
リコンビナント遺伝子をリポソームを使って導入する場合、最初にインビトロでＤＮＡに対する最適値を決定するのが望ましい：特定の形質転換すべき細胞についての細胞死亡および転換効率の係数としての脂質、そしてこれらの数値をインビボでの転換に使用するための、脂質比およびＤＮＡの絶対濃度。これらの数値のインビトロでの決定は、本明細書の実験の部で述べる手法を使用すれば簡単にできる。
本発明のもう一つの方向は、動物の細胞にリコンビナント遺伝子を生体内で全身に導入するためのキットに関する。そのようなキットには、脂質などのキャリヤの最適数量、および核酸、および/または内視鏡またはシリンジなどの供給の手段、が含まれるであろう。このキットにはまた、形質転換用製剤の投与のための説明も含まれるであろう。キャリヤおよび核酸は凍結乾燥され、別々にパッケージされるかあるいはプレミックスすることもできる。このキットにはさらに、キャリヤおよび核酸の複合体を最適に再構成するための溶液が含まれ、これらを生体の細胞に効率的に供給するための手段となる。そのような溶液には、緩衝液、糖類、塩類、タンパク質類、および洗浄剤など１つまたはそれ以上の成分を含ませることができる。
発明を一般的に説明してきたが、本明細書中に提供しているいくつかの実施例を参照することによってさらに理解を深めることができると思われる。ただし、これらは説明のためのものであって、特に断らないかぎり本発明を限定するものではない。
実験の部：
Ａ．正常なブタ内皮細胞およびβ−ガラクトシダーゼが導入されたブタ内皮細胞中でのＡＣＬＤＬレセプター発現の分析。
ユカタン・ミニピッグから採取した内皮細胞系で、ＢＡＧレトロウイルスまたは３Ｔ３線維芽細胞コントロールで感染させた２つのサブ系について、蛍光標識したＡｃＬＤＬを用いたＡｃＬＤＬレセプターの発現を調べた。
中性のプロテアーゼ  ディスパーゼ（８）を用いて、外部頸静脈から内皮細胞を採取した。切除した静脈部分をディスパーゼ（５０Ｕ/ｍｌ、Ｈａｎｋｓのバランス塩溶液中）で満たし、３０℃で２０分間インキュベートした。この方法で得た内皮を、胎児子ウシ血清（１０％）、５０μｇ/ｍｌの内皮細胞成長補助液（ＥＣＧＳ）、およびヘパリン（１００μｇ/ｍｌ）を添加した培養液１９９（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ニューヨーク州）の中で保管した。これらの細胞はＢＡＧレトロウイルスに感染させ、Ｇ−４１８耐性のあるものを選んだ。この細胞種を、（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルバシアニン・パークロレート）（Ｄｉｌ）ＡｃＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，スタウトン、マサチューセッツ州）（１０μｇ/ｍｌ）とともに４−６時間、３７℃で培養し、０．５％グルタルアルデヒドを含んだ燐酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。位相差および蛍光顕微鏡で細胞を視覚化した。
Ｂ．カテーテルによる内皮細胞の導入法。
内皮細胞の点滴注入にはダブルバルーンカテーテルを使用した。このカテーテルは近位および遠位のバルーンを有し、それぞれ長さ６ｍｍ，幅５ｍｍ、バルーンの間の距離は２０ｍｍである。カテーテルの中央部には点滴注入口につながる２ｍｍの孔がある。近位および遠位のバルーンによって中央にスペースができ、器官（血管）の特定の区画に注入口を通して感染させた細胞の点滴注入ができるようになっている。カテーテルによる細胞導入の図解は、図１および図２を参照されたい。
動物の管理は、”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ”および”Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ”（ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．８０−２３，１９７８年改訂）に準拠した。雌のユカタン・ミニピッグ（８０−１００ｋｇ）をペントバルビタール（２０ｍｇ/ｋｇ）で麻酔処理し、挿管し、機械的換気を行った。これらの個体の回腸および大腿動脈を無菌手術で露出させた。遠位の大腿動脈を穿刺し、ガイドワイヤを使ってダブルバルーンカテーテルを回腸動脈に入れた。外部回腸動脈を確認し；近位のバルーンを少し膨らませ、内皮を機械的に裸化させるために遠位および近位を通過させた。ついで、カテーテルの中央スペースが裸化された内皮の位置にくるように調整して置き、両方のバルーンを膨らませた。裸化された区画をヘパリン化した生理食塩水で洗浄し、残留付着している細胞をディスパーゼ（２０Ｕ/ｍｌ）を１０分間点滴注入し除去した。裸化された器官（血管）はさらにヘパリン溶液で洗浄し、ＢＡＧ感染内皮細胞を３０分間点滴注入した。その後、バルーンカテーテルを取り外し、血流を順行状態に戻した。当該器官部分を２−４週間後に切除した。その動脈の１部を０．５％グルタルアルデヒド溶液に５分間入れ、燐酸緩衝生理食塩水に入れて保存し、他の部分を切断細分のためにパラフィンブロックで覆った。β−ガラクトシダーゼ発現のレトロウイルスの存在が標準組織化学手法により確認された（１９）。
Ｃ．インビトロおよびインビボの内皮細胞の分析。
β−ガラクトシダーゼ活性は組織化学着色法により下記のものについて記録された。（Ａ）ユカタン・ミニピッグから取り出された一次内皮細胞、（Ｂ）ＢＡＧレトロウイルスベクターに感染させたサブ系、（Ｃ）正常な動脈のコントロール区画、（Ｄ）ＢＡＧレトロウイルスベクターに感染させた内皮を点滴注入した動脈の区画、（Ｅ）正常コントロール動脈の顕微鏡区画、および（Ｆ）ＢＡＧレトロウイルスベクターに感染させた内皮を点滴注入した動脈の顕微鏡区画。
組織培養の中の内皮細胞は、組織化学的着色の前に０．５％グルタルアルデヒドの中で固定された。インビトロおよびインビボにおける感染された内皮細胞を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼタンパク質の酵素活性を利用した。β−ガラクトシダーゼ形質導入Ｍｏ−ＭｕＬＶベクター（２）、（ＢＡＧ）は、Ｄｒ．Ｃｏｎｓｔａｎｃｅ  Ｃｅｐｋｏの好意により提供された。このベクターはワイルドタイプのＭｏ−ＭｕＬＶ  ＬＴＲをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーターとして使用している。Ｔｎ５ネオマイシン耐性遺伝子にリンクしたサルウイルス４０（ＳＶ−４０）早期プロモーターが薬剤Ｇ−４１８に対する抵抗性を与えるが、これをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の下流に挿入し、レトロウイルスを含んだβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を選択するためのマーカーとさせる。この欠陥レトロウイルスはフィブロブラストψａｍ細胞（３，１０）から準備し、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％子ウシ血清の中で保存する。細胞はトリプシン化の後、一週間に２回継代させた。細胞に、上澄み液（力価１０4−１０5/ｍｌ、Ｇ−４１８耐性８コロニー）を２/３交会で加え、１０％子ウシ血清を加えたＤＭＥＭ中で１２時間、３７℃、５％ＣＯ2、８μｇ/ｍｌのポリブレンの存在下で、培養した。ウイルス性の上澄み液を取り除き、細胞を１０％胎児子ウシ血清、ＥＣＧＳ（５０μｇ/ｍｌ）、を加えた培養液１９９、さらにＧ−４１８（５０％ラセミ混合体０．７μｇ/ｍｌ）の中での選別に先立って、２４から４８時間内皮細胞調整培養液（２０％）で、保存した。
Ｇ−４１８耐性細胞を単離し、標準の組織化学的着色（９）を用いて、β−ガラクトシダーゼ発現の分析を行った。β−ガラクトシダーゼ酵素を安定的に発現している細胞を連続培養しその後の必要に備えた。冷凍アリコートは液体窒素中で保存した。
Ｄ．生体内遺伝子移入による悪性疾患の免疫療法。
Ｈ−２Ｋs遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを調製した。ＣＴ２６細胞がインビトロで感染され、Ｇ４１８耐性のものが選ばれ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により分析された。形質導入されたＣＴ２６細胞は、感染されていないＣＴ２６細胞ならびに他のレトロウイルスベクターで感染されたものより、高い平均蛍光強度を示した。Ｈ−２Ｋsを発現する１０6ＣＴ２６細胞をこの抗原に感染されたＢＡＬＢ/Ｃマウス（Ｈ−２d）に皮下注射で与えた時、無調整のＣＴ２６（Ｈ−２d）腫瘍系統では常にこの投与量で腫瘍が発生するのとは対照的に、８週間腫瘍の発生は見られなかった。Ｈ−２Ｋsに対する免疫反応は従って、この抗原をもったＣＴ２６細胞に保護を与えた。しかしＣＴ２６Ｈ−２ＫsとＣＴ２６を同時接種したときは、腫瘍の成長がみられ、これはＨ−２Ｋsが、変性した細胞にだけ感受性を与えることを示唆している。
Ｈ−２Ｋsを成長中のＣＴ２６腫瘍に導入したときに防御効果があるかどうか調べるために、リコンビナントＨ−２Ｋsリポーターまたはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＤＮＡ/リポソームまたはレトロウイルスベクターのいずれかとともに、腫瘍に導入した。腫瘍カプセル（直径０．５−１ｃｍ）を外科的に露出し、多針注射（２−１０）を実質組織に与えた。β−ガラクトシダーゼリポータープラスミドとともに、リコンビナント遺伝子発現は、ＤＮＡ/リポソームまたはレトロウイルスベクターを腫瘍内に注射した後、容易に検出された。
Ｈ−２ＫsＤＮＡ/リポソーム複合体またはＨ−２Ｋsレトロウイルスベクターの腫瘍内注射を受けたマウスでは、ＰＣＲによって腫瘍の中あるいは時としてその他の組織の中にリコンビナントＤＮＡがＰＣＲによって検出された。その他の器官に検出された時は、病理学的には炎症または器官毒性の徴候はなんら認められなかった。しかしながら、これらの動物においては、リコンビナントＨ−２Ｋsタンパク質に対する免疫反応は明白であった。Ｈ−２Ｋs由来のβ−ガラクトシダーゼ形質導入腫瘍由来ではないリンパ球はレトロウイルスベクターによってもたらされたかあるいはリポソームによってもたらされたかを問わずに、Ｈ−２Ｋsに対する細胞溶解反応を示した。さらに重要なことは、そのＨ−２Ｋs由来のβ−ガラクトシダーゼ形質導入動物由来ではないリンパ球は無変性のＣＴ２６細胞を認識し溶解したことであり、これはこの刺激が遺伝子的に変性されていない腫瘍細胞に対する免疫反応を誘発したことを示している。
Ｈ−２Ｋsに対する免疫反応の防御効果を評価するために、生体中の腫瘍の成長を定量した。事前にＨ−２Ｋsの感作を受けていない動物では、Ｈ−２Ｋ8で形質導入された４つの腫瘍のうち１つで腫瘍成長の減衰が完全ではないが見られた。対照的に、無変性（ｎ＝４）またはβ−ガラクトシダーゼ形質導入のコントロール（ｎ＝４）では抗腫瘍効果は見られなかった。これらの腫瘍は最初の注射の時点ですでに大きなものであり、その後最初の免疫反応が出てくるまでにも成長し続けていたため、マウスをＣＴ２６Ｈ−２Ｋ8腫瘍細胞によって事前に免疫処理したり、ベクターの早期および/または頻繁な注射などによって抗腫瘍反応が適正になるように工夫した。１２および３２日目に、Ｈ−２Ｋsまたはβ−ガラクトシダーゼＤＮＡ/リポソームベクターの腫瘍内注射によって、腫瘍は形質導入された。Ｈ−２Ｋsリポソーム複合体による処理によって、生存率が改善され、腫瘍の成長が減衰した。対照的に、β−ガラクトシダーゼ形質導入腫瘍では注射をしていないコントロールとの間に成長率の差は見られなかった。完全な腫瘍の退縮は２匹のマウスにおいて、注射の回数を増やすことと早い段階でＨ−２Ｋsを腫瘍に与えることにより達成された。コントロール区の動物では腫瘍が成長し続け、３５日以降の生存はなかったことから、この処理は防御効果があった。
Ｅ．免疫システムの調節。
カチオン性の脂質およびプラスミドの注射に対する反応は、ＢＡＬＢ/Ｃマウス（６−１２週令）への静脈内注射により確認された。最初の実験では、Ｈ−２Ｋs分子をコードした遺伝子を尾静脈注射により導入した。２から４週間後、脾臓細胞を取り出し、溶解性Ｔ細胞反応を弱める能力を分析した。これらの細胞を51Ｃｒ目的細胞（Ｈ−２Ｋsを発現しているＣＴ２６細胞）を使用してテストした結果、顕著な細胞溶解性が観察された。これは、コントロールベクターであるβ−ガラクトシダーゼを注射した動物では見られなかったものである（図３参照）。目的細胞の２５％までが溶解しており、効果細胞：目的細胞比は２５：１であった。
この特別の溶解性Ｔ細胞反応に加えて、発現ベクタープラスミドにコードされた遺伝子の血清学的または抗体反応も調査した。ＨＩＶのｇｐ１６０分子をコードしたプラスミドを注射したとき、処理をマウスでは抗体反応が出た。β−ガラクトシダーゼを含んだカチオン性脂質を注射したコントロールのマウスの場合と対照的に、ｇｐ１６０プラスミドを含んだカチオン性の脂質を注射したマウスでは、この分子のｇｐ１６０およびｇｐ１２０の形に対して抗体反応が見られることが、ウェスタン・ブロット分析で示された（図４参照）。これらの結果は、カチオン性脂質/ＤＮＡの全身的投与が、外部の病原菌に対して細胞媒介または抗体媒介の免疫性をうまく誘発させるのに使用できることを示している。
Ｆ．最適形質移入条件の決定。
（１）プラスミドの構築
ラウスサルコマ肉腫ウイルスＬＴＳ（ＲＳＶ−β−ｇａｌ）（Ｎｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５（２）、２８１−１９０、１９８５）のコントロールのもとで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＺを含んだプラスミドを、ブタの一次内皮およびヒーラー（ＨｅＬａ）細胞への形質移入に使用した。さらに、プレプロエンドセリン−１  ５’−フランキングＤＮＡ（−１４１０から＋８３）（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０（９）、４８５４−４８６２、１９９０）のコントロールのもとで、ｌａｃＺ遺伝子を含んだプラスミドを、内皮細胞への形質移入に使用した。生体での毒性分析に、ＲＳＶ−β−ｇａｌプラスミド、およびＨ−２ＫsマウスＭＨＣクラスＩ遺伝子をコードするｃＤＮＡを含んだＰＬＪベクターから取り出されたプラスミドを使用した。
（２）細胞培養、形質移入分析、およびインビトロ毒性
ユカタン・ミニピッグから取り出された一次内皮細胞（ＹＰＥ細胞）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ ｌ−グルタミン、５０Ｕ/ｍｌペニシリン、および５μｇ/ｍｌストレプトマイシンを添加した１９９培養液（Ｍ１９９）で培養した。ヒーラー細胞は、５％ＦＢＳ、２ｍＭ ｌ−グルタミン、５０Ｕ/ｍｌペニシリン、および５μｇ/ｍｌストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で保存した。ＤＮＡリポソーム混合体は、ポリスチレンチューブの中で、０．２ｍｌの血清を含まない溶媒またはリンゲルの乳酸溶液に２．５から２５μＭ脂質濃度のＤＯＰＥ/ＤＣ−ｃｈｏｌを加えて準備した。ゆるやかに攪はんしたあと、その溶液を２５−２０分間室温で放置した。形質移入のために、細胞を６０ｍｍ組織培養皿で７５％交会またはそれ以上で成長させた。細胞は、血清を含まない溶媒またはリンゲルの乳酸溶液で２回洗浄し、０．５ｍｌの同じ溶液中に入れた。ＤＮＡリポソーム溶液（０．２ｍｌ）を、ゆるやかに攪はんしながら、ゆっくり細胞に加え、最終的に０．７ｍｌの容量にした。これによって、ＤＮＡ濃度は０．７から７μｇ/ｍｌ（１３−１３０ｎＭ）の間となり、脂質濃度は７−７０μＭとなった。１−５時間形質移入を進行させ、そのあと細胞を上記の添加溶媒中に入れた。２４−４８時間の形質移入の後、形質移入細胞を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼタンパク質の酵素活性を利用して、Ｘ−ｇａｌクロマゲン染色を行った。インビトロ毒性は、細胞変性効果またはトリパンブルー排除法で評価した。
（３）動物の検討
静脈注射用として、インビトロの形質移入を検討するために、前記のようにＤＮＡリポソームを０．２ｍｌの血清を含まないＭ１９９または乳酸化リンゲル溶液に入れたものを用意した。１５−２０分の培養の後、この混合物を０．７ｍｌに希釈し、この希釈液０．１−０．２ｍｌを直ちに雌、成人のＢＡＬＢ/ｃマウスの尾静脈に注射した。血液は注射前および注射後９−１１日に採取され、血清化学分析が行われた。注射後２−３週間で腎臓、肝臓、肺、心臓、および脳が取り出され、前記のように組織分析およびＰＣＲ  ＤＮＡ増殖分析に供された。ＣＴ２６細胞の主要細胞内注射（Ｆｅａｒｏｎ他、Ｃｅｌｌ、６０、３９７−４０３）およびその分析も前記のプロトコールにしたがって実施された。
（４）結果
ＤＮＡ/リポソームの形質移入のための最適条件および毒性を、まず最初にインビトロで確認した。インビトロにおいて毒性を示さない最大の形質移入を得るために、カチオン性脂質に対するＤＮＡの比、ＤＮＡまたは脂質の絶対濃度、ＤＮＡおよびカチオン性脂質の混合条件について検討した。カチオン性脂質の調合液は２つの化合物の処方品で、ジオレイル・フォスファチジル・エタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびコレステン−３−β−オール  ３−ウレサニル−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン（ＤＣ−ｃｈｏｌ）を含んだものである。この薬剤のインビトロの形質移入効率は、いくつかの細胞系列において、リポフェクチン（商標）（ＢＲＬ）と同等かそれ以上であった。内皮細胞（これは形質移入が難しい典型的なもの）、およびヒーラー細胞（これは種々の手法で簡単に形質移入が可能である）、の形質移入を、インビトロで確認した。
内皮細胞の形質移入の最適条件を決定するため、最初にＤＮＡ濃度は一定にし、脂質の濃度を変えたものを使用した。最高の形質移入効率は０．７μｇ/ｍｌのＤＮＡおよび２１μＭのＤＯＰＥ/ＤＣ０ｃｈｏｌ脂質を使用したときに見られ、脂質濃度が高くなったり、または低くなると形質移入された細胞の数が急激に減少した。次に、脂質濃度を一定に保ち、ＤＮＡ濃度を変えた。この分析においてＤＮＡ濃度に対する同様の傾向、すなわちＤＮＡ濃度の増加、０．４μｇ/ｍｌという低濃度でも、に対応して形質移入される細胞の数が著しく減少することが明らかとなった。これらの結果は、ＤＮＡの脂質に対する比が形質移入の最高効率に重要であることを示しており、またそれぞれの成分の絶対濃度もまた形質移入の効率決定に重要であることを示している。ＤＮＡおよび脂質の最適濃度、すなわちＤＮＡ０．７μｇ/ｍｌ（１３ｎＭ）、ＤＯＰＥ/ＤＣ−ｃｈｏｌ２１μＭ、を越えた増加は、生育可能な細胞の数を減らし、かつ生き残った細胞の形質移入効率を上げるものではなかった。３５μＭ以上の脂質濃度は、形質移入されていないコントロールと比較して生育可能な細胞数を５０％減少させ、一方、最適濃度のＤＮＡ０．７μｇ/ｍｌおよび脂質２１μＭにおいては、培養５時間以上では生育可能細胞数に対する影響はなかった。
異なった細胞のタイプの形質移入における最適濃度を比較するために、ヒーラー細胞でも形質移入を実施した。この場合、ＤＮＡと脂質の最適比は多少異なることが観察された。形質移入効率のピークは、脂質濃度は内皮細胞の場合と同じ（２１μｇ/ｍｌ）であったが、ＤＮＡ濃度では異なり少し低いところであった。ＤＮＡ濃度１．４−４．２μｇ/ｍｌでは同様に効果的であった。再び、ＤＮＡと脂質の比は変えないで、それぞれの濃度を１/３に減らしたところ、ごく僅かの細胞だけが形質移入され、形質移入細胞数を最高にするためにはＤＮＡと脂質の比ならびにそれぞれの成分の絶対濃度の両方が重要であることが示された。もし、ヒーラー細胞が＞８０％またはそれ以上の交会で形質移入される場合、３５μＭ迄の脂質を使用しても毒性はなかった。細胞が低い飽和濃度で形質移入されたときは、脂質７μＭの低濃度でも形質移入されていないコントロールと比較して、細胞の生育可能性は著しく減少した。これらの結果は、形質移入の最適条件および毒性は細胞の系統によって多少異なることを示している。
リポソームの準備におけるもう１つの変数は、カチオン性脂質とＤＮＡの複合体を作るために用いられる溶液の組成である。分析したいくつかの溶媒溶液、Ｍ１９９、ＭｃＣｏｙｓ、ＯｐｔｉＭＥＭ、またはＲＰＭＩ媒体においては、形質移入効率ならびに毒性の点において実質的な差異はなかった。しかし、標準の乳酸化リンゲルを使用した場合、形質移入効率が著しく向上した。形質移入された細胞の数は、血清を含まない媒体に比べて、３倍以上増加した。ただし、長時間の培養（≧２時間）では、いくつかの細胞系統において細胞生育性の低下が見られた。
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４．  Ｒ．Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｅｌｌ，３３，１５３（１９８３）；Ｃ．Ｌ．Ｃｅｐｋｏ，Ｂ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｃｅｌｌ  ３７，１０５３（１９８４）；Ｍ．Ａ．Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６，６０８（１９８８）．
５．  Ｓ．Ｇ．Ｅｌｌｉｓ，Ｇ．Ｓ．Ｒｏｕｂｉｎ，Ｓ．Ｂ．Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｓ．Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｗ．Ｓ．Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７７，３７２（１９８８）；Ｌ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｍ．Ｇ．Ｂｏｕｒａｓｓａ，Ｊ．Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ，Ｈ．Ｅ．Ａｌｄｒｉｇｅ，Ｆ．Ｋａｚｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８，１７１４（１９８８）．
６．  Ｐ．Ｃ．Ｂｌｏｃｋ，Ｒ．Ｋ．Ｍｙｌｅｒ，Ｓ．Ｓｔｅｒｔｚｅｒ，Ｊ．Ｔ．Ｆａｌｌｏｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０５，３８２（１９８１）；Ｐ．Ｍ．Ｓｔｅｅｌｅ，Ｊ．Ｈ．Ｃｈｅｓｅｂｒｏ，Ａ．Ｗ．Ｓｔａｎｓｏｎ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．５７，１０５（１９８５）；Ｊ．Ｒ．Ｗｉｌｅｎｔｚ，Ｔ．Ａ．Ｓａｎｂｏｒｎ，Ｃ．Ｃ．Ｈａｎｄｅｎｓｃｈｉｌｄ，Ｃ．Ｒ．Ｖａｌｅｒｉ，Ｔ．Ｊ．Ｒｙａｎ，Ｄ．Ｐ．Ｆａｘｏｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７５，６３６（１９８７）；Ｗ．ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｒ．Ａ．Ｌａｎｇｅ，Ｌ．Ｄ．Ｈｉｌｌｉｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８，１７３４（１９８８）．
７．  Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５，４４２（１９８７）；Ｓ．Ｊ．Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｊ．Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ，Ｈ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｈｅｐａｒｄ，Ｄ．Ｍ．Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｖ．Ｓｈａｖｅｌｙ，Ｎ．Ｎｕｓｅｉｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，６３０（１９８７）；Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，６７１（１９８７）．
８．  Ｔ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．Ｙａｍａｎｋａ，Ｓ．Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ，Ｙ．Ｉｒｉｅ，Ｋ．Ｎｉｔｔａ，Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．４５，３７７（１９７５）；Ｄ．Ｇ．Ｓ．Ｔｈｉｌｏ，Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｋｕｓｅｌ，Ｄ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｉ．Ｋａｕｆｆｅｒ，Ｅ．Ｗｅｉｓｓ，Ａｒｔｅｒｙ，８，２５ａ（１９８０）．
９．  Ａ．Ｍ．Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｓｕｇａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ，Ｄ．Ｏ．Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｊ．Ｅｄｅｌｓｏｎ，Ｈ．Ｓ．Ｋｏｒｅｎ，Ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８１），ｐｐ３７５−３９５．
１０．  Ｒ．Ｄ．Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，６３４９（１９８４）．
米国特許出願番号０７／７２４，５０９、１９９１年６月２８日出願、および０７／３３１，３３６、１９８９年３月３１日出願の開示をここにリファレンスとして援用する。
いうまでもなく、上記教示に照らせば本発明は多くの改変法や変形法が可能である。したがって、添付のクレームの範囲において、本発明はここに特に記載した以外の方法でも実施可能であることを了解されたい。
【図１】
0003712409.tif 000002
【図２】
0003712409.tif 000003
【図３】
0003712409.tif 000004
【図４】
0003712409.tif 000005