(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節する能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、当該ポリペプチドのアミノ酸配列がヒトOP−１のＣ−末端の７個のシステイン骨格、配列番号５の残基38−139であり、当該ポリペプチドが第二の当該ポリペプチドとともに二量体をつくるとき、骨形成におけるインビボアッセイにおいて軟骨内骨形成誘導の能力を有する蛋白を形成するものである、以下を含む、当該スクーリング方法、
（ａ）候補化合物と当該蛋白を発現可能な細胞とを、当該細胞内に存在し当該ポリペプチドをコードする当該遺伝子の発現に当該化合物が影響を与えるに十分な時間インキュベートし；さらに
（ｂ）当該遺伝子の発現産物の存在、非存在または量について当該細胞をアッセーし、ここで当該候補化合物の非存在下での当該細胞内の当該発現産物レベルと比較してそのレベルにおける変化が、当該細胞内での当該遺伝子の発現を調節する当該化合物の能力を表示する。
【請求項２】
当該ポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号５で規定される配列を含む請求の範囲第１項の方法。
【請求項３】
当該細胞が、脳または腎組織から培養される上皮細胞、もしくは腎、膀胱または副腎から培養される上皮細胞、上皮性癌細胞、又は無限分裂化したヒト膀胱癌細胞ラインからの細胞である請求の範囲第１項の方法
【請求項４】
当該遺伝子発現産物の存在または量が、
（ａ）当該遺伝子によってコードされるポリペプチドと選択的に反応する抗体でアッセーされる、又は
（ｂ）当該インキュベートされた細胞によって分泌された形態発生活性を有する当該ポリペプチドの濃度に対して感受性を有する細胞の細胞増殖を測定することによってアッセーされる、又は
（ｃ）当該遺伝子から転写されたRNAと厳格な条件下でハイブリダイズする核酸プローブを用いてアッセーされる、
請求の範囲第１項の方法。
【請求項５】
当該核酸プローブが、
（ａ）ヒトOP−１、即ち配列番号５のポリペプチド領域Ｎ−末端から残基38、又は
（ｂ）ヒトOP−１、即ち配列番号５の遺伝子領域3'から残基139をコードする遺伝子領域までをコードする配列を含む核酸配列を有するmRNA転写物とハイブリダイズする、
請求の範囲第４項の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、組織の形態形成を誘導することができる蛋白質の哺乳類におけるレベルを調節することができる薬剤のスクリーニング方法、並びにいずれの動物組織および／またはある組織内のいずれの細胞型が特定の形態形成誘導蛋白（morphogenic protein）を発現させているかを決定する方法に関する。
発明の背景
細胞分化は形態形成の主要特性で、これは胎児に始まり、さらに成人の組織修復および再生メカニズムにおいて生命体の一生を通して様々な程度で継続する。TGF−βスーパーファミリーの仲間には緊密な関係を有する遺伝子のスーパーファミリーが含まれ、これらは、発育中および／または発育後の細胞分化および形態形成に重要な役割を果たすのではないかと今日考えられている。例えば、ショウジョウバエの15番目の遺伝子産物（decapentaplegic gene product（DPP））は、ミバエの背腹面軸索（dorsal−ventral axis）の形成に関係し、アクチビン（activins）の哺乳類の中胚葉および腹側構造形成を誘導し、ミューラー氏管抑制物質（MIS）は哺乳類の雄性発育に必要であるかもしれず、成長／分化因子−１（GDF−１）は神経の発育および維持に関係し、他の形態形成誘導蛋白（BMP−２、−３、−４およびOP−１）は骨形成を誘導する。
骨誘導モデル系の開発および研究は、骨の分化が間葉細胞の化学走性、これらの前駆細胞の増殖、軟骨の分化、この軟骨組織の骨化および肥大、脈管侵入、骨生成、再形成さらに最終的には髄の分化から成るような段階的発育であることを確認した（Reddi（1981）Collagen Rel.Res.1:209−206）。成長した哺乳類で行われるこの骨モデル系は、発育胎児における骨形成において生じる段階的骨分化事象を概括している。他の研究では、膀胱の上皮は新しい骨形成を誘導することが示された。ハッギンス（Huggins,1931,Arch.Surg.22:377−408）は、新しい骨の形成は筋膜壁上に膀胱上皮を外科的に移植することによって誘導されるえることを示した。ウリスト（Urist,1956,Science 150:893−899）は、鉱物質消失骨の断片を移植することによって軟骨内骨形成が生じることを示した。後者の研究および観察は、骨形成原蛋白の存在を示唆し、さらにウシの骨幹骨は骨形成原蛋白の濃厚調製物の供給源であることを示した（Sampathら,J.Biol.Chem.265:13198−13205,1990;Urist,上掲書;Reddiら,Proc.Nat.Aca.Sci.69:1601−1605,1972;Sampathら,Proc.Natl.Acad.Sci.80:6591−6595,1983）。哺乳類でマトリックスとともに移植した場合、軟骨内骨形成を誘導することができる蛋白が、今日、哺乳類のいろいろな種で多数確認され、これらの蛋白をコードする遺伝子も同様である（例えば、米国特許第4968590号、U.S.S.N.第315342号（1989年２月23日出願）およびU.S.S.N.第599543号（1990年10月18日出願）を参照）。ヒトのOP−1DNAは、コンセンサスプローブを用いて種々のcDNAおよび遺伝子ライブラリーからクローニングされた（Ozkaynakら、EMBO J.9:2085−2093,1990）。精製ヒト組換え体（リコンビナント）OP−１（哺乳類細胞で発現）はインビボで新しい骨形成を誘導することが示された。TGF−βスーパーファミリーの他の仲間同様、OP−１は前駆体として産生され、糖付加され、さらにプロセッシングを受け成熟二量体として分泌される。成熟OP−１は、RXXRのパターンをもつ配列に続く成熟部位で切断される（Panganibanら、Mol.Cell Biol.10:2669−2677,1990）。
成人組織における形態形成の度合いは種々の組織間で異なり、とりわけそれぞれの組織の細胞の補充の度合いに依存する。この基準に基づいて組織は３つの広いカテゴリーに分けることができる:1）静止状態の細胞集団をもつ組織、例えば神経および骨格筋で、ここでは殆どまたは全く細胞分裂はなく、発育中に形成された殆どの細胞は成長後の期間を通して存続し、したがって損傷後の正常な再生能力を殆どまたは全くもたない;2）条件しだいで再生する集団を含む組織、例えば肝で、ここでは一般に殆ど細胞分裂は生じないが、適切な刺激または損傷に反応して細胞は同じ分化細胞型の娘細胞を生じる;3）永久的に再生する集団をもつ組織で、血液、骨、および層状うろこ状上皮を含み、これらは成熟体における迅速で持続的な細胞補充という特徴を有する。さて、最終的に分化した細胞は短い一生をもち、幹細胞または前駆細胞として知られている異なる細胞亜集団の増殖によって置き換えられる。
本発明の目的は、ある器官のある組織に投与したとき、その組織によって産生される形態形成誘導蛋白（モルホーゲン、“morphogen"レベルに変化をもたらす化合物のスクリーニング方法を提供することである。全身的に投与されたとき、そのような化合物は形態形成誘導活性を全身的または局所的に変化させることになるであろう。この形態形成誘導活性は、前駆細胞の増殖およびその後の連続的分化を誘導する活性、および正常な成熟組織の形成をもたらす現象（臓器の再生を含む）の進行中に分化表現型または一連の表現型を支援し、さらに維持する活性を含む。したがって広く言えば、本発明にさらなる治療様式の開発の鍵を提供するが、これには動物または成熟哺乳類（例えばヒト）における形態形成誘導蛋白産生の調節、および当然の結果としての組織細胞補充バランスの病理学的変化状態の是正が含まれる。本発明のまた別の目的は、哺乳類において前駆細胞集団を増加させ、前駆細胞を刺激してインビボまたはインビトロで分化させ、組織の分化表現型もしくは一連の表現型を維持し、インビボで組織特異的増殖を誘導し、または病的もしくは損傷組織もしくは器官をインビボで置き換えることができる化合物の組み合わせを同定または選別するための方法論を提供することである。本発明のさらに別の目的は、あるモルホーゲンの由来組織または臓器を決定することである。本発明の別の目的は、あるモルホーゲンの合成および産生に必要な、由来組織もしくは器官内の特異的細胞型、または当該組織に由来する細胞系、または由来器官を決定することである。本発明のこれらの目的および特徴は以下の記載、図面および請求の範囲から明白となるであろう。
発明の要旨
本発明は、生命体における形態形成誘導蛋白の局所的または全身的有効量またはレベルを調節することができる候補化合物のスクリーニング方法を開示する。当該方法は、１つまたは２つ以上の候補化合物を、あるモルホーゲンを産生していることが知られている生命体の被験組織型由来の細胞と、当該化合物が当該細胞によるモルホーゲンの産生（すなわち発現および／または分泌）に影響を与えることを可能にするに十分な時間インキュベートし、さらに続いて、当該形態形成誘導蛋白レベルを示す指標の変化について、細胞およびこの細胞によって条件付けられた培養液を分析することによって実施される。この方法は、インビボでモルホーゲンの産生を増加または減少させそれによって病的状態を修正することができる、ヒトに使用するための薬剤として有望な化合物を同定するために用いることができる。
関連する局面において、本発明は、組織の細胞が特定のモルホーゲンを産生するか否か、またはどの程度産生するかを調べ、それによって当該モルホーゲンが由来する組織を決定するために臓器の組織をスクリーニングする方法を開示する。これは、スクリーニングに用いられる組織細胞型の選別を可能にする。本明細書中で用いられているように、“組織”とは自然の状態で連携している細胞群を指し、臓器を含む。
他の組織型によって産生されるレベルと比較して高レベルのモルホーゲンを産生する組織または臓器の例としては、OP−１（骨組織で最初に発見された）は比較的高レベルで腎臓組織（例えば腎または膀胱）または副腎組織に由来する細胞で産生され、GDF−１は神経（例えば脳組織）に由来する細胞で比較的高いレベルで産生され、DPPは以下のショウジョウバエ組織（背側外胚葉、上皮性成虫板（epitherial imaginal disc）、臓側中胚葉（visceral mesoderm）または消化管内皮（gut endoderm））の１つに由来する細胞で比較的高いレベルで産生され、Vgr−１はマウス肺組織に由来する細胞で比較的高いレベルで産生され、Vg1はツメガエル（xenopus）胎児内皮組織に由来する細胞で比較的高いレベルで産生されることが発見された。
さらに、BMP3およびCBMP2B転写物は肺組織で大量に確認された。本明細書中で用いられているように、“由来する”とは当該細胞が培養組織自体であるか、またはその親細胞が組織自体である細胞株を意味している。
培養細胞におけるモルホーゲンレベルまたはその変化を決定するための好ましい方法は、モルホーゲンに特異的な抗体を例えば免疫アッセー（例えばELISAまたは放射性免疫アッセー）で使用し、さらに、厳格な条件下（例えばRNAドットブロットアッセー）でモルホーゲンRNAとハイブリダイズする核酸プローブを用いてモルホーゲンをコードする核酸（最も好ましくはmRNA）のレベルを決定することを含む。モルホーゲンの存在および／または濃度の変化が認められた場合、候補化合物の存在下および非存在下でのモルホーゲンレベルを測定および比較する必要があるだろう。核酸プローブはモルホーゲンをコードするヌクレオチド配列、または特異的モルホーゲンをコードするRNAとのみ厳格な条件下で特異的にハイブリダイズするために十分な長さを有するフラグメントが可能である。本明細書中で用いられているように、“厳格な条件”とは、非特異的なハイブリッドは溶出されるが、特異的なハイブリッドは維持されるような条件と定義される。すなわち、0.1×SSC（15mMのNaCl、5mMのクエン酸ナトリウム）で50℃15分インキュベーションするものである。
本発明にしたがってそのレベルが決定できるモルホーゲンの例はOP−１、OP−２、GDF−１、Vgr−１、DPP、60A  CBMP2A、CBMP2B、BMP  ２、３、４、５、６またはVglである。したがって、モルホーゲンの存在および／または濃度を示すために免疫アッセーを用いる場合は、これらのモルホーゲンの１つにのみ特異的で他のモルホーゲンの存在を検出しない抗体が用いられるであろう。同様に、モルホーゲンをコードするRNAレベルを示すために核酸ハイブリダイゼーションが用いられる場合は、これらモルホーゲンの１つにのみ特異的なヌクレオチドプローブが、当該プローブが異なるモルホーゲンをコードするRNAとハイブリダイズすることができないようなハイブリダイゼーション条件の下で用いられるであろう。モルホーゲンは活性なＣ−末端コアー領域（これは少なくとも６個のシステイン残基を含む）および、当該Ｃ−末端領域に対するＮ−末端領域（これは他のモルホーゲンの対応するＮ−末端領域と比較的相同性がない）を含む。さらに、mRNAの3'非コード領域は各モルホーゲンにとって特有である。したがって、モルホーゲンのＣ−末端コアー領域に対するＮ−末端配列の全部もしくは部分をコードするか、またはモルホーゲンのコアー領域に対するＣ−末端配列の全部もしくは部分、または3'領域をコードする核酸プローブが、そのモルホーゲンのみをコードするmRNAを検出するプローブとして用いることができる。
“形態形成誘導蛋白”または“モルホーゲン”とは、本発明書中で用いられているように、骨形成の段階的発育を誘導できる天然に生じる骨形成原蛋白の他に、通常では骨もしくは骨形成に関連しないが骨形成原蛋白と相同な実体的配列を共有するポリペプチド鎖を含む。そのような蛋白は、それらをコードするDNA配列同様、多数の異なる種について分離され特性を調べられている。例えば以下を参照；米国特許第4968590号および第5011691号、米国特許出願第1989;422699号（1989年10月17日出願）、同600024号および同599543号（共に1990年10月18日出願）、Sampathら，（1990）J.Biol.Chem.265:13198−13205、Ozkaynakら，（1990）EMBO J.9:2085−2093、Lee,Proc.Natl.Acad.Sci.88:4250−4254（1991））。これらはすべて参考文献として本明細書中に含まれている。その後これらの蛋白の多くは骨形態形成の他に有用性を有することが発見された。例えばUSSN第667274号（1991年３月11日出願）を参照。モルホーゲンのこれら成熟形は実質的なアミノ酸配列の相同性を、特にこれら蛋白のＣ−末端コア−領域において共有する。特に当該蛋白の殆どはこの領域に他の外見上必要なアミノ酸の他に７個のシステイン骨格を共有する。下記の表IIは、９個のモルホーゲンについて、カルボキシ末端の102個のアミノ酸におけるアミノ酸配列の相同性を示している。
本発明において有用なモルホーゲンの中には骨形成原蛋白として最初に同定された蛋白（例えばOP−1,OP−２およびCBMP2）が、アミノ酸配列に相関性がある蛋白、例えばDPP（ショウジョウバエ由来）、Vgl（ツメガエル由来）、Vgr−１（マウス由来、Lee（1991）PNAS 88:4250−4254を参照）（これらはすべて表IIおよび配列番号５−14に示されている）および最近同定された60A蛋白（ショウジョウバエ由来、配列番号24、Whartonら，（1991）PNAS 88:9214−9218参照）同様含まれる。この種類に属する仲間（これらはTGF−βスーパーファミリーの蛋白の仲間を含む）は、それらのＣ−末端領域において実質的なアミノ酸配列の相同性を共有する。これらの蛋白質は、Ｎ−末端シグナルペプチド配列を有する前駆体として翻訳される。シグナルペプチド配列は典型的にはおよそ30残基未満で、切断されて成熟配列を生じる“プロ”ドメインがその後に続く。このシグナルペプチドは翻訳に際して、Von Heijne（（1986）Nucleic Acids Research 14:4683−4691）の方法を用いれば与えられた配列において予想可能な切断部位で迅速に切断される。下記の表Ｉは今日までに同定された種々のモルホーゲンを示しているが、本明細書で用いられている命名法、それらの配列番号、および完全な長さの蛋白のアミノ酸配列についての文献（文献リストに含まれていないもの）も記載されている。これらの文献の内容は、本明細書中に含まれている。
表Ｉ
“OP−1"は、属性的にはOP−１蛋白をコードするDNA配列の一部分または全部から発現される形態形成誘導活性を有する蛋白群を指し、その対立形質および種変異体、例えばヒトOP−１（“hOP−1"、配列番号５、成熟蛋白アミノ酸配列）、マウスOP−１（“mOP−1"、配列番号６、成熟蛋白アミノ酸配列）を含む。７個の保存システイン骨格は、配列番号５および６の残基38から139に特定される。CDNA配列および完全な長さの蛋白をコードするアミノ酸は、配列番号16および17（hOP1）および配列番号18および19（mOP1）で提供される。成熟蛋白は残基293−431（hOP1）および292−430（mOP1）に特定される。この蛋白の“プロ”領域（形態形成原活性を有する成熟蛋白を生じるために切断される）は、本質的には残基30−292（hOP1）および残基30−291（mOP1）に特定される。
“OP−2"は、属性的にはOP−２蛋白をコードするDNA配列の一部分または全部から発現される活性を有する蛋白群を指し、その対立形質および種変異体、例えばヒトOP−２（“hOP−2"、配列番号７、成熟蛋白アミノ酸配列）、マウスOP−２（“mOP−2"、配列番号８、成熟蛋白アミノ酸配列）を含む。７個の保存システイン骨格は、配列番号７および８の残基38から139に特定される。cDNA配列および完全な長さの蛋白をコードするアミノ酸は、配列番号20および21（hOP2）および配列番号22および23（mOP2）で提供される。成熟蛋白は残基264−402（hOP2）および261−399（mOP2）に特定される。形態形成原活性を有する成熟蛋白を生じるために同様に切断されるこの蛋白の“プロ”領域は、実質的には残基18−263（hOP2）および残基18−260（mOP2）に特定される。（別の切断部位は両OP−２蛋白について21残基上流で生じる。）
“CBMP2”は、属性的にはCBMP2蛋白をコードするDNA配列の一部分または全部から発現される活性を有する蛋白群を指し、その対立形質および種変異体、例えばヒトCBMP2A（“CBMP2A（fx）”、配列番号９）またはヒトCBMP2B  DNA（“CBMP2A（fx）”、配列番号10）を含む。文献ではBMP2AおよびBMP2B、またはBMP2およびBMP4と呼ばれる、完全な長さの蛋白のアミノ酸配列はウォツニーらの文献（Wozneyら、（1988）Science 242:1528−1534）に記載されている。BMP2（BMP2A）についてのプロドメインは同様に残基25−248または25−282を含み、成熟蛋白は残基249−396または283−396を含む。BMP4（BMP2B）についてのプロドメインは同様に残基25−256または25−292を、成熟蛋白は残基257−408または293−408を含む。
“DPP（fx）”はショウジョウバエのDPP遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明確に示している（配列番号11）。完全な長さの蛋白についてのアミノ酸配列はパジェットらの文献（Padgettら、（1987）Nature  325:81−84）に記載されている。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基456にわたり、成熟蛋白は同様に残基457−588によって特定される。
“Vgl（fx）”はツメガエルのVgl遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明確に示している（配列番号12）。完全な長さの蛋白についてのアミノ酸配列はウィークスの文献（Weeks（1987）Cell 51:861−867）に記載されている。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基246にわたり、成熟蛋白は同様に残基247−360によって特定される。
“Vgr−１（fx）”はマウスVgr−１遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明白に示している（配列番号13）。完全な長さの蛋白についてのアミノ酸配列はリヨンらの文献（Lyonsら、（1989）PNAS 86:4554−4558）に記載されている。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基299にわたり、成熟蛋白は同様に残基300−438によって特定される。
“GDF−１（fx）”はヒトGDF−１遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明確に示している（配列番号14）。cDNAおよび完全な長さの蛋白のコードされたアミノ酸配列は配列番号32に提示される。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基214にわたり、成熟蛋白は同様に残基215−372によって特定される。
“60A”は、属性的には60A蛋白（配列番号24を参照、そこではcDNAおよび完全な長さの蛋白のためにコードされたアミノ酸配列が提供されている）をコードするDNA配列（ショウジョウバエ60A遺伝子由来）の一部分または全部から発現される形態形成誘導活性を有する蛋白を指す。60A（fx）は、保存された７個のシステイン骨格を明確に示す蛋白配列（配列番号24の残基354から455）を指す。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基324にわたり、成熟蛋白は同様に残基325−455によって特定される。“BMP3（fx）”はヒトBMP3遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明確に示している（配列番号26）。完全な長さの蛋白のためのアミノ酸配列はウォツニーらの文献（Wozneyら、（1988）Science242:1528−1534）に記載されている。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基290にわたり、成熟蛋白は同様に残基291−472によって特定される。
“BMP5（fx）”はヒトBMP5遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明確に示している（配列番号27）。完全な長さの蛋白のためのアミノ酸配列はセレステらの文献（Celesteら、（1990）PNAS 87:9843−5847）に記載されている。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基316にわたり、成熟蛋白は同様に残基317−454によって特定される。
“BMP6（fx）”はヒトBMP6遺伝子によってコードされる蛋白配列を指し、保存された７個のシステイン骨格を明確に示している（配列番号28）。完全な長さの蛋白のためのアミノ酸配列はセレステらの文献（Celesteら、（1991）PNAS 87:9843−9847）に記載されている。プロドメインは同様にシグナルペプチド切断部位から残基374にわたり、成熟蛋白は同様に残基375−513によって特定される。
このOP−２蛋白は、この種類の他の蛋白に共通の保存されたシステイン骨格に加え、さらに付加されたシステイン残基をこの領域に有する（例えば配列番号７および８を参照）。GDF−１蛋白は保存骨格内に４個のアミノ酸挿入物を有するが（配列番号14の残基44−47）、同様にこの挿入物は折り畳まれた構造のシステインの関係に影響を与えない。さらに、CBMP2蛋白はシステイン骨格内で１個のアミノ酸残基を失っている。
モルホーゲンは還元されたときは不活性であるが、酸化された同種二量体として、さらに本発明の他のモルホーゲンと組み合わせて酸化されたとき活性を有する。したがって、本明細書で定義されたように、モルホーゲンは１対のポリペプチド鎖を含む二量体蛋白で、このとき各ポリペプチド鎖は、配列番号５の残基43−139によって範囲を特定される少なくとも６個のＣ−末端システイン骨格を含むが、これにはこれらシステイの機能等価配置（例えば、当該配列中のシステインの直線的配置を変化させるが、その折り畳み構造における関係は変化させないアミノ酸の挿入または欠失）、例えばポリペプチド鎖が折り畳まれる場合、ポリペプチド鎖対を含む当該二量体蛋白種が適切な三次元構造を有するようなもの（その蛋白が本明細書で定義されたモルホーゲンとして作用することができるような適切な鎖内および鎖間ジスルフィド結合を含む）を含む。特に、モルホーゲンは、形態形成誘導を許容する環境下で一般に以下のように生物学的に機能することができる：前駆細胞の増殖を刺激し；前駆細胞の分化を刺激し；形質転換細胞の再脱分化を含む分化細胞の成熟および維持を支援する。さらに、モルホーゲンは、適切な環境条件下で拘束された細胞の再脱分化を誘発することもできると期待されている。
本発明で有用なモルホーゲンは２種の一般アミノ酸配列（一般配列１（配列番号１）または一般配列２（配列番号２））の１つを含むが、この場合各Xaaは20個の天然のＬ−異性体、α−アミノ酸またはその誘導体の１つを指す。一般配列１は保存された６個のシステイン骨格を含み、一般配列２は６個の保存システイン骨格およびOP−２で確認された付加的システインを含む（配列番号２の残基36を参照）。別の好ましい局面では、これらの配列はさらに以下の付加配列をそのＮ−末端に含んでいる：
0003616089.tif 000002
前出の一般配列内の好ましいアミノ酸配列には以下のものが含まれる：一般配列３（配列番号３）、一般配列４（配列番号４）、一般配列５（配列番号30）および一般配列６（配列番号31）（下記に一覧）。これらの一般配列は、表IIで確認されるこのモルホーゲン類の種々の好ましい仲間に共通の相同性を、アミノ酸配列の変動同様有している。特に一般配列３および４は、表IIに提示され、配列番号５−14として確認される以下の蛋白の合成アミノ酸配列である：ヒトOP−１（hOP−1,配列番号５および16−17）、マウスOP−１（mOP−１、配列番号６および18−19）、ヒトおよびマウスOP−２（配列番号7,8,および20−22）、CBMP2A（配列番号９）、CBMP2B（配列番号10）、DPP（ショウジョウバエ由来、配列番号11）、Vgl（ツメガエル由来、配列番号12）、Vgr−１（マウス由来、配列番号13）GDF1（マウス由来、配列番号14）。この一般配列は、配列内の種々の部位について変更可能な残基同様、表IIの配列に共通のアミノ酸の同一性を含んでいる。これら一般配列は、一般配列３または４においてそれぞれ41位または46位にシステイン付加を許容し、分子間または分子内ジスルフィド結合を形成することができる適切なシステイン骨格を提供するということ、および蛋白の三次元構造に影響を与える特定の重要なアミノ酸を含んでいるということに留意すべきである。
0003616089.tif 000003
ここで、各Xaaは以下のように規定される１個または２個以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基４のXaa＝（Ser、AspまたはGlu）；残基６のXaa＝（Arg、Gln、SerまたはLys）；残基７のXaa＝（AspまたはGlu）；残基８のXaa＝（LeuまたはVal）；残基11のXaa＝（Gln、Leu、Asp、HisまたはAsn）；残基12のXaa＝（Asp、ArgまたはAsn）；残基14のXaa＝（IleまたはVal）；残基15のXaa＝（IleまたはVal）；残基18のXaa＝（Glu、Gln、Leu、Lys、ProまたはArg）；残基20のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基21のXaa＝（Ala、Ser、Asp、Met、His、LeuまたはGln）；残基23のXaa＝（Tyr、AsnまたはPhe）；残基26のXaa＝（Glu、His、Tyr、AspまたはGln）；残基28のXaa＝（Glu、Lys、AspまたはGln）；残基30のXaa＝（Ala、Ser、ProまたはGln）；残基31のXaa＝（Phe、LeuまたはTyr）；残基33のXaa＝（LeuまたはVal）；残基34のXaa＝（Asn、Asp、AlaまたはThr）；残基35のXaa＝（Ser、Asp、Glu、LeuまたはAla）；残基36のXaa＝（Tyr、Cys、His、SerまたはIle）；残基37のXaa＝（Met、Phe、GlyまたはLeu）；残基38のXaa＝（AsnまたはSer）；残基39のXaa＝（Ala、SerまたはGly）；残基40のXaa＝（Thr、LeuまたはSer）；残基44のXaa＝（IleまたはVal）；残基45のXaa＝（ValまたはLeu）；残基46のXaa＝（GlnまたはArg）；残基47のXaa＝（Thr、AlaまたはSer）；残基49のXaa＝（ValまたはMet）；残基50のXaa＝（HisまたはAsn）；残基51のXaa＝（Phe、Leu、Asn、Ser、AlaまたはVal）；残基52のXaa＝（Ile、Met、Asn、AlaまたはVal）；残基53のXaa＝（Asn、Lys、AlaまたはGlu）；残基54のXaa＝（ProまたはSer）；残基55のXaa＝（Glu、Asp、AsnまたはGly）；残基56のXaa＝（Thr、Ala、Val、Lys、Asp、Tyr、SerまたはAla）；残基57のXaa＝（Val、AlaまたはIle）；残基58のXaa＝（ProまたはAsp）；残基59のXaa＝（LysまたはLeu）；残基60のXaa＝（ProまたはAla）；残基63のXaa＝（AlaまたはVal）；残基65のXaa＝（ThrまたはAla）；残基66のXaa＝（Gln、Lys、ArgまたはGlu）；残基67のXaa＝（Leu、MetまたはVal）；残基68のXaa＝（Asn、SerまたはAsp）；残基69のXaa＝（Ala、ProまたはSer）；残基70のXaa＝（Ile、ThrまたはVal）；残基71のXaa＝（SerまたはAla）；残基72のXaa＝（ValまたはMet）；残基74のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基75のXaa＝（Phe、TyrまたはLeu）；残基76のXaa＝（AspまたはAsn）；残基77のXaa＝（Asp、Glu、AsnまたはSer）；残基78のXaa＝（Ser、Gln、AsnまたはTyr）；残基79のXaa＝（Ser、Asn、AspまたはGlu）；残基80のXaa＝（Asn、ThrまたはLys）；残基82のXaa＝（IleまたはVal）；残基84のXaa＝（LysまたはArg）；残基85のXaa＝（Lys、Asn、GlnまたはHis）；残基86のXaa＝（TyrまたはHis）；残基87のXaa＝（Arg、GlnまたはGlu）；残基88のXaa＝（Asn、GluまたはAsp）；残基90のXaa＝（Val、ThrまたはAla）；残基92のXaa＝（Arg、Lys、Val、AspまたはGlu）；残基93のXaa＝（Ala、GlyまたはGlu）；残基97のXaa＝（HisまたはArg）。
0003616089.tif 000004
ここで、各Xaaは以下のように規定される１個または２個以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基２のXaa＝（LysまたはArg）；残基３のXaa＝（LysまたはArg）；残基４のXaa＝（HisまたはArg）；残基５のXaa＝（Glu、Ser、His、Gly、ArgまたはPro）；残基９のXaa＝（Ser、AspまたはGlu）；残基11のXaa＝（Arg、Gln、SerまたはLys）；残基12のXaa＝（AspまたはGlu）；残基13のXaa＝（LeuまたはVal）；残基16のXaa＝（Gln、Leu、Asp、HisまたはAsn）；残基17のXaa＝（Asp、ArgまたはAsn）；残基19のXaa＝（IleまたはVal）；残基20のXaa＝（IleまたはVal）；残基23のXaa＝（Glu、Gln、Leu、Lys、ProまたはArg）；残基25のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基26のXaa＝（Ala、Ser、Asp、Met、His、LeuまたはGln）；残基28のXaa＝（Tyr、AsnまたはPhe）；残基31のXaa＝（Glu、His、Tyr、AspまたはGln）；残基33のXaa＝（Glu、Lys、AspまたはGln）；残基35のXaa＝（Ala、SerまたはPro）；残基36のXaa＝（Phe、LeuまたはTyr）；残基38のXaa＝（LeuまたはVal）；残基39のXaa＝（Asn、Asp、AlaまたはThr）；残基40のXaa＝（Ser、Asp、Glu、LeuまたはAla）；残基41のXaa＝（Tyr、Cys、His、SerまたはIle）；残基42のXaa＝（Met、Phe、GlyまたはLeu）；残基44のXaa＝（Ala、SerまたはGly）；残基45のXaa＝（Thr、LeuまたはSer）；残基49のXaa＝（IleまたはVal）；残基50のXaa＝（ValまたはLeu）；残基51のXaa＝（GlnまたはArg）；残基52のXaa＝（Thr、AlaまたはSer）；残基54のXaa＝（ValまたはMet）；残基55のXaa＝（HisまたはAsn）；残基56のXaa＝（Phe、Leu、Asn、Ser、AlaまたはVal）；残基57のXaa＝（Ile、Met、Asn、AlaまたはVal）；残基58のXaa＝（Asn、Lys、AlaまたはGlu）；残基59のXaa＝（ProまたはSer）；残基60のXaa＝（Glu、AspまたはGly）；残基61のXaa＝（Thr、Ala、Val、Lys、Asp、Tyr、SerまたはAla）；残基62のXaa＝（Val、AlaまたはIle）；残基63のXaa＝（ProまたはAsp）；残基64のXaa＝（LysまたはLeu）；残基65のXaa＝（ProまたはAla）；残基68のXaa＝（AlaまたはVal）；残基70のXaa＝（ThrまたはAla）；残基71のXaa＝（Gln、Lys、ArgまたはGlu）；残基72のXaa＝（Leu、MetまたはVal）；残基73のXaa＝（Asn、SerまたはAsp）；残基74のXaa＝（Ala、ProまたはSer）；残基75のXaa＝（Ile、ThrまたはVal）；残基76のXaa＝（SerまたはAla）；残基77のXaa＝（ValまたはMet）；残基79のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基80のXaa＝（Phe、TyrまたはLeu）；残基81のXaa＝（ASPまたはAsn）；残基82のXaa＝（Asp、Glu、AsnまたはSer）；残基83のXaa＝（Ser、Gln、AsnまたはTyr）；残基84のXaa＝（Ser、Asn、AspまたはGlu）；残基85のXaa＝（Asn、ThrまたはLys）；残基87のXaa＝（IleまたはVal）；残基89のXaa＝（LysまたはArg）；残基90のXaa＝（Lys、Asn、GlnまたはHis）；残基91のXaa＝（TyrまたはHis）；残基92のXaa＝（Arg、GlnまたはGlu）；残基93のXaa＝（Asn、GluまたはAsp）；残基95のXaa＝（Val、ThrまたはAla）；残基97のXaa＝（Arg、Lys、Val、AspまたはGlu）；残基98のXaa＝（Ala、GlyまたはGlu）；残基102のXaa＝（HisまたはArg）。
同様に一般配列５（配列番号30）および一般配列６（配列番号31）は、表IIに示す全てのモルホーゲン蛋白類の仲間に共通の相同性を有する。特に、一般配列５および６は、ヒトOP−１（hOP−１、配列番号５および16−17）、マウスOP−１（mOP−１、配列番号６および18−19）、ヒトおよびマウスOP−２（配列番号7,8および20−22）、CBMP2A（配列番号９）、CBMP2B（配列番号10）、DPP（ショウジョウバエ由来、配列番号11）、Vgl（ツメガエル由来、配列番号12）、Vgr−１（マウス由来、配列番号13）、およびGDF−１（マウス由来、配列番号14）、ヒトBMP3（配列番号26）、ヒトBMP5（配列番号27）、ヒトBMP6（配列番号28）、および60（Ａ）（ショウジョウバエ由来、配列番号24−25）の合成アミノ酸配列である。この一般配列は、６および７個のシステイン骨格によって範囲が特定される（それぞれ一般配列５および６）Ｃ−末端ドメインのこれらの配列によって共有されるアミノ酸配列の同一性と当該配列内の種々の部位のまた別の残基の両方を含んでいる。一般配列３および４のように一般配列５および６は、41位（一般配列５）または46位（一般配列６）にシステインの付加を許すが、これは分子内または分子間ジスルフィド結合が形成される適切なシステイン骨格を提供し、さらに当該蛋白の三次元構造に影響を与える特定の重要なアミノ酸を含む。
0003616089.tif 000005
ここで、各Xaaは下記のように規定される１個または２個以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基２のXaa＝（TyrまたはLys）；残基３のXaa＝（ValまたはIle）；残基４のXaa＝（Ser、AspまたはGlu）；残基６のXaa＝（Arg、Gln、Ser、LysまたはAla）；残基７のXaa＝（Asp、GluまたはLys）；残基８のXaa＝（Leu、ValまたはIle）；残基11のXaa＝（Gln、Leu、Asp、His、AsnまたはSer）；残基12のXaa＝（Asp、Arg、AsnまたはGlu）；残基14のXaa＝（IleまたはVal）；残基15のXaa＝（IleまたはVal）；残基16のXaa＝（AlaまたはSer）；残基18のXaa＝（Glu、Gln、Leu、Lys、ProまたはArg）；残基19のXaa＝（GlyまたはSer）；残基20のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基21のXaa＝（Ala、Ser、Asp、Met、His、Gln、LeuまたはGly）；残基23のXaa＝（Tyr、AsnまたはPhe）；残基26のXaa＝（Glu、His、Tyr、Asp、GlnまたはSer）；残基28のXaa＝（Glu、Lys、Asp、GlnまたはAla）；残基30のXaa＝（Ala、Ser、Pro、GlnまたはAsn）；残基31のXaa＝（Phe、LeuまたはTyr）；残基33のXaa＝（Leu、ValまたはMet）；残基34のXaa＝（Asn、Asp、Ala、ThrまたはPro）；残基35のXaa＝（Ser、Asp、Glu、Leu、AlaまたはLys）；残基36のXaa＝（Tyr、Cys、His、SerまたはIle）；残基37のXaa＝（Met、Phe、GlyまたはLeu）；残基38のXaa＝（Asn、SerまたはLys）；残基39のXaa＝（Ala、Ser、GlyまたはPro）；残基40のXaa＝（Thr、LeuまたはSer）；残基44のXaa＝（Ile、ValまたはThr）；残基45のXaa＝（Val、LeuまたはIle）；残基46のXaa＝（GlnまたはArg）；残基47のXaa＝（Thr、AlaまたはSer）；残基48のXaa＝（LeuまたはIle）；残基49のXaa＝（ValまたはMet）；残基50のXaa＝（His、AsnまたはArg）；残基51のXaa＝（Phe、Leu、Asn、Ser、AlaまたはVal）；残基52のXaa＝（Ile、Met、Asn、Ala、ValまたはLeu）；残基53のXaa＝（Asn、Lys、Ala、Glu、GlyまたはPhe）；残基54のXaa＝（Pro、SerまたはVal）；残基55のXaa＝（Glu、Asp、Asn、Gly、ValまたはLys）；残基56のXaa＝（Thr、Ala、Val、Lys、Asp、Tyr、Ser、Ala、ProまたはHis）；残基57のXaa＝（Val、AlaまたはIle）；残基58のXaa＝（ProまたはAsp）；残基59のXaa＝（Lys、LeuまたはGlu）；残基60のXaa＝（ProまたはAla）；残基63のXaa＝（AlaまたはVal）；残基65のXaa＝（Thr、AlaまたはGlu）；残基66のXaa＝（Gln、Lys、ArgまたはGlu）；残基67のXaa＝（Leu、MetまたはVal）；残基68のXaa＝（Asn、Ser、AspまたはGly）；残基69のXaa＝（Ala、ProまたはSer）；残基70のXaa＝（Ile、Thr、ValまたはLeu）；残基71のXaa＝（Ser、AlaまたはPro）；残基72のXaa＝（Val、MetまたはIle）；残基74のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基75のXaa＝（Phe、Tyr、LeuまたはHis）；残基76のXaa＝（Asp、AsnまたはLeu）；残基77のXaa＝（Asp、Glu、AsnまたはSer）；残基78のXaa＝（Ser、Gln、Asn、TyrまたはAsp）；残基79のXaa＝（Ser、Asn、Asp、GluまたはLys）；残基80のXaa＝（Asn、ThrまたはLys）；残基82のXaa＝（Ile、ValまたはAsn）；残基84のXaa＝（LysまたはArg）；残基85のXaa＝（Lys、Asn、Gln、HisまたはVal）；残基86のXaa＝（TyrまたはHis）；残基87のXaa＝（Arg、Gln、GluまたはPro）；残基88のXaa＝（Asn、GluまたはAsp）；残基90のXaa＝（Val、Thr、AlaまたはIle）；残基92のXaa＝（Arg、Lys、Val、AspまたはGlu）；残基93のXaa＝（Ala、Gly、GluまたはSer）；残基95のXaa＝（GlyまたはAla）；残基97のXaa＝（HisまたはArg）。
0003616089.tif 000006
ここで各Xaaは下記のように規定される１個または２個以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる：残基２のXaa＝（Lys、Arg、AlaまたはGln）；残基３のXaa＝（Lys、ArgまたはMet）；残基４のXaa＝（His、ArgまたはGln）；残基５のXaa＝（Glu、Ser、His、Gly、Arg、Pro、ThrまたはTyr）；残基７のXaa＝（TyrまたはLys）；残基８のXaa＝（ValまたはIle）；残基９のXaa＝（Ser、AspまたはGlu）；残基11のXaa＝（Arg、Gln、Ser、LysまたはAla）；残基12のXaa＝（Asp、GluまたはLys）；残基13のXaa＝（Leu、ValまたはIle）；残基16のXaa＝（Gln、Leu、Asp、His、AsnまたはSer）；残基17のXaa＝（Asp、Arg、AsnまたはGlu）；残基19のXaa＝（IleまたはVal）；残基20のXaa＝（IleまたはVal）；残基21のXaa＝（AlaまたはSer）；残基23のXaa＝（Glu、Gln、Leu、Lys、ProまたはArg）；残基24のXaa＝（GlyまたはSer）；残基25のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基26のXaa＝（Ala、Ser、Asp、Met、His、Gln、LeuまたはGly）；残基28のXaa＝（Tyr、AsnまたはPhe）；残基31のXaa＝（Glu、His、Tyr、Asp、GlnまたはSer）；残基33のXaa＝（Glu、Lys、Asp、GlnまたはAla）；残基35のXaa＝（Ala、Ser、Pro、GlnまたはAsn）；残基36のXaa＝（Phe、LeuまたはTyr）；残基38のXaa＝（Leu、ValまたはMet）；残基39のXaa＝（Asn、Asp、Ala、ThrまたはPro）；残基40のXaa＝（Ser、Asp、Glu、Leu、AlaまたはLys）；残基41のXaa＝（Tyr、Cys、His、SerまたはIle）；残基42のXaa＝（Met、Phe、GlyまたはLeu）；残基43のXaa＝（Asn、SerまたはLys）；残基44のXaa＝（Ala、Ser、GlyまたはPro）；残基45のXaa＝（Thr、LeuまたはSer）；残基49のXaa＝（Ile、ValまたはThr）；残基50のXaa＝（Val、LeuまたはIle）；残基51のXaa＝（GlnまたはArg）；残基52のXaa＝（Thr、AlaまたはSer）；残基53のXaa＝（LeuまたはIle）；残基54のXaa＝（ValまたはMet）；残基55のXaa＝（His、AsnまたはArg）；残基56のXaa＝（Phe、Leu、Asn、Ser、AlaまたはVal）；残基57のXaa＝（Ile、Met、Asn、Ala、ValまたはLeu）；残基58のXaa＝（Asn、Lys、Ala、Glu、GlyまたはPhe）；残基59のXaa＝（Pro、SerまたはVal）；残基60のXaa＝（Glu、Asp、Gly、ValまたはLys）；残基61のXaa＝（Thr、Ala、Val、Lys、Asp、Tyr、Ser、Ala、ProまたはHis）；残基62のXaa＝（Val、AlaまたはIle）；残基63のXaa＝（ProまたはAsp）；残基64のXaa＝（Lys、LeuまたはGlu）；残基65のXaa＝（ProまたはAla）；残基68のXaa＝（AlaまたはVal）；残基70のXaa＝（Thr、AlaまたはGlu）；残基71のXaa＝（Gln、Lys、ArgまたはGlu）；残基72のXaa＝（Leu、MetまたはVal）；残基73のXaa＝（Asn、Ser、AspまたはGly）；残基74のXaa＝（Ala、ProまたはSer）；残基75のXaa＝（Ile、Thr、ValまたはLeu）；残基76のXaa＝（Ser、AlaまたはPro）；残基77のXaa＝（Val、MetまたはIle）；残基79のXaa＝（TyrまたはPhe）；残基80のXaa＝（Phe、Tyr、LeuまたはHis）；残基81のXaa＝（Asp、AsnまたはLeu）；残基82のXaa＝（Asp、Glu、AsnまたはSer）；残基83のXaa＝（Ser、Gln、Asn、TyrまたはAsp）；残基84のXaa＝（Ser、Asn、Asp、GluまたはLys）；残基85のXaa＝（Asn、ThrまたはLys）；残基87のXaa＝（Ile、ValまたはAsn）；残基89のXaa＝（LysまたはArg）；残基90のXaa＝（Lys、Asn、Gln、HisまたはVal）；残基91のXaa＝（TyrまたはHis）；残基92のXaa＝（Arg、Gln、GluまたはPro）；残基93のXaa＝（Asn、GluまたはAsp）；残基95のXaa＝（Val、Thr、AlaまたはIle）；残基97のXaa＝（Arg、Lys、Val、AspまたはGlu）；残基98のXaa＝（Ala、Gly、GluまたはSer）；残基100のXaa＝（GlyまたはAla）；残基102のXaa＝（HisまたはArg）。
本発明のモルホーゲンとして使用できる特に有用な配列は、Ｃ−末端、例えばVgl、Vgr−１、DPP、OP−１、OP−２、CBMP−2A、CBMP−2B、GDF−１のＣ−末端の96−102アミノ酸残基（下記の表IIおよび配列番号５−14参照）を、60A、BMP3、BMP5およびBMP6のＣ−末端ドメイン（配列番号24−28参照）同様含んでおり、これらはすべて少なくとも６個または７個の保存されたシステイン骨格を含んでいる。さらに、一般配列（例えばCOP−１、３−５、７、16:米国特許第5011691号参照）からデザインされた生合成構造もまた有用である。他の配列はインヒビン／アクチビン蛋白（例えば米国特許第4968590号および5011691号参照）を含む。したがって、その他の有用な配列は、上記配列のいずれかと少なくとも70％のアミノ酸配列相同性または“相似性”を、好ましくは80％の相同性または類似性を共有するものである。これらは対立形質、変種および変異体並びに生合成変種を、このモルホーゲン蛋白類の新規な仲間同様含むと期待される。関連蛋白類の中で特に考えられるのは、形態形成誘導活性を示す蛋白で、この場合好ましい配列とのアミノ酸の違いは、保存的変化（例えばデイオフら（Dayｈoffら、Atlas of Protein Sequence and Structur（蛋白配列および構造図録）第５巻、付録３、345−362ページ、M.O.Dayｈoff編、Nat'l BioMed.Research Fdn社刊、ワシントンD.C.1978）によって定義されたようなもの）を含む。本明細書で用いられているように、潜在的に有用な配列は、ニードルマンらの方法（Needlemanら、（1970）J.Mol.Biol.48:443−453）およびアラインプログラム（DNAstar,Inc社製）によって計算した同一性を用いて既知のモルホーゲン配列と同列のものとできる。本明細書で用いられる“相同性”または“類似性”は、デイオフらの定義する、許される保存的変化を含む。
本発明の方法にしたがって検出されるモルホーゲン配列は、hOP−１（例えば配列番号５の残基43−139）の６個の保存システイン骨格に範囲が特定されたアミノ酸配列と60％以上の同一性、好ましくは65％以上の同一性を有するが、しかしこれらに限られるものではない。もっとも好ましいこれらの配列は、OP−１およびOP−２蛋白（ショウジョウバエ60A蛋白を含む）の対立形質および変異種の両方を含む。したがって、本発明によって検出できるモルホーゲンは、一般アミノ酸配列を有するポリペプチド鎖種（本明細書では“OPX"と呼ぶ）を含むが、これはOP−１およびOP−２の種々の確認された種（配列番号29）の間で相同性を有する。
本発明の方法で検出できるモルホーゲンは、天然のものから分離されたか、または組換え体（リコンビナント）DNAもしくは他の合成技術で製造されたかにかかわらず、上記のポリペプチド鎖の何れかを含有する蛋白を含み、さらに、これら蛋白の対立形質およびその変異種、その天然もしくは生合成変異体、第二の種類に属するものの別のドメインまたは領域を機能的に配置したある１つの種類に属するもののドメインまたは領域を有するキメラ変異体を、種々の縮小および融合構造物同様に含む。欠失、挿入または付加変異体もまた活性を有すると考えられるが、これらには、保存されたＣ−末端システイン骨格を変更（ただしその変更は折り畳まれた構造におけるこれらシステインの関係を機能的に崩壊させないことを条件とする）するものも含まれる。したがって、そのような活性形は、本明細書中の特に記載された構築物と同等のものと考えられる。当該蛋白は、種々の糖付加パターン、種々のＮ−末端を有する形態、アミノ酸相同性をもつ領域を有する関連蛋白の一群、および天然もしくは生合成蛋白の縮小もしくは変異活性形（宿主細胞中でリコンビナントDNAの発現によって産生される）を含むことができる。
形態形成誘導蛋白は、原核または真核細胞中でインタクトなもしくは縮小DNAから、または合成DNAから発現でき、さらに精製、切断、再折り畳みを行ない二量体化して形態形成誘導活性を有する組成物を生成することができる。現時点で好ましい宿主細胞は、大腸菌（E.coli）または哺乳類細胞（例えばCHO、COSまたはBSC細胞）を含む。本発明の方法によって検出できるモルホーゲンの詳細な記載は、共に継続中の米国特許出願第752764号（1991年８月30日出願）および第667274号（1991年３月11日出願）に記載されており、それらの内容は参考文献として本明細書に含まれている。
本発明のスクリーニング方法は、１つまたは２つ以上の化合物に培養細胞を曝す結果による形態形成誘導蛋白レベルの変化を決定する簡単な方法を提供する。与えられた細胞培養における形態形成誘導蛋白レベル、または１つもしくは２つ以上の化合物に曝すことによって生じるそのレベルの変化は、当該化合物の直接適用が培養細胞によって発現されるモルホーゲンレベルを調節することを示す。例えば、ある化合物が腎細胞株によるOP−１の産生を上昇させる場合、インビボでOP−１産生を上昇させるかどうかを決定するために、続いて動物モデルでこの化合物の全身的投与試験を実施することが望ましいであろう。この化合物が内因性循環OP−１レベルを上昇させる場合、骨粗鬆症のような骨代謝疾患の矯正のために当該化合物を全身的に投与することは理に叶うであろう。身体のモルホーゲンレベルは、さまざまな身体条件（例えば疾病で生じる組織の変性で関節炎、気腫、骨粗鬆症、腎疾患、肺疾患、心筋疾患および肝硬変を含む）の結果であろう。身体のモルホーゲンレベルは、また加齢の正常な過程の結果であろう。本発明のスクリーニング方法によって例えば組織中のモルホーゲンレベルを増加させるものとして選択される化合物を、組織変性のある形態を防ぐために、または変性組織をその正常な健康状態に回復させるために全身的または局所的に投与することは理に叶うであろう。本発明のその他の利点は、疾患またはモルホーゲン産生レベルが変化した状態を治療するためにモルホーゲンの全身レベルを調節することを目的として化合物を投与するため、そのモルホーゲンが由来する組織を決定することを含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の工程において有用なノザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いられるOP−１フラグメントを示す。
図２は、異なるOP−１特異的プローブを用いた、RNAのノザンブロットアッセーの結果を示す。
図３は、OP−１プローブで調べた、異なる細胞型に由来するRNAのノザンブロットアッセーの結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は構造的に関係がある形態形成誘導蛋白類（BMPs）（これはまた骨形成原蛋白（OPs）とも呼ばれる）の発見、より具体的にはこれら種々の蛋白は、胚胎発育だけでなく若年および成熟哺乳類における組織および器官の維持と修復に重要な役割を果たしているという発見を基にしている。これまでに確認された形態形成誘導蛋白は、BMP2、３、４、５、６、OP−１およびOP−２（マウスおよびヒト）、Vgr−１、Vgl、DPP、GDF−１、CMBP−2A、CMBP−2B、60Aおよびインヒビン／アクチビンクラスの蛋白を含む。その他のリコンビナント蛋白はCOP1、COP3、COP4、COP5、COP7およびCOP16を含む。一方、本明細書中で説明したようにモルホーゲンは構造に著しい相同性および類似性を有し、形態形成誘導蛋白遺伝子内の異形は特定組織における特定の役割（例えば前駆細胞増殖の刺激、組織特異的もしくは組織にとって好ましい表現型の維持、および／または分裂速度の刺激もしくは調節、頻繁なターンオーバーという特色をもつ組織細胞の成熟および複製を含む）を果たしているかもしれないという仮説が成り立つ。特定のモルホーゲン種による特定の組織の長期的生理、維持および修復は現在のところ詳細には全く未知である。しかしながら、どの特定組織がどの特定モルホーゲンを発現しているかを決定するために、さらにインビボでモルホーゲン発現を刺激もしくは抑制する変化を見つけるために有用な方法は、様々な病的状態の治療方法の発見および開発を可能にし、当該方法を実行するためにデザインされた薬剤を提供するであろう。
本発明はそのような方法、より具体的には、特異的な天然の哺乳類モルホーゲンの構造／活性関係の決定およびそれらの産生を調節することができる薬剤の決定を完全に可能にするデータを得るための２つの一般工程を提供する。例えば、本発明のアッセーを用いて、OP−１（最初に骨で発見され、骨誘導性を有することが示された）は主として腎、膀胱および副腎皮質組織で合成されることが分かった。この驚くべき発見は、腎疾患をもつ患者はしばしば骨体の減少を発現するという観察所見と合わせて、これらの患者における骨体減少は腎におけるOP−１合成の病的抑制による可能性があることを示唆し、さらに、OP−１の全身投与または腎によるOP−１発現および分泌の刺激は骨体の減少を停止させ、または骨形成増強による再石化（すなわち骨形成）をもたらしえるということを示唆する。
本発明には２つの基本的な局面がある。１つの局面は、モルホーゲンを合成および分泌することができる組織および細胞を決定するためのアッセーを含み、他の局面は、モルホーゲンの発現および／または分泌を調節する（すなわち刺激または抑制する）ために治療的に有用な物質を発見するためにスクリーニング系にこの同定された細胞型を使用することを含む。
あるモルホーゲンが由来する組織を決定するためのアッセーは、組織におけるモルホーゲンの産生を示す指標を求めることによって複数の（すなわち２つまたはそれ以上）異なる組織をスクリーニングし、さらにその指標を比較することを含む。当該由来組織は、もちろんのこと、そのモルホーゲンを産生する組織であろう。
本発明の他のアッセー、モルホーゲンの全身的または局所的有効濃度を調節する能力について、候補化合物をモルホーゲンを産生する細胞培養とともにインキュベートし、さらにモルホーゲンの産生レベルにおける変化を表示する指標について当該培養を調べることによって候補化合物をスクリーニングすることを含む。続いて、有用な候補化合物をインビボでの有効性について、適切な動物モデルで調べることができる。これらの化合物はその後、疾病治療においてモルホーゲンの有効な集中化を調節するために用いることができる。
1.モルホーゲンの組織分布
モルホーゲンは発育中および成熟組織に広く分布している。例えば、DPPおよび60Aは胚胎および発育中のショウジョウバエ組織で発現している。Vglはツメガエルの胎児組織で確認された。Vgr−１転写物は種々のネズミの組織（胎児および発育中の脳、肺、肝、腎および頭蓋冠（真皮骨）組織を含む）で確認された。さらに、CBMP2BおよびCBMP3は肺組織で確認された。最近、Vgr−１転写物もまた成熟ネズミの肺、腎、心および脳組織で（特に肺では高濃度で）確認された（下記参照）。さらに、最近のノザンブロットアッセーによって、OP−１は種々の組織の多数の転写物によってコードされることが示された。この潜在性選択性スプライシングは、より長い転写物が付加蛋白（たとえば２シストロン性mRNA）をコードし、各形態は組織的または発育的に関係を有する可能性があるという仮説と一致する。
OP−１およびCBMP2蛋白（両方とも骨モルホーゲンとして最初に確認された）は、マウスおよびヒトの胎盤、海馬、頭蓋冠および骨肉腫組織で、これら組織から構築されたcDNAライブラリーでOP−１およびCMBP2特異的配列を同定することによって確認された（USSN第422699号参照、本明細書中に参考文献として含まれる）。さらに、OP−１蛋白は、ウェスタンブロットアッセーおよび免疫的局在化法（下記参照）によって決定された通り、様々な胎児組織および発育中の組織（腎、肝、心および脳を含む）に存在する。OP−１特異的転写物はまた胎児組織および発育中の組織の両方（最も豊富には発育中の腎、膀胱および副腎皮質）で確認された。OP−１はまた胚胎発育中に存在する中胚葉誘発因子として確認された。のみならず、OP−１は筋肉のサテライト細胞と関連があり、さらに成熟したネズミの軟骨内骨の損傷後の骨髄中の潜在的多能性幹細胞に関係があることが示されたが、これは組織の修復および再生におけるOP−１の形態形成誘導の役割を示唆している。さらに、７個のシステイン骨格を含む新規な蛋白GDF−１は神経組織で確認された（Lee,1991,Proc.Nat.Aca.Sci.88:4250−4254）。
あるモルホーゲンの組織分布の知見は、本発明のスクリーニングのため、さらに治療の目標となる細胞型もしくは組織タイプを選ぶために細胞型を選択するために有用であろう。当該蛋白（またはそのmRNA）は、発現が少ない組織において標準的な方法およびそれをわずかに修飾した方法を用いることによって、種々の組織において容易に確認される。例えば、標準的なウェスタンブロットアッセーまたは免疫細胞化学的手技、および対象となるモルホーゲンに特異的な抗体を用いて蛋白分布を決定できる。同様に、モルホーゲン転写物の分布は、標準的なノザンハイブリダイゼーション手順および転写物特異的プローブとハイブリダイゼーション条件を用いて決定することができる。
2.有用なモルホーゲン
本明細書で定義されたように、蛋白が、新しく臓器特異的な組織を形成することとなる細胞的、分子的現象の段階的発達を誘発する能力を有し、さらに少なくとも６個の保存的Ｃ−末端システイン骨格またはその機能的同等物（下記参照）を含むとき、その蛋白は形態形成誘導性である。特に、モルホーゲンは、一般に形態形成誘導を許容する環境下で下記の生物学的機能のすべての能力を有する：前駆細胞の増殖を刺激し、前駆細胞の分化を刺激し、分化細胞の増殖を刺激し、さらに分化細胞の成熟および維持（形質転換細胞の“再分化”を含む）を支援する。本発明の方法にしたがって検出できるモルホーゲンがまず最初にどのように確認されたかについての詳細は、それらの製造、使用方法およびモルホーゲン活性についての試験方法と同様USSN第667274号（1991年３月11日出願）およびUSSN第752764号（1991年８月30日出願）に開示されており、その開示内容は参考文献として本明細書に含まれている。本明細書に開示されているように、モルホーゲンは天然の物質から精製されるか、または前記出願明細書に開示されている遺伝子配列を用いて原核もしくは真核細胞から遺伝子組み換えで製造することができる。また別に、新規なモルホーゲン配列は、前記の明細書に開示された方法にしたがい確認することができる。
特に有用な蛋白は、表IIに示す天然に得られる配列を有するものを含む。その他の有用な配列は生合成構築物、例えば米国特許第5011691号に開示されたようなもの（その開示内容は参考として本明細書に含まれている）（例えばCOP−１、COP−３、COP−４、COP−５、COP−７およびCOP−16）を含む。
したがって、本発明の方法および構成にしたがって検出できるモルホーゲンはまた、前述の配列のいずれかと70％または好ましくは80％の相同性（類似性）をもつアミノ酸配列を有する形態形成誘導活性をもつ蛋白によって説明することができる（ここで“相同性”とは上記に定義されている）。
本発明の方法にしたがって検出できるモルホーゲンはまた、本明細書に記載されている６個の一般配列（一般配列１、２、３、４、５および６）のいずれかによって説明することができる。一般配列１および２はまたそのＮ−末端に以下の配列を含むことができる：
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下記の表IIは、モルホーゲンとして確認された天然の蛋白の活性領域のアミノ酸配列を比較している。これら蛋白はヒトOP−１（hOP−１、配列番号５および16−17）、マウスOP−１（mOP−１、配列番号６および18−19）、ヒトおよびマウスOP−２（配列番号６、８および20−23）、CBMP2A（配列番号９）、CBMP2B（配列番号10）、BMP3（配列番号26）、DPP（ショウジョウバエ由来、配列番号11）、Vgl（ツメガエル由来、配列番号12）、Vgr−１（マウス由来、配列番号13）、GDF−１（マウス、配列番号13、32および33）、60A蛋白（ショウジョウバエ、配列番号24および33）、BMP5（配列番号27）およびBMP6（配列番号28）を含む。これらの配列はニードルマンらの方法（Needlemanら、（1970）J.Mol.Biol.，48:443−453）にしたがい、アラインプログラム（DNAstar,Inc社製）を用いて計算し配列されている。この表で３個の点は、その位置のアミノ酸はhOP−１のアミノ酸と同じであることを示している。３本のダッシュ記号はその位置にはアミノ酸が存在しないことを示しているが、相同性を図示する目的のために挿入されている。例えばCBMP−2AおよびCBMP−2Bのアミノ酸残基60は存在しない。もちろん、この領域においてこれらアミノ酸配列は両方ともAsn−Ser（残基58、59）を含み、続いてCBMP−2Aの場合はLysおよびIleを、一方CBMP−2Bの場合はSerおよびIleを含んでいる。
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（脚注）BMP3の残基56と57の間の＊＊はVal残基であり、GDF−１の残基43と44の間にはGly−Gly−Pro−Proのアミノ酸配列が入る。
前出のアミノ酸配列の比較から明らかなように、形態形成誘導活性を保持しながら重要なアミノ酸の変化を一般配列内に作ることができる。例えば、表IIに表したGDF−１蛋白配列は、表に記載されているhPO1配列と約50％のアミノ酸同一性しかもたないが、GDF−１配列はhOP1配列と70％以上のアミノ酸配列相同性（または“類似性”）をもつ（ここで“相同性”または“類似性”はデイオフら（Dayｈoffら、蛋白配列および構造図解、第５巻、付録345−362ページ（M.O.Dayｈoffら編、Nat'l BioMed.Res.Fd'n社刊、ワシントンD.C.1978）の定義のように、配列内の許容される保存的アミノ酸変化を含む）。
本発明においてモルホーゲンとして検出できる現在のところ最も好ましい蛋白配列は、hOP1の６個の保存システイン骨格によって特定されるアミノ酸配列（例えば配列番号５の残基43−139）について60％以上、好ましくは65％以上の同一性を有するものを含む。これら最も好ましい配列はOP−１およびOP−２蛋白の対立形質および変異種の両方（ショウジョウバエ60A蛋白を含む）を含む。したがって、また別の好ましい局面において、本発明は、本明細書で“OPX"と呼ぶ一般アミノ酸配列を有するポリペプチド鎖種を含むモルホーゲンの検出を含む。OPXは７個のシステイン骨格を特定するもので、確認された種々のマウスおよびヒトOP−１およびOP2蛋白間の同一性を提供する。OPXは配列番号29で提示される。そこに示されているように、ある位置の各Xaaはそれぞれ別個に、マウスおよびヒトOP−１またはOP2のＣ−末端配列（配列番号５−８および／または配列番号16−23）の対応する位置にある残基から選ばれる。
3.OP−１の組織特異的発現
モルホーゲンが一旦組織で確認されるや、蛋白もしくは核酸レベルのいずれかでそのレベルを決定することができる。種々の組織間であるモルホーゲンの産生レベルを比較することによって、当該モルホーゲンが由来する組織を決定することができる。種々の組織におけるモルホーゲンOP−１の産生レベルは本来の産生組織（すなわち腎で、これは、モルホーゲン（OP−１）産生に対して影響を与える可能性がある種々の化合物を本発明にしたがってスクリーニングするために用いる細胞型としてもまた使用できる細胞型を含んでいる）をもつモルホーゲンの１例である。
OP−１レベルは種々の組織間で異なる。化合物のOP−１産生に対する効果を与えられた細胞型によってスクリーニングするために、どの組織が潜在的減少を示すために十分なほど高いOP−１量を産生し、さらに潜在的増加を示すために十分なほど低いOP−１量を産生しているかを決定することが望ましい。以下のように異なる組織をRNAレベルでスクリーニングすることができる。
転写物と特異的にハイブリダイズし、対象となる転写物を他の関係がある転写物から識別することができるいずれのプローブも用いることができる。本発明の方法で検出できるモルホーゲンはそのＣ−末端に高い配列相同性を有するので、特異的モルホーゲン転写物の組織分布は、成熟蛋白の“プロ”領域および／または成熟蛋白の不均一Ｎ−末端領域に特異的なプローブを用いて決定するのが一番よい。また別の有用なプローブ配列は終止コドン直後の3'非コード領域である。配列のこれらの部分は本発明のモルホーゲン間で実質的に異なっており、したがって各蛋白に特異的である。例えば、特に有用なVgr−１特異的プローブ配列はPvu II−Sac Iフラグメントで、これは成熟蛋白のプロ領域およびＮ−末端の両方を暗号化する265塩基対（bp）のフラグメントである。同様に、特に有用なmOP−１特異的フラグメントは0.68kbのBstX I−Bgl IフラグメントでmOP1プロ領域のおよそ2/3（７−システインドメインの直ぐ上流の0.2kbのStu I−Stu Iフラグメントおよび3'非翻訳配列を含む0.3kbのEar I−Pst Iフラグメント）をカバーする。同様なアプローチは、例えばhOP−１（配列番号16）またはヒトもしくはマウスOP−２（配列番号20および22）について用いることができる。
モルホーゲン特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて、当業者に既知の標準的方法にしたがいモルホーゲン転写物を哺乳類組織において確認することができる。簡単に記せば、マウス胎児および出生後の動物の器官の全RNAを酸グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム法（Chomczynskiら、Anal.Biochem.162:156−159,1987）を用いて調製する。このRNAをTES緩衝液（10mM Tris−Hcl,1mM EDTA,0.1％SDS,pH7.5）に溶解し、プロテイナーゼＫ（およそ1.5mg/g組織サンプル）で１時間45℃で処理する。オリゴ（dT）−セルロースカラム（タイプ７、ファルマシアLKBバイオテクノロジー社製、ピスカタウェー、ニュージャージー）でのポリ（Ａ）+RNA選別を以下のようにバッチ操作で実施してもよい;11mlのRNA溶液（1gの組織から）と0.1gとオリゴ（dT）−セルロースをTES緩衝液および0.5MのNaCl中で混合する。その後、オリゴ（dT）−セルロースを結合緩衝液（0.5M NaCl,10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH7.5）で洗浄し、ポリ（Ａ）+RNAを水で溶出させる。ポリ（Ａ）+RNA（５または15μg/レーン）を１または1.2％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（Selden,“Current Protocols in MolecularBiology",Ausubelら編、１−４、８、９ページ、GreensPublishing and Wiley−Interscience社、ニューヨーク、1991）で分画する。400μg/mlの臭化エチジウムの１μｌを加熱変性前に各サンプルに加える（Rosenら、Focus 12:23−24,1990）。電気泳動の後、ゲルの写真を撮り、Nytranニトロセルロース膜（Schleicher ＆ Schuell Inc.,キーン、ニューハンプシャー）上で10×SSCで一晩処理してRNAのブロットを得る。この膜を80℃で30−60分乾熱処理し、UV光を照射する（1mW/cm2、25秒）。ノザンハイブリダイゼーションの条件は先に記載したとおりでよい（Ozkaynakら、EMBO J.9:2085−2093,1990）。再使用のためには、フィルターをに1mMのTris−HCl、1mMのEDTA、0.1％のSDS（pH7.5）中で90−95℃で脱プローブし、フィルムに曝して先のハイブリダイゼーションシグナルが完全に除去されていることを確認してもよい。
モルホーゲンをコードする転写物についてスクリーニングするために用いることができるプローブは、部分的または完全なOP−1cDNAを含むが、これは関連モルホーゲンのOP−1mRNAの存在を検出するために用いることができる。マウスのcDNA遺伝子の配列は配列番号14で示されている。
OP−1mRNA発現は、種々のプローブで連続的にハイブリダイズしたフィルターによって17日令のマウス胎児および出生後３日令のマウスで調べた。高度に保存された７−システインドメイン以外の領域からのプローブを、この領域がTGF−βスーパーファミリーの仲間において高度に可変であるという理由から選んだ。図１はノザンハイブリダイゼーションでプローブとして用いたOP−１のフラグメントを示している。黒塗りの四角は推定シグナルペプチドを示し、線付四角は７個のシステイン残基を含むTGF−β様ドメインに対応する。星印は潜在的なＮ−グリコシレーション部位を示している。矢印はOP−１成熟のための切断部位の位置を示している。図の下の３本の実線は12P−標識プローブ（0.68kb Bst XI−Bgl Iフラグメント、0.20kb Stu I−Stu Iフラグメントおよび0.34kb Ear I−Pst I非コードフラグメント）を作成するために用いたOP−１特異的フラグメントを示している。
プロ領域のおよそ2/3をカバーするプローブ（0.68kb Bst XI−Bgl Iフラグメント）でのハイブリダイゼーションは、4kbメッセージ並びに1.8kb、2.2kbおよび2.4kbの３メッセージを明らかにした（図2BおよびＤ並びに図３）。図２のノザンハイブリダイゼーションでは、等量（15μｇ）のポリ（Ａ）+RNAを各レーンに適用し、１％のアガロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ブロッティングおよびハイブリダイゼーションを行った。0.24−9.49kbRNAラダー（Bethesda Research Labs,Inc社製）をサイズスタンダードとして用いた。同じフィルターをOP−１（パネルＢおよびＤ）、Vgr−１（パネルＣ）およびEF−Tu（パネルＡ）に特異的な標識プローブで連続的にハイブリダイズさせるために用いた。パネルA:EF−Tu特異的プローブ（コントロール）は0.4kbHind III−Sac Iフラグメント（コード領域の一部分）で、使用したSac Iはベクターに属する；パネルB:OP−１特異的プローブは0.68kbBst XI−Bgl Iフラグメントであった（プロ領域の2/3および成熟ドメインの上流配列であるが、７−システインドメインからのいずれの配列も含まない）；パネルC:Vgr−１特異的プローブは0.26kbPvuI I−Sac Iフラグメントであった（プロ領域の一部分および成熟ドメインのアミノ末端配列であるが、最初のシステインを含む）（Lyonsら、1989、Proc.Nat.Aca.Sci.86:4554（本明細書に参考として含まれている））。パネルD:OP−１（3'近接）特異的プローブは0.34kbEar I−Pst Iフラグメント（OP−１をコードする配列のすぐ後の3'非翻訳配列）。
図３では、RNA調製に用いられる組織は２週令マウス（パネルＡ）または５週令（パネルＢ）から得られたが、例外としてポリ（Ａ）+RNAは２週令のマウスの腎副腎から得られた（パネルＢ）。等量のポリ（Ａ）+RNA（パネルＡには15μｇ、パネルＢには５μｇ）を各ウェルに用いた。電気泳動（1.2％アガロース−ホルムアルデヒドゲル）およびブロッティングの後、図２の説明（パネルＤ）に記載したようにOP−１特異的3'近接プローブとRNAをハイブリダイズした。サイズスタンダードとして0.24−9.5kbRNAラダーを用いた。矢印はOP−１特異的メッセージを示している。パネルＡおよびＢの下の部分はEHF−Tu特異的プローブ（コントロール）を用いて得られたハイブリダイゼーションパターンを示している。
Vgr−１特異的メッセージのサイズは4kbOP−１種に近いが（図２パネルＣ）、CP−１の4kbmRNAの方が幾分大きい。さらに非OP−１メッセージとの交差ハイブリダイゼーションを除外するために、７−システインドメインをコードする配列の直ぐ上流の遺伝子特異的配列を表す0.2kbのStu I−Stu Iフラグメントを用いた。このプローブは図２のパネルＢに示したハイブリダイゼーションパターンと同じパターンを生じた（データはここでは示さず）。第三のプローブ（0.34kbのEar I−Pst Iフラグメントで3'非翻訳配列を含む）でもまた当該パターンが確認された（図２パネルＤ）。したがって、同じ４つのOP−１特異的メッセージが３つの異なるプローブで観察された。新しい4kbOP−1mRNA種の出現は、最初Vgr−1mRNA（これはおよそ当該サイズに等しい）とOP−１プローブとの交差ハイブリダイゼーションと解釈された。しかし4kbメッセージは３つの異なるOP−１特異的プローブで検出され、これには3'非翻訳領域に特異的なものが含まれ、しかもサイズを基にそれはVgr−１メッセージから分離された。したがってもっとも考えられることは、この4kbmRNA（さらに1.8kb、2.2kbおよび2.4kbの３種）はOP−１転写物のまた別のスプライシングから生じるということである。4kbOP−1mRNAは２シストロン性mRNAを表しているということができよう。4kbメッセージは腎では少量の種であるが、一方副腎組織ではより顕著である。
OP−１発現量を、出生後13日のマウスの脳、脾臓、肺、腎および副腎、心臓並びに肝のポリ（Ａ）+RNAを用いて種々の組織で比較した。このRNAを種々のプローブとのハイブリダイゼーションによってノザンブロットで分析した（図３）。吸光度による判定で等量のmRNAをアガロースホルムアルデヒドゲル上で分画した。ゲルの臭化エチジウム染色は、当該mRNAに加えいくらかのリボソームRNAが残存することを明らかにし、さらにこのmRNAは分解せず、調製物における顕著な量的または質的変動は存在しないというまた別の保証を提供した。mRNA回収のためのコントロールとして、EF−Tu（翻訳伸長因子）mRNAをプローブで調べた（殆どの組織でEF−Tuは均一に発現すると仮定して）。OP−１発現量における顕著な変動が脾、肺、腎および副腎組織で認められ、一方、EF−TuのmRNA量はこれらの組織において比較的一定しているようであった（図４パネルＡ）。OP−1mRNAの最高レベルは腎で認められた。EF−Tuの均一に低いmRNAレベルは脳、心および肝で認められた（図３パネルＡ）。OP−1mRNAの追加分析によって膀胱に顕著なレベルのOP−1mRNAが存在することが示された（データは提示せず）。要約すれば、腎、膀胱および副腎組織と並んで脳組織は最高レベルのOP−1RNAを含んでおり、一方、心および肝は検出可能なシグナルを生じなかった。
OP−1mRNAパターンは種々の組織において質的変化を示す。脳で発見された４つのメッセージのうち、2.2kbメッセージが最も豊富で、一方、肺および脾では1.8kbメッセージが支配的である。腎OP−1mRNAにおける1.8−2.4kbのレベルは、17日令の胎児より出生後３日のマウスでは２倍であり、おそらく骨および／または腎の発育の時期を反映しているのであろう。mRNAはまた５週令のマウスの注意深く分離した腎および副腎組織から調製された。ノザンブロットアッセー（図３、パネルＢ）は、高レベルの2.2kbのmRNAは腎組織に由来し、一方4kbmRNAは副腎組織で支配的であることを明らかにした。
主として腎（膀胱も同様であるが）におけるOP−１メッセージの検出は、尿路特異的OP−１発現にリンクしている。興味深いことには、関連を有するVgr−１もまた腎において顕著なレベルで発現しているが、それの主たる発現部位は肺である。あるモルホーゲンの組織特異的発現が一旦分かれば、当該組織に由来する組織もしくは細胞株に存在することが分かっている細胞型を同様な方法でスクリーニングすることができ、モルホーゲンの組織特異的合成および分泌について実際に必要な当該組織内の細胞型を同定することができる。ある化合物に曝したときモルホーゲンの産生量において増加もしくは減少を検出するために十分なレベルでモルホーゲンを産生している細胞型が一旦分かれば、当該細胞型を組織培養に用い、モルホーゲンの合成および分泌を上昇もしくは低下させる化合物の能力を迅速にスクリーニングすることができる。細胞のモルホーゲン合成もしくは分泌能力に対する化合物の影響を評価するために、化合物の存在下、非存在下で細胞を培養して選ばれた細胞型によるモルホーゲン産生レベルを決定する。これはモルホーゲンの産生レベルを蛋白もしくはmRNAレベルで検出することによって達成できる。
4.培養細胞の成長
腎、副腎、膀胱または他の臓器に由来する細胞培養は文献に広く記載されたように調製することができる。例えば、腎は新生児、若年または成熟ゲッ歯類（マウスまたはラット）から取り出すことができ、全組織もしくは薄切り（１−4mm）組織として臓器培養として用いることができる。初代組織培養および継代細胞株（腎、副腎、膀胱、脳または他の器官由来）を、慣用的な細胞培養技術にしたがい多穴プレート（６穴、24穴または96穴）で確立培養とし、一時のあいだ（１−７日）血清の存在下または非存在下で培養する。例えば、細胞は、血清（例えば１−10％ウシ胎児血清、gibco）含有ダルベッコーの修飾イーグル培地（Gibco、ロングアイランド、ニューヨーク）または所望の場合は血清無添加培地、または限定培地（例えばインシュリン、トランスフェリン、グルコース、アルブミンまたは他の成長因子含有）で培養することができる。
モルホーゲン産生レベルを調べるためのサンプルは培養上清または細胞溶解物質を含む。これらを周期的に採集し細胞培養自体のOP−１産生について免疫ブロット分析によって評価し、また周期的に採集しRNA分析のためのポリ（Ａ）+RNAを調製（サンブルックら編、分子クローニング（Molecular Cloning）1989、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク）するために使用する。OP−１の新たな合成をモニターするために、いくつかの培養を35S−メチオニン/35S−システイン混合物で６−24時間標識し、続いて慣用的な免疫沈降反応（サンブルックら編、分子クローニング（Molecular Cloning）1989、コールドスプリングハーバープレス、ニューヨーク）によってモルホーゲン産生を調べる。また別にモルホーゲン産生またはモルホーゲン産生レベルの決定は、細胞成長の指標（例えば細胞分裂または細胞死）についての簡単なアッセーを用いて確認することができる。例えば、モルホーゲンが培養細胞株によって産生されている場合、モルホーゲン特異的抗体の添加は、細胞成長のモルホーゲンによる抑制の解除をもたらすかもしれない。したがって、細胞増殖の測定は組織によるモルホーゲン産生のインジケーターとして用いることができる。
5.形態形成誘導蛋白レベルの決定
細胞型による形態形成誘導蛋白の産生を定量するために、モルホーゲンに特異的なポリクローン抗体またはモノクローン抗体を用いて免疫アッセーを実施しモルホーゲンを検出することができる。例えば、OP−１は、以下のようにOP−１特異的ポリクローン抗体をを用いてELISAで検出することができる。
OP−１に特異的なアフィニティ精製ポリクローン抗体の１μg/100μｌを96穴プレートの各穴（ウェル）に加え、37℃で１時間インキュベートする。このウェルを0.1％トゥイーン20を含む、0.15MのNaCl含有0.16Mのホウ酸ナトリウム緩衝液（BSB）（pH8.2）で４回洗浄する。非特異的結合を最少にするために、BSB中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）をこのウェルに37℃１時間満たしブロックする。続いてこのウェルを0.1％トゥイーン20を含むBSBで４回洗浄する。培養細胞上清の被験サンプルの各々を適切に希釈したものの100μｌを各ウェルに３ウェル１組として加え、37℃30分インキュベートする。インキュベーションの後、100μｌのビオチン基付加（biotinylated）ウサギ抗−OP−１血清（ストック溶液はおよそ1mg/mlで使用前に１％BSA含有BSBで1:400に希釈）を各ウェルに加え、37℃で30分インキュベートする。続いてこのウェルを0.1％トゥイーン20を含むBSBで４回洗浄する。100μｌのストレプトアビジン−アルカリン（Southern Biotechnology Associates,Inc.バーミンガム、アラバマ、使用前に0.1％トゥイーン20含有BSBで1:2000に希釈）を各ウェルに加え、37℃30分インキュベートする。このプレートを0.5Mトリス緩衝食塩水（TBS,pH7.2）で４回洗浄する。50μｌの基質（ELISA増幅システムキット、Life Technologies,Inc.,ベセスダ、メリーランド）を各ウェルに加え、室温で15分インキュベートする。続いて、50μｌのアンプリファイヤー（同じ増幅システムキットから）を加え、さらに15分室温でインキュベートする。0.3Mの硫酸50μｌを加え反応を停止させる。各ウェルの溶液の490nmでのODを記録する。培養液中のOP−１を定量するために、OP−１スタンダード曲線を被験サンプルと平衡して調製する。
6.ポリクローン抗体の調製
ポリクローン抗体を以下のように調製する。各ウサギを500μｌのフロイントの完全アジュバントと混合した、0.1％SDS中の100μg/500μｌの大腸菌産生OP−１モノマー（配列番号11のアミノ酸328−431）で一次免疫する。抗原は動物の背中および脇腹の多数の部位に皮下注射する。この動物にフロイントの不完全アジュバントを用いて同じ方法で１か月後に追加免疫を施す。７日後に耳静脈から試験採血を行う。ELISAアッセーを用いて血清中にOP−１抗体が検出されるまで、１か月間隔でさらに２回の追加免疫および試験採血を実施する。その後、このウサギに毎月100μｇの抗原で追加免疫を施し、追加免疫後７日および10日に採血（15ml/採血）する。
7.モノクローン抗体および中和モノクローン抗体の調製
あるモルホーゲンに対して特異的なモノクローン抗体は以下のように調製される。マウスに大腸菌産生OP−１モノマー（配列番号11のアミノ酸328−431）を２回注射する。最初の注射は100μｇのOP−１をフロイントの完全アジュバント中に含み、皮下に注射される。２回目の注射は50μｇのOP−１をフロイントの不完全アジュバント中に含み、腹腔内に注射される。続いてマウスに８か月の間いろいろな時期に全量230μｇのOP−１（配列番号11のアミノ酸307−431）を４回腹腔内に注射する。融合の１週間前に100μｇのOP−１（15−139）およびSMCC架橋剤でウシ血清アルブミンに付加システイン残基を介して結合させた30μｇのＮ−末端ペプチド（Ser293−Ans309−Cys）でこのマウスに追加免疫を腹腔内に施す。この追加免疫を融合前５日（腹腔内）、４日（腹腔内）、３日（腹腔内）および１日（静脈内）に繰り返す。その後このマウスの脾細胞をミエローマ細胞（例えば653）とPEG1500（Boehringer Mannheim）を用いて1:1の割合で融合させ、この融合細胞物をプレートにまき、抗原としてOP−１（307−431）を用いてOP−１特異抗体についてスクリーニングする。この細胞融合およびモノクローン抗体スクリーニングは当該技術分野において広く利用されている方法に従う。中和モノクローン抗体は、添加OP−１に対して生物学的に反応する細胞アッセーに添加したときOP−１の生物学的活性を遮断する能力によって確認される。
8.OP−１表面レセプターをもつOP−１産生細胞の同定
種々の細胞株の増殖におけるOP−１およびTGF−βの濃度を増加させる効果を日常的に検査する工程中に、驚くべきことにOP−１を合成および分泌するだけでなく、分泌されてOP−１が結合し、細胞の増殖を抑制するように作用する細胞表面レセプターをもつ細胞株が確認された。この細胞株は以下の観察の後確認された。濃度を増加させたOP−１またはTGF−βを添加しても比較的低い細胞増殖の基礎速度を増加または減少させることはできなかった。しかしOP−１の活性を中和させるモノクローン抗体の添加は細胞増殖において大きな増加をもたらした。さらに、一定量のOP−１に対して同じ量のOP−１中和モノクローン抗体の同時添加は増殖増加をもたらしたが、これはOP−１単独で認められた低い基礎レベルとモノクローン抗体単独で認められた高いレベルとの中間であった。膀胱細胞の癌に由来する上皮細胞株であるこの細胞株は本発明のアッセーに用いることができる。本発明にしたがって検査されるべき指標は細胞増殖である。したがって、OP−１産生レベルを増加または減少させる化合物は、以下のようにこの細胞株で検査することができる。
9.OP−１合成に影響する薬剤を確認するためのアッセー
簡単な培地還流スクリーニングアッセーを標準的な24または96穴マイクロタイターディッシュで構成することができる。この場合、各ウェルは上記の特性を有する細胞株の一定数を含んでいる。濃度を増加させながらOP−１中和モノクローン抗体をディッシュの左から右へと加える。異なる被験物質の一定量をディッシュの上から下へと加える。OP−１の合成および分泌の（その構成的（非誘導）レベルを越える）増加は、OP−１の抗有糸分裂活性から細胞を解放するために必要なOP−１中和抗体量の増加によって示されるであろう。OP−１の合成および分泌の（その構成的（抑制された）レベルを下まわる）減少は、OP−１の抗有糸分裂活性から細胞を解放するために濃度を減少させたOP−１中和モノクローン抗体が必要であるという観察によって示されるであろう。このアッセーの主な利点の１つは、終末点（すなわち細胞増殖に対する効果を示す抗体の希釈）は有糸分裂の測定または１ウェル当たりの細胞数の増加であるということである。細胞数を計るためのいくつかの便利で迅速なアッセーが存在するので、このアッセーはより速く、実施には非常に少ない工程を必要とする。
このアッセーは以下のように行うことができる。細胞を含むウェルに適切な濃度のOP−１中和モノクローン抗体および被験物質を添加後、このディッシュを１−３日間37℃でインキュベーターに静置する。インキュベーション／成熟期間の完了後、ディッシュを取り出し各ウェルの細胞を洗浄し、クリスタルバイオレットのような生体染色を施す。洗浄および染色は当該技術分野でよく知られている。続いて細胞を溶解し、エタノールのような溶媒の一定量中に染料を溶解させる。この溶解させた染料の定量（これは自動プレート読み取り器で容易に実施できる）は、各ウェルの細胞数の直接的定量を可能にする。
上記のアッセーは、それがわずかの工程しか必要としないということから、実施が迅速で容易であるという利点をもつ。他の利点はこのアッセーに本質的である。本発明の方法にしたがってスクリーニングされる薬剤で細胞死をもたらすもの（例えば細胞毒性物質）は、確認に実施者の観察を必要とせず直ちに行える。さらに、細胞の成熟を停止させる薬剤（例えば細胞抑制（cytostatic）物質）は細胞数増加を観察させないのでスコア−は陽性となるが、OP−１中和モノクローン抗体の最高濃度がOP−１の抗有糸分裂活性から細胞を解放しないので容疑物質として自動的にスコアーされる。
10.スクリーニングされる候補薬剤
本発明のスクリーニング方法は、与えられた細胞型による形態形成誘導蛋白の産生に対する化合物の影響をテストするために用いられる。スクリーニングできる化合物の例は、生物学的反応修飾物質（例えば、リンホカイン、サイトカイン、ホルモンまたはビタミン）、植物抽出物、真核細胞によって条件づけした微生物ブロスおよび抽出物培地、体液、または組織抽出物を含むが、これらケミカルに限定されるものではない。
本発明は、その真髄またはその本質的特徴から外れることなくその他の特徴的な形態として具体化できる。本具体例はしたがってそのすべての局面において説明としてなされたもので限定としてなされたものと考えるべきでなく、本発明の範囲は前述の記載よりむしろ添付の請求の範囲によって示され、当該請求の範囲内に入るすべての変更はしたがって当該請求の範囲内に含まれる。
配列表
（１）一般的情報
（ｉ）出願人：ジョン  スマート
ハーマン  オパーマン
エンジン  オズカイナック
サンゲーベル  クベラサムパス
ディヴット  シー．ルーガー
ロイ  エッチ．エル．パング
チャールズ  エム．コーエン
（ii）発明の名称：形態形成誘導蛋白のスクリーニング方法
（iii）配列の数:33
（iv）郵便物の宛先：
（Ａ）名宛人：クリエイティブ  バイオモレキュルズ
（Ｂ）通り:35サウス  ストリート
（Ｃ）市：ホプキントン
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）ジップコード:01748
（ｖ）使用コンピューター：
（Ａ）媒体型別：ディスケット5.25
容量360kb
（Ｂ）コンピューター:IBM XT
（Ｃ）オペレーティング  システム：ドス3.30
（Ｄ）ソフト：アスキーII,テキスト
（vi）先行出願：
（Ａ）出願番号:US 667,274
（Ｂ）出願日:1991年３月11日
（vii）先行出願：
（Ａ）出願番号:US 752,861
（Ｂ）出願日:1991年８月30日
（viii）代理人：
（Ａ）氏名：ピッチャー，エドモンド  アール．
（Ｂ）登録番号:27,829
（Ｃ）ドケット番号:CRP−058PC
（ix）電話番号：
（Ａ）617/248−7000
（Ｂ）ファックス:617/248−7100
（２）配列番号１についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称：一般配列１
（Ｄ）他の情報：各Xaaは、20ケの天然で生じるＬ型異性体、α−アミノ酸、又はその誘導体の一つを示す。
（xi）配列表記：配列番号１
0003616089.tif 000014
（２）配列番号２についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称：一般配列２
（Ｄ）他の情報：各Xaaは、20ケの天然で生じるＬ型異性体、α−アミノ酸、又はその誘導体の一つを示す。
（xi）配列表記：配列番号２
0003616089.tif 000015
（２）配列番号３についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称：一般配列３
（Ｄ）他の情報：ここで各Xaaは明細書中に定義した１つ又は２つ以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個にえらばれる。
（xi）配列表記：配列番号３
0003616089.tif 000016
（２）配列番号４についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称：一般配列４
（Ｄ）他の情報：ここで各Xaaは明細書中に定義した１つ又は２つ以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個にえらばれる。
（xi）配列表記：配列番号４
0003616089.tif 000017
（２）配列番号５についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:hOP−１（成熟形）
（xi）配列表記：配列番号５
0003616089.tif 000018
（２）配列番号６についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:mOP−１（成熟形）
（xi）配列表記：配列番号６
0003616089.tif 000019
（２）配列番号７についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:hOP−２（成熟形）
（xi）配列表記：配列番号７
0003616089.tif 000020
（２）配列番号８についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:139アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:mOP−２（成熟形）
（xi）配列表記：配列番号８
0003616089.tif 000021
（２）配列番号９についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:96アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:CBMP−2A（fx）
（xi）配列表記：配列番号９
0003616089.tif 000022
（２）配列番号10についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:101アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:CBMP−2B（fx）
（xi）配列表記：配列番号10
0003616089.tif 000023
（２）配列番号11についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:DPP（fx）
（xi）配列表記：配列番号11
0003616089.tif 000024
（２）配列番号12についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:Vgr（fx）
（xi）配列表記：配列番号12
0003616089.tif 000025
（２）配列番号13についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称:Vgl−１（fx）
（xi）配列表記：配列番号13
0003616089.tif 000026
（２）配列番号14についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:106アミノ酸
（Ｂ）タイプ：蛋白
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ヒト
（Ｆ）組織型：脳
（ix）特色：
（Ｄ）他の情報:/産生物＝“GDF−１（fx）”
（xi）配列表記：配列番号14
0003616089.tif 000027
（２）配列番号15についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:5アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：ペプチド
（xi）配列表記：配列番号15
0003616089.tif 000028
（２）配列番号16についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1822塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ:cDNA
（vi）由来：
（Ａ）生物：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位:49..1341
（Ｄ）他の情報：標準名称＝“hOP1"
（xi）配列表記：配列番号16
0003616089.tif 000029
0003616089.tif 000030
0003616089.tif 000031
（２）配列番号17についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:431アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ｄ）他の情報:/産生物＝“OP1−PP"
（xi）配列表記：配列番号17
0003616089.tif 000032
0003616089.tif 000033
（２）配列番号18についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1873塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ:cDNA
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ネズミ科
（Ｆ）組織型：胎児
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位:104..1393
（Ｄ）他の情報:/注解＝“MOP1（CDNA）”
（xi）配列表記：配列番号18
0003616089.tif 000034
0003616089.tif 000035
0003616089.tif 000036
（２）配列番号19についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:430アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ｄ）他の情報:/産生物＝“mOP1−PP"
（xi）配列表記：配列番号19
0003616089.tif 000037
0003616089.tif 000038
（２）配列番号20についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1723塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ:cDNA
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ホモサピエンス
（Ｆ）組織型：海馬
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位:490..1696
（Ｄ）他の情報:/注記＝“hOP2（cDNA）”
（xi）配列表記：配列番号20
0003616089.tif 000039
0003616089.tif 000040
0003616089.tif 000041
（２）配列番号21についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:402アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）他情報:/産生物＝“hOP2−PP"
（xi）配列表記：配列番号21
0003616089.tif 000042
0003616089.tif 000043
（２）配列番号22についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1926塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイフ:cDNA
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ネズミ科
（Ｆ）組織型：胎児
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位:93....1289
（Ｄ）他の情報:/注記＝“mOP2 cDNA"
0003616089.tif 000044
0003616089.tif 000045
0003616089.tif 000046
（２）配列番号23についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:399アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ｄ）他情報:/産生物＝“mOP2−PP"
（xi）配列表記：配列番号23
0003616089.tif 000047
0003616089.tif 000048
（２）配列番号24についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1368塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ:cDNA
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位:1..1368
（Ｄ）他の情報:/標準名称＝“60A"
（ｘ）出版物情報：
（Ａ）著者：ファートン，クリスティ  エイ.;
トムセン，ジェラルド  エッチ.;
ゲルバート，ウィリアム  エム．
（Ｂ）表題：ショウジョウバエ60A遺伝子
（Ｃ）書名:PROC.NAT'L ACAD.SCI.USA
（Ｄ）巻:88
（Ｅ）配列番号３における対応残基:1から1368
（Ｆ）ページ:9214−9218
（Ｇ）日付:1991年10月
（xi）配列表記：配列番号24
0003616089.tif 000049
0003616089.tif 000050
0003616089.tif 000051
（２）配列番号25についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:455アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（xi）配列表記：配列番号25
0003616089.tif 000052
0003616089.tif 000053
（２）配列番号26についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（iii）由来：
（Ａ）生物体：ホモサピエンス
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位:1..102
（Ｄ）他の情報:/注記＝“BMP3"
（xi）配列表記：配列番号26
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:104アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位:1..104
（Ｄ）他の情報:/注記＝“BMP3"
（xi）配列表記：配列番号26
0003616089.tif 000054
（２）配列番号27についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ホモサピエンス
（ix）特色
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位:1..102
（Ｄ）他の情報:/注記＝“BMP5"
（xi）配列表記：配列番号27
0003616089.tif 000055
（２）配列番号28についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖数:1本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ホモサピエンス
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位:1..102
（Ｄ）他の情報:/注記＝“BMP6"
（xi）配列表記：配列番号28
0003616089.tif 000056
（２）配列番号29についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー：蛋白
（Ｂ）部位:1..102
（Ｄ）他の情報:/標識＝OPX
／注記＝この場合各位置のXAAは、マウス又はヒトOP1又はOP2のＣ−末端（配列番号5,6,7および８又は16,18,20および22参照）の対応する位置に存在する残基からそれぞれ別個に選ばれる。
（xi）配列表記：配列番号29
0003616089.tif 000057
（２）配列番号30についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:97アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称：一般配列５
（Ｄ）他の情報：この場合、各Xaaは明細書中に定義された１ケ又は２ケ以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる。
（xi）配列表記：配列番号30
0003616089.tif 000058
（２）配列番号31についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:102アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）形態：直線状
（ii）分子タイプ：蛋白
（ix）特色：
（Ａ）名称：一般配列６
（Ｄ）他の情報：この場合、各Xaaは明細書中に定義された１ケ又は２ケ以上の特定のアミノ酸の群からそれぞれ別個に選ばれる。
（xi）配列表記：配列番号31
0003616089.tif 000059
（２）配列番号32についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:1238塩基対、372アミノ酸
（Ｂ）タイプ：核酸、アミノ酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ:cDNA
（iii）由来：
（Ａ）生物体：ヒト
（Ｆ）組織型：脳
（iv）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位：
（Ｄ）他の情報:/産生物＝“GDF−1"
／注記＝“GDF−1 CDNA"
（ｘ）出版物情報：
（Ａ）著者：リイ，セ−ジン
（Ｂ）表題：生長／分化因子Ｉの発現
（Ｃ）書名:PROC.NAT'L ACAD.SCI.USA
（Ｄ）巻:88
（Ｅ）対応残基:1−1238
（Ｆ）ページ:4250−4254
（Ｇ）日付:1991年５月
（xi）配列表記：配列番号32
0003616089.tif 000060
0003616089.tif 000061
0003616089.tif 000062
（２）配列番号33についての知見
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:372アミノ酸
（Ｂ）タイプ：アミノ酸
（Ｃ）鎖数：一本鎖
（Ｄ）形態：直線状
（ii）分子タイプ:cDNA
（iii）仮説：なし
（iv）アンチセンス：なし
（vi）由来：
（Ａ）生物体：ヒト
（Ｆ）組織型：脳
（ix）特色：
（Ａ）名称／キー:CDS
（Ｂ）部位：
（Ｄ）他の情報:/機能＝
／産生物＝“GDF−1"
（xi）配列表記：配列番号33
0003616089.tif 000063
0003616089.tif 000064
【図１】
0003616089.tif 000065
【図２】
0003616089.tif 000066
【図３】
0003616089.tif 000067