(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部が減圧にされた容器内に、アレルゲン及び血液抗凝固剤が血液と接触可能な状態とされており、該アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質量を測定することによるアレルギー検査のための検査容器であって、
使用前の該容器中のエンドトキシン量が、検査しようとする液量に等しい量のエンドトキシンフリー水を採取して抽出を行ったときの、該抽出液中の濃度として０．５ＥＵ／ｍｌ以下とされていることを特徴とするアレルギー検査容器。
【請求項２】
請求項１記載の検査容器に血液を吸入し、前記アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質の量を測定することを特徴とするアレルギー検査方法。
【請求項３】
請求項１記載の検査容器と、前記アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質量を定量可能な試薬とからなることを特徴とするアレルギー検査キット。
【請求項４】
生理活性物質がヒスタミンである請求項３記載のアレルギー検査キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アレルギー検査のための検査容器、アレルギー検査方法及びアレルギー検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原が体内に侵入したときに、２つの異なる型の免疫応答が起こることはよく知られている。第一の型は、体液性免疫と呼ばれ、抗原に対して特異的な液性抗体が産生され、この抗体がエフェクターになる場合である。例えば、バクテリアの侵入の場合では、抗体がバクテリアに結合し、白血球の食作用の亢進を促し、バクテリア毒素を中和する。
【０００３】
第二の型は、細胞性免疫応答として知られ、抗原に特異的な感作リンパ球が産生され、それ自身が免疫応答のエフェクターとなる場合である。例えば、代表的な例として、ツベルクリン型遅延型過敏症、Jones-Mote反応、接触性過敏症、同種移植免疫、腫瘍免疫、結核菌、癩菌、サルモネラ、リステリアなどの細胞内寄生性細菌の感染症やウィルス感染症がある。細胞性免疫の生体内発現の局所における特徴は、リンパ球、マクロファージなどの単核細胞の浸潤であり、これらの細胞がその反応の主体であると考えられている。これらの細胞は、炎症局所に集積し、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、走化性因子などの種々のサイトカインやプロスタグランジン、ロイコトリエン、一酸化窒素などの種々のケミカルメディエーターを分泌することによって、オートクリン及びパラクリンに作用しあうことによって、細胞性免疫応答を発現している。
【０００４】
また、ツベルクリン型遅延型過敏症や接触性過敏症は、抗原特異的な細胞性免疫応答の代表とされているが、最近、喘息やアトピー性皮膚炎などのＩｇＥ抗体によるアレルギー疾患と位置づけられてきた疾患においても、リンパ球やマクロファージから産生されるサイトカイン、例えば、ＴＮＦ−αやインターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、γ−インターフェロン（γ−ＩＮＦ）、Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor（ＧＭ−ＣＳＦ）などが、顆粒球の局所集積や活性化に関係し、炎症の維持に働いているという報告がなされ（第２４回日本臨床免疫学会総会・抄録集）、抗原特異的な細胞性免疫応答にも関与していると考えられている。
【０００５】
代表的なアレルギー疾患である喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎は、気道や鼻粘膜中に存在する肥満細胞や末梢血液中に存在する好塩基球の表面に結合したＩｇＥに特異抗原が結合し、肥満細胞、好塩基球の脱顆粒がおこりヒスタミンが遊離されることによりアレルギー反応が引き起こされることが明らかになっている。また、単球・マクロファージがＬＰＳ（リポ多糖、エンドトキシン）によって、活性化されたときに産生されるＩＬ−１によっても好塩基球からのヒスタミン遊離が、引き起こされることも明らかになっている（日本医学館出版、笠倉新平（編集）、サイトカイン  基礎から最新情報まで、１３〜２０頁（１９９２年））。
【０００６】
アレルギーの検査方法としては、採血した血液と抗原を接触させ好塩基球から遊離されるヒスタミン量を指標とする方法が知られている。しかしながら、この方法には、サイトカインを誘導するレベルのＬＰＳが混入している採血管、または、容器を用いて採血した場合、採血管、または、採血容器に混入しているＬＰＳと単球・マクロファージが反応し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１などのサイトカインが誘導され、そのサイトカインにより好塩基球が刺激され、アレルギー検査を行う前にヒスタミンなどの生理活性物質の遊離が引き起こされ、反応を精度良く把握することができない欠点がある。
【０００７】
従来の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験法にて行う、アレルギー検査方法の一例について、市販のキット（販売元：岩井化学薬品）を例として以下に説明する。まず、各種の濃度に希釈されたアレルギーの特異抗原（以下、アレルギーの特異抗原をアレルゲンという）をマイクロプレートのウェル内に分注する。次に、その抗原の入ったウェル内に、被検者からヘパリン採血した血液と酵素固定化抗ヒスタミンモノクローナル抗体を混合した血液−抗体混合液を一定量分注し、３７℃、３０分間反応させる。この反応で、血液中の好塩基球上のＩｇＥと抗原が結合すると好塩基球からヒスタミンが遊離される。遊離されたヒスタミン量をＥＬＩＳＡ法を用いて定量する。
【０００８】
しかしながら、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験法には、以下のような問題点があった。
【０００９】
（１）被検者から血液を採血後、アレルゲンと血液を接触させ、ヒスタミン遊離を誘導するまでに、血液を長時間放置すると、採血容器内にサイトカインを誘導するレベルのＬＰＳが混入していると血液中の単球・マクロファージからＩＬ−１が誘導され、そのＩＬ−１により好塩基球が刺激されてヒスタミンが遊離されてしまい、アレルゲンによるヒスタミン遊離量を正確に測定できなくなるという欠点があった。実際、市販の採血管中のエンドトキシン（ＬＰＳ）量を調べた結果、ＴＮＦ−αやＩＬ−βが誘導されるレベルのエンドトキシンが混入していることが明らかになっている。エンドトキシンは、極微量で白血球から種々のサイトカインの産生を誘導するため、例えば、製造工程での微量の埃の混入、使用する洗浄水からの汚染などにより、血液採取器に混入したものと考えられる。
【００１０】
（２）ヒスタミン遊離誘導試験は、例えば、上記の市販のキットの場合のように、血液と酵素固定化ヒスタミンモノクローナル抗体を混合し、アレルゲンの分注されたヒスタミン遊離マイクロプレートに上記混合液を分注し、ヒスタミン遊離の誘導を行う。この場合、アレルゲンの希釈及びその分注、並びに血液の分注などの手段は、用手法となり煩雑であった。また、血液の分注に際して、検査従事者が血液に触れて、肝炎、エイズなどの種々の感染症に感染する危険性があった。また、これらの操作中に、血液試料中に種々の雑菌や埃などが混入する恐れがあり、これらの汚染物または操作による物理的刺激によって、血液中の細胞（単球・マクロファージ）が不必要に刺激され、ＩＬ−１等のサイトカインの産生、好塩基球への刺激、ヒスタミンの遊離へとつながり、測定結果に悪影響を及ぼす恐れがあった。
【００１１】
（３）また、上記の市販のキットの場合は、少量の血液をマイクロプレートに分注して検査を行うので、血液サンプル量が少なく、検査終了後、同一サンプルを再測定できないという欠点があった。
【００１２】
これらの問題点のため、従来よりも、精度が良く、操作が簡単で、危険性がないアレルギー検査方法が望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来のアレルギーの検査方法の欠点を解消し、従来よりも、精度が良く、操作が簡単で危険性がなくアレルギーの検出ができる検査容器、検査方法及び検査キットを提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１に記載のアレルギー検査容器は、内部が減圧にされた容器内に、アレルゲン及び血液抗凝固剤が血液と接触可能な状態とされており、該アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質量を測定することによるアレルギー検査のための検査容器であって、使用前の該容器中のエンドトキシン量が、検査しようとする液量に等しい量のエンドトキシンフリー水を採取して抽出を行ったときの、該抽出液中の濃度として０．５ＥＵ／ｍｌ以下とされていることを特徴とする。
【００１６】
本発明のアレルギー検査方法は、請求項１記載の検査容器に血液を吸入し、前記アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質の量を測定することを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項３に記載のアレルギー検査キットは、請求項１記載の検査容器と、前記アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質量を定量可能な試薬とからなることを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項４に記載のアレルギー検査キットは、生理活性物質がヒスタミンである請求項３記載のアレルギー検査キットである。
【００１９】
以下、本発明のアレルギーの検査容器について説明する。
【００２０】
本発明で用いられるアレルゲンとは、アレルギーの特異抗原のことであり、例えば、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、消化管アレルギー、寄生虫アレルギーなどのアレルゲン検査に用いられる抗原（Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（岩井化学薬品社製）；ハウスダスト；ダニ抗原；ブタクサ花粉抽出物、スギ花粉抽出物、イネ抽出物などの種々の花粉抗原；真菌抗原；アスカリス抽出物などの寄生虫抗原；卵白アルブミン、小麦、大豆、エビ、カニ、肉類などの食物抗原；ハチ毒など）が挙げられる。また、これらの材料を種々の天然、合成高分子材料に公知の固定化方法によって固定化した材料なども挙げられる。上記固定化方法としては、共有結合法、物理吸着法等のいずれの公知の方法を用いても良い。
【００２１】
上記アレルゲン中のエンドトキシン量は、本発明の検査容器でアレルギー検査を行った場合、検査値の精度に影響を与えないレベルが好ましく、また、ロット間においてあまり差がない方が好ましく、アレルゲンとしては、所謂、エンドトキシンフリーのものが特に好ましい。
【００２２】
本発明における、アレルゲンと血液細胞との反応によって、血液細胞から産生される生理活性物質としては、特に、好塩基球やマスト細胞（肥満細胞）などが産生（遊離）するヒスタミン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、好酸球遊走因子（ＥＣＦ：例えばＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８）などのケミカルメディエーターが好ましい。また、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、走化性因子などの種々のサイトカイン；プロスタグランジン；ロイコトリエン；一酸化窒素などの種々のケミカルメディエーターなども挙げられる。
【００２３】
本発明の検査容器においては、上記アレルゲンが、内部が減圧にされた容器内に、血液と接触可能な状態とされている。上記血液と接触可能な状態としては、例えば、上記アレルゲンが上記容器内に収容されている場合が挙げられる。
【００２４】
上記アレルゲンの形状としては、特に限定されず、例えば、液状、粒子状などが挙げられる。また、担体に固定化されていてもよい。上記液状の場合は、通常、上記アレルゲンを、希釈液として、例えば、リン酸緩衝液、ハンクス緩衝液などの緩衝液やＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等の通常の培地、生理食塩液（例えば、大塚製薬社製）、注射用水（例えば、大塚製薬社製）などで希釈して用いる。
【００２５】
アレルゲンの上記容器中の存在状態は、固体状であってもよく、また、液体状であってもよい。アレルゲンが水溶性材料の場合、容器の内壁面に塗布、あるいは添加された後、粉末状にされてもよい。例えば、注射用水を用いてアレルゲンを希釈した場合は、アレルゲンを容器に入れた後、乾固した方が好ましい。アレルゲンが水不溶性の材料の場合には、上記アレルゲンの表面に気泡が残ると、転倒混和等により血液と接触させる際に過度の溶血を引き起こし、測定系に影響する恐れがあるため、水不溶性材料は、例えば、上記のような希釈液に浸しておくのが好ましい。
【００２６】
担体にアレルゲンが固定化されて用いられる場合、固定化する担体が水溶性材料の場合は、容器の内壁面に塗布、あるいは添加した後、粉末状にしてもよい。担体が水不溶性材料の場合は、材料の表面に気泡が残ると、過度の溶血を引き起こし、測定系に影響する恐れがあるため、例えば、上記のような希釈液に浸しておくのが好ましい。
【００２７】
上記アレルゲンが血液と接触されたときの全液（血液と、血液抗凝固剤溶液と、上記アレルゲンの溶解もしくは懸濁用の液との総和）中のアレルゲンの最適濃度は、それぞれのアレルゲンによって変わり得る。
【００２８】
また、本発明の検査容器は、血液とアレルゲンを接触させ、生理活性物質を産生（遊離又は誘導）する反応容器として用いられるので、血液が凝固しないように、上記容器中に血液抗凝固剤が収容されている必要がある。
【００２９】
上記血液抗凝固剤は、該容器の中に液体又は固体のいずれの状態で存在されてもよい。
【００３０】
上記血液抗凝固剤としては、ヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物などが挙げられ、ヘパリンナトリウムなどが細胞の生物学的反応を阻害しないので好ましい。
【００３１】
上記ヘパリンナトリウムの該容器中の収容量としては、該容器に血液が収容された時に、その血液中の濃度が低くなると血液凝固の恐れがあり、高くなると細胞に不測の活性化や不活性化を起こす恐れがあるので、４〜５０ｕ／ｍｌになるように収容するのが好ましい。
【００３２】
また、本発明の検査容器の形状は、減圧にし得るものであれば、特に限定されず、例えば、採血管のようなチューブ状のもの、筒状のもので入口と出口の両方が何らかの形で閉鎖されているもの、マイクロプレート状のものが挙げられる。
【００３３】
本発明の検査容器の材質としては、プラスチックまたはガラスが挙げられるが、生理活性物質の産生反応後、上記生理活性物質を測定するための遠心分離操作に耐えられるだけの強度を有するものが好ましい。
【００３４】
上記プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂のいずれもが用いられる。熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メチルメタクリレート共重合体、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。熱硬化性樹脂としては、例えば、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹脂、エポキシ−アクリレート樹脂等が挙げられる。
【００３５】
本発明の検査容器には、その内部を減圧に維持するために、通常、栓体を使用する。栓体の材質としては、例えばブチルゴム、塩素化ブチルゴム、熱可塑性エラストマー等が挙げられる。
【００３６】
本発明の検査容器の減圧の程度は、常圧の検体血液と上記検査容器が連通された時に、上記検査容器の中に常圧の検体血液が吸入されうる程度の圧力であればよく、その圧力は、吸入しようとする検体血液の量によって決められる。すなわち、吸入しようとする検体血液の量が多ければ多いほど減圧の程度を大きくする必要がある。
【００３７】
本発明の検査容器を用いてアレルギー検査をする際に、採取する血液量は、容器の容積によって異なるが、通常、４〜５ｍｌの容積のチューブ状の容器を用いる場合であれば、０．５〜２ｍｌ程度でよい。また、マイクロプレート状の容器を用いる場合であれば、０．０５〜２ｍｌ程度でよい。
【００３８】
また、本発明で用いられる容器のエンドトキシン含量は、上記産生される生理活性物質量がエンドトキシンに影響されないように、使用前に制限されていることが必要である。上記使用前の該容器中のエンドトキシン量は、測定しようとする液量に等しい量のエンドトキシンフリー水を該容器内に採取し、３７℃で１時間の条件で攪拌下で抽出を行ったとき、該抽出液中の濃度として０．５ＥＵ（国際エンドトキシンユニット）／ｍｌ以下とされている必要がある。〔なお、上記の抽出を行う際のエンドトキシンフリー水の量は、上記のように測定しようとする液量に全く等しい量である必要は必ずしもなく、抽出が十分になされるなら測定しようとする液量未満であってもよいが、この場合であっても、抽出液中のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ（国際エンドトキシンユニット）／ｍｌ以下であれば本発明の作用効果を奏する〕。
【００３９】
後述の実験例から明らかなように、エンドトキシン量が０．５ＥＵ／ｍｌを超えると血液から顕著にサイトカインの誘導を引き起こし、誘導されたサイトカインにより好塩基球の脱顆粒がおこりヒスタミンが産生（遊離）される。従って、本発明によるアレルギー検査を正確に行うためには、エンドトキシン含量がサイトカインの産生を誘導するレベル以下に制限されていることが必要である。
【００４０】
なお、エンドトキシンは、通常２５０℃、２時間の乾熱滅菌により失活させることが可能であり、乾熱滅菌が不可能な場合は、エンドトキシンフリー水にて洗浄することによって減ずることが可能である。
【００４１】
上記エンドトキシン含量の測定方法としては、種々の方法があるが、本発明でいうエンドトキシン含量の測定方法は、合成発色基質法によるものである。この測定には、例えば、生化学工業社製、商品名  エンドスペシーを利用できる。
【００４２】
本発明の検査容器の製造方法の一例を挙げると、内部を減圧にすることが可能である容器に、上記アレルゲン及び血液抗凝固剤を加え、容器を所定の減圧状態にした後、上記容器に栓をすることによって製造する。
【００４３】
上記の容器としては、例えば、一端が開口し他端が閉塞してなる有底管体が好ましく、開口部は、栓体によって閉塞可能なものが好ましい。上記有底管体としては、例えば、反応後、上記生理活性物質量を測定するための遠心分離操作に好適な試験管状のものがより好ましく、そのサイズとしては、外径が５〜３０ｍｍ、高さ２０〜１５０ｍｍ程度が好ましい。
【００４４】
また、本発明の検査容器は、エンドトキシンや雑菌の混入を避けるため、できる限りクリーンな環境で製造するのが好ましく、また、可能であれば製造後に公知の滅菌処理を施すのが好ましい。
【００４５】
本発明の検査容器によって、アレルギーを検査する方法について説明する。まず、まず血管又は採血容器と上記検査容器とを連通させ、上記検査容器中に検体血液を吸入させる。次いで、上記検査容器を適度に振とうしながら、血液細胞と上記アレルゲンとを接触させ、上記アレルゲンと血液細胞とを反応させて血液細胞から生理活性物質を産生させる。反応後、静置もしくは遠心分離により、血球と血漿に分離して、血漿中の生理活性物質（例えばヒスタミンなど）量を各々の定量可能な試薬により定量する。
【００４６】
上記の採血容器と上記検査容器を連通させる方法としては、例えば、採血容器を注射針付きの注射筒としておき、上記注射針を上記検査容器の栓体に突き刺す方法が挙げられる。
【００４７】
また、上記の血管と上記検査容器を連通させる場合には、通常の真空採血法に用いられる注射針、すなわち、針基の一方の側に血管刺通側の針を有し、他方の側に上記検査容器の栓体を刺通し得る栓体刺通側の針を有し、上記血管刺通側の針と栓体刺通側の針が連通されている針を用いればよい。
【００４８】
上記の血液細胞とアレルゲンとの反応温度は、上記生理活性物質の産生が効率的に行われ、産生された生理活性物質が安定で、しかも、過度の溶血を引き起こさない温度である１〜４２℃が好ましく、４〜４０℃がより好ましい。また、反応時間は、上記生理活性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こさない反応時間である１０秒から３時間が好ましく、１〜１２０分がより好ましい。
【００４９】
本発明の検査容器を用いることにより産生された生理活性物質量を測定する方法としては、例えば、測定しようとする生理活性物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体；ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素；及び各々の酵素の発色基質などを利用した酵素免疫測定方法が挙げられる。
【００５０】
以下に、本発明の検査容器を用いて、アレルギーを検査する１態様を詳しく説明する。先ず、血液と上記アレルゲンとを上記検査容器の中で反応させ、ヒスタミンを産生させ、産生後の検査容器を２５００Ｇで遠心分離して、血球成分と血漿成分を分離させる。次いで、分離された血漿を、上記ヒスタミンに対するモノクローナル抗体を固定化したマイクロプレートのウェルに、ピペッティングにより添加し、３７℃で２時間反応させる。次いで、反応後の血漿液を吸引除去等の手段で廃棄し、さらに、未反応成分を除くため、Tween20 等のノニオン系の界面活性剤を含有する中性pHの洗浄用緩衝液で上記ウェルを洗浄する。次いで、西洋わさびペルオキシダーゼを固定化した上記ヒスタミンに対するポリクローナル抗体をピペッティングにより上記ウェルに添加し、３７℃で１時間反応させる。次いで、未反応の西洋わさびペルオキシダーゼ固定化抗体を除くため、上記ウェルを上記洗浄用緩衝液で洗浄した後、過酸化水素、テトラメチルベンジジンを含む基質溶液を添加し、５〜１０分間反応させる。次いで、１Ｍ硫酸溶液を添加し、反応を停止させて、酵素反応による基質の発色を４５０ｎｍの吸光度から測定する。この測定値と既知濃度の上記ヒスタミンを用いて作成した検量線から、上記ヒスタミンの産生量を測定する。
【００５１】
以下、本発明のアレルギー検査キットについて説明する。本発明のアレルギー検査キットに使用される試薬としては、上記アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質の量を定量可能な試薬であれば、特に限定されないが、例えば、定量しようとする生理活性物質に対するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体；ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵素；及び各々の酵素の発色基質などを利用する酵素免疫測定法用試薬が挙げられる。
【００５２】
上記アレルギー検査キットの使用方法の１例としては、前記の、本発明のアレルギー検査容器を用いてアレルギーを検査する１態様を説明した方法と同様である。
【００５３】
本発明のアレルギー検査キットで測定される生理活性物質としては、ヒスタミンが特に適している。
【００５４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をさらに詳細に述べる。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例１、比較例１
（１）アレルギー検査容器の製造方法
ポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌのエンドトキシンフリーの採血管（１２．６φ×７５ｍｍ、積水化学工業社製）２１本に、濃度２００ｕ／ｍｌのヘパリンナトリウム（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社製、商品名ノボ・ヘパリン注１０００）の注射用生理食塩水（大塚製薬社製）溶液を０．０５ｍｌ添加した。
【００５６】
次いで、アレルゲンとして、Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（岩井化学薬品社製）を岩井化学薬品社販売のアレルギー検査キットの抗原希釈用液を用いて容量で１００００倍に希釈したものを、２０μｌずつ上記ヘパリンナトリウム含有採血管２１本中の９本に添加した（実施例１）。
【００５７】
また、ヘパリンナトリウム含有採血管２１本中の残りの１２本には、何も添加しなかった（比較例１）。
【００５８】
次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）でよく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を、上記のようにして調製したアレルゲン添加したものとアレルゲンを添加しなかったものの合計２１本の採血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せた後、減圧にできる容器内に置き、上記容器を減圧にしてゆき、上記容器を５７０ｍｍＨｇに減圧したところで、該採血管の開口部を密栓した。以上のようにして、アレルギー検査容器を製造した。
【００５９】
（２）採血管（検査容器）のエンドトキシン含量の測定
注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を、上記（１）で製造した、比較例１の検査容器１２本のうちの３本のブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管にエンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）を１ｍｌ採取し、１時間、３７℃で撹拌し、エンドトキシンを抽出し、この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製のエンドトキシン測定用キットであるエンドスペシーＥＳ６（商品名）を用いて、合成発色基質法で測定した。その結果、試験した採血管３本ともに、抽出液中のエンドトキシン含量は０．５ＥＵ／ｍｌ以下であった。
【００６０】
（３）アレルギー検査
上記（１）で製造した実施例１の検査容器３本と比較例１の検査容器３本のそれぞれの中に、Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓに感作性のあるボランティアから、真空採血により検体血液１ｍｌを採取した。この採取操作をボランティア３人（それぞれのボランティア名をＡ、Ｂ、Ｃとする）について行った（従って、検体血液を採取した検査容器は、実施例１の検査容器９本と比較例１の検査容器９本の合計１８本となる）。
【００６１】
次いで、予め３７℃に保温しておいた恒温器の中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液を採取した各々の検査容器をとりつけ、３０分、転倒混和した。混和後、各々の検査容器を２５００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。採取した血漿中のヒスタミンをモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法を用いて測定した。この測定には、岩井化学薬品社販売、アレルギー検査キット（ヒスタミン遊離能測定キット）中のＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いた。なお、このＫＩＴでのヒスタミンの定量範囲は、０．１〜５５ｎｇ／ｍｌである。この測定結果を表１に示した。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
表１から分かるように、比較例１の検査容器では、ヒスタミンは検出されなかった。実施例１の検査容器では、ボランティアＡ、Ｂ、Ｃでそれぞれ、平均値８．７ｎｇ／ｍｌ、１５．７ｎｇ／ｍｌ、１９．０ｎｇ／ｍｌのヒスタミンが検出され、また、ヒスタミン検出値のばらつき（変動係数、ＣＶ％）も、それぞれ４．７％、３．７％、５．３％と小さく、良好に、アレルギー検査をできることが分かった。
【００６４】
比較例２
実施例１で用いたアレルゲンに感作性のあるボランティア３人（実施例１と同一人）から市販のヘパリンナトリウム含有採血管（アレルゲンを含有しない）を用いて採血し、岩井化学薬品社販売のアレルギー検査キット（ヒスタミン遊離能測定キット）を用いて、採血の２時間後、この血液検体のヒスタミン遊離能を検査した。なお、アレルゲンとしては、Ｋ. Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（岩井化学薬品社製）を上記のアレルギー検査キットの抗原希釈用液を用いて容量で１００００倍に希釈したものを用い、その２０μｌを上記のアレルギー検査キット中のウェルに添加した。
【００６５】
アレルギー検査方法は、上記のアレルギー検査キットのプロトコールに従った。すなわち、血液検体を、アレルゲン添加ウェル及びアレルゲン非添加ウェルに添加して、３７℃、３０分反応させ、血液細胞から産生されたヒスタミンを測定し、ヒスタミン遊離（産生）量は、アレルゲン添加ウェルでの測定値からアレルゲン非添加ウェルでの測定値を減ずることにより求めた。
【００６６】
検査は、各ボランティア血液について、ｎ＝３で行ない、結果を表２に示した。
【００６７】
なお、上記の検査において血液の採取に用いた市販のヘパリンナトリウム含有採血管中のエンドトキシン含量を、実施例１の（２）に準じて測定した。すなわち、上記の採血管と同じ製造ロットの採血管３本に、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）をそれぞれ０．９ｍｌずつ採取し、１時間、３７℃で撹拌し、エンドトキシンを抽出し、この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製、エンドスペシーＥＳ６を用いて、合成発色基質法で測定した。その結果、それぞれの採血管抽出液中のエンドトキシン含量は、５０６ＥＵ／ｍｌ、６０４ＥＵ／ｍｌ、７５１ＥＵ／ｍｌであった。
【００６８】
【表２】
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【００６９】
この結果、比較例２では、採血に用いた採血管内にエンドトキシンが混入しているので、アレルゲン非添加ウェルでもヒスタミンが産生された。また、ヒスタミンの遊離（産生）量のばらつき（変動係数、ＣＶ％）も、７０．７％、１４５．５％、１０１．３％と実施例１に比べて著しく大きくなった。
【００７０】
以上より、採血には、エンドトキシンフリーの採血管を用いなければ、血液細胞へのアレルゲン非特異的な刺激が起こり、本来のアレルゲン刺激で産生されるヒスタミン量を正確に、かつ、精度良く測定できないことが明らかである。
【００７１】
実験例
エンドトキシンによる血液細胞からのインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の産生誘導における、エンドトキシン濃度依存性を試験した。
【００７２】
（１）試験用反応器の製造方法
ポリエチレンテレフタレート製の４ｍｌの採血管（１２．６φ×７５ｍｍ、積水化学工業社製）２０本を、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）４ｍｌで１０回よく洗浄し、濃度２００ｕ／ｍｌのヘパリンナトリウム（ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ社製、商品名ノボ・ヘパリン注１０００）の注射用生理食塩水（大塚製薬社製）溶液を０．０５ｍｌ添加した。
【００７３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵＫＴ−Ｂ由来エンドトキシン（日本薬局方標準品Ｌｏｔ．８９２０）を注射用生理食塩水（大塚製薬社製）に溶解、段階希釈して、上記ヘパリン含有採血管１６本のそれぞれ２本ずつに、ヘパリンナトリウム溶解生理食塩水とエンドトキシン溶解生理食塩水との合計の溶液中に、該エンドトキシン濃度が０ＥＵ／ｍｌ、１ＥＵ／ｍｌ、２ＥＵ／ｍｌ、５ＥＵ／ｍｌ、１０ＥＵ／ｍｌ、２０ＥＵ／ｍｌ、５０ＥＵ／ｍｌ、１００ＥＵ／ｍｌとなるように０．０５ｍｌ添加した。
【００７４】
次いで、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）でよく洗浄した、管径に合うブチルゴム製の栓体を上記採血管の開口部に、開口部を密栓しないように、軽く載せた後、減圧にできる容器内に置き、上記容器を減圧にしてゆき、上記容器を５７０ｍｍＨｇに減圧したところで、該採血管の開口部を密栓した。
【００７５】
（２）採血管（反応器）のエンドトキシン含量の測定
注射針のついた注射器に、エンドトキシンフリー水（大塚製薬社製）を採取し、その注射針を上記（１）で得られたヘパリンだけを含有した減圧採血管４本のブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内にエンドトキシンフリー水（大塚製薬製）を０．９ｍｌ採取し、１時間、３７℃で攪拌し、エンドトキシンを抽出した。次に、この抽出液中のエンドトキシン含量を生化学工業社製、エンドスペシーＥＳ６を用いて、合成発色基質法で測定した。その結果、試験した採血管４本共に、抽出液中のエンドトキシン含量は０．５ＥＵ／ｍｌ以下であった。
【００７６】
（３）ＩＬ−１β誘導能の測定方法
健常人ボランティアから、注射針のついた注射器にヘパリン採血し、その注射針を上記（１）で得られた、種々の濃度のエンドトキシンを添加した減圧採血管１６本のブチルゴム製の栓体部分に突き刺し、採血管内に、検体血液０．９ｍｌを採取した。次いで、予め３７℃に保温しておいた恒温器中の転倒混和用ロッカープラットフォームに血液を採取した各々の採血管をとりつけ、４時間、転倒混和した。混和後、各々の反応器を２５００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離して、上澄みの血漿を採取した。採取した血漿中のＩＬ−１β量（ｐｇ／ｍｌ）を、抗ＩＬ−１βモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定キットである、Genzyme 社製、商品名「PREDICTA Human  IL-1β ELIZA KIT」にて測定した。尚、この測定方法の検出限界濃度は１５ｐｇ／ｍｌであった。
【００７７】
この測定結果を図１に示した。図１における横軸のＬＰＳ濃度の単位ＥＵ／ｍｌは、血液と接触したときの全溶液中のエンドトキシン濃度を示し、縦軸の誘導量（ｐｇ／ｍｌ）は、血漿中のＩＬ−１βの濃度についての各２本の採血管で得られた値の平均値を示す。この結果から明らかなように、エンドトキシン濃度が０．５ＥＵ／ｍｌを超えると、ＩＬ−１βの産生誘導が起こることが明らかである。なお、エンドトキシン濃度が０ＥＵ／ｍｌの場合の測定結果は、図１に示していないが、この場合のＩＬ−１β産生量は検出限界濃度以下であった。
【００７８】
【発明の効果】
本発明のアレルギー検査容器の構成は、上記の通りであり、この検査容器では、従来のように、採血した血液と抗原を混合し、マイクロプレートのウェルに分注し、ヒスタミンを遊離させる煩雑な操作は必要でないので操作が簡単であると共に、試験者は、肝炎、エイズなどの種々の感染症に感染する危険性がほとんどない。また、この検査容器では、生理活性物質の測定値に影響を与えないように、使用前の該容器中のエンドトキシン量が制限されており、また、血液試料中に種々の雑菌や埃などの混入の恐れがなく、採血した血液は、不必要な刺激を受けず、よりｉｎ  ｖｉｖｏに近い状態で、アレルゲンと反応をさせることができるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアレルゲンと血液細胞（例えば、好塩基球）との反応に近い状態を実現でき、その反応性を反映する生理活性物質（例えば、ヒスタミン）量を再現性良く、定量できる利点がある。これらのため、この検査容器を用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がなく、精度良くアレルギー検査ができる。
【００７９】
本発明のアレルギー検査容器において、使用前の該容器中のエンドトキシン量が、検査しようとする液量に等しい量のエンドトキシンフリー水を採取して抽出を行ったときの、該抽出液中の濃度として０．５ＥＵ／ｍｌ以下とされているので、この検査容器を用いると、上記の効果の全てを奏すると共に、特に精度良くアレルギー検査ができる。
【００８０】
本発明のアレルギー検査方法の構成は、上記の通りであり、この方法を用いると、従来のように、採血した血液と抗原を混合し、マイクロプレートのウェルに分注し、ヒスタミンを遊離させる煩雑な操作は必要でないので操作が簡単であると共に、試験者は、肝炎、エイズなどの種々の感染症に感染する危険性がほとんどない。また、この検査方法によると、採血した血液は、不必要な刺激を受けず、よりｉｎ  ｖｉｖｏに近い状態で、アレルゲンと反応をさせることができるため、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアレルゲンと血液細胞（例えば、好塩基球）との反応に近い状態を実現でき、その反応性を反映する生理活性物質（例えば、ヒスタミン）量を再現性良く、定量できる利点がある。これらのため、この検査方法を用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がなく、精度良くアレルギー検査ができる。
【００８１】
本発明のアレルギー検査キットの構成は、上記の通り、請求項１記載の検査容器と、アレルゲンと血液細胞との反応によって血液細胞から産生される生理活性物質量を定量可能な試薬とからなるので、この検査キットを用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がなく、精度良くアレルギー検査ができる。
【００８２】
上記のアレルギー検査キットにおいて、生理活性物質がヒスタミンである場合には、この検査キットを用いると、従来よりも、操作が簡単で危険性がなく、より一層精度良くアレルギー検査ができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例の測定結果を示すグラフであり、横軸はＬＰＳ濃度、縦軸はＩＬ−１βの誘導量を示す。
【図１】
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