(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）分離した部位を含む表面を有する基体と、ｂ）少なくとも第１および第２サブ集団を含む微小球の集団とを含み、各サブ集団が、ｉ）生物活性剤とｉｉ）デコーダー結合リガンドと結合して該生物活性剤の同定を解明できる同定物結合リガンドとを含み、該微小球が該表面に分布しているアレイ構成物。
【請求項２】
さらに、少なくとも１つのデコーダー結合リガンドを含む請求項１記載の構成物。
【請求項３】
生物活性剤が核酸である請求項１記載の構成物。
【請求項４】
生物活性剤がタンパク質である請求項１記載の構成物。
【請求項５】
ａ）基体上に個々の部位を含む表面を形成し、ｂ）該表面上に微小球を、個々の部位が微小球を含むように分布させることを含み、該微小球が少なくとも第１および第２のサブ集団を含み、各サブ集団が、ｉ）生物活性剤とｉｉ）少なくとも１つのデコーダー結合リガンドと結合して生物活性剤の同定を解明できるようにする同定物結合リガンドとを含むことを特徴とする構成物の作成方法。
【請求項６】
ａ）ｉ）分離した部位を含む表面を有する基体と、ｉｉ）少なくとも第１および第２のサブ集団を含む微小球の集団とを含み、各サブ集団が生物活性剤を含み、該微小球が該表面に分布しているアレイ構成物を用意し、ｂ）該アレイ構成物に複数のデコーダー結合リガンドを添加して少なくとも複数の生物活性剤の位置を同定することを特徴とするアレイ構成物のデコード方法。
【請求項７】
微小球の少なくとも１つのサブ集団が、デコーダー結合リガンドと結合できる同定物結合リガンドを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
デコーダー結合リガンドが該生物活性剤と結合する請求項６記載の方法。
【請求項９】
デコーダー結合リガンドがラベルされている請求項６記載の方法。
【請求項１０】
各サブ集団の位置を決定する請求項６記載の方法。
【請求項１１】
ａ）ｉ）分離した部位を含む表面を有する基体と、ｉｉ）少なくとも第１および第２のサブ集団を含む微小球の集団とを含み、各サブ集団が１）生物活性剤と、２）デコーダー結合リガンドと結合して生物活性剤の同定を解明できる同定物結合リガンドとを含み、該分離した部位に微小球が含まれるように該表面に微小球が分布している構成物と、試料とを接触させ、ｂ）標的アナライトの存在または不存在を決定することを特徴とする試料中の標的アナライトの存在決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９８年１１月１０日に出願された米国特許第０９／１８９，５４３号および１９９８年６月２４日に出願された第６０／０９０，４７３号の継続出願である。
（技術分野）
本発明は、微小球（microsphere）アレイセンサーをデコードするための組成物および方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
流体および気体中の特異的物質の存在および／または濃度の検出のためのいくつかのアッセイおよびセンサーがある。これらの多くは、検出メカニズムとして特異的リガンド／アンチリガンド反応に依存する。すなわち、一対の物質（すなわち、結合対またはリガンド／アンチリガンド）は、互いに結合するが、他の物質に対してわずかに結合するか、または全く結合しないことが知られている。このことは、これらの結合対を複合体の検出に利用するいくつかの技術の焦点であった。これらは、一般に、例えば、放射性同位元素、蛍光および他の光学上活性な分子、酵素などを用いて検出可能な全複合体を製造するために、複合体の１の成分をある方法で標識することによって行われる。
【０００３】
これらのセンサーにおいて、ルミネセンスを利用する検出メカニズムが特に使用される。近年、化学分析測定のための光吸収色素と組み合わせた光ファイバーおよび光ファイバーストランドの使用が、特に過去１０年の間に迅速に発展した。このような目的の光ファイバーおよび技術の使用は、Milanovichら、"Novel Optical Fiber Techniques For Medical Application", Proceedings of the SPIE 28th Annual International Technical Symposium On Optics and Electro-Optics, Volume 494, 1980; Seitz, W.R., "Chemical Sensors Based On Immobilized Indicators and Fiber Optics" in C.R.C. Critical Reviews In Analytical Chemistry, Vol. 19, 1988, pp. 135-173; Wolfbeis, O.S., "Fiber Optical Fluorosensors In Analytical Chemistry" in Molecular Luminescence Spectroscopy, Methods and Applications (S.G. Schulman編）, Wiley & Sons, New York (1988); Angel, S.M., Spectroscopy 2 (4): 38 (1987); Waltら、"Chemica Sensors and Microinstrumentation", ACS Symposium Series, Vol. 403, 1989, p. 252およびWolfbeis, O.S., Fiber Optic Chemical Sensors, Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2nd Volumeによって記載されている。
【０００４】
光ファイバーをイン・ビトロ／イン・ビボセンサーにおいて使用する場合、１またはそれ以上の光吸収色素をその遠位末端近くに置く。典型的には、適当な光源由来の光を用いて、ファイバーの近位末端を通じて色素を照らす。光は、光ファイバーの長さに沿って伝搬し、この伝搬した光の一部は遠位末端を出て、色素によって吸収される。光吸収色素は、固定されていてもよく、またはされていなくてもよく；光ファイバー自体に直接接着してもよく、またはしなくてもよく；１以上の目的の被検体を含有する流体試料中に懸濁されていてもよく、またはされていなくてもよく；第２の光学的測定における二次使用のために保持可能であってもよく、保持可能でなくてもよい。
【０００５】
いったん光が色素に吸収されると、波長および強度の異なるいくつかの光が再発光し、同一ファイバーまたは収集ファイバーのいずれかによって、観察および測定する検出システムに伝えられる。光ファイバーによって伝えられた光と光吸収色素の特性との間の相互作用は、定性および定量測定のための光学的基礎を提供する。
【０００６】
種々の分析目的のためのファイバーストランドおよび光ファイバーの束と共に従来より使用される光吸収色素の多くの異なるクラスのうち、吸収後に光を放射する「発蛍光団（fluorophore）」と呼ばれる組成物および光を吸収し、光としてそれを放射するよりもむしろ、吸収した光を内的に熱に変換する「発色団（chromophore）」と呼ばれる組成物がより一般的である。
【０００７】
蛍光は、特定の波長で光（光子）を吸収し、次いで、より長波長の光をより低エネルギーで放射するいくつかの分子の能力に基づく物理現象である。蛍光を発することのできる物質は、いくつかの共通の特徴：１の波長λabで光エネルギーを吸収し；励起状態のエネルギー状態に達し；次いで、別の光波長λemで光を放射する能力を有する。吸収および蛍光発光スペクトルは、各発蛍光団に特有であり、しばしば、わずかに重複する２つの別々の曲線として線図で表される。同じ蛍光発光スペクトルは、一般に、励起光の波長に関係なく観察され、したがって、励起光の波長およびエネルギーは適度に変化させてもよいが；発蛍光団によって放射される光は常に、同じ発光スペクトルを提供するであろう。最後に、蛍光シグナルの強度は、放射された光の収量として測定してもよい。蛍光収量は、最初に発蛍光団によって吸収された光子数と比較した放射された光子数の比率である。これらの各特徴のより詳細な情報のために、下記の参考文献を推薦する。Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, 1983; Freifelder, D., Physical Biochemistry, 第２版, W.H. Freeman and Company, New York, 1982, "Molecular Luminescence Spectroscopy Methods and Applications; PartI" (S. G. Schulman編) in Chemical Analysis, vol. 77, Wiely & Sons, Inc., 1985, The Theory of Luminescence, StepanovおよびGribkovskii, lliffe Books, Ltd., London, 1968。
【０００８】
対照的に、光を吸収し、蛍光を発しない物質は、通常、光を熱または運動エネルギーに変換する。吸収した光を内的に変換する能力は、「発色団」として色素を同定する。発色団のような光エネルギーを吸収する色素は、エネルギーの個々の波長でそのように行い、その波長で特有のモル吸収係数によって特徴付けられる。ファイバー光ストランドおよび吸収係数と組み合わせた可視光および紫外線波長を用いる吸収分光法を用いる化学分析は、スペクトル測定によって目的の特異的分析のための濃度の決定を可能にする。光ファイバーを介した吸光度測定の最も一般的な使用は、ベールの法則にしたがって計算される濃度を決定することである；したがって、単一の吸光度波長で、所定の波長で光エネルギーを吸収する組成物の量が多ければ多いほど、試料に対する光学濃度がより大きくなる。このように、直接吸収された光の総量は、試料中の組成物の量に相関する。
【０００９】
定性および定量分析測定において光ファイバーセンサーを使用する近年の発展の多くは、光ファイバーの遠位末端に種々の光吸収色素を置く、および／または固定することが望ましいことに関係する。このように、種々の異なる光ファイバー化学センサーおよび方法が、特異的分析測定および応用、例えば、ｐＨ測定、酸素検出および二酸化炭素分析について報告されてきた。これらの発展は、下記の出版物によって例示される。Freemanら、Anal. Chem. 53:98 (1983); Lippitschら、Anal. Chem. Acta. 205:1, (1988); Wolfbeisら、Anal. Chem. 60:2028 (1988); Jordanら、Anal. Chem. 59: 437 (1987); Lubbersら、Sens. Actuators 1983; Munkholmら、Talanta 35:109 (1988); Munkholmら、Anal. Chem. 58:1427 (1986); Seitz, W.R., Anal. Chem. 56:16A-34A (1984); Petersonら、Anal. Chem. 52: 864 (1980); Saariら、Anal. Chem. 54:821 (1982); Saariら、Anal. Chem. 55: 667 (1983); Zhujunら、Anal. Chem. Acta. 160:47 (1984); Schwabら、Anal. Chem. 56: 2199 (1984); Wolfbeis, O.S., "Fiber Optic Chemical Sensors", Ed. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991, 2nd Volume;およびPantano, P., Walt, D.R., Anal. Chem. 481A-487A, Vol. 67, (1995)。
【００１０】
より近年には、単一の別個のファイバー光束と共に複数の色素の使用を可能にするファイバー光センサーが構築された。Waltらの米国特許第５，２４４，６３６号および第５，２５０，２６４号は、複数の異なる色素を束の遠位末端に付着するシステムを開示する（これらの各特許の教示は、出典明示により本明細書の一部とされる）。開示された形態は、束の分離した光ファイバーが光学上、個々の色素に接近できるようにする。これは、２個以上の色素由来のシグナルが結合する場合に生じる各色素からの再発光において分離したシグナルを解読するという問題を回避し、色素の発光スペクトルにおいて有意な重複が存在する。
【００１１】
米国特許第０８／８１８，１９９号および０９／１５１，８７７号は、微小球またはビーズを基質の表面で、例えば、ファイバー光束の末端上で（個々の各ファイバーは光学的サインを含有するビーズを含む）利用するアレイ構成物を記載する。ビーズはランダムに落ちるので、アレイを「デコード」するためには、独特の光学的サインが必要である。すなわち、アレイを作成後、アレイ上の個々の部位の配置と特定部位におけるビーズまたは生物活性物質との相関を生じることができる。これは、ビーズがアレイ上にランダムに分布しうることを意味し、先行技術のｉｎ ｓｉｔｕ合成またはスポッティング技術のいずれかと比べて高速の費用のかからないプロセスであることを意味する。下記により詳しく概説するように、いったんアレイにビーズを負荷すれば、試験後に生じる完全または部分的デコーディングを用いて、アレイをデコードすることができ、または使用することができる。
【００１２】
以前のシステムに伴う１の欠点は、一連の独特の光学的サインを必要とすることである。大量のこのようなサインは、例えば、異なる比率の異なる色素の使用によって入手できるが、一連の光学的サインの使用に依存しないデコーディングシステムの方が望ましい。したがって、本発明の目的は、独特の光学的サインにのみ依存せずにビーズアレイのデコーディングを可能にする方法を提供することにある。
【００１３】
（発明の開示）
上記の目的によると、本発明は、分離した（discrete）部位を含む表面を有する基体を含むアレイ構成物を提供する。該構成物は、さらに、少なくとも第１および第２サブ集団（各サブ集団は生物活性物質を含む）；および生物活性物質の同一性を解明できるように、デコーダー（decoder）結合リガンドを結合する同定物（identifier）結合リガンドを含む微小球の集団を含む。微小球は、表面に分布される。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、分離した部位を含む表面を有する基体、および少なくとも第１および第２サブ集団を含む微小球の集団を含むアレイ構成物を提供する。各サブ集団は、生物活性物質を含み、光学的サインを含まない。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、上記のようなアレイ構成物を製造する方法を提供する。該方法は、基体上に個々の部位を含む表面を形成し、個々の部位が微小球を含有するように、微小球を該表面上に分布させることを特徴とする。該微小球は、少なくとも第１および第２サブ集団（各サブ集団は生物活性物質を含む）を含み、光学的サインを含まない。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、基体上に個々の部位を含む表面を形成し、個々の部位が微小球を含有するように表面上に微小球を分布させることを特徴とする構成物を製造する方法を提供する。微小球は、少なくとも第１および第２サブ集団（各サブ集団は生物活性物質を含む）および生物活性物質の同定を解明できるように、デコーダー結合リガンドを結合する同定物結合リガンドを含む。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、上記のようにアレイ構成物を提供し、アレイ構成物に複数のデコーディング結合リガンドを添加して、少なくとも複数の生物活性物質の位置を同定することを特徴とするアレイ構成物をデコードする方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、試料中の標的被検体の存在を決定する方法を提供する。該方法は、試料を本明細書に概説するようなアレイ構成物と接触させ、標的被検体の存在または不在を決定することを特徴とする。
【００１９】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、一般に、異なる化学的機能性を担持する、微小球（microsphere）とも称されるビーズを、個々の微小球と結合できる分離した（discrete）部位のパターン化した表面を含む基体上に分布させるビーズに基づく分析化学システムを含む従来の研究に基づいている。ビーズは、一般に、基体上にランダムに置かれているので、従来の研究は、いずれもの個々のビーズの化学的機能性の同定に使用できる固有の光学的サイン、一般には蛍光染料との組み合わせに依存していた。これは、候補薬剤（すなわち、核酸のような化合物および抗体）を、それらのアレイ上の配置とはかけ離して合成することを可能とする、すなわち、候補薬剤をビーズ上で合成でき、ついで、ビーズをパターン化した表面にランダムに分布させることができる。ビーズは、まず、光学的サインでコードされ、このことは、アレイが後にデコード（decode）できることを意味する。すなわち、アレイを作成後、特定の部位におけるアレイ上の個々の部位の位置と、ビーズまたは候補薬剤とを相関させることができる。このことは、従来のin situ合成やスポッティング技術と比べて迅速かつ安価に、ビーズをアレイ上でランダムに分布させることができることを意味する。
【００２０】
しかしながら、これらの方法の欠点は、大きなアレイについて、システムが大量の異なる光学的サインを必要とし、これは利用するのが困難であり、時間がかかることとなる。したがって、本発明は、これらの方法の幾つかの改良を提供するもので、一般に、アレイのコードおよびデコードの方法に向けられている。すなわち、当業者に明らかなごとく、生物活性剤（bioactive agent）の配置は一般にランダムであり、かくして、アレイの各位置における生物活性剤を同定するためにコード／デコード・システムが必要とされる。これは、以下に、さらに詳細に説明する種々の方法で行なうことができ、ａ）ビーズと結合した該生物活性剤または同定物（identifier）結合リガンド（ＩＢＬｓ）と結合する、一般には直接ラベルされた、デコーダー（decoder or decoding）結合リガンド（ＤＢＬｓ）の使用；ｂ）例えば、以下に詳細に説明するごとく、ビーズの配置を標的とするか（例、光活性化または光分解性部分を使用してビーズを個々の位置に選択的に付加できるようにする）か、部位のサブバンドル（sub-bundle）または選択的負荷の使用による位置デコーディング（decoding）；ｃ）標的と結合するビーズだけをデコードする選択的デコーディング；またはｄ）これらのいずれかの組み合わせで、場合により、以下に詳細に説明するように、このデコーディングは全てのビーズまたは個々の標的アナライト（analyte）と結合したビーズにのみ起こさせることができるデコーディングが包含される。同様に、これは標的アナライトの添加前または後に起こさせることができる。
【００２１】
生物活性剤の同定およびそのアレイ中の位置が定まったら、アレイを標的アナライトを含む試料に曝す。以下に説明するが、これは分析前でも分析中でも行なうことができる。標的アナライトは、以下に詳細に説明するように、生物活性剤と結合し、個々のビーズの光学的シグナルの変化をもたらす。
本発明においては、「デコーディング」は、光学的サインの使用に依存せず、デコーディング工程の間に加えるデコーダー結合リガンドの使用に依存する。デコーダー結合リガンドはビーズ上に位置する特有の同定物結合リガンドか、例えば、ビーズが一本鎖核酸を生物活性剤として含む場合、生物活性剤自体と結合する。デコーダー結合リガンドは、直接または間接的にラベルされ、このラベルの存在を検出することによりデコーディングが起こる。デコーダー結合リガンドのプールを連続して使用することにより、デコーディング工程の数を非常に少なくすることが可能である。
【００２２】
したがって、本発明は、個々の部位を含む表面を有する少なくとも第１の基体を含むアレイ構造物（composition）を提供するものである。本明細書における「アレイ」は、配列フォーマットの複数の候補薬剤を意味し、アレイのサイズは構造物およびアレイの最終使用目的に依存する。アレイは、約２つの異なる生物活性剤（すなわち、異なるビーズ）から数百万まで含むことができ、非常に大きなファイバーオプティック・アレイも可能である。一般に、アレイは、ビーズおよび基体のサイズ、アレイの最終使用目的に応じて、２から１０億以上を含むことができ、すなわち、非常な高密度、高密度、中密度、低密度、非常な低密度のアレイとすることができる。非常な高密度のアレイの好ましい範囲は、約１０,０００,０００〜約２,０００,０００,０００（全ての数字はｃｍ2当り）で、好ましくは約１００,０００,０００〜約１,０００,０００,０００である。高密度アレイの範囲は、約１００,０００〜約１０,０００,０００で、特に好ましくは約１,０００,０００〜約５,０００,０００である。中密度アレイの範囲は、約１０,０００〜約１００,０００で、特に好ましくは約２０,０００〜約５０,０００である。低密度アレイは、一般に、１０,０００より少なく、約１,０００〜約５,０００が好ましい。非常な低密度アレイは約１,０００より少なく、約１０〜約１,０００が好ましく、約１００〜約５００が特に好ましい。ある具体例においては、本発明の構造物はアレイフォーマットでなくてもよく、すなわち、ある具体例については、単一の生物活性剤を含む構造物も同様に作成してよい。加えて、いくつかのアレイでは、異なるまたは同一構造物の複数の基体を使用してもよい。かくして、例えば、大きなアレイは複数のより小さい基体を含むことができる。
【００２３】
また、本発明の構造物の１つの利点は、特に、ファイバーオプティック技術を介して、極端な高密度アレイを作成できることである。例えば、２００μｍ以下のビーズ（２００ｎｍのビーズも可能である）を使用でき、非常に小さなファイバーも公知であり、０．５ｃｍ2当り個々のビーズまたはファイバー１５,０００,０００以上の密度（場合により２５〜５０×１０6も）で、１ｍｍ2のファイバーオプティク・バンドル中２５０,０００以上（場合によっては百万）もの多数の異なるファイバーおよびビーズを得ることも可能である。
【００２４】
本明細書で使用する「基体」または「固体支持体」または他の文法的均等物は、ビーズの結合または会合に適した分離した個々の部位を含むように修飾でき、、少なくとも１つの検出法に敏感に反応するいずれかの物質を意味する。当業者に明らかなごとく、可能な基体の数は非常に多い。可能な基体には、限定するものではないが、ガラス、修飾または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の物質との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン等を包含する）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはシリコンおよび修飾シリコンを包含するシリカベース物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、オプティカルファイバー・バンドルおよび種々の他のポリマーが包含される。一般に、基体は光学的検出を可能にし、それ自体は認められるほどに蛍光を発しない。
一般に、基体は平ら（平面）であるが、当業者に明らかなごとく、基体の他の配置も同様に使用でき、例えば、試料のビーズへの接近を可能とし、検出に共焦点（cofocal）顕微鏡を使用できるプラスチックの多孔質ブロックにビーズを埋め込むことにより、三次元配置も使用できる。同様に、ビーズをフロー‐スルー（flow-through）試料分析用のチューブの内表面に位置させて試料容量を最少にすることもできる。好ましい基体には、以下に説明するオプティカルファイバー・バンドルや、ガラス、ポリスチレンと他のプラスチックおよびアクリルのような平面が包含される。
【００２５】
好ましい具体例において、基体は、米国特許出願０８／９４４,８５０号および０８／５１９,０６２号ならびにＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０２５およびＰＣＴ／ＵＳ９８／０９１６３に一般的に記載されているような、オプティカルファイバー・バンドルまたはアレイであり、これらを出展明示で本明細書に組み入れる。好ましい具体例は、予め成形された一元のファイバーオプティック・アレイを利用する。本明細書で使用する「予め成形された一元のファイバーオプティック・アレイ」は、長さ方向に沿って、共軸的に配置され、一体となったファイバーオプティック・バンドルを意味する。ファイバーストランドは、一般的に個々にクラッディングされている。しかし、他のファイバーオプティック・フォーマットと予め成形された一元のアレイとを区別する１つのことは、ファイバーが個々に物理的に操作できないこと、すなわち、一般に、１つのストランドが、長さ方向に沿ったいずれの点でも物理的に他のフェアバーストランドから分離できないことである。
【００２６】
基体の少なくとも１つの表面を修飾して、後の微小球との会合のための分離した個々の部位を含ませる。これらの部位は、物理的に変化した部位、すなわち、ビーズを保持して微小球をその中で支えることができる基体におけるウエルまたは小さなくぼみ、または、他の力（磁力または圧縮）の使用、または、化学的に機能化された部位のような化学的に変化したもしくは活性化された部位、静電気的に変化された部位、親水性／疎水性的に機能化された部位、接着剤のスポット等を含むことができる。
部位はパターン化、すなわち、一定のデザインまたは配置とすることができ、またはランダムに分布させてもよい。好ましい具体例では、Ｘ−Ｙ座標平面でアドレス指定できるように部位の一定のパターンを用いる。この意味での「パターン」には、好ましくは基体上のビーズに高密度を可能とするユニットセルの繰返しが包含される。しかし、これらの部位は、分離した部位でなくてもよいことに注意すべきである。すなわち、例えば、いずれかの位置でビーズの会合を可能にする接着剤または化学的機能性の均一な表面を使用することも可能である。かくして、基体の表面を修飾して、個々の部位が他の部位と連続していても、不連続であっても、微小球の個々の部位への会合を可能とさせる。例えば、基体の表面を、単一の会合したビーズを有するように分離した部位を修飾するか、別法として、基体の表面を修飾し、ビーズがどこかに沈み、最後に分離した部分に入らせることもできる。
【００２７】
好ましい具体例において、基体の表面を修飾してウエル、すなわち、基体表面のくぼみを含ませる。これは、限定するものではないが、フォトリトグラフィー、スタンプ技術、成型技術およびマイクロエッチング技術を包含する種々の技術を用いて、当業者に一般的に知られている方法で行なうことができる。当業者に明らかなごとく、用いる技術は構成物および基体の形状に依存する。
好ましい具体例において、物理的変化を基体の表面に作成し、部位を生じさせる。好ましい具体例において、基体はファイバーオプティカル・バンドルであり、基体の表面は、米国特許出願０８／８１８,１９９号および０９／１５１,８７７号に一般的に記載されるファイバー・バンドルの一末端である。これらを出展明示で本明細書に組み入れる。この具体例において、ウエルは、個々のファイバーを含むファイバーオプティカル・バンドルの末端または遠位端中に作成される。この具体例において、個々のファイバーの芯をクラッディングに関してエッチングされ、ファイバーの一端に小さなウエルまたはくぼみが形成される。ウエルの必要な深さはウエルに加えるビーズのサイズに依存する。
【００２８】
一般に、この具体例において、該ウェルは以下に概説するように化学的に機能するが、微小球はウェルに共有結合しておらず、ビーズ上に架橋剤を用いることができ、あるいは物理的バリアー、すなわち、フィルムまたは膜を用いることもできる。
好ましい具体例においては、本発明の微小球を基体上の別個の部位または位置に共有または非共有のいずれかで結合させるのに用いることのできる、化学的に修飾された部位を含有するように基体の表面を修飾する。本明細書中の「化学的に修飾された部位」とは、さらに対応する反応性官能基を含有するのが一般である微小球を共有結合させるのに用いることのできる、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基およびチオール基を含む、一の型の官能基の付加；微小球を結合させるのに用いることのできる一の型の粘着物の付加（粘着物を付加するための従来の官能基導入によるか、または吸着物の直接的付加のいずれかによる）；微小球がその部位と反対の荷電基を有する場合に、微小球を静電気的結合させるための一の型の荷電基の付加（官能基導入と類似）；適当な実験条件下、疎水性または親水性微小球の付加がヒドロアフィニティーに基づいて微小球の該部位への結合をもたらすように、該部位を特異に疎水性または親水性とする一の型の官能基の付加を包含するが、これらに限定されるものではない。例えば、水性系にて、疎水性部位を疎水性ビーズと使用すると、そのビーズは優勢的に該部位に結合する。上記したように、「型」は、この意味において、ビーズを別個の部位に結合させるためにその表面を均一に処理するのに用いること、ならびにその表面を処理して別個の部位を得ることを包含する。当業者に自明であるように、これは種々の方法で行うことができる。
【００２９】
本発明の組成物はさらに一集団の微小球を含む。本明細書中の「集団」とは、アレイについて上記したように、複数のビーズを意味する。集団内には、一個の微小球または複数の同じ微小球とすることのできる別々のサブ集団がある。すなわち、ある具体例においては、以下にさらに詳細に記載するように、アレイは各生物活性物質用に一個のビーズを含有するだけであってもよい；好ましい具体例は各タイプの複数のビーズを利用する。
本明細書中の「微小球」または「ビーズ」または「粒子」あるいは文法的に均等な物は、小さな別個の粒子を意味する。ビーズの組成物は、生物活性物質の種類および合成方法に応じて変化するであろう。適当なビーズ組成物は、ペプチド、核酸および有機物の合成に用いられる組成物、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性物質、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、セファロース、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびテフロンを含むが、これらに限定されるものではなく、このすべてを用いることができる。Bangs Laboratories、Fishers INの「ミクロスフェア・ディテクション・ガイド（Microspere Detection Guide）」が有用なガイドブックである。
【００３０】
ビーズは球状である必要はなく；不規則な粒子を用いることもできる。加えて、生物活性物質の付着またはＩＢＬの付着に利用できるビーズの表面積を増加させるのに、ビーズは多孔質であってもよい。ビーズの大きさは、ナノメーター、すなわち１００ｎｍから、ミリメーター、すなわち１ｍｍの範囲にあり、約０．２ミクロンないし約２００ミクロンのビーズが好ましく、約０．５ないし約５ミクロンのビーズが特に好ましいが、ある場合には、さらに小さなビーズを用いることもできる。
本発明で重要なことは、検定の過程でビーズが動かないように、ビーズを基体の表面にある別個の部位に結合または付着させることのできる基体／ビーズのペアリングを使用することである。
【００３１】
当業者に明らかであるように、微小球は、各々、生物活性物質を含み、その合成方法に応じて、生物活性物質を含まない微小球が存在してもよい。本明細書中の「候補生物活性物質」または「生物活性物質」または「官能基物質」または「結合リガンド」は、本明細書で用いる場合、本発明の微小球に付着することのできる、いずれの分子、例えば、蛋白、オリゴペプチド、小型有機分子、配位錯体、多糖類、ポリヌクレオチドなどを意味する。本発明の組成物には２通りの主たる用途があることが理解されよう。好ましい具体例において、以下にさらに詳細に記載するように、特定の標的解析物質の存在；例えば、特定のヌクレオチド配列または特定の蛋白、例えば、酵素、抗体もしくは抗原の有無を検出するのに当該組成物が用いられる。別の好ましい具体例において、当該組成物を用い、生物活性物質、すなわち、薬物候補物質を特定の標的解析物質への結合についてスクリーニングすることができる。
【００３２】
生物活性物質は、典型的には有機分子であり、好ましくは分子量が１００ダルトンより大きく、約２５００ダルトンよりも小さい、小型有機化合物であるが、多くの化学種を包含する。生物活性物質は、蛋白との構造的相互作用、特に水素結合に不可欠な官能基を有しており、典型的には少なくとも１個のアミノ、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の官能基を含む。生物活性物質は、上記した１またはそれ以上の官能基で置換された、環状炭素構造または複素環構造および／または芳香族またはポリ芳香族構造を含む場合が多い。生物活性物質はまた、ペプチド、核酸、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログまたは組合せを含む生物分子中にも見られる。核酸および蛋白が特に好ましい。
生物活性物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、多種の供給源から手に入れることができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、多種の有機化合物と生物分子のランダム合成および定方向性合成に多くの手段を利用することができる。別法として、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーも利用可能であり、あるいは容易に生成される。加えて、天然または合成生成されたライブラリーおよび化合物は、慣用的な化学、物理および生化学手段を介して容易に修飾される。既知の薬理学的物質を、アシル化、アルキル化、エステル化および／またはアミド化などの定方向性またはランダムな化学的修飾に付し、構造的アナログを生成してもよい。
【００３３】
好ましい具体例においては、生物活性物質は蛋白である。本明細書の「蛋白」とは、少なくとも２個のアミノ酸が共有結合したものを意味し、蛋白類、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを包含する。蛋白は天然に存在するアミノ酸とペプチド結合とから、あるいは合成ペプチド疑似構造からできていてもよい。このように、本明細書で用いる場合の「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、同種−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸であると考えられる。側鎖は（Ｒ）または（Ｓ）配置のいずれであってもよい。好ましい具体例においては、アミノ酸は（Ｓ）またはＬ−配置である。天然に存在しない側鎖を用いるならば、例えば、インビボ分解を防止または妨げるのに非アミノ酸置換基を用いてもよい。
【００３４】
一の好ましい具体例においては、生物活性物質は天然に存在する蛋白または天然に存在する蛋白のフラグメントである。このように、例えば、蛋白を含有する細胞抽出物または蛋白性細胞抽出物のランダムまたは定方向性消化を用いることができる。この点では、原核生物および真核生物の蛋白のライブラリーを本明細書に記載のシステムにてスクリーニングするために調製することができる。この具体例においては、細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳動物の蛋白が特に好ましく、とりわけ後者が好ましく、ヒト蛋白が最も好ましい。
好ましい具体例において、生物活性物質は、約５ないし約３０個のアミノ酸のペプチドであり、約５ないし約２０個のアミノ酸が好ましく、約７ないし約１５個のアミノ酸が特に好ましい。ペプチドは上記した天然に存在する蛋白の消化物、ランダムペプチドまたは「偏向した」ランダムペプチドであってもよい。本明細書の「ランダム化」または文法的に均等な物は、核酸およびペプチドが、各々、本質的にランダムヌクレオチドおよびアミノ酸からなっていることを意味する。一般に、これらのランダムペプチド（または以下に記載の核酸）は化学的に合成されるため、それらはどのヌクレオチドまたはアミノ酸のどの位置に入ることもできる。合成方法は、ランダム化蛋白または核酸を生成し、配列の長さのすべてまたは大部分で可能な組合わせを形成するように設計し、そうしてランダム化生物活性蛋白性物質のライブラリーを形成することができる。
【００３５】
好ましい具体例においては、生物活性物質のライブラリーを用いる。そのライブラリーは生物活性物質の構造上十分に多様な集団を提供するものであり、標的分析物に対して蓋然的に十分な範囲にて結合する。したがって、反応体ライブラリーはそのメンバーの少なくとも１つが標的分析物に対してアフィニティーを付与する構造を有するように十分に大きくなければならない。反応体ライブラリーの必要とする絶対的な大きさを測ることは困難であるが、免疫応答特性で一の手掛かりが得られる：１０7−１０8種の抗体の多様性は、生物が直面する可能性のある大部分の抗原と相互作用するのに十分にアフィニティーのある少なくとも１つの組合わせを提供する。このように、好ましい具体例においては、少なくとも１０6、好ましくは１０7、より好ましくは１０8種の生物活性物質を本発明の方法にて同時に分析する。好ましい方法はライブラリーの大きさおよび多様性を最大限に活用する。
好ましい態様においては、ライブラリーは十分にランダム化されており、どの場所においても配列の優先性および定常性はない。好ましい具体例においては、ライブラリーを偏向させる。すなわち、配列内のある場所は、定常性を保持するか、または可能性のある限定された数の中から選択される。例えば、好ましい具体例において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は、所定の種類、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、架橋してシステインを創製することに、ＳＨ−３ドメインについてのプロリンに、リン酸化部位についてセリン、トレオニン、チロシンまたはヒスチジン等に、またはプリンに立体的に偏向した（小型または大型）残基内でランダム化する。
【００３６】
好ましい具体例において、生物活性物質は核酸（一般に、本明細書中、「プローブ核酸」または「候補プローブ」と称される）である。本明細書中の「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的に均等な物は、少なくとも２つのヌクレオチドが一緒に共有結合したものを意味する。本発明の核酸はリン酸ジエステル結合を含有するのが一般的であるが、場合によっては、以下に示すように、例えば、ホスホルアミド（Beaucageら、Tetrahedron、49（10）：1925（1993）およびその中の引用文献；Letsinger、J.Org.Chem.、35：3800（1970）；Sprinzlら、Eur.J.Biochem.、81：579（1977）；Letsingerら、Nucl.Acids Res.、14：3487（1986）；Sawaiら、Chem.Lett.、805（1984）；Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.、110：4470（1988）；およびPauwelsら、Chemica Scripra、26：141（1986））、ホスホロチオエート（Magら、Nucleic Acids Res.、19：1437（1991）；および米国特許第５６４４０４８号）、ホスホロジチオエート（Briuら、J.Am.Chem.Soc.、111：2321（1989））、ｏ−メチルホスホルアミド連結（Eckstein、オリゴヌクレオチドおよびアナログ：A Practical Approach、Oxford University Pressを参照のこと）およびペプチド核酸骨格および連結（Egholm、J.Am.Chem.Soc.、114：1895（1992）；Meierら、Chem.Int.Ed.Engl.、31：1008（1992）；Nielsen、Nature、365：566（1993）；Carissonら、Nature、380：207（1996）、そのすべてを出典明示により本明細書の一部とする）を含む、別の骨格を有していもよい核酸類似体が含まれる。他の類似する核酸は正の骨格（Denpcyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92：6097（1995））；非イオン性骨格（米国特許第５３８６０２３号；第５６３７６８４号；第５６０２２４０号；第５２１６１４１号；および第４４６９８６３号；Kiedrowskiら、Angew,Chem.Intl.Ed.English、30：423（1991）；Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.、110：4470（1988）；Letsingerら、Nucleosides＆Nucleotides、13：1597（1994）；第２章および第３章、ＡＳＣシンポジウム・シリーズ５８０、「アンチセンスリサーチにおける炭水化物修飾」、Y.S.SanghuiおよびP.Dan.Cook編；Mesmaekerら、Bioorganic＆Medicinal Chem.Lett.、4：395（1994）；Jeffsら、J.Biomolecular NMR、34：17（1994）；Tetrahedron Lett.、37：743（1996））および米国特許第５２３５０３３号および第５０３４５０６号ならびに第６章および第７章、ＡＳＣシンポジウム・シリーズ５８０、「アンチセンスリサーチにおける炭水化物修飾」、Y.S.SanghuiおよびP.Dan.Cook編に記載の非リボース骨格を有する核酸を包含する。１またはそれ以上の炭素環状糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（Jenkinsら、Chem.Soc.Rev.、（1995）169−176頁を参照のこと）。数種の核酸類似体が、Rawls,C.＆E News、６月２日、１９９７年、３５頁に記載されている。これらの刊行物はすべて出典を明示することにより本明細書の一部とする。リボース−リン酸骨格においてこれらの修飾を行い、標識などの更なる部分の付加を促進し、あるいは生理学的環境中のかかる分子の安定性および半減期を増加させることもできる；例えば、ＰＮＡが特に好ましい。加えて、天然に存在する核酸および類似体の混合物を調製することもできる。また、種々の核酸類似体の混合物、および天然に存在する核酸および類似体の混合物を調製することもできる。核酸は特記されていれば一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、あるいは二本鎖または一本鎖の両方の配列の部分を含有していても��い。核酸はＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡまたはハイブリッドであってもよく；ここで、核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組合わせ、ウラシル、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニンおよび塩基類似体、例えば、ニトロピロールおよびニトロインドール等を含む、塩基のいずれの組合わせを含有していてもよい。
【００３７】
好ましい具体例において、生物活性物質はクローン核酸のライブラリーであり、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。この具体例において、一般的には、慣用的方法（プラスミドまたはファージベクター中での増殖、ＰＣＲを包含する増幅方法等を包含するが、これらに限らない）を用いて個々の核酸が調製される。好ましくは、核酸は、マイクロタイタープレートフォーマット、およびライブラリーを付着させるために添加されるビーズのごとき特定のフォーマットにおいて並べられる。
化学的またはアフィニティー捕捉（例えば、後でそれらを用いて核酸を表面に付着させることができるAminoLinkまたはビオチン化ヌクレオチドのごとき誘導体化ヌクレオチドを含ませること、ならびにハイブリダイゼーションによるアフィニティー捕捉を包含）、架橋、および静電気的付着等を包含する当該分野で理解されている種々の方法（これらの方法に限らない）において、クローンライブラリー（または本明細書で説明するいずれかの核酸）の付着を行うことができる。
好ましい具体例において、アフィニティー捕捉を用いてクローン核酸をビーズに付着させる。例えば、結合ペアーの一方のメンバーでクローン化核酸を誘導体化し、結合ペアーの他方のメンバーでビーズを誘導体化することができる。適当な結合ペアーはＩＢＬ／ＤＢＬペアーに関して本明細書で説明されているものである。例えば、クローン化核酸ををビオチン化してもよい（例えば、ビオチン化ヌクレオチドの酵素による取り込みを用いて、あるいはビオチンの光活性化架橋により）。次いで、当該分野において知られているように、ビオチン化核酸をストレプトアビジン被覆ビーズ上に捕捉することができる。同様に、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体のごとき他のハプテン−受容体の組み合わせを使用することができる。別法として、核酸を表面に付加するために使用する化学基を誘導体化ヌクレオチドの形態に付加することもできる。
好ましい付着は共有結合であるが、核酸分子１個につき複数の付着部位が存在する場合には、比較的弱い相互作用（すなわち、非共有結合）であっても核酸を表面に付着させるに十分でありうる。かくして、例えば、生物活性物質とは逆の電荷を有するビーズを用いることにより、静電気的相互作用を付着に使用することができる。
同様に、ハイブリダイゼーションを用いるアフィニティー捕捉を用いて、クローン化核酸をビーズに付着させることもできる。例えば、当該分野において知られているように、オリゴ−ｄＴビーズへのハイブリダイゼーションによりポリＡ付加ＲＮＡをルーチンに捕捉する。これには、オリゴ−ｄＴ捕捉およびその後の架橋工程（例えば、プソラレン架橋）を用いてもよい。目的の核酸がポリＡ部分を含まない場合には、当該分野で知られているように、ターミナルトランスフェラーゼを用いるポリマー化、あるいはオリゴＡリンカーの連結により付着させることができる。
別法として、例えば、当該分野で知られているように、チミジンを反応性基に対して光活性化架橋することによって化学的架橋を行ってもよい。
【００３８】
一般的には、以下にさらに詳細に説明するように、クローンのアレイを解読するには特別な方法が必要である。
蛋白に関して上で一般的に説明したように、核酸生物活性物質は天然に存在する核酸であってもよい。例えば、蛋白に関して上で説明したように、原核および真核ゲノムの消化物を使用してもよい。
一般的には、標的配列（試料の標的分析物配列または本明細書に記載の他のプローブ配列のいずれか）に対して相補的なものなるように本発明のプローブを設計して、標的と本発明のプローブとのハイブリダイゼーションが起こるようにする。この相補性は完全である必要はない。標的配列と本発明の１本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害するいくつかの数の塩基対ミスマッチが存在するかもしれない。しかしながら、最小のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下においてさえも変異の数が多すぎてハイブリダイゼーションが起こり得ない場合、その配列は相補的でない標的配列である。かくして、本明細書において「実質的に相補的」とは、プローブが標的配列に対して十分に相補的であり、選択された反応条件下においてハイブリダイゼーションすることを意味する。高いストリンジェンシー条件は当該分野において知られており、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989およびShort Protocols in Molecular Biology, ed. Ausbel, et al.参照のこと（いずれも参照により本明細書に一体化させる）。ストリンジェント条件は配列に依存し、異なる状況において異なるであろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイゼーションする。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなるガイドはTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acis assays" (1993)に見出される。一般的には、一定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるようにストリンジェント条件を選択する。Ｔｍは、平衡状態（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍにおいて平衡となっているプローブの５０％が占領されている）において標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイゼーションする温度である（一定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度において）。ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオンよりも低いものであり、典型的には、ｐＨ７．０ないし８．３において約０．０１ないし１．０Ｍのナトリウムイオン濃度であり、短いプローブ（例えば、１０ないし５０ヌクレオチド）の場合には温度は少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドよりも長い）の場合には少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのごとき脱安定化剤の添加によっても達成されうる。もう１つの具体例において、あまりストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件が使用される。例えば、当該分野で知られているような中程度ないし低いストリンジェンシーの条件を用いてもよい。ManiatisおよびAusbelの上記文献およびTijssenの上記文献参照。
本明細書の用語「標的配列」または文法的同義語は、核酸の１本の鎖上にある核酸配列を意味する。標的配列は遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを包含するＲＮＡ、あるいは他のものの一部であってもよい。それはいずれの長さであってもよく、より長い配列がより特異的であることが理解されている。当業者により理解されるように、相補的標的配列は多くの形態であってもよい。例えば、より大きな核酸配列、すなわち、遺伝子またはｍＲＮＡの全体または部分、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの制限フラグメント等の中にそれが含まれていてもよい。後でより十分に説明するが、標的配列にハイブリダイゼーションして試料中の標的配列の存在または不存在を決定するようにプローブが作成される。一般的に言えば、この用語は当業者によって理解されるであろう。
【００３９】
好ましい具体例において、生物活性物質は有機化学的部分であり、種々の有機化学的部分が文献において利用可能である。
好ましい具体例において、各ビーズは単一タイプの生物活性物質を含むが、好ましくは、複数の個々の生物活性物質を各ビーズに付着させる。同様に、好ましい具体例は、ユニークな生物活性物質を含む１種よりも多い微小球を用いるものである、すなわち、微小球の下位集団の使用によって系中に構築された縮重が存在し、下位集団中の各微小球が同じ生物活性物質を含んでいるものである。
当業者によって理解されるように、ビーズ上で生物活性物質を直接合成してもよく、あるいは合成後にビーズに付着させてもよい。好ましい具体例において、リンカーを用いて生物活性物質をビーズに付着させて、良好な付着を可能にし、標的分子との良好な相互作用を可能にする十分な柔軟性を持たせ、望ましくない結合反応を回避するようにする。
好ましい具体例において、ビーズ上で生物活性物質を直接合成する。当該分野で知られているように、ペプチド、有機部分および核酸のごとき多くのクラスの化合物が、ビーズ包含する支持体上で合成されている。
好ましい具体例において、生物活性物質を最初に合成し、次いで、ビーズに共有結合させる。当業者に理解されるように、生物活性物質およびビーズの組成に応じてこれを行う。チオール、アミン、カルボキシル等のごとき化学反応性の基を用いる、ある種のポリマーのごとき固体支持体表面の官能化は当該分野において広く知られている。したがって、使用者による所望の官能基の付着を容易ならしめる表面化学基を有する「ブランク」微小球を用いてもよい。ブランク微小球に関するこれらの表面化学基のいくつかの例は、限定されるものではないが、脂肪族および芳香族アミンを包含するアミノ基、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホナートおよびスルファートを包含する。
一般的には既知の化学的方法を用い、これらの官能基を用いていくつかの種類の異なった候補作用剤をビーズに付加することができる。例えば、炭水化物を含有する候補作用剤をアミノ−機能化支持体に付着させることができる。標準的方法を用いて炭水化物のアルデヒドを作成し、次いで、アルデヒドを表面上のアミノ基と反応させる。別の具体例において、スルフヒドリルリンカーを用いてもよい。ＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチル、およびピリジルジスルフィドのごとき当該分野で知られた多くのスルフヒドリル反応性リンカーがあり（例えば、the 1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200参照（参照により本明細書に一体化させる））、それらを用いてシステイン含有蛋白性作用剤を支持体に付着させることができる。別法として、候補作用剤上のアミノ基を表面上のアミノ基への付着に使用してもよい。例えば、多くの安定な二官能基リンカーが当該分野においてよく知られており、同種二官能基および異種二官能基リンカーが包含される（Pierceのカタログおよびハンドブック１５５〜２００ページ参照）。さらなる具体例において、よく知られたリンカー（Pierceのカタログ参照）を用いてカルボキシル基（表面のもの、または候補作用剤のもののいずれか）を誘導体化してもよい。例えば、カルボジイミドはカルボキシル基を活性化して、アミンのごとき良好な求核剤による攻撃を受けるようにする（Torchillin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275-308 (1991)参照（特に本明細書に一体化させる））。当該分野で知られた他の方法、例えば、抗体をポリマーに付着させるための方法を用いて蛋白性候補作用剤を付着させてもよい。例えば、Slinkin et al., Bioconj. Chem. 2:342-348 (1991); Torchillin et al., 上記文献; Trubetskoy et al., Bioconj. Chem., 3:323-327 (1992); King et al., Cancer Res. 54: 6176-6185 (1994);およびWilbur et al., Bioconjugate Chem. 5:220-235 (1994)参照（参照により本明細書に一体化させる）。上記方法を包含する種々の方法で候補作用剤を付着させてもよいことが理解されるはずである。好ましくは、付着様式は候補作用剤の機能性を有意に変化させないものである。すなわち、その標的との相互作用を可能にするような柔軟性のある様式で候補作用剤を付着させるべきである。
【００４０】
酵素を微小球上に固定化する個々の方法は当該分野において知られている。１の場合において、ＮＨ2表面化学基微小球を用いる。ｐＨを６．９にするリン酸塩緩衝化セイライン（１０ｍＭ）（１３８ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ）中２．５％グルタルアルデヒドを用いて表面の活性化を行う。室温で約２時間、これを撹拌ベッド上で撹拌する。次いで０．０１％ツイン２０（界面活性剤）を添加した超純水で、微小球をすすぎ、次いで、０．０１％ツイン２０を添加したｐＨ７．７のＰＢＳで再度すすぐ。最後に、好ましくは０．４５μｍのamicon micropureフィルターを用いて前濾過した後、酵素を溶液に添加する。
【００４１】
いくつかの実施態様において、微小球は、さらに、ある種のデコーディング系において用いるアイデンティファイヤー結合リガンドを含む。本明細書において、「アイデンティファイヤー結合リガンド」または「ＩＢＬ」とは、対応するデコーダー結合リガンド（ＤＢＬ）と特異的に結合してビーズに付着した生物活性物質の同一性の解明を容易にする化合物を意味する。すなわち、ＩＢＬおよび対応するＤＢＬは、結合対をなす。本明細書において、「特異的に結合する」とは、ＩＢＬが、対応するＤＢＬと他のＤＢＬ（すなわち、他のＩＢＬに対するＤＢＬ）または該系の他の成分もしくは汚染成分との間で区別するのに十分な特異性をもって、そのＤＢＬと結合することを意味する。該結合は、非特異的結合を除去するための洗浄工程を含むデコーディング工程の条件下で結合し続けるのに十分であるべきである。いくつかの実施態様において、例えば、ＩＢＬおよび対応するＤＢＬがタンパク質または核酸である場合、ＩＢＬのそのＤＢＬに対する解離定数は、約１０-4〜１０-6Ｍ-1未満であり、約１０-5〜１０-9Ｍ-1未満が好ましく、約１０-7〜１０-9Ｍ-1が特に好ましい。
【００４２】
ＩＢＬ−ＤＢＬ結合対は、既知であるか、または、既知の記述を用いて容易に見出すことができる。例えば、ＩＢＬがタンパク質である場合、ＤＢＬは、タンパク質（詳しくは、抗体またはそのフラグメント（ＦＡｂなど）を包含する）または小分子を包含するか、またはその反対の場合である（ＩＢＬが抗体であり、ＤＢＬがタンパク質である）。金属イオン−金属イオンリガンドまたはキレート化剤対もまた有用である。抗原−抗体対、酵素および基体または阻害剤、他のタンパク質−タンパク質相互作用対、受容体−リガンド、相補的核酸（三重螺旋を形成する核酸分子を包含する）、および炭水化物およびそれらの結合相手もまた適当な結合対である。一本鎖もしくは二本鎖核酸結合タンパク質および小分子核酸結合剤を包含する、核酸−核酸結合タンパク質対もまた有用である。同様に、米国特許第5,270,163号、第5,475,096号、第5,567,588号、第5,595,877号、第5,637,459号、第5,683,867号、第5,705,337号、および関連特許に概略記載されているように（出典明示により本明細書の一部とする）、核酸「アプタマーズ（aptamers）」は、実際にいずれもの標的に結合するために開発することができる；かかるアプタマー−標的対は、ＩＢＬ−ＤＢＬ対として用いることができる。同様に、組合せ化学的方法をベースとした結合対の開発に関連する広範囲にわたる一群の文献がある。
【００４３】
好ましい実施態様において、ＩＢＬは、色または発光特性が選択的結合ＤＢＬの存在下で変化する分子である。
一の実施態様において、ＤＢＬは、蛍光体のようなラベルを担持していてもよい、ビーズ、すなわち、「デコーダー・ビーズ」に付着していてもよい。
【００４４】
好ましい実施態様において、ＩＢＬ−ＤＢＬ対は、実質的に相補的な一本鎖核酸を含む。この実施態様において、結合リガンドは、「アイデンティファイヤー・プローブ」および「デコーダー・プローブ」と称することができる。一般に、該アイデンティファイヤーおよびデコーダー・プローブは、約４〜約１０００個の範囲の塩基対長であり、約６〜約１００個が好ましく、約８〜約４０個が特に好ましい。重要なことは、該プローブが、特異的であるのに十分に長く、すなわち、異なるＩＢＬ−ＤＢＬ対間で区別するのに充分に長く、しかも、ａ）必要に応じて、適当に実験条件下での、解離、およびｂ）効果的なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に短いことである。
【００４５】
好ましい実施態様において、以下により詳しく概略記載するように、ＩＢＬは、ＤＢＬと結合しない。むしろ、ＩＢＬは、例えば、質量分光分析法の使用を介して、直接同定されるアイデンティファイヤー部分（「ＩＭ」）として用いられる。
【００４６】
別法として、好ましい実施態様において、ＩＢＬおよび生物活性物質は、同じ部分であり；かくして、例えば、本明細書に概略記載するように、特に、光学的サインを用いない場合、生物活性物質は、アイデンティファイヤーおよび該生物活性物質の両方として供することができる。例えば、核酸の場合、ビーズ結合プローブ（生物活性物質として供する）もまた、デコーダー・プローブを結合して、ビーズ上のプローブの配列を同定することができる。かくして、この実施態様において、ＤＢＬは、生物活性物質と結合する。このことは、この実施態様がデコーディングに加えてアレイまたはアッセイについての情報を提供することができる場合に特に有用である。例えば、以下により詳しく記載するように、ＤＢＬの使用は、アレイ検量線作成およびアッセイ開発を可能にする。このことは、ＤＢＬを単独で用いない場合でさえ行われる；例えば、非ランダム・アレイにおいては、これらのプローブセットの使用は、デコーディングが必要とされない場合でさえアレイ検量線作成およびアッセイ開発を可能にすることができる。
【００４７】
好ましい実施態様において、微小球は、光学的サインを含まない。すなわち、米国特許出願第08/818,199号および第09/151,877号に概略記載されているように、従来の処理は、微小球の部分母集団の固有の生物活性物質を同定するのに用いられる固有の光学的サインまたは光学的タグを含む微小球の各部分母集団を有していた。すなわち、デコーディングは、ビーズの光学的特性を利用しており、これにより、固有の光学的サインを含むビーズが異なる光学的サインを有する他の位置のビーズと区別される。かくして、従来の処理は、各生物活性物質に固有の光学的サインを付与し、これにより、この生物活性物質を含む微小球がこのサインに基づいて同定される。これらの光学的サインは、色素、通常、発色基または蛍光体を含み、これらは、ビーズ自体に取込まれているかまたは付着している。光学的サインの多様性は、種々の蛍光色素、種々の比率の蛍光色素混合物、および蛍光色素の種々の濃度（強度）を利用した。
【００４８】
かくして、本発明は、アレイをデコードするのに光学的特性の使用だけに頼るものではない。しかしながら、当業者に理解されるように、いくつかの実施態様において、本発明の系と共に、付加的コーディング法として光学的サインを利用することが可能である。かくして、例えば、以下により詳しく概略記載するように、アレイの大きさは、有効に増大させることができるが、いくつかの方法において一組のデコーディング部分を用いた場合、そのうちの１つの方法は、光学的サインと組み合わせてビーズを用いることである。かくして、例えば、一「組」のデコーディング分子を用いた場合、光学的サインを有するものと有しないものの２つのビーズ群の使用により、アレイの大きさを有効に２倍にできる。同様に、複数の光学的サインの使用は、アレイの可能な大きさを増大させる。
【００４９】
好ましい実施態様において、ビーズの各部分母集団は、複数の異なるＩＢＬを含む。核生物活性物質をエンコードするのに複数の異なるＩＢＬを用いることにより、起こりうる固有のコードの数が実質的に増加する。すなわち、一の生物活性物質につき１個の固有のＩＢＬを用いることにより、アレイの大きさは、固有のＩＢＬの数となる（以下に概略記載するように、「再使用」は生じなかったと仮定する）。しかしながら、インジケーターとして各ＩＢＬの存在または不在を用いた場合、ビーズ１個につき複数の異なるＩＢＬを用いることにより、アレイの大きさを２nに増大させることができる。例えば、ビーズ１個につき１０個のＩＢＬの付与は、１０ビット二進符号を生じ、ここで、各ビットは、「１」（ＩＢＬが存在する）または「０」（ＩＢＬが不在である）で示すことができる。１０ビット二進符号は、２10個の起こりうる変種を有する。しかしながら、以下により詳しく検討するように、濃度または強度などのもう１つのパラメーターが含まれる場合には、アレイの大きさは、さらに、増大できる；かくして、例えば、２種類の濃度のＩＢＬを用いた場合、アレイの大きさは、３n増大する。かくして、この実施態様において、アレイにおける各個々の生物活性物質は、生物活性物質の添加前、生物活性物質の合成後、またはその間にビーズに添加することができるＩＢＬの組合せを付与される（すなわち、ＩＢＬおよび生物活性物質成分の同時添加）。
【００５０】
別法として、生物活性物質を種々の残基のポリマーである場合、すなわち、生物活性物質がタンパク質または核酸である場合、異なるＩＢＬの組合せを用いて、タンパク質または核酸の配列を解明することができる。
【００５１】
かくして、例えば、２種類のＩＢＬ（ＩＢＬ１およびＩＢＬ２）を用いた場合、核酸の１位を解明することができる：例えば、アデノシンは、ＩＢＬ１およびＩＢＬ２の両方の存在により表すことができる；チミジンは、ＩＢＬ１が存在するがＩＢＬ２が存在しないことにより表すことができ、システインは、ＩＢＬ２が存在するがＩＢＬ１が存在しないことにより表すことができ、グアノシンは、共に存在しないことにより表すことができる。核酸の２位は、ＩＢＬ２およびＩＢＬ４を用いて同様に行うことができる；かくして、ＩＢＬ１、ＩＢＬ２、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４の存在は、ＡＡの配列を与え、ＩＢＬ１、ＩＢＬ２およびＩＢＬ３は、配列ＡＴを示し、ＩＢＬ１、ＩＢＬ３およびＩＢＬ４は、配列ＴＡなどを与える。３位は、ＩＢＬ５およびＩＢＬ６などを用いる。このようにして、２０種類のアイデンティファイヤーの使用により、全ての起こりうる１０量体に対する固有のコードを得ることができる。
【００５２】
該系は、タンパク質に類似しているが、各位置での可能な多様性に依存して、各位置を同定するために多数の異なるＩＢＬを必要とする。かくして、例えば、全てのアミノ酸が全ての位置で可能である場合に、各位置について５種類のＩＢＬが必要である。しかしながら、上記で概略記載したように、例えば、生物活性物質としてランダムペプチドを用いる場合、系中に構築された偏りがあってもよい；全てのアミノ酸が全ての位置に存在できるとは限らず、いくつかの位置を予めセットすることができ、したがって、各アミノ酸にについて４種類のＩＢＬを用いることが可能である。
【００５３】
このようにして、核配列に対する１種類の「バーコード」を構築することができる；各々異なったＩＢＬの存在または不在は、各生物活性物質の同定を可能にする。
【００５４】
さらに、ＩＢＬの種々の濃度または密度の使用は、ある程度の「再使用」を可能にする。例えば、第１の薬剤を含むビーズが１倍濃度のＩＢＬを有し、第２の薬剤を含む第２ビーズが１０倍濃度のＩＢＬを有する場合、対応する標識ＤＢＬの飽和濃度を用いることにより、ユーザーに２つのビーズを区別させる。
【００５５】
候補薬剤および固有のＩＢＬを含む微小体を生成したらすぐに、それらを基体に添加してアレイを形成させる。本明細書に記載したほとんどの方法がアッセイの前にビーズを基体に添加するが、アレイの調製、使用およびデコーディングの順序は、変わりうる。例えば、アレイを調製し、デコードし、次いで、アッセイを行うことができる。別法として、アレイを調製し、アッセイに用い、次いで、デコードすることができる；これは、ほんの僅かだけビーズをデコードする必要がある場合に特異な使用を見出すことができる。別法として、ビーズを基体に添加する前に、ビーズをアッセイ混合物、すなわち、標的分析物を含有する試料に添加することができる；添加およびアッセイの後、アレイをデコードすることができる。これは、ビーズを含む試料を撹拌または混合した場合に特に好ましい；これは、単位時間あたりにビーズに結合した標的分析物の量を増加させることができ、かくして、（核酸アッセイの場合）ハイブリダイゼーション速度が速くなる。これは、試料中の標的分析物の濃度が低い場合に特異な使用を見出すことができる；一般に、低濃度の場合、長い結合時間を用いなければならない。
【００５６】
さらに、アッセイ混合物へのビーズの添加は分類または選別を可能にすることができる。例えば、大きなライブラリーのビーズを試料に添加することができ、試料を結合するこれらのビーズだけを基体に添加することができる。例えば、標的分析物が蛍光標識される場合（直接（例えば、標識を核酸増幅反応物に取り込むことによる）または間接的（例えば、サンドウィッチアッセイの使用による））、標的分析物結合の結果として蛍光を示すビーズは、Fluorecence Activated Cell Sorting （ＦＡＣＳ）を介して分類することができ、これらのビーズだけをアレイに添加し、次いで、デコードすることができる。同様に、分類は、親和性技術を介して行うことができる；標的分析物を含むアフィニティカラムを調製することができ、結合するこれらのビーズだけをアレイにて用いることができる。同様に、２つのビーズ系を用いることができる；例えば、標的分析物を含む磁気ビーズを用いて、標的に結合するこれらのビーズを「取り出す」（pull out）ことができ、次いで、磁気ビーズを離脱させ（例えば、温度上昇による）、アレイに添加することができる。
【００５７】
一般に、アレイの調製方法およびアレイのデコーディング方法は、固有にエンコードされ得る異なる候補薬剤の数を最大にするために行われる。本発明の組成物は、種々の方法で調製される。一般に、アレイは、ビーズを含む溶液またはスラリーを、ビーズの会合のための部位を含む表面に添加することにより調製される。これは、水性および有機溶媒ならびに混合液を包含する種々のバッファーにて行われる。溶媒は、蒸発させることができ、過剰のビーズは除去される。
【００５８】
好ましい実施態様において、非共有結合法を用いてビーズをアレイに会合させる場合、ビーズをアレイの上に負荷する新規方法が用いられる。この方法は、アレイを粒子（微小球および細胞を包含する）の溶液に暴露すること、次いで、エネルギーを与えること、例えば、混合物を撹拌または振動することを含む。これにより、弱く会合したビーズを落とす（または、ウェルの場合には、外す）のに十分なエネルギーを用いて撹拌を行った場合、より緊密に会合した粒子を含むアレイが得られる。次いで、これらの部位は、異なるビーズを結合するのに利用可能である。このようにして、部位に対して高い親和性を示すビーズが選択される。このようにして調製したアレイは、静荷重と比較して２つの主要な長所をもっている；第１に、高いパーセンテージの部位を容易に満たすことができ、第２に、かくして負荷されたアレイは、アッセイの間のビーズ損失が実質的に減少することを示す。かくして、好ましい実施態様において、これらの方法を用いて、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、特に好ましくは、少なくとも約９０％の部位が満たされたアレイが得られる。同様に、この方法で得られたアレイは、好ましくは、アッセイの間に約２０％未満、好ましくは、約１０％未満、特に好ましくは約５％未満のビーズが損失する。
【００５９】
この具体例では、離散的な部位を備えた表面を有する基体が粒子（ビーズ、細胞など）を含有する溶液に浸漬される。表面は、ここで説明するように、ウェルを有するか、あるいは上記部位に対する差別的な親和性が存在するようなパターン化された表面上に他の種類の部位を有する。この差別的な親和性は、より強固に結合する粒子が選択されるような競合過程となる。ビーズを「供給」すべき全表面が溶液と流体接触していることが好ましい。この溶液は、一般的に、ビーズ：溶液（体積：体積）が約１０,０００：１〜１：１の範囲内にあるスラリーである。一般的に、溶液は、多数の試薬、例えば、緩衝剤の水溶液、有機溶媒、塩、他の試薬成分などを含有することができる。さらに、溶液は、好ましくは、過剰のビーズを含有する；すなわち、アレイ上の部位より多くのビーズが存在する。好ましい具体例では、２倍〜１０億倍過剰のビーズを利用する。
【００６０】
浸漬はアッセイ条件と同様とすることができる；例えば、アレイを上方から試料を含有するマイクロタイタープレート中に「浸す」べきであれば、この構成を供給の間にわたり繰り返し、かくして、重力により落下しそうなビーズを最少限にする。
【００６１】
いったん表面を浸漬すれば、基体または溶液、あるいは、その両方を競合過程に付す。それにより、低い親和性を有する粒子を基体から解離させ、部位に対して高い親和性を示す粒子に置換することができる。この競合過程は、熱、音波処理、溶液または基体、あるいは、その両方をかき混ぜたり混合したり、振動させたり攪拌したりするという形態で、エネルギーを導入することにより実施される。
【００６２】
好ましい具体例では、攪拌または振動を利用する。一般的に、基体の操作量は、アレイに対する損傷を防止するために最少限にする；かくして、好ましい具体例では、アレイよりむしろ溶液の攪拌を利用するが、どちらでもよい。当業者に理解されるように、この攪拌は多数の形態を採用することができる。好ましい具体例では、ビーズ溶液を含有するマイクロタイタープレートを利用するが、かかるビーズ溶液はマイクロタイターの振盪器を用いて攪拌する。
【００６３】
攪拌は、アレイに所望の量だけ供給するのに十分な時間にわたり続行する。ビーズの寸法および濃度、ならびにアレイの寸法に依存して、この時間は約１秒〜数日間の範囲内でよく、約１分〜約２４時間が好ましい。
【００６４】
アレイの必ずしもすべての部位がビーズを含有するとは限らないこと；すなわち、基体表面上には、空の部位が存在しうることに留意すべきである。さらに、１個以上のビーズを含有する部位が存在しうるが、これは好ましくない。
【００６５】
具体例によっては、例えば、化学的な結合を行う場合、ビーズを非ランダムまたは規則正しい方法で結合させることができる。例えば、光活性化可能な結合リンカーまたは光活性化可能な接着剤またはマスキング剤を用いて、ビーズの所定集団が配置されるように、アレイ上の選択された部位を、順次、結合に適するようにしてもよい。
【００６６】
本発明のアレイは、候補薬剤の正体に関する情報がアレイに組み込まれるように、すなわちファイバーウェルにおけるビーズのランダムな付着が「デコード」されて、すべての位置で候補薬剤の同定が可能になるように構築される。これは、様々な方法で、アレイを用いて目的分子を検出する前、間または後に行えばよい。
【００６７】
かくして、アレイを作成した後、それは、基体表面上の１種またはそれ以上の生物活性な薬剤、すなわちビーズの各部分集団の位置を同定するために「デコード」される。
【００６８】
好ましい具体例では、選択的なデコード系が用いられる。この場合、目的分析物の結合の結果として光学的信号の変化を示すような微球だけがデコードされる。これは、通常、「ヒット」の数、すなわちデコードする部位の数が一般的に低い場合に行われる。すなわち、まずアレイを目的分析物が存在しない実験条件下で走査する。目的分析物を含有する試料を加え、光学的信号の変化を示すような位置だけをデコードする。例えば、陽性または陰性の信号位置にあるビーズを選択的に標識するか、あるいは（例えば、光開裂可能なリンカーを用いて）アレイから放出させ、引き続いて、蛍光活性化された細胞の選別器（ＦＡＣＳ）で選別または濃縮すればよい。すなわち、すべての陰性ビーズを放出させた後、陽性ビーズを放出させるか、あるいはその場で分析する。あるいは、すべての陽性物を放出させ、分析する。あるいは、標識がハロゲン化芳香族化合物を含有していてもよく、標識の検出は、例えば、ガスクロマトグラフィー、化学的な標識、同位元素による標識、または質量スペクトルによる標識を用いて行う。
【００６９】
当業者に理解されるように、これは、アレイがデコードされない系；すなわち、ビーズ組成と位置との相関関係が決して必要でない系で行ってもよい。この具体例では、ビーズをアレイに供給し、アッセイを行う。次いで、「陽性物」、すなわち光学的信号の変化を示すようなビーズ（以下で、より十分に概説する）を「標識」して、それらを「陰性」ビーズから区別し、分離する。これは、いくつかの方法で、好ましくは光ファイバーアレイを用いて、行うことができる。好ましい具体例では、各ビーズは、蛍光色素を含有する。「陽性物」または「活性ビーズ」のアッセイおよび同定の後、一般的には光活性化された試薬（典型的には、溶解した酸素）の存在下で、陽性ファイバーまたは陰性ファイバーだけに光を当てる。前者の場合、すべての活性ビーズは光脱色される。かくして、すべてのビーズを非選択的に放出させ、引き続いて、例えば、蛍光活性化された細胞の選別器（ＦＡＣＳ）の機械を用いて、選別することにより、非蛍光活性ビーズを蛍光陰性ビーズから選別することができる。あるいは、陰性ファイバーに光を当てる場合には、すべての陰性物が非蛍光性であり、陽性物は蛍光性であり、選別を続行することができる。結合した生物活性な薬剤の特性決定は、例えば、質量分析法を用いて、直接的に行ってもよい。
【００７０】
あるいは、ＩＢＬに類似しているが、必ずしもＤＢＬに結合する必要のない同定物部分（「ＩＭ」）を用いて、同定を行ってもよい。すなわち、生物活性な薬剤の構造を直接的に解明するよりむしろ、ＩＭの組成物を同定物として利用してもよい。かくして、例えば、ＩＭの特定の組合せは、ビーズをコードするのに利用し、これを用いて、ビーズから放出させた後、引き続いて、例えば、ガスクロマトグラフィーまたは質量分析器を用いて、分析することにより、ビーズ上の薬剤を同定することができる。
【００７１】
あるいは、各ビーズに蛍光色素を含有させるよりむしろ、各ビーズは蛍光色素の蛍光前駆物質を含有させる。例えば、蛍光分子上におけるオルト−ニトロベンジル基などの光開裂可能な保護基を用いて、蛍光色素の光活性化を行うことができる。アッセイ後、「陽性」または「陰性」ファイバーに再び光を当てて、これらの集団を区別する。次いで、照射された前駆物質は、蛍光色素に化学的に変換される。次いで、すべてのビーズを選別しながらアレイから放出させて、蛍光および非蛍光ビーズ（陽性物および陰性物、あるいはその逆）の集団を形成させる。
【００７２】
別の好ましい具体例では、ビーズの結合部位（例えば、ウェル）が光重合可能な試薬を含むか、あるいは光重合可能な薬剤を組み立てられたアレイに加える。試験アッセイを行った後、「陽性」または「陰性」ファイバーに再び光を当てて、これらの集団を区別する。照射の結果として、すべての陽性物またはすべての陰性物は重合し、部位に捕捉または結合されるが、残りのビーズ集団はアレイから放出させることができる。。
【００７３】
好ましい具体例では、生物活性な薬剤の位置は、デコーダー結合リガンド（ＤＢＬ）を用いて決定される。上で概説したように、ＤＢＬは、同定物結合リガンド（存在すれば）または、好ましくは生物活性な薬剤が核酸またはタンパク質である場合には、生物活性な薬剤自体に結合する結合リガンドである。
【００７４】
好ましい具体例では、上で概説したように、ＤＢＬはＩＢＬに結合する。
【００７５】
好ましい具体例では、生物活性な薬剤は一本鎖の核酸であり、ＤＢＬは生物活性な薬剤に結合（ハイブリダイズ）する実質的に相補的な一本鎖の核酸であり、ここではデコーダープローブと呼ばれる。各候補プローブに実質的に相補的なデコーダープローブを作成し、それを用いてアレイをデコードする。この具体例では、候補プローブおよびデコーダープローブは、特異性を可能にするのに十分な長さを有する（およびデコード工程が適当な条件下で行われる）必要がある；すなわち、各候補プローブは、各候補プローブの区別を可能にするのに十分な特異性を有するその対応するデコーダープローブに結合する。
【００７６】
好ましい具体例では、ＤＢＬは直接的または間接的に標識される。ここで「標識される」とは、化合物が、この化合物の検出を可能にするように結合した、少なくとも１個の元素、同位元素または化学化合物を有することを意味する。一般的に、標識は３種類：ａ）同位元素の標識（放射性同位元素または質量数の大きい同位体）；ｂ）磁気的、電気的、熱的；およびｃ）着色または蛍光色素に分類されるが、酵素や、磁気的粒子などの粒子も同様に標識に含まれる。好ましい標識としては、蛍光標識が挙げられる。好ましい具体例では、ＤＢＬは直接的に標識される；すなわち、ＤＢＬは標識を含有する。別の具体例では、ＤＢＬは間接的に標識される；すなわち、ＤＢＬに結合する標識用結合リガンド（ＬＢＬ）が用いられる。この具体例では、標識用結合リガンド−ＤＢＬペアは、ＩＢＬ−ＤＢＬペアについて上記したとおりとすることができる。適当な標識としては、蛍光性ランタニド錯体、例えば、ヨーロピウムおよびテルビウムの錯体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Malachite green）、スチルベン、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）、カスケードブルー（Cascade BlueTM）、テキサスレッド（Texas Red）、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ｃｙ３、ｃｙ５のほか、リチャード・ピー・ホーグランド(Richard P. Haugland)によるザ・モレキュラー・プローブズ・ハンドブック(the Molecular Probes Handbook)の第６版（出典を示すことにより特に本明細書の一部とする）に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
ある具体例では、標識は色または発光の性質が局所的な環境の変化によりＩＢＬの存在下で変化する分子である。例えば、標識は、（１）ｐＨにより発光強度が変化する蛍光ｐＨ指示薬；（２）イオン濃度により発光の性質が変化する蛍光イオン指示薬；または（３）疎水性環境下で蛍光強度が増大するエチジウム塩などの蛍光分子とすればよい。
【００７８】
従って、個々のビーズ（またはビーズの部分集団）の位置の同定は、標識されたＤＢＬとＩＢＬまたは生物活性な薬剤との間の結合（すなわち、生物活性な薬剤が核酸である場合には、候補プローブとデコーダープローブとの間のハイブリダイゼーション）からなる１種またはそれ以上のデコード工程を用いて行われる。デコードした後、ＤＢＬを除去し、アレイを用いることができる；しかし、場合によっては、例えば、ＤＢＬがＩＢＬに結合し、生物活性な薬剤に結合しない場合には、ＤＢＬの除去は必要ない（場合によっては、望ましいかもしれないが）。さらに、ここで概説したように、デコードは、アレイをアッセイに用いる前、アッセイの間、あるいはアッセイの後に行えばよい。
【００７９】
１つの実施態様において、単一のデコード工程を行う。この実施態様において、各ＤＢＬを特有の標識で標識して、特有の標識の数が生物活性物質の数と等しいかそれ以上になるようにする（いくつかの場合において、本明細書に記載のように、特有の標識の「再使用」を行うことができる；同様に、改変体が別のディメンション（すなわちビーズサイズまたは標識）にエンコードされている場合は、候補プローブの少数の改変体が同じデコーダーを共有することができる）。各生物活性物質またはＩＢＬについて、それに特異的に結合し、特有の標識（例えば、１つ以上の蛍光色素）を含むＤＢＬを作製する。このようにして、各ＤＢＬの同一性（その組成（すなわち、それが核酸際である場合は、その配列）およびその標識の両方）が知られる。次いで、ＤＢＬを、ＤＢＬと生物活性物質またはＩＢＬのいずれかとの間の複合体（成分が核酸である場合は、ハイブリダイゼーション複合体と称する）の形成を可能にする条件下で生物活性物質を含むアレイに加えることによって、各ＤＢＬの位置を明らかにすることができる。このことは、各生物活性物質の位置の同定を可能にし、ランダムアレイがデコードされる。次いで、ＤＢＬを除去することができ、必要であれば、標的試料をアプライする。
【００８０】
好ましい実施態様において、特有の標識の数は特有の生物活性物質の数より少なく、従って、連続的な一連のデコード工程が使用される。議論を容易にするために、この実施態様を核酸について例示するが、他の型の生物活性物質およびＤＢＬも同様に有用である。この実施態様において、デコーダープローブをデコード用にｎ組に分割する。組の数は特有のタグの数に対応する。各デコーダープローブをｎ個の別々の反応でｎ個の異なるタグで標識する。全てのデコーダープローブは同じｎ個のタグを共有する。デコーダーの各プールは各デコーダーのｎ個のタグバージョンのうち１個のみを含み、すべてのプールにわたって２個のデコーダープローブが同じタグの配列を有することはない。これが真実であるために必要とされるプールの数は、デコーダープローブの数およびｎによって決定される。各プールのアレイへのハイブリダイゼーションは、ＩＢＬを含む全てのアドレスにおいてシグナルを生じる。各プールの連続的ハイブリダイゼーションは次に、各候補プローブについて、特有の配列特異的なコードを生じる。これは、アレイ中の各アドレスにおいて候補プローブを同定する。例えば、４個のタグを使用する場合、４×ｎの連続的ハイブリダイゼーションによって理想的には４n個の配列を識別することができるが、いくつかの場合において、より多くの工程が必要とされ得る。各プールのハイブリダイゼーションの後、ハイブリッドを変性し、デコーダープローブを除去して、プローブを次のハイブリダイゼーションのために１本鎖にする（制限した量の標的をハイブリダイズさせて、利用可能なプローブが飽和しないようにすることも可能である。連続的ハイブリダイゼーションを実施し、既存のシグナルを以前のハイブリダイゼーションから差し引くことによって分析することができる）。
【００８１】
一例を示す。１６個のプローブ核酸（番号１〜１６）のアレイおよび４個の特有のタグ（例えば、４つの異なる蛍光；標識Ａ〜Ｄ）を仮定する。ビーズ上のプローブに対応するデコーダープローブ１〜１６を作製する。第１の工程はデコーダープローブ１〜４をタグＡで、デコーダープローブ５〜８をタグＢで、デコーダープローブ９〜１２をタグＣで、デコーダープローブ１３〜１６をタグＤで標識することである。プローブを混合し、プールを候補プローブが結合したビーズを含むアレイと接触させる。次いで、各タグ（および従って各デコーダーおよび候補プローブ対）の位置を決定する。次いで、第１の組のデコーダープローブを除去する。第２の組を加えるが、今回は、デコーダープローブ１、５、９および１３をタグＡで、デコーダープローブ２、６、１０および１４をタグＢで、デコーダープローブ３、７、１１および１５をタグＣで、デコーダープローブ４、８、１２および１６をタグＤで標識する。従って、両方のデコード工程においてタグＡを含んだビーズは候補プローブ１を含み；第１のデコード工程においてタグＡを含み第２のデコード工程においてタグＢを含んだビーズは候補プローブ２を含み；第１のデコード工程においてタグＡを含み第２の工程においてタグＣを含んだビーズは候補プローブ３を含む、など。当業者には明らかなように、デコーダープローブをいずれの順序で作製し、いずれの順序で加えることもできる。
【００８２】
１つの実施態様において、デコーダープローブをインサイチュで標識する；すなわち、これらをデコード反応前に標識する必要はない。この実施態様において、入れるデコーダープローブは、候補プローブよりも短く、５’「突出」をデコードプローブ上に作製する。標識ｄｄＮＴＰ（各々特有のタグで標識されている）およびポリメラーゼの添加は、配列特異的なタグの付加を可能にし、従ってシグナルの配列特異的パターンを作製する。同様に、他の改変（連結などを含む）を行うことができる。
【００８３】
さらに、アレイのサイズは特有のデコード結合リガンドの数によって設定されるので、１組の特有のＤＢＬを「再使用」して、より多数の試験部位を可能にすることができる。これはいくつかの方法で、例えば、光学的特徴を含むいくつかのサブ集団を使用することによって行い得る。同様に、アレイ内の位置的コードスキームの使用；異なるサブバンドル（sub-bundle）が１組のＤＢＬを再使用し得る。同様に、１つの実施態様は、ビーズサイズをコード様式性（coding modality）として利用し、従って各ビーズサイズについての１組の特有のＤＢＬの再使用を可能にする。あるいは、アレイへのビーズの連続的部分的負荷も、ＤＢＬの再使用を可能にする。さらに、「コード共有（code sharing）」も同様に生じ得る。
【００８４】
好ましい実施態様において、ビーズのいくつかのサブ集団が光学的特徴を有するようにさせることによってＤＢＬを再使用し得る。好ましい実施態様において、光学的特徴は一般にレポーター色素（好ましくは蛍光性）の混合物である。混合物の組成（すなわち、１つの色素の他の色素に対する比率）および色素の濃度（シグナル強度の差を導く）の両方を変動させることによって、特有の光学的特徴のマトリックスを生じさせ得る。これを、色素をビーズの表面に共有結合させることによって、あるいは色素をビーズ内にトラップさせることによって行い得る。色素は発光団または蛍りん光体であってもよいが、好ましくは蛍光性色素であり、これはその強力なシグナルによってデコードに良好なＳＮ比を提供する。本発明における使用に適切な色素は上記でＤＢＬの標識について列挙したものを含む。
【００８５】
好ましい実施態様において、エンコードを少なくとも２個の色素の比率で達成することができるが、例えば、より多くのエンコードディメンションをビーズサイズに加えてもよい。さらに、標識は互いに識別可能である；従って、２つの異なる標識が異なる分子（すなわち、２つの異なる蛍光）を含み得るか、あるいは２つの異なる濃度または強度の１つの標識であり得る。
【００８６】
好ましい実施態様において、色素はビーズの表面に共有結合される。これは生物活性物質の結合について一般に概説されるように、ビーズの表面上の官能基を使用して行い得る。当業者には明らかなように、これらの結合は色素の影響を最小化するように行う。
【００８７】
好ましい実施態様において、一般にビーズの孔中に色素をトラップさせることによって、色素を非共有的にビーズと会合させる。
【００８８】
さらに、単一の色素濃度ではなくむしろ２つ以上の色素の比でのエンコードが好ましい。なぜならこれはレポーター色素の特徴および検出器の感度を調べるために使用する光の強度に対する無感応性を提供するからである。
【００８９】
好ましい実施態様において、空間的または位置的コードシステムを行う。この実施態様において、サブバンドルまたはサブアレイ（すなわち、全アレイの一部）が利用される。電話システムから類推すると、各サブアレイは「地域番号」であり、これは他のサブアレイ（これはサブアレイの位置によって分離されている）の同じ標識（すなわち、電話番号）を有することができる。従って、例えば、同じ特有の標識をバンドル毎に再使用することができる。従って、５０個の特有の標識の、１００個の異なるサブアレイとの組合せでの使用は、５０００個の異なる生物活性物質のアレイを形成することができる。この実施態様において、１つのバンドルを他のバンドルから同定可能であることが重要になってくる；これを一般に手動で、またはマーカービーズ（これは、各サブアレイについての特有のタグを含むビーズである）の使用を介して、異なる量の同じマーカービーズの使用を介して、あるいは異なる比率の２つ以上のマーカービーズの使用を介して行う。
【００９０】
別の実施態様において、微小球サイズのようなさらなるエンコードパラメーターを追加することができる。例えば、異なるサイズのビーズの使用もＤＢＬの組の再使用を可能にし得る；すなわち、異なるサイズの微小球を使用して微小球のエンコードディメンションを拡大することが可能である。異なるファイバー直径または断面を有するピクセルを含む光ファイバーアレイを製造することができる；あるいは、２つ以上のファイバー光バンドル（各々が個々のファイバーの異なる断面を有する）を一緒に加えて、より大きなバンドルを形成させることができる；または同じサイズの断面のファイバーのファイバー光バンドルを、異なるサイズのビーズとともに使用することができる。異なる直径を用いて、最大のウェルに最大の微小球を充填し、次いで全てのサイズのウェルが充填されるまで、次第により小さなウェル中のより小さな微小球に移動することができる。こうして、同じ色素比を使用して、異なるサイズの微小球をエンコードし、それによってアレイ中に存在する異なるオリゴヌクレオチド配列または化学官能基の数を拡大することができる。ファイバー光基材について概説したが、この方法ならびに本明細書中に概説する他の方法に、他の基材および他の結合様式を同様に使用することができる。
【００９１】
好ましい実施態様において、コードおよびエンコードを、微小球のアレイへの連続的負荷によって達成する。空間的コードについて上記で概説したように、この実施態様において、光学的特徴を「再使用」することができる。この実施態様において、各々が異なる生物活性物質を含む微小球のライブラリー（または各々が異なる生物活性物質を含むサブ集団）を複数のサブライブラリーに分割する；例えば、所望のアレイのサイズおよび特有のタグの数に依存して、各々が全ライブラリーの約１０％を含む１０個のサブライブラリーを作製し得、各サブライブラリーはおおよそ同じ特有のタグを含む。次いで、第１のサブライブラリーをウェルを含むファイバー光バンドルに加え、各生物活性物質の位置を、一般にＤＢＬの使用を介して決定する。次いで、第２のサブライブラリーを加え、各生物活性物質の位置を再度決定する。この場合、シグナルは「第１」ＤＢＬおよび「第２」ＤＢＬ由来のシグナルを含む；２つのマトリックスを含めることによって、各サブライブラリー中の各ビーズの位置を決定することができる。同様に、第３、第４などのサブライブラリーを連続的に加えることによってアレイを充填させる。
【００９２】
好ましい実施態様において、いくつかの方法でコードを「共有」させることができる。第１の実施態様において、標的分析物の結合強度が十分に異なる場合は、単一のコード（すなわち、ＩＢＬ／ＤＢＬ対）を２個以上の物質に割り当てることができる。例えば、ｍＲＮＡ定量アッセイにおいて使用される２個の核酸プローブは、そのハイブリダイゼーションシグナル強度の範囲が重複しない場合は、同じコードを共有することができる。これは、例えば、標的配列の１つが常に他よりずっとより高い濃度で存在する場合に生じ得る。あるいは、２つの標的配列は常に同様な濃度で存在し得るが、ハイブリダイゼーション効率が異なり得る。
【００９３】
これとは別に、物質が機能的に等価である場合、たった一つのコードを多くの物質に割り当てることができる。例えば、一組のオリゴヌクレオチドプローブを特定遺伝子の存在を検出するという共通の目的で設計する場合、該プローブはそれらの配列が異なっていても機能的に等価である。同様に、分析物のクラスまたは「ファミリー」が所望される場合、キナーゼまたはＧ-タンパク質結合レセプターのようなクラスの個々のメンバーに対する全プローブはコードを共通させることができた。同様にこのタイプのアレイは既知遺伝子の相同物を検出するのに用いることができた。この態様において、各遺伝子は一組の異種構造のプローブにより示され、異なる遺伝子領域（およびそれゆえ、配列が異なる）にハイブリダイゼーションする。該プローブセットは共通のコードを有する。相同物が存在する場合、それはプローブの全部ではないがいくらかにハイブリダイゼーションすることができる。相同性のレベルはハイブリダイゼーションしているプローブのフラクションならびに平均ハイブリダイゼーション強度により示すことができる。同様に、同じタンパク質に対する多数の抗体は全て同じコードを共通させることができた。
【００９４】
好ましい態様において、自己集合ランダムアレイ(self-assembled random arrays)のデコーディングは、ｐＨ滴定に基づいて行う。この態様において、生物活性物質に加えて、ビーズは光学的特徴を含み、光学的特徴は、フルオロフォアのようなｐＨ反応性色素（時に本明細書中、「ｐＨ色素」と呼ぶ）の使用により生じる。この態様は、ＰＣＴ  ＵＳ９８／０５０２５およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ.０９／１５１,８７７に概説されるものと同一であり、溶液のｐＨをｐＫａ未満からｐＫａを上回るまで調節した場合に（または、逆も同様）、本発明で用いる色素が蛍光強度（または他の特性）の変化を示すこと以外は、この両文献を特に引用により組み込む。好ましい態様において、それぞれ異なるｐＫａを有するｐＨ色素であって、好ましくは少なくとも０．５ｐＨ単位で選別したｐＨ色素セットを用いる。好ましい態様は、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１および１１．５のｐＫａのｐＨ色素セットを利用する。各ビーズはｐＨ色素のいずれのサブセットを含むこともでき、この方法において、生物活性物質特有のコードが生成される。こうしてｐＨ１〜ｐＨ１３でアレイを滴定し、各ビーズからの蛍光シグナルを溶液ｐＨの機能として測定することによりアレイのデコーディングが達成される。
【００９５】
こうして、本発明により、別個の部分から成る表面を有する基質から成るアレイ組成物が提供される。ミクロスフェア集団は該部分に分布し、該集団は少なくとも第一および第二サブ集団から成る。各サブ集団は生物活性物質を含み、加えて所定のｐＫａを有する少なくとも一つの光学色素を含む。異なる光学色素のｐＫａは異なっている。
好ましい態様において、例えばアレイがクローン化した核酸を含む場合、アレイをデコードするために用いることができるいくつかの方法がある。好ましい態様において、クローン化した核酸についてのいくつかの配列情報が知られている場合、本明細書中に広く概説するように、特定のデコーディングプローブを作成することができる。
【００９６】
好ましい態様において、「ランダム」なデコーディングプローブを作成することができる。前に概説したように、一連のハイブリダイゼーションまたは多数のラベルの使用により、独特のハイブリダイゼーションパターンが各センサーエレメントに関して生じ得る。これにより、所定のクローンを示すビーズの全ては同じグループに族するとみなすことができる。一般に、これは、配列依存的な様式だが高程度に配列特異的ではない様式で結合するランダムまたは部分変性デコーディングプローブを用いて行う。該プロセスは各回、異なる標識物質を用いて何回も繰り返すことができ、ある意味特異的な相互作用に基づく、異なるシグナルパターンを生むことができる。この方法において、各センサーエレメントに関して独特の光学的特徴が確立される。パターン認識またはクラスター形成アルゴリズムを光学的特徴に適用することにより、ビーズを同じ特徴を共有する（すなわち同じプローブを保持する）セットにグループ分けすることができる。
【００９７】
クローンそのものの実際の配列を同定するためには、追加的方法が必要とされ、例えば、直接配列決定を行うことができる。斑点ｃＤＮＡアレイ(a spotted cDNA)のような、クローンを含むオーダーアレイ(ordered array)を用いることにより、該セット内でのその位置が分かっている特定クローンにハイブリダイゼーションパターンを関係付ける「鍵」を生じることができる。この方法で、クローンを回収し、さらに特徴づけることができる。
これとは別にクローンアレイは、ベクタータグを有する二元デコーディングを用いてデコードすることができる。例えば、部分的にランダム化したオリゴを核酸ベクター（例えばプラスミド、ファージなど）にクローン化する。各オリゴヌクレオチド配列は限られた一組の配列のサブセットから成る。例えば、限られたセットが１０配列を含む場合、各オリゴヌクレオチドは幾つかのサブセット（または１０の全て）配列を有してもよい。つまり、１０配列のそれぞれがオリゴヌクレオチド中に存在することもできるし、あるいは存在しないことも可能である。それゆえ、２10または１,０２４の可能な組み合わせが存在する。配列はオーバーラップしてもよく、可能な組み合わせの数を増すために、副次的な変種を示すこともできる（例えばＡ、Ｃ、ＴおよびＧ置換）。核酸ライブラリーをランダムなコード配列を含むベクターにクローン化する。これとは別に、ＰＣＲのような他の方法を用いてタグを付加することができる。この方法において、クローンの配列をデコードするために、少数のオリゴデコーディングプローブを用いることができる。
【００９８】
一度作成されると、本発明の組成物は、多くの適用において使用できる。好ましい態様において、存在する標的分析物の量の定量化を含め、標的分析物の存在または不在に関してサンプル溶液を試験するために該組成物を用いる。本明細書中の「標的分析物」または「分析物」または文法的に等しいものにより、結合パートナーが検出あるいは評価されるいずれかの原子、分子、イオン、分子イオン、化合物または粒子を意味する。当業者には明らかであるように、多くの分析物を本発明に用いることができ、基本的には、生物活性物質を結合するいずれの分析物もまたは、結合パートナー（すなわち薬物候補物質）が求められているいずれの分析物も用いることができる。
適当な分析物には、生物分子を含む有機および無機分子が含まれる。標的分析物の検出を行う場合、適当な標的分析物には、制限されるものではないが、環境汚染物質（農薬、殺虫剤、毒素などを含む）、化学物質（溶媒、ポリマー、有機物質などを含む）、治療分子（治療薬および濫用薬物、抗生物質などを含む）、生物分子（ホルモン、サイトカイン、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜抗原およびレセプター（神経、ホルモン、栄養素および細胞表面レセプター）またはそれらのリガンドなど）、全細胞（原核細胞（病原性細菌など）および真核細胞、哺乳動物の腫瘍細胞を含む）、ウイルス（レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなどを含む）および胞子などが含まれる。特に好ましい分析物は、核酸およびタンパク質である。
【００９９】
好ましい態様において、標的分析物はタンパク質である。当業者には明らかであるように、本発明を用いて結合パートナーを検出または評価することができる、多数の可能性のあるタンパク質性標的分析物がある。適当なタンパク質標的分析物には、制限されるものではないが、（１）免疫グロブリン；（２）酵素（および他のタンパク質）；（３）ホルモンおよびサイトカイン（その多くは細胞レセプターのリガンドとして役立つ）および（４）他のタンパク質が含まれる。
好ましい態様において、標的分析物は核酸である。これらの分析は、幅広い範囲の適用に用いられる。
好ましい態様において、プローブは遺伝子診断に用いる。例えばプローブを本明細書中に開示する方法を用いて作成し、非ポリープ性の結腸癌、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、様々な癌に関連する遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー病のより大きな危険性を示すＡｐｏＥ４遺伝子のような標的配列を検出することができ、患者、嚢胞性繊維症遺伝子、シトクロムｐ４５０ｓまたは当業者によく知られる他のいずれかの変異を容易に前駆症状スクリーニング(presymptomatic screening)することが可能となる。
【０１００】
さらなる態様において、ウイルスおよび細菌の検出を、本発明の複合体を用いて行う。この態様において、様々な細菌およびウイルス由来の標的配列を検出するためにプローブを設計する。例えば、最新の血液スクリーニング試験は抗ＨＩＶ抗体の検出による。本明細書中に開示する方法により、ＨＩＶ核酸配列、特に高度に保存されたＨＩＶ配列を検出するための臨床サンプルの直接スクリーニングが可能となる。加えて、抗ウイルス治療の効能を評価する改良法のように、これにより患者の体内に循環しているウイルスを直接測定することが可能となる。同様に、白血病、ＨＴＬＶ-ＩおよびＨＴＬＶ-ＩＩと関連するウイルスをこの方法で検出することができる。結核、クラミジアおよび他の性的伝染病のような細菌感染を検出することもできる。
【０１０１】
好ましい態様において、本発明の核酸は、水および食物サンプルのスクリーニングにおいて毒性細菌のためのプローブとして用いる。例えばサンプルを処理して細菌を溶解し、その核酸を放出させ、次いで、サルモネラ(Salmonella)、カンピロバクター(Campylobacter)、ビブリオコレラ(Vibrio cholerae)、リーシュマニア(Leishmania)、イー.コリのエンテロトキシン菌株および在郷軍人病細菌のような病原性菌株を含むがこれらには制限されない細菌株を認識するプローブを設計することができる。同様に、バイオレメディエーション法を本発明の組成物を用いて評価することができる。
さらなる態様において、犠牲者および容疑者から採取したサンプルに対して犯罪事件のＤＮＡ(crime-scene DNA)を対応させるための法医学「ＤＮＡフィンガープリント法」のために該プローブを用いる。
さらなる態様において、アレイ中のプローブをハイブリダイゼーションによる配列決定のために用いる。
【０１０２】
本発明はまた、標的核酸配列における変異またはミスマッチの検出のための方法として用いる。例えば、多型ＤＮＡマーカーを使用することにより遺伝子変異と表現形の間の関係を分析することが近年注目されている。これまでの研究は、多型位置マーカーとして短いタンデムリピート（ＳＴＲｓ）を利用したが、近年は、単一ヌクレオチド多型(polymorphisms)（ＳＮＰｓ）の使用が注目されている。共通のＳＮＰｓは、ヒトのゲノムＤＮＡ１キロベースあたり１以上の平均頻度で生じる。いくらかのＳＮＰｓ、特にコーディング配列内およびその付近のものは、治療的適切な表現形変種の直接原因であるようである。臨床的に重要な表現形を引き起こす多くの周知の多型があり、例えば、ａｐｏＥ２/３/４はアルツハイマーおよび他の疾患（Cordor et al., Science 261(1993)を参照されたい）の異なる相対リスクと関連する。オリゴヌクレオチドアレイに対する配列ハイブリダイゼーションを用いたＳＮＰ位の多重ＰＣＲ増幅は、少なくとも何百のＳＮＰｓを同時にゲノタイピング(genotyping)する迅速かつ信頼できる方法であることが示されている：Wang et al., Science, 280:1077(1998)を参照されたい；さらに、Schafer et al., Nature Biotechnology 16:33-39(1998)も参照されたい。本発明の組成物は従来技術の配列に容易に取って代わることができる。
【０１０３】
好ましい態様において、本発明の組成物を用いて生物活性物質をスクリーニングし、標的分子に結合して好ましくはその機能を変更する物質を見出す。前記のように、当業者には明らかなように、幅広い種類の異なるアッセイフォーマットを作動させてもよい。一般に結合パートナーが所望される標的分析物を標識し、標的分析物を生物活性物質に結合させて標識をビーズに補充し、続いて検出する。
好ましい態様において、生物活性物質と標的分析物の結合は特異的である；つまり、生物活性物質は標的分析物に特異的に結合する。本明細書中、「特異的結合」は、分析物と、試験サンプルの他の成分または汚染物質を分けるのに十分特異的に物質が分析物に結合することを意味する。しかし、当業者には明らかな様に、それほど特異的でない結合を用いて分析物を検出することができるであろう。例えば、該システムは異なる結合リガンド、例えば異なるリガンドのアレイを用いてもよく、特定分析物のいずれの検出も結合リガンドのパネルに結合するその「特徴」によるものであり、「電子ノーズ(electronic nose)」が働く様式と類似している。これは化学分析物の検出において特に利用できる。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄段階を含む（いくらかの態様においては、洗浄段階は必要とされないが）アッセイの条件下で結合を維持するのに、すなわち低い親和性の結合パートナーを検出するのに十分であるべきである。いくらかの態様、例えばある種の生物分子の検出においては、分析物の結合リガンドへの分離定数は１０-4-１０-5Ｍ-1より小さく、約１０‐5-１０-9Ｍ‐1より小さいことが好ましく、１０-7-１０-9Ｍ-1より小さいことが特により好ましい。
【０１０４】
一般に、（標的分析物の検出のための、または、標的分析物の結合パートナーをスクリーニングするための）標的分析物を含むサンプルを、少なくとも一つの生物活性物質に対する標的分析物の結合に適した条件下、すなわち、一般に生理的条件で配列に添加する。標的分析物の存在または不在を次いで検出する。当業者には明らかなように、これは様々な方法で、一般に光学シグナルの変化を用いて行うことが出来る。この変化は、多くの異なるメカニズムにより生じる可能性がある。少数の例としては、ビーズへの色素付けした分析物の結合、ビーズ上または付近での色素種の産生、存在する色素種の破壊、ビーズ上の色素との分析相互作用における光学的サインの変化、またはその他の光学的に応答指令信号を送信可能な事象が含まれる。
【０１０５】
好適な一具体例においては、光学的シグナルの変化は、直接的または間接的に検出可能な標識（好適には蛍光色素のような光学的標識）で標識された標的検体の結合の結果として生じる。したがって、例えば、タンパク質のような標的検体を用いる場合、例えば標識化抗体の使用を介して蛍光（fluor）で直接的または非直接的に標識できる。同様に、核酸は、当業者に既知のように例えばPCR増幅を通じて容易に標識される。別法として、標的配列の結合に基き、ハイブリダイゼーション指示剤を標識として用いることができる。ハイブリダイゼーション指示剤は通常可逆的に、好適に二本鎖核酸と結合する。ハイブリダイゼーション指示剤は、インターカレーター(intercalator)ならびに副溝および／または主溝結合部を含む。好適な一具体例においては、インターカレーターを用いることができる；インターカレーションは通常二本鎖核酸の存在下においてのみ起こるので、標的ハイブリダイゼーションダイゼーションの存在下でのみ標識が明るくなる。したがって、標的検体の生物活性薬剤への結合に基いてこの部位に新たな光学的シグナルが発生し、検出できる。
【０１０６】
別法として、いくつかの場合において、上記のように、酵素のような標的検体は直接的または間接的に光学的に検出できる種を生じる。
【０１０７】
さらに、いくつかの具体例では、光学的サインの変化は光学的シグナルに基きうる。例えば、ある化学的標的検体とビーズ上のある蛍光色素との相互作用は光学的サインを変化させることができ、したがって異なる光学的シグナルを生じる。
【０１０８】
当業者に理解されるように、いくつかの具体例では、標的検体の存在または不在は、他の光学的または非光学的シグナル（表面増強ラマン分光法、表面プラズモン共鳴、放射活性等を含むが、これに限定されるものではない）における変化を用いてなされうる。
【０１０９】
当業者に理解されるように、アッセイは様々な実験条件下で実施できる。スクリーニングアッセイにおいて、種々の他の試薬が含まれうる。これらは最適なタンパク質−タンパク質結合を促進し、および／または非特異的もしくはバックグラウンドの相互作用を減少させるために用いることができる塩、中性タンパク質（例、アルブミン、界面活性剤等）のような試薬を包含する。また、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等のような、別の方法でアッセイの効率を改良する試薬も用いることができる。成分の混合物は、必要な結合を与える任意の順番で添加できる。当業者に知られているように、種々のブロッキングステップおよび洗浄ステップを用いることができる。
【０１１０】
好適な一具体例では、２色拮抗ハイブリダイゼーションアッセイを実行する。これらのアッセイは慣用のサンドイッチアッセイに基くことができる。ビーズはＳＮＰの片側（上流または下流）に位置する捕獲配列を含み、標的配列を捕獲できる。各々異なるフルオロフォアで標識した２つのＳＮＰ対立遺伝子特異的プローブを標的配列にハイブリダイズさせる。通常、より良い結合を示す較正アレイを用いて、２つのシグナルの比率から遺伝子型を得ることができる。さらに、プローブは拮抗するので、これは結合条件を最適化する必要がないことを意味する。ミスマッチのプローブが安定して結合する条件下で、マッチしたプローブをさらに置き換えることができる。したがって、拮抗アッセイはそれらの条件下でより良い識別を与えることができる。多くのアッセイを平行して実施するので、全てのプローブについて条件を同時に最適化することはできない。したがって、拮抗アッセイシステムを用いて、ミスマッチ識別についての非最適条件を補うことを補助するために用いることができる。
【０１１１】
好適な一具体例においては、本発明の組成物を用いてジデオキシヌクレオチド チェーン ターミネーション配列決定を行う。この具体例においては、ＤＮＡポリメラーゼにより蛍光的に標識したｄｄＮＴＰを用いてプライマーを延長する。該プライマーの３’末端はＳＮＰ部位近傍に位置する。この方法において。単塩基の延長は該ＳＮＰ部位の配列に相補的である。各塩基について１つの、４つの異なったフルオロフォアを用い、４つの塩基特異的シグナルを比較することによりＳＮＰの配列を導き出すことができる。これはいくつかの方法で行うことができる。第１の具体例では、捕捉プローブを延長できる；このアプローチでは、プローブはビーズ上の合成５’−３’であるか、５’末端に結合されポリメラーゼ延長のための遊離３’末端を与えなければならない。別法として、サンドイッチ型アッセイを用いることができる；この具体例では、プローブによって標的をビーズ上に捕捉し、ついでプライマーをアニーリングさせ、延長させる。また、後者の場合、標的配列は標識されていなくてもよい。さらに、サンドイッチアッセイは２つの特異的相互作用を必要とするので、このプローブは特に複合試料の分析に有益な特異性を増加させる。
【０１１２】
さらに、標的検体およびＤＢＬの双方が試薬に結合する場合、解読の拮抗を介して非標識化標的検体の検出を行うことも可能である。
【０１１３】
好適な一具体例においては、本発明の方法はアレイ品質管理において有益である。本発明以前には、全アレイ上の全プローブのパフォーマンスのポジティブテストを提供する方法は開示されていない。アレイの解読がこのテストを与えるだけではなく、その解読プロセス自身で生じたデータを利用することによってもそのようにする。したがって、さらなる実験作業は要求されない。本発明はソフトウエアにコードできる１組のデータ分析アルゴリズムのみを必要とする。
【０１１４】
品質管理処置はアレイ中の広範な体系的およびランダムな問題を同定できる。例えば、塵または他の汚染のランダムな点はいくつかのセンサーに正しくないシグナルを与えさせうる−これは解読の間検出できる。複数のアレイに由来する１以上の作用因の遺漏もまた検出できる；すなわち本明細書中に定式化されたアレイはランダムに自己集合するので、各センサー要素の異なった統計学上の分配を含むアレイを作ることができる；理想的な分配ではない「ソーティング」アレイから良い分配を有する「ソーティング(sorting)」アレイについて、アレイ上の実際のＱＣを可能にする。これらの処置はビーズを含まない部位の決定も可能にする。
【０１１５】
この品質管理処置の利点は、アッセイ自体の直前に（いくつかの例では直後に）実行でき、個々のセンサーの真の機能試験であることである。したがって、アレイアセンブリ(assembly)と実際の使用との間で生じうるあらゆる問題を検出できる。非常に高レベルの信頼性が必要で、および／または実験手順の進行中にセンサーの故障の重大な可能性がある場合の適用において、解読と品質管理は実際の試料分析の前後両方で実施できる。
【０１１６】
好適な一具体例においては、アレイを用いて試薬品質管理を行うことができる。多くの例では、生物学的な巨大分子が試薬として用いられ、また品質管理されなければならない。例えば、オリゴヌクレオチドプローブの大きな組が試薬として提供されうる。多数の異なった生物学的な巨大分子において品質管理を実行することは通常困難である。例えば、多集団の異なったランダムオリゴヌクレオチドを合成する場合、各集団が示すものをチェックすることが望ましい。本明細書に記載したアプローチを用いて、アレイの代わりに変化可能である試薬（ＤＢＬとして定式化した）を処理することによってこれをなすことができる。
【０１１７】
好適な実施例においては、本明細書に記載した方法をアレイ較正に用いる。ｍＲＮＡ定量のような多くの適用にとって、標的検体の濃度に対して線形応答であるシグナルを有するか、または別法として、非線型であっても濃度とシグナルとの間の関係を決定し標的検体の濃度を評価できることが望ましい。例えば、異なるプローブはハイブリダイゼーション効率等において違いを示し、実験条件下で適当なプローブを選択できることが望ましい。したがって、例えば、発現プロファイリング（profiling）をする場合、および定量が望ましい場合、較正曲線を作成し、個々のプローブがどのように反応するかを調べ、最良の応答（すなわち、目的の濃度と条件での直線性）を与えるプローブをさらなるアッセイのために選択することができる。したがって、本発明は、アレイにおける複数のビーズについて平行して較正曲線を作成する方法を提供する。分析する試料の複雑さをシミュレートする条件下で較正曲線を作成できる。各曲線は他の曲線（例えば、異なる濃度範囲について）と独立して、アレイについての他の全曲線と同時に構築できる。
【０１１８】
したがって、これらの具体例において、異なるタイプの実験をすることができる。例えば、逐次的な解読計画を異なるフルオロフォアではなくコード「標識」として用いられる異なる濃度で実行できる。この方法において、濃度に対する応答としてのシグナルは各ビーズについて測定できる。この較正はアレイの使用直前に実施でき、全アレイ上の全プローブは必要に応じて個々に較正できる。別法として、解読プローブの異なる濃度が異なるラベルを有することもできる。
【０１１９】
アッセイ較正方法が同様に非ランダムアレイにおける使用を提供する；すなわち、同様にこれらの方法を用いて他のタイプの支持体結合核酸アレイを較正できることに注目すべきである。したがって、例えば、プローブの濃度が異なる、異なるプールのプローブのバイオチップへの逐次的添加はあらゆるアッセイシステムの較正を可能にする。このタイプの分析は品質管理についての非ランダムアレイにおいても実施でき、支持体結合プローブの完全性と配列を保証し、アッセイ開発においては良いプローブを同定する。
【０１２０】
好適な一具体例においては、本発明の方法を同様にアッセイ開発に用いることができる。したがって、例えば、該方法は良いプローブおよび悪いプローブの同定を可能にする；当業者に理解されるように、いくつかのプローブはうまくハイブリダイズしないかまたは１以上の配列とクロスハイブリダイズするので、うまく機能しない。これらの問題は解読の間に容易に検出される。プローブの性能を迅速に評価する能力はアッセイ開発の時間と費用を大きく減少させる可能性を有する。したがって、濃度と直線的に反応し、低い非特異的結合を示し、または特定の範囲でシグナルを与えるプローブを選択して、アッセイのための新しいアレイへ添加できる。
【０１２１】
同様に、好適な一具体例において、本発明の方法はアッセイ開発での定量において有益である。多くのアッセイの主要なチャレンジは試料間の検体濃度における相違を検出する能力、これらの相違を定量する能力、および検体、関係する検体の複合混合物の存在下での全て、の絶対濃度の測定である。この課題の例は全細胞性ｍＲＮＡの存在下における特異的ｍＲＮＡの定量である。ｍＲＮＡ定量の基礎として開発された１つのアプローチは、複数のマッチしたプローブ対とミスマッチのプローブ対を利用する（Lockhartら、１９９６）（出典明示によって本明細書中にその内容を完全に取り込む）。このアプローチは単純であるが、比較的多数のプローブを必要とする。このアプローチにおいて、濃度に対する定量的応答は、目的の遺伝子または配列に対する１組の異なるプローブからのシグナルを平均することによって得られる。一部のプローブのみが定量的に応答し、これらのプローブを確実に予測することはできないので、このことは必須である。事前の知識がない場合、適切に選択されたプローブのコレクションの平均応答のみが定量的である。しかしながら、本発明においては、他のアッセイと同様にアッセイに基いた核酸への一般的な適用が可能である。要するに、そのアプローチは特定のアッセイにおいて定量的に応答するプローブを同定することであり、他のプローブとの平均ではない。これは、濃度に基いたコードを用いる上記のアレイ較正計画によって行われる。各および全配列を有効な方法でテストできるので、このアプローチの利点には；より少いプローブしか必要でないこと；測定の正確さが用いられるプローブの数にあまり依存しないこと；およびセンサーの応答が高度な正確さで知られることがある。特に複雑な配列混合物中において、プローブ性能の予測の困難性と不確実性を避ける、うまく機能するプローブは経験的に選択されることに注目することは重要である。対照的に、順番のアレイを用いる、これまでに記載された実験においては、混合物へ既知のｍＲＮＡを添加する定量的なスパイク（spiking）実験の実施によって比較的少数の配列がチェックされる。
【０１２２】
好適な具体例においては、ＲＮＡ発現プロファイリングのためにｃＤＮＡアレイを作成する。この具体例においては、宿主ベクター系において増殖させたｃＤＮＡから個々のｃＤＮＡクローンを増幅する（例えば、ＰＣＲを用いて）。各増幅ＤＮＡをビーズの集団に結合させる。異なる集団を一緒に混合し、ｃＤＮＡライブラリーを示すビーズのコレクションを作成する。該ビーズをアレイにし、上記のように解読し、アッセイに用いる（本明細書中に記載したが、同様に解読はアッセイ後に生じても良い）。抽出され、必要に応じて標識され、アレイにハイブリダイズしたＲＮＡ試料（全細胞またはｍＲＮＡ）を用いてアッセイを行う。拮抗分析は、個々のＲＮＡの発現レベルにおける相違の検出を可能にする。適当な１組の較正標準との比較は、ＲＮＡの絶対量の定量を可能にする。
【０１２３】
また、ｃＤＮＡアレイをマッピングに用いて、例えば欠失／挿入をマッピングし、または例えば腫瘍や他の組織試料由来のゲノム中のコピー数の変化をマッピングできる。これは、ゲノムＤＮＡのハイブリダイズによって行うことができる。ｃＤＮＡ（またはＥＳＴ等）の代わりに、ランダムゲノム断片を含むその他のＳＴＳ（配列タグ部位）をこの目的でアレイにすることもできる。