(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の組換え宿主細胞においてプロテインＣの生産性を増大させる方法であって、アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の該組換え宿主細胞を３８〜３９℃の温度で培養することを特徴とする方法。
【請求項２】
哺乳類の組換え宿主細胞が２９３細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インキュベーション温度が３８℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
インキュベーション温度が３９℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インキュベーション温度が３８℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
インキュベーション温度が３８.５℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
インキュベーション温度が３９℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
組換えにより調製されたプロテインＣ分子のγ−カルボキシル化のレベルを向上させる方法であって、組換えにより調製された該プロテインＣ分子を組換えＡＶ１２宿主細胞において３８〜３９℃の温度で培養することを特徴とする方法。
【請求項９】
組換えＡＶ１２宿主細胞を３８℃で培養する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
組換えＡＶ１２宿主細胞を３９℃で培養する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、分子生物学、特に哺乳類の細胞系において機能的な組換えプロテインＣを高レベルで製造する方法に関する。
【０００２】
タンパク質の多くは、成熟する過程で広範囲にわたって翻訳後修飾を受ける。ヒトプロテインＣ(ＨＰＣ)は、ＲＮＡの一次転写体が翻訳される過程で、もしくは翻訳の直後に、γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化およびグリコシル化される。シリアンハムスターＡＶ１２細胞系といったような細胞系の多くは、こういった翻訳後修飾を有効にプロセシングし得ないことから、これら細胞系において製造されるプロテインＣ分子は十分に機能的であるというわけではない。ヒト腎臓２９３細胞系といったような他の細胞系では、十分に機能的なプロテインＣ分子が製造されるが、これら細胞系におけるプロテインＣ分子の発現レベルは幾分低い。本発明は、通常では十分に機能的な分子を製造することのない細胞系において、十分に機能的なプロテインＣの製造レベルを向上する方法に関する。本発明はまた、通常でも十分に機能的な分子を製造する細胞系において、プロテインＣ分子の全製造レベルを向上する方法にも関する。本発明の方法は、プロテインＣを産生する細胞系を、３７℃という通常のインキュベーション温度以上の温度で培養することに関する。
【０００３】
本明細書で用いる用語を以下のように定義する。
【０００４】
〈アデノウイルスにより形質転換された細胞系〉
アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子産物を発現する細胞系。
【０００５】
〈ヒトプロテインＣ〉
ヒトプロテインＣチモーゲンおよび活性化ヒトプロテインＣ。
【０００６】
〈形成期タンパク質〉
ｍＲＮＡの転写体が翻訳されることにより製造されたポリペプチドであって、翻訳後修飾を受ける前のもの。ただし、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、およびアスパラギン酸残基のヒドロキシル化といったような翻訳後修飾は、ｍＲＮＡの転写体からタンパク質が完全に翻訳される前に開始されていてもよい。
【０００７】
〈プロテインＣ活性〉
タンパク質分解、アミド分解、エステル分解、および生物学的(抗凝血またはプロフィブリン分解)活性に関与するヒトプロテインＣの特性。タンパク質抗凝血活性の試験法は、当業界にて周知である［すなわち、グリンネル(Ｇrinnell)らの「バイオ／テクノロジー(Ｂio／Ｔechnology) ５」(１９８７、１１８９〜１１９２)を参照］。
【０００８】
〈チモーゲン〉
タンパク質分解酵素の酵素的に不活性な前駆体。ここで使用するプロテインＣチモーゲンは、分泌される１鎖または２鎖の不活性型プロテインＣである。
【０００９】
本明細書で用いるアミノ酸の略号は全て、３７、Ｃ.Ｆ.Ｒ.、§１.８２２(ｂ)(２)(１９９０)で詳述されているように、米国特許商標局が認可したものである。
【００１０】
本発明は、アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の組換え宿主細胞においてプロテインＣの生産性を増大させる方法に関する。この方法は、アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の組換え宿主細胞を約３８〜約３９℃の温度で培養することから成る。本発明はまた、アデノウイルスにより形質転換された哺乳類の組換え宿主細胞において機能的なプロテインＣの生産性を増大させる方法にも関し、この方法もまた、宿主細胞を約３８〜約３９℃の温度で培養することから成る。
【００１１】
組換えヒトプロテインＣを製造するのに多くの細胞系が使用されている。しかし、ヒトプロテインＣ分子は、広範囲にわたって翻訳後修飾を受けるので、通常の細胞系のほとんどでは、十分に機能的なプロテインＣを製造することがないか、もしくは細胞系により十分に機能的なプロテインＣ分子が製造されても、発現または分泌レベルは依然としてかなり低いままである。例えば、シリアンハムスターＡＶ１２細胞系では、通例、十分な活性に必要である９つ全てのγ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するプロテインＣ分子を産生することはできない。他方、ヒト胚腎臓２９３細胞にて産生されるプロテインＣ分子は、通例、完全にγ−カルボキシル化およびβ−ヒドロキシル化されているが、これら細胞系から産生されるヒトプロテインＣのレベルはかなり低い。
【００１２】
普通、哺乳類の細胞培養は３７℃でインキュベートする。ヒトプロテインＣ遺伝子をコードしているプラスミドを含有する、アデノウイルスにより形質転換されたシリアンハムスターＡＶ１２−６６４細胞系(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ９５９５)を３７℃でインキュベートした場合、この細胞系では完全にγ−カルボキシル化されたプロテインＣが４０〜５０％しか製造されないことから、結果として粗製の培養培地におけるプロテインＣの機能性は低いものとなった。これと同じ細胞系を３８.５〜３９℃でインキュベートした場合、ならし培地における分泌されたプロテインＣの機能的な抗凝血活性は上昇した。高温でインキュベートしたこの細胞系から得られるプロテインＣの分泌率は、３７℃でインキュベートした細胞系から得られる分泌率より約２０〜３０％低かったが、このような分泌率の低下は、分泌されたプロテインＣの機能性が増大することにより相殺される。
【００１３】
ヒト腎臓２９３細胞(ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３)は、アデノウイルス５型のトランスホーミング遺伝子を含有して発現する形質転換された初代ヒト胚腎臓細胞である。これらの細胞は、幾つかの重要な遺伝子産物を発現するのに使用され、また研究用や工業的に多くのいろいろな実験室で使用されてきた。例えば、ヤン(Ｙan)の米国特許第４,９８１,９５２号およびバング(Ｂang)らの米国特許第４,９９２,３７３号は共に、ヒトプロテインＣを産生するために２９３細胞系を使用することを開示している。ヒト胚腎臓２９３細胞系は、ヒトプロテインＣ遺伝子をコードする発現プラスミドを担持する場合、完全にγ−カルボキシル化されたヒトプロテインＣを分泌する。３７℃で培養した場合、この２９３細胞系は、比活性が約３５０Ｕ／mgである組換えヒトプロテインＣを分泌した。(この細胞系から得られるプロテインＣは、もはや完全にγ−カルボキシル化されているので、)これら組換え２９３細胞の発育温度を上げても、分泌されるプロテインＣの機能性を向上する結果とはならなかった。しかし、３８〜３９℃で発育させた組換え２９３細胞は、３７℃で発育させた同じ細胞に比べてプロテインＣの分泌率を増大させることを示した。本発明の開示目的として、プロテインＣの生産性を増大させるということは、細胞系からの総プロテインＣ分泌を増大させるということ、または分泌されたプロテインＣの機能性を向上させることを意味し得る。
【００１４】
当業者には、本発明が、アデノウイルスにより形質転換されたヒト胚腎臓細胞系またはアデノウイルスにより形質転換されたシリアンハムスターＡＶ１２−６６４細胞系の使用に限定されるものではないことは理解されよう。哺乳類の細胞系の多くは、ヒトプロテインＣを製造するのに利用できる。例えば、ＨepＧ２細胞系は、ヒトプロテインＣを製造するのに使用されてきたヒト肝細胞系である。またＢＨＫ(ベビーハムスターの腎臓)細胞系、ＳＡ７細胞系、ＳＶ２０細胞系、ＦＡＺＡ細胞系、およびＭＫ２細胞系も、ヒトプロテインＣを製造するのに使用されてきた。前文中に挙げた全ての細胞系がアデノウイルスにより形質転換された細胞系であるというわけではないが、当業者には、多くの哺乳類の細胞系がアデノウイルスにより形質転換して、アデノウイルスにより形質転換された特定の細胞系を創製することができ、これを本発明の方法で使用できるということが分かる。
【００１５】
また本発明が、３８〜３９℃という温度のみに限定されるものではないことも理解されるべきである。哺乳類の発酵のほとんどは３７℃で行われるが、発酵温度が約３８℃であると、アデノウイルスにより形質転換された細胞におけるプロテインＣの産生がより高レベルなものとなることが分かっている。そういった多くの発酵タンクや温室内では温度が０.５℃程度上下することがあることから、「約」という用語は、規定温度から±０.５℃の範囲内の温度として考えるべきである。従って、「約」３８℃という用語は、３７.５〜３８.５℃にまで及び得る。さらに、「約」３９℃という用語は、３８.５〜３９.５℃にまで及び得る。インキュベーション温度が約４０℃に達すると、哺乳類の細胞のほとんどは十分に発育しない。本発明の方法にとって好ましい温度は、約３８〜約３９℃に及ぶが、本発明の最も好ましい態様は、アデノウイルスにより形質転換された細胞系のインキュベーション温度が約３９℃の場合であることが見いだされている。
【００１６】
当業者はまた、本発明の方法により、プロテインＣを高いレベルで発現するクローンをより容易に選択できるようになることも認識するであろう。例えば、細胞系から分泌されるプロテインＣのレベルが向上すると、粗製の培地におけるその分子をより容易にアッセイできるようになることから、最も高いレベルで所望の産物を発現するクローンを選択するのがより容易になる。３９℃で単離したクローンに関する発現レベルの平均増加は、３７℃で単離したクローンに比べて、約６９〜９３％も上がる。
【００１７】
本発明を説明するために以下に実施例を記載するが、これは本発明を限定しようとするものではない。
【００１８】
【実施例】
実施例 １
２９３細胞におけるヒトプロテインＣの製造
ヤンの米国特許第４,９８１,９５２号［ここに記載された全ての教示は引用によって本明細書に包含される］で詳述された当業者に周知の技法により、組換えヒトプロテインＣ(ｒＨＰＣ)をヒト腎臓２９３細胞にて調製した。ヒトプロテインＣをコードしている遺伝子は、バングらの米国特許第４,７７５,６２４号［引用によって本明細書に包含される］に開示され特許請求されている。２９３細胞にてヒトプロテインＣを発現するのに使用するプラスミドは、バングらの米国特許第４,９９２,３７３号［引用によって本明細書に包含される］に開示されているプラスミドpＬＰＣであった。またプラスミドpＬＰＣの構築は、欧州特許公開第０４４５９３９号、およびグリンネルらの「Ｂio／Ｔechnology ５」［１９８７、１１８９〜１１９２］［これらは引用によって本明細書に包含される］にも記載されている。簡単に言えば、プラスミドpＬＰＣを２９３細胞へトランスフェクションした後、安定な形質転換細胞を同定して、継代培養する。最も高い発現レベルを示すクローンに、いろいろな名称(例えば、ＣＣ３５およびＣＣ３１−１)を付与し、標準的な細胞培養条件下に発育させた。あるいはまた、安定に形質転換された細胞系 ＧＴ−２１を調製するのに、プラスミドpＧＴＣを使用した。プラスミドpＧＴＣの構築は、欧州特許公開第０４４５９３９号に開示されている。３７℃で発育させた後、ヤンの米国特許第４,９８１,９５２号に記載されている技法により、ヒトプロテインＣを培養液から分離することができる。そのようにして調製されたヒトプロテインＣは、不活性化チモーゲンの形で使用することができ、または当業者に周知の手法により活性化することができる。また同じ条件下、３９℃で、同じクローンを発育させた。結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
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いろいろな細胞密度で細胞を発育させ、従って細胞(例えば、ＣＣ３５)ごとに異なる発現レベルとなったとしても、３９℃における分泌の増加％が一貫して認められた。
【００２０】
実施例 ２
ＡＶ１２−６６４細胞におけるヒトプロテインＣの調製
ヒト胚腎臓２９３細胞ではなく、シリアンハムスターＡＶ１２−６６４細胞を使用することを除き、実質的に実施例１の教示に従い、プラスミドpＬＰＣを用いてヒトプロテインＣを調製した。グリンネルらの「Ｂio／Ｔechnology ５」［１９８７、１１８９〜１１９２］に記載されている技法により、機能的な抗凝血活性を測定した。結果を表２に示す。
【００２１】
【表２】
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