(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ白血球を活性化してイヌ腫瘍細胞を障害する能力を有し、かつ配列番号：１または配列番号：１１に示すアミノ酸配列を有するＰ４０サブユニットおよび配列番号：２または配列番号：１２に示すアミノ酸配列を有するＰ３５サブユニットからなるイヌインターロイキン１２。
【請求項２】
Ｐ４０サブユニットが、配列番号：３に示すＤＮＡ配列および配列番号：４に示すＤＮＡ配列をプライマーとして用いて、イヌｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより得られる配列番号：１に示すＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列、または配列番号：１を含むＤＮＡ断片を標識したプローブを、イヌｃＤＮＡから作製したファージライブラリーをプラークとして形成させ転写したフィルターとハイブリダイズさせることにより得られる配列番号：１１に示すＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のイヌインターロイキン１２。
【請求項３】
Ｐ３５サブユニットが、配列番号：５に示すＤＮＡ配列および配列番号：６に示すＤＮＡ配列をプライマーとして用いて、イヌｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより得られる配列番号：２に示すＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列、または配列番号：２を含むＤＮＡ断片を標識したプローブを、イヌｃＤＮＡから作製したファージライブラリーをプラークとして形成させ転写したフィルターとハイブリダイズさせることにより得られる配列番号：１２に示すＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を有する請求項１に記載のイヌインターロイキン１２。
【請求項４】
請求項１または２に記載されるP４０サブユニットをコードする配列番号：１または配列番号：１１に示すＤＮＡ配列。
【請求項５】
請求項１または３に記載されるP３５サブユニットをコードする配列番号：２または配列番号：１２に示すＤＮＡ配列
【請求項６】
配列番号：１または配列番号：１１に示すＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項７】
配列番号：２または配列番号：１２に示すＤＮＡ配列を含む組換えベクター。
【請求項８】
配列番号：１および配列番号：２に示すＤＮＡ配列をそれぞれ同時に含む組換えベクター。
【請求項９】
配列番号：１１に示すＤＮＡ配列と配列番号：１２に示すＤＮＡ配列を同時に含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項６から９のいずれかに記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
【請求項１１】
請求項６に記載の組換えベクターおよび請求項７に記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換してなる形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０または請求項１１に記載の形質転換体を培養又は飼育し、イヌインターロイキン１２を採取することを特徴とする、イヌインターロイキン１２の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質の一次構造がイヌの遺伝情報由来であるイヌインターロイキン１２（以下、ＣａＩＬ１２と略す）を遺伝子操作技術により量産し、以って動物用医薬品（抗腫瘍・抗ウイルス・ワクチンアジュバント）とする事を目的とした、プラスミド、形質転換体、ＣａＩＬ１２およびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン１２は、分子量約４０ｋＤ蛋白質（以下Ｐ４０と略記する）と約３５ｋＤ蛋白質（以下Ｐ３５と略記する）とのヘテロダイマーよりなり、ナチュラルキラー細胞および１型ヘルパーＴ細胞を活性化するなどの生理活性作用を有するサイトカインで、ＩＬ１２と略記され、例えば文献１のようにこれまでいくつかの文献が出版されている。  遺伝子操作技術によりヒトのＩＬ１２以外にもマウス（文献２）、ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  データベース  登録番号Ｕ１１８１５およびＵ１４４１６）のＩＬ１２のｃＤＮＡもクローニングされ、腫瘍やウイルス病などの治療薬として用途開発研究が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかるに、イヌのＩＬ１２がクローニングされたという報告は未だない。
【０００４】
イヌには、乳腺腫瘍など多数の腫瘍、パルボウイルス感染症、ジステンバー感染症など多数のウイルス病、アレルギー性の皮膚炎などが知られている。
【０００５】
そこで、イヌのＩＬ１２が容易に入手可能となれば、イヌの抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウイルス剤としての用途が開かれると期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる状況に鑑みＣａＩＬ１２ｃＤＮＡのクローニングおよびそれを用いた大量生産を目的とし、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからＣａＩＬ１２のＰ４０とＰ３５をコードするそれぞれの遺伝子をクローニングすることに成功し、更にはこれらを発現ベクターに連結した２つのプラスミドを用いてＣａＩＬ１２を生産する細胞の作製に成功し、以って簡単に大量にＣａＩＬ１２を製造する方法を確立し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ＣａＩＬ１２を生産させるプラスミド、これらのプラスミドを有する大腸菌の形質転換体、およびこのプラスミドにより形質転換された動物細胞、並びにこれらの形質転換体から得られるＣａＩＬ１２を提供するものである。さらに本発明はＣａＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子も提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のＣａＩＬ１２蛋白質の２つのサブユニットをそれぞれコードするＤＮＡを組込んだプラスミドは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、ウシやヒトのＩＬ１２の２つのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことによってＣａＩＬ１２活性を示す２つのサブユニットをそれぞれコードする２つの遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡ組換え体よりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた２つの遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡとＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【０００９】
イヌの臟器や細胞、例えばマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球などよりＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ臟器やイヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献３）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献４），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１０】
イヌ臟器やマイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献５），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献６）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００１１】
このｃＤＮＡを鋳型としてヒト、マウスおよびウシの塩基配列を基にしたプライマーを用いてＰＣＲを行うことによってＣａＩＬ１２活性を示すＰ４０サブユニットおよびＰ３５サブユニットをコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、ＣａＩＬ１２Ｐ４０ｃＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１２】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ），バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨトウガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ），キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ），カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ），動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００１３】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウイルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばａｄｈ１プロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられるが、これらに限定されない。  発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
【００１４】
産生されたＣａＩＬ１２は，非還元下、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定すると、見かけの分子量が約７０〜８０ｋＤである。
【００１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、７０〜８０ｋＤのバンドが、還元条件下では分子量約４０ｋＤと約３５ｋＤの２つのサブユニットを生じる。
ＣａＩＬ１２は、以下の実施例２で示すように、イヌ白血球からのイヌインターフェロンγ誘導能およびフィトヘムアグルチニンン（以下ＰＨＡと略記する）で刺激されたイヌリンパ球の増殖促進効果により主に特性化される。その他、ＮＫ細胞や細胞障害性Ｔ細胞を活性化してそれらの標的細胞、例えば腫瘍由来のセルラインまたはウイルス感染した線維芽細胞を融解する活性を有する。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００１７】
実施例１
ＣａＩＬ１２Ｐ４０、Ｐ３５遺伝子のクローニング
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ肝臓、ＬＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）で４８時間刺激したイヌ末梢血単核球およびニワトリニューカッスル病ウイルスで７時間処理した（１０７  ｐｆｕ／ｍｌ）イヌ脾臓由来リンパ球よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略記する。）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ＤＴＴを２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００１８】
（２）イヌｃＤＮＡファージライブラリーの調製
上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ１μｇづつを用い、ファルマシア社のタイムセーバーｃＤＮＡ合成キットにて添付のマニュアルに従い、オリゴｄＴプライマーを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、さらにＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを連結した。これを用いて、アマシャム社のｃＤＮＡラピットクローニングモジュール−λｇｔ１０にて添付のマニュアルに従い、組換えλｇｔ１０ベクターを作製し、さらにアマシャム社のインビトロパッケージングモジュールにて添付のマニュアルに従い、組換え体ファージ作製した。
（３）ＣａＩＬ１２Ｐ４０遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ４０のＮ末端およびＣ末端の塩基配列（文献１）をもとに、
５´ＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴ３´（配列番号３）
と
５´ＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡ３´（配列番号４）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ肝臓およびＬＰＳ刺激イヌ末梢血より得られたｃＤＮＡを別々の０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサーマルサイクラーを用い、３５サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献７）に従って調製した。
【００１９】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、Ｇｅｎｅｓｉｓ２０００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（デュポン社）を用いて、ダイデオキシ法（文献９）でＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号１に示す。また、この配列を含む、９９０ｂｐのＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて３２Ｐを標識し、プローブを作製した。上記（２）で得られたイヌ肝臓ｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを大腸菌ＮＭ５１４上でプラークとして形成させ、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＨ２  ＰＯ４  ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、ついで同じ溶液中で上述のようにして作製した標識プローブ１×１０６  ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズさせた。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。陽性のシグナルを有するプラークは常法に従い、再スクリーニングを行った。３回のスクリーニングの結果、陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージを得た。この組換え体ファージより常法に従ってファージＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られたＤＮＡ断片を常法に従い調製し、宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて、宝酒造（株）のｐＵＣ１１８ＢＡＰ処理ＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ）と連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを常法により調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ４０をコードする配列を配列番号１１に示す。
【００２０】
（４）ＣａＩＬ１２Ｐ３５遺伝子のクローニング
ヒトＩＬ１２Ｐ３５のＮ末端（文献１）およびウシＩＬ１２Ｐ３５のＣ末端の塩基配列をもとに、
５´ＡＧＣＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧ３´（配列番号５）
と
５´ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴ３´（配列番号６）
の２種類のプライマ−をＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）の鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡを鋳型として上記（３）と同様にして約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、ＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡの塩基配列を決定した。この配列を配列番号２に示す。また、この配列を含む約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を用いて標識プローブを作製した。上記（２）で得られた鶏ニューカッスル病ウイルスで処理したイヌ脾臓由来リンパ球より得られたｃＤＮＡから作製した組換え体ファージライブラリーを上記（３）と同様にして標識プローブとハイブリダイズさせ、スクリーニングを行った。その結果得られた陽性シグナルを有する１個の組換え体ファージよりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、１％アガロースゲル電気泳動にて得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩのＮｏｔＩサイトに常法に従い連結した。これを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、蛍光ＤＮＡシーケンサーを用いて、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。このうち、ＣａＩＬ１２Ｐ３５をコードする配列を配列番号１２に示す。
【００２１】
実施例２
ＣａＩＬ１２の生産
（１）ＣａＩＬ１２発現ベクターの調製
発現ベクターｐＣＤＬ−ＳＲα２９６（文献９）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、バクテリア由来アルカリホスファターゼで末端を脱リン酸化した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。一方、ＣａＩＬ１２Ｐ４０  ＤＮＡ断片は
５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧＧ３´（配列番号７）
と
５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号８）
の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ４０サブユニットＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡの変性条件を９４℃、１分、プライマーのアニーリング条件を５５℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃，３分、サイクル数３０でＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動にて約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
５´ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＧＧ３´（配列番号１３）
と
５´ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴ３´（配列番号１４）
の２種類のＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩで切断し、約９９０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のようにして調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＣａＩＬ１２Ｐ４０を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０ＦＬを得た。また、ｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を制限酵素ＰｓｔＩで切断し脱リン酸化後、電気泳動にて約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＣａＩＬ１２Ｐ３５
ＤＮＡ断片は
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣ３´（配列番号９）
と
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１０）
の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（３）で調製したＴ−Ｖｅｃｔｏｒに挿入したＣａＩＬ１２活性を示すと思われる２つのサブユニットのうち一方のＰ３５サブユニットＤＮＡを鋳型として、９４℃，１分、５５℃，２分、７２℃，３分、３０サイクルでＰＣＲを行い、エタノール沈殿後、制限酵素ＰｓｔＩで切断した。これを１％アガロースゲル電気泳動にて約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。また、
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＧ３´（配列番号１５）
と
５´ＧＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴ３´（配列番号１６）
の２種類のＰｓｔＩ切断部位を付加したプライマーを作製し、実施例１（２）で調製したｐＵＣ１１８に挿入したＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰｓｔＩで切断し、約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。得られたそれぞれのＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて上述のように、ＰｓｔＩで切断し調製したｐＣＤＬ−ＳＲα２９６に連結、大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ調製を行い、ＣａＩＬ１２Ｐ３５を発現するＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５ＦＬを得た。
【００２２】
さらに、作製したこれら４つの発現プラスミド中のＣａＩＬ１２Ｐ４０ＤＮＡおよびＣａＩＬ１２Ｐ３５ＤＮＡの塩基配列を確認した。
【００２３】
（２）サルＣＯＳ細胞でのＣａＩＬ１２の生産
上記（１）で得られたそれぞれ５μｇのＦＯＣａＩＬ１２Ｐ４０およびＦＯＣａＩＬ１２Ｐ３５を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥデキストラン（ファルマシア製）および１００μＭのクロロキン  （シグマ社）を含む４ｍｌのＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）製）に加えておく。一方、直径１０ｃｍのディッシュを用いて１０％ウシ胎児血清（ギブコ社、以下ＦＢＳと略記する）を含むＥＲＤＦ培地で５０％コンフルエントになるまで増殖させたＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）をＰＢＳで一回洗浄した後、上記で得た４ｍｌのＤＮＡ混合液を加え、５％ＣＯ２  、３７℃の条件で培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地にて５％ＣＯ２  ，３７℃の条件で４日間培養し、ＣａＩＬ１２が生産された培養上清を得た。
【００２４】
（３）ＣａＩＬ１２の活性測定
上記（２）で生産されたＣａＩＬ１２の活性測定は以下のようにして行った。イヌリンパ球からのイヌインタ−フェロンγ誘導活性検定のために、抗ウイルス活性およびイヌ細胞のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。
【００２５】
イヌ脾臓よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち２．５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これに上記（２）で得られた培養上清２．５ｍｌを加え、５％ＣＯ２  、３７℃の条件で２日間培養し、ウイルスとしてＶｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ，感受性細胞としてＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）を用い、文献１０のＣＰＥ法に従ってこの培養液の抗ウイルス活性を測定した。その結果、１０５  希釈単位／ｍｌ以上の抗ウイルス活性が確認された。一方、１０μｇのｐＣＤＬ−ＳＲα２９６を上記（２）と同様にＣＯＳ−１細胞に導入したコントロールの細胞培養液では抗ウイルス活性の誘導能は認められなかった。
【００２６】
また、クラスＩＩＭＨＣを発現したイヌ乳腺腫瘍組織由来細胞株ＦＣＢＲ１を用いて，上記のイヌ脾臓リンパ球培養上清のクラスＩＩＭＨＣ発現増強活性を測定した。６ｃｍディッシュに１０５  ｃｅｌｌｓのＦＣＢＲ１を接着させ、これにＣａＩＬ１２で刺激したイヌ脾臓リンパ球培養上清５ｍｌを添加し、５％ＣＯ２  、３７℃の条件で１晩培養した。培養後、トリプシンにて細胞を剥離し、１．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブにて遠心した。これに１０μｌのラット抗イヌＭＨＣクラスＩＩモノクロ−ナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を添加し、さらに５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗ラットモノクロ−ナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）および５０μｌの１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳｃａｎにて解析した。その結果、ＣａＩＬ１２で刺激したイヌ脾臓リンパ球の培養上清はＦＣＢＲ１上の、クラスＩＩＭＨＣの発現量を約２０％上昇させた。これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球に作用して、イヌインタ−フェロンγを誘導する活性を有することが判明した。
【００２７】
また、芽球化したイヌリンパ球の増殖促進活性を測定した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにＰＨＡ（ＩＣＮ社製）を５μｇ／ｍｌの濃度で添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養してリンパ球を芽球化させた。この芽球化リンパ球を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴マイクロプレート１穴あたり、５０μｌを添加した。これに上記（２）で得られた培養上清を１穴あたり５０μｌ加えた。また、コントロールとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦを１穴あたり５０μｌ加えた。これらをさらに５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養した後、文献１１のＭＴＴアッセイ法により、ＣａＩＬ１２の芽球化リンパ球増殖促進活性を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（シグマ社製）溶液を１穴あたり１０μｌづつ添加し、さらに６時間培養した。１５０μｌの０．０４Ｎ塩酸イソプロパノ−ル溶液を加えた後、超音波にて細胞を破砕し、マイクロプレ−トリ−ダ−（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製Ｍｏｄｅｌ３５５０）にて波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。その結果、コントロールの吸光度が平均０．６９であったのに対し、ＣａＩＬ１２は平均１．５２であり、約２倍の芽球化リンパ球増殖促進活性が認められた。
【００２８】
さらに、ＣａＩＬ１２のイヌ腫瘍に対する抗腫瘍作用を検討した。イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦで５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、このうち５ｍｌを６ｃｍディッシュに添加した。これにベ−リン
ガ−マンハイム（株）のリコンビナントヒトＩＬ２を５００Ｕ添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で３日間培養した。一方、イヌ腫瘍細胞株ＦＣＢＲ１およびＡ７２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５４２）を１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦでそれぞれ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に懸濁し、９６穴プレ−ト１穴あたり５０μｌづつ添加し、プレ−トに接着させた。これにヒトＩＬ２で刺激したイヌリンパ球５０μｌを加え、さらにＣａＩＬ１２を発現している上記（２）で得られた培養上清１００μｌもしくはコントロ−ルとして１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ１００μｌを添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件で２日間培養した。培養後、上清を完全に取り除き、ＭＴＴアッセイを行った。％細胞障害性を次の式にて算出した。
【００２９】
％細胞障害性＝（１−ＯＤ２  ／ＯＤ１  ）×１００
ここで、ＯＤ１＝培地のみで培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度
ＯＤ２  ＝イヌリンパ球と共に培養したイヌ腫瘍細胞の波長５９５ｎｍの吸光度を表す。
【００３０】
その結果、ＦＣＢＲ１ではコントロ−ルが３４％であったのに対し、ＣａＩＬ１２は７５％の細胞障害性を示した。また、Ａ７２ではコントロ−ルが２２％であったのに対し、ＣａＩＬ１２は８３％の細胞障害性を示した。これらのことから、ＣａＩＬ１２はイヌリンパ球を活性化して、イヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍作用を発揮することが判明した。
【００３１】
参考文献
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【００３２】
【配列表】
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【００４３】
配列番号：１２配列の長さ：６６９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ  ｔｏ  ｍＲＮＡ起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：ｐｅｐｔｉｄｅ存在位置：１．．６６６特徴を決定した方法：Ｓ配列ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＡ              ４８Ｍｅｔ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  ＬｅｕＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ              ９６Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  ＳｅｒＣＣＡ  ＡＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ            １４４Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  ＬｅｕＡＧＡ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＡ            １９２Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  ＬｅｕＴＡＴ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＧＡＴ            ２４０Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ
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【００４４】
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