(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシド粗製物をシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エスピー（ｓｐ．）ＹＦ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３５５）と接触させることを特徴とするモノシアロガングリオシドＧＭ１の製造方法。
【請求項２】
ガングリオシド粗製物を添加した培地中で該微生物を培養することを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
シアリダーゼ生産能を有するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エスピー（ｓｐ．）ＹＦ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３５５）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はモノシアロガングリオシドＧＭ１の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガングリオシドは、シアル酸を有するスフィンゴ糖脂質であり、魚類、哺乳類等の脳や神経系に多く存在している。モノシアロガングリオシドであるＧＭ１の持つ生理機能についてはこれまで多くの研究がなされており、モノシアロガングリオシドＧＭ１がある種の酵素、イオンチャンネル、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の増殖因子受容体の機能をモジュレートするといった報告がなされている。また、モノシアロガングリオシドＧＭ１がヘルパーＴ細胞におけるＣＤ４と結合し、抗ＨＩＶ効果を示す事から抗ＨＩＶ剤としての可能性も示唆されている。さらに最近ではアルツハイマー病やパーキンソン病をはじめとする様々な神経系疾患の治療薬として脚光を浴びており、実際にヨーロッパや南アメリカを中心にモノシアロガングリオシドＧＭ１を含むガングリオシド混合物が末梢神経疾患治療薬として臨床応用されている。
【０００３】
ガングリオシドは、通常牛の脳からカンファー（Kanfer,J.N.)らの方法［メソッズ  イン  エンザイモロジー（Methods in  Enzymology) 第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年］により調製されており、シアル酸の数によりＧＭ１、ＧＤ１、ＧＴ１、ＧＱ１等に分類されている。ＧＭ１のＭはモノシアロ、つまりシアル酸を１個持っているガングリオシドで、ＧＤ１は２個、ＧＴ１は３個、ＧＱ１は４個のシアル酸を有している。
【０００４】
モノシアロガングリオシドＧＭ１の調製方法としては、▲１▼牛脳から調製したガングリオシド混合物をアルコール或いはクロロホルムを含む溶媒中で酸性条件下５０℃以上に加温することによってモノシアロガングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＵＳ  Patent  No. ４８６８２９２）、及び▲２▼牛脳を破砕した後界面活性剤存在下でオートリシスを行うことによってモノシアロガングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＥＰ  ０３１９８９０Ａ１）が示されているが収率及び純度の点で決して満足できる方法ではない。
【０００５】
また、糖脂質に作用してシアル酸を遊離する酵素であるシアリダーゼを利用する方法として、▲３▼ Clostridium perfringens由来のシアリダーゼ（Sigma Type VIA) をアガロースゲルに固定化したものをガングリオシド混合物とともに加温することによってモノシアロガングリオシドＧＭ１を調製する方法（ＥＰ  ０５４０７９０Ａ１）、▲４▼ Arthrobacter ureafaciens 由来のシアリダーゼ  アイソザイムＳを用いてガングリオシド混合物からＧＤＩｂ及び／又はＧＭ１を調製する方法（特開平１−２８１０８２号公報）、▲５▼ Arthrobacter ureafaciens 由来のシアリダーゼ  アイソザイムＬを用いてガングリオシド混合物からＧＭ１及び／又はアシアロＧＭ１を調製する方法（特開平１−２８１０８３号公報）等が示されている。
【０００６】
しかしながら、これらの方法はいずれも精製酵素を用いているため製造コストが高くなる問題がある上に、▲４▼或いは▲５▼の方法では酵素量や反応時間など反応条件によって反応生成物中のＧＭ１の純度が変化する為、これらの方法はモノシアロガングリオシドＧＭ１を効率よく安価に調製する方法としては決して満足できるものではなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、効率よく安価にモノシアロガングリオシドＧＭ１を大量調製することの可能なモノシアロガングリオシドＧＭ１の製造方法を提供することにある。本発明の他の目的は、本発明の製造方法に使用する、シアリダーゼ生産能を有するシュードモナス属の細菌を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本明細書では２個以上のシアル酸を持つガングリオシドをポリシアロガングリオシドと呼ぶが、牛脳ガングリオシド中に存在するモノシアロガングリオシドＧＭ１の割合は約２０％しかなく、そのまま精製してもわずかなモノシアロガングリオシドＧＭ１しか得ることが出来ないのが実情である。そこで、この点に着目して本発明者らはモノシアロガングリオシドＧＭ１の大量調製法について検討を行った結果、シアリダーゼを生産する微生物をポリシアロガングリオシドと共に培養すればポリシアロガングリオシドがモノシアロガングリオシドＧＭ１に変換されて最終的に大量のモノシアロガングリオシドＧＭ１が得られる事を見いだし本発明に到達した。
【０００９】
なお、シアリダーゼ生産菌については、現在までにいくつかは知られているが、これらのシアリダーゼ生産微生物は、例えばコレラ菌、肺炎双球菌、ニューカッスル病ウイルス等のように病原性の微生物が多いことからこれらの微生物を使用することは好ましくないと判断される。そこで、本発明者らは、比較的ヒトに対する病原性が少なく、未利用の有用微生物が多く存在していると考えられている海洋環境からシアリダーゼ生産菌の検索を行った。その結果、ある種の細菌がモノシアロガングリオシドＧＭ１の大量調製に最適なシアリダーゼを生産することを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、
（１）  ガングリオシド粗製物をシアリダーゼ生産能を有する微生物と接触させることを特徴とするモノシアロガングリオシドＧＭ１の製造方法、
（２）  ガングリオシド粗製物を添加した培地中で該微生物を培養することを特徴とする前記（１）記載の製造方法、
（３）  該微生物がシュードモナス(Pseudomonas) 属の細菌である前記（１）又は（２）記載の製造方法、
（４）  シアリダーゼ生産能を有するシュードモナス(Pseudomonas) 属の細菌、
並びに
（５）  細菌がシュードモナス(Pseudomonas) エスピー（sp.)  ＹＦ−２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３５５）である前記（４）記載の細菌、に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明はガングリオシド粗製物をシアリダーゼ生産能を有する微生物と接触させることによりモノシアロガングリオシドＧＭ１を製造する方法であるが、本発明に使用される微生物は、シアリダーゼの生産能を有する菌株であればいかなる微生物でもよく、またそれらの微生物の変異株でもよい。この場合、産生されるシアリダーゼはモノシアロガングリオシドＧＭ１には作用しないものが好ましい。このような微生物の単離方法としては、例えば、海藻や海水、海砂などのサンプルを、ガングリオシドを唯一の炭素源とする合成培地に加え、２５℃で３〜４日培養する。その後、培養上清の基質の分解をＴＬＣで確認し、シアリダーゼ活性のあるものを同培地に植え継ぎ、これを３〜４回繰り返したのち、平面培地で各コロニーを単離することにより得ることができる。
【００１２】
モノシアロガングリオシドＧＭ１に作用しないシアリダーゼの生産能を有する菌株の具体例としては、シュードモナス属の細菌、例えば、シュードモナス  エスピー  ＹＦ−２株などが挙げられる。本菌株は博多湾の海水中から本発明者らが新たに検索して得た好塩性の菌株で、その菌学的性質は次の通りである。
透過型電子顕微鏡による観察の結果、本菌株はグラム陰性の短桿菌で非常に長い単極極鞭毛を有し、体長は０．９〜１．２μｍ、体幅は約０．５μｍであった。表１に本菌株の同定結果を示す。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
以上のような菌学的性質を有する菌株について、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネーティブ  バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)（第８版）、ウィリアムズ  アンド  ウィルキンス  カンパニー（Williams & Wilkins Company）、1974年発行、の分類法に基づいて同定を行ったところ、本菌株はシュードモナス (Pseudomonas)属に属するが、本菌株の特徴に十分合致する公知の種は見いだせず、本菌株を新種の海洋性シュードモナスと同定した。本菌株はPseudomonas sp. ＹＦ−２と表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３５５として寄託されている。
【００１５】
本菌株によって培養液中に生産されるシアリダーゼの酵素化学的及び理化学的性質は次の通りである。
（１）作用
シアロシル結合に作用してシアル酸を遊離する。
（２）基質特異性
ＧＭ３、ＧＤ１ａ、シアリルラクトース（ＳＡ−Ｌａｃ）に作用してそのシアル酸を遊離するが、ＧＭ１、ＧＭ２のシアル酸には全く作用しない。つまり本酵素はガングリオシドの糖鎖の非還元末端側に存在するシアル酸に良く作用するが、糖鎖の内側に結合したシアル酸には全く作用しない（表２）。このことから、ポリシアロガングリオシドに作用してモノシアロガングリオシドＧＭ１に変換する作用を有することが示される。
【００１６】
【表２】
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【００１７】
（３）至適ｐＨ及び温度安定性
本酵素の至適ｐＨは５．５でｐＨ４．５〜６．０の間で比較的高い活性を示す（図１）。また、本酵素をｐＨ５．０、２０ｍＭ酢酸緩衝液中、種々の温度で２時間保温した場合、本酵素は４０℃以上ではほぼ失活しており、比較的低い温度域（３７℃以下）で安定である（図２）。
【００１８】
（４）金属塩の影響
本酵素における各種の金属塩の影響を調べた。銅は硫酸塩、亜鉛は酢酸塩を用い、それら以外はすべて塩化物を用い、２ｍＭの濃度になるように反応系に加えた結果、表３に示すように本酵素はマンガン、バリウム等によって強く活性化され、水銀、銅、鉄によって活性が強く阻害された。
【００１９】
【表３】
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【００２０】
本発明のモノシアロガングリオシドＧＭ１の製造法においては、特に限定されるものではないが、例えば上述した菌株を栄養培地中で培養した後、培地にガングリオシド粗製物を加えるか、あるいはあらかじめガングリオシド粗製物を加えた栄養培地中で培養する方法によりガングリオシド粗製物と菌株を接触させることができる。いずれの場合においても、ガングリオシド粗製物の添加量は特に限定されるものではなく適宜決定される。
【００２１】
ここでガングリオシド粗製物とは牛脳などから調製された各種のガングリオシドを含むガングリオシドの混合物である。ガングリオシド粗製物は、例えばカンファー（Kanfer,J.N.)らの方法［メソッズ  イン  エンザイモロジー（Methods in  Enzymology) 第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年］に従って調製することが出来る。
【００２２】
培地としては、本菌株が生育し、シアリダーゼが生産され、培地中に存在するガングリオシド粗製物から効率よくモノシアロガングリオシドＧＭ１が生成するようなものであればよく、特に限定されるものではない。かかる培地において炭素源としては、例えばガングリオシド粗製物、ガングリオテトラオース系のポリシアロガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ）が利用できる。好ましくはＧＤ１ａである。また、窒素源としては例えば塩化アンモニウム、ポリペプトン等が適当である。
その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などの無機質及び金属塩類を加えてもよい。
【００２３】
本菌株を培養するにあたり、シアリダーゼの生産量、モノシアロガングリオシドＧＭ１の生成量は培養条件により大きく変動するが、一般的に培養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨは７．２〜７．４が良く、１日〜７日の通気攪拌培養でモノシアロガングリオシドＧＭ１が生産される。
【００２４】
培養終了後、目的のモノシアロガングリオシドＧＭ１を含む培養液から遠心分離等によって菌株を除去し、得られた培養上清から通常用いられる方法でタンパク質や塩類を除去する。例えば、培養上清をＣ18の逆相カラム等に負荷してタンパク質を除去し、同時に脱塩を行う方法が効果的である。脱塩した培養上清から通常用いられる方法、例えばメソッズ  イン  エンザイモロジー第８３巻、第１３９〜１９１頁、１９８２年に記載の方法でモノシアロガングリオシドＧＭ１を精製することが出来る。精製したモノシアロガングリオシドＧＭ１の構造の確認は、薄層クロマトグラフィーや液体クロマトグラフィー、質量分析、核磁気共鳴スペクトルなどの分析法によって行うことが出来る。このようにしてガングリオシド粗製物を本発明に用いる微生物と共に培養することにより、ガングリオシド粗製物から目的のモノシアロガングリオシドＧＭ１に変換することが出来る。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
シアリダーゼ生産能を有するシュードモナス属菌株の単離
博多湾の海水０．０１ｍＬを採取し、ガングリオシドを唯一の炭素源とする合成培地（ガングリオシド粗製物：０．１重量％、ＮａＣｌ：１重量％、ＮＨ4 Ｃｌ：０．０５重量％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．０５重量％、ｐＨ７．４）０．１ｍＬに加え、２５℃で３日間培養した。なお、ここで用いたガングリオシド粗製物は、牛脳からカンファーらの方法（メソッズ  イン  エンザイモロジー、第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年）により得られたものである。その後、培養上清の基質の分解をＴＬＣで確認し、シアリダーゼ活性のあるものを同培地に植え継ぎ、これを３回繰り返したのち、平面培地で各コロニーを単離した。その結果、２８株のシアリダーゼ生産菌が分離された。その内の１株について菌学的性質を検査し、バージーズ  マニュアル  オブ  ディターミネーティブ  バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)（第８版）、ウィリアムズ  アンド  ウィルキンス  カンパニー、1974年発行、の分類法に基づいて同定を行ったところ、本菌株はシュードモナス (Pseudomonas)属に属する、新種の海洋性シュードモナスと同定され、シュードモナス  エスピー  ＹＦ−２と命名され、Pseudomonas sp. ＹＦ−２と表示され、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５３５５として寄託されている。
【００２７】
実施例２
（１）微生物の培養ならびにガングリオシド粗製物のモノシアロガングリオシドＧＭ１への変換
牛脳からカンファーらの方法（メソッズ  イン  エンザイモロジー、第１４巻、第６６０〜６６４頁、１９６９年）に従って糖脂質の混合物であるガングリオシド粗製物を調製した。得られたガングリオシド粗製物５００ｍｇを含む１００ｍＬの液体培地（Ｋ2 ＨＰＯ4 ：０．０５重量％；ＮＨ4 Ｃｌ：０．０５重量％；ＮａＣｌ：１重量％；ｐＨ７．４）中で、シュードモナス  エスピー  ＹＦ−２を２５℃で３日間培養した。培養液を遠心分離した後、培養上清中のガングリオシドを薄層クロマトグラフィーで分析したところ、ガングリオシド粗製物中のモノシアロガングリオシドＧＭ１含量は約２０％であるのに対して、３日間培養後の培養上清中のガングリオシド中に占めるモノシアロガングリオシドＧＭ１の割合は９０％以上に上昇していた（図３）。なお、各成分の定量は次のようにして実施した。
薄層クロマトグラフィーで展開〔クロロホルム／メタノール／０．２％ＫＣｌ＝５：４：１（ｖ／ｖ）〕後、オルシノール硫酸液を噴霧し、１００〜１１０℃のオーブンで１０分間加熱した。ＧＭ１（ヤトロン社製）、ＧＤ１ａ（ヤトロン社製）、ＧＤ１ｂ（ヤトロン社製）、ＧＴ１ａ（バイオカーブ社製）をそれぞれ標品として、ＴＬＣクロマトスキャナーＣＳ９３００（島津製作所社製）により、５４０ｎｍにおける吸収を測定することにより定量を行った。
【００２８】
（２）モノシアロガングリオシドＧＭ１の精製
培養液を遠心分離して得た培養上清（ガングリオシド約２００ｍｇ分）を、メタノールで洗浄後脱イオン水で平衡化されたＣ18逆相カラム〔Preparative Ｃ18 125Å（ミリポア社製）充填量３０ｇ、カラム直径３０ｍｍ、オープンカラム〕に負荷した。カラムに脱イオン水３００ｍＬを流して脱塩を行った後、クロロホルム／メタノール（２／１：ｖ／ｖ）５００ｍＬを流して糖脂質を溶出した。溶出画分をエバポレーターで濃縮して次の陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。
【００２９】
ＤＥＡＥ Sephadex Ａ２５（ファルマシア社製）陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによるモノシアロガングリオシドＧＭ１の精製は、以下に示すように行った。
溶出溶媒は、溶媒Ｉとしてクロロホルム／メタノール／脱イオン水＝３０：６０：８（ｖ／ｖ）、溶媒IIとしてクロロホルム／メタノール／０．８Ｍ酢酸ナトリウム水溶液＝３０：６０：８（ｖ／ｖ）を用いた。溶媒Ｉで平衡化したＤＥＡＥ Sephadex Ａ２５（７５ｍＬ）をカラム（直径２５ｍｍ、オープンカラム）に充填した。ガングリオシド約２００ｍｇを５０ｍＬの溶媒Ｉに溶かして超音波処理を行い、得られたサンプルをそのカラムに負荷した。溶媒Ｉを３００ｍＬ流した後、溶媒Ｉと溶媒IIそれぞれ４００ｍＬで直線濃度勾配をつくり、モノシアロガングリオシドＧＭ１を溶出した。溶出液は１０ｍＬずつ分画し、各フラクションについて薄層クロマトグラフィーでガングリオシドの分析を行った。
【００３０】
薄層クロマトグラフィーはクロロホルム／メタノール／０．２％ＫＣｌ＝５：４：１（ｖ／ｖ）で展開し、オルシノール硫酸液を噴霧した後１００〜１１０℃のオーブンで１０分間加熱してガングリオシドを検出した。発色後のプレートをＴＬＣクロマトスキャナーＣＳ９３００（島津製作所社製）に供し、５４０ｎｍにおける吸収を測定することによって、ガングリオシドの定量を行った。
その結果、グラディエント溶出画分のフラクション２６−４３にモノシアロガングリオシドＧＭ１が溶出された（図４）。このようにして精製されたモノシアロガングリオシドＧＭ１の量は、ＴＬＣで定量すると１７５ｍｇであった。
得られたＧＭ１についてＦＡＢ−ＭＳを用いて質量分析を行った結果、分子量１５４５の結果が得られ、得られたガングリオシドは間違いなくモノシアロガングリオシドＧＭ１であることが確認できた。
【００３１】
以上のデータを要約すると、次のとおりである。ガングリオシド粗製物５００ｍｇ中にはガングリオシドは約２１５ｍｇ含まれており、その中でモノシアロガングリオシドＧＭ１は約４０ｍｇであった。ガングリオシド粗製物をシュードモナス  エスピー  ＹＦ−２とともに培養し、培養上清を逆相カラムに供した後の溶出液ではモノシアロガングリオシドＧＭ１の含量は約２００ｍｇにまで上昇していた。さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことによって最終的に１７５ｍｇの純粋なモノシアロガングリオシドＧＭ１を原料のガングリオシド粗製物からの収率８１％で得ることが出来た。
【００３２】
試験例
精製モノシアロガングリオシドＧＭ１の神経突起伸展作用
実施例２で得られた精製モノシアロガングリオシドＧＭ１を３３μＭ、１００μＭの濃度で血清含有培地（１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）含有ＭＥＭ培地（日水製薬社製））に加え、神経芽腫瘍細胞Ｎｅｕｒｏ  ２ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）を３７℃で２４時間培養した。培養後の細胞をランダムに写真に撮り、そのうち１００個の細胞のうち突起をもった細胞数を測定し、神経細胞への分化の度合いを検討した。その結果、精製モノシアロガングリオシドＧＭ１を１００μＭ加えた場合、突起を有する細胞の割合の顕著な増加が見られた（図５）。このことから、実施例２で調製したモノシアロガングリオシドＧＭ１は血清含有培地においても神経突起の伸展能を有していること分かった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の製造方法により、効率よく安価にモノシアロガングリオシドＧＭ１を大量調製することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のシュードモナス属菌の産生するシアリダーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図２】図２は、本発明のシュードモナス属菌の産生するシアリダーゼの温度安定性を示す図である。
【図３】図３は、実施例２におけるガングリオシド粗製物からのモノシアロガングリオシドＧＭ１への変換を示す図である。
【図４】図４は、実施例２におけるDEAE Sephadex A25 によるクロマトグラムを示す図である。
【図５】図５は、精製モノシアロガングリオシドＧＭ１の神経突起伸展作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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