(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸含有油脂をキャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを用い水溶性高分子化合物を共存させた条件で加水分解を行った後、脱遊離脂肪処理することを特徴とする高度不飽和脂肪酸グリセリドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する油脂にリパーゼを作用させ天然油脂よりも高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有するグリセリドを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
油脂の加水分解方法には、アルカリによるケン化分解法、高温高圧下での分解法、無水アルコールと触媒の存在下に分解するアルコリシス等の物理化学的方法がある。これらの方法により得られた遊離の脂肪酸から高度不飽和脂肪酸（本発明においては炭素鎖長が２０以上で３つ以上の二重結合を有する脂肪酸を指す。）を濃縮製造するには、蒸留法、低温での分画結晶化法、クロマトグラフィーによる方法、尿素付加法およびこれらの方法を組み合わせた方法により行われてきた。この操作によって得られるのは遊離の酸もしくは脂肪酸のエチルエステルである。魚油に豊富に含まれる血中脂質低下作用、抗動脈硬化作用等の有用な生理活性を有するとされるＥＰＡ（イコサペンタエン酸）やＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）等の高度不飽和脂肪酸は、グリセリンとのエステルであるグリセリドの形態が、ヒトの消化器官での吸収が脂肪酸のエチルエステルよりも優れていることが知られており、ヒトに対して生理活性を発揮するにはエチルエステルよりもグリセリンエステルの方が優れている。
【０００３】
【発明の解決しようとする課題】
油脂の加水分解においては、物理化学的分解方法よりもリパーゼを用いる分解方法が優れている。さらに、二重結合を有するこれらの脂肪酸は、従来使用されているリパーゼでは加水分解されにくい。この酵素の特性を利用して、例えばキャンディダ・シリンドラセ由来のリパーゼ（特開昭５８ー１６５７９６号公報）を用いたグリセリド中への高度不飽和脂肪酸の濃縮方法が開示されているが、これは酵素反応を行う際に、基質である油脂と水のみを使用する方法であり、この方法では、ＤＨＡ等の高度不飽和脂肪酸の一部が加水分解され、その結果として製造された油脂の高度不飽和脂肪酸の濃度が低く、高濃度グリセリドを得るには不十分であった。
したがって、本発明は、有用な生理活性を有するＤＨＡ、ＥＰＡを高濃度に含有するグリセリドを効率良く製造できる方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高度不飽和脂肪酸の高濃度グリセリドを製造するための研究を鋭意行った結果、意外にも従来の水油混合系においてリパーゼ反応を行う際に、キャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを使用する方が、キャンディダ・シリンドラセ由来のリパーゼを使用したときよりもＤＨＡの遊離脂肪酸へのロスが少なく、さらに、反応系に水溶性高分子化合物を添加する反応系においては、キャンディダ属由来酵素が高度不飽和脂肪酸のグリセロールエステルを殆ど加水分解しないか、あるいはごくわずかしか加水分解しないことを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００５】
すなわち、本発明は、高度不飽和脂肪酸含有油脂をキャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを用い水溶性高分子化合物を共存させた条件で加水分解を行った後、脱遊離脂肪処理することを特徴とする高度不飽和脂肪酸グリセリドの製造方法である。
【０００６】
本発明で用いられる高度不飽和脂肪酸含有油脂としては、ＥＰＡやＤＨＡを多く含む魚油、鯨油等の海産性油脂や微生物由来の油脂などを使用することができ、その起源については特に限定されるものではない。
本発明で使用するリパーゼは、高度不飽和脂肪酸に対しできるだけ基質特異性の低い酵素が好ましい。特に好ましくはキャンディダ属由来のリパーゼであり、市販のものを使用することもできるが、キャンディダ・リポリティカ（ＡＴＣＣ３４０８８株）を培養し、培養液から部分精製したリパーゼを用いることもできる。
【０００７】
高度不飽和脂肪酸含有油脂を上記微生物由来のリパーゼで加水分解する反応は、酵素の活性を発現するのに十分の量の水の存在下で行うが、その量は、例えば油脂に対して１〜３００％であり、好ましくは４０〜１００％程度を用いる。加水分解反応のｐＨを一定に保つために、水の代わりに緩衝液を用いてもよい。ｐＨは例えば７から９までの範囲であり、特に好ましくはｐＨ７．５〜８．５である。さらに、加水分解の反応を速めるために、カルシウムやマグネシウム等の２価の陽イオンを反応液中に添加してもよい。その濃度は、１０〜５００ｍＭの範囲で使用できるが、特に好ましくは１５０〜２５０ｍＭのカルシウムイオンを用いる。
【０００８】
前記酵素の使用量は、基質に含有される高度不飽和脂肪酸の濃度、反応温度、反応ｐＨ、反応時間によっても変わるが、油脂１ｇあたり１０〜１０００ユニット（Ｕ）であり、好ましくは５０〜３００ユニット（Ｕ）程度である。反応温度はリパーゼが失活しない範囲で適宜選ぶことができるが、好ましくは２０〜５０℃である。酵素反応は空気存在下でも問題なく進行するが、一般的に高度不飽和脂肪酸は酸化されやすいので、窒素やアルゴンガス等の不活性ガスを用いて、酸素を遮断した環境下で反応を行う方が好ましい。
【０００９】
油脂の加水分解率は、遊離した脂肪酸をアルカリで滴定して測定する方法や、ガスクロマトグラフィー等の方法で求めることができるが、脂肪酸の総量と構成脂肪酸種の分画定量が同時にできるガスクロマトグラフィーが測定精度の点からも有利である。加水分解率は次式により求めることができる。
【００１０】
【数１】
0003719732.tif 000002
また、ＤＨＡ加水分解率は次式により算出した。
【００１１】
【数２】
0003719732.tif 000003
【００１２】
リパーゼの反応系に添加する水溶性高分子化合物は、リパーゼ反応を阻害しない性質のものであればよく、天然由来でも合成高分子化合物でもよい。天然由来の水溶性高分子化合物としては、可溶性澱粉、デキストリン、デキストラン、ペクチン、アラビアゴム、キサンタンガム等の天然高分子糖類化合物、ゼラチン、コーン蛋白由来ペプチド等のアミノ酸高分子化合物、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体等を使用することができる。合成高分子化合物としては、ポリビニルアルコール等を使用することができる。リパーゼの反応系に添加するこれらの水溶性高分子化合物の濃度は、使用する油脂の濃度によっても変化するが、カルボキシメチルセルロース、カチナール、ペクチン、キサンタンガム等の化合物では０．１〜５％の範囲で使用でき、好ましくは０．５〜２％であり、ゼラチン、コーン由来ペプチド、可溶性澱粉、デキストラン、アラビアゴム等の化合物では１〜２０％の範囲で使用でき、好ましくは２〜５％である。
【００１３】
反応系への水溶性高分子化合物の添加時期は特に問わないが、一般に水に溶解するのに時間がかかるため、酵素反応液に油脂を添加する前に予め添加し、溶解して用いる方が好ましい。
【００１４】
上記の酵素は、高度不飽和脂肪酸含有油脂に含まれるＤＨＡ等の高度不飽和脂肪酸エステルに対する加水分解の特異性は低いが、酵素反応系に上記水溶性高分子化合物を添加してリパーゼ反応を行うことにより、さらに、ＤＨＡ等の高度不飽和脂肪酸エステルに対する加水分解特異性は低くなる。高度不飽和脂肪酸は優先的に加水分解されるためにこれを除去し、未分解で残存するグリセリドを分離回収すれば、高度不飽和脂肪酸を高濃度で含有する油脂（通常、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドの混合物）を得ることができる。
【００１５】
上記のリパーゼによる加水分解油よりグリセリド画分を採取する方法としては、通常行われているアルカリ脱酸法、水蒸気蒸留法、イオン交換樹脂や各種の吸着担体を用いた吸着クロマトによる分画等の手段を利用すればよく、特にその方法は問わない。
【００１６】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これにより何ら限定されるものではない。
（実施例１）
０．００５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）、０．２Ｍ塩化カルシウム、および表１に記載した水溶性高分子から構成される反応液１００ｍｌに、２５００ユニット（Ｕ）のキャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを溶解し、さらに、魚油（ＤＨＡ含量：２２．４％，ＥＰＡ：７．０％）１０ｇを混合し、２５℃でｐＨを８．２に調整し、撹拌しながら１５時間加水分解反応を行い、分解油を得た。
この分解油中の遊離の脂肪酸と鹸化後の脂肪酸をガスクロで測定し、加水分解率とＤＨＡ分解率を求めた。結果を表１に示した。
【００１７】
キャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼは、次のようにして調製した。２％グルコース、３％脱脂大豆粉、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、０．１％リン酸二カリウム、０．４％大豆油から成る培地２０リットルに、同じ培地で２８℃で２日間前培養したキャンディダ・リポリティカ株ＡＴＣＣ３４０８８株）の培養液２００ｍｌを接種し、３００回転、２０リットル／分の通気量、２８℃で５０時間培養した。得られた培養物を６、０００回転、１５分間遠心分離にかけ、菌体を除去した。次いで、得られた上清（１６リットル）を減圧濃縮し、濃縮液３リットルを得た。これに４℃に冷却したエタノール４．５リットルを加え、酵素を沈殿させた。沈殿物を１リットルの１０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、不溶物を６、０００回転、１０分間の遠心分離で除去した。上清液９２０ｍｌを凍結乾燥してリパーゼ粉末２４５グラム（１３２Ｕ／ｇ）を得た。
【００１８】
【表１】
0003719732.tif 000004
【００１９】
（比較例１）
実施例１と同様の方法で、表２に記載した添加物を使用して酵素反応を行い，分解油を調製した。この分解油中の遊離の脂肪酸と鹸化後の脂肪酸をガスクロで測定し、加水分解率とＤＨＡ分解率を求めた。結果を表２に示した。表１の水溶性高分子化合物を使用した分解油に比べて、加水分解率は低値を示し、ＤＨＡ分解率は高値を示した。
【００２０】
【表２】
0003719732.tif 000005
【００２１】
（実施例２）
０．００５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）、０．２Ｍ塩化カルシウム、および５％アラビアゴムから構成される反応液１００ｍｌに、２５００ユニット（Ｕ）のキャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを溶解し、さらに、魚油（ＤＨＡ含量：２２．４％，ＥＰＡ：７．０％）１０ｇを混合し、２５℃でｐＨを８．２に調整し、撹拌しながら１５時間加水分解反応を行い、分解油を得た。次いで、ヘキサン１００ｍｌを加え油脂を抽出し、遠心分離（３、０００回転、１０分間）後、ヘキサン相を回収した。この抽出液に４０ｍｌのアセトン、次いで、２０ｍｌの０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え、室温で１時間撹拌した。遊離の脂肪酸が除去されたグリセリドがヘキサン相に回収された。溶媒を減圧下に溜去した油脂の重量は２．３ｇであった。このグリセリドを構成する脂肪酸中の６３．９％がＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、５．７％がＥＰＡ（イコサペンタエン酸）であった。
【００２２】
（実施例３）
０．００５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）、０．２Ｍ塩化カルシウム、５％コーンペプチドから構成される反応液１００ｍｌに、２５００ユニット（Ｕ）のキャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを溶解し、さらに、魚油（ＤＨＡ含量：２２．４％，ＥＰＡ：７．０％）１０ｇを混合し、２５℃でｐＨを８．２に調整し、撹拌しながら１５時間加水分解反応を行い、分解油を得た。後の抽出・分離操作は、実施例２と同様に行い、２．３ｇの油脂を得た。このグリセリドを構成する脂肪酸中の６４．７％がＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、６．５％がＥＰＡ（イコサペンタエン酸）であった。
【００２３】
（比較例２）
比較のために反応系に水溶性高分子化合物を添加しない条件、すなはち、０．００５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）、０．２Ｍ塩化カルシウムから構成される反応液１００ｍｌに、２５００ユニット（Ｕ）のキャンディダ・リポリティカ由来のリパーゼを溶解し、さらに、魚油（ＤＨＡ含量：２２．４％，ＥＰＡ：７．０％）１０ｇを混合し、２５℃でｐＨを８．２に調整し、撹拌しながら１５時間加水分解反応を行い、分解油を得た。後の抽出・分離操作は、実施例２と同様に行い、２．７ｇの油脂を得た。このグリセリドを構成する脂肪酸中の５４．３％がＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、６．５％がＥＰＡ（イコサペンタエン酸）であった。
【００２４】
（実施例４）
０．０１Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２Ｍ塩化カルシウム、および５％アラビアゴムから構成される反応液１００ｍｌに、３０００ユニット（Ｕ）のキャンディダ・シリンドラセ由来のリパーゼを溶解し、さらに、魚油（ＤＨＡ含量：２２．４％，ＥＰＡ：７．０％）１０ｇを混合し、３５℃でｐＨを８．０に調整し、撹拌しながら３０時間加水分解反応を行い、分解油を得た。次いで、ヘキサン１００ｍｌを加え油脂を抽出し、遠心分離（３、０００回転、１０分間）後、ヘキサン相を回収した。この抽出液に４０ｍｌのアセトン、次いで、２０ｍｌの０．３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加え、室温で１時間撹拌した。遊離の脂肪酸が除去されたグリセリドがヘキサン相に回収された。溶媒を減圧下に溜去した油脂の重量は２．１ｇであった。このグリセリドを構成する脂肪酸中の５３．９％がＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、５．７％がＥＰＡ（イコサペンタエン酸）であった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、リパーゼを用いて高度不飽和脂肪酸を加水分解せずにグリセリドの形態で残すために、ＥＰＡやＤＨＡ等の有用な高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する油脂を効率良く製造することができる。この高度不飽和脂肪酸を高濃度に含有する油脂は、成人病の予防や治療に用いられる。