(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）、
【化１】
0003656875.tif 000009
式中、Ｒ1は水素原子をＲ2は水酸基をそれぞれ表すか、あるいはＲ1およびＲ2は一緒になって単結合を表す、で示されるシクロエルゴスタン誘導体。
【請求項２】
式（Ｉ−Ａ）、
【化２】
0003656875.tif 000010
で示される請求項１記載のシクロエルゴスタン誘導体。
【請求項３】
式（Ｉ−Ｂ）、
【化３】
0003656875.tif 000011
で示される請求項１記載のシクロエルゴスタン誘導体。
【請求項４】
エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属し、請求項１〜３記載のシクロエルゴスタン誘導体を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から請求項１〜３記載のシクロエルゴスタン誘導体を採取することを特徴とする請求項１〜３記載のシクロエルゴスタン誘導体の製造方法。
【請求項５】
式（ＩＩ）、
【化４】
0003656875.tif 000012
で示されるシクロエルゴスタン誘導体を、酸化剤を用いて酸化することを特徴とする請求項２記載のシクロエルゴスタン誘導体の製造方法。
【請求項６】
請求項２記載のシクロエルゴスタン誘導体を、脱水剤を用いて脱水することを特徴とする請求項３記載のシクロエルゴスタン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗真菌作用を有するシクロエルゴスタン誘導体およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より抗真菌性物質として、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、トリコマイシン等のポリエン系物質、ミコナゾール、ケトコナゾール等のイミダゾール系物質、フルコナゾール等のトリアゾール系物質が知られていたが、これらの抗真菌性物質は、選択毒性、薬効等において問題があり真菌感染症の治療剤として未だ十分であるとは言えない。さらに高齢者や基礎疾患を有する患者に発症がみられる、日和見感染としての深在性真菌症であるアスペルギルス症に対しては有効な治療法がなく、感染症治療分野で大きな問題となっている。
【０００３】
一方、抗真菌作用を有するシクロエルゴスタン誘導体としてＭｅｒ−ＮＦ８０５４ＡおよびＭｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘ（特開平６−１４５１９４号）が開示されているが、その抗真菌活性は満足できるものではない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、このような問題を克服するため、病原性を有する真菌に対して抗菌力を有する新規なシクロエルゴスタン誘導体およびその製造方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、新規な抗真菌性物質の探索を目的としてカビ類の生産する代謝産物について研究を重ねた結果、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属する菌株が、その培養液中にアスペルギルス症の原因菌であるアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して抗菌活性を示す物質を複数生産していることを見出した。その培養液から有効物質を分離精製し、その理化学的性質を調べたところ、それらの有効物質は、いかなる既知物質とも相違し、かつ優れた抗真菌活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有するシクロエルゴスタン誘導体を提供するものである。
【化５】
0003656875.tif 000002
但し、Ｒ1は水素原子をＲ2は水酸基をそれぞれ表すか、あるいはＲ1およびＲ2は一緒になって単結合を表す。
【０００７】
より具体的には、下記式（Ｉ−Ａ）で示される誘導体、
【化６】
0003656875.tif 000003
【０００８】
および下記式（Ｉ−Ｂ）で示される誘導体、
【化７】
0003656875.tif 000004
を提供するものである。
【０００９】
なお、本発明者らは、式（Ｉ−Ａ）で示される誘導体をエメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）、式（Ｉ−Ｂ）で示される誘導体をエメステロンＢ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＢ）とそれぞれ命名した。以後、本明細書において各誘導体を上記名称を用いて説明する。
【００１０】
また本発明は、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属し、式（Ｉ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物からこれらシクロエルゴスタン誘導体を採取する、式（Ｉ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体の製造方法を提供するものである。
【００１１】
さらに本発明は、式（ＩＩ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体Ｍｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘを、酸化剤を用いて酸化する式（Ｉ−Ａ）で示されるエメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）の製造方法およびエメステロンＡを脱水剤を用いて脱水する式（Ｉ−Ｂ）で示されるエメステロンＢ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＢ）の製造方法を提供するものである。
【００１２】
【化８】
0003656875.tif 000005
【００１３】
【化９】
0003656875.tif 000006
【００１４】
本発明に使用される微生物は、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属し、式（Ｉ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体を生産する能力を有する菌株であればよく、例えば、エメリセラ・ヘテロタリカ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）ＡＴＣＣ１６８２４株を挙げることができるが、この菌株に限らず、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属し、式（Ｉ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体を生産できる菌株であれば、それらの変異株も含めてすべて本発明に使用することができる。
【００１５】
本発明のシクロエルゴスタン誘導体は上記菌株を栄養培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。上記菌株の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による靜置培養を行うのが好適である。
【００１６】
培養に用いられる培地としては、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜などを単独又は組合わせて用いることができる。窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵母エキス、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独又は組合わせて用いることができる。その他、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルトなどの塩類、重金属類塩、ビタミンＢ、ビオチンなどのビタミン類も必要に応じて添加することができる。
【００１７】
培養条件は、上記菌株が良好に生育して本発明のシクロエルゴスタン誘導体を生産し得る範囲内で適宜選択すればよい。例えば、培地のｐＨは、６〜８程度、通常中性付近とすることが好ましい。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常２５〜３０℃、好ましくは２７〜２８℃に保つのがよい。培養時間は、１０〜２８日間程度でよく、好ましくは１４〜２１日間である。もちろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調整できる。
【００１８】
培養中のシクロエルゴスタン誘導体の蓄積量は、検定菌として、例えばアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を用いた液体培養による抗菌力アッセイにより定量できる。上記培養液中に蓄積されたシクロエルゴスタン誘導体は、濾過、遠心分離等の一般的固液分離手段によって菌体を分離し、濾液および上澄液からの抽出により、回収可能である。
【００１９】
本発明のシクロエルゴスタン誘導体の分離、精製は、公知の種々の方法を選択、組み合わせて行うことができる。例えば、酢酸エチル、ｎ−ブタノール等を用いた溶媒抽出や、アンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカゲル、アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによる方法を用いることができる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いることができる。さらにセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲル濾過、シリカゲル、アルミナ等による薄層クロマトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用いることができ、これらの方法を単独または適宜組合せて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製することができる。
【００２０】
以上のようにして得られるシクロエルゴスタン誘導体のうち、エメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）は、以下に示す物理化学的性質を有する。
（１）外観：白色結晶性粉末
（２）融点：１０８〜１０９℃（アセトン−ヘキサン混合溶媒から結晶化）
（３）比旋光度：［α］D20  ＋１７５°（ｃ  ０．１３５、クロロホルム）
（４）分子式：Ｃ28Ｈ40Ｏ5
（５）マススペクトル（ＥＩ−ＭＳ）：  実測値；４５６．２８８３、計算値;４５６．２８７６（Ｃ28Ｈ40Ｏ5として）
【００２１】
（６）ＵＶ吸収スペクトル
クロロホルム中で測定した極大吸収は、下記のとおりである（単位：ｎｍ）。
λｍａｘ（ｌｏｇε）：２４５．０（４．３４）
（７）ＩＲ吸収スペクトル
臭化カリウム錠剤で測定した特徴的な吸収は、下記のとおりである（単位：ｃｍ-1）。
νｍａｘ：３４５０、２９６０、１７１０
（８）円偏光２色性
クロロホルム中で測定した結果は、下記のとおりである。
ＣＤΔε（ｎｍ）：＋８．５（３０３）、＋５．２（２７７）、−８．０（２４１）、−８．２（２３４）、＋５．４（２１５）
【００２２】
（９）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）
重クロロホルム中で測定した主要なピークは下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），１．０１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．０５（１Ｈ，ｍ），１．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，６．４Ｈｚ），１．２９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，３．９Ｈｚ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．５５（１Ｈ，ｍ），１．５９（１Ｈ，ｍ），１．６７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，４．５Ｈｚ，３．４Ｈｚ），１．７８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，８．９Ｈｚ，４．９Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，８．４Ｈｚ，７．６Ｈｚ，３．９Ｈｚ），２．１５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，７．３Ｈｚ，６．４Ｈｚ，３．９Ｈｚ），２．２３（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，７．３Ｈｚ，４．９Ｈｚ），２．３８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，７．６Ｈｚ，４．５Ｈｚ），２．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），２．４１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，８．９Ｈｚ，３．９Ｈｚ），２．４２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，８．９Ｈｚ，４．２Ｈｚ），２．４４（１Ｈ，ｄｄｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，７．３Ｈｚ，７．３Ｈｚ），２．５９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，８．９Ｈｚ，４．２Ｈｚ），２．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），２．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ），２．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ），３．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１．５Ｈｚ），４．１６（１Ｈ，ｓ），４．５３（１Ｈ，ｓ），５．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），６．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ）
【００２３】
（１０）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）
重クロロホルム中で測定した主要なピークは下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：９．４，１０．３，１４．２，２１．０，２１．０，２５．４，２９．３，３０．６，３２．８，３６．９，３６．９２，３７．１３，４２．４６，４３．４２，４６．６１，５１．３２，５２．１，５４．７，５５．３，７２．１，７５．４，７９．９，１２３．８，１２５．２，１３１．６，１５２．７，２０６．９，２１２．０
【００２４】
またエメステロンＢ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＢ）は、以下に示す物理化学的性質を有する。
（１）外観：白色結晶性粉末
（２）融点：１０５〜１０６℃（アセトン−ヘキサン混合溶媒から結晶化）
（３）比旋光度：［α］D20 ＋４１６°（ｃ  ０．０８５、クロロホルム）
（４）分子式：Ｃ28Ｈ38Ｏ4
（５）マススペクトル（ＥＩ−ＭＳ）：  実測値；４３８．２７６４、計算値；４３８．２７６９（Ｃ28Ｈ38Ｏ4として）
【００２５】
（６）ＵＶ吸収スペクトル
クロロホルム中で測定した極大吸収は、下記のとおりである（単位：ｎｍ）。
λｍａｘ（ｌｏｇε）：３３７．２（４．３６）、２２０．６（４．１０）
（７）ＩＲ吸収スペクトル
臭化カリウム錠剤法で測定した特徴的な吸収は、下記のとおりである（単位：ｃｍ-1）。
νｍａｘ：３４５０、２９６０、１７１０、１６５０、１５９０
（８）円偏光２色性
クロロホルム中で測定した結果は、下記のとおりである。
ＣＤΔε（ｎｍ）：＋９．１（３７０）、−８．２（３３３）、＋２１．８（３０５）、−２．０（２５２）、−３．９（２３２）、−１０．３（２１８）
【００２６】
（９）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）
重クロロホルム中で測定した主要なピークは下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．９３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），０．９９（１Ｈ，ｍ），１．０５（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，３．１Ｈｚ），１．４１（３Ｈ，ｓ），１．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，７．０Ｈｚ），１．５６（１Ｈ，ｄｑｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６．４Ｈｚ，６．４Ｈｚ），１．６８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，６．４Ｈｚ，５．５Ｈｚ），１．７１（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，９．２Ｈｚ，４．２Ｈｚ，３．７Ｈｚ），１．８４（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，８．５Ｈｚ，６．１Ｈｚ，４．０Ｈｚ），２．１７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，６．８Ｈｚ，６．１Ｈｚ），２．１９（１Ｈ，ｍ），２．３７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，８．３Ｈｚ，４．２Ｈｚ），２．４４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，６．８Ｈｚ，５．５Ｈｚ），２．４６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，９．２Ｈｚ，６．１Ｈｚ），２．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），２．５２（１Ｈ，ｍ），２．５７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，４．０Ｈｚ，３．７Ｈｚ），２．６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，６．４Ｈｚ，６．１Ｈｚ），２．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ），３．２６（１Ｈ，ｂｒ），３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，１．５Ｈｚ），５．７１（１Ｈ，ｓ），６．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ），６．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）
【００２７】
（１０）13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）
重クロロホルム中で測定した主要なピークは下記のとおりである。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：９．４７，１０．７，２１．０，２１．０，２１．１，２５．７，２９．５，３０．６，３０．９，３４．１，３６．６，３８．４，４２．４，４４．０，４６．４，５１．１，５５．４，５５．６，７２．４，７５．９，１２１．９，１２６．２，１２８．２，１３０．８，１５３．７，１６１．６，１９８．２，２１１．７
【００２８】
また本発明のシクロエルゴスタン誘導体は、上記したとおり微生物の培養液から採取することができるが、化学合成法によっても製造することができる。本発明のシクロエルゴスタン誘導体のうち、エメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）は、式（ＩＩ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体Ｍｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘをジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、トルエン、アセトニトリル、アセトン、酢酸、ジメチルホルムアミドなどの不活性溶媒中、ピリジニウムクロロクロメート、ピリジニウムジクロメート、クロム酸、二クロム酸ナトリウム、二酸化マンガン、四酸化ルテニウム、ヂィス・マーチン試薬、ジョーンズ試薬、コリンズ試薬、ジメチルスルホキシド−オキザリルクロライド、ジメチルスルホキシド−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの酸化剤を用いてＭｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘの３位水酸基を選択的に酸化することにより製造することができる。
【００２９】
溶媒と酸化剤の組合わせ、反応温度、反応時間などの反応条件は、目的とするエメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）が好収率で得られるよう、適宜選択すればよい。例えば、ジクロロメタン溶媒中、酸化剤としてピリジニウムクロロクロメートを原料化合物１モルに対して０．３〜１．５モル加え、−７８〜２５℃で０．５〜３時間反応させると、副反応が少なく、目的とするエメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）を好収率で得ることができる。
【００３０】
なお、原料となる式（ＩＩ）で示されるシクロエルゴスタン誘導体は、特開平６−１４５１９４号公報に開示されているとおり、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する微生物の培養液、あるいは後述するエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属に属する微生物の培養液から、それぞれ抽出精製して得ることができる。
【００３１】
さらに本発明のシクロエルゴスタン誘導体のうち、エメステロンＢ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＢ）は、エメステロンＡ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＡ）をアセトン、メタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジオキサンなどの有機溶媒中、塩化カルシウム、モレキュラシーブなどの脱水剤およびトシル酸、メタンスルホン酸、塩酸、硫酸、トリフルオロボラン−エーテル錯体、塩化スズ、四塩化チタンなどの酸触媒を用いて５位の水酸基を脱水することにより製造することができる。溶媒、脱水剤および酸触媒の組合わせ、反応温度、反応時間などの反応条件は、目的とするエメステロンＢ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＢ）が好収率で得られるよう、適宜選択すればよい。例えば、アセトン溶媒中、脱水剤として塩化カルシウムおよび酸触媒としてトシル酸を原料化合物１モルに対して、それぞれ１〜１００モルおよび０．０１〜１モル加え、０〜１２０℃で０．５〜２時間還流させると目的とするエメステロンＢ（ｅｍｅｓｔｅｒｏｎｅＢ）を好収率で得ることができる。
【００３２】
上述した方法に従い製造することのできる本発明のシクロエルゴスタン誘導体は、アスペルギルス症の原因菌であるアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の生育を低濃度で抑制する。表１に本発明のシクロエルゴスタン誘導体の病原性真菌に対する増殖抑制効果を示す。表１は、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＩＦＭ４９４２の胞子懸濁液を含む平板（グルコース０．５％、ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ社製）６．７％、アガロース１％、ｐＨ６．４）にシクロエルゴスタン誘導体のメタノール溶液を染み込ませたペーパーデイスクをのせ、３５℃で２０時間培養し、阻止円の大きさ（直径）を観察した結果をまとめたものである。
【００３３】
【表１】
0003656875.tif 000007
【００３４】
表１から明らかなように、本発明のシクロエルゴスタン誘導体は、アスペルギルス症の原因菌であるアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の生育を低濃度で抑制した。しかも後述する実施例で示すように培養細胞に対する毒性がほとんどないという優れた性質を有している。
【００３５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。なお、培地におけるパーセント(％)は、特に断りのない限り、重量／容量パーセントを示す。
【００３６】
実施例１
（１）培養
エメリセラ・ヘテロタリカ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）ＡＴＣＣ１６８２４株の斜面培地（ポテト・デキストロース寒天培地）に種培地（スクロース３％、酵母エキス０．１％、硝酸ナトリウム０．６％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム五水和物０．０５％、塩化カリウム０．０５％、硫酸第一鉄０．００１％）を５ｍｌ添加し、菌体を均一に分散し種培養とした。この種培養液を上記と同じ組成の培地６０リットルを含む１０００ｍｌ容のルーフラスコ２４０本に接種し、２７℃で２１日間靜置培養を行なった。
【００３７】
（２）ジクロロメタンによる抽出
培養終了後、培養液（約６０リットル）を濾過により菌体と上清に分け、培養上清について４Ｎ塩酸で液性を酸性に調整した後、約３０リットルのジクロロメタンを加え、抽出し、有機溶媒層を採取した。この操作を２回繰返し、得られた有機溶媒層を併せ、無水硫酸ナトリウムで脱水乾燥した後、減圧下に濃縮乾固して固形物３．４３ｇを得た。
【００３８】
（３）シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製
これをクロロホルム１０ｍｌに溶かし、あらかじめクロロホルム／メタノール混液（１００：１）で充填したシリカゲルカラム（メルク社製、Ａｒｔ７７３４、３５φ×１４０ｍｍ）に吸着させ、クロロホルム／メタノール混液（１００：１）１５００ｍｌで展開し、溶出液を約１００ｍｌずつ分取した。シクロエルゴスタン誘導体の検出は、クロロホルム／アセトン混液（２０：１）およびベンゼン／酢酸エチル混液（２：３）を展開溶媒とするシリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製、Ａｒｔ５７１５、硫酸試薬による発色）で行い、硫酸試薬陽性のフラクションを集め、減圧下に濃縮乾固した。
【００３９】
（４）分取低圧液体クロマトグラフィー（ＬＰＬＣ）による精製
この乾固物をベンゼン／酢酸エチル混液（３：１）５ｍｌに溶かし、あらかじめ同じ組成の展開液で充填したＬＰＬＣ（和光純薬社製、ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌＣＱ−３、２０φ×３００ｍｍのガラスカラムに充填したもの）に付し、同じ組成の溶液１５０ｍｌで洗浄後、ベンゼン／酢酸エチル混液（２：１）３００ｍｌで展開し、溶出液を約１５ｍｌずつ分取し、前述した条件で硫酸試薬陽性のフラクションを集めた。さらにシリカゲルカラムをベンゼン／酢酸エチル混液（１：１）３００ｍｌで展開し、溶出液を約１５ｍｌずつ分取し、硫酸試薬陽性のフラクションを集めた。これを減圧下に濃縮乾固して、Ｍｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘを２０ｍｇ得た。
【００４０】
（５）分取高速液体クロマトグラフィーによる精製
先の分取低圧液体クロマトグラフィーにおいて、ベンゼン／酢酸エチル混液（２：１）で溶出した活性フラクションを減圧下に濃縮し、溶媒を除いた後、クロロホルム３ｍｌに溶かし、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製した。すなわち、カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＳＩＬ−０６（１０φ×３００ｍｍ）、移動相：クロロホルム／メタノール混液（２００：１）、ポンプ流速：３．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＲＩｄｅｔｅｃｔｅｒの条件で、保持時間１５分にピークを示すエメステロンＡおよび保持時間１７．５分にピークを示すエメステロンＢを分取した。これを減圧下に乾固させて新規ステロイドエメステロンＡを８４ｍｇ、エメステロンＢを１０ｍｇ、それぞれ得た。
【００４１】
実施例２
Ｍｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘ３１ｍｇをあらかじめ脱水処理したジクロロメタン４０ｍｌに溶解し、０℃に冷却後、ピリジニウムクロロクロメート７ｍｇを加え、１．５時間撹拌した。これに２−プロパノール２ｍｌを加えた後、反応液を濃縮乾固し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製した。カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＳＩＬ−０６（１０φ×３００ｍｍ）、移動相：クロロホルム／メタノール混液（２００：１）、ポンプ流速：３．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＲＩｄｅｔｅｃｔｅｒの条件で、保持時間１５分にエメステロンＡを３ｍｇ得た。また、エメステロンＡの後画分から未反応原料としてＭｅｒ−ＮＦ８０５４Ｘを２２ｍｇ得た。
【００４２】
実施例３
エメステロンＡ２ｍｇをアセトン２ｍｌに溶解し、トシル酸０．０５ｍｌ、無水塩化カルシウム２、３粒を加え、３０分還流した。
炭酸カリウムで中和した後、反応物をクロロホルムで数回抽出した。有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下に濃縮乾固した。これを分取高速液体クロマトグラフィーにより精製した。カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＳＩＬ−０６（１０φ×３００ｍｍ）、移動相：クロロホルム／メタノール混液（２００：１）、ポンプ流速：３．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＲＩｄｅｔｅｃｔｅｒの条件で、保持時間１７．５分にエメステロンＢを１．５ｍｇ得た。
【００４３】
実施例４
各種ヒトがん細胞を用いてがん細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ50）を測定した。Ｋ５６２（白血病細胞）、ＨＴ２９（大腸がん）、ＨＴ１０８０（細網芽肉腫細胞）、ＭＣＦ７（乳がん細胞）、ＰＣ６（肺がん細胞）、ＭＫＮ２８（胃がん細胞）をそれぞれ２〜５×１０3／ウエルとなるように９６ウエルのマイクロタイタープレートに加え、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地（フェノールレッド不含）とともに種々の濃度の被検化合物の存在下、３７℃の５％ ＣＯ2インキュベーター内で３日間培養した。その後、ＷＳＴ−１試薬［０.０６５％ ２−（４−ヨード−フェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２,４−ジスルフォニル）−２Ｈ−テエトラゾリウムナトリウム塩，０.００７％硫酸メチル−１−メトキシ−５−メチルフェナジウム］を１０μｌ加え、更に３時間インキュベートし、プレートリーダーで４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。被検化合物を添加していない対照の吸光度（Ｃ）と被検化合物を添加した場合の吸光度（Ｔ）より、増殖抑制率（％）を（１−Ｔ／Ｃ）×１００の計算式で求め、ＩＣ50を算出した。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】
0003656875.tif 000008
【００４５】
【発明の効果】
本発明のシクロエルゴスタン誘導体は、表１に示した通り、アスペルギルス症の原因菌であるアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して抗真菌活性を有する。これらの性質に基づき本発明のシクロエルゴスタン誘導体は、医薬、農薬あるいはそれらへの変換素材としての有用性が期待できる。