(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料が湿潤状態において自由に移動できる乾燥多孔質素材上の検出部位に湿潤状態においても安定的に固定化された特異的結合性の物質を保持し、検出部位とは物理的にはなれた部位にシグナルを発する物質を直接標識された特異結合性の物質が湿潤状態で移動可能な状態で保持されており、はじめに検体が多孔質素材上の固定化された特異的結合性の物質と接触し、検体中の分析物質とその特異的結合性物質と第一の複合体を生成した後、次に直接標識された特異結合性の物質が湿潤され検出部位に到達し、第一の複合体と結合を行いその程度を観察できる様設計されている試験片を中空の非浸水性の素材からなる保持体に配置した分析装置であって、液体の検体が検体投入用乾燥多孔質素材を通じて間接的に多孔質素材上の検出部位に安定的に固定された特異的結合性の物質と最初に接触するように設計してなることを特徴とする分析装置。
【請求項２】
検体投入用多孔質片が検出部位を有する多孔質素材と部分的に連結してなることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
検体投入用乾燥多孔質素材がガラスウール、セルロース、ニトロセルロースの少なくともひとつからなることを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項４】
液体の検体が間接的に多孔質素材上の検出部位に安定的に固定化された特異的結合性の物質と最初に反応した後、直接標識された特異結合性の物質に液体試料が直接もしくは間接的に直接標識物を湿潤し、直接標識物が検出部位に到達するように設計してなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
予め分析試験片保持体の中に直接標識物に適用されるように液体試料を保持し、必要に応じ簡単な操作にて直接標識された特異結合性の物質を湿潤させるように設計してある請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
直接標識試薬が着色ラテックス粒子、金属ゾルまたは染料ゾルの少なくともひとつであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
分析試験片保持体がガラス、金属、プラスチックもしくは不透湿性である紙の少なくともひとつから成形されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
多孔質キャリアが多孔質素材製のストリップもしくはシートからなることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異的結合を利用した検定、例えばイムノクロマトグラフィーとも称される免疫学的検定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、感染症の判定など簡易に行うイムノクロマトの原理を用いた分析装置があり、従来の多種に及ぶ試験装置やキットに比較して操作性が優れかつ短時間に測定が出来るようになった。しかし、まだ十分な感度が得られていなかったり、測定不可能な項目がある。
【０００３】
例えば、免疫学的検定方法を利用する技術として、試料を試験片の一部に塗布し、溶液により試料を試験片に浸透させ試料が試験片の検出区域に浸潤し、通過しそこで試料中に含まれる分析物質が試験片の検出区域に固相化された特異結合試薬に固定され、固定化された分析物を標識付試薬を用いて判定することが出来る技術が提案されており、具体的には、この原理の先行技術例がタイロイド・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド（TYROID DIAGOSTICS INC）ＧＢ１５８９２３４、ブーツ・セルテック・ダイアグノスティック・リミテッド（BOOTS-CELLTECH DIAGNOSTICS LIMITED）ＥＰ０２２５０５に記載されている。
【０００４】
さらに上記技術を基に、検査部に特異的物質を固相された多孔質素材および標識付試薬を不透湿性の材料からなる中空ケーシング内に納め、液体の試料がはじめに標識試薬と反応しながら検出部位に到達し固相化された特異的物質との複合体を形成することによりその結合程度を判定することができる様改良された技術が提案されている（特公平７−４６１０７号公報：ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシャープ）。
【０００５】
たしかに上記した提案はすぐれたものであって、この方法における利点は、初めに検体と標識付き試薬が先に反応しながら多孔質材料中を毛細管現象による検出部位に到達、通過する際に、検出部位に有る固相化特異的結合物質と反応を行なう試験片を中空ケーシングに納めることにより特に家庭内などでの使用に適し、速効的で便利にしたことに在る。しかし、すべての反応が同時に行われる一段階反応を特徴としているため、標識付き試薬が余分な反応物や反応阻害物質の影響を受け易い点で、更なる改良が待たれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した技術の現状に鑑みてなされたものであって、本発明の目的は、検体中に含まれる反応阻害物質の影響を押さえ感度を上げて簡便に測定できる分析装置を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、各方面から鋭意、研究、検討の結果、発想の大転換を行い、従来のように検体と標識付き試薬とを直接混合し、これを検出部位にて反応させ、すべての反応を同時に一段階で行うのではなく、これとは全く逆に、検体は、全く別に独立して反応系に添加して検出部位で反応させておき、しかる後に標識付き試薬と反応させたところ（同試薬と最初から反応させるのではなく、いわば間接的に反応させたところ）、検体中に含まれる反応阻害物質の影響を押さえ感度を上げて簡便に測定できるという有用新知見を得、二段階反応に基づく新規な分析装置を発明するのに成功したものである。
【０００８】
本発明の特徴は、検出部位における固相化特異的結合物質と検体中の分析物質が最初に反応した後に、多孔質材料中を毛細管現象により検出部位に到達し初めの標識付き試薬が余分な反応物や反応阻害物質を洗い通過した後、残りの標識付き試薬が効率よく固相化された分析物と反応する様に設計される二段階的に進む反応で、これにより感度を上げ、かつ効率的に分析物を簡便に検出、分析することの出来る様に非浸水性の素材からなる分析試験片保持体に配置した分析装置である。
以下、本発明について詳述する。
【０００９】
反応を阻害する物質が液体に含まれる場合の一例として、例えばヒト血清より該ウイルスに対するＩｇＧ抗体の検出などがあげられる。検出部位に有る固相化特異結合物質に該ウイルス抗原を用い、標識付き試薬に抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることが出来るが、一段階反応では非常に弱い結合しか観察されない。これはヒト血清中に含まれるＩｇＧ総量に対して、該ウイルスに対するＩｇＧ抗体の量が非常に少ないため、最初に標識付き試薬と血清が接触することにより標識付き試薬の多くは該ウイルスに対するＩｇＧ抗体以外の検体中に含まれるヒト由来ＩｇＧと反応してしまうためである。一方、本発明方法では初めに検出部位に有る固相化特異結合物質の該ウイルス抗原と検体中の該ウイルス抗体が血清中などに含まれる他のＩｇＧと交差反応をせず効率よく反応した後、標識付き抗ヒトＩｇＧ抗体試薬が検出部位に到達し、初めの少量の試薬溶液で検出部位を洗浄した後に検出部位に到達した直接標識された抗ヒトＩｇＧ抗体が検出部位に固相化されたヒト抗該ウイルスＩｇＧ抗体と結合することが可能である。この様に本発明においては反応阻害物質の影響を押さえ効率よく検出、分析することが可能となる手段である。
【００１０】
また、検体中に過剰な分析物質が存在する時一段階反応では反応性が弱くなってしまうことが知られている。これは、過剰な分析物質が多くの固相化特異結合物質と反応し、かつ多くの標識付き試薬と反応した時に起こり、固相化特異結合物質、分析物質、標識付き物質との複合体形成が出来なく見掛けの反応が弱くなる現象でフック現象とも呼ばれる。このフック現象により一段階法の原理では過剰の分析物質が存在する検体を測定した際、分析物質が検出できなくなる可能性が有る。しかし、二段階法を原理とする本発明では、初めに分析物質が全ての固相化特異結合物質と反応した後、標識付き試薬が検出部位に到達し、初めの少量の試薬溶液で検出部位にある過剰の分析物質を洗浄した後に効率よく検出部位に結合した分析物質と結合し複合体を形成することが出来、その複合体型形成物を観察することが可能となる。
【００１１】
また、感度を上げる一実施例として、本発明において標識物質や固相化特異結合物質に多価の反応性を持つポリクローナル抗体を用いることが出来る。従来の一段階反応を原理とした方法では分析物質の異なる多くのエピトープに対して特異性を持つポリクローナル抗体を含む標識試薬と分析物質がはじめに反応を行うため、検出部位にそれらが到達した時には分析物質の特異性を持つエピトープの多くは該標識付き試薬により結合し覆われ、検出部位に該標識物質が結合されることはほとんどなくなる。このため、従来の方法では標識付き物質には分析物質の１エピトープに対する特異性を示す物質、例えばモノクローナル抗体などが多く用いられることとなる。そして検出部位には標識付き物質が認識するエピトープとは異なるエピトープに対する特異性を持つものでなくてはならない。本発明では分析物質の異なる多くのエピトープに対して特異性を持つポリクローナル抗体を標識付き試薬として用いる場合、第一の反応にて検出部位に固相化された未標識の分析物質に対する特異性物質と分析物質が反応を終結して、第２の反応で標識付き試薬の反応が行われるため効率よく検出部位に結合される。この際、分析物質が３個以上のエピトープを有する場合には、第一の反応にて検出部位に結合した分析物質に対し第２の反応で標識付き試薬が一対二以上の割合にて結合させることが出来、それにより高感度化する事が容易に可能とすることが出来る。
【００１２】
本発明の重要な特徴のひとつは、従来の固相化された未標識の特異的物質と分析物質と標識付き試薬との同時の反応であるホモジーニアス（一段階反応）な測定系ではなく、第一の反応にて検出部位に固相化された未標識の特異的物質と分析物質が複合体を形成した後に、第２の反応にてこの複合体と標識付き試薬が反応するヘテロジーニアス（二段階反応）な測定系を簡便に測定できるようにし、検体中に含まれる反応阻害物質の影響を押さえ感度を上げたことである。
【００１３】
本発明の分析装置の典型的な実施態様は、検体が間接的に、多孔質素材上の検出部位に湿潤状態にでも安定的に固定化された無標識の特異的結合性の物質と最初に反応するように配置してある事を一特徴とした乾燥多孔質キャリアを配置し、検出部位とは異なる部位に湿潤状態にて移動可能な分析物質に対し特異結合性の標識付き試薬が検体以外の溶液試料を加えることにより検出部位に浸透するように位置関係が決定されており、該装置がさらに、標識付き試薬が検出部位に結合された程度を観察できるように不透湿性固体材料で成形されている分析試験片保持体に含んでなる分析装置である。前記分析装置は多孔質キャリア上の検出部位に液状試薬試料を付与できるように分析試験片保持体が直接もしくは間接的に連通しており、はじめに検体中の分析試料が検査部位の湿潤状態においても安定的に固相化された特異結合性物質と結合した後、溶液試薬を分析試験片保持体が直接的または間接的に標識付き試薬へ供与できるように連通した構造を持つ、これを通じて溶液試薬にて湿潤状態になった標識付き試薬が検査部位に到達し、検体を洗い流しながら固相化分析試料と結合を行うことによりその結合された程度を観察する手段を含む装置である。
【００１４】
本発明に係る検体の検定または分析に使用する別の実施態様装置は、検出部位に湿潤状態で移動しない固相化された特異結合物質を保持しており、初めに間接的に検体中の分析物質が特異結合物質と結合し多孔質材料の上に固定化される様に設計されている。さらに検出部位とは異なる領域に標識付きの分析物質に特異結合物質を含む試薬を保持する多孔質固相材を含み、該標識付き試薬は多孔質材料が乾燥状態にある間はその位置に保持されるが、たとえば液体試薬を含むことにより湿潤されると多孔質材料を通じて自由に移動できるようになる試薬である。それにより該標識付き試薬が保持されている部位と空間的に異なる検出部位に移動する。その際、該標識付き試薬が検出部位に有る検出に余分な検体、過剰な分析物質を取り除きながら、移動し検体中の測定物質と多孔質材料の上に固定化された特異結合物質との複合体との反応を行う。最終的に固相化された特異結合物質と該標識付き試薬により検体中の分析物質はサンドイッチされその結合状態を検出部位にて観察することが出来る不透湿性固体材料で成形されている分析試験片保持体に含んでなる装置である。
【００１５】
本発明に係る検体の検定または分析に使用する別の実施態様装置は、検出部位に湿潤状態で移動しない固相化された特異結合物質を保持しており、初めに間接的にもしくは直接的に検体中の分析物質が特異結合物質と結合し多孔質材料の上に固定化される様に設計されている。さらに検出部位とは異なる領域に標識付きの分析物質もしくはその類似体を含む試薬を保持する多孔質固相材を含み、該標識付き試薬は多孔質材料が乾燥状態にある間はその位置に保持されるが、たとえば液体試薬を含むことにより湿潤されると多孔質材料を通じて自由に移動できるようになる試薬である。それにより該標識付き試薬が保持されている部位と空間的に異なる検出部位に移動する。その際、該標識付き試薬が検出部位に有る検出に余分な検体、過剰な分析物質を取り除きながら、移動し検体中の測定物質と多孔質材料の上に固定化された特異結合物質との複合体との競合反応を行う。最終的に固相化された特異結合物質と分析物質は該標識付き試薬と特異結合物質との反応を阻害し、その結合状態を検出部位にて観察することが出来る不透湿性固体材料で成形されている分析試験片保持体に含んでなる装置である。
【００１６】
本発明における検体の投入方法としては、検体投入用多孔質素材を介して行われる間接的な方法が用いられる。その一例としては、検出部位の有る多孔質素材とは別の検体投入用多孔質片を用い検出部位に効率よく検体が移動するように接触しているような構造を持つ装置にて間接的な方法で検体投入孔へ検体を投入すれば、使用者は容易に検体を検査部位へ投入することが可能となる。本発明にて重要な好適実施一態様では検体が間接的に、多孔質素材上の検出部位に湿潤状態にても安定的に固定化された無標識の特異的結合性の物質と最初に反応するように配置してある必要がある。一例としては、検出部位の有る多孔質素材とは別の検体投入用多孔質片を用い検出部位に効率よく検体が移動するように接触しているような構造を持つ装置である。この検体投入用多孔質片は、正方形、長方形、三角〜多角形、円型、だ円型、菱型、その他適宜な形状ないし大きさを有し、検出部位のある多孔質素材とは別体にした場合、検体投入用多孔質は、その少なくとも一端部が該多孔質素材と重複するように配置するか、両者を検体移動性材料（濾紙、グラスウールその他）で接続するようにしてもよい。その場合、濾紙等の１又は２以上のストリップで両者を接続してもよいし、これらの材料を充填したパイプで両者を接続してもよい。また、所望するのであれば、両者が結合、接続した状態で両者を一体に打抜いたり、成形したりすることも可能である。
【００１７】
この多孔質片は、湿潤性を有する素材であれば何も使用してもかまわないが、一般的に、検体投入用多孔質素材にガラスウール、セルロース、ニトロセルロースなどを用いることが出来る。検体投入用多孔質素材が親水性の低い場合については界面活性剤などによる前処理にて検体を検出部位まで潤滑に移行させることも出来る。ここで用いられる検体投入用多孔質素材は、検体を検出部位まで潤滑かつ迅速に移行させることが大切であり、検体に含まれる分析物質との相互作用がなく、また素材への分析物質の吸着が低い素材が好ましい。さらに、検体が検出部位に移行した後、必要以上に検体が検出部位に流れ出ることにより、第２の反応である直接標識物の流れを遮らないようにするために、保水能力の低い素材が好ましい。このような条件を満たす好適実施例としてガラスウールが使用できる。
【００１８】
また、この様に多孔質片を通して検体を検出部に供与することにより不溶性の物質が検体中に含まれる場合、その不溶性の物質を取り除くこともできる。また、検体投入用多孔質素材に複数の素材を組み合わせることも可能である。
【００１９】
本発明の一実施例として、検出部位と直接標識物質保持領域との間に検体流入阻止壁を配置することが可能である。第一の操作において検体が検出部位に適用されると、その適用された部位を中心に検体が広がり適用された検体量が多く存在するときには第二の反応が進む前に直接標識物質保持領域にまで達してしまう可能性が在る。検出部位と直接標識物質保持領域との間にショ糖水やグリセロール水などを塗布し乾燥させた検体流入阻止壁を配置することにより検体がその阻止壁に到達すると流れが止まり第二の反応が始まる前に直接標識物への接触を防ぐことが出来、第二の操作が行われた後に検体流入阻止壁は検体もしくは第二反応用の液体試薬により溶解し検出部位に標識物質が到達し反応が行われる。また異なる利点としてこの検体流入阻止壁により検体と直接標識物との混和が最小限に押さえられることがあげられる。
【００２０】
本発明の一実施例として、第２の反応を行う為に供与される液状試薬の投入孔が不透湿性固体材料で成形されている分析試験片保持体に窓が開けられている装置が挙げられる。検出部位と物理的に異なる領域に存在する乾燥した直接標識試薬を湿潤させ、多孔質キャリアの中を自由に移動することが可能となり、その移動方向が検出部位に向かうように液状試薬の投入孔が物理的な配置として検出部位、直接標識試薬、投入孔の順番に配列されていることが好ましい。検出部位、直接標識試薬、投入孔はすべて多孔質素材により連結してあり液体が毛細管現象により移動できる状態となっている。さらに、直接標識試薬と投入孔の間に用いる第２反応用多孔質素材にはろ紙を応用することが望ましい。第２反応用多孔質素材は直接標識試薬を湿潤させた後直接標識試薬を検出部位まで到達させさらにその領域から先に移動させる必要があり、さらに、直接標識試薬が検出部位の在る多孔質素材上で安定した流速が得られる様に、多孔質素材に対して一定量の液体を提供し続けることが出来る素材が好ましい。それを安定的に機能させる為には、直接標識試薬を移動させるに十分な一定量の液体を保持するろ紙などが最適である。検体が検出部位に近い検体投入孔に適用された後に、ピペットやドロッピングボトルなどから溶液試薬が第２反応開始投入口に適用されその数分後望ましくは３分から１０分程度にて分析の結果が得られる様に配置された装置である。
【００２１】
本発明の好適実施例として、第２の反応を行う為に供与される液状試薬が不透湿性固体材料で成形されている分析試験片保持体に収められている装置が挙げられる。本装置において検出部位と物理的に異なる領域に存在する乾燥した直接標識試薬を湿潤させ、多孔質キャリアの中を自由に移動することが可能となり、その移動方向が検出部位に向かうように液状試薬を収めるタンクが物理的な配置として検出部位、直接標識試薬、投入孔の順番に配列されていることが好ましい。検出部位、直接標識試薬、タンクはすべて多孔質素材により連結してあり液体が毛細管現象により移動できる状態となっている。さらに、直接標識試薬とタンクの間に用いる第２反応用多孔質素材にはろ紙を応用することが望ましい。第２反応用多孔質素材は直接標識試薬を湿潤させた後直接標識試薬を検出部位まで到達させさらにその領域から先に移動させる必要があり、さらに、直接標識試薬が検出部位の在る多孔質素材上で安定した流速が得られる様に、多孔質素材に対して一定量の液体を提供し続けることが出来る素材が好ましい。それを安定的に機能させる為には、直接標識試薬を移動させるに十分な一定量の液体を保持するろ紙などが最適である。例えば、液状試薬をためるタンクはプラスチック製の分析試験片保持体に予め設計し収められており、この中に液状試薬を必要量収めた後、通常は熱によるアルミシールなどにより蓋をし密閉することにより液体が多孔質素材に触れないように設計した装置であり、第２反応を行う為にこのアルミシールを鋭利なピンにて破り、第２反応用多孔質素材を湿潤させることにより反応が進むことが出来る。他の方法として液状試薬をアルミ製の袋に閉じ込めそれを分析試験片保持体に保持させることにより第２の反応を行うことも可能である。
【００２２】
本発明の全ての実施態様において重要なのは、第一の反応で検体が投入された後、第２の反応にて提供された溶液により全ての溶液が直接標識試薬の配置位置より検出部位へ向かうことにより試薬が検査部位を移動することである。さらに検出部位を越えても引き続き試薬が流れるようにするのが好ましく、それにより反応に関与しなかった標識物を洗い流すことによりより明瞭なシグナルを得ることが出来る。その為にはこの検出部位を越えて流れてくる溶液を吸収するように吸収多孔質素材を設けることが出来る。この素材にはろ紙などが用いることが出来る。
【００２３】
本発明による一実施例として対照区域が存在する場合も在る。対照の区域が存在する場合、その区域には装置動作が順調に働いていることを示すようにすることが出来る。例えば、直接標識試薬にマウスの抗体を含む場合には対照区域には抗マウス抗体を固相化しておくことにより装置が順調に動作していることを確認することが出来得る。
【００２４】
本発明における好適実施例では、多孔質キャリアにニトロセルロースを選択する。その素材はあらかじめ増感しなくても固有に蛋白質と結合する能力が高いことにある。また、ニトロセルロースにはいろいろな孔径（気孔）のものを入手することが出来、直接標識物の粒径に合わせ選択することが出来る。また、本発明にて用いる直接標識試薬には特異的物質に金コロイドや染料ゾルもしくはラテックスなど既知の物質を用いることが出来る。これらは検査部位にて集積される複合体を特別な装置を必要とせず分析結果を瞬時に得ることが出来る。
【００２５】
本発明にて重要な好適実施一態様では、標識付き試薬に用いる標識体として色付きラテックス粒子や金コロイドを使用することが出来る。これらの特徴は直接標識体自体の色をシグナルとして直接検出できることに有る。
【００２６】
本発明にて重要な好適実施一態様では、多孔質材料としてニトロセルロースを使用することが出来る。この素材は物理的な吸着により特異結合性を有する抗体など蛋白質を吸着する性質を持ち、湿潤状態にて安定的に固相化する事が容易に出来る。ニトロセルロースに固相化後、不必要な部位を牛血清アルブミンなど反応において不活性な物質を用いることにより、分析に使われるための蛋白質が吸着することを防ぐことが出来る。
【００２７】
次に本発明のいくつかの好適実施態様について、添付図面を参照しながらより詳細に説明する。
但し、この説明は例示的な意味しか持たないものである。
【００２８】
【実施例】
図１は、本発明による検定試験に使用する典型的な多孔質素材製の試験片をあらわしたものであり、動作原理を示している。図１における正面図は検定結果を分析者が観察する面の様式図を示し、側面図はそれを横方向から見た図の模式図を示す。また、説明の都合上、標識付き試薬が流れる方向として右側から左側に矢印にて示し、左側を下流側とし右側を上流側とする。すべての多孔質素材はすべて多孔質素材支持体である（８）により固定化され、適用される液体試料、試薬が毛細管現象にて移動できるように連結されている。
【００２９】
（３）は試験片を示し、（３）片には検出部位である（４）部位にライン状に特異結合性の物質が湿潤状態においても剥離しない様に固相化されており、さらに対照部位である（５）部位にライン状に標識物質と特異的に結合する物質が湿潤状態においても剥離しない様に固相化されている。検出部位である（４）は対照部位である（５）部位より上流側に配置され、かつ標識物が保持される（２）部位の下流側に配置される。検出部位（４）と対照部位（５）の配置位置は両部位を区別できる程度であれば任意の位置に配する事が出来る。（２）の乾燥標識物を保持した多孔質片は検出部位の上流側に配置され、湿潤されると標識物が溶解し試験片（３）へ流出するように配置される。試験片（３）上の対照部位（５）の下流側に吸収多孔質素材片（６）が配置されており、（６）片にて毛細管現象により試験片（３）を流れてきた液体試料を吸収する。（２）の乾燥標識物を保持した多孔質片の上流に（２）片と連結するように液体試料投入用多孔質片（１）が配置され、第二の操作にて液体試料が添加される領域である。液体試料投入用多孔質片（１）が配置される事により液体試料が添加された時、比較的長時間にわたり一定量の液体試料を乾燥標識物を保持した多孔質片（２）へ供与しつづける事が出来る。
【００３０】
検出部位（４）を中心とした領域付近に検体投入用多孔質素材片（７）が配置される。この際、検体投入用多孔質素材片（７）の少なくとも一辺は試験紙（３）に連結している事が必要である。第一の操作にて検体投入用多孔質素材片（７）に検体が投入された後、多孔質片（７）を通じ試験片（３）に流れ込んだ際、直ちに検出部位（４）が湿潤されるように配置されなくてはならず、検出部位（４）に置ける複合体形成の観察を妨げるほど、検体投入用多孔質素材片（７）が試験片（３）を覆うことは避けるべきである。
【００３１】
本発明は、従来システムのように検体を液体試薬と共に混合状態で標識物保持ゾーンを通過して検出部位にて反応するシステム（いわば一段階法による直接的システム）ではなく、検体はあらかじめ検出部位において固相化しておき、これとは別に液体試薬のみを標識物保持ゾーンを通過せしめ、しかる後にこれらを反応させるシステム（いわば二段階法による間接的システム）をはじめて採用し、あいまいな判断のない正確な分析をはじめて可能としたものである。そして、このシステムを確実に実施するために、検体投入用多孔質素材片７を試験片３とは独立して（但し結合部分は残して）配置せしめたのである。
【００３２】
その作用は、次のとおりである。すなわち、第一操作により検体投入用多孔質素材片（７）に検体が一定量適用されると、（７）片を通じ試験紙（３）に検体が流入され、検出部位が直ちに湿潤される。これにより検体中の分析物質と検出部位に固相化されている特異結合性物質との反応が起り検出部位に分析物質が固相化される。次に、第二の操作により液体試料投入用多孔質片（１）に適当な液体試薬が適用され、乾燥標識物を保持した多孔質片（２）にその液が流入する。その時標識物質が液体試薬により溶解し試験紙（３）へ移動する。試験紙（３）上に操作一にてすでに在る検体液を押し流しながら、下流側へ試薬類は移動し検体部位に到達した時検出部位に固相化されている分析物質との結合反応が始まり最終的に短時間で標識物が検出部位（４）に蓄積された程度を識別する事が出来る。
また、競合反応に改変する事も可能であり、その場合には多孔質片（２）に含まれる標識付き試薬として分析物その物もしくはその類似物を用いる。
【００３３】
この原理にもとづく検定法を用いると、適当な特異結合試薬を選択する事により広範囲の分析物を測定する事が出来る。例えば分析物として、蛋白質、免疫グロブリン、ホルモン、ステロイド、薬品、ウイルス、殺菌、核酸などが挙げられる。
【００３４】
図２には上記の様な多孔質試験片を用いた完成分析装置を示しており、それぞれ図２が完成品の正面図、図３が同装置の試験片内部の詳細を示す図である。図２を参考してわかるように装置はカード状からなりその正面に第一操作にて検体を適用する円形孔のサンプル孔（１０）部位と、第二操作で液体試料を適用する円形の液体試料適用孔（１１）部位およびその試験結果を観察する為に設けられた長方形の観察孔（１２）部位がそれぞれ開口されており、本体内部の多孔質片と連通している。サンプル孔（１０）に連通されている多孔質片（７）は第一の操作により検体を最初に含み観察孔（１２）に見える試験片の検出部位に検体を正確に移行させる様に配置されている。液体試料適用孔（１１）部位には液体試料投入用多孔質材（１）と連結させており、第二の操作により液体試料が適用され、標識付き試薬を含む多孔質片２に流れ込むように配置されている。
【００３５】
本発明に係る装置は、基本的には分析試験片からなるものであって、基本的には、上流から下流へ、液体試料投入用多孔質片１、標識物質保持片２、試験片３（検出部位４、及び必要に応じて対象部位５を含む）、及び必要に応じて吸収多孔質素材片６からなる多孔質片アセンブリーと、検体投入用多孔質素材片７からなるものである。多孔質片アセンブリーにおいて、各片はそれぞれ独立して作成しておき、これらを一部重複せしめてあるいは液体が流動しうるよう適宜多孔質部材で連結して作成してもよいし、一体に作成してもよい。また必要あれば、その強度を保持したり、正しい位置に保持したりするため、多孔質片アセンブリー（及び必要あれば検体投入用多孔質素材片）の下部に多孔質素材支持体（裏打ちシート）８を配置してもよい。
【００３６】
通常、分析試験片（多孔質片アセンブリー及び検体投入用多孔質素材片（７）（及び必要に応じて裏打ちシート８））は、分析試験片保持体（中空の非浸水性素材からなる保持体）に収納、セットする。分析試験片保持体は、上部と下部とから構成され、両者は一体に成型してもよいし、分離してもよい。該下部には、分析試験片を適宜マウントすればよいが、所定位置にマウントしやすくなるため、凹部を設けたり、あるいは逆に突部を設けてもよい。また、該上部には、液体試料投入口、検体投入口、観察窓等を必要個所にあけておく。
【００３７】
他の完成装置形態の例を図４、図５に示す。図４には多孔質試験片を用いた上記とは異なる完成装置の正面図を示しており、図５は同装置の試験片内部の詳細を示す図を示す。図２、図３に示された完成装置と異なる点は、操作２において適用される液体試料を装置内にあらかじめ保持している点であり、試験片の液体試料適用多孔質部位（１）の下部のケース内に液体試料を保持するタンク部位（１５）を有することにある。このタンクには直接液体試料が予め供給されており、その上部開口部にはアルミシートなどを用いてシールする事により液体が流出しない様になっている。操作１にて検体が投入された後に操作２でタンク部位（１５）上部のアルミシールを図４正面図にある開口部（１３）の穴より比較的鋭利なピン状の突起物にて破り、試験片の一端に在る液体試料適用多孔質部位（１）をタンク内の液体試料に浸水する事により操作を行う事が出来るように設計されている。ピン状の突起物は例えば図４の（１４）部位に在るようにケースに付随し折り曲げる事により開口部（１３）へ突起物が刺さり、内部のアルミシールを破るように設計する事も出来る。また異なる方法としてはアルミなどの袋に液体試料が予め供給されておりそれが装置に内蔵されているタンクに収められ、液体試料適用多孔質部位（１）の下部に固定されるように設計する事も可能である。第２の操作にてピン状の突起物は例えば図４の（１４）部位に在るようにケースに付随し折り曲げる事により開口部（１３）へ突起物が刺さり、内部のアルミ袋を破るように設計する事も出来る。
【００３８】
図４及び図５にて説明した形態がこの実施例として好ましく、使用者は検体を所定のサンプル孔に適用した後、直ちに（１４）のピンを（１３）の窓に刺し込むだけで測定を直ちに開始する事が出来るため一連の操作において失敗の可能性が低いものとして試験装置を提供する事が出来る。
【００３９】
上記に説明した装置を製造する場合には、例えばケースをプラスチック素材で２つの部分に分け成型し、多孔質部材と試験片を一部のケースに配置した後に残りのケース部品にて固定する事により容易に組み立てる事が出来る。
【００４０】
さらに、図４、図５にて説明した形態にて一好適実施例として風疹の抗体検査の試験装置について記載する。これ以降に記載する方法は本発明を説明する為の一例であり本発明に制限を与えるものではない。また、本発明に用いられる試験片については種々の先行する技術を応用することができ、その試験片を保持体に配することにより、本発明が完成する。
【００４１】
はじめに図１を参照しながら試験片の作製方法の一例について記載する。
試験片を構成する検出部位および対照部位を有する多孔質素材にニトロセルロース製のメンブランなどを使用する事が出来る。ここではミリポア社のＳＲＨＦメンブランを使用しショ糖密度勾配方法により精製された風疹ウイルス抗原を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度にて１μｌ／ｃｍの割合にて検出部位（４）にライン状にインクジェット印刷技術により塗布される。さらに、対照部位（５）にウサギ由来抗マウスＩｇＧ抗体をＰＢＳに溶解した０．１ｍｇ／ｍｌの濃度にて１μｌ／ｍｌの割合にてライン状にインクジェット印刷技術により塗布される。塗布の方法は、超小型注射器、調節ポンプ付きペン、直接印刷、インクジェット印刷等種々の技術があるが、本発明の目的上、これらの任意の技術を使用することが出来る。好ましい方法としてはメンブランに物理的な傷害を与えない非接触型の印字技術であり定量性に優れた方法が用いられるべきである。また塗布の形状はドット、円、クロス文字など種々の形状にてメンブラン上に塗布することが出来るが、一番効率の良い形状としては標識付き試薬が流れる方向に対して垂直に直線をひくように塗布される方法が好ましい。
【００４２】
塗布されたメンブランは乾燥剤を入れたデシケータなどにて一晩、十分に乾燥させる事により、ニトロセルロースメンブランへの蛋白質が強固に結合されるのを助ける。十分に乾燥したメンブランは１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳ（生理食塩水）にて１０分間含水する事によりメンブランのみ蛋白未吸着領域のブロッキングを行う。ブロッキング後０．５％ＰＶＡ水溶液に浸しメンブランの洗浄を行う。リンス後、メンブランは一晩十分に乾燥させる。このＰＶＡ（ポリビニルアルコール）による洗浄操作は、乾燥メンブランに検体や液体試料を適用した際の親水性をメンブラン自体に保持させる為に必要であり、ＰＶＡなど高分子ポリマーのほかにＴｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤なども用いる事が出来る。
【００４３】
図１の（２）部位にある標識付き試薬を保持する多孔質素材にはガラスウール製の素材が使用される。標識物は色付きラテックス、金属ゾル、染料などを使用できるがここでは青い色の着いたラテックス粒子で粒径は０．１３μｍ（バングス社）の物を用いる。１０％ラテックス溶液に１００μｌに対しマウス由来抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を１．５ｍｇ試験管の中で混和し一晩攪拌し結合させる。更に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を１ｍｌ添加しさらに一時間攪拌する事によりラテックス状の未吸着領域をブロッキングする。ブロッキング終了後、１８０００ｒｐｍにて２０分間遠心しラテックスを沈殿させる。上清にある余分な物質を取り除き２％ショ糖水を添加してラテックスを再可溶化することにより標識付き試薬を作製することが出来る。再可溶化されたラテックスは１％濃度に調製され、ガラスウール製の多孔質材の上に４μｌ／ｃｍの割合で塗布される。塗布された多孔質素材は一晩十分に乾燥される。
【００４４】
試験片を組み立てるに当たり、各多孔質素材を保持、配置するために（８）の粘着性のある裏打ちシートが用いられる。検出部位と対照部位の在るメンブランをはじめに裏打ちシートに張り合わせた後、標識付き試薬の塗布された多孔質素材（２）をメンブランの上流側に数ｍｍかさなり合わさるように張り合わされる。さらに上流側に液体試料適用多孔質素材（１）を標識付き試薬を含む多孔質素材と数ミリ重なり合うように張り合わせる。そしてメンブランの下流側には流れてきた液体試料を受け止める為の液体保持用多孔質材（６）がメンブランと重なるように配置されることにより試験片が作成される。試験片作製における重要な機能はそれぞれの多孔質片は重なり合うことにより液体使用を適用された時すべてが連通されていることで、裏打ちシートを用いる方法は最も簡易に試験片を作成することが出来る方法の一つである。裏打ちシートを使わない方法としては保持体そのものに各多孔質片を定められた位置に固定する構造を有することにより作製することも可能である。
【００４５】
作製された試験片は、ケースの中に収められて初めて本発明の装置として完成する。図４に示す完成装置は上部のプラスチック製からなる部品と下部のプラスチック製の部品からなり下部のプラスチック製の部品には第２の操作にて適用される液体試料を保持するタンク（図５の（１５）部位）が収められ、さらに試験片を保持する枠、サンプルパットを保持する枠を有する。
【００４６】
はじめに、このタンクに液体試料（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を適当量加えその上部をアルミシートを加熱し蓋をする事により液体が漏れないようにする。液体試料は試験片上に標識付き試薬を十分に送り込みさらに下流に流し込むに必要な量が投入される事が必要である。次に、試験片を保持する枠にはめ込む事により、試験片の一端にある液体試料適用多孔質片がアルミシールされたタンク上部に配置される。次にサンプルパットを保持する枠にサンプルパットを配置することにより、試験片の一端が試験片の検出部位付近に数ｍｍ重なるように配置することが出来る。すべての試験片、サンプルパット、液体試料が配置された下部の部品に対し上部の部品がそれぞれの試験片を押え込む様にして組み合わさり、試験片、サンプルパットが動かない様に固定され、その上下の部品を熱などにより密着固定することにより本発明の装置一例が完成される。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によって、感度を高め、あいまいな結果を極力抑えた正確な測定を、簡便な操作により実施することができ、医家向けの分析装置だけでなく、個人用の分析装置としても有用である。検体としても、尿、全血、血清、その他各種サンプルを使用することができ、病気の診断のほか、飲食品の分析、食中毒の検査、環境ホルモン、クラミジア、ＤＮＡその他遺伝子解析も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る分析装置の基本的構成を示す。
【図２】本発明に係る分析装置の完成図の１例を示す。
【図３】その内部を示す。
【図４】本発明に係る分析装置の完成図の別の１例を示す。
【図５】その内部を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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