(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病を診断するための検定方法であって、被検者由来の生物学的サンプルにおいて、次のマーカー:APOEε４対立遺伝子、短鎖D19S178対立遺伝子及び長鎖APO C II対立遺伝子の少くとも２つの存在を、検定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ａ）前記APOEε４、短鎖D19S178及び／又は長鎖APO C II対立遺伝子の全部又は一部の増幅を許容する一対の特定のプライマーに、DNAを含む生物学的サンプルを接触させるステップであって、前記サンプル中に含まれるヒトDNAはハイブリッド形成可能な状態にされ、前記接触は前記生物学的サンプル中に含まれる前記ヒトDNAとの前記プライマーのハイブリッド形成を許容する条件下であることを特徴とするステップと、
ｂ）前記ヒトDNAを増幅するステップと、
ｃ）適当な技術により前記増幅産物を視覚化するステップと、
ｄ）適当な技術により、前記APOEε４、短鎖D19S178及び／又は長鎖APO C II対立遺伝子ののうちで前記DNA中に存在するものを少くとも２つ検出するステップと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記APOEε４、短鎖D19S178及び／又は長鎖APO C II対立遺伝子の存在が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の技術により示されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
−前記対立遺伝子APOEε４、短鎖D19S178及び／又は長鎖APO C IIの少くとも２つに特異的なプライマーの対と、
−DNA増幅を行うために必要とされる試薬と、
を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一に記載の方法を行うためのキット。
【請求項５】
前記APOEε４、短鎖D19S178及び／又は長鎖APO C II対立遺伝子の検出を許容する試薬を更に含むことを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記APOEε４、短鎖D19S178及び／又は長鎖APO C II対立遺伝子の検出を許容する試薬がポリアクリルアミドゲル電気泳動及びマイグレーション後のフラグメントの視覚化のために必要とされる試薬である請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本発明はアルツハイマー病の診断のために共同で用いられる遺伝標識形質に関する。
アルツハイマー病は、β−アミロイドの斑及び神経原繊維のもつれ（tangles）、ほとんどの場合、アミロイド血管障害に関連する皮質のニューロンの喪失を伴う早期の痴呆を特徴とする脳の病理学である。アルツハイマー病の病因における遺伝的影響があることが強く推測されている（WO94/01772）。
この遺伝的構成物は、この病気が家族がこの病気を患っている個人の間に関連性を有することを説明するような年齢依存の浸透度で常染色体の支配的な様式において遺伝されることを示唆する間接的な観察により、多くの年数にわたり表立っている。現在の分子遺伝学的研究は、アルツハイマー病についての推定される遺伝子が、染色体特異的多形性遺伝標識形質を捜すことにより単離されることを可能にしている（Bird et al.,1989,Neurobiology of Aging 10,432〜434）。
３つの染色体の局在化が、早期的兆候的家族性型（兆候時、60歳未満の年齢）に関連するものとして示されている：染色体21、染色体14及び染色体19。２つの結合の研究は染色体の領域19q13.2がアルツハイマー病の晩期的兆候的家族性型に関連することを示唆している（Pericak−Vance et al.,Am.J.Hum.Genet.（1991）,48,1034〜1050;Schellenberg et al.,Ann.Neurol.（1992）,31,223〜227）。この染色体の領域内において、アポリポ蛋白質（APO）Ｅ−C I−C I′−C IIについての遺伝子の群が候補的領域である。これらの遺伝子の産物に関して、アポリポ蛋白質Ｅ（APOE）は特に神経系に関連する:APOEは、老人の斑において存在し、ペプチドβ−A4に対して結合アフィニティーを有する。ストリトマターら（Strittmatter et al.,Proc.Natl.Acad.sci.（1993）90,177〜181）は、アルツハイマー病の晩期的兆候的家族性型におけるAPOEのε４対立遺伝子の増加された頻度を開示する。この観察は、家族性型（Corder et al.,Science（1993）,261,921〜923）及び散在形態（Corder et al.,Science（1993）,261,921〜923;Saunders et al.,Neurology（1993）,13,1467〜1472）について確認されている。
更に、シェレンバーグら（Ann.Neurol.1992,31:233〜227）は、アポリポ蛋白質C II遺伝子のＦ対立遺伝子（Taq I制限フラグメント長多形性（RFLP）対立遺伝子）とアルツハイマー病の家族性型との間の遺伝的関連を報告している。
本発明の著者らは、異なる原因の２つの集団、１つは晩期的兆候型のアルツハイマー病（65歳超）を患う集団及び他は早期的兆候型のアルツハイマー病（65歳未満）を患う集団を含む研究を行った。これにより、少くとも２つの次の遺伝標識形質:APOEε４対立遺伝子、短鎖D19S178対立遺伝子及び長鎖APO C II対立遺伝子の両方の群において、重大な増加が確立された。
染色体19におけるAPOE,APO C II（APO C2）及びD19S178標識形質の局在化は周知であり、特にウィリアムソンらの論文（Williamson et al.,Cyto Genetic and Cell Genetic 1991,vol.58,p.1678）に開示される。
このように、本発明の主題は、アルツハイマー病の診断のための、APOE,D19S178及びAPO C IIから選択される少くとも２つの遺伝標識形質の共同使用である。前記遺伝標識形質は、好ましくはAPOE並びにD19S178及び／又はAPO C II、更に好ましくはAPOE,D19S178及びAPO C IIからなる。
用いられる遺伝標識形質は、有利には、APOEε４対立遺伝子、短鎖D19S178対立遺伝子及び長鎖APO C II対立遺伝子である。
APOE遺伝子は３つの対立遺伝子：ε2,ε３及びε４を有する。
長鎖APO C II対立遺伝子は、30±３超、好ましくは30超の塩基、シトシン−アデニンの連続的な繰り返しを含む対立遺伝子を意味すると理解される。
短鎖D19S178対立遺伝子は、167±４未満、好ましくは167未満のヌクレオチドを含む対立遺伝子を意味すると理解される。
本発明の主題は、少くとも２つの次の標識形質:APOEε４対立遺伝子、短鎖D19S178対立遺伝子及び長鎖APO C II対立遺伝子が、患者由来の生物学的サンプルにおいてテストされることを特徴とするアルツハイマー病の診断の方法でもある。
本発明に従う方法は、有利には、以下のステップ：
ａ）DNAを含有する生物学的サンプルを、APOE,D19S178及び／又はAPO C II遺伝子の全部又は一部の増幅を許容する一対の特定のプライマーに接触させるステップであって、適切な場合、前記サンプル中に含まれるヒトDNAがハイブリッド形成可能であり前記接触が前記生物学的サンプル中に含まれるヒトDNAとの前記プライマーのハイブリッド形成を許容する条件下であることを特徴とするステップと、
ｂ）前記ヒトDNAを増幅するステップと、
ｃ）適当な技術により前記増幅産物を視覚化するステップと、
ｄ）適当な技術によりAPOEε４、短鎖D19S178及び長鎖APO C II対立遺伝子の可能な存在を検出するステップと、
を含む。
本発明の目的のために、診断は、臨床像が、アルツハイマー病とされ得る総合的症状、又は全体としての母集団に関して進行性のアルツハイマー病の患者の増加した確率を示す患者において、上述のものから選択された少くとも２つの標識形質の存在の確認を意味すると理解される。前記確率における増加は少くとも４倍である。
前記生物学的サンプルは、完全な血液、血液の白血球画分もしくはDNAが抽出され得る組織、又は生物学的流体であり得る。
本発明の文脈において用いられる特定のプライマーは、特に、D19S178においてロッパーらの論文（Roppers et al.（1991）,Cytogenet.Cell Genet.58,751〜784）、APOEにおいてヒクスソンらの論文（Hixson et al.（1990）,J.Lipid.Res.31,545〜548）及びAPO C IIにおいてウェバーらの論文（Weber et al.,Am.J.Hum.Genet.44,388〜396）に開示されるものであり得る。
他のプライマーは、プライマーの選択についての基準が、それらが各々の多形性:APOEの領域112〜158、APO C IIの５′末端を含むAPOE,D19S178及びAPO C IIの部分の増幅を許容することであるものとして適合するものであり得る。
テストされる対立遺伝子、特にD19S178及び長鎖APO C IIにおいては、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動により、又は増幅されたフラグメントの配列の決定により、増幅されたフラグメントの長さを決定することにより説明され得る。
テストされる対立遺伝子、特にAPOε４においては、マサト・オリタら（Masato Orita et al.）により開示される一本鎖コンホメーション多形性（SSCP）の分析の技術により、又は特定のプローブを用いるプローブハイブリダイゼーションによっても検出され得る。
本発明の主題は、サンプルにおいて、本発明に従う方法を行うためのキットであって、以下の構成物：
−APOE,D19S178及びAPO C II遺伝子に特異的な一対のプライマー
−DNA増幅を行うために必要とされる試薬
−適切な場合、APOEε４、短D19S178及び／又は長APO C II対立遺伝子の検出を許容する試薬、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動及びマイグレーション後のフラグメントの視覚化のために必要とされる試薬
−適切な場合、変異遺伝子の野生型対立遺伝子からなる標準品
を含むことを特徴とするキットでもある。
本発明の主題は、APOE,APO C II及びD19S178からなる少くとも２つの遺伝子の全部又は一部の増幅産物でもある。
それは、APOE,APO C II及びD19S178から選択される少くとも２つの遺伝標識形質からなる診断的組成物にも関する。
本発明の著者である発明者らの研究の結果が以下に報告され、アルツハイマー病の発生の頻度におけるAPOE,APO C II及びD19S178の関連性を示す。
この研究は、臨床的基準において診断された、アルツハイマー病を患う患者の２つのグループ、即ち、晩期的兆候型のアルツハイマー病を患う36の患者からなるフランスのグループ（78±９歳;65〜91歳の範囲）及び早期的兆候型のアルツハイマー病を示す34の患者からなる英国のグループ（57±４歳;49〜64歳の範囲）を含んでいる。
これらの２つのグループを、アルツハイマー病を患う患者の環境と同一の環境における、各々38及び36の患者からなる同じ出身及び年齢の２つの対照グループと比較した。
マーカデットら（Marcadet et al.）（Standardized Southern−Blot Workshop Technique−Histocompatibility Testing,Springer Verlag,New York,Vol.1）により開示される方法に従って、患者のゲノムDNAを白血球から抽出した。Perkin Elmer Cetus増幅装置を用いるPCRによりゲノムDNAを増幅した。
染色体領域19q13.2内に局在化された５つの標識形質を、相当する引用に開示されるように研究した：（CA）ｎモチーフを含む２つの無名の標識形質、D19S47（Mfd9下の引用（Weber et al.（1989）,Am.J.Hum.Genet.44,388〜396））及びD19S178（Mfd13の下で引用される（Ropers et al.（1991）Cytogenet.Cell Genet,58,751〜784））、APOE多形性（Hixon et al.（1990）J.Lipid Res.31,545〜548）、APO C I遺伝子座の５′未満のHpa Iについての制限フラグメント長多形性（RFLP）（Nillesen et al.（1990）,Nucleic Acids Res.18,3428）及びAOP C II遺伝子における（CA）ｎ繰り返しモチーフの多形性（Mfd5下に引用される）（Weber et al.,Am.J.Hum.Genet.44,388〜396）。
SASバージョン6.04ソフトウェアパッケージを用いて統計的分析を行った。Pearson's χ２テスト及び必要に応じてFisher's exactテストを用いて“一変量”分析を行った。微小付随体多形性について観察されたいくつかの対立遺伝子の頻度のまれなことを考慮して、ヌクレオチドの数に従って、対立遺伝子を２つのグループに共に分類した。このようにD19S178を長鎖対立遺伝子（167ヌクレオチド以上）及び短鎖対立遺伝子（167ヌクレオチド未満）に割り当て、繰り返しモチーフを有するAPO C IIの５′末端の対立遺伝子を長鎖対立遺伝子（30繰り返しモチーフ以上）及び短鎖対立遺伝子（30繰り返しモチーフ未満）に分けた。
対立遺伝子を計数することにより対立遺伝子の頻度を計算した。
記録された結果を、ブレスローらの論文（Breslow N.E.et al.,Statistical Methods in Cancer Research,Vol.1,pp.192〜247）に開示される確率の統計的テストの手段による段階的論理的回帰（Stepwise logistic regression）のモデルを用いて、コンピューター処理した。トンプソンらの論文（Thompson E.A.et al.,Am.J.Hum.Genet.,42,113〜124）及びヒルらの論文（Hill,W.G.,1974,Hereditary,33 229〜239）に開示されるように、連鎖不平衡の分析を行った。
D19S178,APOE,APO C I及びAPO C II標識形質の頻度を、マクリーン及びモートンらの論文（McLean and Morton Genet.Epidemiol.2,263〜272）に開示されるアルゴリズムを用いて予想し、コックスらの論文（Cox et al.,Am.J.Hum.Genet.,43,495〜501）に開示されるようにコンピュータープログラムの形式に入れた。
見積もられた頻度をPearson's χ２の又はFisher's exactテストの平衡を基礎として予想されたものと比較した。
この結果は後述の表Ｉ〜IVに報告される。
表Ｉは、対照に対する、アルツハイマー病を患う散在的患者についてのゲノムの多形性の対立遺伝子の頻度の分布を報告する。
異なる集団についてのD19S47対立遺伝子の分布において、患者と対照との間に重大な違いは現れなかった。この病気の晩期的兆候における集団において、APOE及びAPO C II遺伝子の多形の頻度は、患者と対照との間で重大な違いがあった:APOEε４対立遺伝子及び長鎖APO C II対立遺伝子が、対照におけるものより晩期的兆候的アルツハイマー病を有する患者においてより頻繁に観察された。
対照に対する散在性早期的兆候的患者の英国の集団について同じ分析を行った。この集団を、２つの一般的に許容される限界の兆候時の年齢、即ち、65歳未満及び60歳未満について研究した。兆候時の年齢が65歳未満である患者のグループにおいて、D19S178,APOE及びAPO C Iの多形の対立遺伝子分布は、患者と対照との間で重大に異なっていた：短鎖D19S178対立遺伝子、APOEε４対立遺伝子及びAPO C I（対立遺伝子２）におけるHpa I制限部位の存在が、病気の兆候が対照におけるものより早期である患者においてより高頻度で観察された。60歳未満の病気の兆候の年齢である患者のグループにおいて、D19S178,APOE及びAPO C I遺伝子の多形の対立遺伝子分布は、65歳未満の病気の兆候の年齢である患者のグループのものと同様であった。
以下の分析において、早期的兆候グループと晩期的兆候グループとの間の年齢の期間の分離の限界は65歳である。
早期的兆候的患者グループにおけるAPOEε４対立遺伝子について観察された頻度は、晩期的兆候的患者において観察されたものと重大な差はなく、両集団において、APOEε２対立遺伝子は、アルツハイマー病を患う患者においてまれであった。
兆候時の年齢とAPOEε４対立遺伝子の複製の数との間の逆の相関関係が、晩期的兆候集団（ｐ＜0.026）において観察されたが、早期的兆候集団においては観察されなかった。２つのAPOε４対立遺伝子もしくは１つのε４対立遺伝子を有する患者又はAPOε４対立遺伝子を有さない患者の兆候時の平均年齢は、晩期的兆候グループにおいて各々、70.5,75.0及び81.2歳、早期的兆候グループにおいて各々58.5,56.6及び57.3歳であった。
D19S178,APOE,APO C I及びAPO C II多形の間の対における連鎖不平衡の研究の結果は表IIにおいて報告される。
Hardy−Weinberg平衡の偏りは観察されなかった。両集団におけるAPO C Iの制限フラグメント長多形（RFLP）のAPOε４対立遺伝子と対立遺伝子２の間で完全な連鎖不平衡は明白である。
対照集団において、D19S178とAPOE多形との間の、APOE−C I−C I′−C IIアセンブリー内の大きくない連鎖不平衡は明白である。
４つの標識形質（D19S178,APOE,APO C I及びAPO C II）のハプロタイプ頻度を、後述の表IIIに報告されるように見積もった。
24の理論的ハプロタイプにおいて、15のみがマクリーン及びモートン（McLean and Morton）により開示される方法によるアルゴリズムを用いて見い出された。晩期的兆候集団及び早期的兆候集団の両方において、いくつかのハプロタイプは、患者（Nos1,2及び７）においてのみ観察され、他は対照（Nos12及び13）においてのみ観察された。ハプロタイプNo.10は晩期的兆候患者集団において、早期的兆候集団の２倍の頻度であった。
これら４つの標識形質を組み合わせることにより得られた多形性情報含量（PIC）及び異型接合性の程度は、両グループにおいて高かった。
患者と対照との間の見積もられたハプロタイプ頻度の分布における違いを、15に等しい自由度の範囲の数での公算比の手段によりテストした。この結果は、晩期的兆候患者グループ及び早期的兆候患者グループにおいて、各々88.4及び93.2であった。
異なる遺伝子型の少くとも１つの対立遺伝子の保因者において病気に進展する傾向（“見込み比”）を見積もるために、観察に適している段階的多重論理回帰のモデルを用いた。
晩期的兆候グループにおいて、計算された見込み比は、APOEε４対立遺伝子において6.49（信頼区間＝［1.68;25.03］）、APOE2対立遺伝子において0.10（95％信頼区間＝［1.19;10.70］）。
早期的兆候グループにおいて、得られた計算された見込み比は、APOε４対立遺伝子において3.80（95％信頼区間＝［0.01;0.85］）、短鎖D19S178対立遺伝子において4.44（95％信頼区間＝［1.27;15.49］）である。
散在的早期的兆候又は晩期的兆候型のアルツハイマー病を進展させる少くとも１つのAPOE対立遺伝子の保因者についての調整された見込み比（危険率の近似）は、全集団に関するデータについて適合された論理回帰モデルで計算すると4.10（95％信頼区間＝［1.84;9.16］）であった。
少くとも１つのAPOEε２対立遺伝子の保因者において見込み比は0.11（95％信頼区間＝［0.02;0.50］）であり、これはこの対立遺伝子の保護的効果を示唆する。
少くとも１つのε４対立遺伝子の、及び少くとも１つの２つの標識形質、即ち短鎖D19S178対立遺伝子及び長鎖APO C II対立遺伝子の保因者におけるアルツハイマー病が進行する危険度を後述の表IVに報告する。
両集団において、これら２つの標識形質の１つがAPOEε４対立遺伝子と同時に考慮される時、見込み比は重大に増加した。
例えば、少くとも１つのAPOEε４対立遺伝子及び少くとも１つの長鎖APO C II対立遺伝子を有する患者において晩期的兆候的アルツハイマー病の危険度が最大になる。この形態は対照において決して現れない。この同じ晩期的兆候集団において、少くとも１つのAPOEε４対立遺伝子及び少くとも１つの短鎖S19S178対立遺伝子の保因者において、見込み比は14（14.23）に達する。これらの見込みは、早期的兆候的アルツハイマー病の場合におけるこれらの同じ対立遺伝子についても増加する（８超（8.68））。
全体としての集団において、兆候時の年齢と独立したアルツハイマー病が進行する危険度は、12（12.46）超への見込み比の上昇により証明されるように、少くとも１つのAPOEε４対立遺伝子及び少くとも１つの短鎖D19S178対立遺伝子の保因者において、並びに少くとも１つのAPOEε４及び少くとも１つの長鎖APO C II対立遺伝子の保因者（見込み比９超（9.72））において増加する。
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