【手続補正書】
【提出日】令和2年12月7日(2020.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体(chemical entity)を含むライブラリーをタグ付けする方法であって、該方法が、
(i)第1官能基と第2官能基とを有する一本鎖オリゴヌクレオチドヘッドピースを提供する工程であって、
該オリゴヌクレオチドヘッドピースが5'末端に2'-置換ヌクレオチドを含み、かつ該ヘッドピースの該5'末端の該2'-置換ヌクレオチドが該第2官能基を含む、または
該オリゴヌクレオチドヘッドピースが3'末端に2'-置換ヌクレオチドを含み、かつ該ヘッドピースの該3'末端の該2'-置換ヌクレオチドが該第2官能基を含む、工程；
(ii)該化学実体の第1ビルディングブロックに該オリゴヌクレオチドヘッドピースの該第1官能基を結合させる工程であって、該オリゴヌクレオチドヘッドピースは該第1ビルディングブロックに直接接続されるか、または該オリゴヌクレオチドヘッドピースは2官能性リンカーによって該第1ビルディングブロックに間接的に接続される、工程；および
(iii) 一本鎖オリゴヌクレオチド第1ビルディングブロックタグに該オリゴヌクレオチドヘッドピースの該第2官能基をライゲートさせる工程であって、該第1ビルディングブロックタグが、該5'末端に2'-置換ヌクレオチドおよび該3'末端に2'-置換ヌクレオチドを含み、
該ライゲートさせる工程が、該ヘッドピースの該5'末端の該2'-置換ヌクレオチドと該第1ビルディングブロックタグの該3'末端の該2'-置換ヌクレオチドとの間に共有結合を形成するか、または、該ライゲートさせる工程が、該ヘッドピースの該3'末端の該2'-置換ヌクレオチドと該第1ビルディングブロックタグの該5'末端の該2'-置換ヌクレオチドとの間に共有結合を形成し、
該ライゲートさせる工程が、RNAリガーゼ、DNAリガーゼ、またはRNAリガーゼとDNAリガーゼの組み合わせを使用する酵素的ライゲーションを含み、
複合体が、該化学実体の該第1構成成分に結合され、かつ該第1ビルディングブロックタグにライゲートされた該一本鎖オリゴヌクレオチドヘッドピースを含む、工程
を含み、ここで、
工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、かつ
該第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の該第1ビルディングブロックの正体（identity）をコードしており、
それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する、方法。
【請求項２】
前記ヘッドピースが、該ヘッドピースの内部位置に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記第1ビルディングブロックタグが、該第1ビルディングブロックタグの内部位置に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記2'-置換ヌクレオチドのそれぞれが、独立して、2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記2'-置換ヌクレオチドのそれぞれが、独立して、2'-O-メチルグアニン、2'-O-メチルウラシル、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルイノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルジアミノプリン、2'-フルオログアニン、2'-フルオロウラシル、2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロチミジン、2'-フルオロイノシン、2'-フルオロシチジン、または2'-フルオロジアミノプリンである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記ライゲートさせる工程が、前記オリゴヌクレオチドヘッドピースの5'末端の2'-置換ヌクレオチドと前記第1ビルディングブロックタグの3'末端の2'-置換ヌクレオチドとの間に共有結合を形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドヘッドピースの前記第2官能基が5'-一リン酸である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記ライゲートさせる工程が、前記オリゴヌクレオチドヘッドピースの3'末端の2'-置換ヌクレオチドと前記第1ビルディングブロックタグの5'末端の2'-置換ヌクレオチドとの間に共有結合を形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドヘッドピースの前記第2官能基が3'-OHである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
(iv) 一本鎖オリゴヌクレオチド第2ビルディングブロックタグを前記複合体の前記5'末端にライゲートさせる工程、および
(v) 前記化学実体の第2ビルディングブロックを前記第1ビルディングブロックに結合させる工程
をさらに含む、請求項6または7記載の方法であって、
該工程(iv)および(v)は任意の順序で実施することができる、方法。
【請求項１１】
前記第2ビルディングブロックタグが、該第2ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記複合体の前記5'末端に第2ビルディングブロックタグをライゲートさせる工程が、該複合体の該5'末端の前記2'-置換ヌクレオチドと該第2ビルディングブロックタグの前記3'末端の2'-置換ヌクレオチドとの間に共有結合を形成する、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
(iv) 一本鎖オリゴヌクレオチド第2ビルディングブロックタグを前記複合体の前記3'末端にライゲートさせる工程、および
(v) 前記化学実体の第2ビルディングブロックを前記第1ビルディングブロックに結合させる工程
をさらに含む、請求項8または9記載の方法であって、
該工程(iv)および(v)は任意の順序で実施することができる、方法。
【請求項１４】
前記第2ビルディングブロックタグが、該第2ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記複合体の前記3'末端に第2ビルディングブロックタグをライゲートさせる工程が、該複合体の該3'末端の前記2'-置換ヌクレオチドと該第2ビルディングブロックタグの前記5'末端の2'-置換ヌクレオチドとの間に共有結合を形成する、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
請求項10〜15のいずれか一項記載の方法であって、
(a) 工程(iv)が、RNAリガーゼ、DNAリガーゼ、またはRNAリガーゼとDNAリガーゼの組み合わせを使用する酵素的ライゲーションを含む、
(b) 工程(iv)が、ポリエチレングリコールを使用する工程を含む、
(c) 工程(iv)が、1種以上の可溶性多価カチオンを使用する工程を含む、
(d) 該方法が、工程(iv)および/または工程(v)の前に、未反応オリゴヌクレオチドタグまたは未反応オリゴヌクレオチドヘッドピースから前記複合体を分離する工程をさらに含む、および/または
(e) 該方法が、工程(iv)および/または工程(v)の前に、前記複合体を精製する工程をさらに含む、
方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドヘッドピースがヘアピン構造を含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記DNAリガーゼがssDNAリガーゼまたはT4 DNAリガーゼである、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれか一項記載の方法であって、
(a) 該方法が、前記複合体に1つ以上の追加の一本鎖オリゴヌクレオチドビルディングブロックタグを結合させる工程、および前記第1ビルディングブロックに1つ以上の追加のビルディングブロックを結合させる工程、をさらに含む、
(b) 工程(iii)が、ポリエチレングリコールを使用する工程を含む、
(c) 工程(iii)が、1種以上の可溶性多価カチオンを使用する工程を含む、
(d) 前記オリゴヌクレオチドヘッドピース、前記第1ビルディングブロックタグ、前記第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、前記1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、第1のライブラリー識別配列、使用配列、および/または起源配列をさらに含む、
(e) 該方法が、前記複合体に第1のライブラリー識別タグ、使用配列、起源配列、および/またはテイルピースを結合させることをさらに含む、および/または
(f) 該方法が、複数のオリゴヌクレオチドヘッドピースを使用する工程を含む、
方法。