(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘッジホッグ蛋白質、骨形成因子、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される薬学的に有効なポリペプチドの活性を向上させるためのイオン複合体を含む水性組成物であって、
前記ポリペプチドを含む該組成物が両親媒性化合物をさらに含み、
前記両親媒性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸ならびにデヒドロコール酸のうちいずれかの陰イオン界面活性剤、3［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）ならびにＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Zwittergent）（登録商標）のいずれかの両性イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロミドならびに塩化ドデシルアンモニウムのいずれかの陽性イオン界面活性剤、パルミチン酸などの脂肪酸、スルホン酸デシルなどのアルキルスルホン酸塩、および、ホスファチジルセリンならびにホスファチジン酸塩のいずれかの脂質から選択され、
該ポリペプチドおよび該両親媒性化合物がイオン複合体を形成し、該複合体は、複合体が形成していない状態の該ポリペプチドと比べて溶解性が高くなく、
前記組成物は前記ポリペプチドおよび前記両親媒性化合物のｐK値とは0.5ｐH単位異なるｐH値であり、前記両親媒性化合物の割合がポリペプチド５μｇに対して０．００１から０．０５ｍｇであることを特徴とする組成物。
【請求項２】
ヒトにおける局所適用のための薬学的組成物を製造するための方法であって、
前記組成物がヘッジホッグ蛋白質、骨形成因子、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群から選択される薬学的に有効なポリペプチドとイオン性相互作用によって形成される両親媒性化合物との複合体を用いて構成され、
前記両親媒性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸ならびにデヒドロコール酸のうちいずれかの陰イオン界面活性剤、3［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（CHAPS）ならびにＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Zwittergent）（登録商標）のいずれかの両性イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロミドならびに塩化ドデシルアンモニウムのいずれかの陽性イオン界面活性剤、パルミチン酸などの脂肪酸、スルホン酸デシルなどのアルキルスルホン酸塩、および、ホスファチジルセリンならびにホスファチジン酸塩のいずれかの脂質から選択され、
前記組成物のｐH値が前記ポリペプチド、前記両親媒性化合物のｐK値よりも少なくとも０．５ｐH単位異なり、かつ、組成物中の両親媒性化合物は、複合体を形成していない状態の該ポリペプチドと比べて溶解性を高めないように、前記ポリペプチド５μｇに対して０．００１から０．０５ｍｇの割合で存在することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞膜上の細胞外受容体との相互作用によって生物学的効果を示すポリペプチドの組成物であって、該ポリペプチドが該組成物中に両親媒性化合物とのイオン複合体として存在する組成物に関する。本発明はさらに該組成物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
両親媒性化合物の薬物送達システムとしての使用は、当技術分野ではよく知られている（米国特許第5,650,393号、米国特許第5,688,761号、米国特許第5,665,328号、米国特許第5,124,081号および米国特許第5,109,038号を参照のこと）。例えば有効成分の経皮的および経膜的透過性の向上を目的とする、界面活性物質と薬学的作用物質とのミセル形態にある複合体の形成も知られている（TomlinsonおよびDavis、J. Colloid. Interf., Sci. 74（1980）349）。薬学的作用物質は通常、イオン化状態よりもイオン化されていない状態にある方が生体膜を介した輸送性に優れることも知られている（CoolsおよびJansen、J. Pharm. Pharmacol. 35（1983）689〜691）。また、荷電分子、特にポリペプチドの脂質への溶解性は低いため、生理的pH値で多イオン化形態として存在するペプチドは、作用部位への輸送（薬物送達）には最適ではないことも知られている（Hiraiら、Int. J. Pharm. 7（1991）317〜325）。オカダ（Okada）ら[J. Pharm. Sci. 72（1993）75〜78]により、腸膜を介した蛋白質輸送の促進には、物質のイオン部分に親油性対イオンを結合させ、それによって生体膜との相互作用を向上させることが有益なことが知られている。例えばハッツェンガ（Hazzenga）およびベルナー（Berner）は、両性イオン性作用物質（zwitterionic active agent）の経皮的輸送のための改良された方法を、[J. Controlled Release 16（1991）77〜88]に記載している。
【０００３】
活性物質と生体膜との相互作用を向上させるための他の方法は、例えばリー（Lee）ら[Critical Rev. Therp. Drug Carrier Systems 8（1991）91〜192]、モリモト（Morimoto）ら[Arch. Int. Pharmacodyn. 302（1989）18〜26]およびアングスト（Angst）[Int. J. Pharm. 33（1986）225〜234]に記載されている。しかし、これらの方法ではいずれも、皮膚などの生体膜を介した作用物質の透過を容易にして該物質を細胞内に送達するために、作用物質の疎水性を高めることが目的であった。界面活性物質はこの目的では臨界ミセル濃度（CMC、Womackら、Biochim. Biophys. Acta 733（1983）210）を上回る濃度で用いられる。このような方法の欠点は、用いられる高濃度の界面活性物質が細胞膜に大きな影響を及ぼし、それに損傷を与える可能性があることである。
【０００４】
国際公開公報第94／08599号により、作用物質の均質溶液を調製し、十分量の陰イオン界面活性剤を添加して沈殿物を形成させ、沈殿物を単離してそれを再び有機溶媒中に溶解することにより、担体と結合した活性物質を製造できることが知られている。陰イオン界面活性剤と作用物質との複合体を含むこの均質溶液は、作用物質を固体基質中に包埋または分散させるために用いることができる。さらに国際公開公報第94／08599号は、蛋白質と陰イオン界面活性剤との複合体を形成させることができ、蛋白質の放出制御のために作用物質をそこから放出させうることも述べている。
【０００５】
蛋白質の活性は脂肪酸またはステロイド類などの疎水性化合物との共有結合によって改善させられることが知られている。しかし、このような方法は複雑であり、結合を生じる化学反応に起因する不均質産物をもたらす（例えばEkrami, H.M.ら、FEBS Letters 371（1995）283〜286、Pepinski, R.B.ら、J. Biol. Chem. 273（1998）14037〜14045を参照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、その中に含まれるポリペプチドの活性を向上させる薬学的に有効なポリペプチドの組成物を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この目的は、組成物、好ましくはヘッジホッグ蛋白質、骨形成因子、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される薬学的に有効なポリペプチドを含む薬学的組成物であって、該組成物が両親媒性化合物をさらに含み、該ポリペプチドおよび該両親媒性化合物がイオン複合体を形成し、該複合体の形成が該ポリペプチドの溶解性を高めないことを特徴とする組成物によって達成される。本組成物は有機溶媒を全く含まない。貯蔵するためには本組成物を凍結乾燥することができる。
【０００８】
本発明において、ポリペプチドおよび両親媒性化合物は、水性の、好ましくは緩衝溶液中で用いられる濃度でそれぞれ可溶性であり、ポリペプチドを疎水化してそのためにその水溶性を低下させるか、少なくとも向上させないイオン性相互作用によって複合体の形成がもたらされるのは2つの物質を組み合わせた場合のみである。驚くべきことに、この様式ではこのようなポリペプチドの活性が有意に向上することが明らかになった。
【０００９】
本発明によれば、両親媒性化合物およびポリペプチドの量および比は、好ましくはイオン複合体を含む水性組成物が清澄な溶液であるような様式で選択される。ポリペプチドと両親媒性化合物との複合体の形成により混濁が生じ、本組成物を患者への投与のための溶液として直接用いる場合には、混濁のない溶液を得るためにこの溶液を濾過する。患者への投与の前に本組成物を担体上に固定する場合には、混濁を避ける必要はない。
【００１０】
この薬学的に有効なポリペプチドは、イオン形態として存在することができて、細胞表面受容体（細胞外受容体）によって認識されてそれと結合し、生物活性を生じるポリペプチドである。このようなポリペプチドは、増殖因子（例えばNGF、TGF-β、FGF、GDF、インスリン様増殖因子）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターフェロン-α2bなどのインターフェロン、インターロイキン-2もしくはインターロイキン-12などのインターロイキン、BMP-2などの骨形成因子、またはソニック、インディアンもしくはデザート・ヘッジホッグ蛋白質などのヘッジホッグ蛋白質である。特に好ましいものはヘッジホッグ蛋白質である。ポリペプチドは好ましくは、その活性（治療効果および／またはインビトロでの蛋白質活性）が複合体でない形態と比べて本発明に係る複合体において好ましくは10倍またはそれ以上に高まるものが用いられる。イオン形態のポリペプチドは、そのpK値から少なくとも0.5 pH単位、有利に異なる環境に存在させることによって得られる。
【００１１】
本発明に係る両親媒性化合物は、陰イオン性、両性イオン性もしくは陽イオン性の疎水性界面活性剤、脂肪酸、アルキルスルホン酸または脂質として理解されるべきである。好ましい陰イオン界面活性剤は、デオキシコール酸塩、コール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、デヒドロコール酸塩（陽イオン性ポリペプチドに有用）のようなステロイド系界面活性剤（steroidic tenside）などの陰イオン界面活性剤であり、好ましい両性イオン界面活性剤はCHAPS（3［（3-コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］-1-プロパンスルホネート）およびツヴィッタージェント（Zwittergent）（登録商標）（N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート）であり、好ましい陽イオン界面活性剤はセチルトリメチルアンモニウムブロミドまたは塩化ドデシルトリメチルアンモニウム（陰イオン性ポリペプチドに有用）であり、好ましい脂肪酸はパルミチン酸（陽イオン性ポリペプチドに有用）などの脂肪酸である。好ましいアルキル硫酸塩はスルホン酸デシル（陽イオン性ポリペプチドに有用）などのアルキルスルホン酸塩であり、好ましい脂質はホスファチジルセリン（陰イオン性ポリペプチドに有用）およびホスファチジン酸塩（陽イオン性ポリペプチドに有用）などの脂質である。
【００１２】
両親媒性化合物は、ポリペプチドを疎水化してそれ故にポリペプチドの水溶性を低下させるか、少なくとも上昇させない条件下で本組成物に添加される。本発明により、ポリペプチドと両親媒性化合物との水溶性イオン複合体がこの工程で形成されることは重要である。複合体におけるポリペプチドと両親媒性化合物との比は、用いられるpH値および2つの物質のpK値ならびに濃度比に応じて決まる。pH値は好ましくは、ポリペプチドおよび補助物質（auxilliary substance）のpK値とは少なくとも0.5pH単位異なるものが用いられる。より多くの両親媒性化合物が添加されるほど、より多くの両親媒性化合物がポリペプチドと結合し、複合体はより疎水性となる。これは複合体の沈殿、およびそれによるもはや完全に水溶性ではない可溶性および不溶性複合体の混合物の存在につながる。しかし、トウィーン（Tween）（登録商標）のようなポリオキサマーなどの非イオン性界面活性剤の添加は複合体の水溶性の少なくとも一部を回復させることができ、または必要に応じて組成物を濾過することもできる。この場合には、非イオン性界面活性剤がミセル形成に至るような濃度で存在することも可能である。両親媒性化合物の種類および濃度は、特にポリペプチドとしての蛋白質との共存下でポリペプチドの分子構造がその天然の活性形態に保持され、それ故にポリペプチドの活性が低下しないように選択されることに注意が必要である。通常、この目的には両親媒性化合物はモル量で10倍過剰であれば十分である。好ましくは、蛋白質の量が5μg／mlであれば、0.001〜0.05％（体積当たり重量）の両親媒性化合物が添加される。
【００１３】
例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの変性界面活性剤が本発明に従って用いられる場合、この化合物は低濃度に限って用いることができる。SDSは高濃度で蛋白質を変性させてこれらの蛋白質の水溶性を高めるものの、変性した不活性形態にすることが知られている。こうした、SDSのような両親媒性化合物は比較的高い濃度では本発明に係る望ましい複合体に加えてミセルも形成し、このためポリペプチドの溶解性が高まる。両親媒性化合物がポリペプチドの望ましくない変性を引き起こすか否かは、当業者によく知られた方法によって容易に判定することができる。このような方法は例えばIR、CDおよび蛍光分光法などの、構造を調べるための活性測定または物理化学的方法である。
【００１４】
本発明の意味するところの水性水溶性薬学的組成物は、薬学的に有効なポリペプチドを含み不溶性粒子を本質的には全く含まない組成物と理解されるべきである。特に水性薬学的組成物は本発明により、可視的な混濁がない組成物として理解されるべきである。用いられるポリペプチドの濃度で本発明に係るイオン複合体が完全に水溶性であり、且つ界面活性剤または溶けていない複合体が濾過によって除去されれば、このような可溶性組成物は可能である。本発明に従い、水性組成物は付加的に有機溶媒を含まない。さらに、組成物を製造するために、脂肪酸のような両親媒性化合物を少量の有機溶媒中に溶解させることが必要になる場合もある（組成物の容積の最大5％、好ましくは最大1％）。
【００１５】
本発明のもう1つの主題は、薬学的に有効なポリペプチド、および薬学的に有効なポリペプチドの水溶性を低下させるか少なくとも上昇させない両親媒性化合物が、ポリペプチドと補助物質とのイオン複合体がイオン性相互作用によって形成されるような濃度比およびpH値で結合することを特徴とする、本発明の水性薬学的組成物を製造するための方法である。
【００１６】
本発明の1つのさらなる主題は、ヒトまたは哺乳動物の身体への全身的または局所的投与のための、本発明に係る薬学的組成物の使用である。
【００１７】
本発明に係る組成物においては、（１）ヘッジホッグ蛋白質、骨形成因子、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される薬学的に有効なポリペプチドを含む水性組成物であって、該組成物が両親媒性化合物をさらに含み、該ポリペプチドおよび該両親媒性化合物がイオン複合体を形成し、該複合体の形成が該ポリペプチドの溶解性を高めないことを特徴とする組成物であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る組成物においては、（２）凍結乾燥された形態にある、上記(1)記載の組成物であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る組成物においては、（３）複合体が生体適合性担体上に固定されている、上記(2)記載の組成物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る組成物においては、（４）複合体が溶解形態と沈殿形態との混合物として存在する、上記(3)記載の組成物であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る組成物においては、（５）水性溶液中でのpH値がポリペプチドおよび界面活性剤のpK値と少なくとも0.5pH単位異なる、上記(1)〜(4)記載の組成物であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る組成物においては、（６）ポリペプチドがヘッジホッグ蛋白質である、上記(1)〜(5)記載の組成物であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る組成物においては、（７）両親媒性化合物がデオキシコール酸塩である、上記(1)〜(6)記載の組成物であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る使用においては、（８）ヒト体内でのヘッジホッグ蛋白質の遅延型放出または局所適用のための、上記(1)〜(7)記載の組成物の使用であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る方法においては、（９）ヒトにおける局所適用のための薬学的組成物を製造するための方法であって、ヘッジホッグ蛋白質、骨形成因子、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群から選択される薬学的に有効なポリペプチドとイオン性相互作用によって形成される両親媒性化合物との複合体が本質的な構成要素として用いられ、該ポリペプチドの水溶性を高めない濃度で補助化合物が存在する方法であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る方法においては、（１０）複合体が生体適合性担体上に固定されることを特徴とする、上記(9)記載の方法であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る方法においては、（１１）ポリペプチドと両親媒性化合物とのイオン複合体を形成することを特徴とする、細胞表面受容体によって認識されてそれと結合するポリペプチドの活性を高めるための方法であることを特徴とする。
【００２８】
【発明の実施の形態】
1つの好ましい態様において、ヘッジホッグ蛋白質は薬学的に有効なポリペプチドとして薬学的組成物中で用いられる。ヘッジホッグ蛋白質の活性は共有性疎水性修飾によって向上することが知られている（欧州特許出願第99108032.6号）。
【００２９】
本発明により、驚くべきことに、ヘッジホッグ蛋白質と両親媒性化合物とのイオン複合体を形成することにより、ヘッジホッグ蛋白質の活性をかなりの程度まで上昇させうることが明らかになった。1つの好ましい態様では、ヘッジホッグ蛋白質の活性の10倍またはそれ以上の上昇（大腸菌内で産生される組換えヘッジホッグ蛋白質との比較による）が得られる。
【００３０】
したがって、本発明の1つの好ましい主題は、イオン性相互作用によって形成されるヘッジホッグ蛋白質と両親媒性化合物との複合体を含む薬学的組成物であって、該化合物が該ヘッジホッグ蛋白質の溶解性を低下させるか、少なくとも上昇させない濃度で存在する薬学的組成物である。
【００３１】
ヘッジホッグ（hh）蛋白質は、胚発生における多数の構造の形成を担っている分泌シグナル蛋白質のファミリーとして理解されている（J.C.Smith,Cell 76 (1994) 193-196；N.Perrimonら、Cell 80 (1995) 517-520；C.Chiangら、Nature 83 (1996) 407；M.J.Bitgoodら、Curr.Biol.6 (1996) 296；A.Vortkampら、Science 273 (1996) 613；C.J.Laiら、Development 121 (1995) 2349）。生合成においては、シグナル配列の分解および自己触媒による分解の後に、20kDのN末端ドメインおよび25kDのC末端ドメインが得られる。N末端ドメインは、天然型でコレステロールおよびパルミトイルにより修飾されている（J.A.Porterら、Science 274 (1996) 255-259およびPepinskiら、J.Biol.Chem.273 (1998) 14037-14045）。高等生物においては、hhファミリーは、ソニック（sonic）hh、インディアン（indian）hh、およびデザート（desert）hhという少なくとも3つのメンバーからなっている。（Shh、Ihh、Dhh；M.Fietzら、Development (増補版) (1994) 43-51）。原核細胞で製造した場合と、真核細胞で製造した場合とでは、組換え作製されたヘッジホッグ蛋白質の活性に違いが見られた（M.Hynesら、Neuron 15 (1995) 35-44およびT.Nakamuraら、Biochem.Biophys.Res.Comm.237 (1997) 465-469）。
【００３２】
特に好ましくは、ソニック、インディアンまたはデザートhhが用いられる（Fietz M.ら、Development（Suppl.）（1994）43〜51）。好ましくは、EMBLのデータバンクに第L38518号として記載された配列を有するhh蛋白質が用いられる。ヘッジホッグファミリーの蛋白質はアミノ酸配列に顕著な相同性があり、これが、ソニックヘッジホッグ蛋白質の上記の配列との相同性が80％またはそれ以上であるヘッジホッグ蛋白質をコードする核酸を発現させるためにもそれが好ましい理由である。例えば国際特許出願であるWO99／28454および欧州特許出願第99108032.6号に記載されているようなヘッジホッグ蛋白質が好ましくは用いられる。
【００３３】
ヒト・ソニック・ヘッジホッグ前駆体蛋白質は、L38518なる番号でEMBLデータバンクに開示されている配列の1位〜462位のアミノ酸を含む。1位〜23位アミノ酸はシグナル・ペプチドを表しており、24位〜197位アミノ酸は成熟シグナル・ドメインを表しており、32位〜197位アミノ酸は8アミノ酸短縮されたシグナル・ドメインを表しており、198位〜462位アミノ酸は自己分解後の自己プロセシングC末端ドメインを表している。
【００３４】
好ましくは、ヘッジホッグ蛋白質の薬学的効果は、骨誘導に関してキント（Kinto）ら[FEBS Letters、404（1997）319〜323]に、神経細胞に対する効果に関してミアオ（Miao）ら[J. Neurosci. 17（1997）5891〜5899]に、および軟骨細胞誘導に関してストット（Stott）ら[J. Cell. Sci. 110（1997）2691〜2701]に記載された通り、神経細胞に対する神経学的効果、好ましくは骨形成および／または骨誘導、ならびに特に好ましくは軟骨形成および／または軟骨誘導として理解される。
【００３５】
局所適用のために十分な薬学的有効性を有するような様式で本発明に係る複合体により被覆または包埋される担体基質を調製するには、高濃度のヘッジホッグ蛋白質溶液が必要である。薬学的に用いうる担体は、0.1〜10mg／担体1mlまたはそれ以上の濃度のヘッジホッグ蛋白質を好ましくは含むべきであることが明らかになった。ヘッジホッグ蛋白質は本来、難溶性である。しかし、アルギニンまたはアルギニニウム（argininium）イオンを含む溶液中で低濃度（＜1mg／mlまたはそれ未満）にある場合には、ヘッジホッグ蛋白質の溶解性は劇的に上昇し、hh蛋白質の安定性が増すことが明らかになった。このため、水性溶液および担体結合複合体に対してアルギニンまたはアルギニニウムイオンを添加することが好ましい。
【００３６】
本発明の意味する範囲にあるヘッジホッグ蛋白質の活性は、そのポリペプチドが哺乳動物細胞内で誘発しうるアルカリホスファターゼ（アルカリホスファターゼの発現の促進）活性（アルカリホスファターゼ試験における活性）であると理解される。この方法では、ウシ胎児血清を含む培地中でマウス線維芽細胞株を培養する。続いて滅菌濾過した試料を添加し、約5日後に細胞を可溶化して、色素結合基質（pNp、p-ニトロフェノール）の切断によって細胞可溶化物中のアルカリホスファターゼを測定する（J. Asahina、Exp Cell. Res. 222（1996）38〜47およびT. Nakamura（1997））。
【００３７】
本発明に係る薬学的組成物は薬理学的に有効な量のhh蛋白質を含み、全身的または好ましくは局所的に投与することができる。本発明に係る蛋白質は、ヘッジホッグ・ファミリーの他の蛋白質または骨形成因子（BMP）などの骨増殖因子（Wozneyら、Cell Mol. Biol.，骨、骨形成因子およびそれらの遺伝子の発現（Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression）（1993）Academic Press Inc.、131〜167）または副甲状腺ホルモン（Karablisら、Genes and Development 8（1994）277〜289）またはインスリン様増殖因子（IGF-IまたはII）または形質転換増殖因子ファミリー（TGF-β、GDF）と併用することが好ましい。これらの他の蛋白質は、必ずしもそうである必要はないが、本発明に係る複合体中に存在する。
【００３８】
したがって、本発明の1つのさらなる主題は、ヘッジホッグ蛋白質と両親媒性化合物とのイオン複合体の形成が可能となる条件下での該ヘッジホッグ蛋白質と両親媒性化合物とを結合することにより、ヘッジホッグ蛋白質の好ましくは水溶性である薬学的組成物を製造するための方法である。
【００３９】
本発明のもう1つの主題は、その中の複合体が組成物の本質的な構成要素として用いられ、選択的には適した付加的な薬学的補助物質と組み合わされ、好ましくは緩衝水性溶液中にある薬学的組成物を製造するための、本発明に係るヘッジホッグ蛋白質のこのような複合体の使用である。1つのさらなる好ましい態様において、本発明に係るヘッジホッグ複合体は、ヘッジホッグ蛋白質の徐放もしくはインビボにおける作用部位での局所適用を可能とする溶解および沈殿形態にある混合物として、または沈殿形態のみとして存在する。作用部位での蛋白質の放出は、完全に溶解した薬学的製剤のものよりもこの混合物の方が遅い。
【００４０】
さらに、薬学的組成物の製造のためには、塩化ナトリウム、糖（マンニトール、スクロース、ラクトース、グルコース、サッカロース、トレハロース、好ましくは20〜100mg／ml）またはグリシンもしくはアルギニン、メチオニン、システインなどのアミノ酸のほかに、EDTA、クエン酸塩、チオグリセロール、アセチルシステイン、ポリエチレングリコール（重量にして1〜10％）などの抗酸化物、抗炎症薬、局所麻酔薬、抗生物質および／または安定剤などの補助物質を添加することが好ましい。
【００４１】
さらなる好ましい態様において、シュラミン（suramin）を含む、本発明に係るヘッジホッグ蛋白質の薬学的組成物が好ましく、これは有利に使用されうる。
【００４２】
薬学的組成物は、付加的な薬学的補助物質を含んでいてもよく、好ましくは凍結乾燥されている。
【００４３】
好ましい態様において、薬学的組成物は、0.1〜10 mg/mlの濃度、好ましくは0.1〜5 mg/mlの濃度でヘッジホッグ蛋白質を含む。
【００４４】
好ましい態様において、薬学的組成物は、pH4からpH10の範囲で、特に好ましくはpH6から8の範囲で、生体適合性を有する薬学的に許容される緩衝剤をさらに含む。緩衝剤の濃度は、好ましくは10〜500mmol/l、より好ましくは10〜100mmol/lである。高イオン強度が原因となってそれらが複合体形成に障害を及ぼさないような塩濃度を選択することが好都合である。
【００４５】
本発明のもう1つの態様において、薬学的組成物は、生体適合性があって例えばインプラントとして用いることのできる担体中に包埋された本発明に係る複合体を含む。この担体は、好ましくは
―担体中に包埋された時にヘッジホッグ蛋白質を変性させず、
―平均分子量が少なくとも10,000Daである
重合体である。
【００４６】
このような重合体は、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルジネートもしくはPLGA（ポリ乳酸とグリコール酸との共重合体）などの有機重合体またはそれらの誘導体である。複合体が担体中に包埋される場合には、上記の水性薬学的組成物に関して有用であったように複合体は溶液に完全に可溶性である必要はない。担体結合複合体は、好ましくは骨または軟骨中にヘッジホッグポリペプチドの複合体として、体内に局所的に適用されるため、それは溶解性形態として複合体から徐々に放出され、それによりその望ましい生物学的効果を生じる。
【００４７】
本発明の1つのさらなる主題は、ヒト身体または動物に対する局所適用のための、生体適合性担体上に固定された（可逆的に結合した）本発明に係る薬学的組成物の使用である。このような生体適合性担体は例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、アルジネートもしくはPLGAなどの有機重合体またはそれらの誘導体である。
【００４８】
本発明に係る複合体は好ましくは生体適合性担体上に局在し、担体はインビボにて活性型で複合体を放出することができる。このような製剤は骨および軟骨欠損の修復に特に適するが、神経欠損の修復または全身投与のために用いることもできる。
【００４９】
本発明に係る薬学的組成物は、好ましくは、本質的には構造的物質として作用し、好ましくは細胞に対する接着機能も有する重合体を含む。このような構造的物質は例えばコラーゲンである。
【００５０】
1つのさらなる好ましい態様において、本発明に係る薬学的組成物は、局所的に投与された際の所望の作用部位以外での全身的副作用を軽減するために用いられる。完全には固定されていない、または局所的半減期が極度に短くはない薬学的に有効なポリペプチドの局所投与は、望ましくない全身作用につながる望ましい作用部位の範囲を超えたポリペプチドまたは少なくともその一部の波及につながる。これらの望ましくない全身的効果は、本発明によってかなり軽減すること、または回避さえすることが可能である。本方法は、複合体でない形態と比べてイオン複合体における活性が10倍またはそれ以上高く、複合体の緩衝水性溶液への溶解性が複合体を生じていないポリペプチドよりも低いようなポリペプチドに適する。このようなポリペプチドは好ましくはヘッジホッグ蛋白質、サイトカインおよびNGFなどの増殖因子である。
【００５１】
本発明に従い、ポリペプチドと両親媒性化合物とのイオン複合体は、好ましくは、ポリペプチドが該複合体中でそのインビボでの治療的用量（有効量）に対応する活性を呈するような量で本方法において局所的に適用される。複合体の量は、例えば血液中などの生理的条件下で10倍から20倍に希釈された時に起こるように複合体が解離した時に、ポリペプチドの活性が治療的用量の20％またはそれ未満に過ぎないように選択される必要がある。したがって、本発明の複合体のこのような局所適用において、薬学的に有効なポリペプチドは、ポリペプチドが骨増殖因子である場合には所望の作用部位での局所的な骨増殖などの、ポリペプチドが殺腫瘍薬である場合には細胞増殖抑制作用またはアポトーシス誘導作用などの完全な治療的効果を示す。複合体が作用部位から拡散する際には、複合体は生理的条件下で希釈されて作用部位の外側に波及し、解離に至る。これは複合体を形成したポリペプチドの濃度の低下および複合体を形成していないポリペプチドの濃度の上昇をもたらす。複合体を形成していないポリペプチドの活性は複合体を形成したポリペプチドのそれよりもかなり低いため、作用部位以外ではその治療的効果も低下する。
【００５２】
本発明の1つのさらなる主題は、複合体を形成したポリペプチドがその治療的用量に対応する活性を示し、複合体を形成していない同量のポリペプチドが治療的用量の20％またはそれ未満の活性を示すような量で複合体が投与されることを特徴とする、ヒトにおける局所適用のための本発明に係る薬学的組成物の使用である。
【００５３】
本発明の1つのさらなる主題は、イオン性相互作用によって形成される薬学的に有効なポリペプチドと両親媒性化合物との複合体が本質的な構成要素として用いられ、化合物が薬学的に有効なポリペプチドの水溶性を低下させる濃度で存在し、且つ複合体を形成したポリペプチドはその治療的用量に対応する活性を示すものの複合体を形成していない同量のポリペプチドは治療的用量の20％またはそれ未満の活性を示すような量で複合体が投与されることを特徴とする、ヒトにおける局所適用のための薬学的組成物の製造のための方法である。
【００５４】
【実施例】
以下の実施例、文献、および図面は、本発明をさらに明らかにし、本発明の保護されるべき請求の範囲は特許請求の範囲から得られる。記載された方法は、改変後であっても本発明の主題を開示する具体例として理解されたい。
【００５５】
実施例１．
細胞試験における異なるヘッジホッグ製剤の活性の解析：
アルカリホスファターゼの誘導
マウス間葉多分化能細胞系C3H10T1/2（ATCC CCL-226）の細胞5000個を96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに播く。細胞はDMEM、2mMグルタミン、100 IUペニシリン／ml、100μgストレプトマイシン／mlおよび10％ウシ胎児血清中に置く。翌日に、ヒトshh（0、5または50μg／ml）を種々の処方物（0、0.00016、0.00052、0.0013、0.0019または0.01％デオキシコール酸ナトリウム）中に含む培地によって培地を交換するか、または種々のヘッジホッグ製剤を直接添加する。試験は5日後に中止する。これに関して上清をデカントし、細胞をPBSで1回洗浄する。細胞を50μlの0.1％トリトン（Triton）（登録商標）X-100中に溶解し、-20℃で凍結する。解凍後、25μlのアリコートを蛋白質測定およびアルカリホスファターゼ活性の測定に用いる。
【００５６】
製造者であるピアス（Pierce）社の指示に従った蛋白質の測定：
75μlの再蒸留水を混合物に添加し、次に100μlのBCA蛋白質試薬を添加する（Pierce Micro BCA、No. 23225）。60分後に550nmでの吸光度を測定する。
【００５７】
製造者であるシグマ（Sigma）社の指示に従ったアルカリホスファターゼ活性の測定：
100μlの反応緩衝液（Sigma 221）を混合物に添加する。基質カプセル（Sigma 104-40）を10mlの水に溶解し、次にその100μlを試験混合物にピペットで添加する。450nmでの吸光度を測定する。反応中にアルカリホスファターゼはp-ニトロフェニルホスフェートからp-ニトロフェノール（pNP）に変換される。測定された吸光度は標準曲線を用いてpNPのnmol値に変換される。
【００５８】
種々のヘッジホッグ製剤の活性をpNP nmol／分／蛋白質mg単位で表したものを図1にグラフ化している。これは、同じ蛋白質濃度では、検討したヘッジホッグ製剤の活性がデオキシコール酸塩の濃度が上昇するに伴ってかなり上昇することを示している。
【００５９】
実施例２．
hshh（二量体）の疎水性イオン対の滴定
組換えヒトソニックヘッジホッグ蛋白質（二量体、50mM Tris-HCl、pH7.4中または0.1％Tween 80、50mM Tris-HCl、pH7.4中に0.8mg／ml）を、デオキシコール酸ナトリウムの濃度を徐々に高めながら混合する。混濁（イオン性の蛋白質-界面活性剤複合体を含む水不溶性凝集体の形成）の指標として、360nmでの吸光度を測定する。図2からは、デオキシコール酸ナトリウムの約0.04％を上回る割合が水不溶性凝集体に転換したことが明らかである。0.1％Tween 80の存在下では水不溶性凝集体の形成がかなり防止される。表示した吸光度は希釈度に関して補正していない。
【００６０】
実施例３．
生物活性解析におけるNGF形成の解析：
後根神経節ニューロン発生アッセイ
NGFの生物活性は、インビトロで発生中の後根神経節（DRG）ニューロンの形態計測学的解析によって測定した。簡潔に述べると、腰部DRGをE7〜E8期のニワトリ胚から摘出し、周囲の結合組織を取り除き、先端熱加工を施したパスツールピペットによって粉砕した後に、0.1％トリプシンにより37℃で20分間の消化を行った。プラスチック組織培養皿上で全細胞調製物のプレプレーティングを2時間行うことにより、線維芽細胞などの混入細胞を除去した。これらの条件下ではニューロンは基質に付着しないが、線維芽細胞および他の非神経細胞は組織培養皿のプラスチックに接着する。上清を回収し、ポリオルニチン／ラミニン被覆を施したプラスチック皿（48ウェル）に、5％FBSを含むハム（HAM）F14培地中にて細胞10,000個／ウェルの密度で播くことにより、「浄化した（clean）」ニューロンを回収した。NGFに関する用量反応曲線を約1pg／mlから15ng／mlまで作成した。異なるNGF製剤とともに48時間インキュベートした後に神経細胞体の直径の2倍を超える長さの神経突起を伸ばしている生存分化ニューロンを計数することにより、神経栄養活性を定量化した。データとして2回の測定での分化ニューロンの平均数をNGF試験製剤の濃度に対してプロットし、いくつかの異なる処方物における50％NGF刺激活性濃度（halfmaximal stimulatory activities of NGF）（EC50）を決定した（表1）。
【表１】
0003664373.tif 000002
これらのデータは、両親媒性添加物（ここではデオキシコール酸ナトリウム）を含む処方物ではNGFの比活性が上昇することを明瞭に示している。
【００６１】
実施例４．
デオキシコール酸を有する薬学的組成物
薬学的組成物を製造するために、50mmol／lトリス緩衝液、pH7.4中の5mg／mlまたは1mg／mlのHshh（ヒトソニックヘッジホッグ蛋白質）水性溶液100mlを、デオキシコール酸塩を含まない処方溶液に対して4℃で24時間透析する。透析後、ストック溶液からデオキシコール酸ナトリウムを撹拌しながら添加して、1mg／mlまたは5mg／ml Hshhを処方溶液中に含む水性薬学的組成物を得る。溶液を滅菌濾過して4℃で保存する。ヒトまたは動物への注入には0.05〜2mlの溶液を用いる。
【００６２】
4.1  水性リン酸緩衝生理食塩水中にあるイオン的に疎水化されたヘッジホッグ蛋白質の処方（低デオキシコール酸ナトリウム）
処方溶液：
NaCl：                          150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：        10mmol／l
デオキシコール酸ナトリウム：    0.05％（w／v）
pH：                            7.4
【００６３】
4.2  水性リン酸緩衝塩類溶液中にあるイオン的に疎水化されたヘッジホッグ蛋白質の処方（高デオキシコール酸ナトリウム）
処方溶液：
NaCl：                          150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：        10mmol／l
デオキシコール酸ナトリウム：    0.1％（w／v）
pH：                            7.4
【００６４】
4.3  低イオン強度リン酸緩衝液中にあるイオン的に疎水化されたヘッジホッグ蛋白質の処方（低デオキシコール酸ナトリウム）
処方溶液：
NaCl：                          30mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：          20mmol／l
デオキシコール酸ナトリウム：    0.05％（w／v）
pH：                            6.5
【００６５】
4.4  低イオン強度リン酸緩衝液中でイオン的に疎水化されたヘッジホッグ蛋白質の処方（高デオキシコール酸ナトリウム）
処方溶液：
NaCl：                          30mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：          20mmol／l
デオキシコール酸ナトリウム：    0.1％（w／v）
pH：                            6.5
【００６６】
実施例５．
脂質、脂肪酸またはステロイドを含む、リン酸緩衝塩類溶液中にあるイオン的に疎水化されたヘッジホッグ蛋白質の薬学的組成物
薬学的組成物を製造するために、50mmol／lトリス緩衝液、pH7.4中にある1mg／mlまたは2mg／mlのHshh水性溶液100mlを、脂質、脂肪酸またはコール酸を含まない処方溶液に対して4℃で24時間透析する。透析後、ストック溶液から0.01gのホスファチジン酸、0.01gのホスファチジルセリン、0.01gのパルミチン酸、0.05gのコール酸、0.05gのタウロデオキシコール酸または0.05gのタウロコール酸を撹拌しながら添加して、1mg／mlまたは2mg／ml Hshhを処方溶液中に含む水性薬学的組成物を得る。溶液を滅菌濾過して4℃で保存する。0.05〜2mlの溶液をヒトまたは動物への注入に用いる。
【００６７】
処方溶液：
NaCl：                                150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：              10mmol／l
ホスファチジン酸：                    0.01％（w／v）
pH：                                  7.4
【００６８】
処方溶液：
NaCl：                                100mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：              10mmol／l
ホスファチジルセリン：                0.01％（w／v）
pH：                                  7.4
【００６９】
処方溶液：
NaCl：                                150mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：                20mmol／l
パルミチン酸ナトリウム：              0.01％（w／v）
pH：                                  7.4
【００７０】
処方溶液：
NaCl：                                150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：              10mmol／l
コール酸ナトリウム：                  0.05％（w／v）
pH：                                  7.4
【００７１】
処方溶液：
NaCl：                                100mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：              10mmol／l
タウロデオキシコール酸ナトリウム：    0.05％（w／v）
pH：                                  7.4
【００７２】
処方溶液：
NaCl：                                150mM
リン酸カリウム緩衝液：                20mM
タウロコール酸ナトリウム：            0.05％（w／v）
pH：                                  7.4
【００７３】
実施例６．
アルギニン緩衝液中にあるイオン的に疎水化された骨形成因子（BMP-2）の薬学的組成物
薬学的組成物を製造するために、0.4mg／mlのBMP-2水性溶液100mlを、10mmol／lリン酸カリウム緩衝液、pH6.0中の500mmmol／lアルギニンに対して4℃で24時間透析する。透析後、ストック溶液から0.01g（パルミチン酸）または0.05g（デオキシコール酸またはタウロデオキシコール酸）を撹拌しながら添加して、0.4mg／mlのBMPを含む処方溶液として水性薬学的組成物を得る。溶液を滅菌濾過して4℃で保存する。0.05〜2mlの溶液をヒトまたは動物への注入に用いる。
【００７４】
処方溶液：
アルギニン：                        500mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：              10mmol／l
デオキシコール酸ナトリウム：        0.05％（w／v）
pH：                                6.0
【００７５】
処方溶液：
アルギニン：                        500mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：              10mmol／l
パルミチン酸ナトリウム：            0.01％（w／v）
pH：                                6.0
【００７６】
処方溶液：
アルギニン：                        500mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：              10mmol／l
タウロデオキシコール酸ナトリウム：  0.05％（w／v）
pH：                                6.0
【００７７】
実施例７．
リン酸緩衝塩類溶液中にあるイオン的に疎水化されたインターロイキン2の薬学的組成物
薬学的組成物を製造するために、50mmol／lトリス緩衝液、pH7.4中にある100万または200万IUのインターロイキン2水性溶液100mlを、両親媒性化合物を含まない処方溶液に対して4℃で24時間透析する。透析後、ストック溶液から0.05gのデオキシコール酸、0.01gのホスファチジルセリンまたは0.01gのパルミチン酸ナトリウムを撹拌しながら添加して、100万または200万IUのインターロイキン2を含む処方溶液として水性薬学的組成物を得る。溶液を滅菌濾過して4℃で保存する。0.05〜2mlの溶液をヒトまたは動物への注入に用いる。
【００７８】
処方溶液：
NaCl：                              150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：            10mmol／l
デオキシコール酸：                  0.05％（w／v）
pH：                                7.4
【００７９】
処方溶液：
NaCl：                              150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：            10mmol／l
ホスファチジルセリン：              0.01％（w／v）
pH：                                7.4
【００８０】
処方溶液：
NaCl：                              150mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：              20mmol／l
パルミチン酸ナトリウム：            0.01％（w／v）
pH：                                7.4
【００８１】
実施例８．
リン酸緩衝塩類溶液中にあるイオン的に疎水化されたインターフェロンαの薬学的組成物
薬学的組成物を製造するために、50mmol／lトリス緩衝液、pH7.4中にある400万または4000万IUのインターフェロンα2b水性溶液100mlを、両親媒性物質を含まない処方溶液に対して4℃で24時間透析する。透析後、ストック溶液から0.05gのデオキシコール酸、0.01gのホスファチジルセリン、または0.05gのタウロデオキシコール酸を添加して、400万または4000万IUのインターフェロンα2bを含む処方溶液として水性薬学的組成物を得る。溶液を滅菌濾過して4℃で保存する。0.05〜2mlの溶液をヒトまたは動物への注入に用いる。
【００８２】
処方溶液：
NaCl：                              150mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：            10mmol／l
デオキシコール酸：                  0.05％（w／v）
pH：                                7.4
【００８３】
処方溶液：
NaCl：                              100mmol／l
リン酸ナトリウム緩衝液：            10mmol／l
ホスファチジルセリン：              0.01％（w／v）
pH：                                7.4
【００８４】
処方溶液：
NaCl：                              150mmol／l
リン酸カリウム緩衝液：              20mmol／l
タウロデオキシコール酸ナトリウム：  0.05％（w／v）
pH：                                7.4
【００８５】
実施例９．
酢酸緩衝液中にあるイオン的に疎水化されたヒトNGFの薬学的組成物
薬学的組成物を製造するために、100mmol／l酢酸ナトリウム緩衝液、pH6.0中にある1または2mg／mlのヒトNGF水性溶液100mlに、ストック溶液から0.05gのデオキシコール酸、0.01gのホスファチジン酸または0.05gのタウロデオキシコール酸を撹拌しながら添加して、水性薬学的組成物を得る。溶液を滅菌濾過して4℃で保存する。0.05〜2mlの溶液をヒトまたは動物への注入に用いる。
【００８６】
組成物：
ヒトNGF：                            1mg／ml
酢酸ナトリウム緩衝液：               100mmol／l
デオキシコール酸：                   0.05％（w／v）
pH：                                 6.0
【００８７】
ヒトNGF：                            2mg／ml
酢酸ナトリウム緩衝液：               100mmol／l
ホスファチジン酸：                   0.01％（w／v）
pH：                                 6.0
【００８８】
ヒトNGF：                            1mg／ml
酢酸ナトリウム緩衝液：               100mmol／l
タウロデオキシコール酸ナトリウム：   0.05％（w／v）
pH：                                 6.0
【００８９】
実施例１０．
ヘッジホッグ蛋白質を含むアルジネートゲルの製造
実施例4.1の処方溶液のアリコートを、ゼラチン状のアルジネート蛋白質混合物が形成されるような様式で、1％（w／v）アルギン酸ナトリウム水性ストック溶液（Pronova Biopolymer、Norway）と撹拌する。このゲルを直接、0.05〜2mlの量の注入可能な基質として用いる。
【００９０】
実施例１１．
BMP-2を含むコラーゲン混合物の製造
実施例6の処方溶液のうち1つの100μlを、大きさ10×10×3 mmのコラーゲンスポンジ（Helistat、Integra Life Science、USA）に対して滴下する形で添加する。続いてローディングされた担体を冷凍（-70℃）し、凍結乾燥する。本スポンジは骨折治癒のために局所的に用いられる。
【００９１】
参考文献
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国際公開公報第99/28454号
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【００９２】
【発明の効果】
本発明により、組成物、好ましくはヘッジホッグ蛋白質、骨形成因子、増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、インターロイキンおよびインターフェロンからなる群より選択される薬学的に有効なポリペプチドを含む薬学的組成物であって、該組成物が両親媒性化合物をさらに含み、該ポリペプチドおよび該両親媒性化合物がイオン複合体を形成し、該複合体の形成が該ポリペプチドの溶解性を高めないことを特徴とする組成物が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  デオキシコール酸塩の濃度を徐々に高めた場合の細胞試験におけるshhに対するアルカリホスファターゼ誘導の依存性を示す図である。
【図２】  デオキシコール酸塩の濃度に対する凝集体形成の依存性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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