(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0003636733.tif 000009
（式中、Ｒは炭素数１〜６の飽和アルキル基を表わす）
で示される２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルのラセミ体に、キャンディダ  ヘムロニイ、ロードスポリディウム  デオボバタム、ロードトルラ  グルティニス、トルラスポラ  デルブルエキー、アルカリゲネス  フェカリス、バチルス  サーキュランス、コリネバクテリウム  フラベッセンス、ロードコッカス  ロドクロウス、ノカルディア  リエナ、ノカルディア  グロベルーラ、シュードモナス  シュッツェリィおよびロードコッカス  エリスロポリスからなる群より選択される微生物のもつ一般式（Ｉ）の化合物を立体特異的に加水分解する能力を作用させ、えられた反応液より、生成した一般式（II）：
【化２】
0003636733.tif 000010
（式中、＊は光学活性な炭素を表わす）
で示される光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸および／または一般式（III）：
【化３】
0003636733.tif 000011
（式中、Ｒおよび＊は前記に同じ）
で示される残存する一般式（II）の光学活性なプロピオン酸誘導体の対掌体のエステルを採取することを特徴とする光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸および／またはその対掌体のエステルの製造法。
【請求項２】
前記一般式（Ｉ）および（III）において、Ｒがメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基およびｎ−ヘキシル基よりなる群から選ばれる基である請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸およびその対掌体エステルの製造法に関する。光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸およびその対掌体エステルは、種々の医薬品や生理活性物質の有用な中間体である。また、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸は、抗生物質ブチロシンＡおよびＢの構成成分として知られており、各種の医薬品の合成原料として有用な、光学活性イソセリンに容易に誘導することができる。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルのラセミ体に微生物を作用させて光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸とその対掌体エステルとに光学分割する方法については、知られていない。また、光学活性イソセリンの製造法としては、Ｌ−β−マラミド酸より導く方法（オーガニック・リアクション(Organic Reactions）、３、284 頁(1946)) 、リンゴ酸ジメチルエステルより導く方法（特開昭63-187687 号公報）およびＬ−アスパラギンより導く方法（アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、40、1651頁(1976)) などが知られている。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸およびその対掌体エステルの工業的生産を目指して鋭意検討した結果、２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルのラセミ体を、微生物を用いて光学分割できることを見出した。
【０００４】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）：
【０００５】
【化４】
0003636733.tif 000002
【０００６】
（式中、Ｒは炭素数１〜１２の飽和または不飽和のアルキル基、シクロアルキル基、アリール基またはアラルキル基を表わす）
で示される２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステルのラセミ体に、微生物のもつ一般式（Ｉ）の化合物を立体特異的に加水分解する能力を作用させ、えられた反応液より、生成した一般式（II）：
【０００７】
【化５】
0003636733.tif 000003
【０００８】
（式中、＊は光学活性な炭素を表わす）
で示される光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸および／または一般式（III)：
【０００９】
【化６】
0003636733.tif 000004
【００１０】
（式中、Ｒおよび＊は前記に同じ）
で示される残存する一般式（II）の光学活性なプロピオン酸誘導体の対掌体のエステルを採取することを特徴とする光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸および／またはその対掌体のエステルの製造法に関する。
【００１１】
【実施例】
本発明に用いられる原料は、前記一般式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルのラセミ体である。一般式（Ｉ）中のＲとしては、たとえば、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基およびｎ−ヘキシル基などの炭素数１〜１２、好ましくは１〜６の飽和または不飽和のアルキル基；シクロヘキシル基などの炭素数３〜１２、好ましくは３〜７のシクロアルキル基；フェニル基およびナフチル基などのアリール基；ならびにベンジル基などのアラルキル基など（これらアリール基およびアラルキル基は芳香環上にニトロ基、ハロゲン原子、メチル基などのような置換基を有していてもよい）があげられる。
【００１２】
これらのエステルは公知の方法により合成することができる。すなわち、水酸化ナトリウムによりｐＨ８に調整したグリオキシル酸水溶液にニトロメタンを滴下し、室温で撹拌することによって２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のラセミ体を合成することができる（エイチ・シェクターほか：ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（H.Schecter,et al.:J.Am.Chem.Soc.) 、75、5610頁(1953)参照）。この物質を酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウムなどで脱水後、減圧下で有機溶媒を留去する。こうしてえられた２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のラセミ体を常法によりエステル化することによって２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステル類のラセミ体を合成することができる。
【００１３】
本発明に用いられうる微生物としては、キャンディダ(Candida) 属、ロードスポリディウム(Rhodosporidium)属、ロードトルラ(Rhodotorula) 属、トルラスポラ(Torulaspora) 属、アルカリゲネス(Alcaligenes) 属、バチルス(Bacillus)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属、ノカルディア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas) 属およびロードコッカス(Rhodococcus) 属などに属する微生物があげられる。さらに詳しくは、キャンディダ  マルトーサ(Candida maltosa)ATCC 20275 、キャンディダ  ヘムロニイ（Candida haemulonii)IFO 10001、ロードスポリディウム  デオボバタム(Rhodosporidum diobovatum)IFO 0688、ロードトルラ  グルティニス(Rhodotorula glutinis)IFO 0395、トルラスポラデルブルエキー(Torulaspora delbrueckii)IFO 0381 、アルカリゲネス  フェカリス(Alcaligenes faecalis)IFO 12669 、バチルス  サーキュランス(Bacillus circulans)IFO 3329、コリネバクテリウム  フラベッセンス(Corynebacterium flavescens)IFO 14136 、ロードコッカス  ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)IFO 3338 、ノカルディア  リエナ(Nocardia lyena)ATCC 21338、ノカルディア  グロベルーラ(Nocardia globerula)IFO 13510 、シュードモナス  シュッツェリィ(Pseudomonas stutzeri)IFO 12510 およびロードコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)IFO 12320 などがあげられる。
【００１４】
前記微生物の培養には、通常、微生物の培養に用いられる栄養成分を含む培地（寒天培地などの固体培地または液体培地）が用いられうる。大量培養時には、液体培地が好ましい。培地には、炭素源として、グルコース、シュクロース、マルトースなどの糖類、乳酸、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、またはこれらの混合物などが、また窒素源として、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキスおよびペプトンなどが用いられる。さらに、無機塩、ビタミン類などの栄養源が適宜混合されうる。また、前記微生物は通常の条件により培養されうる。たとえば、  ｐＨ４．０〜９．５にて、２０〜４５℃の温度範囲で好気的に１０〜９６時間培養する。
【００１５】
微生物のもつ２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルのラセミ体を立体特異的に加水分解する能力を作用させる形態は、生菌体のまま、あるいは凍結乾燥やアセトン粉末などの処理をほどこした菌体、菌体を破砕した無細胞抽出液、さらに各種の分画法により部分精製された酵素活性画分、あるいは精製された酵素もしくはこれらよりえられる固定化酵素調製物など、前記加水分解能を発揮できるものであれば、その態様は問わない。
【００１６】
基質である２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルのラセミ体に前記微生物を全菌体のまま作用させるには、通常、微生物の培養液をそのまま反応に用いることもできるが、培養液中の成分が反応に悪影響を与えるばあいには、培養液を遠心分離することなどによってえられる菌体の懸濁液を用いればよい。反応温度は通常１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃であり、反応時のｐＨは４．０〜８．０である。反応液中の菌体の量は菌体の当該反応の接触能力に応じて適宜調節すればよい。
【００１７】
基質は、そのままあるいはリン酸緩衝液などに懸濁して前記培養液あるいは懸濁液に添加すればよく、最終的に基質濃度は０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）である。なお、そのほかの形態で前記微生物のもつ能力を作用させるばあいも、処理菌体、細胞抽出液、酵素活性画分、酵素などを基質とともにリン酸緩衝液などに懸濁させ、最終的に前記と同様の基質濃度範囲とする。
【００１８】
反応は、通常、振とうあるいは通気撹拌しながら行なう。反応時間は、基質濃度、菌体の量、立体特異性の厳密さおよびそのほかの反応条件などによる反応収率およびＲ／Ｓ比などを考慮して、目的の立体異性体が最も多く採取できる時間を選ぶ。通常、２時間〜１週間、好ましくは２〜９６時間で反応が終了するように各条件を決定することが好ましい。反応の進行中、水酸化ナトリウム水溶液などを滴下して反応液のｐＨを一定に保つと反応が促進されるばあいが多い。
【００１９】
生成した光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステルを反応液から採取するには、一般的な単離法が採用されうる。たとえば、水酸化ナトリウムなどで反応液のｐＨを７．０に調整後、反応液にジエチルエーテルなどの有機溶媒を加えて抽出する。えられた抽出液を無水硫酸ナトリウムなどで脱水後、減圧下で有機溶媒を留去する。その結果、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステルの粗生成物をえることができる。さらに、この粗生成物は必要に応じて再結晶化や蒸留を行ない、純粋な光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステルをえることができる。
【００２０】
また、生成した光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸を反応液から採取するには、前記の操作にしたがって反応液から光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステルを抽出した抽出母液のｐＨを塩酸などで２．０以下に調整後、ジエチルエーテルなどの有機溶媒を加えて抽出する。えられた抽出液を無水硫酸ナトリウムなどで脱水後、減圧下で有機溶媒を留去する。その結果、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸の粗生成物をえることができる。さらに、この粗生成物は必要に応じて再結晶化を行ない、純粋な光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸をえることができる。
【００２１】
えられた光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エステルは化学的に加水分解することにより、その立体配置を保持したまま、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸に誘導することができる。一方、えられた光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸は化学的にエステル化することにより、その立体配置を保持したまま、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のエステルに誘導することができる。
【００２２】
したがって、前記微生物のもつ能力を用いた光学分割操作により、所望の立体配置を有する光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸またはその対掌体エステルを容易にえることができる。
【００２３】
えられた光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸は、種々の医薬品や生理活性物質の重要な合成中間体である光学活性イソセリンへ、立体配置を保持したまま誘導することができる。すなわち、光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸をメタノールなどのアルコールに溶解させたのち、パラジウム活性炭素を加えて水素加圧下で水素化分解を行なう（ティ・エム・ウィリアムズほか：ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(T.M.Williams,et al.：J.Org.Chem.)、50、91頁(1985)) 。反応後、パラジウム活性炭素を濾過により除去した濾液を減圧下で濃縮することにより光学活性イソセリンがえられる。この物質は必要に応じて再結晶化を行ない、より純粋な光学活性イソセリンとすることができる。
【００２４】
つぎに実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
参考例１  ２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エチルのラセミ体の合成
グリオキシル酸一水和物４６ｇを水680ml に溶解し、１０％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを8.0 に調整した。これにニトロメタン244ml を加えて室温で２４時間撹拌した。６Ｎ塩酸でｐＨを2.2 に調整し、減圧下で約５０mlになるまで濃縮した。このものを酢酸エチル２０mlで５回抽出した。抽出液をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を留去して２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のラセミ体５１ｇをえた（収率７６％）。２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸のラセミ体１５ｇをエタノール200ml に溶解し、濃硫酸0.5ml を加えて還流下で１２時間反応させた。反応後飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨを7.0 に調整し、減圧下でエタノールを留去した。これをジエチルエーテル100ml で２回抽出した。抽出液をあわせて無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を留去して２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エチルのラセミ体２５ｇをえた（収率７０％）。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
【００２６】
1Ｈ−ＮＭＲ：ＣＤＣＬ3   δ(ppm) ：
4.74(d,J=3.42Hz,2H) 、4.61(t,J=3.90Hz,1H) 、4.32(q,J=5.86,            5.86Hz,2H)、3.34(s,1H)、1.31(t.J=7.33Hz 、3H)
実施例１
下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１０ｍｌずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なった。
【００２７】
培地組成：
グルコース                        ２．０％
ペプトン                          １．０％
酵母エキス                        ０．５％
麦芽エキス                        ０．５％
水道水
ｐＨ７．０
これらの液体培地に表１に示す各微生物を一白金耳接種して、３０℃で２４〜７２時間振とう培養した。つぎに、各培養液を遠心分離して菌体を集め、水洗後、各菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍｌに懸濁させてつぎのような組成の反応液の成分として用いた。
【００２８】
反応液組成：
（１）前記菌体懸濁液                                ０．２５ｍｌ
（２）２．５％（ｗ／ｖ）（ＲＳ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エチルの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）溶液                ０．０５ｍｌ
前記（１）および（２）を試験管に分注して混合し、振とうしながら３０℃で８〜２４時間反応させた。反応後、遠心分離により反応液から菌体を除去し、えられた上清についてＨＰＬＣ（カラム：ファインパック(Finepak) ＳＩＬ  Ｃ18-5（商標登録、日本分光社製）４．５×２５０ｍｍ、溶離液：５％メタノールを含む０．１％Ｈ3 ＰＯ4 水溶液、流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、検出波長：２２５ｎｍ）により基質の残存量と生成物量を測定した。また、この上清についてＨＰＬＣ（カラム：キラルパック(CHIRALPAK) ＷＨ（登録商標、ダイセル化学工業）４．５×２５０ｍｍ、溶離液：１ｍＭ硫酸銅水溶液、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、検出波長：２５４ｎｍ）により、生成物である２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸の光学純度を測定した。これらの結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
0003636733.tif 000005
【００３０】
実施例２
下記の組成からなる液体培地を調製し、大型試験管に１０ｍｌずつ分注して、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なった。
【００３１】
培地組成：
肉エキス                            １．０％
ペプトン                            １．０％
酵母エキス                          ０．５％
水道水
ｐＨ７．０
これらの液体培地に表２に示す各微生物を一白金耳接種して、３０℃で７〜４６時間振とう培養した。つぎに、各培養液を遠心分離にかけて菌体を集め、水洗後、各菌体を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２ｍｌに懸濁させて実施例１と同様に反応液の成分として用いた。実施例１と同様に反応を行ない、反応液の分析を行なった。その結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
0003636733.tif 000006
【００３３】
実施例３
表３に示す各微生物を実施例１と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。実施例１の反応液組成（２）の（ＲＳ）２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エチルのかわりに表３に示したエステルを用いて、実施例１と同様に反応を行ない、反応液の分析を行なった。その結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
0003636733.tif 000007
【００３５】
実施例４
表４に示す各微生物を実施例２と同様に培養し、菌体懸濁液を調製した。実施例１の反応液組成（２）の（ＲＳ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸エチルのかわりに表４に示したエステルを用いて、実施例１と同様に反応を行ない、反応液の分析を行なった。その結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
0003636733.tif 000008
【００３７】
実施例５
実施例２に示した組成からなる液体培地を調製し、５００ｍｌ容肩付き振とうフラスコ５本に５０ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行なった。これに、大型試験管にて同一組成の培地１０ｍｌで３０℃、４８時間振とう培養したノカルディア  グロベルーラ(Nocardia globerula)IFO 13510 を１ｍｌずつ接種し、３０℃で４８時間振とう培養した。培養液を遠心分離して菌体を集め、水洗後、菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁して全量を２２．５ｍｌとした。１Ｌ容三つ口反応用フラスコにこの菌体懸濁液２２．５ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０２．５ｍｌ、（ＲＳ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸ｎ−ブチルエステル５．６３ｇを加え、２．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で反応液のｐＨを６．０に保ちながら３０℃で２８時間反応を行なった。このときの変換率は５５％であった。反応後、遠心分離により反応液から菌体を除去し、ジエチルエーテル５０ｍｌで３回抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、ジエチルエーテルを留去して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸ｎ−ブチルエステル２．２５ｇをえた。その一部を１Ｎ塩酸中で５０℃に加熱して（Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸に導いた。えられた物質の光学純度を実施例１の方法で測定したところ、Ｒ／Ｓ＝９６／４であった。また、エーテル抽出後の母液のｐＨを６Ｎ塩酸で２．０に調整したのち、酢酸エチル５０ｍｌで５回抽出した。この抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後、溶媒を留去して（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸１．２ｇをえた。光学純度はＲ／Ｓ＝４／９６であった。
【００３８】
参考例２
（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸９９２ｍｇ（光学純度Ｓ／Ｒ＝９５／５）をメタノール４０ｍｌに溶解し、５％パラジウム活性炭素６００ｍｇを加えて４．５ａｔｍの下、室温で２０時間撹拌した。反応後、濾過により不溶物を濾取し、よく水洗した。洗液および濾液を減圧下で濃縮乾固して光学活性イソセリンの粗生成物６７０ｍｇをえた（収率８７％）。この物質の光学純度をＨＰＬＣ（カラム：クラウンパック(CROWNPAK)ＣＲ（−）（登録商標、ダイセル化学工業（株）製）、溶離液：０．１Ｍ過塩素酸水溶液、流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：０℃、検出波長：２００ｎｍ）で測定したところ、Ｓ／Ｒ＝９５／５であった。（［α］D ＝−２５．６７°(H2 O ，c=1.01))
以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
【００３９】
1Ｈ−ＮＭＲ：Ｄ3 Ｏ  δ(ppm) ：5.32(dd,1H) 、4.45(dd,1H) 、4.41(dd,1H)
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、医薬品などの合成中間体として有用な光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸およびその対掌体エステルを製造することができる。えられた光学活性２−ヒドロキシ−３−ニトロプロピオン酸は、容易に光学活性イソセリンへと誘導することができる。