(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
校正用、洗浄用、測定用、緩衝用の溶液とこれらの溶液を貯蔵する容器、および電磁弁、送液ポンプ、エアポンプを有する試料溶液混合系と、２枚の多孔質膜の間に微生物を固定化した微生物膜、溶存酸素電極、フローセルから成る微生物センサ、および熱交換器、恒温槽を有する測定系と、制御部、表示部、記録計を有する制御出力系とから成る、水中のＢＯＤを測定するＢＯＤバイオセンサ測定装置において、
前記微生物膜として、前記微生物センサに装着する前に、冷蔵保存された前記微生物膜を予め１５℃以上から装置の運転温度以下の温度範囲で２４時間以上放置したものを用いること、および前記微生物膜を前記微生物センサに装着してから使用する前記緩衝用の溶液が、微生物の増殖を抑制する阻害剤を添加したものであることを特徴とするＢＯＤバイオセンサ測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置において、微生物膜が基質を含まない緩衝溶液で湿式冷蔵保存したことを特徴とするＢＯＤバイオセンサ測定装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置において、阻害剤がアジ化ナトリウムであることを特徴とするＢＯＤバイオセンサ測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、下水処理場、工場、事業所などからの排水、および河川、湖沼などの環境水域における検水について、検水中の有機物汚染の尺度である生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）をバイオセンサにより測定する装置において、冷蔵保存した微生物膜をセンサに取付ける前の操作方法、および緩衝溶液中に添加する物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＢＯＤは、好気性微生物によって検水中の有機物が資化される際に、２０℃、５日間という条件で消費される水中溶存酸素量を、ｍｇ／Ｌの単位で表したものであり、最も代表的な水質汚濁指標の一つである。ＢＯＤは通常、日本工業規格（ＪＩＳＫ０１０２）や、日本下水道協会の下水試験方法（１９８４年）により、公定法として、手分析によって測定されている。
【０００３】
また、これら手分析によるＢＯＤ測定法とは別に、簡便性、迅速性を特徴とするバイオセンサを用いたＢＯＤの測定法があり、その測定方法は例えば特公昭６１−７２５８号公報などに記載されている。センサに微生物を用いたこのＢＯＤバイオセンサ測定装置は、検水中のＢＯＤを約２０〜４０分程度で測定することができる非常に有効なＢＯＤ測定方法であり、平成２年（１９９０年）には日本工業規格「ＪＩＳＫ３６０２：微生物電極による生物化学的酸素要求量（ＢＯＤＳ）計測器」に採用され、既に製品化、実用化されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の微生物センサを用いたＢＯＤバイオセンサ測定装置は、微生物膜を新しいものに交換して運転を開始すると、初期のセンサ出力が徐々に増加し、安定化するまでに数時間から数日を要するという問題点がある。
このセンサ出力の変動は、次のような２つの原因によるものと考えられる。即ち、微生物膜を冷蔵保存状態からセンサに装着した直後は、微生物膜内に固定化した休眠中の微生物が、温度の上昇により活性化を開始し、微生物の内生呼吸量の変化により、センサ出力の基準となるベースライン出力が徐々に増加するという現象が起こる。さらに、保存性の向上を目的として、基質を含まない緩衝溶液中に微生物膜を湿式保存しているために、校正および検水測定のたびに、校正用標準液および検水中に含まれる有機物を餌として微生物の増殖が起こるので、センサ出力の大きさが増加する傾向がある。したがって、ベースライン出力およびセンサ出力が安定化するまでは検水の測定精度に問題があり、この装置では、冷蔵保存した微生物膜を装着した直後には、検水の測定は行わない方が良いことになる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
湿式冷蔵保存した微生物膜を装着した直後はセンサ出力が増加するという上記の問題を解決するために、本発明では、基質成分を含まないリン酸緩衝溶液で湿式冷蔵保存した微生物膜を、センサに装着する前に予め１５℃以上から装置の運転温度以下の温度範囲で２４時間以上放置した微生物膜を用いることと、微生物膜をセンサに装着してから使用するリン酸緩衝溶液に微生物の増殖の阻害剤であるアジ化ナトリウムを添加して用いることとする。
【０００６】
これは、微生物膜をセンサに装着する前に、上記の温度範囲で２４時間以上放置することによって微生物が活性化し、また、微生物膜をセンサに装着してから、緩衝溶液へのアジ化ナトリウムの添加によって微生物膜内に固定化した微生物の増殖を抑制することができるからである。この結果、センサに装着した直後の微生物の内生呼吸量の変化によるベースライン出力の増加や、微生物膜内に固定化した微生物の増殖によるセンサ出力の増加が抑制され、安定化するまでの時間短縮が可能となり、微生物膜交換直後から精度良くＢＯＤ測定が可能となる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をＢＯＤバイオセンサ測定装置を用いた実施例に基づいて説明する。図１はＢＯＤバイオセンサ測定装置の要部構成の一例を示す模式図である。この測定装置は、（１）校正用、洗浄用、測定用、緩衝用の溶液とこれらの溶液を貯蔵する容器、および電磁弁、送液ポンプ、エアポンプを有する試料溶液混合系と、（２）２枚の多孔質膜の間に微生物を固定化した微生物膜、溶存酸素電極、フローセルから成る微生物センサ、および熱交換器、恒温槽を有する測定系と、（３）制御部、表示部、記録計を有する制御出力系とで、構成されている。
【０００８】
図１において、校正に使用される標準液１、洗浄液２、測定対象である検水３、緩衝溶液４は、それぞれの容器に満たされている。
測定では、制御部１４のプログラムに従って、まず標準液１、洗浄液２、検水３のそれぞれの溶液の流路に設けた電磁弁５Ａ〜５Ｃを切り替えて選択された一種類の溶液は、緩衝溶液４と送液ポンプ６Ａおよび６Ｂを用いて混合され、その後にエアポンプ７からのエアによりこの混合溶液中に酸素が注入される。次に、この溶存酸素が飽和状態の混合溶液は、測定系に送られる。
【０００９】
この過程で使用する標準液１は、手分析法であるＪＩＳ  Ｋ０１０２の工業排水試験法および日本下水道協会による下水試験方法で定められたＢＯＤ標準溶液で、グルコースとグルタミン酸の等量混合液である。この標準液１は微生物センサ１０の検量線の作成に用いられる。また、洗浄液２は、配管系に残った標準液１や検水３の洗浄と、微生物センサ１０の出力を内生呼吸（餌の無いときの呼吸）状態に戻すために用い、他の溶液を送液して測定が終了するたびに、洗浄液２を送液して流路を洗浄する。
【００１０】
微生物センサ１０は、微生物（酵母菌であるトリコスポロン・クタネウム）を２枚の多孔質膜の間に固定化した微生物膜１２と、溶存酸素電極１１と、フローセル１３とから成り、測定時の各混合溶液の温度を一定にする熱交換器９と共に、設定温度に温度制御された恒温槽８内に設置されている。溶存酸素が飽和状態の上記の混合溶液は、まず恒温槽８内の熱交換器９を通過し、設定温度に保たれた後、微生物センサ１０へ送られる。
【００１１】
ここで、微生物膜１２の中の微生物と溶存酸素電極１１とによって、送液された溶液中の有機物を微生物が資化する（取り込む）際に消費される溶存酸素量（呼吸量）に応じた微生物センサ１０の電気信号（電圧または電流）が出力される。この時消費される溶存酸素量は、測定溶液中の有機物量と比例関係にあるので、あらかじめ既知のＢＯＤ濃度の標準液１による測定から検量線を作成して置き、これに対して検水３を測定した時の電気信号出力を、制御部１４により比較、演算して検水３中のＢＯＤ濃度を算出し、一連のデータを表示部１５に表示し、また、記録計１６に印字出力する。
【００１２】
制御部１４のプログラムは次の通りである。
はじめに微生物センサ１０の出力を内生呼吸状態（以下、ブランク状態と記載する）にするために、洗浄液２を送液するように電磁弁５Ｂを開く。ブランク状態になった時や、既にブランク状態になっている時には、電磁弁５Ａ、５Ｂがこの順で開いてＢＯＤ濃度既知の標準液１や洗浄液２を送液し、校正のための測定と洗浄を行う。その後、ブランク状態のセンサ出力値である原点とこの標準液１での校正値とを用いて、検量線を作成すると共に、データを表示部１５に表示し、また記録計１６に印字出力する。
【００１３】
次に検水３を電磁弁５Ｃを開いて送液し、濃度未知の検水３のＢＯＤ濃度を検量線から演算して、データ表示部１５に表示し、また記録部１６に印字出力する。設定した回数の検水測定が終わり、センサ出力が標準状態になった時点、または検水を１回測定するごとに再び校正を開始する。これらのそれぞれの測定の間には、必ず洗浄液２を送液して、微生物センサ１０の出力を内生呼吸状態に戻す。各バルブの開閉時間、および検水の測定回数などの条件設定は、プログラムへ入力するパラメーターの値により容易に変更する事ができる。
【００１４】
以上の構成のＢＯＤバイオセンサ測定装置において行った２つの実施例を以下に説明する。
〔実施例１〕
まず、微生物膜をセンサへ装着する場合、装着前の温度と時間の条件差によるセンサ出力変動の測定例を示す。
【００１５】
冷蔵保存した微生物膜を恒温槽８の中で３０℃で一日放置した後に微生物センサ１０に装着した場合と、取り出して直ぐに微生物センサ１０に装着した場合とについて、標準液１に対する微生物センサ１０のセンサ出力値の測定例を、図２および表１に示す。
【００１６】
【表１】
0003664888.tif 000002
【００１７】
また、この測定では、緩衝溶液は濃度１ｍＭのアジ化ナトリウムを添加した本発明の緩衝溶液４を、標準液１はＢＯＤ５０ｍｇ／Ｌグルコース・グルタミン酸混合溶液を用いており、測定ごとに校正をするプログラムで運転している。
図２において、プロットの黒丸（●）の点は、微生物センサ１０に装着する前にＢＯＤ測定装置の恒温槽の温度で一日保った場合の標準液１に対するセンサ出力を、また白三角（△）の点は、冷蔵保存された微生物膜を取り出して直ぐにセンサに装着した場合の検水に対するセンサ出力を示している。この図から、冷蔵保存された微生物膜を取り出して直ぐにセンサに装着した場合は、測定回数が増える毎にセンサ出力は増加傾向にあることがわかる。。
【００１８】
ここで、増加傾向を定量的に表すために、１０回測定におけるセンサ出力の増加率αを次式（１）のように表わすことにする。
【００１９】
【数１】
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ここで、α：センサ出力の増加率、Ｖa ：センサ出力測定１０回の平均値、Ｖmax ：センサ出力測定１０回の最大値、Ｖ min：センサ出力測定１０回の最小値  である。
【００２０】
実験での測定例では、微生物膜を取り出して直ぐにセンサに装着した場合、標準液１を１０回測定した場合のセンサ出力の増加率αi は１８. ７％であった。一方、微生物膜をセンサに装着する前にＢＯＤ測定装置の恒温槽の温度である３０℃で２４時間放置した場合のセンサ出力の増加率α0 は５. ９％となり、αi に比べて３分の１以下になった。さらに、両者の１０回測定におけるＣ. Ｖ値（＝（測定値の標準偏差／平均値）×１００）の比較でも、取り出し直後センサ装着膜のＣ. Ｖ値ＣViが５. ８％に対して、１日恒温槽放置膜のＣ. Ｖ値ＣV0は１. ６％と低くなり、測定回数が１回目からセンサ出力が安定している。
【００２１】
これは冷蔵保存された微生物膜をセンサに装着後、温度上昇と共に膜内に固定化した微生物の活性が高まってくるためにセンサ出力も増加するが、ＢＯＤ測定装置の恒温槽の温度で２４時間放置することにより、膜内に固定化した微生物の活性が安定な状態になってからセンサに装着することになり、測定回数が１回目から安定したセンサ出力を得るのに効果があるものと考えられる。
【００２２】
なお、微生物の培養実験によって、１５℃以下では、微生物が増殖しないことがわかっているので、この温度以下では効果が期待できない。
〔実施例２〕
次に、微生物増殖の阻害剤を添加した場合の影響についての測定例を示す。
緩衝溶液４として従来の組成の０．１Ｍリン酸緩衝溶液を用い、校正用の標準液１および検水３として、ＢＯＤ５０ｍｇ／Ｌグルコース・グルタミン酸混合溶液を用い、新しい微生物膜を装着して測定ごとに校正をするプログラムで運転した結果を図３および表２に示す。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
図３の縦軸は校正および検水測定直前のベースライン出力で、プロットの黒丸（●）の点は標準液１（ＳＴＤ  ＢＡＳＥ）、白三角（△）の点は検水３（ＳＰＬ  ＢＡＳＥ）についての値を表している。横軸は微生物膜をセンサに取付けてからの測定回数を示している。図３の標準液１および検水３のセンサ出力の増加率αはそれぞれ７２. １％、７１. ４％となる。
【００２５】
一方、緩衝溶液４として本発明の組成の濃度１ｍＭのアジ化ナトリウムを添加した０．１Ｍリン酸緩衝溶液を用い、校正用の標準液１および検水３として、ＢＯＤ５０ｍｇ／Ｌグルコース・グルタミン酸混合溶液を用い、新しい微生物膜を装着し、上と同様に１０回測定を行なった結果を図４および表３に示す。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
図４の縦軸、横軸、プロットの種類は、図３と同様に黒丸（●）の点は標準液１、白三角（△）の点は検水３についての値を表している。この場合も、微生物膜をセンサに取付けてからの測定回数が増えるごとに、ベースライン出力が増加する傾向にあるが、標準液１、検水３のセンサ出力の増加率αはそれぞれ２９. ９％、２６. ８％と、従来の緩衝溶液を用いた場合に比べ２分の１以下になっている。また、測定回数が６回目以降の標準液１、検水３のセンサ出力の増加率αは、それぞれ３. ４％、３. ２％に減少し、この時点で既にセンサ出力は安定したと考えられる。
【００２８】
上記の実験結果から、新しく交換した微生物膜は微生物の活性が高いので、センサに装着した直後は内生呼吸量の変化に基づいてベースラインの増加が起こるが、緩衝溶液中に添加したアジ化ナトリウムによる抑制効果のために内生呼吸量の変化が少なくなり、センサ出力の早期安定化に効果があると考えられる。
表４には本発明の効果によるセンサ出力安定化時間と従来法によるセンサ出力安定化時間の比較を示した。
【００２９】
【表４】
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【００３０】
このように、微生物膜をセンサに装着する前に１５℃以上からＢＯＤ測定装置の恒温槽の温度以下で一日保つこと、および緩衝溶液中にアジ化ナトリウムを添加することによって、従来５日間必要としていたセンサ出力安定化時間を１２時間以内へ早期化することが可能である。
【００３１】
【発明の効果】
微生物センサを用いたＢＯＤバイオセンサ測定装置では、冷蔵保存した微生物膜を装着して直ちに運転を開始すると、初期のセンサ出力が徐々に増加し安定になるまでに数時間〜数日を必要とする。この問題に対して、本発明では、冷蔵保存した微生物膜をセンサに取付ける前に１５℃以上からＢＯＤ測定装置の恒温槽の温度で２４時間保つこと、および微生物膜を前記微生物センサに装着してから、微生物膜内に固定化した微生物の増殖を抑制する阻害剤としてアジ化ナトリウムを添加した緩衝溶液を使用することによって、センサ出力を１２時間以内の早期に安定化することができ、実用性の向上ができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の緩衝溶液が適用されるＢＯＤバイオセンサ測定装置の要部構成例を示す模式図
【図２】本発明の緩衝溶液を適用したＢＯＤバイオセンサで微生物膜装着後のセンサ出力変動測定結果を示す図
【図３】従来の緩衝溶液を適用したＢＯＤバイオセンサで微生物膜装着直後のベースライン出力変動測定結果を示す図
【図４】本発明の緩衝溶液を適用したＢＯＤバイオセンサで微生物膜装着直後のベースライン出力変動測定結果を示す図
【符号の説明】
１  ：        標準液
２  ：        洗浄液
３  ：        検水
４  ：        緩衝溶液
５Ａ〜Ｃ：        電磁弁
６Ａ、Ｂ：        送液ポンプ
７  ：        エアポンプ
８  ：        恒温槽
９  ：        熱交換器
１０  ：        微生物センサ
１１  ：        溶存酸素電極
１２  ：        微生物膜（酵母菌トリコスポロン・クタネウム）
１３  ：        フローセル
１４  ：        制御部
１５  ：        表示部
１６  ：        記録計
１７  ：        排水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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