(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク材料の酵素的加水分解により得られるグルタミン含有タンパク加水分解物を含む培地を用いることによって真核細胞をインビトロで維持しまたは生育させるための方法であって、上記タンパク加水分解物が、
・総タンパク様物質量の15重量％未満の遊離アミノ酸レベル
・15アミノ酸未満の平均ペプチド鎖長
を有し、
・上記タンパク加水分解物の少なくとも90重量％が、本明細書中に記載したようにprotein−Pak  60カラムでのゲル透過クロマトグラフィにより決定する場合に1000D未満の分子量を有すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
上記タンパク加水分解物における平均ペプチド鎖長が10アミノ酸残基未満である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記タンパク加水分解物が総タンパク様物質量の４重量％未満の遊離アミノ酸レベルを有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
上記タンパク加水分解物が20重量％以上のグルタミン残基を含有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
上記タンパク材料が穀類タンパクである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
上記タンパク材料がコムギグルテンまたはその画分である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
タンパク材料の酵素的加水分解により得られるグルタミン含有タンパク加水分解物を含む、真核細胞をインビトロで維持しまたは生育させるための培地であって、上記タンパク加水分解物が、
・総タンパク様物質量の15重量％未満の遊離アミノ酸レベル
・15アミノ酸未満の平均ペプチド鎖長
を有し、
・上記タンパク加水分解物の少なくとも90重量％が、本明細書中に記載したようにProtein−Pak  60カラムでのゲル透過クロマトグラフィにより決定する場合に1000D未満の分子量を有すること
を特徴とする培地。
【請求項８】
上記タンパク加水分解物における平均ペプチド鎖長が10アミノ酸残基未満である、請求項７記載の培地。
【請求項９】
上記タンパク加水分解物が総タンパク様物質量の４重量％未満の遊離アミノ酸レベルを有する、請求項７または８記載の培地。
【請求項１０】
上記タンパク加水分解物が20重量％以上のグルタミン残基を含有する、請求項７〜９のいずれか１項記載の培地。
【請求項１１】
上記タンパク材料が穀類タンパクである、請求項７〜10のいずれか１項記載の培地。
【請求項１２】
上記タンパク材料がコムギグルテンまたはその画分である、請求項11記載の培地。
【請求項１３】
請求項７〜12のいずれか１項記載の培地および容器を含む、真核細胞をインビトロで維持しまたは生育させるためのキット。
【請求項１４】
上記培地が使用準備の完了した無菌的液体である、請求項13記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、真核細胞の増殖（proliferating）、増殖（propagating）、維持および培養のための新規な方法、およびこの目的のための好適な培地に関する。特に、本発明は、真核細胞用培地の基礎として、１つ以上の加水分解酵素を用いてタンパク質から調製されたタンパク加水分解物を用いることを特徴とする上記方法およびこのようなタンパク加水分解物を含むことを特徴とする培地に関する。
関連技術の説明
真核細胞のインビトロ培養のための現存する培地（培養培地）は、一般にアミノ酸、ビタミン類、炭水化物および無機質の混合物を含有する。従来技術においては、このような培地の必須成分としてアミノ酸、Ｌ−グルタミンの必要性を記載してきた。この技術の例としては、米国特許第3,579,423号（Yamane et al.）がある。培地は、比較的大量のＬ−グルタミンを含有する。典型的には、Ｌ−グルタミンは細胞生育および維持培地において約2mMの濃度で用いられる。Ｌ−グルタミンは増殖中の真核細胞の重要なエネルギー源であり、（特にプリンおよびピリミジン合成のための）炭素および窒素両方の供給源としても役立つ。
培養哺乳類細胞におけるエネルギー源としてのグルタミンの利用は、グルタミン酸とアンモニアとを生じる、グルタミナーゼによるグルタミンの脱アミド化を通じて進行する。グルタミン酸は、次いでトランスアミノ化を受けてα−ケトグルタール酸が生成され、これがエネルギーを生じるクレブストリカルボン酸回路に取り込まれる。
しかし、液体細胞培養培地へのグルタミンの包含は、グルタミンは遊離アミノ酸形態ではあまり安定ではないという欠点を有する。それがアンモニアとピログルタミン酸とに急速に分解することは、よく知られている。最近、Heenemanら（J.Immunological Methods 116,85−91,1993）は、この分解の結果として、試験したすべての市販の培地を処方されたよりも有意に少ないグルタミンを含有することを見出した。さらに、Heenemanらは、形成されたアンモニアは培養細胞に有害でありうる事実を指摘している。
グルタミンがペプチド中に包含されている場合には、アミノ末端の位置においてのみグルタミン残基はピログルタミン酸およびアンモニアに分解しうるので、グルタミン残基がアミノ末端に存在しないのであれば、グルタミンは分解しない。
従来技術においては、細胞の生育のための小さい合成ペプチドの用途が米国特許第4,235,772号（Hugo）および米国特許第4,058,512号（Sievertsson et al.）において記載されている。これらのペプチドは、少量のＬ−グルタミンを含有し、したがってこの必須アミノ酸のよい供給源ではない。Heenemanら（上述）およびK.Brandら（Metabolism 38（８）,Suppl.1,1989 29−33）は、ジペプチド、グリシル−Ｌ−グルタミンをグルタミンの供給源として用いることを推薦している。しかしBrandは、グルタミンベースで、同じ結果を得るためには遊離のグルタミンより多くのジペプチド（６倍まで）が必要であることを報告している。このジペプチドは、合成によってのみ好適に得ることができる。すべての合成ペプチドは、高価で入手可能性が限られているという欠点を有する。
タンパク質の加水分解によるペプチドの調製に関しては、豊富な従来技術がある。一般に、２つのタイプのこのようなタンパク加水分解物を区別することができる。すなわち、（１）15アミノ酸を超える鎖長を有するペプチドおよび比較的低レベルの遊離アミノ酸（一般に10％未満）を含む加水分解物、および（２）15アミノ酸未満の鎖長を有するペプチドおよび比較的高レベルの遊離アミノ酸（約20％以上）を含む加水分解物である。
第一のグループの加水分解物は、食品への応用において機能的な成分、例えば乳化剤またはエアレーション補助剤（aeration aids）として用いられる。最適な特性のためには、15アミノ酸残基を超えるペプチド鎖（例えば15〜50）が必要であることは周知である。遊離アミノ酸の存在は、製品に望ましくない味とにおいを与えるため、避けるべきである。結果として、これらのタイプの加水分解物は、15アミノ酸をゆうに超える鎖長を有するペプチドおよび約10％未満のレベルの遊離アミノ酸を含む。
第二のグループの加水分解物は、食品への応用においては、主に、低アレルゲン性および好ましくは低減された苦味が必要とされる幼児用および臨床的栄養製剤に用いられる。これらの目的のためには、製品は小さいペプチドを含むべきであり、これは、エンドおよびエキソの両ペプチダーゼ活性を有する酵素調製物を用いて達成される。エキソペプチダーゼの作用により、遊離アミノ酸の量は、約20％またはそれ以上のレベルまで強力に高められる。
発酵産業においては、大量の遊離アミノ酸（20％以上）を有する第二のグループの加水分解物は、微生物用の培地において比較的廉価なアミノ酸供給源として用いられている。しかし、高レベルの遊離アミノ酸を含むタンパク加水分解物は、遊離のグルタミンがピログルタミン酸と有害なアンモニアとに分解するという欠点をも有し、したがって、真核細胞の培地においての応用には、非常に適しているものではない。
従来技術（例えばAnimal Cell Culture,A Practical Approach,second edition,ISBN 0−19−963213−８）においては、細胞培養培地におけるラクトアルブミン加水分解物（エンドおよびエキソの両ペプチダーゼ活性を有するパンクレアチンを用いて調製される）またはペプトン（非常に高レベルの遊離アミノ酸を有する加水分解物）の使用が記載されているが、添加物としてのみであり、グルタミンまたは他のアミノ酸の主要供給源としてではない。
従来技術においては、分子中にグルタミン残基を含むコムギグルテン由来の種々の加水分解物が記載されてきた。例として、米国特許第3,852,479号（Yokotsuka et al.）、第3,932,671号（Yokotsuka et al.）および第4,100,151号（Adler−Nissen）がある。これらの生成物は食品中に用いられる。Tanabeら（J.Food Biochem.,16（４）,1993 235−48）は、ラット食餌実験を通じて、腸栄養におけるグルタミン供給源としての、グルテンの加水分解により得られる高グルタミンオリゴペプチドの利用を研究した。
従来技術には、（合成）ジペプチドよりも高分子のペプチド、タンパク加水分解物から得られるペプチド混合物、またはグルタミンを含有するインタクトなタンパクの、真核細胞のための培地における主要なまたは唯一のグルタミンおよび／または他のアミノ酸供給源としての用途については記載されていないようである。
本発明の目的
真核細胞のインビトロ培養のための新規な方法を提供することは、本発明の１つの目的である。特に、アミノ酸、特にグルタミンを、真核細胞を培養するのに用いられる条件下で水性溶液中で安定であり、簡便に使用でき、従来の手段により無菌化することができ、毒性および阻害的な影響を与えない、真核細胞により取り込まれうる形態で、経済的に提供することは本発明の１つの目的である。さらに、簡便かつ経済的に製造される、真核細胞を培養するための安定なグルタミン供給培地を提供することも、本発明の１つの目的である。本発明の他の目的は、当業者には明らかになるであろう。
本発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質材料の酵素的加水分解により得られるグルタミン含有タンパク加水分解物を含むことを特徴とする培地を用いることにより真核細胞をインビトロで維持しまたは生育させる方法を提供する。上記タンパク加水分解物は、総タンパク様物質量の15重量％未満の遊離アミノ酸レベルを有する。
さらに、本発明は、タンパク質材料の酵素的加水分解により得られるグルタミン含有タンパク加水分解物を含むことを特徴とする、真核細胞をインビトロで維持しまたは生育させるための培地を提供する。上記タンパク加水分解物は、総タンパク様物質量の15重量％未満の遊離アミノ酸レベルを有する。
本発明の目的のために用いられるグルタミン含有タンパク加水分解物は、当該技術分野で公知の方法、すなわちタンパク質の酵素的加水分解により得られる。そのタンパク質は、植物由来でも動物由来でもよく、例えば、乳タンパク（カゼイン、アルブミン等）、肉タンパク、大豆タンパクまたは穀類タンパク（コムギ、コメ、トウモロコシ等）であってよい。ほとんどの一般的に用いられる細胞培養培地は高レベルのグルタミンを含有するので、本発明の目的のためのタンパク加水分解物は、好ましくは20重量％以上のグルタミン残基のレベルを有する。したがって、グルタミン残基が豊富なタンパク供給源、例えば、穀類タンパク、より具体的にはコムギグルテンまたはその画分であるグルテニンおよびグリアジン（これらは、25〜30％のグルタミンを含有することが知られている）は、出発材料として一般的に好ましい。
タンパク出発材料の加水分解のために用いられる加水分解酵素は、動物、植物、酵母、細菌または菌類由来であってよい。好ましくは、酵素は、遊離アミノ酸の放出が最小限になるように、低いエキソペプチダーゼ活性を有するものが用いられる。好適な酵素は、例えばペプシン、アルカラーゼ（Alcalase）またはオリエンターゼ（Orientase）である。
タンパク加水分解物は、15重量％未満、好ましくは10％未満の遊離アミノ酸レベルを有するべきである。特定の目的には、４％以下のレベルが必要とされる可能性がある。ペプチドは、44kD未満の分子量を有するべきである。好ましいものとしては、大部分のペプチドが1000D未満の分子量を有するタンパク加水分解物であり、より好ましくはタンパク加水分解物の少なくとも90重量％が1000D未満の分子量を有する。また、タンパク加水分解物中の平均ペプチド鎖長は、好ましくは15アミノ酸残基未満であり、より好ましくは10未満である。一方、ペプチドの最小分子量は、好ましくは200Dを超えるべきである。
従来の培地は、ビタミン類、炭水化物供給源およびアミノ酸（の供給源）を含有する。培地のpHは、好ましくは６〜８の間である。上記に概略を示したように、従来技術においては、微生物の培養を意図する培地のために、種々の加水分解されたタンパク質、例えば乳タンパク（カゼイン）が用いられてきた。微生物は、複雑なタンパク質を用いて生育することを可能にするために必要な酵素を持っている。しかし、高等真核細胞は、非常に異なる特性を有する細胞のサブセットを含んではいるが、一般に、複雑なタンパク質を利用する能力を欠いている。したがって、本発明によるタンパク加水分解物が真核細胞の培養を支持することができることは、予想外であった。この観察についての明確な説明はされていないが、しかし、真核細胞は、ナトリウム依存性アミノ酸取り込み系（キャリアタンパクを含む）とは別に、小さいペプチドが細胞内に移送されうるメカニズムを有する、という仮説が可能である。
本発明の培地は、真核細胞の培養用の培地に従来見出される成分、すなわち、ビタミン類、無機質、炭水化物、成長促進因子およびアミノ酸を含む。本発明の培地は、遊離のＬ−グルタミンではなく、その主要なまたは唯一の供給源としてタンパク加水分解物を含有する。タンパク加水分解物は、培地中の他の必須アミノ酸の供給源としても用いることができる。
真核細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類（例えばヒト）または昆虫細胞である。
真核細胞は、しばしばある種の貴重な化合物、特に医薬または診断薬のための化合物をそれらに産生させることを目的として培養される。当業者には、真核細胞の培養物が、細胞数が増加する増殖期、続いて細胞数は多かれ少なかれ一定にとどまる定常期を示すことは周知である。所望の化合物の産生が培養中最大になるのは、しばしはこの定常期である。本発明のタンパク加水分解物は、増殖期に対して有利に作用するのみでなく、特に産生期にも有利に作用すること、すなわち遊離のグルタミンを含有する従来の培地と比較して一定時間、一定細胞量による所望の化合物の産生を増加させることが見出された。
本発明の培地は、培養すべき細胞を入れることができる容器を含む完全なキットとして提供してもよい。この培地は、水を加えて使用の準備が完了した液体培地を製造する乾燥混合物として供給することができる。あるいは、この培地は、直接細胞を添加する、使用準備完了した無菌的液体として提供することもできる。後者は、調製後の滅菌の必要性を排除する。従来技術の培地と異なり、本発明の液体培地は、グルタミンが存在する安定な形態のため、品質の劣化を伴わず輸送および貯蔵が可能である。
種々の関連パラメーターを決定するための分析方法を以下に記載する。
1.分析方法
定義
TN:総窒素。
AN:α−アミノ窒素。
EN:ε−アミノ窒素。
AEN:α−およびε−窒素の合計。
PN:（潜在的）ペプチド結合中の窒素（したがって、PNはすべてのANを含む）。
FAA:遊離アミノ酸レベル。
F:タンパク質中の１アミノ酸残基当たりの平均窒素量。
PCL:平均ペプチド鎖長。
パラメーターの決定
AENは、TNBS法（J.Adler−Nissen,Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,Elsevier Applied Science Publishers,1986参照）またはホルモール滴定法のような方法により決定することができる。
TNは、周知のケルダール法により決定することができる。
ENは、リジンの側鎖中にのみ存在するので、生成物中のリジンの量に等しい。
FAAは、アミノ酸解析機を用いて決定することができる。
ANは、タンパク加水分解物中のAEN（TNBS法またはホルモール滴定法により決定されたもの）およびリジンの量（＝EN）から算出することができる：
AN＝AEN−EN                               （１）
PNは、１アミノ酸当たりの平均窒素量（Ｆ）を用いてTNから概算することができる：
PN＝TN/F                                  （２）
ほとんどのアミノ酸は、α窒素原子のみを有するが、Trp、Lys、AsnおよびGlnはその側鎖中に１つ余分の窒素を有し、Hisは２つの余分な窒素を有し、Argは３つの余分な窒素を側鎖中に有する。表１に、多数の一般的タンパクについての１アミノ酸当たりのＮの平均量（Ｆ）を示す。
0003649249.tif 000002
平均ペプチド鎖長の計算
平均ペプチド鎖長は、ANおよびPNから算出することができる：
PCL＝PN/AN                                （３）
式（３）を式（２）と合わせると、以下のようになる：
PCL＝TN/（Ｆ＊AN）                        （４）
式（４）を式（１）と合わせると、以下のようになる：
PCL＝TN/｛Ｆ＊（AEN−EN）｝               （５）
式（５）を用いて、FAAも考慮に入れた形で加水分解物中の平均ペプチド鎖長が計算される。厳密にいえば、１個のアミノ酸はペプチドではなく、したがって、FAAは、平均PCLの計算に含まれるべきではない。非FAA画分の平均ペプチド鎖長を算出するためには、この画分のTNおよびANが必要である。式（４）をペプチド画分について書き直すと、以下のようになる：
PCLpep＝TNpep/（Ｆ＊ANpep）               （６）
ここで、
TNpep＝TN−TNFAA                          （７）
TNFAA＝Ｆ＊FAA                            （８）
ANpep＝AN−FAA                            （９）
である。式（６）を式（１）、（７）、（８）および（９）と合わせると、以下の式が得られる：
0003649249.tif 000003
ここで、TN、AN、AEN、ENおよびFAAは、単位重量当たりのmmolで与えられる。
2.分子量分布の決定
分子量分布の決定のためには多数の方法がある。容易で簡便な方法の１つは、ゲル透過クロマトグラフィを用いる。文献には、多くの、すべて少しずつ異なる手順が報告されている。本発明の目的には、Watersから入手できる長さ30cm、内径7.8mmのProtein−Pak60カラムおよびProtein−Pak 125 Bulk Packing guardカラムを用いた。カラムは、pH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液を用いて流速1.01ml/minで溶出した。解析のために、溶出緩衝液1ml当たり0.2〜0.5mgの生成物を含有する20μｌの試料をカラムに注入した。タンパク質およびペプチドのピークは、214nmで検出した。ある分子量域内の物質の量は、その分子量域におけるクロマトグラムの下の面積から決定した。
3.タンパク加水分解物中のグルタミンレベルの決定
遊離グルタミンの不安定性のため、アミノ酸組成を決定するための通常の手順によりタンパクベースの生成物中のグルタミンの量を決定することは不可能である。この手順においては、タンパクベースの生成物は、6N塩酸で処理して遊離アミノ酸に加水分解し、次いでその量をアミノ酸解析機を用いて決定することができる。6N塩酸での加水分解中に、グルタミンはアンモニアとピログルタミン酸に分解し、これが続いてグルタミン酸に変換される。
加水分解物中のグルタミンの量を解析する間接的な方法は、MacRitchie（J.Food Technol.14,595−601、1979）により記載されたように酸加水分解中に放出されたNH3の量を決定することである。NH3はグルタミンのみからでなく、アスパラギン（これはアンモニアとアスパラギン酸に分解する）からも放出されるので、タンパク試料から放出されたNH3の量（mmol）は、そのタンパク試料中のアスパラギン＋グルタミン（Asn＋Gln）の量（mmol）と等しい。放出されたNH3の起源は決定することができないので、アミド化された基の比率は２つのタイプの鎖において同じであると仮定しなければならない。我々は、カゼインおよびホータンパクから放出されたNH3の量の決定と、その結果を個々のカゼインおよびホエータンパクの既知のアミノ酸配列および組成に基づいて算出された理論的結果と比較することとにより、この方法の信頼性を試験した。さらに、グルテンから放出されたNH3の量を決定した。その結果を表２にまとめて示す。放出されたNH3の解析された量から実験的に決定した（Asn＋Gln）／（Asx＋Glx）比、Glx（グルタミン＋グルタミン酸）およびAsx（アスパラギン＋アスパラギン酸）、およびアミノ酸組成に基づいて理論的にそうであるべき比が、よく一致していることがわかる。グルテンについて実験的に決定した比（77.3％）は、MacRitchieにより報告された比（75.8％）と整合する。
0003649249.tif 000004
これらの結果から、タンパク質またはタンパク加水分解物から放出されたNH3の量の決定は、タンパクベースの生成物中の（Asn＋Gln）／（Asx＋Glx）比を評価するための好適な方法であると結論される。
以下に、本発明の制限的でない実施例を示す。
実施例１
バイタル（vital）グルテンを用いるタンパク加水分解物の製造
バイタルグルテンの８％分散液を、１％（E/S）の市販の酵素調製物Orientase 90N（neutral protease ex Quest International Cork,Ireland）を用いて50℃で４時間、加水分解した。pHは、当初、７に設定し、加水分解中には制御しなかった。加水分解後、95℃、１分の熱処理により酵素を不活性化した。残存するインタクトなタンパク質および不溶性成分は、2500Gで５分間遠心分離して除去し、得られた上清を、続いて限外ろ過した。好ましくは、分子量カットオフ10,000ダルトンの膜を使用する。得られた限外ろ過透過駅は、蒸発させて濃縮し、次いでスプレー乾燥または凍結乾燥した。
得られた最終生成物は、上述の方法を用いて特徴づけした。結果を表３にまとめて示す。
0003649249.tif 000005
細胞組織培養における加水分解物の評価
周知のRPMI−1640培地に基づいて３種の培地を作成した。この培地は、Gibco BRL,Lige Technologies,Inc.、カタログ番号17402−017のRPMI−1640セレクトアミン（select Amine）キットに処方されたように調製した。この培地を三等分し、それを培地１、２および３のベースとして用いた。
これらの培地には、My添加物を添加することができる。この添加物は、以下のものを含有する：
Ｌ−グルタミン:2mM
ピルビン酸ナトリウム:1mM
ゲンタマイシン:55μg/ml
β−メルカプトエタノール:50μＭ
ヒポキサンチン:100μＭ
チミジン:15μＭ
ウシ胎児血清:8％（v/v）
培地１
Gibcoのセレクトアミン（select Amine）キットから得られる基本のRPMI−1640培地に、My添加物を添加した。
培地２
Gibcoのセレクトアミン（select Amine）キットから得られる基本のRPMI−1640培地に、Ｌ−グルタミンを含まないMy添加物を添加した。My添加物に依存するＬ−グルタミンの代わりに、得られたグルタミン加水分解物、2.2g/lを添加した。
培地３
Gibcoのセレクトアミン（select Amine）キットから得られる基本のRPMI−1640培地に、Ｌ−グルタミンを含まないMy添加物を添加した。その代わりに、得られたグルテン加水分解物と同じ組成の遊離アミノ酸の混合物、2.2g/lを添加した。
これらの３種の培地を用いて、以下の細胞株を培養した：
・U266:ヒトミエローマ細胞株
・SP2/0:マウスミエローマ細胞株
・AntiCD20:ハイブリドーマ細胞株
標準的培地で生育させた細胞懸濁液0.5mlに、4.5mlの培地１、２または３を添加した。２日後、5mlの新鮮な培地１、２または３を添加した。細胞数は、培地添加直後、１、５および７日後に決定した。結果を表４にまとめて示す。
これらの結果から、本発明のグルテン加水分解物は急性細胞毒性を与えないこと、および本発明のグルテン加水分解物を用いて細胞を培養できることがわかる。
0003649249.tif 000006
実施例２
バイタルグルテンを用いるタンパク加水分解物の製造
バイタルグルテンの８％分散液を、0.1％（E/S）の市販の酵素調製物pepsinorthana1:100,000NF（PCA Diagnostica,Haarlem,Netherlands）を用いて50℃で16時間、加水分解した。pHは、当初、塩酸で1.5に設定し、その後の加水分解中には制御しなかった。加水分解後、95℃、１分の熱処理により酵素を不活性化した。残存するインタクトなタンパクおよび不溶性成分は、遠心分離して除去し、得られた上清を、続いて限外ろ過した。好ましくは、分子量カットオフ10,000ダルトンの膜を使用する。得られた限外ろ過透過液は、蒸発させて濃縮し、次いでスプレー乾燥または凍結乾燥した。
得られた最終生成物を、上述の方法を用いて特徴づけした。結果を表５にまとめて示す。
0003649249.tif 000007
細胞組織培養における加水分解物の評価
周知のRPMI−1640培地に基づいて２種の培地を作成した。この培地は、Gibco BRL,Life Technologies,Inc.、カタログ番号17402−017のRPMI−1640セレクトアミン（select Amine）キットから調製した。この培地を二等分し、それを培地１および４のベースとして用いた。
培地１
実施例１のように、Gibcoのセレクトアミン（select Amine）キットから得られる基本のRPMI−1640培地に、My添加物を添加した。
培地４
Gibcoのセレクトアミン（select Amine）キットから得られる基本のRPMI−1640培地に、Ｌ−グルタミンを含まないMy添加物を添加した。My添加物に存在するＬ−グルタミンの代わりに、得られたグルテン加水分解物、3.1g/lを添加した。
これらの２種の培地を用いて、実施例１に記載した細胞株を、実施例１に記載した手順にしたがって培養した。結果を表６にまとめて示す。
0003649249.tif 000008
これらの結果から、本発明のグルテン加水分解物は急性細胞毒性を与えないこと、および本発明のグルテン加水分解物を用いて細胞を培養できることがわかる。
実施例３
細胞組織培養における産生に対する加水分解物の影響
実施例１に記載した加水分解物を用いて、３種の培地を作成した。これらの培地は、Gibco BRL,Life Technologies,Inc.、カタログ番号17402−017（Glasgow,Scotland）のRPMI−1640セレクトアミン（select Amine）キットから調製した。
培地に、以下のものを含有する添加物を添加した：
ピルビン酸ナトリウム:1mM
ゲンタマイシン:55μg/ml
β−メルカプトエタノール:50μＭ
ヒポキサンチン;100μＭ
チミジン:15μＭ
ウシ胎児血清:8％（v/v）
培地１
基本のRPMI−1640培地。この培地は、2mMグルタミンを含有する。
培地２
遊離アミノ酸を含まない基本のRPMI−1640培地に、実施例１に記載したグルテン加水分解物、1.07g/lを添加した。したがって、この培地は、約2mMのグルタミン残基を含有する。さらに、遊離アミノ酸の、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、イソロイシン、リジン、アルギニンおよびヒドロキシプロリンを少量添加して、得られたグルテン加水分解物におけるこれらのアミノ酸の低レベルを補った。
培地３
遊離アミノ酸を含まない基本のRPMI−1640培地に、実施例１に記載したグルテン加水分解物、2.14g/lを添加した。さらに、遊離アミノ酸の、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、イソロイシン、リジン、アルギニンおよびヒドロキシプロリンを少量添加して、得られたグルテン加水分解物におけるこれらのアミノ酸の低レベルを補った。
培地４
遊離アミノ酸を含まない基本のRPMI−1640培地に、実施例１に記載したグルテン加水分解物、4.28g/lを添加した。さらに、遊離アミノ酸の、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、イソロイシン、リジン、アルギニンおよびヒドロキシプロリンを少量添加して、得られたグルテン加水分解物におけるこれらのアミノ酸の低レベルを補った。
上述の培地を用いてハイブリドーマ細胞株AntiCD−20の生育能およびそれによる産生を調べた。この細胞株は、高い栄養要求性を有する抗体産生細胞株であるため、選んだ。細胞は、25cm2フラスコ中で３つ１組で処方した培地により生育させた。培地は第７日に更新した。結果を表７にまとめて示す。
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表７のすべての試験条件を、抗体産生についてELISAを用いて解析した。結果を表８にまとめて示す。
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実施例４
細胞組織培養における加水分解物の影響
実施例１に記載した加水分解物を用いて、２種の培地を作成した。これらの培地は、Gibco BRL,Life Technologies,Inc.、カタログ番号17402−017（Glasgow,Scotland）のRPMI−1640セレクトアミン（select Amine）キットから調製した。
培地に、添加物を添加した。この添加物は、以下のものを含有する：
ピルビン酸ナトリウム:1mM
ゲンタマイシン:55μg/ml
β−メルカプトエタノール:50μＭ
ヒポキサンチン:100μＭ
チミジン:15μＭ
ウシ胎児血清:8％（v/v）
培地１
基本のRPMI−1640培地。この培地は、2mMグルタミンを含有する。
培地２
遊離アミノ酸を含まない基本RPMI−1640培地に、実施例１に記載したグルテン加水分解物、1.07g/lを添加した。したがって、この培地は、約2mMのグルタミン残基を含有する。
培地３
遊離アミノ酸を含まない基本のRPMI−1640培地に、実施例１に記載したグルテン加水分解物、2.14g/lを添加した。したがって、この培地は、約4mMのグルタミン残基を含有する。
上述の培地を用いてハイブリドーマ細胞株AntiCD−20の生育能およびそれによる産生を調べた。細胞は、25cm2フラスコ中で３つ１組で処方した培地により生育させた。培地は第７日に更新した。結果を表９にまとめて示す。
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表９のすべての試験条件を、抗体産生についてELISAを用いて解析した。結果を表10にまとめて示す。
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実施例３および実施例４は、グルタミンの供給源としてタンパク加水分解物を用いることにより、ほとんどの場合において、遊離アミノ酸を含有する標準的RPMI−1640培地と比較して改善された生育が得られることを示す。抗体産生に対する影響は、さらに顕著であり、標準的培地と本発明のタンパク加水分解物を含有する培地との間で細胞数が顕著に異ならないような場合においてさえ、見られた。