(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分を、配列番号１６又は配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１７又は配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（ｉｉ）該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出法。
【請求項２】
亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分又は１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
５’末端側のプライマーが配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
５’末端側のプライマーが配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（ii）該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出法。
【請求項６】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（ii）該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出方法。
【請求項７】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（ii）上記（ｉ）の増幅ＤＮＡの、亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（iii）上記（ii）の増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出方法。
【請求項８】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群に特異的な塩基配列を持つ部分を、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるオリゴヌクレオドより成る群から選ばれる少なくとも一種のオリゴヌクレオチド、並びに配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で示されるオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる一種のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅し、
（ii）該増幅ＤＮＡを検出及び解析することを特徴とするアデノウイルスの亜群の鑑別方法。
【請求項９】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群に特異的な塩基配列を持つ部分を、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオドより成る群から選ばれる少なくとも一種の該遺伝子領域内の各亜群に特異的な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチより成る群から選ばれる一種の血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて増幅し、
（ii）該増幅ＤＮＡを検出及び解析することを特徴とするアデノウイルスの亜群の鑑別方法。
【請求項１０】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分を、配列番号１６又は配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１７又は配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（ii）配列番号２５、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる少なくとも一種のオリゴヌクレオチドを標識してＤＮＡプローブとし、
（iii）上記（ｉ）の増幅ＤＮＡと上記（ii）のＤＮＡプローブとをハイブリダイズせしめ、
（iv）ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの種類を解析することを特徴とするアデノウイルス血清型の鑑別方法。
【請求項１１】
亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分又は１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分を、配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
（ii）アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を有する配列番号２５、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる少なくとも一種のオリゴヌクレオチドを標識してＤＮＡプローブとし、
（iii）上記（ｉ）の増幅ＤＮＡと上記（ii）のＤＮＡプローブとをハイブリダイズせしめ、
（iv）ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの種類を解析することを特徴とするアデノウイルス血清型の鑑別方法。
【請求項１３】
配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２０で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＢ亜群に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２１で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＣ亜群に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号２２で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＤ亜群に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号２３で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＥ亜群及び４型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号２４で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＦ亜群に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号２５で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の３型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号２６で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の８型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号２７で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の１１型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号２８で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の１９型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号２９で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の３７型に共通な塩基配列に相補性を有しアデノウイルスの検出または鑑別に用いうるオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の塩基配列を用いるアデノウイルスの検出及び鑑別方法並びにそれに用いるオリゴヌクレオチド及びＤＮＡ断片に関する。
アデノウイルス（以下これを「mastadenovirus」と称することがある）は眼、呼吸器等に炎症を起こす、人に対する重要な病原ウイルスである。
【０００２】
【従来の技術】
アデノウイルスは、現在Ａ〜Ｆ亜群の６種類の亜群、更に４７種類もの血清型に分類されており、それぞれ多彩な感染像をしめす。その中でもＢ亜群の３型、１１型、Ｄ亜群の８型、１９型、３７型、更にＥ亜群の４型は、ヒトの目に感染し結膜炎、角膜炎等を発症させる。
【０００３】
アデノウイルス感染症の診断は、アデノウイルスの分離同定、アデノウイルス抗原検出、電子顕微鏡による形態学的検査及び中和抗体価測定や補体結合抗体価測定等の血清学的検査で行われている。このうち、血清学的検査はアデノウイルスに対する抗体を検出する間接的方法であり、アデノウイルス自体を検出する検査は、分離同定、形態学的検査及び抗原検出である。
【０００４】
確実な診断手段である分離同定法では、判定までの期間が約１ヶ月程かかり、また検出感度が低く、検出感度を上げようとすると培養に相当の時間が必要となり培養操作が煩雑になる。また、血清型の鑑別は、中和抗血清を用いた分離ウイルスの中和試験で行われているが、非特異的選択による交差反応によって、鑑別が困難になる場合がある等の問題点を有している。
【０００５】
アデノウイルスＤＮＡを直接検出する方法として、高感度且つ特異的にＤＮＡを増幅するポリメラーゼ・チェーン・リアクション法〔Polymerase Chain Reaction 法、以下これを「ＰＣＲ法」と略記する；Saiki et al., Science, 230巻, 1350-1354 （1985）〕を用いた方法によるヘキソン（Hexon), Ｅ１Ａ領域を増幅しての検出〔A. Allard, et al; J. Med Virology 37巻, 149-157 （1992）〕等の報告がある。しかしながら、これらの方法では、感染の有無のみの検出もしくは特定の亜群血清型（とくにＦ亜群−下痢症適疾患の原因ウイルス）のみの鑑別は可能であるが、確実な亜群、血清型鑑別は困難である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決する、確実で、迅速かつ簡便なアデノウイルスの検出並びに亜群及び血清型の鑑別方法の提供を目的としてなされたものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドを用いて増幅し、該増幅遺伝子ＤＮＡ断片を検出すれば、アデノウイルスを、確実に、迅速かつ簡便に検出可能なことを見いだし、また、該増幅ＤＮＡ内の亜群共通塩基配列を検出することによりアデノウイルス亜群の鑑別が、更に亜群及び血清型特異的塩基配列を検出することによりアデノウイルス血清型の鑑別が可能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、下記１〜４３に記載のアデノウイルス検出方法、亜群及び血清型の鑑別方法、それらに用いるオリゴヌクレオチド及びＤＮＡ断片を提供するものである。
【０００９】
１．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する２種のオリゴヌクレオチドを５’末端側及び３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出法。
【００１０】
２．亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の３’末端側である、上記１．記載の方法。
３．亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分である、上記２．記載の方法。
４．亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分である、上記２．記載の方法。
【００１１】
５．５’末端側のプライマーが配列番号１６又は配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１７又は配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記１．記載の方法。
６．５’末端側のプライマーが配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記１．記載の方法。
７．５’末端側のプライマーが配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記１．記載の方法。
【００１２】
８．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出法。
【００１３】
９．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出方法。
【００１４】
１０．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  該増幅ＤＮＡの、亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(iii) 該増幅ＤＮＡを検出することを特徴とするアデノウイルスの検出方法。
【００１５】
１１．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群に特異的な塩基配列を持つ部分を、該遺伝子領域内の各亜群に特異的な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドと、血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  該増幅ＤＮＡを検出及び解析することを特徴とするアデノウイルスの亜群の鑑別方法。
１２．亜群に特異的な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる少なくとも一種のオリゴヌクレオチドである、上記１１．記載の方法。
１３．血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で示されるオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる一種のオリゴヌクレオチドである、上記１１．記載の方法。
【００１６】
１４．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群に特異的な塩基配列を持つ部分を、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオドより成る群から選ばれる少なくとも一種の該遺伝子領域内の各亜群に特異的な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチより成る群から選ばれる一種の血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  該増幅ＤＮＡを検出及び解析することを特徴とするアデノウイルスの亜群の鑑別方法。
【００１７】
１５．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する２種のオリゴヌクレオチドを５’末端側及び３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを標識してＤＮＡプローブとし、
(iii) 上記(i) の増幅ＤＮＡと上記(ii)のＤＮＡプローブとをハイブリダイズせしめ、
(iv)  ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの種類を解析することを特徴とするアデノウイルス血清型の鑑別方法。
【００１８】
１６．亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対の大きさの部分である、上記１５．記載の方法。
１７．亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分が、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分である、上記１５．記載の方法。
【００１９】
１８．５’末端側のプライマーが配列番号１６又は配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１７又は配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記１５．記載の方法。
１９．５’末端側のプライマーが配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記１５．記載の方法。
【００２０】
２０．５’末端側のプライマーが配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、３’末端側のプライマーが配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記１５．記載の方法。
２１．亜群及び血清型に特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２５、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる少なくとも一種のオリゴヌクレオチドである、上記１５．記載の方法。
【００２１】
２２．(i) アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ該遺伝子領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対の大きさの部分を、該遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有する配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを５’末端側のプライマーとして及び配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを３’末端側のプライマーとして用いて増幅し、
(ii)  アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を有する配列番号２５、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドより成る群から選ばれる少なくとも一種のオリゴヌクレオチドを標識してＤＮＡプローブとし、
(iii) 上記(i) の増幅ＤＮＡと上記(ii)のＤＮＡプローブとをハイブリダイズせしめ、
(iv)  ハイブリダイズしたＤＮＡプローブの種類を解析することを特徴とするアデノウイルス血清型の鑑別方法。
【００２２】
２３．配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８又は配列番号１９で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
２４．配列番号２０で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＢ亜群に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
２５．配列番号２１で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＣ亜群に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
２６．配列番号２２で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＤ亜群に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
【００２３】
２７．配列番号２３で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＥ亜群及び４型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
２８．配列番号２４で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内のＦ亜群に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
２９．配列番号２５で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の３型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
【００２４】
３０．配列番号２６で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の８型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
３１．配列番号２７で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の１１型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
３２．配列番号２８で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の１９型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
３３．配列番号２９で示される塩基配列を有する、アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域内の３７型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド。
【００２５】
３４．配列番号６に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス１型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
３５．配列番号７に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス３型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
３６．配列番号８に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス４型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
３７．配列番号９に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス６型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
３８．配列番号１０に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス７型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【００２６】
３９．配列番号１１に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス８型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
４０．配列番号１２に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス１１型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
４１．配列番号１３に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス１４型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
４２．配列番号１４に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス１９型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
４３．配列番号１５に記載の塩基配列又はアミノ酸配列で示される、アデノウイルス３７型のヘキソンの一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【００２７】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の実施においては、特に指示されない限り当該分野の技術範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学に於ける従来の手法が採用される。このような手法は文献中に詳しく説明されている。例えば次のような文献を参照されたい。Maniatis, Fitsch  及び Sambrook, MOLECULAR CLONING;A LABORATORY MANUAL (1982) ; Kevin Struhlら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1 巻および2 巻 ;  村松正實編, ラボマニュアル遺伝子工学 (1990) ; 村松正實  岡山博人  編, 遺伝子工学ハンドブック ,  実験医学  別冊 (1991) ; 東京大学医科学研究所制癌研究部編 ,  細胞工学実験プロトコール (1991) 。
【００２８】
本発明で用いる、アデノウイルスのヘキソン（hexon)をコードする遺伝子領域（以下これを「ヘキソン領域」と略称することがある）内の血清型に共通な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド（以下これを「血清型共通プライマー」と略称することがある）塩基配列は、既知のアデノウイルスヘキソン領域遺伝子配列に基づいて設計することができる。
【００２９】
アデノウイルス遺伝子配列は、通常用いられる遺伝子配列データベース、例えばＤＮＡＳＩＳ−ＤＢ（日立ソフトウエアエンジニアリング社製）を用いて知ることができ、本発明に用いたアデノウイルス２型、５型、４０型及び４１型のヘキソン領域の一部をコードする塩基配列は配列番号１〜５で示される通りであり、それらは下記の文献に開示されている。
【００３０】
２型（配列番号１）：ADRCG Accession J01917〔Akusjaervi,G. and Pettersson,U.: Sequence analysis of the gene for adenovirus type 2 hexon. Virology 91, 477-480(1978)〕〔Joernvall,H.,et al.:Order of the CNBr fragments in the adenovirus hexon protein. J. Biol. Chem. 256, 6204-6212 (1981) 〕〔Akusjaervi,G., et al.:The sequence of the 3'noncoding region of the hexon mRNA discloses a novel adenovirus gene. Nucleic Acids Res. 9, 1229-1240 (1981)〕〔Akusjaervi,G., et al.:The gene for the adenovirus 2 hexon polypeputide. J. Biol. Chem. 259, 13976-13979 (1984)〕。
【００３１】
５型（配列番号２）：Ad5-ADRA2 Accession J01966〔Kinloch,R., et al.:Adenovirus hexon:sequence comparison of subgroup c serotypes 2 and 5. J. Biol. Chem. 259, 6431-6436 (1984) 〕。
５型（配列番号３）：Ad5-AD5002 Accession X02997 〔Kruijer,W.,et al.:Structure and function of adenovirus DNA binding protein: Comparison of the amino acid sequence of the Ad5 and Ad12 proteins derived from the nucleotidesequence of the corresponding genes. Virology 128, 140-153 (1983) 〕、〔Kinloch,R., et al.: Adenovirus hexon: sequence comparison of subgroup c serotypes 2 and 5. J. Biol. Chem. 259, 6431-6436 (1984) 〕。
【００３２】
４０型（配列番号４）：Ad40-ADTY40HEX Accession X51782 〔Toogood,C.I.A.: Direct Submition. Submitted (06-FEB-1990) Toogood C.I.A., University of St Andrews, Dept of Biochemistry & Microbiology, North Street, St Andrews Fife, Scotland, U K.〕。
【００３３】
４１型（配列番号５）：Ad41-ADTY41HEX Accession X51783 〔Toogood,C.I.A.: Direct Submition. Submitted (06-FEB-1990) Toogood C.I.A., University of St Andrews, Dept of Biochemistry & Microbiology, North Street, St Andrews Fife, Scotland, U K.〕。
【００３４】
血清型共通プライマーは、上記遺伝子配列に基いて設計することができ、その塩基配列は、ヘキソン領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分、特にヘキソン領域の３′末側にある該部分をはさむ塩基配列であれば特に制限されるものでないが、好ましくは、５′末端側の配列として配列番号１６、３′末端側の配列として配列番号１７で示される塩基配列を挙げることができる。
【００３５】
上述したプライマーは、それ自体既知の通常用いられる核酸合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems) 社製、モデル３８１−ＡＤＮＡ合成機等を用いる固相合成法により、容易に化学合成することができる。
【００３６】
これらプライマーを用いて、次のとおり、ヘキソン領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分を増幅し、該増幅ＤＮＡの塩基配列を決定し、さらにその塩基配列から血清型共通プライマー、亜群に特異的な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド（以下これを「亜群特異的プライマー」と略称することがある）および血清型に特異的な塩基配列に相補性を有するオリゴヌクレオチド（以下これを「血清型特異的ＤＮＡプローブ」と略称することがある）を設計することができる。
【００３７】
先ず、亜群及び血清型が既知のアデノウイルス標準株（国立予防衛生研究所で継代培養されており当研究所より入手可能）から常法によりウイルスＤＮＡを抽出し、該抽出ＤＮＡを鋳型とし、前記血清型共通プライマーを用いて、前記ヘキソン領域の一部、例えばヘキソン領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対ではさまれる１２６３塩基対の部分を増幅する。
ＤＮＡ断片の増幅は、通常用いられるＰＣＲ法〔Saiki 等、サイエンス（Science) 239巻、487-491 頁参照〕により容易に行うことができる。
【００３８】
この増幅ＤＮＡを、常法、例えばアガロースゲル電気泳動法等により、抽出、精製後、平滑末端化処理し、適当なベクター、例えばファージベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦ（宝酒造社製）等にクローニングする。
【００３９】
各アデノウイルス標準株に由来する遺伝子ＤＮＡを保有する各クローンを分離し、アデノウイルス由来の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
ＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばサンガー法〔F. Sanger 等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of the Science USA) 、74巻 5463-5467頁参照〕により決定することができる。
【００４０】
かくして得られる各アデノウイルス標準株の「ヘキソン領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分」の塩基配列を、配列番号６（１型由来）、配列番号７（３型由来）、配列番号８（４型由来）、配列番号９（６型由来）、配列番号１０（７型由来）、配列番号１１（８型由来）、配列番号１２（１１型由来）、配列番号１３（１４型由来）、配列番号１４（１９型由来）、配列番号１５（３７型由来）に示す。
【００４１】
上記ＤＮＡ断片もまた本発明に包含されるものであり、上記塩基配列を包含する本発明のＤＮＡ断片は、アデノウイルス標準株染色体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられる核酸合成装置、例えば上記アプライド・バイオシステムズ社製、モデル３８１−Ａ  ＤＮＡ合成機を用いて合成されたものであってよい。
【００４２】
上記塩基配列に基き、さらに前記血清型共通プライマーを設計することができる。かくして得られる血清型共通プライマーとしては、例えば配列番号１８（５′末端側）及び配列番号１９（３′末端側）に示されるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。ＰＣＲ法でこれらプライマーを用いれば、ヘキソン領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対ではさまれる９６５塩基対の部分を増幅することができる。
【００４３】
また、前記配列番号１〜５で示される既知のヘキソン領域の配列、上記配列番号６〜１５で示される本発明ＤＮＡ断片の塩基配列中の、亜群に特異的な配列を解析することにより、亜群特異的プライマーを設計することができる。
かくして得られる亜群特異的プライマーとしては、例えば配列番号２０（Ｂ亜群特異的）、配列番号２１（Ｃ亜群特異的）、配列番号２２（Ｄ亜群特異的）、配列番号２３（Ｅ亜群特異的）、配列番号２４（Ｆ亜群特異的）に示されるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００４４】
さらに、血清型特異的ＤＮＡプローブは、同様に上記配列番号１〜１５で示される配列中の、血清型に特異的な塩基配列を解析することにより設計することができる。かくして得られるＤＮＡプローブとしては、例えば、配列番号２３（４型特異的）、配列番号２５（３型特異的）、配列番号２６（８型特異的）、配列番号２７（１１型特異的）、配列番号２８（１９型特異的）、配列番号２９（３７型特異的）に示されるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００４５】
上記した、本発明で用いるヘキソン領域ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡプローブ、該プライマーを用いて増幅可能なＤＮＡ断片等の一例を図５に示す。図中、２桁の数字は配列番号、（  ）内の数字はプライマーもしくはＤＮＡプローブが結合するヘキソン領域内の位置（塩基対番号）、〔  〕内の数字は増幅されるＤＮＡの大きさ、ｂｐは塩基対を示す。
【００４６】
上記したプライマー又はＤＮＡプローブを用いて、次のとおり、アデノウイルスを検出し、亜群及び血清型を鑑別することができる。
先ず、診察時に採取した臨床検体、臨床検体からのウイルス分離培養株から、常法によりウイルスＤＮＡを抽出する。該抽出ＤＮＡを鋳型として、前記血清型共通プライマーを用いて、ヘキソン領域内の亜群及び血清型に特異的な塩基配列を持つ部分、例えば前記１２６３塩基対又は９６５塩基対の部分を、前記ＰＣＲ法により増幅する。該増幅ＤＮＡを適当な方法で検討することにより、アデノウイルスを検出することができる。
増幅ＤＮＡの検出は、通常ポリアクリルアミドやアガロースゲル電気泳動等により増幅ＤＮＡを分離し、適当な染色剤、例えばエチジウム・ブロマイド等で染色後、紫外線照射等により発色させ、そのＤＮＡバンドを確認することにより行うことができる。
【００４７】
さらに、高感度のアデノウイルス検出を必要とする場合は、先ず血清型共通プライマー、例えば配列番号１６及び１７で示されるオリゴヌクレオチドを用いて、ヘキソン領域の一部、例えば前記１２６３塩基対の部分を増幅し、さらに該増幅ＤＮＡの内側の塩基配列と相補性を有するように設計された血清型共通プライマー、例えば配列番号１８及び１９で示されるオリゴヌクレオチドを用いてヘキソン領域の一部、例えば前記９６５塩基対の部分を増幅し、該増幅ＤＮＡを検出すれば良い。
【００４８】
亜群の鑑別は、同様に前記抽出ＤＮＡを鋳型とし、前記血清型共通プライマーの一種と前記亜群特異的プライマー、例えば配列番号２０〜２４の少なくとも一種のプライマーを用いて、前記ＰＣＲ法により増幅し、各亜群に由来する大きさの増幅ＤＮＡを前記方法で検出することにより行うことができる。用い得る血清型共通プライマーは、５’末端側のもの、例えば配列番号１６及び１８で示されるオリゴヌクレオチドであっても、３’末端側、例えば配列番号１７及び１９で示されるオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００４９】
血清型の鑑別は、前記ヘキソン領域の一部を血清型共通プライマーを用いて増幅したＤＮＡ断片と、前記血清型特異的ＤＮＡプローブ、例えば配列番号２３、２５〜２９で示されるオリゴヌクレオチドを標識してプローブとし、固相上で常法によりハイブリダイズさせ、標識された血清型特異的ＤＮＡプローブの種類を検出・解析することにより行うことができる。
【００５０】
固相上へのＤＮＡの結合は、それ自体既知の通常用いられる方法、例えば、増幅ＤＮＡを変性後、適当な固相、例えばナイロンメンブレンに、常法により化学結合させることにより行うことができる。
ＤＮＡプローブの標識は、５’末端のリン酸化反応により、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ、Ｔ4 ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）を用いて行うことができる。また、標識物の検出は、標識されたＤＮＡとのハイブリダイズを行ったナイロンメンブレンのオートラジオグラフィーを行い、各プローブとのハイブリッド形成の有無を調べることにより行うことができる。
【００５１】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、下記の実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲は何等限定されるものではない。
【００５２】
【実施例】
実施例１  アデノウイルス標準株のヘキソン領域のＰＣＲ法による増幅及び増幅ＤＮＡの検出
（Ａ）使用微生物
国立予防衛生研究所において継代培養されている下記１４種類のアデノウイルス標準株を用いて実験を行った。これらのアデノウイルスは、いずれも特異抗血清を用いた中和試験で亜群及び血清型が同定されている標準株である。
0003709211.tif 000002
【００５３】
（Ｂ）ＤＮＡの抽出
アデノウイルス１型、２型、３型、４型、５型、６型、７型、８型、１１型、１４型、１９型、３７型、４０型、４１型の各ウイルス培養液を Proteinase K で処理し、さらに Phenol-Chroloform  法によりアデノウイルスＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを精製した。
【００５４】
（Ｃ）血清型共通プライマーの設計と合成
遺伝子塩基配列データベース（ＤＮＡＳＩＳ−ＤＢ；日立ソフトウエアエンジニアリング社製）を用いて既知のアデノウイルスヘキソン領域遺伝子配列〔配列番号１（２型）、配列番号２（５型）、配列番号３（４０型）、配列番号４（４１型）〕を検索・解析し、これらの配列からアデノウイルスヘキソン領域を共通に増幅できるプライマーペアを、配列番号１６（５’末端側）、配列番号１７（３’末端側）のように設計した。
これらのオリゴヌクレオチドをホスホアミダイド (Phosphoamidide) 法により、アプライド・バイオシステムズ社製、モデル３８１−Ａ  ＤＮＡ合成機を用いて合成し、ＯＰＣＴＭカートリッジを用いて精製後、ＰＣＲのプライマーとして使用した。
なお、このプライマーペアを用いて増幅されるＤＮＡは、ヘキソン領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の１２６３塩基対部分である。
【００５５】
（Ｄ）標的ＤＮＡの増幅（ＰＣＲ法）
反応液として、１０×反応用緩衝液 (Reaction Buffer)１０μl 、デオキシヌクレオチド３−リン酸混合液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ；各１．２５mM含有）１６μl 、上記オリゴヌクレオチド合成プライマー（配列番号１６及び１７；各５０μM ）各２．０μl 、前記（Ｂ）項で抽出したアデノウイルスＤＮＡ  １００ng〜１μg 、およびTaq ポリメラーゼ（日本ロシュ社製）１μl(５unit) に蒸留水を加え、計１００μl としたものを調製した。ＰＣＲの１サイクルは、塩基鎖の変性工程を９４℃１分、アニーリング工程を６０℃１分、塩基鎖伸張工程を７２℃２分に設定し、アンプリフィケーションシステム（Amplification System、シータス社）を用いて標的ＤＮＡを３５サイクル増幅した。
【００５６】
（Ｅ）ゲル電気泳動法による増幅ＤＮＡの確認
２．０％のアガロースゲルにエチジウムブロマイドを０．５μg/ml  加え、上記（Ｃ）項で増幅したＤＮＡの電気泳動を行った。泳動後、２５４nmの紫外線を照射し、エチジウムブロマイドの発色反応によりＤＮＡバンドを検出し、ヘキソン領域の一部に由来する１２６３塩基対の増幅ＤＮＡを確認した。なお、マーカーとしてファージφｘ１７４の制限酵素ＨａｅIII 分解物を同時に泳動した。
その結果、図１に示すように、用いたアデノウイルス標準株（１４株）の全ての血清型について、１２６３塩基対の標的ＤＮＡバンドが確認された。
【００５７】
実施例２  ヘキソン領域の塩基配列決定
実施例１で増幅したヘキソン領域ＤＮＡを、常法（アガロースゲルからのエレクトロエリューション法）によりゲルから抽出した。抽出ＤＮＡをＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）により平滑末端化処理し、ファージベクターＭ１３ｍｐ１８ＲＦ（宝酒造社製）に組み込んだ。
【００５８】
この組換えファージベクターと、ＹＴ培地〔Bacto-Triptone (DIFCO 社製) ８g 、Bacto-Yeast Extract (DIFCO  社製) ５g 、ＮａＣｌ  ２．５g を１L の蒸留水に溶解し、ｐＨを７．４に調製した後、１２１℃で１５分間滅菌処理〕中で生育させたエシェリッシア・コリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９株（宝酒造社製）と、３７℃に保温した５mlの軟寒天培地〔ＹＴ培地に Bacto-Agar(DIFCO 社製) ６g/L を含む〕とを混ぜ合わせ、ＹＴ寒天培地〔ＹＴ培地に Bacto-Agar(DIFCO 社製) １２g/L を含む〕上にまき、３７℃で４〜６時間培養した。
【００５９】
培養後、培地上にできたプラークよりアデノウイルスヘキソン領域ＤＮＡを含む組換えファージを釣り上げ、２倍濃度のＹＴ培地中でエシェリッシア・コリＪＭ１０９株と共に培養し、培地から常法にて一本鎖ファージＤＮＡを抽出した。各血清型から１〜１０個ずつのクローンが得られた。
それぞれのクローン由来のファージＤＮＡに含まれるアデノウイルスヘキソン領域ＤＮＡの塩基配列を、サンガー法（F. Sanger 等、前出）により決定した。
【００６０】
その結果を、配列番号６（１型）、配列番号７（３型）、配列番号８（４型）、配列番号９（６型）、配列番号１０（７型）、配列番号１１（８型）、配列番号１２（１１型）、配列番号１３（１４型）、配列番号１４（１６型）、配列番号１５（３７型）に示す。
【００６１】
実施例３  アデノウイルス標準株の２段階ＰＣＲ法による検出
（Ａ）ＤＮＡの抽出
実施例１の（Ａ）項に記載した各ウイルス標準株から、同（Ｂ）項に準じてＤＮＡを抽出・精製した。
【００６２】
（Ｂ）血清型共通プライマー（２段階ＰＣＲ用）の設計と合成
アデノウイルスの検出感度を更に高めるために、実施例２で決定した各血清型のヘキソン領域塩基配列を解析し、前記プライマー（配列番号１６及び１７）より内側に、ヘキソン領域の一部を共通に増幅できるプライマーペアを配列番号１８（５’末端側）、配列番号１９（３’末端側）のように設計した。
これらのオリゴヌクレオチドを実施例１の（Ｃ）項記載の方法で合成した。
なお、このプライマーペアを用いて増幅されるＤＮＡは、ヘキソン領域の１８９７〜２８６１番目の塩基対間の９６５塩基対部分である。
【００６３】
（Ｃ）標的ＤＮＡの第１段階増幅（ＰＣＲ法）
実施例１の（Ｄ）項に準じてヘキソン領域ＤＮＡを増幅した。
【００６４】
（Ｄ）ゲル電気泳動法による第１段階増幅ＤＮＡの確認
増幅ＤＮＡを、実施例１（Ｅ）項に準じてゲル電気泳動法で分離・検出した。その結果、図１に示す通り、ヘキソン領域由来の１２６３塩基対のＤＮＡバンドが確認された。
【００６５】
（Ｅ）標的ＤＮＡの第２段階増幅（ＰＣＲ法）
上記（Ｃ）項で増幅したＤＮＡサンプルを鋳型として、上記（Ｂ）項で調製した合成プライマー（配列番号１８及び１９；各５０μM ）を用いて、実施例１の（Ｄ）項に準じてヘキソン領域ＤＮＡを増幅した。
【００６６】
（Ｆ）ゲル電気泳動法による第２段階増幅ＤＮＡの確認
増幅ＤＮＡを、実施例１（Ｅ）項に準じてゲル電気泳動法で分離・検出した。その結果、図２に示す通り、用いたアデノウイルス標準株（１４株）の全ての血清型についてヘキソン領域由来の９６５塩基対のＤＮＡバンドが確認された。
【００６７】
実施例４  アデノウイルス標準株の亜群鑑別
（Ａ）ＤＮＡの抽出
実施例１の（Ａ）項に記載した各アデノウイルス標準株から、同（Ｂ）項に準じてＤＮＡを抽出・精製した。
【００６８】
（Ｂ）亜群特異的プライマー（亜群鑑別用）の設計と合成
実施例２で決定した各血清型のヘキソン領域の塩基配列を解析し、ヘキソン領域内の亜群に特異的な塩基配列に相補性を有するプライマーを、配列番号２０（Ｂ亜群用）、配列番号２１（Ｃ亜群用）、配列番号２２（Ｄ亜群用）、配列番号２３（Ｅ亜群用）、配列番号２４（Ｆ亜群用）のように設計し、実施例１（Ｃ）項に準じて合成した。
【００６９】
（Ｃ）標的ＤＮＡの増幅（ＰＣＲ法）
実施例３の（Ｃ）項で増幅したＤＮＡを鋳型として、上記各亜群特異的プライマーと血清型共通プライマーを用いて、亜群特異的ＤＮＡ領域を次の通り増幅した。
反応液として、１０×反応用緩衝液 (Reaction Buffer)９．８μl 、デオキシヌクレオチド３−リン酸混合液（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ；各１．２５mM含有）１６μl 上記亜群特異的プライマー〔配列番号２０、２１、２２、２３、２４；各５０μM 各２．０μl 、血清型特異的プライマー（配列番号１９；５０μM ）２．０μl 、実施例３の（Ｃ）項で増幅した標的ＤＮＡ１００ng〜１μg 、及び Taq  ポリメラーゼ（日本ロシュ社製）１μl(５unit) に蒸留水を加え、計１００μl としたものを調製し、実施例１の（Ｄ）項に準じて増幅した。
【００７０】
（Ｄ）ゲル電気泳動法による増幅ＤＮＡの確認
増幅ＤＮＡを、実施例１（Ｅ）項に準じてゲル電気泳動法で分離・検出した。その結果、図３に示す通り、Ｂ亜群は１１６８塩基対、Ｃ亜群は７４塩基対、Ｄ亜群は３７５塩基対、Ｅ亜群は１００塩基対、Ｆ亜群は２５６塩基対のヘキソン領域由来のＤＮＡバンドが確認された。交差反応は認められず、亜群特異的なＤＮＡバンドが検出でき、この方法により亜群の鑑別が可能であることが判明した。
【００７１】
実施例５  アデノウイルス標準株の血清型鑑別
（Ａ）血清型特異的ＤＮＡプローブの設計と合成
実施例２で決定した各血清型のヘキソン領域の塩基配列を解析し、ヘキソン領域内の血清型に特異的な塩基配列に相補性を有するＤＮＡプローブを、配列番号２５（３型用）、配列番号２３（４型用）、配列番号２６（８型用）、配列番号２７（１１型用）、配列番号２８（１９型用）、配列番号２９（３７型用）のように設計し、実施例１（Ｃ）項に準じて合成した。
このＤＮＡプローブの標識は、５’末端のリン酸化反応により〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績社製）を用いて行った。
【００７２】
（Ｂ）ドットブロット法
実施例３の（Ｃ）項で増幅したＤＮＡを試料とし、その分子数を２６０ｎｍの吸光度により算出した。この増幅ＤＮＡ  １０12 molecule ／２μl を、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡで変性させた後ナイロンメンブレンに滴下し、２５４ nm の紫外線１．２×１０5 μJOULES/cm2（UV stratalinkerTM ；ストラタジーン製）により固着させた。
【００７３】
32Ｐで標識されたＤＮＡプローブは、１回のハイブリダイゼーションにつき１０6cpm/ml 使用した。プレハイブリダイゼーションは、反応液として６×クエン酸標準緩衝液、５×デンハルト（Denhardt's）試薬、１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ソーダ）、０．１％脱脂粉乳、１００μg/ml  変性サケ精子ＤＮＡを用いて、６０℃で１時間行った。
【００７４】
ハイブリダイゼーションは、反応液として３．０M テトラメチルアンモニウムクロライド、０．１M リン酸ナトリウム（pH６．８）、０．５mM  ＥＤＴＡ（pH７．６）、１０％ＳＤＳ、１００μg ／ml  変性サケ精子ＤＮＡ、０．１％脱脂粉乳を用い、６０℃で一晩行った。ハイブリダイゼーション後、余分なプローブを、６×ＳＳＣを用い、６０℃で５分間、３回繰り返し洗浄した。
その後、３．０M テトラメチルアンモニウムクロライドで、６０℃で１０分間洗浄した。その後、配列番号２９のプローブは６０℃から６５℃まで、また配列番号２５及び２８のプローブは６０℃から６８℃まで温度を上げながら（約５分）、３．０M テトラメチルアンモニウムクロライドで洗浄した。ナイロンメンブレンを乾燥後ラップに包み、オートラジオグラフィーを−８０℃で４時間から一晩行い、各プローブとのドットハイブリッド形成の有無により試料の血清型を鑑別した。
【００７５】
その結果、図４に示す通り、血清型特異的ＤＮＡプローブと各血清型のアデノウイルス標準株から得られたＤＮＡとの間で、交差反応はなく、特異的な結合パターンが認められた。この結合パターンからアデノウイルスの各血清型の鑑別が可能である事が判明した。
【００７６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：２型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
0003709211.tif 000003
0003709211.tif 000004
0003709211.tif 000005
【００７７】
配列番号：２
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：５型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００７８】
配列番号：３
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：５型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００７９】
配列番号：４
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：４０型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８０】
配列番号：５
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：４１型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８１】
配列番号：６
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：１型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８２】
配列番号：７
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：３型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８３】
配列番号：８
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：４型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８４】
配列番号：９
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：６型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８５】
配列番号：１０
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：７型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８６】
配列番号：１１
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：８型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８７】
配列番号：１２
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：１１型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８８】
配列番号：１３
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：１４型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００８９】
配列番号：１４
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：１９型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００９０】
配列番号：１５
配列の長さ：１２６３
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：Mastadenovirus
株名：３７型
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：１−１２６３
他の情報
ヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜２９０７番目の塩基対間の配列
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【００９１】
配列番号：１６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１６４５〜１６６４番目
の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
AATCCCTTTA ACCACCACCG                                                20
【００９２】
配列番号：１７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の２８８８〜２９０７番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
GTAGCGTTGC CGGCCGAGAA                                                20
【００９３】
配列番号：１８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の１８９７〜１９１６番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
GCCACCTTCT TCCCCATGGC                                                20
【００９４】
配列番号：１９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスのヘキソンをコードする遺伝子領域の２８４２〜２８６１番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
GCCTCGATGA CGCCGCGGTG                                                20
【００９５】
配列番号：２０
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスＢ亜群のヘキソンをコードする遺伝子領域の１６９４〜１７１４番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
TTCTGGGTAA CGGTCGTTAT G                                              21
【００９６】
配列番号：２１
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスＣ亜群のヘキソンをコードする遺伝子領域の２７８７〜２８０９番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
CACCCTTCTT TATGTTTTGT TTG                                            23
【００９７】
配列番号：２２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスＤ亜群のヘキソンをコードする遺伝子領域の２４９７〜２５１６番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
GTCACCCTGC CCTTCCAGCA                                                20
【００９８】
配列番号：２３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスＥ亜群及び４型のヘキソンをコードする遺伝子領域の２７５３〜２７７２番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
ACATGAATTT CGAAGTCGAC                                                20
【００９９】
配列番号：２４
配列の長さ：２１
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルスＦ亜群のヘキソンをコードする遺伝子領域の２６０６〜２６２６番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
TTCTGGGTAA CGGTCGTTAT G                                              21
【０１００】
配列番号：２５
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルス３型のヘキソンをコードする遺伝子領域の２４７１〜２４９３番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
AGGTTAATTA CACTGACTAC AAA                                            23
【０１０１】
配列番号：２６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルス８型のヘキソンをコードする遺伝子領域の２１４５〜２１６４番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
TGTTTACTCG GGCACCATCC                                                20
【０１０２】
配列番号：２７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルス１１型のヘキソンをコードする遺伝子領域の１７８８〜１８０７番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
TTATGAGTGG AACTTTAGGA                                                20
【０１０３】
配列番号：２８
配列の長さ：
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルス１９型のヘキソンをコードする遺伝子領域の２６０１〜２６２０番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
TGGCTCCACC GCAGTGCCCT                                                20
【０１０４】
配列番号：２９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
他の情報
アデノウイルス３７型のヘキソンをコードする遺伝子領域の２１４５〜２１６４番目の塩基対間の配列と相補性を有する配列
配列
TGTCTACTCG GGCTCCATCC                                                20
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘキソン領域に由来する大きさが１２６３塩基対の増幅ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による検出図。
【図２】ヘキソン領域に由来する大きさが９６５塩基対の増幅ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による検出図。
【図３】ヘキソン領域に由来する各亜群に特異的な大きさの増幅ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動による検出図。
【図４】血清型特異的ＤＮＡプローブと各血清型由来のＤＮＡとの結合パターン。
【図５】本発明で用いる、ヘキソン領域ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡプローブ、該プライマーを用いて増幅可能なＤＮＡ断片。
【図１】
0003709211.tif 000048
【図２】
0003709211.tif 000049
【図３】
0003709211.tif 000050
【図４】
0003709211.tif 000051
【図５】
0003709211.tif 000052