(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子含有試料を試料流に変換するフローセルと、前記試料流を連続的な光によって照明する第１光源と、第１光源によって照明された粒子からの光を検出して粒子の特徴を表す粒子信号に変換する光検出素子と、前記試料流を瞬間的な光によって照明する第２光源と、第２光源によって照明された粒子を撮像して粒子像を得る撮像器と、前記粒子信号と粒子像を粒子分析用データとして粒子分析を行う分析部を備え、分析部は第２光源の発光時に得られる光検出素子からの粒子信号を粒子分析用データとして不採用とするための不採用期間を設定する禁止部を備え、不採用期間の終了時に分析部が粒子信号を得た場合に禁止部が不採用期間を延長することを特徴とする粒子分析装置。
【請求項２】
分析部が、光検出素子からの粒子信号を予めＡ／Ｄ変換するためのＡ／Ｄ変換器を備え、禁止部は、Ａ／Ｄ変換器の変換動作を第２光源の発光に対応して一時的に停止させる手段からなる請求項１記載の粒子分析装置。
【請求項３】
分析部が、光検出素子からの粒子信号を予めＡ／Ｄ変換するためのＡ／Ｄ変換器を備え、禁止部は、Ａ／Ｄ変換器への粒子信号の入力動作を第２光源の発光に対応して一時的に停止させる手段からなる請求項１記載の粒子分析装置。
【請求項４】
分析部が、光検出素子からの粒子信号を予めＡ／Ｄ変換するためのＡ／Ｄ変換器と、Ａ／Ｄ変換された粒子信号を格納する格納部を備え、禁止部は、Ａ／Ｄ変換された粒子信号の格納部への格納動作を第２光源の発光に対応して一時的に停止させる手段からなる請求項１記載の粒子分析装置。
【請求項５】
分析部が、光検出素子からの粒子信号を予めＡ／Ｄ変換するためのＡ／Ｄ変換器と、第２光源の発光時に得られた粒子信号か否かを表わす識別子をＡ／Ｄ変換された各粒子信号に付加する識別子付加手段と、Ａ／Ｄ変換された粒子信号を付加した識別子と共に格納する格納部とを備え、禁止部は、識別子に基づいて粒子信号を粒子分析用データとして不採用とする手段からなる請求項１記載の粒子分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、粒子分析装置に関し、とくに、粒子を撮像するための粒子撮像系と粒子の特徴を光学的に検出するための粒子検出系とを備えた粒子分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のこのような粒子分析装置においては、血球や細胞のような粒子を含む試料流を形成し、その試料流の上流に粒子検出系によって粒子を検出する検出エリアを設け、下流に粒子撮像系によって粒子を撮像する撮像エリアを設けている。
【０００３】
そして、検出エリアで検出された粒子が、対象とする粒子か否かを粒子検出系から得られる粒子信号によって判別し、対象粒子が撮像エリアに到達したとき、その粒子を撮像する。ここでは、粒子検出系の光検出器にシャッタを設け、撮像系光源の発光時にそのシャッタを閉じて、その光が光検出器に入射しないようにしている（例えば、特開平５−１８０７５１号公報参照）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の粒子分析装置においては、試料流と共に流れる複数の粒子について、最初の粒子が撮像エリアで撮像されるときにシャッタが閉じるが、そのシャッタが、開→閉になる瞬間あるいは閉→開になる瞬間に、次の粒子が検出エリアに既に到達していると、次の粒子からの光が部分的にシャッタに遮られた状態で受光素子に受光されるため、次の粒子に対しては正しい粒子信号を得ることができない。
【０００５】
もっとも、上記従来の装置は粒子の撮像を主目的としており、正確な粒子信号を得ること自体を目的としていないため、このことを特に問題視していない。
【０００６】
これに対して、この発明においては、正しい粒子信号に基づいて粒子分析を行うことをも目的としているため、このような不確かな粒子信号は問題となる。
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、粒子を撮像すると共に、不正確な粒子信号の場合にはこれを除去して正確な粒子信号のみを検出することにより、高精度の粒子分析が可能な粒子分析装置を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この発明は粒子含有試料を試料流に変換するフローセルと、前記試料流を連続的な光によって照明する第１光源と、第１光源によって照明された粒子からの光を検出して粒子の特徴を表す粒子信号に変換する光検出素子と、前記試料流を瞬間的な光によって照明する第２光源と、第２光源によって照明された粒子を撮像して粒子像を得る撮像器と、前記粒子信号と粒子像を粒子分析用データとして粒子分析を行う分析部を備え、分析部は第２光源の発光時に得られる光検出素子からの粒子信号を粒子分析用データとして不採用とするための不採用期間を設定する禁止部を備え、不採用期間の終了時に分析部が粒子信号を得た場合に禁止部が不採用期間を延長することを特徴とする粒子分析装置を提供するものである。
【０００８】
この発明のフローセルは、粒子を含む試料をシース液で包んで流すことにより流体力学的効果によって細い試料液の流れを形成させることのできるフローセルであり、これには、従来公知のものを用いることができる。
【０００９】
この発明の対象とする粒子は、血液や尿に含まれる血球や細胞を主としているが、酵母菌や乳酸菌等の微生物、あるいは工業用の粉体等を測定対象としてもよい。血球や細胞の種類を分類するために、細胞内の種類や核酸等を特異的な蛍光試薬と反応させ、その蛍光強度を計測するようにすることがある。
【００１０】
第１光源には、例えば、レーザやハロゲンランプ又はタングステンランプのような連続的に光を照射する連続光源を用いることができ、光検出素子は、例えば、フォトダイオード、フォトトランジスタ又はフォトマルチプライヤチューブで構成することができる。なお、粒子信号とは、具体的には粒子の特徴を表す前方散乱光強度や蛍光強度などのデータである。
【００１１】
また、第２光源としては、パルスレーザ（例えば、Spectra-Physics 社製、7000シリーズ）やマルチストロボ（例えば、（株）菅原研究所製、ＤＳＸシリーズ）のような断続的に光を照射する断続光源を用いることができる。
【００１２】
粒子の像を撮像する撮像器には、一般的な２次元画像を撮像するビデオカメラを使用してもよいが、微弱な蛍光像を増幅するイメージインテンシファイアを備えたものを用いてもよい。さらに、そのイメージインテンシファイアにはシャッター手段を備えてもよい。
【００１３】
分析部は、ＣＰＵ、ＲＯＭおよびＲＡＭからなるマイクロコンピュータによって構成することができる。
【００１４】
禁止部は、第２光源の発光時に得られる光検出素子からの粒子信号を粒子分析用データとして不採用とするものであるが、ハードウェア、ソフトウェアいずれによって実現してよい。例えば分析部が光検出素子から得られる粒子信号をＡ／Ｄ変換して粒子分析用データとするためのＡ／Ｄ変換器を備える場合には、この禁止部は、Ａ／Ｄ変換器への粒子信号の入力動作、あるいはＡ／Ｄ変換動作を第２光源の発光に対応して一時的（所定期間）に停止させる回路であることが好ましい。
【００１５】
また、分析部が粒子信号を格納部（メモリ）に格納した後に分析を行う場合には、禁止部は、第２光源の発光時に得られる粒子分析用データの格納を禁止する回路であってもよい。
【００１６】
さらに禁止部は、第２光源の発光時に得られた粒子信号に識別子（フラグビット）を付加するフラグ付加部からなり、分析部は、識別子を有する粒子信号を粒子分析用データとして不採用とするようにしてもよい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この発明の実施形態における光学系を図１および図２に示す。この実施形態では、散乱光や蛍光を検出するための連続発光レーザ光源１（第１光源）と、細胞像を撮像するためのパルス光源２（第２光源）との２つの光源を設けている。
【００１８】
この２つの光源１、２からの光Ｌ１、Ｌ２は、図２に示すように角型のシースフローセル３（図１では紙面に垂直方向に試料流が流れる）に対して互に直交するように９０°交差させて照射している。
【００１９】
また、細胞像を撮像するためのパルス光源２は、シースフローセル３内の試料流に対して、連続発光レーザ光源１の照射位置より（例えば20μｍ程）下流側に照射するようにしている。
【００２０】
適当な試薬で処理された細胞浮遊液は、シースフローセル３に導かれ、シース液によって細く絞られた試料流が形成される。連続発光レーザ光Ｌ１は、コンデンサレンズ４によって細く絞られて試料流に照射される。
【００２１】
この照射領域に細胞が流れてくると、その細胞による散乱光や蛍光が集光レンズ５によって集められ、散乱光はダイクロイックミラー６によって反射され、フォトダイオード７で受光される。蛍光は、それぞれダイクロイックミラー８によって反射され、光電子増倍管１０で受光、増倍される。
【００２２】
図３はこの実施例の信号処理系の構成を示し、フォトダイオード７と光電子増倍管１０とによってそれぞれ検出された散乱光強度信号Ｓ１および蛍光強度信号Ｓ２は、信号処理回路１００に入力され、各検出信号パルスの高さ情報がＡ／Ｄ変換された散乱光強度ａと蛍光強度ｂの２つの特徴パラメータを得るようにしている。
【００２３】
撮像制御回路２００では、撮像判別部２０２がそれらのパラメータを用いて各細胞の種類を実時間で同定し、あらかじめ撮像対象として入力装置４００によって指定された種類の細胞だけを選別して撮像できるように制御する。
【００２４】
すなわち、ある細胞の特徴パラメータが、撮像対象としている種類の細胞の特徴パラメータに合致しているかどうかを実時間で比較し、その結果撮像対象としている細胞であると判定されれば、その細胞を撮像するための発光トリガ信号Ｔｓをパルス光源２に対して供給する。
【００２５】
パルス光源２は、発光トリガ信号Ｔｓによって一瞬だけ（数十ナノ秒程度）発光するタイプの光源であり、試料流の流速が数ｍ／秒と高速であっても、流れる粒子をブレ無く撮像することができる。
【００２６】
パルス光は図１に示すように、光ファイバー１２でフローセル３へ導かれ、コンデンサレンズ１３によって細く絞られて試料流に照射される。光ファイバー１２を介して照射することにより、パルス光のコヒーレンシーを低下させ、回析縞の少ない細胞像を撮像することができる。
【００２７】
試料流を透過したパルス光は、投影レンズ１４によってビデオカメラ１５の受光面に結像され、細胞の透過光像が撮像される。ビデオカメラ１５からの画像信号Ｖｓは図３に示すデータ処理装置３００に渡され、画像メモリ６００にディジタル画像として記憶、保存される。
【００２８】
散乱光強度や蛍光強度等の特徴パラメータａとｂは、データ処理装置３００に入力され、パラメータメモリ７００に格納される。データ処理装置３００は、それらの画像やパラメータの組み合わせによるスキャッタグラム（２次元頻度分布）の解析を行う。
【００２９】
なお、入力装置４００はキーボードやマウスからなり、スキャッタグラムの領域指定や、撮像回数の設定などを行なう。５００は入力装置４００からの指令や設定条件に基づきスキャッタグラム、粒子像および解析結果などを表示する表示装置である。
【００３０】
この発明では、表示装置５００によって表示されたスキャッタグラムに対して、撮像したい細胞の種類等をあらかじめ設定しておくことができる。図４を用いその例を説明する。
【００３１】
図４のスキャッタグラムは、入力装置４００により、Ｘ軸を特徴パラメータａ、Ｙ軸を特徴パラメータｂの値に割り当てたものである。細胞群Ａは枠１の領域内に、細胞群Ｂは枠２の領域内に、細胞群Ｃは枠３の領域内に分布することが予め分かっているものとする。
【００３２】
そこで、例えば細胞群Ｂだけを選別して撮像するには、入力装置４００を用いて細胞群Ｂを枠２で囲む。そこで、撮像制御回路２００は、信号処理回路１００によって得られる各細胞の特徴パラメータａ，ｂの値が、図４のスキャッタグラムの枠２の領域内であるかどうかを判定し、その領域内のデータであれば、その細胞を撮像するためにパルス光源２を発光させる。
【００３３】
撮像制御回路２００には、各細胞の特徴パラメータが、指定した枠内のデータであるかどうかを判定するために、スキャッタグラムのＸ軸とＹ軸に割り当てた特徴パラメータの値をアドレス入力とする分布領域登録用メモリ２０１を設けている。
【００３４】
その２つの特徴パラメータによる２次元座標（スキャッタグラム）が、図５のようにメモリ領域Ａ０、Ａ１、Ａ２にイメージされる。スキャッタグラム上で設定されたそれぞれの枠内の領域に相当するメモリ領域（アドレス）のデータビットが１になるようにあらかじめ設定しておく。
【００３５】
図４の例では、データビットｄ０を枠１に対応させ、枠１に対応するメモリ領域のデータビットｄ０を１に設定しておく、同様に、枠２はデータビットｄ１に、枠３はデータビットｄ２に対応させ、それぞれの枠に対応するメモリ領域のデータビットを１に設定しておく。
【００３６】
図５では、黒く塗りつぶしたメモリ空間に相当するアドレスのデータビットを１に設定し、枠外の領域に相当するメモリアドレスのデータビットを０に設定しておく。
【００３７】
このように撮像以前にあらかじめ分布領域登録用メモリ２０１を設定、登録しておくと、測定期間中にある細胞の特徴パラメータが得られれば、その値をメモリアドレスとするメモリの内容（８ビットデータ）がすぐに出力される。撮像判別部２０２は、そのデータの各ビットが１か０かによって、その細胞がどの細胞群に属するかを即座に判定できる。
【００３８】
分布領域登録用メモリには、例えば、特徴パラメータが８ビットデータである場合には、８ビット×２＝１６ビットのアドレス空間を有するメモリ、すなわち、６４ｋ×８ビットの容量を持つメモリを使用する。
【００３９】
さらに、図３の信号処理回路１００および撮像制御回路２００の動作を図６のタイミングチャートと共に詳述する。
信号Ｓ１はシースフローセル３を順番に流れる第１、第２…の粒子に対応して連続するパルスＰ１，Ｐ２…となるが、まず、パルスＰ１がコンパレータ１０１でしきい値Ｔｈと比較され、しきい値をＴｈを越えると、ビジィ信号生成部１０２は、その時点から所定時間Ｔ１だけ粒子ビジィ信号Ｓ５をＨｉｇｈにする。
【００４０】
また、微分器１０３は信号Ｓ１を微分してその微分値Ｓ３が０になる時点、すなわち信号Ｓ１がピークに達する時点から所定時間Ｔ２だけＬｏｗとなる信号Ｓ４を出力する。
【００４１】
Ｓ−Ｈ指令部１０７は、サンプルホールド回路１０４ａ，１０４ｂに対して信号Ｓ４の立下りからビジィ信号Ｓ５の立下りまでｈｉｇｈとなる信号Ｓ６を出力し、信号Ｓ１，Ｓ２のピーク値をサンプリングさせてビジィ信号Ｓ５が立下るまで保持させる。
【００４２】
Ａ／Ｄ指令部１０５は、信号Ｓ４の立下りの時点から所定時間Ｔ３だけＡ／Ｄ変換を指令する信号Ｓ７をＡ／Ｄ変換部１０６ａ，１０６ｂに出力する。これによって、信号Ｓ１，Ｓ２はそれぞれＡ／Ｄ変換され特徴パラメータａ、ｂとなる。
【００４３】
信号Ｓ７が立下り後、つまりＡ／Ｄ変換完了後、時間Ｔ４において、撮像判別部２０２は、得られた特徴パラメータａ，ｂから、その粒子が撮像すべき粒子か否かを判別し、その判別結果を撮像許可部２０３へ入力する。
【００４４】
そして、撮像すべき粒子である場合には、撮像許可部２０３は撮像許可信号Ｓ９を所定時間Ｔ５だけトリガ部２０４へ出力する。トリガ部２０４は、時間Ｔ５においてビデオカメラ１５からの同期信号Ｓｙにより偶数フィールド期間であることを検出すると、発光トリガ信号ＴＳを出力する。
【００４５】
ここで、Ａ／Ｄ禁止部１０６は信号Ｓ９の立上りと同時に立上るＡ／Ｄ禁止信号Ｓ８をＡ／Ｄ指令部１０５に出力し、信号Ｓ８のｈｉｇｈの期間Ｔ６においてＡ／Ｄ指令部１０５が信号Ｓ７を出力すること、つまり、信号Ｓ１，Ｓ２がＡ／Ｄ変換されることを禁止する。
【００４６】
通常、信号Ｓ８は信号Ｓ９と同じ信号（Ｔ５＝Ｔ６）なるよう設定されているが、信号Ｓ９の立下り時において、第２のつまりパルスＰ２によるビジィ信号Ｓ５が立上っている場合には、Ａ／Ｄ禁止部１０６は信号Ｓ８の立下りを信号Ｓ５の立下りまで延長して、第２の粒子による信号Ｓ１，Ｓ２のＡ／Ｄ変換を禁止する。
【００４７】
従って、第１の粒子に対して照射された撮像用のパルス光が、フォトダイオード７や光電子増倍管１０に混入しても、それによって生じる誤った信号Ｓ１，Ｓ２が、第２の粒子の特徴パラメータａ，ｂとして検出されることはない。
このようにして、データ処理装置３００は、正確な粒子の特徴パラメータと粒子像に基づいて、粒子の分類や分析を行う。
なお、Ａ／Ｄ変換を禁止する代りにＡ／Ｄ変換器に入力する信号を例えばアナログスイッチなどのスイッチ手段により信号入力を禁止するようにしてもよい。
【００４８】
また禁止部は、Ａ／Ｄ禁止部１０６がＡ／Ｄ指令部１０５に与える信号Ｓ８を、Ａ／Ｄ変換器１０６ａ，１０６ｂへの制御信号として使用せずに、データ処理装置３００に入力し、格納部への格納動作の制御信号として使用するものであってもよい。例えば、信号Ｓ７の立ち下り時、つまりＡ／Ｄ変換完了時における禁止信号Ｓ８の論理（正負）によって、信号Ｓ１、Ｓ２をＡ／Ｄ変換して得られた特徴パラメータａ，ｂのデータ取り込み制御をすること、すなわち、パラメータメモリ７００への格納動作を制御するものであってもよい。
【００４９】
また禁止部は、格納した特徴パラメータａ，ｂを粒子分析データとして採用・不採用とするものであってもよい。例えば、信号Ｓ７の立ち下り時、つまりＡ／Ｄ変換完了時における禁止信号Ｓ８をデータ処理部３００へ入力し、禁止信号Ｓ８の論理（正負）によって、特徴パラメータａ，ｂに正負の識別子（フラグビット）を付加し、特徴パラメータ及び対応する識別子をパラメータメモリ７００に格納させる。そして、特徴パラメータａ，ｂを分析する場合に、その識別子の論理に従って、その特徴パラーメータを粒子分析データとして採用・不採用とするものであってもよい。
【００５０】
【発明の効果】
この発明によれば、粒子撮像用光源の発光によって影響をうけた粒子検出信号は、すべて粒子分析用データから除去されるので、精度の高い粒子分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施形態の光学系の構成説明図である。
【図２】図１の要部斜視図である。
【図３】実施形態の信号処理系のブロック図である。
【図４】表示されたスキャッタグラムの例を示す説明図である。
【図５】分布領域登録用メモリの図４に対応するビットマップの説明図である。
【図６】実施形態の信号処理系の動作を示すタイミングチャートである。
【符号の説明】
１．連続発光レーザ
２．パルス光源
３．シースフローセル
４．コンデンサレンズ
５．集光レンズ
６．ダイクロイックミラー
７．フォトダイオード
８．ダイクロイックミラー
１０．光電子増倍管
１２．光ファイバー
１３．コンデンサレンズ
１４．投影レンズ
１５．ビデオカメラ
【図１】
0003640461.tif 000002
【図２】
0003640461.tif 000003
【図３】
0003640461.tif 000004
【図４】
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【図５】
0003640461.tif 000006
【図６】
0003640461.tif 000007