(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素反応を利用して体液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定するための試薬において、以下の試薬からなるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬；
(i)  グリシルグリシン緩衝液を含む第１試薬：
(ii)  γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドと、糖または糖類似体を含み、該糖または糖類似体は、該γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド１ｍＭあたり０．０１〜１Ｍ共存した第２試薬。
【請求項２】
糖、糖類似体またはグリセリン系物質が、サッカロースである請求項１記載のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は体液成分中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定するための試薬に関し、より詳しくは、測定時の酵素反応を均一に行うための技術である。
【０００２】
【従来の技術】
患者の病態把握のために用いられる臨床検査試薬には、酵素反応を利用して患者の体液成分中の酵素や基質を光学的に比色定量する酵素的分析法を利用した試薬がある。酵素的分析法を利用した試薬では、その測定値は基質の濃度や種類、またｐＨや反応温度などの反応条件に大きく影響を受けために各メーカから市販されている検査試薬を用いて同一検体の測定を行った場合、測定ごとに検査値が異なり、病態把握を客観的に行うことが難しかった。このため、一定の検査値が得られるよう測定に関する条件を細部にわたり規定した統一的な合意が行われ、勧告法として各国で定めらている。例えば、国際臨床化学会（ＩＦＣＣ）やヨーロッパ臨床検査標準化協議会（ＥＣＣＬＳ）、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）等があり、これらの勧告法に法った試薬開発が各メーカで進められている。
【０００３】
しかしながら、最近の臨床検査試薬は検査時間の短縮や測定操作の簡便さから溶液状態で供給されることも多くなってきており、勧告法に準じる測定法を用いた試薬組成でも保存中の酵素や基質の劣化の問題や、体液成分に含まれる他の成分などの妨害物質による測定値への影響など、精度管理上の解決しなければならない課題は多い。
【０００４】
酵素的分析法では酵素反応による生成物を発色系に導き、光学的に比色定量して目的成分量の測定を行うことが一般的である。この吸光度測定の際に問題となるのが体液成分の測定対象以外の成分によるブランク値のバラツキや酵素反応が均一に行われず測定値にバラツキがみられることである。前者のブランク値に対しては例えば特公平８−７８号公報に生体内の還元物質であるアスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等による測定値の負の誤差を回避する方法として測定系にアニオン性界面活性剤または両性界面活性剤を共存させることが開示されている。また特公平２−２４５２０号公報には体液中の混濁の影響を除去する方法として測定系にＨＬＢ１０〜１３の非イオン性界面活性剤とコラン酸のオキシ誘導体を共存させることが開示されている。一方、後者の酵素反応を均一に行うものに関しては何も開示がなされていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
検査の自動化の進んだ日常検査における酵素活性の分析は、単位時間あたりの基質の減少、補酵素の増減、生成物の増量などの変化量を測定して反応速度を求める初速度測定法（ｒａｔｅ  ａｓｓａｙ）を用いて行われることが多い。このため酵素反応が均一に行われ、一定の割合で増減されないと目的成分の正確な値が得られないといった問題があった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、体液中の成分を測定する際に基質と酵素との反応が均一に行われ、同時再現性の優れた体液成分測定用試薬を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は酵素反応を利用して体液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定するための試薬において、前記試薬中に基質１ｍＭあたり１〜３級または高級アルコールが０．０１〜１０Ｍ共存されていることを特徴とするγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬である。
また、前記基質がγ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドである体液成分測定用試薬である。
さらにまた、１〜３級または高級アルコールが糖、糖類似体またはグリセリン系物質であるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬である。
【０００７】
本発明において、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ反応を均一化するために試薬中に１〜３級または高級アルコールを添加する。１〜３級または高級アルコールとしては、具体的には糖、糖類似体、グリセリン系化合物およびそれら由来の界面活性剤が挙げられる。
このような糖としては、単糖類、ホモ・ヘテロ多糖類、細胞壁多糖類、アミノ糖等があり、糖類似体としてはアスパルテーム、Ｄ−キシロース、Ｄ−ソルビトール液等がある。またグリセリン系物質としてはグリセリン、グリセリンアルデヒド、グリセリンホスホリルコリン、グリセリンホスホリルエタノールアミン等が挙げられる。さらにまた界面活性剤としてはアルキルグリコシド、アルキルエチルグリコシド、糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、グリセリン脂肪酸エステル、アルコール脂肪酸エステル等がある。
【０００８】
これらの水酸基を有する親水性化合物を基質１ｍＭあたり０．０１〜１０Ｍ試薬中に共存させる。より好ましくは試薬中に０．０１〜１Ｍ共存させる。０．０１Ｍより添加濃度が低いと酵素反応にバラツキがみられ、１０Ｍ以上になると粘度が高くなり扱いにくくなるので好ましくない。
【０００９】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性を測定するための試薬には、これと特異的に作用するための基質となるべき化合物、例えば、γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドなどを含む。そして、体液成分と上記基質との酵素反応を行わせ、これによる生成物を光学的に測定して目的成分量を求める。このため試薬中には酵素反応による生成物を光学的に定量するのに必要な補酵素、ペルオキシダーゼ、色原体などが含まれ、さらに酵素反応のｐＨ条件を調整するために緩衝液が適時含まれる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に述べる。
〔実施例１〕
安定剤として０〜１Ｍのサッカロースを用いて、下記の試薬を調製し、管理血清中のγ−ＧＴＰ活性値の測定を行った。
（第１試薬）
１９１．５ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
（第２試薬）
３０．６ｍＭ    γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド水溶液
０〜１Ｍ        サッカロース
管理血清（三光純薬製）８μｌに第１試薬３２０μｌを加え、３７℃で５分間予備加熱後、８０μｌの第２試薬を加えて攪拌し、３７℃で５分間の吸光度変化量（ΔＯＤ）を主波長４０５ｎｍ、副波長７００ｎｍの二波長で吸光度変化を測定し、演算により酵素活性値（ＩＵ／Ｌ）を求めた。測定は自動分析装置（日立７１５０）で行った。前記操作を同一血清について１０回測定し、低値および高値についての同時再現性を調べた。その結果を表１および表２に示す。
【００１１】
〔比較例１〕
ＪＳＣＣ勧告法の試薬規格に基づいて調製した試薬を用いて測定を行った。
（第１試薬）
１５３．０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
（第２試薬）
１５３．０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
３０．６ｍＭ  γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド水溶液
管理血清（三光純薬製）６μｌに第１試薬３２０μｌを加え、３７℃で５分間予備加熱後、８０μｌの第２試薬を加えて攪拌し、３７℃で５分間の吸光度変化量（ΔＯＤ）を主波長４０５ｎｍ、副波長７００ｎｍの二波長で吸光度変化を測定し、演算により酵素活性値（ＩＵ／Ｌ）を求めた。測定は自動分析装置（日立７１５０）で行った。前記操作を同一血清について１０回測定し、低値および高値についての同時再現性を調べた。その結果を表１および表２に示す。
【００１２】
【表１】
0003633118.tif 000002
【００１３】
【表２】
0003633118.tif 000003
【００１４】
サッカロースを添加した試薬はサッカロース無添加およびＪＳＣＣ勧告法に定める試薬を用いて測定を行った時に比べ、変動係数（ＣＶ）が良好であった。このため同時再現性は優れているといえる。
【００１５】
〔実施例２〕
安定剤として０．２５Ｍのサッカロースを用いて下記組成の試薬を調製して、下記方法で測定を行い試薬の直線性を検討した。
（第１試薬）
１９１．５ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
（第２試薬）
３０．６ｍＭ    γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド水溶液
０．２５Ｍ      サッカロース
管理血清（三光純薬製）８μｌに第１試薬３２０μｌを加え、３７℃で５分間予備加熱後、８０μｌの第２試薬を加えて攪拌し、３７℃で５分間、１２秒おきに波長４０５ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。測定は自動分析装置（日立７１５０）で行った。前記操作による測定を３回繰り返して行った。その結果を図１に示す。
【００１６】
〔比較例２〕
ＪＳＣＣ勧告法の試薬規格に基づいて調製した試薬を用いて、下記方法で測定を行い試薬の直線性を検討した。
（第１試薬）
１５３．０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
（第２試薬）
１５３．０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
３０．６ｍＭ    γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド水溶液
管理血清８μｌに第１試薬３２０μｌを加え、３７℃で５分間予備加熱後、８０μｌの第２試薬を加えて攪拌し、３７℃で５分間、１２秒おきに波長４０５ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。測定は自動分析装置（日立７１５０）で行った。前記操作二よる測定を３回繰り返して行った。その結果を図２に示す。
【００１７】
図１に示すようにサッカロースを添加した試薬を用いて吸光度を測定したものは時間の経過とともに反応が均一に進み、単位時間あたりの直線性（傾き）はほぼ一定であった。一方、図２に示すようにＪＳＣＣ勧告法に基づく試薬を用いて測定を行った場合、酵素反応が均一に行われず、吸光度にバラツキが見られ、単位時間あたりの直線性（傾き）は不安定であった。
【００１８】
〔実施例３〕
安定剤として０．０１Ｍのエチレングリコール又はプロピレングリコールを用いて下記の試薬を調製し、管理血清のγ−ＧＴＰ活性の測定を行った。なお、測定は実施例１と同様な方法を用いて行った。その結果を表３に示す。
（第１試薬）
１９１．５ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ７．９
（第２試薬）
３０．６ｍＭ    γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド水溶液
０．０１Ｍ      エチレングリコールまたはプロピレングリコール
【００１９】
【表３】
0003633118.tif 000004
【００２０】
表３からもＪＳＣＣ勧告法を用いて測定した試薬に比べ、エチレングリコールやプロピレングリコールなどの親水性化合物を添加した試薬は変動係数（ＣＶ）が良好であった。
【００２１】
〔参考例１〕
安定剤として０〜０．５Ｍのサッカロースを用い、下記組成の試薬を調製し、下記方法で管理血清中の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性値を測定した。
（第１試薬）
０．３６８ｍＭ  ＮＡＤＨ
５０ｍＭ        リン酸緩衝液
（第２試薬）
２．７６ｍＭ    ピルビン酸ナトリウム
５０ｍＭ        リン酸緩衝液
０〜０．５Ｍ    サッカロース
検体はブタ筋肉由来ＬＤＨ（ベーリンガー製）を０．１％ＢＳＡ溶液で希釈調整した酵素含有測定検体Ａ，Ｂと管理血清（三光純薬製）を用いた。この検体８μｌに第１試薬２５０μｌを加え、３７℃で５分間予備加熱後、１２５μｌの第２試薬を加えて攪拌し、３７℃で５分間の吸光度変化量（ΔＯＤ）を主波長４０５ｎｍ、副波長７００ｎｍの二波長で吸光度変化を測定し、演算により酵素活性値（ＩＵ／Ｌ）を求めた。測定は自動分析装置（日立７１５０）で行った。前記操作を同一検体について３回測定し同時再現性を調べた。その結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
0003633118.tif 000005
【００２３】
乳酸脱水素酵素測定用試薬を用いた測定においてもサッカロースを添加したものは標準偏差（ＳＤ）が低値に抑えられ、反応が均一に進んでいた。
【００２４】
【発明の効果】
本発明の試薬を用いて測定を行えば、従来、不安定だった酵素反応を均一に行うことができるため、測定値の同時再現性が優れ、安定した酵素活性値が得られる。このため、体液中の目的成分、γ―グルタミルトランスペプチダーゼ活性を正確に測定することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２のサッカロース添加試薬の吸光度と反応経過時間の関係を示す。
【図２】比較例２の従来法に基づく試薬の吸光度と反応経過時間の関係を示す。
【図１】
0003633118.tif 000006
【図２】
0003633118.tif 000007