(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ポックスウイルス源からの外因性ＤＮＡを含む組換え鶏痘ウイルスであって、
鶏痘ウイルスに属する親株に由来し、孵化鶏卵での約５０回の連続継代、それに続くニワトリ胚繊維芽細胞での約２５回の連続継代、マスターウイルス種の４回の連続プラーク精製、および初代ＣＥＦ細胞での増幅によって弱毒化された鶏痘ウイルスであるＴＲＯＶＡＣを含み、
前記非ポックスウイルス源が、狂犬病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシへルペスウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ハンターンウイルス、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、鳥類インフルエンザウイルス、ムンプスウイルスおよびニューカッスル病ウイルスからなる群より選択されることを特徴とする組換え鶏痘ウイルス。
【請求項２】
前記非ポックスウイルス源が鳥類インフルエンザウイルスであるところの、ｖＦＰ８９、ｖＦＰ９２、ｖＦＰ１００またはｖＦＰ１２２であることを特徴とする請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。
【請求項３】
前記非ポックスウイルス源がヒト免疫不全ウイルスであるところの、ｖＦＰ６２、ｖＦＰ６３またはｖＦＰ１７４であることを特徴とする請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。
【請求項４】
前記非ポックスウイルス源がニューカッスル病ウイルスであるところのｖＦＰ９６であることを特徴とする請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、1991年 3月 7日に出願した出願番号第07/666,056号の一部継続出願である、1991年 6月11日に出願した出願番号第07/713,967号のさらなる一部継続出願であり、その出願の両方をここに参照文献として含む。また、米国特許継続出願である、1991年 6月14日に出願した出願番号第715,921 号、1991年 7月26日に出願した出願番号第736,254 号、1991年10月22日に出願した出願番号第776,867 号、および1992年 1月13日に出願した出願番号第820,077 号についても言及し、これら全てをここに参照文献として含む。
【０００２】
産業上の利用分野
本発明は改変ポックスウイルス、およびその産生方法、並びにその使用方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、様々な病原体に対して防御する安全免疫運搬体として使用する異種遺伝子の挿入と発現のための改良ベクターに関するものである。
【背景技術】
【０００３】
この出願においていくつかの刊行物を参照する。請求の範囲の直前で明細書の後に、または刊行物と記載されているところに、これらの参照文献を完全に列挙する；これら刊行物のそれぞれをここに参照文献として含む。これらの刊行物は、本発明が属する従来技術に関する。
【０００４】
発  明  の  背  景
ワクシニアウイルスおよびさらに近年の他のポックスウイルスは、異種遺伝子の挿入と発現に用いられている。異種遺伝子の生感染ポックスウイルスへの挿入の基礎技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素を側腹に有するポックスＤＮＡ配列と救助（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ポックスウイルス中に存在する相同配列との間の組換えを含む（ピッチーニら、1987）。
【０００５】
具体的には、組換えポックスウイルスは従来技術において知られ、特許文献１から３に記載のワクシニアウイルスの合成組換え体の産生方法と類似した２工程で構築され、これらの開示をここに参照文献として含む。この点において、1990年 6月14日に出願された米国特許継続出願第537,890 号についても言及し、ここに参照文献として含む。
【０００６】
第一に、ウイルス、特に非ポックス源からの読取り枠に挿入されるＤＮＡ遺伝子配列は、ポックスウイルスのＤＮＡ部分に相同なＤＮＡが挿入されるＥ．ｃｏｌｉプラスミド構成中に配される。それとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列は、プロモーターに繋げられる。プロモーター遺伝子連結は、非必須座を含有するポックスＤＮＡの領域を側腹に有するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡにより両端の側腹にあるように、プラスミド構築体中に位置せしめられる。生成したプラスミド構築体を次いでＥ．ｃｏｌｉ細菌において増殖により増幅させ（クレウェル、1972）、単離する（クレウェルら、1969；マニアチスら、1982）。
【０００７】
第二に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、培養細胞、例えば鶏胚繊維芽細胞中にポックスウイルスとともにトランスフェクションせしめる。プラスミド中の相同ポックスＤＮＡとウイルスのゲノムとの間の組換えにより、ゲノムの非必須領域中の異種ＤＮＡ配列の存在により改変されたポックスウイルスが得られる。「異種」ＤＮＡという用語は、外因性のＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡを示し、これは、外因性ＤＮＡが配されるゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコードする。
【０００８】
遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鎖の間の相同切片の交換である。あるウイルスにおいてはＲＮＡがＤＮＡを置換する。核酸の相同切片は、ヌクレオチド塩基の同一配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の切片である。
【０００９】
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウイルスゲノムの複製中または製造中に自然に行なわれる。それゆえ、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウイルスまたは他の遺伝子構造に共感染せしめられる宿主細胞中に生じるウイルス複製周期中で行なわれる。第１のゲノムからのＤＮＡの切片は、ＤＮＡが第１のウイルスゲノムの切片と相同である第２の共感染ウイルスのゲノムの切片を交換可能に構築する際に用いられる。
【００１０】
しかしながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの切片間にも行なわれる。そのような切片の１つが、例えば、相同ＤＮＡの部分中に挿入される抗原決定因子をコードする遺伝子または遺伝子マーカーの第１の切片内の存在を除いた別のゲノムの切片と相同な第１のゲノムからのものである場合、組換えがまた行なわれ、次いでその組換えの産生物は組換えウイルスゲノム中の遺伝子または遺伝子マーカーの存在により検知できる。
【００１１】
改変感染ウイルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の一連の発現には２つの条件が必要である。第１に、改変ウイルスが生存可能であるように、挿入はウイルスの非必須領域中で行なわなければならない。挿入ＤＮＡの発現の第２の条件は、挿入ＤＮＡに対して適切な関係二にあるプロモーターの存在である。プロモーターは発現されるＤＮＡは配列から上流に位置するように配されなければならない。
【００１２】
ワクシニアウイルスは、1980年に天然痘の世界規模での撲滅となった天然痘に対する免疫にうまく用いられた。その歴史において、多くのワクシニアの菌株が生じた。これらの異なる菌株は、変化する免疫抗原性を示し、潜在的な複雑さとともに変化する程度に関係し、その最も重大なのは、ワクチン後の脳炎と全身性痘疱である（ベーベハニ、1983）。
【００１３】
天然痘の撲滅に関して、異種遺伝子を発現する遺伝子操作したベクターという、ワクシニアの新たな役割が重要となった。非常に多くの非相同抗原をコードする遺伝子は、ワクシニア中に発現され、しばしば対応病原による抗原投与に対する防御免疫となってきた（タータグリアら、1990ａに記載されている）。
【００１４】
ワクシニアベクターの遺伝子の背景は、発現された異種免疫原の防御効果に影響することが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのイエスワクチン菌株内のエプステインバーウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０の発現は、ＥＢＶウイルス誘発リンパ種に対するコットントップタマリンス（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎｓ）を防御せず、一方ワクシニアウイルスのＷＲ研究所菌株中の同一の遺伝子の発現は防御性であった（モルガンら、1988）。
【００１５】
ワクシニアウイルスベースの組換えワクチン候補の効能と安全性との間の優れたバランスが特に重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種した動物中で棒業免疫応答を引き出すが、いかなる著しい病原特性も欠如するように免疫原を提供しなければならない。それゆえ、ベクター菌株の弱毒化は技術の現在の状態では非常に望ましい進歩である。
【００１６】
組織培養におけるウイルス増殖に非必須であり、その欠損または不活性化が様々な動物系における毒性を低減する多くのワクシニア遺伝子が同定されている。
【００１７】
ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子が、地図作成され（フルビーら、1982）、配列せしめられている（フルビーら、1983；ウィアーら、1983）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完全な欠損は、組織培養中の様々な細胞中のワクシニアウイルスの増殖を妨げない。ＴＫ- ワクシニアウイルスはまた、様々な経路により様々な宿主中の接種部位で生体内複製を行なうことができる。
【００１８】
２型単純ヘルペスウイルスに関して、モルモットのＴＫ- ウイルスの腟内接種は、ＴＫ+ ウイルスを接種したよりも、脊髄中で著しく低いウイルス力価となったことが示された（スタンベリーら、1985）。生体外でＴＫ活性をコードしたヘルペスウイルスは、活性で代謝している細胞におけるウイルスの増殖には重要ではないが、静止状態の細胞中のウイルスの増殖には必要であったことが説明されている（ジェイミーソンら、1974）。
【００１９】
ＴＫ- ワクシニアの弱毒化が、大脳内経路と腹腔内経路により接種したマウス中に示された（ブラーら、1985）。ＷＲ神経毒性研究所菌株とイエスワクチン菌株の両者に関して弱毒化が観察された。皮内経路により接種したマウス中で、ＴＫ- 組換えワクシニアは、親のＴＫ+ ワクシニアウイルスと比較して等量の抗ワクシニア中和抗体を産生し、この試験系において、ＴＫ機能の損失によりワクシニアウイルスベクターの免疫抗原性を著しくは減少しないことを示した。マウスにＴＫ- とＴＫ+ 組換えワクシニアウイルス（ＷＲ菌株）を鼻腔内接種することに続いて、脳を含む、他の位置へのウイルスの内転移はそれほど著しくは発見されなかった（テイラーら、1991ａ）。
【００２０】
ヌクレオチドの代謝に関わる別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。巨大サブユニットをコードする遺伝子の欠損により単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）中のウイルス性にコードしたリボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は、生体外の細胞の分裂におけるＤＮＡ合成とウイルスの増殖には効果がないことが示され、ウイルスの血清欠乏細胞での増殖能力を著しく損なった（ゴールドスタインら、1988）。眼の急性ＨＳＶ感染と三又神経節内の再活性化可能潜伏感染のマウスモデルを使用した場合、野生型ＨＳＶにより示された毒性と比較して、リボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの欠損したＨＳＶに関して、毒性が減少したことが示された（ジェイコブソンら、1989）。
【００２１】
リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニット（スラボーグら、1988）と巨大ユニット（シュミットら、1988）の両方は、ワクシニアウイルス中で同定される。ワクシニアウイルスのＷＲ菌株中のリボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの挿入不活性化により、マウスの頭蓋内接種により測定されたようなウイルスの弱毒化となる（チャイルドら、1990）。
【００２２】
ワクシニアウイルス血球凝集素遺伝子（ＨＡ）を遺伝子地図作成し、配列した（シダ、1986）。ワクシニア憂いするのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖に非必須である（イチハシら、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活性化することにより、頭蓋内経路により接種した家ウサギ中の神経毒性を減少せしめ、皮内接種の部位での家ウサギの病巣をより小さくする（シダら、1988）。ＷＲ菌株中の異種遺伝子の挿入（シダら、1987）、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株（グオら、1989）とリスター菌株（シダら、1988）の誘導にＨＡ座を用いた。異種遺伝子を発現する組換えＨＡ- ワクシニアウイルスは、免疫抗原性であり（グオら、1989；イタムラら、1990；シダら、1988；シダら、1987）、関連病原による抗原投与に対して防御性である（グオら、1989；シダら、1987）ことが示された。
【００２３】
牛痘（ブリントンレッド菌株）は、鶏の卵の絨毛尿膜上に赤い（出血性）痘疹を生じる。牛痘ゲノム内の自発的な欠損により、白色痘疹を生じる変異体を産生する（ピカップら、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によりコードされた３８ｋＤａタンパク質まで遺伝子地図を作成した（ピカップら、1986）。セリンプロテアーゼ抑制因子に対して相同性を有するこの遺伝子は、牛痘に対する宿主炎症反応を抑制することが示され（パランボら、1989）、血液凝固の抑制因子である。
【００２４】
ｕ遺伝子はワクシニアウイルスのＷＲ菌株中に存在する（コトワルら、1989ｂ）。ｕ領域が異種遺伝子の挿入により不活性化せしめられたＷＲワクシニアウイルス組換え体を接種したマウスは、ｕ遺伝子が完全である同様の組換えワクシニアウイルスを接種したマウスと比較して、異種遺伝子産生物に対して高い水準で抗体を産生する（ゾーら、1990）。ｕ領域はワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株中に欠損可欠形状で存在する（ゲーベルら、1990ａ、ｂに報告されている用語法による読取り枠Ｂ１３とＢ１４）。
【００２５】
牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）中の感染細胞内に制限される（カトウら、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への内転移中の牛痘ウイルスビリオンの防御であると考えられる（バーゴインら、1971）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は、ＡＴＩボディのマトリックスを形成する１６０ｋＤａタンパク質をコードする（フナハシら、1988；パテルら、1987）。ゲノム中に相同領域を含有するけれどもワクシニアウイルスは一般的にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ菌株において、ゲノムのＡＴＯ領域は９４ｋＤａタンパク質として翻訳される（パテルら、1988）。ワクシニアウイルスのコンハーゲン菌株において、ＡＴＩ領域に対応するＤＮＡ配列のほとんどは欠損し、ＡＴＩ領域から上流の配列と融合した領域の残りの３′末端は読取り枠（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成する（ゴーベルら、1990ａ、ｂ）。
【００２６】
様々な自発的で（アルテンバーガーら、1989；ドリリアンら、1981；ライら、1989；モスら、1981；パエズら、1985；パニカリら、1981）操作された（パーカスら、1991；パーカスら、1991；パーカスら、1986）欠損がワクシニアウイルスゲノムの左末端に近くに報告されている。１０ｋｂ自発欠損したワクシニアウイルスのＷＲ菌株（モスら、1981；パニカリら、1981）が、マウスの頭蓋内接種により弱毒化されたことが示された（ブラーら、1985）。この欠損は後に１７の潜在的なＯＲＦを含むことが示された（コトワルら、1988ｂ）。欠損領域内の特異的遺伝子は、ビロキンＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質を含有する（ゲーベルら、1990ａ、ｂに報告された用語法によるＣ３Ｌ）。Ｎ１Ｌの挿入不活性化は、通常のマウスと裸のマウスの両方の頭蓋内接種により毒性を低減せしめる（コトワルら、1989ａ）。３５ｋＤａタンパク質は、Ｎ１Ｌのようにワクシニアウイルス感染細胞の培地中に分泌される。このタンパク質は、補体対照タンパク質、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）の類に対する相同性を含有する（コトワルら、1988ａ）。細胞Ｃ４ｂｐのように、ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は補体の４番目の成分と結合し、典型的な補体カスケードを抑制する（コトワルら、1990）。それゆえ、ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は、ウイルスが宿主防御機構を避けるのを助けるのに巻き込まれると思われる。
【００２７】
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子、Ｋ１Ｌ（ギラードら、1986）およびＣ７Ｌ（パーカスら、1990）と同定された２つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子の両方を欠損すると、ワクシニアウイルスの様々なヒト細胞株において増殖する能力を低減せしめる（パーカスら、1990）。
【００２８】
鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス類のアビポックス属の基本型ウイルスである。ウイルスは、弱毒化ワクチンの使用により1920年台から良好に制御されているかきんの経済的に重要な病気を生じる。アビポックスウイルスの複製は、アビアン種に制限されており（マチュース、1982ｂ）、人類を含む非アビアン種における生産的な感染を生じるウイルスの文献には報告されていない。この宿主制限は、ウイルスの他の種への伝染に対する固有の安全バリアを提供し、かきんにおけるワクチンベクターとしてＦＰＶを使用して魅力的な提案とする。
【００２９】
ＦＰＶは好ましくはかきん病原からの抗原を発現するベクターとして用いられている。毒性アビアンインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質はＦＰＶ組換え体中で発現された（テイラーら、1988ａ）。組換え体の鶏と七面鳥への接種後、相同または非相同毒性インフルエンザウイルス抗原投与のいずれかに対して防御的である免疫応答が誘発された（テイラーら、1988ａ）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換え体もまた発達せしめられた（テイラーら、1990；エドバウアーら、1990）。
【００３０】
弱毒化ベクターワクチンの使用は、多くの潜在的な長所を示す。ワクチンは製造するのに高価ではなく、多くのかきん病原は潜在的には１つのベクター中に含まれる。免疫原は、液性および細胞性免疫応答が引き起こせるような確実な方法で免疫システムに提供される。病気剤は複製していないので、ワクチン接種の側面効果は最小限であり、病気剤の環境への連続的な再導入は除かれる。
【００３１】
安全性が高められた新たなワクチン菌株を提供することが現在の技術状態よりも非常に望ましい進歩であることが理解できる。例えば、ウイルスによる遺伝子の発現からのより安全なワクチンまたはより安全な産生物を提供するためである。
【特許文献１】米国特許第4,769,330号明細書
【特許文献２】米国特許第4,772,848号明細書
【特許文献３】米国特許第4,603,112号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
発  明  の  目  的
それゆえ本発明の目的は、安全性が高められた改変組換えウイルスを提供することにあり、さらにそのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して安全性の水準が高められた組換えポックスウイルスワクチンを提供することにある。
【００３４】
さらに本発明の目的は、宿主中に遺伝子産生物を発現する改変ベクターであって、宿主中で毒性が弱毒化されるように改変されているベクターを提供することにある。
【００３５】
本発明のもう一つの目的は、安全性の水準が高められた改変ベクターまたは改変組換えウイルスを用いて生体外培養細胞において遺伝子産生物を発現する方法を提供することにある。本発明のこれらと他の目的並びに利点は、以下の検討後には容易に明確となる。
【課題を解決するための手段】
【００３６】
発  明  の  記  載
本発明は、組換えウイルスの毒性が弱毒化され、安全性が高められるようにウイルスコード遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスに関するものである。この機能は、非必須であっても、または毒性に関連であってもよい。ウイルスは好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。
【００３７】
本発明は、ワクチン接種した宿主動物中に免疫応答を誘発するワクチンに関し、このワクチンは組換えウイルスが毒性が弱毒化され、安全性が高められるように非必須ウイルスコード遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスおよび担体を含む。本発明によるワクチンに用いられるウイルスは好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。
【００３８】
本発明は、組換えウイルスの毒性が弱毒化され安全性が高められるように非必須ウイルスコード遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスを含有する免疫原組成物に関するものである。改変組換えウイルスは、ウイルスゲノムの非必須領域内に、病原から誘導された抗原タンパク質をコードする非相同ＤＮＡ配列を含有する。このとき組成物は、宿主に施された場合、病原によりコードされたタンパク質に特異的な免疫応答を誘発できる。
【００３９】
さらに本発明は、毒性が弱毒化され安全性が高められた改変組換えウイルスを細胞中に導入することにより生体外培養細胞において遺伝子産生物を発現する方法に関するものである。
【００４０】
さらに本発明は、ウイルスの毒性が弱毒化されるように非必須ウイルスコード遺伝子機能が不活性化された改変組換えウイルスに関し、この改変組換えウイルスはさらに、ウイルスゲノムの非必須領域中に非相同源からのＤＮＡを含有する。特に、遺伝子機能は、毒性因子をコードする読取り枠を欠損せしめることにより、または宿主制限ウイルスを自然に用いることにより不活性化せしめられる。本発明により用いられるウイルスは、好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。好ましくは、その読取り枠は、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌからなる群より選択される（ゲーベルら、1990ａ、ｂに報告された用語法による）。この点に関して、読取り枠は、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域または巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼからなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下の詳細な記載は、実施例として与えられたものであり、本発明を記載した特定の実施態様に制限するものではなく、添付した図面とともに理解されよう。
【００４２】
第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を模式的に示すものである。
【００４３】
第２図は、出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示すものである。
【００４４】
第３図は、ＡＴＩ領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４９４Δの構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８の産生方法を模式的に示すものである。
【００４５】
第４図は、血球凝集素の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示すものである。
【００４６】
第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を模式的に示すものである。
【００４７】
第６図は、巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼの欠損したプラスミドｐＳＤ５４８の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８８６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を模式的に示すものである。
【００４８】
第７図は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をＴＫ欠損座中に挿入したプラスミドｐＲＷ８４２の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９の産生方法を模式的に示すものである。
【００４９】
第８図は、ＥＢＶトリプル１プラスミド中に挿入されたＥＢＶコード領域の遺伝子地図である。
【００５０】
第９図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１４）を有する改変合成ワクシニアウイルスＨ６初期／晩期プロモーターおよび合成ｓｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１３）を示すものである。
【００５１】
第１０図は、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６の構築方法を模式的に示すものである。
【００５２】
第１１図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１６）を有するｕプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１５）を示すものである。
【００５３】
第１２図は、組換えワクシニアウイルスｖＰ８９６の構築方法を模式的に示すものである。
【００５４】
第１３図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１７）を有するＩ３Ｌプロモーター／Ｓ１２／コア遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号８７）を示すものである。
【００５５】
第１４図は、組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９の構築方法を模式的に示すものである。
【００５６】
第１５図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１９）を有するＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１８）を示すものである。
【００５７】
第１６図は、Ｃ５  ＯＲＦを含有するカナリヤポックスＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列（配列認識番号２１７）を示すものである。
【００５８】
第１７図は、組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築方法を模式的に示すものである。
【００５９】
第１８図は、ワクシニアウイルスｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に挿入されるＪＥＶコード領域の模式図である。
【００６０】
第１９図は、ワクシニアウイルスｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７２９およびｖＰ７２５に挿入されるＹＦコード領域の模式図である。
【００６１】
第２０図は、ワクシニアウイルスｖＰ８６７、ｖＰ９６２およびｖＰ９５５に挿入されるＤＥＮコード領域の模式図である。
【００６２】
第２１図は、Ｆ８  ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ  ＤＮＡの３６６１塩基対断片のヌクレオチド配列（配列認識番号２２１）を示すものである。
【００６３】
第２２図は、Ｆ７  ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ  ＤＮＡの２３５６塩基対断片のＤＮＡ配列（配列認識番号２２２）を示すものである。
【００６４】
第２３図は、ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）のヌクレオチド配列（配列認識番号２７９）を示すものである。
【００６５】
第２４図は、ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ２／フォンテンブルー／７９）のヌクレオチド配列（配列認識番号２８４）を示すものである。
【００６６】
第２５図は、ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ２／サフォーク／８９）のヌクレオチド配列（配列認識番号３００）を示すものである。
【００６７】
第２６図は、ＦｅＬＶ−Ｂエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号３１０）を示すものである。
【００６８】
第２７図は、ＦｅＬＶ−Ａｑａｑおよび部分的ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号３２４）を示すものである。
【００６９】
第２８図は、ＦＨＶ−１ＣＯ菌株ｇＳホモログ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号２９０）を示すものである。
【００７０】
第２９図は、ｐＵＲＦ３により表されるコンセンサスＦヌクレオチド配列（おたふくかぜ）（配列認識番号３７０）を示すものである。
【００７１】
第３０図は、ｐＵＨＮ５により表されるコンセンサスＨＮヌクレオチド配列（おたふくかぜ）（配列認識番号３７１）を示すものである。
【００７２】
第３１図は、ワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスベクター（ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ）もしくはＨＩＶ  ＩＩＩ  Ｂ  ｅｎｖを発現するワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルス（ｖＰ９１１、ｖＤＰ１１２）で免疫した、マウスの脾臓細胞の細胞傷害性応答を示すものである。
【００７３】
第３２図は、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞表面抗原Ｔｈｙ１．２およびＬｙｔ２．２に対する抗体に対してのｖＣＰ１１２で免疫したマウスの脾臓からの細胞傷害性作動体細胞の感度を示すものである。
【００７４】
第３３図は、ｇｐ１２０のＨＩＶ  ＩＩＩ  Ｂ超可変Ｖ３ループのであって、ＨＩＶ  ＭＮまたはＳＦ２のＶ３ループのではない細胞傷害性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を示すものである。
【００７５】
第３４図は、ベクター（ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ）またはワクシニアウイルス組換え体ｖＰ９１１またはＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現するカナリヤポックス組換え体ｖＣＰ１２で免疫したマウスのＨＩＶ  ＩＩＩ  Ｂ  ｇｐ１２０に対する抗体応答を示すものである（逆三角は、２回目の接種を施した時間を示す）。
【００７６】
第３５図は、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであって、同一のワクチンまたは交互のワクチンで事前に免疫した志願者にＨＤＣおよびｖＣＰ６５を追加抗原投与した効果（１０5.5 ＴＣＩＤ50）を示すものである（ワクチンは０、２８および１８０日目に与え、抗体力価は０、７、２８、３５、５６、１７３、１８７および２０８日に測定した）。
【００７７】
第３６図は、ｖＰ９０８、ｖＰ５５５、ｖＰ９２３およびｖＰ８２９中に含有せしめられたＪＥＶ  ｃＤＮＡ配列を示すものである。
【００７８】
第３７図は、０日と２８日にｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８６６およびＰＢＳで免疫したブタに観察されたＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性を示すものである（矢印は接種の日を示す）。
【００７９】
第３８図は、ＰＢＳ、ｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で免疫し、ＪＥＶのＢ−２３５８／８４菌株で抗原投与した各群の個々のブタに検出したウイルス血症の時間の経過を示すものである。
【００８０】
第３９図は、ＮＹＶＡＣを産生するのに欠損したＯＲＦを模式的に示したものである。
【００８１】
発明の詳細な説明
新たなワクシニアワクチン菌株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン菌株を、既知のまたは潜在的な毒性因子をコードするゲノムの６つの非必須領域を欠損せしめることにより改変した。この配列欠損は以下に詳細に示す。ワクシニア制限断片、読取り枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、ゲーベルら、1990ａ、ｂに報告された用語法に基づくものである。
【００８２】
欠損座はまた、異種遺伝子の挿入の受容体座として作成された。
【００８３】
ＮＹＶＡＣ中の欠損領域を以下に示す。また、短縮型および欠損領域の読取り枠の名称（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）並びに下記に特性される全ての欠損を含むワクシニア組換え体（ｖＰ）の名称も記載する：
(1) チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
(2) 出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
(3) Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
(4) 血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
(5) 宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；
(6) 巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
【００８４】
ＤＮＡクローニングおよび合成
プラスミドを構築し、スクリーニングして、標準方法により増殖せしめた（マニアチスら、1982；パーカスら、1985；ピッチーニら、1987）。制限エンドグルカナーゼを、ＭＤ、ゲセルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ；ＭＡ、ビバーリー、ニューイングランドバイオラボ；およびＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片を、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４  ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。様々な供給者により明示された試薬を用いた。
【００８５】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述のようにバイオサーチ８７５０または応用バイオシステム３８０Ｂ
ＤＮＡシンセサイザーで調製した（パーカスら、1989）。前述したように（グオら、1989）シーケナーゼを用いて（タボアら、1987）、ジデオキシ鎖終了法（サンガーら、1977）によりＤＮＡ塩基配列決定を行なった。自動パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー中で、注文合成オリゴヌクレオチドプライマーとジェネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（ＣＴ、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、配列確認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（エンゲルケら、1988）を行なった。制限エンドヌクレアーゼ切断および続いてのＢＡＬ−１３エキソヌクレアーゼによる制限切断並びに合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）によりプラスミドから過剰のＤＮＡ配列を欠損せしめた。
【００８６】
細胞、ウイルス、およびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株の培養の起源と条件は以前に記載した（グオら、1989）。ニトロセルロースフィルターの現場での雑種形成、組換え、およびＢ−ガラクトシダーゼ活性のスクリーニングによる組換えウイルスの産生は以前に記載している（パニカリら、1982；パーカスら、1989）。
【００８７】
説明のために示した以下の実施例により、本発明および多くの利点がよりよく理解されるであろう。
【実施例１】
【００８８】
チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構築
ここで第１図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０６はｐＵＣ８中にクローンされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含有している。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄＩＩＩとＰｖｕＩＩで切断し、ｐＵＣ８中にクローンされたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊの左側からの１．７ｋｂ断片をＨｉｎｄ／ＳｍａＩで切断し、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒの完全な遺伝子を含有している（位置８３８５５−８４３８５）。開始コドンはＮｌａＩＩＩ部位内に含有され、終止コドンはＳｓｐＩ部位内に含有される。第１図の矢印により転写の方向を示す。
【００８９】
左側フランキングアームを得るために、０．８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、次いでＮｌａＩＩＩで切断し、０．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（配列認識番号１／配列認識番号２）
【化１】
0003624911.tif 000002
【００９０】
をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミド中で０．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｌａＩＩＩ断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４４９を産生した。
【００９１】
ワクシニア右側フランキングアームとｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を得るために、ワクシニア配列内のＳｓｐＩ（部分的）とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩでｐＳＤ４４７を切断し、２．９ｋｂベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（配列認識番号３／配列認識番号４）
【化２】
0003624911.tif 000003
【００９２】
と連結し、ｐＳＤ４５９を産生した。
【００９３】
左側と右側フランキングアームを１つのプラスミド中に結合させるために、０．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミドｐＳＤ４６０を産生した。ｐＳＤ４６０は、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン菌株ＶＣ−２との組換えの供与体プラスミドとして用いた。テンプレートととしてのＭＰＳＹＮ４５（配列認識番号３）とプライマーとしての相補的２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列認識番号５）（５′ＴＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３′）を用いたプライマー延長により32Ｐ標識プローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０をプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
【実施例２】
【００９４】
出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構築（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４）
ここで第２図を参照する。プラスミドｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローンされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置１６０，７４４−１７３，３５１）を含有している。ｐＳＤ４２２はｐＵＣ８中にクローンされた、右側への隣接ワクシニアＳａｌＩ断片、ＳａｌＩ  Ｊ（位置１７３，３５１−１８２，７４６）を含有している。出血性領域、ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３，５５２）の欠損したプラスミドを構築するために、左側フランキングアームの供給源としてｐＳＤ４１９を用い、右側フランキングアームの供給源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向を第２図の矢印で示す。
【００９５】
ｐＳＤ４１９からの不必要な配列を除去するために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩによりｐＳＤ４１９の切断によりＮｃｏＩ部位（位置１７２，２５３）の左側までの配列を除去し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片によるブラントエンド並びに連結を行ないプラスミドｐＳＤ４７６を産生した。Ｂ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａＩでのｐＳＤ４２２の切断と右側の０．３ｋｂのＮｒｕＩでの切断によりワクシニア右側フランキングアームを得た。この０．３ｋｂ断片を単離して、ｐＳＤ４７６から単離した３．４ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を産生した。ｐＳＤ４７７のワクシニアｕ領域の部分的な欠損位置を三角形により示す。ＣｌａＩ／ＨｐａＩでの切断により、ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒコード配列を除去し、生成したベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ２２ｍｅｒ／ＳＤ２０ｍｅｒ（配列認識番号６／配列認識番号７）
【化３】
0003624911.tif 000004
【００９６】
と連結し、ｐＳＤ４７９を産生した。ｐＳＤ４７９は開始コドン（下線）と続いてＢａｍＨＩ部位を含有している。ｕプロモーターの制御下でＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠損座中にＥ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを配するために、ベータガラクトシダーゼを含有する３．２ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位中に挿入し、ｐＳＤ４７９ＢＧを生成した。ｐＳＤ４７９ＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ４１０による組換えの供与体プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を、色素基体Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。ｖＰ５３３において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠損しており、ベータガラクトシダーゼにより置換されている。
【００９７】
ｖＰ５３３からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠損接合部には開始コドンを含有しないｐＳＤ４７７の誘導体、プラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に上述したｐＳＤ４７７からのＣｌａＩ／ＨｐａＩベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅｒ／ＳＤ４０ｍｅｒ（配列認識番号８／配列認識番号９）
【化４】
0003624911.tif 000005
【００９８】
と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生した。次に、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲＩでの切断によりｐＵＣ／ワクシニア接合でのＥｃｏＲＩ部位を破壊し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でのブラントエンド並びに連結を行ないプラスミドｐＳＤ４７８Ｅ- を産生した。ｐＳＤ４７８Ｅ- をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（配列認識番号１０／配列認識番号１１）
【化５】
0003624911.tif 000006
【００９９】
と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６を産生した。ｐＳＤ４８６を、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えのための供与体プラスミドとして用い、ｖＰ５５３を産生し、これをＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
【実施例３】
【０１００】
ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）の欠損したプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築
ここで第３図を参照する。ｐＳＤ４１４はｐＵＣ８中にクローニングされたＳａｌＩ  Ｂを含有している。Ａ２６Ｌ領域の左側の不必要なＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４１４を、ワクシニア配列内のＸｂａＩ（位置１７３，０７９）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドして連結し、プラスミドｐＳＤ４８３を産生した。Ａ２６Ｌ領域の右側の不必要なＤＮＡ配列を除去するために、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ（位置１４０，６６５およびｐＵＣ／ワクシニア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２６Ｌコード領域を除去するために、Ａ２６Ｌ  ＯＲＦからや上流のＮｄｅＩ（部分的）（位置１３９，００４）およびＡ２６Ｌ  ＯＲＦのやや下流のＨｐａＩ（位置１３７，８８９）で切断した。５．２ｋｂベクター断片を単離して、アニールした合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（配列認識番号１２／配列認識番号１３）
【化６】
0003624911.tif 000007
【０１０１】
と連結し、Ａ２６Ｌから上流の領域を再構築し、上記したようにＡ２６Ｌ  ＯＲＦを、制限部位ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを含有する短いポリリンカー領域と置換した。生成したプラスミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特有ではないので、ＢｇｌＩＩ（位置１４０，１３６）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩで切断により望ましくないＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位をプラスミドｐＳＤ４８３（上述）から除去し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンド並びに連結した。産生したプラスミドをｐＳＤ４８９と称した。Ａ２６Ｌ  ＯＲＦを含有するｐＳＤ４８９からの１．８ｋｂ  ＣｌａＩ（位置１３７，１９８）／ＥｃｏＲＶ（位置１３９，０４８）断片を、ｐＳＤ４８５からの対応０．７ｋｂポリリンカー含有ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置換してｐＳＤ４９２を産生した。ｐＳＤ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特有である。
【０１０２】
ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、1985；パーカスら、1990）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する３．３ｋｂ  ＢｇｌＩＩカセットをｐＳＤ４９２のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧは救助（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ウイルスｖＰ５５３との組換えに用いた。Ａ２６Ｌ欠損領域中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ５８１を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
【０１０３】
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からのベータガラクトシダーゼを除去したプラスミドを産生するために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（配列認識番号１４）
【化７】
0003624911.tif 000008
【０１０４】
を用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠損した。産生したプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいて、完全なＡ２６Ｌ  ＯＲＦを含有し、位置［１３７，８８９−１３８，９３７］を包含するワクシニアＤＮＡは欠損している。ｐＭＰ４９４Δとワクシニア組換え体、ｖＰ５８１を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体ｖＰ６１８を産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
【実施例４】
【０１０５】
血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構築
ここで第４図を参照する。ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限断片（位置１６０，７４４−１７３，３５１）はＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９）と交差している。ｐＳＤ４１９はｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇを含有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図に矢印で示す。ｐＳＤ４１９をワクシニア配列内とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｂから誘導したワクシニア配列を除去し、続いて連結した。産生したプラスミドｐＳＤ４５６は、左側の０．４ｋｂのワクシニア配列と右側の０．４ｋｂのワクシニア配列を側腹に有するＨＡ遺伝子、Ａ５６Ｒを含有している。ｐＳＤ４５６を、Ａ５６Ｒコード配列から上流のＲｓａＩ（部分的；位置１６１，０９０）、および遺伝子の末端近くのＥａｑＩ（位置１６２，９５４）で切断することによりＡ５６Ｒコード配列を除去した。ｐＳＤ４５６からの３．６ｋｂ  ＲｓａＩ／ＥａｑＩベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（配列認識番号１５）、ＭＰＳＹＮ６２（配列認識番号１６）、ＭＰＳＹＮ６０（配列認識番号１７）、およびＭＰＳＹＮ６１（配列認識番号１８）
【化８】
0003624911.tif 000009
【０１０６】
と連結し、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦから上流のＤＮＡ配列を再構築し、上記のごとく示したようにＡ５６Ｒ  ＯＲＦをポリリランカー領域で置換した。産生したプラスミドはｐＳＤ４６６である。ｐＳＤ４６６中のワクシニア欠損は、位置［１６１，１８５−１６２，０５３］を包含する。ｐＳＤ４６６中の欠損部位を第４図に三角形で示す。
【０１０７】
ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、1985；グオら、1989）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する３．２ｋｂ  ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ（部分的）カセットを、ｐＳＤ４６６のＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧは、救助ウイルスｖＰ６１８との組換えに用いた。Ａ５６Ｒ欠損中にベーカダラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ７０８を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
【０１０８】
供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ７０８から欠損した。ｐＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＧＩで切断することにより、ｐＵＣ／ワクシニア接合部からＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位を除去し、続いてＥ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、連結したことを除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同一である。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間の組換えにより、組換えワクシニア欠損変異体、ｖＰ７２３を産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとし単離した。
【実施例５】
【０１０９】
読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
ここで第５図を参照する。ｐＭＰＣＳＫ１Δの構築に、以下のワクシニアクローンを用いた。ｐＳＤ４２０はｐＵＣ８中にクローニングされたＳａｌＩ  Ｈである。ｐＳＤ４３５はｐＵＣ１８中にクローニングされたＫｐｎＩ  Ｆである。ｐＳＤ４３５をＳｐｈＩで切断し、再連結し、ｐＳＤ４５１を形成した。ｐＳＤ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ中のＳｐｈＩ部位（位置２７，４１６）の左側のＤＮＡ配列を除去する（パーカスら、1990）。ｐＳＤ４０９はｐＵＣ８中にクローニングされたＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍである。
【０１１０】
ワクシニアからの［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子クラスターの欠損した基体を提供するために、Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを以下のようにワクシニアＭ２Ｌ欠損座（グオら、1990）中に最初に挿入した。ｐＳＤ４０９のＢｇｌＩＩ部位を除去するために、ワクシニア配列のＢｇｌＩＩ（位置２８，２１２）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＢａｍＨＩで切断し、次いで連結し、プラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。ｐＭＰ４０９Ｂを特有ＳｐｈＩ部位（位置２７，４１６）で切断した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ８２（配列認識番号１９）
【化９】
0003624911.tif 000010
【０１１１】
を用いた突然変異誘発（グオら、1990；マンデッキ、1986）によりＭ２Ｌコード配列を除去した。産生したプラスミド、ｐＭＰ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠損座中に挿入された特有ＢｇｌＩＩ部位を含有した。１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、1985）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する３．２ｋｂ  ＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌＩＩカセットをＢｇｌＩＩで切断したｐＭＰ４０９Ｄ中に挿入した。産生したプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（グオら、1990）を救助ワクシニアウイルスｖＰ７２３により組換えの供与体プラスミドとして用いた。Ｍ２Ｌ欠損座中に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ７８４を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
【０１１２】
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドを、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ８中に組み入れ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドした。ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ配列からなる左側フランキングアームを、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置１８，６２８）で切断することにより得て、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドしてＢｇｌＩＩ（位置１９，７０６）で切断した。ｐＳＤ４５１をＢｇｌＩＩ（位置２９，０６２）とＥｃｏＲＶ（位置２９，７７８）で切断することにより、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ配列からなる右側フランキングアームを得た。産生したプラスミド、ｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｃ中のＢｇｌＩＩ部位（位置１９，７０６）とＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９，０６２）の間のワクシニア配列が欠損している。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠損部位を第５図に三角形で示す。
【０１１３】
ワクシニア欠損接合部の過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置１８，８１１；１９，６５５）で切断し、Ｂａｌ−３１エキソクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（配列認識番号２０）
【化１０】
0003624911.tif 000011
【０１１４】
を用いて突然変異誘発（マンデッキ、1986）を行なった。産生したプラスミド、ｐＭＰＣＳＫ１Δは、１２ワクシニア読取り枠［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含する、ワクシニア配列位置１８，８０５−２９，１０８が欠損している。ｐＭＰＣＳＫ１Δとワクシニア組換え体、ｖＰ７８４を含有するベーダラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体、ｖＰ８０４が産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
【実施例６】
【０１１５】
巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）の欠損したプラスミドｐＳＤ５４８の構築
ここで第６図を参照する。プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローンされたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉ（位置６３，８７５−７０，３６７）を含有している。ｐＳＤ４０５をワクシニア配列（位置６７，９３３）内のＥｃｏＲＶおよびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＳｍａＩで切断し、連結し、プラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５１８は、ｐＳＤ５４８の構築に用いる全てのワクシニア制限断片の供給源として用いた。
【０１１６】
ワクシニアＩ４Ｌ遺伝子は、位置６７，３７１−６５，０５９に亘り延びる。Ｉ４Ｌの転写方向を第６図の矢印で示した。Ｉ４Ｌコード配列の部分が欠損したベクタープラスミド断片を得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置６５，３８１）とＨｐａＩ（位置６７，００１）で切断し、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。この４．８ｋｂベクター断片を、ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレット、1985；パーカスら、1990）Ｅ．ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する３．２ｋｂ  ＳｍａＩカセットと連結し、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを産生した。ｐＳＤ５２４ＫＢＧは、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えの供与体プラスミドとして用いた。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分的欠損中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ８５５を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。
【０１１７】
ｖＰ８５５からのＩ４Ｌ  ＯＲＦの残りとベータガラクトシダーゼを欠損するために、欠損プラスミドｐＳＤ５４８を構築した。以下に示すように左側と右側のワクシニアフランキングアームをｐＵＣ８中で別々に組み立て、これを第６図に模式的に示した。
【０１１８】
左側ワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（配列認識番号２１／配列認識番号２２）
【化１１】
0003624911.tif 000012
【０１１９】
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分的）とＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８をＢｇｌＩＩ（位置６４，４５９）／ＲｓａＩ（位置６４，９９４）で切断し、０．５ｋｂ断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３７を形成した。このｐＳＤ５３７はＩ４Ｌコード配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有する。
【０１２０】
右側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（配列認識番号２３／配列認識番号２４）
【化１２】
0003624911.tif 000013
【０１２１】
と連結し、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断し、２．７ｋｂベクター断片を単離した。ｐＳＤ５１８を、ワクシニア配列内のＲｓａＩ（位置６７，４３６）およびワクシニア／ｐＵＣ接合部のＥｃｏＲＩで切断し、０．６ｋｂ断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３８を形成した。このｐＳＤ５３８はＩ４Ｌコード配列の右側の完全なワクシニアフランキングアームを含有する。
【０１２２】
ｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として右側ワクシニアフランキングアームを単離して、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで切断したｐＳＤ５３７ベクタープラスミド中に連結した。産生したプラスミド、ｐＳＤ５３９において、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ（位置６５，０４７−６７，３８６）は、全てｐＵＣバックグラウンドにおいて左側の０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡと右側に０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡを側腹に有するポリリンカー領域により置換される。ワクシニア配列内の欠損部位を第６図に三角形で示す。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５内のベータガラクトシダーゼ配列との潜在的な組換えを避けるために、ワクシニアＩ４Ｌ欠損カセットをｐＳＤ５３９から、全てのベータガラクトシダーゼ配列が除去されポリリンカー領域と置換されたｐＵＣ誘導体である、ｐＲＣ１１中にトランスフェクションした（コリナスら、1990）。ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断し、１．２ｋｂ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（２．３５ｋｂ）中に連結し、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とワクシニア組換え体、ｖＰ８５５を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えにより、ワクシニア欠損変異体ｖＰ８６６を産生し、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。
【０１２３】
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６からのＤＮＡを、制限切断と、続いてアガロースゲルでの電気泳動により分析した。制限模様は予期した通りであった。テンプレートとしてのｖＰ８６６と上述した６つの欠損座を側腹に有するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケら、1988）により、予期したサイズのＤＮＡ断片が産生された。欠損接合部の区域辺りのＰＣＲ産生断片の配列分析により、接合部が予期したものであることが確認された。上述したような６つの作成した欠損を含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６はワクシニアワクチン菌株「ＮＹＶＡＣ」と称した。
【実施例７】
【０１２４】
狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（テイラーら、1988ａ、ｂ）の制御下で遺伝子コード狂犬病糖タンパク質ＧをＴＫ欠損プラスミドｐＳＤ５１３中に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を除いてはプラスミドｐＳＤ４６０（第１図）と同一である。
【０１２５】
ここで第７図を参照する。ｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、プラスミドベクターをアニールした合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（配列認識番号２５／配列認識番号２６）
【化１３】
0003624911.tif 000014
【０１２６】
と連結することによりポリリンカー領域を挿入し、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成した。ｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をコードする遺伝子を含有するＳｍａＩ末端１．８ｋｂカセットと連結した（テイラーら、1988ａ、ｂ）。産生したプラスミドをｐＲＷ８４２と称する。ｐＲＷ８４２を、ＮＹＶＡＣ救助ウイルス（ｖＰ８６６）との組換えの供与体プラスミドとして用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇコード配列に対する32Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
【０１２７】
本発明の改変組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を提供する。ベクターの毒性が弱毒化したことにより、ワクチン接種した個体のワクチン接種により手に負えない（ｒｕｎａｗａｙ）感染の可能な機会が減少し、またワクチン接種した個体からワクチン接種していない個体への伝染または環境の汚染が減少する。
【０１２８】
改変組換えウイルスはまた好ましくは、細胞中の遺伝子産生物をコードし発現する異種ＤＮＡを有する改変組換えウイルスを細胞中に導入することにより、生体外で培養した細胞中に遺伝子産生物を発現する方法に用いられる。
【実施例８】
【０１２９】
ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素ノイラミニターゼ糖タンパク質と融合を発現するＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの構築
毒性ＮＤＶ菌株テキサスのＦおよびＨＮ遺伝子の両方を発現する鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）ベクターを構築した。産生した組換え体はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶと称した。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶは組換えウイルスに感染したアビアン細胞中の確実に処理したＮＤＶ糖タンパク質を発現し、生後１日のひなに接種することにより続いての毒性ＮＤＶ抗原投与に対して防御を与える。
【０１３０】
細胞およびウイルス
ＮＤＶのテキサス菌株は短潜伏期性菌株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローンの調製は前に記載してある（テイラーら、1990；エドバウアーら、1990）。ＦＰＶ選定ＦＰ−１の菌株は前に記載してある（テイラーら、1988ａ）。生後１日のひなのワクチン接種に有用なのは弱毒化ワクチン菌株である。親ウイルス菌株デュベッティは、鶏からの鶏痘かさぶたとしてフランスで得られた。ふ化鶏卵での約５０連続の継代接種と続いての鶏繊維芽細胞での約２５回の継代接種によりウイルスは弱毒化された。ウイルスに４連続のプラーク精製を施した。１つのプラーク単離体をさらに初代ＣＥＦ細胞中で増幅し、ＴＲＯＶＡＣと称する同種菌を作成した。ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを産生する生体内組換え試験に用いられる同種ウイルスに、プラーク単離体からの初代ＣＥＦ細胞中で１２回継代接種を施した。
【０１３１】
ＮＤＶ−Ｆのカセットの構築
Ｆタンパク質コード配列の５′末端からの２２ヌクレオチド以外の全てを含有する１．８ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ断片をｐＮＤＶ８１（テイラーら、1990）から切除し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ部位で挿入し、ｐＣＥ１３を形成した。ｐＣＥ１３をＳａｌＩで切断し、付着末端をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で充填し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、上述したワクシニアウイルスＨ６プロモーター（テイラーら、1988ａ、ｂ；グオら、1989；パーカスら、1989）をｐＣＥ１３中に挿入した。Ｈ６プロモーター配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＣＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３８を形成した。ｐＣＥ３８をＫｐｎＩとＮｒｕＩで切断し、アニールしキナーゼした（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴヌクレオチドＣＥ７５（配列認識番号２７）とＣＥ７６（配列認識番号２８）を挿入することにより完全な５′末端を産生し、ｐＣＥ４７を産生した。
【化１４】
0003624911.tif 000015
【０１３２】
ＮＤＶ−Ｆの３′末端から非コード配列を除去するために、ｐＣＥ１３からのＳｍａＩからＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩとＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＣＥ２３を形成した。ｐＣＥ２３のＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、エキソクレアーゼＩＩＩ、ＳＩヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩでの配列切断により、非コード配列を除去した。次いで、アニールし、キナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ４２（配列認識番号２９）およびＣＥ４２（配列認識番号３０）を挿入し、ｐＣＥ２９を形成した。
【化１５】
0003624911.tif 000016
【０１３３】
次いで、ｐＣＥ２９からのＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をｐＣＥ２０のＰｓｔＩとＳａｃＩ部位にクローニングすることにより、ＮＤＶ−Ｆ配列の３′末端を、すでにＮＤＶ−Ｆの５′末端を含有するプラスミドｐＣＥ２０に挿入し、ｐＣＥ３２を形成した。ｐＣＥ２０の産生は以前にテイラーら、1990に記載されている。
【０１３４】
ｐＣＥ４７中に含有されるＮＤＶ−Ｆ  ５′配列とＨ６プロモーターをｐＣＥ３２中に含有される３′ＮＤＶ−Ｆ配列と配列させるために、ｐＣＥ４７のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片を、ｐＣＥ３２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＣＥ４９を形成した。次いで、ｐＣＥ４９からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片まをｐＪＣＡ００２のＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩ部位（上述）中にクローニングすることにより、Ｈ６プロモートしたＮＤＶ−Ｆ配列を脱ＯＲＦした（ｄｅ−ＯＲＦｅｄ）Ｆ８座に転移せしめ、ｐＣＥ５４を形成した。ｐＣＥ５４をＳａｃＩで、部分的にＢａｍＨＩで切断し、アニールしキナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ１６６（配列認識番号３１）およびＣＥ１６７（配列認識番号３２）を挿入することにより、転写終止シグナルをｐＣＥ５４に挿入し、ｐＣＥ５８を産生した。
【化１６】
0003624911.tif 000017
【０１３５】
テンプレートとしてのｐＣＥ５４およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドＣＥ１８２（配列認識番号３３）とＣＥ１８３（配列認識番号３４）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより、ＮＤＶ−Ｆの完全３′末端を得た。
【化１７】
0003624911.tif 000018
【０１３６】
ＰＣＲ断片をＰｖｕＩＩとＨｐａＩＩで切断し、ＨｐａＩと部分的にＰｖｕＩＩで切断したｐＣＥ５８中にクローニングした。産生したプラスミドをｐＣＥ６４と称した。完全Ｈ６プロモーターとｐＣＥ６４からのＦコード配列を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＷ８４６のＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩ部位にクローニングすることにより、翻訳終止シグナルを挿入し、ＮＤＶ−Ｆの最終カセットであるｐＣＥ７１を産生した。プラスミドｐＲＷ８４６は実質的にプラスミドｐＪＣＡ００２（以下に記載）と等しいが、Ｈ６プロモーターおよび転写ならびに翻訳終止シグナルを含有する。ｐＲＷ８４６をＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断することによりＨ６プロモーターを除去するが、終止シグナルは完全に残す。
【０１３７】
ＮＤＶ−ＨＮのカセットの構築
プラスミドｐＲＷ８０２の構築はエドバウアーら、1990に記載している。このプラスミドはｐＵＣ９ベクター中にワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列を含有している。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５′末端を包含するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、ｐＲＷ８０２のＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐＲＷ８３０を形成した。アニールしキナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ１６２（配列認識番号３５）およびＣＥ１６３（配列認識番号３６）をｐＲＷ８３０のＥｃｏＲＩ部位中に挿入することによりＮＤＶ−ＨＮの３′末端を得て、ＮＤＶ−ＨＮの最終カセットであるｐＣＥ５９を形成した。
【化１８】
0003624911.tif 000019
【０１３８】
ＦＰＶ挿入ベクターの構築
プラスミドｐＲＷ７３１−１５はゲノムＤＮＡからクローニングされた１０ｋｂ  ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を含有している。３６６０ｂｐ  ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両鎖についてヌクレオチド配列を決定した。ここにＦ８として示した読取り枠の制限を決定した。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐ  ＥｃｏＲＶ断片を含有するｐＲＷ７３１−１５のサブクローンである。Ｆ８  ＯＲＦはｐＲＷ７６１中のＸｂａＩ部位とＳｓｐＩ部位との間に完全に含まれた。ＴＲＯＶＡＣとの組換えに関してゲノムＤＮＡがＦ８  ＯＲＦを除去する挿入プラスミドを産生するために、以下の工程を行なった。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩで完全に切断し、ＳｓｐＩで部分的に切断した。３７００ｂｐ  ＸｂａＩ−ＳｓｐＩ帯をゲルから単離して、アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１７（配列認識番号３７）およびＪＣＡ０１８（配列認識番号３８）と連結した。
【化１９】
0003624911.tif 000020
【０１３９】
この連結により産生したプラスミドをｐＪＣＡ００２と称した。
【０１４０】
ＮＤＶ  ＦとＨＮの二重挿入ベクターの構築
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼが充填されたｐＣＥ５９からのＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＣＥ７１のＨｐａＩ部位にクローニングすることにより、Ｈ６プロモートしたＮＤＶ−ＨＮ配列をＨ６プロモートしたＮＤＶ−Ｆカセットに挿入し、ｐＣＥ８０を形成した。プラスミドｐＣＥ８０をＮｄｅＩで完全に切断し、ＢｇｌＩＩで部分的に切断して、Ｈ６プロモーターによりドライブされＦ８フランキングアームに連結したＮＤＶ  ＦおよびＨＮ遺伝子を含有するＮｅｅＩ−ＢｇｌＩＩ４７６０ｂｐ断片を産生した。ｐＲＷ７３１−１５からの４９００ｂｐ  ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫ＋のＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することによりプラスミドｐＪＣＡ０２１を得た。次いでプラスミドｐＪＣＡ０２１をＮｄｅＩとＢｇｋＩＩで切断し、ｐＣＥ８０の４７６０ｂｐＮｄｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片に連結し、ｐＪＣＡ０２４を形成した。それゆえ、プラスミドｐＪＣＡ０２４はＦＰＶフランキングアーム間に隣接する３′末端と反対の配向で挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を含有している。両方の遺伝子をワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結する。ＮＤＶ−Ｆ配列に隣接した右側フランキングアームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。ＮＤＶ−ＨＮ配列に隣接した左側フランキングアームは１７００ｂｐのＦＰＶ配列からなる。
【０１４１】
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶの発達
前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてＴＲＯＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞中にプラスミドｐＪＣＡ０２４をトランスフェクションした（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）。特異的ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ放射線標識プローブに関するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、これらのプラークに、純粋な固体群となるまで５回のプラーク精製を行なった。１つの典型的なプラークを増幅せしめ、産生したＴＲＯＶＡＣ組換え体をＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）と称した。
【０１４２】
蛍光抗体法
多クローン性抗ＮＤＶ血清と、単特異的試薬として、ＮＤＶ−ＦまたはＮＤＶ−ＨＮを発現するワクシニアウイルス組換え体に対して家ウサギ中で産生された血清を用いて、間接蛍光免疫法を記載したように行なった（テイラーら、1990）。
【０１４３】
免疫沈降
ＣＮ、ストース、ＳＰＡＦＡＳ社から得た多クローン性抗ＮＤＶ血清を用いて記載したように免疫沈降反応を行なった。
【０１４４】
株ウイルスを現場でのプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングしてＦ８  ＯＲＦが欠損していることを確認した。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、ＮＤＶ遺伝子のＴＲＯＶＡＣゲノム中への正確な挿入とＦ８  ＯＲＦの欠損もまた確認した。
【０１４５】
ＮＤＶ感染細胞において、Ｆ糖タンパク質を、カルボキシル末端に近い疎水性膜貫通領域により膜中に固定し、これは前駆体、Ｆ0 の、２つのジスルフィド連結ポリペプチドＦ1 およびＦ2 への翻訳後切断を必要とする。Ｆ０の切断は、所定のＮＤＶ菌株の病原性を決定するのに重要であり（ホンマおよびオーウチ、1973；ナガイら、1976；ナガイら、1980）、切断部位でのアミノ酸配列はそれゆえウイルスの毒性を決定するのに重要である。ＦＰＶ中に挿入され、組換え体ｖＦＰ２９を形成するＮＤＶ−Ｆ配列中の切断部位でのアミノ酸は、毒性ＮＤＶ菌株（チャクバーら、1986；エスピオンら、1987；リーら、1988；マックギネスおよびモリソン、1986；トヤダら、1987）に必要条件であることが分かった配列に一致する配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列認識番号３９）（テイラーら、1990）。ＮＤＶの毒性菌株に感染した細胞中に合成されたＨＮ糖タンパク質は７４ｋＤａの未切断糖タンパク質である。アルスターおよびクイーンズランドのようなきわめて無毒性の菌株は、活性化に切断を必要とするＨＮ前駆体（ＨＮｏ）をコードする（ガーテンら、1980）。
【０１４６】
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中のＦおよびＨＮ遺伝子の発現を分析して、遺伝子産生物が自発的に処理され存在することを確認した。多クローン性抗ＮＤＶ鶏血清を用いた間接蛍光抗体法により、免疫半の失せてタンパク質が感染細胞表面に存在したことが確認できた。両方のタンパク質が血漿膜上に存在することを確定するために、ＦまたはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換え体に対する単特異的家ウサギ血清を産生した。これらの血清を用いた間接蛍光抗体法により、両方のタンパク質が表面に存在することを確認した。
【０１４７】
親および組換えウイルスに感染したＣＥＦ細胞の（35Ｓ）メチオニン標識溶解産物を用いて免疫沈降実験を行なった。Ｆ1 とＦ2 の糖溶解産物形状のみかけの分子量の予測値はそれぞれ５４．７と１０．３ｋＤａである（チャンバースら、1986）。多クローン性抗ＮＤＶ血清を用いた免疫沈降実験において、適切なサイズの融合特異的産生物をＮＤＶ−Ｆ単一組換え体ｖＦＰ２９（テイラーら、1990）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ二重組換え体ｖＦＰ９６から欠損せしめた。また適切なサイズのＨＮ糖タンパク質を、ＮＤＶ−ＨＮタンパク質組換え体ＶＦＰ−４７（エドバウアーら、1990）およびＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶから欠損せしめた。どのＮＤＶ特異的産生物も、未感染および親ＴＲＯＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞から欠損されなかった。
【０１４８】
ＣＥＦ細胞において、ＦおよびＨＮ糖タンパク質は、ＮＤＶ免疫血清により認識される感染細胞表面に適切に存在する。免疫沈降分析により、Ｆ0 タンパク質が毒性菌株中に必要とされるＦ1 およびＦ2 成分に関して確実に切断せしめられることが示された。同様に、ＨＮ糖タンパク質も組換え体ＴＲＯＶＡ−ＮＤＶに感染したＣＥＦ細胞中で確実に処理された。
【０１４９】
以前の報告によると（テイラーら、1990；エドバウアーら、1990；ボースネルら、1990ａ、ｂ、ｃ；オガワら、1990）、ＨＮまたはＦのいずれかのみの発現はＮＤＶ抗原投与に対する防御免疫を誘発するのに十分であることが分かっている。しかしながら、他のパラミクソウイルスへの作業により、両方のタンパク質への抗体には十分な防御免疫を必要とすることが示されている。Ｆ糖タンパク質に対してではなくＨＮ糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中にＳＶ５ウイルスが拡散することが示されている（マーツら、1980）。加えて、死菌麻疹ウイルスワクチンを伴うワクチンの失敗は、融合成分の不活性化によるものであることが示唆されている（ノルビーら、1975）。両方のＮＤＶ糖タンパク質がウイルス中和抗体（アベリーら、1979）を誘発することが示され、両方の糖タンパク質が個々に鶏痘ベクター中に発現される場合に防御免疫応答を誘発することができるので、最も有効なＮＤＶワクチンは両方の糖タンパク質を発現すべきである。
【実施例９】
【０１５０】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶ組換え発現麻疹融合および血球凝集素糖タンパク質の構築
麻疹ウイルスＭＶ（エドモンストン菌株）のＨＡおよびＦタンパク質をコードする配列のｃＤＮＡコピーをＮＹＶＡＣ中に挿入してＮＹＶＡＣ−ＭＶと称する二重組換え体を産生した。この組換え体は、感染細胞の表面上に両方の糖タンパク質を確実に発現した。免疫沈降分析は、両方のＦおよびＨＮ糖タンパク質の正確な加工を示した。この組換え体はまた融合細胞の形成も誘発することが示された。
【０１５１】
細胞およびウイルス
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの産生に使用した救助ウイルスは、ＮＹＶＡＣと称するワクシニアウイルスの改変コペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスを増殖せしめ、ベロ細胞単層において滴定した。
【０１５２】
プラスミドの構築
プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡ（テイラーら、1991ｃ）は、前述したワクシニアウイルスＨ６プロモーター（テイラーら、1988ａ、ｂ；グオら、1989；パーカスら、1989）と正確なＡＧ対ＡＴＧの配置に連結された完全な麻疹ＨＡ遺伝子を含有している。３′側の２６ｂｐを欠如したＨＡ遺伝子と正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配置に融合したＨ６プロモーターの３′側の２４ｂｐを含有する１．８ｋｐｂ  ＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片をｐＳＰＭ２ＬＨＡから単離した。この断片を、ｐＳＰＭＨＨＡ１１の１．８ｋｂｐ  ＥｃｏＲＶ／ＳｍａＩ断片（テイラーら、1991ｃ）を置換するのに用い、ｐＲＷ８０３を産生した。プラスミドｐＲＷ８０３は、完全麻疹ＨＡ遺伝子に正確に連結した完全Ｈ６プロモーターを含有している。
【０１５３】
麻疹ＨＡ遺伝子に関する以前の構築を確認するに当たって、コドン１８（ＣＣＣ）の配列を公表した配列と比較して欠損せしめた（アルハチブら、1986）。オリゴヌクレオチドＲＷ１１７（配列認識番号４０）
【化２０】
0003624911.tif 000021
【０１５４】
を用いたクンケル法（クンケル、1985）によりＣＣＣ配列をオリゴヌクレオチド突然変異誘発で置換した。一本鎖テンプレートを、ｐＩＢＩ２５中のｐＲＷ８０３からのＨ６／ＨＡカセットを含有するプラスミドｐＲＷ８１９から誘導した（ＣＴ、ニューヘブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）。コドン１８でのプロリン残留物をコードする挿入された（ＣＣＣ）を含有する突然変異誘発したプラスミドをｐＲＷ８２０と称した。ｐＲＷ８２０のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の間の配列を、ヌクレオチド配列分析により確認した。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はＨ６プロモーターの５′へりに位置し、一方ＸｂａＩ部位はＨＡ遺伝子の開始コドンから２３０ｂｐ下流に位置する。ＸｂａＩ（上述）から下流のＨＡコード配列を含有し、終止コドンを含むｐＲＷ８０３からの１．６ｋｂｐ  ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用い、等量のｐＲＷ８２０の断片を置換してｐＲＷ８３７を産生した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、２ｍＭ  ｃＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いたブラントエンドを行ない、ｐＳＤ５１３のＳｍａＩ部位に挿入することによりｐＲＷ８３７内に含有された突然変異誘発した発現カセットを誘導し、ｐＲＷ８４３を産生した。ポリリンカー配列を添加することによりプラスミドｐＳＤ４６０からプラスミドｐＳＤ５１３を誘導した。プラスミドｐＳＤ４６０は、ワクシニアウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を欠損できるように誘導した。
【０１５５】
ＨＡ挿入プラスミド中に麻疹ウイルスＦ遺伝子を挿入するために、ｐＳＰＨＭＦ７において操作を行なった。プラスミドｐＳＤＨＭＦ７（テイラーら、1991ｃ）は、以前に記載したワクシニアウイルスＨ６プロモーターに近位の麻疹Ｆ遺伝子３′を含有している。ＡＴＧ配置のための完全なＡＴＧを達成し、プロモーターの３′末端と麻疹ウイルスＦ遺伝子のＡＴＧとの間の介在配列を除去するために、オリゴヌクレオチドＳＰＭＡＤ（配列認識番号４１）
【化２１】
0003624911.tif 000022
【０１５６】
を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を行なった。産生したプラスミドをｐＳＰＭＦ７５Ｍ２０と称した。
【０１５７】
Ｈ６プロモーターと正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配置に連結した麻疹Ｆ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＤＭＦ７５Ｍ２０をＮｒｕＩおよびＥａｇＩで切断した。Ｈ６プロモーターの３′側の２７ｂｐと完全な融合遺伝子を含有する、産生した１．７ｋｂｐ平滑末端断片を単離し、ＮｒｕＩとＸｂａＩで切断し、平滑末端とした中間プラスミドｐＲＷ８２３に挿入した。産生したプラスミドｐＲＷ８４１は、ｐＩＢＩ２５プラスミドベクター中の麻疹Ｆ遺伝子に連結したＨ６プロモーターを含有している（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）。ＳｍａＩで切断することにより、Ｈ６／麻疹ＦカセットをｐＲＷ８４１から切除して産生した１．８ｋｂ断片をｐＲＷ８４３（麻疹ＨＡ遺伝子を含有する）に挿入した。プラスミドｐＲＷ８４３を、最初にＮｏｔＩで切断し、２ｍＭ  ｃＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端とした。それゆえ、産生したプラスミド、ｐＲＷ８５７は、尾対尾の配置に連結した麻疹ウイルスＦおよびＨＡ遺伝子を含有する。両方の遺伝子はワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結している。
【０１５８】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶの開発
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）を用いて、プラスミドｐＲＷ８５７をＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞にトランスフェクションした。特異的ＭＶ  ＦおよびＨＡ放射線標識プローブに関して現場でのプラークハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるまで、６回のプラーク精製を行なった。１つの代表的なプラークを増幅し、産生した組換え体をＮＹＶＡＣ−ＭＶと称した（ｖＰ９１３）。
【０１５９】
蛍光抗体法
前述したように間接蛍光抗体法を行なった（テイラーら、1990）。使用した単特異的試薬は、家ウサギに麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換え体を接種することにより産生した血清であった。
【０１６０】
免疫沈降
モルモット抗麻疹血清（ＭＤ、ウォーカースビル、ウィタッカーＭ．Ａ．バイオプロダクツ）を用いて前述したように免疫沈降反応を行なった。
【０１６１】
細胞融合実験
６０ｍｍのディッシュ中のベロ細胞単層に、細胞当たり１ｐｆｕの多重度で親または組換えウイルスを接種した。３７℃で１時間の吸収後、接種物を除去し、培地を上に載せ、ディッシュを３７℃で一晩接種した。２０時間後の感染で、ディッシュを試験した。
【０１６２】
麻疹ＦおよびＨＡ遺伝子の両方の発現産生物が感染細胞表面上に存在することを確定するために、麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換え体に対して家ウサギ中に産生した単特異的血清を用いて間接蛍光抗体法を行なった。その結果により、両方の単特異的血清に関して強い表面蛍光によって示されたように、ＦおよびＨＡ遺伝子産生物の両方が感染細胞表面上に発現されたことが分かった。親ＮＹＶＡＣ菌株を接種した細胞のいずれの細胞にもバックグラウンドの染色はなく、また単特異的血清をＨＡまたはＦ遺伝子のいずれかを発現するワクシニア単一組換え体に対して試験した場合にも交差反応染色は見られなかった。
【０１６３】
ＮＹＶＡＣ−ＭＶにより発現されたタンパク質が、麻疹ウイルス特異的血清と免疫活性であり、感染細胞中で確実に加工されたことを確定するために、免疫沈降分析を行なった。ベロ細胞単層を、35Ｓメチオニンの存在下で親または組換えウイルスの１０ｐｆｕ／細胞の多重度で接種した。免疫沈降分析は、約７６ｋＤａのＨＡ糖タンパク質およびそれぞれ分子量が４４ｋＤａおよび３３ｋＤａの切断融合産生物Ｆ1 とＦ2 を示した。麻疹特異的産生物は、未感染細胞または親ＭＹＶＡＣウイルスに感染したベロ細胞中には全く検出されなかった。
【０１６４】
ＭＶ細胞病理学の特性は、周辺の感染または未感染細胞と感染細胞の融合と続いての融合細胞の中心への核の移動により生じた融合細胞の形成である（ノービーら、1982）。これはパラミクソウルイスに関して、ＨＡ特異的ウイルス中和抗体の存在により生じ得るウイルスの拡散の重要な方法であることが示された（マーツら、1980）。ワクシニアウイルス中で発現されたＭＶタンパク質が機能的に活性であることを確定するために、ベロ細胞単層にＭＹＶＡＣとＮＹＶＡＣ−ＭＶを接種し、細胞病理効果を観察した。強い細胞融合活性が、感染から約１８時間後にＮＹＶＡＣ−ＭＶ感染ベロ細胞中で明確であった。親ＮＹＶＡＣに感染した細胞中には細胞融合活性は見られなかった。
【実施例１０】
【０１６５】
仮性狂犬病の糖タンパク質を発現するＭＹＶＡＣ組換え体の構築
ＰＲＶ  ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０糖タンパク質を、個々または組合せのいずれかで発現するワクシニアウイルス組換え体が有効なワクチン候補であること、すなわち、生ＰＲＶの毒性抗原投与からブタを防御することが示された。ＭＹＶＡＣベクターが培養ブタ細胞中で生産的に複製できないこと、および既知の潜在的な毒性遺伝子の欠損によるベクター固有の安全性を考慮して、ＰＲＶ  ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０を単体または様々な組合せで含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体を産生した。これらの組換え体は、ブタに安全であり、環境への伝染を減少または著しく制限したＰＲＶに対して効果的なワクチン候補を提供するために産生した。
【０１６６】
ウイルスおよび細胞
ＮＹＶＡＣの操作と分子クローニングを標準技術により行なった（ピッチーニら、1987；マニアチスら、1982）。ＮＹＶＡＣおよびＭＹＶＡＣベースの組換え体の培養は以前に記載した（ピッチーニら、1987）。
【０１６７】
ＰＲＶ  ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０遺伝子のクローニング
ＰＲＶの増殖、ＰＲＶゲノムＤＮＡの抽出、およびＰＲＶ  ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０遺伝子の同定は以前に記載した。
【０１６８】
仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）遺伝子のＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）へのクローニングおよび発現
ヒトおよびブタ宿主域遺伝子（Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌ）を法含有する領域が欠如したＮＹＶＡＣ欠損変異体、ｖＰ８６６は、ＰＲＶ遺伝子を挿入するのに用いたベースベクターであった。このベクターはまた、ワクシニアウイルスｔｋ遺伝子、血球凝集素遺伝子、出血性遺伝子、リボヌクレオチドレダクターゼ（巨大サブユニット）遺伝子、およびＡ型封入体遺伝子が欠如している。重要なことは、ｖＰ８６６は、ヒトまたはブタ肝臓（ＬＬＣ−ＰＫ１）細胞については少しも効果的には複製しない。単純ヘルペスウイルスｇＢ（ロビンソンら、1987）、ｇＣ（ロビンソンら、1986ｂ）、およびｇＤ（ワッソンおよびワッソン、1984）にそれぞれ相同なＰＲＶ遺伝子ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０を下記に概略示したようにｖＰ８６６に挿入した。
【０１６９】
ＰＲＶ  ｇｐＩＩ遺伝子をｖＰ８６６の血球凝集素座に挿入
ＰＲＶ  ｇｐＩＩ遺伝子をコードするＤＮＡ配列はＰＲＶゲノムのＢｍａＨＩ断片にある（メッテンライターら、1986）。
【０１７０】
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入されたＰＲＶ  ＢａｍＨＩ断片１を含有する、ｐＰＲ９．２５と称するプラスミドをＮｃｏＩで切断した。産生した制限断片を９．８％のアガロースゲルで分画し、ジェネクリーン（ＣＡ、ラジョラ、バイオ１０１社）を用いて６．２ｋｂ  ＮｃｏＩ  ＤＮＡ断片を精製し、続いてＣｉＡＰで処理したｐＢＲ３２８（ＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルス）のＮｃｏＩ部位に挿入した。精製したプラスミド、ｐＰＲ２．１５をＳｐｈＩで切断し、アガロースゲルで分画した。２．７ｋｂと１．８ｋｂ断片を精製して、ｐＵＣ１８のＳｐｈＩ部位に挿入し、ｐＰＲ１およびｐＰＲ２をそれぞれ産生した。
【０１７１】
ｐＰＲ１からの１０６０ｂｐ  ＰＲＶ  ＳｐｈＩ／ＮｈｅＩ断片をアガロースゲルから単離して、アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ１（配列認識番号４２）
【化２２】
0003624911.tif 000023
【０１７２】
およびＭＲＳＹＮ２（配列認識番号４３）
【化２３】
0003624911.tif 000024
【０１７３】
によりｐＩＢＩ２５のＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ部位に挿入し、ｐＰＲ６を産生した。ｐＰＲ６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで切断した。ＡｐａＩ部位は、ＰＲＶ  ｇｐＩＩのＡＴＧ開始コドンから３２ｂｐ下流に位置する。この３９２０ｂｐ断片をアニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ３（配列認識番号４４）
【化２４】
0003624911.tif 000025
【０１７４】
およびＭＲＳＹＮ４（配列認識番号４５）
【化２５】
0003624911.tif 000026
【０１７５】
と連結し、ｐＰＲ９を産生した。これらのアニールしたオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位からＡＴＧを通じてＰＲＶ  ｇｐＩＩコード配列に続くワクシニアウイルスＨ６プロモーターを特定するＤＮＡ配列を提供する。プラスミドｐＰＲ９をＢａｍＨＩとＮｈｅＩで切断し、子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣｉＡＰ）で処理し、アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ７（配列認識番号４６）
【化２６】
0003624911.tif 000027
【０１７６】
およびＭＲＳＹＮ８（配列認識番号４７）
【化２７】
0003624911.tif 000028
【０１７７】
並びにｐＰＲ１から得た１６４０ｂｐ  ＳｐｈＩ／ＮｈｅＩ断片と連結し、プラスミドｐＰＲ１２を産生した。
【０１７８】
ｐＰＲ２からの１０３０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩ／ＳｐｈＩ断片をアガロースゲルから単離し、ＨｉｎｃＩＩ／ＳｐｈＩ  ｐＵＣ１８ベクターに挿入した。産生したプラスミド、ｐＰＲ１０をＨｉｎｄＩＩＩとＮａｅＩで切断し、ＣｉＡＰで処理した。ＮａｅＩ部位は終止コドン（ＴＡＧ）の４４ｂｐ上流である。アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮ９（配列認識番号４８）
【化２８】
0003624911.tif 000029
【０１７９】
およびＭＲＳＹＮ１０（配列認識番号４９）
【化２９】
0003624911.tif 000030
【０１８０】
をｐＰＲ１０からの３７２０ｂｐ  ＮａｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結し、プラスミドｐＰＲ１１を産生した。ｐＰＲ２からの７７０ｂｐ  ＳｐｈＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片をアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩリン酸化リンカーＭＲＳＹＮ７（配列認識番号４６）およびＭＲＳＹＮ８（配列認識番号４７）を用いてＣｉＡＰ処理したｐＰＲ１１のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ｐＰＲ１３を産生した。ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＰＲ１２を、ＭＲＳＹＮ１９（配列認識番号５０）
【化３０】
0003624911.tif 000031
【０１８１】
およびＭＲＳＹＮ２０（配列認識番号５１）
【化３１】
0003624911.tif 000032
【０１８２】
を用いてｐＰＲ１３からの９９０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ断片と連結し、プラスミドｐＰＲ１５を産生した。プラスミド、ｐＰＲ１５をＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶで切断し、２７８０ｂｐ断片を産生した。この断片を、ＸｍａＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断したｐＴＰ１５（グオら、1989）に挿入し、ｐＰＲ１８を産生した。ｐＰＲ１８において、ｐＲＶｇｐＩＩをＨＡ欠損プラスミド中のワクシニアウイルスＨ６プロモーターと連結する。救助ウイルスとしてｖＰ８６６による生体外組換え実験にｐＰＲ１８を用いてｖＰ８８１を産生した。
【０１８３】
ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子をＮＹＶＡＣのＴＫ座に挿入
ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子をコードする配列がＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ２および９断片に遺伝子地図を作成する（ロビンスら、1986ｂ）。プラスミドｐＰＲ９．９およびｐＰＲ７．３５は、それぞれｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に挿入されるＰＲＶ  ＢａｍＨＩ断片２および９を含有する。ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子の５′末端を含有するＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＰＲ９．９から単離した。ｇｐＩＩＩ遺伝子の残りを含有するＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＰＲ７．３５から単離した。完全なＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子は、これら２つの断片をｐＩＢＩ２５に連結することにより組み立て、ｐＰＲ１７を産生した。
【０１８４】
ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｂ領域に位置する初期ワクシニアウイルス出血性プロモーターの制御下で発現されるように操作した（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）。部位定方向突然変異誘発を用いて、ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ中の配列ＣＧＣ（塩基１９２−１９４）をＡＴＧに変化せしめることによりＮｓｉＩ部位を導入し、配列ＧＴＣＡＣＧＴをＴＴＣＴＡＧＡ（塩基１６３２−１６３８）に変化せしめることによりＸｂａＩ部位を導入した。突然変異誘発反応を行なうために、ヘルパーファージＲ４０８（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）を用いることにより一本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＰＲ１７から産生した。ＭＲＳＹＮ５（配列認識番号５２）
【化３２】
0003624911.tif 000033
【０１８５】
およびＭＲＳＹＮ６（配列認識番号５３）
【化３３】
0003624911.tif 000034
【０１８６】
並びにＥ．ｃｏｌｉ  ｄｕｒ-   ｕｎｇ- 菌株ＣＪ２３６（ＣＴ、ニューハブン、バイオテクノロジー社）を用いて部位定方向突然変異誘発を行なった。クンケルの実験記録（1985）にしたがって突然変異誘発を行なった。これらの突然変異誘発により、プラスミドｐＰＲ２８が産生した。
【０１８７】
プラスミドｐＰＲ２８をＮｓｉＩおよびＸｂａＩで切断して、マング豆ヌクレアーゼで処理した。１４４０ｂｐ断片を精製して、マング豆ヌクレアーゼと子牛腸あるか理性ホスファターゼで処理し多後にｐＳＤ４７８ＶＣで切断したＢｇｌＩＩ／ＨｐａＩに挿入した。産生したプラスミドをｐＰＲ２４と称した。
【０１８８】
プラスミドｐＰＲ２４をＳｎａＢ１とＤｒａＩで切断し、ｕプロモーターとＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子をが有する１５００ｂｐ平滑末端断片を離生した。この断片をｐＳＤ５１３ＶＣで切断したＳｍａＩに連結し、ｐＰＲＶＩＩＩＶＣＴＫを産生した。救助ウイルスとしてのｖＰ８６６およびｐＰＲＶＩＩＩＶＣＴＫに関して、生体外組換え実験を行なってｖＰ８８３を産生した。ｖＰ８８３において、ゲノムに関して、１２０ｂｐワクシニアｕプロモーター要素の制御下で右から左の方向に挿入したＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子によりワクシニアｔｋコード配列を置き換えた。
【０１８９】
ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子をＮＹＶＡＣのＡＴＩ座へ挿入
ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ５０の遺伝子をコードするＤＮＡはＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ断片７に位置している（ペトロフスキスら、1986ａ、ｂ）。プラスミドｐＰＲ７．１はｐＢＲ３２２のＢａｎＨＩ部位に挿入されたＰＲＶ  ＢａｍＨＩ断片７を含有している。完全なｇｐ５０遺伝子を含有するｐＰＲ７．１のＳｔｕＩ／ＮｄｅＩサブ断片はｐＩＢＩ２５にサブクローニングされてプラスミド＃８５６を産生した。
【０１９０】
初期／中間ワクシニアプロモーター、Ｉ３Ｌの制御下でＰＲＶ  ｇｐ５０のコード配列を配した（シュミットおよびスタネンベルグ、1988；ボスおよびスタネンベルグ、1988）。このプロモーター要素は、以前にワクシニア組換え体中の異種遺伝子を発現するのに用いた（パーカスら、1985；バッチャーら、1989）。合成オリゴヌクレオチドＰ５０ＰＰＢＡＭ（配列認識番号５４）
【化３４】
0003624911.tif 000035
【０１９１】
およびＰ５０ＰＰＡＴＧ（配列認識番号５５）
【化３５】
0003624911.tif 000036
【０１９２】
並びにテンプレートとしてのコペンハーゲンＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉ領域のサブクローンであるｐＭＰＩＶＣを用いてＰＣＲ（ササキら、1988）により、Ｉ３Ｌ読取り枠から上流のプロモーター配列に対応するＤＮＡ（シュミットおよびスタネンベルグ、1988）を誘導した。産生した１２６ｂｐ断片をＢａｍＨＩで切断し、プロモーター配列の５′末端でのＢａｍＨＩ付着末端を産生した。３′末端は平滑末端のままであった。
【０１９３】
ＰＲＶ  ｇｐ５０コード領域をプラスミド＃８５６から切除した。プラスミド＃８５６を、ＡＴＧから７ｂｐ上流を切断し、３′懸垂となるＮｓｉＩで最初に切断した。３′懸垂を、２ｍＭ  ｄＮＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした。産生したＤＮＡを部分的にＢｇｌＩＩで切断し、ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子を含有する１．３ｋｂブラント／ＢｇｌＩＩ断片を単離した。
【０１９４】
１２６ｂｐ  Ｉ３Ｌプロモーター断片（ＢａｍＨＩ／ブラント）および１．３ｋｂ  ｇｐ５０遺伝子含有断片（ブラント／ＢｇｌＩＩ）をＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。産生したプラスミドをｐＢＳＰＲＶ５０Ｉ３と称した。ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子に連結したＩ３Ｌプロモーターを含有する発現カセットをＢａｍＨＩ／部分的ＳｍａＩ切断により切除した。Ｉ３Ｌプロモーター／ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子を含有する１．４ｋｂ断片を単離して、２ｍＭ  ｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。
【０１９５】
Ｉ３Ｌプロモーター／ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子を含有する１．４ｋｂ平滑末端断片をＡＴＩ挿入プラスミドｐＳＤ５４１に挿入した。ＡＴＩ領域のフランキングアームを、テンプレートとしてのコペンハーゲンＨｉｎｄＩＩＩ  Ａ領域のサブクローンを用いたＰＣＲにより産生した。オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６７（配列認識番号５６）
【化３６】
0003624911.tif 000037
【０１９６】
およびＭＰＳＹＮ２６８（配列認識番号５７）
【化３７】
0003624911.tif 000038
【０１９７】
を用いてＡＴＩ欠損の右側に４２０ｂｐワクシニアアームを誘導した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６９（配列認識番号５８）
【化３８】
0003624911.tif 000039
【０１９８】
およびＭＰＳＹＮ２７０（配列認識番号５９）
【化３９】
0003624911.tif 000040
【０１９９】
を用いて欠損の左側に４２０ｂｐワクシニアアームを誘導した。左右のアームＰＣＲによりともに融合して、ＢｇｌＩＩ、ＳｍａＩ、およびＸｈｏＩの制限部位を特定するポリリンカー領域により分離した。ＰＣＲ産生断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断して付着末端を産生し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８に連結してｐＳＤ５４１を産生した。
【０２００】
Ｉ３Ｌ／ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子を含有するｐＳＤ５４１プラスミドをｐＡＴＩｇｐ５０と称した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９００を産生した。ｖＰ９００はＡＴＩ遺伝子の位置にＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子を含有している。
【０２０１】
ＮＹＶＡＣ内の二重および三重ＰＲＶ組換え体の産生
生体外組換え実験を行なって、多重ＰＲＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベース組換え体を産生した。供与体プラスミド、ｐＡＴＩＰ５０を用いた生体外組換え実験を、ｖＰ８８１、ｖＰ８８３、およびｖＰ９１５に行なって、それぞれｖＰ９１２、ｖＰ９１６、およびｖＰ９２５を産生した（表１）。実験は救助ウイルスとしてのｖＰ８８３およびプラスミドｐＰＲ１８に関して行なってｖＰ９１５を産生した（表１）。
【０２０２】
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体感染細胞からの免疫沈降
ベロ細胞について、細胞当たり１０ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で、個々の組換えウイルス、ＮＹＶＡＣ親ウイルスを感染せしめるか、または疑似（ｍｏｃｋ）感染せしめた。１時間の吸収期間の後、接種物を除去して、感染細胞に35Ｓメチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するメチオニン不含有培地を添加した。全ての試料を感染８時間後に収集した。ヒツジ抗ｇｐＩＩ血清で分析した試料に関して、遠心分離により細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０、１％Ｎａ−デオキシクロレート、０．１％ＳＤＳ、０．０１Ｍメチオニン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ２−メルカプト−エタノール、１ｍ／ｍｌ  ＢＳＡ、および１００ｕ／ｍｌアプロチニン）で分離した。ヒツジ抗ｇｐＩＩＩで分析した試料およびｇｐ５０に特異的な単クローンを１Ｘ緩衝液Ａ（１％ＮＰ４０、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０％Ｎａアジド、０．２ｍｇ／ｍｌＰＭＳＦ）中に溶解せしめた。全ての血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着し、全ての溶解産物を通常の血清（ヒツジまたはマウス）および第２抗体に連結したタンパク質Ａセファロースで前吸着した。
【０２０３】
感染細胞からの溶解産物を、ヒツジ抗ｇｐＩＩ血清を用いたＰＲＶ  ｇｐＩＩ発現に関して分析した。この第１抗血清を、家ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ベーリンガーマンハイム）に接合したタンパク質Ａセファロースと共にインキュベートした。４℃での一晩のインキュベート後、試料を１×ＲＩＰＡ緩衝液で４回、ＬｉＣｌ−尿素（０．２Ｍ  ＬｉＣｌ、２Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。マイクロ遠心分離により沈殿物を収集した。２Ｘラエムリの緩衝液（１２５ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、４％（ＳＤＳ）、２０％グリセロール、１０％  ２−メルカプト−エタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％のドレイファスゲルシステム（ドレイフィスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１Ｍ  Ｎａ−サリチル酸塩で処理した。
【０２０４】
ヒツジ抗ｇｐＩＩ血清を用いたＰＲＶ  ｇｐＩＩ発現に関して溶解産物を分析した。この第１抗血清を家ウサギ抗ヒツジＩｇＧに接合したタンパク質Ａセファロース（ベーリンガーマンハイム）と共にインキュベートした。４℃での一晩のインキュベート後、試料を１Ｘ緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ−尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿物を処理し、上述したようにフルオログラフィーにより分析した。
【０２０５】
溶解産物を、単クローン性抗体、２２Ｍ４（フランス、リヨン、ローンメリオクスにより供給された）を用いたＰＲＶ  ｇｐ５０発現に関して分析した。この第１抗体を、山羊抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ（ベーリンガーマンハイム）に接合したタンパク質Ａセファロースと共にインキュベートした。沈殿物を回収し、上述したようにＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ免疫沈降に関して分析した。
【０２０６】
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞中のＰＲＶ糖タンパク質の発現
ＰＲＶ  ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０産生物は、ＰＲＶ感染細胞中の膜構造に関連した典型的な糖タンパク質である。抗ｇｐＩＩ、抗ｇｐＩＩＩおよび抗ｇｐ５０特異的体クローン性抗体および続いてのフルオロセイン接合ヒツジ抗マウスＩｇＧを用いて、組み得たい感染ベロ細胞の表面上のＰＲＶ糖タンパク質発現を分析した。ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、またはｇｐ５０の表面発現はいずれも、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）親ウイルスに感染した細胞の表面には検知できなかった。ＰＲＶ  ｇｐＩＩ発現がｖＰ８８１、ｖＰ９１２、およびｖＰ９２５感染細胞の表面に観察された。ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ表面発現が、ｖＰ８８３、ｖＰ９１５、ｖＰ９１６、およびｖＰ９２５感染細胞中に観察された。ＰＲＶ  ｇｐ５０表面発現が、ｖＰ９００、ｖＰ９１２、ｖＰ９１６、およびｖＰ９２５感染細胞中に観察された。要約すると、特定のＰＲＶ糖タンパク質の表面発現は、適切なＰＲＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞中のみに検知可能であった。
【０２０７】
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞からのＰＲＶ糖タンパク質の免疫沈降
ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染したベロ細胞中の発現ＰＲＶ  ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０糖タンパク質の確実性を免疫沈降により分析した。ＰＲＶ  ｇｐＩＩ遺伝子産生物は、ＰＲＶ感染細胞中でコードされた主要糖タンパク質の１つである。熟成タンパク質は、ジスルヒド結合により連結した糖タンパク質の複合体からなる（ハンペルら、1984；ルーカスら、1985）。還元条件下で、３つの種がこの複合体から分解した。これら３つの種（ＩＩａ−ｃ）は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて、それぞれ１２０ｋＤａ、７４−６７ｋＤａ、および５８ｋＤａの適切なサイズで移動した（ハンプルら、1984）。
【０２０８】
抗ＰＲＶｇｐＩＩ特異的血清を用いた免疫沈降分析において、どのＰＲＶ特異的タンパク質種も、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）親細胞に感染した細胞からは沈殿しなかった。ＰＲＶ  ｇｐＩＩもまた、ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体ｖＰ９１６、ｖＰ８８３、およびｖＰ９００を含有する非ｇｐＩＩに感染した細胞中では検知できなかった。ＰＲＶ  ｇｐＩＩがＰＲＶ  ｇｐＩＩ遺伝子をハーバーする全てのＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体中で発現されたことが明確である。これらはｖＰ９２５、ｖＰ９１２、ｖＰ９１５、およびｖＰ８８１である。組換え体を含有するＰＲＶ  ｇｐＩＩに感染したベロ細胞からの溶解産物は、適切な発現に調和し、ｇｐＩＩをｇｐＩＩａ（１２０ｋＤａ）、ｇｐＩＩｂ（７４−６７ｋＤａ）、およびｇＩＩｃ（５８ｋＤａ）に加工するタンパク質種を含有した。４５ｋＤａと１０ｋＤａの２つの追加のタンパク質種を抗ｇｐＩＩ血清により特異的に沈殿せしめた。これらのタンパク質種は、組換え感染細胞中の晩期にＰＲＶ  ｇｐＩＩの変型のタンパク質分解工程により現れるように思われる。
【０２０９】
ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ産生物は、もう１つの主要ＰＲＶ糖タンパク質である。ｇｐＩＩＩは、９２ｋＤａの明確な分子量で移動する他のウイルスタンパク質とは複合体をなさない単量体単位として存在する（ハンプルら、1984；ロビンスら、1986ｂ）。ｇｐＩＩＩに特異的な抗血清を用いたＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体感染細胞からの免疫沈降分析において、抗ｇｐＩＩＩ特異的タンパク質種は、疑似感染細胞、非組換え体感染細胞、またはｇｐＩＩＩを含有しないＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体（それぞれ、ｖＰ９１２、ｖＰ８８１、およびｖＰ９００）に感染した細胞からの溶解産物中には全く存在しなかった。ｖＰ９２５、ｖＰ９１５、ｖＰ９１６，およびｖＰ８８３感染細胞からの溶解産物は全て９２ｋＤａ  ＰＲＶ  ｇｐＩＩＩ遺伝子産生物を含有した。
【０２１０】
熟成ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子産生物は、約５０から６０ｋＤａ（ペトロフスキスら、1986ａ；ワッセンら、1984）であり、そのほとんどはＯ連結炭化水素を含有しそうである（ペトロフスキスら、1986ｂ）。ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子産生物に特異的な抗血清を用いた、ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞の溶解産物からの免疫沈降において、ｇｐ５０は、疑似感染細胞、非組換え体感染細胞、またはｇｐ５０遺伝子を含有しない組換え体（それぞれ、ｖＰ９１５、ｖＰ８８１、およびｖＰ８８３）に感染した細胞からの溶解産物中には全く存在しなかった。ＰＲＶ  ｇｐ５０遺伝子を含有する組換えＮＹＶＡＣウイルス（それぞれ、ｖＰ９２５、ｖＰ９１２、ｖＰ９１６、およびｖＰ９００）に感染した細胞からの溶解産物は全て、抗ＰＲＶ  ｇｐ５０血清により特異的に沈殿した５０−６０ｋＤａタンパク質種を発現した。
【表１】
0003624911.tif 000041
【実施例１１】
【０２１１】
エプステイン−バーウイルスのｇｐ３４０、ｇＢおよびｇＨ遺伝子を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ＥＢＶ  ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ供与体プラスミドを構築した。この供与体プラスミドを用いて２つの組換え体、ｖＰ９４１およびｖＰ９４４を産生した。
【０２１２】
制限酵素は、ベセスダリサーチラボラトリーズ社（ＭＤ、ゲイサースブルグ）、ニューイングランドバイオラボ社（ＭＡ、ビバーリー）、またはベーリンガーマンハイム（ＩＮ、インディアナポリス）から得た。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片を、ニューイングランドバイオラボ社から得た。クローニング、スクリーニングおよびプラスミド精製の少しの修飾には、標準組換えＤＮＡ技術を用いた（マニアチスら、1982）。アルカリ性変性二本鎖プラスミドテンプレートに標準ジデオキソ鎖−終止反応（サンガー、1977）を用いて核酸配列を確認した。Ｍ１３ｍｐ１８ファージ、ｐＩＢＩ２４およびｐＩＢＩ２５プラスミドをＣＴ、インターナショナルバイオテクノロジー社から得た。
【０２１３】
細胞株およびウイルス菌株
救助ウイルスとしてＮＹＶＡＣを用いて組換え体を産生した。５−１０％の新生子牛血清を補給したタカのＭＥＭ培地中のベロ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）細胞（ＶＩ、マクリーン、フローラボラトリーズ）において、全てのワクシニアウイルス株を産生した。
【０２１４】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発
突然変異誘発反応に用いたウラシル置換一本鎖ＤＮＡテンプレートはＣＪ２３６転換細胞からのものであった。変異は、クンケルらの（1987）プロトコルを用いて行なわれた。標準化学物質を用いて様々なオリゴヌクレオチドを合成した（ＣＡ、サンラファエル、バイオリサーチ８７００；ＣＡ、フォスターシティー、アプライドバイオシステム３８０Ｂ）。
【０２１５】
ワクシニアウイルス組換え体の構築
救助ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞への組換え供与体プラスミドのトランスフェクションおよび現場でのニトロセルロースフィルター上でのハイブリダイゼーションによる組換え体の同定の工程は前述したようなものであった（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）。
【０２１６】
ＥＢＶ遺伝子ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨのワクシニア組換え体における改変および発現
ｇｐ３４０遺伝子は、完全ＥＢＶ配列の読取り枠ＢＬＬＦ１ａに対応する（ベアーら、1984）。ｇｐ２２０遺伝子は、内部スプライシングイベント（読取り枠ＢＬＬＦ１ｂ）によりｇｐ３４０  ｍＲＮＡから由来する。ｇｐ３４０およびｇｐ２２０遺伝子を、Ｄｒ．ペリコーデット（Centre de Recherche sur le Cancer-IRSG,7 rue Guy Mocquet,94802 Villejuif,France ）により提供されたｃＤＮＡクローン（それぞれ、プラスミドｐＭＬＰｇｐ３４０、ｐＭＬＰｇｐ２２０）から単離した。
【０２１７】
ｐＭＬＰｇｐ２２０の２１００ｂｐ  ＸｍａＩ／ＣｌａＩ断片をＸｍａＩ／ＣｌａＩ  Ｍ１３  ｍｐ１８に挿入し、産生したプラスミドをｍｐ１８ｇｐ２２０と称した。オリゴヌクレオチドＣＭ４およびＣＭ５を用いた生体外突然変異誘発により、ｇｐ２２０遺伝子の５′および３′端を、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下で発現に関して改変した。改変ｇｐ２２０遺伝子を含有するプラスミドをｍｐ１８ｇｐ２２０（４＋５）と称した。ＣＭ４（配列認識番号６０）およびＣＭ５（配列認識番号６１）のヌクレオチド組成は以下の通りであった。
【化４０】
0003624911.tif 000042
【０２１８】
ｍｐ１８ｇｐ２２０（４＋５）の２３００ｂｐ  ＮａｒＩ／ＥｃｏＲＶ断片を、ＮａｒＩ／ＥｃｏＲＶプラスミドＳＰ１３１ＮｏｔＩ中にクローニングした。ＳＰ１３１ＮｏｔＩは、前に定義したように完全なＨ６ワクシニアプロモーターを含有している（テイラーら、1988ａ、ｂ）。産生したプラスミドをＳＤ１３１ｇｐ２２０と称した。
【０２１９】
ｐＭＬＰｇｐ３４０の２３６０ｂｐ  ＳｃａＩ／ＸｈｏＩ断片を、ＳｃａＩ／ＸｈｏＩ  ＳＰ１３１ｇｐ２２０プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをＳＰ１３１ｇｐ３４０と称した。
【０２２０】
ＳＰ１３１ｇｐ３４０の２８００ｂｐ  ＮｏｔＩ／ＮｏｔＩ断片を、ＳｍａＩ切断ワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ４８６中にクローニングした。産生したプラスミドを４８６Ｈ６３４０と称した。ＥＢＶ  ｇＢ遺伝子は、完全ＥＢＶ配列の読取り枠ＢＡＬＦ４に対応する（ベアーら、1984）。３５００ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＸｍｎＩ断片を、ＥＢＶ  ＢａｍＨＩ  Ａ断片から単離して、ＨｉｎｃＩＩ／ＥｃｏＲＩプラスミドｐＩＢＩ２５中にクローニングした。産生したプラスミドをｐ２５ｇＢと称した。
【０２２１】
生体外突然変異誘発により、オリゴヌクレオチドＥＢＶ
Ｍ５（配列認識番号６２）およびＥＢＶＭ３（配列認識番号６３）を用いて、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下でＥＢＶ  ｇＢ遺伝子を発現に適用した。ＥＢＶＭ５（配列認識番号６２）およびＥＢＶＭ３（配列認識番号６３）のヌクレオチド組成は以下の通りである。
【化４１】
0003624911.tif 000043
【０２２２】
産生したプラスミドをｐ２５ｇＢ（５＋３）と称した。
【０２２３】
ｐ２５ｇｂ（５＋３）の２６００ｂｐ  ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ  Ｓｐ１３１プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをＳＰ１３１ｇＢと称した。
【０２２４】
ＥＢＶ  ｇＨ遺伝子は、完全ＥＢＶ配列のＢＸＬＦ２読取り枠に対応する（ベアーら、1984）。完全ＢＸＬＦ２読取り枠は、２つのＢａｍＨＩ  ＥＢＶ断片、ＢａｍＨＩ  ＸおよびＢａｍＨＩ  Ｔに含有される。ＥＢＶ  ＢａｍＨＩ  Ｔ断片の８３０ｂｐ  ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ断片をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩｐＩＢＩ２４プラスミド中にクローニングすることにより、完全ＢＸＬＦ２読取り枠を再構築した。産生したプラスミドを２４ｇＨ５と称した。ＥＢＸ  ＢａｍＨＩ  Ｘ断片の１８５０ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ２４ｇＨ５プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを２４ｇＨと称した。
【０２２５】
オリゴヌクレオチドＨＭ５、ＨＭ４、およびＨＭ３を用いた生体外突然変異誘発により、ＥＢＶ  ｇＨ遺伝子を改変して、ワクシニアＢ１３Ｒ出血性プロモーターの制御下で発現した（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）。オリゴヌクレオチドＨＭ４を用いて、ワクシニア初期転写終止シグナルに対応する配列を改変した。ＨＭ５（配列認識番号６４）、ＨＭ４（配列認識番号６５）、およびＨＭ３（配列認識番号６６）のヌクレオチド組成は以下の通りである。
【化４２】
0003624911.tif 000044
【０２２６】
改変ｇＨを含有する産生したプラスミドを２４ｇＨ（５＋４＋３）と称した。
【０２２７】
ワクシニア出血性プロモーターは、他のポックスプロモーターと比較して強力なプロモーターであるとは思われない。４２ｋＤａエントモポックスプロモーターの制御下でＥＢＶ  ｇＨ遺伝子を配した。これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特異的オリゴヌクレオチド４２ｇＨ（配列認識番号６７）およびＢＡＭｇＨ（配列認識番号６８）並びにテンプレートとしてのプラスミド２４ｇＨ（５＋４＋３）を用いることにより行なわれた。
【化４３】
0003624911.tif 000045
【０２２８】
（最初のＡ残留物は、ｇＨコード配列の位置２９２に対応する）
ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラー（ＣＴ、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）中において、９４℃で１分間、４２℃で１．５分間、および７２℃で３分間の３６サイクルを行ない、最後に７２℃で５分間の延長工程を行なった。ＰＣＲ産生物を精製し、ＢａｍＨＩで切断し、２４ｇＨ（５＋４＋３）の４５５０ｂｐ  ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ断片中にクローニングした。産生したプラスミドを２４ＢＸＬＦ２．４２Ｋと称した。
【０２２９】
ＥＢＶ  ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨ遺伝子のワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ５４２への挿入およびｖＰ９４１とｖＰ９４４の単離
ワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ５４２は、延長ポリリンカー領域を有するｐＳＤ４６０の誘導体であり、異種遺伝子をワクシニアＴＫ座に組換えるのに用いる。４８６Ｈ６３４０プラスミドの２８２０ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ  ｐＳＤ５４２プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを５４２．３４０と称した。
【０２３０】
２４ＢＸＬＦ２．４２の２１５０ｂｐ  ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ断片を、ＳｍａＩ／ＢｇｌＩＩ５４２．３４０プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを５４２．３４０ｇＨと称した。
【０２３１】
ＳＰ１３１ｇＢプラスミドの２７００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ＢｇｌＩＩ５４２．３４０ｇＨプラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをＥＢＶトリプル１と称した。ＥＢＶトリプル１中に挿入されたＥＢＶコード領域の遺伝地図を第８図に示す。第８図の矢印により、転写方向を示す。
【０２３２】
ＥＢＶトリプル１プラスミドをＮｏｔＩにより切断し、ＮＹＶＡＣまたは３つのＨＢＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースのワクシニア組換え体に感染したベロ細胞中にトランスフェクションせしめた。対応する組換えワクシニアウイルスｖＰ９４４およびｖＰ９４１を単離した。
【実施例１２】
【０２３３】
２型単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ＨＳＶ２  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを構築した。
【０２３４】
細胞およびウイルス
ＨＳＶ  ２（菌株Ｇ）をベロ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）中で増殖せしめ、スクロース勾配での遠心分離により精製した（ポウエルら、1975）。
【０２３５】
ワクシニアウイルス（コペンハーゲン）およびそれから誘導された組換え体を前述したようにベロ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８１）中で増殖せしめた（パニカリら、1982；グオら、1989）。
【０２３６】
ＨＳＶ２  ｇＢ遺伝子の単離
ＨＳＶ２  ｇＢ遺伝子を含有する１２ｋｂ  ＢｇｌＩＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノムＤＮＡから単離し、ｐＳＤ４８  ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入した。産生したプラスミドをｐＪ４と称した。
【０２３７】
次いでｇＢ遺伝子をワクシニアウイルスのフランキングアーム間にクローニングした。これは、ｐＪ４の２，７００ｂｐ  ＳｓｔＩＩ−ＳａｃＩ（部分的）断片をｐＭＰ４０９ＤＶＣのＳｓｔＩＩ−ＳａｃＩ断片中にクローニングすることにより達成された（グオら、1989）。これはＭ２Ｌ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間にｇＢ遺伝子を配した。この操作により産生されたプラスミドをｐＧＢ１と称した。
【０２３８】
次いでインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）終止コドンをｇＢ遺伝子の３′末端に加えた。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＢＬ３（配列認識番号６９）５′−ＣＴＡＡＴＡＧ−３′およびＧＢＬ４（配列認識番号７０）５′−ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴ−３′をｐＧＢ１の６，３００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ（部分的）断片中にクローニングすることにより達成された。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢ２と称した。
【０２３９】
次いでワクシニアウイルスＨ６プロモーター（テイラーら、1988ａ；パーカスら、1989）をｇＢ遺伝子の上流にクローニングした。これは、Ｈ６プロモーターを含有する、ｐＢＬＶＨ１４の３７０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片（ポーテテレら、1991）をｐＧＢ２のＢｇｌＩＩ中にクローニングすることにより達成された。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢ３と称する。
【０２４０】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＢ遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＢＬ１（配列認識番号７１）
【化４４】
0003624911.tif 000046
【０２４１】
およびＧＢＬ１（配列認識番号７２）
【化４５】
0003624911.tif 000047
【０２４２】
をｐＧＢ３の６，３００ｂｐ  ＳｓｔＩＩ−ＥｃｏＲＶ（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢ５と称した。
【０２４３】
次いでＨ６プロモートしたｇＢ遺伝子を異なるワクシニアウイルス供与体プラスミド中にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子を含有する、ｐＧＢ５の２，８００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５１３ＶＣＶＱのＢｇｌＩＩ部位中にクローニングすることにより行なった。（ｐＳＤ５１３ＶＣＶＱは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子がポリリンカー領域により置換されたワクシニアウイルスＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ断片のサブクローンである。）これにより、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子をｔｋ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢ６と称した。
【０２４４】
ＨＳＶ２  ｇＣ遺伝子の単離
ＨＳＶ２  ｇＣ遺伝子を含有する、２，９００ｂｐ  ＳａｌＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノムＤＮＡから単離し、ｐＩＢＩ２５のＳａｌＩ部位に挿入した。産生したプラスミドをｐＧＣ３と称した。
【０２４５】
次いでｇＣ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアーム間にクローニングした。これは、ｐＧＣ３の２，９００ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＧＣ２のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより達成された。Ｈ６プロモーターを含有する、ｐＢＬＶＨ１４の３７０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片（ポーテテレら、1991）を、ｐＳＤ４８６のＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることによりｐＧＣ２を産生した（第２図）。これにより、ｕ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間にｇＣ遺伝子を配した。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣ５と称した。
【０２４６】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＣ遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＣＬ１（配列認識番号７３）
【化４６】
0003624911.tif 000048
【０２４７】
およびＧＣＬ２（配列認識番号７４）
【化４７】
0003624911.tif 000049
【０２４８】
を、ｐＧＣ５の５，４００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＳｆｉＩ断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣ１０と称した。
【０２４９】
次いでｐＧＣ１０から、外来の３′−非コード配列を除去した。これは、ｐＧＣ１０の４，９００ｂｐ  ＳａｌＩ−ＳｍａＩ（部分的）断片が満たされたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を再び環状とすることにより行なわれた。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣ１１と称した。
【０２５０】
次いでさらに３′−非コード配列をｐＧＣ１１から除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＣＬ３  ５′−ＣＴＡＧＧＧＣＣ−３′をｐＧＣ１１の４，９００ｂｐ  ＸｂａＩ−ＡｐａＩ（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣ１２と称した。
【０２５１】
ＨＳＶ２  ｇＤ遺伝子の単離
ＨＳＶ２  ｇＤ遺伝子を含有する、７．５ｋｂ  ＸｂａＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノムＤＮＡから単離し、ｐＩＢＩ２５のＸｂａＩ部位に挿入した。産生したプラスミドをｐＧＤ１と称した。
【０２５２】
次いでｇＤ遺伝子をＨ６プロモーターの下流とワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｐＧＤ１の１，５００ｂｐ  ＤｒａＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＴＰ１５の３，７００ｂｐ  ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローニングすることにより行なった（グオら、1989）。これにより、ｇＤ遺伝子をＨ６プロモーターの下流とＨＡ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生したプラスミドをｐＧＤ２と称した。
【０２５３】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＤ遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＤＬ１（配列認識番号７５）
【化４８】
0003624911.tif 000050
【０２５４】
およびＧＤＬ２（配列認識番号７６）
【化４９】
0003624911.tif 000051
【０２５５】
を、ｐＧＤ２の５，１００ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＡｈａＩＩ（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＤ５と称した。
【０２５６】
次いで外来の３′−非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＤＬ３（配列認識番号７７）
【化５０】
0003624911.tif 000052
【０２５７】
およびＧＤＬ４（配列認識番号７８）
【化５１】
0003624911.tif 000053
【０２５８】
をｐＧＤ５の４，８００ｂｐ  ＮａｅＩ−ＰｓｔＩ断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＤ７と称した。
【０２５９】
次いで追加の配列をＨ６プロモーターの上流に加えた。これは、ｐＧＢ６の１５０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片（上記参照）をｐＧＤ７の４，８００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＤ８と称した。
【０２６０】
ＨＳＶ２  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するワクシニアウイルス供与体プラスミドの構築
ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するプラスミドを構築した。これは、Ｈ６プロモートしたｇＣ遺伝子を含有する、１，８５０ｂｐ  ＰｓｔＩ断片を、ｐＧＤ８のＰｓｔＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＣＤ１と称した。
【０２６１】
次いでｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するプラスミドを構築した。これは、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子を含有する、ｐＧＢ６の２，８００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＧＣＤ１の６，８００ｂｐ  ＢａｍＨＩ（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢＣＤ１と称した。
【０２６２】
次いで外来のＤＮＡを除去した。これは、Ｈ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する、ｊｐＧＢＣＤ１の６，０００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（部分的）断片が満たされたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を、ｐＭＰ８３１のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＧＢＣＤＣ１と称した。
【０２６３】
次いでＨ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアーム間にクローニングした。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＳＶＬ１（配列認識番号７９）５′−ＴＣＧＡＴＣＴＡＧＡ−３′およびＨＳＶＬ２（配列認識番号８０）５′−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡ−３′、並びにＨ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する、ｐＧＢＣＤＣ１の５，７００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ（部分的）断片を、ｐＳＤ５４１の３，６００ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片中にクローニングすることにより行なった。これにより、Ｈ６プロモートしたｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を、ＡＴＩ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生されたプラスミドをｐＧＢＣＤ４と称した。
【０２６４】
ｖＰ９１４の構築
ＨＳＶ２  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する、ワクシニアウイルス組換え体、ｖＰ９１４を構築した。ワクシニアウイルス組換え体を構築するのに用いた工程は以前に記載している（パニカリら、1982；グオら、1989；グオら1990）。ｐＧＢＣＤ４をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションすることにより、ワクシニアウイルス組換え体、ｖＰ９１４を産生した。この組換え体のＨＳＢ２遺伝子は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの転写制御下にある。
【０２６５】
ｖＰ９１４感染細胞の蛍光抗体法および免疫沈降
前述したように、蛍光抗体法および免疫沈降を行なった（グオら、1989）。ＨＳＶ２に対する家ウサギ抗血清をダコ社（コード番号Ｂ１１６）から得た。ＨＳＶ２  ｇＢ（Ｈ２３３）およびＨＳＶ２  ｇＤ（ＨＤ１）に対する単クローン性抗体（メイグニアら、1987）を、Ｂ．メイグニア（フランス、リヨン、インスティテュートメリオクス）から得た。
【０２６６】
ＨＳＶ２感染細胞において、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ（他のＨＳＶ２糖タンパク質と同様に）は細胞表面上に発現される。ＨＳＶ２  ｇＢ（Ｈ２３３）およびＨＳＶ２  ｇＤ（ＨＤ１）に特異的な単クローン性抗体を使用した、ｖＰ９１４感染細胞に関する蛍光抗体法により、これらの細胞中で産生されたＨＳＶ２  ｇＢおよびｇＤ糖タンパク質はまた細胞表面に発現されることが示された。
【０２６７】
ＨＳＶ２感染細胞において、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤは、それぞれ約１１７ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５１ｋＤａの分子量を有する（マースデンら、1987；マースデンら、1984；ツウェイグら、1983）。ｖＰ９１４感染細胞のｇＢ特異的単クローン性抗体（Ｈ２３３）による免疫沈降により、約１１７ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび１００ｋＤａの分子量を有する３つの主要なタンパク質、並びに他の少量のタンパク質が沈殿した。ｇＤ特異的単クローン性抗体（ＨＤ１）による免疫沈降により、約５１ｋＤａの分子量を有する主要なタンパク質および約５５ｋＤａと４６ｋＤａの分子量を有する少量のタンパク質が沈殿した。加えて、ｖＰ９１４感染細胞のＨＳＶ２に対する多クローン性抗血清による免疫沈降により、ｇＣに同様の６３ｋＤａの分子量を有するタンパク質（８５ｋＤａタンパク質と同様）およびサイズでｇＢとｇＤに対応するタンパク質が沈殿した。それゆえ、ｖＰ９１４に感染した細胞は、ｇＢ、ｇＣおよびｇＤと同一の分子量を有するＨＳＶ２タンパク質を発現するように思われた。
【実施例１３】
【０２６８】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ＤＮＡクローニングおよび合成
プラスミドを構築し、スクリーニングし、標準方法により増殖せしめた（マニアチスら、1982；パーカスら、1985；ピッチーニら、1987）。制限エンドヌクレアーゼを、ベセスダリサーチラボラトリーズ（ＭＤ、ゲイサースブルグ）、ニューイングランドバイオラボ（ＭＡ、ビバーリー）、およびベーリンガーマンハイムバイオケミカルス（ＩＮ、インディアナポリス）から得た。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼをベセスダリサーチラボラトリーズから得た。プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚをプロメガ（ＷＩ、マジソン）から得た。ｐＢＲ３２２中にクローニングされたＨＢＶゲノムを含有するプラスミドｐＴＨＢＶの起源は以前に記載されている（パオレッティら、1984）。
【０２６９】
合成オリゴブオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ８７５０またはアプライドバイオシステム３８０Ｂ  ＤＮＡシンセサイザーにより調製した（パーカスら、1989）。前述したように（グオら、1989）、シーケナーゼ（タバーおよびリチャードソン、1987）を用いたジデオキシ鎖終止法（サンガーら、1977）により、ＤＮＡ塩基配列決定を行なった。自動パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラー中で注文合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびジェネアンプＤＮＡ増幅試薬キット（ＣＴ、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、クローニングと配列確認（エンゲルケら、1988）のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅を行なった。
【０２７０】
ウイルスおよびトランスフェクション
ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ菌株およびその中間祖先、ｖＰ８０４（第５図）を用いた。組換えウイルスの産生と加工は前述したようなものである（パニカリら、1982）。
【０２７１】
免疫沈降
ベロ細胞を、細胞当たり１０ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で、組換えワクシニアウイルス、ＮＹＶＡＣ親ウイルス（ｖＰ８６６）に感染せしめたか、または疑似感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を除去して、感染細胞に35Ｓメチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するメチオニン不含有培地を添加した。全ての試料を感染８時間後に収集した。試料を、トリトンを含有する３×緩衝液Ａおよび５０ｕｌのアプロチニン（ＭＯ、セントルイス、シグマケミカル社、＃Ａ６２７９）を含有するＤＯＣ（３％  ＮＰ−４０、３％  トリトン、３％  ＤＯＣ、３０ｍＭ  トリスｐＨ７．４、４５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  ＮａＡｚｉｄｅ、０．６ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）中に溶解せしめた。全ての溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに連結した通常の家ウサギ血清に対して前浄化した。
【０２７２】
ＨＢＶコア抗原とＨＢＶ  Ｓ２ペプチド（ａａ１２０−１５３）に対して生じた家ウサギ抗血清をＲ．ニューラスから得た（ニューヨーク血液センターのリンドスレーＦキンボールリサーチインスティテュート）。抗Ｓ２抗血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着せしめた。電気泳動と続いてのオートラジオグラフィーのために、ＨＢＶタンパク質を、抗コアまたは抗Ｓ２抗血清を用いて免疫沈降を行ない、２×ラエムリ試料緩衝液（ラエムリ、1970）中で再懸濁せしめた。
【０２７３】
血清学
家ウサギおよびモルモットに、皮内、皮下または筋肉内の経路により、２つずつ１０8 ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種せしめた。最初の接種から６週間後、同じ経路と接種量で家ウサギに追加抗原投与した。最初の接種から７週間後、同じ経路と接種量でモルモットに追加抗原投与した。１２匹のマウスの群に、皮内、皮下または筋肉内の経路により、１０7 ｐｆｕの組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種せしめた。最初の接種から７週間後、同じ経路と接種量でマウスに追加抗原投与した。１週間ごとに血清を採取した。マウスの各群から毎週採血した。ＡＵＳＡＢラジオイムノアッセイキット（ＩＬ、北シカゴ、アボット）を用いて全ての血清をＨＢＶ表面抗原に対する抗体に関して分析した。標準技術を利用したＣＯＲＡＢコンペティティブラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いてＨＢＶコア抗原に対する抗体に関して分析した。
【０２７４】
ｖＰ９１９の構築
ワクシニア組換え体ｖＰ９１９は、ＮＹＶＡＣワクシニアウイルスベクターに挿入されたＢ型肝炎からの３つの遺伝子を含有している。この遺伝子は、ウイルスの３つの異なった部位に個々に挿入された。３つのＨＢＶ遺伝子は以下のタンパク質産生物をコードする：（１）ＨＢＶ  Ｍタンパク質、（ここではスモールプレＳ抗原、またはｓｐｓＡｇと称した）、（２）ＨＢＶ  Ｌタンパク質（ここではラージプレＳ抗原、またはｌｓｐＡｇと称した）、（３）コア抗原のアミノ末端に連結した完全なプレＳ領域（Ｓ１＋Ｓ２）からなる融合タンパク質、（ここではＳ１２／コアと称した）。
【０２７５】
ワクシニアウイルスは、単一ワクシニアゲノム中に連続して挿入された同一の非相同ＤＮＡ配列の多重コピーを保持しない（パニカリら、1982）。ｓｐｓＡｇのコード配列はｌｐｓＡｇのコード配列内に含有されるので、単一ワクシニアゲノムへの両方の遺伝子の挿入によりゲノムが不安定となると思われる。同様に、ハイブリッドＳ１２／コア遺伝子中に存在するＳ１＋Ｓ２  ＤＮＡ領域ｌｐｓＡｇの等量のＳ１＋Ｓ２領域との組換えを経る。潜在的な問題は２つの方法で防いだ。（１）３つの遺伝子は、必須遺伝子を含有するワクシニアＤＮＡの大きな領域により互いに離れたワクシニアゲノム中の３つの異なる座に挿入した。それゆえ、ＨＢＶ遺伝子間のいかなる組換えによっても、生存可能なワクシニア後代を産生しない不完全なワクシニアゲノムとなる。（２）ｓｐｓＡｇ遺伝子とＳ１２／コアハイブリッド遺伝子のＳ１＋Ｓ２領域をコードするＤＮＡを、ｌｐｓＡｇをコードする原生ＨＢＶ遺伝子と互いとのＤＮＡ相同性を最小限とする異なるコドンの用法で化学的に合成した。ｌｐｓＡｇをコードする原生ＨＢＶ遺伝子とｓｐｓＡｇをコードする合成遺伝子は、ａｙｗ亜型である；融合Ｓ１２／コア遺伝子のＳ１＋Ｓ２領域をａｄｗ２亜型に対応するように合成した（バレンズエラら、1979）。
【０２７６】
ポックスウイルスプロモーターの制御下で３つのここのＨＢＶ遺伝子を含有するカセットを、異なるワクシニア供与体プラスミド中で組み立てて続いて以下に記載するようにワクシニアウイルスに挿入した。
【０２７７】
ＨＢＶ  ｓｐｓＡｇをコードする遺伝子の合成型を、以下の改変によるワクシニアに好ましいコドンを用いて合成した。（１）ｓＡｇ（ＨＢＶ  Ｓタンパク質）のアミノ酸１９から２１に生じたＴ５ＮＴ初期転写終止ＴＴＴＴＴＣＴをＴＴＣＴＴＴＣに改変し、他のＴ５ＮＴ終止シグナルを産生しないようにコドンの用法を調整した（ユエンら、1987）。（２）潜在的な変型翻訳産生物を避けるために、いずれの方向にもフレームＡＴＧ開始コドンからの産生を防ぐようにコドンの用法を調整した。合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を、改変ワクシニアウイルスＨ６初期／晩期プロモーターに正確に連結した（パーカスら、1989）。プロモーターと遺伝子の完全な配列を第９図に示す。アミノ酸配列は、プラスミドｐＴＨＢＶ中に配列に基づき、これはＳ２領域の２つのアミノ酸位置：ガリバート、ａａ  ３１  ｔｈｒ；ａａ  ３６  ｌｅｕ；ｐＴＨＢＶ、ａａ  ３１  ａｌａ；ａａ  ３６  ｐｒｏで発表されているａｙｗ配列とは異なる（ガリバートら、1979）。
【０２７８】
プラスミドｐＧＪ１５は、ワクシニアＡＴＩ挿入座にＨ６プロモーター／合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有している（パーカスら、1990）。ｐＧＥＭ−３Ｚ中の合成ｓｐｓＡｇ遺伝子の部分を組み立て、組み立てた遺伝子を、ＡＴＩ欠損座に合成Ｈ６プロモーターを含有するｐＳＤ４９２の誘導体である、挿入プラスミドｐＭＰ４９４Ｈに運搬することによりｐＧＪ１５を構築した。
【０２７９】
ここで第１０図を参照する。合成ＨＢＶ  ｓｐｓＡｇを３つの部分で組み立てた。プラスミドｐＧＪ５、ｐＧＪ３、およびｐＧＪ７を、以下のようにそれぞれ相補オリゴヌクレオチドの６、５、および８対からそれぞれ産生した。標準化学物質により合成した相補オリゴヌクレオチド対を、標準条件下で、６５℃に加熱し、アニーリンクに効果のあるように室温までゆっくりと冷却することによりキナーゼした。各断片からなるアニールした対のアリコートを、適切に切断したｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ）と組み合わせ、標準条件下で連結した。ＳｐｈＩおよびＸｂａＩ制限部位により制限された断片ＳＸ（黒塗りの四角で示す）を、プラスミドｐＧＪ５を産生するそれらの酵素で切断したｐＧＥＭ−３Ｚベクタープラスミドと連結した。ベクタープラスミド配列を開いた領域で示す。同様に、断片ＸＢ（斜線）とＢＨ（横線）を、それぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩ、またはＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩのいずれかで切断したプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ中で組み立て、プラスミドｐＧＪ３およびｐＧＪ７を産生した。各プラスミド中の挿入の完全性を、ＤＮＡ配列の決定により確認した。
【０２８０】
ＳＸ、ＸＢおよびＢＨ遺伝子断片を側腹に有する適切な制限酵素でプラスミドｐＧＪ５、ｐＧＪ３およびｐＧＪ７を切断することにより合成ＨＢＶ遺伝子断片を単離し、続いてＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＧＥＭ−３Ｚに連結し、連続ＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ配列を含有するプラスミドｐＧＨ９を産生した。開始メチオニンから最初のコドンより９ｂｐ下流のＥｃｏＲＩ部位で合成ｐｓｐＡｇに付加されたＨ６プロモーターの３′２８ｂｐ（斜線）を含有するオリゴヌクレオチドＨ６ＬＩＮＫ（配列認識番号８１）
【化５２】
0003624911.tif 000054
【０２８１】
およびＨ６ＬＩＮＫ２（配列認識番号８２）
【化５３】
0003624911.tif 000055
【０２８２】
を、ＫｐｎＩ（ｐＧＥＭ−３Ｚから誘導された多重クローニング領域内の５′からＳｐｈＩ部位）とＥｃｏＲＩで切断したｐＧＪ９と連結し、プラスミドｐＧＪ１２を産生した。ＮｒｕＩ／ＨｐａＩ断片をｐＧＨ１２から単離して、同様に切断したｐＭＰ４９４Ｈに連結し、プラスミドｐＧＪ１５を産生した。ｐＭＰ４９４Ｈは、ＡＴＩ欠損領域にワクシニアＨ６プロモーターを含有するＡＴＩ挿入プラスミドである。ｐＧＪ１５は、ＡＴＩ座を囲うワクシニア配列（点領域）によりフランクされたＨ６プロモータードリブンＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有している。
【０２８３】
ワクシニア組換え体ｖＰ８０４との組換えの供与体プラスミドとしてｐＧＪ１５を用いて組換え体ワクシニアウイルスｖＰ８５６を産生した。ｖＰ８０４は、ＴＫ、ＨＡ、ｕおよび［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］のＮＹＶＡＣ欠損を含有する。組換えウイルスｖＰ８５６は、ＡＴＩ領域を置換したＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を挿入した上述欠損を含有する。以下に記載するＩ４Ｌ領域中に挿入を含有する後代ウイルス組換え体は、欠損に関してＮＹＶＡＣと等量である（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、Ｉ４Ｌ、ｕ、［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］）。
【０２８４】
ＨＢＶ  ｌｐｓＡｇをコードする遺伝子をプラスミドｐＴＨＢＶから誘導した。上述したＳ２領域のアミノ酸変化に加えて、ｐＴＨＢＶは、Ｓ１領域の１つのアミノ酸位置での発表されたａｙｗ亜型とは異なる：ガリバートら、1979、ａａ  ９０  ｓｅｒ；ｐＴＨＢＶ  ａａ９０  ｔｈｒ。上述したｓＡｇ中の初期翻訳終止シグナルを、ＴＴＴＴＴＣＴからＴＴＣＴＴＣＴに改変した。１０５ｂｐ  牛痘ｕプロモーターの制御下で、完全なｌｐｓＡｇ遺伝子を配した（ピカップら、1986）。ｕプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子カセットを第１１図に示す。
【０２８５】
プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓは、ワクシニアＩ４Ｌ欠損座にｕプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子を含有している。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓの構築を第１２図に模式的に示す。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ中のＩ４Ｌ欠損は、ＮＹＶＡＣ中のＩ４Ｌ欠損と等量である。
【０２８６】
ここで第１２図の（Ａ）を参照する。合成オリゴヌクレオチドプライマーＭＰＳＹＮ３２２（配列認識番号８３）、ＭＰＳＹＮ３２３（配列認識番号８４）およびテンプレートプラスミドｐＢＳｃｏｗを使用するＰＣＲにより、ＨＢＶ  ｌｐｓＡｇ遺伝子の５′末端を牛痘ｕプロモーター（矢印で示した方向）に加え、ｐＭＰｕＳ１を産生した。（黒い四角がｕプロモーターを示し、線の四角がＨＢＶ配列を示す。）ｐＳＤ５５０は、Ｉ４Ｌ欠損領域のワクシニア挿入プラスミドである。（三角形は欠損の部位を示し、四角はワクシニア配列を示す。）ｕプロモーター／ＨＢＶ接合部を含有するＳｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離し、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＳＤ５５０に挿入して、ｐＭＰ５５０ｕを産生した。
【０２８７】
ここで第１２図（Ｂ）を参照する。完全ＨＢＶ  ｌｐｓＡｇを含有する１．１ｋｂ  ＤｒａＩ断片をｐＴＨＢＶから単離し、ｐＵＣ８中に挿入し、ｐＭＰ８Ｓを形成した。翻訳開始コドンおよび終止コドンを示す。（＊）はＴ５ＮＴ転写終止シグナルの部位を示す（ユエンら、1987）。示したようにＰＣＲ突然変異誘発により転写終止シグナルをｐＭＰ８Ｓから除去し、ｐＭＰ８ＳＴを産生した。ｌｐｓＡｇのバルクを含有する１．１ｋｂ  ＢａｍＨＩ（部分的）断片をｐＭＰ８ＳＴから単離して、ＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＭＰ５５０ｕに挿入し、ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓを産生した。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓはワクシニア組換え体ｖＰ８５６との組換えに用いて、ｖＰ８９６を産生した。合成オリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：
ＭＰＳＹＮ３２２（配列認識番号８３）
【化５４】
0003624911.tif 000056
【０２８８】
ＭＰＳＹＮ３２３（配列認識番号８４）
【化５５】
0003624911.tif 000057
【０２８９】
ＭＰＳＹＮ３３０（配列認識番号８５）
【化５６】
0003624911.tif 000058
【０２９０】
ＭＰＳＹＮ３３１（配列認識番号８６）
【化５７】
0003624911.tif 000059
【０２９１】
ＭＰＳＹＮ３２２（配列認識番号８３）のＨＢＶ開始コドンに下線を引き、ＭＰＳＹＮ３３１（配列認識番号８６）の変異した塩基にも下線を引き、制限部位を表示した。
【０２９２】
上述したように救助ウイルスｖＰ８５６により組換えの供与体プラスミドとしてｐＭＰ５５０ｕｌｐｓを用いて組換えウイルスｖＰ８９６を産生した。ｖＰ８９６は、ＮＹＶＡＣのバックグラウンド（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、Ｉ４Ｌ、ｕ、［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠損）にＨＢＶ  ｓｐｓＡｇおよびＨＢＶ  ｌｐｓＡｇの両方の遺伝子を含有している。多価ＨＢＶワクシニア組換え体との比較目的のためにＨＢＶ  ｌｐｓＡｇ遺伝子のみを含有する組換え体を産生するために、ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）との組換えにｐＭＰ５５０ｕｌｐｓを用いて、組換えウイルスｖＰ８９７を産生した。
【０２９３】
ワクシニアウイルスに挿入された３番目のＧＢＶ遺伝子は融合タンパク質をコードする。ＨＢＶ  Ｓ１およびＳ２領域を特定する合成ＤＮＡを、ＨＢＶコア抗原を特定する遺伝子の５′末端にクローニングした。ａｄｗ亜型のＳ１＋Ｓ２領域をコードし（バレンズエラら、1979）、ａａ位置１２のｍｅｔ（ａｙｗ亜型の位置１に等しい）により開始するように合成ＤＮＡを設計した（ガリバートら、1979）。Ｓ１＋Ｓ２の合計翻訳領域は１６３コドンである。多価ＨＢＶワクシニア組換えウイルス中のＨＢＶ遺伝子の中で望ましくない分子内組換えを防ぐために、ｐＴＨＢＶ中に存在する原生ａｙｗＳ１＋Ｓ２領域を有する合成Ｓ１＋Ｓ２領域、並びにｐＧＪ１５中の合成Ｓ２領域のＤＮＡ相同性を最小限にするためにコドンの用法を調整した。
【０２９４】
コア抗原をコードする全縁遺伝子をｐＴＨＢＶから得た。ｐＴＨＢＶによりコードされたコア抗原のアミノ酸配列は発表されたａｙｗ配列と一致する（ガリバートら、1979）。ワクシニアＩ３Ｌ初期／中間プロモーターの制御下でＳ１２／コアをコードする肝炎融合遺伝子を配した（フォスら、1988；ゲーベルら、1990ｂ位置６４，９７３−６５，０７４）。Ｉ３Ｌプロモーター／Ｓ１２／コア遺伝子カセットの全縁配列を第１３図に示す（配列認識番号８７）。
【０２９５】
プラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃは、ＨＡ欠損座にＩ３Ｌプロモーター／Ｓ１＋Ｓ２／コア遺伝子を含有している（グオら、1989）。ｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃの構築を第１４図に模式的に示す。
【０２９６】
ここで第１４図を参照する。プラスミドｐＭＰＣＡ−Ｂは、ｐＵＣ９のＳｍａＩ部位に挿入されたｐＴＨＢＶからの１ｋｂ  ＨｈａＩ断片を含有している。ｐＭＰ９ＣＡ−Ｂは、ＨＢＶコア抗原、並びに遺伝子の上流と下流のフランキングＨＢＶ  ＤＮＡの全縁コード配列を含有している。ｐＭＰ９ＣＡ−Ｂを、遺伝子の３′末端から３０ｂｐ上流のＢｇｌＩＩ（部分的）およびＨＢＶ／ｐＵＣ接合部でのポリリンカー領域のＥｃｏＲＩで切断した。ＨＢＶ遺伝子のバルクを含有する３．４ｋｂベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２７５（配列認識番号８８）
【化５８】
0003624911.tif 000060
【０２９７】
およびＭＰＳＹＮ２７６（配列認識番号８９）
【化５９】
0003624911.tif 000061
【０２９８】
と連結し、ｐＭＰ９ＣＡ−Ｃを産生した。制限部位を表示し、翻訳終止コドンに下線を引き、初期ワクシニア転写ターミネーターには上に線を引いた。
【０２９９】
ｐＭＰ９ＣＡ−Ｃは、ＨＢＶコア抗原の全縁コード配列を含有し、上述したように遺伝子のバルクの供給源として用いた。
【０３００】
以下に示すように、合成オリゴヌクレオチド、ＭＰＳＹＮ２９０からＭＰＳＹＮ３０８（配列認識番号９０）−（配列認識番号９９）を用いて上述したような５つの二本鎖セクションＡからＥにおいて合成Ｓ１＋Ｓ２領域を組み立てた。オリゴヌクレオチドは、４から８ｂｐの付着末端とともに、４６ｍｅｒから７１ｍｅｒのサイズに亘った。セクション内の内部位置にあるオリゴヌクレオチドの５′末端は、セクションをアニールする前にキナーゼした。セクションＡからＥを構築するのに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。コード鎖のみを示す。関連制限部位を示す。Ｓ１（セクションＡ）、Ｓ２（セクションＣ）およびコア（セクションＥ）の開始コドンに下線を引いた。
【化６０】
0003624911.tif 000062
【化６１】
0003624911.tif 000063
【０３０１】
テンプレートとして、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉのサブクローンである、ｐＭＰ１、およびＰＣＲプライマーとして合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３１０（配列認識番号１００）、ＭＰＳＹＮ３１１（配列認識番号１０１）を用いて、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターを合成した。制限部位を示す。
【化６２】
0003624911.tif 000064
【０３０２】
Ｉ３プロモーター／ＨＢＶ  Ｓ１＋Ｓ２／コア発現カセットを上述した中間プラスミドクローンを用いて段階でｐＵＣ８とｐＵＣ９において組み立て、ｐＭＰ９Ｉ３Ｓ１２コアを産生した。関連する場合のみに制限部位を示す。プラスミドｐＭＰ９Ｉ３Ｓ１２コアをＳｍａＩで切断し、全縁プロモーター／遺伝子カセットを含有する１．２ｋｂ断片を単離した。ワクシニアＨＡ欠損プラスミドｐＳＤ５４４をＳｍａＩで切断し、１．２ｋｂ断片と連結してプラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを産生した。
【０３０３】
ｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを、上述したワクシニア組換え体ｖＰ８９６との組換えの供与体プラスミドとして用いて、組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を産生した。ｖＰ９１９は、ＮＹＶＡＣバックグラウンド中に全て３つのＨＢＶ挿入物：ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇおよびＳ１２コア融合を含有する。ｖＰ９１９中の全てのＨＢＶ挿入物の配列は、テンプレートとしてｖＰ９１９を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、続いてのＰＣＲ産生物質のジデオキシ配列決定により確認した。加えて、上述したようにｖＰ８０４との組換えにおいて、ｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを用いて、ＨＢＶ  Ｓ１２／コア融合のみを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５８を産生した。また組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６との組換えにｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃを用いて組換えワクシニアウイルスｖＰ８９１を産生した。ｖＰ８９１は、２つのＨＢＶ遺伝子挿入物、ｓｐｓＡｇおよびＳ１２／コアを含有している。
【０３０４】
ｖＰ９１９によるＨＢＶタンパク質の発現
三重ＨＢＶ組換え体により合成された様々なＨＢＶタンパク質をアッセイするために、ｖＰ９１に感染した代謝標識した溶解産物および一重と二重ＨＢＶ遺伝子挿入物を含有する適切なワクシニア組換え体に、免疫沈降を施し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラフィーにより分析した。未感染細胞と、ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）、ｖＰ８５６（ｓｐｓＡｇ）、ｖＰ８９６（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ）またはｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇ、Ｓ１２／コア）に感染した細胞中のタンパク質を家ウサギ抗Ｓ２抗血清を用いて免疫沈降した。さらに未感染細胞と、ｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇ、Ｓ１２／コア）、ｖＰ８５８（Ｓ１２／コア）またはｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）に感染した細胞中のタンパク質を家ウサギ抗コア抗血清を用いて免疫沈降した。抗Ｓ２血清は、ｓｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体ｖＰ８５６からの３３ｋＤａの主要タンパク質を沈殿せしめた。これは、ＨＢＶ  ｓｐｓＡｇの単独にグリコシル化した形状に予期したサイズに対応する。ｓｐｓＡｇの二重にグリコシル化した形状に予期されるサイズに対応するタンパク質３６ｋＤａは少量沈殿した。抗Ｓ２血清は、ｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア二重組換え体ｖＰ８９６からの同一のタンパク質を沈殿せしめる。加えて、ｌｐｓＡｇの予期したサイズに良好に対応する（３９ｋＤａ未グリコシル化および４２ｋＤａグリコシル化）３８と４１ｋＤａの２つの大きなタンパク質が沈殿する。ｖＰ８５６とｖＰ８９６からの抗Ｓ２血清により沈殿した全てのタンパク質はまた、ワクシニアＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９からも沈殿する。
【０３０５】
ＨＢＶ  Ｓ１２／コア融合タンパク質の予期したサイズは３８ｋＤａである。家ウサギ抗コア抗血清は、予期したサイズのタンパク質、並びに、ＨＢＶ融合遺伝子Ｓ１２／コアを含有するワクシニア単独組換え体である、ｖＰ８５８からの様々な小さなタンパク質を沈殿せしめた。抗コア血清によりｖＰ８５８から沈殿した最も豊富なタンパク質は、２７ｋＤａのサイズを有した。これは、融合タンパク質遺伝子が２番目の（Ｓ２）ＡＴＧまで開始する場合に予期される翻訳産生物にサイズで対応する。ｖＰ８５８から沈殿した２９ｋＤａタンパク質は、２７ｋＤａタンパク質のグリコシル化された形状である。コアタンパク質のみの翻訳産生物にサイズで対応する２０ｋＤａの小さなタンパク質もまた、少量ｖＰ８５８から沈殿した。３つのＨＢＶ遺伝子全て（ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇおよびＳ１２／コア融合）を含有するワクシニア組換え体ｖＰ９１９は、抗コア抗血清による免疫沈降によりｖＰ８５８に観察された模様と同一の模様を与えた。抗コア抗血清によりｖＰ８５８とｖＰ９１９から沈殿した２７ｋＤａおよび２９ｋＤａタンパク質もまた予期したように、抗Ｓ２抗血清によりｖＰ９１９から沈殿した。
【０３０６】
ｖＰ９１９に対する抗体応答
ｖＰ９１９により産生されたＨＢＶタンパク質に対する血清学的応答を試験するために、ウイルスを家ウサギ、モルモットおよびマウスに接種した。家ウサギとモルモットには皮内、皮下および筋内経路により、１０8 ｐｆｕで２セットの組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種した。最初の接種から６週間後、家ウサギに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。最初の接種から７週間後、モルモットに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。１２匹のマウスの群に皮内、皮下および筋内経路により、１０7 ｐｆｕで組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９を接種した。最初の接種から７週間後、マウスに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。血清を１週間ごとに採取した。マウスの群のそれぞれから１週間の出血を集積した。ＡＵＳＡＢラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いてＨＢＶ表面抗原に対する抗体について、全ての血清を分析した。ＣＯＲＡＢ比較ラジンイムノアッセイキット（アボット）を用いてＨＢＶコア抗原に対する抗体に関して、全ての血清を分析した。標準技術を用いてアッセイを行なった。これらの分析の結果を表２（家ウサギ）、３（モルモット）および４（マウス）に示す。
【０３０７】
表２に示した結果を要約すると、６匹の家ウサギは全て、１度のｖＰ９１９の接種の後に抗コア抗体応答を示した。６匹のうち５匹の家ウサギにおいて、抗コア抗体応答は、ｖＰ９１９の２度の接種により追加抗原投与された。６匹のうち４匹の家ウサギは、１度のｖＰ９１９の接種の後に抗ｓＡｇ応答を示した。これらの４匹の家ウサギと追加の１匹のウサギは、２度の接種の後に抗ｓＡｇ応答の増大を示した。
【０３０８】
表３に示した結果を要約すると、１匹のモルモットは、最初のｖＰ９１９の接種後に抗コア応答を示し、７週間後の追加抗原投与後には合計３匹のモルモットが抗コア応答を示した。３匹のうち１匹が８週間後に抗ｓＡｇ抗体応答を示した。
【０３０９】
表４の結果を要約すると、マウスの３つの群は全てｖＰ９１９の接種後様々な時期に抗コア抗体応答を示、３つの群のうち２つの群が抗ｓＡｇ応答を示した。
【０３１０】
ＡＵＳＲＩＡアッセイ
ＨＢＶ含有ポックスウイルス組換え体に感染した細胞からの微粒子ＨＢＶ表面抗体の発現を、市販されているＡＵＳＲＩＡ  ＩＩ−１２５キット（ＩＬ、ノースシカゴ、アボットラボラトリーズ）を用いてアッセイした。２×１０6 のベロ細胞を含有するディッシュに、２ｐｆｕ／細胞で３重に組換えワクシニアウイルスで感染せしめた。２４時間後、培養培地を除去し、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、洗浄物を培地と組合せ、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを培地分画と称した。２ｍｌのＰＶＳをディッシュに加え、細胞を削り取り、上記からの細胞ペレットと組み合わせることにより細胞分画を調製した。培地と細胞分画の両方の最終容積をＰＢＳで４ｍｌに調節した。細胞分画をアッセイの前に２分間音波処理した。細胞分画と培地分画を、ＡＵＳＲＩＡキットを用いて１：５に希釈したＨＢＶ表面抗体の存在下でアッセイした。キットにより供給された負の対照の２．１倍のカットオフ値より低い試料を負であると考えた。全てのディッシュからの細胞分画と培値分画の出力ウイルスをベロ細胞において滴定した。結果を表５に示す。
【０３１１】
ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターの制御下でＨＢＶ  ｌｐｓＡｇを発現するワクシニア組換え体の構築
ワクシニア組換えｖＰ９１９は、感染後の初期に機能する３つの異なるポックスウイルスプロモーターの制御下で３つの異なるＨＢＶ遺伝子を含有している。同一のワクシニアバックグラウンドで感染後初期に異種遺伝子を発現する様々なポックスウイルスプロモーターの相対強度を比較するために、試験遺伝子として狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行なった。この試験システムを用いると、ワクシニアＨ６プロモーターおよびワクシニアＩ３Ｌプロモーターは、牛痘ｕプロモーターよりも強いプロモーターであることが分かった。ｖＰ９１９において、Ｈ６プロモーターはＨＢＶ  ｓｐｓＡｇの発現を指示し、Ｉ３ＬプロモーターはＨＢＶ  Ｓ１２／コア融合の発現を指示し、ＵプロモーターはＨＢＶｌｐｓＡｇの発現を指示する。ｌｐｓＡｇの共発現は粒子の形成とｓＡｇまたはｓｐｓＡｇの分泌を妨害することが示されたので、相対的に弱いｕプロモーターはＨＢＶ  ｌｐｓＡｇの発現のために故意に選択される（オウら、1987；チェンら、1986；マックラクランら、1987；チサリら、1986）。
【０３１２】
ＨＢＶ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスによりｓＡｇまたはｓｐｓＡｇを含有する粒子の生体外での産生を測定するためにＡＵＳＲＩＡラジオイムノアッセイキットを用いた。予備実験により、ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の形成と分泌はｖＰ８５６（ｓｐｓＡｇを含有）、ｖＰ８９６（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇを含有）およびｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ＋Ｓ１２／コアを含有）中に生じたことが示された。ｖＰ８９６およびｖＰ９１９において、ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の相対水準は、ｖＰ８５６に観察された水準よりも低かった。
【０３１３】
ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の形成と分泌が高水準のｌｐｓＡｇ発現の存在下で観察されることを決定するために、エトモポックス（ＥＰＶ）４２ｋＤａプロモーターの制御下でｌｐｓＡｇを配した。上述した比較ＥＬＩＳＡ試験により、ワクシニア組換えウイルス中のＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーターは、ワクシニアＨ６プロモーターまたはワクシニアＩ３Ｌプロモーターに観察された水準と等しい水準で異種遺伝子の発現を指示した。
【０３１４】
プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓは、ワクシニアＩ４Ｌ欠損座に牛痘ｕプロモーターの制御下でｌｐｓＡｇ遺伝子を含有している（第１２図）。プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ中に存在する牛痘ｕプロモーターを以下のようにしてＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーターにより置換した：相補オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３７１−３７４を内部５′末端でキナーゼして（ＭＰＳＹＮ３７２；ＭＰＳＹＮ３７３）、アニールして、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＵＣ８中にクローニングし、プラスミドｐＭＰ３７１／３７４を形成した。ＭＰＳＹＮ３７１（配列認識番号１０２）、ＭＰＳＹＮ３７３（配列認識番号１０３）、ＭＰＳＹＮ３７２（配列認識番号１０４）、およびＭＰＳＹＮ３７４（配列認識番号１０５）
【化６３】
0003624911.tif 000065
【０３１５】
は、ＨＢＶ  Ｓ１領域（ＡＴＧ下線）からＢａｍＨＩ部位の後に３１ｂｐ  ＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーター要素を含有している。ＤＮＡ配列の確認に続いて、挿入物をＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩでの切断によりｐＭＰ３７１／３７４から単離し、以下のようにｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ中の対応ｕプロモーター／ＨＢＶ配列を置換するのに用いた：ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓをＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌＩＩで切断し、適切な５ｋｂベクター断片を単離して、ｐＭＰ３７１／３７４からのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片と連結した。産生したプラスミド、ｐＭＰ５５０Ｅ３１ｌｐｓにおいて、ＨＢＶ  ｌｐｓＡｇは、ＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーターの制御下にある。ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子カセットの全縁配列を第１５図に示す。
【０３１６】
ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ８５６に関する供与体プラスミドとしてｐＭＰ５５０Ｅ３１ｌｐｓを用いて、二重ＨＢＶ組換えワクシニアウイルスｖＰ９３２を産生した。Ｓ１２／コア融合を含有する供与体プラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３Ｓ１２Ｃに関する救助ウイルスとしてｖＰ９３２を用いて、三重ＨＢＶ組換えワクシニアウイルスｖＰ９７５を産生した。ＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇのみを含有するワクシニア組換え体を産生するために、ｖＰ８６６に関する供与体プラスミドとしてｐＭＰ５５０Ｅ３１ｌｐｓを用いて組換えワクシニアウイルスｖＰ９３０を産生した。
【０３１７】
組換えワクシニアウイルスによる生体外ＨＢＶ表面抗原の分泌
ベロ細胞を含有するディッシュに、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）またはＨＢＶ  ｓｐｓＡｇおよび／またはＨＢＶ  ｌｐｓＡｇを発現する組換えワクシニアウイルスを三重に感染せしめた。感染細胞に関連するＨＢＶ表面抗原粒子の相対量を、ＡＵＳＲＩＡ  ＩＩ−１２５キットを用いて培地に分泌された量と比較した（表５）。培地中のＨＢＶ表面抗原の存在は、ウイルス感染度の９９．８％以上が細胞関連にとどまっていたので、感染細胞の溶解によるものではなかった。細胞ペレットと培地の容積は、直接の比較のために等しくした。ｓｐｓＡｇを発現する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６に感染した細胞において、ＡＵＳＲＩＡ反応性表面抗原の４２％が培地に分泌された。比較的弱いｕプロモーター（ｖＰ８９６）の制御下でのｌｐｓＡｇの共発現は、細胞関連ＡＵＳＲＩＡ反応性材料の量を著しくは変化せしめなかったが、分泌した材料の相対量を合計の２４％まで減少せしめた。比較的強いＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーター（ｖＰ９３２）の制御下でのｌｐｓＡｇの共発現は、分泌された材料の相対量を合計の６％まで低下せしめた。ｖＰ８９６に関しては、ｖＰ９３２中のｓｐｓＡｇによるｌｐｓＡｇの共発現は、ＡＵＳＲＩＡ反応性細胞関連材料の量を低下せしめなかった。興味をひくことに、ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター（ｖＰ９３０）の制御下でｌｐｓＡｇのみの発現は、アッセイのためのバックグラウンドより著しく高い細胞関連ＡＵＳＲＩＡ反応性材料の水準の産生となり、一方でｕプロモーター（ｖＰ８９７）の制御下でのｌｐｓＡｇの発現はそうならなかった。これは、内部（Ｓ２またはＳ）開始コドンでの開始によるｖＰ９３０感染細胞中に産生された高水準のｓｐｓＡｇまたはｓＡｇによるようである。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【実施例１４】
【０３１８】
Ｂ型肝炎ウイルスおよびエプステイン−バーウイルスを発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
エプステイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、アフリカを含む類似の地理的区域に亘る地方特有のものであるので、両方の病原の免疫原を発現する組換えワクシニアウイルスを産生することが好ましい。この目的に関して、ＮＹＶＡＣバックグラウンドで３つのＥＢＶ遺伝子と３つのＨＢＶ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス、ｖＰ９４１を産生した。
【０３１９】
ＨＢＶタンパク質の免疫沈降
ＨＢＶタンパク質の免疫沈降と代謝標識付けは、実施例１３のｖＰ９１９に記載したものに以下の改変を行なったものであった。組換えワクシニアウイルス、親ＮＹＶＡＣウイルス（ｖＰ８６６）による感染および疑似感染を、ベロ細胞ではなくＲＫ−１３細胞に行なった。抗Ｓ２と抗コア抗血清の両方に、ｖＰ８６６感染ＲＫ−１３細胞を吸着せしめた。
【０３２０】
組換えワクシニアウイルスｖＰ９１４の産生
ワクシニアウイルス組換え体ＥＢＶトリプレットｖＰ９４４を産生するのに用いた３つのＥＢＶ遺伝子を含有する供与体プラスミドであるプラスミドＥＢＶトリプル１を、救助ウイルスとして、ワクシニアウイルス組換え体ＨＢＶトリプレットである、ｖＰ９１９による組換えに用いた。産生したウイルス、ｖＰ９４１を、32Ｐ標識ＥＢＶ  ＤＮＡにより同定した。ｖＰ９４４のように、ｖＰ９４１は、エントモポックスウイルス４２ｋＤａプロモーターの制御下でＥＢＶ遺伝子を、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇＢを、そしてワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇｐ３４０を含有し、全てをワクシニアＴＫ欠損座に挿入した。ｖＰ９１９のように、ｖＰ９４１は、ＡＴＩ欠損座に挿入されたワクシニアＨ６プロモーターの制御下で合成ＨＢＶ  ｓｐｓＡｇを、Ｉ４Ｌ欠損座に挿入された牛痘ｕプロモーターの制御下でＨＢＶ  ｌｐｓＡｇを、そしてＨＡ欠損座に挿入されたＩ３Ｌプロモーターの制御下でＨＢＶ  Ｓ１２／コア融合を含有した。組換えワクシニアウイルスｖＰ９４１のゲノムの完全性は、ＤＮＡの制限分析により確認された。
【０３２１】
ｖＰ９４１によりＨＢＶタンパク質の発現
６組のＨＢＶ／ＥＢＶワクシニア組換え体ｖＰ９４１により合成された様々なＨＢＶタンパク質をアッセイするために、ｖＰ９４１に感染したＲＫ−１３細胞中で合成された代謝的標識タンパク質および適切な単一、二重および三重のＨＢＶ組換え体に、イムノプレシテーションを行なった。未感染細胞と、ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）、ｖＰ８５６（ｓｐｓＡｇ）、ｖＰ８９６（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ）、ｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ＋Ｓ１２／コア）、またはｖＰ９４１に感染した細胞中のタンパク質を、家ウサギ抗Ｓ２抗血清を用いて免疫沈降を行なった。さらに未感染細胞およびさらにｖＰ９４１、ｖＰ９１９、ｖＰ８５８（Ｓ１２／コア）、またはｖＰ８６６に感染した細胞中のタンパク質を、抗コア抗血清を用いて免疫沈降を行なった。
【０３２２】
抗Ｓ２血清により、ｓｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体ｖＰ８５６から３３ｋＤａと３６ｋＤａの２つのタンパク質が沈殿する。これらはＨＢＶ  ｐｓｐＡｇの単一と二重にグリコシル化された形状の予期サイズに対応している。抗Ｓ２血清により、ｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア二重組換え体ｖＰ８９６が沈殿する。加えて、ｌｐｓＡｇの単一グリコシル化形状に対応する４２ｋＤａのタンパク質が、４５ｋＤａと４８ｋＤａの大きなタンパク質と同様に沈殿する。ｌｐｓＡｇの未グリコシル化形状に対応する３９ｋＤａのタンパク質は、グリコシル化形状と比較して少量で沈殿する。抗Ｓ２血清によりｖＰ８５６とｖＰ８９６から沈殿した全てのタンパク質はまた、ＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９およびＨＢＶ／ＥＢＶ６重ｖＰ９４１から沈殿する。ラジオオートグラムにおいて、ＨＢＶタンパク質は、ワクシニア組換え体に感染したＲＫ−１３細胞からの抗Ｓ２により免疫沈降せしめられる。ＨＢＶタンパク質が、同一のワクシニア組換え体（ｖＰ８５６、ｖＰ８９６およびｖＰ９１９）に感染したベロ細胞から免疫沈降せしめられる場合、同一のタンパク質が観察されたが、異なる相対量であった。一般的に、これらの組換えワクシニアウイルスにより発現されたｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの両者は、ベロ細胞中よりもＲＫ−１３細胞中でより完全にグリコシル化せしめられているように思われる。
【０３２３】
ｖＰ８５８に感染したベロ細胞に見られるように、ｖＰ８５８に感染したＲＫ−１３細胞から抗コア血清により沈殿せしめられた最も豊富なタンパク質は、２７ｋＤａのサイズを有する。これは、Ｓ１２／コア融合遺伝子が第２の（Ｓ２）ＡＴＧで始まる場合に予期される翻訳産生物のサイズに対応する。ベロ細胞のｖＰ８５８感染後に観察された状況とは異なって、抗コア血清による免疫沈降後のＲＫ−１３細胞のｖＰ８５８感染は、完全Ｓ１２／コア翻訳産生物に予期される３８ｋＤａのサイズに対応する可視帯とはならない。ＨＢＶ単一組換え体ｖＰ８５８から抗コア血清により沈殿せしめられた全てのタンパク質はまた、ＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９とＨＢＶ／ＥＢＶ６重ｖＰ９４１からも沈殿せしめられる。
【実施例１５】
【０３２４】
狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣの構築
この実施例は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と称するカナリヤポックス狂犬病組換え体の開発およびその安全性並びに効果を記載するものである。
【０３２５】
細胞およびウイルス
親カナリヤポックスウイルス（レントシュラー菌株）はカナリヤのワクチン菌株である。ワクチン菌株を野生型単離体から得て、鶏胚繊維芽細胞での２００連続以上の継代により弱毒化した。マスターウイルス種子についてアガーで４連続のプラーク精製を行ない、１つのプラーククローンを、株ウイルスが後に生体外組換え試験の親ウイルスとして用いられる５連続の追加の継代により増幅せしめた。プラーク精製カナリヤポックス単離体をＡＬＶＡＣと称する。
【０３２６】
カナリヤポックス挿入ベクターの構築
８８０ｂｐのカナリヤポックスＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間にクローニングしてｐＲＷ７６４．５を形成した。この断片の配列を第１６図の位置１３７２と２２５１の間に示す。Ｃ５と称する読取り枠の制限を規定した。読取り枠は、断片内の位置１６６で開始し、位置４８７で終止することを決定した。読取り枠を妨害することなく、Ｃ５欠損を行なった。位置１６７から位置４５５の塩基を、配列（配列認識番号１０６）ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴと置換した。この置換配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ挿入部位を含有し、この後にワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止および転写終止シグナルが続く（ユエンら、1987）。Ｃ５  ＯＲＦの欠損を以下に記載するように行なった。プラスミドｐＲＷ７６４．５を部分的にＲｓａＩで切断し、線状産生物を単離した。ＲｓａＩ線状断片をＢｇｋＩＩで再切断し、今では位置１５６から位置４６２ままでのＲｓａＩからＢｇｌＩＩが欠損したｐＲＷ７６４．５断片を単離して、以下の合成オリゴヌクレオチドのベクターとして用いた：
ＲＷ１４５（配列認識番号１０７）
【化６４】
0003624911.tif 000070
【０３２７】
ＲＷ１４６（配列認識番号１０８）
【化６５】
0003624911.tif 000071
【０３２８】
オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニールして、上述したｐＲＷ７６４．５ＲｓａＩおよびＢｇｌＩＩベクターに挿入した。産生したプラスミドをｐＲＷ８３１と称する。
【０３２９】
狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構築
ｐＲＷ８３８の構築を以下に説明する。狂犬病ＧのＡＴＧを有するＨ６プロモーターの翻訳開始コドンと重複するオリゴヌクレオチドＡからＥをｐＲＷ７３７としてｐＵＣ９中にクローニングした。オリゴヌクレオチドＡからＥは、ＮｒｕＩで始まり、ＢｇｌＩＩが後に続く狂犬病ＧのＨｉｎｄＩＩＩ部位までのＨ６プロモーターを含有する。オリゴヌクレオチドＡからＥ（配列認識番号１０９）から（配列認識番号１１３）の配列を以下に示す：
【化６６】
0003624911.tif 000072
【０３３０】
アニールしたオリゴヌクレオチドＡからＥのダニアグラムは以下の通りである：
【化６７】
0003624911.tif 000073
【０３３１】
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼして、アニールし（５分間９５℃で加熱し、次いで室温まで冷却せしめる）、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。産生したプラスミド、ｐＲＷ７３７をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯの１．６ｋｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片のベクター（キニーら、1984）として用い、ｐＲＷ７３９を産生した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯ  ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、狂犬病Ｇ翻訳開始コドンの８６ｂｐ下流にある。ＢｇｌＩＩはｐｔｇ１５５ＰＲＯ中の狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９を部分的にＮｒｕＩで切断し、ＢｇｌＩＩで完全に切断し、前述したＨ６プロモーターの３′末端（テイラーら、1988ａ、ｂ；グオら、1989；パーカスら、1989）から全縁狂犬病Ｇ遺伝子を含有する１．７ｋｂｐ  ＮｒｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＲＷ８２４のＮｒｕＩ部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。産生したプラスミドをｐＲＷ８３２と称する。ｐＲＷ８２４への挿入は、ＮｒｕＩのＨ６プロモーター５′を加えた。ＳｍａＩが後に続くＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４配列は：ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧである。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を含有する。ＮｒｕＩとＢａｍＨＩによる切断は完全にこの非関連遺伝子を切除した。Ｈ６プロモートした狂犬病Ｇを含有する１．８ｋｂｐ  ｐＲＷ８３２  ＳｍａＩ断片をｐＲＷ８３１のＳｍａＩに挿入して、プラスミドｐＲＷ８３８を形成した。
【０３３２】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発
前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いて、プラスミドｐＲＷ８３８をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にトランスフェクションした（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）。特異的狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるまで６連続のプラーク精製を行なった。次いで１つの典型的なプラークを増幅し、産生したＡＬＶＡＣ組換え体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と称した。続いて突然変異しない狂犬病Ｇ遺伝子のＡＬＶＡＣゲノムへの正確な挿入を配列分析により確認した。
【０３３３】
蛍光抗体法
熟成狂犬病ウイルス粒子のアッセンブリの最終段階中に、糖タンパク質成分はゴルジ体から血漿膜に運搬され、そこで、細胞膜の外面のタンパク質のバルクと細胞質中に延びるカルボキシ末端により蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ中で発現された狂犬病糖タンパク質が正確に存在することを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染した初代ＣＥＦ細胞に、蛍光抗体法を行なった。前述したように（テイラーら、1990）狂犬病Ｇ単クローン性抗体を用いて蛍光抗体法を行なった。強い表面蛍光がＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したＣＥＦ細胞に検出されたが、親ＡＬＶＡＣには検出されなかった。
【０３３４】
免疫沈降
初代ＣＥＦ細胞、ベロ細胞（アフリカ緑猿肝臓細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１の系統）およびＭＲＣ−５細胞（通常のヒトの胎児の肺組織ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７Ｉから誘導した繊維芽細胞状細胞形状）の前形成単層に、放射線標識した35メチオニンの存在下で親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを細胞あたり１０ｐｆｕで接種し、前述したように処理した（テイラーら、1990）。免疫沈降反応を、狂犬病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いて行なった。約６７ｋＤａの分子量を有する狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現を組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧに関して検出した。未感染細胞または親ＡＬＶＡＣウイルスに感染した細胞中には、狂犬病特異的産生物は検出されなかった。
【０３３５】
連続継代実験
非アビアン種の範囲のＡＬＶＡＣウイルスに関する研究において、増殖性感染または顕著な病気はなにも観察されなかった（テイラーら、1991ｂ）。しかしながら、非アビアン細胞中の増殖には親または組換えウイルスのいずれも適応できないことを確証するために、連続継代実験を行なった。
【０３３６】
２つのウイルス、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを、３つの細胞株における１０連続のブラインド継代に接種した：
（１）生後１１日の白のレグホン種のひなから産生された初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）；
（２）ベロ細胞−アフリカ緑猿肝臓細胞の連続継代細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）；および
（３）ＭＲＣ−５細胞−ヒトの胎児肺組織から誘導した二倍体細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１）各ディッシュ２×１０6 の細胞を含有する各細胞株の３つの６０ｍｍディッシュを用いて、細胞当たり０．１ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で最初の接種を行なった。ＤＮＡ複製の阻害因子であるシトシンアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）４０μｇ／ｍｌの存在下で１つのディッシュを接種せしめた。３７℃の１時間の吸着期間後、接種物を取り出して、単層を洗浄して未吸着ウイルスを除去した。この時点で、培地を、２つのディッシュの５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％のＮＢＣＳ（試料ｔ０およびｔ７）および第３の４０μｇ／ｍｌのＡｒａ  Ｃを含有する５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％のＮＢＣＳ（試料ｔ７Ａ）と置換した。試料ｔ０を−７０℃で凍結せしめ、残留入力ウイルスの徴候を与えた。試料ｔ７およびｔ７Ａを３７℃で７日間インキュベートし、その後成分を収集して感染音波処理により細胞を破壊した。
【０３３７】
各細胞株の試料ｔ７の１ｍｌを希釈せずに、同一の細胞株の３つのディッシュ（試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを提供する）および初代ＣＥＦ細胞の１つのディッシュに接種した。試料ｔ０、ｔ７およびｔ７Ａを、継代１としての処理を施した。非アビアン細胞中に存在するウイルスのより敏感な検出のための増幅工程を提供するために、ＣＥＦ細胞への追加の接種を行なった。
【０３３８】
この方法を、１０回（ＣＥＧおよびＭＲＣ−５）または８回（ベロ）の連続したブラインド継代について行なった。次いで試料を凍結せしめ、３回溶かし、初代ＣＥＦ単層での滴定によりアッセイした。
【０３３９】
次いで各試料のウイルス産生を、アガロースでのＣＥＧ単層でのプラーク滴定により測定した。実験の要約結果を表６と７に示す。
【０３４０】
その結果により、親ＡＬＶＡＣと組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの両者は、力価を損失することなくＣＥＦ単層で一様の複製ができることが示されている。ベロ細胞において、ウイルスの水準は、ＡＬＶＡＣの２回の継代およびＡＬＶＡＣ−ＲＧの１回の継代の後に検出水準より低下した。ＭＲＣ−５細胞において、同様の結果が明確であり、１回の継代後にはウイルスは検出されなかった。表６と７において、４回の継代の結果のみを示しているが、一連の結果は、８回（ベロ）および１０回（ＭＲＣ−５）の継代に関して、いずれのウイルスも非アビアン細胞での増殖への適応は検出不可能であった。
【０３４１】
継代１において、ＭＲＶ−５細胞とべロ細胞のｔ７試料では比較的高い水準のウイルスが存在した。しかしながら、この水準のウイルスは、ウイルスの複製が生じないシトシンアラビノシドの存在下でインキュベートされたｔ０試料とｔ７Ａ試料に見られる水準と等しかった。これにより、非アビアン細胞中の７日で見られるウイルスの水準は、残留ウイルスを表し、新たに複製されたウイルスは表さないことが示された。
【０３４２】
アッセイをより敏感に行なうために、各細胞株から収集した７日の部分を任意のＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）となったときに、またはＣＰＥが不明確な場合は７日後に収集した。この実験の結果を表８に示す。任意の細胞株により増幅後でさえも、ウイルスは２回の追加の継代のＭＲＣ−５とベロ細胞に検出されたのみであった。これらの結果により、使用した条件下では、ベロ細胞とＭＲＣ−５細胞にはいずれのウイルス増殖も適応しないことが示された。
【０３４３】
マカクの接種
表９に記載したように、４つのＨＩＶ漿陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）マカクに最初にＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。１００日後、これらの動物に再接種し、追加抗原投与効果を測定し、追加の７匹の動物に供給量を変えて接種した。適切な間隔で血液を採取し、５６℃で３０分間の熱不活性化後、急速蛍光焦点抑制アッセイ（Ｒａｐｉｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）を用いた抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した（スミスら、1973）。
【０３４４】
チンパンジーの接種
２匹の大人のメスのチンパンジー（５０から６５ｋｇの範囲）に、１×１０7 ｐｆｕのｖＣＰ６５を筋内または皮下に接種した。反応に関して動物を監視し、ＲＦＦＩ試験による抗狂犬病抗体の存在の分析のために規則的な間隔で採血した（スミスら、1973）。最初の接種から１３週間後に等量の供給量で動物を再接種せしめた。
【０３４５】
マウスの接種
マウスの群に、５０から１００μｌの範囲のｖＣＰ６５の異なるバッチの希釈物を接種した。マウスは足蹠で接種した。１４日目に、狂犬病ウイルスの毒性ＣＶＳ菌株の１５から４３マウスＬＤ50をマウスに皮内接種で抗原投与した。マウスの生存を監視し、接種後２８日での防御量５０％（ＰＤ50）を計算した。
【０３４６】
イヌとネコの接種
生後４か月の１０匹のビーグル犬と生後４か月の１０匹のネコに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを６．７または７．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で頭蓋内に接種した。接種後１４日と２８日に動物の採血を行ない、ＲＦＦＩ試験において抗狂犬病抗体を評価した。６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物に、ワクチン接種後２９日目に、３．７ｌｏｇ10マウスＬＤ50（イヌ）または４．３ｌｏｇ10マウスＬＤ50（ネコ）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス抗原投与菌株を抗原投与した。
【０３４７】
リスサル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ）の接種
４匹のリスサル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の３つの群には、（ａ）ＡＬＶＡＣ、親カナリヤポックスウイルス、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組換え体、または（ｃ）ｖＣＰ３７、ネコ白血病ウイルスのエンベロープを発現するカナリヤポックスウイルス組換え体の３つのウイルスのうちの１つを接種した。接種はケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）麻酔により行なった。各動物に同時に：（１）乱切することなく右目の表面に２０μｌを；（２）口に数滴として１００μｌを；（３）右腕の外面の毛を剃った皮膚の２か所の皮内注射部位のそれぞれに１００μｌを；（４）右腿の前部筋肉に１００μｌを与えた。
【０３４８】
４匹のサルに各ウイルスを接種した。２匹には合計５．０ｌｏｇ10ｐｆｕを、他の２匹には合計７．０ｌｏｇ10ｐｆｕを接種した。動物から規則的な間隔で採血し、ＲＦＦＩ試験を用いて抗狂犬病抗体の存在に付いて血清を分析した（スミスら、1973）。ワクチン接種に対する反応について動物を毎日観察した。最初の接種から６か月後、ＬＡＶＡＣ−ＲＧを受けた４匹のサル、ｖＣＰ３７を受けた２匹のサル、および最初にＡＬＶＡＣを受けた２匹のサル、並びに１匹の未接種のサルに、６．５ｌｏｇ10ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下に接種した。ＲＦＦＩ試験において、狂犬病中和抗体の存在について血清をモニタした（スミスら、1973）。
【０３４９】
ヒト細胞株へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種
異種遺伝子の効果的な発現が、ウイルスが生産的に複製する非アビアン細胞中に得られるか否かを決定するために、１つのアビアンと４つの非アビアンの５つの細胞型を、ウイルス産生、異種狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種した細胞は：
（ａ）ベロ、アフリカ緑サルの肝臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１；
（ｂ）ＭＲＣ−５、ヒトの胎児の肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１；
（ｃ）ＷＩＳＨヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５；
（ｄ）デトロイト−５３２、ヒト包皮、ダウン症候群、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４；および
（ｅ）初代ＣＥＦ細胞であった。
【０３５０】
生後１１日の白レグホンの胚から産生された鶏胚繊維芽細胞を陽性対照として含む。全ての接種は、以下に記載するように２×１０6 細胞の前形成単層上で行なった。
【０３５１】
Ａ．ＤＮＡ分析の方法
各細胞株の３つのディッシュに、５ｐｆｕ／細胞のウイルスを接種し、未接種の各細胞株の余分の１つのディッシュを容易した。１つのディッシュを、４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）の存在下でインキュベーションした。３７℃での６０分間の吸着期間の後、接種物を除去し、単層を２回洗浄して未吸着ウイルスを除去した。次いで培地（Ａｒａ  Ｃの有無に関わらず）を置き換えた。ディッシュからの細胞（Ａｒａ  Ｃのない）を時間ゼロ試料として収集した。残りのディッシュを３７℃で７２時間インキュベーションし、その後細胞を収集し、ＤＮＡ蓄積を分析するのに用いた。各試料の２×１０6 細胞を、４０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．５ｍｌの食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に再懸濁せしめ、５分間３７℃でインキュベーションした。４２℃に予熱し、１２０ｍＭのＥＤＴＡを含有する等容積の１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合した。懸濁をアガロースプラグモールドに運搬し、少なくとも１５分間硬化せしめた。次いでアガロースプラグを取り出し、そのプラグを完全に覆う容積の溶菌緩衝液（１％サーコシル、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、２００ｍＭのＥＤＴＡ）中において５０℃で１２−１６時間に亘りインキュベーションした。次いで溶菌緩衝液を５．０ｍｌのステリル０．５×  ＴＢＥ（４４．５ｍＭのトリスホウ酸塩、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）と置き換え、ＴＢＥ緩衝液の３回の交換により４℃で６時間平衡せしめた。パルスフィールド電気泳動システムを用いて細胞ＲＮＡとＤＮＡからプラグ内のウイルスＤＮＡを分画せしめた。０．５×  ＴＢＥ中で１５℃の５０−９０秒のランプでの１８０Ｖで２０時間に亘り電気泳動を行なった。ＤＮＡは、ラムダＤＮＡ分子量標準で展開せしめた。電気泳動後、ウイルスＤＮＡ帯を、臭化エチジウムで染色することにより視覚化した。次いでＤＮＡをニトロセルロース膜に運搬し、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射線標識プローブでプローブした。
【０３５２】
Ｂ．ウイルス産生の評価
入力多重度が０．１ｐｆｕ／細胞であることを除いて、上述したようにディッシュを正確に接種した。感染の７２時間後、凍結と解凍の３連続のサイクルにより細胞を溶解せしめた。ＣＥＦ単層のプラーク滴定により、ウイルス産生を評価した。
【０３５３】
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現分析
ディッシュに１０ｐｆｕ／細胞の多重度で組換えウイルスまたは親ウイルスを接種し、未感染ウイルス対照としての追加のディッシュを用意した。１時間の吸着時間後、培地を除去し、メチオニン不含有培地と置き換えた。３０秒後、この培地を、２５ｕＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含有するメチオニン不含有培地と尾個か得た。感染細胞を１晩標識し（約１６１間）、次いで緩衝液Ａ溶菌緩衝液の添加により溶解せしめた。狂犬病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いて、前述したように免疫沈降を行なった。
【０３５４】
結果：ウイルス産生の評価
細胞当たり０．１ｐｆｕの接種７２時間後の産生の滴定の評価を表１０に示す。この結果により、生産的な感染がアビアン細胞においては達成されるが、４つの非アビアン細胞株においてはこの方法によりウイルスの産生の増大は検出されなかった。
【０３５５】
ウイルスＤＮＡ蓄積の分析
非アビアン細胞中の生産的ウイルス複製に対するブロックが、ＤＮＡ複製の前または後に生じるか否かを決定するために、細胞溶解産物からのＤＮＡを、電気泳動により分画し、ニトロセルロースに運搬し、ウイルス特異的ＤＮＡの存在下でプローブした。おそらくは放射線標識した＋ＶＡＣ  ＤＮＡプローブ調製におけるＣＥＦ細胞ＤＮＡの汚染のために、未感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞、感染から７２時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞および４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下での感染から７２時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞からのＤＮＡは全て、バックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染から７２時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、ＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積を示す約３５０ｋｂｐの領域に強い帯を示した。培地がＤＮＡ合成抑制因子、シトシンアラビノシドの存在下でインキュベーションされる場合には、そのような帯は検知不可能である。ベロ細胞中で産生された等量の試料は、時間ゼロでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ベロ細胞において約３５０ｋｂｐでは非常にわずかな帯を示した。この水準は、残留ウイルスを示す。ウイルス後代の増大とはならないベロ細胞に生じたウイルス特異的ＤＮＡ複製の水準を示す帯の強度は、感染７２時間後に増幅された。ＭＲＣ−５細胞中に産生された等量の試料により、この細胞株におけるこれらの条件下ではウイルス特異的ＤＮＡ蓄積が検出されないことが示された。次いでこの実験を、追加のヒト細胞株、特にＷＩＳＨおよびデトロイト−５３２細胞を含むまでに広げた。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞は、陽性対照として作用した。ＡＬＶＡＣを接種したＷＩＳＨまたはデトロイト細胞においてはウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は生じなかった。この方法の検出限界は完全に確認され、ういるくＤＮＡ蓄積が生じるが、方法の感度より低い水準である。ウイルスＤＮＡ複製が3 チミジン含有により測定された他の実験は、ベロ細胞とＭＲＶ−５細胞に得られた結果を支持する。
【０３５６】
狂犬病遺伝子発現の分析
ウイルス遺伝子発現、特に挿入された異種遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製のないヒト細胞株でさえ生じるか否かを決定するために、ＡＬＶＡＣとＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したアビアンと非アビアン細胞の35メチオニン標識溶解産物に免疫沈降を行なった。狂犬病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いた免疫沈降の結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したＷＩＳＨおよびデトロイト細胞、ＣＥＦ、ベロおよびＭＲＶ−５細胞中の６７ｋＤａ糖タンパク質の特異的免疫沈降を説明した。未感染、および親感染細胞溶解産物のいずれにもそのような特異的狂犬病遺伝子産生物を検出されなかった。
【０３５７】
この実験の結果により、分析したヒト細胞株において、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換え体は感染を開始し、Ｈ６初期／晩期ワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下で異種遺伝子産生物を発現できるけれども、複製はＤＮＡ複製をとはならず、または検出可能なウイルス後代は産生されなかった。ベロ細胞において、ある水準のＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積が観察されたが、これらの方法によってはウイルス後代は検出されなかった。これらの結果により、分析したヒト細胞株において、ウイルス複製に対するブロックは、ＤＮＡ複製の着手の前に生じ、一方ベロ細胞においてブロックはウイルスＤＮＡ複製の着手の後に生じる。
【０３５８】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧに発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性であるか否かを決定するために、多くの動物種を組換え体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの硬化は、マウスモデルシステムにおいて評価される。それゆえ、同様の試験をＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて行なった。１ｍｌ当たり６．７から８．４ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の範囲に亘る感染力価を有する９つの異なるウイルスの調製物（種子ウイルスの１０連続の組織培地継代後に産生された１つのワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を連続的に希釈し、生後４から６週間のマウスの足蹠に５０から１００μｌの希釈物を接種した。１４日後に、対照マウス群の致死率滴定により決定されるような１５から４３マウスＬＤ50を含有する狂犬病ウイルスのＣＶＳ菌株３００μｌをマウスに頭蓋内経路により抗原投与した。ＰＤ50（防御量５０％）として表される効力は、抗原投与１４日後に計算した。実験結果を表１１に示す。結果により、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは、平均値が３．７３（ＳＴＤ０．４８）である３．３３から４．５６に亘るＰＤ50値での狂犬病ウイルス抗原投与に対して矛盾なくマウスを防御することができたことが示された。この研究の延長として、おすのマウスに、６．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有する５０μｌのウイルスまたは等容積の未感染細胞懸濁液を頭蓋内で接種した。マウスを接種から１、３および６日後に乱切し、マウスの脳を取り出し固定して切り分けた。組織病理学的実験により、マウスのＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は見られなかった。
【０３５９】
イヌとネコのＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性と効果を評価するために、生後１４，５か月のビーグル犬と生後１４，４ネコの群を分析した。各種において４匹をワクチン接種しなかった。５匹の動物に６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を皮下に接種し、５匹の動物に７．７のｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を同一経路で接種した。抗狂犬病抗体についての分析のために、動物から採血した。接種しなかった、または６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物に、ワクチン接種から２９日後に、３．７ｌｏｇ10マウスＬＤ50（イヌ、こめかみの筋肉に）または４．３ｌｏｇ10マウスＬＤ50（ネコ、首に）のＮＹＧＳ狂犬病ウイルス抗原投与菌株を抗原投与した。この実験結果を表１２に示す。
【０３６０】
いずれの接種ウイルスの供与量のネコまたはイヌにも接種に対して副作用は見られなかった。６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で免疫した５匹のうち４匹のイヌがワクチン接種から１４日後に抗体力価を有し、全てのイヌが２９日後には力価を有した。全てのイヌは、４匹のうち３匹の対照を殺した抗原投与から防御された。ネコにおいて、６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で免疫した５匹のうち３匹のネコは、１４日後に特異的抗体力価を有し、全てのネコが２９日後には陽性であったが、平均抗体力価は２．９ＩＵと低かった。５匹のうち３匹のネコが、全ての対照を殺した抗原投与にも生き残った。７．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で免疫した全てのネコが１４日後に抗体力価を有し、２９日後の幾何学平均力価は８．１国際単位として計算された。
【０３６１】
ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび未関連カナリヤポックスウイルス組換え体による接種に対するリスサル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の免疫応答を実験した。サルの群に上述したように接種を行ない、狂犬病特異的抗体の存在に関して血清を分析した。皮内経路による接種に対するわずかな典型的な皮膚反応を別にして、どのサルにも副作用は見られなかった。皮内接種から２および４日後のみに、少量の残留ウイルスを皮膚の傷から単離した。全ての種が７日後以降に陰性であった。筋内注射に対する局部的な反応は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した４匹全てのサルは、ＲＦＦＩ試験に測定された抗狂犬病血清中和抗体を発達せしめた。最初の接種から約６か月後に、全てのサルと１匹の追加の純粋なサルに、皮下経路により、６．５ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを左腿の外面に再接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果を表１３に示す。
【０３６２】
狂犬病を未経験な５匹のサルのうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの感染から７日後に免疫応答を発達せしめた。接種から１１日後には５匹全てのサルが検知可能な抗体を有した。狂犬病等タンパク質に以前に露出した４匹のサルのうち全てが、ワクチン接種後３から７日の間に血清中和力価に著しい増大を示した。その結果により、ＡＬＶＡＣｐＲＧによるリスサルのワクチン接種は、簡単の側面効果を与えず、一次抗体応答が誘発せしめられたことが示される。アムナネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ）応答もまた再ワクチン接種により誘発せしめられる。ＡＬＶＡＣまたは未関連異種遺伝子を発現するカナリヤポックス組換え体への事前の露出は、再ワクチン接種により抗狂犬病免疫応答の誘発を妨害しない。
【０３６３】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種に対するＨＩＶ−２漿陽性マカクの免疫応答を評価した。上述したように動物を接種し、ＲＦＦＩ試験において抗狂犬病血清中和抗体の存在を評価した。表１４に示した結果により、皮下経路により接種したＨＩＶ−２陽性動物は、１回の接種から１１日後に抗狂犬病抗体を発達せしめた。最初の接種から約３か月後に与えられた追加抗原投与の接種後に既往反応が検知された。口頭経路により組換え体を接種した動物にはどのような反応も検知されなかった。加えて、一連の６匹の動物に、筋内または皮下経路のいずれかにより与えたＡＬＶＡＣ−ＲＧの減少した供給量を接種した。接種した６匹のうち５匹の動物は、ワクチン接種間から１４日後にそれほど違わない抗体力価で反応した。
【０３６４】
ＨＩＶに事前に露出した２匹のチンパンジーに、皮下または筋内経路により７．０ｌｏｇ10ｐｆｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。接種から３か月後、両方の動物は各様式で再ワクチン接種した。結果を表１５に示す。
【０３６５】
皮下または筋内経路のいずれの経路によっても、接種に対して副作用は示されなかった。両方のチンパンジーは、１４日後に最初の接種に反応し、強く上昇する反応が再ワクチン接種後に検知された。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【実施例１６】
【０３６６】
フラビウイルスタンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
この実施例は、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、黄熱病ウイルス（ＹＶ）および１型デング熱からの遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ供与体プラスミドの構築、対応ＮＹＶＡＣフラビウイルス組換え体の単離、および相同ウイルスによる致死抗原投与に対してマウスを防御するＪＥＶまたはＹＦのゲノムの部分を発現するワクシニア組換え体の能力を記載している。
【０３６７】
細胞株およびウイルス菌株
ワクシニアウイルスｖＰ４１０のコペンハーゲン菌株のチミジンキナーゼ変異体（グオら、1989）を用いて組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４を産生した（下記参照）。ｖＰ５５５の産生は以前に記載している（メイソンら、1991）。ＦＢＳと抗生物質を補給したイーグルス最小限基礎培地中に３７℃で増殖せしめられたヘラ（ＨｅＬａ）細胞を用いて生合成研究を行なった。全ての生体外実験で用いたＪＥＶウイルスは、ＪＥＶのナカヤマ菌株の継代５５哺乳マウス脳懸濁液に感染したＣ６／３６から調製した浄化培養液であった（メイソン、1989）。ＪＥＶの高度病原Ｐ３菌株を用いて動物抗原投与実験を行なった（下記参照）。
【０３６８】
ＪＥＶ遺伝子のワクシニアウイルス供与体プラスミド中へのクローニング
ＪＲＶワクシニア組換えウイルスを構築するのに用いたＪＥＶ  ｃＤＮＡは、ＪＥＶのナカヤマ菌株から誘導した（マックアダら、1987）。
【０３６９】
ｐＵＣ８のＳｍａＩとＥｃｏＲＩ部位にＪＥＶ  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド−２８から１０００）を含有するプラスミドｐＤｒ２０をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＪＥＶ  ｃＤＮＡ挿入物をｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジーズ社）中にクローニングしてプラスミドＪＥＶ１８を産生した。ＪＥＶ１８をＪＥ配列（ヌクレオチド２３）内のＡｐａＩとｐＩＢＩ２５内のＸｈｏＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＪ９０（配列認識番号１１４）およびＪ９１（配列認識番号１１５）（ＸｈｏＩ付着末端、ＳｍａＩ部位、およびＪＥヌクレオチド１から２３を含有する）と連結し、プラスミドＪＥＶ１９を産生した。ＪＥＶ１９をｐＩＢＩ２５内のＸｈｏＩとＪＥ配列（ヌクレオチド６０２）内のＡｃｃＩで切断し、産生した６１３ｂｐ断片を、プラスミド起点と、カルボキシ末端４０％ｐｒＭおよびＥの３分の２のアミノ末端（ヌクレオチド６０２から２１２４）をコードするＪＥＶ  ｃＤＮＡとを含有するＪＥＶ２のＸｈｏＩとＡｃｃＩ断片（メイソンら、1991）中にクローニングし、ＣのＡＴＧからＥの最後の３分の１に発見されたＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２４）のＪＥ配列を含有するプラスミドＪＥＶ２０を産生した。
【０３７０】
ＴＴＴＴＴＧＴヌクレオチド１３０４から１３１０がＴＣＴＴＴＧＴに改変せしめられ、Ｅの最後の３分の１からＮＳ２Ｂの最初の２つのアミノ酸（ヌクレオチド２１２４から４１２６）までのＪＥ配列、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有するＪＥＶ８からのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片をＪＥＶ２０からの精製ＳｍａＩ−ＳａｃＩ挿入物に連結し、ＪＥＶ２２−１を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変異誘発（マンデッキ、1986）を用いて、ＪＥＶ２２−１を構築するのに用いたユニークＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを除去し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンに先立つＪＥＶ２４を産生した。
【０３７１】
プラスミドＪＥＶ７（メイソンら、1991）をＪＥ配列内のＳｐｈＩ（ヌクレオチド２１８０）とＩＢＩ２４内のＨｉｎｄＩＩＩで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチドＪ９４とＪ９５［ＳｐｈＩ付着末端、翻訳停止、ワクシニア初期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＡＴ；ユエンら、1987）翻訳停止、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ付着末端を含有する］への連結により、Ｅの最後の３分の１のＳａｃＩ部位（ヌクレオチド２１２４）からＥのカルボキシ末端に亘るＪＥ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶ２５が産生された。ＪＥＶ２５からのＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片をＪＥＶ８のＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片（１５ａａＣ、ｐｒＭおよびＥヌクレオチド３３７から２１２４の３分の２のアミノ末端をコードするＪＥ  ｃＤＮＡ、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有する）に連結し、プラスミドＪＥＶ２６を産生した。ＡＴＧ開始コドンを先行するユニークＳｍａＩ部位を上述したように除去し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンを先行するＪＥＶ２７を産生した。
【０３７２】
オリゴヌクレオチドＪ９６、Ｊ９７、Ｊ９８およびＪ９９（ＳｐｈＩ付着末端を有するＪＥヌクレオチド２２４３から２３８０を含有する）をキナーゼし、アニールし、ＳｍａＩ−ＳｐｈＩ切断してアルカリ性ホスファターゼ処理したｐＩＢＩ２５に連結し、プラスミドＪＥＶ２８を産生した。ＪＥＶ２８をＪＥ配列内のＨｐａＩ（ヌクレオチド２３０１）とｐＩＢＩ２５配列内のＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼ処理した。ＪＥＶ１からのＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片またはＪＥＶ７からのＨｐａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（メイソンら、1991）への連結により、ＪＥＶ２９（ＳｍａＩ部位とそれに続く、３０ａａＥ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ヌクレオチド２２９３から４１２６をコードするＪＥ  ｃＤＮＡを含有する）およびｊｅｖ３０（ＳｍａＩ部位とそれに続く３０ａａＥ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ヌクレオチド２２９３から４５１２をコードするＪＥ  ｃＤＮＡを含有する）を産生した。
【０３７３】
ＪＥＶ２９からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片をＳｍａＩ−ＥａｇＩ切断したｐＴＰ１５（メイソンら、1991）に連結してＪＥＶ３１を産生した。ＪＥＶ３１を産生するのに用いたユニークＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンを先行するＪＥＶ３３を産生した。
【０３７４】
ＪＥＶ３０からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片をＳｍａＩ−ＥａｇＩ切断したｐＴＰ１５と連結してＪＥＶ３２を産生した。ＪＥＶ３２を産生するのに用いたユニークＳｍａＩ部位に対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンを先行するＪＥＶ３４を産生した。オリゴヌクレオチドＪ９０（配列認識番号１１４）、Ｊ９１（配列認識番号１１５）、Ｊ９４（配列認識番号１１６）、Ｊ９５（配列認識番号１１７）、Ｊ９６とＪ９７（配列認識番号１１８）およびＪ９９とＪ９８（配列認識番号１１９）を以下に示す：
【化６８】
0003624911.tif 000084
【０３７５】
ワクシニアウイルスＪＥＶ組換え体の構築
プラスミドＪＥＶ２４、ＪＥＶ２７、ＪＥＶ３３およびＪＥＶ３４をｖＰ４１０感染細胞にトランスフェクションして、それぞれワクシニア組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４を産生した（第１８図）。
【０３７６】
生体外ウイルス感染および標識付け
ヘラ細胞単層を３５ｍｍの直径のディッシュに調製し、放射線標識付けの前にワクシニアウイルス（細胞当たり２ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．）またはＪＥＶ（細胞当たり５ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．）に感染せしめた。細胞を35Ｓ−Ｍｅｔを含有する培地で瞬間標識し、メイソンらに記載されたように（1991）正確に過剰の未標識Ｍｅｔの存在下で６時間追跡した。
【０３７７】
放射性免疫沈降、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびエンドグリコシダーゼ処理
放射線標識細胞溶解産物と培地液体を収集し、ウイルスタンパク質を免疫沈降し、エンドグリコシダーゼで切断し、メイソンにより記載されているように（1989）ＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で分離した。
【０３７８】
動物防御実験
メイソンらにより記載されているように（1991）、マウス防御実験を正確に行なった。手短に言うと、生後３週間のマウスの群を、１０7 ｐｆｕのワクシニアウイルス組換え体で腹腔内（ｉｐ）注射により免疫せしめ、３週間後に選択したマウスから血清を集めた。次いでマウスに組換えウイルスを再接種せしめるか、またはＪＥＶのＰ３菌株に感染した哺乳マウス脳の懸濁液を腹腔内により１．３×１０3 ＬＤ50で抗原投与した。３週間後、追加免疫した動物をレブル（ｒｅｂｌｅｄ）し、４．９×１０5 ＬＤ50のＪＥＶのＰ３菌株で抗原投与した。抗原投与に続いて、３週間に亘り毎日マウスを観察し、実験動物の同腹兄弟を用いて各抗原投与実験において致死救急量滴定を行なった。加えて、抗原投与後４週間後の全ての生存動物から血清を採取した。
【０３７９】
組換えウイルスの免疫応答
メイソンらに記載されたよう（1991）に正確に、35Ｓ−Ｍｅｔ標識ＪＥＶ感染細胞から得た培養液または洗浄剤処理細胞溶解産物からのＪＥＶタンパク質を沈殿せしめる能力に関して血清を試験した。ＮＥＵＴ試験においてカルボキシメチルセルロースを培地に用いたことを除いてメイソンらに記載されたよう（1991）に、血球凝集素阻害（ＨＡＩ）および中和（ＮＥＵＴ）試験を行なった。
【０３８０】
組換えワクシニアウイルスの構造
ＣからＮＳ２Ｂに亘るＪＥＶコード領域の部分を発現した４つの異なるワクシニア組換え体（ＨＡ座における）を構築した。これらの組換えウイルス中に含有されたＪＥＶ  ｃＤＮＡ配列を第１８図に示す。４つの組換えウイルス全てにおいて、ＪＥＶ  ｃＤＮＡの感覚鎖はワクシニアウイルス初期／晩期Ｈ６プロモーターの背後に位置し、翻訳はウイルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置する自然発生ＪＥＶ  Ｍｅｔコドンから開始されると予期された。
【０３８１】
組換え体ｖＰ８２５は、カプシドタンパク質、構造タンパク質前駆体ｐｒＭ、構造糖タンパク質Ｅ、非構造糖タンパク質ＮＳ１、および非構造タンパク質ＮＳ２Ａをコード下（マックエイダら、1987）。組換え体ｖＰ８２９は、ｐｒＭのアミノ末端に先行する推定１５ａａシグナル配列、ｐｒＭおよびＥをコードした（マックエイダら、1987）。組換え体ｖＰ８５７は、Ｅの３０ａａ疎水性カルボキシ末端、続いてＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするｃＤＮＡを含有した。組換え体ｖＰ８６４は、ｖＰ８５７と同様のタンパク質と追加にＮＳ２ＢをコードするｃＤＮＡを含有した。組換え体ｖＰ８２５とｖＰ８２９において、Ｅ中の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止シグナル（ＴＴＴＴＴＧＴ；ヌクレオチド１３０４−１３１０）を、ａａ配列を改変することなくＴＣＴＴＴＧＴに改変した。この配列は生体外転写アッセイにおける転写終止を増大するのが示されているので、Ｅの発現の水準を高めるためにこの改変を行なった（ユエンら、1987）。
【０３８２】
組換えワクシニアウイルスにより発現される場合には、ＥおよびｐｒＭは正確に処理される
瞬間標識実験により、Ｅとサイズが同一のタンパク質が、Ｅ遺伝子を含有する全ての組換えワクシニアウイルスに感染した細胞中で合成されたことが示された（表１６）。ＪＥＶ、ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で遅く移動したＥタンパク質はまた、感染細胞から収集された培養液中にも観察された（表１６）。ＪＥＶおよびｖＰ５５５感染細胞により産生されたＥの細胞外形状は、ｖＰ８２９感染細胞により産生されたＥの細胞外形状に確認されるように、熟成したＮ連結グリカンを含有した（メイソン、1989；メイソンら、1991）。興味のあることに、ｐｒＭとＥに加えてＣコード領域を含有したｖＰ８２５は、細胞外液体中に放出されない形状のＥの合成を特定した（表１６）。Ｍ（およびｐｒＭ）に特有なＭＡｂを用いた放射線標識組換えワクシニア感染細胞から調製した免疫沈降により、ｐｒＭはｖＰ５５５、ｖＰ８２５、およびｖＰ８２９に感染した細胞中で合成され、ＭはｖＰ５５５またはｖＰ８２９に感染した細胞の培養液中に検出されたことが分かった（表１６）。
【０３８３】
ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞から収集した細胞外液体は、ｖＰ４１０、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７またはｖＰ８６４に感染した細胞の培養液には検出されなかったＨＡ活性を含有した。このＨＡは、抗ＪＥＶ抗体とそのｐＨ最適条件によるその阻害に基づいてＪＥＶ感染細胞中に産生されたＨＡと同一であるように思われた（メイソンら、1991）。ワクシニアウイルスＪＥＶ組換え体ｖＰ８２９、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細胞からの培養液に関してショ糖密度勾配を調製した。勾配の分析により、ＪＥＶ培養液に見られた遅い沈降血球凝集素（ＳＨＡ）のピークとともに移動したｖＰ８２９感染試料のＨＡ活性のピークを同定した（データは示さず）。この結果により、ｖＰ８２９感染細胞は、ｖＰ５５５感染細胞から収集された培養液中に観察されたＥおよびＭを含有する空のウイルスエンベロープに同一の細胞外粒子を産生することが示された（表１６およびメイソンら、1991）。
【０３８４】
組換えワクシニアウイルスにより発現される場合、ＮＳ１は正確に処理され分泌される
瞬間標識実験により、真正ＮＳ１およびＮＳ１′とサイズが同一なタンパク質がｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細胞中で合成されることが示された。ｖＰ５５５感染細胞により産生されたＮＳ１は、高分子量形状の感染細胞の培養液中に放出された。ＮＳ１はまた、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４感染細胞の培養液中に放出されるが、一方でＮＳ１は、ｖＰ８２５に感染した細胞からは放出されなかった（表１６）。ＮＳ２Ａ（ｖＰ８５７）コード領域またはＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂコード領域を含有する組換えワクシニアウイルスからのＮＳ１の合成の比較により、ＮＳ２Ｂコード領域の存在または不在は、ＮＳ１の発現には影響せず、ＮＳ２Ａ遺伝子のみがＮＳ１の真正処理に必要であることを示す以前のデータと首尾一貫していることが分かった（ファルゴートら、1989；メイソンら、1991）。
【０３８５】
組換えワクシニアウイルスはＪＥＶ抗原に対する免疫応答を誘発した
各群から選択した動物から採取した前抗原投与した血清を、放射線標識したＥとＮＳ１をイムノプレイピテーションする能力に関して試験した。これらの研究の結果により以下のことが示された（表１６）：（１）Ｅに対して誘発せしめられた免疫応答の大きさは、ｖＰ８２９＞ｖＰ５５５＞ｖＰ８２５であった、（２）ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードする全てのウイルスはＮＳ１に対する抗体を誘発した、（３）全ての免疫応答は、組換えウイルスの２回目の接種により増大せしめられた。これらの動物から採取した血清に関する中和とＨＡＩデータの分析により（表１７）、免疫沈降分析の結果が確認でき、ＲＩＰにより示されたようにＥに対する免疫応答は、他の血清学的試験と良好に相関関係にあることを示す（表１７）。
【０３８６】
組換えウイルスによるワクチン接種は致死ＪＥＶ感染からの防御を提供した
全ての組換えワクシニアウイルスは、ＪＥＶの末梢病原Ｐ３菌株による致死感染からの防御をマウスに与えることができた（ハング、1982）（表１７）。これらの研究によりｖＰ５５５の防御潜在能力が確認され（メイソンら、1991）ｖＰ８２５とｖＰ８２９に感染した動物において同様の防御を示した。ＮＳ１に対する強い免疫応答を誘発した組換えウイルスｖＰ８５７およびｖＰ８６４は、低水準の防御を示したが、これらの組換え体を接種したマウスは、対照ウイルス、ｖＰ４１０を接種したマウスと比較してまだ十分に防御された（表１７）。
【０３８７】
後抗原投与免疫応答はＪＥＶ複製の水準を示す
これらの組換えウイルスを接種した動物の致死抗原投与からの防御の機構をよりよく理解するために、後抗原投与血清における抗体のＪＥＶを認識する能力を評価した。これらの研究に関して、放射線標識したＪＥＶ感染細胞の溶解産物に存在する抗原を用い、高度免疫したマウス（メイソンら、1987ａ）中の高水準の抗体を誘発するＮＳ３タンパク質に対する応答を試験した。これらの研究結果（表１８）は、高水準の防御を誘発した組換えウイルス（ｖＰ８２９、ｖＰ５５５、およびｖＰ８２５）でワクチン接種した動物の群がＮＳ３に対する低い後抗原投与応答を示したが、一方でＮＳ１のみを発現した組換え体（ｖＰ８５７およびｖＰ８６４）でワクチン接種した群の生存者からの血清はＮＳ３に対して高い後抗原応答を示したという生存データと相関性がある。
【表１６】
0003624911.tif 000085
【表１７】
0003624911.tif 000086
【表１８】
0003624911.tif 000087
【０３８８】
ＪＥＶ遺伝子のワクシニア（ＮＹＶＡＣ）供与体プラスミド中へのクローニング
プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流のワクシニア配列内にポリリンカー領域を含有する）をポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ  ＡからＤと連結し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｈ６プロモーター−１２４から−１（パーカスら、1989）、並びにＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有するＳＰ１２６を産生した。
【０３８９】
プラスミドｐＳＤ５４４ＶＣ（ポリリンカー領域と置換されたＨＡ遺伝子の部位を包囲するワクシニア配列および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー領域内のＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を充填し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。ＳＰ１２６をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、クレノウで処理し、ＳｍａＩの切断によりＨ６プロモーターを単離した。Ｈ６プロモーター断片のｐＳＤ５４４ＶＣへの連結により、ポリリンカー領域（ＨＡ転写方向内）にＨ６プロモーターを含有したＳＰＨＡ−Ｈ６を産生した。
【０３９０】
プラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣをＨ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとＪＥＶ配列内のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１７８９ｂｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣ（メイソンら、1991）をＴ５ＮＴ後のＥａｇＩ部位でのＥｃｌＸＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、ＪＥＶ配列内のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、２００５ｂｐ断片を産生した。１７８９ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩおよび２００５ｂｐ（ＳａｃＩ充填ＥｃｌＸＩ）断片をＥｃｏＲＶ（Ｈ６内）に連結し、ＳｍａＩ（ポリリンカー内）で切断し、ＳＰＨＡ−Ｈ６をアルカリ性ホスファターゼ処理しＪＥＶ３５を産生した。ＪＥＶ３５をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ９０８を産生した（第１８図）。
【０３９１】
ＪＥＶ３５をＳａｃＩ（ＪＥ配列ヌクレオチド２１２４内）とＥｃｌＸＩ（Ｔ５ＮＴの後）で切断し、５４９７ｂｐ断片を単離し、ＪＥＶ２５のＳａｃＩ（ＪＥＶヌクレオチド２１２４）からＥａｇＩ断片（Ｅの残りの３分の２、翻訳終止およびＴ５ＮＴを含有する）に連結し、ＪＥＶ３６を産生した。ＪＥＶ３６をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ９２３を産生した（第１８図）。ＳＰＨＰＲＨＡ  ＡからＤオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ：Ａ＋Ｂ（配列認識番号１２０）およびＳＰＨＰＲＨＡ：Ｃ＋Ｄ（配列認識番号１２１）を以下に示す
【化６９】
0003624911.tif 000088
【０３９２】
ＹＦワクシニア組換えウイルス（クローン１０ＩＩＩおよびクローン２８ＩＩＩ）を構築するのに用いたＹＦ１７Ｄ  ｃＤＮＡクローンをチャールスライス（ＭＯ、セントルイス、ワシントン大学スクールオブメディスン）から得た。全てのヌクレオチド座標はライスら1985に存在した配列データから誘導した。
【０３９３】
カルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１（ヌクレオチド５３７−１６５９）をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ０を、ＹＦ  ｃＤＮＡのＡｖａＩからＮｓｉＩ断片（ヌクレオチド５３７−１６５９）とＹＦ  ｃＤＮＡのＮｓｉＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド１６６０−３２６６）をＡｖａＩとＫｐｎＩで切断したＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）中にクローニングすることにより誘導した。Ｃおよびアミノ末端２０％ｐｒＭをコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ１を、ＹＦ  ｃＤＮＡのＲｓａＩからＡｖａＩ断片（ヌクレオチド１６６−５３６）とアニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ４６とＳＰ４７（不能ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端、ＸｈｏＩとＣｌａＩ部位およびＹＦヌクレオチド１１９−１６５を含有する）をＡｖａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。Ｅのカルボキシ末端６０％とＮＳ１のアミノ末端２５％をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ３を、ＹＦ  ｃＤＮＡのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＡｐａＩとＢａｍＨＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより産生した。カルボキシ末端２０％ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ３をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ８を、ＹＦ  ｃＤＮＡのＫｐｎＩからＸｂｎＩ断片（ヌクレオチド３２６７−４９４０）をＫｐｎＩとＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端６０％ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ３をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ９を、ＹＦ  ｃＤＮＡのＳａｃＩからＸｂａＩ断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）をＳａｃＩとＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより産生した。Ｃのカルボキシ末端２５％、ｐｒＭおよびＥのアミノ末端４０％をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ１３を、ＹＦ  ｃＤＮＡのＢａｌＩからＡｐａＩ断片（ヌクレオチド３８４−１６０３）をＡｐａＩとＳｍａＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。
【０３９４】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、1985）を用いて、以下の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止シグナル（ユエンら、1987）（１）ＹＦ１中のＣ遺伝子のアミノ末端からの４９ａａ（ＴＴＴＴＴＣＴヌクレオチド２６３−２６９およびＴＴＴＴＴＧＴヌレオチド２６９−２７５）を（配列認識番号１２２）ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴに改変してプラスミドＹＦ１Ｂを産生し、ＹＦ３中のＥ遺伝子において（ヌクレオチド１８８６−１８９３ＴＴＴＴＴＴＧＴからカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＴＧＴ１８９ａａおよびヌクレオチド２４２９−２３５ＴＴＴＴＴＧＴをカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＧＴ８ａａ）に改変することにより、それぞれＹＦ３ＢとＹＦ３Ｃを産生した。ＹＦ３ＣからのＰｓｔＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１９６５−２７２５）をＹＦ３Ｂの対応断片と交換し、両者とも突然変異誘発転写終止シグナルを有するカルボキシ末端６０％Ｅとアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ４（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を産生した。ＹＦ４からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦ０中の相当領域と置換して、両者とも突然変異誘発転写終止シグナルを有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅとアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ６（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生した。プラスミドＹＦ６をＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとヌクレオチド５３７でのＡｖａＩで切断し、ＹＦ１ＢからのＥｃｏＲＶからＡｖａＩ断片（ＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶからヌクレオチド５３６でのＡｖａＩ）と連結し、１１９にＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位並びに４つの突然変異誘発終止シグナルを有するＣからＮＳ１のアミノ末端８０％をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ２（ヌクレオチド１１９−３２６６）を産生した。
【０３９５】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ１７ａａに先行するＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ヌクレオチド２４０２−２４０４）をプラスミドＹＦ３Ｃに挿入してＹＦ５を産生し、（２）ｐｒＭのカルボキシ末端からのＡＴＧ１９ａａに先行するＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ヌクレオチド９１７−９１９）をプラスミドＹＦ１３に挿入してＹＦ１４を産生し、（３）Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ２３ａａに先行するＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド２３８４−２３８６）をプラスミドＹＦ３Ｃに挿入してＹＦ２５を産生し、（４）Ｃのカルボキシ末端からのＡＴＧ２１ａａおよびＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド４１９）をプラスミドＹＦ１に挿入してＹＦ４５を産生した。
【０３９６】
ＹＦ５からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦ０の対応領域と交換して、２４０２でＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（Ｅのカルボキシ末端からの１７ａａ）並びに２４２９−２４３５での突然変異誘発転写終止シグナル（Ｅのカルボキシ末端からの８ａａ）を有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ７（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生した。ＹＦ２５からのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦ０の対応領域と交換して、２３８４でＸｈｏＩ部位（Ｅのカルボキシ末端からの２３ａａ）および２４２８−２４３５での突然変異誘発転写終止シグナル（Ｅのカルボキシ末端からの８ａａ）を有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ２６（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生した。
【０３９７】
ＹＦ１４からのＡｖａＩからＡｐａＩ断片（ヌクレオチド５３７−１６０３）をＹＦ６の対応領域と交換して、ヌクレオチド９１７でＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位（ｐｒＭのカルボキシ末端からの１９ａａ）および２つの突然変異誘発転写終止シグナルを有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ２６（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生した。ＹＦ６をＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとＹＦ内のヌクレオチド５３７でのＡｖａＩで切断し、ＹＦ４５のＥｃｏＲＶ（ＩＢＩ２５内）からＡｖａＩ断片に連結して４１９でＸｈｏＩ部位（Ｃのカルボキシ末端からの２１ａａ）および除去し２つの転写終止シグナルを有するＣからアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ４６（ヌクレオチド１１９−３２６６）を産生した。
【０３９８】
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端でのＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）をプラスミドＹＦ９に挿入してＹＦ１１を産生し、ＮＳ２Ａのカルボキシ末端のＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４１８０）をプラスミドＹＦ８に挿入してＹＦ１０を産生した。ＹＦ１１からのＳａｃＩからＸｂａＩ断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）およびＹＦ８からのＡｓｐ７１８からＳａｃＩ断片（ヌクレオチド３２６２−４３３８）をＡｓｐ７１８とＸｂａＩで切断したＩＢＩ２５に連結して、ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端の後にあるＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）を有するカルボキシ末端２０％ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ２ＢまをコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ１２（ヌクレオチド３２６２−４９４０）を産生した。
【０３９９】
ＹＦ遺伝子のｐＨＥＳシステムワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
ＹＦクローニング配列のＮＹＶＡＣ供与体プラスミドへの挿入の前に、ＹＦコード配列をワクシニアプラスミドｐＨＥＳ４に挿入した（パーカスら、1989）。カルボキシ末端２０％ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２ＢをコードするＹＦ１２からのＫｐｎＩからＳｍａＩ断片（ヌレオチド３２６７−４５６９）、１９ａａｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ１５からのＸｈｏＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド９１７−３２６６）およびＸｈｏＩ−ＳｍａＩで切断したｐＨＥＳ４を連結してＹＦ２３を産生した。２３ａａＥ、アミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ２６からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド２３８４−２７２５）をＹＦ２３（カルボキシ末端７５％ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂ、複製の起点並びにワクシニア配列を含有する）からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片と連結してＹＦ２８を産生した。
【０４００】
ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ切断したｐＨＥＳ４を、１７ａａＥおよびアミノ末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ７からのＸｈｏＩからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド２４０２−３２６６）およびカルボキシ末端２０％ＮＳ１およびＮＳ２ＡをコードするＹＦ１０からのＫｐｎからＳｍａＩ（ヌクレオチド３２６７−４１８０）を連結することにより、ＹＦ１８を産生した。Ｃ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ２からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片をＹＦ１８のＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％ＮＳ１およびＮＳ１Ａ、不正の起点並びにワクシニア配列を含有する）に連結し、ＹＦ１９を産生した。ＹＦ２からの同一のＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片をＹＦ２８からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％ＮＳ１およびＮＳ２Ａ、複製の起点並びにワクシニア配列を含有する）に連結し、ＹＦ２０を産生した。２１ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端２５％ＮＳ１をコードするＹＦ４６からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド４１９−２７２５）をＹＦ１８からのＸｈｏＩからＢａｍＨＩ断片と連結し、ＹＦ４７を産生した。オリゴヌクレオチドＳＰ４６（配列認識番号１２３）およびＳＰ（配列認識番号１２４）は以下の通りである：
【化７０】
0003624911.tif 000089
【０４０１】
組換え体ＹＦワクシニアウイルスの構築
ＣからＮＳ２Ｂに亘るＹＦコード領域の部分を発現した５つの異なるワクシニアウイルス組換え体を、宿主範囲選択システムを用いて構築した（パーカスら、1989）。プラスミドＹＦ１８、ＹＦ２３、ＹＦ２０、ＹＦ１９およびＹＦ４７をｖＰ２９３感染細胞中にトランスフェクションし、ワクシニア組換え体ｖＰ７２５、ｖＰ７２９、ｖＰ７６４、ｖＰ７６６およびｖＰ８６９を産生した。これらの組換え体中に含まれたＹＦ  ｃＤＮＡ配列を第１９図に示す。５つの組換えウイルス全てにおいて、ＹＦ  ｃＤＮＡの間隔鎖は、ワクシニアウイルス初期／晩期Ｈ６プロモーターの背後に位置し、翻訳は、ウイルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置するＭｅｔコドンから開始すると予期された（第１９図）。
【０４０２】
組換え体ｖＰ７２５は、非構造タンパク質ＮＳ１のＮ末端に先行する推定１７−ａａシグナル配列および非構造タンパク質ＮＳ１とＮＳ２Ａをコードした（ライスら、1985）。組換え体ｖＰ７２９は、ＥのＮ末端に先行する推定１９−ａａシグナル配列、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂをコードした（ライスら、1985）。組換え体ｖＰ７６４は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡおよびＮＳ２Ｂをコードした（ライスら、1985）。組換え体ｖＰ７６６は、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードした（ライスら、1985) 。組換え体ｖＰ８６９は、ｐｒＭ構造タンパク質前駆体のＮ末端に先行する推定２１−ａａシグナル配列、並びにｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、およびＮＳ２Ａをコードした（ライスら、1985）。
【０４０３】
致死ＹＦ抗原投与からの防御
ｖＰ８６９は、他の組換え体に感染した培養液中に見られなかったＨＡ活性を分泌した。このＨＡは、抗ＹＦ抗体により抑制とｐＨ最適条件に基づいてＹＦ感染細胞中に産生されたＨＡと同一であるように思われた。
【０４０４】
生後３週間のマウスに、１０7 ｐｆｕのｖＰ８６９、ｖＰ７６４、またはＹＦ−１７Ｄを腹腔内に接種し、３週間後に１００ＬＤ50のＹＦのフレンチ神経親和性菌株を抗原投与した。ｖＰ８６９は著しい防御を提供したが（表１９）、一方でｖＰ７６４は、ＹＦ遺伝子を欠如した対照ワクシニアウイルスよりも良好な防御を提供しなかった（ｖＰ４５７）。
【表１９】
0003624911.tif 000090
【０４０５】
ＹＦ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミド中へのクローニング
２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ（ＮＳ１が掛けたヌクレオチド２９６２を有する）をコードするＹＦ  ｃＤＮＡを含有するＹＦ４７からのＸｈｏＩからＳｍａＩ断片（ヌクレオチド４１９−４１８０）をＸｈｏＩ−ＳｍａＩで切断したＳＰＨＡ−Ｈ６（ＨＡ領域供与体プラスミド）と連結し、ＹＦ４８を産生した。ＹＦ４８をＳａｃＩ（ヌクレオチド２４９０）で切断し、Ａｓｐ７１８（ヌクレオチド３２６２）で部分的に切断し、６７００ｂｐ断片を単離し、（複製のプラスミド起点、ワクシニア配列、２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、アミノ末端３．５％ＮＳ１、カルボキシ末端２３％ＮＳ１、ＮＳ２Ａを含有する）、ＹＦ１８からのＳａｃＩ−Ａｓｐ７１８断片（２９６２に存在する塩基とともにＮＳ１の残りを含有する）に連結し、ＹＦ５１を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変異誘発（マンデッキ、1986）を用いて、ＹＦ５１中の特有のＸｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを除去し、ＨＡ座供与体プラスミド中にＹＦ２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするプラスミドを産生した。供与体プラスミドＹＦ５０をｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中にトランスフェクションしてワクシニア組換え体ｖＰ９８４を産生した。
【０４０６】
オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変異誘発を用いて、ＹＦ４８中の特有のＸｈｏＩ部位に対応する６ｂｐを除去してＹＦ４９を産生した。オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、Ｅのカルボキシ末端でのＳｍａＩ部位をＹＦ４中に挿入し、ＹＦ１６を産生した。ＹＦ４９のＡｐａＩ−ＳｍａＩ断片（２１アミノ酸Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端４３％ＥをコードするＹＦ  ｃＤＮＡ、並びに複製のプラスミド起点、ワクシニア配列を含有する）をＹＦ１６からのＡｐａＩ−ＳｍａＩ断片（カルボキシ末端５７％Ｅを含有するヌクレオチド１６０４−２４５３）に連結し、ＨＡ座にＥ、ｐｒＭ、Ｃの２１アミノ酸を含有するＹＦ５３を産生した。供与体プラスミドＹＦ５３をｖＰ９１３（ＮＹＶＡＣ−ＭＶ）に感染した細胞中にトランスフェクションしてワクシニア組換え体ｖＰ９９７を産生した。
【０４０７】
１型デング熱のワクシニアウイルス供与体プラスミド中へのクローニング
カルボキシ末端８４％ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１（ヌクレオチド２５５９−３７４５、メイソンら、1987ｂ）を、ＤＥＮ  ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５５９−３７４０）およびアニールしたオリゴヌクレオチドＤＥＮ１（配列認識番号１２５）とＤＥＮ２（配列認識番号１２６）（ＸｂａＩ付着末端、翻訳終止コドン、Ｔ５ＡＴワクシニアウイルス初期転写終止シグナル（ユエンら、1987）、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ付着末端を含有する）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８中にクローニングすることにより誘導した。ＤＥＮ１からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ヌクレオチド２５５９−３７４５）およびＥのカルボキシ末端３６％とアミノ末端１６％ＮＳ１をコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩで切断したＩＢＩ２４（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）に連結し、カルボキシ末端６４％Ｅからアミノ末端４５％ＮＳ２Ａをコードし、ＮＳ１に塩基の欠けた（ヌクレオチド２４６７）ＤＥＮ３を産生した。
【０４０８】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断したＩＢＩ２４をアニールしたオリゴヌクレオチドＤＥＮ９（配列認識番号１２７）およびＤＥＮ１０（配列認識番号１２８）［ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端、ＳｍａＩ部位、ＤＥＮヌクレオチド３７７−４２８（メイソンら、1987ｂ）およびＸｂａＩ付着末端を含有する］に連結し、ＳＰＤ９１０を産生した。ＳＰＤ９１０をＳａｃＩ（ＩＢＩ２４内）とＡｖａＩ（ヌクレオチド４２３のＤＥＮ内）で切断し、ＤＥＮ  ｃＤＮＡのＡｖａＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド４２４−１４４７メイソンら、1987）に連結し、カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ４を産生した。
【０４０９】
カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１をコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ６（ヌクレオチド２４６７が存在するヌクレオチド１４４７−２５７９、メイソンら、1987ｂ）を、ＤＥＮ  ｃＤＮＡのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片をＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）中にクローニングすることにより誘導した。ＤＥＮ５′未翻訳領域の５１塩基、Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１５を、ＤＥＮ  ｃＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド２０−１４４７、メイソンら、1987ｂ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ＮＳ２Ａおよびアミノ末端２８％ＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２３を、ＤＥＮ  ｃＤＮＡのＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片をＸｂａｉ−ＳｐｈＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ酸ＮＳ３をコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２０（ヌクレオチド３７４５−４５６３）を、ＤＥＮ  ｃＤＮＡのＸｂａＩからＥｃｏＲＩ断片をＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。
【０４１０】
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、1985）を用いて以下の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止シグナルを改変せしめた（ユエンら、1987）。ＤＥＮ４中のｐｒＭ遺伝子における２つのＴ５ＮＴ配列、（１）カルボキシ末端からの２９ａａ（ヌクレオチド８２２−８２８ＴＴＴＴＴＣＴをＴＡＴＴＴＣＴに）および（２）カルボキシ末端からの１３ａａ（ヌクレオチド８７０−８７５ＴＴＴＴＴＡＴからＴＡＴＴＴＡＴに）を突然変異誘発せしめてプラスミドＤＥＮ４７を産生した。ＤＥＮ６中のＮＳ１遺伝子における単一のＴ５ＮＴ配列、アミノ末端からの１７ａａを突然変異誘発せしめて（ヌクレオチド２４４８−２４５４ＴＴＴＴＴＧＴからＴＡＴＴＴＧＴに）プラスミドＤＥＮ７を産生した。
【０４１１】
上述したようにオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）ＮＳ２Ａのカルボキシ末端でのＥａｇＩとＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド４１０２）をプラスミドＤＥＮ２３に挿入してＤＥＮ２４を産生し、（２）Ｅのカルボキシ末端らのＡＴＧ１５ａａとＳｍａＩ部位をＤＥＮ７（ヌクレオチド２３４８）に挿入してＤＥＮ１０を産生し、（３）ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端でのＥａｇＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位（ヌクレオチド４４９２）をプラスミドＤＥＮ２０に挿入してプラスミドＤＥＮ２１を産生し、そして（４）プラスミドＤＥＮ１５中のフクレオチド６３−６７をワクシニアウイルス初期／晩期Ｈ６プロモーター（位置−１から−２１、パーカスら、1989）と置換してＤＥＮ１６（ＤＥＮヌクレオチド２０−５９、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１およびＤＥＮヌクレオチド６８−１４４７を含有する）を産生した。
【０４１２】
ＤＥＮ７からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を、ＤＥＮ１３中の対応領域と置換して、カルボキシ末端６４％Ｅとアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有し（ヌクレオチド１４４７−３７４５）、ヌクレオチド２４６７が存在し改変転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）を有するＤＥＮ１９を産生した。ＤＥＮ１９からのＸｈｏＩ−Ｘｂａｉ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４５）およびＤＥＮ２４からのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ＸｂａＩヌクレオチド３７４５ＤＥＮからＩＢＩ２４中のＨｉｎｄＩＩＩ）をＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＩＢＩ２５に連結して、カルボキシ末端８２％ＮＳ１、ＮＳ２Ａおよびアミノ末端２８％ＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有し（ヌクレオチド２５７９−４２１３）、４１０２でのＥａｇＩ部位、ヌクレオチド２４６７が存在し、突然変異誘発転写終止シグナルを有する（ヌクレオチド２４４８−２４５４）ＤＥＮ２５を産生した。ＤＥＮ１９からのＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４５）をＸｈｏＩ（ＩＢＩ２５内）とＸｂａＩ（ＤＥＮヌクレオチド３７４５）で切断したＤＥＮ２１に連結し、カルボキシル末端８２％ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２４ａａＮＳ３をコードし（ヌクレオチド２５７９−４５６４）、ヌクレオチド２４６７が存在し、改変転写終止シグナル（ヌクレオチド２４４８−２４５４）および４４９２でのＥａｇＩ部位を有するＤＥＮ２２を産生した。
【０４１３】
ＤＥＮ１６からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（ヌクレオチド２０−４９４）をＤＥＮ４７からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片（Ｅのカルボキシ末端８３％ｐｒＭとアミノ末端３６％ヌクレオチド４９４−１４４７および複製のプラスミド起点をコードする）と連結し、Ｃ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅ並びにＣのアミノ末端に先行するＥｃｏＲＶ部位とＨ６プロモーターの部分をコードするＤＥＮ１７を産生した。
【０４１４】
カルボキシ末端１３ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ１７からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ヌクレオチド３７０−１４４７）をアニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ１１１およびＳＰ１１２（不能ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１、およびＢｇｌＩＩ付着末端を有するＤＥＮヌクレオチド３５０−３６９）に連結し、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１、カルボキシ末端２０ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ３３を産生した。
【０４１５】
ＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５（メイソンら、1991）を、カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ４からのＳｍａＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド３７７−１４４７）と、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２ＡをコードするＤＥＮ３からのＳａｃＩ−ＥａｇＩ断片とに連結し、ＤＥＮＬを産生した。カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１をコードするＤＥＮ７からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を、ＤＥＮ４７からのＢｓｔＥＩＩ−ＳａｃＩ断片（カルボキシ末端５５％ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅヌクレオチド６３１−１４４７をコードする）とＤＥＮＬからのＢｓｔＥＩＩ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ、アミノ末端４５％ｐｒＭ、カルボキシ末端８２％ＮＳ１、カルボキシ末端ＮＳ２Ａ、複製の起点およびワクシニア配列をコードする）とに連結し、ＤＥＮ８を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖切断突然変異誘発（マンデッキ、1986）を用いて特有のＳｍａＩ部位（Ｈ６プロモーターとＡＴＧの間に位置する）を除去し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンに先行するＤＥＮ８ＶＣを産生した。
【０４１６】
ＤＥＮ１７からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド６８−１４４７）をＤＥＮ８ＶＣのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（ワクシニア配列、−２１から−１２４のＨ６プロモーター、複製の起点およびアミノ末端６４％Ｅ、ＮＳ１、アミノ末端４５％ＮＳ２Ａヌクレオチド１４４７−３７４５）に連結し、ＤＥＮ１８を産生した。ＤＥＮ２５からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−４１０２）をＤＥＮ１８のＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列およびＤＥＮ  Ｃ、ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１を含有する、ヌクレオチド６８−２５７９）に連結し、ＤＥＮ２６を産生した。ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（位置−２１から−１Ｈ６プロモーター、ヌクレオチド３７７−１４４７）をＤＥＮ２６からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（カルボキシル末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２Ａをコードしヌクレオチド２８９４でＮＳ１に塩基の欠けたＤＥＮ領域、複製の起点およびワクシニア配列を含有する）に連結し、ＤＥＮ３２を産生した。ＤＥＮ３２をｖＰ４１０に感染した細胞中にトランスフェクションして組換え体ｖＰ８６７を産生した（第２０図）。
【０４１７】
ＤＥＮ１０からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）をＤＥＮ３中の対応領域と置換して、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２Ａをコードし、Ｅのカルボキシ末端からのＡＴＧ１５ａａとＳｍａＩ部位を有するＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有するＤＥＮ１１を産生した。ＤＥＮ１１からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片（カルボキシ末端１５ａａＥ、ＮＳ１およびアミノ末端４５％ＮＳ２Ａをコードする、ヌクレオチド２３４８−３７４５）をＳｍａＩ−ＥａｇＩで切断したｐＴＰ１５に連結し、ＤＥＮ１２を産生した。
【０４１８】
ＤＥＮ２２からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−４４９２９を上述したＤＥＮ１８からのＸｈｏＩ−ＥａｇＩ断片に連結して、ＤＥＮ２７を産生した。ＤＥＮ１２からのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片（位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥＮ、ヌクレオチド２３４８−３４４７）を、ＤＥＮ２７からのＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列、Ｈ６プロモーター−２１から−１２４およびＮＳ２ＡとＮＳ２ＢをコードするＤＥＮ  ｃＤＮＡを含有する）に連結し、ＤＥＮ３１を産生した。
【０４１９】
ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ、ｐｒＭ  Ｅ、アミノ末端１８％ＮＳ１をコードする位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド）をＤＥＮ３１らのＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端８２％ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂをコードし、位置２８９４でＮＳ１に塩基が存在するＤＥＮ  ｃＤＮＡ、ワクシニア配列および複製の起点を含有する）に連結し、ＤＥＮ３５を産生した。ＤＥＮ３５をｖＰ４１０感染細胞中にトランスフェクションして組換え体ｖＰ９５５を産生した（第２０図）。ＤＥＮ３３からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（カルボキシ末端２０ａａＣ、ｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅをコードする位置−２１から−１Ｈ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド３５０−１４４７）およびＤＥＮ３２からのＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳ１ヌクレオチドをコードする）を上述したＤＥＮ３１からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片に連結し、ＤＥＮ３４を産生した。ＤＥＮ３４をｖＰ４１０に感染した細胞中にトランスフェクションして、組換え体ｖＰ９６２を産生した（第２０図）。オリゴヌクレオチドＤＥＮ１（配列認識番号１２５）、ＤＥＮ２（配列認識番号１２６）、ＤＥＮ９（配列認識番号１２７）、ＤＥＮ１０（配列認識番号１２８）、ＳＰ１１１（配列認識番号１２９）、およびＳＰ（配列認識番号１３０）を以下に示す：
【化７１】
0003624911.tif 000091
【実施例１７】
【０４２０】
改変ＮＹＶＡＣウイルスの構築
ワクシニアの左側末端に近い［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損のサイズを異なる程度に増大せしめ、右側末端に近い欠損を導入することにより、ＮＹＶＡＣを改変した。全ての欠損は、Ｅ．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子とミコフェノール酸を一過性選択システムで使用することにより行なった。
【０４２１】
一過性優性選択
環状供与体プラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈殿プラスミドＤＮＡをワクシニア感染ベロ細胞へトランスフェクションする標準方法によりワクシニアウイルスの組換えを行なった。２４時間後、感染細胞を収集して、溶解産物を１マイクログラム／ｍｌのミコフェノール酸（ＭＰＡ）の存在下で平板培養した。個々のプラークを採取してＭＰＡの存在下においてベロ細胞で増幅した。ウイルスを収集して、ＭＰＡが存在しない条件でプラークの採取を２回行なってプラークを精製した。ＭＰＡなくして各回で採取したプラークをベロ細胞において平板培養し、適切な遺伝子の存在下でフィルターをハイブリダイゼーションした。
【０４２２】
ＮＹＶＡＣ．１．
ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）中に存在する［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損を、隣の２つのＯＲＦから右側のＫ２ＬおよびＫ３Ｌを含有するように拡張せしめた。Ｋ２Ｌ  ＯＲＦに関する推定の翻訳産生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の類に対する相同性を示す（ボースネル、1988）。しかしながら、ワクシニアゲノムのこの領域の転写地図作成は発現されない（マルガンら、1984）。
【０４２３】
Ｋ３Ｌの翻訳産生物は、セリン（アミノ酸５１）ホスホリル化部位に亘り重複する８７アミノ酸に亘る真核性阻害因子２アルファ（ｅＩＦ−２アルファ）に対して２８％の相同性を示す。ｅＩＦ−２アルファのホスホリル化は、インターフェロンにより誘発された抗ウイルス状態における段階であり、ワクシニアがインターフェロンの効果を回避する機構には、ワクシニアＫ３Ｌ遺伝子産生物が必要であることを示す。ワクシニアのコペンハーゲン菌株からのＫ３Ｌ遺伝子を欠損せしめた（ビーティーら、1991）。産生したウイルスは、タンパク質合成のウイルス誘発の阻害とウイルス複製の阻害により測定されるような生体外インターフェロンに対して増大した感度を示した。これにより、ワクシニアウイルスからのＫ３Ｌの欠損は、ワクチン接種の合併症の場合にはインターフェロンにより制御されるより安全なワクチン菌株となることが示される。
【０４２４】
Ｃ７ＬからＫ３Ｌが欠損したプラスミドｐＭＰＣ７Ｋ３ＧＰＴの構築
［Ｃ７Ｌ−Ｋ３Ｌ］欠損を側腹に有する左右ワクシニアアームを別々に組み立てた。左アームをｐＳＤ４２０から誘導し（パーカスら、1990）、中間欠損プラスミドｐＭＰ２５６／２５７中に組み立てた（パーカスら、1991）。合成オリゴヌクレオチドＮＰＳＹＮ３７９（配列認識番号１３１）、ＭＰＳＹＮ３８０（配列認識番号１３２）
【化７２】
0003624911.tif 000092
【０４２５】
を、テンプレートとしてプラスミドｐＳＤ４２０を用いたＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いた。差錬成した０．１４ｋｂ断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩで切断し、ｐＭＰ２５６／２５７に挿入して、プラスミドの左アームを置換した。産生したプラスミドをｐＭＰ３７９／３８０と称した。０．７ｋｂ  ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４２０から単離して、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰ３７９／３８０に連結し、プラスミドｐＭＰＣ７Ｆ４を形成した。
【０４２６】
Ｋ３Ｌの右側の配列を含有する右側欠損接合部を構築するために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３８１／ＭＰＳＹＮ３８２（配列認識番号１３３／配列認識番号１３４）
【化７３】
0003624911.tif 000093
【０４２７】
をアニールしてＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８に連結し、プラスミドｐＭＰ３８１／３８２を形成した。１．０ｋｂ  ＨｐａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＶ断片をクローニングしたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｋから単離して、ｐＰ３８１／３８２に連結し、全縁右側ワクシニアフランキングアームを含有するプラスミドｐＭＰＫ３Ｒを形成した。左側ワクシニアフランキングアームを０．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩ（部分的）／ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてのｐＭＰＣ７Ｆ４から単離して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＭＰＫ３Ｒに挿入した。産生したプラスミド、ｐＭＰＣ７Ｋ３は、１４遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ３Ｌ］が欠損している。
【０４２８】
選択可能なマーカーとしての使用のために、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）をコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子（プラットら、1983）を、ポックスウイルスプロモーターの制御下で配した。昆虫ポックス４２ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子から直接上流の３１ｂｐプロモーター要素は、感染後の初期に組換えワクシニアウイルスの強力な真プロモーターとして機能できる。３１ｂｐ  ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターを含有するアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３６９／３７０（配列認識番号１３５／配列認識番号１３６）
【化７４】
0003624911.tif 000094
【０４２９】
を、ｐＢＳ−ＳＫバックグラウンドのＥｃｏｇｐｔ遺伝子ら上流に連結し、プラスミドｐＭＰ４２ＧＰＴを産生した。４２ｋＤａプロモーター／Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子発現カセットを含有するＳｍａＩ断片をｐＮＰ４２ＧＰＴから単離して、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＳｍａＩ部位のワクシニア欠損プラスミドｐＭＰＣ７Ｋ３に挿入した。産生したプラスミド、ｐＭＰＣ７Ｋ３ＧＰＴをｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）中にトランスフェクションした。一過性優性選択システムにおける組換えの中間産生物の選択に関して培養培地にミコフェノール酸を用いた（フォークナーら、1990）。選択的な圧力の除去後に、Ｋ２Ｌ  ＤＮＡ配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとＫ４Ｌの保持により、後代ウイルスをスクリーニングした。欠損接合部の適合度をＰＣＲおよびＤＮＡ制限および配列分析により確認した。組換えワクシニアウイルスｖＰ９５４（ＮＹＶＡＣ．１．）は、［Ｃ７Ｌ−Ｋ３Ｌ］欠損、並びにＮＹＶＡＣに存在する他の欠損（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、Ｉ４Ｌ、［Ｂ１３−Ｂ１４］）も含有する。
【０４３０】
ＮＹＶＡＣ．２．
ＮＹＶＡＣに存在する［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損を、３８のＯＲＦ、［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］の合計を含有するように両方向に拡張した。これは以前にワクシニア欠損変異体ｖＰ７９６に報告した同一の欠損である（パーカスら、1991）。拡張した欠損領域で除去した著しいＯＲＦは、ＮＹＶＡＣ欠損の左側に位置するワクシニア増殖因子（ＶＧＦ；Ｃ１１Ｒ）を含有する。ＶＧＦの２つのコピーを含有するワクシニアのＷＲ菌株と対称的に、Ｃ１１Ｒは、ワクシニアのコペンハーゲン菌株中のＶＧＦをコードする唯一のＯＲＦである。ＷＲからのワクシニア増殖因子の両方のコピーの欠損は、家ウサギの皮内接種で皮膚の外傷の酷さを除去し、マウスのウイルスの神経毒性を減少することが示されている（バラーら、1988）。［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損における右側のＯＲＦ、Ｆ４Ｌは、リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニットの遺伝子をコードする（スラボーら、1988）。この欠損にはＯＲＦ  Ｆ２Ｌが含まれ、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄＵＴＰａｓｅ、ヌクレオチド配列に必要な別の酵素に対する相同性を示す（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）。Ｆ２Ｌはまたレトロウイルスプロテアーゼに対する相同性を示す（スラボーら、1989）。
【０４３１】
Ｃ２３ＬからＦ４Ｌの欠損したプラスミドｐＭＰＴＲＦ４ＧＰＴの構築
ワクシニア欠損変異体ｖＰ７９６の産生に中間体として使用したプラスミドｐＭＰＬＥＮＤΔ（パーカスら、1991）を、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／Ｅｃｏｇｐｔ遺伝子を含有するＳｍａＩ発現カセットを添加することにより改変した。産生したプラスミド、ｐＭＰＴＲＦ４ＧＰＴをＮＹＶＡＣ中にトランスフェクションした。ＭＰＡを用いた選択後に、Ｆ４Ｌ  ＤＮＡ配列の損失のためのプラークハイブリダイゼーションとＦ５Ｌの保持によりスクリーニングした。ＰＣＲおよびＤＮＡ制限分析により、欠損接合部の適合度を確認した。組換えウイルスｖＰ９３８（ＮＹＶＡＣ．２．）は、［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損並びにＮＹＶＡＣ中に存在する他の欠損を含有する。
【０４３２】
ＯＲＦ  Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒの欠損
ＮＹＶＡＣ中に存在するｕ欠損［Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ］を、右側の全てのＯＲＦ、１７のＯＲＦ［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］の合計を含有するように拡張せしめた。これは、以前に報告したワクシニア欠損変異体ｖＰ７５９中の同一の欠損である（パーカスら、1991）。拡張欠損領域は、その産生物が互いに２０％のアミノ酸同一性を示す２つの遺伝子を含有する（スミスら、1991）。これらの遺伝子産生物をコードするＯＲＦは、コペンハーゲンのＢ１６ＲとＢ１９Ｒを示し（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）、これらはそれぞれＷＲ菌株中のＯＲＦ  Ｂ１５ＲとＢ１８Ｒに対応する（スミスら、1991）。両方の遺伝子産生物が典型的なシグナル配列を含有するワクシニアのＷＲ菌株とは違って、コペンハーゲンＯＲＦ  Ｂ１６の予期した翻訳産生物をアミノ末端で切断されている。Ｂ１９Ｒは、感染後初期に発現されたワクシニア表面タンパク質（Ｓ抗原）をコードした（ウエダら、1990）。Ｂ１６ＲとＢ１９Ｒの両者は、免疫グロブリン上科、特にＩＬ−１受容体に対する相同性を示す。ワクシニア遺伝子産生物の１つまたは両方は、ワクシニアが、シトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を結合せしめ、それゆえ宿主炎症応答を減少せしめることにより免疫システムを避けるのを助けることが示唆されている（スミスら、1991）。
【０４３３】
Ｂ１３ＲからＢ２９Ｒの欠損したプラスミドｐＮＰＴＲＢ１３ＧＰＴの構築
ワクシニア欠損変異体ｖＰ７５９およびｖＰ８１１の産生に中間体として用いたプラスミドｐＭＰＲＥＮＤΔ（パーカスら、1991）を、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／Ｅｃｏｇｏｔ遺伝子を含有するＳｍａＩ発現カセットの添加により改変した。産生したプラスミド、ｐＭＰＴＲＢ１３ＧＰＴをＮＹＶＡＣ中にトランスフェクションした。ＭＰＡを用いた選択の後に、Ｂ１５ＤＮＡ配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとＢ１２の保持により、後代ウイルスをスクリーニングした。ＰＣＲとＤＮＡ制限分析により欠損接合部の適合度を確認した。組換えウイルスｖＰ９５３は、［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］欠損並びにＮＹＶＡＣ中に存在する他の欠損を含有する。
【０４３４】
左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損と右側［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］欠損の結合
ワクシニアウイルスの左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］と右側［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］末端の両方で欠損を含有する、真ワクシニア欠損変異体ｖＰ８１１の産生を記載した（パーカスら、1991）。ｖＰ８１１は、ワクシニア宿主域遺伝子、Ｃ７Ｌおよび選択可能マーカーＥｃｏｇｐｔの両者を含有する。ＮＹＶＡＣバックグラウンド中にＣ７ＬまたはＥｃｏｇｐｔを有さない巨大末端欠損を含有するウイルスを産生するために、ｖＰ９５３による組換えの供与体プラスミドとしてｐＭＰＴＲＦ４ＧＰＴを用いた。後代ウイルスは上述した一過性優性選択システムにおいてＭＰＡにより選択され、Ｆ４Ｌ  ＤＮＡ配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとＦ５Ｌの保持によりスクリーニングされている。組換えウイルスｖＰ９７７は、［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］および［Ｃ２３Ｒ−Ｆ４Ｌ］の欠損並びにＮＹＡＶＣ中に存在する他の欠損を含有する。ｖＰ８１１のように、ｖＰ９７７は、ワクシニア末端反復のコピーの両方からの全ての遺伝子が欠損している。
【実施例１８】
【０４３５】
宿主制限ポックスウイルスによるＨＩＶ遺伝子産生物の発現
この実施例は、ＨＩＶ−１遺伝子産生物を発現する宿主制限ポックスウイルスの産生を記載するものである。使用したベクターはＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣである。
【０４３６】
細胞およびウイルス
ＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣウイルスベクターおよびそれらの誘導体を前述したように繁殖せしめた（ピッチーニら、1989；テイラーら、1988ａ、ｂ）。ベロ細胞と初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を前述したように増殖せしめた（テイラーら、1988ａ、ｂ）。Ｐ８１５マウスの肥満細胞種（Ｈ−２d ）をＡＴＣＣ（＃ＴＩＢ６４）から得て、１０％のウシ胎仔血清ＣＦＢＳおよび１００Ｉｕ／ｍｌペニシリンおよび１ｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシンを補給したイーグルＭＥＭ中に保持した。
【０４３７】
マウス
メスＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２d ）マウスをジャクソン研究所（ＭＥ、バーハーバー）から購入し、不断給餌で保持した。全てのマウスは、生後６から１５週間のものを用いた。
【０４３８】
培地
免疫学的アッセイのアッセイ培地は、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホネート）、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、１ｍｌ当たり１００ＩＵのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０培地からなるものであった。スチム（ｓｔｉｍ）は、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０-4Ｍの２−メルカプトエタノール、１ｍｌ当たり１００ＩＵのペニシリン、および１ｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシンを補給したイーグル最小必須培地からなる。
【０４３９】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）エンベロープのエピトープおよびＶ３ループを含有するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ組換え体
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）のＶ３ループを包含する１５０ｂｐ（アミノ酸２９９−３４４；ジャブヘリアンら、1989）を、テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）を有するオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ５（配列認識番号１３７）
【化７５】
0003624911.tif 000095
【０４４０】
およびＨＩＶ３ＢＬ３（配列認識番号１３８）
【化７６】
0003624911.tif 000096
【０４４１】
（ＭＤ．ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロにより供給された）を用いたＰＣＲにより誘導した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ａ（配列認識番号１３９）
【化７７】
0003624911.tif 000097
【０４４２】
およびＨＩＶ８８Ｂ（配列認識番号１４０）
【化７８】
0003624911.tif 000098
【０４４３】
をともにアニールして、ＨＩＶ−１エピトープ８８を含有する二本鎖断片を産生した（アミノ酸９５−１０５、シャファーマンら、1989）。相補性配列の存在によるＰＣＲにより、エピトープを含有する１５０ｂｐ  Ｖ３含有ＰＣＲ断片および８８エピトープ配列を含有する４２ｂｐ断片をともに融合せしめた。この反応はオリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃ（配列認識番号１４１）（５′−ＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＣ−３′）およびＨＩＶ３ＢＬ３（配列認識番号１３８）を用いて行なった。１９２ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片は、Ｖ３ループ配列の上流で融合したエピトープ８８配列を含有する。終止コドン（ＴＡＡ）をオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３Ｐに含有せしめ、読取り枠の翻訳を終止し、開始コドンを翻訳の開始として機能するオリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃに含有せしめ、エピトープ８８／Ｖ３ループ融合タンパク質を発現した。加えて、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３を、ＥｃｏＲＩ部位が１９２ｂｐ  ＰＣＲ断片の３′末端に存在するように合成した。テンプレートとしてプラスミド、ｐＡＭ１２とともに、オリゴヌクレオチドＲＧ２７３（配列認識番号１４２）（５′−ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＣ−３′）およびＲＧ２７４（配列認識番号１４３）（５′−ＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣ−３′）を用いたＰＣＲにより、昆虫ポックスウイルス４２ｋＤａ（初期）プロモーターを産生した。４２ｋＤａプロモーターを含有する１０８ｂｐ断片を、５′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するように合成した。断片を含有する４２ｋＤａをキナーゼして、ＥｃｏＲＩで切断したエピトープ８８／Ｖ３断片とＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＲＷ８３１に連結する前にＨｉｎｄＩＩＩで切断した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＬ８８と称した。このプラスミドを、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐとともに生体外組換えアッセイにおいてｖＣＰ９５を産生した。ＡＬＶＡＣ組換え体、ｖＣＰ９５は、ＣＰｐｐのｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｃ５座にエピトープ８８／Ｖ３ループを含有する。
【０４４４】
プラスミドｐＣ５ＨＩＶＬ８８をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断して、叙述したエピトープ８８／Ｖ３発現カセットを含有する３００ｂｐ断片を離生した。この断片をＬＭＰ−アガロースゲルから切除して、フェノール抽出（２×）とエーテル抽出（１×）により単離した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて、単離した断片をブラントエンドした。断片をｐＳＤ５５０に連結し、ｐＳＤ５４８からの誘導体（第６図）をＳｍａＩで切断してプラスミドｐＨＩＶＬ８８ＶＣを産生した。このプラスミドを治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とともに用いてｖＰ８７８を産生した。ｖＰ８７８は、ＮＹＶＡＣのｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｉ４Ｌ座にエピトープ８８／Ｖ３ループカセットを含有する。
【０４４５】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）エンベロープ糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣベースの組換え体
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに３′が隣接したＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ遺伝子からなる発現カセット（グオら、1989；テイラーら、1988ａ、ｂ）を、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣベクターによりＨＩＶ−１からｇｐ１６０の発現に関して操作した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）
【化７９】
0003624911.tif 000099
【０４４６】
およびＨＩＶ３Ｂ５（配列認識番号１４５）
【化８０】
0003624911.tif 000100
【０４４７】
を用いて１．４ｋｂ断片をｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロにより供給された）から増幅せしめた。この断片は、ｅｎｖ遺伝子の３′部分を含有する。これらのプライマーによるＰＣＲ増幅は、コード配列の後にワクシニアウイルス初期転写終止Ｔ５ＮＴ配列モチーフを配し、アミノ酸配列を改変することなく位置６１４６から６１５２に位置したＴ５ＮＴモチーフ（ラトナー、1985）を除去した。この変化（ＴからＣ）は、この位置にＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）を産生する。この１．４ｋｂ断片をＥｃｏＲＩ（５′末端）とＸｂａＩ（３′末端）で切断し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶＥＮＶ１、５と称した。この断片のヌクレオチド配列分析により、配列は位置７８４８でのＴからＣの塩基転移を除いて完全に正確であることが示された。この塩基転移は以下のように正確であった：テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）
【化８１】
0003624911.tif 000101
【０４４８】
およびＨＩＶ３Ｂ１７（配列認識番号１４６）
【化８２】
0003624911.tif 000102
【０４４９】
を用いてＰＣＲにより２５０ｂｐ断片を誘導した。この断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断した。この断片を、ＧｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳＨＩＶ３Ｂ１、５に挿入し、それゆえ不正確なヌクレオチドノ領域と置換してプラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＢＰを産生した。
【０４５０】
テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）とともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ９（配列認識番号１４７）
【化８３】
0003624911.tif 000103
【０４５１】
およびＨＩＶ３Ｂ１０（配列認識番号１４８）
【化８４】
0003624911.tif 000104
【０４５２】
を用いたＰＣＲにより、ｅｎｖ遺伝子の５′部分を含有する１５０ｂｐ断片を誘導した。オリゴヌクレオチドＶＶＨ６５Ｐ（配列認識番号１４９）
【化８５】
0003624911.tif 000105
【０４５３】
およびＶＶＨ６３Ｐ（配列認識番号１５０）
【化８６】
0003624911.tif 000106
【０４５４】
を用いたＰＣＲによりｐＣ３ＦＧＡＧからのワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する１２８ｂｐ断片を産生した。両方の断片をＫｐｎＩで切断し、これらの断片をＫｐｎＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入する前に、１５０ｂｐ断片をキナーゼした。産生したプラスミドをｐＢＳＨ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐと称した。
【０４５５】
オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２（配列認識番号１５１）
【化８７】
0003624911.tif 000107
【０４５６】
およびＨＩＶ３Ｂ７（配列認識番号１５２）
【化８８】
0003624911.tif 000108
【０４５７】
を用いたＰＣＲにより、ｐＨＸＢ．２Ｄ（ＩＩＩ）からの６００ｂｐ断片を産生した。この断片をＥｃｏＲＩで切断し、キナーゼした。同一のテンプレートであるが、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ６（配列認識番号１５３）
【化８９】
0003624911.tif 000109
【０４５８】
およびＨＩＶ３Ｂ８（配列認識番号１５４）
【化９０】
0003624911.tif 000110
【０４５９】
を用いたＰＣＲにより、５００ｂｐ断片を誘導した。この断片をＫｐｎＩで切断した。これらの断片は、ヌクレオチド５８７８から６３６８にともに対応するものである（ラトナーら、1985）。これらのプライマーによりこれらの断片の操作はまた、アミノ酸配列を改変することなく、ヌクレオチド６３３２から６３２８に位置するＴ５ＮＴ配列を除去する。これらの２つの断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳＨＩＶ３Ｂ３Ｐに挿入した。このプラスミドをｐＢＳＨＩＶ３ＢＰ２７６８と称した。
【０４６０】
プラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ３Ｂ５ＰをＫｐｎＩで切断し、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の５′部分（１５０ｂｐ）およびＨ６プロモーターを含有する３６０ｂｐ断片を離生した。このＫｐｎＩ断片をＫｐｎＩで切断したｐＢＳＨＩＶ３ＢＰ２７６８に連結し、プラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩを産生した。ＸｂａＩの切断と続いての部分的なＫｐｎＩの切断により２．８ｋｂ断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩから誘導した。この断片をブラントエンドし、ＳｍａＩで切断したｐＳＤ５５０に挿入した。プラスミドｐＩ４ＬＨ４ＨＩＶ３Ｂを産生し、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とともに生体外組換え実験に用いた。これにより、ＮＹＶＡＣゲノムのＩ４Ｌ座にＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子を含有するｖＰ９１１が産生せしめられた。
【０４６１】
ＨＩＶ−１  ｅｖｎ遺伝子をＡＬＶＡＣベクターに挿入するために、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩをＮｒｕＩとＸｂａＩで切断した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で誘導した２．７ｋｂ断片をブラントエンドした。この断片は、ワクシニアＨ６プロモーターの３′末端側の２１ｂｐ（ＮｒｕＩ部位に対して）に３′が隣接した全縁ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子を含有する。ｐＲＷ８３８のＮｒｕＩとＥｃｏＲＩによる切断と続いてのクレノウによるブラントエンドにより誘導した３．１ｋｂ断片に、この断片を連結した。ｐＲＷ８３８誘導断片は、カナリヤポックスから誘導した相同アームを含有し、異種遺伝子をＣ５座に向ける。この断片はまた、Ｈ６プロモーターの５′末端側の１００ｂｐを含有する。それゆえ、これらの断片の連結により、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の発現カセットを含有する挿入プラスミドが産生され、これをｐＣ５ＨＩＶ３ＢＥと称した。治療ウイルスとしてとＡＬＶＡＣによる生体外組換え実験にこのプラスミドを用いてｖＣＰ１１２を産生した。
【０４６２】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｇｐ１２０を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体
プラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＡＩＩをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、４．３ｋｂ断片を離生した。この断片は、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子に連結したワクシニアウイルスＨ６プロモーターからヌクレオチド６９４６を含有する（ラトナーら、1985）。４．３ｋｂ断片を、ｇｐ１２０コード配列の３′部分に対応する３００ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ切断ＰＣＲ誘導断片に連結した。テンプレートとしてのｐＨＸＢ．２ＤとともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ１−１２０Ａ（配列認識番号１５５）
【化９１】
0003624911.tif 000111
【０４６３】
およびＨＩＶ１−１２０Ｂ（配列認識番号１５６）
【化９２】
0003624911.tif 000112
【０４６４】
を用いて３００ｂｐ  ＰＣＲ断片を誘導した。４．３ｋｂ  ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片と３００ｂｐ  ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片の連結により、プラスミドｐＢＳＨＩＶＢ１２０を産生した。
【０４６５】
最初にプラスミドをＸｂａＩで線状化して続いて部分的にＫｐｎＩ切断により１．６ｋｂのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をｐＢＳＨＩＶＢ１２０から誘導した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片による処理でブラントエンドした。この断片をＳｍａＩで切断したｐＳＤ５４ＩＶＣに挿入し、ｐＡＴＩＨＩＶＢ１２０を産生した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９２１を産生した。この組換え体は、ＮＹＶＡＣのＡＴＩ座においてｇｐ１２０をコードするＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の部分を含有する。
【０４６６】
免疫沈降
ｖＰ９１１、ｖＰ９２１およびｖＣＰ１１２により発現されたＨＩＶ−１遺伝子産生物の真正を決定するために、免疫沈降分析を行なった。ベロ細胞単層を、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で、疑似感染、親ウイルスｖＰ８６６、または組換えウイルスに感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、細胞に２ｍｌのＭＥＭ（２％のＦＢＳおよび［35Ｓ］−メチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するマイナスメチオニン）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅ、および０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加して続いて細胞単層を書き取ることにより、感染から１８時間後に細胞を収集した。
【０４６７】
感染細胞から誘導した溶解産物を、ＨＩＶ−１血清陽性個体（ＭＤ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．ゲノベファフランチーニから得た）から採取した血清を用いてＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。この血清をｖＰ感染ベロ細胞で前に吸着せしめた。前に吸着せしめたヒトの血清を４℃の１晩のインキュベーションによりタンパク質Ａプロテアーゼに結合せしめた。ある場合には、ｇｐ１２０に特異的な単クローン性抗血清（デュポン）を第１血清として用い、第２抗体としてラット抗マウスを用いた。このインキュベーション期間の後に、物質を１×の緩衝液Ａで４回洗浄した。次いでタンパク質Ａセファロースに結合した血清陽性の個体からのヒトの血清とともに、通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースにより前に浄化した溶解産物を４℃でインキュベーションした。１晩のインキュベーション期間の後に、試料を、１×緩衝液Ａと２×ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で４回洗浄した。２×のラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのとリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール；１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸
塩で処理した。
【０４６８】
ＨＩＶ−１血清陽性個体から採取した血清を用いた免疫沈降の結果により、ｖＰ９１１巻戦災房溶解産物からのｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１熟成形状の特異的な沈殿が示された。親（ＮＹＶＡＣ；ｖＰ８６６）感染細胞溶解産物にはそのような特異的遺伝子産物を検出されなかった。ｇｐ１２０の特異的沈殿はまたｖＰ９２１感染細胞溶解産物にも見られた。
【０４６９】
同一の血清による免疫沈降分析により、それぞれｖＰ９１１およびｖＰ９２１により発現されたｇｐ１６０およびｇｐ１２０種は、感染細胞の表面に存在したことが示された。
【０４７０】
免疫沈降を、ｖＣＰ１１２感染細胞に関しても行なった。ＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染した細胞および未感染細胞からのｇｐ１２０細胞外部分に対して向けられた単クローン性抗体に関しては、ＨＩＶ−特異的ポリペプチドは沈殿しなかった。しかしながら、２つのＨＩＶ特異的ポリペプチド種は、ｖＣＰ１１２感染細胞からは沈殿した。これらの種は、それぞれ前駆体ｅｎｖ遺伝子産生物および熟成細胞外形状に対応する１６０ｋＤａおよび１２０ｋＤａの明確な移動度で移動した。
【０４７１】
接種
外側の尾の静脈により、０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中５×１０7 プラーク形成単位（ＰＦＵ）をマウスに静脈接種せしめた。
【０４７２】
脾臓細胞調製
頸部の脱臼による安楽死の後に、ハンクス平衡塩溶液を含有する無菌のプラスチックバッグに、マウスの脾臓を移した。単一の実験群からの個々の脾臓または採取した脾臓を、ストマッチャーブレンダー中での１分間のサイクルにより１つの細胞懸濁液に処理した。脾臓細胞懸濁液を、アッセイ培地またはスチム培地のいずれかで適切に数回洗浄した。血球計算盤および顕微鏡を用いて、トリパンブルー染料排除により、またはカトラーカウンターの使用により脾臓細胞を枚挙した。
【０４７３】
血清
マウスにエーテルで軽く麻酔をかけ、血液をレトロオービタル集網から採取した。実験群からなるマウスからの血液を採取し、凝固せしめた。血清を採取し、使用まで−７０℃で貯蔵した。
【０４７４】
二次細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生のための生体外刺激
様々な実験群（応答細胞）から採取した脾臓細胞をスチム培地中で５×１０6 細胞／ｍｌまで希釈した。同系の未経験のマウス（スティミュレーター）からの脾臓細胞を、１ｍｌ当たり１×１０7 まで希釈して、細胞当たり２５ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．で適切なワクシニアウイルスにより３７℃で２％のＦＢＳを含有する組織培養培地中において１時間、感染せしめた。感染後、スティミュレーター細胞をスチム培地中で数回洗浄し、スチム培地により１ｍｌ当たり１×１０6 細胞まで希釈した。５ｍｌのスティミュレーター細胞と５ｍｌの反応細胞を、２５ｃｍ3 の組織培養フラスコに加え、５％のＣＯ2 中で３７℃、直立して５日間インキュベーションした。アッセイの日に、脾臓細胞をアッセイ培地中で数回洗浄し、顕微鏡を使用したトリパンブルーの血球計算盤で数えた。
【０４７５】
標的細胞の調製
ワクシニア特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、３７℃で１時間に細胞当たり２５ｐｆｕのｍ．ｏ．ｉ．での２％のＦＢＳを含有する組織培養培地中に１ｍｌ当たり１×１０7 細胞でのインキュベーションにより一晩感染せしめる。インキュベーション後、細胞を、１０％のＦＢＳを含有する組織培養培地により１ｍｌ当たり１−２×１０6 細胞の間に希釈し、使用するまでさらに５％のＣＯ2 中でインキュベーションした。ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、それぞれＨＩＶ−１単離体ＩＩＩB 、ＳＦ２、およびＭＮのｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対応する２０μｇ／ｍｌのペプチドＨＢＸ２（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）、ＳＦ２（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）、またはＭＮ（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）で一晩インキュベーションした。アッセイの日に、アッセイ培地中での遠心分離により標的を数回洗浄した。最後の洗浄後、約１００μＣｉのＮａ2 51ＣｒＯ4 （51Ｃｒ）中で再懸濁せしめた。３７℃での１時間のシンキュベーション後、遠心分離によりアッセイ培地中で少なくとも３回洗浄し、血球計算盤上で計測し、アッセイ培地中で１×１０5 ／ｍｌに希釈した。
【０４７６】
細胞傷害性アッセイ
一次ＣＴＬアッセイに関して、新鮮に調製した脾臓細胞を１ｍｌ当たり１×１０7 細胞までアッセイ培地で希釈した。二次ＣＴＬアッセイに関して（生体内接種または生体外刺激のいずれかの後の）、脾臓細胞をアッセイ培地中で２×１０6 ／ｍｌまで希釈した。０．１ｍｌの脾臓細胞懸濁液を、９６ウェル（ｗｅｌｌ）の丸底マイクロタイタ板（ＥＸＰ）のウェル中で51Ｃｒ標識標的細胞に加えた。ほとんどの場合、第１のＣＴＬ活性に関してアッセイされる脾臓細胞は、標的細胞の添加の前に、マイクロタイタ板のウェル中でさらに２倍に希釈した。51Ｃｒ（ＳＲ）の自発的放出の測定の場合、標的細胞をアッセイ培地のみでインキュベーションした。51Ｃｒ（ＭＡＸ）の最大放出を測定するために、アッセイの初めに、０．１ｍｌの１０％ナトリウムドデシル硫酸塩を適切なウェルに加えることにより、標的細胞を慎重に溶解せしめた。アッセイを開始するために、マイクロタイタ板を２分間２００×ｇで遠心分離し、５％のＣＯ2 中、３７℃で４、５時間インキュベーションした。インキュベーション後、各ウェルの培養上澄みを、スカトロン上澄み採取システムを用いて採取した。ベックマン５５００Ｂガンマカウンターにより放出した51Ｃｒを測定した。特異的細胞傷害性のパーセントは、以下の式によるカウントから決定した：
細胞傷害性％＝（ＥＸＰ−ＳＲ）／（ＭＡＸ−ＳＲ）×100 
単クローン性抗ＣＤ４と単クローン性抗ＣＤ８を用いたＴヘルパー細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球の欠損
抗ＣＤ４（単クローン性抗体１７２．４）の１：５の希釈物または抗ＣＤ８（単クローン性抗体抗Ｌｙｔ２．２）の１：２００の希釈物およびセダーレインロー−トックス家ウサギ補体の１：１６の希釈物を含有する細胞傷害性培地（０．２％のＢＳＡおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）中で１０7 ／ｍｌの密度に脾臓細胞懸濁液を希釈した。単一成分の適切な対照（補体、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８）を含有した。
【０４７７】
抗ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０  ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ板のウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中で１００ｎｇの精製ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０（ＮＣ、ダーハム、デューク大学、Ｄｒ．Ｄ．ボログネシーにより提供された）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を、０．０５％トイーン２０を含有する食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）により洗浄した。次いでその板を、１％の子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴで３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳＴによる洗浄後、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（希釈緩衝液）で血清を最初に１：２０に希釈した。ＥＬＩＳＡ板のウェル中で血清をさらに２倍に希釈した。板を３７℃で２時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。ウサギ抗マウスムノグロブリン（ＤＡＫＯ）に接合したホースラディッシュペルオキシダーゼを、希釈緩衝液出１：２０００に希釈史、ＥＬＳＡ板のウェルに加え、３７℃で１時間シンキュベーションした。ＰＢＳＴでの洗浄後、基質緩衝液中のＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）を加え、約２０分間周囲温度で色を呈させた。２．５ＭのＨ2 ＳＯ4 の添加により、反応を終わらせた。バイオテックＥＬ−３０９ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍでの吸収を測定した。血清の終端は、１．０の吸収値を与えた希釈の逆数として定義した。
【０４７８】
リンパ球増殖反応測定
各マウスからの脾臓細胞の単一の細胞懸濁液をアッセイ培地で２×１０6 ／ｍｌまで希釈し、アッセイ培地のみ、１、５、または１０μｇのＨＩＶ−１ペプチドＴ１、１、５、または１０μｇのＨＩＶ−１ペプチドＴ２、および１、または１０μｇの精製ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０（イムノ）を含有する９６ウェル、平底マイクロタイタ板のウェルに加えた。細胞を５％のＣＯ2 中、３７℃で５日間インキュベーションした。最終の６時間のインキュベーションのために、１．０はμＣｉの［3 Ｈ］−チミジンまを各ウェルに加え、ケンブリッジＰＨＤ細胞収集器を用いてベックマンレディーフィルターに収集した。フィルターディスクを液体シンチレーションカウンター中でドライカウントした。
【０４７９】
刺激指数＝ＣＰＭEXP ／ＣＰＭMEDIUM
結果：ＨＩＶ  ｇｐ１２０を発現する組換えワクシニアウイルスは、一次ＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘発する
５×１０7 ＰＦＵのワクシニアウイルス組換え体ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１、または、対照としてのＮＹＶＡＣベクターでのｉｖ投与の後に、ペプチドＨＢＸ２で一晩インキュベーションした有性生殖Ｐ８１５細胞に対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓ＣＴＬ活性を評価した（表２０）。ＨＩＶ  ｇｐ１２０を発現するｖＰ９２１を投与したマウスの脾臓において、適度であるが、著しい（Ｐ＜０．０５）の一次ＣＴＬ活性が産生された。どの法の組換えワクシニアウイルスまたはＮＹＶＡＣ親ベクターも、一次ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性を誘発できなかった。これは、一次ワクシニア特異的ＣＴＬ活性に応答したワクシニアウイルスをマウスの各群に投与したときの不適切な感染のためではなかった。対照である、免疫しなかったマウスも標的には応答しなかった。
【０４８０】
ＨＩＶ  ｅｎｖペプチドを発現する組換えポックスウイルスは、ＨＩＶ特異的記憶細胞傷害性Ｔリンパ球を産生する
組換えワクシニアウイルスの１つを１回接種してから少なくとも１か月後、マウス脾臓細胞を、ＮＹＶＡＣまたは各ＨＩＶ組換えワクシニアウイルスに事前に感染した有性生殖未経験脾臓細胞で生体外刺激した（表２１）。ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１で免疫したマウスの脾臓細胞培養においてのみ強いＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性検出され、この培養細胞は、同一のワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体（ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１）のうちの１つに感染した細胞で生体外で再刺激された。ＨＩＶ  ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を発現するワクシニアウイルス組換え体は、８８エピトープに融合されるＶ３ループのみを発現するワクシニアウイルス組換え体よりも良好に記憶ＣＴＬを産生できた。ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性は、免疫しなかった対照またはＮＹＶＡＣ免疫脾臓細胞からは誘発できなかった。使用したいかなるワクシニアウイルスに感染した脾臓細胞での生体外刺激の後に明確であったので、ワクシニア特異的記憶ＣＴＬ活性がベクター免疫したマウスにはないことは乏しい免疫のためではなかった。
【０４８１】
同様の研究において、８８エピトープ（ｖＣＰ９５）に融合されるＶ３ループ領域を発現するカナリヤポックス組換え体のＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬを産生する能力を試験した（表２２）。１０8 ＰＦＵのｖＣＰ９５またはＡＬＶＡＣベクターの１回の接種から３週間後、ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ応答、ＣＰｐｐを、組換えワクシニアウイルスアナログ、ｖＰ８７８により誘発された応答と比較した。ワクシニアおよびカナリヤポックスＣＴＬ応答は、適切な免疫の対照として含んだ。ｖＰ８７８およびｖＣＰ９５面液化マウスからの脾臓細胞のみが、ｖＰ８７８により刺激されたＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性を示した。機能的な細胞溶解性ＣＴＬに対して、存在する記憶ＣＴＬを刺激するｖＣＰ９５の不能は、ワクシニアウイルス組換え体の使用に基づいて最大にせしめられた生体外条件に関連する。いうまでもなく、ｖＣＰ９５は、免疫マウスの脾臓中に著しいＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬを産生することができた。
【０４８２】
生体外刺激細胞傷害性細胞の特徴付け
ＨＩＶペプチド瞬間標的細胞に対して細胞傷害性を介在する細胞が、ナチュラルキラー細胞のようなＣＴＬに関連のない非特異的エフェクター細胞の個体群を表すことが考えられる。このことを試験するために、ｖＰ９２１で免疫し、ｖＰ９２１感染脾臓細胞で生体外刺激したマウスの脾臓細胞は、Ｔヘルパーリンパ球（ＣＤ４）または細胞傷害性リンパ球（ＣＤ８）のＴリンパ球結果表面抗原特性が枯渇しており、Ｖ３ループペプチド瞬間標的細胞に対してアッセイした（表２３）。前述したように、ｖＰ９１１面液化したマウスのみが、ｖＰ９２１感染有性生殖脾臓細胞で生体外刺激できる記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性を示した。補体調製（Ｃ′）および単クローン性抗ＣＤ４および抗ＣＤ８はある程度毒性効果を示したが、ＣＤ８結果細胞（抗ＣＤ８＋Ｃ′）が枯渇した培養のみがＨＩＶ特異的細胞傷害性エフェクター細胞が枯渇している。それゆえ、ＨＩＶペプチド瞬間標的細胞に対する細胞介在細胞傷害性活性は、その細胞膜上に、ＭＨＣ科Ｉ制限ＣＴＬの特性である、ＣＤ８抗原を有した。
【０４８３】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体認識の特異性
Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列における小さな改変に対して鋭敏に感度を有する。ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＶ３領域は、超可変性であり、免疫学的にＨＩＶ単離体の中でも異なる。この超可変性は、いくつかのアミノ酸の置換および添加にある。ＨＩＶワクシニアウイルス組換え体により産生された細胞傷害性細胞の特異性を試験するために、ＨＩＶ単離体ＩＩＩB 、ＳＦ２、およびＭＮのＶ３ループ領域に対応するペプチドをパルスしたＰ８１５標的細胞の中でＣＴＬ活性に対する感受性を比較した。ｖＰ９１１およびｖＰ９２１による免疫のみがＨＩＶ特異的一次ＣＴＬ活性を誘発した（表２４）。さらに、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性は、ＨＩＶ単離体ＩＩＩB のＶ３ループに対応するペプチドでパルスしたＰ８１５標的細胞のみに限られた。ワクシニアウイルス組換え体ｖＰ８７８７、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１による免疫により誘発された生体外刺激したＨＩＶ特異的二次ＣＴＬ活性に関して同様の結果が得られた（表２５）。それゆえ、ＨＩＶ単離体ＩＩＩB のｅｎｖ遺伝子の様々な部分を発現する組換えワクシニアウイルスにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗原単離体から誘導された標的エピトープのみを認識する。
【０４８４】
ワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体により免疫後のＨＩＶエピトープに対するリンパ球増殖応答
抗原に対するリンパ球増殖は、細胞性免疫の生体外体件（ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）である。適切な抗原の提示は、抗原の受容体を発現する細胞の免疫個体群において細胞増殖を誘発する。増殖の開始と継続には、溶性媒介物によるＴヘルパーリンパ球の介在が必要である。ＨＩＶ抗原を発現する組換えワクシニアウイルスで免疫したマウス中のＨＩＶ抗原に対する細胞性免疫を評価するために、２７日前に免疫したマウスからの脾臓細胞を、Ｔ1 およびＴ2 と称するＴヘルパーリンパ球エピトープに関連するペプチド、並びに精製ＨＩＶ  ｇｐ１６０で５日間インキュベーションした（表２６）。脾臓細胞培養では、Ｔヘルパー細胞エピトープＴ1 およびＴ2 に対する増殖応答は観察されなかった。しかしながら、ｖＰ９２１で事前に免疫したマウスの脾臓細胞は、［3 Ｈ］−チミジンの包含により測定されるように、ＨＩＶ  ｇｐ１６０に活発に応答した。２．０より大きな刺激指数（ＳＩ）は免疫性を示すと考えられる。それゆえ、ｖＰ９２１によるマウスの接種は、ＨＩＶ  ｇｐ１６０に対する細胞性免疫を誘発した。
【０４８５】
ワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体を接種したマウスの抗体応答
ＨＩＶに対する液性免疫応答を評価するために、マウスを０日にワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体の１つで免疫し、第５週に２回目の免疫を行なった。マウスを最初の免疫から９週間に亘り様々な間隔で採血した。各処理群から採取した血清を、抗原として精製ｇｐ１６０を用いたＥＬＩＳＡによりＨＩＶに対する抗体についてアッセイした（表２７）。一次抗体応答は、一般的に適度であったが、ｖＰ９１１により誘発された最高水準は、検出可能であった。二次免疫後に、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１で免疫したマウスの抗体力価は増大し、第９週にやや減少するまで、それぞれ４，６００と３，２００を越えた力価で第７週にピークとなった。それゆえ、２つのワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１は、著しい抗体応答を誘発することができた。
【表２０】
0003624911.tif 000113
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【実施例１９】
【０４８６】
ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２またはＳＦ−２菌株）ｅｎｖ遺伝子の発現
プラスミドの構築
全縁ＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２またはＳＦ−２菌株）ゲノムを含有するラムダクローンを、Ｊ．レビーにより得て、これは前述したものである（サンチェス−ペスカドールら、1985）。ｅｎｖ配列をｐＵＣ１３中にサブクローニングし、プラスミドｐＭＰ７ＭＸ３７３を産生した。このプラスミドは、ｅｎｖ遺伝子産生物の開始コドン（ＡＴＧ）に対して−１からｅｎｖ遺伝子の終止コドン（ＴＡＡ）の７１５ｂｐ下流までの配列を含有している。これらのｅｎｖ配列をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによる切断によりｐＭＰ７ＭＸ３７３から切除し、プラスミドベクター、ｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）に挿入し、プラスミドｐＩＢＩ２５ｅｎｖを産生した。
【０４８７】
組換え体プラスミドｐＯＢＯ２５ｅｎｖは、応答能のあるＥ．ｃｏｌｉ  ＣＪ２３６（ｄｕｔ−  ｕｎｇ−）細胞を転換するのに用いた。一本鎖ＤＮＡを、転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＪ２３６細胞のヘルパーファージ、ＭＧ４０８による感染により誘導したファージから単離した。この一本鎖テンプレートは、オリゴヌクレオチドＭＵＥＮＶＴ１２（配列認識番号１５７）
【化９３】
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【０４８８】
により生体外突然変異誘発反応（クンケルら、1985）に用いた。このオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発により、ＴからＣ転移が行なわれ、ＡＲＶ−２ゲノムのヌクレオチド位置６９２９−６９３５でＴ５ＣＴモチーフを分断する（サンチェス−ペスカドールら、1985）。この突然変異は、ｅｎｖ遺伝子のアミノ酸配列を改変せず、突然変異誘発したプラスミドクローンのスクリーニングに用いられるＥｃｏＲＩ部位を産生する。ジデオキシヌクレオチド鎖終止法により配列の確認を行なった（サンガーら、1977）。産生した突然変異誘発プラスミドをｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ１１と称した。
【０４８９】
１．４５ｋｂのＢｇｌＩＩ断片をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ１１から誘導した。この断片は、突然変異したｅｎｖ配列を含有した。この断片をｐＩＢＩｅｎｖ中の対応未突然変異断片を置換するのに用いた。産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８と称した。さらに改変をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８に行なった。レックスタンパク質とＬＴＲ配列（ＬＴＲ領域）をコードする配列を遺伝子の３′末端から除去し、アミノ酸５８３から５９９の推定免疫抑制（ＩＳ）領域（配列認識番号１５８）
【化９４】
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【０４９０】
を欠損するために、生体外突然変異誘発を行なった（クラッセら、1988）。オリゴヌクレオチドＬＴＲ２（配列認識番号１５９）
【化９５】
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【０４９１】
およびＭＵＥＮＳＶＩＳＲ（配列認識番号１６０）
【化９６】
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【０４９２】
によりｐＩＢＩｍｕｔｅｎｖ８から誘導した単一標準テンプレートに関してこれらの反応を行なった。ハイブリダイーションと制限分析により突然変異誘発したクローンを認識した。ＩＳ領域とＬＴＲ領域の両方が欠損し、またはＬＴＲが欠損するように突然変異誘発せしめられたクローンをヌクレオチド配列により確認し、それぞれｐＩＢＩ２５ｍｕｔ３ｅｎｖ４０およびｐＩＢＩ２５ｍｕｔ２ｅｎｖ２２と称した。
【０４９３】
全縁ｅｎｖ遺伝子を含有する３．４ｋｂのＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＩＢＩ２５ｍｕｔ３ｅｎｖ４０とｐＩＢＩｍｕｔ２ｅｎｖ２２から誘導し、ｐＣＰＣＶ１に挿入し、ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。プラスミドｐＣＰＣＶ１は、ＣＰ組換え体の産生を可能にする挿入プラスミドである。異種遺伝子は、Ｃ３挿入座に向いていた。プラスミドｐＣＰＣＶ１とｐＦＰＣＶ２は、１９８９年４月２０日に発行されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ８９／０３４２９号に記載され、ここに参照文献として包含する。
【０４９４】
ＶＶＨ６プロモーターとｅｎｖ配列により正確なＡＴＧ：ＡＴＧ構造を構築するために、マンデッキの方法（1986）による生体外突然変異誘発反応に、オリゴヌクレオチドＰＲＯＶＥＣＮＳ（配列認識番号１６１）
【化９７】
0003624911.tif 000125
【０４９５】
を用いた。潜在的な変異体を、ＳｍａＩ部位の損失に関してスクリーニングした。ＳｍａＩ部位の欠如したプラスミドクローンを認識し、ヌクレオチド配列分析により確認した。適切に突然変異誘発したプラスミドクローンを認識し、ｐＣＰｅｎｖＩＳ＋またはｐＣＶｅｎｖＩＳ−およびｐＦＰｅｎｖＩＳ＋またはｐＦＰｅｎｖＩＳ−と称した。
【０４９６】
ＮｒｕＩとＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、ＨＩＶ−１
ｅｎｖ遺伝子をｐＣＰｅｎｖＩＳ−から切除した。それぞれ２．５ｋｂ（ｅｎｖＩＳ＋）および２．４ｋｂ（ｅｎｖＩＳ−）の２つのｅｎｖ断片を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片との反応によりブラントエンドした。これらの断片を、ＮｒｕＩとＰｓｔＩによるｐＳＩＶｅｎｖＶＶの切断と続いての２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によるブランティング工程により誘導した３．５ｋｂの断片に連結せしめた。プラスミドｐＳＩＶｅｎｖＶＶは、ＡＴＩ挿入座のワクシニアウイルスＨ６プロモーターにより規制されるＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子発現カセットを含有する。ｐＳＩＶ  ｅｎｖＶＶのＮｒｕＩとＰｓｔＩによる切断は、全縁ＳＩＶ  ｅｎｖコード配列とプロモーター要素の３′末端側の２０ｂｐを切除する。ｅｎｖ  ＩＳ−とｅｎｖ  ＩＳ＋断片との連結により、Ｈ６プロモーターの２０ｂｐが保存され、ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子をＡＴＩ挿入プラスミドに挿入する。産生したプラスミドをそれぞれ、ｅｎｖ  ＩＳ＋とｅｎｖ  ＩＳ−に関してｐＡＴＲ５ＶＶ＋とｐＡＲ６ＶＶと称した。
【０４９７】
生体外組換えと組換え体の精製
前述したように（ピッチーニら、1987）、ＣＰ（ＡＬＶＡＣ）とＦＰ（ＴＲＯＶＡＣ）組換え体の両者のリン酸カルシウム沈殿により、プラスミドＤＮＡを感染細胞に導入することにより組換えを行なった。それぞれ組換え体ｖＣＰ６１とｖＣＰ６０を産生するためにプラスミドｐＳＰｅｎｖＩＳ＋とｐＣＰｅｎｖＩＳ−（Ｃ５座、第１６図）を用いた。それぞれ組換え体ｖＦＰ６３とｖＦＰ６２を産生するために、プラスミドｐＦＰｅｎｖＩＳ＋とｐＦ＋ｅｎｖＩＳ−（Ｆ７座、第２２図）を用いた。治療としてｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）により生体外組換え実験にプラスミドｐＡＲ５ＶＶ＋とｐＡＲ６ＶＶを用いて、それぞれｖＰ９３９とｖＰ９４０を産生した。前述したように、32Ｐ−標識したｅｎｖ特異的プローブによるハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフィーにより組換えプラークを選択し、純度を確認するために連続して３回継代を行なった（ピッチーニら、1987）。
【０４９８】
放射性免疫沈降分析
細胞単層に、１０ｐｆｕ／細胞を修飾イーグルメチオニン不含有培地（ＭＥＭｍｅｔ−）で感染せしめた。感染から２時間後、２０ｕＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］−メチオニンを２％の透析したウシ胎仔血清（フロー）を含有するＭＥＭ（−ｍｅｔ）中に加えた。それらを溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ、１％のＮＰ４０、０．０１％のＮａ  Ａｚｉｄｅ）と５０μｌのアプロチニン中に再懸濁せしめ、エッペンドルフ管に集めることにより細胞を感染から１５時間後に収集し、溶解産物を４℃で２０分間回転せしめることにより精製した。６０ｍｍの直径のペトリディッシュの上澄み液の３分の１を、１μｌの通常のヒトの血清と１００μｌのタンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（ＳＰＡ）（ファーマシア）とともに室温で２時間インキュベーションした。１分間の回転後、上澄み液を、２μｌの、ＨＩＶ血清陽性の個体（熱不活性化した）からの前吸着したヒト血清と１００μｌのＳＰＡとともに４℃で１時間と３０分間インキュベーションした。
【０４９９】
ペレットを、溶解緩衝液で４回、塩化リチウム／尿素緩衝液（０．２Ｍ  ＬｉＣｌ、２Ｍ  尿素、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８）で２回洗浄し、沈殿したタンパク質を６０μｌのセエムリ緩衝液中に溶解せしめた（ラエムリ、1970）。１００℃での５分間の加熱と１分間の回転を行ないセファロースを除去した後、上澄み中のタンパク質をＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル上で再溶解せしめ、間接撮影を行なった。
【０５００】
ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の発現
ＡＲＶ−２またはＳＦ−２菌株のＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子がワクシニア初期−晩期プロモーター、Ｈ６の下流に挿入された６つの異なる組換えウイルスを調製した。簡単にするために、２つのＡＬＶＡＣベースの組換えウイルス、ｖＣＰ６１およびｖＣＰ６０をＣＰＩＳ＋およびＣＰＩＳ−と称し、２つのＴＲＯＶＡＣベースの組換え体、ｖＦＰ６３およびｖＦＰ６２をＦＰＩＳ＋およびＦＰＩＳ−と称し、２つのＮＹＶＡＣベースの組換え体、ｖＰ９３９およびｖＰ９４０をＶＶ−とＶＶ＋と称した。
【０５０１】
ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子の開始コドンがワクシニアＨ６プロモーターのＡＴＧと重複している点で、全ての構成が正確であった。さらに、３′から終止コドンまでの異種の遺伝子情報は除去されていた。ｇｐ４１遺伝子産生物の５′部分の近くに位置したアミノ酸５８３−５９９に対応する５１ｂｐ領域を欠損せしめることにより、ＣＰＩＳ−、ＦＰＩＳ−、およびＶＶ−を得た。この領域は、他のレトロウイルス糖タンパク質の膜貫通ポリペプチド（チアンチオロ、1985；ルーグら、1989ａ、ｂ）に生じる推定の免疫抑制領域（クラッセら、1988；ルーグら、1989ｂ）との相同性を有する。
【０５０２】
６つの組換えウイルスの発現分析は、ＣＥＦ、ベロ、およびＭＲＣ−５細胞単層中で行なった。ＨＩＶ血清陽性の個体から採取した血清を用いた免疫沈降実験は、材料と方法に記載したように行なった。６つの全ての組換え体は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６１エンベロープ前駆体の合成を指示した。しかしながら、ｇｐ１６０からｇｐ１２０およびｇｐ４１への処理の効果は、細胞の種類により異なり、また免疫抑制領域の欠損の影響を受けた。ＨＩＶ血清陽性個体から採取した血清によるｇｐ４１の認識はまた、ウイルスバックグラウンドと細胞の種類により変化した。
【実施例２０】
【０５０３】
ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−２（ＩＳＳＹ菌株）ｅｎｖ遺伝子の発現
ｇｐ１６０の発現
オリゴヌクレオチドＨＩＶ２５ＰＡ（配列認識番号１６２）
【化９８】
0003624911.tif 000126
【０５０４】
およびＨＩＶ２５ＰＢ（配列認識番号１６３）
【化９９】
0003624911.tif 000127
【０５０５】
をアニールして、ＨＩＶ−２  ＳＢＬ／ＩＳＹ単離体（フランチーニら、1989）ｅｎｖコード配列の最初の５４ｂｐを構築した。この断片は、テンプレートとしてｐＴＰ１５を用いてオリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化１００】
0003624911.tif 000128
【０５０６】
およびＨ６３ＰＨＩＶ２（配列認識番号１６５）
【化１０１】
0003624911.tif 000129
【０５０７】
によるＰＣＲにより誘導した融合３′から１２９ｂｐ断片である。オリゴヌクレオチドＨＩＶ２５ＰＣ（配列認識番号１６６）
【化１０２】
0003624911.tif 000130
【０５０８】
およびＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）を用いたＰＣＲによりこれら２つの断片の融合を行なった。１７４ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した（ストラタジェネ、ラジョラ、ＣＡ）。産生したプラスミドをｐＢＳＨ６ＨＩＶ２と称した。挿入はヌクレオチド配列分析により確認した。
【０５０９】
ＨＩＶ−２  ｅｎｖ遺伝子の３′部分をＰＣＲにより誘導した。この反応において、テンプレートとしてｐＩＳＳＹ−ＫＰＮ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．ジェノベファフランチーニにより提供された）を用いてオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｂ１（配列認識番号１６７）
【化１０３】
0003624911.tif 000131
【０５１０】
およびＨＩＶ２Ｂ２（配列認識番号１６８）
【化１０４】
0003624911.tif 000132
【０５１１】
に関して増幅した。この断片をＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断した。この切断により誘導した１５０ｂｐ断片は、５′ＢａｍＨＩおよび３′ＸｂａＩ付着末端を含有した。ワクシニアウイルス初期転写終止シグナルとして認識されることが知られているＴ５ＮＴ配列モチーフを、終止コドンの後に含有するようにこの断片を操作した。
【０５１２】
ＨＩＶ−２  ｅｎｖ遺伝子の大部分は、ＳａｃＩとＢａｍＨＩの切断によりｐＩＳＳＹ−ＫＰＮから得た。この切断により産生された２．７ｋｂ断片を、遺伝子の３′末端に対応する１５０ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片とともにＳａｃＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶ２ＥＮＶと称した。
【０５１３】
ｐＢＳＨ６ＨＩＶ１からの１７４ｂｐ  ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片とｐＢＳＨＩＶ２ＥＮＶからの２．５ｋｂ  ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結し、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶを産生した。ｐＢＳＨ６ＨＩＶ３ＥＮＶからの２．７ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ挿入物を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドした。このブラントエンドした断片をＳｍａＩ切断ｐＳＤ５ＨＩＶＣ挿入ベクターに挿入した。産生したプラスミドをｐＡＴＩＨＩＶ２ＥＮＶと称した。このプラスミドを、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ９２０を産生した。
【０５１４】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９２０が真正のＨＩＶ−２  ｇｐ１６０を発現するか否かを確認した。ベロ細胞単層を、疑似感染か、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスｖＰ８６６に感染せしめるか、またはｖＰ９２０に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、その細胞に、２％のウシ胎仔血清と［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンのない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層のひきかきにより感染から１８時間後に細胞を収集した。
【０５１５】
感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ−２血清陽性個体（Ｄｒ．ジェノベッフェフランチーニから供給された）からの採取した血清を用いてＨＩＶ−２  ｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着したヒト血清を、４℃の一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間の後に、この物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化したした溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合した血清陽性個体からのヒト血清と、４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液で４回と、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により沈殿タンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定して蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０５１６】
ＨＩＶ−２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９２０感染細胞からのＨＩＶ−２  ｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた。さらに、ｇｐ１６０ポリタンパク質を熟成ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質種に処理されるので、発現ＨＩＶ−２  ｅｎｖ遺伝子産生物の真正が確認された。疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ親ウイルスに感染した細胞からはＨＩＶ特異的タンパク質種は全く沈殿しなかった。また、ｖＰ９２０によるＨＩＶ−２  ｅｎｖの適切な発現の平衡は、遺伝子産生物はｖＰ９２０感染細胞の表面上に発現されるということである。
【０５１７】
ｇｐ１２０の発現
ＨＩＶ−２  ｅｎｖ遺伝子の５′末端に融合されたワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有するプラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ２を、ＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これらの配列を含有する１８０ｂｐ断片を離生した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに、ｐＢＳＨＩＶ２１２０Ａの１．４ｋｂ  ＳｐｅＩ／ＸｂａＩ断片とともに連結し、ｐＳＨＩＶ２１２０Ｂを産生した。
【０５１８】
最初にｇｐ１２０コード配列の３′部分をＰＣＲにより誘導することにより、プラスミドｐＢＳＨＩＶ２１２０Ａを誘導した。ＰＣＲは、テンプレートとしてのｐＩＳＳＹ−ＫＰＮとともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ２１２０Ａ（配列認識番号１６９）
【化１０５】
0003624911.tif 000133
【０５１９】
およびＨＩＶ２１２０Ｂ（配列認識番号１７０）
【化１０６】
0003624911.tif 000134
【０５２０】
を用いて行なった。ＰＣＲ誘導断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、５′ＥｃｏＲＩ付着末端と３′ＸｂａＩ付着末端を含有する３００ｂｐ断片を産生した。この断片を、翻訳終止配列（ＴＡＡ）と５′からＸｂａＩ部位のＴ５ＮＴ配列モチーフについて操作した。３００ｂｐのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ  ＰＣＲ断片を、ｐＩＳＳＹ−ＫＰＮから誘導された１．４ｋｂのＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ断片とともにＳａｃＩ／ＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結した。
【０５２１】
プラスミドｐＢＳＨＩＶ２１２０ＢをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断し、３′に隣接したＨＩＶ−２  ｇｐ１２０コード配列からワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する１．８ｋｂ断片を産生した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片とブラントエンドした。ブラントエンドした断片をＳｍａＩで切断したｐＳＤＳＨＩＶＣに連結し、ｐＡＴＩ  ＨＩＶ２１２０を産生した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９２２を産生した。
【０５２２】
ｖＰ９２２感染細胞の免疫沈降実験を、全縁ＨＩＶ−２  ｅｎｖ遺伝子の発現に関して上述したように行なった。疑似感染細胞またはｖＰ８６６感染ベロ細胞からはＨＩＶ特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、１２０ｋＤａのタンパク質種が、ｖＰ９２２に感染した細胞から誘導した溶解産物から沈殿した。ｖＰ９２２により発現されたＨＩＶ−２  ｇｐ１２０は、ｖＰ９２０感染ベロ細胞の細胞表面上に存在することが分かった。
【実施例２１】
【０５２３】
ＮＹＶＡＣ中のＳＩＶ遺伝子の発現
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｇｐ１４０組換え体の産生
ＳＩＶ（Ｍａｃ142 ）ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドｐＳＳＩＩＥをＤｒ．ジェノバフランチーニ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断し、ＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド２２０から翻訳終止コドンから１６０ｂｐ下流の領域を含有する２．２ｋｂの断片を離生した。この断片をが有する発現カセットは、ｇｐ１６０の種よりもｇｐ１４０タンパク質種の発現となる。膜貫通領域の４０％欠損は、ゲノムのヌクレオチド７，９３４での成熟前終止から生じる（フランチーニら、1987）。ｅｎｖ遺伝子産生物のそのような成熟前終止は、培養中のＳＩＶの繁殖後には観察されない（コダマら、1989）。
【０５２４】
テンプレートとしてのｐＳＳＩＩＥおよびオリゴヌクレオチドＳＩＶＥＮＶ１（配列認識番号１７１）
【化１０７】
0003624911.tif 000135
【０５２５】
とＳＩＶＥＮＶ２（配列認識番号１７２）
【化１０８】
0003624911.tif 000136
【０５２６】
を用いたＰＣＲにより遺伝子のアミノ部分を誘導した。産生した２５０ｂｐ断片は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′側の２０ｂｐ（ＮｒｕＩ部位の３′末端）から下流に隣接したＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子の５′側の２３０ｐｂを含有する。ＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子配列の８０ｂｐを除去するＨｉｎｄＩＩＩの断片の切断により１７０ｂｐの断片を得た。
【０５２７】
成熟前終止シグナルの後のＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子の残りを含有する配列をＰＣＲによりｐＳＳ３５Ｅ（Ｄｒ．ジェノベファフランチーニから得た）から誘導した。このプラスミドは、ＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のＣ末端部分からｅｎｖ遺伝子から下流のＬＴＲ領域を含有する配列を含有している。３６０ｂｐ断片を誘導するのに用いたオリゴヌクレオチドは、ＳＩＶＥＮＶ３（配列認識番号１７３）
【化１０９】
0003624911.tif 000137
【０５２８】
とＳＩＶＥＮＶ４Ａ（配列認識番号１７４）
【化１１０】
0003624911.tif 000138
【０５２９】
であった。この断片をＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断し、５′ＰｓｔＩ付着末端と３′ＥｃｏＲＩ付着末端を有する２６０ｂｐ断片を産生した。
【０５３０】
ｐＳＳＩＩＥからの２．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ断片、遺伝子の５′末端を含有する１７０ｂｐのＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片および遺伝子の３′末端を含有する２６０ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩを、ｐＲＷ８３８から誘導した３．１ｋｂのＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩと連結した。ｐＲＷ８３８は、遺伝子のＣ５座への挿入を可能にするカナリヤポックスウイルス配列により側腹に位置する狂犬病Ｇ遺伝子に連結したワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有している。ＮｒｕＩとＥｃｏＲＩの切断により、狂犬病Ｇ遺伝子を離生し、Ｈ６プロモーターの３′側２０ｂｐを除去する。ワクシニアＨ６プロモーターに連結したＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有する産生したＣ５挿入プラスミドをｐＣ５ＳＩＶＥＮＶと称した。
【０５３１】
プラスミドｐＣ５ＳＩＶＥＮＶをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド１５０から全縁遺伝子の末端までを含有する２．２ｋｂ断片を離生した。ＰＣＲを用いてｐＣ５ＳＩＶＥＮＶからのワクシニアＨ６プロモーター／ＳＩＶ  ｅｎｖ結合を、オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８６（配列認識番号１７５）
【化１１１】
0003624911.tif 000139
【０５３２】
とＳＩＶＥＮＶ２（配列認識番号１７６）
【化１１２】
0003624911.tif 000140
【０５３３】
により誘導した。３２０ｂｐ断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２４０ｂｐ断片を誘導した。２．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩと２４０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＣ３Ｉにともに連結した。ＳＩＶｅｎｖコード配列に関して適切な配向のＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有する産生したプラスミドをｐＣ３ＳＩＮＥＭと称した。プラスミドｐＣ３Ｉは以下のようにして誘導した。２．５ｋｂのＢｇｌＩＩカナリヤポックスウイルスゲノム断片のヌクレオチド配列分析により、全縁Ｃ３読取り枠と５′および３′非コード領域が明確となった。Ｃ３読取り枠が完全に切除された、異種遺伝子のＣ３座への挿入のための供与体プラスミドを構築するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に対する５′および３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、ＲＧ２７７（配列認識番号１７７）
【化１１３】
0003624911.tif 000141
【０５３４】
およびＲＧ２７８（配列認識番号１７８）
【化１１４】
0003624911.tif 000142
【０５３５】
であった。
【０５３６】
３′配列のプライマーは、ＲＧ２７９（配列認識番号１７９）
【化１１５】
0003624911.tif 000143
【０５３７】
およびＲＧ２８０（配列認識番号１８０）
【化１１６】
0003624911.tif 000144
【０５３８】
であった。ワクシニア転写および翻訳終止シグナルにより側腹にある多重クローニング部位を含有するようにプライマーを設計した。また、左側アームと右側アームの５′末端と３′末端には、２つのアームをＡｓｐ７１８／ＳａｃＩで切断したｐＢＰ−ＳＫプラスミドベクターに連結せしめる適切な制限部位（左側アームにはＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、そして右側アームにはＥｃｏＲＩとＳａｃＩ）を含有した。産生したプラスミドをｐＣ３Ｉと称した。
【０５３９】
ＥｃｏＲＩでの切断により、プラスミドｐＣ３ＳＩＶＥＭを線状とした。続いての部分的なＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、２．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を離生した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片での処理によりブラントエンドした。この断片をＳｍａＩで切断したｐＳＤ５５０ＶＣに連結した。産生したプラスミドをｐＳＩＶＥＭＶＣと称した。このプラスミドを、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６により生体外組換え実験に用いて、ｖＰ８７３を産生した。ｖＰ８７３はＩ４Ｌ座にＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有した。
【０５４０】
ＮＹＶＡＣ／ｇａｇ／ｐｏｌおよびｇａｇ組換え体の産生
ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を包含するＳＩＶ  ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＳＩＶＡＧＳＳＩＩＧをＤｒ．ジェノベファフランチーニ（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、ワクシニアｔｋフランキングアームの間のワクシニアＩ３Ｌプロモーターに対して３′に隣接せしめた。これは、ｇａｇおよびＩ３Ｌプロモーターに対応するオリゴヌクレオチドＳＩＶＬ１（配列認識番号１８１）
【化１１７】
0003624911.tif 000145
【０５４１】
とＳＩＶＬ２（配列認識番号１８２）
【化１１８】
0003624911.tif 000146
【０５４２】
を含有するｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧの４，８００ｂｐ  ＣｆｏＩ／ＴａｇＩ断片をｐＳＤ４６０の誘導体であるｐＳＤ５４２の４，０７０ｂｐ  ＸｈｏＩ／ＡｃｃＩ断片中にクローニングすることにより行なった（第１図）。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ１と称した。
【０５４３】
ｐｏｌ遺伝子を除去するために、オリゴヌクレオチドＳＩＶＰ５（配列認識番号１８３）
【化１１９】
0003624911.tif 000147
【０５４４】
およびＳＩＶＰ６（配列認識番号１８４）
【化１２０】
0003624911.tif 000148
【０５４５】
を用いて、２１５ｂｐのＰＣＴ断片をｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧから誘導した。ＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩとＳｔｕＩで切断し、ＳＩＶＧ１の５，３７０ｂｐの部分的なＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ断片に連結した。これにより、ｐＳＩＶＧ２が産生した。ｐＳＩＶＧ２を、治療ウイルスとしてのｖＰ８７３と生体外組換え実験に用いてｖＰ９４８を産生した。
【０５４６】
ｇａｆとｐｏｌの両者をＮＹＶＡＣベースのベクターに挿入するプラスミドを以下のようにして操作した。上述したｐＳＩＶＧ１は、１ｋｂのＰＣＲ断片を用いて除去した異種３′非コード配列を含有する。この断片を、オリゴヌクレオチドＳＩＶＰ５とＳＩＶＰ６によりプラスミドｐＳＩＶＧＡＧＳＳＩＩＧから産生した。ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有するこのＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断した。１ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ断片をｐＳＩＶＧ１の７，４００ｂｐの部分的なＢａｍＨＩ／ＨｐａＩ断片に連結し、ｐＳＩＶ４を産生した。
【０５４７】
ｐＳＩＶ４の配列分析により、ｐｏｌ遺伝子内に１つの塩基対欠損が発見された。このエラーを修正するために、ｐＳＩＶＧ１からの２，３００ｂｐのＢｇｌＩ／ＳｔｕＩ断片をｐＳＩＶＧ４の６，１００ｂｐの部分的なＢｇｌＩ／ＳｔｕＩ断片に挿入し、ｐＳＩＶＧ５を産生した。プラスミド、ｐＳＩＶＧ５を、治療としてのｖＰ８７３とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ９４３を産生した。
【０５４８】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｐ１６およびｐ２８組換え体の産生
ｐ２８、ｐ２、ｐ８、ｐ１およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分とｐｏｌ遺伝子をｐＳＩＶＧ１から除去した。これは、オリゴヌクレオチドＳＩＶＬ１０（配列認識番号１８５）
【化１２１】
0003624911.tif 000149
【０５４９】
およびＳＩＶＬ１１（配列認識番号１８６）
【化１２２】
0003624911.tif 000150
【０５５０】
をｐＳＩＶＧ１の４，４３０ｂｐ  ＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片中にクローニングすることにより行ないｐＳＩＶＧ３を産生した。このプラスミドは、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターにより発現されたＳＩＶ  ｐ１７遺伝子産生物の発現カセットを含有する。
【０５５１】
昆虫ポックスウイルス４２ｋＤａプロモートしたＳＩＶ  ｐ２８遺伝子（５′末端のみ）をＩ３Ｌプロモートしたｐ１７遺伝子から下流に挿入した。これは、ｐ２８遺伝子の５′末端を含有するｐＳＩＶＧＩの３６０ｂｐ  ＢｓｐＭＩ／ＢａｍＨＩ断片、昆虫ポックス４２ｋＤａプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドｐＳＩＶＬ１４（配列認識番号１８７）
【化１２３】
0003624911.tif 000151
【０５５２】
およびＳＩＶＬ１５（配列認識番号１８８）
【化１２４】
0003624911.tif 000152
【０５５３】
を、ｐＳＩＶＧ３の４，４７０ｂｐの部分的なＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片中にクローニングすることにより行なった。産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ６と称した。
【０５５４】
次いでｐ２８遺伝子の３′部分をｐＳＩＶＧ６中に挿入した。ＳＩＶ  ｐ２８遺伝子の３′末端を含有する２９０ｂｐ  ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチドＳＩＶＰ１２（配列認識番号１８９）
【化１２５】
0003624911.tif 000153
【０５５５】
およびＳＩＶＰ１３（配列認識番号１９０）
【化１２６】
0003624911.tif 000154
【０５５６】
を用いてｐＳＩＶＧＩから誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐＳＩＶＧ７の４，８３０ｂｐの断片に連結し、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とｖＰ８７３とともに生体外組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９４２およびｖＰ９５２を産生した。
【０５５７】
発現アッセイ
ＳＩＶ  ｇｐ１４０  ｅｎｖ遺伝子産生物は、感染細胞の形質膜と関連した典型的な糖タンパク質である。これは１１２ｋＤａの細胞外種と２８ｋＤａの膜貫通領域に対してタンパク質分解的に切断された１４０ｋＤａのポリタンパク質として発現される（フランチーニら、1987）。ＳＩＶに血清陽性のアカゲサルマカクからの血清と続いてウサギ抗サルＩｇＧに接合したフルオレセインを用いた免疫発光分析により、組換え体感染ベロ細胞の表面にｅｎｖ遺伝子産生物の発現が示された。表面発現は、疑似感染細胞またＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）親ウイルスに感染した細胞の表面には観察されなかった。さらに、ｇａｇ遺伝子のみを含有する組換え体に感染した細胞は、表面にＳＩＶ成分を発現したことを示さなかった。ｖＰ８７３、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２に感染した細胞中の表面発現はすべて表面発現を示し、ＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を著しく含有する。
【０５５８】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ組換え体に感染したベロ細胞中の発現ＳＩＶ遺伝子産生物（ｅｎｖおよびｅｎｖ）の真正をイムノプレシピテーショにより分析した。１０のｍ．ｏ．ｉ．でベロ細胞を個々の組換えウイルス、ＮＹＶＡＣ親ウイルスに感染せしめ、または疑似感染せしめた。吸着期間の１時間後、接種物を除去し、感染細胞に、［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌのメチオニン不含有培地を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａの添加により、感染から１７時間後に全ての試料を収集した。感染細胞からの溶解産物を、ＳＩＶ血清陽性アカゲサルマカクから採取した血清、またはｇａｇ  ｐ２４遺伝子産生物に特異的な単クローン性抗体（両者ともＭＤ、ベセスダ、ＮＩＣ−ＮＩＨ、Ｄｒ．ジェノベファフランチーニから得た）に関して分析した。
【０５５９】
ＳＩＶ血清陽性のマカクの血清に関して免疫沈降を以下のようにして行なった。マカク血清を、タンパク質Ａセファロースとともに４℃で１６時間に亘りインキュベーションした。緩衝液Ａによる洗浄後、タンパク質Ａセファロースに結合した血清を、通常のサル血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物に加えた。４℃での一晩のインキュベーション後、沈殿物を緩衝液Ａで４回とＬｉＣｌ／尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を抗体から分離するために、試料を８０μｌの２×ラエムリ緩衝液中で５分間沸騰せしめた。ドリファスゲルシステムを用いて１２．５％のゲルで試料を分画した（ドリファスら、1984）。ゲルを固定して、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。ＳＩＶ遺伝子を含有する全ての組換え体を適切な遺伝子産生物を発現していた。ＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ８７３、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２は全て真正のｇｐ１４０を発現した。しかしながら、ｇｐ１４０タンパク質の１１２ｋＤａおよび２８ｋＤａ熟成形状への処理を評価するのは困難である。疑似感染ベロ細胞、ｖＰ８６６感染ベロ細胞およびＳＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有しないＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ組換え体に感染した細胞からのマカク抗ＳＩＶ血清によっては、１４０ｋＤａのみかけ分子量を有する種は沈殿しなかった。ＳＩＶに感染したマカクから採取した血清およびｐ２８  ｇａｇ成分に特異てきな単クローン性抗体を用いて、ｖＰ９４２、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８、およびｖｐ９５２によるＳＩＶｇａｇコード遺伝子産生物の発現が示された。ベロ細胞中のＮＹＶＡＣ（ｖＰ９４８）によりプロテアーゼ機能を含むｐｏｌ領域のない全縁ｐ５５  ｇａｇタンパク質の発現は明確である。これらの結果により、ＳＩＶプロテアーゼ発現の欠如はｐ５５の熟成形状への完全なタンパク質分解を妨げることが示された。ｐ２８に特異的な単クローン性抗体を用いてｇａｇ特異的遺伝子産生物をｖＰ９４８感染ベロ細胞から沈殿させる場合、このことはより明確に示される。この結果に対して、ｖＰ９４３感染ベロ細胞中にｐｏｌ遺伝子（プロテアーゼを含む）を有するＳＩＶ  ｇａｇの発現により、発現されたｐ５５  ｇａｇ前駆体ポリペプチドがその熟成形状にタンパク質分解的に切断させることができた。
【０５６０】
ＳＩＶに感染したマカクから採取した血清を用いて、ｖＰ９４２およびｖＰ９５２感染ベロ細胞中のｐ１６とｐ２８  ＳＩＶ遺伝子産生物の両方の発現が示された。ｐ２８に特異的な単クローン性抗体は明らかにｐ２８発現成分のみを認識した。
【実施例２２】
【０５６１】
アビアンインフルエンザウイルスの血球凝集素糖タンパク質を発現するＴＲＯＶＡＣ組換え体の構築
この実施例は、アビアンインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子を発現する鶏痘ウイルス組換え体の開発を記載するものである。
【０５６２】
細胞およびウイルス
Ｈ４、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドを、テネシー州、メンフィスのセントジュード小児科研究病院のＤｒ．ロバートウェブスターから得た。ＦＰ−１と称するＦＰＶの菌株は以前に記載した（テイラーら、1988ａ、ｂ）。これは生後１日の鶏のワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン菌株である。親ウイルス菌株デュベッティを、鶏からの鶏痘かいせんとしてフランスから得た。鶏の感染幼虫包蔵卵での５０回の継代と続いての鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）での２５回の継代によりウイルスを弱毒化した。このウイルスを、フランス、リヨン、ローンメリクスにより1980年の９月に得て、マスターウイルス種を設立した。1989年の９月にウイルスをバイロジェネティックスが受けとり、ここで４連続のプラーク精製を行なった。初代ＣＥＦ細胞中で１つのプラーク単離体をさらに増幅し、ＴＲＯＶＡＣと称する株ウイルスを設立した。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を産生する生体外組換え試験に用いた株ウイルスをさらに初代ＣＥＦ細胞中で８回の継代により増幅した。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を産生するのに用いた株ウイルスはさらに初代ＣＥＦ細胞中で１２回の継代により増幅した。
【０５６３】
Ｆ８座での鶏痘挿入プラスミドの構築
プラスミドｐＲＷ７３１．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローニングされた１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片を含有する。ヌクレオチド配列を、３６６１ｂｐ  ＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両鎖に決定した。この配列を第２１図に示す。Ｆ８としてこの研究所で称する読取り枠をこの配列内に決定した。読取り枠は位置７０４で開始し、位置８８８で終止する。隣接する読取り枠を妨害しないように、以下に記載するように、位置７８１から位置１９２８に欠損を作った。
【０５６４】
プラスミドｐＲＷ７６１は、２４３０ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶ断片を含有するｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。Ｆ８  ＯＲＦは完全に、ＰＲＷ７６１のＸｂａＩ部位とＳｓｐＩ部位の間に含有された。ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡによる組換えにおいてＦ８  ＯＲＦを除去する挿入プラスミドを産生するために、以下の工程を行なった。プラスミドｐＲＷ７６１をＸｂａＩで完全に、ＳｓｐＩで部分的に切断した。３７００ｂｐのＸｂａＩ−ＳｓｐＩ帯を単離して、アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡ０１９（配列認識番号１９１）およびＪＣＡ０１８（配列認識番号１２９）
【化１２７】
0003624911.tif 000155
【０５６５】
と連結した。
【０５６６】
この連結により産生したプラスミドをｐＪＣＡ００２と称した。プラスミドｐＪＣＡ００４は、プラスミドｐＪＣＡ００２中のワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を含有する。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの配列は以前に記載した（テイラーら、1988ａ、ｂ；グオら、1989；パーカスら、1989）。プラスミドｐＪＡＣ００４を、非関連遺伝子とＨ６プロモーターの３′末端の部分を欠損せしめるＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチドＲＷ１７８（配列認識番号１９３）およびＲＷ１７９（配列認識番号１９４）をＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断し、ＪＣＡ００４のＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩ部位の間に挿入し、ｐＲＷ８４６を形成した。
【化１２８】
0003624911.tif 000156
【０５６７】
それゆえ、プラスミドｐＲＷ８４６は、ｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｆ８座にＥｃｏＲＶのＨ６プロモーター５′を含有する。ｐＲＷ８４６中のＨ６プロモーターには、終止コドン、ワクシニアウイルス初期プロモーターにより認識される転写終止配列（ユエンら、1987）およびＳｍａＩ部位が続いている。
【０５６８】
Ｆ７座での鶏痘挿入プラスミドの構築
起源Ｆ７非ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、ｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位に５．５ｋｂのＦＰゲノムＰｖｕＩＩ断片を含有した。挿入部位は、これらの配列内の特有のＨｉｎｃＩＩ部位であった。第２２図に示したヌクレオチド配列は、特有のＨｉｎｃＩＩ部位を包含する２３５６ｂｐ領域に関して決定した。この配列の分析により、特有のＨｉｎｃ部位（第２２図での下線）が９０アミノ酸のポリペプチドをコードするＯＲＦ内に位置することが示された。ＯＲＦは、位置１５３１でのＡＴＧで開始し、位置８９８で終止する（第２２図の矢印により示した位置）。
【０５６９】
ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミドのアームを、テンプレートとしてのｐＲＷ７３１．１３を用いたＰＣＲにより誘導した。ＯＲＦから上流の領域に対応する５９６ｂｐアーム（ＨＢと称する）を、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列認識番号１９５）
【化１２９】
0003624911.tif 000157
【０５７０】
およびＦ７３ＰＢ（配列認識番号１９６）
【化１３０】
0003624911.tif 000158
【０５７１】
で増幅した。ＯＲＦから下流の領域に対応する２７０ｂｐアーム（ＥＨと称する）を、オリゴヌクレオチドＦ７５ＰＥ（配列認識番号１９７）
【化１３１】
0003624911.tif 000159
【０５７２】
およびＦ７３ＰＨ１（配列認識番号１９８）
【化１３２】
0003624911.tif 000160
【０５７３】
で増幅した。
【０５７４】
断片ＥＨをＥｃｏＲＶで切断し、１２６ｂｐ断片を産生した。ＥｃｏＲＶ部位は３′末端であり、５′末端はＨｉｎｃＩＩ部位の３′末端を含有するようにＰＣＲにより形成した。この断片を、ＨｉｎｃＩＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入し、プラスミドｐＦ７Ｄ１を形成した。配列を、ジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ１をＡｐａＩで線状化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてブラントエンドし、５９６ｂｐ  ＨＢ断片に連結した。産生したプラスミドをｐＦ７Ｄ２と称した。全縁配列と包囲をヌクレオチド配列分析により確認した。
【０５７５】
プラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで切断し、６００ｂｐ断片を産生した。この断片を、ＡｐａＩで切断されたｐＢＳ−ＳＫに挿入し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドし、続いてＢａｍＨＩで切断した。産生したプラスミドをｐＦ７Ｄ３と称した。このプラスミドは、４０４ｂｐのＨＢアームと１２６ｂｐのＥＨアームを含有する。
【０５７６】
プラスミドｐＦ７Ｄ３をＸｈｏＩで線状化し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によりブラントエンドした。この線状化したプラスミドを、アニールしたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ（配列認識番号１９９）
【化１３３】
0003624911.tif 000161
【０５７７】
およびＦ７ＭＣＳＡ（配列認識番号２００）
【化１３４】
0003624911.tif 000162
【０５７８】
に連結した。これを行なって、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩの制限部位を含有する多重クローニング領域をＥＨとＨＢアームの間に挿入した。産生したプラスミドをｐＦ７ＤＯと称した。
【０５７９】
Ｆ８座でのＨ４血球凝集素の挿入プラスミドの構築
プラスミドｐＴＭ４Ｈ８３３中に、Ａ／Ｔｙ／Ｍｉｎ／８３３／８０から誘導したアビアンインフルエンザＨ４をコードするｃＤＮＡコピーをＤｒ．Ｒ．ウェブスターから得た。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＮｒｕＩで切断し、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。Ｈ４コード領域を含有するブラントエンドした２．５ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片をｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。産生したプラスミドｐＲＷ８２８を部分的にＢａｎＩＩで切断し、線状産生物を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで再度切断した。１００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩが欠損したプラスミドｐＲＷ８２８を、合成オリゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列認識番号２０１）およびＲＷ１５３（配列認識番号２０２）のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーターの３′部分を表し、プロモーターのＡＴＧをＨ４  ｃＤＮＡのＡＴＧと配列させる。
【化１３５】
0003624911.tif 000163
【０５８０】
オリゴヌクレオチドをアニールし、ＢａｎＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上述したＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｎＩＩが欠損したｐＲＷ８２８ベクターに挿入する。産生したプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断し、３′Ｈ６プロモートしたＨ４コード配列を含有する１．７ｋｂｐ断片をｐＲＷ８４６（前出）のＥｃｏＲＶとＨｉｎｃＩＩ部位の間に挿入し、プラスミドｐＲＷ８４８を形成した。それゆえ、プラスミドｐＲＷ８４８は、鶏痘ウイルスのｄｅ−ＯＲＦｅｄＦ８座のワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ４コード配列を含有する。
【０５８１】
Ｆ８座でのＨ５血球凝集素の挿入プラスミドの構築
プラスミドｐＴＨ２９中に、Ａ／ターキー／アイルランド／１３７８／８３から誘導したアビアンインフルエンザＨ５のｃＤＮＡクローンをＤｒ．Ｒ．ウェブスターから得た。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１０（配列認識番号２０３）からＲＷ１３（配列認識番号２０６）を、前述したワクシニアウイルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンとＨ５遺伝子のＡＴＧが重複するように設計した。配列はＨ５遺伝子の５′ＳａｌＩ部位を通じて継続し、Ｈ５終止コドンを含有する３′Ｈ５  ＤｒａＩ部位で再度開始する。
【化１３６】
0003624911.tif 000164
【０５８２】
オリゴヌクレオチドを９５℃で３分間アニールし、続いて室温で徐冷した。これにより、表示した末端を有する以下の二本鎖構造となる。
【化１３７】
0003624911.tif 000165
【０５８３】
ｐＲＷ７４２ＢのＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ部位の間のオリゴヌクレオチドのクローニングによりｐＲＷ７４４が産生した。プラスミドｐＲＷ７４２Ｂは、前述したｐＲＷ７３１．１５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入された非関連遺伝子に連結したワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する。ＰｓｔＩとＥｃｏＲＶの切断により、Ｈ６プロモーターの３′末端と非関連遺伝子が除去される。プラスミドｐＲＷ７４４はここで、アビアンインフルエンザＨ５のＡＴＧと重複するＨ６プロモーターの３′部分を含有する。このプラスミドはまた、Ｈ５配列から５′ＳａｌＩ部位までとＨ５終止コドン（ＤｒａＩ部位を含有する）からの３′配列を含有する。ＤｒａＩ部位を使用するとＨ５  ３′非コード末端が除去される。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写終止シグナルを加える（ユエンら；1987）。Ｈ６プロモートしたＨ５構造を完成するために、Ｈ５コード領域をｐＴＨ２９から１．６ｋｂｐ  ＳａｌＩ−ＤｒａＩ断片として単離した。プラスミドｐＲＷ７４４を部分的にＤｒａＩで切断し、線状断片を単離し、ＳａｌＩで再度切断した。ここでＳａｌＩとＤｒａＩの間の８つの塩基が欠損したプラスミドを、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９  ＳａｌＩおよびＤｒａＩ断片のベクターとして用いた。産生したプラスミドをＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断した。３′Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含有する１．７ｋｂｐ  ＰＲＷ７５９  ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩ断片をｐＲＷ８４６（前出）のＥｃｏＲＶとＨｉｎｃＩＩ部位の間に挿入した。産生したプラスミドｐＲＷ８４９は、ｄｅ−ＯＲＦｄｅＦ８座にＨ６プロモートしたアビアンインフルエンザウイルスＨ５遺伝子を含有する。
【０５８４】
Ｆ７座でのＨ７血球凝集素の挿入ベクターの構築
Ａ／ＣＫ／ＶＩＣ／１／８５からのＨ７血球凝集素を含有するプラスミドｐＣＶＨ７１をＤｒ．Ｒ．ウェブスターから得た。Ｈ７遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、ＰＲＷ８２７としてｐＩＢＩ２５のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列認識番号２０７）およびＲＷ１６６（配列認識番号２０８）をアニールし、ＨｉｎｃＩＩとＳｔｙＩで切断し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶとＳｔｙＩ部位の間に挿入してｐＲＷ８４５を産生した。
【化１３８】
0003624911.tif 000166
【０５８５】
オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（配列認識番号２０７）およびＲＷ１６６（配列認識番号２０８）は、Ｈ６プロモーターの３′部分をＨ７遺伝子に連結させる。ｐＲＷ８４５のＡｐａＬＩ切断の線状産生物を単離し、これをＥｃｏＲＩで再度切断し、最大の断片を単離して合成オリゴヌクレオチドＲＷ２２７（配列認識番号２０９）およびＲＷ２２８（配列認識番号２１０）でアニールすることにより、Ｈ７遺伝子の３′非コード末端を除去した。産生したプラスミドはｐＲＷ８５４であった。
【化１３９】
0003624911.tif 000167
【０５８６】
ＰＲＷ８５４中のＨ７の終止コドンの次にはＨｐａＩ部位が続いている。ｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｆ７座中の中間Ｈ６プロモートしたＨ７構造（以下に記載する）を、ＥｃｏＲＶで切断し、そのＰｓｔＩ部位でブラントエンドしたｐＲＷ８５８中にｐＲＷ８５４  ＥｃｏＲＶ−ＨｐａＩ断片を移動せしめることにより産生した。プラスミドｐＲＷ８５８（以下に記載する）はＦ７  ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミド中にＨ６プロモーターを含有する。非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを含有する８５０ｂｐ  ＳｍａＩ／ＨｐａＩ断片を前述したｐＦ７ＤＯのＳｍａＩ部位に挿入することによりプラスミドｐＲＷ８５８を構築した。ｐＲＷ８５８をＥｃｏＲＶ（Ｈ６プロモーターの３′末端の２４ｂｐ上流の部位）とＰｓｔＩでの切断により非関連配列を切除した。産生した３．５ｋｂ断片を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、ｐＲＷ８５４（前出）から誘導した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片に連結した。このＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ断片は、ＶＶ  Ｈ６プロモーターの３′側の２４ｂｐに隣接した３′の全縁ＡＩＶ  ＨＡ（Ｈ７）遺伝子を含有する。産生したプラスミドをｐＲＷ８６１と称した。
【０５８７】
１２６ｂｐ  ＥＨアーム（以前に規定した）をｐＲＷ８６１中で延長せしめ、組換え頻度をゲノムＴＲＯＶＡＣ  ＤＮＡで増大せしめた。このことを達成するために、５７５ｂｐ  ＡｃｃＩ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（前に規定した）から誘導した。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃＩとＮａｅＩ部位の間に挿入した。７２５ｂｐのＥＨアームとＡＩＶ  Ｈ７を側腹に有する４０４ｂｐのＨＢアームを含有する、産生したプラスミドをｐＲＷ８６９と称した。それゆえ、プラスミドｐＲＷ８６９は、５′末端でワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結したＨ７コード配列からなる。左側のフランキングアームは、４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり、右側フランキングアームは、ｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｆ７座への挿入を指向する７２５ｂｐのＴＲＶＡＣ配列からなる。
【０５８８】
ＴＲＯＶＡＣアビアンインフルエンザウイルスの開発
アビアンインフルエンザウイルスＨＡコード配列を含有する挿入プラスミドを、前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてＴＲＯＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞に個々にトランスフェクションした（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）。ＨＡ特異的放射線標識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個体群となるまで、連続したプラーク精製を行なった。次いで１つの代表的なプラークを増幅して株ウイルスを産生した。プラスミドｐＲＷ８４９を生体外組換え試験に用いてＨ５血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）を産生した。プラスミドｐＲＷ８４８を用いてＨ４血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）を産生した。プラスミドｐＲＷ８６９を用いて、Ｈ７血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）を産生した。
【０５８９】
蛍光光度法
インフルエンザウイルス感染細胞において、ＨＡ分子を合成し、粗い小胞体での前駆体分子としてグリコシル化する。形質膜に通過中に、ジスルヒド連結ＨＡ1 およびＨＡ2 サブユニットへのタンパク質分解切断となる広範囲の翻訳後修飾と、続いて熟成ウイルスエンベロープに含まれる宿主細胞膜への挿入を経る。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＶ組換えウイルスに感染した細胞中に産生されたＨＡ分子が細胞表面上に発現されたか否かを測定するために、蛍光光度法を行なった。間接蛍光光度法を記載したように行なった（テイラーら、1990）。間接蛍光光度法により、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５のＨ５血球凝集素、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４のＨ４血球凝集素、およびＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７のＨ７血球凝集素の表面発現を確認した。Ｈ５ＨＡに特異的な単クローン性抗体の貯留を用いて、Ｈ５血球凝集素の発現を検出した。ヒツジ単特異的抗Ｈ４血清を用いてＨ４ＨＡの発現を分析した。Ｈ７特異的単クローン性抗体標品を用いてＨ７ＨＡの発現を分析した。
【０５９０】
免疫沈降
血球凝集素ポリペプチドの切断はウイルス粒子が感染性であるために必要であるので、血球凝集素分子の切断部位がウイルスの毒性を決定するのに重要な役割を果たすことが分かっている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスの血球凝集素タンパク質はＨＡ１のカルボキシ末端に１つより多くの塩基アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基アミノ酸を認識する細胞プロテアーゼが血球凝集素を切断でき、感染ウイルスが生体外と体内の両方に広がる。Ｈ４無毒性菌株の血球凝集素分子は、異種トリプシンが加えられるまで、組織培養中で切断されない。
【０５９１】
ＴＲＯＶＡＣ組換え体により発現された血球凝集素分子が確実に処理されたことを測定するために、上述した特異的試薬を用いて記載したように（テイラーら、1990）免疫沈降を行なった。
【０５９２】
ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５（ｖＦＰ８９）により発現されたＨ５血球凝集素の免疫沈降分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および２３ｋＤａの分子量を有する２つの切断産生物ＨＡ1 およびＨＡ2 として明確であることが示された。未感染細胞または親ＴＲＯＶＡＣに感染した細胞からはそのようなタンパク質は沈殿しなかった。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７（ｖＦＰ１００）により発現された血球凝集素の同様の免疫沈降分析により、ＨＡ2 切断産生物の特異的な沈殿が示された。ＨＡ1 切断産生物は確認されなかった。未感染ＣＥＦ細胞またはＴＲＯＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞からはタンパク質は特異的には沈殿しなかった。これに対して、ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４（ｖＦＰ９２）の発現産生物の免疫沈降分析により、前駆体タンパク質ＨＡ0 のみの発現が示された。これは、組織培養中の無毒性亜種の血球凝集素に切断のないことと一致する。未感染ＣＥＦ細胞またはＴＲＯＶＡＣに感染した細胞にはＨ４特異的タンパク質は検出されなかった。
【実施例２３】
【０５９３】
３つのアビアンインフルエンザ遺伝子を発現する３重組換え体の発生
プラスミドの構築
プラスミドｐＲＷ８４９は以前に記載しており、Ｈ６プロモートしたアビアンインフルエンザＨ５遺伝子を含有する。このプラスミドをｖＦＰ８９の発生に用いた。プラスミドｐＲＷ８６１は、ｖＦＰ１００の発生に用いた以前に記載した中間プラスミドであった。このプラスミドは、Ｈ６プロモートしたアビアンインフルエンザＨ７遺伝子を含有する。プラスミドｐＲＷ８４９をＳｍａＩで切断し、Ｈ６プロモーターの５′末端からＨ５遺伝子までの産生した１．９ｋｂｐの断片をｐＲＷ８６１のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＲＷ８６５を産生した。Ｈ４コード配列を挿入するために、プラスミドｐＲＷ８４８を用いた。プラスミドｐＲＷ８４８をｖＦＰ９２の発生に用いた。このプラスミドをＨ６プロモートしたＨ４遺伝子を含有する（前述）。プラスミドｐＲＷ８４８をＳｍａＩで切断し、Ｈ６プロモートしたＨ４コード配列を含有する１．９ｋｂｐの断片をＨ６プロモートしたＨ５配列のＳｍａＩ部位５′でｐＲＷ８６５に挿入した。それゆえ、産生したプラスミドｐＲＷ８７２は、Ｆ７  ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入プラスミド中にＨ４、Ｈ５およびＨ７コード配列を含有する。
【０５９４】
遺伝子のｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｆ８座への挿入を指向するために、ｐＲＷ８７２を部分的にＳｍａＩで切断し、線状断片を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで再度切断した。３つのＨ６プロモートしたアビアンインフルエンザ遺伝子を含有する５．７ｋｂｐのＳｍａＩからＨｉｎｄＩＩＩ  ｐＲＷ８７２断片をブラントエンドし、ＨｉｎｃＩＩで切断されたｐＣＥＮ１００に挿入した。プラスミドｐＣＥＮ１００は、転写および翻訳終止シグナルおよび多重挿入部位を含有するｄｅ−ＯＲＦｅｄ  Ｆ８挿入ベクターである。プラスミドｐＣＥＮ１００を以下のように産生した。合成オリゴヌクレオチドＣＥ２０５（配列認識番号２１１）およびＣＥ２０６（配列認識番号２１２）をアニールし、ホスホリル化し、ｐＪＣＡ００２（前述）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＣＥ７２を形成した。ｐＣＥ７２からのＢｇｌＩＩからＥｃｏＲＩ断片をｐＪＣＡ０２１のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＣＥＮ１００を形成した。
【化１４０】
0003624911.tif 000168
【０５９５】
ｐＲＷ７３１−１５（前述）からの４９００ｂｐ  ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ断片をｐＢＳＳＫＴのＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することにより、プラスミドｐＪＣＡ０２１を得た。
【０５９６】
最終の挿入プラスミドｐＲＷ８７４は、欠損Ｆ８  ＯＲＦと同一の方向に転写した３つのアビアンインフルエンザＨＡ遺伝子を有した。Ｈ４遺伝子に隣接したプラスミドの左側フランキングアームは、２３５０ｂｐの鶏痘配列からなるものであった。Ｈ７遺伝子に隣接する右側フランキングアームは１７００ｂｐの鶏痘配列からなるものであった。このプラスミドの線状表示を以下に示す。
【化１４１】
0003624911.tif 000169
【０５９７】
組換え体ｖＦＰ１２２の発生
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、1982；ピッチーニら、1987）を用いて、プラスミドｐＲＷ８７４をＴＲＯＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞中にトランスフェクションした。特異的Ｈ４、Ｈ５およびＨ６放射線標識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個体群となるまで、５連続のプラーク精製を行なった。前述した特定の試薬を用いたプラークイムノスクリーンにより、３つの糖タンパク質の全ての表面発現を確認した。２回の増幅後に、挿入遺伝子の安定性を確認し、組換え体をｖＦＰ１２２と称した。
【実施例２４】
【０５９８】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ50の様々なワクシニアウイルス菌株との比較
マウス
オスの非近交スイスウェブスターマウスをタコニック農場（ＮＹ、ジャーマンタウン）から購入し、生後３週間までマウスに任意に餌と水を与え続けた（「通常の」マウス）。新生の非近交スイスウェブスターマウスは両方の性であり、タコニック農場により行なわれた妊娠により得た。使用した全ての新生マウスは２日間で生まれたものであった。
【０５９９】
ウイルス
カナリヤポックス個体群のプラーク精製によりＡＬＶＡＣを誘導し、初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）において調製した。ショ糖密度勾配の遠心分離により精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でユニットを形成するプラークに関してＡＬＶＡＣを列挙した。ＷＲの巨大なプラーク表現型の選択により、ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変形を誘導した。ワクシニアウイルスのエス（Ｗｙｅｔｈ）ニューヨーク州保健局ワクチン菌株を、対照番号３０２００１Ｂとして、製薬牛リンパ型ワクチンドライバックスから得た。コペンハーゲン菌株ワクシニアウイルスＶＣ−２を、フランスのインスティテュートメリクスから得た。ワクシニアウイルス菌株ＮＹＶＡＣをコペンハーゲンＶＣ−２から誘導した。エス菌株を除いて全てのワクシニアウイルス菌株はベロアフリカグリーンサル肝臓細胞中で培養し、ショ糖勾配密度遠心分離により精製し、ベロ細胞上のユニットを形成するプラークに関して列挙した。エス菌株をＣＥＦ細胞中で増殖せしめ、ＣＥＦ細胞中で列挙した。
【０６００】
接種
１０匹の通常のマウスの群に、無菌の食塩加リン酸緩衝液中で株標品を１０倍に希釈することにより調製したウイルスいくつかの希釈物の１つの０．０５ｍｌを頭蓋内（ｉｃ）により接種した。ある例においては、未希釈の株ウイルス標品を接種に用いた。
【０６０１】
０．０３ｍｌの接種容量を用いたことを除いて、生後１または２日の１０匹の新生マウスの群に頭蓋内に通常のマウスと同様に接種した。
【０６０２】
接種後、全てのマウスを１４日間（新生マウス）または２１日間（通常のねすみ）に亘り、死亡率を毎日観察した。接種後の翌朝に死亡したマウスは、外傷による潜在的な死のために除外した。
【０６０３】
実験個体群の５０％の死亡率となるのに必要な致死量（ＬＤ50）を、リードとミュンヒの比例法により決定した。
【０６０４】
ｉｃ経路による通常、若い非近交マウスに関するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ50と様々なワクシニアウイルス菌株との比較
若い通常のマウスにおいて、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、試験した他のワクシニアウイルス菌株よりも数桁低い大きさであった（表２８）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、通常のマウスにおいてエス菌株よりも３，０００倍も毒性が弱く；親ＶＣ−２菌株よりも１２，５００倍も毒性が弱く；ＷＲ（Ｌ）変形よりも６３，０００，０００倍も毒性が弱いことが分かった。これらの結果により、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア菌株と比較して非常に弱毒化されており、ＡＬＶＡＣは頭蓋内に施されたときに若いマウスにとっては一般的に無毒性であるが、両者とも、この経路による接種の未決定の機構による非常に高い接種量（３．８５×１０8 ＰＦＵ、ＡＬＶＡＣおよび３×１０8 ＰＦＵ、ＮＹＶＡＣ）ではマウスを死に至らせる。
【０６０５】
ｉｃ経路による新生非近交マウスに関するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ50と様々なワクシニアウイルス菌株との比較
頭蓋内（ｉｃ）抗原投与モデルシステムの滴定により、通常の新生マウスに関して５ポックスウイルス菌株の相対毒性を試験した（表２９）。最終点での死亡率に関して、ＬＤ50値は、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウイルスのエスワクチン菌株よりも１００，０００倍も毒性が弱く；ワクシニアウイルスのコペンハーゲンＶＣ−２菌株よりも２００，０００倍も毒性が弱く；ワクシニアウイルスＷＲ−Ｌ変形よりも２５，０００，０００倍も毒性が弱いことが示された。言うまでもなく、試験した最高の接種量、６．３×１０7 ＰＦＵでは、１００％の死亡率となった。３３．３％の死亡率は、６．３×１０6 ＰＦＵで観察された。最高接種群のマウスの平均生存時間（ＭＳＴ）（約６．３ＬＤ50）は６．７±１．５日であるので、死亡の原因は、実際には決定されないが、毒性学的性質または外傷性質によるものではないようである。ＭＳＴが４．８±０．６日である５ＬＤ50の抗原投与量でのＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣを抗原投与したマウスのＭＳＴは著しく長い（Ｐ＝０．００１）。
【０６０６】
ＮＹＶＡＣと比較して、エスは、１５，０００倍も毒性が強く；ＶＣ−２は３５，０００倍も毒性が強く；ＷＲ（Ｌ）は３，０００，０００倍も毒性が強いことが分かった。ＡＬＶＡＣと同様に、ＮＹＶＡＣの２つの最高接種量、６×１０8 および６×１０7 ＰＦＵでは１００％の死亡率となった。しかしながら、３８０ＬＤ50に対応する、最高接種量を抗原投与したマウスのＭＳＴは、２日のみであった（２日目に９匹死に、４日目に１匹死んだ）。対称的に、５００ＬＤ50と等量の、ＷＲ−Ｌの最高接種量を抗原投与した全てのマウスは４日目まで生存した。
【表２８】
0003624911.tif 000170
【表２９】
0003624911.tif 000171
【実施例２５】
【０６０７】
ＥＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質相同物を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターの制御下にＥＨＶ−１  ｇＢ相同物遺伝子を配することにより、ＥＨＶ−１  ｇＢ糖タンパク質の発現を行なった。ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの制御下にＥＨＶ−１  ｇＣ相同物遺伝子を配することによりＥＨＶ−１  ｇＣ糖タンパク質の発現を行なった。昆虫ポックスウイルス４２Ｋ遺伝子プロモーターの制御下にＥＨＶ−１  ｇＤ相同物遺伝子を配することによりＥＨＶ−１  ｇＤ糖タンパク質の発現を行なった。
【０６０８】
ｖＰ１０２５の産生（ＡＴＩ座におけるｇＢおよびｇＣ；ＨＡ座におけるｇＤ）
供与体プラスミドｐＪＣＡ０４２の産生
ＥＨＶ−１  ｇＢコード配列の４３０ｂｐの５′側領域を、テンプレートとしてのプラスミドｐＪＣＡ０１１（ＡＴＩ座カセットＨ６−ＥＨＶ−１  ｇＢ）およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５６（配列認識番号２２３）
【化１４２】
0003624911.tif 000172
【０６０９】
とＪＣＡ１５７（配列認識番号２２４）
【化１４３】
0003624911.tif 000173
【０６１０】
を用いてＰＣＴ誘導し、ＢａｍＨＩで切断してキナーゼした。この４３０ｂｐの断片を、テンプレートとしてのプラスミドｐＭＰ６９１（Ｉ３Ｌ１０１ＲＡＢ）およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５８（配列認識番号２２５）
【化１４４】
0003624911.tif 000174
【０６１１】
とＭＰ２８７（配列認識番号２２６）
【化１４５】
0003624911.tif 000175
【０６１２】
を用いて得られたＩ３Ｌプロモーター要素を含有する１２０ｂｐのＰＣＴ誘導断片に融合した。この１２０ｂｐ断片をＸｂａＩで切断し、ＥＨＶ−１  ｇＢ断片の４３０ｂｐ  ５′側領域と連結する前にキナーゼした。産生したプラスミドをｐＪＣＡ０３４と称した。ｐＪＣＡ０３４の直接の塩基配列決定法により、接合Ｉ３Ｌ−ＡＴＧおよびＥＨＶ−１  ５′側領域のＩ３Ｌプロモーターの配列を確認した。プラスミドｐＪＣＡ０３４をＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断して５５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ  ５′−ＢａｍＨＩ断片（Ａ）を切除した。プラスミドｐＭＰ６６５（ＣＯＰＣＳシステム中のカセットＨ６−ＨＥＶ−１  ｇＢ）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、２５３０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥＨＶ−１  ｇＢ  ３′断片（Ｂ）を切除した。次いで断片ＡおよびＢをともに、ＳｍａＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＳＤ５４１ＶＣ（ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座）に連結し、ｐＪＣＡ０３７を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０３７は、ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座にカセットＩ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢを含有する供与体プラスミドである。プラスミドｐＪＣＡ０３７をＳｍａＩとＸｈｏＩで切断し、３０５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−ＸｈｏＩ断片（Ｃ）を単離した。２２５ｂｐのＫｐｎＩ−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ３′末端浄化ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３（ＨＡｄｅｏｒｆｅｄ座のカセットＨ６−ＥＨＶ−１  ｇＣ）およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５４（配列認識番号２２７）
【化１４６】
0003624911.tif 000176
【０６１３】
とＪＣＡ１６３（配列認識番号２２８）
【化１４７】
0003624911.tif 000177
【０６１４】
を用いてＰＣＲ誘導し、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ 中に連結し、ｐＪＣＡ０３３を産生した。ｐＪＣＡ０３３の直接の配列塩基決定方により確認した。プラスミドｐＪＣＡ０３３をＫｐｂＩとＥｃｏＲＶで切断し、２２ｂｐＫｐｎＩ−ＥＨＶ−１  ｇＣ′末端ＥｃｏＲＶ断片（Ｄ）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで切断し、１３３０ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ５′ＫｐｎＩ断片（Ｅ）を単離した。
【０６１５】
断片Ｃ、ＤおよびＥを最終的に、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＳＤ５４１ＶＣ中にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４２を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０４２は、ＮＹＶＡＣ  ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座にＩ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ−１  ｇＣ二重構造を挿入する供与体プラスミドである。プラスミドｐＪＣＡ０４２はＩＶＲの前にＮｏｔＩを用いて線状化した。
【０６１６】
供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡ０４２および治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）を用いてベロ細胞において生体外組換え実験を行なった。標準プロトコルを用いて組換えウイルスを同定し精製した（ピッチーニら、1987）。ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１  ｇＢおよびｇＣ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ９５６と称した。
【０６１７】
供与体プラスミドｐＪＣＡ０６４の産生
プラスミドｐＥＨＶ１ＢａｍＨＩＤ（ＥＨＶ−１  ＢａｍＨＩ  Ｄ断片を含有する）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、全縁ＥＨＶ−１  ｇＤコード配列を含有するが１５  ５′側ｂｐを含有しない１２４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを切除した。１２４０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、ＳｍａＩで切断したベクターｐＣＯＰＣＳ６５７に連結し、ホスファターゼした。産生したプラスミドはｐＪＣＡ００６と称した。プラスミドｐＪＣＡ００６をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１５００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−−ＥＨＶ−１  ｇＤ−ＢｇｌＩＩ断片を切除した。この断片を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＩＢＩ２４に連結し、プラスミドｐＥＨＶ１ｇｐ５０ａを産生した。プラスミドｐＥＨＶ１ｇｐ５０ａを、両者とも特有部位であるＥｃｏＲＶとＮｃｏＩで切断し、４１００ｂｐ断片を切除した。この断片を、オリゴヌクレオチドＪＣＡ０５２（配列認識番号２２９）
【化１４８】
0003624911.tif 000178
【０６１８】
およびＪＣＡ０５３（配列認識番号２３０）
【化１４９】
0003624911.tif 000179
【０６１９】
との間のハイブリダイゼーションにより得た合成二本鎖オリゴヌクレオチドに連結した。産生したプラスミドをｐｇｐ５０ａ３−２と称した。４９０ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＥＨＶ−１  ｇＤ  ３′末端浄化−ＨｐａＩを、テンプレートとしてのプラスミドｐＪＣＡ００５およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ０４１（配列認識番号２３１）
【化１５０】
0003624911.tif 000180
【０６２０】
とＪＣＡ０９９（配列認識番号２３２）
【化１５１】
0003624911.tif 000181
【０６２１】
を用いてＰＣＴ誘導した。プラスミドｐｇｐ５０ａ３−２をＥｃｏＲＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に切断し、８５０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１  ｇＤ  ５′−ＥｃｏＲＩ断片を切除した。この断片を４９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０２０を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０２０はカセットＨ６−ＥＨＶ−１  ｇＤを含有する。
【０６２２】
ＥＨＶ−１  ｇＤコード配列の７２０ｂｐの５′側領域を、テンプレートとしてのプラスミドｐＪＣＡ０２０およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ０４４（配列認識番号２３３）
【化１５２】
0003624911.tif 000182
【０６２３】
とＪＣＡ１６５（配列認識番号２３４）
【化１５３】
0003624911.tif 000183
【０６２４】
を用いてＰＣＴ誘導した。この断片をＥｃｏＲＩで切断し、キナーゼした。１０７ｂｐ  ４２Ｋプロモーター要素を、テンプレートとしてのプラスミドｐＡＭ１２およびオリゴヌクレオチドＲＧ２８６（配列認識番号２３５）
【化１５４】
0003624911.tif 000184
【０６２５】
とＪＣＡ１６４（配列認識番号２３６）
【化１５５】
0003624911.tif 000185
【０６２６】
を用いてＰＣＲ誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、キナーゼし、７２０ｂｐのＡＴＧ−ＥＨＶ−１  ｇＤ  ５′−ＥｃｏＲＩ断片とともにＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０３５を産生した。接合４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤおよびＥＨＶ−１  ｇＤ  ５′部分の４２Ｋプロモーターの配列をｐＪＣＡ０３５の直接の塩基配列決定法により確認した。
【０６２７】
プラスミドｐＪＣＡ０３５をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、８３０ｂｐのＢａｍＨＩ−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ  ５′部分−ＥｃｏＲＩ断片（Ｆ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０２０をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、５００ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＥＨＶ−１  ｇＤ  ３′末端浄化−ＸｂａＩ断片（Ｇ）を単離した。次いで断片ＦおよびＧを、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０３８を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０３８は、ベクターｐＢＳ−ＳＫ+ 中にカセット４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤを含有している。プラスミドｐＪＣＡ０３８をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断し、１３４０ｂｐのＨｐａＩ−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片を単離した。この断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐＳＤ５４４（ＨＡ  ｄｅｏｒｆｅｄ座）に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０６４を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０６４は、カセット４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤをＮＹＶＡＣ  ＨＡ  ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入する供与体プラスミドである。ＩＶＲの前にＮｔＩを用いてプラスミドｐＪＣＡ０６４を線状化した。
【０６２８】
供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡ０６４および治療ウイルスとしての組換えワクシニアウイルスｖＰ９５６（ＮＹＶＡＣバックグラウンド）を用いてベロ細胞において生体外実験を行なった。これは標準方法に関して行なった（ピッチーニら、1987）。ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１  ｇＢおよびｇＣ遺伝子を、ＨＡ  ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１  ｇＤ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０２５と称した。
【０６２９】
供与体プラスミドｐＪＣＡ０４３の産生
プラスミドｐＪＣＡ０１１およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５９（配列認識番号２３７）
【化１５６】
0003624911.tif 000186
【０６３０】
とＪＣＡ１６０（配列認識番号２３８）
【化１５７】
0003624911.tif 000187
【０６３１】
を用いて２２０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＨＶ−１  ｇＢ  ３′側領域をＰＣＲ誘導した。この断片をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ に連結し、プラスミドｐＪＣＡ０３６を産生した。ｐＪＣＡ０３６の直接の塩基配列決定法により、ＥＨＶ−１  ｇＢ  ３′側領域ＰＣＲ断片の配列を確認した。
【０６３２】
プラスミドｐＪＣＡ０３３をＥｃｏＲＶとＫｐｎＩで切断し、ＫｐｎＩ−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ３′側領域−ＥｃｏＲＶ断片（Ｈ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０３８をＢａｍＨＩとＨｐａＩで切断し、１３６０ｂｐのＨｐａＩ−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片（Ｉ）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断し、９００ｂｐのＸｈｏＩ−ＥＨＶ−１  ｇＣ中央部分−ＫｐｎＩ断片（Ｊ）を単離した。次いで断片Ｈ、ＩおよびＪを、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４１を産生した。
【０６３３】
プラスミドｐＪＣＡ０３４をＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、５９００ｂｐの線状化ベクターＸｈｏＩ−ｐＢＳ−ＳＫ+ −Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｋ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０３６をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２２０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥＨＶ−１  ｇＢ  ３−−側領域−ＢａｍＨＩ断片（Ｌ）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、４４０ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ５′部分−ＸｈｏＩ断片（Ｍ）を単離した。次いで断片Ｋ、Ｌおよびｍをともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４０を産生した。
【０６３４】
プラスミドｐＪＣＡ０４０をＳｍａＩとＸｈｏＩで切断し、３５５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ５′部分−ＸｈｏＩ断片（Ｎ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０４１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、２４６０ｂｐのＸｈｏＩ−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ３′部分−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片（Ｏ）を単離した。断片ＮおよびＯを最終的に、ＢｇｌＩＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐＳＤ５４１ＶＣ（ＮＹＶＡＣ  ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座）にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４３を産生した。プラスミドｐＪＣＡ０４３は、Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ−１  ｇＣ−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ三重構造をＮＹＶＡＣ  ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入する供与体プラスミドである。ＩＶＲの前にＮｏｔＩを用いてプラスミドｐＪＣＡ０４３を線状化した。
【０６３５】
供与体プラスミドとしてｐＪＣＡ０４３および治療ウイルスとしてｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）を用いて初代鶏胚繊維芽細胞において生体外実験を行なった。標準方法を用いて産生した組換え体を同定し、精製した（ピッチーニら、1987）。ＡＴＩ  ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０４３と称した。
【実施例２６】
【０６３６】
ＥＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ糖タンパク質相同物を発現するＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生
供与体プラスミドｐＪＣＡ０４９の産生
プラスミドｐＪＣＡ０４０をＳｍａＩとＸｈｏＩで切断し、３５５０ｂｐのＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ５′部分−ＸｈｏＩ断片（Ａ）を単離した。プラスミドｐＪＣＡ０４１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、２４６０ｂｐのＸｈｏＩ−ＥＨＶ−１  ｇＣ  ３′部分−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片（Ｂ）を単離した。断片ＡおよびＢを、ＢａｍＨＩとＳｍａＩで切断したプラスミドｐＳＰＶＱＣ３Ｌにともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０４９を産生した。ｐＪＣＡ０４９は、Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１  ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ１  ｇＣ−−４２Ｋ−ＥＨＶ−１  ｇＤ三重構造をＡＬＶＡＣ  Ｃ３  ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入するプラスミドである。ＩＶＲの前に、ＮｏｔＩを用いてプラスミドｐＪＣＡ０４９を線状化した。
【０６３７】
供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡ０４９および治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）を用いて、初代鶏胚繊維芽細胞において生体外実験を行なった。標準方法を用いて産生した組換え体を同定し精製した（ピッチーニら、1987）。Ｃ３  ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え体をｖＣＰ１３２と称した。
【実施例２７】
【０６３８】
ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのウマヘルペスウイルス１型三重組換え体の発現分析
ＥＨＶ−１  ｇＢ（１６Ｇ５または３Ｆ６）、ＥＨＶ−１  ｇＣ（１４Ｈ７）およびＥＨＶ−１  ｇＤ（２０Ｃ４）に特異的な単クローン性抗体を用いて、前述したように（テイラーら、1990）蛍光抗体法アッセイを行なった。全ての抗ＥＨＶ−１単クローンをジョージアレン（４０５４６−００７６、ケンタッキー州、レキシントン、ケンタッキー大学、獣医科学科）から得た。３つのＥＨＶ−１特異的産生物全ての発現は、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３まはｖＣＰ１３２のいずれに感染した細胞内部に検出可能であった。ＥＨＶ−１  ｇＣ糖タンパク質のみが、感染細胞の表面上に良好に発現された。ＥＨＶ−１  ｇＢ糖タンパク質の表面発現は非常に弱く、ＥＨＶ−１  ｇＤ糖タンパク質の表面発現は疑わしいものであった。
【０６３９】
同一の単クローン性抗体を用いて免疫沈降を行ない、発現されたＥＨＶ−１  ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子産生物の真正を測定した。ＥＨＶ−１  ｇＢ糖タンパク質に特異的な単クローン性３Ｆ６は、組換えウイルスｖＰ９５６、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２に感染した細胞から誘導された溶解産物からの１３８ｋＤａ、７０ｋＤａおよび５４ｋＤａのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上の見かけ分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた。未感染細胞またはいずれの親ウイルス（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ）感染細胞から誘導された溶解産物からはどのタンパク質も沈殿しなかった。ＥＨＶ−１  ｇＣ糖タンパク質に特異的な単クローン性１４Ｈ７は、ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５またはｖＰ１０４３のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物からは９０ｋＤａの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。組換え体ｖＣＰ１３２により発現されたＥＨＶ−１  ｇＣ糖タンパク質は、組換え体ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５またはｖＰ１０４３により発現された糖タンパク質よりもやや小さな（約２ｋＤａ小さい）見かけ分子質量を有する。ＥＨＶ−１  ｇＤ糖タンパク質に特異てきな単クローン性抗体２０Ｃ４は、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２に感染した細胞から誘導された溶解産物からは５５ｋＤａの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。
【０６４０】
またはＧ．アレンから得たウサギ抗−ＥＨＶ−１高度免疫血清を用いて免疫沈降を行なった。この血清は、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物から３つのＥＨＶ−１産生物全てを沈殿せしめた。
【実施例２８】
【０６４１】
ハムスター抗原投与モデルを用いて得られた防御データ
抗原投与実験（ハムスターモデル）をローンメリクス（フランス、リヨン）で行ない、ポックスウイルスＥＨＶ−１組換え体ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５およびｖＣＰ１３２により誘発した防御の相対水準を評価した。ハムスターを０日にワクチン接種し、１４日にＥＨＶ−１組換え体の様々な希釈物を追加抗原投与した。全て免疫し、対照の動物に、２８日にハムスター適用ＥＨＶ−１抗原投与気株を抗原投与した。死亡した動物の最終的な数は３５日（抗原投与後７日）に数えた。抗原投与実験の結果を表３０に示す。
【表３０】
0003624911.tif 000188
【実施例２９】
【０６４２】
イヌの免疫持続期間の研究
この研究の目的は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の１回の接種後のイヌに防御免疫応答が保持される期間を測定することにある。抗狂犬病抗体を有さない生後８か月の、４１匹のビーグル犬に、皮下経路により６．７ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧの１回の接種量を接種した。ワクチン接種後、０日と１、２、３、６および１２か月でイヌを採血し、ＲＦＦＩ試験を用いて抗狂犬病抗体の存在について血清をアッセイした。全ての動物を、ワクチン接種の副作用について監視した。
【０６４３】
ワクチン接種から６か月後、５匹のイヌに、狂犬病ウイルスの毒性ＮＹＧＳ菌株を筋内接種により抗原投与した。その動物には側頭筋に１０3.4 ５０％マウス致死量を投与した。３匹の未接種対照動物にも同一の接種を行なった。１１匹のワクチン接種したイヌと３匹の未接種対し卯よイヌには、ワクチン接種から１２か月後に同一の方法で抗原投与した。血清学的結果と６および１２か月での抗原投与の結果を表３１に示す。
【０６４４】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）でワクチン接種したどのイヌもワクチン接種に対する副作用は示さなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を接種した全てのイヌは、ワクチン接種から７日後に狂犬病ウイルス中和抗体の誘発を示した。最大の力価は、ワクチン接種後１４から２８日の間に達成され、その後減少した。ワクチン接種から６または１２か月後での抗原投与の時に、力価は低く、ある動物においてはゼロに近かった。低い力価にもかかわらず、全ての動物は、ワクチン接種をしなかった対照イヌが死んだ致死狂犬病抗原投与にも生存した。ワクチン接種から６か月後の抗原投与に生存した動物のＲＦＦＩ力価を８か月目（抗原投与から２か月後）に評価した。これらの動物の血清力価は、７．４、７．４、２．３、１．８、および７．４国際単位であった。狂犬病中和抗体のこれらの上昇し保持された水準は、動物が最初の１回の接種により効果的に備えられたことを示す。実験は進行中であり、残りの動物は、ワクチン接種から２または３年後に抗原投与する。しかしながら、データに関して、実験を成功であり、本発明の効用を説明している。
【表３１】
0003624911.tif 000189
【０６４５】
0003624911.tif 000190
【実施例３０】
【０６４６】
ＮＹＶＡＣ中のウシヘルペスウイルス１型ＢＨＶ１遺伝子の発現
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１  ｇＩＶ組換え体の産生
プラスミドｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクスから得た。このプラスミドは、３．９ｋｂ  ＰｓｔＩ断片上にコードされ、ｐＢＳ−ＳＫ+ のＰｓｔＩ部位にクローニングされるＢＨＶ１  ｇＩＶ遺伝子（ストローブ菌株）を含有する。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子（チコーら、Ｊ．ビロル（1990）64：5132）をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。ｇＩＶ遺伝子をが有するｐＢＨＶｇＩＶの２，０００ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＳＤ５４２のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位（実施例３２に定義）にクローニングすることによりこのことを行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０６４７】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端とｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ７（配列認識番号２３９）
【化１５８】
0003624911.tif 000191
【０６４８】
およびＢＨＶＬ８（配列認識番号２４０）
【化１５９】
0003624911.tif 000192
【０６４９】
をｐＢＨＶ１の５，５００ｂｐの部分的ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０６５０】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５（配列認識番号２４１）（５′−ＧＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡ−３′）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）（５′−ＧＴＣＡＣＣＣ−３′）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＶＨ４と称する。
【０６５１】
次いで異種リンカー配列を除去した。これはｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ  ＰｓｔＩ断片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ５と称する。
【０６５２】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ５の５，２００ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０６５３】
ｐＢＨＶ６を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０５１を産生した。
【０６５４】
免疫沈降を行なって、ｖＰ１０５１が真正ＢＨＶ１  ｇＩＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０５１に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、２％のウシ胎仔血清と［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンのない）を細胞に添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンの添加と続いての細胞単層のかきとりにより細胞を感染から７時間後に収集した。
【０６５５】
次いでＢＨＶ１  ｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフリーリッチワースから得た）を用いて溶解産物を、ＢＨＶ１  ｇＩＶ発現に関して分析した。これは以下の方法によって行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２に結合せしめた。一方で、通常のマウス血清およびタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩に亘りインキュベーションすることにより、溶解産物を前浄化した。この物質を１×の緩衝液Ａで５回洗浄した後、ＢＨＶ１セファロース単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩に亘りインキュベーションした。その試料を、１×緩衝液Ａで５回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後、２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０６５６】
ＢＨＶ１  ｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２は、ｖＰ１０５１感染細胞からＢＨＶ１  ｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、ＮＹＶＡＣまたは疑似感染細胞からはＢＨＶ１−特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【０６５７】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＶ組換え体の産生
ＢＨＶ１  ｇＩＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＶは、ローンメリクスから得た。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＩＶ遺伝子を含有するｐＢＨＶ１ｇＩＶの２，０００ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片を、ｐＳＤ５４２のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０６５８】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端とｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ７（配列認識番号２３９）およびＢＨＶＬ８（配列認識番号２４０）をｐＢＨＶ１の５，５００ｂｐの部分的ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０６５９】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５（配列認識番号２４１）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂｐ部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。
【０６６０】
次いで異種リンカー配列を除去した。これし、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐのＰｓｔＩ断片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ５と称する。
【０６６１】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ５の５，２００ｂｐのＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０６６２】
次いでＢＨＶ１  ｇＩ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐのＢｇｌＩＩ断片をｐＢＨＶ６のＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ９と称する。
【０６６３】
ｐＢＨＶ８を以下の方法により産生した。プラスミドｐＩＢＲＳ６をローンメリクスから得た。このプラスミドは、ＢＨＶ１ｇＩ遺伝子を含有する６．６ｋｂのＳａｌＩ断片（ストローブ菌株）を含有する。ｇＩ遺伝子の５′末端（ホワイトベックら、Ｊ．ビロル（1988）62：3319）をＨ６プロモーターの下流と、ワクシニアウイルスＨＡフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｐＩＢＲＳ６の５４ｂｐのＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＧＤ５の４，４００ｂｐのＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ２と称する。
【０６６４】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンを、オリゴヌクレオチドＩＢＲＬ１（配列認識番号２４３）
【化１６０】
0003624911.tif 000193
【０６６５】
およびＩＢＲＬ２（配列認識番号２４４）
【化１６１】
0003624911.tif 000194
【０６６６】
を、ｐＩＢＲ２の３，８００ｂｐのＮｒｕＩ−ＳｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ４と称する。
【０６６７】
次いで将来の操作に必要なＮｃｏＩ部位をｇＩ配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチドＩＢＲＬ３（配列認識番号２４５）
【化１６２】
0003624911.tif 000195
【０６６８】
およびＩＢＲＬ４（配列認識番号２４６）
【化１６３】
0003624911.tif 000196
【０６６９】
をｐＩＢＲ４のＰｓｔＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ５と称する。
【０６７０】
次いで追加のｇＩ配列をｐＩＢＲ５にクローニングした。これは、ｐＩＢＲＳ６の１，７４０ｂｐのＴｔｈ１１１Ｉ−ＮｃｏＩ断片をｐＩＢＲ５の３，７００ｂｐのＴｔｈ１１１Ｉ−ＮｃｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ７と称した。
【０６７１】
次いで将来の操作に必要なＢｇｌＩＩ部位をｇＩ配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチドＩＢＲＬ５（配列認識番号２４７）
【化１６４】
0003624911.tif 000197
【０６７２】
およびＩＢＲＬ６（配列認識番号２４８）
【化１６５】
0003624911.tif 000198
【０６７３】
をｐＩＢＲ７のＮｃｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ８と称する。
【０６７４】
次いでｇＩ遺伝子の３′末端をｐＩＢＲ８にクローニングした。これは、ｐＩＢＲＳ６の２，２８５ｂｐ  ＳｔｕＩ断片をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）が充填されたｐＩＢＲ８の４，３００ｂｐ  ＳｔｕＩ−ＢｇｌＩＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ２０と称する。
【０６７５】
次いでＨ６プロモートしたＢＨＶ１  ｇＩ遺伝子をワクシニアウイルス供与体プラスミドに移動せしめた。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）が充填されたｐＩＢＲ２０の２，９００ｂｐ  ＢｇｌＩ−ＮｃｏＩ（部分的）断片をｐＳＤ５４２のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより行なった。これによりＨ６プロモートしたｇＩ遺伝子をｔｋフランキングアームの間に配する。この操作により産生したプラスミドをｐＩＢＲ２２と称する。
【０６７６】
次いでＢｇｌＩＩ部位をＨ６プロモーターの下流に産生した。これは、ｐＩＢＲ２２の２，８００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＧＤ３の３，５００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片にクローニングすることにより行なった。（ｐＧＤ３は、Ｈ６プロモートした２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ２）ｇＤ遺伝子から下流のＧｇｌＩＩ部位を含有する。この操作により、ＨＳＶ２ｇＤ配列をＢＨＶＩｇＩ遺伝子が置換され、それゆえＨ６プロモートしたｇＩ遺伝子から下流にＢｇｌＩＩ部位を産生する）。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ８と称する。
【０６７７】
ｐＢＨＶ９を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０７４を産生した。
【０６７８】
免疫沈降分析を行ない、ｖＰ１０７４が真正ＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染したか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０７４に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０６７９】
次いでＢＨＶ１  ｇＩ特異的単クローン性抗体５１０６、およびｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＶ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩ特異的単クローン性抗体とｇＩＶ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ｇＩまたはｇＩＶ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０６８０】
ＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、５１０６および３４０２は、ｖＰ１０７４感染細胞からＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からのＢＨＶ１−特異的タンパク質は沈殿しなかった。
【０６８１】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１  ｇＩＩＩ組換え体の産生
プラスミドｐＢＨＶｇＩＩＩをローンメリクスから得た。このプラスミドは、ｐＢＳＫ+ のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングされた３．４ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片上にコードされたＢＨＶ１  ｇＩＩＩ遺伝子（ストローブ菌株）を含有する。このプラスミドからのｇＩＩＩ遺伝子（フィッツパトリックら、ウイルス学、（1989）173 ：146 ）をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の５′末端を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの１，０００ｂｐのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片、およびＩ３ＬプロモーターをコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１（配列認識番号２４９）
【化１６６】
0003624911.tif 000199
【０６８２】
とＢＨＶＬ２（配列認識番号２５０）
【化１６７】
0003624911.tif 000200
【０６８３】
をｐＳＤ５４４のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ２と称する。
【０６８４】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の３′末端をｐＢＨＶ２にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の３′末端をコードする、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１５（配列認識番号２５１）
【化１６８】
0003624911.tif 000201
【０６８５】
およびＢＨＶＬ１６（配列認識番号２５２）
【化１６９】
0003624911.tif 000202
【０６８６】
をｐＢＨＶ２の４，７００ｂｐ  ＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したフラクションをｐＢＨＶ７と称する。
【０６８７】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の残りをｐＢＨＶ７にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の内側部分を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの５００ｂｐ  部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ７の４，７５０ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１０と称する。
【０６８８】
ｐＢＨＶ１０を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０７３を産生した。
【０６８９】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０７３が真正ＢＨＶ１  ｇＩＩＩ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０７３に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０６９０】
次いでＢＨＶ１  ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体１５０７（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１  ｇＩＩＩ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、１５０７に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０６９１】
ＢＨＶ１  ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、１５０７は、ｖＰ１０７３感染細胞からのＢＨＶ１  ｇＩＩＩ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からのＢＨＶ１−特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０６９２】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１  ｇＩＩＩおよびｇＩＶ組換え体の産生
ＢＨＶ１  ｇＩＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクスから得た。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＩＶ遺伝子を含有するｐＢＨＶｇＩＶの２，０００ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＳＤ５４２のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０６９３】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端およびｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ７（配列認識番号２３９）およびＢＨＶＬ８（配列認識番号２４０）をｐＢＨＶ１の５，５００ｂｐ  部分的ＳｓｔＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０６９４】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５（配列認識番号２４１）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。
【０６９５】
次いで異種リンカー配列を除去した。これは、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ  ＰｓｔＩ断片を連結することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ５と称する。
【０６９６】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ５の５，２００ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０６９７】
次いでＢＨＶ１  ｇＩＩＩ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｉ３ＬプロモートしたｇＩＩＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ１０の１，６００ｂｐ  Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＨＶ６の５，３００ｂｐ  部分的ＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１１と称する。
【０６９８】
ｐＢＨＶ１１を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０８３を産生した。
【０６９９】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０８３が真正ＢＨＶ１  ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０８３に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０７００】
次いでＢＨＶ１  ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体１５０７、およびｇＩＶ特異的単クローン性抗体３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１  ｇＩＩＩおよびｇＩＶ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体およびｇＩＶ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＨＶ１  ｇＩＩＩまたはｇＩＶ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０７０１】
ＢＨＶ１  ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、１５０７および３４０２は、ｖＰ１０８３感染細胞からのＢＨＶ１  ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からのＢＨＶ１特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０７０２】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＩＩ組換え体の産生
ＢＨＶ１  ｇＩＩＩ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＩＩをローンメリクスから得た。このプラスミドからのｇＩＩＩ遺伝子を、ワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の５′末端を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの１，０００ｂｐ  ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片、およびＩ３ＬプロモーターをコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１（配列認識番号２４９）とＢＨＶＬ２（配列認識番号２５０）をｐＳＤ５４４ＶＣのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ２と称する。
【０７０３】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の３′末端をｐＢＨＶ２にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の３′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１５（配列認識番号２５１）およびＢＨＶＬ１６（配列認識番号２５２）をｐＢＨＶ２の４，７００ｂｐ  ＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ７と称する。
【０７０４】
次いでｇＩＩＩ遺伝子の残りをｐＢＨＶ７にクローニングした。これは、ｇＩＩＩ遺伝子の内側部分を含有するｐＢＨＶｇＩＩＩの５００ｂｐ  部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ７の４，７５０ｂｐ部分的ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１０と称する。
【０７０５】
次いでＢＨＶ１  ｇＩ遺伝子をｐＢＨＶ１０にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片をｐＢＨＶ１０のＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１２と称する。
【０７０６】
ｐＢＨＶ１２を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０８７を産生した。
【０７０７】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０８７が真正ＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＩＩ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０８７に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０７０８】
次いでＢＨＶ１  ｇＩ特異的単クローン性抗体５１０６、およびＢＨＶ１  ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体１５０７（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＩＩ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩ特異的単クローン性抗体およびｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＨＶ１  ｇＩまたはｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０７０９】
ＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体、５１０６および１５０７は、ｖＰ１０８７感染細胞からＢＨＶ１  ｇＩおよびｇＩＩＩ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からＢＨＶ１特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０７１０】
ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶ１  ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ組換え体の産生
ＢＨＶ１  ｇＩＶ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクスから得た。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＩＶ遺伝子を含有する２，００ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱのＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ１と称する。
【０７１１】
次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端およびｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチド、ＢＨＶＬ７およびＢＨＶＬ８を、ｐＢＨＶ１の５，５００ｂｐ  部分的ＳｓｔＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。
【０７１２】
次いで異種３′非コード配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＢＨＶＬ５（配列認識番号２４１）およびＢＨＶＬ６（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５，２００ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。
【０７１３】
次いで異種リンカー配列を除去した。これは、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ  ＰｓｔＩ断片を連結することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ５と称する。
【０７１４】
次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するｐＰＩ４の１３０ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ５の５，２００ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ６と称する。
【０７１５】
次いでＢＨＶ１  ｇＩＩＩ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｉ３ＬプロモートしたｇＩＩＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ１０の１，６００ｂｐ  Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＨＶ６の５，３００ｂｐ  部分的ＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１１と称する。
【０７１６】
次いでＢＨＶ１  ｇＩ遺伝子をｐＢＨＶ１１にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片をｐＢＨＶ１１のＢｇｌＩＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＨＶ１３と称する。
【０７１７】
ｐＢＨＶ１３を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０７９を産生した。
【０７１８】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０７９が真正ＢＨＶ１  ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０７９に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収集した。
【０７１９】
次いでＢＨＶ１  ｇＩ特異的単クローン性抗体５１０６、ＢＨＶ１  ｇＩＩＩ特異的単クローン性抗体１５０７、およびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、３４０２（ＷＩ、マジソン、ウィスコンシン大学、Ｄｒ．ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶ１  ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＨＶ１  ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０７２０】
ＢＨＶ１  ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ特異的単クローン性抗体、５１０６、１５０７および３４０２は、ｖＰ１０７９に感染した細胞から、ＢＨＶ１  ｇＩ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＭＹＶＡＣ感染差異簿からはＢＨＶ１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【実施例３１】
【０７２１】
ＮＹＶＡＣ中のウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）の発現
ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ  ｇＥ１／ｇＥ２組換え体の産生
ＢＶＤＶ  ｇＥ１（ｇｐ４８／ｇｐ２５）「遺伝子」（オスロス菌株）をｐＩＢＩ２５にクローニングした。これは、ｐＳＰ６５−ｇＥ１の１，３７０ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にＸｈｏＩリンカーを連結し、産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１と称する。
【０７２２】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＥ１「遺伝子」の「開始コドン」に配列した。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ１「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ４（配列認識番号２５３）
【化１７０】
0003624911.tif 000203
【０７２３】
およびＢＤＶＭ５（配列認識番号２５４）
【化１７１】
0003624911.tif 000204
【０７２４】
を、ｐＢＤＶ１の４，２５０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｈｇｌＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ６と称する。
【０７２５】
次いでｇＥ１「遺伝子」を、Ｈ６＋ＡＴＩ＋ＨＡ三重プロモーター（ポーテテレら、ワクチン（1991）9 ：194 ）の下流およびＨＡフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝子」を含有するｐＢＤＶ６の１，３８０ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ（部分的）断片を、ｐＡＴＩ２５の３，７００ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ７と称する。
【０７２６】
次いで、将来の操作に必要なＢａｍＨＩ部位をＢＶＤＶ配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ６（配列認識番号２５５）
【化１７２】
0003624911.tif 000205
【０７２７】
を、ｐＢＤＶ７のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ８と称する。
【０７２８】
次いでｇＥ２（ｇｐ５３）配列（オスロス菌株）の約８３０ｂｐをｇＥ１配列の下流にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の９８０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）を、ｐＢＤＶ８の５，１００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ９と称する。
【０７２９】
次いでＨ６プロモートしたｇＥ１／ｇＥ２配列をＡＴＩフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＥ１／ｇＥ２配列を含有する、ｐＢＤＶ９の２，２００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＧＩ７の４，９００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。これにより、ｇＥ１／ｇＥ２配列がＨ６プロモーターの転写制御下に置かれ、挿入ベクターに配される。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２３と称する。
【０７３０】
次いで約２７０ｂｐの追加のｇＥ２配列（オスロス菌株）を存在するＢＶＤＶ配列の下流にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，２６０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）を、ｐＶＤＶ２３の６，１００ｂｐ断片にクローニングすることにより行なわれた。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＤＶ２４と称する。
【０７３１】
ｐＢＤＶ２４を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いて、ｖＰ９７２を産生した。
【０７３２】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９７２が真正ＢＶＤＶ  ｇＥ１およびｇＥ２糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ９７２に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍｌのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から１８時間後に細胞を収集した。
【０７３３】
次いでＢＶＤＶ  ｇｐ４８特異的単クローン性抗体、ＮＹＣ１６およびＮＹ１２Ｂ１、およびＢＶＤＶ  ｇｐ５３特異的単クローン性抗体、２０９Ｄ３（フランス、リヨン、ローンメリクスから得た）を用いて、溶解産物をＢＶＤＶ  ｇＥ１およびｇＥ２発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗マウス血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体をｇＥ１特異的単クローン性抗体、ＮＹＣ１６およびＮＹ１２Ｂ１、およびｇＥ２特異的単クローン性抗体、２０９Ｄ３に結合せしめた。一方で、通常マウス血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗マウス抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＶＤＶ  ｇＥ１またはｇＥ２特異的単クローン性抗体、ラット抗マウス、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリファスゲルシステムで分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【０７３４】
ＢＶＤＶ  ｇＥ１またはｇＥ２特異的単クローン性抗体は、ｖＰ９７２感染細胞からＢＶＤＶ特異的糖タンパク質を沈殿せしめたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞または疑似感染細胞からはＢＶＤＶ特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【０７３５】
ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ  カプシド／ｇＥ１／ｇＥ２組換え体の産生
ＢＶＤＶｇＥ１「遺伝子」をｐＩＢＩ２５にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝子」を含有する、ｐＳＰ６５−ｇＥ１の１，３７０ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にＸｈｏＩリンカーを連結し、産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１と称する。
【０７３６】
次いでｇＥ１「遺伝子」をｕフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＥ１配列を含有する、ｐＢＤＶ１の１，４００ｂｐ  ＸｈｏＩ断片をｐＳＤ４８６のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＤＶ１１と称する。
【０７３７】
次いでｇＥ１「遺伝子」の「開始コドン」をｕプロモーターの開始コドンに配列した。これは、ｕプロモーターの３′末端およびｇＥ１配列の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ７（配列認識番号２５６）
【化１７３】
0003624911.tif 000206
【０７３８】
およびＢＤＶＭ８（配列認識番号２５７）
【化１７４】
0003624911.tif 000207
【０７３９】
を、ｐＢＤＶ１１の４，８００ｂｐ  部分的ＢｇｌＩ−ＣｌａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１２と称する。
【０７４０】
次いでＢＶＤＶ  ｇＥ２「遺伝子」の一部をｇＥ１配列から下流のｐＢＤＶ１２にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の１，０００ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ１２の４，６５０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１４と称する。
【０７４１】
次いでｇＥ２「遺伝子」の残りをｐＢＤＶ１４にクローニングした。これは、ｇＥ２「遺伝子」を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，２６０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ１４の４，６５０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１７と称する。
【０７４２】
次いでカプシド「遺伝子」（オスロス菌株）をｇＥ１配列の上流のｐＢＤＶ１７にクローニングした。これは２工程で行なった。最初の工程では、ｕプロモーターの開始コドンをカプシド「遺伝子」の「開始コドン」と配列せしめた。これは、ｕプロモーターの３′末端およびカプシド配列の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＶＤＶＬ１２（配列認識番号２５８）
【化１７５】
0003624911.tif 000208
【０７４３】
およびＢＤＶＬ１３（配列認識番号２５９）
【化１７６】
0003624911.tif 000209
【０７４４】
を、ｐＢＤＶ１７の５，２００ｂｐ  ＣｌａＩ−ＸｂａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２５と称する。第２の工程で、カプシド「遺伝子」の残りをｐＢＤＶ２５にクローニングした。これは、カプシド「遺伝子」を含有する、ｐＳＰ６５Ｃ−Ｅ１−Ｅ２の１，８７０ｂｐ  ＢｓｔＥＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）を、ｐＢＤＶ２５の４，７００ｂｐ  ＢｓｔＥＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２６と称する。
【０７４５】
次いでｕプロモートしたカプシド／ｇＥ１／ｇＥ２配列をｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｕプロモートしたカプシド／ｇＥ１／ｇＥ２配列を含有する、ｐＢＤＶ２６の３，２００ｂｐ  ＳｎａＢＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＳＤ５４２の４，０００ｂｐ  ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２７と称する。
【０７４６】
ｐＢＤＶ２７を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０１７を産生した。ｖＰ９７２の発現に関して、ｖＰ１０１７感染細胞の免疫沈降実験を上述したように行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＢＶＤＶ特異的タンパク質は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０１７の溶解産物からは、ＢＶＤＶ特異的タンパク質が沈殿した。
【０７４７】
ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ  ｇＥ２組換え体の産生
ＢＶＤＶ  ｇＥ１「遺伝子」をｐＩＢＩ２５にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝子」を含有するｐＳＰ６５−ｇＥ１の１，３７０ｂｐ  ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にＸｈｏＩリンカーを連結し、産生したプラスミドをｐＩＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ１と称する。
【０７４８】
次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＥ１「遺伝子」の推定「開始コドン」と配列せしめた。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ１「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ４（配列認識番号２５３）およびＢＤＶＭ５（配列認識番号２５４）を、ｐＢＤＶ１の４，２５０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ６と称する。
【０７４９】
次いでｇＥ１「遺伝子」をＨ６＋ＡＴＩ＋ＨＡ三重プロモーターの下流とＨＡフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＥ１「遺伝子」を含有する、ｐＢＤＶ６の１，３８０ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ（部分的）断片を、ｐＡＴＩ２５の３，７００ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ７と称する。
【０７５０】
次いで、将来の操作に必要なＢａｍＨＩ部位をＢＶＤＶ配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチドＢＤＶＭ６（配列認識番号２５５）をｐＢＤＶ７のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ８と称する。
【０７５１】
次いでＢＶＤＶ  ｇＥ２配列の約８３０ｂｐをｇＥ１「遺伝子」の下流にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の９８０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ８の５，１００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ９と称する。
【０７５２】
次いでｇＥ１／ｇＥ２配列をＡＴＩフランキングアームの間にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＥ１／ｇＥ２「遺伝子」を含有するｐＢＤＶ９の２，２００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＧＩ７の４，９００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２３と称する。
【０７５３】
次いで、約２７０ｂｐの追加のｇＥ２配列を存在するＢＶＤＶ配列の下流にクローニングした。これは、追加のｇＥ２配列を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，２６０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ２３の６，１００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２４と称する。
【０７５４】
次いでｇＥ１配列をＢＤＶ２４から欠損せしめた。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ２「遺伝子」の５′末端を含有する、１３０ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ  ＰＣＲ断片をｐＢＤＶ２４の５，９００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＰ１４（配列認識番号２６０）
【化１７７】
0003624911.tif 000210
【０７５５】
およびＢＤＶＰ１５（配列認識番号２６１）
【化１７８】
0003624911.tif 000211
【０７５６】
によりプラスミド、ｐＢＤＶ１７から産生した。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＤＶ２８と称する。
【０７５７】
配列分析により、ｐＢＤＶ２８中のＨ６プロモーターは２ｂｐ挿入物を含有することが分かった。この誤りを直すために、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ２「遺伝子」の５′末端を含有する、ｐＢＤＶ２８の１３０ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＢＤＶ２４の５，９００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングした。この操作荷より産生したプラスミドをｐＢＤＶ２９と称する。
【０７５８】
ｐＢＤＶ２９を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０９７を産生した。
【０７５９】
上述したようにｖＰ１０９７感染細胞に関する免疫沈降を行なって、細胞または溶解産物からＢＶＤＶタンパク質を産生した。
【実施例３２】
【０７６０】
ポックスウイルスベクター中のヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タンパク質抗原のクローニングおよび発現
ＨＣＭＶ  ｇＢ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミド，ｐＳＤ５４２へのクローニング
ＨＣＭＶ  ＤＮＡのＨｉｎｄＤプラスミド４，８００ｂｐ  Ｈｉｎｄ−ＢａｍＨＩ断片をプラスミドｐＩＢＩ２４の２８００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングした。オリゴヌクレオチドＣＭＶＭ５（配列認識番号２６２）
【化１７９】
0003624911.tif 000212
【０７６１】
およびＣＭＶＭ３（配列認識番号２６３）
【化１８０】
0003624911.tif 000213
【０７６２】
を用いた生体外突然変異誘発（クンケル、1985；ラッセルら、1986）により、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇＢ遺伝子を改変して発現せしめた（テイラーら、1988ａ、ｂ；パーカスら、1989）。改変ｇＢを含有するプラスミドを２４ＣＭＶｇＢ（５＋３）と称した。
【０７６３】
２４ＣＭＶｇＢ（５＋３）の２９００ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＰ１３１の３１００ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングした。このクローニング工程により、ｇＢ遺伝子がＨ６プロモーターの制御下におかれた。産生したプラスミドをＳＰ１３１ｇＢと称した。
【０７６４】
ＳＰ１３１ｇＢ中のＨ６プロモートしたｇＢを側腹に有する制限部位を改変するために、以下の工程を行なった。プラスミドｐＭＰ２２ＢＨＰは、ＢａｍＨＩ部位でのポリリンカー領域にＨＢＶ  ｓＡｇの部分を含有するワクシニアのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｆ断片（ＷＲ菌株）のサブクローンを含有する。ｐＭＰ２２ＢＨＰをポリリンカー内でＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、ＳＰ１３１ＣＭＶｇＢからのＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子を含有する）に連結し、プラスミドＳＡｇ２２ＣＭＶｇＢを産生した。ＳＡｇ２２ＣＭＶｇＢをＢａｍＨＩで切断し、部分的にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの切断によりｐＩＢＩ２４から誘導したポリリンカーに連結し、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子を含有するがＨＢＶ  ｓＡｇを有さないプラスミド２２ＣＭＶｇＢを産生した。
【０７６５】
実施例７に記載したようにベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成することにより、プラスミドｐＳＤ４６０からプラスミドｐＳＤ５４２（ＮＹＶＡＣ  ＴＫ座供与体プラスミド）を誘導した（タータグリアら、1992）。ｐＳＤ５１３のポリリンカー領域を、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８８（配列認識番号２６４）
【化１８１】
0003624911.tif 000214
【０７６６】
およびＭＰＳＹＮ２８９（配列認識番号２６５）
【化１８２】
0003624911.tif 000215
【０７６７】
に連結することにより改変し、プラスミドｐＳＤ５４２を産生した。
【０７６８】
２２ＣＭＶｇＢを、ＢａｍＨＩとＮｓｉＩで切断してＨ６プロモーターおよびｇＢ遺伝子の一部を含有する断片を産生し、ＮｓｉＩとＰｓｔＩで切断してｇＢ遺伝子の残りを含有する断片を産生した。これら２つの断片を、ポリリンカー内のＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断したｐＳＤ５４２と連結し、ＮＹＶＡＣ供与体プラスミド５４２ＣＭＶｇＢを産生した。
【０７６９】
ＨＣＭＶ  ｇＢサイズのＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＣＰ３ＬＶＱＨ６へのクローニング
８．５ｋｂのカナリヤポックスＢｇｌＩＩ断片をｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターのＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＷＷ５を形成した。ヌクレオチド配列分析により、Ｃ３と称する読取り枠が示された。異種遺伝子を、Ｃ３読取り枠を完全切除したＣ３座に挿入するための供与体プラスミドを構築するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に関連した５′および３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、ＲＧ２７７（配列認識番号１７７）およびＲＧ２７８（配列認識番号１７８）であった。
【０７７０】
３′配列のプライマーは、ＲＧ２７９（配列認識番号１７９）およびＲＧ２８０（配列認識番号１８０）であった。ワクシニア転写および翻訳終止シグナルを側腹に有する多重クローニング部位を含有するようにプライマーを設計した。また、左側アームおよび右側アームの５′末端および３′末端に、２つのアームをＡｓｐ７１８／ＳａｃＩ切断したｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターに連結させる適切な制限部位（左側アームにはＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、右側アームにはＥｃｏＲＩとＳａｃＩ）を含んだ。産生したプラスミドをｐＣ３Ｉと称した。
【０７７１】
プラスミドｐＷＷ５のＮｓｉＩとＳｓｐＩの切断によりＣ３座から直接上流のカナリヤポックスの９０８ｂｐの断片を得た。テンプレートとしてのプラスミドｐＷＷ５およびオリゴヌクレオチドＣＰ１６（配列認識番号２６６）
【化１８３】
0003624911.tif 000216
【０７７２】
とＣＰ１７（配列認識番号２６７）
【化１８４】
0003624911.tif 000217
【０７７３】
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、1988）によりカナリヤポックスとＤＮＡの６０４ｂｐ断片を得た。６０４ｂｐの断片をＡｓｐ７１８とＸｈｏＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ１６とＣＰ１７の５′末端に存在する部位）で切断し、Ａｓｐ７１８−ＸｈｏＩで切断しアルカリ性ホスファターゼ処理したＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）にクローニングしてプラスミドＳＰＣ３ＬＡを産生した。ＳＰＣ３ＬＡを、ＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとカナリヤポックスＤＮＡ内のＮｓｉＩで切断し、９０８ｂｐのＮｓｉＩ−ＳｓｐＩ断片に連結し、Ｃ３座の上流の１４４４ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡを含有するＳＰＣＰＬＡＸを産生した。
【０７７４】
カナリヤポックスＤＮＡの２１７８ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＳｔｙＩ断片をプラスミドｐＸＸ４（ｐＢＳ−ＳＫのＰｓｔＩ部位にクローニングされたカナリヤポックスＤＮＡの６．５ｋｂ  ＮｓｉＩ断片を含有する）から単離した。テンプレートとしてのプラスミドｐＸＸ４およびオリゴヌクレオチドＣＰ１９（配列認識番号２６８）
【化１８５】
0003624911.tif 000218
【０７７５】
とＣＰ２０（配列認識番号２６９）
【化１８６】
0003624911.tif 000219
【０７７６】
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、1988）によりカナリヤポックスＤＮＡの２７９ｂｐ断片を単離した。２７９ｂｐ断片をＸｈｏＩとＳａｃＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ１９とＣＰ２０の５′末端に存在する部位）で切断し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩで切断しアルカリ性ホスファターゼ処理したＩＢＩ２５にクローニングして、プラスミドＳＰＣ３ＲＡを産生した。
【０７７７】
ポリリンカーに追加の特有の部位を加えるために、ｐＣ３Ｉをポリリンカー領域内のＥｃｏＲＩとＣｌａＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ１２（配列認識番号２７２）とＣＰ１３（配列認識番号２７３）（ＥｃｏＲＩ付着末端、ＸｈｏＩ部位、ＢａｍＨＩ部位およびＣｌａＩに一致する付着末端を含有する）に連結し、プラスミドＳＰＣＰ３Ｓを産生した。
【化１８７】
0003624911.tif 000220
【０７７８】
ＳＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３座の下流のカナリヤポックス配列内のＳｔｙＩとＳａｃＩ（ｐＢＳ−ＳＫ）で切断し、ＳＰＣ３ＲＡからの２６１ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片とｐＸＸ４からの２１７８ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＳｔｙＩ断片に連結し、Ｃ３座の下流の２５７２ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰＲＡＬを産生した。ＳＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３座の上流のカナリヤポックス配列内のＡｓｐ７１８（ｐＢＳ−ＳＫ内）とＡｃｃＩで切断し、ＳＰＣＰＬＡＸからの１４３６ｂｐ  Ａｓｐ７１８−ＡｃｃＩ断片に連結し、Ｃ３座の下流の１４５７ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰＬＡＬを産生した。ＣＰＬＡＬを、Ｃ３座の下流のカナリヤポックス配列内のＳｔｙＩとＳａｃＩ（ｐＢＳ−ＳＫ内）で切断し、ＣＰＲＡＬからの２４３８ｂｐ  ＳｔｙＩ−ＳａｃＩ断片に連結し、Ｃ３座の上流の１４５７ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡ、６つの読取り枠の終止コドン、初期転写終止シグナル、ポリリンカー領域、初期転写終止シグナル、６つの読取り枠の終止コドン、およびＣ３座の下流の２５７２ｂｐのカナリヤポックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰ３Ｌを産生した。産生したプラスミドをＳＰＣＰ３Ｌと称した。
【０７７９】
テンプレートとしてのｐＲＷ８３８およびオリゴヌクレオチドＣＰ２１（配列認識番号２７０）
【化１８８】
0003624911.tif 000221
【０７８０】
とＣＰ２２（配列認識番号２７１）
【化１８９】
0003624911.tif 000222
【０７８１】
を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、1988）により、初期／晩期Ｈ６ワクシニアウイルスプロモーター（グオら、1989；パーカスら、1989）を誘導した。ＰＣＲ産生物を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ２１とＣＰ２２の５′末端に存在する部位）で切断し、ポリリンカー内のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断されたＣＰ３Ｌに連結し、プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを産生した。ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを、ポリリンカー内のＸｈｏＩとＨ６プロモーター内のＮｒｕＩで切断し、Ｈ６プロモーターとｇＢ遺伝子を含有する２２ＣＭｇＢからのＮｒｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片並びにＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの切断によりｐＩＢＩ２４から誘導したポリリンカーに連結し、ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドＣＰ３ＬＣＭＶｇＢを産生した。
【実施例３３】
【０７８２】
組換えウイルス：サイトメガロウイルスの構築
ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）  ｇＢ遺伝子をＮＹＶＡＣのＴＫ部位に挿入した。組換えウイルスをｖＰ１００１と称した。ＣＭＶ  ｇＢ遺伝子をＡＬＶＡＣのＣ３座に挿入した。組換え体をｖＣＰ１３９と称した。
【実施例３４】
【０７８３】
組換えウイルス感染細胞中のＣＭＶ  ＧＢタンパク質の蛍光抗体法
モルモット多クローン性血清と続いてフルオレセインイソチオシアネートヒツジ抗モルモットを用いて、蛍光抗体法研究を前述したように行なった（テイラーら、1990）。ｖＰ１００１に感染した細胞は、形質膜上に発現されたｇＢを示した。ｖＣＰ１３９に感染した細胞内では弱い内側発現が検出された。
【実施例３５】
【０７８４】
組換え体感染細胞中にＣＭＶ  ＧＢの免疫沈降
前述したように免疫沈降実験を行なった（テイラーら、1990）。ＣＭＶ感染細胞中で産生されたＣＭＶ  ｇＢ糖タンパク質は、１３０ｋＤａの前駆体形状とともに５５ｋＤａの分子量を有する（グレッチら、1988）。ｖＰ１００１とｖＣＰ１３９に感染した細胞は、約１１６ｋＤａと約５５ｋＤａの２つのＣＭＶ  ｇＢコードタンパク質を産生する。
【実施例３６】
【０７８５】
中和抗体
ｖＰ１００１（ＮＹＶＡＣ−ＨＣＮＶ  ｇＢ）によるＣＢＡマウスの免疫の後で、接種したマウスの血清の中和抗体力価を評価した（ゴンクゾル、1986）。ヒトサイテメガロウイルスを中和できる抗体をマウスの血清中に、免疫後１４−２１日（１：１６の幾何学平均力価（ｇｍｔ））および２８と６０日の間（ｇｍｔ＝１：２６）で検出した。ＣＢＡマウスのＡＬＶＡＣ−ＨＣＭＶ  ｇＢによる免疫により、１：６４ｇｍｔ（１４−２１日のｐｉ、２１と２８日のｐｉでは１：９１ｇｍｔ）および２８と６０日の間のｐｉでは１：１１１のＨＣＭＶ中和抗体力価を示した。それゆえ、ＨＣＭＶ  ｇＢを発現するカナリヤポックスウイルス組換え体またはワクシニアウイルスでのマウスの免疫は、ＨＣＭＶの感染性を中和できる抗体を誘発した。
【実施例３７】
【０７８６】
細胞性免疫
ＨＣＭＶ中和抗体力価以外にも、ｖＣＰ１３９はまた、ＨＣＭＶ  ｇＢを発現する組換えワクシニアウイルス（ワクシニアＷＲ−ｇＢ）に感染したマウスＬ９２９細胞を殺すことのできる細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発できる。ＣＢＡマウスに、２．５×１０8 ｐｆｕのｖＣＰ１３９を腹腔内により免疫した。１６から３０日後、マウスの脾臓細胞の懸濁液を２：１の比率でｖＰ１００１に事前に感染せしめた同系脾臓細胞とともにコインキュベーションすることにより生体外で再刺激した。５日後、脾臓細胞を数え、51Ｃｒ−放出アッセイ（ジンカーナゲルら、1984）を用いて、未感染Ｌ９２９細胞またはアデノウイルスＡｄ５ｄｌＥ３、ＨＣＭＶ  ｇＢを発現する組換えアデノウルイス（Ａｄ−ｇＢ）、ワクシニアウイルス、およびＨＣＭＶ  ｇＢを発現する組換えワクシニアウイルスに感染したＬ９２９細胞に対する細胞傷害性を評価した。未感染標的並びにＡｄ５ｄｌＥ３に感染した標的に対して、反応性のバックグラウンド水準のみが測定された。これに反して、生体外刺激脾臓細胞は、ＨＣＭＶ  ｇＢを発現するＡｄ−ｇＢに感染したＬ９２９細胞を容易に殺した。ワクシニアウイルスベクターに感染した標的に対して溶菌がある程度観察されたが、ｇＢを発現する組換えワクシニアウイルスに感染した標的に対してはより高い細胞溶解が測定された。これにより、ＨＣＭＶ  ｇＢ内に位置するエピトープに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球は、ＨＣＭＶ  ｇＢを発現する組換えカナリヤポックスウイルス（ｖＣＰ１３９）の接種により産生されることが明確に示された。
【実施例３８】
【０７８７】
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ供与体プラスミド構築：イヌパルボウイルス
イヌパルボウイルスＶＰ２カプシド遺伝子を発現するポックスウイルス組換え体を産生するために、ＶＰ２遺伝子がＣＰＶ−ｄ単離体のゲノム（ＣＰＶ−２抗原型）から増幅され、ワクシニアＨ６プロモーターに結合せしめられ（パーカスら、1989）、ＮＹＶＡＣまはＡＬＶＡＣ挿入ベクターに挿入された供与体プラスミドを構築した。ＮＹＶＡＣ挿入部位はｄｅｏｒｆｅｄＡＴＩ座であり、ＡＬＶＡＣ挿入部位はｄｅｏｒｆｅｄＣ３座である。
【０７８８】
ＶＰ２遺伝子配列は、プラスミドｐＢＩ２６５（１）からＰＣＲにより得た。ＮＹ、イタカ、コーネル大学、ジェームズＡ．ベーカー研究所、Ｄｒ．コリンＲ．パリッシュ、から得たこのプラスミドは、ＣＰＶ−ｄ単離体のゲノムを含有する（コーネル790320）（抗原型ＣＰＶ−２）。この単離体からのＶＰ２遺伝子のＤＮＡ配列は公表されている（パリッシュら、1988）。
【０７８９】
テンプレートとしてのｐＢＩ２６５（１）およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドＲＧ４５１（配列認識番号２７４）
【化１９０】
0003624911.tif 000223
【０７９０】
とＲＧ４５２（配列認識番号２７５）
【化１９１】
0003624911.tif 000224
【０７９１】
を用いて、ＰＣＲにより完全ＶＰ２読取り枠（ＯＲＦ）を増幅した。精製したＤＮＡ断片をＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋中のＡｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｐＤＴ４を産生した。ＤＮＡ配列分析によりＶＰ２遺伝子を確認した。
【０７９２】
ＶＰ２遺伝子は、初期転写終止シグナルとして機能できるＯＲＦ内に２つのＴＴＴＴＴＮＴ配列を含有する（ユエンら、1987）。これらのシグナルを除去するために、ＰＣＲ部位定方向突然変異誘発を用いて、正確なアミノ酸配列を保持しながら、ヌクレオチド配列を改変した。合成オリゴヌクレオチドＲＧ４５３（配列認識番号２７６）
【化１９２】
0003624911.tif 000225
【０７９３】
およびＲＧ４５４（配列認識番号２７７）
【化１９３】
0003624911.tif 000226
【０７９４】
を用いてｐＢＩ２６５（１）から２５０ｂｐの断片を増幅せしめた。精製した断片をＢｇｌＩＩとＡｃｃＩで切断し、ＢｇｌＩＩ／ＡｃｃＩ  ＶＰ２断片をｐＤＴ４に配するのに用いた。産生したプラスミドｐＥＤ３は、ＴＴＴＴＴＮＴ配列がＴＴＴＣＴＡＴおよびＴＴＣＴＴＣＴに改変された改変ＶＰ２遺伝子を含有した。
【０７９５】
ｐＭＰＡＴＩＨ６ＨＳＶＴＫは、Ｈ６プロモーターの制御下でＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子のコード配列を含有する発現カセットがポリリンカー領域のＨｐａＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入されたｐＳＤ５５２（この明細書の別の箇所に記載されている）の誘導体である。このプラスミドをＮｒｕＩとＸｈｏＩ部位で切断してｔｋ遺伝子を切除するがＨ６プロモーターの５′末端を保持する。上述したこのベクターへの改変ＶＰ２遺伝子の挿入によりｐＡＴＩ−ＶＰ２が産生される。このＮＹＶＡＣ供与体プラスミドは、ＡＴＩ挿入アームを側腹に有するＨ６プロモートしたＶＰ２遺伝子である。
【０７９６】
ＣＰＶ  ＶＰ２カプシド遺伝子を含有するＡＬＶＡＣ供与体プラスミドを以下のように構築した。改変ＶＰ２遺伝子をＮｒｕＩとＸｈｏＩによりｐＥＤ３から切除し、精製したプラスミドをＮｒｕＩとＸｈｏＩで切断したｐＶＱＨ６ＣＰ３Ｌ（フラビウイルスのセクションに記載されたプラスミド）にクローニングした。産生したプラスミド、ｐＣ３−ＶＰ２は、Ｃ３挿入アームを側腹に有するＨ６プロモートしたＶＰ２遺伝子を含有する。
【実施例３９】
【０７９７】
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換え体：イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の構築
供与体プラスミドｐＡＴＩ−ＶＰ２を、治療ウイルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９９８とｖＰ９９９を産生した（タータグリアら、1992）。放射線標識したＶＰ２特異的ＤＮＡプローブを用いて現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、1987）により組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。
【０７９８】
供与体プラスミドｐＣ３−ＶＰ２を、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５Ａ）をＣＥＦ細胞において生体外組換え実験に用いて、それぞれｖＣＰ１２３とｖＣＰ１３６を産生した。放射線標識したＶＰ２特異的プローブ（陽性信号）とＣ３  ＯＲＦ特異的プローブ（陰性信号）を用いた現場でのハイブリダイゼーション方法により組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。
【実施例４０】
【０７９９】
ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのＣＰＶ  ＶＰ２組換え体の発現分析
多クローン性ＣＰＶイヌ血清またはＶＰ２エピトープに特異的な単クローン性抗体を用いる前述したような蛍光抗体法（テイラーら、1990）により、ＣＰＶ  ＶＰ２遺伝子を含有する全ての組換え体を発現に関して試験した。全ての血清は、ＮＹ、イサカ、コーネル大学、ジェームズＡ．ベーカー研究所、Ｄｒ．コリンＲ．パリッシュから得た。ＮＹＶＡＣベースの組換え体をベロ細胞において試験し、一方ＡＬＶＡＣベースの組換え体はＣＥＦ細胞において試験した。組換え体ｖＰ９９８、ｖＰ９９９、ｖＣＰ１２３、およびｖＣＰ１３６は全て、核内に局在した内部蛍光を示した。表面には蛍光は検出されなかった。加えて、狂犬病Ｇ遺伝子を含有する２つの組換え体（ｖＰ９９９およびｃＣＰ１３６）は、狂犬病Ｇエピトープに特異的な単クローン性抗体でスクリーニングした。両者とも細胞の表面に強い蛍光を示した。
【０８００】
上述した組換え体中の真正ＶＰ２遺伝子産生物の発現をさらに特徴付けるために、同一の抗血清を用いて免疫沈降を行なった（テイラーら、1990）。ＮＹＡＶＣベースの組換え体をベロ細胞において試験し、一方ＡＬＶＡＣベースの組換え体はＣＥＦ細胞において試験した。全ての組換え体（ｖＰ９９８、ｖＰ９９９、ｖＣＰ１２３、およびｖＣＰ１３６）において、抗血清は６５ｋＤａのタンパク質を沈殿せしめ、これは天然ＶＰ２遺伝子のサイズと一致する。このサイズのタンパク質は、細胞溶解産物またはいずれの親ウイルス（ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ）からは検出されなかった。
【実施例４１】
【０８０１】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入
供与体プラスミドＥＢＶトリプル２の構築
プラスミドＥＢＶトリプル（Ｔｒｉｐｌｅ）１（実施例１１）は、全てワクシニアＴＫ座挿入プラスミドに挿入されたＥＢＶ遺伝子ｇＨ、ｇＢおよびｇｐ３４０の発現カセットを含有する。プラスミドＥＢＶトリプル１をＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断し、４２ｋＤａ昆虫ポックスウイルスプロモーターとＥＢＶ  ｇＨ遺伝子の５′末端を含有する０．３ｋｂ断片を単離した。またＥＢＶトリプルプラスミドをＢａｍＨＩで切断し、ＥＢＶ  ｇＨ遺伝子の３′末端、ＥＢＶ  ｇＢ発現カセット、およびＥＢＶ  ｇｐ３４０発現カセットを含有する７．３ｋｂの断片を単離した。次いでこれら２つの断片を、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断したＡＬＶＡＣ  Ｃ４座挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７（テタナスの実施例参照）に連結した。産生したプラスミドをＥＢＶトリプル２と称した。
【０８０２】
ＥＢＶ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入
Ｃ５挿入座に、３つのＥＢＶ遺伝子、ｇＨ、ｇＢおよびｇｐ３４０の発現カセットを含有するプラスミドＥＢＶトリプル２をＡＬＶＡＣによる組換えの供与体プラスミドとして用いてＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６７を産生した。
【０８０３】
ｖＰ９４４およびｖＣＰ１５７によるＥＢＶタンパク質の発現
ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６７とｖＰ９４４、同一の３つの遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体（実施例１１）に感染した細胞からの代謝標識した溶解産物に、ＥＢＶに対してはヒト多クローン性血清、並びにＥＢＶ  ｇＢとｇｐ３４０に対してはマウス単クローン性抗体を用いた免疫沈降を行なった。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラフィーにより沈殿物を分析した。ＮＹＶＡＣベースの組換え体ｖＰ９４４およびＡＬＶＡＣベースの組換え体ｖＣＰ１６７について、正確な分子量のタンパク質とＥＢＶ  ｇＢ、ｇＨおよびｇｐ３４０の特異性を観察した。
【実施例４２】
【０８０４】
ウマインフルエンザＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）のＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣへの挿入のための発現カセットの構築
産生したＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）ゲノムＲＮＡをローンメリクス（フランス、リヨン）から得た。ガブラーとホフマンにより記載されたように（1983）、ＥＩＶ−特異的ｃＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）
【化１９４】
0003624911.tif 000227
【０８０５】
を用いて第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。このオリゴヌクレオチド（配列認識番号２７８）は、各ゲノムＲＮＡ断片の３′末端に相補的である。ガブラーとホフマン（1983）によると、ｃＤＮＡはｄＧテイルされ（ｔａｉｌｅｄ）、ＥｃｏＲＶで切断されたｐＭＧ５に挿入され、ｄＣテイルされる。この方法によるｃＤＮＡのｐＭＧ５への挿入により、両方のプラスミド／ｃＤＮＡ配列縁にＢａｍＨＩ部位が産生される。
【０８０６】
このＥＩＶ  ｃＤＮＡライブラリーからの５００のコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ−アガープレートに二通りに運搬した。コロニーを放射線標識したＥＩＶ  ＨＡ特異的プローブとともにハイブリダイゼーションのためにニトロセルロースに運搬した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）により合成した放射線標識した第１の鎖ｃＤＮＡおよびテンプレートとしての精製ＨＡゲノムＲＮＡを用いてこのプローブを誘導した。ＨＡゲノム断片を１．２％の低融点アガロースゲル（ＭＤ、ゲイサルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ）から精製した。このゲルシステムにおいて１×のＴＢＥの２ボルト／ｃｍで展開して合計ゲノムＲＮＡを分画した。ＨＡ帯を切除し、アガロースを７５℃で融合し、続いて２回のフェノール抽出と１回のエーテル抽出とＥＴＯＨ沈殿によりＨＡ  ＲＮＡを収集した。
【０８０７】
標準方法（マニアチスら、1991）にしたがってコロニーハイブリダイゼーションを行ない、１．４ｋｂ  ＨＡ  ｃＤＮＡ挿入物を含有するｃＤＮＡクローンを同定した。そのクローンは、ゲノムＲＮＡに対するノーザンブロット分析とヌクレオチド配列分析により、ＨＡ特異的であることが分かった。この１．４ｋｂの断片を用いて、続いてのｃＤＮＡライブラリースクリーニングのための放射線標識したＨＡ特異的ＤＮＡプローブを産生した。
【０８０８】
このプローブを用いて、他のＨＡ特異的ｃＤＮＡクローンを同定した。最大のものは、１．０ｋｂ、１．２ｋｂ、および１．４ｋｂであり、それぞれ、ｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−１、−１０、および−８と称した。集団的に、これらのコロニーは、ヌクレオチド配列分析により決定される全縁ＥＩＶ  ＨＡコード配列を含有する。これらの分析により決定されたＥＩＶ  ＨＡの全縁配列（Ａ１／プラハ／５６）を第２３図に示す（配列認識番号２７９）。
【０８０９】
次に、異なるｃＤＮＡクローンからの断片をスプライシングすることによりＥＩＶ  ＨＡの全長のｃＤＮＡクローンを産生した。ＨＡコード配列の５′側の１２００ｂｐを、テンプレートとしてのこのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）とＥＩＶＡＩＰ７Ａ（配列認識番号２８０）
【化１９５】
0003624911.tif 000228
【０８１０】
を用いたＰＣＲによりｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−８から誘導した。この１２００ｂｐの断片をＰｓｔＩで切断し、５′と３′の両末端にＰｓｔＩ付着末端を産生した。ＨＡコード配列の３′側の６００ｂｐを、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩでの切断によりｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−１０から誘導した。これら２つの断片を、ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。全縁ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）コード配列を含有する産生したプラスミドをｐＢＳＥＩＶＡＩＰＨＡと称した。
【０８１１】
オリゴヌクレオチドＥＩＶＡＩＰＨＡ５Ｐ（配列認識番号２８１）
【化１９６】
0003624911.tif 000229
【０８１２】
およびＥＩＶＡＩＰＨＡ３Ｐ（配列認識番号２８２）
【化１９７】
0003624911.tif 000230
【０８１３】
を用いて、ｐＢＳＥＩＶＡＩＰＨＡからＰＣＲによりＥＩＶ  ＨＡコード配列（ＡＴＧからＴＡＡ）を誘導した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＡＩＰＨＡ５Ｐ（配列認識番号２８１）は、枠ウイルスＨ６プロモーター（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）の３′側２６ｂｐ（ＮｒｕＩ部位）を提供した。１．７ｋｂのＰＣＲ誘導断片をＮｒｕＩ切断ｐＣＰＣＶ１に挿入し、ｐＣ３ＥＩＶＡＩＰＨＡを産生した。ｐＣＰＣＶ１は、Ｈ６プロモーターを含有する挿入ベクターである。適切な方向で１．７ｋｂのブラントエンドした断片を挿入することにより、Ｈ６プロモーターに対してＥＩＶ  ＨＡ３′を配した。プラスミドｐＣＰＣＶ１を以下のようにして誘導した。ｐＴＰ１５（グオら、1989）のＰｓｔＩ部位にＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子（ギルホットら、1987）を含有する２．４ｋｂの断片を含有するプラスミドｐＦｅＬＶ１ＡをＰｓｔＩで切断して、ＦｅＬＶ配列を切除し、再結合せしめてプラスミドｐＦｅＬＶＦを産生した。ポリリンカー領域の次のワクシニアウイルスＨ６プロモーター要素は、ＫｐｎＩとＨｐａＩの切断によりｐＦｅＬＶＦ４から離生した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５０ｂｐの断片をブラントエンドし、カナリヤポックスＤＮＡの３．３ｋｂ  ＰｖｕＩＩゲノム断片を含有するプラスミド、ｐＲＷ７６４．２に挿入した。ｐＲＷ７６４．２を、カナリヤポックス配列内の特有のＥｃｏＲＩ部位を認識するＥｃｏＲＩで線状化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。産生したプラスミドをｐＣＰＣＶ１と称した。このプラスミドは、ポリリンカー領域が続き、カナヤポックスウイルス相同配列を側腹に有するワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する。
【実施例４３】
【０８１４】
ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ２／フォンテインブルー（ＦＯＮＴＡＩＮＥＢＬＥＡＵ）／７９）をＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣに挿入するための発現カセットの構築
精製ＥＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ゲノムＲＮＡをローンメリクス（フランス、リヨン）から得た。ガブラーとホフマン（1983）により記載され、ＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）ｃＤＮＡ調製に記載されたように、ＥＩＶ特異的ｃＤＮＡを調製した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成には、オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）を用いた。
【０８１５】
ＨＡ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを含有する細菌コロニーをスクリーニングするために、転換したコロニーの８つのプールを５００ｍｌの培養中で増幅し、標準方法により（サムブルックら、1989）プラスミドＤＮＡ標品を得た。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）およびＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２８３）
【化１９８】
0003624911.tif 000231
【０８１６】
による標準ＰＣＲ反応において全プラスミドＤＮＡをテンプレートとして用いた。これらのプライマーはこれらの８つの断片の５′および３′末端での保存した（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）配列に相補的であったので、そのような反応は、潜在的に８つのＥＩＶゲノム断片の全長ｃＤＮＡ配列のみを増幅する。
【０８１７】
テンプレートとしてのプラスミド標品、ｐＰＥＩＶＡ２Ｆ−０５は、全長ＨＡ特異的断片のサイズと一致する１．８ｋｂのＰＣＲ誘導断片を産生した。このＰＣＲ誘導断片を、ｃＤＮＡライブラリーの残りに対するプローブとしての使用のために、ＰＣＲにより再度増幅した。このプローブを用いて、クローンｐＥＩＶＡ２ＦＨＡ−７および−８を同定し、注文合成したオリゴヌクレオチド（ゲーベルら、1990ａ）を用いたヌクレオチド配列分析によりｃＤＮＡ挿入物を分析した。
【０８１８】
ヌクレオチド配列分析により、クローン＃７および＃８は、ＥＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ＨＡコード配列（第２４図）（配列認識番号２８４）の３′側１２００ｂｐを表すことが分かった。
【０８１９】
オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ（配列認識番号２８５）
【化１９９】
0003624911.tif 000232
【０８２０】
およびＡ２ＦＢＡＭ２（配列認識番号２８６）
【化２００】
0003624911.tif 000233
【０８２１】
を用いたＰＣＲにより、１２００ｂｐ  ＥＩＶ（配列認識番号をクローン＃７から増幅した。ＢａｍＨＩによる切断後のこの１２００ｂｐの断片の５′末端は、第２４図の完全ＥＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ＨＡコード配列（配列認識番号２８４）のヌクレオチド６１７に対応する。またこの断片を、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ（配列認識番号２８５）を用いてコード配列に対して操作した３′であるＳｐｅＩで切断した。この１２００ｂｐ断片を、５′側６１６ｂｐを含有する断片（以下に定義する）とともにＳｍａＩ／ＳｐｅＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）にともに挿入した。しかしながら、潜在的な転換体のスクリーニングは、１２００ｂｐの断片が挿入されたことのみを示した。ヌクレオチド配列分析のために多くのクローンを選択した。
【０８２２】
多くのクローンのヌクレオチド配列分析後、さらなる操作のために、ｐＢＳＥＩＶＡ２ＦＨＡ−１９を選択した。このクローンは、ヌクレオチド６１７（第２４図）（配列認識番号２８４）およびヌクレオチド１５７０（第２４図）（配列認識番号２８４）でのＢａｍＨＩ部位の近くにエラーを含有する。これらのエラーを訂正するために、以下の操作を行なった。プラスミドｐＢＳＥＩＶＡ２ＦＨＡ−１９をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、切除した９００ｂｐの断片を単離した。この断片を、ＨＡコード配列の３′側領域を包含する２５０ｂｐ  ＳｐｈＩ／ＳｐｅＩ断片とともにＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにともに挿入した。テンプレートとしてのクローン＃７（上記）およびオリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ（配列認識番号２８５）とＡ２Ｆ６（配列認識番号２８７）
【化２０１】
0003624911.tif 000234
【０８２３】
を用いて、この２５０ｂｐ  ＰＣＲ断片を誘導した。産生したプラスミドをｐＥＩＶＨ３３Ｐと称する。
【０８２４】
ＥＩＶ  ＨＡのＨＡコード配列の５′側６１６ｂｐを以下の方法により産生した。最初に、第１の鎖ｃＤＮＡを上述したように産生した。次いでこの第１の鎖ｃＤＮＡ標品をテンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ５Ｐ（配列認識番号２８８）
【化２０２】
0003624911.tif 000235
【０８２５】
とＡ２ＦＢＡＭ１（配列認識番号２８９）
【化２０３】
0003624911.tif 000236
【０８２６】
を用いたＰＣＲによりこれらの配列を増幅した。この断片をＨｉｎｃＩＩ切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、シスラタジェネ）に挿入し、産生したプラスミドをｐＥＩＶＨ３５Ｐと称した。
【０８２７】
ワクシニアウイルスＨ６プロモーター配列（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）およびＨＡコード配列の５′側領域を、以下のように増幅し、融合せしめた。ｐＢＳＨ６ＩＩＩＢＥと称するＨ６プロモーターに正確に連結したＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ遺伝子を含有するｐＢＳベースのプラスミドからＨ６配列を誘導した。これらの配列を、オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化２０４】
0003624911.tif 000237
【０８２８】
およびＨ６３Ｐ（配列認識番号２９１）
【化２０５】
0003624911.tif 000238
【０８２９】
を用いたＰＣＲにより増幅した。オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）およびＥＩＶ５ＰＡＣＣ（配列認識番号２９２）
【化２０６】
0003624911.tif 000239
【０８３０】
とともに１２０ｂｐのＨ６断片をテンプレートとして用い、Ｈ６プロモーターおよびＨＡコード配列の最初の４１ｂｐからＡｃｃＩ制限部位を含有する１６１ｂｐ断片を産生した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩとＡｃｃＩで切断し、ｐＥＩＶＨ３５Ｐからの５５０ｂｐ  ＡｃｃＩ／ＢａｍＨＩ断片とともにＨｉｎｄ／ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにともに挿入した。産生したプラスミドをｐＨ６ＥＩＶＨ３５Ｐと称した。
【０８３１】
ｐＨ６ＥＩＶＨ３５Ｐからの７１０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片およびｐＥＩＶＨ３３Ｐからの１２００ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ断片をＨｉｎｄとＳｐｅＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにともに挿入することにより、全縁ＨＡ発現カセットを誘導した。誘導プラスミドをｐＢＳＡ２ＦＨＡＢと称した。
【０８３２】
ヌクレオチド位置６１７でのＢａｍＨＩ部位の近くの上述した塩基変化を訂正するために、マンデッキ方法（マンデッキ、1986）を用いた。ｐＢＳＡ２ＦＨＡＢをＢａｍＨＩで線状化し、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ７（配列認識番号２９３）
【化２０７】
0003624911.tif 000240
【０８３３】
を用いて突然変異誘発方法を行なった。ＨＡの訂正変形を含有するプラスミドをｐＢＳＡ２ＦＨＡと称した。
【実施例４４】
【０８３４】
それぞれｖＣＰ１２８およびｖＰ９６１を産生するのに使用する挿入プラスミドｐＥＩＶＣ５ＬおよびｐＥＩＶＨＡＶＱＶＶの構築
プラスミドｐＣ３ＥＩＶＡＩＰＨＡをＮｒｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｈ６プロモーターの３′側２６ｂｐおよび全縁ＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）ＨＡコード配列を含有する１．７ｋｂの断片を切除した。クレノウによるブラントエンドの後に、この断片を、ＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩで切断しクレノウでブラントエンドしたプラスミドｐＲＷ８３８に挿入してプラスミドｐＣ５ＡＩＰＨＡを産生した。プラスミドｐＲＷ８３８は、カナリヤポックス挿入プラスミド（Ｃ５座）中のワクシニアＨ６プロモーターに融合された狂犬病Ｇ遺伝子（キエニーら、1984）を含有する。ＮｒｕＩとＥｃｏＲＩによる切断により、Ｈ６プロモーターの５′側１００ｂｐとＣ５フランキングアームを残して狂犬病Ｇ遺伝子を切除した。
【０８３５】
プラスミドｐＣ５ＡＩＰＨＡをＳｍａＩとＳａｃＩで切断し、Ｈ６プロモーターとＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）コード配列の５′側６４５ｂｐを含有する８２０ｂｐ断片を切除した。この断片を、ＨＡコード配列の残りを含有するｐＣ３ＥＩＶＡＩＰＨＡらの１．１ｋｂ  ＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＡＩＰＨＡＶＱと称した。
【０８３６】
次いでプラスミドｐＢＳＡＩＰＨＡＶＱを、ＳｐｅＩとＳｍａＩで線状化した。この４．７ｋｂの断片をｐＢＳＡ２ＦＨＡから誘導した１．８ｋｂ  ＳｐｅＩ／部分的ＨｉｎｃＩＩ断片に連結した。ＥＩＶ（Ａ１／プラハ／５６）および（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ＨＡ遺伝子を頭対頭の配置で含有する、産生したｐＢＳベースのプラスミドを、ｐＢＳＡＩＰＡ２ＦＨＡＱと称した。
【０８３７】
２つのＨＡ遺伝子を含有するｐＢＳＡＩＰ２ＦＨＡＶＱから誘導したＮｏｒＩ／ＸｈｏＩ断片（３．５ｋｂ）を単離し、ｐＳＤ５４２（ＥＩＶ（Ａ２／サフォーク／８９）に関して以下に記載する）とｐＣ５Ｌに挿入し、それぞれ挿入プラスミドｐＥＩＶＨＡＶＱＶＶおよびｐＥＩＶＣ５Ｌを産生した。
【０８３８】
Ｃ５Ｌ挿入プラスミドは以下のように誘導した。コスミドベクターｐＶＫ１０２（ノフおよびネスター、1982）を用いて、ｖＣＰ６５のゲノムライブラリー（Ｃ５座に狂犬病を有するＡＬＶＡＣベースの狂犬病Ｇ組換え体）を構築した。このライブラリーに、ｐＲＷ７６４．５（Ｃ５座）内に含有される０．９ｋｂのＰｖｕＩＩカナリヤポックスウイルスゲノム断片をプローブした。これらのカナリヤポックスＤＮＡ配列は、起点挿入座を含有している。２８ｋｂの挿入物を含有するクローンが増殖せしめられ、ｐＨＣＯＳ１と称した。Ｃ５配列を含有するこのコスミドから３．３ｋｂのＣｌａ断片をサブクローンした。このＣｌａＩ断片らの配列分析を用いて、１−１３７２のＣ５座の遺伝子地図を延長した。
【０８３９】
Ｃ５挿入ベクター、ｐＣ５Ｌを、２段階で構築した。オリゴヌクレオチドＣ５Ａ（配列認識番号２９４）
【化２０８】
0003624911.tif 000241
【０８４０】
およびＣ５Ｂ（配列認識番号２９５）
【化２０９】
0003624911.tif 000242
【０８４１】
を用いたＰＣＲ増幅により、１５３５ｂｐの左側アームを産生した。テンプレートＤＮＡはｖＣＰ６５ゲノムＤＮＡであった。この断片をＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ切断ｐＵＣ８にクローニングした。標準塩基配列決定プロトコルにより配列を確認した。オリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（配列認識番号２９６）
【化２１０】
0003624911.tif 000243
【０８４２】
およびＣ５ＤＡ（配列認識番号２９７）
【化２１１】
0003624911.tif 000244
【０８４３】
を用いたＰＣＲ増幅により、４０４ｂｐの右側アームを産生した。次いでこの断片を、以前に産生し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩで切断した左側アームを含有するベクターにクローニングした。全縁構成を、標準配列分析により確認し、ｐＣ５Ｌと称した。この挿入プラスミドは異種遺伝子のＣ５座への挿入を可能にする。
【実施例４５】
【０８４４】
インフルエンザウイルス（Ａ２／サフォーク／８９）血球凝集素遺伝子を発現するＡＬＶＡＣ−およびＮＹＶＡＣベースの組換え体を産生する挿入プラスミドの構築
ウマインフルエンザウイルス（Ａ２／サフォーク／８９）からの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を過含有するＭ１３クローンをＤｒ．Ｍ．ビンス（イギリス、ＣＢ８  ７ＤＷ、サフォーク、ニューマーケット、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ５、アニマルヘルストラスト）から得た。このクローンは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位によりＭ１３ベクターに挿入されたこのＨＡＳ遺伝子を含有する全長１．７ｋｂ  ｃＤＮＡ断片を含有する。
【０８４５】
最初に、オリゴヌクレオチドＥＩＶＳ１（配列認識番号２９８）
【化２１２】
0003624911.tif 000245
【０８４６】
およびＥＩＶＳ２（配列認識番号２９９）
【化２１３】
0003624911.tif 000246
【０８４７】
を用いたＰＣＲにより上述したＭ１３クローンからウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ）ＨＡ遺伝子を増幅した。この１．７ｋｂの断片を、ＳｍａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。２つの陽性クローンを誘導し、ヌクレオチド配列分析により分析した（ゲーベルら、1990ａ）。クローンＡは１つの非保存塩基変化を含有し、一方クローンＢは、第２５図に示した配列と比較した３つの変化を含有した（配列認識番号３００）。ＥＩＶＨＡ遺伝子の全長訂正変形を産生するために、クローンＢをＳａｃＩとＭｓｃＩで切断し、３９０ｂｐの断片を切除した。この断片をクローンＡから誘導した４．３ｋｂのＭｓｃＩ／部分的ＳａｃＩ断片に連結した。これにより訂正されたＥＩＶＨＡが得られ、ｐＢＳＥＩＶＨＳと称した。
【０８４８】
ＥＩＶＨＡコード配列の５′側３６０ｂｐを、オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５ＥＩＶ（配列認識番号３０１）
【化２１４】
0003624911.tif 000247
【０８４９】
およびＥＩＶＰＶＵ（配列認識番号３０２）
【化２１５】
0003624911.tif 000248
【０８５０】
を用いたＰＣＲにより、ｐＢＳＥＩＶＨＳから誘導した。オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５Ｂ５（配列認識番号３０３）
【化２１６】
0003624911.tif 000249
【０８５１】
およびＥＩＶ５Ｉ３Ｌ（配列認識番号３０４）
【化２１７】
0003624911.tif 000250
【０８５２】
を用いたＰＣＲにより全縁Ｉ３Ｌプロモーター領域（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）をｐＭＰＩ３Ｌ１０１から誘導した。オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５Ｂ５（配列認識番号３０３）およびＥＩＶＰＶＵ（配列認識番号３０２）によるＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドＩ３Ｌ５ＥＩＶ（配列認識番号３０１）およびＥＩＶ５Ｉ３Ｌ（配列認識番号３０４）による操作により協議された相補にしたがってこれらの断片を融合し、４８０ｂｐの断片を産生した。
【０８５３】
プラスミドｐＭＰＩ３Ｌ１０１は、Ｉ３Ｌプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質をコードする遺伝子からなる発現カセットを含有し、全てはＯＲＦ  Ｃ６Ｌ−Ｋ１Ｌが欠損したワクシニア挿入プラスミドに挿入された（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）。Ｉ３Ｌプロモーターは、ＯＲＦ  Ｉ３Ｌの開始コドンから直ちに上流の１０１塩基（ｎｔ  ６４，９７３−６５，０７４  ゲーベルら、1990ａ、ｂ）からなる。
【０８５４】
Ｉ３ＬプロモーターをＥＩＶＨＡコード配列の５′領域に正確に連結せしめる上述のように誘導した融合断片をＢａｍＨＩ（５′末端）とＡｃｃＩ（３′末端）で切断し、４００ｂｐの断片を単離した。この断片をｐＢＳＥＩＶＨＳから誘導した４．６ｋｂのＢａｍＨＩ／部分的ＡｃｃＩ断片に連結し、産生したプラスミドをｐＢＳＥＩＶＨＳＩ３Ｌと称した。
【０８５５】
ＥＩＶＨＡ発現カセットを含有する１．８ｋｂ  ＳｍａＩ／ＸｈｏＩ断片をｐＢＳＥＩＶＨＳＩ３Ｌから誘導した。この断片をＳｍａＩ／ＸｈｏＩ切断ｐＳＤ５４２（実施例３２に記載した）挿入ベクターに挿入し、ｐＴＫＥＩＶＨＳＩ３Ｌを産生した。
【０８５６】
ｐＢＳＥＩＶＨＥＩ３Ｌ（上記）からの１．８ｋｂ  ＳｍａＩ／ＸｈｏＩ断片を、ＳｍａＩ／ＸｈｏＩで切断した、ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）挿入プラスミド、ＶＱＣＰ３Ｌに挿入した。産生したプラスミドをｐＣ３ＥＩＶＨＳＩ３Ｌと称した。
【０８５７】
挿入プラスミドＶＱＣＰ３Ｌを以下のように誘導した。ＸｍａＩによる切断と、線状化したプラスミドのホスファターゼ処理と、アニールし、キナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＰ２３（配列認識番号３０５）
【化２１８】
0003624911.tif 000251
【０８５８】
およびＣＰ２４（配列認識番号３０６）
【化２１９】
0003624911.tif 000252
【０８５９】
に連結することにより、ＶＱＣＰＣＰ３ＬをｐＳＰＣＰ３Ｌから誘導した。
【実施例４６】
【０８６０】
ＡＬＶＡＣウマインフルエンザウイルス組換え体の発生
プラスミドｐＥＩＶＣ５Ｌは、ウマ−１、Ａ１／プラハ／５６（Ｈ７）およびウマ−２、Ａ２／フォンテインブルー／７９（Ｈ３）の血球凝集素コード配列を含有する。両方の遺伝子をワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結し、ｄｅ−ｏｒｆｅｄ  Ｃ５座に挿入する。ＡＬＶＡＣウイルスは、生体外組換えにおいて治療ウイルスとして用い、挿入されたＤＮＡを治療した。Ｈ７およびＨ３コード配列に対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択した。両方の異種遺伝子を含有する純粋な個体群が得られるまで、組換え体プラークにプラーク精製した。この時点で組換え体はｖＣＰ１２８と判明し、株ウイルスを設立した。ウマからの多クローン性抗Ｈ７血清およびＨ３血球凝集素に特異的な単クローン性抗体を用いて、蛍光抗体法を行なった。両方の試薬を用いてｖＣＰ１２８感染ベロ細胞に表面蛍光が検出され、両方の抗原が感染細胞表面に適切に存在することが示された。
【０８６１】
Ｈ３特異的単クローン性抗体を用いた免疫沈降分析により、ｖＣＰ１２８感染ＣＥＦ細胞中に約７５ｋｄのタンパク質の存在が示された。これは潜在的にＨＡ前駆体糖タンパク質を表すものである。切断産生物は検出されなかった。Ｈ７特異的多クローン性血清を用いた免疫沈降分析により、約７５ｋｄの前駆体糖タンパク質の存在が示された。それぞれ約４５および３０ｋｄの分子量を有するＨＡ1 およびＨＡ2 切断産生物もまた視覚化された。
【０８６２】
プラスミドｐＣ３ＥＩＶＨＳ１３Ｌは、ウマ−２  Ａ２／サフォーク／８９亜型の血球凝集素コード配列を含有する。遺伝子は、ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターに連結され、ｄｅ−ｏｒｆｅｄＣ３挿入部位に挿入される。生体外組換えにおいて、ＡＬＶＡＣウイルスは治療ウイルスとして用いられ、異種遺伝子を治療する。Ｈ３特異的放射線標識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて組換え体プラークを選択した。純粋な組換え体個体群となるまで、陽性プラークをプラーク精製した。この時点で、組換え体はｖＣＰ１５９であると判明し、ウイルス株を設立した。鶏からのＨ３特異的血清多クローンを用いたｖＣＰ１５９感染ＣＥＦ細胞への蛍光抗体法により、免疫学的に認識したタンパク質が感染細胞表面に発現されたことが示された。
【実施例４７】
【０８６３】
ウマインフルエンザウイルス亜型の血球凝集素糖タンパク質を含有するＮＹＶＡＣ組換え体の発生
プラスミドｐＥＩＶＨＡＶＱＶＶは、ウマ−１、Ａ１／プラハ／５６（Ｈ７）およびウマ−２、Ａ２／フォンテインブルー／７９（Ｈ３）をコードする配列を含有する。両方の遺伝子をワクシニアウイルスＨ６プロモーターに連結し、ＴＫ部位に挿入する。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を生体外組換えにおいて治療ウイルスとして用い、異種遺伝子を治療する。放射線標識したＨ３およびＨ７特異的タンパク質に対するハイブリダイゼーションに基づいて組換えプラークを選択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え後代ウイルスをプラーク精製した。この時点で組換え体はｖＰ９６１であると判明し、ウイルス株を設立した。Ｈ３特異的単クローン性行為およご多クローン性抗Ｈ７血清を用いた蛍光抗体法により、両方の糖タンパク質が感染細胞表面に発現されたことが分かった。同一の試薬による免疫沈降分析により、Ｈ３糖タンパク質は、約７５ｋｄの分子量を有する前駆体糖タンパク質として発現されたことが示された。切断産生物は証明されなかった。Ｈ７糖タンパク質は、約７５ｋｄの前駆体糖タンパク質として証明され、ＨＡ1 およびＨＡ2 切断産生物はそれぞれ約４５および３０ｋｄの分子量を有した。
【０８６４】
プラスミドｐＴＫＥＩＶＨＳＩ３Ｌは、ウマ−２  Ａ２／サフォーク／８９血球凝集素糖タンパク質のコード配列を含有する。コード配列を、Ｉ３Ｌプロモーターに連結し、ＴＫ部位に挿入する。ＮＹＡＶＣ（ｖＰ８６６）を治療ウイルスとして用い、組換え体プラークは、Ｈ３特異的放射線標識したプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて選択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え体プラーク後代をプラーク精製した。この時点で組換え体はｖＰ１０６３であることが判明し、ウイルス株を設立した。鶏からの多クローン性抗Ｈ３を用いた蛍光抗体法により、免疫的に認識されたタンパク質が感染細胞表面に発現された子とが分かった。
【実施例４８】
【０８６５】
ワクシニアウイルス／ＦＥＬＶ挿入プラスミドの構築
ＦｅＬＶ（ネコ白血病ウイルス）ｅｎｖ  ＤＮＡ配列を、Ｍ１３ｍｐ（ベクターに挿入された２．４ｋｂｐ  ＦｅＳＶ−ＳＭ  ＤＮＡ（ギルホットら、1987）の形状でＤｒ．Ｆ．ゲイルバート（フランス、パリ、セントルイス、血液実験病院の研究所）から得た（メシング、1983）。全縁読取り枠を含有するこの２．４ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ断片（ＦｅＬＶ  ｐ７０＋ｐ１３Ｅ）を単離し、都合よくｐＵＣ１８に挿入した（メシング、1983）。ｅｎｖ配列の３′末端でのＫｐｎＩ部位をＰｓｔＩ部位に変換し、２．４ｋｂｐ  ＰｓｔＩ断片を単離してＰｓｔＩ切断したｐＴｐ１５に連結した（グオら、1989）。産生したプラスミドをｐＦｅＬＶ１Ａと称した。
【０８６６】
生体外突然変異誘発を用いて（マンデッキら、1986）、ｐＦｅＬＶ１ＡをｐＦｅＬＶ１Ｂに変換した。これは、オリゴヌクレオチドＳＰＢＧＬＤ（配列認識番号３０７）
【化２２０】
0003624911.tif 000253
【０８６７】
を用いて行なった。このオリゴヌクレオチドにより突然変異誘発により、Ｈ６プロモーターの境界でのＢｇｌＩＩ部位およびＨＡ配列を除去することができた。これにより、ウイルス中に発見されたこれらのＤＮＡ断片の実際の配列が提供される。
【０８６８】
次いでプラスミドｐＦｅＬＶ１Ｂを、オリゴヌクレオチドＦｅＬＶ５Ｐ（配列認識番号３０８）
【化２２１】
0003624911.tif 000254
【０８６９】
で突然変異誘発せしめ、ｐＦｅＬＶ１Ｃを産生した。以下の改変に関して、生体外突然変異誘発をマンデッキ（1986）に記載されたように行なった。特有のＳｍａＩ部位でのｐＦｅＬＶ１Ｂの切断後、ＤＮＡをＢａｌ３１で切断した。５秒、１０秒、２０秒、４０秒および８０秒の時間に、アリコートを採取し、ＥＧＴＡを２０ｍＭの最終濃度に加えることにより、反応を終了せしめた。アリコートを採取し、突然変異誘発反応に用いた。産生したプラスミド、ｐＦｅＬＶ１Ｃは、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′で隣接したＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子およびＡＴＧ：ＡＴＧ置換を含有した。プラスミドｐＦｅＬＶ１Ｃを、治療ウイルスとしてのｖＰ４２５とともに生体外組換え試験に用い、全縁ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス（ｖＰ４５３）を産生した。
【０８７０】
プラスミドｐＦｅＬＶ１Ｃを試薬として用いてｐＦｅＬＶ１Ｄを産生した。この組換えプラスミドは、推定免疫抑制領域を欠如することを除いては全縁ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有する（シアンシオロら、1985；マセスら、1978）。免疫抑制領域をコードする配列（ギホットら、1987におけるヌクレオチド２２５２−２３３２の配列）を以下の方法により生体外突然変異誘発により欠損せしめた（マンデッキ、1986）。プラスミドｐＦｅＬＶ１ＣをＢｓｍＩで線状化した。線状化したプラスミドをＢａｌ３１で処理し、１分、２分、４分および８分でアリコートを採取し、突然変異誘発反応の使用のために採取した。オリゴヌクレオチドＦｅＬＶ１ＳＤ（配列認識番号３０９）
【化２２２】
0003624911.tif 000255
【０８７１】
を用いて生体外突然変異誘発を行なった。産生したプラスミド、ｐＦｅＬＶ１Ｄを、治療ウイルスとしてのｖＰ４１０とともに生体外組換え試験に用いて、ｖＰ４５６を産生した。このワクシニアウイルス組換え体は、推定免疫抑制領域が欠如した全縁エンベロープ糖タンパク質を発現するように産生された。
【実施例４９】
【０８７２】
アビポックスウイルス／ＦｅＬＶ挿入プラスミドの形成
ＦＰ−１組換え体の構築のために、２．４ｋｂｐのＨ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を、ＢｇｌＩＩの切断とＰｓｔＩの部分的な切断により、ｐＦＥＬＶ１Ａ（上記）から切除した。ＢｇｌＩＩ部位は、Ｈ６プロモーター配列の５′境界にある。ＰｓｔＩ部位は、エンベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止シグナルから４２０ｂｐ下流に位置する。
【０８７３】
２．４ｋｂｐ  Ｈ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列をＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断したｐＣＥ１１に挿入した。多重クローニング部位を不可欠ＨｉｎｄＩＩ部位に挿入することにより、ＦＰ−１挿入ベクターｐＣＥ１１をｐＲＷ７３１．１３から誘導した。この挿入ベクターにより、ＦＰ−１ゲノムが産生される。次いで組換え体ＦＰ−１／ＦｅＬＶ挿入プラスミドをｐＦｅＬＶＦ１で切断した。この構成では、ＡＴＧ置換のための正確なＡＴＧが提供されない。
【０８７４】
正確なＡＴＧ：ＡＴＧ構成を達成するために、約１．４ｋｂｐのＮｒｕＩ／ＳｓｔＩＩ断片をワクシニアウイルス挿入ベクターｐＦｅＬＶ１Ｃ（上述）から誘導した。ＮｒｕＩ部位は、ＡＴＧから２４ｂｐ下流の位置にあるＨ６プロモーター内に生じる。ＳｓｔＩＩ部位は、ＡＴＧから１．４ｋｂｐ下流で、翻訳終止コドンから１ｋｂｐ上流に位置する。ｐＦｅＬＶＦ１のＳｓｔＩＩによる切断とＮｒｕＩによる部分的な切断によって産生された９．９ｋｂｐの断片に、ＮｒｕＩ／ＳｓｔＩＩ断片を連結した。この９．９ｋｂｐの断片は、５．５ｋｂｐ  ＦＰ−１フランキングアーム、ｐＵＣベクター配列、ｅｎｖ遺伝子の下流部分に対応する１．４ｋｂｐのＦｅＬＶ配列、およびＨ６プロモーターの５′側部分（約１００ｂｐ）を含有する。産生したプラスミドをｐＦｅＬＶＦ２と称した。ヌクレオチド配列分析により、正確なＡＴＧ：ＡＴＧ構成が確認された。
【０８７５】
推定免疫抑制領域（上述）に対応するＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を序供することにより、ＦｅＬＶＦ２からさらなるＦＰ−１挿入ベクター、ｐＦｅＬＶＦ３を誘導した。これは、ワクシニアウイルス挿入ベクター、ｐＦｅＬＶ１Ｄ（上述）から得た約１ｋｂｐのＰｓｔＩ／ＳｓｔＩＩ断片を単離し、この断片を、ｐＦｅＬＶＦ２のＰｓｔＩとＳｓｔＩＩによる切断によって誘導された残りのＨ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を含有する１０．４ｋｂｐ  ＰｓｔＩ／ＳｓｔＩＩ断片に挿入することにより行なった。
【０８７６】
挿入プラスミド、ｐＦｅＬＶＦ２およびｐＦｅＬＶＦ３を、治療ウイルスとしてのＦＰ−１とともに、生体外組換え試験に用いた。後代ウイルスを、生後１０日の感染幼虫包蔵卵から得た初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）単層に塗布し、ＣＥＦ単層のプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションにより同定した組換え体後代を選択し、４回のプラーク精製を行なって均質な個体群を得た。全縁ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子をハーバリング（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）するＦＰ−１組換え体は、ｖＦＰ２５と称し、それを含有するＦＰ−１組換え体は、ｖＦＰ３２と称した。
【０８７７】
ＣＰ組換え体を構築するために、Ｈ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子配列を含有する２．２ｂｐ断片を、ＫｐｎＩとＨｐａＩでの切断によりｐＦｅＬＶＦ２とｐＦｅＬＶＦ３から切除した。ＫｐｎＩ部位は、Ｈ６プロモーター配列の５′境界にある。ＨｐａＩ部位は、エンベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止シグナルから１８０ｂｐ下流にある。これらの単離した断片をブラントエンドした。これらの２．２ｋｂｐ  Ｈ６／ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列を挿入プラスミドｐＲＷ７６４．２の不可欠ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、次いでＥｃｏＲＩ部位でブラントエンドした。これらの挿入ベクターにより、ＣＰゲノムのＣ３座において異種遺伝子をハーバリングするＣＰ組換え体が産生できる。次いで組換え体ＣＰ挿入プラスミドをそれぞれｐＦｅＬＶＣＰ２とｐＦｅＬＶＣＰ３と称した。
【０８７８】
挿入プラスミド、ｐＦｅＬＶＣＰ２とｐＦｅＬＶＣＰ３を、治療ウイルスとしてのＣＰとともに生体外組換え試験に用いた。組換え体の後代を、生後１０日の感染幼虫包蔵卵（ＣＴ、ストー、ＳＰＡＦＡＳ）から得た初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）単層に塗布し、プローブとしての放射線標識したＦｅＬＶ  ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを選択した。陽性雑種形成プラークを選択し、４回のプラーク精製を施し、均質な個体群を得た。全縁ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ３５と称し、免疫抑制領域を欠いて全縁ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ３７と称した。
【実施例５０】
【０８７９】
ＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生
プラスミドｐＦｅＬＶ  ｅｎｖ２４は、ローンメリクス（フランス、リヨン）から得て、これはＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子を含有する。このプラスミドは、ＮＣＥ１６１  ＦｅＬＶ菌株から誘導した４．２ｋｂのｃＤＮＡ誘導断片を含有する。プラスミドｐＦｅＬＶｅｎｖ３４は、ｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）のＳｍａＩ部位に４．２ｋｂのＦｅＬＶ−Ｂ特異的挿入物を含有する。ＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子の配列を第２６図に示す（配列認識番号３１０）。この配列において、開始コドン（ＡＴＧ）と終止コドン（ＴＧＡ）に下線が引いてある。
【０８８０】
ＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖの発現カセットは、以下のようにして構築した。オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化２２３】
0003624911.tif 000256
【０８８１】
およびＨ６３ＰＦＢ（配列認識番号３１１）
【化２２４】
0003624911.tif 000257
【０８８２】
を用いたＰＣＲによりプラスミドｐＩ４ＬＨ６ＨＩＶ３Ｂ（ＨＩＶに関して上述した）から、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターを誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによるこれらの配列の増幅は、最初の２０ｂｐのＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖコード配列を含有する３′末端と５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するＨ６プロモーターを産生した。
【０８８３】
オリゴヌクレオチドＦＢ５Ｐ（配列認識番号３１２）
【化２２５】
0003624911.tif 000258
【０８８４】
およびＦＢ５ＰＡ（配列認識番号３１３）
【化２２６】
0003624911.tif 000259
【０８８５】
を用いたＰＣＲによりｐＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ３４からＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子の５′部分を誘導した。このＰＣＲ誘導断片は、Ｈ６プロモーターの３′側２３ｂｐの相同性（５′末端）および位置５４６での特有のＡｐａＩ部位を含有する。テンプレートとして上記のように定義した２つのＰＣＲ断片と、オリゴヌクレオチドＦＢ５ＰＡ（配列認識番号３１３）およびＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）を用いたＰＣＲにより、Ｈ６プロモーターをＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子に融合した。ＰＣＲ融合断片をＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで切断し、６８０ｂｐ断片を産生した。
【０８８６】
プラスミドｐＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ３４をＡｐａＩとＮｃｏＩで切断し、ｅｎｖ遺伝子の中間部分を含有する７４０ｂｐの断片を離生した。テンプレートとしてｐＦｅＬＶ−ｂ  ｅｎｖ３４およびオリゴヌクレオチド（配列認識番号３１４）
【化２２７】
0003624911.tif 000260
【０８８７】
とＦＢ３ＰＸ（配列認識番号３１５）
【化２２８】
0003624911.tif 000261
【０８８８】
を用いたＰＣＲにより、遺伝子の３′末端を誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによるｅｎｖ遺伝子の３′末端のＰＣＲ増幅により、位置１３２６−１３３２でのＴ５ＮＴ要素を除去した。位置１３２９でのＴからＣの置換を行なうことにより、この配列を改変した（第２６図）。このＰＣＲ誘導断片の５′末端はまた、特有のＮｃｏＩ部位を含有する（位置１２９８での部位に一致する；第２６図）。この断片をＮｃｏＩとＸｂａＩで切断し、７０７ｂｐの断片を産生した。
【０８８９】
７４０ｂｐのＮｃｏＩ／ＡｐａＩ断片と７０７ｂｐのＮｃｏＩ／ＸｂａＩ断片をともに、ＡｐａＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＦＢ３Ｐと称した。次いでｐＢＳＦＢ３Ｐからの１．５ｋｂのＡｐａＩ／ＸｂａＩ断片を、ＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子（上述）のＨ６プロモートした５′末端を含有する６８０ｂｐのＰＣＲ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドをｐＢ５ＦＥＢと称した。
【０８９０】
Ｈ６プロモートしたＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＢ５ＦＥＢからの２．２ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、クレノウ断片でブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、ＳｍａＩで切断したｐＣ５Ｌ（ここのＨＩＶに関する議論を参照）に挿入し、ｐＣ５ＬＦＥＢを産生した。
【０８９１】
プラスミドｐＣ５ＬＦＥＢを、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに、標準生体外組換えアッセイに用いた。ＦｅＬＶ−Ｂ  ｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いて、組換え体プラークを同定した。３回のプラーク精製後、ウイルスを繁殖せしめ、ｖＣＰ１７７と称した。
【実施例５１】
【０８９２】
ＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ  ＥＮＶ組換えウイルスの産生
ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ配列を誘導したプラスミドｐＦＧＡ−５はＤｒ．Ｊ．ネイル（グラスゴー大学）から得て、以前に記載したものである（スチュワートら、1986）。最初に、ヌクレオチド１から５３１ｂｐに対応する５３１ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（スチュワートら、1986）を切除して、ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＣＰＣＶ１に連結し、ｐＣ３ＦＡ−１と称した。このプラスミドｐＣＰＣＶ１は以下のように誘導した。プラスミドｐＦｅＬＶ１ＡをＰｓｔＩで切断し、ＦｅＬＶ配列を切除して再度連結し、プラスミドｐＦｅＬＶＦ４を産生した。ワクシニアウイルスＨ６プロモーター要素（テイラーら、1988）と続くポリリンカー領域を、ＫｐｎＩとＨｐａＩでの切断により、ｐＦｅＬＶＦ４から離生した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５０ｂｐの断片をブラントエンドし、カナリヤポックスＤＮＡの３．３ｋｂ  ＰｖｕＩＩゲノム断片を含有するプラスミド、ｐＲＷ７６４．２に挿入した。カナリヤポックス配列内で特有のＥｃｏＲＩ部位を認識するＥｃｏＲＩでｐＲＷ７６４．２を線状化し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。産生したプラスミドは、ｐＣＰＣＶ１と称した。このプラスミドは、ポリリンカー領域が続き、側腹にカナリヤポックスウイルス相同配列を有する、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターを含有する。
【０８９３】
プラスミドｐＣ３ＦＡ−１を、ＰｓｔＩで線状化し、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡＨ６−１（配列認識番号３１６）
【化２２９】
0003624911.tif 000262
【０８９４】
を用いたマンデッキ法（1986）により生体外組換えにおいて突然変異誘発を行なった。生体外突然変異誘発により、ワクシニアＨ６プロモーター要素の正確なＡＴＧ：ＡＴＧ配列となる異種５′非コード配列およびＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ配列を除去した。産生したプラスミドをｐＨ６ＦＡ−１と称した。
【０８９５】
注文合成したオリゴヌクレオチド（ＣＡ、サンラファエル、アプライドバイオシステムス）を用いた標準ＰＣＲによりＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子の残りをｐＦＧＡ−５から誘導した。テンプレートとしてのｐＦＧＡ−５およびオリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−２（配列認識番号３１７）
【化２３０】
0003624911.tif 000263
【０８９６】
とＦＥＮＶＡＨ（配列認識番号２３１）
【化２３１】
0003624911.tif 000264
【０８９７】
を用いて、８３６ｂｐ  ＰＣＲ断片を誘導した。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド４８８から１３２７と一致する（スチュワートら、1986）。オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−２（配列認識番号３１７）の使用により、位置１３０１から１３０９でのヌクレオチド配列をＧＡＴ5 ＧＴをＧＡＡＴＴＣＴＧＴに改変する。この改変により、ポックスウイルス初期転写終止シグナル（ユエンとモス、1987）として認識されるＴ５ＮＴ配列モチーフを除去し、この位置でのＥｃｏＲＩ制限部位を導入する。これらのヌクレオチド操作は、グルタミン酸からアミノ酸４１４を保存アミノ酸アスパラギン酸に変化せしめる（スチュワートら、1986）。これらのヌクレオチド変化によりアミノ酸４１５は改変されない。この８３６ｂｐの断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド５３２から１３０２に対応する７７０ｂｐの断片を産生した。テンプレートとしてのｐＦＧＡ−５およびオリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号３１９）
【化２３２】
0003624911.tif 000265
【０８９８】
とＦＥＮＶＡ−４（配列認識番号３２０）
【化２３３】
0003624911.tif 000266
【０８９９】
を用いて、７０９ｂｐのＰＣＲ断片を誘導した。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド１２８１から１９９０と一致する（スチュワートら、1986）。この断片を増幅するためにオリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号３１９）を用いて、Ｔ５ＮＴ要素を改変し、上述したように、８３６ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片のためにＥｃｏＲＩ部位を導入する。７０９ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、産生したプラスミドを、８３６ｂｐ断片（上記）から誘導した７７０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをｐＦ３ＢＳ１−Ｂと称し、ＦｅＬＶ  ｅｎｖ配列をヌクレオチド配列分析により確認した。
【０９００】
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターに正確に連結した全縁ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子を再構築するために、１．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＦ３ＢＡ１−Ｂから単離した。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖのヌクレオチド５３２から１９９０と一致する（スチュワートら、1986）。１．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＨ６ＦＡ−１に連結した。１．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミド構築物を、制限分析により適切な配向でスクリーニングし、Ｈ６プロモーターに連結した全縁無傷ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドクローンをｐＨ６ＨＡ−３と称した。
【０９０１】
２．２ｋｂ  Ｈ６／ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ発現カセットを、ＥｃｏＲＩでの部分的な切断と、ＨｉｎｄＩＩＩでの部分的な切断によりｐＨ６ＦＡ−３から切除した。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＲＷ８３１に挿入した。産生したプラスミドをｐＣ５ＦＡと称した。
【０９０２】
ｐＲＷ８３１は、異種遺伝子をＣ５読取り枠に挿入させるＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）挿入プラスミドを指す。この領域への挿入工程において、ｐＲＷ８３１の使用により、Ｃ５読取り枠のほとんどが欠損せしめられる。ｐＲＷ８３１を産生するために、以下の操作を行なった。カナリヤポックスウイルスゲノムからの８８０ｂｐ  ＰｖｕＩＩゲノム断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。産生したプラスミド、ｐＲＷ７６４．５内に含有されたカナリヤポックスウイルス配列をヌクレオチド配列分析により分析し、Ｃ５読取り枠を定義した。この座で組換え体を操作するために、事前に、Ｃ５  ＯＲＦ内に位置する１対のＢｇｌＩＩ部位の間の挿入を用いた（テイラーら、1992）。全縁領域の配列を第１６図に示す（配列認識番号２２０）。ヌクレオチド配列（配列認識番号２２０）はＰｖｕＩＩ部位で開始する。Ｃ５  ＯＲＦは位置１６６で開始し、ヌクレオチド４８７で終止する。これらの配列の正確な操作により、ヌクレオチド１６７から４５５の欠損をすることができる。そのような欠損は、他のウイルス遺伝子の発現を妨害しないように行なった。
【０９０３】
ｐＲＷ８３１を誘導する方法を以下のように行なう。ｐＲＷ７６４．５をＲｓａＩで部分的に切断し、線状化された断片を単離する。ＲｓａＩ線状断片をＢｇｌＩＩＩで再切断した。産生した２．９ｋｂ  ＲｓａＩ／ＢｇｌＩＩ断片（ヌクレオチド１５６から４６２が欠損した）を単離し、アニールしたオリゴヌクレオチドＲＷ１４５（配列認識番号１０７）およびＲＷ１４６（配列認識番号１０８）に連結した。産生したプラスミドはｐＲＷ８３１と称し、Ｃ５配列の場所に、特有のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ部位を有する配列を含有する。
【０９０４】
プラスミドｐＣ５ＦＡを、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに生体外組換え実験に用いた。放射線標識したＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ特異的プローブを用いた現場でのプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製と続いてのハイブリダイゼーション確認後、組換え体をｖＣＰ８３と称した。
【実施例５２】
【０９０５】
ｐ１５Ｅの推定免疫抑制領域が欠如したＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ  ＥＮＶ組換えウイルスの産生
推定免疫抑制領域は、ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質のｐ１５Ｅ膜貫通領域内に位置する（シアンシオロら、1986；マセスら、1978）。この領域は以下の方法により欠損せしめた。ヌクレオチド１２８２から１６０２のＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ配列（スチュワートら、1986）は、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号３２０）およびＩＳ−Ａ（配列認識番号４６８）
【化２３４】
0003624911.tif 000267
【０９０６】
を用いたＰＣＲによりｐＦＧＡ−５から増幅した。ヌクレオチド１６８４から１９９０のｅｎｖ配列（スチュワートら、1986）は、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−４（配列認識番号３２０）およびＩＳ−Ｂ（配列認識番号３２３）
【化２３５】
0003624911.tif 000268
【０９０７】
を用いたＰＣＲによりｐＦＧＡ−５から増幅した。前者のＰＣＲ誘導断片は、ＥｃｏＲＩで切断し、後者はＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いてＡＴＰとＴ４キナーゼでキナーゼした。これらの断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにともに連結した。産生したプラスミドは、ヌクレオチド配列分析により確認し、ｐＢＳＦＡＩＳ- と称した。上述した断片の連結は、配列５′および３′を、推定免疫抑制領域をコードする８１ｂｐのＤＮＡ断片に結合させ、それゆえ、免疫抑制ペプチドをコードする配列を欠損せしめる。
【０９０８】
免疫抑制領域をコードする領域が欠如したＦｅＬＶ−Ａ配列をＳｓｔＩＩ／ＡｐａＩでの切断によりｐＣ５ＦＡから切除した。この３８１ｂｐの断片をｐＢＳＦＡＩＳ- からの３００ｂｐ  ＳｓｔＩＩ／ＡｐａＩ断片により置換した。行なった連結は、ｐＣ５ＦＡからの４．８ｋｂ  ＳｓｔＩＩ／ＡｐａＩ断片と上述した３００ｂｐ断片によるものであった。産生したプラスミドをｐＣ５ＦＡＩＳＤと称した。
【０９０９】
プラスミドｐＣ５ＦＡＩＳＤは、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに組換え実験に用いた。放射線標識したＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ特異的プローブを用いた現場でのハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製後、組換え体をｖＣＰ８７と称した。この組換え体は、推定２７アミノ酸免疫抑制領域をコードする領域が欠如したＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子を含有する。この遺伝子をＣ５座に挿入した。
【実施例５３】
【０９１０】
ＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇ組換えウイルスの産生
ＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇ／ｐｏｌ配列をプラスミドｐＦＧＡ−２  ｇａｇから誘導した。このプラスミドは、ＬＴＲ（６５１ｂｐ）配列の部分、全縁ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子の１２７２ｂｐを含有する３．５ｋｂ  ＰｓｔＩサブ断片をサブクローニングすることによりＦｅＬＶ−Ａ感染クローンｐＦＧＡ−２（スチュワートら、1986）から誘導した。３．５ｋｂ断片をＰｓｔＩで切断したｐＵＣ８（ＭＤ、ゲイサースブルグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ）に挿入した。最初にこの３．５ｋｂ  ＰｓｔＩ  ＦｅＬＶ−Ａ  ＤＮＡ断片を単離し、ｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをｐＢＳＧＡＧと称した。ヌクレオチド配列（配列認識番号３２４）（第２７図）分析により全縁３．５ｋｂ挿入物を分析し、開始コドン（第２７図に下線を引いたヌクレオチド６５２から６５４）およびＦｅＬＶ−Ｂ（レプロベッテら、1984）に関して以前に記載したｇａｇ領域のヌクレオチド配列内に定義された関連制限部位の位置を確認した。
【０９１１】
プラスミドｐＦＧＡ−２  ｇａｇをＢｇｌＩＩとＰｓｔＩで切断し、２．５ｋｂ断片を離生した。ＢｇｌＩＩは、ヌクレオチド位置１０７６（配列認識番号３２４）での部位を認識し、一方ＰｓｔＩは、ＦｅＬＶ−Ａ挿入物の末端での部位を認識する。２．５ｋｂ団便を単離し、共移動プラスミド配列内の部位を認識するＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩで再切断した。これにより、プラスミド配列の続いての連結反応を競合する能力が除去された。
【０９１２】
ＰＣＲを用いてＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇコード配列の５′末端を誘導した。プラスミドｐＦＧＡ２  ｇａｇは、オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＢＧＬ（配列認識番号３２５）
【化２３６】
0003624911.tif 000269
【０９１３】
およびＦＧＡＧＡＴＧ（配列認識番号３２６）
【化２３７】
0003624911.tif 000270
【０９１４】
とともにテンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＡＴＧ（配列認識番号３２６）は、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの３′側の２５ヌクレオチドを含有し、その５′末端でのＮｒｕＩ部位の３′側３ｂｐを含有する。これらのＨ６配列は、ＡＴＧ（開始コドン）で正確に結合し、ヌクレオチドはｇａｇコード配列の最初の１６ヌクレオチドに一致する。オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＢＧＬ（配列認識番号３２５）は、ｇａｇ配列中の特有のＢｇｌＩＩ部位から５９ｂｐ下流の配列の逆補体と一致する（レプレボッテら、1984）。これらの試薬を用いたＰＣＲにより、続いてＢｇｌＩＩで切断されて４５０ｂｐ断片を産生する５００ｂｐ断片を産生した。
【０９１５】
４５０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ切断ＰＣＲ誘導断片を、ｇａｇ遺伝子の残りとｐｏｌ遺伝子の部分を含有する２．５ｋｂ  ＢｇｌＩＩ／ＰｓｔＩ断片、およびＮｒｕＩとＰｓｔＩで切断したｐＣＰＣＶ１（上記ｅｎｖ構造）と共連結した。ｐＣＰＣＶ１（ＮｒｕＩ／ＰｓｔＩ）は、ＮｒｕＩ認識シグナルの５′側の３ｂｐを含有するワクシニアウイルスＨ６プロモーターの５′部分を含有する。産生したプラスミドをｐＣ３ＦＧＡＧと称した。
【０９１６】
プラスミドｐＣ３ＦＧＡＧを、ＰｓｔＩで線状化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンドし、ｐＳＤ５１３（実施例７に定義した）から切除した１００ｂｐ  ＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片に連結した。１００ｂｐのＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片により、ＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇ／ｐｏｌ配列の３′末端で終止コドンが提供される。産生したプラスミドをｐＣ３ＦＧＡＧＶＱと称した。
【０９１７】
ＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでの切断によりｐＣ３ＦＧＡＧＶＱから切除した。産生した３．４ｋｂ断片を単離し、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＣ３Ｉ（実施例３２に定義した）に連結し、ｐＣ３Ｄ０ＦＧＡＦＶＱを産生した。
【０９１８】
プラスミドｐＣ３Ｄ０ＦＧＡＧＶＱを、治療ウイルスとしてのｖＣＰ８３とｖＣＰ８７とともに生体外組換え実験に用いた。ＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇ／ｐｏｌ配列および全縁ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子を含有する組換え体はｖＣＰ９７と称し、一方同一のｇａｇ／ｐｏｌ配列および免疫抑制領域が欠如した全縁ＦｅＬＶ−Ａ  ｅｎｖを含有する組換え体をｖＣＰ９３と称した。
【実施例５４】
【０９１９】
ＦｅＬＶ−Ａ  ｇａｇのワクシニアウイルスバックグラウンドへの挿入
ｐＣ３ＦＧＡＧ（上記）からの３．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＳＤ５５３のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより、挿入プラスミドｐＣＥＮ１５１を産生した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によりその断片をブラントエンドした後に、この挿入を行なった。
【０９２０】
プラスミドｐＳＤ５５３は、ＣＯＰＡＫシリーズのワクシニア欠損／挿入プラスミドである。このプラスミドは、フランキングコペンハーゲンワクシニアアーム内のワクシニアＫ１Ｌ宿主域遺伝子（ギラードら、1986；パーカスら、1990）を含有し、ＡＴＩ領域（ＯＲＦ  Ａ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ；ゲーベルら、1990ａ、ｂ）を置換する。ｐＳＤ５５３は以下のようにして構築した。プラスミドｐＳＤ５４１のワクシニアＡＴＩ欠損座に位置するポリリンカー領域（実施例１０に定義した）を以下のように拡張した。ｐＳＤ５４１をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで切断し、アニールした相補合成デオキシオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３３３（配列認識番号３２９）
【化２３８】
0003624911.tif 000271
【０９２１】
およびＭＰＳＹＮ３３４（配列認識番号３３０）
【化２３９】
0003624911.tif 000272
【０９２２】
に連結し、プラスミドｐＳＤ５５２を産生した。Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子を、プラスミドｐＳＤ４５２からの１ｋｂ  ＢｇｌＩＩ（部分的）／ＨｐａＩ断片として単離した（パーカスら、1990) 。ｐＳＤ５５２を、ＢｇｌＩＩ／ＨｐａＩで切断し、断片を含有するＫ１Ｌに連結し、ｐＳＤ５５３を産生した。
【０９２３】
プラスミドｐＣＥＮ１５１を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０１１を産生した。
【実施例５５】
【０９２４】
ＡＬＶＡＣ組換えウイルスにおけるＦｅＬＶ  ＥＮＶおよびｇａｇ遺伝子の蛍光抗体法および免疫沈降分析
免疫沈降
ベロ細胞単層を、１０ｐｆｕ／細胞に等しいｍ．ｏ．ｉ．で親または組換えウイルスに感染せしめた。感染から１時間後、接種物を吸引し、（35Ｓ）−メチオニン（ＭＡ、ボストン、デュポン；１０００  Ｃｉ／ｍモル）、２０μＣｉ／ｍｌを補給したメチオニン不含有培地を加え、さらに感染から１８時間後までインキュベーションした。ウシ抗ＦｅＬＶ血清（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）またはｐ２７コアタンパク質に特異的な単クローン性抗体（ＧＡ、アテネ、ローンメリクスから得た）を用いて、免疫沈降および蛍光抗体法分析を前述したように行なった。
【０９２５】
ＦｅＬＶウイルスの単離
１日目に、３×１０4 ＱＮ１０細胞／ウェルを、ＨＥＦＰＥＳ緩衝液（ＤＦＢ）、１０％のＦＢＳ、および４μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を含有する１ｍｌのダルベッコＭＥＭ中の１２ウェル板に展開した。細胞を３７℃で一晩インキュベーションした。培地を取り除くことなく、２００μｌの試料（ネコ血漿）を各ウェルに加えた。３７℃の２時間のインキュベーション後、培地を１．５ｍｌ新鮮なのＤＦＢと置き換えて、さらに３７℃でシンキュベーションした。５日目に、板を転換に関して検査した。陰性の場合には、培地を１．５ｍｌの新鮮なＤＦＢと置き換えて、さらに３７℃でシンキュベーションした。８日目に、板を転換に関して再検査した。陰性の場合には、トリプシン−ＥＤＴＡでの２回の洗浄により細胞を分散せしめ、５ｃｍの板への接種のための４ｍｌのＤＦＢ中に配することにより、細胞を５ｃｍの板に継代培養せしめた。転換の検査の前に、細胞を３７℃で４時間に亘りインキュベーションせしめた。
【０９２６】
蛍光抗体法によるＦｅＬＶ抗原の検出
血液スミアを−２０℃で５分間ＭｅＯＨ中に固定し、ｄＨ2 Ｏ中で洗浄し、次いで空気乾燥せしめた。２４μｌのウサギ抗ＦｅＬＶ抗体を、ダイアモンドペンでスミア上に記した円内に血液スミアを施した。ＰＢＳで３回、ｄＨ2 Ｏで１回の洗浄の前に、抗体の存在下で加湿器中、１時間、３７℃でスミアをインキュベーションした。次いでスミアを空気感想せしめた。２５μｌのヒツジ抗ネコＩｇＧ−ＦＩＴＣを円に施し、第１抗血清とともに上述したようにインキュベーションした。紫外線光源での顕微鏡による蛍光抗体法の検査の前に、試料を洗浄し、第１抗血清について上述したように乾燥せしめた。
【０９２７】
ＦｅＬＶ抗体中和アッセイ
１日目に、５×１０4 ＱＮ１０細胞／ウェルを、１ｍｌのＤＦＢと４μｇ／ｍｌのポリブレン中の１２ウェル板に展開した。細胞を３７℃でインキュベーションした。５０μｌのレイボウィッツ培地を用いて、１：２から１：２５６までの血清希釈物を丸底９６ウェル板中に調製した。１ｍｌ当たり４×１０5 フォーカス形成単位（ｆｆｕ）での５０μｌのＦｅＬＶ−Ａを加えた。２つのウェルをウイルス対照として血清のない培地とともにインキュベーションした。板を３７℃で２時間インキュベーションした。２時間の吸着期間後、２５μｌの各希釈物をＱＮ１０細胞のウェル中に配した。ＱＮ１０細胞への２５μｌの接種の前に、９６ウェル板中のレイボウィッツ培地の５０μｌ中で１：２、１：４、１：８および１：６で希釈することによりウイルス対照を滴定した。３日間、３７℃で板をインキュベーションした。１日目に培地を１ｍｌのＤＦＢ／ウェルと置き換えた。２日後に、フォーカスを顕微鏡で数えた。ウイルス対照と比較したフォーカスの数が７５％減少した血清の希釈物として、中和抗体抗体滴定を評価した。
【０９２８】
ｖＣＰ８３およびｃＣＰ８７により発現されたｅｎｖ遺伝子産生物が感染細胞の形質膜に運搬されたか否かを決定するために、前述したように蛍光抗体法実験を行なった（テイラーら、1990）。初代ＣＥＦ単層を、親（ＡＬＶＡＣ）または組換えウイルス、ｖＣＰ８３およびｖＣＰ８７に感染せしめ、感染から２４時間後に、ウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いて蛍光抗体法を行なった。結果により、ｖＣＰ８３に感染した細胞は、強い表面蛍光着色を示し、ｖＣＰ８７または親ＡＬＶＡＣに感染した細胞は著しい表面着色は示さなかったことが分かった。
【０９２９】
ウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いて、免疫沈降分析により、ＦｅＬＶ  ｅｎｖ遺伝子産生物の発現もまた分析した。未感染ＣＥＦまたは親ＡＬＶＡＣウイルスに感染したＣＥＦから誘導した溶解産物からはＦｅＬＶ特異的タンパク質種は沈殿しなかった。ｖＣＰ８３感染細胞からは、８５ｋＤａ、７０ｋＤａ、および１５ｋＤａの見かけの分子量を有する３つのＦｅＬＶ特異的タンパク質が沈殿した。この結果は、前駆体ｅｎｖ遺伝子産生物（８５ｋＤａ）および熟成切断産生物ｐ７０およびｐ１５Ｅの発現と一致するものである。ｖＣＰ８８感染細胞から誘導した溶解産物からの免疫沈降により、８３ｋＤａの見かけの分子量を有する１つのＦｅＬＶ特異的タンパク質種が示された。これは、推定免疫抑制領域の欠損後に予期されたサイズの非タンパク質分解加工ｅｎｖ遺伝子産生物の発現に一致するものである。手短にいうと、免疫抑制領域の欠如したｅｎｖの発現は、感染細胞の表面には明らかに適切には運搬されず、または熟成ｅｎｖ特異的タンパク質形状にはタンパク質分解的に切断されない。
【０９３０】
ｐ２７コアタンパク質（Ｄ５）内のエピトープに特異的な単クローン性抗体およびウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いた免疫沈降により、ＦｅＬＶ  ｇａｇ特異的遺伝子産生物の発現を分析した。未感染細胞または親ウイルスに感染した細胞から誘導した溶解産物からは、ＦｅＬＶ特異的タンパク質は沈殿しなかった。Ｄ５およびウシ抗ＦｅＬＶ血清により、ｖＰ１０１１、ｃＣＰ９３、およびｖＣＰ９７に感染した細胞からは、５５ｋＤａのＦｅＬＶ特異的タンパク質種が沈殿した。これらの見かけの分子量のタンパク質種は、ｇａｇ特異的前駆体形状と一致する。熟成ｐ２７コアタンパク質のサイズに一致する低水準の２７ｋＤａタンパク質種もまた明確であった。
【実施例５６】
【０９３１】
ｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７の体内評価
組換えウイルスの２回の接種後のネコの生ＦｅＬＶ抗原投与によりｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７の防御効果を評価した。０日と２８日の皮下経路の１０8 ＰＦＵにより、ＡＬＶＡＣベースのＦｅＬＶ組換え体を投与した。追加抗原投与接種後から７日目に、相同ＦｅＬＶ−Ａ菌株（グラスゴー１）を口鼻投与によりネコに抗原投与した。ＦｅＬＶ抗原血症（ｐ２７検出）、ＦｅＬＶ単離、蛍光抗体法による白血球（ＷＢＣ）スミア中のＦｅＬＶ抗原の存在、およびＦｅＬＶ中和活性の誘発の評価のために、抗原投与の前と後に、血液試料を得た。
【０９３２】
ＡＬＶＡＣ（カナリヤポックスウイルス）ベースの組換えウイルス、ｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７によるワクチン接種後には、副作用は観察されなかった。６つの非ワクチン接種対照の全ては、ＦｅＬＶ抗原投与のために死亡し、抗原投与の露出後３週間で持続性のウイルス血症を発達せしめた。これは、血液中のｐ２７抗原の検出、ＦｅＬＶの単離およびＷＢＣスミアの蛍光抗体法によるＦｅＬＶ抗原の検出により証拠付けられた（表３２）。非ワクチン接種の対照は、研究の残りの期間に亘り感染し続けた（抗原投与後１２週間まで）。
【０９３３】
持続性のウイルス血症は、抗原投与から３週間後にｖＣＰ９３をワクチン接種した６匹のネコのうち３匹に発達した。この時点で、これらの３匹のネコからの血液のサンプリングにより、ｐ２７抗原および／または生ＦｅＬＶを含有することが示された（表３２）。これらのネコのうち１匹（２番）は、感染から６週間後にこの感染から解放され、抗原投与から１２週間後までウイルス血症のないままでいた。他の２匹のネコ（１番と５番）は、３つの分類基準、ｐ２７抗原血症、ＦｅＬＶの単離、およびＷＢＣ中のＦｅＬＶ抗原検出により持続的に感染したままであった。ｖＣＰ９３をワクチン接種した６匹のネコのうち３匹（３番、４番、および６番）は、抗原投与から９週間に亘り持続性ウイルス血症には感染しないままでいた（表３２）。これらのネコのうち２匹（３番と６番）は、抗原投与後から１２週間に亘り循環ウイルスのないままであったが、一方で１匹のネコ（４番）は、１２週間目に突然感染した。ｖＣＰ９３でのワクチン接種により、持続性ウイルス血症に対して部分的な防御（６匹のネコのうち３匹）が与えられた。
【０９３４】
最も印象的なことには、ｖＣＰ９７をワクチン接種した６匹のネコ全てが、ＦｅＬＶ−Ａ（グラスゴー１）による相同抗原投与に対して完全に防御された。これらのネコのうち１匹のみ（１２番）が、持続性ウイルス血症の様子を示した。ｐ２７抗原が血液試料中に検出された（表３２）抗原投与から３週間後に生じた。抗原投与後に、このネコの血液からは生ＦｅＬＶは決して単離されなかった。他のネコは、抗原投与露出から１２週間に亘り、ｐ２７抗原血症がなく、生ＦｅＬＶがなく、ＷＢＣスミア中にＦｅＬＶ抗原を決して示さなかった（表３２）。
【０９３５】
ＦｅＬＶ中和抗体の進化
ＦｅＬＶ感染に対する防御における中和抗体の潜在的な役割のために（ラッセルおよびジャレット、1978；ラッツら、1980）、そのような応答の発生は抗原投与の前後に監視された。ｖＣＰ９３またはｖＣＰ９７のいずれかでワクチン接種された研究におけるネコは、ＦｅＬＶ抗原投与前には、中和抗体力価を示さなかった（表３３）。抗原投与後に、持続性ウイルス血症を発達せしめたどのネコも、検出可能な中和抗体力価を示したものはいなかった。驚くべきことに、持続性感染に対して防御されたネコは、ＦｅＬＶ特異的血清中和力価を発達せしめた（表３３）。これらの力価は、抗原投与後に防御された全てのネコにおいて著しく増大し、研究の終止時点である抗原投与から１２週間後に、高水準であることが観察された（表３３）。
【表３２】
0003624911.tif 000273
【０９３６】
0003624911.tif 000274
【表３３】
0003624911.tif 000275
【実施例５７】
【０９３７】
ＦＨＶ−１  ｇＤ糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターの制御下で、ＦＨＶ−１  ｇＤ相同遺伝子のＡＬＶＡＣベクターへの挿入により、１型ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ−１）  ｇＤ糖タンパク質の発現を行なった。カセットＩ３Ｌ−ＦＨＶ−１  ｇＤをＡＬＶＡＣに挿入するのに必要とされる供与体プラスミドを以下のように産生した。
【０９３８】
ＦＨＶ−１  Ｃ０菌株ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に切断し、断片Ｍ（４４８０ｂｐ）をアガロースゲルから切除し（遺伝子洗浄方法）、ＥｃｏＲＩで切断してホスファターゼしたベクターｐＢＳ−ＳＫ+ にクローニングした。ＦＨＶ−１  ＥｃｏＲＩ  Ｍ断片を含有する、産生したプラスミドをｐＨＦｅＭ２と称した。修飾Ｔ７酵素シーケナーゼ（米国バイオケミカル社）を用いて、両鎖のＦＨＶ−１  ＥｃｏＲＩ  Ｍ断片完全ヌクレオチド配列を、ベクターｐＢＳ−ＳＫ+ に挿入されたＦＨＶ−１  ＥｃｏＲＩ  Ｍ断片のいくつかのサブクローンから得た（テイバーおよびリチャードソン、1987）。０．４Ｍ−ＮａＯＨ中で変性せしめられた二本鎖テンプレートを用いて、標準ジデオキシヌクレオチド鎖終止反応（サンガーら、1977）を行なった（ハットリおよびササキ、1986）。Ｍ１３順および逆プライマーを用いて、各クローンの最初の配列を得た。標準化学種（バイオリサーチ８７００およびアプライドバイオシステム３８０Ｂ）を用いて合成した、注文プライマー（１８ｍｅｒ）を続いての配列反応に用いた。続発性断片間の接合の配列を、最初のクローン、ｐＨＦｅＭ２で確認した。全ての配列データ分析に、ＰＣ＼ＧＥＮＥ（インテリジェネティックス）およびＩＢＩパステルソフトウェアーパッケージを用いた。スイスプロトリリース１８．０（インテリジェネティックス）に対するＰＡＳＴＰプログラム（リップマンおよびペアーソン、1985）に関して、相同探求を行なった。ＦＨＶ−１  Ｃ０菌株ｇＤ相同遺伝子の全配列を第２８図に示す（配列認識番号２９０）。
【０９３９】
テンプレートとしてのプラスミドｐＨＦｅＭ２およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ２３４（配列認識番号３３１）
【化２４０】
0003624911.tif 000276
【０９４０】
とＪＣＡ２３５（配列認識番号３３２）
【化２４１】
0003624911.tif 000277
【０９４１】
を用いて、ＦＨＶ−１  ｇＤコード配列の１８５ｂｐ  ５′側領域を誘導し、ＢａｍＨＩで切断した。この１８５ｂｐ断片を、プラスミドｐＭＰ６９１（Ｉ３Ｌ１０１ＲＡＢ）およびオリゴヌクレオチドＭＰ２８７（配列認識番号２２６）
【化２４２】
0003624911.tif 000278
【０９４２】
とＪＣＡ１５８（配列認識番号２２５）
【化２４３】
0003624911.tif 000279
【０９４３】
を用いて得たＩ３Ｌプロモーター要素を含有する１２０ｂｐのＰＣＲ誘導断片に融合し、ＸｂａＩで切断した。１８５ｂｐおよび１２０ｂｐ断片を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ 中にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡ０７１を産生した。接合部Ｉ３Ｌ−ＡＴＧおよびＦＨＶ−１  ｇＤ  ５′側領域のＩ３Ｌプロモーターの配列を、ｐＪＣＡ０７１の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドｐＪＣＡ０６７は、ＦＨＶ−１  ＥｃｏＲＩ  Ｍ断片のサブクローンである。以下のようにしてそのプラスミドは産生された。プラスミドｐＨＦｅＭ２をＢａｍＨＩで切断し、１８５０ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をアガロースゲルから切除し、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ+ に連結した。このクローンは、ＦＨＶ−１  ｇＤの３′領域およびさらなる下流の配列を含有する。プラスミドｐＪＣＡ０６７をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、１２７０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＦＨＶ−１  ｇＤ  ３′−領域−ｇＩ  ５′領域−ＸｈｏＩ断片を切除した。この断片をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ+ に連結し、ｐＪＣＡ０７２を産生した。テンプレートとしてのプラスミドｐＨＦｅＭ２およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ２３７（配列認識番号３３３）
【化２４４】
0003624911.tif 000280
【０９４４】
とＪＣＡ２４２（配列認識番号３３４）
【化２４５】
0003624911.tif 000281
【０９４５】
を用いたＰＣＲにより３′側２９０ｂｐのＦＨＶ−０１  ｇＤコード配列を誘導した。これら注文合成したオリゴヌクレオチドによるこの断片の合成は、１）ＦＨＶ−１  ｇＤの３′側の配列および５′末端でのＸｂａＩ部位を含有し、２）ＦＨＶ−１  ｇＤコード配列の３′末端に、Ｔ5 ＮＴ要素および特有のＨｐａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ並びにＸｈｏＩ部位を加える。この断片をＸｂａＩとＸｈｏＩで切断し、ＸｂａＩとＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＪＣＡ０７２から得た３５７５ｂｐ  ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片により連結した。産生したプラスミドをｐＪＣＡ０７３と称した。
【０９４６】
ＦＨＶ−１  ｇＤの２９０ｂｐ  ＸｂａＩ−−＞ＸｈｏＩ部分の配列を、ｐＪＣＡ０７３の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドｐＪＣＡ０７１をＳｍａＩとＢａｍＨＩで切断し、３０５ｂｐ  ＳｍａＩ−Ｉ３Ｌ−ＦＨＶ−１  ｇＤ  ５′側領域−ＢａｍＨＩ断片を切除した。プラスミドｐＪＣＡ０７３をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、９７０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＦＨＶ−１  ｇＤ  ３′領域−ＸｈｏＩ断片を切除した。ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ  ３０５ｂｐ断片とＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ  ９７０ｂｐ断片を最終的にベクターｐＣＰＣ６Ｌ（Ｃ６  ｄｅｏｒｆｅｄ座；ｐＣＰＣ６Ｌの産生の他のＡＬＶＡＣ  Ｃ６供与体プラスミドを参照）中にともに連結し、ＳａｍＩとＸｈｏＩで切断した。この連結により産生したプラスミドをｐＪＣＡ０８４と称した。
【０９４７】
プラスミドｐＪＣＡ０８４を、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐとともに初代鶏胚繊維芽細胞での生体外組換え実験に用いてｖＣＰ１６２を産生した。放射線標識ＦＨＶ−１  ｇＤ特異的プローブを用いた標準方法（ピッチーニら、1987）にしたがった現場でのハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。組換え体プラークを３回のプラーク精製により精製し、さらなる分析のために増幅した。組換えウイルスｖＣＰ１６２は、カナリヤポックスウイルスのＣ６座にＦＨＶ−１  ｇＤコード配列を含有する。
【実施例５８】
【０９４８】
ｖＣＰ１６２の発現分析
フランス、ローンメリクス、Ｄ．ファーギュードから得たヒツジ抗ＦＨＶ−１  ｇＤ多クローン性血清を用いて前述したように（テイラーら、1990）、蛍光抗体法アッセイを行なった。組換え体ｖＣＰ１６２は、強烈な内部並びに表面蛍光を示し、感染細胞の表面にＦＨＶ−１  ｇＤ糖タンパク質の発現を示した。
【０９４９】
同一の抗血清を用いて免疫沈降を行ない、発現されたＦＨＶ−１  ｇＤ産生物の真正を決定した。この方法は、前述した方法にしたがって行なった（テイラーら、1990）。ヒツジ抗ＦＨＶ−１  ｇＤ血清は、組換えウイルスｖＣＰ１６２に感染した細胞から誘導した溶解産物から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上で６０ｋＤａの見かけの分子質量を有する産生物を沈殿せしめた（ドリファスら、1984）。未感染細胞または親カナリヤポックスウイルス（ＣＰｐｐ）に感染した細胞からはタンパク質はまったく沈殿しなかった。
【実施例５９】
【０９５０】
ＨＡＮＴＡＡＮウイルスＧ１およびＧ２糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生
昆虫ポックスウイルス４２ｋＤａプロモーターの制御下で、Ｍ断片をＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣベクターに挿入することにより、ハンターン（Ｈａｎｔａａｎ）ウイルスＧ１およびＧ２糖タンパク質の発現を行なった。これらのウイルスベクターに挿入するポックスウイルス発現カセットは以下のようにして産生した。
【０９５１】
ハンターンウイルスＭ断片のｃＤＮＡクローンをシュマルジョンらにより記載されたように（1987）誘導し、Ｄｒ．Ｊ．ダルリンプル（ＭＤ、フレデリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得て、プラスミドベクターｐＴＺ１９Ｒ（ＮＪ、ピスキャタウェイ、ファーマシア）に挿入した。ｃＤＮＡの全配列は、以前にシュマルジョンらにより示した（1987）。テンプレートとしてＭ断片ｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＴＺ１９ＲおよびオリゴヌクレオチドＨＭ５Ｐ（配列認識番号３３５）
【化２４６】
0003624911.tif 000282
【０９５２】
とＨＭ３Ｐ（配列認識番号３３６）
【化２４７】
0003624911.tif 000283
【０９５３】
を用いて、Ｍ断片コード配列の３２６ｂｐ  ５′側領域を誘導した。この３２６ｂｐ断片を、テンプレートとしてのｐＡＭ１２およびオリゴヌクレオチドＲＧ２７３（配列認識番号１４２）
【化２４８】
0003624911.tif 000284
【０９５４】
とＲＧ２７４（配列認識番号１４３）
【化２４９】
0003624911.tif 000285
【０９５５】
を用いて得た４２ｋＤａプロモーター要素を含有する１０７ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片に融合した。テンプレートとしての１０７ｂｐと３２６ｂｐの断片およびオリゴヌクレオチドＲＧ２７３（配列認識番号１４２）とＨＭ３Ｐ（配列認識番号３３６）の等モル混合物を用いて、ＰＣＲ融合を行なった。融合断片をＨｉｎｄＩＩＩ（５′末端）とＢｃｌＩ（３′末端）で切断し、３４３ｂｐ断片を産生した。
【０９５６】
プラスミドｐＡＭ１２を以下のように誘導した。Ａｍｓａｃｔａ  ｍｏｏｒｅｉ昆虫ポックスウイルス（ＡｍＩＰＶ）から単離したゲノムＤＮＡをＣｌａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離した。高度に転写されたＡｍＥＰＶ遺伝子を含有することが以前に同定された２．６ｋｂ断片をゲルから精製し、ｐＢＳ−ＳＫ+ のＣｌａＩ部位にクローニングし、ｐＡＭ１２を産生した。この断片のＤＮＡ配列分析により、４２ｋＤａの完全ＯＲＦが明らかになった。この遺伝子からの５′未翻訳配列（ＡｍＥＰＶ  ４２ｋＤａプロモーター）は、ワクシニアとアビポックスウイルスにおける強い、初期プロモーターとして機能することが続いて示された。
【０９５７】
Ｍ断片コード配列の３′側７４８ｂｐを、テンプレートとしてｐＴＺ１９Ｒ中に得られたｃＤＮＡクローンおよびオリゴヌクレオチドＨＭＴＳ−５（配列認識番号３３７）
【化２５０】
0003624911.tif 000286
【０９５８】
とＨＭＴＳ−３（配列認識番号３３８）
【化２５１】
0003624911.tif 000287
【０９５９】
を用いたＰＣＲにより誘導した。これらの注文合成オリゴヌクレオチドによるこの断片の合成は、１）５′末端でのＥｃｏＲＶ部位と３′側配列を含有し、２）ヌクレオチド位置２６７８−２６９３でＴ5 ＮＴ配列モチーフを分断し（ユエンおよびモス、1987）、３）コード配列の３′末端部位でＥｏＲＩ部位およびＴ5 ＮＴ要素を加える。この断片をＥｃｏＲＩで切断し、７４１ｂｐ  ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片を産生した。７４１ｂｐ  ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入し、プラスミドｐＢＳＨＶＭ３Ｐを産生した。
【０９６０】
ｐＴＺ１９Ｒ中にＭ特異的ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドを用いて、ＧＭ４８（Ｄａｍ- ）細菌細胞（ＭＤ、ゲイサースブルグ、ＢＲＬ）を転換した。この細菌菌株から誘導したプラスミドＤＮＡをＢｃｌＩとＥｃｏＲＶで切断し、２３６２ｂｐ断片を産生した。この２３６２ｂｐ断片を、コード配列の５′側領域に融合された４２ｋＤａプロモーターを含有する３４３ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｃｌＩ断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢＳＨＶＭ３Ｐに挿入した。全縁Ｍ断片発現カセットを含有する産生したプラスミドをｐＢＳＨＶＭと称した。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ｐＢＳＨＶＭから全縁Ｍ断片カセットを切除した。３５０８ｂｐ誘導断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉのクレノウ断片でブラントエンドした。ブラントエンドした断片をｐＳＤ５５０に挿入して、ｐＨＶＭＶＣを産生した。
【０９６１】
プラスミドｐＳＤ５５０を以下のように誘導した。プラスミドｐＳＤ５４８（タータグリアら、1992）は、Ｉ４Ｌ  ＯＲＦ（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）がＢｇｌＩＩとＳｍａＩ部位からなるクローニング領域により置換されたワクシニアベクタープラスミドである。多重クローニング領域を延長するために、ｐＳＤ５４８をＢｇｌＩＩとＳｍａＩで切断し、アニールした補体合成オリゴヌクレオチド５３９Ａ（配列認識番号３３９）
【化２５２】
0003624911.tif 000288
【０９６２】
および５３９Ｂ（配列認識番号３４０）
【化２５３】
0003624911.tif 000289
【０９６３】
に連結した。産生したプラスミド、ｐＳＤ５５０において、多重クローニング領域は、ＢｇｌＩＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含有する。
【０９６４】
プラスミドｐＨＶＭＶＣを治療ウイルスとしてのｖＰ８０４（タータグリアら、1992）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて、ｖＰ８８２を産生した。放射線標識したＭ特異的ＤＮＡプローブを用いた標準方法（ピッチーニら、1987）にしたがって、現場でのハイブリダイゼーションにより、組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により、組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。組換えウイルス、ｖＰ８８２は、ワクシニアウイルスのＩ４Ｌ座にハンターンＭ断片を含有する。Ｉ４Ｌ読取り枠とｖＰ８０４バックグラウンド中のＭ断片カセットとの置換により、ＮＹＶＡＣ−等量ウイルスバックグラウンドが作られる（タータグリアら、1992）。
【０９６５】
Ｍ断片カセット（上述）を含有する、ｐＢＳＨＶＭから誘導した３５０８ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐＣ４Ｉに挿入した。プラスミドｐＣ４Ｉを以下のように誘導した。ＣＰｐｐからの６．５ｋｂ  ＮｓｉＩ断片をｐＢＳ−ＳＫ+ のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＸＸ−４を産生した。ＤＮＡ配列分析により、座中のＣ４挿入物を含有した完全読取り枠ＯＲＦを同定した。Ｃ４  ＯＲＦが欠損した供与体プラスミドを構築するために、オリゴヌクレオチドＲＧ２８７（配列認識番号３４１）
【化２５４】
0003624911.tif 000290
【０９６６】
ＲＧ２９３（配列認識番号３４２）
【化２５５】
0003624911.tif 000291
【０９６７】
ＲＧ２８９（配列認識番号３４３）
【化２５６】
0003624911.tif 000292
【０９６８】
およびＲＧ２９０（配列認識番号３４４）
【化２５７】
0003624911.tif 000293
【０９６９】
をプライマーとして用い、ｐＸＸ４からのＣ４  ＯＲＦの５′および３′未翻訳領域を増幅した。精製したＰＣＲ断片をＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位でのｐＢＳ−ＳＫ+ に挿入した。産生したプラスミド、ｐＣ４Ｉは、完全ＯＲＦが翻訳およびワクシニア初期転写終止シグナルを側腹に有する多重クローニング部位と置換されたＣ４の５′および３′未翻訳領域（各２０１ｂｐ）を含有する（ユエンおよびモス、1987）。
【０９７０】
Ｍ断片カセットのｐＣ４Ｉへの挿入により、プラスミドｐＣ４ＨＶＭが産生した。ｐＳＤ５１３から誘導した１００ｂｐのＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片の挿入のために、プラスミドｐＣ４ＨＶＭをＳｍａＩで線状化した（実施例７に定義した）。産生したプラスミドをｐＣ４ＨＶＭＶＱと称した。プラスミドｐＣ４ＨＶＭＶＱをＳｍａＩで切断し、続いて部分的なＨｉｎｄＩＩＩでの切断により、Ｍ断片カセットを含有する３．６ｋｂ断片を回収した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、ＳｍａＩ切断したｐＳＰＣＰＣ３Ｌに挿入し、ｐＣ３ＨＶＭＶＱ（実施例３２に定義した）を産生した。
【０９７１】
供与体プラスミドとしてｐＣ３ＨＶＭＶＱおよび治療ウイルスとしてＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）を用いて、初代鶏胚繊維芽細胞に、生体外組換え実験を行なった。標準プロトコルを用いて組換えウイルスを同定し、精製した（上述；ピッチーニら、1987）。ハンターンウイルスＭ断片を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え体をｖＣＰ１１４と称した。
【実施例６０】
【０９７２】
ハンターンウイルスＳコード配列を含有するＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの制御下で、Ｓ断片をＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベクターに挿入することにより、ハンターンウイルス核タンパク質の発現を行なった（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）。これらのウイルスベクター中に挿入したポックスウイルス発現カセットは以下のように構築した。
【０９７３】
ハンターンウイルスＳ断片のｃＤＮＡクローンをシュマルジョンらにより記載されたように（1987）誘導し、Ｄｒ．ジョエル  ダルリンプル（ＭＤ、フレデリック、Ｆｔ、デトリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得て、プラスミドベクターｐＧＥＭ−１（ＷＩ、マジソン、プロメガバイオテック）に挿入した。Ｓ断片の全縁配列は以前に記載している（シュマルジョンら、1986）。
【０９７４】
テンプレートとしてプラスミドｐＩ４ＬＨ６ＨＩＶ３ＢおよびオリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）
【化２５８】
0003624911.tif 000294
【０９７５】
とＨＴＨ６３Ｐ（配列認識番号３４６）
【化２５９】
0003624911.tif 000295
【０９７６】
を用いたＰＣＲにより、Ｈ６プロモーター要素を増幅した。この１５０ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片は、５′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、Ｓ断片コード配列の５′側領域を含有する３′末端での２８ｂｐの延長部を有する。
【０９７７】
オリゴヌクレオチドＨＴＳ５Ｐ（配列認識番号３４７）
【化２６０】
0003624911.tif 000296
【０９７８】
およびＧＰＳ５ＰＮＣＩ（配列認識番号３４８）
【化２６１】
0003624911.tif 000297
【０９７９】
並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンでのＰＣＲにより、Ｓ断片コード配列の５′末端を合成した。５６０ｂｐのＰＣＲ誘導断片を、オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）およびＨＴＳ５ＰＮＣＩ（配列認識番号３４８）を用いたＰＣＲにより融合した。ＰＣＲ誘導融合産生物をＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｉＩで切断した。
【０９８０】
オリゴヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ（配列認識番号３４９）
【化２６２】
0003624911.tif 000298
【０９８１】
およびＨＰＳ５５ＰＮ（配列認識番号３５０）
【化２６３】
0003624911.tif 000299
【０９８２】
並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣＲにより、ハンターンウイルスＳ断片の中央領域を産生した。５８１ｂｐ断片は、その３′末端でＰｓｔＩ部位を含有し、５′末端はＳ断片の位置４９９のＮｃｉＩ部位を含有する（シュマルジョンら、1986）。さらに、オリゴヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ（配列認識番号３４９）を使用することにより、アミノ酸配列を改変することなく、位置１０２９から１０３５までのＴ5 ＮＴ要素を除去する。次いでこの断片をＮｃｉＩとＰｓｔＩで切断した。Ｈ６プロモーターに融合されたコード配列の５′末端を含有するＰＣＲ断片（上述のようにＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｉＩ切断した）を、Ｓ断片の中央領域を含有する５８１ｂｐ  ＮｃｉＩ／ＰｓｔＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＴＳＨ６５Ｐと称した。
【０９８３】
オリゴヌクレオチドＨＴＳ３ＰＸＢＡ（配列認識番号３５１）
【化２６４】
0003624911.tif 000300
【０９８４】
およびＴ５ＨＴ５ＰＳＰ（配列認識番号３５２）
【化２６５】
0003624911.tif 000301
【０９８５】
並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣＲによりＳ断片の３′側４３８ｂｐを誘導した。この断片の５′末端は、Ｓ断片コード配列の位置１０３９に位置するＰｓｔＩ部位を含有し（シュマルジョンら、1986）、３′末端は、Ｔ5 ＮＴ配列モチーフおよび特有ＸｂａＩ部位を含有する。ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫへの挿入の前に、この断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで切断し、ｐＢＳＨＴＳ３Ｐを産生した。
【０９８６】
全縁Ｓ断片発現カセットを産生するために、１１２２ｂｐ  ＰｓｔＩ／部分的ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＢＳＨＴＳＨ６５Ｐから誘導した。この断片を、ｐＢＳＨＴＳ３Ｐからの２９０ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断ｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生したプラスミドを、ＸｂａＩで線状化し、続いて部分的なＨｉｎｄＩＩＩでの切断し、ｐＢＳＨＶＳと称した。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドし、次いでｐＳＤ５４１のＳｍａＩ部位に挿入して、ｐＡＴＩＨＶＳを産生した。
【０９８７】
プラスミドｐＡＴＩＨＶＳを、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とｖＰ８８２とともにベロ細胞での生体外組換え実験に用いた。これは、標準プロトコルにより行なった（ピッチーニら、1987）。放射線標識したＳ断片特異的ＤＮＡプローブを用いた前述したプラークハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、1987）により組換えウイルスから誘導したプラークを同定した。それぞれ治療ウイルスｖＰ８６６およびｖＰ８８２を用いて回収したウイルスに関して、産生した組換え体をｖＰ９５０およびｖＰ９５１と称した。組換えウイルス、ｖＰ９５０は、ＡＴＩ部位にＳ断片発現カセットを含有し、ｖＰ９５１は、同一の座にこのカセットを含有するが、ｖＰ８８２を含有するＭ断片による治療のために、Ｉ４Ｌ座にもＭ断片を含有する。
【０９８８】
プラスミドｐＢＳＨＶＭをＳａｌＩで線状化し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このプラスミドを、ハンターンＳ断片発現カセットを含有するｐＢＳＨＶＳから誘導した１．４ｋｂ  ＸｂａＩ／部分的ＨｉｎｄＩＩＩ（上述したようにクレノウでブラントエンドした）断片に連結した。誘導したプラスミドをｐＢＳＨＶＭＳと称した。このプラスミドは、頭対頭（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｈｅａｄ）の配置でＭおよびＳカセットを含有した。プラスミドｐＢＳＨＶＭＳをＸｈｏＩで線状化し、クレノウでブラントし（上述したように）、ｐＳＤ５１３（実施例７で定義した）からの１００ｂｐ  ＳｓｐＩ／ＳｍａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＶＭＳＶＱを産生した。
【０９８９】
プラスミドｐＢＳＨＶＭＳＶＱをＳｌａＩ／Ａｓｐ７１８で切断し、Ｓ断片発現カセットを含有する１．５ｋｂの断片を離生した。この断片を２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドし、ｐＳＰＣＰ３Ｌ（実施例３２に定義した）のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＣ３ＨＶＳＶＱを産生した。
【０９９０】
プラスミドｐＣ３ＨＶＳＶＱを、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに初代鶏胚繊維芽細胞での生体外組換え実験に用いた。これは、プラーク同定、プラーク精製、およびウイルス増幅のような標準方法を用いて行なった（ピッチーニら、1987）。産生した組換え体をｖＣＰ１１９と称した。この組換え体は、ＡＬＶＡＣのＣ３座にＳ断片を含有する。
【実施例６１】
【０９９１】
ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのハンターンウイルスＭおよびＳ断片組換え体の発現分析
Ｇ１、Ｇ２、またはウサギ抗ハンターン多クローン性血清に特異的な単クローン性抗体のプールのいずれかを用いて、前述したように蛍光抗体法アッセイを行なった（テイラーら、1990）。全ての血清は、Ｄｒ．Ｃ．シュマルジョン（ＭＤ、フレデリック、Ｆｔ．デトリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得た。Ｍ断片のみ（ｖＰ８８２、およびｖＣＰ１１４）またはＳ断片との組合せ（ｖＰ９５１）を含有する組換えウイルスは、上述した抗血清のいずれを用いても強い表面蛍光を示し、感染細胞の表面にＧ１およびＧ２の糖タンパク質の両方の発現を示した。核タンパク質が感染細胞の表面には現れないので、Ｓ断片のみを含有する組換え体（ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９）を用いては、表面蛍光は観察されなかった。しかしながら、ウサギ抗ハンターン血清を用いての組換え体、ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９に関しては、内部蛍光が観察された。
【０９９２】
同一の抗血清を用いて免疫沈降を行なって、発現したＧ１、Ｇ２、およびＳ遺伝子産生物の真正を測定した。この方法は、前述した方法にしたがって行なった（テイラーら、1990）。Ｇ１に特異的な単クローン性抗体プールは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上で、組換えウイルスｖＰ８８２、ｖＰ９５１、およびｖＣＰ１１５４に感染した細胞から誘導した溶解産物から６４ｋＤａの見かけの分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた（ドリファスら、1984）。未感染細胞、または親（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ）に感染した細胞もしくはＳ断片のみを含有する組換えウイルス（ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９）に感染した細胞から誘導した溶解産物からはタンパク質は沈殿しなかった。沈殿したポリペプチドが約５０−５５ｋＤａの分子質量を有したことを除いては、Ｇ２に特異的な単クローン性抗体プールを用いては同様の結果が得られた。これらのサイズのタンパク質（６４ｋＤａおよび５０−５５ｋＤａ）は、それぞれＧ１およびＧ２タンパク質のサイズと一致する（シュマルジョンら、1990）。
【０９９３】
ウサギ抗ハンターンは、ｖＰ９５１に感染した細胞から誘導した溶解産物から、Ｇ１、Ｇ２および核タンパク質の発現と一致する６４ｋＤａ、５０−５５ｋＤａ、および４８ｋＤａの見かけの分子量を有する３つのタンパク質種を沈殿せしめた。同一の血清は特異的に、ｖＰ８８２およびｖＣＰ１１４感染細胞溶解産物からはＧ１およびＧ２（６４ｋＤａ、５０−５５ｋＤａ）種を、ｖＰ９５０およびｖＣＰ１１９感染細胞溶解産物からは核タンパク質（４８ｋＤａ）を沈殿せしめた。未感染細胞またはＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ親ウイルスに感染した細胞から誘導した溶解産物からはそのようなタンパク質は沈殿しなかった。
【実施例６２】
【０９９４】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子のＡＬＶＡＣ挿入プラスミドへの挿入
ＡＬＶＡＣ  Ｃ５挿入プラスミドｐＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ１８（実施例４４に定義した）をＢａｍＨＩで切断し、キナーゼしてアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３８／ＭＰＳＹＮ４３９（配列認識番号３５３／３５４）に連結した。
【化２６６】
0003624911.tif 000302
【０９９５】
産生したプラスミド、ｐＭＰＣ５Ｓｍａは、リンカー領域のＢａｍＨＩ部位の隣にＳｍａＩ部位を含有する。
【０９９６】
ｐＭＰ５５０Ｅ３１１ｐｓ（ここの他のＨＢＶの実施例に定義した）をＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ（部分的）で切断し、ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターの制御下でＨＢＶ  ｌｐｓＡｇを含有する１．２ｋｂの断片を単離し、ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰＣ５Ｓｍａに連結し、プラスミドｐＭＰＣ５Ｌを産生した。ｐＭＰＣ５ＬをＳｍａＩ（部分的）で切断し、単位長さ（４ｋｂ）断片を単離した。この断片をＮｒｕＩで切断し、最大の帯（４ｋｂ）を単離した。
【０９９７】
ｐＧＪ１５（実施例１３で定義した）をＳｍａＩ（部分的）とＮｒｕＩで切断し、ＨＢＶ  ｓｐｓＡｇおよびＨ６プロモーターの２４ｂｐを含有する０．９ｋｂ断片を単離し、ｐＭＰＣ５Ｌからの４ｋｂ  ＳｍａＩ／ＮｒｕＩベクター断片に連結し、プラスミドｐＭＰＣ５ＬＳを産生した。
【実施例６３】
【０９９８】
ＳＰＳＡＧおよびＬＰＳＡＧをコードするＨＢＶ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入
Ｃ５挿入座にＨＢＶ  ｌｐｓＡｇおよびｓｐｓＡｇの両方を含有するｐＭＰＣ５ＬＳを、ＡＬＶＡＣに関する組換え体の供与体プラスミドとして用い、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１５７を産生した。
【０９９９】
ｖＣＰ１５７のＨＢＶタンパク質の発現
ＡＬＶＡＣ−ＨＢＶ二重組換え体ｖＣＰ１５７に感染した細胞からの代謝的に標識した溶解産物に、ウサギ抗Ｓ２血清を用いて免疫沈降を行ない、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラフにより分析した。ｌｐｓＡｇ（４１ｋＤａ、３８ｋＤａ）およびｓｐｓＡｇ（３６ｋＤａ、３３ｋＤａ）の正確なサイズのタンパク質を観察した。これらのタンパク質は、対照として用いたｓｐｓＡｇまたはｌｐｓＡｇを発現するＮＹＶＡＣ単体ＨＢＶ組換え体により産生された同一のタンパク質とともに移動した。
【実施例６４】
【１０００】
ＳＰＳＡＧ、ＬＰＳＡＧおよびＳ１２／コア融合をコードするＨＢＶ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入
Ｃ５挿入座にＨＢＶ  ｌｐｓＡｇおよびｓｐｓＡｇ遺伝子並びにＳ１２／コア融合を特定する遺伝子の両方を含有するｐＭＰＣ５ＬＳＣをＡＬＶＡＣに関する組換えの供与体プラスミドとして用い、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６９を産生した。
【実施例６５】
【１００１】
ＨＢＶ遺伝子を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体：ウサギ、マウスおよびモルモットからの免疫学的データ
ウサギ、マウスおよびモルモットに、ＮＹＶＡＣベースのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）組換え体ｖＰ８５６、ｖＰ９３０、ｖＰ９３２およびｖＰ９７５を接種した（実施例１３）。ｖＰ８５６は、表面抗原の中間（Ｍ）形状であるｓｐｓＡｇを発現する。ｖＰ９３０は、表面抗原の大型（Ｌ）形状であるｌｐｓＡｇを発現する。ｖＰ９３２は、ｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの両方を発現する。ｖＰ９７５は、ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇおよびコア抗原に融合される表面抗原ｐｒｅＳ１＋ｐｒｅＳ２領域からなる融合タンパク質を発現する。ＡＵＳＡＢ試験（アボット）を用いて、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体について、およびＣＯＲＡＢ競合ラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いて、ＨＢＶコア抗原に対する抗体について、血清を分析した。ＨＢＶ  ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域に対する抗体をＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を表３４から４０に示す。
【表３４】
0003624911.tif 000303
【表３５】
0003624911.tif 000304
【表３６】
0003624911.tif 000305
【表３７】
0003624911.tif 000306
【表３８】
0003624911.tif 000307
【表３９】
0003624911.tif 000308
【表４０】
0003624911.tif 000309
【実施例６６】
【１００２】
ポックスウイルス中の細菌遺伝子の発現：ポックスウイルス中の破傷風毒素断片Ｃ（Ｃ．ＴＥＴＡＮＩ）
Ｃ．ｔｅｔａｎｉは、クロストリジウム属、胞子形成嫌気菌の細菌である；Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍもまたその属に含まれる。Ｃ．Ｔｅｔａｎｉは、感染に観察される麻痺効果に主に原因となる毒素、テタノスパスミン（ｔｅｔａｎｏｓｐａｓｍｉｎ）（ＴＴ）を産生する。ＴＴは、１本の１５０ｋＤａの軽鎖および細菌から放出された１００ｋＤａの重鎖である。重鎖は、穏やかなタンパク質分解処理により２つの断片、ＢおよびＣ（４５ｋＤａおよび５５ｋＤａ）を産生する。この実施例は、本発明のウイルスが、Ｃ．ｔｅｔａｎｉの断片Ｃのような免疫原細菌遺伝子産生物を発現するのに用いられることを示す。
【１００３】
発現カセットは、一連のポリメラーゼ連鎖反応により産生される。この方法は、天然破傷風毒素配列に存在するＴＴＴＴＴＡＴ初期転写終止シグナル（ユエンおよびモス、1987）を除去するのに必要であった（イーゼルら、1986；フェアウェザーおよびリネス、1986）。
【１００４】
プライマーＨ６ＴＥＴＣ（配列認識番号３５５）
【化２６７】
0003624911.tif 000310
【１００５】
およびＴＥＴＦＩＸ２（配列認識番号３５６）
【化２６８】
0003624911.tif 000311
【１００６】
を用いてプラスミドｐＳＳ１２６１（ハルパーンら、1990）からＰＣＲによりＨ６プロモーター連結した断片Ｃを誘導した。構成の残りのコード領域は、プライマーＴＥＴＦＩＸ１（配列認識番号３５７）
【化２６９】
0003624911.tif 000312
【１００７】
およびＴＥＴＥＮＤ（配列認識番号３５８）
【化２７０】
0003624911.tif 000313
【１００８】
を用いて、プラスミドｐＳＳ１２６１のＰＣＲ増幅により、構成のコード領域の残りを産生される。これらのコード配列は、プライマーＨ６ＴＥＴＣ（配列認識番号３５５）およびＴＥＴＮＤ（配列認識番号３５８）を用いた、これら５５３ｂｐおよび８８１ｂｐ  ＰＣＲ誘導産生物のＰＣＲ増幅により行なわれた。産生した１．４ｋｂのＰＣＲ誘導産生物をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した。１．４ｋｂの断片をアガロースゲルから単離して、同様に単離したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。ヌクレオチド配列分析を行なって、産生したプラスミドｐＢＳＴＥＴＣ中に挿入物を確認した。ＴからＣのサイレント置換がこのプラスミド中に発見され、これはイーゼルら（1986）の配列における位置３５３５に対応する。
【１００９】
ｐＣ５Ｌ（実施例４４に定義した）をポリリンカー内のＡｓｐ７１８とＮｒｕＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２６（配列認識番号３５９）
【化２７１】
0003624911.tif 000314
【１０１０】
およびＣＰ２７（配列認識番号３６０）
【化２７２】
0003624911.tif 000315
【１０１１】
（不能Ａｓｐ７１８部位、６つの読取り枠中の翻訳終止コドン、ワクシニア初期転写終止シグナル（ユエンおよびモス、1987）、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、およびＳｍａＩ制限部位、ワクシニア初期転写終止シグナル、６つの読取り枠中の翻訳終止コドン、および不能ＮｏｔＩ部位を含有する）に連結し、プラスミドｐＣ５ＬＳＰを産生した。オリゴヌクレオチドＣＰ３０（配列認識番号３６１）
【化２７３】
0003624911.tif 000316
【１０１２】
およびＣＰ３１（配列認識番号３６２）
【化２７４】
0003624911.tif 000317
【１０１３】
を用いて、プロモーターを含有するプラスミドからＰＣＲにより初期／晩期Ｈ６ワクシニアウイルスプロモーター（パーカスら、1989）を誘導した。このＰＣＲ産生物をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ（ＰＣＲにより５′および３′末端で産生した部位）で切断し、同様に切断したｐＣ５ＬＳＰに連結し、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを産生した。ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰをＥｃｏＲＩで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、自己アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列認識番号３６３）
【化２７５】
0003624911.tif 000318
【１０１４】
に連結し、ＮｏｔＩで切断し、線状精製して自己連結した。この方法によりｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰにＮｏｔＩ部位を導入し、ｐＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ１８を産生した。ｐＢＳＴＥＴＣからの１．４ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ断片を単離し、同様に切断したｐＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ１８に連結し、ｐＣ５ＴＥＴＣを産生した。
【１０１５】
ＰＣＲとプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）
【化２７６】
0003624911.tif 000319
【１０１６】
およびＨ６ＰＣＲ２（配列認識番号３６５）
【化２７７】
0003624911.tif 000320
【１０１７】
を用いて、合成Ｈ６プロモーター（パーカスら、1989）を含有するプラスミドからＥｃｏＲＶにつながったＨ６プロモーターを誘導し、５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位を産生した。この１２２ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断し、同様に切断したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドｐＢＳＨ６を産生した。ヌクレオチド配列分析により挿入物を確認した。ｐＣ５ＴＥＴＣからの１．４ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ断片を切除して、同様に切断したｐＢＳＨ６に連結し、ｐＨ６ＴＥＴＣを産生した。
【１０１８】
次いで全縁Ｈ６断片Ｃカセットを含有するｐＨ６ＴＥＴＣからの１．５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片をｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）に連結し、ｐＴＫＴＥＴＣを産生した。
【１０１９】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１６１およびｖＰ１０７５が真正断片Ｃを発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、親ウイルス、ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）またはｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）に感染せしめたか、または１０ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でｖＣＰ１６６１またはｖＰ１０７５に感染せしめた。細胞を、感染せしめ、［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）中でインキュベーションし、溶解せしめ、テイラーらにより記載された（1990）ように、マウス単クローン性抗体（ＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイム、クローン４９．４）および第２抗体としてのヤギ抗マウス抗血清を用いて沈殿せしめた。溶解産物を通常のマウス血清およびタンパク質Ａセファロースで前浄化した。
【１０２０】
単クローン性抗体は特異的に、約４７ｋＤａに対応する種をｖＣＰ１６１およびｖＰ１０７５感染細胞から沈殿せしめた。ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）またはｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）感染細胞からは類似のタンパク質種は沈殿しなかった。４７ｋＤａサイズは、天然破傷風毒素のパパイン切断により産生された断片Ｃ並びにｖＣＰ１６１およびｖＰ１０７５によりコードされたものと同一のＥ．ｃｏｌｉ産生組換え断片ＣＩ関してマコフら（1989）による観察と一致する。
【実施例６７】
【１０２１】
ブタ中のＮＹＶＡＣベースの仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）組換え体の効果
４匹の子豚の６つの群に、ＮＹＶＡＣベースのｇＩＩ組換え体（ｖＰ８８１）、ｇＩＩＩ組換え体（ｖＰ８８３）、ｇｐ５０組換え体（ｖＰ９００）、ＮＹＶＡＣ親ウイルス（ｖＰ８６６）、市販の不活性化仮性狂犬病ウイルスワクチン、または仮性ワクチンとしてウシ胎仔血清を含有するイーグルＭＥＭのいずれかに感染せしめた。全てのブタに、筋内経路により２８日の間隔で２回投与した。親または組換えＮＹＶＡＣウイルスを投与されたブタに、接種当たり約１０6 ＴＣＩＤ50で接種した。感染から１２日間に亘り、全てのブタを体温と臨床の徴候について監視した。組換え体または親ＮＹＶＡＣウイルスでのワクチン接種に対しては部分的なまたは全身的な副作用は観察されなかった。
【１０２２】
仮性狂犬病ウイルスに対する血清中和抗体を、接種から１、２、および４週間後に監視した。表４１から明確なように、不活化ワクチン標品のみが１回の接種後に著しい仮性狂犬病ウイルス血清中和力価を誘発できた。しかしながら、２回の接種後では、全ての３つのＮＹＶＡＣベースの組換え体が識別できる仮性狂犬病ウイルス血清中和力価を誘発することができた（表４２）。力価は、仮性狂犬病ウイルスｇｐ５０糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体について最も著しかった。実際、ＮＹＶＡＣ組換え体を発現するｇｐ５０により誘発された力価は、市販されている不活化ワクチンの２回の接種に得られた水準に相当した（表４２）。
【１０２３】
２回の免疫から４週間後、鼻腔内点滴注入により、全てのブタに約１０5 ＰＦＵの毒性仮性狂犬病ウイルス菌株を抗原投与した。予期したように、仮性および親ＮＹＶＡＣワクチン接種対照は全て、最も厳しい臨床症候を示し、鼻と口咽頭スワブにより単離した仮性狂犬病ウイルスの最高水準は、抗原投与から１４日後までであった。ＮＹＶＡＣベースの仮性狂犬病ウイルス組換えウイルスは、対照と比較して、毒性仮性狂犬病ウイルス抗原投与の効果（すなわち、臨床症候およびウイルス単離）を減少し、組換えウイルスを発現するｇｐ５０が最も有効であった。実際、この組換え体は、市販の不活化仮性狂犬病ウイルスワクチンと同程度に効果的である。
【１０２４】
他のヘルペスウイルスのようにＰＲＶは、ストレスまたはコルチコステロイドの投与により再活性化される潜伏性感染を発達せしめる可能性を有するので（ホイットマンおよびジハ、1989）、そのような感染に対するＮＹＶＡＣ組換え体の防御効果を評価するために、２匹のブタの群に関して実験を行なった。プロトコルには、以下のスケジュールにおいてブタにデキサメタゾンを投与することが必要であった：１日目に静脈経路により１．２５ｍｇ／ポンドおよび静脈経路により０．２５ｍｇ／ポンド。以後、４日間に亘り約１２時間ごとにデキサメタゾンの投与（０．５ｍｇ／ポンド）を行なった。鼻（Ｎ）と喉（Ｔ）のスワブを用いてデキサメタゾン処理後０日から１０日まで、ウイルスの放出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を評価した。結果を表４３に示す。これらの結果は明らかに、潜伏性ＰＲＶ感染の成立に対する防御におけるＮＹＶＡＣベースのＰＲＶ組換えウイルスの効果を示した。この基準により、ＮＹＡＶＣ−ｇＩＩ（ｖＰ８８１）は十分に最も有効である。
【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【１０２５】
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【実施例６８】
【１０２６】
ベクターとしてのＮＹＶＡＣ．１（ｖＰ９５４）の使用
ＮＹＶＡＣ．１（ｖＰ９５４）（実施例１７）において、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）中の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損は、Ｋ３Ｌを通じて、その右側の、欠損がインターフェロンに対する感度を高める遺伝子まで拡張せしめられる（ビーティーら、1991）。狂犬病糖タンパク質の免疫ベクター並びに以下に記載するような麻疹ＨＡおよびＦ遺伝子の免疫ベクターとしてＮＹＶＡＣ．１を試験した。
【１０２７】
狂犬病糖タンパク質遺伝子のｖＰ９５４への挿入；ワクシニア組換え体ｃＰ１００６の産生
ＴＫ欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセットを含有する、供与体プラスミドｐＲＷ８４２（実施例７）を、治療ウイルスとしてのｖＰ９５４とともに組換えに用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇコード配列に対する32Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ１００６を同定した。
【１０２８】
麻疹ＨＡ、Ｆをコードする遺伝子のｖＰ９５４への挿入；ワクシニア組換え体ｖＰ１０１５の産生
ＴＫ挿入座に麻疹Ｆおよび麻疹ＨＡの両方の発現カセットを含有する、ｐＲＷ８５７（実施例９）を、ｖＰ９５４治療ウイルスとともに組換えのための供与体プラスミドとして用いた。麻疹ＨＡおよび麻疹Ｆのコード配列の両方に対する32Ｐ標識プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスｖＰ１０１５を同定した。
【１０２９】
免疫ビヒクルとしてのＫ３ＬのないＮＹＶＡＣ．１ベースのベクターの効能；狂犬病Ｇ組換え体ｖＰ１００６
生後４から６週間のマウス（ウイルスごとで希釈ごとに１０匹）に、ｖＰ１００６、ｖＰ９５４（ｖＰ１００６の親）、ｖＰ８７９（ＮＹＶＡＣベースの狂犬病Ｇ、実施例７）、またはワクシニア狂犬病１８７  ＸＰ１2 の未希釈、１０-2、１０-4、または１０-6のいずれかを接種した。接種は、足のパッドによりマウスごとに５０−１００μｌで行なった。接種から１４日後に、全てのマウスに、２０ＬＤ50のＣＶＳ菌株（０．０３ｍｌ中）を大脳半球間接種により抗原投与した。生存したマウスを数え、防御投与量５０％（ＰＤ50）を計算した。
【１０３０】
表４４に示すように、ｖＰ１００６の親ウイルス、ｖＰ９５４は、最高量の接種物でさえも生狂犬病抗原投与からマウスを防御しなかった。組換えウイルス１８７  ＸＰ１２（キーニーら、1984）、ｖＰ８７９、およびｖＰ１００６は全て、生狂犬病抗原投与からマウスを防御する能力を示した。しかしながら、この能力におけるこれらのウイルスの相対的な効能は、ＰＤ50値により示したように（表４４）異なる。
【１０３１】
麻疹ウイルス組換え体ｖＰ１０１５
２匹のウサギに、０日と２８日に皮下経路により８．０ｌｏｇ10ＰＦＵのｖＰ１０１５を接種した。０、１４、２１、２８、３５、４２および４９日目に、連続の採血を行なった。アルブレヒトら（1981）により記載されたプラーク退行（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）中和法を用いたウイルス中和抗体の存在に関して血清を分析した。
【１０３２】
この分析により結果を表４５に示す。両方の動物は、１回のｖＰ１０１５の接種後に血清転化し、動物Ａ１６９は、接種から２週間後に防御水準の抗体を示した。抗体水準における著しい増加が２回目の接種後に観察された。等しいプロトコルにおける、２匹のウサギのＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３；実施例９）による接種の結果を表４５に示す。この結果により、Ｋ２ＬとＫ３Ｌの欠損は、効果的な免疫ビヒクルとして機能するウイルスの能力には影響しないことが示される。
【表４４】
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【表４５】
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【実施例６９】
【１０３３】
ベクターとしてのＮＹＶＡＣ．２（ｖＰ９３８）の使用；狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体ＶＰ９９６の産生
ＮＹＶＡＣ．２（ｖＰ９３８）において（実施例１７）、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）中の［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］欠損が、３８  ＯＲＦ［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］の合計を含むように両方向に拡張される。ＴＫ欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセットを含有する、供与体プラスミドｐＲＷ８４２（実施例７）を、ｖＰ９３８治療ウイルスとともに組換えに用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇコード配列に対する32Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ９９６を同定した。
【１０３４】
ベロ細胞およびＭＲＣ−５細胞での改変ＮＹＶＡＣウイルスの増殖
ワクシニアの左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］および右側［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］末端に近い大型欠損の、組織培養での増殖への効果を実験するために、ＭＲＣ−５細胞とベロ細胞での複製に関してＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）、ｖＰ９３８、ｖＰ９９６および以下の追加のＮＹＶＡＣベースのウイルスを試験した。
【１０３５】
ｖＰ８７９（実施例７）は、ＮＹＶＡＣのＴＫ座に挿入された狂犬病糖タンパク質遺伝子を含有する。
【１０３６】
ｖＰ９５３（実施例１７）は、ＮＹＶＡＣ欠損およびゲノムの右側末端に近い追加の欠損［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］を含有する。
【１０３７】
ｖＰ９９７（実施例１７）は、ＮＹＶＡＣ欠損に加えゲノムの左右の末端の両方に近い追加の欠損を含有する。
【１０３８】
１．５×１０6 での６０ｍｍディッシュ中の感染の２日前に、ベロ細胞（アフリカグリーンサルの肝臓細胞株、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１）およびＭＲＣ−５細胞（ヒトの胎児の肺、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）に接種した。感染時に、全ての細胞は融合性であり、ディッシュは２×１０6 の細胞を含有した。細胞を、ａｒａ  Ｃの有無にかかわらずＭＥＭ＋２％新生ウシ血清（ＮＣＳ）で希釈された（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）、細胞当たり０．１ｐｆｕの多重度でのウイルス（表４６）に感染せしめた。ときどきロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）しながら、感染単層を３７℃で６０分間インキュベーションせしめた。１時間の吸着期間後、細胞をＭＥＭ＋２％  ＮＣＳで２回洗浄し、次いで３ｍｌの、ａｒａ  Ｃの有無にかかわらずＭＥＭ＋２％を添加し、３７℃でインキュベーションした。３回の凍結と解凍により、感染から１時間後と７２時間後に感染細胞を収集した。各試料を、ベロ細胞において２重に滴定した。
【１０３９】
表４６に示すように、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、ヒトＭＲＣ−５細胞において制限された増殖を行なうことができる。ここに試験した条件下で（０．１ｐｆｕ／細胞のｍｏｉ、７２時間のインキュベーション）、ＮＹＶＡＣは、約２ｌｏｇの力価の増大を示した。これらの同一の条件下で、ゲノムの左側（ｖＰ９３８）および右側（ｖＰ９５３）末端の近くに欠損を含む改変ＮＹＶＡＣウイルスは、約１ｌｏｇの力価の増大を示した。両末端の近くに欠損を含有する改変ＮＹＶＡＣ（ｖＰ９７７）からの収集は、入力ウイルスと比較して減少し、ＭＲＣ−５細胞では増幅を示さなかった。これに対して、これらの条件下では、ベロ細胞で試験した全てのウイルスはほぼ同程度増幅した。表４６に示すように、様々な改変ＮＹＶＡＣウイルス欠損変異体に関するベロ細胞での収集と比較したＭＲＣ−５細胞でのワクシニアウイルス収集の百分率は、以下の通りである：ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）３．５％；ｖＰ９３８（ＮＹＶＡＣ．２、左末端欠損）１．４２％；ｖＰ９５３（右末端欠損）０．５％；ｖＰ９７７（左右末端欠損）０．０６％。ＭＲＣ−５細胞でのＮＹＶＡＣベースの狂犬病組換え体ｖＰ８７９およびＮＹＶＡＣ．２ベースの狂犬病組換え体ｖＰ９９６の収集は、それぞれの親ウイルスに関して実質的に同一であり、異種遺伝子の発現は、組織培養中の組換えウイルスの増殖には影響しないことを示す。
【表４６】
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【実施例７０】
【１０４０】
マンプスＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローニング
マンプスウイルスのウラベＡＭ−９菌株は、欧州と日本においてワクチンとしての使用が認可されている生、弱得化ウイルスである。このウイルスは、フランス、マーシールエトイル、メリクス研究所からワクチン標品（イモバクス  オレイロンス）として得た。ウイルスをベロ細胞で増幅させ（２継代）、全ＲＮＡを単離して感染細胞から精製した（チャーグウィンら、1979）。ＡＭＶ逆トランスクリプターゼと任意のプライマーを用いて、このＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡを調製した（ワトソンおよびジャクソン、1985）。ＲＷマンプス菌株からの公表された配列を用いて（ワキサムら、1987；ワキサムら、1988）、ＦおよびＨＮ遺伝子の５′および３′未翻訳領域から一連の特異的なプライマーを合成した。これらのプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により第１の鎖ｃＤＮＡからウラベＡＭ−９  ＦおよびＨＮ遺伝子を増幅した。合成オリゴヌクレオチドＲＧ５０３（配列認識番号３６６）
【化２７８】
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【１０４１】
およびＲＧ４９４（配列認識番号３６７）
【化２７９】
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【１０４２】
を用いてＦ遺伝子を増幅した。ＲＧ５００（配列認識番号３６８）
【化２８０】
0003624911.tif 000330
【１０４３】
およびＲＧ５０１（配列認識番号３６９）
【化２８１】
0003624911.tif 000331
【１０４４】
を用いてＨＮ遺伝子を増幅した。５′プライマー（ＲＧ５０３およびＲＧ５００）をＳａｃＩ部位で、３′プライマー（ＲＧ４９４およびＲＧ５０１）をＡｓｐ７１８部位で切断した。増幅したＦおよびＨＮ断片をＳａｃＩとＡｓｐ７１８で切断し、多重クローニング部位のＳａｃＩとＡｓｐ７１８でのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋にクローニングした。６つのＦ遺伝子クローンと５つのＨＮ遺伝子クローンをＤＮＡ配列していかなる逆トランスクリプターゼまたはＰＣＲのエラーも除去した。第２９図はｐＵＲＦ３（配列認識番号３７０）により示されるコンセンサスＦ配列を提供し、第３０図はｐＵＲＨＮ５（配列認識番号３７１）により示されるコンセンサスＨＮ配列を提供する。
【実施例７１】
【１０４５】
ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドの構築：マンプスＦおよびＨＮ遺伝子
マンプスＦおよびＨＮ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣ組換え体の産生のためのＡＬＶＡＣ供与体プラスミドの全体的な設計を以下に示す。マンプスＦ遺伝子は、昆虫ポックス４２Ｋプロモーター（実施例５９に記載した）に結合せしめられ、マンプスＨＮ遺伝子はワクシニアＨ６プロモーターに結合せしめられている（パーカスら、1989）。２つのプロモートされた遺伝子を５′対５′配向に配置し、ＡＬＶＡＣ  Ｃ３座挿入プラスミドに挿入した。構成の特定の詳細を以下の段落に示す。
【１０４６】
ｐＳＰＣＰ３Ｌの多重クローニング領域（実施例３２に記載した）を、ＥｃｏＲＶ、ＲｓｒＩＩ、ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ制限部位を含有する３１ｂｐリンカー断片を加えることにより改変した。アニーリング合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６０（配列認識番号３７２）
【化２８２】
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【１０４７】
およびＲＧ５６１（配列認識番号３７３）
【化２８３】
0003624911.tif 000333
【１０４８】
によりリンカーを産生し、次いでＥｃｏＲＶとＰｓｔＩで切断した。リンカーをｐＳＰＣＰ３ＬのＥｃｏＲＶとＰｓｔＩ部位にクローニングし、ｐＣ３ＬＲを産生した。
【１０４９】
合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６２（配列認識番号３７４）
【化２８４】
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【１０５０】
およびＲＧ５６３（配列認識番号３７５）
【化２８５】
0003624911.tif 000335
【１０５１】
を用いたＰＣＲによりｐＲＷ８２３からＨ６プロモーターを増幅した。ｐＲＷ８２３は、パーカスら、1989により記載したように、Ｈ６プロモーター配列を含有する。精製した断片をＥｃｏＲＩとＳｍａＩで切断し、ｐＣ３ＬＲ中のＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位に連結し、ｐＣ３ＬＲＶＱＨ６を産生した。
【１０５２】
マンプスＦ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ａｓｐ７１８断片（Ｎ末端から約５０コドンを欠如したＦ遺伝子ＯＲＦ）としてｐＵＲＦ３から切除した。この断片の末端をクレノウポリメラーゼを用いて修復し、ＥｃｏＲＩで切断されクレノウポリメラーゼにより修復されたｐＣ３ＬＲＶＱＨ６に連結した。正確な配向のスクリーニングにより、ｐＣ３ＬＲＦＶＱＨ６を産生した。
【１０５３】
合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６４（配列認識番号３７６）
【化２８６】
0003624911.tif 000336
【１０５４】
およびＲＧ５６５（配列認識番号３７７）
【化２８７】
0003624911.tif 000337
【１０５５】
を用いたＰＣＲによりｐＵＲＦ３から、Ｆ遺伝子のＮ末端ｐＵＲＦ３および４２Ｋプロモーター配列を含有する断片を増幅した。精製した断片をＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断し、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＣ３ＬＲＦＶＱＨ６に連結した。産生したプラスミドｐＣ３ＬＲＦ４２ＫＶＱＨ６を、挿入断片のＤＮＡ配列分析により確認した。
【１０５６】
マンプスＨＮ遺伝子を、ＳｓｐＩ／Ａｓｐ７１８断片（Ｎ末端から約３５コドンの欠如したＨＮ遺伝子）としてｐＵＲＨＮ５から切除した。この断片の末端をクレノウポリメラーゼを用いて修復し、ＳｍａＩで切断したｐＣ３ＬＲＦ４２ＫＶＱＨ６に結合した。正確な配向のスクリーニングによりｐＦＲ２Ａ−３０を産生した。Ｈ６プロモーターの３′部分およびＨＮ遺伝子のＮ末端配列を含有する断片を、合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６６（配列認識番号３７８）
【化２８８】
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【１０５７】
およびＲＧ５６７（配列認識番号３７９）
【化２８９】
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【１０５８】
を用いたＰＣＲによりｐＵＲＨＮ５から増幅した。精製した断片をＮｒｕＩとＢｓｕ３６Ｉで切断し、ＮｒｕＩとＢｓｕ３６Ｉで切断したｐＦＲ２Ａ−３０に連結した。産生したＡＬＶＡＣ供与体プラスミド、ｐＣ３ＵＲＦＨＮを、挿入プラスミドのＤＮＡ配列分析により確認した。
【実施例７２】
【１０５９】
ＡＬＶＡＣ組換え体の産生
供与体プラスミドｐＣ３ＵＲＦＨＮを、ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともにＣＥＦ細胞中の生体外組換え実験に用いてｖＣＰ１７１を産生した（テイラーら、1992）。放射線標識したＦおよびＨＮ特異的プローブを用いた現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、1987）により、組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、発現分析により増幅した。発現分析により、ＦおよびＨＮを発現した。
【実施例７３】
【１０６０】
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）１５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ２１、ＮＳ２Ａを含有する挿入ベクターの構築
ｐＲＷ８３８の構築は前述している（実施例１５参照）。
【１０６１】
ｐＲＷ８３８を、狂犬病糖タンパク質遺伝子の３′末端での、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲＶで切断されたＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填されたＥｃｏＲＩで切断し、アルカリ性ホスファーゼで処理し、Ｈ６プロモーターの５′の１０３ｂｐ、複製のプラスミド起点およびＣ５フランキングアームを含有する３２０３ｂｐ断片を単離した。ワクシニアウイルス供与体プラスミド中で１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２ＡをコードするＪＥＶ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣ（メイソンら、1991）（ヌクレオチド３３７−４１２５、コニシら、1991）をＨ６プロモーター中のＥｃｏＲＩとＪＥＶ配列中のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１８０９ｂｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填され、Ｔ５ＡＴの後のＥａｇＩ部位でのＥｃｌＸＩで切断し、ＪＥＶ配列内のＳａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、２０１１ｂｐ断片を産生した。１８０９ｂｐ  ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ、２０１１ｂｐ  ＳａｃＩ充填ＥｃｌＸＩおよび３２０２ｂｐ  ＥｃｐＲＶ充填ＥｃｏＲＩ断片を連結し、ＪＥＶＣＰ１を産生した。
【実施例７４】
【１０６２】
ＪＲＶ  １５ａａＣ、ｐｒＭ、Ｅを含有するＣ５挿入ベクターの構築
プラスミドＪＥＶ３６を、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとＪＥＶ配列内のＳｐｈＩ（ヌクレオチド２３８０）で切断し、２０６５ｂｐの断片を単離した。プラスミドＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ（実施例４４で定義した）を、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとポリリンカー内のＸｂａＩで切断し、２０６５ｂｐ断片とアニールしたオリゴヌクレオチドＳＰ１３１（配列認識番号３８２）およびＳＰ１２３（配列認識番号３８３）（ＳｐｈＩ付着末端、Ｅコード領域を補充したＴヌクレオチド、翻訳終止、ワクシニア初期転写終止シグナル（ＡＴ５ＡＴ；ユエンおよびモス、1987）、第２の翻訳終止、およびＸｂａＩ付着末端）に連結し、Ｃ５フランキングアームの間のＨ６プロモーターの制御下で１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭおよびＥをコードするプラスミドＪＥＶＣＰ５を産生した。
【実施例７５】
【１０６３】
ＡＬＶＡＣベースのＪＥＶ組換え対の構築
ＪＥＶＣＰ１をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にトランスフェクションし、１５アミノ酸Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａをコードするカナリヤポックス組換え体ｖＣＰ１０７を産生した。ＪＥＶＣＰ５をＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にトランスフェクションし、ＪＥＶ１５  ａａＣ、ｐｒＭおよびＥをコードするカナリヤポックス組換え体ｖＣＰ１４０を産生した。
【化２９０】
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【実施例７６】
【１０６４】
組換え体感染細胞中のＪＥＶタンパク質の免疫沈降
前述したように免疫沈降実験を行なった（コニシら、1991）。ｖＣＰ１０７およびｖＣＰ１４０感染細胞中に産生したＥタンパク質を、真正Ｅタンパク質を産生することが示されているＪＥＶ−ワクシニア組換え体により産生されたＥタンパク質とともに移動する（コニシら、1991）。ｖＣＰ１０７は、真正ＮＳ１タンパク質を産生することが示されているＪＥＶ−ワクシニア組換え体により産生されたＮＳ１タンパク質とともに移動する（コニシら、1991）。
【実施例７７】
【１０６５】
マウスのｖＣＰ１０７による免疫
腹腔注射により、生後３週間のスイスマウスを１０7 ＰＦＵのｖＣＰ１０７で免疫し、３週間後に選択したマウスから血清を採取した。マウスの半分にｖＣＰ１０７を再接種せしめ、３週間後に血清を採取した。前述したように、中和（Ｎｅｕｔ）および血球凝集阻害抗体（ＨＡＩ）について血清をアッセイした（コニシら、1991）。ｖＣＰ１０７で１度または２度免疫したマウスは、高い力価のＮｅｕｔおよびＨＡＩ抗体を発達せしめ、両方の力価は２度目の免疫により増大した。親ＡＬＶＡＣを投与したマウスは抗体力価を発達せしめなかった。ｖＣＰ１０７免疫マウスに得た抗体水準は、ＪＥＶ−ワクシニア組換え体での免疫により達成された水準と匹敵した（コニシら、1991）。
【実施例７８】
【１０６６】
ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）への効能研究
特定病原体感染防止条件（ＳＰＦ）の鶏と市販のブロイラーの鶏におけるＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）（実施例８）のＮＤＶ（ニューカッスル病ウイルス）に対する防御効能を測定するために、数多くの研究を行なった。
【１０６７】
研究Ａ．
生後１日のＳＰＦ鶏の４つの群に、０．３から６．３ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の投与量の範囲のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）または親ＴＲＯＶＡＣウイルスを足に筋内経路により接種した。接種部位での反応について鳥を監視し、抗ＮＤＶ血清中和抗体および血球凝集素抑制抗体の存在の分析のために、接種から１４日後に血清試料を採取した。接種から２１日後に、鳥に５．０ｌｏｇ10５０％卵感染量の短潜伏期性ＮＤＶ菌株テキサスＧＢを筋内接種により抗原投与した。健康な鳥が防御されたと考えられる抗原投与から１４日間に亘り鳥を保持した。６．３または２．６ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）またはＴＲＯＶＡＣ親ウイルスの筋内接種により、接種の時点で、ある場合には死亡する皮膚の病害となることが分かった。病害の酷さには特定の投与量効果があり、これは、１．１から１．４ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の投与量で、接種の時点でのわずかな炎症反応に限られる。全ての場合において、病害は接種の点に限定され、鶏の他の部分には広がらない。効果はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ中のＮＤＶ  ＦおよびＨＮ遺伝子の発現によるものではなく、同様の効果が親ウイルスにも観察された。他の接種経路が用いられた場合に、高い投与量のＴＲＯＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣベースの組換え体の接種では有害な副作用が見られるので、反応はこの接種経路に特異的である。
【１０６８】
血清学分析と防御効能の結果を表４７に示す。ＴＲＯＶＡＣ親ウイルスを接種した全ての鳥は、致死量抗原投与のために死亡した。１．１および２．６ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）をワクチン接種した全ての鳥は、抗原投与に生き残り、一方０．３ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50を投与した鳥の８２％が生存した。これにより、この経路によるこの組換え体の５０％の防御投与量（ＰＤ50）は０．３ＴＣＩＤ50であることが分かった。
【表４７】
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【１０６９】
研究Ｂ．
市販のブロイラー鶏の２つの供給源とＳＰＦ鶏におけるＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）の防御効能を評価した。生後１日の鳥の３つの群について研究した。群１：鶏痘ウイルスによりワクチン接種した経験のないふ化場から得た卵から鶏をふ化させた。群２：鶏痘ウイルスによりワクチン接種した経験のあるふ化場から得た卵から鶏をふ化させた。群３：特定病原体感染防止条件鶏を得た。
【１０７０】
２．０または４．０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のいずれかのＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶを皮下で鳥にワクチン接種した。ワクチン接種から２１および２８日後に鳥から採血し、ＮＤＶ  ＨＩ抗体の存在を評価した。また、アガーゲル沈降試験を用いてワクチン接種後の鶏痘抗体の存在について血清を評価した。ワクチン接種から２８日後、各群の１０匹の鳥と１０匹の対照に、４．２ｌｏｇ10ＥＩＤ50の短潜伏期性のＮＤＶ菌株テキサスＧＢを筋内接種により抗原投与し、生存した鳥を評価した。また、各群の１０匹の鳥と１０匹の対照に、鶏痘ウイルスのＮＶＳＬ菌株を翼に刺す接種により抗原投与した。鶏痘抗原投与からの防御を、接種部位での病害または生着（ｔａｋｅ）の欠如に基づいて評価した。この実験結果を表４８に示す。
【１０７１】
この結果により、市販のブロイラー鶏はＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶにより発現されたＮＤＶ抗原に対する検出可能な免疫応答を発達させず、一方ＳＰＦ鶏は免疫応答を示したことが分かる。市販の鳥には特異的抗ＮＤＶ抗体の欠如にもかかわらず、短潜伏期性ＮＤＶ抗原投与後に見られた防御水準には差はなかった。アガーゲル沈降試験により検出可能な鶏痘ワクチン接種に対する免疫応答は、どの鳥も示さなかった。検出可能な抗鶏痘抗体の欠如にもかかわらず、全てのワクチン接種した鳥は、鶏痘抗原投与から防御され、一方ワクチン未接種の鳥は死亡した。これらの結果により、雄鳥の鶏痘ウイルスへの先の露出では、鶏痘ベースのＮＤＶ組換え体をワクチン接種した鶏におけるＮＤＶまたは鶏痘に対する防御免疫の誘発を妨げないことが分かる。
【表４８】
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【１０７２】
ヒト組換え体免疫不全ウイルス−ＮＹＶＡＣまたは−ＡＬＶＡＣウイルス；細胞株に関する以下の実施例７９から８１のための材料および方法
Ｐ８１５マウス肥満細胞種細胞（Ｈ−２d ）をアメリカ型培養コレクションから得て、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン並びに１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給したイーグルＭＥＭ中に保持した。
【１０７３】
マウス
雌ＢＡＬＢ／ｃＪ（Ｈ−２d ）マウスをジャクソン研究所（ＭＥ、バーハーバー）から購入し、任意に餌と水を与え続けた。全て生後６から１５週間のマウスを用いた。
【１０７４】
接種
外側尾静脈により０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中の５×１０7 プラーク形成単位（ｐｆｕ）を、マウスに静脈接種した。
【１０７５】
血清
マウスをエーテルで軽く麻酔して、レトロオービタル（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）叢から採血した。実験群よりなるマウスから採血し、凝固せしめた。血清を採取し、使用まで−７０℃で貯蔵した。
【１０７６】
細胞傷害性Ｔリンパ球のアッセイおよび細胞傷害性Ｔリンパ球の記憶前駆体の生体外刺激
生後６週間の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０7 ｐｆｕのワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｅｎｖを発現する組換えワクシニアウイルス（ｖＰ９１１）、カナリヤポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ）、またはＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｅｎｖを発現する組換えカナリヤポックスウイルス（ｖＣＰ１１２）を静脈接種した。７日後、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｇｐ１２０の超可変Ｖ３ループ領域に対応するペプチドで一晩インキュベーションしたＰ８１５細胞または非改変Ｐ８１５細胞に対する一次ＣＴＬ活性に関して、脾臓細胞をアッセイした。最初の免疫から２２日後、実験マウスの脾臓細胞をポックスウイルス感染スティミュレーター脾臓細胞でインキュベーションし、前述のようにペプチド瞬間標識した標的に対する記憶ＣＴＬ活性に関してアッセイした。二次ＣＴＬ活性を測定するために、最初の接種から２９日後、初回免疫マウスに最初と同量で同成分の２回目の接種を行なった。５日後、ペプチド瞬間標識標的に対する細胞傷害性活性に関して脾臓細胞をアッセイした。細胞傷害性アッセイに関して、Ｈ−２d Ｐ８１５マウス肥満細胞種細胞を、２０μｇ／ｍｌのＶ３ペプチド（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＧＫ、アメリカンバイオテクノロジー社）（配列認識番号４５７）の有無のかかわらず培地中（アール塩を含有し、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給した）で一晩インキュベーションした。次の朝、遠心分離によりＰ８１５細胞を洗浄し、２×１０6 の細胞当たり１００μＣｉのＮａ2 51ＣｒＯ4 中３７℃で１時間標識した。無傷脾臓を、安楽死させたマウスから除去して、氷冷したハンクス平衡塩溶液中に入れ、ストマッチャーブレンダーを用いて１つの細胞懸濁液に粉砕した。脾臓細胞懸濁液を低速遠心分離により数回洗浄し、アッセイ培地（１０％のウシ胎仔血清、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬグルタミン、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁せしめた。記憶ＣＴＬ活性に関して、免疫したマウスからの脾臓細胞を刺激培地中に再懸濁せしめ（１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬグルタミン、１０-4Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するアール塩を有するＭＥＭ）、ポックスウイルスまたはポックスウイルス組換え体の１つに感染した未経験同系スティミュレーター脾臓細胞により、直立させた２５ｃｍ2 組織培養フラスコ中で生体外刺激した。３７℃での５日間の後、細胞を洗浄し、数え、アッセイ培地中に再懸濁した。51クロム標識標的細胞を、４時間の51Ｃｒ放出アッセイのための９６ウェルマイクロタイタ板中の滴定したエフェクター細胞に加えた。３つのアッセイに見られた標的細胞に対するエフェクターの比率（Ｅ：Ｔ）は、１００：１（一次）、２０：１（記憶）、および５０：１（二次）であった。細胞傷害性のパーセントは、（実験51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出）／（最大51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出）×１００により計算した。最大放出��、５％のドデシル硫酸ナトリウムを標的細胞に加えることにより測定し、一方自発的放出は、エフェクター細胞の不在下で標的細胞をインキュベーションすることにより測定した。どの実験においても、最大51Ｃｒ放出の２０％を超える標的細胞からの51Ｃｒの自発的な放出は存在しなかった。誤差のバーは、平均からの１標準偏差を示す。（＊）Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定を適切なワクシニアまたはカナリヤワクシニア免疫マウスと比較した。
【１０７７】
細胞傷害性エフェクター細胞の細胞表面発現型
方法は実質的に、ワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルスベクター（ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ）またはＨＩＶ  ＩＩＩＢ  ｅｎｖを発現するワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルス組換え体（ｖＰ９１１、ｖＣＰ１１２）で免疫したマウス脾臓細胞に関して行なった。２回目の接種は、最初の接種から３０日後に行なった。Ｖ３ペプチド瞬間標識した標的に添加する前に、脾臓細胞を、２段階プロトコルにおいてマウスＴリンパ球表面抗原に対する単クローン性抗体または同種異系抗血清で処理した。手短にいうと、脾臓細胞を、同種異系Ｔｈｙ１．２（セダーレーン）、単クローン性抗ＣＤ−４（１７２．４、デューク大学医療センター、Ｋ．Ｊ．ワインホールドからのギフト）、または単クローン性抗Ｌｙｔ２．２（セダーレーン）が加えられる細胞傷害性培地（０．２％のＢＳＡおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）に１ｍｌ当たり１０7 の生存可能細胞で再懸濁せしめた。５℃での３０分後、細胞を洗浄し、補体（セダーレーン、ウサギ  ロートクスＭ）の有無にかかわらず２つの等しい部分に分けた細胞傷害性培地の元の容積に再懸濁せしめ、３７℃で４５分間インキュベーションした。次いで細胞をアッセイ培地中で洗浄し、前処理細胞密度に基づいて、５時間の51Ｃｒ放出アッセイに添加する前に、１００：１（一次）、１０：１（記憶）、または８０：１（二次）の標的細胞に対するエフェクターの比率を近似するアッセイ培地の容積中に再懸濁した。誤差のバーは平均からの１標準偏差を示す。
【１０７８】
ＨＩＶ  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体認識の特異性
細胞傷害性Ｔリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球の記憶前駆体を、前述したようにマウスのｖＣＰ１１２による接種により産生した。Ｐ８１５標的細胞を、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＧＫ）（配列認識番号３８４）、ＭＮ（ＣＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）（配列認識番号３８５）、またはＳＦ２（ＣＮＴＲＫＳＩＹＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴＧＲ）（配列認識番号３８６）からのＶ３ペプチドで一晩瞬間標識したことを除いては、上述したように、細胞傷害性Ｔリンパ球のアッセイを行なった。標的細胞に対するエフェクターの比率は、１００：１（一次）、２０：１（記憶）、および５０：１（二次）であった。
【１０７９】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１２０に対する抗体応答
ＥＬＩＳＡ板のウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中の０．５μｇの部分的に精製したＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１２０（ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を０．０５％のトイーン２０（ＰＢＳＴ）を含有する食塩加リン酸緩衝液で洗浄した。次いで板を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴにより３７℃で２時間遮断した。ＰＢＳＴにより洗浄後、最初に血清を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（希釈緩衝液）で１：２０に希釈した。さらに血清をＥＬＩＳＡ板のウェル中で２倍に連続的に希釈した。この板を３７℃で２時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。ウサギ抗マウスムノグロブリン（ダコ）に接合されたホースラディッシュペルオキシダーゼを希釈緩衝液中で１：２０００に希釈して、ＥＬＩＳＡ板のウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴでの洗浄後、基体緩衝液中のＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）を加え、周囲温度で約２０分間に亘り呈色せしめた。反応を、２．５ＭのＨ2 ＳＯ4 の添加により停止せしめた。４９０ｎｍでの吸収を、バイオテックＥＬ−３０９ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。０．４の吸収値を与えた希釈の逆数として血清の終点を定義した。
【実施例７９】
【１０８０】
ＨＩＶ  ｅｎｖを発現する組換え体カナリヤポックスウイルスはＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘発する
ＨＩＶカナリヤポックスウイルス組換え体（ｖＣＰ１１２；実施例１８で定義した）での最初の接種から７日後、ＨＩＶ  Ｖ３ペプチド瞬間標識標的細胞に対する脾臓細胞の細胞傷害性応答を、同一の投与量、５×１０7 ｐｆｕの同一のＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体（ｖＰ９１１）（実施例１８）により誘発した細胞傷害性応答に粗く等しくした（第３１図）。適切な生体外刺激または２回目の接種後に、カナリヤポックスウイルス組換え体を与えたマウスの脾臓細胞の細胞傷害性の水準は増大し、同様にワクシニアウイルス組換え体を投与したマウスからの脾臓細胞と一致した。それぞれ、非組換えワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスベクター、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣを接種したマウスの脾臓細胞からはそのような細胞傷害性応答は検出されず、ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子を発現するポックスウイルス組換え体での免疫の必要性を確認した。さらに、接種養生にもかかわらず、どのようなマウスからの脾臓細胞からの非改変Ｐ８１５細胞に対しては細胞傷害性反応性は検出されなかった。それゆえ、組換えワクシニアウイルスまたは、より著しくは、ＨＩＶ−１からのｅｎｖコード配列を発現する組換えカナリヤポックスウイルスを接種したマウスのみが、Ｖ３特異的細胞傷害性応答を示した。
【実施例８０】
【１０８１】
細胞傷害性エフェクター細胞の特徴付け
ＨＩＶ−１  Ｖ３ペプチド瞬間標識標的の溶菌に関する脾臓細胞の同一性を測定するために、マウスをｖＣＰ１１２で免疫した。それぞれを免疫した後に、または最初の接種から２１日後に生体外刺激したときに、２段階枯渇方法を行ない、脾臓細胞を、Ｖ３ペプチド瞬間標識Ｐ８１５細胞に対する細胞傷害性に関して評価した。カナリヤポックスベクターＡＬＶＡＣを接種したマウスは、ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできる脾臓細胞を産生しなかった。１回の免疫後、ｖＣＰ１１２は、Ｖ３ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできる脾臓細胞を誘発した。溶菌エフェクター細胞は、抗マウスＴｈｙ１．２またはＬｙｔ２．２および補体による処理に感度があり、第３２図に示すように抗ＣＤ４に対して抵抗があった。この図は、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞表面抗原Ｔｈｙ１．２およびＬｙｔ２．２に対する抗体に対しての、ｖＣＰ１１２で免疫した脾臓細胞からの細胞傷害性エフェクター細胞の感度を示す。補体またはいずれの単クローン性抗体または同種異系抗血清のみのどれもこれらの細胞の細胞溶解性作用に影響しなかった。３０日目に投与した２回目の免疫から５日後にも同様の結果が得られた。１回目の接種から２１日後、ｖＣＰ１１２感染同系脾臓細胞による生体外刺激により、抗Ｔｈｙ１．２に部分的に感度があるが、抗Ｌｙｔ２．２に完全に感度があり。抗ＣＤ４には抵抗がある溶菌エフェクター細胞となる。ｖＣＰ１１２を接種したマウスからの脾臓細胞のｖＰ９１１による生体外刺激後には、これらのＴｈｙ１．２−、ＣＤ４−、Ｌｙｔ２．２＋エフェクター細胞は見られない。いうまでもなく、ＨＩＶ  Ｖ３ループ特異的細胞傷害性は、ＣＤ４ではなくＴｈｙ１．２およびＬｙｔ２．２を発現するＴリンパ球の個体群により媒介されたことが明確である。
【実施例８１】
【１０８２】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＶ３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体の特異性
Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列中の小さな改変に対して精巧に感度がある。ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＶ３ループ領域は超可変性であり、ＨＩＶ単離体の中で免疫学的に異なる。超可変性は、置換といくつかのアミノ酸の添加にある。ＨＩＶカンリヤポックスウイルス組換え体により産生された細胞傷害性細胞の特異性を試験するために、ＣＴＬ活性に対する感受性は、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢ、ＭＮ、またはＳＦ２のｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞の中で比較した。ＨＩＶ特異的一次ＣＴＬ活性は、第３３図に示したように、ＨＩＶ単離体ＭＮまたはＳＦ２のｇｐ１２０のＶ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識した標的細胞ではなく、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢのＶ３ループに対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞のみに限定された。第３３図は、ＨＩＶ  ＭＮまたはＳＦ２のＶ３ループのではなく、ｇｐ１２０のＨＩＶ  ＩＩＩＢ超可変Ｖ３ループの細胞傷害性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を説明するものである。生体外刺激された、ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性およびカナリヤポックスウイルス組換え体ｖＣＰ１１２による免疫により誘発された二次ＣＴＬ活性に関して、同様の結果が得られた。それゆえ、ＨＩＶ単離体ＩＩＩＢのｅｎｖ遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗原単離体から誘導された標的エピトープのみを認識する。これらの結果は明確に、ＨＩＶカナリヤポックスウイルス組換え体により産生されたリンパ球エフェクター細胞の精巧な特異性を示し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性としての非特異的エフェクター機構を除外する。これらの結果は、ＨＩＶ  Ｖ３特異的マウス細胞傷害性Ｔリンパ球によるエピトープ認識の正確さを特徴付ける他の報告と完全に一致する。
【実施例８２】
【１０８３】
ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ組換え体を接種したマウスの抗体応答
ＨＩＶに対する液性免疫応答を評価するために、０日にワクシニアウイルスＨＩＶ組換え体またはカナリヤポックスウイルス組換え体でマウスを免疫し、４週間目に２回目の免疫を行なった。最初の免疫から２０週間に亘り、様々な間隔でマウスを採血した。各処理群から採取した血清を、抗原として精製したｇｐ１２０を使用したＥＬＩＳＡによりＨＩＶに対する抗体に関してアッセイした；ベクター（ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ）またはワクシニアウイルス組換え体ｖＰ９１１またはＨＩＶ−１  ｅｎｖを発現するカナリヤポックス組換え体（ｖＣＰ１１２）で免疫したマウスのＨＩＶ  ＩＩＩ  Ｂ  ｇｐ１２０に対する抗体応答を提供する第３４図に結果を示す。ここで逆三角形は、２回目の接種の投与時間を示す。一次抗体応答は、一般的に穏やかであったが検出可能であった。２回目の接種後に、ｖＰ９１１およびｖＣＰ１１２の両方で免疫したマウスの抗体力価は増大し、６週目に１０，０００を超える力価でピークとなった。これらの抗体力価は、研究の期間に亘りほぼ同一の水準で保持された。それゆえ、カナリヤポックスウイルスＨＩＶ組換え体、ｖＰ１１２は、著しい抗体応答を誘発することができた。
【１０８４】
ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子を発現するカナリヤポックスウイルスによるマウスの接種により、細胞傷害性Ｔリンパ球の特徴：免疫の必要条件、細胞表面発現型、記憶、および簡潔なエピトープ特異性を有する脾臓細胞活性を誘発する。さらに、この組換えカナリヤポックスウイルスの接種によりＨＩＶ−１  ｇｐ１２０にいする抗体応答が誘発される。
【実施例８３】
【１０８５】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖを発現するＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣベースＨＩＶ−１組換え体の誘導
ＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖ配列を、それぞれ、ＨＩＶ−１（ＭＮ）のゲノムｃＤＮＡからの１７７４ｂｐおよび１８０３ｂｐサブ断片を含有するプラスミドｐＭＮ１．８−９およびｐＭＮ１．８−１０から誘導した。これらのプラスミドは、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）の研究所から得た。オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ６（配列認識番号３８７）
【化２９１】
0003624911.tif 000343
【１０８６】
およびＨＩＶ３Ｂ２（配列認識番号１５１）を用いたＰＣＲによりｐＭＮ１．８−９からのこれらの配列を増幅し、続いてＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩによる切断により、１，０２６ｂｐ  ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片を誘導した。この断片をＫｐｎＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入し、ｐＢＳＭＩＤＭＮを産生した。
【１０８７】
オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５（配列認識番号３８８）
【化２９２】
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【１０８８】
およびＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号３８９）
【化２９３】
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【１０８９】
を用いたＰＣＲと、続いてのＳａｃＩとＸｂａＩによる切断により、ｐＭＮ１．８−１０から１，０２８ｂｐ  ＳａｌＩ／ＸｂａＩ断片を誘導した。この断片を、４０４ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ断片とともに、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに連結した。テンプレートとしてのｐＭＮ１．８−９およびオリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）並びにＨＩＶＭＮ４（配列認識番号３９０）
【化２９４】
0003624911.tif 000346
【１０９０】
を用いたＰＣＲにより、４０４ｂｐ断片を誘導した。産生したプラスミドをｐＢＳ３ＭＮと称した。
【１０９１】
ｐＢＳＭＩＤＭＮからの１，０２６ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断した４，３１５ｂｐ  ｐＢＳ３ＭＮに挿入した。このプラスミドは、５′側領域を除いたｅｎｖ遺伝子のほとんどを含有する。ｐＨ６ＨＩＩＩＢＥ（実施例１８に定義した）から３１８ｂｐ  ＫｐｎＩ断片を単離することにより、ワクシニアウイルスＨ６プロモーター（ゲーベルら、1990ａ、ｂ）およびｅｎｖ遺伝子の５′側領域を得た。この断片を、ｐＢＳＭＩＤ３ＭＮからの２．９ｂｐ  ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片とともに、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩ切断ｐＢＳ−ＳＫに連結した。産生したプラスミドをｐＨ６ＨＭＮＥと称した。
【１０９２】
Ｈ６プロモーターの３′側の２６ｂｐに３′が隣接した全縁ＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥからの２．７ｂｐ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片をブラントエンドし、ＮｒｕＩ／ＳｍａＩ切断ｐＳＰＨＡＨ６に挿入した。これによりプラスミドｐＨＡＨＩＶＭＮＥを産生した。プラスミドｐＳＰＨＡＨ６を以下のように誘導した。
【１０９３】
プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流のワクシニア配列内にポリリンカー領域を含有する）を、ポリリンカー内のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ  ＡからＤまでに連結し、
【化２９５】
0003624911.tif 000347
【１０９４】
ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｈ６プロモーター−１２４から−１（パーカスら、19889 ）およびＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ並びにＥｃｏＲＩ部位を含有するｐＳＰ１２６を産生した。
【１０９５】
プラスミドｐＳＤ５４４（ポリリンカー領域で置換したＨＡ遺伝子の部位を囲むワクシニア配列および６つの読取りワクシニア中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー内のＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノウ断片で充填し、アルカリホスファターゼで処理した。ＳＰ１２６をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、クレノウで処理し、ＳｍａＩでの切断によりＨ６プロモーターを単離した。ｐＳＤ５５４へのＨ６プロモーター断片の連結により、ポリリンカー領域（ＨＡ転写の方向）内にＨ６プロモーターを含有したｐＳＰＨＡＨ６を産生した。この挿入プラスミドにより、ワクシニアＨＡ遺伝子（Ａ５６；ゲーベルら、1990ａ、ｂ）の異種遺伝子材料による置換が可能になった。
【１０９６】
ｐＨ６ＨＭＮＥからの２．８ｋｂ  ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片を単離し、ＸｂａＩとＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌ（実施例４４に定義した）に挿入した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＭＮＥと称した。
【１０９７】
プラスミドｐＨＡＨＩＶＭＮＥおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥを、治療ウイルスとしての、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに生体外組換え実験に用いた。これらは、標準方法により行なった（ピッチーニら、1987）。組換えウイルスから誘導したプラークを、放射線標識したｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションにより同定した（ピッチーニら、1987）。３回のプラーク精製後、組換えウイルスを増幅した。ＮＹＶＡＣ−ベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖ組換え体をｖＰ１００８と称し、ＡＬＶＡＣベースの組換え体ｖＣＰ１２５と称した。
【１０９８】
組換えウイルス、ｖＣＰ１２５およびｖＰ１００８を、前述した方法を用いて蛍光抗体法および免疫沈降によりＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖ遺伝子の発現に関して分析した（テイラーら、1990）。ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｄｒ．Ｋ．ステイマーから得た）をこれらのアッセイに用いた。蛍光抗体法からの結果により、ｖＣＰ１２５またはｖＰ１００８に感染した細胞は、その表面にＨＩＶ−１（ＭＮ）遺伝子産生物を発現することが示された。ｖＰ１００８およびｖＣＰ１２５感染細胞から調製した溶解産物からの免疫沈降は、それぞれ約１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、および４１ｋＤａの見かけの分子質量を有する３つの主要ＨＩＶ−１−特異的タンパク質を示した。これらは、前駆体エンベロープ糖タンパク質（１６０ｋＤａ）およびタンパク質分解により誘導した熟成形状（１２０ｋＤａおよび４１ｋＤａ）の発現と一致する。
【実施例８４】
【１０９９】
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣによるりＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０の発現
オリゴヌクレオチドＴ７（配列認識番号３９５）
【化２９６】
0003624911.tif 000348
【１１００】
およびＨＩＶＭＮ１２０（配列認識番号３９６）
【化２９７】
0003624911.tif 000349
【１１０１】
を用いてｐＢＳ３ＭＮから３９１ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を増幅し、続いてＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断した。この断片をｐＨ６ＨＭＮＥ（実施例８３で定義した）から誘導した４．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片に連結した。産生したプラスミドは、ｐＢＳ−ＳＫ中のＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０のポックスウイルス発現カセットを含有し、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０と称した。
【１１０２】
１．７ｋｂ  ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片を単離し、ＫｐｎＩ／ＸｂａＩで切断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０と称した。ＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０をＮＹＶＡＣへ組み込む挿入プラスミドは、最初にｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０から１．６ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＳｍａＩ断片を単離することにより得た。この断片をＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を得た。
【１１０３】
挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０およびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を、治療ウイルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とともに組換え実験に用いた。これらのアッセイおよびプラーク同定と精製は標準方法により行なった（ピッチーニら、1987）。放射線標識したＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０特異的プローブに関してハイブリダイゼーション分析を行なった。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０組換え体をｖＣＰ１２４と称し、ＮＹＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０組換え体をｖＰ１００４と称した。
【１１０４】
ｖＣＰ１２４およびｖＰ１００４に感染した細胞を、蛍光抗体法および免疫沈降により、ＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０を発現した組換え体の存在に関して分析した。これらのアッセイは、前述したように（テイラーら、1990）、ＨＩＶ−血清陽性個体から採取したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｋ．ステイマーから得た）を用いて行なった。これらの研究からの結果により、ｖＣＰ１２４およびｖＰ１００４のいずれかに感染した細胞は、ＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０を含有したことが分かり、一方ｇｐ１２０は、親ウイルス、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣに感染した細胞および未感染細胞には観察されなかった。
【実施例８５】
【１１０５】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１  ｇｐ１６０の非切断形状の発現
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１６０の非切断形状を発現するために、スレオニン突然変異に対するアルギニンをグオらにより示されたように（1990）、アミノ酸５１１で操作した（ラトナーら、1985）。感染細胞の表面からのｇｐ１２０の放出を減少するためにこれらの改変を行なった。これらの操作を以下のように行なった。オリゴヌクレオチド（配列認識番号３９７）
【化２９８】
0003624911.tif 000350
【１１０６】
およびＨＩＶＥＣＢ（配列認識番号３９８）
【化２９９】
0003624911.tif 000351
【１１０７】
を用いてｐＨ６ＨＩＩＩＢＥからの配列を増幅し、続いてＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断により３７６ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。この断片を、ｐＨ６ＨＩＩＩＢＥからの４．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片と１，０６１ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。
【１１０８】
ｇｐ１６０カセットに連結したＨ６プロモーターの３′側２６ｂｐを含有する、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣからの２．６ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＢＳＨＶＳ（実施例６０で定義した）の３．０ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭを産生した。ＮｒｕＩとＸｂａＩでの切断により、Ｈ６プロモーターの３′側２６ｂｐおよびハンターンウイルスＳ配列を切除した。３．０ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片は、ｐＢＳ−ＳＫプラスミド中にＨ６プロモーターの５′側１００ｂｐを含有する。
【１１０９】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭからの２．８ｋｂ  ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片をＸｂａＩ／ＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌに連結し、ｐＣ５ＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭからの２．７ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、ＮｒｕＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。
【１１１０】
治療ウイルスとしての、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を用いた標準方法（ピッチーら、1987）により、挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶ３ＢＥＥＣおよびｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥＣを生体外組換え実験に用いた。ＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子に特異的な放射線標識プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション分析（ピッチーニら、1987）により組換えプラークを同定した。３回の精製後に、組換えウイルスを増幅した。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１６０（非切断可能）をｖＣＰ１２６と称し、ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ１０２０と称した。
【１１１１】
ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｋ．ステイマーから得た）を用いてｖＰ１０２０およびｖＣＰ１２６感染細胞について、前述した方法（テイラーら、1990）により、蛍光抗体法および免疫沈降分析を行なった。蛍光抗体法の結果により、ｖＣＰ１２６またはｖＰ１０２０のいずれからに感染した細胞の表面上のＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１６０（非切断可能形状）の表面発現が示された。さらに、免疫沈降の結果により、熟成ｇｐ１２０およびｇｐ４１フレームにタンパク質分解的に切断されなかったこれらの感染細胞中にＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１６０の存在が示された。
【１１１２】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｇｐ１６０の非切断可能形状を追跡し、組換えウイルスを以下のようにして得た。
【１１１３】
オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号３８９）
【化３００】
0003624911.tif 000352
【１１１４】
およびＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）
【化３０１】
0003624911.tif 000353
【１１１５】
を用いたｐＨ６ＨＭＮＥからのＰＣＲ増幅と続いてのＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断により、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。１０６１ｂｐ断片を、ｐＢＳＨＩＶＮＮＴからの３９１ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ形状（下記）およびｐＨ６ＨＭＮＥからの４．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片（実施例８３に記載した）に連結した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣ１と称した。ＨＩＶ  ｅｎｖ挿入物の配列分析により、１つのヌクレオチドが失われたことが示された。これを訂正するために、以下の操作を行なった。ｐＨ６ＨＭＮＥからの４．６ｋｂ  ＳａｃＩ／ＸｂａＩによりｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣが形成された。
【１１１６】
ｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣからの２．６  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を挿入し、クレノウでブラントエンドし、ＮｒｕＩ／ＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６（実施例８３で定義した）に挿入した。産生したプラスミドをｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥＣと称した。ｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣからの２．６ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＡＩ断片もＮｒｕＩ／ＸｂａＩで切断したｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６（下記）に挿入し、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを産生した。
【１１１７】
挿入プラスミド、ｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥＣおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを、治療ウイルスとしての、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともに、標準組換え実験（ピッチーニら、1987）に用いた。放射線標識したＨＩＶ  ｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、1987）より、組換えウイルスを同定し、プラーク精製した。次いで精製した組換えウイルスを増幅した。ＨＩＶ−１（ＭＮ）非切断可能ｇｐ１６０を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０７８と称し、ＡＬＶＡＣのものをｖＣＰ１４４と称した。
【１１１８】
ｖＣＰ１２６およびｖＰ１０７８の発現分析を上述したように行なった。これらの結果により、発現は、質的にＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）対照物、ｖＰ１０２０およびｖＣＰ１２６と等しいことが分かった。
【実施例８６】
【１１１９】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１  ｅｎｖの非切断可能分泌形状の発現
タンパク質分解的に切断されず、遺伝子産生物のカルボキシ末端の近くの膜貫通配列の除去により分泌されるＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖを発現するＡＬＶＡＣ−およびＮＹＶＡＣベースの組換えウイルスを産生した。最初にｐＨ６ＨＭＮＥ（実施例８３に定義した）からのこれらの配列をオリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）およびＨＩＶＭＮＴ１（配列認識番号４００）
【化３０２】
0003624911.tif 000354
【１１２０】
を用いて増幅し、続いてＰｓｔＩ（５′末端）およびＸｂａＩ（３′末端）での切断により５０２ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。この断片は、ヌクレオチド７２１９から７８０８に対応する（ラトナーら、1985）。この断片は、ｅｎｖ発現カセットの３′末端として作用する。それ自体、ｅｎｖ遺伝子産生物は、膜貫通領域が欠如し、オリゴヌクレオチド（配列認識番号４００）により提供される終止コドンにより終止せしめられ、オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）を用いて提供された５１１（上記）でのアミノ酸変化により切断されない。この５０２ｂｐ断片を、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）およびＨＩＶＥＣＢ（配列認識番号３９８）、並びにｐＨ６ＨＭＮＥに対する４．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を用いたＰＣＲによりｐＨ６ＨＭＮＥから誘導した３９１ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片に、この５０２ｂｐ断片を連結した。産生したプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮＴと称した。
【１１２１】
ｐＢＳＨＩＶＭＮＴからの２．２ｋｂ  ＸｂａＩ／部分的ＫｐｎＩ断片を単離し、ＸｂａＩとＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生したプラスミドをｐＣ５ＨＩＶＭＮＴと称した。ｐＢＳＨＩＶＭＮＴから２．１ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を単離することにより、ＮＹＶＡＣ挿入プラスミドを誘導した。次いで、この断片を２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によりブラントエンドし、ＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮＴを産生した。
【１１２２】
挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮＴを、治療ウイルスとしての、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とともに標準組換え実験（ピッチーニら、1987）に用いた。放射線標識したＨＩＶ  ｅｎｖ特異的プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、1987）により組換えウイルスを同定した。増幅の前に、組換えウイルスに３回の精製を行なった。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｅｎｖ（非切断可能；分泌）をｖＣＰ１２０と称し、ＮＹＶＡＣのものをｖＰ９４４と称した。
【１１２３】
前述した方法により（テイラーら、1990）、ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒト血清を用いて、ｖＣＰ１２０およびｖＰ９９４感染細胞に関して免疫沈降を行なった。ｖＣＰ１２０およびｖＰ９９４の両者は、非切断可能、切形遺伝子産生物と一致する分子量を有するＨＩＶ−１（ＭＮ）ｅｎｖ特異的遺伝子産生物を発現した。さらに、ｖＣＰ１２０およびｖＰ９９４感染細胞培養からの細胞不含有培地の免疫沈降により、このｅｎｖ遺伝子産生物の分泌が示された。
【１１２４】
ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）  ｅｎｖに関して同様の構成を操作した。これを行なうために、以下の操作を行なった。最初にｐＨ６ＨＩＩＩＢＥ（実施例１８に定義した）からのこれらの配列を、オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）およびＨＩＶ３ＢＴ（配列認識番号４０１）
【化３０３】
0003624911.tif 000355
【１１２５】
を用いて増幅し、続いてＰｓｔＩとＸｂａＩでの切断により４８７ｂｐ  ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を得た。ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣから３９７ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片を単離して、ｐＨ６ＨＩＩＩＢＥＭから４．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を単離した。これの３つの断片をともに連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＴ１を産生した。
【１１２６】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断により誘導した２．１ｋｂおよび２．９ｋｂ断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＴ１からの１０５ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＴを産生した。このプラスミドをＮｒｕＩとＸｂａＩで切断し、２．１ｋｂ断片を切除した。この断片をブラントエンドし、ＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを産生した。
【１１２７】
プラスミドｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを、治療ウイルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）とともに、上述したように組換え実験に用いた。組換えウイルスを同定し、上述したように精製し、産生した組換え体をｖＰ１０３６と称した。この組換え体はｖＣＰ１２０およびｖＰ９９４に関して上述した発現特徴全てを有した。
【実施例８７】
【１１２８】
ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣにより膜貫通配列により固定されたＨＩＶ−１（ＭＮ）の発現
ｇｐ１２０をコードするｅｎｖ領域を親水性膜貫通配列をコードする領域に融合するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列認識番号４０２）
【化３０４】
0003624911.tif 000356
【１１２９】
を用いてｐＨ６ＨＭＮＥからＰＣＲにより、ｇｐ１２０コード配列の３′側領域に対応する２００ｂｐ断片を誘導した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）およびＨＩＶＴＭ３（配列認識番号４０５）
【化３０５】
0003624911.tif 000357
【１１３０】
をも用いて、ＰＣＲによりこの断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）
【化３０６】
0003624911.tif 000358
【１１３１】
およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）
【化３０７】
0003624911.tif 000359
【１１３２】
に融合した。オリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）は、ヌクレオチド７８５０から７９３４に対応し（ラトナーら、1985）、ＨＩＶ  ｅｎｖ親水性固定配列をコードする領域を示す。ＨＩＶＴＭ３（配列認識番号４０５）による融合は、終止コドンおよび３′ＸｂａＩ部位を有する最後のカセットの３′末端を操作する。誘導断片をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断したｐＨ６ＨＭＮＥに連結し、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０Ｔを産生した。
【１１３３】
Ｈ６プロモーターの３′側の２６ｂｐおよび全縁ＨＩＶ−１カセットを含有する、１．７ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６からの５．１ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片に挿入し、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０Ｔを単離した。ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６を以下のように誘導した。
【１１３４】
ｐＣ５ＬＳＰ（実施例６６で定義した）をＢａｍＨＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ３２（配列認識番号４０６）
【化３０８】
0003624911.tif 000360
【１１３５】
およびＣＰ３３（配列認識番号４０７）
【化３０９】
0003624911.tif 000361
【１１３６】
に連結してｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生した。
【１１３７】
ｐＢＳＨＩＮＭＮ１２０Ｔからの１．７ｋｂ  ＮｒｕＩ／ＸｂａＩ断片もまたブラントエンドし、ＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入した。産生したプラスミドをｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔと称した。
【１１３８】
挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮ１２０ＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔを、治療ウイルスとして、それぞれＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣとともに、標準組換え実験（ピッチーニら、1987）に用いた。放射線標識したＨＩＶ−１  ｇｐ１２０特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、1987）により、組換えウイルスを同定し、精製した。純粋な個体群を増幅し、ＡＬＶＡＣベースの固定した（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０組換え体をｖＣＰ１３８と称した。ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ１０３５と称した。
【１１３９】
標準方法により（テイラーら、1990）、蛍光抗体法および免疫沈降分析を行ない、ｖＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞中のＨＩＶ−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０の発現を評価した。ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒト血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｄｒ．Ｋ．ステイマーから得た）を用いて、アッセイを行なった。
【１１４０】
表面蛍光抗体法の探求により、ｖＣＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞が形質膜中にＨＩＶ−１（ＭＮ）  ｇｐ１２０を含有したことが分かった。特に、ｖＣＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞の表面染色は、ｇｐ１６０または非固定ｇｐ１２０を発現する組換えウイルス（すなわち、ｖＣＰ１２５、ｖＣＰ１２４、ｖＰ１００４、およびｖＰ１００８）に感染した細胞と比較して、著しく増大した。免疫沈降分析からの結果により、ｖＣＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞の発現、および発現された産生物が予期した分子質量であったことが確認された。
【実施例８８】
【１１４１】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ＧＡＧ（プロテアーゼ- ）組換え体の産生
１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＨＸＢ２ＤはＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片をｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）の４，０７５ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称した。
【１１４２】
次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｇａｇ遺伝子の残りの下流にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する２８０ｂｐ  ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐ  ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチドＨＩＶＰ５（配列認識番号４０８）
【化３１０】
0003624911.tif 000362
【１１４３】
およびＨＩＶＰ６（配列認識番号４０９）
【化３１１】
0003624911.tif 000363
【１１４４】
を有するプラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称した。
【１１４５】
次いでＩ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７（配列認識番号４１０）
【化３１２】
0003624911.tif 000364
【１１４６】
およびＨＩＶＬ１８（配列認識番号４１１）
【化３１３】
0003624911.tif 000365
【１１４７】
を、ｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐ部分的ＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称した。
【１１４８】
ｐＨＩＶＧ４を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ９６９を産生した。免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９６９が真正ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染したか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＰ９６９に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）の添加と続いて細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から１８時間後に収集した。
【１１４９】
ＨＩＶ−１血清陽性個体から採取した血清（ＣＡ、エメリービル、シロンから得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体発現について分析した。血清を、ｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を、４℃での一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、材料を４回１×の緩衝液Ａで洗浄した。次いで、通常ヒト血清およびタンパク質Ａセファロースで前洗浄した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清とともに４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【１１５０】
ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９６９感染細胞からのＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【実施例８９】
【１１５１】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。このは、ｇａｇ遺伝子の５′末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１，６２５ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片をｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）の４，０７５ｂｐ  ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称する。
【１１５２】
次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＨＩＶＧ２にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する、２８０ｂｐ  ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐ  ＡｐａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ５（配列認識番号４０８）およびＨＩＶＰ６（配列認識番号４０９）を有するプラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称する。
【１１５３】
次いでＩ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウイルスＩ３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７（配列認識番号４１０）およびＨＩＶＬ１８（配列認識番号４１１）をｐＨＩＶＧ３の５，５４０ｂｐ部分的ＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。
【１１５４】
次いでｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１９（配列認識番号４１２）
【化３１４】
0003624911.tif 000366
【１１５５】
およびＨＩＶＬ２０（配列認識番号４１３）
【化３１５】
0003624911.tif 000367
【１１５６】
をｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐ部分的ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ５と称した。
【１１５７】
ｐｏｌ遺伝子と同様に、ｇａｇ遺伝子の残りをｐ１７「遺伝子」の下流にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子のほとんどおよびｐｏｌ遺伝子の全てのを含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの４，９５５ｂｐ  ＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片をｐＨＩＶＧ５の４，１５０ｂｐ  ＣｌａＩ−ＳａｃＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ６と称する。
【１１５８】
次いで外来３′非コード配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する、３６０ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ６の８，０３０ｂｐ  ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ７（配列認識番号４１４）
【化３１６】
0003624911.tif 000368
【１１５９】
およびＨＩＶＰ８（配列認識番号４１５）
【化３１７】
0003624911.tif 000369
【１１６０】
を有するプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ７と称する。
【１１６１】
ｐＨＩＶＧ７を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ９８９を産生した。
【１１６２】
上述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９８９感染細胞に免疫沈降を行なった。疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＨＩＶ−１特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９８９感染細胞からの溶解産物からは、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間帯と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例９０】
【１１６３】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【１１６４】
ｐＨＩＶＧ７を、治療ウイルスとしてのｖＰ９２１とともに組換え実験に用いて、ｖＰ９９１を産生した。
【１１６５】
ＨＩＶ  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように、ｖＰ９９１感染細胞の免疫沈降を行なった。疑似感染ベロ細胞からはＨＩＶ特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９９１感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例９１】
【１１６６】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したように、プラスミドｐＨＩＶＧ７を産生することにより行なった（実施例８９参照）。
【１１６７】
ｐＨＩＶＧ７を治療ウイルスとしてのｖＰ９１１（上記）とともに組換え実験に用いてｖＰ９９０を産生した。
【１１６８】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９９０感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からはＨＩＶ０１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９９０感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例９２】
【１１６９】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｐ１７、ｐ２４組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ５を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【１１７０】
次いでｐ２４「遺伝子」の３′末端をｐＨＩＶＧ５にクローニングした。これは、ｐ２４「遺伝子」の３′末端を含有する、６６０ｂｐのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ  ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ５の４，４５０ｂｐ  ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ２５（配列認識番号４１６）
【化３１８】
0003624911.tif 000370
【１１７１】
およびＨＩＶＰ２６（配列認識番号４１７）
【化３１９】
0003624911.tif 000371
【１１７２】
を有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ８と称した。
【１１７３】
次いで昆虫ポックス４２ｋｄプロモーターをｐ２４「遺伝子」の上流にクローニングした。これは、昆虫ポックス４２ｋｄプロモーターおよびｐ２４「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２１（配列認識番号４１８）
【化３２０】
0003624911.tif 000372
【１１７４】
およびＨＩＶＬ２２（配列認識番号４１９）
【化３２１】
0003624911.tif 000373
【１１７５】
をｐＨＩＶＧ８の５，０７０ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＮｓｉＩ断片に挿入した。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ９と称する。
【１１７６】
ｐＨＩＶＧ９を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ９７０を産生した。
【１１７７】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７０感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７０感染細胞の溶解産物からはｐ２４に対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例９３】
【１１７８】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（実施例９２参照）。
【１１７９】
ｐＨＩＶＧ９を、治療ウイルスとしてのｖＰ９２１とともに組換え実験に用いてｖＰ９７３を産生した。
【１１８０】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７３感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７３感染細胞の溶解産物からはｐ２４に対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例９４】
【１１８１】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（実施例９２参照）。
【１１８２】
ｐＨＩＶＧ９を、治療ウイルスとしてのｖＰ９１１とともに組換え実験に用いてｖＰ９７１を産生した。
【１１８３】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７１感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７１感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｐ２４に対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例９５】
【１１８４】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ（プロテアーゼ- ）およびｅｎｖ（切形の）組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【１１８５】
次いでＨ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ４に挿入した。これは、Ｈ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＥ１０のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）充填１，６００ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧ４の充填ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１１と称する。
【１１８６】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１からのＳａｃＩ／部分的ＫｐｎＩ断片をｐＩＢＩ２５（ＣＴ、ニューハブン、ＩＢＩ）の多重クローニング領域に挿入することとによりプラスミドｐＨＩＶＥ１０を誘導した。プラスミドｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１は、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）エンベロープ（アミノ酸１から４４７；ラトナーら、1985）の著しく切形された形状を発現するＨ６プロモートされたカセットを含有する。Ｖ３ループ領域とＴ１エピトープを保持しながらＣＤ４結合を除去するために、このカセットの発現を評価した。
【１１８７】
ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１を構築するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ（配列認識番号３９７）およびＨＩＶＣＤ４Ａ（配列認識番号４２０）
【化３２２】
0003624911.tif 000374
【１１８８】
を用いてｐＨ６ＨＩＩＩＢＥ（実施例１８で定義した）から２００ｂｐのＰＣＲ誘導断片を増幅した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ（配列認識番号３９７）およびＨＩＶＴＭ３（配列認識番号４０５）を用いてＰＣＲにより、この断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）に融合した。ＨＩＶ−１  ｅｎｖ膜貫通アンカー（アミノ酸６９１から７１８；ラトナーら、1985）、翻訳終止コドン（ＴＡＡ）、および３′ＸｂａＩ部位をコードする配列を配することにより、これらの操作で切形ｅｎｖカセットの３′末端を産生した。このＰＣＲ融合産生物をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、２４３ｂｐの断片を産生した。この断片をｐＨ６ＨＩＩＩＢＥの４．５ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１を産生した。
【１１８９】
ｐＨＩＶＧＥ１１を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ９７９を産生した。
【１１９０】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７９感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７９感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例９６】
【１１９１】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（切形）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【１１９２】
次いでＨ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ７に挿入した。これは、Ｈ６プロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＥ１０（実施例９５に定義した）のＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）充填１，６００ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧ７の充填ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１２と称する。
【１１９３】
ｐＨＩＶＧＥ１２を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ９７８を産生した。
【１１９４】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７８感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７８感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例９７】
【１１９５】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【１１９６】
次いでＩ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリヤポックス挿入ベクターに挿入した。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４，３６０ｂｐ  部分的ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１４と称する。
【１１９７】
次いでＨ６プロモートしたＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１２０）遺伝子をｐＨＩＶＧＥ１４に挿入した。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２９（配列認識番号４２１）
【化３２３】
0003624911.tif 000375
【１１９８】
およびＨＩＶＬ３０（配列認識番号４２２）
【化３２４】
0003624911.tif 000376
【１１９９】
並びにＨ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子を含有する、ｐＢＳＨＩＶＭＮ１２０の１，６００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１４の１１，５００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＮｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１５と称する。
【１２００】
次いで、Ｈ６プロモートしたエンベロープ（ｇｐ１２０）遺伝子およびＩ３Ｌプロモートしたｇａｇとｐｏｌ遺伝子をワクシニアウイルス挿入ベクターに挿入した。これは、Ｈ６プロモートしたｇｐ１２０遺伝子およびＩ３Ｌプロモートしたｇａｇとｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧＥ１５の６，４００ｂｐ  ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱの４，０００ｂｐ  ＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１６と称する。
【１２０１】
ｐＨＩＶＧＥ１６を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ９８８を産生した。
【１２０２】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９８８感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９８８感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例９８】
【１２０３】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１６を調製することにより行なった（実施例９７参照）。
【１２０４】
次いでｇｐ１６０遺伝子により、ｇｐ１２０遺伝子を置換した。これは、全縁ＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥの２，６００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＨＩＶＧＥ１６の８，０００ｂｐ  部分的ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１９と称する。
【１２０５】
ｐＨＩＶＧＥ１９を、治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１００９を産生した。
【１２０６】
前述したように、ＨＩＶ−１  ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ１００９感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１００９感染細胞からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例９９】
【１２０７】
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ＧＰ１２０）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１５を調製することにより行なった（実施例９７参照）。
【１２０８】
ｐＨＩＶＧＥ１５を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１１７を産生した。
【１２０９】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１１７が真正ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＣＰ１１７に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から１８時間後に収集した。
【１２１０】
ＨＩＶ−１血清陽性個体からの血清（ニューヨーク州保険省から得た）を用いてＨＩＶ  ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して感染細胞から溶解産物を分析した。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃で一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、材料を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション後、試料を１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１Ｍ  Ｎａ−サリチル酸塩で処理した。
【１２１１】
ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１１７感染細胞からはＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
【実施例１００】
【１２１２】
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＢＧＥ１５を調製することにより行なった（実施例９７参照）。
【１２１３】
次いでｇｐ１２０をｇｐ１６０で置換した。これは、全縁ＨＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥの２，６００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＨＩＶＧＥ１５の９，８００ｂｐ  ＮｒｕＩ−ＮｏｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１８と称する。
【１２１４】
次いで前の工程で欠損したカナリヤポックスフランキングアームをｐＨＩＶＧＥ１８にクローニングした。これは、Ｃ３フランキングアームを含有する、ｐＨＩＶＧＥ１５の１，５００ｂｐ  ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１８の１２，４００ｂｐ  ＮｏｔＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧＥ２０と称する。
【１２１５】
ｐＨＩＶＧＥ２０を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１３０を産生した。
【１２１６】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１３０がＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＣＰ１３０に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清と［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０、３０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から１８時間後に収集した。
【１２１７】
ＨＩＶ−１血清陽性個体から採取した血清（ＣＡ、エメリービル、シロンから得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃での一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで、通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６．８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加および５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１３０感染細胞からＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【実施例１０１】
【１２１８】
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。
【１２１９】
次いで、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子、並びにオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６（配列認識番号４２３）
【化３２５】
0003624911.tif 000377
【１２２０】
とＨＩＶ２Ｌ７（配列認識番号４２４）
【化３２６】
0003624911.tif 000378
【１２２１】
を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４，４００ｂｐ  ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＳＰＣＰ３ＬのＳｍａＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶＧ２４と称する。
【１２２２】
ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１５２を産生した。
【１２２３】
前述したようにＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖＣＰ１５２感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染またはＡＬＶＡＣ感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＣＰ１５２感染細胞の溶解産物からは、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例１０２】
【１２２４】
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（切形）組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を調製することにより行なった（実施例１０１参照）。
【１２２５】
ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウイルスとしてのｖＣＰ１２０とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１５５を産生した。
【１２２６】
前述したようにＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖＣＰ１５５感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＣＰ１５５感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例１０３】
【１２２７】
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（膜貫通アンカーを有するｇｐ１２０）組換え体の産生
ＨＩＶ−１  ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ．Ｒ．Ｃ．ガロ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を調製することにより行なった（実施例１０１参照）。
【１２２８】
ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウイルスとしてのｖＣＰ１３８とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１５６を産生した。
【１２２９】
前述したようにＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖＣＰ１５６感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＣＰ１５６感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【１２３０】
ＨＩＶ−１  ｇａｇ特異的遺伝子産生物単体またはワクシニアウイルスによりｅｎｖとの組合せのいずれかの発現は、非感染ウイルス状粒子の産生となることが示されている（ハッファーら、1990；フーら、1990）。このバックグラウンドに関して、ＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣベースの組換え体に感染した細胞もまたそのような粒子を産生するか否かを探求した。さらにこれらのＡＬＶＡＣベース組換え体から非アビアン細胞（すなわち、ベロ、ＭＲＣ−５、等）を感染せしめるのに用いられる場合、いかなるＨＩＶ−１ウイルス状粒子がポックスウイルスビリオン不純物もなく精製できた。
【１２３１】
ｖＣＰ１５６に感染したベロ細胞を用いた粒子形成を評価するために、以下の実験を行なった。ベロ細胞を約５ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で感染せしめた。２４感染期間後、上澄みを収集し、２０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離により浄化した。次いで上澄みを、３０，０００ｋＤａの分子量をカットオフするフィルターを通じて回転せしめた。それゆえ、小さな分子はこれらのフィルターを通過する。ＨＩＶ血清陽性個体から採取したヒト血清（ニューヨーク州、保険省、Ｄｒ．Ｊ．コーニーから得た）を用いて、標準ウエスタンブロット分析により、フィルターに保持された物質を分析した。ウエスタンブロット分析の結果により、フィルターに保持された物質中に主要コアタンパク質ｐ２４およびＨＩＶ−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０の存在が示された。上述したサイズ排除に関して、ｐ２４が高等構造立体配置（すなわち、ウイルス状粒子）になければ、ｐ２４はそのフィルターを通過する。それゆえ、これらの結果は強く、ｇｐ１２０エンベロープ成分を含有するＨＩＶ−１ウイルス状粒子はｖＣＰ１５６感染細胞中で産生されることを示唆している。
【実施例１０４】
【１２３２】
ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１  ｅｎｖ遺伝子のＴ１、Ｔ２，、およびＴＨ４．１エピトープの発現
組換えポックスウイルスｖＰ１０６２およびｖＣＰ１４６を産生して、個々のペプチドとしてＨＩＶ−１  ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１エピトープを発現した（ホスマリンら、1991）。
【１２３３】
プラスミドｐ７３１Ｔ１の構築
プラスミドｐＭＰＩ３Ｈは、ｐＵＣ８バックグラウンド中にワクシニアＩ３Ｌ初期／中間プロモーター要素（シュミットおよびスタネンベルグ、1988；ホスおよびスタネルベルグ、1988）を含有する。テンプレートとしてのｐＭＰＶＣ１、ワクシニアＨｉｎｄＩＩＩ  Ｉのサブクローンおよびプライマーとして、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８３（配列認識番号４２５）
【化３２７】
0003624911.tif 000379
【１２３４】
とＭＰＳＹＮ２８７（配列認識番号４２６）
【化３２８】
0003624911.tif 000380
【１２３５】
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、プロモーター要素を合成した。この反応からのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＲｓａＩで切断し、プロモーター要素を含有する０．１ｋｂ断片を精製した。補体合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３９８（配列認識番号４２７）
【化３２９】
0003624911.tif 000381
【１２３６】
とＭＰＳＹＮ３９９（配列認識番号４２８）
【化３３０】
0003624911.tif 000382
【１２３７】
をアニーリングすることにより、リンカー領域を組み立てた。ＰＣＲ誘導プロモーター要素およびポリリンカー領域を、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで切断したベクタープラスミドｐＵＣ８と連結した。産生したプラスミド、ｐＭＰＩ３Ｈは、開始コドンに対して位置−１００から−６までのＩ３Ｌプロモーター領域と続いての、ＨｐａＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有するポリリンカー領域を含有する。ＨｐａＩでの切断により、プロモーター中の位置−６で線状化されたブラントエンドのＤＮＡが産生される。
【１２３８】
補体オリゴヌクレオチドＴ１Ｃ（配列認識番号４２９）
【化３３１】
0003624911.tif 000383
【１２３９】
およびＴ１Ｎ（配列認識番号４３０）
【化３３２】
0003624911.tif 000384
【１２４０】
をＨｐａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＭＰＩ３Ｈに連結することにより、ワクシニアＩ３Ｌプロモーターに誘導されたＴ１ペプチドを含有するカセットを産生した。この連結は、プロモーターの最後の５塩基対を再構築し、Ｔ１ペプチドの完全コード配列を提供し、終止コドンとＢａｍＨＩ部位の間にＸｈｏＩ部位を産生する。これがプラスミドｐ７３１Ｔ１である。ヌクレオチド配列分析により断片の配列を確認した。
【１２４１】
プラスミドｐＨ６Ｔ２の構築
ワクシニアＨ６プロモーターによりドライブされたＴ２ペプチドを含有するカセットを２工程で産生した：ＰＣＲおよびプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）とＨ６ＰＣＲ２（配列認識番号３６５）を用いて、合成Ｈ６プロモーター（パーカスら、1989）を含有するプラスミドからＥｃｏＲＶ部位を通じるＨ６プロモーターを誘導し、５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位を産生した。この１２２ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断し、続いて同様に切断したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドｐＢＳＨ６を産生した。ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーターの３′末端を完全にし、Ｔ２ペプチドをコードし、遺伝子の３′末端にＢａｍＨＩ部位を産生する補体オリゴヌクレオチドＴ２Ｃ（配列認識番号４３１）
【化３３３】
0003624911.tif 000385
【１２４２】
およびＴ２Ｎ（配列認識番号４３２）
【化３３４】
0003624911.tif 000386
【１２４３】
をアニールし、ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで切断したｐＢＳＨ６に連結した。このプラスミドをｐＨ６Ｔ２と称し、ヌクレオチド配列分析により断片を確認した。
【１２４４】
プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１の産生
持続性ＰＣＲ反応により、ＡｍＥＰＶ  ４２ＫプロモーターによりドライブされたＴＨ４．１ペプチドを含有するカセットを産生した：プライマー４２ＫＶＱ１（配列認識番号４３３）
【化３３５】
0003624911.tif 000387
【１２４５】
および４２ＫＶＱ２（配列認識番号４３４）
【化３３６】
0003624911.tif 000388
【１２４６】
を用いて、４２Ｋプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質の遺伝子を含有するプラスミドである、プラスミドｐ４２ＫＲＡＢＩからＰＣＲにより５′ＰｓｔＩとＳｍａＩ部位を有する１０７ｂｐ  ４２Ｋプロモーターを誘導した。このＰＣＲ誘導断片の１０７ｂｐプロモーター領域の配列は（配列認識番号４３５）
【化３３７】
0003624911.tif 000389
【１２４７】
である。この断片と、テンプレートとしての、ＴＨ４．１ペプチドＴＨ４１Ｃ（配列認識番号４３６）
【化３３８】
0003624911.tif 000390
【１２４８】
およびＴＨ４１Ｎ（配列認識番号４３７）
【化３３９】
0003624911.tif 000391
【１２４９】
をコードする合成オリゴヌクレオチドと、プライマー４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３８）
【化３４０】
0003624911.tif 000392
【１２５０】
および４２ＫＶＱ１（配列認識番号４３３）とを用いて１５９ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片を、第２のＰＣＲでＴＨ４．１のコード配列に融合した。プライマー４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３８）およびＢＡＭＶＱ（配列認識番号４４１）
【化３４１】
0003624911.tif 000393
【１２５１】
を用いた第３のＰＣＲのためにテンプレートとして合成オリゴヌクレオチドＶＱＣ（配列認識番号４３９）
【化３４２】
0003624911.tif 000394
【１２５２】
およびＶＱＮ（配列認識番号４４０）
【化３４３】
0003624911.tif 000395
【１２５３】
並びに断片を用いて、５′末端でＢａｍＨＩ部位を包含して、この２１０ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片を５′末端に伸長した。続いてのヌクレオチド配列分析により、４２ＫＴＨ４１の上記配列の下線により示したような位置２４後に外来の塩基（Ａ）が挿入されているようなオリゴヌクレオチド４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３８）の配列中のエラーが示された。これは、テンプレートとしてのＢＡＭＶＱ入れ４４１）および４２ＫＴＨ４１Ａ（配列認識番号４４２）
【化３４４】
0003624911.tif 000396
【１２５４】
による第３のＰＣＲから誘導した２７２ｂｐ断片を用いて最終ＰＣで訂正した。最終ＰＣＲ後、カセットは、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ部位３′を有する４２Ｋ−ＴＨ４．１に対してＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、およびＳｍａＩ部位５′を含有した。この２７１ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１を産生した。このプラスミドのヌクレオチド配列分析により、プロモーターとコード領域の配列を正確であったことが確認された。しかしながら、３ｂｐの欠損が生じ、３′ＢａｍＨＩ部位の損失となった。
【１２５５】
プラスミドｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１の構築
これらの３つのカセットを、Ｉ３Ｌ−Ｔ１が以下の方法の他の２つの遺伝子に対して反対方向となるように特異プラスミドｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１に結合した：１７０ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片をｐ７３１Ｔ１から単離し、同様に切断したｐＨ６Ｔ２に連結し、ｐＴ１Ｔ２を産生した。ｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１からの２９０ｂｐ  ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ断片を同様に切断したｐＴ１Ｔ２に連結し、ｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１を産生した。挿入物の配列をヌクレオチド配列分析により確認した。
【１２５６】
ｐＣ５ＬＳＰ（実施例６６に定義した）をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、ＮｏｔＩで切断し線状精製して自己連結した自己アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列認識番号３６３）
【化３４５】
0003624911.tif 000397
【１２５７】
に連結した。この方法によりＮｏｔＩ部位をｐＣ５ＬＳＰに導入し、ｐＮＣ５ＬＳＰ５を産生した。
【１２５８】
それぞれのプロモーターによりドライブされたエピトープの遺伝子を含有されるｐＴ１Ｔ２ＴＨ４．１からの６０２ｂｐ  ＸｈｏＩ断片を、供与体プラスミドｐＮＣ５ＬＳＰ５およびｐＳＤ５５０（実施例５９で定義した）のＸｈｏＩ部位にクローニングした。ヌクレオチド配列分析を用いて挿入物の配列と配置を確認した。産生したプラスミドｐＣ５Ｔ１Ｔ２ＴＨ４．１およびｐＩ４Ｔ１Ｔ２ＴＨ４．１を、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣとともに生体外組換え実験に用いて、それぞれ組換えウイルスｖＣＰ１４６およびｖＰ１０６２を産生した。これらの組換えウイルスは、ウイルスプラークに対する特異的ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。
【実施例１０５】
【１２５９】
ＨＩＶ−１  ｅｎｖからの形質膜アンカードメイン有するものと有さないＨＩＶ−１  ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１エピトープを含有する２つの融合ペプチドの発現
組換えポックスウイルスｖＰ１０６０、ｖＰ１０６１、ｖＣＰ１５４およびｖＣＰ１４８を産生し、切断可能リンカー領域によるＨＩＶ−１  ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１に対応する配列に結合したＨＩＶ−１  ｅｎｖからのシグナル配列からなる融合ペプチドを発現した。ｖＰ１０６０およびｖＣＰ１５４は、ｖＰ１０６１およびｖＣＰ１４８とは異なり、これは前者の組換えウイルスがＨＩＶ−１  ｅｎｖの形質膜領域に対応する配列とともに融合ペプチドを発現する点からである。
【１２６０】
両方の融合ペプチドは、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖの５１アミノ酸Ｎ末端部分、ラトナーら（1985）に基づく残留物１−５０（開始Ｍｅｔを加える）を含有する。このシグナル領域（配列認識番号４４３）のアミノ酸配列は、
【化３４６】
0003624911.tif 000398
【１２６１】
である。これには、互いにシグナルから離れたＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４．１エピトープ（ホスマリンら、1991）、および存在する場合にはアンカー配列が続き、長さで５のアミノ酸までの切断可能リンカー領域が続く。ペプチド（配列認識番号４４４）のこの領域のアミノ酸配列は、
【化３４７】
0003624911.tif 000399
【１２６２】
である。アンカードメインは、ＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）ｅｎｖの２８アミノ酸形質膜領域、残留物６９１−７１８である。この領域（配列認識番号４４５）のアミノ酸配列は、
【化３４８】
0003624911.tif 000400
【１２６３】
である。
【１２６４】
融合ペプチドの両方のバージョンに関して、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）およびＰＣＲＳＩＧＴ１（配列認識番号４４６）
【化３４９】
0003624911.tif 000401
【１２６５】
を用いてプラスミドｐＨ６ＨＩＩＩＢＥＭ（実施例１８で定義した）からＰＣＲによりＨ６プロモーターおよびＨＩＶ−１  ｅｎｖシグナル配列を誘導した。この３１４ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片は、５′ＨｉｎｄＩＩＩ部位と続くＨ６プロモーターおよびシグナル、リンカー、並びにＴ１ペプチドの最初の６アミノ酸のコード配列からなる。
【１２６６】
プライマーＰＣＲＴ１Ｔ２（配列認識番号４４９）
【化３５０】
0003624911.tif 000402
【１２６７】
およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番号４５０）
【化３５１】
0003624911.tif 000403
【１２６８】
を用いてオリゴヌクレオチドＴ２Ｔ４Ａ（配列認識番号４４７）
【化３５２】
0003624911.tif 000404
【１２６９】
およびＴ２Ｔ４ＴＢ（配列認識番号４４８）
【化３５３】
0003624911.tif 000405
【１２７０】
のＰＣＲ増幅により、形質膜領域のない構成のコード領域の残りを産生した。この１７７ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片は、Ｔ１ペプチド、リンカー領域、Ｔ２ペプチド、別のリンカー領域、およびＴＨ４．１ペプチド、それに続く３′ＸｂａＩ部位をコードする。この断片を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番号４５０）のＰＣＲによりプロモーターおよびシグナル配列を含有する３１４ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片と融合した。この４７３ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩでの切断の後、４５５ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳ−ＳＫに連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生したプラスミドをｐＢＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１と称した。
【１２７１】
プライマーＰＣＲＴ１Ｔ２（配列認識番号４４９）およびＰＣＲＴ４ＴＭ（配列認識番号４５１）
【化３５４】
0003624911.tif 000406
【１２７２】
を用いてオリゴヌクレオチド、Ｔ２Ｔ４Ａ（配列認識番号４４７）およびＴ２Ｔ４ＴＢ（配列認識番号４４８）のＰＣＲ増幅により、形質膜アンカーを有するバージョンのコード領域の残りを産生し、３′末端を改変して形質膜領域を収容した。この１９５ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片を、プライマーＰＣＲＴ１Ｔ２（配列認識番号４４９）およびＰＣＲＴＭＥＮＤ（配列認識番号４５０）を用いてアンカーからなるオリゴヌクレオチド、ＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）のＰＣＲにより融合した。この２７６ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）およびＰＣＲＴＭＥＮＤ（配列認識番号４５０）のＰＣＲによりプロモーターおよびシグナル配列を含有する３１４ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片と融合した。この５７２ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩでの切断後、５５４ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳに連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生したプラスミドをｐＢＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１Ａと称した。
【１２７３】
ｐＣ５ＬＳＰ（実施例６６に定義した）をＢａｍＨＩで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ３２（配列認識番号４０６）およびＣＰ３３（配列認識番号４０７）に連結し、ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生した。ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、ＮｏｔＩで切断し線状精製して自己連結した自己アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列認識番号３６３）に連結した。この方法によりＮｏｔＩ部位をｐＶＱＣ５ＬＳＰ６に導入し、ｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７を産生した。
【１２７４】
両カセットを挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７のＸｈｏＩとＸｂａＩ部位の間にそれぞれ配した。これらのプラスミドｐＣ５ＳＴ１Ｔ１ＴＨ４．１およびｐＣ５ＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１Ａを用いて、それぞれＣ５座中にカナリヤポックスウイルス組換え体、ｖＣＰ１４８およびｖＣＰ１５４を産生した。ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片をｐＣ５ＳＴ１Ｔ１ＴＨ４．１およびｐＣ５ＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１Ａから切除し、同様に切断したｐＳＤ５５０（実施例５９に定義した）に連結し、それぞれプラスミドｐＩ４ＳＴ１Ｔ２ＴＨ４．１およびｐＩ４ＳＴ１Ｔ１ＴＨ４．１Ａを産生した。これらのプラスミドをＮＹＶＡＣのＩ４座のＩＶＲに用いて、それぞれ組換え体ｖＰ１０６１およびｖＰ１０６０を産生した。これらの組換え体は、ウイルスプラークに対する特異的ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。
【実施例１０６】
【１２７５】
ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、およびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１  ｎｅｆの発現
ＨＩＶ−１  ｎｅｆ（ＭＮ）を発現する、組換えポックスウイルスｖＰ１０８４、ｖＦＰ１７４、およびｖＣＰ１６８を以下のように産生した：
プライマーＩ３ＰＣＲ１（配列認識番号４５２）
【化３５５】
0003624911.tif 000407
【１２７６】
およびＰＩ３ＮＥＦ２（配列認識番号４５３）
【化３５６】
0003624911.tif 000408
【１２７７】
を用いて、プラスミドｐＭＰＩ３ＨからＰＣＲによりＩ３Ｌプロモーターを誘導した。プライマーＰＩ３ＮＥＦ１（配列認識番号４５４）
【化３５７】
0003624911.tif 000409
【１２７８】
およびＰＮＥＦＢＡＭ（配列認識番号４５５）
【化３５８】
0003624911.tif 000410
【１２７９】
を用いて、ｐＭＮ１．８−１０（７７９２と９５９５でのＳｓｔＩ部位の間のＭＮゲノムのその部分のクローン）のＰＣＲ増幅により、ｎｅｆのコード領域を産生した。コード領域とプロモーターとの融合は、プライマー（配列認識番号４５２）およびＰＮＥＦＢＡＭ（配列認識番号４５５）を用いて、以前のＰＣＲ産生物の増幅により行なった。この産生物のＢａｍＨＩでの切断後に、０．７ｋｂの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳ−ＳＫ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドｐＩ３ＮＥＦを産生した。配列異常が最初に観察されたのがこの時点であった。プラスミドｐＭＮ１．８−１０における異常のために、カセットの配列は公表された配列（ガーゴら、1988、ゲンバンク承認番号Ｍ１７４４９）とは異なると決定した。これらの違いは、公表された配列と比較して以下のように要約する。
【化３５９】
0003624911.tif 000411
【１２８０】
カセット中の２つのサイレント突然変異（位置８８３４と９１２７で）はＰＣＲ中で明確な誤差である。コードしたタンパク質には効果がないので、これらは存続し続けた。９９３０でのフレームシフトにより、他のＨＩＶ−１単離体をより密接に組み立てる伸長した読取り枠が生じる。ＮＭ単離体からのｎｅｆの公表されたサイズのままでいるには、このカセットにはコード領域の切形３′末端を産生する第４のＰＣＲが必要である。
【１２８１】
位置９９３０での余分な塩基の除去は、プライマーＩ３ＰＣＲ１（配列認識番号４５２）およびＰＮＥＦＦＩＸ１（配列認識番号４５６）
【化３６０】
0003624911.tif 000412
【１２８２】
によるｐＩ３ＮＥＦ中の挿入物のＰＣＲ増幅により行なった。この６７８ｂｐ  ＰＣＲ誘導断片のＢａｍＨＩでの切断後、６６０ｂｐの断片をアガロースゲルから単離して、同様に切断したｐＢＳに連結し、プラスミドｐＢＳＩ３ＮＥＦを産生した。この挿入物をヌクレオチド配列分析により確認した。
【１２８３】
ｎｅｆ遺伝子を含有するｐＢＳＩ３ＮＥＦからの６６０ｂｐ  ＢａｍＨＩ断片を、挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７（実施例１０５で定義した）のＢａｍＨＩ部位に配した。産生したプラスミドｐＣ５Ｉ３ＮＥＦを、ＡＬＶＡＣのＣ５座へのＩＶＲに用いて、組換え体ｖＣＰ１６８を産生した。また同一の６６０ｂｐ  ＢａｍＨＩ断片を、挿入プラスミドｐＳＤ５５０ＶＣ（実施例５９で定義した）のＢａｍＨＩ部位に配し、プラスミドｐＩ４Ｉ３ＮＥＦを産生した。ＮＹＶＡＣを有するこのプラスミドに関するＩＶＲにより組換え体ｖＰ１０８４を産生した。
【１２８４】
ＴＲＯＶＡＣのＦ１６座の挿入プラスミドを以下のように誘導した。７．３ｋｂ  ＮａｅＩ／ＮｄｅＩ断片を、タータグリアら（1990）により記載された鶏痘ウイルスの１０．５ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドから単離し、同様に切断したｐＵＣ９に連結し、プラスミドｐＲＷ８６６を産生した。
【１２８５】
ｐＵＣ９をＰｖｕＩＩで切断し、ＥｃｏＲＩリンカーをＰｖｕＩＩ部位の間に連結し、プラスミドｐＲＷ７１５を産生した。鶏痘配列を側腹に有するクローニング部位を、プライマーＲＷ２６４（配列認識番号４５７）
【化３６１】
0003624911.tif 000413
【１２８６】
およびＲＷ２６７（配列認識番号４５８）
【化３６２】
0003624911.tif 000414
【１２８７】
を有する１０．５ｋｂ断片の部分のＰＣＲ増幅により産生した。隣接した領域もまた、プライマーＲＷ２６６（配列認識番号４５９）
【化３６３】
0003624911.tif 000415
【１２８８】
およびＲＷ２６５（配列認識番号４６０）
【化３６４】
0003624911.tif 000416
【１２８９】
を用いたＰＣＲにより増幅した。これらのＰＣＲ誘導断片を、プライマーＲＷ２６６（配列認識番号４５９）およびＲＷ２６７（配列認識番号４５８）を用いた第３のＰＣＲにより融合した。産生したＰＣＲ誘導断片は、５′ＥｃｏＲＩ部位および３′ＮｄｅＩ部位を側腹に有する鶏痘配列からなる。この断片の中央は、ＮｏｔＩ部位および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを側腹に有し、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有するポリクローニング領域である。初期転写終止シグナル（ユエンおよびモス、1987）は３′ＮｏｔＩ部位に隣接している。ＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで切断した、このＰＣＲ誘導断片を、同様に切断したｐＲＷ７１５に連結し、プラスミドｐＲＷ８６４を産生した。１１ｋプロモートしたｌａｃ  Ｚ遺伝子を、部分的なＢａｍＨＩの切断と全体的なＰｓｔＩの切断によりｐＡＭ１から切除した。この断片をクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、ＳｍａＩ切断したｐＲＷ８６４に連結し、ｐＲＷ８６７Ａを産生した。ＮｏｔＩ部位が、ＦｓｐＩ部位に連結される場合に再産生されるように、ｐＲＷ８６７ＡからのＮｏｔＩ断片を、ｄＮＴＰの存在下でクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、挿入がタータグリアら（1990）により記載された位置１９５５に対応して行なわれるように部分的にＦｓｐＩで切断されたｐＲＷ８６６に連結した。次いで産生したプラスミドｐＲＷ８６８をＮｏｔＩで切断し、ｌａｃ  Ｚカセットを除去し、ＮｏｔＩ切断により切除されたｐＲＷ８６４からの６６ｂｐ  ポリリンカーに連結した。産生したプラスミドをｐＲＷ６７３と称した。８１ｂｐ  ＳｍａＩ断片をｐＶＱ４２ＫＴＨ４．１（実施例１０４で定義した）から誘導し、ＳｍａＩ切断したｐＲＷ８７３に挿入し、プラスミドｐＶＱ８７３を産生した。
【１２９０】
ｎｅｆカセットを、ｐＶＱ８７３および続いてＩＶＲによるＴＲＯＶＡＣのＦ１６座への挿入のための６８４ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてｐＢＳＩ３ＮＥＦから切除し、ｖＦＰ１７４を産生した。
【実施例１０７】
【１２９１】
ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−２遺伝子の発現
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２  ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、プラスミド、ｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間に挿入した。これは、ＨＩＶ２  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するｐＩＳＳＹＥＧＰの４，４４０ｂｐ  ＢｓｔＵＩ−ＢｇｌＩＩ断片、およびＩ３Ｌプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１（配列認識番号４６１）
【化３６５】
0003624911.tif 000417
【１２９２】
とＳＩＶＬ１（配列認識番号１８１）を、ｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した）の４，０７０ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２１と称する。
【１２９３】
次いで外来３′非コード配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する２８０ｂｐ  ＢｃｌＩ−ＳｍａＩ  ＰＣＲ断片をｐＨＩＶ２１の８，１００ｂｐ  ＢｃｌＩ−ＳｍａＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｐ２（配列認識番号４６２）
【化３６６】
0003624911.tif 000418
【１２９４】
およびＨＩＶ２Ｐ３（配列認識番号４６３）
【化３６７】
0003624911.tif 000419
【１２９５】
を有する、プラスミドｐＩＳＳＹＥＧＰから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２２と称する。
【１２９６】
ｐＨＩＶ２２を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ１０４５を産生した。
【１２９７】
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ１０４５が真正ＨＩＶ２  ｇａｇ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＰ１０４５に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％  ＮＰ−４０、３０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  Ｎａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から１８時間後に細胞を収集した。
【１２９８】
ＨＩＶ２血清陽性個体から採取した血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ２  ｇａｇ発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ２血清陽性での４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ  トリス（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【１２９９】
ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ１０４５感染細胞からＨＩＶ２  ｇａｇ前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成ｇａｇ切断タンパク質産生物を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からはＨＩＶ２特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【実施例１０８】
【１３００】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
ＨＩＶ２  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をＩ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、上述したように最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を調製することにより行なった（実施例１０７参照）。
【１３０１】
ｐＨＩＶ２２を治療ウイルスとしてのｖＰ９２０とともに組換え実験に用いて、ｖＰ１０４７を産生した。
【１３０２】
上述したように、ＨＩＶ２  ｇａｇタンパク質の発現に関してｖＰ１０４７感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０４７感染細胞の溶解産物からは、ＨＩＶ２  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例１０９】
【１３０３】
ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０）組換え体の産生
ＨＩＶ２  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラス
ミド、ｐＩＳＳＹＥＧＰをＤｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をＩ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは、上述したように最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を調製することにより行なった（実施例１０７参照）。
【１３０４】
ｐＨＩＶ２２を治療ウイルスとしてのｖＰ９２２とともに組換え実験に用いて、ｖＰ１０４４を産生した。
【１３０５】
上述したように、ＨＩＶ２  ｇａｇタンパク質の発現に関してｖＰ１０４４感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０４４感染細胞の溶解産物からは、ＨＩＶ２  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例１１０】
【１３０６】
ＡＬＶＡＣ中のＨＩＶ２遺伝子の発現
ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１６０）組換え体の産生
プラスミド、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶはＨ６プロモートしたＨＩＶ２  ｅｎｖ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する。このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＢＳＨ６ＨＩＶ３ＥＮＶの２，７００ｂｐ  ＸｈｏＩ−ＳａｃＩＩ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４（配列認識番号４６４）
【化３６８】
0003624911.tif 000420
【１３０７】
とＨＩＶ２Ｌ５（配列認識番号４６５）
【化３６９】
0003624911.tif 000421
【１３０８】
を、ｐＣ６ＬのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２３と称する。
【１３０９】
次いでＨＩＶ２  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした。これは、Ｉ３ＬプロモートしたＨＩＶ２  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶ２２の４，４５０ｂｐ  ＸｍａＩ−ＮｏｔＩ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６（配列認識番号４２３）とＨＩＶ２Ｌ７（配列認識番号４２４）を、ｐＨＩＶ２３の７，０００ｂｐ  ＸｍａＩ−ＸｈｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＨＩＶ２５と称する。
【１３１０】
ｐＨＩＶ２５を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１５３を産生した。
【１３１１】
免疫沈降分析を行なって、ｖＣＰ１５３が真正ＨＩＶ２  ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＣＰ１５３に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％  ＮＰ−４０、３０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  Ｎａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から１８時間後に細胞を収集した。
【１３１２】
ＨＩＶ２血清陽性個体から採取した血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ２  ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ２血清陽性での４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ  トリス（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【１３１３】
ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１５３感染細胞からＨＩＶ２  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成ｇａｇ切断タンパク質産生物を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感染細胞からはＨＩＶ２特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【実施例１１１】
【１３１４】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ２８）およびｇａｇ（プロテアーゼ- ）組換え体のＮＹＶＡＣ産生におけるＳＩＶ  遺伝子の発現
免疫沈降分析を行なって、ｖＰ９４８（実施例２１で定義した）が真正ＳＩＶｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．で親ウイルスに感染せしめたか、またはｖＰ９４８に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞に、２％のウシ胎仔血清および［35Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）を添加した。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％  ＮＰ−４０、３０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３％  Ｎａ  Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から１８時間後に細胞を収集した。
【１３１５】
ＳＩＶ血清陽性マカク（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＳＩＶｇａｇおよびｅｎｖ前駆体発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６´ＮＹＶＡＣ）感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したＳＩＶ血清陽性マカクでの４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×ＬｉＣｌ2 ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ  トリス（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、１０％  ２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）で分画し、固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。
【１３１６】
ＳＩＶ血清陽性個体からのカマクは、ｖＰ９４８感染細胞からはＳＩＶ  ｇａｇ前駆体タンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞からはＳＩＶ特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
【実施例１１２】
【１３１７】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ＳＩＶMAC142ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳ１１ＧをＤｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をＩ３Ｌプロモーターの下流およびワクシニアウイルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは前述したようにプラスミドｐＳＩＶＧ５を調製することにより行なった（実施例２１参照）。
【１３１８】
次いで外来の３′非コード配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有する、１，０００ｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ  ＰＣＲ断片を、ｐＳＩＶＧ１の７，４００ｂｐ  部分的ＢａｍＨＩ−ＨｐａＩ断片にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド、ＳＩＶＰ５（配列認識番号１８３）およびＳＯＶＰ６（配列認識番号１８４）を有するプラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳ１１Ｇから産生した。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ４と称する。
【１３１９】
配列分析により、ｐＳＩＶＧ４がｐｏｌ遺伝子内に単一の塩基対欠損を含有することが分かった。この誤差を訂正するために、ｐＳＩＶＧ１の２，３２０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＳｔｕＩ断片をｐＳＩＶＧ４の６，１００ｂｐ  部分的ＢｇｌＩＩ−ＳｔｕＩ断片にクローニングした。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＧ５と称する。
【１３２０】
ｐＳＩＶＧ５を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＰ１０４２を産生した。
【１３２１】
ＳＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に関して前述したように、ｖＰ１０４２感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＳＩＶ特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０４２感染細胞の溶解産物からは、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例１１３】
【１３２２】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ４１）組換え体の産生
ｐＳＩＶＧ５（実施例２１）を治療ウイルスとしてのｖＰ１０５０とともに組換え実験に用いてｖＰ１０７１を産生した。
【１３２３】
ｖＰ１０７１感染細胞の免疫沈降実験によりＳＩＶ遺伝子の発現が示される。
【実施例１１４】
【１３２４】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ２８）組換え体の産生
ｐＳＩＶＧ５（実施例２１）を治療ウイルスとしてのｖＰ８７４とともに組換え実験に用いてｖＰ９４３を産生した。ＳＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したようにｖＰ９４３感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からはＳＩＶ特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９４３感染細胞からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ切断産生物が沈殿した。
【実施例１１５】
【１３２５】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｐ１６、ｐ２８組換え体の産生
ＳＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したようにｖＰ９４２（実施例２１）感染細胞の免疫沈降実験を行なった。しかしながら、ｖＰ９４２感染細胞の溶解産物からは、ｐ１６およびｐ２８に対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例１１６】
【１３２６】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｐ１６、ｐ２８およびｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ２８）組換え体の産生
ＳＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したようにｖＰ９５２（実施例２１）感染細胞の免疫沈降実験を行なった。しかしながら、ｖＰ９５２感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖ、ｐ１６およびｐ２８に対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例１１７】
【１３２７】
ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ  ｅｎｖ（ｇｐ１２０−ｇｐ４１）組換え体の産生
プラスミド、ｐＳＩＶＥＭＶＣは、Ｈ６プロモートしたＳＩＶMAC142エンベロープ遺伝子（生体外選択切形バージョン）を含有する。未熟終止コドンを含有するエンベロープ遺伝子の領域をｐＢＳＫ＋にクローニングした。これは、ｐＳＩＶＥＭＶＣの１，１２０ｂｐ  ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＳＫ＋のＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶ１０と称する。
【１３２８】
次いで上流の終止コドン、ＴＡＧを起点ＣＡＧコドンに改変した。これは、オリゴヌクレオチド、ＳＩＶＬ２０（配列認識番号４６６）
【化３７０】
0003624911.tif 000422
【１３２９】
およびＳＩＶＬ２１（配列認識番号４６７）
【化３７１】
0003624911.tif 000423
【１３３０】
を、ｐＳＩＶ１０の４，０００ｂｐ  ＮｈｅＩ−ＰｐｕＭＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶ１１と称する。
【１３３１】
次いで改変コドンを含有する領域をｐＳＩＶＥＭＶＣにクローニングした。これは、終止コドンを含有する、ｐＳＩＶ１１の３８０ｂｐ  ＢｇｌＩＩ−ＮｈｅＩ断片をｐＳＩＶＥＭＶＣの５，６００ｂｐ  部分的ＢｇｌＩＩ−ＮｋｈｅＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶ１２と称する。
【１３３２】
ｐＳＩＶ１２を治療ウイルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ１０５０を産生した。
【１３３３】
ＳＩＶ  ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したようにｖＰ１０５０感染細胞の免疫沈降実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＳＩＶ特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０５０感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖに対応するタンパク質種が沈殿した。
【実施例１１８】
【１３３４】
ＡＬＶＡＣ中のＳＩＶ遺伝子の発現
ＡＬＶＡＣ／ＳＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ組換え体の産生
ＳＩＶMAC142ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳ１１Ｇは、Ｄｒ．Ｇ．フランチーニ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドｐＳＩＶＧ５を調製することにより行なった（実施例２１参照）。
【１３３５】
次いでｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＳＩＶＧ５の４，５００ｂｐ  ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＣ５Ｌ（実施例４４で定義した）のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをｐＳＩＶＧＣ１３と称する。
【１３３６】
ｐＳＩＶＧＣ１３を治療ウイルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換え実験に用いてｖＣＰ１７２を産生した。
【１３３７】
ｖＣＰ１７２感染細胞の免疫沈降実験によりＳＩＶ遺伝子の発現が示される。
【実施例１１９】
【１３３８】
狂犬病糖タンパク質を発現するカナリヤポックスを用いてヒトの免疫（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）
実施例１５および第１７図に記載したように、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ＶＣＰ６５）を産生した。拡張とワクチン製造のために、特定病原体感染防止条件卵から誘導した初代ＣＥＦにおいてＡＬＶＡＣ−ＥＧ（ｖＣＰ６５）を増殖させた。０．０１の多重度で細胞を感染せしめ、３７℃で３日間インキュベーションした。
【１３３９】
感染細胞の血清不含有培地中の超音波分裂により、ワクチンウイルス懸濁液を得た；次いで細胞デブリを遠心分離と濾過により除去した。産生した浄化懸濁液に、１回の投与量のガラスびんに分配され凍結乾燥せしめられた凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を補給した。凍結乾燥の前に、血清不含有培地と凍結乾燥安定剤の混合物中のウイルス懸濁液を連続の１０倍希釈により、力価を減少させる３つのバッチを調製した。
【１３４０】
細胞基質、培地およびウイルス種並びに、外来剤の探求と研究所のげっ歯動物の無害性に重点を置いた最終産生物に品質管理試験を施した。所望の特徴は見られなかった。
【１３４１】
前臨床データ
生体外研究により、ＶＥＲＯまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の増殖を指示しないこと；一連の８（ＶＥＲＯ）および１０（ＭＲＣ）ブラインド血清継代ではこれらの非アビアン系において増殖するウイルスの適応は検出可能とはならなかったことが示された。ヒト細胞株の分析（ＭＣＲ−５、ＷＩＳＨ  デトロイト５３２、ＨＥＬ、ＨＮＫまたはＥＢＣ転換リンパ球幼若化ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５））は、これらの細胞中で複製のブロックがＤＮＡ合成の前に生じることを示唆するウイルス特異的ＤＮＡの蓄積を示さなかった。しかしながら、試験した全ての細胞株の狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、カナリヤポックス複製サイクルの不完全工程がウイルスＤＮＡ複製の前に生じることを明らかに示している。
【１３４２】
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性および効能を動物の一連の実験に報告した。カナリヤ、鶏、アヒル、ガチョウ、研究所のげっ歯動物（乳獣と成長したマウス）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスサル、アカゲサルマカク、およびチンパンジーを含む多くの種に１０5 から１０8 ｐｆｕの範囲の投与量で接種した。様々な経路を用いたが、通常は皮下、筋内および皮内であるが、または口頭（サルとマウス）および大脳内（マウス）もまた用いた。
【１３４３】
カナリヤにおいて、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は、病気または死の徴候を示さず乱切の部位で「生着」外傷を生じた。ウサギの皮内接種は、広がらず７日から１０日で直った典型的なポックスウイルス接種反応となった。どの動物試験においても、カナリヤポックスのための副作用は生じなかった。急速蛍光焦点阻害試験（Ｒａｐｉｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ；ＲＦＦＩＴ）により測定したように、げっ歯動物、イヌ、ネコ、および霊長目動物へのＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の接種後、抗狂犬病抗体の発達により、免疫抗原性を証明した。また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫したマウス、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス抗原投与実験により防御を証明した。
【１３４４】
志願者
狂犬病免疫の前歴のない２０−４５才の２５人の大人を登録した。志願者の健康状態を、完全な医学経歴、物理試験、血液学的および血液化学分析により評価した。除外基準は、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫低下、慢性衰弱病、癌、過去３か月の免疫グロブリンの注射、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原に対する血清陽性を含んだ。
【１３４５】
研究設計
標準ディプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バッチＥ０７５１番（フランス、リヨン、パスチュアーメリクス血清＆ワクチン）または研究ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）のいずれかを接種するように、参加者を任意に分配した。
【１３４６】
その試みを投与量段階的拡大研究と称した。実験ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の３つのバッチを、各段階の間が２週間の間隔で、志願者の３つの群（Ａ、Ｂ、およびＣ群）に連続的に使用した。３つのバッチの濃度は、投与量当たり、それぞれ１０3.5 、１０4.5 、１０5.5 組織培養感染投与量（ＴＣＩＤ50）であった。
【１３４７】
各志願者に、４週間の間隔で三角領域に皮内に同一のワクチンを２回接種した。注射したワクチンの性質は、最初の注射のときには参加者には知られていないが、試験者は知っていた。
【１３４８】
２回目の注射の時に即座の超感受性の危険を最小限にするために、中間投与量の実験ワクチンを分配したＢ群の志願者に、１時間前に低い投与量を注射し、高い投与量（Ｃ群）を分配した志願者には、１時間の間隔で低い投与量と中間の投与量を連続して接種した。
【１３４９】
６か月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）（Ｃ群）とＨＤＣワクチンの最高の投与量を接種した者は、３回目のワクチン投与を受けた；次いでその参加者には前と同一のワクチンたまは改変ワクチンのいずれかを任意に接種した。結果として、以下の免疫計画に対応して、４つの群を形成した：１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
【１３５０】
副作用の監視
注射後１時間に亘り全ての被実験者を監視し、次の５日間毎日再検査した。被実験者は、次の３週間に亘り局部的および全身的反応を記録するように求められ、週に２回電話で質問された。
【１３５１】
研究所の研究者
登録の前と、各注射の２、４、および６日後に血液を採取した。分析は、完全血球細胞算定、肝臓酵素およびクレアチニンキナーゼアッセイを含んだ。
【１３５２】
抗体アッセイ
最初の注射の７日前と、研究の７、２８、３５、５６、１７３、１８７、および２０８日後に、抗体アッセイを行なった。
【１３５３】
急速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）（スミス＆イエーガー、狂犬病の研究所技術）を用いて、狂犬病に対する中和抗体の水準を測定した。直接ＥＬＩＳＡによりカナリヤポックス抗体を測定した。抗原である、０．１％のトリトンＸ１００により分断された精製カナリヤポックスウイルスの懸濁液をマイクロ板に被膜した。固定化した血清の希釈物を室温で２時間反応せしめ、反応抗体は抗ヒトＩｇＧヤギ血清を標識したとが示された。結果を４９０ｍｎでの光学密度リードとして示した。
【１３５４】
分析
２５人の対象を登録し、研究を完了した。この対象は、１０人の男性と１５人の女性であり、平均年齢は３１．９（２１から４８）才であった。３人を除いた全ての対象は、前の天然痘ワクチン接種の形跡があった；残りの３人は典型的な跡およびワクチン接種の経歴がなかった。３人の対象に、低い投与量（１０3.5 および１０4.5 ＴＣＩＤ50）の実験ワクチンを投与し、９人の対象には１０5.5 ＴＣＩＤ50を投与し、１０人の対象にＨＤＣワクチンを投与した。
【１３５５】
安全性（表４９）
最初の一連の免疫中、注射から２４時間以内に、１人のＨＤＣ接種者（３７．８℃）および１人のｖＣＰ６５  １０5.5 ＴＣＩＤ50接種者（３８℃）では３７．７℃より高い熱が測定された。ワクチン接種に帰する他の全身的な反応はどの参加者にも見られなかった。
【１３５６】
皮内にＨＤＣを注射した接種者の９／１０と、それぞれｖＣＰ６５  １０3.5 、１０4.5 、１０5.5 ＴＣＩＤ50の接種者の０／３、１／３および９／９に局部的な反応が見られた。
【１３５７】
テンダネス（ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）が最も一般的な症状であり、通常は軽かった。他の局部的な症状は、赤味（ｒｅｄｎｅｓｓ）および軽く一時的な硬化（ｉｎｄｕｒａｔｉｏｎ）を含んだ。全ての症状は、通常２４時間以内にやわらぎ、７２以上は持続しなかった。
【１３５８】
血球細胞算定、肝臓酵素またはクレアチニンキナーゼ値には、著しい変化はなかった。
【１３５９】
免疫応答；狂犬病に対する中和抗体（表５０）
最初の注射から２８日後、全てのＨＤＣ接種者が防御力価（≧０．５ＩＵ／ｍｌ）を有した。これに対して、ＡおよびＢ群（１０3.5 および１０4.5 ＴＣＩＤ50）では誰もその値に達せず、Ｃ群（１０5.5 ＴＣＩＤ50）における２／９のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）接種者のみがこの防御力価に達した。
【１３６０】
５６日目に（すなわち、２回目の接種から２８日後）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチンの接種者のＡ群の０／３、Ｂ群の２／３およびＣ群の９／９において、防御力価が達成され、１０人のＨＤＣ接種者全てに保持された。
【１３６１】
５６日での幾何学的平均力価は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣ群においてそれぞれ０．０５、０．４７、４．４および１１．５  ＩＵ／ｍｌであった。１８０日目には、狂犬病抗体力価は全ての対象において実質的に減少したが、５／１０のＨＣＤ接種者と５／９のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ５６）接種者においては０．５  ＩＵ／ｍｌの最小防御力価より上の値を保持した；ＨＣＤおよびＣ群における幾何学平均力価は、それぞれ０．５１および０．４５  ＩＵ／ｍｌであった。
【１３６２】
カナリヤポックスウイルスに対する抗体（表５１）
高い力価を有するそれらの対象におけるカナリヤ鳥との前の接触の欠如にもかかわらず、観察された前免疫力価は、０．２２から１．２３  Ｏ．Ｄ．単位に変化する力価とともに大きく変化した。前免疫と２回目の注射力価の間で２倍より大きい増加と定義した場合、血清転化はＢ群の１／３およびＣ群の９／９に達成されたが、ＡまたはＨＤＣ群においては血清転化された対象はいなかった。
【１３６３】
追加抗原投与注射
追加抗原投与注射のときに、ワクチンは６か月後に同様に良好に耐性があった：２／９のＨＤＣ追加抗原投与接種者および１／１０のＡＬＶＡＣ／ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与接種者が熱を生じた。５／９のＨＤＣ追加抗原投与接種者と６／１０のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与接種者には、局部的反応が存在した。
【１３６４】
観察
第３５図は、狂犬病中和抗体力価のグラフを示すものである（急速蛍光焦点抑制試験またはＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）：同一または改変ワクチンのいずれかで以前に免疫した志願者におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５（１０5.5 ＴＣＩＤ50）の追加抗原投与効果。ワクチンは０、２８および１８０日に与えた。抗体力価は、０、７、２８、３５、５６、１７３、および１８７と２０８日に測定した。
【１３６５】
第３５図に示すように、与えられた追加抗原投与量により、どのような免疫計画の対象全てにおいても、狂犬病抗体力価がさらに増大することとなった。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与は全体的に、ＨＤＣ追加抗原投与およびＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）より低い免疫応答を誘発し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）群は他の３つの群よりも著しく低い力価を有した。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）追加抗原投与注射により、３／５の以前にＨＤＣワクチンを接種した対象、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫した５人全ての対象において、カナリヤポックス抗体力価の増大となった。
【１３６６】
一般的に、ｖＣＰ６５の投与からの局部的などの副作用も、ウイルスの局部的な複製を示さなかった。特に、ワクチンの注射後に観察されたような皮膚の外傷はなかった。ウイルスの複製の明確な欠如にもかかわらず、注射により志願者に、カナリヤポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する著しい量の抗体を産生させた。
【１３６７】
マウスにおける血清中和化試験と良好に相関することが知られている急速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）により、狂犬病中和抗体をアッセイした。１０5.5 ＴＣＩＤ50の９人の接種者のうち、５人は最初の投与の後に低水準の応答を有した。試験した最高投与量の接種者全て、および中間の投与量の３人のうち２人の接種者において、２回目の注射後には、狂犬病抗体の防御力価が得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワクチンに通常推奨されているが、不活化ＨＤＣワクチンに推奨されない皮内に与えられた。注射のこの経路は、注射部位の注意深い実験となるように選択されたが、これは、ＨＤＣ接種者における抗体の遅い発生となる：実際、どのＨＤＣ接種者も７日目荷は抗体の増加とはならず、一方ＨＤＣワクチンが筋内に与えられる研究のほとんどの場合、対象の著しい比率が抗体を増加させる（クレイトマンら、Ｉｎｔ′ｌ  グリーンクロス−ジェネバ、1981；クワートら、Ｉｎｔ′ｌ  グリーンクロス−ジェネバ、1991）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の接種に限られたものではない。
【１３６８】
狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何学的平均力価）は、ＨＤＣ対照ワクチンによるものよりも、本発明のワクチンによるもののほうが低いが、防御に要する最小力価よりはまだ十分に高い。本研究に用いた３回の投与により得られた明確な投与量効果応答は、より高い投与量はより強い応答を誘発することを示唆する。この開示から、当業者は所定の患者に適切な投与量を選択することができる。
【１３６９】
抗体応答を増加せしめる能力はこの実施例の別の重要な結果である；実際、狂犬病抗体力価の増大は、免疫計画がどのようなものであろうとも、投与から６か月後に全ての対照に達成され、カナリヤポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質のいずれかにより誘発された前から存在する免疫性が、組換えワクチン候補または従来のＨＤＣ狂犬病ワクチンでの追加免疫への遮断効果を有さないことが示された。これは、免疫応答が前から存在する免疫性により遮断されるというヒトのワクシニア組換え体に関する他者の発見と対照的である（コーニーら、ランセット1991、337:567-72；エトリンガーら、ワクチン1991、9:470-72）。
【１３７０】
それゆえ、この実施例は明確に、非複製ポックスウイルスは、複製剤が免疫応答に与える全ての長所を有するが、完全許容ウイルスにより生じた安全性問題なく、ヒトにおいて免疫ベクターとして機能できることを示している。
【表４９】
0003624911.tif 000424
【表５０】
0003624911.tif 000425
【表５１】
0003624911.tif 000426
【実施例１２０】
【１３７１】
ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶ組換え体（ｖＰ９０８、ｖＰ９２３）による日本脳炎ウイルスに対する防御
ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶ組換え体を用いて、日本脳炎ウイルスに対する防御を提供した。ＮＹＶＡＣ  ｖＰ８６６、ＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ９０８とｖＰ９２３、およびワクシニア組換え体ｖＰ５５５とｖＰ８２９をここに記載したように産生した。
【１３７２】
マウス防御実験
マウス防御実験を前述したように行なった（メイソンら、1991）。手短にいうと、生後４週間の非近交スイスマウスの１０から１２匹の群を、１０7 ＰＦＵのｖＰ８２９、ｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で腹腔（ｉ．ｐ．）注射により免疫し、血清を３週間後に採取した。マウスに、ＪＥＶのベイジン（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｐ３菌株をｉ．ｐ．注射により抗原投与した。抗原投与後、３週間後に実験が完了するまで毎日観察した。実験動物の同腹子を用いて致死量滴定を行なった。
【１３７３】
ブタの防御実験
約２５ｋｇの体重のランドレース交雑去勢ブタを用いた。５匹のブタの群を、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、または２ｍｌのＰＢＳで希釈された１×１０8 ＰＦＵのｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で皮下（ｓ．ｃ．）注射により免疫した。接種から２８日後、上述したのと同じ方法で注射により追加抗原投与し、最初の接種から５６日後に、２×１０5 ＰＦＵのＪＥＶのＢ−２３５８／８４菌株をｓ．ｃ．注射により抗原投与した。０（免疫前）、７、１４、２８（追加抗原投与前）、３１、３５、４２、５６（抗原投与前）、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４および７６（抗原投与後）日に、全ての群の動物から血清を採取した。
【１３７４】
免疫応答の評価
抗ブタイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇで被膜した固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細菌（カリフォルニア、カーピンテリア、ダコー社）を使用したことを除いては、ボニシら（1991）に記載されているように、［35Ｓ］Ｍｅｔ−標識ＪＥＶ感染細胞から得た培養液または洗浄剤処理細胞溶解産物から、ＪＥＶタンパク質を沈殿せしめる能力に関して、ブタの血清を検定した。クラーケおよびカサルス（1958）の方法の修正方法により、ブタとマウスの前抗原投与血清のＨＡＩ検定を行なった。ブタの血清を検定するのに新鮮に解凍したヒトの血清を使用しなかったことを除いては、実質的にメイソンら（1991）に記載されたように、ＮＥＵＴ検定を行なった。
【１３７５】
ウイルス血症
ＪＥＶ抗原投与から８日後に採取した脊椎血清の新鮮に解凍したアリコートを、６ウェルマイクロ板中のＶＥＲＯ単層細胞上の感染ＪＥＶに関してプラーク滴定した。ウイルス吸着後、細胞単層に、１％のカルボキシメチルセルロースを含有する培地を添加し、２０％エタノール中に溶解せしめた０．１％のクリスタル紫の染色により感染から５日後にプラークを視覚化した。３つ以下のプラークが３００μｌの血清でインキュベーションしたウェル中に観察された場合には、力価は＜１０ＰＦＵ／ｍｌと記録した。
【１３７６】
組換えワクシニアウイルスの構造
本研究において構築したワクシニア組換え体に含有されたＪＥＶ  ｃＤＮＡ配列を第３６図に示す。これらの組換えウイルスにおいて、ＪＥＶ  ｃＤＮＡの血清ストランドを初期／晩期Ｈ６プロモーターの後ろに配した。組換え体ｖＰ９０８（およびｖＰ５５５；メイソンら、1991）は、ｐｒＭ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１およびＮＳ２ＡのＮ末端に選考する推定１５アミノ酸シグナル配列を含有する。組換え体ｖＰ９２３（およびｖＰ８２８；コニシら、1991）は、ｐｒＭ、ｐｒＭ、およびＥの推定シグナル配列をコードする。
【１３７７】
組換えワクシニアウイルスによるＥおよびＮＳ１の合成
ＥまたはＮＳ１遺伝子の免疫沈降を、ＥまたはＮＳ１に特異的な単クローン性抗体を用いて行なった。ｖＰ５５５、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３に感染した細胞中でＥ  ＭＡｂに反応性のあるタンパク質を合成し、ｖＰ９２３に感染した細胞中ではなくｖＰ５５５およびｖＰ９０８に感染した細胞中で、ＮＳ１  ＭＡｂに反応性のあるタンパク質を合成した。ｖＰ５５５感染細胞は、細胞の内側と外側でＥおよびＮＳ１の正確な形状を産生した。ｖＰ９０８およびｖＰ９２３により産生されたタンパク質は、ｖＰ５５５により産生されたタンパク質のサイズと等しかった。ＥおよびＮＳ１に関して、細胞外形状は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中の細胞内形状より遅く移動し、これは、細胞からの放出に直ちに先行するＮ連結グリカンの成熟と一致する。加えて、ｖＰ９０８感染細胞は、ＮＳ１、ＮＳ１′の高分子量形状を産生し、これはＪＥＶゲノムのＮＳ２Ａ領域によりコードされた配列のプロセシングにより誘導される（メイソンら、1987）。Ｍ（およびｐｒＭ）に特異的なＭＡｂを用いて放射線標識ワクシニア組換え体感染細胞から調製した免疫沈殿物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３に感染した細胞中でｐｒＭが合成されたことが分かった。
【１３７８】
ｖＰ９０８およびｖＰ９２３感染ＨｅＬａ細胞の細胞外液体は、ｖＰ８６６感染細胞の培養液中では検出不可能なＨＡ活性を示した。データにより、ｖＰ８２９はｖＰ５５５よりも約８倍多い細胞外血球凝集素の合成を誘発したことが分かった。その差異に対応して、ｖＰ９２３に感染した細胞は、ｖＰ９０８に感染した細胞よりも約８倍のＨＡ活性を産生した。これらの結果により、ｖＰ９８０およびｖＰ９２３により産生されたＪＥＶタンパク質の組換え体形状は、それぞれｖＰ５５５およびｖＰ８２９により産生されたものと等しいことが示された。
【１３７９】
マウスの免疫および抗原投与
ＮＹＶＡＣベースの組換えウイルスの防御免疫を誘発する能力をマウスで実験した。前抗原投与血清のＮＥＵＴおよびＨＡＩデータにより、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３は、ｖＰ８２９と同水準の抗体を産生した（コニシら、1991）（表５２）。これらの血清学的データと一致して、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３は、ＪＥＶの病原体Ｐ３菌株による致死量ＪＥＶ感染からの防御をマウスに提供することができた（表５２）。防御の水準は、ｖＰ８２９での免疫により達成された水準と同様であった（表５２）（コニシら、1991）。これらの研究により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３の２つのＮＹＶＡＣベースの組換え体は、前述した水準（コニシら、1991）と同様の水準でマウスに免疫原性であったことが確認された。
【１３８０】
組換えワクシニアウイルスによるブタのＪＥＶ抗原に対する免疫応答の導入
７日ごとに収集した各群の全てのブタから採取した前抗原投与血清を、抗ＪＥＶ  ＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性に関して検定した。第３７図に示すように、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３で免疫したブタ中にはＮＥＵＴとＨＡＩ活性の両者が観察されたが、ＰＢＳまたはｖＰ８６６を接種したブタには観察されなかった。ｖＰ９０８およびｖＰ９２３免疫ブタの両者には、１回目と２回目の接種から７日後に比較的高水準のＮＥＵＴ抗体が観察されたが、２１日後にわずかに検出可能な水準まで減少した。第１の接種と追加抗原投与の両方に関して、ＨＡＩは、ＮＥＵＴ抗体よりもゆっくりと減少した（第３７図）。ｖＰ９０８は、ｖＰ９２３よりもやや高い水準のＨＡＩおよびＮＥＵＴ抗体を提供した。両方の組換え体のＨＡＩ力価は、１回の接種後に達成されたものよりも、２回目の接種後に達成されたほうが大きかった。ｖＰ９２３は、１回の接種よりも２回目の接種後のほうが高いＮＥＵＴ力価を提供し、一方ｖＰ９０８は、１回または２回目の接種後には等量のＮＥＵＴ力価を誘発した。
【１３８１】
ブタを０日と２８日に免疫し、ＰＢＳまたはｖＰ８６６で免疫したブタから５６日目に血清を採取し、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で免疫したブタからは０、７、２８、３５および５６日目に血清を採取した。５の各群の全ての動物から採取した血清を、ＪＥＶ感染細胞の培養液から収集した放射線標識したタンパク質を免疫沈降する能力に関して検定した。
【１３８２】
Ｅに対する免疫応答は、ＮＥＵＴおよびＨＡＩ検定の結果と良好に相関性があった。ｖＰ９２３で免疫したブタに観察された３５日目のＥに対するＲＩＰ応答は、ｖＰ９０８で免疫したブタ中のＥに対するＲＩＰ応答よりも高かったが、３５日目のＨＡＩ力価は、２つの群と等しかった。しかしながら、ｖＰ９２３で免疫したブタにおける３５日目のＮＥＵＴ力価は、ｖＰ９０８で免疫したブタよりも高かった。ＮＥＵＴまたはＨＡＩに関わる抗体以外の抗体が誘発されるが、ＲＩＰ分析の量に関する面はさらには確認できなかった。比較的高いＮＥＵＴ抗体力価にもかかわらず、７日目にＥに対する血清の弱いＲＩＰ応答が、免疫後の初期のＩｇＭ抗体により説明できた。ＪＥＶ特異的ＩｇＭの水準はさらには分析しなかった。どの採取した血清もＮＳ１に対する免疫応答を示さなかった。
【１３８３】
組換えワクシニアウイルスで免疫したブタ中のウイルス血症
対照ブタ［ＰＢＳ（４／５）またはｖＰ８６６（５／５）］からの抗原投与後の血清中に、＞１０ＰＦＵ／ｍｌのＪＥウイルス力価が検出され、一方ｖＰ９２３を接種した５匹のブタのうち２匹のみが＞１０ＰＦＵ／ｍｌのウイルス血症を示した（第３８図）。目だったことには、ｖＰ９０８で免疫した５匹のブタのうちどれも、＞１０ＰＦＵ／ｍｌの測定可能なウイルス血症を示さなかった。ＰＢＳおよびｖＰ８６６（１．２×１０3 ＰＦＵ／ｍｌ）で免疫した群の個々のブタの最大ウイルス力価の幾何学平均は、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３（１．９×１０1 ＰＦＵ／ｍｌ；スチューデントｔ検定によりＰ＜０．００１；＜１０ＰＦＵ／ｍｌのウイルス血症を有する全てのブタに関して、１０ＰＦＵ／ｍｌの力価であると推定する）で免疫した群の平均より著しく高かった。さらに、＞１０ＰＦＵ／ｍｌの細胞を示すブタのウイルス血症の平均期間は、ＰＢＳおよびｖＰ８６６に関しては２．７日であり、＞１０ＰＦＵ／ｍｌの力価を有する２つのｖＰ９２３免疫ブタでは２．０日であった。これらの結果により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３の免疫は、抗原投与後にＪＥＶウイルス血症を著しく減少したことが示される。
【１３８４】
ＪＥＶ抗原投与に対する免疫応答を評価するために、抗原投与後２０日目に硝石した個々の血清をＪＥＶに対する抗体に関して検定した。ｖＰ９０８またはｖＰ９２３をワクチン接種したブタは、ＰＢＳまたはｖＰ８６６を接種したブタよりも高いＥに対する応答を有し、抗原投与前に存在したＥに対する抗体活性をＪＥＶ感染により追加抗原投与したことが示された。組換えワクシニアウイルス中で発現されなかったＪＥＶタンパク質、ＮＳ３およびＮＳ５に対する応答が抗原投与後の血清全ての検出され、ある水準のＪＥＶ複製が、＜１０ＰＦＵ／ｍｌのウイルス血症を有したブタでさえも生じたことを示した。それゆえ、ＮＳ３に対する抗原投与後の血清の反応性と血清ＪＥＶ力価により測定された感染の欠乏との間の予期された逆数の関係は観察されなかった。これは、抗原投与後のＮＳ３に対する採取しマウスの血清の反応性の欠乏が防御と相関するという、マウスに得られた以前のデータと対照的である（コニシら、1991）。
【１３８５】
防御実験中、抗原投与から１２日後に親ワクシニア（ｖＰ８６６）群の１匹のブタが死亡した。この動物は、抗原投与後の期間に亘り、他のブタより高い体温を示し、３日間に亘り＞１，０００ＰＦＵのＪＥＶ血清力価を有する唯一の動物であった。検死時にサンプリングした脳検体からはＪＥＶは検出されなかったけれども、ＪＥＣ感染により生じた病気により動物は死亡した。
【１３８６】
観察
実施例は、ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶがＪＥＶウイルス血升対する効果的な防御を提供することを示し；それゆえ、ＮＹＡＶＣ−ＪＥＶは有用であり、獣医用途に安全である。
【表５２】
0003624911.tif 000427
【実施例１２１】
【１３８７】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
免疫沈降
アビアンまたは非アビアン細胞の前形成した単層に、細胞当たり１０ｐｆｕの親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）またはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを接種した。接種は、メチオニンを含まず、２％の透析ウシ胎仔血清を補給したＥＭＥＭ中で行なった。１時間のインキュベーション後、接種物を除去して、培地を２０μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニンを含有するＥＭＥＭ（メチオニンを含まない）と置き換えた。約１６時間の一晩のインキュベーション後、緩衝液Ａ（１％  ノニデットＰ−４０、１０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  アジ化ナトリウム、１ｍｌ当たり５００単位のアプロチニン、および０．０２％  フェニルメチルスルホニルフッ化物）の添加により、細胞を溶解せしめた。ニューヨーク州、アルバニー、ニューヨーク州保険省、グリフィス研究所、Ｄｒ．Ｃ．トリナーチにより提供された２４−３Ｆ１０と称する狂犬病糖タンパク質特異的単クローン性抗体、およびベーリンガーマンハイム社（ネコ．６０５−５００）から得たラット抗マウス複合体を用いて、免疫沈降を行なった。ニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシアＬＫＢバイオテクノロジー社から得たタンパク質ＡセファロースＣＬ−４８を、支持マトリックスとして用いた。免疫沈殿物を、ドリファスら（1984）の方法にしたがって、１０％のポリアクリルアミドゲルで分画した。ゲルを固定し、フルオログラフィーのために１ＭのＮａ−サリチル酸塩で１時間処理し、コダックＸＡＲ−２フイルムに露出して免疫沈殿したタンパク質種を視覚化した。
【１３８８】
動物の供給源
ニュージーランド白ウサギをヘアマーランド（ニュージャージー、ヘウィット）から得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター非近交マウス、妊娠時期の雌のスイスウェブスター非近交マウス、および生後４週間のスイスウェブスターヌード（ｎｕ+ ｎｕ+ ）マウスをタコニックファーム社（ニューヨーク、ジャーマンタウン）から得た。ＮＩＨガイドラインにしたがって、全ての動物を保持した。全ての動物のプロトコルは、ＩＡＣＵＣ協会により認可された。必要と思われる場合、明らかに末期の病気であるマウスを安楽死させた。
【１３８９】
ウサギの病害の評価
２匹のウサギのそれぞれに、様々な部位に、１０4 、１０5 、１０6 、１０7 、または１０8 ｐｆｕの各試験ウイルスを含有する０．１ｍｌのＰＢＳまたＰＢＳ単体を皮内に接種した。病害が解決されるまで、４日目から毎日ウサギを観察した。硬結および潰瘍を測定し、記録した。
【１３９０】
接種部位からのウイルスの回収
１匹のウサギに、様々な部位に、１０6 、１０7 、または１０8 ｐｆｕの各試験ウイルスを含有する０．１ｍｌのＰＢＳまたＰＢＳ単体を皮内に接種した。１１日後、ウサギを安楽死させ、ウイルス回収のために機械的な分断と間接超音波処理により、各接種部位から採取した皮膚の生検材料を無菌の状態に調製した。ＣＥＦ単層のプラーク滴定により感染ウイルスをアッセイした。
【１３９１】
マウスの毒性
１０匹のマウスの群または５匹のヌードマウスの群に、０．５ｍｌの無菌ＰＢＳ中のウイルスのいくつかの希釈の１つをｉｐにより接種した。実施例２４を参照のこと。
【１３９２】
シクロホスファミド（ＣＹ）処理
ｉｐ経路により、２日前に４ｍｌ（０．２ｍｌ）のＣＹ（シグマ）をマウスに注射し、０日にウイルスを注射した。感染から以下の日に、マウスにＣＹをｉｐにより注射した：１日目に４ｍｇ；４、７および１１日に２ｍｇ；１４、１８、２１、２５および２８日に３ｍｇ。１１日目にカルターカウンターで白血球を数えることにより免疫抑制を間接的にモニタした。平均の白血球数は、未処理マウスでは１μｌ当たり１３，５００細胞（ｎ＝４）であり、ＣＹ処理対照マウスでは１μｌ当たり４，２２０細胞（ｎ＝５）であった。
【１３９３】
ＬＤ50の計算
５０％の死亡率（ＬＤ50）となるのに必要な致死量を、リードおよびミュンヒ（リードおよびミュンヒ、1938）の比率方法により測定した。
【１３９４】
マウスのＮＹＶＡＣ−ＲＧの効能検定
生後４から６週間のマウスには、５０から１００μｌの希釈範囲（２．０−８．０  ｌｏｇ10組織培養感染投与量５０％（ＴＣＩＤ50））のＶＶ−ＲＧ（キーニーら、1984）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（テイラーら、1991ｂ）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかをフットパッドで接種した。各群は８匹のマウスからなる。ワクチン接種から１４日後、頭蓋内接種により、１５ＬＤ50の狂犬病ウイルスＣＶＳ菌株（０．０３ｍｌ）をマウスに抗原投与した。２８日目に、生存したマウスを数え、防御投与量５０％（ＰＤ50）を計算した。
【１３９５】
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導
コペンハーゲンワクチン菌株のプラーククローン単離体である、ＶＣ−２から、ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ菌株を産生した。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを産生するために、毒性に関連する多くのウイルス機能を含む、１８のワクシニアＯＲＦは、この開示の最初のほうに記載したような一連の配列操作で正確に欠損せしめた。新たな望ましくない読取り枠の状況を避けるために設計した方法で、これらの欠損を構築した。第３９図は、ＮＹＶＡＣを産生するために欠損したＯＲＦを模式的に描いたものである。第３９図の上部には、ワクシニアウイルスゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ制限地図（ＶＣ−２プラーク単離体、コペンハーゲン菌株）が描かれている。ＮＹＶＡＣの産生において続発的に欠損せしめられたＶＣ−２の６つの領域が伸長している。欠損は、この開示の最初のほうに記載した（実施例１から６）。その座から欠損され、その遺伝子産生物の分子量および機能または相同性を伴ってＯＲＦがそのような欠損座の下に列記されている。
【１３９６】
ヒト組織細胞株のＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製研究
ヒト起源の細胞中のワクシニアウイルス（ｖＰ８６６）のＮＹＶＡＣ菌株の複製水準を測定するために、６つの細胞株を、液体培養下で細胞当たり０．１ｐｆｕの入力多重度で接種し、７２時間インキュベーションした。コペンハーゲン親クローン（ＶＣ−２）を平行して接種した。全てのウイルスの許容細胞基質を代表するために、初代鶏胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）（ＣＴ、スパラス社、ＳＰＦ期限の生後１０−１１日の感染細胞包蔵卵から得た）を含む。２つの基準に基づいて培養を分析した：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現。
【１３９７】
多くのヒト誘導細胞中のＮＹＶＡＣの複製能力を表５３に示す。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣの両者は、ＣＥＦ細胞中で生産的な複製ができるが、ＮＹＶＡＣは、やや減少した産生となる。ＶＣ−２はまた、ＥＢＶ転換リンパブラストイド（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞株ＪＴ−１（エプスタインバーウイルスで転換したヒトリンパブライトイド細胞株、リキンソンら、1984参照）を除いて、匹敵する産生物で処理した６つのヒト誘導細胞株において生産的複製ができる。これに対して、ＮＹＶＡＣは、検定したヒト誘導細胞株のいずれにでも生産的複製能力においては高度に弱毒化されている。ＮＹＶＡＣ感染ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５３２（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ５４、ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ  ２９９（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ１３７、ヒト胚肺起源）、およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓、ＭＤ、ウォーカースビル、ウィチカーバイオプロダクツ社、ネコ＃７０−１５１）細胞から、残留ウイルス水準より高い感染細胞の少量の増加が達成された。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞または親ＶＣ−２感染ＣＥＦ細胞から得られたウイルス産生物と比較した場合、これらの細胞株の複製は著しく少ない（表５３）。ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２両者のＣＥＦ細胞中の２４時間での産生は、７２時間の産生と等しい。それゆえ、ヒト細胞株培養を追加に４８時間に亘りインキュベーションすると（さらなる２つのウイルス増殖サイクル）、達成された相対ウイルス産生を増幅させる。
【１３９８】
ヒト誘導細胞株、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２に得られた低水準のウイルス産生と一致して、検出可能であるがわずかな水準のＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積が認められた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞中に観察されたＤＮＡ蓄積の水準と相対的なＭＲＣ−５およびデトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞株中のＤＮＡ蓄積の水準は、相対的なウイルス産生と匹敵する。ＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ蓄積は、いずれの他のヒト誘導細胞にも観察されなかった。
【１３９９】
アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣを用いて、同様の実験を行なった。ウイルス複製の結果を表５３に示す。どの後代ウイルスも、アビアン種に対するカナリヤポックスウイルスの宿主範囲制限と一致してヒト細胞株のいずれにも検出不可能であった。いずれのヒト誘導細胞株にもＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積が検出不可能であったことは、これらのヒト誘導細胞中のＡＬＶＡＣの生産的複製の欠如と一致する。
【１４００】
ヒト細胞におけるＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現
異種遺伝子の能率的な発現が、生産的ウイルス複製水準が著しく欠如した状態で得られるか否かを決定するために、同一の細胞株に、35Ｓ−メチオニンの存在下で狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体（ｖＰ８７９、実施例７）を接種した。狂犬病糖タンパク質に特異的な単クローン性抗体を用いて放射線標識した培養溶解産物から、狂犬病糖タンパク質の免疫沈降を行なった。狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化形状と一致する６７ｋＤａタンパク質の免疫沈降が検出された。どの血清学的交差反応性産生物も、未感染または親ＮＹＶＡＣ感染細胞溶解産物中には検出されなかった。分析した全ての他のヒト細胞株にも同様の結果が得られた。
【１４０１】
ウサギの皮膚への接種
皮内接種後のウサギへの皮膚の外傷の性質と誘発を、枠ウイルス菌株の病原性の尺度として以前から用いている（バラーら、1988；チルドら、1990；フェナーら、1958；フレクスナーら、1987；ゲンドンおよびチャーノス、1964）。それゆえ、ワクシニア菌株ＷＲ（パニカリら、（1981）に記載されたような、ＡＴＣＣ  ＃ＶＲ１１９  ＣＶ−１細胞において精製したプラーク、ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ７０、およびＬバリアントと称するプラーク単離体、選択したＡＴＣＣ  ＃ＶＲ２０３５）、ＷＹＥＴＨ（ＰＡ、マリエッタ、エスラボラトリーズによりＤＲＹＶＡＣとして市販されているＡＴＣＣ  ＃ＶＲ３２５）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、およびＮＹＶＡＣによるｉｄ接種に関連する外傷の性質を、２匹のウサギの接種により評価した（Ａ０６９およびＡ１２８）。２匹のウサギは、ウイルスに対して全体的に異なる感度を示した。すなわち、ウサギＡ１２８は、ウサギＡ０６９よりも強烈ではない反応を示した。ウサギＡ１２８において、外傷は比較的小さく、接種から２７日後に消散した。ウサギＡ０６９では、外傷は酷く、ＷＲ接種部位では特に酷く、４９日後に消散した。外傷の酷さはまた、リンパ液排液網に関連する接種部位の位置に依存した。特に、背の脊椎（ｂａｃｋｓｐｉｎｅ）より上に位置する全ての部位は、より酷い外傷を示し、側腹部に位置する外傷を消散するのにより長い時間が必要であった。全ての外傷を、４日目から最後の外傷が消えるまで毎日測定し、最大外傷サイズと消散までの日数の平均を計算した（表５４）。対照ＰＢＳを注射した部位からは局部的な反応は観察されなかった。ＷＲ、ＶＣ−２、およびＷＹＥＴＨワクシニアウイルス菌株を注射した部位では潰瘍外傷が観察された。特に、ＮＹＶＡＣを接種した部位では、硬結または潰瘍外傷は観察されなかった。
【１４０２】
接種部位での感染細胞の残存率
接種部位でのこれらのウイルスの相対的残存率を評価するために、ウサギに、１０6 、１０7 または１０8 ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ、ＷＹＲＴＨまたはＮＹＶＡＣを含有する０．１ｍｌのＰＢＳを様々な部位に皮内に接種した。各ウイルスに関して、背の脊椎の上の位置に１０7 ｐｆｕの投与量と、その側腹に１０6 および１０8 の投与量を与えた。１１日間に亘り、接種部位を毎日観察した。ＷＲは、最も強烈な応答を誘発し、次にはＶＣ−２とＷＹＥＴＨが続いた（表５５）。ＷＲとＷＹＥＴＨに関しては、９日目に、ＶＣ−２に関しては１０日目に、潰瘍が観察された。ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は、硬結また潰瘍を示さなかった。接種から１１日目に、接種の部位から皮膚の試料を切除し、機械的に分断し、ウイルスをＣＥＦ細胞において滴定した。その結果を表５５に示す。この時点で、投与したよりも回収したウイルスが多いことはなかった。投与したウイルスの量にかかわりなく、カーワクシニア菌株ＷＲの回収は、各部位で約１０6 ｐｆｕであった。ワクシニア菌株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収は、投与量にかかわらず１０3 から１０4 ｐｆｕであった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは、感染ウイルスは回収されなかった。
【１４０３】
遺伝子的または化学的免疫不全マウスの接種
多量の投与量のＮＹＶＡＣ（５×１０8 ｐｆｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０9 ｐｆｕ）のヌードマウスへの腹腔内接種では、１００日間の観察期間に亘り、死亡、外傷、およ明らかな疾病とはならなかった。これに対して、ＷＲ（１０３から１０４ｐｆｕ）、ＷＹＥＴＨ（５×１０７または５×１０８ｐｆｕ）またはＶＣ−２（１０４から１０９ｐｆｕ）を接種したマウスは、最初に爪先、次いで尾のポックスウイルスに典型的な広がった外傷を示し、続いてある動物ではこう丸炎を示した。ＷＲまたはＷＹＥＴＨに感染したマウスにおいて、広がった外傷は一般的に、最終的には死亡を導き、一方ほとんどのＶＣ−２に感染したマウスは最終的には回復した。計算したＬＤ50値を表５６に示す。
【１４０４】
特に、ＶＣ−２を接種したマウスは、爪先に外傷を示し始め（赤い丘疹）、１から２日後には尾に示した。これらの外傷は、最高の投与量（１０9 、１０8 、１０7 および１０6 ｐｆｕ）を与えたマウスでは接種後（ｐｉ）１１と１３日の間、１０5 ｐｆｕを与えたマウスではｐｉ１６日目、そして１０4 ｐｆｕを与えたマウスではｐｉ２１日目に生じた。１０3 および１０2 ｐｆｕを接種したマウスには１００日の観察期間中は、外傷は観察されなかった。１０9 から１０8 ｐｆｕを与えたマウスにはｐｉ２３日目に、こう丸炎が観察され、他の群（１０7 から１０4 ｐｆｕ）では約７日後に観察された。こう丸炎は、１０9 と１０8 ｐｆｕの群に特に強烈であったが、１００日の観察期間の終りには、減退が観察された。数匹のマウスの皮膚には、痘状の外傷がいくつか観察され、これはｐｉ３０−３５日辺りに生じた。ほとんどの痘外傷は、通常ｐｉ６０−９０日の間に直った。１０９ｐｆｕを接種した群では１匹のマウスが死亡し（ｐｉ３４日）、１０８ｐｆｕを接種した群では１匹のマウスが死亡した（ｐｉ９４日）。ＶＣ−２接種マウスでは他には死亡は観察されなかった。
【１４０５】
１０4 ｐｆｕのワクシニアのＷＲ菌株を接種したマウスをｐｉ１７日目に痘外傷を示し始めた。これらの外傷は、ＶＣ−２注射マウス（膨れた爪先、尾）により示された外傷と同一であった。１０3 ｐｆｕのＷＲ菌株を接種したマウスは、ｐｉ３４日目まで外傷を示さなかった。ＷＲの最高投与量（１０4 ｐｆｕ）を接種したマウスのみにこう丸炎が観察された。観察期間の後半の段階に亘り、外傷が口の回りに発生し、マウスは餌を食べるのをやめた。１０4 ｐｆｕのＷＲを接種した全てのマウスは死亡したか、またはｐｉ２１と３１日の間に必要な場合には安楽死させた。１０3 ｐｆｕのＷＲを接種した５匹のマウスのうち４匹は死亡したか、またはｐｉ３５と５７日の間に必要な場合には安楽死させた。低い投与量（１から１００ｐｆｕ）のＷＲを接種したマウスには死亡したものはなかった。
【１４０６】
より多量（５×１０7 および５×１０8 ｐｆｕ）の投与量のワクシニアウイルスのＷＹＥＴＨ菌株を接種したマウスは、爪先と尾に外傷を示し、こう丸炎を発達させ、死亡した。５×１０６ｐｆｕまたはそれ未満のＷＹＥＴＨを接種したマウスは、疾病または外傷の徴候を示さなかった。
【１４０７】
表５６に示すように、ＣＹ処理マウスは、ヌードマウスよりもポックスウイルスの毒性をアッセイするのにより感度のあるモデルを提供した。このモデル系において、ＷＲ、ＷＹＥＴＨ、およびＶＣ−２ワクシニアウイルス菌株のＬＤ50値は、ヌードマウスモデルよりも著しく低かった。加えて、以下に記載するように、ＷＹＥＴＨ、ＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを接種したマウスには外傷が発達し、各ウイルスの投与量が多ければ多いほど、外傷の形成が急速であった。ヌードマウスに見られるように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを接種したＣＹ処理マウスは外傷を発達せしめなかった。しかしながら、ヌードマウスのようではなく、投与量にかかわらず、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを抗原投与したＣＹ処理マウスはその何匹かが死亡した。これらの偶発的な発生は、死因に関しては、疑わしい。
【１４０８】
全ての投与量のＷＹＥＴＨ（９．５×１０4 から９．５×１０8 ｐｆｕ）を接種したマウスは、尾におよび／または爪先にｐｉ７と１５日の間に痘外傷を示した。加えて、尾と爪先は膨れた。尾の外傷の展開は、丘疹、潰瘍および最終的にかさぶたの形成とともに痘外傷の典型であった。全ての投与量のＶＣ−２（１．６５×１０5 から１．６５×１０9 ）を接種したマウスもまた、尾および／または爪先に、ＷＹＥＴＨ接種マウスの外傷と相同な痘外傷を発達させた。これらの外傷は、接種から７−１２日後に観察された。低い投与量のＷＲウイルスを接種したマウスには外傷は観察されなかったが、これらの群には死亡したマウスがいた。
【１４０９】
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力検定
産生したＮＹＶＡＣ菌株が有用なベクターとなる能力を著しく変更することなく、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株の弱毒化が行なわれたことを決定するために、比較効力検定を行なった。ウイルスを弱毒化するために行なった連続遺伝子操作に間にベクターの免疫原をモニターするために、レポーター外因抗原として狂犬病ウイルス糖タンパク質を用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効能を狂犬病の標準ＮＩＨマウス効力検定により評価した（セリグマン、1973）。表５７は、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣベクターに得られたＰＤ50値は、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を含有するコペンハーゲンベースの組換え体を用いて得られたものと同一であり（キーニーら、1984）、アビアン種への複製に制限されたカナリヤポックスベースのベクター、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに得られたＰＤ50値と同様である。
【１４１０】
観察
既知の毒性遺伝子が欠損し、制限された生体外増殖特性を有する、ＮＹＶＡＣを、動物モデル系で分析し、その弱毒化特性を評価した。神経毒性ワクシニアウイルス研究所菌株、ＷＲ、２つのワクシニアウイルスワクチン菌株、ＷＹＥＴＨ（ニューヨーク市保険局）およびコペンハーゲン（ＶＣ−２）、並びにカナリヤポックスウイルス菌株、ＡＬＶＡＣとの比較で、これらの研究を行なった（実施例２４参照）。これらのウイルスは、マウス抗原投与モデルとウサギ皮膚モデルにおける相対病原能力の範囲を提供し、ＷＲは最も毒性のある菌株であり、ＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）は報告した特性を有する、以前に使用した弱毒化したワクシニア菌株を提供し、ＡＬＶＡＣは複製がアビアン種に制限されるポックスウイルスの実施例を提供した。これらの体内分析からの結果は、ワクシニアウイルス菌株、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）に関連するＮＹＶＡＣの高度に弱毒化された特性を明確に示す（表２８−２９、５３−５７）。特に、ＮＹＶＡＣのＬＤ50値は、アビアン宿主制限アビポックスウイルス、ＡＬＶＡＣに観察された値と一致した。ＮＹＶＡＣ、並びにＡＬＶＡＣにより死亡は、頭蓋内経路により非常に多量の投与量のウイルスが投与されたときのみに、観察された（実施例２４、表２８、２９、５６）。それでも、これらの死亡が高いタンパク質質量の接種の非特異的な結果によるものであるかどうかは分かっていない。免疫無防備状態のマウスモデル（ヌードおよびＣＹ処理）の分析結果は、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン菌株と比較して、ＮＹＶＡＣの比較的高度に弱毒化された特性を示す（表５４および５５）。著しくは、ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種動物には、観察期間に亘り、広がったワクシニア感染または接種の疾病の証拠は観察されなかった。ＮＹＶＡＣの多重毒性感染遺伝子の欠損は、病原性に関して相乗効果を示す。ウサギの皮膚への皮膚内投与により、ＮＹＶＡＣの無害性の別の測定を提供した（表５４および５５）。非アビアン種中では複製できないウイルスであるＡＬＶＡＣに関する結果を考慮すると、接種部位での複製能力は、ＡＬＶＡＣの皮内接種が投与量依存方法において硬結の領域を生じるので（未公表の観察）、反応性に相関する唯一のものではない。それゆえ、ウイルスの複製容量以外の要因が外傷の形成に帰すると言えそうである。ＮＹＶＡＣ中の遺伝子の欠損は、外傷の発生を妨げる。
【１４１１】
これとともに、この実施例と、実施例２４を含む前述した実施例の結果は、ＷＲ、および以前に用いたワクシニアウイルスワクチン菌株、ＷＹＥＴＨとコペンハーゲンに対するＮＹＶＡＣの高度に弱毒化された性質を示す。実際、検定した動物モデル系における、ＮＹＶＡＣの病原プロファイルは、アビアン種のみにおいて生産的複製をすることが知られているポックスウイルス、ＡＬＶＡＣのプロファイルと同様であった。ヒトおよび、マウス、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から誘導した細胞において生産的に複製するＮＹＶＡＣの明確に制限された容量により、ワクチン未接種接触または一般的な環境への潜在的な伝染を制限または妨げる重要なバリアを提供し、加えて、ワクチン接種した個体内の減少した繁殖の可能性を有するベクターを提供する。
【１４１２】
特に、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補は、有効であることが分かった。多くの病原から異種遺伝子産生物を発現するＮＹＶＡＣ組換え体は、霊長類を含むいくつかの動物種中の異種遺伝子産生物に対する免疫応答を誘発した。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体は、致死量狂犬病抗原投与に対してマウスを防御することができた。ＮＹＶＡＣベースの狂犬病糖タンパク質組換え体の効力は、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質を過含有するコペンハーゲンベースの組換え体のＰＤ50値に匹敵した（表５７）。ＮＹＶＡＣベースの組換え体はまた、ウサギの麻疹ウイルス中和抗体およびブタの仮性狂犬病ウイルスと日本脳炎ウイルス抗原投与に対する防御を誘発することが示された。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ菌株には、ヒトと獣医用途について安全性の利点がある（タータグリアら、1990）。さらに、一般的な研究所発現ベクター系としてのＮＹＶＡＣの使用は、ワクシニアウイルスのしように関する生物学的危険を著しく減少する。
【１４１３】
以下の基準により、この実施例および実施例２４を含む、前述した実施例の結果により、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることが分かる：ａ）接種部位に硬結または潰瘍が検出不可能（ウサギの皮膚）；ｂ）接種の皮内部位からの感染ウイルスの急速な除去（ウサギの皮膚）；ｃ）精巣炎症がない（ヌードマウス）；ｄ）著しく低減した毒性（頭蓋内抗原投与、生後３週間と新生マウスの両者）；ｅ）著しく提言した病原性および免疫不全対象で伝染しないこと（ヌードおよびシクロホスファミド処理したマウス）；およびｆ）著しく低減した様々なヒト組織培養細胞での複製能力。それでも、高度に弱毒化されているにもかかわらず、ベクターとしてのＮＹＶＡＣは、外因抗原に対して強い免疫応答を誘発する能力を保持している。
【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【１４１４】
それゆえ、本発明の好ましい実施態様を詳細に記載したが、添付した請求の範囲により定義された本発明は、多くの様々な変更が本発明の意図と範囲から逸脱することなく可能であるので、上記記載に述べた特定の詳細に限定されるものではないことが理解されよう。
【参考文献】
【１４１５】
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【図面の簡単な説明】
【１４１６】
【図１】図１は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠損したプラスミドｐＳＤ４６０の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ４１０の産生方法を模式的に示すものである
【図２】図２は、出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示すものである
【図３】図３は、ＡＴＩ領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４９４Δの構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ６１８の産生方法を模式的に示すものである
【図４】図４は、血球凝集素の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示すものである
【図５】図５は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］の欠損したプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８０４の産生方法を模式的に示すものである
【図６】図６は、巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼの欠損したプラスミドｐＳＤ５４８の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８８６（ＮＹＶＡＣ）の産生方法を模式的に示すものである
【図７】図７は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をＴＫ欠損座中に挿入したプラスミドｐＲＷ８４２の構築方法と組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９の産生方法を模式的に示すものである
【図８】図８は、ＥＢＶトリプル１プラスミド中に挿入されたＥＢＶコード領域の遺伝子地図である
【図９Ａ】図９Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１４）を有する改変合成ワクシニアウイルスＨ６初期／晩期プロモーターおよび合成ｓｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１３）を示すものである
【図９Ｂ】図９Ｂは図９Ａの続きである
【図１０Ａ】図１０Ａは、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５６の構築方法を模式的に示すものである
【図１０Ｂ】図１０Ｂは図１０Ａの続きである
【図１１Ａ】図１１Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１６）を有するｕプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１５）を示すものである
【図１１Ｂ】図１１Ｂは図１１Ａの続きである
【図１２Ａ】図１２Ａは、組換えワクシニアウイルスｖＰ８９６の構築方法を模式的に示すものである
【図１２Ｂ】図１２Ｂは図１２Ａの続きである
【図１３Ａ】図１３Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１７）を有するＩ３Ｌプロモーター／Ｓ１２／コア遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号８７）を示すものである
【図１３Ｂ】図１３Ｂは図１３Ａの続きである
【図１４】図１４は、組換えワクシニアウイルスｖＰ９１９の構築方法を模式的に示すものである
【図１５Ａ】図１５Ａは、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１９）を有するＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１８）を示すものである
【図１５Ｂ】図１５Ｂは図１５Ａの続きである
【図１６】図１６は、Ｃ５  ＯＲＦを含有するカナリヤポックスＰｖｕＩＩ断片のＤＮＡ配列（配列認識番号２１７）を示すものである
【図１７Ａ】図１７Ａは、組換えカナリヤポックスウイルスｖＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）の構築方法を模式的に示すものである
【図１７Ｂ】図１７Ｂは図１７Ａの続きである
【図１８】図１８は、ワクシニアウイルスｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に挿入されるＪＥＶコード領域の模式図である
【図１９】図１９は、ワクシニアウイルスｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７２９およびｖＰ７２５に挿入されるＹＦコード領域の模式図である
【図２０】図２０は、ワクシニアウイルスｖＰ８６７、ｖＰ９６２およびｖＰ９５５に挿入されるＤＥＮコード領域の模式図である
【図２１】図２１は、Ｆ８  ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ  ＤＮＡの３６６１塩基対断片のヌクレオチド配列（配列認識番号２２１）を示すものである
【図２２】図２２は、Ｆ７  ＯＲＦを含有するＴＲＯＶＡＣ  ＤＮＡの２３５６塩基対断片のＤＮＡ配列（配列認識番号２２２）を示すものである
【図２３】図２３は、ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ１／プラハ／５６）のヌクレオチド配列（配列認識番号２７９）を示すものである
【図２４】図２４は、ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ２／フォンテンブルー／７９）のヌクレオチド配列（配列認識番号２８４）を示すものである
【図２５】図２５は、ＥＩＶ  ＨＡ（Ａ２／サフォーク／８９）のヌクレオチド配列（配列認識番号３００）を示すものである
【図２６】図２６は、ＦｅＬＶ−Ｂエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号３１０）を示すものである
【図２７】図２７は、ＦｅＬＶ−Ａｑａｑおよび部分的ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号３２４）を示すものである
【図２８】図２８は、ＦＨＶ−１ＣＯ菌株ｇＳホモログ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号２９０）を示すものである
【図２９】図２９は、ｐＵＲＦ３により表されるコンセンサスＦヌクレオチド配列（おたふくかぜ）（配列認識番号３７０）を示すものである
【図３０】図３０は、ｐＵＨＮ５により表されるコンセンサスＨＮヌクレオチド配列（おたふくかぜ）（配列認識番号３７１）を示すものである
【図３１】図３１は、免疫したマウスの脾臓細胞の細胞傷害性応答を示すものである
【図３２】図３２は、免疫したマウスの脾臓からの細胞傷害性作動体細胞の感度を示すものである
【図３３】図３３は細胞傷害性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を示すものである
【図３４】図３４は免疫したマウスのＨＩＶ  ＩＩＩ  Ｂ  ｇｐ１２０に対する抗体応答を示すものである
【図３５Ａ】図３５Ａは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフである
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフである
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフである
【図３５Ｄ】図３５Ｄは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフである
【図３６】図３６はＪＥＶ  ｃＤＮＡ配列を示すものである
【図３７】図３７はＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性を示すものである
【図３８Ａ】図３８Ａはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３８Ｂ】図３８Ｂはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３８Ｃ】図３８Ｃはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３８Ｄ】図３８Ｄはウイルス血症の時間の経過を示すものである
【図３９】図３９は、ＮＹＶＡＣを産生するのに欠損したＯＲＦを模式的に示したものである
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９】
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