(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（b）（a）のヌクレオチド配列の相補体、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつGnRH受容体またはGnRH受容体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項４】
（a）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（b）（a）のヌクレオチド配列の相補体、を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子とストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつGnRH受容体またはGnRH受容体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号３のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸残基１から35まで、100から115まで、181から209まで、もしくは293から304までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または（b）（a）のヌクレオチド配列の相補体、を含んでなる核酸分子。
【請求項８】
請求項１、２または３に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項４、５、６または７に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項１、２または３に記載の核酸と、これに機能的に連結された、宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する転写および翻訳調節情報を含む調節ヌクレオチド配列と、を含有する発現ベクター。
【請求項１１】
請求項４、５、６または７に記載の核酸と、これに機能的に連結された、宿主細胞における該ヌクレオチド配列の発現を制御する転写および翻訳調節情報を含む調節ヌクレオチド配列と、を含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項８に記載の組換えベクターまたは請求項10に記載の発現ベクターを含有する遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項９に記載の組換えベクターまたは請求項11に記載の発現ベクターを含有する遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる単離されたGnRH受容体。
【請求項１５】
配列番号１の核酸とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされており、かつGnRH受容体活性を示す、単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる単離されたGnRH受容体。
【請求項１７】
配列番号３の核酸とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされており、かつGnRH受容体活性を示す、単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項14または16に記載のGnRH受容体の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１９】
異種タンパク質またはペプチドに連結された、請求項14または16に記載のGnRH受容体タンパク質あるいは請求項15または17に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２０】
組換えGnRH受容体を生産する方法であって、
（a）請求項10に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養してGnRH受容体を発現させ、そして
（b）GnRH受容体を回収する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２１】
組換えGnRH受容体融合タンパク質を生産する方法であって、
（a）請求項11に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養してGnRH受容体融合タンパク質を発現させ、そして
（b）GnRH受容体融合タンパク質を回収する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２２】
GnRH受容体をコードする遺伝子に相補的であり、細胞における該遺伝子の転写を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
GnRH受容体の膜貫通領域の部分をコードするヌクレオチド配列に相補的である、請求項22に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
GnRH受容体のエピトープと免疫特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体である、請求項24に記載の抗体。
【請求項２６】
GnRHのGnRH受容体への結合を阻害する、請求項24または25に記載の抗体。
【請求項２７】
ヒトGnRH受容体と結合する、請求項24または25に記載の抗体。
【請求項２８】
GnRH受容体シグナル伝達をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、
（a）化合物を、配列番号１または３からなる核酸プローブとハイブリダイズする核酸分子によりコードされた、GnRH受容体活性を示す組換えポリペプチドを発現する遺伝子操作された細胞と接触させ、
（b）ステップ（a）の混合物を、GnRHまたはGnRH類似体の存在下で、該化合物がシグナル伝達を刺激または阻害するのに十分な時間にわたりインキュベートし、
（c）シグナル伝達を測定し、そして
（d）該シグナル伝達を、該化合物とインキュベートしなかったGnRH受容体のシグナル伝達と比較し、それにより該化合物がシグナル伝達を刺激するのか阻害するのか判定する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２９】
GnRH受容体により媒介されるシグナル伝達が、ホスホリパーゼＣ活性の刺激または阻害をアッセイすることにより測定される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
GnRH受容体により媒介されるシグナル伝達が、イノシトールリン酸活性の刺激または阻害をアッセイすることにより測定される、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
GnRH受容体により媒介されるシグナル伝達が、細胞内の供給源からのカルシウムイオンの放出をアッセイすることにより測定される、請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
シグナル伝達が増加し、該化合物がGnRH受容体アゴニストであることを示す、請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
シグナル伝達が減少し、該化合物がGnRH受容体アンタゴニストであることを示す、請求項28に記載の方法。
【請求項３４】
GnRH受容体と結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
化合物を、GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質と、該化合物がGnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質のGnRH受容体部分と結合するのに十分な時間にわたり接触させ、そして
該化合物のGnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質への結合を検出し、それにより該化合物をGnRH受容体と結合する化合物として同定する、
ことを含んでなり、ここにおいて、GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質のGnRH受容体部分は、配列番号１または３からなる核酸プローブとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされるものである、上記方法。
【請求項３５】
GnRH受容体と結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
GnRHまたはGnRH類似体をGnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質と結合させ、
化合物を、前記GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質と、該化合物が結合したGnRHまたはGnRH類似体を特異的に置換するのに十分な時間にわたり接触させ、そして
結合したGnRHまたはGnRH類似体の置換を検出し、それにより該化合物をGnRH受容体と結合する化合物として同定する、
ことを含んでなり、ここにおいて、GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質のGnRH受容体部分は、配列番号１または３からなる核酸プローブとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされるものである、上記方法。
【請求項３６】
GnRH受容体と結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
化合物および(i)GnRHまたは(ii)GnRH類似体を、GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質と、該化合物と該GnRHまたはGnRH類似体がGnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質のGnRH受容体部分と結合するのに十分な時間にわたり接触させ、
該化合物のGnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質への結合を検出し、そして
GnRHまたはGnRH類似体の不在下での該化合物のGnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質への結合と比較し、それにより該化合物をGnRH受容体と結合する化合物として同定する、
ことを含んでなり、ここにおいて、GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質のGnRH受容体部分は、配列番号１または３からなる核酸プローブとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされるものである、上記方法。
【請求項３７】
GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質が精製されているか、精製された細胞膜中に存在する、請求項34、35または36に記載の方法。
【請求項３８】
GnRH受容体、GnRH受容体断片、またはGnRH受容体融合タンパク質が、固定化GnRH、固定化GnRH類似体、GnRH受容体に対する固定化抗体、またはGnRH受容体融合タンパク質中のGnRH受容体に融合されたペプチドの結合パートナーに結合される、請求項34、35または36に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
1.  序論
本発明は、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨ−Ｒ）のクローニング、ならびにＧｎＲＨ−Ｒを発現する遺伝子工学的に操作された宿主細胞に関するものである。このような遺伝子操作細胞は、ＧｎＲＨ−Ｒの活性化、調節および結合解離（uncoupling）に関与する薬剤およびＧｎＲＨの類似体を評価し、スクリーニングするのに用いられる。
2.  発明の背景
ＧｎＲＨ−Ｒは神経系と内分泌系を統合するにあたり重要な媒介物質となっている。正常な生殖は生理学的濃度のＧｎＲＨの拍動的放出に依存しており、ＧｎＲＨは特異的で高親和性の下垂体受容体に結合して、黄体形成ホルモン（ＬＨ）や卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）といったゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）類の分泌の引き金となる。生理学的濃度のＧｎＲＨは正常な生殖の調和を保っているが、高レベルのアゴニストは相反する応答、つまりゴナドトロピン分泌の抑制へと導く。視床下部−下垂体−生殖腺軸を活性化または抑制することができるＧｎＲＨ類似体は、不妊症から前立腺癌までのさまざまな疾病の治療において臨床的に広く利用されている。
ゴナドトロープＧｎＲＨ−Ｒの応答性および能力はアゴニスト、濃度および暴露パターンに影響される（Clayton, 1989, J. Endocrinol 120: 11-19）。in vivoおよびin vitroの両方の研究から、低濃度の拍動的ＧｎＲＨは該受容体に対して刺激的であり、高濃度のアゴニストは該受容体のダウンレギュレーション(down-regulation)および脱感受性を誘導することが実証されている。ＧｎＲＨがその受容体に結合すると、ホスホリパーゼＣが刺激されてイノシトール-1,4,5-三リン酸およびジアシルグリセロールを生成させる（Huckle & Conn, 1988, Endocrine Reviews 9: 387-395）。これら第二のメッセンジャーが、その後、細胞内の蓄えからカルシウムを放出させ、そしてプロテインキナーゼＣを活性化させる。受容体のアップレギュレーション（up-regulation）にはプロテインキナーゼＣとカルシウムの両方が関係しているらしい（Huckle & Conn, 1988, Endocrine Reviews 9: 387-395; Huckleら, 1988, Journal of Biological Chemistry 263: 3296-3302; Youngら, 1985, Journal of Endocrinology 107: 49-56）。ダウンレギュレーションにどのようなエフェクターが作用しているのかは不明である。
受容体結合実験からＧｎＲＨ−Ｒの調節および脱感受性の基礎となるメカニズムを理解するうえで大きな前進が見られたものの、ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子の転写および生合成の直接的測定はいまだに可能ではない。ＧｎＲＨ−ＲのｃＤＮＡのクローニングはＧｎＲＨ−Ｒの活性化、調節および結合解離の評価を前進させるであろう。受容体の一次配列が決定されると、改良類似体の特定された設計が容易になろう。しかしながら、これまで、関心が集中していたにもかかわらず、ＧｎＲＨ−Ｒの遺伝子はいかなる種においてもクローニングされておらず、発現されていない。
3.  発明の概要
本発明は、ＧｎＲＨ−Ｒの遺伝子およびタンパク質に関するものである。ここに開示したＤＮＡは、ＧｎＲＨ−Ｒ生産用に設計された発現系へと、そして／また、ＧｎＲＨ−Ｒを発現し、好ましくはＧｎＲＨ誘導シグナル変換に応答する細胞系へと、遺伝子操作され得る。かかる細胞系は、有利には、ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングならびに同定に用いられる。本発明の他の面によると、ＧｎＲＨ−ＲのＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ＧｎＲＨ−Ｒ発現産物、および該産物に対する抗体がＧｎＲＨ−Ｒの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現または機能不全変異型受容体の発現）に関係した生殖障害の診断ならびに治療に用いられる。ＧｎＲＨ−Ｒトランスジーンを含有するトランスジェニック動物はＧｎＲＨ類似体のin vivo試験用の動物モデルとして使用することができる。
ここに記載したＧｎＲＨ−Ｒ配列の解明は生殖内分泌学の大きな前進につながり、ＧｎＲＨ−Ｒのシグナル変換および調節の複雑な機構を明らかにするだろう。大半のホルモン性シグナルと違って、ＧｎＲＨは拍動的方法で放出され、パルスの頻度および大きさが決定的情報を伝える（Weissら, 1990, Mol. Endocrinol. 4: 557-564; Hasenlederら, 1991, Endocrinology 128: 509-517）。ＧｎＲＨ−Ｒの結合能それ自体は暴露時間および濃度に応じてアゴニストによってアップまたはダウンレギュレーションされる（Loumaye & Catt, 1982, Science 215: 983-985）。ヒトの各種疾患、例えば前立腺肥大、前立腺癌、子宮内膜症、性的早熟などをコントロールするのに役立つＧｎＲＨアゴニストの臨床上の有用性は、下垂体の脱感受性の誘導に依存する。ＧｎＲＨ−Ｒのクローニングは、薬物療法ならびに生殖の基礎をなす視床下部、下垂体および生殖腺ホルモンの複雑な相互作用の更なる理解へと導くだろう。
4.  図面の説明
図１．アンチセンスオリゴヌクレオチドによるセロトニン（５ＨＴ）受容体およびＧｎＲＨ−Ｒの発現のハイブリッド阻止。100nMの５ＨＴまたは200nMのＧｎＲＨを水平線において浴中に導入した。Ａ、（５ＨＴ応答については）ラット脳ＲＮＡ、（ＧｎＲＨ応答については）αＴ３−１ＲＮＡおよびアンチセンス５ＨＴ10受容体オリゴヌクレオチドの混合物を前もって注入した卵母細胞における５ＨＴおよびＧｎＲＨに対する応答。１６個の細胞が同一の応答を示した。Ｂ、ラット脳ＲＮＡ、αＴ３−１ＲＮＡおよびアンチセンスＷＺ７オリゴヌクレオチドの混合物を前もって注入した卵母細胞における５ＨＴおよびＧｎＲＨに対する応答。２４個の細胞が同一の応答を示した。
図２．卵母細胞において発現されたクローンＷＺ２５の特性決定。Ａ、ＧｎＲＨアンタゴニストの不在下（左）または存在下（右）でのＷＺ２５転写物を注入した卵母細胞のＧｎＲＨに対する電気生理学的応答。示した３つのトレーシングは異なる細胞からのものである。実線および破線は、それぞれＧｎＲＨおよびＧｎＲＨアンタゴニストの投与を示す。注入しなかった卵母細胞はＧｎＲＨに対して何ら応答しなかった（ｎ＝１２）。Ｂ、ＷＺ２５からの転写物を注入した卵母細胞の膜における125Ｉ−ＧｎＲＨ−ＡのＧｎＲＨ−ＡおよびＧｎＲＨによる置換。注入しなかった卵母細胞からの膜と組み合わせたαＴ３−１細胞膜を使用する比較置換曲線も示してある（●）。誤差バーは平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
図３．クローンＷＺ２５のヌクレオチド配列（配列番号：１）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号：２）。番号づけは９８１塩基対のオープンリーディングフレームの最初のメチオニンから始まる。推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に示してある。想定される膜貫通ドメインＩ−VIIには下線を引いてある。アミノ酸配列の下の記号は、存在しうるＮ−グリコシル化部位（▲）、ならびにプロテインキナーゼＡ（◆）、カゼインキナーゼ２（●）およびプロテインキナーゼＣ（＊）のリン酸化部位を示す（Hubbard & Ivatt, 1981, Ann Rev. Biochem. 50: 555-583; Kemp & Pearson, 1990, Trends Biochem. Sci. 15: 342-346; Pearson & Kemp, 1991, Meth. Enzymol. 200: 62-81; Kennelly & Krebs, 1991, J. Biol. Chem. 266: 15555-15558）。
図４．ＧｎＲＨ−Ｒの疎水性プロットならびにＧｎＲ、マウスゴナドトロピン放出ホルモン受容体；ＩＬＲ、ヒト・インターロイキン−８受容体（Murphy & Tiffany, 1991, Science 253: 1280-1283）；ＳＰＲ、ラット・サブスタンスＰ受容体（Hershey & Krause, 1990, Science 247: 958-962）；β１Ｒ、ヒトβ１−アドレナリン作動性（Frielleら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7920-7924）；およびＲＨＯ、ヒト・ロドプシン（Nathans & Hogness, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4851-4855）のアミノ酸配列の並列化。Ｉ−VIIは想定される膜貫通ドメインを示す。ボックス内は同一のアミノ酸残基を示す。
図５．ＧｎＲＨ−ＲのｍＲＮＡの分布。オートラジオグラムＡ、２μｇの全マウス下垂体、ＧＴ−１、ＧＨ３、およびＡｔＴ２０のＲＮＡならびに625ngのαＴ３−１の全ＲＮＡを使用する溶液ハイブリダイゼーションアッセイ。Ｂ、３μｇのポリ（Ａ）+αＴ３−１ＲＮＡによるノーザンブロット分析。Ｃ〜Ｆ、ラット下垂体前葉in situハイブリダイゼーション。Ｃ、アンチセンスプローブＸ線フィルムオートラジオグラフィー。Ｄ、センスプローブ対照（キャリブレーションバー＝450μm）。Ｅ、Ｆ、エマルジョンに浸した下垂体前葉切片の暗視野（キャリブレーションバー＝50μm）、明視野（キャリブレーションバー＝100μm）顕微鏡写真。分子量マーカーはHind IIIで消化したλＤＮＡである。
図６．ツメガエル卵母細胞におけるヒトＧｎＲＨ−Ｒ  ｃＤＮＡの発現。
図７．pSV2A-ヒトGnRH-R構築物でトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から調製された膜への［125Ｉ］ＧｎＲＨアゴニスト結合の置換。
図８．pSV2A-ヒトGnRH-RでトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞におけるイノシトールリン酸の生産に対するＧｎＲＨおよびＧｎＲＨアンタゴニストの影響。
図９．ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチド配列ならびに推定アミノ酸配列。
図10．ヒトＧｎＲＨ−ＲのｃＤＮＡによるノーザンブロット分析。レーン１（Ｔ）：ヒト精巣ポリ（Ａ）ＲＮＡ；レーン２（Ｐ）：ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ；レーン３（Ａ）：ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ；レーン４（Ｒ）：ヒトＧｎＲＨ−Ｒ  ｃＤＮＡ。
図11．ヒトＧｎＲＨ−Ｒの模式図。
5.  発明の詳細な説明
本発明は、マウスおよびヒトのＧｎＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現に関するものである。生殖系において中心的な役割を果たしているＧｎＲＨ−Ｒは、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの膜貫通ドメインを有するが、典型的な細胞内Ｃ末端をもたない点に特徴がある。この受容体によって仲介されるシグナル変換および調節の風変わりな面はＧｎＲＨ−Ｒの特異な構造および調節ドメインによるところが大きい。本発明により産生されたＧｎＲＨ−Ｒは受容体の活性化、調節、結合解離に関与する薬剤およびＧｎＲＨ類似体の評価ならびにスクリーニングに使用することができる。また、ＧｎＲＨ−ＲのＤＮＡ、オリゴヌクレオチドおよび／またはアンチセンス配列、あるいはＧｎＲＨ−Ｒ、そのペプチド断片もしくはその抗体は生殖障害の診断および／または治療に使用することができる。
論議をわかりやすくするために、本発明は、マウスおよびヒトＧｎＲＨ−Ｒの例を用いて、以下の分節にわけて説明することにする。しかしながら、この原理は他の種のＧｎＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現のみならず、特殊なＧｎＲＨ−Ｒファミリーに属する他の受容体、すなわち細胞内Ｃ末端をもたずかつＧｎＲＨやその類似体と結合するＧタンパク質型の受容体、のクローニングおよび発現にも同様に応用することができる。
5.1.  ＧｎＲＨ−Ｒのコード配列
マウスＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列（配列番号：１）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号：２）を図３に示す。最長のオープンリーディングフレームは327個のアミノ酸からなる分子量約37,000のタンパク質をコードしている。３つのコンセンサスＮ結合グリコシル化部位が存在し、２つはＮ末端に、そして１つは最初の細胞外ループにある（図３）。推定タンパク質の疎水性分析から、他のＧタンパク質受容体に対して２０〜３０％の類似性（インターロイキン−８受容体に対して最も高い相同性）を有する高度に疎水性のアミノ酸からなる７つの領域が明らかになった（図４）。
ＧｎＲＨ−ＲはＧタンパク質受容体スーパーファミリーの最も小さい方のメンバーであり、ＧｎＲＨ−Ｒの最初の細胞質ループは他のＧタンパク質受容体よりも長く、また、他のＧタンパク質受容体と違って、それは極性の細胞質Ｃ末端を欠いている。ＧｎＲＨ−Ｒには、例えば多くの受容体を安定化する最初の２つの細胞外ループのそれぞれに存在するシステインのような、高度に保存された残基が存在するものの、ＧｎＲＨ−Ｒのいくつかの特徴は他には見られないものである。例えば、高度に保存された膜貫通ドメインIIアスパルテート／グルタメートは、多くのＧタンパク質受容体の機能にとって不可欠であることが分かっているが、これがアスパラギンによって置換されている。他のＧタンパク質受容体からのもう１つの逸脱は、膜貫通ドメインIIIの隣に位置する保存されたチロシンがセリンに置換されていることである。これは、他のＧタンパク質受容体のシグナル変換にとって重要な領域に、ＧｎＲＨ−Ｒに特有の潜在的リン酸化部位を生じさせる。その他の潜在的調節リン酸化部位も存在する（図３参照）。
本発明は、また、他の種（ヒトを含む）から単離されたＧｎＲＨ−Ｒの遺伝子にも関係している。ヒトのＧｎＲＨ受容体は、λｇｔ１０ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを、ランダムヘキサマープライミングにより32Ｐ標識したマウスＧｎＲＨ受容体挿入物で釣り上げる（probing）ことによりクローン化した。単離したクローンが機能的なヒトＧｎＲＨ−Ｒをコードすることを確かめるために、合成ＲＮＡ転写物を卵母細胞に注入した。ＲＮＡを注入された卵母細胞はすべて、ＧｎＲＨにさらした際に、大きな脱分極電流を発生し、このことはクローン化ＤＮＡ断片が機能的な受容体をコードしていることを示すものである。
ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列（配列番号：３）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号：４）を図９に示す。ヒトクローンの配列決定により、984bpのオープンリーディングフレームを含む2160bpの挿入物が確認された。このオープンリーディングフレームは328個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしており、マウス受容体の推定された配列に対して９０％の相同を示した。
疎水性分析からは、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの疎水性ドメインが確認された。マウス受容体の想定された構造にも見られたように、ヒトＧｎＲＨ−Ｒは本質的にＣ末端細胞内ドメインを欠いている。２つの可能なＮ結合グリコシル化部位が存在し、最初の細胞外ドメインのそれぞれに１つある。数個の細胞質セリンおよびトレオニン残基が細胞内ドメインに存在し、これらは調節リン酸化部位として役立っているのかもしれない（図11）。
放射性標識したヒトＧｎＲＨ−Ｒをプローブとして用いるノーザンブロット分析により、ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ中に約4.7kbの転写物が確認された（図10）。ヒト精巣から精製されたポリ（Ａ）ＲＮＡ、あるいはヒトβ−アクチンｃＤＮＡ対照にはシグナルが全く検出されなかった。
このＲＮＡの５’および３’非翻訳領域の程度を調べるために、一次ライブラリースクリーニングからのファージ単離物のＰＣＲ分析を行った。ＧｎＲＨ−Ｒ  ｃＤＮＡ挿入物の５’末端近傍の配列を表すアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーまたは同一配列の３’末端近傍のセンスプライマーを、未精製クローンをマッピングするために隣接ＧＴＩクローニング部位に対して設計したプライマーとともに使用した。確認された最長のＰＣＲ産物は-1.3kbの追加の５’配列および-0.3kbの追加の３’配列をもっていた。これらのデータは、ＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡが少なくとも1.3kbの５’非翻訳配列と1.5kbの３’非翻訳配列を含むことを示唆する。ノーザンブロットのデータに基づいて、これは、単離したクローンのどれにも追加の非翻訳配列（<1kb）が含まれていないことを示唆する。
本発明は、また、ＧｎＲＨ−Ｒ活性が存在する他の種から単離されたＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子に関するものである。ＧｎＲＨ−ＲファミリーのメンバーはここではＧｎＲＨと結合する受容体として定義される。このような受容体は、膜貫通ドメインの外側の領域に位置する実質的な広がりの配列において、ヌクレオチドレベルで約８０％の相同を、そしてアミノ酸レベルでは９０％もの相同を示すことがある。
ＧｎＲＨ−Ｒファミリーに属する他の受容体のクローニングは多くの異なる方法で実施し得る。例えば、マウスやヒトの配列を使って、ＰＣＲプローブとして使用できる縮重または完全縮重のオリゴヌクレオチドプローブを設計したり、ＧｎＲＨ−Ｒを発現する適当な細胞からのｃＤＮＡライブラリー、あるいはゲノミックライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなオリゴヌクレオチドプローブを設計するにあたっては、図３および図11にそれぞれ示したマウスおよびヒト配列のＮ末端ならびに細胞質ループ（細胞内と細胞外の両方）を使うことが有利であるかもしれない。なんとなれば、これらの領域はＧｎＲＨ−Ｒファミリー内で比較的保存されているからである。
また、ヒトやマウスのＧｎＲＨ−Ｒクローンの放射性標識断片を用いて、低ストリンジェント条件下で、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても、ＧｎＲＨ−Ｒ関連タンパク質を単離することができよう。使用できるクローニング戦略については、例えば、Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい。
本発明によると、ＧｎＲＨ−Ｒ、その断片、融合タンパク質または機能的均等物をコードするヌクレオチド配列は、適当な宿主細胞において、ＧｎＲＨ−Ｒ、その機能的に活性なペプチド、融合タンパク質または機能的均等物を発現させる組換えＤＮＡ分子を作製するために使用し得る。また、ＧｎＲＨ−Ｒ配列の一部にハイブリダイズするヌクレオチド配列も、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析などに使うことができる。
本発明を実施するにあたって、遺伝暗号の縮重のため、ＧｎＲＨ−Ｒのアミノ酸配列、例えば図３に示したマウスの配列（配列番号：２）またはヒトの配列、あるいは機能的均等物を実質的にコードする他のＤＮＡ配列を、ＧｎＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現のために使用してもよい。このようなＤＮＡ配列として、ストリンジェント条件下でマウスまたはヒトＧｎＲＨ−Ｒ配列にハイブリダイズし得るもの、あるいは遺伝暗号の縮重が無ければストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るものが含まれる。ストリンジェント条件はいろいろなやり方で調整しうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う場合は、鋳型へのプライマーのアニーリングが起こる温度あるいは反応緩衝液中のＭｇＣｌ2の濃度を調整すればよい。フィルターをプローブで検索するために放射性標識したＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを使用する場合は、洗液のイオン強度を変えたり、フィルターの洗浄温度を注意深くコントロールすることによってストリンジェント条件を調整すればよい。
本発明にしたがって使用される改変ＤＮＡ配列は、同一のまたは機能的に等しい遺伝子産物をもたらすヌクレオチド残基の欠失、付加または置換を含んでいる。遺伝子産物それ自体がＧｎＲＨ−Ｒ配列内にサイレント変化をもたらす（それゆえ、機能的に等しいＧｎＲＨ−Ｒをもたらす）アミノ酸残基の欠失、付加または置換を含んでいてもよい。こうしたアミノ酸の置換は関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行われる。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸とグルタミン酸があり、正に荷電したアミノ酸としてはリシンとアルギニンがある。類似の親水性値を有する非荷電極性基を含むアミノ酸としては次のものがある：ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン。ここで用いる「機能的に等しいＧｎＲＨ−Ｒ」とは、ＧｎＲＨに結合するが、その同等物である天然ＧｎＲＨ−Ｒと必ずしも同じ結合親和性で結合しない受容体を指す。
本発明のＤＮＡ配列は、いろいろな目的（遺伝子産物のプロセシングおよび発現を変更する改変を含むが、これに限らない）にむけてＧｎＲＨ−Ｒのコード配列を変更すべく遺伝子工学的に操作することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発のような当分野で公知の技法を用いて変異を導入することにより、新たな制限部位を挿入したり、グリコシル化パターン、リン酸化などを変更してもよい。例えば、酵母のようなある種の発現系では、宿主細胞が遺伝子産物を過剰にグリコシル化することがある。このような発現系を使う場合は、ＧｎＲＨ−Ｒのコード配列を、Ｎ結合グリコシル化部位を排除するように変更することが好ましいかもしれない。例えば、マウスの配列では、図３に示したグリコシル化部位の１以上を変更することによってこれが可能である。本発明の別の態様では、融合タンパク質をコード化するために、ＧｎＲＨ−Ｒまたは改変ＧｎＲＨ−Ｒ配列を異種配列に連結させることができる。融合タンパク質はＧｎＲＨ−Ｒ配列と異種タンパク質配列の間に切断部位を含むように操作されてもよく、こうするとＧｎＲＨ−Ｒを異種成分から切り離すことができる。
本発明のもう１つの態様では、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の全部または一部を当分野で公知の化学的方法により合成することができる。例えば、Caruthersら, 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7: 215-233; Crea and Horn, 1980, Nuc. Acids Res. 9(10): 2331; Matteucci and Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21:719;およびChow and Kempe, 1981, Nuc. Acids Res. 9(12):2807-2817を参照されたい。また、ＧｎＲＨ−Ｒのアミノ酸配列の全部または一部を合成して、タンパク質自体を化学的方法により製造することもできよう。例えば、ペプチドを固相合成により製造し、樹脂から切り離し、そして分離用の高性能液体クロマトグラフィーによって精製してもよい。例えば、Creighton, 1983, Proteins, Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 50-60を参照されたい。合成ペプチドの組成はアミノ酸解析または配列決定（例えば、エドマン分解法；Creighton, 1983, Proteins, Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. pp. 34-49を参照）により確認することができる。
5.2  GnRH-Rの発現
生物学的に活性なGnRH-Rを発現するために、GnRH-Rをコードするヌクレオチド配列、または上記5.1に記載したような機能的均等物を、適当な発現ベクター、即ち挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入する。GnRH-R遺伝子産物、並びに組換えGnRH-R発現ベクターでトランスフェクトもしくは形質転換された宿主細胞または細胞系は、種々の目的に使用できる。これらには、限定するものではないが、GnRH結合を競争的に阻害し、GnRH活性を「中和」するものを含む前記受容体に結合する抗体（即ち、モノクローナル及びポリクローナル）の生成、GnRH類似体あるいはGnRH-Rを介して作用する薬剤のスクリーニング及び選択等が含まれる。
5.2.1  発現系
当業者によく知られた方法を使用して、GnRH-Rコード配列及び適当な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法及びインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.及びAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.に記載された方法を参照されたい。
種々の宿主発現ベクター系をGnRH-Rコード配列の発現に使用することができる。これらは、限定するものではないが、GnRH-Rコード配列を含むバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌、GnRH-Rコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母のような微生物、GnRH-Rコード配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞系、GnRH-Rコード配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)、タバコモザイクウィルス(TMV)）を感染させた、あるいはGnRH-Rコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばTiプラスミド）により形質転換された植物細胞系、あるいは、二重の微小染色体中に安定に増幅された（例えばCHO/dhfr）または不安定に増幅された（例えばマウス細胞系）、GnRH-RＤＮＡの多数のコピーを含むように遺伝子操作された細胞系を含む、組換えウィルス発現ベクター（例えばアデノウィルス、ワクシニアウィルス）を感染させた動物細胞系を含む。
これらの系の発現要素は、その強度及び特異性において変化する。使用した宿主／ベクター系に応じて、構成的なプロモーター及び誘導可能なプロモーターを含む多数の適当な転写及び翻訳要素の任意のものを発現ベクター中に使用することができる。例えば、細菌系中にクローン化する場合には、バクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）等の誘導可能なプロモーターを使用することができ、昆虫細胞系中にクローン化する場合には、バキュロウィルスポリヘドリンプロモーターのようなプロモーターを使用することができ、植物細胞系中にクローン化する場合には、植物細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えば熱ショックプロモーター、RUBISCOの小サブユニットに対するプロモーター、クロロフィルa/b結合タンパクに対するプロモーター）あるいは植物ウィルスからのプロモーター（例えばＣａＭＶの35ＳＲＮＡプロモーター、ＴＭＶのコートタンパクプロモーター）を使用することができ、哺乳類細胞系中にクローン化する場合には、哺乳類細胞のゲノムから誘導したプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、あるいは哺乳類ウィルスから誘導したプロモーター（例えばアデノウィルス後期プロモーター、ワクシニアウィルス7.5Kプロモーター）を使用することができ、GnRH-RＤＮＡの多数のコピーを含む細胞系を生成する場合には、SV40-、BPV-及びEBVを土台にしたベクターを適当な選択マーカーとともに使用することができる。
細菌系においては、発現されたGnRH-Rについて意図される用途に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の生成のために多量のGnRH-Rを生産する場合には、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベル発現を指向するベクターが望ましい。このようなベクターは、限定するものではないが、GnRH-Rコード配列をフレーム内でベクターのlac Zコード領域と結合してハイブリッドAS-lac Zタンパクを生成することができる、大腸菌発現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EMBO J. 2:1791）、pIN-ベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acid Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509）等を含む。pGEXベクターも、外来ポリペプチドを、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパクとして発現するのに使用することができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに対する吸着及びその後の遊離グルタチオンの存在下における溶出により溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、トロンビンあるいはXa因子プロテアーゼ開裂部位を含み、所望のクローン化ポリペプチドをGST部分から放出できるように設計されている。
酵母においては、構成的あるいは誘導可能なプロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。概観のためには、Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubelら, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grantら, 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3;Bitter, 1987, Heterologous Gene Experession in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684;及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathernら, Cold Spring Harbor Press, Vols I及びIIを参照されたい。
植物発現ベクターを使用する場合、GnRH-Rコード配列の発現は多数のプロモーターの任意のものにより駆動することができる。例えば、CaMVの35S ＲＮＡ及び19S ＲＮＡプロモーター（Brissonら, 1984, Nature 310:511-514）、またはTMVのコートタンパクプロモーター(Takamatsuら, 1987, EMBO J. 6:307-311)のようなウィルスプロモーターを使用することができ、あるいは、RUBISCOの小サブユニット(Coruzziら, 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglieら, 1984, Science 244:838-843);もしくは熱ショックプロモーター、例えば大豆hsp17.5-Eもしくはhsp17.3-B（Gurleyら, 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565）のような植物プロモーターを使用することができる。これらの構築物はTiプラスミド、Riプラスミド、植物ウィルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等を使用して植物細胞内に導入することができる。このような技術の概観については、例えば、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463;及びGrierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London Ch. 7-9を参照されたい。
GnRH-Rを発現するのに使用できるまた別の発現系は、昆虫系である。そのような系の１つにおいては、Autographa californica核多角体病ウィルス（AcNPV）が外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウィルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。GnRH-Rコード配列は、このウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローン化し、AnNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。GnRH-Rコード配列をうまく挿入できれば、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉塞組換えウィルス（即ち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされたタンパク質コートを欠いているウィルス）の生産が得られる。これらの組換えウィルスは、その後Spodoptera frugiperda細胞を感染させるのに使用され、この中で挿入された遺伝子が発現される（例えば、Smithら, 1983, J. Viol. 46:584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051を参照されたい）。
哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づいた発現系を使用することができる。アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合、GnRH-Rコード配列をアデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及び三分節リーダー配列に結合することができる。このキメラ遺伝子を次にインビトロまたはインビボ組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１あるいはＥ３）に挿入すれば、感染した宿主内で生存可能であり、GnRH-Rを発現することができる組換えウィルスを得ることができる（例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659を参照）。あるいは、ワクシニア7.5Kプロモーターを使用することができる（例えば、Mackettら, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackettら, 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicaliら, 1982, Proc. Natl. Acad Sci. 79:4927-4931を参照）。
挿入されたGnRH-Rコード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要になることもある。これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を含む。それ自身の開始コドン及び隣接配列を含む全GnRH-R遺伝子が適当な発現ベクターに挿入される場合は、追加の翻訳制御シグナルが必要でない場合もある。しかし、GnRH-Rコード配列の一部分のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンはGnRH-Rコード配列のリーディングフレームと合致していて、全挿入物の翻訳が確保されなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の種々の起源のものであることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を挿入することにより高めることができる（例えば、Bitterら, 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。
さらに、宿主細胞株については、挿入配列の発現を変調し、あるいは所望の特異的な方法で遺伝子産物を修飾及びプロセシングするものを選択し得る。このようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要なものである場合がある。種々の宿主細胞が、タンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾に特徴的で特異的なメカニズムを持っている。適当な細胞系あるいは宿主系を選択することにより、発現された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にすることができる。この目的で、一次転写物の適当なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有している真核細胞宿主を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞として、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38等を挙げることができる。
組換えタンパク質の長期間の高収率生産のためには、安定な発現であることが好ましい。例えば、GnRH-Rを安定に発現する細胞系を遺伝子工学的に作製することができる。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）及び選択マーカーにより制御されたGnRH-RＤＮＡにより形質転換された宿主細胞を使用することができる。外来ＤＮＡの導入の後、遺伝子操作された細胞を１〜２日富化培地で増殖させ、その後選択培地に変更することができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗性を与え、細胞がその染色体にプラスミドを安定に組み込み、増殖してフォーカス（増殖巣）を形成し、その後これをクローン化して細胞系へとふやすことができるようにする。この方法は、GnRH-Rを細胞表面に発現し、GnRH媒介シグナル変換に応答する細胞系を作製するのに有利に使用することができる。このような遺伝子操作細胞系は、GnRH類似体をスクリーニングするのに特に有用である。
多数の選択系を使用することができ、限定するものではないが、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell 11:223）、ピポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell 22:817）をtk-、hgprt-、あるいはaprt-細胞にそれぞれ使用することができる。また、代謝拮抗物質抵抗性を選択のベースとして使用することができ、メトトレキセート耐性を与えるdhfr（Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hareら, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527）、マイコフェノール酸耐性を与えるgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072）、アミノグリコシドG-418耐性を与えるneo（Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1）、ヒグロマイシン耐性を与えるhygro（Santerreら, 1984, Gene 30:147）の各遺伝子を使用することができる。最近、別の選択可能な遺伝子が記載されており、即ち、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB;細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisD（Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047）;及びオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤の2-（ジフルオロメチル）-DL-オルニチン(DFMO)に対する抵抗性を与えるODC（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogueL., 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Horbor Laboratory ed.）である。
本明細書に記載する特定の態様においては、ヒトGnRH-R cＤＮＡをSV40初期プロモーターを含む発現ベクター、pSV2Aにサブクローン化した。COS-1細胞をトランスフェクションのDEAE−デキストラン法（Keown, W.A.ら, 1990, in Methods of Enzymology, VI. 185（Goeddel, D.V., ed.）pg. 527-537 Academic Press, New York）を使用して一時的にpSV2A-ヒトGnRH-R構築物でトランスフェクトした。COS-1トランスフェクト細胞からの膜を使用した実験により、異種的に発現された受容体がGnRHに結合できることが示された。リガンド結合は、イノシトールリン酸代謝に関連することも見出され、トランスフェクトCOS-1細胞は機能的なヒトGnRH-Rを発現したことがさらに示された。
5.2.2  GnRH-Rを発現するトランスフェクタントまたは形質転換体の同定
コード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも４つの一般的方法、（a）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、（b）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、（c）宿主細胞中におけるGnRH-R mＲＮＡ転写物の発現により測定される転写レベルの評価、及び（d）イムノアッセイあるいはその生物学的活性により測定される遺伝子産物の検出により同定され得る。
最初の方法においては、発現ベクター中に挿入されたGnRH-Rコード配列の存在は、GnRH-Rコード配列に相同なヌクレオチド配列を含むプローブ、またはその部分もしくは誘導体を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出できる。
第２の方法においては、組換え発現ベクター／宿主系は、何らかの「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスにおける封入体の形成等）の存在または不存在により同定できる。例えば、GnRH-Rコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合は、GnRH-Rコード配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、GnRH-Rコード配列の発現の制御に使用されるプロモーターと同じまたは異なるプロモーターの制御下に、GnRH-Rコード配列とタンデムに置かれてもよい。誘導あるいは選択に応答するマーカーの発現は、GnRH-Rコード配列の発現を示す。
第３の方法においては、GnRH-Rコード領域についての転写活性はハイブリダイゼーションアッセイにより測定できる。例えば、ＲＮＡは、GnRH-Rコード配列またはその特定の部分に相同なプローブを使用したノーザンブロットにより単離及び分析できる。あるいは、宿主細胞の全核酸を抽出し、そのようなプローブとのハイブリダイゼーションをアッセイすることができる。
第４の方法においては、GnRH-Rタンパク質産物の発現は、例えばウェスタンブロット、放射線免疫沈降、ＥＬＩＳＡ等のようなイムノアッセイにより、免疫学的に測定され得る。しかし、発現系がうまく機能しているかどうかの最終的な試験には、生物学的に活性なGnRH-R遺伝子産物の検出を使用する。多くのアッセイが受容体活性を検出するのに用いられ、限定するものではないが、GnRH結合アッセイ及び遺伝子操作細胞系を試験基質として使用するGnRH生物学的アッセイが含まれる。
本明細書中に記載する特定の態様においては、ヒトGnRH-R cＤＮＡを含む組換え発現ベクターによりトランスフェクトされたCOS-1細胞から細胞膜を調製した。ヒトGnRH-Rの発現は、125I標識GnRH類似体を使用して検出した。さらに、生物学的に活性なGnRH-Rの発現は、第7.1.5節に記載するようにGnRH-刺激イノシトールリン酸(IP)生産のレベルの測定によりトランスフェクトされた細胞中で検出することができた。
5.2.3  GnRH-Rの回収
高レベルで生物学的に活性なGnRH-Rを生成するクローンが同定されたら、そのクローンをふやし、多量の受容体の製造に使用することができ、その受容体は当分野でよく知られた方法により精製することができ、そのような方法には、限定するものではないが、イムノアフィニティ精製、高速液体クロマトグラフィー、ビーズに結合したGnRHあるいはその類似体のような固定化リガンドを使用するアフィニティクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法、抗体を使用したイムノアフィニティ精製等が含まれる。
GnRH-Rコード配列が、開裂可能な融合タンパク質をコードするように遺伝子操作される場合は、精製はアフィニティ精製法を使用して容易に達成することができる。例えば、コラゲナーゼ開裂認識コンセンサス配列をGnRH-Rのカルボキシ末端とプロテインＡの間に導入することができる。得られる融合タンパク質は、プロテインＡ部分に結合するＩｇＧカラムを用いて容易に精製することができる。非融合GnRH-Rはコラゲナーゼ処理により容易にカラムから放出され得る。もう１つの例は、外来ポリペプチドをグルタチオニンＳ−トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現するpGEXベクターの使用である。融合タンパク質はクローン化遺伝子及びGST部分の間にトロンビンまたはXa因子開裂部位のいずれかを有するように操作することができる。この融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズへの吸着の後、グルタチオンの存在下における溶出により細胞抽出物から容易に精製することができる。本発明のこの形態においては、GnRH-R配列と、例えば抗原（そのためのイムノアフィニティカラムを調製し得る）のような、精製に使用できる結合パートナーを有する第２のペプチドあるいはタンパク質との間に、任意の開裂部位あるいは酵素開裂基質を導入することができる。
5.3  GnRH-Rを規定する抗体の生成
当分野においてよく知られた種々の方法を、組換えにより生成されたGnRH-Rのエピトープに対する抗体の産生に使用することができる。中和抗体、即ち、受容体のGnRH結合部位に競合できるものは、診断及び治療に特に好ましい。ウィルスの血清学的マーカーを規定する抗体は診断用途に適している。このような抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fabフラグメント、Fab発現ライブラリーにより生成されたフラグメントを含む。
抗体の生産のためには、種々の宿主動物をGnRH-Rの注射により免疫することができ、このような動物には、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット等が含まれる。宿主の種に応じて、免疫応答を増加させるために種々のアジュバントを使用することができ、このようなアジュバントには、限定するものではないが、フロインド（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルヴムのような潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
GnRH-Rに対するモノクローナル抗体は、培養下の連続細胞系により抗体分子の生産が得られるような任意の方法を用いて調製することができる。これらの方法は、限定するものではないが、Kohler & Milstein (Nature, 1975, 256:495-497)により最初に記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kosborら, 1983, Immunology Today, 4:72; Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:2026-2030)及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)を含む。さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生産のために開発された方法(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature, 312:604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314:452-454)も使用できる。あるいは、単鎖抗体の生産のために記載された方法（米国特許第4,946,778号）も、GnRH-R特異的単鎖抗体を生産するのに適合させることができる。
GnRH-Rの特異的結合部位を含む抗体フラグメントは公知の技術により生成できる。例えば、そのようなフラグメントは、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化により生産されるF(ab')2フラグメント及びF(ab')2フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより生成されるFabフラグメントを含む。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築すると（Huseら, 1989, Science, 246:1275-1281）、GnRH-Rに対して所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定が可能となる。
5.4  GnRH-R、ＤＮＡ及び遺伝子操作細胞系の使用
上記したGnRH-RＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、GnRH-R発現産物、抗体及び遺伝子操作細胞系は、生殖機能障害の診断及び治療、薬剤の設計及び発見に多数の用途を有する。
例えば、GnRH-RＤＮＡ配列は、バイオプシーのハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、in situハイブリダイゼーションアッセイを含むサザンあるいはノーザン分析に使用して、GnRH-R発現の異常の診断に使用することができる。治療的用途においては、GnRH-RＤＮＡ配列に基づいて設計したアンチセンスまたはリボザイム分子を、GnRH-R遺伝子産物の輸送及び発現をブロックするのに使用することができる。この点では、例えばGnRH-Rヌクレオチド配列の-10と+10領域の間にある、翻訳開始部位から誘導されたオリゴヌクレオチドが好ましい。あるいは、GnRH-RＤＮＡを遺伝子治療法に使用して、正常な組換え遺伝子を患者の欠陥細胞に導入したり、内因的変異を修正してGnRH-Rとその機能を再構成するために使用することができる。
本発明の別の態様においては、GnRH-Rに特異的な抗体を、バイオプシー組織中の受容体発現パターンを決定するのに使用したり、インビボにおける診断画像化に使用することができ、このような用途においては、「中和」抗体が好ましい。例えば、画像化用の化合物と結合した抗体を患者に投与して、インビボにおいてGnRH-Rの位置と分布の「地図」を作成することができる。
本発明の別の態様においては、GnRH-R自体、またはそのGnRH結合部位を含むフラグメントをインビボで投与することができる。遊離のGnRH-Rあるいは前記ペプチドフラグメントは、GnRHに競争的に結合して、インビボで天然の受容体とのその相互作用を阻害する。
本発明の別の態様においては、GnRH-Rに特異的な抗体応答の刺激を、避妊の手段として使用することができる。例えば、GnRH-RあるいはGnRH-R融合タンパク質の注射により種々の宿主動物を免疫すると、それらの免疫系が刺激されて循環抗GnRH-R抗体の生成へと導く。
さらに別の態様においては、GnRH-Rを発現し、シグナル変換に応答する遺伝子操作細胞系を、生物学的に活性なGnRH類似体、即ち、アゴニストあるいはアンタゴニストのいずれかをスクリーニングし、同定するのに使用することができる。GnRH-RＤＮＡをトランスジーンとして含むトランスジェニック動物を、そのようなアゴニストあるいはアンタゴニストの効果をインビボで試験するために作製することができる。
近年、コンピュータにより作成されたリガンド−受容体相互作用についてのモデルが開発されており、本発明の特定の態様においては、GnRH-Rのコンピュータモデル化から得られた情報を受容体アゴニストまたはアンタゴニストの設計に使用し得る。74以上の異なるGPR（G-タンパク質受容体）配列が発表されており、GnRH-R配列との並列化は、リガンド結合及び制御を調べる際に特定のタンパク質配列の役割を理解することを容易にし得る。例えば、部位特異的突然変異誘発の技術を使用してなされたGnRH-R配列についての変更、及び細胞系における変異型受容体の発現は、特定の受容体領域及び残基の機能的役割をさらに規定するのに使用できる。
６．実施例：機能性マウスＧｎＲＨ−Ｒのクローン化
以下の分節に、マウスＧｎＲＨ−Ｒを表す相補的ＤＮＡのクローン化を記述し、またアフリカツメガエル卵母細胞発現を用いてその同一性を確認する。センスＲＮＡ転写物の注入は機能性で、高親和性のＧｎＲＨ−Ｒの発現をもたらす。しかし、ゴナドトロープ細胞系ＲＮＡを用いるＧｎＲＨ−Ｒの発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによってブロックされる。ラット下垂体前葉におけるin situハイブリダイゼーションは、特徴的なＧｎＲＨ−Ｒ分布を示す。ヌクレオチド配列は、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの推定上の膜貫通ドメインを有するが、典型的な細胞内Ｃ末端を欠く３２７アミノ酸タンパク質をコードする。ＧｎＲＨ−Ｒのこの例外的な構造および新規な潜在的調節ドメインは、そのシグナル変換および調節における独特の側面を説明するかもしれない。
６．１．材料および方法
薬品類は以下の入手先より得た：ＧｎＲＨアンタゴニスト［Ｄ−Ｐｈｅ26，Ｐｒｏ3］（Bachem, Torrance, CA）、ブセレリン（buserelin）（Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）6，Ｐｒｏ9−Ｎ−エチルアミドＧｎＲＨ（Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals, Somerville, NJ）。他のすべての薬品は、Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）より入手した。動物の管理はすべて実験動物の管理および使用に関するＮＩＨ指針にしたがった。
６．１．１．卵母細胞マイクロインジェクションおよび記録
生体雌アフリカツメガエル（Xenopus laevis）（Nasco, Ft. Atkinson, WI）を１８〜２０℃で、昼／夜のサイクルを１５時間／９時間にして飼育した。以前に記載されたように（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol 4:119-124）インジェクション用に卵母細胞を調製し、応答を記録した。細胞を０．５ｍｌの浴に入れ、標準的二電極法により−７０ｍＶで電圧をクランプした（Dascal, 1987, CRC Crit. Rev. Biochem. 417:47-61）。ペプチドリガンドを灌流緩衝液中で希釈し、上記の浴に導入した。クランプ電流はチャート記録計で記録した。反転電位は、ＴＬ−１インターフェースおよびｐＣＬＡＭＰソフトウエアー（Axon Instruments, Burlingame, CA）を用いたＩＢＭ  ＰＣ／ＡＴシステムによりアゴニストの存在下、および不在下で２秒間の−７０〜＋１０ｍＶの連続ランピング（ramping）によって測定した。
６．１．２．ＰＣＲクローニングおよびハイブリッド阻止スクリーニング
ＲＮＡの調製およびｃＤＮＡの合成は、以前に記載されたように実施した（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol 4:119-124; Snyderら、1991, Neurosci. Lett. 122:37-40）。ハイブリッド阻止スクリーニング用のサブクローンは、ＧＰＲスーパーファミリーの保存された膜貫通ドメインに対応する種々の縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより単離した。ＷＺ７を含むサブクローングループを単離するのに用いた、公知のオリゴマー配列（Zhouら、1990, Nature 347:76-80）に由来する修飾されたオリゴヌクレオチドは、膜貫通ドメインIII（５′−ＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＴＧ（ＣＴ）Ｇ（ＣＴ）（ＧＣ）ＡＴ（ＣＴ）（ＡＧ）ＣＮＮＴ（ＧＴ）ＧＡＣ（ＡＣ）Ｇ（ＣＧ）ＴＡＣ−３′）および膜貫通ドメインVI（５′−ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧ（ＡＴ）ＡＧＧＧＣＡＮＣＣＡＧＣＡＧＡＮ（ＣＧ）（ＡＧ）（ＣＴ）ＧＡＡ−３′）に対応していた。ＰＣＲは、反応条件のストリンジェンシー（stringency）を低くして実施した。反応の一部分を高ストリンジェント条件の下で再度増幅し、制限酵素で切断し、pBluescript II KS+（Stratagene）中にサブクローン化し、配列決定した。ハイブリッド阻止アッセイのために、５ＨＴ10受容体の膜貫通ドメインII（５′−ＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＧ−３′）（Juliusら、1988, Science 241:558-564）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＷＺ７（５′−ＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧ−３′）に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。αＴ３−１（１ｍｇ／ｍｌ）およびラット脳全ＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）の混合物をアンチセンスオリゴヌクレオチド（１００μｇ／ｍｌ）とともに１０分間３７℃で、３μｌ容量の２００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭ  Ｔｒｉｓを含有するｐＨ７．４の緩衝液中でプレインキュベートした。アフリカツメガエル卵母細胞にこの混合物５０ｎｌを注入し、記録開始前に４８時間インキュベートした。
６．１．３．ライブラリースクリーニングおよび配列決定
ＵｎｉＺａｐ（Stratagene）αＴ３−１  ｃＤＮＡライブラリーの１０6プラークを、ランダムヘキサマー（hexamer）プライマーによって前もって32Ｐで標識したＷＺ７の挿入配列を用いてスクリーニングした。４０個の陽性プラークが同定され、７個が２次および３次スクリーニングにより精製された。ＷＺ２５をヘルパーファージ切除によりpBluescript II KS+にサブクローン化し、両方の鎖をシークエナーゼ（Sequenase）Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）を用いたジデオキシチェーンターミネーション法により配列決定した。ｔａｑポリメラーゼによる標識化およびApplied Biosystems社の自動シークエンサーを用いて両鎖を再度配列決定して、配列をさらに確認した。予測される細胞質Ｃ末端が、ＷＺ２５における突然変異によって切られたという可能性を排除するために、３′配列をさらに２個の独立クローンにおいて確認した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＶＡＸコンピューターでWisconsin GCGパッケージおよびマイクロプロセッサーでMacVector（IBI）を使用して分析した。
６．１．４．ＷＺ２５ＲＮＡ転写物の特徴づけ
pBluescript II KS+（Stratagene）中のＷＺ２５を線状とし、キャップされたＲＮＡ転写物をＴ３ＲＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いて合成した。得られた転写物１．２５ｎｇを卵母細胞に注入し、記録開始前に４８時間インキュベートした。卵母細胞は、ＧｎＲＨを投与する前にあらかじめ緩衝液またはＧｎＲＨアンタゴニスト（アンタゴニスト６：［Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）1，Ｄ−α−Ｍｅ−ｐＣｌ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｔｒｐ3，Ｄ−Ａｒｇ6、Ｄ−Ａｌａ10］ＧｎＲＨ；アンタゴニスト２７：［Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）1，Ｄ−α−Ｍｅ−ｐＣｌ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｔｒｐ3，Ｎ−ε−ｌｐｒ−Ｌｙｓ5、Ｄ−Ｔｙｒ6、Ｄ−Ａｌａ10］ＧｎＲＨ；Can der Spuyら,1987,Vickery BHおよびNestor JJ（編）LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, NTP Press, Lancaster, England中参照）で３分間前処理した。受容体発現を確認するため、アンタゴニストを３分間洗い落とした後、卵母細胞を再度ＧｎＲＨに暴露した。
６．１．５．放射性リガンド結合アッセイ
膜調製のため、卵母細胞５００個のそれぞれに２．５ｎｇの合成ＷＺ２５  ＲＮＡを注入した。４８時間後に、卵母細胞膜を記述にしたがって調製し（Kobilkaら, 1987, J. Biol. Chem. 262:15796-15802）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ウシ血清アルブミンを含有する結合緩衝液に最終濃度が２０卵母細胞／ｍｌとなるように再度懸濁した。125Ｉ−［Ｄ−Ａｌａ6，ＮａＭｅ−Ｌｅｕ7，Ｐｒｏ9−ＮＨＥｔ］ＧｎＲＨ（ＧｎＲＨ−Ａ）を用いる受容体結合アッセイは、ラットおよびヒツジの下垂体膜について以前に記述されたアッセイに基づいて行なった（Millarら、1989, J. Biol. Chem. 264:21007-21013）。１０-6ＭのＧｎＲＨ類似体の存在下での結合は、非特異的結合を表すと考えられた。平均Ｂｏ（最大結合）値および非特異的結合値はそれぞれ１４２９および６６２ｃｐｍであった。ＧｎＲＨ−ＡおよびＧｎＲＨの解離定数（Ｋｄ）はEnzfitter（Elsevier-BIOSOFT）を用いて測定した。
６．１．６．溶液ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、およびin situハイブリダイゼーション
３９９ヌクレオチド32Ｐ標識ＧｎＲＨ−Ｒおよび１１７ヌクレオチド１Ｂ１５（シクロフィリン内部標準品）アンチセンスｃＲＮＡプローブを合成し、記述された方法で（Autelitanoら、1989、Mol.Cell.Endo.67:101-105）、溶液中のＲＮＡとハイブリッド形成させた。ポリ（Ａ）+αＴ３−１  ＲＮＡを用いたノーザンブロット分析を記述にしたがって実施した（Sambrookら、1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。35Ｓ−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡを用いたin situハイブリダイゼーションを、自由に浮遊する下垂体切片を使用して、公表された方法にしたがって実施した（GallおよびIsackson, 1989, Science 245: 758-761）。切片を固定し、Amersham Beta-maxフィルムに３日間暴露するかまたは放射性エマルジョンに浸漬し１７日後に現像した。
６．２．結論
６．２．１．機能性マウスＧｎＲＨ−ＲのｃＤＮＡクローニング
アフリカツメガエル卵母細胞における機能性ＧｎＲＨ−Ｒの発現を支配するマウスゴナドトロープ細胞系由来のＲＮＡ、すなわちαＴ３−１［５］（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol 4:119-124参照）を、Ｇタンパク質結合受容体の保存されたモチーフに対応するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲのためのｃＤＮＡを合成するのに使用した（Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＲ）；
Probstら、1992, DNA and Cell Biol. 11:1-20参照）。ＰＣＲ産物をサブクローン化し、配列決定し、ハイブリッド阻止アッセイのためにアンチセンスオリゴマーを合成した（Kawashi, 1985, Nuc. Acids Res. 13:4991-5004）。クローンＷＺ７に対応するオリゴヌクレオチドは、αＴ３−１およびラット脳ＲＮＡと共注入した場合、卵母細胞におけるＧｎＲＨ−Ｒの発現を完全に阻止したが、能５ＨＴ10受容体の発現には影響を及ぼさなかった（図１参照）。ＷＺ７の別のセグメントを表す第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた完全に、かつ特異的に、試験したすべての卵母細胞（ｎ＝１６）においてＧｎＲＨ−Ｒ発現を阻止した。クローンＷＺ７を、αＴ３−１バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用し、７個の陽性プラークを精製した。
１．３ｋｂの最大挿入配列を有するクローンＷＺ２５が機能性ＧｎＲＨ−Ｒをコードしているかどうかを試験するため、これをＲＮＡ合成と卵母細胞発現のためにサブクローン化した。合成ＲＮＡを注入したすべての卵母細胞（ｎ＞５０）は、ＧｎＲＨに暴露すると、ＧｎＲＨ−Ｒ発現の大きな減極性の応答特徴を示した（図２参照）。卵母細胞においてＷＺ２５  ＲＮＡ転写物によって誘発されたＧｎＲＨへの応答のカルシウム依存性および反転電位（Ｖr）は，αＴ３−１  ＲＮＡを用いてすでに得られた結果と同様であった（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol 4:119-124）。ＧｎＲＨによって引き出された電流のＶrは−２７±０．７９ｍＶ（ｎ＝７）で、卵母細胞中の塩化物イオンのそれと一致していた（Barish, 1983, J. Physiol. 342:309-325）。ＧｎＲＨによって誘発される応答は、記録開始の１時間前に卵母細胞に５ｍＭ  ＥＧＴＡをあらかじめ負荷することによって完全に消滅した（ｎ＝４）。しかし、灌流物中のＣａ2+の不在によっては重大な影響を受けなかった（ｎ＝７）。ＷＺ２５クローンから発現された受容体は、ホスファチジルイノシトール加水分解を引き起こす受容体に特徴的な、細胞内カルシウムによる卵母細胞のカルシウム依存性塩化物電流の活性化によって媒介される応答を示した（Dascal, 1987, CRC Crit. Rev. Biochem. 417:47-61参照）。得られた応答の薬理学は、哺乳類ＧｎＲＨ−Ｒの発現と一致していた。ＧｎＲＨアゴニスト［Ｄ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）6，Ｐｒｏ9−ＮＨＥｔ］ＧｎＲＨ［１００ｎＭブセレリン（buserelin）、ｎ＝６］は、ＲＮＡを注入した卵母細胞に減極性の電流を引き起こした。等モルの弱いＧｎＲＨアンタゴニスト［Ｄ−Ｐｈｅ2,6，Ｐｒｏ3］ＧｎＲＨの存在下では、ＧｎＲＨ単独への応答に比較し、ＧｎＲＨへの応答が６０％減少した（それぞれ１８８０±５５１ｎＡ，ｎ＝５，および４７５６±１０８２ｎＡ，ｎ＝４）。２つの強力なＧｎＲＨアンタゴニストは、ＧｎＲＨが誘発する電流を完全に消滅させた（図２Ａ参照）。
このｃＤＮＡクローンによってコードされる受容体をさらに特徴づけるため、ＷＺ２５ＲＮＡ転写物を注入した卵母細胞から精製膜を用いて放射性リガンド結合アッセイを実施した。ＧｎＲＨアゴニスト［Ｄ−Ａｌａ6，ＮαＭｅ−Ｌｅｕ7，Ｐｒｏ9−ＮＨＥｔ］ＧｎＲＨ（ＧｎＲＨ−Ａ）は高親和性で、合成ＲＮＡを注入した卵母細胞の膜と結合した（図２Ｂ参照）。125ＩＧｎＲＨ−ＡのＧｎＲＨ−Ａとの置換は、ＷＺ２５  ＲＮＡ注入卵母細胞膜およびαＴ３−１細胞膜において類似したＫｄの４．５および２．９ｎＭをそれぞれ示した。クローン化された受容体に結合しているＧｎＲＨ−ＡのＧｎＲＨによる置換は、αＴ３−１膜についてすでに報告されているように（Hornら、1991, Mol. Endocrinol. 5:347-355）、効果のより低い程度のものであった。したがって、ハイブリッド阻止および発現データから、クローンＷＺ２５がマウスＧｎＲＨ−Ｒを提示することを確認できる。
６．２．２．マウスＧｎＲＨ−Ｒのコード配列の特徴づけ
クローンＷＺ２５のヌクレオチド（配列番号：１）およびそれに対応する推定アミノ酸配列（配列番号：２）を図３に示す。最長オープンリーディングフレームは３２７アミノ酸タンパク質（相対分子質量Ｍr＝３７，６８３）をコードしている。可溶化ラットＧｎＲＨ−Ｒの結合サブユニットについて報告されたより大きいサイズ、すなわちＭr50,000〜60,000（Hazumら,1986,J.Mol.Endocrinol.1:187-196）は、受容体のグリコシル化によるものかもしれない。３つの共通のＮ結合グリコシル化部位が存在し、２つはＮ末端部に、もう１つは推定上の第１細胞外ループにある。最初のＡＴＧは、コザック（Kozak）コンセンサス配列（Kozak, 1987, Nuc.Acids Res. 15:8125-8148）に非常に近いので翻訳開始部位を表すと考えられ、また付加的５′配列を有する第２のｃＤＮＡクローンはこのリーディングフレーム中の−５４位および−５７位に２個のナンセンスコドンを含有する。したがって、上流のいかなる翻訳開始部位で始まった翻訳も正しいオープンリーディングフレームに到達する前に終止するであろう。ポリアデニル化シグナルはなく、また明らかなポリ（Ａ）尾部はライブラリー構築時の３′非翻訳領域におけるオリゴ（ｄＴ）プライミング（priming）を表している可能性が高い。単離された機能性ＧｎＲＨ−Ｒ  ｃＤＮＡは、ショ糖勾配（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol 4:119-124）およびノーザンブロット分析によって測定したところ１．３ｋｂで、他方この配列を含むｍＲＮＡは約４．６ｋｂであった（図５Ｂ参照）。一次ライブラリースクリーニングによって同定された４０個の陽性プラークのＰＣＲ分析は、ＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡが付加的５′および付加的３′非翻訳領域の両方を含有することを示唆する。
推定されるタンパク質の疎水性分析は、インターロイキン−８受容体に最大程度の相同性を有し、他のＧＰＲに２０〜３０％の配列類似性を有する、７つの高疎水性アミノ酸領域を示す（図４参照）。ＧｎＲＨ−Ｒでは数個の高度に保存された残基、例えば多くの受容体を安定化させる、最初の２つの細胞外ループのそれぞれにあるシステインなどが注目される一方、ＧｎＲＨ−Ｒのいくつかの特徴は変わっている。例えば、多くのＧＰＲの機能にとって不可欠であると判明した、高度に保存された膜貫通ドメインＩＩアスパルテート／グルタメートがアスパラギンに置換されている。このＧｎＲＨ−ＲはＧＰＲスーパーファミリーのほぼ最小のメンバーで、他のＧＰＲと違い、極性の細胞質Ｃ末端を欠く。推定上の最初の細胞質ループは、他のいかなるＧＰＲのそれよりも長い。ＧＰＲの中で独特なことに、このＧｎＲＨ−Ｒは二量化によって活性化することが可能である（Connら、1982, Nature 296:653-655;GregoryおよびTaylor, 1982, Nature 300:269-271）。その例外的な構造が、この提示された活性化メカニズムに役立つのかもしれない。
他のＧＰＲからのもう１つの逸脱は、膜貫通ドメインＩＩＩの近くに位置する保存されたチロシンに代えての、セリンの代用である。このことは、他のＧＰＲのシグナル変換にとって決定的な領域に、このＧｎＲＨ−Ｒに独特の潜在的なリン酸化部位を作り出す。このＧｎＲＨ−ＲにはないＣ末端のリン酸化は、いくつかのＧＰＲの脱感受性（desensitization）に寄与する（Probstら、1992, DNA and Cell Biology 11:1-20参照）。このＧｎＲＨ−Ｒの新規リン酸化部位が受容体の脱感受性を仲介するかどうかを決定するのは興味深いであろう。他の潜在的な制御リン酸化部位もまた存在する（図３参照）。
多様な神経内分泌細胞系におけるＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡの存在を、溶液ハイブリダイゼーション／ヌクレアーゼ保護アッセイ（図５Ａ参照）によって研究した。ＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡは、αＴ３−１細胞およびマウス下垂体に検出されたが、ＧｎＲＨニューロン誘導（ＧＴ−１）、コルチコトローフ（ＡｔＴ２０）またはソマトラクトトローフ（ＧＨ３）細胞系にはアッセイの検出限界でも検出されなかった。検出可能なＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡがＧＴ−１およびＡｔＴ−２０細胞系に存在しないことは、溶液ハイブリダイゼーション／ヌクレアーゼ保護アッセイにより高濃度のＲＮＡを使用して、すでに確認されている（Dr. Andrea C. Gore,未公表データ）。図５Ｃは、ラット下垂体前葉におけるＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡの分布を示す。標識は下垂体全体にわたってヘテロジニアスに分布し、以前にＧｎＲＨ−Ｒオートラジオグラフィーによって観察されたパターンを示した（BadrおよびPelletier, 1988, Neuropeptides 11:7-11）。明視野および暗視野の顕微鏡検査は、ＧｎＲＨ−Ｒ  ｍＲＮＡを発現している細胞のクラスター化を示す（図５Ｅおよび５Ｆ参照）。
７．実施例：ヒトＧｎＲＨ−Ｒのクローン化および特徴づけ
以下の分節に、ヒトＧｎＲＨ−Ｒを表す相補的ＤＮＡのクローン化を記述し、またアフリカツメガエル卵母細胞発現を用いてその同一性を確認する。さらに、ヒトＧｎＲＨ−ＲをＣＯＳ−１細胞で発現させ、それが機能的に活性であることを示した。
７．１．材料および方法
７．１．１．ヒトＧｎＲＨ−Ｒのクローン化
ＧＴ１０ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）の１２０万個のプラークを高ストリンジェント条件下（Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、N.Y.）で、ランダムヘキサマープライミングにより32Ｐで標識したマウスＧｎＲＨ−Ｒ挿入配列（Tusumiら、1992, Mol. Endocrinol. 6:1163-1169）をプローブとして用いて検索した。３２個の陽性プラークが２重反復フィルター上に同定された。さらに特徴づけをするために１０個を選択し、６個がその後のスクリーニングによってうまく精製できた。最大の挿入配列をもつクローンをpBluescript II SK+（構築体ＬＣ２７−４）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローン化し、両方の鎖をApplied Biosystemsの自動シークエンサー（Foster City, CA, USA）で合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて繰返し配列決定した。その配列を、ＶＡＸコンピューターでＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧパッケージを用いて分析した。
７．１．２．アフリカツメガエル卵母細胞における発現
構築体ＬＣ２７−４を線形とし、キャップされたＲＮＡ転写物をＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。卵母細胞の調製および電気生理学的実験は以前に記述されたように実施した（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol. 4:119-124）。細胞に１〜１０ｎｇの合成転写物を注入し、電気生理学を２電極電圧クランプにより４８時間後に記録した。すべてのアゴニストおよびアンタゴニストは０．２μＭの濃度で加えた。アンタゴニストはＧｎＲＨ暴露の３分前に浴中に導入した。
以下のＧｎＲＨ類似体を使用した。すなわち、ＧｎＲＨ−Ａ：［Ｄ−Ａｌａ6，Ｎ−Ｍｅ−Ｌｅｕ7，Ｐｒｏ4−ＮＨＥｔ］ＧｎＲＨ；アンタゴニスト５：［Ｄ−ｐＧｌｕ1，Ｄ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｔｒｐ3,6］ＧｎＲＨ；アンタゴニスト６：［Ａｃ−Ｄ−ＮａＩ（２）1，Ｄ−α−Ｍｅ−ｐＣｌ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｔｒｐ3，Ｄ−Ａｒｇ6，Ｄ−Ａｌａ10］ＧｎＲＨ；アンタゴニスト１３：［Ａｃ−Ｄ−ＮａＩ1，Ｄ−α−４−ＣｌＰｈｅ2，Ｄ−Ｐａｌ3，Ｄ−Ａｒｇ6，Ｄ−Ａｌａ10］ＧｎＲＨ；アンタゴニスト２７：［Ａｃ−Ｄ−ＮａＩ（２）1，Ｄ−α−Ｍｅ−ｐＣｌ−Ｐｈｅ2，Ｄ−Ｔｒｐ3，Ｎ−ε−ｉｐｒ−Ｌｙｓ5，Ｄ−Ｔｙｒ6，Ｄ−Ａｌａ10］ＧｎＲＨ（Van der Spuyら、1987、Vickery BHおよびNestor JJ（編）LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, NTP Press, Lancaster中）。ブセレリン（buserelin）［Ｄ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）6，Ｐｒｏ9］ＧｎＲＨは、Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals(Somerville, NJ,USA)からの寛大な贈与品であった。
７．１．３．ＣＯＳ−１細胞のトランスフェクション
ヒトＧｎＲＨ−Ｒ  ｃＤＮＡを、ＳＶ４０初期プロモーターを含有する発現ベクターｐＳＶ２Ａにサブクローン化した。ＣＯＳ−１細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いて一時的にｐＳＶ２Ａ−ヒトＧｎＲＨ−Ｒ構築体でトランスフェクトした［Keownら、1990、Methods in Enzymology, VI. 185（Goeddel, D.V.編）527-537, Academic Press, New York］。ＧｎＲＨ結合に関する研究には、３ｘ１０6細胞／１０ｃｍ培養皿を１５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。イノシトールリン酸産生に関する研究には、１．８ｘ１０5細胞／ウエル（１２ウエルプレート）を１．５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクションの４８時間後にアッセイを行なった。
７．１．４．受容体結合
トランスフェクトした細胞から、ラット下垂体について記述したように１回の遠心分離工程により、細胞膜を調製した（Millarら、1989, J.Biol.Chem. 264:21007-21013）。受容体結合アッセイを以前に記述されたように（Tusumiら、1992, Mol. Endocrinol. 6:1163-1169）125Ｉ−ＧｎＲＨ−Ａを用いて実施した。予測される非特異的結合に、１０-7ＭのＧｎＲＨ−Ａを用いた。
７．１．５．イノシトールリン酸産生の刺激
ＧｎＲＨで刺激したイノシトールリン酸（ＩＰ）産生を記述されているように（Davidsonら、1990,Endocrinology 126:80-87）測定した。塩化リチウムの存在下における［3Ｈ］ＩＰの蓄積をイノシトールリン酸産生高の指標として用いた。簡単に述べると、トランスフェクトした細胞を１晩［3Ｈ］イノシトールで標識し、塩化リチウムの存在下で１．０μＭのＧｎＲＨで刺激した。過塩素酸溶液およびフィチン酸を加えて反応を停止させた。水酸化カリウムで中性化した後、イノシトールリン酸をＤｏｗｅｘイオン交換カラムで分離し、計量した。
７．１．６．ノーザンブロットおよびＰＣＲ分析
６個のヒト下垂体（男性５、女性１、年齢３０〜４５）および１個のヒト精巣（年齢８０）より、グアニジニウムチオシアネートによる抽出とそれに続く塩化セシウム中での遠心により、ＲＮＡを調製した（Sambrookら、1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、N.Y.）。Promega PolyA Tract ｍＲＮＡ単離システムを用いて調製した下垂体（１．６μｇ）および精巣（０．９μｇ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを、１％アガロース、２．２Ｍ  ホルムアルデヒドゲルを用いる電気泳動にかけ、２０ｘＳＳＣ中でニトロセルロース膜（HYbond-Cエクストラ、Amersham）に移し、真空下８０℃で固定した。構築体ＬＣ２７−４由来の挿入配列は、Amersham Megaprimeラベリングキットを用いて、７．２ｘ１０8ｃｐｍ／μｇの比活性に標識した。ブロットを２ｘピペス（Pipes）、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ中で４２℃で、プレハイブリダイズし（２時間）、ハイブリダイズし（１晩）、その後洗浄した（最終洗浄０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６０℃で１０分間）。ヒトＲＮＡにおける５′および３′非翻訳配列の範囲を正確に描くため、一次ライブラリースクリーニングで２重反復フィルター上に同定されたが精製されなかったクローンをＰＣＲ鋳型として、プライマー対（これらはＧＴ１０クローニング部位および公知のヒトＧｎＲＨ−Ｒ挿入配列に向けられたものである）と共に用いた。得られたＰＣＲ反応産物は、クローンＬＣ２７−４をＰＣＲ鋳型として用いて得られた産物と１％アガロースゲル上で比較した。
７．２．結果
７．２．１．ヒトＧｎＲＨ−Ｒのクローン化および特徴づけ
クローンＬＣ２７−４の配列決定は、２１６０ｂｐの挿入配列を同定した（図９参照）。最大オープンリーディングフレーム（１００８ｂｐ）はこのクローンの５′末端に伸びている。翻訳開始部位は、コザックコンセンサス配列が存在するため、部分的に最初のＡＴＧに定められる（Kozak,1987,Nucleic Acids Res. 15:8125-8148）。特徴づけられたクローンはリーディングフレーム内にその完全な５′範囲（extent）をもって残るので、上流にあるこのほかの開始部位の存在は除外できない。しかし、さらなる５′コード領域の存在は、ないように思われる。なぜなら、その翻訳開始部位がより大きな確実性をもって規定され得るマウス受容体との高い相同性のゆえにである（Tsutsumiら、１９９２）。したがって、ヒト受容体ｃＤＮＡは、マウス受容体の想定される配列と９０％の同一性を有する３２８アミノ酸タンパク質をコードする９８４ｂｐのリーディングフレームを含有する。長い３′非翻訳領域はポリアデニル化シグナルを含まない。
全長ヒトＧｎＲＨ−ＲのＲＮＡのサイズを決定するために、ノーザンブロット分析を実施した。プローブは、ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡに約４．７ｋｂの単一バンドを示した（図１０参照）。ヒト精巣から精製したポリ（Ａ）ＲＮＡには、いかなるシグナルも検出されず、またヒトβ−アクチンｃＤＮＡ対照についてもシグナルは検出されなかった。ＲＮＡの５′および３′非翻訳領域の範囲を決定するため、一次ライブラリースクリーニング由来のファージ単離物のＰＣＲ分析を行なった。ＬＣ２７−４挿入配列の５′末端付近の配列を表すアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー、または同配列の３′末端付近を表すセンスプライマーを、隣接のＧＴ１クローニング部位に対して設計されたプライマーと共に用いて、未精製クローンの地図を作製した。同定された最長のＰＣＲ産物は、約１．３ｋｂの付加的５′配列および０．３ｋｂの付加的３′配列を有した（ここには示していない）。これらのデータは、ＧｎＲＨ−ＲのｍＲＮＡは少なくとも１．３ｋｂの５′非翻訳配列および１．５ｋｂの３′非翻訳配列を含有することを示唆する。ノーザンブロットデータによると、これは単離されたいかなるクローンにも付加的非翻訳配列（＜１ｋｂ）は含有されていないことを示唆する。
疎水性分析（Kyte-Dolittle）は、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの疎水性ドメインを同定した（図９参照）。マウス受容体の想定された構造に見られたように、ヒトＧｎＲＨ−Ｒは本質的にいかなるＣ末端細胞内領域ももたない。２つの潜在的なＮ−結合グリコシル化部位が、最初の２つの細胞外領域のそれぞれに１つずつ存在する。数個の細胞質セリン及びトレオニン残基が細胞内領域に存在し、調節的リン酸化部位として役立っている可能性がある。
７．２．２．アフリカツメガエル卵母細胞への注入
単離された最大のクローンＬＣ２７−４は、約２．２ｋｂの挿入配列を含有した。このクローンが機能性ヒトＧｎＲＨ−Ｒをコードしているかどうかを試験するため、合成ＲＮＡ転写物をアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。ＲＮＡを注入したすべての卵母細胞は、２ｘ１０-7ＭのＧｎＲＨ（ｎ＝１７）または２ｘ１０-7Ｍのブセレリン（ｎ＝６；図１参照）に暴露すると大きな減極性電流を生じた。これは組織または細胞系ＲＮＡを用いた、卵母細胞における哺乳類ＧｎＲＨ−Ｒの発現に続いて得られた応答特別不可能であった（Sealfonら、1990, Mol. Endocrinol. 4:119-124）。これらの応答は、等モル濃度の２つの強力なＧｎＲＨ受容体アンタゴニストによって完全にブロックされた（それぞれｎ＝５；図６参照）。
７．２．３．ＣＯＳ−１細胞におけるヒトＧｎＲＨ−Ｒの発現
クローン化したヒトＧｎＲＨ−Ｒをさらに特徴づけるため、この受容体をＣＯＳ−１細胞で発現させた。ヒトＧｎＲＨ−Ｒ構築体でトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞由来の膜を用いた結合データを図７に示す。ＧｎＲＨ−ＡのＧｎＲＨ−Ａ、ＧｎＲＨ、およびアンタゴニスト５による置換は、それぞれ解離定数が０．９７ｎＭ、２．８ｎＭおよび８．４ｎＭで、これらの値は先にヒト下垂体を用いて得られた値と類似していた（Wormaldら、1985, J.Clin. Endocrinol. Metab. 61:1190-1198）。
ＣＯＳ−１細胞中に発現される受容体は機能性であり、またイノシトールリン酸代謝に関係していることが判明した。イノシトールリン酸代謝の約８倍増加が最大受容体刺激により達成され、ＧｎＲＨのＥＣ50は約３ｎＭであった。10-8ＭのＧｎＲＨによって誘発されるＰＩ産生の刺激は、ＧｎＲＨアンタゴニストによって濃度依存的に阻害された（図８参照）。ＧｎＲＨ（１０-8Ｍ）により刺激されたイノシトールリン酸産生は、アンタゴニスト１３によって６．７ｘ１０-9ＭというＩＣ50で、またアンタゴニスト５によって１．０５ｘ１０-7ＭというＩＣ50で阻害され（データは示していない）、それぞれＫd値２．１ｘ１０-10Ｍおよび３．６ｘ１０-9Ｍを示した（Leslie, F.M．， 1987 Pharmacol. Rev. 39:197-247）。
本発明は、例示した態様によってその範囲を制限されるものではない。これらの態様は、本発明の個々の側面を説明するためのもので、機能的に等価ないかなるクローン、ＤＮＡ、またはアミノ酸配列も本発明の範囲に入る。実際、当業者には、これまでの記述および添付の図面からさらに様々な本発明の変更が可能であろう。そのような変更は、本発明の特許請求の範囲内に入るものとする。
さらにまた、ヌクレオチドに与えられているすべての塩基対サイズは大体のもので、説明のために使用されていることが理解されねばならない。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：1227
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：43..1023
配列
0003719712.tif 000002
0003719712.tif 000003
配列番号：２
配列の長さ：327
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0003719712.tif 000004
0003719712.tif 000005
配列番号：３
配列の長さ：2160
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：不明
配列の種類：DNA（genomic）
配列の特徴
特徴を表す記号：CDS
存在位置：25..1008
配列
0003719712.tif 000006
0003719712.tif 000007
0003719712.tif 000008
配列番号：４
配列の長さ：328
配列の型：アミノ酸
トポロジー：不明
配列の種類：タンパク質
配列
0003719712.tif 000009
0003719712.tif 000010
【図１Ａ】
0003719712.tif 000011
【図１Ｂ】
0003719712.tif 000012
【図２Ａ】
0003719712.tif 000013
【図２Ｂ】
0003719712.tif 000014
【図３Ａ】
0003719712.tif 000015
【図３Ｂ】
0003719712.tif 000016
【図４Ａ】
0003719712.tif 000017
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
0003719712.tif 000019
【図５】
0003719712.tif 000020
【図６】
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【図７】
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【図８】
0003719712.tif 000023
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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