(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする配列を含む単離されたDNA分子であって，前記分子が、
以下を含むＡブロックを含み：
−配列リスト番号３に示された一つの配列を有するDNA配列；または
−配列リスト番号４に示された一つの配列を有するアミノ酸配列をコードするDNA配列；あるいは
−配列リスト番号４に示された一つの配列を有し、および該配列中に１または数個のアミノ酸の、アルギン酸塩中のMGブロックまはたＧブロックを生成させる該酵素の生物学的活性を変えない欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列をコードするDNA配列、
および、任意にさらに以下を含むＲブロックを含み：
−配列リスト番号５に示された一つの配列を有するDNA配列；または
−配列リスト番号６に示された一つの配列を有するアミノ酸配列をコードするDNA配列；あるいは
−配列リスト番号６に示された一つの配列を有し、および該配列中に１または数個のアミノ酸の、アルギン酸塩中のMGブロックまたはＧブロックを生成させる該酵素の生物学的活性を変えない欠失、置換または付加を含むアミノ酸配列をコードするDNA配列、
かつ、前記配列が天然供給源から単離されたかまたは合成的に誘導されたものである、単離されたDNA分子。
【請求項２】
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする前記配列が、一つ以上のＡブロックのみを含むことをさらに特徴とする、請求項１に記載の単離されたDNA分子。
【請求項３】
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする前記配列が、一つ以上のＡブロックおよび一つ以上のＲブロックを含むことをさらに特徴とする、請求項１に記載の単離されたDNA分子。
【請求項４】
配列リスト番号３に示された一つの配列を有するDNA分子を含む少なくとも一つのＡブロック；および配列リスト番号５に示された一つの配列を有するDNA分子を含む０ないし５のＲブロックを含むことをさらに特徴とする、請求項１に記載の単離されたDNA分子。
【請求項５】
配列リスト番号１に示されたヌクレオチド配列を含み、または配列リスト番号１に示されたアミノ酸配列をコードし得ることをさらに特徴とする、請求項１または４に記載の単離されたDNA分子。
【請求項６】
配列リスト番号１に示された、（ｉ）ヌクレオチド部位290〜1951に対応する配列を有するアミノ酸配列；（ii）ヌクレオチド部位2227〜6438に対応する配列を有するアミノ酸配列；（iii）ヌクレオチド部位6702〜9695に対応する配列を有するアミノ酸配列；または（iv）ヌクレオチド部位9973〜12411に対応する配列を有するアミノ酸配列をコードすることをさらに特徴とする、請求項１または３ないし５のいずれかに記載の単離されたDNA分子。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載のDNA分子を含む、組換えDNAベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えDNAベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有する酵素の生産および／またはアルギン酸塩の微生物学的生産のための組換え宿主細胞を構築する方法であって、前記方法が、請求項１ないし７のいずれかに記載のDNA分子またはベクターにより宿主細胞を形質転換させることを含む、方法。
【請求項１０】
生産されるアルギン酸塩が、75〜98％の高Ｇブロック含有率を有する、請求項９に記載のアルギン酸塩の微生物学的生産のための組換え宿主細胞を構築する方法。
【請求項１１】
DNA配列が、所望のM/Gブロック含有率を有するアルギン酸塩を生産させるように選択される、請求項９または10に記載の方法。
【請求項１２】
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有する酵素の生産方法であって、前記方法が、エピメラーゼ活性を発現し得る組換え宿主細胞を構築することを含み、
前記宿主細胞内で機能するプロモーターおよび翻訳活性化配列；および
前記プロモーターおよび翻訳活性化配列により発現される位置にある、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードするDNA配列であって、
前記DNA配列が請求項１に記載のＡブロックを含み；および
前記DNA配列が請求項１に記載のＲブロックを任意にさらに含むDNA配列、を含む組換えDNA発現ベクターにより前記宿主細胞を形質転換させることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
天然宿主細胞内のマンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする一つ以上のDNA配列を選択的に不活性化することを含み、前記不活性化される一つ以上のDNA配列が、請求項１に記載の少なくとも一つのＡブロックを含み；および前記不活性化される一つ以上のDNA配列が、請求項１に記載の少なくとも一つのＲブロックを任意にさらに含む、アルギン酸塩の微生物学的生産方法。
【請求項１４】
生産されるアルギン酸塩が、純粋なポリＭアルギン酸塩または０〜25％のＧブロック含有率を有するアルギン酸塩である、請求項13に記載のアルギン酸塩の微生物学的生産方法。
【請求項１５】
前記DNA配列が選択的に不活性化されて、所望のM/Gブロック含有率およびＧブロック分布を有するアルギン酸塩を生産する、請求項13または14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする配列を組み込んだDNA化合物、そのような酵素の調製方法、規定のG/M比率およびブロック構造を有するアルギン酸塩の生産における前記遺伝的配列の使用、ならびに前記遺伝的配列の不活性化による規定のG/M比率を有するアルギン酸塩の生産に関する。
本出願全体にわたって、科学文献および特許文献の出版物を言及している。本明細書において言及した出版物の教示の全てが、参考として本出願に取り入れられる。
本出願において、遺伝子という術語を用いてタンパク質をコードする遺伝的配列を示すが、その遺伝的配列によりコードされるタンパク質が自然状態において本来の宿主生物内で発現されるか否かには拘わらない。
アルギン酸塩は多糖体類の一種であり、Azotobacter vinelandiiおよびAzotobacter chroococcum等の細菌類ならびに褐藻類において合成される。また、アルギン酸塩はPseudomonas sp.の幾つかの菌株によっても合成される。
化学的には、アルギン酸塩は１−４結合したβ−Ｄ−マンヌロン酸（以下Ｍと称することがある）とそのＣ−５エピマーであるα−Ｌ−グルロン酸（以下Ｇと称することがある）との枝なしの２成分コポリマーである。
海藻およびAzotobacter属細菌から誘導されるアルギン酸塩は一般的に真のブロックコポリマーであり、そのモノマーはＭのホモポリマーの連なり（以下Ｍブロックと称する）およびＧのホモポリマーの連なり（以下Ｇブロックと称する）の中に配置され、双方のモノマーを含有する領域が両ブロックの中間に介在しているが、この領域は一般的に交互ブロックまたはMGブロックと称される。アルギン酸塩の組成および配列構造は供給源により大きく変化する。しかし、Pseudomonas属細菌により産生されるアルギン酸塩はＧブロックをまったく有しない。
ゲル形成能力および水との結合の如き種々の機能特性は、M/G比率および様々なブロックの長さに依存する。比較的高いＧブロック含有率は、例えば良好なゲル化特性を与えるが、それはアルギン酸塩溶液にCa2+イオンが添加されたときに鎖のイオン架橋が生じるからである。組成およびブロック構造はアルギン酸塩の免疫学的特性にも影響する。オッテルレイらの文献［Otterlei et al.,J.of Immunotherapy 10,286−291,（1991）］は、マンヌロン酸ブロックの高い含有率を有するアルギン酸塩は非常に有効な無毒性免疫促進剤であることを示している。
現在、アルギン酸塩の工業的製造は供給源藻類に頼り切っている。しかし、その組成範囲は限られており、知られているグルロン酸の最大含有率は75％、そして最小含有率は25％である。さらに、Ｇ含有率が42〜54％の範囲内であるアルギン酸塩の適切な供給源はない。生物工学または生物医学の分野においては、細胞の不動化のための高いＧ含有率［Martinsen A.,
0003665905.tif 000002
G.and Smidsrφd O.,Biotechnol.Bioeng.33,79−86,（1989）］および免疫促進剤としての高いＭ（90〜100％）［Otterlei et al.,J.of Immunotherapy 10,286−291,（1991）］の如き極端な組成を有するポリマーが主な興味の対象である。
Ｇブロックの生成に関して鍵となる酵素はマンヌロナンＣ−５エピメラーゼと呼ばれている。今までは特定のアミノ酸配列を有するただ一つの酵素だけがこの活性を示すと考えられていた。しかし驚くべきことに、この活性を有する酵素をコードする遺伝子が少なくとも５つは存在することがこのほど判明した。これらの酵素の幾つかは分子量およびアミノ酸配列が異なっている。これらの遺伝子はAzotobacter vinelandii細菌中で互いに隣接して発見された。酵素のアミノ酸配列が酵素の活性に影響することも判明したが、ここで言う活性とは酵素としての能力だけではなく、形成されるアルギン酸塩のタイプをも意味しており、例えば、グルロン酸含有率およびアルギン酸塩の単独／ブロックＧ含有率を変化させるものである。
ラーセンとホウグの文献［Larsen,B.and Haug,A.,Carbohydr.Res.17,（1971）,287−296 and 297−308］において、Azotobacter vinelandiiの液体培養物からのマンヌロナンＣ−５エピメラーゼの単離が報告されている。以下、このエピメラーゼをマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ（２）と称し、これに応じて、このエピメラーゼをコードするDNA配列をE2と称する。
スカヤック−ブレクとラーセンの文献［
0003665905.tif 000003
G.and Larsen,B.,Carbohydr.Res.103:133−136,（1982）］において、アルギン酸塩セファロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーによるマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ（２）の精製が開示されている。別の文献［
0003665905.tif 000004
G.and Larsen,B.,Carbohydrate Research,139,（1985）273−283］において、この酵素の特徴が開示されている。さらにこの酵素の活性が、広範囲のモノマー組成およびブロック単位の配列を有する、細菌および海藻の双方のアルギン酸塩を異性体化する能力として記載されている。
国際出願WO 86/03781号明細書および日本特許出願第63−233797号明細書から、前記酵素（E2）のアルギン酸またはアルギン酸塩に対する作用によりＧ含有率を増加させて、グルロン酸の高い含有率を有するアルギン酸および／またはアルギン酸塩を生産することが知られている。
チトニスとオマンの文献［Chitnis,C.E.and Ohman,D.E.,J.Bacteriol.,172,p2894−2900,（1990）］において、Pseudomonas aeruqinosaの細胞外多糖体（exopolysaccharides）内へのグルロン酸の導入に係る遺伝子配列が報告されている。しかし、この導入過程に関与する酵素の性質は同定されていない。この属の細菌はＧブロックを含有するアルギン酸塩を産生することはできない［
0003665905.tif 000005
G.,Larsen,B.and Grasdalen,H.Carbohydr.Res.54（1986）169−174］ので、アルギン酸を産生するPseudomonas属細菌における異性体化システムは藻類およびAzotobacter vinelandiiの有するエピメラーゼとは本質的に異なるものと考えられる。Pseudomonas属細菌の酵素は、糖ヌクレオチドレベルで作用するモノマーエピメラーゼであり、そしてそれ単独では既に重合されたアルギン酸塩内にＧブロックを導入することはできないように思われる。
Azotobacter vinelandii培養物からのマンヌロナンＣ−５エピメラーゼの生産は収率が非常に低いので困難である。また、この酵素は大量の非常に粘稠なアルギン酸塩と共に分泌されるために、これが酵素精製を妨害するという大きな障壁となっている。アルギン酸塩は何種類かの細菌により分泌されるが、これらの微生物に基づく工業的生産は成功していない。その主な理由は、細胞外多糖体の組成および分子サイズの管理の困難さにある。Azotobacter vinelandii由来のアルギン酸塩におけるグルロン酸ブロック含有率は、良好なゲル化特性を有するポリマーを作るには低すぎる傾向がある。
上述した如き免疫原特性を有する高Ｍ含有率のアルギン酸塩はPseudomonas aeruqinosaにより産生されるが、ポリマーの産生が安定しないので、この生物体は生産という観点からは魅力的でない。さらに、この生物体は膵嚢胞性繊維症に罹患している患者の二次病原体であることが知られている。
従って、規定のモノマー組成および配列構造を有するアルギン酸塩を医薬用の品質で製造するためには、鍵となる酵素であるマンヌロナンＣ−５エピメラーゼのコントロールを介してアルギン酸塩の生合成をコントロールするための改善された方法が必要である。
本発明は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードするDNA断片クローンに関する。本発明は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードするDNA断片とDNA要素との結合体を含むベクターを包含するが、前記DNA要素とは、タンパク質をコードするDNAクローン由来のマンヌロナンＣ−５エピメラーゼの発現に関するものである。また本発明は、精製タンパク質の供給源および組成の変えられたアルギン酸塩の供給源として、DNAクローン由来のマンヌロナンＣ−５エピメラーゼタンパク質を発現する微生物をも提供する。マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子の発現レベルが変更されているか、あるいはマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子の幾つかまたは全部が不活性化されている菌株もまた、本発明の主題に包含される。さらに、本発明はマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子の発現レベルが変更された微生物を培養することにより、非常に効率化されているかまたは変更された組成を有するか、あるいはその両方であるアルギン酸塩の生産方法を包含する。
本発明は、さらに、グルロン酸の所望のレベルを達成し、そして酵素の単独／ブロックＧ特性を変更するためのエピメラーゼの選択により特徴付けられる。別の態様において、本発明は合成タンパク質の生産およびマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有するそのようなタンパク質をコードするDNAにより特徴付けられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、122kdタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列、および対応するオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を示している。DNAプローブは、122kdタンパク質の配列中の最初の７つのアミノ酸から推測された64の可能な組合せの（それぞれの割合の等しい）混合物として合成した。Ｎはその位置に４つの塩基全てが使用されたことを示している。
図２は、プラスミドpHE14、pHE16、pBD1、pHE18およびpML1内の組み込み挿入断片の制限エンドヌクレアーゼ地図である。底線の数字は分子サイズを塩基対単位（bp.）で表している。矢印はライブラリーのスクリーニングに用いた合成オリゴヌクレオチドと均質な配列の位置および方向を表している。配列決定により見いだされた５つの遺伝子（オープンリーディングフレーム）をボックスにより示し、かつE4、E1、E2、E3およびE5と表した。E1はエピメラーゼＩに対応している。
図３は、E1によりコードされるタンパク質の一部分のマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ（１）活性を、細胞増殖の関数として示している。＊は細胞培養物の光学濃度OD600であり、０は細胞培養物の壊変毎分毎ミリリットルdpm/mlとして表したエピメラーゼ活性である。本実験に用いた菌株はDH5α（pHE5）であり、その抽出物を基質と23時間インキュベートした。
図４は、3H放出の速度論を示している。酵素活性はpHE5を含有する、IPTG誘導されたJM105細胞から調製した抽出物を用いて検定した（表３の説明文参照）。
図５は、異なる遺伝子の間および異なる遺伝子内の相同性を示している。同一の文字を有するボックスは互いに相同である。ボックス長辺のギャップは配置を最適化するために設けられたものである。E1〜E4は図２および６から明らかな如く定義付けられる。
図６は、ヌクレオチド配列、ならびにE4、E1、E2およびE3（部分）に対応するアミノ酸配列を示している。
図７は、E4、E1、E2およびE3からのＡブロックのDNA配列の配置を示している。
図８は、E4、E1、E2およびE3からのＡブロックの推測されたアミノ酸配列の配置を示している。
図９は、E4、E1、E2およびE3からのＲブロックのDNA配列の配置を示している。
図10は、E4、E1、E2およびE3からのＲブロックの推測されたアミノ酸配列の配置を示している。
図11は、A:DH5α（pHE8）（切頭されたエピメラーゼ１）の抽出物またはB:JM109（pBD9）の抽出物により異性体化された、あるいはC:無抽出物により処理されたアルギン酸塩それぞれの1H−NMRスペクトラムを示している。左のピークはＧ−１からの信号を与え、中央のピークはＧＭ−５とＭ−１とからの複合信号を与え、そして右のピークはＧＧ−５からの信号を与えている。
図12は、E2のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示している。
今回、本発明により、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝的配列が見いだされた。従って、本発明の第１の主題はマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性をコードするヌクレオチド配列を包含する、精製単離されたDNAである。
精製マンヌロナンＣ−５エピメラーゼタンパク質のアミノ末端に隣接するアミノ酸配列が決定されている［G.
0003665905.tif 000006
et al.,Carbohydr.Res.103:133−136（1982）］。このデータを用いて、Azotobacter vinelandii DNAの遺伝子ライブラリーのスクリーニングに使用したオリゴヌクレオチドプローブの配列を誘導した。このスクリーニング実験の結果の１つは、第２の遺伝子の意外な発見であった。そしてその後、少なくとも１つの遺伝的ブロックＡを含む遺伝子がさらに３つ発見された。これより、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、全部で少なくとも５つは存在するものと思われる。従って、本発明の第２の目的はマンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする幾つかのDNA配列を提供することである。
Ａ、ＲおよびＳと定められた遺伝的配列の３つの異なるブロックが遺伝子内に見いだされた。これらの遺伝的ブロックは組合せた状態で最もしばしば見いだされるが、その組合せにおいて、Ａは１〜２回、Ｒブロックは０から少なくとも５回、そしとＳブロックは０または１回出現する。
前記異なる遺伝子（１〜５）のそれぞれのブロックのヌクレオチド配列におけるコンセンサスの程度は高い。従って、本発明の第３の目的はマンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードし、かつDNAブロックＡおよび／またはＳおよび／またはＲを含むDNA配列を提供することであるが、その際に、Ａは１回以上、そしてＲが存在する場合にはＲは１回または反復するときには少なくとも５回または６回まで出現していてもよい。
３種類のブロックが全て存在する場合には、その３種類のブロックの連続順序は、Ａ、ＲそしてＳであることが好ましい。しかし、逆の連続順序、例えばＲがＡの前に出現してもマンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする遺伝子を与える。したがって、本発明はさらに、任意の順序および任意の数のブロックＡ、ＲおよびＳを有する遺伝的配列をも包含する。
本発明の別の主題は、組換え宿主細胞内でのマンヌロナンＣ−５エピメラーゼの調製のための前記遺伝的配列の使用に関する。例えば、Escherichia coliまたはBacillus subtilis等の細菌、あるいは酵母の如き宿主内にこの遺伝子を挿入することが特に好ましい。E.coliにおける上記遺伝的配列のクローニングおよび発現は、後記実施例において述べられる。
また、本発明は組換え発現プラスミドをも包含するが、そのプラスミドは宿主微生物内でマンヌロナンＣ−５エピメラーゼを生産することに使用され得る。そのような発現プラスミドは、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードするDNA断片を適当な発現要素、例えば（これらに制限されるものではないが）プロモーター、リボソーム結合部位、翻訳開始点および転写末端等を含むベクター内に挿入することにより作成される。発現プラスミドは、通常使用される種々の宿主微生物内への形質導入のために調節されることができ、その際にマンヌロナンＣ−５エピメラーゼを産生することが望ましいと思われる。
通常使用される宿主内へ外来遺伝子を挿入する技術は、当該分野において公知であり、例えば酵素学手法第185巻［METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.185,Gene Expression Technology,Ed.D.V.Goeddel,Academic Press,Inc.（1990）］に記載されている。さらに、当該分野において公知であり、例えばラモスらの文献［J.L.Ramos et al.,FEBS Letters,Vol.226,2,241−246］に記載されている、宿主範囲の広いベクターおよび適切なプロモーターを選択することにより、種々の異なった宿主内でマンヌロナンＣ−５エピメラーゼの遺伝的配列を挿入および発現することが可能である。
このことは、この活性を有する精製酵素の１つまたは全ての大量生産を可能にすると同時にアルギン酸塩から酵素を分離する際の問題を回避する。
エピメラーゼをコードする遺伝的配列を含む多コピー数ベクターを、生来アルギン酸塩を産生する細菌、例えばAzotobacter vinelandiiに挿入することにより、酵素の増産が可能になるであろう。
生来アルギン酸塩を産生する宿主におけるエピメラーゼの過剰な発現も、酵素の高いレベルの発現を誘導するプロモーターを使用することにより達成される。アルギン酸塩産生をコードする他の遺伝的配列を阻害することで、精製酵素の生産が達成され得る。
本発明の更に別の主題は、生来アルギン酸塩を産生する宿主内でマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子を選択的に不活性化して、Ｇブロック含有率の低いアルギン酸塩あるいは純粋なポリＭアルギン酸塩の細菌による生産を提供することである。これは、生来アルギン酸塩を産生する宿主生物体であるAzotobacter属細菌内のマンヌロナンＣ−５エピメラーゼの１つ、幾つかまたは全てにヌクレオチドを挿入することにより成し遂げられる。選択可能なマーカー遺伝子、好ましくは抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードするDNA断片を挿入することが特に好ましい。選択可能なマーカー遺伝子の挿入は、挿入が成功した細菌の選抜を可能にする。別種の選択可能なマーカー、例えば異なる抗生物質に対する耐性を付与するマーカーを複数選ぶことにより、幾つかまたは全てのマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子内に挿入配列が組み込まれた形質転換体を選抜することができる。従って、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼの１つ、幾つかまたは全てが不活性化された細菌株を選択して生産することが可能である。
全てのエピメラーゼ遺伝子を不活性化する第２の方法は、生来アルギン酸を産生する宿主株であるAzotobacterの細胞を、これらのエピメラーゼ遺伝子から転写されたmRNAと特異的に結合するアンチセンスRNAを発現するベクターを用いて形質転換させることである。細胞の形質転換に使用されるベクターの創製にアンチセンスRNAの発現を誘発するために種々の強さのプロモーターを使用することは、産生されるアルギン酸塩内のＧブロックのＭブロックに対する割合が様々に変化した菌株の生産を可能にする。アンチセンスRNAを誘発するために誘導可能なプロモーターを使用することは、培地条件に応じて変化し得る組成のアルギン酸塩を産生する菌株の創製を可能にする。明らかに、組換え宿主微生物が生来アルギン酸塩を産生する宿主であるAzotobacter属細菌であれば、１つのエピメラーゼ遺伝子の産生を増幅しながら、他のエピメラーゼ遺伝子の発現をその通常のレベルに留めることが可能であるので、ＧブロックのＭブロックに対する割合が変更されたアルギン酸塩を生産する菌株を作成することができる。０〜25％のＭブロックを有するアルギン酸塩を作る菌株が好ましい。
また、上述の如く、エピメラーゼ遺伝子は１つだけを除いて全て不活性化されることができ、そして残ったエピメラーゼ遺伝子は調節されたプロモーターにより制御されることができる。エピメラーゼ遺伝子のそのような相補物（com−pliment）を有する菌株は、それによりＧブロックの高含有率、特には75〜98％を有するアルギン酸塩を生産することができる。高いＧブロック含有率を有するアルギン酸塩を生産するための菌株を作成する別の方法は、アンチセンスRNA遺伝子の転写を調節する誘導プロモーターを用いて、挿入によりマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子をその１つだけを除いて全て不活性化し、そしてアンチセンスRNAにより残った遺伝子を制御することである。高いＧブロック含有率を有するアルギン酸塩を生産する菌株を作成するさらに別の方法は、生来有するエピメラーゼ遺伝子を全て不活性化し、そしてベクターを介して調節されたエピメラーゼ遺伝子を導入することにより行われる。
したがって、本発明は、
（ａ）宿主細胞内で機能するプロモーターおよび翻訳活性化配列、および
（ｂ）少なくともDNAブロックＡおよび／またはDNAブロックＳおよび／またはDNAブロックＲを含み、該プロモーターおよび翻訳活性化配列により発現される位置にある、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードするDNA配列、を包含するベクターにより前記宿主細胞を形質転換させることによる、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を発現し得る組換え宿主細胞の構築方法をも包含する。
本発明はまた、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする遺伝的配列の１つ、幾つかまたは全ての中に外来の遺伝的配列を挿入することにより生来アルギン酸塩を産生する宿主内で酵素をコードするDNA配列を阻害して、純粋なポリＭアルギン酸塩、あるいは低いＧブロック含有率、好ましくは０〜25％のＧ含有率を有する特別なアルギン酸塩を細菌により生産する方法をも包含する。
同様の結果を達成する別の方法は、当業者には容易に気付かれるであろうが、それらも本発明の主題に包含されている。
本発明のさらなる主題は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を有する新規な酵素類である。アミノ酸配列および均質性の程度は図６〜11から明らかであろう。
また、当業者に知られている如く、野生型マンヌロナンＣ−５エピメラーゼと同程度の活性を有するタンパク質をコードする限り、ヌクレオチド配列における変異は本発明に包含される。
また、アミノ酸配列における変異も、生物学的活性を実質的に変えない、欠失、置換および付加を包含することができる。
さらに、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼをコードする合成DNA配列を、当業者に周知の技術により作成することもできる。例えば、イタクラらの文献［Itakura et al.,Science 198:1056（1977）］およびクレアらの文献［Crea et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:5765（1978）］並びに米国特許第4,800,159号明細書、同第4.683,202号明細書および欧州特許出願公開EP−Ａ−0258017号を参照されたい。合成酵素はエピメラーゼ活性を維持しながら、Ａ、ＲおよびＳ要素を異なる組合せで組み込むことにより作成されることができる。得られるアルギン酸塩組成は、酵素の選択により変化させ得る。
材料および一般的方法
細菌株、プラスミドおよびファージ。細菌株、プラスミドおよびファージを表１に列挙して示す。
これらの実験において使用したA. vinelandiiの細菌株は、ノルウエイのトロンハイムにある生物工学研究所海生化学研究室のビヨルン・ラーセン［Bjφrn Larsen,Inst.of Biotechnology,Lab.for Marine Biochemistry,7034 Trondheim−NTH,Norway］またはノルウエイのトロンハイム大学分子生物学研究所のスベイン・バラ［Svein Vall,unigen,Center for Molecular Biology,University of Trondheim,7005 Trondheim,Norway］から自由に入手可能であり、かつジェント大学にある微生物学研究所内のBCCM［the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms at the Laboratorium voor Microbiologie（LMG）at Universiteit Gent（RUG）,K.L.Ledeganckstraat 35,B−9000 Gent］に1993年10月４日付けで、受託番号LMG P−14235として寄託されている。実施例９に記載されているA. vinelandiiの他の株は、次に示すATCC番号、即ちATCC 478、ATCC 12837およびATCC 12518を有している。プラスミド／細菌株DH5α（pHE14）、JM109（pHE16）、JM109（pBD1）、JM109（pHE18）およびSURETM（pML1）は、（前出のLMGと同所の）分子生物学研究所内のBCCMに1993年10月４日付けで寄託されており、それらの寄託番号はLMBP 2932、2933、2934、2935およびLMBP 2936である。
細菌およびファージの生育。A. vinelandiiを窒素を含有しない培地［9.8mM K2HPO4/KH2PO4,0.8mM MgSO47H2O,3.4mM NaCl,0.34mM CaCl2,8.7μM Na2MoO42H2O,54μM FeSO47H2O,1％ソルビトール,pH7.4］中にて、30℃で振盪培養した。E. coliはLB培地［Sambrook J,Fritsch,E.F.and Maniatis T,Molecular cloning,A laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,（1989）］中にて37℃で振盪培養した。細胞がファージの生育に使用されているときには、LB培地に2.5mM CaCl2、10mM MgCl2および0.4％マルトースを補足した。ファージは、Ｌ寒天（２％寒天を補足したLB培地）上のQ359菌株上に蒔いた。0.8％寒天を補足したファージLB培地（力価測定および遺伝子ライブラリーの増幅）または0.8％アガロースを補足したファージLB培地（遺伝子ライブラリーのスクリーニングおよびファージ溶解物の調製）のいずれか一方を覆い寒天（overlaying ager）として使用した。
標準組換えDNA技術。制限エンドヌクレアーゼ分解、T4DNAポリメラーゼの３末端エンドヌクレアーゼ活性を用いた付着DNA端の除去、連結、アガロースゲル電気泳動、および32Pによる末端標識は、標準プロトコル［Sambrook J,Fritsch,E.F.and Maniatis T,Molecular cloning,A laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,（1989）］に従い実施した。形質転換はチャンらの文献［Chung,C.T.,Niemela S.L.and Miller R.H.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,86,2172−2175,（1989）］に記載の如く実施し、そしてDNA配列の決定は、サンガーらの文献［Sanger F.,Nicklen S.,and Coulsom A.R.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,74,4563（1977）］に従って実施した。
粘度計による測定。本実験に用いたアルギン酸塩は、Ascophyllum nodosumから得たものであり、0.1M NaCl中25℃で17.6dl/gの固有粘度を有していた。この粘度はウベローデ粘度計により測定した。
NMR分光法。これらの分析に用いた基質は褐藻類であるAscophyllum nodosumから得た低グルロン酸含量アルギン酸塩であり、既に記載されている方法［Larsen,B.,Proceedings of the Tenth International Seaweed Symposium,Ed:Levring,T.Gothenburg,p7−33,（1980）］により調製した。NMR分析のために、pHE5を含有する、IPTG誘導されたE. coli JM105細胞からエピメラーゼを得た。遠心により250mlの細胞培養物を収穫し、これを20mlの溶液［10mM Tris,0.34mM CaCl2,pH7.0］に再懸濁した。超音波処理後、この溶液を31,000×ｇで１時間遠心分離した。上澄みを約−70℃で凍結保存した。解凍後、上澄みを0.22μｍの孔サイズの膜を通して濾過し、そして酵素をモノQHR515イオン交換カラム（pharmacia製）にてさらに精製した。酵素を０〜1MのNaCl塩勾配（適用溶液と同じ緩衝液中）で溶離して約0.6M NaClの画分2ml中の酵素を収集した。２つの試験管それぞれに0.28mlのこの酵素溶液（0.9mg/ml総タンパク質）、1mlアルギン酸塩（水中7.5mg/ml）、および4.62mlの2,3,6−トリメチルピリジン緩衝液（上記参照）を添加した。次いでCaCl2を6mlの総反応量に添加して、１つの試験管は0.85mM、別の試験管は3.4mMのCaCl2を含むようにした。30℃で20時間インキュベーションした後、Na2EDTA（10mM）を添加してCa2+イオンをキレートさせ、そして次に溶液を蒸留水に対して大規模に透析した。透析したアルギン酸塩溶液を凍結乾燥させた後、D2Oに溶解させた。これらの溶液のNMR分光法は最終的にグラスダレンらの文献［Grasdalen H.,Larsen B.,and Smidsrφd O.,Carbohydr.Res.,68,23−31（1979）］に従い実施した（表４参照）。さらなる分析を、同様の方法にて、DH5α（pHE8）、JM109（pHE16）およびJM109（pBD9）について実施した。表４中の結果は、測定された酵素的活性がマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性であることを決定的に示している。この活性は多くのプラスミドにより発現されており、エピメラーゼ活性を維持するためには全てのエピメラーゼ遺伝子／タンパク質が必要であるというわけではないことを示している。エピメラーゼ活性はCa2+に依存している。
実施例  １
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ（１）の精製、部分アミノ酸配列の決定および混合DNAプローブの合成。酵素は、A. vinelandiiの液体培養物から、本質的にはスカヤック−ブレクとラーセンの文献［
0003665905.tif 000007
G.and Larsen,B.Carbohydrate Research,103,（1982）137−140］の記載の通りに単離した。細胞を遠心分離により除去し、そして酵素を30％硫酸アンモニウムで沈殿させて単離した後、10000rpmで20分間の遠心分離に供した。次いで、上澄みを50％硫酸アンモニウム（最終濃度）を用いて沈殿させて遠心分離にかけた後、得られた沈殿を、0.34mM CaCl2および0.5mMジチオトレイトールを含有する0.05Mイミダゾール/HCl（pH6.8）に溶解させた。次に、この粗抽出液を、同じ緩衝液で平衡させたセファデックスＧ−25（pharmacia製）の予めパッキングされたカラム（PD−10）上で脱塩させた。そして、この抽出液をアルギン酸塩−セファロースカラムに供した。非特異的相互作用により結合したタンパク質は、0.1M NaClにて溶離させた。エピメラーゼは、0.5M NaCl画分の鋭いピークとして溶離した。タンパク質の配列決定に充分な程度に酵素を精製するために、TE緩衝液に対して一晩透析し、凍結乾燥させ、そしてSDS−PAGEゲル電気泳動（25mM Tris中7.5％ポリアクリルアミド、192mMグリシン、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、pH8.3）に引き続いて0.45μｍの孔サイズのポリビニリデンジフルオリド膜（Millipore製）上の電気ブロッティング（ドデシル硫酸ナトリウムを含まない電気泳動緩衝液中）に供してさらに精製した。使用した膜をクーマシブリリアントブルーで染色して風乾し、そして分子量（Mw）122kdのタンパク質を切り出して、アプライドバイオシステムズ社製477A型タンパク質配列決定装置によるＮ末端配列決定に供した。得られたアミノ酸配列情報に基づいてDNAオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドキナーゼにより32Pで末端標識した後で、遺伝子ライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして使用した。
実施例  ２
A. vinelandiiからのDNAの単離および遺伝子ライブラリーの構築。A. vinelandii細胞を収穫し、0.9％NaCl中で１回洗浄した。次いで、ハンセンとオルセンの文献［Hansen,J.B.and Olsen,R.H.,J.Bacteriol.,135,227−238,（1978）］に従い細胞を溶かして壊し、得られた溶菌物をフェノールにて２回、そしてクロロフォルムにて２回抽出した。核酸をエタノールにて沈殿させ、得られたDNAをガラス棒上に収集した後、TE緩衝液（10mM Tris,1mM Na2EDTA,pH7.9）に溶解させた。CsCl/エチジウムブロマイド密度勾配遠心によりさらに精製した。イソプロパノールで抽出してエチジウムブロマイドを除去した後、得られたDNA溶液をTE緩衝液に対して透析した。
得られたDNA（分子サイズ60kb超）を、15〜20kb断片の生成量を最大とする条件下にSau3A Iで部分分解した。エタノール沈殿させた後、DNAを40μｌのTE緩衝液に溶解させて0.5μg/μｌの濃度とした。次に、DNAを子ウシ腸管フォスファターゼにて脱リンし、引き続いて10mMニトリロトリ酢酸の存在下に75℃で10分間インキュベートして酵素を不活性化した。脱リンしたDNAをエタノールで沈殿させ、そして40μｌの0.1×TE緩衝液中に溶解させた。
EMBL3ベクターDNAをBamH I＋EcoR Iにて分解し、引き続き溶液中のBamH I/EcoR Iオリゴヌクレオチドの短い断片を取り除いた条件下におけるイソプロパノール沈殿工程［Frischauf A.,Lehrach H.,Poustka A.and Murray N.,J.Mol.Biol.,170,827−842,（1983）］に供した。次にSau3A Iにて分解し、脱リンさせたA. vinelandii DNA（1.75μｇ）とBamH I/EcoR Iで分解したベクターDNA（4.75μｇ）とを、T4DNAリガーゼを用いて20μｌの総反応量で結合させた。10℃で一晩かけて結合させた後、結合混合物の内の10μｌをプロメガバイオテックパッケージングシステム（Promega Biotech packaging system）中で試験管内パッケージングに供した。試験管内で構築したファージ粒子をE. coliのQ359株に感染させ、固体培地上に蒔いてQ359株上でライブラリーを１サイクル増幅させた。ライブラリーのスクリーニングは標準プロトコル［Sambrook J,Fritsch,E.F.and Maniatis T,Molecular cloning,A laboratory manual,2nd ed.,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,（1989）］に従い実施したが、最も厳密な洗浄は3.2Mテトラメチルアンモニウムクロライドを用いて50℃で実施した。総量で1.4×105個の一次組換えファージが構築され、ライブラリーはA. vinelandii遺伝子の標本を得るのに必要なものよりも遥かに複雑であった。
実施例  ３
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ（１）のエピメラーゼ活性の測定。（５−3H）アルギン酸塩をスカヤック−ブレクとラーセンの文献［
0003665905.tif 000008
G.and Larsen,B.Carbohydrate Res.,103,133−136,（1982）］に記載の通り調製した。（５−3H）アルギン酸塩は、培地［Ｄ−グルコース（20g）、K2HPO4（1g）、MgSO4・7H2O（200mg）、FeSO4・7H2O（50mg）、NaMoO4・2H2O（5mg）、NH4OAc（2.3g）およびCaCl2・2H2O（59mg）を水で希釈して1lとした。］内で増殖中のAzotobacter vinelandiiにより産生された。細胞は30℃で強く振盪しながら増殖させた。30時間後に0.6mg/mlの濃度（比活性0.7μCi/mg）でＤ−［５−3H］グルコースを添加し、細胞をさらに72時間増殖させた。培養物を氷浴中で冷却し、細胞を遠心分離により除去した。上澄み溶液を0.05M EDTAナトリウム（３×５リットル）に対して24時間透析し、引き続き蒸留水に対して大規模に透析させた。次いで、アルギン酸塩ナトリウムを0.2％の塩化ナトリウムの存在下にエタノールで沈殿させた。標識の比活性は29000dpm/mgアルギン酸であった。また、このアルギン酸塩の組成をNMR分光法により分析したところ、59％マンヌロン酸を含有することが判明した。プレート当たり105のファージを蒔いてファージ溶菌物を調製した。2ml2,3,6−トリメチルピリジン緩衝液（50mM、pH6.9）をそれぞれのプレートに添加し、そしてソフトアガロース／緩衝液混合物をそぎ取って掻き回した後、10000rpmで10分間の遠心分離に供した。得られた上澄みを（５−3H）アルギン酸塩とインキュベートしたが、その際に、0.25ml（５−3H）アルギン酸塩（2.5mg/ml）、6.3μl0.1M CaCl2および1.45mlファージ溶菌物とを混合した。この混合物を30℃で一晩インキュベートした後、15μl5M NaClおよび2mlエタノールを添加してアルギン酸塩を沈殿させた。−20℃で30分間のインキュベーションを行い、得られた溶液を10,000rpmで30分間の遠心分離に供した。そして得られた上澄みの1mlを放出3Hの測定に用いた［
0003665905.tif 000009
G.and Larsen,B,Carbohydrate Res.,103,133−136,（1982）］が、測定は液体シンチレーションカウンターを用いて行った。
組換えプラスミドを含有する細胞における放出3Hとしてのエピメラーゼ活性の測定のために、細胞培養物を遠心分離により収穫し、2,3,6−トリメチルピリジン緩衝液中に再懸濁した。1acプロモーターの誘導にIPTG（3mM）を用いた場合には、細胞を指数関数的に増殖させるために誘導物質を添加し、そしてインキュベーションを３時間継続した。細胞を超音波処理して分断し、種々の量の溶菌物を、100μｌ（５−3H）アルギン酸塩（2.5mg/ml）および400μl2,3,6−トリメチルピリジン緩衝液と共に（総量0.6ml）、3.3mM CaCl2の存在下に振盪培養した。使用した酵素含有細胞抽出物の量を調節して、酵素が制限因子となる条件下に測定が実施されるようにした。それぞれの場合において明示される時間に亙って30℃でインキュベーションした後、ファージ溶菌物の調製のために述べた条件下に混合物をエタノールで沈殿させ、上澄みの内の0.1mlをシンチレーションの計測に用いた。対照（pUC18ベクターを有する適当な宿主を用いた）は低いバックグラウンド値を与えた。それらの数字を減算した値を表３に示してある。
実施例  ４
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を発現するDNA断片のE. coli内における分子クローニング。A. vinelandii DNAのSau3A I部分分解物をバクテリオファージλベクターEMBL3内へクローニングすることにより、A. vinelandii遺伝子ライブラリーを構築した。このライブラリー内のエピメラーゼ遺伝子を同定するために、本発明者らは、予め精製された122kdタンパク質はエピメラーゼであろうとの推定［
0003665905.tif 000010
G.and Larsen,B.,Carbohydr. Res.,103,137−149（1982）］に基づきDNAプローブを構築した。最初に、本発明者らは対応するタンパク質溶液をこの122kdタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の測定に使用しようと試みたが、その結果は、本調製物はこの目的のためには充分でないことを明らかにした。そこで、本発明者らはこのタンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後引き続き膜への電気ブロッティングに供してさらに精製した。122kdタンパク質を含有するバンドをこの膜から切り出してＮ末端アミノ酸配列分析に供した。この配列の部分配列に基づき、本発明者らは図１に示す混合DNAプローブを合成した。
実施例１と同様にして合成されたDNAプローブを32Pで標識した後、A. vinelandii遺伝子ライブラリーのスクリーニングに用いた。標識プローブに対して反復してハイブリダイズしたクローンを、ほぼ10-3の頻度で同定し、６種類のそのようなクローンを後続の研究のために選抜した。ファージ溶菌物をそれぞれの６種類のクローンから調製し、そしてそれぞれの溶菌物のエピメラーゼ活性を検定した（表２）。そこに見られるとおり、６種類のクローンすべてから調製された溶菌物はエピメラーゼであることを表し得る弱い酵素活性を含むように思われた。この結論は、ライブラリーから無行為に選ばれた組換えファージから調製された対照溶菌物がバックグラウンド活性であることを表す、これよりも低い活性を反復して与えたという観察により、さらに支持された。
実施例  ５
エピメラーゼをコードするDNA断片のサブクローニング。ファージEP2由来のDNAをSau3A Iで部分分解し、４〜9kbのサイズ範囲である断片を、プラスミドpUC18のBamH I部位にサブクローニングした。組換えプラスミドを含むDH5α形質転換体から得た細胞抽出物のエピメラーゼ活性を検定し、そして同種のプラスミドを遺伝子ライブラリーのスクリーニングに用いた合成オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズさせることも行った。細胞抽出物の分析はそれらの内の１つが酵素活性を含むことを示したが、このことは、エピメラーゼ活性を有するポリペプチドはこのクローン内のプラスミド（pHE1）により発現されたという推定と合致している（表３参照）。また、本発明者らがこの抽出物を30000gで3.5時間の遠心分離に供してみたところ、得られた上澄みにおけるエピメラーゼ活性の有意な減少は観察されなかった。本発明者らは培養培地における有意なエピメラーゼ活性を全く検出できなかったので、本発明者らは、エピメラーゼはE. coli菌体内に配置されているものと推断する。pHE1中の挿入断片もスクリーニングに用いた合成オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズするので、さらなる分析のためにpHE1を選択した。
実施例  ５
エピメラーゼをコードするDNA断片のサブクローニング。ファージEP2由来のDNAをSau3A Iで部分分解し、４〜9kbのサイズ範囲である断片を、プラスミドpUC18のBamH I部位にサブクローニングした。組換えプラスミドを含むDH5α形質転換体から得た細胞抽出物のエピメラーゼ活性を検定し、そして同種のプラスミドを遺伝子ライブラリーのスクリーニングに用いた合成オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズさせることも行った。細胞抽出物の分析はそれらの内の１つが酵素活性を含むことを示したが、このことは、エピメラーゼ活性を有するポリペプチドはこのクローン内のプラスミド（pHE1）により発現されたという推定と合致している（表３参照）。また、本発明者らがこの抽出物を30000gで3.5時間の遠心分離に供してみたところ、得られた上澄みにおけるエピメラーゼ活性の有意な減少は観察されなかった。本発明者らは培養培地における有意なエピメラーゼ活性を全く検出できなかったので、本発明者らは、エピメラーゼはE. coli菌体内に配置されているものと推断する。pHE1中の挿入断片もスクリーニングに用いた合成オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズするので、さらなる分析のためにpHE1を選択した。
実施例  ６
エピメラーゼの発現に必要なクローンDNAの特徴ならびに生体内および試験管内における酵素の安定性。pHE1内の挿入断片はほぼ4kbのサイズであり、図２はこの挿入断片の制限地図を示している。オリジナルの合成オリゴヌクレオチドによるpHE1のハイブリダイゼーション分析は、このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列がSph I部位の下流に配置されていることを示した。DNA配列決定によりこのハイブリダイズする配列をさらに特性付けしたところ、この分析は、この配列のリーディングフレームらしき配列の１つが前記122kdタンパク質のオリジナルのＮ末端アミノ酸配列と100％一致することを示した。しかし驚くべきことに、この配列の方向性はクローン断片を転写しないであろうと思われるものであった。従って、この結果は、観察されたエピメラーゼ活性が122kdタンパク質をコードする配列とは無関係であることを示しており、このことは、対応する細胞抽出物からのエピメラーゼ活性を損なう事なく、末端部の0.5kb Sph I断片を取り除き得る（プラスミドpHE7の作成）という観察によりさらに確認された。このSph I断片の欠失に加えて、本発明者らは挿入断片の反対側の末端部の0.7kb Kpn I断片を（pHE7から）取り除いた。表３に示した通り、（DH5α内の）pHE5は、pHE1から得られる発現レベルの約27倍高いレベルでエピメラーゼ活性を発現した。
上記発現研究の間に、本発明者らは、細胞の収穫時期を可能な限り一定に維持しない限り、測定を定量的に再現することは困難であることに気が付いた。本発明者らは、E. coli細胞の異なる増殖段階において酵素活性を測定することによりこの問題をさらに注意深く分析した。その分析結果を図３に示すが、この結果は、細胞抽出物における酵素活性は細胞が静止期に入った直後に劇的に減少することを示している。従って、最適な酵素収率を得るためには、指数関数的増殖期の終期または静止期の開始期に細胞を収穫することが重要である。エピメラーゼ活性減少の理由は、もしかすると静止期細胞におけるエピメラーゼのタンパク質加水分解によるものであるのかもしれない。試験管内における酵素の安定性を研究するために、本発明者らはDH5α（pHE5）抽出物における3H放出の速度論も分析した。図４から見て取れるように、酵素活性は少なくとも30時間に亙って直線的であるが、これは酵素が試験管内において非常に安定であることを明示している。従って、再現性のある結果を得るために決定的な因子は細胞の収穫時期である。
実施例  ７
1acプロモーターの誘導によるエピメラーゼ活性の促進。上記の結果は、pHE5由来のエピメラーゼの発現レベルはpHE1における発現レベルよりも充分に高いことを示している。1acプロモーターがエピメラーゼ発現にとって重要であることがその理由である可能性があるので、本発明者らはこの問題をより詳細に分析した。この分析はE. coliのJM105株を用いて行ったが、このJM105株は1ac抑制因子を高レベルで発現することにより非誘導条件下で1acプロモーターをより抑制された状態にする。JM105（pHE1）の非誘導細胞および（IPTGによる）誘導細胞から細胞抽出物を調製したときに、酵素活性の充分な促進は誘導細胞において観察された（表３）。JM105（pHE5）を用いた同様の実験は、この実験におけるIPTGの添加によるエピメラーゼ発現のより大幅な促進を示した。これらの実験により、1acプロモーターが、pHE5由来のエピメラーゼの発現のための、これが唯一ではないであろうが、鍵となる要素であるだろうことが示された。また、これらの実験は転写の方向が挿入断片内のKpn I部位からSph I部位に向かうものであることを示した。従ってエピメラーゼ遺伝子は、クローンDNAの単離のためにそのＮ末端アミノ酸配列が用いられた122kdタンパク質をコードする遺伝子と同じ向きに転写される。
挿入断片のSph I側からさらにDNAを取り除く予備実験は、エピメラーゼ活性を損なわずに取り除き得る部分が殆どないことを示した。これに反し、本発明者らは、Kpn I側においては充分にDNAを取り除き得ることを見いだした。表３は、pHE5から0.8kbKpn I/Sac II断片を取り除いて構築されたプラスミド（pHE8）によるエピメラーゼ発現の分析結果を示している。そこに見られるとおり、この取り除きは、非誘導細胞および誘導細胞の両方においてエピメラーゼ活性を非常に強く促進する結果を齎した。pHE8による発現はベクター内のシャイン−ダルガノ配列（1acプロモーターとポリリンカーの間に配置されている）からの翻訳の開始に多分基づいている。同様にして、やはりシャイン−ダルガノ配列を有するフレーム内に存在するコード配列に起因する高レベルの発現が、pHE22から得られている。現時点では、本発明者らは、Sac II部位を越える範囲まで取り除いた建築物においてはエピメラーゼの発現を得ていない。
実施例  ８
1acプロモーターと異なるプロモーターの使用。pHE5内の（EcoR I−Hind III）挿入断片をプラスミドpT7−３（タバーとリチャードソンの文献［Tabor,S.,and C.C.Richardson）（1985）.Proc.Natl.Acad.Sci.82,1074−1078］に記載されたpT7−１の誘導物）にサブクローニングし、得られた新規プラスミドをpLB1と命名した。pLB1内の挿入断片をベクター内のφ10プロモーターの下流に配置した。このプロモーターはバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼによってのみ認識されるので、このプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現は細胞内におけるこのポリメラーゼ活性の発現に依存することとなる。442bp（図２参照）のSac I−Spo I断片をpLB1内の挿入断片より最終的に取り除くことにより、プラスミドpLB2を作成した。pLB2をE. coli K38（pGP1−２）内へ形質転換させた。プラスミドpGP1−２はT7 RNAポリメラーゼ遺伝子をコードしており、この遺伝子の発現は温度誘導性抑制因子により制御されている。K38（pLB1,pGP1−２）を30℃で4.5時間指数関数的に増殖させた。次に、平行して行った２つの細胞培養の１つを42℃に30分間移してT7−ポリメラーゼを誘導した。平行して行った細胞培養のもう一方は、30℃で５時間増殖させた。細胞におけるエピメラーゼ活性を実施例３に記載の方法にて測定した。その測定結果を表３に示す。
実施例  ９
マンヌロナンＣ−５エピメラーゼ（２）のクローニング。組換えバクテリオファージラムダの誘導物であるEP2からの6.2kb Xho I断片をpUC128内へ挿入してプラスミドpHE12を構築した。図２に見られるとおり、pHE12内の挿入断片はpHE1内の挿入断片と部分的にオーバーラップしている。pHE12を含む細胞から調製された抽出物の分析（pHE1に関して記載したと同様の分析）は、細胞がマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ活性を発現したことを示した（表３）。さらなる分析は、マンヌロナンＣ−５エピメラーゼの発現に影響を与えることなく、pHE12内の挿入断片から2.5kb Spo I−Xho I断片を取り除き得ることを示した。さらにプラスミドを構築し（図２参照）、そしてその活性を分析した（表３参照）。この実験は、実験した遺伝子および遺伝子断片の双方がエピメラーゼ活性を発現し得たことを示している。この挿入断片のヌクレオチド配列をサンガー法［Sanger,F.,S.Nicklen,and A.R.Coulson.1977.Proc.Natl.Acad.Sci.74,5436］により決定した。そのヌクレオチド配列を図６に示す。
実施例  10
配列の比較。図２に示す如く、５つの遺伝子を同定した。E5を含む挿入断片は他の遺伝子から約５〜10キロ塩基離れて位置している。図６は、E4、E1、E2の完全な遺伝子ならびにE3の大部分を含むヌクレオチド配列を示している。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列の詳細な分析はそれぞれの遺伝子内および種々の遺伝子間において高度に均質な領域を明らかにした。図５は、均質なブロックを参照することにより、遺伝子をそれぞれを特徴付けている。遺伝子はそれぞれ少なくとも１つのＡ要素および少なくとも１つのＲ要素を有している。
E1、E2およびE4は全て、Ｓ要素（図５に図示していない）と呼ばれるかなり均質な配列をその端部に付けている。E1とE2のＳ要素の最後の14アミノ酸は１つの例外を除き同一である。図７〜10は、コンセンサス配列（con.）を参照することにより、それぞれの遺伝子内のＡ要素およびＲ要素の詳細な分析を示している。それぞれのＡ要素はほぼ1,150塩基対の長さであり、それぞれのＲ要素はほぼ450塩基対の長さである。短いオリゴヌクレオチドが、E1、E2およびE3中、第2R要素と第3R要素の間に存在する。ギャップを、配置を最適化する必要のあるところに導入した（特にE2の第3R要素を参照されたい）。
Ａ要素の最上流部分から作成されたプローブによる、制限エンドヌクレアーゼBal IIにより分解されたA. vinelandii DNAのサザーンブロット産物へのハイブリダイゼーションは、５つの明瞭なバンドを与えた。これらのバンドの１つは２つのＡブロックを含み、そしてこれらのバンドの別の１つは同一サイズを有する、Ａ要素とは異なる断片を２つ含んでいた。同種に属する他の株（ATCC 478、ATCC 12837およびATCC 12518）を用いたときのバンドの数は同じであった。このことは、これらの細菌が少なくとも５コピー数のＡ要素を含むこと、およびこれは幾つかの独立に単離されたA. vinelandii菌株に共通していることを意味している。
それぞれのＲ要素の最上流部分は、コンセンサス配列LXGGAGXDXを有する９ペプチドの完全な反復を６反復と１つの不完全な反復を含有しているが、例外的に、E2の第3R要素はこれらの反復を２反復欠いている。第12図は、E2の完全なヌクレオチド配列とそれに対応するアミノ酸配列を示している。前記９ペプチドの内でコンセンサス配列と良く合致するものを２重線でマークし、そして良く合致する程度の低いものを１本線でマークしてある。この９ペプチドの繰り返し（nonapeptide motif）は溶血素に属する分泌タンパク質の特徴である［Suh,Y.and Benedik,M.J.,J.Bacteriol 174,（1992）2361−2366］。これらのタンパク質は全てカルシウム依存性であり、Ｎ末端シグナルペプチドの切断を含まない経路により分泌される。E. coliから分泌される溶血素に関して、前記９量体がカルシウムイオンの結合に関与するとの仮説が提案されている［Ludwing,A.et al.,Mol.Gen.Genet.214,（1988）553−561;Boehm,D.F.et al.,Infect.Immun.58（1990）1959−1964］。Ｒ要素はカルシウムイオン結合に関与し、カルシウムは酵素活性とゲル形成の双方に必要であるように思われる。
実施例  11
改変エピメラーゼの作成。
表３に見られるとおり、エピメラーゼ活性を有するタンパク質の発現を維持しながら種々の要素を遺伝子から取り除くことができる。明らかに、配列ARSを有するE1の下流部分はエピメラーゼ活性を有している（プラスミドpHE8参照）が、E1のA2を取り除くことは許されない（実施例７参照）。さらに、配列ARRRRSを有するE2もエピメラーゼ活性を示す。また、カルボキシ末端を欠き、かつ配列ARRRおよびARRRARRを有するE3の断片も、エピメラーゼ活性を発現する。（プラスミドpH18およびpBD6参照）。従って、Ｓ要素はエピメラーゼ活性にとって必要不可欠なものではないものの、この要素の存在は活性に影響を与えるように思われる。そこで本発明者らは、エピメラーゼは少なくとも１つのＡ要素およびＲ要素を必要としている可能性があり、これらの要素を異なる方法で組み合わせることにより改変エピメラーゼを作成し得るにちがいないとの仮定を立てた。このことを示すために、本発明者らは配列RARSを有するエピメラーゼをコードするプラスミドを構築した。
pHe1内の挿入断片（EcoR I−Hind III）をプラスミドpTrc99A（pharmacia製）内にサブクローニングしてプラスミドpHE21を作成した。このプラスミドはエピメラーゼＩ遺伝子の直前部分のtrcプロモーター、この遺伝子の下流部分の強力な転写終了シグナル、そしてIPTGにより誘導されるlac Iq遺伝子を含む。pHE21をKpn IおよびSpo Iにて分解し、S1ヌクレアーゼで鈍端を作って再結合した。得られたプラスミドであるpHE22はエピメラーゼ１のカルボキシ末端配列である配列RARSを有するタンパク質を発現する。そのエピメラーゼ活性を実施例３と同様にして測定して表３に示す。
エピメラーゼ活性は多くの構築物により発現されるので、異なる数のＡ、ＲおよびＳブロックを含む、エピメラーゼ活性を有する多くの合成酵素が生産され得るように思える。pHE22における活性の存在は、アミノ末端のＡブロックは必要不可欠なものではなく、従ってブロックの順序もまた変更し得るものであることを示唆している。
実施例  12
プラスミドpHE8およびpBD9からの抽出物により異性体化さたアルギン酸塩の1H−NMRスペクトラムは、これらのプラスミドによりコードされるタンパク質が異なる酵素活性を有していること、即ち、pHE8は単独Ｇ活性を有するエピメラーゼを生産するのに対し、pBD9はＧブロック活性を有するエピメラーゼを生産することを示している。pHE8はE1のカルボキシ末端配列ARSをコードし、そしてpBD9はE2の配列ARRRRSをコードしている。従って、生来的にコードされているエピメラーゼは、特にＧの分布パターンにおいて、異なる活性を有し得る。５つの遺伝子によりコードされている種々のエピメラーゼの異なる活性を用いて、１つまたはそれ以上の所望の遺伝子を選択的に発現させることにより、所望の構造を有するアルギン酸塩を創製することができる。また、それぞれのエピメラーゼのＡ、ＲおよびＳブロック含有率を変化させた合成酵素を構築して、所望のアルギン酸塩の生産をより高いレベルでコントロールすることを可能にする、変更された活性を有する酵素を提供することが可能であろう。
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EPxはA. vinelandii遺伝子ライブラリーから無行為に取得したプラークとして得られたものであり、他の６種類のファージは、それらのDNAとライブラリーのスクリーニングに用いた標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づき選抜したものである。
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抽出物をアルギン酸塩と共に16時間インキュベートした。数字は、壊変毎分（dpm）で表されている。ndは未測定を意味する。
＊培養物はIPTG誘導されず、温度を30℃から42℃に上昇させることにより誘導された。
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配列表
配列リスト番号:1
配列番号:1
配列の型：ヌクレオチドおよび対応するタンパク質
配列の長さ:12411塩基対
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線鎖状
配列の種類:Genomic DNA
起源生物：Azotobacter vinelandii E株
配列の特徴：
290〜 1951bpエピメラーゼ４
2227〜 6438bpエピメラーゼ１
6702〜 9695bpエピメラーゼ２
9973〜12411bpエピメラーゼ３の上流部分
他の情報：Azotobacter vinelandiiマンヌロナンＣ−５エピメラーゼ遺伝子群
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配列リスト番号:2
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配列リスト番号:3
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配列リスト番号:4
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配列リスト番号:5
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配列リスト番号:6
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配列リスト番号:7
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図１１】
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