(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出しようとする細菌を宿主とする、標識されたファージを被検体に添加し、該被検体中に存在し得る細菌と該標識されたファージが吸着し、細菌−標識ファージ複合体が生成した段階で、該細菌−標識ファージ複合体の標識に由来する信号について測定を行うことを包含する細菌の検出方法であって、該標識に由来する信号が、該ファージ自体に取り込まれた3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ及び35Ｓからなる群から選択される少なくとも１種の放射性同位体が発する放射線であるか、又は該標識されたファージにリンカーを介して結合された酵素と該酵素に対する基質との反応により生じる発光若しくは発色であることを特徴とする細菌の検出方法。
【請求項２】
該細菌−標識ファージ複合体の標識に由来する信号が、該ファージの外被蛋白質に取り込まれた35Ｓのみである請求項１に記載の細菌の検出方法。
【請求項３】
該細菌−標識ファージ複合体の標識に由来する信号が、該細菌−標識ファージ複合体にリンカーを介して結合された酵素と該酵素に対して特異的な物質との反応により生じる発光若しくは発色であって、該細菌−標識ファージ複合体にリンカーを介して結合された酵素において、（Ａ）該細菌−標識ファージ複合体、（Ｂ）該リンカー及び（Ｃ）該酵素の組み合わせが、（Ａ−１）該細菌と該ファージとビオチン若しくはその誘導体との複合体、（Ｂ−１）アビジン若しくはその誘導体、及び（Ｃ−１）アルカリホスファターゼ若しくはパーオキシダーゼから選択されるか、又は（Ａ−２）該細菌と該ファージとの複合体、（Ｂ−２）該ファージに対する抗体、及び（Ｃ−２）アルカリホスファターゼ若しくはパーオキシダーゼから選択される請求項１に記載の細菌の検出方法。
【請求項４】
該（Ａ）該細菌−標識ファージ複合体、（Ｂ）該リンカー、及び（Ｃ）該酵素の組み合わせが、（ａ）該細菌と該ファージとフォトビオチンとの複合体、（ｂ）アビジン、及び（ｃ）アルカリホスファターゼであり、該酵素に対する基質が蛍光色素ＡＭＰＰＤである請求項３に記載の細菌の検出方法。
【請求項５】
検出しようとする細菌を含有し得る被検体を貯留するための被検体貯留部と、
標識されたファージを貯留するための標識ファージ貯留部と、
該被検体中の細菌と該標識されたファージとを接触させ、請求項１に記載される細菌−標識ファージ複合体を形成させるための被検体処理部であって、該被検体貯留部及び該標識ファージ貯留部とそれぞれ導管により連結された被検体処理部と、
該細菌−標識ファージ複合体の標識に由来する信号を検出するための検出器であって、放射線測定器及び化学発光測定器からなる群から選択される検出器と、
該検出器からの信号を処理するデータ処理部と、
を具備することを特徴とする細菌の検出装置。
【請求項６】
液体シンチレーターを貯留するための液体シンチレーター貯留部を更に有し、該検出器が放射線測定器である請求項５に記載の検出装置。
【請求項７】
該細菌−標識ファージ複合体に結合し得る、リンカーと酵素との複合体を貯留するためのリンカー−酵素複合体貯留部を更に有し、該リンカー−酵素複合体貯留部が、該被検体処理部と導管により連結され、かつ該検出器が、光電子倍増管を用いる化学発光測定器である請求項５に記載の細菌の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、細菌の検出方法及びこの検出方法を用いる細菌の検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌は広く自然界に分布し、物質循環や発酵など我々の生活に不可欠な役割を果たすものも多く存在するが、動植物の病原や食品の腐敗の原因としてなど、我々の生活に悪影響を及ぼすものもまた数多く存在する。後者の我々の生活に悪影響を及ぼす細菌については、その被害を最小限に止めるために、これらの原因となる特定の細菌を早期に検出して対処しなければならない。
【０００３】
近年、生化学、特に分子生物学の発展に伴い、免疫学的手法や分子遺伝学的手法を用いた細菌の検出方法が報告されている。そのような検出法の例として、ファージ増殖法、ＥＬＩＳＡ法、レポーター遺伝子を用いる方法などを挙げることができる。
【０００４】
ファージ増殖法は、一定の力価のファージを、例えば水田水などの試料に添加し、試料のファージ力価を測定することにより植物病原細菌等の対象細菌の検出を行なう方法である。ファージは細菌に感染するウイルスであり、ＤＮＡもしくはＲＮＡからなる核酸がタンパク質からなる構造物で被覆された形態をとる。ファージ力価とは、通常、このファージ粒子の試料中の総数である。この方法の場合には、ファージ力価の上昇が対象細菌の存在を示す。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ法は、細菌に対する抗体を予め酵素標識しておき、力価測定用プレートに細菌を固定した後、前記抗体を添加し、さらに標識に用いた酵素の基質を加えて、発色、蛍光等を測定する方法である。固定した細菌の中に目的の細菌が存在する場合には、発色もしくは蛍光が生じる。
【０００６】
レポーター遺伝子とは、測定対象である生物には存在しない外来の遺伝子で、広義のマーカー遺伝子である。ただし、形質転換体の選抜に用いられる選択マーカー遺伝子とは異なり、ある遺伝子の発現を定量的または組織化学的に測定する目的で用いられる遺伝子を指す。レポーター遺伝子を用いる細菌の検出方法では、レポーター遺伝子を細菌の染色体またはプラスミドに組込み、その活性を測定する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ファージ増殖法は、ファージ添加後の試料のファージ力価を測定するために、試料を予め培養した感受性細菌と混合して一日程度培養し、形成された溶菌斑（プラーク）数を計測しなければならない。このため、結果を得るまでに時間がかかる。また、測定には繁雑な操作を必要とし、測定者は操作に熟練しなければならない。さらに、例えファージが細菌に吸着して細菌内への核酸の注入が行なわれたとしても感染が成立しないことがあり、その場合には検出を行なうことができない。
【０００８】
また、ＥＬＩＳＡ法では、細菌を固定した後何回か洗浄工程を繰り返す必要があるが、その際、細菌が容易に洗い流されてしまう。このため、再現性に乏しく、誤った結果を生じやすい。また、この方法では目的とする細菌に特異的に結合する抗体を用いるが、そのような抗体を用意するには大変な時間と労力が必要である。さらに、特異抗体は死菌にも反応するので、生菌だけではなく死菌をも検出してしまう。
【０００９】
レポーター遺伝子を用いる方法は、上述のようにレポーター遺伝子を細菌の染色体またはプラスミドに組込み、その活性を測定する。このレポーター遺伝子の組込みには繁雑な処理を必要とする。また、レポーター遺伝子を組み入れた細菌のモニターには適しているものの、自然界における同じ細菌の検出に用いることはできない。また、レポーター遺伝子を染色体に組込んだ場合には、コピー数が少なく、レポーター遺伝子の発現が充分ではない。さらに、試料によっては雑菌がレポーター遺伝子と同一の遺伝子を有していることがあり、この遺伝子に由来して活性が出現することがある。
【００１０】
上記検出法を含めて、従来の細菌検出方法はそれぞれ優れた特徴を有しており、その特徴を生かした研究等に用いるには好適なものも多い。しかしながら、細菌による病気の診断、環境調査の一環としての微生物検査、食品中に混入した微生物の検査等、大量の試料を短期間で処理する検査方法に用いることができる方法は限られており、それらの方法も検出限度（検出可能な最小限の細菌数）、精度（目的の細菌に対する特異性）共に不十分である。このため、より少数の細菌をも検出することが可能な高い感度を有し、かつ目的とする細菌を特異的に検出することが可能な高い精度を有する検出法が求められている。
【００１１】
したがって、この発明は、大量の試料を短期間で処理することが可能であり、感度及び精度に優れた簡便な細菌の検出方法を提供することを目的とする。
また、この発明は、上記検出方法を利用し、大量の試料を短期間で処理することが可能で、感度及び精度に優れた細菌の検出装置を提供することをも目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この発明による細菌の検出方法は、検出しようとする細菌を宿主とする、標識されたファージを被検体に添加し、該標識に由来する信号について測定を行なうことを特徴とする。
【００１３】
前述のように、ファージは細菌に感染するウイルスであるが、その宿主範囲は非常に狭く、特定の細菌にしか感染することができない。したがって、この発明による検出方法において用いられるファージは検出しようとする細菌に依存し、細菌に合わせて適宜選択される。具体的な例として、大腸菌にはラムダファージ、Ｔファージ及びＭ１３ファージを、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃｉｔｒｉ）にはＣＰ１  及びＣＰ２  を、枯草菌にはφ１０５  及びφＥ１  を、サルモネラ菌等にはＰ２２を、赤痢菌等にはＰ２  を、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  にはＣＤβ及びＤＥβを、ジフテリア菌にはβｔｏｘｔを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓには４２Ｄを、緑膿菌にはＤ３  を、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｅｔｕｓ  にはＶＦＰ−１３  をそれぞれ用いることができる。
【００１４】
ファージの標識は、ファージ自体を放射性同位元素（ＲＩ）や酵素標識法によって直接標識するか、もしくはファージ自身が有する核酸（以下、ファージ核酸と称することがある）にレポーター遺伝子を組込むことにより行なうことができる。直接標識によってなされた標識は直接測定することが可能であるが、レポーター遺伝子を組込んだ場合にはレポーター遺伝子が発現し、それがコ−ドする蛋白質の産生を検出することにより間接的に測定することができる。
【００１５】
ファージ自体を直接標識するための放射性同位元素としては、例えば、  ３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ及び３５Ｓを挙げることができる。ファージを放射性同位元素で標識するには、放射性同位元素を含むヌクレオチドをファージ核酸に取込ませるか、放射性同位元素を含むアミノ酸でファージ外被蛋白質を形成させればよい。
【００１６】
酵素標識法では、例えば、ファージをフォトビオチンで標識し、次いで酵素標識アビジン（又はストレプトアビジン）を加えてアビジン（又はストレプトアビジン）−ビオチン複合体を形成させ、それによりファージ表面に酵素を固定する。酵素の固定には、アビジン−ビオチン以外にも、抗原−抗体反応などを用いることができる。また、ここで用いられる酵素は、通常この分野において用いられる酵素であればいかなるものでもよく、例えば、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼを挙げることができる。
【００１７】
さらに、ファージ核酸に組込むレポーター遺伝子としては、例えば、オパイン合成酵素遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ＮＴＰＩＩ遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、並びにホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）及び海洋性発光細菌  Ｖｉｂｒｉｏ  ルシフェラーゼ（Ｌｕｘ）のようなルシフェラーゼ遺伝子を挙げることができる。これらのレポータ−遺伝子は、トランスポゾンを用いたり、通常のクローニングによって、ファージのプロモーターの支配を受けるようにファージ核酸に組込まれる。
【００１８】
このように標識されたファージを被検体に添加し、被検体中に含まれる細菌に感染させる。被検体中に検出しようとする細菌が存在する場合には、ファ−ジは細菌に吸着し、ファージ自身の核酸を細菌に注入する。細菌に注入された核酸は、自らの遺伝子が産生する酵素によって複製され、短時間のうちに数百倍に増幅する。その後、複製されたそれぞれの核酸がファージ自身の外被蛋白質を産生し、この蛋白質が各々のファージ核酸を被覆して多数のファージ粒子を形成する。これら一連の過程は常法により行なうことができる。
【００１９】
標識したファージを被検体に添加した後、被検体中の細菌と細菌に吸着せずに残存するファージとをフィルター等の適当な手段で分離し、分離した細菌から標識に由来する信号の検出を行なう。被検体中に目的とする細菌が含まれている場合には、分離した細菌からファージの標識に由来する信号が検出される。
【００２０】
検出する信号及びその検出方法は用いた標識の種類によって異なる。例えば、放射性同位体で標識した場合には、放射性同位体が発する特有の放射線をシンチレーションカウンターなどで測定すればよい。また、酵素で標識した場合には、標識した酵素の基質を添加し、特有の発色、発光等を比色計や光度計で測定すればよい。なお、ファージを直接標識した場合には、通常、ファージが細菌に吸着した段階で測定を行なう。
【００２１】
ファージ核酸にレポーター遺伝子を組込んだ場合には、ファージを細菌に感染させ、レポーター遺伝子を含むファージ核酸の複製、転写及び翻訳を活発に行なわせた後、レポーター遺伝子の活性を測定する。ファージの感染から測定までに要する時間は、検出可能な程度までファージが増幅すればよく、特に限定されるものではないが、通常  １時間程度である。レポーター遺伝子の活性は、レポーター遺伝子が発現し、その遺伝子がコ−ドする蛋白質が産生されることをもって判定する。産生される蛋白質が上述のように酵素である場合には、それぞれの酵素の検出に通常用いられる方法で検出を行なえばよい。
【００２２】
この発明による細菌の検出方法は、食品、医療、工業など様々な分野における特定細菌の検出・同定に広く適用することができ、例えば、下水、海水、工場廃棄水など各環境における細菌のアセスメント、ジュース、ビール等の食品中の細菌混入の検査、人間及び動物における特定病原細菌感染の迅速な診断、植物防疫の観点からの特定植物病原細菌の早期検出などに好適に用いることができる。
【００２３】
次に、上記検出方法を利用する、この発明のよる細菌の検出装置について以下に説明する。
この発明による細菌の検出装置は、図１に概略構成を示すように、被検体中の細菌に標識したファージを感染させる被検体処理部  １と、このファージの標識に由来する信号を検出する検出器  ２と、この検出器  ２からの信号を処理するデータ処理部  ３とを具備することを特徴とする。
【００２４】
被検体処理部  １では、被検体中の細菌に標識ファージを感染させるための処理が行なわれる。ここで用いられる標識ファージ及び感染処理は上記検出方法において詳細に説明した通りである。標識ファージは、被検体を被検体処理部  １に収容する前に予め添加してもよく、また被検体を被検体処理部  １に収容した後に添加することができるように被検体処理部  １に適当なファージ液注入手段を設けてもよい。
【００２５】
被検体の細菌に標識ファージ液を感染させた後、検出器  ２で標識の検出を行なう。検出器  ２は標識に由来する信号を検出するものであり、信号の種類により適宜選択され、例えば、光電子増倍管のような光電変換素子等を用いる化学発光測定器、ＲＩ検出器などを用いることができる。この検出器  ２は、被検体処理部  １と一体に設けられていてもよく、あるいは被検体処理部  １とは独立に設けられ、測定時に被検体処理部  １内の所定の位置に移動する形式でもよい。さらには、被検体処理部  １と検出器  ２とがラインを形成し、被検体処理部  １において処理された被検体を検出器  ２内に搬送する形式でもよい。
【００２６】
検出器  ２における測定結果は、通常電気信号としてデータ処理部  ３に送られて電気的に処理される。データ処理部  ３において処理されたデータは、表示装置、記録装置等に出力される。
【００２７】
この発明による細菌の検出装置の具体的な例として、光電子増倍管を用いる化学発光測定器を具備する装置の概略を図２に示す。すなわち、図２に示す装置は、上記細菌の検出方法のうち、化学発光を生じる物質をファージの標識として用いる方法に適用することができる。
【００２８】
この装置は、円形底板の周縁に側板を設けた形状の容器底部材１２と、円筒形状の容器枠部材１３とからなる収容容器１１を有している。容器底部材１２の側板の内壁及び容器枠部材１３の一方の端部近傍外壁にはそれぞれねじ山が設けられて互いに螺合可能となっており、螺合することにより一体に収容容器１１を形成する。容器枠部材１３の下端には、ゴム、プラスチック等からなる封止部材１４が設けられ、一体に形成された収容容器１１内の液密性を確保している。容器底部材１２及び容器枠部材１３は通常金属製であるが、プラスチック等弾性を有する材料からなるものでもよく、その場合には封止部材１４は設けなくともよい。
【００２９】
容器底部材１２の底板には、収容容器１１内部の液の貯留及び廃液を自在に行なうための弁１５が設けられている。また、容器底部材１２には収容容器１１を加熱するための図示しない加熱手段が設けられており、温度制御装置３３により温度調節がなされている。さらに、容器枠部材１３の内壁にはフィルター１６を係止するための突出部１７が設けられており、突出部１７に係止されたフィルター１６は上方から固定部材１８で固定される。
【００３０】
収容容器１１の開口部上方には２本の液導入管２３及び２４が位置している。これらの導入管２３及び２４は、それぞれ被検体貯留槽２０及び標識ファージ液貯留槽２４に接続し、それぞれ被検体及び標識ファージ液を収容容器１１内部に導入する。なお、図中には２つの貯留槽とそれに接続する導入管のみを示したが、例えば洗浄水など、必要に応じてさらに貯留槽を設けることができる。
【００３１】
液導入管２３及び２４のさらに上方には光電子増倍管２５が設けられており、この光電子増倍管２５と収容容器１１の間には、光フィルター２６と光電子増倍管２５を保護するための光シャッター２７が設けられている。光電子増倍管２５は、雑音を低減するための冷却部材２８で周囲を覆われ、さらに、プリアンプ２９および振幅弁別アンプ３０を介して主制御装置３１に接続されている。
【００３２】
主制御装置３１には、光電子増倍管２５の他に、光シャッター２７を制御する光シャッター制御装置３２および収容容器１１の加熱手段が接続され、これらの制御及び／またはデータ処理が行なわれる。主制御装置３１において処理されたデータは、表示装置３４やプリンター３５に出力され、表示や記録がなされる。
【００３３】
この装置を用いる細菌の検出は、以下のように行なわれる。
まず、測定の前段階として、被検体を被検体貯留槽２０に、また標識ファージ液を標識ファージ液貯留槽２１にそれぞれ注入する。ここで用いられるファージの標識は化学発光や蛍光を生じるものであり、以下、酵素標識法に基づいてフォトビオチンを標識したファージを例にとって説明する。これとは別に、容器枠部材１３にフィルターを固定し、容器底部材１２に螺合して収容容器１１を形成し、装置内の所定の位置に装着する。
【００３４】
準備が整った後、まず、収容容器１１の底部に設けられた弁１５を解放し、続いて被検体貯留槽２０から導入管２３を介して収容容器１１内に被検体を注入する。注入された被検体は、フィルター１６によって細菌を含む固形物と可溶成分とに分離され、可溶成分を含む濾液はフィルター１６を通過して弁１５から収容容器外に排出される。次に、標識ファージ液貯留槽２１から導入管２４を介して標識ファージ液を収容容器１１内に注入し、フィルター上に残留する細菌に接触させる。これにより、フィルター上に目的の細菌が存在する場合には、細菌にファージが感染する。その後、図示しない導入系より洗浄水を収容容器内に導入してフィルターを洗浄し、同様に図示しない導入系よりアルカリホスファターゼ標識アビジンの溶液を導入してアルカリホスファターゼを細菌に固定する。さらに洗浄して未反応のアビジンを除去した後、図示しない導入系より蛍光色素であるＡＭＰＰＤを導入する。
【００３５】
ＡＭＰＰＤを添加した後、アルカリホスファターゼとＡＭＰＰＤとの反応により生じる蛍光を、光シャッター２７を制御装置３２で制御しつつ、光電子増倍管２５で測定する。
【００３６】
光電子増倍管２５によって測定された結果は電気信号として主制御装置３１に送られ、光シャッター制御装置３２及び収容容器１１の加熱手段からの情報と合わせて処理され、表示装置３４やプリンター３５に出力される。
【００３７】
以上、光電子増倍管を用いる化学発光測定器を具備する装置について説明したが、上述の装置は、光電子増倍管を、例えば放射線測定器に代えることにより、ＲＩを標識として用いる上記細菌の検出方法に適用することができる。その場合には、収容容器１１のフィルター１６上に細菌を濾別して洗浄した後、弁１５を閉鎖し、シンチレーションカクテルを収容容器内に注入して計測を行なう。
【００３８】
図２に示す装置においては、測定期間中、収容容器１１は光電子増倍管２５の直下に固定されているが、収容容器１１を移動ステージ上に装着し、例えばＡＭＰＰＤの添加までを各貯留槽の直下で行ない、測定時には光電子増倍管２５の直下に移動させて測定を行なう構成とすることもできる。
【００３９】
【作用】
細菌に感染するウイルスであるファージは、宿主範囲が非常に狭く、特定の細菌にしか感染することができない。すなわち、細菌に対して特異性を有している。このため、被検体中にファージが宿主とする細菌が存在する場合にはファージはその細菌に感染し、宿主とする細菌が存在しない場合には他の細菌に感染することなく被検体中に浮遊する。したがって、ファージの感染を利用することにより、目的の細菌を高い精度で検出することが可能となる。
【００４０】
また、ファージは宿主とする細菌に遭遇すると、まず細菌に吸着し、ファージ自身の核酸を細胞に注入する。細菌に注入された核酸は、自らの遺伝子が産生する酵素によって複製され、短時間のうちに数百倍に増幅する。その後、複製されたそれぞれの核酸がファージ自身の外被蛋白質を産生し、この蛋白質が各々のファージ核酸を被覆して多数のファージ粒子を形成する。したがって、たとえ被検体中の細菌数が少なくとも、測定は数百倍に増幅したファージに対して行なうため容易であり、検出の感度を大幅に高めることが可能となる。
【００４１】
【実施例】
以下に記載する実施例１〜７のうち、実施例３、及び実施例５〜７において実施例３と同様の方法で実施したものは、参考例である。
［実施例１］
非ＲＩ直接標識法により標識したλファージを用いて大腸菌の検出を行った。
【００４２】
まず、λファージを超遠心密度勾配法によって純化した後、フォトビオチンで標識した。次いで、この標識λファージ液を、ミリポアフィルター（ミリポア社製）上に集菌した既知濃度の大腸菌に、  １００ないし１０００倍の力価となるように加えてファージを吸着させた。ファージ液を加えた１０分後にフィルターをリン酸緩衝液などで洗浄し、アルカリホスファターゼ標識アビジンを加えてファージに吸着させた後、蛍光色素（ＡＭＰＰＤ）を添加して生じた発光の発光量を化学発光測定機で測定した。その結果、フィルター上の  ２×１０３  個の大腸菌を検出することができた。
【００４３】
［実施例２］
ＲＩ直接標識法により標識したλファージを用いて大腸菌の検出を行なった。
λファージの標識は、λファージ液を調製する段階で  ３Ｈ−ｄＣＴＰをファージＤＮＡに取込ませることにより行なった。この標識λファージ液を用いて、上記実施例１と同様に既知濃度の大腸菌にλファージを吸着させて洗浄した後、大腸菌にシンチレーションカクテル（同仁化学社製、Ｓｃｉｎｔｉｓｏｌ  ５００  ）を加えてシンチレーションカウンターで計測した。
その結果、  ５×１０２  個の大腸菌を検出することができた。
【００４４】
［実施例３］
レポーター法により標識したλファージを用いて大腸菌の検出を行なった。
まず、Ｌｕｘオペロンを接続したλファージ（ファージベクターＥＭＢＬ３  ）を１０３  個含むファージ液を調製した。次に、ミリポアフィルター上に既知濃度の大腸菌を集菌し、このフィルターを培地に置床した後フィルター上に上記ファージ液を拡げ、３７℃で  １時間培養した。その後、フィルターを取出し、そのまま化学発光測定機で発光量を測定した。
【００４５】
一方、同じフィルターに大腸菌を用いずに同様の処理を施し、これをコントロールとして同様に化学発光測定機で発光量を測定した。
検体の測定結果とコントロールの測定結果とを比較し、コントロールよりも有意に高い蛍光を発したものを「大腸菌有り」と判定した。その結果、  ３×１０３  個の大腸菌を検出することができた。
【００４６】
［実施例４］
カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ   ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  ｃｉｔｒｉ）の検出を、この病原細菌のファージであるＣＰ１  及びＣＰ２  を用いて、上記実施例１と同様の方法で行なった。その結果、  １×１０３  個の細菌を検出することができた。
【００４７】
［実施例５］  食品中の大腸菌の検出
５×１０３  個の大腸菌を含むビールと大腸菌を含まないビールのそれぞれ  １００ｍｌをフィルター濾過し、濾過後のフィルターを検体として各々上記実施例１ないし３と同様の方法で蛍光量または放射線量の測定を行なった。得られた結果を比較したところ、いずれの方法においても、大腸菌を含むビールから得られた結果のほうが有意に高く、大腸菌を検出できることが確認された。
【００４８】
［実施例６］  海水中の大腸菌の検出
５×１０３  個の大腸菌を含む海水と大腸菌を含まない海水のそれぞれ  １００ｍｌをフィルター濾過し、濾過後のフィルターを検体として各々上記実施例１ないし３と同様の方法で蛍光量または放射線量の測定を行なった。得られた結果を比較したところ、いずれの方法においても、大腸菌を含む海水から得られた結果のほうが有意に高く、大腸菌を検出できることが確認された。
【００４９】
［実施例７］  植物葉上の病原細菌の検出
カンキツ葉を滅菌蒸留水  １００ｍｌで洗浄し、この洗液及びこの洗液に  １×１０４  個のカンキツかいよう病菌を加えたものをそれぞれフィルター濾過し、濾過後のフィルターを検体として各々上記実施例４と同様の方法で蛍光量を測定した。得られた結果を比較したところ、病原細菌を加えたものから得られた結果のほうが有意に高く、病原細菌を検出できることが確認された。
【００５０】
【発明の効果】
以上のように、この発明による細菌の検出方法は、大量の試料を短期間で処理することが可能であり、感度及び精度に優れた簡便な方法である。より具体的には、同じファージを用いるファージ増殖法と比較しても、操作に熟練を要することなくより短時間（具体的には  ３時間以内）に結果を得ることができる。また、ファージ増殖法ではファージが細菌に吸着してファージ核酸の注入が行なわれたとしてもファージが増殖せずに測定できないことがあるが、この発明による方法では、ファージを直接標識することにより、ファージが細菌に吸着しただけであっても検出が可能である。
【００５１】
また、ＥＬＩＳＡ法と比較すると、固定化した細菌が洗浄の際に流れてしまい再現性に問題が生じるＥＬＩＳＡ法と異なり、この発明による方法では細菌を固定化する必要はなく、そのような問題は生じない。また、この発明による方法に用いられる標識ファージの調製は容易であり、ＥＬＩＳＡ法に用いられる抗体の調製のような多大な労力は必要としない。
【００５２】
さらに、従来のレポーター遺伝子を組込む方法では、レポーター遺伝子を組込んだ細菌及びその子孫しか検出することはできなかったが、この発明による方法では、レポーター遺伝子の組込みにファージを用いることにより試料中に存在する特定の細菌のみにレポーター遺伝子を組込むことができる。そのため、混入細菌の検出など試料中の特定の細菌の検出を、それも高い精度で、行なうことができる。
【００５３】
この発明による細菌の検出装置は、上述のこの発明による細菌の検出方法を実施するに好適に用いられ、大量の試料を短期間で処理することができ、感度び精度の高い測定を行なうことができる。さらには、一連の操作を自動化し、被検体を入れるだけで測定結果が得られるようにすることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明による細菌の検出装置の概略を説明する図。
【図２】光電子増倍管を用いる化学発光測定器を具備する、この発明による細菌の検出装置の具体例を模式的に示す図。
【符号の説明】
１…被検体処理部、  ２…検出器、  ３…データ処理部、１１…収容容器、
１２…容器底部材、１３…容器枠部材、１５…弁、１６…フィルター、
１８…フィルター固定部材、２０…被検体貯留槽、２１…標識ファージ液貯留槽、
２３、２４…液導入管、２５…光電子増倍管、２６…光フィルター、
２７…光シャッター、２８…冷却部材、３１…主制御装置、
３２…光シャッター制御装置、３３…温度制御装置、３４…表示装置、
３５…プリンター
【図１】
0003615810.tif 000002
【図２】
0003615810.tif 000003