(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一工程を弱陰イオン交換体ゲルで、第二工程を強陽イオン交換体ゲルで行う、テンタキュラー型イオン交換体ゲルを充填したクロマトグラフィーカラムの２つの分離工程を含んで成ることを特徴とする、ヒト血漿画分からの、治療目的のＣ１−エステラーゼ阻害剤（C1-INH）濃厚物の調製法。
【請求項２】
−移植DEAE基をもつゲルへの吸着後にヘパリン固定化アフィニティークロマトグラフィーで前精製した寒冷沈殿物を含まない血漿画分を第一クロマトグラフィーカラムに添加し、
−弱陰イオン交換体ゲルのクロマトグラフィーで分離し、そして濾液を廃棄し、
−補体C3成分を溶出、そして廃棄し、
−C1-INHを溶出、そして取り出し、
−溶出液を第二クロマトグラフィーカラムに添加し、
−強陽イオン交換体ゲルでクロマトグラフィー分離を行い、そしてIgMを含む溶出液の第一画分を廃棄し、
−C1-INHを溶出、そして取り出し、
−溶出液を濃縮し、そして凍結乾燥する、
工程を含んで成ることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
純度が85％より高いことに相当する少なくとも6U/mgタンパク質に等しい比活性を示すことを特徴とする請求項１または２に記載の方法により得られた治療用C1-INH濃厚物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術】
本発明は陰イオン交換体、次に陽イオン交換体での２つのクロマトグラフィー分離工程、ならびにウイルス混入の可能性を除去する２回の処理を含んで成る、ヒト血漿画分起源のＣ１−エステラーゼ阻害剤濃厚物の調製法に関する。得られた濃厚物は治療目的に使用することを意図する。
【０００２】
Ｃ１−エステラーゼ阻害剤（Ｃ１−ＩＮＨという略称で知られている）は血漿に存在するプロテアーゼ阻害剤であり、これは補体第１成分（Ｃ１）の活性化を制御し、そして副−成分Ｃ１ｒおよびＣ１ｓを不活性化する。これはカリクレイン、プラスミン−活性化ハゲマン因子（Ｈａｇｅｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ）および第ＸＩａ因子のような、凝固およびフィブリン溶解性、ならびに接触系の他のセリンプロテアーゼも阻害する。
【０００３】
ヒト血漿由来のＣ１−ＩＮＨは、分子量が１０４  ０００ダルトンの１つのグリコシル化ポリペプチド鎖から成る。
【０００４】
Ｃ１−ＩＮＨの欠如には致命的にもなりうる重い病状が多少なりとも付随する。遺伝性の血管性水腫を患っている患者はＣ１−ＩＮＨ（１型）が欠損しているか、あるいはＣ１−ＩＮＨ活性の減少を示す（ＩＩ型）。遺伝性の血管性水腫の他の型（ＩＩＩ型）はアルブミンのＣ１−ＩＮＨへの異常結合から生じる。阻害剤の異常に高い同化作用または自己−抗体の存在による後天的Ｃ１−ＩＮＨ欠損症もある。
【０００５】
この疾患は顔面水腫として、四肢、胃壁および上部呼吸気道中の水腫に現れる。
【０００６】
【従来の技術】
発作の重症度を減ずるために、抗フィブリン溶解剤またはホルモンを使用する様々な治療法が主に予防に応用されたが、それらは急性の発症に効果的ではなく、そのうえ、それらは長期間の治療には適合しない副作用を誘発する。急性の発症にアプロチニンのようなカリクレイン阻害剤を投与すると、それらはアレルギー反応を引き起こしてしまう。
【０００７】
新鮮な血漿を使用するＣ１−ＩＮＨ交換治療法はすでに口腔外科手術を受けている高い危険率の患者に適用された。この治療により疾患症状が軽減された。しかし、血漿にさらに役に立たないタンパク質（特に病状を悪化させる補体第Ｃ２およびＣ４構成物）をもたらす。
【０００８】
精製されたＣ１−ＩＮＨでの交換治療法は、長期治療または同様に手術前の予防のために、急性発作治療の選択となるように思われる。
【０００９】
現在、幾つかの部分精製された濃厚物を入手できるが、すべての記載されている調製法は、技術的問題または使用する材料のコストから工業的規模に適用するには難しい：
−Ｈａｒｒｉｓｏｎ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８３；２２：５００１−５００７）は、分子の特性を決定する目的で実験室規模に応用できる精製法を報告しているが、この方法にかかる時間は工業規模に転換するには長すぎる；
−Ｒｅｂｏｕｌら（Ｆｅｄ．Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．１９７７；７９：４５−５０）およびＰｉｌａｔｔｅら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８９；１２０：３７−４３）はレクチンのアフィニティークロマトグラフィーを含んで成る調製法を報告している；
−Ｐｒｏｇｒａｉｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；９９：１１３−１２２）は亜鉛でのゲルキレート化アフィニティクロマトグラフィーを含んで成る方法を報告している；
−Ａｌｓｅｎｚら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８７；９６：１０７−１１４）はモノクローナル抗体を使用する免疫吸着法による調製法を報告している。
【００１０】
これらのすべての方法で、Ｃ１−ＩＮＨ活性を保護するために緩衝液に毒性の安定化剤が加えられている。
【００１１】
−最初の大規模調製法はＶｏｇｅｌａａｒら（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．１９７４；２６：１１８−１２７）により、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）のバッチ式吸着、そして高塩濃度で溶出、次にアルブミンおよびセルロプラスミンを除去するための硫酸アンモニウムによる沈殿を用いて記載された。
−この方法は、２つのバッチ様式のクロマトグラフィー工程（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ：商標、次にＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ：商標）、そしてＰＥＧによる沈殿により改良され（Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ．第１８回合同会議、ＩＳＨ／１６ｔｈ会議、ＩＳＢＴ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ  １９８０、抄録：１６１およびＧａｄｅｋら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８０；３０２：５４２−５４６）、その最終生成物は“中程度の純度”であった。
【００１２】
最終的に“高純度”生成物は塩の存在下で最終的な沈殿工程を加えるか（Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒ．Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．１９８７；５３：１−６）、またはＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）をＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）−ＦＦに代えるか（Ｂｅｎｎｙら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９８８；４３３：３６３−３６６）により得られた。Ｆｕｈｇｅら（Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｓｃｉ．１９９０，１１：２３Ｓ−３３Ｓ）も２つのクロマトグラフィー工程（ＱＡＥ−およびＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））および硫酸アンモニウムによる沈殿工程を報告している。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
これらの様々な方法には後で遠心をしなければならない沈殿工程を含み；これらの方法は選択性が悪く、大規模で行うには困難であり、そして収量が低い。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
これらの困難を回避するために、沈殿工程またはバッチ吸着を含まず、カラムクロマトグラフィーのみによる方法の開発に成功した。
【００１５】
さらに様々な種類のクロマトグラフィーゲルを試験して、従来にはない“テンタキュラー型（ｔｅｎｔａｃｕｌａｒ  ｔｙｐｅ）”イオン交換体ゲルを選択し、特にこれのＣ１−ＩＮＨに対する分離能の性能を証明した。
【００１６】
このテンタキュラーイオン交換体ゲルはＭｕｌｌｅｒ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９０；５１０：１３３−１４０）ににより記載されている。それらはメルク（Ｍｅｒｃｋ）（ダーモスタット、独国）によりＦｒａｃｔｏｇｅｌ−ＥＭＤ（商標）というイオン交換体基の略号（ＴＭＡＥ−、ＤＥＡＥ−、ＤＭＡＥ−、ＳＯ３−、ＣＯＯ−）により表された商品名で販売されている。それらは不活性な多孔性かつ半−固定Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）型マトリックスから成り、このマトリックスはオリゴエチレングリコールグリシジルメタクリレートおよびペンタエリスリトール−ジメタクリレートコポリマーから成り、その上に直線状のビニルポリマー鎖から成る移植されたテンタクル（ｔｅｎｔａｃｕｌｅ）が存在する（直線状であり、従来のように架橋結合していない）。これらの直線鎖により保持されているこのイオン交換基は、従来の網目状の配置より、より大きい移動度を持ち、かつよりマトリックスから独立している。これらの特性により可動アームまたはテンタクルを持つゲルの組織が正当化される。
【００１７】
従って本発明の方法はテンタキュラー型のイオン交換ゲルを使用するクロマトグラフィーカラムの２つの分離工程を含んで成り、第一は弱陰イオン交換体ゲル、第二は強陽イオン交換体ゲルである。
【００１８】
弱陰イオン交換体はＤＭＡＥ−型交換体であり、マトリックスに移植されたビニルポリマーは式ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２のモノマーにより構成されている。
【００１９】
強陽イオン交換体はＳＯ３−基であり、マトリックスに移植されたビニルポリマーは式ＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨ（ＣＨ３）２Ｎ（ＣＨ２）ＳＯ３−のモノマーにより構成されている。
【００２０】
本発明の方法を行うために、出発物質として寒冷沈殿物を含まないヒト血漿分画を使用し、そしてＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）型のＤＥＡＥ−基を移植したゲルへの吸着により前−精製され（これはビタミンＫ−依存性タンパク質を排除する）、次にアンチトロンビンＩＩＩを固定化ヘパリンのアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより排除する。
【００２１】
従って本方法は治療目的の他の血液因子の分画および調製を妨害しない。
【００２２】
本発明は以下の工程を含んで成る：
−前精製した血漿画分を第一クロマトグラフィーカラムに添加し、
−弱陰イオン交換体ゲルのクロマトグラフィー分離、そしてアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、α．ＡＴおよびα２−マクログロブリンを含む濾液を廃棄し、
−補体Ｃ３構成物を溶出、そして廃棄し、
−Ｃ１−ＩＮＨを含む画分を溶出、そして取り出し、
−溶出液を第二クロマトグラフィーカラムに添加し、
−強陽イオン交換体ゲルでクロマトグラフィー分離を行い、そして濾液およびＩｇＭを含む第一画分を廃棄し、
−Ｃ１−ＩＮＨを溶出、そして取り出し、
−溶出液を濃縮し、そして凍結乾燥する。
【００２３】
第一クロマトグラフィー分離は、６０ｍＭのＮａＣｌを補充した２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で行う。緩衝液のＮａＣｌ濃度を１２０ｍＭに上げることにより、所望しないタンパク質（特に補体Ｃ３構成物）を溶出でき；次にＮａＣｌ濃度を１７０ｍＭに上げることによりＣ１−ＩＮＨの溶出を可能にする。
【００２４】
第二クロマトグラフィー分離は、３０ｍＭのＮａＣｌを補充した２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中で行い、緩衝液のＮａＣｌ濃度を９０ｍＭに上げることによりＣ１−ＩＮＨの溶出が得られる。ＩｇＭを含む初めの少量の分画を同条件で溶出し、そして廃棄する；Ｃ１−ＩＮＨを含む主要画分は第一のものからきれいに別れた分画として出てくる。
また本発明の方法は好ましくは２つのウイルスの不活性化処理を含んで成る。溶媒／表面活性剤を使用する第一処理は、溶媒／表面活性剤が第二クロマトグラフィーの濾液から排出されるように第一クロマトグラフィーの溶出液に適用する。第二処理は可能性のある小さいサイズのウイスルの混入を排除することを目的とした３５ｎｍ、次に１５ｎｍフィルターによるの連続的なナノ濾過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）である。この処理を第二クロマトグラフィーの濃縮された溶出液に行う。
【００２５】
本発明はまた比活性が少なくとも６Ｕ／ｍｇタンパク質を示すＣ１−ＩＮＨ濃厚物に関し、これは純度が８５％よりも高いことに対応する。その純度、生化学的特性および生物学的活性は、上記のようなＣ１−ＩＮＨ欠損を補うだけでなく、カリクレインおよび活性化ハゲマン因子により触媒される炎症反応の種々の病状を治療するための治療的使用にすべて許容できるものである。
【００２６】
以下の実施例では範囲を制限することなく本発明を説明する。
【００２７】
【実施例】
実施例１ Ｃ１−ＩＮＨの精製
寒冷沈殿物を含まないヒト血漿画分を２−工程の前精製に供した。
【００２８】
−ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ａ５０（ファルマシア−ＬＫＢ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）への吸着によりビタミンＫ−依存性タンパク質を除去し、
−そしてヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ファルマシア−ＬＫＢ）のアフィニティークロマトグラフィーによりアンチトロンビン−ＩＩＩを除去した。
【００２９】
ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのカラムクロマトグラフィーの濾液は平均０．２４ｇ／ｌの血漿の正常Ｃ１−ＩＮＨ濃度の５０−７０％を含有した。
【００３０】
精製工程は室温で前精製画分について各々１８０リットルのバッチで行った。
【００３１】
クロマトグラフィー平衡化緩衝液に対して１０Ｋ限外濾過システム（Ｆｉｌｔｒｏｎ：商標）中での透析後、血漿画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。血漿画分をクロマトグラフィーカラムＭｏｄｕｌｉｎｅ（商標）Ｐ６３０−２５０（アミコン：Ａｍｉｃｏｎ）（ＤＭＡＥ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ（商標）６５０Ｍ（メルク：Ｍｅｒｃｋ）を充填し、そして６０ｍＭのＮａＣｌを補充した２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７で平衡化した）に添加した。
【００３２】
ゲルを平衡化緩衝液で濾液の吸収がベースラインに落ちるまで洗浄した。このカラムクロマトグラフィーの濾液はベースヘインを含んでいた。このクロマトグラフィーの濾液はアルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、α−ＡＴおよびα２−マクログロブリンを含み、これらは分画回路で再利用した。次に緩衝液に１２０ｍＭ濃度のＮａＣｌを補充し、所望でないタンパク質、特に補体Ｃ３構成物を除去した。
【００３３】
次にＣ１−ＩＮＨは緩衝液のＮａＣｌ濃度を１７０ｍＭに上げることにより溶出した。
【００３４】
ＩｇＭ、セルロプラスミンおよび補体Ｃ４構成物はカラムに強く吸着し残った。
【００３５】
溶出液は１，３±０，２Ｕ  Ｃ１−ＩＮＨ／ｍｇタンパク質の比活性を示し、これは純度約３０％に対応する。溶出液を１０ｇタンパク質／ｌに濃縮し、そして続くカラムクロマトグラフィー（ＳＯ３−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）の平衡化緩衝液に対し透析した（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ：商標１０Ｋ  カセットで）。
【００３６】
溶出液をＴｎＢＰ  ０，３％およびＴｗｅｅｎ８０  １％（最終濃度）と混合し、そして２５℃で７時間ゆるやかに撹拌しながらインキューベーションすることにより溶媒／表面活性剤でのウイルス不活化処理に供した。
【００３７】
次に溶液をＳＯ３−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ（商標）の陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。
【００３８】
溶媒／表面活性剤で処理した溶液を、ＳＯ３−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ（商標）６５０（Ｍ）（メルク）を充填したＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓ（商標）２５２カラム（ファルマシア）（３０ｍＭのＮａＣｌを補充した２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７で平衡化したもの）に添加した。
【００３９】
ゲルを少なくとも１２倍のカラム容量で洗浄し、ウイルス不活化剤を除去した。
Ｃ１−ＩＮＨを次に緩衝液中のＮａＣｌ濃度を９０ｍＭに上げて溶出した。
【００４０】
本質的にＩｇＭを含む第一画分を捨てた。Ｃ１−ＩＮＨを含有する主要画分を次に溶出し、明らかに第一とは分離し、そして回収した。これは６，５±０，５Ｕ／ｍｇタンパク質の比活性を示し、８４−９２％純度に対応する。
【００４１】
精製生成物の回収率は出発画分の４０−５０％であり、そして全血漿の２５−３０％であった。
【００４２】
溶出液を次に濃縮し、そして１５０ｍＭのＮａＣｌを補充した１０ｍＭ  トリスナトリウム  クエン酸緩衝液（ｐＨ７）中で透析した（Ｆｉｌｔｒｏｎ：商標、３０Ｋカセットで）。
【００４３】
両方の種類のカラムを１Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍ  ヒドロキシドナトリウムおよび２Ｍ  ＮａＣｌで連続して洗浄することにより再生した。
【００４４】
濃縮された溶出液（約１０ｇ／ｌのＣ１−ＩＮＨ抗原が１，２リットル）を、３５ｎｍ次に１５ｎｍ（アサヒＢＭＭ：Ａｓａｈｉ  ＢＭＭ）孔のフィルターで連続してナノ濾過することにより２回目のウイルス除去に供した。小さいサイズのマーカーウイルス（ポリオウイルスおよびウシパルボウイルスのような）を除去するためのこの処理の効率は、すでに実証されている。
【００４５】
この濃厚物を次に容器に分配（５ｍｌ／容器）し、そして凍結乾燥した。
【００４６】
実施例２              最終生成物の分析
Ｃ１−ＩＮＨ活性を色素生産性基質（Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ：商標）によりＣ１−エステラーゼを阻害する能力として測定した。Ｃ１−ＩＮＨ活性の１単位（ＵＩ）は正常血漿１ｍｌ中に存在する活性と定義した。
【００４７】
凍結乾燥最終生成物を、すぐに注入できる水中の溶液で即座（＜１分）に再構成し；溶液は透明、無色であり、そして室温で２４時間安定であった。
【００４８】
最終生成物の特徴を次の表に示す
0003615595.tif 000002
Ｃ１−ＩＮＨ活性とＣ１−ＩＮＨ−抗原量の比はＵ／ｍｌで表すと１，７から２であり、阻害剤がすべての精製工程を通して安定に存在することを示している。
【００４９】
主な混入物は補体Ｃ３構成物であり、全タンパク質の４−１０％を示す。
【００５０】
動物実験では生成物が非パイロジェン性であり、マウスに対していかなる毒性も示さなかった（耐容投与量はマウスの２０００Ｕ／ｋｇ体重より高かった）。最高投与量が３００Ｕ／ｋｇ体重ラットの静注では、高血圧症または不整脈を誘発しなかった。
本発明の特徴および主な態様は次の通りである。
【００５１】
１．第一工程を弱陰イオン交換体ゲルで、第二工程を強陽イオン交換体ゲルで行う、テンタキュラー型イオン交換体ゲルを充填したクロマトグラフィーカラムの２つの分離工程を含んで成ることを特徴とする、治療目的のＣ１−エステラーゼ阻害剤濃厚物、Ｃ１−ＩＮＨの調製法。
【００５２】
２．ゲルが、イオン性基を持つ移植された非架橋の直線状ビニルポリマー（テンタクル）を持つオリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレートおよびペンタエリスロール−ジメタクリレート型コポリマーの不活性な多孔性マトリックスから成ることを特徴とする上記１記載の方法。
【００５３】
３．弱陰イオン交換体がＤＭＡＥ−型であることを特徴とする上記１または２記載の方法。
【００５４】
４．強陽イオン交換体がＳＯ３−基であることを特徴とする上記１ないし３のいずれか１つに記載の方法。
【００５５】
５．出発物質が寒冷沈殿物を含まないヒト血漿であり、移植ＤＥＡＥ−基をもつゲルへの吸着により、そして次にヘパリン固定化アフィニティークロマトグラフィーにより前−精製されていることを特徴とする、上記１ないし４のいずれか１つに記載の方法。
【００５６】
６．−前記５記載の前精製した血漿画分を第一クロマトグラフィーカラムに添加し、
−前記３記載の弱陰イオン交換体ゲルのクロマトグラフィーで分離し、そして濾液を廃棄し、
−補体Ｃ３成分を溶出、そして廃棄し、
−Ｃ１−ＩＮＨを溶出、そして取り出し、
−溶出液を第二クロマトグラフィーカラムに添加し、
−前記４記載の強陽イオン交換体ゲルでクロマトグラフィー分離を行い、そしてＩｇＭを含む溶出液の第一画分を廃棄し、
−Ｃ１−ＩＮＨを溶出、そして取り出し、
−溶出液を濃縮し、そして凍結乾燥する、
工程を含んで成ることを特徴とする前記１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
７．第一クロマトグラフィー分離を６０ｍＭのＮａＣｌを補充した２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７で行い、そして緩衝液中のＮａＣｌ濃度を１２０ｍＭに上げることによりＣ３の溶出を、そして緩衝液中のＮａＣｌ濃度を１７０ｍＭに上げることによりＣ１−ＩＮＨの溶出を得ることを特徴とする前記６記載の方法。
【００５８】
８．第二クロマトグラフィー分離を３０ｍＭのＮａＣｌを補充した２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７で行い、そして緩衝液中のＮａＣｌ濃度を９０ｍＭに上げることによりＣ１−ＩＮＨの溶出を得ることを特徴とする前記６記載の方法。
【００５９】
９．第一クロマトグラフィーの溶出液を溶媒／表面活性剤でのウイルス不活化処理に供することを特徴とする前記１ないし８のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
１０．第二クロマトグラフィーの濃縮溶出液のナノ濾過により、存在しうる小さいサイズのウイルス混入物を除去する工程を含んで成ることを特徴とする上記１ないし９のいずれか１つに記載の方法。
【００６１】
１１．純度が８５％より高いことに相当する少なくとも６Ｕ／ｍｇタンパク質に等しい比活性を示すことを特徴とする前記１ないし１０のいずれか１つに記載の方法により得られた治療用Ｃ１−ＩＮＨ濃厚物。