(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカゴンであるバイスタンダー抗原からなる、個人の自己免疫疾患を治療または予防するための経口用または吸入用の薬剤。
【請求項２】
前記自己免疫疾患がタイプＩ糖尿病である、請求項１記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
アメリカ合衆国政府は、アメリカ予防衛生研究所からの承認番号５２９３５２からの資金援助によってこの発明の権利を有する。この発明に達した研究の一部は、公衆衛生局フォガティ・インターナショナル・リサーチ・フェローシップ（Forgarty Int&l Research Fellowship）番号１ｆｏ５ｔｗｏ４４１８１ｃｐによって支持されている。
この出願は、ウェイナーらによって１９９０年２月２１日に出願された出願番号４６０，８５２の米国特許出願と、１９９０年１０月１５日に出願された出願番号５９６，９３６の米国特許出願（前者は、１９８８年６月２４日に出願された出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８８／０２１３９のＰＣＴ出願の国内段階）の一部継続出願であり、これらの出願は、以下に挙げる出願に換わる一部継続出願である。その出願とは、
１９８７年６月２４日に出願された出願番号０６５，７３４の米国特許出願；ウェイナーらによって１９８９年１２月２０日に出願された出願番号４５４，４８６の米国特許出願；
ウェイナーらによって１９９０年３月２日に出願された出願番号４８７，７３２の米国特許出願；
１９８９年７月１４日に出願された出願番号３７９，７７８の米国特許出願（現在は放棄されている）に換わる一部継続出願で、ウェイナーらによって１９９０年７月１０日に出願された出願番号５５１，６３２の米国特許出願；
ウェイナーらによって１９９０年１０月３１日に出願された出願番号６０７，８２６の米国特許出願；そして
ウェイナーらによって１９９０年１０月１０日に出願された出願番号５９５，４６８の米国特許出願である。
発明の分野
この発明は自己免疫疾患の治療における改良に関する。より詳しくは、本発明は、自己免疫疾患の治療のためにバイスタンダー(bystander)抗原（すなわち、自己免疫の進行過程に関与する細胞を抑制する抗原）の利用に関するものである。本発明は、哺乳動物の自己免疫疾患の治療に有益なバイスタンダー抗原を含む薬剤の製剤をも含むものである。
発明の背景
自己免疫疾患は、正常な自知の（自己の）組織に対して向けられる異常な免疫反応によって特長付られる。
哺乳動物における自己免疫疾患は、そこに含まれる超正常な免疫反応の種類に基づいて、一般に二つの異なるカテゴリーの一方に分類されうる：細胞-媒介性（すなわち、Ｔ-細胞-媒介性）、または、抗体-媒介性の疾患である。細胞-媒介性の自己免疫疾患の非限定的な例としては、多発性硬化症（ＭＳ）、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、自己免疫性甲状腺炎（ＡＴ）、糖尿病（若年性初期、またはタイプ１の糖尿病）および自己免疫葡萄膜網膜炎（ＡＵＲ）がある。抗体-媒介性の自己免疫疾患には、重症筋無力症（ＭＧ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）がある。
両方のカテゴリーの自己免疫疾患は、現在のところ非特異的に免疫反応を抑制する薬、すなわち異常な免疫反応を選択的に抑制することができない薬を用いて治療されている。このような薬の非限定的な例は、メトトレキセート、シクロホスファミド、イムラン（アザチオプリン）およびシクロスポリンＡ(cyclosporin A)を含んでいる。プレドニソンやメチルプレドニソロンのようなステロイド化合物（これらも非特異的な免疫抑制剤）もまた、多くの例に使用されている。これらの現在用いられている薬の全ては、細胞-および抗体-媒介性の自己免疫疾患の両方に対して限られた効力しか有さない。さらに、このような薬はかなりの毒性と副作用とを有し、さらに重要なことに、結局のところ治療患者に「全体的な」免疫抑制を引き起こしてしまう。言い換えれば、この薬による長期にわたる治療は、病原体に対する正常な防衛的免疫反応をダウンレギュレート(downregulate)してしまい、その結果として、感染の危険性が増加する。さらに、長期にわたり全体的な免疫抑制を受けた患者は、治療によって、例えば悪性の腎臓疾患や糖尿病のような重い病気を患う危険性が増加してしまう。
自己免疫疾患の従来の治療の欠点の克服の努力において、本発明者とその協力者は、自己抗原、あるいは、疾患-抑制性フラグメントまたは自己抗原の類似体を単独またはいわゆる「相乗剤」すなわち自己抗原のトラライジング(tolerizing)の効果を増幅する化合物と組み合わせたものをトラライザー(tolerizers)として用いて、経口トラライゼーション(Tolerization)（または吸入によるトラライゼーション）の概念に基づいて、自己免疫疾患の治療に有用な方法および薬剤の製剤を発明した。
自己抗原とは、それ自身が自己免疫反応の主要な標的となる、自己免疫の攻撃にさらされる器官または組織に特異的で、その内部に普通に見られる抗原である。
上記方法と薬剤の製剤は自己免疫疾患の治療に本質的な改善を示したが、それらの治療上の有効性は遅れている。それは、各々の場合について、疾患状態の誘発及び維持に含まれる特異的な自己抗原が同定されなければならないからである。言い換えれば、免疫機構による攻撃の標的である特異的な物質が同定されなければならない。多くの場合、当業者には認められているように、このことは困難かつ時間を要するものである。例えば、一つ以上の自己抗原が同時に自己免疫攻撃の標的であるかもしれず、疾患が徐々に関与する組織をますます破壊するにつれ自己抗原の属性が変化するかもしれない。
それゆえ、当該技術分野において必要とされるものは、自己免疫疾患で苦しむ個体を治療するための改良された試薬、方法、組成物であり、これらはより容易に治療用途に供することができ、例えば、自己抗原を予め同定する必要がないものである。さらにこの分野において、自己免疫疾患を治療するために付加的な方法と組成物が必要であり、その方法と組成物は自己抗原に加えて、あるいは自己抗原に代わって使用されるものである。
さらには、当該技術分野において、それによって自己免疫疾患が戦われる機構を解明し、自己免疫疾患と戦うために使用できる新たに獲得されたこの知識を考慮した新規な方法と組成物とを同定する必要がある。
従って、本発明の一つの目的は、自己免疫疾患に苦しむ哺乳動物を治療するために改善された方法と組成物を提供することであり、前記方法と組成物は単独に、または、一つまたはそれ以上の自己抗原、相乗剤、他の免疫反応抑制剤と任意に組み合せて使用される。
本発明のさらなる目的は、自己免疫疾患に苦しむ哺乳動物を治療するための方法および組成物を提供することであり、これは、そのような病気を治療するため、症状を和らげるため、または予防するために効果的に使用され、自己免疫疾患を引き起こし維持することに関与する自己抗原を予め同定する必要がないものである。
さらに、本発明のもう一つの目的は、自己免疫疾患にひどく苦しめられ、あるいは、自己免疫疾患を受けやすい哺乳動物を治療するための方法および組成物を提供することであり、この方法と組成物とは無害な試薬を伴うもので、好ましくは、疾患-特異的なものである。
発明の要旨
本発明は、ある抗原（「バイスタンダー抗原」と呼ばれるもので、定義は後述する）の経口または経腸投与（あるいは吸入による投与）がＴ-細胞の誘引を生ずること、逆に、器官または組織の免疫攻撃に寄与する抑制細胞が自己免疫疾患に含まれるという予期せぬ、驚くべき発見に基づくものである。バイスタンダー抗原によって誘引されたＴ-細胞は、同じ部位に見られる免疫攻撃に寄与する細胞を抑制するトランスフォーミング(transforming)成長因子β（ＴＧＦ-β）の放出を媒介する。
このタイプの作用する抑制機構では、ＴＧＦ-βを放出するＴ細胞が疾患-寄与の細胞を認識する必要がない。唯一、ＴＧＦ-βが放出されるときに、同じ部位に両種の細胞が見られればよい。これに到達する一つの方法は、バイスタンダー抗原として、（ａ）ＴＧＦ-βの放出を引き起こすＴ細胞を誘引する能力をもち、（ｂ）それ自体が攻撃を受けている器官や組織に特異的であって、ＴＧＦ-βを放出させるサプレッサーＴ-細胞（バイスタンダー抗原の経口投与に応じて引き起こされる）が、疾患を促進する細胞が集中した場所でもある同じ器官や組織に向かうような抗原を用いるものである。
バイスタンダー抗原は、自己抗原であってもよいが、そうである必要はない。すなわちそれらは疾患を引き起こす細胞によって攻撃されるものと同じ抗原である必要がない。バイスタンダー抗原の経口投与により、他の抗原または抗原フラグメントに特異的な細胞によってなされる組織の被害を食い止めることができるということは、本発明における興味深い特長である。この第二の抗原（またはフラグメント）は同定される必要すらない。
それゆえ、本発明の一つの態様は、哺乳動物における自己免疫疾患の治療方法であり、その方法は前記疾患を治療するためにバイスタンダー抗原の効果的な量を前記哺乳動物に投与することからなり、前記抗原は、自己免疫応答に寄与するＴ細胞が前記応答に寄与するＴ-細胞を抑制することが確認される前記哺乳動物の体の部位にトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）の放出を引き起こすものである。
他の態様は、本発明が哺乳動物における自己免疫疾患を治療するのに効果的なバイスタンダー抗原の量を含む組成物および投薬形態である。
さらに他の態様は、本発明が哺乳動物における自己免疫疾患を治療する吸入型投与形態を提供することであり、その形態は、前記病気を治療するために効果的な量のバイスタンダー抗原であって、投与に供される前記抗原が、自己免疫反応に寄与するＴ細胞が前記反応に寄与するＴ-細胞を抑制することが確認される前記哺乳動物の体の部位にトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）の放出を引き起こすもの；そして薬剤学上許容されるキャリアまたは希釈剤からなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、経口でトラライズされた動物から単離したリンパ球の上澄みまたはリンパ球サブセットによるインビトロにおける増殖反応の抑制を示す棒グラフである。
図２は、抗-トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）抗体によるインビトロにおける抑制の阻害を示す棒グラフである。
図３は、経口でトラライズされた動物から単離されたサプレッサーＴ-細胞の無血清培養上澄みにおけるＴＧＦ-βの活性を示す棒グラフである。
図４（Ａ−Ｄ）は、経口でトラライズされたＭＢＰ給餌動物および非ＭＢＰ給餌動物における実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する、抗-ＴＧＦ-β抗体と対照血清の効果を示す一連のグラフを示すものである。
図５（Ａ−Ｄ）は、抗-ＴＧＦ-β抗体の、経口でトラライズされた動物とその対照動物における遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応に対する効果を示した一連の棒グラフを示すものである。
図６（Ａ−Ｃ）は、バイスタンダー抗原の経口投与と、実質的に同時のＭＢＰを用いた免疫処置に続く選定された抗原の注射とに関係した自己免疫疾患の抑制を示す一連の図を示したものである。
図７は、このようなバイスタンダー抑制と関連した遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を示す棒グラフである。
図８は、インビボでのＥＡＥのバイスタンダー抑制が、ＭＢＰで免疫処置され、与えられたものと同じ抗原を注射された動物に与えられた、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オブアルブミン（ＯＶＡ）およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に関係するかどうかを示す棒グラフである。
図９は、バイスタンダー抑制のアドプチブ・トランスファー(adoptive transfer)がＣＤ８+サプレッサーＴ-細胞と関係していることを示す棒グラフである。
図１０は、ＭＢＰで感作されたリンパ系細胞による合成された重複するモルモットのＭＢＰペプチドに対する反応におけるＴ-細胞（ＥＡＥを媒介するタイプのもの）の増殖を示す棒グラフである。
図１１は、ＭＢＰを与えられた動物の脾臓細胞がインビトロのトランスウェル(transwell)装置におけるＯＶＡで感作された脾臓細胞を抑制する契機となる様々なＭＢＰペプチドの効力を示す棒グラフである。
図１２（Ａ）は、自己抗原（ＰＬＰ）またはバイスタンダー抗原（ＭＢＰ）を与えることが、ＰＬＰペプチドを用いてＳＪＬ／Ｊマウスに引き起こされたＥＡＥに与える効果を示したグラフである；（Ｂ）は（Ａ）の結果を要約した棒グラフである。
図１３（Ａ）は、ＰＬＰペプチドを用いてＳＪＬ／Ｊマウスに引き起こされたＥＡＥに対する、自己抗原（ＰＬＰ）またはバイスタンダー抗原（ＭＢＰ）の静脈内への投与というトラライジングの効果を示したグラフである；（Ｂ）は（Ａ）の結果を要約した棒グラフである。
図１４は、様々なモルモットＭＢＰペプチドを単独またはダイズのトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）と組み合せて与えることによる、ＥＡＥ（ＭＢＰペプチド７１-９０で引き起こされたもの）の抑制を示す棒グラフである。
図１５（Ａ−Ｄ）は、完全なＭＢＰまたはＭＢＰペプチド７１-９０を用いてＥＡＥに対して免疫処置され、完全なＭＢＰまたは様々なＭＢＰペプチド（単独またはＳＴＩとの組み合せで）を与えられた動物におけるＤＴＨ反応を示す一連の棒グラフである。
図１６は、ＭＢＰと発病性および発病性でないその断片を用いた静脈内へのトラライゼーションの、ＳＪＬ／Ｊマウスに引き起こされた表現への効果を示した棒グラフである。
発明の詳細な説明
この明細書に引用された全ての特許出願、特許、および引用文献は、その全体が参考として取り入れられる。矛盾がある場合は、本明細書中の定義および説明を含む記述が優先されるであろう。
定義
この明細書中で使用された以下の用語は、その後に続く意味を有する。
（ａ）“バイスタンダー抗原”あるいは“バイスタンダー”は、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、糖タンパク質、あるいは他の免疫原物質（例えば、免疫応答を引き出すことが可能な物質など）である。そして、それは、経口あるいは経腸投与（あるいは吸入による投与）により、ＴＧＦ−βを放出する一因となるサプレッサーＴ細胞を引き出し、それによって、自己免疫疾患の間および破壊的な細胞が異なる免疫原物質に特異的であるときでさえ、組織の破壊の一因となる細胞を抑制する。好ましくは、バイスタンダーによって顕現されたサプレッサーＴ細胞は、自己免疫疾患中に攻撃下にあるものと、同じ組織を標的にする。それゆえ、この用語は、前記ＴＧＦ−βの放出の一因であり、自己免疫疾患の攻撃下の組織または器官に特異的な抗原を含むものであるが、それに限定されるものではない。また、この用語は、自己抗原、および経口投与、経腸投与、あるいは吸入において、Ｔ細胞のようなサプレッサーを顕現させることができるフラグメントあるいは類似体を含む。このように、“バイスタンダー”は、“自己抗原”と同一ではない。なぜなら、後者は、ここで、経口摂取あるいは吸入により上述したようなＴＧＦ−βの放出の原因となるＴ−サプレッサーの顕現を経て自己免疫反応を抑制しないならば、“自己抗原”は“バイスタンダー”ではないと定義されるからである。
（ｂ）“バイスタンダー抑制”は、免疫抑制因子であるＴＧＦ−βの放出による自己免疫破壊に寄与する細胞の抑制である。逆に、この放出はバイスタンダー抗原の経口摂取あるいは吸入により引き出されたサプレッサーＴ細胞によって媒介され、自己免疫破壊に寄与する細胞が見いだされる部位に補充される。その結果は、特定の自己免疫反応のダウンレギュレーションである。
（ｃ）“哺乳類”は、ここでは、免疫系を有し、自己免疫疾患になり得る生物体と定義する。
（ｄ）“自己免疫疾患”は、ここでは、ヒトを含む哺乳類の免疫系の機能不全と定義し、そこでは、哺乳類中の外来物質及び／または自己組織または自己物質との間の区別ができなくなり、結果として、自己組織および自己物質を、まるでそれらが外来物質であるかのように扱い、それらに対して免疫応答を開始する。
（ｅ）“自己抗原”は、異常な状態の哺乳類に通常見つけることのできる物質またはタンパク質で、もはや、その哺乳類中のリンパ球または抗体によって、哺乳類の一部と認識されず、それゆえ、外来物質として、免疫調整系によって攻撃される主要な標的となるものと定義する。また、この用語は哺乳類に投与したとき、自己免疫疾患の特徴を有する状態を誘発する抗原物質をも含む。
（ｆ）“治療”は、自己免疫疾患を防ぐため（あるいは、臨床的または亜臨床的な発現、例えば組織学的な徴候などを防ぐため）の予防処理と同様に、このような自己免疫疾患開始後の徴候の治療的抑制または緩和の両方を含むと意味される。
（ｇ）“相乗剤”は、ここでは、バイスタンダー抗原および／または自己抗原の投与とともに、経口的にあるいは吸入によって投与したときに、自己免疫疾患の臨床的（および／または組織学的）な発現の抑制を促進向上させる物質として定義される。また、前文および明細書中の他の箇所で使用されている“とともに(in conjunction with)”（また、とともに(in association with)も参照）とは、自己抗原および／またはバイスタンダー抗原の経口あるいはエアロゾル投与の前、実質的には同時、あるいは後であることを意味する。当然、その共同物質の投与は、最初に投与された物質の関連した効能が、徐々になくなってしまうほどの長時間間隔をあけて、自己抗原あるいはバイスタンダー抗原の投与より先行することもなく、遅れることもないようにすべきである。それゆえ、相乗剤は、自己抗原あるいはバイスタンダー抗原の投与の前後２４時間以内、好ましくは１時間以内に投与されるべきである。
（ｈ）“経口”投与は、経口、経腸、あるいは胃内投与を含む。
（ｉ）特別な自己免疫疾患の”特徴”あるいは”徴候”を有する疾患とは、自己免疫疾患に悩まされるのと同じ器官あるいは組織の特異的な炎症に存在する自発的なあるいは誘発された疾患状態である。誘発された状態の例として、多発性硬化症のモデルであるＥＡＥがある。また、自発的症状の例として、ＮＯＤマウスによって発現された糖尿病がある。
バイスタンダー抑制の説明
バイスタンダー抗原の経口あるいは吸入による投与は、自己免疫疾患において効果的な治療であることが予期することなく発見された。少なくとも、細胞-媒介自己免疫疾患は、本発明に記載の方法および薬剤製剤を使用することによって治療することができる。
バイスタンダー抗原の経口投与によって媒介された抑制は、免疫抑制因子、トランスフォーミング(transforming)成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）を放出するサプレッサーＴ細胞の顕現によって引き起こされる。ＴＧＦ−βはそれを放出するサプレッサー細胞を誘発する抗原にとって特異的なものではない、たとえ、これらのサプレッサーＴ細胞が、経口的に投与（あるいは吸入）された抗原によって誘発されたとき、ＴＧＦ−βを放出するものであってもである。器官あるいは組織の自己免疫破壊に寄与する細胞が存在する哺乳類中の部位へのサプレッサーＴ細胞の補充は、疾患誘発細胞近傍へのＴＧＦ−βの放出により濃縮が可能となり、これらの細胞を抑制（例えば、シャット・ダウン(shuts down)）する。これらの“破壊的な”細胞を抑制するＴＧＦ−βの能力は、破壊的な細胞に特異的な抗原とは無関係である。
破壊的な細胞の抑制を完成するための好ましい方法は、哺乳類への抗原の経口投与を選ぶことである。そして、前記抗原は、ＴＧＦ−βを放出するサプレッサーＴ細胞を顕現させるだけでなく、破壊的な細胞が高濃度で発見される哺乳類の体の中の部位をこれらのサプレッサーＴ細胞の標的とすることができる。サプレッサーＴ細胞にとって、好ましいそして有効な標的は、特別の自己免疫疾患における免疫攻撃下の器官または組織である。なぜならば、破壊的な細胞は、その器官または組織の付近に濃縮されているからである。この故に、バイスタンダー抗原（サプレッサーＴ細胞と特異的な）は、それ自身、攻撃下の組織または器官に特異的な抗原であることが好ましい。このように、バイスタンダー抗原は、自己抗原、あるいは好ましくは非疾患誘発フラグメント、あるいは自己抗原の類似体であってもよい（誘発疾患、あるいは組織破壊に含まれる自己抗原のエピトープの一部は、バイスタンダー抑制に含まれるものとは同じものではないという証拠がある。これは、以下実施例６に示す）。しかしながら、もっと重要なことは、バイスタンダーは自己抗原ではない他の抗原であってもよいということである。この故に、自己抗原（あるいは自己抗原群）は、同定される必要はない。
本発明による組織特異性バイスタンダー抗原のバイスタンダー抑制の機構を、より詳細に以下に示す。組織特異性バイスタンダー抗原は、経口投与（あるいは経腸投与、たとえば胃に直接）されるかあるいは吸入された後、小腸に入り込み、腸壁下にある免疫細胞の集合体であるパイエル板と呼ばれているものと接触する。逆に、これらの細胞は、脾臓やリンパ節を含む免疫系と連絡している。その結果、サプレッサー（ＣＤ８＋）Ｔ細胞が誘導され、自己免疫攻撃のエリアに増加していく。前記エリアは、ＴＧＦ−βの放出がされる箇所であり、また、前記ＴＧＦ−βは非特異的であり、哺乳類が有する組織に直接拮抗するＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するのと同様、Ｂ細胞をダウンレギュレートさせる。ＴＧＦ−βの活性の非特異性にもかかわらず、結果的なトラランスは、バイスタンダー抗原が、攻撃下の組織に特異的であり、損傷を受けている組織あるいはその近傍で発見される免疫細胞を抑制するという事実によって、自己免疫疾患に対して特異的である。
本発明の範囲内のバイスタンダーサプレッションの他の例は、自己抗原でもなく、攻撃下において組織あるいは器官に特異的でもない抗原の経口投与を含む。バイスタンダー抑制を活性にするために、同じ抗原を注入することが行われなくてはならない。摂取されたまたは吸入された抗原は、ＴＧＦ−βの放出させる微環境、経路、炎症が起こった組織（注入された抗原が位置する）を標的とするサプレッサーＴ細胞の構成を顕現させる。一度、放出されたＴＧＦ−βは、組織破壊細胞を含む全ての免疫攻撃細胞を抑制する。
ＴＧＦ−β
ＴＧＦ−βは免疫系の細胞（例えば、ＴまたはＢリンパ球）に影響を及ぼす。その結果、炎症性の反応にも影響を及ぼす。Ｔ−リンパ球（そして、他の細胞）は、ＴＧＦ−βを生産する。すなわち、免疫系応答の結果（Ｔ−細胞の活性後）、のカスケードにおいて比較的遅く放出され、ＴおよびＢ細胞の増殖を高度に抑制する。多数の通常の組織は、ＴＧＦ−βを生産する能力を有する。これらは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞及び活性化大食細胞と同様、ヒトの血小板、胎盤、ウシの腎臓、骨、ＮＫ細胞を含む。ＴＧＦ−βの分離と、生物的性質は、トランスフォーミング成長因子β  化学、生物学、及び治療学、Piez, K.A. et al., eds., Ann. N. Y. Acad. Sci. 593: 1-217, 1990に記載されている。
ＴＧＦ−βは、当初は成長因子として確認されていなかったが、齧歯動物及びヒトにおける、Ｂ及びＴ細胞の阻害や、ＣＤ８＋細胞よりも高い、ＣＤ４＋細胞の活性の阻害を含む、多数のそして重要な免疫調整特性を有する物質であることが即座に確認された。また、ＴＧＦ−βは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ガンマ・インターフェロン（ＩＮＦ−γ）、ブロック細胞障害性リンパ球活性のような炎症性のシトキンを弱め、インターロイキン−Ｉ（ＩＬ−１）、インターロイキン−ＩＩ（ＩＬ−２）のレセプターの誘導を阻害することが知られている。それゆえ、これらシトキンを感応の鈍い細胞とすることができる。ＴＧＦ−βは、分子量が２５ｋＤで、多数の鎖間ジスルフィド結合によって結合された２つの同一の１２．５ｋＤサブユニットから構成されるタンパク質である。そして、少なくとも、活性、潜伏性の２つの種類のＴＧＦ−βが存在する。活性ＴＧＦ−βは、半減期が短く、小さな容量分布を有しているが、潜伏性ＴＧＦ−βは、半減期が長く、大きな容量分布を有している。２つのＴＧＦ−βのイソ型が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２として存在する。ＴＧＦ−β１が、バイスタンダー抑制に含まれると考えられている。
動物モデル
本明細書を通じて、自己免疫疾患研究のために発達してきた種々のモデル系に対して参照がなされた。実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）が、ネズミ及び他の哺乳類種において、多発性硬化症（ＭＳ）のモデルとして研究された。当業者は、ＭＳに対する実質的に全ての潜在的免疫治療が、第１にこの動物モデル系で試験されたことを知っている。その疾患は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはプロテオリピドタンパク（ＰＬＰ）、及び（完全フロイントアジュバント、ＦＣＡのような）アジュバントの腸管外投与によって引き起こされる。いずれかの抗原によるこの処理は、（その種及び投与の詳細に依存して）、脱髄疾患の単相及び増進／停止形態の両方を引き起こす。引き起こされた疾患は、自己免疫疾患ＭＳの特徴を有している。
油中の結核菌と完全フロイントアジュバントの、感受性の哺乳類の後根尾部への腸管外投与は、ヒトのリウマチ様関節炎の特徴を持つ疾患を引き起こす。同様な方法で、タイプＩＩコラーゲンとアジュバントの腸管外投与も、ヒトのリウマチ様関節炎の特徴を持つ疾患を引き起こすだろう。
ルイスラットへのＳ−抗原またはＩＲＢＰ−抗原とアジュバントの投与は、自己免疫性葡萄膜網膜炎を引き起こし、一方、ＮＯＤマウス及びＢＢラットにおいては、糖尿病が自発的に進行する。
上述したモデル系のひとつまたはそれ以上は、本発明によって提供された効力及び改善された治療を示すために採用できる。実際に、それらの動物モデルは、バイスタンダー抑制を含む治療の試験に対して特に好適である。これは、この機構が、それらに特異的な抗原に関わらず、すべての免疫攻撃細胞を抑制させ、従って、ヒトの自己免疫性の病気とその動物モデルとの間の、実際のまたは潜在的な多数の相違により影響を受けないからである。
上記の動物モデルは、本発明の、哺乳類（ヒトを含む）での有用性の確立に使用することができる。例えば、本願発明者は、ダブル−ブラインド(double-blind)研究において、多発性硬化症抗原、ウシのミエリンを、ヒトに経口投与し、ある患者亜群が、この処理からかなりの恩恵を受けることを見いだした。さらに、ヒトにおける関節痛、ＡＭこわばり、握り強さ等の、リウマチ性関節炎の徴候は、経口コラーゲン（０．１−１．０ｍｇ１日１回投与）を受けて連続的に抑制された。最後に、経口Ｓ−抗原のヒト試験は、葡萄膜網膜炎に対して非常に助長する結果を示した。これらのヒト試験の全ては、適当な疾患モデルを用いた動物データに基づいて試みられた。よって、自己免疫疾患の治療的処理のための動物モデルの予想値は、実質的に高められた。
バイスタンダー抗原
疾患の間攻撃を受けている組織に特異的でないバイスタンダー抗原は、非毒性抗原物質の中で、例えば実施例１におけるＯＶＡに対して用いたものと同様な検定系を使用して同定できる。
組織または器官に特異的なバイスタンダー抗原は、検知可能なＴＧＦ−βの放出を引き起こすそのような抗原の能力を試験することによって簡単に同定できる。例えば、ひとつまたはそれ以上の潜在的組織特異的バイスタンダー抗原は、自己免疫性攻撃の標的である器官または組織から、良く知られた抗原精製方法を用いて精製される。
バイスタンダー抗原及び自己抗原（それらの任意のもののフラグメント及び類似体も同様に）は、当業者にはよく知られた技術を用いた、細菌、酵母菌、昆虫（プサカラン(Psacalan)ウィルス）及び哺乳類の細胞中での、再配列ＤＮＡ技術を用いても得ることができる。多くの潜在的及び実際のバイスタンダー抗原のアミノ酸配列は知られている（好ましくは、疾患誘発性エピトープは用いられるべきではない）：例えば、Hunt, C. et al PNAS(USA), 82: 6455-6459, 1985（熱衝撃タンパク質ｈｓｐ７０）；Burkhardt, H., et al., Eur. J. Immunol. 21: 49-54, 1991（抗原性コラーゲンＩＩエピトープ）；Tuohy, V.K., et al., J. Immunol. 142: 1523-1527, 1989（マウスＰＬＰの起脳炎決定基）；Shinohara, T., et al., In Progress in Retinal Research, Osborne, N. & Chader, J. Eds, Pergamon Press 1989, pp. 51-55（Ｓ−抗原）；Donoso, L.A., et al., J. Immunol. 143:79-83, 1989（ＩＲＢＰ）；Borst, D.E., et al., J. Biol. Chem. 264: 115-1123, 1989（ＩＲＢＰ）；Yamaki, K., et al., FEBS 234: 39-43, 1988; Donoso, L.A., et al., Eye Res. 7: 1087, 1988（ＩＲＢＰ）；Wyborski, R.J., et al., Mol. Brain Res. 8: 193-198, 1990（ＧＡＤ）。
ウシＰＬＰ；ウシ、ヒト、チンパンジー、ラット、マウス、ブタ、ウサギ、モルモットＭＢＰ；ヒト及びウシコラーゲンアルファ−１（ＩＩ）及びウシコラーゲンアルファ−１（Ｉ）；及びヒトインシュリンのアミノ酸配列を、出版物から取り出したものであるが、便利のために補足Ａに与えた。
さらに、いくつかの組織特異的抗原が商業的に入手可能である：例えば、インシュリン、グルカゴン、ミエリン塩基性タンパク質、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、等。
そこで、潜在的バイスタンダーは、哺乳類に与えることができ、これらの哺乳類からのＥＡＥまたはＭＳの場合、例えば、血液または脳脊髄液からの脾臓細胞またはサーキュレーティング(circulating)Ｔ−細胞を取り出し、同じ抗原でインビトロで刺激することができる。刺激によって引き出されたＴ−細胞は、精製され、希釈液はＴＧＦ−β含有量を、例えば、ＴＧＦ−βに対して生成した、好適な商業的に入手可能なポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル抗体を用いて、あるいは、商業的に入手可能なミンク肺上皮細胞列を用いた後述の実施例１に示すような他の知られたＴＧＦ−β検出検定を用いて、定量的及び／または定性的に試験される。ＴＧＦ−βの試験のそのような方法は、後述の実施例では詳細に説明する。自己抗原から導かれるペプチドのバイスタンダー能力の確認方法もまた実施例中で説明する。
バイスタンダー抗原の用途−投与法（薬用量）
本発明のバイスタンダー抗原に誘引されたトラランスは、経口（または経腸）もしくは吸入投与の広い範囲に渡って投与量依存性である。しかし、最小及び最大の有効投与量が存在する。言い換えれば、自己免疫性疾患の臨床的及び組織学的特徴の抑制は、特別な投与量範囲で起こるが、それは疾患に応じて、哺乳類の種に応じて、そしてバイスタンダー抗原に応じて変化する。例えば、その疾患がマウスにおけるＰＬＰ−またはＭＢＰ−誘起性ＥＡＥである場合、ＭＢＰをバイスタンダーとして用いたときの抑制できる投与量範囲は、約０．１から約１ｍｇ／マウス／給餌（給餌を、ほぼ１日おきに行って、例えば、１０−１４日に渡って５−７給餌）。最も好ましい投与量は０．２５ｍｇ／マウス／給餌である。ラットにおける同じ疾患の抑制については、ＭＢＰの抑制できる投与量範囲は、約０．５から約５ｍｇ／ラット／給餌であり、最も好ましい投与量は１ｍｇ／ラット／給餌である。ＭＳのヒトに有効な投与量は、ＭＢＰを用いる場合、１日に約１から約１００、好ましくは約１から約５０ｍｇのＭＢＰ（毎日または１日おきに投与）であり、最適値は約３０ｍｇ／日である。
リウマチ様関節炎に対しては、タイプＩまたはタイプＩＩコラーゲンのいずれかを受容しているヒトに対する有効な投与量範囲は、約０．１から約１ｍｇ／日である。ネズミにおけるアジュバント誘起性関節炎に対する有効コラーゲン投与量範囲は、ＥＡＥに対するものと同じ給餌計画によれば、約３から約３０マイクログラム／給餌である。
有効投与量範囲と最適量の確認は、当業者にとって良好である。例えば、哺乳類に対する投与量及びヒト投与量は、比較的低い投与量（例えば１ミリグラム）からはじめて、徐々にそれを増やし（例えば対数的に）、血液中のＴＧＦ−β量を測定し、及び／または、（例えば１から５で記録したり、または攻撃の数を測定したり、または疾患のタイプに応じて、関節腫脹、握り強さ、こわばり、視力等を測定するといった）よく知られた記録方法に従って疾患の重篤さを記録することにより決定することができる。最適投与量は、血液中にＴＧＦ−βの最大量を生成するものであり、及び／または、疾患徴候の最大の減退を引き起こすものである。有効な投与量範囲は、治療されるべき疾患に特徴的な徴候の少なくともひとつの、少なくとも統計学的に有意義な希薄化を生ずるものである。
本発明は、自己免疫性疾患の危険にさらされている感受性の個人における自己免疫性疾患の開始の防止にも有利に使用できる。例えば、進行性タイプ１糖尿病の危険性にさらされている患者の識別は現存し、信頼され、最近米国糖尿病協会（ＡＤＡ）によって裏書きされている。（特に組み合わせにおいて）タイプ１糖尿病に対する感受性を評価する高い予想値を持つ種々の検定系が発達してきている(Diabetes Care 13: 762-775, 1990)。ひとつの好ましいスクリーン試験の詳細が、当業者に入手可能である（Bonifacio, E., et al., The Lancet 335: 147-149, 1990）。
実用的な見地から、ほとんどの自己免疫疾患の開始を防止することは、糖尿病の場合の測定のように重要ではない。ＭＳ、ＲＡ、ＡＴ及びＡＵＲは、実際の組織破壊が起こる以前の初期の段階で宣言され、従って、これらの疾患の抑制治療は、糖尿病の場合ほど重要ではない。
自己免疫疾患、及び、組織または器官特異的な、確認されたまたは潜在的な、経口または吸入形態で投与されたとき、これらの疾患の治療に有効なバイスタンダー抗原の、限定されないリストを以下の表１に示す。各個の疾患に対する挙げられた抗原の組み合わせの投与もまた、疾患の治療に有効であると予想される。
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任意の自己免疫疾患に対して、組織抽出物は、特異的なバイスタンダー抗原と同じように用いることができる。例えば、ミエリンはＭＳに対して用いられ、膵臓抽出物は、タイプ１糖尿病に対して用いられる。しかし、個々の抗原をひとつまたはそれ以上投与するのが好ましい。
そのように、本発明によれば、タイプ１糖尿病を治療するとき、（上述のように決定した）有効な量のグルカゴンを、経口または吸入によって投与できる。グルカゴンは、特に膵臓に存在する。しかし、グルカゴンは自己抗原ではない。なぜならば、それはタイプ１糖尿病の間に破壊される膵臓ベータ細胞であり、一方グルカゴンは、異なる細胞種であるアルファ細胞中にのみ見いだされるからである。従って、グルカゴンは、自己抗原活性を持たない「純粋な」バイスタンダーである。
インシュリンは、明確にタイプ１糖尿病に対するバイスタンダー活性を有している。現時点では、インシュリンが自己抗原でもあるかどうかは知られていない。しかし、機能の機構がいかなるものであれ、経口、経腸、または吸入可能なインシュリン製剤は、審査中の共同出願した特許出願である出願番号５９５，４６８にあるように、タイプ１糖尿病の特徴を有する疾患の抑制に有効である。
多発性硬化症の特徴を有する疾患に対して、ＭＢＰの非誘引性フラグメント、例えばモルモットＭＢＰアミノ酸２１−４０からなるペプチドは、ＭＢＰ誘引性疾患（即ち、ＭＢＰが自己免疫の攻撃の第１の標的であるとき）のみならず、ＰＬＰ誘引性疾患（即ち、ＰＬＰが自己免疫の攻撃の第１の標的であるとき）に対してもバイスタンダーとして振る舞う。
リウマチ様関節炎及びその動物モデルに対しては、タイプＩ及びタイプＩＩコラーゲンがバイスタンダー活性を有する。
葡萄膜網膜炎の特徴を持つ疾患に対しては、Ｓ−抗原がバイスタンダー活性を有する。
自己抗原でもあるこれらのバイスタンダー抗原の非誘引性フラグメントは好ましい。そのようなフラグメントは、実施例３のオーバーラップ・ペプチド法（これは一般的な方法であるが、実施例３では、特にＭＢＰの非誘引性フラグメントの同定について説明される）を用いて同定することができる。
本発明者らは、経口投与された自己抗原及びバイスタンダー抗原の両方が、特にＴＧＦ−βの生成及び／または放出を誘起するエピトープを有していることを見いだした。例えば、ＭＢＰの免疫優性エピトープは、以前に開示されているが、即ち、患者のＣＤ４＋Ｔリンパ球の大多数が認識し、免疫抑制エピトープへの応答において増殖し、または患者の抗体の大多数が認識するもの、即ち、ＴＧＦ−βの生成及びまたは放出を引き起こすものは、本発明以前に開示も示唆もされていない。従って、これらのエピトープを含むペプチドの、経口または吸入による投与は、バイスタンダー抑制の誘引において、全抗原の投与より特異的であると予想され、抗原の疾患誘引性または疾患促進性部位を動物に感作する危険もない。免疫抑制エピトープは、ＭＢＰペプチド２１−４０の同定に関する実施例３で説明する方法を用いて同定できる。（図１４も参照）
バイスタンダー抗原は、自己免疫疾患の治療及び予防のために、（有効な組み合わせで）自己抗原とともに投与できる。自己抗原の投与は、先に述べた米国特許出願の出願番号４６０，８５２、５９６，９３６、４５４，４８６、５５１，６３２、５０２，５５９、６０７，８２６及び５９５，４６８に開示されたように行われる。特別な自己抗原（及び好ましくは自己抗原の非誘引性フラグメント）と他のバイスタンダー抗原との共投与が、自己免疫疾患を有効に抑制することは、先に出願されている。
さらに、上記の有効性を向上させるために、相乗剤を加えることができる。本発明で使用するための相乗剤の非限定的な例は、イー・コリ(E.coli)及びサルモネラの種々のサブタイプのようなグラム陰性細菌の多くのものからの細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ、シグマ・ケミカル、セント・ルイス、ＭＯ；ディフコ(DIfco)，デトロイト、ＭＩ；バイオモル・レス・ラブス(BIOMOL Res. Labs.)、プリマス、ＰＡ）、リピドＡ（シグマ・ケミカル、セント・ルイス、ＭＯ；アイシーエヌ・バイオケミカルズ(ICN Biochemicals)、クリーブランド、ＯＨ；ポリサイエンス・インク(Polyscience Inc.)、ウェリントン、ＰＡ）、及び、デレス・ケー(Deres, K.)ら(Nature, 342: 561-564, 1689)に開示されたように得られるトリパルミトイル−Ｓ−グリカリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ3Ｃ５５）に共有結合したペプチド、または、ブラウン・ヴィ(Braun, V.）ら(Biochem. Biophis. Acta 435: 335-337, 1976)に開示されたように得られるイー・コリからの「ブラウンズ(Brauns)」リポタンパクのような免疫調節リポタンパクを含んでいる。ＬＰＳが好ましく、リピドＡは特に好ましい。リピドＡは、全ＬＰＳ分子より毒性が低いので、本発明で用いるのは特に好ましい。本発明で用いるＬＰＳは、グラム陰性細菌から抽出でき、ガラネス(Galanes)ら(Eur. J. Biochem. 9: 245, 1969)及びスケリー・アール・アール(Skelly, R. R.)ら(Infect. Immun. 23:287, 1979)の方法を用いて精製できる。
製剤
他の態様において、本発明は、自己免疫疾患にかかった哺乳類の治療用の経口薬剤の製剤も提供する。その製剤は、（以下に説明するように、）自己免疫疾患を抑制するのに有効な量のバイスタンダー抗原からなる。その製剤は、さらに、１９９０年３月２日に出願された審査中の米国特許出願、出願番号４８７，７３２に開示されているような相乗剤を、（本発明のバイスタンダー抗原とともに）、特別な自己免疫疾患の臨床的徴候を処理するのに有効な量含んでいてもよい。相乗剤は、バイスタンダー抗原とともに投与されたとき、標的器官の近傍における、シトキンＰＧＥ（プロスタグランジン−Ｅ）及びＩＬ−４（インターロイキン−４）の増加をもたらす。
この議論を通して、本発明の治療に従う自己免疫疾患のひとつの徴候の統計学的に有意義な希薄化も発明の範囲内であることが理解されるであろう。
本発明による各経口（または経腸）製剤は、製薬上許容されるキャリア、希釈剤、フィラー、可溶化または乳化剤、及び塩といったこの分野でよく知られた不活性成分が付加されてもよい。例えば、錠剤は、この分野でよく知られた固体キャリアを用いて、従来の方法に従って製剤できる。本発明で採用されるカプセル剤は、ゼラチンまたはセルロース誘導体のような製薬上許容される材料から製造される。１９８７年１１月３日に発行された米国特許番号４，７０４，２９５；１９８５年１２月３日に発行された米国特許番号４，５５６，５５２；１９８２年１月５日に発行された米国特許番号４，３０９，４０４；１９８２年１月５日に発行された米国特許番号４，３０９，４０６に記載されたような、持続放出経口デリバリ・システム(delivery system)及び／または経口投与される投薬形態の経腸被覆もまた考えられる。
固体キャリアの例は、澱粉、砂糖、ベントナイト、シリカ、及び他の一般に用いられているキャリアを含む。さらに、本発明の製剤に使用できるキャリア及び希釈剤の非限定的な例は、塩化ナトリウム水溶液、シロップ、デキストロース、及び水を含む。
各投与形態の個々の投薬に含まれる活性成分の単位含有量は、それ自体で有効量をなす必要はない。なぜならば、必要な有効量は、複数の投薬単位（カプセルまたは錠剤またはそれらの組み合わせ）を投与することによって達成されるからである。
本発明のバイスタンダー抗原の投薬経路は、経口または経腸が好ましい。好ましい経口または経腸薬剤の製剤は、例えば、本発明のバイスタンダー抗原のひとつまたはそれ以上の有効量を含み、有効量の相乗剤を含むかまたは含まない丸薬あるいはカプセルからなる。
一般に、経口または経腸で投与されるとき、バイスタンダー抗原は、単一投与形態あるいは複数投与形態で投与されてよい。
バイスタンダー抗原とともに投与されるべき有効量の相乗剤、例えば、ＬＰＳまたはリピドＡは、１日に、前記哺乳類の体重１ｋｇ当たり、約０．１５から１５ｍｇ、好ましくは、１日に前記哺乳類の体重１ｋｇ当たり、０．３から１２ｍｇの広い範囲にある。
本発明の他の好ましい実施態様にあっては、本発明の薬剤の製剤または投与形態は、自己免疫疾患にかかった哺乳類に対して、吸入、好ましくはエアロゾル形態で投与することができる。吸入方式の投与は、鼻の通路ではなく、気管及び肺の粘膜を通すのが好ましい。
１９８９年１２月２０日に出願された審査中の米国特許出願、出願番号４５４，４８６に開示されている実験的な自己免疫脳脊髄炎をミエリン塩基性タンパク質で、及びアジュバント関節炎のコラーゲンで治療する際に見られるように、自己免疫疾患の治療のためのエアロゾル投与を用いることは、本発明のバイスタンダー抗原のより低い量を必要とすることが予想される。エアロゾル投薬形態で投与される本発明のバイスタンダー抗原の量は、１日に、哺乳類の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから約１５ｍｇであり、任意に、１日に、哺乳類の体重１ｋｇ当たり約０．１から約１５ｍｇの相乗剤を、単一投与形態または複数投与形態で投与してもよい。投与すべき正確な量は、患者の疾患の段階及び重篤さ、及び患者の肉体的状態に依存して変化するであろう。
本発明のエアロゾル薬剤の製薬は、任意の成分として、この分野でよく知られたタイプの、製薬上許容されるキャリア、希釈剤、可溶化及び乳化剤、及び塩を含んでいてもよい。そのような物質の例は、生理学的に緩衝された水酸化ナトリウム水溶液のような標準水酸化ナトリウム水溶液、及び水を含む。
本発明のこの他の実施態様によるバイスタンダー抗原の投与経路は、エアロゾルまたは吸入形態である。本発明のバイスタンダー抗原及び関連化合物は、乾燥粉体粒子として、またはキャリア・ガス（例えば、空気またはＮ2）中に懸濁させた噴霧した水溶液として投与することができる。好ましいエアロゾル薬剤の製剤は、例えば、本発明のバイスタンダー抗原を約１ｍｇから約３００ｍｇ含む生理学上許容される緩衝水酸化ナトリウム水溶液からなる。
液体に溶解せず、懸濁もしていないバイスタンダー抗原の、微細に分割した固体粒子の形態をした乾燥エアロゾルもまた、本発明の実用において有用である。バイスタンダー抗原は、ダスティング(dusting)粉体の形態にあってもよく、平均粒子寸法が約１から５ミクロン、好ましくは２から３ミクロンの微細に分割した粒子からなってもよい。微細に分割した粒子は、この分野でよく知られた技術を用いて、粉砕及びスクリーン・フィルトレーション(screen filteration)によって調整される。その粒子は、予め決められた量の微細に分割した材料を吸入によって投与され、それは粉体の形態であることができる。
本発明のエアロゾル薬剤の製剤において有用なキャリア及び／または希釈剤の、特別な非限定的な例は、水、及び、燐酸緩衝水酸化ナトリウム水溶液ｐＨ７．０−８．０のような、生理学的に許容される緩衝水酸化ナトリウム水溶液である。さらに、本発明のエアロゾル薬剤の製剤または投与形態において使用される好適なキャリアまたは希釈剤の非限定的な例は、１９８７年４月２１日に発行された米国特許番号４，６５９，６９６、１９８９年９月５日に発行された４，８６３，７２０、及び１９８７年１０月６日に発行された４，６９８，３３２に開示されている。
本発明の薬剤の製剤は、例えば、１９８６年１１月２５日に発行された米国特許番号４，６２４，２５１、１９７２年１１月２１日に発行された３，７０３，１７３、１９７１年２月９日に発行された３，５６１，４４４、及び１９７１年１月１３日に発行された４，６３５，６２７に開示されているもののような噴霧器を用いて、エアロゾル・スプレーの形態で投与することができる。エアロゾル材料は、治療されるべき主体に吸入される。
ニューマン・エス・ピー(Newman, S. P.)の、エアロゾル及び肺、クラーク・エス・ダブリュ(Clarke, S. W.)とダビア・ディー(Davia, D.)編、ｐｐ．１９７−２２４、ブッターワース(Butterworths)、ロンドン、英国、１９８４に開示されていように、加圧メータード・ドーズ・インハラー(meterd dose inhaler)（ＭＤＩ）及び乾燥粉体吸入器のような、他のエアロゾル・デリバリ・システムが、本発明を実用する際に使用できる。
ここで開示されるタイプのエアロゾル・デリバリ・システムは、フィッションズ・コーポレーション(Fisions Corporation)（ベッドフォード(Bedford)、ＭＡ）、シェリング・コープ(Schering Corp.)（ケニルワース(Kenilworth)、ＮＪ）、及びアメリカン・ファーマシール・カンパニー(American phemeseal Co.)（バレンシア(Valencia)、ＣＡ）を含む多くの販売元から入手可能である。
当業者には理解されるだろうが、本発明のバイスタンダー抗原の投与（経口またはエアロゾル形態）の、正確な投与量及び頻度は、バイスタンダー抗原の活性によって決まり、同様に、治療されるべき主体の年齢、体重、肉体的状態、及び同時投与または他の治療の欠落によって決まる。従って、使用される投与量及び投与計画の調節は、これらの因子を基に決めなければならず、それは実験的に決定する必要があるかもしれない。しかし、そのような決定は、ここのガイドラインに与えられた日常的実験以上のものを要求しない。
実験
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく本発明を例解するものであるが、この実施例において次のことが説明される：
実施例１は、ＴＧＦ-β１イソタイプの活性の形態はＭＢＰに特異的なＣＤ４+Ｔ細胞の抑制を媒介し、動物にＭＢＰを給餌することによって誘発されるＣＤ８+Ｔ細胞はＴＧＦ-βの放出を引き起こし、抑制の原因はＴＧＦ-βであることを示している。同じ例によって、自己抗原ではなくかつ自己免疫の攻撃下の組織又は器官に特異的でもない抗原は、ＴＧＦ-βの放出を引き起こすＴサプレッサー細胞の形成を引き出すことができることも説明される。このことは、オボアルブミンの経口投与によって例解される。しかし、オボアルブミンの問題は、これは自己免疫に苦しめられている組織に特異的でないため、これ自体は、自己免疫の攻撃に関与している細胞が見出され得る部位に、Ｔサプレッサー細胞を指し向けることができない。（この問題は実施例２に譲る。）実施例１は、全ての経口投与された抗原がバイスタンダー型抑制を引き起こすわけではない（ウシ血清アルブミンは引き起こさない）ことも例解している。
最後に、実施例１は、同じ機構（バイスタンダー抑制）がＭＢＰの経口投与によってＥＡＥの抑制において作用していることも説明している。
実施例２は、バイスタンダー抑制の能力のある抗体は経口投与の際にＴＧＦ-βの放出を引き起こすことと、さらに、この抗原によって引き出されるサプレッサーＴ細胞が自己免疫の攻撃に関与する細胞が見出され得る位置に補充され得るならば、それらの疾患を促進する細胞は抑制されることとを示している。さらに実施例２は、抗原が自己免疫の攻撃下にある組織に特異的ではないときであっても、この様な補充をもたらす仕方を提供する。最後に、実施例２は、ＴＧＦ-βの放出の準備をするサプレッサーＴ細胞は、抑制が起こるために抑制された細胞に出会う必要はないことを示している。
非特異的バイスタンダー抗原が効率的なバイスタンダーにされ得る（すなわち、疾患を促進する細胞の近傍でＴＧＦ-βの放出が起こるように「強いられる」）仕方は、同じ抗原を実質的に同時に注射すること（バイスタンダーの経口投与の前後２４時間以内）によるものである。例えば、ＯＶＡが動物に給餌され、次いでこれらの動物がＥＡＥを誘発するためにＭＢＰ／ＣＦＡで免疫化されたとき、ＯＶＡを用いた注射はＥＡＥを抑制することがわかった。これは、動物のリンパ節中のＯＶＡに特異的な細胞（これは、まさにＯＶＡに引き出されるサプレッサーＴ細胞の様に、ＯＶＡに特異的である）とＥＡＥを促進する細胞（ＯＶＡに引き出されるサプレッサーＴ細胞はこれを認識しない）との両方の濃度による。非特異的バイスタンダー抗原は、これらのサプレッサーＴ細胞が、これらが疾患を促進する細胞を抑制する部位に指し向けられ得るならば、自己免疫疾患と戦う際にも用いることができるであろう、という意味をこの治療のための説明は包含している。この様な非特異的バイスタンダー抗原の使用は、特異的バイスタンダー治療にとってのアジュバントとして主に考えられるが、これは明らかに本発明の範囲内にある。
実施例３は非誘発のフラグメントと、そしてより重要な、自己抗原でもある、あるバイスタンダーに関する免疫抑制エピトープ、すなわちＭＢＰ、とを同定するための技術を例解している。しかし、この技術は、一般的なものであり、アミノ酸配列がわかっている限り、いかなるバイスタンダー抗原にも適用可能である。（図１０，１１及び１４も参照。）
実施例３は、ＴＧＦ-βの放出の触発(triggering)にも、バイスタンダー抑制にも参加しない、自己抗原（例えば、ＥＡＥを誘発するフラグメントである、モルモットＭＢＰのイムノドミナント(immunodominant)エピトープ、ＭＢＰ７１-９０）の部分があることも示唆している。この様に、実施例３は、「純粋な」バイスタンダーが好ましく、自己抗原のうち少なくともイムノドミナント（疾患を誘発する）の部分は用いられるべきではなく、その代わりに、免疫抑制エピトープを含み疾患を促進するエピトープを除外するように構成物が作られなければならないことを例解している。実施例３は、バイスタンダー抑制の能力のある抗原中に免疫抑制のエピトープがあり、自己抗原の場合には、この免疫抑制のエピトープは、自己免疫応答の原因となるものとは異なることも示している。
実施例４は、実際に自己免疫応答及びその抑制に包含される細胞及びシトキンの型は、純粋な（対照）動物、又はＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置され及び／又はＭＢＰを給餌された、又はＭＢＰと相乗剤ＬＰＳとを給餌された動物の皮質及び小脳中に存在する（あるいは存在しない）ことを説明している。
実施例５は、タイプ１糖尿病（ＮＯＤモデル）に関連するインシュリン炎のバイスタンダー抑制におけるグルカゴンと同様に、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、及び４つのインシュリンのＢ鎖のフラグメントのそれぞれの効能を例解している。インシュリン炎、すなわち島の細胞で観察される炎症の応答は、タイプ１糖尿病の自己免疫の抑制の効能を測定するための適当なマーカー(marker)を提供する。なぜなら、インシュリン炎は、（ａ）タイプ１糖尿病と同じ機構によって触発され、（ｂ）自己免疫の破壊がなおも起こっている間にのみ、すなわちこの主体が少なくともある島の細胞の機能を維持している間に存続する。
実施例６は、ある自己抗原は、他の自己抗原に関するバイスタンダーとして単独で作用できることを説明している。この様に、ＭＢＰはＰＬＰに関してバイスタンダーであることが説明された。（ＰＬＰも、ＭＢＰで誘発される疾患を抑制する能力を有し、それゆえにＰＬＰはＭＢＰに関してバイスタンダーである。）
実施例６は、バイスタンダーの抑制とは異なり、Ｉ.Ｖ.トラライゼーションには、自己免疫の攻撃の標的である（あるいは動物モデル中で、疾患を誘発する）抗原と同じ抗原が投与されることが要求されることも示している。
実施例１：  ミエリン塩基性タンパク質への経口トラライゼーションによって生じたサプレッサーＴ細胞は、抗原特異性の触発に続くＴＧＦ-βの放出によるインビトロ及びインビボの両方の免疫応答を抑制する
下記の実験において、次の材料及び方法が用いられた。
動物．  メスの生後６-８週のルイス(Lewis)ラットをハーラン-スプレイグ ドーリー インク(Harlan-Sprague Dawley Inc.)（インディアナポリス，ＩＮ）から入手した。動物は任意に標準飼料及び水を与えて飼育した。
抗原．  １９９０年３月２日に出願された米国特許出願出願番号第０７／４８７，７３２号に開示されている、ディブラー(Deibler)他（Prep.Biochem.  ２：１３９，１９７２）の修正された方法によって、モルモットのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を脳組織から精製した。ゲル電気泳動及びアミノ酸分析によって、タンパク質含有量及び純度を確かめた。
試薬．  用いられた商業的試薬は次の通りである：  モノクローナルマウス抗ラットＩＮＦγ中和抗体（アムゲン バイオロジカルズ(Amgen Biologicals),サウザンド オークス(Thousand Oaks), ＣＡ）；モノクローナルハムスター抗マウスＴＮＦα+β抗体（ゲンザイム(Genzyme)，ボストン，ＭＡ）；ポリクローナルウサギ抗ＴＧＦ-β1+2中和抗体（アール アンド ディー システムズ，インク(R & D Systems, Inc.)，ミネアポリス，ＭＮ），及びインドメタシン（シグマ(Sigma)，セントルイス，ＭＯ）。ＴＧＦ-βのタイプ１イソ型タンパク質に関して特異的なシチメンチョウ抗血清を、前記したように（ダニエルプール，ディー．(Danielpour, D.)他， J. Cell. Physiol. 138:   ７９-８６，１９８９）調製した。
経口トラランスの誘発．  １８ゲージのステンレス鋼動物給餌針（トーマスサイエンティフィック(Thomas Scientific)，スウィーズボロー(Swedesboro)，ＮＪ）を用いた胃の挿管によって、１mlのＰＢＳに１mgのＭＢＰを溶解したもの又はＰＢＳのみをラットに給餌した。最後の給餌を免疫処置の２日前とし、２-３日の間隔で５回動物に給餌した。この目的は、トラランスを誘発することである。
上澄みによる増殖応答のインビトロ抑制．  最後の給餌の７-１４日後に脾臓細胞を取り除き、この脾臓をステンレス鋼のメッシュに押し通して単一細胞の懸濁物を調製した。上澄みを調製するために、５ｘ１０6細胞/mlの濃度の脾臓細胞を、１０mlの増殖媒体中のＭＢＰ（５０μg/ml）を用いてインビトロで刺激した。増殖媒体は、２ｘ１０5Ｍの２-メルカプトエタノール、１％のピルビン酸ナトリウム、１％のペニシリンとストレプトマイシン、１％のグルタミン、１％のヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、１％の非必須アミノ酸、及び１％の自己由来の血清を補った、ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ(GIBCO)，グランド アイランド(Grand Island)，ＮＹ）からなる。２４時間で上澄みを収集し、前に記したように１００μlを２．５ｘ１０4のＭＢＰ特異性Ｔ細胞に加え、増やし、維持して（ベン-ナン，エイ．(Ben-Nun, A.)他，Eur. J. Immunol. 11: １９５-１９９，１９８１）、そして１００μlの増殖媒体中で５ｘ１０5の照射された（２５００rad）胸腺細胞を用いて培養した。丸底の９６ウエル(well)のプレート（コスター(Costar)，ケンブリッジ，ＭＡ）中で実験を３度行った。湿された６％ＣＯ2及び９４％空気の雰囲気を有するインキュベーター中で３７℃で７２時間細胞を培養し、培養の最後の１８時間の間、１μＣｉの3Ｈチミジンを用いてそれぞれのウエルをパルスした(pulsed)。培養をマルチハーベスター(multiharvester)を用いてファイバーグラスフィルター上に収集し、標準液体シンチレーションの技術を用いて計数した。
この目的は、経口トラライゼーションの際に生成する可溶の因子に関する検定系を設定することである。
Ｔ細胞サブセットの精製．  クルイクシャンク(Cruikshank)（J. Immunol. 138：3817-3823,1987）の修正された方法に従って、磁気ビーズを用いて負の選択をすることによって、リンパ球サブセットを減少させた。脾臓細胞を、氷上で３０分間、マウス抗ラットＣＤ８、ＣＤ４又はＢ細胞モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）（それぞれ、クローンＯＸ／８、Ｗ３／２５、又はＯＸ／３３、セロテック／バイオプロダクツ(Serotec/Bioproducts)，インディアナポリス，ＩＮ、より商業的に入手可能）の１：１０の希釈物を用いてインキュベートし、２度洗浄し、次に、ヤギ抗マウスＩｇＧが共有結合的に付着した、４．５μm（Ｍ-４５０）の平均直径を有する、予備洗浄した磁気粒子（ダイナル インク(Dynal Inc.)，フォートリー(Fort Lee)，ＮＪ）に加えた。用いられた磁気ビーズの量は、概算される標的細胞の個数の１０倍となるように計算された。この細胞を、１０ml丸底試験管（ヌンク(Nunc)）中の、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補った０．５mlのＲＰＭＩ１６４０中で、このビーズを用いて、５分毎に穏やかに振りながら、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、このビーズ／細胞懸濁物を５mlの媒体で洗浄し、この細胞-ｍＡｂ-ビーズ複合体を、磁気粒子コンセントレーター(concentrator)（ダイナル-ＭＰＣ-１）を２分間用いて、強力な磁場中で標識されていない細胞から分離した。上澄みを取り除き、この手順を２回繰り返して非付着の部分を得た。このＴ細胞及びＢ細胞を減少させた集団の細胞は、間接流動細胞計測法で示されたものによれば、＞９５％ＣＤ４+ＣＤ８-、ＣＤ４-ＣＤ８+、又はＣＤ４+ＣＤ８+、又はＣＤ４+ＣＤ８+ＯＸ／３３-（Ｂ細胞を減少させたもの）であった。ＭＢＰを給餌された、あるいは対照を給餌された動物からの脾臓の集団全体（５ｘ１０6細胞）を、血清の無い増殖媒体１ml中で、ＭＢＰ（５０μg/ml）の存在下で培養した。減少された集団を、２．５ｘ１０6細胞/mlの濃度で培養した。２４時間後に上澄みを収集し、１００μlを上述したようにレスポンダー(responder)細胞に加えた。
この目的は、どのＴ細胞がバイスタンダー抑制に関わっていたかを決定するために、Ｔ細胞の特異的サブセットを単離することである。
抗シトキン抗体を用いた上澄みの処置．  ＭＢＰを給餌された、及び対照の動物からの脾臓細胞（増殖媒体中で５ｘ１０6/ml）を、ＭＢＰ（５０μg/ml）の存在下で、インターフェロン-ガンマ（ＩＮＦγ）、ＴＧＦ-β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α+βに抗する中和する抗体と共に、又はインドメタシンと共に、７２時間インキュベートした。抗体は（１：２５０，１：５００，１：１０００）の濃度の範囲で試験され、インドメタシンは０．５−１μg/mlの濃度で試験された。２４時間後に、上澄みを収集し、遊離の抗体又は抗体-シトキン複合体を、磁化できる重合体のビーズ（ダイナビーズ(Dynabeads)，ダイナル インク，フォート リー，ＮＪ）を用いて除去した。抗イムノグロブリン抗体と対にしたビーズを３０分間、４ｘ１０7ビーズ/mlの濃度でインキュベートし（それぞれの試料について２回行った）、そしてリアバク(Liabakk)他（Scand. J. Immunol. 30: ６４１，１９８９）の修正された方法によって、ダイナル磁性粒子コンセントレーター（ダイナル，ＭＰＣ-１）を用いて除去した。
これらの実験の目的は、経口トラライゼーションに際して生成された可溶性のシトキンを検討することである。
血清の無い培養の上澄み中のＴＧＦ-βの測定．  血清の無い培養の上澄みを、前に記されたように（ケーリ(Kehri)他J. Exp.Med.163:1037-1050, 1986；ワール(Wahl)他J. Immunol.145:2514-2419,1990）収集した。簡潔に言えば、モジュレーター細胞を、増殖媒体中でＭＢＰ（５cμ1/ml）を用いて８時間最初に培養した。その後で、細胞を３回洗浄し、７２時間の培養の残り時間で血清の無い媒体中で再懸濁し、収集し、次いで検定するまで氷結した。上澄み中のＴＧＦ-βの含有量およびイソ型タンパク質のタイプの決定を、ダニエルプール他（上述）によってミンクの肺上皮細胞列(cell line)（アメリカンタイプ培養コレクション(American Type Culture Collection)，ベセズダ(Bethesda)，ＭＤ  ＃ＣＣＬ-６４）を用いて行い、前に記されたように（ダニエルプール他成長因子(Growth Factors)2:61-71,1990）によるサンドイッチ(Sandwich)免疫検定法（ＳＥＬＩＳＡ）の検定によって確定した。前もって試料を酸で活性化しない検定によって、パーセント活性ＴＧＦ-βを決定した。
これらの実験の目的は、経口的にトラライズされた動物から得られたＴ細胞によって生成されたＴＧＦ-βのイソ型タンパク質を測定し決定することである。
動物の免疫処置．  実質的なＥＡＥ疾患状態を誘発するために、ルイスラットを、左のフードパッド(food pad)内に、５０μl中の２５μgのＭＢＰであって、４mg/mlのヒト型結核菌（ディフコ(Difco)）を含有する同体積の完全フロイントアジュバント中で乳化されたものを用いて、免疫化した。
抗ＴＧＦ-β抗血清および対照血清のインビボ投与．  タイプ１イソ型タンパク質に特異的なシチメンチョウ抗ＴＧＦ-β抗血清をインビボ実験のために用いた。これは前に調製され、特定されたものである（ダニエルプール他，１９９０，上述）。注射の前に血清を５６℃で３０分間熱不活性化した。様々な濃度（最終体積１００μlまでＰＢＳ中で希釈された、１２．５、２５、又は５０μl）の抗ＴＧＦ-β抗血清又は対照シチメンチョウ血清を用いて、ＭＢＰ／ＣＦＡ免疫処置に関して−２、０、＋２、＋４、＋６日目に５回、動物（グループあたり５匹）の腹腔内（Ｉ．Ｐ．）に注射した。１μgの抗血清は、Ｉ-ＴＧＦ-β1のＡ５４９細胞に対する結合の活性４mg/mlを遮断した（ダニエルプール他，１９９０，上述）。経口トラライズされた動物と、経口トラライゼーションなしでＥＡＥを発達させる動物との両方に対して、インビボ処置を与えた。
これらの実験は、インビボでの経口トラランス誘発に関する抗ＴＧＦ-β抗血清の効果を検討し、ＴＧＦ-β活性が廃棄されるかどうかを確かめるために実施された。
臨床評価．  インビトロ検定と臨床上の疾患との相関性を検討するために、見えないようにした(blinded)仕方で毎日、ＥＡＥの徴候に関して動物を評価した。ＥＡＥの臨床上の重症度(severity)は、次のように採点された：  ０，疾患なし；１，尾の弱り；２，後脚の麻痺；３，後脚の対麻痺、失禁；４，四肢麻痺；５，死亡。疾患の持続期間は、各動物に関して、疾患の始まり（通常、免疫処置後第１０又は１１日）から完全な回復又は死亡までの合計日数を数えて測定した。
遅延型過敏症（ＤＴＨ）検査．  耳中の皮下に、ＰＢＳ中の２５μgのＭＢＰを注射して、ＤＴＨを検査した。測微計カリパス（ミツトヨ、日本）を用いて、見えないようにした観測者によって、免疫性テスト(challenge)の前及び４８時間後に、厚さを測定した。免疫性テストの前後の耳の厚さにおける変化を各動物に関して記録し、その結果を各実験グループ±ＳＥＭに関する平均として現した。
ＤＴＨ応答を観測した。なぜなら、これらは、ＥＡＥがそうであるように、ＣＤ４+Ｔ細胞によって仲介されるからである。
統計的分析．  ワン−テイルド(one-tailed)スチューデントt-検定を用いて平均の比較を行い、グループ間の疾患の発生率を比較する際にカイ二乗解析（当該技術において通常の知識を有する者に公知のもの）を用いた。
ＭＢＰに経口トラライズされ、ＭＢＰによってインビトロで刺激されたラットからのＢ細胞又はＴ細胞サブセットを減少した脾細胞から収集された上澄みが、ＭＢＰ系(line)を抑制することができるかどうか決定するために、実験を行った。図１に示された通り、ＭＢＰ系の増殖の減少は、ＭＢＰを給餌した、及びＭＢＰを用いてインビトロで刺激された動物からの、Ｂ細胞欠如又はＣＤ４欠如脾細胞からの、上澄みの追加と共に起こった。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を給餌された動物の細胞からの、又はＭＢＰを給餌された動物より得られたＣＤ８欠如脾細胞からの上澄みを用いた場合は、抑制は起こらなかった。このことは、抑制が給餌された抗原と、必要なサプレッサーＴ細胞とに特異的であることを示唆している。
公知のシトキンが抑制を媒介することに関与しているかどうかを決定するために、サプレッサー活性を有すると仮定されるシトキンに対する中和する抗体を、抑制を排除するために上澄みに加えた。図２に示されたように、ウサギ抗ＴＧＦ-β抗体は、投与量に依存するように、上澄みによって媒介される抑制を排除した。ＩＮＦγ、ＴＮＦ-α+βに対する中和抗体について、又はインドメタシン、プロスタグランジン遮断薬、が加えられたときは、抑制に関する効果は見られなかった。抗ＴＧＦ-β抗体が、ＭＢＰ特異性のレスポンダーＴ細胞系に直接加えられたときは、抑制は起こらなかった（データは示されていない）。このことは、ＴＧＦ-βが、図１で観察された抑制に関与し、可溶性因子によることを示唆している。
ＭＢＰを給餌され、ＭＢＰを用いてインビトロで刺激された動物からの脾臓の細胞の上澄み中のＴＧＦ-βの存在を直接的に説明するために、血清のない状態で上澄みを収集し、上述のようにＴＧＦ-βに関して直接的に検定した。図３に示されたように、ＴＧＦ-βは、ＭＢＰの不在下ではなく、存在下で、インビトロで刺激された、ＭＢＰを給餌された動物からの脾臓細胞によって分泌された。さらに、ＴＧＦ-βは、オボアルブミン（ＯＶＡ）を給餌された動物からの脾細胞が、ＯＶＡを用いてインビトロで刺激された時にも分泌された。ＴＧＦ-β1又はＴＧＦ-β2のいずれかに特異的な遮断する抗体を用いる特定のＳＥＬＩＳＡ検定を用いて、ＴＧＦ-βがＴＧＦ-β1のイソタイプのものであることがさらに説明された。また、分泌されたＴＧＦ-βは、潜伏性の形態というよりむしろ活性の形態にあるものであった。ＭＢＰを用いて給餌されインビトロで刺激されたグループにおけるＴＧＦ-βの量は、６．８±１．７ng/mlで、活性の形態で６８±９％を有していた。ＯＶＡグループにおいて、ＴＧＦ-βの量は、６．１±１．０ng/mlで、活性の形態で６５±９％を有していた。ＭＢＰを給餌され、Ｔ細胞増殖の非特異的誘導物質、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ-Ａ）、を用いて刺激された動物の脾臓細胞からの上澄み中では観察されたなかった。もっとも、少量（２．１±０．４５ng/ml）の潜伏性のＴＧＦ-βは観察された。
ＴＧＦ-β1が、ＭＢＰへの経口トラライゼーションによるＥＡＥの抑制においても役割を演じるかどうかを決定するために、シチメンチョウ抗ＴＧＦ-β1抗血清をインビボで投与した。図４Ａに示されたように、動物がＰＢＳ又は対照シチメンチョウ血清を注射された場所に、第１３日目に、３．２-３．５の間の最大疾患重症度で、対照動物中に麻痺のＥＡＥが発達した。ＭＢＰを用いた経口トラライゼーションによって、ＰＢＳ又は対照シチメンチョウ血清を注射した動物中のＥＡＥの重症度は著しく減少した（図４Ｃ）。５０μlの対照血清で５回処置された動物中の最大疾患重症度は３．２±０．２で、５０μlの対照血清で５回処置された経口トラライズされた動物中では１．０±０．２（ｐ＜０．００１）であった。図４Ｄに示されたように、抗ＴＧＦ-β1抗血清でのインビボ処置によって、投与量依存の仕方でのＭＢＰの経口投与によって誘発された保護は廃棄された；５０μlの抗ＴＧＦ-β1抗血清で５回処置された経口トラライズされた動物における最大重症度は、１．０±０．２に対して３．７±０．２であった（ｐ＜０．００１、グループＣに対してグループＤ）。図４Ｂに示されたように、ＭＢＰへ経口トラライズされなかった抗ＴＧＦ-β1抗血清で処置された動物中での疾患の投与量依存の増大があったことが注目される。疾患の開始はより早期であり、回復は遅れ、そして疾患の重症度はより大きかった（３．２±０．２に対して４．５±０．２、グループＡに対してグループＢ、ｐ＜０．０１）。
遅延型過敏症（ＤＴＨ）の応答は、ＥＡＥの臨床上の道程と相関があり、ＭＢＰへのインビボでの細胞の免疫の手段として使われる（ブロド，エス．エイ．(Brod, S. A.)他Ann. Neurol. 29:615-622,1991；コウリー，エス．ジェイ．(Khoury, S. J.)他，Cell. Immunol. 131:302-310,1990）。耳中の皮下に、ＰＢＳ中の２５μgのＭＢＰを注射して、図４に記載された同じグループにおいて、ＤＴＨ応答を検査した。免疫性テストの前及び４８時間後に、厚さを測定した。免疫性テストの前後の耳の厚さにおける変化を各動物に関して記録し、その結果を各実験グループ±ＳＥＭに関する平均として現した。
図５（Ａ-Ｄ）に示されたように、顕著なＤＴＨ応答がＥＡＥを被る動物中に発達し、ＤＴＨ応答はＭＢＰの経口投与によって抑制された。抑制されたＤＴＨ応答は、投与量依存の仕方で、インビボ抗ＴＧＦ-β1処置によって廃棄された（１．４±０．３に対して２．１±０．３；ｐ＜０．０１、対照血清に対して５０μlの抗ＴＧＦ-βで５回注射された動物中）。
上記の結果より、ＭＢＰへの経口トラライゼーションによって誘発されるＥＡＥの抑制において及び自発的に起こるＥＡＥからの回復において、内因性のＴＧＦ-β1によって演じられる免疫調節の役割についての証拠が与えられる。ＴＧＦ-βの特徴が進化において高度に保存されるということを考慮すれば、実験動物中でのＴＧＦ-βの免疫抑制効果はヒトにおけるその効果と同様であると予想される。
実施例２：  抗原の経口投与後の抗原駆動のバイスタンダー抑制
下記の実験において、以下の原料及び方法を用いた。
動物．  メスの生後６-８週のルイスラットをハーラン-スプレイグ ドーリー インク（インディアナポリス，ＩＮ）から入手した。動物は任意に標準飼料及び水を与えて飼育した。
抗原．上記実施例１で述べられているディブラー他（上述）を修正した方法によって、モルモットのＭＢＰを脳組織から精製し、ゲル電気泳動によって純度を確かめた。オボアルブミン（ＯＶＡ）及びＢＳＡを、シグマ ケミカル カンパニー(Sigma Chemical Co.)（セントルイス，ＭＯ）から購入し、キーホール リンペット(keyhole limpet)のヘモシアニン（ＫＬＨ）をカルバイオケム ベーリング コープ(Calbiochem Behring Corp.)（ラ・ジョラ(La Jolla)，ＣＡ）から購入した。
動物の免疫処置．  実質的なＥＡＥ疾患状態を誘発するために、動物を、足蹠内に、２５μgのＭＢＰであって、４mg/mlのヒト型結核菌（ディフコ ラブズ(Difco Labs)，デトロイト，ＭＩ）を含有する同体積のＣＦＡ中で乳化されたものを用いて、免疫処置した。インビボバイスタンダー抑制実験のために、ＭＢＰ  ＣＦＡを用いた最初の免疫処置の８時間後に、５０-３００μgの二次的抗原ＯＶＡ、ＢＳＡ又はＫＬＨを、１００μl ＰＢＳ中で、同じ足蹠の皮下に注射した。
臨床評価．  バイスタンダー抑制の臨床上の発現の、上述したインビトロ検定との相関性を示すために、見えないようにした仕方で毎日、ＥＡＥの徴候に関して動物を評価した。ＥＡＥの臨床上の重症度は、次のように採点された：０，疾患なし；１，尾の弱り；２，後脚の麻痺；３，後脚の対麻痺、失禁；４，四肢麻痺；５，死亡。各実験グループ（７）に関して、前に述べたように、平均最大臨床重症度を計算した。グループ間の疾患の発生率を比較するために、一末端のスチューデントt-検定及びカイ二乗解析を用いて統計的解析を行った。
経口トラランスの誘発．  １８ゲージのステンレス鋼動物給餌針（トーマス サイエンティフィック，スウィーズボロー，ＮＪ）を用いた胃の挿管によって、１mlのＰＢＳに１mgのＭＢＰ、ＯＶＡ、ＢＳＡ又はＫＬＨを溶解したものを、又はＰＢＳのみを動物に給餌した。最後の給餌を免疫処置の２日前とし、２-３日の間隔で５回（総投与量５mg）動物に給餌した。
遅延型過敏症（ＤＴＨ）検査．  耳中の皮下に、ＰＢＳ中の５０μgのＭＢＰ又はＯＶＡを注射して、ＤＴＨを検査した。ＭＢＰは左耳に注射され、ＯＶＡは同じ動物の右耳に注射された。測微計カリパス（ミツトヨ、宇都宮、日本）を用いて、免疫性テストの前及び４８時間後に、見えないようにした仕方で、０．０１インチの単位で厚さを測定した。免疫性テストの前後の耳の厚さにおける変化を各動物に関して記録し、その結果を各実験グループ±ＳＥＭに関する平均として表した；各グループは５匹の動物からなる。
トランスウエル(Transwell)培養．  孔の大きさが０．４μmのポリカーボネート半透膜で隔離された２つの隔室からなり、直径が２４．５mmの、双室トランスウエル培養システム（コスター，ケンブリッジ，ＭＡ）を用いた。２つの室は１mm離れており、細胞どうしが直接接触することなく、細胞がごく接近して共にインキュベートされるようになっている。トランスウエル培養中での増殖の応答のインビトロ抑制を測定するために、前に述べられたように（ベン-ナン，エイ．他，Eur. J. Immuno. 11：195,1981）増大され維持された、５ｘ１０4のＭＢＰ又はＯＶＡ特異性の系統の細胞を、下部ウエルにある６００μlの増殖媒体中の、１０6の照射された（２，５００rad）胸腺細胞を用いて培養した。経口でトラライズされたラット又は対照（ＢＳＡを給餌されたもの）からの脾臓細胞を、上部ウエルに加えた（２００μl中に５ｘ１０5細胞）。最後の給餌から７-１４日後に脾臓細胞を取り除き、この脾臓をステンレス鋼のメッシュに押し通して単一細胞の懸濁物を調製した。ＭＢＰ及びＯＶＡ（５０μg/ml）を、２０μlの体積で加えた。モジュレーター細胞は半透膜によってレスポンダー細胞から隔離されるので、照射は不要である。いくつかの実験においては、モジュレーター細胞をレスポンダー細胞と共に下部ウエル中に加え、この場合には、培養中に置かれる直前に、モジュレーター細胞を照射した（１，２５０rad）。増殖媒体は、２ｘ１０5Ｍの２-メルカプトエタノール、１％のピルビン酸ナトリウム、１％のペニシリンとストレプトマイシン、１％のグルタミン、１％のヘペス緩衝剤、１％の非必須アミノ酸、及び１％の自己由来の血清を補った、ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ，グランド アイランド，ＮＹ）からなる。各トランスウエルは、４倍にされた。このトランスウエルを湿された６％ＣＯ2及び９４％空気の雰囲気中で、７２時間インキュベートした。培養の５４時間後、４μＣｉの［3Ｈ］チミジンを用いてそれぞれの下部ウエルを短期間標識し、７２時間後にファイバーグラスフィルター上に収穫して、標準液体シンチレーションの技術を用いて計数するために、丸底の９６ウエルのプレート（コスター）中の３つのウエルに、分割して播種した。パーセント抑制＝１００ｘ（１−モジュレーターで培養されたΔcpmレスポンダー／レスポンダーのΔcpm）。
バイスタンダー抑制の間に生成された可溶性の因子を検討し、この課程での抑制の転移を監視するために、このトランスウエル システムを用いた。
Ｔ細胞サブセットの精製．  クルイクシャンク、上述、の修正された方法に従って、磁気ビーズを用いて負の選択をすることによって、Ｔ細胞サブセットを減少させた。脾臓細胞を、氷上で３０分間、マウス抗ラットＣＤ８、又はＣＤ４、ｍＡｂｓ（クローンＯＸ／８又はＷ３／２５、セロテック／バイオプロダクツ，インディアナポリス，ＩＮ）の１：１００の希釈物を用いてインキュベートし、２度洗浄し、次に、ヤギ抗マウスＩｇＧが共有結合的に付着した、４５０ミクロン（Ｍ-４５０）の平均直径を有する、予備洗浄した磁気粒子（ダイナル インク，フォート リー，ＮＪ）に加えた。用いられた磁気ビーズの量は、概算される標的細胞の個数の１０倍となるように計算された。この細胞を、１０ml丸底試験管（ヌンク，ロスキルド(Roskilde)，デンマーク）中の、１０％ＦＣＳを補った０．５mlのＲＰＭＩ１６４０中で、このビーズを用いて、５分毎に穏やかに振りながら、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、このビーズ／細胞懸濁物を５mlの媒体で洗浄し、細胞-ｍＡＢ-ビーズ複合体を、磁気粒子コンセントレーター（ダイナル-ＭＰＣ-１）を２分間用いて、強力な磁場中で標識されていない細胞から分離した。上澄みを取り除き、この手順を２回繰り返して非付着の部分を得た。この減少させた集団中のＴ細胞は、間接流動細胞計測法で示されたものによれば、９５％ＣＤ４+ＣＤ８-又はＣＤ８+ＣＤ４-であった。
疾患抑制の養子移入．  バイスタンダー抑制の間に起こる疾患抑制の養子移入を監視するために、ドナーラットに、１mgのＭＢＰ、ＯＶＡ又はＫＬＨのいずれかを２日に５回の間隔で給餌し、最後の給餌から７-１４日目に殺した。脾臓細胞を収穫し、増殖媒体中で同一抗原（５０μg/ml）を用いてインビトロで７２時間インキュベートした。細胞を腹腔内に注射した：  全脾臓集団に対して１０8細胞、又はＣＤ８あるいはＣＤ４を減少された集団に対して５-６ｘ１０7細胞。受容体の動物を、養子移入の前に照射し（２５０rad）、養子移入の６時間後にＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置し、８時間のちに５０μgのＯＶＡで免疫性テストを行った。
細胞どうしの直接の接触が、インビトロ抑制が起こるために必要であるかどうかを決定するために、トランスウエル システム（上記）を用いた。この結果は、以下の表２に示されている。
表２に示されているように、ＭＢＰを給餌された動物からの照射された脾細胞が下部ウエル中でＭＢＰ系と共にインキュベートされたとき、増殖の抑制があった（系２）が、一方、ＰＢＳを給餌された動物（系３）からの脾細胞では抑制は観察されなかった。モジュレーター細胞が半透膜によってレスポンダー細胞から隔離されたときには、仮想的に理想的な抑制が観察された（系４及び５）。このように、抑制は、トランスウエルの膜を通して拡散する因子又は可溶性の因子によって仲介されているように思われる。従って、バイスタンダー抑制は、ＥＡＥ中での経口トラランスの誘発において効能があるように思われる。
0003712260.tif 000003
５ｘ１０4ＭＢＰ系細胞＋ＭＢＰ（５０μg/ml）を、抗体を与える細胞（ＡＰＣ）としての、１０6の照射された（２，５００rad）胸腺細胞と共に下部ウエル中においた。ＭＢＰ又はＰＢＳを給餌された動物からの脾臓のモジュレーター細胞（５ｘ１０5）を、上部又は下部ウエルのいずれかに加えた。下部ウエルに加えられたモジュレーター細胞を照射した（１，２５０rad）。加えられたＭＢＰの無いＭＢＰ系のバックグラウンド計数は、１，０００と２，０００cpmとの間であった。
トランスウエル システムで観察されたインビトロ抑制が、モジュレーターとレスポンダー細胞との間の同様の抗体特異性を必要とするかどうかを決定するために、ＯＶＡ系を下部ウエル中に置いた。この結果は、以下の表３に示されている。
表３に表されているように、上部ウエルに置かれたＭＢＰを給餌された動物からのモジュレーター細胞は、ＭＢＰの不在下ではなく存在下で、下部ウエル中でのＯＶＡ系を抑制することができた（系２及び３）。ＰＢＳを給餌された動物からのモジュレーターに加えられたＭＢＰは、ＯＶＡ系を抑制しなかった（系４）。逆に、ＯＶＡの存在下で、ＯＶＡを給餌された動物からのモジュレーター細胞を用いた場合には、ＭＢＰ系の抑制が見られた（系７）。どちらのウエル中のトランスウエルに加えられた可溶性の抗体も、膜を横切って拡散し、従ってインビボで起こり得ると同様に両方のウエルに存在していたことが注目される。
0003712260.tif 000004
５ｘ１０4ＭＢＰ又はＯＶＡ系細胞を、ＡＰＣとしての、１０6の照射された（２，５００rad）胸腺細胞と共に下部ウエル中においた。ＭＢＰ、ＯＶＡ又はＰＢＳを給餌された動物からのモジュレーター細胞（５ｘ１０5）を、上部ウエルに加えた。加えられたＭＢＰ又はＯＶＡの無いＭＢＰ及びＯＶＡ系のバックグラウンド計数は、１，０００と２，０００cpmとの間であった。
上記インビトロバイスタンダー抑制とインビボの場合との関係を決定するために、ＥＡＥモデルにおいて一連の実験を行った。ラットにＯＶＡ（１mg、１０日間で５回）を給餌し、次いで足蹠中にＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置し、８時間後に同じ足蹠中にＯＶＡを注射した。図６Ａに示されたように、ＭＢＰ／ＣＦＡでの免疫処置の８時間後の足蹠中への注射は、予想されたように、ＥＡＥには影響を及ぼさなかった。平均最大臨床疾患重症度は、免疫処置されたＭＢＰ／ＣＦＡに関して３．９±０．２であり、皮下に与えられたＯＶＡを用いた場合３．８±０．１であった。しかし、ＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置される前にＯＶＡを給餌された動物で、その後にＯＶＡが足蹠の皮下に与えられたものにおいては、ＥＡＥの抑制がＭＢＰの給餌と同様に起こった（図６Ｂ）；ＯＶＡを給餌され、加えてＯＶＡを皮下に与えられたものにおける疾患重症度は０．９±０．２であり、ＭＢＰを給餌されたものにおいては１．１±０．１であり、そしてＯＶＡを給餌されＫＬＨを皮下に与えられたもの（対照グループ）においては３．９±０．１であった（ｐ＜０．００１、対照に対してＯＶＡ及びＭＢＰを給餌されたもの）。従って、ＭＢＰ／ＣＦＡを用いた免疫処置によって誘発されたＣＤ４+Ｔ細胞はバイスタンダー抗原、この場合ＯＶＡ、の経口投与によって誘発されたＣＤ８+Ｔ細胞によって放出されたＴＧＦ-βによってダウンレギュレートされた(down regulated)。ＭＢＰ／ＣＦＡに加え、ＯＶＡが皮下に与えれた後に、ＫＬＨが与えられた、ＯＶＡを給餌された動物においては、ＥＡＥの抑制は観察されず（図６Ｃ）、疾患の重症度は、それぞれ３．７±０．１及び３．８±０．２であった。これらの実験により、トランスウエル システム中でのインビトロでみられるものと同様のインビボの効果が説明された。特に、ある抗原への経口トラライゼーションによって生じたモジュレーター細胞は、トラライズする抗原が存在するときに、異なる抗原の特異性を有する細胞を抑制できる。
インビボ バイスタンダー システムにおいて相関性が存在するかどうかを決定し、バイスタンダー効果と関連して起こる感作の程度を決定するために、ＤＴＨ応答を測定した。ＭＢＰに対する抑制されたＤＴＨ応答は、ＭＢＰを給餌された動物及びＯＶＡを給餌されたものであって、続いてＭＢＰ／ＣＦＡに加えてＯＶＡで免疫処理されたものの両方で観察された（図７）。ＫＬＨやＢＳＡなどの、他の抗原の経口投与は、これらの動物でのＭＢＰに対するＤＴＨ応答に影響を及ぼさなかった。ＯＶＡを給餌し、次いでＭＢＰ／ＣＦＡと共にＯＶＡを皮下に注射することによっては、ＤＴＨによって測定されるＯＶＡに対する免疫応答は生じなかった。
ＯＶＡに独特なものが、観察されるインビボ バイスタンダー抑制に関与する可能性を排するために、ＭＢＰ／ＣＦＡ免疫処置の後にＢＳＡが給餌され次いで皮下に与えられる、同様の実験を行った。図８に示されたように、ＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置をし次いでＢＳＡ（バイスタンダー抗原）を皮下に与える前の、ＢＳＡの経口投与は、ＯＶＡを用いた場合にみられたものと同様に、ＥＡＥを抑制した。ＢＳＡに関連するＥＡＥの抑制が、二次的な抗原が投与量３００μgで皮下に与えられたときにのみ観察され、一方ＯＶＡを用いた場合には、投与量５０μgで抑制が起こったことは注目される。
図９に示されたように、ＭＢＰ又はＯＶＡを給餌された動物からの脾臓細胞は、自然のままの受容体中に保護を養子移入し、これはＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置され、皮下にはＯＶＡが与えられた。さらに、養子移入された抑制は、ＣＤ４+細胞の減少ではなく、ＣＤ８+（サプレッサーＴ細胞）の減少によって廃棄された。ＫＬＨを給餌した動物からの脾臓細胞を、ＭＢＰ／ＣＦＡに加えてＯＶＡで免疫処置をした動物へ養子移入した場合には、保護は観察されなかった。
実施例３：  モルモットＭＢＰの免疫抑制エピトープの同定
サプレッサーＴ細胞からのＴＧＦ-βの放出を誘発する、モルモットＭＢＰ上に存在するエピトープを同定するために、上記実施例２のトランスウエル システムを用いた。
まず、ＭＢＰの、疾患を誘発するフラグメント（自己免疫応答エピトープ）を、次のように確定した：  モルモットＭＢＰの、図１０に詳記した重複するペプチドを、商業的ソースから入手するか、あるいは公知の技術によって、特に商業的なペプチド合成装置（アプライド バイオシステムズ(Applied Biosistems)より）を用いてこの製造者の指示に従い、これを合成した。次に、ＭＢＰ全体をラットに給餌し、経口トラライズされた動物からのリンパ節細胞を、ＭＢＰペプチドを用いて触発した。次に、増殖の検定によって、また、実施例１及び２に述べられているように、そして増殖細胞が疾患を転移する能力を検査することによって、触発された細胞がキラーＴ細胞を誘発する能力を定量的に決定した。
図１０に示されたように、モルモットＭＢＰの残基７１-９０に渡るペプチドは、はるかに、最も効率のよい、キラーＴ細胞の誘発物質であり、それゆえに、最も効能のある、ＭＢＰの疾患促進フラグメントである。従って、モルモットＭＢＰのこの領域は、タンパク質のイムノドミナント エピトープに対応している。
ＭＢＰを給餌されＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置された動物から得られた脾臓細胞（上記実施例１及び２に記載）が、ＯＶＡを給餌された動物から単離された脾臓細胞と共にトランスウエル システム中で共培養された(co-cultured)とき、モジュレーター ウエルに加えられた、モルモットＭＢＰアミノ酸残基２１-４０、５１-７０及び１０１-１２０に対応するペプチドは全て、ＯＶＡが給餌された系の増殖の抑制を触発することができた。この結果は図１１に示されている。図１０及び１１（アミノ酸残基番号７１-９０に対応）で同定された、モルモットＭＢＰのイムノドミナント エピトープは、トランスウエル システムにおける抑制の触発においては効果がないことは、注目される。モルモットＭＢＰ残基番号１５１-１７０及び１６１-１７８に対応するペプチドはＯＶＡ（レスポンダー）系の増殖を抑制したが、この効果は非特異的であり、そしてこのことはこれらのペプチドによってインビトロで誘発された毒性によるものであったかもしれない。なぜなら、対照（非ＭＢＰ給餌）モジュレーター細胞と共培養されたとき（データは示されていない）はＯＶＡを給餌された動物から単離された脾臓細胞の増殖はこれら同じペプチドによって抑制されるからである。さらにこれらの実験により、ＴＧＦ-βを引き出す抗原を動物に給餌するには、バイスタンダー抑制が必要であることが説明された。また、これらの実験により、バイスタンダー抑制に関与する自己抗原の部分は自己免疫応答に関与するものとは異なることが説明された。
実施例４：  通常のＥＡＥ誘発及びＭＢＰ給餌のラットから得られたラットの脳の切片における細胞、シトキン及び活性化マーカー
ＥＡＥに関して誘発されたラットにおけるＭＢＰの経口投与の効果を、給餌された及び対照のラットの脳に存在する細胞及び因子に関して分析した。ルイスラットにＭＢＰを５回給餌し、次いでＭＢＰ／ＣＦＡで免疫処置し、そして１４日目（疾患のピーク）にこれらの脳を免疫組織学的に検査し、そして同時に収穫された、免疫処置された、対照-給餌動物からの脳、及び自然のままの動物の脳と比較した。皮質及び小脳のクリオスタット切片を、白血球及び活性化抗原を決定するためにパラホルムアルデヒド-リシン-過ヨウ素酸塩中に、又はシトキンの標識をするためにアセトン中に固定し、そしてペルオキシダーゼ-アンチペルオキシダーゼ(antiperoxidase)法によって染色した（ハンコック，ダブリュー．ダブリュー．(Hancock, W.W.)ほか，J. Immunol. 138: １６４，１９８７）。２０の連続的なフィールドにおけるシトキン及び内皮の標識付けの結果は、（−）標識付けなし、（＋／−）＜１０細胞／切片又はわずかに標識付け、（＋）小数の小さい病巣、（２＋）複数の病巣、及び（３＋）複数の大きい脈管周囲の堆積と広がった髄膜の染色、として判断された。
この結果を、表４に要約する。
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ＭＢＰを給餌されたグループでは、細胞の炎症の免疫応答と、ＴＮＦ、Ｉａ及びＩＣＡＭ-１の発現とのダウンレギュレーションの証拠があり、一方ＴＧＦ-β発現のアップレギュレーション(upregulation)があった。
リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＭＢＰの経口投与によって達せられるＥＡＥの抑制を増大することが前に発見された。従って、疾患のピークにおいて、ＭＢＰ+ＬＰＳを給餌された動物の脳も検討され、そしてＭＢＰのみを給餌して観察された変化の他には、ＩＬ-４及びＰＧＥ発現のアップレギュレーションはなかった。従って、ある条件では、ＩＬ-４又は他の調節シトキンは、ＴＧＦ-βと共に、免疫応答のダウンレギュレーションに関係する。
相乗剤のみの給餌（バイスタンダー又は自己抗原なし）によっては、ＩＬ-４又はＰＧＥのアップレギュレーションは、結果的に生じなかった（データは示されていない）。
要約すれば、上記表４に示された結果からわかるように、通常のラットの脳は細胞、シトキン及び活性化マーカーを含有しておらず、一方、ＥＡＥを誘発されたラットによって、様々な炎症細胞及び炎症シトキン（すなわち、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-６、ＩＮＦ-γ及びＴＮＦ）が現された。対照的に、ＭＢＰに加えてＬＰＳ（相乗剤）を給餌された、ＥＡＥを誘発されたラットは、細胞及び炎症のシトキンの減少を起こし、さらに、サプレッサーＴ細胞（ＣＤ８+サブセット）、ＩＬ-４、ＴＧＦ-β及びプロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）を含有していたが、これらは全てＣＤ４+ＭＮＣ及び炎症シトキンの作用に対抗するものである。
実施例５：  インシュリンペプチド及びグルカゴンの経口投与によるＮＯＤマウスにおけるインシュリン炎の抑制
分離されたインシュリンＡ又はＢ鎖と、インシュリンＢ鎖のタンパク質分子から誘導される様々な合成ペプチドとを給餌する効果、及びＮＯＤマウスにおけるインシュリン炎に対するグルカゴンの効果を調べた。
ＮＯＤマウス（タコニック ラブズ(Taconic Labs)）に、１週間に２回５週間にわたって、１mgのグルカゴン、又は１mgのブタ インシュリン（共に商業的に購入されたもの）あるいは等モル量のインシュリンＡ鎖、Ｂ鎖及び下記のＢ鎖ペプチド（全てのインシュリンフラグメントは合成されたもの）を給餌し、生後２週目に屠殺した。
対照動物に、非脾臓の（すなわち、無関係の）ペプチド、ＧＡＰを給餌した。ザン，ズィー．ジェイ．(Zhang, Z. J.)，PNAS(USA)，88：１０２５２-１０２５６，１９９１、に記載されている方法による、半定量的なインシュリン炎の採点として、インシュリン炎を測定した。
インシュリンＢ鎖ペプチドは、アミノ酸残基１-１２（Ｂ1-12）、１０-２２（Ｂ10-22）、１１-３０（Ｂ11-30）及び２３-３０（Ｂ23-30）に対応した。全ての動物に、３週間にわたって１０回給餌した。
この結果は、下の表５に示されている。
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上の表６に示された結果からわかるように、インシュリンＡ鎖又はＢ鎖はインシュリン炎を抑制し、Ｂ鎖の給餌はより程度の高い抑制を示した。ペプチドＢ1-１2、Ｂ10-22、及びＢ11-30もインシュリン炎を抑制したが、Ｂ23-30はしなかった。ＭＢＰ又はＧＡＰを給餌された動物においては、抑制は観察されなかった。さらに、グルカゴン、バイスタンダー抗原、もインシュリン炎の抑制において有効であった。
実施例６：  ウシＰＬＰ又はマウスＭＢＰのＩＶ投与に対する経口トラランス
経口又は静脈内（ＩＶ）の投与経路を経るトラライゼーションの効果を比べ、さらにバイスタンダー抑制を説明するために、５-６のメスの、生後７週の、ＳＪＬ／Ｊマウス（ジャクソン ラブズ(Jackson Labs)，バー ハーバー(Bar Harbor)，ＭＥ）を、０及び７日目にＰＬＰペプチド１４０-１６０を用いて免疫処置し、次の処理を施した：
グループ
１．ヒストン（０．２５mg）を給餌
２．マウスＭＢＰ（０．２５mg）を給餌
３．ウシＰＬＰ（０．２５mg）を給餌
４．ヒストン（０．２５mg）をＩ．Ｖ．注射
５．ＭＢＰ（０．２５mg）をＩ．Ｖ．注射
６．ＰＬＰ（０．２５mg）をＩ．Ｖ．注射
それぞれのグループを、７日間にわたって１日おきに処理した。静脈内のグループにおいては、この材料を目の神経叢に注射した。用いられたＰＬＰペプチドは、ウシＰＬＰの疾患を誘発するフラグメント１４０-１６０であった。このペプチドは、前記のアミノ酸残基を表す、アミノ酸配列ＣＯＯＨ-ＰＬＡＹＴＩＧＶＦＫＤＰＨＧＬＷＫＧＬＣＮＨ2を有する。
図１２に示されたように、マウスＭＢＰ及びウシＰＬＰは共に、経口投与されたときには、ＰＬＰペプチドを誘発されたＥＡＥをダウンレギュレートする際に、等しく効果的であった。非特異的なタンパク質、ヒストンは、経口投与されたときのＥＡＥの抑制に際しては効果がなかった。このように、バイスタンダー抗原、この場合にはマウスＭＢＰ、はウシＰＬＰを用いてＥＡＥに関して誘発された動物に経口投与されたときには、効果的にＥＡＥを抑制した。
対照的に、静脈内に投与されたときには、疾患を誘発するために用いられた抗原、この場合ウシＰＬＰ、のみがＥＡＥを抑制する際に効果的であった。この結果は図１３に示されている。
様々なペプチドを、モルモットＭＢＰ残基番号７１-９０（上記実施例３に示されたように、モルモットＭＢＰの主要なイムノドミナント エピトープ）によってＥＡＥに関して誘発された、ルイスラットに給餌することの効果も調べられた。
完全フロイント アジュバント中の、０．２５mgのモルモットＭＢＰのアミノ酸残基番号７１-９０を用いて免疫処置することによってＥＡＥを誘発し、様々なモルモットＭＢＰペプチドを給餌することによるＥＡＥへの効果を検討した。
図１４に示されたように、モルモットＭＢＰ全体と２１-４０モルモット、ペプチドとは、７１-９０がそうであったように、モルモットＭＢＰ７１-９０によって誘発されたＥＡＥをダウンレギュレートする際に、等しく有効であった。モルモットＭＢＰペプチド１３１-１５０は、この場合には効果がなかった。ペプチドは、胃液による損傷を防ぎ生物学的効果を増大するＳＴＩと共にも給餌された。ＭＢＰ全体へのＤＴＨ応答は、ＭＢＰ又はＭＢＰペプチド２１-４０か７１-９０かのいずれか一方を給餌することによって抑制された。しかし、モルモットＭＢＰペプチド７１-９０へのＤＴＨ応答は、ＭＢＰ全体又はモルモット ペプチド７１-９０のいずれかを給餌することによってのみ抑制され、モルモットＭＢＰペプチド２１-４０によっては影響されなかった（図１５）。このことは、ＭＢＰフラグメント７１-９０はバイスタンダー抑制と関係がないという結論と一致する。
最後に、疾患の発現の前の（免疫処置後８及び９日目）、ＭＢＰ及びＭＢＰペプチドを用いたＩ．Ｖ．トラライゼーションによるＥＡＥの抑制を検討した。
図１６に示されたように、モルモットＭＢＰ全体を用いてＥＡＥに関して誘発された動物においては、モルモットＭＢＰ全体及びアミノ酸残基７１-９０に対応するモルモットＭＢＰペプチドのみが、１．Ｖ．経路を経て投与されたときにＥＡＥを抑制する際に有効であった。モルモットＭＢＰアミノ酸残基番号２１-４０は、経口投与されたときにはＥＡＥをダウンレギュレートする際に有効であるが、静脈内に投与されたときはＥＡＥを抑制する際に効果がなく、バイスタンダー抑制を触発するＩＶ投与の能力がないことと一致した。アミノ酸残基番号１３１-１５０に対応するペプチド及びヒストンも、静脈内に投与されたときにはＥＡＥを抑制する際に効果がなく、これらの抗原のいずれもが自己免疫応答に関与しないという事実と一致した。
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ウシＰＬＰの配列。
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ヒト（Ｈｕｍ）、ウシ（Ｂｏｖ）、ラビット（Ｒａｂ）、モルモット（ＧＰｉｇ）、ラット（Ｒａｔ）、及びニワトリ（Ｃｈｉｃ）中枢神経システム組織から導かれたミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸配列。使用した速度ＢＰは、１４ｋＤａＢＰ（ラットスモール、またはラットＳ）であり、それはＢＰ遺伝子の６番目のエクソン(exon)によってコードされる残基１１８−１５９の欠損を有している。ヒトの１８．５及び１７．２ｋＤａの遺伝子形態が使用された。後者は、ＢＰ遺伝子の５番目のエクソンによりコードされる１０７−１１７残基（下線部）の欠損を有する。配列は、各種からの相同残基が垂直に並び、互いに容易に比較できるように並べた。このシステムは、種の間に見られる欠損及び付加を調節し、異なる分子間に合計１７７の潜在的部位を許容する。括弧内の残基配列は、まだ確定していない。
アミノ酸配列の比較：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
0003712260.tif 000025
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0003712260.tif 000030
【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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