(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式；Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチド。
【請求項２】
次式；Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ
で示されるＬ体のアミノ酸の配列によるペプチド構造を有する新規なトリペプチドを有効成分として含有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬品として有用性を有する下記アミノ酸の配列のペプチド構造を有するトリペプチドならびにそのペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ
（式中、アミノ酸残基を表す各記号は、アミノ酸化学において慣用の表示法によるものである。）
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
レニン−アンジオテンシン系が生体の水・電解質及び血液の調節に重要な役割を果たしていることはよく知られている。このレニン−アンジオテンシン系にはアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略記する。）が存在し、アンジオテンシンＩはＡＣＥによってアンジオテンシンＩＩに変換される。アンジオテンシンＩＩは強力な昇圧物質で、血管、副腎皮質のみならず中枢神経系ならびに末梢神経系に働いて血圧上昇を促す。又、ＡＣＥは生体内降圧物質であるブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有し、昇圧系に関与している。従って、ＡＣＥの活性を阻害することによって血圧を降下させることが可能であり、又、そのことは臨床的に高血圧の予防、治療に有効であると考えられている。この目的のためプロリン誘導体であるカプトリルが合成され、その降圧作用が確認されて以来、カプトリルの構造研究に基づく種々のＡＣＥ阻害物質の合成研究が盛んに行われ、最近ではマレイン酸エナラブリルやアラセブリル等の物質が、次々と臨床の場に供されている。現在、ＡＣＥ阻害剤は本態性高血圧症、病候性高血圧症を問わず、又、軽症、重症を問わず、幅広く用いられ、高血圧症の第一次選択の治療薬中に加えられ、多く優れた点を有することが見出されている。一方、ＡＣＥ阻害物質の作用機序としては、アンジオテンシンＩＩの産生抑制によるアルドステロンやバソプレッシンの分泌抑制、又、腎動脈収縮の解除によるナトリウムや水の排泄促進が考えられている。更に、ＡＣＥ阻害物質については、それがカリクレン−キニン系の不活性化を抑制し、プロスタグランジン系を賦活させることにより末梢血管拡張やナトリウム及び水の排泄を更に促進させると考えられており、心不全の悪循環を断つ上で合目的な治療薬として期待されている。ところで、ＡＣＥ阻害物質としては、上記の合成品の他に天然物又は天然物由来の物質として蛇毒由来のブラジキニン増強因子（Ｃ末端がＰｒｏ）［Ｓ．Ｈ．Ｆｅｒｒｅｉａ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，３５８３（１９７０）］、ゼラチンのコラゲナーゼ消化物由来の６種類のペプチド（いずれもＣ末端がＡｌａ−Ｈｙｐ）［Ｇ．Ｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｓ．Ａｃｔａ，５６６，１２８（１９７９）］、牛カゼインのトリプシン消化物由来のペプチド（Ｃ末端がＧｌｙ−Ｌｙｓ）［Ｓ．Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．：Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６，１３９３（１９８３）］等に始まり本発明者等のイワシ筋肉由来の５種のヘクサペウチド（いずれもＣ末端から２番目又は３番目がＰｒｏ、Ｎ末端がＬｅｕ）［特許第２０４６４８３号］、海苔由来のテトラペプチド（Ｐｒｏ−ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ）［特許第２６７８１８０号］、朝鮮人参由来のペンタペプチド（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）［特許第２９２０８２９号］、クロレラ由来のペンタペプチド（Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ）及び３種のワカメ由来のテトラペプチド（Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ，Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ，Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ）［特許第３１０８９２０号］等が挙げられ、いずれもＡＣＥ阻害剤となり得ることが開示されている。更に、合成法により得た鎖長の短いジ、トリペプチド［特開平６−８７８８６号］［特開平６−１６５６８号］についての提案は行われているが、天然物由来の規則性を持ったアミノ酸配列を有するジ、トリペプチドのＡＣＥ阻害作用並びに経口投与による降圧効果（薬理効果）は不明であり、発見されてから長時間経過しているが、未だ医薬品としての開発が進んでいるとの報告はない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、褐藻コンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）の海藻種に属するワカメの蛋白質分解酵素の分解液から薬理作用を有する物質を検索し、新規なトリペプチドが強いアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有することを見出した。そして、このトリペプチドを医薬として実用化するための研究を鋭意行った。その結果、このトリペプチドが血圧降下作用を有し、天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害剤としての有用性を見出した。本発明は係る知見に基づくものである。本発明に係る新規なペプチドは、次式、
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ
の式で示されるＬ体のアミノ酸の配列を有する新規なトリペプチドであり、常温における性状は白色の粉末である。
【０００４】
前記のトリペプチドは、化学的に合成する方法またはワカメの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製する方法を挙げることができる。本発明に係る新規なペプチドを化学的に合成する場合には、液相法または固相法等の通常のペプチド合成方法によって行うことができるが、好ましくは、固相法によってポリマー性の固相支持体へ前記ペプチドのＣ末端（カルボキシル末端側）からそのアミノ酸残基に対応したＬ体のアミノ酸を順次ペプチド結合によって結合して行くのが良い。そして、そのようにして得られた合成ペプチドは、トリフルオロメタンスルホン酸、フッ化水素等を用いてポロマー性の固相支持体から切断した後、アミノ酸側鎖の保護基を除去し、逆相系のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する。）などを用いた通常の方法で精製することができる。
【０００５】
上記したように、本発明に係る新規なペプチドは、ワカメの蛋白質分解酵素の分解液から分離精製することができるが、その場合には、例えば以下のようにして行うことができる。上記の新規なペプチドを含有しているワカメのタンパク質部分を用いて加水分解する。加水分解は常法に従って行う。例えば、ペプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解する場合は、ワカメを必要とあれば更に加水分解した後、酵素の至適温度まで加温しｐＨを至適値に調整し酵素を加えてインキュベートする。次いで必要に応じ中和した後、酵素を失活させて加水分解液を得る。その加水分解物を濾紙及び／又はセライト等を用いて濾過することによって不溶性成分を除去し、その得られた濾液をセロファンなどの半透膜を用いて適当な溶媒（例えば、水、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液の中性の緩衝液等）中で十分に透析し、その濾液中の成分で半透膜を通過した成分を含む溶液を強酸性陽イオン交換樹脂（例えば、ダウケミカル社製のＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ等）にかけ、その吸着溶出分画からアンジオテンシン変換酵素（以下、ＡＣＥと略記する。）阻害活性を有する成分を含有する分画を得、得られたＡＣＥ阻害活性分画をゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５等）によって分画し、得られたＡＣＥ阻害活性分画を陽イオン交換ゲル濾過（例えば、ファルマシア社製のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５等）によって分画し、その得られたＡＣＥ阻害活性画分を更に逆相ＨＰＬＣによって分画する。
【０００６】
本発明に係る新規なペプチドの製法において用いる褐藻類としては、本発明の目的を達成できる限りいかなる褐藻類を用いても良いが、好ましくはワカメを用いるのが良い。以上のようにして得られた本発明に係る新規なペプチドは、静脈内へ繰り返し投与を行った場合、抗体産生を惹起せず、アナフィラキシーショックを起こさせない。又、本発明に係る新規なペプチドはＬ−アミノ酸のみの配列構造からなり、投与後、生体内のプロテアーゼにより徐々に分解される為、毒性は極めて低く、安全性は極めて高い（ＬＤ５０＞５０００ｍｇ／ｋｇ；ラット経口投与）。本発明に係る新規なペプチドは、通常用いられる賦形剤等の添加物を用いて注射剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等に調製することができる。投与方法としては、通常は、ＡＣＥを有している哺乳類（例えば、ヒト、イヌ、ラット等）に注射すること、あるいは経口投与することがあげられる。投与量は、例えば、動物体１ｋｇ当りこのペプチドを０．０１〜１０ｍｇの量である。投与回数は、通常１日１〜４回程度であるが、投与経路によって、適宜、調製することができる。
【０００７】
上記の各種製剤において用いられる賦形剤、結合剤、潤沢剤の種類は、特に限定されず、通常の注射剤、散剤、顆粒剤、錠剤あるいはカプセル剤に用いられるものを使用することができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤に用いる添加物としては、下記のものをあげることができる。賦形剤としては、結晶セルロース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール類、デンプン類、無水リン酸カルシウム等；結合剤としては澱粉類、ヒドロキシプロピルメチルセルローズ等；崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース及びそのカリウム塩類；潤滑剤としてはステアリン酸及びその塩類、タルク、ワックス類を挙げることができる。又、製剤の調整にあたっては必要に応じメントール、クエン酸及びその塩類、香料等の矯臭剤を用いることができる。注射用の無菌組成物は、常法により、本発明に係る新規なペプチドを、注射用水、生理食塩水及びキシリトールやマンニトール等の糖アルコール注射液、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコールに溶解または懸濁させて注射剤とすることができる。この際、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤等を必要に応じて添加することができる。本発明に係る新規なペプチドを含有する製剤は凍結乾燥品又は乾燥粉末の形とし、用時、通常の溶解剤、例えば水又は生理食塩液に溶解して用いることもできる。
【０００８】
本発明に係る新規なペプチドは優れたアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示す。従って、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧等の高血圧症の予防、治療剤、これらうっ血性心不全に対する臓器循環の正常化と長期予後の改善（延命効果）作用を有し、心不全の治療剤として有用である。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例として、製造例および試験例を記載し、本発明を更に詳細に説明する。
製造例１
ワカメ粉末２３．６ｇに脱イオン水７０８ｍιを加えホモジナイズしたワカメホモジネイトを用いた。透析チューブ（内径３６インチ，和光純薬工業社製）に詰め、流水に対して３日間透析を行い透析内液を得た。この内液を１規定の塩酸にてｐＨを２．０に調整し、ペプシン（メルク社製、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１）７０８ｍｇを添加し、４５℃で５時間撹拌しながら加水分解を行った。分解反応液を直ちに限外濾過膜（アミコン社製、ＹＭ１０型；分画分子量約１万）に通過させた通過液を、Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×４［Ｈ＋］カラム（φ４．０×５５ｃｍ）に加えた。そのカラムを脱イオン水で十分洗滌した後、２規定の水酸化アンモニウム液２ιを用いて溶出した。減圧濃縮によりアンモニアを除去し濃縮液を予め脱イオン水で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（φ１．６×１１３ｃｍ）に負荷し、流速１２ｍι／ｈｒ、各分画量５．７ｍιでゲル濾過を行った。その結果は図１のとおりである。ゲル濾過を繰り返して大量分取したＡＣＥ阻害活性の高い画分を集め凍結乾燥してペプチド粉末とした。このペプチド粉末１．５５ｇを２０ｍｌの脱イオン水に溶解後、予め、脱イオン水で緩衝化したＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５［Ｈ＋］カラム（φ１．８×４０ｃｍ）に負荷し、脱イオン水５００ｍιから１．５％塩化ナトリウム５００ｍιの濃度勾配法を行い、流速７０ｍι／ｈｒ、各分画量１０ｍιでクロマトグラフィーを行った。その結果は図２のとおりである。上記クロマトグラフ中、ＡＣＥ阻害活性の高かった分画番号２３〜５１の画分を集めて凍結乾燥して精製ペプチド粉末（ＳＰ−ＩＩ分画）を得た。この精製ペプチド粉末２０ｍｇを６０μιの脱イオン水に溶解した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。カラムとしては野村化学社製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−５（４．５ｍｍＩＤ×２５ｃｍＬ）を使用し、移動相としては０．０５％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略記する。）から２５％アセトニトリル／０．０５％ＴＦＡの濃度勾配法を行い、流速１．０ｍι／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍでＨＰＬＣを行い、ＡＣＥ阻害活性の高いペプチドフラグメントを得た。その結果は図３に示すとおりである。｛溶出時間；５１．３分｝
このようにして得られたＡＣＥ阻害作用を有するペプチドのアミノ酸配列は、アプライドバイオシステム（ＡＢＩ）社製のプロテインシークエンサー４７７Ａ型を用いて決定された。その結果、次式、
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ
で示されるＬ体のアミノ酸配列で表わされる新規なトリペプチドであることが確認された。常温における性状は白色の粉末である。尚、本発明に係る新規なトリペプチドをＡＣＥ阻害剤として、例えば錠剤に製剤する場合には、常法に従って、例えば次のように処理すればよい：▲１▼ペプチド１０ｇ、▲２▼乳糖６８ｇ、▲３▼コーンスターチ３９ｇ、▲４▼ステアリン酸マグネシウム１．２ｇを原料とし、先ず▲１▼、▲２▼及び２０ｇのコーンスターチを混和し、１１ｇのコーンスターチから作ったペーストとともに顆粒化し、この顆粒に９ｇのコーンスターチと▲４▼とを加え、得られた混合物を圧縮錠剤機で打錠し、錠剤１０００個を製造する。
【００１０】
製造例２
本例は、合成法による製造例である。
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓの合成法
アプライドバイオシステム社製のペプチド自動合成装置４３０Ａ型を用いた固相法によって当該ペプチドを合成した。固相担体としては、スチレンジビニルベンゼン共重合体（ポリスチレン樹脂）をクロロメチル化した樹脂を使用した。まず、当該トリペプチドのアミノ酸配列に従って、常法どおり、そのＣ末端側のヒスチジンからクロロメチル樹脂に反応させペプチド結合樹脂を得た。この時のアミノ酸は、ｔ−ブトキシカルボニル（以下、ｔ−Ｂｏｃと略記する。）基で保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用した。次にこのペプチド結合樹脂をエタンジチオールとチオアニソールからなる混合液に懸濁し、室温で１０分間撹拌後、氷冷下でトリフルオロ酢酸を加え、更に１０分間撹拌した。この混合液にトリフルオロメタンスルホン酸を滴下し、室温で３０分間撹拌した後、無水エーテルを加えてその生成物を沈澱させて分離し、その沈澱物を無水エーテルで数回洗浄した後、減圧下で乾燥した。このようにして得られた未精製の合成ペプチドは蒸留水又はメタノールに溶解した後、逆相系のカラムＣ１８（５μｍ）を用いたＨＰＬＣにより精製した。移動相として（Ａ）０．１％ＴＦＡ含有蒸留水、（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液を使用し、（Ａ）液が６０分間で９３％→５２％の濃度勾配法により流速１．１ｍι／ｍｉｎでクロマトグラフィーを行った。紫外部波長２１６ｎｍで検出し、最大の吸収を示した溶出画分を分取し、これを凍結乾燥することによって目的とする合成ペプチドを得た。
【００１１】
この合成ペプチドをマススペクトルにより分析した結果、アミノ酸配列及びアミノ酸組成が前記で示したアミノ酸配列構造を有するトリペプチドであることが確認された。このマススペクトルの結果は図４に示す通りである。
合成によって得られた本発明のトリペプチドは、以下に示す試験によって薬理効果が確認された。
【００１２】
試験例１
（アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法）ＡＣＥ（シグマ社製、酵素番号ＥＣ３．４．１５．１）２．５ｍＵ、合成基質Ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ（ペプチド研究所製）１２．５ｍＭを用いＬｉｅｂｅｒｍａｎの測定法を改良した山本等の方法［日胸疾会誌，１８巻，２９７−３０２頁（１９８９年）］に準じて測定した。すなわち、生成した馬尿酸を酢酸エチルにて抽出し２２５ｎｍの吸光度で測定した。被検液での吸光度をＥｓ、被検液の代わりに緩衝液を加えた時の値をＥｃ、予め反応停止液を加えて反応させた時の値をＥｂとして次式から阻害率を求めた。
阻害率（％）＝（Ｅｃ−Ｅｓ）／（Ｅｃ−Ｅｂ）×１００
ＡＣＥ阻害剤の阻害活性ＩＣ５０値は、ＡＣＥの酵素活性を５０％（阻害率）阻害するために必要な試料の濃度（Ｍ）で示した。本発明に係るトリペプチドの牛肺血清のアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性（ＩＣ５０値）；（１）は０．９６μＭである。
【００１３】
試験例２
（高血圧自然発症ラットへ投与時の降圧効果）実験動物は日本チャールズ・リバー社より１５週齢雄性高血圧自然発症ラット（以下、ＳＨＲと略記する。）を購入し、１週間の予備飼育後、収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上（体重２８０〜３３０ｇ）の動物６匹１群として用いた。ラットは、室温２３±２℃、湿度５５±１０％および１２時間明暗（午前６時〜午後６時点灯）に調整された飼育室でステンレスワイヤー製ラット用個別ゲージに１匹ずつ収容し飼育した。飼料はオリエンタル酵母社製ＭＦ粉末飼料を、飲水は自家揚水（水道水質基準適合）をそれぞれ自由に摂取させた。血圧は非観血的尾動脈血圧測定装置（理研開発社製、ＰＳ−１００型）を用いｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により、投与前、投与後１週間後、２週間後、３週間後、４週間後及び５週間後のＳＨＲ尾動脈の収縮期血圧（ｍｍＨｇ、上値）、拡張期血圧（ｍｍＨｇ、下値）及び平均血圧（ｍｍＨｇ）の測定を一定時間毎に各５回づつ行い、得られた測定値の最高値と最低値を棄却し、３回の平均値をもって各時間の測定値とした。本発明に係る合成トリペプチド１０ｍｇ／ｋｇをＳＨＲに経口投与した時の各血圧値（ｍｍＨｇ）への作用についての結果は、図６に示すとおりである。以上の試験の結果、本発明に係るトリペプチドは、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）においても有意な血圧降下作用を示すことが確認された。従って、本発明に係るトリペプチドは高血圧症の治療又は予防薬として有用である。尚、本発明に係るトリペプチドは、構造的にそのアミノ酸配列を部分構造とするペプチドにおいて、構造中に採用することもできる。
【００１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るワカメの蛋白質分解液の、製造例１におけるＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムクロマトグラフィーによるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。尚、図中マーカーとして分子量６千のインスリン、分子量３，５００のインスリンＢ鎖、分子量２，５００のインスリンＡ鎖、分子量１，０５２のブラジキニン及び分子量７５のグリシンを用いた。
【図２】本発明に係るワカメの蛋白質分解液の、製造例１におけるＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（Ｈ＋）カラムクロマトグラフィーによるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図３】本発明に係るトリペプチドの、製造例１における逆相ＨＰＬＣによるＡＣＥ阻害ペプチドの分離精製の結果を示す図である。
【図４】本発明に係るトリペプチドの、製造例２で得られた合成トリペプチドのマススペクトルを示す図である。
【図５】製造例２で得られた合成トリペプチド１０ｍｇ／ｋｇを、ＳＨＲに経口投与した場合の収縮期血圧値、拡張期血圧値及び平均血圧値（ｍｍＨｇ）の５週間の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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