(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
0003662936.tif 000033
［式中、
Ｘは、
（ａ）  ＣＨ2ＯＨ、
（ｂ）  ＣＨＯ、
（ｃ）  ＣＯ2Ｒ4、又は
（ｄ）  ＣＯＮＲ42、
である；
Ｙは、
（ａ）  ＣＨ3、又は
（ｂ）  ＣＨ2ＯＲ5
である；
Ｒ1は、
（ａ）  Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、
（ｂ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2、
（ｃ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3、
（ｄ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＣＨ3、
（ｅ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＮＨ2、
（ｆ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3、
（ｇ）  Ｐ（Ｏ）（ＣＨ3）ＯＨ、及び
（ｈ）  Ｐ（Ｏ）（ＣＨ3）ＮＨ2
からなる群から選択される；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素、
（ｂ）  ハロ、
（ｃ）  Ｃ1-6アルコキシ、
（ｄ）  Ｃ1-6アルキルチオ、
（ｅ）  ＣＮ、
（ｆ）  ＣＦ3、
（ｇ）  Ｃ1-6アルキル、及び
（ｈ）  Ｎ3
からなる群から選択される；
Ｒ4は、
（ａ）  水素、
（ｂ）  Ｃ1-6アルキル、及び
（ｃ）  一置換もしくは二置換のベンジル（但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルキル、
（４）  Ｃ1-6アルコキシ、
（５）  Ｃ1-6アルキルチオ、
（６）  ＯＨ、
（７）  ＣＮ、及び
（８）  ＣＦ3
から選択される）
からなる群から選択される、
又は同じＮに結合している２個のＲ4は、１個のＯ原子もしくは１個のＳ原子もしくは更なる１個のＮ原子（Ｎ原子は１個の水素もしくはＣ1-6アルキルで置換されている）を場合によっては含む５員、６員もしくは７員の飽和環を形成できる；
Ｒ5は、
（ａ）  Ｃ1-6アルキル、
（ｂ）  一置換もしくは二置換のベンジル（但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルキル、
（４）  Ｃ1-6アルコキシ、
（５）  Ｃ1-6アルキルチオ、
（６）  ＯＨ、
（７）  ＣＮ
（８）  ＣＦ3、及び
（９）  ＣＯ2Ｒ4
から選択される）
からなる群から選択される］
を有する化合物又は医薬として許容できるその塩。
【請求項２】
Ｙは、ＣＨ3又はＣＨ2ＯＣ1-6アルキルであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙは、ＣＨ3又はＣＨ2ＯＣ1-6アルキルである；
Ｒ1は、
（ａ）  Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、
（ｂ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2、
（ｃ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3、
（ｄ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＣＨ3、
（ｅ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＮＨ2、及び
（ｆ）  Ｓ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3
からなる群から選択される；及び
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素
（ｂ）  フルオロ、クロロ、及びブロモ、
（ｃ）  Ｃ1-4アルコキシ、
（ｄ）  Ｃ1-4アルキルチオ、
（ｅ）  ＣＮ、
（ｆ）  ＣＦ3、及び
（ｇ）  Ｃ1-4アルキル、
からなる群から選択される；
ことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（１）  水素、及び
（２）  ハロ
からなる群から選択される；
Ｒ4は水素又はメチルである；及び
Ｒ5はＣ1-6アルキルである；
ことを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1は、
（ａ）  Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、及び
（ｂ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2
からなる群から選択される；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（１）  水素、
（２）  フルオロ、クロロ及びブロモからなる群から選択されるハロ
からなる群から選択される；
ことを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＸはＣＯ2Ｒ4であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ＸはＣＯ2Ｒ4である；
Ｙはメチル又はＣＨ2ＯＲ5である；
Ｒ1はＳ（Ｏ）2ＣＨ3である；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素、及び
（ｂ）  ハロ
からなる群から選択される；
Ｒ4は、
（ａ）  水素、及び
（ｂ）  Ｃ1-6アルキル
からなる群から選択される；
Ｒ5は、
（ａ）  Ｃ1-6アルキル、
（ｂ）  一置換もしくは二置換のベンジル（但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルコキシ、及び
（４）  ＯＨ
から選択される）
からなる群から選択される；
ことを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
式Ｉａ
0003662936.tif 000034
［式中、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ及びＹの組合せは次の２０個の組合せの表から選ばれる
0003662936.tif 000035
を有する化合物。
【請求項９】
式Ｉｂ
0003662936.tif 000036
［式中、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ及びＹの組合せは次の１５個の組合せの表から選ばれる
0003662936.tif 000037
を有する化合物。
【請求項１０】
（ａ）  （Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−フェニルブト−２−エン酸メチルエステル、
（ｂ）  （Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−フェニルブト−２−エン酸、
（ｃ）  （Ｅ）−２−（４−フルオロフェニル）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−ブト−２−エン酸メチルエステル、
（ｄ）  （Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−１−モルホリン−４−イル−２−フェニルブト−２−エン−１−オン、及び
（ｅ）  （Ｅ）−４−メトキシ−３−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−フェニルブテン酸
から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
非ステロイド性抗炎症剤による治療が可能な炎症性疾患の治療用医薬製剤であって、非毒性量で治療有効量の請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物と医薬として許容できる担体を含むことを特徴とする該医薬製剤。
【請求項１２】
ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２を選択的に阻害する活性薬剤で有利に治療されるシクロオキシゲナーゼ媒介疾患の治療用医薬製剤であって、非毒性量で治療有効量の請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物と医薬として許容できる担体を含むことを特徴とする該医薬製剤。
【請求項１３】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載の許容可能で抗炎症量の式（Ｉ）の化合物又は医薬として許容できるその塩、並びに医薬として許容できる担体を一緒に含むことを特徴とする抗炎症医薬製剤。
【請求項１４】
ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２を選択的に阻害する薬剤によって有利に治療されるシクロオキシゲナーゼ媒介疾患の治療における使用のための請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載の式（Ｉ）の化合物又は医薬として許容できるその塩。
【請求項１５】
非ステロイド性抗炎症剤によって治療可能な炎症性疾患の治療のための医薬の製造における請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に記載の式（Ｉ）の化合物又は医薬として許容できるその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、シクロオキシゲナーゼ媒介疾患の治療方法及びそのためのある特定の医薬製剤に関する。
非ステロイド性の抗炎症剤は、抗炎症活性、鎮痛活性及び解熱活性の大部分を発揮し、プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ（シクロオキシゲナーゼともいわれる）の阻害を介して、ホルモン誘起子宮収縮及びある種の癌成長を阻害する。最初はシクロオキシゲナーゼのただ一つの型が知られていたが、これは、ウシ精嚢で最初に同定されたシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）即ち構成型酵素に対応する。より最近、シクロオキシゲナーゼの第２の誘導型、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の遺伝子が、最初にニワトリ、マウス及びヒトから、クローン化され、配列決定され、特徴付けが行われた。その酵素は、ヒツジ、マウス及びヒトを含む種々の源からクローン化され、配列決定され、特徴付けが行われたＣＯＸ−１とは異なる。第２の型のシクロオキシゲナーゼ、即ちＣＯＸ−２は、マイトジェン、エンドトキシン、ホルモン、サイトカイン及び成長因子を含む多数の薬剤で急速かつ容易に誘導される。プロスタグランジンは生理的役割と病原的役割の両方を有するので、本発明者らは、構成型酵素であるＣＯＸ−１はプロスタグランジンの内因性の基礎放出の大部分に関わり、そのため胃腸の保全の維持と腎血流の維持のような生理的機能に重要であると推定した。対照的に、本発明者らは、誘導型ＣＯＸ−２は、プロスタグランジンの病原効果に主に関わる（該酵素の急速な誘導は、炎症物質、ホルモン、成長因子及びサイトカインなどの薬剤に反応して起る）と推定した。従って、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤は、通常の非ステロイド性抗炎症剤と同様の抗炎症、解熱及び鎮痛特性を有し、更にホルモン誘導子宮収縮を阻害し、抗癌効果の可能性を有するが、メカニズムに基づく副作用の一部を誘導する能力は減少するであろう。特に、このような化合物は、胃腸毒性の可能性、腎での副作用の可能性を減少させ、出血時間に対する効果を減少させ、アスピリン感受性喘息患者での喘息発作を誘起する能力を減少させる可能性を有するはずである。
更に、このような化合物は、収縮性プロスタノイドの合成を防止することによって、プロスタノイド誘導平滑筋収縮も阻害するであろうし、そのため月経困難症、早産、喘息及び好酸球関連疾患の治療に有用でありうるし、アルツハイマー症の治療において、特に閉経後婦人の骨損失の減少（即ち、骨粗鬆症の治療）のために、及び緑内障の治療にも有用であろう。
シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤の有用性の可能性の簡単な説明が、John Vane, Nature, Vol.367, pp.215-216, 1994の論文及びDrug News and Perspectives, Vol.7, pp.501-512, 1994の論文に記載されている。
幾つかのスチルベン誘導体は化学文献で知られている。Todaら，Chem. Commun. 1234-5(1984)では、ジアルデヒドＡが記載されており、ジオールＢはTsujiら，J.Am.Chem.Soc. 88, 1289-92(1966)によって記載され、ジオールＣはDhawauら，J.Org.Chem., 45, 922-4(1980)によって製造された。これらの化合物に関し、有用性の開示はなく、これらの化合物は本発明のＲ1置換基を有しない。
0003662936.tif 000002
構造Ｄは高脂血症の治療に有用であると、Hashimotoら，欧州特許出願第４２４，５４１号（1991年5月2日）によって開示されている。
0003662936.tif 000003
これらの化合物（Ｄ）は本発明の第２の炭素置換基Ｘを欠き、関連した有用性を持たない。
発明の概要
本発明は、式Ｉの新規化合物、及びＣＯＸ−２媒介疾患の治療方法であって、このような治療の必要のある患者に非毒性量で治療有効量の式Ｉの化合物を投与することを特徴とする該方法を包含する。これらの化合物は、ＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２を選択的に阻害する化合物のプロドラッグである。該プロドラッグは、選択的に阻害剤にインビボで変換される。
0003662936.tif 000004
本発明は、式Ｉの化合物を含む、ＣＯＸ−２媒介疾患の治療のためのある特定の医薬製剤も包含する。
発明の詳細な説明
一実施態様において、本発明は、式Ｉの新規化合物、及びＣＯＸ−２媒介疾患の治療方法であって、このような治療の必要のある患者に非毒性量で治療有効量の式Ｉ
0003662936.tif 000005
［式中、
Ｘは、
（ａ）  ＣＨ2ＯＨ、
（ｂ）  ＣＨＯ、
（ｃ）  ＣＯ2Ｒ4、又は
（ｄ）  ＣＯＮＲ42、
である；
Ｙは、
（ａ）  ＣＨ3、又は
（ｂ）  ＣＨ2ＯＲ5
である；
Ｒ1は、
（ａ）  Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、
（ｂ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2、
（ｃ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3、
（ｄ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＣＨ3、
（ｅ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＮＨ2、
（ｆ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3、
（ｇ）  Ｐ（Ｏ）（ＣＨ3）ＯＨ、及び
（ｈ）  Ｐ（Ｏ）（ＣＨ3）ＮＨ2
からなる群から選択される；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素、
（ｂ）  ハロ、
（ｃ）  Ｃ1-6アルコキシ、
（ｄ）  Ｃ1-6アルキルチオ、
（ｅ）  ＣＮ、
（ｆ）  ＣＦ3、
（ｇ）  Ｃ1-6アルキル、及び
（ｈ）  Ｎ3
からなる群から選択される；
Ｒ4は、
（ａ）  水素、
（ｂ）  Ｃ1-6アルキル、及び
（ｃ）  一置換もしくは二置換のベンジル、但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルキル、
（４）  Ｃ1-6アルコキシ、
（５）  Ｃ1-6アルキルチオ、
（６）  ＯＨ、
（７）  ＣＮ、及び
（８）  ＣＦ3
から選択される、
からなる群から選択される、
又は同じＮに結合している２個のＲ4は、１個のＯ原子もしくは１個のＳ原子もしくは更なる１個のＮ原子（Ｎ原子は１個の水素もしくはＣ1-6アルキルで置換されている）を場合によっては含む５員、６員もしくは７員の飽和環を形成できる；
Ｒ5は、
（ａ）  Ｃ1-6アルキル、
（ｂ）  一置換もしくは二置換のベンジル、但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルキル、
（４）  Ｃ1-6アルコキシ、
（５）  Ｃ1-6アルキルチオ、
（６）  ＯＨ、
（７）  ＣＮ
（８）  ＣＦ3、及び
（９）  ＣＯ2Ｒ4
から選択される、
からなる群から選択される］
を有する化合物又は医薬として許容できるその塩を投与することを特徴とする該方法を包含する。
一属において、この実施態様内の好適な化合物は、
Ｒ1は、
（ａ）  Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、及び
（ｂ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2
からなる群から選択される；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（１）  水素、
（２）  フルオロ、クロロ及びブロモからなる群から選択されるハロ
からなる群から選択される；
であることを特徴とする化合物である。
別の属において、本実施態様内の好適な化合物は、
Ｙは、ＣＨ3又はＣＨ2ＯＣ1-6アルキルであることを特徴とする化合物である。
この属内に、
Ｙは、ＣＨ3又はＣＨ2ＯＣ1-6アルキルである；
Ｒ1は、
（ａ）  Ｓ（Ｏ）2ＣＨ3、
（ｂ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨ2、
（ｃ）  Ｓ（Ｏ）2ＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3、
（ｄ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＣＨ3、
（ｅ）  Ｓ（Ｏ）（ＮＨ）ＮＨ2、及び
（ｆ）  Ｓ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）ＣＦ3
からなる群から選択される；及び
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素、
（ｂ）  フルオロ、クロロ、及びブロモ、
（ｃ）  Ｃ1-4アルコキシ、
（ｄ）  Ｃ1-4アルキルチオ、
（ｅ）  ＣＮ、
（ｆ）  ＣＦ3、及び
（ｇ）  Ｃ1-4アルキル、
からなる群から選択される；
であることを特徴とする化合物のクラスがある。
このクラス内に、
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（１）  水素、及び
（２）  ハロ
からなる群から選択される；
Ｒ4は水素又はメチルである；及び
Ｒ5はＣ1-6アルキルである；
であることを特徴とする化合物のサブクラスがある。
別の属において、上記実施態様内の好適化合物は、
ＸはＣＯ2Ｒ4であることを特徴とする化合物である。
この属内に、
ＸはＣＯ2Ｒ4である；
Ｙはメチル又はＣＨ2ＯＲ5である；
Ｒ1はＳ（Ｏ）2ＣＨ3である；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素、及び
（ｂ）  ハロ
からなる群から選択される；
Ｒ4は、
（ａ）  水素、及び
（ｂ）  Ｃ1-6アルキル
からなる群から選択される；
Ｒ5は、
（ａ）  Ｃ1-6アルキル、
（ｂ）  一置換もしくは二置換のベンジル、但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルコキシ、及び
（４）  ＯＨ
から選択される、
からなる群から選択される；
であることを特徴とする化合物のクラスがある。
このクラス内に、
ＸはＣＯ2Ｒ4である；
Ｙはメチル又はＣＨ2ＯＲ5である；
Ｒ1はＳ（Ｏ）2ＣＨ3である；
Ｒ2及びＲ3は各々独立に、
（ａ）  水素、及び
（ｂ）  ハロ
からなる群から選択される；
Ｒ4は、
（ａ）  水素、及び
（ｂ）  Ｃ1-6アルキル
からなる群から選択される；
Ｒ5は、
（ａ）  Ｃ1-6アルキル、
（ｂ）  一置換もしくは二置換のベンジル、但し置換基は、
（１）  水素、
（２）  ハロ、
（３）  Ｃ1-6アルコキシ、及び
（４）  ＯＨ
から選択される、
からなる群から選択される；
であることを特徴とする化合物のサブクラスがある。
表II及びIIIの化合物は本発明の例である。
本明細書の目的のために、アルキルは、指示数の炭素原子を有する、直鎖構造、分枝構造及び環状構造を含むものと定義される。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｓ−及びｔ−ブチル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、１，１−ジメチルエチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルである。同様に、アルコキシ及びアルキルチオは、指示数の炭素原子を有する直鎖構造、分枝構造及び環式構造を意味する。
本明細書の目的のために、“ＣＯＮＲ42”の“Ｒ4”のように、定義が２度現れる場合、各存在は互いの存在とは独立と考えるべきである。即ち、“ＣＯＮＲ42”では、“Ｒ4”基は同一である必要はない。
本明細書の目的のために、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味する。
以下の略語は記載した意味を持つ。
0003662936.tif 000006
0003662936.tif 000007
0003662936.tif 000008
本明細書に記載した化合物の幾つかは、一つ以上の不斉中心を含み、従ってジアステレオマー及び光学異性体を生じさせうる。本発明は、このような、可能性のあるジアステレオマー並びにそれらのラセミ型と分割されたエナンチオマー的に純粋型及び医薬として許容できるその塩を含むものとする。
本明細書記載の化合物の幾つかはオレフィン性二重結合を含み、特記していなければ、Ｅ及びＺ幾何異性体の両方を含むものとする。
式Ｉの化合物は、リウマチ性発熱、インフルエンザもしくは他のウイルス感染と関連する症状、普通の風邪、腰痛及び首痛、月経困難症、頭痛、歯痛、捻挫及び変形、筋炎、神経痛、滑膜炎、リウマチ性関節炎を含む関節炎、変形性関節症（骨関節症）、痛風及び強直性脊椎炎、滑液包炎、火傷、損傷、手術手順後及び歯科手順後を含む種々の疾患の疼痛、発熱及び炎症の軽減に有用である。更に、このような化合物は、細胞の腫瘍性トランスフォーメーション及び転移性癌成長を阻害しえ、このため癌の治療に使用できる。化合物Ｉまたは、糖尿病性網膜炎及び腫瘍血管形成において起りうるようなシクロオキシゲナーゼ媒介増殖性疾患の治療及び／又は予防にも有用でありうる。
ＣＯＸ−２阻害剤へのインビボ変換によって、化合物Ｉは、収縮性プロスタノイド合成を防止することによって、プロスタノイド誘導平滑筋収縮も阻害するであろうし、それ故、月経困難症、早産、喘息及び好酸球関連疾患の治療に有用でありうる。化合物Ｉは、アルツハイマー症の治療にも、特に閉経後婦人における骨損失の減少のためにも（即ち、骨粗鬆症の治療）、及び緑内障の治療にも有用であろう。
式Ｉの化合物は選択的ＣＯＸ−２阻害剤のプロドラッグであり、活性を有する選択的ＣＯＸ−２阻害剤へのインビボ変換によって作用する。本発明の化合物から生成される活性化合物は以下の特許［引用により本明細書に含まれるものとする］に記載されている：ＷＯ  ９５／００５０１（1995年1月5日公開）、ＷＯ  ９５／１８７９９（1995年1月13日公開）及び米国特許第５，４７４，９９５号（1995年12月12日発行）。
ある点では、本発明の化合物は、薬物動力学及び／又は安全性の改善によって、上記特許に記載の化合物に対し利点を有する。医薬として有用な化合物としてプロドラッグの利点と使用に関する一般的説明は、Waller and George,Br.J.Clin.Pharmac. Vol.28, pp.497-507, 1989の論文に記載されている。
例を挙げると、本発明の以下の化合物は、記載されたＣＯＸ−２選択的阻害剤に変換される。
0003662936.tif 000009
ＣＯＸ−２に対する高い阻害活性及び／又はＣＯＸ−１よりもＣＯＸ−２に対する特異性を有する化合物へのインビボ変換によって、特に、消化性潰瘍、胃炎、限局性腸炎、潰瘍性大腸炎、憩室炎、又は胃腸疾患の回帰性病歴；ＧＩ出血、低プロトロンビン血症、ヘモフィリア、又は他の出血性疾患のような貧血を含む凝固性疾患；腎疾患；手術又は抗凝固剤投与の患者におけるように、このような非ステロイド性抗炎症剤が禁忌兆候を示しうる場合に、化合物Ｉは通常のＮＳＡＩＤに対する代替薬として有用であろう。
本発明の医薬製剤は、活性成分として式Ｉの化合物又は医薬として許容できるその塩を含み、また医薬として許容できる担体及び必要に応じて他の治療成分を含みうる。“医薬として許容できる塩”という用語は、無機塩基及び有機塩基を含む医薬として許容できる非毒性塩基から製造される塩を指す。無機塩基から得られる塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、三価マンガン塩、二価マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などがある。特にアンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩及びナトリウム塩が好ましい。医薬として許容できる有機非毒性塩基から得られる塩には、第一級、第二級及び第三級アミンの塩、天然の置換アミンを含む置換アミンの塩、環式アミンの塩、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩、及び塩基性イオンの交換樹脂の塩がある。
以下の治療方法の考察で、式Ｉの化合物に言及する場合、式Ｉの化合物は、医薬として許容できる塩をも含むものとすることが理解されよう。
式Ｉの化合物は、リウマチ性発熱、インフルエンザもしくは他のウイルス感染と関連する症状、普通の風邪、腰痛及び首痛、月経困難症、頭痛、歯痛、捻挫及び変形、筋炎、神経痛、滑膜炎、リウマチ性関節炎を含む関節炎、変形性関節症（骨関節症）、痛風及び強直性脊椎炎、滑液包炎、火傷、損傷、手術手順後及び歯科手順後を含む種々の疾患の疼痛、発熱及び炎症の軽減に有用である。更に、このような化合物は、細胞の腫瘍性トランスフォーメーション及び転移性癌成長を阻害しえ、このため癌の治療に使用できる。化合物Ｉはまた、糖尿病性網膜炎及び腫瘍血管形成において起りうるようなシクロオキシゲナーゼ媒介増殖性疾患の治療及び／又は予防にも有用でありうる。
化合物Ｉはまた、収縮性プロスタノイドの合成を防止してプロスタノイド誘導平滑筋収縮をも阻害し、そのため月経困難、早産、喘息、及び好酸球関連疾患の治療に有用でありうる。化合物Ｉはまた、アルツハイマー病の治療、及び骨損失の防止（骨粗鬆症の治療）及び緑内障の治療に有用であろう。
ＣＯＸ−１に対する化合物Ｉ由来の阻害剤の高ＣＯＸ−２活性及び／又はＣＯＸ−２への特異性のために、特に、消化性潰瘍、胃炎、限局性腸炎、潰瘍性大腸炎、憩室炎、又は胃腸疾患の回帰性病歴；ＧＩ出血、低プロトロンビン血症・ヘモフィリア・又は他の出血性疾患のような貧血を含む凝固性疾患；腎疾患；手術又は抗凝固剤投与の患者におけるように、非ステロイド性抗炎症剤が禁忌兆候を示しうる場合に、化合物Ｉは通常のＮＳＡＩＤに対する代替薬として有用であろう。
同様に、現在他の薬剤又は成分と共投与されている製剤で、通常のＮＳＡＩＤの部分的又は全部の代替物として、化合物Ｉは有用であろう。従って、本発明は更なる面で、非毒性の治療上有効量の上記式Ｉの化合物、及びアセトミノフェンもしくはフェナセチンを含む別の疼痛軽減薬；カフェインを含む増強剤；Ｈ2−アゴニスト、水酸化アルミニウムもしくは水酸化マグネシウム、シメチコン、フェニルエフリン・フェニルプロパノールアミン・シュードフェドリン・オキシメタゾリン・エフィネフリン・ナファゾリン・キシロメタゾリン・プロピルヘキセドリン・もしくはレボデスオキシエフェドリンを含む充血緩和剤；コデイン・ヒドロコドン・カラミフェン・カルベタペンタン・デキトラメトルファンを含む鎮咳剤；ミソプロストール・エンプロスティル・リポスティル・オルノプロストール・もしくはロサプロストールを含むプロスタグランジン；利尿剤；鎮痛もしくは非鎮痛抗ヒスタミンなどの一つ以上の成分を含む、上記ＣＯＸ−２媒介疾患の治療用医薬製剤を包含する。更に、本発明は、シクロオキシゲナーゼ媒介疾患の治療方法であって、このような治療の必要のある患者に、非毒性の治療上有効量の式Ｉの化合物の投与、必要に応じて直前に記載のような成分の一つ以上の共投与を特徴とする方法を包含する。
これらのシクロオキシゲナーゼ媒介疾患の任意のものの治療において、化合物Ｉを、経口、局所、非経口、吸入噴霧、又は経直腸により、通常の非毒性の医薬として許容できる担体、アジュバント及びビヒクルを含む投与単位製剤として投与できる。本明細書で使用する非経口という用語は、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、胸骨内注射又は輸液技術を含む。マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコなどの温血動物の治療に加えて、本発明の化合物はヒトの治療に有効である。
上述のように、上記ＣＯＸ−２媒介疾患の治療用医薬製剤は、必要に応じて上記の一つ以上の成分を含んでもよい。
活性成分を含む医薬製剤は、例えば錠剤、トローチ、ドロップ、水性もしくは油性懸濁液、分散粉末もしくは顆粒、エマルション、硬もしくは軟カプセル、又はシロップもしくはエリキシル剤として、経口使用に適切な剤形でありうる。経口使用用の製剤を、医薬製剤の製造のために当業界公知の方法によって製造でき、このような製剤は、甘味剤、フレーバー剤、着色剤、及び保存剤からなる群から選択される一つ以上の薬剤を含み、医薬として上品で美味の製剤を得ることができる。錠剤は、活性成分を、その製造に適した非毒性の医薬として許容できる賦形剤と混合して含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；例えばコーンスターチ又はアルギン酸などの顆粒化剤及び崩壊剤；例えば澱粉、ゼラチン又はアカシアなどの結合剤、並びに例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの潤滑剤でありうる。錠剤はコートされなくともよいし、又は公知技術でコートされて、胃腸管での崩壊及び吸収を遅らせ、より長時間にわたって作用を維持できうる。例えば、モノステアリン酸グリセロール又はジステアリン酸グリセロールなどの時間遅延物質を使用できる。錠剤をまた、米国特許第4,256,108号、第4,166,452号、及び第4,265,874号に記載の技術によってコートし、放出制御のための浸透性治療用錠剤を形成できる。
経口使用用製剤はまた、活性成分が、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンなどの不活性固体希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が、水、又はプロピレングリコール、ＰＥＧ及びエタノールなどの混和できる溶媒、又は例えばピーナッツ油、液体パラフィン、もしくはオリーブ油などの油性媒体と混合されている軟ゼラチンカプセルとして、得られることができる。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した活性成分を含む。このような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムなどの懸濁剤である；分散剤又は湿潤剤は、例えばレシチンなどの天然のホスファチド、又は例えばポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合産物、又は例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合産物、又は例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどのエチレンオキシドと、脂肪酸由来部分エステル及びヘキシトールとの縮合産物、又は例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートなどのエチレンオキシドと、脂肪酸由来部分エステル及びヘキシトール無水物との縮合産物でありうる。水性懸濁液はまた、例えばエチル、安息香酸又はｎ−プロピル安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などの一つ以上の保存剤、一つ以上の着色剤、一つ以上のフレーバー剤、及び砂糖、サッカリン又はアスパルテームなどの一つ以上の甘味剤を含みうる。
活性成分を、例えばピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油などの植物油、又は液体パラフィンなどの鉱油中に懸濁して、油性懸濁液を製造できる。油性懸濁液は、例えば蜜蝋、硬パラフィン、又はセチルアルコールなどの粘稠化剤を含みうる。上記のような甘味剤及びフレーバー剤を加えて、美味の経口製剤が得られる。アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加して、これらの製剤を保存できる。
水の添加による水性懸濁液の製造に適した分散粉末及び顆粒は、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁剤及び一つ以上の保存剤と混合された活性成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、上記のものによって例示される。更なる賦形剤、例えば甘味剤、フレーバー剤及び着色剤も存在しうる。
本発明の医薬製剤はまた、水中油型エマルションの剤形でありうる。油相は、例えばオリーブ油もしくはピーナッツ油などの植物油、又は例えば液体パラフィン又はこれらの混合物などの鉱油でありうる。適切な乳化剤は、例えば大豆レシチンなどの天然のホスファチド、及びソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸とヘキシトール無水物由来のエステルもしくは部分エステル、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの、該部分エステルとエチレンオキシドとの縮合産物でありうる。エマルションはまた、甘味剤及びフレーバー剤を含んでもよい。
シロップ及びエリキシル剤は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール又は砂糖などの甘味剤を用いて製造できる。このような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、フレーバー剤、着色剤を含みうる。医薬製剤は、滅菌注射用水性又は油性懸濁液の剤形でありうる。この懸濁液を、上記の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用する公知技術によって製造できる。滅菌注射用製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液でありうる。使用できる許容できるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。エタノール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどの共溶媒も使用できる。更に、滅菌不揮発性油を、溶媒又は懸濁媒体として使用するのも便利である。この目的のために、合成モノグリセライド又はジグリセリドを含む任意の柔和な不揮発性油を使用できる。更に、オレイン酸などの脂肪酸を、注射用のものの製造に使用できる。
化合物Ｉはまた、薬剤の直腸投与のための座薬の剤形で投与できる。これらの製剤は、通常の温度では固体で、直腸温度で液体であり、そのため直腸で溶融し薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合して製造できる。このような物質はカカオバター及びポリエチレングリコールである。
局所使用の場合、式Ｉの化合物を含むクリーム、軟膏、ゲル、溶液又は懸濁液等を使用する（本出願の目的のために、局所適用は口洗浄薬とうがい薬を含むものとする）。一般的に、局所用製剤は、医薬担体、共溶媒、乳化剤、浸透増強剤、保存システム及び軟化剤からなりうる。
上記疾患の治療において投与レベルは、１日当たり、約０．０１〜約１４０ｍｇ／ｋｇ体重のオーダー、あるいは１日当たり患者１人当たり約０．５ｍｇ〜約７ｇが有用である。例えば、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１〜５０ｍｇの化合物の投与、あるいは１日当たり患者１人当たり約０．５ｍｇ〜約３．５ｇの投与により、炎症を効果的に治療できる。
１個の投与賦形を製造するために、担体物質と混合できる活性成分の量は、治療される患者と特定の投与法により異なる。例えば、ヒトの経口投与用の製剤は、製剤全体の約５〜約９５％で変わりうる適切で便利な量の担体物質と混合された０．５ｍｇ〜５ｇの活性薬剤を含みうる。一般的に、投与単位剤形は、活性成分約１〜約５００ｍｇ、典型的には２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、又は１０００ｍｇを含む。
しかし、任意の特定の患者のための特定の投与レベルは、年齢、体重、全体的健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬剤の組合わせ、及び治療を受ける特定の病気の程度を含む種々の因子によることが理解されよう。
本発明の化合物は以下の方法により製造できる。
方法Ａ：
ＣＨ2Ｃｌ2のような適切な溶媒中、ＴｉＣｌ4又はＥｔ2Ｏ・ＢＦ3のような適切なルイス酸によるケタール１とビストリメチルケテンアセタール２の処理によって、ジアステレオマー混合物として付加物３を得る。ＣＨ2Ｎ2による３のエステル化、次にＤＢＵのような塩基による処理で、５と６の混合物が得られ、それらはシリカゲルクロマトグラフィーで分離される。ＭＭＰＰ又はｍＣＰＢＡによる５の酸化によって所望の生成物７を得る。
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方法Ｂ：
ＴＨＦ／Ｈ2Ｏ又はＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏのような水と溶媒の混合液中でＬｉＯＨ又はＮａＯＨのような塩基によるエステル７の加水分解により、所望のカルボン酸８を得る。
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方法Ｃ：
塩化オキサリル、次に適切なアミンによるカルボン酸８の処理によって所望のアミド９を得る。
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方法Ｄ：
トルエン、ヘキサン、テトラヒドロフラン又はエーテルのような適切な溶媒中で、水素化ジイソブチルアルミニウム又は水素化リチウムアルミニウムのような適切な還元剤によって、ジフェニルラクトン１０をジオール１１に還元する。ＮａＨ又はＫＯＢｕｔのような塩基の存在下、ジオール１１をハロゲン化アルキル又はハロゲン化ベンジルでアルキル化する。このアルキル化により所望の異性体１２と所望しない異性体１３を得るが、これらはクロマトグラフィー又は結晶化により分離される。二酸化マンガンのような試薬により、化合物１２はアルデヒド１４に酸化される。ＮａＣｌＯ2による１４の更なる酸化により、酸１５を得る。あるいは、１２は、Ｃｒ+6試薬で酸１５に直接酸化されることができる。１５の塩基処理によって塩１６が生成する。塩基の存在下、アルキル化試薬と１５を反応させて、エステル１７を製造できる。１５のメチルエステルは、エーテル中１５とジアゾメタンを反応させて、小規模で便利に製造される。
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方法Ｅ：
水素化ジイソブチルアルミニウム又は水素化リチウムアルミニウムのような適切な水素化物還元試薬により、ジフェニルマレイン酸無水物１８はジオール１１に還元されることができる。トルエン、テトラヒドロフランもしくはエーテル、又はそれらの混合液のような溶媒は還元に適切である。
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方法Ｆ：
還流無水酢酸中で、フェニル酢酸１９をα−オキソフェニル酢酸２０（好ましくはそのカリウム塩）と反応させるというFieldsの方法［J.Org.Chem., Vol.55, pp.5165-70(1990)；米国特許第４，５６９，８６７号］によって、２，３−ジフェニルマレイン酸無水物１８を製造できる。
２１及び２２のようなフェニルアセトニトリルから１８への多数段の工程順序は、Smithら，J.Org.Chem., Vol.55, pp.3351-62(1990)によって報告されている。
Florac及び協同研究者ら，Tetrahedron, Vol.46, pp.445-52(1990)は、α−ブロモフェニルアセトヒドラジン２３と２４から数工程での１８の別の合成を報告している。
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方法Ｄに従い、それらから本発明の化合物が製造できる幾つかののラクトン１０を表Ｉに示す。
本発明の代表的化合物（構造Ｉａ及びＩｂ）を表IIとIIIに示す。
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生物活性測定のアッセイ
式Ｉの化合物を、シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性測定の以下のアッセイを用いて試験できる。
シクロオキシゲナーゼ活性の阻害
シクロオキシゲナーゼ活性の阻害剤として、細胞まるごとのシクロオキシゲナーゼアッセイで、化合物を試験する。これらのアッセイの両方で、放射性免疫アッセイを用いてアラキドン酸に反応して合成されるプロスタグランジンＥ2を測定する。これらのアッセイで、１００％活性とは、アラキドン酸非存在下及び存在下でのプロスタグランジンＥ2合成の差と定義される。
細胞まるごとアッセイ
シクロオキシゲナーゼアッセイのために、骨肉腫細胞を、密集するまで（１−２×１０5細胞／穴）２４穴マルチディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ）中の培地１ｍＬ中で培養する。Ｕ−９３７細胞を、スピナーフラスコ中で生育させ、２４穴マルチディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ）中に最終密度１．５×１０6細胞／ｍＬに再懸濁させる。骨肉腫細胞とＵ−９３７細胞の洗浄及びＨＢＳＳ  １ｍＬへの再懸濁後、試験化合物のＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯビヒクル  １μＬを加え、サンプルを穏やかに混合する。全てのアッセイを３重に行う。その後、サンプルを５〜１５分間３７℃でインキュベートし、アラキドン酸を加える。アラキドン酸（過酸化物を含まない、Cayman Chemical）を、エタノール中の１０ｍＭ保存溶液として調製し、更にＨＢＳＳで１０倍希釈する。この希釈溶液の１０μＬアリコートを、最終アラキドン酸濃度１０μＭになるように細胞に加える。対照サンプルを、アラキドン酸の代りにエタノールビヒクルとインキュベートする。サンプルを再度穏やかに混合し、３７℃で更に１０分インキュベートする。骨肉腫細胞の場合、その後、１Ｎ  ＨＣｌ  １００μＬを添加混合し、細胞単層から溶液を素早く除去して反応を止める。Ｕ−９３７細胞の場合、１Ｎ  ＨＣｌ  １００μＬを添加混合して反応を止める。その後、サンプルを、１Ｎ  ＮａＯＨ  １００μＬを添加して中和し、ＰＧＥ2レベルを放射性免疫アッセイで測定する。
ＣＨＯトランスフェクト細胞系を用いるＣＯＸ−２及びＣＯＸ−１の細胞まるごとアッセイ
ヒトＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２ｃＤＮＡのどちらかを含む真核発現ベクターｐＣＤＮＡIIIで安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系をアッセイに用いる。これらの細胞系を、それぞれＣＨＯ［ｈＣＯＸ−１］とＣＨＯ［ｈＣＯＸ−２］と命名する。シクロオキシゲナーゼアッセイの場合、懸濁培養からのＣＨＯ［ｈＣＯＸ−１］及び接着培養のトリプシン処理で調製したＣＨＯ［ｈＣＯＸ−２］を、遠心（３００×ｇ，１０分）で取得し、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４を含むＨＢＳＳで一度洗浄し、ＨＢＳＳ、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４に再懸濁し、細胞濃度を１．５×１０6細胞／ｍＬにする。試験する薬剤をＤＭＳＯに溶解し、最大試験薬剤濃度の６６．７倍にする。典型的には、最大薬剤濃度のＤＭＳＯでの３倍連続希釈を用いて、化合物を二連で８個の濃度で試験する。細胞（２００μＬ中０．３×１０6細胞）を、試験薬剤又はＤＭＳＯビヒクル３μＬで３７℃で１５分間プレインキュベートする。過酸化物非含有ＡＡの作業用溶液（ＣＨＯ［ｈＣＯＸ−１］とＣＨＯ［ＣＯＸ−２］アッセイの場合にそれぞれ５．５μＭと１１０μＭ  ＡＡ）を、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４を含むＨＢＳＳ中へのエタノール中濃厚ＡＡ溶液の１０倍希釈によって調製する。次に、薬剤の存在下又は非存在下、ＣＨＯ［ｈＣＯＸ−１］アッセイでは最終濃度０．５μＭ  ＡＡ及びＣＨＯ［ｈＣＯＸ−２］アッセイでは最終濃度１０μＭ  ＡＡになるように、ＡＡ／ＨＢＳＳ溶液を細胞に加える。１Ｎ  ＨＣｌ  １０μＬの添加によって反応を終結させ、続いて０．５Ｎ  ＮａＯＨ  ２０μＬによって中和する。３００×ｇ，４℃，１０分間、サンプルを遠心し、清澄化上清のアリコートを適切に希釈し、ＰＧＥ2の酵素結合免疫アッセイ（Correlate  ＰＧＥ2酵素免疫アッセイキット，Assay Designs, Inc.）を用いてＰＧＥ2レベルの測定を行う。試験化合物の非存在下のシクロオキシゲナーゼ活性は、［アラキドン酸添加の細胞のＰＧＥ2レベル］対［エタノールビヒクルのにせ添加の細胞のＰＧＥ2レベル］の差として測定する。試験化合物によるＰＧＥ2合成の阻害は、［薬剤の存在下の活性］対［陽性対照サンプルの活性］のパーセントとして計算する。
Ｕ９３７細胞ミクロソームからのＣＯＸ−１活性のアッセイ
５００×ｇ、５分の遠心でＵ９３７細胞をペレットとし、リン酸緩衝化生理食塩水で一度洗浄し、再ペレット化する。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２μｇ／ｍＬロイペプチン、２μｇ／ｍＬダイズトリプシンインヒビター、２μｇ／ｍＬアプロチニン、及び１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルからなるホモジナイゼーション緩衝液に、細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を１０秒で４回音波処理し、１０，０００×ｇ、１０分、４℃で遠心する。上清を、１００，０００×ｇ、１時間、４℃で遠心する。１００，０００×ｇのミクロソームペレットを、約７ｍｇタンパク質／ｍＬになるように０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡに再懸濁し、−８０℃で保存する。
ミクロソーム調製物は、使用直前に融解し、簡単な音波処理を行い、次に１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭフェノール、１ｍＭ還元型グルタチオン及び１μＭヘマチンを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．４中でタンパク質濃度１２５μｇ／ｍＬになるように希釈する。アッセイは、最終容量２５０μＬで２連行う。最初に、ＤＭＳＯビヒクル又はＤＭＳＯ中の薬剤５μＬを、９６ディープウエルポリプロピレンタイタープレートのウエル中の、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．４  ２０μＬに加える。次に、ミクロソーム調製物２００μＬを加え、室温で１５分間プレインキュベートし、次に０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４中の１Ｍアラキドン酸２５μＬを添加する。サンプルを、室温で４０分間インキュベートし、１Ｎ  ＨＣｌ  ２５μＬを添加して反応を止める。１Ｎ  ＮａＯＨ２５μＬでサンプルを中和し、次に放射性免疫アッセイ（Dupont-NEN又はAmershamアッセイキット）によってＰＧＥ2含量の定量を行う。シクロオキシゲナーゼ活性は、アラキドン酸存在下及びエタノールビヒクル存在下でインキュベートしたサンプル中のＰＧＥ2レベルの差として定義される。
精製ヒトＣＯＸ−２活性のアッセイ
酵素活性は、ＣＯＸ−２によるＰＧＧ2からＰＧＨ2への還元の間のＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン（ＴＭＰＤ）の酸化に基づく発色アッセイを用いて測定する（Copelandら(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci. 91, 11202-11206）。
組換えヒトＣＯＸ−２は、以前に報告されたように（Percivalら(1994)Arch.Biochem.Biophys. 15,111-118）、Ｓｆ９細胞から精製する。アッセイ混合液（１８０μＬ）は、１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．５、２ｍＭゲナポールＸ−１００、１μＭヘマチン、１ｍｇ／ｍＬゼラチン、８０−１００単位の精製酵素（酵素１単位は、６１０ｎｍでO.D.変化が０．００１／分になるのに必要な酵素量として定義される）、及びＤＭＳＯ中の試験化合物４μＬを含む。混合液を室温（２２℃）で１５分間プレインキュベートし、次にアッセイ緩衝液中の１ｍＭアラキドン酸（ＡＡ）と１ｍＭ  ＴＭＰＤの音波処理溶液２０μＬ（酵素もヘマチンも含まない）を添加して酵素反応を開始させる。酵素活性は、反応の最初の３６秒にわたるＴＭＰＤ酸化の初速度の算定によって測定する。酸化の非特異的速度を、酵素非存在下で観察し（０．００７−０．０１０  O.D.／分）、差し引き、％阻害の計算を行う。ＩＣ50値は、（ｌｏｇ−投与量）対（％阻害）プロットの４変量最小二乗非線形回帰解析から得られる。
ヒト全血アッセイ
原理
ヒト全血は、選択的ＣＯＸ−２阻害剤などの抗炎症化合物の生化学的効力の研究のために適切なタンパク質及び細胞が豊富な環境を提供する。研究によって、正常なヒト血液はＣＯＸ−２酵素を含まないことが示された。このことは、ＣＯＸ−２阻害剤は正常の血液中でＰＧＥ2産生になんら効果をもたないという観察に一致する。ＣＯＸ−２を誘導するＬＰＳ（リポ多糖）とのヒト全血のインキュベート後のみ、これらの阻害剤は活性を有する。このアッセイを用いて、ＰＧＥ2産生に対する選択的ＣＯＸ−２阻害剤の阻害効果を評価できる。更に、全血の血小板は大量のＣＯＸ−１酵素を含む。血液凝固後直ちに、血小板は、トロンビン媒介機構を介して活性化される。この反応により、ＣＯＸ−１の活性化を介してトロンボキサンＢ2（ＴｘＢ2）が産生される。従って、血液凝固後のＴｘＢ2レベルに対する試験化合物の効果は試験でき、ＣＯＸ−１活性の指標として使用できる。それ故、試験化合物の選択性の程度は、ＬＰＳ誘導後のＰＧＥ2のレベル（ＣＯＸ−２）及び同じアッセイでの血液凝固後のＴｘＢ2のレベル（ＣＯＸ−１）を測定することによって決定できる。
方法
Ａ．ＣＯＸ−２（ＬＰＳ誘導ＰＧＥ2産生）
新鮮な血液を、男女のボランティアから静脈突刺により、ヘパリン化チューブに集める。患者は明らかに炎症状態ではなく、血液採取の前少なくとも７日は全くＮＳＡＩＤを投与されなかった。ブランクとして使用するために、血液の２ｍＬアリコートから血漿を直ちに得る（ＰＧＥ2の基礎レベル）。残った血液をＬＰＳ（最終濃度１００μｇ／ｍＬ、Sigma Chem, ＃L-2630（大腸菌から）、０．１％ＢＳＡ−リン酸緩衝化生理食塩水で希釈）と室温で５分間インキュベートする。血液の５００μＬアリコートを、ベヒクル（ＤＭＳＯ）２μＬ又は最終濃度１０ｎＭ〜３０μＭの試験化合物２μＬと３７℃で２４時間インキュベートする。インキュベーションの終りに、血液を12,000×ｇで５分間遠心分離し、血漿を得る。血漿の１００μＬアリコートをメタノール４００μＬと混合し、タンパク質を沈殿させる。上清を得、製造業者の方法の通りに、ＰＧＥ2のそのメチルオキシメート誘導体への変換後、放射性免疫アッセイキット（Amersham, ＲＰＡ＃５３０）を用いてＰＧＥ2をアッセイする。
Ｂ．ＣＯＸ−１（凝固誘導ＴｘＢ2産生）
新鮮な血液を、抗凝固剤をふくまないvacutainerに集める。５００μＬのアリコートを、ＤＭＳＯ２μＬ又は最終濃度１０ｎＭ〜３０μＭの試験化合物２μＬを予め入れたシリコン化微量遠心チューブに直ちに移す。チューブを３７℃で１時間、うずまき状に回転、インキュベートし、血液を凝固させた。インキュベーションの終りに、遠心分離して（12,000×ｇ、５分間）、血清を得る。血清の１００μＬアリコートをメタノール４００μＬと混合し、タンパク質を沈殿させた。上清を得、製造業者の指示の通りに酵素免疫アッセイキット（Cayman, ＃519031）を用いてＴＸＢ2をアッセイする。
ラットの足水腫アッセイ
プロトコル
オスのSprague-Dawleyラット（１０５−２００ｇ）を一晩絶食させ、ベヒクル（１％メトセル又は５％ツウィーン８０）又は試験化合物を経口で与える。１時間後、モニターすべき足の区域を規定するために、一つの後足の足首の上のレベルにパーマネントマーカーで一本の線を引く。水置換原理に基づくPlethysmometer（Ugo-Basile, Italy）を用いて、足の体積（Ｖ0）を測定する。その後、２５ゲージ針のインシュリン用注射器を用いて、生理食塩水中の１％カラゲナン溶液（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ，Ｍａｉｎｅ）５０μＬを動物の足裏に注射した（即ち、一足当たりカラゲナン５００μｇ）。３時間後、足の体積（Ｖ3）を測定し、足体積の増加（Ｖ3−Ｖ0）を計算する。動物をＣＯ2 aphyxiationで殺し、胃障害が有るか無いかを記録する。データをビヒクル−対照値と比較し、％阻害を計算する。オブザーバー先入観を除去するために、全ての処理群にコードを付ける。
ラットにおけるＮＳＡＩＤ誘起胃障害
原理
通常のＮＳＡＩＤの主要な副作用は、ヒトで胃障害を引起す能力である。この作用は胃腸管でのＣＯＸ−１の阻害により起ると考えられている。ラットは特にＮＳＡＩＤに感受性が高い。事実、ラットモデルは、現在の通常のＮＳＡＩＤの胃腸副作用を評価するために過去において通常用いられてきた。本アッセイでは、ＮＳＡＩＤ誘起胃腸障害は、51Ｃｒ−標識赤血球の全身的注入後の糞便の51Ｃｒ排出を測定して観察される。糞便の51Ｃｒ排出は、動物及びヒトでの胃腸の障害の無いことを検出するための、十分に確立された感受性の高い技術である。
方法
オスのSprague Dawleyラット（１５０−２００ｇ）に、一度（急性投与）又は５日間ｂ．ｉ．ｄ（慢性投与）で試験化合物を経口で投与する。最後の投与後直ちに、ラットに、ドナーラットからの51Ｃｒ−標識赤血球０．５ｍｌを、尾の静脈を介し注射する。随意に餌と水を有する代謝ケージに動物を個々に置く。糞便を４８時間集め、51Ｃｒ糞便排出を総注射投与量の％として計算する。
51Ｃｒ−標識赤血球を以下の方法を用いて調製する。血液１０ｍＬを、ドナーラットから大動脈を通ってヘパリン化チューブに集める。血漿を遠心分離で除去し、等量のＨＢＳＳを再び入れる。赤血球を、３７℃、３０分間51クロム酸ナトリウム４００μＣｉとインキュベーションする。インキュベーションの終りに、赤血球をＨＢＳＳ２０ｍＬで２度洗浄し、遊離の51クロム酸ナトリウムを除去する。最終的に、赤血球をＨＢＳＳ１０ｍＬ中に再構成し、ラット１匹当たり溶液０．５ｍＬ（約２０μＣｉ）を注射する。
リスザルにおけるタンパク質−漏出胃障害
原理
タンパク質漏出胃障害（ＧＩ管での循環細胞及び血漿タンパク質の出現として現れる）は、標準的非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）に対する重大な、投与を限定する重大な副反応であり、51ＣｒＣｌ3溶液の静脈投与によって定量的に評価されうる。この同位体イオンは大量、細胞、血清グロビン及び細胞小胞体に結合できる。従って、同位体投与後２４時間中に集められた糞便に現れる放射活性の測定は、タンパク質漏出胃障害の感受性の高い、定量的指標である。
方法
オスのリスザル（０．８〜１．４ｋｇ）の群を、５日間Ｈ2Ｏビヒクル中の１％メトセルもしくは５％ツウィーン８０（３ｍＬ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ）又は５日間（１−１００ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｉ．ｄ）の試験化合物の胃管投与で処理する。最後の薬剤／ベヒクル投与後１時間で、静脈に51Ｃｒ（１ｍＬ／ｋｇ  リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に５μＣｉ／ｋｇ）を投与し、糞便を２４時間代謝ケージで集め、γ−計測で排出された51Ｃｒを評価する。最後の薬剤投与後１時間及び８時間で静脈血液をサンプリングし、薬剤の血漿濃度をＲＰ−ＨＰＬＣで測定する。
ラット血漿レベル
ラットにおける経口の薬物動力学
方法
the Canadian Council on Animal Careのガイドラインに従って、動物を収容し、食物を与え、世話をする。
オスのSprague Dawleyラット（３２５−３７５ｇ）を、各ＰＯ血液レベル研究の前に一晩絶食させる。
ラットを一度に１匹拘束器で拘束し、箱をしっかりと固定する。尾の先端の小部分（１ｍｍ以下）を切開して、零時の血液サンプルを採取する。次に、しっかりとした、しかし穏やかな動きをしながら、先端から根元まで尾を搾り、血液を搾りだす。約１ｍＬの血液を、ヘパリン添加バキュテイナーチューブに集める。
標準的投与容量１０ｍＬ／Ｋｇで必要なように、化合物を調製し、胃の中に１６ゲージの３″胃管注射針を通して、その化合物を経口投与する。
零時の採血と同じように次の採血を行う。但し、再び尾を切開する必要はない。１枚のガーゼで尾をきれいにし、上記のように搾りだし、適当にラベルのあるチューブに入れる。
サンプリングの直後、血液を遠心し、分離し、鮮明に印のついたバイアルに入れ、分析するまでフリーザーに保存する。
ＰＯ投与後のラット血液レベルの測定の典型的時点は、０、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間である。
４時間時点の採血後、ラットに随意に食物を与える。研究期間中いつでも、水は与える。
ビヒクル：
ＰＯラット血液レベル測定で、以下のビヒクルを用いることができる。
ＰＥＧ２００／３００／４００−        ２ｍＬ／Ｋｇに制限
メトセル０．５％−１．０％          １０ｍＬ／Ｋｇ
ツウィーン８０  ５％                １０ｍＬ／Ｋｇ
ＰＯ血液レベルのための化合物は懸濁液の剤形でありうる。より良好な溶解のために、溶液を約５分間音波処理器に置くことができる。
ラットにおける静脈内投与の薬物動力学
方法：
the Canadian Council on Animal Careのガイドラインに従い、動物を収容し、食物を与え、世話をする。
オスのSprague Dawley（３２５−３７５ｇ）ラットを、吊るし床、ケージの天井、水ボトル及び食物を備えたプラスティックシューボックスケージに入れる。
化合物は、標準的投与容量１ｍＬ／Ｋｇに必要なように調製する。
ラットの採血を零時血液サンプルのために行い、ＣＯ2鎮静下に薬剤を投与する。一度に１匹ずつラットを、ＣＯ2充満チャンバーに入れ、ラットが立直り反射を失うと直ぐに取出す。次に、ラットを拘束板で拘束し、ＣＯ2通気用鼻コーンを鼻口部に置き、ラットをゴムで板に拘束する。ピンセットとハサミを用いて、頚静脈を曝し、零時のサンプルを採り、次に化合物の測定済投与量を頚静脈に注入する。光デジタル圧を注入部位に適用し、鼻コーンを取外す。時間を記録する。これは、零時点となる。
尾の先端の小部分（１ｍｍ以下）を切開して、５分の採血を行う。次に、しっかりとした、しかし穏やかな動きをしながら、先端から根元まで尾を搾り、血液を搾りだす。約１ｍＬの血液を、ヘパリン添加収集バイアルに集める。次の採血を同様に行うが、再度尾を切開する必要はない。尾を１枚のガーゼできれいにし、上記のように採血を適当なラベルのあるチューブに入れる。
Ｉ．Ｖ．投与後のラット血液レベルの測定用の典型的時点は、０、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、６時間又は０、５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間である。
ビヒクル：
ＩＶラット血液レベル測定に、以下のビヒクルを使用できる。
デキストロース：        １ｍＬ／Ｋｇ
Molecusol ２５％：      １ｍＬ／Ｋｇ
ＤＭＳＯ：（ジメチルスルホキシド）動物１匹当り投与容量０．１ｍＬに制限
ＰＥＧ２００：６０％以下を４０％滅菌水と混合−１ｍＬ／Ｋｇ
デキストロースの場合、溶液が曇っているならば、重炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウムを添加できる。
分析するとき、アリコートを等容量のアセトニトリルで希釈し、遠心してタンパク質沈殿を取除く。上清を、ＵＶ検出のできるＣ−１８ＨＰＬＣカラムに直接注入する。定量は、既知量の薬剤を添加したきれいな血液サンプルで行う。生物利用性（Ｆ）は、ｉ．ｖ．対ｐ．ｏ．の曲線下面積（ＡＵＣ）を比較して評価する。
Ｆ＝（ＡＵＣｐｏ／ＡＵＣｉｖ）×（投与量ｉｖ／投与量ｐｏ）×１００％。
クリアランス率を以下の式から計算する。
Ｃｌ＝投与量ｉｖ（ｍｇ／ｋｇ）／ＡＵＣｉｖ。
Ｃｌの単位はｍＬ／ｈ・Ｋｇ（時間キログラム当りのミリリットル）。
代表的生物データ
本発明の化合物はＣＯＸ−２阻害剤のプロドラッグであり、そのため上記ＣＯＸ−２媒介疾患の治療に有用である。活性なＣＯＸ−２阻害剤へのこれらの化合物の変換の程度は、下記の代表的結果で知ることができる。示した血漿レベルは、指示したプロドラッグの２０ｍｇ／ｋｇ経口投与でラットを処理したときに観察される、活性なＣＯＸ−２阻害剤の最大ラット血漿濃度である。
0003662936.tif 000032
本発明を以下の非限定実施例で説明するが、異なるように記載していなければ次の通りである。
（ｉ）全ての操作を室温又は外界温度、即ち１８−２５℃の範囲内の温度で行った。
（ii）ロタリーエバポレーターを用いて、減圧下（６００−４０００パスカル：４．５−３０ｍｍＨｇ）、最大６０℃の浴温で、溶媒蒸発を行った。
（iii）反応過程を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で追跡した。反応時間は実例としてのみ記載する。
（iv）融点は補正していない。‘ｄ’は分解を示す。記載されている融点は、記載されたように製造した物質で得られたものである。多形により幾つかの製造品で異なる融点を有する物質が単離できる。
（ｖ）全ての最終産物の構造及び純度は、以下の技術の少なくとも一つで支持された。ＴＬＣ、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析、又は微量分析データ。
（vi）収率を実例としてのみ記載する。
（vii）ＮＭＲデータが記載されている場合、ＮＭＲデータは、記載された溶媒を用い、３００ＭＨｚ又は４００ＭＨｚで測定された、内部標準品としてテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に比較して百万分の一単位（ｐｐｍ）で記載された主要判別プロトンのデルタ（δ）値の形態である。。シグナル形のために使用した通常の略号は以下の通りである。ｓ．シングレット、ｄ．ダブレット；ｔ．トリプレット；ｍ．マルチプレット；ｂｒ．幅広；など。更に“Ａｒ”は芳香族シグナルを示す。
（viii）化学的シンボルは通常の意味をもつ。以下の略号もまた使用する。ｖ（容量）、ｗ（重量）、ｂ．ｐ．（沸点）、Ｍ．Ｐ．（融点）、Ｌ（リットル）、ｍＬ（ミリリットル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、ｅｑ（当量）。
実施例１
（Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−フェニルブト−２−エン酸メチルエステル
工程１：２−メトキシ−３−（４−メチルチオ）フェニル−２−フェニルブタン酸メチルエステル
−７８℃に冷却したＣＨ2Ｃｌ2  １００ｍＬ中の１−（１，１−ジメトキシエチル）−４−メチルチオベンゼン（２．９ｇ，１３．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴｉＣｌ4溶液（１３．７ｍＬ，ＣＨ2Ｃｌ2中１Ｍ）、次に（２，２−ビストリメチルシリルオキシビニル）ベンゼン（４．６ｇ，１６．４ｍｍｏｌ，Ainsworth, J.Organomet.Chem. 1972, 46, 73によって報告された方法により製造）を滴下添加した。反応混合液を−７８℃で２時間攪拌し、ｐＨ７緩衝液（６０ｍＬ，ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4）で反応を止めた。混合液をＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍＬ）で抽出した。抽出液を一緒にし、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮した。残渣をエーテル５０ｍＬに溶解し、エーテル中過剰のＣＨ2Ｎ2溶液で処理した。エーテルを蒸発させて、粗標記化合物をジアステレエオマー混合物として得た。
工程２：（Ｅ）及び（Ｚ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−フェニルブト−２−エン酸メチルエステル
工程１の粗生成物（０．６２ｇ）をＭｅＯＨ１０ｍＬ中に溶解し、０℃に冷却した。オクソン溶液（４．０ｍＬ，水中０．７５Ｍ）を滴下添加し、混合液を０℃で１０分、室温で２時間攪拌した。次に混合液を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出液を一緒にし、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濃縮した。残渣をＣＨ3ＣＮ（１０ｍＬ）に溶解し、ＤＢＵ（０．５１ｍＬ）で処理した。次に混合液を２２時間加熱還流し、室温に冷却した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。９：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃによる溶出で最初に、所望のＥ−異性体（０．２５ｇ）を白色固体として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ4）δ７．６９（２Ｈ，ｄ），７．２０（２Ｈ，ｄ），７．１１（３Ｈ，ｍ），６．９６（２Ｈ，ｍ），３．７８（３Ｈ，ｓ），２．９７（３Ｈ，ｓ），２．３４（３Ｈ，ｓ）。
４：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃによる連続的溶出で、Ｚ−異性体（０．３５ｇ）を白色固体として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．９２（２Ｈ，ｄ），７．４８（２Ｈ，ｄ），７．４１（２Ｈ，ｍ），７．３３（３Ｈ，ｍ），３．４４（３Ｈ，ｓ），３．０７（３Ｈ，ｓ），２．０１（３Ｈ，ｓ）。
実施例２
（Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−フェニルブト−２−エン酸
ジオキサン５ｍＬと水５ｍＬ中の（Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−２−フェニルブト−２−エン酸メチルエステル（２５８ｍｇ）とＬｉＯＨ・Ｈ2Ｏ（９８ｍｇ）の混合液を２時間加熱還流した。次に、反応混合液を室温に冷却し、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ約１に酸性化し、ＥｔＯＡｃ５０ｍＬで抽出した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮した。１：１ヘキサン／ＥｔＯＡｃからの結晶化により、標記酸（２００ｍｇ）を白色固体として得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．６９（２Ｈ，ｄ），７．１９（２Ｈ，ｄ），７．１３（３Ｈ，ｍ），６．９８（２Ｈ，ｍ），２．９７（３Ｈ，ｓ），２．４７（３Ｈ，ｓ）。
実施例３
（Ｅ）−２−（４−フルオロフェニル）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−ブト−２−エン酸メチルエステル
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ6）δ７．７６（２Ｈ，ｄ），７．３６（２Ｈ，ｄ），７．０６（２Ｈ，ｍ），６．９０（２Ｈ，ｍ），３．７６（３Ｈ，ｓ），３．０５（３Ｈ，ｓ），２．３６（３Ｈ，ｓ）。
実施例４
（Ｅ）−３−（４−メチルスルホニル）フェニル−１−モルホリン−４−イル−２−フェニルブト−２−エン−１−オン
方法Ｃに記載の方法により、標記化合物を製造した。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．７３（２Ｈ，ｄ），７．２８（２Ｈ，ｄ），７．１３（３Ｈ，ｍ），７．０１（２Ｈ，ｍ），３．７２（２Ｈ，ｍ），３．６４（２Ｈ，ｍ），３．４２（４Ｈ，ｂｓ），３．００（３Ｈ，ｓ），２．２１（３Ｈ，ｓ）。
実施例５
（Ｅ）−４−メトキシ−３−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−フェニルブテン酸
方法Ｄに記載された方法に従い、標記化合物を製造した。
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ6）δ７．７５（２Ｈ，ｍ），７．４２（２Ｈ，ｄ），７．１５（５Ｈ，ｍ），４．５５（２Ｈ，ｓ），３．３０（３Ｈ，ｓ），３．０５（３Ｈ，ｓ）。