(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自律増殖ベクター（autonomously  replicating  vector）に組込まれた形で少なくとも１つのプロモータヌクレオチド配列と毒素として作用する融合たんぱくを暗号化する少なくとも１つのヌクレオチド配列とを含み、前記プロモータヌクレオチド配列の下流側にいくつかのクローニング部位を含む暗号ヌクレオチド配列と抗毒素が存在するたんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列とを順に配置してそれらを融合することによって前記毒素として作用する融合たんぱくを暗号化するヌクレオチド配列を得ることを特徴とするベクター。
【請求項２】
前記たんぱく毒と前記抗毒素とが、以下の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター：たんぱくCcdBとたんぱくCcdA;たんぱくKidとたんぱくKis;たんぱくPemKとたんぱくPemI;たんぱくDocとたんぱくPhd;たんぱくHokとたんぱくSok。
【請求項３】
前記たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列がたんぱくCcdBを暗号化する野性型遺伝子のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のベクター。
【請求項４】
前記たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列に制限酵素Sma Iの切断部位（cleavage  site）が存在しないことを特徴とする請求の範囲第３項に記載のベクター。
【請求項５】
寄託No.LMBP2781に相当することを特徴とする請求の範囲第４項に記載のベクター。
【請求項６】
自律増殖ベクターが組換えウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
自律増殖ベクターが組換えプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
自律増殖ベクターが組換えpUCプラスミドであることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のベクター。
【請求項９】
前記プロモータヌクレオチド配列がLacオペロンプロモーターから成ることを特徴とする請求の範囲第１項から第８項までのいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
前記いくつかのクローニング部位を含む暗号ヌクレオチド配列の特定クローニング部位（unique  cloning  sites）が、ベクターのヌクレオチド配列の残り部分に存在しないことを特徴とする請求の範囲第１項から第９項までのいずれかに記載のベクター。
【請求項１１】
請求の範囲第１項から第10項までのいずれかに記載のベクターで形質転換される原核細胞。
【請求項１２】
染色体Iq及び高い形質転換効率を有し、前記融合たんぱくの毒性に対する耐性を授ける突然変異を有し、及び／または前記融合たんぱくに対する抗毒素であるたんぱくを暗号化する遺伝子を有することを特徴とする請求の範囲第１項から第10項までのいずれかに記載のベクターのための原核宿主細胞。
【請求項１３】
ジャイレースのサブユニットＡを暗号化する遺伝子またはジャイレースのサブユニットＢを暗号化する遺伝子中に突然変異を有し、前記融合たんぱくに対する耐性を授け、及び／または前記融合たんぱくに対する抗毒素であるたんぱくCcdAを暗号化する遺伝子を有することを特徴とする請求の範囲第12項に記載のベクターのための原核宿主細胞。
【請求項１４】
ジャイレースのGyrAポリペプチドのアミノ酸配列中でアルギニン462をシステインに代える突然変異を有し、それによって前記融合たんぱくに対する耐性を授けることを特徴とする請求の範囲第12項または第13項に記載の大腸菌細胞。
【請求項１５】
Lac Iq突然変異を有することを特徴とする請求の範囲第12項から第14項までのいずれかに記載の細胞。
【請求項１６】
No.LMGP−12601として寄託されていることを特徴とする請求の範囲第15項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の主題
本発明は組換えクローンの直接選択を可能にするクローニング及び／または配列ベクターに係わる。
本発明はこのベクターによって形質転換される原核細胞、このベクターのための原核宿主細胞、及び組換えクローンの選択及び配列を目的とするこのクローニング及び配列ベクターの利用に係わる。
公知技術及び発明の技術的背景
種々の特定クローニング部位を含むファージ（M13系）及びプラスミド（pUC系）クローニングベクターがメッシング等（Messing  et  al）（P.N.A.S  USA,79,3642−3646頁（1977）），ノランダ等（Norrander  et  al）（ジーン（Gene）,26,101−106頁（1983））、及びヤーニッシュ−ペロン等（Yanisch−Perron  et  al）（ジーン（Gene）,33,103−119頁（1985））によってつくられた。
これらのベクターの多重クローニング部位（MCS−multiple  cloning  sites）はLacZ遺伝子の暗号列中に位置する。
組換えベクターを含む形質転換細胞と非組換えベクターを含む細胞との弁別は、グロンボーン（Gronenborn）及びメッシング（Messing）が記述している”ブルースクリーン”法を利用して達成される（インビトロにおける単鎖DNAのメチル化による新規制限エンドヌクレアーゼ切断部位の導入，ネイチャー,272,375−337頁（1978）;Methylation  of  single−stranded  DNA  in  vitro  introduces  new  restriction  endonuclease  cleavages  sites,Nature,272,pp.375−377（1978））。
ただし、この“ブルースクリーン”法には、クローン選択方法（procedure  for  selecting  the  clones）ではなくてスクリーニング方法（screening  procedure）（弁別）（discrimination））を利用することに不都合がある。
スクリーニングによる弁別は、クローン母集団の中から他のクローンとは異なる特徴（色）に基づいてクローンを識別するというものである。選択（selection）にはこの特徴を必要としない。というのは、この方法で単離されるのは組換えクローンだけだからである。
スクリーニング法は、組換えクローン（白色）と非組換えクローン（青色）の色に基づく方法である。この色はＸ−ガラクトース（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド）の切断（cleavage）を防ぐマーカーβ−ガラクトシダーゼの不活性に基づく。非組換えベクターを含む細胞コロニーは官能性β−ガラクトシダーゼを生成させ、Ｘ−ガラクトース基質を加水分解することによって青色を発生させる。一般にβ−ガラクトシダーゼにDNA断片を挿入するとＸ−ガラクトースの切断が防止される。組換えベクターを含む細胞が白色を呈するのはこのためである。
また、この複雑な方法は極めて高価で、不安定な、使用し難い生成物である基質Ｘ−ガラクトースを使用しなければならない。
他方、組換え菌株の直接選択（積極選択:positive  selection）を可能にする種々のクローニングベクターが学術文献に記載されている。
ピアス等（Pierce  et  al）等はデンプン液化バチルス（Bacillus  amylolique−faciens）から得られる致死遺伝子sacBをバクテリオファージP1から誘導されたプラスミドに組込み、特定の大腸菌プロモータの制御下に置いたベクターを記述している（Proc.Notl.Acad.Sci.,89巻,6号,1992,2056−2060頁）。
このベクターのプロモータは、いくつかの特定（specific）クローニング部位（制限酵素切断部位:cleavage  site  for  ａ  restriction  enzyme）を有する部分を含む。
遺伝子sacBは大腸菌に対して有毒な生成物となるスクロースの加水分解に触媒として関与するレバンスクラーゼを暗号化（encode）するから、組換えプラスミドを組入れる突然変異体の直接選択はスクロースを含む培地上で行われる。スクロースが存在しない場合でもレバンスクラーゼは有毒であるから、バクテリアの細胞質中に多数のプラスミドコピーを得たければレバンスクラーゼの合成を抑制しなければならない。
ただし、特に多数のベクターコピーを必要とする場合、細胞毒性遺伝子を完全に抑制することは不可能でないまでも困難である。
従って、細胞毒性遺伝子を抑制することが不可能であればプラスミド生成の段階で細胞が死に、その結果、（不活性致死遺伝子によって特徴づけられる）突然変異株に対して淘汰圧が作用する。
この場合、sacB遺伝子によって暗号化された酵素が宿主細胞を殺さないようにするためには、この遺伝子の発現を制御するCIリプレッサーをクローニングベクターに組込む必要がある。
また、バクテリア培地はスクロースを含むことが多いから、この操作を行うためにはスクロースを全く含まない培地を調製しなければならない。
ヘンリッヒ等（Henrich  et  al）等はバクテリオファージφX174から得られるＥ遺伝子を含むベクターを記述しており（ジーン（Gene）,42巻,3号,1986,345−349頁）、前記Ｅ遺伝子はLacプロモータの制御下にプラスミドpUH84に組込まれる。
この場合、Ｅ遺伝子は６つの特定制限部位（Ｅ遺伝子列全体に位置する）を含み、大腸菌の細胞を溶解するgpEを暗号化する。この場合、制限部位の１つに異種の組換え遺伝子が挿入されていれば積極選択が行われる。
ただし、gpEを暗号化するＥ遺伝子の列に位置する制限部位に外来遺伝子を挿入すると、gpEを暗号化するＥ遺伝子に属する無用の列の部分も配列され、増幅され、特徴づけられるから、外来遺伝子の配列及び／またはPCRによるその増幅はさらに困難になる。
クーン等（Kuhn  et  al）等（ジーン（Gene）,42巻,3号,1986,253−263頁）は、分裂させることでバクテリアのゲノムを殺す制限酵素を暗号化する大きい遺伝子を含むベクターを記述しており、前記遺伝子はLacUV5プロモータの制御下にプラスミドpKG2に組込まれる。
公知のクローニングベクターには、プロモータを不活性化して宿主菌株の死を招くキラー遺伝子の発現を防止するために、エピソーム形態のLac Iqリプレッサーを有する宿主菌株中に維持されなければならないという不都合がある。
さらにまた、この菌株を利用してクローニングベクターのコピーを多数生成させようとすれば、このリプレッサーはベクターの細胞毒作用を変化させる淘汰圧またはベクターのコピー発現及び宿主菌株の死を意味する“遺伝子漏出（genetic  leakage）”を防止するのには不適当であろう。
従って、公知文献のうち、操作し易く、かつ微生物によって工業的規模で生産可能な、即ち、微生物によりこれを殺さずに多数のコピーとして生産可能な大きいヌクレオチド断片を組込むことのできるクローニングベクターを記述しているものは皆無である。
発明の目的
本発明の目的は、簡単にしかも比較的低コストで構成し、生産することができ、上述した公知技術の不都合を伴なうことなく組換えクローンを直接選択することを可能とする新規のクローニング及び／または配列ベクター、及びその宿主菌株を提供することにある。
本発明の具体的な目的の１つは、組換えクローンの特定の選択を可能にするベクターを得ることにある。
本発明の他の目的は、同じプライマーを利用して組換えクローン中で任意の外来DNA断片を（そのサイズに関係なく）配列、拡充及び／または特徴づけを可能にするベクターを得ることにある。
本発明のさらに他の目的は、組換えクローンからこの外来DNA断片を簡単に抽出することも可能にするベクターを得ることにある。
本発明の目的の最後の１つは、前記ベクターの細胞毒作用を変化させるかまたは宿主菌株の死を招く淘汰圧を作用させることなく前記ベクターの多数のコピーを生成させることを可能にする前記ベクターのための宿主菌株を得ることにある。
発明の特徴的要素
本発明は自律増殖ベクター（autonomously  replicating  vector）内に組込まれた形で少なくとも１つのプロモータヌクレオチド配列と、毒物として作用する融合たんぱくを暗号化する（encoding）少なくとも１つの暗号ヌクレオチド配列（coding  mucleotide  sequence）を含み、前記ヌクレオチド配列がいくつかの特定クローニング部位を含む暗号ヌクレオチド配列とたんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列とを融合することによって得られる新規のクローニング及び／または配列ベクターに係わる。
自律増殖ベクターは、組換えウィルスまたはpUCプラスミドのような組換えプラスミドであることが好ましい。
プロモータヌクレオチド配列は、毒物として作用する融合たんぱくを暗号化するヌクレオチド配列の発現を可能にするならいかなるプロモータであってもよい。
このプロモータヌクレオチド配列は、Lacオペロンプロモータから成ることが好ましい。
本発明の好ましい実施例では、たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列に融合するヌクレオチド配列の特定クローニング部位（MCS）が本発明のベクターのヌクレオチド配列の残り部分には存在しない。
たんぱく毒を暗号化する遺伝子のヌクレオチド配列は、たんぱくCcdBを暗号化する野性型遺伝子のヌクレオチド配列の全部または一部であることが有利である。
たんぱく毒を暗号化する遺伝子のヌクレオチド配列に制限酵素Sma I切断部位が存在しないことが好ましい。
本発明はまた、本発明のクローニングベクターで形質転換される原核細胞に係わる。
本発明はまた、染色体Iq及び高い形質転換効率を有し、融合たんぱくの毒性に対する耐性を授ける突然変異を有し、さらに／または融合たんぱくに対する抗毒素であるたんぱくを暗号化する遺伝子を有する、本発明のベクターのための原核宿主細胞に係わる。
本発明のベクターのための原核宿主細胞は、サブユニットＡを暗号化する遺伝子、またはサブユニットＢを暗号化する遺伝子においてジャイレースの突然変異を有し、融合たんぱくに対する耐性を授与し、さらに／または融合たんぱくに対する抗毒素であるたんぱくCcdAを暗号化する遺伝子を有することが好ましい。
原核細胞は、ジャイレースのGyrAポリペプチドのアミノ酸配列においてアルギニン462をシステインに代えて融合たんぱくに対する耐性を授ける突然変異を有する大腸菌細胞であることが好ましい。
この原核宿主細胞は、Lac Iq突然変異をも有することが好ましい。
本発明は、本発明のベクターの断片、特に本発明のベクターに挿入される外来ヌクレオチド断片を配列及び／または（例えばPCRによって）拡充するためのプライマーにも係わる。
これらのプライマーは、いくつかの特定クローニング部位を含む本発明のベクターのヌクレオチド配列の両側に位置するヌクレオチド配列とハイブリット化する（hybridize）10ないし30個のヌクレオチドの配列からなることが好ましい。
本発明は、組換えクローンの選択及び配列を目的とする本発明に従ったベクターの利用にも係わる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のクローニングベクターの模式的説明図である。
図２は、遺伝子ccdBの、たんぱくCcdBを暗号化するヌクレオチド配列図である。
図３及び図４は、それぞれクローニングベクターpKIL18及びpKIL19の融合たんぱくを暗号化するヌクレオチド配列図である。これらの配列には各種制限酵素に対する複数の特定切断部位を含むヌクレオチド配列が含まれる。これらのクローニングベクターpKIL18及びpKIL19は、Ｆプラスミドの野性型ccdB遺伝子とプラスミドpUC18との間、及びプラスミドpUC19との間のインビトロ組換えによって得られた。
発明の好ましい実施例の説明
本発明では、クローニング及び／または配列ベクター１が自律増殖ベクター（autonomously  replicating  vector）２に組込まれた所で少なくとも１つのプロモータヌクレオチド配列３と、毒素として作用する融合たんぱくを暗号化する（encode）少なくとも１つのヌクレオチド配列４を含み、複数の（多重の）特定クローニング部位（MCS）を含む暗号ヌクレオチド配列（coding  mucleotide  sequence）５（またはポリリンカー）とたんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列（６）とを融合することによって前記ヌクレオチド配列４を得る。
自律増殖ベクター２とは、微生物に導入し、微生物中で組換え、及び／または微生物中で増殖することができるウィルスやプラスミド（好ましくはPUC系組換えプラスミド）のようなヌクレオチド構造を意味する。
図１は本発明のクローニングベクターを示す説明図であり、このベクターはノランダ等（Norrander  et  al）（オリゴデオキシヌクレオチド系突然変異誘発を利用した改良型M13ベクターの構造，ジーン,26,101−106頁（1983）;Construction  of  improved  M13  vectors  using  oligodeoxinucleotide−directed  mutagenesis,Gene,26,pp.101−106（1983））及びヤーニッシュ−ペロン等（Yanisch−Perron  et  al）（改良型M13ファージクローニングベクター及び宿主細胞:M13mp18及びpUC19ベクターのヌクレオチド配列，ジーン,33,103−119頁（1985）;Improved  M13  phage  cloning  vectors  and  host  strains:nucleotide  sequences  of  the  M13mp18  and  pUC19  vectors,Gene,33,pp.103−119（1985））が報告しているpUC系（pUＣ18及びpUC19）プラスミドから構成されている。
複数の（多重の）特定クローニング部位（MCS）を含む暗号ヌクレオチド配列５は、複数の制限酵素切断部位を含む短い暗号配列（coding  sequence）（またはポリリンカー）を意味する。
本発明のベクターにポリリンカーが含まれていることの利点は、単一の短い配列に異なるクローニング部位が存在することであり、これにより：
……同じプライマーを利用してこのベクターに挿入されるいかなるDNA断片も迅速に配列し、増幅することが可能になる。
……制限部位の近接効果に助けられてクローン化断片を迅速に抽出することが可能になる。従って、公知技術とは異なり、この近接が本発明のベクターの他の配列からの無用な断片の配列、増幅、特徴づけを回避する。
たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列６は、本来有毒で宿主細胞の１つまたは２つ以上の生活機能にとって特異な活性を示すたんぱくを暗号化するすべての（野性型）ヌクレオチド構造を意味する。
たんぱく毒は、例えばたんぱくCcdB及びCcdAのような解毒素または抗毒素、たんぱくKid及びそのアンタゴニストKis、たんぱくPemK及びそのアンタゴニストPemI、たんぱくDoc及びそのアンタゴニストPhd、たんぱくHoK及びそのアンタゴニストSoK、及びプラスミドを起源とする、または起源としないその他の毒性分子の存在をも特徴とする。
この場合、たんぱく毒を暗号化するヌクレオチド配列はたんぱくCcdB（細胞死の制御）を暗号化し、かつＦプラスミドのccd部位（図２）から得られる野性型遺伝子ccdBから成る。
Ｆプラスミドのccd部位は２つの野性型遺伝子ccdA及びccdBを含み、これら２つの遺伝子はＨ及びＧまたはletA及びletDとも呼称され、それぞれ72または101個のアミノ酸からなるたんぱくを暗号化する（ベックス等、ミニ−Ｆ暗号化たんぱく；新規10.5lキロダルトンスピーシズの同定,EMBO  J.2,1853−1861（1983）;Bex  et  al、Mini−Ｆ  encoded  proteins;identification  of  ａ  new  10.5  kilodalton  species.EMBO  J.2,1853−1861（1983）；三木等、大腸菌における性因子Ｆによる細胞分裂の制御.I.42.84−43.6Fセグメントによる宿主菌の細胞分裂とプラスミドDNAの複製との関連づけ,J.Mol.Bio.174,605−625（1984）;Miki  et  al、Control  of  cell  division  by  sex  factor  Ｆ  in  E.coli.I.The  42.84−43.6  Ｆ  segment  couples  cell  division  of  the  host  bacteria  with  replication  of  plasmid  DNA,J.Mol.Bio.,174,605−625（1984）。
大腸菌においては、ＦプラスミドのCcdBたんぱくは細胞毒であり、その致死作用はたんぱくCcdAによって中和される（カルイ等、Ham22、すなわち、宿主細胞によって致死的であり、ラムドイドプロファージのrecA依存性の誘導を促進するミニ−Ｆ突然変異、EMBO  J.2,1863−1868（1983）:Karoui  et  al、Ham22,a  mini−Ｆ  mutation  which  is  lethal  to  host  cell  and  promotes  recA−dependent  induction  of  lambdoid  prophage.EMBO  J.2.1863−1868（1983）；小倉及び平賀、宿主細胞分裂をプラスミド増殖に関連づけるミニ−Ｆプラスミド遺伝子、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4784−4788（1983）:Ogura  and  Hiraga,Mini−Ｆ  plasmid  gene  that  couple  host  cell  division  to  plasmid  proliferation,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4784−4788（1983）；三木等、大腸菌における性因子Ｆによる細胞分裂の制御、42.84−43.6Fセグメント上におけるインヒビタたんぱくとトリガたんぱくに対する遺伝子の同定、J.Mol.Bio.174,627−646（1984b）:Miki  et  al,Control  of  cell  division  by  sex  factor  Ｆ  in  E.coli.Identification  of  genes  for  inhibitor  protein  and  trigger  protein  on  the  42.84−43.6  Ｆ  segment,J.Mol.Biol.174,627−646（1984b））。
たんぱくCcdBがその致死作用を行う分子メカニズムは解明されている；たんぱくCcdBはDNAトポイソメラーゼIIに対して有毒性である。
II型のDNAトポイソメラーゼは重要かつ偏在的な酵素であり、DNAへ一時的に２本鎖切断を導入することによってDNAのトポロジーを変える。切断−再結合の過程でトポイソメラーゼIIはDNA基質とともに切断したDNAの５′末端に酵素が共有結合している中間複合体を形成する。トポイソメラーゼIIがDNAと共有結合しているこの過渡的な中間生成物に“切断可能複合体（cleavable  complex）”の名称が与えられている（ワン,DNAトポイソメラーゼ、Annu.Rev.Biochem.54,1165−97,1985;Wang,DNA  topoisomerases.Annu.Rev,Biochem.54,665−97,1985;マックスウェル及びジェラート、DNAトポイソメラーゼの機械作用的側面、Advan.Protein  Chem.38,69−107,1986;Maxwell  ＆  Gellert,Mechanistic  aspects  of  DNA  topoisomerases.Advan.Protein  Chem,38,67−107,1986;リュウ、抗腫瘍薬としてのDNAトポイソメラーゼ毒素、Annu.Rev.Biochem.58.351−375,1989;Liu,DNA  topoisomerase  poisons  as  antitumor  drugs,Annu.Rev.Biochem.58.351−375,1989）。
真核生物においても原核生物においても、切断可能なトポイソメラーゼII−DNA複合体は、ジャイレース（バクテリアのトポイソメラーゼII）に作用する“キノロン”系抗生物質や哺乳類のトポイソメラーゼIIに作用する抗癌剤（アクリジン及びエピポドフィロトキシン（epipodophyllotoniins））などのような強力な治療剤のターゲットである。トポイソメラーゼ毒の治療効果は切断可能な複合体を安定させるその能力と相関関係にある。
DNAトポイソメラーゼIIはあらゆる生体に必須の酵素であり、種の進化において極めて安定である。即ち、CcdBたんぱくは広範囲の原核生物にとって潜在的に細胞毒性である作用を有する。
野性型ccdB遺伝子は、サイズが小さいからプラスミドのサイズを過度に大きくすることなくプラスミドに挿入することができ、その結果、プラスミドが外来DNAの大きい断片を含むことができる。また、サイズが小さいだけに、Ｆプラスミドの野性型ccdB遺伝子は極めて少ない制限部位を含む；従って、加えられる多重クローニング部位（MCS）の特定性（uniqueness）を簡単に維持することができる。
意外にも、発明者等はたんぱくCcdBを暗号化するヌクレオチド配列６と複数の（多重の）特定クローニング部位（MCS）を含む暗号ヌクレオチド配列（ポリリンカー５）との同相融合（in−phase  fusion）の結果、毒素として作用する融合たんぱくを暗号化し、従って、組換えプラスミドを直接選択（キラー選択:killer  selection）するためのベクターの生成を可能にするヌクレオチド配列４が得られるとの所見を得た。
得られたプラスミドは、lacプロモータに関して両方向に二重消化制限断片（doubly  digested  restriction  fragments）をクローン化することを可能にする。特定クローニング部位の１つに制限断片が挿入されると遺伝子融合の遺伝子情報が遮断され、その結果、非官能性の遺伝子融合生成物が合成される。挿入による遺伝子融合不活性化は常に終了コドンの導入時、または読取りフレームの変更時に行われねばならない。
このような手つかずのクローニングベクターを有する細胞は官能性の有毒融合たんぱくを形成し、死滅する。
遺伝子融合の特定クローニング部位の１つに外来DNA断片が挿入されると毒の生成が妨げられる。
組換えベクターを有する細胞は生育可能であるが、手つかずのベクターを有する細胞は生育できない。固形培地上での簡単な培養によるこのキラー選択によって非組換えベクター（生育不能クローン）を有する細胞を排除し、組換えクローン（生育可能クローン）を選択することができる。
例I:プラスミドpKIL19の構成
ccdB遺伝子を、DNA鋳型としてプラスミドpULB2208を利用するPCR（ベルナルド及びクットリエール、ミニＦプラスミドCcdAたんぱくの41個のカルボキシ末端残渣はCcdBたんぱくのキラー作用に拮抗するに十分である。Mol.Gen.Genet.226,297−304（1991）;Bernard  and  Couturier,The  41  carboxy−terminal  residues  of  the  miniF  plasmid  CcdA  protein  are  sufficient  to  antagonize  the  killer  activity  of  the  CcdB  protein,Mol  Gen.Genet.226,297−304（1991））及び合成オリゴヌクレオチドによって増幅した。
野性型ccdB遺伝子をMCS19多重クローニング部位のコドンを有するフレーム内で再クローン化し、生の状態の（native）ccdB遺伝子の開始コドンを排除するため、野性型ccdB遺伝子の両側にEcoR I制限部位を発生させるように合成オリゴヌクレオチド配列を選択した。PCR反応から得られたDNAを酵素EcoR Iで消化し、プラスミドpUC19のEcoR I部位へクローニングした。MCS19多重クローニング部位に対応するコドンを追加されたccdB遺伝子をLacプロモータから読取ることを可能にする配向でEcoR I断片が一体化されている処理後のプラスミドをpKIL2と命名した。プラスミドpKIL2は野性型バクテリアにとって致死的である（CcdBs感応性）。
pKIL2は２つのSma I部位をも有し、その１つは多重クローニング部位に存在し、他方はccdB遺伝子の中央領域に存在する。後者は部位に向けた変位誘発によって排除された。得られたプラスミドpKIL3は、特定のSma I部位を有し、依然として２つのEcoR I部位を有する。ccdBの下流に存在するEcoR I部位はその付着末端（cohesive  end）における充填（filling）によって排除した。
得られたプラスミドpKIL19（図４）は多重クローニング部位を含む配列５内に特定のEcoR I制限部位を有する。
例II:プラスミドpKIL18の構成
DNA鋳型としてプラスミドpKIL19及び合成オリゴヌクレオチドを使用して、PCRによってccdB遺伝子を増幅した。ccdB遺伝子をMCS18多重クローニング部位のコドンを有するフレーム内で再クローン化することができるようにccdB遺伝子の両側にHind III部位を発生させるように合成オリゴヌクレオチドの配列を選択した。PCR反応から得られたDNAを酵素Hind IIIによって消化し、プラスミドpUC18のHind III部位へクローン化した。得られたプラスミドは、MCS18多重クローニング部位に対応するコドンを追加されたccdB遺伝子をLacプロモータから読取ることを可能にする配向でHind III断片が一体化されており、pKIL4と命名した。プラスミドpKIL4は、CcdBs−感応性バクテリアにとって致死的である。
ccdB遺伝子のHind III部位下流は、その付着末端における充填によって排除した。得られたプラスミドはpKIL18（図３）であって、特定のSma I部位とともに特定のHind III制限部位を有する（pKIL19からつくられたからである）。
例III:菌株CcdBr及びCcdBSの構成
バクテリア内にプラスミドpKIL18及びpKIL19を維持できるようにするためには、毒として作用する融合たんぱくの致死作用にバクテリアが耐えねばならない。意外にも、染色体突然変異gyrA462は菌株に融合たんぱくの有毒性に対する全面的な耐性を授ける。
さらにはまた、プラスミドpKIL18及びpKIL19はプラスミドpUC18及びpUC19から直接誘導され、LacプロモータからccdB遺伝子を発現させるから、これらのプラスミドをLac Iq菌株中に維持することが好ましい。即ち、本発明の場合には、これらの遺伝子の連続的な過発現は特定の突然変異に有利な淘汰圧を作用させないが、Lac Iq菌株はLacプロモータからの発現を抑制してバクテリアの機能を保護することにより迅速な世代時間（generation  time）を可能にする（菌株によるベクターの増産）。
菌株HB101  Lac Iq,LacYr（マニアティス等，モレキュラークローニング  ラボラトリーズ  マニトバ．コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリ  ニューヨーク;Maniatis  et  al,Molecular  Cloning  Laboratories  Man.Cold  Spring  Habor  Laboratory  N.Y.）から誘導され、染色体Iq及び高い形質転換効率を特徴とする菌株D1210（サドラー等、ジーン8,279−300頁（1980）;Sadler  et  al,Gene  8,pp.279−300（1980））をプラスミドpCOS2.1で形質転換した。カナマイシン耐性を授与するこのプラスミドはエルウイニア  クリサンセミ  3665（Erwinia  chrysanthemi  3665）からrecA遺伝子を搬送し、大腸菌中での組換え（recombination）を可能にする。CcdBRgyrA462,zei298::Tn10菌株でP1ファージの溶解産物（lysate）を調製し、これを利用して菌株D1210/pCOS2.1を感染させた。テトラサイクリンに対して耐性である被形質導入体（transductants）を選択し、CcdBたんぱくに対するその耐性及び感受性をテストした。次いでCcdBR被形質導入体の１つからプラスミドpCOS2.1を除き（cured）、KIB22と命名した。
菌株KIB22はプラスミドpKIL18及びpKIL19の理想的な宿主菌株を構成し、菌株D1210は組換えプラスミドを選択するための理想的な宿主を構成する。
即ち、菌株KIB22は（pUCプラスミドの生成量に比較して）高いDNA抽出効率を有し、予期せぬことであるが、pKIL18及びpKIL19によって暗号化される融合たんぱくに対する耐性を有する。
従って、この微生物を利用して本発明のクローニングベクターを、前記微生物の死を伴なうことなく工業規模で多数のコピーという形で生産することができる。
選択は、IPTG（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド;Isopropyl−Beta−Ｄ−thiogalactopyranoside）及びアンピシリン（ampicillin）を含有する培地にバクテリアを分散させることによって簡単に行うことができる。
菌株KIB22は、No.LMG  Ｐ−12601としてベルギー微生物総合収集機関（the  Belgian  Coordinated  Collections  of  Microorganisms（BCCM））の微生物研究所−バクテリアコレクション（the  Laboratorium  voor  Microbiologie−Bacterienverzameling（LMG））に寄託された。
クローニングベクターpKIL19は、No.LMBP2781として、ベルギー微生物総合収集機関の分子生物学研究所−プラスミド  コレクション（the  Laborium  voor  Moleculaire  Biologie−Plasmiden  Collectie（LMBP））に寄託された。
【図１】
0003654648.tif 000002
【図２】
0003654648.tif 000003
【図３】
0003654648.tif 000004
【図４】
0003654648.tif 000005