(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる調節因子、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する調節因子。
【請求項２】
ニトリル類の存在により、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用が増強される請求項１記載の調節因子。
【請求項３】
ニトリル類がイソバレロニトリルである請求項２記載の調節因子。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる調節因子、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する調節因子、をコードする遺伝子。
【請求項５】
前記遺伝子が、配列番号２で表される塩基配列からなるものである、請求項４記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる調節因子、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ニトリラーゼ活性を上昇させる作用を有する調節因子。
【請求項７】
ニトリル類の存在により、ニトリラーゼ活性を上昇させる作用が増強される請求項６記載の調節因子。
【請求項８】
ニトリル類がイソバレロニトリルである請求項７記載の調節因子。
【請求項９】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる調節因子、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつニトリラーゼ活性を上昇させる作用を有する調節因子、をコードする遺伝子。
【請求項１０】
前記遺伝子が、配列番号２で表される塩基配列からなるものである、請求項９記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項４〜５及び９〜１０のいずれか１項記載の遺伝子、プロモーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子及びロドコッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮＡ領域を含む組換え体プラスミド。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニトリラーゼ遺伝子の発現に関わる調節因子及び該調節因子をコードする遺伝子ＤＮＡに関する。詳しくは、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株に由来し、ニトリラーゼ遺伝子のプロモーターを活性化する作用を有する調節因子、並びに該調節因子をコードする遺伝子ＤＮＡ、ニトリラーゼ遺伝子プロモーター及びニトリラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド、並びに該組換え体プラスミドＤＮＡにより形質転換された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリル化合物から対応する有機酸を製造する際の触媒として、微生物又は微生物由来の酵素（例えばニトリラーゼ）を用いることにより、温和な条件で有機酸を生成させることができる（特開昭58-201992号公報、特開昭同61-40795号公報、特開平2-84198号公報、3-251192各公報参照）。
【０００３】
クローン化されたニトリラーゼ遺伝子を有する組換え体によるニトリルの加水分解では、菌体内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法と比べ飛躍的に増大させることが期待できる。
既に、本発明者らはより高い触媒活性を持つ微生物触媒を調製する目的で、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株のニトリラーゼ遺伝子をクローニングし、大腸菌ラクトースプロモーターの下流に該遺伝子を挿入したプラスミドを作製している（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (1992)）。該プラスミドが導入された大腸菌は、ＩＰＴＧ（イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトシド）存在下で培養することにより高いニトリラーゼ活性を示した。
【０００４】
さらに、微生物触媒として利用価値を高めるために、より機能性に優れたロドコッカス属に属する微生物の組換え体を作製した。すなわち、ニトリラーゼ遺伝子部分をロドコッカス属細菌−大腸菌複合プラスミドベクター（特開平5-64589号及び特開平5-68566号公報参照）に組み込み、これをロドコッカス属に属する微生物に導入した。
【０００５】
しかし、ニトリラーゼ遺伝子部分が導入されただけの形質転換体では、ニトリラーゼ活性は得られなかった。
そこで、ニトリラーゼ活性を得ることができるロドコッカス属に属する微生物の形質転換体の開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株に由来し、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する調節因子、並びに該調節因子をコードする遺伝子ＤＮＡ、ニトリラーゼ遺伝子プロモーター及びニトリラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド、並びに該組換え体ＤＮＡにより形質転換された形質転換体を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ロドコッカス属に属する微生物を宿主とした場合に遺伝子の発現が認められないのは、ニトリラーゼ遺伝子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが機能するために必要な調節因子をコードする遺伝子が形質転換体内に含まれていないためであると考えた。そこで、本発明者らは、かかる調節因子をコードする遺伝子がＪ１株染色体ＤＮＡ上のいずれかの位置に存在するのではないかと考え、鋭意研究を行った。その結果、ニトリラーゼ構造遺伝子の下流にその存在を見いだし、かかる調節因子をコードする遺伝子を含む組換え体を作製した結果、形質転換されたロドコカッス属に属する微生物においてニトリラーゼ遺伝子を発現させ、高いニトリラーゼ活性を得ることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を実質的に含み、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する調節因子である。該調節因子は、ニトリル類、例えばイソバレロニトリルの存在により上記活性化作用が増強されるものである。
さらに、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を実質的にコードするＤＮＡを含む調節因子遺伝子である。
【０００９】
さらに、本発明は、前記調節因子遺伝子、プロモーター領域を含むニトリラーゼ遺伝子及びロドコッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮＡ領域を含む組換え体プラスミドである。ロドコッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮＡ領域としては、プラスミドpRC001、pRC002、pRC003及びpRC004からなる群から選ばれるものが挙げられる。
【００１０】
ここで、アミノ酸配列を「実質的に含み」又は「実質的にコードする」とあるのは、このペプチドがニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する機能を有する限り、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸のいくつかについて欠失、置換、付加等があってもよいことを示すものである。従って、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、第１番目のアミノ酸であるメチオニン(Met)が欠失等しているものなどもこのアミノ酸配列の変化によるポリペプチドに包含される。さらに、ポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有するものの他、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリペプチドをコードする縮重異性体をも包含するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、前記組換え体プラスミドにより形質転換された形質転換体である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化させる作用を有する調節因子（以下「調節因子」という）をコードする遺伝子を含み、以下の工程により調製される。
【００１２】
(1) ニトリラーゼ遺伝子および調節因子をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
ロドコッカッス・ロドクロウスＪ１株（以下「Ｊ１株」という）由来のニトリラーゼ遺伝子は既に公知であり（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (1992)）、該遺伝子は、ベクターpUC19 に挿入されたプラスミドpNJ10 として得られている。ニトリラーゼ遺伝子は、このプラスミドpNJ10 を適当な制限酵素、例えばPstIなどを用いて消化することにより調製することができる。調製された遺伝子断片中には、ニトリラーゼ遺伝子及び調節因子をコードする遺伝子が含まれている。
【００１３】
一方、ニトリラーゼ遺伝子を含む断片を連結させるためのプラスミドとしては、例えば、複合プラスミドであるpK1、pK2、pK3又はpK4が挙げられる。
ここで、pK1 は、大腸菌用プラスミドベクターpHSG299 と、ロドコッカス属に属する微生物の菌体内で複製増殖可能なＤＮＡ領域であるプラスミドpRC001とを結合させた複合プラスミドであり、プラスミドpRC001の代わりにプラスミドpRC002、pRC003、pRC004を連結させた複合プラスミドがそれぞれpK2、pK3、pK4である（特開平5-68566号公報参照）。本発明では、複合プラスミドpK4 を例示して説明する。
【００１４】
次に、前記ニトリラーゼ遺伝子及び調節因子をコードする遺伝子を含む断片と前記複合プラスミドとを連結させる。連結は、公知のいずれの方法により行ってもよい。例えば、市販のライゲーションキット（TAKARAライゲーションキット（宝酒造社製））を用いて連結させることができる。
このようにして得られたプラスミドＤＮＡは、ニトリラーゼ遺伝子及び調節因子をコードする遺伝子を含有するが、調節因子をコードする遺伝子の存在位置は明らかではない。
【００１５】
そこで、上記プラスミドＤＮＡを各種制限酵素で処理して種々の長さをもつＤＮＡ断片を調製し、得られるＤＮＡ断片をロドコッカス属に属する微生物に導入して形質転換させ、いずれの長さのＤＮＡ断片を有する形質転換体がニトリラーゼ遺伝子を発現するかを調べることによりその存在位置を知ることができる。
この場合、ニトリラーゼをコードする遺伝子及び調節因子をコードする遺伝子を含む遺伝子断片は、前記プラスミドに正方向又は逆方向に２分の１の確率で連結させることができる。
【００１６】
なお、Ｊ１株は、FERM BP-1478として工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、ニトリラーゼ遺伝子および調節因子をコードする遺伝子を含むプラスミドpNJ10は、これを有する組換え体E. coli JM109/pNJ10（FERM P-15048）として、複合プラスミドベクターpK4はこれを有する組換え体R. rhodochrous ATCC 12674/pK4（FERM BP-3731）として寄託されている。
(2) ロドコッカス属形質転換体の作製およびニトリラーゼ活性測定
まず、(1) で調製されたプラスミドＤＮＡをロドコッカス属に属する微生物、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（ATCC12674）株に導入する。すなわち、ロドコッカス・ロドクロウス（ATCC12674）株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、洗浄後プラスミドＤＮＡと混合する。次いで、公知方法、例えばエレクトロポレーション法等を用いてプラスミドＤＮＡを菌体内に導入する。形質転換体のスクリーニングは、カナマイシンを含む培地で培養することにより行うことができ、カナマイシン耐性のコロニーとして目的とする形質転換体を得ることができる。
【００１７】
次に、得られた上記形質転換体を、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等を含む通常の培養培地中で培養して菌懸濁液を得、該菌懸濁液に基質であるベンゾニトリルを添加し、生成する安息香酸をHPLC等で測定する。ニトリラーゼ遺伝子が発現した場合は、産生されたニトリラーゼの働きによりベンゾニトリルは安息香酸に変換される。従って、その生成の有無によりニトリラーゼ遺伝子の発現を確認することができ、ひいては調節因子遺伝子の発現の有無（ニトリラーゼ遺伝子プロモーターの活性化）を確認することができる。
【００１８】
さらに、Ｊ１株ニトリラーゼの良好な誘導物質として知られるイソバレロニトリルを添加することにより、より高いニトリラーゼ活性を得ることができる。
(3) 塩基配列の決定
(2) により活性の認められた形質転換体から遺伝子を取り出し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定法は、公知方法のいずれでもよく、例えば、チェーンターミネーション法（Sanger F.  Science 214, 1205-1210 (1980)）等により行うことができる。
【００１９】
ここで、取り出した遺伝子のうち、BsmI部位からニトリラーゼ遺伝子下流のPvuI部位までの塩基配列（1286bp) は既に明らかとなっているため（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (1992)）、PvuI部位から更に下流のEcoRI部位までの塩基配列を決定する。さらに、決定された塩基配列をもとに、本発明の調節因子のアミノ酸配列を推定することができる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本実施例では、緩衝液及び培地について下記の略語を用いた。
ＴＥ：10 mM Tris-HCl (pH7.8)-1 mM EDTA (pH8.0)
ＭＹ培地：１％ポリペプトン、0.3％酵母エキス、0.3％麦芽エキス、１％グルコース
〔実施例１〕
(1) ニトリラーゼ遺伝子および調節遺伝子を含むプラスミドの作製
Ｊ１株ニトリラーゼ遺伝子断片を含むプラスミドから該遺伝子断片（5.4 kbの PstI断片）を切り出し、これを複合プラスミドベクターpK4のPstI部位に挿入することにより組換え体プラスミドを作成した。また、前記5.4 kbの PstI断片よりも更に短い領域を挿入したプラスミドも作製した。
【００２１】
まず、Ｊ１株ニトリラーゼ遺伝子を含む5.4 kbの PstI断片をベクターpUC19に挿入して得られたプラスミドpNJ10（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (1992)）から、5.4 kbの PstI断片を切り出した。
一方、PstI切断pK4は以下のように調製した。pK4 10μLに対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）３μL、制限酵素PstIを２μL、滅菌水15μLを加え、37℃で２時間反応させた。反応液に等量のTE飽和フェノールを加えて撹拌後遠心し、上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルムを加え、同様の抽出操作を２回繰り返した。上層に３μLの３M 酢酸ナトリウムと90μLのエタノールを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTEに溶解した。
【００２２】
次に、TAKARAライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、5.4 kb PstI断片を含むＤＮＡ断片画分３μLを、前記PstI切断pK4 １μLと４℃で一晩反応させることにより、5.4 kb PstI断片のpK4への挿入を行った。反応終了後、本反応液を用いて大腸菌JM109株の形質転換を行った。こうして得られた複数の形質転換体からBirnboim and Doly (Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979))の方法によりプラスミドを調製し、pYHJ10、および挿入断片がpYHJ10の挿入方向とは逆向きであるpYHJ10Rを得た。
【００２３】
また、同様にして、前記5.4 kbの PstI断片よりも更に短い領域を挿入したプラスミドpYHJ20〜50および挿入断片がそれぞれ逆向きであるpYHJ20R〜50Rを作製した。
用いた制限酵素及び手法は以下の通りである。
pYHJ20及びpYHJ20R：
Pst-EcoT22I断片をpK4のPstI部位に挿入した。
【００２４】
pYHJ30及びpYHJ30R：
pNJ10をPstIで切断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した。次いでNaeIで切断し、電気泳動（0.7 ％アガロース）により断片を分離回収し、pK4をPstIで切断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した部位へ挿入した。
pYHJ40及びpYHJ40R：
pNJ10をNheI、EcoT22Iで切断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した。電気泳動（0.7 ％アガロース）により断片を分離回収し、pK4をPstIで切断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した部位へ挿入した。
【００２５】
pYHJ50及びpYHJ50R：
pNJ10をNheIで切断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した。次いでNaeIで切断し、電気泳動（0.7 ％アガロース）により断片を分離回収し、pK4をPstIで切断後、T4 DNA polymeraseで末端平滑化した部位へ挿入した。
(2) ロドコッカス属形質転換体の作製およびニトリラーゼ活性測定
こうして得られたプラスミドをロドコッカス・ロドクロウスATCC12674株に導入し、それぞれの形質転換体のニトリラーゼ活性を測定した。
【００２６】
まず、プラスミドの菌体への導入は以下のように行った。ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、15％ PEG 6000（ポリエチレングリコール6000）溶液に懸濁した（菌体濃度109細胞/mL 以上）。プラスミドＤＮＡ１μg を菌体懸濁液100μL に加え混合し、氷冷した。ジーンパルサー用のチャンバーにＤＮＡと菌体の混合液を入れ、氷冷した後、静電容量25μF、抵抗 400オーム、電場強度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分間静置し、37℃で５分間熱処理後、ＭＹ培地１mlを加え、25℃で３時間振とうした。得られた処理液を50μg/mlカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布し、28℃で２日間培養した。出現したコロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを、別に作成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することにより確認した。
【００２７】
こうして作製したロドコッカス属細菌の形質転換体を、グリセロール 10 g、ポリペプトン５g、酵母エキス３g、麦芽エキス３g、KH2PO4 １g 、K2HPO4 １g、CoCl2・6H2O 0.01g、(pH7.0) / Lからなる培地にて28℃で２日間培養した。また、Ｊ１株ニトリラーゼの良好な誘導物質として知られるイソバレロニトリル（0.5及び１g /L）を添加した培養も同様に行った。
【００２８】
培養液より遠心分離により集菌し、10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)で洗浄後、１mMジチオスレイトールを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)に菌体を懸濁した。
ニトリラーゼ活性測定は以下のように行った。
適当に水で希釈した菌体懸濁液0.25 mLに、0.1 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.25mL、12 mMのベンゾニトリルを0.5 mLそれぞれ加え、20℃にて10分間反応後、１N HCl を0.1 mL加えることにより反応を停止させた。酵素反応により生成した安息香酸をHPLCにより分析した。
【００２９】
測定結果を図１に示す。図１中、Ｊ１株ＤＮＡ断片上における２本の矢印（大矢印）は、ニトリラーゼ遺伝子及び本発明において見いだされた調節遺伝子の位置及び方向を示す。また、各プラスミドにおいて記された領域はベクターpK4に挿入されたＪ１株由来のＤＮＡ領域を示し、矢印（小矢印）はベクターpK4上のlacプロモータの位置及び方向を示す。
【００３０】
また、図１中のニトリラーゼ活性の強さは、「＋」が弱く、「＋＋＋」が最も強いことを意味する。「−」は活性が検出されなかったことを示す。
プラスミドpYHJ10およびpYHJ10Rを有する形質転換体においてニトリラーゼ活性が検出され、特にイソバレロニトリルを加えた場合には高い活性が認められた。ニトリラーゼ遺伝子の1.4 kb下流から先を欠失させたプラスミド（pYHJ20およびpYHJ20R）や、さらにニトリラーゼ遺伝子の上流側も欠失させたプラスミド（pYHJ40およびpYHJ40R）を有する形質転換体においても同様の結果が得られた。しかし、ニトリラーゼ遺伝子の約0.5 kb下流から先を欠失させたプラスミド（pYHJ30およびpYHJ30R）では活性は全く検出されなかった。
【００３１】
以上より、ニトリラーゼ構造遺伝子のすぐ下流に、調節因子の遺伝子が存在することが明らかとなった（図１参照）。
pYHJ10R〜50Rを有する形質転換体について、どのプラスミドを有する形質転換体が高い活性を有するか、その定量的試験を上記ニトリラーゼ活性測定と同様の方法で行った。
【００３２】
その結果を表１に示す。表１より、pYHJ20Rを有する形質転換体が最も高い活性を示した。
【００３３】
【表１】
0003709422.tif 000002
(3) 塩基配列の決定
ニトリラーゼ遺伝子下流のPvuI部位までの塩基配列は既に明らかとなっているため（J. Biol. Chem. 267, 20746-20751 (1992)）、PvuI部位よりEcoRI部位までの約1.4 kbの塩基配列を決定した。塩基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンターミネーション法（Sanger F.  Science 214, 1205-1210 (1980)）により行った。
【００３４】
結果を配列番号３に示す。配列番号３の塩基配列を調べた結果、その配列中には、配列番号１に示されるアミノ酸配列を持つ、唯一の長いオープンリーディングフレームが見いだされた。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号２に示す。また、配列番号２に示す塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００３５】
【発明の効果】
本発明により、ニトリラーゼ遺伝子プロモーターを活性化する作用を有する調節因子、該調節因子を実質的にコードするＤＮＡを含む遺伝子、該遺伝子を含む組換え体プラスミド、及び該プラスミドにより形質転換された形質転換体が提供される。
【００３６】
該形質転換体よりニトリラーゼが生産される。また、本調節遺伝子とニトリラーゼ遺伝子プロモーターの利用により、異種タンパク質の高発現化にも応用できる。
【００３７】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３１９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：Ｊ１
配列：
Met Asn Thr Phe Phe Ser Ser Asp Gln Val Ser Ala Pro Asp Arg
1               5                  10                  15
Val Ala Leu Trp His Asp Val Ile Cys Arg Ser Tyr Val Pro Leu
20                  25                  30
Asn Ile Thr Leu Thr Ser Glu Gln Pro Phe Ile Gly Thr Val Ser
35                  40                  45
Thr Gly Asn Leu Gly Thr Val Arg Ile Ala Thr Ser Ser Ser Leu
50                  55                  60
Pro Gln Gln Ile Thr Arg Thr Arg Arg Leu Ile Arg Gln Asp Glu
65                  70                  75
Arg Glu Tyr Leu Met Val Gly Val Gln Ser Ala Gly His Ala Leu
80                  85                  90
Val Gln Gln His Gly Arg Thr Ala Arg Val Gly Arg Gly Gly Leu
95                 100                 105
Val Phe Trp Asp Thr Arg His Pro Tyr Asp Ile Leu Phe Pro Thr
110                 115                 120
Asp Trp Arg Met Ser Val Phe Gln Phe Pro Arg Tyr Ser Phe Gly
125                 130                 135
Phe Thr Glu Asp Phe Ile Gly Arg Met Thr Ala Val Asn Val Gly
140                 145                 150
Gly Asp Arg Gly Ile Gly Arg Val Val Ser Ser Phe Met Thr Ser
155                 160                 165
Ile Asn Asp Ala Thr Asp Ala Gly Asp Leu Ala Glu Val Ala Ser
170                 175                 180
Leu His Asn Ser Ala Val Asp Leu Leu Ser Ala Ala Ile Arg Thr
185                 190                 195
Glu Leu Ala Asp Gln Ala Ala Ala Ser Asp Gly Leu Leu Glu Cys
200                 205                 210
Val Leu Ala Tyr Ile Arg Gln Asn Leu Ala Asp Pro Asn Leu Cys
215                 220                 225
Ala Ser Gln Ile Ala Ala Glu His Asn Val Ser Val Arg Thr Leu
230                 235                 240
His Arg Leu Phe Ser Ala Thr Gly Gln Gly Val Ala Glu His Ile
245                 250                 255
Arg Asn Leu Arg Leu Glu Arg Ile Lys Thr Glu Leu Ala Asp Pro
260                 265                 270
Thr Ser Arg Arg Tyr Thr Ile Ser Ala Leu Ala Arg Lys Trp Gly
275                 280                 285
Phe Leu Asp Pro Ser Thr Phe Ser Arg Ala Phe Lys Asp Ala Tyr
290                 295                 300
Gly Ile Thr Ala Arg Glu Trp Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ser Pro
305                 310                 315
Thr Glu Val Ser                                             319
【００３８】
配列番号：２
配列の長さ：９６０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：Ｊ１
配列：
ATG AAC ACT TTC TTC TCC TCA GAC CAG GTC TCG GCG CCC GAT CGC    45
GTC GCG CTC TGG CAC GAT GTC ATC TGC CGT AGC TAT GTC CCG CTC    90
AAC ATC ACC CTC ACG AGC GAG CAA CCC TTC ATC GGT ACG GTC TCG   135
ACG GGC AAC TTG GGC ACG GTA CGT ATC GCG ACG TCC TCG TCA CTG   180
CCC CAA CAG ATC ACC CGC ACT CGT CGC TTG ATC AGG CAG GAC GAG   225
CGT GAG TAC CTC ATG GTT GGG GTG CAG TCC GCC GGC CAT GCA CTC   270
GTG CAG CAG CAC GGC AGA ACT GCA CGA GTC GGT CGC GGT GGA CTG   315
GTC TTC TGG GAC ACC CGC CAT CCC TAC GAC ATC CTC TTC CCG ACA   360
GAC TGG AGG ATG AGC GTA TTC CAG TTC CCG CGA TAC TCT TTC GGC   405
TTC ACC GAA GAC TTC ATC GGC AGG ATG ACC GCG GTG AAC GTC GGG   450
GGC GAT CGC GGT ATC GGC CGA GTG GTT TCA TCC TTC ATG ACA AGC   495
ATC AAC GAT GCG ACC GAC GCA GGA GAC TTG GCG GAG GTA GCT TCA   540
CTC CAC AAC AGT GCT GTC GAT CTT CTG TCA GCG GCG ATA CGG ACC   585
GAG CTT GCC GAT CAA GCC GCC GCC TCC GAC GGC CTA CTC GAG TGT   630
GTG CTC GCG TAT ATC CGA CAG AAC CTG GCC GAC CCG AAC CTG TGT   675
GCC TCA CAG ATC GCG GCG GAA CAC AAC GTC TCT GTG CGG ACC CTC   720
CAC CGA CTG TTC TCG GCC ACG GGA CAG GGC GTG GCC GAA CAC ATC   765
CGT AAC CTC CGA CTC GAG CGC ATC AAG ACT GAG CTG GCA GAC CCA   810
ACG AGC CGG CGA TAT ACG ATC AGC GCT TTG GCG AGA AAA TGG GGG   855
TTC CTC GAT CCC TCA ACG TTC TCA CGC GCG TTC AAA GAC GCC TAC   900
GGC ATC ACT GCC CGA GAG TGG GCG GCT TCT GCA TCA GCA TCA CCG   945
ACG GAG GTT TCG TAG                                           960
【００３９】
配列番号：３
配列の長さ：1390
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：Ｊ１
配列：
CGATCGCAGC GAGGCTGCCC GCCGGTAACC CCGATAGGTC CACACCACGT    50
ATCCGGCCGG TTACACCTTC TCGACAGGGG CAATCGAGAC CGAGCCCGGC   100
ATCGCGATTA CGGCTACCCT GAAAAGAGCA ATGAACGGGG TGAGCACCAG   150
GTAGGTCGAT GAACACTTTC TTCTCCTCAG ACCAGGTCTC GGCGCCCGAT   200
CGCGTCGCGC TCTGGCACGA TGTCATCTGC CGTAGCTATG TCCCGCTCAA   250
CATCACCCTC ACGAGCGAGC AACCCTTCAT CGGTACGGTC TCGACGGGCA   300
ACTTGGGCAC GGTACGTATC GCGACGTCCT CGTCACTGCC CCAACAGATC   350
ACCCGCACTC GTCGCTTGAT CAGGCAGGAC GAGCGTGAGT ACCTCATGGT   400
TGGGGTGCAG TCCGCCGGCC ATGCACTCGT GCAGCAGCAC GGCAGAACTG   450
CACGAGTCGG TCGCGGTGGA CTGGTCTTCT GGGACACCCG CCATCCCTAC   500
GACATCCTCT TCCCGACAGA CTGGAGGATG AGCGTATTCC AGTTCCCGCG   550
ATACTCTTTC GGCTTCACCG AAGACTTCAT CGGCAGGATG ACCGCGGTGA   600
ACGTCGGGGG CGATCGCGGT ATCGGCCGAG TGGTTTCATC CTTCATGACA   650
AGCATCAACG ATGCGACCGA CGCAGGAGAC TTGGCGGAGG TAGCTTCACT   700
CCACAACAGT GCTGTCGATC TTCTGTCAGC GGCGATACGG ACCGAGCTTG   750
CCGATCAAGC CGCCGCCTCC GACGGCCTAC TCGAGTGTGT GCTCGCGTAT   800
ATCCGACAGA ACCTGGCCGA CCCGAACCTG TGTGCCTCAC AGATCGCGGC   850
GGAACACAAC GTCTCTGTGC GGACCCTCCA CCGACTGTTC TCGGCCACGG   900
GACAGGGCGT GGCCGAACAC ATCCGTAACC TCCGACTCGA GCGCATCAAG   950
ACTGAGCTGG CAGACCCAAC GAGCCGGCGA TATACGATCA GCGCTTTGGC  1000
GAGAAAATGG GGGTTCCTCG ATCCCTCAAC GTTCTCACGC GCGTTCAAAG  1050
ACGCCTACGG CATCACTGCC CGAGAGTGGG CGGCTTCTGC ATCAGCATCA  1100
CCGACGGAGG TTTCGTAGGA AGAGCCCGGT CTCCGGCCTG CCCTTGTTCG  1150
CTTGCGCACC GTTCGGTCCG TCGCTTCCGA TGAAGCCGGA GCCGGCAGGT  1200
TGGCTTCCTC CCGCGATCCG ATCGCTCGGG GATTGTCCGG GGCACCGCTG  1250
GTGACCTCCA GTGCTGCTCC GGCCTGGTGT CCGCGATCGG TGTGCCCCTG  1300
CCCCGATGCA TCCGGGCCGT GATGCCAGTG CTCGGCAGGA CCCACCGGCG  1350
ACGACGGCCA GCATGACCCA TGGACCGGTC GGTCGAATTC             1390
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｊ１株ニトリラーゼ遺伝子周辺の制限酵素地図、本発明において作製されたプラスミド、およびそれらのプラスミドを含む形質転換体のニトリラーゼ活性を示す図である。
【図１】
0003709422.tif 000003