(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を含む被測定液を測定チャンバに注入するステップと、
前記測定チャンバから被測定液を搬送して、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板を通過させることにより、前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップと、
前記測定電極を介して生体試料の活動信号を計測するステップとを備える生体試料の活動信号計測方法。
【請求項２】
前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、被測定液を吸引して前記多孔性絶縁基板を通過させるステップを備える請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項３】
前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、前記測定チャンバに収容された被測定液を全て搬送して排出するステップを含み、
前記活動信号を計測するステップの後、新たな生体試料を含む被測定液を測定チャンバに注入するステップを更に備え、
前記測定チャンバから被測定液を再び搬送することにより、生体試料の活動信号の計測を繰り返す請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項４】
前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、前記測定チャンバに収容された被測定液を全て吸引して前記多孔性絶縁基板を通過させるステップを備える請求の範囲第３項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項５】
前記活動信号を計測するステップの後、新たな生体試料を含む被測定液を測定チャンバに注入するステップの前に、前記多孔性絶縁基板を取り替えるステップを更に備える請求の範囲第３項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項６】
前記多孔性絶縁基板は、孔径が１〜１０００μm で、厚さが１〜１００００μm の樹脂フィルムからなる請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項７】
前記多孔性絶縁基板は、一方面にマスク層を介して形成され且つ前記測定電極に電気的に接続された導電線を更に備え、
前記測定電極は、前記導電線よりも前記多孔性絶縁基板の深部まで侵入して形成されている請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項８】
前記測定電極及び導電線は、前記多孔性絶縁基板の表面に導電性材料をスパッタリングすることにより形成されている請求の範囲第７項に記載の生体資料」の活動信号計測方法。
【請求項９】
前記被測定液を測定チャンバに注入するステップは、同一または異なる被測定液を複数の測定チャンバにそれぞれ注入するステップを備え、
前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、前記各測定チャンバと連通する共通の吸引ラインを介して前記各測定チャンバに収容された被測定液を吸引し、前記各測定チャンバに対応してそれぞれ設けられた複数の測定電極を少なくとも一方面に備える多孔性絶縁基板を通過させることにより、同一または異なる生体試料を前記各測定電極に同時に捕捉させるステップを備える請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項１０】
前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出するステップと、
得られた複数の標準偏差の平均値を算出するステップと、
得られた標準偏差の平均値に基づいて、生体試料の活性度を評価するステップと、
活性度の評価結果を表示するステップとを備える請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項１１】
前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出するステップと、
得られた複数の標準偏差を所定幅ごとに設定された複数の階級に分類し、この分類結果を正規分布に近似するステップと、
得られた正規分布に基づいて生体試料の活性度を評価するステップと、
活性度の評価結果を表示するステップとを備える請求の範囲第１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項１２】
前記活性度を評価するステップは、得られた正規分布の平均値および半値幅を算出するステップと、得られた正規分布の平均値および半値幅に基づいて活性度を評価するステップとを含む請求の範囲第１１項に記載の生体試料の活動信号計測方法。
【請求項１３】
生体試料を含む被測定液を収容する測定チャンバと、
少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板と、
前記測定チャンバ内の被測定液を搬送して、前記測定電極側から前記多孔性絶縁基板を通過させる搬送装置とを備え、
前記搬送装置を作動させて、被測定液に含まれる生体試料を前記測定電極において捕捉することにより、該測定電極を介して生体試料の活動信号を計測することができる生体試料の活動信号計測装置。
【請求項１４】
前記測定チャンバ内に設けられた基準電極を更に備える請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項１５】
前記搬送装置は、被測定液を吸引して前記多孔性絶縁基板を通過させる吸引装置を備える請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項１６】
前記多孔性絶縁基板は、前記測定チャンバと前記吸引装置との間に着脱自在に設けられる請求の範囲第１５項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項１７】
前記多孔性絶縁基板は、孔径が１〜１０００μm で、厚さが１〜１００００μm の樹脂フィルムからなる請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項１８】
前記測定電極に電気的に接続された導電線を更に備え、
前記導電線は、前記多孔性絶縁基板の一方面にマスク層を介して形成されており、
前記測定電極は、前記導電線よりも前記多孔性絶縁基板の深部まで侵入して形成されている請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項１９】
前記測定電極及び導電線は、前記多孔性絶縁基板の表面に導電性材料をスパッタリングすることにより形成される請求の範囲第１８項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項２０】
前記測定チャンバおよび前記測定電極を複数備え、
前記搬送装置は、前記各測定チャンバと連通する共通の吸引ラインを有しており、
前記搬送装置の作動により、前記各測定チャンバに収容された被測定液に含まれる生体試料を、対応する前記測定電極において同時に捕捉することができる請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項２１】
前記測定チャンバ内にそれぞれ設けられた複数の基準電極を更に備える請求の範囲第２０項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項２２】
前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出する単位標準偏差計算手段と、
得られた複数の標準偏差の平均値を算出する平均値計算手段と、
得られた標準偏差の平均値に基づいて、生体試料の活性度を評価する活性度評価手段と、
活性度の評価結果を表示する表示手段とを更に備える請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項２３】
前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出する単位標準偏差計算手段と、
得られた複数の標準偏差を所定幅ごとに設定された複数の階級に分類し、この分類結果を正規分布に近似する正規分布近似手段と、
得られた正規分布に基づいて生体試料の活性度を評価する活性度評価手段と、
活性度の評価結果を表示する表示手段とを更に備える請求の範囲第１３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【請求項２４】
得られた正規分布の平均値および半値幅を算出する平均値・半値幅計算手段を更に備え、
前記活性度評価手段は、得られた正規分布の平均値および半値幅に基づいて活性度を評価する請求の範囲第２３項に記載の生体試料の活動信号計測装置。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、細胞などの生体試料が発する活動信号を計測する装置および方法に関する。
背景技術
従来、生体試料の活動に伴い発せられる物理化学的信号は、電気的信号や、生体試料に取り込まれた指示薬により発せられる蛍光強度信号などのデジタル信号として、測定装置に取り込まれて測定される。例えば、細胞のチャンネル活性度は、単一チャンネルレベルで測定する場合、パッチクランプなどの微小電極プローブと専用の制御装置とを用いた電気生理測定装置によって得られるチャンネル通過電気量を表すデジタル信号から、チャンネルの開閉時間、タイミング、回数などを算出することにより測定される。
パッチクランプ法は、マイクロピペットの先端部分につけた細胞膜の微小部分（パッチ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法である。パッチクランプ法は、細胞生物学の技術の中で、１個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の１つである（例えば、細胞の分子生物学、第３版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、日本語版、中村桂子ら監訳、１８１〜１８２頁、１９９５年、教育社を参照）。
蛍光色素法は、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する発光指示薬または蛍光色素と画像処理法とを組み合わせることにより、細胞の電気的活動を測定する方法である。例えば、ＣＣＤカメラを用いて撮影した細胞の蛍光画像に基づいて、細胞内のイオンの移動をモニタする。蛍光色素法では、細胞全体のイオンチャンネル活性は、一般に、細胞内に流入するイオンの全体量を蛍光測定法によって測定する。
ところが、パッチクランプ法は、マイクロピペットの作製およびその操作などに特殊な技術を必要とし、１つの試料の測定に多くの時間を要するため、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングするのには適していない。また、蛍光色素法は、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要であり、測定において、色素の影響によるバックグラウンドが高い上に、時間とともに脱色するためＳ／Ｎ比が悪いという欠点がある。
生体試料の電気化学的変化を観察する方法を開示する従来文献として、特許第２９４９８４５号、米国特許第５８１０７２５号、米国特許第５５６３０６７号、特開平９−８２７３１８号、国際公開第０１／２５７６９号、米国特許第５１８７０６９号、国際公開第９８／５４２９４号、国際公開第９９／６６３２９号、国際公開第９９／３１５０３号などが挙げられる。
特許第２９４９８４５号、米国特許第５８１０７２５号、米国特許第５５６３０６７号、および特開平９−８２７３１８号は、ガラス基板上にフォトリソグラフ技術を用いて微小電極を構成し、細胞の電気的変化を多点で細胞外測定できることを特徴とする一体化複合電極とそれを用いた計測システムを開示する。
国際公開第０１／２５７６９号は、絶縁基板上に貫通孔を備え、この貫通孔にイオンチャンネルを含む細胞などの生体試料を配置することによって、細胞などおよび絶縁基板表面上にギガシールドを構成し、このギガシールドにより隔てられた２つの領域に設置された基準電極および測定電極を用いて、イオンチャネルをイオンが通過するときに発生する電流を測定できる基板を開示する。
米国特許第５１８７０６９号は、電極上で細胞を培養し、インピーダンス変化を測定することにより、細胞の増殖をモニタできるデバイスを開示する。
国際公開第９８／５４２９４号は、平板電極上に細胞を接着させ、その電気的信号を測定するデバイスを開示する。
国際公開第９９／６６３２９号は、多孔性の材料上にある細胞の活動状態を、抵抗またはインピーダンス変化により観察するデバイス、およびそれを用いたアッセイ法を開示する。
国際公開第９９／３１５０３号は、貫通孔を備えた基板を用い、この貫通孔に細胞をトラップすることによりパッチクランプを形成し、電流変化を測定する方法を開示する。
その他、本出願に関する先行例として、特開平１１−３２６１６６号公報、特開平５−１５７７２８号公報、および特開昭６２−７３１５２号公報を挙げることができる。
発明の開示
本発明は、生体試料が発する活動信号を容易、迅速且つ高精度に検出することができる生体試料の活動信号計測装置および計測方法の提供を目的とする。
本発明の前記目的は、生体試料の活動信号を計測する装置であって、生体試料を含む被測定液を収容する測定チャンバと、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板と、前記測定チャンバ内の被測定液を搬送して、前記測定電極側から前記多孔性絶縁基板を通過させる搬送装置とを備え、前記搬送装置を作動させて、被測定液に含まれる生体試料を前記測定電極において捕捉することにより、該測定電極を介して生体試料の活動信号を計測することができる生体試料の活動信号計測装置により達成される。
また、本発明の前記目的は、生体試料の活動信号を計測する方法であって、生体試料を含む被測定液を測定チャンバに注入するステップと、前記測定チャンバから被測定液を搬送して、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板を通過させることにより、前記測定電極において生体試料を捕捉するステップと、前記測定電極を介して生体試料の活動信号を計測するステップとを備える生体試料の活動信号計測方法により達成される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の第１の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の要部概略構成図である。
第２図は、第１図に示す装置の要部拡大図である。
第３図（Ａ）および（Ｂ）は、生体試料（細胞）の活動状況を示す模式図である。
第４図は、本発明の第２の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略平面図である。
第５図は、第４図に示す装置の細胞隔離部の（Ａ）平面図および（Ｂ）断面図である。
第６図は、第４図に示す装置の多孔性絶縁基板の（Ａ）平面図および（Ｂ）断面図である。
第７図は、第４図に示す装置の一部断面図である。
第８図は、第４図に示す装置の他の一部断面図である。
第９図（Ａ）および（Ｂ）は、本発明の第３の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。
第１０図は、Ｃａｒｂａｃｈｏｌ濃度に対する標準偏差の平均値の変動を示す図である。
第１１図（Ａ）および（Ｂ）は、本発明の第４の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。
第１２図は、Ｃａｒｂａｃｈｏｌを投与する前後における標準偏差のばらつきを正規分布で近似した結果を示す図である。
第１３図は、従来の方法により求めたＣａｒｂａｃｈｏｌを投与する前後における標準偏差のばらつきを正規分布で近似した結果を示す図である。
第１４図は、得られた正規分布の平均値および半値幅をそれぞれ基準値と比較したときの隔たり量を示す図である。
第１５図は、本発明の他の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。
第１６図は、本発明の更に他の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の要部概略構成図である。この装置は、多孔性絶縁基板５の上面（生体試料を配置する側の面）に、細胞などの生体試料の物理化学的信号を検出する測定電極１を形成し、この測定電極１から導電線２が導出されるように構成されている。物理化学的信号とは、細胞などの生体試料が発する信号のうち、細胞のイオンチャンネルのような測定対象の特定部位から発生する信号、または、薬剤に応答する細胞のイオンチャンネルや受容体の活性化のような測定対象における特定の事象に起因して変化する信号などである。
多孔性絶縁基板５として、本実施形態においてはナイロンメッシュを用いるが、これに限定されず、セルロース混合エステル、親水性ポリビニリデンジフロライド、疎水性ポリビニリデンジフロライド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどを用いてもよい。具体的には、アイソポア（ポリエチレンテレフタレート製：ミリポア社製）やオムニポア（ポリテトラルフルオロエチレン製：ミリポア社製）などを好ましく用いることができる。また、多孔性絶縁基板５のサイズとして、通常、１〜１０００μｍの孔径および１〜１００００μｍの厚さを有するものが選択される。代表的な例として、５μｍの孔径および１０μｍの厚さを挙げることができるが、１００μｍ以上の厚さの多孔性絶縁基板も好適に用いることができる。
この計測装置は、以下のようにして製造される。まず、多孔性絶縁基板５に測定電極１および導電線２を形成する。測定電極１および導電線２の形成は、導電性材料のスパッタにより行うことが好ましい。本実施形態においては、導電性材料として金を用い、アルゴンなどの不活性ガスの存在下、低真空条件にある一対の電極間に高周波によるプラズマを発生させ、陰極上の金をイオンエネルギーではじき飛ばし、対向する陽極上にある多孔性絶縁基板上に形成する。電極および導電線の形成は、スパッタ法以外に、真空蒸着法や印刷法などにより形成することも可能である。また、導電性材料として金を使用する代わりに、白金、銅、銀、銀および塩化銀、白金および白金黒などから選択してもよい。また、金属材料以外に、導電性プラスチックからなる導電性材料を用いることもできる。
測定電極１のスパッタ時には、マスクを用いず、多孔性絶縁基板５の深部に電極材料が侵入するように形成するのが好ましい。一方、導電線２は、あらかじめ多孔性絶縁基板５をマスク（図示せず）で覆ってパターニングし、多孔性絶縁基板５の深部への導電性材料の侵入を抑制することが好ましい。
形成された測定電極１の形状は、本実施形態においては円板状であるが、測定対象に応じて任意の形状とすることができる。また、測定電極１のサイズについても特に制限はないが、本実施形態においては、後述する測定チャンバＡの水平断面積と略同じ大きさの水平断面積を有する。
こうして、測定電極１および導電線２を多孔性絶縁基板５に形成した後、この多孔性絶縁基板５を細胞隔離部３と支持基板６との間に挟持する。細胞隔離部３及び支持基板６はそれぞれ開口を有しており、細胞隔離部３の開口、多孔性絶縁基板５の測定電極１および支持基板６の開口の各中心が略一致するように配置する。これにより、細胞隔離部３の開口壁および多孔性絶縁基板５によって画定される測定チャンバＡ（図１における細胞隔離部３に形成された開口部の空間全体に相当）が形成される。細胞隔離部３と支持基板６とは、開口周縁に介在させた接着剤からなる接着層４により固定される。この接着層４は、易剥離性および止水性を有することが好ましく、例えば、一液型ＲＴＶゴム（脱酢酸タイプ）ＫＥ４２Ｔ（信越化学工業株式会社）を挙げることができる。
測定チャンバＡの側壁には基準電極７が設けられており、基準電極７は、測定チャンバＡに収容した被測定液２３に浸漬される。基準電極７は、測定対象となる生体試料の活動信号を検出するための基準電位を与えるものであり、例えば、Ａｇ−ＡｇＣｌからなる。また、被測定液２３として、ＤＭＥＭ培養液を例示することができ、培養する細胞として、動物由来細胞を例示することができる。
測定チャンバＡの上部は蓋体２１によって覆われており、これによって被測定液２３の蒸発を防止することができる。尚、蓋体２１は、被測定液２３の種類や測定条件などによっては必ずしも必要でなく、蓋体２１を設けない構成にすることもできる。
次に、支持基板６の下面側に、接着層９を介して吸引ラインアタッチメント８を固定する。吸引ラインアタッチメント８は、下方から上方に向けてテーパ状に拡がる吸引部８ａと、この吸引部８ａに接続される吸引ライン８ｂとを有しており、吸引部８ａが支持基板６の開口と略一致するように、位置合わせが行われる。こうして、多孔性絶縁基板５、支持基板６の開口壁および吸引部８ａの内壁によって画定される吸引チャンバＢが形成される。この吸引ラインアタッチメント８は、被測定液２３を吸引して搬送するための搬送装置として機能し、吸引ライン８ｂに吸引ポンプ（図示せず）に接続される。このようにして、生体試料の活動信号計測装置を構成することができる。
次に、この装置を用いた生体試料の活動信号計測方法を説明する。まず、測定チャンバＡに細胞培養液などの被測定液２３を注入する。測定チャンバＡに供給される被測定液２３の量は、例えば、５０マイクロリットルである。
吸引部８ａに吸引力を作用させない状態では、多孔性絶縁基板５を介して吸引チャンバＢに落下する被測定液２３の量はごく僅かであり、通常は測定チャンバＡにおける被測定液２３の量の１／５０以下である。
次に、吸引ポンプ（図示せず）を作動させて、測定チャンバＡの被測定液２３を吸引する。これにより、吸引チャンバＢは減圧されるので、被測定液２３は多孔性絶縁基板５を通過し、吸引チャンバＢを介して吸引ライン８ｂを矢印の方向に流れる。一方、被測定液２３に含まれる細胞などの生体試料２５は多孔性絶縁基板５を通過することができず、図２に示すように、測定電極１に吸着される。この生体試料２５が発する活動信号は、測定電極１と基準電極７との間に生じる電位差として検出することができる。例えば、生体試料２５が細胞である場合、図３（Ａ）に示すように、静止状態の細胞は、イオンチャンネルの開閉が平衡状態にあり、チャンネル毎のコンダクタンスの変化が小さいため、発生電圧変化が小さく、細胞膜近傍電位の振幅が略均一となる。これに対し、図３（Ｂ）に示すように、活動状態の細胞は、イオンチャンネルの開閉が非平衡状態にあり、チャンネル毎のコンダクタンスの変化が大きいため、発生電圧変化が大きく、細胞膜近傍電位の振幅が不均一となる。したがって、検出される電位差の時系列変化に基づいて、細胞の活動状態を把握することができる。
測定終了後は、吸引ポンプ（図示せず）を作動させながら測定チャンバＡに生理食塩水などの洗浄液を供給することにより装置内部を洗浄し、必要に応じて多孔性絶縁基板５を取り替えた後、次の被測定液２３を測定チャンバＡに注入する。こうして、例えば薬品候補となる化合物を含む各種溶液に対して、生体試料の活動信号の測定を順次行うことができる。
このように、本実施形態の計測方法によれば、被測定液２３を測定チャンバＡに供給し吸引ラインアタッチメント８を介して吸引するだけで、生体試料２５を測定電極１に密着させることができ、接触抵抗を増大させて、信号検出感度を上げることができる。更に、被測定液２３の入れ換えや洗浄も、吸引ラインアタッチメント８により短時間で行うことができる。この結果、生体試料の活動信号を容易、迅速且つ高精度に検出することができる。
（実施の形態２）
図４は、本発明の第２の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略平面図である。この装置は、図１に示す第１の実施形態の装置における測定電極１をマトリクス状に１６個配置したものであり、本実施形態においては各測定電極１の直径を２ｍｍとし、隣接する測定電極１の間隔を１ｍｍとしている。測定電極１の数、配置、大きさ、形状などは、本実施形態のものに限定されないが、好ましい一例を挙げると、測定電極１の面積は１μｍ2〜１ｃｍ2、形状はほぼ円または矩形、隣接する測定電極１の間隔は１０〜１００００μｍで、配置はマトリクス状である。本実施形態において、上記第１の実施形態と同様の構成部分に同一の符号を付して、詳細な説明を省略する。
図４において、測定電極１およびこれに接続される導電線２は、多孔性絶縁基板５の表面側に配置されている。多孔性絶縁基板５の表面における複数の導電線２の間に熱またはレーザを作用させることにより、多孔性構造を破壊して絶縁性をよい高めるようにしてもよい。また、基準電極７及びこれに接続される導電線１２は、各測定電極１に対応させて、細胞隔離部３の開口内壁および上面にそれぞれ設けられている。細胞隔離部３は、通常は透明な材質からなる。
図５は、細胞隔離部３の（Ａ）平面図および（Ｂ）断面図であり、図６は、多孔性絶縁基板５の（Ａ）平面図および（Ｂ）断面図である。図５に示すように、測定チャンバＡは、複数の測定電極（図示せず）がそれぞれ配置される細胞隔離部３の各開口部に形成される。図６（Ｂ）に示すように、測定電極１は、導電性材料をマスクなしでスパッタすることにより、多孔性絶縁基板５の内部まで含浸させて形成される一方、導電線２は、多孔性絶縁基板５の上面に形成したマスク層１０を介してスパッタすることにより、多孔性絶縁基板５の内部への侵入を抑制して形成される。図７および図８は、図４に示す装置の部分断面図であり、図７は、領域Ｃを拡大して示し、図８は、領域Ｄを拡大して示している。被測定液２３に含まれる細胞などの生体試料２５は、第１の実施形態と同様に、吸引ラインアタッチメント（図示せず）によって吸引されることにより、測定電極１に吸着される。吸引ラインアタッチメントの吸引部（図１の符号８ａに相当）は、各測定電極１に対応して複数設けられており、共通の吸引ライン（図１の符号８ｂに相当）を介して、各測定電極１に生体試料２５を同時に吸着させることができる。これにより、各種条件下における生体試料の活動信号の計測を短時間で行うことができる。各測定電極１への生体試料２５の吸着は、共通の吸引ラインを設ける代わりに測定電極１毎に個別に吸引ラインを設けることにより、それぞれ異なるタイミングにすることもできる。
（実施の形態３）
図９は、本発明の第３の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。この装置は、上記第１の実施形態における装置を測定部（信号源）１０１とし、この測定部１０１において検出される電気信号を処理する機能を有するものであり、図９（Ａ）に示すように、単位標準偏差計算部１０２、平均値計算部１０５、活性度評価部１２０およびデータ表示部１１０を備えている。単位標準偏差計算部１０２は、測定部１０１において検出された時系列データに基づき、所定のサンプル数を一単位として標準偏差を算出する。所定サンプル数を含む各単位は、時間的に連続してもよく、或いは一定の時間間隔をおいてもよい。平均値計算部１０５は、得られた複数の標準偏差の平均値を算出する。活性度評価部１２０は、標準偏差の平均値に基づいて、生体試料の活性度を評価する。活性度評価部１２０は、活性度計算部１０８および活性度分類部１０９を備えており、計測の目的に応じて、入力された情報に基づいて活性度を計算したり、予め格納された情報と比較して活性度を分類することができる。データ表示部１１０は、得られた活性度を画面表示する。この装置によれば、一定のサンプリング速度で取り込まれたデジタル信号（所定の時系列データ）からノイズを除去して、例えばイオンチャンネルの開閉を表す有意信号を抽出、測定および分類することができる。
図９（Ｂ）に示すように、単位標準偏差計算部１０２、平均値計算部１０５および活性度評価部１０８は、これらの計算を実行するためのプログラムが記録されたハードディスクを内蔵するコンピュータにより構成することができ、データ表示部１１０は、ＣＲＴにより構成することができる。尚、図９（Ｂ）に示すように、コンピュータは、正規分布近似部１０３、刺激発生部１０４および平均値・半値幅計算部１０６を更に備えており、これらについては後述する。
上記構成を有する本実施形態の装置を用いて、モノアラガイより調製した神経細胞を材料に、化学物質Ｃａｒｂａｃｈｏｌの神経細胞に対する作用を測定した。Ｃａｒｂａｃｈｏｌは、神経伝達物質であるアセチルコリンのアナログであることが知られる化学物質である。Ｃａｒｂａｃｈｏｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を人工脳−脊髄液に溶解し、０，０．１，０．３，１，３，１０，３０，および１００μＭの濃度で神経細胞に作用させたときの細胞が発する電気信号をそれぞれ測定した。そして、各Ｃａｒｂａｃｈｏｌ濃度について、測定部１０１から得た１０秒間の時系列データから１００ミリ秒ごとの時系列データをサンプリングし、標準偏差を計算した。得られた標準偏差の平均値をプロットした結果を図１０に示す。
標準偏差の平均値は、細胞膜近傍電位の揺らぎを表しており、この値によってイオンチャンネルのの活性度を評価することができる。図１０に示すように、Ｃａｒｂａｃｈｏｌ濃度が大きくなるにつれて標準偏差の平均値も大きくなるが、１０μＭをピークに標準偏差の平均値は小さくなる。このように、本実施形態に係る計測方法および装置により、モノアラガイの神経細胞におけるイオンチャネルの活性が、Ｃａｒｂａｃｈｏｌ濃度に依存することを確認することができた。更に、本実験結果に基づいて、神経細胞の全チャネル活性度を類推することが可能である。
（実施の形態４）
図１１は、本発明の第４の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。この装置は、図１１（Ｂ）に示すように、上記第３の実施形態と同様の構成（図９（Ｂ）参照）を備えている。そして、図９（Ａ）における平均値計算部１０５を使用しない一方、正規分布近似部１０３および平均値・半値幅計算部１０６を使用することにより、図１１（Ａ）に示すように構成される。
正規分布近似部１０３は、単位標準偏差計算部１０２で得られた複数の標準偏差を、所定幅ごとに設定された複数の階級に分類する。そして、この階級をＸ軸とし、各階級に分類された標準偏差の数をＹ軸にプロットして、得られたグラフを正規分布に近似する。正規分布に近似する方法としては、指数減少、指数増加、ガウス、ローレンツ、シグマ、多重ピーク、非線形などの各種曲線近似解析を挙げることができる。平均値・半値幅計算部１０６は、得られた正規分布の平均値および半値幅（ピーク高さの半分となる幅）を計算する。
上記構成を有する本実施形態の装置を用いて、モノアラガイより調製した神経細胞を材料に、化学物質Ｃａｒｂａｃｈｏｌの神経細胞に対する作用を測定した。具体的には、モノアラガイの神経細胞に対し５０μＭ濃度のＣａｒｂａｃｈｏｌを投与する前後における測定部１０１の検出信号に基づいて、正規分布近似部１０３が標準偏差の頻度分布を作成した。
図１２は、Ｃａｒｂａｃｈｏｌを投与する前後１０秒間の検出信号からなる時系列データに基づき、５ミリ秒毎に計算して得た標準偏差によりヒストグラムを作成して正規分布に近似した結果であり、左側のグラフが投与側の状態を示し、右側のグラフが投与後の状態を示している。図１２に示すように、Ｃａｒｂａｃｈｏｌの投与により、標準偏差の平均値および半値幅が大きくなっていることがわかる。平均値・半値幅計算部１０６による算出結果は、投与前の平均値および半値幅が０．４７８および０．１０９であるのに対し、投与後の平均値および半値幅が０．７０３および０．１７５であった。この結果は、Ｃａｒｂａｃｈｏｌを投与することによって、モノアラガイ神経細胞のイオンチャンネルが活性化され、その活性化されたチャンネルの開閉による活動電位の変動を表していると考えられる。
上記実験と同様の条件で、従来の細胞内記録法により投与前後を比較した結果を図１３に示す。本実施形態に係る計測方法は、細胞外記録法によるものであるが、図１２と図１３とを比較すると、細胞内記録法の場合と同様の結果が得られていることがわかる。このように、本発明の計測方法によれば、従来の細胞内記録法を用いることなく、イオンチャンネルの開閉に伴う細胞活動、およびその変化を容易に測定することができる。したがって、例えば、生体試料と測定用デバイスとの間に高抵抗のシールド（ギガシールド）を形成しなくても生体試料の電気的変化を計測することができ、生体試料を傷つけるおそれがない。
また、本発明により、細胞への薬物投与の前後またはその投与量に対するイオンチャンネル活性度の絶対値やチャンネル活性度の増減を比較することができ、例えば以下に示すように、薬物の作用効果の定性的または定量的な分類を行うことができる。
（実施の形態５）
平滑筋細胞のＣａイオンチャンネルの活性は、ノルエピネフィリン１０μＭ刺激時において、ニフェジピンにより濃度依存的に阻害されることが、細胞内記録法などによって確認されている。本実施形態においては、上記第４の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置を用いて薬剤を評価する方法を説明する。
図１４は、測定部１０１の検出信号から標準偏差の正規分布グラフを作成し、この正規分布の平均値および半値幅をそれぞれ基準値と比較したときの隔たり量を、相対的移動値および相対的広がりとして表した結果である。ニフェジピンにの相対的移動値および相対的広がりを、種々の濃度（０．１μＭ〜１００μＭ）をパラメータとして予めデータベースに格納しておき、２種類のＣａチャンネル阻害薬ＡおよびＢについて作用効果の分類を行った。
図１４に示すように、化合物Ａ（△）は、各濃度に対する相対的移動値および相対的広がりの挙動がニフェジピン（○）とほぼ同様であり、ニフェジピンと同様のＣａイオンチャンネル阻害剤であると推定される。これに対し、化合物Ｂ（□）は、濃度が変化しても相対的移動値および相対的広がりがほとんど変化せず、ニフェジピン（○）とは挙動が大きく異なっているので、平滑筋細胞には存在しないタイプのＣａイオンチャンネル阻害剤である可能性が高いと考えられる。このようにして、種々の薬物についての作用効果を推定することができる。
更に、図１４に示す相対的移動値および相対的広がりに基づいて、基準値からの隔たり量が所定値の範囲内（例えば、図に破線で示す±５％の円内）に存在するか否かを判断することにより、薬品スクリーニングを効率よく行うことができる。
（その他の実施形態）
以上、本発明の各実施形態について説明したが、本発明の具体的な態様は上記実施形態に限定されない。例えば、上記第４および第５の実施形態においては、検出信号に基づき得られた正規分布の平均値および半値幅をそれぞれ基準値と比較したときの隔たり量を用いて評価を行っているが、得られた正規分布の標準偏差（または分散）に基づくパラメータを適宜用いて、活性度を評価してもよい。
また、図１１（Ａ）に示す第４および第５の実施形態の構成においてサンプル振り分け部１１１を更に備えることにより、図１５に示す構成にしてもよい。サンプル振り分け部１１１は、細胞膜上に複数種類存在する各イオンチャンネルごとの特徴を解析する時に、非常に有効な手段である。
また、図１１（Ａ）に示す第４および第５の実施形態の構成においては、測定部（信号源）１０１を１つのみ用いているが、第２の実施形態に示すように複数の測定電極１０１を備える場合には、図１６に示すように構成することができる。この計測装置において、信号加算部１０７は、選択した１または複数の測定部（信号源）１０１において発生した活動信号を加算する。各信号源１０１に対しては、刺激発生部１０４から刺激信号を付与することにより各生体試料を同時に刺激することができ、これによって加算する複数の活動信号のタイミングを一致させることができる。
また、上記各実施形態においては、吸引ラインアタッチメントを設けて被測定液を吸引することにより、被測定液が多孔性絶縁基板を通過するように構成しているが、被測定液の搬送手段として吸引ラインアタッチメントの代わりに加圧装置を設けて測定チャンバを加圧することにより、被測定液が多孔性絶縁基板を通過するように構成することもできる。
また、上記第３の実施形態において、平均値計算部は、単位標準偏差計算部により算出された複数の標準偏差に基づいて平均値を算出するようにしているが、更に、この複数の標準偏差を時系列に沿って一定数ごとにグループ分けを行い、各グループ毎に平均値を算出するようにしてもよい。各グループの平均値が時系列に沿って増加する場合、この平均値が所定値以上となった時刻、および／または、平均値の増加率が所定値以下となった時刻を特定して、データ表示部に表示させるようにしてもよい。これにより、化学物質が細胞活動に影響を与えるまでのタイムラグの目安を得ることができる。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明によれば、生体試料が発する活動信号を容易、迅速且つ高精度に検出することができる生体試料の活動信号計測装置および計測方法を提供することができる。
本発明は、例えば、高速薬品スクリーニングや、細胞診断（例えば、がん細胞と正常細胞との識別）などに適用可能であり、手術などの際にオンサイトで実施することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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