(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞における組換え遺伝子発現のための相同的組換え発現ベクターであって、該ベクターが、以下：
（ａ）組換え遺伝子の発現のためのプロモーター；
（ｂ）選択マーカーをコードする転写ユニット；および
（ｃ）マウスの免疫グロブリンγ2A座位の5.1kbのBamH Iフラグメント、または該フラグメントと高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、該マウス免疫グロブリンγ2A座位に相同的組換えターゲッティングを行い得る、フラグメントまたはポリヌクレオチド、
を含有する、ベクター。
【請求項２】
マウス細胞における組換え遺伝子の発現のための請求項１に記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項３】
NS/O細胞における組換え遺伝子の発現のための請求項２に記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項４】
前記選択マーカーが、gpt、dhfr、抗生物質耐性、またはグルタミン合成酵素転写ユニットからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項５】
前記選択マーカーが、グルタミン合成酵素転写ユニットである、請求項４に記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項６】
前記プロモーターが、CMV−IEプロモーターである、請求項１〜５のいずれかに記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項７】
前記組換え遺伝子が免疫グロブリン遺伝子である、請求項１〜６のいずれかに記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項８】
哺乳動物細胞における組換え免疫グロブリン遺伝子の発現のための相同的組換え発現ベクターであって、該ベクターが、以下：
（ａ）第１の免疫グロブリン遺伝子の発現のための第１のプロモーター；
（ｂ）第２の免疫グロブリン遺伝子の発現のための第２のプロモーター；
（ｃ）選択マーカーをコードする転写ユニット；および
（ｄ）マウスの免疫グロブリンγ2A座位の5.1kbのBamH Iフラグメント、または該フラグメントと高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、該マウス免疫グロブリンγ2A座位に相同的組換えターゲッティングを行い得る、フラグメントまたはポリヌクレオチド、
を含有する、ベクター。
【請求項９】
前記第１のプロモーターおよび第２のプロモーターがそれぞれCMV−IEプロモーターである、請求項８に記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項１０】
前記選択マーカーが、グルタミン合成酵素転写ユニットである、請求項８または９に記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項１１】
マウス細胞における組換え免疫グロブリン遺伝子の発現のための請求項８〜10のいずれかに記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項１２】
NS/O細胞における組換え免疫グロブリン遺伝子の発現のための請求項11に記載の相同的組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜12のいずれかに記載の発現ベクターをトランスフェクトされた、十分に分化したＢ細胞である宿主細胞。
【請求項１４】
哺乳動物宿主細胞における組換え遺伝子の発現方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜12のいずれかに記載の免疫グロブリンγ2A座位特異的な相同的組換えベクターを該宿主細胞に転移する工程；および
（ｂ）選択および組換え遺伝子発現に適切な条件下で該宿主細胞を培養する工程、を包含する、方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞選択が、gpt、dhfr、抗生物質耐性、またはグルタミン欠乏からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターが、前記宿主細胞染色体γ2A座位と、該宿主細胞γ2A座位中の任意の部位で相同的に組換わる、請求項15に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
背景
組換え発現構築物は、所望の組換えタンパク質を発現する安定な哺乳動物細胞株を産生するために、日常的に用いられている。これらの組換え発現構築物は、トランスフェクトされた宿主細胞中に染色体外プラスミドとしてとどまるタイプであり得るか、または宿主のゲノムに組込まれるタイプであり得る。安定に組込まれた組換え遺伝子のコピーを保有する哺乳動物宿主細胞は、一般に、組換え遺伝子の維持および完全性に関してより信頼性が高い。一旦組換え哺乳動物宿主細胞が、組換えタンパク質を産生することを同定されると、組込まれた組換え遺伝子のコピーは、その遺伝子の染色体外コピーよりもより好しくあり得る。
しかし、所望の組換えタンパク質を高レベルで発現する安定に組込まれた組換え遺伝子のコピーを保有する細胞株の頻度は、極めて低い。一般に、組換えタンパク質を高レベルで発現するクローンを同定するためには、多数の安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞が、スクリーニングされなければならない。これは、哺乳動物ゲノムへの組換え遺伝子の挿入の座位の影響に起因すると一般に考えられている。哺乳動物ゲノムのサイズのために、無行為な組込み事象が、結果として高レベルの遺伝子発現に有利な座位への組換え遺伝子の挿入となることは、非常に稀である。
高レベルに組換え遺伝子を発現する細胞株の頻度の増加により、引き続く選択のために、組換えタンパク質生産体として選択される高発現体の非常に大きなプールが準備される。さらに、頻度の増加は、高レベル組換えタンパク質発現体を同定するために産生されることを必要とする安定な細胞株の数を減少する。
発明の要旨
本発明は、高レベルの組換え遺伝子発現に好都合な哺乳動物ゲノムにおける特定の位置を定義する方法、および、好都合なゲノム位置に発現構築物をターゲッティングすることにより、高発現体の頻度を増加させる効率的な方法を開示する。
また、高レベルの組換えタンパク質を発現する安定な細胞株を樹立するための本発明の方法の実施も開示する。さらに本発明は、本発明を用いて産生される細胞株が、非常に高いレベルで組換えタンパク質を発現し、これが、哺乳動物ゲノムへの発現構築物の無行為な組込みにより産生された最高の発現細胞株を頻繁に上回ることを示す。
【図面の簡単な説明】
図１−プラスミドp9014の概略図を示す。
図２−マウス染色体へのp9014の挿入部位を示す。
図３パネルＡ、Ｂ、およびＣ−パネルＡは、相同的組換え抗体発現プラスミドpIgG2Aの略図を示す；パネルＢは、染色体への抗体発現プラスミドの挿入のための相同的組換え事象の略図を示す；そしてパネルＣは、相同的に組換えられた抗体発現プラスミドを含有する染色体の一部を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞における組換え遺伝子の高レベル発現を達成する方法に関する。本発明の方法における高レベルの組換え遺伝子発現は、宿主細胞ゲノムへの組換え遺伝子の部位特異的組込みに起因する。この組込み部位は、予め選択され、そしてこの組込み事象は、宿主ゲノム中の特定部位と相同であることが知られている特定のDNA配列を含有するDNAベクターの相同的組換えにより達成される。宿主ゲノム中の特定部位は、この部位が遺伝子転写に関して高度に活性であり、そして相同なDNAセグメントを容易に組込むという決定に基づき組換え遺伝子の挿入のために選択される。
本発明の方法で利用され得る哺乳動物細胞は、NS/O細胞を含有するが、これに限定されず、そしてNS/O細胞は、最も好ましい細胞である。
NS/O細胞［Galfre,GおよびMilstein,C.Methods in Enzymology（1981）73B:3−46］を、約37℃で、例えば、約10％のウシ胎児血清（HyClone;検出可能なエンドトキシンを含有しない血清として定義される）を有するDulbeccoの改変最少必須培地（Hazelton Research Phoducts）、または約９％のウマ血清を有するIscoveの改変Dulbeccoの培地（JRH Biosciences）中で浮遊状態で成育させる。この細胞を毎週約１〜２×106細胞/ml（３〜４倍加／週）の収穫量で、ローラーボトル、Wheaton turbolift 46 liter suspension flask（Wheaton）、あるいは75リットル、200リットル、または300リットルの発酵槽中で成長させた。浮遊フラスコまたは発酵槽で使用される培地は、細胞に対する剪断力を減少させるために、約0.1〜0.3％のF68プルロック（pluronic）を含有し得る。細胞は代表的には、開始培養に続いて３〜４ヶ月まで成長させられる。
無細胞抽出物は、窒素キャビテーション、低張溶解などによる細胞の破壊によりNSO細胞から調製される。この細胞は、遠心分離により収集され、そしてリン酸緩衝生理食塩水,pH約7.4のような等張性緩衝液中で洗浄され得る。低張溶解は、約10容量の低張緩衝液（約10mM KCl、約20mM HEPES、pH約7.4、約1.5mM MgCl2、約0.1mM EDTA）または（約25mM HEPES、pH約7.5、約5mM MgCl2、および1mM EGTA）中で細胞を洗浄することにより達成され、そして遠心分離により回収される。溶解緩衝液はまた、ジチオスレイトール（DDT）のような還元剤をも含有し得る。低張緩衝液は一般に、プロテアーゼインヒビター（例えばPMSF、ロイペプチンおよびペプスタチン）を含有する。細胞は、約３容量の低張緩衝液中に再懸濁され、約20分間氷上に放置され、そしてDounceホモナジイザー中で約20ストロークにより溶解される。約90〜95％の細胞の破砕が、それぞれ約25または15ストロークを用いて100mlまたは300mlの隙間なく充填された（tight filling）Dounceホモジナイザー中で得られる。低張緩衝液中では窒素加圧による破砕も起きる。再懸濁された細胞は、400psiの窒素で約30分間、約４℃で、撹拌しながら窒素加圧セル中に置かれる。破砕は、加圧を開放し、加圧セルから細胞を排出することにより達成される。この細胞溶解物は、次の遠心分離工程により明澄化される；約400〜約1000×ｇ（上清S1）、約30,000×ｇ（上清S2）および約300,000×ｇ（上清S3）。この細胞溶解物はまた、以下の手順により明澄化され得る。非破壊細胞および核は、Beckman GPR Centrifugeで約3000rpm、約10分間、約５℃の遠心分離により除去される。この核後上清液体は、SS34ローターを有するSorval centrifugeにおいて約20分間16,000rpmで遠心分離される。この上清液は、Beckman centrifuge（50.2Tiローター）で約60分間、約50,000rpm、または45,000rpm（45Tiローター）での遠心分離により、さらに明澄化される。得られた上清液は、約2mM DTTおよび0.1％CHAPSの添加に続いて、約−80℃で保存される。
任意の種々の手順が、cDNAの分子的クローン化に用いられ得る。これらの方法は、適切な発現ベクター系におけるcDNAライブラリーの構築に続く組換え遺伝子の直接的な機能性発現を包含するが、これに限定されない。別の方法は、所望のタンパク質のアミノ酸配列から設計された標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いてバクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中で構築されたcDNAライブラリーをスクリーニングすることである。
cDNAライブラリーの調製は、当該分野で周知の標準的技術により実施され得る。周知のcDNAライブラリー構築技術は、例えば、Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1982）に見い出され得る。所望のタンパク質をコードするDNAはまた、適切なゲノムDNAライブラリーからも単離され得ることは、当業者に容易に明らかである。
ゲノムDNAライブラリーの構築は、当該分野で周知の標準的な技術により実施され得る。周知のゲノムDNAライブラリー構築技術は、Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.,Molecular Cloning:A Laboratory Manuel（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1982）に見い出され得る。
好ましい方法により組換え遺伝子をクローン化するためには、DNA配列が入手可能でない場合、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が必要とされ得る。これを達成するために、所望のタンパク質は精製され、そして部分的アミノ酸配列が自動配列決定装置により決定される。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的DNAフラグメントのPCR増幅のために約６〜８アミノ酸の１つ以上の領域の直線配列が決定される。
一旦適切なアミノ酸配列が同定されると、それらをコードし得るDNA配列が合成される。遺伝コードは縮重しているために、１つ以上のコドンがある特定のアミノ酸をコードするために用いられ得る。従ってアミノ酸配列は、類似したDNAオリゴヌクレオチドのセットのいずれかによりコードされ得る。このセットの１つのメンバーのみが、DNA配列と同一であるが、このメンバーは、ミスマッチを有するDNAオリゴヌクレオチドの存在下であってもそのDNAにハイブリダイズし得る。このミスマッチDNAオリゴヌクレオチドは、そのDNAに依然として十分にハイブリダイズし、所望のタンパク質をコードするDNAの同定および単離を可能にし得る。
本明細書で用いられるように、全てのアミノ酸３文字表記および１文字表記は、当該分野で標準であるそれらの呼称に従い、それらを以下に表記する：
0003654446.tif 000002
上記の方法によって得られたクローン化DNAは、適切なプロモーターおよび他の適切な転写調節エレメントを含有する発現ベクターに分子クローニングすることにより、組換え的に発現され得、そして原核または真核宿主細胞に転移され、組換えタンパク質を産生し得る。このような操作に関する技術は、Maniatis,Tら、前出、に十分に記載され、そして当該分野において周知である。
発現ベクターは、適切な宿主においてクローン化された遺伝子のコピーの転写、およびそのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列として本明細書中で定義される。このようなベクターは、種々の宿主（例えば、細菌、青緑藻類、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞）において真核生物の遺伝子を発現するために用いられ得る。
特別に設計されたベクターは、宿主間（例えば、細菌−酵母、または細菌−動物細胞）のDNAの往復（shuttling）を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数のための潜在力、および活性なプロモーターを包含すべきである。プロモーターは、DNAと結合し、そしてRNA合成を開始するようにRNAポリメラーゼを指揮するDNA配列として定義される。強力なプロモーターは、mRNAを高頻度で開始させることを引き起こすプロモーターである。発現ベクターは、クローニングベクター、改変したクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを包含するが、これらに限定されない。
様々な哺乳動物発現ベクターが用いられ、哺乳動物細胞において組換えタンパク質を発現し得る。組換えタンパク質発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターは、pMClneo（Stratagene）、pXT1（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、EBO−pSV2−neo（ATCC 37593）pBPV−１（８−２）（ATCC 37110）、pdBPV−MMTneo（342−12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37199）、pRSVneo（ATCC 37198）、pSV2−dhfr（ATCC 37146）、pUCTag（ATCC 37460）、および1ZD35（ATCC 37565）を包含するが、これらに限定されない。
所望のタンパク質をコードするDNAは、組換え宿主細胞における発現のための発現ベクターにクローン化され得る。組換え宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得、細菌、酵母、哺乳動物細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サル、および齧歯類起源の細胞株を包含するが、これらに限定されない）、および昆虫細胞（ショウジョウバエ由来の細胞株を包含するが、これらに限定されない）を包含するが、これらに限定されない。適切であり得、そして市販されている哺乳動物種由来の細胞株は、CV−１（ATCC CCL 70）、COS−１（ATCC CRL 1650）、COS−７（ATCC CRL 1651）、CHO−K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）、BS−Ｃ−１（ATCC CCL 26）、およびMRC−５（ATCC CCL 171）を包含するが、これらに限定されない。
発現ベクターは、トランスフォーメーション、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを包含するが、これらに限定されない多数の技術のいずれかにより宿主細胞に導入され得る。発現ベクター含有細胞は、クローン的に繁殖させられ、そして個々に分析され、それらが組換えタンパク質を産生しているか否かが決定される。組換えタンパク質を発現する宿主細胞クローンの同定は、いくつかの手段（抗体との免疫学的反応性、および宿主細胞関連組換えタンパク質活性の存在を包含するが、これらに限定されない）により行われ得る。
組換え宿主細胞における組換えタンパク質の発現に続いて、このタンパク質は、回収され、精製された形態のタンパク質を提供し得る。いくつかの精製手順が利用可能であり、そして使用に適切である。組換えタンパク質は、細胞溶解物および抽出物から、または馴化培養培地から、あるいは塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組み合わせ、または個別の適用により精製され得る。
さらに、組換えタンパク質は、組換えタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体で作製された免疫アフィニティーカラムの使用により、他の細胞性タンパク質から分離され得る。抗体は、当該分野で周知の方法により調製される。
単一特異性抗体は、組換えタンパク質に対して反応性の抗体を含有する哺乳動物抗血清から調製されるか、またはKohlerおよびMilstein、Nature 256:495−497（1975）の技術を用いて、組換えタンパク質に対して反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書中で用いられる単一特異性抗体は、組換えタンパク質に対して均一な結合特性を有する単一の抗体種または多数の抗体種として定義される。本明細書中で用いられる均一な結合とは、上記のように組換えタンパク質に会合するような特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力をいう。特定の抗体は、動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなど、ウサギが好ましい）を、適切な濃度の組換えタンパク質を用いて免疫アジュバントを伴って、または免疫アジュバントを伴わずに免疫化することにより産生される。
以下の手順は、ヒト定常領域と結合したヒトＢ細胞株から得られる抗体可変領域、軽鎖、および重鎖を取り込む組換えDNA配列を調製するために好ましい。これらの組換えDNAを用いて、ヒト−ドナーＢ細胞由来抗体の抗原特異性を保持する組換えヒト抗体の発現のために哺乳類細胞をトランスフェクトし得る。好ましくは、組換え免疫グロブリンは、治療的な目的で投与される場合には、自己タンパク質として認識される。全RNAは、ヒトへテロハイブリドーマ（例えば、記載されるヒトヘテロハイブリドーマ細胞）から、標準的な方法（例えば、グアニジニウムイソチオシアネートを用いる細胞可溶化を含む方法）を用いて、抽出される（Chirgwinら、Biochem.18:5294−5299［1979］）。
抗体産生細胞が、抗体分子の一部または全てをコードする組換えDNA分子の調製に適していることは当業者には容易に明らかである。このような抗体産生細胞は、ATCC Catalogue of Cell Lines And Hybridomas,第７版、1992に記載の細胞を包含するが、これらに限定されない。Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第４版、Bethesda,Maryland:National Institutes of Health,1987に、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードするDNAが開示され、そしてヒト抗体可変領域についての入手可能な配列データが集められ、このデータベース、および他のアクセス可能な米国および外国のデータベースを更新する（核酸配列およびタンパク質配列の両方）。
発現プラスミド、p9014［Palladinoら、1993,Biotechniques,14,pp.754−755］を、標準的なDNAクローニング方法により構築した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス即時型プロモーターから駆動される免疫グロブリン重鎖および軽鎖転写ユニットを含有し、そして選択マーカーとしてグルタミン合成酵素転写ユニットを使用する（図１）。細胞株を、Sal I線状化p9014をマウスプラズマサイトーマ細胞株NS/Oにエレクトロポレートし、そしてグルタミン非含有培地中の生育により安定な組込み体について選択することにより産生した［DeMartinoら、Antibody、Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 1991 4:829−835およびSingerら、Journal of Immunology 1993 150:2844−2857］。産生されたクローンから、D12がさらなる研究のために選択され、そしてこのクローンが非常に高いレベル（＞15pg/細胞／日）で組換え抗体を産生していることが示された。このクローンの高い比生産性は、p9014ベクターが、発現のための特別な部位でマウスゲノムに挿入されたことを示唆する。これらの細胞中のp9014の組込み部位を特徴付けることの第１の工程として、ゲノムDNAをD12から単離し、Xba Iで消化し、そしてヒト免疫グロブリンκ定常領域フラグメントでプローブした。ストリンジェントな条件下では、このフラグメントは、トランスフェクトされた遺伝子のみにハイブリダイズし、そしてこの遺伝子がプラスミドを線状化するために用いられたSal I部位の近くに存在するので、プラスミド／マウスゲノムDNA接合部を含む制限フラグメントを同定する。このプローブは、組込まれたp9014の１コピーを表す１つの3.3kbのバンドをD12ゲノムDNA中で同定した。これらの結果は、D12クローン中で見られる高レベルの発現が、3.3kb Xba I接合部フラグメントを産生するように挿入されたp9014のシングルコピーに由来することを示唆する。
この挿入部位を特徴づけるために、全ゲノムD12 DNAライブラリーを作製し、そして組換えバクテリオファージプラークを、ヒト免疫グロブリンκ定常領域プローブおよびトランスフェクションの前に本来のプラスミドを線状化するために用いられたSal I部位の他方の側由来のプラスミドプローブを用いてスクリーニングした。挿入部位の両側由来のp9014/マウスゲノムDNA接合部フラグメントを含む組換えバクテリオファージクローンを単離し、そしてプラスミドにサブクローン化した。組込み位置のマウスゲノムDNAの配列分析は、p9014ベクターがマウス免疫グロブリンγ2A座位に挿入されたことを示した。この挿入により、膜エキソン２の上流48塩基対（b.p.）から始まり、ポリＡ付加シグナルの下流まで伸長しているマウス免疫グロブリンγ2A遺伝子の1.8kbの重複が生じた。3'プラスミド／マウスゲノムDNA接合部に、トランスフェクトされたベクターまたはマウス免疫グロブリンγ2A座位のいずれにも由来しない36b.p.のDNAが存在した。この接合部では、32b.p.のプラスミド配列が欠失していた。5'接合部の調査は、791b.p.のベクター配列が、挿入プロセスにおいて欠失したこと、および16b.p.の未同定DNAが存在したことを示した（図２）。
トランスフェクションに用いられた本来の細胞株、NS/Oは、十分に分化したＢ細胞であり、通常、Ig重鎖座位から非常に高いレベルの免疫グロブリンRNAを発現する細胞タイプである。この座位に挿入されたp9014の観察は、CMV−IEpプロモーターが、この染色体位置において高レベルで発現され得ることを実証する。これらの結果は、この免疫グロブリン座位に組換えDNA発現ベクターを挿入するための相同的組換えの使用が、この細胞株内の他の組換えタンパク質の高レベルの発現を促進し得ることを示す。
このアプローチを評価するために、相同的組換えターゲッティング配列として生殖系列マウス免疫グロブリンγ2A遺伝子を含有する発現構築物を産生した。NS/OゲノムDNAバクテリオファージライブラリーを作製し、マウスIgG2A遺伝子のM23'非翻訳領域由来のプローブでスクリーニングし、そしていくつかの精製したクローンが、完全な生殖系列マウスIgG2A遺伝子を含有することを示した。これらのバクテリオファージの１つから、5.1kbのBamH Iゲノムフラグメントをサブクローン化した。このフラグメントは、CH1エキソンのほとんどの5'部分以外のマウスIgγ2Aのコード領域の全てを含有した。Sal I制限部位を、膜エキソン２の39b.p.上流に位置する天然に存在するStu I部位に挿入し、マウス免疫グロブリンγ2A配列中に線状化のための唯一の部位を提供した。このクローン化したフラグメントを用いて、複合発現ベクターを産生した。このベクターは、以下を含む:1）ヒトCMV即時型プロモーターから転写される重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子;2）選択マーカーとして使用されるグルタミン合成酵素遺伝子;3）プラスミドベクター配列；および４）マウス免疫グロブリンガγ2A座位の5.1kbのBamH Iフラグメント（図3A）［Yamawaki−Kataoka,Y.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1982 79:2623−2627;Hall,B.ら、Molecular Immunology 1989 26:819−826,Yamawaki−Kataoka,Y.ら、Nucleic Acid Research 1981 9:1365−1381;Bebbington,C.R.ら、Biotechnology 1992 10:169−175］。この相同的組換え挿入型ベクターは、組込み事象を至適化するように設計されている。この組込み事象では、ベクターに含まれるマウス免疫グロブリンγ2A座位は、内因性マウス免疫グロブリンγ2A座位と組換わり得、これは特異的な、そして限定された発現ベクターの挿入を引き起こす（図3B）。免疫グロブリンγ2A座位中の任意の部位における相同的組換えによるこのベクターの挿入が、結果として組換え抗体をコードするDNAの高レベルの発現を生じることが、予測される。
NS/O細胞を、エレクトロポレーションにより、Sal I線状化免疫グロブリンベクター構築物でトランスフェクトし、そして96ウェルマイクロタイタープレートにプレートした。147ウェルが、GS選択培地条件下での細胞増殖についてポジティブであった。安定な細胞株（相同的組換えにより内因性マウス免疫グロブリンγ2A座位に免疫グロブリン構築物を組込んでいる）は、高レベルの組換え抗体を発現する。相同的組換え体の可能性があるクローンについて迅速にスクリーニングするために、ELISAを、高レベルの組換え抗体を発現するウェルについての迅速一次通過（rapid first pass）スクリーニングとして用いた。147ウェルの全ての上清に実施したELISAにより、高レベルの抗体を発現する20ウェルを同定した。これらの20ウェルの細胞を拡大し、そして抗体の発現について再アッセイした。20ウェルの内12ウェルの細胞は、高レベルの抗体を発現し続けた。これらの12の細胞株は、染色体にpIgG2A/免疫グロブリンプラスミドを挿入したクローンのプールを形成した。
ゲノムサザンブロットアッセイを行い、トランスフェクトされたベクターがマウス免疫グロブリンγ2A座位に組込まれた安定なクローンを同定した。多数の制限酵素を調べ、相同的組換えを検出するために適切な酵素を同定した。Hpa Iは、NS/OゲノムDNAを消化し、ブロットし、そしてマウス免疫グロブリンγ2A座位の3'側由来のプローブでプローブした場合、15kbの生殖系列バンドを生じさせる。対照的に、免疫グロブリンベクターが、相同的組換えによりIgG2A座位に挿入されている場合、10kb Hpa Iフラグメントがブロット上に現れるであろう（図3C）。
12の高発現細胞株のサザン分析は、これらの細胞株の９つが、相同的組換えによるマウスIgG2A座位への構築物の挿入に一致する10kbのバンドを有することを実証した（表１）。これらの９つのクローンを、免疫グロブリン発現ベクターに対して特有のハイブリダイゼーションプローブを用いるさらなるサザンブロットにより、相同的組換えであることを確認した。この結果は、マウス免疫グロブリンγ2A座位への相同的組換えが非常に高い頻度で生じたことを示す。高発現クローンの75％および安定な細胞株の総数の６％が相同的組換えであった。
0003654446.tif 000003
12の体発現クローンの全てを、それらの組換えタンパク質生産性のレベルについて試験した。細胞培養培地を、24、48、および72時間で、既知の濃度でプレートした細胞から除去し、そしてPorosアッセイを実施して産生された組換え抗体の量／細胞／日を測定した。これらの細胞は、14〜43pg/細胞／日の範囲の非常に高いレベルの組換え抗体を産生する。この生産性のレベルは、本来のD12細胞株により産生される組換え抗体の量に等しいか、またはこの量よりも高い。
これらの細胞における組換え抗体の比生産性における３倍の変動が、RNAレベルにおける差異またはクローンの変動に起因するのかを決定するために、選択した細胞株をプレートし、そして比生産性を測定し、そしてRNAを同一の本来の細胞プールから単離した。ノーザン分析を、ハイブリダイゼーションプローブとして免疫グロブリン重鎖および軽鎖定常領域遺伝子を用いて、単離したRNAについて実施した。１レーンあたりにロードするRNAの量を、マウスβアクチン発現に対して基準化し、そしてハイブリダイゼーションシグナルの強さを定量化した。この実験の結果は、RNAの量が細胞株間で比較的一定であることを示す。これは、これらの細胞における抗体発現の変動は、細胞性因子に起因し、主として異なるRNAレベルにより引き起こされるわけではないことを示唆する。
以下の実施例は、本発明の説明として提供されるが、同一の実施例に限定されることはない。
実施例１
ライブラリー構築
細胞株を、Sal I線状化p9014［Palladinoら、1993、Biotechniques,14,pp.754−755］をマウスプラズマサイトーマ細胞株NS/Oにエレクトロポレートし、そしてグルタミン非含有培地中の生育により安定な組込み体について選択することにより産生した［DeMartinoら、Antibody、Immunoconijugates and Radiopharmaceuticals 1991 4:829−835およびSingerら、Journal of Immunology 1993 150:2844−2857］。産生されたクローンから、細胞株D12が非常に高いレベル（＞15pg/細胞／日）で組換え抗体を産生していることを示した。このクローンの高い比生産性は、p9014ベクターが、発現のための特別な部位でマウスゲノムに挿入されたことを示唆する。5'ゲノムDNA/プラスミド接合部をクローン化するために、ゲノムライブラリーを、製造業者のプロトコルに従い、Lambda−Gem 11 Xho I Half−Site Arms Cloning System（Promega）を用いて構築した。D12ゲノムDNAを、Mbo I（Boehringer−Mannheim）で部分的に消化した。ポジティブプラークを、２つの異なるプローブ:1）アンピシリン耐性遺伝子のXmn I/Pst Iフラグメント（354bp）および２）ハムスターグルタミン合成酵素遺伝子のエキソン７の300bpフラグメントを用いて同定した。
3'プラスミド／ゲノムDNA接合部をクローン化するために、ゲノムライブラリーを、Lambda/Zap II/Gigapack II Goldクローニングキット（Stratagene）を用いて構築した。ベクターおよびD12ゲノムDNAの両方を、Xba I（Boehringer−Mannheim）で完全に消化し、この産物を連結し（Ligation Kit、Stratagene）、そして製造業者のプロトコルに従いパッケージングした。ポジティブプラークを、プローブとしてヒトκ定常領域遺伝子を用いて同定した。全てのプローブをニックトランスレーションにより標識した。ファージDNAを、製造業者のプロトコルに従い、LambdaSorb（Promega）を用いて単離した。
ファージ挿入物を、pSP72ベクター（Promega）にサブクローン化した。細菌由来のプラスミドDNAを、標準的なアルカリ溶解法を用いて単離した。挿入物を、Sangerのジデオキシ鎖終止法により配列決定した。
実施例２
NS/O細胞由来の生殖系列マウスIgG2A遺伝子の単離
マウスプラズマサイトーマ細胞株NS/Oから単離したDNAのMbo I部分消化物を、PromegaのLambda Gem11ベクターに挿入し、1.8×106の独立したプラークを、IgG2AM2 3'非翻訳領域由来のプローブ（Bgl II−BstX1）を用いてスクリーニングした。14のポジティブバクテリオファージをプラーク精製し、そして大規模の溶菌液を調製した。組換えバクテリオファージを、制限マッピングおよびサザンハイブリダイゼーションにより特徴づけ、そしてマウスIgγ2A遺伝子の全てのコード領域を包含する１つのクローンを同定した。全てのIgG2Aコード領域（CH1エキソンのほとんどの5'部分を除く）、膜エキソン、および3'非翻訳領域を含有する5.1kbのBamH Iフラグメントを切り出し、そしてマルチクローニング部位のSal I部位が破壊されているBluescript（Stratagene）の改変体のBamH I部位にクローン化した。
実施例３
IgG2Aターゲッティングプラスミドの構築
5.1kbのマウスIgG2A遺伝子を含有するプラスミドを、Stu Iで部分的に消化し、そして線状プラスミドをゲル精製した。唯一のSal I部位を、リンカーライゲーションによりIgG2Aフラグメントに挿入し、そしてIgG2A M2エキソンの39b.p.上流に付加されたSal I部位を含むサブクローンを選択した。改変した5.1kbのIgG2A挿入物を、BamH Iで消化することにより切り出し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し、そして同様に平滑末端化したIg発現ベクターのSal I部位にクローン化した。最終的なpIgG2Aターゲティングプラスミドを、エレクトロポレーションのために、Sal Iで消化することにより線状化した。最終的なターゲッティングプラスミドのマップを図３に示す。
実施例４
エレクトロポレーション
NS/O細胞を、10％のウシ胎児血清および4mMグルタミンを補充したIscoveの改変Dulbecco培地（Sigma）中で成育させた。1000万の細胞を、容量800μｌのリン酸緩衝生理食塩水中の25μｇの線状pIgG2Aと混合し、そしてBio−Rad Gene Pulser（1.5kV;3μF;電極距離、0.4cm）を用いてエレクトロポレートした。トランスフェクトした細胞を、GS選択されるクローンのために10％FCSおよび1mMのグルタミンを有するIscoveの培地にプレートした。選択培地（GS選択−グルタミン非含有Iscoveの培地、10％透析FCS、１×ヌクレオシド、１×アスパラギン）を、24時間後にウェルに添加した。147のウェルが細胞増殖についてポジティブであり、そしてこれらをELISAでアッセイした。
実施例５
ELISA
組換え抗体産生に関するクローンのスクリーニングをELISA（enzyme−linked immunosorbent assay）により達成した。クローンの培養上清を、PBS中の１％BSAで1:10および1:100に希釈した。このサンプルを、ヒトλ軽鎖に対するマウスモノクローナル抗体（Zymed）で被覆した96ウェルマイクロタイタープレート（Immulon2,Dynatech Laboratories,Inc.）に添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。次いで西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したマウスモノクローナル抗ヒトIgG1抗体（Zymed）を添加し、そして37℃で１時間インキュベートした。このプレートを、各々のインキュベーション後、PBSで３回洗浄した。結合した抗体の検出を、基質ABTS（2,2−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン）スルホン酸）（Zymed）を添加することにより視覚化した。色は、20分間、室温で発色させた。吸光度を415nmで測定し（BioRad Microplate Reader 3550）、そして抗体濃度をMicroplate Manager（BioRad）データ分析ソフトウェアを用いて計算した。検量線を、組換え抗体の２倍の段階希釈を用いて作製した。
実施例６
サザンブロッティングによる相同的組換えの同定
クローン由来のゲノムDNAを、プロテイナーゼK/SDS法、または迅速なグアニジン塩酸塩法（Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,Sambrook,J.、Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1982））のいずれかにより単離した。
相同的組換えを同定するために、高発現クローンおよび非産生コントロールクローン由来の10μｇのゲノムDNAをHpa Iで完全に消化し、0.8％のアガロースゲルに泳動し、そしてサザン法（Southern,E.J.Mol.Biol.1975 98:503）によりニトロセルロースにトランスファーした。このブロットを、２つの異なるプローブ、１）マウスIgG2a座位の下流の約3.5kbのXba Iフラグメント、および２）pBR322プラスミドの骨格のSal I/BamH Iフラグメント（276bp）を用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのためのDNAプローブを、ニックトランスレーション（Rigby,P.J.J.Molec.Biol.1977 113:237−251）により標識した。高レベルの抗体を発現する20のウェルを同定した。クローン拡大後の再スクリーニングで、20ウェルの内12ウェルが、高レベルの抗体を産生し続け、それらの全ては、ゲノムDNA中に発現ベクターを相同的に組換えていた。
実施例７
比生産性
クローンの比生産性を、６ウェル組織培養プレート中に３つ組で３×105細胞／ウェルの濃度で細胞をプレートすることにより、測定した。培地を、24時間後に１つのウェルから回収し、48時間後に第２のウェルから、そして72時間後に第３のウェルから回収した。細胞計数を各々の時間点で計測した。この培地を、POROSプロテインＡアフィニティーカラムを用いて組換え抗体濃度について分析した。pg/細胞／日で表される比生産性を、Kalaidagraphプログラムを用いて計算した。抗体産生のレベルは、約14〜約43pg/細胞／日であった。
実施例８
RNA分析
それぞれの細胞株について、108の細胞を、１×PBSで３回洗浄し、4Mグアニジンイソチオシアネート中で溶解し、そして組織ホモジナイザーを用いて破砕した。溶解物を、5.7M CsClクッション上に重層し、20,000rpm、20℃でSW28ローター中で一晩回転させた。このRNAを、dH2O中でペレットを溶解し、続いてエタノール沈澱することにより回収した。RNAの濃度を、260nmの波長における吸光度を読みとることにより測定した。
10μｇの全RNAをそれぞれの細胞株について、３時間180Vで、１×MOPS緩衝液中のホルムアルデヒド／アガロースゲルで泳動し、次いで本質的には記載のように、ニトロセルロースペーパーにトランスファーした（Chirgwinら、Biochem.18:5294−5299［1979］）。
RNAブロットを、以下の32P標識マウスDNAプローブにハイブリダイズさせた:a.）ヒトIgG1定常領域を含有する2kbのEcoR1−Xho1フラグメント;b.）ヒトIgλC2定常領域を含有する600bpのEcoR1−Xba1フラグメント;c.）オリゴヌクレオチド5'−CUA CUA CUA CUA ATG GAT GAC GAT ATC GCT GC−3'（配列番号１）および5'CAU CAU CAU CAU ACG CAG CTC AGT AAC AGT CC−3'（配列番号２）を用いてRT−PCR増幅により産生されたマウスβアクチン遺伝子由来の1200bpのEcoR1−BamH Iフラグメント。１つのRNAブロットを、一晩42℃で10％デキストラン硫酸、４×SSC、40％ホルムアミド、0.8％Denhardt's Tris緩衝溶液中で２つのそれぞれの免疫グロブリンプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、オートラジオグラフィーの前に、室温で２×SSC、0.1％SDSで３回、20分間50℃で0.1×SSC、0.1％SDSで２回洗浄した。シグナル強度をPhosphorimagerで測定した。２つの免疫グロブリンプローブで定量した後、フィルターを、70℃で15分間dH2O中で洗浄することによりシグナル除去し、そしてそれぞれのレーン中にロードされたRNAの量について基準化を可能にするβアクチンプローブと再びハイブリダイズさせた。それぞれの細胞株は、おおよそ等しい量の抗体特異的RNAを産生した。
実施例９
NS/O細胞のトランスフェクション
NS/O細胞を、以下の培地中で指数関数的な増殖に維持した:10％の熱不活化ウシ胎児血清および4mMグルタミンを補充したIscoveの最小必須培地；それらを５％〜6.5％のCO2にセットされた加湿したインキュベーター中で37℃で維持した。
トランスフェクションのためのプラスミドを、唯一の部位での制限酵素による消化により線状化した；好ましい唯一の部位は、ベクターの細菌配列では外来遺伝子発現配列の外側に位置する唯一の部位であった。制限消化後、DNAをフェノール抽出、フェノール／クロロホルム（1:1）抽出および最後の１回のクロロホルム抽出により除タンパク質を行った；次いでDNAを、最終濃度0.2〜0.4Mの塩化ナトリウムおよび70％エタノールを用いて、生物学的安全キャビネット中で無菌条件下で沈澱させた。DNAを、計算上1mg/mlの濃度で滅菌蒸留水に再懸濁した。DNAを、ただちに使用するか、または使用するまで凍結（−20℃）させた。
トランスフェクションの日に、ストックNS/O培養物について生存細胞数を計測した。トランスフェクションキュベットあたり全部で１×107の生存細胞を使用した。細胞を、最初に3,000×ｇで５分間室温で遠心分離することにより回収した；次いでペレット化した細胞を、無菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で２回洗浄し、そして800mlあたり107の細胞の濃度でPBS中に再懸濁した。細胞懸濁物を、この時点から氷上で維持した。107の細胞を、生物学的安全キャビネット中で無菌条件下で、0.4cm（電極間の距離）BioRadキュベットに穏やかに移した。溶液中の40mgの線状プラスミドDNAを、この細胞と穏やかに混合し、そしてキュベットを５分間氷上で維持した。エレクトロポレーションの前に、キュベットの外側をふき取って乾かし、そして「BioRad Gene Pulser」のキュベットホルダーに置いた。gene pulserをパルスあたり1500ボルトで3mFを与えるようにセットした。２つの連続性パルスを使用した。次いでこのキュベットを２〜５分間氷上に置き、次いで細胞を、50mlの使い捨ての滅菌チューブ中の4mMグルタミンではなくむしろ1mMグルタミンを含有する30mlの改変増殖培地に移した。30mlのうち10mlの細胞懸濁物を、ウェルあたり約100mlで、１つの96ウェルマイクロタイターディッシュに分配し;10mlの細胞懸濁物（残りの20mlから）を10mlの改変した増殖培地で希釈し、そしてウェルあたり約100mlで、２つの96ウェルマイクロタイターディッシュに分配し；最後の10mlの細胞懸濁物を30mlの改変した増殖培地で希釈し、そしてウェルあたり約100mlで４つの96ウェルマイクロタイターディッシュに分配した。これらのプレートを、37℃で５％〜6.5％のCO2にセットした加湿したインキュベーター中で一晩インキュベートしたる。選択培地
GS選択のための選択培地は、以下のようであった：
Iscoveの最少必須培地（グルタミン非含有;Sigma）
10％の透析したウシ胎児血清（Hyclone由来）
１×ヌクレオシド＊
１×アスパラギン＊＊
＊50×リボヌクレオシドストック溶液：
35mgアデノシン
35mgグアノシン
35mgシチジン
12mgチミジン
（それぞれSigma由来、細胞培養グレード）滅菌蒸留水で100mlにする。0.1mフィルターユニットによりフィルター滅菌し、10mlアリコートで凍結保存（−20℃）する。
＊＊100×アスパラギン:100mlの滅菌蒸留水あたり600mg、0.1mフィルターユニットによりフィルター滅菌し、そして４℃で保存。
選択：
トランスフェクションの24時間後、それぞれの96ウェルマイクロタイターディッシュに、100μｌの選択培地を供給し、そしてコロニーが形成されるまで37℃で５％〜6.5％のCO2にセットした加湿したインキュベーター中でインキュベートした。これは、約３〜3.5週間を要した。ウェルが乾燥し始めない限り、供給物は必要とされなかった；プレートを、３〜４日間隔でモニターした。増殖するコロニーを有するウェルは、最終的には黄色く変色し、そしてこの時点でこれらのウェルを、50〜100μｌの培養液を除去し、そして（生存コロニーを維持するために）選択培地をウェルに再供給することによりアッセイした。
【図３Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｂ】
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