【手続補正書】
【提出日】令和3年9月10日(2021.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアミド基が結合された固相担体が充填されたカラムである、グリコサミノグリカンの分析方法。
【請求項２】
前記第１工程において、前記複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素のうち、前記生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖のうち少なくとも１種の二糖を生成する第１酵素を前記生体試料に添加する工程と、前記複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素のうち、前記第１酵素によって生成される二糖以外のグリコサミノグリカン由来の１又は複数種類の二糖を生成する第２酵素を添加する工程とを備え、
前記第２工程において、前記第１酵素が添加された生体試料と、前記第２酵素が添加された生体試料を、それぞれ液体クロマトグラフィ質量分析する、請求項１に記載のグリコサミノグリカンの分析方法。
【請求項３】
前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−４Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−６Ｓが含まれているか、前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−０Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−０Ｓが含まれている、請求項２に記載のグリコサミノグリカンの分析方法。
【請求項４】
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、グリコサミノグリカンの分析方法。
【請求項５】
前記第２工程において、１個のＭＲＭトランジションで液体クロマトグラフィ質量分析を行った結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが３個以上のピークを含むとき、溶出時間が最も短いピークか溶出時間が最も長いピークを用いて二糖を定量する、請求項４に記載のグリコサミノグリカンの分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
表１中、「ＣＳ」はコンドロイチン硫酸、「ＤＳ」はデルマタン硫酸、「ＨＳ」はヘパラン硫酸、「ＫＳ」はケラタン硫酸の略号である。
また、ΔＤｉ−４Ｓ、Ｄｉ−０Ｓはそれぞれコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸がコンドロイチナーゼＢで分解（消化）されてできる二糖であり、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓはヘパラン硫酸がヘパリチナーゼにより分解されてできる二糖であり、Ｇａｌ−ＧｌｃＮａｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮａｃ（６Ｓ）はケラタン硫酸がケラタナーゼＩＩで分解されてできる二糖である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
［実施例３］
生体試料として、ＧＡＧ特異的酵素であるコンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼ、ケラタナーゼＩＩの混合液を添加した血液（全血）をろ紙に含ませて乾燥させた乾燥ろ紙血（乾燥血液ろ紙（Dried Blood Spots（ＤＢＳ）））試料を用い、該ＤＢＳ試料から抽出した二糖を含む回収物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入してＧＡＧの定量分析を行った。ＬＣ分析条件、ＭＳ分析条件、ＭＲＭの測定条件は実施例２と同じ条件に設定した。この実施例では、１０個のＤＢＳ試料（ＤＢＳ１〜１０）を用意した。ＤＢＳ試料から回収物を得、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入するまでの手順は以下の通りである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
＜二糖の回収及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳへの導入＞
１．各ＤＢＳ試料の血液が含浸している部分をＤＢＳパンチャー（PerkinElmer（登録商標）、株式会社パーキンエルマージャパン）で切り出してディスク（直径３．３ｍｍ）を得た。
２．ディスクを、100μLの0.1％ＢＳＡを含有する、９６ウェルフィルタープレート（Omega 10K、日本ポール株式会社）の各ウェルに入れた。
３．各ウェルにＧＡＧ特異的酵素（コンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼおよびケラタナーゼII）を添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
４．得られたＧＡＧの消化物をフィルタープレートでろ過し、得られたろ過液を2500×gで１５分間、遠心分離した後、回収物をＬＣ ／ ＭＳ ／ ＭＳに導入した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
［実施例４］
生体試料として、ＧＡＧ特異的酵素であるコンドロイチナーゼＢ、ヘパリチナーゼ、ケラタナーゼＩＩの混合液を添加した血液（血清）試料を用い、各血清試料から抽出した二糖を含む回収物をＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入してＧＡＧの定量分析を行った。ＬＣ分析条件、ＭＳ分析条件、ＭＲＭの測定条件は実施例２と同じ条件に設定した。この実施例では、１０個の血清試料（Ｓｅｒｕｍ２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０）を用意した。血清試料から回収物を得、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに導入するまでの手順は、以下の通りである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
＜分析結果＞
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムを図４に示す。図４には、それぞれ、ΔＤｉ−４Ｓ、ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨｓ−ＮＳ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、Ｇａｌ（６Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、コンドロシンのそれぞれのプリカーサーイオンのm/zとプロダクトイオンのm/zの組合せをＭＲＭトランジションとして設定し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析した結果、得られたＭＲＭクロマトグラムが示されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
また、本発明の第２態様は、
生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する第１工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する第２工程と
を備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、分析方法である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本発明の第４態様は、第１態様のグリコサミノグリカンの分析方法において、前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−４Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−６Ｓが含まれているか、前記第１酵素によって生成される二糖にΔＤｉ−０Ｓが含まれており、前記第２酵素によって生成される二糖にΔＤｉＨＳ−０Ｓが含まれているものである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
また、本発明の第２態様の別の側面は、
被検者から生体試料を取得する工程と、
前記生体試料に複数種類のグリコサミノグリカン特異的酵素を添加して、該生体試料に含まれるグリコサミノグリカン由来の複数種類の二糖を生成する工程と、
液体クロマトグラフィ質量分析法により、前記複数種類の二糖を分離して分析する工程と、
前記分析結果に基づき前記被検者におけるムコ多糖症の有無を検査する工程とを備え、
前記液体クロマトグラフィ質量分析法における液体クロマトグラフィで用いられるカラムが、官能基としてのアダマンチル基が結合された固相担体が充填されたカラムである、ムコ多糖症の検査方法である。