【手続補正書】
【提出日】令和3年8月12日(2021.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
農耕地において使用される肥料、堆肥、収穫残さ等の窒素含有物に起因して生成される一酸化二窒素を低減する農耕地用一酸化二窒素低減材であって、前記窒素含有物に発生し一酸化二窒素を生成する糸状菌を摂食する菌食性土壌動物を増殖若しくは活性化させるココナッツピートと、このココナッツピートを担体として生存可能な一酸化二窒素除去能を有するHerbaspirillum属細菌とを含有することを特徴とする農耕地用一酸化二窒素低減材。
【請求項２】
請求項１記載の農耕地用一酸化二窒素低減材において、前記菌食性土壌動物は、トビムシであることを特徴とする農耕地用一酸化二窒素低減材。
【請求項３】
請求項１，２いずれか１項に記載の農耕地用一酸化二窒素低減材において、前記Herbaspirillum属細菌は、Herbaspirillum sp. UKPF54（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３８６、識別の表示：Ｈ５４）であることを特徴とする農耕地用一酸化二窒素低減材。
【請求項４】
農耕地において該農耕地で使用される肥料、堆肥、収穫残さ等の窒素含有物に起因して生成される一酸化二窒素を低減する方法であって、ココナッツピートを前記農耕地に施用し該農耕地の土壌中に生息している糸状菌を摂食する菌食性土壌動物を増殖させ若しくは活性化させ、前記菌食性土壌動物が摂食する糸状菌の摂食量を増加させて、前記土壌中の糸状菌量を減少させることで、この糸状菌から発生する一酸化二窒素の量を低減することを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法。
【請求項５】
請求項４記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記菌食性土壌動物は、トビムシであることを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法。
【請求項６】
請求項４，５いずれか１項に記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記ココナッツピートを播種若しくは定植の約一ヶ月前から直前の間に施用することを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法。
【請求項７】
請求項４〜６いずれか１項に記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記ココナッツピートの施用量は、前記農耕地の施用範囲における土壌容量の０．２５％〜２０％とすることを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法。
【請求項８】
請求項４〜７いずれか１項に記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記ココナッツピートに一酸化二窒素除去能を有するHerbaspirillum属細菌を担持させ、前記Herbaspirillum属細菌が担持されたココナッツピートを施用することを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法。
【請求項９】
請求項８記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記Herbaspirillum属細菌は、Herbaspirillum sp. UKPF54（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３８６、識別の表示：Ｈ５４）であることを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】農耕地用一酸化二窒素低減材及び農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農耕地において使用される肥料、堆肥、収穫残さ等の窒素含有物に起因して生成され大気中に放出される一酸化二窒素を低減させるための農耕地用一酸化二窒素低減材及び農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一酸化二窒素（Ｎ２Ｏ、別名：亜酸化窒素）は、二酸化炭素の約３００倍の温室効果を有し、地球温暖化に大きな影響を与える温室効果ガスであるとともに、オゾン層破壊の最大原因物質とされている。近年、この地球環境問題に大きな影響を与えている一酸化二窒素の大気中の濃度が急激に上昇してきていることから、この一酸化二窒素の排出量の削減が喫緊の課題とされている。
【０００３】
日本における一酸化二窒素の人為的排出源としては、燃料の燃焼、農耕地、家畜排泄物管理、工業プロセス、廃棄物の焼却、排水処理などが挙げられるが、これらのうち農耕地においては全体排出量の約３割と大きな割合を占めている。
【０００４】
農耕地から排出される一酸化二窒素の多くは、この農耕地に施用した有機質肥料や化学肥料などの窒素含有物が原因であるとされており、具体的には、これらに含まれている窒素が土壌中の細菌等の土壌微生物によって分解される際の硝化反応（アンモニア酸化）や脱窒反応（硝酸還元）によって生成されるものと考えられている。
【０００５】
したがって、農耕地からの一酸化二窒素の排出を低減するには、有機質肥料や化学肥料の施肥量を減らすこと、即ち窒素施肥量を減らす施肥管理技術が有効であるが、現在の農業形態において、施肥量を大幅に削減することは生育不良や収量低下など多くの問題が生じる懸念があるため殆ど実施には至っていない。
【０００６】
そこで、現状は、硝化抑制剤入り肥料（アンモニア態の肥料に硝化抑制剤が添加された肥料）や被覆肥料（肥料成分を樹脂などでコーティングして肥料成分が徐々に溶出してゆく肥料）を使用する対策が行われている。
【０００７】
しかしながら、これらを用いた対策は、平均値で見ると一酸化二窒素削減率は３５％前後と一定の効果が見られているものの、土壌の質や利用形態によって削減効果に大きな差が見られており、日本の畑でよく見られる黒ボク土の土壌では削減率０〜１０数％と明瞭な効果が得られていないことが明らかになっている。
【０００８】
したがって、日本においては、農耕地における一酸化二窒素削減対策が十分にとられているとは言えないのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景のもと、本発明者等は、有機質肥料や化学肥料などの窒素含有物を施用した農耕地における一酸化二窒素の発生メカニズムに関する研究を行ってきており、この窒素含有物を施用した農耕地における一酸化二窒素の発生は、この施用した窒素含有物に発生する微生物、具体的には、Fusarium oxysporum，Fusarium solani，Fusarium avenaceum，Actinomucor elegans，Bionectria ochroleuca，Nectria sp.，Rhizomucorなどの糸状菌が関与していることを明らかにするとともに、これらの糸状菌は、土壌中に生息するトビムシやマダニなどの菌食性土壌動物に摂食されるものであることも明らかにしている。
【００１０】
本発明者は、窒素含有物に発生する糸状菌と菌食性土壌動物には密接な関係があり、この菌食性土壌動物が農耕地における一酸化二窒素低減対策の鍵になると考え、更なる研究を進めてきた。
【００１１】
また、一方で、本発明者は、農耕地でも水田と畑とでは一酸化二窒素の排出量が全く異なることから（水田からは一酸化二窒素は殆ど排出されない）、水田には一酸化二窒素除去能を有する微生物（水田における硝化の副産物や脱窒の中間生成物として生成され土壌水中に溶解した一酸化二窒素を窒素に還元して一酸化二窒素を除去する機能を有する微生物）が存在すると考え、農耕地における一酸化二窒素除去微生物の特定に関しても研究を進めてきた。
【００１２】
そして、本発明者等は、特定の条件下で増殖する微生物細胞をひとつずつ採取する手法（Ashida et al.,Appl.microbiol.85:1211-1217(2010））を適用することで多くの一酸化二窒素除去微生物の分離に成功するとともに、Herbaspirillum属の細菌に高い一酸化二窒素還元能、言い換えると、一酸化二窒素除去能が備えられていることを明らかにした。
【００１３】
本発明者は、上述した菌食性土壌動物の糸状菌の摂食行動を利用して一酸化二窒素の発生源である窒素含有物に発生する糸状菌を減らすこと、及び一酸化二窒素除去微生物であるHerbaspirillum属細菌を利用することで農耕地における一酸化二窒素の発生量を低減できると考え、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。
【００１４】
本発明は、農耕地に施用することで菌食性土壌動物の糸状菌摂食行動を活性化して農耕地中の糸状菌の生息数を減少させることで農耕地からの一酸化二窒素の発生を低減するとともに、一酸化二窒素除去微生物の一酸化二窒素除去能により農耕地からの一酸化二窒素の発生を低減するもので、農耕地の土質や利用形態に関わらず安定的に高い一酸化二窒素低減効果を発揮する画期的な農耕地用一酸化二窒素低減材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１６】
農耕地において使用される肥料、堆肥、収穫残さ等の窒素含有物に起因して生成される一酸化二窒素を低減する農耕地用一酸化二窒素低減材であって、前記窒素含有物に発生し一酸化二窒素を生成する糸状菌を摂食する菌食性土壌動物を増殖若しくは活性化させるココナッツピートと、このココナッツピートを担体として生存可能な一酸化二窒素除去能を有するHerbaspirillum属細菌とを含有することを特徴とする農耕地用一酸化二窒素低減材に係るものである。
【００１７】
また、請求項１記載の農耕地用一酸化二窒素低減材において、前記菌食性土壌動物は、トビムシであることを特徴とする農耕地用一酸化二窒素低減材に係るものである。
【００１８】
また、請求項１，２いずれか１項に記載の農耕地用一酸化二窒素低減材において、前記Herbaspirillum属細菌は、Herbaspirillum sp. UKPF54（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３８６、識別の表示：Ｈ５４）であることを特徴とする農耕地用一酸化二窒素低減材に係るものである。
【００１９】
また、農耕地において該農耕地で使用される肥料、堆肥、収穫残さ等の窒素含有物に起因して生成される一酸化二窒素を低減する方法であって、ココナッツピートを前記農耕地に施用し該農耕地の土壌中に生息している糸状菌を摂食する菌食性土壌動物を増殖させ若しくは活性化させ、前記菌食性土壌動物が摂食する糸状菌の摂食量を増加させて、前記土壌中の糸状菌量を減少させることで、この糸状菌から発生する一酸化二窒素の量を低減することを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に係るものである。
【００２０】
また、請求項４記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記菌食性土壌動物は、トビムシであることを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に係るものである。
【００２１】
また、請求項４，５いずれか１項に記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記ココナッツピートを播種若しくは定植の約一ヶ月前から直前の間に施用することを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に係るものである。
【００２２】
また、請求項４〜６いずれか１項に記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記ココナッツピートの施用量は、前記農耕地の施用範囲における土壌容量の０．２５％〜２０％とすることを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に係るものである。
【００２３】
また、請求項４〜７いずれか１項に記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記ココナッツピートに一酸化二窒素除去能を有するHerbaspirillum属細菌を担持させ、前記Herbaspirillum属細菌が担持されたココナッツピートを施用することを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に係るものである。
【００２４】
また、請求項８記載の農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法において、前記Herbaspirillum属細菌は、Herbaspirillum sp. UKPF54（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３８６、識別の表示：Ｈ５４）であることを特徴とする農耕地における一酸化二窒素発生量の低減方法に係るものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は上述のように構成したから、本発明を農耕地に施用することにより、農耕地の土質や利用形態に関わらず、この農耕地に施用した有機質肥料や化学肥料などの窒素含有物に起因して発生する一酸化二窒素が低減される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本実施例の試験１における有機質肥料を施用した各処理区の一酸化二窒素フラックスの推移を示すグラフである。
【図２】本実施例の試験１における有機質肥料を施用した各処理区の一酸化二窒素発生量を示すグラフである。
【図３】本実施例の試験１における有機質肥料を施用した各処理区のスイートコーンの収量を示すグラフである。
【図４】本実施例の試験２における各処理区の一酸化二窒素フラックスの推移を示すグラフである。
【図５】本実施例の試験２における各処理区の一酸化二窒素発生量を示すグラフである。
【図６】本実施例の試験２におけるココナッツピート施用の有無及び殺虫剤散布の有無による菌食性土壌動物数を示すグラフである。
【図７】本実施例の試験２におけるココナッツピート施用の有無による有機質肥料の糸状菌発生数を示すグラフである。
【図８】本実施例の試験２における化学肥料を施用した各処理区の一酸化二窒素フラックスの推移を示すグラフである。
【図９】本実施例の試験２における化学肥料を施用した各処理区の一酸化二窒素発生量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
好適と考える本発明の実施形態を、図面に基づいて本発明の作用を示して簡単に説明する。
【００２８】
本発明を、例えば播種若しくは定植の１ヶ月前乃至直前に農耕地（例えば畑）に施用すると、主成分である菌食性土壌動物活性化物質、例えばココナッツピートにより、一酸化二窒素を生成するカビ（例えば当該農耕地に施用した窒素含有物に発生した糸状菌）を摂食する菌食性土壌動物（例えばトビムシやダニなど）が増殖若しくは活性化し、よって、それだけ一酸化二窒素を生成するカビが減少し、当該農耕地からの一酸化二窒素の発生が減少する。
【００２９】
これは、菌食性土壌動物活性化物質が菌食性土壌動物の餌として好まれること、また、菌食性土壌動物活性化物質が施用されることで菌食性土壌動物の生育環境が向上すること（例えば土壌の保湿性が向上したり、土壌が膨軟になる等）ことが要因と考えられる。
【００３０】
したがって、この菌食性土壌動物が増殖若しくは活性化することで、一酸化二窒素を生成するカビの摂食量が増加し、よって、一酸化二窒素を生成するカビが減少し、当該農耕地における一酸化二窒素の発生量（排出量）が低減される。
【００３１】
また、例えば、本発明の菌食性土壌動物活性化物質を担体にして、この菌食性土壌動物活性化物質に一酸化二窒素除去微生物としてHerbaspirillum属細菌を接種した構成とすれば、上述した一酸化二窒素を生成するカビの減少による一酸化二窒素低減効果とともに、この接種したHerbaspirillum属細菌の一酸化二窒素除去作用、具体的には、一酸化二窒素を生成するカビが一酸化二窒素を生成するために取り込むＮＯ３−を先取りすることでカビが生成する一酸化二窒素の生成量を低下させる一酸化二窒素生成量削減作用、及び一酸化二窒素を生成するカビが生成した一酸化二窒素（Ｎ２Ｏ）を窒素（Ｎ２）に還元する一酸化二窒素還元作用により、更に高い一酸化二窒素低減効果が発揮され、より一層農耕地における一酸化二窒素の発生量（排出量）が低減される。
【実施例】
【００３２】
本発明の具体的な実施例について図面に基づいて説明する。
【００３３】
本実施例は、農耕地において使用される肥料、堆肥、収穫残さ等の窒素含有物に起因して生成され大気中に放出される一酸化二窒素を低減させるための農耕地用一酸化二窒素低減材であって、農耕地中に生息し該農耕地で使用される窒素含有物に発生して一酸化二窒素を生成するカビ、及び農耕地中に生息し脱窒により一酸化二窒素を生成するカビを摂食する菌食性土壌動物を増殖若しくは活動を活性化させる菌食性土壌動物活性化物質を主成分として含有するものである。
【００３４】
具体的には、この菌食性土壌動物活性化物質は、植物繊維含有物質であり、具体的には、この植物繊維含有物質は、植物が発酵した発酵物、植物が腐植した腐植物若しくは植物が乾燥した乾燥物である。
【００３５】
また、更に説明すると前記植物は、ヤシ科植物、ミズゴケ科植物、ヒノキ科植物若しくはアオイ科植物のいずれかから選択されるものである。
【００３６】
即ち、本実施例における菌食性土壌動物活性化物質は、ヤシ科植物が乾燥した乾燥物としてのココナッツピート、ミズゴケ科植物が腐植した腐植物としてピートモス、ヒノキ科植物（例えばスギ、ヒノキ等）若しくはアオイ科植物（例えばシナノキ）の樹皮が発酵した発酵物としてバーク堆肥のいずれかから選択されるもの、又は前記ヒノキ科植物若しくは前記アオイ科植物の樹皮の粉砕物又はこれら内の二種若しくは全部を混合した混合粉砕物のいずれかから選択されるものであり、本実施例ではココナッツピートが採用されている。
【００３７】
尚、本実施例におけるココナッツピートとは、ヤシ科植物のココヤシ（学名：Cocos nucifera L.）の果実（一般的にはココナッツと称されている。）の繊維質状の厚い殻を乾燥した後、細かく裁断したヤシ殻繊維乾燥裁断物である。
【００３８】
また、菌食性土壌動物活性化物質の具体例として、上述したもの以外に、例えば、バガス、果実パルプ、腐葉土、アブラヤシの果実の絞りかすなども挙げられる。
【００３９】
また、本実施例は、この菌食性土壌動物活性化物質とともに、一酸化二窒素除去能（一酸化二窒素還元能）を有する微生物（以下、一酸化二窒素除去微生物という。）を含有するものである。
【００４０】
具体的には、この一酸化二窒素除去微生物は、前述した菌食性土壌動物活性化物質を担体として長期生存が可能で、且つ硝化還元能および亜硝酸還元能を有しておらず一酸化二窒素還元能のみを有するHerbaspirillum属細菌であり、本実施例では、このHerbaspirillum属細菌として、Herbaspirillum sp. UKPF54（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３８６、識別の表示：Ｈ５４）が採用されている。
【００４１】
即ち、本実施例は、菌食性土壌動物活性化物質としてのココナッツピートと、一酸化二窒素除去微生物としてのHerbaspirillum sp. UKPF54（以下、単にＨ５４という。）とからなる構成とされ、ココナッツピートの菌食性土壌動物増殖活性化作用によって窒素含有物（有機質肥料や化学肥料など）を施用した農耕地における主たる一酸化二窒素発生源となっている糸状菌を摂食する菌食性土壌動物（トビムシやマダニなど）が増殖し、この増殖した菌食性土壌動物の糸状菌大量摂食作用により農耕地における糸状菌の生息数が減少して一酸化二窒素の発生が減低される一酸化二窒素低減作用を発揮するとともに、Ｈ５４による一酸化二窒素除去作用、具体的には、糸状菌が一酸化二窒素を生成するために取り込むＮＯ３−を先取りして糸状菌が生成する一酸化二窒素の生成量を低下させる糸状菌一酸化二窒素生成量削減作用、及び糸状菌が生成した一酸化二窒素を窒素に還元する一酸化二窒素還元作用を発揮し、農耕地から発生する（排出される）一酸化二窒素を大幅に削減（低減）する構成とされている。
【００４２】
本実施例について、更に具体的に説明すると、Ｈ５４のココナッツピートに対する接種量は、ココナッツピート１ｇあたり、Ｈ５４、１０６〜１０８個とされている。
【００４３】
また、本実施例の使用方法について説明すると、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材の施用時期は、播種若しくは定植の１ヶ月前〜直前が好ましい。
【００４４】
また、適正施用量は、施用範囲における土壌容量の０．２５％〜２０％であり、栽培作物の種類などによりその適正値は異なる。尚、本実施例は、一度施用すると、分解されるまでその効果が発揮される（例えば土壌容量の１０％以上を施用した場合は一酸化二窒素低減効果が３年ほど継続する。）。
【００４５】
以下に本実施例に関する一酸化二窒素低減効果の確認、作用メカニズムを究明するためのメカニズム解明について詳述する。
【００４６】
〈試験１：一酸化二窒素低減効果の確認〉
有機質肥料を施用した土壌における本実施例の一酸化二窒素低減効果、及び本実施例の構成成分であるココナッツピート及びＨ５４の夫々の一酸化二窒素低減効果を明確にするための一酸化二窒素低減効果の確認試験を行った。具体的には、４つの試験区（処理区）を設定し、処理区ごとに施用内容を変え、各処理区における一酸化二窒素の発生量（一酸化二窒素フラックス）を、クローズドチャンバー法を用いて測定し、その結果を比較して、本実施例、ココナッツピート、Ｈ５４の夫々の一酸化二窒素低減率を求めた。以下に試験条件の詳細を示す。尚、本実施例では、ココナッツピートは市販のもの（フジック社製、商品名：あく抜きスーパーベラボン）を使用した。
【００４７】
（１）試験条件
ア  圃場：新潟県農業総合研究所  中沢圃場
イ  土壌タイプ：腐植質普通非アロフェン質黒ボク土
ウ  試験期間：２０１６年５月〜８月
エ  圃場履歴：前作  ダイズ
オ  供試作物：スイートコーン（品種名：ゴールドラッシュ）
カ  処理区（試験条件）：各処理区における施用内容は以下のとおりとした。    
Ａ処理区：有機質肥料のみ
Ｂ処理区：有機質肥料＋Ｈ５４
Ｃ処理区：有機質肥料＋ココナッツピート
Ｄ処理区：有機質肥料＋ココナッツピート＋Ｈ５４
尚、各処理区の面積は５ｍ２とし、また、施肥窒素量は、各処理区とも、基肥
Ｎ３００ｋｇ／ｈａ、追肥Ｎ２００ｋｇ／ｈａとした。                    
キ  ココナッツピート施用量：２．５Ｌ／１区（５ｍ２）
ク  菌体接種量：２．４×１０８ｃｆｕ／ｍｌを１区あたり５０ｍｌ。          
尚、菌体は、処理区Ｂでは有機質肥料に接種し、処理区Ｄではココナッツピー
トに接種した。
【００４８】
（２）試験結果
図１は、各処理区（試験条件）における一酸化二窒素フラックス（単位面積から単位時間に発生する一酸化二窒素量）の推移を示すグラフである。また、図２は、各処理区における一酸化二窒素発生量を示すグラフである。
【００４９】
本試験において、基準となる有機質肥料のみのＡ処理区に対して、Ｈ５４の一酸化二窒素低減効果を確認するためのＢ処理区では約１０％の一酸化二窒素低減効果が確認され、ココナッツピートの一酸化二窒素低減効果を確認するためのＣ処理区では約５０％の一酸化二窒素低減効果が確認された。そして、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材、即ち、ココナッツピートとＨ５４の両方を用いた場合の一酸化二窒素低減効果を確認するためのＤ処理区では約６０％の一酸化二窒素低減効果が確認された。
【００５０】
（３）考察
本試験により、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材の一酸化二窒素低減効果が明確になるとともに、各成分（ココナッツピート及びＨ５４）の一酸化二窒素低減効果も明確になった。また更に、本試験により、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材は、従来の硝化抑制剤入り肥料や被覆肥料を使用する対策において効果が見られない黒ボク土において、高い一酸化二窒素低減効果を発揮することも確認された。
【００５１】
また、本試験においては、供試作物の収量及び収量安定性に関する評価を合わせて行った。図３は、本試験の供試作物であるスイートコーン（品種名：ゴールドラッシュ）の各処理区における収量を示すグラフである。この図３に示すように、ココナッツピート施用区では収量のばらつきが小さく安定して高い収量が得られている。
【００５２】
即ち、この結果から、ココナッツピートには作物の収量を高位に安定化させる効果があることが確認された。
【００５３】
〈試験２：一酸化二窒素低減メカニズムの解明〉
本発明者等は、菌食性土壌動物活性化物質の施用による一酸化二窒素低減メカニズムは、菌食性土壌動物活性化物質の施用により土壌中の糸状菌を摂食する菌食性土壌動物が増殖するか、若しくは活動が活発化して、糸状菌に対する摂食量が増加することで糸状菌の数が減少し、この糸状菌の減少により一酸化二窒素の発生が低減されると考えた。そこで、この菌食性土壌動物活性化物質の一酸化二窒素低減メカニズムを検証するための試験を行った。
【００５４】
（１）菌食性土壌動物による一酸化二窒素低減効果の検証
本試験は上述した一酸化二窒素低減効果の確認試験と同様の方法で一酸化二窒素フラックスの推移と一酸化二窒素発生量を確認し、その結果から菌食性土壌動物の一酸化二窒素低減効果を検証した。以下に試験条件の詳細を示す。
【００５５】
ア  試験条件
（ア）圃場：新潟県農業総合研究所  中沢圃場
（イ）土壌タイプ：腐植質普通非アロフェン質黒ボク土
（ウ）試験期間：２０１６年９月〜１１月
（エ）処理区（試験条件）：各処理区における施用内容は以下のとおりとした。    
Ａ処理区：有機質肥料のみ
Ｂ処理区：有機質肥料＋ココナッツピート
Ｃ処理区：有機質肥料＋殺虫剤
Ｄ処理区：有機質肥料＋ココナッツピート＋殺虫剤
Ｅ処理区：ココナッツピートのみ
Ｆ処理区：無処理
尚、各処理区は、直径３２ｃｍ、深さ５ｃｍの円形土壌区とし、この中に集中
的に施肥を行った。施肥窒素量は、Ｎ３７５ｋｇ／ｈａ（通常の約５倍量）と
した。また、土壌及びココナッツピートは、後で回収できるようにメッシュ袋
に入れて埋設した。また、殺虫剤は、菌食性土壌動物を死滅させることにより
一酸化二窒素低減効果が見られなくなることを確認する目的で施用した（殺虫
剤は市販品（アース製薬社製、商品名：ダニアース）を使用した。）。      
（オ）ココナッツピート施用量：土壌体積の１０％
【００５６】
イ  試験結果
図４は、各処理区（試験条件）における一酸化二窒素フラックス（単位面積から単位時間に発生する一酸化二窒素量）の推移を示すグラフである。また、図５は、各処理区における一酸化二窒素発生量を示すグラフである。
【００５７】
図４及び図５に示すように、Ｃ処理区（有機質肥料＋殺虫剤）で最も一酸化二窒素の発生が多かった。また、Ａ処理区とＢ処理区の結果より、前述した有機質肥料を施用した土壌における一酸化二窒素低減効果の確認試験結果と同様、ココナッツピートの施用により一酸化二窒素フラックスは大きく低下するが、Ｂ処理区とＤ処理区の結果から、殺虫剤の散布によりその効果が著しく低下することが確認された。
【００５８】
ウ  考察
ココナッツピートを施用しないＡ処理区（有機質肥料のみ）とＣ処理区（有機質肥料＋殺虫剤）との比較結果、ココナッツピートを施用したＢ処理区（有機質肥料＋ココナッツピート）とＤ処理区（有機質肥料＋ココナッツピート＋殺虫剤）との比較結果から、殺虫剤の散布により一酸化二窒素の発生量が増加することが確認された。これは、殺虫剤の散布によって土壌中の菌食性土壌動物が死滅することで、土壌中の菌食性土壌動物の数が減少し、菌食性土壌動物の糸状菌の摂食量が減少することによるものと推考でき、これにより、有機質肥料を施用した土壌における一酸化二窒素低減には菌食性土壌動物が大きく寄与していることが確認された。
【００５９】
また、有機質肥料を施用しないＥ処理区（ココナッツピートのみ）とＦ処理区（無処理）においても一酸化二窒素の発生量に差が見られた。この結果は、菌食性土壌動物が、有機質肥料に発生する糸状菌以外の一酸化二窒素生成微生物、具体的には、土壌脱窒菌を摂食することを示しており、ココナッツピートによる菌食性土壌動物の増殖作用で、この土壌脱窒細菌がより多く摂食され一酸化二窒素の発生量が減少したものと考える。
【００６０】
（２）ココナッツピートの菌食性土壌動物数に対する効果の検証
上記の菌食性土壌動物の一酸化二窒素低減効果の検証を行った処理区において、更に、ココナッツピートが菌食性土壌動物に与える効果（増殖或いは活性化）の検証を行った。具体的には、ココナッツピートを施用しない土壌における菌食性土壌動物の生息数と、ココナッツピートを施用した土壌における菌食性土壌動物の生息数を調査した。尚、本試験においては、この菌食性土壌動物数を調査した土壌における糸状菌発生状況も同時に調査した。
【００６１】
ア  試験条件
菌食性土壌動物計測方法：施用後１ヶ月経過した土壌を採取し、計量後、ツルグレン装置により菌食性土壌動物（ダニ及びトビムシ）の捕獲を行い、その捕獲数を計測した。
【００６２】
イ  試験結果
図６は、有機質肥料を施用したＡ処理区（有機質肥料のみ）、Ｂ処理区（有機質肥料＋ココナッツピート）、Ｃ処理区（有機質肥料＋殺虫剤）及びＤ処理区（有機質肥料＋ココナッツピート＋殺虫剤）の各処理区における菌食性土壌動物（ダニ及びトビムシ）の計測数を示すグラフである。また、図７は、Ａ処理区（ココナッツピート無施用区）とＢ処理区（ココナッツピート施用区）における有機質肥料の糸状菌発生数を示すグラフである。
【００６３】
図６に示すように、ココナッツピートを施用したＢ処理区は、菌食性土壌動物の計測数がココナッツピートを施用しないＡ処理区の約２倍となった。この結果からココナッツピートの施用は土壌中の菌食性土壌動物を増殖させる効果があることが確認された。
【００６４】
また、ココナッツピートを施用しても殺虫剤を散布したＤ処理区は菌食性土壌動物数が少なく、ココナッツピートによる菌食性土壌動物の増殖作用が殺虫剤により阻害されることも確認された。
【００６５】
また、図７に示すように、ココナッツピートを施用したＢ処理区は、有機質肥料の糸状菌発生数がココナッツピートを施用しないＡ処理区の半数以下と大幅に減少している。
【００６６】
ウ  考察
上述した菌食性土壌動物による一酸化二窒素低減効果の検証試験及びこのココナッツピートの菌食性土壌動物数に対する効果の検証試験の結果から、ココナッツピートの施用により、土壌中の菌食性土壌動物が増殖し、この菌食性土壌動物の増殖により有機質肥料に発生した糸状菌が大量に摂食され、糸状菌の数が減ることで一酸化二窒素の発生量が減少するというメカニズムが検証された。
【００６７】
（３）化学肥料に対する一酸化二窒素低減効果の確認
本試験ではココナッツピートの化学肥料を施用した土壌に対する一酸化二窒素低減効果の確認を行った。具体的には、前述した有機質肥料を施用した土壌における試験と同様、処理区ごとに施用内容（試験条件）を変え、各処理区における一酸化二窒素の発生量（一酸化二窒素フラックス）を、クローズドチャンバー法を用いて測定し、その結果を比較した。以下に試験条件の詳細を示す。尚、本試験でも、ココナッツピートは市販のもの（フジック社製、商品名：あく抜きスーパーベラボン）を使用した。また、化学肥料は尿素を用いた。
【００６８】
また、本試験では、作物の植え付けは行わず、一酸化二窒素の発生量のみについて確認を行った。
【００６９】
ア  試験条件
（ア）圃場：新潟県農業総合研究所  長倉圃場
（イ）土壌タイプ：灰色低地土
（ウ）試験期間：２０１６年９月〜１１月
（エ）処理区（試験条件）：各処理区における施用内容は以下のとおりとした。    
Ａ処理区：化学肥料（尿素）のみ
Ｂ処理区：化学肥料（尿素）＋ココナッツピート
Ｃ処理区：ココナッツピートのみ
Ｄ処理区：無処理
尚、各処理区は、直径２５ｃｍ、深さ１０ｃｍの円形土壌区とし、この中に集
中的に施肥を行った。施肥窒素量は、Ｎ３７５ｋｇ／ｈａ（通常の約２．５倍
量）とした。また、土壌及びココナッツピートは、後で回収できるようにメッ
シュ袋に入れて埋設した。                                              
（オ）ココナッツピート施用量：土壌体積の５％
【００７０】
イ  試験結果
図８は、各処理区（試験条件）における一酸化二窒素フラックス（単位面積から単位時間に発生する一酸化二窒素量）の推移を示すグラフである。また、図９は、化学肥料（尿素）施用各区における一酸化二窒素発生量を示すグラフである。
【００７１】
本試験において、化学肥料（尿素）のみのＡ処理区に対して、Ｂ処理区（化学肥料＋ココナッツピート）では約４０％の一酸化二窒素低減効果が確認された。
【００７２】
ウ  考察
本試験により、本実施例の菌食性土壌動物活性化物質（ココナッツピート）は、有機質肥料だけでなく化学肥料に対してもその効果が発揮されることが明確になった。また、本試験では土壌を変更し、黒ボク土ではなく灰色低地土で試験を行ったが、黒ボク土同様に高い一酸化二窒素低減効果を確認することができた。これにより、土壌の土質に関わらず高い一酸化二窒素低減効果を発揮することも確認された。
【００７３】
以上の試験１及び試験２より、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材は、ココナッツピートによる菌食性土壌動物の増殖作用により、有機質肥料に発生する糸状菌数を減らし、この糸状菌から放出される一酸化二窒素量を、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材を施用しない場合に比べて約５０％低減し、更に、このココナッツピートを担体として接種した一酸化二窒素除去微生物であるＨ５４による一酸化二窒素除去作用（一酸化二窒素還元作用）により、農耕地から発生する一酸化二窒素量を、更に約１０％低減することができる。
【００７４】
即ち、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材を、有機質肥料を施用した農耕地に施用することで、約６０％の一酸化二窒素低減効果が見込まれる。
【００７５】
更に、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材は、従来の硝化抑制剤入り肥料や被覆肥料を使用する対策では明確な低減効果が得られなかった黒ボク土土壌でも高い一酸化二窒素低減効果を発揮する。
【００７６】
しかも、本実施例の農耕地用一酸化二窒素低減材は、施用により作物の収量を高位に安定させる効果も発揮し、一酸化二窒素低減効果と共に、作物の生育安定化効果をも発揮する画期的な農耕地用一酸化二窒素低減材となる。
【００７７】
尚、本発明は、本実施例に限られるものではなく、各構成要件の具体的構成は適宜設計し得るものである。
【受託番号】
【００７８】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３８６