(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表される（ジチオカルバミン酸誘導体）2Ｆｅ（II）錯体−テトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）からなる一酸化窒素（ＮＯ）の捕捉によりテトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）を放出する一酸化窒素探索用スピントラップ剤。
【化１】
0003665927.tif 000005
一般式（１）
（ＲおよびＲ’は、炭素数８までの、末端にＯＨまたはＣＯＯＨを有していても良い非置換または置換アルキル基であり、置換基は、メチル基および／またはＯＨ基である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は−ＣＨ３、Ｒ５は−ＯＨ、−Ｈまたは−ＣＯＯＨである。）
【請求項２】
検出は、放出されたテトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）の電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）により行うことを特徴とする請求項１に記載の一酸化窒素探索用スピントラップ剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＮＯを直接捕捉して、検出、例えば電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）などによる検出が容易な化合物を放出する、一酸化窒素スピントラップ剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
一酸化窒素（ＮＯ）は、循環系（血管拡張：血圧コントロール）、神経系、免疫系を始め、生体内において極めて多彩、且つ重要な役割を演じているメッセンジャーであり、製薬あるいは医学的な観点から極めて注目されている。しかしながら、その働きは通常のメッセンジャーとは異なり、固有のレセプターを持たず、疎水性ガスおよびフリーラジカルとしての性質を利用して細胞膜を障壁としないで広範に作用をおよぼし得る。
また、生体分子や酸素種との反応により、変幻自在に生理活性を変化させるため、その正確な作用を調べることは極めて困難である。
例えば、炎症部位や敗血症、虚血−再灌流時等に見られるように、その濃度と共存物質（例えばスーパーオキシドアニオン）の場合は組織障害を起こす毒になるし、他の場合には障害から保護する薬として機能する。
この様なＮＯの作用を理解するためには、なによりも、ＮＯの濃度変化を空間的、時間的にモニターすることが重要である。しかしながら、現在までのところ、前記要求を完全に満たす手法は見出されていない。
もし、ＮＯの放出過程を画像化できれば、基礎医学の進展といったことだけでなく、臨床的にも、製薬など開発においても重要な情報をもたらすものである。
【０００３】
この様な中で、ＥＰＲ法を利用したスピントラップ剤を利用したＮＯの画像化は、ＮＯの体内動態を知る上で重要であり、ヘモクロビンやジチオカルバメート−鉄錯体を用いたいくつかの例がある（例えば、文献 H.Kosaka et al., Am. J. Physiol.  Vol.266, C1400-(1994),  C-S.Lai, A.M.Komarov, FEBS Lett.  Vol.345, 120 (1994).）。しかしながら、これらの従来型トラップ剤は、鉄にＮＯが結合してできる鉄−ニトロシル型化合物のシグナルを測定するものであるから、これらは感度が低いという点で実用としては満足すべきものではない。例えば、ジチオカルバメート−鉄錯体（（ＤＴＣＳ）2Ｆｅ）を用いてＮＯを検出する場合の模式図を図５に示す。
ただ、炎症部位のように大量にＮＯが産生されているものの測定には十分対応しうる。また、ヘモクロビンを利用するものでは、試料を凍結しなければならない点で、また、ジチオカルバメートの場合は錯体の安定性の面で問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記ＮＯ検出剤の不都合を改善した、検出剤を提供することである。
本発明者らは、グアニル酸シクラーゼはＮＯの細胞内の標的酵素であり、グアニル酸シクラーゼの分子内のヘム（鉄−プロトポルフィリンIX）にＮＯが結合すると、電子的な影響により鉄に配位している軸性配位子（ヒスチジン残基のイミダゾール基）の結合が著しく弱められて解離することを観察し、この化学的メカニズムをモデルとしてＮＯによりスピンプローブが放出される分子を設計することを考えた。
前記分子の設計を検討する中で、ヘムに相当する部位構成するものとして、平面性のジチオカルバメート型鉄（II）錯体を利用し、これに軸性配位子としてテトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）を用いることにより、ＮＯが中心の鉄（II）に結合することにより、前記軸性配位子のＴＥＭＰＯ誘導体を解離すること。そして、ＴＥＭＰＯ誘導体は、非常に安定なラジカルであり、また高感度に検出できるＥＳＲシグナルを有し、しかも、鉄に配位している際は、鉄とのレドックス相互作用のためシグナルは消失している特性を持ち、ＮＯが鉄（II）に結合することで、前記ＴＥＭＰＯ誘導体のＥＳＲシグナルが回復するので、このシグナル強度からＮＯの計測が可能となることを発見した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式（１）で表される（ジチオカルバミン酸誘導体）2Ｆｅ（II）錯体−テトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）配位子からなる一酸化窒素（ＮＯ）の捕捉によりテトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）を放出する一酸化窒素探索用スピントラップ剤であり、
【０００６】
【化２】
0003665927.tif 000002
【０００７】
（ＲおよびＲ’は、炭素数８までの、末端にＯＨまたはＣＯＯＨを有していても良い非置換または置換アルキル基であり、置換基は、メチル基および／またはＯＨ基である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は−ＣＨ３、Ｒ５は−ＯＨ、-Ｈ、または−ＣＯＯＨである。）、好ましくは、検出は、放出されたテトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）の電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）により行うことを特徴とする前記一酸化窒素探索用スピントラップ剤である。
本発明者は、一酸化窒素（ＮＯ）の捕捉により検出感度の良い探索分子テトラメチルピペリジンＮ−オキシル誘導体（ＴＥＭＰＯ誘導体）を放出するスピントラップ剤を設計することにより前記課題を解決したものである。
【０００８】
【本発明の実施の態様】
本発明を詳細に説明する。
Ａ．スピントラップ剤の合成。
１．ジチオカルバメート類は、対応する２級アミンと二硫化炭素を水酸化ナトリウム存在下、水または、水−ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）中で撹拌することにより、下記の反応式によりナトリウム塩として得られる。
【０００９】
【化３】
0003665927.tif 000003
【００１０】
（反応式中ＲおよびＲ’は化合物（１）におけるＲおよびＲ’と同じ。）
前記反応によって得られる、または市販の化合物を以下に例示する。
【００１１】
【化４】
0003665927.tif 000004
【００１２】
前記略称のものは以下のとおりである：
DMTC：N,N-ジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム
DETC：N,N-ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（市販）
DPTC：N,N-ビスプロピルジチオカルバミン酸ナトリウム
DOTC：N,N-ジオクチルジチオカルバミン酸ナトリウム
M-DETC：N,N-ジイソプロピルジチオカルバミン酸ナトリウム
M-DPTC：N,N-ビス（1-メチルプロピル）ジチオカルバミン酸ナトリウム
DTCS：N-ジチオカルボキシサルコシン-２ナトリウム（市販）
DTC-MA：N-ジチオカルボキシ-N-メチルアラニン-２ナトリウム
DTC-IDA：N-ジチオカルボキシイミノ二酢酸-３ナトリウム
DETC-OH：N,N-ビスヒドロキシエチルジチオカルバミン酸ナトリウム
DPTC-OH：N,N-ビス（２ーヒドロキシプロピル）ジチオカルバミン酸ナトリウム
MGD：N-ジチオカルボニルーN-メチルグルカミン  ナトリウム
２．鉄錯体は、１．で得られたジチオカルバメートを再結晶により精製後、燐酸バッファー（ｐＨ７．４，１００ｍＭ）に溶解し、硫酸第一鉄水溶液と５：１のモル比で混合することにより得られる。
疎水性のジチオカルバメートを原料とするときは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤を加えるのが好ましい。
３．これにＴＥＭＰＯ誘導体のバッファー溶液添加して、約３０分室温で撹拌すると、目的のスピントラップ剤が得られる。ＴＥＭＰＯ誘導体の鉄への結合は、ＥＳＲシグナルの消失を追跡することで確認した。
【００１３】
Ｂ．前記合成した、スピントラップ剤の性能評価。
生体でのＮＯの生理活性への関与を調べるためのＮＯ発生剤化合物についても多くの研究がされ、市販されているが、ここでは、ＮＯ発生剤として、ＮＯＣ−７（例えば（株）同仁化学研究所から市販されており、具体的化合物は３−（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル−２−ニトロソヒドラジノ）−Ｎ−メチル−１−プロパンアミンである。）を使用し、これを前記で調製したスピントラップ剤溶液に最終濃度１００μＭになるまで加え、ＥＳＲシグナルを測定することでＮＯの検出を行った。
平面性のジチオカルバメート型鉄（II）錯体に軸性配位子としてＴＥＭＰＯを配位させたスピントラップ剤の模式図と、これにＮＯが反応した場合のスピンプローブの概念を図１に示す。
【００１４】
【実施例】
以下に、具体例を示す。
実施例１
Ａ．ＴＥＭＰＯＬ−Ｆｅ（ＤＴＣＳ）2の合成
ＴＥＭＰＯＬ（２２２μＭ）／１００ｍＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．４）９００μｌに、ＤＴＣＳ（１００ｍＭ）／１００ｍＭ燐酸バッファー（ｐＨ７．４）５０μｌを加え、これにＦｅＳＯ4（２０ｍＭ）／Ｈ2Ｏ５０μｌを加える。
これを３７℃において反応させて目的の錯対化合物を得る。
Ｂ．前記合成した、スピントラップ剤の性能評価
前記溶液に、ＮＯＣ−７（１０ｍＭ）／１００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μｌ）を加え、３７℃においてＥＳＲによる測定を行った。
ＮＯによるＴＥＭＰＯの放出反応、およびＮＯの発生に伴い、次第にシグナルが大きくなって行くところを一定時間ごとに５回重ね書きしたものを示す。両端の信号は内部標準として加えたＭｎＯ2のものであり、この位置を基本に、シグナル位置や大きさを比較することができる。
この様子を図２に示す。
【００１５】
実施例２
ここでは、既に動物で使用されているＤＴＣＳ−鉄（II）錯体（（ＤＴＣＳ）2Ｆｅ：ＤＴＣＳ；５ｍＭ，Ｆｅ2+；１ｍＭ）を使用した場合と、前記実施例で合成したＴＥＭＰＯＬ−（ＤＴＣＳ）2Ｆｅ錯体（ＴＥＭＰＯＬ；２００μＭ，ＤＴＣＳ；５ｍＭ，Ｆｅ2+；１ｍＭ）を用いた場合の、ＮＯ発生剤としてＮＯＣ−７（１０ｍＭ）／１００ｍＭのＮａＯＨ水溶液（５０μｌ）を加え、室温においてＥＳＲシグナルの変化を観察した際の結果を図３に示す。
このことから、本発明のスピントラップ剤は感度が優れていることが理解できる。
【００１６】
実施例３
ここでは、実施例１に記載した本発明のスピントラップ剤を用いた場合の、ＮＯ放出剤を用いて（上記実施例で使用したものを用いて）、ＥＳＲ強度およびＮＯＣ−７の吸収強度の変化を、時間経過に対して計測したものを図４に示す。
ＮＯの捕捉に伴ってＥＳＲによるシグナルが増大していることが理解される。
【００１７】
前記以外のジチオカルバメート−Ｆｅ(II)錯体を用いた場合においても、上記実施例で示したと同様のＮＯ計測特性を持つことが確認さている。
生体内におけるＮＯの計測には、水溶性の錯体化合物が好ましい。
【００１８】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の新規なスピントラップ剤を用いることにより、生体内の一酸化窒素を含めて、高感度で一酸化窒素を計測できるという優れた効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  平面性のジチオカルバメート型鉄（II）錯体に軸性配位子としてＴＥＭＰＯＬを配位させたスピントラップ剤の模式図と、これにＮＯが反応した場合のスピンプローブ放出の概念図
【図２】  ＴＥＭＰＯＬ−Ｆｅ（ＤＴＣＳ）2を用いて、ＮＯ（発生剤；NOC-7）の発生をＥＳＲスペクトル（シグナル）として計測したもの
【図３】  ＴＥＭＰＯＬ−Ｆｅ（ＤＴＣＳ）2（ａ）と（ＤＴＣＳ）2Ｆｅ（ｂ）とのＮＯ（発生剤；NOC-7）に対する計測感度の比較
【図４】  ＴＥＭＰＯＬ−Ｆｅ（ＤＴＣＳ）2を用いて、ＮＯ（発生剤；NOC-7）添加後の時間経過とＥＳＲシグナルおよびNOC-7による吸収光度の変化
【図５】  ジチオカルバメート−鉄錯体（（ＤＴＣＳ）2Ｆｅ）を用いてＮＯを検出する場合の模式図
【図１】
0003665927.tif 000006
【図２】
0003665927.tif 000007
【図３】
0003665927.tif 000008
【図４】
0003665927.tif 000009
【図５】
0003665927.tif 000010