(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも次の〔式１〕（配列表配列番号２）で示されるアミノ酸配列の一次構造を含み、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド。
His  Ser  Cys  Ala  Gly  Asn  Arg  Gly  Trp  Cys
5                        10
Arg  Ser  Lys  Cys  Phe  Arg  His  Glu  Tyr  Val
15                       20
Asp  Thr  Tyr  Tyr  Ser  Ala  Val  Cys  Gly  Arg
25                       30
Tyr  Phe  Cys  Cys  Arg  Ser  Arg                   〔式１〕
35
〔式中、３、１０、１４、２８、３３および３４位のシステイン残基は、３位と３４位、１０位と２８位、および１４位と３３位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
【請求項２】
〔式１〕（配列表配列番号２）で示されるアミノ酸配列の一次構造をカルボキシル末端に有し、アミノ末端に疎水性ポリペプチド領域を有し、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
カブトガニ血球内小顆粒画分をグアニジンとキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出液を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、アセトニトリルの濃度勾配溶出により溶離させることによって得られうる画分に含まれ、次の物性値を示し、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド。
(i)   SDS-PAGEにより還元条件下で単一のバンドを示す。
(ii)  SDS-PAGEにより求めた分子量が約8,200である（還元条件下）。
(iii) アミノ酸79個より構成される。
(iv)  グラム陰性菌、グラム陽性菌および真菌に対して抗菌性を示す。
【請求項４】
次の〔式２〕（配列表配列番号１）で示されるアミノ酸配列の一次構造をもつポリペプチドを蛋白分解酵素によって分解して得られ、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド。
Asn  Pro  Leu  Ile  Pro  Ala  Ile  Tyr  Ile  Gly
1                   5                        10
Ala  Thr  Val  Gly  Pro  Ser  Val  Trp  Ala  Tyr
15                       20
Leu  Val  Ala  Leu  Val  Gly  Ala  Ala  Ala  Val
25                       30
Thr  Ala  Ala  Asn  Ile  Arg  Arg  Ala  Ser  Ser
35                       40
Asp  Asn  His  Ser  Cys  Ala  Gly  Asn  Arg  Gly
45                       50
Trp  Cys  Arg  Ser  Lys  Cys  Phe  Arg  His  Glu
55                       60
Tyr  Val  Asp  Thr  Tyr  Tyr  Ser  Ala  Val  Cys
65                       70
Gly  Arg  Tyr  Phe  Cys  Cys  Arg  Ser  Arg         〔式２〕
75
〔式中、４５、５２、５６、７０、７５および７６位のシステイン残基は、４５位と７６位、５２位と７０位、および５６位と７５位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
【請求項５】
次の〔式３〕（配列表配列番号３）で示されるアミノ酸配列の一次構造をもち、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド。
Ala  Ser  Ser  Asp  Asn  His  Ser  Cys  Ala  Gly
1                   5                        10
Asn  Arg  Gly  Trp  Cys  Arg  Ser  Lys  Cys  Phe
15                       20
Arg  His  Glu  Tyr  Val  Asp  Thr  Tyr  Tyr  Ser
25                       30
Ala  Val  Cys  Gly  Arg  Tyr  Phe  Cys  Cys  Arg
35                       40
Ser  Arg                                            〔式３〕
〔式中、アミノ末端にArg が１個ペプチド結合していてもよく、また８、１５、１９、３３、３８および３９位のシステイン残基は、８位と３９位、１５位と３３位、および１９位と３８位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の抗菌活性を有するポリペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗菌剤。
【請求項７】
〔式２〕で示されるアミノ酸配列の一次構造をもち、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗菌剤。
【請求項８】
次の〔式４〕で示されるアミノ酸配列の一次構造をもち、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗菌剤。
Asn  Pro  Leu  Ile  Pro  Ala  Ile  Tyr  Ile  Gly
1                   5                        10
Ala  Thr  Val  Gly  Pro  Ser  Val  Trp  Ala  Tyr
15                       20
Leu  Val  Ala  Leu  Val  Gly  Ala  Ala  Ala  Val
25                       30
Thr  Ala  Ala  Asn  Ile  Arg                        〔式４〕
35
〔式中、カルボキシル末端にArg がさらに１個ペプチド結合していてもよい。〕
【請求項９】
〔式２〕で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ。
【請求項１０】
配列表配列番号５の塩基番号１３５〜３７１で示される配列をもつ請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のＤＮＡと、このＤＮＡと相補的なＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、細菌（グラム陽性菌、グラム陰性菌）や真菌等に対する抗菌活性等の生理活性を有するポリペプチドおよびその製造法ならびに該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
本発明のポリペプチドは、強い抗菌活性を有するので、この性質を用いて、様々な種類の微生物に対して有効な抗菌剤、殺菌剤又は防腐剤として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
カブトガニは、その体内に一種類の血球細胞を有している。細胞内は、密度の異なる大、小、二種類の顆粒で満たされており、大顆粒画分には体液凝固因子および抗リポ多糖因子、小顆粒画分にはタキプレシンなどの抗菌性物質が含まれている。本発明者らは、先にカブトガニの血球細胞中の小顆粒画分の成分として６種類の蛋白質（Ｓ１〜Ｓ６）を分離している（Shigenaga, T. ら，J. Biochem. 114, 307-316 (1993))。
【０００３】
一方、ヒト、ウサギ、モルモット、ラットなどのほ乳類の好中球やマクロファージの細胞内顆粒からは、デフェンシン（defensin）と総称される抗菌活性を有するペプチド群が単離されており、米国特許第 5242902号明細書には全アミノ酸配列が開示されている。また、デフェンシンは、グラム陰性菌、グラム陽性菌および真菌に対して抗菌活性を有することに加えて、上皮細胞および繊維芽細胞増殖を促進する効果を有することが同明細書に開示されている。デフェンシンに共通した構造上の特徴としては、システイン残基を６個有し、ジスルフィド結合を３個有し、アミノ酸残基数が約３０個の塩基性ペプチドであることが挙げられる。
カブトガニの血球細胞からデフェンシンに類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドが単離されたという報告はない。また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に対応した塩基配列も知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は種々の生理活性を有する新規なポリペプチド、その製造法、用途および該ポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に分離していたカブトガニ血球細胞の小顆粒画分の成分のうち、Ｓ５ペプチドについて全アミノ酸配列を決定したところ、カルボキシ末端（Ｃ末端）側に、従来知られているデフェンシンに類似した構造を持つことを見いだした。さらに、このＳ５ペプチドの抗菌活性を鋭意検索したところ、グラム陽性菌、グラム陰性菌および真菌のいずれに対しても強い抗菌活性を示すことを見いだし、本発明に至った。
すなわち、本発明は、次の１）〜５）で示されるポリペプチド及び６）で示されるその製造法を提供するものである。
【０００６】
１）少なくとも次の〔式１〕で示されるアミノ酸配列の一次構造を含むポリペプチド、
0003654667.tif 000002
〔式中、AA1 は塩基性アミノ酸残基、AA2 は中性アミノ酸残基、AA3 は酸性アミノ酸残基、AA4 は芳香族アミノ酸残基をそれぞれ示す。ここで３、１０、１４、２８、３３および３４位のシステイン残基は、３位と３４位、１０位と２８位および１４位と３３位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい〕。
【０００７】
２）AA1 はArg 、Lys およびHis からなる群から選ばれた塩基性Ｌ−アミノ酸残基、AA2 はGly 、Ala 、Leu 、Val 、Ile 、Met 、Pro 、Asn 、Thr 、Ser およびGln からなる群から選ばれた中性Ｌ−アミノ酸残基、AA3 はAsp およびGlu からなる群から選ばれた酸性Ｌ−アミノ酸残基、AA4 はTrp 、Tyr およびPhe からなる群から選ばれた芳香族Ｌ−アミノ酸残基である上記１）記載のポリペプチド。
【０００８】
３）少なくとも次の〔式２〕（配列表配列番号２）で示されるアミノ酸配列の一次構造を含むポリペプチド、
0003654667.tif 000003
〔式中、３、１０、１４、２８、３３および３４位のシステイン残基は、３位と３４位、１０位と２８位、および１４位と３３位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
【０００９】
４）〔式２〕の一次構造をカルボキシル末端に有し、アミノ末端に疎水性ポリペプチド領域を有する抗菌性ポリペプチド、
【００１０】
５）カブトガニ血球内小顆粒画分をグアニジンとキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出液を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、アセトニトリルの濃度勾配溶出により溶離させることによって得られうる画分に含まれ、次の物性値を示す抗菌性ポリペプチド、
(i)   SDS-PAGEにより還元条件下で単一のバンドを示す。
(ii)  SDS-PAGEにより求めた分子量が約8,200 である (還元条件下) 。
(iii) アミノ酸79個より構成される。
(iv)  グラム陰性菌、グラム陽性菌および真菌に対して抗菌性を示す。および
【００１１】
６）カブトガニ血球内小顆粒画分を蛋白質変性剤とキレート剤を含む緩衝液を用いて抽出し、抽出液を逆相高速液体クロマトグラフィーに付し、疎水性有機溶媒によって溶出させることを特徴とする上記１）〜５）のいずれかに記載のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造法。
【００１２】
７）さらに、次の〔式３〕（配列表配列番号１）で示されるアミノ酸配列の一次構造をもつポリペプチドを蛋白分解酵素によって分解して得られるポリペプチド。
0003654667.tif 000004
〔式中、４５、５２、５６、７０、７５および７６位のシステイン残基は、４５位と７６位、５２位と７０位、および５６位と７５位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
【００１３】
８）  またさらに、〔式４〕（配列表配列番号３）で示されるアミノ酸配列の一次構造をもつポリペプチドを提供するものである。
【００１４】
0003654667.tif 000005
〔式中、アミノ末端にＡｒｇが１個ペプチド結合していてもよく、また８、１５、１９、３３、３８および３９位のシステイン残基は、８位と３９位、１５位と３３位、および１９位と３８位との少なくとも一つの組合せの残基間でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）していてもよい。〕
【００１５】
さらに本発明は、これらのポリペプチドまたはその薬理的に許容される塩を有効成分とする抗菌剤を提供することにある。
【００１６】
さらに、〔式３〕で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を含む一本鎖のＤＮＡあるいは該ＤＮＡと相補的なＤＮＡとからなる二本鎖のＤＮＡを提供することにある。
【００１７】
本発明の製造法において、原料のカブトガニ血球内小顆粒画分とは、リムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス (Tachypleus tridentatus ）、タキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas)、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ(Carcinoscorpius rotundicauda）等のカブトガニの血液を採取し血球を分離後、さらにその血球細胞内の小顆粒を分離したものである。
【００１８】
具体的には、例えば分離したカブトガニ血球に0.008Mトリス−塩酸緩衝液 (0.001Mプロプラノロール、0.001Mフェニルメタンスルホニルフロライド（ＰＭＳＦ）及び0.75M ショ糖含有，pH7.4)を加えて懸濁させ、しばらく振とう後、遠心分離し、その上清にヘパリン（終濃度40ＵＳＰ単位/ml)を加え、遠心分離し、上層部を採取し、 1.5−2.4Mショ糖密度勾配液（0.008Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4) 、0.001MＰＭＳＦ及びヘパリン（40ＵＳＰ単位／ml）含有）によって遠心分離 (112,000 ×ｇ、30分）し、下層を採取して小顆粒画分として使用する。
【００１９】
このようにして得られたカブトガニ血球内小顆粒画分から▲１▼ 0.02Mトリス−塩酸緩衝液 (6Mグアニジン及び0.002Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有、pH 8.0）などの適当な緩衝液を加えて超音波処理し、37℃で１時間加温して抽出し、▲２▼抽出物をTSK gel Phenyl 5PW-RP(東ソー (株))を担体とする逆相ＨＰＬＣに付し、アセトニトリルの濃度勾配で溶出し、Ｓ５画分を採取することによって本発明の抗菌性ポリペプチドを得ることができる。
▲２▼の逆相ＨＰＬＣ工程によって得られた溶出画分（Ｓ５）は、TSK gel ODS120T （東ソー (株))を担体とする逆相ＨＰＬＣでさらに精製してもよい。
なお、精製過程でのペプチド含量の測定は、波長214nm における紫外部吸収を測定することによって行うことができる。
【００２０】
また、本発明のポリペプチドは、それ自体公知の方法、例えば液相合成法あるいは固相合成法（泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇  道典、「ペプチド合成の基礎と実験」1985、丸善（株））によって製造することができる。例えば、〔式１〕のポリペプチドを、固相合成法で製造する場合、アミノ酸配列の３７位がアルギニン残基のときは、Ｎ−保護アルギニンのカルボキシル基を直接、或いは場合によりスペーサーを介して、クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させて後、アミノ酸配列の３６位から１位までの各保護アミノ酸を固相合成法に従って順次結合し、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱離させて、直鎖状の〔式１〕のポリペプチドを得ることができる。さらに、得られたポリペプチドの３位と３４位、１０位と２８位，１４位と３３位の３対のシステインは、独立してメルカプト基を介してジスルフイド結合（−Ｓ−Ｓ−）を形成することができる。
これらのジスルフイド結合は、それ自体公知の方法、例えば、温和な空気酸化により形成することができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドを合成する場合に使用される前記のクロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂及びスペーサー、場合によりＮ−保護アミノ酸を該不溶性樹脂に結合したＮ−保護アミノ酸樹脂等は、公知の方法で調製でき、各種のものが市販されている。
【００２２】
該不溶性樹脂としては、Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸のカルボキシル基と直接、或いは場合によりスペーサーを介して、結合可能であり、かつ、その後脱離可能なものであれば如何なるものでもよい。かかる不溶性樹脂としては、例えば、Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン- ジビニルベンゼン共重合体）、オキシメチル樹脂あるいはスペーサーを導入した４−オキシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）−樹脂が、Ｆmoc （９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーの場合は、オキシメチルフェノキシメチル樹脂（Ｗａｎｇ）樹脂及びこれらの誘導体等が好ましい。
【００２３】
保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販されている。本発明のポリペプチドを合成する場合には、以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい。まず、アミノ酸のα−アミノ基の保護基はＢｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ (９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）である。アルギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基の保護基は、Ｔｏｓ（トシル）、ＮＯ2 （ニトロ）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２, ３, ６−トリメチル  ベンゼンスルホニル）又はＰｍｃ（２, ２, ５, ７, ８- ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）である。リジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基の保護基は、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Ｃl ・Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｏｃ、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフエニル）である。ヒスチジン（Ｈｉｓ）のイミダゾリル基の保護基は、Ｔｏｓ、Ｚ、Ｐａｃ（フェナシル）、Ｂｏｍ（ベンジルオキシメチル）、Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）又はＴｒｔ（トリチル）である。システイン（Ｃｙｓ）のメルカプト基の保護基としてはＢｚｌ (ベンジル）、ＭＢｚｌ (４−メトキシベンジル）、４−Ｍe Ｂｚｌ（４−メチルベンジル）、Ａｃｍ（アセタミドメチル）、Ｔｒｔ、Ｎｐｙｓ、t-Ｂｕ (t-ブチル）、t-ＢｕＳ（t-ブチルチオ）が挙げられるが、ＭＢｚｌ、４−Ｍe Ｂｚｌ、Ｔｒｔ、Ａｃｍ、Ｎｐｙｓが好ましい。チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基の保護基は、Ｂｚｌ、Ｃl2・Ｂｚｌ（２, ６−ジクロロベンジル）、t-Ｂｕであるか、あるいは保護しなくてもよい。トリプトファン（Ｔｒｐ）のインドール基の保護基はＣＨＯ（フォルミル）であるか、あるいは無保護でもよい。メチオニン（Ｍｅｔ）のチオメチル基の保護基は、メチルスルホキシドであるか、あるいは保護しなくてもよい。セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基の保護基は、Ｂｚｌ又はｔ−Ｂｕである。アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基の保護基は、ＯＢｚｌ（ベンジルエステル）、ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル）、ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル）、ＯＰａｃ（フェナシルエステル）等が挙げられる。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）のカルバミド基の保護基は、ＴｒｔまたはＸａｎ（キサンチル）である。
各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適当なものをそれ自体公知の中から選択することが好ましい。
【００２４】
保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Ｔartar.Ａら；Ｊ．Ｏrg．Ｃhem.，44、5000（1979）］、活性エステル法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダゾール法、ＤＣＣ- ＨＯＢt(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法［Ｋeonig 、Ｗら；Ｃhem.Ｂer.,103 、788 、2024、2034（1970）］、ジフエニルホスホリルアジド法、ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Hudson, D., J. Org. Chem.,53, 617(1988))、ＨＢＴＵ（2-(1H)- ベンゾトリアゾ−ル-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Knorr,R.ら, Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989)）、ＴＢＴＵ（2-(1H)- ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Knorr, R. ら, Tetrahedron Lett., 30, 1927 (1989)）等に従って行なうことができる。しかしこれらのうち、ＤＣＣ法、ＤＣＣ−ＨＯＢt 法、ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法、ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法、対称酸無水物法が好ましい。
【００２５】
これらの縮合反応は、通常、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。
α- アミノ基の保護基の脱離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、ＨＣl ／ジオキサン、ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等が用いられ、該保護基の種類により適宜選択する。
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．カイサーらの方法 [Anal. Biochem., 34, 595(1970) ］（ニンヒドリン反応法）によって検査される。
以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることができる。
【００２６】
保護ペプチド樹脂は、フッ化水素、ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［Aademic Press 発行、E. Gross編集、Ｙajima ，Ｈら; " The Peptides "５、65(1983)］、ＴＭＳＯＴf （トリメチルシリルトリフラート）［ Fujii、N ら； J. Chem．Soc., Chem. Commun., 274 (1987) ］、ＴＭＳＢr(トリメチルシリルブロミド）[Fujii、N ら； Chem. Pharm. Bull.,35、3880 (1987) ］、またはトリフルオロ酢酸などで処理することにより、該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は、該ストラテジー（Ｂoc又はＦmoc)、該樹脂、該保護基の種類により適宜選択する。
【００２７】
次いで、所望により、２- メルカプトエタノール、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などで還元することによりシステインのメルカプト基が還元型となっていることを確実ならしめた後、酸化処理することによりジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）結合の環状ポリペプチドを得ることができる。
この際の酸化処理は、公知の方法を用いることができ、通常、大気中の酸素やフエリシアン酸塩（例えば、フエリシアン化カリウム）のような酸化剤を用いる。
かくして得られたポリペプチドは、該ポリペプチド関連分野で知られた手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフイー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電気泳動、向流分配等により単離精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフイーによる方法が最も効果的である。
【００２８】
本明細書のポリペプチドのアミノ酸残基は国際的に認められた三文字表示による記号で示す。すなわち各記号は下記アミノ酸の残基を示す。
Ｈｉｓ；  ヒスチジン
Ｓｅｒ；  セリン
Ｃｙｓ；  システイン
Ａｌａ；  アラニン
Ｇｌｙ；  グリシン
Ａｓｎ；  アスパラギン
Ａｒｇ；  アルギニン
Ｔｒｐ；  トリプトフアン
Ｌｙｓ；  リジン
Ｐｈｅ；  フェニルアラニン
Ｇｌｕ；  グルタミン酸
Ｔｙｒ；  チロシン
Ｖａｌ；  バリン
Ａｓｐ；  アスパラギン酸
Ｔｈｒ；  トレオニン
Ｌｅｕ；  ロイシン
Ｉｌｅ；  イソロイシン
Ｍｅｔ；  メチオニン
Ｐｒｏ；  プロリン
Ｇｌｎ；  グルタミン
【００２９】
また、本発明のポリペプチドの誘導体として、ジスルフィド結合せずに存在しているシステイン残基またはジスルフィド結合を公知の方法（ジチオスレイトール等の還元剤で還元する方法等）で還元して得られたシステイン残基を公知の方法（ヨード酢酸等を使用する方法等）でカルボキシメチル化したポリペプチド誘導体もグラム陰性菌およびグラム陽性菌に対し、強い抗菌活性を示す。
次に、本発明のポリペプチド断片は、本発明の上記〔式３〕のポリペプチドをトリプシン、キモトリプシン又はペプシン等の蛋白分解酵素を用いて、それ自体公知の方法で分解して得ることができる。得られたポリペプチドは、ペプチド分野で公知の方法により単離精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が最も効果的である。
【００３０】
次いで、本発明によれば、以下の方法によって、〔式３〕（配列表、配列番号５）のアミノ酸配列（Asn 〜 Arg；アミノ酸番号１〜７９）で示されるポリペプチドをコードするＤＮＡ（AAT 〜 CGC；塩基番号１３５〜３７１）を得ることができる。さらに、〔式３〕のポリペプチドと共通のアミノ酸配列部分をもつ、〔式２〕、〔式４〕または〔式５〕のポリペプチドをコードするＤＮＡも同様の方法で得ることができる。
【００３１】
すなわち、カブトガニ血球より単離した poly(A)+ RNA より作製したcDNAライブラリーから〔式３〕のアミノ酸配列で示されるポリペプチドの部分アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドまたは該ポリペプチドに対する抗体等を用いることにより該ポリペプチドをコードするcDNAを単離し、それらの塩基配列をダイデオキシチェインターミネーション法(Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977) Sanger, F. et al.) 等により確認することで、本発明のＤＮＡを得ることができる。また、このように決定された塩基配列と上記部分アミノ酸配列を基に該ポリペプチドのアミノ酸配列を決定することもできる。
なお、ポリペプチドをコードする領域の塩基配列について、アミノ酸配列が異ならないように同一アミノ酸に対応する他のコドンとなるように塩基を置換して得たＤＮＡも本発明の範疇に含まれる。
【００３２】
そして、本発明のＤＮＡを用いて、例えば、以下の方法により、本発明のポリペプチドを得ることができる。
上記の方法で得られた、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、超音波処理、制限酵素処理または遺伝子工学の分野において知られたその他の方法により切り出し、適当なベクターに組み込む。このベクターを適当な宿主生物または細胞に移入することにより、形質転換体を得ることができる。この形質転換体を、該転換体に適した方法で飼育、培養することにより、多量のポリペプチドを安定して生産することができる。形質転換体の飼育、培養条件は、ポリペプチドを生産する範囲で適宜選定可能であるが、用いた宿主の生育に適した、遺伝子工学の分野で周知の条件を用いるとよい。そして、得られた飼育物または培養物から、遺伝子工学およびタンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、構成するアミノ酸の特徴から塩基性を示す故に酸付加により塩を形成する。たとえば無機酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）または有機カルボン酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸など）、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸等の酸性糖、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩類、アルギン酸等の酸性多糖、または有機スルホン酸（メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸など）との塩を形成する。本発明のポリペプチドは、これらの医薬として許容しうる塩として用いることができる。
【００３４】
本発明のポリペプチドをうがい薬、消毒薬、防腐剤および抗菌剤として用いる場合は、有効成分として、本発明のポリペプチドまたはその塩と、薬剤の投与方法および投与形態に応じて選択された薬学的に許容されうる担体とからなる組成物として調製される。すなわち、本発明のポリペプチドを有効成分とする、うがい薬、消毒薬、防腐剤および抗菌剤は、生体外部微生物感染部の治療又は消毒対象、あるいは生体内部微生物感染疾患に応じて、非経口的（外用、注射、座薬として）あるいは経口的に使用され、その使用方法に応じて適宜な薬物担体により、粉末、顆粒、注射用もしくは内服用液剤、錠剤、座剤、ベッサリー、軟膏、クリーム、エアゾールなどの製剤として調製することができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドを有効成分とする抗菌剤を、注射剤として直接、生体に投与する場合には、本発明のポリペプチドまたはその塩を生理食塩液に溶解し点滴又は静注により連続的又は間欠的に投与することができる。
さらに、本発明のポリペプチドは、従来知られているデフェンシンに類似したアミノ酸配列を含むので、創傷治癒効果も期待される。
【００３６】
本発明のポリペプチドの投与量は、その症状、性別、年令、投与方法によって異なるが、非経口的に投与する場合はうがい薬および抗菌剤等として成人、１人１日当りの 0.2〜20mgを上記投与方法によって数回に分けて投与または使用する。また経口的に投与する場合は、２〜200mg を数回に分けて投与するとよい。
【００３７】
次に、本発明の具体例を実施例を挙げて説明する。
【実施例１】
(1) カブトガニ血球内小顆粒画分の調製
タキプレウス・トリデンタツス (Tachypleus Tridentatus)の血リンパ液１００mlに0.002Mプロプラノロールを含む３％食塩水100ml を加え、15分間、氷冷下に放置後、４℃で遠心分離(150×ｇ、５分）して沈澱（血球細胞）を採取した。その沈澱を0.008Mトリス−塩酸緩衝液（0.001Mプロプラノロール、0.001MＰＭＳＦ及び0.75M ショ糖含有、p H7.4）20mlに懸濁し、静かに混合後、４℃で遠心分離(400×ｇ、15分）し、その上清に40USP 単位／mlになるようにヘパリンを添加後、４℃で遠心分離し(400×ｇ、10分）した。上層部の５ml（顆粒画分）を 1.5−2.4Mショ糖密度勾配液（0.008Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.4) 、ヘパリン（40ＵＳＰ単位／ml）及び 0.001M ＰＭＳＦ含有）８mlの上に加え、４℃で遠心分離（112,000 ×ｇ、30分）した。２つの層に分離されるが、そのうちの下の層を採取し、小顆粒画分を得た。
【００３８】
(2) 抗菌性ポリペプチドの調製
この小顆粒画分３mlにクロロホルム−メタノール（１：４）混液１mlを加え、遠心分離し、沈澱を得た。その沈澱に0.05M トリス−塩酸緩衝液（６M グアニジン及び0.002M  ＥＤＴＡ含有、pH8.0 ）を加え、超音波処理(10W、10秒）し、37℃、１時間加温後、遠心分離した。上清をあらかじめ0.1 ％(V/V) トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したTSK gel Phenyl 5PW-RP カラム（4.6 ×75mm、東ソー (株) ）に添加し、アセトニトリル濃度を16−48％(V/V) に連続的に上昇させる 0.1％ＴＦＡ溶液により、0.5ml ／分の流速で吸着したポリペプチドを溶出した。この際に溶出されるポリペプチドは214nm の紫外部吸収でモニターした。その結果を図１に示す。図１中のＳ５画分をあらかじめ 0.1％ＴＦＡで平衡化したTSK gel ODS120T カラム(4.6×150mm 、東ソー (株))に添加し、アセトニトリル濃度を０−80％(V/V) に連続的に上昇させる直線的濃度勾配法により、0.5ml ／分の流速で溶出し、精製Ｓ５画分（ポリペプチド）を得た。
このようにして得られたポリペプチドをSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけたところ、還元条件下で図２に示すように単一のパンドが得られ、その分子量は約 8,200であった。
【００３９】
【実施例２】
〔アミノ酸分析およびアミノ酸配列の決定〕
実施例１によって得られた精製ポリペプチドを、あらかじめ 0.1％(V/V) ＴＦＡで平衡化したTSKgel Phenyl5PW-RP (4.6×75mm) に添加した。次いで充分にカラムを洗浄した後、10分後に８％、15分後に16％、105 分後に48％、110 分後に80％までアセトニトリル濃度を連続的に上昇させた直線的濃度勾配法により、0.5ml ／分の流速で吸着したポリペプチドを溶出した。この際に溶出されるポリペプチドは 214nmの紫外部吸収でモニターし、ポリペプチド含量の高い部分を採取した。
このポリペプチドを6M塩酸で24、48及び72時間加水分解し、あるいは4Mメタンスルホン酸で加水分解し、アミノ酸組成を測定した。その結果を表１に示す。アミノ酸分析によるアミノ酸組成の測定値は〔式３〕のアミノ酸配列から計算されるアミノ酸組成の理論値とほぼ一致した。
【００４０】
【表１】
0003654667.tif 000006
a)5.7M塩酸で 110℃、24、48および72時間加水分解した結果の平均値。なおSer,Thr については、０時間への外挿値
b)ギ酸および過酸化水素を用い過ギ酸酸化した後、24時間加水分解しシステイン酸として測定
c)4Mメタンスルホン酸法により測定
【００４１】
また、このようにして得られたポリペプチドのアミノ酸配列を気相エドマン分解法（アプライド・バイオシステムズ社、477A使用）によって決定したところ次の〔式３〕に示されるとおりのアミノ酸配列（配列表、配列番号１）が得られた。
0003654667.tif 000007
【００４２】
【実施例３】
以下の実施例において、使用された装置および試薬は、下記のとおりである。中圧カラムクロマトグラフイー装置：  山善（株）  中圧分取液体クロマトグラフ  ＹＦＬＣ−6004−ＦＣ−６Ｒ型
同装置のカラム：  セッパック  Ｃ18（ウオーターズ社（米国））充填カラム
ペプチドシンセサイザ：  アプライド  バイオシステムズ社（米国） 430Ａ型
アミノ酸分析計：（株）日立製作所  日立高速アミノ酸分析計  Ｌ−8500型
Ｆmoc −アミノ酸：（株）ペプチド研究所  及び  渡辺化学工業（株）
固相合成用樹脂：（株）ペプチド研究所  及び  渡辺化学工業（株）
縮合剤：（株）ペプチド研究所、渡辺化学工業（株）及び（株）アプライドバイオシステムズ  ジャパン（株）
保護基脱離試薬：（株）ペプチド研究所  及び  渡辺化学工業（株）
セファデックス  Ｇ−10担体：ファルマシア  バイオテク（株）
【００４３】
次のポリペプチド〔式６〕の固相合成法による調製
【化１】
上記式中、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、ＡｓｐおよびＴｈｒは前記したアミノ酸残基を示し、３位と３４位、１０位と２８位および１４位と３３位Ｃｙｓ間の実線はジスルフイド結合を示す。
【００４４】
Ｎα−Ｆｍｏｃ基を除去した保護基保護化ペプチド−Ｗａｎｇ樹脂は、ペプチド自動合成機（ペプチドシンセサイザ：アプライド  バイオシステムズ社（米国））を用い、Ｆｍｏｃストラテジーによる固相合成法により調製した。合成過程及びそのコントロールには、アプライド  バイオシステムズ社（米国）の開発したＦａｓｔ  Ｍｏｃプログラムを使用した。このＦａｓｔ  Ｍｏｃプログラムは、迅速で高効率の縮合反応が進行するＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法を採用している。
１）出発原料（Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂）は、３７位保護アルギニンをオキシメチルフェノキシメチル樹脂（Ｗａｎｇ）樹脂に導入した市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（渡辺化学工業（株））を出発原料とした。
２）３６位セリンの導入；  １）のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（1.25ｇ、0.25mmol；  0.2mmol アルギニン／ｇ  Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂）及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ)(383mg 、1.00mmol；４等量）を反応ベッセル及びＦｍｏｃアミノ酸用カ−トリッジにそれぞれをとり、該ベッセル及び該カ−トリッジを上記ペプチド自動合成機に装着し、Ｆａｓｔ  Ｍｏｃプログラムにより自動合成操作を開始した。そのプログラムによる１サイクルの合成反応は、表２の操作条件のとおりである。
【００４５】
【表２】
0003654667.tif 000008
１サイクル所要時間：   55 分
１サイクル廃液容量：  160 ml
* ジイソプロピルエチルアミン
【００４６】
３）３５位〜１位のアミノ酸の導入；  以下同様にしてＣ端アミノ酸からの配列に従い順次Ｎα−Ｆｍｏｃ化のＡｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｖａｌ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｌys（Ｂoc）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）残基をＷａｎｇ樹脂に導入してほぼ１００％の収率でＮα−Ｆｍｏｃ基を除去した保護基保護化ペプチド- Ｗａｎｇ樹脂（３．３１ｇ）を得た。
【００４７】
４）脱保護基並びに脱樹脂操作と部分精製によるペプチドの調製；  前記１）〜３）の操作を経て調製したＮα−Ｆｍｏｃ基を除去した保護基保護化ペプチド樹脂は、次いで該樹脂100mg 当り１Ｍ- ＴＭＳＯＴｆ−チオアニソール／ＴＦＡ系（ｍ−クレゾール（100eq)、エタンジチオール（300eq)の存在するトリフルオロ酢酸10ml）で25℃２時間反応させた。反応混合液から樹脂を濾別し、トリフルオロ酢酸１mlにて２回洗浄し、濾液、洗液を合せたものに氷冷乾燥エーテル100ml を加え、生じた沈殿物を遠心し、残渣をデカンテーションにより上清から分離した。得られた残渣を、冷エーテルで洗浄後４Ｎ酢酸（ＡｃＯＨ）10mlに溶解し830mg 、80eqのジチオスレイトールを加え、室温で一夜撹拌した。
反応液を遠心し、上清をＳephadex Ｇ-10 (3.7×50cm）、４Ｎ  ＡｃＯＨでゲル濾過し、素通り画分である主溶出部分を集め、凍結乾燥して粉末状の部分精製未環化ポリペプチド〔式２〕を得た。
【００４８】
５）空気酸化によるポリペプチド〔式６〕の調製：  上記、部分精製未環化ポリペプチドの水溶液を濃アンモニア水にてpH7.5 に調整し、通気により空気酸化を行い環化反応を行った。空気酸化終了後環化ペプチドをダイアイオンＨＰ−20樹脂10ｇに吸着せしめ、次いで60％アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ)(１Ｎ  ＡｃＯＨ中）を用いて脱着溶出し、該溶出液を室温下減圧濃縮してＣＨ3 ＣＮを除去し、さらに凍結乾燥により粉末化した。
該粉末を少量の水に溶解し、その溶液をＳｅｐＰａｋ中圧カラム（24ｘ190mm)にかけ、アセトニトリル（ＣＨ3ＣＮ）のグラデイエント溶出(0.1％トリフルオロ酢酸水溶液中）により部分精製し(280nmの吸光度でモニター）、純度40−50％の目的フラクションを得た。該フラクションを集め、減圧濃縮、さらに凍結乾燥し粉末を得た。さらに、該粉末を少量の水に溶解し、その溶液をアサヒパックＯＤＰ−90カラム（2.15ｘ30cm）（旭化成工業（株））にかけ、ＣＨ3ＣＮのグラディエント溶出による高速液体クロマトグラフイー（東ソー（株）製  全自動高速液体クロマトグラフ  ＨＬＣ−8070型）で精製し、単一ピークの目的ペプチド〔式６〕を13％の収率（保護基保護化ペプチド樹脂から計算した値）で得た。
【００４９】
６）ポリペプチドの分析；
前記５）で精製されたポリペプチドを、Ｌｉｕらの（Liu 、T. Y. ら、J. Biol. Chem., 251 、1936（1976））方法に従い、0.2 ％トリプタミン含有  ４Ｍメタンスルホン酸で 115℃下24時間、酸加水分解し、そのアミノ酸組成を調べたところ、前記、〔式６〕のアミノ酸配列による組成の計算値とよく一致した。
また、下記条件下での分析的逆相高速液体クロマトグラフイー（（株）島津製作所  高速液体クロマトグラフ  ＬＣ−６ＡＤ型；  ＴＳＫ  ＯＤＳ−１２０Ｔ（0.46ｘ15cm）カラム及び  ＴＳＫ  ＯＤＳ−１２０Ｔガードカラム (0.32ｘ1.5cm)（東ソー（株）））で22.8分に単一ピークとして溶出した。
【００５０】
比較対照とした抗菌性ペプチドのタキプレシンＩ（Nakamura、H.ら、J. Biol.Chem.,263, 16709(1988)) は24.1分に、抗ＨＩＶ活性ペプチドのＴ22（Nakashima 、H.ら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36, 1249(1992))は、17.2に溶出した。
分析的逆相高速液体クロマトグラフイーの条件は、溶離液として10％ＣＨ3ＣＮを含む 0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）、80％ＣＨ3ＣＮを含む 0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（Ｂ液）の２液グラジエントで、１分後にＢ液０％、29.4分後にＢ液42％にするグラジエントを用い、カラム温度40℃、流速 0.8ml／分、検出波長220nm および280nm 、サンプルインジェクト量20μl(ペプチド濃度 0.1mg/ml)である。
【００５１】
【実施例４】
（抗菌活性の測定）
表３の各種微生物を、10mMリン酸緩衝液，pH7.0(低張液) に懸濁した菌液(5,000−10,000 CFU/ml) 900μl に、実施例１で得られたポリペプチド（20μg/ml）の２倍系列希釈液 100μl を加え、37℃で１時間インキュベートした後、100 μl を普通寒天培地に接種した。37℃で12時間培養した後、コロニー数を肉眼で計測した（参考文献  Infections and Immunity, 42, 10-14 (1983))。なお、ＣＦＵは、コロニー形成単位のことである。
結果を、表３に示す。表３から明らかなように本発明のポリペプチドは、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌のいずれに対しても強い抗菌活性を示した。
【００５２】
【表３】
0003654667.tif 000009
【００５３】
【実施例５】
50mMトリス−塩酸緩衝液，pH８に、実施例１で得られた精製ポリペプチド２mgとトリプシン（シグマ社）20μg を添加し、37℃で24時間インキュベートして分解し、ポリペプチド断片を得た。これを、あらかじめ0.06％(V/V) トリフルオロ酢酸で平衡化したＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ５Ｃ４（ＹＭＣ社）カラム(4.6×150mm)に負荷し、アセトニトリル濃度を５分後に０％、55分後に80％(V/V) まで連続的に上昇させた 0.052％トリフルオロ酢酸溶液により、0.5ml ／分の流速で吸着したポリペプチド断片を溶出した。この際溶出されるポリペプチド断片は210nm の紫外部吸収でモニターし、ペプチド含量の高い部分であった溶出時間27分および47.6分の画分をおのおの採取することで、２つのポリペプチド断片を得た。以下、該断片をそれぞれポリペプチド断片Ｔ３、Ｔ６と呼ぶことがある。
このようにして得られた２つのポリペプチド断片をそれぞれ、5.7M塩酸、110 ℃で24時間加水分解しアミノ酸組成を測定した。その結果を表４に示す。アミノ酸分析から、ポリペプチド断片Ｔ３およびＴ６のアミノ酸組成の測定値は、〔式４〕および〔式５〕（配列表、配列番号３および４）のアミノ酸組成から計算されるアミノ酸の理論値とほぼ一致した。
【００５４】
【表４】
0003654667.tif 000010
【００５５】
【実施例６】
（抗菌活性）
10mMリン酸緩衝液，pH7.0 に懸濁した、 Escherichia coli (10000 CFU/ml) 450 μl に、実施例５で得られたポリペプチド断片Ｔ3(〔式４〕のポリペプチド）、ポリペプチド断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）、実施例１で得られたポリペプチド（いずれも40μg/ml）および対照として10mMリン酸緩衝液，pH7.0 を各々50μl 加え、37℃で１時間インキュベートした後、100 μl を普通寒天培地に接種した。37℃で12時間培養した後、コロニー数を肉眼で計測した。この結果、 Escherichia coliの生育を、対照に比べ、ポリペプチド断片Ｔ3(〔式４〕のポリペプチド）は約90％、ポリペプチド断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）は約20％、および実施例１のポリペプチドは約95％以上阻害した。
また、10mMリン酸緩衝液，pH 7.0に懸濁した、Staphylococcus aureus (5000CFU/ml)450μl に、実施例５で得られたポリペプチド断片Ｔ３（〔式４〕のポリペプチド）、ポリペプチド断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）、実施例１で得られたポリペプチド（いずれも40μg/ml）および対照として10mMリン酸緩衝液，pH 7.0を各々50μｌを加え、37℃で１時間インキュベートした後、100 μl を普通寒培地に接種した。37℃で12時間培養した後、コロニー数を肉眼で計測した。この結果、Staphylococcus aureusの生育を、対照に比べ、ポリペプチド断片Ｔ３（〔式４〕のポリペプチド）は約３０％、ポリペプチド断片Ｔ6(〔式５〕のポリペプチド）は約70％、および実施例１のポリペプチドはほぼ完全に阻害した。
これらの結果から明らかなように、本発明の上記のポリペプチド断片は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌に、強い抗菌活性を示すが、特に、ポリペプチド断片Ｔ３（〔式４〕のポリペプチド）はグラム陰性菌である Escherichia coliに対して、またポリペプチド断片Ｔ６（〔式５〕のポリペプチド）はグラム陽性菌である、Staphylococcus aureusに対して、強い抗菌活性を示した。
【００５６】
【実施例７】
〔ポリペプチドをコードするＤＮＡの採取〕
１．オリゴヌクレオチドの合成
実施例２で決定したアミノ酸配列中のHis-Glu-Tyr-Val-Asp-Thr （配列表、配列番号１、アミノ酸番号５９〜６４）をアンチセンスに逆翻訳し、さらに５′末端側に制限酵素（ＥｃｏＲＩ）認識配列とＤＮＡの保護のための２塩基を付けた２５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドの混合物をＤＮＡシンセサイザー３８０Ａ（アプライド  バイオシステムズ  ジャパン（株））を用いて合成した。
0003654667.tif 000011
ここに示すオリゴヌクレオチドは、His-Glu-Tyr-Val-Asp-Thr から逆翻訳した塩基配列に相補的な配列の全ての可能性を包括している（但し、Thr に対するコドンに相補的な塩基配列（ 3'-TG(T/G/C/A)-5'）の５’末端のヌクレオチド(T/G/C/A) は除かれている）。
【００５７】
２．ポリペプチドをコードするmRNAを含む poly(A)+RNA の調製
本発明のポリペプチドはカブトガニ血球より精製されることから、 poly(A)+ RNA はカブトガニ血球より単離した。
（１）全ＲＮＡの調製
カブトガニ血球11.8ｇよりAGPC法 (実験医学Vol.9, p1937〜1940を参照) を用いて、全RNA 約11mgを分離した。
（２） poly(A)+ RNA の調製
分離した全RNA のうち約2mg の全RNA よりOligotex-dT 30 Superキット（日本ロシュ（株））を用いて poly(A)+ RNA を単離した。さらに、一度単離したpoly (A)+ RNA は、より純度を高めるために、同様の操作をもう一度繰り返した。このように２度のOligotex-dT 30 Superキットの操作により、2 mgの全RNA から34.5μｇの高純度の poly(A)+ RNA を得た。
【００５８】
３．カブトガニ血球ｃＤＮＡのライブラリーの作製
（１）ｃＤＮＡの合成
前記２で得た poly(A)+ RNA からGIBCO BRL 社の SUPERSCRIPTTMチョイスシステム（商品名）を利用し、ｃＤＮＡを合成した。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）で合成したｃＤＮＡからGIBCO BRL 社のλＺＩＰＬＯＸ，ＥｃｏＲＩアーム（商品名）とラムダパッケージングシステム（商品名）を用いて、カブトガニ血球由来λＺＩＰＬＯＸ ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００５９】
４．ポリペプチドのｃＤＮＡクローニング
Seki N.(J.Biol.Chem.269,1370-1374(1994))らが調製したλgt10 cDNAライブラリーより調製したファージＤＮＡを鋳型とし、プライマーとして二種のオリゴヌクレオチド、すなわち前記１で合成したオリゴヌクレオチドとファージベクターλgt10のＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列周辺と同じ配列(3'-ATGGGACCTTCTTTATGAGTAT-5')の合成オリゴヌクレオチドを用いて、PCR 法(Saiki,R.K. et al., Science, 239,487-491,(1988))を行い、〔式３〕のポリペプチドの一部をコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。このＤＮＡフラグメントは Ready-to-GoTM DNAラベリングキット（ファルマシア  バイオテク（株））を用いて[ α−32Ｐ]dCTP で標識した。次いでこの標識化ＤＮＡフラグメントをプローブとして、前記３.(２）で作製したλＺＩＰＬＯＸ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、最長の581bp のインサートｃＤＮＡを含むポジティブクローンを得、このインサートｃＤＮＡの塩基配列を解析した。
【００６０】
５．ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ塩基配列の決定
前記４．で得られたポジティブクローンを、λＺＩＰＬＯＸ，ＥｃｏＲＩアームの添付文書に従い、添付されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ（ＺＩＰ）に感染させ該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを得た。このインサートのｃＤＮＡの全塩基配列を決定するため、ｃＤＮＡ断片上の制限酵素認識部位ならびにキロ−シークエンスデレーションキット（宝酒造（株））を用いたデレーションによるサブクローニングを行った。上記方法により作製したクローンのｃＤＮＡの塩基配列をDNA シークエンサー373A（アプライド  バイオシステムズジャパン（株）(ABI社) ）を用いて決定した。この際、シークエンシングプライマーとしては、ポジティブクローンから得たインサートｃＤＮＡを含むプラスミドが、Ｍ１３系プラスミドであることからABI 社のユニバーサルプライマーおよびＭ１３リバースプライマーの塩基配列を模した合成オリゴヌクレオチド（5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'、5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'）ならびに〔式３〕のポリペプチドのアミノ酸配列中のArg-Ala-Ser-Ser-Asp-Asn の配列を逆翻訳した合成オリゴヌクレオチド（5'-CGAGCCTCTTCTGATAAC-3'）を用いた。
このように決定した該ポリペプチドのｃＤＮＡの塩基配列、ならびにそれより明らかにされたアミノ酸配列を配列番号５の配列表に示した。このアミノ酸配列中に、実施例２で決定したアミノ酸配列（配列番号：１）が全て含まれており、今回塩基配列を決定したインサートｃＤＮＡは該ポリペプチドを確かにコードしていた。
【００６１】
【実施例８】
（製剤例）
（１）外傷薬
１ｇクリーム
実施例１のポリプペプチド                        １０ｍｇ
モノステアリン酸ソルビタン                        ７ｍｇ
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン      ７ｍｇ
パルミチン酸イソプロピル                        ３７ｍｇ
ワセリン                                        ３７ｍｇ
流動パラフィン                                  ３７ｍｇ
セタノール                                      ５０ｍｇ
グリセリン                                      ７０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ２ｍｇ
に精製水を加えて１ｇのクリームとした。
（２）内服薬
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上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。
【００６２】
【配列表】
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【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１によるTSK gel Phenyl 5PW-RP カラムから本発明のポリペプチドをアセトニトリル濃度勾配法により溶出する図を示す。
【図２】実施例１より得られる本発明のポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）を示す。左側は本発明のポリペプチド、右側はマーカーを示す。マーカーはLMW Kit １（ファルマシアバイオシステムズ (株) ）を使用した。
【図１】
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【図２】
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