(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式〔Ｉ〕で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも一つ以上の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
0003664735.tif 000017
【請求項２】
抗ヒト後天性免疫不全ウイルス剤、又は抗Ｃ型肝炎ウイルス剤である請求の範囲１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
ヒト用抗ウイルス剤、非ヒト動物用抗ウイルス剤又は植物用抗ウイルス剤である請求の範囲１記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
家畜、家禽、魚類又はエビ類用抗ウイルス剤である請求の範囲３記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
本発明は、抗ウイルス作用により、病原生物に対し有用な医薬及び飲食品に関する。
従来の技術
抗ウイルス作用を考える場合、細胞へのウイルス感染の阻害、感染細胞でのウイルスの増殖の阻害等のウイルス抵抗能を誘導する作用、ウイルス感染した細胞を選択的に死滅させる作用、及びウイルス自身を不活化する（感染力をなくす）作用が考えられる。
ウイルス自身を不活化する作用を持つものとしてウイルスに対する中和抗体がある。またこのような抗体を誘導する方法としてワクチンがある。しかし、ワクチン投与による抗体誘導は、ウイルス感染の予防には効果的であるが、現時点では抗体を用いる効果的な治療法はあまりない。更に、ウイルスを直接不活化する薬剤による効果的な治療法もない。
ウイルス抵抗能を誘導する作用としては、ウイルスゲノムの複製阻害、ウイルス遺伝子の転写阻害、ウイルスタンパクの合成阻害、ウイルスタンパクのホールディング阻害等が考えられる。このような作用を誘導するには、細胞内の転写因子の活性あるいは発現の抑制、ウイルス由来の転写因子の活性あるいは発現の抑制、熱ショックタンパクの誘導等がある。このような作用を誘導するものとして、プロスタグランジンが挙げられる。
またウイルス感染細胞を選択的に死滅させるものとしては、抗ヘルペスウイルス薬として用いられているアシクロビル、ガンシクロビル、ソリブジン等がある。
発明が解決しようとする課題
ウイルスに対しては、単独の作用で対処するより、複合的作用で対処した方が効果的である。例えば、ウイルス感染細胞を選択的に死滅させる物質を投与しても、感染細胞が死に至るまでの間に、ウイルスが産生され他の細胞に感染するため、ウイルスを完全に除去するのは非常に困難である。一方、ウイルス抵抗能を誘導する作用を持った物質を投与しても、感染細胞を除去することはできない。
本発明の目的は、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能、及びウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物を開発し、該物質を有効成分とする抗ウイルス剤、肝機能改善剤、熱ショックタンパク誘導剤、がん遺伝子発がん防止剤、化学発がん抑制剤等の医薬品、及び抗ウイルス用食品又は飲料を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らはかかる目的を達成するために鋭意検討した結果、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物を作用させると、ウイルス感染細胞が選択的に傷害を受け、なおかつ死に至るまでに産生されるウイルス量が減少すること、またそのため、感染細胞が死に至るまでに産生されたウイルスに新しく感染する細胞も減少すること、更に、ウイルス未感染の細胞もこの化合物の投与により前もってウイルス抵抗能を獲得しているため、新しく感染してもウイルスの増殖が抑制されること、すなわち、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物は、ウイルスの除去、例えばヒト後天性免疫不全ウイルス、又はＣ型肝炎ウイルスの除去に極めて効果的であることを見出した。
本発明において使用する化合物の細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能は、ウイルス感染前の細胞に化合物を作用させた後、ウイルスの細胞への感染阻害、ウイルスゲノムの複製阻害、ウイルス遺伝子の転写阻害、ウイルスタンパクの合成阻害、ウイルスタンパクのホールディング阻害等を指標として測定することができる。
またウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能はウイルス感染細胞と非感染細胞の生存率を比較することにより測定することができる。
細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物としては、該両機能を有すれば良く何ら限定はない。
そして、本発明者らは、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物として、式〔Ｉ〕で表される化合物、４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（以下、単にシクロペンテノンと称す）若しくはその光学活性体又はその塩を見出し、発明を完成させた。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下記式〔Ｉ〕で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも一つ以上の化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤に関する。
0003664735.tif 000002
本発明の第２の発明は式〔Ｉ〕で表される４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも一つ以上の化合物を含有することを特徴とする抗ウイルス用食品又は抗ウイルス用飲料に関する。
本発明の好ましい態様において、ウイルスとしてはヒト後天性免疫不全ウイルス、又はＣ型肝炎ウイルスが例示される。また抗ウイルス剤としてはヒト用抗ウイルス剤、非ヒト動物用抗ウイルス剤（例えば家畜、家禽、魚類又はエビ類用抗ウイルス剤）、又は植物用抗ウイルス剤が例示される。
【図面の簡単な説明】
図１はＣＥＭ−ＳＳ細胞を用いた場合のシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図である。
図２はＨ９細胞を用いた場合のシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図である。
図３はＣＥＭ−３Ｂ細胞を用いた場合のシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図である。
図４はＨ９−３Ｂ細胞を用いた場合のシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図である。
図５はシクロペンテノンの発がん抑制作用を示す図である。
図６は（−）体シクロペンテノンのｐ−ジメチルアミノベンゾイル誘導体のＣＤ及び（−）体シクロペンテノンの立体構造を示す図である。
図７は（＋）体シクロペンテノンのｐ−ジメチルアミノベンゾイル誘導体のＣＤ及び（＋）体シクロペンテノンの立体構造を示す図である。
発明の実施の形態
本発明において使用する式〔Ｉ〕で表されるシクロペンテノンは、４位と５位のヒドロキシル基の立体配置がシスの異性体とトランスの異性体の双方を包含する。本発明においてはシス体シクロペンテノンを用いても良いし、トランス体シクロペンテノンを用いても良いし、シス体シクロペンテノンとトランス体シクロペンテノンの混合物を用いても良い。また、これらの光学活性体を用いても良い。
シス体シクロペンテノンは化学合成法によって得られる〔ヘルベチカ  キミカ  アクタ（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ）、第５５巻、第２８３８〜２８４４頁（１９７２）〕。トランス体シクロペンテノンは化学合成法によっても得られるし〔カーボハイドレート  リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．）、第２４７巻、第２１７〜２２２頁（１９９３）〕、またウロン酸、例えばグルクロン酸、ウロン酸誘導体、例えばグルクロノラクトン、又はこれらの含有物等を加熱処理することによっても得られる（ＰＣＴ／ＪＰ９７／０３０５２号明細書参照）。本発明ではシクロペンテノンを含有するこれらの加熱処理物、その部分精製物及び精製物が使用できる。
例えば、ウロン酸としてＤ−グルクロン酸を使用し、その１％溶液を１２１℃で４時間加熱処理することにより、加熱処理物中にシクロペンテノンが生成される。この加熱処理物中のシクロペンテノンを溶媒で抽出し、抽出物を濃縮する。次にこの濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、溶出するシクロペンテノン画分を濃縮し、濃縮物からシクロペンテノンをクロロホルムで抽出し、抽出濃縮物の順相カラムクロマトグラフィーを行うことにより、加熱処理物中のシクロペンテノンが単離される。
シクロペンテノンの物性を下記に示す。なおシクロペンテノンの質量分析はＤＸ３０２質量分析計（日本電子社製）を用いて行った。また、重クロロホルム溶媒を用いたＮＭＲスペクトルの測定はＪＮＭ−Ａ５００（日本電子社製）を用いた。比旋光度はＤＩＰ−３７０型旋光計（日本分光社製）、ＵＶ吸収スペクトルはＵＶ−２５００分光光度計（島津製作所社製）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）はＦＴＩＲ−８０００赤外分光光度計（島津製作所社製）をそれぞれ用い測定した。
ＭＳ  ｍ／ｚ  １１５〔Ｍ＋Ｈ〕+
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）
δ４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，５−Ｈ）、４．８３（１Ｈ，ｍ，４−Ｈ）、６．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，６．１Ｈｚ，２−Ｈ）、７．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，６．１Ｈｚ，３−Ｈ）
但し、1Ｈ−ＮＭＲの化学シフト値はＣＨＣｌ3の化学シフト値を７．２６ｐｐｍとして表した。
旋光度：〔α〕D20０°（ｃ１．３、水）
ＵＶ：λｍａｘ  ２１５ｎｍ（水）
ＩＲ（ＫＢｒ法）：３４００、１７１５、１６３０、１１１５、１０６０、１０２５ｃｍ-1に吸収を有する。
単離されたシクロペンテノンを光学分割することにより、（−）−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン及び（＋）−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オンを得ることができる。当然、合成方法により得られたシクロペンテノンも光学分割することができる。
例えば、シクロペンテノンをエタノールに溶かす。このエタノール溶液にヘキサン／エタノール（94/6）を更に加え、シクロペンテノン溶液を調製する。この試料溶液を、例えばキラールパックAS（ダイセル化学工業）カラムを用いカラム温度：４０℃、移動相：ヘキサン／エタノール（94/6）でＨＰＬＣを行うことにより、シクロペンテノンを光学分割することができる。
分割された（−）−トランス−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン〔以下、（−）体シクロペンテノンと称する〕の旋光度は〔α〕D20−１０５°（ｃ0.30、エタノール）であり、（＋）−トランス−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン〔以下、（＋）体シクロペンテノンと称する〕の旋光度は〔α〕D20＋１０４°（ｃ0.53、エタノール）である。なお旋光度は前記のＤＩＰ−３７０型旋光計（日本分光社製）を用いて測定した。
次に（−）体シクロペンテノン及び（＋）体シクロペンテノンのそれぞれの質量分析、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）による構造解析、ＵＶ吸収スペクトルの測定、赤外吸収スペクトルの測定を上記記載の方法に準じ行う。その結果、両光学活性体は光学分割前のシクロペンテノンと同一の結果を示す。
光学分割された（−）体シクロペンテノン及び（＋）体シクロペンテノンをそれぞれｐ−ジメチルアミノベンゾイル誘導体とし、Ｊ−７２０型円二色性分散計（日本分光社製）を用い、円二色性スペクトル（ＣＤ）を測定し、その結果をジベンゾエートキラリティルールに適用し［ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティ（J．Am．Chem．Soc．）、第９１巻、第３９８９〜３９９１頁（１９６９）］、その立体配置を決定した。
（−）体シクロペンテノンのｐ−ジメチルアミノベンゾイル誘導体のＣＤ及び（−）体シクロペンテノンの立体構造を図６に示す。図中縦軸はモル円二色性、横軸は波長（ｎｍ）を示す。なお、上記立体構造を、式〔II〕として下記に示す：
0003664735.tif 000003
（＋）体シクロペンテノンのｐ−ジメチルアミノベンゾイル誘導体のＣＤ及び（＋）体シクロペンテノンの立体構造を図７に示す。図中縦軸はモル円二色性、横軸は波長（ｎｍ）を示す。なお、上記立体構造を、式〔III〕として下記に示す：
0003664735.tif 000004
図６、７及び式〔II〕、式〔III〕に示すように（−）体シクロペンテノンは（−）−（４Ｒ，５Ｓ）−トランス−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン、（＋）体シクロペンテノンは（＋）−（４Ｓ，５Ｒ）−トランス−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オンである。
以上、本発明に使用するシクロペンテノン又はその光学活性体はいかなる方法で製造しても良く、明細書で開示の方法で製造しても良く、化学合成方法で合成しても良く、シクロペンテノンのトランス体、シス体及びそれらの混合物も本発明に使用される。当然、化学合成法で得られたシクロペンテノンの光学活性体も本発明で開示の光学活性体に包含される。
シクロペンテノン又はその光学活性体の塩としては、医薬として許容される塩があり、公知の方法にて変換することができる。
本発明で使用する、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は抗ウイルス作用を有し、これらの化合物から選択される少なくとも１つの化合物を有効成分として抗ウイルス剤を作製することができる。
すなわち細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば抗ウイルス剤を製造することができる。抗ウイルス剤の製造は一般的には、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン、若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも１以上の化合物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤であることができる。またこれを使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
医薬用担体は、上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分である細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製される。
本発明の抗ウイルス剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。
抗ウイルス剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有される細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の物の量が成人１日当り０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を抗ウイルス剤、抗ウイルス用食品又は飲料の原料として用いても良い。
本発明で使用する、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、及びウイロイドに対して抗ウイルス活性を示す。
従って、ヒト用抗ウイルス剤、非ヒト動物用抗ウイルス剤、例えば家畜、家禽、養殖動物、例えば魚類、エビ類等のウイルス病に有効な抗ウイルス剤、植物用抗ウイルス剤、例えば花卉類、野菜類等の農園芸作物のウイルス病に有効な抗ウイルス剤等、有用生物用の抗ウイルス剤として使用することができる。
動物に感染するＤＮＡウイルスとしては例えばポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン−バールウイルス、バキュロウイルスが挙げられ、植物に感染するＤＮＡウイルスとしては例えばカリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。動物に感染するＲＮＡウイルスとしては例えばロタウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、ジステンパーウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ヒトポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスが挙げられ、植物に感染するＲＮＡウイルスとしては例えばタバコモザイクウイルス、麦類矮小ウイルス、イネ縞葉枯ウイルス、タバコ輪点ウイルスが挙げられる。レトロウイルスとしては例えば成人Ｔ細胞白血病ウイルス、ヒト後天性免疫不全ウイルスが挙げられ、ウイロイドとしては例えばジャガイモスピンドルチューバーウイロイドが挙げられる。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は非ヒト哺乳動物、鳥、例えばニワトリ及び七面鳥、冷血動物、例えば魚のウイルス病の治療及び予防に有効であり、これらの化合物は下記の非ヒトウイルスに対して抗ウイルス活性を示す。サイルイド、ヘルペスウイルス１型、カプリド  ヘルペス１型、ラガモルフ  ヘルペスウイルス１型、ファシアニド  ヘルペスウイルス１型、ファシアニド  ヘルペスウイルス２型、ターキー  ヘルペスウイルス１型、アナチドヘルペスウイルス１型、キャット  フィッシュ  ヘルペスウイルス１型、エクイド  ヘルペスウイルス３型、ボビド  ヘルペスウイルス１型、ボビド  ヘルペスウイルス３型、ボビド  ヘルペスウイルス４型、ピッグ  ヘルペルウイルス１型、ピッグ  ヘルペスウイルス２型、ミュリッド  ヘルペスウイルス１型、セピド  ヘルペスウイルス１型、セピド  ヘルペスウイルス２型、ツパイード  ヘルペスウイルス１型、カニン  ヘルペスウイルス１型、ヒライン  ヘルペスウイルス１型、エクイド  ヘルペスウイルス１型、エクイド  ヘルペスウイルス２型。
本発明の抗ウイルス剤を鳥類に注射するか又は飼料若しくは飲料水に添加する等の獣医術、飼育術において周知の方法によって、マーレック氏病等の鳥類のウイルス性疾患が本発明に使用する化合物によって、予防及び／又は治療される。またプール、水槽、保持タンク又は飼育領域の水、海水等に直接、本発明に使用する化合物を添加するか、又は飼料中に本発明に使用する化合物を混合して、ヘルペス類ウイルス、例えばプチナマズウイルス、ヘルペス−ウイルス  ソロモンス、ナーカ  ウイルス等のウイルス感染によるプール、水槽、保持タンク又は飼育領域中の狭い区域に棲息する魚のウイルス病、例えばサケ科魚類の伝染性造血器壊死病、ヘルペスウイルス感染症又は伝染性膵臓壊死病、ニジマスのウイルス性出血性敗血症、コイの春ウイルス病、種々の魚のリンホシスチス病、海産魚・遡河魚のウイルス性赤血球壊死病、ヒラメ等のラブドウイルス病、ブリ稚魚等のウイルス性膵肝壊死病、トラフグ等の口白病等を同様に予防及び／又は治療し得る。なお本発明に使用する化合物、本発明の抗ウイルス剤を投与するに当っての正確な規制は、必然的に治療されている個々の被検体に関する必要性、治療の種類及び飼育者の判断次第である。
本発明の抗ウイルス剤が投与された非ヒト動物はその健康保持により、生存率、成長率、産卵率等の改善が顕著である。
本発明で使用する、細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はこれらのウイルスタンパクの合成を抑制し、ウイルスゲノムの合成も抑制することにより、強い抗ウイルス作用を示す。またこれらのウイルス感染細胞を選択的に死滅させる。
例えばヒト後天性免疫不全ウイルス（以下HIVと略記する）の感染患者においても、すべてのCD4陽性細胞にHIVが感染しているのではなく、一部の細胞にのみ感染している。本発明の抗ウイルス剤は、この感染細胞のHIV増殖を抑制しながら選択的に感染細胞を死滅させ、未感染細胞にウイルス抵抗能を誘導し、細胞からのHIVの除去が可能となる。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は上記抗ウイルス作用のほか、肝機能改善作用、熱ショックタンパク誘導作用を有し、シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物を有効成分とする肝機能改善剤や熱ショックタンパク誘導剤を、上記抗ウイルス剤に準じ、製剤化することができ、抗ウイルス剤に準じた方法で投与することができる。
肝機能改善剤や熱ショックタンパク誘導剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが一般には製剤中に含有されるシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物の量が成人１日当り０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。またシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物物を肝機能改善用飲食品、熱ショックタンパク誘導用飲食品の原料として用いても良い。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を摂取することにより、肝機能障害も改善され、ＧＯＴ、ＧＰＴ値が正常化する。
またシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩は７０ｋダルトン（ＨＳＰ７０）等の熱ショックタンパク誘導活性を有し、肝炎ウイルス、エイズウイルス、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ヘルペスウイルス等のＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルスに対する抗ウイルス作用を有する。また、熱ショックタンパクはがん免疫に関与しており、また生体防御作用をも有する。シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を摂取することにより、インフルエンザウイルスによる風邪疾患等のウイルス性疾患が予防、治療できる。
なお熱ショックタンパクは細胞や個体が平常の温度よりも５〜１０℃程度高い温度変化を急激に受けたときに合成が誘導されるタンパクの総称であり、原核生物から高等真核生物まで幅広く分布している。真核生物の熱ショックタンパクとしてはＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ユビキチン、ＨＳＰ２６等が知られている。その中でＨＳＰ７０は分子シャペロンの一種であり、フォールディングが完了していない、または不完全にフォールディングしたタンパクに結合して立体構造の形成を助ける。熱ショックタンパクのアミノ酸配列は進化の過程でよく保存されており、ＨＳＰ７０は大腸菌のＤｎａＫタンパクと相同である。ヒトには約１０個のＨＳＰ７０遺伝子が存在しているが、これらのあるものは構成的に発現しており、あるものは様々な刺激によって誘導される。熱ショックタンパクの合成は熱ショックのほかに様々な化学物質、酸化ストレス等の細胞障害によっても誘導される。
Ｃ．アミチら（C．Amici）ら〔ジャーナル  オブ  ビロロジー（Journal of Virology）、第６８巻、第6890〜6899頁（1994）〕は、α，β−不飽和カルボニルを持つプロスタグランジンＡ1の存在下でセンダイウイルスを感染させた動物細胞を培養するとＨＳＰ７０とＨＳＰ９０の合成が誘導され、ＨＳＰ７０の合成が誘導されている間はウイルスタンパクの合成が抑制されることを報告している。また、Ａ．ロッシ（A．Rossi）ら〔ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（The Journal of Biological Chemistry）、第２７１巻、第32192〜32196頁（1996）〕は、２−シクロペンテノン−１−オンがプロスタグランジンＡ1と同様にＨＳＰ７０の合成を誘導し、水疱性口内炎ウイルスタンパクの合成を抑制することを報告している。
本発明で使用するシクロペンテノンによるＨＳＰ７０誘導能は１０μＭでみられ、２０〜３０μＭで最大となるが、これは２−シクロペンテノン−１−オンがＨＳＰ７０を誘導するには数百μＭの濃度を要することと比較すると極めて高い誘導能であるといえる。これはプロスタグランジンＡ1によるＨＳＰ７０誘導能に匹敵するものであり、シクロペンテノンの分子量がプロスタグランジンＡ1の３分の１以下であるので重量濃度で比較するとプロスタグランジンＡ1よりも高い誘導能を持つといえる。
本発明で使用するシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はこのように高い熱ショックタンパク誘導作用を持つことから、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、レトロウイルス、及びウイロイドに対して抗ウイルス活性を示す。これらのウイルス、ウイロイドには上記の各ウイルス、ウイロイドが例示される。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はがん遺伝子で形質転換されたがん細胞に対しても増殖抑制活性を有し、がん遺伝子による発がんを防止する作用を有する。
例えばパピローマウイルスはパポバウイルス科（papovaviridae）、パピローマウイルス属（papillomavirus）のDNAウイルスであり、ヒトパピローマウイルス（HPV）としては、例えば子宮頚がんなどの原因となるHPV16型が知られている。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はHPV16型のがん遺伝子E7によってがん化した細胞に対し、増殖抑制効果を有し、シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物を有効成分として、ウイルス発がん細胞増殖抑制剤を提供することができ、がん遺伝子による発がんを防止することができる。
またシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩はイニシエーターとプロモーターによる２段階発がんの抑制作用を有し、これらの化合物から選択される少なくとも一つの化合物を有効成分として、化学発がん抑制剤を提供することができる。
したがってシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物を含有する発がん予防用食品又は発がん予防用飲料を提供することができる。
シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも一つの化合物を有効成分として含有するがん遺伝子発がん防止剤又は化学発がん抑制剤は抗ウイルス剤に準じ、製剤化することができ、抗ウイルス剤に準じた方法で投与することができる。
本発明の抗ウイルス用食品又は抗ウイルス用飲料の製造においては細胞にウイルス抵抗を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を使用することができる。またシクロペンテノンを含有するウロン酸の加熱処理物、該加熱処理物からの部分精製シクロペンテノン及び精製シクロペンテノンを使用することができる。
また肝機能改善作用、熱ショックタンパク誘導作用、発がん予防作用等を有する作用発現用食品又は作用発現用飲料の製造においても、シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩、シクロペンテノンを含有する加熱処理物、該加熱処理物からの部分精製シクロペンテノン及び精製シクロペンテノンを使用することができる。
すなわちこれらのシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩、シクロペンテノンを含有する加熱処理物、該加熱処理物からの部分精製シクロペンテノン及び精製シクロペンテノンから選択される原料を希釈及び／又は添加して、製造される食品又は飲料は本発明の抗ウイルス用食品又は飲料に包含される。
本発明の抗ウイルス用食品又は抗ウイルス用飲料の製造法は、特に限定はないが、調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品又は飲料に、細胞にウイルス抵抗を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物の有効量が含有されていれば良い。
本発明の抗ウイルス用食品又は抗ウイルス用飲料としては、細胞にウイルス抵抗を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物が含有、添加及び／又は希釈されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状、ゲル状、ゾル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
また肝機能改善用、熱ショックタンパク誘導用、発がん予防用食品又は肝機能改善用、熱ショックタンパク誘導用、発がん予防用飲料としては肝機能改善作用、熱ショックタンパク誘導作用、発がん予防作用を有するシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される１以上の化合物が含有、添加及び／又は希釈されていれば特にその形状に限定は無く、タブレット状、顆粒状、カプセル状、ゲル状、ゾル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
本発明の食品又は飲料は生理活性を有するシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を含有し、これらの化合物の有する種々の生理活性、抗ウイルス作用、肝機能改善作用、熱ショックタンパク誘導作用、発がん予防作用等によって、これらを摂取することによりウイルス性疾患予防、治療、肝機能改善効果、発がん予防効果等を有する健康食品又は飲料であり、生体の恒常性の維持に有用な食品又は飲料である。
本発明で使用する化合物はその生理活性の有効量の投与を行っても毒性は認められず、例えば経口投与の場合シクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩のいずれかを１００ｍｇ／ｋｇでラットに単回投与しても死亡例は認められない。
以上、本発明の薬剤はウイルス性疾患、肝疾患、がん等の治療剤又は予防剤として用いることができ、特にHIVが惹起する後天性免疫不全症候群の治療、症状改善に有用である。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味する。
参考例１
１０ｇのＤ−グルクロン酸（シグマ社製  Ｇ  ５２６９）を１リットルの水に溶解し、１２１℃で４時間加熱した後約１０ｍｌになるまで減圧下濃縮した。これに酢酸ブチル：酢酸：水＝３：２：２混合液の上層４０ｍｌを加えて混合後、遠心によって得た上清を減圧下約１０ｍｌまで濃縮した。
上記抽出液をカラムクロマトグラフィー用シリカゲルＢＷ−３００ＳＰ（２×２８ｃｍ、富士シリシア化学社製）にアプライし、酢酸ブチル：酢酸：水＝３：２：２の上層を溶離液としてコンプレッサーで０．２ｋｇ／ｃｍ2に加圧し、毎分５ｍｌの流速で分離を行った。１画分当り１０ｍｌになるようにフラクショネーションを行い、各画分の一部をとって薄層クロマトグラフィーで分析したところ６１番から８０番までの画分に高純度のシクロペンテノンが含まれていた。これらの画分を集めて減圧下濃縮した後４０ｍｌのクロロホルムで抽出し、抽出液を減圧下濃縮することによって１００ｍｇのシクロペンテノンを得た。
この画分をパルパックタイプＳカラムを用いた順相ＨＰＬＣで分離し、２１５ｎｍの紫外線吸収で検出したところ、純度は９８％であった。
上記シクロペンテノン１１３．９ｍｇをエタノール２．８５ｍｌに溶かした。このエタノール溶液にヘキサン／エタノール（94/6）３．８５ｍｌを更に加え、１７ｍｇ／ｍｌのシクロペンテノン溶液を調製した。この液を０．５μｍのフィルターでろ過し、光学分割HPLC試料溶液とした。
この試料溶液を以下の条件で光学分割HPLCを行い、前ピークの（−）体シクロペンテノン及び後ピークの（＋）体シクロペンテノンのフラクションをそれぞれ集め、減圧乾固し、（−）体シクロペンテノン43.2mg、（＋）体シクロペンテノン４３．０ｍｇをそれぞれ得た。
光学分割HPLC条件
カラム：キラールパックAS（ダイセル化学工業）2.0cm×25.0cm
カラム温度：40℃
移動相：ヘキサン／エタノール（94/6）
流速：14.0ml/min
検出：UV 210nm
試料注入量：150μl（2.55mg）
得られた（−）体シクロペンテノン及び（＋）体シクロペンテノンは両者共に約１％のエナンチオマーを含有していたため再度上記の条件で光学分割した。その結果、前ピークの（−）体シクロペンテノン３０．０ｍｇから１９．７ｍｇのエナンチオマーを含有しない（−）体シクロペンテノンを、後ピークの（＋）体シクロペンテノン３７．４ｍｇから２７．７ｍｇのエナンチオマーを含有しない（＋）体シクロペンテノンをそれぞれ得た。なお（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンの光学分割ＨＰＬＣの溶出時間はそれぞれ３３分、４０分であった。
実施例１
（１）２×１０5cells/mlのヒト前骨髄性白血病細胞HL-60（ATCC CCL-240）を含む１０％牛胎児血清含有RPMI1640培地5mlを６穴プレートの各ウエルに入れ、３７℃５％ＣＯ2存在下で２４時間培養した後、最終濃度が、０、１０、２０、３０、４０、５０、１００μＭになるように参考例１記載のシクロペンテノンを添加し、更に８時間培養を続けた。
培養終了後、細胞数を計測した後、細胞を遠心分離で回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、シクロペンテノン処理細胞を調製した。また、45℃10分間熱処理を行った後、同様に培養した細胞も調製した。
これらの処理細胞を用い、モレキュラー  クローニング（Molecular Cloning）〔コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（1989）〕記載の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を行った。処理細胞は、２．５×１０6cells/mlになるようにSDS-PAGE Sample bufferに懸濁し、この細胞懸濁液を１００℃で１０分間処理した後、５μlずつを２枚のSDS-PAGEゲル（５％スタッキングゲル、１０％セパレーションゲル）にアプライし、電気泳動を行った。一方のゲルは、クマシー染色し、他方のゲルは、Polyvinylidene difluoride transfer membrane〔ImmobilonTM：ミリポア（MILLIPORE）社製Cat.# IPVHOOO-10〕にブロッティングした。このメンブレンをBlock Ace（大日本製薬株式会社Cat.# UK-B25）で４℃一晩ブロッキングした。
このブロッキングしたメンブレンに熱誘導される７０kDaの熱ショックタンパクと特異的に反応するモノクローナル抗体HSP 72/73(Ab-1)〔オンコジーン  リサーチ  プロダクツ（Oncogene Research Products）社製Cat.# HSP01〕を反応させた後、０．０５％Tween２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、更に、ＴＢＳで洗浄した。次いで、Peroxidase複合二次抗体HRP-RabbitAnti Mouse IgG（H+L）〔ZYMEDラボラトリース社（ZYMED Laboratolies，Inc．）製Cat.# 61-6520〕を反応させ、先の操作と同様に洗浄した。このように一次抗体、二次抗体と反応させたメンブレンに、ケミルミノール試薬RENAISSANCETM〔デュポンNEN（Dupont NEN）社製Cat.# NEL-100〕を反応させた後、X-Rayフィルムを感光して70kDaの熱ショックタンパクの誘導を確認した。
その結果、２０から３０μＭのシクロペンテノンの添加で、４５℃１０分間熱処理と同程度の７０kDaの熱ショックタンパクの誘導が確認された。その誘導の強弱は表１に示した。なお表１中、＋は誘導の強さを表し、＋が多いほど誘導が強いことを意味する。また−は誘導が認められなかったこと、±は誘導がわずかであることを意味する。
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また（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンについても同様の結果を得た。
実施例２
（１）ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）を１０ｃｍプレート中、１０％牛胎児血清含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；日水社製）で８０％コンフルエントになるまで５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した後、終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加し、上記条件で更に６時間培養を続けた。培地を捨て、各ウェルに１ｍｌの１０％トリクロロ酢酸を加えた後、スクレーパーで細胞を回収した。
こうして得られた細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥとブロッティングを実施例１の方法で行い、７０ｋｄ熱ショックタンパクの発現を検出した。
その結果、５μＭ〜４０μＭシクロペンテノン添加区分で７０ｋｄ熱ショックタンパクの誘導が見られた。その結果を表２に示す。なお、表２中、＋はブロッティングによって観察された７０ｋｄ熱ショックタンパクのシグナルの強さを表し、＋が多いほどシグナルが強いことを意味する。また、±はシグナルが非常に弱いことを意味する。
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（２）ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍプレート中、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭで８０％コンフルエントになるまで５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した後、終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加し、上記条件で更に６時間培養を続けた。この後、５％牛胎児血清含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄し、アデノウイルスであるＡｄ５  ｄｌＸ〔サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ら、ジャーナル  オブ  ビロロジー、第５４巻、第７１１〜７１９頁（１９８５）〕を含む５％牛胎児血清含有ＤＭＥＭを細胞に加えて感染させ、２０時間培養した。但し、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を５０に設定した。培地を捨て、各ウェルに１ｍｌの１０％トリクロロ酢酸を加えた後、スクレーパーで細胞を回収した。
こうして得られた細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥとブロッティングを実施例１の方法で行い、アデノウイルスのヘキソンタンパクの発現を検出した。但し、一次抗体は抗アデノウイルスヘキソン抗体〔ケミコン  インターナショナル社（Chemicon International Inc.）製、ＡＢ１０５６〕を用いた。
１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにヘキソンタンパク量が減少していた。また、２０μＭ以下のシクロペンテノン添加区分ではシクロペンテノン非添加区分と同様の細胞増殖が見られた。
（３）実施例２−（２）と同様にシクロペンテノン処理の後でアデノウイルスを感染させて培養したＨｅＬａ細胞から「ウイルス実験プロトコール」（メジカルビュー社発行）２４〜２５頁記載の方法に従ってウイルスＤＮＡを抽出した。
すなわち、ウイルス感染細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、１ｍｌの０．６％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液に懸濁した後、３．０ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を添加した。０℃で１時間放置し、遠心により得た上清に３ｍｌのエタノールを加えて混合した。遠心によって得た沈殿を０．２ｍｌのＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕に溶解し、２μｌの１０％  ＳＤＳと４μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間保温した。フェノールとクロロホルムの等量混合液で２回抽出し、水層に２０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと４００μｌのエタノールを加えて遠心し、沈殿を５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解してＤＮＡ溶液を得た。１０μｌのＤＮＡ溶液に１０単位のＥｃｏＴ２２Ｉ（宝酒造社製）と１μｌの１０ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを加えて消化し、アガロースゲル電気泳動を行ってウイルスＤＮＡ量を測定した。その結果、５μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスＤＮＡ量が減少していた。
（４）実施例２−（２）と同様にＨｅＬａ細胞を培養した後、シクロペンテノンを添加せずに、５型アデノウイルス（Adenoid 75 ATCC VR-5）を含む５％牛胎児血清含有ＤＭＥＭを細胞に加えて感染させた。但し、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）を５０に設定した。その後、終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加し、２０時間培養した。培養後は、実施例２−（２）と同様にアデノウイルスのヘキソンタンパクの検出を行った。その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにヘキソンタンパク量が減少していた。また、２０μＭ以下のシクロペンテノン添加区分ではシクロペンテノン非添加区分と同様の細胞増殖が見られた。
（５）実施例２−（２）と同様にＨｅＬａ細胞を培養し、シクロペンテノンで処理した。その後、実施例２−（４）と同様に、５型アデノウイルス（Adenoid 75 ATCC VR-5）を感染させ、シクロペンテノンを添加した培地で培養した。培養後は、実施例２−（２）と同様にアデノウイルスのヘキソンタンパクの検出を行った。その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにヘキソンタンパク量が減少していた。また、２０μＭ以下のシクロペンテノン添加区分ではシクロペンテノン非添加区分と同様の細胞増殖が見られた。
（６）実施例２−（５）と同様にシクロペンテノン処理の後で５型アデノウイルス（Adenoid 75 ATCC VR-5）を感染させて培養したＨｅＬａ細胞から実施例２−（３）と同様の方法でウイルスＤＮＡ量を測定した。その結果、５μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスＤＮＡ量が減少していた。
以上、実施例２−（２）〜（６）の結果から、シクロペンテノンは感染前、感染後、あるいは感染前後の投与により、アデノウイルスに対して抗ウイルス活性をもつことが明らかになった。また（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンについても同様の結果を得た。
実施例３
（１）プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.）、第８４巻、第１５６〜１６０頁(1987)に記載の、β−ガラクトシダーゼ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子をレポーター遺伝子として持つ組換レトロウイルスベクターBAGを、制限酵素BamHIで消化し、セルフライゲーションさせることによってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を抜き取ったDOLベクターを構築した。
（２）実施例３−（１）記載のDOLベクタープラスミドを大腸菌（E.Coli）HB１０１に形質転換し、L-ブロス培地で培養し、集めた菌体よりプラスミドを抽出し、塩化セシウム密度勾配超遠心にてDOLプラスミドを精製した。
精製したDOLプラスミド１０μgを組換えレトロウイルスパッケージング細胞ΨCRIP〔プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ、第８５巻、第6460〜6464頁(1988)〕にカチオニックリポソーム〔Trans ２T LT-１（宝酒造社）〕を用いて導入した。
導入した細胞を３７℃、５％ＣＯ2条件下、G418（ギブコ社）を０．４ｍｇ／ｍｌ含む１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地で２週間選択し、得られたコロニーを２０個クローニングし、直径１００ｍｍプレートで増やし、セミコンフルエントの状態で培地を交換し、２４時間後に上清を回収して０．４５μｍフィルター（Milex HV；ミリポア社）でろ過し、ウイルス上清とした。また細胞はトリプシンではがし、液体窒素中で保存した。
各コロニーより得たウイルス上清の力価は下記の実施例３−（３）に示す方法で測定し、最も力価の高いウイルス液が得られたクローンを組換えレトロウイルスプロデューサー細胞ΨCRIP／DOLとして樹立した。樹立時のプロデューサー細胞から得たウイルス上清の力価は１×106コロニー形成ユニット（cfu）／mlであった。樹立したプロデューサー細胞はG418を０．２ｍｇ／ｍｌ含む１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地で維持した。
（３）ウイルス力価の測定にはNIH3T3細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を用いた。10%仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地で培養したNIH3T3細胞を６ウエルプレート（岩城硝子社）に50000個／ウエルで植え継ぎ、翌日、８μg/mlのポリブレン（シグマ社）を含む1mlのウイルス希釈液でNIH3T3細胞に３時間感染させた。ウイルスの希釈には１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地を用いた。感染終了後、ポリブレンを希釈するために、更に２ｍｌの１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地を添加した。翌日よりG418を0.4mg/ml含む１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地に交換し、３〜４日ごとに培地を交換しながら、２週間選択を行い、コロニーを形成させた。得られたコロニーをギムザ染色液（ギブコ社）にて、常法に従い染色し計数した。得られたコロニー数に希釈倍率を乗じた値を、cfuとしてウイルス力価とした。
（４）実施例３−（２）記載の組換えレトロウイルスプロデューサー細胞ΨCRIP／DOLを６ウエルプレートに植え継ぎ、セミコンフルエントの状態になったときにシクロペンテノンを０〜２０μＭ含む１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地1.5mlに交換し、24時間後に上清を回収した。回収した上清のウイルス力価を実施例２−（３）記載の方法で測定し、シクロペンテノンの添加による組換えレトロウイルスプロデューサー細胞のウイルス産生能への影響を検討した。
シクロペンテノンを添加していない対照実験区より得たウイルス液の力価は9.５×104cfu/mlであったのに対し、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μMのシクロペンテノン存在下でのウイルス液の力価はそれぞれ8.3×104、6.4×104、6.1×104、3.8×104、5.6×104、5.1×104、4.1×104cfu/mlであり、シクロペンテノンの添加によりプロデューサー細胞から得られるウイルス液の力価の低下が確認された。すなわちシクロペンテノンよる組換えレトロウイルスプロデューサー細胞のウイルス産生能の抑制作用が認められた。
（５）G418耐性遺伝子を発現するコントロールプラスミドpcD2-Y［Mol．Cell．Biol．第７巻、第２７４５〜２７５２頁（１９８７）］、およびHPV16型E7とG418耐性遺伝子の両方を発現できるプラスミドpcD2-16E7［Jpn．J．Cancer Res．第８２巻、第１３４０〜１３４３頁（１９９１）を大腸菌E.coli HB101に形質転換し、L-ブロス培地で培養し、集めた菌体よりプラスミドを抽出し、塩化セシウム密度勾配超遠心にて精製し、遺伝子導入用ベクタープラスミドとした。
NIH3T3細胞は３７℃、５％ＣＯ2条件下、１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地中にて培養した。
精製したプラスミド１０μｇをNIH3T3細胞にカチオニックリポソーム（TransIT LT-1，宝酒造社製）を用いて導入し、細胞を３７℃、５％ＣＯ2条件下、G418（GIBCO）を０．４ｍｇ／ｍｌ含む１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地で２週間選択し、得られたコロニーをクローニングし、φ１００ｍｍの組織培養プレートにまで増やし、順次、液体窒素で保存した。
これにより、コントロールベクターを導入したNIH3T3細胞、及びHPV16型E7によってがん化させたNIH3T3細胞をそれぞれ９株づつ樹立した。
コントロールベクターを導入した細胞株をNIH3T3/Y-1、NIH3T3/Y-2、NIH3T3/Y-3、NIH3T3/Y-4、NIH3T3/Y-5、NIH3T3/Y-6、NIH3T3/Y-7、NIH3T3/Y-8およびNIH3T3/Y-9とした。
E7を導入した細胞株をNIH3T3/E7-1、NIH3T3/E7-2、NIH3T3/E7-3、NIH3T3/E7-4、NIH3T3/E7-5、NIH3T3/E7-6、NIH3T3/E7-7、NIH3T3/E7-8およびNIH3T3/E7-9とした。
（６）NIH3T3細胞、コントロールベクターを導入した細胞株、およびE7を導入した細胞株を１００ｍｍの組織培養プレートにて１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地で５０〜７０％コンフルエントにまで増やし、PBSで洗浄後、０．２５％トリプシン-EDTA溶液で細胞を剥がし、１０%仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地５ｍｌに懸濁した。
懸濁液の一部をとり、ノイバウエル型血球計算板にて細胞密度を計算した。得られた数字を元に１０％仔ウシ血清含ダルベッコ改変イーグル培地にて希釈し、直径６０ｍｍの組織培養プレートに２００細胞/プレートになるように播き、３ｍｌの培地中で培養を開始した。培養開始から２４時間後、シクロペンテノンを５μＭになるように添加した。さらに２４時間後、新しい培地と交換しシクロペンテノンを５μＭになるように添加した。
以後は2〜3日毎に培地を交換しシクロペンテノンを５μＭになるように添加した。対照実験区として、シクロペンテノンを添加しないプレートを用意し、同じように培地交換した。培養はそれぞれ３本立てで行った。９日間培養後、メタノールで固定してギムザ液（GIBCO）でコロニーを染色した。
なおNIH3T3、NIH3T3/Y-1およびNIH3T3/E7-2を用いて評価した。
染色したコロニーを計数した結果を表３に示す。E7を導入した細胞は、コントロール細胞に比べてシクロペンテノンへの感受性が高く、シクロペンテノンはがん遺伝子形質転換細胞を選択的に作用した。
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実施例３−（５）の他の細胞株を使用した場合も、同様の結果を得た。また（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンでも同様の結果を得た。
実施例４
（１）２４穴マイクロプレート中で１０％牛胎児血清含有Eagle-MEMを用い単層になるまで５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養したＭＤＣＫ細胞（大阪府立公衆衛生研究所保存株）に終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加し、上記条件で更に６時間培養を続けた。
この後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株（大阪府立公衆衛生研究所保存株）を細胞に加えて感染させ、３０分間、３７℃でインキュベートした。但し、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を0.01に設定した。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０μg／ｍｌトリプシンを含んだEagle-MEMで培養した。
感染細胞上清を０、１、２、３日後に採取し、ウイルスのタイターをＰＡＰ法によるフォーカス計数法［J．Clin．Microbiol．第２８巻、第１３０８〜１３１３頁（１９９０）］で求めた。
その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表４に示す。また各シクロペンテノン添加区分でも、細胞ははがれること無く接着していた。
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（２）実施例４−（１）と同様の手順でシクロペンテノン非存在下、単層に培養したＭＤＣＫ細胞に実施例４−（１）と同様にインフルエンザウイルスを細胞に加えて感染させ、終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加した１０μg／ｍｌトリプシンを含んだEagle-MEMで培養した。その後、実施例４−（１）と同様に、ウイルスのタイターを求めた。その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表５に示す。また、各シクロペンテノン添加区分で、細胞ははがれること無く接着していた。
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（３）実施例４−（１）と同様の手順で単層に培養し、終濃度が０、２０、又は４０μＭのシクロペンテノンで６時間処理したＭＤＣＫ細胞に、実施例４−（１）と同様にインフルエンザウイルスを感染させ、感染前と同濃度のシクロペンテノンを含む１０μｇ／ｍｌトリプシン含有Eagle-MEM培地で培養を続けた。その後、実施例４−（１）と同様に、ウイルスのタイターを求めた。その結果、２０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表６に示す。また各のシクロペンテノン添加区分でも、細胞ははがれること無く接着していた。
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（４）実施例４−（１）と同様の実験を感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を0.001に設定して行った。その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表７に示す。また、各シクロペンテノン添加区分でも、細胞ははがれること無く接着していた。
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（５）実施例４−（２）と同様の実験を感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を0.001に設定して行った。その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表８に示す。また各シクロペンテノン添加区分でも、細胞ははがれること無く接着していた。
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（６）実施例４−（３）と同様の実験を感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）を0.001に設定して行った。その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表９に示す。また各シクロペンテノン添加区分でも、細胞ははがれること無く接着していた。
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以上、実施例４−（１）〜（６）の結果から、シクロペンテノンはインフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性をもつことが明らかになった。また（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンでも同様の結果を得た。
実施例５
（１）ヒトＴ細胞に対するシクロペンテノンの作用
２×１０5個／ｍｌのＣＥＭ−ＳＳ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１１９）又はＨ９細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７６）に０．５〜５μＭシクロペンテノンを添加して３日間培養し、生細胞数と死細胞数を計数して細胞生存率を算出した。
その結果、どちらの細胞においてもシクロペンテノン添加による細胞生存率の顕著な減少は見られなかった。その結果を図１と図２に示す。すなわち、図１と図２は添加したシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図であり、横軸は添加したシクロペンテノン濃度（μＭ）、縦軸は３日間培養後の細胞生存率（％）を示す。図１はＣＥＭ−ＳＳ細胞を用いた場合の結果であり、図２はＨ９細胞を用いた場合の結果である。
（２）ＨＩＶ感染Ｔ細胞に対するシクロペンテノンの作用
ＨＩＶ−１III Bに感染したＣＥＭ−ＳＳ細胞（ＣＥＭ−３Ｂと略称する）又はＨＩＶ−１III Bに感染したＨ９細胞（Ｈ９−３Ｂと略称する）に１〜５μＭシクロペンテノンを添加して３日間培養した。両細胞の９０％以上がＨＩＶ−１III Bに感染している。生細胞数と死細胞数を計数して細胞生存率を算出した。
その結果、どちらの細胞においても３μＭシクロペンテノン添加によって細胞生存率が顕著に減少し、５μＭシクロペンテノン添加では更に細胞生存率が低下した。すなわち実施例５−（１）と比較し、シクロペンテノンは抗ＨＩＶ作用を示した。その結果を図３と図４に示す。すなわち、図３と図４は添加したシクロペンテノン濃度と細胞生存率の関係を示す図であり、横軸は添加したシクロペンテノン濃度（μＭ）、縦軸は３日間培養後の細胞生存率（％）を示す。図３はＣＥＭ−３Ｂを用いた場合の結果であり、図４はＨ９−３Ｂを用いた場合の結果である。
実施例６
実施例５−（２）の３日間培養した後の培養上清中に含まれるｐ２４抗原の濃度を測定した。その結果、添加したシクロペンテノン濃度に応じてｐ２４濃度が減少し、抗ＨＩＶ作用が認められた。その結果を表１０に示す。但し、表１０において括弧内の数字はシクロペンテノン非添加時のそれぞれの細胞培養上清のｐ２４濃度に対する比を％で表したものである。
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実施例７
Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）を１０％牛胎児血清含有Eagle-MEMに５×１０4cells／１００μｌの細胞濃度になるように懸濁し、９６穴マイクロタイタープレートに1穴当たり１００μｌの細胞懸濁液を入れ、５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養し、単層となったＶｅｒｏ細胞を調製した。
この細胞に、終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加したEagle-MEM培地を添加して５％炭酸ガス存在下、３７℃で７時間培養した。
培養終了後、培地を除去し、ＰＢＳで2回洗浄後、日本脳炎ウイルス（JEV JaOAr-363-70株）を４．９×１０2pfu/mlになるように接種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で３０時間培養した後、細胞をエタノール固定し、ＰＡＰ法によるフォーカス計数法［Arch．Virol．第８６巻、第１２９〜１３５頁（１９８５）］でフォーカス計数を行った。
その結果、４０μＭのシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにフォーカスの数が低下していた。その結果を表１１に示す。また各シクロペンテノン添加区分で、細胞ははがれることなく接着していた。
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（２）２４穴マイクロプレート中で１０％牛胎児血清含有Eagle-MEMを用い単層になるまで５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養したＶｅｒｏ細胞をＰＢＳで洗浄し、４．９×１０2pfu/mlの日本脳炎ウイルス（JEV JaOAr-363-70株）を細胞に加えて感染させ、９０分間、３７℃でインキュベートした。
インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、終濃度が０、５、１０、２０、又は４０μＭになるようにシクロペンテノンを添加したＭＥＭで培養した。
感染細胞上清を０、１、２、３日後に採取し、ウイルスのタイターをＶｅｒｏ細胞を用いたＰＡＰ法によるフォーカス計数法［J．Clin．Microbiol．第２８巻、第１３０８〜１３１３頁（１９９０）］で求めた。
その結果、１０μＭ以上のシクロペンテノンを添加した区分ではシクロペンテノン非添加の対照に比べて明らかにウイルスのタイターが低下していた。その結果を表１２に示す。また各シクロペンテノン添加区分で、細胞ははがれることなく接着していた。
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上記実施例７−（１）、（２）の結果から、シクロペンテノンは日本脳炎ウイルスに対して抗ウイルス活性をもつことが明らかになった。さらに、日本脳炎ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスと同系の種であり、Ｃ型肝炎ウイルスのin vitroでの培養が確立していない現在ではＣ型肝炎ウイルスのモデルとして日本脳炎ウイルスが利用されている。これらのことより、シクロペンテノンはＣ型肝炎の治療薬としても有効である。
また（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンについても同様の結果を得た。
実施例８
５年前にＣ型肝炎ウイルス感染症と診断され、インターフェロン、強力ミノファーゲンによる治療を受けてきたが、ＧＯＴ、ＧＰＴともに１５０前後と肝機能の改善が見られなかった女性が、後記実施例１３で得られた飲料を毎日５０ｍｌ（シクロペンテノン２ｍｇ含有）、２カ月飲用した結果、ＧＯＴ、ＧＰＴともに８０と改善した。更に同様に１カ月飲用を続けた結果、ＧＯＴ、ＧＰＴともに３０と顕著な肝機能の改善が見られた。
実施例９
ＩＣＲ系マウス（日本エスエルシーより購入、７週令、雌性）の背部の毛を剃った後、イニシエーターとしてＤＭＢＡ（dimethylbenzanthracene）を５０μｇ／マウスとなるように、そのアセトン溶液を塗布し、その１週間後より、プロモーターとしてＴＰＡ（12-o-Tetrasecanoylphorbol 13-acetate）を１μｇ／マウスとなるように、そのアセトン溶液をイニシエーター塗布部に、毎週２回試験終了まで塗布し、シクロペンテノンの８０％エタノール溶液又は対照の８０％エタノール溶液を各ＴＰＡ塗布の１時間前に塗布し、２段階皮膚発がんにおける発がん抑制作用を２０週間観察した。
対照群（vehicle塗布群）は１５週以降は１００％（１２匹中１２匹）の発がん率を示したのに対し、シクロペンテノンは強力に発がんを抑制し、２．５ｍｇ／マウスは１５週以降に８．３％（１２匹中１匹）、１９週以降に２５％（１２匹中３匹）の発がん率という発がん抑制を示した。結果を図５に示す。すなわち図５はシクロペンテノンの発がん抑制作用を示す図であり、縦軸は発がん率、横軸は時間（週）を示す。図中白三角はシクロペンテノン２．５ｍｇ／マウス処理群（１２匹）、黒三角はシクロペンテノン０．８ｍｇ／マウス処理群（１１匹）、白丸は対照群（１２匹）を示す。
なおマウス耳介におけるＴＰＡ炎症試験においてシクロペンテノンは２．５ｍｇ／マウスのマウス耳介塗布において抗炎症活性を示さなかった。
以上シクロペンテノンは２段階化学発がんにおいて抗プロモーター作用を示した。シクロペンテノンを含有するグルクロン酸の加熱処理物、（−）体シクロペンテノン、（＋）体シクロペンテノンも同様の結果を示した。
実施例１０
注射剤
（１）生理食塩液（日本薬局方収載品）にシクロペンテノンを１％濃度で加え注射剤を作製した。
（２）生理食塩水（前記と同じ）に（−）体シクロペンテノン及びグリシルリチン酸をそれぞれ０．５％及び０．１％濃度で加え、注射剤を作製した。
実施例１１
錠剤
（１）シクロペンテノン１０ｍｇと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、錠剤を作製した。
（２）（＋）体シクロペンテノン０．１ｍｇ、グリシルリチン酸ジカリウム１０ｍｇ及び微結晶セルロースの適量を含有する錠剤を調製し、糖衣を施し、錠剤を作製した。
実施例１２
軟膏
シクロペンテノン                      １ｇ
吸水軟膏（日本薬局方収載）          ９９ｇ
シクロペンテノンをまず少量の吸水軟膏と十分に練り合せ、次いで残った吸水軟膏を徐々に加えて均一になるまで練り合せて軟膏を作製した。
この軟膏は１日４〜５回患部に塗布される。
実施例１３
（１）ペクチン（ポモシンペクチンＬＭ−１３ＣＧ：ハーキュリーズ社製）５ｋｇを水道水１００リットルに添加し、液温２８℃から液温１２０℃となるまで水蒸気吹き込みにより３５分間昇温させ、次いでかくはん下で１２０℃、５時間保温し、次いで冷却し、冷却物１３５リットルを調製した。次いで冷却物にろ過助剤として、セライト＃５４５（セライト社製）１．３５ｋｇ、及びシリカ＃６００−Ｓ（中央シリカ社製）１．３５ｋｇを添加し、次いでセライト＃５４５の０．１ｋｇ、及びシリカ＃６００−Ｓの０．１ｋｇでプレコートしたコンパクトフィルター（６インチ１６段ろ紙：ＡＤＶＡＮＴＥＣ＃３２７）でろ過を行った。得られたろ液はプレートヒーター（日阪製作所製）による連続瞬間加熱処理（９８℃、６０秒）を行った後冷却し、１５０リットルのシクロペンテノン含有のペクチン加熱処理液を調製した。
シクロペンテノン含有のペクチン加熱処理液のｐＨは約３．５、酸度は６．２ｍｌ、糖度は５．８Ｂｒｉｘ％であった。なおｐＨはｐＨメーターで測定し、酸度は試料１０ｍｌをｐＨ７．０に中和するのに要する０．１Ｎ  ＮａＯＨ量（ｍｌ）で表示した。更に糖度はブリックス糖度計で測定した。
（２）下記組成で飲料を調製した。
果糖ブドウ糖液糖                  ５．００％
砂糖                              ４．００％
酸味料                            １．２０％
香料                              ０．３０％
シクロペンテノン含有物            ０．５  ％
精製水                            残        
計                              １００．００％
シクロペンテノン含有物としては実施例１３−（１）記載のシクロペンテノン含有ペクチン加熱処理液を使用し、その固形物換算量を添加した。この飲料１００ｍｌ中には４ｍｇのシクロペンテノンが含有されている。
発明の効果
本発明により細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする抗ウイルス剤が提供される。本発明の抗ウイルス剤はウイルス感染細胞を選択的に死滅させ、且つウイルス未感染の正常細胞にウイルス抵抗性を付与し、その相乗作用により、難治療性のウイルス疾患、例えばＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎等の治療及び症状改善に極めて有用な抗ウイルス剤である。また本発明により、肝機能改善作用、熱ショックタンパク誘導作用、ウイルス発がん予防作用、抗プロモーター作用等の生理活性を有するシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を含有する医薬品が提供され、該医薬品は生体の恒常性の維持、特に胃腸健康保持に有用な医薬品となる。
また本発明により細胞にウイルス抵抗性を誘導する機能を有し、且つウイルス感染細胞を選択的に死滅させる機能を有する化合物、例えばシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される化合物を有効成分とする抗ウイルス用食品又は抗ウイルス用飲料が提供され、これらの飲食品はウイルスが起因となる種々の疾病の症状改善用飲食品又は予防用飲食品として有用である。また本発明により、肝機能改善作用、熱ショックタンパク誘導作用、ウイルス発がん予防作用、抗プロモーター作用等の生理活性を有するシクロペンテノン若しくはその光学活性体又はそれらの塩を含有する飲食品が提供され、該飲食品は生体の恒常性の維持、特に胃腸健康保持に有用な飲食品となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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