(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型ＶＥＧＦ／ＶＰＦ受容体ＫＤＲの細胞外領域またはＦＬＴ−１の細胞外領域とヒト型ＶＥＧＦ／ＶＰＦに対する高親和性モノクロナール抗体を用いた免疫測定法を組み合わせることを特徴とするＶＥＧＦ／ＶＰＦ拮抗阻害剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管新生阻害剤として医薬や診断薬等に有用なＶＥＧＦ／ＶＰＦ拮抗阻害剤の探索、すなわち、各種の化合物のなかから、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ拮抗阻害剤として有効な化合物を選択する方法、いわゆるスクリーニング方法に関するもの、さらには該スクリーニングに用いられるキットに関するものである。
即ち、本発明は医薬及び診断薬製造技術に属するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞組織における血管新生は、数多くの疾病の症状や病因と密接に関連していることが知られており、これらの血管新生は病理的血管新生と呼ばれている。
病理的血管新生が認められる代表的な疾病は固形ガンで、固形ガンにおいてガン組織が直径１〜２mmを越えて増殖するためには、既存血管から新生血管が延びてガン組織まで到達することが必要であり(J. Folkman, J. Natl. Cancer Inst., 82:4 (1990))、また血管がガン組織に到達するとガン組織の増殖が爆発的に加速されることが知られている。
さらに、糖尿病網膜症では網膜に病理的血管新生を伴い、それはしばしば失明の原因となっている。
他に慢性関節リューマチ、乾せん、血管腫、強皮症、血管新生緑内障などの疾病においても病理的血管新生を伴い、それが主な症状の一つとなっている(J. Folkman, N. Engle. J. Med., 320:1211 (1989))。
【０００３】
血管新生は血管の最も内側の層を形成している細胞である血管内皮細胞が成長因子や生理活性物質あるいは機械的損傷などの刺激を受けて、増殖することによって行われるのであり、直接または間接的に血管内皮細胞の増殖を刺激する成長因子としては、bＦＧＦ(basic Fibroblast Growth Factor)、aＦＧＦ(acidic Fibroblast Growth Factor)、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ(Vascular Endothelial cell Growth Factor／Vascular Permiability Factor)、ＰＤ−ＥＣＧＦ(Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor)、ＴＮＦ-α(Tumour Necrosis Factor-α) 、ＰＤＧＦ(Platelet Derived Growth Factor)、ＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)、ＴＧＦ-α(Transforming Growth Factor-α)、ＴＧＦ-β(Transforming Growth Factor-β)、ＨＧＦ(Hepatocyte Growth Factor)等が知られている(L. Diaz-Flores et al., Histol.Histopath., 9:807 (1994))。
この中でＶＥＧＦ／ＶＰＦ(以下ＶＥＧＦという)は血管内皮細胞に極めて特異的に作用する点で他の成長因子と区別できるものである。このことは言い換えれば、ＶＥＧＦの受容体は血管内皮細胞以外ではごく限られた細胞でしか発現しないというものである。
【０００４】
ＶＥＧＦは分子量４万〜４万５千の糖タンパク質で２量体として存在し(P. W. Leung et al., Science 246:1306 (1989)、P. J. Keck et al., Science:246:1319(1989))、ＶＥＧＦ受容体に結合することによって作用が伝播し、細胞の増殖を促進したり膜透過性を促進するのである。
【０００５】
ＶＥＧＦは血管新生を促進するものであるから、前記した様にガンとの関連が深く、それを示唆する以下のような報告がある。
多くのガン細胞はＶＥＧＦを分泌する(S. Kondo et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 194:1234(1993))。
ガン組織切片を抗ＶＥＧＦ抗体で染色するとガン組織およびその周辺の新生血管が強く染色される(H. F. Dvorak et al., J. Exp. Med. 174:1275(1991)、L. F. Brown at al., Cancer Res., 53:4727 (1993))。
ＶＥＧＦ受容体の一つが遺伝的に不活化されたマウスでは移植されたガンの増殖が抑制される(B. Millauer et al., Nature, 367:576 (1994)) 。
抗ＶＥＧＦ中和抗体が坦ガンマウスに対して抗腫瘍活性を示す(K. J. Kim et al., Nature, 362:841(1993)、S. Kondo et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 194:1234(1993))。
従って血管新生を阻害する物質、ガン細胞が分泌するＶＥＧＦが惹起する血管新生を阻害する物質はガンや前述の疾病の治療に利用できる可能性がある。
【０００６】
すなわち、血管新生を阻害する物質（血管新生拮抗阻害剤）、特にＶＥＧＦ拮抗阻害剤は、上記の様なさまざまの疾病の治療に利用することが考えられるが、膨大に存在する各種化合物、発酵生産物、天然物等の中からそれら拮抗阻害剤を見だすこと、すなわち有効な化合物の選択、いわゆるスクリーニングは容易なことではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ＶＥＧＦ拮抗阻害剤を簡便且つ効率良くスクリーニングを行える方法を提供すべく鋭意研究を行ったのである。
【０００８】
スクリーニングする方法につき鋭意研究した結果、ヒト型ＶＥＧＦ受容体の細胞外領域を用い、酵素免疫測定法やラジオレセプターアッセイを適用することで、ＶＥＧＦ拮抗阻害剤を簡便且つ効率良くスクリーニングできることを見出して本発明を完成したのである。すなわち、本発明はヒト型ＶＥＧＦ受容体ＫＤＲの細胞外領域またはＦＬＴ−１の細胞外領域とヒト型ＶＥＧＦ／ＶＰＦに対する高親和性モノクロナール抗体を用いた免疫測定法を組み合わせることを特徴とするＶＥＧＦ拮抗阻害剤のスクリーニング方法に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
ＶＥＧＦの受容体は、ヒトではＦＬＴ−１(M. Shibuya, et al., Oncogene, 5:519 (1990)、C. DeVries et al., Science, 255:989 (1992))とＫＤＲ(B. I. Terman et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 187:1579 (1992))の２種類が知られている。また、ＦＬＴ−１に関しては可溶性型受容体のcＤＮＡがクローニングされている(R. L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:10705 (1993))。このcＤＮＡによりコードされるポリペプチドはＦＬＴ−１の細胞外領域の第１〜第６イムノグロブリン様ドメインと対応しており、本来のＦＬＴ−１と同程度の親和性でＶＥＧＦと結合しＶＥＧＦ活性を阻害する。またＫＤＲについても遺伝子工学的に発現させた細胞外領域の第１〜第６ドメインがＶＥＧＦに結合することが知られている(R. L. Kendal et al., Bichem. Biophys. Res. Commun., 201:326 (1994)、J. B. Kaplan et al., Growth Factor, 14:243 (1997))。
スクリーニングに用いられるヒト型ＶＥＧＦ受容体の例としては、組換え体を用いて大量発現させたＫＤＲやＦＬＴ−１、またはこれらと実質的に同質の活性を有するもの、たとえば細胞外領域のもの、イムノグロブリンのＦcなどの他のタンパク質とヒト型ＶＥＧＦ受容体との融合体などが挙げられる。
これらの発現方法として様々な宿主を利用することができる。例えばEscherichia coli、Pseudomonos属細菌、Bacillus subtilis、Bacillus brevis、Bacillus liqueniformis、Bacillus thuringensisなどのグラム陰性またはグラム陽性細菌、Pichia pastoris、Shizosaccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiaeなどのような酵母、Aspergillus属のような真菌類、Sf9(Spodoptera frugiperda由来)、Sf21、TN5(Trichoplusia ni由来)、BN4(Bombyx moli)などのような昆虫細胞、CHO(chinese hamster ovary由来)、ＣＯＳ細胞(サル腎臓由来)などのようなほ乳類細胞が利用できる。ベクターは宿主の種によってそれぞれ適したベクターを利用すればよい。最終的な形質転換細胞を得る前に、宿主と大腸菌とのシャトルベクターを用い、一度大腸菌で組換えＤＮＡを得るのがより容易であろう。
本発明中のヒト型ＶＥＧＦ受容体と実質的に同質の活性を有するものの発現方法はメルク社の特許(特表平8-508161)や文献(J. B. Kaplan et al., Growth Factor, 14:243 (1997))及び本発明者らの特許(特開平9-154588、特願平9-19706)に従って行うことができる。
本発明のスクリーニング用キットやスクリーニング方法においては、ヒト型ＶＥＧＦ受容体はそれを含有する細胞の膜画分からの抽出液を用いても良く、また、それを含有する培養上清を用いても良いし、さらにこれらから単離されたものを用いても良い。
【００１０】
一般にＶＥＧＦの様な蛋白性のリガンドと受容体に対する結合を測定する系としてラジオレセプターアッセイが用いられる。たとえばリガンド(ＶＥＧＦ)を放射性ヨウ素(125Ｉ)で標識し、受容体と反応させた後、特異的結合を放射活性で測定する系であり、本発明にも適用される。
しかしながら、放射性ヨウ素(125Ｉ)を用いるラジオレセプターアッセイは、特殊な研究設備が必要であること、標識時に用いる125Ｉ−ヨウ化ナトリウムは大気中に蒸散しやすく、体内へ吸入されて内部被爆の危険性があること、125Ｉの半減期(約６０日)が短く、頻繁に標識が必要で同一ロットが得られにくいこと、更に125Ｉのγ線によるリガンドの変質のため結果の再現性に悪影響を与えることなどの問題がある。
一方、本発明に使用する受容体は、ＶＥＧＦとの結合親和性が非常に高く(ＫＤＲ：約１０-10Ｍ、ＦＬＴ−１：約１０-11Ｍ)、抗体との結合親和性に匹敵するものであることから、抗体と抗原の結合を測定する系の一つである酵素免疫測定法に適したものである。すなわち、固相化抗体の代わりにヒト型ＶＥＧＦ受容体と実質的に同質の活性を有するものを用いることである。
該方法によれば、リガンドを放射性ヨウ素(125Ｉ)で標識する必要がないため、体内吸収による内部被爆の危険性は無くなり、同一ロットで実験を継続することができ、γ線によるＶＥＧＦの変質も無いなど、ラジオレセプターアッセイの問題点は全て解消することができ、ＶＥＧＦ拮抗阻害剤を簡便且つ効率良くスクリーニングすることができる。
【００１１】
ＶＥＧＦ拮抗阻害剤をスクリーニングするために用いられるヒト型ＶＥＧＦ受容体と実質的に同質の活性を有するものとしては、ヒト型ＶＥＧＦ受容体を含有する細胞膜画分、培養上清あるいはそれらより単離したヒト型ＶＥＧＦ受容体、その部分ペプチドまたは他の蛋白質との融合体が挙げられる。
酵素免疫測定法にヒト型ＶＥＧＦ、ヒト型ＶＥＧＦに対する抗体(ＶＥＧＦ抗体)もしくはそれの酵素標識(例えばペルオキシダーゼ)体、ＶＥＧＦ抗体と反応する酵素標識された抗体も必要であるが、それらヒト型ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ抗体はＲ＆Ｄ社から市販されており、それらを利用することができる。
【００１２】
ＶＥＧＦ拮抗阻害剤のスクリーニングを行うには、適当なヒト型ＶＥＧＦ受容体を含有する細胞膜画分、培養上清あるいはそれらより単離したヒト型ＶＥＧＦ受容体あるいはその部分ペプチドまたは他の蛋白質との融合体をスクリーニングに適したバッファーに懸濁し、９６wellプレートに添加する。
バッファーとしてはpＨ約４〜９(望ましくはpＨ約６.５〜７.５)のリン酸バッファーなど、ＶＥＧＦと受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれ用いられる。
受容体溶液を添加した９６wellプレートを４℃で１晩放置した後、１％ＢＳＡを含む前述のバッファーでブロッキング(室温で３時間放置)する。０.１％ＢＳＡを含む前述のバッファーで３ng／mlに希釈したＶＥＧＦ溶液を１００μl／wellずつ添加し、同時に検体化合物や発酵生産物等を共存させる。室温で１時間放置した後、０.１％ＢＳＡを含む前述のバッファーで洗浄し、ＶＥＧＦ抗体を１００μl／wellずつ添加する。室温で１時間放置した後、０.１％ＢＳＡを含む前述のバッファーで洗浄し、ＶＥＧＦ抗体と反応する酵素標識された抗体を１００μl／wellずつ添加する。室温で１時間反応させた後、０.１％ＢＳＡを含む前述のバッファーで洗浄し、酵素基質溶液液を１００μl／wellずつ添加する。
室温で一定時間反応させた後、発色・蛍光等をそれぞれの計測器で測定する。拮抗する物質が無い場合の計測値(ＴＢ0)からＶＥＧＦが無い場合の計測値(ＮＳＢ)を差し引いた値(ＴＢ0−ＮＳＢ)を１００％とした時、(ＴＢ−ＮＳＢ)が例えば５０％以下になる検体を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００１３】
本発明のＶＥＧＦ／ＶＰＦ拮抗阻害剤スクリーニング用キットの具体例としては、次の物が挙げられる。
（１）ヒト型ＶＥＧＦ受容体コートプレート
ヒト型ＶＥＧＦ受容体の一つであるＫＤＲの細胞外領域を発現させた昆虫細胞(Ｓf９)の培養上清を０.０５％アジ化ナトリウム、ＰＢＳで５０倍希釈し、９６wellプレート(ＩＭＭＵＬＯＮ２：Ｄynatech Ｌaboratories社製)に１００μl／wellずつ添加し、４℃で１晩放置したもの。
または、ヒト型ＶＥＧＦ受容体の一つであるＦＬＴ−１の細胞外領域を昆虫細胞(Ｓf９)の培養上清に発現させ、そこから精製したＦＬＴ−１細胞外領域を０.０５％アジ化ナトリウム、ＰＢＳで１００ng／mlになるように希釈し、９６wellプレートに１００μl／wellずつ添加し、４℃で１晩放置したもの。
（３）ヒト型ＶＥＧＦ165溶液
Ｈuman,ＶＥＧＦ Ｒecombinant(Ｒ＆Ｄ社製)１０μgを蒸留水１mlで溶解し、−２０℃で保存(使用前に反応・洗浄用バッファーで６ng／mlになる様に希釈する)。
（４）抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体
特開平０８−１６９８９８に従って作成され、精製された抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体(１０mg／ml、−２０℃保存：使用前に反応・洗浄用バッファーで２μg／mlになる様に希釈する)。
（５）ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ抗体
ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ(Ｈ＋Ｌ鎖、Ｇoat、４℃保存、ＭＢＬ社製：使用前に反応・洗浄用バッファーで１０００倍に希釈する)。
（６）ペルオキシダーゼ基質溶液
使用前に、３０mlの１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.２)にＯＰＤ錠(o-フェニレンジアミン二塩酸塩  １３mg／錠：和光純薬)１錠を溶解し、３％過酸化水素溶液９０μlを添加したもの。
（７）反応・洗浄用バッファー
使用前に、リン酸緩衝液(ＮaＣl：８g、ＫＣl：０.２g、ＫＨ2ＰＯ4：０.２g 、Ｎa2ＨＰＯ4：１.１５g を蒸留水１Lに溶解)にＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)：１gを溶解したもの。
（８）ブロッキング用バッファー
リン酸緩衝液１ＬにＮaＮ3：０.５g、ＢＳＡ：１０gを溶解したもの(４℃で保存)。
【００１４】
上記キットを使用したスクリーニング方法の具体例を以下に示す。
（１）ヒト型ＶＥＧＦ受容体コートプレートにブロッキング用バッファーを３００μl／wellずつ添加し、室温で３時間放置してブロッキングを行う。
（２）６ng／mlに調製したヒト型ＶＥＧＦ165溶液５０μlと反応・洗浄用バッファーで適当に希釈した検体５０μlを混合し、ブロッキング済みのヒト型ＶＥＧＦ受容体コートプレートに１００μl ／wellずつ添加し、室温で１時間反応させる。その際、ＴＢ0を求めるために検体無しのＷellとＮＳＢを求めるために検体・ＶＥＧＦが無いＷellも作成しておく。
（３）反応・洗浄用バッファーで６回洗浄した後、抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体を１００μl／wellずつ添加し、室温で１時間反応させる。
（４）反応・洗浄用バッファーで６回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を１００μl／wellずつ添加し、室温で１時間反応させる。
（５）反応・洗浄用バッファーで６回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μl／wellずつ添加し、室温で４５分間反応させる。
（６）２Ｎ硫酸を１００μl／wellずつ添加して反応を停止させ、６５０nmの吸光度に対する４９０nmの吸光度をプレートリーダー(Flow Titretek Multiskan PLUS MK11、ＩＣＮ社製)で計測し、ＰＳＢ(% of Specific Binding)を次式で求める。
【００１５】
【式１】
ＰＳＢ＝｛（ＴＢ−ＮＳＢ）／（ＴＢ0−ＮＳＢ）｝×１００
ＰＳＢ：% of Specific Binding
ＴＢ：検体を加えた時の測定値
ＮＳＢ：Non Specific Binding(非特異的結合値：ＶＥＧＦ無しの時の測定値)
ＴＢ0 ：最大結合値（検体無し・ＶＥＧＦのみの時の測定値）
【００１６】
【実施例】
○実施例１
＜ＫＤＲ細胞外領域をＶＥＧＦ受容体とするヒト型ＶＥＧＦ拮抗阻害剤スクリーニング方法でのＶＥＧＦ165結合＞
ＫＤＲ細胞外領域はメルク社の特許（特表平8-508161）及び本発明者の特許（特願平9-19706)に従い、以下の様にＳf９細胞を宿主として培養上清中に分泌させた。
・ヒト臍帯由来血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)cＤＮＡの調製
ＨＵＶＥＣ(クラボウ製)約１ｘ１０7個の細胞に１mlのＩＳＯＧＥＮ(和光純薬工業製)を加え、ペッスルで細胞を破砕し更に９mlのＩＳＯＧＥＮを加え５分間振とうした。この溶液に１mlのクロロフォルムを添加し１分間振とうし、１０,０００rpmで１０分間遠心し、上清を回収し、１／１０容の３M酢酸ナトリウム(pＨ５.２)を添加して混合し更に２.５容のエタノールを添加した。遠心して沈澱を回収し、７５％エタノールで沈澱を洗浄し乾燥して１００μlの加熱滅菌した純水に溶解した。１０２μgのＲＮＡが得られた。この溶液に１０％ＳＤＳを１μl添加し１００μlの「Oligotex-dT30( 宝酒造製)」を添加し６５℃で５分間保温した後、氷中にて急冷した。この溶液に２０μlの５M塩化ナトリウムを混合し３７℃で１０分間保温した。この懸濁液を１５,０００rpmで１５分間遠心し、沈澱を１００μlの加熱滅菌した純水に懸濁し６５℃で５分間保温した。この懸濁液を１５,０００rpmで１５分間遠心した上清を回収してエタノール沈澱を行った。乾燥した沈澱を２０μlの加熱滅菌した純水に溶解し、ＨＵＶＥＣポリ(Ａ)+ＲＮＡとした。以下この溶液を用いファルマシアのcＤＮＡ合成キットを用い、マニュアルに従ってoligo(dT)プライミングのＨＵＶＥＣ２重鎖cＤＮＡ溶液１００μlを得た。
【００１７】
・ＫＤＲ細胞外領域(ＥＤＫ)の部分断片をコードするＤＮＡのクローニング  上記で得たＨＵＶＥＣ由来cＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行った 。
【００１８】
【表１】
反応液組成（５０μｌ中）：          ＰＣＲの反応条件
5μl LA-PCR buffer （宝酒造製）    1)  ９５℃、１.５分を１サイクル
0.25 mM dNTPs                      2)  ９５℃、１分、５８℃、１分、
200 nM プライマー1                     ７２℃、２.５分を３５サイクル
200 nM プライマー2                 3)  ７２℃、５分を１サイクル
1μl  HUVEC cDNA
0.5 U LA-Taq polymerase（宝酒造製）
【００１９】
上記反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
プライマー1: 5'-TTCTCGGATCCTATAAATATGGAGAGCAAGGTGCTGCTGGCCGTC-3'
プライマー2: 5'-TTCTCGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACGCTCTAGGACTGTGAGCTG-3'
「プライマー1」の下線部はＫＤＲのＮ末端コーディング配列に、「プライマー2」の下線部はＫＤＲの第６イムノグロブリン様ドメインのＣ末端コーディング配列に対応する。
【００２０】
反応液５０μlからミネラルオイルを除くために等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、１０％ＳＤＳを１μl添加し、６０℃で５分間保温した。この溶液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層を回収し、エタノール沈澱してＤＮＡ断片を回収した。乾燥した沈澱を３０μlのＴＥに溶解し、アガロースゲル電気泳動にかけた。およそ２.０KbpのＤＮＡ断片を切り出し、「Prep-A-Gene」(バイオラッド製)を使用しマニュアルに従いＤＮＡ断片を回収した。次にこのＤＮＡ断片をBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し 、水層から「Prep-A-Gene」を用いてBamHI消化ＤＮＡ断片を回収した。このBamHI消化ＤＮＡ断片に対して「T4ポリヌクレオチドキナーゼ(T4 Polynucleotide Kinase)」(宝酒造製)を用いて、５'末端のリン酸化を行った。この反応液から等量のＴＥ飽和フェノールで処理した水層を回収し、エタノール沈澱し５'末端リン酸化BamHI消化ＤＮＡ断片を回収した。
【００２１】
同様にプラスミドベクターpＵＣ１１８ HincII／BAP処理済みＤＮＡ(宝酒造製)１μgをBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、その水層から「Prep-A-Gene」を用いてBamHI消化pＵＣ１１８ HincII／BAP処理済みＤＮＡを回収した。このようにして得られたＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡを１０：１のモル比で混合し、ライゲーション(ライゲーションキット、宝酒造製)を行った。このライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル(宝酒造製)を形質転換し、７５μg／mlのアンピシリンを含む２ｘＴＹ培地(１ｌ中１６gトリプトン、１０g酵母エキス、５g塩化ナトリウム、１.５ｇ寒天)にプレーティングし３７℃で一夜培養した。出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝で突き、５０μg／mlのアンピシリンを含む１０mlの２ｘＴＹ培地で３７℃で１夜培養し、回収した菌体からアルカリ法(「J. Sambrook,et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989」の方法に従った)でプラスミドＤＮＡを抽出し、「pＥＤＫＨ８」と名付けた。
このようにして得られたＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡを１０：１のモル比で混合し、ライゲーションを行った。このライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、７５μg／mlのアンピシリンを含む２ｘＴＹ培地にプレーティングし３７℃で一夜培養した。出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝で突き、前述のＰＣＲ反応液から鋳型を除いた溶液１５μlに移し、サイクル数を３０回にして前述と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルで電気泳動し、２.０Kbpのバンドを与えるコロニーから更にシングルコロニーを単離し、「pＥＤＫＨ２２」と名付けた。このプラスミドＤＮＡを、プライマー1あるいはプライマー2を用いてシーケンシング(「Molecular Cloning」の方法に従った)を行い、上流および下流から約１５０塩基の配列を調べたところ、ＫＤＲ細胞外領域(ＥＤＫ)コーディングＤＮＡの塩基配列と一致した。
【００２２】
・第１〜第３イムノグロブリン様ドメインを発現する組換えバキュロウイルスの作成用組換えトランスファーベクターの構築
上記のようにして得られたプラスミド「pＥＤＫＨ２２」を鋳型として、以下の条件でＰＣＲを行った。
【００２３】
【表２】
反応液組成（５０μｌ中）：          ＰＣＲの反応条件
5μl LA-PCR buffer （宝酒造製）    1) ９５℃、１.５分を１サイクル
0.25 mM dNTPs                      2) ９５℃、１分、５８℃、１分、
200 nM プライマー1                    ７２℃、２.５分を３５サイクル
200 nM プライマー3                 3) ７２℃、５分を１サイクル
1μl  HUVEC cDNA
0.5 U LA-Taq polymerase（宝酒造製）
【００２４】
上記反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
プライマー3: 5'-TTCTCGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGATTCCATGCCACTTCC-3'
「プライマー3」の下線部はＫＤＲの第３イムノグロブリン様ドメインのＣ末端コーディング配列に対応する。
【００２５】
反応液５０μｌからミネラルオイルを除くために等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、１０％ＳＤＳを１μｌ添加し、６０℃で５分間保温した。この溶液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層を回収し、エタノール沈澱しＤＮＡ断片を回収した。乾燥した沈澱を３０μｌのＴＥに溶解し、アガロースゲルで電気泳動した。およそ１.０ＫｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、「Prep-A-Gene」を使用しマニュアルに従いＤＮＡ断片を回収した。次にこのＤＮＡ断片をBamHIおよびEcoRIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層から「Prep-A-Gene」を用いてBamHI、EcoRI消化ＤＮＡ断片を回収した。
【００２６】
同様に組換えバキュロウイルス用トランスファーベクターであるプラスミドpＶＬ１３９３、１μgをBamHIおよびEcoRIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層から「Prep-A-Gene」を用いてBamHI、EcoRI消化pＶＬ１３９３断片を回収した。
このようにして得られたＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡを１０：１のモル比で混合し、ライゲーションを行った。このライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換し、７５μg／mlのアンピシリンを含む２ｘＴＹ培地にプレーティングし３７℃で一夜培養した。出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝で突き、前述のＰＣＲ反応液から鋳型を除いた溶液１５μlに移し、サイクル数を３０回にして前述と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、１.０kbpのバンドを与えるコロニーから更にシングルコロニーを単離し、「pbＥＤＫ１３」と名付けた。
【００２７】
「pＥＤＫＨ２２」もしくは「pbＥＤＫ１３」を持つ大腸菌を５０μg／mlのアンピシリンを含む１００mlの２ｘＴＹ培地で３７℃で１夜培養し、回収した菌体からアルカリ法でプラスミドＤＮＡを抽出し、マニュアルに従ってイオン交換カラム(Diagen GimbH、QIAGEN製)で精製し、各々２００μlのＴＥに溶解した約１００μgのプラスミドＤＮＡを得た。
【００２８】
・ＥＤＫの部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成
ＴＭＮ−ＦＨ培地(PharMingen製)で培養した８０％コンフルエンシーの状態のＳf9細胞(Invitrogen Corp.製)をピペッティングで剥し、２ｘ１０6個の細胞を直径３５mmのディッシュに撒き３０分放置して表面に吸着させた後、培地を無血清培地であるＥx−Ｃellｌ４００(岩城硝子製)１.５mlに交換した。１２μl中に「pbＥＤＫ１３」４μl(２μg)、欠失バキュロウイルスＤＮＡ(BaculoGold、PharMingen製)２μl(２０ng)を混合した溶液とリポフェクチンを滅菌純水で２倍希釈した溶液１２μlを混合し１５分放置した後、全量２４μlを前述のディッシュに添加し混合した。このディッシュを湿潤箱に入れ２７℃で１昼夜静置培養した後、培地を２.５mlのＴＭＮ−ＦＨに置換し２７℃で４日間静置培養した。培地を回収し遠心した上清をオリジナルウイルスストックとし、この組換えウィルスを「ＢＥＤＫ１３Ｍ」と名づけた。「Invitrogen corp.」のマニュアルに従いプラークアッセイを行った結果、これらのウイルスタイターはおよそ３ｘ１０6であった 。得られたオリジナルウイルスストックを用い、「Invitrogen corp.」のマニュアルに従って３段階に増幅したウイルス溶液約３０ml(タイターはおよそ５ｘ１０7／ml)を得た。
【００２９】
同様にして、「pＥＤＫＨ２２」を用い組換えウイルス「ＢＥＤＫ１６」を作成した。
【００３０】
＜組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞発現産物の解析＞
・125Ｉ−ＶＥＧＦ165との共有結合架橋産物
Ｓf9細胞に組換えウイルス「ＢＥＤＫ１３Ｍ」をm.o.i.５(m.o.i.とはウイルス粒子：細胞数の比のこと)で感染させ、７日間培養した培養上清に125Ｉ−ＶＥＧＦ165(100,000cpm/ng、Amersham製）を２００,０００cpm添加し、１００μlのＰＢＳ−０.１％ＢＳＡ中で室温で１.５時間置いた。この溶液に２５mM ジサクシニルスベレート(disuccinylsuberate)／ジメチルスルホキシド(dimethylsulfoxide)／ＰＢＳ溶液を４μl添加し室温で４０分間置いた後、1M Tris-HCl(pH6.8)を１／１０容混合した。このサンプルについてレムリ法、非還元条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、オートラジオグラフィによりシグナルを検出した結果、分子量９８,０００の共有結合架橋産物が検出できた。
【００３１】
ＶＥＧＦ165２量体の分子量が４２,０００であるので、共有結合架橋産物の分子量９８,０００から差し引くと、５６,０００である。アミノ酸配列から予想される分子量は約５６,０００であり、このことから、「ＢＥＤＫ１３Ｍ」を感染させた細胞はＥＤＫの第１〜第３イムノグロブリン様ドメインからなるポリペプチドを発現していることが確認された。「ＢＥＤＫ１３Ｍ」から発現されるポリペプチドを「ＥＤＫ１３」と名づけた。
得られた培養上清を０.０５％アジ化ナトリウム、ＰＢＳで５０倍希釈し、１００μl／wellずつ９６穴プレートに添加し４℃で１晩放置した後、１％ＢＳＡ、０.０５％アジ化ナトリウム、ＰＢＳでブロッキング(室温で３時間)した。
０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで３倍／７段階希釈したＶＥＧＦ165(Ｒ＆Ｄ社製)溶液(終濃度６.２ng／ml〜８.５pg／ml)を１００μl／wellずつ添加し、室温で１時間放置した後、０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄した。
ヒトＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体(特願平０７−１６２８４１に従って作成)を１００μl／wellずつ添加し、室温で１時間反応させた後、０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ抗体を１００μl／wellずつ添加し、室温で１時間反応させ、０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで６回洗浄した後、０.１２５％(w／v)オルトフェニレンジアミン、０.００９％過酸化水素、１０mM酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.２)を１００μl／wellずつ添加し、室温で４５分間反応させた。２N硫酸を１００μl／wellずつ入れ、反応を停止させた後、６５０nmの吸光度に対する４９０nmの吸光度をプレートリーダー(Flow Titretek Multiskan PLUS MK11、ＩＣＮ社製)で測定した（図１）。図１において●は可変量のＶＥＧＦ165を加えたときに得られた吸光度を、○は０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳだけを加えた対照の吸光度である。ＶＥＧＦ165を加えたときに得られる吸光度は、ＶＥＧＦ165の濃度に依存して増加した。
【００３２】
○実施例２
＜ＦＬＴ−１細胞外領域をＶＥＧＦ受容体とするヒト型ＶＥＧＦ拮抗阻害剤スクリーニング方法でのＶＥＧＦ165結合＞
・ＦＬＴ細胞外領域(ＥＤＦ)と反応するポリクローナル抗体の作成
・ＦＬＴ細胞外領域(ＥＤＦ)コーディングＤＮＡのクローニング
前記で得たＨＵＶＥＣ由来cＤＮＡを鋳型として以下の条件でＰＣＲを行った。
【００３３】
【表３】
反応液組成（１００μｌ中）          ＰＣＲの反応条件
10 μｌTaq buffer（Promega社製）   1)  ９５℃、１分を１サイクル
2.5 mM MgCl2                        2)  ９４℃、１分、５６℃、１分、
0.1 mM dNTPs                            ７２℃、２.５分を３４サイクル
200 nM プライマー4                  3)  ７２℃、７分を１サイクル
200 nM プライマー5
2.5 U Taq ポリメラーゼ（Promega社製）
【００３４】
上記反応に用いたプライマー配列は以下の通り。
プライマー4: 5'-CTCGGATCCGGATCTAGTTCAGGTTCAAAA-3'
プライマー5: 5'-CTCGAATTCACTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3'
「プライマー４」の下線部は成熟ＦＬＴのＮ末端コーディング配列に、「プライマー５」の下線部は、ＦＬＴ細胞外領域Ｃ末端コーディング配列に対応する。
【００３５】
反応液２００μlをミネラルオイルを除くために等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、１０％ＳＤＳを４μl添加し、６０℃で５分間保温した。この溶液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理した水層を回収し、エタノール沈澱しＤＮＡ断片を回収した。乾燥した沈澱を３０μlのＴＥに溶解し、アガロースゲル電気泳動にかけた。およそ２.２kbpのＤＮＡ断片を切り出し、「Prep-A-Gene」(BIORAD製)を使用しマニュアルに従いＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ断片をHincII、HindIII、HhaIまたはPstIで消化し、切断パターンがＦＬＴ細胞外領域コーディングＤＮＡの塩基配列から予想されるパターンと一致することを確認した。次にこのＤＮＡ断片をEcoRIおよびBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、水層から「Prep-A-Gene」を用いてEcoRI、BamHI消化ＤＮＡ断片を回収した。同様にプラスミドベクターpＧＥＸ２Ｔ(ファルマシアバイオシステム製)１μgをEcoRIおよびBamHIで消化し、その反応液を等量のＴＥ飽和フェノールで処理し、その水層から「Prep-A-Gene」を用いてEcoRI、BamHI消化pＧＥＸ２ＴＤＮＡを回収した。
【００３６】
このようにして得られたＤＮＡ断片とプラスミドＤＮＡを１０：１のモル比で混合し、ライゲーション(ライゲーションキット、宝酒造製)を行った。このライゲーション溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル(宝酒造製)を形質転換し、７５μg／mlのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地(１l中１６gトリプトン、１０g酵母エキス、５g塩化ナトリウム、１.５g寒天)にプレーティングし３７℃で一夜培養した。出現するアンピシリン耐性コロニーを爪楊枝で突き、前述のＰＣＲ反応液から鋳型を除いた溶液１５μlに移し、サイクル数を３０回にして前述と同様にＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動し、２.２kbpのバンドを与えるコロニーから更にシングルコロニーを
単離し、少量の培養液からプラスミドＤＮＡを調製した。("Molecular Cloning"の方法に従った。）これらのプラスミドＤＮＡをBamHIおよびEcoRIで消化し、２.２kbpのＤＮＡ断片が生じることを確認した。これらのプラスミドＤＮＡの一つを前記「primer4」あるいは「primer5」を用いて配列決定を行い("Molecular Cloning"の方法に従った)、上流および下流から約１５０塩基の配列を調べたところ、ＦＬＴ細胞外領域(ＥＤＦ)コーディングＤＮＡの塩基配列と一致した。
【００３７】
＜ＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドの調製＞
前述の塩基配列の一部を確認したプラスミドを有する大腸菌クローンを５００mlの５０μg／mlアンピシリンを含む２×ＴＹ培地で、３０℃で振とう培養を行い、波長６００nmの吸光度が１.０に達した時にＩＰＴＧを０.１mMとなるように添加し、更に２０時間培養した。遠心して細胞を回収し、グルタチオンセファロース(ファルマシアバイオシステム)を用いてマニュアルに記載された方法に従って、純度６０％程度のＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドを約７.１mg調製した。レムリ法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結果、この融合ポリペプチドは分子量６０,０００であり、ＧＳＴの分子量２８,０００を差し引くと融合ポリペプチドの相手の分子量は３２,０００程度である。グルタチオンセファロースに結合することからＧＳＴ部分はほとんど分解していないと考えられるので、ＥＤＦのＮ末端側が分子量３２,０００程度残り、ＥＤＦの後半部が欠失していると考えられた。
【００３８】
＜ＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドに対する抗体の調製＞
上記で調製したＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドをフロイントコンプリートアジュバントと混合し、ウサギ１羽につきＧＳＴ−ＥＤＦ融合ポリペプチドを初回２００μg、以後２週間ごとに１００μgずつ、７回皮下に免疫した。抗原をコートしたプレートによって力価測定を行った結果、血清を６４,０００倍以上希釈しても十分な免疫反応があった。ウサギ２羽の血清から「E. Harlow and D. Lane」の「Antibodies」に記載された方法に従い、１５０mgのＩgＧ画分を得た。
【００３９】
＜ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成＞
・ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成用組換えトランスファーベクターの構築
プラスミドpflt３−７(M. Shibuya et al., Oncogene, 5:519 (1990))を鋳型として以下の条件でＰＣＲを行った。
【００４０】
【表４】
0003690100.tif 000002
【００４１】
上記反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
プライマー6:5'-TTTCTCGGATCCTATAAATATGGTCAGCTACTGGGACACC-3'
プライマー7:5'-GTGGTGGTGGTGGTGGTGACGCTCCAGATTAGACTTGTCCGA-3'
「プライマー６」の下線部は成熟ＦＬＴのＮ末端コーディング配列に、「プライマー７」の下線部は、ＦＬＴ細胞外領域Ｃ末端コーディング配列に対応する。
【００４２】
またポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ断片を得るために、プラスミドpＲc／ＲＳＶ(Invitrogen corp.製)を鋳型として牛成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ(０.３kbp)を得るために以下の条件でＰＣＲを行った。
【００４３】
【表５】
0003690100.tif 000003
【００４４】
上記反応に用いたプライマー配列は以下の通りである。
プライマー8:5'-CACCACCACCACCACCACTAACTAGAGCTCGCTGATC-3'
プライマー9:5'-TTCTCGAATTCTCCCCAGCATGCCTGC-3'
「プライマー８」「プライマー９」の下線部は、pRc/RSVのウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニレーションシグナルの前後に対応する。
【００４５】
得られた各々の反応液 200μlを等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、0.5%SDS、0.1M Tris-HCl(pH6.8)、5 mM EDTA、200μg/mlプロテネースＫ(proteinase K)となるように各試薬を添加し、３７℃で３０分間保温した。これらの溶液をＴＥ飽和フェノールで処理し、水層をエタノール沈澱し、ＥＤＦをコードするＤＮＡ断片およびポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡをＴＥに溶解した。これらのＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、各々から２.２kbp、０.３kbpのＤＮＡ断片を回収し、各々５０μlのＴＥ溶液とした。次にこれらのＤＮＡ断片をＰＣＲにより融合させる(R. Higuchi, "PCR Protocols", Academic Press Inc.,177 (1990)参照)ために以下の条件でＰＣＲを行った。
【００４６】
【表６】
反応液組成（１００μｌ中）：         反応条件
10μl Pfu buffer #1 (Stratagene)    1) ９５℃  １分        ３サイクル
4μl EDF coding DNA                   ５８℃  １分
0.25 μl poly A signal DNA             ７５℃  ０．５分
0.1 mM dNTPs                        2) ９４℃  １分      ３０サイクル
200 nM  プライマー6                    ５５℃  １分
200 nM  プライマー9                    ７５℃  ０．５分    １サイクル
5 U Pfu polymerase (Stratagene)     3) ７５℃  ５分
【００４７】
得られた反応液 200μlを等量のクロロフォルムで処理し、水層を回収し、0.5%SDS、0.1M Tris-HCl(pH6.8)、5 mM EDTA、200μg/mlプロテネースＫとなるように試薬を添加し、３７℃で３０分間保温した。この溶液をＴＥ飽和フェノールで処理し、水層をエタノール沈澱し、ＤＮＡをＴＥに溶解した。このＤＮＡ溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、ＥＤＦをコードするＤＮＡ断片とポリアデニレーションシグナルを含むＤＮＡ断片が融合したと考えられる２.５kbpのＤＮＡ断片を回収し５０μlのＴＥ溶液として調製した。このＤＮＡ断片の両端をBamHIおよびEcoRIで消化したＤＮＡ断片を調製した。一方組換えバキュロウイルス用トランスファーベクターであるプラスミドpＶＬ１３９３(PharMingen社)の１μgをBamHIおよびEcoRIで切断したものを調製した。このプラスミドＤＮＡとプラスミドpflt３−７からＰＣＲにより増幅したＥＤＦをコードするＤＮＡ断片をBamHIおよびEcoRIで消化したＤＮＡ断片をモル比およそ１：５で混合し、ライゲーションキット(宝酒造製)で処理し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに形質転換し、組換えプラスミドを有するクローンを６種選択した。各クローンの３mlの培養液からアルカリ法でプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行い、挿入断片の上流約３００塩基と下流約５００塩基を調べたところ正しい配列は２種類のクローン由来のプラスミドであった。これらのプラスミドを「pＥＤＦＨ１０」および「pＥＤＦＨ１１」と名付けた。これらのプラスミドを持つ大腸菌を５０μg／mlのアンピシリンを含む１００mlの２×ＴＹ培地で３７℃で１夜培養し、回収した菌体からアルカリ法("Molecular Cloning"の記載に従う）でプラスミドＤＮＡを抽出し、マニュアルに従ってイオン交換カラム(Diagen GimbH、QIAGEN社製)で精製し、各々２００μlＴＥに溶解した約１００μgのプラスミドＤＮＡを得た。
【００４８】
＜ＥＤＦおよびその部分断片を発現する組換えバキュロウイルスの作成＞
ＴＭＮ−ＦＨ培地(PharMingen社製)で培養した８０％コンフルエンシーの状態のＳf9細胞(Invitrogen Corp.社製)をピペッティングで剥し、２×１０6個の細胞を直径６０mmのディッシュに撒き３０分放置して表面に吸着させた後、培地を無血清培地であるＥx−Ｃellｌ４００(岩城硝子製)２mlに置換した。「pＥＤＦＨ１０」または「pＥＤＦＨ１１」を８μl(４μg)、欠失バキュロウイルスＤＮＡ(BaculoGold、PharMingen社製)２μl(４０ng)を１６μl中に混合した溶液と、リポフェクチンを滅菌純水で２倍希釈した溶液１６μlとを混合し１５分放置した後、全量３２μlを前述のディッシュに添加し混合した。このディッシュを湿潤箱に入れ２７℃で６時間３０rpmで振とう培養した後、培地を２.５mlのＴＭＮ−ＦＨに置換し２７℃で５日間静置培養した。培地を回収し遠心した上清をオリジナルウイルスストック（それぞれ「ＢＥＤＦＨ１０」「ＢＥＤＦＨ１１」と称する)とした。「Invitrogen corp.」のマニュアルに従いプラークアッセイを行った結果、これらのウイルスタイターは共におよそ３×１０6であった。各々のウイルスについて２クローンずつ(「ＢＥＤＦＨ１０」からは「ＢＥＤＦＨ１０１」「ＢＥＤＦＨ１０２」、「ＢＥＤＦＨ１１」からは「ＢＥＤＦＨ１１１」「ＢＥＤＦＨ１１２」)プラーク単離を行い、Invitrogen corp. のマニュアルに従って４段階に増幅したウイルス溶液約２００ml(タイターはおよそ５×１０7／ml)を得た。
【００４９】
＜組換えウイルス感染Ｓf9細胞発現産物の解析＞
・125Ｉ−ＶＥＧＦ121との共有結合架橋産物
上記の組換えウイルスをm.o.i.０．３で感染させたＳf9細胞２×１０5に、125Ｉ−ＶＥＧＦ121(150,000cpm/ng)を１８０,０００cpm添加し、１００μlのＰＢＳ−０.１％ＢＳＡ中で室温で１時間置いた。遠心により２回、同バッファーで洗浄し、再度１００μlのＰＢＳ−０.１％ＢＳＡに懸濁した。この溶液に５０mMジサクシニルスベレート(disuccinylsuberate)／ジメチルスルホキシド(dimethylsulfoxide)を１／１０溶混合し室温で４０分間置いた後、1M Tris-HCl(pH6.8)を１／１０溶混合した。このサンプルをレムリ法で還元条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、オートラジオグラフィによりシグナルを検出した。
プラスミド「pＥＤＦＨ１０」を用いて作成した組換えウイルスである「ＢＥＤＦＨ１０」から分離した２クローンの感染細胞では、分子量１３０,０００の共有結合架橋産物が検出できたのに対して、プラスミド「pＥＤＦＨ１１」を用いて作成した組換えウイルスである「ＢＥＤＦＨ１１」から分離した２クローンの感染細胞では分子量５０,０００の共有結合架橋産物が観察された。一方、ＥＤＦをコードするＤＮＡをプロモーターとは逆向きに挿入した組換えトランスファーベクターを用いて作成したコントロールウイルス感染細胞では共有結合架橋産物は検出できなかった。ＶＥＧＦ121モノマーの分子量が２０,０００であるので、それぞれの共有結合架橋産物の分子量から差し引くと、１１０,０００と３０,０００である。このことから「ＢＥＤＦＨ１０」感染細胞はＥＤＦの全長を生産しており「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞はＥＤＦの断片を発現していると考えられた。「ＢＥＤＦＨ１１」から発現されるＥＤＦの断片を「ＥＤＦΔ１１」と名付けた。
【００５０】
＜ＶＥＧＦとの親和性＞
Ｓf9細胞に組換えウイルス「ＢＥＤＦＨ１０」あるいは「ＢＥＤＦＨ１１」をm.o.i.５で感染させ、７日間培養した培養上清をマイクロタイタープレート(イムロン２、ダイナテック社製)のウェルに１００μl入れ４℃で一夜置いた。その後ウェルの中の液を捨て、ＰＢＳ−０.１％ＢＳＡで３回洗浄し、次にＰＢＳ−１％ＢＳＡを２５０μl入れ、室温で２時間放置しブロッキングした。ウェルの中の液を捨て、１００μl中に比活性78,000cpm/ngの125Ｉ−ＶＥＧＦ165（アマシャム社製）１１３００cpmに非標識のＶＥＧＦ165を０〜１２５００pg混合した溶液を入れ室温で３時間放置した。ウェルの中の液を捨てＰＢＳ−０.１％ＢＳＡで３回洗浄し、各ウェルに残った放射活性をγカウンターで測定しスカッチャード解析を行った。この時にコントロールウイルス感染Ｓf9細胞の培養上清でコートしたプレートには125Ｉ−ＶＥＧＦ165ほとんど結合しないので、結合放射活性は挿入遺伝子からの発現産物への125Ｉ−ＶＥＧＦ165の結合であると考えられる。「ＢＥＤＦＨ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞の培養上清中の発現産物のＶＥＧＦ165に対する親和性は共にＫd(解離定数)がおよそ５×１０-11でありＦＬＴ(J. Waltenberger, et al., J. Biol. Chem., 269:26988 (1994)) あるいは可溶性型ＦＬＴ(R. L. Kendal and K. A. Thomas, Proc. Natl., Acad. Sci., U. S. A., 90:10705 (1993))について報告されている値に近かった。
【００５１】
＜組換えトランスファーベクターへの挿入ＤＮＡの塩基配列解析＞
プラスミド「pＥＤＦＨ１０」および「pＥＤＦＨ１１」にクローニングしたＤＮＡの塩基配列を確認するために塩基配列の決定を行った結果、「pＥＤＦＨ１０」の挿入ＤＮＡのＦＬＴ細胞外領域と対応する領域の塩基配列はＦＬＴと完全に一致していた。「pＥＤＦＨ１１」の挿入ＤＮＡのＦＬＴ細胞外領域と対応する領域の塩基配列はＦＬＴと比較して８０７番目のＣが欠失していた。その結果、オープンリーディングフレームがＦＬＴ細胞外領域のＮ末端から２７６アミノ酸に対応する部分になっていた。そのうち２６７アミノ酸がＦＬＴのアミノ酸配列と一致する。この２６７アミノ酸はＦＬＴの第１ドメインの全てと第２ドメインの大半を含む。
【００５２】
＜発現産物の精製＞
１００mlの三角フラスコに３０mlＴＭＮ−ＦＨを入れ２７℃、７０rpmで培養したＳf9細胞９０ml(１.５×１０6／ml)に組換えウイルス「ＢＥＤＦＨ１０」または「ＢＥＤＦＨ１１」をm.o.i.５で感染させ、２０時間後に遠心して培地を６０ml(３０ml×２)のＥx−Ｃellｌ４０５(岩城硝子製)に置換して４８時間培養し、１／１００溶の３３０mMフェニルメチルスルフォニルフルオライド(phenylmethylsulfonyl fluoride)／エタノールと１／１０００溶の100μg／mlアンチパイン(antipain)、200μg／mlアプロチニン(aprotinin)、200μg／mlロイペプチン(leupeptin)を添加し上清を回収した。「ＢＥＤＦＨ１０」感染細胞の培養上清は「Immercible CX-10」(日本ミリポアリミテッド製)で８倍濃縮し、20 mM Tris-HCl(pH7.8)／50 mM KCl／0.1% ノニデット(Nonidet)P-40／1 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)で平衡化したNi++-NTA（QIAGEN、Diagen GimbH）を添加して４℃で１時間混合した。１０,０００rpmで遠心して沈澱に３０mlの150 mM KCl／0.1% ノニデット P-40/40 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を添加し４℃で１５分間混合し、遠心して沈澱を回収し、更に２回同バッファーで洗浄した。沈澱に０.２mlの250 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を添加し室温で１５分間混合し遠心して上清を回収した。再度沈澱に０.２mlの250 mM イミダゾール-塩酸(pH7.8)を添加し同様にして上清を回収し、前回の上清と併せて精製ＥＤＦサンプルとした。「ＢＥＤＦＨ１１」感染細胞の培養上清は０.３MになるようＮaＣlを添加してＦＰＬＣ(ファルマシアバイオシステム製)でヘパリンカラム(ファルマシアバイオシステム製)を用いて分画した。サンプル負荷のあと０.１Mリン酸バッファー(pＨ７.０)−０.３M ＮaＣlで２８０nmの吸光度が十分下がるまで洗浄し、０.３−１.０M ＮaＣlのリニアグラディエントで溶出した。２８０nmの吸収がある画分を回収しＶＥＧＦアフィニティクロマトグラフィーを行った。ＰＢＳでサンプルを２倍に希釈して、１．４mgのＶＥＧＦをセファロース４Ｂに共有結合したカラム０.４mlに負荷した。２０mlのＰＢＳ−０.５M ＮaＣlでカラムを洗浄し、１０mM酢酸ナトリウム(pＨ４.０)で、０.０５mlの２Ｍ Tris-HCl(pH8.0)を入れたチューブに０.５ml／チューブで溶出した。各フラクションをレムリ法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色した。また各フラクションをＰＢＳ−０.１％ＢＳＡで１０倍希釈して、等溶の125Ｉ−ＶＥＧＦ165と混合し、１時間後に１００μlの混合液を先に使用したマイクロタイタープレートでＶＥＧＦの結合を調べた。その結果、電気泳動で共有結合架橋実験での予想とほぼ一致する分子量３５,０００バンドが観察されたフラクションにＶＥＧＦの結合阻害が見られた。
【００５３】
＜免疫化学的解析＞
ＥＤＦあるいは「ＥＤＦΔ１１」をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、「E. Harlow and D. Lane」の「Antibodies」に記載の方法に従ってウェスタンブロティングを行った。１次抗体として先の抗体を２μg/mlで使用し、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩgＧ(E. Y. Laboratories )を５０００倍希釈して使用し、ＮＴＢ(Nitroblue tetazolium chrolide)／ＢＣＩＰ(5-Bromo-4-chrolo-3-indolylphosphste p-toluidine salt)(Gibco BRL社製)で発色させた。その結果、約３５kdの単一バンドが観察され、この抗体との特異的な反応性が確認された。以上のことから「ＥＤＦΔ１１」はＦＬＴのＮ末端２６７に相当するポリペプチドであることがわかった。
【００５４】
＜ＶＥＧＦの生物活性の阻害＞
ＶＥＧＦによるヒト臍帯由来血管内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)のチミジン取り込み促進に対する「ＥＤＦ」発現培養上清、「４Ｎ−ＦＬＴ」発現培養上清または「ＥＤＦΔ１１」発現培養上清による阻害を調べた。ＨＵＶＥＣ(クラボウ社製)を９６穴コラーゲンコートプレート(岩城硝子製)に３０００個／ウェル／１００μl(ＥＧＭ−ＵＶ培地、クラボウ製)で撒き、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養する。ＰＢＳで２回洗浄し、２０ng／mlのＶＥＧＦ165を５０μlとサンプル５０μlをウェルに添加して４日間培養した。５０μＣi／２nmoles／mlの3Ｈ−チミジンを１０μlウェルに添加して更に２４時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥し、セルハーベスター(Cambridge Technology Inc.製)でグラスフィルターに回収し液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。対照として用いた野生株(wt)ウイルス感染培養上清をサンプルとして添加した場合に比べ、組換えウイルスを用いた「ＥＤＦ」「４Ｎ−ＦＬＴ」「ＥＤＦΔ１１」発現培養上清を添加した場合は、有意にＶＥＧＦ依存性チミジン取り込みが阻害された。この結果から「ＥＤＦ」「４Ｎ−ＦＬＴ」または「ＥＤＦΔ１１」は、ＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣのチミジン取り込みの促進、即ちＤＮＡ合成の促進を阻害することが明らかになった。
精製したＦＬＴ−１細胞外領域溶液を０.０５％アジ化ナトリウム、ＰＢＳで１００ng／mlに調製し、１００μl／wellずつ９６穴プレートに添加してＶＥＧＦ受容体コートプレートを作成し、実施例１と同様の操作を行った(図２)。図２において●は可変量のＶＥＧＦ165を加えたときに得られた吸光度を、○は０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳだけを加えた対照の吸光度である。実施例１と同様に、ＶＥＧＦ165を加えたときに得られる吸光度は、ＶＥＧＦ165の濃度に依存して増加した。
【００５５】
○実施例３
＜実施例１および２におけるＶＥＧＦ特異性＞
リガンドと受容体との結合は抗原抗体反応のように特異性の高いものであるが、ＶＥＧＦはＰｌＧＦやＰＤＧＦと構造上類似していることや、ＶＥＧＦ受容体のＦＬＴ−１やＫＤＲはいずれもＭ−ＣＳＦ受容体であるc−fms遺伝子産物と構造上の類似点があることが知られており、一群の受容体ファミリーを構成していると考えられている。そこで、本発明がＶＥＧＦに特異的であることを確認するために、本スクリーニング方法に各種増殖因子が影響を与えるかを検討した。
ＫＤＲ細胞外領域を含む培養上清または精製したＦＬＴ−１細胞外領域溶液を用いて実施例１及び２で示したようにＶＥＧＦ受容体コートプレートを作成し、０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで希釈した各種増殖因子と０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで終濃度３ng／mlに調製したＶＥＧＦ165溶液を混合した溶液を１００μl／wellずつ添加して室温で１時間放置し、以降は実施例１と同様の操作を行い、吸光度の変化を調べた（図３、４）。図３はＫＤＲ細胞外領域を含む培養上清で作成した受容体コートプレートでの結果であり、図４は精製したＦＬＴ−１細胞外領域溶液で作成した受容体コートプレートでの結果である。その結果、いずれの増殖因子もＶＥＧＦと受容体との結合に影響を与えず、本発明がＶＥＧＦに特異的であることを確認できた。
【００５６】
○実施例４
＜スラミン、ヘパリンによる阻害の測定＞
リガンドであるＶＥＧＦやその受容体はヘパリンに対する結合能を有しており、ＶＥＧＦとその特異的受容体との結合はヘパリンやスラミンによって影響を受けることが知られている(B.I. Terman  et al.,Growth Factors, 11:187, (1994)、T. Cohen et al., J. Biol. Chem., 270:11322,(1995)、H. Gitay-Goren et al., 267:6093, (1992))。
そこで、スラミン及びヘパリンを阻害物質と見立て、本スクリーニング方法にて阻害を測定できるか検討した。
ＫＤＲ細胞外領域を含む培養上清または精製したＦＬＴ−１細胞外領域溶液を用いて実施例１及び２で示したようにＶＥＧＦ受容体コートプレートを作成し、０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで２倍／７段階希釈したスラミン(Ｓigma)(終濃度１２５μg／ml〜１.９５μg／ml)またはヘパリン(Ｓigma)(終濃度１０００μg／ml〜１５.６μg／ml)と０.１％ＢＳＡ、ＰＢＳで終濃度３ng／mlに調製したＶＥＧＦ165溶液を混合した溶液を１００μl／wellずつ添加して室温で１時間放置し、以降は実施例１と同様の操作を行い、ＰＳＢを求めた（図５、６）。図５は可変量のスラミンを加えたときに得られた結果であり、図６は可変量のヘパリンを加えたときに得られた結果である。
図５、６において●はＫＤＲ細胞外領域を含む培養上清で作成した受容体コートプレートでの、○は精製したＦＬＴ−１細胞外領域溶液で作成した受容体コートプレートでのＰＳＢである。その結果、どちらのＶＥＧＦ受容体でも、スラミンは２０μg／ml以上の濃度領域で、ヘパリンは１０μg／ml以上の濃度領域で濃度依存的に阻害を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＤＲ細胞外領域に対するＶＥＧＦ165の結合曲線を示す図である。
【図２】ＦＬＴ−１細胞外領域に対するＶＥＧＦ165の結合曲線を示す図である。
【図３】ＫＤＲ細胞外領域とＶＥＧＦ165との結合における各種増殖因子による影響を示す図である。
【図４】ＦＬＴ−１細胞外領域とＶＥＧＦ165との結合における各種増殖因子による影響を示す図である。
【図５】ＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ165との結合におけるスラミンによる阻害を示す図である。
【図６】ＶＥＧＦ受容体とＶＥＧＦ165との結合におけるヘパリンによる阻害を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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