(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質を発現しうる宿主細胞を流加培養により増殖させて所望タンパク質を生産する方法であって、宿主細胞の比増殖速度を当初の比増殖速度から所定の比増殖速度に切り替えるに際して、その切り替えを、宿主細胞の増殖を支配する基質の添加速度を連続的に変化させることにより行うことを特徴とする前記タンパク質の生産方法。
【請求項２】
宿主細胞が、所望のタンパク質を構成的に発現するか、もしくは誘導物質により増殖可能な場合に所望のタンパク質を実質上構成的に発現する宿主細胞である請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項３】
宿主細胞が、酵母由来の細胞であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項４】
宿主細胞が、メタノール資化性酵母由来の細胞であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項５】
宿主細胞が、ピキア属酵母由来の細胞であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項６】
所望のタンパク質が、宿主細胞に対して異種タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質の生産方法。
【請求項７】
異種タンパク質が、ヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項６に記載のタンパク質の生産方法。
【請求項８】
宿主細胞の増殖を支配する基質が、炭素エネルギー源である請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項９】
炭素エネルギー源がメタノール，グリセリン，ソルビトール，グルコース，フルクトース，ガラクトース，スクロースから選ばれる請求項８記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、ピキア属酵母由来であり、宿主細胞の増殖を支配する基質がメタノール、グリセリンおよびそれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【請求項１１】
宿主細胞が、サッカロマイセス属由来であり、宿主細胞の増殖を支配する基質がガラクトース、スクロースおよびそれらの組合せからなる群から選ばれる請求項１記載のタンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、培養プロセスにおける培地への基質添加速度の制御によるタンパク質の生産方法に関し、かくして、タンパク質の効率的生産が達成される。詳細には、本発明は比増殖速度μを指標とする流加培養系での培養環境の最適化を培地への基質添加速度の制御によって実現し、タンパク質を効率的に生産する方法に関する。
背景技術
現在、商業的に価値のあるタンパク質の多くは、その遺伝子を発現し得る宿主細胞を培養することにより生産されている。
培養技術もしくは遺伝子組換え技術を用いるタンパク質の生産は、培養により宿主細胞が指数関数的に増殖するに伴って所望のタンパク質が産生されることを利用するものであるが、タンパク質の生産性を向上させるためには宿主細胞の働き（細胞の機能）を最も有効に活用できるようにその培養環境を整備または制御する必要がある。このため、培養プロセスの面から、培養生産に適した、すなわち所望のタンパク質を短時間で高い収率、収量をもって生産する方法が種々検討されている。
宿主細胞の比増殖速度と該宿主細胞が産生するタンパク質の量との間には密接な関係があり、該タンパク質の産生量を最大にするためにはその宿主細胞の比増殖速度を至適な値にコントロールすることが必要である。このため、従来より宿主細胞（微生物）の産生量と比増殖速度との関係について種々研究され、数多くのモデルが提案されている。
これらのモデルによると、産生量の増大を図るためには、培養の途中で、細胞の比増殖速度を少なくとも一回異なる比増殖速度に切り替える必要が生じる場合がある（醗酵工学会誌、第70巻、第５号、395−404、1992）。
しかしながら、本発明者らの研究により、このような培養の最適化を図るがゆえの比増殖速度の切り替えによっては、目的生産物の産生量は期待した程上昇しないことが初めて分かった（本明細書、実施例１参照）。
従って、宿主細胞による目的生産物の生産性を向上させるためには、宿主細胞の比増殖速度の切り替えに際して、宿主細胞の機能に影響を与えることなく生産物を効率よく産生させるような培養方法が求められる。
本発明の目的は、流加培養系において、宿主細胞の比増殖速度μを培地への基質の流加速度で制御することにより、短時間で所望のタンパク質を大量に産生し得るタンパク質の生産方法を提供することである。
また、他の面において、本発明は所望のタンパク質を高効率で生産し得る宿主細胞の培養方法を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者らは、フィードバック制御をしないで宿主細胞の比増殖速度μを最適値（目的値）に調整・制御する方法として、流加培養における基質の流加速度と宿主細胞の比増殖速度、ひいては目的生産物（タンパク質）の産生量との関係を検討していたところ、培地への基質の流加速度を連続的に変化させることにより、培養途中での細胞の比増殖速度μの切り替えに際して、細胞の機能および目的生産物の生産量に悪影響を与えることなく、目的生産物の生産性が向上することを見出して本発明を完成した。
即ち、本発明は、宿主細胞、好ましくは所望のタンパク質が構成的に発現するか、もしくは誘導物質により宿主細胞が増殖可能な場合に所望のタンパク質が実質上構成的に発現する宿主細胞を流加培養により増殖させて所望のタンパク質を生産する方法であって、宿主細胞の比増殖速度μを当初の比増殖速度から所定の比増殖速度に切り替えるに際して、その切り替えを、宿主細胞の増殖を支配する基質の添加速度を連続的に変化させることにより行うことを特徴とする所望のタンパク質の生産方法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、メタノールの培地への添加速度の経時的変化を示す図である（実施例１）。
図２は、メタノールの添加速度を連続的に変化させる系（本発明）の比増殖速度μの経時的変化（図ａ）、およびメタノールの添加速度を瞬時に変更する系（対照▲１▼）の比増殖速度μの経時的変化（図ｂ）を示す図である。
図３は、メタノールの添加速度を連続的に変化させる系（本発明−△−）と該添加速度を瞬時に変更する系（対照▲１▼−●−）とで、増殖する菌体濃度を比較した図である。
発明の詳細な説明
本発明において、「所望のタンパク質が構成的に発現する」とは、所望のタンパク質が宿主細胞の生育条件とは無関係に常に発現することを意味する。
また、本発明において「誘導物質により宿主細胞が増殖可能な場合に所望のタンパク質が実質上構成的に発現する」とは、宿主細胞の生育条件とタンパク質の発現との間に何らかの関係があり、宿主細胞の増殖に必要な物質と誘導物質とが同じである場合に、宿主細胞の増殖と同時に所望のタンパク質も発現することをいう。
また、ここで「誘導物質」とは、所望のタンパク質をコードする遺伝子の転写・翻訳を開始させる物質をいい、例えばメタノール、ガラクトース、スクロース等が挙げられる。
本発明で用いられる「所望のタンパク質を発現しうる宿主細胞」（以下、単に宿主細胞という）としては、自然に生じる天然由来の細胞または外来タンパク質を産生することができるように変異した細胞（以下、適宜形質転換細胞ともいう。）が挙げられる。
また、宿主細胞の由来も特に限定されず、例えば、微生物〔細菌（例えば、エシュリキア属菌，バチルス属菌等），酵母（例えば，サッカロマイセス属，ピキア属等）〕等が挙げられる。具体的には、エシュリキア属菌では、エシュリキア・コリ（Escherichia coil、以下、E.coliという）K12DH1,M103,JA221,HB101,X600,XL−1 Blue,JM109などが例示される。バチルス属菌ではバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）MI114,207−21などが、また酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22,AH22R-,NA87−11A,DKD−5D、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。好ましくは、酵母である。
また、宿主細胞として酵母を用いる場合、メタノール資化性（methylotrophic）酵母であってもよい。適切なメタノール資化性酵母としては、ハンセヌラ属またはピキア属に所属するメタノール中で増殖しうる酵母が挙げられるが、これらに限定されない〔The Biochemistry of methylotrophs,269（1982）〕。好ましくは、ピキア属メタノール資化性酵母であり、例えば栄養要求性ピキア・パストリスGTS115（NRRL  Ｙ−15851），ピキア・パストリスGS190（NRRL  Ｙ−18014），ピキア・パストリスPPF1（NRRL  Ｙ−18017）、野生型ピキア・パストリス株（NRRL  Ｙ−11430、NRRL  Ｙ−11431）等が挙げられる。
「宿主細胞」として好ましくは、当該宿主細胞に対して異種である所望のタンパク質（以下、適宜異種タンパク質という）を産生し得る形質転換細胞である。当該細胞は、異種タンパク質のアミノ酸配列をコードし得る外来DNAを有しており、かつ該DNA情報により所望の異種タンパク質を発現・産生する細胞であればよい。また、その取得方法も特に限定されない。例えば、組換えDNA技術を使用して、所望のタンパク質をコードするDNAを担持するプラスミドまたはファージなどで形質転換することによって取得することができる。
本発明でいう「宿主細胞」の一具体例として、HSAを産生する宿主細胞が挙げられるが、当該細胞の調製ならびに該細胞の使用によるHSAの発現・産生は、公知ならびにそれに準じた手法により実施することができる。
具体的には、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭58−56684号、同58−90515号、同58−150517号公報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭62−29985号、特開平１−98486号公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−240191号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−167095号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組み込む方法（特開平３−72889号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−53877号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型AOX2プロモーターを用いる方法（特開平４−299984号公報）、枯草菌によるHSAの発現（特開平62−25133号公報）、酵母によるHSAの発現（特開昭60−41487号、同63−39576号、同63−74493号公報）、ピキア属酵母によるHSAの発現（特開平２−104290号公報）等が例示される。
本発明の方法が対象とする所望のタンパク質は、特に限定されず、上述の天然由来の宿主細胞が産生する該細胞の構成タンパク質、また形質転換細胞が産生する外来タンパク質等いずれのタンパク質であってもよい。
具体的には、宿主細胞の構成タンパク質としてはRNAポリメラーゼ，アクチン，呼吸系または解糖系に関わる酵素等が例示され、また異種タンパク質としてはインターフェロン，ウロキナーゼ，プロウロキナーゼ,t−PA（組織プラスミノーゲン活性化因子）,G−CSF（顆粒球・コロニー刺激因子）,M−CSF（マクロファージ・コロニー刺激因子）,HSA（ヒト血清アルブミン）,IGF（インシュリン様成長因子），尿性トリプシンインヒビター（UTI）等が例示される。好ましくは、HSA,インターフェロン，ウロキナーゼ，プロウロキナーゼ,IGF,UTIであり、より好ましくはHSAである。
また、宿主細胞と異種タンパク質との組合せについても特に制限はなく、適宜組み合わせることができる。例えば、エシュリキア・コリとインターフェロン，サッカロマイセス・セレビシエとプロウロキナーゼ，サッカロマイセス・セレビシエとHSA,ピキア・パストリスとHSA等が挙げられる。
宿主細胞（形質転換細胞）の培養は、流加培養法により、種々の炭素エネルギー源および／または栄養源を含有する培地を用いて行うことができる。すなわち、一定期間、宿主細胞をその増殖に適した炭素エネルギー源および／または栄養源を含有する培地（初期培地）中で培養し、状況に応じてある時点から、宿主細胞の増殖を支配する基質を該培地に追加供給しながら、目的タンパク質を培養終了時まで系外に抜き出さない方法が用いられる（特開平３−83595号公報）。
本発明で「宿主細胞の増殖を支配する基質」とは、宿主細胞を増殖させるのに適した基質をいい、好ましくは炭素エネルギー源となりうるものである。
当該基質としては、メタノール，グリセリン，ソルビトール，グルコース，フルクトース，ガラクトース，スクロース等が例示される。また、これらは１成分に限定されず２成分以上であってもよい。
宿主細胞としてピキア・パストリスを用いる場合の好ましい基質としては、メタノール，グリセリンおよびそれらの組合せからなる群から選択されるものが例示される。宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビシエを用いる場合の好ましい基質はガラクトース，スクロース等、またエシュリキア・コリを用いる場合はラクトース等が例示される。
さらに、培地に添加する基質の態様は、基質そのもの単独であってもよいし、また他の成分（例えば、ビタミン，無機塩等）に配合された組成物の態様であってもよい。また、添加する形態として、固形状、粉体状、顆粒状、液体状等のいずれの形態であってもよいが、好ましくは、速やかに培地に均一に溶解し得る液体状のものである。
宿主細胞の初期培養に用いられる炭素エネルギー源および／または栄養源としては、培養する宿主細胞に応じてそれに適した公知の炭素エネルギー源および／または栄養源が挙げられる。炭素エネルギー源としては、例えばグルコース，グリセリンが挙げられ、栄養源としては、例えば窒素源（例えば、イーストエキストラクト，バクトペプトン、カザミノ酸，アンモニア，リン酸アンモニウム，酢酸アンモニウム等）、ホスフェート源（リン酸，リン酸アンモニウム等）、無機質源その他微量元素（例えば、鉄，亜鉛，銅，マグネシウム，マンガン，カルシウム，モリブデン，コバルトなど）、ならびにビタミン（例えば、ビオチン，パントテン酸，チアミン等）等である。
本発明でいう「基質の添加速度を連続的に変化させる」とは、培養槽に添加する基質の速度を途切れることなく連なり続くように変えることをいう。この結果、宿主細胞の比増殖速度μは当初の比増殖速度から所定の比増殖速度へと緩やかに切り替わる。
本発明でいう「宿主細胞の比増殖速度μ」とは、単位時間（hr），単位細胞量当たりの宿主細胞の増殖量をいい、一般に下式のように表される。
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〔式中、Ｘは菌体濃度（g/L）、Ｖは培地量（Ｌ）、ｔは培養時間（hr）、△XV,△ｔはそれぞれXV,tの変化量を表す。〕
本発明でいう「当初の比増殖速度から所定の比増殖速度に切り替える」とは、宿主細胞の当初の比増殖速度を、流加培養の途中で異なる所定の比増殖速度に変化させることを意味する。好ましい当初の比増殖速度，所定の比増殖速度および切り替え時間（換言すれば、当初の比増殖速度に保たれる時間）は、比増殖速度μと比生産速度ρとの関係から求めることができる（醗酵工学会誌、第70巻、第５号、395−404,1992）。
ここでいう比生産速度ρとは単位時間（hr），単位細胞量当たりのタンパク質の生産の増加量をいい、一般に下式のように表される。
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〔式中、Ｐはタンパク質の生産量（g/L）、Ｖは培地量（Ｌ）、ｔは培養時間（hr）、△PV,△ｔはそれぞれPV,tの変化量を表す。〕
なお、当該切り替えは複数回行ってもよい。
本発明で用いられる培養温度は、培養する宿主細胞に応じてその増殖および所望タンパク質の産生に適した温度であることが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合は20〜46℃、好ましくは36〜38℃であり、酵母の場合は約20〜35℃、好ましくは約23〜30℃であり、枯草菌の場合は28〜40℃、好ましくは36〜38℃である。
また、培地のpHも、培養する宿主細胞に応じてその増殖および所望タンパク質の産生に適したpHを適宜採用することができる。さらに、培養槽の溶存酸素含量は飽和の約10〜70％の範囲で適宜選択採用することができる。
以下、実施例および参考例に基づいて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
実施例１
HSAを発現・産生し得るピキア属酵母UHG42−３株（特開平４−29984号公報にその作成方法が記載されている。）の比増殖速度μを当初の比増殖速度μ’＝0.025から所定の比増殖速度μ''＝0.002に切り替える培養系を用いて、HSAの産生を行った。具体的には、下記の方法で行った。
（１）培養方法
▲１▼前培養
前培養はYPDブロス（２％バクトペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）を用いて行った。詳細には、20％グリセロール中に凍結保存したピキア属酵母UHG42−３株の菌体懸濁液1mL（OD540≒10）を50mLのYPDブロスを含むバッフル付き300mL容三角フラスコに植菌して、30℃にて24時間振盪培養した。
▲２▼本培養
本培養は、一定時間、表１に示す組成からなる培地（初期培地）を用いて回分培養した後、メタノールを図１に示す流加速度で連続的に添加しながら行った。
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詳細には、バッチ培地1.7Lを含む10L容ジャーファーメンター（バイオマスターＤ型、10L）に前培養液を34mL植菌し通気攪拌培養した。培養温度は30℃とした。攪拌速度は900rpmで一定にして回分培養を行った。pHはpH5.85に定値制御した。消泡のため、消泡剤を必要に応じて添加した。
回分培養において初期培地中のグリセロールが全て消費された時点（培養24時間目）からメタノールの添加を開始した。
メタノールの添加速度は、下式に従って制御した〔但し、ｔはメタノール添加開始後の経過時間（hr）を示す。〕。
０≦ｔ＜72のとき、Ｆ（ｔ）＝3.712×exp（0.025×ｔ）                                      （g/hr）
72≦ｔ＜92のとき、Ｆ（ｔ）＝22.456×exp［−0.025×（ｔ−72）］
92≦ｔのとき、Ｆ（ｔ）＝13.62×exp［0.002×（ｔ−92）］
図１にメタノールの添加速度の経時的変化を示す（培養約24〜96時間目は実線、培養約96〜116間目は細かい破線、および培養約116〜360時間目は実線で表される）。
メタノールの添加開始時の培養約24時間目から培養約96時間目まではピキア属酵母の当初の比増殖速度μ’が0.025となるようにメタノールを添加し、ついでメタノールの添加速度を一旦図中細かい破線で示すように穏やかに減少させ、引き続きピキア属酵母の所定の比増殖速度μ”が0.002となるようにメタノールを添加した。
また、比較対照実験として、▲１▼μを0.025から0.002に切り替えるに際して添加速度を瞬時に変更する系での培養、および、▲２▼μを切り替えない系での培養を行った。
▲１▼のμ切り替えに際して、メタノールの添加速度を瞬時に変更する系でのメタノールの添加速度は、下式に従って制御した〔但し、ｔはメタノール添加開始後の経過時間（hr）を示す。〕。なお、当該系のメタノール添加速度の経時的変化は、図１中の実線および太い実線で表される。
０≦ｔ＜72のとき、Ｆ（ｔ）＝3.712×exp（0.025×ｔ）                                      （g/hr）
72≦ｔのとき、Ｆ（ｔ）＝13.086×exp［0.002×（ｔ−72）］
すなわち、メタノールの添加開始時の培養約24時間目から培養約96時間目まではピキア属酵母の当初の比増殖速度μ’が0.025となるようにメタノールを添加し、ついでピキア属酵母の所定の比増殖速度μ”を0.002に切り替えるに際して、メタノールの添加速度を瞬時に変更し、引き続きμが0.002となるように制御した。
また、▲２▼のμを切り替えない系でのメタノールの添加速度は、下式に従って制御した〔但し、ｔはメタノール添加開始後の経過時間（hr）を示す。〕。当該式による制御が、μを切り替えない系での好適な培養方法である。すなわち、μ＝0.015となるようにフィードを開始し、溶存酸素濃度（培養液中に溶け込んでいる酸素濃度）が一定濃度より低くなった時点で定速流加にする方法である。なお、当該系のメタノール添加速度の経時的変化は、図１中の破線で表される。
０≦ｔ＜127のとき、Ｆ（ｔ）＝2.176×exp（0.015×ｔ）＋1.632                               （g/hr）
127≦ｔのとき、Ｆ（ｔ）＝16.253
図２に、メタノールの添加速度を連続的に変化させる系（本発明）でのμの切り替わり方〔図２（ａ）〕と、添加速度を瞬時に変更させる系（比較対照▲１▼）でのμの切り替わり方〔図２（ｂ）〕を比較した結果を示す。
また、各培養の結果として、図３に菌体濃度の経時変化（本発明と比較対照▲１▼）を、また表２に培養終了時点でのHSA産生割合（本発明、比較対照▲１▼および▲２▼）を示す。
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培養後約360時間目の産生HSA量を比較すると、μの切り替えをする場合（本発明、比較対照▲１▼）としない場合（比較対照▲２▼）とでは切り替えをした方がいいが、切り替えをする場合であっても、流加速度の瞬時の変更を実施した場合（比較対照▲１▼）のHSAの産生量（107％）に比べて、流加速度の連続的変化の系を実施した場合（本発明）でのHSAの産生量は156％と大きく、μの切り替えに際して基質（メタノール）の添加速度を連続的に変化させることにより、所望のタンパク質（HSA）の産生量が向上することが判明した。
実施例２
本培養に際してメタノールの代わりに表３に記載のフィード培地を用いることのみを異にして、あとは実施例１と同じ方法で培養を行った。
その結果、実施例１と同様な結果が得られた。
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参考例１  菌体濃度の測定
任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で測定時のOD540値が0.3以下となるように希釈したのち、分光光度計（UV2200型、島津製作所）を用いて540nmにおける吸光度を測定し、その値に希釈率をかけて、培養液の吸光度とした。さらに、OD540/5.6を指標として、該吸光度から乾燥菌体濃度を算出した。
参考例２  HSA濃度の測定
任意の培養時間で培養液をサンプリングし、15,000rpmで５分間遠心した。得られた上清をウルトラフリーC3HVにより清澄濾過後、下記条件下でのHPLCによるゲル濾過分析を実施した。
カラム:TSKgel  G3000SWX1
移動相:0.3M NaCl,50mMリン酸ナトリウム,0.1％NaN3.pH6.5
流速:1.0ml/min
インジェクション量:50μｌ
検出:A280,A350（２波長）
参考例３  メタノール濃度の測定
任意の培養時間で培養液をサンプリングし、15,000rpmで５分間遠心した。得られた上清をウルトラフリーC3HVにより清澄濾過後、下記条件下でのHPLCによる定量分析を実施した。
カラム:Sugar−pak Ca（Waters社製）
移動相:0.02％NaN3
カラム温度:80℃
インジェクション量:28μｌ
検出：示差屈折計
産業上の利用可能性
本発明の培地への基質添加速度の変化態様によれば、流加培養系の最適化を念頭において求められる比増殖速度μや比生産速度ρの最適パターンを実現することができる。また、この実現により、流加培養による宿主細胞の高密度培養が可能となり、短時間で効率よく所望のタンパク質を生産することができる。
従って、本発明の方法は、HSA,IGF,プロウロキナーゼ,UTI等の商業的価値の高いタンパク質の工業的製法として極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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