(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）：
【化１】
0003664763.tif 000008
〔式中、Ｒはヒドロキシ基が置換していてもよい炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を示す〕
で表される没食子酸エステルを有効成分とする細胞接着抑制剤（免疫抑制剤を除く）。
【請求項２】
上記式（１）の没食子酸エステルを有効成分とする癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、免疫抑制剤、癌転移抑制剤として有用な細胞接着抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫抑制剤としては従来より、アザチオプリン、ミゾリビン等の代謝拮抗剤、プレドニゾロン等のステロイド、各種抗体、サイクロスポリン、ＦＫ５０６等が用いられている。そして、癌転移抑制剤として有効な物質はない。このように、従来、これら免疫抑制剤及び癌転移抑制剤には、明らかな関連性は認められていなかった。
【０００３】
ところが最近、各種炎症、免疫反応及び癌転移についての細胞レベルでの研究が進展し、これらの疾患に細胞間接着が大きく関与するとの報告がなされている〔「細胞分子の発現調節と臨床応用」（１９９１年、メジカルビュー社）、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３６４，１４９−１５１（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４７，４５６−４５９（１９９０）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  免疫  １９８９，１７５−１８５、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．１９，４０５−４１４（１９９２）、実験医学  Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１１，１４０２−１４１３（１９９２）、実験医学  Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１６，２１６８−２１７５（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２５５，１１２５−１１２７（１９９２）等〕。そして、細胞間の接着にはＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１等の細胞表面接着分子が関与していることも判明している〔Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ  免疫  １９８９，１７５−１８５、感染・炎症・免疫  Ｖｏｌ．１９（２），１２９−１５３（１９８９）、感染・炎症・免疫  Ｖｏｌ．２４（３），１５８−１６５（１９９４）〕。
【０００４】
これらの細胞接着を抑制する物質としては、細胞表面接着分子に対する抗体やリガンド、Ｎ−（フルオレニル−９−メトキシカルボニル）アミノ酢酸、３−デアザアデノシン等が知られているが〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８８，３５５−３５９（１９９１）、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２３，１３９−１４９（１９９２）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７，Ｎｏ．１３，９３７６−９３８２（１９９２）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４４，Ｎｏ．２，６５３−６６１（１９９０）〕、その活性は未だ満足すべきものではなく、また安全性等にも問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、安全性が高く、細胞接着抑制に基づく優れた免疫抑制剤、癌転移抑制剤を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
このような実情において、本発明者は、細胞接着抑制試験及び安全性試験を数多くの化合物について行った結果、没食子酸エステルが優れた細胞接着抑制作用を有し、かつ安全性も高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の一般式（１）：
【化２】
0003664763.tif 000002
【０００８】
〔式中、Ｒはヒドロキシ基が置換していてもよい炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基を示す〕
で表される没食子酸エステルを有効成分とする細胞接着抑制剤（免疫抑制剤を除く）及び癌転移抑制剤を提供するものである。
【０００９】
ここで、没食子酸エステルは、従来から抗酸化作用、血小板凝集抑制作用、美白作用、線維化抑制作用、コラゲナーゼ阻害作用、ペルオキシダーゼ阻害作用などを有することが知られているが、細胞接着抑制作用については全く知られていない。
【００１０】
一般式（１）で表される没食子酸エステルにおいて、Ｒはヒドロキシ基が置換していてもよい炭素数１〜２４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基又アルケニル基を示すが、特に炭素数１〜１０のアルキル基が好ましい。Ｒとして具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、イソヘキシル基、２−エチルヘキシル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、オレイル基、リノレイニル基、３，５，５−トリメチルヘキシル基、３，７−ジメチルオクチル基、３，７，１１−トリメチルドデシル基、３−メチル−２−ブテニル基、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエニル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、８−ヒドロキシオクチル基、１０−ヒドロキシデシル基、１１−ヒドロキシウンデシル基、１２−ヒドロキシデシル基、１２−ヒドロキシオクタデシル基等を挙げることができる。本発明においては、このうち直鎖アルキル基が好ましい。すなわち没食子酸エステルとしては没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、没食子酸ブチル、没食子酸オクチル等が好ましい。
【００１１】
没食子酸エステルは、細胞接着に関与するＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１等の細胞表面分子の発現を抑制し、また優れた白血球−血管内皮細胞間に代表される細胞接着を抑制する作用を有する。さらにまた、細胞毒性、皮膚刺激性が弱く、安全性も高い。
従って、没食子酸エステルを有効成分として含有する製剤は、細胞接着抑制に基づき、移植臓器拒絶反応抑制、自己免疫疾患の治療及び癌転移予防等に有用である。
【００１２】
本発明の製剤は、上記疾患の治療又は予防のため、経口、経腸、非経口、局所投与などのいずれの経路によってもヒトに投与することができる。投与量は、患者の年齢、病態、体重などに応じ適宜決定されるが、通常は１日あたり没食子酸エステルとして０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から選ばれ、一回又は数回に分けて投与される。
【００１３】
本発明の製剤は、通常製剤に使用される賦形剤、その他の添加剤を含む組成物として使用するのが普通である。これらの例として、固体状のものとしては、乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウムなどが挙げられ、液状のものとしてはグリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水などが挙げられる。
【００１４】
剤形としては任意の形態を採ることができ、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、トローチ剤などの固形製剤；シロップ、乳液、軟ゼラチンカプセル、クリーム、ゲル、ペースト、スプレー、注射などの液状製剤が挙げられる。
【００１５】
【発明の効果】
没食子酸エステルは、優れた細胞接着抑制作用を有し、かつ安全性も高いので、移植臓器拒絶反応、自己免疫疾患等の治療及び癌転移予防に有用である。
【００１６】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
白血球−血管内皮細胞接着抑制試験：
９６穴培養プレート上にコンフルエントとなったヒト血管内皮細胞に対し、最終濃度２×１０-6〜１０-5Ｍとなるように被験化合物を添加した。１８時間後にヒト１Ｌ−１αを最終濃度５ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように添加し、６時間培養する。培養液除去後、新しい培養液で２回洗浄した後、予め常法に従い蛍光標識したヒト末梢白血球１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌを２００μｌを添加し、培養した。３０分後、未接着細胞を除去し、接着細胞を溶解後その蛍光活性を測定した。その結果、表１に示すように没食子酸エステルは優れた細胞接着抑制効果を有することが判明した。
【００１８】
【表１】
0003664763.tif 000003
【００１９】
実施例２
細胞接着に関与する細胞表面分子の抑制試験（ＦＡＣＳｃａｎ）：
２５ｃｍ2 培養フラスコ内にて、コンフルエントとなったヒト血管内皮細胞に対し、最終濃度２×１０-6〜１０-5Ｍとなるように被験化合物を添加した。１８時間後にヒト１Ｌ−１α又はＴＮＦαを最終濃度２．５ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、６時間培養した。培養液除去後、ＰＢＳ（−）にて洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡにて細胞を剥離、回収した。抗ＩＣＡＭ−１、抗ＥＬＡＭ−１のそれぞれの抗体（ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）を一次抗体、また抗ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＦＩＴＣを二次抗体とし、常法に従い細胞を染色後、ＦＡＣＳｃａｎによる解析を行った。
その結果、表２に示すように没食子酸エステルは、細胞表面の接着分子として、また免疫反応に関与する細胞表面因子として知られているＩＣＡＭ−１及びＥＬＡＭ−１の発現を強く抑制することが判明した。
【００２０】
【表２】
0003664763.tif 000004
【００２１】
実施例３
癌細胞−血管内皮細胞接着抑制試験：
９６穴培養プレート上にコンフルエントとなったヒト血管内皮細胞に対し、最終濃度２×１０-6〜１０-5Ｍとなるように被験化合物を添加した。１８時間後にヒト１Ｌ−１αを最終濃度５ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように添加し、６時間培養した。培養液除去後、新しい培養液で２回洗浄した後、予め常法に従い51Ｃｒ標識したヒト骨髄腫瘍細胞（ＨＬ−６０）１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌを２００μｌを添加し、培養した。３０分後、未接着細胞を除去し、接着細胞を溶解後その放射活性を測定した。
その結果、表３に示すように没食子酸エステルは癌細胞の転移に重要な、癌細胞と血管内皮細胞との接着を強く抑制することが判明した。
【００２２】
【表３】
0003664763.tif 000005
【００２３】
実施例４
血管内皮細胞に対する毒性（細胞形態，ＤＮＡ合成）：
形態変化に関しては倒立顕微鏡による目視評価とし、ＤＮＡ合成は常法に従い3Ｈ−ＴｄＲ取り込み量を指標にサンプル添加後２４時間培養の最終８時間における取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて定量評価した。なお、被験化合物濃度は２×１０-6〜１０-5Ｍとした。
その結果、表４に示すように、没食子酸エステルは血管内皮細胞に対する毒性がほとんど認められなかった。
【００２４】
【表４】
0003664763.tif 000006
【００２５】
実施例５
免疫担当細胞（リンパ細胞）に対する毒性（ＤＮＡ合成）：
マウスリンパ節細胞を使用した。ＤＮＡ合成は常法に従い3Ｈ−ＴｄＲ取り込み量を指標にサンプル及びリンパ球刺激物質（ＩＬ−２：５Ｕ／ｍｌ）添加後７２時間培養の最終２４時間における取り込み量を液体シンチレーションカウンターを用いて定量評価した。なお、被験化合物濃度は２×１０-6〜１０-5Ｍとした。
その結果、表５に示すように、没食子酸エステルは免疫担当細胞に対する毒性がほとんど認められなかった。
【００２６】
【表５】
0003664763.tif 000007
【００２７】
実施例６
皮膚刺激性：
被験化合物（２％／エタノール）又は溶媒（エタノール）をヘアレスマウス背部に１００μｌずつ３カ月間塗布し、無処理皮膚との肉眼的差異につき観察を行った。
その結果、没食子酸エステルは、３カ月連続して皮膚に塗布してもなんら炎症を発生せず、安全性が高いことが確認された。