(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
常染色体性劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）遺伝子における変異であって、その第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜６０７番が連続した９個のシトシンとなっており、さらにヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっている変異の有無を判定することを特徴とする、変異ＡＲＨ遺伝子のスクリーニング方法。
【請求項２】
ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲにより増幅し、得られた増幅フラグメントを配列決定し、正常なヒトのＡＲＨ遺伝子の第６エキソンの塩基配列と比較することにより変異の有無を判定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト対象から取得された試料中のＡＲＨ遺伝子における変異であって、その第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜６０７番が連続した９個のシトシンとなっており、さらにヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっている変異の有無を判定することを特徴とする、ＡＲＨの検査方法。
【請求項４】
ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲにより増幅し、得られた増幅フラグメントを配列決定し、正常なヒトのＡＲＨ遺伝子の第６エキソンの塩基配列と比較することにより変異の有無を判定することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲ増幅するためのプライマーを含み、該プライマーを用いてＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲにより増幅し、得られた増幅フラグメントを配列決定し、正常なヒトのＡＲＨ遺伝子の第６エキソンの塩基配列と比較することにより、その第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜６０７番が連続した９個のシトシンとなっており、さらにヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっている変異の有無を判定することを特徴とする、ＡＲＨを診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、常染色体性劣性高コレステロール血症（以下、「ＡＲＨ」ともいう）遺伝子の変異、該変異を有するＡＲＨ遺伝子のスクリーニング、ＡＲＨの診断、ならびにＡＲＨ診断用キットに関する。詳細には、該変異はＡＲＨ遺伝子の第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜６０７番が９個の連続したシトシンとなっており、さらにヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっているものである。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝性高コレステロール血症は、１９７３年に常染色体優性および常染色体性劣性の２つの遺伝形式のものがあることが報告された１。常染色体優性高コレステロール血症（ＡＲＨ）は家族性高コレステロール血症（ＦＨ）として認識され、低密度リポ蛋白受容体の遺伝学的欠損に関して十分に特徴付けられた。
一方、常染色体性劣性高コレステロール血症は、ＦＨホモ接合体と同様の臨床的特徴を示すが、明らかに稀な疾病であり、その特徴もあまりわかっていなかった。ホモ接合ＦＨ患者は、重篤な血漿低密度リポ蛋白（以下、「ＬＤＬ」ともいう）レベルの上昇、広範な皮膚および腱黄色腫、ならびに若年性動脈硬化症を呈する２。ＡＲＨは、常染色体性劣性遺伝パターンを除いて、上記のようなホモ接合ＦＨと非常に類似した徴候を示す１。
【０００３】
本発明者らは、ＦＨと同様の臨床的特徴を有するＡＲＨ症例（姉弟例）について研究を行い、患者が正常なＬＤＬ受容体活性を有していることを見出した。すなわち、患者の培養線維芽細胞中のＬＤＬ受容体蛋白はその活性を含めて全く正常であるが、血漿ＬＤＬレベルが非常に上昇しており、ホモ接合ＦＨ患者と同様のレベルであるという特徴を見出した３，４。患者のＬＤＬ受容体遺伝子は異なるハプロタイプであることが示され、この疾病がＬＤＬ受容体遺伝子のホモ接合性により引き起こされる可能性が排除された。ＬＤＬ−アフェレーシス後のコレステロール値の再上昇カーブからコレステロールの分解速度を計算したところ、その速度が非常に低下していることが示され、血漿中のＬＤＬ代謝に関するかぎり、患者の疾病はＦＨホモ接合体と類似の疾病であることがわかった。これらの結果は、患者はコレステロール産生調節における障害でなく、コレステロール代謝における障害を有していることを示唆するものであり、ＬＤＬ受容体の変異により引き起こされる障害以外の障害であるように思われた４。
これとは別に、本発明者以外にもいくつかのグループがアイソトープ標識ＬＤＬを用いて、肝ＬＤＬ摂取の選択的低下を有するＡＲＨ患者を見出している５−７。
【０００４】
このように、ＡＲＨをキャラクタリゼーションするため、病因論的、遺伝学的、また、代謝面からアプローチが行われてきたが、最近、分子生物学的アプローチも行われるようになってきた。ガルシア（Garcia）らは、ＡＲＨ家系において推定ＬＤＬ受容体アダプター蛋白をコードする遺伝子中に６つの突然変異を同定した８。この結果から、ＡＲＨ遺伝子により作られるＡＲＨ蛋白はＬＤＬ受容体のアダプター蛋白であり、インビボ（in vivo）でのＬＤＬ受容体機能の発現に重要であると考えられる。しかしながら、ガルシアらは、本願発明の新規変異については全く記載しておらず、その示唆さえしていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のごとく、ＡＲＨは、最近になってその原因遺伝子（ＡＲＨ遺伝子）が同定された遺伝性疾患であり、具体的にいかなる変異が疾病発現と関連しているのかは未だ不明であり、ＡＲＨ蛋白の機能も推定の域を出ていない。現時点では、高コレステロール血症の遺伝素因としては、ＦＨの原因であるＬＤＬ受容体遺伝子のみが知られているに過ぎない。高脂血症のなかでもＡＲＨは研究知見が少なく、常染色体性劣性遺伝病であるため、一般的に他の遺伝病に比べて重篤である。したがって、ＡＲＨの原因となる遺伝子異常を探求し、その遺伝素因の決定や早期診断に役立てることが必要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題に鑑みて本発明者は鋭意研究を重ね、ＡＲＨ患者のＬＤＬ受容体アダプター蛋白遺伝子（ＡＲＨ遺伝子）中に新規な挿入変異を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンは、健常人ではヌクレオチド第５９９〜６０６番は８つのシトシンが続いたものであるが、ＡＲＨ患者の第６エキソンでは、上記領域のいずれかの位置にさらに１個のシトシンが挿入されて、ヌクレオチド第５９９〜６０７番に９個のシトシンが連続していること、さらにこのような変異によりフレームシフトが起こり、ヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっていることを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、
（１）常染色体性劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）遺伝子における変異であって、その第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜６０７番が連続した９個のシトシンとなっており、さらにヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっている変異の有無を判定することを特徴とする、変異ＡＲＨ遺伝子のスクリーニング方法、
（２）ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲにより増幅し、得られた増幅フラグメントを配列決定し、正常なヒトのＡＲＨ遺伝子の第６エキソンの塩基配列と比較することにより変異の有無を判定することを特徴とする上記（１）に記載の方法、
（３）ヒト対象から取得された試料中のＡＲＨ遺伝子における変異であって、その第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜６０７番が連続した９個のシトシンとなっており、さらにヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドンとなっている変異の有無を判定することを特徴とする、ＡＲＨの診断方法、
（４）ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲにより増幅し、得られた増幅フラグメントを配列決定し、正常なヒトのＡＲＨ遺伝子の第６エキソンの塩基配列と比較することにより変異の有無を判定することを特徴とする上記（３）に記載の方法、および
（５）ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲ増幅するためのプライマーを含む、ＡＲＨを診断するためのキット
に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記のごとく、本発明は、試料中の常染色体性劣性高コレステロール血症（ＡＲＨ）遺伝子の変異の有無を判定することを特徴とする、変異ＡＲＨ遺伝子のスクリーニング方法に関するものである。
なお、ＡＲＨの典型的な特徴としては、（１）著明な高コレステロール血症、（２）著明な皮膚および腱の黄色腫、（３）線維芽細胞でＬＤＬ受容体が正常、ならびに（４）インビボ（in vivo）でＬＤＬのターンオーバーが遅いことが挙げられる。
【０００９】
ＡＲＨ遺伝子を取り出すための試料は、ヒト対象から得られたいずれの試料であってもよく、いずれの部位、器官、組織、細胞に由来するものであってもよい。また、生検、剖検を問わない。例えば血液、唾液等の体液であってもよく、肝臓組織等の生検であってもよい。培養ヒト線維芽細胞または末梢単核細胞中のＡＲＨ遺伝子を分析してもよい。
【００１０】
本発明におけるＡＲＨ遺伝子の変異は下記のものである。正常なＡＲＨ遺伝子の第６エキソンはそのヌクレオチド第５９９〜６０６番が連続した８個のシトシンであるのに対し、本発明の変異したＡＲＨ遺伝子では第６エキソンのこの領域のいずれかの位置にさらに１個のシトシンが挿入されて、ヌクレオチド第５９９〜６０７番がすべてシトシン（９個の連続したシトシン）となり、その結果、フレームシフトが起こって、ヌクレオチド第６５７〜６５９番がストップコドン（第２２０番のアミノ酸位置）となり、そのことにより第６エキソンによりコードされる第２０４番以降のアミノ酸が変化し、第２１９番目のアミノ酸（Ｇｌｙ）で終了するものである。
【００１１】
好ましくは、かかる変異の有無の判定は、ヒト試料中のＡＲＨ遺伝子の第６エキソンを増幅し（例えば、ＰＣＲにより）、得られたフラグメントを配列決定し、正常なヒトＡＲＨ遺伝子の塩基配列、詳細にはその第６エキソンの塩基配列と比較することにより行われる。
試料からの遺伝子の抽出法、ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンの増幅方法，塩基配列の決定・比較法ついて、典型的な方法として、それぞれ、カラムによる抽出法（Qiagen Kit）、ＰＣＲ増幅法、直接配列決定法（ダイターミネーター（dye-terminator）法）が本明細書の材料および方法のセクションで説明されているが、当業者はそれ以外の方法を本発明の実施に適用することも可能である。例えば、ゲノム採取法として、従来的な方法で、フェノール・クロロホルムを用いる方法、ＰＣＲ増幅法として、AmpliTaq Gold （Applied Biosystems）、ExTaq（Takara）を用いる方法も使用可能である。直接配列決定法は、プライマー・ラベル法（ALF express法）（Amersham-Pharmacia）を用いる方法などがある。また、直接配列決定法以外に、サブクローニングを行った後、塩基配列決定を行う方法もある。
【００１２】
さらに本発明は、ＡＲＨ遺伝子の第６エキソン中の上記変異の有無を判定することを特徴とする、ＡＲＨの診断方法に関する。ここで使用するＡＲＨ含有試料はヒトから取り出したものであればいずれの試料であってもよいことは上記と同じである。
詳細には、ヒト対象の試料中のＡＲＨ遺伝子の第６エキソンを増幅し（例えばＰＣＲにより）、得られたフラグメントを配列決定し、正常なヒトＡＲＨ遺伝子の塩基配列、詳細にはその第６エキソンの塩基該列と比較することによりＡＲＨの診断が行われる。該変異が見出されたならば、その対象はＡＲＨにかかっているか、あるいはＡＲＨに対する素因を有すると診断される。
ここで、試料からのＡＲＨ遺伝子の抽出法、その第６エキソンの増幅方法，塩基配列の比較方法等については上記と同様である。
【００１３】
さらに本発明は、ＡＲＨ遺伝子の第６エキソンをＰＣＲ増幅するためのプライマー（例えば、表１のExon 6-F（配列番号：９）およびExon6-R（配列番号：１０））を含む、ＡＲＨ診断用キットにも関する。さらにキットには試料からの遺伝子を抽出するための試薬および器具、配列決定用の試薬および器具、増幅に必要な制限酵素等、そして必要な場合には説明書等が含まれていてもよい。
【００１４】
材料および方法：
以下に、本発明の実施に用いた材料および方法を説明するが、これらの材料および方法は典型例であり、それら以外であっても、本発明に適したものを使用できることは当業者に明らかである。
【００１５】
細胞培養：ＡＲＨヒト個体ならびに正常対照ヒト個体、すなわち、発端者、発端者の姉、それらの母親および正常な対照個体の皮膚生検標本から線維芽細胞を細胞系として確立した。加湿インキュベーター中、３７℃において、ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、および１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Hyclone, AB, Lund Sweden）を含有する最少必須培地（Ｓ−ＭＥＭ）（Gibco BRL, Rockville, Maryland）中にてストック培養を単層として維持した。
【００１６】
ＤＮＡ抽出、増幅、および配列分析：
培養線維芽細胞（発端者、発端者の姉およびそれらの母親）または正常対照ヒト対象の末梢単核細胞からゲノムＤＮＡを常法（フェノール・クロロホルム抽出法等を用いた）に従って単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用した。第１エキソンを除いて、ＡＲＨ遺伝子のエキソンおよびイントロン境界の配列をCeleraヒト配列データ９から得た。ＡＲＨの各エキソンおよびエキソン−イントロン境界を含むＤＮＡフラグメントを、Gene Amp, PCR System 9700（Applied BioSystem）を用いてゲノムＤＮＡから増幅した。Advantage 2 プロトコル（Clontech）を用い、表１に示す各プライマーペアー２５ｐｍｏｌを用いてＰＣＲを行った。
【００１７】
【表１】
0003709438.tif 000002
【００１８】
エキソン１−イントロン１境界の情報はCeleraのヒト配列データにもHuman Genome Project Consortiumのデータベース中にも存在しなかった。発端者に関する情報を得るために、Superscript II逆転写酵素（Gibco BRL）を用いてメッセンジャーＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＲＴに使用したプライマーをエキソン１−ＲＴとして表１に示す。このプライマーはエキソン２中に存在するアンチセンス配列である。エキソン１−Ｆセンスプライマーおよびプライマーエキソン１−ＲＴの入れ子アンチセンスプライマーエキソン１−Ｒを用いるＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ生成物をMicrocon（Millipore, Bedford, Massatusets）により精製し、直接配列決定のための鋳型として使用した。製造者の指示に従ってダイターミネーター（dye terminator）法（BigDye Terminator Cycles Sequencing Ready Reaction, Applied BioSystem）を用いてＤＮＡ配列決定を行った。
上記プライマーは本発明の実施に使用できるプライマーの例であり、当業者はそのようなプライマーを適宜選択することができる。
【００１９】
【実施例】
次に、本発明を実施例にて説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
Ｉ．対象、家系および病歴（図１参照）：
４８歳の発端者（ＩＩ−１）は、９〜１０歳の時に肘および膝にはじめて黄色腫を認めた。１９８２年にこの男性が国立循環器病センターに来院したのは３０歳の時であった。その指、肘および膝に大きな皮膚および腱の黄色腫が認められた。この患者の右のアキレス腱の厚さは２３ｍｍ、左のアキレス腱の厚さは２８ｍｍであった。この患者が医学的処置を受ける前に、この患者は腹部ＣＴおよび超音波検査により脂肪肝を有するものと診断された。１９８３年以来、この患者はＬＤＬ−アフェレーシス治療を１週間おきに受けていた。１９８７年にこの患者は３５歳であり、狭心症の徴候を示し、血管造影法により重篤な狭窄が冠状動脈に認められた。経皮的冠状動脈血管形成術を５回受け、それ以来、この患者は心臓の徴候を示していない。
【００２０】
発端者の姉（ＩＩ−２）は、１歳の時、原因不明の高熱後難聴になったことが判明した。この患者は１４歳以降、重症の高コレステロール血ならびに多発性の皮膚および腱の黄色腫を有していた。この患者は３２歳の時、筋肉の痛みおよび衰弱を示し、筋肉および肝臓の生検により、多発性筋炎および脂肪肝であると診断された。筋肉生検標本は塊状の炎症細胞の浸潤を示した。診断時にはステロイドをはじめとする薬剤療法を開始しなかった。この患者のアキレス腱の厚さは、右が１８．５ｍｍ、左が２０ｍｍであった。この患者は、高コレステロール血症に対してＬＤＬ−アフェレーシス治療を、多発性筋炎に対してコルチコステロイド治療を受けた。患者が４５歳の時、多発性筋炎がさらに悪化し、疾病を抑制するためにより高用量のコルチコステロイドが投与された。その後、腸穿孔および腹膜炎を発症し、この患者はエンドトキシンショックにより死亡した。
【００２１】
該同胞患者は、叔父と姪の血族結婚の両親から生まれた４。該同胞の父親は発作により６１歳で死亡したが、高コレステロール血症あるいは黄色腫の徴候は有していなかった。該同胞の母親（Ｉ−１）は健康であり、正常な血漿コレステロールレベル（２００ｍｇ／ｄＬ）を有し、黄色腫を有しない。判明している親戚には冠状動脈疾患の病歴を有するものはいない。発端者、発端者の姉、およびその母親の主な臨床パラメーターを表２に示す。
【００２２】
【表２】
0003709438.tif 000003
【００２３】
該同胞の臨床的症状発現および遺伝学的特徴から、該同胞はＡＲＨに関してホモ接合体であると診断される。該同胞の線維芽細胞および単球中のＬＤＬ受容体活性は正常であり、該同胞のＬＤＬは、その線維芽細胞によって正常な結合、取り込みおよび分解を受けていた。一方、ＬＤＬ−アフェレーシス治療後のリバウンドから計算された血漿コレステロールの分解速度から、発端者およびその姉はいずれも血漿コレステロールのクリアランス速度が遅く、ＦＨに関してホモ接合体である個体と同等のクリアランス速度であった。
【００２４】
ＩＩ．ＡＲＨ遺伝子中の変異
第２〜第９エキソンのＤＮＡセグメントに関して、材料および方法のセクションにて説明したプライマー（表１参照）を用いてエキソンおよびエキソン−イントロン境界をＰＣＲ増幅した。Gene Amp, PCR System 9700（Applied BioSystem）を用い、Advantage 2 プロトコル（Clontech）を用い、表１に示す各プライマーペアー２５ｐｍｏｌを用いてＰＣＲを行った。第１エキソンに関する情報は利用可能なデータバンンクには見出されなかったので、その情報を得るために、５’フランキング配列および第２エキソン中の配列をプライマーとして用いて逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は以下のごとし。逆転写はSuperscript II Reverse Transcriptase（Gibco BRL）を用いて、４２℃、５０分で行った。用いたプライマーは、第２エキソンのアンチセンス鎖を用いて、逆転写を行った。ＰＣＲの増幅は、上記プライマーの内側（nested）のプライマーと、センス鎖として第１エキソンのプライマーを用いて行った。酵素はAmpliTaq Goldで行った。ＲＴ−ＰＣＲ生成物をサブクローニングして、配列決定を行った。
該同胞およびその母親の各エキソンのＰＣＲ生成物を配列決定し、対照である正常対象中のカウンターパートと比較した。対照である正常対象のＡＲＨ遺伝子の第６エキソン中には、そのヌクレオチド位置第５９９〜６０６番に８個の連続したシトシンが存在した（図２ 正常対象）。一方、ＡＲＨにかかっている同胞中の遺伝子においては、この領域にさらに１個のシトシンが挿入されていた（図２ 患者(II-1)および患者(II-2)）。この挿入変異はフレームシフトを引き起こし、第２０４番目以降のアミノ酸が変化し、アミノ酸位置第２２０番にストップコドンが生じていた（図３）。該同胞患者の母親からの増幅ＤＮＡをｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen, Carlsbad, California）中にクローニングした。各増幅ＤＮＡにつき１０個の独立したクローンが単離され、それらを配列決定した。それらのクローンのうち４つは８個のシトシンを示し、６つは９個のシトシンを示し、同胞の母親が当該変異に関してヘテロ接合であることが示唆された（図２患者の母親）。
【００２５】
上に記載した患者分析のすべての手順は倫理委員会による承認を受けたものであり、書面によるインフォームドコンセントが各患者またはその法的代理人になされた。
【００２６】
引用文献：
1. Khachadurian AK, Uthman SM. Experiences with the homozygous cases of familial hypercholesterolemia. A report of 52 patients. Nutr Metab 1973; 15(1):132-40.
2. Goldstein JL, Hobbs HH, Brown MS. Familial hypercholesterolemia In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D, editors, The Metabolic and molecular Bases of Inherited disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001. vol. II, chap. 120. pp.2863-913.
3. Harada-Shiba M, Tajima S, Miyake Y, Kojima S, Tsushima M, Yamamoto A. Severe hypercholesterolemia patients with normal LDL receptor. J. Jpn Atheroscler Soc 1991;19(4), 227-242.
4. Harada-Shiba M, Tajima S, Yokoyama S, Miyake Y, Kojima S, Tsushima M, Kawakami M, Yamamoto A. Siblings with normal LDL receptor activity and severe hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb 1992;12(9):1071-8.
5. Zuliani G, Vigna GB, Corsini A, Maioli M, Romagnoni F, Fellin R. Severe hypercholesterolaemia: unusual inheritance in an Italian pedigree. Eur J Clin Invest 1995;25(5):322-31
6. Schmidt HH, Stuhrmann M, Shamburek R, Schewe CK, Ebhardt M, Zech LA, Buttner C, Wendt M, Beisiegel U, Brewer HB, Jr, Manns MP. Delayed low density lipoprotein (LDL) catabolism despite a functional intact LDL-apolipoprotein B particle and LDL-receptor in a subject with clinical homozygous familial hypercholesterolemia. J Clin Endocrinol Metab 1998;83(6):2167-74.
7. Zuliani G, Acra M, Signore A, Bader G, Fazio S, Chianelli M, Bellosta S, Campagna F, Montali A, Maioli M, Pacifico A, Ricci G, Fellin R. Characterization of a new form of inherited hypercholesterolemia: familial recessive hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19(3):802-9.
8. Garcia CK, Wilund K, Arca M, Zuliani G, Fellin R, Maioli M, Calandra S. Bertolini S, Cossu F, Grishin N, Barnes R, Cohen JC, Hobbs HH. Autosomal recessive hypercholesterolemia caused by mutations in a purative LDL receptor adaptor protein. Science 2001; 292(5520):1394-8.
9. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO, Yandell M, Evans CA, Holt RA, et al. The sequence of the human genome. Science 2001;291(5523):1304-51.
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、ＡＲＨ遺伝子の異常（変異）の有無を判別することによる変異ＡＲＨ遺伝子のスクリーニング方法、該変異によりＡＲＨを診断する方法、ならびにＡＲＨ診断用キットが提供される。これらはＡＲＨの診断に極めて有用なものである。
【００２８】
配列表フリーテキスト
[SEQ ID NO: 1]
A forward primer for PCR amplification of exon 2 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 2]
A reverse primer for PCR amplification of exon 2 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 3]
A forward primer for PCR amplification of exon 3 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 4]
A reverse primer for PCR amplification of exon 3 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 5]
A forward primer for PCR amplification of exon 4 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 6]
A reverse primer for PCR amplification of exon 4 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 7]
A forward primer for PCR amplification of exon 5 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 8]
A reverse primer for PCR amplification of exon 5 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 9]
A forward primer for PCR amplification of exon 6 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 10]
A reverse primer for PCR amplification of exon 6 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 11]
A forward primer for PCR amplification of exon 7 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 12]
A reverse primer for PCR amplification of exon 7 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 13]
A forward primer for PCR amplification of exon 8 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 14]
A reverse primer for PCR amplification of exon 8 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 15]
A forward primer for PCR amplification of exon 9 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 16]
A reverse primer for PCR amplification of exon 9 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 17]
A primer for RT-PCR amplification of exon 1 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 18]
A forward primer for PCR amplification of exon 1 of ARH gene.
[SEQ ID NO: 19]
A reverse primer for PCR amplification of exon 1 of ARH gene.
【００２９】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Cardiovascular Center
<120> Novel mutation in autosomal ressesive hypercholesterolemia gene
<130> 183577
<160> 19
<210> 1
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<213> Homo sapiens
<400> 12
aggctcaccc agaggtcagg                    20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ccaccctgag cttgtgtcct                    20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
gcacaccagg ccccctaccc                    20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
gtgccccctc gcgtctgacc                    20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gatgccccca gggaaatttg                    20
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
aacagcatcc cctccagcag cgtctcccgc          30
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
cgcgtccgcc ggagcgggcc                    20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gtgtctgtcc agttctcagg cagct               25
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、発端者（ＩＩ−１）、その姉（ＩＩ−２）、およびその母親（Ｉ−１）を含む家系図である。□は男性、○は女性、数字は年齢、┼は死亡を示し、■および●は罹患者を示す。
【図２】  図２は、ＡＲＨ患者である同胞（ＩＩ−１（弟）、ＩＩ−２（姉））、その母親（Ｉ−１）、および対照である正常対象のＤＮＡ配列を示す。患者の母親はサブクローニングにより検出可能な２つの対立遺伝子を有していた。
【図３】  図３は、患者および対照である正常対象のＡＲＨ遺伝子の第６エキソン中のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。正常対象の第６エキソンの第５９９〜第６０６番目の連続した８個のシトシンに下線を付した。患者の第６エキソンのヌクレオチド第５９９〜第６０７番目の連続した９個のシトシンにも下線を付した。さらに患者第６エキソンのヌクレオチド第６５７〜第６５９番目のストップコドンに二重下線を付した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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