(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲンレセプターの遺伝子多型について、制限酵素ＰｖｕIIで切断されない遺伝子型  Ｐおよび同部において切断される遺伝子型ｐとの組み合わせで決定される遺伝子多型ＰＰ、Ｐｐまたはｐｐ、および制限酵素ＸｂａＩで切断されない遺伝子型Ｘおよび同部において切断される遺伝子型ｘとの組み合わせで決定される遺伝子多型ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘのそれぞれの組み合わせについて測定し、同遺伝子多型のＰＰｘｘを骨密度低下群と判断する、日本人の骨密度低下の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は骨密度および／または骨疾患リスクの予測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年高齢者、特に女性の高齢者において骨粗鬆症の発生が問題とされており、高齢者の骨密度について大きな関心が寄せられている。かかる骨密度低下については、その治療方法、治療薬の研究も盛んであり、エストロゲンやビタミンＤおよびそれに関連する物質に関する研究がなされている。
【０００３】
遺伝的要因の検討については、Ｎ．Ａ．ＭｏｒｒｉｓｏｎらがＮａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３６７，１９９４，ｐｐ２８４−２８７において白色人種（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）に関し、ビタミンＤレセプター遺伝子の制限酵素ＢｓｍＩによる多型の遺伝子型と骨密度の関係を調べ、ＢＢ（２本の対立遺伝子がともに制限酵素ＢｓｍＩの切断をうけない）型が骨密度が最も低いことを報告している。一方、Ｆ．Ｇ．ＨｕｓｔｍｙｅｒらはＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９４，１９９５，ｐｐ２１３０−２１３４において同じ白色人種でもアメリカ人においてはこの結果が再現されないことを報告している。このように様々な因子の相互作用によっておこる骨の減少を、１つの遺伝子のみで決定することは困難であることが示された。
【０００４】
エストロゲンが骨量の維持に重要な役割をはたしていることは、閉経後女性の骨量が急激に減少することからも明らかである。Ｒ．ＬｉｎｄｓａｙらはＬａｎｃｅｔ，ｖｏｌ．１，１９７６，１０３８−１０４１で閉経後女性においてエストロゲンの補充により骨密度の上昇がみられたと報告している。エストロゲンレセプター（ＥＲ）遺伝子の多型についてはいくつかの報告がある。例えばＳ．ＬｅｈｒｅｒらはＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ｖｏｌ．２１，１９９３，ｐｐ４３９−４４１においてＥＲ遺伝子の多型性と高血圧との関連を調べているが、骨密度との関連については何も述べられていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
かかる状況下から、本発明者らは、エストロゲンレセプター（ＥＲ）遺伝子の多型性が日本人における骨密度の多様性を予測することを可能とするとの期待のもとに、制限酵素ＰｖｕＩＩおよびＸｂａＩの多型と腰椎および全身の骨密度との関係を調べたところ、ＥＲ遺伝子多型のハプロタイプによる分類により、閉経後の日本人女性の骨密度と極めて良好な相関関係を有することを見いだし本発明に到達した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
しかして本発明は、
項１］エストロゲンレセプターの遺伝子多型について測定し、それと骨密度の高低および／または骨疾患とを結びつける事を特徴とする骨密度の高低および／または骨疾患リスクの予測方法、
項２］上記遺伝子多型が制限酵素ＰｖｕＩＩで切断されない遺伝子型Ｐおよび同部において切断される遺伝子型ｐとの組み合わせで決定される遺伝子多型ＰＰ、Ｐｐまたはｐｐ、および制限酵素ＸｂａＩで切断されない遺伝子型Ｘおよび同部において切断される遺伝子型ｘとの組み合わせで決定される遺伝子多型ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘのそれぞれの組み合わせについて測定することを特徴とする骨密度の高低および／または骨疾患リスクの予測方法、
項３］使用する制限酵素がＰｖｕＩＩ、ＸｂａＩのどちらかと連鎖している制限酵素である場合の骨密度の高低および／または骨疾患リスクの予測方法、
項４］上記遺伝子多型のＰＰｘｘを低骨密度と分類する骨密度の高低および／または骨疾患リスクの予測方法、及び
項５］測定対象が日本人である請求項１〜４のいずれか記載の骨密度の高低および／または骨疾患リスクの予測方法
である。
【０００７】
本発明に用いるエストロゲンレセプター（ＥＲ）のゲノムＤＮＡは第６番染色体上にあることがわかっているが、本発明においてはＤＮＡ増幅法を用いるので、第６番染色体上にあるかどうかは直接発明には関係しない。ＥＲゲノムＤＮＡの観察しようとする領域を含む増幅領域の端部に特異的なプライマーを塩基配列のデータから設計することができ、それによりＥＲゲノムＤＮＡが第６番染色体にあるかどうかを知らなくても特異的に増幅できるからである。
【０００８】
本発明において遺伝子型はまず、制限酵素ＰｖｕＩＩまたはＸｂａＩで切断反応を行って切断されるか否かによって決定される。ＰｖｕＩＩで切断されない型がＰであり、切断される型がｐである。ＸｂａＩで切断されない型がＸであり、切断される型がｘである。
【０００９】
ゲノムＤＮＡの遺伝子多型測定を行う生体試料の採取源には特に限定はないが、血球成分が採取しやすく、これで十分である。
【００１０】
以下、本発明における遺伝子多型測定に用いることのできる標準的なＤＮＡ抽出操作、遺伝子増幅操作、制限酵素切断操作および電気泳動操作、並びに骨密度の測定方法について説明する。
【００１１】
（１）ゲノムＤＮＡを用いた多型分析
（ａ）標準的ＤＮＡ抽出操作
１．全血０．５ｍｌ（２Ｎａ−ＥＤＴＡ抗凝固剤使用）を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管にいれる。
２．溶解液を０．５ｍｌ加えて、チューブを数回軽く逆さにして液を混ぜる。
（下記の操作はこれに従う）
溶解剤例：１×ＳＳＣ（１リットル中にＮａＣｌ１７５．３ｇ，クエン酸ナトリウム８８．２ｇを含む１０Ｎ    ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整した２０×ＳＳＣを２０倍に希釈したもの）
３．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、黒っぽいペレットが流出しないように上清を除く。
４．溶解液を１ｍｌ加えて、マイクロチューブミキサーにて撹拌する（ＭＴ−３６０では、スピード７で３０秒）。
５．遠心（１０，０００ｇ、２０秒、４℃）した後、上清を除く。
６．ステップ４〜５を１回繰り返す。
７．酵素反応液２００μｌと蛋白質分解酵素１０μｌを加えて混合する。
酵素反応液例：１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）
８．３７℃で１時間保温する（途中２〜３回軽く振り混ぜる）。
９．ヨウ化ナトリウム溶液を３００μｌ加えて混合する。
１０．イソプロピルアルコールを０．５ｍｌ加えて、白い線状のＤＮＡが完全に見えてくるまで、混合する。
１１．遠心（１０，０００ｇ、１０分間、室温）した後、上清をゆっくり除く。容器を濾紙の上に逆さに置く等の方法で、器壁に残った溶液を十分に除く。
１２．洗浄液（Ａ）を１ｍｌ加えて混合する。沈殿が器壁からはがれる程度に十分混合する。
洗浄液例：７０％エタノール
１３．遠心（１０，０００ｇ、５分間、室温）した後、上清を除く。
１４．洗浄液（Ｂ）を１ｍｌ加えて混合する。沈殿が器壁からはがれる程度に十分混合する。
洗浄液例：８０％エタノール
１５．遠心（１０，０００ｇ、５分間、室温）した後、上清を除く。
１６．ＤＮＡ沈殿を軽く減圧乾燥する。（乾燥しすぎると、ＤＮＡが溶けにくくなるので３分間以内にする。）
【００１２】
（ｂ）標準的遺伝子増幅操作
遺伝子増幅法についてはいくつかの原理が知られているが、ここではポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）を標準的な方法として記載する。
反応液組成：５０ｍＭ    ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、２５℃）、０．１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５ｍＭ    ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ    ｄＮＴＰｓ、４μＭフォワードプライマー、４μＭリバースプライマー、０．１μｇ／ｍｌゲノムＤＮＡ、１ユニット    ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、全容量５０μｌ
反応サイクル：９４℃、３０秒；６１℃、４０秒；７２℃、２分を１サイクルとし、３０サイクル実施
ＰｖｕＩＩ，ＸｂａＩ切断に供するＤＮＡ断片増幅用プライマーとしては、Ｌ．ＹａｉｃｈらのＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，ｖｏｌ．５２，１９９２，ｐｐ７７−８３に示されたものを用いる。
【００１３】
塩基配列は下記のとおりである。
増幅用プライマー
プライマーＡ（ｆｏｒｗａｒｄ    ｐｒｉｍｅｒ）：５’−ＣＴＧＣＣＡＣＣＣＴＡＴＣＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣ−３’
プライマーＢ（ｒｅｖｅｒｓｅ    ｐｒｉｍｅｒ）：５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＴＣＧＡＴＴＡＴＣＴＧＡ−３’
【００１４】
（ｃ）標準的制限酵素切断操作
ＰｖｕＩＩ用反応液組成：１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１０ｍＭＭｇＣｌ２，５０ｍＭ    ＫＣｌ，１ｍＭ    ＤＴＴ
ＰｖｕＩＩを１０ユニット／２０μｌ反応液の濃度で加え、３７℃、２時間インキュベートする。
ＸｂａＩ用反応液組成：１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１０ｍＭ    ＭｇＣｌ２，５０ｍＭ    ＫＣｌ，１ｍＭ    ＤＴＴ，１００μｇ／ｍｌ    ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
ＸｂａＩを１０ユニット／２０μｌ反応液の濃度で加え、３７℃、２時間インキュベートする。
【００１５】
（ｄ）標準的電気泳動操作
電気泳動緩衝液は、１×ＴＡＥである。但し、５０×ＴＡＥは１リットル中Ｔｒｉｓベース２４２ｇ、５７．１ｍｌ氷酢酸およびＥＤＴＡ５０ｍＭを含有しｐＨ８．０に調製してある。上記緩衝液を用いて、１％アガロースゲル（アガロースＭＥ、和光純薬工業）（０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド含有）を使用して、電圧１００Ｖで３０分間泳動する。その後ＵＶランプでＤＮＡのバンドを観察する。
【００１６】
プライマーＡ及びプライマーＢを用いて増幅したＤＮＡフラグメントをＰｖｕＩＩにより切断した場合、電気泳動により、１．３ｋｂにバンドがあらわれる場合の遺伝子型をＰＰ、約０．８５ｋｂと約０．４５ｋｂにバンドがあらわれる遺伝子型をｐｐ、３本一緒にあらわれる場合を遺伝子型Ｐｐと判定できる。一方同じフラグメントをＸｂａＩにより切断した場合、電気泳動により、１．３ｋｂにバンドがあらわれる場合の遺伝子型をＸＸ、約０．９５ｋｂと約０．３５ｋｂにバンドがあらわれる遺伝子型をｘｘ、３本一緒にあらわれる場合を遺伝子型Ｘｘと判定できる（図１）。
【００１７】
（２）骨密度の測定方法
骨密度の測定は、ＤＥＸＡ（Ｄｕａｌ    Ｅｎｅｒｇｙ    Ｘ−ｒａｙ    Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法に基づいて、腰椎骨および全身骨について行う。ＤＥＸＡ法に用いる装置として、例えばＤＰＸ−Ｌ（Ｌｕｎａｒ    Ｒａｄ．Ｃｏ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いて行うことができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００１９】
［実施例１］
無作為に選んだ閉経後の日本人女性１６４名を対象として、前記の標準的操作に従い、各人のＰ−ｐ型およびＸ−ｘ型による遺伝子型、骨密度（腰椎骨；Ｌ２−４ＢＭＤ、全身骨；総ＢＭＤ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）濃度を測定した。
【００２０】
各遺伝子型の出現頻度は下記表１のとおりであった。
【００２１】
【表１】
0003616416.tif 000002
【００２２】
上記遺伝子多型の組み合わせと、骨密度（Ｌ２−４ＢＭＤ，総ＢＭＤ）のＺスコア（各年齢の平均をＺスコア０とし、それに対して標準偏差（ＳＤ）分高値の値をＺスコア＋１．０、ＳＤ分低値の値を−１．０としたときの相対的な値）、およびＡＬＰ濃度との相関を表２に示す。
【００２３】
【表２】
0003616416.tif 000003
【００２４】
表中、＊はＰＰｘｘ型に対して有意に値が高いまたは低いもの（ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ）である。
【００２５】
上記結果は、ＰＰｘｘ遺伝子型はＬ２−４ＢＭＤのＺスコア−０．８３、総ＢＭＤのＺスコア−０．６６でその他の群に比べてＡＮＯＶＡで計算したＰ値では有意ではないものの骨密度の低下を示している。
【００２６】
これを別の見方から解析した。すなわち、注目する群とその他の群の有意差検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ    ｕ−ｔｅｓｔ）を行った。その結果、ＰＰｘｘ群のＬ２−４ＢＭＤのＺスコア−、総ＢＭＤのＺスコア−ともにその他の６群合計に比べて、有意な低値（Ｌ２−４ＢＭＤ；ｐ＝０．０４０，総ＢＭＤ；ｐ＝０．００３）、を示した（図２）。さらにＡＬＰの値も有意な高値（ｐ＝０．０２３）を示した（図３）。
【００２７】
ちなみにＰ−ｐ型、Ｘ−ｘ型単独の遺伝子型とＺスコア（Ｌ２−４ＢＭＤ，総ＢＭＤ）との相関を表３に示す。
【００２８】
【表３】
0003616416.tif 000004
【００２９】
表３のとおり、ＰＰはＺスコアが−０．４６であり、平均で、平均値より標準偏差の４１％低値であり、単独でもやや予測しうる可能性がある。しかも出現頻度も２３％ありその意味でも実用性もある。一方、Ｘ−ｘ型単独では全く差がない。
【００３０】
これに対し、上記のようにＰ−ｐ型とＸ−ｘ型とを組み合わせた遺伝子型のうちＰＰｘｘ型（Ｐｘというハプロタイプをホモに持つ遺伝子型）は出現頻度も約１０％あり、日本人で検出できた他の６つの遺伝子型を合わせたグループと比べ有意に骨密度の低下がみられるから（Ｌ２−４ＢＭＤ；ｐ＝０．０４０，総ＢＭＤ；ｐ＝０．００３）、この遺伝子型の組み合わせを骨密度低下型に分類することは実用的に意味があると考えられる。
【００３１】
またこのＰＰｘｘ型の人はＡＬＰの濃度が他のグループに比べて有意に高値であり（ｐ＝０．０２３）骨減少の代償として骨形成が上昇している可能性がある。
【００３２】
【発明の効果】
ストロゲン受容体（ＥＲ）の遺伝子の多型を分析することにより、骨密度低下群に分類される人を鑑別することができる。さらにこの骨密度低下群は上記Ｎａｔｕｒｅ掲載の論文におけるビタミンＤ受容体のＢＢ型に分類された群とは異なっており、本発明は骨密度低下群予測の新しい方法として非常に有用であり、本発明によって分類された骨密度低下群は将来骨密度が低下し、骨粗鬆症などの骨疾患のリスクの高いことを予測しうる。従って、本発明により現実に骨密度が低下する年齢に達するよりかなり前に、将来骨密度の低下および／または骨疾患が発生するか否かをかなりの確度で予測することができ、それにより食事または栄養素、生活習慣に注意して将来の骨密度低下を予防することができ、骨粗鬆症のような骨疾患を回避することができる。
【００３３】
【配列表】
【００３４】
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【００３５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ産物を制限酵素ＰｖｕＩＩ，ＸｂａＩで切断したときのパターンを示す図である。
【図２】ＰＰｘｘ群とその他の群における骨密度（Ｌ２−４ＢＭＤ，総ＢＭＤ）の比較を示した図である。それぞれの値は平均値±ＳＥである。
【図３】ＰＰｘｘ群とその他の群におけるＡＬＰ濃度の比較を示した図である。それぞれの値は平均値±ＳＥである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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