(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１の１位のMetから２９３位のGluまでのアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３】
配列表の配列番号１の８７位のＡから９６５位のＧまででなる塩基配列からなる、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列表の配列番号１の１位のＧから１７３３位のＡまででなる塩基配列からなる、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の核酸分子を有する発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項７】
前記宿主が大腸菌である請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６に記載の形質転換体を培養する工程、および産生されたタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質；該タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換体；該形質転換体を用いる神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法；該タンパク質を認識する抗体；および、該抗体を産生し得るハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経の軸索損傷により影響を受けた神経細胞の逆行性変性または軸索の再生は、中枢および末梢神経系で通常に生じるプロセスである。ラットの顔面神経の軸索切断により影響を受けた神経細胞では、以下のような一連のグリア反応が報告されている。第１に、アストログリア細胞で、グリア線維性酸性タンパク質のレベルが増加する（KitamuraおよびFujita、Denshi-kenbikyou 19:193-199 (1985)；GraeberおよびKreutzberg、J Neurocytol 15:363-373 (1986)）。第２に、ミクログリア細胞が活性化され、そして増殖する（KitamuraおよびFujita、(1985)前出；Graeberら、Neurosci Lett 85:317-321 (1988)）。第３に、神経周囲のミクログリア細胞が、シナプス結合に侵入し、神経細胞体および主要樹状突起の表面からシナプス末端を阻害する（BlinzingerおよびKreutzberg、Z Zellforsch Mikrosk Anat 85:145-157 (1968)）。このような一連の反応が起こった後に、顔面神経の軸索が再生を起こすことが知られている。
【０００３】
これらの現象論的観察にも関わらず、軸索切断に応答する神経細胞体の周りの領域で生じる分子生物学的事象についてはほとんど知られていない。GAP-43（Basiら、Cell 49:785-791 (1987)）、α-チューブリン（α-tubulin）（Millerら、J Neurosci 9:1452-1463 (1989)）、α-インターネキシン（α-internexin）（Fliegnerら、EMBO J 9:749-755 (1990)）、SCG-10（Okazakiら、Genomics 18:360-373 (1993)）、ユビキチン（Finchら、Nucleic Acids Res 18:1907 (1990)）、MHCクラスI RT1 Aa α鎖（Radaら、Proc Natl Acad Sci USA 87:2167-2171 (1990)）、カテプシンS（PetanceskaおよびDevi、J Biol Chem 267:26038-26043 (1992)）、ニューロフィラメント（KitamuraおよびWatanabe、Acta Histochem Cytochem 23:375-386 (1990)；Kitamuraら、Neuropathology Suppl 4:263-268 (1991)）、GFAP（Kitamura、「Functional neuroteratology of short-term exposure to drugs」（Fujita TおよびBoer GJ編）187-197頁、Tokyo、Teikyo UP (1991)；Tetzlaffら、J Neurosci 11:2528-2544 (1991)）、神経成長因子レセプター（Saikaら、Mol Brain Res 9:157-160 (1991)；Chiuら、J Comp Neurol 328:351-363 (1993)）、およびアミロイドβタンパク質前駆体（βAPP：Solaら、Eur J Neurosci 5795-5808 (1993)）を含む非常に少数の遺伝子が、軸索切断後にその発現レベルが変化することが既に報告されている。しかし、これらの同定された遺伝子は、軸索切断によりその発現が変動した一部の遺伝子であり、軸索切断後に重要な役割を果たすさらに他の未知遺伝子の存在が考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、神経損傷に伴い発現が変動する上記従来技術の遺伝子とは別の遺伝子から発現するタンパク質、特にその発現が上昇するタンパク質を提供することにある。さらに本発明の目的は、上記タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換体；該形質転換体を用いる神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法；該タンパク質に対する抗体；および該抗体を産生し得るハイブリドーマを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、顔面神経の軸索切断により転写レベルで影響を受ける遺伝子についてさらに種々の検討を行うために、ディファレンシャルハイブリダイゼーション法を用いた。これによりいくつかの軸索切断に伴いその発現が変動する遺伝子を単離し得、このうちの１つは、軸索切断により転写レベルで発現が上昇する新規の遺伝子であり、これをｒａｎｐ−１と命名した。ＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列、および大腸菌を用いてこの遺伝子を発現して得られた産物（ｒａｎｐ−１タンパク質）が、５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を有するタンパク質であることを見出した。さらに、このタンパク質が、５'-ヌクレオチダーゼ活性を有さないが、５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質（ｒａｎｐ−１タンパク質）は、５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を含む。
【０００７】
好ましい実施態様によれば、上記５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列は、配列表の配列番号１の２１９位のMetから２２９位のSerまでのアミノ酸配列またはその類似の配列である。
【０００８】
好ましい実施態様によれば、上記タンパク質は、配列表の配列番号１の１位のMetから２９３位のGluまでのアミノ酸配列またはその類似の配列を含む。
【０００９】
本発明のＤＮＡ配列は、上記のいずれかに記載のタンパク質をコードする。
【００１０】
好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の７４１位のＡから７７３位のＴまででなる塩基配列を有する。
【００１１】
好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の８７位のＡから９６５位のＧまででなる塩基配列を有する。
【００１２】
好ましい実施態様によれば、上記ＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１の１位のＧから１７３３位のＡまででなる塩基配列を有する。
【００１３】
本発明の発現ベクターは、上記のいずれかに記載のＤＮＡ配列を有する。
【００１４】
本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを宿主に導入して得られる。
【００１５】
好ましい実施態様によれば、上記宿主は大腸菌である。
【００１６】
本発明の神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法は、上記形質転換体を培養する工程、および産生されたタンパク質を培養培地から回収する工程を包含する。
【００１７】
本発明の抗体は、上記のいずれかに記載のタンパク質を認識する。
【００１８】
好ましい実施態様によれば、上記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
本発明のハイブリドーマは、上記のいずれかに記載の抗体を産生し得る。
【００２０】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）定義
「５'-ヌクレオチダーゼ」は、ヌクレオチドの５'位のリン酸を加水分解してヌクレオシドにする酵素であり、その触媒する反応を図１に示す。本明細書中では、特にＣＤ７３と呼ばれる膜表面上に存在する５'-ヌクレオチダーゼを指し、これは、真核生物では原形質膜に局在し、細胞膜表面に活性部位を有するエクト型の酵素である。エクト型の酵素とは、一般に、細胞膜の内在性タンパク質で細胞の外表に活性部位を有し、外側に向かって活性を発揮する酵素である。
【００２１】
アミノ酸配列またはＤＮＡ配列に「類似の配列」とは、特定の配列に必ずしも限定されることはなく、この配列に加えて当業者に公知の置換、挿入、欠失などを含み、そしてコードされるタンパク質の機能または活性が実質的に同じ程度である改変を含む配列をいう。あるいは、タンパク質の機能または活性が実質的に同じ程度であるならば、化学的または生化学的な改変、あるいは非天然または誘導体化されたアミノ酸または塩基を含んでいてもよい。
【００２２】
（ＩＩ）本発明のタンパク質またはＤＮＡ配列の単離または同定に用い得る方法本発明の各工程において用い得る一般的な分子生物学的実験手法（ＤＮＡの電気泳動、電気泳動分離したＤＮＡをゲル中から回収する方法、ライゲーション、宿主の形質転換、組換え宿主の培養、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの制限酵素による切断、ＤＮＡの放射標識など）は、例えばMolecular Cloning 第２版（Maniatisら、Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)）に記載されているような、当業者に公知の方法が採用される。
【００２３】
以下に本発明のタンパク質またはＤＮＡ配列の単離または同定に用い得る一般的方法を述べる。
【００２４】
（１）ｒａｎｐ−１のｃＤＮＡのクローニング
本発明のタンパク質であるｒａｎｐ−１をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片のクローニングを配列決定方法と共に以下に例示する。本発明のｒａｎｐ−１については、顔面神経軸索切断により発現が上昇すること以外に情報がないので、この遺伝子を得るために、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いて、例えば、以下に記載のように行う。
【００２５】
（Ａ）ＲＮＡの調製
例えばラットなどの動物を麻酔して、その片側の顔面神経を、例えば茎乳突孔のレベルで切断する。適当な時間の後、これらの動物を屠殺し、その脳幹から、切断側および非切断側の顔面神経核を取り出す。それぞれの取り出した顔面神経核を有する脳組織から、グアニジンチオシアネート法（ChomczynskiおよびSacchi、Anal Biochem 162:156-159 (1987)）に従ってＲＮＡを抽出し得る。
【００２６】
（Ｂ）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーを、上記のようにして得た切断側または非切断側顔面神経核由来のＲＮＡから、例えば市販のｃＤＮＡ構築キット（GIBCO BRL社製）を用いて構築し得る。ｃＤＮＡ合成用のアダプタープライマーとして、および適切なベクターへのｃＤＮＡ挿入物用のアダプターとしての適当な長さのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機などで化学的に合成し得る。
【００２７】
（Ｃ）ディファレンシャルハイブリダイゼーション
上記のようにして得たｃＤＮＡライブラリーを、例えば大腸菌にエレクトロポレーションする。この菌をプレーティングして増殖し、次いで大腸菌の各クローンの中のｃＤＮＡ挿入物を、適当なオリゴマーを用いてＰＣＲで増幅し得る。得られたＰＣＲ産物について、例えばアガロースゲル電気泳動を行った後、ナイロンメンブレンにトランスファーする。顔面神経軸索切断７日後の切断側神経核から抽出したＲＮＡから作製した二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡと、同じラットの非切断側神経核由来のｄｓｃＤＮＡとを、例えば32P-dCTPでランダムラベルし、これをハイブリダイゼーション用のプローブとして用い得る。上記メンブレンとプローブとをハイブリダイズさせた後、メンブレンを洗浄する。これをＸ線フィルムに露光することにより、切断側で発現が上昇するＤＮＡが検出される。
【００２８】
（Ｄ）ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列のホモロジー検索
上記のようにして、軸索切断後に顔面神経核で発現が上昇するいくつかのｃＤＮＡを単離し得る。このような軸索切断により影響を受ける遺伝子を有するクローンについて、例えばジデオキシ法により部分的に配列決定し、そしてこの配列を、例えば、GenBank/EMBL/DDBJ ＤＮＡ配列データベースに対して核酸ホモロジー検索を行い得る。この検索の結果、新規のｃＤＮＡクローンを１つ単離し、これをｒａｎｐ−１と命名した。
【００２９】
上記のようにして得られたｒａｎｐ−１ｃＤＮＡの一部をプローブとして、軸索切断側の顔面神経核から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡのほぼ全長を含むクローンを分離し得る。ＤＮＡ塩基配列の解析は、例えば、DNASIS（Hitachiソフトウェア社製）を用いて行い、このｃＤＮＡの塩基配列を決定し得る。ＤＮＡから予想されるタンパク質のアミノ酸配列について、例えば、データベースであるprositeに対してモチーフ検索を行い得る。タンパク質のモチーフ検索の結果、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質のＣ末端に、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）のコンセンサス配列が存在することが明らかとなった。
【００３０】
５'-ヌクレオチダーゼは、脊椎動物のほとんど全臓器で発現しており、正常成熟ラットの脳では、主としてグリア細胞の膜表面上に存在する。神経細胞においては、現在のところ、網膜光受容体および上部頸管ガングリオンのシナプスにのみ存在が認められている。また、ラットの顔面神経軸索切断側の神経核周囲に存在する神経周囲のミクログリア細胞で、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼの発現が損傷に伴い上昇することも知られている（Schoenら、GLIA 6:314-317 (1992)）。このことから、細胞外のヌクレオチドをこの酵素がヌクレオシドに変換し、そのことにより生体膜に対する透過性が上昇し、増殖中のグリア細胞およびその周囲の神経細胞への核酸前駆体の取り込みを補助していることが推測されている。また、ラット海馬の嗅内皮質に損傷を与えて歯状回の分子層に存在する神経細胞を変性させた場合、変性した神経細胞の神経終末と、この領域を再生するために中隔核から発芽し、シナプス形成を行った神経細胞とのシナプス間隙に、高い５'-ヌクレオチダーゼの活性が認められる。さらにエクト型の５'-ヌクレオチダーゼは、脂質により膜に挿入されたタンパク質で、活性部位を含めた全領域が膜の外に出ており、細胞マトリックスのラミニン、フィブロネクチン等と結合する接着分子としての一面を持っているために、神経損傷時の神経周囲のミクログリアの突起進展との関係が予想されている。以上のことより、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼは、神経再生に何らかの積極的な役割を果たしているものと推測されている。従って、このような５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を有する本発明のｒａｎｐ−１タンパク質も、神経再生に関与すると考えられる。
【００３１】
（２）ｒａｎｐ−１の組織および組織内分布の確認
本発明のｒａｎｐ−１の組織分布は、例えば、ｍＲＮＡの発現またはｒａｎｐ−１タンパク質の発現を解析することにより、確認することができる。ｍＲＮＡの発現については、本発明のｒａｎｐ−１ｃＤＮＡを用いてノーザンブロット分析により確認し得る。ｒａｎｐ−１タンパク質の発現については、このタンパク質に対する抗体を作成した後、ウエスタンブロット分析により確認することができる。本発明のｒａｎｐ−１のｍＲＮＡは、正常ラットの全組織で発現しており、特に肝臓、腎臓、および脳に多く発現していた。また、脳細胞質で本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の発現が確認されている。
【００３２】
本発明のｒａｎｐ−１の組織内分布は、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションなどによりｍＲＮＡを、抗体を使用する免疫組織化学などによりタンパク質を分析することによって確認することができる。インサイチュハイブリダイゼーションは、例えば、公知の文献に記載のように（Nakayamaら、Mol Brain Res 21:206-218 (1994)）、同位体またはジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いて、組織の凍結切片について行い得る。これを顕微鏡検査することにより、本発明のｒａｎｐ−１ｍＲＮＡが、神経切断側の神経核で上昇していることが明らかとなった。
【００３３】
（３）ｒａｎｐ−１タンパク質の発現
本発明のｒａｎｐ−１をコードする遺伝子は、適当なベクター、例えば、pGEX5X-3、pGEX4T-3などに組み込まれて、ｒａｎｐ−１タンパク質を発現させるための発現ベクターとされる。
【００３４】
この発現ベクターを、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体が作成される。この形質転換体を培養することにより、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質が産生され得る。また、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、適当なタンパク質との融合タンパク質としても産生され得る。
【００３５】
発現させた本発明のｒａｎｐ−１タンパク質またはその融合タンパク質は、ｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体を産生するための抗原として用い得る。本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の特定部分のみを抗原として利用して、抗体を作成し得る。
【００３６】
例えば、pGEX5X-3のSmaI部位に本発明のｒａｎｐ−１タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで、該遺伝子を含む発現ベクターを作成し、これを大腸菌などに導入することによって形質転換体を作成し得る。この形質転換体は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現され得る。このようにして得られたｒａｎｐ−１遺伝子産生培養物は、アフィニティーカラム法などで精製され得る。
【００３７】
（４）ｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体の産生
上記（３）項のようにして得られるｒａｎｐ−１タンパク質または融合タンパク質を、例えば、ウサギに注射して抗血清を誘起し、その血清から抗体をｒａｎｐ−１タンパク質アフィニティーカラムで精製し得る。このようにして得られる抗体を用いて、例えば、上記（２）項のウエスタンブロット分析を行い得る。
【００３８】
（５）５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定
５'-ヌクレオチダーゼ活性は、５'-ＡＭＰを基質として決定し得る。例えば、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質、陰性コントロールとしてＧＳＴタンパク質、または陽性コントロールとして５'-ヌクレオチダーゼを、50 mM グリシン緩衝液、pH 8.5、５mM MgCl2、10mM ５'-ＡＭＰを含む基質液中で37℃、30分間インキュベーションし、反応停止液（10％トリクロロ酢酸、0.02％アスコルビン酸）を加える。この反応液中の５'-ＡＭＰから遊離したリン酸の量により、５'-ヌクレオチダーゼ活性を定量し得る。この結果から、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は５'-ヌクレオチダーゼ活性を有さないことが明らかになった。
【００３９】
（６）５'-ＡＭＰとの結合アッセイ
例えば、５'-ＡＭＰセファロース4Bゲルにサンプルをかけて、フリーの５'-ＡＭＰを用いてゲルに特異的に結合しているタンパク質を交換置換反応により溶出させることにより、５'-ＡＭＰとの結合アッセイを行い得る。このアッセイ結果より、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、５'-ＡＭＰと特異的に結合する領域を有することが明らかとなった。
【００４０】
（７）抗ｒａｎｐ−１抗体の作製
本発明のｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体は、例えば、ｒａｎｐ−１タンパク質またはその一部分を認識する抗体を産生させ得るタンパク質を免疫原とし、マウス、ラット、ウサギなどの動物を免疫して、その血清由来の抗体（ポリクローナル抗体）を作製し得る。または、免疫した動物の脾臓またはリンパ節から細胞を取り出し、ミエローマ細胞などの細胞と融合させてハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生させ得る。
【００４１】
本発明のｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体を用いて、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質を免疫学的に測定することができる。例えば、免疫に用いた免疫原と同一の抗原部位を有する標識した一定量のタンパク質に、濃度既知の非標識抗原、および血清由来のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を加えて、抗原抗体競合反応を行わせる。非標識抗原の濃度を適当に変化させた後、抗体に結合した標識抗原と抗体に結合していない標識抗原とを適当な方法で分離して、抗体と結合した標識抗原の放射能量、酵素活性、または蛍光強度を測定する。非標識抗原の量が増すにつれ、抗体と結合する標識抗原の量は減少する。この関係をグラフにして標準曲線を得る。
【００４２】
次に、上記の反応系に濃度既知の非標識抗原の代わりに未知量の抗原を含む試料を加え、これを反応させた後に得られる放射能量、酵素活性、または蛍光強度を、標準曲線にあてはめれば、試料中の抗原の量を知ることができる。
【００４３】
【実施例】
［実施例１］ｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーション
顔面神経軸索切断により発現が変動する遺伝子を得るために、ラットの顔面神経核のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーとプローブとを用いて、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを以下に記載のように行った。
【００４４】
（１）ＲＮＡの調製
40匹の成熟雄Sprague-Dawley系ラット（６〜８週齢）を、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、左側顔面神経を茎乳突孔のレベルで切断した。その７日後にこれらのラットをエーテル麻酔下で断頭により屠殺した。ラットの脳幹を、両側の顔面神経核が1.5mm厚の薄片に含まれるようにかみそりの刃で切断し、そして各顔面神経核を15ゲージのステンレス管で穴をあけて取り出した（Yu、「A dissection and tissue culture manual of the nervous system 」（Shaharら編）30-39頁、New York:Alan R. Liss Inc. (1989)）。それぞれの取り出した顔面神経核を有する脳組織から、公知の方法（ChomczynskiおよびSacchi、(1987) 前出）に従ってＲＮＡを抽出した。
【００４５】
（２）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーを、上記のようにして得た左側（切断）または右側（非切断）顔面神経核由来の30〜60μgの総ＲＮＡから、Superscript ｃＤＮＡ合成キット（GIBCO-BRL社製）を用いて構築した：第１鎖のｃＤＮＡ合成用のアダプタープライマーとして、オリゴマーＡ（配列表の配列番号２）を用い、そしてpBluescript SKベクター（Stratagene社製）へのｃＤＮＡ挿入物用のアダプターとして、オリゴマーＢおよびＣ（それぞれ、配列表の配列番号３および配列番号４）をアニールしたアダプターを用いた。これらのオリゴマーは、Pharmacia Gene Assembler Plus ＤＮＡ合成機で合成した。ゲルろ過により二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡのサイズ分画を行い、pBluescript SKベクター（Stratagene社製）に結合して、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００４６】
（３）ディファレンシャルハイブリダイゼーション
上記（２）項で得たｃＤＮＡライブラリーを、GenePulser（Bio-Rad社製）を用いて16.6kv/cm、パルス長４msの条件で、大腸菌ElectroMAXDH10B（GIBCO-BRL社製）にエレクトロポレーションを行った。ＬＢプレート（１L中、トリプトン10g、イーストエキストラクト５g、塩化ナトリウム10g、および寒天10gを含む（pH 7.0））にこの菌をプレーティングし、大腸菌各クローンの中のｃＤＮＡ挿入物をオリゴマーＡおよびオリゴマーＢを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、以下の熱サイクル条件を用いて、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer-Cetus社製）およびＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer-Cetus社製）で行った：94℃にて30秒変性、55℃にて30秒アニール、72℃にて１分伸長；30サイクル。各ＰＣＲ産物について等量（10μl）ずつ各２レーンで１％アガロースゲル電気泳動を行った後、ナイロンメンブレン（PALL社製）にそれぞれトランスファーした。顔面神経軸索切断７日後の切断側神経核から抽出したＲＮＡから作製したｄｓｃＤＮＡと、同じラットの非切断側神経核由来のｄｓｃＤＮＡとを、Prime-It II（Stratagene社製）を用いて、32P-dCTP（Amersham社製）でランダムラベルした。これらをそれぞれプローブとして用い、各メンブレンについてハイブリダイゼーション緩衝液（0.5M リン酸ナトリウム（pH 7.2）、1mM EDTA、１％ BSA、７％ SDS）中で、65℃、16時間ハイブリダイゼーションを行った。その後メンブレンを0.1×SSC、55℃で洗浄し、これを、増感紙存在下−70℃で16時間、Ｘ線フィルム（Eastman Kodak社製）に露光した。
【００４７】
（４）ＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列のホモロジー検索
ディファレンシャルハイブリダイゼーションを行い、陽性と判断した大腸菌クローンをLBブロス培地で増殖した後、アルカリ変性法（0.2N NaOHおよび１％SDS中、氷上にて５分間ＤＮＡを変性させ、次いで7.5M 酢酸アンモニウムを加えて中和する。次に、フェノールを加えてタンパク質を変性させ、除タンパクを行うために遠心分離し、上清を回収後、エタノール沈殿する。）により大腸菌内のプラスミドを回収して、軸索切断後に顔面神経核で転写レベルで発現が上昇するいくつかのｃＤＮＡを単離した。このような軸索切断により影響を受ける遺伝子を有するクローンについて、T7 Sequencingキット（Pharmacia社製）を用いてジデオキシ法により部分的に配列決定し（100〜200塩基対（bp））、そしてこの配列をGenBank/EMBL/DDBJ ＤＮＡ配列データベースに対してFASTAプログラムを用いて核酸ホモロジー検索を行った。この核酸ホモロジー検索により、GAP43、α-チューブリンなどの、軸索切断後に顔面神経核で転写レベルで発現が上昇している既知のｃＤＮＡクローンを７つ、および新規のｃＤＮＡクローンを１つ単離した。この新規の遺伝子をｒａｎｐ−１と命名した。
【００４８】
ディファレンシャルハイブリダイゼーションで得られたｒａｎｐ−１ｃＤＮＡの一部（３'末端の約400bp）をプローブとして、軸索切断側の顔面神経核から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡのほぼ全長を含むクローンを分離した。その後、ＤＮＡ塩基配列の解析をDNASIS（Hitachiソフトウェア社製）を用いて行い、このｃＤＮＡの塩基配列（1733bp）を決定した。全長ｃＤＮＡについて、再度ＤＮＡデータベースでのホモロジー検索を行った結果、この遺伝子と高いホモロジーのある遺伝子は存在しなかった。従って、ｒａｎｐ−１は新規の遺伝子である。この遺伝子は、２９２アミノ酸のオープンリーディングフレームを含み、予想されるタンパク質の分子量は34キロダルトン（kd）、等電点は7.4である。また、ＤＮＡから予想されるタンパク質のアミノ酸配列について、コンピュータソフトMacPattern 2.01（Fuchs、Biosci 7:105-106 (1991)）を用いて、データベースであるprositeに対してモチーフ検索を行った。タンパク質のモチーフ検索の結果、Ｃ末端にエクト型の５'-ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）のコンセンサス配列が存在することが明らかとなった。
【００４９】
［実施例２］ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーション
ｒａｎｐ−１のｃＤＮＡの３'末端の約400bpが挿入されているプラスミドＤＮＡを、制限酵素MluI（TOYOBO社製）で消化後、T3ＲＮＡポリメラーゼを用いて35S-UTP（800 Ci/mmol、Amersham社製）標識のアンチセンスＲＮＡを作製した。これをプローブとして用い、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した軸索切断７日後のラット脳幹部の切片を用いて、以下のようにインサイチュハイブリダイゼーションを行った。すなわち、固定した切片を、ハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、0.5M NaCl、10mM Tris-HCl (pH 7.5)、1mM EDTA、0.02％ BSA、0.02％フィコール、0.02％ポリ[ビニルピロリドン]、0.1％ SDS、100μg/mlサケ精子ＤＮＡ、500μg/mlイーストｔＲＮＡ、125nM ウリジン 5'-[α-tチオ]トリホスフェート、10mM DTT、10％硫酸デキストラン）中で、35S標識ＲＮＡプローブ（比活性：１×106cpm/ml）とともに、55℃にて16時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズした切片を、洗浄緩衝液（0.1×SCC、20mM DTT）で、65℃にて30分間洗浄した。次いで、切片をRNaseＡ（20μg/ml：Sigma社製）で、37℃にて30分間処理した。これを、さらに65℃にて30分間洗浄した後、エタノールで脱水して風乾した。乾燥した切片を、Kodak nuclear emulsion NTB2中に浸して、暗所で４℃にて３時間感光した。現像した後、切片をヘマトキシリン-エオシン染色し、暗視野−明視野像を観察できる顕微鏡（Zeiss Axiophoto：Karl-Zeiss）を用いてシグナルを検出した。
【００５０】
暗視野顕微鏡検査による結果を図２に示す。顔面神経核は図の矢印の所にあり、左側が切断側、右側が非切断側である。図中の白い点として確認される部分にｒａｎｐ−１ｍＲＮＡが存在する。図から明らかなように、ｒａｎｐ−１の発現は切断側の神経核で上昇していた。また、図３に明視野顕微鏡検査の結果を示す。図中の黒い斑点として確認される部分がｒａｎｐ−１ｍＲＮＡの存在する部分であり、ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡは神経細胞に存在することも明らかとなった。
【００５１】
［実施例３］ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡの正常ラット組織内での発現
ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡのラット各組織での発現を検討するために、以下のようにしてノーザンブロット分析を行った。ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡの３'末端の約400bpを含むＤＮＡフラグメントを、Prime-It II（Stratagene社製）を用い、32P-dCTP（Amersham社製）でランダムラベルした。これをプローブとして、正常ラットの各臓器（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および精巣）から得たｍＲＮＡを５μgブロットしたナイロンメンブレン（Rat Multiple Tissue Northern (MTN) Blot（Clontech社製））と、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、65℃、16時間ハイブリダイゼーションを行った。その後フィルターを0.1×SSC、65℃で洗浄し、これを増感紙存在下−70℃、16時間Ｘ線フィルムに露光させた。
【００５２】
結果を図４に示す。ｒａｎｐ−１ｍＲＮＡは検討した全組織で発現しており、特に肝臓、腎臓、および脳で多いことが明らかになった。また、そのサイズは全て2.4kbであった。
【００５３】
［実施例４］ｒａｎｐ−１タンパク質の大腸菌内での発現
ｒａｎｐ−１タンパク質のオープンリーディングフレーム全長をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｒａｎｐ−１ｃＤＮＡが挿入されているプラスミドＤＮＡを、制限酵素BalI（Takara Shuzo社製）で消化した。この断片をアガロースゲル電気泳動した後、DEAEメンブレン（Schleicher & Schnell社製）を用いて、発現に必要なＤＮＡフラグメントを回収し、精製した。得られたＤＮＡフラグメントを、制限酵素SmaI（Takara Shuzo社製）で消化後、ウシ小腸アルカシホスファターゼ（CIAP：Takara Shuzo社製）処理したプラスミドpGEX5X-3（Pharmacia社製）に、アミノ酸の読み枠があうように、T4ＤＮＡリガーゼ（GIBC0-BRL社製）を用いて16℃で、16時間をかけて結合させた。これを大腸菌ElectroMaxDH10B（GIBCO-BRL社製）にエレクトロポレーションした。次いで、目的の大腸菌クローンを分離し、ＬＢ培地で培養し、対数増殖期の菌液中に、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトピラノシド（Sigma社製）を最終濃度が0.5 mMになるように添加し、37℃で２時間培養して、タンパク質の発現誘導を行った。大腸菌を集菌し、Triton X100を１％含むＰＢＳ中で菌を音波処理し、４℃で10分間、10,000×gにて遠心分離した。得られた上清の可溶性画分を、グルタチオン-セファロース4B（Pharmacia社製）に室温で５分間吸着させた。次いで、このゲルをＰＢＳで十分に洗浄し、ゲルに結合したタンパク質を５mMのグルタチオン（KOHJIN社製）を含む50 mM Tris-HCl、pH 8.0）の溶出緩衝液中、室温で５分間放置することにより溶出させた。次にこのタンパク質を陽イオン交換カラムであるHiTrapQ（Pharmacia社製）にかけ、移動相である50 mM Tris-HCl（pH8.0）に０〜１M NaCl塩濃度グラジエントをFPLC（Pharmacia社製）でかけることによリ、ｒａｎｐ−１タンパク質を溶出し、精製した。得られたタンパク質１μgを、12.5％ SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、クーマシーブリリアントブルー染色により精製融合タンパク質を検出した。
【００５４】
このタンパク質を検出した結果を図５に示す。Ｍのレーンは分子量マーカーである。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のレーンには、予想される分子量のタンパク質（34kd）が観察された。
【００５５】
［実施例５］ｒａｎｐ−１タンパク質に対する抗体の産生
上記実施例４で得た精製ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質100μgを、フロイントの完全アジュバント（DIFCO社製）を用いてエマルジョン形成した後、ニュージーランドホワイトウサギの皮下に注射した。初回免疫の１カ月後にブーストを行い、その18日後に全血を採取した。
【００５６】
上記実施例４で得た精製したＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質およびＧＳＴタンパク質を、それぞれCNBr活性化セファロース4B（Pharmacia社製）ゲルに結合して固相化し、これらをそれぞれカラムに充填し、それぞれＧＳＴ-ｒａｎｐ−１カラムおよびＧＳＴカラムとした。まず、ウサギ抗血清をＧＳＴ-ｒａｎｐ−１カラムにかけ、結合緩衝液（20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、0.3M NaCl）でゲルを洗浄後、溶出緩衝液（0.17 M グリシン-HCl、pH 2.3）で、ゲルに特異的に結合している抗体を溶出した。１M Tris-HCl、pH 9.0で中和した後、この抗体をＧＳＴカラムにかけた。抗ＧＳＴ抗体はカラムに吸着するので、素通り画分を回収することにより抗ｒａｎｐ−１タンパク質抗体を得た。
【００５７】
得られた抗体は、ウエスタンブロット分析により以下のようにして確認した。精製ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質およびＧＳＴタンパク質を、それぞれ0.1μgおよび0.5μgSDS化した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲル上のバンドをニ卜ロセルロースメンブレン（ATTO社製）にトランスファーした。このメンブレンを、５％スキムミルク（DIFCO社製）を含むＰＢＳ（ブロッキング液）中で４℃、16時間ブロッキングした。次いで、ブロッキングしたメンブレンを、ブロッキング液で１：500希釈した精製抗ｒａｎｐ−１タンパク質抗体（一次抗体）と、１時間、室温で反応させた。0.05％ Tween20を含むＰＢＳでメンブレンを洗浄し、ＡＢＣキット（Vectastain社製）を用い、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ビオチン（二次抗体）と反応をさせた後、化学発光増強システム（Amersham社製）を用いて、タンパク質を検出した。
【００５８】
結果を図６に示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のレーンのみにバンドが検出され（62kd）、ＧＳＴタンパク質は検出されなかった。従って、得られた抗体がｒａｎｐ−１タンパク質のみを認識する抗体であることが明らかとなった。
【００５９】
［実施例６］ｒａｎｐ−１タンパク質のラット脳組織内での発現
正常ラットの脳細胞のタンパク質を、以下のようにウエスタンブロット分析を行って、ｒａｎｐ−１タンパク質の発現について検討した。正常ラットの脳を、溶解緩衝液（25 mM Tris-HCl、pH 7.4、50 mM NaCl、0.5％ デオキシコール酸ナトリウム、２％ NP-40、0.2％ SDS、１mM PMSF）中でホモジナイズした。これを、４℃にて10分間、12,000rpmで遠心分離し、上清を回収した。タンパク質定量は、Bio-Rad Protein Assayを用いて行った。サンプル15μgをSDS化した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ゲル上のバンドをニ卜ロセルロースメンブレン（ATTO社製）にトランスファーした。このメンブレンを、５％スキムミルク（DIFCO社製）を含むＰＢＳ（ブロッキング液）中で４℃、16時間ブロッキングした。次いで、ブロッキングしたメンブレンを、ブロッキング液で１：500希釈した精製抗ｒａｎｐ−１タンパク質抗体（一次抗体）と、１時間、室温で反応させた。0.05％ Tween20を含むＰＢＳでメンブレンを洗浄し、ＡＢＣキット（Vectastain社製）を用い、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ビオチン（二次抗体）と反応をさせた後、化学発光増強システム（Amersham社製）を用いて、ｒａｎｐ−１タンパク質を検出した。
【００６０】
結果を図７に示す。Ｍのレーンは分子量マーカーである。正常ラットの脳の細胞質タンパク質のレーンには、68kdのタンパク質が検出された。ｒａｎｐ−１タンパク質の推定分子量は34kdであるため、このタンパク質は、細胞内で翻訳後修飾を受けていると考えられる。
【００６１】
［実施例７］ｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定
ｒａｎｐ−１タンパク質はモチーフ検索により、Ｃ末端に５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を含むことが明らかとなった。そこで、大腸菌内で発現させたＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質を用い、ｒａｎｐ−１タンパク質に５'-ヌクレオチダーゼ活性があるかどうかの検討を行った。
【００６２】
５'-ヌクレオチダーゼ活性は、５'-ＡＭＰを基質として以下のようにして決定した。50mM グリシン緩衝液、pH 8.5、５mM MgCl2、および10mM ５'-ＡＭＰを含む基質液200μlにサンプルを加えて、これを37℃で、30分間インキュベーションした後、反応停止液１ml（10％トリクロロ酢酸、0.02％アスコルビン酸）を加えた。反応液の一部（750μl）を取り、５'-ＡＭＰから遊離したリン酸をGerlachらのリンモリブテン酸定量法（GerlachおよびHiby、「Methods of Enzymatic Analysis」第2巻（Bergmeyer編）871-875頁、Academic Press、New York (1974)）に従って定量した。すなわち、５'-ヌクレオチダーゼ反応液（750μl）に水を加えて１mlとし、これに40mM モリブデン酸アンモニウム（200μl）および還元溶液（100μl）を加えて室温で10分間放置した。次いで、2.5M 酢酸ナトリウム（400μl）および水300μlを加えて反応を停止し、この溶液の578nmにおける吸光度を測定した。酵素１ユニットは、37℃で基質５'-ＡＭＰから１分間に１μmolの無機リン酸を加水分解する単位と定義する。
【００６３】
図８は、上記の基質液中に、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質1.2μg、陰性コントロールとしてＧＳＴタンパク質1.6μg、または陽性コントロールとして５'-ヌクレオチダーゼ（5'-N；crotalus atrox venom（ヘビ毒）由来、Sigma社製）0.1ユニットを加えて、５'-ヌクレオチダーゼ活性を測定した結果を示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性は、陰性コントロールであるＧＳＴタンパク質と同等であり、ｒａｎｐ−１タンパク質は５'-ヌクレオチダーゼ活性を有さないことが明らかになった。
【００６４】
次に、このタンパク質が５'-ヌクレオチダーゼに及ぼす影響について検討した。上記基質液200μl中に、５'-ヌクレオチダーゼを0.01ユニット加え、さらに、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質1.5μg（24 pmol）またはＧＳＴタンパク質0.8μg（29 pmol）を加え、以下は５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定法に従って行った。結果を図９に示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質を添加することにより、５'-ヌクレオチダーゼ活性は約５倍になった。このことから、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質が、インビトロで５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強する機能を有することが示唆された。また、ＧＳＴタンパク質の添加ではこのような活性の増強が認められなかったため、５'-ヌクレオチダーゼ活性の増強はｒａｎｐ−１タンパク質に起因すると考えられる。
【００６５】
［実施例８］ｒａｎｐ−１タンパク質と５'-ＡＭＰとの結合アッセイ
エクト型の５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列は、５'-ヌクレオチダーゼ配列中に２種類あることが知られており、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質はこのうちの片方の配列を有している。現在、２種類のコンセンサス配列の一方が酵素の活性中心に対応し、他方が基質である５'-ＡＭＰの結合に必要であると考えられているが、その配列との対応は知られていない。ｒａｎｐ−１タンパク質がインビトロで５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強する機能を有する理由として、ｒａｎｐ−１タンパク質が、５'-ヌクレオチダーゼの基質である５'-ＡＭＰに結合し、５'-ヌクレオチダーゼに効率よくそれを受け渡す機構が予想される。
【００６６】
このことを検討するために、ｒａｎｐ−１タンパク質と５'-ＡＭＰとの結合アッセイを行った。結合緩衝液（10 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4、0.5M NaCl）500μl中に、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質1.4μgおよびＧＳＴタンパク質1.6μgをそれぞれ含む液に対して、同じ緩衝液で平衡化した５'-ＡＭＰセファロース4B（Pharmacia社製）ゲルを50μl加えた。室温で10分間放置した後、ゲルを結合緩衝液で十分に洗浄し、これに10 mM ５'-ＡＭＰを含むグリシン緩衝液（pH 7.0）を加えた。室温で10分間放置し、５'-ＡＭＰの交換置換反応によりゲルに特異的に結合しているタンパク質を溶出させた。溶出液のそれぞれ10μlをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、５'-ＡＭＰに結合したタンパク質を検出した。
【００６７】
結果を図１０に示す。ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質は５'-ＡＭＰによりカラムから溶出されたので、５'-ＡＭＰに特異的に結合していたことが示された。ＧＳＴタンパク質は、５'-ＡＭＰによりカラムから溶出されなかったので、５'-ＡＭＰに結合していなかったことが示された。従って、ＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のｒａｎｐ−１部分に５'-ＡＭＰと特異的に結合する領域があることが明らかになった。
【００６８】
【発明の効果】
本発明によれば、神経損傷に伴い発現が上昇する、上記従来技術とは別のタンパク質、特に５'-ヌクレオチダーゼのコンセンサス配列を含むタンパク質が提供される。さらに本発明によれば、上記タンパク質の構造遺伝子；該遺伝子を有する発現ベクター；該発現ベクターを導入した形質転換体；該形質転換体を用いる神経損傷に伴い発現が上昇するタンパク質の製造方法；該タンパク質を認識する抗体；および該抗体を産生し得るハイブリドーマが提供される。
【００６９】
本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、５'-ヌクレオチダーゼ活性を増強し、５'-ヌクレオチダーゼの基質である５'-ＡＭＰと特異的に結合する。従って、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質が５'-ヌクレオチダーゼに関与して、基質をこの酵素に効率よく渡す機能、そして核酸の細胞への利用効率が高められると考えられる。エクト型の５'-ヌクレオチダーゼもまた、神経再生に関与が示唆される分子であることから、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質が、エクト型の５'-ヌクレオチダーゼ活性をコントロールすることにより、神経細胞の機能回復に深く関与している可能性がある。このことから、本発明のｒａｎｐ−１タンパク質は、神経再生の機構の解明に有用であり得る。さらに、本発明のｒａｎｐ−１遺伝子は、肝臓などの脳以外にも存在している。従って、本発明のｒａｎｐ−１遺伝子およびタンパク質の発現をコントロールすることによって、神経疾患の治療に応用すること、および身体の諸臓器の活性を高めることが可能になり得る。
【００７０】
【配列表】
【００７１】
【配列番号１】
0003649480.tif 000002
0003649480.tif 000003
0003649480.tif 000004
【００７２】
【配列番号２】
0003649480.tif 000005
【００７３】
【配列番号３】
0003649480.tif 000006
【００７４】
【配列番号４】
0003649480.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】エクト型５'-ヌクレオチダーゼが触媒する生化学反応を示す図である。
【図２】ラットの顔面神経軸索切断７日後の顔面神経核におけるインサイチュハイブリダイゼーションによる、本発明のｒａｎｐ−１ｍＲＮＡの発現を示す暗視野顕微鏡写真である。
【図３】ラットの顔面神経軸索切断７日後の顔面神経核におけるインサイチュハイブリダイゼーションによる、本発明のｒａｎｐ−１のｍＲＮＡの発現を示す明視野顕微鏡写真である。
【図４】ラットの各組織における本発明のｒａｎｐ−１のｍＲＮＡの発現についてのノーザンブロット分析の結果を示す電気泳動像の写真である。
【図５】大腸菌中で発現させたＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質の発現を示す、免疫ブロッティング分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。
【図６】抗ｒａｎｐ−１抗体を用いたＧＳＴ-ｒａｎｐ−１融合タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。
【図７】ラット脳細胞質における本発明のｒａｎｐ−１タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す、電気泳動像の写真である。
【図８】本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ヌクレオチダーゼ活性に及ぼす影響を測定した結果を示すグラフである。
【図１０】本発明のｒａｎｐ−１タンパク質の５'-ＡＭＰへの特異的結合を検討した結果を示す、免疫ブロッティング分析の電気泳動像の写真である。
【図１】
0003649480.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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