(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アントラセン構造部とポリアミン構造部とを有する錯形成性蛍光試薬の金属錯体の水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を含む試料を加え、かつｐＨを弱酸性ないし中性とした水溶液を調製したのち、励起光により蛍光を発生させ、該蛍光強度の増大度に基づいて該試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤の濃度を求めることを特徴とする末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量方法。
【請求項２】
アントラセン構造部とポリアミン構造部とを有する錯形成性蛍光試薬の金属錯体の水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を含む試料を加え、かつｐＨを弱酸性ないし中性とした水溶液を調製したのち、励起光により蛍光を発生させ、該蛍光強度を、末端アミノ酸型有機リン系除草剤濃度と蛍光強度との関係を示す検量線と照合して、該試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤の濃度を求めることを特徴とする末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量方法。
【請求項３】
前記のｐＨを弱酸性ないし中性とした水溶液が、ｐＨを５〜７とした水溶液である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
錯形成性蛍光試薬が、Ｎ‐（アントリルメチル）‐ポリアミンである請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
Ｎ‐（アントリルメチル）‐ポリアミンがＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記金属錯体を形成する金属イオンが、銅(ＩＩ)イオン、ニッケル(ＩＩ)イオン及び水銀(ＩＩ)イオンの中から選ばれた少なくとも１種である請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
末端アミノ酸型有機リン系除草剤が、Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシン、４‐〔ヒドロキシ（メチル）ホスフィノ〕‐ＤＬ‐ホモアラニン、ＤＬ‐ホモアラニン‐４‐イル（メチル）ホスフィン酸、Ｌ‐２‐アミノ‐４‐〔（ヒドロキシ）（メチル）＝ホスフィノイル〕ブチリル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニン、４‐〔ヒドロキシ（メチル）ホスフィノ〕‐Ｌ‐ホモアラニル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニン又はそれらの塩である請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を、高感度で迅速に定量する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
末端アミノ酸型有機リン系除草剤は、水溶性で、比較的毒性が少なく、生物分解性がよいため、多用されている。自然界や農作物における末端アミノ酸型有機リン系除草剤の残留量をモニターするため、高感度で簡便な定量法が求められている。末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量法としては、揮発性化合物へ誘導体化した後、ＧＣやＧＣ−ＭＳを用いる方法が知られているが（Ｃ．Ｄ．Ｓｔａｌｉｋａｓ、Ｃ．Ｎ．Ｋｏｎｉｄａｒｉ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、９０７巻、１頁、２００２年）、この方法は煩雑な誘導体化反応と特殊な装置を必要とするし、また、イオンクロマトグラフィー法は、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を成分分離し、定量する方法として研究されているが、通常用いられる電気伝導度による検出法では感度の点で十分満足しうるものではない。
【０００３】
比色法や蛍光法は高感度で簡便な定量法ではあるが、末端アミノ酸型有機リン系除草剤はそれ自身発色団を持たず、また発色や蛍光を与えるためのラベル化も困難である。モリン(２′，３，４′，５，７‐ペンタヒドロキシフラボン)のＡｌ（ＩＩＩ）錯体の示す蛍光の該除草剤による消光現象を利用する方法が知られているが（Ｍ．Ｌｏｖｄａｈｌ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、６０２巻、１９７頁、１９９２年）、該除草剤の濃度増大に従って蛍光が減少するため、蛍光が微少になると測定誤差を生じやすくなるなど精度等の点で問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情の下、試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤を、簡便な操作で、高感度かつ迅速に、しかも精度よく定量する方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量について鋭意研究を重ねた結果、水溶液中、錯形成性蛍光試薬、中でもＮ‐（９‐アントリルメチル）‐ポリアミンの示す蛍光強度が金属イオンとりわけＣｕ（ＩＩ）イオンでの錯体形成により減少すること、またこの形成された錯体に末端アミノ酸型有機リン系除草剤を加えると再び蛍光強度が増大することを見出し、これらの知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）アントラセン構造部とポリアミン構造部とを有する錯形成性蛍光試薬の金属錯体の水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を含む試料を加え、かつｐＨを弱酸性ないし中性とした水溶液を調製したのち、励起光により蛍光を発生させ、該蛍光強度の増大度に基づいて該試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤の濃度を求めることを特徴とする末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量方法、及び
（２）アントラセン構造部とポリアミン構造部とを有する錯形成性蛍光試薬の金属錯体の水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を含む試料を加え、かつｐＨを弱酸性ないし中性とした水溶液を調製したのち、励起光により蛍光を発生させ、該蛍光強度を、末端アミノ酸型有機リン系除草剤濃度と蛍光強度との関係を示す検量線と照合して、該試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤の濃度を求めることを特徴とする末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量方法、
を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の好ましい態様としては、以下のとおりのものが挙げられる。
（３）前記のｐＨを弱酸性ないし中性とした水溶液が、ｐＨを５〜７とした水溶液である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）錯形成性蛍光試薬が、Ｎ‐（アントリルメチル）‐ポリアミンである前記（１）、（２）又は（３）記載の方法。
（５）Ｎ‐（アントリルメチル）‐ポリアミンがＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンである前記（４）記載の方法。
（６）前記金属錯体を形成する金属イオンが、銅(ＩＩ)イオン、ニッケル(ＩＩ)イオン及び水銀(ＩＩ)イオンの中から選ばれた少なくとも１種である前記（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法。
（７）末端アミノ酸型有機リン系除草剤が、Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシン、４‐〔ヒドロキシ（メチル）ホスフィノ〕‐ＤＬ‐ホモアラニン、ＤＬ‐ホモアラニン‐４‐イル（メチル）ホスフィン酸、Ｌ‐２‐アミノ‐４‐〔（ヒドロキシ）（メチル）＝ホスフィノイル〕ブチリル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニン、４‐〔ヒドロキシ（メチル）ホスフィノ〕‐Ｌ‐ホモアラニル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニン又はそれらの塩である前記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。
【０００８】
本発明で用いる錯形成性蛍光試薬は、光エネルギーを受容するアントラセン構造部分と、金属イオンを捕捉するポリアミン構造部分とを有するものであって、ポリアミン構造部分については、金属イオン、好ましくはＣｕ（ＩＩ）イオン、Ｎｉ（ＩＩ）イオン及びＨｇ（ＩＩ）イオンの中から選ばれた少なくとも１種、中でもＣｕ（ＩＩ）イオンと安定な錯体を形成するものであれば特に制限されないが、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、２‐アミノメチルピリジン構造のものが好ましい。このような錯形成性蛍光試薬としては、例えばアントラセン構造部分におけるアントラセン環を形成する炭素原子と、ポリアミン構造部分における窒素原子とが直接結合しているかあるいはアルキレン基を介して結合しているものなどが挙げられ、このようなものとしては、例えばＮ‐（アントリルメチル）‐ポリアミン、Ｎ‐（アントリルメチル）‐アミノアルコール、Ｎ‐（アントリルメチル）‐アザサイクリックアミンなどが挙げられ、中でもＮ‐（９‐アントリルメチル）‐ポリアミン、例えばＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミン、Ｎ‐（９‐アントリルメチル）‐ジエチレントリアミンが好ましい。
【０００９】
これらの錯形成性蛍光試薬は、水溶液中、ｐＨが弱酸性ないし中性、好ましくは５〜７で強い蛍光を示すが、金属イオン、とりわけＣｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｈｇ（ＩＩ）イオンと錯体を形成すると消光が起こる。この錯体水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を加えると蛍光が回復し、この除草剤の添加量に比例して蛍光強度は増大する。このような現象は、末端アミノ酸型有機リン系除草剤が、Ｃｕ（ＩＩ）イオンなどの金属イオンと結合することで錯体から該金属イオンを奪い取り、その結果除草剤の添加量に応じて錯形成性蛍光試薬の遊離が進行し、再び蛍光を発するようになるという特有の挙動に基づくものである。
【００１０】
末端アミノ酸型有機リン系除草剤は、有機リン構造部とアミノ酸末端構造部とを有する除草剤であればよく、アミノ酸末端構造部にはペプチド構造をもつものも包含され、このようなものの例としては、Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシン、４−〔ヒドロキシ（メチル）ホスフィノ〕‐ＤＬ‐ホモアラニン、ＤＬ‐ホモアラニン‐４‐イル（メチル）ホスフィン酸、Ｌ‐２‐アミノ‐４‐〔（ヒドロキシ）（メチル）＝ホスフィノイル〕ブチリル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニン、４‐〔ヒドロキシ（メチル）ホスフィノ〕‐Ｌ‐ホモアラニル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニン又はそれらの塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩、イソプロピルアミン塩やエタノールアミン塩等の有機アミン塩など）が挙げられ、市販品としてはグリホセート、ビアラホス（Ｌ‐２‐アミノ‐４‐〔（ヒドロキシ）（メチル）＝ホスフィノイル〕ブチリル‐Ｌ‐アラニル‐Ｌ‐アラニンナトリウム塩）、及びグルホシネート（アンモニウム‐ＤＬ‐ホモアラニン‐４‐イル（メチル）ホスフィネート）などが挙げられる。
次に、この蛍光発現反応の一例のスキームを示す。
【００１１】
【化１】
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【００１２】
この反応スキームに示されるように、蛍光の消光された、Ｎ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンのＣｕ（ＩＩ）錯体水溶液に対し、Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシンが加えられると、これがＣｕ（ＩＩ）イオンと結合するように作用し、錯形成性蛍光試薬のＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンが遊離され、それにより蛍光が発現される。
【００１３】
定量に際して用いられる錯形成性蛍光試薬の濃度は、５×１０-5〜１０-7Ｍ（Ｍ＝モル／リットル）の範囲で用いられる。また、Ｃｕ（ＩＩ）イオンなどの金属イオンは、錯形成性蛍光試薬の半当量になるように水溶液として添加される。生成した金属錯体の水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤の試料水溶液を加え、ｐＨを調整した後にその蛍光強度を測定する。ｐＨ条件は弱酸性ないし中性、好ましくはｐＨ５〜７、中でもｐＨ６〜７の範囲であるのが蛍光変化がシャープとなるので好ましい。ｐＨの調整にあたっては、ＰＩＰＥＳ〔ピペラジン‐１，４‐ビス（２‐エタンスルホン酸）〕緩衝液が好ましく用いられる。
【００１４】
蛍光を発生させるための励起光の波長は、３５０〜４３０ｎｍの範囲で選ばれるが、３６８ｎｍとするのが蛍光強度を最大化しうるので好ましい。
【００１５】
本発明方法では、前記したように、蛍光試薬の金属錯体を含む水溶液に、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を含む試料を加え、かつｐＨを弱酸性ないし中性に調整したのち、励起光により蛍光を発生させ、該蛍光強度の増大度に基づいて該試料中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤の濃度が求められる。
【００１６】
本発明方法は、測定系中にアニオンが比較的多量に混在してもそれによる影響はほとんどなく、例えば末端アミノ酸型有機リン系除草剤の濃度が０．１８ｐｐｍ（１×１０-5Ｍ）程度の場合、これに対し、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオンが１×１０-3Ｍ程度共存しても妨害を受けずに末端アミノ酸型有機リン系除草剤を定量することができる。一方、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ａｌ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃａ（ＩＩ）等の金属イオンの共存は、末端アミノ酸型有機リン系除草剤の定量を妨害するが、キレート樹脂により金属イオンをあらかじめ除去することにより防ぐことができる。この際に用いられるキレート樹脂としては、イミノ二酢酸、ＥＤＴＡ、ジエチレントリアミン‐Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′‐テトラ酢酸等のアミノポリカルボン酸の構造をもつ金属捕捉基を有するものが好ましい。
【００１７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、水中の微量末端アミノ酸型有機リン系除草剤を室温で迅速に蛍光光度定量することができる。本発明方法は、蛍光強度の変化がシャープであり、また可視部に蛍光を持つため、ハンディＵＶランプ等の紫外線灯を用いた目視による判定が可能であること、試薬ならびにその金属錯体が水溶性であることから、末端アミノ酸型有機リン系除草剤を含む、河川水、湖沼水、地下水などの環境試料中や、農作物中の末端アミノ酸型有機リン系除草剤のモニターやイオンクロマト分離後の迅速定量に対し、きわめて実用価値が高いと言える。
【００１８】
【実施例】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
なお、Ｍはモル／リットル濃度を示す。
【００１９】
実施例１
５０ｍｌメスフラスコに９×１０-5ＭのＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミン水溶液を５ｍｌ、４．５×１０-5Ｍの銅（ＩＩ）イオンを供与する硫酸銅水溶液を５ｍｌ、１ＭのＰＩＰＥＳ緩衝液１ｍｌを加えたものを用意し、これに直接純水を加えて全量を５０ｍｌとしたコントラスト試料と、また、これにＮ‐（ホスホノメチル）グリシンを含む検液を後述の各所定量加え、さらに純水を加えて全量を５０ｍｌとした各実施試料とを調製した。これら試料を２、３分室温で放置した後に、蛍光光度計にて励起波長３６８ｎｍとした際の蛍光スペクトルを得た。添加したＮ‐（ホスホノメチル）グリシンの濃度が高くなるに従い、蛍光波長４１９ｎｍにおける蛍光強度が増大することが認められた。蛍光スペクトルの変化を図１に示す。図１において、横軸は励起波長３６８ｎｍの際の蛍光波長を、縦軸は相対蛍光強度を表す。Ｎ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンおよびＣｕ（ＩＩ）イオンの濃度はそれぞれ９．０×１０-6Ｍ、４．５×１０-6Ｍ、反応溶液のｐＨは６．８である。スペクトルは下から上へ順に、コントラスト試料、Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシン濃度（ｐｐｂ）で、４３、８５、１２８、１７０、２１２、２５４、２９５、３３６、３７８の検液をそれぞれ添加した各実施試料についてのものである。
【００２０】
実施例２
実施例１における図１の各最大ピークの蛍光強度とＮ‐（ホスホノメチル）グリシン濃度の対数値とを関数として図２に示す検量線を作成した。全量２５ｍｌの測定検液に対して、１７０ｐｐｂ〜１７ｐｐｍの範囲のＮ‐（ホスホノメチル）グリシンの定量が可能であることが分る。図２の検量線において、横軸はＮ‐（ホスホノメチル）グリシン濃度（×１０-5Ｍ)の対数値、縦軸は相対蛍光強度を表わす。測定における励起波長は３６８ｎｍであり、蛍光検出波長は４１９ｎｍである。Ｎ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンおよびＣｕ（ＩＩ）イオンの濃度はそれぞれ２×１０-5Ｍ、１×１０-5Ｍ、反応溶液のｐＨは６．８である。
【００２１】
実施例３
Ｎ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミンの蛍光強度とｐＨの関係をＣｕ（ＩＩ）イオンの存在下、非存在下で調べた。３×１０-6ＭのＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミン水溶液１００μｌ、１．５×１０-6Ｍの硫酸銅水溶液１００μｌを加え、ｐＨを調整後に、イオン交換水を用いて全量２５ｍｌとした。各々の溶液の蛍光光度及びｐＨを測定した。４１９ｎｍの蛍光の強度とｐＨの関係を図３にグラフで示す。図３において、横軸は溶液のｐＨ、縦軸は相対蛍光強度を表す。●はＣｕ（ＩＩ）イオン非存在下での、また、○はＣｕ（ＩＩ）イオン存在下での蛍光強度変化を、△はその蛍光強度の差をそれぞれ示す。
【００２２】
実施例４
Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシン（１×１０-5Ｍ）に対しそれぞれ２０倍当量の銅、亜鉛、ニッケル及び鉄を含む、ｐＨ６．８に調整した全量５０ｍｌの水溶液からなる模擬検液を、ジエチレントリアミン‐Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′‐テトラ酢酸構造をもつ金属捕捉基を有するキレート樹脂２ｇを充填したカラムに通液する。通液後の溶液とカラム洗液をあわせ、さらに水を加えて全量を１００ｍｌとする。この中から５ｍｌを取り、これにＮ‐（９‐アントリルメチル）‐２‐ピリジルメチルアミン（１×１０-4Ｍ）０．９ｍｌ、銅（ＩＩ）イオン（１×１０-4Ｍ）０．４５ｍｌ、ＰＩＰＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ６．８）１ｍｌを加え、さらに水で全量を１０ｍｌとし、４１９ｎｍの蛍光の強度を３回測定し、得られた蛍光強度を各検量線にあてはめ、模擬検液中のＮ‐（ホスホノメチル）グリシンの濃度を求めた。その結果を、３回の測定の平均値ならびに真値とともに表１に示す。
【００２３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１において、Ｎ‐（ホスホノメチル）グリシンの添加濃度による蛍光スペクトルの変化を示すグラフ。
【図２】  実施例２において作成した検量線を示すグラフ。
【図３】  実施例３における蛍光強度とｐＨの関係を示すグラフ。
【図１】
0003656106.tif 000004
【図２】
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【図３】
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