(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体の熱サイクルを行なうためのカートリッジであって、
ａ）ほぼ平面である熱伝達壁と、
ｂ）前記熱伝達壁にほぼ垂直に配置された光透過壁と、
ｃ）カートリッジに流体を供給するための入口（１０）と、
ｄ）流体やガスをカートリッジから排出するための出口（１１）と、
ｅ）前記入口（１０）と出口（１１）とを連結している空洞
とを備え、
前記空洞が、底壁と直立する壁とを有する前記カートリッジの本体内に形成され、当該本体が兆部壁によって閉鎖され、
前記空洞内に突起（５）が設けられ、該突起（５）が空洞の入口（１０）と出口（１１）との間に鼻の形に延び、
前記空洞入口（１０）と出口（１１）との間の長さ（Ｌ）が前記入口（１０）と出口（１１）との間の最短の幾何学的な距離（Ｄ）よりも長い
ことを特徴とするカートリッジ。
【請求項２】
前記空洞が、幅ＤL（水平方向の差し渡し）および深さＤV（鉛直方向の差し渡し）を有し、最大幅ＤL,maxとＤVの比が１〜１０の範囲にある請求項１記載のカートリッジ。
【請求項３】
ａ）請求項１記載のカートリッジと、
ｂ）前記カートリッジ（１）の熱伝達壁に熱的に接触した熱サイクルユニットと、
ｃ）前記カートリッジ内の光透過壁を通し、光を伝達する光源（３０）であって、該光透過壁が前記熱伝達壁にほぼ垂直に配されてなる光源（３０）と、
ｄ）前記カートリッジ内から生じる光を前記第２の壁を通して検出する光検知器（２０）と、
ｅ）前記カートリッジの入口に接続され、フロー−スルー−フィリングによってカートリッジに流体を供給する流体供給ユニット
とを備えてなる、カートリッジ中の流体の熱サイクルのための装置。
【請求項４】
前記カートリッジが楔状であり、前記熱サイクルユニットが、楔状のカートリッジを受け入れるための楔状の受け入れ部を有する請求項３記載の装置。
【請求項５】
請求項３記載の装置を用いた、流体の熱サイクルのための方法であって、
フロー−スルー−フィリングによって、カートリッジの測定領域における気泡を回避しつつカートリッジを満たす工程と、
カートリッジ中の流体の熱サイクルの工程と、
カートリッジ内へと光を送る工程と、
カートリッジを出る光を検出する工程
とを備えてなる方法。
【請求項６】
カートリッジ中の流体の熱サイクルのための装置であって、
ａ）少なくとも１つの熱伝達壁、少なくとも１つの光透過壁、フロー−スルー−フィリングを可能とする流路によって接続された入口および出口を備えたカートリッジと、
ｂ）前記カートリッジ（１）の熱伝達壁に熱的に接触した熱サイクルユニットと、
ｃ）前記熱伝達壁にほぼ垂直に配された前記光透過壁を通し、前記カートリッジ内へと光を伝達する光源（３０）と、
ｄ）前記カートリッジ内から生じる光を前記第２の壁を通して検出する光検知器（２０）と、
ｅ）前記カートリッジの入口に接続され、フロー−スルー−フィリングによってカートリッジに流体を供給する流体供給ユニット
とを備え、
前記カートリッジが、空洞（２）を有する本体（３）を備え、
当該空洞（２）が、底壁と直立する壁とを有する前記カートリッジの本体内に形成され、当該本体が兆部壁によって閉鎖され、
該空洞（２）の入口（１０）と出口（１１）との間に突起（５）が鼻の形に延びてなる
ことを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核酸配列の増幅および検知を達成するために、カートリッジ中の流体に熱サイクルを加えるための装置に向けられている。本発明の特定の局面は、増幅と増幅処理の監視がカートリッジの位置を変更することなく同時になされ得ることである。本発明のさらなる局面は、熱サイクルのための流体を完全に、かつ気泡のないようにカートリッジに充填することである。増幅処理の監視は標的（ないしはターゲット）核酸の開始濃度を量るために使用されてもよい。
【０００２】
反応カートリッジ中で核酸増幅を行なうための装置が、米国特許第５，５６７，６１７号明細書に開示されている。この米国特許は可撓性を有するキュベット内での核酸増幅のための発明に関する。増幅のために、このキュベットは、光路となる中央の窓をもつ薄い加熱要素を有する加熱器内に配置される。そのような実施例は、加熱と検知とが当該反応キュベットの水平方向の自由空間で競り合うという欠点がある。米国特許第５，５６７，６１７号において用いられた装置のさらなる問題は、流路をもつキュベットの可撓性である。キュベットが加熱器内に設けられたときにキュベット内での通液が邪魔されないことを保証するような対策がなされなければならない。
【０００３】
本発明は、米国特許第５，５６７，６１７号明細書に記載された装置に類似している熱サイクルのための装置に向けられているが、熱効率が検知のために必要とされる自由空間によって制限されないという利点がある。米国特許第５，５６７，６１７号と比較したされるさらなる利点は、カートリッジ内の流路の狭窄が問題とはならないことである。
【０００４】
国際公開第ＷＯ９８／３８４８７号公報には、流体チャンバ内の温度を制御するためのサーマルスリーブ（thermal sleeve）をもつ構造体が記載されている。当該構造体は、該チャンバをサーマルスリーブ内に設けているあいだに該チャンバの内容物を調べるための光学系をさらに備えている。
【０００５】
しかしながら、開示されたチャンバは、チャンバの上端の流体ポートを経てボトムアップ式に充填することによって流体を受け取るように設計されている。そのようなチャンバへの充填は、直径が気泡で覆われることなく流体を侵入させるために充分大きければ、問題ではない。しかしながら、内径を減少させることは、流体の充分な加熱および冷却速度を許すために温度制御された壁間の内側の距離を低減させるべく内径を減少させることが望ましい。
【０００６】
本発明の目的は、オンライン式の光学監視によるカートリッジ中の流体の急速熱サイクルのための装置を提供することである。具体的な目的は、流体中に含まれる気泡によって光学的測定の邪魔になることを回避しながら迅速な加熱および冷却速度を達成することである。
【０００７】
この目的は、熱サイクルユニット、光源、光検知器、流体供給ユニットおよびカートリッジを備え、カートリッジの位置を変化させることなく熱サイクルおよび検知が行われ得る装置によって達成される。そのような装置は、オンライン式の光学監視による熱サイクルを可能にする。オンライン式の監視とは、温度サイクルを実行させているあいだの光学的な監視を意味する。そのうえさらに、温度制御される壁のあいだのカートリッジの内径は充分に小さく、これによってカートリッジ中の流体の正確な温度制御を可能にしている。カートリッジへの充填は、フロースルー（flow-through）処理によって達成されるのが好ましい。
【０００８】
本発明のカートリッジは、薄板の形状を有している。対向している２つの大きい壁は熱伝達のために用いられ、該２つの大きい壁に対して実質的に垂直な１または２以上の壁はカートリッジ内に光を伝達し、該カートリッジの外で検知されるべく光を伝達するために用いられる。このカートリッジの構成は、光路および熱交換のための通路が空間的に分離され、その結果、検知と熱伝達とが空間で競り合うことはない。カートリッジの厚さは２．５〜５ｍｍの範囲であることが好ましく、熱伝達のためのそれぞれの壁の面積が０．１〜４ｃｍ2の範囲であることが好ましい。そのようなカートリッジは底壁と直立する側壁とを有する本体から製造され、この本体は頂部壁によって閉鎖され、内部に反応チャンバをもつ閉じられたカートリッジを形成する。しかしながら、該カートリッジの好ましい実施例は、カートリッジの側壁となるフレームから製造され、底壁および頂部壁によって閉鎖される。頂部壁および底壁が、厚さが２００μｍ未満のフォイル（ないしは箔（foil））であることがとくに好ましい。本発明のカートリッジは一様な厚さを有してもよいが、熱伝導性の頂部壁および底壁が互いに３〜８度の角度を形成するのが好ましい。そのような楔状のカートリッジは、それぞれ楔状の受け入れ部を有する熱サイクルユニットと関連づけて使用されるとき、効率的な熱伝達と容易な取り扱いとを与えるという利点を有する。
【０００９】
本発明のカートリッジは、透明な合成樹脂から製造することができる。厚さ０．３〜４ｍｍの壁をもつ環状のフレームが設けられて、カートリッジの側壁を形成することが好ましい。該フレームは、たとえば、ポリエチレンまたはポリプロピレンのようなポリマーから射出成形することによって製造することができる。当該フレームは熱シールにより頂部および底壁を形成するフォイルによって閉鎖される。そのようなフレームにポリマーフォイルをシールするための処理は当該技術分野において周知であるので、本明細書では詳細に記載しない。熱シール処理は、たとえば、つぎの文献に記載されている。すなわち、ハンス  バッツァ（シュトゥットガルト）編著、「ポリメーレ  ヴェルクシュトッフェ（３版）」、２０６〜２１２頁、シーム社（ニューヨーク）、テヒノロギー１（第２巻）、１９８４年；オットー  シュヴァルツら編著、「クンストシュトッフフェアアルバイトゥング（第４版、１９８８年）」、１９３〜２０６頁、フォーゲル社（ビュルツブルク）；ヨーアヒム  ネントヴィッヒ（ミュンヘン）編著、「ヘルステルンク、アイゲンシャフテン、アンヴェンドゥング」、８８〜９３頁、ハンザー社（ウィーン）１９９４年。金属化された多層フォイルはフレームへのシールのためにも採用され得る。
【００１０】
以下に充填処理と関連づけることによってより明確になるが、カートリッジは高い表面張力をもつ材料から製造されているか、または内側の壁の表面張力が強化されることができる。表面張力のそのような強化は、表面の適切な酸化被膜またはプラズマ処理によって達成される。しかしながら、気泡のない充填を可能にする表面張力の限界値は流体の表面張力に依存する。
【００１１】
叙上のとおり、カートリッジの熱制御された壁のあいだの内径が小さいカートリッジを採用することは有利である。約５ｍｍ未満の直径は正確な温度制御を可能にし、それゆえ、高い加熱および冷却速度を可能にする。カートリッジの内部が流路とともに突出部および凹所をもってもよいことは注意されるべきである。さらに、使用している文言「閉鎖されたカートリッジ」は、流体をカートリッジの中に入れ、カートリッジの外に出すために用いられるカートリッジの壁を横切る流路を除外しない。
【００１２】
本発明の熱サイクルユニットは、カートリッジの熱伝導壁との熱接触を確立するための加熱部を備えている。加熱部は、カートリッジの熱伝導壁と機械的に接触される少なくとも１つのプレートないしは板を備えていることが好ましく、熱サイクル処理で必要に応じて該プレート自体は加熱されたり冷却されたりする。この加熱および冷却は、たとえばペルチェ素子によってなされるか、抵抗加熱器（resistor heater）によって加熱し、プレートにエアを吹きつけることによって冷却することによってなされる。プレートとの熱接触により熱サイクルを行なう方法および装置は当該技術分野において周知である。
【００１３】
しかし、カートリッジを加熱および冷却するための他のデバイスが本発明の範囲から逸脱することなく使用され得ることは理解されるべきである。カートリッジを加熱し、冷却するために使用されるデバイスが当該処理にかかわる温度にし、維持することができ、所望の温度対時間プロファイルを達成することだけが必要である。そして、核酸増幅のためには、そのようなデバイスは、変性温度Ｔ1（約８０〜１０５℃の範囲であり、好ましくは９０〜１００℃である）とアニーリング／伸張温度Ｔ2（約３０〜９０℃の範囲であり、好ましくは５０〜７０℃である）とのあいだの増幅反応混液の温度サイクルを可能ならしめるべきであり、ここに当該技術において知られているとおりＴ1＞Ｔ2である。
【００１４】
カートリッジと加熱部とのあいだの充分な熱接触を達成するために、カートリッジに対して１または２枚のプレートを押圧する手段が設けられ得る。そのような手段は、たとえば米国特許第５，５６７，６１７号明細書に記載されている。しかし、本発明においては、楔状の凹所の受け入れ部を有する加熱ユニットを採用することが好ましい。当該受け入れ部は、互いに傾斜した２つの壁によって形成されてもよい。楔状のカートリッジは単純にそのような楔状の受け入れ部内に配設することができ、受け入れ部の壁とカートリッジの熱伝導壁とのあいだの充分な熱接触が機械的接触によって自動的に達成され、当該カートリッジが受け入れ部内に止まったときに個々の壁が機械的に接触する。
【００１５】
熱サイクルユニットは操縦ユニットをさらに備えており、当該加熱および冷却部をタイムリーに操縦する。そのような操縦部は、たとえばヨーロッパ特許第０  ２３６  ０６９号公報に記載されており、参考までに本明細書に取り入れられている。本発明はヨーロッパ特許第０  ２３６  ０６９号公報に記載されたものと異なる操縦ユニットを必要とはしないが、タイミング、温度プロファイルおよびカートリッジと交換される熱の量は特定のニーズに適合されなければならない。
【００１６】
本発明は核酸増幅と、増幅産物の検知、監視および定量化にかかわる。本発明の増幅データ収集および処理装置を容易に理解するために、まず本発明と関連して用いるのにとくに適した核酸の増幅方法の概要を説明する。
【００１７】
当業者は、核酸の二重形体（duplex form）の増幅を本発明が要求していると認識するであろう。核酸の増幅のためには周知の方法が存在している。増幅のための手段は重要ではなく、本発明は、核酸の二重鎖が発生するどのような方法とも作用する。バイオ／テクノロジー第８巻（２９０〜２９３頁、１９９０年４月）において種々の方法が精査されている。これらの方法は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、Ｑβおよび３ＳＲを含むが、これらには限定されない。３ＳＲおよびＱβは熱サイクルにかかわるものではないが、増幅の結果は後述する蛍光検知装置によって監視され、本発明の原理にしたがって分析される。それぞれの方法を以下に簡単に述べる。
【００１８】
ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、ＤＮＡを熱変性し、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、増幅されるべきＤＮＡセグメントに隣接する配列にアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによりアニーリングされたプライマーを伸張するという繰り返されるサイクルを含んでいる。プライマーは標的配列のストランドと対向するようにハイブリダイズ（ないしはハイブリッド形成）し、配向され、その結果ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がプライマー間の領域を横切って進み、それぞれのつぎのサイクルが前のサイクルで合成されたＤＮＡの量を本質的に２倍にする。これが、サイクルあたり約２nの割合で特異的な標的フラグメントの指数アキュムレーションを引き起こす。なお、ｎはサイクル数である。この技術の完全な精査はＰＣＲ技術の原理および応用の中に見出すことがことができる（エルリッヒ  ハー  アー、シュトックトン  プレス、ニューヨーク、１９８９年）。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲが本発明と関連して用いられる場合には好ましいが、これは本発明の本質的な局面ではない。
【００１９】
リガーゼ鎖反応（ligase chain reaction）は、国際特許出願公開第ＷＯ８９／０９８３５号公報に記載されている。該プロセスはターゲット核酸に対してアニーリングするオリゴヌクレオチド部分（ないしはセグメント）を結合するためのリガーゼの使用にかかわるものである。リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）は、オリジナルターゲット分子の増幅を引き起こし、プロダクトＤＮＡの何百万ものコピーをもたらすことができる。その結果、ＬＣＲは二重ストランドのＤＮＡの正味の増加を引き起こす。この検知方法は、ＬＣＲのみならずＰＣＲに適用され得る。ＬＣＲは、通常、オリゴヌクレオチドプローブのようなプロダクトＤＮＡを検知するためのなんらかの手段を必要とする。開示された増幅プロダクトを検知するための方法と関連付けて使用すると、そのような手段は不必要であり、ＬＣＲの結果は直ちに検知できる。
【００２０】
他の増幅スキームであるＱ−ベータレプリカーゼは、ＲＮＡバクテリオファージＱβ由来のレプリカーゼを使用している。この増幅スキームにおいて、ターゲット配列用の特異的な配列で修飾された組換えバクテリオファージゲノムは、もともと試験されるべき核酸に連結されている。サンプル中でバクテリオファージプローブと核酸とのあいだで形成された２本鎖の集積（enrichment）に引き続き、Ｑβレプリカーゼが添加され、このＱβレプリカーゼは保持された組換えゲノムを認識すると、多くのコピーの作製を開始する。Ｑβシステムはプライマー配列を必要とせず、ＰＣＲおよびＬＣＲ増幅システムのような熱変性工程が存在しない。ある温度、典型的には３７℃で反応が起こる。好ましい鋳型はＱβレプリカーゼのための基質、ミッドバライアント−１（mid variant-1）ＲＮＡである。このシステムの使用により、非常に大きい該鋳型の増加が達成される。この増幅システムの精査を国際特許出願公開第ＷＯ８７／０６２７０号公報およびリツァルディらの「バイオ／テクノロジー（１９８８年）」第６巻、１１９７〜１２０２頁に見出すことができる。
【００２１】
３ＳＲシステムは、インビトロの転写に基づく増幅システムの変形である。転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）は、相補的な配列のみならずプロモータ配列をコード化するプライマーを標的ストランドに対して用いてターゲットストランドのＤＮＡコピーを発生すること、およびＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡコピーからＲＮＡコピーを製造することを含んでいる。米国特許第４，６８３，２０２号明細書の実施例９Ｂとヨーロッパ特許出願公開第ＥＰ−Ａ−０  ３１０，２２９を参照されたい。当該３ＳＲシステムは、ターゲット核酸の等温複製を行なうために３つの酵素を使用するシステムである。
【００２２】
当該システムは、一本鎖ＲＮＡによって開始し、当該一本鎖ＲＮＡにはＴ７ＲＮＡ  ＤＮＡプライマーが結合される。逆転写による当該プライマーの伸張によってｃＤＮＡが形成され、かつＲＮアーゼＨ処理がヘテロ２本鎖からｃＤＮＡを開放させる。第２のプライマーはｃＤＮＡに結合され、二重鎖のｃＤＮＡが逆転写酵素処理によって形成される。プライマーの一方（または両方）はプロモーター、たとえばＴ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターをコード化し、その結果二重鎖ｃＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼ用の転写の鋳型である。
【００２３】
転写に適格なｃＤＮＡは、オリジナルのターゲットのアンチセンスＲＮＡコピーを産出する。該転写物は逆転写酵素によって二重鎖ｃＤＮＡに変換され、該二重ストランドｃＤＮＡは、その両端において選択的に、逆方向反復配向（inverted repeat orientation）で二重ストランドのプロモーターを含んでいる。当該ＤＮＡはサイクルをリエンター（reenter）することができるＲＮＡを産出することができる。３ＳＲシステムのより完全な記載は、グァッテリらのアメリカ合衆国、ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス会報、第８７号、１８７４〜１８７８頁（１９９０年）およびヨーロッパ特許出願公開第ＥＰ−Ａ−０  ３２９  ８２２号公報において見出すことができる。
【００２４】
本発明によれば、反応混液が２つの温度間でサイクル（熱サイクル）処理されるときに、反応混液に供される挿入（ないしはインターキャレーティング（intercalating））蛍光色素のような蛍光色素が、各アニーリング／伸張期のあいだに二重ストランド核酸と結合するときに発する蛍光を検知することによって核酸増幅が監視される。蛍光の増加は、ターゲット核酸のポジティブな増幅を示す。適切な挿入（ないしはインターキャレーティング）剤または色素として、エチジウムブロマイド、プロピジウムブロマイド、プロフラビン、アクリジン  オレンジ、アクリフラビン、フルオルクマリン、エリプティシン、ダウノマイシン、クロロキノン、ジスタマイシンＤ（distamycin D）、クロモマイシンＣ（chromomycin）、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジルス（ruthenium polypyridyls）、アントラマイシン（anthramycin）、メチジウムブロマイド（methidium bromide）、２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−ベンゾイミダゾール］−６−（１−メチル−４−ピペラジン）ベンゾイミダゾールトリヒドロクロライドなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
当該技術分野において記載された蛍光体およびＤＮＡ結合発色基は、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に開示された５′乃至３′のヌクレアーゼ・アッセイに使用するのに適しており、本発明にも有用である。適切なドナー蛍光体および消光剤は、ドナー蛍光体の発光スペクトルが消光剤の吸収スペクトルと重なるように選択される。散乱励起光による干渉を最小にするために、蛍光体は高いストークス・シフト（Stokes shift、最大吸収のための波長と最大発光のための波長とのあいだの大きい差）を有するべきである。
【００２６】
当該技術分野において周知である適切なラベルは、エフ・エイ・エム（ＦＡＭ）、エイチ・イー・エックス（ＨＥＸ）、ティー・イー・ティー（ＴＥＴ）、ジェイ・オー・イー（ＪＯＥ）などのフルオレセインおよびその誘導体；テキサスレッド（Texas Red）、アール・オー・エックス（ＲＯＸ）、タムラ（TAMRA）などのローダミンおよびその誘導体；ルシファイエロー（Lucifer Yellow）、および７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセテート、７ＯＨ−４−ＣＨ３−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテートおよび７−ＮＨ２−４−ＣＨ３クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）などのクマリンの誘導体とを含むが、これらに限られることはない。エフ・エイ・エム、エイチ・イー・エックス、ティー・イー・ティー、ジェイ・オー・イー（ＪＯＥ）、アール・オー・エックスおよびタムラは、パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステム・ディビジョン（カリフォルニア州、フォスターシティ）によって市場に出されている。テキサスレッドおよび多くの他の化合物はモレキュラー  プローブ（オレゴン州、ユージーン）によって市場に出されている。エネルギードナーとして使用するために適したケミルミネッセンスおよびバイオルミネッセンス化合物は、ルミノール（アミノフタール−ヒドラジド）およびその誘導体と、ルシフェラーゼである。
【００２７】
本発明の装置の光学系は光源と光検知器とを備えている。当該装置によれば、カートリッジ内の流体によって吸収または散乱の測定を行なうことができる。しかしながら、光検知器によって検知される蛍光発光を開始するカートリッジの内部に光が伝達される蛍光測定のために本装置を用いることが好ましい。光源は半導体光源およびハロゲンランプまたは他の実施例を備えてもよい。本発明の精神の範囲内で、光はカートリッジの光透過性を備える第２の壁を経てカートリッジ内部に伝達される。当該光透過性を備える第２の壁は、熱伝達のための壁に対して実質的に垂直である。カートリッジの平坦な形状のために、当該光透過性を備える第２の壁の厚さは、１次元において０．５〜５ｍｍしかない。それゆえ、この制限された窓を経て光を導くために光源と協働するビーム状の光学系を採用することが好ましい。かかるビーム状の光学系は、隙間、複数のレンズおよび光ファイバとを含んでよい。蛍光測定のために、色素の吸収スペクトルの範囲内の波長の光にて、蛍光色素を刺激ないしはスティーミュレート（stimulate）する必要がある。通常、蛍光色素よりも他の光源からの発光によって引き起こされるバックグラウンド放射線（background radiation）を抑制することが望まれる。多くの実施例においては、同一の反応容積内で２または３以上の色素をもつ蛍光測定を行なうことがさらに望まれる。これらの場合において、照明用の光の帯域ないしはバンド幅を制限することが必要である。これは、たとえば発光ダイオード（ＬＥＤ）などの狭い帯域を有する光源を用いて、あるいは広い帯域を有する光源を適当なフィルタと組み合わせて用いてなされ得る。
【００２８】
本発明の装置は、前述の光透過性を備える第２の壁を経てカートリッジの内部から発する光を検知するために１または２以上の光検知器をさらに備えている。適切な光検知器は、ホトダイオードまたは光電子増倍管（ないしフォトマルチプライア）のような半導体検知器である。すでに述べたとおり、バックグラウンド信号を抑制することが望まれ、それゆえ検知は、検知されるべき蛍光色素の発光バンドに限定するべきである。これは、波長フィルタまたはスペクトロメータによる光のスペクトル分離によって達成することができる。本発明の範囲内で、色素から発せられた蛍光放射線の個別の検知によって、同一のカートリッジ内の２または３以上の蛍光色素を検知することが好ましい。当該色素は適切な光源によって別々に刺激ないしはスティーミュレート（stimulate）されると有利である。
【００２９】
本発明の光検知器は、光ファイバ、レンズシステムなどの導光手段と協働してもよい。
【００３０】
本発明のカートリッジは、流体の熱サイクルキャビティーとして使用され、したがって、カートリッジに流体を供給するための入口を有している。選択的に、カートリッジは、カートリッジからの流体をドレインにするための出口を有してもよい。しかし、ある種の用途では、流体出口なしの使い捨てカートリッジが好ましい。そのようなカートリッジは、使用後に中身と共に捨てることができる。入口および選択的な出口は、カートリッジの本体またはフレームを貫いてつながっていることが好ましい。すでに述べたとおり、本体またはフレームは多くの場合、非圧縮性にされており、その結果流体チャネルは、加熱ユニットによって熱接触ないしは熱コンタクトを達成するためにカートリッジに圧力を加えるときに邪魔にならない。本発明の装置は、流体供給ユニットを備えており、該流体供給ユニットはカートリッジの入口に結合されている。そのような流体供給ユニットは、ピペットユニットまたは装置の内部流体チャネルであってもよく、これらから流体がカートリッジ内に圧入される。当該装置は、選択的に流体受け入れユニットを備えており、当該流体受け入れユニットはカートリッジの出口に結合されて、カートリッジからの流体を受け入れる。そのような流体受け入れユニットは、カートリッジが空にされなければならないか、または異なる流体が同一のカートリッジ内で処理されなければならない場合に必要である。しかし、好ましい実施例において、カートリッジは一度の使用後に内部の流体と共に捨てられる。そのような実施例は流体受け入れユニットを必要とせず、カートリッジが流体によって充填されるときにガスをドレインにする出口だけが必要である。
【００３１】
本発明のカートリッジは、いわゆるフロー−スルー−フィリング（flow-through-filling）によって充填されることが好ましい。フロー−スルー−フィリングとは、流体が入口を経て導入され、該入口に直接隣接するカートリッジの内部空間を充填する。さらなる流体の充填は、充填された空間を連続的に拡大し、ついには所望の充填度が達成される。このプロセスにおいては、国際公開第ＷＯ９８／３８４８７号公報に開示されているとおり、ボトム−トゥー−トップ−フィリング（bottom-to-top-filling）の場合のように充填のあいだ入口から流体ボラス（bolus）は決して放出されない。フロー−スルー−フィリング処理を可能にするために、当該カートリッジの内部の幾何学的特徴、入口および出口と連結するチャネルが重要である。カートリッジを熱サイクルさせるために、熱制御された壁と流体との大きい接触面積を有することが望ましい。接触面積を制御するチャネルの寸法はＤL（横方向の径ないしは差し渡し）と熱制御された壁間の内側の距離ＤV（垂直方向の径ないしは差し渡し）で示される。商ＤL／ＤVが大きくなればなるほど、熱制御の効率および充填中に気泡に包まれる危険性が増大する。最適な商ＤL／ＤVは、１〜１０の範囲である。
【００３２】
気泡形成の危険性が横方向の径の増大に伴って増加することを念頭におけば、商はチャネルの垂直方向の最大径（ＤV,max）を用いて算出されるべきであり、該最大径は流れの方向に対して垂直に測定される。
【００３３】
（壁および流体の）表面張力、流体の粘度、キャピラリーフォース（capillary force）、充填率のような他のファクタは充填プロセスに影響を及ぼす。しかし、前記流体チャネルは、各部において特徴ある形状をもつ必要はない。カーブしたチャネルを採用することが有利であることが示されるので、チャネルの長さＬは内および外のあいだ幾何学的な距離Ｄよりも長い。そのような構成ないしは設計は、図１に示されるとおりカートリッジの内部に突出する突起によって有効に達成される。
【００３４】
当該カートリッジは、ガスを受け入れるための空間をもってもよく、当該ガスは流体の加熱のあいだ開放するように設定される。該空間はカートリッジの部位に設けられ、光学的測定を干渉しない。
【００３５】
本発明を、さらに、以下の図面に関連してより詳細に説明する。
【００３６】
図１は、流体で部分的に満たされた状態のカートリッジの平面図である。
【００３７】
図２は、カートリッジの平面図であり、光源と検知器が備えられている。
【００３８】
図３は、光源モジュールである。
【００３９】
図４は、斜めの窓を有するカートリッジについて、光線を追跡（raytrace）した図である。
【００４０】
図５は、熱サイクル中の蛍光信号である。
【００４１】
図６は、熱サイクルのための装置であり、光源および光検知器を統合した金属ブロック熱サイクル装置内にカートリッジが位置している。
【００４２】
図７は、熱サイクルのための装置であり、楔状のカートリッジを備えている。
【００４３】
図８は、図１に示したカートリッジについて、注入プロセスを説明した図である。
【００４４】
図１は、流体の熱サイクルのためのカートリッジ１の平面図を示している。カートリッジは、本体３およびその中の空洞２を有する。カートリッジ本体は、固体のポリプロピレンのブロックから成形されている。空洞の部分において、室の底の厚さが２００μｍとなるまで材料が除去されている。（カートリッジは、射出成型によってより効率的に、一続きの製造で製造することができる。）さらにポリプロピレンのブロックには、注入時に流体を受け入れるための入口１０、および空洞の空気を排出するための出口１１が成形されている。図１に示したカートリッジの本体は、カートリッジ本体上に厚さ４０μｍの密封フォイルを溶着させることによって封じられている。図１には、空洞２の好ましい一形状が示されており、空洞内に鼻のかたちに延びた突起５を有している。突起５により、空洞が気泡を包含することなく完全に流体で満たされるようになる。突起によって、カートリッジの幾何学的形状が多少変化しており、水平方向の最大の差し渡しＤL,max、および比率ＤL,max／ＤVが小さくなっている（ＤVは、熱コントロール壁間の間隔であり、すなわちカートリッジ内の流体の厚さである）。開示の実験用の配置では、ＤL,maxは４．０ｍｍ、ＤVは１．５ｍｍであり、その結果、比率は２．７であった。
【００４５】
突起５のサイズは、この特定の状況にあわせて調整される必要があり、空洞の厚さ、流体の粘性、カートリッジの上部壁および底壁の表面張力、および空洞のサイズや形状によって決まる。突起の効果は、入口と出口とのあいだの液体のショートカットを防止する点にあることがわかった。この趣旨において、突起は、流体を、入口と出口とのあいだの最短距離Ｄよりも長い経路Ｌ上へと導く。図１では、流体の経路がいくつか、破線にて示されている。最短のＬをＤで割った比率が２あるいはそれより大であるとき有利であることがわかった。さらに図１に示した態様は、入口および出口の配置がカートリッジの同じ側にあるという点でも、好ましい実施例である。この構成によれば、流体の接続を同じ側に位置させることができ、装置への接続をより容易にすることができる。また、入口および出口の同じ側への配置は、装置での注入中、サイクル中および測定中に、この側を上方に向けておいてもよいという点でも有利である。この構成により、時として空洞内に残ってしまう気泡やカートリッジの加熱中に生じる気泡を、入口や出口から取り除くことができる。また図１には、入口や出口の近辺における空洞の形状についても、有利な形状が示されている。図から明らかなとおり、壁７、７'、７''、７'''は、入口および出口と約１３０°の角度をなしている。この角度について好ましい範囲は１００〜１５０°であり、空洞を流体で満たすときに、満たされない箇所が生じない。図１において明らかになる本発明のさらなる特徴は、斜めの窓４、４’である。光は空洞内へと空洞の面８、８’に垂直に照射され、略図にて示した検知器２０によって検出される。照射光は、斜めの面４、４’によって、検知器へと向かう方向に屈折させられる。この構成によって、蛍光光の発生を検知器により近い空洞の中央付近へと導くことができ、検出感度を高めることができる。
【００４６】
図２にカートリッジの概略図を、光源３０、３０'、３０''、３０'''および検知器２０と組み合わせて示す。図から分かるとおり、各光源の焦点は、空洞の中央に置かれており、各焦点はほぼ一致している。空洞の中央からの蛍光光を検出するため、検知器２０は、カートリッジの検出窓のすぐ下に配置されている。図２の配置によって、４つの異なる蛍光色素の蛍光発光を観測することが可能である。各光源がそれぞれ、これら蛍光色素のうちのひとつを特定的に励起させるように選ばれる。これら光源を順次動作させ、検知器で蛍光の放射を検出することにより、各蛍光色素の量を観測することができる。
【００４７】
図３に、本発明での使用に好適な光源モジュールを示す。光源モジュールは、半導体光源３１、波長選択フィルタ３２および光出力監視器３３からなる。光出力監視器は、光路上から光の一部を取り出すためのビームスプリッタ３３ａ、および取り出した光を検出するための検出器３３ｂからなる。検出された光の量が半導体光源に与える電流の制御に使用され、所期の出力が安定して作り出される。さらに図３の光源モジュールは、レンズ方式によるビーム整形器３４を有する。半導体光源の発光面は、レンズによってカートリッジの中央へと投写されることが有利である。
【００４８】
図４に、斜めの窓を備えたカートリッジを用いる装置について、光線追跡を示す。図から分かるように、光源３０によって生成された光は、球形状のレンズ３５によってカートリッジの斜めの窓４へと投写される。この構成により、光は検知器２０の方向へと屈折させられる。
【００４９】
図５は、蛍光の時間推移の図であり、本発明による装置によって測定したものである。横軸には測定の回数を示し、縦軸には蛍光の強度を任意単位にて示す。測定は、ポリメラーゼ鎖反応の各変性、伸張過程ののちに行なった。図１および図６に示すカートリッジ１が、図６に示すホルダに差し込まれて固定される。カートリッジとともにホルダが熱サイクルユニットと組み合わされる。蛍光の定量的測定のために、シンプルなビーム整形用光学装置を備えた照明用光学装置、および検出用光学装置を用いた。そして、ＰＣＲの実行（MastermixによるＨＣＶ制御、所期のコピー数５×１０3）が以下の手順（プロトコール）にしたがって行なわれた。
【００５０】
１２０サイクル
変性温度Ｔdenat＝９４℃
アニーリング温度Ｔanneal＝６０℃
温度立ち上げ時間ｔramp  約２０秒
温度安定期間ｔplateau  約２６秒
全プロセス時間ｔtot  約３時間
【００５１】
実験にて測定した蛍光信号と測定回数との関係を図５にプロットした（実線）。比較のため、同じＰＣＲの手順で、ある容器内での増幅について蛍光信号を測定した。その結果も図５（一点鎖線）に示す。カートリッジにおいて蛍光信号が小さく（係数、約２）なっているのは、測定に用いたビーム整形用光学装置に起因するものである。この光学装置によって、照明光のパワーに約３０％のロスが生じる。
【００５２】
図６に、熱サイクルのための金属ブロックの凹部に配された本発明のカートリッジを示す。金属ブロック内には、光源および光検知器が一体化されている。熱サイクルのため、金属ブロック４０上に閉鎖材４１がねじ止めできるようにされており、カートリッジと金属ブロックとのあいだで最適な熱的接触が得られるようになっている。金属ブロックそのものには、加熱および冷却のためにペルチェ素子が備えられている。
【００５３】
図７に、本発明によるさらに好都合な装置を示す。図示されたカートリッジは楔状の実施例であり、入口および出口の側で厚さが厚くなっている。この装置は、互いに角度をなすペルチェ素子４０’からなる収容ユニットを備えており、楔状のカートリッジを収容するようになっている。この実施の形態によれば、単にカートリッジをペルチェ素子４０’のあいだに差し込むだけで、カートリッジと加熱ユニットとのあいだの強力な熱的接触を実現することができる。この図によれば、光学的な経路と熱交換の経路とが空間的に分離しており、検出と熱の伝達とがスペースに関して競合することがない。
【００５４】
図８に、図１に示したカートリッジへの流体の注入を示す。流体は、入口１０をとおって導入され、カートリッジの入口直ぐ近くの領域を満たす（図ａ））。さらに流体を導入すると、図８ｂ）およびｃ）に示すように流体に満たされた領域が広がる。このフロー−スルー−フィリングプロセスにより、カートリッジを気泡なく満たすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  流体で部分的に満たされた状態のカートリッジの平面図である。
【図２】  カートリッジの平面図であり、光源と検知器が備えられている。
【図３】  光源モジュールである。
【図４】  斜めの窓を有するカートリッジについて、光線を追跡（raytrace）した図である。
【図５】  熱サイクル中の蛍光信号である。
【図６】  熱サイクルのための装置であり、光源および光検知器を統合した金属ブロック熱サイクル装置内にカートリッジが位置している。
【図７】  熱サイクルのための装置であり、楔状のカートリッジを備えている。
【図８】  図１に示したカートリッジについて、注入プロセスを説明した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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