(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に密閉された反応容器内に、その上部に空間を有するように収納された反応混合物の温度を経時に変化させて前記反応混合物の反応を進行させる方法であって、前記反応容器内の反応混合物の温度（１）と、前記空間に接する反応容器の内壁の少なくとも前記反応混合物の表面と対向する面の温度（２）とを、温度（２）が温度（１）より高くなるように、かつ温度（１）と温度（２）が連動して変化するように制御することを特徴とする微量検体用反応容器の温度を制御する方法。
【請求項２】
温度（１）と温度（２）とを、温度（１）と温度（２）との温度差が１〜３０℃の範囲内に維持されるように連動して変化させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
温度（１）の温度の経時変化を周期的に行う請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
反応混合物の反応がＰＣＲ反応である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
反応容器の容量が１〜１００μｌの範囲であり、かつ反応混合物の容量が０．５〜５０μｌの範囲である請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
反応混合物を収納するための複数の孔を有する基板からなる反応容器と前記反応容器の温度を変化させるための１対の温度コントローラー（１）及び（２）を有し、温度コントローラー（１）は、前記反応容器の孔に収納される反応混合物の温度（１）を制御するように前記反応容器と接しており、温度コントローラー（２）は、前記反応容器の孔の開口を封鎖する部材の孔の内壁であって、かつ前記反応容器に収納される反応混合物の表面と対向する面の温度（２）を制御するように前記反応容器と接していることを特徴とする微量検体用インキュベーター。
【請求項７】
複数の孔を有する基板が金属製である請求項６記載のインキュベーター。
【請求項８】
反応容器の孔の開口を封鎖する部材が複数の孔を封鎖できるシートまたはフィルムである請求項６または７に記載のインキュベーター。
【請求項９】
温度コントローラー（１）及び（２）がペルチェ素子である請求項６〜８のいずれか１項に記載のインキュベーター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ関連分野において汎用されているＰＣＲ法のようなプログラマブル・インキュベーターにおいて、より微量の検体のハンドリングを可能にする反応容器（インキュベーター）の温度の制御方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明の背景】
酵素反応等の化学反応を行う上で、その温度を正確に制御することは、最適な反応条件を保ち、その最適な反応収量、反応効率を達成する上で非常に重要なことである。そのため、至適温度条件を経時的に変化させる場合、コンピューターで温度制御されたインキュベーターを使用して反応の初めから温度条件とそれを達成する時間を予めセットしておくことが多い。特に最近では、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅が盛んに行われ、その需要が益々増加している。さらに、遺伝子診断やゲノムプロジェクトにおいて、コストやスペースさらには労働量を上げずに、反応数を大幅に増やす必要性が増している。そのため、反応混合物（検体）の容量を減らして、より多数のサンプルを同時に処理できる方法に対する要望がある。
【０００３】
しかしながら、多数の微量検体の温度制御を並行して行うには以下のような問題がある。
（１）反応温度を比較的高温にする必要がある場合、検体の量が微量であるため、検体中の溶媒（通常は水）が蒸発して反応がそれ以上進行しなくなることがある。これは、検体を収納しているテストチューブの上部の温度が検体の温度より低いため、テストチューブの上部の壁面に蒸発した水蒸気が液化してしまうためである。
（２）そこで検体からの水の蒸発を防止するために、ミネラルオイル等を検体上に重層することが行われる。しかるに、検体の量がより微量になると、ミネラルオイルの下の検体をサンプリングすることが困難になる。
【０００４】
そこで、上記問題を解決する手段として、検体を収納しているテストチューブの上部の温度を水の沸点以上の温度に維持して、テストチューブの上部の壁面への液化を防止することが提案されている。図２に示すように、テストチューブ３０内の検体を加熱するためのヒーター３２以外にテストチューブの上部を加熱するヒーター３２（ホットボンネット）を備えたインキュベーター３３が知られている（DNA engine、MJ research 社製) 。具体的には、テストチューブの上部を加熱するヒーター３２は約１０５℃に維持されている。
このインキュベーター３３は、通常５００μｌのテストチューブを用い、かつ約５０μｌの検体について良好に使用されている。
【０００５】
しかるに、前述のように、より少ない検体量でより多数の検体を一度に処理しようとする場合、検体量を上記５０μｌより少ない量、例えば、０．５〜２５μｌ程度とすることが望まれる。
ところが、本発明者らが上記インキュベーター３３について、検体量を減少させる検討を行ったところ、検体量が少なくなるとテストチューブの上部を加熱しても検体の水分が蒸発してしまい反応が停止してしまうという問題があることが判明した。
これは、検体量に比べて、テストチューブ３０の容量が大きく、従って、テストチューブの上部の加熱により壁面への液化は防止できても、テストチューブ内の空間に水蒸気圧分の水分が蒸発するためであると推察された。
【０００６】
そこで本発明者らは、サンプルチューブの容量を少なくして水分の蒸発量を抑制することを試みた。ところが、サンプルチューブの容量を少なくすると、検体が１０５℃にコントロールされているテストチューブの上部から加熱の影響を受けて、検体の反応温度の制御が困難となり、所定の反応を進行させることができなくることが判明した。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、より微量の検体について、水分の蒸発を防止しつつ検体の温度を所望の反応温度にコントロールできる方法を提供することにある。
さらに本発明は、上記方法を実施する、微量検体用のプログラマブル・インキュベーターを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、実質的に密閉された反応容器内に、その上部に空間を有するように収納された反応混合物の温度を経時に変化させて前記反応混合物の反応を進行させる方法であって、
前記反応容器内の反応混合物の温度（１）と、前記空間に接する反応容器の内壁の少なくとも前記反応混合物の表面と対向する面の温度（２）とを、温度（２）が温度（１）より高くなるように、かつ温度（１）と温度（２）が連動して変化するように制御することを特徴とする反応容器の温度を制御する方法である。
【０００９】
本発明のインキュベーターは、反応混合物を収納するための複数の孔を有する基板からなる反応容器と
前記反応容器の温度を変化させるための１対の温度コントローラー（１）及び（２）を有し、
温度コントローラー（１）は、前記反応容器の孔に収納される反応混合物の温度（１）を制御するように前記反応容器と接しており、
温度コントローラー（２）は、前記反応容器の孔の開口を封鎖する部材の孔の内壁であって、かつ反応容器に収納される反応混合物の表面と対向する面の温度（２）を制御するように前記反応容器と接していることを特徴とするインキュベーターである。
【００１０】
【発明の実施の態様】
本発明の方法は、実質的に密閉された反応容器内に、その上部に空間を有するように収納された反応混合物の温度を経時に変化させて前記反応混合物の反応を進行させる方法である。
本発明の方法においては、反応容器内の反応混合物から発生する水蒸気が容器外に流出することを実質的に防止しつつ行う。水蒸気の容器外への流出を防止することで、反応を良好に行うことができる。ある程度以上の水蒸気が容器外へ流出し、乾燥してしまうと、反応は停止してしまう。また、反応混合物は、反応容器内の上部にある程度の空間を有するように収納される。
【００１１】
上記反応容器内の反応混合物の温度を経時に変化させて反応混合物の反応を進行させる。本発明においては、反応混合物に含まれる成分やそこで進行する反応については全く制限はない。反応温度を経時に変化させる反応であれば良い。酵素反応等の生体系の反応を例示することができる。さらに、酵素反応の例としてＰＣＲ法を例示することができる。また、反応混合物の反応は、温度（１）の温度の経時変化を周期的に行う反応であることができ、その例としてＰＣＲ法を挙げることができる。
【００１２】
本発明の方法は、検体の量が少なくても良好に反応を行うことができるものであり、従って、容量の少ない反応に特に好ましく使用できる。しかし、容量の大きい範囲においても同様に適用できるものであり、本発明の方法を実施する上では検体の量に何ら制限はない。但し、微量検体向け（少量の検体を多数処理する）という観点からは、反応容器の容量が１〜１００μｌの範囲、好ましくは１〜５０μｌの範囲であり、かつ反応混合物（検体）の容量が０．５〜５０μｌの範囲、好ましくは０．５〜２０μｌの範囲であることが適当である。但し、反応容器の容量及び反応混合物（検体）の容量はさらに減少させて小型化することも可能であり、例えば、反応容器及び反応混合物（検体）をマイクロチップ化してｎｌ（ナノリットル）オーダーで行うインキュベーターを作成することも可能である。
【００１３】
本発明の方法においては、反応容器内の反応混合物の温度（１）と、前記空間に接する反応容器の内壁の少なくとも前記反応混合物の表面と対向する面の温度（２）とを、温度（２）が温度（１）より高くなるように、かつ温度（１）と温度（２）が連動して変化するように制御する。即ち、温度（１）が上がれば、それに連動して、温度（２）も上がり、逆に温度（１）が下がれば、それに連動して、温度（２）も下がるように温度制御を行う。
【００１４】
但し、温度（１）と温度（２）との温度差は、常に一定である必要はなく、ある幅をもってその範囲内にあれば良い。また、温度（１）と温度（２）との温度差が大きすぎると、温度（１）の制御が難しくなり（温度（１）が設定より高くなりすぎて）、反応を良好に進行させにくくなる。一方、温度（１）と温度（２）との温度差が小さいと、特に温度（１）が高温で、水蒸気圧が高くなると、検体中の水分の消失を招き易い。そこで、例えば、温度（１）と温度（２）とは、温度（１）と温度（２）との温度差が１〜３０℃の範囲内、好ましくは２〜２０℃の範囲内に維持されるように連動して変化させることが適当である。
【００１５】
本発明のインキュベーターを図１に基づいて説明する。
本発明のインキュベーター１は、反応混合物（検体）１０を収納するための複数の孔１１を有する基板１２からなる反応容器１３と
前記反応容器１３の温度を変化させるための１対の温度コントローラー（１）及び（２）２１、２２を有する。
複数の孔を有する基板１２が金属製であることが、コントローラーの温度を反応混合物（検体）１０に反映させやすく、反応の制御がより正確にできるという観点から好ましい。但し、反応混合物、特に酵素活性に対する金属の阻害作用を防止したり、或いは内壁の濡れ特性を改質する目的で、前記孔の内壁は、ポリマー等で表面コートすることもできる。
【００１６】
また、基板１２に形成されている孔は、底が封鎖されていて反応用の空間を形成しているものであることができる。またそれ以外に、基板１２に形成されている孔が基板１２を貫通していて、基板１２と積層する温度コントローラー（１）で直接、または温度コントローラー（１）との間に介在させる適当な中間シートやフィルムによって、底を形成して反応用の空間を形成するものであることもできる。前記孔が貫通孔である場合、貫通孔を有する基板を反応媒体や試薬等含む溶液に浸漬することで、前記溶液を多数の孔に一度に供給することができるという利点がある。
【００１７】
温度コントローラー（１）２１は、１つまたは複数の部分からなることができ、例えば、ペルチェ素子を用いることができる。温度コントローラー（１）２１は、前記反応容器１３の孔に収納される反応混合物１０の温度（１）を制御するように前記反応容器１３と接している。
【００１８】
温度コントローラー（２）２２は、１つまたは複数の部分からなることができ、例えば、ペルチェ素子を用いることができる。温度コントローラー（２）２２は、前記反応容器１３の孔の開口１４を封鎖する部材（図示せず）の孔の内壁を構成する面の温度（２）を制御するように前記反応容器１３と接している。
尚、前記反応容器１３の孔１１の開口１４を封鎖する部材は、例えば、複数の孔を同時に封鎖できるという観点から、シートまたはフィルムであることが適当である。
【００１９】
【実施例】
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
以下の実施例では、ＰＣＲ反応を例にとり、図１に示す本発明のインキュベーター（RIKEN GS-384) を用いた。また、従来の機種として、MJ research 社製DNA engineを用いた。
実施例
ＰＣＲ反応液
ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてヒト甲状腺刺激ホルモンのβ鎖のｃＤＮＡクローンであるＢＳ７５０を用いた。インサートＤＮＡのサイズは６８０ｂｐである。反応液は、ＢＳ７５０を１０ｐｇ、ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰそれぞれ）５０μＭ、１０ｘ  ＥＸバッファー（２５ｍＭＴＡＰＳ緩衝液、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）１μｌ、プライマーＬ２２０とプライマー１２１１（Ｌ２２０5'TAACAATTTCACACAGGAAACA3'、１２１１：5'ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT3'、それぞれ）０．２ｐｍｏｌｅ、ＥＸ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を加え、滅菌蒸留水にて全量が１０μｌとなるように調製する。
但し、RIKEN GS-384を使用する場合、反応容器は、アルミ板（厚み約４ｍｍ）に開けられた直径３ｍｍ、深さ３ｍｍの孔（容量約２１μｌ）として、上記ＰＣＲ反応液を収納した。
DNA engine用には、ＰＣＲ反応液の調製を５倍のスケールで行い、最終量が５０μｌとなるようにした。また、テストチューブとしては５００μｌの容量のものを用いた。
【００２０】
ＰＣＲサイクルと電気泳動による増幅の検出
９４℃、３分間インキュベートした後、〔９４℃１分間−５５℃１分間−７２℃１分間〕を３５サイクル繰り返す。その後、７２℃１０分間インキュベーションし、４℃で保存する。
〔９４℃１分間−５５℃１分間−７２℃１分間〕の温度調整の際、MJ research 社製  DNA engineを用いる場合には、図３に示す温度変化パターンＡで、図２に示すヒーター３１及び３２の温度を調節した。テストチューブの上部を加熱するヒーター３２はほぼ１０５℃に維持され（曲線１）、反応混合物の温度を変化させるヒーター３１は上記サイクルで調節される（曲線２）。
【００２１】
また、本発明のインキュベーターRIKEN GS-384を使用する場合、図４〜６のＢ、Ｃ、Ｄのいずれかの温度変化パターンで図１に示す温度コートローラー２１、２２の温度を調節した。パターンＢ（図４）では、上部を加熱する温度コートローラー２１がパターンＡと同様に約１０５℃に維持されている（曲線３）のに対して、反応混合物の温度を変化させる温度コートローラー２２は上記サイクルで調節される（曲線４）。パターンＣ（図５）では、反応混合物の温度を変化させる温度コートローラー２２は上記サイクルで調節される（曲線６）のに対して、上部を加熱する温度コートローラー２１の温度も温度コートローラー２２と連動して変化している（曲線５）。しかし、曲線５と６が一時期接触して、温度差がなくなっている。パターンＤ（図６）では、反応混合物の温度を変化させる温度コートローラー２２は上記サイクルで調節される（曲線８）のに対して、上部を加熱する温度コートローラー２１の温度も温度コートローラー２２と連動して変化している（曲線７）。さらに、曲線７は常に曲線８より高い温度を維持しており、両者の温度差が維持されている。
【００２２】
表１に示すように、温度パターンＡ〜Ｄのいずれかを用い、かつＰＣＲ反応液が鋳型ＤＮＡとプライマーとを含む場合（レーン２〜５）、ＰＣＲ反応液が鋳型ＤＮＡを含まない場合（レーン６〜９）、ＰＣＲ反応液がプライマーを含まない場合（レーン１０〜１３）についてそれぞれＰＣＲ反応を行い、反応後、ＰＣＲ反応液を０．８％アガロースゲルを用いて１Ｘ  ＴＢＥバッファー中にて電気泳動に供した。そのパターンを図７に図面に代わる写真として示す。
図７の電気泳動写真から、ＰＣＲ反応液が鋳型ＤＮＡまたはプライマーを含まないレーン６〜１３については、ＰＣＲ増幅産物のスポットが見られない。また、本発明のインキュベーターを用い、しかし、温度変化パターンＢまたはＣを用いたレーン３及び４についてもＰＣＲ増幅産物のスポットが見られなかった。それに対して、反応液量か１０μｌであるにも係わらず、温度変化パターンＤでＰＣＲを行ったレーン５（本発明の方法の実施例）では、５倍量のＰＣＲ反応液を用いたDNA engineの場合（レーン２）と同様のＰＣＲ増幅産物のスポットが見られ、良好にＰＣＲ反応が進行していることが分かる。
【００２３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のインキュベーターの概略図。
【図２】  従来のインキュベーターの概略図。
【図３】  図２に示すヒーター３１及び３２の温度の調節パターン（パターンＡ）。
【図４】  図１に示す温度コートローラー２１、２２の温度の調節パターン（パターンＢ）。
【図５】  図１に示す温度コートローラー２１、２２の温度の調節パターン（パターンＣ）。
【図６】  図１に示す温度コートローラー２１、２２の温度の調節パターン（パターンＤ）。
【図７】  実施例のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す図面に代わる写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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