(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ペプチド領域（変異モチーフ）を確定したペプチド領域（スカフォード配列）に組み込むことにより所定の特徴を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を得る方法において、
ａ）１又はそれ以上のタンパク質モチーフをコードする親ポリヌクレオチド配列に突然変異誘発を施して、異なる変異を有する複数の誘導体を生成し、
ｂ）介在している変異タンパク質モチーフに隣接する部位であって、親ポリヌクレオチド配列上の離れた部位に存在する、複数のオリゴヌクレオチドの対を提供して、オリゴヌクレオチドの各対を、ＰＣＲの増幅プライマーとして用いて介在モチーフを増幅し、
ｃ）前記増幅ヌクレオチド配列から一本鎖ヌクレオチド配列を得て、
ｄ）スカフォード配列をコードするヌクレオチド配列と、前記工程ｃ）から誘導されたヌクレオチド配列を組み込むことによりタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程を具備してなる方法。
【請求項２】
親ポリヌクレオチド配列が、エラー・プローンＰＣＲを施される請求項１記載の方法。
【請求項３】
変異ペプチド領域（変異モチーフ）を確定したペプチド領域（スカフォード配列）に組み込むことにより所定の特徴を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を得る方法において、
ａ）１又はそれ以上の変異タンパク質モチーフをコードする親ポリヌクレオチドを得て、
ｂ）介在している変異タンパク質モチーフに隣接する部位であって、親ポリヌクレオチド配列上の離れた部位に存在する、複数のオリゴヌクレオチドの対を提供して、オリゴヌクレオチドの各対を、ＰＣＲの増幅プライマーとして用いて介在モチーフを増幅し、
ｃ）前記増幅ヌクレオチド配列から一本鎖ヌクレオチド配列を得て、
ｄ）スカフォード配列をコードするヌクレオチド配列と、前記工程ｃ）から誘導されたヌクレオチド配列を組み込むことによりタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程を具備してなる方法。
【請求項４】
組み立てられたポリヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を発現させ、所定の特性をスクリーニングする工程をさらに具備する請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが一本鎖である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチド対の１つが、特異的結合対の成員（ＭＳＢＰ）に結合している請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＭＳＢＰを、その特異的結合パートナーに結合させることにより、増幅した変異モチーフを単離する工程をさらに具備する請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＭＳＢＰが、ビオチンである請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
特異的結合パートナーが、ストレプトアビジンである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
親ポリヌクレオチド配列が、抗体またはその一部をコードする請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドライブラリーを作製する方法において、１又はそれ以上のタンパク質モチーフをコードする親ポリヌクレオチド配列に突然変異誘発を施して、異なる変異を有する複数の誘導体を生成し、
ａ）介在している変異タンパク質モチーフに隣接する部位であって、親ポリヌクレオチド配列上の離れた部位に存在する、複数のオリゴヌクレオチドの対を提供して、オリゴヌクレオチドの各対を、ＰＣＲの増幅プライマーとして用いて介在モチーフを増幅し、
ｂ）前記増幅ヌクレオチド配列から一本鎖ヌクレオチド配列を得て、
ｃ）スカフォード配列をコードするヌクレオチド配列と、前記工程ｂ）から誘導されたヌクレオチド配列を組み込むことによりポリヌクレオチド配列を組み立て、
ｄ）前記ポリヌクレオチド配列を適当なベクターに挿入する工程を具備してなる方法。
【請求項１２】
親ポリヌクレオチド配列が、エラー・プローンＰＣＲを施される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドライブラリーを作製する方法において、１又はそれ以上の変異タンパク質モチーフをコードする親ポリヌクレオチドを得て、
ａ）介在している変異タンパク質モチーフに隣接する部位であって、親ポリヌクレオチド配列上の離れた部位に存在する、複数のオリゴヌクレオチドの対を提供して、オリゴヌクレオチドの各対を、ＰＣＲの増幅プライマーとして用いて介在モチーフを増幅し、
ｂ）前記増幅ヌクレオチド配列から一本鎖ヌクレオチド配列を得て、
ｃ）スカフォード配列をコードするヌクレオチド配列と、前記工程ｂ）から誘導されたヌクレオチド配列を組み込むことによりポリヌクレオチド配列を組み立て、
ｄ）前記ポリヌクレオチド配列を適当なベクターに挿入する工程を具備してなる方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチド配列を選択して発現させ、対応するポリペプチド配列ライブラリーを得る工程をさらに具備する請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
所定の特徴のポリペプチドについて、ライブラリーをスクリーニングする工程をさらに具備する請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１から１３のいずれかに記載の方法でのポリヌクレオチドライブラリーの生成に続いて、前記ポリヌクレオチド配列を選択して発現させ、所定の特徴を持つポリペプチドを得ることをさらに含む方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチド対の１つが、特異的結合対の成員（ＭＳＢＰ）に結合している請求項１１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＭＳＢＰを、その特異的結合パートナーに結合させることにより、増幅した変異モチーフを単離する工程をさらに具備する請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、タンパク質機能のインビトロ分子進化の方法に関する。
特に、それに限られるわけではないが、コード配列内のポリヌクレオチド配列を入れ換えること(shuffling)に関する。
発明の背景
タンパク質機能は、インビトロにおいて、位置指向性突然変異(Moore，等，1987)、組み合わせクローニング(Huse等1989；Marks等，1992)、及び、適当な選択系と組み合わせたランダム突然変異(Barbas等，1992)を含む種々の方法で変性及び改善され得る。
選択を伴うランダム突然変異の方法は、タンパク質機能の改善のための多くの場合に用いられてきているが、異なる２つの方法が存在する。第１に、所定の特徴を有する変異体（突然変異体）の選択と組み合わせた全遺伝子配列のランダム化(randomisation)、それに次ぐランダム突然変異及び選択の新たなラウンドである。この方法は、最適と思われるタンパク質変異体が見つかるまで繰り返される(Moore等，1996)。ここで、突然変異を誘導する伝統的な経路は、エラー・プローン(error prone)ＰＣＲ(Leung等,1989)であり、約０．７％の突然変異比率を有する。
第２に、遺伝子の決定された領域を変質(degenerate)プライマーで突然変異させることができ、それは突然変異比率を１００％までにすることができる(Griffiths等，1994；Yang等，1995)。用いる突然変異比率が高くなると、突然変異を受ける遺伝子の領域がより制限される。
ランダム突然変異は、抗体工学の分野で広く用いられてきた。インビトロで生成された抗体遺伝子はインビトロでクローニングされ(Larrick等，1989)、種々の重い及び軽い遺伝子をコードする遺伝子のランダムな組み合わせに選択を施すことができる(Marks等,1992)。選択された機能的抗体フラグメントは、ランダム突然変異及び付加的選択のラウンドを用いてさらに改善することができる(Hoogenboom等,1992)。
ランダム突然変異の方法は選択へと続く。興味深い特徴を持つ変異体を選択することができ、各々が興味深い特徴を持つ異なる変異体からの突然変異したＤＮＡ領域が、１つのコード配列に組み合わせられる(Yang等，1995)。これは、多段階連続プロセスであり、異なる領域の異なる突然変異は、組み合わせて選択されないので、それらの潜在的な相乗効果を失い得る。即ち、これら２つの方法では、決定された領域の突然変異と、これらの領域の組み合わせの選択が同時に起こることはない。他のプロセスは、例えば抗体親和性を改善するのに用いられる遺伝子の組み合わせ対形成を含む(Marks等,1992)。ここでは、各々が可変遺伝子である３つのＣＤＲ−領域が固定されており、この技術では、クローン間の個々のＣＤＲ領域の入れ換えはできない。
分子ライブラリーからの機能的タンパク質の選択は、ファージ表示技術の開発によって大変革された(Parmley等,1987；McCafferty等,1990；Barbas等,1991)。ここで、表現型（タンパク質）は、その対応する遺伝子型（ＤＮＡ）に直接結合し、これにより、遺伝子物質の直接クローニングが可能になり、それは次いで、さらなる修飾を施されてタンパク質機能が改善される。ファージ表示は、１０11までのサイズの形質転換体を持つ種々の分子ライブラリーからの機能的バインダーをクローニングするのに用いられていた(Griffiths等,1994)。よって、ファージ表示は、分子ライブラリーからの機能的バインダーの直接クローニングに用いることができ、最初に選択されたクローンをさらに改善するために用いることもできる。
異なる突然変異をしたクローンからのＤＮＡのランダムな組み合わせは、配列空間を通した探索のための、より有効な方法である。ＤＮＡ入れ換え(Stemmer，1994)の概念は、ＤＮＡのランダムな断片化、及び断片の機能的コード領域への組み込みを利用する。このプロセスにおいては、化学的に合成されたＤＮＡ配列の導入が可能であり、このようにして、ＤＮＡ配列が知られた遺伝子の決定された位置に目的とする変異を導入することが可能である(Crameri等,1995)。理論上、あらゆるクローン間でのＤＮＡ入れ換えが可能である。しかし、得られる入れ換えられた遺伝子が、発現及び活性について機能的であるとするならば、入れ換えられるクローンは、低レベルのランダム突然変異の例外と関連または同一でなければならない。遺伝子的に異なるクローン間のＤＮＡ入れ換えは、一般的に、非機能的遺伝子を生成する。
発明の概要
最も一般的には、本発明は、少なくとも１つの変異ヌクレオチド領域（変異モチーフ）を、親ポリヌクレオチド配列から誘導された決定されたヌクレオチド領域（スカフォード配列）に組み込む工程を具備してなる、所定の特徴を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を得る方法を提供する。次いで、新たに組み立てられたポリヌクレオチド配列は、発現され、得られたタンパク質は、その特徴を測定するためにスクリーニングされる。
この方法によれば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を特異的な方法で変更することにより、タンパク質の特徴を変えることを可能にする。これは、ａ）ヌクレオチド配列の特定の領域を異なるヌクレオチド配列で置換するか、ｂ）特定の領域を突然変異させてヌクレオチド配列を変更するかのいずれかによって達成される。これらの特定の領域（変異モチーフ）は、最初のポリヌクレオチド配列（親ポリヌクレオチド配列）のスカフォードまたはフレームワーク領域（スカフォード配列）内に組み込まれ、それは、再配列されたとき、変更された特徴のタンパク質をコードする。コードされたタンパク質の特徴は、コードするポリヌクレオチド配列の変化に対応して変化したアミノ酸配列によって変更される。
本発明者らは、配列をランダムに修飾し、次いで、所定のコードされたタンパク質のための膨大なスクリーニングに依存するよりも、タンパク質の選択されたセグメント（変異モチーフ）は修飾するが他は維持する方法が望ましいことを見出した。
変異モチーフは、タンパク質の特定領域をコードするヌクレオチド配列であってよい。例えば、タンパク質の機能的領域（例えば、ループ）または抗体のＣＤＲ領域。
スカフォード配列は、維持するのが望ましいヌクレオチド配列であり、例えば、タンパク質のより構造的な領域、例えば、抗体のフレームワーク領域をコードすることもできる。
変異モチーフは、スカフォード配列としての同じポリヌクレオチド配列、即ち親ポリヌクレオチドを起源とするヌクレオチド配列であってもよいが、それは、コード配列が親におけるものとは変化するように突然変異している。例えば、親ポリヌクレオチド配列は抗体をコードしてもよい。抗体のＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列（変異モチーフ）は、親ポリヌクレオチドの残ったコード配列から選択してもよく、突然変異され、次いで、残ったコード配列から誘導されたスカフォード配列とともに再配列される。発現される抗体は、親ポリヌクレオチドによってＣＤＲ領域で発現される野生型の抗体とは異なるであろう。
あるいは、変異モチーフは、親ポリヌクレオチド配列にコードされるタンパク質と順序的に関連したタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列から誘導してもよい。例えば、１つの抗体（抗体Ａ）からのＣＤＲ領域は、他の抗体（抗体Ｂ）のＣＤＲ領域で置換してもよい。
各場合において、得られる発現されたタンパク質は、所定の特徴についてスクリーニングされる。好ましい特徴は、タンパク質の生物学的特性における変化であってもよい。例えば、タンパク質の３次元構造を変化させてもよい。これは、その結合特性、細胞へ又は細胞から分泌される能力、あるいは、例えば酵素の場合、その触媒特性に影響し得る。タンパク質が、抗体またはその一部であるとき、抗原に対する特異的結合能力を変化させる、即ち、親抗体に比較して結合特性を向上させるのが望ましい。
本発明の一態様では、変異ペプチド領域(変異モチーフ）を決定された領域(スカフォード配列）に組み込むことにより、所定の特徴を持つタンパク質を得る方法が提供され、その方法は、
（ａ）１又はそれ以上のタンパク質モチーフをコードする親ポリヌクレオチド配列に突然変異誘発を施して、複数の異なる変異をしたその誘導体を生成し、または、１又はそれ以上の変異タンパク質モチーフをコードする親ポリヌクレオチドを得て、
（ｂ）各対が、変異タンパク質モチーフを結合した親ポリヌクレオチド配列の離間した位置に存在する、複数のオリゴヌクレオチドの対を提供して、オリゴヌクレオチドの各対を、増幅プライマーとして用いて介在モチーフを増幅し、
（ｃ）このように単離された増幅ヌクレオチド配列から一本鎖ヌクレオチド配列を得て、そして、
（ｄ）スカフォード配列をコードするヌクレオチド配列を持つ前記工程（ｃ）から誘導されたヌクレオチドを組み込むことによりタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を組み立てる工程を具備する。
この方法は、組み立てられたポリヌクレオチド配列によってコードされて得られるタンパク質を発現させ、所定の特性をスクリーニングする工程をさらに具備していてもよい。
好ましくは、親ポリヌクレオチド配列はＤＮＡであり、それから変異モチーフ及びスカフォード配列をコードするＤＮＡが誘導される。
好ましくは、オリゴヌクレオチド対は一本鎖のオリゴヌクレオチドプライマーである。当該対の１又はそれ以上は、特異的結合対（ＭＳＢＰ）の成員に結合していてもよい。ＭＳＢＰは、好ましくはビオチンであり、その特異的結合パートナーは、例えばストレプトアビジンとすることができる。特異的結合対を用いることにより、増幅されたヌクレオチド配列を単離することができる。
ランダム突然変異は、任意の従来法によって実施することができるが、好ましい方法は、エラー・プローンＰＣＲである。
問題とするタンパク質は、例えば、所定の特徴を有する抗体または抗体フラグメントである。抗原または他の結合パートナーと結合できる抗体フラグメントの例は、VL,VH,Cl及びCH1ドメインからなるFabフラグメント；VH,及びCH1ドメインからなるFdフラグメント；抗体の単一腕(single arm)のVL及びVHドメインからなるFvフラグメント；VHドメインからなるdAbフラグメント；単離されたＣＤＲ領域及びF(ab')2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのFabフラグメントを含む２価フラグメントである。一本差Fvフラグメントも含まれる。
一つの方法において、抗体をコードするＤＮＡ、またはそのＤＮＡの一部（例えば、Fab領域または可変領域をコードする部分）をランダムに突然変異させた後、ＣＤＲに結合した配列（変異モチーフ）に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ＣＤＲにおいて起こった全ての変異とともに、ＣＤＲをコードするＤＮＡを増幅することができる。これらは、増幅されたＣＤＲ ＤＮＡ配列及び変異していないスカフォードフレームワーク（ＦＲ）ＤＮＡ配列を用いて、抗体コード配列の再配列に組み込むことができ、その結果、新たなＣＤＲの組み合わせを持ち、潜在的に変化した特性を有する抗体が発現され、それは従来の方法で選択またはスクリーニングされ得る。
他の方法では、ＣＤＲを突然変異させ、それらを抗体に戻して再配列させて、ＣＤＲが誘導された親抗体に極めて近いものとするのではなく、ＣＤＲを、存在するが配列が知られていない１又はそれ以上の抗体から取り出してもよい。種々のＣＤＲに結合した配列を表現するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、個々のＣＤＲを増幅し、単離し、予め決定されたスカフォードに組み込むことができる。
当然のことながら、前記の方法の組み合わせを用いることもでき、１又はそれ以上の親抗体から取ったＣＤＲを、スカフォードに組み込み、完全に新規な、二次抗体を生成し、次いで、スクリーニングの後、所定の特徴を持つ二次抗体を得、それをコードするＤＮＡを変異させ、ＣＤＲを増幅して単離し、次いで、二次抗体からの変異していない非−ＣＤＲ（スカフォード）ＤＮＡとともに再配列させて、ＣＤＲが変異していない二次抗体の変異体を生成し、それに、最初に分泌された二次抗体に対して改善された特性についてスクリーニングを施す。
本発明は、機能的には異なるが遺伝子的に関連したクローンからＤＮＡ配列を単離する新規な方法を可能にする。遺伝子的に関連したクローンは、特別な構造分類、例えば、免疫グロブリンまたはα−β−バレルに属する。本発明は、単離、及びこれらの関連するクローンからの機能的配列の与えられたＤＮＡ配列へのランダムな組み合わせの両方を可能にする。
本発明の概念は、異なる生殖細胞系配列からのＣＤＲ領域が単離され、決定されたフレームワーク配列にランダムに組み込まれるような抗体分子を用いて説明される。本発明は、ファージ表示を用いて選択される分子ライブラリーの複雑さを増大させる。また、本発明の概念は、変異したＣＤＲ−領域の単離及びランダムな組み合わせによる抗体フラグメントの親和性突然変異によっても示される。
特定の配列を単離し、これらを与えられた遺伝子配列にランダムに組み込むために、ＤＮＡ入れ換えの考え方(Stemmer，1994)を使用することはできないが、これは、インビボで形成された個々のＤＮＡ領域をＤＮＡ入れ換えを用いて増幅することができないからである。全遺伝子配列の組み合わせが可能であるが、ここで、決定された領域の入れ換えはできない。むしろ全てのＤＮＡが入れ換えられてしまう。即ち、遺伝子的に関連するクローンからのＤＮＡ配列であって、機能的に相違するもの、例えば、免疫グロブリンまたはα-β-バレルのような構造分類に属するタンパク質は、特定領域が一定に保持され、他の領域が入れ換えられるような方法で入れ換えることはできない。
本発明で提供されるシステムは、タンパク質の機能的領域（例えばループ）を決定された（特に選択された）スカフォードに組み込むための、即ち、与えられたタンパク質の３次元構造のループを入れ換えて新たなタンパク質機能を見出すための簡単な方法を提供する。さらに、ＤＮＡ入れ換え技術は、０．７％の比率の突然変異を誘導する(Stemmer,1994)。即ち、周知のＤＮＡ入れ換え技術(Stemmer，1994)は、そのプロセス自体がスカフォード領域を含むランダムな位置に突然変異を誘導するので、変異していない領域の入れ換えをすることはできない。
それに対して、本発明は、決定されたＤＮＡ-配列の突然変異を、これらのＤＮＡ断片の入れ換え及びコード配列への組み込みとともに可能にし、決定された領域の突然変異とともに、それに続くこれらの領域の選択をも可能にするであろう。
本発明は、異なる配列（クローン）からのＤＮＡの異なる領域を、入れ換えかつランダムに組み合わせることを可能にする。これにより、遺伝子的変化が増大し、そこから機能的抗体フラグメントが選択され、よって、所定の特徴を有するタンパク質の選択の可能性が増大する。これは、フラグメントのVH及びVLにおける各位置で100程度の少ないＣＤＲをランダムに入れ換えることによって、１０12程度の多数の組み合わせが得られ、それにより、免疫系に通常見られる変異性を拡張することにより達成される。
本発明は、例えばｃＤＮＡライブラリーからの決定された領域の、一方がビオチニル化されている(biotinylated)２つのプライマーを用いた増幅を提供する。ＭＳＢＰ基、例えばビオチンを用いて、一本差ＤＮＡを単離し、遺伝子組み換えプロセスに用いることができる。本発明者らは、このことを、抗体遺伝子ライブラリーからの多様ＣＤＲ領域の増幅、及びこれらのＣＤＲ領域の与えられたフレームワーク領域へのランダムな組み込みによって示す。即ち、ＤＮＡの決定された領域（フレームワーク領域）は、ＤＮＡのランダム領域（ＣＤＲ領域）の間に置くことができ、それはインビボ起源または化学合成されたものである。
また、本発明は、上記の方法で生成されコードされたポリヌクレオチド及びタンパク質も提供する。また、そのポリヌクレオチド配列を組み入れたベクター、及びそのベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
本発明はまた、上記の方法で生成され、ファージ表示に使用することのできるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーも提供する。
ここで、本発明の態様及び実施態様を、添付図面を参照しつつ実施例として示す。さらなる態様及び実施態様は当業者には明らかであろう。この本文で述べた全ての文献は、参考としてここに取り入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
図１は、１段階ＰＣＲプロトコールに従い、重複するオリゴヌクレオチドの組からの遺伝子配列の組み換えに基づく、異なるクローン間での特異的ＤＮＡ配列の入れ換えを示す。
図２は、種々のＣＤＲ−入れ換えクローンについての異なる解離速度定数を示す。低いバーは遅い解離速度を示し、高いバーは速い解離速度を示す。クローン３６は、最初(original)の非-突然変異抗体フラグメントである。
図３は、ＨＰＬＣ，Superose S-200 FPLC-カラム(Pharmacia)上で、ＰＢＳバッファー中でアッセイされた、親和性精製されたscFv抗体フラグメントの結果を示す。ピーク１は、抗体フラグメントのモノマー体であり、ピーク２は、少量の不純物であり、ピーク３は、保存剤として用いられたＮａＮ3（アジ化ナトリウム）である。
図４は、ＤＮＡの決定された配列の増幅、及びそれらのマスターフレームワークへの入れ換えの図式的表示である。ＣＤＲ領域のみが増幅される。図４Ａ：VH-ドメインについての遺伝子の組み立て。個々のＣＤＲを、特定のＣＤＲに隣接する２つのプライマーであって、その一方が５’末端でビオチニル化されたプライマーを用いて増幅する。個々のＣＤＲを増幅し、２つの増幅プライマーは突然変異を含まないので、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をＣＤＲに集束した突然変異で精製する。このＤＮＡを２つの一本鎖ＤＮＡ分子に分離する。遺伝子組立にはビオチンを持たない分子を用いる。プライマー725,729,730,728,727をＤＮＡシンセサイザーで合成し、プライマーH2,H3,H5は、変異したＣＤＲを含まず、上記のように増幅した。図４Ｂ：VL-ドメインについての遺伝子の組み立て。ＣＤＲは、Ａと同様の方法で増幅した。プライマー759,738,745,744,880は、ＤＮＡシンセサイザーで合成し、プライマーL2,L3,L5は変異したＣＤＲを含まず、上記のように増幅した。
図５は、クローン３，１１及び３１についてのペプチドのアライメントを、最初の非-突然変異抗体フラグメント(wt)とともに示す。ＣＤＲ領域に印を付けた。クローン３，１１及び３１における突然変異には下線を付した。
図６は、決定されたＤＮＡ領域の入れ換えのための一本鎖ＤＮＡの単離の概念を示す。
図７は、異なるクローンからのＣＤＲ重鎖の長さを示す。これらのＣＤＲ領域は、異なる生殖細胞系から増幅し、（ＤＰ−４７配列からの）決定されたフレームワーク領域にランダムにクローニングされる。
図８は、ＤＮＡの決定された領域の増幅、及びそれらのマスターフレームワークへの入れ換えの図式的表示である。遺伝子組立に用いられた全てのオリゴヌクレオチドはＰＣＲで増幅したが、ＣＤＲ領域のみが任意の遺伝子的変異を含んでいる。図８Ａ：VH-ドメインについての遺伝子の組み立て。フレームワーク領域の増幅のためのテンプレートはscFv-B11であるが、ＣＤＲは、末梢血液リンパ球、扁桃腺及び脾臓から調製したｃＤＮＡから増幅した。個々のＣＤＲは、増幅すべきフラグメントの両末端に位置する２つのプライマー増幅し、そのプライマーの一方は５’末端でビオチニル化されている。個々のＤＮＡフラグメントを増幅し、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成する。このＤＮＡを、２つの一本鎖ＤＮＡ分子に分離する。遺伝子組立にはビオチンを持たない分子を用いる、即ち、プライマーH1，H4，H6であり、これらのプライマーは変異を含まない。プライマーHCDR1，HCDR2，HCDR3は異なるＣＤＲを含み、特定のＣＤＲに隣接する２つのプライマーであって、その一方が５’末端でビオチニル化されたプライマーを用いて増幅する。個々のＣＤＲを増幅し、２つの増幅プライマーは突然変異を含まないので、二本鎖ＤＮＡ（dsDNA）をＣＤＲに集束した突然変異で精製する。このＤＮＡを２つの一本鎖ＤＮＡ分子に分離し、ライブラリーフォーマットのVHドメインの遺伝子組み立てに用いた、即ち、ＣＤＲにおける変異は、異なる生殖細胞系配列から誘導される。プライマーBT25及びBT26をＤＮＡ合成機で合成する。図８Ｂ：VL-ドメインについての遺伝子の組み立て。原理的にはＡと同じ手法である。プライマーL1，L4，L6が増幅され、ＰＣＲによって生成され、変異を含まない。LCDR1，LCDR2，LCDR3は異なるＣＤＲを含む。プライマーBT7及びBT12はＤＮＡ合成機で合成した。
図９は、図８に従って構築したライブラリにおける変異を示す。ＦＩＴＣ(フルオレセイン-イソ-チオシアネート)に結合したライブラリークローンのscFv領域及び最初のscFv-B11はＰＣＲで合成した。精製したＰＣＲ産物をBstNIで切断し、2.5%寒天ゲル上で分離した。クローン１−１５はレーン２−１６、クローン１６−２９はレーン１８−３１である。最初のscFv-B11はレーン３２である。分析により、制限パターン及びフラグメントサイズに従って、２８クローンが１３の異なる群に分けられることが明らかとなった。８つのクローン（１，２，８，１０，１２，１６，２６，２７）は独特であり、２つのクローン（１７，２４）は類似しており、クローンの１群（１８，２３，２９）は３つの類似した成員を有し、２群（５，１５，１４，１９）及び（３，４，６，１１）は４つの成員、そして１群（７，９，１３，２０，２１，２２，２５）は７つの類似した成員を有していた。この実験は、BstNIが配列変異のフラクションのみを検出するので、ライブラリーの変異を低く見積もる。さらに、ゲル分解能がサイズの小さな相違を可能にせず、100bp未満のフラグメントを分析できない。
図９Ｂは、上記図９Ａに例示した実験において類似の制限パターンを示すクローンを示すが、BstNi及びBamHIの両方で切断し、3%寒天ゲルで分離したものである。比較しやすくするために、実験Ａにおいて記載した類似のクローンの群をゲル上に一緒に配置した。実験Ａからのクローン８及び２８は、空間的制限によって排除した。
ゲルＩ）レーン１-８；各々、標準、クローン５、１５、１４、１９、２，２７、最初のscFv-B11。
ゲルＩＩ）レーン１-８；各々、標準、クローン１６、１７、２４、１８、２３、２９、２６。
ゲルＩＩＩ）レーン１-８；各々、標準、クローン７、９、１３、２０、２１、２２、２５。
ゲルＶＩ）レーン１-８；各々、標準、クローン３、４、６、１１、１、１０、１２。
これらの改良した実験条件下では、実質的に全てのクローンが異なる制限パターン／フラグメントサイズを有していた。全てのクローンが最初のscFv-B11遺伝子（レーン８、ゲルＩ）とは異なる。さらに、図９Ａで類似して見えたクローンの群は、図９Ｂで分析すると異なっていることが解った。クローン５，１５，１４，１９（レーン２−５、ゲルＩ)、クローン１７，２４（レーン３−４、ゲルＩＩ)、クローン１８，２３，２９（レーン５−７、ゲルＩＩ)、クローン７，９，１３，２０，２１，２２，２５（レーン２−８、ゲルＩＩＩ)、及びクローン３，４，６，１１（レーン２−５、ゲルＩＶ）参照。
結論として、これらの実験は、ライブラリーが高度な変異性を含有することを示唆している。
詳細な説明及び発明の実例
ＤＮＡ入れ換え方法の一態様は、図１の以下の工程１に従って例示することができる。
Ａ：目的とするタンパク質をコードする遺伝子を重複オリゴヌクレオチドに分割する。
Ｂ：オリゴヌクレオチドをＰＣＲを用いて全長遺伝子配列に組み立てる。
Ｃ：遺伝子配列に、例えばエラー・プローンＰＣＲによって突然変異を施す。
Ｄ：各対が上記工程Ａにおけるオリゴヌクレオチドの１つで決定される領域であって、工程Ａオリゴヌクレオチドの中間領域以外の領域をカバーするオリゴヌクレオチド対を合成する。このカバーされていない領域は、ＰＣＲ増幅の後に入れ換えることのできるＤＮＡ配列である。これら２つの合成オリゴヌクレオチドは、カバーされていない領域を増幅するための増幅プライマーとして用いられる。
Ｅ：これらの増幅プライマーの１つはビオチニル化され、二本鎖ＰＣＲ産物は、次いで、周知のストレプトアビジン系を用いて単離される。
Ｆ：このように単離された増幅されたオリゴヌクレオチドから、上記のカバーされていない領域からのＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡ配列が得られ、次いで、工程Ａに記載した遺伝子配列の新規な組立体において、オリゴ-ヌクレオチドとして用いられる。
Ｇ：異なるクローンから、及び突然変異した遺伝子配列の異なる領域からのＤＮＡ配列が増幅され、一本鎖からなる場合、それらは、遺伝子組み換えのＰＣＲプロセスにおいてランダムに組み合わされる。このランダムな組み合わせが、インビトロの分子進化の基礎となる。
実施例
本発明者らは、異なる実験的設定における決定されたＤＮＡの入れ換えの概念を示してきた。第１に、親和性突然変異を目的とする抗体フラグメントのインビトロで突然変異したＣＤＲ領域における入れ換えが例示され(実施例１及び２)、第２に、高度に変異した抗体ライブラリーの製造のためのインビボで形成されたＣＤＲの入れ換えが例示される（実施例３及び４)。
１．親和性突然変異
ＦＩＴＣに結合したscFv-B11抗体フラグメントに基づいて、モデル系が開発された。このscFvをコードする全長遺伝子は、scFv-B11の周知のＤＮＡ配列を発現する１２のオリゴヌクレオチドの組（図４Ａ及び図４Ｂ）から組み立てられ、遺伝子産物のＦＩＴＣへの機能的結合が確認される。この遺伝子配列は、次いで、エラー・プローンＰＣＲを用いて突然変異され、ＣＤＲ領域をコードするＤＮＡが、一方がビオチニル化された増幅プライマーを用いて上記のように増幅される。（ＣＤＲ領域は、抗原、この場合はＦＩＴＣの結合に含まれる抗体分子の対である。）
６つのＣＤＲ領域全てが増幅され、新たな遺伝子が、１２のオリゴヌクレオチド（上記参照）の第１の組立体から選択される６つ、そして突然変異したＣＤＲ領域の増幅からの６つのオリゴヌクレオチドを用いて組み立てられる。ＦＩＴＣに結合した機能的抗体フラグメントの選択は、ファージ表示(phage display)を用いて行った。50%のクローンが、BIAcoreバイオセンサーで測定したところ、最初のscFv-B11とは異なる解離速度でＦＩＴＣに結合した（図２)。このことは、クローンがＦＩＴＣを認識する方法で変化したことを示している。
BIAcoreにおいてＦＩＴＣに結合すると同定された１６クローンのうち（図２）、クローン３、１１、２７及び３１を選び、これらのクローンが解離速度(off-rates)において大きな変化を示したので、さらに詳細に分析した。これらのクローンを発現させ、ＦＩＴＣ-ＢＳＡで共役したカラム上で親和性精製し、低ｐＨバッファーで溶離した。精製したscFv-抗体フラグメントは、抗体のモノマー及びダイマー形態を分離する能力を持つPharmacia Superdex 200 FLPCカラムを用いたＨＰＬＣでさらに精製して分析した。全てのクローンにおいて、モノマー形態が優勢であった（典型的なサイズプロフィールを図３に示す）。次いで、これを精製し、BIAcoreバイオセンサーを用いた親和性の詳細な分析に使用した。
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クローン＃１１は、最初のscFv-B11抗体フラグメントの２．８倍の親和性を示した。この増加は、より遅い解離速度に基づいている。あるクローン（＃２７）は、結合速度が２倍に増加した。しかし、このクローン全体の親和性は、速い解離速度のために最初のＦＩＴＣ-Ｂ１１クローンと類似していた。クローン間の異なる結合及び解離速度の分布は、親和性のさらなる改良のためのＣＤＲ再入れ換えの基となった。
３つのクローンを配列分析した。VH領域（即ち、scFv-B11の半分及び３つのＣＤＲ領域を具備）において見出された突然変異は、これらが唯一の変異した領域であり、増幅プライマーを用いて増幅されたので、予想通り全てＣＤＲ領域にあった。興味深いことに、全てのＣＤＲ領域は相違し、異なる突然変異を有していた（図５)。しかしながら、ＣＤＲ領域２の場合は、３つのクローン全てにおいて同じ突然変異（チロシンからヒスチジンへの置換）が見られた（残りのＣＤＲ領域はクローン間で異なっていた)。
さらに、突然変異比率は、３つのＣＤＲ領域をともに構成している90bp長の配列における塩基変化から測定したところ、２％から４％の間であることが解った。これは、エラー・プローンＰＣＲ突然変異比率より高く、異なるクローンからの個々のＣＤＲ領域の組み合わせがあることを示している。
２．親和性突然変異−再入れ換え
第２の入れ換え（再入れ換え）を実施するために、ＣＤＲ増幅及びライブラリー構築のさらなるラウンドにおいて、ＦＩＴＣに対する結合親和性で選択されたクローンを用いた。理論的には、再入れ換えしたライブラリーは、ＦＩＴＣに対する向上した結合で選択された、突然変異した入れ換えＣＤＲ領域を含む。このようにして、結合性の向上した新たなＣＤＲ領域の組み合わせが構築され、このライブラリーは、向上した親和性を持つバインダーで選択される。
選択手法から得られた全てのクローンのプール（実施例１に詳述）は、ＣＤＲ増幅のためのテンプレートとして用いた。各ＣＤＲについて１つの増幅を、表２に掲げたプライマーを用いて行った。
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増幅は以下のパラメーターに従って実施した：100ngテンプレート(1.6 x 103CFU 6時間細菌成長)、各プライマー60pmol、5ユニットPFUポリメラーゼ(Stratagene)、1 x PFUバッファー、500μM dNTPs、反応容積100μl、予備加熱96℃10分間、96℃1分間：68℃1分間：72℃1分間を25サイクル、72℃10分間、この方法は、実施例１のＣＤＲ増幅と実質的に同じである。増幅されたＣＤＲは、図１、４Ａ、４Ｂ及び表３に従って、ＶＨ及びＶＬコード配列に組み込むために使用した。
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次いで、ＶＨ及びＶＬを、scFvコード配列に、標準的な方法に従って組み込んだ（Griffiths等，1994)。得られたライブラリーにパンニングを施し、ＦＩＴＣに対する向上した親和性を持つバインダーを選択した。再入れ換えしたライブラリーについての選択手法は、最初に入れ換えしたライブラリーに対するものと同じである。選択後に得られたクローンの総数は５１０であった。６つのクローン（Ｂ）を、この新たなプールから選択し、試験し、そして入れ換えライブラリーを基とする最初のプールからの６つのクローン（Ａ）と比較した（表４)。
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再入れ換え実験からの２つのクローン（２２Ｂ及び３１Ｂ）は、有意に遅い解離速度を示し、再入れ換えプロセスが、親和性の向上したバインダーを生成することを示している。
３．決定されたＤＮＡ領域のクローニング及び入れ換え
我々の系では、一方がビオチニル化された２つのプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーからの決定された領域を増幅することができる。ビオチン基を用いて、遺伝子組立プロセスによって一本鎖ＤＮＡが単離できる（図６)。我々は、このことを、抗体遺伝子ライブラリーからの多様なＣＤＲ領域の増幅、及びこれらのＣＤＲ領域の与えられたフレームワーク領域へのランダムな組み合わせで示した。即ち、ＤＮＡの決定された領域（フレームワーク領域）は、インビトロ起源のＤＮＡのランダム領域（ＣＤＲ領域）によって離間され得る（表５)。ＣＤＲ３領域はサイズが変化する（図７)。あるいは、これらの領域は化学的に合成される。
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４．ライブラリー構築
scFv抗体フラグメントをコードする遺伝子ライブラリーが構築された。このライブラリーのために用いた方法は、オリゴヌクレオチドの組の、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインをコードする配列への組み込みに基づく（図８Ａ、８Ｂ)。無傷のインビボ形成されたＣＤＲ領域は、入れ換えられ、与えられたマスターフレームワークに組み込まれる。この実施例において、我々は、この概念をさらに発展させ、ＶＨ及びＶＬ両方をコードする遺伝子配列を、無傷のＣＤＲ領域とともに与えられたマスターフレームワークに組み込んだ。即ち、６つのＣＤＲ位置全てが入れ換えられた。ＣＤＲ増幅のためのテンプレート起源は、末梢血液Ｂ細胞、脾臓、扁桃腺及びリンパ腺からのｃＤＮＡであった。フレームワーク領域をコードするオリゴヌクレオチドも、一方がビオチニル化された２つのフランキングプライマーの方法を用いて増幅した（プライマーL1,H1,L4,H4,L6,H6)。用いたプライマーは、表６及び図８Ａ、８Ｂに示す。
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ＣＤＲ及びフレームワーク領域の増幅のためのＰＣＲパラメーターは、実施例２に記載したものと実質的に同じであった。ＶＨ及びＶＬをコードする遺伝子の組立体についてのＰＣＲパラメーターは表７に記載する。
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組み立てられたＶＨ及びＶＬ遺伝子配列は、scFvコード配列に、標準的な方法でを用いて組み込まれた（Griffiths等，1994)。試験した４０のクローンから成員１．１×１０9のライブラリーが構築されたが、それら４０のクローン全てが、ＰＣＲ寒天ゲル電気泳動で測定して正しいサイズの挿入を含んでいた。ライブラリーの変異性を試験するために、ＰＣＲ増幅し精製した挿入物を、BsTN1及びBamH1で切断した。クローンは、寒天ゲル電気泳動によって測定したコントロールscFv-B11と比較したところ、異なる制限パターンを有していた（図９)。
scFv抗体フラグメントを発現できるクローンの頻度を見積もるために、FLAG配列(Hopp等，1989)を含むライブラリーからのクローン、並びにFLAG配列有りまたは無しのコントロール細菌を、100μg/mlのアンピシリン、25μg/mlのテトラサイクリン及び1%のグルコースを含むルリアの肉汁プレートに低密度でプレートした。このプレートを、37℃で終夜成長させ、標準的な方法によってニトロセルロースフィルターに移した(Sambrook等,1989)。細菌内でのscFv遺伝子の合成を誘発するため、フィルターを、0.5mMイソプロピル-チオ-β-Ｄ-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むがグルコースは含まないプレート上で４時間インキュベーションした。次いで、細菌をリゾチーム／クロロホルム処理で溶解し、フィルターを洗浄し、抗-FLAG M2抗体(Kodak)、次いで抗-マウスペルオキシダーゼ共役二次抗体（P260 Dakopatts）とともにインキュベーションし、DAB 3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Sigma)によって検出した（表８)。
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抗-FLAG抗体は、ライブラリー構築物並びにコントロールベクターpFAB5His scFv-B11におけるscFv遺伝子の下流側に位置するFLAG配列を検出したが、最初のベクターpFAB5cHisでは検出しなかった。従って、抗-FLAG抗体が結合するクローンは、scFv遺伝子の無傷のオープンリーディングフレームを含む。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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