(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオレセインの3'位と6'位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に13Ｃまたは14Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩。
【請求項２】
酸がカルボン酸である請求項１記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
カルボン酸が脂肪酸である請求項２記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
脂肪酸の炭素数が２から１６である請求項３記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
脂肪酸がラウリン酸、酢酸およびオクタン酸からなる群より選択される請求項４記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
下記の化合物(a)〜(c)からなる群より選択される請求項１記載の13Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物またはその塩。
(a)13Ｃ−ジラウリルフルオレセイン
(b)13Ｃ−ジアセチルフルオレセイン
(c)13Ｃ−ジオクタノイルフルオレセイン。
【請求項７】
フルオレセインの3'位と6'位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に13Ｃまたは14Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩を含有する、呼気テスト用の膵外分泌機能診断剤。
【請求項８】
酸がカルボン酸である請求項７記載の膵外分泌機能診断剤。
【請求項９】
カルボン酸が脂肪酸である請求項８記載の膵外分泌機能診断剤。
【請求項１０】
脂肪酸の炭素数が２から１６である請求項９記載の膵外分泌機能診断剤。
【請求項１１】
13Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物が下記の化合物(a)〜(c)からなる群より選択される請求項７記載の膵外分泌機能診断剤。
(a)13Ｃ−ジラウリルフルオレセイン
(b)13Ｃ−ジアセチルフルオレセイン
(c)13Ｃ−ジオクタノイルフルオレセイン。
【請求項１２】
13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩が膵外分泌性コレステロールエステルハイドロラーゼおよび膵外分泌性エステラーゼの作用を受けた後に脱炭酸され、13ＣＯ2または14ＣＯ2を生じる請求項７〜１１のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵外分泌機能診断剤として有用な新規化合物およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵外分泌機能検査は慢性膵炎、急性膵炎、膵臓癌等の膵臓疾患の診断に有用な検査法である。また、病態の把握や投薬管理、疾患の予後の評価にも有用な検査法である（総説  Arvanitakis and Cooke.  Gastroenterology 74:932 (1978)、Niederau and Grendell.  Gastroenterology 88:1973 (1985)、Goldberg.  Bull. Mol. Biol. Med. 15:1 (1990)、Lankisch.  Int. J. Pancreatology 14:9 (1993)、Bank and Chow  Gastroenterologist 2:224 (1994)、Steer et al. New Eng. J. Med. 332:1482 (1995)）。
【０００３】
膵外分泌機能検査の標準検査法とされているのは、ゾンデを口から十二指腸まで挿入し十二指腸液を採取する検査法で、現在ではセクレチンを静脈内投与することにより膵液の分泌を誘起してから採取するセクレチン試験が一般的である。この方法は直接膵液の量や成分を分析することから正確度が高い。しかしながら、被験者の負担が非常に大きいため、繰返し試験やスクリーニング試験として用いることのできる検査法ではない。また、験者にも技術的熟練が要求されるため、一部の医療機関でしか実施できない検査法である。さらに、Ｘ線透視下でゾンデの位置を確認しながら十二指腸液を採取するため、Ｘ線被曝の問題もある。
【０００４】
このため、繰返し試験やスクリーニング試験には、ゾンデの挿入を必要としない簡易法が用いられている。その一つが、膵臓から分泌されるコレステロールエステルハイドロラーゼ、エステラーゼの合成基質 FDL (Fluorescein diraulate ）を経口投与した後１０時間蓄尿し、分解産物であるFluoresceinの尿中排泄率を測定するPancreolauryl test（PLT）である(US Patent No.3917812、Barry et al. Lancet (1982) Oct. 2 p.742、Scharpe and Iliano Clin. Chem. 33:5 (1987)）。
【０００５】
しかしながらこの方法も、検査に長時間を要するため、通院患者に頻繁に実施することはできないし、健康診断等で実施するには適当でない。
かかる状況下、被験者への負担が小さく、かつ結果が短時間で得られる簡易膵外分泌機能検査法の開発が望まれるところである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、被験者への負担が小さく、かつ結果が短時間で得られる簡易膵外分泌機能検査を可能にする膵外分泌機能診断剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、膵外分泌機能検査に利用できる新規な化合物を提供することも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、13Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物を慢性膵炎ラットに経口投与し、投与後の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度を測定することにより、膵外分泌機能検査を行うことができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物またはその塩を提供する。本発明の化合物またはその塩は、フルオレセインの3'位と6'位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に13Ｃまたは14Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩であるとよく、13Ｃまたは14Ｃで標識された酸は、カルボン酸を例示することができ、カルボン酸の中でも脂肪酸、特に炭素数が２から１６の脂肪酸が好ましい。好ましい酸の例としては、酢酸、オクタン酸、ラウリン酸などを挙げることができる。
【０００９】
また、本発明は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を含有する膵外分泌機能診断剤を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物およびその塩を包含する。
フルオレセイン(CA Name: 3',6'-Dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen-3-one)は以下の構造式で表される。
【００１１】
【化１】
0003669880.tif 000002
【００１２】
「フルオレセインエステル化合物」とは、フルオレセインの水酸基に酸がエステル結合した化合物であり、フルオレセインおよび酸に修飾がなされていてもよい。
「13Ｃ−または14Ｃ−標識」とは、フルオレセインエステル化合物中の少なくとも１個の炭素原子が13Ｃ−または14Ｃ原子に置換されていることにより、フルオレセインエステル化合物中の13Ｃ−または14Ｃ原子の存在比が天然存在比より高くなっていることをいう。
【００１３】
本発明の一態様において、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物またはその塩は、フルオレセインの3'位と6'位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に13Ｃまたは14Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩である。
【００１４】
13Ｃまたは14Ｃで標識された酸は、カルボン酸を例示することができるが、カルボン酸の中でも脂肪酸が好ましい。本明細書において、「脂肪酸」とは、Ｒ−ＣＯＯＨ（式中、Ｒは脂肪族基で分枝や２重結合があってもよい。）で表される化合物をいう。脂肪酸の炭素数は、好ましくは２から１６である。
脂肪酸の例としては、酢酸、オクタン酸、ラウリン酸などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１５】
本発明の13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物としては、13Ｃ−ジラウリルフルオレセイン、13Ｃ−ジアセチルフルオレセイン、13Ｃ−ジオクタノイルフルオレセインなどを挙げることができる。
13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物は、以下のようにして製造することができる。
【００１６】
たとえば、フルオレセインをクロロホルムに溶解し、13Ｃ−または14Ｃ−標識脂肪酸クロライドを等モルもしくは２倍モル加える。その後、ピリジンを含むクロロホルム溶液を滴下し遮光下で加熱攪拌する。反応終了後、溶媒を留去しカラムクロマトグラフィー、再結晶により13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物を得ることができる。
上記の13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物は、塩の形で得ることもできる。塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩などを挙げることができる。
【００１７】
本発明の膵外分泌機能診断剤は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等）に製剤化されたものであるとよい。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は適宜変更される。例えば、液状担体としてはオリーブ油が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。また、凍結乾燥製剤として用いたりすることもできる。
【００１８】
13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100重量％、好ましくは50〜100 重量％である。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩の製剤中における含量は、約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。
【００１９】
本発明の膵外分泌機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の13ＣＯ2または14ＣＯ2の増加を確認できる量が必要であり、患者の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば1回当たりの投与量は成人の場合、1〜2000mg/kg体重程度である。
【００２０】
本発明の膵外分泌機能診断剤を用いる検査は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を被験者に投与することにより行う。投与後の血中、尿中、便中の13Ｃ−または14Ｃ−標識化合物濃度を測定する検査も可能であるが、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度あるいは14Ｃ濃度の増加を測定する呼気テストが望ましい。13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を被験者に投与する前に、試験食等を投与して、膵酵素の分泌を誘起しておいてもよく、また、試験食等と共に投与してもよい。また、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩の複数種を組み合わせて使用してもよい。13Ｃの場合は具体的には、投与後の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度を測定し、投与後一定時間（例えば１時間、２時間、３時間）経過後における呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）の積算または経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから膵外分泌機能の診断を行う。14Ｃの場合は具体的には、投与後の呼気ＣＯ2中の14Ｃ濃度すなわち放射能を測定し、投与後一定時間（例えば１時間、２時間、３時間）経過後における呼気ＣＯ2中の放射能量、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ2中の放射能量の増加率の積算または経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから膵外分泌機能の診断を行う。
【００２１】
この検査法は、13Ｃ−または14Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を被験者に投与すると、この化合物が膵外分泌性コレステロールエステルハイドロラーゼ、エステラーゼの作用を受けて分解された後に、消化管から吸収されて体内の代謝作用により脱炭酸され、13ＣＯ2または14ＣＯ2を生じ、これが呼気に排出されるという現象を利用するものである。
【００２２】
ここで、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-MS）、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法等で行うことができる。
【００２３】
また、呼気ＣＯ2中の14Ｃ濃度すなわち放射能の測定は、呼気を直接あるいは溶媒等にＣＯ2 をトラップした後、GM計数管、液体シンチレーションカウンター、固体シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー、電離箱法などで行うことができる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕13Ｃ-ジラウリルフルオレセイン（13C-FDL）の製造
１-13Ｃ-ラウリン酸５ｇ（Masstrace社)を乾燥クロロホルムに溶解し、これに２０倍モル量の塩化チオニルを加えた。この溶液を２時間加熱還流した後、クロロホルムをエバポレーターで除いた。さらに、減圧下、塩化チオニルを留去し、残さを直ちに次の反応に用いた。ラウリン酸クロリドの６分の１モル量に相当するフルオレセイン２Ｎａを乾燥アセトン２０ｍｌに溶解し、ピリジンを等モル加えて４５℃で加熱した。これに滴下ロートを用いて、上述の方法で得た酸クロライドを３０分間で滴下した。この間、光を遮蔽し、温度を４５℃に保った。滴下後、２時間反応させた。
【００２５】
反応終了後、アセトンを留去した後、クロロホルムを加えて残さを溶解した。クロロホルムに溶解しないものを濾過で除き、クロロホルムを、水、アルカリ、水、酸、水の順で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。クロロホルムを留去し、残さをシリカゲルカラム（3 cm x 60 cm、クロロホルム／エーテル）と活性炭素により精製し、得られた化合物を冷メタノールで洗浄し、13C-FDLを得た。
【００２６】
構造の確認と13Ｃの標識位置は、13Ｃ−ＮＭＲとマススペクトルで行った。
13Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、300MHz）  172.2 ｐｐｍ（13ＣＯＯＲ）
マススペクトル（EI-MS）    ｍ/ｚ698（Ｍ+）、288、287、271
ＬＣ−ＭＳ（APCI）      ｍ/ｚ699（Ｍ++H）、516、333
【００２７】
〔実施例２〕13C-FDL 呼気テスト
２-１  方法
慢性膵炎ラットと対照ラットに13C-FDLを経口投与し、投与後の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の経時変化を測定する13C-FDL呼気テストを行った。
慢性膵炎ラットの作成はMundlosらの方法（Mundlos et al.Pancreas 1:29 (1986)）に従い、5 週齢の Wistar 系雄性ラットの膵管へオレイン酸を注入し、３週間飼育した。また、腹部正中切開を実施したラットを対照とした。
【００２８】
一晩絶食した８週齢の慢性膵炎ラット、および対照ラットを、無麻酔のままマイクロ照射装置用ラットホルダー内に固定した。炭酸ガス計（CAPSTER-100）を用いて呼気を約 100〜300 ml/minの速度で吸引し、炭酸ガス濃度をモニターした。炭酸ガス濃度が安定した状態でいったんラットホルダーからラットを出し、オリーブ油に溶解した13C-FDL （160 mg/kg, 4 ml/kg）を、経口投与用ゾンデを用いて胃内に投与した。
【００２９】
投与直前と、投与後１時間毎に５時間まで呼気をサンプリングし、呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度をガスクロマトグラフ−質量分析計（GC-MS ）で分析した。GC-MS の分析条件は下記の通りである。吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。
【００３０】
[ＧＣ−ＭＳ条件]
装置                     Shimadzu GC-MS QP-5000   [(株) 島津製作所]
カラム                    0.32mm×25m (ID ×L) fused silica capillary column PORAPLOT Q (CHROMPACK社)
イオン化法                EI (electron impact)  法
気化室温度                60℃
カラム温度                60℃
GCインターフェース温度    230 ℃
キャリアガス              He
キャリアガス圧力          20Kpa
測定モード                SIM (selected ion monitoring)
測定イオン                m/z=45, 46, 47
試料注入量                25μl
【００３１】
[13Ｃ濃度計算方法]
酸素同位体存在比を天然存在比とし、m/z=45, 46のイオンピーク面積より13Ｃ濃度を下式により算出した。m/z=45, 46の面積比 (A45/A46)をａとする（特開平7-120434号に基づく）。
【００３２】
【数１】
13Ｃ濃度(%) ＝｛(0.004176-0.0007462a)/(0.9944396＋0.0034298a) ｝×100
尚、Δ13Ｃ(‰)は各時点の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度 (13Ｃ tmin)とＣＯ2標準ガスの13Ｃ濃度( 13Ｃ std)から下式により算出した。
【００３３】
【数２】
Δ13Ｃ(‰)＝｛(13Ｃ tmin-13Ｃ 0min)/13Ｃ std｝×1000
【００３４】
２-２  結果
対照ラット、慢性膵炎ラットともに、測定を終了した５時間までΔ13Ｃ（‰）値が増加を続けたが、慢性膵炎ラットのΔ13Ｃ（‰）値は５時間までの各時間において対照ラットよりも小さかった（図１）。投与後３時間におけるΔ13Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 42.0 ± 21.3 に対して対照ラットで 153.3± 22.8 と非常に有意に（p ＜ 0.01）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後５時間におけるΔ13Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 95.4 ± 47.1 に対して対照ラットで 236.3± 12.4 と有意に（p ＜ 0.05）慢性膵炎ラットで小さかった。
【００３５】
〔実施例３〕13Ｃ-ジオクタノイルフルオレセイン（13C-ＦＤＯ）の製造
１-13Ｃ-オクタン酸２ｇ（Masstrace社)、フルオレセイン２Ｎａ１.５２ｇをDimethylformamide（DMF）に溶解し、Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate（BOP）９.１３ｇ及びDiisopropylethylamine（DIEA）７.２mlを順に添加して室温で１２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後、酢酸エチル抽出した。有機層を乾燥、濃縮後、遮光下カラム精製（溶媒20%酢酸エチル／ヘキサン）し、濃縮後、13Ｃ-ＦＤＯ１.０５ｇを得た。
【００３６】
構造の確認と13Ｃの標識位置は、13Ｃ−ＮＭＲとマススペクトルで行った。
13Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、400MHz）  171.9 ｐｐｍ（13ＣＯＯＲ）
マススペクトル（EI-MS）    ｍ/ｚ586（Ｍ+）、542、415、332、288、287、271
【００３７】
〔実施例４〕13C-ＦＤＯ呼気テスト
２-１と同様に、慢性膵炎ラットと対照ラットに13C-ＦＤＯを200mg/kg経口投与し、投与後の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の経時変化を測定する13C-ＦＤＯ呼気テストを行った。
【００３８】
慢性膵炎ラットのΔ13Ｃ（‰）値は測定を終了した５時間までの各時間において対照ラットよりも小さかった（図２）。投与後１時間におけるΔ13Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 2.7± 3.8に対して対照ラットで 46.3± 11.5 と非常に有意に（p ＜ 0.001）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後３時間におけるΔ13Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 18.4 ± 12.1 に対して対照ラットで 60.6 ± 12.7 と非常に有意に（p ＜ 0.01）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後４時間におけるΔ13Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 15.2 ± 13.4 に対して対照ラットで 88.7 ± 8.2と非常に有意に（p ＜ 0.001）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後５時間におけるΔ13Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 20.6 ± 11.2 に対して対照ラットで 73.6 ± 14.1 と非常に有意に（p ＜ 0.01）慢性膵炎ラットで小さかった。
【００３９】
〔実施例５〕13Ｃ-ジアセチルフルオレセイン（13C-ＦＤＡ）の製造
１-13Ｃ-酢酸２ｇ（Masstrace社)、フルオレセイン２Ｎａ３.６３ｇをＤＭＦに溶解し、ＢＯＰ１５.９４ｇ及びＤＩＥＡ１７.１mlを順に添加して室温で１２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後、酢酸エチル抽出した。有機層を乾燥、濃縮後、遮光下カラム精製（溶媒20%酢酸エチル／ヘキサン）し、濃縮後、13Ｃ-ＦＤＡ１.０１ｇを得た。
【００４０】
構造の確認と13Ｃの標識位置は、13Ｃ−ＮＭＲとマススペクトルで行った。
13Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、400MHz）  168.8 ｐｐｍ（13ＣＯＯＲ）
マススペクトル（EI-MS）    ｍ/ｚ418（Ｍ+）、374、331、314、288、287、271
【００４１】
〔製剤例１〕  （内服液剤）
13Ｃ-FDL 4重量部に対し、オリーブ油を加え全量を100重量部として、これを溶解後バイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、被験者への負担が小さく、かつ結果が短時間で得られる簡易膵外分泌機能検査が可能となった。
この検査法は、集団検診や人間ドッグでの膵炎のスクリーニング検査、さらに、慢性膵炎の重症度の判定、未だに死亡率の高い（30％）劇症膵炎の重症化予知、膵炎の成因の診断、膵臓癌の早期診断にも利用できる。また、一般外来患者の診察において、膵炎を否定する診断法としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】13C-FDL投与後の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）の経時変化。0分で慢性膵炎ラット（●、n=3）、および対照ラット（□、n=3）に13C-FDL（160mg/kg）を経口投与した。バーはＳＤを表す。
【図２】  13C-FDO投与後の呼気ＣＯ2中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ(‰)）の経時変化。0分で慢性膵炎ラット（●、n=4）、および対照ラット（□、n=4）に13C-FDO（200mg/kg）を経口投与した。バーはＳＤを表す。
【図１】
0003669880.tif 000003
【図２】
0003669880.tif 000004