(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表されるトリプロスタチン。
【化１】
0003719689.tif 000010
式中、Ｒは、メトキシ基または水素原子である。
【請求項２】
アスペルギルス属に属する、請求項1記載の式（Ｉ）で表されるトリプロスタチンの生産菌を培地に培養し、トリプロスタチンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするトリプロスタチンの製造方法。
【請求項３】
トリプロスタチン生産菌がアスペルギルス・フミガタスBM939 株である請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項1記載の式（Ｉ）で表されるトリプロスタチンを有効成分とする細胞周期阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規物質トリプロスタチン、その製造方法、それを有効成分とする細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人体を構成する細胞は恒常性を維持するためにその増殖と分化は厳しく制御されている。細胞は、Ｍ期・Ｇ1 期・Ｓ期・Ｇ2 期という一連の過程からなる細胞周期を回転することにより分裂、増殖を行う。この細胞周期の制御機構に異常が生じると癌や免疫疾患になる。最近では、細胞周期の調節機構が分子レベルで解明されつつあり、細胞周期を調節する物質には、抗腫瘍剤、免疫抑制剤の可能性が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞周期阻害活性、抗腫瘍活性を有する新規物質、その製造方法、それを有効成分とする細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤の提供を目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題の解決のために鋭意検討した結果、静岡県大井川沖の海底から採取した土壌から分離された、アスペルギルス属に属するカビBM939 株が細胞周期阻害活性および抗腫瘍活性を有する物質を生産することを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の一般式（Ｉ）で表される新規物質トリプロスタチンを提供するものである。
【０００５】
【化２】
0003719689.tif 000002
式中、Ｒは、メトキシ基（トリプロスタチンＡ）または水素原子（トリプロスタチンＢ）である。
【０００６】
本発明のトリプロスタチンは、アスペルギルス属に属する、トリプロスタチン生産菌を培地に培養し、トリプロスタチンを生成蓄積せしめ、これを採取することにより製造することができる。本発明で使用するトリプロスタチン生産菌の好ましい例としては、アスペルギルス・フミガタスBM939 株が挙げられる。
本発明はさらに、新規物質トリプロスタチンを有効成分とする細胞周期阻害剤およびトリプロスタチンを有効成分とする抗腫瘍剤を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の新規物質トリプロスタチンＡおよびＢは以下の式で表される。
【０００８】
【化３】
0003719689.tif 000003
【０００９】
本発明の物質トリプロスタチンＡおよびＢを生産するアスペルギルス属に属する菌の代表例としてはアスペルギルス・フミガタスが挙げられ、その具体例としてはカビBM939 株が挙げられる。BM939 株は以下の菌学的性質を有する。
（１）各種培地上での生育形態
培養はすべて25℃で行い寒天平板培地上での生育形成を記載した。
(1-1) CYA 寒天培地
生育は良好であり、25℃、７日間の培養でコロニーの直径は65mmである。コロニーはビロード状に生育して多くの分生子を形成し分生子は青緑色である。コロニの裏面は淡黄色である。
(1-2) CY20S 寒天培地
生育は中程度であり、25℃、７日間の培養でコロニーの直径は50mmである。コロニーはビロード状に生育して分生子を形成し、分生子は青緑である。コロニーの裏面は淡黄色である。
(1-3) MEA 寒天培地
生育は中程度であり、25℃、７日間の培養でコロニーの直径は55mmである。コロニーはビロード状に生育して分生子を形成し、分生子は淡黄色である。コロニーの裏面は淡黄色である。
【００１０】
（２）形態的性質
25℃、７日間、CYA 寒天培地上での形態的性質は以下のとおりであった。
分生子柄の幅は 2.5〜５μm 、長さは 100〜350 μm で、その先端に直径10〜25μm 、淡緑色の球〜半球状の頂のうを形成する。分生子柄の表面は平滑状であり、メトレは生産していない。頂のうの約2/3 より上部に淡緑色の幅 5〜10×長さ２〜3.5mm のフィアライドを一段形成する。分生子はフィアライドより連鎖して形成され、直径２〜3.5mm 、深緑色の球〜半球状である。ヒューレ細胞は観察されなかった。
以上の菌学的性状から、本菌株はアスペルギルス(Aspergillus) 属の菌であり、レイパーとフェンネル(Raper & Fennel)の「ザ・ジーナス・アスペルギルス」(1965)(“The GENUS Aspergillus") を参考に既知菌種を検索したところ、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus Fumigatus) の性状と一致した。なお、当該菌株Aspergillus fumigatus BM939 は生命工学工業技術研究所に１９９５年７月２６日に寄託され、その受託番号はFERM P-15067である。
【００１１】
上記菌株カビBM939 株を培養し、当該培養物から新規物質トリプロスタチンＡおよびＢ（以下「本発明化合物」とも記載する）を採取する方法は、具体的には後述する製造例に記載するが、概ねアスペルギルス属に属する菌の培養方法に従って実施することができる。培養終了後、培養液から本発明のトリプロスタチンを精製、単離するには、一般に微生物代謝産物を採取するのに通常用いられる手段を適宜利用して行うことができる。例えば、各種イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、ゲル濾過クロマトグラフィー、又は活性炭、アルミナ、シリカゲル等の吸着剤によるクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー、或いは結晶化、減圧濃縮、凍結乾燥等の手段をそれぞれ単独又は適宜組み合わせて、或いは反復して使用することが可能である。
【００１２】
以上のようにして製造される新規なトリプロスタチンは、後述の試験例に示すように細胞周期阻害活性、抗腫瘍活性を有する。
本発明のトリプロスタチンを有効成分とする細胞周期阻害剤は、その使用目的に合わせて、使用方法、剤型、投与量（使用量）が適宜決定される。例えば、本発明のトリプロスタチンを有効成分とする抗腫瘍剤の場合、その投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。剤型としては、例えば、錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤又は注射剤もしくは座剤等の非経口投与剤を挙げることができる。これらの製剤は、賦形剤、結合剤等の製薬上許容される添加剤を用いて、既知の方法で製造される。また、上記のトリプロスタチンを有効成分として含有する抗腫瘍剤の臨床的投与量は、年齢、体重、患者の感受性、症状の程度により異なるが、通常効果的な量は、成人一日 0.1mg〜１ｇ程度であり、一日一回又は数回にわけて投与することも可能である。また、必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００１３】
また生化学試験用試薬として使用する場合、有機溶剤または含水有機溶剤に溶解して各種培養細胞系へ直接投与すると、細胞周期の進行をＧ２／Ｍ期で阻止する。使用可能な有機溶剤としては、例えば、メタノールやジメチルスルホキシド等を挙げることができる。剤型としては、例えば、粉末または顆粒等の固形剤もしくは有機溶剤または含水有機溶剤に溶解した液体剤等を挙げることができる。通常、上記トリプロスタチンを有効成分とする細胞周期阻害剤の効果的な使用量範囲は５〜５０μm/mlであるが、適切な使用量は培養細胞系の種類や使用目的により異なる。また、必要により上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例等を記載して本発明を具体的に記載する。
【製造例】
グルコース３％、可溶性澱粉２％、大豆粉２％、リン酸第二カリウム0.５％、および硫酸マグネシウム0.05％の組成の培地(pH 6.5)に、前記菌株BM939 株を接種して28℃で４８時間振盪培養を行った。この培養液70mlを同組成の培地18Ｌに接種し、28℃で７２時間にわたって毎分７Ｌの通気を行いながら、毎分３００回転の攪拌培養を行った。
上記培養液を高速遠心分離器（１５０００回転／分）で菌体と上清に分離し、菌体を８０％アセトン１８Ｌを用いて抽出した。上清を18Ｌの酢酸エチルで３回抽出し、含水アセトン抽出液は減圧濃縮して、得られる水溶液を５Ｌの酢酸エチルで３回抽出を繰り返した。抽出後、全ての酢酸エチルをあわせて減圧濃縮し、褐色のシロップ18.5ｇを得た。
【００１５】
このシロップをメタノール200 mlにより溶解してメタノール可溶部を得、メタノール可溶部を水に混濁させ、クロロホルムと酢酸エチルで順次抽出し、クロロホルムエキスと酢酸エチルエキスを得た。クロロホルムエキスはさらにｎ−ヘキサン200 mlで油分を３回溶出して除去し、残るｎ−ヘキサン不溶部を酢酸エチルエキスと合併して本発明化合物を含有するエキス4.3gを得た。このエキスを20mlのｎ−ヘキサンークロロホルム(20:80) で溶解し、ｎ−ヘキサンークロロホルム(20:80) で調製したシリカゲルカラム（ベッド容積：直径4.5 cm、長さ15cm）に浸潤させ、最初にｎ−ヘキサンークロロホルム溶液を配合割合20:80 、10:90 と5:95の順でそれぞれ500 mlずつ流し、引き続いてクロロホルム１Ｌを流した後、クロロホルムーメタノール溶液を配合割合を順次変えて（95.5：0.5 、99：１、98：2 、96：4 、92：8)それぞれ１Ｌずつ流し、最後にクロロホルムーメタノール割合80：20と70：30の溶液を各500 mlずつ流した。
【００１６】
本発明化合物はクロロホルム溶液画分に溶出され、計880 mgの本発明化合物を含有する粗粉末を得た。
この粗粉末をメタノールで結晶化することにより、本発明化合物以外の結晶性物質を除去した。メタノール溶液部(385 mg)は、ODS カラム（直径２cm、長さ２５cm; カプセルパック、資生堂社製）と60％メタノール溶出溶媒を用いて流速10ml／分と検出波長210nm の条件下で分取高速液体クロマトグラフィーにより分離し、本発明化合物トリプロスタチンＡとＢの粗品を得た。これら粗品は溶出溶媒のみを55％メタノールに変更した上記同条件下の分取高速液体クロマトグラフィーまたはそれに分取用シリカゲル薄層板（厚さ0.5mm 、大きさ20x20cm)および展開溶媒クロロホルムーメタノール（95：5)を用いた分取薄層クロマトグラフィーを組み合わせることにより精製した。
この結果、淡黄色結晶性固体として精製標品トリプロスタチンＡとＢをそれぞれ7.7 mgと6.9 mgずつ得た。表１および表２に精製標品の物性値等を示す。
【００１７】
【表１】
0003719689.tif 000004
【００１８】
【表２】
0003719689.tif 000005
0003719689.tif 000006
0003719689.tif 000007
【００１９】
本発明化合物の活性を以下の方法に従って測定した。
【試験例１】
トリプロスタチンＡ、Ｂの細胞周期阻害活性
細胞周期の調節蛋白質である p34cdc2キナーゼが温度感受性に変異したマウス乳癌細胞tsFT210 細胞を用いた。tsFT210 細胞は通常32℃で5%仔牛血清を含むRPMI1640培地にて5%炭酸ガスと水蒸気を飽和させた培養器内で培養する。tsFT210 細胞は39℃で培養すると、細胞周期がG2期で停止し、これを32℃にシフトダウンすると再び細胞分裂を開始してG1期へ移行する。シフトダウンと同時にトリプロスタチンＡまたはＢを添加して、フローサイトメーターと顕微鏡観察により細胞周期 (G2→M →G1) の進行を解析した。結果を表３に示す。
【００２０】
【表３】
0003719689.tif 000008
表３の結果は本発明のトリプロスタチンが細胞周期阻害剤として有用であることを示している。
【００２１】
【試験例２】
トリプロスタチンＡおよびＢの細胞増殖抑制効果
ヒト白血病細胞K-562 及びHL-60 をRPMI1640培地（10％の牛胎仔血清を含む）で培養した。これに一連の稀釈系列のトリプロスタチンＡおよびＢを加え、17時間培養したのち、MTT 試薬を加えて生育を計測した。その結果を表４に示す。
【００２２】
【表４】
0003719689.tif 000009
表４の結果は、本発明のトリプロスタチンが抗腫瘍剤として有用であることを示している。
【００２３】
【製剤例１】
（注射・点滴剤）
トリプロスタチンＢ１０mgを含有するように、粉末ぶどう糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封入して冷暗所に保存した。使用前にエタノールに溶解し、０．８５％生理的食塩水１００mlを添加して静脈内注射剤とし、一日、１０〜１００mlを症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。
【製剤例２】
（注射・点滴剤）
トリプロスタチンＢ２mgを用いて、製剤例１と同様の方法により軽症用静脈内注射剤とし、一日、１０〜１００mlを症状に応じて静脈内注射または点滴で投与する。
【製剤例３】
（顆粒剤）
トリプロスタチンＡ１ｇ、乳糖９８ｇおよびヒドロキシプロピルセルロース１ｇを各々とり、よく混合した後、常法に従って粒状に成形し、これをよく乾燥して篩別してビン、ヒートシール包装などに適した顆粒剤を製造した。一日、 100〜1000mgを症状に応じて経口で投与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】トリプロスタチンＡ（１）およびＢ（２）のメタノール中の紫外線吸収スペクトルを示す。
【図２】トリプロスタチンＡ（１）およびＢ（２）の赤外線吸収スペクトル（KBr)を示す。
【図３】トリプロスタチンＡ（１）およびＢ（２）の1H-NMR (CDCl3)スペクトルを示す。
【図４】トリプロスタチンＡ（１）およびＢ（２）の13C-NMR (CDCl3) スペクトルを示す。
【図１】
0003719689.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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