【手続補正書】
【提出日】令和3年5月25日(2021.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子をコードする発現ベクターの細胞への送達方法であって、
前記細胞及び前記発現ベクターを含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記発現ベクターが通過するのに十分なほど大きい細胞膜の摂動を引き起こすこと；及び
前記発現ベクターを前記細胞内に輸送するために、少なくとも１つの電極によって生成された電場に前記細胞懸濁液を通すこと；
を含み、
前記細胞中の前記導入遺伝子の最大発現が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞中、又は前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞中の対応する最大発現と比べ、早く達成される、前記送達方法。
【請求項２】
細胞中の導入遺伝子の最大発現が、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞中の対応する最大発現と比べ、約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４時間、又は０．１〜４時間早く達成される、請求項１に記載の送達方法。
【請求項３】
導入遺伝子をコードする発現ベクターの細胞への送達方法であって、
前記細胞及び前記発現ベクターを含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記発現ベクターが通過するのに十分なほど大きい細胞膜の摂動を引き起こすこと；及び
前記発現ベクターを前記細胞内に輸送するために、少なくとも１つの電極によって生成された電場に前記細胞懸濁液を通すこと；
を含み、
前記細胞中における前記導入遺伝子の発現レベルが、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞中、又は前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞中の対応する発現レベルと比べ、高い、前記送達方法。
【請求項４】
細胞中における導入遺伝子の発現レベルが、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞中の対応する発現レベルと比べ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００％高いか、又は２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上高い、請求項３に記載の送達方法。
【請求項５】
細胞が細胞変形狭窄部を通過してから約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、又は０．１〜４時間以内における前記細胞内での導入遺伝子の発現レベルが、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した対応する細胞中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞中の対応する発現レベルと比べ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００％高いか、又は２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上高い、請求項３に記載の送達方法。
【請求項６】
導入遺伝子をコードする発現ベクターの細胞集団への送達方法であって、
前記細胞及び前記発現ベクターを含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記発現ベクターが通過するのに十分なほど大きい前記細胞の摂動を引き起こすこと；及び
前記発現ベクターを前記細胞内に輸送するために、少なくとも１つの電極によって生成された電場に前記細胞懸濁液を通すこと；
を含み、
前記細胞集団中の前記導入遺伝子を発現する細胞の割合が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞集団中、又は前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の対応する細胞の割合よりも大きい、前記送達方法。
【請求項７】
細胞集団中の導入遺伝子を発現する細胞の割合が、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞集団中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の対応する細胞の割合と比べ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００％大きいか、又は２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上大きい、請求項６に記載の送達方法。
【請求項８】
細胞が細胞変形狭窄部を通過してから約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、又は０．１〜４時間以内における細胞集団中の導入遺伝子を発現する細胞の割合が、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞集団中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の対応する細胞の割合と比べ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００％大きいか、又は２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上大きい、請求項６又は７に記載の送達方法。
【請求項９】
導入遺伝子をコードする発現ベクターの細胞集団への送達方法であって、
前記細胞及び前記発現ベクターを含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記発現ベクターが通過するのに十分なほど大きい前記細胞の摂動を引き起こすこと；及び
前記発現ベクターを前記細胞内に輸送するために、少なくとも１つの電極によって生成された電場に前記細胞懸濁液を通すこと；
を含み、
前記細胞集団中の前記導入遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞集団中、又は前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の対応する細胞の割合と比べ、大きい、前記送達方法。
【請求項１０】
細胞集団中の導入遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞集団中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の対応する細胞の割合と比べ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００％大きいか、又は２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上大きい、請求項９に記載の送達方法。
【請求項１１】
細胞が細胞変形狭窄部を通過してから約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、又は０．１〜４時間以内における細胞集団中の導入遺伝子を高レベルで発現する細胞の割合が、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞集団中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞集団中の対応する細胞の割合と比べ、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、若しくは１００％大きいか、又は２倍、５倍、８倍、１０倍、２０倍若しくはそれ以上大きい、請求項９又は１０に記載の送達方法。
【請求項１２】
導入遺伝子をコードする発現ベクターの細胞への送達方法であって、
前記細胞及び前記発現ベクターを含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通し、それによって前記細胞に圧力を加え、前記発現ベクターが通過するのに十分なほど大きい細胞膜の摂動を引き起こすこと；及び
前記発現ベクターを前記細胞に輸送するために、少なくとも１つの電極によって生成された電場に前記細胞懸濁液を通すこと；
を含み、
前記細胞内の前記導入遺伝子が、前記細胞変形狭窄部を通過することなく前記電場を通過した細胞中、又は前記電場を通過することなく前記細胞変形狭窄部を通過した細胞中の前記導入遺伝子の発現よりも、より早く発現する、前記送達方法。
【請求項１３】
細胞内の導入遺伝子の発現が、細胞変形狭窄部を通過することなく電場を通過した細胞中、又は電場を通過することなく細胞変形狭窄部を通過した細胞中の対応する発現と比べ、約０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、又は０．１〜４時間早く達成される、請求項１２に記載の送達方法。
【請求項１４】
細胞変形狭窄部がマイクロ流体チャネル中にある、請求項１〜１３のいずれかに記載の送達方法
【請求項１５】
（ａ）細胞を、第一装置内のマイクロ流体チャネルに通し、次いで前記第一装置から除去し、第二装置内の電場と接触させる；又は
（ｂ）前記マイクロ流体チャネル及び前記電場が１つの装置内にある；
請求項１４に記載の送達方法。
【請求項１６】
マイクロ流体チャネル及び電場が１つの装置内にあり、細胞が細胞変形狭窄部を通過して連続流で前記場に進入し、
（ａ）細胞変形狭窄部を通過する前若しくは後に細胞が、一時的な摂動を介してペイロードを輸送するのに十分な強度を有する電場の一部に接触する又はそこを通過するか；あるいは 
（ｂ）細胞変形狭窄部を通過した後に細胞が、装置のゾーンに流入して留まり、そこで前記細胞が電場と接触する；
請求項１５に記載の送達方法。
【請求項１７】
細胞変形狭窄部の直径が、ペイロードが通過するのに十分なほど大きい細胞膜の一時的な摂動を誘発するように選択され、前記狭窄部の前記直径が、細胞の直径よりも小さい、請求項１〜１６のいずれかに記載の送達方法。
【請求項１８】
細胞変形狭窄部の直径が、そこを通る細胞の直径の約２０〜９９％である、請求項１〜１７のいずれかに記載の送達方法。
【請求項１９】
細胞変形狭窄部の直径が、約４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、４〜１０μｍ、又は１０〜２０μｍである、請求項１〜１８のいずれかに記載の送達方法。
【請求項２０】
（ａ）細胞変形狭窄部の長さが、約１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２４μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、１０〜４０μｍ、１０〜５０μｍ、又は１０〜６０μｍである；
（ｂ）細胞が、細胞変形狭窄部に進入する前に、約０．０００１秒、０．００１秒、０．００２秒、０．００３秒、０．００４秒、０．００５秒、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、０．００１〜０．００５秒、若しくは０．０００１〜１０秒電場と接触するか、又は細胞変形狭窄部を出てから約０．０００１秒、０．００１秒、０．００２秒、０．００３秒、０．００４秒、０．００５秒、１秒、２秒、３秒、４秒、５秒、６秒、７秒、８秒、９秒、１０秒、０．００１〜０．００５秒、又は０．０００１〜１０秒以内に電場と接触する；
（ｃ）電場に対する細胞の曝露時間が約１０〜５０ｍｓ、５０〜１００ｍｓ又は１０〜１００ｍｓである；
（ｄ）電場が直流パルス電流である；
（ｅ）電場をパルスする；
（ｆ）電場の強度又はパルス強度が約１〜３ｋＶ／ｃｍ又は０．１〜０．５ｋＶ／ｃｍ、０．１〜１ｋＶ／ｃｍ、０．１〜１．５ｋＶ／ｃｍ、０．１〜２ｋＶ／ｃｍ、０．１〜２．５ｋＶ／ｃｍ、若しくは０．１〜３ｋＶ／ｃｍである；
（ｇ）電場の強度又はパルス強度が、電気穿孔法単独で特定の細胞型に対する所与のペイロードに対して同じレベルの送達を達成するのに必要な強度よりも低い；
（ｈ）電場の強度又はパルス強度が、細胞を電気穿孔するのに必要な強度よりも約５０％、１〜５０％、５０〜９９％、若しくは１〜９９％低い；
（ｉ）細胞が複数の細胞であり、電場に通した後に、細胞の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９０〜９５％、若しくは８０〜１００％が生存可能である；
（ｊ）電場を、約０．１ｍｓの持続時間、１〜２０ｍｓ、０．１〜２０００ｍｓ、若しくは１〜２００ｍｓの周期でパルスする；
（ｋ）細胞を、約１００ｍｍ／ｓ、１７０ｍｍ／ｓ、３００ｍｍ／ｓ、１００〜３００ｍｍ／ｓ、２００〜７００ｍｍ／ｓ、２５０〜４００ｍｍ／ｓ、１００〜１０００ｍｍ／ｓ、若しくは１〜１０００ｍｍ／ｓの速度で電場に通す；
（ｌ）細胞膜の摂動が、約１〜２０ｎｍ、１〜６００ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ、１６ｎｍ、１８ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、若しくは６００ｎｍの最大直径を有する；及び／又は、
（ｍ）約１〜２０ｎｍ、１〜６００ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ、１６ｎｍ、１８ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、若しくは６００ｎｍの最大直径を有する細胞膜の摂動が、細胞膜上において、少なくとも約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、若しくは１〜１０分間持続する；
請求項１〜１９のいずれかに記載の送達方法。
【請求項２１】
（ａ）約１０〜１００ｐｓｉの圧力を用いて細胞懸濁液をマイクロ流体チャネルに通す；
（ｂ）細胞を、約３００ｍｍ／ｓ、１００〜３００ｍｍ／ｓ、２００〜７００ｍｍ／ｓ、２５０〜４００ｍｍ／ｓ、１００〜１０００ｍｍ／ｓ、若しくは１〜１０００ｍｍ／ｓの速度でマイクロ流体チャネルに通す；及び／あるいは、
（ｃ）マイクロ流体チャネルが、単一の細胞変形狭窄部を有するか、又はマイクロ流体チャネルが、並列及び／若しくは直列の複数の細胞変形狭窄部を有する；
請求項１４〜２０のいずれかに記載の送達方法。