(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿を３０〜４０℃の範囲の温度で３〜１２時間加温処理し次いで凍結乾燥することを特徴とする、凍結乾燥血漿の製造方法。
【請求項２】
凍結乾燥血漿が血液凝固検査の対照として使用される請求項１に記載の凍結乾燥血漿の製造方法。
【請求項３】
請求項１の方法で製造された凍結乾燥血漿。
【請求項４】
３７℃で測定される、トロンボテスト凝固時間において、精製水で再生８時間後の変化率が初期値の±５％以内である請求項３に記載の凍結乾燥血漿。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、凍結乾燥血漿およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、凍結乾燥血漿を精製水で再生した後の、トロンボテスト凝固時間の経時変化が安定な凍結乾燥血漿およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液凝固検査の項目には、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、フィブリノーゲン濃度定量、トロンボテスト（ＴＴ）、ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）などがあることが知られている。臨床現場では、それらの検査が精度よくなされているかどうかを点検するために、ある既知の凝固能を有する検体を対照として時々測定し、その測定値が変わっていないかを確認しながら、被検体を検査するのが一般的である。通常、正常の凝固能を有する検体と異常の凝固能を有する検体とを準備し、両方の凝固能を測定し、血液凝固検査の精度管理がなされている。そのような目的で使用される検体は一般的に、管理血漿と呼ばれている。このような管理血漿は、検査結果の施設間差、凝固分析システム間差の把握と検査結果の標準化のためにも使用されている。
【０００３】
管理血漿として、主に凍結血漿あるいは凍結乾燥血漿が用いられているが、保存が容易であることや取り扱いが簡便であることから、市販の凍結乾燥血漿が広く使用され、普及している。市販の管理血漿の中には、正常の凝固能を有する血漿（以下、正常域管理血漿という）および異常の凝固能を有する血漿（以下、異常域管理血漿という）がある。
【０００４】
正常域管理血漿は、正常の凝固能を有する血漿をプールし、それを凍結乾燥したものが市販されている。また、異常域管理血漿は、プールした正常血漿を異常の凝固能を有する血漿に加工したものを凍結乾燥したもの、あるいは、ある一定の異常の凝固能を有する血漿をプールし、該プール血漿を凍結乾燥したものが市販されている。プールした正常血漿を異常の凝固能を有する血漿に加工する方法としては、希釈による凝固因子含有率の低減あるいは硫酸バリウム処理による凝固因子の除去等の方法が知られている。このような管理血漿の凍結乾燥品の製造方法には、特開昭５１−９１３１０号公報に報告されている技術等が挙げられる。
【０００５】
管理血漿は、使用する目的上、ある一定時間、同じ凝固能を有することが必要である。
【０００６】
例えば、２〜８℃で６〜８時間安定した測定値を示すものが多く市販されている。市販されている管理血漿のうち、血漿を加工せず、ある一定の凝固能（正常あるいは異常）を有する血漿をプールし、それを凍結乾燥した血漿については、精製水で再生後の測定値は、前述に示したどの検査項目についても安定した測定値を示すことが知られている。しかしながら、正常血漿を加工した血漿（正常、異常とも）を凍結乾燥したものについては、多くの場合、精製水で再生した後、他の測定項目では安定な測定値が得られるものの、トロンボテスト（ＴＴ）の測定値については変動することがわかっている。具体的には、凝固時間が短縮する方向に変動し、再生直後に測定した凝固時間と数時間後に測定した凝固時間が乖離してしまう現象が見られる。
【０００７】
前述の理由から、トロンボテスト（ＴＴ）検査の精度管理には、ある一定の凝固能（正常あるいは異常）を有する血漿をプールし、それを凍結乾燥した血漿の使用が推奨される。しかしながら、ある一定の凝固能を有する血漿（特に、異常血漿）を入手することは容易ではなく、そのため市販されているそれらの血漿はかなり高価なものとなっている。実際の臨床現場では、比較的安価な、正常血漿を加工して製造した凍結乾燥血漿が使用されている。前述のように、再生直後に測定した凝固時間と数時間後に測定した凝固時間とが異なるので、実際の使用方法としては、該凍結乾燥品を再生した直後に測定したり、再生してから測定までの時間を定めるなどの処置が取られている。しかし精度管理の際にこのような制約を受けることは好ましい状態とは言えず、該血漿を管理血漿として用いるには非常に不都合である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、正常血漿から、精製水で再生した後のトロンボテスト凝固時間の経時変化が抑制された凍結乾燥血漿を製造する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、上記本発明方法により製造された凍結乾燥血漿を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を行なった結果、凍結乾燥前の血漿に対して特定の加温処理を行なうことにより、精製水で再生した後のトロンボテスト凝固時間の経時変化が極めて効果的に安定することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の上記目的および利点は、本発明によれば、第１に、血漿を３０〜４０℃の範囲の温度で３〜１２時間加温処理し次いで凍結乾燥することを特徴とする、凍結乾燥血漿の製造方法によって達成される。
【００１３】
本発明の上記目的および利点は、第２に、本発明の上記製造法により製造された凍結乾燥血漿、好ましくは３７℃で測定される、トロンボテスト凝固時間において、精製水で再生８時間後の変化率が初期値の±５％以内である凍結乾燥血漿によって達成される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明で原料として用いられる血漿は、ヒト由来の血漿であり抗凝固剤としてクエン酸塩あるいはシュウ酸塩が添加された、血液凝固検査を目的とした血漿である。血液の採血方法および血球成分の分離方法は一般の凝固検査検体を採取する際に用いられる公知の手法で行なうことができる。また、血漿を目的とする凝固活性に人為的に調整する場合は、バリウム塩（好ましくは硫酸バリウム）によって血漿中の血液凝固因子を吸着除去する公知の方法が使用できる。
【００１５】
本発明では凍結乾燥前の血漿を、３０〜４０℃の範囲の温度で加温処理を行なう。この加温温度が３０℃未満である場合は、加温処理によるトロンボテスト凝固時間の安定化効果を発揮する凍結乾燥血漿を得ることができない。一方、温度が４０℃を超える場合は温度が高すぎて血漿中の血液凝固因子の一部が失活してしまい、結果として元々の凝固時間を延長させ、管理血漿としての機能が損なわれる可能性があるため不適当である。
【００１６】
また、本発明において血漿の加温時間は、好ましくは３〜１２時間である。この加温時間が３時間未満の場合は、加温処理によるトロンボテスト凝固時間の安定化効果を発揮する凍結乾燥血漿を得ることができない。また、１２時間を超える場合は血漿の凝固時間そのものを延長させてしまうため適当ではない。
【００１７】
血漿の加温処理の方法は特に限定されないが、好ましくはウォーターバスを使用し、加温する血漿に温度勾配ができないように緩やかに攪拌させながら加温処理を行なう方法が好ましい。
【００１８】
本発明で用いられる血漿の凍結乾燥方法は特に限定されず、公知の方法が使用できる。即ち、血漿中に添加する凍結乾燥保護剤は公知のものが使用でき、好ましくはグリシンに代表されるアミノ酸類、グリシルグリシンの添加（特開平２−７５９５３号公報参照）等が挙げられる。次いで血漿に前述した加温処理を施し、その血漿をシリコン処理されたガラス容器またはそれに相当する合成樹脂容器に充填し、凍結後、凍結乾燥を行なう。
本発明の凍結乾燥後の血漿は真空状態で保存し、再生する際は同量の精製水で復元してから使用する。
【００１９】
また、ガラス表面との接触活性化により血漿の凝固活性が増大するのを防止するため、本発明の実施全般において、ガラス器具の使用および血漿との接触は避けるようにし、プラスチック容器を使用することが好ましい。このようにして、再生後のトロンボテスト凝固時間の経時変化が抑制された凍結乾燥血漿を提供することができる。
【００２０】
本発明の凍結乾燥血漿は、好ましくは、３７℃で測定される、トロンボテスト凝固時間において精製水で再生８時間後の変化率が初期値の±５％以内であるという特性を有する。
【００２１】
【実施例】
本発明をさらに具体的に説明するために以下実施例および比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
まず、健常者から採取したヒト由来４％クエン酸ナトリウム加血漿（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｉｎｃ．製）１５ｍｌに、グリシルグリシン（和光純薬製）を最終濃度が１％になるように添加し、よく攪拌し溶解した。次いで、３種類の凝固異常度の異なる血漿（正常血漿（以下、Ｌ１血漿という）、中等度異常血漿（以下、Ｌ２血漿という）、高等度異常血漿（以下、Ｌ３血漿という））を調製するために、上記の健常者由来の血漿に対し硫酸バリウムによる凝固因子吸着処理を行なった。具体的には、該血漿１０ｍｌに対し１．７５ｇの硫酸バリウム粉末を添加し１時間激しく攪拌させ、その後３，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離を行ない、上清のバリウム吸着血漿を取得した。さらに、該バリウム吸着血漿と元の健常者血漿とをＬ１血漿については、２５：７５の混合比で混ぜ合わせ、また、Ｌ２血漿については、８０：２０の混合比で混ぜあわせ、Ｌ３血漿については、９５：５の混合比で混ぜ合わせ、凝固異常度の異なる３種類の血漿を調製した。次に、これらの３種類の血漿に対し、ウォーターバス内で３７℃、６時間の加温処理をした。そして、加温処理を施した後、シリコン処理したガラス容器にそれぞれ０．５ｍｌずつ充填し、−４０℃で凍結した。その後、これらの血漿を凍結乾燥し、真空状態で密栓した。
【００２２】
このようにして作製した凍結乾燥血漿について、精製水で再生した後のトロンボテスト凝固時間を経時的に０時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後と測定した。その結果を表１および図１に示す。
【００２３】
なお、トロンボテスト凝固時間は次のとおり測定した。
【００２４】
３７℃で３分間予備加温した血漿１５μｌに、３７℃に加温したトロンボテスト測定試薬（国際試薬社製、複合因子Ｔコクサイ）１２５μｌを添加して凝固反応を開始し、凝固するまでの秒数を測定した。測定機種はＫＣ１０Ａ  ｍｉｃｒｏ（アメルング社製）を使用した。また、凍結乾燥血漿を精製水で再生した後１５分間静置し、１５分後を０時間として測定を開始した。再生した血漿は測定時以外は冷蔵保存した。
【００２５】
表１および図１に示すように、すべての凝固レベルにおいて、トロンボテスト凝固時間の変動幅は初期値の±５％以内の範囲で安定していた。
【００２６】
【表１】
0003712989.tif 000002
【００２７】
参考例１
市販されている凍結乾燥血漿Ａについて、実施例１と同様の実験を行なった。その結果を表２および図２に示す。
【００２８】
市販品Ａの測定結果では、特に中等度異常血漿および高等度異常血漿で凝固時間が経時的に短縮し、最大で２０％以上初期値に比べて凝固時間が変動した。
【００２９】
【表２】
0003712989.tif 000003
【００３０】
参考例２
市販されている凍結乾燥血漿Ｂについて、実施例１と同様の実験を行なった。その結果を表３および図３に示す。
【００３１】
市販品Ｂの測定結果では、特に正常血漿および中等度異常血漿で凝固時間が経時的に短縮し、最大で２０％以上初期値に比べて凝固時間が変動した。
【００３２】
【表３】
0003712989.tif 000004
【００３３】
比較例１
まず、健常者から採取したヒト由来４％クエン酸ナトリウム加血漿（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｉｎｃ．製）１５ｍｌに、グリシルグリシン（和光純薬製）を最終濃度が１％になるように添加し、よく攪拌し溶解した。次いで、３種類の凝固異常度の異なる血漿（正常血漿（以下、Ｌ１血漿という）、中等度異常血漿（以下、Ｌ２血漿という）、高等度異常血漿（以下、Ｌ３血漿という））を調製するために、上記の健常者由来の血漿に対し硫酸バリウムによる凝固因子吸着処理を行なった。具体的には、該血漿１０ｍｌに対し１．７５ｇの硫酸バリウム粉末を添加し１時間激しく攪拌させ、その後３，０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離を行ない硫酸バリウムを除去した上で、上清のバリウム吸着血漿を取得した。さらに、該バリウム吸着血漿と元の健常者血漿とを、Ｌ１血漿については２５：７５の混合比で混ぜ合わせ、Ｌ２血漿については８０：２０の混合比で混ぜあわせ、Ｌ３血漿については９５：５の混合比で混ぜ合わせることで、凝固異常度の異なる３種類の血漿を調製した。次に、これらの３種類の血漿に対し、加温処理せずそのまま、シリコン処理したガラス容器にそれぞれ０．５ｍｌずつ充填し、−４０℃で凍結した。その後、これらの血漿を凍結乾燥し、真空状態の中に密栓した。
【００３４】
このようにして作製した凍結乾燥血漿について、精製水で再生した後のトロンボテスト凝固時間を経時的に０時間後、１時間後、４時間後、６時間後、８時間後と測定した。その結果を表４および図４に示す。尚、トロンボテスト凝固時間は次のとおり測定した。
【００３５】
３７℃で３分間予備加温した血漿１５μｌに、３７℃に加温したトロンボテスト測定試薬（国際試薬社製、複合因子Ｔコクサイ）１２５μｌを添加して凝固反応を開始し、凝固するまでの秒数を測定した。測定機種はＫＣ１０Ａ  ｍｉｃｒｏ（アメルング社製）を使用した。また、凍結乾燥血漿を精製水で再生した後１５分間静置し、１５分後を０時間として測定を開始した。再生した血漿は測定時以外は冷蔵保存した。
【００３６】
表４および図４に示すように、特に中等度異常血漿および高等度異常血漿で凝固時間が経時的に短縮し、最大で１６％以上初期値に比べて凝固時間が変動した。
【００３７】
【表４】
0003712989.tif 000005
【００３８】
【発明の効果】
本発明の製造方法により、精製水で再生後のトロンボテスト凝固時間の経時変化が安定した凍結乾燥血漿を製造することが可能になり、それを血液凝固検査用の管理血漿として提供することができる。再生後のトロンボテスト凝固時間の安定性が確保されることで、トロンボテスト測定の精度管理作業がより容易になり、また測定データの信頼性を向上させることができるので、施設間のデータの互換性を高めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた凍結乾燥血漿についてのトロンボテスト凝固時間の経時変化を示すグラフ。
【図２】市販凍結乾燥血漿についてのトロンボテスト凝固時間の経時変化を示すグラフ。
【図３】他の市販凍結乾燥血漿についてのトロンボテスト凝固時間の経時変化を示すグラフ。
【図４】比較例１で得られた凍結乾燥血漿についてのトロンボテスト凝固時間の経時変化を示すグラフ。
【符号の説明】
ａ：正常血漿
ｂ：中等度異常血漿
ｃ：高等度異常血漿
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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