(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチド、またはリガンド／レセプター結合活性または当該ICAM−Ｒポリペプチドに特異的な免疫学的特性を有し、かつ配列番号:1に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする、ことを特徴とする精製および単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
DNAである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記DNAが、cDNAまたはその生物学的複製物、ゲノミックDNAまたはその生物学的複製物、およびその全部または一部が化学的に合成されたDNAまたはその生物学的複製物からなるグループから選択される請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記DNAが、内因性発現調節DNA配列をさらに含む請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
リガンド／レセプター結合活性または配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドに特異的な免疫学的特性を有するポリペプチドをコードし、かつ配列番号:2に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、発現調節DNA配列に機能的に結合している請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
プラスミドpCDNA−ｌ−neo−ICAM−Ｒである請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれかに記載のポリヌクレオチドによって安定的に形質転換または形質変換された宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチド、またはリガンド／レセプター結合活性または当該ICAM−Ｒポリペプチドに特異的な免疫学的特性を有し、かつ配列番号:1に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドの製造方法であって、当該方法が、以下の工程、すなわち；
請求項10に記載の宿主細胞を栄養培地で生育し、および
当該宿主細胞または当該栄養培地から当該ポリペプチドを単離する、
工程を含む、ことを特徴とするポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチド、またはリガンド／レセプター結合活性または当該ICAM−Ｒポリペプチドに特異的な免疫学的特性を有し、かつ配列番号:1に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる精製および単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列の第29位〜第518位、第１位〜第518位、第１位〜第482位および第456位〜第518位の連続するアミノ酸から構成される四つのペプチド断片の内の少なくとも一つのペプチド断片を含む請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列の第１位〜第90位、第91位〜第187位、第188位〜第285位、第286位〜第387位および第388位〜第481位の連続するアミノ酸から構成される五つのペプチド断片の内の少なくとも一つのペプチド断片を含む請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列の第24位〜第71位、第28位〜第67位、第110位〜第161位、第212位〜第265位、第307位〜第346位および第394位〜第433位の連続するアミノ酸から構成される六つのペプチド断片の内の少なくとも一つのペプチド断片を含む請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
水溶性ポリペプチドである請求項12に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記水溶性ポリペプチドが、配列番号:1に記載のアミノ酸配列の第１位〜第456位または第482位〜第518位の連続するアミノ酸から構成されるペプチド断片を含む請求項16に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項１９】
ヒト型化抗体である請求項18に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
請求項18または19に記載のモノクローナル抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体が、26E3D−１（ATCC HB 11053）、26I18F−２（ATCC HB 11054）、26I10E−２（ATCC HB 11055）、26H11C−２（ATCC HB 11056）、42C5H（ATCC HB 11235）、42D9B（ATCC HB 11236）、43H7C（ATCC HB 11221）、46D7E（ATCC HB 11232）、および46I12H（ATCC HB 11231）、からなるグループから選択されたハイブリドーマ細胞系から産生される請求項18または19に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドとの結合に際して、請求項18または19に記載のモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体。
【請求項２３】
VLSAGGSLFV（配列番号:26）またはLSAGGSLFVN（配列番号:27）のアミノ酸配列からなるエピトープを認識する請求項18または19に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２４】
ICAM−Ｒポリペプチドで調節された細胞凝集または免疫応答において、ICAM−Ｒポリペプチドで調節されたエフェクター機能を阻害または低減する請求項18または19に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
ICAM−Ｒポリペプチドで調節された細胞凝集または免疫応答において、ICAM−Ｒポリペプチドで調節されたエフェクター機能を強化または刺激する請求項18または19に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２６】
請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
【請求項２７】
前記ハイブリドーマ細胞系が、26E3D−１（ATCC HB 11053）、26I18F−２（ATCC HB 11054）、26I10E−２（ATCC HB 11055）、26H11C−２（ATCC HB 11056）、42C5H（ATCC HB 11235）、42D9B（ATCC HB 11236）、43H7C（ATCC HB 11221）、46D7E（ATCC HB 11232）、および46I12H（ATCC HB 11231）、からなるグループから選択される請求項26に記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項２８】
ICAM−Ｒポリペプチドによるリガンド／レセプター結合活性の調節作用を検定するためのキットであって、請求項18または19に記載のモノクローナル抗体と配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドとを含む、ことを特徴とする検定用キット。
【請求項２９】
前記リガンド／レセプター結合活性を阻害する調節作用を検定するための請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
前記リガンド／レセプター結合活性を刺激する調節作用を検定するための請求項28に記載のキット。
【請求項３１】
特異的免疫系の調節が必要なヒト以外の哺乳類に対して、免疫細胞活性およびその増殖を増進させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ことを特徴とするヒト以外の哺乳類の特異的免疫系を調節する方法。
【請求項３２】
免疫細胞活性およびその増殖を増進させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする哺乳類の特異的免疫系調節剤。
【請求項３３】
特異的免疫系の調節が必要なヒト以外の哺乳類に対して、免疫細胞活性およびその増殖を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ことを特徴とするヒト以外の哺乳類の特異的免疫系を調節する方法。
【請求項３４】
免疫細胞活性およびその増殖を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする哺乳類の特異的免疫系調節剤。
【請求項３５】
非特異的免疫系の調節が必要なヒト以外の哺乳類に対して、免疫細胞活性およびその増殖を増進させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ことを特徴とするヒト以外の哺乳類の非特異的免疫系を調節する方法。
【請求項３６】
免疫細胞活性およびその増殖を増進させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする哺乳類の非特異的免疫系調節剤。
【請求項３７】
非特異的免疫系の調節が必要なヒト以外の哺乳類に対して、免疫細胞活性およびその増殖を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ことを特徴とするヒト以外の哺乳類の非特異的免疫系を調節する方法。
【請求項３８】
免疫細胞活性およびその増殖を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする哺乳類の非特異的免疫系調節剤。
【請求項３９】
特異的免疫系の応答に由来する炎症の治療を必要とするヒト以外の哺乳類に対して、炎症を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ことを特徴とするヒト以外の哺乳類の特異的免疫系の応答に由来する炎症を治療する方法。
【請求項４０】
特異的免疫系の応答に由来する炎症の治療を必要とする哺乳類の炎症を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする哺乳類の特異的免疫系の応答に由来する炎症の治療剤。
【請求項４１】
非特異的免疫系の応答に由来する炎症の治療を必要とするヒト以外の哺乳類に対して、炎症を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を投与する工程を含む、ことを特徴とするヒト以外の哺乳類の非特異的免疫系の応答に由来する炎症を治療する方法。
【請求項４２】
非特異的免疫系の応答に由来する炎症の治療を必要とする哺乳類の炎症を抑制させるに十分な量の請求項18または19に記載のモノクローナル抗体を含む、ことを特徴とする哺乳類の非特異的免疫系の応答に由来する炎症の治療剤。
【請求項４３】
ICAM−Ｒ関連疾患状態をモニターする方法であって、以下の工程、すなわち；
▲１▼  配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドの断片である可溶性ICAM−Ｒポリペプチド断片をヒト以外の動物の血清から検出および定量し、および
▲２▼ 得られた定量値と、ICAM−Ｒポリペプチド関連疾患状態にない対照のヒト以外の動物での当該ICAM−Ｒポリペプチド断片の血清定量値とを比較する、
工程を含む、ことを特徴とするICAM−Ｒ関連疾患状態をモニターする方法。
【請求項４４】
前記定量工程▲１▼が、以下の工程、すなわち；
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドの第一エピトープに特異的な第一モノクローナル抗体をヒト以外の動物の血清に接触させ、
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドの第二エピトープに特異的な第二モノクローナル抗体を当該第一モノクローナル抗体と結合したICAM−Ｒポリペプチド断片に接触させ、および
結合した第二モノクローナル抗体を定量する、
工程を含む請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記第二モノクローナル抗体が、検出可能な標識を具備している請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドをコードする検出可能なポリヌクレオチドと細胞のRNAとをハイブリダイズさせる工程を含む、ことを特徴とする細胞によるICAM−Ｒポリペプチドの合成能力を検出する方法。
【請求項４７】
細胞が産生したポリペプチドと請求項18または19に記載のモノクローナル抗体とを反応させる工程を含む、ことを特徴とする細胞によるICAM−Ｒポリペプチドの合成能力を検出する方法。
【請求項４８】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的なアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項４９】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチド、またはリガンド／レセプター結合活性または当該ICAM−Ｒポリペプチドに特異的な免疫学的特性を有し、かつ配列番号:1に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを具備したアミノ末端、および免疫グロブリンＨ鎖および／またはその対立性変異体の不変領域を具備したカルボキシ末端を含む、ことを特徴とするハイブリッド融合ポリペプチド。
【請求項５０】
請求項49に記載のハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５１】
配列番号:1に記載のアミノ酸配列からなるICAM−Ｒポリペプチド、またはリガンド／レセプター結合活性または当該ICAM−Ｒポリペプチドに特異的な免疫学的特性を有し、かつ配列番号:1に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを具備したアミノ末端、および非ICAM−Ｒポリペプチド細胞接着性分子の一部を具備したカルボキシ末端を含む、ことを特徴とするハイブリッド融合ポリペプチド。
【請求項５２】
請求項51に記載のハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
本願出願は、1992年１月27日出願の係属中の米国特許出願第07/827,689号の一部継続出願である、1992年５月26日出願の係属中の米国特許出願第07/889,724号の一部継続出願である、1992年６月５日出願の係属中の米国特許出願第07/894,061号の一部継続出願である。
発明の技術分野
本発明は、一般に細胞接着分子に関し、具体的には、ヒト細胞間接着分子のICAM−１およびICAM−２と構造上の関連性を有する新規の「ICAM−Ｒ」と称するヒトポリペプチドをコードするDNAのクローニングおよび発現に関する。
発明の背景
この10年間における研究によって、体の細胞間の相互作用に関する現象、特に、免疫系における細胞の挙動および活性化に関する現象が解明されてきた。一般には、Springer,Nature,346:425−434（1990）を参照のこと。細胞表面タンパク質、および、特に所謂細胞接着分子（"CAMs"）は、相応じて、炎症部位への白血球溢出および別異の標的組織への白血球の動きのプロセスに介入することを目的とした製薬学的研究および開発のテーマとなっていた。細胞接着分子の単離および特徴、このような分子をコードするDNAのクローニングおよび発現、さらには炎症プロセス、ウイルス感染およびガン転移に関する治療薬および診断薬の開発もまた、多くの米国および外国特許出願のテーマとなっている。Edwards,Current Opinion in Therapeutic Patents,1（11）:1617−1630（1991）およびその中で引用されている発行済「参考特許文献」を参照のこと。
本願発明の技術背景における重要事項は、細胞接着の特定の媒介体、すなわち、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、および顆粒球上に存在するヘテロダイマー「インテグリン」細胞表面タンパク質のサブファミリーを形成する「ロイコインテグリン」、LFA−１、MAC−１およびgp150.95（WHOの命名法によると、CD18/CD11a、CD18/CD11b、およびCD18/CD11cとそれぞれ称される）の一刻も早い同定および特徴づけである。例えば、前出のSpringerの文献第429頁の表１を参照のこと。さらに、炎症プロセスに観られる現象である白血球の活性化、接着、運動性等に影響を与える他の一本鎖接着分子（CAMs）も重要事項である。例えば、現在、炎症プロセスに固有の白血球溢出に先がけて、白血球上で構造的に発現しているインテグリンの活性化が起こり、次に、インテグリン（例えば、LFA−１）と血管内皮細胞表面上および他の白血球にて発現されるICAM−１およびICAM−２と称されている二つの相異なる細胞間接着分子（ICAMs）の一方あるいは両方との間に堅固なリガンド／レセプター相互作用が生じると考えられている。
今日までに特徴付けられている他のCAM（例えば、1990年11月15日に発行されたPCT WO 90/13300に開示された管接着分子（VCAM−１）；およびNewmanら、Science、247:1219−1222（1990）および1991年７月25日に発行されたPCT WO 91/10683に開示された血小板内皮細胞接着分子（PECAM−１））と同様に、ICAM−１およびICAM−２は、他の免疫グロブリン遺伝子上科と、それぞれの細胞外部分が類似のカルボキシ末端基を有する領域の連続からなるという点で、構造的に相同である。「典型的な」免疫グロブリン様領域は、通常、それぞれの末端の二つのシステイン間のジスルフィド結合によって固定されているループ構造を含んでいる。ICAM−１は、五つの免疫グロブリン様領域を含んでおり；細胞分布の点でICAM−１と異なるICAM−２は、このような領域を二つ含んでおり;PECAM−１は六つ含んでおり;VCAMは、接合の多様性、その他によって、六つあるいは七つを含んでいる。さらに、CAMsは、典型的には、細胞表面の分子の配向に関係していると考えられる疎水性「経膜的」領域およびカルボキシ末端「細胞質」領域を含んでいる。CAMsの機能的配置のグラフィックモデルでは、一般的に、細胞の細胞質にまで伸長している細胞質「テール」と、細胞表面から外側に向けて伸長している１つ以上の免疫グロブリン様ループによって、経膜的領域に固定されている分子が認められる。
ヒト・ライノウイルスに結合するためのICAM−１の能力を前提とする用途を含んだ、細胞間接着分子の様々な治療上の使用が計画されてきた。例えば、1992年１月29日に発行された欧州特許出願第468 257 A号は、リガンド／レセプター結合活性、特に、ウイルス、リンパ球関連抗原およびプラスモディウム・ファルシパラム（Plasmodium falciparum）のような病原体への結合する際の結合活性が向上するものと提案された（全長および切断型分子形態を含む）ICAM−１の様々な配座および形態の改良について述べている。
同様にして、細胞間接着分子に免疫学的に関連しているタンパク質の様々な使用が考案されてきた。例えば、1991年11月14日に発行されたWO 91/16928には、ヒト型化されたキメラ抗ICAM−１抗体、および特異的および非特異的炎症、ウイルス感染、および喘息の治療におけるその使用について述べている。抗ICAM−１抗体およびその断片は、菌体内毒ショックの治療に有効である旨が、1992年３月19日に発行されたWO 92/04034に述べられている。抗ICAM−１抗イディオタイプ抗体および抗体断片によるICAM−１依存型炎症反応の阻害が、1992年４月16日に発行されたWO 92/06119に述べられている。
ICAM−１のような細胞間接着タンパク質およびLFA−１のようなリンパ球相互作用性インテグリンの同定および特徴づけによって得られた細胞接着現象の基本的な洞察にもかかわらず、その全容解明は程遠い。一般的には、炎症のプロセスおよび標識付けられたリンパ球の生体内における挙動には、多くの他のタンパク質が関与していると考えられている。ごく最近になって、例えば、Springerおよび彼の共同研究者等は、LFA−１の第三のカウンターレセプターの存在を予想し［de Fougerollesら、J.Exp.Med.,174:253−267（1991）］、次いで、「ICAM−３」と称する「第三の」ICAMリガンドを免疫沈降することに成功したことを報告した［de Fougerollesら、J.Exp.Med.,175:185−190（1992）］。この分子は、可溶性のLFA−１に結合し、休止リンパ球、単球、および好中球によって高度に発現される。しかしながら、ICAM−１およびICAM−２とは異なり、この新しいリガンドは、内皮細胞によって発現されることは認められていない。Ｎ−グリアナーゼ処理によって、分子量が約87,000にまで落ちることから、免疫沈降された生産物が約124,000の分子量を有し、高度にグリコシル化されていることは明らかである。さらにもっと最近になって、別の研究グループも、同様に「ICAM−３」と称するLFA−１のカウンターレセプターのcDNA配列を記載した［Fawcettら、Nature,360:481−484（1992）を参照のこと］。
したがって、当該技術分野では、ヒトの細胞間の相互作用に関与するさらなるタンパク質、特に、そのタンパク質のアミノ酸配列を特異的に同定しかつ特徴づけるのに役立つ情報が望まれている。さらに、そのような分子が治療薬および診断薬の開発の基礎を形成し得る程度に、それらをコードしているDNAが解明されることが必須である。そのような根本的な情報は、とりわけ、タンパク質の大量生産に役立ち、タンパク質を天然に産生する細胞の同定を促し、そして抗体物質あるいはそれらと特異的に結合する他の新規な結合タンパク質および／または関与するリガンド／レセプター結合反応を抑制する他の新規な結合タンパク質の調製を可能にする。
発明の要旨
一つの態様において、、本発明は、新規なヒトポリペプチド「ICAM−Ｒ」およびICAM−Ｒに特異的な一つ以上のリガンド／レセプター結合生物学的活性および／または免疫学的特性を有する（断片および類似体を含む）その変異体をコードする精製・単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA配列およびそのRNA転写物）を提供する。ICAM−Ｒ特異的リガンド／レセプター結合生物学的活性には、ICAM−Ｒ細胞外ドメインおよび細胞質ドメインの両方と他の分子との（例えば、細胞間の接着および／あるいはジグナルトランスダクションのプロセスにおける）相互作用が含まれる。本発明の好ましいDNA配列には、ゲノムの配列およびcDNA配列ならびに全部あるいは部分的に化学合成されたDNA配列が含まれる。本発明のDNA配列の生物学的レプリカ（すなわち、in vivoあるいはin vitroで調製された単離されたDNA配列のコピー）も意図されてている。さらに、ICAM−Ｒを有するプラスミドおよびウィルスベクターのような、自律的に複製する組換え構築物、特に、ICAM−ＲあるいはICAM−Ｒ変異体をコードするDNAが、内因性あるいは外因性発現制御DNA配列に機能的に結合しているベクターもまた提供される。
本発明の他の態様によると、特に、原核細胞および真核細胞のような単細胞の宿主細胞が、所望のポリペプチドを発現できるように、本発明のDNA配列で安定的に形質転換される。このようなICAM−ＲおよびICAM−Ｒ変異体生産物を発現する宿主細胞は、様々な有用な目的に役立つ。発現した生産物が宿主細胞の表面に「現れる」程度に、細胞は、ICAM−ＲおよびICAM−Ｒ変異体と特異的に免疫反応する抗体物質の誘起のための有用な免疫原を構成し得る。本発明の宿主細胞は、適当な培養培地中で細胞を生育し、所望のポリペプチド生産物が細胞あるいは細胞が生育していた培地から単離する、ICAM−ＲおよびICAM−Ｒ変異体の大量生産の方法に非常に有用である。
本発明の新規なICAM−ＲおよびICAM−Ｒ変異体生産物は、天然の細胞源から得ることができるが、好ましくは、本発明の宿主細胞が関与する組換え操作によって産生される。生産物は、組換え生産および／あるいは単離後調製作業のために選択された宿主細胞によって、完全にあるいは部分的にグリコシル化された状態、部分的にあるいは完全に脱グリコシル化された状態、またはグリコシル化されていない状態で得られる。
本発明の生産物は、本明細書の配列番号:1の−29から518までのアミノ酸残基の配列を有する単量体および多量体ポリペプチドを含む。以下に詳しく説明するように、この配列は、「成熟」タンパク質配列に先立つ、−29から−１にわたる残基の推定シグナルあるいはリーダー配列を含み、この配列の後に、順番に、五つの推定免疫グロブリン様領域（それぞれ、残基１から90、91から187、188から285、286から387、および388から約456）、残基約457から約481に伸びる疎水性「経膜的」領域、およびカルボキシ末端で残りのポリペプチドを構成する「細胞質」領域がある。アミノ酸組成に基づいて、グリコシル化あるいは他の翻訳後修飾が欠如している成熟タンパク質の分子量の計算値は、約52,417である。本発明のICAM−Ｒ変異体は、上記した一つ以上の領域を含む水に可溶性のICAM−Ｒ断片および不溶性のICAM−Ｒ断片を含み、さらに、一つ以上のアミノ酸が下記したような欠損あるいは置換を有するポリペプチド類似体を含むものである：（１）損失なしで、好ましくは、ICAM−Ｒの１つ以上の生物学的活性あるいは免疫学的特性が強化されている；あるいは（２）特定のリガンド／レセプター結合機能が特異的に無力化されている。多量体の形成を促進する付加的なアミノ酸（例えば、リシンあるいはシステイン）残基を含む類似体ポリペプチドが、意図されている。
さらに、本発明では、ICAM−ＲあるいはICAM−Ｒ変異体に対する抗体物質（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体等）および他の結合タンパク質（例えば、特異的（すなわち、ICAM−Ｒが構造上関連しているICAM−１およびICAM−２細胞間接着分子と非反応性である）ポリペプチドおよびペプチド）もまた意図されている。抗体物質は、単離された天然あるいは組換えICAM−ＲあるいはICAM−Ｒ変異体、またはそのような生産物を表面に発現する細胞を用いて調製される。本発明において特に例示されている抗体は、郵便番号20852、メリーランド州、パークロウン、ロックビル12301に所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に、1992年６月２日に、受託番号HB11053、HB11054、HB11055、およびHB11056としてそれぞれ寄託された、26E3D−１、26I18F−２、26I10E−２、26H11C−２と称するハイブリドーマ細胞系;1992年12月16日にATCCに、受託番号HB11221として寄託された、43H7Cと称するハイブリドーマ細胞系;1993年１月15日にATCCに、受託番号HB11235およびHB11236としてそれぞれ寄託された、42C5Hおよび42D9Bと称するハイブリドーマ細胞系；および1993年１月７日にATCCに、受託番号HB11232およびHB11231としてそれぞれ寄託された、46D7Eおよび46I12Hと称するハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である。
結合タンパク質もまた、免疫のための組成物ならびに本発明のポリペプチドを精製するため、および表面上にこのポリペプチドが現れる細胞を同定するために有用である。これらのタンパク質はまた、ICAM−Ｒが関与するリガンド／レセプター結合生物学的活性、特に特異的および非特異的免疫系反応に関与するICAM−Ｒエフェクター機能を調節（すなわち、ブロッキング、阻害、あるいは刺激）するのに明らかに役立つ。抗ICAM−Ｒ抗体物質に特異的な抗イデオタイプ抗体およびそのような抗イデオタイプ抗体物質の免疫反応の調節における使用もまた目的とされている。細胞表面上および血清などの液体中のICAM−Ｒの検出および定量のための分析には、「サンドイッチ」分析様式における単一抗体物質あるいは多抗体物質が含まれる。
本発明のDNA配列およびアミノ酸配列の開示によってもたらされる情報の科学的価値は、明白である。一連の例としては、ICAM−ＲのcDNA配列の知識によって、ICAM−ＲをコードするゲノムのDNA配列のDNA/DNAハイブリダイゼーションによる単離、およびプロモーター、オペレーターなどのICAM−Ｒ発現制御調節配列の特定が可能となる。本発明のDNA配列を用いた厳重な条件下でのDNA/DNAハイブリダイゼーションによって、ICAM−Ｒの対立変異体をコードするDNAの単離、ICAM−Ｒに特異的な一つ以上の生物学的および／あるいは免疫学的特性が共通する構造的に関連のある他のタンパク質の単離、そして、ICAM−Ｒに類似する非ヒト種（例えば、囓歯動物）のタンパク質単離が期待される。本発明のDNAは、ICAM−Ｒを合成する細胞の能力を検出するためのDNA/RNAハイブリダイゼーション分析に有用である。さらに、本発明によって、通常ICAM−Ｒを発現する細胞によるICAM−Ｒの発現の調節に関連するアンチセンス・ポリヌクレオチドが入手できるようになる。他の一連の例としては、ICAM−ＲのDNA配列およびアミノ酸配列の知識によって、組換え手段による、ハイブリッド融合タンパク質（時々、「免疫接着体」と称する）などのICAM−Ｒ変異体の調製が可能になる。この変異体は、ICAM−Ｒタンパク質配列および免疫グロブリンＬ鎖不変領域および／またはヒンジ領域の存在により特徴づけられる。Caponら、Nature,337:525−531（1989）;Ashkenaziら、P.N.A.S.（USA）,88:10535−10539（1991）；および1989年４月６日発行のPCT WO 89/02922を参照のこと。ICAM−Ｒ変異体融合タンパク質はまた、例えば、選択されたICAM−Ｒの細胞外領域および他の細胞間接着分子の部分を含む。
本発明によって提供されるDNAおよびアミノ酸配列の情報により、ICAM−Ｒの構造および機能の系統的分析およびICAM−Ｒが細胞外および細胞内レベルで相互作用する分子の定義付けが可能になる。本発明の抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体のイディオタイプは、このような分子の例であり、天然の結合タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）を再現し得る。この天然の結合タンパク質を通じてICAM−Ｒ細胞間および細胞内活性が調節され、あるいは、このタンパク質によりICAM−Ｒ分子が細胞間および細胞内現象を調節する。あるいは、このタンパク質は、ICAM−Ｒ活性の新しいクラスのモジュレーターを意味する。抗イディオタイプの抗体もまた、生物学的に活性なICAM−Ｒ等価物の新しいクラスの例である。
【図面の簡単な説明】
本発明の多くの他態様および利点は、以下の詳細な説明、図面の説明を考慮すれば明らかである。
図１（ＡからＧ）は、ICAM−ＲをコードするHL60細胞由来の単離されたcDNAクローン挿入物（配列番号:2）およびその読取枠の推定アミノ酸（配列番号:1）を示す。
図２（ＡからＢ）は、ICAM−R DNAプローブおよびICAM−1 DNAプローブを用いた形質導入したＬ細胞のノーザンブロット・ハイブリダイゼーションの結果を示す棒グラフである。
図３（ＡからＦ）は、ICAM−R RNAプローブあるいはICAM−1 RNAプローブを用いた形質導入されたＬ細胞のインサイテュ・ハイブリダイゼーションの結果を示す顕微鏡写真である。
図４は、ICAM−Ｒ、ICAM−１、あるいはICAM−２に特異的なモノクローナル抗体を用いた形質導入Ｌ細胞の間接蛍光抗体染色のFACS分析の結果をヒストグラム様式で表している。
図５は、本発明の抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体のエピトープをマップするために用いられた三つのキメラICAM−Ｒタンパク質を表している。
図６（ＡからＢ）は、ICAM−R DNAプローブあるいはICAM−1 DNAプローブを用いた、ヒト白血球細胞系および臍の緒内皮細胞のアクチン標準化ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼーションの結果を表す棒グラフを示している。
図７（ＡからＢ）は、ICAM−Ｒに特異的なモノクローナル抗体を用いた、ヒト細胞系由来の溶解物の免疫沈降のウエスターン・ブロットの写真である。
図８（ＡからＧ）は、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体を用いた、様々なヒト組織の免疫組織学的染色の顕微鏡写真を表している。
図９（ＡからＢ）は、ヒト末梢血リンパ球の超抗原誘導増殖に対する抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体の影響を表す棒グラフである。
図10は、アロ抗原誘導Ｔ細胞増殖に対する抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体の影響を表す棒グラフである。
図11は、架橋した別々のICAM−ＲエピトープがICAM−Ｒの細胞骨格への結合に個々に影響することを表した棒グラフである。
詳細な説明
本発明について、ヒトHL60プロミエロサイト細胞（ATCC CCL240）由来のcDNAライブラリーから得られた、ICAM−Ｒをコードする全長のcDNAクローンの単離およびＬ細胞中でのICAM−Ｒの発現に関して、以下の実施例で説明する。より詳細には、実施例１は、ICAM関連DNAのPCR増幅のためのオリゴヌクレオチドプローブの設計および構築について述べている。実施例２は、ICAM−１およびICAM−２をコードするDNAと類似した、別個のゲノムのDNA断片を増幅するためのプローブの使用について述べている。実施例３は、さらなるICAM−Ｒコード配列を単離するためにゲノムの断片でcDNAライブラリーをスクリーニングすることについて述べている。実施例４は、ICAM−Ｒをコードする全長のヒトcDNAを単離するために、さらにcDNAライブラリーをスクリーニングすることについて述べている。実施例５は、ICAM−ＲのDNA配列およびアミノ酸配列の情報の特徴づけを行い、そしてICAM−１およびICAM−２とその構造との関連づけを行っている。実施例６は、ICAM−Ｒの囓歯類の類似体をコードするDNA配列の単離について記載している。実施例７は、ICAM−Ｒを発現する哺乳類の宿主細胞の調製に関する。実施例８は、ICAM−Ｒがβ−２インテグリン経路が関与する細胞間接着現象に関与し得ることを示す予備実験について記載している。実施例９は、ICAM−Ｒの可溶性変異体の構築および発現に関する。実施例10は、抗ICAM−Ｒ抗体の調製を記載している。実施例11は、本発明の抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体によって認識されるICAM−Ｒエピトープのマッピングに関する。実施例12、13および14は、ICAM−ＲポリペプチドおよびそれをコードするRNAの、正常細胞中、組織中および様々な細胞系中での分布および生物学的特徴付けの評価に関する。実施例15は、ホモタイプの細胞と細胞の接着におけるICAM−Ｒの関与に関する分析について記載している。実施例16は、ICAM−Ｒが免疫細胞活性化／増殖に関与していることを示す予備実験について述べている。実施例17は、ICAM−Ｒの細胞質領域の異なるリン酸化および細胞骨格結合を示す実験について記載している。
実施例１
各々のCAMsのセット（例えば、ICAM−１およびICAM−１）の核酸およびアミノ酸配列では、関連の新規遺伝子を単離するための、共通タイプのプローブのデザインに有用な情報を得るのに十分な分子間の保存が明らかにならなかった。したがって、細胞間接着分子をコードする未知のDNAを単離する試みの戦略の中心は、別個の様々な既知分子の推定DNA配列を表す縮重共通オリゴヌクレオチドの開発、そして、（既知のDNAに似ているが、同一ではない）中間体遺伝子配列のDNA複製物のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のためのプライマーとしてのこれらのオリゴヌクレオチドの使用を含むものであった。オリゴヌクレオチドプライマー設計の出発点は、ある種のCAMsの免疫グロブリン様ループを形成しているシステインを囲む領域中のアミノ酸がいくらか保存されていることに気付いたことであった。反応部位のアミノ末端側の配列が；
配列番号:3
Ｇ−Ｘ−Ｘ−（ＶまたはＬまたはＩ）−Ｘ−（ＶまたはＬまたはＩ）−Ｘ−Ｃ
であることが判明し、一方で、残基のカルボキシ末端側の配列が；
配列番号:4
Ｎ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｙ−Ｘ−Ｃ−Ｘ−（ＶまたはＡ）
が、典型的である。［Hunkapillerら、Nature,323:15−16（1986）;Williamsら、Ann.Rev.Immunol.,6:381−405（1988）；およびNewmanら、前出の文献を参照のこと。］これらの二つのアミノ酸部位は、それ自身では、一般的すぎて、共通の部位を持つであろう未知のDNAのためのプローブとして有用なオリゴヌクレオチドの変性セットの構築はできない。この問題を解決しようとする試みとして、個々のCAM配列が、上記のシスティン部位末端によって規定される領域のサブファイルに分類された。このサブファイルは、ヒト管接着分子（VCAM−１）の七つの領域、ヒト血小板内皮細胞間接着分子（PECAM−１）の六つの領域、ICAM−１の五つの領域、ICAM−２の二つの領域、ヒトミエログロビン関連グリコタンパク質およびヒト繊維芽細胞成長因子レセプター双方の四つの内の三つの領域、およびマウス神経細胞間接着分子（NCAM）の五つの領域のそれぞれに対して調製された。すべてのサブファイルはプールされ、システィン部位の周囲の共通配列を確かめることができるような配列の樹木図を提供する［Corpet,Nucleic Acids Research,16（22）:10881−10890（1988）］の「マルタリン」と称するマルチ配列相同性−コンピューターアルゴリズムを用いて、CAMの起源から独立的に分離された。アミノ末端のシスティン部位を示す共通配列は、
配列番号:5
Ｇ−Ｋ−（ＮまたはＳ）−（ＬまたはＦ）−Ｔ−（ＬまたはＩ）−（ＲまたはＥ）−Ｃ
と決定され、一方で、カルボキシ末端の共通配列は、
配列番号:6
（ＤまたはＥ）−（ＨまたはＤ）−（ＨまたはＧ）−（ＧまたはＨ）−（ＡまたはＲ）−Ｎ−Ｆ−Ｓ−Ｃ
と決定された。
部分的変性を解消するために、ヒトの好ましいコドンを取り入れ、推定アミノ末端部位から増幅するためのトップ・ストランドPCRプライマーを使用するために、三つの異なる変性オリゴヌクレオチドのセットで、計1152個のプローブを調製した。三つのプールの特定の変性配列は、IUPAC命名法に従って、以下の通りとなった。
配列番号:7
ATTCTGCAGGCAARAAYCTSACHMTBMGSTG
配列番号:8
ATTCTGCAGGCAARAGYTTYACHMTBGARTG
配列番号:9
ATTCTGCAGGCAARTCYTTYACHMTBGARTG
各プライマーは、増幅された生成物のクローニングを促進するために、Pst Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（CTGCAG）を含んでいた。
推定カルボキシ末端部位から増幅するためのボトム・ストランドプライマーとして、IUPAC命名法で下記のような768個のプローブが設計された。これら各プライマーは、増幅された生成物のクローニングを促進するために、Xba Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識部位（TCTAGA）を含んでいた。
配列番号:10
ATTTCTAGARAARTTRGCSCCRTGRTSRTC
配列番号:11
ATTTCTAGARAARTTSCKRTGSCCRTSKTC
オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムス社（Foster市、カリフォルニア州）製のモデル394 DNA自動合成機で、0.2マイクロモル・スケール合成プログラムに従って、β−シアノエチル作用によって合成した。次に、６時間以上、55℃で加熱して保護基を除去した。次に、オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、TE（10mM Tris、pH7.0、1mm EDTA）中で再水和し、そしてG25−150セファデックスで、サイズ排除クロマトグラフィーによりTE中で脱塩した。
実施例２
設計と合計に関して、実施例１に記載の二つのセットのプローブを、ICAM−１およびICAM−２の免疫グロブリン様ループ領域と同様の大きさのPCRで作成した断片を単離し、Bluescriptプラスミド（Stratagene社、LaJolla、カリフォルニア州）中にサブクローン化し、そして配列決定によって直接的に、ならびに順番にハイブリダイゼーションすることによって、ICAM−2 DNAに対する相同性を調べるために、ヒトゲノムDNA鋳型のPCR増幅の操作に用いた。断片の約55％（もちろん、変性プライマーの領域を除いて）が、ICAM−１あるいはICAM−２と同じであった。13−3C7と称する一つのサブクローンは、ICAM−１およびICAM−２のそれぞれの二番目の領域中の読取枠と同様のものを有していることが認められた。Geneデータバンク中に存在するどの既知の配列とも対応しなかった。サブクローン13−3C7の単離に至るまでの操作は、以下の通りであった。
末梢血白血球あるいはHela細胞から得られたヒトゲノムDNAを増幅させるために、変性オリゴヌクレオチドを最終濃度10μg/mlになるように、PCR反応液に混合した。DNA増幅は、PCR緩衝液（2mM MgCl2、25mM KCl、10mMトリスpH8.3）中で2mMデオキシヌクレオチドの存在下で行なわれた。94℃での４分間の変性の後、60゜にて２分間のアニーリング、72℃にて４分間の伸長、そして94℃にて１分間の変性を含むPCRのサイクルを30回行なった。約0.2kbに移動したDNAバンドを、６％ポリアクリルアミドゲルから電気溶出によって抽出し、Xba ＩおよびPst Ｉ制限酵素で消化し、そしてBluescriptベクター（Stratagene社）中にライゲーションした。このプラスミドを大腸菌のXL 1−ブルー株（Stratagene社）中にエレクトロポレーションし、コロニーをＸ−gal IPTG、カーベニシリン寒天プレート上で選択した。M13K07ヘルパーファージ（Stratagene社）、カーベニシリン、およびカナマイシンをそれぞれのコロニーの2ml培養液に加えた後、一本鎖鋳型を六つの白いコロニーから得た。配列分析のために、次に、DNA自動配列決定機器（Applied Biosystems）およびシークエナーゼ・キット（UCB Belgium）双方を用いたザンガー法により、一本鎖鋳型を配列決定した。184−185塩基対（bp）長の、ICAM−２と92％−95％相同性の四つの配列（クローン1.1、1.3、1.4、1.6）が得られた。さらに、ICAM−１様領域の読取枠中にフレームシフトを含む182bp長のDNA配列（クローン1.5）と、切断型免疫グロブリン様領域に対応する66bp DNA（クローン1.2）が得られた。
クローン1.6、1.5、1.2の配列を、次の試験に用いる三つのオリゴヌクレオチドプローブ（RM16、RM15、RM12）を設計するために用いて、先に単離されたクローンと高度に相同性のあるDNAを含むさらなるコロニーを考慮から外した。プローブRM16、RM15、およびRM12のプローブの配列は、以下の通りである。
プローブRM16（配列番号:12）
GAGACTCTGCACTATGAGACCTTCG
プローブRM15（配列番号:13）
CAGGTGATTCTCATGCAGAGTCCAGG
プローブRM15（配列番号:14）
CCGACATGCTGGTAAGTGTGTCCAA
第２ラウンドの試験では、Xba ＩおよびPst Ｉで消化した起源のPCR産物から、およびポリメラーゼＩのクレノウ断片によりさらに処理されて平滑末端化されたPCR生成物から、平滑末端ライゲーションによるサブクローン化により、新しいコロニーを得た。インサートを有するベクターを含んだコロニーを、Ｘ−galおよびIPTGを含むカーベニシリン・Ｌブロス・アガロースプレートで選択した。次に、それぞれの白いコロニーを、300μl Lブロス中に、M13K07ファージ、カーベニシリン、およびカナマイシンを加えて、生育させることによって、一本鎖鋳型を96穴プレートで合成した。10μｌのそれぞれの鋳型を尖った器具で、ナイロン膜に移し、変性させ、紫外線ライトで固定させた。（それぞれの96穴プレートの、10μｌのそれぞれの鋳型を、異なる三つのナイロン膜に移した。）オリゴヌクレオチドRM16、RM15、RM12を、［λ−32P］ATPを用いたリン酸化により標識付けした。ナイロン膜を20％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハート溶液および0.5％SDS中で、42℃にて３時間プレハイブリダイズし、次に同じ条件下で異なった放射性同位元素標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、一晩ハイブリダイズした。次に、膜を0.2×SSC、0.5％SDS中で、３回、15分間づつ室温にて洗浄し、次に、37℃にて15分間同じ緩衝液で洗浄し、２×SSCで洗浄し、感光させた。三つのオリゴヌクレオチドプローブのいずれともハイブリダイズしなかったそれぞれの鋳型を、さらに、DNA自動配列決定およびシークエナーゼキットを用いたザンガー法によって、配列決定した。この方法を用いてクローン化された、13−3C7と称する170bpのDNA配列が決定された。
実施例３
実施例２で単離されたサブクローン13−3C7のcDNA挿入体を、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ヒト脾臓、ヒト胎盤（二つのライブラリー）、およびヒト白血球細胞系U937（ATCC CRL1593）から調製した四つの異なるラムダファージcDNAライブラリーのスクリーニングに用いた。簡単にまとめると、120個の陽性クローンを、（約160万個のスクリーニングされたクローンから）取り、サブクローニングし、13−3C7プローブで再度スクリーニングし、そして、再度スクリーニングされた陽性クローンを、分析用PCRにて、DNAの挿入体に位置するプラスミドDNAに対応するプライマーで、約500bpより大きい挿入体について、大きさに基づいて選択した。19Cと称するU937 cDNA由来の1.3kbのクローンを配列決定し、そして、cDNA形成の前の不適当で不完全なmRNAスプライシングに起因する、介在配列（イントロン）等で分けられる二つの免疫グロブリン様領域をコードするDNA領域が明らかになった。二つの領域は、ICAM−１の領域２と領域３との比較で十分な相同性を示すが、結果的には異なり、ICAM−２の領域１および領域２とは、より低い相同性を示した。
19Cの単離に至る手順は、以下の通りである。ラムダgt10ファージ（λgt10）中で、U937細胞系、慢性骨髄単球性白血病患者の脾臓、およびヒト胎盤から得られたcDNAを用いて、四つのライブラリーを構築した。1Hr−5'および1Hr−3'と称する、正確に適合するオリゴヌクレオチドを、（起源の変性プライマーの結合に関与する塩基を含めて）サブクローン13−3C7の領域様領域の5'および3'側に対応するように設計した。
プライマー1Hr−5'（配列番号:15）
GACCATGAGGTGCCAAG
プライマー1Hr−3'（配列番号:16）
ATGGTCGTCTCTGCTGG
これらのオリゴヌクレオチドを13−3C7挿入体鋳型および32P−dCTPと共にPCR反応に用いたところ、148bp長のDNAプローブが作成された。cDNAライブラリーをプレートし、ナイロン膜に移した。この膜を40％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハート、0.5％SDS中で、42℃にて少なくとも15分間プレハイブリダイズし、次にプローブで、同じ緩衝液中で、42℃にて一晩、ハイブリダイズした。膜を２×SSC中で室温で数回洗浄し、感光した。プローブとハイブリダイズしたほとんどのファージプラークは、U937 cDNAライブラリー由来であった。これらのファージは、さらに精製され、そして、PCRで（1Hr−5'および1Hr−3'をプライマーとして）cDNA中の領域の存在に関して試験した。ファージはまた、クローンの長さおよびcDNA断片中の領域の位置を決定するために、（13−3C7特異的プライマーおよび位置するラムダgt10ベクター配列に類似するプライマーとの組合せを用いて）PCRによって試験された。二つのクローンが選択された。クローン1Fは0.7kb長で、19Cは1.3kb長であった。これらのcDNAを、 EcoR Iで消化し、そしてBluescriptベクター中にサブクローニングした。さらに、最大のcDNA（クローン19C）を超音波処理し、小さい断片を得て、配列決定のために、Bluescript中にサブクーン化した。ICAM−１分子との相同性によって、クローン19C cDNAは、それぞれICAM−１の領域２および領域３と相同性を有する、無関係のDNAの介在配列をもつ二つの領域を含んでいた。これ以降、これらのDNA領域を、ICAM−Ｒの領域２および領域３と称する。
実施例４
次に、実施例３で単離し、ICAM−１の領域２および領域３に似た免疫グロブリン様ループをコードする領域を有する1.3kbのDNA（クローン19C）を、完全な長さのcDNAクローンを単離する試みにおいて、さらにcDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブを調製するために用いた。簡単に言えば、クローン19C中の領域２および３領域を、それぞれ、領域のアミノ末端（5'）およびカルボキシ（3'）末端部分に適合するように設計された独特なプローブを用いて、PCRで増幅させた。これらの増幅したDNAは、下記のものに由来するcDNAライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして提供された：（１）HL60骨髄単球細胞系；（２）リポ多糖活性化ヒト単球；（３）HUT−78T細胞（ATCC T1B161）および（４）活性化末梢血白血球。後者の二つのライブラリーからは、スクリーニングで陽性体を得ることはできなかった。HL60および単球cDNAライブラリー由来の陽性体を、ICAM−１クローンを排除するために、次にICAM−1DNA（GenBank、受託番号22634号）の領域２を有するプローブでスクリーニングした。ラムダ345由来の一つのファグミド・クローンは、pVZ−147と称する、陽性体を実施例４で単離したDNAに基づくプローブとのハイブリダイゼーションで、陰性体をICAM−1 DNAプローブとのハイブリダイゼーションで、繰り返し試験された。クローンpVZ−147からの約1.7kbの挿入体を単離し、配列決定して、配列番号:2に示したような1781bpの配列が得られた。このDNAによってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列を配列番号:1に示す。このポリペプチドは、ICAM−１およびICAM−２との構造上の関連性に基づいて、「ICAM−Ｒ」と命名された。ICAM−ＲのDNAおよび推定アミノ酸配列は、この出願の優先日の後に、Vazeuxら、Nature,360:485−488（1992）に公表された。この出願の優先日の後に、Fawcettら、前出の文献に公表されたICAM−３のDNA配列の読取枠は、本明細書の図１（ＡからＧ）に記載のICAM−ＲのDNA配列のコード領域と二つのヌクレオチドの位置で異なっている。（194位および1275位のヌクレオチドを参照のこと。）
ラムダファージクローンpVZ147の単離のために行った操作は、以下の通りである。すべてのcDNAライブラリーは、ラムダgt10中で構築されたが、HL60ライブラリーは、ファージラムダ345中でクローン化された。ライブラリーのスクリーニングおよび再スクリーニングに用いるためのオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有していた。
プローブIHr2−5'（配列番号:17）
TTCACCCTGCGCTGCCAA
プローブIHr2−3'（配列番号:18）
AAAGGGGCTCCGTGGTCG
プローブIHr3−5'（配列番号:19）
CCGGTTCTTGGAGGTGGAA
プローブIHr3−3'（配列番号:20）
CATGACTGTCGCATTCAGCA
プローブIcam1−５（配列番号:21）
GCAAGAACCTTACCCTAC
プローブIcam1−３（配列番号:22）
GAAATTGGCTCCATGGTGA
プローブIHr2−5'およびIHr2−3'は、32P−dCTPを用いたクローン19C鋳型のPCR増幅に用いられ、cDNAのスクリーニングのための領域２に特異的なプローブが調製された。同様に、プローブIHr3−5'およびIHr3−3'は、領域３に特異的なプローブを作成するために用いられた。最後に、プローブIcam1−５およびプローブIcam1−３は、ICAM−1 cDNA配列（GenBank受託番号22634号）の440から609の塩基、すなわち、ICAM−１の第二領域に対応するICAM−１セグメント・プローブを増幅するために用いられた。
cDNAライブラリーをプレートし、ナイロン膜に移し、領域２プローブ（クローン19C由来）と、40％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハート、0.5％SDS中でハイブリダイズさせ、上記したように洗浄した。領域２プローブとハイブリダイズするすべてのプラークは、単球およびHL60ライブラリー由来であった。これらのファージプラークは、希釈、載置、移転および領域２プローブとのハイブリダイゼーションにより精製された。さらにcDNAクローンを特徴づけるために、領域２プローブとハイブリダイズしたそれぞれのプラークを順番に三つ生育させ、ニトロ膜に移し、そして厳重な条件下（50％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハート、0.5％SDS）で、三つの異なるプローブでハイブリダイズさせた。プローブは、領域２プローブ、領域３プローブ、およびICAM−１第二領域プローブであった。領域２および領域３プローブの両方とハイブリダイズし、ICAM−１の第二領域プローブとはハイブリダイズしないクローンが、HL60ライブラリーから五つ、単球ライブラリーから二つ認められら。HL60ライブラリーからの第６のクローンは、領域２プローブとのみハイブリダイズし、そして、領域３あるいはICAM−１第二領域とはハイブリダイズしなかった。HL60ライブラリー由来の６つのクローンのcDNAは、さらに分析された。ファージは、適性にスプライスされたcDNAの存在を、領域２の5'末端に対応するオリゴヌクレオチドプライマー（IHr2−5'）、および領域３の3'末端に対応するオリゴヌクレオチドプライマー（IHr3−3'）を用いたPCRによって、試験された。クローンはまた、クローン中の領域の長さおよび位置を調べるために、PCRによって試験された。cDNAプラスミドは、Sfi Ｉによる消化およびセルフライゲーションによって、ファージラムダ345から取り出されて、環化された。一本鎖鋳型をつくり、両方向の配列決定を行なうために、各cDNAもまた、Bluescript SK＋ベクター（Stragene社）中にサブクローン化した。プラスミドpVZ147は、一つの読取枠に全ICAM−Ｒコード配列を含むものであると決定した。
実施例５
A.ICAM−Ｒポリヌクレオチドの特徴付け
図１（ＡからＧ）は、上記の実施例４で単離されたラムダファージクローンpVZ147のヒトcDNA挿入体の配列を示す図である。開示された全1781bpを、配列番号:2に示した。配列番号:1に示したICAM−Ｒポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図１（ＡからＧ）で、以下の領域に図中にて分けている。
（１）推定シグナルあるいはリーダー配列は、「成熟」タンパク質の前に表されており、アミノ酸−29から−１にわたっている。翻訳生成物が実際に−29あるいは−26にて開始するか否かを決定するのは、細胞間発現生成物のアミノ酸配列決定による。成熟タンパク質の最初の残基の指定は、分泌ヒトタンパク質の成熟タンパク質およびリーダー配列の境界領域のアミノ酸（および対応する塩基）残基の一般化された類似性に基づいた。実際の成熟タンパク質の開始残基の配座は、分泌された組換え生成物、あるいは、例えば、免疫精製された天然生成物の配列決定を待つ。
（２）＋１から518にわたる成熟タンパク質中で、五つの推定免疫グロブリン様ループ領域が示されている（黒に白字）。この領域は、五つの推定免疫グロブリン様領域中のシスティンによって結合している（囲ってある箇所）。第一の領域（残基１から91）では、ループ形成の可能性が十分なシスティン残基は、24位、28位、67位および71位に存在していることに留意すること。残りの推定ループのそれぞれは、その末端に一つの適切なシスティンを有している。
（３）同様に成熟タンパク質中では、第五の免疫グロブリン様領域の後の、推定の疎水性「経膜的」領域は、残基457から481を結ぶダッシュで示している。推定カルボキシ末端「細胞質」領域は、残基482から518である。
（４）可能性のあるＮ−結合グリコシレーション部位［共通配列、アスパラギン−Ｘ−（セリンあるいはスレオニン）］は、星印で示す。可能性のあるＯ−結合グリコシレーション部位は、セリンあるいはスレオニン残基にある。
ICAM−Ｒのアミノ酸配列およびICAM−１の公表された537残基のアミノ酸配列（GenBank受託番号22634号；注釈、1988年11月11日公開の欧州特許出願0 289 949号の図８）との比較を行なった。この比較によって、対応させた537残基中に249の適合が認められ、この二つのポリペプチドの間では全体として48％のアミノ酸の一致があることがわかった。もっとも高い適合率は、ICAM−１の領域２および３とICAM−Ｒの推定領域２および３との間に存在することが示された。同様に、配列番号:1と公表されたICAM−２の295残基のアミノ酸配列（GenBank受託番号22635号；注釈、1990年９月19日公開の欧州特許出願0 387 668号の図２）とを対応させてみると、282の残基の内、ち、78の適合が認められ、一つの並び方で、全体的には27％の一致が認められた。ある並び方において、ICAM−Ｒの細胞質領域は、ICAM−１の細胞質領域と20％一致することが認められ、そしてICAM−２の細胞質領域と34％一致することも認められた。
B.ICAM−R DNAの特徴付け
ヒトICAM−R DNA配列（配列番号:2）を、公表されたICAM−１および前出のICAM−２のDNA配列と比較した。ICAM−ＲおよびICAM−１の1623の塩基の中で、計677個の適合がみられ、全体として41％が一致していた。ICAM−ＲおよびICAM−2 DNAの1136塩基の間で42％の一致（484の適合）が認められた。
ICAM−Ｒ遺伝子の単離に「歴史的」重要性を有する、図１（ＡからＧ）のDNAの参照符には、下記のものが含まれる。
（ａ）実施例２にて単離されたサブクローン13−3C7に対応する塩基420から567;
（ｂ）実施例３のクローン19C中に位置する、免疫グロブリン様領域２に対応する塩基373から663（実施例４に用いるためのオリゴヌクレオチドプローブの一つを提供するために、領域２のPCR増幅に用いられた、プローブIHr2−5'およびIHr2−3'にそれぞれ対応する、塩基418から435および561から578を含む。）；および
（ｃ）実施例３のクローン19C上に位置する、免疫グロブリン様領域３に対応する塩基664から957（実施例４に用いるための他のオリゴヌクレオチドプローブを提供するために、領域３のPCR増幅に用いられた、プローブIHr3−5'およびIHr3−3'にそれぞれ対応する、塩基699から717および800から819を含む。）
実施例６
ICAM−Ｒの囓歯類の類似体が、ICAM−Ｒ特異的プローブを用いて低い厳重条件下でのハイブリダイゼーションによって、単離された。
成体Balb/cマウスPBL cDNAラムダファージ・ライブラリーおよびラットPBC cDNAラムダファージ・ライブラリー（Clonetech社,La Jolla,カリフォルニア州）およびラット肝臓DNAおよびC6VLリンパ芽球細胞DNAから調製されたラムダファージ・ラットゲノムDNAライブラリーを、全長のヒトICAM−Ｒ遺伝子あるいはその断片でスクリーニングした。ライブラリープラークをHybond N＋ナイロン膜（Amersham社、Arlington Heights、イリノイ州）に移した。すべてのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、42℃にて、40〜50％ホルムアミド、５×デンハート、５×SSPEおよび1.0％SDSの溶液中で行なわれた。32P放射性同位元素標識したプローブをハイブリダイゼーション溶液の105〜106cpm/mlの濃度で加えた。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを室温で２×SSPE/0.1％SDS中でよく洗浄し、次にＸ線フィルムに感光した。陽性クローンをさらなるハイブリダイゼーションによって、プラーク精製した。ラムダDNAをそれぞれのクローンの溶解物から調製し、Hae IIIあるいはRsa Ｉのいずれかで消化した。ゲノムDNAの断片を分析のためにシークエンス・ベクター中にクローン化した。囓歯類のcDNAライブラリー由来の約2.5×106個のプラークおよびゲノムライブラリー由来の2.0×106個のプラークを全長のヒトICAM−Ｒプローブでスクリーニングした。ICAM−Ｒに関連するクローンはまったく確認されなかった。さらに囓歯類cDNAライブラリー由来の0.5×106個のプラークおよび囓歯類ゲノムライブラリー由来の1.0×106個のプラークを、配列番号:2のヌクレオチド372から663に対応する、ICAM−Ｒ領域２特異的プローブで、スクリーニングした。一つのラット由来のゲノムクローンは、ICAM−Ｒの囓歯類相同物の候補として同定された。配列番号:23および24は、ラット領域２クローンの配列データ（341bp）を示している。下記の表１は、ラットクローンの、ヒトICAM−Ｒ、ICAM−１、およびICAM−２に対応する領域へのDNAおよびアミノ酸配列の一致を示す。
0003616090.tif 000002
実施例７
ICAM−R cDNAを、Ｌ−Ｍ（TK-）マウス細胞（ATCC CCL 1.3）中に形質導入し、そしてノーザンブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーションによって、ICAM−Ｒの発現を調べるために、細胞の分析を行った。
A.ICAM−R DNAの形質導入
pVZ−147のICAM−R cDNA挿入体の全長およびそのcDNAの3'側のファグミド・ベクタ−の一部を、制限酵素Not ＩおよびXba Ｉを用いて切り出し、Not ＩおよびXba Ｉで切断した市販のプラスミドpCDNA 1−neo（Invitrogen社、San Diego、カリフォルニア州）中にライゲーションして入れた。得られた、pCDNA 1−neo ICAM−Ｒと称するプラスミドを、Chenら、Molecular and Cellular Biology,7:2745−2748（1987）に記載のリン酸カルシウム沈殿法によって、マウスＬ細胞中に形質導入した。ICAM−1 DNA（pCDNA−neo−ICAM−１構築物）もまた、対照としてマウスＬ細胞中に形質導入した。完全なICAM−１タンパク質コード領域を含むcDNA断片をプラスミドpCDNA 1−neoにライゲーションし、リン酸カルシウム沈殿法によって、Ｌ細胞中に形質導入した。ネオマイシン耐性による選択に続いて、個々のICAM−ＲあるいはICAM−１形質導入体を、クローニングシリンダー（Bellco Glass社、Vineland、ニュー・ジャージー州）を用いてサブクローン化した。次に、ICAM−ＲおよびICAM−１タンパク質を最も高いレベルで発現しているクローンをセルソーターで分けた。
構築物pCDNA−neo−ICAM−ＲおよびpCDNA−neo−ICAM−１もまた、CV−１細胞中に、リン酸カルシウム沈殿法によって、形質導入した。高いレベルのICAM−ＲおよびICAM−１を発現しているクローンを、上記のＬ細胞形質導入体で述べたように選択した。ICAM−ＲおよびICAM−１特異的抗体によるFACs分析に基づけば、タンパク質発現のレベルは、CV−１形質導入体の方が、マウスLTK形質導入体より高かった。
B.ノーザンブロットハイブリダイゼーション
全長のICAM−ＲあるいはICAM−1 cDNAsをマウスＬ細胞中に形質導入した後、形質導入されたおよび形質導入されていないＬ細胞中での、対応するmRNAsの特異的発現を、32P標識したICAM−ＲあるいはICAM−1 DNAプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションによって調べた。形質導入体は、対数増殖期に来たとき、遠心分離して、150mMのNaClで２回洗浄した。沈殿を3.5mlのGIT（グアニジウムイソチオシアナート）緩衝液中に再懸濁し、20秒間ポリトロンミキサーで破砕した。1.7mlCsCl緩衝液を超遠心管に加えたのち、GIT/RNA混合物を上部に上層した。試料を35K（179,000×ｇ）で、20℃にて、21時間遠心分離した。すべての液体を除去し、沈殿したRNAを300μｌの0.3M酢酸ナトリウムpH5.2中に再懸濁し、次に750μｌのエタノールで、−20℃で沈殿させた。沈殿物を水中で再懸濁し、プロテアーゼＫで処理してすべてのRNAseを取り除いた。フェノール・クロロホルム抽出の後、RNAを再沈殿し、水中で再懸濁し、そして260nmにおけ試料の吸光度を測定した。
ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理溶液で調製した溶液を用いて、RNAを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動した。全RNA試料10μｇを、各レーンにのせた。RNAを30Vで、蠕動ポンプによって緩衝液を連続循環させながら、約18時間電気泳動した。それぞれの得られたゲルを20×SSPEに20分間、それぞれ室温で、二回浸した。RNAのHybond−Ｃ膜（Amersham社、Arlington Heights、イリノイ州）への移行は、20×SSPE中、一晩、毛管現象を利用して行なわれた。Stratagene社のストラタリンカーを用いて、紫外光に曝すことによって、それぞれの膜にRNAを安定に架橋した。
ICAM−1 DNAプローブを調製するために、100〜200ngの鋳型DNA（ICAM−１コード配列全体を含む1.bkbの Xba／Kpn 断片）を水およびランダムヘキサマーと、32P−dCTPおよび32P−dTTP、10-4M dGTP/dATP、10×クレノウ緩衝液（Boehringer Mannheim Biochemicals社、Indianapolis、インディアナ州）およびクレノウ酵素を混合し、５分間煮沸し、次に５分間氷上でインキュベートし、そして混合物を１時間室温で放置した。試料をQuickspin G25 DNAカラム（Boehringer社）に通し、取り込まれた標識を取り込まれていない標識から分離した。
ICAM−R DNAプローブを作成するために、200pgのDNA鋳型（ポリＡテールを除くために切断したクローンpVZ−147の1.4kbの断片）を、領域１の5'および3'末端に相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRで増幅させた。32P−dCTPを反応混合物に加えた。試料を94℃にて４分間維持し、次に温度変換工程（94℃、１分;50℃、２分;72℃、４分）の30サイクルを行なった。試料を次に、Quickspinカラムに通し、標識の取り込みを１μｌのシンチレーション測定によって調べた。
DNAプローブを5M NaOHで変性させ、次に1Mのトリスで中和した。Hybond n−Ｃ膜を、50℃にて30分、50％ホルムアミド・プレハイブリダイゼーション混合物でプレハイブリダイズした。
プローブをそれぞれの膜について１×106cpm/mlハイブリダイゼーション混合物（50％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×SSPE、１％SDS）の濃度で加え、膜を一晩、42℃にてインキュベートした。次にそれぞれの膜を２×SSPE/0.1％SDS中、室温で10分間ずつ、５回洗浄した。50℃にて10分間、0.5×SSPE/0.1％SDS中で１回洗浄し、２×SSPE中で１回洗浄した。主要なRNA転写物とのハイブリダイゼーションを、Molecular Dynamics（Sunnyvale社、カリフォルニア州）モデル400Aホスホ・イメージャーを用いて定量した。
ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果は、図２（ＡからＢ）中に、棒グラフの形で表した。図2Aは、ICAM−ＲプローブとICAM−Ｒ形質導入体から抽出されたRNAとの特異的ハイブリダイゼーションを表している。ICAM−１形質導入体由来のRNAあるいは形質導入していないＬ細胞由来のRNAとは、ハイブリダイズしない。逆に、図2Bは、ICAM−１プローブとICAM−１形質導入体由来のRNAとはハイブリダイゼーションするが、ICAM−Ｒ形質導入体由来のRNAあるいは親のＬ細胞由来のRNAとはハイブリダイゼーションしないことを示している。
C.インサイチュハイブリダイゼーション
Ｌ細胞およびICAM−ＲあるいはICAM−1 cDNAで上記のように形質導入されたＬ細胞を、ICAM−ＲあるいはICAM−１由来の放射性同位元素標識した一本鎖RNAプローブでインサイチュでハイブリダイズさせた。一本鎖RNAプロ−ブは、ICAM−ＲあるいはICAM−１の第一の（すなわち、Ｎ末端）免疫グロブリン様領域に対応するDNA鋳型から、35S−UTPを取り込むin vitro RNA転写により調製した。プローブは、約200bpにまで化学的に加水分解した。
形質導入済および未形質導入のＬ細胞を、Vectabond（Vector Laboratories社、Burlingame、カリフォルニア州）で被覆したスライド上にのせ、−70℃で保存した。使用前に、スライドを−70℃から取出し、55℃にて５分間置いた。次に、載置部位を４％パラホルムアルデヒト中で、20分間、４℃で固定し、70−95−100％エタノール中で10分間室温にて脱水し、30分間空気乾燥した。載置部位を70℃、２分間、70％ホルムアミド/2×SSC中で変性し、２×SSC中で洗浄し、脱水して、30分間空気乾燥した。50％ホルムアミド、0.3M NaCl、20mMトリスpH8.0、10％硫酸デキストラン、１×デンハート溶液、100mMジチオスレイトール（DTT）および5mM EDTAを含む混合物で、２時間、42℃にて、プレハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションは、同じ混合物中で50℃にて一晩（12〜16時間）行なった。この時、混合物中には、さらに35S−標識ICAM−１あるいは35S−標識ICAM−R RNAプローブ（６×105cpm/載置部位）のいずれかが含まれていた。ハイブリダイゼーションの後、載置部位を、１時間、室温にて、４×SSC/10mM DTT中で、次に40分間、60℃にて、50％ホルムアミド/1×SSC/10mM DTT中で、30分間室温にて、２×SSC中で、そして30分間室温にて、0.1×SSC中で洗浄した。載置部位をアルコール脱水し、30分間空気乾燥し、（４℃にて完全な暗やみの中で保存した後）現像し、そして、ヘマトキシリン／エオシンで対比染色した。
インサイチュハイブリダイゼーションの顕微鏡写真は、図３（ＡからＦ）に示されている。ここで、顕微鏡写真3Aは、ICAM−R RNAでプローブした親のＬ細胞であり;3Bは、ICAM−R RNAでプローブした、ICAM−Ｒを形質導入したＬ細胞であり;3Cは、ICAM−R RNAでプローブした、ICAM−１を形質導入したＬ細胞であり;3Dは、ICAM−1 RNAでプローブした、親のＬ細胞であり;3Eは、ICAM−1 RNAでプローブした、ICAM−Ｒを形質導入したＬ細胞であり;3Fは、ICAM−1 RNAでプローブした、ICAM−１を形質導入したＬ細胞である。顕微鏡写真は、それぞれのRNAプローブが、類似のcDNAで形質導入したＬ細胞のみと特異的にハイブリダイズすることを示している。
実施例８
ICAM−Ｒを発現する、形質導入したＬ細胞に対する、表面上での白血球の接着を試験する実験により、ICAM−Ｒが接着分子あるいは白血球上の分子のためのリガンド／レセプターであることが示唆される。Dustinら、Nature,341:619−624（1989）に記載に従って、SKW3細胞（Ｔリンパ芽球細胞）をホルボールエステルで前処理し、LFA−１依存性接着を活性化し、そしてICAM−ＲおよびICAM−１形質導入体の結合について分析した。
形質導入していないＬ細胞あるいはICAM−ＲあるいはICAM−１（実施例７を参照のこと）のいずれかで形質導入したＬ細胞を、密着性分析の24〜48時間前に24穴組織培養プレートに接種した（１つの穴あたり３×105個の細胞）。SKW3細胞を血清を含まないRPMI（Gibco社、カナダ）で洗浄し、Calcein−AM（Molecular Probes社、Eugene、オレゴン州）で標識し、10ng/mlホルボールミリスチルアセテート（PMA）で、20分間、37℃にて刺激した。選択され、刺激されたSKW3細胞を、次に、抗CD18（TS1/18、ATCC HB203）、抗CD11a（TS1/22、ATCC HB202）ハイブリドーマ上清あるいは対照として精製された抗CD2（ATCC HB195）モノクローナル抗体で、30分間、付着性の形質導入したＬ細胞とインキュベーションする前に、室温で前処理した。抗体で処理した、あるいは抗体で処理していない、Calcein標識したSKW−３細胞を、ICAM−ＲあるいはICAM−１の形質導入体の集密的単層に加え（１穴あたり、５×105個の細胞）、そしてRPMI/1％ウシ胎児血清（FCS、Hyclone Laboratories社、Logan、ユタ州）中で、37℃にて30分間インキュベートした。未結合の細胞を吸引し、そしてウエルをRPMI−FCSで満たした。プレートをシールし、反転位して、200rpmで４分間遠心分離し、吸引した。次にプレートをRPMI−FCSで洗浄し、そして自動蛍光読取機で走査した。
刺激したSKW3細胞のICAM−ＲおよびICAM−１形質導入体双方に対する接着は、モノクローナル抗体で阻害された。これらモノクローナル抗体は、LFA−１のα（CD11a）あるいはβ（CD18）鎖に対するものであった。このことから、ICAM−Ｒは、β２インテグリン経路が関与する細胞間接着現象に関与している可能性がうかがえた。細胞内接着は、対照の抗CD2試薬によっては影響されなかった。
実施例９
ICAM−Ｒの水可溶性の変異体は、以下のように構築および発現された。
ICAM−ＲのcDNAは、部位特異的変異導入の標準的手順［例えば、Kunkelら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492（1985）を参照のこと］により改変し、タンパク質コード配列を、その細胞外領域および経膜的領域の予定された継ぎ目（457位のアミノ酸）の部分で切断した。この領域は、水治療法予測するコンピューター・アルゴリズム［Kyteら、J.Mol.Biol.,157:105−132（1982）］で決定した。ICAM−ＲのDNA配列は、pVZ147（実施例４）から制限酵素Sal ＩおよびNot Ｉで切断した。得られた断片は、コード鎖の5'末端から始まり、そしてマルチクローニング部位の短いセグメントの3'末端をも含む、完全なICAM−Ｒコード配列を含んでいた。この断片を、Sal ＩおよびNot Ｉで直鎖化されたM13BM21ベクター（Boehringer社）中にサブクローン化し、M13BM21 ICAM−Ｒと称する分子が得られた。
変異導入のためのオリゴヌクレオチドは、以下の配列のように合成された。
ICAM−Rt1（配列番号:25）
CTGCCCCTGAATCACCCTCGA
このオリゴヌクレオチドは、ICAM−Ｒの457位のフェニルアラニンを終止コドンに変える。オリゴヌクレオチドは、Kunkelらの前出の文献んに記載されているように用いられ、M13BM21 ICAM−Ｒから、457位に終止コドンをコードする、六つのM13ファージ単離物が調製された。BM21 ICAM−Rt1と称する単離物がさらなる研究のために選択された。
この一本鎖鋳型を、以下のように、クレノウDNAポリメラーゼを用いたプライマー伸長により、二本鎖DNA分子に変えた。精製した一本鎖M13BM21 ICAM−Rt 1DNAの10μｇを50ngのLacZユニバーサルー20プライマ−（GTAAAACGACGGCCAGT、配列番号:26）とアニールした。アニールは、１×クレノウDNAポリメラーゼ緩衝液（10mM Tris−C1 pH7.5、5mM MgCl2、7.5mMジチオスレイトール）中で、混合物を65℃にて５分間、そして25℃にて５分間インキュベートして行なった。次に、以下の混合物をアニーリング反応に加えた：最終濃度33μＭのdATP、dGTP、dCTP、dTTP;4ユニットのクレノウDNAポリメラ−ゼ（Boehringer社）、および１×クレノウ緩衝液。プライマー伸長反応は、１回のフェノ−ル／クロロホルム（1:1）抽出およびエタノール沈殿によって停止されるまで、45分間、37℃にてインキュベートすることにより行なわれた。cDNA挿入体の一部を、M13BM21 ICAM−Rt1ファージから、制限酵素Eco R VおよびNco Ｉを用いた制限消化により、取り出した。取り出されたDNAの断片は、切断型ICAM−Ｒの完全なコード配列、3'の非翻訳領域およびM13BM21ファージ由来のポリリンカー配列の小さなセグメントを含んでいた。アガロースゲル精製の後、この断片は、直鎖状になったベクターBluebac III（Invitrogen社、San Diego、カリフォルニア州）にライゲーションして、大腸菌のβガラクトシダーゼ遺伝子の発現を駆動させるETLプロモーターに位置する相同組換えのためのゲノムのバキュロウイルス配列、およびこの場合ICAM−Rt1である目的遺伝子の発現を駆動させるポリヘドロンプロモーターを含む転移ベクターとした。
Bluebac IIIベクターは、以下のように調製し、その後ライゲーションした。３μｇのスーパーコイルプラスミドDNAを、20ユニットのHinD IIIエンドヌクレアーゼ（Boehringer社）で消化した。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿の後に、DNA沈殿を、１×クレノウDNAポリメラーゼ緩衝液；最終濃度33μＭのdATP、dGTP、dCTP、dTTP;2ユニットのクレノウDNAポリメラーゼ（Boehringer社）中で再懸濁し、37℃にて60分間インキュベートして分子の末端を修復した。この修復の反応は、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により停止させた。平滑末端DNAは、1X Nco Ｉ緩衝液中に再懸濁し、20ユニットのNco Ｉエンドヌクレアーゼを加えて37℃にて60分間インキュベートした。
ICAM−Rt1挿入体および直鎖状プラスミドのライゲーション反応の一部を、エレクトロコンピテントXL−１大腸菌（Stratagene社）の形質転換に用い、個々のコロニーを60μ/mlカーベニシリン添加のLBプレート上で選択した。12個の個々の単離物を、診断の目的で、Pst ＩあるいはEco R Iを用いて、ミニプレップDNAの消化により分析した。期待されたバンドパターンを示す１つの単離物を、pBB III.ICAM−Rt1と命名した。
pBB III.ICAM−Rt1 DNAで形質導入あるいは感染されるSf−９細胞（Invitrogen社）は、スピナー・フラスコでTNM−FH［10％熱不活性化ウシ胎児血清および10μg/mlのゲンタマイシンを添加したグレース培地（Gibco社、Grand Island、ニューヨーク州）］中27℃で、強制通風インキュベーターで保持された。スピナー・フラスコ・インペラーは、絶縁された５プレース・攪拌プレート上で60rpmで回転した。90％より多い生存数の対数増殖期のSf−９細胞（1.5×2.5×106/ml）を、定期的に、１週間に２回、サブカルチャーした。
対数増殖期のSf−９細胞を、TNM−FH培地中に載置（２×106細胞/60mm皿）し、27℃にて１時間付着させた。この後、以下の混合物を殺菌したポリスチレン・チューブ中に作り、そして室温で15分間インキュベートした:1ml TNM−FH培地、１μｇの線状Autograha dalifornica核ポリヒドロシスウイルス（AcNPV、バキュロウイルス）ゲノムDNA（Invitrogen社）、３μｇのpBB III.ICAM−Rt1 DNAおよび20μｌのストック陽イオン性リポソーム溶液（Invitrogen社）。対照として、pBB III.ICAM−Rt1 DNAの代わりに、二つの別々の混合物（pBluebac IIIの有無により区別）を調製した。培地を接種したプレートから取り除き、2mlのグレース培地と置き換え、そして２分間インキュベートした。すべての培地をプレートから除去し、そしてDNA/リポソーム混合物をそれぞれのプレートの細胞上に１滴ずつ加えた。一つのプレートには、偽形質導入のコントロールとして、TNM−FH培地のみを入れた。次に、プレートを27℃にて、時々揺らしながら、４時間インキュベートした。このインキュベーションの後、1mlのTNM−FH培地をプレートに加えた。さらに48時間インキュベーションした後、ウィルスを含む形質導入培地を除去し、そしてこれらのウィルスストックを、プラーク同定のために、Sf−９細胞のプレートを感染させるのに用いた。
Sf−９細胞を、TNM−FH培地中に、２×106細胞/60mm皿になるように接種し、そして約１時間27℃にて付着させた。培地を除去した。それぞれのウィルスストックから、数段階の十倍希釈物を作り、そして各々の１μｌの希釈物を付着性のSf−９細胞の１つの皿に加え、そして27℃にて１時間インキュベートした。ウィルス接種物を除去した後、それぞれの皿の細胞の上に、3mlのTNM−FH培地、0.625％低融点アガロース（BRL社、Gaithersburg、メリーランド州）および300μg/mlハロゲン化イドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Bluo−gal、BRL社）の混合物であって、あらかじめ約30℃にしておいたものを重層して、１時間室温で固めた。次に、プレートに青色が現われるまで（典型的には、４〜５日）インキュベートした。組換え体のウィルスの（βガラクトシダーゼが発現され、発色物質であるBluo−galが、感染した細胞中で青い沈殿に変換することにより同定された）24個のプラークを、TNM−FH中に1mlのSf−９細胞（２×105/ml）を播き、24穴細胞培養プレートの個々のウェルに移した。27℃にて５日おいた後に培地を回収し、1,000rpmで、４℃にて５分間微量遠心分離し、そして得られた上清を新しいチューブに移した。これらのストックは、BacR.P1ストックと命名し、それぞれに単離番号を付与した。
BacR.P1ストックを抗原捕捉（ELISA）分析により、ICAM−Ｒの産生について分析した。抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26I10E−２（実施例10を参照のこと）を、以下のようにしてビオチン化した。1mg/mlのモノクローナル抗体26I10Eに、1/10容量の1M NaCO3を加えた。NHS−ビオチン（Sigma Chemical社、St.Louis、モンタナ州）をジメチルスルホキシド（DMSO,Mallinckrodt,Paris,KY）中に、1mg/mlで溶解した。180μｌのビオチン溶液をそれぞれ1mgの抗体に加え、４℃一晩、遠心した。このビオチン化反応を、４℃で、16時間、PBSを三回交換する透析で停止させた。BacR.P1ストックの分析用に、96穴ウェルプレートのそれぞれのウェルをモノクローナル抗体26E3D（10μg/mlで50μｌ）で、37℃にて２時間あるいは４℃にて16時間のいずれかで被覆した。次に被覆物を吸引し、ウェルをPBSで２回洗浄した。ウェルを、200μｌのPBS中の１％BSAで、37℃にて30分間ブロックした。BacR.P1ストックの10倍段階希釈物をPBS中で二つ調製した。BacR.P1ストック（そのまま）あるいは希釈物から、50μｌを取り、ウェルに加え、そして37℃にて30分間インキュベートした。PBSで２回洗浄した後、１％BSA/PBS中のビオチン化26I10Eの1:250希釈の50μｌをウェルに加え、37℃にて30分間インキュベートした。PBSによる３回の洗浄の後、ストレプトアビジンに結合し、１％BSA/PBS中で1:4000に希釈した、50μl/ウェルのセイヨウワサビペルオキシダーゼを加え、37℃にて30分間インキュベートした。PBSで２回洗浄した後、200μl/ウェルのABTS（Zymed社）入りの基質緩衝液を加え、そして室温にて、発色反応が現われるまでインキュベートした。プレートを自動プレート・リーダーで、410nmの波長で計測した。
上記の抗原捕捉分析によって決定した可溶性ICAM−Ｒを最も高く発現するものを、プラーク精製のために四つ選んだ。そして、これらの単離体のBacR.P1ストックを10倍段階希釈によって希釈し、アガー上層と共に播いた。最も高い希釈物から１つの青色プラークを単離し、そして1mlのTNM−FH培地中に入れ、激しく渦巻き攪拌し、さらにプラーク単離するために段階希釈した。すべての野性型バキュロウイルスを除いた最終的なプラーク単離体を選択し、そしてTNM−FH培地に２×106個のSf−９細胞を播いたＴ−25フラスコに採った。27℃にて５日間インキュベーションした後に、培地を1200rpm、５分間の遠心分離によって回収し、そして4mlの上清（Bac−R.P2ストックとした）を、２×106細胞/mlを播いた500mlのTNM−FHを含む、１リッターのスピナー・フラスコに移した。さらに27℃にて５日間インキュベーションした後、感染した培地を、1000rpmにて５分間遠心して回収した。上清を４℃にて保存し、BACR.P3ストックとした。このBACR.P3ストックの力価を、10倍段階希釈の一部を付着性のSf−９細胞上にプレートし、300μg/mlのBluo−gal（BRL）を添加したTNM−FH中の0.625％アガロ−スで上層することにより測定した。27℃にて、４日間インキュベーションした後、プラークの数を計測し、力価を測定した。
可溶性のICAM−Ｒタンパク質の発現のための感染を、1.5LのEX/Cell 401培地（JRH Biosciences社、Lenexa、カンザス州）を含む3Lフラスコで行なった。対数増殖期に分けたSf−９細胞（２×106/ml）にBACR.P3ウィスルストックを感染の多重度（moi）５で感染させた。４日後に、培地を回収し、そして遠心分離によって細胞から分離した。可溶性のICAM−Ｒタンパク質は、昆虫細胞培地から、以下のように精製した。4mlの1M Tris−C1 pH7.5をそれぞれ200mlの昆虫細胞上清に加え、そして、約35ml/時間で４℃にて、レンチル・レクチン・セファロース（Pharmacia社、Uppsala、スウェーデン）の3.5ml以下カラム上に送液した。このカラムは、あらかじめ20mMのTris−C1 pH7.5/0.1M NaCl（平衡化緩衝液）で平衡化していた。載置してから、カラムを25mlの平衡緩衝液で洗浄した。次にカラムを、0.2Mのメチルα−Ｄ−マンノピラノシドを含む11mlの平衡化緩衝液で溶出した。溶出された液は、可溶性のICAM−Ｒを含んでいた。
部分精製された可溶性ICAM−Ｒタンパク質を、実施例８に記載のようにLFA−１依存性接着を活性化するために、ホルボールエステルで前処理したSKW3細胞に対する結合について分析した。レクチン溶出液を25mMカーボネートpH9.6に調整した後、ICAM−Ｒタンパク質を、96穴ウェルイムロン４（Dynatech社）プレート上に被覆し、そして４℃にて一晩インキュベートした。プレートをPBSで２回洗浄し、200μl/ウェルのPBS、１％BSAで37℃にて30分間ブロックし、細胞を加える前に再度PBSで洗浄した。SKW3細胞を血清を含まないRPMI（Gibco社）中で洗浄し、Calcein−AM（Molecular Probes社）で標識し、そしてPMAで刺激した。モノクローナル抗体ブロッキング実験において、プレート結合ICAM−Ｒタンパク質とインキュベーションする前に、実施例８に記載のように、細胞を（PMAで刺激する前に）適当な精製モノクローナル抗体で、室温で、20分間処理した。次に、細胞をプレートに加え、37℃にて、１時間インキュベートした。プレートをシールし、反転させて、200rpmで４分間遠心分離して、吸引した。遠心分離の後、RPMI/1％FCSで洗浄した。次に、プレートを蛍光顕微鏡および自動蛍光読取機で走査した。予備データによると、ホルボールエステル活性化リンパ球が、プレートに結合したICAM−Ｒタンパク質に接着することが示された。
実施例10
NS−１ミエローマ細胞と、ICAM−Ｒを発現するヒト細胞系で免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞との融合体から、ICAM−Ｒに特異的なモノクローナル抗体を調製した。モノクローナル抗体を、融合体26、42、43および46と称する四つの異なる融合体から調製した。
A.マウスの免疫措置
融合体26のために、５匹の６〜12週齢のBalb/cマウス（Charles River Biotechnical Services社、Wilmington、マサチューセッツ州、IACUC＃901103）を、HL−60細胞で免疫し、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体を調製した。０日目のプレ免疫血清の回収のために、２匹のBalb/cマウスの採血を眼窩後方から行った。２日目に、各動物に0.5ml中の計６×106個のHL−60細胞（0.1ml s.c.および0.4ml i.p.）を与えた。第二回目の、9.5×106個のHL−60細胞による免疫も、28日目に同様に行なわれた。免疫血清を回収し、眼窩後方からの採血を35日目に行い、FACS（FACSスクリーニングは、以下のＣ節で詳細に記載した）で試験して、ICAM−Ｒ形質導入体に体する反応性を調べた。これらの結果に基づいて、両方のマウスを51日目に、6.5×106個のHL−60細胞で３回目の免疫を行い、そして54日目に１匹の動物（＃764）から滅菌状態で取り出した脾臓細胞で融合を行なった。
融合体42のために、０日目に５匹のそれぞれのマウスから採血し、次に腹腔内から、50μｇのアジュバントペプチド（Sigma社）を含む0.5ml PBS中の５×106個のSKW3細胞によって、免疫した。マウスに、同様にして21日目および42日目に追加免疫した。３回目の注入の10日後、マウスから採血し、免疫血清をFACSによって試験をした。マウス＃843に、64日目にSKW3細胞で最後の追加免疫を行なった。３日後に脾臓を滅菌状態で取り出した。
融合体43のために、０日目に５匹のそれぞれのマウスから採血し、次に静脈から、赤白血病細胞系K562由来の５×106個の細胞によって、免疫した。それぞれのマウスに、次の２日間毎日、150μｌ中の1.5mgシクロホスファミドを腹腔内から注射した。10日目に、アジュバントペプチド入りのSKW10細胞を融合体42と同様に注入した。30日目に、マウスにさらにK562細胞を追加免疫し、その後シクロホスファミドを注入した。42日目に、マウスをアジュバントペプチドを含むSKW3細胞で追加免疫した。56日目にマウスから採血し、そして免疫血清をFACSで試験した。78日目に、マウス＃1021に、SKW3細胞およびアジュバントペプチドで最終的な追加免疫を行なった。３日後に脾臓を滅菌状態で取り出した。
融合体46のために、マウス（＃900）を融合体42の時と同様に免疫した。128日目に、マウスに約４×106個のMacaca nemestrina脾臓細胞を最終追加免疫した。サル脾臓の単一の細胞の懸濁物を、次のパラグラフに記載するように調製した。サル細胞を沈殿させ、以下の赤血球溶血緩衝液中に再懸濁した:0.15M NH4Cl2、1M KHCO3、0.1mM Na2EDTA、pH7.2〜7.4。赤血球を溶血した後、脾臓細胞をRPMIで２回、PBSで１回洗浄した。最後に、細胞を50μｇアジュバントペプチドを含む400μl PBS中に再懸濁して注入した。３日後にマウスの脾臓を滅菌状態で取り出した。
B.融合
簡単に言えば、単一細胞の懸濁物を、それぞれのマウス脾臓から、脾臓を、２つのガラス顕微鏡スライドの白い淵の間で擦り潰すことによって調製した。このスライドは、2mM L−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、100ユニット/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシン（Gibco社）を添加した血清を含まないRPMI1640（Gibco社）中に浸す。この細胞懸濁液を滅菌した70メッシュNitex細胞濾過器（Becton Dickinson社、Parsippany、ニュージャージー州）でフィルター濾過し、そして、200gで５分間遠心分離して、沈殿を20mlの血清を含まないRPMI中に再懸濁することにより、２回洗浄した。３匹の普通のBalb/cマウスから取り出した胸腺リンパ球を、同様に調製した。
融合の前の３日間、11％ウシ胎児血清（FBS）あるいは胎児クローン（Hyclone）入りのRPMI中に対数増殖期に保持しておいたNS−１ミエローマ細胞を、200gで５分間遠心分離し、そして沈殿を前述のパラグラフに記載したように２回洗浄した。洗浄の後、それぞれの細胞の懸濁液を血清を含まないRPMIで最終容量10mlになるようにし、そして10μｌを1:100に希釈した。それぞれの希釈液の20μｌを取り、20μｌの0.85％生理食塩水（Gibco社）中の0.4％トリパンブルーステインと混合し、ヘマサイトメ−タ−（Baxter Healthcare社、Deerfield、イリノイ州）上に載せ、計測した。
２×108個の脾臓細胞の試料を４×107個のNS−１細胞と結合させ、遠心分離し、そして上清を吸引した。チューブを軽くたたくことにより細胞の沈殿を緩め、2mlの37℃のPEG 1500（75mMヘペス、pH8.0中50％）を１分間にわたってかき混ぜながら加え、その後血清を含まないRPMI 14mlを７分間かけて加えた。さらに16mlのRPMIを加え、細胞を200gで10分間、遠心分離した。上清を廃棄した後、沈殿を、15％FBSあるいは胎児クローン、100μＭのヒポキサンチンナトリウム、0.4μＭアミノプテリン、16μＭチミジン（HAT）（Gibco）、25ユニット/ml IL−６（Boehringer社）および1.5×106個の胸腺細胞/mlを含む200mlのRPMI中に再懸濁した。懸濁液を10個の96穴平底組織培養プレートに、200μl/ウェルになるよう分配した。プレート中の細胞に、18G針（Becton Dickinson社）でそれぞれのウェルから約100μｌを取り、100μl/ウェルのプレート用培地（10ユニット/mlのIL−６を含み胸腺細胞を欠いている以外は、上記に記載したのと同じ）を加えることによって、典型的には、融合の後２、４および６日目の計三回栄養を与えた。
C.スクリーニング
細胞増殖が60〜80％の集密度（８〜10日目）に達した時、融合体26および42のそれぞれのウェルから培養上清を取り、縦列あるいは横列によりプールし、FACSにより親Ｌ細胞（融合体26）あるいは親CV−１細胞（融合体42）；（陰性対照）およびICAM−R DNAで形質導入されたＬ細胞（融合体26）あるいはCV−１細胞（融合体42）上で分析した。簡単に言えば、形質導入済および未形質導入のＬ細胞あるいはCV−１細胞を、EDTA（Versene）処理および細胞をプラスチックの組織培養容器から取り除くために軽く擦ることにより、培養物から回収した。細胞を、Ca2+およびMg2+を含むダルベッコのPBS中で２回洗浄し、「FA緩衝液」（Ｄ−PBSまたはRPMI1640のいずれか、１％BSA、10mM NaN3）中で１回洗浄し、そして、96穴丸底プレート中に、1.5〜2.0×105細胞/100μl FA緩衝液／ウエルの割合で分配した。この時点で、分析を４℃にて続けた。細胞を４℃にて臨床用遠心機中で沈澱させた。それぞれのウェルからの上清を注意深く吸い出し、分析用プレートのすべての部分を軽くたたくことにより、沈殿を壊した。100μｌのハイブリドーマ上清のプールを、12チャンネルのピペットマンを用いてウェルごとに加えた。モノクローナル抗体を含む上清のプールのそれぞれを親細胞および形質導入した細胞上の両方で、４℃にて、１時間インキュベートした。次に、分析用プレートを上記のようにFA緩衝液で２回洗浄した。最後の洗浄液を、FA緩衝液中で調製したヒツジ抗マウスIgG（完全な分子）−FITC結合物（Sigma社）のＦ（ab'）２断片の、50μl/ウェルの1:100希釈液と交換した。分析用プレートを、遮光しながら、４℃にて45分間インキュベートした。次に、分析用プレートを、NaN3のみを含む（すなわち、BSAを含まない）Ｄ−PBSで前記したのと同様に２回洗浄し、最後の洗浄液を、200μl/ウェルのＤ−PBS中の１％パラホルムアルデヒドと交換した。次に、試料を、Becton Dickinson FACscan解析機でのフローサイト・メトリック分析（FACS）のために、マルチチャンネルピペットマンでポリスチレンチューブに移した。
融合体43および46を、まず抗体捕捉ELISAによりスクリーニングし、ハイブリドーマ上清中のマウスIgGの存在について試験した。イムンロン４プレート（Dynatech社、Cambridge、マサチューセッツ州）を、４℃にて、50mMカーボネート緩衝液、pH9.6で1:5000に希釈した、50μl/ウェルのヤギ抗マウスIgA、IgG、あるいはIgM（Organon Teknika社、Durham、ノースカロライナ州）で被覆した。プレートを、３回、0.05％Tween20入りのPBS（PBST）で洗浄し、そして50μｌの培養上清を加えた。37℃にて30分間インキュベーションし、上述したように洗浄した後、PBST中で1:3500に希釈した、50μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウスIgG（fc）（Jackson ImmunoResearch社、West Grove、ペンシルバニア州）を加えた。プレートを上記のようにインキュベートし、PBSTで４回洗浄し、そして、1mg/ml o−フェニレンジアミン（シグマ社）および100mMクエン酸塩、pH4.5中の0.1μl/mlの30％過酸化水素からなる、100μｌの基質を加えた。発色反応は、50μｌの15％硫酸を加えて、５分間で停止させた。A490を自動プレートリーダーで計測した。
D.サブクローニング
陽性の縦列および横列の交点の個々のウェルからの上清（融合体26および42）、あるいはIgGを産生する個々のウェルからの上清（融合体43および46）を、次の日にFACSにより再スクリーニングした。Ｌ細胞あるいはICAM−R DNAで形質導入したＬ細胞を融合体26の抗体をスクリーニングするのに用い、CV−１細胞あるいはICAM−R DNAで形質導入したCV−１細胞を融合体42、43および46由来の抗体をスクリーニングするのに用いた。12個のウェル（26E3D−１、26E3E、26H3G、26H11C−２、26I8F−２、26I10E−２、26I10F、42C5H、42D9B、43H7C、46D7Eおよび35I12H）は、対照細胞に対し、ICAM−Ｒ形質導入体によく染まった。これらのウェルは、RPMI、15％FBS、100μＭヒポキサンチンナトリウム、16μＭチミジン、および10ユニット/ml IL−６（Boehringer社）中で２倍希釈することにより、連続して２〜３回サブクローン化した。４日後に、サブクローンプレートのウエルを視覚的に評価し、そして一番低い密度のウェル中のコロニーの数を記録した。それぞれのクローニングで選択されたウェルを、７〜10日後にFACSにより試験した。活性は、９つの系で保持されていた［26E3D−１（ATCC HB 11053）、26H11C−２（HB 11056）、26I8F−２（HB 11054）、26I10E−２（ATCC HB 11055）、42C5H（ATCC HB 11235）、42D9B（ATCC 11236）、43H7C（ATCC 11221）、46D7E（ATCC HB 11232）、および46I12H（ATCC HB 11231）］。最後のクローニングで、単一のコロニーを含む陽性のウェルを11％FBSを含むRPMI中で拡げた。
E.特徴付け
上記のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を、ELISA分析によってタイプ分けした。イムロン４プレート（Dynatech社）を、50mMカーボネート緩衝液、pH9.6中に1:5000で希釈した、50μl/ウェルのヤギ抗マウスIgA、IgGあるいはIgM（オルガノン・テクニカ）で、４℃にて被覆した。プレートを、37℃にて30分間、PBS中１％BSAでブロックし、0.05％Tween 20を含むPBS（PBST）で３回洗浄し、そして50μｌの培養上清（PBSTで1:10希釈された）を加えた。上記のようなインキュベーションおよび洗浄の後、１％の正常ヤギ血清入りのPBSTで1:1000希釈されている50μｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIgG1、G2a、G2bあるいはG3（Zymed社）を加えた。プレートを上記したようにインキュベートし、PBSTで４回洗浄し、100mMクエン酸塩、pH4.5中の1mg/ml o−フェニレンジアミン（シグマ社）および0.1μl/mlの30％過酸化水素からなる100μｌの基質を加えた。発色反応を15％硫酸50μｌの添加により５分間で停止させた。A490をプレートリーダーで計測した。その結果、ハイブリドーマ26E3D−１、42C5Hおよび46I12Hにより産生されたモノクローナル抗体はIgG2aであり、一方他の六つのモノクローナル抗体は、IgG1であることが判明した。
ICAM−Ｒ、ICAM−１、およびICAM−２に対するモノクローナル抗体を用いた、コントロール細部およびICAM−ＲあるいはICAM−1 DNAで形質転換した細胞の、間接蛍光抗体染色のFACS分析を行なった。染色は、実施例10CのFACS分析で記載したように行った。この時、5x105個の細胞当たり、0.1mlのハイブリドーマ培養上清（抗ICAM−Ｒ）あるいは１μｇの純粋なモノクローナル抗体（抗ICAM−１あるいはICAM−２）を用いた。この分析の結果は、図４にヒストグラム（分析した104個の細胞を示す）で表されている。抗ICAM−Ｒ抗体26H11C−２は、ICAM−R cDNAで形質導入したＬ細胞に特異的に結合したが、親のＬ細胞あるいはICAM−１形質導入Ｌ細胞には結合しなかった。ICAM−Ｒは、ICAM−１に対する抗体（Edward Clark,Washington大学のモノクローナル抗体LB2）あるいはICAM−２に対する抗体（IC2/2,Biosource Genetics社、Vacaville、カリフォルニア州）とは反応しなかった。平行した実験では、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3D−１、26I10E−２、および26I8F−２は、形質導入体に対して、モノクローナル抗体26H11C−２と同様の反応性を示した。抗ICAM−Ｒ抗体の42C5H、42DF9B、43H7C、46D7Eおよび46I12H抗体もまた、ICAM−Ｒで形質導入された細胞と特異的に反応したが、親のCV−１細胞あるいはICAM−１形質導入CV−１細胞とは反応しなかった。
Macaca fascicularisあるいはイヌ末梢血白血球の間接蛍光抗体のFACS分析を、９つの抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体を用いて行なった。20mlのヘパリン化Macaca fascicularisの血の20mlを280mlの赤血球溶血緩衝液で希釈し、室温で３〜５分間インキュベートし、そして５分間200gで遠心分離した。上清を廃棄した。沈殿を２％ウシ胎児血清を含む冷Ｄ−PBSで１回洗浄し、細胞をヘマサイトメータで計測した。20mlのヘパリン化したイヌの血を、２倍容量の、２％の必須でないアミノ酸（NEAA）を含むWaymouthの培地（Gibco社）で希釈した。それぞれ5mlの血液溶液を、4mlのヒストパークの上に上層し、1000gで20分間室温にて遠心分離した。細胞を中間面から回収し、２％のNEAAを含むWaymouthの培地中で１回洗浄し、そして上述したようにして計測した。それぞれの細胞の集団を、実施例10C中で述べたように染色し、そしてFACSにより分析した。抗ICAM−Ｒ抗体26I10Eおよび46I12Hは、サルPBLを特異的に染色したが、他の七つの抗体にはかような特異的な染色は観られなかった。イヌPBLを特異的に染色する抗体は、無かった。
F.精製
抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3D−１あるいは26I10E−２を含むハイブリドーマ培養上清を、1.5Mグリシン、3.0M NaCl、pH8.9に調整し、そして2mlのベッドボリュームのプロテインＡカラム（シグマ社）に載せた。1.5Mグリシン、3M NaCl、pH8.9での洗浄の後、カラムを100mMのクエン酸ナトリウム、pH4.0で溶出した。1mlの画分を100μｌの1.5Mトリス、pH8.8上に集めた。A280で決定した抗体を含む画分をプールし、PBSに対して透析した。
実施例11
ヒト末梢血白血球あるいはSKW3細胞（両方ともICAM−Ｒを発現する細胞）を用いた、FACSに基づいた競合分析により、モノクローナル抗体26I10Eおよび26E3Dが、ICAM−Ｒの離れたエピトープと免疫学的に反応性があることが示された。分析では、正常末梢血のフィコールハイパーク遠心分離により得られた、ヒト末梢血白血球（PBL）を、氷冷FACS緩衝液（0.1％アジ化ナトリウムおよび１％ウシ血清アルブミンを含むPBS）中で２回洗浄した。そして、２×105個の細胞を、５μｇの26E3D−１、26I10E−２、および対照のイソタイプIgG（シグマ社）のそれぞれを含む、ポリプロピレンチューブ中で３つずつインキュベートした。第一段階の抗体を含むすべてのチューブを、次に４℃にて30分間インキュベートし、冷FACS緩衝液中で２回洗浄した。それぞれの３つのチューブに、下記した各々の第二段階の抗体５μｇを加えた：ビオチン化26E3D−１、ビオチン化26I10E−２、ビオチン化抗ラットCD4（陰性対照）。すべての第二段階の抗体は、実施例９に記載の標準手法に従ってビオチン化され、そして、すべてのチューブを、次に４℃にてさらに30分間インキュベートし、FACS緩衝液中で、２回洗浄した。次に、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（Southern Biotechnology社、Birmingham、アラバマ州）の1:10希釈物の５μｌを、50μｌのFACS緩衝液を含むそれぞれのチューブに加え、そしてすべてのチューブを、４℃にて30分間インキュベートした。最後に、すべてのチューブをFACS緩衝液中で２回洗浄し、そしてフローサイトメトリー（FACScan,Becton−Dickson社）で分析した。モノクローナル抗体26I19E−２は、PBL上のICAM−Ｒに対するビオチン化26I10E−２の結合をブロックしたが、モノクローナル抗体26E3D−１の結合をブロックしなかった。同様に、モノクローナル抗体26E3D−１は、ビオチン化26E3D−１の結合をブロックしたが、モノクローナル抗体26I10E−２の結合をブロックしなかった。これらの結果から、２つの抗体が、ICAM−Ｒ上の異なるエピトープを認識していることが示された。以下のヒト細胞系SKW3を用いた時にも同様の結果が得られた。SKW3細胞を１μｇの抗体26E3D−１あるいは26I10E−２のいずれかで標識し、FACS緩衝液中で洗浄し、１μｇのビオチン化26E3D−１あるいはビオチン化26I10E−２とインキュベートした。次に、すべてのチューブをFACS緩衝液中で洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリンともに、４℃にて30分間インキュベートし、そしてFACScanにより分析した。分析においては、未標識の抗体（「ブロッキング」抗体）が、標識抗体のICAM−Ｒに対する結合を阻害すれば、それは、未標識の抗体が標識抗体とICAM−Ｒに対する結合で「競合する」こと、および二つの抗体がICAM−Ｒ上の同じエピトープを認識することを示す。未標識の抗体が、標識抗体の結合を「競合して離す」のに用いられる、競合分析の改変もまた、二つの抗体が同じエピトープを認識するかどうかを決定するために用いられる。
本発明の様々なモノクローナル抗体によって認識される特異的なICAM−Ｒエピトープは、三つの異なる方法により、マップされ得る。
A.マルチピンペプチド合成システムを用いたエピトープマッピング
本発明のICAM−Ｒ特異的抗体によって認識される一次エピトープのマッピングの第一の方法は、マルチピンペプチド合成システム（Chiron Mimotopes Pty.社、Victoria、オーストラリア）を利用する方法である。このシステムでは、目的のタンパク質の重複するセグメントを表す10個のアミノ酸ペプチドを、一連のプラスチックピンの表面上に置くものである。改変型ELISA試験を行い、それぞれのペプチドに対するモノクローナル抗体の結合を決定した。
ICAM−Ｒペプチドに対するモノクローナル抗体の結合を決定するためのELISAを、以下のように行なった。ピンを200μl/ウェルのブロッキング緩衝液（２％重量／容量BSA、0.1％容量／容量のTween20、0.01M PBS、pH7.2）を含む五つの96穴プレートに置き、20℃にて攪拌しながら１時間インキュベートした。ピンを175μl/ウェルの希釈していない抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体上清の入ったプレートに移し、４℃にて、攪拌しながら一晩インキュベーションした。次に、ピンを0.01M PBS、pH7.2で４回洗浄（20℃にて、攪拌しながら、10分間/1回の洗浄）し、接合希釈液（１％容量／容量のヒツジ血清、0.1％容量／容量のTween 20、0.1％重量／容量のカゼインナトリウム塩および0.01M PBS）で適当な濃度に希釈した175μl/ウェルのHRP−ヤギ抗マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）（Kirkegaard and Perry Laboratory社、Gaithersburg、メリーランド州）を含むプレート中に置いた。プレートを20℃にて１時間攪拌し、0.01M PBSで４回洗浄した。ピンをABTS基質溶液［基質緩衝液（17.9g/L Na2HPa4H2O、16.8g/Lクエン酸モノハイドレート、pH4.0）中の0.5mg/ml ABTS、0.01％重量／容量H2O2］を含むプレートに移し、45分間20℃にて攪拌し、次にプレートを410/495nmで読み取った。
個々のピンとの相対的反応性を、抗ICAM−Ｒおよび対照ハイブリドーマ上清の免疫グロブリン濃度の違いならびに分析実験間の陽性対象の反応性の違いを標準化した結果で決定した。それぞれの上清のマウスIgGレベルを、抗体捕捉ELISAで、以下のように決定した。イムロン４プレートを、実施例10Cに記載のように被覆し、そして洗浄した。PBST中で希釈した50μl/ウェルの培養上清［あるいは、PBST中で２倍にした既知濃度のマウスIgG1およびIgG2a（MOPC−21およびUPC−10）（シグマ社）］をプレートに加えた。室温にて１時間インキュベートしてPBSTで３回洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗マウスIgG（fc）（Jackson ImmunoResearch社、West Grove、ペンシルベニア州）をマウスIgG1用に1:2000に希釈し、IgG2a用に1:1000に希釈し、そして50μl/ウェルに加えた。プレートを室温にて１時間インキュベートしてPBST中で４回洗浄した後、残りの分析を実施例10Cに記載の方法に従って行った。培養上清の抗体の濃度は、測定した光学濃度をイソタイプに合った対照の標準曲線に当てはめることにより決定した。
モノクローナル抗体26E3D−２の強い反応性が、以下に示す、アミノ酸13〜23にわたる２つの重複するペプチドで認められた。
配列番号:27
VLSAGGSLFV
配列番号:28
LSAGGSLFVN
抗ICAM−Ｒ抗体と反応性のある領域は、以下の方法を用いて、明確にされ、および／または証明される。
B.細菌クローンのライブラリーを用いるエピトープマッピング
抗ICAM−Ｒ抗体によるエピトープマッピングもまた、Novatope Library Construction and Screening System（Novagen社、Madison、ウィスコンシン州）を用いて行った。この方法を用いて、調査するタンパク質由来の小さいペプチドを含んだポリペプチドを発現している細菌のクローンのライブラリーを作成した。次に、このライブラリーを、標準コロニーリフト方法により、モノクローナル抗体をプローブとして用い、スクリーニングした。
ICAM−Ｒの外部領域（１から480のアミノ酸）をコードする二本鎖DNAを、21℃にて10分間、10mMマンガンの存在下で異なる量のDNAse Iにより、pVZ147（実施例４参照）から切り出した。反応をEDTAで停止させ、反応液の1/10量を、エチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルを、適当なマーカーとともに電気泳動した。50〜150bpの範囲の断片を含む反応液をプールし、そして別の２％ゲル上で電気泳動した。50〜150bpの間の領域を取出し、その中に含まれる断片を透析チューブ（SP Brand Spectra/Por 2,MWCO 12〜14,000）中に電気溶出し、次にフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿した。
１μg DNAを、T4DNAポリメラーゼおよびすべての４つのdNTPsを用いて、製造元のプロトコールに従い、平滑末端化した。反応を、45℃で、10分間熱することにより停止し、次に、一つの3'dA残基を、Tth DNAポリメラーゼ（Novagen社）を用いて、付加させた。反応を、70℃で、15分間熱することにより停止し、そしてクロロホルムで抽出した。１μｇのDNAから開始した場合、最終濃度は、85μｌ中、11.8ng/μｌであった。dAテールを有する断片をpTOPE T−ベクター（Novagen社）中にライゲーションした。このベクターは、挿入体を安定な融合タンパク質として、T7DNAポリメラーゼ（この構造遺伝子は、宿主細胞中のレプリコン上に担われている）により発現させるために設計された。6ngの100bp DNA（0.2pmol）を用いて、ライゲーション反応を、16℃にて５時間行なった。NovaBlue（DE3）（Novagen社））細胞を１μｌ（1/10）の反応混合物で形質転換し、そしてLBアガー（カーベニシリン／テトラサイクリン）プレート上に拡げ、形質転換体の最初の計測値を得た。残りのライゲーション反応を、さらに16時間、16℃にて行なった。最初の載置に基づいて、２μｌのライゲーション反応液を40μｌのコンピテントNovaBlue（DE3）細胞を形質転換するために用いた。次に、八つのプレートを、抗体によるスクリーニングのために、約1250コロニー／プレートの密度に拡げた。
コロニーを、ニトロセルロース膜上で、クロロホルム蒸気室中で溶解して変性させる、標準コロニーリフト法を用いて、スクリーニングした。TBST（トリス緩衝液生理食塩水/Tween）中で1:10希釈した、抗ICAM−Ｒ抗体26E3D−１を一次抗体として用いて、アルカリホスファターゼ結合した二次試薬を用いて、分析を行なった。基質混合物を30分間インキュベートした。一つの単離されたコロニーは、強い陽性反応を示した。３つの他の領域（単離されていないコロニー）は、弱い陽性反応を示した。再スクリーニングのために、単離されたコロニーあるいはコロニー領域のスタブから画線培養を行った。26E3D−１の再プローブによって、単離されたコロニー由来の画線培養物が、基質との20分間のインキュベーションの後に、陽性の反応性領域を有していた。他の３つのコロニー領域の試料は陰性であった。ICAM−Ｒ反応性領域由来のスタブをもう一度画線培養し、37℃にて一晩インキュベートし、そして基質と10分間インキュベートすることにより再プローブした。多くの26E3D−１反応性コロニーが得られた。これらのコロニーから得られたプラスミドDNAは、配列決定することができ、26E3D−１反応性のエピトープに対応するアミノ酸配列を決定できる。
C.領域置換によるエピトープマッピング
本発明のモノクローナル抗体により認識されるICAM−Ｒの配座エピト−プは、領域置換実験によりマッピングできる。これらの実験では、ICAM−Ｒのキメラ変異体が調製される。キメラ変異体は、選択されたICAM−Ｒの免疫グロブリン様領域をICAM−１の一部と融合して調製される。そして、この変異体をFACSによって、本発明のモノクローナル抗体の結合について分析する。
図５は、キメラタンパク質の図であり、その構築については、以下に述べる通りである。番号１のタンパク質は、ICAM−Ｒのアミノ末端の免疫グロブリン様領域（残基１から93）を、ICAM−１（残基117から532）に融合したものを含む。番号２のタンパク質は、ICAM−Ｒのアミノ末端の始めの二つの免疫グロブリン様領域（残基１から190）をICAM−１（残基118から532）に融合したものを含む。番号３のタンパク質は、ICAM−Ｒの初めの３つの免疫グロブリン様領域（残基１から291）をICAM−１（残基317から532）に融合したものを含む。
番号１のタンパク質は、ICAM−ＲよびICAM−１のコード配列中の、それぞれの免疫グロブリン様領域１および２の境目に、唯一のNhe Ｉ部位を作ることにより調製された。ICAM−ＲのDNA配列を、実施例９に記載のように、M13BM21ベクター（Boehringer社）中にサブクローン化し、M13BM21 ICAM−Ｒと称する分子を得た。ICAM−１全体のコード配列［Simmonsら、Nature,331:624−627（1988）］をプラスミドpBSSK（＋）（Invitrogen社）中にサブクローン化した。得られたpBSSK（＋）ICAM−１を、Sal ＩおよびKpn Ｉで切断し、ICAM−１コード配列をマルチクローニングサイトの短いセグメントと共に取り出し、これを、制限酵素Sal ＩおよびKpn Ｉで切断したM13BM21にライゲーションし、M13BM21 ICAM−１と称する分子を得た。M13ファージ単離体をDNA配列分析で確認した。
以下の配列を有する、変異導入のためのオリゴヌクレオチドICAM1.D1.Nhe1（ICAM−１の426から393のヌクレオチドに対応する）およびICAMR.D1Nhe1（367から393のヌクレオチドに対応する）を通常の実験室の方法で合成した。
ICAM1.D1.Nhe１（配列番号:29）
AGAGGGGAGGGGTGCTAGCTCCACCCGTTCTGG
ICAMR.D1.Nhe１（配列番号:30）
GAGCGTGTGGAGCTAGCACCCCTGCCT
ICAM1.D1.Nhe１の16および19位のヌクレオチドおよびICAMR.D1.Nhe１の15位のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが、それぞれに相補的なDNA配列とアニールした時に、ミスマッチ塩基対を形成する。両方のオリゴヌクレオチドとも、エンドヌクレアーゼ Nhe Iの認識部位を導入する。このオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入により、これらオリゴの配列を、それぞれICAM−１およびICAM−Ｒ標的DNA配列のM13BM21 ICAM−１およびM13BM21 ICAM−Ｒに導入した。それぞれの変異誘発反応から得られたいくつかのファージ単離体の配列を決定し、正しいDNA配列が存在することを確認した。これらの単離体は、M13BM21 ICAM−R.Nhe IおよびM13BM21 ICAM−1.Nhe Iと命名された。
ICAM−Ｒシグナルペプチドおよび免疫グロブリン様領域１のコード領域を、以下の方法により、M13BM21 ICAM−R.Nhe Iから単離した。10μｇの精製した一本鎖M13BM21 ICAM−R.Nhe IファージDNAを、50ngのLacZユニバーサルー20プライマー（配列番号:26）にアリールした。アニールは、１×クレノウDNAポリメラーゼ緩衝液（10mM Tris−Cl pH7.5、5mM MgCl2、7.5mMジチオスレイトール）中で、混合物を65℃にて、５分間、次に、25℃にて５分間インキュベートすることにより行なった。次に、以下の混合物をアニーリング反応液に加えた：最終濃度33μＭのdATP、dGTP、dCTP、dTTP;4ユニットのクレノウDNAポリメラーゼ（Boehringer社）、および１×クレノウ緩衝液。プライマー伸長反応を、37℃にて45分間インキュベートして行い、１回のフェノール／クロロホルム（1:1）抽出およびエタノール沈殿により、反応を停止した。乾燥した沈殿を１×Eco R I緩衝液中に再懸濁し、そしてそれぞれ20ユニットのEco R IおよびNhe Ｉエンドヌクレアーゼを加え、37℃にて60分間インキュベーションした。ICAM−Ｒシグナルペプチドおよび免疫グロブリン様領域１のコード配列を含む、412bpの断片をアガロースゲル精製した。
免疫グロブリン様領域２から５、経膜的領域および細胞質領域のコード領域を含む、ICAM−１のDNA配列を、制限酵素消化により単離した。10μｇのプライマー伸長したM13BM21 ICAM−1.Nhe Iを、Nhe ＩおよびNot Ｉで切断した。これにより、アガロースゲル精製した1476bpのDNA断片が取り出された。
５μｇの哺乳類発現プラスミドpCDNAIAmp（Invirogen社）をEco R IおよびNot Ｉで消化し、スピンカラムクロマトグラフィーで精製した。20μｌのライゲーション混合液を以下の成分を含むように調製した:50ngのEco R IおよびNot Ｉ末端を有する直鎖状pCDNA1Amp、100ngの412bpのICAM−Ｒ断片、100ngの1476bpのICAM−１断片、１×リガーゼ緩衝液および１ユニットのDNAリガーゼ（Boehringer社）。反応液を25℃にて16時間インキュベートし、そしてコンピテントXL−１細胞（Biorad社）を形質転換するのに用いた。形質転換体を、最終濃度100μg/mlのカーベニシリンを添加したLBプレート上で選択した。形質転換体を標準ミニDNAプレップ法および実態分析のためのエンドヌクレアーゼによる消化を用いて分析した。pCDNA1Amp.RD1ID2−５と命名された単離体を発現の研究のために選択した。
タンパク質２およびタンパク質３のコード配列の構築のために、唯一のNhe Ｉ部位が、免疫グロブリン様領域２および３の間に作成されているか、あるいは唯一のAfl II部位が、免疫グロブリン様領域３および４の間に作成されているM13BM21 ICAM−１およびM13BM21 ICAM−Ｒの調製体を、上述のパラグラフと同様の方法で作成した。以下の配列を有する４つのオリゴヌクレオチド（ICAM−１のヌクレオチド686から713に対応するICAM−1.D2.Nhe Ｉ、ICAM−Ｒのヌクレオチド655から690に対応するICAM−R.D2.Nhe Ｉ、ICAM−１のヌクレオチド987から1026に対応するICAM−1.D3.Afl II、ICAM−Ｒのヌクレオチド962から993に対応するICAM−R.D3.Afl II）を、この目的のために合成した。
ICAM−1.D2.Nhe Ｉ（配列番号:31）
GGGGGAGTCGCTAGCAGGACAAAGGTC
ICAM−R.D2.Nhe Ｉ（配列番号:32）
CGAACCTTTGTCCTGCTAGCGACCCCCCCGCGCCTC
ICAM−1.D3.Afl II（配列番号:33）
TGAGACCTCTGGCTTCCTTAAGATCACGTTGGGCGCCGG
ICAM−R.D3.Afl II（配列番号:34）
GACCCATTGTGAACTTAAGCGAGCCCACCG
ICAM−1.D2.Nhe Ｉのヌクレオチド13;ICAM−R.D2.Nhe Ｉのヌクレオチド17、18および20;ICAM−1.D3.Afl IIのヌクレオチド17、18、20および22;およびICAM−R.D3.Afl IIのヌクレオチド15および17は、オリゴヌクレオチドが、それぞれに相補的なDNA配列にアニールした時、ミスマッチ塩基対を形成する。次に、ICAM−ＲおよびICAM−１の適当なコード配列（タンパク質２には、ICAM−１残基118から532をコードする配列に融合しているICAM−Ｒの初めの２つのアミノ末端の免疫グロブリン様領域をコードする配列、ならびにタンパク質３には、ICAM−１残基317から532をコードする配列に融合しているICAM−Ｒの初めの３つのアミノ末端の免疫グロブリン様領域をコードする配列）を発現プラスミドpCDNA1Amp（Invitrogen社）中にサブクローン化し、それぞれICAM−Ｒ変異体タンパク質２および３をコードする、pCDNA1Amp.RD1−2.D3−５およびpCDNAAmp.RD1−3.1D4−５を作成した。
ICAM−ＲあるいはICAM−1 cDNA配列の全長を含む対照のプラスミドを、ゲル精製したcDNA断片をプラスミドpCDNA1Ampにライゲーションすることによって作成した。２つのプラスミドpCDNA1Amp ICAM−１およびpCDNA1Amp ICAM−Ｒは、それぞれ全長のICAM−１およびICAM−Ｒタンパク質を発現し、等価の細胞内容物中で、天然のタンパク質に対するモノクローナル抗体の結合が評価され得るようにした。
これらの構築物をリン酸カルシウム共沈殿プロトコールによるラットＬ細胞の形質導入に用いた。この時、10μｇの2XCsClバンドしたpCDNA1Amp.RD1.1D2−５（タンパク質１）、pCDNA1Amp.RD1−2.1D3−５（タンパク質２）、pCDNAAmp.RD1−3.1D4−５（タンパク質３）、pCDNA1AmpICAM−１、pCDNA1AmpICAM−ＲあるいはpCDNA1Ampを用いる。このプロトコールでは、形質導入の48時間後、細胞を穏やかなトリプシン処理で皿から除去した。細胞を分けて、10μg/mlの濃度のモノクローナル抗体26E3D−１、26HIIC−２、26I8F−２、および26I10E−２あるいは対照のイソタイプに適合するモノクローナル抗体とともに、またはモノクローナル抗体が無い状態で、氷上で１時間インキュベートした。次に細胞を、先に実施例10Cに記載したように、FACS分析にかけた。
本発明の抗ICAM−Ｒ抗体のICAM−Ｒ変異体タンパク質との特異的な反応性は、ICAM−Ｒの特異的領域との反応性を示唆している。特定の領域が特定の抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体と反応することが確認されたら、それらの領域の個々の残基を、オリゴ特異的部位特異的変異導入により変え、モノクローナル抗体結合に対する、それらの相対的影響を調べる。タンパク質のハイドロパシーおよび二次構造を予測するコンピューターアルゴリズム（Kyteら、前出の文献）に基づいて、抗体との相互作用の能力を持つ特定の残基を変異導入の標的とする。
実施例12
ICAM−Ｒタンパク質の分布および様々な細胞および細胞系中におけるICAM−ＲのRNAの発現をそれぞれ、FACS分析およびノーザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。
A.ICAM−Ｒタンパク質分布のFACS分析
白血球細胞系および正常白血球中
白血球細胞系上で、抗ICAM−Ｒモノクロ−ナル抗体26HIIC−２、抗ICAM−１抗体（LB2）および抗CD18抗体（TS1/18、ATCC HB203）を用いて、実施例10Cに記載されたようにして行なったFACS分析から、ICAM−Ｒが、主要な白血球系統において、in vitroで増殖した細胞系、すなわち、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および骨髄細胞で広範に発現していることが示された。ICAM−Ｒの表面発現は、初期の赤白血病系K562上では検出されなかった。さらに、ICAM−Ｒは、培養ヒト臍静脈内皮細胞（HUVECS）により、腫瘍壊死因子による刺激前あるいは刺激後のいずれにも、検出できるほどには発現しなかった。この因子は、ICAM−１の発現を向上させた。この発現のパターンは、内皮細胞上で発現するICAM−２で見られたものとも異なっている。以下の表２は、それぞれの細胞の試料の平均蛍光、および各細胞試料中の対照に対する陽性細胞の百分率を示している（例えば、平均蛍光13/11％陽性細胞）。
0003616090.tif 000003
B.ヒトおよびマカクザルの白血球における
ICAM−Ｒ分布のFACS分析
実施例10Cに記載に従って、正常ヒトおよびマカクザル末梢血白血球上で、FACS分析を行なった。これにより、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26HIIC−２が、リンパ球、単球および顆粒球の、三つの主要なヒト白血球系統と反応することがわかった。表２の最後の６つの項目を参照のこと。さらに、モノクローナル抗体26I10E−２および46I12Hは、マカクザル白血球と交差反応した（表２および実施例10E）。これにより、これらのモノクローナル抗体が、この動物中で実行される疾病モデル中でのICAM−Ｒの発現をモニタ−するのに有用であり得ることが示された。
ヒト細気管支洗浄細胞（第一マクロファージ）を、５つの抗ICAM−Ｒ抗体（26H11C−２、26I8F−２、26I10E−２、42D9B、43H11C）で、実施例10に記載した様にして染色し、FACSにより分析をした。どの抗体も特異的にこれらの細胞を染色しなかった。（肺組織中のICAM−Ｒの発現が記載されている実施例14を参照のこと。）
C.白血球細胞系およびHUVECS中における
ICAM−R RNA発現のノーザンブロット分析
RNAを、ヒト白血球細胞系およびHUVECSから、実施例７の記載に従って抽出した。そして、ICAM−ＲあるいはICAM−1 cDNAのいずれかでプローブ接触することにより、（実施例７に記載されている）ノーザンハイブリダイゼーションによる分析を行なった。最初のハイブリダイゼーションのリン光体イメージングの後、ブロットを細長く切り、ヒトアクチンプローブを用いて、再分析した。アクチン標準化したICAM−ＲおよびICAM−１でプローブしたブロットのノーザンの結果は、図６（ＡからＢ）に棒グラフとして表されている。RNAレベルでは、ICAM−Ｒは、様々な白血球細胞タイプ中に発現した。ICAM−R RNA発現は、必ずしもICAM−1 RNAの発現と同じではなかった。例えば、刺激していないHUVECSは、低いレベルのICAM−１を発現し、発現はTNF刺激の後に上昇した（図6B）。これに対して、検出し得るレベルのICAM−Ｒメッセージは、未刺激あるいは刺激済HUVECS中で観られなかった（図6A）。
実施例13
表面をビチオン化したヒト細胞系KG1a、K562およびCEMの、界面活性剤で可溶化した溶解物の免疫沈降を、４つの抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体（26H11C−２、26E3D−１、26I10E−２、および26I8F−２）を用いて行なった。
ヒト白血球細胞系KG1、K562、およびCEM上の細胞表面タンパク質を、以下のようなスルホ−NHS−ビチオン（Pierce Chemical社、Rockford、イリノイ州）との反応により標識した。それぞれの反応で、0.5〜１×107個の細胞を、リン酸緩衝液生理食塩水（PBS）中で２回洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁し、そしてPBS中で希釈した10μｌの100mMスルホ−NHS−ビチオンを加えた。37℃にて10分間インキュベートした後、細胞をPBSで１回洗浄し、そして4mlの10mMトリスpH8.4、0.25M蔗糖を加えた。そして、次に細胞を４℃にて30分間穏やかに混合しながらインキュベートした。細胞を遠心分離により沈澱し、上清を吸引し、そして沈殿を300μｌの10mMトリスpH8、50mM NaCl、１％トリトンＸ−100、1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド、1mM EDTAで氷上で15分間インキュベートしながら溶解した。溶解物を遠心分離で洗浄し、上清を、25μｌの正常マウス血清を加えて、４℃にて１時間インキュベーションすることにより前処理した。この工程の後、あらかじめ20μｇのアフィニティー精製したウサギ抗マウス免疫グロブリン（Zymed社）と共にインキュベートしておいた、プロテインＡセファロースビーズ（シグマ社）の20μｌの50/50（v/v）溶液を加えた。４℃にて30分間インキュベーションした後、遠心分離によりセファロースビーズを除去した。
次に、ウサギ抗マウス免疫グロブリン、および抗ICAM−ＲあるいはコントロールのIgG1あるいはIgG2aモノクローナル抗体のいずれかと連続的にインキュベーションすることによりあらかじめ結合しておいた、20μｌのセファロースビーズを加えることにより、特異的免疫沈降を行なった。４℃にて攪拌しながら一晩インキュベーションをした後、セファロースビーズを微量遠心機中で沈澱し、そして1ml 10mMヘペスpH7.3、150mM NaCl、１％トリトンＸ−100で２回;0.1MトリスpH8、0.5M LiCl、１％βメルカプトエタノールで１回；そして20mMトリスpH7.5、50mM NaCl、0.5％NP−40で１回、連続的に洗浄した。次に、ビーズを50μｌの150mMトリスpH6.8、ブロムフェノールブルー、20％βメルカプトエタノール、４％SDS、および20％グリセロールで溶出し、５分間煮沸し、そして遠心分離で沈澱した。次に、得られた溶出液の35μｌをSDS−PAGE（10％アクリルアミド）で分析した。電気泳動の後、タンパク質を、イモビロンＰメンブレン（Millipore社、Bedford、マサチューセッツ州）上に電気ブロットし、そして、0.2％Tween−20を含むトリス緩衝液生理食塩水で希釈した、２％ウシ血清アルブミン中で４℃で20分間インキュベートした。次にブロットをストレプトアビジン（Vector社）に結合したセイヨウワサビペルオキシダーゼと、TBS−Tween中で、室温にて20分間インキュベーションした。TBS−Tween中で３回洗浄した後、ECLウエスタンブロッティング検出試薬（Amersham社）を加え、化学ルミネセンスバンドをKodak X−OMAT−ARフィルム上で視覚化した。
図７（ＡからＢ）に、ウエスタンブロットの結果を示す。KG1細胞由来のモノクローナル抗体26H11C−２との免疫沈降で、特異的に沈降した120kDのバンドが見られたが、K562細胞由来のものでは認められなかった（図7Aを参照のこと）。
Ｔ細胞系CEMの免疫沈降物中にも、120kDのバンドが見られた（図7B、ここでレーンＡは、モノクローナル抗体26H11C−２と；レーンＢは、モノクロ−ナル抗体26I10E−２と；レーンＣは、モノクローナル抗体2618Eと；レーンＤは、モノクローナル抗体26E3D−１と；およびレーンＥは、陰性対照抗体とそれぞれ反応した）。他の免疫沈降で見られるICAM−Ｒが示すバンドの大きさは、細胞により多少異なった。あるリンパ様細胞の116kD以下から、ある骨髄細胞の140kD以下までの範囲のバンドが観られた。ICAM−Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、コアペプチドの予測サイズ（約52kD）と、これらの結果から、ICAM−Ｒが翻訳後に高度に修飾され、タンパク質の成熟細胞表面型が得られていることがわかる。
実施例14
抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26I10E−２、26E3D−１および26H11C−２、および対照抗体による、免疫組織学的染色を、扁桃、脾臓、肝臓、肺、腎臓、心臓、消化器系、皮膚、滑膜、および脳（正常脳組織および多発性硬化症に冒された脳組織）を含む様々なヒト組織に関して行った。異なる抗ICAM−Ｒ抗体と、精製した抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3Dあるいはハイブリドーマ上清を用いて、類似の染色パターンが得られた。
様々な組織の切片（6um）を、Vectabond（Vector社）で被覆したスライド上に載せ、そして−70℃にて保存した（切片のいくつかは、−20℃で保存した）。使用前に、スライドを−70℃から取り、55℃にて５分間置いた。次に、切片を冷アセトン中で10分間固定し、そして空気乾燥した。切片を１％BSA、60％正常ヒト血清、および６％正常ウマ血清を含む溶液中で、室温にて30分間ブロックした。ICAM−Ｒに対する一次抗体、陰性対照抗体、抗ICAM−１モノクローナル抗体あるいは抗ICAM−２モノクローナル抗体をそれぞれの切片に、室温にて１時間作用させた。スライドを１×PBSTに３回、それぞれ５分間ずつ浸すことにより、未結合の抗体を洗い落とした。次に、ビオチン化抗マウス免疫グロブリン（Vector社）をそれぞれの切片に同様にして作用させた。ABC−HPO（Avidin−Biotin複合体−HPO）を二次抗体の検出に用いた。1mlの１％BSA/PBST中で試薬Ｂ（9ul）（Vector社）と結合した試薬Ａの溶液（9ul）（Vector社）を、それぞれの切片に室温にて30分間作用させた。次に、スライドを１×PBST中で３回洗浄した。DAB基質（3'3ジアミノベンジジン−４塩酸塩、シグマ社）（ストック:0.05Mトリス緩衝液、pH7.6中で1:10に希釈した600mg/ml DAB、最終濃度１％になるように加えられた３％過酸化水素水）をそれぞれのスライドに、室温にて８分間作用させた。スライドを水中で５〜10分間室温にて洗浄し、次に１％オスミウム酸を、（着色を促進するために）室温で１分間加えた。次に、スライドを生水で５〜10分間洗浄し、そして室温にて30秒間、１％Nuclear Fast Red（NFR）中で対比染色した。最後に、スライドをアルコール脱水し、ヒストロクリアー処理し、そしてヒストマウントを用いて、カバーガラスを取り付けた。
モノクローナル抗体で染色した結果の代表的なものを、図８（ＡからＧ）に顕微鏡写真として示す。この中で、図8A、8B、および8Eの組織は、ヒト扁桃;8Cおよび8Dは、ヒト肝臓;8Fは、多発性硬化症のヒト患者由来の脳；そして8Gは正常ヒト脳である。8A、8C、8F、および8Gに示されるセクションは、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26I10E−２で染色された。8Bおよび8Dに示した切片は、陰性対照抗体で染色され、一方、8Eに示される切片は、抗ICAM−１抗体で染色された。染色により、扁桃のようなリンパ組織中で高レベルのICAM−Ｒが発現していることが明らかになった（8A）。発現は、肝臓のような他の非リンパ器官中の組織白血球上からも検出された。例えば、Kupfer細胞（肝臓マクロファージ）は、明らかに染色された（8C）。ICAM−１およびICAM−Ｒ発現がin vivoで別々に調節されていることの証拠が、扁桃およびリンパ節での染色パターンで観られた。ICAM−１は、第二濾胞の胚中心のＢ細胞上でよく発現し、第一濾胞中では発現しない。一方、ICAM−Ｒは、第一濾胞中の細胞で発現し、胚中心中では発現しない（8Aおよび8E）。意味深いことに、ICAM−Ｒ発現は、炎症部位に浸潤している白血球上にも検出された。例えば、ICAM−Ｒの発現は、多発性硬化症に冒されている個体の脳組織中の、管周辺に浸潤している白血球上でも検出された（8F）。正常な個体由来の脳組織の解剖学的に等しい位置では、同様の染色は見られなかった（8G）。ICAM−Ｒ発現は、関節の滑液に浸潤する白血球上でも検出された。さらに、ICAM−１およびICAM−２の発現は、内皮リグニング管上で検出されたが、ICAM−Ｒは、典型的には、管内皮上では見られなかった。ICAM−Ｒの発現は、肺の肺胞細胞上で検出された。
より一般的には、ICAM−Ｒを発現する細胞は、すべての正常組織および病気の組織中に検出された。これらのICAM−Ｒ発現細胞は、形態学的に白血球および抗原提示細胞と同定され得る。非リンパ組織中では、抗ICAM−Ｒ抗体で標識された細胞の形態は、固有の組織マクロファージおよび抗原提示細胞と一致した。
ICAM−Ｒが異なる組織および上皮上に広く分布しているのに対して、ICAM−２は、ほとんど、正常組織および病気の組織の血管中にのみ発現し、一方ICAM−１は、血管および白血球の両方に発現するが、ほとんどは病気の組織中であった。
実施例15
ICAM−Ｒが同型の細胞の接着に関与しているか否かを調べるために、ICAM−Ｒを発現する細胞系の一群で凝集分析を行った。これらの細胞系には、Ｔリンパ芽球細胞系（SupT1、CEM、Molt4、Hut78、Jurkat、SKW3）、Ｂリンパ芽球細胞系（Jijoye,Raji）、単球細胞系（U937、HL60）、骨髄細胞系（KG−１）、および赤白血球細胞系K562が含まれる。ICAM−Ｒ分子の機能を調べるために、凝集を分析する前に、細胞を様々な抗体とインキュベートした。ハイブリドーマ26H11C−２、26I10E3−２、26E3D−１および26I8F−２によって調製された抗ICAM−Ｒ上清、ならびにβ２インテグリン経路を通じて凝集をブロックすることが知られている抗体調製物が用いられた。これらは、LFA−１のβサブユニットであるCD18分子に特異的なTS1/18（AtCC HB203）;LFA−１のα鎖であるCD11a分子に特異的なTS1/22（ATCC HB202）；およびMAC−１のαサブユニットであるCD11b分子に特異的なLM2/1（ATCC HB204）である。精製した抗ICAM−１抗体およびVLA−４分子のα鎖に対するハイブリドーマ（ハイブリドーマクローン163H:Michael Longenecker社、Alberta、カナダ）上清を対照として用いた。
凝集分析を、ホルボール12−ミリステート13−アセテート（PMA）（50ng/ml）を添加あるいは無添加にて二連で行なった。10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640中の３×105個の細胞を、平底96穴マイクロテストプレート中に加えた。１つの抗体を実験で試験した時、50μｌの精製した抗体あるいはハイブリドーマ上清をウェル中に加えた（選択されたウェルに、同時にPMAを加えた）。二つの抗体を実験で試験した時、抗体は、室温にて、細胞に連続的に加えられ、それぞれ30分間インキュベート（37℃で15分間のインキュベーションでも同じ結果が得られた）し、そして細胞を37℃でインキュベートした。PMAを加える前にあるいはPMAと同時に、抗体を細胞とインキュベーションしても、凝集の結果に有為な変化はなかった。単数あるいは複数の抗体とインキュベーションした後、細胞を均一に再懸濁し、そして次に37℃にて４から24時間インキュベートした。凝集の評価を倒立顕微鏡で行なった。それぞれの実験で、PMA刺激の効果を、Raji細胞を等量のPMAで刺激し、そしてCD18、CD11aおよびICAM−１分子に対するモノクローナル抗体によりブロックされ得る凝集の量を測定することにより、平行して確認した。
以下の表３は、PMAを加えた１つの代表的な凝集の実験の結果を示すものである。凝集の評価は、０から５までの範囲でなされている。ここで、０は細胞が全く集合していないことを示し;1は細胞の10％未満が集合していることを示し;2は細胞の10から50％が凝集していることを示し;3は細胞の50から100％が緩い集合になっていることを示し;4は細胞のほとんど100％が一体的な凝集体になっていることを示す。
0003616090.tif 000004
興味深いことに、ICAM−Ｒに特異的な三つの抗体（26H11C−２、26E3D−１および26I8F−２）が同型の細胞間の凝集を刺激した（26H3D−１および26I8F−２のデータは示さず）。刺激は、ホルボールエステル（PMA）のような共刺激剤の存在および非存在下の両方で起こった。四番目の抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体（26I10E−２）は、細胞凝集を刺激しなかったが、他の抗ICAM−Ｒ抗体によって刺激された凝集をブロックした。抗ICAM−Ｒ抗体で刺激されたPMA処理細胞の凝集の少なくとも一部は、CD18あるいはCD11aに対するモノクローナル抗体での前処理によりブロックされた。このことから、１つ以上のロイコインテグリンが、このタイプの接着に関与し得ることがわかった。
凝集が、抗ICAM−Ｒ抗体26H11C−２、26E3D−１および26I8F−２により誘導されたことを確かめるために、同じ抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体（26E3D）から精製された完全な免疫グロブリン（26E3D−Ig）およびFab'断片（26E3D−Fab'）の両方を用いて、凝集分析を行なった。Fab'断片の産生には、Johnstoneら、Blackwell,Immunochemistry in Practice,Oxford Press（1982）の第52頁を参照のこと。分析は、26E3D−Igおよび26E3D−Fab'を１μg/mlの濃度で用い、上述した方法に従ってSKW3T細胞で行なわれた。抗CD18および抗ICAM−Ｒ（26E3D−上清および26I10E−上清）ハイブリドーマを対照として用いた。４時間の後、完全な免疫グロブリンについて、Fab'断片あるいは26E3D上清と同じ細胞凝集の増加が見られた（下記の表４を参照のこと）。
0003616090.tif 000005
抗CD18上清あるいは抗ICAM−R 26I10E上清での凝集の増加は見られなかった。これらの結果から、凝集が強められたのは、抗体が介在する細胞同士の結合によったものであるという、当然の説明が導きだされた。この場合、選択された抗体によるICAM−Ｒタンパク質の結びつきは、結合した細胞の接着力を変えるシグナルを伝達するものである。
実施例16
免疫系細胞の活性化および増殖のプロセスは、細胞現象の連続性によって認識される。ある種の細胞表面細胞分子（例えば、CD69およびトランスフェリンレセプタ−）の上昇は、細胞活性化の初期マーカーである。同様に、細胞の凝集は、活性化のプロセスの初期に起こる。IL−２レセプターの上昇は、後期段階の中間で起こり、細胞増殖は、後の現象である。ICAM−Ｒが免疫細胞の活性化／増殖に関与する程度を決定するために、二つのタイプの実験を行なった。１番目のタイプでは、形質導入した細胞の表面に存在するICAM−Ｒの、リンパ球の増殖を刺激する能力が調べられた。２番目のタイプでは、ICAM−Ｒ上の異なるエピトープを認識する本発明の抗体が、ICAM−Ｒの外部領域と結合するためにプローブとして用いられ、抗体結合単独あるいは他の刺激剤との組合せの、リンパ球の活性化と増殖に与える影響を調べた。
ICAM−R cDNAあるいはICAM−1 cDNAで形質導入したマウスＬ細胞（実施例７）を分析して、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）の増殖を刺激する能力を調べた。測定は、DNA複製の割合の変化を示す3H−チミジン取込み分析で行なった。形質導入されていないマウスＬ細胞あるいは形質導入されているＬ細胞は、組織培養フラスコからのトリプシン処理により得られ、10％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640中で洗浄した。120ulの組織培養培地（10％ウシ胎児血清を含むRPMI−1640）中の５×104個のＬ細胞を、滅菌した96穴平底組織培養プレートの個々のウェルに加え、そしてプレートを、37℃にて24〜36時間、５％CO2インキュベーターで、インキュベートした。次に、培地を滅菌状態で除去し、そして２×105個の新しく単離したPBMC（全容量は、組織培養培地で200ul）を、形質導入したマウスＬ細胞あるいは形質導入していないマウスＬ細胞を含むそれぞれのウェルに加えた。PBMCを、Ｌ細胞を含まない対照のウェルにも加えた。PBMCは、健康なドナーからヒストパークグラジエント（シグマ社）での遠心分離によって、あらかじめ単離した。新鮮な末梢血を等量のPBSと混合し、ヒストパーク上に上層し、そして、450gで20分間、制動無しで遠心分離した。PBMCを含む画分を回収し、PBS中で洗浄し、ウェルに加える前に、１×106個の生存能力のある細胞/mlに調整した。次に、組織培養プレートを、最終濃度5ng/mlのPMAの存在下あるいは非存在下のいずれかで、計４日間インキュベートした。次に、1uCiの3H−チミジン（NEN社、Boston、マサチューセッツ州）を個々のウェルに、培養の最後の18〜24時間加えた後に、リンパ球の増殖を評価した。次に、PHDモデルプレートハーベスター（Costar社、Cambridge、マサチューセッツ州）を用いて、それぞれのウェルの内容をグラスファイバーフィルター片上に回収することによって、すべての培養を終えた。次に、それぞれのフィルターマットを、3mlのエコリウム・シンチレーションカクテル（ICN Biomedicals社、Costa Mesa、カリフォルニア州）中に置き、βシンチレーションカウンターを使って計数した。ICAM−Ｒを発現するLTK細胞は、形質導入していない対照のLTK細胞あるいはどの刺激剤も無い状態と比べて、PBMCの増殖を刺激した（DNA複製の増加によって示された）。ICAM−１を発現するLTK細胞は、PBMCの増殖をほぼ同程度に誘導した。PBMC上のレセプター（単数あるいは複数）に結合することによって、ICAM−Ｒは、細胞間シグナルをPBMCに伝え、この場合、細胞増殖の結果となる。
本発明の抗ICAM−Ｒ抗体もまた、免疫細胞の活性化および増殖に与える影響を調べるために試験した。
まず、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体の、細胞活性化の最初の現象に影響を与える能力について、予備的に試験した。これらの現象には、フローサイトメトリー分析で測定される標的の細胞上の、細胞表面分子CD69、トランスフェリンレセプターおよびIL−２レセプターの上昇が含まれる。刺激されていないリンパ球は、低いレベルのトランスフェリンおよびIL−２レセプターを発現している。レセプターの発現は、リンパ球が活性化された時に、著しく増加した。
抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3D−１および26I10E−２のそれぞれを、他の誘導刺激剤の非存在下で、PMBC活性化を誘導する能力について試験した。モノクローナル抗体26E3D−１あるいは26I10E−２（あるいは対照のモノクローナル抗体）を、96穴平底組織培養プレート個々のウェルに加え（PBS中に10μg/ウェル）、37℃にて、５％CO2インキュベーター中で、３時間インキュベートした。プレートを、滅菌したPBSで３回洗浄し、未結合の抗体を除去し、そして新たに単離されたPBMCをすぐに加え、最終濃度を200μｌの培地中で２×105個の細胞／ウェルとした。次に、プレートを１日あるいは３日のどちらかの期間、インキュベートし、この異なる抗体の存在下で培養した細胞を取り除き、0.01％アジ化ナトリウムおよび１％BSA（FACS緩衝液）を含むPBS中で、上記のように洗浄し、FITC（Becton Dickinson社）結合した陰性対照抗体あるいはFITC接合した抗CD69、抗トランスフェリンレセプターおよび抗IL−２レセプター抗体のいずれかで染色した。FACScan分析の結果を得た。IL−２レセプター以外のCD69およびトランスフェリンレセプターの発現は、PBMCを固定化（すなわち、架橋）抗体26E3D−１上で培養したとき１日後に増加したが、固定化抗体26I10−２上で培養したときは増加しなかった。固定化した26E3D−１あるいは26I10E−２上で３日間インキュベートしたPBMCは、トランスフェリンレセプターおよびIL−２レセプターの両方の細胞表面発現のレベルが増加したが、CD69は増加しなかった。しかしながら、これらのリンパ球活性化マーカーの発現の増加が１日および３日後に観察されたが、この発現の増加は、細胞のサイズによってもたらされるものではなかった。これらの結果から、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3D−１および26I10E−２が、別の外来性の刺激剤の非存在下で、PMBC活性化の初期の現象を直接誘導することができるが、この活性化によって、胚形質転換および関連した細胞の大きさの増加の結果にはつながらなかった。
抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体はまた、固定化抗CD3モノクローナル抗体G19［Ledbetterら、J.Immuno.,135（４）:2331−2336（1985）］によって刺激されるPMBC活性化の初期現象を変える能力について試験した。モノクローナル抗体G19は、Ｔ細胞上のCD3複合体（Ｔ細胞レセプター）に結合し、そしてＴ細胞を活性化する。PBMCを、抗CD3抗体（0.05μg/ウェル）単独であらかじめ被覆しておいたウェル中で培養したとき、CD69の発現のみが１日後に上昇した。３日後、CD69、トランスフェリンレセプターおよびIL−２の細胞表面発現は著しく上昇した。これらの活性化マーカーの上昇は、細胞の大きさの増加と相関関係にあった。
10μｇの抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3Dあるいは26I10E（あるいはHLAクラスＩの対照モノクローナル抗体;Serotec,Oxford,England）を、0.025μg/ウェルの抗CD3抗体が最初に存在あるいは欠如している96穴平底組織培養プレートのそれぞれのウェルに加え、その後、未結合の抗体を除去するために洗浄した。新しく得られたPBMCをすぐに加えた（２×105個の細胞／ウェル）。次に細胞を計16時間あるいは３日間インキュベートし、氷冷FACS緩衝液中で２回洗浄した。２×105個の細胞を、次に50μｌの氷冷FACS緩衝液中で再懸濁し、そして５μｌのFITC接合抗CD69、抗トランスフェリンレセプター、抗IL−２レセプター抗体あるいは抗FITC接合対照Igを加えた。細胞を４℃にて30分間インキュベートし、そして次に0.5mlの氷冷FACS緩衝液で２回洗浄した。最後の洗浄の後、細胞を0.5mlの氷冷FACS緩衝液中に再懸濁し、蛍光をFACScan分析で測定した。PBMCを、0.025μg/ウェルの固定化抗CD−３（単独あるいはHLAクラスＩに対する固定化抗体の存在中）上で、３日間培養した時、トランスフェリンおよびIL−２レセプターの発現は、このような低い量の固定化抗CD3では、上昇しない。これに対して、0.025μg/ウエルの固定化抗CD3および固定化抗ICAM−Ｒ抗体26E3D−１あるいは26I10E−２のいずれかの存在下で、PBMCを培養したところ、トランスフェリンおよびIL−２レセプターの両方の有為な上昇の結果となった。抗体26E3D−１では、効果はより明らかであった。16時間の培養の後もまた、同様の結果が得られた。固定化した26E3D−１あるいは26I10E−２抗体の存在下での低い量の抗CD3により、CD69の発現が誘導されたが、トランスフェリンレセプターは誘導されなかった。一方、固定化した抗HLA−Ｉの存在下での低い量の抗CD3（0.025μg/ウエル）は、CD69あるいはトランスフェリンレセプターの発現の増加を誘導しなかった。これらの結果から、これらの抗ICAM−Ｒ抗体が、初期の免疫細胞活性化事象の共刺激分子として役立ち得ることがわかった。
第二に、抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体が細胞増殖の後期現象に関与しているかどうかを、再び3H−チミジン取込み分析による測定で決定するために、予備実験を行なった。
ICAM−Ｒに対するモノクローナル抗体を、ヒト組換えIL−２の存在あるいは非存在のいずれかで、PMBC増殖を直接刺激する能力について試験した。このヒト組換えIL−２は、細胞増殖を強化するが誘導はしない。PBS中の10μｇのICAM−Ｒモノクローナル抗体26I10E−２および26E3D−１（あるいは対照IgG1およびIgG2）抗体）を、96穴平底組織培養プレートのそれぞれのウェルに加え、そしてプレートを37℃にて３〜４時間、５％CO2インキュベーター中でインキュベートした。インキュベーションの後、それぞれのウエルをPBSで３回洗浄し、新鮮なPBLを、最終濃度が200μｌ中２×105個の細胞／ウェルになるように加えた。次に、10ユニット/mlのヒト組換えIL−２（Genzyme社、Boston、マサチューセッツ州）を、選択されたウェルに加えた。プレートを計３日間、37℃にて５％CO2インキュベーター中でインキュベートした。PMBCによる3H−チミジン取込みを本実施例の前半の記載に従って測定した。抗ICAM−Ｒ抗体26E3Dおよび26I10Eは、rIL2の存在下でさえも、PBMC増殖を誘導しなかった。リンパ球増殖の陽性対照は、固定化した抗CD3および抗LFA−１（60.3）［Beattay J.Immunol.,131:2913−2918（1983）］モノクローナル抗体を含んでいた。これらの結果から、固定化抗ICAM−Ｒ抗体は、CD69などのような活性化マーカーの発現を刺激するが、それら自身では、多数のPBMCが細胞サイクルのＳ期入りを、直接刺激することはないことがわかる。
抗ICAM−Ｒ抗体は、抗CD3抗体と共に、初期のPBMC活性化現象を刺激するため、抗ICAM−Ｒ抗体を、固定化した抗CD3抗体により誘導されたリンパ球増殖を共に刺激する能力について試験した。正常ドナーからPBMCを得て、組織培養培地中、１×106個の生存する細胞/mlの濃度に調整した。96穴底板組織培養プレートの個々のウェルを0.001μｇの抗CD3モノクローナル抗体G19/ウェルであらかじめ被覆した。プレートを、37℃にて５％CO2インキュベーター中で３時間インキュベートし、未結合抗体をウェルをPBS中で３回洗浄することにより、除去した。最後のPBS洗浄の後、ICAM−Ｒに対するモノクローナル抗体（26I10E−２あるいは26E3D−１）あるいは対照抗体を、最終濃度10μg/ウェルですぐに加えた。次に、プレートをさらに37℃にて３時間再インキュベーションした。ウェルを再びPBSで３回洗浄し、未結合の抗体を除去し、そして新しく単離したPBMCをウェルに直ちに加えた（200μ／ウエルの容量中２×105個の細胞）。次に、プレートを３日インキュベートした。リンパ球の増殖は、PMBCの3H−チミジン取込みで測定した。固定化抗ICAM−Ｒ抗体26E3D−１は、PBMC細胞の抗CD3に対する反応を増加させた。固定化抗ICAM−Ｒ抗体の、抗CD3モノクローナル抗体により誘導されるPBMC凝集（PBMC増殖より初期の現象）に対する影響もまた、この実験で調べた。抗CD3で刺激される凝集は、抗体26E3D−１によりほぼ100％阻害されたが、固定化26I10E−２には影響されず、そして抗体26H11C−２および抗体26I8F−２によってはわずかに阻害された。
ICAM−Ｒを発現する細胞の増殖に影響を及ぼす抗ICAM−Ｒ抗体の能力の分析の結果から、本発明の抗体のICAM−Ｒに対する結合により細胞内シグナルがPBMCに伝達され、それが細胞増殖を調節する。
最後に、ICAM−Ｒが細胞と細胞の接触に依存するＴリンパ球活性化の初期現象に関与するかどうかを調べる予備実験も行った。
超抗原により誘導されたヒト末梢血リンパ球（PBL）の増殖および凝集を、本発明のICAM−Ｒ特異的抗体の存在下で評価した。可溶性およびプレート結合した26E3D−１、26I10E−２および抗HLAクラスＩ対照Ｂ−H9（Serotec社）抗体の、増殖および細胞凝集に与える影響を、ヒトPBLをスタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（SEA）（Toxin Technology社、Sarasota、フロリダ州）での刺激の３日後に測定した。プレートに結合した抗体は、培養の日に以下のようにして調製した。精製した抗体（0.1ml PBS中10μｇ）を96穴平底プレートのそれぞれのウェルに加えた。次に、プレートを37℃にて４時間インキュベートした。インキュベーションの後、未結合の抗体を、それぞれのウェルを吸引しかつ新鮮なPBSで４回洗浄することによって、除去した。ヒトPBLを健康なドナーから、ヒストパーク（シグマ社）グラジエント上で単離した。新鮮な末梢血を等量のリン酸緩衝液生理食塩水（PBS）と混合し、ヒストパーク上に上層し、そして450×ｇで20分間、正動無しで遠心分離した。リンパ球の画分を回収し、そして10％ウシ胎児血清を含む新鮮なRPMIを加えることによって２回洗浄し、そして８分間200×ｇで遠心分離した。PBLを最終容量10mlのRPMI−FBS中で懸濁した。生存しているPBLを成体色素排除法を用いて計数した。20μｌの0.4％トリパンブルー染色（Gibco社）中の細胞懸濁物の希釈液をヘマサイトメーターチャンバーに加え、そして次に色素排除細胞を倒立顕微鏡を用いて計数した。次に、20万個の生存しているPBLを、10μｇの可溶性あるいはプレート結合26I10E−２、26E3D−１、あるいはＢ−h9抗体を含む96穴底板組織培養プレートに加えた。最後に、それぞれの培養物をSEAで刺激し（1000あるいは10pg/mlで３回）、37℃にて５％CO2中で培養した。３日後、増殖を3H−チミジン取込みで測定し、凝集を倒立顕微鏡で測定した。
可溶性の26E3D−１あるいは26I10E−２抗ICAM−Ｒ抗体は、可溶性のＢ−H9抗体に比べてPBLの増殖を変えることはできなかった。しかしながら、プレートに結合した（すなわち交差した）抗体26E3D−１は、両方の用量のSEA（ｐ＜0.05）で増殖を有為に阻害し、一方、抗体26I10E−２は、低い用量のSEAでしか増殖を阻害しなかった。プレート結合した26E3D−１はまた、プレート結合したＢ−H9および26I10E−２抗体に比べて、両方のSEA濃度で細胞凝集を有為に阻害した。プレート結合した26E3D−１による凝集の阻害はほぼ完全であった。これに対して、プレート結合した26I10E−２抗体は、プレート結合したＢ−H9と比べてわずかに凝集を阻害したのみであった。SEAにより誘導されるPBLの凝集は、可溶性のＢ−H9抗体に比べて、可溶性抗ICAM−Ｒ抗体26E3D−１あるいは26I10E−２によっては影響されなかった。プレートに結合した抗ICAM−ＲがSEAに誘導される増殖を阻害するのに必要な最小限の時間もまた測定された。PBLは、プレートに結合した26I10E−２、26E3D−１、あるいはイソタイプに適合した抗HLA−１対照抗体Ｂ−H9（IgG1）および10T2（IgG2）（AMAC社、Westbrook、メイン州）で、SEAとともに（10pg/ml）あるいはSEA無しで、３、５および７時間、あらかじめインキュベートした。次に、PBLを清潔なウェルに移し、そしてSEAの存在下で（10pg/ml）、３日間培養した。3H−チミジン取込み（増殖）分析の結果を図９にまとめている。固定化された26E3D−１抗体および低レベルの26I10E−２は、わずか３時間のインキュベーションの後に、イソタイプに適合した対照に比べて、有為に増殖を減少させた。この結果から、プレート結合した26E3D−１あるいは26I10E−２のICAM−Ｒに対する結合が、細胞が固定化された抗体から除去された後に、増殖を阻害することができる細胞内シグナルを伝達することが示されたのである。
ICAM−Ｒに対するモノクローナル抗体はまた、アロ抗原に曝された刺激細胞に応答したリンパ球増殖（3H−チミジン取込みで測定した）を変える能力について試験された。100μl PBS中の、10μｇのICAM−Ｒに対するモノクローナル抗体（26E3D−１あるいは26I10E−２）、ICAM−１に対するモノクローナル抗体（LB2）、ICAM−２に対するモノクローナル抗体（IC2/2、Bender社）あるいは対照の抗CD2（TS2/9）抗体のいずれかを、96穴平底組織培養プレートの個々のウェルに加え、そしてプレートを37℃にて、３〜４時間インキュベートした。次に、ウェルを200μｌのPBSで３回洗浄し、未結合の抗体を除去し、すぐに応答性のＴ細胞を加えた。イソタイプ対照マウスIgG2aおよびIgG1抗体（シグマ社）を対照ウェルに加えた。PBLを上記した方法に従って、ヒストパーク遠心分離によって得た。そして、プラスチック組織培養フラスコ上で37℃にて２時間インキュベーションすることによる細胞付着性の消耗、ならびに抗ヒトIgMで被覆したマグネチックビーズを用いたネガティブ・イムノ・マグネチック選択の後、Ｔリンパ球を、PBLから単離した。得られた細胞は、CD2陽性細胞を、FACScan分析により測定した時＞90％になるように高め、組織培養培地中、１×106個の細胞/mlにまで調整した。200μｌ容量中の細胞（２×105）を抗体で被覆した96穴組織培養プレートの個々のウェルに加えた。第二の無関係の正常ヒト・ドナーから、ヒストパーク遠心分離によりPBLを同時に単離し、そしてγ放射セシウム源に曝すことにより1500Rで照射した。次に、放射された刺激PBLを、50μｌに２×105の濃度になるように、照射を受けていないＴ細胞を含むそれぞれのウエルに加えた。そしてプレートを37℃にて５％CO2インキュベーター中で計６日間インキュベートした。次に、リンパ球の活性化を、培養の最後の18〜24時間の間に、１μCi3H−チミジンをそれぞれのウェルに加えた後に評価した。
その結果は図10に示され、プレート結合したイソタイプに一致した対照抗体の存在下に見られる応答に対する、プレート結合した抗体の存在下に見られる応答率の向上あるいは応答率の阻害のいずれかを表している。図10に示されるように、ICAM−１あるいはICAM−２のいずれかに対する抗体は、照射されたアロ抗原の刺激細胞に対するＴ細胞の応答を、対照抗体に比べ60〜80％有為に阻害した。これに対して、抗CD2抗体は、Ｔ細胞応答を変えなかった。二つの抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体は、この分析でＴ細胞の増殖を阻害する能力において相違していた。例えば、抗体26E3D−１は、アロ抗原誘導のＴ細胞応答を、ICAM−１あるいはICAM−２のいずれかに対する抗体と同程度にブロックしたが、一方26I10E−２は、アロ抗原に対するＴ細胞の応相を向上させた。抗ICAM−Ｒ抗体26I8F−２および26H11C−２は、抗体26E3D−１よりずっと低いレベルで、Ｔ細胞の応答をブロックした。モノクローナル抗体26E3D−１のアロ抗原誘導のリンパ球活性化をブロックする能力は、抗体の固定化に依存した。［Dustin,Nature，341:619（1989）］の文献では、可溶化型ではなく、セファロースに結合されているか、あるいはプラスチックに固定化されている刺激モノクローナル抗体によって、シグナルの強化が適正に達成されることが示されている。
実施例17
ICAM−Ｒに特異的な抗体が、様々な刺激剤（例えば、SEAおよびアロ抗原細胞）に対するリンパ球の応答を調節するという、上記の実施例からの、一つの推論は、天然の対応レセプターあるいは本発明の抗体によるICAM−Ｒの結合は、ICAM−Ｒを発現する細胞にシグナルを伝達しているということである。ICAM−Ｒに特異的なシグナルを出す現象には、ICAM−Ｒの細胞質領域の一つ以上の第二メッセンジャー経路の細胞酵素成分および／あるいは細胞骨格の成分に対する、ICAM−Ｒに独特の相互作用が関与する可能性がある。
予備実験は、この概念およびICAM−Ｒが第二メッセンジャー・システムとの結合においてICAM−１と異なっているという考えと一致している。以下の様にして、刺激されていないRaji細胞からの抽出物を調製し、分画し、そしてキナーゼ活性について分析した。７×107個の細胞をPBS中で１回洗浄し、そして、20mMトリスpH7.5、0.5mM EDTA、１％トリトンＸ−100（Pierce社）、10ug/mlペプスタチンおよびロイペプチン（Boehringer社）、2mM PMSFを含む緩衝液中で、１時間氷上で溶解した。溶解物を冷やしたマイクロファージ中で、14,000rpmで15分間遠心分離して沈澱させ、得られた上清を、20mMトリスpH7.5、0.5mM EDTA（緩衝液Ａ）で平衡化したDEAEセファセルカラム（Pharmacia社）にかけた。カラムを0.25ml/分で流し、そして緩衝液Ａ中の０から0.35MのNaClの勾配で、60分間かけて溶出した。これらの最初の実験で、プロテインキナーゼＣ（PKC）活性が強化されている画分（アマ−シャム分析キットを用いて製造元の指示に従って決定した）のみが調べられた。PKC活性が強化された画分は、プールされ、そしてキナーゼ（単数あるいは複数）源として用いられ、ICAM−１、ICAM−２、およびICAM−Ｒの完全な細胞質領域の合成ペプチド（配列番号:1の481位から518位のアミノ酸）の異なるリン酸化について試験した。分析は、製造元の指示に従って、75uMの最終濃度のペプチドで行なった。10ulの反応混合液を30ulのLaemmli試料緩衝液中で煮沸し、12.5％SDS−PAGEゲル上で分離した。ゲルをＸ線フィルム上で1.5時間曝したところ、ICAM−ＲおよびICAM−２のリン酸化は検出され、ICAM−１は検出されなかった。リン酸化が、PKCによるのか、あるいは共に分画した他のキナーゼによるのかは決定されなかった。
予備実験によって、ICAM−Ｒの細胞質領域が、細胞骨格成分と特異的に結合することも示された。競合しないモノクローナル抗体26E3Dおよび26I10EのICAM−Ｒに対する結合が調べられ、それぞれの抗体の、リンパ球ICAM−Ｒの細胞骨格との結合に対する潜在的な影響が評価された。抗体は、ICAM−Ｒを細胞表面レセプターとして用いる異なる天然ICAM−Ｒリガンドを再現することができ、それによって調節された細胞応答が引き出される。
以前に他の研究者が、細胞表面膜貫通糖タンパク質として現われた多数のヒトＴリンパ球表面抗原が、もしこれらの抗原に特異的な表面結合抗体が第二抗体と交差する場合、細胞骨格と結合するために誘導され得ることを見い出した［Geppertら、Ｊ．Immuno.,146:3298（1990）］。多くのこれらの細胞表面分子は、リンパ球接着および／あるいは活性化経路の成分であることが明らかである。細胞骨格との誘導性の結合の現象は、決められた条件の下での界面活性剤抽出に対する細胞表面免疫複合体の耐性として機能上明らかになる。誘導性の界面活性剤耐性では代謝エネルギーは必要とされず、そして実験の間中０℃〜４℃に維持された細胞中で観察される。
実験は、新しく調製されたPBLあるいはヒトＴリンパ芽球細胞系CEM−CCRF（ATCC CCL119）を用いて行われた。簡単にいえば、健康なボランティアのドナーから新しく取ったヒト血液を、PBSで1:1に希釈し、シグマヒストパーク密度分離培地上に上層した。勾配を1500rpmで30分間遠心分離し（600×ｇ）、そして中間期の単核細胞画分を回収し、PBSで３回洗浄した。細胞の沈殿を完全なRPMI−1640培地（Gibco社、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、および10％FBSを含む）中に再懸濁し、そして付着性細胞の消耗のために、細胞培養処理ペトリ皿上に置いた。プレートを、37℃にて１〜２時間、５％CO2中でインキュベートした。その後、非付着性PBLを回収し、氷冷PBSで２回洗浄した。フルオレセインイソチイオシアネート（FITC）を用いたモノクローナル抗体のフルオレセインへの結合は、文献の手順に従って行なった［例えば、Goding,Ｊ．Immunol．Meth.,13:215（1976）を参照のこと］。簡単にいえば、この手順は、精製した抗体と過剰のFITC（シグマ社）との0.1Mバイカーボネート緩衝液pH8.1中での、37℃、90分間のインキュベーション、およびその後の、未反応のFITCを除去するための、PBSを外液とする徹底的な透析を含むものである。
PBLあるいは洗浄したCEM細胞懸濁液（１×106個の細胞）を、ファルコン12×75mmチューブの氷冷PBS−５％FBS中に分配し、沈澱させ、そして50μｌの同じ緩衝液中で、FITC接合した抗ICAM−Ｒモノクローナル抗体26E3D−１あるいは26I10E−２中に再懸濁し、飽和濃度に調整した。抗体結合を氷上で30分間行わせ、その後、原液の（希釈していない）FBSの下層クッション（0.7ml）を通じて最初に1mlのPBS−５％FBSで再懸濁しておいた細胞を沈澱させることにより、未結合の抗体を除去した。
FITC接合モノクローナル抗体単独で染色したグループに対しては、1mlの懸濁液を二等分し、それぞれにFBSを別々に下層し、遠心分離し、そして上清を吸引により取り除いた。細胞沈澱を次に、200ulの対照緩衝液（13mMトリスpH8.0、150mM NaCl、2mM MgCl2、2mM EGTA、２％FBS、2.5ug/mlアプロチニン、1mM PMSF、10mMヨードアセトアミド）あるいは界面活性剤緩衝液［対照緩衝液中に0.5％NP−40（v/v）（US Biochemical社、Cleveland、オハイオ州）］中に再懸濁し、FACS分析の前に、室温で20分間、あるいは４℃にて一晩置いた。第一の抗体染色工程の後に、細胞表面に結合したモノクローナル抗体を第二の抗体と交差したグループについては、洗浄した細胞沈殿物を、PBS−５％FCS中で1:100希釈した、50ulのFITC−ヤギ抗マウスIgG（Sigma社、St.Louis、モンタナ州）中に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。次に、細胞を再懸濁し、上述のように二つのチューブに分け、沈澱させ、そして界面活性剤の存在下あるいは非存在下で緩衝液で処理した。次に、FACS分析をこれらの細胞について行なった。
CEM細胞について得られた結果（図11を参照のこと）は、PBLについて見られた結果と同様であった。界面活性剤耐性分析によって評価された細胞骨格とのICAM−Ｒ結合は、FITC接合26I10E−２あるいは26E3D−１抗体を単独で細胞表面ICAM−Ｒに結合させたとき、ごくわずかであった。しかしながら、細胞表面に結合した26I10E抗体を第二の抗体と交差させたとき、界面活性剤耐性のわずかな上昇が見られた。第二の抗体を細胞表面に結合した26E3D−１（これは、26I10E−２によるものとは別のICAM−Ｒのエピト−プを認識する）と交差するのに用いた場合、より大きな（PBL中で約２倍、そしてCEM中で２〜３倍）界面活性剤耐性の増加が、繰り返しみられた。このように、ICAM−ＲリガンドのICAM−Ｒの異なる構造上の領域に対する相互作用は、ICAM−Ｒの細胞骨格に対する結合に別々に影響するようである。
前述の具体的な実施例は、本発明の現在の好ましい態様に関し、それら実施例の修正や変更も当業者であれば容易に思いつくものである。
明らかに、ICAM−Ｒをコードするポリヌクレオチド（例えば、DNAおよびRNA）は、ICAM−Ｒおよび改変型ポリペプチドの発現を確保するのに有用なだけでなく、正常な状態あるいは活性化された状態でICAM−Ｒを発現する細胞（特に、免疫学的プロセスに関与する細胞）を同定するのに簡単に用いられ得る。ICAM−R DNAを用いた、典型的な検出方法には、（適当に標識されて検出される）DNAあるいはRNAが、試料中のRNAにハイブリダイズする、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、RNAse保護、およびインサイチュハイブリダイゼーション細胞学的分析法が含まれる。ICAM−ＲをコードするDNA（特に、領域２および３をコードするDNAよりも、ICAM−１およびICAM−２をコードするDNAに対してより低い相同性しか持たない、第一、第四および第五の領域をコードするDNA）は、ICAM−R DNAのための内因性の発現制御DNA配列を特定するゲノムDNAを含む、ICAM−ＲをコードするゲノムDNAの単離に有用である。前述したように、ICAM−Ｒをコードするポリヌクレオチド配列および／あるいはICAM−Ｒの発現を制御するポリヌクレオチド配列の知識により、ICAM−Ｒの発現の調節に役立つ、様々なアンチセンスポリヌクレオチドが入手可能となる。
本発明によって、ICAM−Ｒポリペプチド、およびICAM−Ｒの五つの免疫グロブリン様領域のうちの一つ以上を含む断片のような、可溶性断片であって、グリコシル化型、非グリコシル化型、あるいは脱グリコシル化型のものを含む変異体の作成ができるようになる。本発明のタンパク質生成物を含む薬学的組成物、例えばICAM−Ｒが関与する細胞間および細胞内リガンド／レセプター結合反応の競合阻害剤あるいは刺激剤などは、免疫細胞の活性化／増殖の調節に、治療上の可能性を有するものである。このような治療上の可能性は、特に「イムノアドヘシン」タイプの組換えハイブリッド融合タンパク質に現われる。このタンパク質は、アミノ末端に一つ以上のICAM−Ｒの領域を含み、カルボキシ末端に少なくとも一つの免疫グロブリンの不変領域を含む。このようなハイブリッド融合タンパク質は、ホモダイマーの型で入手することができるのが普通であり、Ig部分は、より長い血清半減期を提供し、そしてICAM−Ｒ部分は、ICAM−Ｒ自身よりもICAM−Ｒ被結合体に対して高い親和性を有している。強化されたアビディティを有し得る他のICAM−Ｒの多量体の型もまた、治療上の可能性を有しているものと考えられている。
抗体物質および結合タンパク質、特にモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む単一特異的抗体は、本発明によって容易に入手できるようになる。このことは、ICAM−Ｒを天然に発現する細胞、本発明のポリペプチド産物を産生する組換え宿主細胞、ICAM−Ｒポリペプチド生成物自体、および細胞間の凝集を刺激するICAM−Ｒ特異的抗体に結合している本発明のポリペプチド生成物（すなわち、「高親和性」結合配剤形のポリペプチド生成物）を含む免疫原の使用によってなされる。このような抗体および他のICAM−Ｒ特異的結合タンパク質は、ICAM−Ｒおよび変異体の免疫精製のために、ならびにICAM−Ｒおよびその可溶性断片のリガンド／レセプター結合のブロッキングおよび／あるいは刺激を前提にした治療のための薬学的組成物に用いることができる。薬学的組成物として用いるには、ICAM−Ｒ特異的抗体および抗イディオタイプ抗体物質は、当該分野で公知の組換え手法により、ヒト化（例えば、CDR−移植）される。ICAM−Ｒの異なる領域に特異的な複数の抗体が、ELISAシステムに用いられる。このシステムでは、可溶性のICAM−Ｒポリペプチドの量が、血清のような体液中で増加することにより特徴づけられる炎症のプロセスをモニターするための免疫学的「サンドイッチ」が含まれる。
ICAM−Ｒ関連産物によって処置され、あるいはモニターされる炎症の症状には、以下の症状が含まれる：哺乳類の非特異的免疫系の応答に起因する症状（例えば、成人呼吸障害症候群、敗血症から派生する多器官障害症候群、外傷から派生する多器官障害症候群、組織の再還流障害、急性糸球体腎炎、反応性関節炎、急性炎症成分での皮膚炎、発作、熱障害、血液透析、ロイコフェレシス、潰瘍性大腸炎、クローン病、壊死全腸炎、顆粒球輸血関連症候群、およびサイトカイン誘導性毒）および哺乳類の特異的免疫系の応答に起因する症状（乾癬、器官／組織移植拒絶、およびレイノー病、自己免疫甲状腺炎、EAE、多発性硬化症、リューマチ様関節炎、エリトマトーデスなどを含む自己免疫疾患）。本発明のICAM−Ｒ生成物はまた、喘息、腫瘍増殖および／あるいは転移、およびウイルス感染（例えば、HIV感染）のモニターおよび処理に有用である。
従って、本発明の範囲は、添付の請求の範囲の記載によってのみ限定されるべきである。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ガラティン、ダブリュ、ミッシェル
ヴェゼウクス、ローズメイ
（ii）発明の名称：細胞間接着分子関連タンパク質
（iii）配列の数:34
（iv）連絡先住所：
（Ａ）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェースティン、マレー、アンド  ビックネル
（Ｂ）番地：トゥー  ファースト  ナショナル  プラザ、20サウス  クラークストリート
（Ｃ）都市名：シカゴ
（Ｄ）州名：イリノイ
（Ｅ）国名：米国
（Ｆ）郵便番号:60603
（ｖ）コンピューター読取形式：
（Ａ）媒体：フロッピー  ディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PC互換機
（Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア：パテント  イン  リリース＃1.0、バージョン＃1.25
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）先行出願データ：
（Ａ）出願番号:US 07/827,689
（Ｂ）出願日:27−１月−1992
（vii）先行出願データ：
（Ａ）出願番号:US 07/889,724
（Ｂ）出願日:26−５月−1992
（vii）先行出願データ：
（Ａ）出願番号:US 07/894,061
（Ｂ）出願日:05−６月−1992
（vii）先行出願データ：
（Ａ）出願番号:US 08/009,266
（Ｂ）出願日:22−１月−1993
（viii）弁護士／弁理士情報：
（Ａ）氏名：ノーランド、グレタ  イー
（Ｂ）登録番号:35,302
（Ｃ）参照／事件番号:31218
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：（312）346−5750
（Ｂ）ファックス：（312）984−9740
（Ｃ）テレックス:25−3856
（２）配列番号:1の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:547アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Protein
（Ｂ）存在位置:30..547
（xi）配列：配列番号:1
0003616090.tif 000006
0003616090.tif 000007
0003616090.tif 000008
（２）配列番号:2の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:1781塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:cDNA
（xi）配列：配列番号:2
0003616090.tif 000009
0003616090.tif 000010
（２）配列番号:3の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:8アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:4
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンになり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:6
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンになり得る。
（xi）配列：配列番号:3
0003616090.tif 000011
（２）配列番号:4の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:9アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:9
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、バリン、もしくはアラニンになり得る。
（xi）配列：配列番号:4
0003616090.tif 000012
（２）配列番号:5の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:8アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:3
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、アスパラギン、もしくはセリンになり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:4
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、リシン、もしくはフェニルアラニンになり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:6
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、リシン、もしくはイソロイシンになり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:7
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、アルギニン、もしくはグルタミン酸になり得る。
（xi）配列：配列番号:5
0003616090.tif 000013
（２）配列番号:6の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:9アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:1
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、アスパラギン酸、もしくはグルタミン酸になり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:2
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、ヒスチジン、もしくはアスパラギン酸になり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:3
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、ヒスチジン、もしくはグリシンになり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:4
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、グリシン、もしくはヒスチジンになり得る。
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:Modified−site
（Ｂ）存在位置:5
（Ｄ）他の情報：この部位でのアミノ酸は、アラニン、もしくはアルギニンになり得る。
（xi）配列：配列番号:6
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（２）配列番号:7の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:7
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（２）配列番号:8の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:8
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（２）配列番号:9の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:9
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（２）配列番号:10の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:10
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（２）配列番号:11の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:11
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（２）配列番号:12の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:12
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（２）配列番号:13の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:13
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（２）配列番号:14の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:14
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（２）配列番号:15の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:17塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:15
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（２）配列番号:16の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:17塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:16
0003616090.tif 000024
（２）配列番号:17の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:17
0003616090.tif 000025
（２）配列番号:18の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:18
0003616090.tif 000026
（２）配列番号:19の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:19塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:19
0003616090.tif 000027
（２）配列番号:20の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:20
0003616090.tif 000028
（２）配列番号:21の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:18塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:21
0003616090.tif 000029
（２）配列番号:22の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:19塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:22
0003616090.tif 000030
（２）配列番号:23の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:315塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（ゲノミック）
（ix）配列の特徴：
（Ａ）配列を表す記号:CDS
（Ｂ）存在位置:1..315
（xi）配列：配列番号:23
0003616090.tif 000031
（２）配列番号:24の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:105アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号:24
0003616090.tif 000032
（２）配列番号:25の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:25
0003616090.tif 000033
（２）配列番号:26の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:17塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:26
0003616090.tif 000034
（２）配列番号:27の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:10アミノ酸
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号:27
0003616090.tif 000035
（２）配列番号:28の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:10アミノ酸
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号:28
0003616090.tif 000036
（２）配列番号:29の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:29
0003616090.tif 000037
（２）配列番号:30の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:30
0003616090.tif 000038
（２）配列番号:31の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:31
0003616090.tif 000039
（２）配列番号:32の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:32
0003616090.tif 000040
（２）配列番号:33の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:39塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:33
0003616090.tif 000041
（２）配列番号:34の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA
（xi）配列：配列番号:34
0003616090.tif 000042
【図１Ａ】
0003616090.tif 000043
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
0003616090.tif 000045
【図１Ｄ】
0003616090.tif 000046
【図１Ｅ】
0003616090.tif 000047
【図１Ｆ】
0003616090.tif 000048
【図１Ｇ】
0003616090.tif 000049
【図２Ａ】
0003616090.tif 000050
【図２Ｂ】
0003616090.tif 000051
【図７Ａ】
0003616090.tif 000052
【図３Ａ】
0003616090.tif 000053
【図３Ｆ】
0003616090.tif 000054
【図３Ｂ】
0003616090.tif 000055
【図８Ｂ】
0003616090.tif 000056
【図３Ｃ】
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【図８Ｃ】
0003616090.tif 000058
【図３Ｄ】
0003616090.tif 000059
【図３Ｅ】
0003616090.tif 000060
【図４】
0003616090.tif 000061
【図８Ｄ】
0003616090.tif 000062
【図５】
0003616090.tif 000063
【図６Ａ】
0003616090.tif 000064
【図６Ｂ】
0003616090.tif 000065
【図７Ｂ】
0003616090.tif 000066
【図８Ａ】
0003616090.tif 000067
【図８Ｅ】
0003616090.tif 000068
【図８Ｆ】
0003616090.tif 000069
【図８Ｇ】
0003616090.tif 000070
【図９】
0003616090.tif 000071
【図１０】
0003616090.tif 000072
【図１１】
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