(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸を含む水溶液にプライマー及びヌクレオチドを添加しポリメラーゼ存在下で前記プライマーから鎖伸長反応を行わせて合成された核酸断片を未反応のヌクレオチドから分離する方法であって、
前記鎖伸長反応終了後の反応液をフェノール試薬と混合し、攪拌する攪拌工程と、
前記反応液とフェノール試薬との混合液を加温する加温工程と、を含み、
前記加温工程において、前記混合液を４０度〜８０度に加温させ、前記加温工程により前記反応液とフェノール試薬との混合液を水相とフェノール層とに分離させ、該水相を回収することにより前記核酸断片が未反応のヌクレオチドから分離されることを特徴とする核酸断片の分離方法。
【請求項２】
前記加温工程が、攪拌工程後に行われることを特徴とする請求項１に記載の核酸断片の分離方法。
【請求項３】
前記核酸断片が、核酸配列決定用のシークエンス用断片であり、前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はジデオキシリボヌクレオチドであること特徴とする請求項１又は請求項２に記載の核酸断片の分離方法。
【請求項４】
前記デオキシリボヌクレオチド又はジデオキシリボヌクレオチドが標識されていることを特徴とする請求項３に記載の核酸断片の分離方法。
【請求項５】
鋳型核酸を含む水溶液にプライマー、デオキシリボヌクレオチド及びジデオキシリボヌクレオチドを添加し、ポリメラーゼ存在下で前記プライマーから鎖伸長反応を行わせて生成されたシークエンス用断片を精製する核酸シークエンス前処理装置であって、
前記鎖伸長反応終了後の反応液をフェノール試薬と混合し、攪拌する攪拌手段と、
前記反応液とフェノール試薬との混合液を４０度〜８０度に加温する加温手段と、を含むことを特徴とする核酸シークエンス前処理装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、合成核酸断片の精製方法に関し、特に、プライマーにヌクレオチドを付加させて伸長させて合成された核酸断片から不要な未反応のヌクレオチドを除去する方法に関する。また、本発明は、この精製方法を利用した核酸シークエンス前処理方法並びに装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子等の特性を解析するために、その遺伝子の塩基配列を決定することは不可欠になってきている。この遺伝子等の塩基配列を決定する方法の一つにサンガ（sanger)法（または、ジデオキシ法とも言われている）がある。
【０００３】
このサンガ法では、鋳型ＤＮＡと相補するプライマーとを含む反応液にデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を添加したものを４つ準備し、この４つにｄＮＴＰとは別にそれぞれ一種類のジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）すなわちｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ又はｄｄＴＴＰを添加して、ポリメラーゼ存在下で伸長反応を行なわせる。
【０００４】
この伸長反応では、鋳型ＤＮＡの塩基配列と相補する塩基がプライマーの３’末端に次々付加され鎖が伸長するが、この伸長過程でジデオキシリボヌクレオチドが付加されると、次の塩基が結合できず鎖伸長が停止する。従って、このジデオキシリボヌクレオチドが付加された位置の相違から、各反応液中には鋳型ＤＮＡに相補する種々の長さの一本鎖の核酸断片が生成される。そして、最終的に各反応液中の各核酸断片を並行に電気泳動で分画することにより、この分画パターン（シークエンスラダー）から鋳型ＤＮＡの塩基配列が決定される。
【０００５】
このサンガ法は、操作の簡便さ、解析精度の高さなどの点から広く用いられ、近年では、このサンガ法に基づいたシークエンス決定器などが種々開発されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記シークエンス決定においては、より長い核酸配列を読む取れるようにすることが求められているが、上記サンガ法においては未反応のヌクレオチド（デキオキシヌクレトチド、ジデオキシリボヌクレオチド）が、最終的な電気泳動のパターンを読み取る際に障害となり、その読み取りを困難にし、また読み取る長さを制限することになる場合があった。特に、このような問題は内部標識法やターミネータ標識法において顕著であった。
【０００７】
すなわち、サンガ法において、最終的に電気泳動を行い、その電気泳動パターンを読み取るためには、各断片を視覚化する必要がある。この視覚化を行うために断片の標識が行われる。この断片の標識法には、大きく分けて内部標識法とターミネータ標識法とプライマー標識法という３つの方法がある。プライマー標識法では、シークエンス用断片を合成する際に用いられるプライマーをあらかじめ蛍光等で標識し、この標識されたプライマーを用いてシークエンス用断片の合成が行われる。
【０００８】
一方、内部標識法及びターミネータ標識法では、プライマーは特に標識されている必要はなく、合成の際の基質であるヌクレオチドとして蛍光等の標識がされたものが用いられる。このように標識されたヌクレオチドを用いて断片の合成を行うことにより、合成されたシークエンス用断片が結果として標識されることになる。この内部標識方法及びターミネータ標識法では、プライマー標識法のように、あらかじめプライマーなどを標識する必要がないため簡便であり、任意のプライマーを用いることができるため、決定したい核酸領域に合わせたプライマーを用いて自在に核酸シークエンスの決定を行うことが可能となる。
【０００９】
しかし、この内部標識法及びターミネータ標識法では、上述したように簡便な方法であるが、最終的に電気泳動で核酸断片を分画し読み取る際に核酸断片と共に多量に存在する未反応の標識ヌクレオチドがバックグランドに出現し、その周辺の伸長断片の電気泳動パターン（シークエンスラダー）の読み取りが障害されることがあった。
【００１０】
そのため、このような問題を解決し、より広範囲に精度の高い塩基配列の決定を行うために、伸長反応後に未反応のヌクレオチドを除去することが行われている。このヌクレオチドの除去法としては、エタノール沈殿、精製用カラムを用いた方法等がある。
【００１１】
しかし、エタノール沈殿では、反応液の量が微量であること、またその中に含まれる核酸量自体も微量であることから、エタノール沈殿後の回収率が低く、さらに回収率にばらつきが生じ易いという問題がある。特に、上記シークエンス決定においては、４つの塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を同時に決定することが必要になるため、これら塩基のうちいずれか一つでも、その処理過程で著しい試料の減少が生じると、全体としてシークエンス決定が行えないことにもなる。
【００１２】
また、エタノール沈殿に代えて精製用カラムを用いる方法もあるが、この方法の場合には、担体に吸着させた核酸を溶出させる際に、核酸が溶出バッファにより希釈されることとなる。また、この希釈された核酸液を濃縮するためには、上記エタノール沈殿を行わざるを得ず、上記と同様の問題が生じることとなる。このように従来の未反応のヌクレオチドの除去方法では、その後のシークエンス反応の効率化を図ることは困難であった。
【００１３】
他方、近年のヒトゲノム解析の進展から、今後、核酸シークエンスの解析は遺伝子が原因となる疾患の診断などに利用されることが予想される。このような疾患の臨床診断にシークエンス解析を利用する場合には、より簡便な操作で、かつ精度の高い解析が求められることとなる。
【００１４】
そこで、本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便な操作で混在するヌクレオチドを除去することができる核酸断片の分離方法を提供し、さらには、この分離方法を利用したシークエンスの前処理方法及び装置を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本願発明者らは、鋭意研究を行い、その結果、核酸合成後の反応液にフェノール試薬を添加、攪拌した後、水相とフェノール層とに分離させることにより、合成核酸を含む水相から未反応のヌクレオチドを取り除くことができることを見い出した。さらには、反応液とフェノール試薬との混合液を加温することにより水相とフェノール層とに簡便に分離させることができることをも見い出し、本発明の完成に至った。
【００１６】
すなわち、本発明の核酸断片の分離方法は、鋳型核酸を含む水溶液にプライマー及びヌクレオチドを添加しポリメラーゼ存在下で前記プライマーから鎖伸長反応を行わせて合成された核酸断片を未反応のヌクレオチドから分離する方法であって、前記鎖伸長反応終了後の反応液をフェノール試薬と混合し、攪拌する攪拌工程と、前記反応液とフェノール試薬との混合液を加温する加温工程と、を含み、前記加温工程において、前記混合液を４０度〜８０度に加温させ、前記加温工程により、攪拌された混合液を水相とフェノール層とに分離させ、該水相を回収することにより前記核酸断片が未反応のヌクレオチドから分離されることを特徴とする。
【００１７】
上記発明によれば、鎖伸長反応終了後の反応液とフェノール試薬とを含む混合液を攪拌し、加温することにより、混合液を水相とフェノール層とに分離させる。そして、このうち水相を回収することにより核酸断片を未反応のヌクレオチドから分離することができる。このように本発明では、攪拌後に遠心分離などの装置を用いることなく、熱を加えるだけで攪拌後の混合液を水相とフェノール層とに分離させることができるため、操作の簡便化を図ることが可能となり、大量の試料の処理などをも可能とする。
【００１８】
本発明は、このような温度範囲で加温することにより、水相とフェノール層とを効果的に分離させることができる。
【００１９】
本発明は、前記加温工程が、攪拌工程終了後に行われることを特徴とする。このように本発明によれば、加温工程を攪拌工程終了後に行うことにより、反応液とフェノール試薬とをあらかじめ十分に攪拌した上で加温により水相とフェノール層とに分離されるため、核酸断片から未反応ヌクレオチドを効率よく分離させることが可能となる。
【００２０】
また、本発明は、前記核酸断片が、核酸配列決定用のシークエンス用断片であり、前記ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド又はジデオキシリボヌクレオチドであること特徴とする。
【００２１】
すなわち、上記分離方法をシークエンス用断片から未反応のジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチドを分離する際に用いることにより、従来、シークエンス解析を障害する原因となっていた未反応のヌクレオチドをシークエンス用断片から分離することが可能となる。この結果、本発明によればシークエンス解析の効率化が図られる。
【００２２】
本発明の核酸シークエンス前処理装置は、鋳型核酸を含む水溶液にプライマー、デオキシリボヌクレオチド及びジデオキシリボヌクレオチドを添加し、ポリメラーゼ存在下で前記プライマーから鎖伸長反応を行わせて生成されたシークエンス用断片を精製する核酸シークエンス前処理装置であって、前記鎖伸長反応終了後の反応液をフェノール試薬と混合し、攪拌する攪拌手段と、前記反応液とフェノール試薬との混合液を４０度〜８０度に加温する加温手段と、を含むことを特徴とする。
【００２３】
上記発明によれば、攪拌手段により鎖伸長反応終了後の反応液とフェノール試薬とを含む混合液が攪拌され、加温手段により攪拌された反応液が加温され、混合液が水相とフェノール層とに分離される。ここで分離された水相には、未反応のデオキシヌクレオチドなどが除かれたシークエンス断片が含まれることになる。
【００２４】
このように本発明では、従来、シークエンス解析の障害となっていた未反応のヌクレオチドをシークエンス用断片から分離することができる。その上、本発明では、加温手段により水相とフェノール層とを分離することができることから、大型化しやすい遠心分離器を備えなくても、小型の装置で上記未反応のヌクレオチドを除去するという目的を達成することが可能となる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施形態を図面を用いて説明する。
【００２６】
[第一の実施形態]
本実施形態の核酸の分離方法は、鋳型核酸を含む水溶液にプライマー及びヌクレオチドを添加し、ポリメラーゼ存在下で前記プライマーから鎖伸長反応を行わせて生成された核酸断片を未反応のヌクレオチドから分離する際に使用される。
【００２７】
すなわち、試験管内などで人工的にＤＮＡ合成を行う際に、過剰に添加されたヌクレオチド（ｄＮＴＰ）が核酸断片の合成終了後に残存し、生成された核酸断片と混在することとなることから、この混在する未反応のヌクレオチドを除去するために使用される。そのため、このように合成後に核酸断片と未反応のヌクレオチドが混在するものであれば、分離対象となる核酸断片の合成法や核酸断片合成後の使用目的等には限定はされない。
【００２８】
従って、上記「核酸断片」としては、サンガ法によりシークエンス決定を行うために鋳型ＤＮＡから合成された核酸断片（以下、シークエンス用断片という）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により生成された増幅核酸断片等が含まれ、このようにポリメラーゼ、ヌクレオチド存在下で人工的に合成された核酸断片であれば、核酸断片が一本鎖であると、二本鎖であるとを問わない。また、この核酸断片には、ＤＮＡに限らず、ＲＮＡを含めることもできる。
【００２９】
また、除去されることとなる「ヌクレオチド」としては、核酸断片合成時に添加されるものであれば、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）に限られず、ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）なども含まれる。また、この「ヌクレオチド」には、放射線や蛍光で標識されたヌクレオチド等も含まれる。
【００３０】
以下、本実施形態の分離方法を図１を用いて説明する。なお、図１には本核酸分離操作の概略を示す。
【００３１】
先ず、ポリメラーゼ存在下で合成された合成核酸と未反応のヌクレオチドとが混在した反応液２を容器１に準備し、これにフェノール試薬３が添加される。このフェノール試薬３は、純粋なフェノールを用いてもよいが、好ましくは、中性フェノール、フェノール−クロロホルムなどを用いることができる。
【００３２】
この中性フェノールは、融解したフェノールに緩衝液（例えば、トリスＥＤＴＡ緩衝液など）を注入してｐＨを調整するとともにフェノールを緩衝液で飽和させることにより生成される。このような中性フェノールを用いることにより、合成終了後の反応液のｐＨを変動させることなく、また反応液の液量を変化させることなくヌクレオチドの除去を行うことができる。
【００３３】
また、フェノール−クロロホルムは、上記中性フェノールにクロロホルムを混合することにより調製される。このようにクロロホルムを添加することにより、反応液である水溶液との比重差が大きくなり、水相とフェノール層との分離能を向上させることができ、水相中にフェノールの残留を防止することができる。
【００３４】
また、これら中性フェノール、フェノール−クロロホルム以外に、ヌクレオチドを除去することができるものであれば、例えば、置換フェノール、フェノール樹脂などを用いてもよい。フェノールは揮発性が高く、また刺激臭を有するため、フェノールに代えて、フェノールに置換基が挿入された置換フェノールや樹脂として加工されているフェノール樹脂などを用いることにより環境面、取扱いの容易さの面から有利となる。
【００３５】
上記フェノール試薬添加後、反応液２とフェノール試薬３とを攪拌し、懸濁液とする。この攪拌操作は、ミキサーなどを用いて行ってもよく、また、ピペットにより吸引、吐出を繰り返すピペッティング操作により実行してもよい。
【００３６】
上記攪拌後、攪拌液４は加温され、攪拌液４を水相とフェノール層とに分離させる。この加温時の温度は、攪拌液を水相とフェノール層とに分離し得る温度、例えば、４０度以上とすることができる。但し、高温にし過ぎると未反応のヌクレオチドの除去能が低下し水相に混在する傾向があるため、加温時の温度は、好ましくは、上限８０度とすることがよく、さらに好ましくは、上限６０度とする。
【００３７】
また加温時間は加温温度にもよるが、加温温度が４０〜６０℃であれば、攪拌液を十数秒程度、より確実には３０秒程度、上記温度下で保持する。
【００３８】
なお、上記加温操作は、必ずしも攪拌工程後に開始する場合に限らず、攪拌工程とともに又はその前に開始し、攪拌工程終了時には、攪拌液が所定の加温温度に達した状態にすることもできる。このように加温操作を攪拌工程と同時に又はその前に開始することにより、攪拌工程と加温工程とを二段階に分けて操作を行う場合に比して、時間的な面で効率化を図ることも可能である。
【００３９】
上記加温工程が終了すると、容器１内の液は水相５とフェノール層６とに分離され、これらの間に肉眼では認識できない場合もあるが中間層７が形成される。すなわち、この加温工程により遠心分離器等を用いることなく水相とフェノール層とに簡便に分離させることが可能となる。
【００４０】
そして、上記において分離された水相５には、目的とする核酸断片が含有され、また、除去したい未反応のヌクレオチドは、ポリメラーゼなどの不必要となった蛋白質とともに中間層７に移行することになる。このため、最終的に、上記水相５を回収することにより、核酸断片を選択的に回収することでき、合成ＤＮＡを電気泳動等により解析する際に泳動像の読み取りを困難にさせるような未反応のヌクレオチドが除去される。その結果、この水相５中の核酸断片を用いてシークエンスなどの解析を行うことにより、解析精度の向上等を図ることが可能となる。
【００４１】
[第二の実施形態]
本実施形態では、上記第一の実施形態の核酸断片の分離方法を核酸シークエンスの前処理に利用した場合を説明する。
【００４２】
先ず、本実施形態において分離対象となるシークエンス用断片の合成について図２を用いて簡単に説明する。
【００４３】
図２（Ａ）に示すように、シークエンス用断片は、出発材料として、鋳型ＤＮＡ、この鋳型ＤＮＡと相補するプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド；ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）、さらにポリメラーゼとバッファーが混合され、この混合液は、例えば９６穴のプレート１０の中の４つの穴１２にそれぞれ添加される。そして、この４つの穴１２に、さらに異なる一種類のジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰのいずれか）がそれぞれ添加される。
【００４４】
シークエンス用断片は、最終的に断片を視覚化し得るように標識が行われるが、この標識方法としては、内部標識法と末端標識法のいずれを用いてもよい。例えば、内部標識法では、上記ｄＮＴＰのうち少なくとも一種類の塩基が放射線や蛍光で標識されたものが用いられる。また、末端標識法では、上記プライマーもしくはターミネータがあらかじめ放射線又は蛍光で標識されたものが用いられる。
【００４５】
上記において反応液が反応プレート１０上で調製された後、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応が行われる。このＤＮＡ合成反応では、プライマーの３’末端に鋳型ＤＮＡと相補するヌクレオチドが次々組み込まれ、鎖が伸長する。しかし、この鎖伸長過程で３’末端に水酸基のないジデオキシヌクレオチドが組み込まれると、次のヌクレオチドが結合できず鎖伸長が特異的に停止する。このようにジデオキシヌクレオチドが組み込まれた位置の相違から、図２（Ｂ）に示すように各穴１２内では、種々の長さの核酸断片が生成される。
【００４６】
次に、ここで生成された核酸断片から混在するヌクレオチドを除去するために前処理が行われる。
【００４７】
このヌクレオチドを除去するための前処理は、上記第一の実施形態に示したフェノール試薬を用いた核酸分離方法に基づいて行われる。さらに、ここでは核酸シークエンス前処理装置により、この前処理を自動化して行う場合を示す。図３、４には、核酸シークエンス前処理装置の正面図と平面図をそれぞれ示す。
【００４８】
図３、４に示すように装置内の基板１３上には、準備ブロック１４が備えられ、この準備ブロック１４には、チップラック１６、フェノール試薬を収容した試薬ラック１８が配置されている。この試薬ラック１８に収容されるフェノール試薬としては、上述した第一の実施形態と同様に中性フェノール、フェノール−クロロホルム等を用いることができる。
【００４９】
基板１３上には、上記準備ラック１４に隣接して攪拌ブロック２０が備えられ、この攪拌ブロック２０には、上記シークエンス反応後の反応液が収容されたプレート１０が載置される。この攪拌ブロック２０では、プレート１０内の反応液に後述する分注器２４によりフェノール試薬が添加され、ここで攪拌が行われる。なお、この攪拌ブロック２０における攪拌操作は、この攪拌ブロックにミキサーなどを備えて行うこともできるが、ここでは後述する分注器により攪拌を実施することとしている。なお、攪拌操作については、後に詳述する。
【００５０】
攪拌ブロック２０に隣接して基板１３上には、ヒートブロック２２が設けられている。このヒートブロック２２では、攪拌ブロック２０で攪拌が行われた攪拌液が移送され、この場所で攪拌液の加温が行われて、攪拌液が水相とフェノール層とに分離させる。
【００５１】
このヒートブロック２２における温度は、攪拌液を水相とフェノール層とに分離させ得る温度、例えば、４０度〜８０度、好ましくは、４０度〜６０度となるように調節される。また、必要に応じて、タイマー等が設けられ、加温時間が制御される。攪拌液を水相とフェノール層に分離させるためには、少なくとも十数秒間、より確実には３０秒程度、加温温度で保持することが必要である。そのため、このタイマーを設置することにより、加温操作を確実に実施することができる。
【００５２】
一方、基板１３の上部には、分注器２４が備えられている。この分注器２４は、先端が基板１３に向けて、ガイドレール２６に左右方向に移動可能に、昇降可能に保持されている。また、このガイドレール２６自体は、その両端が固定部２８に前後方向にスライド可能に支持されている。そのため、分注器２４は、装置の内部を前後左右自在に移動可能とされ、攪拌ラック２０への試薬の移送、反応液への分注及び後述する攪拌操作を実行可能に構成されている。
【００５３】
以下、上記前処理装置の動作について図６を用いて説明する。
【００５４】
上記シークエンス反応が終了した反応液が収容されたプレート１０が、攪拌ブロック２０に配置される。また、準備ブロック１４には、チップラック１６、試薬ラック１８が載置される。これらの準備が完了すると、分注器２４は、攪拌ブロック上のプレート１０に試薬ラック１８からフェノール試薬を移送する。
【００５５】
分注器２４による試薬の移送は、先ず、分注器２４が、ガイドレール２６に案内されて、前記準備ブロック１４のチップラック１６の上部に配置され、降下してチップ１６ａを取り付け、上昇する。次に、試薬ラック１８の上部まで案内され、その位置で降下してフェノール試薬を吸引する。試薬を吸引した分注器２４は、次いで攪拌ブロックの分注するプレート１０の上部まで移動し下降して、吸引したフェノール試薬を分注する（Ｓ０１）。
【００５６】
分注器２４により試薬の分注が完了すると、図５に示すように分注器２４は、プレート１０の穴１２内の反応液とフェノール試薬とが混合された混合液を吸引、吐出しを繰り返して、混合液の攪拌を行う（Ｓ０２）。
【００５７】
攪拌された混合液は、次いで、ヒートブロック２２に移送される（Ｓ０３）。このヒートブロック２２への移送は、例えば、分注器２４を用いて行うこともできる。また、図３、４には示していないアーム手段等を用いてプレート１０のままヒートブロック２２に移送することもできる。
【００５８】
ヒートブロック２２に移送された混合液は上記所定の加温温度下で加温されて、水相とフェノール層とに分離される（Ｓ０４）。そして、このうち水相を回収して（Ｓ０５）、続くシークエンス解析に利用される。このように加温操作により、水相とフェノール層とに分離させることにより、遠心分離器のような大型化する傾向にある機器を備えることなく、上記分離操作を実行することができる。
【００５９】
上記一連の前処理操作により得られた水相は、図２（Ｄ）に示すように、電気泳動に供され、泳動パターンからシークエンスの決定が行われる。特に、本実施形態では、前処理により泳動結果の読み取りを阻害する未反応のヌクレオチド、さらには蛋白質が除去されているため、精度が高く、より長いシークエンス長のの読み取りを可能にすることができる。
【００６０】
なお、ここでは第一の実施形態の核酸分離方法を核酸シークエンスの前処理に利用した前処置装置として説明したが、この装置をＰＣＲなどの核酸増幅装置の未反応のヌクレオチドを除去する装置として利用することもできる。
【００６１】
また、本実施形態では、攪拌ブロック２０とヒートブロック２２とを別に設けたが、これらブロックを一体化させることもできる。この場合には、反応液とフェノール試薬との攪拌操作を行う間は、常温等に保持し、攪拌終了後にそのブロックの温度を上昇させて、混合液を加温し、水相とフェノール層とに分離させることができる。
【００６２】
【実施例】
本発明の核酸分離方法を実施例を用いてより詳細に説明する。ここでは、本方法を核酸シークエンス前処理方法に用いた場合を示す。
【００６３】
１．シークエンス用断片の合成
鋳型ＤＮＡ、プライマー、蛍光標識されたｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、バッファーを混合した混合液を４つ準備し、これらに異なる１種類のｄｄＮＴＰを添加した。このセットを複数準備し、それぞれポリメラーゼ反応を行わせてシークエンス用断片を生成した。
【００６４】
２．前処理
上記において生成されたシークエンス用断片のセットについて前処理を行い、ヌクレオチドの除去を行った。この前処理方法としては、本実施例によるフェノール試薬による前処理を行った。
【００６５】
フェノール試薬による前処理では、上記合成反応後の反応液に、同量の中性フェノールを添加し、攪拌後、５０℃に加温して水相とフェノール層とに分離させた。このうち、水相を回収して、以下のシークエンス決定に用いた。
【００６６】
また同時に、比較対照として従来のエタノール処理、カラムによる精製処理を行ったもの、さらに、未処理のものを準備した。この比較対照であるエタノール沈殿による前処理は、通常のエタノール沈殿法を利用した。すなわち、上記反応液に１００％エタノールを添加し、氷上放置し、その後、遠心分離を行い、沈さを回収し、その沈さを緩衝液により懸濁させた。
【００６７】
同様に他の比較対照であるカラムを用いた処理では、上記反応液を５０μｌ程度に希釈し、QIA quick カラム(QIAGEN Nucleotide Removal Kit)に添加して、一定の時間経過後の溶出液を回収し、この回収液を濃縮するために上記エタノール沈殿処理を行った。
【００６８】
３．シークエンス決定工程
シークエンス決定は、自動シークエンサー（LICOR Model 4200 DNAシークエンサー）を用いて行った。上記において種々の方法で前処理を行ったサンプル液を、シークエンサーの電気泳動ゲルのウェルにそれぞれ注入し、電気泳動を開始して、泳動パターン（シークエンスラダー）を記録した。なお、図７には、プライマーから１〜３００ｂｐ付近の泳動パターンを示す。
【００６９】
図７において、図面に向かって左端に示す未処理の反応液の泳動パターン（サンプル１）では、１〜３００ｂｐ付近において、未反応のヌクレオチドによる団子状のシグナルが複数出現し、周辺のバンドの読み取りが極めて困難であることが示されている。また、図７には示されていないが３００ｂｐ以上の部分では、未処理のヌクレオチドによるシグナルは出現しないものの、各バンドが尾を引いた像となりバンド間が接近した部分では重なり合って読み取りが困難であった。
【００７０】
また、エタノール処理による前処理（サンプル４、５）では、未反応のヌクレオチドによるシグナルは減少したが、完全に消失するには至らなかった。また、全体的にラダー状のバンドのシグナル強度も低下し、各ヌクレオチド（レーン）においてシグナル強度が不均一なためシークエンス決定可能な範囲を狭める結果となった。また、カラムを用いた前処理（サンプル６、７）では、エタノール処理による前処理にも増して、処理後の断片の回収率が低下し各バンドのシグナル強度が著しく減少した。また、各ヌクレオチド（レーン）においてシグナル強度が不均一なためシークエンス決定が困難である。
【００７１】
これに対し、本実施例のフェノール試薬を用いた処理（サンプル２、３）では、１〜３００ｂｐ付近における未反応のヌクレオチドによるシグナルは完全に消失し、かつ、各バンドの分離能が向上し鮮明なラダーバンドが得られた。また、各バンドのシグナル強度が均一で、その低下率もバンドの読み取りに支障のない範囲の低下であり、非常に良好な前処理であることが示された。
【００７２】
なお、上記未処理の泳動パターンでは、通常未反応のヌクレオチドは泳動の先端部分に出現することとなるが、図７に示す結果では、２００ｂｐ付近に団子状に出現した。このことは未反応のヌクレオチドとポリメラーゼなどの蛋白質が塊となっていることが予想される。従って、本実施例のフェノール処理では、一つの操作で、ヌクレオチドと蛋白質とを同時に除去することができることをも示している。
【００７３】
【発明の効果】
以上の通り、本発明によれば、合成後の核酸断片を失うことなく、未反応のヌクレオチドを取り除くことが可能となることから、精度の高いシークエンス解析等の核酸分析を可能とする。特に、本発明では、遠心分離のような煩わしい操作を行うことなく、簡便な操作により目的の核酸断片を回収でき、大量なサンプルの処理などに有利となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  第一の実施形態の核酸断片分離方法の概略を示す図である。
【図２】  第二の実施形態の核酸シークエンス前処理方法を含むシークエンス決定操作の一連の工程を示す図である。
【図３】  第二の実施形態における核酸シークエンス前処理装置の正面図である。
【図４】  第二の実施形態における核酸シークエンス前処理装置の平面図である。
【図５】  第二の実施形態における核酸シークエンス前処理装置における攪拌操作を示す図である。
【図６】  第二の実施形態における核酸シークエンス前処理装置の動作を示す工程図である。
【図７】  実施例における各前処理操作を行った後のサンプルを電気泳動を行った際の１〜３００ｂｐ付近のラダーバンドを示す図である。
【符号の説明】
２  反応液、３  フェノール試薬、５  水相、６  フェノール層、１０  反応プレート、１４  準備ブロック、１６  チップラック、１８  試薬ラック、２０攪拌ブロック、２２  ヒートブロック、２４  分注器。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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