(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式で表される化合物。
【化１】
0003649617.tif 000014
【請求項２】
請求項１に記載の化合物及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物。
【請求項３】
癌の治療薬である請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学合成により製造し得る化合物を用いて２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル化し、切断し得る化合物、これらの化合物を用いたＤＮＡのアルキル化方法、２本鎖ＤＮＡの切断方法、及び、これらの化合物を用いた医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムプロジェクトにより我々の「生命の設計図」である全遺伝子の塩基配列が数年内に解明されようとしている。この設計図に傷があったり、後天的に傷がはいると、病気や老化を引き起こすことが知られている。ヒトゲノムプロジェクトの進展により癌を含む多くの疾病はＤＮＡレベル理解されるようになり、診断、予防などを中心とした医学全体が、革命的に変化するものと考えられる。さらに、これらの疾病のＤＮＡレベルでの理解に基づいた治療法、すなわち病因遺伝子やその産物をターゲットとした医薬品の開発への期待も大きいが、基礎研究を臨床研究に生かしてゆくための橋渡し的な研究はまだ、途についたばかりである。現在、用いられている抗癌剤は、スクリーニングによって選択された抗生物質が多く、もともと癌細胞を殺すために微生物が産生したものではなく、癌の分子生物学的知見に基づいたものはほとんどない。細胞内の特定遺伝子の発現を細胞外から自由自在にコントロールすることが可能になれば、究極の遺伝子レベルでの治療法となると考えられる。
【０００３】
本発明者らは、最近抗生物質デュオカルマイシンがディスタマイシンなどの他種分子とへテロダイマーを形成し協同的にＤＮＡの分子認識を行ない、デュオカルマイシン単独の場合とは異なる塩基配列を効率よくアルキル化することを発見した（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,14405,1996）。この結果をもとにデュオカルマイシンのアルキル化部分にＤＮＡ認識部位としてピロール−イミダゾールポリアミドを結合させ、任意の塩基配列でＤＮＡを選択的にアルキル化する分子の合成に成功し、特許出願をした（特願平１０−２６０７１０号）。
【０００４】
しかし、デュオカルマイシンのアルキル化部分にＤＮＡ認識部位としてピロール−イミダゾールポリアミドを結合させだけの化合物ではアルキル化能が十分なだけではなく、これらの化合物は１本鎖の塩基配列しか認識できないものであった。
そこで、本発明者らは、これらの化合物の分子動力学などのコンピュータモデリングを用いてこれらの分子とＤＮＡとのアルキル化を詳細に検討すると、デュオカルマイシンの反応性のあるシクロプロパン部分（セグメントＡ）にビニル基などのリンカーを導入することにより、ＤＮＡに対するアルキル化能が増すことが期待できそうであることが判明した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アルキル化能が増大したＤＮＡのアルキル化剤を提供するものである。さらに、本発明者らは、この研究において本発明のアルキル化剤がダイマー様の挙動をとり、２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル化し切断することを見出し、特定の塩基配列に対して人工の制限酵素としての作用を有するものであることを見出した。
したがって、本発明は２本鎖ＤＮＡを同時にアルキル化し、切断し得る新規な化学種を提供するものであり、さらにこれらの化学種を用いたＤＮＡのアルキル化および切断方法を提供するものである。
また、本発明はこれらの化合物を用いた抗癌剤を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式（Ｉ）
Ｂ−Ｌ−Ａ        （Ｉ）
（式中、ＢはＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造を示し、ＡはＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造を示し、ＬはＡ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカーを示す。）
で表されるＤＮＡの２本鎖を同時に切断することができる化合物に関する。
また、本発明は、前記の化合物を用いた２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分をアルキル化する方法、及び２本鎖ＤＮＡの特定の塩基配列部分を切断する方法に関する。
さらに、本発明はこれらの化合物を用いた医薬組成物、特に抗癌剤に関する。
【０００７】
本発明の前記一般式（Ｉ）における、ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造部分であるＢは、置換基を有してもよいピロール及び／又はイミダゾールから誘導される化学構造が好ましい。ピロールやイミダゾールの置換基としては、ＤＮＡの塩基配列を認識する妨げとならないものであれば特に制限はなく、例えば、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖又は分枝状のアルキル基、前記したアルキル基から誘導されるアルコキシ基、水酸基、アミノ基、前記したアルキル基から誘導されるＮ−アルキル置換アミノ基、有機カルボン酸から誘導されるＮ−アシルアミノ基、グアニジノ基、置換グアニジノ基などが挙げられる。例えば、Ｎ−メチルピロール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−ヒドロキシピロール、Ｎ−メチル−３−ヒドロキシピロールなどが挙げられる。
また、ＤＮＡの塩基配列を認識できる化学構造部分であるＢとしては、より具体的にはピロール−イミダゾールポリアミド結合が好ましい。ピロールやイミダゾールの長さ（個数）は特に制限はないが２〜１０個、好ましくは２〜５個程度である。
【０００８】
ＤＮＡの塩基の一種に結合し得る化学構造部分であるＡとしては、シクロプロパン環を有する化学構造が好ましく、デュオカルマイシンのアルキル化部分がより好ましい。
Ａ及びＢの化学構造を結合させ得るリンカー部分Ｌとしては、セグメントＡとセグメントＢとを適当な距離隔てることができ、かつ、アルキル化活性を失活させないものが好ましい。好ましい具体例としてはビニル基を含有する化学構造が挙げられる。
【０００９】
一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物の好ましいものとしては、次式
【化３】
0003649617.tif 000002
で表される化合物（以下、「ＰｙＰｙＬＤｕ８６」という。）、又は
【化４】
0003649617.tif 000003
で表される化合物（以下、「ＩｍＰｙＬＤｕ８６」という。）が挙げられる。
前記した化合物は、塩基配列ＴＧＡＣＧ若しくはＣＧＡＣＧ又はそれらの相補鎖を認識する。
【００１０】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、公知の方法に準じて製造することができる。即ち、Ａセグメント及びＢセグメントを常法により製造し、これに順次リンカーセグメントＬを結合させ、次いで残りのセグメントを結合させることにより製造することができる。
【００１１】
例えば、前記のＩｍＰｙＬＤｕ８６（７ａ）及びＰｙＰｙＬＤｕ８６（７ｂ）の製造例を次の化学反応式で示す。反応式中の各化合物の下の数字は化合物の番号を示す。
【化５】
0003649617.tif 000004
反応式中のａ）はベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）のＴＨＦ溶液での処理、次いでＮａＢＨ４処理を示し、ｂ）はＴＨＦ中でのＭｎＯ２処理を示し、ｃ）はＴＨＦ中でのトリエチルホスホノアセテート及びＮａＨ処理を示し、ｄ）は水−メタノール中での水酸化ナトリウムによる処理を示し、ｅ）はＤＭＦ中での１，１−カルボニルジイミダゾールでの処理を示し、ｆ）はＤＭＦ中での水素化ナトリウムを用いたＤＵ８６のセグメントＡとの処理を示す。
【００１２】
こうして合成されたＰｙＰｙＬＤｕ８６および、ＩｍＰｙＬＤｕ８６のＤＮＡとの反応性を調べた。ＩｍＰｙＬＤｕ８６によるアルキル化の結果を図１に示した。この実験に用いたＤＮＡ及び使用したＩｍＰｙＬＤｕ８６を図２に示す。
【００１３】  左側の泳動図は２本鎖ＤＮＡの上のストランドの結果、右側の泳動図は下のストランドの結果である。アルキル化の位置は加熱により切断バンドとしてみることができる。その結果低濃度から主に２本鏡ＤＮＡはサイト１とサイト２で２本鎖の切断されていることがわかり、アルキル化が２本鎖で同時に起っていることが判断できる。このような切断を引き起こす化合物はこれまでに例がなく、まさに人工の制限酵素ということができる。また用いたＩｍＰｙＬＤｕ８６の量から７０％の高率で切断が起っていることが判明し、以前に合成した分子（特願平１０−２６０７１０号参照）にくらべて非常に高い効率であることがわかる。
【００１４】
２本鎖で同時にアルキル化が起った原因は、図３に示すように、ＩｍＰｙＬＤｕ８６が２量体を形成しリンカー部分とイミダゾールがよいスタッキングをすることによりＧＣ塩基対を認識して、このものが２本鎖ＤＮＡの認識配列に特異的に結合しておきているものと考えられる。これらの結果、分子設計により提案され導入したりンカーは反応性も向上させ、またイミダゾールとのペアによる認識ユニットとしても利用できることが明らかになった。これらの知見に基づいてＤＮＡの特定配列をターゲットとする新しいタイプの遺伝子治療薬の分子設計に一歩近づいたと言える。
【００１５】
次に、本発明の化合物の前記した性質に基づく抗細胞活性を検討した。即ち、本発明のＰｙＰｙＬＤｕ８６、ＩｍＰｙＬＤｕ８６と、抗癌剤として公知のデュオカルマイシンＡについてＨｅＬａＳ３細胞（子宮頚部扁平上皮癌細胞）の抗細胞活性を試験した。結果を表１に示す。この結果、本発明の化合物はデュオカルマイシンＡに比べて約３〜７倍の活性があることがわかった。
【００１６】
本発明の化合物は抗癌剤として有用であり、製薬上許容される医薬担体と共に医薬組成物とすることができる。本発明の医薬組成物は、経口投与又は非経口投与により症状に応じて投与することができる。本発明の医薬組成物の有効投与量は、患者の状態や症状などにもよるが、通常は１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で適宜選択することができる。また、本発明の医薬組成物は通常の方法により、注射剤などに製剤化することができる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
以下の実施例において使用される試薬の略称は次のとおりである。
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート。
【００１９】
以下の実施例においては、反応の進行を０．２５ｍｍシリカゲル６０プレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で２５４ｎｍの蛍光インジケーター（メルク社製）によって追跡した。ＴＬＣプレートはＵＶによって観察した。
ＮＭＲスペクトルは、テトラメチルシランを内部標準とし、Ｈ１−ＮＭＲスペクトルの化学シフトはｐｐｍで表記した。
ＥＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｉｍｐａｃｔ）マススペクトルは、ＪＮＭ−ＡＸ  ５０５を用い、ＥＳＩＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ）は、ＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  １６５を用いて測定した。
Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼとフィルターチューブ（Ｓｕｐｒｅｃ−０２）は、宝酒造から、ｔｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｃｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔとローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）はアマシャム社から、５’エンドテキサスレッド修飾ＤＮＡオリゴマー（１８ｍｅｒ）はクラボウから、５０％ロングレンジャー（登録商標）ゲル溶液はＦＭＣバイオプロダクト社からそれぞれ購入した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動はＨＩＴＡＣＨＩ  ５５００−Ｓ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いて行った。
【００２０】
実施例１（化合物２ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造）
ＴＨＦ３０ｍｌ中に化合物１ａ  ２０４．８ｍｇ（０．６７ｍｍｏｌ）、ＢＯＰ３２６．３ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）１７０ｍｌ、ＮａＢＨ４    ９８ｍｇ（２．５９ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を室温下で３時間反応させた後、溶媒を減圧留去して得られた残さにＣＨ３ＯＨ  ２０ｍｌと水５ｍｌを加えた。この溶液を１時間撹拌し、透明な溶液を得た。減圧下で溶媒を留去し、黄色の残査をＣＨ３ＯＨとＣＨ２Ｃｌ２を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して収量９２．６ｍｇの目的の化合物２ａを収率４７．４％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６） δ
10.24 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 7.38 (s, 1H),
7.10(d, J=2.0Hz, 1H), 6.09 (d, J=2.0Hz, 1H),
4.86 (t, J=5.5Hz, 1H), 4.34 (d, J=5.5Hz, 2H),
3.93 (s, 3H), 3.54 (s, 3H), 2.01 (s, 3H).
【００２１】
実施例２（化合物２ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製造）
化合物２ｂは化合物２ａと同様の方法で収率６８．５％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
9.76 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.10 (d, J=2.0Hz, 1H),
7.05 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.78 (d, J=2.0Hz, 1H),
6.01 (d, J=2.0Hz, 1H), 4.82 (t, J=5.5Hz, 1H),
4.34 (d, J=5.5Hz, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.53 (s, 3H),
1.96 (s, 3H).
【００２２】
実施例３（化合物３ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造）
ＴＨＦ３０ｍｌ中に化合物２ａ  ８５ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ）、活性化されたＭｎＯ２（８５％）５５０ｍｇを加え、室温下で１．５時間撹拌した後、ろ過した。溶媒を減圧留去して得られた残査を１Ｈ  ＮＭＲを測定し、次の反応に直接使うのに十分な純度であり、さらに精製する必要がないことを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
10.21 (s, 1H), 10.18 (s, 1H), 9.50 (s, 1H),
7.63 (s, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.10 (d, J=2.0Hz, 1H),
3.94 (s, 3H), 2.84 (s, 3H), 2.02 (s, 3H).
【００２３】
実施例４（化合物３ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製造）
化合物３ｂは化合物３ａと同様の方法で得られた。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
9.99 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 9.49 (s, 1H),
7.57 (s, 1H), 7.14 (d, J=1.0Hz, 1H),
6.98 (d, J=1.0Hz, 1H), 6.88 (d, J=2.0Hz, 1H),
3.87(s, 3H), 3.82 (s, 3H), 1.97 (s, 3H).
【００２４】
実施例５（化合物４ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造）
氷冷下で、ＴＨＦ６ｍｌにＮａＨ（６０％）２３．１ｍｇ（０．５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、さらにトリエチルホスホノアセテート１１６ｍｌを加えた。この反応溶液を５分間撹拌した後、ＴＨＦ２５ｍｌに溶解した化合物３ａを加え、終夜反応させた。ＴＨＦを減圧留去し、得られた残査から酢酸エチルを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより収量８８．５ｍｇの黄色の固体の化合物４ａを収率８４％で得た。（化合物２ａからの２段階での収率）．
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
10.25 (s, 1H), 9.87 (s, 1H), 7.51 (d, J=15.9Hz, 1H),
7.44 (d, J=1.8Hz, 1H), 7.42 (s, 1H),
6.84 (d, J=1.8Hz, 1H), 6.11 (d, J=15.9Hz, 1H),
4.16 (q, J=7.0Hz, 2H), 4.13 (s, 3H), 3.70 (s, 3H),
2.02 (s, 3H), 1.24 (t, J=7.0Hz, 3H).
【００２５】
実施例６（化合物４ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製造）
化合物４ｂは化合物４ａと同様の方法で収率５５％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
9.87 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.51 (d, J=15.5Hz, 1H),
7.39(d, J=2.0Hz, 1H), 7.13 (d, J=2.0Hz, 1H),
6.85 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.73 (d, J=2.0Hz, 1H),
6.07 (d, J=15.5Hz, 1H), 4.16 (q, J=7.0Hz, 2H),
3.82 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 1.97 (s, 3H),
1.23 (t, J=7.0Hz, 3H).
【００２６】
実施例７（化合物５ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造）
ＣＨ３ＯＨ  ５ｍｌ中に化合物４ａ  ７０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、２Ｎ稀ＮａＯＨ  １．５ｍｌと水３ｍｌを加えた反応溶液を室温下で４．５時間撹拌した。  溶媒を減圧留去により除去した後、水２０ｍｌを加えた。この溶液をろ過し、ろ液を２Ｎ  ＨＣｌによりｐＨ２〜３にした。これにより得られたゲル状の沈殿物をろ過し、収量４３ｍｇで化合物５ａを収率６７％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
10.24 (s, 1H), 9.84 (s, 1H), 7.43 (d, J=15.0Hz, 1H),
7.41 (s, 1H), 7.40 (s, 1H), 6.78 (s, 1H),
6.03 (d, J=15.0Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.67 (s, 3H),
3.86(s, 3H);
0003649617.tif 000005
【００２７】
実施例８（化合物５ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製造）
化合物５ｂは化合物５ａと同様の方法で収率５７％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
9.83 (s, 1H), 9.78 (s, 1H), 7.38 (d, J=16.0Hz, 1H),
7.34 (s, H), 7.13 (d, J=2.0Hz, 1H),
6.84 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.64 (s, 1H),
5.99 (d, J=16.0Hz, 1H), 3.82 (s, 3H),
3.65 (s, 3H), 1.99 (s, 3H);
0003649617.tif 000006
【００２８】
実施例９（化合物６ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造）
ＤＭＦ２ｍｌ中に化合物５ａ ２６．４ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）、１，１’−カルボキシルジイミダゾール４９．９ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応溶液を室温下で終夜撹拌した後、水２０ｍｌを加え、ろ過して黄色の沈殿物として化合物６ａを収量２０．５ｍｇ収率６８％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
10.23 (s, 1H), 10.04 (s, 1H), 8.67 (s, 1H),
7.90 (d, J=1.0Hz, 1H), 7.88 (d, J=15.5Hz, 1H),
7.50 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.44 (s, 1H),
7.32 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.16 (d, J=15.5Hz, 1H),
7.10 (S, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.79 (s, 3H),
2.03 (s, 3H);
0003649617.tif 000007
【００２９】
実施例１０（化合物６ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製造）
化合物６ｂは化合物６ａと同様の方法で収率８０％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
10.1 (s, 1H), 9.82 (s, 1H), 8.68 (s, 1H),
7.91 (t, J=2.0 and 2.0Hz, 1H),
7.87 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.48 (d, J=2.0Hz, 1H),
7.22 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.16 (d, J=1.5Hz, 1H),
7.14 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.10 (s, 1H),
6.89 (d, J=1.5Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.78 (s, 3H),
1.97 (s, 3H);
0003649617.tif 000008
【００３０】
実施例１１（化合物７ａ（Ｘ＝Ｎ）の製造）
−５０℃においてＤＭＦ０．３ｍｌ中に水素化ナトリウム（６０％）３．２ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液を、ＤＭＦ０．３ｍｌにＤＵ８６のセグメントＡ６．１ｍｇ（０．０２４ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液を加えた。この反応溶液を−５０〜−４０℃下で３時間撹拌した後にＤＭＦ  １ｍｌに化合物６ａ１０．８ｍｇ（０．０２８ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液を−５０℃下で加えて、更に−４０℃下で５時間撹拌した後、−３０℃に保つ冷凍庫で２日間置いた。その後、リン酸ナトリウム緩衝液（０．０１Ｍ）３ｍｌを加えて、室温下で５分間撹拌した。溶媒を減圧留去して得られた黄色の残さをＣＨ３ＯＨとＣＨＣｌ３を用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して収量１２．３ｍｇの化合物７ａを収率９１％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
12.36 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 9.97 (s, 1H),
7.58 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.43 (s, 1H),
7.41 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.99 (d, J=2.0Hz, 1H),
6.85 (s, 1H), 6.58 (d, J=15.0Hz, 1H),
4.29 (d, J=10.5Hz, 1H),
4.19 (dd, J=5.0Hz and 4.5Hz, 1H), 3.95 (s, 3H),
3.73 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.46 (m, 1H),
2.47 (s, 3H), 2.08 (m, 1H), 2.02 (s, 3H),
1.29 (t, J=4.5 and 3.5Hz, 1H);
0003649617.tif 000009
【００３１】
実施例１２（化合物７ｂ（Ｘ＝ＣＨ）の製造）
化合物７ｂは化合物７ａと同様の方法で収率７７％で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ
12.36 (s, 1H), 9.90 (s, 1H), 9.80 (s, 1H),
7.57 (d, J=15.0Hz, 1H), 7.38 (d, J=1.5Hz, 1H),
7.14 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.88 (d, J=1.5Hz, 1H),
6.86 (d, J=2.0Hz, 1H), 6.84(s, 1H),
6.56 (d, J=15.0Hz, 1H), 4.29 (d, J=10.5Hz, 1H),
4.19 (dd, J=4.0 and 4.5Hz, 1H), 3.83 (s, 3H),
3.73 (s, 1H), 3.71 (s, 1H), 3.46 (m, 1H),
2.47 (s, 3H), 2.09 (m, 1H), 1.97 (s, 3H),
1.29 (t, J=4.5 and 3.5Hz, 1H);
0003649617.tif 000010
【００３２】
実施例１３（４５０ｂｐのＤＮＡフラグメントのアルキル化）
（１）５’−テキサスレッド−末端修飾４５０塩基対ＤＮＡフラグメントの合成。
５’−テキサスレッド−末端修飾４５０ｂｐＤＮＡフラグメントｐＵＣ１８  Ｆ７８０＊−１２２９とｐＵＣ１８  Ｒ１４５９＊−１９０８（これらは相補的配列）は、５’−末端テキサスレッド修飾１８ｍｅｒｓをプライマーとして用いたＰＣＲ法により製造され、Ｓｕｐｒｅｃ−０２によって精製された。これらの濃度はエチヂュウムブロマイド染色法によって決定された。アスタリスクはテキサスレッド修飾位置を示し、数字は複製開始点からのヌクレオチド番号を示している。この塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。
（２）高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動。
全量１０μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１２．５ｍＭ中に５’末端がテキサスレッドでラベルされたＤＮＡフラグメント６０ｎＭ、ＤＭＦ５％（ｖ／ｖ）とさまざまな濃度の薬剤を含む標準反応溶液を微量遠心分離管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れて室温下で一晩温置した後、ｃａｌｆ  ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡ（５ｍＭ，１μｌ）を加えて９０℃５分間加熱した。ＤＮＡはエタノール沈殿により得られた。得られたＤＮＡはローディング色素（フューシンレッドのＤＭＦ溶液）８μｌに溶解させた。サンプル溶液はＤＮＡを変性させるため、９４℃２０分温置した後、すぐに０℃に冷却した。２μｌについて、５５００−ＳＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｓｙｓｔｅｍを用いた、６％  ロングレンジャー（登録商標）を用い、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけられた。
【００３３】
実施例１４（ＨｅＬａＳ３細胞生育阻害試験）
２４穴カルチャープレートの各ウェルに１０％牛胎児血清および２ｍＭグルタミンを含むＭＥＭ培地で２．６７×１０４個／ｍｌに調整したＨｅＬａＳ３細胞を０．７５ｍｌずつ分注した。炭酸ガスインキュベーター内で一晩３７℃で培養後、培地により適宜希釈した表１に示す各試験化合物を０．２５ｍｌずつ各ウェルに加えた。
炭酸ガスインキュベーター内で細胞を７２時間培養後、培養上清を除去し、トリプシン・エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液で細胞を分散、回収した。セルカウンターで細胞数を測定し、無処理での細胞数と既知濃度の試験化合物で処理した場合の細胞数を比較することにより、細胞の増殖を５０％阻害する試験化合物の濃度（ＩＣ５０）を算出した。その結果を下表に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
【発明の効果】
本発明は、２本鎖のＤＮＡを同時にアルキル化又は切断することができる合成可能な化合物を提供するものであり、人工の制限酵素として有用なばかりでなく、特定の塩基配列をターゲットとして遺伝子治療において有用なものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のＩｍＰｙＬＤｕ８６とＤＮＡとの反応の結果を示した、図面に代わる写真である。
【図２】図２は、実験に使用したＤＮＡの塩基配列及びＩｍＰｙＬＤｕ８６の化学構造を示したものである。
【図３】図３は、本発明の化合物によるＤＮＡの切断サイトを模式的に示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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