(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ７５ＴＮＦ受容体をポリエチレングリコールと共役させる方法であって、
ｐ７５ＴＮＦ受容体にｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体を結合させて部位保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体を与え；そして
該部位保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体にポリエチレングリコールを共役させるのに充分な条件下で、該部位保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体をポリエチレングリコールと接触させる
工程を含む方法。
【請求項２】
ｐ７５ＴＮＦ受容体にｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体を結合する工程が、
ｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体を固体支持体に固定し、そして
ｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体がｐ７５ＴＮＦ受容体に可逆的に結合しうる条件下で、該ｐ７５ＴＮＦ受容体を該固定されたｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体と接触させて、保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体を提供する
工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体が、ｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体を共有結合できる官能基を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体をポリエチレングリコールと接触させる工程が、活性ポリエチレングリコールをｐ７５ＴＮＦ受容体上の求核基と反応させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体を脱保護する工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体を脱保護する工程が、保護されたｐ７５ＴＮＦ受容体を脱保護剤で処理することを含む、ここにおいて該脱保護剤はｐ７５ＴＮＦ受容体をｐ７５ＴＮＦ受容体中和抗体から解離させることができる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリエチレングリコール共役ｐ７５ＴＮＦ受容体を回収する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法によって製造されたポリエチレングリコール共役ｐ７５ＴＮＦ受容体。
【請求項９】
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を修飾する方法であって、
ＴＮＦ受容体中和抗体を固体支持体に固定し；
ＴＮＦ受容体中和抗体がＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に結合しうる条件下で、該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を該固定されたＴＮＦ受容体中和抗体と接触させ；そして
該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質にポリエチレングリコールを共役させるのに充分な条件下で、該保護されたＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質をポリエチレングリコールと接触させる
工程を含む方法。
【請求項１０】
保護され、そして共役したＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を脱保護する工程を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法によって製造されたポリエチレングリコール共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１２】
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質をポリエチレングリコールと共役させる方法であって、
ＴＮＦ受容体中和抗体を固体支持体に固定し；
ＴＮＦ受容体中和抗体がＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質に結合しうる条件下で、該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を該固定されたＴＮＦ受容体中和抗体と接触させ；そして
該ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質にポリエチレングリコールが共役しうる条件下で、該保護されたＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質をポリエチレングリコールと接触させる
工程を含む方法。
【請求項１３】
共役したＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を脱保護する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、タンパク質を修飾する方法に関する。より詳しくは、本発明は、所望のタンパク質生物活性を維持したまま、ポリエチレングリコール共役タンパク質に関係した利点を提供する方式で、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合する方法に関する。
関連技術の説明
タンパク質を化学的に修飾する方法および試薬は、何十年かで広範囲に用いられてきた。伝統的に、タンパク質化学修飾は、タンパク質の機能的性質および構造的特徴を研究するために行なわれた。組換えＤＮＤ技術およびタンパク質療法の出現に伴い、研究者らは、タンパク質の治療的性質を変化させるためにタンパク質を化学的に修飾してきた。特に、タンパク質をポリエチレングリコールと共役させる方法は、ポリエチレングリコール共役タンパク質に関係した多数の改良された薬理学的および生化学的性質の結果として、薬学および生化学界内で広く用いられてきた。例えば、ポリエチレングリコール修飾は、臨床用途で用いられるタンパク質の血漿半減期を有意に延長するので、タンパク質の臨床的有用性を実質的に向上させることが知られている。ポリエチレングリコール共役は、タンパク質の抗原性および免疫原性を低下させることによって、生命を脅かすアナフィラキシーを減少させることも知られている。
ポリエチレングリコール修飾タンパク質に関係したもう一つの利点は、ポリエチレングリコールの水への高い溶解度の結果として増加するその水溶性である。増加した水溶性は、生理学的ｐＨでのタンパク質の製剤化特性を改良できるし、溶解度の低いタンパク質の凝集に関係したやっかいな問題を減少させることができる。
更に、ポリエチレングリコール共役タンパク質は、反応環境が酵素の活性に最適でない酵素に基づいた反応などの生物工業用途で用いられてきた。例えば、若干のポリエチレングリコール共役酵素は、より広範な最適ｐＨ活性および低下した最適活性温度を示す。更に、多数の有機溶媒中で低下した活性を有する酵素は、それらが有機溶媒中で反応を触媒するにの有用になる程度までポリエチレングリコールと好結果で共役した。例えば、ポリエチレングリコールは、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役した後、クロロホルムおよびトルエン中で可溶性になり且つ活性になる（Urrotigoityら, Biocatalysis, 2:145-149,1989）。
ポリエチレングリコール共役タンパク質は、血漿循環半減期を増加させ、免疫原性を減少させ、水溶性を増大させ、そして酵素活性を向上させる範囲内で変化する。これらの変化に関与する因子は極めて多く、タンパク質がポリエチレングリコールで置き換えられる程度、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合する化学、およびタンパク質上のポリエチレングリコール部位の位置が含まれる。
ポリエチレングリコールをタンパク質に結合する最も一般的な方法は、タンパク質上のアミノ基の窒素による求核攻撃に感受性の官能基を有するポリエチレングリコール上の少なくとも一つのヒドロキシル基を活性化させることを含む。これら方法は、概して、ポリエチレングリコールの非特異的結合のために、生物学的活性を減少させる。
タンパク質をポリエチレングリコールと共役させる別のアプローチは、共役部位がＮ末端（Kinstlerら, Pharm.Res. 13:996,1996）に限定されるように共役試薬および条件を制御して、ポリエチレングリコールをタンパク質炭水化物官能基に結合させること（Urrutigoityら, Biocatalysis, 2:145-149,1989）およびポリエチレングリコールをタンパク質システイン残基で結合させること（Goodsonら, Biotechnology 8:343,1990）を含む。これらは、反応部位をある程度制御するが、ポリエチレングリコール共役タンパク質を提供する改良された方法は引続き必要とされる。特に、タンパク質をポリエチレングリコールと共役させる方法であって、修飾されたタンパク質に特有の、実質的に低下した免疫原性、増加した溶解性、および延長された循環半減期を含めたポリエチレングリコール共役の利点を維持しながら増大した生物活性を有するかまたは生物活性がほとんど損なわれていない修飾タンパク質を生じる方法を提供することが望まれるであろう。
発明の概要
本発明は、タンパク質に関係した活性がほとんどまたは全く減少していない修飾タンパク質を生じるタンパク質修飾法を提供する。より詳しくは、本明細書中で記載の発明は、最初にタンパク質上のある部位を保護した後、その保護されたタンパク質を、タンパク質にポリエチレングリコールを結合させるのに適した条件下でポリエチレングリコールと接触させることによってタンパク質を修飾する方法を含む。タンパク質の脱保護後、得られたポリエチレングリコール修飾タンパク質は、先行技術手順によって修飾されたタンパク質にまさる改良された特性を有する。好都合な活性の保持は、共役過程において変化していないので、共役過程後に結合パートナーと相互作用するように立体的にフリーのままである１か所またはそれ以上のタンパク質結合部位の利用可能性に起因する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＴＮＦＲ；Ｆｃトリプシン消化フラグメントの逆相ＨＰＬＣ分離によって得られたｐ７５ＴＮＦＲ；Ｆｃペプチドマップである。
図２は、ポリエチレングリコールを共役した未保護ＴＮＦＲ；Ｆｃトリプシン消化フラグメントの逆相ＨＰＬＣ分離によって得られた共役ｐ７５ＴＮＦＲ；Ｆｃペプチドマップである。
図３は、ポリエチレングリコールを共役した保護ＴＮＦＲ；Ｆｃトリプシン消化フラグメントの逆相ＨＰＬＣ分離によって得られた共役ｐ７５ＴＮＦＲ；Ｆｃペプチドマップである。
発明の詳細な説明
本発明は、所望の活性がほとんどまたは全く減少していないポリエチレングリコール共役タンパク質を生じる方式でタンパク質またはポリペプチドをポリエチレングリコールと共役させる方法および試薬を提供する。より詳しくは、本発明は、タンパク質上の部位でポリエチレングリコール共役を妨げる条件下においてポリエチレングリコールをタンパク質と共役させる方法を提供する。好都合に、それら部位はポリエチレングリコールと共役しないので、本発明によって共役したタンパク質は、所望の活性を維持すると同時に、ポリエチレングリコール共役に関係した利点を示す。それら方法は、タンパク質上の１か所若しくはそれ以上の同族部位、基質結合部位または他の結合部位を保護し、その保護されたタンパク質をポリエチレングリコールと共役させた後、そのタンパク質を脱保護することにより、得られたポリエチレン修飾タンパク質は所望の活性の減少を示さないという知見に基づく。
本発明によるポリエチレングリコール修飾には、タンパク質リガンド、受容体、抗原、抗体、酵素、タンパク質フラグメント、ペプチドおよびポリペプチドを含めたいずれのタンパク質も適しているが、これらに制限されるわけではない。本明細書中で記載のポリエチレングリコール修飾に特に望ましいタンパク質候補は、先行技術方法によるそれらの修飾後に、所望の活性の減少を示さないものである。本発明による修飾に適した他のタンパク質は、多数の結合部位を有するものである。この実施態様において、タンパク質は、それら多数の結合部位の１個またはそれ以上に関係した活性を減少させると同時に、１個またはそれ以上の別の部位に関係した活性を維持できるように共役しうる。これは、選択された結合部位だけを保護し、他の結合部位を未保護のまま且つポリエチレングリコール共役に利用可能なまま残すことによって達成される。得られたポリエチレングリコール共役タンパク質は、保護された結合部位に関係した活性を有するであろうし、しかも、未保護部位が共役過程に関与する程度によって、未保護部位に関係した活性を全く示さないかまたは減少した活性を有するであろう。このアプローチは、１か所またはそれ以上のタンパク質結合部位への同族体または基質結合を、ある種の臨床、診断または工業用途で望ましく抑制する場合に有用である。
本発明によって修飾されうるタンパク質には、臨床および診断用途で有用性があるもの並びにバイオリアクター中の酵素のような生物工学産業で用いられるものが含まれる。本明細書中で示されたように修飾されうる受容体には、サイトカイン受容体、例えば、ＴＮＦＲ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ｐ５５ＴＮＦＲ：Ｆｃおよびｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃが含まれる。共役のための候補抗体には、ＯＫＴ３（抗Ｔ細胞）、ＣＥＮＴＮＦTM（抗ＴＮＦ）および抗Ｈｅｒ２／Ｎｅｕが含まれるが、これらに制限されるわけではない。共役に興味深い酵素には、ＣＤ３９、ｔＰＡおよびＤＮＡｓｅTMが含まれる。多数のタンパク質は多量体結合部位を有し、活性に関して二つ以上の組合わせを必要とする。このようなタンパク質は、１個の結合部位が減少してもタンパク質全体は不活性のままであるので、修飾に特に望ましい。多量体タンパク質の群のメンバーには、ＴＮＦ、ｈＧＨ、ＣＤ４０ＬおよびＦａｓＬが含まれる。他の候補タンパク質リガンドは、多数の受容体サブユニットに結合することが知られており、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦが含まれる。
本発明により、タンパク質上の部位の保護は、種々の適当な保護剤並びにその保護剤およびタンパク質の複合体を形成する方法で行なうことができる。本発明の文脈中、保護剤には、１個またはそれ以上のアミノ酸でありうるタンパク質上の部位と可逆的に結合するまたは会合する能力を有する任意の分子が含まれる。その部位が２個以上のアミノ酸を含む場合、それらアミノ酸は隣接していてよいし、またはそのタンパク質のコンホメーションはそれらアミノ酸を空間的に極めて近接して配置しうる。それら部位には、タンパク質活性に関係している同族部位または基質結合部位が含まれるが、それらに制限されるわけではない。例えば、ポリエチレングリコール共役のために選択されたタンパク質に対して免疫反応性の抗体の形の保護剤は、当該技術分野において知られている結合法を用いてタンパク質上の選択された活性部位に結合されうる。好ましくは、選択された抗体結合剤は、目的の活性を与える選択されたタンパク質の部位または保存の的にされた活性を有する部位に対して生じる。逆に、抗原は、本発明による修飾のために選択された抗体上の選択された部位を保護するように作用した後、ポリエチレングリコールとその抗体を共役させることによる抗体の保護剤でありうる。抗体を生産する方法およびタンパク質−抗体複合体を提供する方法は、当該技術分野において知られているし、当業者の知識の範囲内である。
同族部位、基質部位または結合部位を保護する別のアプローチは、修飾のために選択された同族タンパク質への保護剤として受容体またはリガンドを利用することを含む。このような受容体またはリガンド保護剤は、そのタンパク質の天然の同族体または基質である必要はないが、目的のタンパク質上の選択された１か所または複数の活性部位に関して、その１か所または複数の活性部位がポリエチレングリコール共役反応に関与しないよう保護するのに充分な結合親和性が可能であることだけは必要である。更に、本発明によるポリエチレングリコール修飾に選択された基質の結合部位を有する酵素は、その基質に適した保護剤である。
いずれか選択されたタンパク質のための保護剤を選択する場合、いくつかの判定基準を考えることが望ましい。一つの考慮すべき問題は、保護剤および共役のために選択されたタンパク質の相対分子寸法である。保護工程収率は、保護剤の寸法に対する共役に選択されたタンパク質の寸法の比率によって制限されうる。典型的に、保護反応は、その比率が１に近い場合に最高収率で生じるであろう。概して、保護剤およびタンパク質の分子質量は、それら分子寸法の尺度である。したがって、例えば、二価の抗体は約１２５〜１５０ｋＤａの質量を有し、最適反応条件下において１０ｍｇの抗体は、１５０ｋＤａの分子量を有する選択されたタンパク質を約２０ｍｇ保護するであろう。もう一方において抗体は、１５ｋＤａの分子量を有するタンパク質を２ｍｇ程度の少量保護するかもしれない。したがって、保護剤および選択されたタンパク質が同様の質量である場合、保護工程収率は最高でありうる。
タンパク質のために保護剤を選択する場合に考慮されうるもう一つの因子は、本発明の脱保護工程中に用いられる脱保護剤の溶液中での保護剤の安定性およびポリエチレングリコール共役タンパク質の安定性である。下で詳細に論評されるように、共役タンパク質を保護剤から脱保護する工程は、保護剤および共役脱保護タンパク質を、両極端のｐＨ、高イオン強度溶液またはカオトロピック剤へ暴露することを含んでよい。保護剤を追加の保護反応で再使用することになっている場合、共役タンパク質の脱保護に、保護剤活性の不可逆的減少をもたらすかもしれない極端な反応条件を必要としないように保護剤を選択することが好ましい。
保護剤を選択する場合のもう一つ考慮すべき問題には、その保護剤またはその使用に関係した何等かの潜在的毒性が含まれうる。本発明によって共役され且つ臨床用途に予定されたタンパク質は、当然、いずれの毒性物質も実質的に含まない。既知のタンパク質精製法が極めて純粋な物質を与えるとしても、何等かの既知の毒性を有する保護剤を避けることが好ましい。
保護剤を選択する場合のもう一つの考慮すべき問題は、選択されたタンパク質上の可能なポリエチレングリコール共役部位の位置および保護のために選択された結合部位へのそれら位置それぞれの近さである。保護ために選択された部位に極めて近接して可能な共役部位を有する選択されたタンパク質については、それが結合する部位に極めて近接しているタンパク質上の部分を保護するのに充分に大きい保護剤を利用することが望ましいかもしれない。保護剤が、その選択された結合部位の外側に広がった充分に大きい空間的部分を「保護すること」ができる場合、ポリエチレングリコール共役は妨げられるかまたは実質的に減少するので、グリコール共役タンパク質の所望の活性は保存されると考えられる。タンパク質上の好ましい空間的に保護された部分は、タンパク質中の共役部位の空間的配向および下で論評されているポリエチレングリコールの寸法に依るであろう。
本発明によって共役したタンパク質の所望の活性は、保護剤の選択によって影響されうる。例えば、多数の受容体サブユニットを結合するタンパク質は、第一受容体サブユニット結合部位が共役反応の前に保護され、そして第二受容体サブユニット結合部位が保護されないようにポリエチレングリコールと共役しうる。この実施態様において、ポリエチレングリコール共役は、保護された部位で妨げられまたは阻害されるので、リガンドまたは受容体結合のための部位が保存され；そしてポリエチレングリコール共役は未保護部位で行なわれるので、その部位はリガンドまたは受容体結合にほとんど利用できなくなる。この実施態様は、一つの受容体サブユニットの結合部位は保存されうるが、もう一つの受容体サブユニットへの結合は妨げられるので、治療または他の臨床用途で価値がある。この作用は、他の独特の修飾機能を有する具体的なアンタゴニストまたはポリエチレングリコール共役タンパク質の生産をもたらすことができる。
同様に、本発明は、タンパク質の多量体会合を防止する方法を提供する。例えば、ポリエチレングリコールは、多量体会合界面中または周囲の部位に選択的に共役しうるが、本明細書中で示される「部位保護された」ポリエチレングリコール共役によってその天然の同族体へのタンパク質の結合は保存されるので、受容体多量体化は妨げられる。
表Ｉは、本発明の方法で用いるのに適した候補である種々のタンパク質および可能な保護剤を示す。
0003708134.tif 000002
本発明の好ましい実施態様において、選択されたタンパク質を保護する工程は、最初に、１種類またはそれ以上の保護剤を固体支持体に固定した後、その固定された保護剤にタンパク質が結合する方式でタンパク質をその固定された保護剤に接触させることによって行なわれる。好都合に、保護剤を固体支持体に固定することを含む本発明の方法は、引続きの保護反応に同じ固体支持体を用いて繰返すことができるので、反応混合物から保護剤を分離することを必要とすることなく、保護剤を再使用する利点を有する。この実施態様に関係したなおもう一つの利点は、未反応ポリエチレングリコール並びに共役反応副産物および任意の副産物が、保護修飾タンパク質を脱保護する前にカラムを充分に洗浄し、カラムから共役タンパク質を回収することによってポリエチレングリコール修飾タンパク質から容易に除去されることである。好ましくは、固体支持体の化学的および物理的性質は、保護剤およびタンパク質を反応させるための大きな表面積があり、そしてそれが種々のｐＨ、温度、および水性および非水性溶媒を含めた一定範囲の反応条件下で安定であるようにある。更に、固体支持体は、それが、タンパク質を保護するのに利用可能な部位を有する充分な量の保護剤を与える方式で保護剤を固定するように選択されるべきである。
固体支持体またはカラム材料の選択に影響を与える一つの因子は、固定された保護剤の最終の空間的配向である。好ましくは、固定された保護剤は、それが、選択されたタンパク質を最適な方式で保護することができるように固体支持体上で空間的に配向される。これを行なうためには、保護剤を所望の立体配置で配向する追加の活性化合物を用いることが有用でありうる。例えば、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧを含有する固体支持体カラムは、抗体のＦｃドメインによって結合することにより、抗体を固定するためのカラムを製造するであろう。この方法で固定された抗体は、共役のために選択されたタンパク質とそれらの最大結合を与える空間的配向を有する。追加の化合物を利用するもう一つのアプローチは、カラム材料と保護剤との間にスペーサーまたはリンカーを用いて、保護剤を配向させ且つ保護剤と共役に選択されたタンパク質との間に最大の接触面積を与えることを行なう。タンパク質および生体分子のためのリンカーまたはスペーサーは、概して、Pierce ChemicalおよびSigma Chemicalを含めた市販元から広く入手可能である。スペーサーまたはリンカーの最適反応条件および好ましい用途は、当該技術分野において周知である。例えば、Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993は、タンパク質および他の分子をヘテロ二官能性試薬およびホモ二官能性試薬によって種々の官能基に結合させるための試薬の使用を記載している。
種々の反応条件で充分な構造的および化学的安定性を有する固体支持体は、商業的に入手可能である。これら支持体は、典型的にビーズまたは粒子の形であり、架橋ポリマーから加工され、そして種々の固定機序と一緒に利用可能である。例えば、反対電荷イオンの官能基を有する化合物と陽イオンまたは陰イオンによって相互作用する能力を有する固体支持体は、イオン部分によって保護剤を結合するのに用いることができる。イオン交換固体支持体は広く利用可能であり、種々のイオン強度およびｐＨを有する荷電アミノ基、カーボネート、酸性および塩基性基などの官能基を含む。同様に、適当な固体支持体には、目的のタンパク質の一部分に結合することができる特異的結合官能基を有するものが含まれる。例えば、ＩｇＧのＦｃ部分のリガンドを包含する固体支持体は、抗体またはＦｃ融合タンパク質を固定するのに用いることができる。適当な商業的に入手可能なカラムには、結合プロテインＡおよびプロテインＧを含む固体支持体を有するものが含まれ、それらは両方ともＩｇＧの選択された部分を結合するであろう。なお他に適当な固体支持体は、所望の保護剤を共有結合するための活発な反応性部位を有するものである。この特性を有する固体支持体には、アミノ基、ヒドロキシル基およびスルフヒドリル基などの求核基と反応する官能基を包含するものが含まれる。下記の実施例１は、求核基と反応性のアズラクトン官能基を有する一つのこのような商業的に入手可能な固体支持体ＥＭＰＨＡＺＥTMの使用を記載している。なお他に適当な固体支持体は、ポリマー材料から加工され且つ特定のアミノ酸配列を結合する部位を共有結合している、密に会合しているまたは包含しているものである。結合リガンドがそのリガンドを精製する目的で固定されうるようなクロマトグラフィーベッド上で１種類またはそれ以上の特異的結合パートナーを利用可能にさせるアフィニティークロマトグラフィーの一般的な理論およびアフィニティークロマトグラフィーを実施するための固体支持体は、本明細書中に援用されるAffinity Chromatography,Principles and Methods, Pharmacia Publication 18-1022-29で論評されている。
保護剤を固体支持体上に固定する好ましい実施態様において、タンパク質上の部位を保護する工程は、ポリエチレングリコール共役のためのタンパク質を含有する溶液を、固定された保護剤を有する固体支持体に接触させて、保護剤およびタンパク質の複合体の形で保護されたタンパク質を提供することによって行なうことができる。当業者は、最適反応条件が、タンパク質、固体支持体および保護剤に依ることを理解するであろう。したがって、反応ｐＨ、反応温度、反応時間および反応媒質は、選択された保護剤およびタンパク質の複合体の製造に関して知られている理論によって異なってよい。固定された保護剤を有する固体支持体はカラム中に含まれていてよく、この場合、タンパク質を接触させることは、タンパク質含有溶液を一定速度で並びに保護反応を促進する温度およびｐＨ条件下でカラムに通過させることを含みうる。
本発明の範囲内に含まれるのは、保護工程を溶液中で行ない、保護剤を固定しない方法である。このような溶液の基づく方法は、保護剤および選択されたタンパク質の溶液を適当な相対量でおよび保護剤およびタンパク質が複合体を形成するのに充分な反応条件下で提供することを含む。上述のように、反応ｐＨ、反応温度、反応時間および反応媒質は、保護剤およびタンパク質を結合させることに関して周知の理論によって異なってよい。好ましくは、保護反応後、保護剤およびタンパク質の複合体を慣用的な分離技術によって反応混合物から分離する。適当な分離技術には、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法；分離用電気泳動法；および選択的沈降法が含まれる。或いは、保護剤およびタンパク質の複合体を、ポリエチレングリコール共役タンパク質の形成前に保護反応溶液から回収しない。この実施態様では、ポリエチレングリコール共役タンパク質を形成する反応を、タンパク質を保護するのに用いられる溶液中で行なう。下記のような共役反応後、ポリエチレングリコール共役タンパク質は、下記のように１か所または複数の活性部位がフリーであるように脱保護された後、溶液から回収することができる。或いは、保護剤と一緒に複合体を形成したポリエチレングリコール共役タンパク質を回収後、共役反応溶液中でポリエチレングリコール共役タンパク質を脱保護し、そして上記のものが含まれるがそれらに制限されるわけではない、いずれかのタンパク質精製スキームを用いて共役タンパク質を回収することができる。
タンパク質と一緒にポリエチレングリコール共役体を形成するための試薬および手順は、当該技術分野においてそれ自体知られており、概して、本発明の実施に適応しうる。典型的に、これら手順は、ポリエチレングリコール上の一つまたは両方のヒドロキシル基が活性化されている活ポリエチレングリコールを最初に与え、その活性ポリエチレングリコールをポリエチレングリコール共役に選択されたタンパク質上の活性部位と反応させることを行なう。タンパク質をポリエチレングリコールと共役させるのに最も広く用いられている手順は、タンパク質アミノ部位（リシンのε−アミノ窒素またはアミノ末端アミン）とポリエチレングリコールの活性ヒドロキシルとの間の求核反応に基づいている。スルフヒドリルも求核基であるので、ジスルフィド架橋の一部分ではないシステインスルフヒドリルも、タンパク質上の可能な反応部位である。タンパク質とのポリエチレングリコール共役の一般的な理論および一般的な活性化試薬は、本明細書中に援用される、DelgadoらによるThe Uses and Properties of PEG-Linked Proteins,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4):249-304(1992)で記載されている。ポリエチレングリコールおよびモノメトキシポリエチレングリコールの活性型は商業的に入手可能であり、本発明の方法で用いることができる。特に、Shearwater Polymers,Inc.ハンツビル, ＡＬは、多数のポリエチレングリコールポリマーおよびポリエチレングリコール誘導体を提供している。Shearwater Polymers,Inc Catalog（本明細書中に援用されるShearwater Polymers,Inc.Catalog Functionalized Biocompatible Polymers for Research, 1994）には、広範囲の反応条件下でタンパク質とカップリングさせるのに適した多種多様の活性ポリエチレングリコールが含まれている。このカタログは、更に、それら誘導体のポリエチレングリコール試薬に好ましい反応条件を提供している。タンパク質をポリエチレングリコールと共役させるのに適した多数の試薬を承知した当業者は、選択されたタンパク質の性状、タンパク質上の反応性アミノ基またはスルフヒドリル基の性状および共役タンパク質の最終用途を考えた様々な試薬選択を理解するであろう。例えば、改良された溶解性、活性特性および供給性を有するが、必ずしも臨床的クリアランス時間が増加していない共役タンパク質を提供するためには、コハク酸スクシンイミジル活性化ポリエチレングリコール（ＳＳ−ＰＥＧ）を共役反応で用いることができる。タンパク質へのエステル結合はあまり安定ではないが、in vivoで加水分解して、タンパク質からポリエチレングリコールを放出するであろう。活性ポリエチレングリコールは利用可能であり、これは、スルフヒドリル基に対立してアミノ基とより選択的に反応するであろうし、逆の場合も同じである。一般的に選択される活性ポリエチレングリコールには、炭酸スクシンイミジル活性化ポリエチレングリコールおよびプロピオン酸スクシンイミジルポリエチレングリコールが含まれる。
商業的に入手可能な活性ポリエチレングリコールの選択に代わるものとして、目的のポリエチレングリコールは、ヒドロキシル官能基と反応して目的のタンパク質上の部位と反応性の部位を形成する試薬を用いて活性化させることができる。典型的に、タンパク質反応性部位はアミノ基であるが、スルフヒドリルまたはヒドロキシルであることができ、活性ポリエチレングリコールは、典型的に、活性エステルまたはイミダゾールである（同書中274-285頁を参照されたい）。好ましくは、ポリエチレングリコールの一つのヒドロキシル官能基だけが活性化され、これは、活性化反応においてモノメトキシポリエチレングリコールを利用することによって得ることができる。しかしながら、２個のヒドロキシルが活性化される方法は本発明の範囲内である。活性化基の性状および求核攻撃によって、その活性化部分は求核反応後にタンパク質中に包含された状態になってよいしまたはならなくてよい。
ポリエチレングリコールは、いずれの分子量でもありうるが、好ましくは、約５００〜約１００，０００の範囲内、より好ましくは、２，０００〜２０，０００の範囲内である。具体的なポリエチレングリコール分子量を選択する判定基準には、修飾に選択されるタンパク質の分子量、タンパク質上の電荷、タンパク質の種類、および共役に可能な部位の数および位置が含まれるが、これらに制限されるわけではない。異なった分子ポリエチレングリコール分子量と共役したタンパク質に特有の免疫学的および血漿半減期は、Delgadoら, Clitical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249,1992で論評されている。当該技術分野において知られているように、概して、タンパク質に共役したポリエチレングリコールの量が多いほど、血漿半減期は長く、タンパク質溶解性は大きい。糸球体濾過の分画分子量はおよそ７０ｋＤａであるので、約７０ｋＤａ未満の分子量のタンパク質は、延長された血漿半減期を経るであろう。７０ｋＤａより大きいタンパク質については、ポリエチレングリコールの作用およびその分子量はそのクリアランス機序で異なるであろう。
概して、本発明の方法において高分子量を有するポリエチレングリコールを用いると、より低い分子量を有するポリエチレングリコールを用いた場合よりも、タンパク質の分子につきより大きいポリエチレングリコールを有する共役タンパク質を生じる。したがって、タンパク質分子につき多量のポリエチレングリコールが望まれる場合、ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは、最大２０，０００までである。しかしながら、より小さい分子量ポリエチレングリコールは、それらのより大きい溶液移動度のために、より高い分子量の場合よりもタンパク質上の多くの部位に共役できる。したがって、タンパク質が多数の望ましい共役部位を有する場合、より低い分子量を有するポリエチレングリコールを用いて、最適な数の部位を確実に共役させるのが好ましいことがありうる。これは、タンパク質上の可能な共役部位または反応部位が互いに極めて近接している場合、特に望ましいアプローチでありうる。ポリエチレングリコール分子量を選択する場合に用いられるもう一つ考慮すべき問題は、本発明によって処理されたタンパク質が保護された部位を有するとしても、より大きい分子量ポリエチレングリコールは、いったん共役すると、それら分子寸法がそれらに空間的または立体的に影響を及ぼすほど大きいことがありうるので、結合部位または受容体部位が接近しにくくなるということである。何等かの選択されたタンパク質に最適なポリエチレングリコール分子量およびポリエチレングリコール共役から望まれる利点を決定することは、当業者の知識の範囲内である。
保護されたタンパク質をポリエチレングリコールと共役させることに続いて、本発明は、更に、タンパク質を脱保護剤で脱保護することを含む。本明細書中で用いられているように、脱保護剤は、タンパク質および保護剤の複合体から可逆的に結合したタンパク質を放出するまたは切断するような、所定のｐＨを有する任意の分子、溶液または気体、または所定のイオン強度を有する溶液である。保護剤を固体支持体に固定する好ましい実施態様において、共役タンパク質の脱保護は、固定された保護剤を有する固体支持体および共役タンパク質を適当な脱保護剤と接触させることによって行なうことができる。好都合に、この技法は、固体支持体に固定されたままの且つ同じ固体支持体および固定された保護剤を用いる引続きのポリエチレングリコール共役反応での再使用に利用可能な保護剤を生じることができる。選択された脱保護剤およびその使用は、保護剤および共役タンパク質の複合体の性状で異なることがありうる。より詳しくは、脱保護剤およびそれを用いる手順を選択する場合、保護剤および共役タンパク質の複合体の強度すなわち複合体の解離定数（Ｋｄ）は考慮すべき問題でありうる。例えば、本発明の多数の方法において、適当な脱保護剤は、保護剤が共役タンパク質を保護剤から放出させるｐＨを有する緩衝溶液でありうる。保護剤および共役タンパク質の複合体が強く会合していて、その複合体を解離させるのに苛酷なｐＨ条件を必要とする場合、典型的に、脱保護された共役タンパク質溶液の最終ｐＨを中性に近づける調整されたｐＨを有する緩衝液系中に脱保護された共役タンパク質を溶離することが得策である。
或いは、脱保護剤は、保護剤および共役タンパク質の複合体を破壊し且つ共役タンパク質を保護剤から放出させるのに充分なイオン強度を有する溶液でありうる。共役タンパク質は、より強く競合的に結合する保護剤を用いてタンパク質および保護剤の複合体から放出させることができる。更に別の脱保護剤には、尿素などの変性剤、ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡなどのキレート剤、またはイソチオシアン酸カリウムおよびカオトロピック塩を含めた他の試薬が含まれる。多数のリガンド：結合パートナー複合体およびその複合体を脱保護するのに適した試薬の特徴は、Pharmacia Affinity Chromatography Principles and Methods, 18-1022-29,117-119頁（1993）で論評されている。いずれにせよ、脱保護剤は、タンパク質が保護剤に対して有するよりも大きい親和性をそのタンパク質が脱保護剤含有溶液に対して有する原因となるように選択される。例えば、修飾のために選択されたタンパク質がＴＮＦＲであり且つ保護剤がＴＮＦＲ中和抗体である場合、適当な脱保護剤は、ＴＮＦＲがその中和抗体から低ｐＨで解離するので、低ｐＨ緩衝溶液である。
固体支持体がカラム中に配置されている実施態様において、共役タンパク質の脱保護は、便宜上、脱保護剤がタンパク質を脱保護できる条件下において脱保護剤の溶液をそのカラムに通過させることによって行なわれる。ポリエチレングリコール共役タンパク質は、脱保護剤の溶液から直接的に集め且つ回収できる。固体支持体が容器中に含まれている場合、固定された保護剤を有するその固体支持体は、脱保護されたポリエチレングリコール共役タンパク質含有溶液から濾過、遠心分離または当該技術分野において知られている他の分離技術によって分離することができる。
保護剤およびポリエチレングリコール共役タンパク質の複合体が溶液中であるかまたは固体支持体に固定されていない場合、その共役タンパク質は、共役タンパク質溶液に脱保護剤を加えることによって脱保護されうる。脱保護剤を選択する判定基準は上記と同様であり、選択されたｐＨを有する緩衝溶液、選択されたイオン強度を有する溶液、または結合パートナーからタンパク質を脱保護するのに適した性質を有する他の溶液若しくは可能ならば気体であってよい。脱保護工程の条件は、脱保護剤が共役タンパク質を保護剤から解離させることができる充分な時間および温度が維持されるようにあるべきである。脱保護されたポリエチレングリコール共役タンパク質は、分離用液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分離用電気泳動法を含めた標準的なタンパク質の回収および精製技術を用いて保護剤の溶液から回収できる。
上記のポリエチレングリコール共役法は、その結果が、共有結合によってタンパク質に共役したポリエチレングリコールである方法であるが、その共役が異なった会合による方法を含むことは本発明の範囲内である。本発明の文脈中、タンパク質は、種々の異なった結合または共役機序を用いてそれらをポリエチレングリコールに共役させることによって修飾されうる。例えば、共役のために選択されたタンパク質は、アミノ基または他の適当に反応性の官能基においてポリＡオリゴヌクレオチドで誘導体化された後、ポリＴオリゴヌクレオチドで誘導体化されたポリエチレングリコールと共役することができる。もう一つのアプローチは、既知の特異的結合パートナーを有する官能基でタンパク質を誘導体化させた後、そのタンパク質を、その官能基の結合パートナーで誘導体化されたポリエチレングリコールと共役させることを行なう。例えば、タンパク質をビオチンで誘導体化し、ポリエチレングリコールをストレプアビジンまたはアビジンで誘導体化することができる（または逆も同じ）。これは、ビオチンを有するタンパク質部位へポリエチレングリコールを特異的に結合させる。ある種の官能基を導入する目的でタンパク質を修飾するための多数の試薬は商業的に入手可能である。例えば、Pierce Immuno Technologyカタログは、タンパク質修飾に関係した種々の試薬の入手法を確認し且つ提供している。これらの中には、Traut's ReagentsおよびＳＡＴＡ（Pierce Immuno Technology Catalogue, Vol I, E-14頁）があり、これらは、活性基をＮ末端アミンおよびリシンアミノ基に導入することができる。これら活性基は、ポリエチレングリコールとより特異的に反応する官能基を更に導入するための部位を与える。当業者は、ポリエチレングリコールと目的のタンパク質との間のイオン相互作用も可能であるということも理解するであろう。例えば、タンパク質上のイオン部分とポリエチレングリコール上のその対イオンとの間の会合は、その会合が生理学的条件下で会合したままであるように充分に強い場合に利用することができる。
先の修飾タンパク質を利用しうる本発明のもう一つの実施態様は、共役に選択されたタンパク質に、保護されたアミノ酸部分以外に可能なポリエチレングリコール共役部位がほとんどまたは全くない方法を含む。選択されたタンパク質をそのタンパク質上にアミノおよびスルフヒドリル部位を導入するように修飾することにより、充分なポリエチレングリコールをその選択されたタンパク質に共役させて所望の利点を提供することができる。選択されたタンパク質の修飾は、遺伝子工学の方法または化学修飾を用いて行なうことができる。上述のように、タンパク質を修飾して多種多様な望ましい結果を得るための方法および試薬は、当該において周知である。特に、本明細書中に援用されるWong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1993では、共役試薬および作業条件に関する情報が提供されている。
ポリエチレングリコールは好ましいタンパク質共役反応体であるが、種々の更に別のポリマー修飾因子がタンパク質を修飾するのに用いられてきた。これらには、修飾ポリエチレングリコール、分岐状ポリエチレングリコール、架橋ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、アルブミンおよびゼラチンが含まれる。当業者は、本発明をいったん理解したら、本明細書中で記載の理論および方法を、これら追加の試薬のいずれかでタンパク質を修飾する方法に応用できることを理解するであろう。
本明細書中で記載の方法によって修飾されたタンパク質は、予想される有意の活性の減少を伴うことなく、ポリエチレングリコール共役に関係した利点を有する。共役後活性を決定する既知の試験法を単に適用することにより、本発明によって共役したタンパク質の利点を示すことができる。活性試験はタンパク質に特異的であり、目的のタンパク質ごとに選択されるはずである。多数のタンパク質は、１種類または複数の活性に関係した２個以上の部位を有する。このようなタンパク質に関する活性測定の選択は、目的の活性と、共役反応のために特異的に保護されている部位に依る。ポリエチレングリコール共役タンパク質の活性について評価することに加え、それら試験は、ポリエチレングリコール置換の程度、分子量および共役部位について分析することができる。これら分析法を実施する技術は周知であり、いくつかは、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3:4):285-291,1992においてポリエチレングリコール共役タンパク質に関して記載されている。下記の実施例３は、本発明によって共役したｐ７５ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の分子量すなわち流体力学的容積、ポリエチレングリコール置換の程度、および生物活性を決定する方法を記載している。共役タンパク質の分子量および置換の程度について特性決定することは、本発明の実施に不可欠ではないが、共役生成物の特性について洞察を与える。
次の実施例は、本発明の具体的な実施態様をより詳細に説明するために与えられているが、発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例１
部位保護されたＴＮＦＲ：Ｆｃ共役
次は、本発明による二量体ＴＮＦ受容体のポリエチレングリコール共役の方法を記載する。選択されたタンパク質は、ＩｇＧ１Ｆｃ部分で互いに融合したヒトｐ７５ＴＮＦ受容体の二つの細胞外リガンド結合部分の共有結合によって二量体化した融合構築物（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）であった（Mohlerら, J.Immunol. 151:1548-1561,1993）。ＴＮＦＲ：Ｆｃは、ＴＮＦαおよびＬＴαに高親和性で結合する１２０ｋＤａタンパク質である。
組換え体ＴＮＦＲ：Ｆｃは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ選択性の増幅可能なマーカーを用いてＣＨＯ細胞中でタンパク質を発現させることによって得た。懸濁細胞を遠心分離し、制御バイオリアクター中の血清不含培地中に再懸濁させた。生産物を７日後に集め、そしてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後にイオン交換クロマトグラフィー工程を用いてＴＮＦＲ：Ｆｃ分子を精製した。
抗ヒトＴＮＦＲ：Ｆｃ中和単クローン性抗体（ｈｕＴＮＦＲ  Ｍ１）を、Wareら, Immunol. 147:4229で記載のように生じさせた。１９ミリグラム（１９ｍｇ）のｈｕＴＮＦＲ  Ｍ１を、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ８．６に調整された０．５Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．１Ｍ重炭酸ナトリウムのカップリング用緩衝液１Ｌ中に透析した。一晩中透析後、透析用緩衝液を次の１Ｌ容量と交換し、透析を１日の間続けた。アフィニティーカラムは、０．３７ｇの３Ｍ  ＥＭＰＨＡＺＥTMBiosupport Medium（３Ｍ, ミネアポリス, ＭＮから購入された）を３ｍＬのAmiconカラム中に充填することによって製造した。３Ｍ  ＥＭＰＨＡＺＥ Biosupport Mediumは、生体分子をそれらの求核性官能基を介して共有結合するアズラクトン官能基を有する親水性の高度に架橋したビスアクリルアミド／アズラクトンコポリマービーズから加工されている。
ヒトＴＮＦＲ  Ｍ１は、アズラクトン官能基とタンパク質を反応させるための製造者の指示にしたがって１７ｍｇの全ｈｕＴＮＦＲ  Ｍ１含量の透析されたｈｕＴＮＦＲ  Ｍ１溶液５ｍＬをビーズに加えることによって固体支持体ＥＭＰＨＡＺＥTMに固定した。反応後、ビーズおよび溶液を、遠心管中でビーズペレットが形成されるまで遠心分離した。上澄みを傾瀉除去し、ビーズを１０容量の３．０Ｍエタノールアミンを用いてｐＨ９で急冷して、ビーズ上の未反応アズラクトン部位を遮断した。製造者の指示によって２．５時間急冷後、ビーズを遠心分離してペレットにし、エタノールアミン上澄みをペレットから傾瀉した。２５ｍＬのタンパク質不含ＰＢＳをビーズに加え、その混合物を１０分間回転させた。回転混合後、そのＰＢＳを除去し、追加の２５ｍＬのＰＢＳをその混合物に加えた。
抗体を固体支持体上に固定後、固定された抗体を有するビーズをAmiconカラムに移した。次に、０．５ｍｇのＴＮＦＲ：Ｆｃ含有溶液を０．１ｍＬ／分の流速でビーズ上に通過させることにより、ＴＮＦＲ：Ｆｃ上の活性部位をＭ１抗体保護剤で保護した。保護反応が完了後、保護されたＴＮＦＲ：Ｆｃは、１０ｍｇのＳＣ−ＰＥＧ−５０００（shearwater Polymers, バーミンガム, ＡＬから購入された５，０００ＭＷ炭酸スクシンイミジル活性モノメトキシポリエチレングリコール）の５０ｍＬの５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ８．５中溶液を２５℃において１ｍＬ／分でＥＭＰＨＡＺＥTMカラムに一晩中連続的に通過させることによって５，０００ＭＷポリエチレングリコールと共役した。
共役反応後、ｐＨ３．０に調整されたクエン酸ナトリウムの５０ｍＭ溶液を１ｍＬ／分の流速でそのカラムに６０分間通過させることによってポリエチレングリコール共役ＴＮＦＲ：Ｆｃを脱保護した。次に、回収されたポリエチレングリコール共役ＴＮＦＲ：Ｆｃの溶液を０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．４まで中和した。
実施例２
対照ＴＮＦＲ：Ｆｃ共役
次は、ＴＮＦＲ：Ｆｃを保護する工程を含まない方法で対照ポリエチレングリコール共役ＴＮＦＲ：Ｆｃを製造する方法を記載する。４００μＬの５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4中でｐＨ８．５の実施例１で用いられた組換え体ヒト（ｒｈｕ）ＴＮＦＲ：Ｆｃの１００マイクログラム（１００μｇ）をＳＣ−ＰＥＧ  ５０００と、異なったモル比のポリエチレングリコール対タンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃ中のリシン残基の数として計算される）で４℃において一晩中反応させた。タンパク質対リシン残基のモル比は、１．２５：１、０．６２５：２、０．３１３：１、０．１５６：１および０．０７８：１であった。ポリエチレングリコール共役ＴＮＦＲ：Ｆｃは、BioRad, ハークルズ, ＣＡから入手可能なBio-Sil４００カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質精製に関する製造者の指示にしたがって精製した。
実施例３
共役ＴＮＦＲ：Ｆｃの特性決定
次は、実施例１で製造された共役し保護されたＴＮＦＲ：Ｆｃおよび実施例２で製造された対照ＴＮＦＲ：Ｆｃの特性決定を記載する。特性決定には、共役タンパク質をＴＮＦＲ：Ｆｃ分子当たりのポリエチレングリコール鎖の数（共役度）、タンパク質分子量および共役タンパク質生物活性について分析することが含まれた。更に、非共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ対照試料を、同じ分析法を用いて分析した。
ポリエチレングリコール共役度
実施例１および実施例２で得られたタンパク質の溶液中の濃度を、Beckman Amino Acid Analyzerを用いて製造者の指示にしたがって決定した。次に、溶液中のＴＮＦＲ：Ｆｃ分子当たりのポリエチレングリコール単位数を、Sartoreら, Applied Biochemistry and Biotechnology, 31:213,1991で概ね記載されているフルオレスカミン法を用いて決定した。参照されたフルオレスカミン法は、第一アミンと反応して極めて蛍光性の定量的に検出可能な生産物を生じる非蛍光性試薬であるフルオレスカミン試薬を用いて行なう。具体的には、タンパク質溶液それぞれの容量を、タンパク質の濃度が約２００μｇ／ｍＬであるように調整した。次に、各タンパク質溶液を一連の５本の試験管に、試験管がそれぞれ次の容量、すなわち、０．５ｍＬ、０．４ｍＬ、０．３ｍＬ、０．２ｍＬおよび０．１ｍＬを有するように加えた。各試験管を２．０ｍＬの全量までｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈した。
引続き、０．３ｍｇ／ｍＬフルオレスカミン（Sigma Chemical Company, セント・ルイス, ＭＯより購入）のアセトン中溶液１．０ｍＬを、それぞれの試料試験管および２ｍＬの緩衝溶液が入っている対照試験管に加えた。５分間激しく混合後、それぞれの試料を蛍光スペクトロメーターにおいて３９０ｎｍの励起波長および４７５ｎｍの発光波長で分析した。リシン修飾の相対量を決定するために、蛍光単位対タンパク質濃度のプロットを作成した。ポリエチレングリコール共役の百分率は、１−（修飾タンパク質傾き／非修飾タンパク質傾き）×１００として決定した。
分子寸法分析
保護されていない共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ試料、保護された共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ試料および対照ＴＮＦＲ：Ｆｃ試料の相対分子寸法を、標準的なサイズ排除法およびBio-Sil ＳＥＣ４００カラムを用いて決定した。分子寸法は、高分子量タンパク質標準を用いて決定されたが、より正確には、正確な分子量と対比される共役タンパク質の流体力学的容積すなわち相対寸法を反映している。これは、それら標準が既知の分子量を有するタンパク質であり、ポリエチレングリコール修飾タンパク質ではないためである。ポリエチレングリコール鎖は溶液中で伸長し、タンパク質より大きい半径を有する。したがって、ポリエチレングリコールのタンパク質への共役は、それら共役タンパク質が、ポリエチレングリコールによる実際の分子量増加につきより大きい流体力学的容積を有するために、それらの見掛けの分子量を増加させる。その作用は、タンパク質標準と比較した場合のより大きい相対分子寸法である。
共役ＴＮＦＲ：Ｆｃおよび非共役ＴＮＦＲ：Ｆｃの生物活性
実施例１および実施例２で製造されたポリエチレングリコール共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ並びに非共役ＴＮＦＲ：Ｆｃの生物活性を、Onozakiら, J.Immunology 135:3962(1985)およびNakaiら, Biochem.Biophys.Res.Comm. 154:1189(1988)で概ね記載されたバイオアッセイを用いて決定した。そのバイオアッセイは、Ａ３７５ヒト悪性黒色腫付着細胞系のＴＮＦαへの阻害反応に基づいている。可溶性ＴＮＦＲ：Ｆｃは、ＴＮＦαの阻害活性を用量依存様式で特異的に中和できる。バイオアッセイを行なうために、３７５細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １８７２）をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて収集して、細胞単層をフラスコから取出した。収集された細胞を、添加ウシ胎児血清、非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウム（全てＧＩＢＣＯから購入された）を含むDulbeccos' Modified Eagles Mediumの検定培地で洗浄した。
９６ウェルプレートを、実施例１で記載のように製造された非修飾ＴＮＦＲ：Ｆｃ、実施例１で記載のようにポリエチレングリコールと共役した保護ＴＮＦＲ：Ｆｃ、および実施例２で記載のように製造されたポリエチレングリコールと共役した非保護ＴＮＦＲ：Ｆｃの使用液の連続希釈で調製した。次に、上記の検定培地中の等量のＴＮＦα（R & D Systems, Cat.No. ＃２１０−ＣＡ  ＴＦ）を９６ウェルプレート中のウェルに加えた後、等容量の約４×１０5個の収集細胞懸濁液を各ウェルに加えた。
それらプレートを３７℃および１０％ＣＯ2の湿潤室中に入れ、それら細胞を７２時間インキュベートさせた。次に、プレートを室から取出し、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄し、ブロッティングし、エチルアルコールで固定した。生菌は、固定された細胞を０．１％クリスタルバイオレット水溶液で染色することによって可視化した。プレートを水で洗浄後、細胞をブロッティングし、２％デオキシコール酸ナトリウム溶液を各ウェルに加え、それぞれのプレートのウェルの光学濃度を、Delta Softマイクロプレート分析ソフトウェアを用いてプレートリーダーにおいて５７０ｎｍで読み取った。標準的な生物活性単位を各試料に当てはめ、ウェル中のＴＮＦＲ：Ｆｃの濃度を考慮するように調整した。ブランクが入ったウェルを生物活性０とし、非修飾または非共役ＴＮＦＲ：Ｆｃが入ったウェルの生物活性を１００とした。
表IIは、ＴＮＦＲ：Ｆｃタンパク質実験それぞれについてのポリエチレングリコール共役度分析、分子寸法分析および生物活性試験の結果を示す。
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表IIで示された特性決定分析の結果によって示されるように、共役の前に保護されたタンパク質は、それらの活性の減少を示さない。実際に、ＴＮＦＲ：Ｆｃの場合、タンパク質の生物活性は増加する。ＴＮＦＲ：Ｆｃをポリエチレングリコールとそれの共役の前に保護しない場合、それは、ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子当たり最大約４．５単位のポリエチレングリコールまでの、ＴＮＦＲ：Ｆｃ分子当たりのポリエチレングリコール単位または鎖の数の増加を示す。同様に且つ予想通り、共役タンパク質の相対分子量は、反応混合物中のポリエチレングリコールの量の増加に伴って増加する。更に、予想通り、保護部位の利点を伴うことなく共役したＴＮＦＲ：Ｆｃの活性は、共役反応中のポリエチレングリコール：リシン残基の比率の増加に伴って減少する。驚くべきことに、タンパク質を共役反応の前に保護した場合、その共役タンパク質の活性は、非共役対照タンパク質の活性よりはるかに高い活性で測定される。保護条件下で共役したタンパク質の活性は、タンパク質へ共役したポリエチレングリコール単位数が比較的高いにもかかわらず増加する。すなわち、反応条件下では、ＴＮＦＲ：Ｆｃにつき約５〜６ポリエチレングリコール単位が保護されたタンパク質に共役して、対照タンパク質の１１０％〜１３０％で測定される生物活性を生じる。対照的に、平均約４．５ポリエチレングリコール単位が非保護ＴＮＦＲ：Ｆｃに共役する場合、その活性は、対照共役タンパク質の活性の４０％未満まで降下する。明らかに、本発明の方法は、先行技術の方法にまさる向上した利点を有するポリエチレングリコール共役タンパク質を提供する。
実施例４
ＴＮＦＲ：Ｆｃペプチドマップの作成
ポリエチレングリコール共役の部位およびその共役部位に関係した活性を研究するために、非保護ＴＮＦＲ：Ｆｃの共役生産物、本発明によって共役した生産物、および非共役対照ＴＮＦＲ：Ｆｃについてペプチドマップを作成した。ペプチドマップは、ペプチド鎖のリシルおよびアルギニル結合に作用する酵素であるトリプシンでＴＮＦＲ：Ｆｃを消化することによって作成した。トリプシンで処理された天然の非グリコシル化ＴＮＦＲ：Ｆｃは、リシンまたはアルギニン残基を有する部位が３８あるので、３９フラグメントを形成すると考えられる。ポリエチレングリコールは、リシン上の利用可能なアミノ官能基によって共役することが知られており、共役したリシン部位に対するトリプシンの反応性は変化する。したがって、非共役タンパク質と比較された共役タンパク質のトリプシン消化マップは、共役部位および共役度に関する情報を提供すると考えられる。
トリプシン消化は、約１０ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液２００μＬを、５００μＬの７Ｍグニジン：ＨＣｌおよび０．１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３で消化することによって行なわれた。次に、１Ｍジチオトレイトール７μＬをそのタンパク質溶液に加え、その溶液を６５℃で１５分間インキュベートしてタンパク質を還元した。還元されたタンパク質溶液を冷却後、１Ｍ水性ヨードアセトアミド１５．４μＬを加え、還元タンパク質溶液を室温で１０分間インキュベートした。追加の１Ｍジチオトレイトール１５．４μＬを溶液に加えた後、それを１０分間インキュベートし、そして０．１Ｍ  ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５を６．２７６ｍＬ加えることによって７ｍＬの最終容量まで希釈した。Ｎ−グリカナーゼの溶液をそのタンパク質溶液に加えて、２Ｕ  Ｎ−グリカナーゼ／１００μｇＴＮＦＲ：Ｆｃの最終比率にした。この溶液を３７℃で１時間インキュベートした。次に、１μｇ／μＬのトリプシンを含有する充分なトリプシン溶液をタンパク質溶液に加えて、最終トリプシン：タンパク質重量比を１：１０にした。試料を３７℃で５時間インキュベートすることによってそれを消化させた。インキューベーション後、消化物を３分間沸騰させ、１０％トリフルオロ酢酸を用いて消化物をｐＨ２に調整することによって消化を停止させた。
上の手順は、非共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ、結合部位を保護した後に共役したＴＮＦＲ：Ｆｃ、および結合部位を保護することなく共役したＴＮＦＲ：Ｆｃの試料を用いて行なった。次に、Kromasil Ｃ１８、５μ、１００Ａ細孔度、ガードカラムを含む３．２×２５０ｍｍを備えたWaters ＨＰＬＣシステムを用いて全ての試料をクロマトグラフィーで分離した。勾配移動相は、水性０．１５％ＴＦＡを含有する溶媒Ａおよび８０％ＣＨ3ＣＮ中０．１２％ＴＦＡを含有する溶媒Ｂと一緒に用いた。流量は０．５ｍＬ／分で運転時間は２１５分であった。ｕｖ検出器は２２０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を監視した。
対照非共役ＴＮＦＲ：Ｆｃ、保護工程を伴うことなく共役したＴＮＦＲ：Ｆｃ、および保護工程後に共役したＴＮＦＲ：Ｆｃについて得られたトリプシンペプチドマップクロマトグラムは、それぞれ図１、図２および図３で示す。概して、それらマップは、保護ＴＮＦＲ：Ｆｃおよび非保護ＴＮＦＲ：Ｆｃの共役が、マップからピークを消失させるかまたはピーク高さを減少させることを示している。特に、Ｔ７、Ｔ１およびＴ９として識別されたピークに注目されたい。Ｔ７ピークは、両末端のアルギニンと隣接しているトリプシン消化フラグメントであると確認されている。この消化フラグメントの活性部位はどちらもリシンを含まないので、このフラグメントはポリエチレングリコール共役反応によって影響されないと考えられる。したがって、そのピークは、ＴＮＦＲ：Ｆｃがポリエチレングリコール共役反応をしたか否かとは無関係に、ＴＮＦＲ：Ｆｃ消化試料に関して同じであると考えられる。この理由で、Ｔ７ピークは、三つのクロマトグラムの他のピーク全てを規格化するのに用いられたが、三つのマップでは同等のピーク高さを有するように示されている。
Ｔ１フラグメントは、ＴＮＦＲ：ＦｃのＮ末端として確認されており、非共役対照タンパク質のトリプシン消化マップで明瞭であるが（図１）、先行保護を伴わないタンパク質共役対のマップ（図２）および保護工程後に共役したタンパク質のマップでは不存在である。これは、Ｎ末端が、活性ポリエチレングリコール官能基と速やかに共役する極めて反応性のアミノ官能基を含有するためであると考えられる。消化されたポリエチレングリコール共役フラグメントは、ＨＰＬＣ分離中に同じ溶離容量で溶離しないであろう。
興味深いことに、Ｔ９と識別されたピークは、ＴＮＦαの結合に関与していると考えられるアミノ酸残基ｌｙｓ１０８を含むフラグメントに該当することが知られている。重要なことに、Ｔ９ピークは、先行保護することなく共役したＴＮＦＲ：Ｆｃの消化に関係したマップで実質的に減少し（図２）、おそらくは非保護ポリエチレングリコール共役反応の結果として、このリシン残基がトリプシン消化の活性部位ではなかったことを示している。対照的に、保護後に共役したＴＮＦＲ：Ｆｃの消化マップに関するＴ９ピーク（図３）は大きさが減少せず、リシン残基が共役反応によって影響されなかったことを示しているので、トリプシン消化中に活性のままである。このデータは、ＴＮＦＲ：Ｆｃが共役反応の前に充分に保護されたという強い示唆を与え、本発明によって共役したＴＮＦＲ：Ｆｃに関係した保持された活性を説明する。
実施例５
ＩＬ−４Ｒの共役
次は、部位保護法を利用してＩＬ−４Ｒ受容体（ＩＬ−４Ｒ）を共役させることを記載する。ＣＨＯ細胞で生産された組換え体ＩＬ−４Ｒは選択されたタンパク質であり、用いられた保護剤は、ＩＬ−４Ｒの活性を中和するＩＬ−４Ｒ単クローン性抗体であった。ＣＨＯ細胞でＩＬ−４Ｒを発現させる方法および中和抗体を製造する方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１８３号で記載されている。ＩＬ−４Ｒ中和抗体は、実施例１で記載されたのとほぼ同様に３Ｍ  ＥＭＰＨＡＺＥ TM Biosupport Mediumに、１５ｍｇの中和抗体および０．２５ｇの３Ｍ  ＥＭＰＨＡＺＥTMを用いて固定させた。
固定された抗体を有するビーズを２ｍＬステンレス鋼製Amiconカラム（ＶＬ１ｌ×２５）に移し、ＰＢＳを１ｍＬ／分で２分間カラムに流すことによって充填した。そのカラムを、５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．５）を０．５ｍＬ／分で２０分間流すことによって平衡させた。次に、ＩＬ−４Ｒ溶液（２０ｍＭトリス, ｐＨ７．４中５．０ｍｇ／ｍＬ  ＩＬ−４Ｒ）４００μｌを、カラム上の５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．５）中に加えた。得られた溶液を０．５ｍＬ／分で１時間カラムに連続的に通過させた。
保護反応後、カラム中の樹脂中に溶液をポンプで送ることによって５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．５）６ｍＬ中のスクシンイミジルプロピオン酸（ＳＰＡ）活性ＰＥＧ５０００（ＩＬ−４Ｒ上のリシン残基に対して１０倍モル過剰のポリエチレングリコール）５０ｍｇを加えることにより、ＩＬ−４Ｒをポリエチレングリコールと共役させた。ポリエチレングリコール共役反応を一晩中進行させた。非結合ポリエチレングリコールおよび共役反応副産物を、５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．５）を０．５ｍＬ／分で６０分間ポンプで送ることによってカラムから洗落とした。
０．２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）を０．５ｍＬ／分で１時間カラムを介してポンプで送ることにより、共役ＩＬ−４Ｒを脱保護し、カラムから溶離させた。溶離物質の画分を集め、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって分析した。タンパク質含有試料を０．１Ｎ  ＮａＯＨの添加でｐＨ７．０まで中和した。
共役ＩＬ−４Ｒを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー分析によって特性決定した。これらの技術はそれぞれ、保護されたＩＬ−４Ｒがポリエチレングリコールと共役したことを確認した。
実施例６
ｈｕＧＭ−ＣＳＦの共役
組換え体ｈｕＧＭ−ＣＳＦを、Gillis,D.L.ら, Behring Inst.Mitt., 83:1-7（1988）で記載のように酵母で生産した。ｈｕＧＭ−ＣＳＦのＮ末端に特異的なImmunex呼称Ｍ８のＧＭ−ＣＳＦ単クローン性抗体８９ミリグラムを、臭化シアン活性Sepharose ２５ｍＬに、製造者の指示にしたがって共役させた。
抗体を樹脂に固定後、それを５０ｍＬ Amiconカラムに注入し、ＰＢＳをカラムに流すことによって充填した。ＧＭ−ＣＳＦ（６．８ｍｇ／ｍＬ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）で１．５ｍＬ）を、カラム上の５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．０）中に加え、その溶液を０．５ｍＬ／分で２時間カラムに連続的に通過させた。次に、５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．５）をカラムに１時間通過させることによってそのカラムを平衡させた。
１０ｍＬの５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．５）中の炭酸スクシンイミジル（ＳＣ）活性ポリエチレングリコール５０００（ＧＭ−ＣＳＦ上の残留リシンアミノ基に対して５０倍モル過剰のポリエチレングリコール）５００ｍｇを加え、その溶液を０．１ｍＬ分で一晩中カラムにポンプで送ることによってＧＭ−ＣＳＦをポリエチレングリコールと共役させた。
共役したＧＭ−ＣＳＦは、５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ１１．０）を１ｍＬ／分で１時間ポンプで送ることによってカラムから溶離した。溶離物質の画分を集め、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって分析した。タンパク質含有試料を１Ｍ  ＨＣｌの添加でｐＨ７．１まで中和した。共役ＧＭ−ＣＳＦを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって特性決定した。これらの技術はそれぞれ、ＧＭ−ＣＳＦがＰＥＧと共役したことを確認した。質量の変化は、非修飾ＧＭ−ＣＳＦの分子量である約１４ｋＤａから２９ｋＤａであった。検出された分子量変化は、５，０００分子量ポリエチレングリコールの３分子がＧＭ−ＣＳＦの分子にそれぞれ共役したことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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