(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リビトール生産菌を水性培地中で好気的条件下で培養して培養液中にリビトールを蓄積させる培養工程、培養液から菌体を除去する菌体除去工程、菌体が除去された培養液にＣ1〜Ｃ3のアルコールを添加してリビトールを結晶として晶析させる晶析工程、及び晶析したリビトール結晶を培養液から分離する結晶分離工程の各工程を経由することを特徴とするリビトールの製造方法。
【請求項２】
リビトール生産菌を水性培地中で好気性条件下で培養して培養液中にリビトールを蓄積させる培養工程、培養液から菌体を除去する菌体除去工程、菌体が除去された培養液を濃縮する濃縮工程、濃縮された培養液にＣ1〜Ｃ3のアルコールを添加してリビトールを結晶として晶析させる晶析工程、及び晶析したリビトール結晶を培養液から分離する結晶分離工程の各工程を経由することを特徴とするリビトールの製造方法。
【請求項３】
晶析工程で培養液中のＣ1〜Ｃ3アルコールの濃度が５０％以上となるように培養液にＣ1〜Ｃ3アルコールを添加することを特徴とする請求項１又は２記載のリビトールの製造方法。
【請求項４】
晶析工程で培養液にメタノールまたはエタノールを添加することを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載のリビトールの製造方法。
【請求項５】
培養工程で培養液中に蓄積される糖アルコールがリビトール、エリスリトール及びグリセロールを主成分とするものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のリビトールの製造方法。
【請求項６】
リビトール結晶の晶析を０℃以上１０℃以下で行うことを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のリビトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリビトールの製造方法に関するものであり、より詳細にはリビトール生産菌の培養液からリビトールを結晶として分離、回収する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リビトールは生物の構成糖としてのみならず、医薬及び農薬の中間原料として注目されている。従来、微生物を用いてリビトールを製造する方法としてはＤ−リボースを原料として酵素反応により製造する方法、グルコースなどの発酵により製造する方法、及び藻類の炭酸固定による方法が知られている。これらの内、グルコースなどの糖の発酵による方法としては、ピキア  ギリエルモンディ（Pichia guilliermondii ）を用いる方法（Biochem.Physiol.Pflanz 175(8/9)732(1980)) 、モニリエラ  トメントーサ  バー  ポリニス（Moniliella tomentosa var polinis）を用いる方法（特公平６−３０５９１号公報、特公平６−３０５９２号公報、特公平６−３０５９３号公報、特公平６−３０５９４号公報）等が報告されている。
【０００３】
リビトール結晶を高純度に得るためには、これらのリビトール生産菌を水性培地中で培養して得られた培養液からリビトールを高純度で分離、回収する必要が生じる。従来、水溶性の糖アルコール含有溶液から純度の高い糖アルコールを回収する方法としては、クロマト分離を用いる方法や低温晶析法等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
リビトールの場合、これまで培養液からの有効な分離、精製方法は報告されていない。従来の方法はエリスリトールなどの他の糖アルコールは効率的に分離、精製できるものの、リビトールに関しては必ずしも応用され得る方法ではなかった。そこで、培養終了後のリビトール含有液からリビトールを効率よく分離、精製する方法の開発が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、リビトールがＣ1〜Ｃ3のアルコールにより容易に晶析されることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち本発明の要旨は、リビトール生産菌を水性培地中で好気的条件下で培養して培養液中にリビトールを蓄積させる培養工程、培養液から菌体を除去する菌体除去工程、菌体が除去された培養液にＣ1〜Ｃ3のアルコールを添加してリビトールを結晶として晶析させる晶析工程、及び晶析したリビトール結晶を培養液から分離する結晶分離工程の各工程を経由することを特徴とするリビトールの製造方法に存する。
【０００６】
本発明の好ましい実施の形態としては、上記のリビトールの分離、回収方法において、（１）Ｃ1 〜Ｃ3 のアルコールを添加してリビトール結晶を晶析するに先立って、培養液から菌体を除去した上清液に消石灰を添加した後、二酸化炭素を吹き込み、上清液中に共存した糖以外の不純物質を不溶性の金属塩に吸着させ、ろ過によって除去することを特徴とする方法、（２）Ｃ1 〜Ｃ3 のアルコールを添加してリビトール結晶を晶析するに先立って、菌体を除去した上清液を濃縮することを特徴とする方法、（３）Ｃ1 〜Ｃ3 のアルコールを添加してリビトール結晶を晶析するに先立って、培養液から菌体を除去した上清液に消石灰を添加した後、二酸化炭素を吹き込み、上清液中に共存した糖以外の不純物質を不溶性の金属塩に吸着させ、ろ過した後得られたろ過液を濃縮することを特徴とする方法、（４）晶析により得られたリビトール結晶を水に溶解し、消石灰を添加した後二酸化炭素を吹き込み、上清液中に共存した糖以外の不純物質を不溶性の金属塩に吸着させ、ろ過によって除去することを特徴とする方法が挙げられる。
【０００７】
更に、上記の方法は（１）菌体を除去した上清液中に含まれる糖がリビトール、エリスリトールおよびグリセロールを主成分とすること、（２）Ｃ1 〜Ｃ3 のアルコールがメタノール、エタノールまたはプロパノールであること（３）Ｃ1 〜Ｃ3 のアルコールを濃度が５０％以上となるよう添加することが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用するＣ1 〜Ｃ3 のアルコールとしては、水溶性溶液中のリビトールを晶析させる能力を有するアルコールであれば、特に限定されないが、好ましくは、メタノール、エタノール、１ープロパノール、２ープロパノールが挙げられ、さらに好ましくは、メタノールとエタノールが挙げられる。なお、上記アルコールは１種類あるいは２種類以上が用いられる。効率よくリビトールを回収するためには、添加したアルコール濃度が５０％以上好ましくは８０％程度になるように、アルコールを加える必要がある。
【０００９】
次に、本発明の分離、精製方法について具体的に説明する。
本発明の分離、精製方法において培養終了後、微生物は定法、即ち遠心分離や膜ろ過により除去される。除菌に先立ち、培養終了液に熱を加え殺菌を行ってもよい。また更に、必要に応じて脱塩、脱色等、通常の糖の精製における操作を加えることもできる。こうして得られた除菌済みの培養上清液はそのままか、あるいは濃縮、好ましくは５倍から１５倍に濃縮される。
【００１０】
このリビトール含有シロップにＣ1 〜Ｃ3 のアルコール、好ましくはメタノール、エタノール、１ープロパノール、２ープロパノール、更に好ましくはメタノールまたはエタノールを、１種類あるいは２種類以上を、シロップ容量の２分の１量以上、好ましくは２倍以上、更に好ましくは５倍以上攪拌しながら加える。こうして得られたアルコール混液を室温以下、好ましくは０℃以上１０℃以下で静置するとリビトールが晶析される。
【００１１】
こうして得られた結晶は、遠心分離や膜ろ過といった定法を用いることで容易にアルコール溶液中から分離できる。得られた湿潤結晶は真空乾燥等により乾固される。こうして得られたリビトール結晶は必要に応じて再度水溶液に溶解し、脱塩、脱色など、通常の糖の精製における操作を加えさらに精製することも可能である。
【００１２】
本発明の分離、精製方法においては、必要に応じてアルコール晶析の前後に脱塩・脱色と行った工程を組み合わせることが可能であるが、晶析前の濃縮工程以前に炭酸飽充を行うことが有効である。即ち、除菌済みの培養上清液に、その培養上清液に含まれると思われる固形分の０．１％から１０％、好ましくは０．５％から２．０％の消石灰を添加し、好ましくは６０℃前後で１５分から１時間保持した後、二酸化炭素を吹き込み中和する。液中に共存したタンパク質、多糖、核酸、色素などの糖以外の不純物質は不溶性の金属塩に吸着され、ろ過によって除去される。
【００１３】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。
ａ）使用微生物
菌株Ｅ  Trichosporonoides.megachiliensis  ＣＢＳ５６７．８５
ｂ）培養方法
３０％グルコース、１．０％酵母エキスよりなる培地２０ｍｌを入れた２００ｍｌバッフル付きフラスコに、上記ａ）記載の菌株Ｅを接種し、１６０ｒｐｍで回転する振とう培養機にセットされ、３０℃で７日間培養した。
【００１４】
ｃ）リビトールの生産確認
まず上記ｂ）記載の培養にて得られた培養終了液を各々遠心分離し、微生物菌体を除去した。得られた培養上清液に含まれるリビトールの含量を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で測定した。リビトールの保持時間は下記分析条件において１２．２２分である。
高速液体クロマトグラフィー分析条件
カ  ラ  ム：  ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＨ
８mmI.D.×３００mm    （三菱化学株式会社製）
溶  離  液：  １Ｎ  リン酸水溶液
流      速：  ０．６ｍｌ／分
カラム温度：  ５０℃
検  出  器：  ＲＩ
【００１５】
実施例１
上述の培養で得られた培養終了液５００ｍｌを１００℃で２０分間加熱殺菌した後、菌体及び熱変性した不溶性タンパク質等を遠心分離により除去した。得られた培養上清液４８０ｍｌを６０℃に加熱し、消石灰２ｇを添加して３０分間緩やかに攪拌した後、遠心分離により不溶性物質を除去した。得られた清澄な上清液をさらにイオン交換樹脂カラム（ＤＩＡＩＯＮ  ＰＡ３１２（三菱化学株式会社製）とＤＩＡＩＯＮ  ＷＫ１０（三菱化学株式会社製）の混合床）に通し脱塩した。次に粉末活性炭０．６ｇを加えて６０℃、３０分攪拌した後、活性炭を除去した。得られた上清液は淡黄色を呈している。これを５０ｍｌまで濃縮した。このシロップにメタノール２００mlを攪拌しながら加え、４℃で１５時間静置し、結晶を成長させた。十分結晶が成長しメタノール中で沈降してることを確認の上、上清液の糖組成をＨＰＬＣにて分析し、晶析率を算出したところ、リビトールが８５％であったのに対して、エリスリトール及びグリセロールは１０％未満であった。上清液をデカンテーションにより除いた後、メタノールで３回洗浄した。得られた湿潤結晶を減圧乾燥し、糖質純度９９．９％の白色のリビトール粉末結晶２２ｇを得た。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
実施例２
上述の培養で得られた培養終了液５００ｍｌを１００℃で２０分間加熱殺菌した後、菌体及び熱変性した不溶性タンパク質等を遠心分離により除去した。得られた培養上清液４８０ｍｌを６０℃に加熱し、消石灰２ｇを添加して３０分間緩やかに攪拌した後、遠心分離により不溶性物質を除去した。得られた清澄な上清液を５０ｍｌまで濃縮した。このシロップにエタノール２００mlを攪拌しながら加え、４℃で１５時間静置し、結晶を成長させた。十分結晶が成長しメタノール中で沈降してることを確認の上、上清液の糖組成をＨＰＬＣにて分析した。晶析率を算出したところ、リビトールは７１．８％であった。上清液をデカンテーションにより除いた後、エタノールで３回洗浄した。得られた湿潤結晶を減圧乾燥し、糖質純度９８．６％の乳白色のリビトール粉末結晶２７．７ｇを得た。
【００１８】
【表２】
0003719309.tif 000003
【００１９】
実施例３
上述の培養で得られた培養終了液５００ｍｌを１００℃で２０分間加熱殺菌した後、菌体及び熱変性した不溶性タンパク質等を遠心分離により除去した。得られた培養上清液４８０ｍｌを５０ｍｌまで濃縮した。このシロップにメタノール２００mlを攪拌しながら加え、４℃で１５時間静置し、結晶を成長させた。十分結晶が成長しメタノール中で沈降してることを確認の上、上清液の糖組成をＨＰＬＣにて分析した。晶析率を算出したところ、リビトールは７３．５％であった。上清液をデカンテーションにより除いた後、メタノールで３回洗浄した。得られた湿潤結晶を減圧乾燥し、糖質純度８７．５％の淡褐色のリビトール粉末結晶２３．７ｇを得た。
【００２０】
【表３】
0003719309.tif 000004
【００２１】
【発明の効果】
本発明の分離、回収方法により、微生物発酵液からリビトールを高純度に分離、精製することができる。更にこの方法を用いた場合、培養液中にグリセロールがかなりの割合で副製していても、グリセロールはＣ1 〜Ｃ3 のアルコールには比較的容易に溶解するため、容易にリビトールと分離することができる。また更に、このようなアルコール晶析を行った場合、アルコールに可溶な着色成分がアルコール溶液中に溶解し、得られた結晶中から除去されているため、晶析の前、あるいは後で脱色工程を行う場合でも、その負荷を著しく軽減することが可能である。