(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチド。
【請求項２】
配列番号２記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチド。
【請求項３】
配列番号１記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドと配列番号２記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドが２本鎖を形成しているペプチド。
【請求項４】
配列番号１記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドと配列番号２記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドがジスルフィド結合によって２本鎖を形成しているペプチド。
【請求項５】
請求項３あるいは請求項４記載のグルタミン酸遊離阻害活性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、グルタミン酸遊離阻害活性を有する、医薬として有用な新規ペプチドに関する。
【０００２】
【発明の背景及び従来技術】
近年興奮性アミノ酸に関する研究は、脳虚血など後の遅延性神経細胞壊死および記憶などに密接に関連しているという点からますます興味深い領域になっている。
特に脳虚血による神経細胞壊死については、虚血によって神経終末からグルタミン酸が異常に遊離され、これが一連の細胞壊死反応を惹起するものと考えられている［S.M.Rothman et al., Ann.Neurol.,19 ,105-111(1986) , D.W.Choi,Neuron, 1 ,623-634(1988)]。よって、グルタミン酸の遊離を抑制すれば、虚血性脳神経障害の治療に極めて有用と考えられ、このような作用機序を有する薬剤の開発が渇望されている。
【０００３】
一方、１９９２年Mintz らは、蜘蛛（funnel web spider,学名  Agelenopsis aperta) の毒液（以下ＦＴＸと記す）よりラット神経終末からのグルタミン酸遊離を抑制するペプチド、ω−アガトキシンIV A（ω-Agatoxin IV A  以下、単にアガトキシンと略記する。) を初めて見いだし、その構造を決定した。[I.Mintz et al.,Nature,355,827-829(1992)] 。アガトキシンは、アミノ酸４８残基からなるペプチドであり、神経終末のＰ型カルシウムチャネルを抑制することにより、グルタミン酸の遊離を阻害するものと考えられている[T.J.Turner et al.,Science,258,310-313(1992)] 。更に特開平３−１４５５１号には、ＦＴＸから分離した新規ペプチドが開示されており、アガトキシンと同様の薬理作用を持つものであるということが記載されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、神経終末からのグルタミン酸遊離を阻害する作用を有するものとして知られている化合物は、現在のところ極めて少なく、実際に薬剤として使用するには、さまざまな検討課題が残されているというのが現状である。
従って、本発明の目的は、グルタミン酸遊離阻害活性を有する新規ペプチドを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は配列番号１及び配列番号２記載のアミノ酸配列を含有するペプチドを提供するものである。
【０００６】
本発明者等は、ＦＴＸ中の成分について、更なる詳細な検討を行った。
まず第１にグルタミン酸遊離を阻害する粗画分ＦＴＸから、活性物質の分離・精製を試みた。第２にその活性本体の構造解析を行った。
その結果、ＦＴＸ中よりラットシナプトソームからのグルタミン酸の遊離を著明に阻害する活性物質を見いだした。本発明者らは、更に該ペプチドの構造解析を行い、該ペプチドが二本鎖構造を有していることを明らかにし、この二本鎖構造を持つペプチドのアミノ酸配列を決定し、ここに本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドであり、配列番号２記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドであり、配列番号１記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドと配列番号２記載のアミノ酸配列の全部を包含するペプチドが２本鎖を形成しているペプチドである。
【０００８】
本発明において開示された連続したアミノ酸配列のＣ末端及び／またはＮ末端に更に他のアミノ酸配列やその他の化合物が結合しているものや、本発明で開示されたペプチドに何らかの結合により結合して、２本鎖以上のペプチド鎖を形成しているものも含むということは言うまでもない。
【０００９】
本発明にかかるペプチドは、ブラウンリー RP-4,RP-8,RP-18と同様、既知の方法でＦＴＸから分離・精製することができる。
ＦＴＸから分離・精製する方法としては、例えば、疎水性基修飾したシリカゲル担体を使用し、濃度勾配のある親水性有機溶媒で溶出させ、目的画分を集める方法によって行うことができる。この場合の疎水性有機溶媒は、通常この分野で使用し得るあらゆるものが用いられるが、例としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコールなどの低級脂肪族アルコールや、アセトニトリルのような低級脂肪族ニトリルを挙げることができる。また、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等で精製することも可能である。このように本発明のペプチドは、ＦＴＸを原料として、分離、精製することによって製造することも可能である。この場合、配列番号１及び配列番号２に記載のペプチドがジスルフィド結合によって二本鎖構造をとっている。
上記方法における分離・精製における目的画分の追跡は、調製したシナプトソームからのカルシウム依存性のグルタミン酸の遊離を抑制する活性を指標に行えばよい。
すなわち、後述実施例に示されるように、検体にラット前脳からのシナプトソーム画分、ＮＡＤＰ+ 及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと略記する。）を添加し、３７℃で２０分間インキュベート後、３０mM塩化カリウムで脱分極させ、 シナプトソームから遊離されるグルタミン酸によって精製されるＮＡＤＰＨとして測定するものである。
【００１０】
本発明にかかるペプチドは、上記のようにＦＴＸから分離・精製する方法以外にも、既知の方法による遺伝子組み替え技術あるいはペプチドの化学合成技術によって製造することもできる。
要するに、いずれの方法によって得られたものも本発明に包含されるものである。
【００１１】
また本発明にかかるペプチドは、二本鎖でＦＴＸから抽出される場合が主であるが、一本鎖単独であっても本発明に包含される。この場合、抽出された２本鎖のペプチドを２−メルカプトエタノールで還元するなど、通常行われる方法によって、一本鎖にしてもよいし、既知の方法による遺伝子組み替え技術あるいはペプチドの化学合成技術によって一本鎖単独のものを得てもよい。すなわち、一本鎖のペプチドを得る方法についても特に限定されない。
本発明にかかるペプチドの構造解析は、既知の方法によって行うことができるが、例えば、後述の実施例に示されるように、アミノ酸配列自動分析装置を使用し、エドマン分解法によりＮ末端から逐次分解を行い、アミノ酸配列を決定することができる。この結果を配列番号１及び２に示した。
【００１２】
【発明の効果】
以下に、本発明の有用性を示すために、薬理実験例を掲げる。
薬理実験例
（１）グルタミン酸遊離阻害活性
ｉ）実験方法
▲１▼シナプトソーム画分の調製
シナプトソーム画分の調製は、以下のとおり、常法[E.G.Gray et al.,JAnat.,96,79-88(1962)] に従った。なお、シナプトソームの調製に使用する溶液は、すべて実験前に９５％Ｏ2 ＋５％ＣＯ2 混合ガスで十分飽和させたものを用いた。
６周令のウィスター系雄性ラットを屠殺後速やかに脳を摘出し、冷カルシウムフリー  タイロード溶液［組成(mM):NaCl 140,KCl 5,MgCl2 1,D-glucose 24,Na-HEPES 10,pH 7.4]で冷却し、下丘と小脳の間で二分し、その前脳を用いた。
脳組織に２０倍容量の０．３２Ｍショ糖液を加え、ガラスホモジナイザーで氷冷下ゆっくりとホモジナイズした。１０００×ｇ，４℃で１０分間遠心後その上清を２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。沈渣に、カルシウムフリー  タイロード溶液を加え、攪拌後、再び２００００×ｇ、４℃で２０分間遠心した。
【００１３】
沈渣にカルシウムフリー  タイロード溶液を加え、３．５mg  protein/mlの濃度に懸濁させ、１００μＭとなるように塩化カルシウムを添加した。カルシウム添加試料及び塩化カルシウムを添加しないカルシウム無添加試料を調製し、それぞれ３７℃で１時間インキュベートした。以上のようにして得られたシナプトソーム画分を、以下に示したグルタミン酸誘導体阻害活性の実験に用いた。
【００１４】
▲２▼グルタミン酸遊離阻害活性の測定
経口測定用９６穴マイクロプレートの各ウェルに検体及び調製したシナプトソームを８０μｌ（終濃度１．４mg  protein/ml）添加し、更に１ｍＭＮＡＤＰ+ 、５０Ｖ  ＧＤＨを加え、最終容量２００μｌとして、３７℃で２０分間インキュベートした。なおカルシウム無添加試料には、０．２ｍＭＥＧＴＡを添加した。
次に、３０ｍＭ塩化カリウムを加え脱分極させ、その１０分後に９６穴マイクロプレート用自動蛍光光度計を用いて、３５５ｎｍで励起し、４６０ｎｍでの相対蛍光強度を測定した。
実験系において、カルシウム添加試料とカルシウム無添加試料０．２ｍＭＥＧＴＡとの蛍光値の差が、カルシウム依存性のグルタミン酸の遊離量となるため、検体のグルタミン酸遊離の阻害率は、下記に示した数式により算定した。
【００１５】
【数１】
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【００１６】
ii) 実験結果
上記の方法で行った結果を表１に示した。
【表１】
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精製したペプチドは、ＦＴＸ換算で１００００倍希釈液及び１０００倍希釈液相当濃度において、カルシウム依存性グルタミン酸の遊離を著明に抑制し、その抑制は、濃度依存的であった。
【００１７】
上記の結果より、本発明にかかるペプチドは、グルタミン酸遊離阻害作用を有することが明らかとなった。よって、本発明にかかるペプチドは、脳虚血やてんかん重積状態などの病態で発生する急性の脳障害またはアルツハイマー、ハンチントン舞踏症などの慢性疾患などに代表される脳神経疾患治療剤として用いることができるほか、脳神経生理の解明試薬としても非常に有用なものであるということができる。
【００１８】
更に本発明にかかるペプチドは、毒性が低く安全性が高いので、その意味からも、本発明は有用であるといえる。
本発明にかかるペプチドを医薬として使用する場合は、非経口投与により投与されるが、通常は、注射剤などとして投与される。投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、薬剤に対する感受性差、投与の時期、投与の間隔、医薬製剤の性質などによって異なり、特に限定されないが、通常成人１回０．１μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇが好ましい。
【００１９】
注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調製剤、緩衝剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤などを添加し、常法により静脈、皮下、筋肉内注射剤とする。その際必要により、常法により凍結乾燥物とすることも可能である。
【００２０】
懸濁化剤としての例を挙げれば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
【００２１】
溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルベタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。
【００２２】
また安定化剤としては例えば、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテルなどが、保存剤としては、例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。
【００２３】
【実施例】
本発明を更に詳述するために、以下に本発明の実施例を掲げるが、本発明は、これに限定されないことは言うまでもない。
【００２４】
実施例１
（１）  本発明にかかるペプチドの精製
ＦＴＸ２０μｌに１％トリフルオロ酢酸２μｌを加え酸性とした後、これを高速クロマトグラフィーに供し、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したブラウンリーＲＰ−８カラム（４．６mm径×２５cm長）に吸着させた。溶出は、同溶液と６０％アセトニトリル水溶液による濃度勾配溶出法により活性成分を溶出した。以下に示した図１はその溶出パターンであり、横軸は濃度勾配溶出後の経過時間、縦軸は、吸光度を示した。図１で黒く塗りつぶしたグルタミン酸遊離阻害活性を有する画分を集め、凍結乾燥により溶媒を除去した。
得られた物質についてレーザーデソープション飛行時間型質量分析計にて分析を行ったところ、分子量約３００００ダルトンの単一成分として認められた。
【００２５】
（２）  構造解析
本物質約１０ピコモルを用いて、気相プロテインシークエンサー（島津製作所）によりアミノ末端側から確認された。また、本物質を２−メルカプトエタノールを用いて還元したあと、前述の質量分析計にて分析を行ったところ、分子量が約２８０００ダルトンと約２０００ダルトンの２成分が検出された。
すなわち本物質はジスルフィド結合により結合した二本鎖が他のペプチドであることが判明した。
上記の方法で、得られた一本鎖のペプチドのそれぞれのアミノ酸配列決定は、クレストフィールド(Crestfield)等の方法に従い還元カルボキサミドメチル化した後、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液で平衡化したバイダックＣ４カラム（４．６ミリメートル径×１５センチメートル長）に吸着させ、同溶液と８０％アセトニトリルによる濃度勾配溶出法により本物質を図２に示すように軽鎖と重鎖に分離精製した。分離した両鎖について各々を気相プロテインシークエンサーを用いて、アミノ末端側からのアミノ酸配列解析を行った。その結果、配列表に示すように軽鎖に関しては、１８残基を、重鎖に関しては、アミノ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定した。配列番号１に軽鎖のアミノ酸配列を示した。
重鎖の構造解析は、更に、リシルエンドペプチダーゼ、黄色ぶどう球菌由来Ｖ８プロテアーゼ、アスパラギニルエンドペプチダーゼにより、断片ペプチドを調製し、各ペプチドのアミノ酸配列を同定し、以下の配列番号２に示したアミノ末端から１６１残基のアミノ酸配列を同定した。
添加前に、上記条件で脱分極をかけたものを示した。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明にかかるペプチドの第１段階精製クロマトパターンを示す。縦軸の吸光度は、２７９nmで測定しており、１．０ＡｕＦＳで示してある。
【図２】  本発明にかかるペプチドの第２段階精製クロマトパターンを示す。縦軸の吸光度は、２７９ｎｍで測定しており、０．０５ＡｕＦＳで示してある。
【図１】
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【図２】
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