(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法において、カロテノイドの生合成を抑制するDNA構造体で該植物を形質転換させ、かかる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させ、カロテノイド含量が抑制された植物を選択することからなり、該DNA構造体は、
これが植物細胞中でmRNAを生成し得るように植物中で作用する転写開始領域で先導されており、しかも、pTOM5遺伝子の塩基１〜794のアンチセンスDNA配列を含有するものである、植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法。
【請求項２】
トマト植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法において、カロテノイドの生合成を抑制するDNA構造体でトマト植物を形質転換させ、かかる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させ、カロテノイド含量が抑制された植物を選択することからなり、該DNA構造体は、
pTOM遺伝子の塩基１〜794に対応するmRNAと相補なRNAをエンコードするDNA配列を転写するのに定置された、植物中で作用する転写開始領域を含有してなる、トマト植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この出願は新規なDNA構造体、これらを含有する植物細胞及びこれらから誘導した植物に関する。特にこの出願は植物における形質発現を調節する組換えDNA技法の使用を伴なう。
背景技術
本発明を生起する研究においては本発明者はトマトの熟成に関与する酵素を発現する遺伝子（gene）を同定した。この遺伝子はクローン化され且つ特徴付けられている。本発明者は今般該遺伝子がカロテノイドの合成に関与していることを示した。当該遺伝子はクローンpTOM5中に殆んど完全にエンコード（encoded）されており、Rayら（Nucleic Acids Research,15,10587,1989）によって開示されている。
カロテノイドの生合成経路は本明細書の第４図に概略的に示されている。pTOM5遺伝子はゲラニルゲラニルピロリン酸とフイトエンとの間の合成経路の１つ又はそれ以上の工程に関与すると本発明者は考える。合成経路のこの分枝路によつて製造された生成物のうちにはカロテン、ルテイン、キサントフイル及びリコペンの如き色素がある。本発明は植物中でかゝる化合物の合成を改変することを提案する。
発明の開示
本発明によると、植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法において、カロテノイドの生合成を抑制するDNA構造体で該植物を形質転換させ、かかる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させ、カロテノイド含量が抑制された植物を選択することからなり、該DNA構造体は、
これが植物細胞中でmRNAを生成し得るように植物中で作用する転写開始領域で先導されており、しかも、pTOM5遺伝子の塩基１〜794のアンチセンスDNA配列を含有するものである、植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法が提供される。
別の要旨においては、本発明によると、トマト植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法において、カロテノイドの生合成を抑制するDNA構造体でトマト植物を形質転換させ、かかる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させ、カロテノイド含量が抑制された植物を選択することからなり、該DNA構造体は、
pTOM遺伝子の塩基１〜794に対応するmRNAと相補なRNAをエンコードするDNA配列を転写するのに定置された、植物中で作用する転写開始領域を含有してなる、トマト植物中のカロテノイドの製造を抑制する方法が提供される。本発明者は更に本発明の構造体で植物を形質転換することにより植物中のカロテノイド（即ちカロチノイド）の製造を改質する方法を提供する。本発明者は更に、カロテノイドの生合成を改変するのに適したDNAで植物を形質転換させ、かゝる形質転換した植物又はそれらの子孫植物を生長させてカロテノイド含量が改変した植物部分（例えば葉片、花弁又は果実）を製造することにより植物中のカロテノイドの製造を改質する方法を提供する。適当なDNAは就中本発明の構造体を包含してなるが、カロテノイド合成経路の別の部分に作用する別の同様な構造体も使用できる。かゝる構造体はカロテノイド（例えばリコペン）の製造を促進させるか又は植物によるかゝる製造を阻害するのに適用し得る。
周知の通り、細胞は、遺伝子のDNAをタンパク質に転写させてメツセンジヤーRNA（mRNA）を製造し、次いでこのmRNAを例えばイントロン部分の切り出しにより加工（プロセツシング）し最後にリボソームによりタンパク質中に翻訳することによりタンパク質を製造するものである。この過程は細胞中に“アンチセンス（antisense）RNA"の存在によつて阻害されてしまう。このアンチセンスRNAなる用語は当該mRNA中の塩基の配列と相補的なRNA配列を意味し；アンチセンス（逆方向の）配列（３′〜５′の方向で読み取る）中の各々の塩基又は塩基の大部分が５′〜３′の方向に読み取つたmRNA配列中の対応の塩基（Ｃに対してはＧ、Ｕに対してはＡ）と対合（pairing）を行ない得る意味で相補的なRNA配列を意味する。この阻害は２本の相補的なRNA鎖同志間での複合体（complex）の生成によつて生起し、タンパク質の形成を妨害すると思われる。しかしながらこの研究は不確定であり；複合体は更なる転写、プロセツシング、輸送又は翻訳を妨害してしまい又はmRNAを分解してしまい又はこれらの作用の１つ以上を有してしまう。かゝるアンチセンスRNAは、関連する遺伝子の（又はこれと実質的な相同性を示すDNA塩基配列の）コード化DNA鎖（coding strand）（鋳型DNA鎖と相対して）の後方部分を転写するように設けた適当なDNA構造体で形質転換することにより細胞中に製造できる。
特異的な植物遺伝子の発現をダウンレギユレート（downregulate）するのにこの技法を使用することは、例えば米国特許出願第119614号に対応する欧州特許公開第271988号に記載されている。形質発現の減少は植物の表現型の変化を生起し：この変化は全体の眼で見うる表現型の差異のレベルで例えば色のついた花弁の代りに無色となるペチユニアの花弁におけるアントシアニン生産の欠如で（van der KrolらのNature,333,866〜869,1988）；あるいはより微細な生化学的レベルで例えばトマト果実の成熟中にポリガラクツロナーゼの量の変化及びペクチンの解重合の減少で（SmithらのNature,334,724〜726,1988;SmithらのPlant Molecular Biology,14,369〜379,1990）行われる。即ちアンチセンスRNAは植物における形質発現のダウンレギユレーシヨン（downregulation）を達成するのに有用であることが判明された。
本発明はまた本発明のDNA構造体を含有する植物細胞；改質した特性例えば果実の色を示す植物細胞由来の植物；及びかゝる植物の果実及び種子を包含する。
本発明のDNA構造体はpTOM5酵素の生産を調節するのに植物中に挿入できる。DNA構造体の性状に応じて、pTOM5酵素の生産は植物の一生涯に亘つて又は植物の寿命の特定の段階で増大又は減少させ得る。一般に、予期される様に、酵素の生産は実質的に完全な遺伝子と相同性のDNAを含有する構造体によつてのみ促進される。更に驚くべきことは、完全な遺伝子に相当するDNA塩基配列よりも実質的に短かい不完全なDNA塩基配列を含有する構造体はそれらがセンス又はアンチセンスRNAを発現するように設けられたかに拘らず酵素の発現を一般に阻害するものである。
カロテノイド合成経路（第４図参照）におけるpTOM5遺伝子の機能に対する別の証拠はpTOM5塩基配列の翻訳から予測されるポリペプチドとロードバクテル・カプスレイタス（Rhodobacter capsulatus）、紅色硫黄無含有グラム陰性菌からcrtB遺伝子によつてエンコードされたタンパク質との間の有意な程度の相同性（27％の類似性;17％の同一性）である。crtB遺伝子生成物はゲラニルゲラニルピロリン酸の尾−尾二量化を触媒させてプレフイトエンピロリン酸を形成する。この酵素、プレフイトエンシンテターゼは他のイソプレノイド代謝からのカロテノイド生合成の分岐点である。更には、カプシクム  アヌウム（Capsicum annuum）の果実有色体から酵素が単離され、該酵素はプレフイトエンピロリン酸の合成とフイトエンへのその次後の転換との両方を触媒させると思われる。この酵素は、pTOM5タンパク質の予測された大きさ（48,000）と密接に一致して47,500の分子量を有する。
色の産生と同様に、他の重要な機能は本発明の方法によつて改質でいる。即ちβ−カロテン（ビタミンＡの前駆体）及び他のカロテノイドは人間の健康にとつて重要であり、或る病気に対して保護効果を有すると主張されていた。食用植物は本発明の構造体で形質転換することにより改質できこうして食用植物は高含量のかゝる化合物を有し；あるいは別の植物も改質できこうして該植物はかゝる化合物を抽出し得る供給源として作用できる。カロテノイドは高度の光度損傷に対して植物を保護するのに役割りを演ずると考えられ、こうしてかゝる化合物を高含量で有する植物は何らかの地球規模の気候変動の影響を克服するのに価値があり得る。
本発明の別の可能な用途はスポロポレニン合成を調節するものである。この重合体はカロテノイド生合成の産物であると思われる。スポロポレニンは花粉の生成及び成熟中に重要であり、特に胞子生殖の初期段階中に重要である。胞子のう膜における本発明のpTOM5遺伝子の発現を改質することは、特に胞子のう膜の生成、発達又は機能を変化させることによつて花粉の生成を妨害すると予期される。即ちスポロポレニンの抑制はカロテノイドに関与する経路によつてスポロポレニンを生産する全ての植物で行われる。従つて本発明を用いて形質転換した植物の花粉生成を阻止できる。こうして製造した植物は雄性不稔性であり、均質な雑種（ハイブリツド）の工業的製造に有用なものである。この用途については、胞子のう膜に機能性であるプロモーター例えば花粉プロモーターMFS 14を含有する構造体を使用するのが重要である。構成プロモーターの全てが胞子のう膜に作用するものではない（例えばCaMV 35Sプロモーターは作用しない）。
本発明を応用し得る植物には、商業的に重要な果実担持植物特にトマトがある。この様にして、カロテノイド生合成経路及び特に色素のリコペンの促進又は阻害により改質した色を有する植物を生成できる。
本発明を使用してリコペンに伴なう赤色の生成を促進又は阻害できる。トマト果実にこの赤色を抑制すること（例えばアンチセンス構造体での形質転換により）は魅力的な色合いの黄色（或るコシヨウの様な）の果実を与える。同様な黄色のトマトは知られているが、本発明は、同時に他の特徴を変化させるかもしれない延長した養育予定なしに特徴をエリートライン（elite line）に乗換える手段を提供する。リコペン生成を促進するとより深みのある赤色のトマト果実を生成でき、これは特にペースト及びスープの如き加工した材料の形で消費者にとつてより魅力的であると思われる。本発明をまた使用して果実以外の植物の部分に赤色を導入できる。リコペンの促進は植物中で機能性のプロモーターの調節下に遺伝子cDNA又は全長遺伝子の１つ又はそれ以上の機能性コピーを挿入することにより生起できる。リコペンが植物中に天然に発現されるならば、プロモーターを選択して天然のプロモーターによつて与えられる発現よりも高度の発現を与えることができる。
本発明のアンチセンスDNA構造体はきわめて短かくあり得る。該構造体は相同性の塩基配列として長さが少なくとも10個の塩基を含有してなるのが好ましい。塩基配列については理論上の上限はなく、細胞によつて生産された関連あるmRNA程長くあり得るが、便宜上長さにつき100〜2000個の塩基間の塩基配列を用いるのが適当であると一般に見出されるものである。
本発明で用いるに好ましいDNAはクローンpTOM5由来のDNAである。アンチセンスRNAをエンコードする所要のDNAは幾つかの方法で得ることができ即ち：かゝるDNAの適当な配列を制限酵素で切断することにより；各々の末端で適当な制限部位を与えるような仕方でアニールされ次いで互いに連結反応される合成オリゴヌクレオチドを用いてDNAフラグメントを合成することにより；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において合成オリゴヌクレオチドを用いて各々の末端に適当な制限部位を有する所要のフラグメントを生成することにより得ることができる。次いで所要のDNAを、上流側のプロモーター配列と下流側のターミネーター配列とを含有するベクター（vector）中にクローン化し、該クローン化（cloning）はDNA配列がそれを切断するDNA鎖中でその配向に関して反転するように行なう。
アンチセンス（逆方向）RNAを発現する新規なベクターにおいては、以前は鋳型DNA鎖であつたDNA鎖（ストランド）は暗号用（コード用）ストランドとなり、又はその逆であり得る。かくして新規なベクターはpTOM5 mRNAの配列に相補的である塩基配列中にRNAをエンコードするものである。かくして２本のRNA鎖はそれらの塩基配列においてのみならずそれらの配向（５′〜３′）においても相補性である。
転写用のDNA塩基配列の供給源としては、pTOM5の如きcDNAクローンを使用するのが都合良い。pTOM5の塩基配列は第１図に記載される。このクローンは、寄託番号NCIB 40191により大腸菌（E.coli）中のプラスミドとして、現在スコツトランドの23 St.Machar Drive,Aberdeen AB2 lRYに在る寄託機関the National Collections of Industrial and Marine Bacteriaに1989年９月１日に寄託されている。別の場合には、pTOM5と同様なcDNAクローンはスレーターらのプラントモレキユラーバイオロジー（Plant Molecular Biology）５,137〜147,1985によつて記載された方法により成熟しているトマトのmRNAから得ることができる。この様にしてpTOM5によつて生産されたmRNAの全体又は実質的に全体についてコードする塩基配列を得ることができる。こうして得られたcDNAの適当な長さは制限酵素により使用するのに切断できる。
前述した如く、本発明で使用するのに逆方向RNAの好ましい供給源はクローンpTOM5（40191としてNCIMBに寄託した、前述参照）によりエンコードした遺伝子と相同性を示すDNAである。pTOM5は完熟トマトRNAから単離したcDNAライブラリーから由来する（スレーターらのPlant Molecular Biology ５,137〜147,1985）。同じライブラリーからの３つの他のクローン（pTOM45,pTOM91,pTOM104）は交叉雑種形成（cross−hybridise）してpTOM5となり、恐らくは関連する配列を含有している。pTOM5は大体48kDのタンパク質をエンコードするハイブリツド選択翻訳によつて特徴付けられる（スレーターらのPlant Molecular Biology ５,137〜147,1985）。DNA配列を分析するとクローンpTOM5は46.7kDのポリペプチドをエンコードする読み取り枠を有する1600個の塩基の長さである。
pTOM5がコードしているmRNAは成熟しているトマト果実で発現していることを本発明者は示した。未成熟のトマト果実では発現は検出できなかつた。pTOM5は成熟の全赤黄色段階で最も強く発現される。次いでmRNAのレベルは、成熟している果実の生合成能力の一般的な下落と一致して下落する。pTOM5の発現は成熟した緑色の果実を外来のエチレンに暴露することによつても誘発させ得る。pTOM5の発現は成熟阻害剤（Ripening inhibitor;rin）とネバーライプ（Neverripe;Nr）とのトマト果実成熟変異体中で減少され、該変異体はきわめて緩慢に成熟させしかも通常のトマト果実に伴なう完全な赤色を決して達成しない。
pTOM5と相同性の配列のトマト中のゲノム位置はRFLPマツピングを用いて同定された：染色体２及び染色体３上の２つの位置はそれぞれpTOM5と相同性の配列を担持する。遺伝子は小さな多重遺伝子族として存在し得ることがサザン法によつても示された。２本の個々の遺伝子を表わすゲノムクローンは単離されしかもDNA配列分析によつて特徴付けられた。gTOM5はpTOM5と同一のエキソン配列を有する遺伝子を表わす。クローンＦはpTOM5と同様だが同一ではない配列を含有する。配列及び発現のデータはクローンＦが未転写の偽遺伝子をエンコードしていると示唆している。
pTOM5遺伝子族の構造及び発現についてかなりの量の情報があるけれども、このクローンの生化学的機能は今まで知られていなかつた。
転写用の塩基配列についてDNAの別の供給源はpTOM5酵素をエンコードする適当な遺伝子である。この遺伝子はイントロンが存在し得る点でpTOM5のcDNAとは異なつている。イントロンはmRNA中に転写されない（又はこうして転写されたとしても、イントロンは次後に切り落される）。かゝる遺伝子を転写用の部分塩基配列の供給源として使用する時には、イントロン領域又はエキソン領域の何れかを使用できる。
転写用の適当なDNA塩基配列を得る別の仕方は、例えば手引きとして第１図を用いて適当な塩基から非経験的にDNA塩基配列を合成するものである。
本発明の組換えDNA及びベクターは次の如く生成できる。転写用の所望の塩基配列を含有する適当なベクター（例えばpTOM5）を制限酵素で処理して配列を切断する。こうして得られたDNA鎖（ストランド）は、所望のプロモーター配列例えばカリフラワーのモザイクウイルス35Sプロモーター又はトマトのポリガラクツロナーゼ遺伝子プロモーター配列（BirdらのPlant Molecular Biology,11,651〜662,1988）と所望のターミネーター配列（例えば細菌のAgrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子の３′配列、nos 3′末端）とを含有する第２のベクター中にクローン化される（所望ならば逆の配向で）。
本発明によると、事情が要求するように構成プロモーター（例えばカリフラワーのモザイクウイルス35S）と誘導性又は発生的に調節したプロモーター（例えば成熟果実の特異的ポリガラクツロナーゼプロモーター）との両方をしようすることを提案する。構成プロモーターを使用すると植物の全ての部分での機能に作用する傾向があり：然るに組織特異性のプロモーターを使用することにより、機能はより選択的に調節できる。即ち本発明を例えばトマトに応用する際には、PG遺伝子のプロモーター（Birdらの前記文献、1988参照）を用いるのが都合良いと見出される。少なくともトマトにこのプロモーターを使用すると組換えRNAの製造は熟成−特異性プロモーターの制御下にあるという利点がある。即ち組換えRNAはその作用が必要とされる器官でのみ生産される。この事実により特定の器官がその色を変性させ得ることを意味する。観賞物として用いるべき植物（多数あるけれども）に対して、構成プロモーターを使用することにより植物全体にカロテノイドの生産を誘発させて全体に変性した色即ち赤味がかつた／黄色がかつた色を植物に与えることができるが；通常は組織特異性の又は発生的に調節したプロモーター例えば前記したPG遺伝子プロモーターを使用することにより特定の部位（例えば果実、花弁又は塊茎）にカロテノイドの生産を限定するのが好ましいものである。使用し得る他の成熟用−特異的プロモーターにはE8プロモーター（Deikman ＆ FischerのEMBO Journal,７,3315〜3320,1988）及び米国特許第4,943,674号に記載のトマト由来の2A11プロモーターがある。
本発明のベクターを使用して所望に応じて植物を形質転換させることができ、かくして本発明の植物を形成できる。トマトの如き双子葉植物は例えばBevanのNucleic Acid Research,12,8711〜8721（1984）により記載される如くAgrobacterium Tiプラスミド技法によつて形質転換させることができる。かゝる形質転換した植物は有性的に又は細胞培養により又は組織培養により生殖させ得る。
植物細胞中のRNAの作製程度は、プロモーター配列の適当な選択により又は植物ゲノム中に誘導される本発明のDNA配列の複製（コピー）の個数又は組込みの座位を選択することにより調節することができる。この様にして色の生成をより大きな又はより小さな程に改質することができる。
本発明の構造体を使用して、技術的に知られた種々の仕方で単子葉植物と双子葉植物との両方の細胞を形質転換させ得る。多くの場合に、かゝる植物細胞（特に該細胞が双子葉植物の細胞である時）を培養して全植物を再生でき、続いて生殖して遺伝子的に改質した植物の連続世代を与える。
本発明の遺伝子的に改質した植物の例は、トマトと同様に例えばマンゴー、桃、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及びメロンの果実を包含する。かゝる植物の果実はそこに赤色を誘発又は強化することによりより魅力的とさせ得る（又は少なくとも有用とさせ得る）。本発明の方法によつて改質させ得る他の植物にはハツカダイコン、カブラ及びポテトの如き塊茎並びにトウモロコシ（コーン）、小麦、大麦及び稲の如き穀物がある。改質した色の花及び赤色又は赤味がかつた全体の又は赤色の種子頭を有する観賞用草類を製造できる。
本発明の方法によつて製造した植物はまた他の組み換え構造体例えば果実の熟成に別の作用を有する構造体を含有できる。特に本発明の増大した色のトマトは、ポリガラクツロナーゼ及びペクチンステラーゼの如き酵素の生産を阻害する構造体又はエチレンの産生を妨害する構造体（例えばpTOM13から、1990年７月12日提出のPCT出願90/01072号参照）を含有できる。かゝるトマトは慣用のトマトよりも高い固形分含量を有することができしかも果実の重量単位当りより多いトマトペーストを製造できる。かゝるトマトにおける余分のリコペン生産はもしそうでなければかゝるペーストに見られるかもしれない色の軽減を防止するのに望ましい。組み換え構造体の両型式を含有するトマトは連続的な形質転換により又は構造体のうちの１つを各々が含有する２種の品質を交叉させ、両構造体を含有する品種について所産（progeny）のうちから選択することにより形成できる。
本発明を添附図面を参照しながら更に以下に記載する；
第１図はクローンpTOM5の塩基配列を示し；
第２図は、ポリメラーゼ連鎖反応により合成できしかも本発明のベクターの構成に使用できるpTOM塩基配列の領域を示し；
第３図は第２図に例示したフラグメントを合成するポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示し；
第４図はカロテノイドの合成経路の図式であり；
第５図はDNAベクターpCB17の図式であり；
第６図はDNAベクターpCB19の図式であり；
第７図は構造体pJREX5を製造する図式を表わし；
第８図は構造体pCBEXを製造する図式を表わす。
次の実施例は本発明の要旨を説明する。
実施例１
CaMV 35Sプロモーターを有するpTOM5アンチセンスRNAベクターの構成
第２図に示した如くpTOM5 cDNAの異なつた長さに対応する配列を用いて３種のベクターを構成できる。
1.塩基１〜187                             −pJR15A
2.塩基１〜794                             −pJR15B
3.塩基１〜1598（完全なcDNA）              −pJR15C
プライマーとして第２図に示した合成オリゴヌクレオチドT5AS−１及びT5AS−３及び鋳型としてpTOM5 cDNAと共にポリメラーゼ連鎖反応を用いてpJR15Bを試験管内で合成した。合成オリゴヌクレオチドプライマーは、BamH I制限部位をフラグメントの５′末端に組入れKpn I制限部位をフラグメントの３′末端に組入れるように意図した。BamH I及びKpn Iでの切断（cleavage）後に、該フラグメントをKpn I及びBamH Iで前もつて切断しておいたベクターpJR1にクローン化した。pJR1（SmithらのNature 334,724〜726,1988）はBin19（BevanのNucleic Acids Research,12,8711〜8721,1984）基質のベクターであり、これはCaMV35Sプロモーターの制御下にアンチセンスRNAの発現を可能とさせる。このベクターはノパリンシンターゼ（nos）３′末端終結配列を包含する。
ベクターpJR15Bの合成後に、pTOM5配列の構造及び配向はDNA配列分析により確認した。
ベクターpJR15A及びpJR15Cは第２図及び第３図に示した構成図式に従つて、同様に形成した。
実施例２
ポリガラクツロナーゼプロモーターと共にpTOM5アンチセンスRNAベクターの構成
実施例１に記載したpTOM5 cDNAのフラグメントをベクターpJR2中にクローン化して次のクローンを得る：
1.塩基１〜187                             −pJR25A
2.塩基１〜794                             −pJR25B
3.塩基１〜1598                            −pJR25C
pJR2はBin19基質のベクターであり、トマトのポリガラクツロナーゼプロモーターの制御下にアンチセンスRNAを発現し得る。このベクターはノパリンシンターゼ（nos）３′末端終結配列を包含する。このベクターはプロモーターとターミネーター配列との間のKpn I又はBamH I部位を含有しない。従つて、PCR合成フラグメントはKpn I及びBamH Iで消化され、切断末端はT4ポリメラーゼでフラツシユ（flush）させ次いでpJR2のHinc II部位中にクローン化される。
合成後に、pTOM5配列の正確な配向を有するベクターはDNA配列分析により同定される。
実施例３
CaMV 35Sプロモーターと共にpTOM5センスRNAベクターの構成
実施例２に記載したpTOM5 cDNAのフラグメントをセンス配向でベクターpJR1中にクローン化して次のクローンを得る：
1.塩基１〜187                            −pJR15AS
2.塩基１〜794                            −pJR15BS
3.塩基１〜1598                           −pJR15CS
PCRフラグメントをKpn I及びBamH Iで消化し、切断末端をT4ポリメラーゼでフラツシユさせ、次いでpJR1のHinc II部位中にクローン化した。合成後に、pTOM5配列のセンス配向を有するベクターはDNA配列分析により同定された。
実施例４
ベクターpJR15Bで形質転換した植物の世代及び分析
pJR15Bベクターをアグロバクテリウム  ツメフアシエンス（Agrobacterium tumefaciens LBA4404（植物のバイオテクノロジストに広く入手し得る微生物）に転移させ、これを用いてトマト植物を形質転換した。トマトの茎分節片の形質転換は標準の生化学記録書に従つた（例えばBirdらのPlant Molecular Biology 11,651〜662,1988）。形質転換した植物は抗生物質のカナマイシンを含有する培地上で生長する能力により同定した。41本の個々の植物を再生し、成熟するまで生長させた。これらの植物のうち37本が赤色に変化するよりもむしろ黄色に変化した果実を生成し；これらは熟れ過ぎの時でさえ赤色に戻らなかつた。他の４本の植物からの果実は橙赤色に変化した。
黄色の果実を有する植物の花は淡い花冠を有した。花における黄色色素の集積は個々の形質転換細胞同志間で変化し、その際若干の花は殆んど白色である。
予備的な分析が示す所によれば黄色果実中のカロテノイド集積は非形質転換対照体中のカロテノイド集積量の大体６％であつた。リコペンは殆んど検出されなかつた（標準果実中の集積量の＜２％）；残留カロテノイドの大部分はルテイン及びβ−カロテンであり、そのどちらも対照の果実中におけるよりも有意な程に大きな濃度には集積されていなかつた。黄色果実色素の大部分は表皮中に在り、メタノールによつては抽出できなかつた。即ちカロテノイドであるとはありそうもない。
黄色果実を与える形質転換細胞の３つと、赤色果実を与える形質転換細胞の２つをポリメラーゼ連鎖反応分析にかけた。この分析によりpJR15Bアンチセンス構造体は全ての５つに存在し且つ完全なものであることを示した。DNAブロツト分析は挿入複製数（insert copy number）が１〜４であることを示した。
黄色果実を有するコードしたE64C8の形質転換済み植物を自己化（selfed）して子孫植物を生産した。これによりメンデルの原理に応じて黄色の花と白色の花との分離を示し、植物がアンチセンス構造体の機能性コピーを含有し且つ表現型が安定に継承されていることを示している。
実施例５
CaMV 35Sプロモーターと共にpTOM5発現ベクターの構成
pJREX5の構成
発現ベクターpJREX5は第７図に示した図式により試験管内で合成される。1468bp Ssp IフラグメントをpTOM5から単離し、切断末端をT4ポリメラーゼでフラツシユさせ、次いで得られる生成物をプラスミドpJR1のSma I座位中にクローン化させる。
合成後にpTOM5フラグメントをセンス及びアンチセンス配向させたベクターをDNA配列分析により同定した。
実施例６
トマトのポリガラクツロナーゼ  プロモーターと共にpTOM5発現ベクターの構成
A.  pCB17の構成
トマトPG遺伝子の３′末端からの1.6kb領域を、pCB1中のノパリンシンターゼ  ポリアデニル化配列の代りに代用した（BirdらのPlant Molecular Biology11,651〜662,1988）。
gTOM23中のラムダEMBL3の右腕に隣接する5.8kb Sal I/BamH IフラグメントをpUC8のSal I/BamH I座位中にクローン化させてプラスミドpGTOM23.5.8を得た。pGTOM23.5.8から1.6kb Bg IIIフラグメントを単離し、pUC19のBamH I座位中にクローン化した。1.6kb Bg III挿入部を正確に配向したプラスミドは550bp Xba I/BstE IIフラグメントを含有した。かゝる１つのクローンをA3/1と呼ぶ。
2.2kb Hind III/Pvu IをpCB1からのフラグメントとして単離した。これは1.45kb PGプロモーターフラグメントとクロラムフエニコールアセチル  トランスフエラーゼ（CAT）遺伝子とを含有した。これをBin19（BevanのNucleic Acids Research,1984,12,8711〜8721）中にクローン化させ、Bin19はSal Iで切断されており続いてT4 DNAポリメラーゼで付着端を装填し、次後にHind IIIで消化してあつた。2.2kb Hind III/Pvu Iフラグメントを有するプラスミドは2.2kb Hind III/Xba Iフラグメントを含有した。これらのクローンのうちの１つをXba I及びKpn Iで消化させ、A3/1からの1.6kb Xba I/Kpn Iフラグメントと連結反応させた。形質転換後に、正確な挿入部を有する１つのクローンをpCB17（第５図）と呼称する。
pCB17の正確な構成はCAT遺伝子とPG3′フラグメントとの間の境界でプラスミドDNAのヌクレオチド配列分析により点検した。Bin19ポリリンカーの予期せぬ領域がこの接合部で残存していることが見出された。これはプラスミドの正確な機能化を妨害しそうもないものと判断された。この領域におけるpCB17の配列は次の通りである；
0003616638.tif 000002
B.  pCB19の構成
プラスミドpCB17中のPGプロモーター領域はゲノムクローンgTOM23（NCIMB受理番号12373）からの3.5kbフラグメントの付加により延長させた。
pGTOM23.7.8からの3.5kb Hind IIIフラグメントをpCB17中のHind III座位中にクローン化させた。3.5kb Hind AYE挿入部を正確に配向させたプラスミドは4.9kb Sa II/Bam Iフラグメントを含有した。かゝる１つのクローンをpCB19と呼称した（第６図）
C.  pCB19の構成
第８図に示した図式により発現ベクターpCBEX5を試験管中で合成する。1468bp Ssp IフラグメントをpTOM5から単離させ、切断末端をT4ポリメラーゼでフラツシユさせる。次いで得られるpCB19中にクローン化させ、pCB19からクロラムフエニコールアセチル  トランスフエラーゼをエンコードするBamH I−Xba Iフラグメントを削除しておき、しかも切断末端をT4ポリメラーゼでフラツシユさせてある。
合成後に、pTOM5フラグメントをセンス及びアンチセンス配向させたベクターはDNA配列分析により同定した。
実施例７
センスベクターpJREX5及びpCBEX5を有する形質転換した植物の世代
所要のセンス発現ベクター（実施例５又は６で製造した）をAgrobacterium tumefaciens LBA4404（植物のバイオテクノロジストには広く入手し得る微生物）に転移させしかもこれを用いてトマトを形質転換させる。トマトの茎分節片の形質転換は標準の生化学記録書に従がう（例えばBirdらのplant Molecular Biology,11,651〜662,1988）。形質転換した植物は、抗生物質のカナマイシンを含有する培地上で生長する能力により及びゲノムDNAのDNAブロツト分析によりDNAを検定することにより同定された。成熟している果実をリコペン及び他のカロテノイドの濃度について分析する。通常のリコペン濃度よりも高いリコペン濃度の植物を別の用途及び研究用に選択する。
【図１】
0003616638.tif 000003
【図２】
0003616638.tif 000004
【図３】
0003616638.tif 000005
【図４】
0003616638.tif 000006
【図５】
0003616638.tif 000007
【図６】
0003616638.tif 000008
【図７】
0003616638.tif 000009
【図８】
0003616638.tif 000010