(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水、ヒルジン、及び水に不溶な塩の形態でのカルシウム、マグネシウム又は亜鉛イオンを含む、水性貯蔵配合物。
【請求項２】
前記の水に不溶な塩が、リン酸塩である、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
4 〜11のpHをもつ、請求項１又は２に記載の配合物。
【請求項４】
6 〜8 のpHをもつ、請求項３に記載の配合物。
【請求項５】
金属塩の濃度が、100mM 〜600mM である、前記の請求項のいずれかに記載の配合物。
【請求項６】
金属塩の濃度が、150mM である、請求項５に記載の配合物。
【請求項７】
ヒルジンの濃度が、1 〜600mg/mlである、前記の請求項のいずれかに記載の配合物。
【請求項８】
ヒルジンの濃度が、20〜80mg/ml である、請求項７に記載の配合物。
【請求項９】
前記のヒルジンが、デスルファトヒルジン変異体又はそれらの突然変異体である、前記の請求項のいずれかに記載の配合物。
【請求項１０】
前記のヒルジンが、デスルファトヒルジンHV1 である、前記の請求項のいずれかに記載の配合物。
【請求項１１】
前記の水に不溶な塩の粒子の大きさが、直径10〜30μm である、前記の請求項のいずれかに記載の配合物。
【請求項１２】
前記の水に不溶な塩の粒子の大きさが、直径10〜20μm である、請求項１１に記載の配合物。
【請求項１３】
糖をも含む、前記の請求項のいずれかに記載の配合物。
【請求項１４】
前記の糖が、マンニトールである、請求項１３に記載の配合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒルジンの水性配合物、そして特に、貯蔵配合物(depot formulations)に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒルジン、すなわち、ヒル(Hirudo medicinalis)内の天然の抗血液凝固剤は、単一のポリペプチド種ではなく、ヒルジン変異体1(HV1)、ヒルジン変異体2(HV2)( 欧州特許出願第158 564 号を参照のこと) 、ヒルジン変異体3(PA)[PCT 出願第86/03493] 及び" デス-(Val)2 - ヒルジン"(欧州特許出願第158 986 号を参照のこと) と命名れている少なくとも4 つの代表から成る1 クラスの等しく作用するポリペプチドである。この変異体は、構造において、アミノ酸の数により( 特に、HV1 のN-末端配列は、Val-Val-Tyr であり、HV2 及びHV3 のものは、Ile-Thr-Tyr であり、そして" デス-(Val)2 - ヒルジン" のものは、Thr-Tyr である。) 互いに異なっているが、そのN-末端における疎水アミノ酸の集積及びそのC-末端における極性アミノ酸の集積、硫酸モノエステルとして存在するチロシン残基(Tyr63) 、3 つのジスルフィド結合並びに共通の抗血液凝固活性をもっている。
【０００３】
近年、ヒルジン変異体をコードしているcDNA及び合成遺伝子が、クローン化され、そして微生物宿主内で発現された。この発現生成物は、Tyr 63において硫酸モノエステル基を欠き- そしてそれ故、" デスルファトヒルジン" と命名されており- それらは、その天然のもの、硫酸化ヒルジンとほとんど同じ生物学的活性を示すことが明らかになった。デスルファトヒルジンHV1 は、大腸菌(Escherichia coli)内で( 欧州特許出願第158 564 号及び第168 342 号) 、そしてサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)( 欧州特許出願第168 342 号、第200 655 号、第225 633 号、第252 854 号及び第341 251 号) 内で発現された。同様に、デスルファトヒルジンHV2 は、大腸菌(Escherichia coli)内で( 欧州特許出願第158 564 号) 、そしてサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)( 欧州特許出願第200 655 号、PCT 出願第86/01224) 内で発現され、そしてデス-(Val)2 - デスルファトヒルジンは、大腸菌(Escherichia coli)内で( 欧州特許出願第158 986 号) 内で発現された。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明に従えば、用語" ヒルジン(hirudin)"は、ヒルジン、デスルファトヒルジン、ヒルジン変異体又はデスルファトヒルジン変異体あるいはそれらの突然変異体であって、それぞれ、文字通り記載されているもの、そして特に、デスルファトヒルジン又はそれらの突然変異体をコードしているDNA を含む形質転換微生物株から得られたデスルファトヒルジン又はそれらの突然変異体、を包含すると意図されている。このようなデスルファトヒルジンは、例えば、デスルファトヒルジンHV1 、HV1 修飾(a,b) 、HV2 、HV2 修飾(a,b,c) 、HV3 、HV3 の変異体、及びデス(Val2 )-デスルファトヒルジンである。
【０００５】
好ましいデスルファトヒルジンは、以下の式( 配列番号1):
0003649343.tif 000002
をもつものであって、
【０００６】
a)27、36及び47におけるXaa がそれぞれLys であり、51におけるXaa がHis であり、そして62におけるXaa がペプチド残基Glu-Tyr-Leu-Gin であり(HV1) 、又は、
b)27におけるXaa がIle 又はGlu であり、そして36、47、51及び62におけるXaa がa)中に記載したものと同じであるもの(HV1修飾a)、又は、
c)36におけるXaa がIle 又はGlu であり、そして27、47、51及び62におけるXaa がa)中に記載したものと同じであるもの(HV1修飾a)、又は、
d)47におけるXaa がIle 又はGlu であり、そして27、36、51及び62におけるXaa がa)中に記載したものと同じであるもの(HV1修飾a)、又は、
e)51におけるXaa がLeu 又はAsp であり、そして27、36、47及び62におけるXaa がa)中に記載したものと同じであるもの(HV1修飾a)、又は、
f)62におけるXaa がGlu-Tyr 、Glu-Tyr-Leu 、Glu-Asp-Leu-Gln 、Glu-Glu-Leu-Gln 、Glu-Tyr-Lys-Arg 、Glu-Asp-Lys-Arg 、Glu-Lys-Leu-Gln 、Ser-Phe-Arg-Tyr 、Trp-Glu-Leu-Arg 、Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro 及びGlu-Tyr-Leu-Gln-Arg から成る群より選ばれており、そして27、36、47及び51におけるXaa がa)中に記載したものと同じであるもの(HV1修飾b)、
【０００７】
又は、以下の式( 配列番号2):
0003649343.tif 000003
をもつもの、
【０００８】
又は、以下の式( 配列番号3):
0003649343.tif 000004
をもつものであって、
a)47におけるXaa がAsn であり、そして63におけるXaa がTyr であるもの(HV2) 、又は、
b)47におけるXaa がLys 、Arg 又はHis であり、そして63におけるXaa がTyr であるもの(HV2修飾a)、又は、
c)63におけるxaa がGlu 又はAsp であり、そして47におけるXaa がAsn であるもの(HV2修飾b)、
【０００９】
又は、以下の式( 配列番号4):
0003649343.tif 000005
をもつもの、
【００１０】
又は、以下の式( 配列番号5):
0003649343.tif 000006
をもつHV3 及びこのHV3 の変異体であってそのN-末端における1 又は2 アミノ酸により、又はそのC-末端における18、10、9 、6 、4 又は2 アミノ酸により、その一次構造が短縮されていることを特徴とするもの、である。
【００１１】
特に好ましいデスルファトヒルジン化合物は、式(I) のものであって、そのXaa 基が、a)の下に定義したものであり、又は式(III) のものであって、47におけるXaa がLys でありそして63におけるXaa がTyr であるものである。
最も好ましいヒルジンは、式(I) をもつデスルファトヒルジンHV1 であって、27、36及び47におけるXaa がそれぞれLys であり、51におけるXaa がHis であり、そして62におけるXaa がペプチド残基Glu-Tyr-Leu-Gln であるものである。
本発明において使用されるヒルジンは、合成的に、例えば、化学的に、又は好ましくは、組換え技術により、又はヒルからの単離により、製造されることができる。
【００１２】
本発明に従えば、用語”突然変異体”は、単一の又は複数の突然変異により、生来のヒルジン又はデスルファトヒルジンと異なる抗トロンビン活性を示す蛋白質( ムテイン) をさしている( 欧州特許出願第352 227 号及び第352 228 号を参照のこと) 。当業者に知られた方法、例えば、部位特異的突然変異誘発により、作られることができる上記の突然変異体をコードしてるDNA を、クローン化し、そして微生物宿主、例えば、大腸菌(Escherichia coli)及びサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)内で発現させる。
【００１３】
本発明において使用するヒルジン化合物は、その遊離の形態においてだけではなくその塩の形態においても存在することができる。それらは、幾つかのアミノ酸残基内に遊離のアミノ基を含むので、その化合物は、酸添加塩の形態で存在することができる。好適な酸添加塩は、特に、慣用の治療的に許容される酸による薬理学的に許容される塩である。代表的な無機酸は、ハロゲン化水素酸( 例えば、塩化水素の酸) 、そしてまた、硫酸、リン酸及びピロリン酸である。代表的な有機酸は、特に、アレーンスルホン酸( 例えば、ベンゼンスルホン酸又はp-トルエンスルホン酸) 、又は低級アルカンスルホン酸( 例えば、メタンスルホン酸) 、並びにカルボン酸、例えば、酢酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸及びクエン酸である。しかしながら、本発明において使用する化合物は、また、いくつかのアミノ酸残基内に遊離のカルボキシル基であってそのペプチド全体に酸の特徴を付与するものを含んでいるので、それらは、無機又は有機の塩基による塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩又はマグネシウム塩、又はアンモニア又は薬理学的に許容される有機窒素含有塩基から得られたアンモニウム塩の形態で存在することもできる。しかしながら、それらは、同時に、遊離のカルボキシル基及び遊離のアミノ基を含むので、それらは、分子内塩の形態でも存在することができる。薬理学的に許容される塩が好ましい。
ヒルジンを含む投与形態の開発における1 つの問題は、水溶液中での、その低い安定性である。これは、前充填シリンジ配合物、すなわち、患者にとってより取扱が易しくそして削減された製造コストをもつような利点をもつ投与形態の開発において、主な妨害である。
【００１４】
上記の低い安定性は、ヒルジンをクロマトグラフ法により分析したときに見ることができる。
モノQ 法: ヒルジンの安定性を、Mono-Qカラム(10 μm 粒子サイズ、5.0 x 50mm、Pharmacia から購入) を使用した、FPLC( 微小蛋白液体クロマトグラフィー) により分析することができる。この方法は、Ciba-Geigy, Basel により開発された。溶液A は、H 2 O 中の50mM HCOONH 4 、pH 4.5であり、そして溶液B は、H 2 O 中の50mM HCOONH 4 、pH 3.5である。この溶出を、流速1.4ml/分を使用して室温(22 ℃) で行う。その最初の5 分間の2 次元溶出は、20% B の一定の流速、その後の20%Bから75%Bまでの10分間にわたる線型グラジエント、そして100%B において2 分間であり、その後、そのカラムを、20%Bの出発条件において2 分間平衡化する。
【００１５】
プロパック法: ヒルジン分析について最近開示された方法を、使用することもできる[Tuong, A., Maftouh, M., Ponthus, C., Whitechurch, O., Roitsch, C., and Picard, C. (1992)"Characterisation of the Deaminated Forms of Recombinant Hirudin" Biochemistry 31, 8291-8299]。この方法においては、DionexからのProPac PA1アニオン- 交換カラム(250 x 4 mm 内径) を使用する。溶液A は、20mM Tris-HCl 、pH 7.0であり、そして溶液B は、A 中の0.5M NaCl である。28% での5 分間のイソクラティック溶離の後、流速1.3ml/分における60分間の、28%Bから54%Bまでの線型グラジエントを行う。
【００１６】
モノQ 及びProPac法を使用した、水中の(20mg/mlヒルジン) 組換えヒルジン  (CGP 39393) の典型的なクロマトグラムを図1 中に示す。見てわかるように、この方法は、同様の結果を生じさせる。
主要ピークの前に溶出する2 つのピーク( 図1)を、それぞれ、Q4及びQ5ピークとして称する。図2 は、水中でのヒルジンの貯蔵が時間によるこのQ4及びQ5ピークの増加を、そしてまた、主要ヒルジン・ピークの後ろのピークの発生をもたらすことを示している。これらの余計なピークを作り出す生成物の正確な性質は、知られていない。
異なった指標における、例えば、深静脈血栓症の予防におけるヒルジンの使用のために、貯蔵配合物として上記のヒルジンを提供することは有利なことであろう。このような配合物は、1 日1 回の使用を許容することができ、患者のコンプライアンスの問題を減少させる。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
我々は、貯蔵配合物を、カルシウム、マグネシウム又は亜鉛イオンを使用して作ることができることを発見した。これらの配合物は、ゆっくりとヒルジンを放出し、そして長時間の化学的安定性をももっている。
したがって、本発明は、水、ヒルジン、及び水に不溶な塩の形態での、カルシウム、マグネシウム又は亜鉛イオンを含んで成る、水性貯蔵配合物を提供する。
この水に不溶な塩は、好ましくは、リン酸塩である、なぜならそれらが非常に不溶性であるからである。
この貯蔵配合物は、4 から11までの、好ましくは、5 から9 までのpHをもつことができる。
この金属塩の濃度は、100mM から600mM まで、好ましくは、100mM から300mM まで、そして最も好ましくは、約150mM であることができる。この濃度が使用可能な生理学的濃度よりも高い場合には、この貯蔵物を、使用前に生理学的濃度まで希釈することができる。
【００１８】
ヒルジンの濃度は、1 から600mg/mlまで、好ましくは、20から80mg/ml までであることができる。高い濃度である場合には、それを、例えば、20から80mg/ml までに希釈することができる。
水に不溶な塩の粒子の大きさは、直径10から30μm まで、好ましくは、直径10から20μm までであることができる。
この貯蔵配合物を、水性ヒルジン溶液中で、その場で、上記の水に不溶な塩を沈殿させることにより製造することができる。例えば、上記の選ばれた金属(Ca 、Mg又はZn) の塩化物を、アルカリ金属リン酸塩と混合することができる。得られた配合物のpHを、次に、例えば、適切には塩酸又は水酸化ナトリウムを使用して調整することができる。
沈殿後、上記の配合物は、ミルク状の外観をもち、そしてやがて沈殿する。しかしながら、振とうにより、この配合物は、再びミルク状になる。
【００１９】
上記の貯蔵物のために好ましい金属は、亜鉛である。
本発明の配合物は、糖、例えば、シュクロース、トレハロース(trehalose) 又は好ましくは、マニトールをも含むことができる。
本貯蔵配合物中に存在するヒルジンは、非常に純粋であり、そして長い期間にわたり、少なくとも数カ月の間、安定である。本配合物を、室温以下で、例えば、4 ℃で保存することができる。それらは、より低温である程、長い期間にわたり安定である。配合物は、室温で、少なくとも3 ヶ月間保存され、分解を全く示さなかった。
本発明の配合物を、注射により非経口的に又は皮下に投与することができる。ヒルジンが本発明に記載の貯蔵配合物として投与されたとき、それが単一溶液として投与されたときよりもその注射部位の回りの出血がより少ないことが判明した。
【００２０】
【実施例】
本発明を、以降の例により説明する。
例1 
溶液A は、pH 2.5において、水中に、2.43 M ZnCl 2 、及び0.455 M Na2 HPO 4 を含み、pHをHCl で調整する。溶液B は、0.6 M NaOH、0.25 M NaCl から成る。溶液C を、2 部の、水中のヒルジン保存溶液(80mg/ml) を、1.05部の溶液A と混合[ 比2:1.05(v/v)]することにより作る。この貯蔵配合物を、水、溶液B 、及び溶液C を、それぞれ、0.66:0.183:0.4の重量比で混合することにより得る。
同様の混合を、ZnCl 2の代わりに、CaCl2 又はMgCl2 を使用して作った。
【００２１】
例2 
例I 中で得られた貯蔵配合物を、遠心分離する。その上澄を取り出し、そして分析し、そして水をその残渣に添加する。第一遠心分離の後、ヒルジンの85-95%が形成されたペレット中にあることが分かった。
これを次に振とうし、そして遠心分離し、そしてこの工程を再び繰り返した。表I は、第一、第二及び第三遠心分離の後の、貯蔵配合物の上澄のモノQ 分析を示している。
【００２２】
0003649343.tif 000007
サンプルは、150mM pH 7.4であった。
表I 中のデータは、上記の上澄液が非常に純粋なヒルジンを含んでいることを示している。それぞれの遠心分離後のヒルジンの相対量は、データを示していないが、減少した。表I 中のデータは、それぞれの配合物が貯蔵体として働き: それぞれの遠心分離の後、その残渣上への水の添加がより多くのヒルジンの放出をもたらすことをも、示している。
【００２３】
例3 
例1 の工程により作られた貯蔵配合物を、4 ℃で5 ヶ月間、保存し、そして次に、そのヒルジンを、上記のProPac法を使用して分析する。結果を表II中に与える。
0003649343.tif 000008
pH範囲6-7 内の、表IIからのZn及びCa貯蔵配合物は、上記のProPac法による過度の非安定性を全く示さなかった。pH 8.5におけるZn配合物は、いくつかの非安定性を示した。
【００２４】
例4 
溶液A1は、165 mM ZnCl 2 、2.11mM Na 2 HPO 4 及び37.8mM HClを含む。溶液B1は、0.6 N NaOHを含む。ヒルジンの粉末を、31.7容量部のA1、次に55容量部のマニトール溶液、198mM 、そして次に、13.3容量部のB1に添加する。この溶液は、貯蔵物が形成されるとき、混濁する。ヒルジンを、20mg/ 使用水mlの量で使用する。pH調整は全く必要ない。
【００２５】
例5 
ヒルジンを、13.5容量部のマニトール溶液、198mM 及び27.75 容量部の水の中に溶解させる。これに、10容量部の溶液B1( 例4 を参照のこと) を、そして次に、23.75 容量部の溶液A1( 例4 を参照のこと) を添加する。この溶液は、貯蔵物が形成されるとき、混濁する。ヒルジンを、20mg/ 使用水mlの量で使用する。pH調整は全く必要ない。
【００２６】
例6 
ヒルジンを、1 容量部のCaCl2 溶液、120mM に、そして次に、1 容量部のK 2 HPO 4 溶液、150mM の中に溶解させる。この溶液は、貯蔵物が形成されるとき、混濁する。ヒルジンを、20mg/ 使用水mlの量で使用する。pH調整を、1M NaOH 溶液の添加により7.4 調整する。
【００２７】
例7 
貯蔵の効果を説明するために、ヒルジンを、生理食塩水(hir/sal) としてか又は亜鉛貯蔵配合物(Zn/hir)中のどちらかで、ラットに、皮下投与した(n=6) 。
このラットからの血漿中のヒルジンの濃度を、投与後、1 、3 、5 及び8 時間目に測定する。ヘパリン化血漿を、サンドイッチELISA により検定した。結果を図3 中に示す。
活性化粒トロンボプラスチン時間(Activated particle thromboplastin time(APTT) を、投与後、1 、5 及び8 時間目に測定する。結果を図4 中に示す。
上記の貯蔵の効果は、そのヒルジンのより長く持続する作用により示される。
【００２８】
【配列表】
0003649343.tif 000009
【００２９】
0003649343.tif 000010
【００３０】
0003649343.tif 000011
0003649343.tif 000012
【００３１】
0003649343.tif 000013
【００３２】
0003649343.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】モノQ 及びProPac法を使用した水中のヒルジンのクロマトグラム。
【図２】主要ピークの前に溶出する2 つのピークの、貯蔵時間による増加、及び後方ピークの発生。
【図３】ヒルジンの生理食塩水又は亜鉛貯蔵配合物の皮下投与後の、ラット血漿中ヒルジン濃度のサンドイッチELISA による検定結果。
【図４】ヒルジンの生理食塩水又は亜鉛貯蔵配合物の皮下投与後の、活性化粒トロンボプラスチン時間の測定結果。
【図１】
0003649343.tif 000015
【図２】
0003649343.tif 000016
【図３】
0003649343.tif 000017
【図４】
0003649343.tif 000018