(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショック蛋白質のＤｎａＪが過剰産生されている大腸菌を宿主としたトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項２】
熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードする遺伝子を含有するベクター及びトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を含有するベクターを保持する大腸菌を培養し、該大腸菌体内に蓄積したトランスグルタミナーゼを採取する事を特徴とするトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項３】
熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードする遺伝子及びトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子が同一ベクター上に存在するベクターを保持する大腸菌を培養し、該大腸菌体内に蓄積したトランスグルタミナーゼを採取する事を特徴とするトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項４】
熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードする遺伝子の発現が増強された、又は、そのｄｎａＪ遺伝子量が増幅された染色体を有し、かつトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子を含有するベクターを保持する大腸菌を培養し、該大腸菌体内に蓄積したトランスグルタミナーゼを採取する事を特徴とするトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項５】
熱ショック蛋白質であるＤｎａＫをコードする遺伝子を更に、ＤｎａＪをコードする遺伝子と共に用いることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項６】
トランスグルタミナーゼが魚類由来トランスグルタミナーゼである請求項１、２、３、４又は５記載のトランスグルタミナーゼの製造法。
【請求項７】
トランスグルタミナーゼが真鯛由来トランスグルタミナーゼである請求項６記載のトランスグルタミナーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、組換えＤＮＡ法により形質転換された大腸菌を培養して、目的とするトランスグルタミナーゼ（以下、ＴＧと略する）を効率的に製造する方法に関する。より詳細には、本発明はＴＧの過剰発現に伴う大腸菌内での不溶化を抑制し、より生理活性を発現しやすい可溶化状態でＴＧを産生し、取得するという製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌を宿主に、組換えＤＮＡ技術を用いて、菌体内に目的ポリペプチドを産生させることは、現在広く用いられている手法である。しかしながら、目的ポリペプチドを過剰産生させた多くの場合、その目的ポリペプチドは、大腸菌体内に、本来の高次構造を持たずに、変性状態にて蓄積してしまう。一般には、菌体内封入体と呼ばれる不溶性顆粒を形成しながら蓄積する〔Schein, Bio/Technology, 7: 1141-1149(1989)〕。
【０００３】
この不溶性顆粒から、生理活性を発現しうる目的ポリペプチドを得る為には、一旦塩酸グアニジンや尿素といった変性剤を用いた変性溶液中で、その顆粒を処理し、その顆粒中のポリペプチドを解きほぐした後に、適当な立体構造再生処理を行うという一連の煩雑な操作が必須であった〔Kohno et al., in Methods in Enzymology vol.185, pp187〕。
この立体構造再生処理としては、（１）目的ポリペプチドを含む変性溶液を透析操作にて、変性剤を徐々にぬき、該ポリペプチドの立体構造を再生させる方法や、（２）目的ポリペプチドが分子内ジスルフィド結合を有する場合などは、適当な濃度の酸化型そして還元型グルタチオンを加えた酸化還元系の変性剤中で、該ポリペプチドをインキュベートする手法等が知られている。
【０００４】
しかしながら、極めて再生効率の低い例やあるいは、試験管内では立体構造を再生しきれない蛋白質等もあり、このことは、大腸菌を宿主として組換えＤＮＡ技術を用いても、最終的に正しい立体構造で活性を発現できる目的ポリペプチドを取得する事が困難であったり、あるいは、その取得の為には、極めて多大な労力や精製コストが必要になる事を示している。また、組換えポリペプチドを治療目的で投与する様な場合等は、不完全に再生されたポリペプチドでは、これが生体中で抗原性を発現する事になり、極めて大きな問題となってしまう。
【０００５】
上述したような不溶性顆粒形成問題の簡便な解決方法の一つに、目的ポリペプチドを産生する為に改良された微生物、特に大腸菌の生産培養温度を下げるという手法が知られている〔Schein, et al., Bio/Technology, 6: 291-294(1988), Kopetzki, et al., Mol.Gen.Genet., 216: 149-155 (1989)〕。しかし、この低温培養の場合、生産宿主である大腸菌の生育速度の低下と共に、目的ポリペプチドの生産量も低下するという欠点があった。
【０００６】
また、別の解決方法としては、目的ポリペプチドを大腸菌から分泌させる事で、立体構造を形成させるという手法も報告されている。しかしながら、一般に、大腸菌を宿主とした、外来ポリペプチドの分泌生産性は低く、特にその目的ポリペプチドが、本来、非分泌性のポリペプチドである場合などは、更に生産量は低いとされる。
【０００７】
そこで、目的ポリペプチドが可溶化状態で、且つ、活性発現可能な状態で、菌体内に著量蓄積させる為の技術開発が切望されていた。
【０００８】
最近の研究によって、分子シャペロンと呼ばれる一群の熱ショック蛋白質が、試験管内での蛋白質の立体構造形成に極めて重要な働きをしている事が明らかになってきた〔Gething et al., Nature, vol.355, pp33(1992)〕。それらの分子シャペロンは、各々の受け持つ蛋白質の立体構造が崩れた時に、一時的に、それらの蛋白質を安定化し、不適切な変性を防ぐ様に機能すると考えられている。大腸菌においては、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳ等が知られている。
【０００９】
そのような背景の下、蛋白質の立体構造形成にかかわる補助因子（分子シャペロン）の重要性が、認識されるようになり、分子シャペロンの過剰発現による目的ポリペプチドの不溶化抑制効果が研究されてきた。ＤｎａＫ単独、あるいはＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳの過剰発現による目的ポリペプチドの溶解性改善の成功例としては、リーらによるプロコラゲナーゼの研究〔Lee, et al.,J.Biol.Chem.267: 2849-2852 (1992)〕がある。
【００１０】
最近、カスパースらは〔Caspers, et al., Cell. mol. Biol., 40: 635-644 (1994)〕プロテインチロシンキナーゼの大腸菌での発現の際に、（１）ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳを同時に、あるいは（２）ＤｎａＫ，ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ全てを同時に、その宿主へ導入する事で可溶性のキナーゼ量の比率が増えたと報告している。但し、それらのキナーゼは活性を発揮できる状態かどうかは不明である。更に発現させたキナーゼの総生産量は低下してしまうと報告している。一般に、蛋白質合成速度を低下させると、該ポリペプチドの可溶性が増すとされている為〔Kopetzki, et al., Mol.Gen, Genet., 216巻、149-155頁(1989)〕、彼らの報告では、実際に分子シャペロンの機能効果なのか、分子シャペロンの量産化の為に起こった宿主大腸菌の機能低下による効果であるかは不明である。更に、彼らは、分子シャペロンとして、どの分子シャペロンの効果であるかは全く触れていないし、溶解しているキナーゼが実際に、活性を発揮したかどうかも不明である。
【００１１】
さて、ＴＧはペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル基転移反応を触媒する酵素である。このＴＧはアシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のεアミノ基が作用すると、分子内及び分子間にε−（γ−グルタミル）リジン架橋結合が形成され、また、アシル受容体としてアミノ酸、アミノ酸誘導体等の、一級アミンが存在した時は、それがタンパク質に導入される。そして水がアシル受容体として機能する時は、グルタミン残基が脱アミド化されグルタミン酸残基になる反応を進行させる酵素である。
【００１２】
ＴＧはゲル状食品、ゲル状化粧品をはじめとしてヨーグルト、ゼリー及びチーズ等を製造する際に用いられている（特公平1-50382、特開平64ー27471号等参照）。
【００１３】
ＴＧは微生物から哺乳類まで、存在する酵素である。例えば、モルモット由来のもの〔Connellan, et al., Journal of Biological Chemistry 246巻4号、1093-1098頁、(1971)〕、ヒトの血液凝固第１３因子〔Takahashi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83巻、8019-8023頁、(1986)〕、微生物由来のもの（特開昭64-27471号参照）等が知られている。
【００１４】
更に最近、我々は、魚類由来のＴＧの精製に成功し、その遺伝子ｃＤＮＡを取得し、構造について解明した（特開平7-23787号参照）。
【００１５】
一方、ＴＧの組換えＤＮＡ技法による、大腸菌を宿主とした生産例としては、モルモット肝ＴＧの例〔Ikura, et al., Eur. J. Biochem. 187巻、705-711頁(1990)〕やヒト血液凝固第１３因子の例〔Board, et al., Thrombosis and Haemostasis, 63巻2号、235-240頁(1990)〕が報告されているが、共に、それぞれの抗体で、その生産量を検定する程度の極めて少量の発現量であると言える。
【００１６】
我々は、先に組換えＤＮＡ技術を用い、真鯛ＴＧの大腸菌を宿主にして、従来は思いもしなかった大量発現生産に成功している（特開平６−２２５７７５参照）。  しかし、そのＴＧを生産するように改変された大腸菌の培養を３７℃で行うと、産生されたＴＧは、やはり菌体内に封入体を形成して、不活性体として蓄積するにとどまっていた。一方、培養温度３０℃では、活性を発揮するＴＧの生産に至るが、詳細にその蓄積状態を解析すると、大腸菌の細胞抽出液中に回収されない不溶性のＴＧは、生産されたＴＧの約４／５ある事が判明した。つまり、培養温度３０℃でも、充分な可溶化状態で該ＴＧが蓄積していない事が判明したのである。
【００１７】
更に低温側の培養温度にて、該ＴＧの生産菌を培養したところ、ＴＧの可溶性分子の比率は増加したものの、総生産量の顕著な低下がみられ、結局、従来の方法では、大腸菌を宿主にして目的ポリペプチドであるＴＧを、更に極めて著量に蓄積させる有効な製造方法がなかった。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
食品に馴染みの深い魚由来ＴＧの食品製造における産業的応用を考えるに、該ＴＧの大量、かつ安価な製造法の開発は待望されている。その解決の為の中心課題は、量産化目的ポリペプチドの生産宿主菌体内での不溶化阻止あるいは抑制技術の開発にある。つまり、更なる量産化の為には、菌体内での不溶化ＴＧを可溶化し、活性発現可能な立体構造を保持するＴＧとして、著量蓄積せしめる技術を開発する事である。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、研究当初、既に公知技術である、ＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳ，そしてＤｎａＫの過剰産生による、目的ポリペプチドであるＴＧの可溶化能の検討を行った。しかしながら、従来、報告されてきた、各シャペロンでは、全くその効果を発揮できず、あるいは、逆に、宿主菌体の生育を阻害してしまうという結果を得た。
【００２０】
そこで、本発明者らは上記課題を解決すべく、様々なシャペロンの効果を鋭意検討を加えた結果、従来のＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、やＤｎａＫとは異なり、全く思いもよらないシャペロンの補助的因子であるところのＤｎａＪが、目的ポリペプチドであるＴＧの菌体内での可溶化蓄積、及び活性発現可能状態での著量蓄積において、有効な効果を発揮する事を見いだした。更に解析した結果、そのＤｎａＪが該ＴＧの可溶化に中心的な役割を果たしており、そこへｄｎａＫ遺伝子産物が追加する事で、よりその可溶化及び活性発現可能な状態での蓄積効果が安定する事を見いだした。
【００２１】
つまりは、ＤｎａＪ又はＤｎａＪ，ＤｎａＫの過剰発現大腸菌を用いた宿主において、目的ポリペプチドを生産させる事で、目的ポリペプチドを即活性発現可能な状態の可溶化状態にて著量蓄積させ、そして取得できる事を発見し、このことにより、目的ポリペプチドであるＴＧを極めて効率よく、且つ経済的に製造する方法の開発に成功し、本発明を完成した訳である。
【００２２】
本発明は全ての種類のＴＧに適用できる汎用性の高い技術であるが、特に、魚由来のＴＧの生産には最もふさわしい技術である。本発明により、食品産業上有益な酵素であるＴＧを安価に、効率的に、かつ大量に生産することができる。
【００２３】
即ち、本発明はＤｎａＪが過剰産生されている大腸菌を宿主としたＴＧの製造法である。以下に本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、上述したように、（１）ｄｎａＪ遺伝子、又は（２）ｄｎａＫ遺伝子及びｄｎａＪ遺伝子の発現を強化した大腸菌宿主を用いたＴＧの製造法に関するが、その一例としては、（１）ｄｎａＪ遺伝子、あるいは（２）ｄｎａＫ遺伝子及びｄｎａＪ遺伝子を含有するベクター及び目的ポリペプチドであるＴＧをコードする遺伝子を含有するベクターを保持する大腸菌を培養し、菌体内に活性発現可能な形態で蓄積した目的ＴＧを採取する事を特徴とするＴＧの製造法に関するものである。
【００２５】
ここに、ＤｎａＫとは大腸菌の主要な熱ショックタンパク質のひとつで、熱以外にも様々な環境的ストレスに対応して合成され、細胞内でのタンパク質の立体構造形成過程において、重要な役割をもつ。
一方、ＤｎａＪは、ＤｎａＫの反応を補助する因子として知られている〔Gething, et al., Nature, 355巻, 33-45頁 (1992)〕。
【００２６】
それらのシャペロン遺伝子の取得方法としては、（１）まず、それらの温度感受性株を用いて、その温度感受性を相補できる遺伝子を、大腸菌の野生株の染色体からクローニングする方法や、（２）それらシャペロンのＤＮＡ塩基配列は公知であるので、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）によるクローニング等が挙げられる。いずれの方法を用いても構わない。
【００２７】
（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａＫ、ｄｎａＪ遺伝子の発現には、それぞれのプロモーターの利用でもよいし、あるいは、ベクター上にあるものや大腸菌由来のものを組み込んでもよい。例えば、trpプロモーター、lacプロモーターなどを用いる事もできる。
【００２８】
これら（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａＫ，ｄｎａＪ遺伝子を組み込むベクターは市販されているものでも、任意に各人が作製したものでもかまわない。しかしながら、一般には、目的ポリペプチドであるＴＧの大量生産用プラスミドはpBR322由来か、pUC18やpUC19由来である事が多い為、これらのプラスミドと共存できるプラスミドベクターである事が望ましいため、pACYC184由来やpMW118由来のプラスミド等に代表されるプラスミドベクターを用いるのが一般的である。このように、熱ショック蛋白質のＤｎａＪをコードする遺伝子を含有するベクターとＴＧをコードする遺伝子を含有するベクターの２種類のベクターを大腸菌内に保持させてもよい。
【００２９】
また、一方で、これら（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａＫ，ｄｎａＪの遺伝子発現系を、目的ポリペプチドであるＴＧの遺伝子発現プラスミド上に組み込んでもよい。このように、ｄｎａＪをコードする遺伝子及びＴＧをコードする遺伝子が同一ベクター上に存在するベクターを用いても良い。
【００３０】
更には、宿主大腸菌の染色体上にある（１）ｄｎａＪ又は（２）ｄｎａＫ，ｄｎａＪ遺伝子の発現を強化した株を予め作製しておき、これを目的ポリペプチドであるＴＧ生産の宿主としても用いる事もできる。
【００３１】
それらシャペロン発現の強化方法は、該シャペロン遺伝子の上流にlacプロモーター等の強力なプロモーターを接続させたシャペロン発現系を試験管内で、公知の方法により作製し、これを、元の大腸菌染色体内の該シャペロン遺伝子と置換する方法や、染色体上の該シャペロンの遺伝子の数を増幅させる方法による。即ち、この方法はｄｎａＪ遺伝子の発現が増強された、又は、ｄｎａＪの遺伝子量が増幅された染色体を有し、かつＴＧをコードする遺伝子を含有するベクターを保持する大腸菌を用いる方法である。
【００３２】
一方、ＴＧの発現プラスミドは公開特許明細書に記載された方法により取得できる（特開平6-225775、欧州出願公開EP-0555649A参照）。
【００３３】
次に、ＴＧ遺伝子を搭載する発現ベクターや、ｄｎａＪ、ｄｎａＫ等の熱ショックタンパク質遺伝子を搭載するベクターで形質転換された種々の形質転換体について説明する。
本発明に於いて形質転換体として用いられる生物は大腸菌Ｋ−１２株である。この中でもEscherichia coliＨＢ１０１株やＪＭ１０９株が好ましい。これら形質転換体を適切な培地中で培養することにより、真鯛ＴＧ遺伝子の発現産物である真鯛由来ＴＧを細胞内に産生、蓄積させる。
尚、形質転換は通常用いられる方法により行われる。例えば、カルシウムクロライド法やエレクトロポレーション法等である。もちろん、他の方法を用いても構わない〔Sambrook, et al., Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1989)〕。
【００３４】
最後に、上記の形質転換体を培地中で培養する事により、組換型ＴＧを製造する方法について説明する。培養条件は、形質転換体や遺伝子発現系の種類に応じて当業者が適宜決定し得るものである。また、発現され細胞内に蓄積された当該ＴＧは、従来から公知の種々の方法で単離、精製される。例えば、報告されている天然の真鯛からの精製方法と同様の手法により〔Yasueda, et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 58: 2041-2045(1994)〕、遺伝子組換型ＴＧも精製できる。
【００３５】
なお、ＴＧの活性は、ジメチル化カゼインとモノダンシルカダベリンを基質として反応を行い、取り込まれたモノダンシルカダベリンに由来するカゼインの蛍光強度増加を測定することにより求める。反応組成液を以下に記載する。
〈反応組成液〉
１．０ｍｇ／ｍｌ  ジメチル化カゼイン
０．０１５ｍＭ   モノダンシルカダベリン
３．０ｍＭ     ジチオスレイトール
５０ｍＭ      トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
５ｍＭ      塩化カルシウム
なお、後記実施例でも、特段の記載がない限り本条件を採用している。
【００３６】
上記反応組成液２．４ｍｌにＴＧ溶液２０から１００μｌ加え、３７℃、３０分の反応を行った後、５００ｍＭのＥＤＴＡを１００μｌ加えて反応を停止させ、蛍光強度を測定する（島津社製 ＲＦー１５００、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４８０ｎｍ）。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に従って更に詳細に説明する。尚、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
（真鯛由来トランスグルタミナーゼの製造法）
（１）熱ショックタンパク質をコードするｄｎａＫ遺伝子、ｄｎａＪ遺伝子、そしてｇｒｏＥＳＬ遺伝子群のクローニング
本発明者らは、各種熱ショック蛋白質の遺伝子を大腸菌の染色体からＰＣＲ法によりクローニングした〔Erlich, et al., Nature, 331巻、461-462頁(1988)〕。
【００３９】
各遺伝子、ｄｎａＫ〔Cowing, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82巻、2679-2683頁(1985)、Bardwell, et al.,Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 81巻、848-852頁(1984)〕、ｄｎａＪ〔Ohki, et al., J.Biol. Chem., 261巻、1778-1781頁 (1986)〕、ｇｒｏＥＳＬ〔Hemmingsen, et al., Nature, 333巻、330-334頁(1988)〕の塩基配列は既に公知である。そこで、各２種のＤＮＡプライマーを作製した。まず、ｄｎａＫについては、プライマーDNAK-01(5'-CCTTGATGACGTGGTTTACG-3')（配列番号１）とDNAK-02(5'-CCTTCGCCCGTGTCAGTATA-3')（配列番号２）を、ｄｎａＪについてはプライマーDNAJ-01(5'-CTGATGGAATTCGCCCAGCA-3')（配列番号３）とDNAJ-02(5'-CGTGAGAGGAATTCATCGGC-3')（配列番号４）をｇｒｏＥＳＬについては、GROELS-01(5'-GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3')（配列番号５）とGROESL-02(5'-GACGCACTCGCGTCGTCCGT-3')（配列番号６）を作製した。なお、プライマーDNAJ-01とDNAJ-02のＤＮＡ断片の5'端には制限酵素EcoRI切断認識配列が組込まれている。
【００４０】
大腸菌のゲノムDNAを鋳型として、それぞれのDNAプライマーを用いて、94℃１分間、37℃２分間、72℃３分間の反応を２５サイクル行う条件にてＰＣＲ増幅を試みたところ、目的の各遺伝子、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｏＥＳＬのDNA断片が増幅され、取得する事ができた。
ｄｎａＫ遺伝子の場合、まず、増幅されたDNA断片の両末端を平滑化した後、市販のプラスミドベクターpSTV28（宝酒造）の制限酵素HincII部位へ、公知の方法により組み入れ、プラスミドpDnaK-01を構築した。このプラスミドの複製起点はp15A由来であるため、pBR322やpUC19等のプラスミドと一つの細胞の中で共存可能なプラスミドである。
【００４１】
遺伝子ｇｒｏＥＳＬの場合は、ＰＣＲにて増幅させたDNA断片を、公知の方法により、市販のベクターpSTV28の制限酵素HincII部位へ組み入れ、pGroESL-01を構築した。
【００４２】
遺伝子ｄｎａＪの場合は、ＰＣＲ増幅DNA断片を、まず制限酵素EcoRIで処理し、そのＤＮＡ末端をEcoRI切断端とした。これを市販されているクローニングベクターpSTV28のEcoRI部位へ挿入する事で、dnaJ発現プラスミドpDnaJ-01を構築した。
【００４３】
（２）熱ショック蛋白質ＤｎａＫ，ＤｎａＪオペロン遺伝子のクローニング
ｄｎａＫ、ｄｎａＪオペロン遺伝子の塩基配列も既に公知である〔Cowing, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82巻、2679-2683頁(1985)、Bardwell, et al.,Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 81巻、848-852頁(1984)、Ohki, et al., J.Biol. Chem., 261巻、1778-1781頁 (1986)〕。そこで、同様に、ＰＣＲ法により目的遺伝子群をクローニングした。使用したプライマーは、プライマーDNAKJ-01:  5'-CCTGGATCCCGTGGTTTACGACCCCATTTAGTAGTC-3' （配列番号７）及び DNAKJ-02: 5'-TTCACCTGCAGGTTAAATCATATCAGGCGTAATAC-3'（配列番号８）であった。なお、プライマーDNAKJ-01の、及びDNAKJ-02の5'側には、それぞれ、制限酵素BamHI、Sse8387Iの切断認識配列を組み入れた。また、増幅させる為の鋳型ＤＮＡは、大腸菌ＨＢ１０１株より調製したゲノムである。これに対してＰＣＲ反応を行ったところ、目的遺伝子オペロン断片に相当する約3.4kbpのＤＮＡ断片を得た。なお、ＰＣＲ条件は、94℃で90秒間の熱変性後、98℃10秒、68℃５分30秒を25サイクル、その後、72℃１０分間であった。
【００４４】
これを制限酵素BamHI、Sse8387Iにて処理し、それぞれの制限酵素切断端を持つＰＣＲ増幅断片を得た。一方、ベクターにはpSTV28を用いた。これを同酵素にて処理し、ここへ、上記PCR増幅ＤＮＡ断片をクローニングする事で、プラスミドpDnaKJ-01を構築した。
【００４５】
（２）熱ショック蛋白質を過剰生産する大腸菌宿主中で、真鯛ＴＧを生産する例
真鯛ＴＧの高発現プラスミドpTTG2-22（本プラスミドを含有する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ12742）は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（以下、生命研と略する。）に寄託されており、その寄託番号はFERM BP-4117である。）は、特開平6-225775、欧州出願公開EP-0555649A に記載されているプラスミドである。
【００４６】
このＴＧ生産菌に対して、上に記載した各シャペロン遺伝子発現プラスミドを公知の方法にて大腸菌に形質転換した。
pTTG2-22とpDnaK-01を保持する株として、ＡＪ-１３０９８を得た。尚、Escherichia coli AJ13098は生命研に寄託されており、その寄託番号はFERM P-14914である。
pTTG2-22とpDnaJ-01を保持する株として、ＡＪ−１３０９７を得た。尚、Escherichia coli AJ13097は生命研に寄託されており、その寄託番号はFERM P-14913である。
また、pTTG2-22とpGroESL-01を保持する株としてＡＪ−１３０９９を得た。尚、Escherichia coli AJ13099は生命研に寄託されており、その寄託番号はFERM P-14915である。
更に、そして、pTTG2-22とpDnaKJ-01を保持する株としてＡＪ-１３０９６を得た。尚、Escherichia coli AJ13096は生命研に寄託されており、その寄託番号はFERM P-14912である。
【００４７】
取得した各形質転換体のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフエニコールを含む、２ｘＴＹ培地(1.6％バクトトリプトン、1％酵母エキス、0.5％NaCl、ｐＨ７の組成よりなる)３ｍｌに植菌し、３２℃にて１４時間振とう培養した。
【００４８】
次に、上記の培養液0.5ｍｌを修正Ｍ９カザミノ酸培地（培地１リットルに、燐酸水素２ナトリウム１２水15.1g、燐酸２水素カリウム3.0g、カザミノ酸8.0g、酵母エキス0.2g、L-ロイシン0.2g、L-プロリン0.2g、ビタミンＢ１塩酸塩2mg、硫酸マグネシウム７水0.5g、塩化カルシウム２水14.5mg、グルコース5.0gを含む組成よりなる）５０ｍｌを含む坂口フラスコに接種し、２８℃、３２℃並びに３７℃で２０時間振とう培養し、菌体を遠心操作にて集菌した。
【００４９】
集菌した菌体を、３０ｍｌの菌体破砕液(２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡよりなる)に懸濁し、更に１０ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム溶液を２ｍｌ加え、氷上に２時間静置した。その後、菌体懸濁液を超音波破砕した。次に、これを遠心処理（２００００ｘｇで１０分間）し、菌体破砕上清を調製した。
また、同様に、コントロールとしてｐＴＴＧ２−２２及びベクターpSTV28を保持する大腸菌についても菌体破砕し、その後、遠心分離により菌体破砕上清液を調製した。
【００５０】
図１には、上記のうち、（１）大腸菌AJ13096（FERM P-14912)株、（２）大腸菌AJ13097(FERM P-14913)株 及び（３）pTTG2-22と pSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株を32℃で培養したものの菌体破砕液の全画分と遠心上清画分に含まれるタンパク質状態をＳＤＳーＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にて展開し、解析した結果を示した。
この結果から分かるように、pTTG2-22と pSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株の遠心上清画分にはＴＧタンパク質は認められなかった。
【００５１】
次に、（１）pTTG2-22及び pSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株、（２）pTTG2-22及びpDnaK-01を保持する大腸菌AJ13098株（FERM P-14914）、（３）pTTG2-22及びpGroESL-01を保持する大腸菌AJ13099株（FERM P-14915)、（４）pTTG2-22及びｐTTG2-22及びpDnaJ-01を保持する大腸菌AJ13097株(FERM P-14913）及び（５）pTTG2-22及びpDnaKJー01を保持する大腸菌AJ13096株（FERM P-14912）の遠心上清画分中のＴＧ活性について調べた。その結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
0003656277.tif 000002
【００５３】
その結果、表１に見られるように、ＤｎａＪの過剰発現株において、明らかに活性発現可能なトランスグルタミナーゼが著量産生される事、そして、その効果は、ｄｎａＪとｄｎａＫとの共存により、安定化する事が判明した。このような結果は、従来のＤｎａＫ、ＧｒｏＥＳＬといった主要シャペロンの機能からは、全く予想されなかった事であり、本研究結果により、全く新規に見いだされた効果である。
【００５４】
【発明の効果】
ＴＧは特に食品タンパク質の物性改質用酵素として、利用が益々期待されている酵素である。その酵素の大量生産法として、組換えＤＮＡ法による生産は有効な方法であるが、従来の組換えＤＮＡ法の場合、更なる大量生産を試みると、大腸菌体内に不活性なＴＧが蓄積するという問題がある。
しかし、本発明の熱ショックタンパク質（１）ｄｎａＪ、又は（２）ｄｎａＪとｄｎａＫを用いた方法を用いれば、大量に、可溶化状態で、目的ＴＧを取得できる。
即ち、本発明は従来の製法でのＴＧ生産量の限界を打破した画期的な製法である。また、本発明を用いれば、不溶化した目的ＴＧの試験管内での立体構造再生操作は必要なくなるという利点もある。
これ故、本発明を用いれば、極めて大量のＴＧの供給が可能となるばかりか、ひいては産業上のＴＧの利用範囲も大きく広げるものと考えられる。
【００５５】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CCTTGATGAC GTGGTTTACG
【００５６】
配列番号：2
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CCTTCGCCCG TGTCAGTATA
【００５７】
配列番号：3
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CTGATGGAAT TCGCCCAGCA
【００５８】
配列番号：4
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CGTGAGAGGA ATTCATCGGC
【００５９】
配列番号：5
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GACGTCGATA GCAGGCCAAT
【００６０】
配列番号：6
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
GACGCACTCG CGTCGTCCGT
【００６１】
配列番号：7
配列の長さ：36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
CCTGGATCCC GTGGTTTACG ACCCCATTTA GTAGTC
【００６２】
配列番号：8
配列の長さ：35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
配列
TTCACCTGCA GGTTAAATCA TATCAGGCGT AATAC
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの解析図である。
レーン１はpTTG2-22とpSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株の全画分である。
レーン２はpTTG2-22とpSTV28を保持する大腸菌ＨＢ１０１株の遠心上清画分である。
レーン３はpTTG2-22とpDnaJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ13097、      FERM P-14913）の全画分である。
レーン４はpTTG2-22とpDnaJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ13097、      FERM P-14913）の遠心上清画分である。
レーン５はpTTG2-22とpDnaKJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株（AJ13096、    FERM P-14912）の全画分である。
レーン６はpTTG2-22とpDnaKJ-01を保持する大腸菌ＨＢ１０１株(AJ13096、     FERM P-14912）の遠心上清画分である。
また、左側の数字は、同時に電気泳動されたタンパク質マーカーの分子量(×1000)を示す。
更に、右側の矢印（→）は真鯛ＴＧの分子量を示す。
【図１】
0003656277.tif 000003