(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好気的条件下、培地中でｄ−デチオビオチン生産能を有するクルチア属に属する微生物を培養し、次いで生成したｄ−デチオビオチンを発酵ブロスから採取することを特徴とするｄ−デチオビオチンの製造法。
【請求項２】
クルチア  エスピー. ５３８−６（ＤＳＭ−９４５４）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、発酵によるｄ−デチオビオチン（以下、ＤＴＢと略記する）の製造法に関する。
【０００２】
ＤＴＢは、いわゆるビオチン  バイタマーの一つであり、一般に多くの微生物においてｄ−ビオチンの直接の前駆体と考えられている。したがって、ＤＴＢは、生物学的なｄ−ビオチンの製造に非常に重要な物質である。
【０００３】
ビオチン  バイタマーの製造に関する研究は知られている。ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、アスぺルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびスポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）のような属に属する各種微生物が、ビオチン  バイタマーを生産することが知られている。しかしながら、クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属に属する微生物が大量のＤＴＢを蓄積することは知られてない。
【０００４】
本発明によれば、大量のＤＴＢを生産することができる。クルチア属に属する微生物は、発酵液中に大量のＤＴＢを蓄積することができ、そこから所望の純度で蓄積したＤＴＢを採取できることを見出した。
【０００５】
ｄ−ビオチン−ｄ−スルホキシド、ｄ−デチオビオチン（ＤＴＢ）、７，８−ジアミノペラルゴン酸、および７−ケト−８−アミノペラルゴン酸を含むビオチン  バイタマーの含有量は、サッカロミセス  セレビシイェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ７７５４（J. Am. Chem. Soc., 62, 175-178, 1940）を用いてぺーパーディスクプレート法により定量できる（J. Microbiological Methods, 6, 237-246, 1987）。また、試料中のそれぞれのビオチン  バイタマーは、サッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を用いてバイオオートグラフ法により同定することができる（Agr. Biol. Chem., 33, (12), 1730-1736, 1969)。
【０００６】
本発明を実施するにあたり、クルチア属に属する微生物は、資化可能な炭素源、消化可能な窒素源および微生物の成育に必要な他の栄養素を含有する培地で培養される。炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、でんぷん、ラクトース、マルトース、ガラクトース、スクロース、デキストリン、グリセリンまたはキビゼリーなどが用いられる。窒素源としては、例えばペプトン、大豆粉、コーンスチープリカー、肉エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などがそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。更に、その他の微量要素としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、コバルトおよび鉄の、硫酸塩、塩酸塩または燐酸塩などが用いられる。また、培地にピメリン酸などのビオチン前駆体を含んでいてもよい。更に、必要に応じて動物油、植物油、鉱油などのごく一般的な栄養因子もしくは消泡剤を補足的に加えてもよい。培養に用いる培地のｐＨは、約５. ０〜９. ０であり、約６. ５〜７. ５が好ましく、培養温度は、約１０〜４０℃であり、約２６〜３０℃が好ましい。培養時間は、通常、約１〜１０日であり、約２〜５日が好ましい。通常、培養において、通気および攪拌は好ましい結果を与える。培養後、培養液中に生産されたＤＴＢは、培養液から分離し、精製する。この目的のために、通常、発酵液から生成物の抽出に使用される方法をＤＴＢの各種の性質を利用して行ってもよい。このように、例えば菌体を培養液から分離し、そのロ液中の所望の物質を活性炭に吸着させ、次いで溶離させ、イオン交換樹脂で精製する。あるいは、培養ロ液を直接にイオン交換樹脂に適用し、溶離後所望の生成物をアルコールと水の混合液から再結晶する。
【０００７】
本発明において使用する微生物は、ＤＴＢ生産能を有するクルチア属に属するすべての菌株を含む。クルチア属の菌株の中で、特に好ましい菌株としては、横浜市舞岡公園で採取された土壌試料から分離しクルチア  エスピー. （Ｋｕｒｔｈｉａ  ｓｐ. ）５３８−６（以下、５３８−６号菌と略記する）が挙げられ、１９９４年１０月５日に、ＤＳＭ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Gottingen, Germany)へ、ＤＳＭ  Ｎｏ. ９４５４として寄託されている。５３８−６号菌の分類は、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th Edition (N.R. Krieg and P.H.A. Sneath, The Williams & Wilkins Co., Baltimore,1984)に基づき行った。
【０００８】
５３８−６号菌の形態学的性質を表Ｉに要約する。細胞形態は、２４時間培養（培養初期）において、０. ８７−１. ２μm ×１. ５−５. ２μm の桿菌で、連鎖し、その長さは６０μm 以上にもなる。９６時間培養（培養後期）では、一部の桿菌はコッコイド（Ｃｏｃｃｏｉｄ）細胞を形成する。３０℃で培養されたニュートリエント  アガー（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ａｇａｒ）上の５３８−６号菌の単一集落類は、円形状、レギュラー（ｒｅｇｕｌａｒ）、半レンズ状、黄味白色−ロウ色、無光沢および少しシワ状であり、色素生産は見られなかった。２４時間での集落は、直径２mmであった。その桿菌は、グラム陽性、非運動性であり、胞子を形成しなかった。流動パラフィンの存在または非存在でのニュートリエント  アガーを用いた穿刺培養における５３８−６号菌の１４日間での成育は、流動パラフィン非存在での寒天表面付近でのみ観察された。この結果は、本菌が通性嫌気性ではなく絶対好気性であることを明確に示している。上述の性質は、５３８−６号菌がBergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.2  のセクション１４：レギュラー、ノンスポーリング  グラム−ポジティブ  ロッド（Ｒｅｇｕｌａｒ、Ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｒｏｄｓ）に属することを示している。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
５３８−６号菌は、カタラーゼ陽性であり、細胞壁中のペプチドグリカンは、ジアミノ酸としてリジンを含有していた。５３８−６号菌の細胞壁中の主要な脂肪酸のタイプは、飽和の直鎖型ならびにアンテイソ（ａｎｔｅｉｓｏ）−およびイソ−メチルの分岐型であるが、主要脂肪酸は、１２−メチルテトラデカン酸（アンテイソ−Ｃ  １５：０）であった。細胞壁中の主要なキノンは、７個のイソプレンユニットを有する不飽和メナキノン（ＭＫ−７）であった。ＧＣ含量は、４１％であった（表II）。
【００１１】
【表２】
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【００１２】
ａ：Ｓ、直鎖飽和脂肪酸；Ａ、アンテイソ−メチル−分岐脂肪酸；Ｉ、イソ−メチル−分岐脂肪酸
【００１３】
これらの性質は、５３８−６号菌がクルチア属に属することを支持している。クルチア属は、二つの種、すなわち、クルチア  ギブソニー（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびクルチア  ゾフィー（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｚｏｐｆｉｉ）に分類されている。しかし、さらに１つの種、クルチア  シビリカ（Ｋｕｒｔｈｉａ  ｓｉｂｉｒｉｃａ）が、Berukoba et al. （Mikrobiologiya, 55, 831-836, 1986)により報告された。クルチアの種は、以下の９つの性質により区別されている。４５℃での成育、熱抵抗性、集落の色、４−アミノ−ｎ−ブチレートの資化性、エタノールおよびグリセリンからの酸生成、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ホスファターゼおよびパントテン酸の要求性。そこで、表III に示すように５３８−６号菌のそれら９つの性質を調べた。
【００１４】
【表３】
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【００１５】
クルチア  ギブソニー、クルチア  ゾフィーおよびクルチア  シビリカの資料は、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (9th Ed.)およびBerukoba et al. (1986)から引用した。
（  ）：その種のなかで陽性を示す株の割合（％）
【００１６】
これらの結果から、５３８−６号菌は、以下の性質において上述の３つの既知クルチアの種とは異なった。クルチア  ゾフィー：熱抵抗性、４−アミノ−ｎ−ブチレートの資化性およびパントテン酸の要求性；クルチア  ギブソニー：４５℃での成育；クルチア  シビリカ：集落の色およびパントテン酸の要求性。次に、表IVに示すように，５３８−６号菌と、３つの既知クルチアの種、クルチア  ゾフィー（ＮＣＩＢ９８７８）、クルチア  ギブソニー（ＮＣＩＢ９７５８）およびクルチア  シビリカ（ＢＫＭ  Ｂ−１５４９）との定量的ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行い、それぞれ１６、１９および４％の相同値を得た。細菌分類法での種の独立性の概念によれば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより同一種菌株間で得られる相同値は、一般的に７０％以上である。これら４つの菌株で得られた相同値から、それらの菌株は、独立の種であると決定した。したがって、５３８−６号菌をクルチアの新種と決定し、とりあえずクルチア  エスピー. （Ｋｕｒｔｈｉａ  ｓｐ．）５３８−６と命名した。
【００１７】
【表４】
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【００１８】
５３８−６号菌の他の分類学的性質を表Ｖに要約する。細胞の多形性は見られず、抗酸性は陰性であった。生理学的性質は以下の通りであった。
【００１９】
硝酸塩の還元：陽性；脱窒反応：陰性；メチルレッドテスト：陰性；ＶＰテスト：陰性；インドールの生成：陰性；硫化水素の生成：陰性；でんぷんの加水分解：陰性；クエン酸塩の利用性（Koser's)：陽性；塩化アンモニウムおよび硝酸カリウムの利用性：陽性；ウレアーゼ反応：陽性；オキシダーゼ反応：陰性；成育範囲：ｐＨ５. ７〜ｐＨ１０、かつ１５℃〜３７℃で生育；ＯＦテスト（Hugh & Leifson）：陰性；酸生成：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトール、およびグリセリンで微陽性、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、イノシトールおよびでんぷんで陰性；ガス生成：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、イノシトール、グリセリンおよびでんぷんで陰性。
【００２０】
その他の性質は、以下の通りであった。糖から酢酸、プロピオン酸および酪酸の生成：陰性；グルコン酸の酸化：陽性；アルコールの酸化：陰性；ジヒドロキシアセトンの生成：陰性；エスクリンの分解：微陽性；セルロースおよび馬尿酸の分解：陰性；マロン酸の資化性：陰性；アルギニンの分解：陰性；リジンおよびオルニチンの脱炭酸反応：陰性；フェニルアラニンの脱アミノ化反応：陰性；コアグラーゼの生成：陰性；馬血液の溶血性：陰性；８０℃、１０分間での生存：陰性；塩化ナトリウムに対する耐性：０−７％；シアン化カリウムに対する耐性：陰性；ペクチナーゼの生成：陰性；リパーゼの生成（Tween ８０）：陽性；レシチナーゼ（Egg yolk）の生成：陰性；およびビタミン要求性：陰性。
【００２１】
【表５】
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【００２２】
【表６】
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【００２３】
【表７】
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【００２４】
【実施例】
以下、本発明についてさらに実施例を示して詳細な説明を行うが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
クルチア  エスピー. ５３８−６号菌（ＤＳＭ−９４５４）の斜面固体培養基から一白金耳の細胞を、１％ブイヨン（極東製薬社製）から成る５mlの液体培地を含む試験管に植菌し、２８℃で一晩、振とう培養した。その種培養液の１mlを２. ０％グリセリン、４％プロテアーゼ・ペプトン（日本製薬社製）、０. ２％酵母エキス（ディフコ社製）、０. １％リン酸一カリウム、０. ０５％硫酸マグネシウム７水和物、０. ００１％硫酸第一鉄７水和物、０. ００１％硫酸マンガン４−７水和物および一滴の消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂社製）から成る５０mlの培地を含む５００ml容フラスコに植菌し、２８℃で振とう培養した。７２時間培養後、その培養液を、９N 硫酸でpH３. ０に調整し、８，０００rpm で１０分間遠心分離を行った。その上澄中のビオチン  バイタマーの含有量を、サッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を用いてペーパーディスクプレート法により測定した。１５μl の上澄およびビオチン標準溶液を、ペーパーディスクに浸みこませた。風乾後、そのペーパーディスクをサッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を含むアッセイプレートの寒天上に置き、２８℃で１７時間培養を行い、成育ゾーンの直径を測定した。上澄中のビオチン  バイタマーの含有量は、標準成育曲線から計算した。その結果、上澄には１８.mg/L のビオチン  バイタマーが含まれていた。
【００２６】
実施例２
実施例１で述べたと同様の方法で調製された１L の培養上澄からビオチン  バイタマーを採取した。精製のすべての過程でのビオチン  バイタマーをサッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を用いてペーパーディスクプレート法により追跡した。上澄を、３７０mlの活性炭（和光純薬社製）で充填した３. ６×４０cmのカラムに通した。そのカラムを５００mlの脱イオン水で洗浄後、４００mlのエタノール／アンモニア混合液（３７９mlの５０％エタノールと２１mlの２５％アンモニアを混合して調整）で展開し、１０mlずつ試験管に集めた。１７. １mgのビオチン  バイタマーに相当するビオチン  バイタマー活性を含む３０本の試験管の溶出液を減圧下に、５０mlまで濃縮した。その溶液のｐＨを１N 塩酸で７. ０に調整後、その溶液を、１７５mlのダウエックス１×４（ギ酸型、１００−２００メッシュ、ダウケミカル社製）を充填したカラム（２. ６×３８cm）でクロマトグラフィーを行った。そのカラムを２００mlの脱イオン水で洗浄後、５００mlの０. ２５N のギ酸で溶出し、それぞれ１０mlずつ試験管に集めた。ビオチン  バイタマー活性をもつ２０本の試験管の溶出液を集め、減圧下で濃縮し、１７. ５mgの白色粉末を得た。その白色粉末をエタノールと水の混合液で結晶化し、１５６℃の融点を有する１０mgの無色針状結晶を得た。その試料の融点、薄層クロマトグラフ上でのＲｆ値、赤外線吸収スペクトル、ＮＭＲスペクトルおよびサッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４に対する活性は、ＤＴＢ標品（シグマ社製）とよく一致した。ＤＴＢに加え、少量の７−ケト−８−アミノペラルゴン酸、７，８−ジアミノペラルゴン酸、ｄ−ビオチンが産生物として検出された。
【００２７】
実施例３
クルチア  エスピー. ５３８−６号菌（ＤＳＭ−９４５４）の斜面固体培養基から一白金耳の細胞を、１％ブイヨン（極東製薬社製）から成る５mlの液体培地を含む試験管に植菌し、２８℃で一晩、振とう培養した。その１mlの種培養液を２. ０％グルコース、４％プロテアーゼ・ペプトン（日本製薬社製）、０. ２％酵母エキス（ディフコ社製）、０. １％リン酸一カリウム、０. ０５％硫酸マグネシウム７水和物、０. ００１％硫酸第一鉄７水和物、０. ００１％硫酸マンガン４−７水和物および一滴の消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂社製）から成る５０mlの培地を含む５００ml容フラスコに植菌し、２８℃で３日間振とう培養した。その培養液から遠心分離により細胞を取り除き、その上澄中のビオチン  バイタマーの含有量を、サッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を用いてペーパーディスクプレート法により測定した。その上澄は、サッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４に対して１７. ８mg/Lのビオチン  バイタマー活性を示した。
【００２８】
更に、上澄のビオチン  バイタマーをサッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を用いてバイオオートグラフ法により測定した。１０μl の上澄を、シリカゲルプレート（１０×２０cm、０. ２５mm、Ａｒｔ. ５７２９、メルク社製）にのせ、そのプレートを酢酸エチル／メチルアルコール（１０：１）の混合液で展開した。そのプレート上のビオチン  バイタマーをサッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を含む寒天プレート上で検出した。試料の成育ゾーンのＲｆ値を、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸、７，８−ジアミノペラルゴン酸、ＤＴＢ、ｄ−ビオチン−ｄ−スルホキシドまたはｄ−ビオチンの標品と比較した。その結果、このビオチン  バイタマーを、ＤＴＢと同定した。
【００２９】
実施例４
クルチア  エスピー. ５３８−６号菌（ＤＳＭ−９４５４）の斜面固体培養基から一白金耳の細胞を１％ブイヨン（極東製薬社製）から成る５mlの液体培地を含む試験管に植菌し、２８℃で一晩、振とう培養した。その１mlの種培養液を、２. ０％グルコース、４％プロテアーゼ・ペプトン（日本製薬社製）、０. ２％酵母エキス（ディフコ社製）、０. １％リン酸一カリウム、０. ０５％硫酸マグネシウム７水和物、０. ００１％硫酸第一鉄７水和物、０. ００１％硫酸マンガン４−７水和物、０. ０５％ピメリン酸および一滴の消泡剤ＣＡ−１１５（日本油脂社製）から成る５０mlの培地を含む５００ml容フラスコに植菌し、２８℃で３日間振とう培養した。その培養液から遠心分離により細胞を取り除き、その上澄中のビオチン  バイタマーの含有量を、サッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４を用いてペーパーディスクプレート法により測定した。その上澄は、サッカロミセス  セレビシイェーＡＴＣＣ７７５４に対して４５mg/Lのビオチン  バイタマー活性を示した。
【００３０】
その上澄中のビオチン  バイタマーを、ＤＴＢと決定した。