(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含んで成る組換えベクター。
（ａ）リコンビナーゼをコードする配列と、それに機能するべく連結され、１つまたは複数の転写因子による活性化に依存する最小プロモーターＭＰと、転写因子結合部位と、選択肢としてポリアデニル化配列とを含む、少なくとも１つの第１転写カセット；
（ｂ）自殺遺伝子と、それに機能するべく連結されたプロモーターＰと、選択肢としてポリアデニル化配列とを含む、少なくとも１つの第２転写カセット；そして
（ｃ）リコンビナーゼ標的配列を含む５’隣接配列および／または３’隣接配列。
【請求項２】
前記転写因子結合部位が転写因子ｐ５３を結合することを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
５’および／または３’隣接配列が実質的にリコンビナーゼ標的配列からなること特徴とする、請求項１または２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
ベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項５】
５’および／または３’隣接配列が一部または全部のレトロウイルスＬＴＲ領域を含み、少なくとも１つのリコンビナーゼ標的配列が該５’および／または３’ＬＴＲのＵ３および／またはＵ５領域に埋め込まれていることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
リコンビナーゼがＣｒｅであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項７】
リコンビナーゼがＦｌｐであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記リコンビナーゼ標的配列がｌｏｘＰであることを特徴とする、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項９】
前記リコンビナーゼ標的配列がＦＲＴであることを特徴とする、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
最小プロモーターがΔＣＭＶまたはΔＭＭＴＶであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
自殺遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
自殺遺伝子がシトシンデアミナーゼをコードすることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
プロモーターＰがＭｏＭｕＬＶ−ＬＴＲプロモーターであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１４】
ベクターが少なくとも１つの選択マーカーカセットを含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１５】
前記選択マーカーカセットがＳＶ４０Ｐｕｒｏであることを特徴とする、請求項１４に記載の組換えベクター。
【請求項１６】
自殺遺伝子が（ｉ）自殺タンパク質をコードする、または（ｉｉ）必須細胞性遺伝子に対し部分的または完全に相補的である、または（ｉｉｉ）細胞変性ウイルスをコードすることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４、または１６のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
欠損転写因子を含む腫瘍細胞を請求項１〜１４、または１６のいずれか１項に記載の組換えベクターで感染させることにより得られる形質導入真核細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換えベクター、本発明の組換えベクターを含む薬学的組成物、および本発明の組換えベクターを腫瘍患者の治療に使用すること、および形質導入細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで良性および悪性の腫瘍は、腫瘍の外科的摘出等の侵襲性の処置あるいは細胞増殖抑止剤の投与または患部器官への放射線の照射などの保存的処置、あるいは上記方法の組み合わせを用いて主に治療されてきた。これらの治療的可能性についても、外科手術法の弛み無い進歩と細胞増殖抑止剤の分野でのすばらしい発展によって、すでに大きな成功がおさめられている。
【０００３】
しかしながら、上記の治療法による腫瘍の治療における成否は変動が大きく、成果の程は予測不能である。さらに、上記の３つのいずれの方法も深刻な欠点を伴う。例えば、外科手術そのもののために、腫瘍の外科的除去およびおこりうる健康な組織の切除は、患者に甚大な影響を与える。細胞増殖抑止剤の投与および腫瘍の放射線照射を標的細胞に、適切に限局できることはむしろ例外的であり、したがって、健康な細胞、および健康な組織をも処置に晒すことがほとんど不可避である。細胞増殖抑止剤の投与とはすなわち有糸分裂の阻害であって、例えば萎縮性脱毛症などの不快な副作用を持つ。細胞増殖抑止治療および放射線治療のどちらも生殖適齢期の患者の不稔性を必然的に招来する。
【０００４】
上記の欠陥のために、腫瘍細胞を標的化した様式で治療薬、特に細胞増殖抑止剤を輸送し、該細胞内部に取り込ませる方法が既に試みられてきた。このような試みの一例として、腫瘍細胞特異的抗原に結合する抗体に細胞増殖抑止剤をカップリングさせる方法がある。このようなアプローチは理論的に魅力的であるが、例えば、十分な量の抗体を取得すること困難であることなどかなりの問題があり、そしてまた、提供される外来タンパク質に対する免疫反応を引き起こす危険性が少なからずある。
【０００５】
もうひとつのアプローチは、腫瘍細胞の発生段階における転写因子の役割に関する知見に基づくものである。少数の核内転写因子が細胞内ゲノムの完全性をモニターする働きがあることは広く知られている。ゲノムＤＮＡが損傷を受けると、前記転写因子は修復に必要な細胞周期停止を誘発するか、あるいは修復不能な損傷の場合にはアポトーシスを誘起する。したがって、該転写因子は重要な腫瘍抑制機能を有する。転写因子p53、とりわけp53の機能障害にともなう癌の発生について最近多くの報告がある（Levine, 1997）。「ジーン・ターゲティング」の手段により生産されたp53-/-表現型のマウスが上述の関連性の証明となっている。そのタンパク質の不在が自然発生腫瘍の発生の増加をもたらす（Donehowerら、1992）。さらに、前記マウスの助けによって、p53がアポトーシスの誘発に主要な役割を果たすことを証明することができた（Loweら、1994）。
【０００６】
放射線照射や化学療法など、従来の腫瘍治療において重要な役割を演じているのが、まさにこのp53が介在するアポトーシスなのである（Loweら、1994）。変異されたp53を持つ（p53mut）タイプの癌がそれに伴い、細胞増殖抑止剤および放射線治療に対して抵抗性であり、そのため多くは予後不良である。ヒトにおいては、全ての癌タイプのうち50-80%においてp53の変異ないし欠失が観察されている（Levineら、1991）。これらは常にＤＮＡ結合ドメインに関するものであり、その結果としてp53のトランスアクティベーターとしての機能を喪失させるものである。
【０００７】
正常細胞と形質転換細胞とにおけるp53分子の遺伝的差異が、腫瘍細胞を選択的に殺す（selective  elimination）のに最近利用されてきた。p53欠損細胞においてのみ増殖可能であるアデノウイルス変異体は、ヌードマウスでの実験で移植されたヒトp53mut腫瘍を選択的かつ効果的に破壊した（Bischoffら、1996）。しかしながら、ヒトにおいては、既にアデノウイルスに対する免疫が存在することが大きな問題となりうる。全人口の大多数は、既にアデノウイルスに感染して免疫化されているので、治療を行おうとする患者のほとんどは治療用ウイルスが殺傷能を発揮できる前にこれを排除してしまうであろう。このようにアデノウイルスベクターは、遺伝子療法に用いるには限られた範囲でしか適していない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来技術から出発して、本発明の目的は、腫瘍細胞を標的化した様式で、それと戦う方法および手段を提供することであった。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、この目的は以下の（ａ）〜（ｃ）を含んで成る組換えベクターにより達成される。
（ａ）リコンビナーゼをコードする配列と、それに機能するべく連結され、１つまたは複数の転写因子による活性化に依存する最小プロモーターＭＰと、転写因子結合部位と、選択肢としてポリアデニル化配列とを含む、少なくとも１つの第１転写カセット；
（ｂ）自殺遺伝子と、それに機能するべく連結されたプロモーターＰと、選択肢としてポリアデニル化配列とを含む、少なくとも１つの第２転写カセット；そして
（ｃ）リコンビナーゼ標的配列を含む５’隣接配列および／または３’隣接配列。
【００１０】
本発明のベクターは、自殺遺伝子を細胞に該ベクターによって導入し、健康な細胞にあってはリコンビナーゼの発現により前記遺伝子がただちに排除され、一方、腫瘍細胞中にあっては不活性転写因子により活性化され、(i)自殺タンパク質の発現により、また、(ii)アンチセンスＲＮＡの転写により、さらにまた、(iii)細胞変性のウイルスの生産によるかして、細胞死に導き、腫瘍細胞を標的とし、選択的に殺すことを可能とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の記述中において、「ベクター」なる用語は、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸から構成される直鎖状もしくは環状の核酸分子を指す。本発明のベクターの出発材料となりうる、遺伝子治療に適するベクターは公知である。ウイルスにパッケージングすることができ、容易に形質導入法により細胞に導入しやすいため、ウイルスまたはレトロウイルスのゲノムに由来するベクターが好ましいペクターである。ウイルスに由来しないベクターもまた使用可能であるが、さらにトランスフェクションの技法が必要となる。適当なベクターは、例えば完全に合成されたベクター、または弱毒化細菌によって形質導入されたベクターであろう。
【００１２】
「複製能力」とは、ベクターが宿主細胞内で増殖する能力を意味する。哺乳動物細胞に関しては、非常に高い複製能力は、例えばアデノウイルスや、特にモロニー・マウス白血病ウイルス(MoMuLV)のマウス白血病ウイルスMuLVのようなレトロウイルスに見出される。本発明は、一般に真核細胞内で複製能力をもつベクターを含む。ベクターがレトロウイルスである場合は、感染性のあるレトロウイルスが好適である。
【００１３】
「転写カセット」とは、タンパク質をコードする配列とは別個に、例えばプロモーター、または転写因子結合部位およびポリアデニル化配列を有する最小プロモーターなどの、必要な制御領域を含む核酸ユニットである。第１転写カセットは、第２転写カセットに対して5'または3'に位置している。
【００１４】
「最小プロモーター」とは、天然または合成のプロモーターもしくはエンハンサーであって、特異的な転写因子の存在下にあってのみ遺伝子発現が活性化されるものである。それは少なくとも１つの天然または合成の転写因子結合部位を含む。
【００１５】
「転写因子結合部位」とは、最小プロモーターを活性化するのに必要な転写因子が結合することができる天然または合成の核酸配列である。
【００１６】
「リコンビナーゼ」とは、特定の標的塩基配列を認識、切断し、かつ同配列をお互いに組換える天然または合成の酵素である。実例として、Ｐ１大腸菌ファージからのＣｒｅリコンビナーゼ（SternbergおよびHamilton、1981）およびサッカロミセス属菌(S. cerevisiae)からのＦｌｐリコンビナーゼ（BroachおよびHicks、1980）があげられる。
【００１７】
「標的配列」とは、リコンビナーゼが特異的に認識することができる天然または合成の配列である。実例として、Ｐ１大腸菌ファージからのloxP配列（Guら、1993；  SauerおよびHenderson 1988、StembergおよびHamilton、1991）およびサッカロミセス属菌からＦＲＴ配列（BroachおよびHicks、1980、GolicおよびLindquist、1989； O'Gormanら、1991）があげられる。
【００１８】
「自殺遺伝子」とは、転写そしておそらく発現によって細胞死に至らしめる核酸配列である。本発明のベクターにおいては転写カセットの一部として、すなわち、プロモーターおよび選択肢としてポリアデニル化配列と組み合わされて存在する。
【００１９】
本発明の一側面では、自殺遺伝子が必須遺伝子に部分的または完全に相補的となるべく意図される。転写によって生産される自殺遺伝子のｍＲＮＡは、必須細胞性遺伝子とハイブリダイズすることができる。ｍＲＮＡハイブリダイゼーションの結果、必須細胞性遺伝子の翻訳が阻止され、そして／または、リボヌクレアーゼ(RNase)Ｈが活性化され、続いて細胞死が起こる。前記必須細胞性遺伝子は、サイクリン遺伝子およびＢｃｌ−２のような抗アポトーシスタンパク質などのうちから選ぶことができる。
【００２０】
本発明に従って、意図される自殺遺伝子のさらなる作用機序は、自殺遺伝子が細胞を殺すセムリキ森林熱ウイルスなどの細胞変性ウイルスをコードする。さらに、自殺遺伝子は、自殺タンパク質をコードする核酸配列を含んでもよい。
【００２１】
「自殺タンパク質」とは、直接または間接に細胞死に至らしめる天然または合成のポリペプチド産物である。その間接作用は、例えば、非毒性の薬物前駆体との相互作用に基づき、前駆体が細胞死の引き金を引くことができる毒性薬物に転化される。自殺タンパク質は、インフルエンザ赤血球凝集素や外来の主要組織適合性（MHC）抗原のような抗原であってもよい。前記直接作用は、ここで腫瘍細胞に対する免疫反応の刺激に基づくものである。
【００２２】
本発明のベクターを用いると、欠損転写因子を持つ腫瘍細胞を標的化した、直接的な様式で殺すことが初めて可能となる。本発明のベクターの選択性の基礎は、第１転写因子によってコードされるリコンビナーゼがそのままの転写因子を有する細胞においてのみ発現されるということである。欠損転写因子を有する腫瘍細胞では、最小プロモーターに関係する転写因子結合部位への転写因子の結合はない。最小プロモーターの活性化には転写因子の結合が必要であるため、転写が起こらず、したがって第一転写カセットによってコードされる遺伝子、すなわちリコンビナーゼの発現はない。これとは対照的に、第２転写カセットのコーディング配列、すなわち自殺遺伝子は、それに機能すべく連結されたプロモーターが、転写因子によるいかなる活性化とも独立しているため転写されることができる。発現された自殺タンパク質は、薬物前駆体と接触するに至った後に、該前駆体を代謝し、それにより毒性薬物の生産に寄与する。前記代謝産物は、最終的に個々の患部細胞の死をもたらす。あるいはまた、細胞タイプ特異的アンチセンスＲＮＡまたはウイルスが細胞死を招来することも可能である。
【００２３】
これと対照的に、健康な細胞すなわちそのままの転写因子を有する細胞においては、該因子が転写因子結合部位に結合でき、したがって第１転写カセットによってコードされるタンパク質、すなわちリコンビナーゼが発現される。リコンビナーゼの標的配列については、例えばベクターによって予め用意され、転写カセットの領域を挟むが、標的配列の間に位置する第１、第２転写カセットを伴う領域は、ただちに削除される。レトロウイルスベクターの場合、ＬＴＲおよびかくしてリコンビナーゼの標的配列は、インテグレーションによって２重になる。標的配列の間に位置する領域もまた、削除される。健康な細胞の場合、残るものは、標的配列のコピーのみ、あるいは選択肢として、ベクターの以前のインテグレーション部位としてのＬＴＲとである。
【００２４】
上述の転写因子としては、トランスアクティベーター能力の制限または完全な削除をもたらす欠損を有するいかなる転写因子であってよい。ＤＮＡ結合そしてそのためトランス活性がもはや起こらないように、腫瘍細胞においてそのＤＮＡ結合ドメインがしばしば相対的に変化される、転写因子の例としては、前記ｐ５３因子があげられる。
【００２５】
ヒトの腫瘍においては、ｐ５３の変異は常にＤＮＡ結合ドメインに見出される。これはしばしばＤＮＡ結合能、したがって該タンパク質のトランスアクティベーター機能の喪失を引き起こす。数々のプロモーターにおいてｐ５３結合コンセンサス配列が発見され、それらの特性が調べられている。さらに、ｐ５３がとりわけｐ２１（ＷＡＦ１）（el-Deiryら、1994）、ｂａｘ（MiyashitaおよびReed、1995）およびＩＧＦ−ＢＰ３（Buckbinderら、1995）の発現を調節する。このようなｐ５３結合コンセンサス配列は、例えば、ＰＧモチーフ（ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧ）（el-Deiryら、1992）である。本発明者らおよび他は、最小プロモーター（ＭＰ）に接続された該モチーフ（ＰＧｎ）がレポーター遺伝子の発現によってｐ５３を誘導可能にすることを示してきた。このような誘導は、変異ｐ５３によっては不可能である。これは、とりわけＰＧｎ−ＣＭＶＭｉｎ−ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）の組合せ（Kernら、1992）およびｐｇ１３−ＳＶ４０Ｍｉｎ−ＳＥＡＰ（分泌型アルカリフォスファターゼ）の組合せに対して実証されてきた。本発明の目的には、ｐ５３結合コンセンサス配列ｐｇ１３が好ましい。
【００２６】
本発明の１つの実施形態において、前記近接配列（flanking  sequence）は、実質的にリコンビナーゼ標的配列からなる。これらは天然または組換えリコンビナーゼによって認識される、天然または合成の配列であってよい。
【００２７】
好ましい実施の形態において、本発明のベクターは、レトロウイルスに由来する。レトロウイルスはＲＮＡウイルスであって、その複製には中間体としてＤＮＡが含まれる。前記ウイルス性ＲＮＡゲノムは、短い反復配列（リピート、Ｒ）および非反復配列（ユニーク配列、Ｕ５およびＵ３）に挟まれ、これらはＤＮＡ合成、ウイルスゲノムの宿主ゲノムへの組込み（インテグレーション）、転写およびＲＮＡプロセッシングを制御する。これらの制御領域は、ウイルス粒子の最も重要な構成タンパク質、すなわちｇａｇおよびｅｎｖと、さらに粒子にパッケージされる酵素群（ｐｏｌ、プロテアーゼ、逆転写酵素およびインテグラーゼ）をそれらの間に提供する。感染後すぐに、前記ウイルスＲＮＡは逆転写酵素によりＤＮＡに翻訳される。インテグレーションに先立ち、ウイルスゲノムの末端配列は、レトロウイルスゲノムが長い末端反復配列（ロング・ターミナル・リピート、ＬＴＲ）に挟まれるように重複し、これらはそれぞれがＵ３領域、ＲおよびＵ５領域を含む。直鎖状分子はその後、ゲノムに組み込まれる。
【００２８】
逆転写されたウイルスゲノムは、宿主ゲノムに組み込まれた後はプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは宿主細胞ＤＮＡと共に、複製され、細胞遺伝子と同様に転写される。プロウイルスの転写は、５’ＬＴＲのＵ３領域中にあるプロモーターおよびエンハンサー配列により制御される。ポリアデニル化された転写物は、５’ＬＴＲ中のＵ３とＲの間の移行部に始まり、ポリアデニル化シグナルを含む３’ＬＴＲのＲに終焉する。
【００２９】
特異的制御配列がＬＴＲ中に残っていれば、レトロウイルスゲノムは、逆転写、インテグレーション、および粒子形成に必要なタンパク質を発現する細胞で複製する能力を損なうことなく外来ＤＮＡと交換することができる。複製機構に必要とされる酵素を供給するには、ベクターＤＮＡがレトロウイルス全ゲノムまたはヘルパーウイルスを含む細胞株にトランスフェクトされる。前記ヘルパーウイルスは、Ｕ５領域とｇａｇとの間の欠失のために粒子中に集合することはできない。その結果、組換え転写産物のみがウイルス粒子中にパッケージされ、細胞から放出される。前記の技術的可能性から、遺伝子治療用のベクターとしてはレトロウイルスベクターが好適である。
【００３０】
レトロウイルスに由来するベクターの場合、５’および／または３’近接配列は、完全なまたは部分的なＬＴＲ領域を含む。少なくとも一つのリコンビナーゼ標的配列は、ここで好ましくは５’および／または３’ＬＴＲのＵ３またはＵ５領域中にある。リコンビナーゼ標的配列がＬＴＲの外側にある場合は、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列が必要である。しかしながら、転写カセットは好ましくはＬＴＲの外側にある。非レトロウイルスベクターの場合は、少なくとも２つのリコンビナーゼ標的配列を用意する。
【００３１】
第１転写カセットは、とりわけリコンビナーゼをコードする配列を含む。好ましくは、おそらく基礎をなすウイルスゲノムと転写方向が同じになるように配置する。
【００３２】
リコンビナーゼ活性を有する、天然または合成のいかなるタンパク質もリコンビナーゼとして使用できる。好適な実施の形態では、第１転写カセットによってコードされるリコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼである。該Ｃｒｅリコンビナーゼは、元来大腸菌ファージＰ１で同定されたが、その特性がよく研究されている。好適な実施の形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼの標的配列は、ｌｏｘＰ配列である。Ｃｒｅリコンビナーゼに認識されうる人工のリコンビナーゼ標的配列も使用することができる。代わりの実施の形態では、Ｆｌｐがリコンビナーゼとして用いられる。
【００３３】
Ｆｌｐは、元来パン酵母菌(S. cerevisiae)に由来する。これは、S. cerevisiaeのＦＲＴ配列を優先的に認識する。かわって、これらの標的配列は、リコンビナーゼＦｌｐによって認識される人工的な認識配列で置換できる。
【００３４】
転写因子に依存する、いかなるプロモーターも最小プロモーターとして使用することができる。好適な実施の形態は、ΔＣＭＶ（GossenおよびBujard、1992）またはΔＭＭＴＶ（Hoffmannnら、1997）を使用する。これらのプロモーターは、切り詰めたサイトメガロウイルスまたはマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターであり、転写因子によりトランス活性化される。
【００３５】
第２転写カセットによってコードされる自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ遺伝子である。本発明に従えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が特に好ましい。ＨＳＶ−ＴＫは、例えばガンシクロビルを加えるとこれを転化し、有毒代謝産物とする。しかしながら、非毒性の薬物前駆体から代謝によって有毒薬物を生産することが知られている全てのタンパク質は自殺タンパク質として使用できる。このような自殺タンパク質の例として、さらにシトシンデアミナーゼがあげられる。
【００３６】
さらなる好適な実施の形態において、自殺遺伝子は、部分的または完全に必須細胞性遺伝子に相補的である。自殺遺伝子の転写により生成するｍＲＮＡは、必須細胞性遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる（アンチセンス機序）。ｍＲＮＡハイブリダイゼーションの結果、翻訳が阻止、および／またはリボヌクレアーゼ(RNase)Ｈの活性化であり、必須細胞性遺伝子の発現を防ぎそして細胞死に至らしめる。例えば、基礎代謝などの必須細胞性遺伝子は当業者に公知である。
【００３７】
さらなる好適な実施の形態において、前記自殺遺伝子は、発現によって細胞変性ウイルスを生成することができる。当業者に公知の細胞変性ウイルスは、感染細胞において退行変性、例えば巨核細胞、シンシチウム、封入体、液胞および顆粒の形成、核の変化、細胞溶解などを生じる。細胞変性ウイルスの例としては、セムリキ森林熱ウイルスがあげられる。
【００３８】
第２転写カセットは、ウイルスゲノムおよび第１転写カセットと同じ転写方向となるように配置されることが好ましい。第１転写カセットは、第２転写カセットに対して相対的に５’または３’のいずれに位置してもよい。反対向きに配置する場合、これもまた可能であるが、前記第２転写カセットに対して、もう一つのポリアデニル化配列を用意しなければならない。
【００３９】
自殺遺伝子のプロモーターとしては、いかなる望ましい強い真核細胞プロモーターも使用できる。好ましいプロモーターは、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のＬＴＲプロモーターである。当業者であれば、さらに他のプロモーターについても知見を有する。
【００４０】
さらなる好適な実施の形態において、本発明のベクターは、選択マーカーカセットを含む。選択マーカーカセットは、例えば、Ｕ３領域に挿入することができる。該領域は実行したインテグレーションの証拠となりうる。実施例に例示する選択マーカーカセットは、ＳＶ４０Ｐｕｒｏである。しかしながら、真核細胞において転写され、翻訳されそして当業者に公知である、他の全ての選択マーカーシステムもまた、使用することができる。
【００４１】
さらに本発明は、請求項１乃至１４、または１６のいずれか１つに記載のベクターを含む薬学的組成物に関する。これらの薬学的組成物は、腫瘍治療に有用であり、転写因子の欠損によって特徴付けられる。好適な実施の形態では、治療用組成物中のベクターは、ウイルス粒子にパッケージされる。
【００４２】
本発明のベクターは、薬学的組成物中で、好ましくは複製能を持つ。特に、これらは好ましくは、感染性、すなわちさらに細胞に感染できる。
【００４３】
本発明のベクターは、腫瘍患者の治療に用いることができる。好適な実施の形態において、本発明は、本発明のベクターを投与し、そして続いてガンシクロビルのような自殺タンパク質により代謝されるべき前駆体を投与することによって、腫瘍細胞を標的化した様式で殺すことになっている。
【００４４】
本発明のさらなる主題は、欠損転写因子を含む腫瘍細胞を請求項１乃至１４、または１６のいずれか１つに記載の組換えベクターで感染させることにより得ることができる形質導入された真核細胞である。
【００４５】
図面および以下の実施例は、本発明を説明する。
【００４６】
【実施例】
（実施例１）  Ｃｒｅが介在する組換えを検出するためのＳａｏｓ２レポーター細胞株の生産
Ｃｒｅリコンビナーゼ活性がそれによつて検出することができる細胞株を取得するために、ヒトｐ５３欠損Ｓａｏｓ２骨肉腫細胞をカルシウムリン酸共沈法（Pearら、1993）によってレポーター構築体ｐＳＶｐａＸ１で安定的にトランスフェクトした。
【００４７】
前記レポーター構築体ｐＳＶｐａＸ１（Buchholzら、1996）は、検出が容易なタンパク質（βガラクトシダーゼ）をコードするＬａｃＺ遺伝子からなる。該ＬａｃＺ遺伝子は、Ｃｒｅ介在型リコンビナーゼが作用して初めてＳＶ４０プロモーターによって転写される（図５）。
【００４８】
２つのｌｏｘＰ部位に挟まれたピューロマイシンリン酸転移酵素耐性遺伝子は、ＳＶ４０プロモーターおよびＬａｃＺのそれぞれのコーディング配列の間に配置される。ＳＶ４０プロモーターは、非組換え状態において、耐性遺伝子を転写し、これによりレポーター構築体の選択が可能となる。Ｃｒｅリコンビナーゼの非存在下では、前記ピューロマイシン−リン酸転移酵素配列は、ｌｏｘＰ配列の間で除去され、そして前記ｌａｃＺ遺伝子はＳＶ４０プロモーターの制御下に入る。このようにして、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性は、細胞中のβ−ガラクトシダーゼの発現（Ｘ−Ｇａｌ染色）により容易に検出できる。
【００４９】
ｐＳＶｐａＸ１でトランスフェクトされた細胞は、0.5mg/mlのピューロマイシン（シグマ社）で７日間選択された。得られた形質転換細胞は、Ｘ−Ｇａｌでインキュベートしてもバックグラウンド染色を全く示さなかった。Ｃｒｅ発現プラスミドｐＭＣ−Ｃｒｅでトランスフェクションすると、明確なｌａｃＺ陽性の表現型の形質転換細胞が得られた。
【００５０】
（実施例２）  ｐ５３依存性Ｃｒｅ発現プラスミドの生産
本発明者らは、Ｃｒｅ発現プラスミドの助けで２つの異なる最小プロモーターがｐ５３依存性であることを示した。これらの最小プロモーターは、ｐ５３結合モチーフｐ１３（Kernら、1992）であって、その一方が短縮されたサイトメガロウイルス（ΔＣＭＶ）プロモーター（GossenおよびBujard、1992）に、他方は短縮されたマウス乳腺腫瘍ウイルス（ΔＭＭＴＶ）プロモーター（Hoffmannら、1997）に連結されているものからなる。前記２つの発現ベクターを下記の方法でクローニングした。
１．  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）プラスミドを制限酵素ＣｌａＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化し、そしてｐＵ３Ｃｒｅ（Russら、1996）をＮｈｅＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化する。Ｃｒｅ断片と直鎖状ベクターをライゲーションしｐＢＳＣｒｅを得た。
２．  ｐＢＳＣｒｅおよびｐＧＬｐｇ１３Ｓｅａｐ（C. Rinderele, Asta Medica AG）をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化する。ｐＧＬｐｇ１３ＳｅａｐのＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ消化断片のＣｒｅ５’をｐｇ１３断片としてｐＢＳＣｒｅにクローニングした。これによりｐｐｇ１３Ｃｒｅを得た。
３．  ｐｐｇ１３ＣｒｅをＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化する。
【００５１】
ライゲーション１：合成ΔＣＭＶプロモーター断片（ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＧＣＣ）からｐｐｇ１３ΔＣＭＶＣｒｅを得た。  ライゲーション２：ΔＭＭＴＶプロモーターのＰＣＲ断片（５’プライマー：ＣＣＴ  ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＴＣＣ，  ３’プライマー：ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  Ｃ）からｐｐｇ１３ΔＭＭＴＶＣｒｅを得た。
４．  ２つの構築体（ｐｐｇ１３ΔＣＭＶＣｒｅおよびｐｐｇ１３ΔＭＭＴＶＣｒｅ）をＳａｌＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化し、そしてｐｐｇ１３ＳｅａｐをＢａｍＨＩ，ＳａｌＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化する。切り出されたポリアデニル化シグナル（ｐＡ）をライゲーションした結果、以下の２つのｐ５３依存性Ｃｒｅ発現プラスミドを得た。
− ｐｐｇ１３ΔＣＭＶＣｒｅｐＡ
− ｐｐｇ１３ΔＭＭＴＶＣｒｅｐＡ
ｐ５３依存性でＣｒｅが介在する組換えを検出するために、ｐ５３発現プラスミドｐＳＢＣ２−ｐ５３存在、または非存在下で、Ｃｒｅ発現プラスミドをｐ５３-/- レポーター細胞株Ｓａｏｓ２／ｐＳＶｐａｘ１に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションは、カルシウムリン酸共沈法（Pearら、1993）を用いて標準プロトコールに従い行った。
【００５２】
４８時間後、βガラクトシダーゼの検出をするため細胞をＸ−Ｇａｌで染色した。両方の場合、図６から、ｐ５３がレポータープラスミドｐＳＶｐａｘ１のＣｒｅ介在型組換えと、その結果としてβガラクトシダーゼの発現を有意に促進することが明らかに実証された。
【００５３】
これらの結果により、生産されたｐｇ１３ΔＣＭＶおよびｐｇ１３ΔＭＭＴＶの２つの最小プロモーターによりＣｒｅリコンビナーゼのｐ５３依存的な発現が可能であることが実証された。
【００５４】
（実施例３）  ｐ５３調節、自己消滅型レトロウイルスベクターのクローニング
ｐ５３依存性、自己消滅型構築体に導くクローニング法は、以下に簡単に記載される。
１．ｐＢＳおよびｐＧＬｐｇ１３ＳｅａｐをＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ベクターとｐｇ１３ＳＶ４０断片とのライゲーションし、ｐｐｇ１３ＳＶ４０を得た。
２．ｐＵＣ３ＴＫ（Russら、1996b）をＮｈｅＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化し、そしてｐｐｇ１３ＳＶ４０をＳａｌＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化する。ベクターとチミジンキナーゼ（ＴＫ）カセットをライゲーションし、ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０を得た。
３．ｐＵ３ＣｒｅをＮｈｅＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化し、ｐＴＫｐｇ１３ＳＶ４０をＸｂａＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で消化する。ベクターとＣｒｅをライゲーションし、ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０Ｃｒｅを得た。
４．ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０ＣｒｅをＮｏｔＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で、次いでＸｈｏＩで消化し、そしてｐＢＡＢＥｐｕｒｏ（Russら、1996b）をＣｌａＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素で、次いでＳａｌＩで消化する。ＴＫｐｇ１３ＳＶ４０ＣｒｅカセットとｐＢＡＢＥ断片とをライゲーションし、ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０ＣｒｅＵ３ＲＵ５を得た。
５．ｐｇｇＳＶ４０ＣｒｅｌｘＳＶ４０Ｐｕｒｏ（Russら、1996a）構築体からｌｘＳＶ４０ＰｕｒｏカセットをＢａｍＨＩおよびＣｌａＩにより切り出し、そしてｐＢＳの対応する制限酵素部位にライゲーションした。これによりｐＢＳｌｘＳＶ４０Ｐｕｒｏを得た。
６．ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０ＣｒｅＵ３ＲＵ５をＮｈｅＩで、さらにｐＢＳｌｘＳＶ４０ＰｕｒｏをＳｐｅＩおよびＸｂａＩで消化する。ｌｘＳＶ４０Ｐｕｒｏカセットをレトロウイルスベクターでライゲーションし、ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０ＣｒｅＵ３ｌｘＳＶ４０Ｐｕｒｏを得た。
【００５５】
以下の方法により、最小プロモーターｐｇ１３ＳＶ４０を最小プロモーターｐｐｇ１３ΔＣＭＶおよびｐｇ１３ΔＭＭＴＶと交換した。
【００５６】
ｐＨＳＶＴＫｐｇＳＶ４０ＣｒｅＵ３ｌｘＳＶ４０ＰｕｒｏプラスミドをＢｓｔＢＩで消化し、ＥｃｏＲＩで部分消化する。ｐｐｇ１３ΔＣＭＶＣｒｅｐＡおよびｐｐｇ１３ΔＭＭＴＶＣｒｅｐＡを同じ制限酵素で消化する。それぞれの断片をライゲーションし、以下のｐ５３制御、自己消滅型構築体を得た（図３）。
−ｐＨＳＶＴＫｐｇΔＣＭＶＣｒｅＵ３ｌｘＳＶ４０Ｐｕｒｏ
−ｐＨＳＶＴＫｐｇΔＭＭＴＶＣｒｅＵ３ｌｘＳＶ４０Ｐｕｒｏ
【００５７】
レトロウイルスベクター ｐＨＳＶＴＫｐｇΔＣＭＶＣｒｅＵ３ｌｘＳＶ４０ＰｕｒｏおよびｐＨＳＶＴＫｐｇΔＭＭＴＶＣｒｅＵ３ｌｘＳＶ４０ＰｕｒｏにおいてもＣｒｅ／ｌｏｘＰ介在性組換えがｐ５３依存的のままであることを確認するために、前記プラスミドをＰｈｏｅｎｉｘ細胞に一過性にトランスフェクトし、レトロウイルス粒子にパッケージングした（Pearら、出版中、インターネットウェブページに掲載中）。ウイルスを含む細胞培養上清を、ｐ５３を含まないＳａｏｓ２細胞に感染させた。ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）中、選択後、プロウイルス保有シングルクローンを単離できた。ｐ５３非存在化でも微量のＣｒｅ発現がある可能性を検証するため、各クローンを２０μＭのガンシクロビル（ＧＣ、Ｓｙｎｔｅｘ社）中に置いた。プロウイルス発現クローンにおいて、５６％および８６％がそれぞれの最小プロモーターに依存してＧＣ存在下で死滅したことを表１が示す。全てのＧＣ感受性クローンにおいて、特異的ＰＣＲ法によりＣｒｅＤＮＡが検出できた（図７）。このことは、感染したＳａｏｓ２クローンの大多数において組換えが起こらなかったことを意味する。さらなる試験で、ＧＣ感受性クローンを野生型ｐ５３発現プラスミド（ｐＳＢＣ２−ｐ５３）で一過性にトランスフェクトした。ＧＣ生存細胞について、再びＰＣＲ法を用いて組換えのアッセイを行った。図７に例示するように、ＧＣ耐性細胞は、もはやＣｒｅリコンビナーゼを含んでいなかった。これらの結果から野生型ｐ５３がＣｒｅリコンビナーゼの転写を活性化することによって、ゲノムからのプロウイルスＬＴＲ間に位置する配列を除去できることが明白に実証された。
【００５８】
（実施例４）  自己消滅型レトロウイルスベクターによるｐ５３-/-細胞の選択的殺傷
内因性ｐ５３も同様にベクターのＣｒｅ発現を活性化できるか否かという問いに答えるために、実施例３に既述したように形質転換マウス線維芽細胞を、同じレトロウイルスで感染させ、プロウイルス保有クローンを単離した。線維芽細胞の一方は、ｐ５３ノックアウトマウス（Loweら，1994）由来のｐ５３-/-−１ＡＲ．Ａ９細胞であり、他方は少量の野生型ｐ５３を発現する従来型ＮＩＨ３Ｔ３細胞である。ピューロマイシン耐性１ＡＲ．Ａ９全クローンは、組換えが起こらないため、ＧＣ中では１００％が死滅したが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞クローンの５７％が生存した（図７、表１）。ＤＮＡ試験により、この表現型はＣｒｅ介在型組換えによりＨＳＶ−ＴＫを有するプロウイルスの大多数が除去されたことによるものであることが示された（図４）。
【００５９】
表１：ウイルス感染細胞におけるｐ５３依存性ガンシクロビル耐性
0003669927.tif 000002
【００６０】
ｎｔ：未測定
＊ピューロマイシン耐性クローンはガンシクロビル（２０ｍＭ）存在下で、７日間培養し、そして７日間培養後、生存クローン数を測定した。
【００６１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】  腫瘍細胞を選択的に殺すためのベクターの概念および機能的原理を示す。Ｐ：プロモーター、ＭＰ：最小プロモーター、ｐＡ：ポリアデニル化配列、ｌｘ：配列特異的リコンビナーゼＣｒｅの標的配列ｌｏｘＰ。
【図２】  腫瘍細胞を選択的に殺すための自己消滅型レトロウイルスベクターおよび機能的原理を示す。プロウイルスのインテグレーションの後、自殺遺伝子およびＣｒｅリコンビナーゼは２つのｌｏｘＰ部位の間に位置する。正常細胞にあっては、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が活性化され、組み込まれた配列の大部分は除去される。対照的に、癌細胞においては、転写因子が変異型として存在し、リコンビナーゼの転写を活性化することができない。この結果として、感染した癌細胞のみが自殺遺伝子を発現する。このようにして腫瘍細胞のみが、対応する薬物に感受性となる。Ｕ３ＲＵ５：プロモーターを有するレトロウイルス制御領域、ＭＰ：最小プロモーター、ｌｘ：すなわち配列特異的リコンビナーゼＣｒｅのｌｏｘＰ標的配列。
【図３】  ガンシクロビルによる腫瘍細胞を選択的に殺すための自己消滅型レトロウイルスベクターを示す。ＨＳＶ−ＴＫ：単純ヘルペスウイルス２チミジンキナーゼ遺伝子、ｐｇ１３：ｐ５３結合コンセンサス配列、ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＭＴＶ：マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ｌｘ：ｌｏｘＰ、配列特異的リコンビナーゼＣｒｅの標的配列、ＳＶ４０：シミアンウィルス４０プロモーター、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子。
【図４】  自己消滅型レトロウイルスの正常細胞および腫瘍細胞に於ける相異なる挙動を示す。プロウイルスのインテグレーションによりＬＴＲのＵ３領域が重複した後、構築体の大部分は２つのｌｏｘＰ部位の間に存在する。Ｃｒｅ酵素のｐ５３依存性転写は、結果として正常細胞では選択的組換えをもたらす。腫瘍細胞においては、ｐ５３は変異型として存在し、そのため機能的には存在しない。したがってＣｒｅが介在する組換えが不可能であり、全プロウイルスが維持される。その結果、ＨＳＶ−ＴＫが発現し、腫瘍細胞をガンシクロビル感受性にする。正常細胞はＨＳＶ−ＴＫを欠くため、ガンシクロビルに反応しない。ＨＳＶ−ＴＫ：単純ヘルペスウイルス２チミジンキナーゼ遺伝子、ｐｇ１３：ｐ５３結合コンセンサス配列、ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター、ＭＭＴＶ：マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ｌｘ：配列特異的リコンビナーゼＣｒｅのｌｏｘＰ標的配列、ＳＶ４０：シミアンウィルス４０プロモーター、Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン耐性遺伝子。
【図５】  ＣｒｅレポータープラスミドｐＳＶｐａｘ１を示す。Ｃｒｅが介在する組換えは、結果としてＳＶ４０プロモーターのＬａｃＺ遺伝子の転写をもたらす。ＳＶ：ＳＶ４０プロモーター、ｌｘ：配列特異的リコンビナーゼＣｒｅの標的配列ｌｏｘＰ、ＬａｃＺ：βガラクトシダーゼ遺伝子、ｐＡ：ポリアデニル化配列。
【図６】  リポーター細胞株Ｓａｏｓ２／ｐＳＶｐａｘ１へのｐ５３依存性Ｃｒｅ発現プラスミドのトランスェクションを示す。Ａ：ｐｐｇ１３ΔＣＭＶＣｒｅｐＡ単独（−ｐ５３）およびｐＳＢＣ２−ｐ５３（＋ｐ５３）とともにトランスェクション、Ｂ：ｐｐｇ１３ΔＭＭＴＶＣｒｅｐＡ単独（−ｐ５３）およびｐＳＢＣ２−ｐ５３（＋ｐ５３）とともに同時トランスェクション。
【図７】  Ｃｒｅリコンビナーゼの検出のためのＰＣＲを示す。ゲノムＤＮＡをＣｒｅ特異的プライマーで増幅した。ＳＶ４０特異的プライマーをプロウイルスのインテグレーションの対照とした。
【図１】
0003669927.tif 000003
【図２】
0003669927.tif 000004
【図３】
0003669927.tif 000005
【図４】
0003669927.tif 000006
【図５】
0003669927.tif 000007
【図６】
0003669927.tif 000008
【図７】
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