(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞機能または細胞機能における変化を決定する方法であって、
細胞または細胞の成分のサンプルを活性化剤と接触させること；
細胞または細胞の成分のサンプルに赤外光のビームを向けること；
少なくとも一つの範囲の周波数においてサンプルの赤外線スペクトルを分析すること；および
活性化剤による、細胞機能もしくは細胞機能における変化に関連しうる、細胞の活性化または細胞成分の変化によって、スペクトル特性に少なくとも一つの変化が起こったかどうかを調べ、その変化から細胞機能を決定することを含む方法。
【請求項２】
スペクトル特性の分析が、赤外線スペクトル特性の少なくとも一つの変化が、サンプル中の分子の少なくとも一つの官能基の振動および／またはその立体構造の変化によって起こったかどうかを評価するための、少なくとも一つの範囲の振動数のスペクトル特性の分析を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
赤外線スペクトル特性の少なくとも一つの変化が、特定の周波数における吸収強度の変化または特定の吸収が起こる周波数の変化である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つの官能基が、炭水化物、核酸、脂質分子、タンパク質、糖タンパク質、グリコーゲンまたは他のあらゆる分子成分から選択された少なくとも一つの分子中のものである、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの分子の官能基が、ホスホジエステル基、Ｃ-ＯＨ基、ＣＨ基およびＣＨ3から選択された、請求項４記載の方法。
【請求項６】
サンプルのスペクトル特性の測定が２回以上行われる、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが体液である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが血液またはその成分である、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記成分がリンパ球または他の免疫担当細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
赤外光がフーリエ変換赤外線分光計によって得られた、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
赤外光がラマン共焦分光計によって得られた、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
活性化剤が一つ以上のマイトジェンである、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
活性化剤が一つ以上の抗原である、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
活性化剤が、細胞成分に対するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはリガンドである、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一つの範囲の周波数が、９５０ｃｍ-1〜１６５０ｃｍ-1の範囲である、請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記調査が、血液または血液成分の生存能力および／または機能的完全性の調査である、請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記成分が、赤血球または血小板から選択された、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記成分が、貯蔵された血液中に含まれている、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
決定された細胞機能または細胞機能における変化が、細胞の免疫能力である、請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
決定された細胞機能または細胞機能における変化が、細胞の免疫能力であって、サンプルが、免疫不全、自己免疫、感染性疾患との接触可能性、アレルギー、過敏症またはガンの患者から得られた、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
決定された細胞機能または細胞機能における変化が、組織適合性である、請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
組織または臓器移植のために、組織適合性を調べるために用いられる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
血液成分の生存能力および／または機能的完全性を調査するために用いられる、請求項１ないし１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
活性化剤が、マイトジェン、抗原、微生物、植物または動物から誘導された細胞または細胞成分もしくは生成物、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体からなる群の一つ以上から選択された、請求項１ないし２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物学的材料の調査のための分光学的方法に関する。本発明は、特に血液または他の体液、もしくはそれらの一つ以上の成分の調査における赤外線（ＩＲ）分光学（分光測定）の適用に関する。
本発明に係る調査の例は、免疫不全、自己免疫、感染性疾患との接触、アレルギー、過敏症およびガンの患者における細胞性免疫の決定である。この調査は、移植片の組織適合性を決定することに関するものでもよい。
現在、細胞性免疫を決定する多くの臨床的試験方法がある。遅延型過敏症皮膚試験は、時としてアレルギー研究のような分野における診断を確立するのに役立つ一つの手段である。しかしながら、種々の抗原に高度に敏感な患者は、この様な皮膚試験に顕著な反応を示すだろう。ある場合には、潜在的に危険性のある抗原を用いて患者をチャレンジすること(challenging)を回避すべく、皮膚試験は全く行うことができない。
細胞性免疫を決定する別の技術は、リンパ球活性化である。リンパ球刺激としても知られるリンパ球活性化は、抗原が宿主において特異的に感作されたリンパ球と反応もしくは相互作用する場合に通常起こるin vivo過程のin vitro相関関係(an in vitro correlate)を指す。リンパ球活性化または刺激試験は、リンパ球が全血から抽出され抗原とインキュベートされる試験である。次いで、分子中にトリチウムを含むチミジンを１６時間以上添加し、細胞を回収し、その放射線活性を液体シンチレーションカウンターを使用して測定する。このin vitroにおける技術は免疫不全、自己免疫、感染性疾患、アレルギーまたは過敏症およびガンの患者において、並びに移植適合性の領域において、細胞性免疫を評価するために使用されてもよい。
リンパ球と単球に基づくin vitroアッセイに存在する不利益は、それらに時間がかかること、重労働であること、精度が悪いこと、並びに試薬、装置および高度の労力を必要とするために高価であることである。
ＩＲ分光学が血液または他の体液もしくはこれらの成分を調査するのに使用できることを、驚くべきことに見出した。ＩＲ分光学の使用は、従来の方法と比較して、少ない労力で比較的速く結果を出すという利点を有する。さらに、ＩＲ分光学の使用により、血液または体液成分の特性のより正確な示度を出すことができる。ＩＲ分光学の使用のさらなる利点は、ＩＲスペクトルの変化を介して動的過程の同定を可能にすることである。
体液成分という用語は、汗、唾液、尿、精液および涙の分泌物を含む。
ＩＲ分光学は、有機化学者および生物学者等により、分子的なプローブとして慣例的に用いられる。赤外光が有機化合物のサンプルを通過する際に、ある周波数は吸収されるが、他の周波数は吸収されることなくサンプルを通過する。ＩＲ分光学には、ラマン共焦レーザー分光学(Raman confocal laser spectroscopy)を含むレーザーラマン分光学(Laser-Raman spectroscopy)もしくは他のあらゆるＩＲ分光学技術も含める。
ＩＲ分光学の有機的応用は、６５０−４０００ｃｍ-1の範囲の周波数にほぼ完全に該当する。６５０ｃｍ-1より低い周波数は遠赤外線と呼ばれ、４０００ｃｍ-1より大きいものは近赤外線と呼ばれる。
従来のＩＲ分光計は、感度、速さおよび波長精度において欠点があった。ほとんどの分光計が前記波長範囲を越えてスキャンし、格子またはプリズムを用いて赤外光を分散する。これらの分散赤外線分光計は、鏡や格子の回転のような機械的動作におけるバックラッシュに関連して波長が不正確であった。
完全に異なる原理は、マイケルソン干渉計の中心となるフーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光学に関するものである。このＦＴＩＲ分光計は、速さ、並びにピコグラム量のサンプルが良好なスペクトルを示し得るような感度において利点を備えている。
本発明は、一つの態様として、
血液もしくは他の体液の少なくとも一つの成分：
少なくとも一つの成分の変化：
少なくとも一つの成分の機能状態：もしくは
少なくとも一つの機能成分の機能状態の変化
の調査の方法を提供し、この方法は少なくとも一つの成分を含有するサンプルを通るように赤外光を向けること、および前記サンプルの吸収特性を分析することを含む。
好ましくは、本発明の方法はＦＴＩＲ分光学を用いて行われるが、別のＩＲ分光学的技術を用いてもよい。
決定される吸収特性は、ホスホジエステル基の対称および逆対称伸縮モード(stretching modes)の領域、Ｃ-Ｏ伸縮モード、ＣＨ2曲げモード(bending mode)、並びにアミドIおよびIIバンドにおける特性とすることができる。分析される吸収特性は、例えば核酸のホスホジエステル基、例えば脂肪アシル基またはグリコーゲンバンド、炭水化物のＣＯＨ基、Ｃ-Ｏ基等の、シグナル分子または基の官能基振動、または検体中に存在する脂質分子によるものとすることができる。
血液および体液成分としては、これに限定されるわけではないが、血液または体液から誘導もしくは調製された、単一もしくは混合された細胞集団、単一の単純な生化学成分、もしくは生化学成分の複合混合物を挙げることができる。
この調査は、全血または他の体液、もしくはこれらの成分の抽出物に対して行うことができる。この成分は、例えばリンパ球、赤血球または血小板とすることができる。
本発明の方法は、細胞機能または細胞機能における変化の決定に特に適用される。
従って、さらなる態様では、本発明は細胞の細胞機能または細胞機能における変化を決定する方法を提供するものであって、この方法は、
細胞または細胞の成分のサンプルを活性化剤と接触させること；
細胞のサンプルに赤外光のビームを向けること；
少なくとも一つの範囲の周波数におけるサンプルの赤外線吸収を分析すること；および
活性化剤による細胞の活性化によって、少なくとも一つの変化が吸収特性に起こったかどうかを確かめ、前記変化から細胞機能または細胞機能における変化を決定するか、あるいは細胞の成分の変化を細胞機能の変化と関連づけること
を含む。
決定された細胞機能は、細胞の生存力、完全性または機能状態の指標のようなあらゆる機能とすることができる。機能状態は免疫能力であってもよい。
本発明の方法に用いられる細胞は、リンパ球または赤血球から選択することができる。好ましくは、前記細胞はリンパ球である。
リンパ球は、例えば密度勾配遠心またはマグネティックビーズの使用等の適切なあらゆる技術による抗凝固末梢血液の精製によって単離してもよい。
活性化剤は、生物学的または非生物学的薬剤とすることができる。これらの薬剤は、天然に由来するものであっても合成によるものであってもよい。これらの生物学的または非生物学的薬剤の例は以下のものを含むが、これらに限定されるわけではない：
ａ）多くのリンパ球を刺激または活性化し、感作宿主を必要としない非特異的薬剤であるマイトジェン。マイトジェンは無数の生物化学的事象およびリンパ球の究極的な分裂を引き起こす。マイトジェンの例は、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン、ブドウ球菌タンパク質Ａ(Staphylococcus Protein A)、ポークウィードマイトジェン(pokeweed mitogen)、ホルボールミリステートアセテートおよびストレプトリシンＳを含む。
ｂ）感作宿主を有し、例えば問題の抗原に特異的に感作されたあるいは感作されるＴまたはＢリンパ球または他の免疫担当細胞等の特定の細胞を刺激する、潜在的な抗原または以前に遭遇した抗原。抗原は、以下のものを含むが、これらに限定されるものではない：
ｉ）天然由来、合成もしくは遺伝子操作された、生きている、減弱した、あるいは死んでいる微生物もしくは微生物の成分または生成物であって、例えばカンジダ抗原、ストレプトキナーゼ、破傷風毒素、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルス等の細胞表面リポポリサッカリドまたは毒素。
ii）細胞表面成分を含む、天然由来、合成的誘導もしくは遺伝子操作された、植物、動物から誘導された細胞、細胞成分または生成物。このカテゴリーに含まれるものは、細胞上に提示されたあるいは細胞から単離された抗原であって、組織適合性抗原、ＡＢＯ血液群抗原、ウイルス誘発性細胞成分もしくは表面マーカー、細胞発達または分化マーカー、腫瘍誘発性または腫瘍特異的成分、並びにハプテンまたは分子であって、細胞に結合することにより細胞を刺激または活性化するか、あるいは単離された細胞成分に結合することにより細胞刺激または活性化に関連した変化を引き起こすもの。
ｃ）活性化または細胞死を引き起こすリンパ球細胞表面分子に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
リンパ球の活性化／刺激において引き起こされることが知られる動的細胞過程は、活性化されていないリンパ球と比べて活性化されたリンパ球の赤外線スペクトルプロフィールにおける経時的な変化として現れることを見出した。本発明の決定はサンプルのＩＲスペクトルプロフィールを測定して“通常のもの”と比較することによって、あるいは経時的なスペクトルプロフィールの変化を調査することによって行うことができる。
ＩＲスペクトルプロフィールをある期間に渡って二回以上調べ、このスペクトルプロフィールをプロフィールの一つ以上の領域において吸収特性に少なくとも一つの変化が起こったかどうかを決定するために比較してもよい。ある場合には、スペクトルプロフィールの変化が３０分以内に起こり得ることを見出した。
あるいは、サンプルの赤外線スペクトルを取り、標準スペクトルと比較し、プロフィールの一つ以上の領域の吸収特性に少なくとも一つの差異があるかどうかを確かめることによって、前記決定を行ってもよい。
さらに別の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の被験者の免疫能力および／または疾患状態の決定のための方法を提供するものであり、この方法は、前記被験者の血液または他の体液のサンプルを取り、サンプルまたはその抽出物を、任意に刺激剤と接触させた後に、赤外線に当てて、そのＩＲスペクトルプロフィールを作成し、被験者の免疫能力および／または疾患状態の尺度としてリンパ球機能および／または活性化を決定することを含む。
本発明は、血液または赤血球または血小板のような血液成分の経時的な生存能力および機能的完全性並びに貯蔵の状態を調べるために用いてもよい。これは、“新鮮な”材料のプロフィールとＩＲスペクトルプロフィールとを比較し、スペクトルに何らかの差異があるかどうかを決定することにより達成することができる。これは、血液バンク等において特に適用でき、本発明は、貯蔵された血液の生存能力および機能的完全性を決定するのに比較的速い方法を提供する。
本発明の理解を助けるために、以下の非限定的な実施例を提供する。
実施例１
リンパ球活性化のＦＴＩＲモニタリング
勾配混合物(gradient mixtures)を用いて単離した、二人の志願者の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ(Peripheral blood mononuclear cells)）を０．９％生理食塩水中で二度洗浄し、遠心分離した。得られたペレットを１ｍｌの生理食塩水中に再懸濁した。各サンプルの半分のうちの一方をホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を用いて活性化し、他方の半分をコントロールとして用いた。１５分後、これら４つを乾燥させ、ＦＴＩＲ微量分析用の赤外線セルに移した。それぞれのサンプルに対し、６つのスペクトルを記録した。
両志願者の活性化および非活性化リンパ球の高精度で、再現性の高いスペクトルが得られた。活性化リンパ球のスペクトルは、非活性化リンパ球のスペクトルとは顕著な差異を示した。活性化リンパ球のスペクトルは、α-ヘリックスアミドＩバンドにおける減少と、１６３４ｃｍ-1におけるアミドＩβ-プリーツシート成分に関連するバンドにおける増大によって特徴付けられる。アミドIIバンドは、タンパク質高次構造の変化に関連するβターンを示す肩ピークの多さを示す。脂肪アシル基のＣ−Ｏストレッチ(stretch)（１４００ｃｍ-1）、および１０５８ｃｍ-1と１０３８ｃｍ-1におけるグリコーゲンバンドのＣ−Ｏストレッチは、活性化リンパ球において非常に強烈であった。１２９５ｃｍ-1におけるバンドは、非活性化細胞の１２８６ｃｍ-1からシフトしたものであると思われる。
これらのＰＭＡ試験の結果は、リンパ球の初期同種異系活性化(the initial allogeneic activation)を検出するのみではなく、免疫応答の引き金を引くことに関連した分子情報の財産を提供するというＦＴＩＲ分光学の潜在能力を示す。
実施例２
二人のＨＬＡ異種志願者（ＬとＰ）からの血液を、０．９％生理食塩水で希釈した。１０ｍｌのLymphoprepTMを、希釈した血液の下方に注意深く重層し、そのチューブを２３００ｇで１５分間遠心した。得られたリンパ球層を分離し、二度洗浄し、遠心分離し、最後に２ｍｌの等張生理食塩水に再懸濁した。一定分量を各チューブから回収し、９つのエッペンドルフチューブ中で混合し、さらにＰから９つ、Ｌから９つを別のエッペンドルフチューブに移し、コントロールとした。リンパ球を２６００ｇで５分間遠心し、３７℃のインキュベーターに移した。０〜１８０分において、混合したもの、ＬおよびＰのチューブから１００μＬ分量を赤外線セルのウェルに移し、急速に乾燥させた。得られた薄いペレットをＦＴＩＲミクロスコープで分析した。二人のＨＬＡ同一の双子の血液を用いて、正確に同じ方法でＩＲスペクトルを得た。５０％のＨＬＡの差異を有する二人の血液を、インキュベーション培地として等張生理食塩水の代わりに組織培養成長培地を用いること以外は同じ方法で処理した。
５分後（図１参照）スペクトルプロフィールには何ら明確な変化が見られなかった。１５分後には１２３８ｃｍ-1と１０８６ｃｍ-1においてリン酸バンドに増大が見られ、３０分後には急激なスペクトル変化が観察された。アミドIIバンドは減少し、タンパク質高次構造変化に関連したβターンを示す肩ピークがより明白になった。脂肪アシル基のＣ−Ｏストレッチからの１３９３ｃｍ-1におけるバンドは劇的に増大し、１２８６ｃｍ-1における鋭いバンドが現れた。ＰＭＡ活性化リンパ球は、１２９５ｃｍ-1において類似するバンドを備えたスペクトルを生じた。最も顕著な特徴は、炭水化物／ホスホジエステル領域（１２００−１０００ｃｍ-1）において観察され、１００４ｃｍ-1と１０５８ｃｍ-1における炭水化物のＣ−Ｏストレッチに関連するバンドにおいて劇的な増大を伴う。この特徴は、ＰＭＡで活性化されたリンパ球のスペクトルにおいても観察され、表面の糖タンパク質の増大を反映するのかもしれない。６０分後、スペクトルプロフィールは、３０分後のプロフィールとまだ類似しているが、後者のサンプルではこれらの変化が劇的であり、活動していない期間を示している。
５０％のＨＬＡの差異を有する個人については、上記スペクトルとほぼ同じスペクトル変化が生じたが、ずっと長時間遅れた後（５５分）に起こった。これらの変化は、ＨＬＡの差異を有する個人のスペクトルにおけるものと類似した長さを示した。この結果は、何らかのＨＬＡ対立遺伝子を共有する個人の同種異系(allegenaic)の刺激スペクトルがより長い時間間隔をおいて活性化を示唆するスペクトル変化を示すことを暗示する。この暗示は、理論的にリンパ球活性化時間を増すインキュベーション培地として、生理食塩水の代わりに組織培養培地の使用を介しても支持される。
ＨＬＡの同じ兄弟の同種異系の刺激を受けたリンパ球の時間的に連続した赤外線スペクトルは、１８０分間以上もの間、リンパ球活性化を示唆する変化を一つも示さないが、このことは、適切な免疫対立遺伝子を有する個人の同種異系の刺激赤外線スペクトルが活性化を示唆するスペクトル変化を示すのに、より長いインキュベーション時間を要するという仮設を支持する。ＨＬＡ同一の双子の場合には、この様な変化を観察することは期待しないが、より長時間の連続した研究によって、この仮設を確認することができるだろう。これらの予備的な結果は、組織移植の分野において適切なプロトコルに革命的変化を起こすというＩＲ分光学の潜在能力を証明する。赤外線スペクトルから利用できる化学的情報は、活性化の生物化学を解明することも助けるだろう。
【図１】
0003712132.tif 000002