(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）蛍光標識としてＮＢＤを備えた炭素数８〜２０の鎖長を有する飽和または不飽和の脂肪酸を、アルコール溶液中で室温において塩基を添加して、２,３−エポキシプロパノールと反応させてＮＢＤ−モノアシルグリセリドを生成させ、
ｂ）このＮＢＤ−モノアシルグリセリドをリン脂質としてのホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルイノシトールと共に１：１０〜１０：１mg／mlの比で超音波処理に供してミセル又は小嚢を形成することにより生成される、
電荷転移複合体に基づく黄色から赤色への変色により認識可能な基質。
【請求項２】
脂肪酸が炭素数１２の飽和カルボン酸である、請求項１に記載の基質。
【請求項３】
ＮＢＤ−モノアシルグリセリドが式Ｉ：
【化２】
0003712232.tif 000015
の化合物である、請求項１または２に記載の基質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質を用いた複合リン脂質／脂肪構造の完全性の決定方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質を用いたリン脂質／脂肪構造の同定方法。
【請求項６】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質をリパーゼと共にインキュベートし、
ｂ）変色を測定すること
を含む、リパーゼおよびリパーゼ阻害剤の同定方法。
【請求項７】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質をリパーゼと共にインキュベートし、
ｂ）変色度を測定し、
ｃ）活性を確認する
ことを含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性の決定方法。
【請求項８】
前記リパーゼがホルモン感受性リパーゼであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質を試験化合物と共にインキュベートし、
ｂ）細胞毒性化合物および界面活性作用を有する化合物を同定する、赤色から黄色への変色を視覚的／光学的または蛍光測定的に測定すること
を含む、化合物の界面活性作用または細胞毒性の決定方法。
【請求項１０】
ａ）輸送体／輸送体タンパク質をリポソーム中で機能的に再構築し、
ｂ）ａ）により製造されたリポソームを請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質に添加し、変色を肉眼的または光学的に測定すること
を含む、脂質輸送体の活性の決定方法。
【請求項１１】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質、
ｂ）超音波装置、および場合により、
ｃ）変色を肉眼的／光学的および／または蛍光測定的に測定するための装置
を含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤を同定するためのアッセイ用具。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質、
ｂ）超音波装置、
ｃ）変色度を測定するための装置、および
ｄ）吸収または蛍光を測定するための装置
を含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性を測定するためのアッセイ用具。
【請求項１３】
キットの形態にある、請求項１１または１２に記載のアッセイ用具。
【請求項１４】
上記アッセイがリパーゼアッセイである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の基質、および
ｂ）容器
を含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、芳香族物質の配置に助力して例えば複合リン脂質／脂質構造（二重層、単層、集合体、ミセル）のような電荷転移複合体を与える構造を合成蛍光標識アシルグリセリドにより同定するための簡単な連続的試験、およびリン脂質／脂質阻害剤の活性を決定するためのその使用に関する。
【０００２】
リパーゼ、ホスホリパーゼおよび他の脂肪分解酵素は、バイオテクノロジーおよび医学の分野において極めて重要である。ある種の代謝不全において、脂肪組織中で上昇したリパーゼ活性を検出することができ、この上昇した活性は、一部はこの疾患の発生機序の原因であると考えられている。身体のエネルギー予備の大部分は脂肪組織の細胞中に脂肪酸のトリグリセリドとして貯蔵される。インスリンにより引き起こされる本質的な同化過程には、トリグリセリド合成のための物質吸収の刺激および脂肪生成の増加が含まれる。インスリンにより引き起こされるもう一つの重要な過程は、脂肪分解の阻害であり、その異化性ホルモン、主としてカテコールアミンによる過程は、トリグリセリドの加水分解を刺激し、これにより脂肪酸の遊離を誘発する。インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）と結びついた重要な問題は、脂肪細胞の非阻害脂肪分解にその原因があることであり、これはエステル化されていない脂肪酸の血漿中レベルを上昇させる。この考えによれば、脂肪酸は肝臓における糖新生を刺激し、まだ充分には確認されていない分子機構により、骨格筋のグルコース利用を減少させる。事実、脂肪分解阻害剤、例えば脂肪細胞のニコチン酸受容体の作動剤により脂肪細胞中での脂肪分解を抑制すると、血漿中の脂肪酸濃度および糖尿病の動物および患者の上昇した血糖の両者を低下させる。残念ながら、これらの有益な効果は特に著しく顕著ではなく、比較的に短い時間しか持続しない。これは、脂肪分解の速度決定酵素であるホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）が調節機構に介入することにより引き起こされる生理的反対調節に基づくのかもしれない。脂肪分解反応の阻害が、少なくとも脂肪細胞から脂肪酸を遊離させるのを抑制することに関して、改善されたＮＩＤＭＭの治療に導くであろうと推定するのにもっともな理由がある。この場合、好適な阻害剤によりＨＳＬを直接に阻害することは、ＨＳＬの複雑な調節への介入という自明の困難を回避するはずである。
【０００３】
脂肪分解酵素の活性は、伝統的には放射測定法、滴定法、酵素法または蛍光測定／光度測定法を用いて調査される。放射測定法は最も感度が良いが、高価な放射標識基質を必要とし、不連続的であり、放射性標識生成物から放射性標識基質を分離しなければならない。このような分離はしばしば面倒であり、放射性廃棄物の回避／低減は重要性を増している（特に試験数が多い場合に当てはまる）。
【０００４】
滴定試験は連続的であり、天然基質および合成基質の両者を用いて実施できるが、かなり低い感度にたびたび苦しめられ、プロトンの放出量に影響を与える状態では影響を受けやすい。
【０００５】
脂肪分解反応産物の一つ（例えばグリセロール）を検出するための酵素法またはクロマトグラフ法は極めて感度が高く、比較的に適切なものであるが、実際に酵素法／クロマトグラフ法で検出する前にリパーゼ反応のインキュベーションバッチを処理することが必要なので、同様に取り扱いの点で複雑である。酵素試験のカップリングは終点測定（「タイムストップ」測定）しか許容しない。さらに未知物質の研究（例えば潜在的阻害剤の探索）において、酵素に対する検出反応の影響を原則として除外することができず、それ故に適切なコントロールを必要とする。
【０００６】
これらの考慮により蛍光測定／光度測定法の開発が促進された。これらは原則として放射測定法の感度があるが、発蛍光団または発色団で修飾された合成基質またはサンプルを必要とする。伝統的な蛍光測定／光度測定法は放射測定手法と同様に、進行が不連続的であり、生成物から基質を分離することが必要である。最近、連続的な蛍光測定／光度測定アッセイが開発され (S. Hendrickson, Analyt. Biochem 219 (1994) 1-8)、これは基質と比較した、生成物の蛍光極大または吸光極大のシフトに基づいている。しかしながらこれら全ての方法は、ホスホリパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、コレステロールエステラーゼ、スフィンゴミエリナーゼおよびグルコシルセラミドグルコシダーゼの検出に限られている。トリグリセリド切断酵素（例えばホルモン感受性リパーゼ、モノグリセリドリパーゼ、ジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、膵臓リパーゼ、肝臓リパーゼ、細菌リパーゼ、ＰＬＡ2、ＰＬＣ、コレステロールエステラーゼ）の連続的活性測定に適する発蛍光団／発色団基を有する基質は、まだ知られていない。
【０００７】
それ故に本発明の目的は、芳香族物質の配置に助力して例えば複合リン脂質／脂質構造（二重層、単層、集合体、ミセル）のような電荷転移複合体を与える構造を合成蛍光標識アシルグリセリドにより同定するための簡単な連続的試験、およびリパーゼのような脂質結合タンパク質の活性を決定する方法を開発することである。
【０００８】
脂質輸送体は、脂質を認識するがリパーゼのようには切断せず、その代わりに生物学的膜を通して輸送するタンパク質である。ここでリパーゼとは、例えば R.D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110 (1998) 1694-1720 において定義されているような、生物学的に関連する内因性リパーゼを意味すると理解される。
【０００９】
ホルモン感受性酵素とは、その活性がリン酸化依存性の第二メッセンジャー（例えばｃＡＭＰ）により影響を受けるか、またはホルモンのコントロール下にある他のアロステリック機構（例えばタンパク質-タンパク質相互作用）により影響を受ける酵素を意味すると理解される。ｃＡＭＰレベルを調節するホルモンは、例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、グルカゴンおよびインスリンである。
【００１０】
本発明は、
ａ) 蛍光標識を備えた脂肪酸を、アルコール溶液中、例えばＣ1〜Ｃ4−アルカノール、好ましくはメタノールなどの中で、室温において、塩基、例えば非親核性無機塩基、好ましくはアルカリ金属炭酸塩およびアルカリ金属Ｃ1〜Ｃ4−アルカノレート、特に好ましくはメタノレート、例えばナトリウムメタノレートまたはカリウムメタノレートを添加して、2,3-エポキシプロパノールと反応させてモノアシルグリセリドを生成させ、
ｂ) このモノアシルグリセリドをリン脂質と共に１：１０〜１０：１、好ましくは１：２〜３：１、特に好ましくは１：１〜１.５：１の比（mg／ml）で超音波処理に供し、これから、黄色から赤色への変色により認識可能な基質を生成させること
を含む、基質の製造方法に関する。
【００１１】
蛍光標識とは、光で励起した後にそれ自体が光を発することが可能である分子内の化学基と定義される。ここで、このような基は、約１nMの最低濃度でもなお基質自体が検出可能である基質を製造するために用いられる。例えばＮ,Ｎ−ジメチルアミノスルホン酸（dansyl、ダンシル）またはＮＢＤ、好ましくはＮＢＤを挙げることができる。
【００１２】
脂肪酸とは、例えば、飽和または不飽和であり、Ｃ-８〜Ｃ-20の鎖長を有する長鎖カルボン酸、好ましくは飽和または不飽和Ｃ-12、Ｃ-14、Ｃ-16およびＣ-18カルボン酸、特に好ましくは飽和Ｃ-12カルボン酸を意味すると理解される。
【００１３】
蛍光標識を備えた脂肪酸を、2,3-エポキシプロパノールを用いてモノアシルグリセリドと結合させた。この合成基質およびリン脂質、例えばホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンの各単独または一緒から、場合により１０：１〜１：１０、好ましくは３：１〜１：３、特に好ましくは２：１の重量比において、例えば約１〜１０分間、好ましくは１〜６分間、特に好ましくは４分間持続する超音波処理により、調査すべきリパーゼの基質として役立つミセルまたは小嚢を形成した。ミセルまたは小嚢中へのこの取り込みは、この構造において空間的に近接している芳香族物質の電荷転移複合体に基づいて、黄色から赤色への変色を伴う。リパーゼと共にインキュベートすると、脂肪酸が除去されることになり、標識脂肪酸およびグリセロールが遊離される。
【００１４】
リン脂質として、例えばホスファチジルコリン（６mg）およびホスファチジルイノシトール（６mg）をクロロホルム（各１ml）に溶解する。基質を製造するために、２部のホスファチジルイノシトール溶液（例えば８３.５μｌ）および１部のホスファチジルコリン溶液（例えば４１.５μｌ）および１００μｌのＮＡＧ溶液（１mlのクロロホルム中１０mg）をピペットで一緒にする（試験における最終濃度：０.０３７５mgのリン脂質／ml；０.０５mg／ＮＡＧ／ml）。クロロホルムを除去した後、２０mlの２５mM tris／ＨＣｌ、ｐＨ７.４；１５０mlのＮａＣｌを添加し、超音波プローブ（Branson Sonifier タイプ II、標準マイクロチップ、２５Ｗ）を用いて、二通りの超音波処理を行う。第一処理：セッティング２、２×１分、合間にそれぞれ氷上で１分；第二処理：セッティング４、２×１分、合間にそれぞれ氷上で１分。この手順の間に、基質溶液の色は、小嚢／ミセルのリン脂質分子間にＮＡＧが介在するために、黄色（吸光極大４８１nm）から赤色（吸光極大５５０nm）に変わる。
【００１５】
遊離脂肪酸はミセルまたは小嚢を形成しない。それ故に赤色から黄色への変色はミセル／小嚢から脂肪酸が除去される間に観察される。こうしてミセル／小嚢の破壊、従ってリパーゼの酵素活性の破壊を、赤色から黄色への変色により視覚的に（４８１nmまたは５５０nmにおいて）、キュベット光度測定器（例えば Beckman (Munich) からの DR-640）またはマイクロタイタープレートリーダー（例えば Wallac (Turku, Finland) からの Microβeta）を用いて、あるいはその代わりにホスホ装置（例えば Molecular Dynamics (Krefeld) からの Storm 840）、蛍光スキャナー（例えば Shimazu (Osaka, Japan) からの DA-2）を用いて、またはＣＣＤ（チャージ−カップルド装置）（この装置は電気信号および光学的信号を処理するための集積回路を有し、この装置では情報が貯蔵され電荷の形態で伝達される）に基づくイメージ分析方法（例えば Molecular Devices (USA) からの ArrayScan）を用いて、蛍光測定法により、測定することができる。
【００１６】
これら全ての方法は、好ましくは高速処理スクリーニング（ＨＴＳ）と組み合わせて採用される。この概念に基づく他の方法は、化合物の細胞毒性および界面活性剤の作用の測定である。
【００１７】
本発明はまた、上記方法により製造された基質、ならびに芳香族物質の配置に助力して電荷転移複合体を与える構造の同定方法に、好ましくはリン脂質／脂質構造、特に好ましくは上記のようなリパーゼ／リパーゼ阻害剤の同定方法に使用するための基質の使用に関する。この方法は、単層または二重層構造［これらの構造は湾曲している（例えばミセルまたは小嚢）か、または平面的である（例えば人工的に作成されたまっすぐな二重層）］の破壊であって変色を伴う破壊にも使用することができる。変色は、上記のように視覚的／光学的に、または蛍光測定法により測定可能な手段で監視することができる。
【００１８】
本発明はさらに、１２−アミノラウリン酸を、アルコール溶液中で室温において塩基、例えばアルカリ金属炭酸塩およびアルカリ金属Ｃ1〜Ｃ4−アルカノレート、好ましくはメタノレート、例えばナトリウムメタノレートまたはカリウムメタノレートを添加して、最初に７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールと反応させ、次いで得られた中間体を２,３−エポキシプロパノールと反応させることによる、モノアシルグリセリドである１２−（７−ニトロベンゾ−［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ)-ドデカン酸 ２,３−ジヒドロキシプロピルの製造方法、およびモノアシルグリセリドである１２−（７−ニトロベンゾ−［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカン酸 ２,３−ジヒドロキシプロピルそれ自体に関する。
【００１９】
本発明の目的は、
ａ) 上記のように基質を製造し、
ｂ) この基質をリパーゼ（例えばホルモン感受性リパーゼ、モノグリセリドリパーゼ、ジグリセリドリパーゼ、トリグリセリドリパーゼ、リポタンパク質リパーゼ、膵臓リパーゼ、肝臓リパーゼ、細菌リパーゼ、ＰＬＡ2、ＰＬＣ、コレステロールエステラーゼなど、好ましくはホルモン感受性リパーゼおよび膵臓リパーゼ、特に好ましくはホルモン感受性リパーゼ）と共にインキュベートし、
ｃ) 変色を、例えば視覚的／光学的または蛍光測定的に測定すること
を含む、リパーゼ／リパーゼ阻害剤（その存在が変色を生じさせる）の同定方法によって達成される。
【００２０】
本発明はさらに、上記方法により同定されたリパーゼおよびリパーゼ阻害剤に関する。
本発明は同様に、上記のような基質を製造し、この基質をリパーゼと共にインキュベートし、赤色から黄色へ、または逆に黄色から赤色への変色度を測定し、例えば光度測定器での吸光度測定または蛍光測定器での蛍光測定により活性を確認する、リパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性の測定方法に関する。
【００２１】
典型的な反応は、例えば１.５ml エッペンドルフ容器または９６穴プレートにおいて、３０℃で６０分間行われる。１０μｌの試験物質（例えばＨＳＬの阻害剤）を、１６.６％のＤＭＳＯの存在下にアッセイ用緩衝液（２５mM tris／ＨＣｌ、ｐＨ７.４；１５０mM ＮａＣｌ）に導入する。１８０μｌの基質溶液（アッセイ用緩衝液中の２０μｇ／mlのホスファチジルコリン、１０μｇ／mlのホスファチジルイノシトール、５０μｇ／mlのＮＡＧ）を添加する。３０℃で１５分間のプレインキュベーションの後、アッセイ用緩衝液中の２０μｌのＨＳＬをピペットで添加し、直ちにキュベット光度測定器（０.５mlキュベット）またはマイクロタイタープレートリーダーで４８１nmにおいて吸光度を測定する（上記参照）。あるインキュベーション時間（これは可変であり、選択された酵素濃度に依存し、２〜２４０分間であってよい）、この場合は３０℃で６０分間のインキュベーションの後、吸光度を再び測定する。黄色領域、この場合は４８１nmにおける吸光度の増加は、酵素活性の尺度である。
【００２２】
リパーゼ阻害剤を同定するための、またはリパーゼ／リパーゼ阻害剤の活性を測定するためのアッセイ系もまた、本発明の主題である。これらの系は上記のような基質、超音波装置および場合により赤色から黄色への変色を視覚的／光学的および／または蛍光測定的に測定するための装置、または上記のような基質および超音波装置に加えて、変色度を測定するための装置および吸収または蛍光測定のための装置を含む。
【００２３】
アッセイ系はキットの形態で存在することもでき、アッセイはリパーゼアッセイである。
キットは、場合によりアッセイ用緩衝液中の上記のような基質、および試験を行うための容器、例えばエッペンドルフ容器またはマイクロタイタープレートなど、好ましくはマイクロタイタープレートを含む。
【００２４】
本発明の他の主題は、上記のような基質およびホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼＡ2（ヘビ毒から）またはホスホリパーゼＣ（バチルス・セレウス）を含む、分子の輸送／転移系の測定方法、化合物の界面活性作用の測定方法または化合物（医薬など）の細胞毒性の調査方法に関する。
【００２５】
輸送体／転移タンパク質とは、それら自体が炭水化物、脂質およびタンパク質のような主要栄養素を認識し、生物学的膜を通してこれらを輸送するか、またはこれらをある生物学的膜から別の膜に転移させるタンパク質を意味すると理解される。輸送体／転移タンパク質、例えばラット回腸から単離されたものは、リン脂質小嚢（リポソーム）中で機能的に再構築される（プロテオリポソーム）か、または可溶性ポリペプチドとしてのリポソームと共にインキュベートされ、次いで上記のようなリン脂質およびＮＢＤ−グリセリドの混合物に添加され、超音波で処理される。ＮＢＤ−グリセリドが輸送体によりＮＢＤ-グリセリド含有ミセル／小嚢からプロテオリポソームの内腔中へ、または転移タンパク質によりリポソームの膜中へ輸送される過程または転移される過程は、ミセル構造の溶解／破壊を引き起こし、次に上記のように光度測定的または蛍光測定的に監視することができる。
【００２６】
化学的化合物の界面活性作用はミセル／小嚢の直接の破壊に基づいている。生物学的膜もこのようにして構築されるので、このような化合物は通常細胞毒性である。ミセルの破壊は、本発明の方法を用いて上記の変色により容易に検出することができる。
【００２７】
合成：
少数のＮＢＤ−標識脂肪酸、例えば１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸（１）は確かに市販されているが、高価である。最初の実験は市販の材料を用いても行ったが、１２−アミノラウリン酸と４−クロロ−７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾールとをメタノール中で反応させることにより、化合物（１）を良好な収率で得ることができた。
【００２８】
化合物１〜９のリスト
【化１】
0003712232.tif 000002
【００２９】
（１）を２,３−エポキシプロパノール（２）に親核付加させることにより、モノアシルグリセリド（３）を良好な収率で得ることができた。次いで化合物（３）を、トリグリセリド（４）および（５）を得るためにアシル化した。ジアシルグリセリド（６）は、（１）をパルミチンでエステル化することにより得られた。この化合物を同様に反応させて相当するトリアシルグリセリド（７）を得た。グリセロールジエーテル（８）を反応させるために同じ方法を用い、二つのアシル基が長鎖エーテルで置き換えられたプソイドトリアシルグリセリド（９）を得た。
【００３０】
合成した全ての化合物は、リパーゼ、好ましくはＨＳＬの基質であることが判明したが、かなりの活性差を示した。リパーゼの「最良の」基質は、モノアシルグリセリド（３）であることが判明した。化合物（４）、（５）、（６）および（７）におけるように、他のアシル基の導入は活性の低下を引き起こした。
【００３１】
これは、ＮＢＤアシル基の除去において新たに導入されたアシル基と競争することによって容易に説明できる。この仮説を確認するために、二つのアシル基がヘキサデシルエーテル単位で置き換えられたプソイドトリアシルグリセリド（９）を合成した。これらの単位はリパーゼから除去することができないので、ＮＢＤ脂肪酸エステルと競争しないはずである。生物学的試験において、この化合物は基質であるが活性が低いことが、実際に判明した。明らかに、触媒領域に加えて、リパーゼは、脂肪酸単位の付加が妨げられるように長鎖エーテル基に接近可能な延長した疎水性結合領域を有する。
【００３２】
モノアシルグリセリド（３）はリパーゼの良好な基質であることが判明したので、１位または３位に対する部位選択的優先性があるかどうかを調査した。この調査のために、エナンチオマー部位異性体（３ａ）および（３ｂ）を合成した。
【００３３】
エナンチオマー（３ａ、ｂ）の合成は、ジシクロヘキシルカルボジイミド活性化によりＮＢＤ−標識脂肪酸（１）でエステル化された D-およびＬ−１,２−Ｏ−イソプロピリデングリセロールから出発する。１Ｎメタノール性ＨＣｌを用いて保護基を除去した。両化合物は同一の生物学的活性を示し、エナンチオマー的に純粋な化合物の使用は何の利益もないようであった。
【００３４】
１．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸（１）：
３０％濃度のナトリウムメタノレート溶液（１４.５ml，７６mmol）を、ＭｅＯＨ（３００ml）中の１２−アミノラウリン酸（１８ｇ，８３.７mmol）の溶液に撹拌しながら加える。５分後に反応混合物は透明になり、ＭｅＯＨ（３００ml）中の７−クロロ−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアソール（１５ｇ，７５mmol）の溶液を加える。反応混合物（これはすぐに暗色になる）を２５℃で１８時間撹拌する。次いで１Ｍメタノール性ＨＣｌ（１００ml，１００mmol）を加え、溶剤を真空留去する。残留物をＭｅＯＨに吸収させ、この混合物をシリカゲルを通して濾過し、濾液を蒸発乾固し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。（１）が赤色固体として得られる（２６.４ｇ，９３％）。
RF: 0.16 (1:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.35(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 3.48(dt, 2H, CH2NH2), 2.36(t, 2H, CH2COOH), 1.9-1.2(m, 18H, 9CH2)
MS (ESI-MS) 379.2 (M+1)
【００３５】
２．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,３］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 ２,３−ジヒドロキシプロピル（３）：
イソプロパノール（５０ml）中の化合物（１）（１２ｇ，３１.７mmol）の溶液を５０℃で１６時間撹拌する。溶剤を真空留去し、残留物を０.０１トルで乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ジイソプロピルエーテル、エーテル、ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（３）が赤色油として得られる（１０.３ｇ，７１.８％）。
RF：0.18 (1:1 のトルエン／ＥｔＯＡｃ)；RF：0.5 (30:5:1 のCH2Cl2−MeOH−NH3)、これはEtOAc／ジエチルエーテルから結晶化する。
1H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.35(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 4.19(dd, 2H, H-1, H-1′), 3.94(m, 1H, H-2), 3.65(dd, 2H, H-3, H-3′), 3.48(dt, 2H, CH2NH2), 2.35(t, 2H, CH2COOH), 1.8(m, 2H, CH2), 1.6(m, 2H, CH2), 1,27-1,15(m, 14H, 7CH2)
MS (ESI-MS) 453.4 (M+1)
【００３６】
３．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 (Ｓ)−２,２−ジメチル［１,３］ジオキソラン−４−イルメチル（９ａ）：
ＣＨ2Ｃｌ2（２ml）中の化合物（１）（６０mg，１５９μmol）の溶液をジシクロヘキシルカルボジイミド（１６０mg，７７０μmol）で処理し、２５℃で３０分間撹拌する。次いでＣＨ2Ｃｌ2（２ml）中の(Ｒ)−（２,２−ジメチル［１,３］ジオキソラン−４−イル）メタノール（１００mg，７６０μmol）およびジメチルアミノピリジン（９４mg，７７０μmol）を加え、反応溶液を２５℃でさらに４時間撹拌する。溶剤を真空留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１５：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（９ａ）が黄色蛍光性油として得られる（４６mg，５８％）。
RF: 0.29 (4:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (CDCl3): δ 8.5(d, 1H, 芳香族), 6.2(m, 1H, NH), 6.16(d, 1H, 芳香族), 4.31(m, 1H), 4.1(m, 3H), 3.73(dd, 1H), 3.48(dt, 2H, CH2NH2), 2.35(t, 2H, CO-CH2), 2.0-1.2(m, 18H, 9CH2), 1.42(s, 3H, CMe2), 1.37(s, 3H, CMe2)
【００３７】
４．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 (Ｒ)−２,２−ジメチル［１,３］ジオキソラン−４−イルメチル（９ｂ）：
化合物（９ｂ）は化合物（９ａ）について記載したようにして製造する。化合物（９ｂ）が黄色蛍光性油として得られる（５１.４mg，６５％）。
RF: 0.29 (4:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.2(m, 1H, NH), 6.16(d, 1H, ArH), 4.31(m, 1H), 4.1(m, 3H), 3.73(dd, 1H), 3.48(dt, 2H, CH2NH2), 2.32(t, 2H, CO-CH2), 2.0-1.2(m, 18H, 9CH2), 1.42(s, 3H, CMe2), 1.37(s, 3H, CMe2)
【００３８】
５．１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 (Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロピルおよび１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 (Ｒ)−  ２,３−ジヒドロキシプロピル（３ｂ）：
メタノール性ＨＣｌ（１Ｍ，２００μl）を、メタノール２５ml中の化合物（９ａ）１３.９mg（２８.２μmol）または化合物（９ｂ）１７.８mg（３６.１μmol）の溶液に加え、この混合物を２５℃で１.５時間撹拌する。溶剤を真空留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２：１, １：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。脂肪酸エステル（３ａ）および（３ｂ）がそれぞれ１０.５mg(８２％）および９.３mg（５７％）の収量で得られる。
1H-NMR (CDCl3) データおよびマススペクトルは化合物（３）と同一である。
【００３９】
６．酢酸 ２−アセトキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピル（４）：
化合物（３）（１２mg, ２６.５μmol）を２：１のピリジン／無水酢酸（３ml）中でアセチル化する。８時間後、この混合物を蒸発乾固し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（１：２のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（４）が黄色蛍光性油として得られる（１３mg, ９１％）。
RF: 0.66 (1:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.3(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 5.24(m, 1H), 4.92(m, 1H), 4.34(m), 4.28, 4.16,3.48(dt, 2H, CH2NH2), 2.32(CH2COO), 2.1(2s, 6H, 2OAc), 2.0-1.0(m, 18H, 9CH2)
MS (ESI-MS): 537.4 (M+1)
【００４０】
７．ヘキサン酸 ２−ヘキサノイルオキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピル（５）：
無水ヘキサン酸（１００μl）をピリジン（３００μl）中の化合物（２）（５mg, １１μmol）に加え、反応混合物を２５℃で１６時間放置する。溶剤を真空留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー （９：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（５）が黄色蛍光性油として得られる（１.８mg, ２５％）。
RF: 0.73 (1:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.25(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 5.26(m, 1H, H-2), 4.29(dd, 2H, H-3, H-3′), 4.15(dd, 2H, H-1, H-1′), 3.46(dt, 2H, CH2NH2), 2.34(t, 6H, 3CH2COO), 1.63-1.2(m, 12H, 6CH2), 0.88(m, 6H, 2CH3)
MS (ESI-MS): 649.5 (M+1)
【００４１】
８．ヘキサデカン酸 ２−ヒドロキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピル（６）：
ＣＨ2Ｃｌ2（５ml）中の化合物（１）（２５mg, ６６μmol）、４−ジメチルアミノピリジン（９mg，７３μｍｏｌ）および１,１−カルボニルジイミダゾール（１５mg, ７３μmol）の溶液を２５℃で３０分間撹拌する。溶剤を真空留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（９：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（６）が黄色蛍光性油として得られる（９.５mg, ２１％）。
RF: 0.25 (5:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ 8.54(d, 1H, ArH), 6.3(m, 1H, NH), 6.19(d, 1H, ArH), 4.20(dd, 2H, H-1, H-1′), 4.15(dd, 2H, H-3, H-3′), 4.12(m, 1H, H-2), 3.5(dt, 2H, CH2-NH), 2.36(t, 4H, 2CH2COO), 1.82(m, 2H, CH2-CH2-NH), 1.63(m, 4H, 2CH2CH2COO), 1.47(m, 2H, CH2-(CH2)2-NH), 1.31-1.26(m, 22H, 11CH2), 1.287(m, 2H,CH2), 1.26(m, 2H, CH2), (m, 4H, 2CH2CH2CH2COO), 1.31-1.26(m, 18H, 9CH2), 1.3(m, 2H, CH2), 1.26(m, 2H, CH2), 0.89(t, 3H, CH3)
MS (ESI-MS): 649.5 (M+1)
【００４２】
９．ヘキサデカン酸 ２−アセチルオキシ−３−［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）−ドデカノイルオキシ］プロピル（７）：
化合物（６）（６mg, ８.７μmol）を、化合物（４）について記載したようにアセチル化し、処理する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（９：１のトルエン／ＥｔＯＡｃ）で精製する。化合物（７）が黄色蛍光性油として得られる（５.１mg, ９５％）。
RF: 0.71 (5:1 トルエン／EtOAc)
1H-NMR (250 MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.25(m, 1H, NH), 6.17(d, 1H, ArH), 5.25(m, 1H, H-2), 4.27(dd, 2H, H-1, H-3), 4.15(dd, 2H, H-1′, H-3′), 3.73(dt, 4H, CH2-NH), 2.3(t, 2H, CH2COO), 2.08(s, 3H, OAc), 1.8(m, 2H, CH2-CH2-NH), 1.6(m, 8H, 4CH2), 1.4-1(m, 32H, 16CH2), 0.85(t, 3H, CH3)
MS (FAB-MS): 739 (M+Li)
【００４３】
10．［１２−（７−ニトロベンゾ［１,２,５］オキサジアゾール−４−イルアミノ）ドデカン酸 ２，３−ビス−オクタデシルオキシ−プロピル（８）：
２,３−ビス−オクタデシルオキシプロパン−１−オール（５mg, ８.３７μmol）を、ＣＨ2Ｃｌ2中の化合物（１）（３mg, ７.９μmol）、ジメチルアミノピリジン（５mg, ４１μmol）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（５mg, ２４μmol）の溶液に加える。反応混合物を２５で２時間撹拌し、溶剤を真空留去し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２：１の石油エーテル／ジエチルエーテル）で精製する。化合物（８）が黄色蛍光性油として得られる（３.５mg, ４６％）。
RF：0.55 (３：７のジエチルエーテル／石油エーテル）
MS (FAB-MS)：957.8 (M+1)
【００４４】
酵素の製造：
部分的に精製したＨＳＬの製造：
単離ラット脂肪細胞を、未処理の雄ラット（Wistar, ２２０−２５０ｇ）の精巣上体脂肪組織から、刊行された方法に従ってコラゲナーゼ処理することにより得る。１０匹のラットからの脂肪細胞を、各５０mlの均質化緩衝液（２５ml tris／ＨＣｌ, pH７.４, ０.２５Ｍ蔗糖, １mM ＥＤＴＡ, １mM ＤＴＴ, １０μg／ml leupetin, １０μg／ml antipain, ２０μg／ml pepstatin）で浮遊させることにより３回洗浄し、最後に１０mlの均質化緩衝液中に溶解させる。脂肪細胞を、ガラス入りテフロンホモジナイザー（Braun-Melsungen）中で１５００rpmおよび１５℃において１０ストロークで均質化する。この均質化物を遠心する（Sorvall SM24 チューブ, 5000rpm, １０分, ４℃）。上の脂肪層とペレットとの間の底部層を除去し、遠心を繰り返す。これから生じた底部層を再び遠心する（Sorvall SM24 チューブ, 20,000rpm, ４５分, ４℃）。底部層を除去し、１ｇのヘパリン−Sepharose で処理する（Pharmacia Biotech, CL-6B, ２５mM tris／ＨＣｌ, pH７.４, １５０mM ＮａＣｌで５回洗浄)。４℃で６０分間のインキュベーション（１５分間隔で振盪）の後、このバッチを遠心する（Sorvall SM24 チューブ, 3000rpm, １０分, ４℃）。氷酢酸を加えて上澄み液をpH５.２にし、４℃で３０分間インキュベートする。沈殿を遠心して集め（Sorvall SS34, 12,000rpm, １０分, ４℃）、２.５mlの２０mM tris／ＨＣｌ, pH７.０, １mM ＥＤＴＡ, ６５mM ＮａＣｌ, １３％蔗糖, １mM ＤＴＴ, １０μg／mlの leupetin／pepstatin／antipain に懸濁させる。この懸濁液を２５ml tris／ＨＣｌ, pH７.４, ５０％グリセロール, １mM ＤＴＴ, １０μg／mlの leupetin、pepstatin、antipain に対して４℃で一夜透析し、次いでヒドロキシルアパタイトカラムにかける（１mlの懸濁液当たり０.１ｇ、１０mMリン酸カリウム, pH７.０, ３０％グリセロール, １mM ＤＴＴで平衡化）。カラムを４体積の平衡化緩衝液で２０〜３０ml／ｈの流速で洗浄する。０.５Ｍリン酸カリウムを含む１体積の平衡化緩衝液でＨＳＬを溶離し、次いで透析し（上記参照）、４℃での限外濾過（Amicon Diaflo PM 10 フィルター）で５〜１０倍濃縮する。この部分精製したＨＳＬは -７０℃で４〜６週間貯蔵できる。
【００４５】
ＮＡＧ(ＮＢＤ-モノアシルグリセリド)基質の製造：
６mgのホスファチジルコリンおよび６mgのホスファチジルイノシトールをそれぞれ１mlのクロロホルムに溶解する。１０mgのＮＡＧを１mgのクロロホルムに溶解する。２部のホスファチジルイノシトール溶液（例えば８３.５μl）および１部のホスファチジルコリン溶液（例えば４１.５μl）および１００μｌのＮＡＧ溶液を、ピペットでプラスチック製シンチレーション容器内で一緒にする（試験における最終濃度：リン脂質 ０.０３７５mg／ml；ＮＡＧ ０.０５mg／ml）。クロロホルム（全体積２２５μｌ）をＮ2気流で吹き飛ばして完全に除去する。この乾燥物質は４℃で３日まで貯蔵できる。介在ＮＡＧを有するリン脂質小嚢／ミセルを製造する（試験日）ために、上記乾燥物質をアッセイ用緩衝液（２５mM tris／ＨＣｌ、pH７.４；１５０mM ＮａＣｌ）に溶解させ、超音波プローブ（Branson Sonifier タイプII、標準マイクロチップ）を用いて二通りの超音波処理を行う。第一処理セッティング２、２×１分、各場合に氷上で１分；第二処理セッティング４、２×１分、各場合に氷上で１分。この手順の間に基質溶液の色は、小嚢／ミセルのリン脂質分子間にＮＡＧが介在するため、黄色（吸光極大４８１nm）から赤色（吸光極大５５０nm）に変わる。基質として使用する前（次の２時間以内）、この溶液をさらに１５分間氷上でインキュベートする。
【００４６】
間接的ＮＡＧアッセイ：
このアッセイは、１.５mlエッペンドルフ容器または９６穴プレートで３０℃において６０分間行われる。ＨＳＬの阻害剤を見出すために、アッセイ用緩衝液（２５mM tris／ＨＣｌ、pH７.４；１５０mM ＮａＣｌ）中の１０μｌの試験物質を１６.６％ＤＭＳＯの存在下に導入する。１８０μｌの基質溶液（アッセイ用緩衝液中の２０μｇ／mlのホスファチジルコリン、１０μｇ／mlのホスファチジルイノシトール、５０μｇ／ml ＮＡＧ）を加える。３０℃で１５分間プレインキュベートした後、アッセイ用緩衝液中の２０μｌの酵素溶液（１〜４倍希釈）をピペットで加え、直ちに吸光度を４８０nmにおいてキュベット光度測定器（０.５ml キュベット）で、またはマイクロタイタープレート（microβeta, Wallac）で測定する。３０℃で６０分間インキュベートした後、吸光度を再び測定する。４８０nmにおける吸光度の増加は酵素活性の尺度である。標準的条件下で、２０μｌの部分精製ＨＳＬは４０００ arb. units の吸光度の変化を生じさせる。
【００４７】
直接的ＮＡＧアッセイ：
基質溶液の吸光度の変化を測定する代わりに、ＨＳＬ反応の生成物を相分離／薄層クロマトグラフィーで調査する。このために、インキュベーションバッチ（全体積２００μｌ、間接的ＮＡＧアッセイ参照）を、２mlエッペンドルフ容器中で１.３mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７）と、次いで０.４mlの０.１Ｍ ＮａＯＨと混合する。徹底的に撹拌した後（１０秒間）、遠心（８００×ｇ、２０分、室温）により相分離を開始させる。上の水相から等体積（例えば０.４ml）を取り、吸光度を４８１nmにおいて測定する。薄層クロマトグラフィーのために水相を乾燥し（SpeedVac）、次いで５０μｌのテトラヒドロフランに溶解させる。５μｌのサンプルをシリカゲル Si−60プレート（Merck, Darmstadt）に適用する。７８mlのジエチルエーテル／２２mlの石油エーテル／１mlの氷酢酸を溶離剤として用いてクロマトグラフィーを行う。遊離した蛍光性ＮＢＤ脂肪酸の量を、ホスホ造影法（Molecular Dynamics, Storm 840 および ImageQuant ソフトウェア）により４６０nmの吸光波長および５４０〜５６０nmの発光波長において測定する。
【００４８】
ＴＡＧアッセイ：
基質を製造するために、２５〜５０μＣｉの［3Ｈ］トリオレオイルグリセロール（トルエン中）、６.８μＭの未標識トリオレイルグリセロールおよび０.６mgのリン脂質（ホスファチジルコリン／ホスファチジルイノシトール ３：１w/v）を混合し、Ｎ2上で乾燥し、次いで超音波処理（Branson 250、マイクロチップ、セッティング１−２、１分の間隔で２×１分）により２mlの０.１Ｍ ＫＰｉ（pH７.０）に溶解させる。１mlのＫＰｉを加え、新たに超音波処理（氷上で３０秒の間隔で４×３０秒）した後、１mlの２０％ＢＳＡ（ＫＰｉ中）を加える（トリオレオイルグリセロールの最終濃度１.７mM）。反応のため、１００μｌの基質溶液を１００μｌのＨＳＬ溶液（上記のように製造したＨＳＬ、２０mM ＫＰｉ、pH７.０、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＤＴＴ、０.０２％ＢＳＡ、２０μｇ／mlの pepstatin、１０μｇ／mlの leupeptin 中に希釈）にピペットで加え、３７℃で３０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７）および１.０５mlの０.１Ｍ Ｋ2ＣＯ3、０.１Ｍホウ酸（pH１０.５）を加えた後、このバッチをよく混合し、最後に遠心する（８００×ｇ、２０分）。相分離した後、１等量の上相（１ml）を取り、放射活性を液体シンチレーション測定により決定する。
【００４９】
ＰＮＰＢアッセイ：
１０μｌの酪酸ｐ−ニトロフェニル（ＰＮＰＢ）（アセトニトリル中２mM）、８９０μｌの０.１Ｍ ＫＰｉ（pH７.２５）、０.９％ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴおよび１００μｌのＨＳＬ（上記のように製造、この緩衝液中に希釈）を３７℃で１０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７, w/v）を加え、激しく振盪した後、このバッチを遠心し（８００×ｇ、２０分）、４２℃で３分間インキュベートする。次いで等量の上相を取り、吸収を４００nmにおいて測定する。
【００５０】
トリブチリンアッセイ：
基質を製造するために、５μＣｉの［１−14Ｃ］トリブチリン（トルエン中）を１mlの未標識トリブチリン（アセトニトリル中）に加える。１０μｌのこの基質溶液を、３９０μｌの０.１Ｍ ＫＰｉ（pH７.２５）、０.９％ＮａＣｌ、１mM ＤＴＴ、２％ＢＳＡおよび１００μｌのＨＳＬ（上記のように製造、この緩衝液中に希釈）と共に３７℃で１０分間インキュベートする。３.２５mlのメタノール／クロロホルム／ヘプタン（１０：９：７, w/v）および１mlの０.１Ｍ ＮａＯＨを加えた後、このバッチを激しく混合し、最後に遠心する（８００×ｇ、２０分）、４２℃で３分間インキュベートする。次いで等量（１ml）の上相を取り、放射活性を液体シンチレーショ測定により決定する。
【００５１】
分析：
物質を四つの独立したバッチにおいて普通のように試験する。試験物質によるＨＳＬの酵素活性の阻害を、未阻害コントロール反応と比較することにより決定する。ＩＣ50値を、少なくとも１０種の濃度の試験物質を用いた阻害曲線により計算する。データ分析のために、ソフトウェアパッケージ GRAPHIT, Elsevier-BIOSOFT（version 3.0）を用いる。
【００５２】
【実施例】
実施例１：ＨＳＬによるＮＡＧ切断の動力学
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を表示した量の部分精製ＨＳＬタンパク質と共にインキュベートし（温度制御光度測定器）、４８１nmにおける吸光度を特定の時点で測定する。不活性化のためにＨＳＬを１００℃で１５分間インキュベートした（ｎ＝８、平均±ＳＤ）。
【００５３】
結果：２０μｇのタンパク質量まで、反応は６０分まで線形に進行した。この場合の吸光度の差は０.８〜０.９ＯＤであった。より少ないタンパク質量の場合、線形性は１８０分まで得られた。
【００５４】
【表１】
0003712232.tif 000003
【００５５】
実施例２：ＨＳＬ量に対するＮＡＧ切断の依存性
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を表示した量の部分精製ＨＳＬタンパク質と共に６０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度の増加（ＨＳＬ反応の生成物としての遊離ＮＢＤ脂肪酸の形成＝間接的ＮＡＧアッセイ）または５５０nmにおける吸光度の減少（ＨＳＬ反応の基質としてのＮＡＧの消費）を、反応バッチのアリコートにおいて測定した。その代わりに、他のアリコートをメタノール／クロロホルムで抽出し、有機相中に含まれる遊離したＮＢＤ脂肪酸をＴＬＣ分析および蛍光測定法（ホスホ造影装置 Storm 840, Molecular Dynamics）により測定した（＝間接的ＮＡＧアッセイ）（ｎ＝６、平均±ＳＤ）。
【００５６】
結果：反応は２０μｇのタンパク質量まで、生成物の形成（４８１nmにおける吸光度の増加またはＴＬＣ分析による遊離ＮＢＤ脂肪酸の生成）および基質の消費（５５０nmにおける吸光度の減少）に関して線形に進行した。間接的および直接的ＮＡＧアッセイ間での一致は、間接的アッセイにおけるＮＡＧ切断の分析を支持していた。
【００５７】
【表２】
0003712232.tif 000004
【００５８】
実施例３：基質濃度に対するＨＳＬによるＮＡＧ切断の依存性
種々の量のＮＡＧ（リン脂質に対する比率は一定）を表示した量の部分精製ＨＳＬと共に６０分間インキュベートし、次いで吸光度を４８１nmにおいて測定した（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。
【００５９】
結果：三つの全ての酵素量で、切断率は典型的な飽和曲線の経過を示した。しかしながら、ＨＳＬ反応の酵素的特異性（「二次元的」基質の現出、「界面活性化」）のために、５μｇのタンパク質および最低基質濃度でのみ、ほぼ線形の依存性を測定することができた。２０μｇのタンパク質および０.０５mg／mlのＮＡＧの組み合わせが、基質依存性とシグナル強度（ＯＤ ０.６〜０.７）との間の合理的な妥協であった。
【００６０】
【表３】
0003712232.tif 000005
【００６１】
実施例４：ＮＡＧとリン脂質との比に対するＨＳＬによるＮＡＧ切断の依存性
表示した比のホスファチジルイノシトール対ホスファチジルコリンを有するリン脂質を種々の量（全量）で用いて超音波処理し、次いで部分精製ＨＳＬ（２０μｇ）と共に６０分間インキュベートすることにより、ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を基質として製造した。４８１nmにおける吸光度の増加を測定した（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。
【００６２】
結果：酵素速度は３：１のＰＩ／ＰＣ比（重量による）および０.０３７５〜０.０７５の全リン脂質で最大であった。リン脂質の全濃度およびそれらの組成に関して顕著な最適経路は、リン脂質小嚢および／またはミセル中のＨＳＬの基質（この場合はＮＡＧ）の現出、または基質の（天然）コア上でのリン脂質単層の形成が重要であることを支持していた。
【００６３】
【表４】
0003712232.tif 000006
【００６４】
実施例５：種々の阻害剤に関するＩＣ50値の測定による、間接的／直接的ＮＡＧアッセイと従来のＨＳＬアッセイとの比較
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｌの部分精製ＨＳＬと共に、異なる濃度（０.１〜１００μＭ）の種々の基質の存在下に６０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度をバッチのアリコートにおいて測定した（間接的アッセイ）か、または遊離したＮＢＤ-ＦＡをクロロホルム／メタノールで抽出し、ＴＬＣ分析および蛍光測定法により測定した（直接的アッセイ）。その代わりに、［3Ｈ］トリオレイルグリセロールを部分精製ＨＳＬと共に刊行された条件に従ってインキュベートし、遊離した放射標識オレイン酸エステルをクロロホルム／メタノールで抽出した後に液体シンチレーション測定により決定した。ＩＣ50値を阻害曲線から決定した（ｎ＝６、平均±ＳＤ）。
【００６５】
結果：試験した全ての基質について、三つの方法を用いてＳ字状阻害曲線を測定した。間接的／直接的ＮＡＧアッセイ（４８１nmにおける吸光度の増加／ＮＢＤ脂肪酸の遊離化）において、ＩＣ50値は、ＨＳＬによるトリオレイルグリセリドの切断と比較して一般的に係数４〜１０だけ低かったが；阻害剤の順位（それらのＩＣ50値による）は三つの全ての方法において同一であった。これは、ＨＳＬの阻害作用が基質の性質および基質現出に依存するという刊行された知見を確認するものであった。さらに有効基質濃度（ＮＡＧおよびトリオレイルグリセリド）は二つのアッセイ（小嚢またはミセルとしての基質調製物のために殆ど測定できない）間で異なることもあり、従って競争的阻害剤の場合におけるこれらの差異を説明していた。吸光度およびＮＢＤ脂肪酸の遊離化により測定した、ほぼ一致するＩＣ50値はＨＳＬによりＮＡＧが切断されること、従って４８１nmにおける吸光度の増加に起因してＮＢＤ脂肪酸が遊離することを提案しており、すなわちＮＡＧアッセイにより脂質の脂肪分解的切断が検出された。
【００６６】
【表５】
0003712232.tif 000007
【００６７】
実施例６：間接的ＮＡＧアッセイと、ＴＡＧ、ＰＮＰＢおよびトリブチリンに関するアッセイとの比較
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｇの部分精製ＨＳＬと共に、異なる濃度（０.１〜１００μＭ）の種々の基質の存在下に６０分間インキュベートする。４８１nmにおける吸光度をバッチのアリコートにおいて測定した（間接的アッセイ）。その代わりに、［3Ｈ］トリオレイルグリセロール（ＴＡＧ）、ｐ−ニトロフェニル酪酸（ＰＮＰＢ）または［14Ｃ］トリブチリンを部分精製ＨＳＬと共にインキュベートし、遊離した放射標識オレイン酸エステル、ｐ−ニトロフェノールまたは酪酸エステルをクロロホルム／メタノールで抽出した後に液体シンチレーション測定または分光測定により決定した。ＩＣ50値を阻害曲線から決定した（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。
【００６８】
結果：ＩＣ50値で示された阻害剤の相対的順位は脂質基質（ＮＡＧおよびＴＡＧ）を用いた両方のアッセイで同一であった。これは基本的に、水溶性基質であるトリブチリンおよびＰＮＰＢにも当てはまるが、ＮＡＧおよびＴＡＧと比較してＨＳＬ活性を有意に低下させる幾つかの活性化合物は、トリブチリンおよびＰＮＰＢと比較してＨＳＬの阻害において不活性であった。これは、これらの阻害剤がＨＳＬの脂質結合（脂質結合ドメインによる）で干渉されることによって説明できるが、触媒機構は不利な影響を受けない。それ故に水溶性基質は、これらの阻害剤の存在下でさえもＨＳＬから切断される。水溶性基質の場合でも作用する阻害剤に関するＩＣ50値は、一般的に基質としてのＮＡＧおよびＴＡＧに関するＩＣ50値の間にあった。これは、ＮＡＧが標品トリグリセリドと同様にＨＳＬに対する「脂質様」基質として挙動すること、およびＨＳＬの脂質結合（および触媒機構）をブロックする阻害剤を見出すためにＮＡＧアッセイを採用できることを示していた。
【００６９】
【表６】
0003712232.tif 000008
【００７０】
実施例７：基質安定性に対する種々の界面活性剤および溶剤の影響
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を上昇する濃度の種々の界面活性剤および溶剤の存在下に３７℃で１８０分間インキュベートし、次いで５５０nmにおける吸光度の減少（特異的基質構造の溶解）を測定した（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。
【００７１】
結果：基質（リン脂質小嚢またはミセル）は使用した物質と比較して異なる感度を示した。吸光度（すなわち基質の量）は、１％のＤＭＳＯの存在下で１０％だけ、エタノールまたはメタノールの場合は多くても２０％だけ、１％のＴＸ−100 またはＳＤＳの場合は多くても３０％だけ減少した。ＤＭＦが小嚢／ミセルを溶解するのに最も効果的で、１％で８０％を超えるＮＡＧがリン脂質／小嚢構造から遊離した。基質構造の溶解に用いた溶剤および界面活性剤の効力の順位は、ＮＡＧによるか、あるいは発色団基（ＮＢＤ）がリン脂質小嚢／ミセルの非極性環境中に導入されること、およびこれにより生じる水性環境から該発色団基が除去されることによる吸光極大のシフト（４８１nmから５５０nmへ）と適合した。小嚢／ミセルの溶解（例えば界面活性剤による）によって、水性媒体中でこれらの構造からＮＡＧが遊離するか、またはＮＡＧの脂肪分解的切断（ＨＳＬによる）によってＮＢＤ脂肪酸としての発色団基が遊離すると、５５０nmにおける吸光度の低下、および４８１nmにおける吸光度の上昇を生じさせた。１％のＤＭＳＯにおける安定性について、ＮＡＧ基質はしっかりしたＨＴＳアッセイに対する基本的必要条件の一つを満たした。
【００７２】
【表７】
0003712232.tif 000009
【００７３】
実施例８：ＨＳＬの活性に対する種々の界面活性剤および溶剤の影響
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）をＨＳＬ（２０μｇ）と共に、上昇する濃度の種々の物質の存在下に６０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度を測定した（ｎ＝４、平均±ＳＤ）。
【００７４】
結果：１％までのＤＭＳＯは遊離したＮＢＤ−ＦＡ量を約１０％だけ減少させた。このＤＭＳＯ濃度において１０％までのＮＡＧがこれら構造の溶解によりリン脂質小嚢／ミセルから遊離するので、酵素活性の低下は算術的に２０％となった。０.５％のＤＭＳＯの場合、活性低下はまだ１０％であった。０.１〜１０％のＴＸ−100、アセトン、エタノールおよびメタノールはＨＳＬ活性の上昇を引き起こし、これは多分、より効果的な基質現出により生じたものであった。高濃度においては、これらは活性を干渉した。ＤＭＦは０.１％からの濃度においてさえもＨＳＬ活性の有意な損失をもたらした。
【００７５】
【表８】
0003712232.tif 000010
【００７６】
実施例９：特異性の異なるリパーゼによるＮＡＧの切断
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｇの部分精製ＨＳＬ、ラット脂肪細胞からの７５μｌの部分精製ＬＰＬ、２０mUの細菌リパーゼ、５０mUの膵臓リパーゼ、ヘビ毒からの１００mUのＰＬＡ2およびバチルス・セレウスからの０.５ＵのＰＣ特異的リン脂質と共に６０分間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度の増加を測定した（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。
【００７７】
結果：ＨＳＬに対して与えられた最適化条件において、予想されたように、ＨＳＬ（１００％）およびＬＰＬ（約７０％）が最大活性を示した。細菌および肝臓リパーゼの活性は著しく低い（２５または１％）が、細菌ＰＣ特異的ホスホリパーゼは実際上不活性であった。これらの極めて異なる活性は、ＨＳＬの間接的ＮＡＧアッセイに選択された条件が特異的であることを示しており、従って例えば、おそらく粗製細胞抽出物中に含まれるホスホリパーゼは検出されない。しかしながらこれらのデータは、このアッセイ原理が他のリパーゼに原則的に適用できることも示していた。
【００７８】
【表９】
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【００７９】
実施例１０：ＮＢＤ脂肪酸で変性された種々のアシルグリセリドのＨＳＬによる切断
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）または異なる濃度の種々のＮＢＤ脂肪酸変性脂質を２０μｇの部分精製ＨＳＬと共にインキュベートした。４８１nmにおける吸光度を特定の時点で測定した（ｎ＝５、平均±ＳＤ）。
【００８０】
結果：
【表１０】
0003712232.tif 000012
【００８１】
実施例１１：ジイソプロピルホスホ弗素化物によるＨＳＬの阻害
ＮＡＧ（０.０５mg／ml）を２０μｇの部分精製ＨＳＬと共に、増加する濃度のジイソプロピルホスホ弗素化物の存在下６０分間にインキュベートした。４８１nmにおける吸光度の増加を反応バッチのアリコートで測定した（間接的ＮＡＧアッセイ）か、またはクロロホルム／メタノールで抽出した後に有機相中の遊離したＮＢＤ−ＦＡ量を蛍光測定により測定した（直接的ＮＡＧアッセイ）。その代わりとしては、基質としての［3Ｈ］トリオレイルグリセロールと一緒にＨＳＬのインキュベーションを行い（上記参照）、遊離した放射標識オレイン酸量をクロロホルム／メタノールで抽出した後に測定した。阻害剤の不在における切断活性を、各アッセイについて１００％とした（ｎ＝７、平均±ＳＤ）。
【００８２】
結果：三つの全てのアッセイにおいて、ジイソプロピルホスホ弗素化物に関して典型的なＳ字状阻害曲線が得られた。これから計算したＩＣ50値は、間接的（０.８mM）または直接的ＮＡＧアッセイ（１.１mM）に関する値とは互いに有意差がなかった。２.１mMという若干高いＩＣ50値がトリオレイルグリセリド切断について計算された。これは、これらのアッセイで観察された種々の阻害剤の阻害活性において上記で見出された相違（説明するとすれば実施例６参照）と一致していた。これとは無関係に、ジイソプロピルホスホ弗素化物によるＨＳＬの阻害に関して間接的ＮＡＧアッセイで測定されたＩＣ50値は刊行されたデータ (P. Stralfors, H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987, 147-177; P. Stralfors, P. Belfrage, J. Biol. Chem. 258, 1983, 15146-15151; P. Belfrage, B. Jergil, P. Stralfors, H. Tornquist, FEBS Lett. 75, 1977, 259-263) と非常に一致していた。
【００８３】
【表１１】
0003712232.tif 000013
【００８４】
実施例１２：マイクロタイタープレートフォーマットにおける間接的ＮＡＧアッセイの実行可能性
ＮＡＧを部分精製ＨＳＬと共に、９６穴マイクロタイタープレートのウェル中で２００μｌのアッセイ体積において種々の時間インキュベートした。４８１nmにおける吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで測定した。
【００８５】
結果：選択された条件において、反応は約６０分まで線形である。この場合の分散（ＳＤ）は４〜７％である。このように間接的ＮＡＧアッセイはＨＴスクリーニングに使用するのに適している。
【００８６】
【表１２】
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【００８７】
使用した略語：
arb. Units    任意単位
ＢＳＡ        ウシ血清アルブミン
ｃＡＭＰ      サイクリックアデノシン一リン酸
ＤＣＣ        ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＦ        N,N-ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ      ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ        ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ      エチレンジアミン−Ｎ,Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラ酢酸
ＦＡＢ−ＭＳ  高速原子衝突質量分析
ＨＳＬ        ホルモン感受性リパーゼ
ＫＰｉ         リン酸二水素カリウム／リン酸カリウム緩衝液
ＬＰＬ        リポタンパク質リパーゼ
ＮＡＧ        ＮＢＤ-モノアシルグリセリド：12-(7-ニトロベンゾ[1,2,3]オキサジアゾール-4-イルアミノ)ドデカン酸 2,3-ジヒドロキシプロピル
ＮＢＤ        4-クロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾール
ＮＢＤ−ＦＡ  ＮＢＤ脂肪酸：12-(7-ニトロベンゾ[1,2,3]オキサジアゾール-4-イルアミノ)ドデカン酸
ＮＩＤＤＭ    インスリン非依存型糖尿病
ＰＬＡ２      ホスホリパーゼＡ２
ＰＬＣ        ホスホリパーゼＣ
ＰＮＰＢ      酪酸ｐ−ニトロフェニル
ＳＤ          標準偏差
ＳＤＳ        ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＡＧ        [3Ｈ] トリオレイルグリセロール
Tris          トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＴＬＣ        薄層クロマトグラフィー
ＴＸ-100      Triton (登録商標) Ｘ-100