(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物（ヒトを除く）の皮膚組織に、ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光をシングルフォトンカウンター方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラにより検出、定量又は同定することからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法。
【請求項２】
活性酸素との反応の結果発生する発光が、蛍光である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性酸素の発生の有無、発生した活性酸素の量、発生した活性酸素の種類及び／又は活性酸素の発生した部位を検出、定量又は同定する方法である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）を添加又は塗布した動物（ヒトを除く）の皮膚組織を固定することができる装置、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するためのシングルフォトンカウンター方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラを有する装置を包含してなる活性酸素を検出、定量又は同定するための装置。
【請求項５】
活性酸素との反応の結果発生する発光が、蛍光である請求項４に記載の装置。
【請求項６】
活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置からのデータを処理する装置をさらに有してなる請求項４又は５に記載の装置。
【請求項７】
ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）を含有してなる、生体組織の活性酸素をシングルフォトンカウンター方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラにより検出、定量又は同定するための組成物。
【請求項８】
生体組織に塗布できる形態である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質を、検体（ヒトを除く）に添加又は塗布した後、検体を活性酸素が発生する状態とし、次いで当該検体にルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光をシングルフォトンカウンター方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラにより検出、定量又は同定することからなる検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
検体が生体組織である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定することからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法、そのための装置に関する。また、本発明は、活性酸素と反応して発光する物質を含有してなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物に関する。さらに、本発明は検体、好ましくは生体組織中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質をスクリーニングする方法及びそのための装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近のオゾン層の破壊による太陽光紫外線（ＵＶＡ、ＵＶＢ）の増大は、人を含む地球上の全生物に相当な皮膚損傷を与えると懸念されており、ＵＶＡやＵＶＢによる皮膚傷害に関する多くの知見が蓄積されてきている。身体の最外層に位置し、人体組織では最大臓器である皮膚は、紫外線などの環境因子の影響を最も受けやすい臓器である。皮膚は直接外気とも接触しているので、常に酸素と紫外線に暴露されており、紫外線により発生する活性酸素の第一の標的部位であり、身体の内部を活性酸素による傷害から防御する役割を担っている。体内で生成する活性酸素は多くの疾患と関連することが既に指摘されているが、近年では日焼け、光毒性、光アレルギーといった紫外線による皮膚損傷やアトピー性皮膚炎、乾せんなどの皮膚疾患にも関与することが示唆されている。
【０００３】
したがって、活性酸素を消去する化合物は、２１世紀には飛躍的な増大が予測されている紫外線傷害による皮膚疾患の予防や治療に有効であると考えられ、新しい医薬品開発の概念としてとらえられている。しかし、皮膚における活性酸素の産生機構はいまだ明らかでなく、生体内（in vivo ）の人や動物の皮膚において紫外線照射下で活性酸素が実際に検出された報告すらないのが現状である。
また、生体内、特に皮膚においてどのような抗酸化剤が有効であるかを試験する方法も知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体内、特に皮膚における活性酸素を検出、定量する方法およびその装置を提供するものであり、かつ生体内、特に皮膚における抗酸化剤をスクリーニングする方法に関する。
即ち、本発明は、新規な微弱光測定システムを用いることにより生体内における動物の皮膚において紫外線照射下で産生される活性酸素を直接観測できる方法を提供するものであり、さらに、この方法を用いた活性酸素の発生機構の解明と新しい皮膚傷害防御薬の開発方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定することからなる活性酸素を検出、定量又は同定する方法に関する。本発明は、前記の活性酸素を検出、定量又は同定する方法を実施するための装置に関し、より詳細には、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を固定することができる装置、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置を包含してなる活性酸素を検出、定量又は同定するための装置に関する。
また、本発明は、検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質を検体に添加又は塗布した後、検体を活性酸素が発生する状態とし、次いで当該検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布して、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定することからなる検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。本発明は、前記したスクリーニングする方法を実施するために使用するスクリーニング装置にも関する。さらに、本発明は前記したスクリーニング方法やスクリーニング装置を用いてスクリーニングされた検体中に発生する活性酸素を中和する作用を有する物質を含有してなる抗酸化組成物にも関する。
【０００６】
本発明の他の目的は、活性酸素と反応して発光する物質を含有してなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物を提供することでもある。本発明のこの組成物は、生体組織に悪影響を及ぼさない担体を含有することができる。したがって、本発明は、活性酸素と反応して発光する物質及び生体組織に対して許容される担体とからなる生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物に関する。
【０００７】
本発明の活性酸素を検出、定量又は同定するための方法は、活性酸素の発生の有無、発生した活性酸素の量、発生した活性酸素の種類及び／又は活性酸素の発生した検体上の部位などを検出、定量又は同定する方法であり、必要に応じてこれらの中の１種類の検出、定量又は同定をする方法とすることもできるが、これらの中の２種以上を同時に検出、定量又は同定することもできる。また、検出、定量又は同定を同時に行うこともできるが、これらを別々に測定することもできる。
【０００８】
本発明の検体としては、紫外線やストレスなどにより活性酸素を発生することができるものであり、例えば、動物の皮膚組織、培養された生体組織などが挙げられる。動物の皮膚を検体として使用する場合には、必要に応じて脱毛したり、テープなどを用いて皮膚の角質層を除去して使用することができる。
本発明の活性酸素とは、通常の酸素分子に比べて著しく反応性に富む酸素含有の基又は分子であって、好ましくは生体内において発生し得るものであり、例えば、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、ペルヒドロキシラジカル（・Ｏ２Ｈ）、一重項酸素（１Ｏ２）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、脂質過酸化物（・ＲＯＯ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）、イオウ酸化物（ＳＯｘ）などのフリーラジカルや分子種が挙げられる。
【０００９】
本発明の活性酸素と反応して発光する物質としては、前記した活性酸素の中の特定の活性酸素種と反応するものであってもよいが、いずれの活性酸素種と反応するものであってもよい。また、発光する光としてはＣＣＤカメラなどの検出装置で測定することができる光又は波動であるならば特に制限はないが、可視光線又は蛍光による可視又は紫外線領域の光が好ましい。好ましいが、活性酸素と反応して発光する物質としては、例えば、ルミノール又はＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）などが挙げられる。
ＣＬＡは、・０２−または１０２の存在下で特異的に強く発光することが化学系実験において見出したので、・０２−や１０２の測定に好ましい。
また、ルミノール（Luminol（3-Aminophthaloylhydrazine））は、最も発光量子率の大きい化学発光性有機化合物であり、Ｈ２０２または・ＯＨの存在下で触媒により酸化されて発光することが化学系実験において見出したので、Ｈ２０２や・ＯＨの測定に好ましい。
【００１０】
したがって、本発明の生体組織の活性酸素を検出、定量又は同定するための組成物としては、ＣＬＡ及び／又はルミノールを含有するものが好ましい。本発明のこの組成物は、検体に添加して均一に混合又は分散されるものが好ましく、そのための溶媒や分散剤などを含有することができる。また、本発明のこの組成物は、検体に塗布することができる形態として使用することができる。この場合には展開剤としての溶剤や粘着性を付与するために粘着剤などを含有させることもできる。
【００１１】
活性酸素と反応して発光する物質が活性酸素と反応して発光する光を計測するための装置としては、従来の蛍光分析などに使用されている受光器を用いることもできるが、微弱光測定システムを用いることが好ましい。微弱光測定システムを用いることにより活性酸素と反応して発光する物質が活性酸素と反応して発光する光を直接測定することができる。また、発光する部位などを計測するためにはＣＣＤカメラの使用が好ましい。ＣＣＤカメラの感度は低感度のものでも本発明の測定は不可能ではないが、高感度ＣＣＤカメラの使用が好ましい。また、得られる発光画像はアナログ方式のものでもよいが、発光画像の処理をする場合にはデジタル方式のものが好ましい。
【００１２】
本発明の活性酸素を検出、定量又は同定するための装置としては、検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を測定中静止させるための検体を固定することができる装置及び活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置を包含してなる装置であればよい。
検体に活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した検体を固定することができる装置としては、例えば、手や足などを載せることができる台のようなものであってもよいし、必要な場合にはこの台にバンドのような固定具を設けることもできる。また、活性酸素との反応の結果発生する発光を検出、定量又は同定するための装置としては、前記したＣＣＤカメラを備えた装置などを挙げることができ、測定結果を表示するためのディスプレーやプリンターや、測定結果を記録しておくための記録装置を備えたものが好ましい。
【００１３】
本発明の活性酸素を検出、定量又は同定するための装置は、必要に応じて測定した結果をデータ処理することができるデータ処理装置を設置することができる。このようなデータ処理をすることにより肉眼で観察される発光画像よりもより詳細な発光に関する情報を得ることが可能となる。画像処理の方法としては従来のＣＴ技術を応用することができる。
【００１４】
本発明の方法において、活性酸素の発生の有無を検出する場合には、ＣＣＤカメラなどにより活性酸素と反応して発光する物質の発光の有無を検出すればよい。発生した活性酸素の量を定量する場合には、活性酸素と反応して発光する物質が発光する蛍光などの光の発光量を発光強度として定量したり、標準物質との相対強度により定量することができる。また、活性酸素の発生した検体上の部位などを検出又は同定する場合には、ＣＣＤカメラなどの画像データをディスプレーに直接表示するか、画像データをデータ処理して出力することにより行うことができる。
【００１５】
さらに、発生した活性酸素の種類を検出、定量又は同定しようとする場合には、活性酸素と反応して発光する物質として特定の活性酸素種と反応する物質を使用することもできるが、より簡便には、検体に特定の活性酸素種と反応して当該活性酸素種を消去する物質（以下、活性酸素消去物質という。）を添加又は塗布し、次いで本発明の活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した後、検体をＣＣＤカメラなどで測定し、これを前記した活性酸素消去物質を添加又は塗布しない場合の検体から得られたデータと比較することにより行うことができる。
本発明で使用し得る活性酸素消去物質としては、特定の活性酸素種と選択的にに反応して、当該活性酸素種を消去することができるものであればよい。このような活性酸素消去物質として、例えば、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ２−）を選択的に消去するＳＯＤ、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を選択的に消去するエタノール、過酸化水素（Ｈ２０２）を選択的に消去するカタラーゼ（Catalase）、一重項酸素（１０２）を選択的に補足するβ−カロテン（β−calotene）などが挙げられる。これらの１種又は２種以上を適宜使用することができる。
【００１６】
また、本発明のスクリーニング方法は、前記した活性酸素種を検出、定量又は同定する方法と同様な方法により行うことができる。例えば、活性酸素が発生している検体にスクリーニング物質を添加又は塗布し、さらに本発明の活性酸素と反応して発光する物質を添加又は塗布した後、ＣＣＤカメラなどにより検体を測定して、活性酸素の発生量を対照検体の測定値と比較することにより、前記スクリーニン物質の有効性を判定することができる。また、前記した活性酸素消去物質の使用を組み合わせることにより、当該スクリーニング物質がどの活性酸素種に対して有効であるかということも判定することが可能となる。
本発明のスクリーニング方法により、簡便かつ正確に生体内で活性な抗酸化剤を見出すことができることになる。したがって、本発明は当該スクリーニング方法によって得られた抗酸化剤組成物を提供するものでもある。
【００１７】
次に本発明をより具体的に説明する。
本発明者らは、紫外線照射後の皮膚において発生する活性酸素種の検出と同定について検討した。
活性酸素と反応して発光する物質（以下、単に発光物質という。）としてＣＬＡを用いた場合、照射終了３０秒後から３０分間にわたって非常に強い発光が観測された。この惹起された発光がＳＯＤ前処置によってほぼ完全に抑制され、β−カロテン（β-calotene ）前処置では若干抑制されたことから、紫外線照射後の皮膚において発生する主な活性酸素種は・０２−であり、さらに一部１０２も発生していることが示された。
【００１８】
図１にその結果を示す。図１の左側の連続写真は、紫外線（ＵＶＡ）照射時の１分後から２９分後までの１分間隔の写真であり、最も左側はＣＬＡのみの場合のものであり、中側はこれにＳＯＤを加えた場合のものであり、右側はβ−カロテン（図１では、ｂ−ＣＡＬとして表示されている。）を加えたものである。
紫外線照射後から、多量の活性酸素が発生していることが画像データとして示されている。そして、これにＳＯＤを加えることにより発生した活性酸素のほぼ全てを消滅させることができること、及び、この照射により発生した活性酸素種のほとんどがＳＯＤによって消去可能な種であることがわかる。紫外線照射の右側の写真はβ−カロテンを加えたものであり、β−カロテンによっては発生した活性酸素種を全て消滅させることができないことがわかる。
なお、図１における輝度は発光の強度を示している。
【００１９】
次に正常の皮膚において発生する活性酸素種の検出と同定を検討した。
発光物質としてＣＬＡを用いた場合、塗布５分後から１５分間にわたって発光が観測された。ただし、正常皮膚からの発光量は紫外線照射後の発光量と比較するとかなり弱いものであった。この場合の発光はＳＯＤ前処置によってほぼ完全に抑制され、β−カロテンにはほとんど影響されなかったことから、正常の皮膚において発生している主な活性酸素種は・０２−であることが示された。
この結果を図１の右側の連続写真として示す。
【００２０】
ルミノールを使用してもほぼ同様な結果が得られる。ルミノールの場合には活性酸素種として特に過酸化水素との反応が強い点において前記したＣＬＡとは異なる結果となる。
本発明者らは、ルミノールやＣＬＡの活性酸素との反応を次のように推定した。
【００２１】
【化１】
0003708368.tif 000002
まず、ルミノールに活性酸素種が作用して脱水素反応が生起し、さらに酸化されて窒素が遊離し、生成したジエステル体が基底状態に戻るときに波長４２５ｎｍの光を発生すると考えられる。また、ＣＬＡについては、
【００２２】
【化２】
0003708368.tif 000003
まず、活性酸素の作用によりイミダゾロン環が開裂し、環状過酸化エステルが生成し、これが活性アミドとなりこのときに波長３８０ｎｍの光を発生すると考えられる。
【００２３】
この実験に使用した検出装置は、Ｎｉｇｈｔ  Ｏｗｌ  ＬＥ９８１（ＥＢ＆ＧＢｅｒｔｈｏｌｄ社製）であり、この装置は、シングルフォトンカウンター方式による超高感度イメージングＣＣＤカメラを装備しており、各種の活性酸素が発光物質と反応して生じる微弱光を最高感度で検出することができ、さらに画像解析をも可能とした測定装置である。１分間における発光強度の積算量を単位時間・単位面積あたりの平均値として数値化することにより、各種活性酸素の発生量を定量化することもできる。
したがって、このような装置を使用することにより、測定結果をビジュアル化するだけでなく、得られた画像の解析結果を数値化することによって定量できることができ、実験の再現性については統計的に良好な結果が得られた。
【００２４】
図１に示される結果によれば、紫外線照射などにより発生する活性酸素種としては主として一重項酸素（１０２）であることがわかり、活性酸素発生を抑制する物質として一重項酸素（１０２）を消滅させることができる物質が有望であることが示されている。
【００２５】
本発明によれば、生体内における活性酸素の生成を直接かつリアルタイムで測定することができ、また、発生する活性酸素種を特定することができるので、生体内における活性酸素の発生機構の解明やその対処、例えば抗酸化剤の開発などについて極めて重要な方法、装置及びそのための組成物を提供するものである。
【００２６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
ｄｄｙ系雄性マウス（６−８  ｗｅｅｋｓ）の背部をバリカンにより除毛した後、さらに除毛剤（チオグリコール酸ナトリウム）を５分間塗布することで角質層を除去した。除毛２４時間後ペントバルビタール腹腔内投与による麻酔下のマウスの皮膚に、紫外線（ＵＶＡもしくはＵＶＢ）を１分間照射して皮膚傷害を惹起させた。紫外線照射装置にはラボテック社の  ＲＵＶＦ−２０２Ｓを用いた。照射後直ちにＣＬＡもしくはルミノールを照射部の皮膚に塗布し、照射終了３０秒後からＮｉｇｈｔ  Ｏｗｌ  ＬＥ９８１社製の超高感度イメージングＣＣＤカメラを装備した装置により微弱光の連続測定を開始した。
このときのマウスの発光の結果を図２に示す。
【００２８】
実施例２
さらに、紫外線照射により生体内（in vivo）の皮膚組織で発生する活性酸素種を同定するために、ＳＯＤ又はβ−カロテンなどの活性酸素消去物質をあらかじめ皮膚に塗布した後に紫外線を照射して、照射終了後、同様に微弱光を測定した。
前記の実施例１の結果と併せて結果を図１の左側の連続写真として示す。
【００２９】
実施例３
紫外線を照射しない正常状態の皮膚において常在的に発生している活性酸素種を検出する目的で、ＣＬＡもしくはルミノールを正常の皮膚に塗布し、３０秒後から微弱光を連続測定した。
結果を図１の右側の連続写真として示す。
【００３０】
【発明の効果】
本発明は、検体、特に動物の皮膚などにおける活性酸素の発生の状況を簡便、高精度で且つリアルタイムで測定できる方法及び装置を提供する。また、本発明はそのための組成物を提供するものである。
本発明の方法によれば、生体内における活性酸素の発生の機構の解明が可能となるばかりでなく、発生する活性酸素種を特定することもでき、生体内に発生した活性酸素を効率的に除去し得る物質をスクリーニングすることができる簡便な方法及び装置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の装置により生体内で発生した活性酸素を連続的に撮影した図面に代わる写真である。図１の左側は紫外線（ＵＶＡ）を照射したときのものであり、右側は紫外線を照射しないときのものである。
【図２】図２は、マウスの皮膚に発生した活性酸素を本発明の装置により撮影した図面に代わる写真である。
【図１】
0003708368.tif 000004
【図２】
0003708368.tif 000005