(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコン基板の表面に異方性エッチングにより形成された複数の独立した反応チャンバと、該シリコン基板の表面に陽極接合され前記反応チャンバを密閉する平板とからなり、
前記反応チャンバは、３０ｃｍ直径の単一シリコン基板上に１０００以上集積することができる程度に小さく形成されているとともに、注入ポート及び排出ポートと、該注入ポートと排出ポートを連通するチャネルとを有し、注入ポートと排出ポートは、シリコン基板の裏面に連通する貫通孔を備え、該貫通孔を通して注入ポートへ試薬を供給し、かつ排出ポートから排出するようになっている、
ことを特徴とする生化学反応用マイクロリアクタ。
【請求項２】
前記平板の少なくとも一部が透明部であり、該透明部を通して内部の反応を光学的に観察する、ことを特徴とする請求項１に記載の生化学反応用マイクロリアクタ。
【請求項３】
前記シリコン基板の一部に計測用回路が構成されている、ことを特徴とする請求項１に記載の生化学反応用マイクロリアクタ。
【請求項４】
前記注入ポートは、発光酵素用の第１ポートと基質溶液用の第２ポートとからなり、前記チャネルは、第１ポートと第２ポートを連通する合流用チャネルと、該合流用チャネルと排出ポートを連通する反応チャネルとからなり、該反応チャネル内での生物発光反応が透明部を通して光学的に観察される、ことを特徴とする請求項２に記載の生化学反応用マイクロリアクタ。
【請求項５】
前記注入ポートは、遺伝情報を有する核酸を含む混合液Ａ用の第１ポートと混合液Ｂ用の第２ポートとからなり、前記チャネルは、第１ポートと第２ポートを連通する合流用チャネルと、該合流用チャネルと排出ポートを連通する反応チャネルとからなり、シリコン基板を外部より所定の温度に保持し、これにより反応チャネル内で核酸上の遺伝暗号に従った蛋白質合成反応が生じる、ことを特徴とする請求項２に記載の生化学反応用マイクロリアクタ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多数の生化学反応を同時に並列的に行うための生化学反応用マイクロリアクタに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生化学実験においては、一般にμＬオーダーの試薬を対象に分取、混合、反応、検出、分離等、多段階の煩雑な操作が必要とされる。特に蛋白質やＲＮＡ等不安定な物質を扱う場合には、温度や分解酵素対策など、実験環境への配慮も不可欠であり、実験の効率化を議論するどころか、実験技術の熟練度合いが、研究成果に少なからず影響を与える。
【０００３】
従来、かかる生化学実験では、多数（例えば４８個）の反応チャンバにそれぞれ異なる試薬を入れ、全体を同時に同条件で処理して最適条件を検出する手法がとられていた。しかし、この手法をそのまま更に多数（例えば１０００以上）の反応試験に適用しようとすると、試験装置が非常に大型となり、全体を同一条件で処理し検査することが不可能になる問題点があった。
【０００４】
一方、キャピラリー電気泳動 (Capillary Electrophoresis)など、１ｍｍ以下のマイクロスケールの流路を用いることにより、装置を小型化し、分析を高速化することが従来から行われている (Proc. of HPCE '93, Orlando, 1993) 。また、近年ではいわゆるＭＥＭＳ (Microelectromechanical Systems) Ｔechnology  (Proc. of MEMS '97, Nagoya, 1997)を化学分析や遺伝子解析に応用する研究として、例えば米国ではヒューマンゲノム計画の関連技術課題 (“Microfabrication Technology for Biomedical Applications", Cambrige Health Institute, 1996) 、欧州ではμＴＡＳ (“Micro Total Analysis System", Kluwer Academic, 1995) などが議論されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これらの研究において実現されている具体的システムは、主にＤＮＡ分子のハンドリング及び定量などをターゲットとした分析目的であり、そこではシステムのファブリケーションとインテグレーションに伴う技術課題が主な研究対象となっている。そのため上述した従来のシステムでは、蛋白質合成などの物質合成反応を含む広範囲の生化学実験には対応できなかった。
【０００６】
更に、米国特許第５，５８９，１３６号 (“SILICON-BASED SLEEVE DEVICES FOR CHEMICAL REACTIONS")には、図９に模式的に示すように、スリーブ反応チャンバと、このスリーブ反応チャンバ用の加熱手段とからなり、スリーブ反応チャンバは溝を有し、この溝にインサート又はライナーが挿入できるようになっているマイクロ化学反応器が開示されている。なお、この図で１はマイクロ化学反応器、１ａは凹み、２は電源／制御システム、３は注射器、４はシリコムゴムの窓、５は電磁コイル、６，７は電極、Ｃはコンデンサ、Ｌはコイルである。
【０００７】
しかし、このマイクロ化学反応器では、ＤＮＡ反応、ＤＮＡ増殖、ＤＮＡ合成等ができるものの、多数（例えば１０００以上）の反応器の集積化が困難であり、従って多数の生化学反応を同時に並列的に行うことが難しい問題点があった。
【０００８】
本発明は、上述した問題点を解決するために創案されたものである。すなわち、本発明の主目的は、例えば１０００以上の多数の生化学反応を同時に並列的に行うことができる生化学反応用マイクロリアクタを提供することにある。また、本発明の別の目的は、単なる分析だけではなく、蛋白質合成などの物質合成反応をもセル上で行うことができる生化学反応用マイクロリアクタを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、シリコン基板の表面に異方性エッチングにより形成された複数の独立した反応チャンバと、該シリコン基板の表面に陽極接合され前記反応チャンバを密閉する平板とからなり、前記反応チャンバは、３０ｃｍ直径の単一シリコン基板上に１０００以上集積することができる程度に小さく形成されているとともに、注入ポート及び排出ポートと、該注入ポートと排出ポートを連通するチャネルとを有し、注入ポートと排出ポートは、シリコン基板の裏面に連通する貫通孔を備え、該貫通孔を通して注入ポートへ試薬を供給し、かつ排出ポートから排出するようになっている、ことを特徴とする生化学反応用マイクロリアクタが提供される。
【００１０】
上記本発明の構成によれば、シリコン基板上に平板で密閉された独立した複数の反応チャンバを有するので、各反応チャンバで複数の生化学反応を同時に並列的に行うことができる。特に、この反応チャンバは、シリコン基板の表面に異方性エッチングにより形成されているので、例えば４ｍｍ×１０ｍｍで１つの反応チャンバを構成すれば、３０ｃｍ直径の単一シリコンウエハ上に１０００以上の反応チャンバを形成することができる。従って、この一枚のシリコンウエハ内で１０００以上の生化学反応を同時に並列的に行うことにより、全体を同一条件で処理し検査して最適条件を容易に決定することができる。また、各反応チャンバを動物の細胞に匹敵する大きさにできるので、細胞内に近い環境にすることも可能となり、単なる分析だけではなく、蛋白質合成などの物質合成反応をもセル上で行うことができる。
【００１１】
また、反応チャンバは、注入ポート及び排出ポートと、該注入ポートと排出ポートを連通するチャネルとを有し、注入ポートと排出ポートは、シリコン基板の裏面に連通する貫通孔を備え、該貫通孔を通して注入ポートへ試薬を供給し、かつ排出ポートから排出するようになっているので、異なる種々の試薬を注入ポートへ連続して供給し、異なる反応を長時間同時に並列的に行うことができる。
【００１２】
また、前記平板の少なくとも一部が透明部であり、該透明部を通して内部の反応を光学的に観察するようになっている。この構成により、高感度フィルムやＣＣＤカメラ等を用いて多数の反応チャンバ内での反応を同時に観察することができ、画像処理等により最適セルを容易に検出することができる。
【００１３】
更に、シリコン基板の一部に計測用回路が構成されている、ことが好ましい。この構成により、集積回路と同様の回路製造技術を用いて、各種センサー、温度調節器、発振器、等を組み込むことができ、多数の生化学反応を同時に並列的に行い、かつ効率よく制御しデータを取得することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施形態を図面を参照して説明する。なお、各図において、共通する部分には同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
本発明は、上述した一般のワークベンチ上で行われる操作をマイクロシステム上で実現し、自動化、高速化することにより、大規模でシステマチックな実験を可能とするようなシステムの開発を目指すものである。以下、ワークベンチをマイクロ化するとの意味から、このシステムを「マイクロワークベンチ」（Micro Work Bench: ＭＷＢ）と名付ける。
【００１５】
システムをマイクロ化するメリットとしては一般に、
▲１▼デッドボリュームが小さく、少量サンプルで高速に分析が可能である。
▲２▼小型、軽量な実験システムが実現できる。
▲３▼集積化、並列化が容易である。
▲４▼不純物の混入が抑えられる。
▲５▼システム化により、操作上のエラーを低減できる。
などが考えられ、幅広い応用が期待できる。
【００１６】
図１は、本発明のマイクロリアクタの概念を模式的に示す図である。このマイクロリアクタは、溶液を混合して反応を行った後、定量及び分析してから分離するという一連の生化学実験操作をいくつかのセルの組み合わせによって実現する。
図中では例えば、▲１▼リザーバセル（Reservoir Cell）、▲２▼混合セル（Mixing Cell ）、▲３▼反応セル（Incubation Cell ）、▲４▼検出セル（Detection Cell）、及び▲５▼分離セル（Separation Cell ）の組み合わせの例を示している。
【００１７】
更に、マイクロファブリケーションの利点を活かして、これらのセルを更に集積化すれば、多段階の反応分離操作を並列に実行できるシステムが考えられ、例えば近年注目を集めている分子進化や組合せ化学（Combination Chemistry ）など、広い範囲の生化学実験に対応可能なシステムが実現できる。
【００１８】
図２は、図１と同様の概念図である。この図に示すように、例えば４ｍｍ×１０ｍｍで１つの反応チャンバ１１を構成すれば、３０ｃｍ直径の単一シリコンウエハ上に１０００以上の反応チャンバを形成することができる。従って、この一枚のシリコンウエハ内で１０００以上の生化学反応を同時に並列的に行うことにより、全体を同一条件で処理し検査して最適条件を容易に決定することができる。なお、これは一例であり、反応チャンバ１１を更に小さくすることにより、更に大量の反応を同時に行うことができる。
【００１９】
【実施例】
（実施例１）
図３は、本発明のマイクロリアクタの実施形態を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はＡ−Ａ線における断面拡大図を示している。
上述したようなシステムを実現するためには、液送、反応、検出、分離等にかかる要素技術に加えて、流路を含めたセル間の接続の問題やシステム全体としての制御の問題など様々な技術課題を解決する必要がある。こうした問題を検討するための第１段階として、図３に示すような２液を混合して反応を行うためのマイクロリアクタを製作した。
【００２０】
図３において、２０ｍｍ×２０ｍｍのシリコン基板１２上に異方性エッチングによって深さｈ＝２０μｍのチャネル１３を掘り、それぞれサンプルの注入ポート１４ (Inlet)を２つ、排出ポート１５ (Outlet) を１つ設けた。チャネル形状はＴ字型とｈ型の２種類、チャネル幅ｗについては２００μｍ、４００μｍ、８００μｍの３種類、計６種類のリアクタを製作した。
【００２１】
図４は、図３の製造方法を示す図である。この図に示すように、（Ａ）まず、シリコン基板１２上に異方性エッチングによってチャネル１３を加工する。異方性エッチングはマイクロマシーニング技術の１つであり、ウエットエッチングにおいて、アンダーカットが少ない高アスペクト比構造を得る技術である。これは、例えばＫＯＨやエチレンジアミン水溶液をエッチング液とした結晶方位依存性エッチングによって達成することができる。
【００２２】
（Ｂ）次に、注入ポート１４及び排出ポート１５に裏面に連通する貫通孔１６を設ける。この加工も、異方性エッチングによって行うことができる。（Ｃ）次いで、シリコン基板１２の表面に平板１７を陽極接合する。この平板１７は、少なくとも一部が透明部であることが好ましい。かかる透明部を設けることにより、透明部を通して内部の反応を光学的に観察することができる。
【００２３】
なお、平板１７には、例えば耐熱ガラス（商標名：パイレックス）等を用いるのがよい。また、陽極接合は、通常３００〜５００℃程度に加熱した状態で、両者の間に電圧を加えて接合するものである。この陽極接合により、平板１７で閉じられたチャネル１３が、反応チャンバ１１として機能する。（Ｄ）最後に、ハトメ１８をシリコン基板１２の裏面に接着剤（例えばエポキシ系）を用いて接着する。
【００２４】
上述したように、本発明の生化学反応用マイクロリアクタは、シリコン基板１２の表面に異方性エッチングにより形成された複数の独立した反応チャンバ１１と、シリコン基板１２の表面に陽極接合され反応チャンバ１１を密閉する平板１７とからなる。
また、反応チャンバ１１は、注入ポート１４及び排出ポート１５と、注入ポートと排出ポートを連通するチャネル１３とを有し、注入ポート１４と排出ポート１５は、シリコン基板の裏面に連通する貫通孔１６を備え、この貫通孔１６を通して注入ポート１４へ試薬を供給し、かつ排出ポート１５から排出するようになっている。また、平板１７の少なくとも一部が透明部であり、この透明部を通して内部の反応を光学的に観察できるようになっている。更に、必要により、シリコン基板１２の一部に計測用回路（各種センサー、温度調節器、発振器、等）を構成する。
【００２５】
（第１実験例）
図５は、図３のマイクロリアクタを用いた第１実験例である。実験の際には、この図に示すように注入ポート１４及び排出ポート１５の部分にシリコンチューブ１９を接続し、マイクロシリンジ２１からシリンジポンプなどを用いてサンプルを注入する。ジャンクション部分で２種のサンプルが接触し、ジャンクションより下流のチャネル部分がリアクタとなってサンプル同士が反応する。なお、シリンジ２１でサンプルを注入する際には、気泡等によって流れがブロックされることを避けるため、いわゆるプライミングを行ってリアクタ内部を液体で満たしておく必要がある。
【００２６】
マイクロシステムにおける生化学反応についての基礎的な検討を行う目的で、製作したマイクロリアクタ内において具体的反応実験を行った。図３に示したマイクロリアクタにおいて、注入ポート１４は、ルシフェラーゼとルシフェリンの混合溶液用の第１ポート１４ａとＡＴＰ溶液用の第２ポート１４ｂとからなり、チャネル１３は、第１ポート１４ａと第２ポート１４ｂを連通する合流用チャネル１３ａと、この合流用チャネル１３ａと排出ポート１５を連通する反応チャネル１３ｂとからなる。また、反応チャネル１３ｂ内でのホタルルシフェラーゼ反応が透明部を通して光学的に観察されるようになっている。
【００２７】
すなわち、本発明では比較的検出の容易な生化学反応として、ホタルルシフェラーゼによる発光反応を取り上げた。ホタルルシフェラーゼ反応は、ルシフェラーゼという酵素がルシフェリン及びＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を基質として反応が進む発光反応で、ルシフェリンの酸化に伴って光が発せられるため、チャネル部分での発光強度をモニタすることにより、反応のアクティビティを知ることができる。
【００２８】
実験では、ＡＴＰ検出に用いられるルシフェリン及びルシフェラーゼを含む検出試薬 (Sigma#L0633)及びＡＴＰ水溶液をそれぞれ注入ポートから注入した後、高感度フィルムを用いてリアクタの撮影を行うことにより、発光の観察を行った。
【００２９】
図６は、図５の試験結果を示す図である。撮影の結果、図６に示すように、リアクタ内で検出試薬とＡＴＰが徐々に混合し、発光していることが確認された。マイクロチャネル内の液送等メカニカルな部分についても、蛋白溶液が目詰まりを起こすなどの問題もなく、単純な構造ではあるが、マイクロリアクタの実現に向けて多くの基礎的知見が得られた。
【００３０】
（第２実験例）
図７は、図３のマイクロリアクタを用いた第２実施例である。蛋白質合成の可能性を評価するために、混合すると蛋白質を合成することが知られている２つの混合液Ａ，Ｂを準備し、かつ混合液ＡにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むものと、含まないものを試験した。すなわち、混合液Ａとして、Ｌ−〔14Ｃ〕−フェニルアラニン、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ｍＲＮＡ、ホスホエノールピルベート、ピルビン酸キナーゼ、ポリウリジル酸の混合液を使用し、混合液Ｂとして、リボソーム、可溶性蛋白因子類、ｔＲＮＡの混合液を使用した。
【００３１】
図７に示すように、この実験に用いたマイクロリアクタの注入ポート１４は、混合液Ａ用の第１ポート１４ａと混合液Ｂ用の第２ポート１４ｂとからなり、チャネル１３は、第１ポート１４ａと第２ポート１４ｂを連通する合流用チャネル１３ａと、合流用チャネル１３ａと排出ポート１５を連通する反応チャネル１３ｂとからなる。また、このシリコン基板１２を３７℃に保持した温水に浮かして、反応チャンバ１１（すなわち反応チャネル１３ｂ）と排出ポート１５の温度を熱電対で計測した。反応中、マイクロリアクタを除くすべての機器は２℃〜４℃の低温に保持し、マイクロリアクタ以外での反応を防止した。
【００３２】
反応は、２つの混合液Ａ，Ｂを等量混合することで引き起こされた。この等量混合は、マイクロシリンジ２１を用い、０．０５μＬ／ｍｉｎの一定流量で１００分間行った。マイクロリアクタの排出ポート１５から排出された混合反応液はフィルタ紙２２（Whatmann 3mm) に集め、１０％のＴＣＡ液 (trichloroacetic acid) で２０分間煮沸し、更に、同液で１０分間２回、常温で洗浄し、更にエタノールで１０分間２回、常温で洗浄した。乾燥後、フィルタ紙２２に残留した不溶性ＴＣＡの放射性を計測した。計測は、混合液ＡにメッセンジャーＲＮＡとしてのポリウリジル酸 (Polyuridylic acid)を含むものと、含まないものを同一条件で試験した。
【００３３】
図８は、図７の試験結果を示す図である。この図において、横軸は、14Ｃの検出量であり、縦軸の（ａ）はｍＲＮＡを含まない場合、（ｂ）はこれを含む完全な場合である。（ｂ）の完全なシステムでは、（ｂ）のｍＲＮＡを含まない場合に比較して、約２倍の14Ｃを検出している。従って、ｍＲＮＡにより14Ｃの取り込みが強化されること、及びｍＲＮＡ上の遺伝暗号に対応した蛋白質（ポリフェニルアラニン）の合成がマイクロリアクタ内で成功したことがわかる。
【００３４】
なお、本発明は上述した実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変更できることは勿論である。
【００３５】
【発明の効果】
上述したように、本発明の生化学反応用マイクロリアクタは、例えば１０００以上の多数の生化学反応を同時に並列的に行うことができ、かつ、単なる分析だけではなく、蛋白質合成などの物質合成反応をもセル上で行うことができる、等の優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマイクロリアクタの概念を模式的に示す図である。
【図２】図１と同様の概念図である。
【図３】本発明のマイクロリアクタの実施形態を示す図である。
【図４】図３の製造方法を示す図である。
【図５】図３のマイクロリアクタを用いた第１実験例である。
【図６】図５の試験結果を示すディスプレー上に表示した中間調画像である。
【図７】図３のマイクロリアクタを用いた第２実験例である。
【図８】図７の試験結果を示す図である。
【図９】従来のマイクロリアクタの構成図である。
【符号の説明】
１  マイクロ化学反応器
２  電源／制御システム
３  注射器
４  シリコムゴムの窓
５  電磁コイル
６，７  電極
１１  反応チャンバ
１２  シリコン基板
１３  チャネル
１３ａ  合流用チャネル
１３ｂ  反応チャネル
１４  注入ポート
１４ａ  第１ポート
１４ｂ  第２ポート
１５  排出ポート
１６  貫通孔
１７  平板（耐熱ガラス）
１８  ハトメ
１９  シリコンチューブ
２１  マイクロシリンジ
２２  フィルタ紙
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0003654481.tif 000009
【図９】
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