(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリン類の０．２〜２０倍（重量比）のマンノースとシクロデキストリン類を含有する溶液にα−マンノシダーゼを作用させることを特徴とするシクロデキストリン類の水酸基にα結合で１個または数個のマンノシル基が結合しているマンノシル−シクロデキストリン類の製造方法。
【請求項２】
シクロデキストリン類の濃度が５〜７０％（ｗ／ｗ）であり、マンノースの濃度が２０〜８０％（ｗ／ｗ）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨ３〜１０、温度２５〜８５℃で反応させる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、シクロデキストリン類の水酸基にα結合でマンノシル基が結合したマンノシル−シクロデキストリン類の製造方法に関する。詳しくは、酵素反応を利用するマンノースとシクロデキストリン類からの効率的なマンノシル−シクロデキストリン類の製造方法に関する。
本発明により得られるマンノシル−シクロデキストリン類は、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く利用される。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
シクロデキストリン類（以下、ＣＤと略記する。）は、グルコースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−およびγ−ＣＤが良く知られている。さらに、最近ではＣＤの溶解度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグルコシル基やマルトシル基を結合させた分岐ＣＤが合成されている。
【０００３】
これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっているため、包接作用があり、各種油性物質等を取り込む性質を有している。
ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質をもっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く使用されている。
【０００４】
最近、医薬品工業の分野では、薬剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞，マクロファージに強い親和性を示すことが良く知られている。
【０００５】
以前、我々は上述した現状に鑑み、シクロデキストリンとα−マンノシル糖化合物を含有する溶液に、α−マンノシル基転移酵素を作用させることによって、ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤの開発に成功している。また、マルトオリゴ糖とα−マンノシル糖化合物を含有する溶液に、α−マンノシル基転移酵素およびシクロデキストリン合成酵素を作用させることによって、同様のマンノシル−ＣＤの開発に成功している。
【０００６】
しかし、これらマンノシル基転移酵素の転移反応およびシクロデキストリン合成酵素の作用を利用して直接マンノシル−ＣＤを合成する方法は、反応に用いる基質であるマンノシル糖化合物が高価であるために、コストの面に問題がある。また、マンノシル糖化合物は溶解度が低いものが多く、基質濃度が低く抑えられるため、転移効率が低い。その結果、収率，コストの面に問題がある。
したがって、本発明の目的はマンノシル−ＣＤをより効率的な方法で製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような事情に鑑み、本発明者は鋭意努力を重ねた結果、高濃度のマンノースとＣＤを含有する溶液に、α−マンノシダーゼを作用させると、縮合反応によってＣＤのグルコース残基に直接マンノシル基が結合したマンノシル−ＣＤを効率良く合成することを見出した。基質となるマンノースは比較的安価であり、高い溶解度を有する。その結果、収率，コストを格段に高めることが可能になった。また、基質濃度を高めることによって、α−マンノシダーゼの安定化、反応槽のコンパクト化も可能となった。これらの知見に基づいて本発明は完成されたのである。
【０００８】
すなわち、本発明はシクロデキストリン類の０．２〜２０倍（重量比）のマンノースとシクロデキストリン類を含有する溶液にα−マンノシダーゼを作用させることを特徴とするシクロデキストリン類の水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−シクロデキストリンの製造方法を提供するものである。
【０００９】
本発明で得られるマンノシル−シクロデキストリン（分岐ＣＤと略記することがある。）は、ＣＤの水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤであり、ＣＤ１分子当たりマンノシル基１分子以上が結合している化合物をいう。これら分岐ＣＤの代表的な構造式を図１〜３、Ｉ〜IXに表す。
【００１０】
本発明の分岐ＣＤは、高濃度のマンノースとＣＤとを含有する溶液に、α−マンノシダーゼを作用させることによって得られる。本発明において反応に供するＣＤは、α−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤのいずれでもよく、これらの混合物であってもよい。また、グルコシル−ＣＤ，マルトシル−ＣＤ，ガラクトシル−ＣＤなど分岐側鎖を有するＣＤおよびその混合物や、前記のα−ＣＤなどのＣＤとの混合物であってもよい。
【００１１】
本発明に用いるα−マンノシダーゼとしては、マンノースとＣＤを含有する溶液に作用させたとき、マンノースとＣＤの縮合反応を触媒し、ＣＤの水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤを合成するものであれば、いずれも使用可能である。本発明に用いるα−マンノシダーゼは、自然界に広く分布しているものである。例えば、タチナタマメあるいはアーモンドなどの植物由来の酵素、サザエや肝臓（ウシ，ラット，ヒト）などの動物由来の酵素、さらにはアルスロバクター・オーレセンス，アスペルギルス・ニガーなどの微生物由来の酵素がよく知られている。本発明では植物由来の酵素が好適に用いられる。
【００１２】
本発明の反応系において、マンノースとＣＤを含む溶液（水溶液または懸濁液）は、ＣＤの濃度が通常５〜７０％（ｗ／ｗ），好ましくは２０〜５０％（ｗ／ｗ）であり、マンノースの濃度が通常２０〜８０％（ｗ／ｗ），好ましくは２５〜７０％（ｗ／ｗ）であることが適当である。また、ＣＤに対するマンノースの比率（重量）は、使用するＣＤの種類によって異なるが、０．２〜２０倍の範囲、好ましくは１〜１０倍の範囲とするのが適当である。
【００１３】
反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜７、温度は２５〜８５℃、好ましくは５０〜７０℃に調整して反応させることが適当である。また、使用酵素量は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が１時間〜２週間、好ましくは６時間〜１０日間で終了するような酵素量とすればよいが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
以上のような方法で反応させて得られた液を、高速液体クロマトグラフィーにかけて、ＣＤへの反応生成物を分画・分取した後、酵素分解法およびＦＡＢ−ＭＳによる分子量測定により構造解析を行なった結果、また既知のマンノシル−ＣＤとの高速液体クロマトグラフィーの溶出時間から、該反応生成物は図１〜３に示す構造式Ｉ〜IXに表される分岐ＣＤであることを確認した。
【００１５】
【実施例】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）縮合反応
マンノース２．７５ｇ，α−ＣＤ２．７５ｇを１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４．２ｍｌに溶解させた後、タチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を４２単位加え、６０℃にて９日間反応させた。
反応終了後、反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図４に示す。また、反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィーにかけて反応生成物Ａを２７０ｍｇ、反応生成物Ｂを１２ｍｇおよび反応生成物Ｃを１８ｍｇ分取した。
【００１６】
（２）構造解析
上記（１）で単離された反応生成物Ａ（図５）は、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１１３４であることがわかった。また、図６に示すように、このものはタチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとα−ＣＤに分解された。さらに、13Ｃ−ＮＭＲ解析により、図７に示すように、α−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式Ｉ）であることが確認された。
【００１７】
また、反応生成物ＢおよびＣ（図８）はいずれも、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量１２９６であることがわかった。これらは、タチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に分解され、α−ＣＤと２倍モルのマンノースを生成した。さらに、高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを考慮して、反応生成物ＢおよびＣはαＣＤ１分子に対して２分子のマンノシル基が結合した化合物と考えられる（図２および３の構造式IVおよびVII)。
【００１８】
実施例２
（１）縮合反応
マンノース８ｇ，β−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１４ｍｌに溶解させた後、タチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を７５．６単位加え、６０℃にて９日間反応させた。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図９に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィーにかけて反応生成物Ｄ１３０ｍｇ、反応生成物Ｅ４ｍｇおよび反応生成物Ｆ８ｍｇをそれぞれ分取した。
【００１９】
（２）構造解析
上記（１）で単離された反応生成物Ｄは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量が１２９６であることがわかった。また、タチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとβ−ＣＤに分解された。13Ｃ−ＮＭＲ解析により、β−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式II）であることが確認された。
【００２０】
また、反応生成物ＥおよびＦはいずれもＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量１４５８であることがわかった。これらは、タチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に分解され、β−ＣＤと２倍モルのマンノースを生成した。さらに、液体クロマトグラフィーの溶出パターンを考慮して、反応生成物ＥおよびＦはβ−ＣＤ１分子に対して２分子のマンノシル基が結合した化合物と考えられる（図２および３の構造式ＶおよびVIII) 。
【００２１】
実施例３
（１）縮合反応
マンノース２．７５ｇ，γ−ＣＤ２．７５ｇを１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４．２ｍｌに溶解させた後、タチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を４２単位加え、６０℃にて９日間反応させた。反応液の一部を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図１０に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィーにかけて反応生成物Ｇ１３０ｍｇ、反応生成物Ｈ８ｍｇおよび反応生成物Ｉ１２ｍｇをそれぞれ分取した。
【００２２】
（２）構造解析
上記（１）で単離された反応生成物Ｇは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１４５８であることがわかった。また、タチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとγ−ＣＤに分解された。13Ｃ−ＮＭＲ解析により、γ−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式III)であることが確認された。
また、反応生成物ＨおよびＩはいずれもＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量１６２０であることがわかった。これらは、タチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に分解され、γ−ＣＤと２倍モルのマンノースを生成した。さらに、高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを考慮して、生成物ＨおよびＩはγ−ＣＤのグルコシル基に２分子のマンノシル基が結合した化合物と考えられる（図２および３の構造式VIおよびIX）。
【００２３】
実施例４
ＣＤとしてα−ＣＤを用いた場合の縮合反応によるマンノシル−α−ＣＤの生成率に及ぼす諸条件について検討した。
（１）酵素添加量の影響
マンノース１．８Ｍ、α−ＣＤ０．３６Ｍ（１００ｍＭマッキーベン緩衝液、ｐＨ４．５）にマンノース１ｇあたり２７．８，５５．６または１１１．２単位のタチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を加え、６０℃で反応させて経時的にサンプリングし、これを加熱し、酵素反応を停止した後、生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、図１１に示すように、酵素量の増加に伴って生成率は高くなった。
なお、高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
【００２４】
0003637085.tif 000002
【００２５】
また、酵素１単位は５ｍＭのｐ−ニトロフェニルα−マンノシド（ｐＨ４．５）に４０℃で１０分間作用させたときに１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールが遊離する酵素量とした。
【００２６】
（２）ｐＨの影響
種々のｐＨの１００ｍＭマッキーベン緩衝液中、マンノース１．８Ｍ、α−ＣＤ０．３６Ｍの基質にマンノース１ｇあたり５５．６単位のタチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を加え、６０℃で７日間反応させ、加熱によって酵素反応を停止した後、生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、図１２に示すように、至適ｐＨはｐ−ニトロフェニルα−マンノシドを基質に用いた加水分解反応の場合と同じであった。
【００２７】
（３）温度の影響
マンノース１．８Ｍ、α−ＣＤ０．３６Ｍ（１００ｍＭマッキーベン緩衝液、ｐＨ４．５）の基質にマンノース１ｇあたり５５．６単位のタチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を加え、各温度で１日および７日目にサンプリングし、加熱によって酵素反応を停止した後、生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、図１３に示すように、反応１日目では６５℃のときの生成率が高いが、反応７日目では酵素の失活のため、６５℃よりも６０℃のときが最も高かった。
【００２８】
（４）α−ＣＤ濃度の影響
マンノースを１．８Ｍに固定し、α−ＣＤ濃度を０．２〜０．５Ｍ（１００ｍＭマッキーベン緩衝液、ｐＨ４．５）とした基質にマンノース１ｇあたり５５．６単位のタチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を加え、６０℃で反応させ、１日および７日目にサンプリングし、加熱によって酵素反応を停止した後、生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、α−ＣＤの増加に伴って縮合生成物の生成量は増加したが、図１４に示すように、α−ＣＤあたりの生成率は低下した。
【００２９】
（４）マンノース濃度の影響
α−ＣＤを０．３６Ｍに固定し、マンノース濃度を０．５〜３．５Ｍ（１００ｍＭマッキーベン緩衝液、ｐＨ４．５）とした基質にα−ＣＤ１ｇあたり５１．４単位のタチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を加え、６０℃で７日間反応させ、加熱によって酵素反応を停止した後、生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、図１５に示すように、反応１日目では大きな差はないが、７日目ではマンノース濃度の増加に伴い生成率は増加した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、α−マンノシダーゼの縮合反応を利用して、ＣＤ分子中の水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤを効率よく得ることができる。本発明の方法により得られるマンノシル−ＣＤは、医薬品分野のほか食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明により得られる分岐ＣＤの構造を示す。
【図２】  本発明により得られる分岐ＣＤの構造を示す。
【図３】  本発明により得られる分岐ＣＤの構造を示す。
【図４】  実施例１の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図５】  実施例１の反応生成物Ａの高速液体クロマトグラフである。
【図６】  実施例１の反応生成物Ａの酵素分解液の高速液体クロマトグラフである。
【図７】  実施例１の反応生成物Ａの13Ｃ−ＮＭＲ解析スペクトルである。
【図８】  実施例１の反応生成物ＢおよびＣの高速液体クロマトグラフである。
【図９】  実施例２の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図１０】  実施例３の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図１１】  実施例４の酵素添加量を変えた場合の生成率の経時的変化を示すグラフである。
【図１２】  実施例４の反応の至適ｐＨを示すグラフである。
【図１３】  実施例４の反応の至適温度を示すグラフである。
【図１４】  実施例４のＣＤ濃度を変えた場合の生成率の変化を示すグラフである。
【図１５】  実施例４のマンノース濃度を変えた場合の生成率の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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