【手続補正書】
【提出日】令和3年4月15日(2021.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を以下に記載した順で含む、試料中の特定の配列を有する低分子干渉RNA(siRNA)を定量する方法、但し、工程(iii)と工程(iv)は互いに順序を入れ替えることができる:
(i)当該siRNAを含む又は含むことが疑われる試料にポリAポリメラーゼ(ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ)及びアデノシン三リン酸(ATP)をポリAポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、前記試料中のsiRNAをポリアデニル化する工程;
(ii)随意により、前記試料を熱処理することによりポリAポリメラーゼを熱失活させる工程;
(iii)前記の随意により熱失活工程を行った試料に、当該siRNAを捕捉するための固定化プローブを接触させる工程、ここで、当該固定化プローブは、表面に第1の蛍光物質を有するビーズと、当該siRNAの一方の鎖に特異的に結合する核酸ハイブリダイゼーションプローブとを含み、当該核酸ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも連続する15merの部分が前記siRNAの前記一方の鎖に対して完全に相補的な配列を含み;
(iv)前記固定化プローブとの接触工程を行った前記試料に、自己凝集可能な第1のオリゴヌクレオチド及び第2のオリゴヌクレオチドを接触させる工程、ここで、第1のオリゴヌクレオチドはポリA配列に対してハイブリダイズ可能であり、第1及び第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方は標識物質により標識されている;
(v)前記固定化プローブ及びポリアデニル化された当該siRNAの当該一方の鎖及び自己凝集した第1及び第2のオリゴヌクレオチドの4成分複合体を遠心分離法により沈殿させる工程;
(vi)随意により、前記沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離法により沈殿させる工程;
(vii)前記(v)又は(vi)工程の沈殿に第2の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体を緩衝液中で接触させ、蛍光物質反応液を得る工程;
(viii)前記固定化プローブ及びポリアデニル化された当該siRNAの当該一方の鎖及び自己凝集した第1及び第2のオリゴヌクレオチド及び前記抱合体の5成分複合体を遠心分離法により沈殿させる工程;
(ix)随意により、前記沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離法により沈殿させる工程;
(x)前記(viii)又は(ix)工程の沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー法を用いて、第1の蛍光物質が発する第1の蛍光と第2の蛍光物質が発する第2の蛍光を検出する工程。
【請求項２】
低分子干渉RNA(siRNA)を定量する方法であって、請求項1記載の工程(x)の後に、
(xi)第1の蛍光と第2の蛍光が同時に検出される場合における第2の蛍光の強度を、当該siRNAを既知の濃度で含む対照試料において第1の蛍光と第2の蛍光が同時に検出される場合における第2の蛍光の強度と比較することにより、前記試料中の当該siRNAの濃度を決定する工程を含む請求項1記載の方法。
【請求項３】
試料は、ヒト、げっ歯類動物(ラット、マウス、モルモット)又は非げっ歯類動物(サル、イヌ、ブタ)の体液(全血、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、涙液、汗、胃液、膵液、胆汁、胸水、関節腔液、脳脊髄液、髄液、骨髄液)又は組織(肝臓、腎臓、肺、心臓)である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
第1のオリゴヌクレオチドが、5'末端側から順に少なくとも核酸領域X、核酸領域Y、及び核酸領域Zを含むオリゴヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチドが、5'末端側から順に少なくとも前記核酸領域Xに相補的な核酸領域X'、前記核酸領域Yに相補的な核酸領域Y'、及び前記核酸領域Zに相補的な核酸領域Z'を含むオリゴヌクレオチドである請求項1〜3の何れかに記載の方法
【請求項５】
前記核酸領域ZがポリT配列を含み、かつ、前記核酸領域Z'がポリA配列を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
第1のオリゴヌクレオチドが配列番号14で表されるオリゴヌクレオチドである請求項1〜5の何れかに記載の方法。
【請求項７】
第2のオリゴヌクレオチドが配列番号15で表されるオリゴヌクレオチドである請求項1〜6の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ビーズは、直径が1〜10μmの磁性または非磁性ポリスチレン製ビーズである、請求項1〜7の何れかに記載の方法。
【請求項９】
核酸ハイブリダイゼーションプローブは、前記siRNAの前記一方の鎖の15mer以上の連続する部分に対して完全に相補的な配列を含む、請求項1〜8の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
第1及び第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方は標識物質により標識されており、第1及び第2のオリゴヌクレオチドの標識はビオチン化することにより行われる、請求項1〜9の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
第2の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体は、ストレプトアビジン-フィコエリスリン(SAPE)抱合体である、請求項1〜10の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
洗浄緩衝液は、界面活性剤及び/又は血清アルブミンを含む、請求項1〜11の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
第2の蛍光の強度は中央値蛍光強度である、請求項1〜12の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
沈殿と、第2の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体との接触工程は、界面活性剤及び/又は血清アルブミンを含む緩衝液中で行われる、請求項1〜13の何れかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
従って、本発明は以下の構成を有する。
[実施態様1]
以下の工程を以下に記載した順で含む、試料中の特定の配列を有する低分子干渉RNA(siRNA)を定量する方法、但し、工程(iii)と工程(iv)は互いに順序を入れ替えることができる:
(i)当該siRNAを含む又は含むことが疑われる試料にポリAポリメラーゼ(ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ)及びアデノシン三リン酸(ATP)をポリAポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、前記試料中のsiRNAをポリアデニル化する工程;
(ii)随意により、前記試料を熱処理することによりポリAポリメラーゼを熱失活させる工程;
(iii)前記の随意により熱失活工程を行った試料に、当該siRNAを捕捉するための固定化プローブを接触させる工程、ここで、当該固定化プローブは、表面に第1の蛍光物質を有するビーズと、当該siRNAの一方の鎖に特異的に結合する核酸ハイブリダイゼーションプローブとを含み、当該核酸ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも連続する15merの部分が前記siRNAの前記一方の鎖に対して完全に相補的な配列を含み;
(iv)前記固定化プローブとの接触工程を行った前記試料に、自己凝集可能な第1のオリゴヌクレオチド及び第2のオリゴヌクレオチドを接触させる工程、ここで、第1のオリゴヌクレオチドはポリA配列に対してハイブリダイズ可能であり、第1及び第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方は標識物質により標識されている;
(v)前記固定化プローブ及びポリアデニル化された当該siRNAの当該一方の鎖及び自己凝集した第1及び第2のオリゴヌクレオチドの4成分複合体を遠心分離法により沈殿させる工程;
(vi)随意により、前記沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離法により沈殿させる工程;
(vii)前記(v)又は(vi)工程の沈殿に第2の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体を緩衝液中で接触させ、蛍光物質反応液を得る工程;
(viii)前記固定化プローブ及びポリアデニル化された当該siRNAの当該一方の鎖及び自己凝集した第1及び第2のオリゴヌクレオチド及び前記抱合体の5成分複合体を遠心分離法により沈殿させる工程;
(ix)随意により、前記沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離法により沈殿させる工程;
(x)前記(viii)又は(ix)工程の沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー法を用いて、第1の蛍光物質が発する第1の蛍光と第2の蛍光物質が発する第2の蛍光を検出する工程。
[実施態様2]
低分子干渉RNA(siRNA)を定量する方法であって、実施態様1記載の工程(x)の後に、
(xi)第1の蛍光と第2の蛍光が同時に検出される場合における第2の蛍光の強度を、当該siRNAを既知の濃度で含む対照試料において第1の蛍光と第2の蛍光が同時に検出される場合における第2の蛍光の強度と比較することにより、前記試料中の当該siRNAの濃度を決定する工程を含む実施態様1記載の方法。
[実施態様3]
試料は、ヒト、げっ歯類動物(ラット、マウス、モルモット)又は非げっ歯類動物(サル、イヌ、ブタ)の体液(全血、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、涙液、汗、胃液、膵液、胆汁、胸水、関節腔液、脳脊髄液、髄液、骨髄液)又は組織(肝臓、腎臓、肺、心臓)である、実施態様1又は2に記載の方法。
[実施態様4]
第1のオリゴヌクレオチドが、5'末端側から順に少なくとも核酸領域X、核酸領域Y、及び核酸領域Zを含むオリゴヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチドが、5'末端側から順に少なくとも前記核酸領域Xに相補的な核酸領域X'、前記核酸領域Yに相補的な核酸領域Y'、及び前記核酸領域Zに相補的な核酸領域Z'を含むオリゴヌクレオチドである実施態様1〜3の何れかに記載の方法
[実施態様5]
前記核酸領域ZがポリT配列を含み、かつ、前記核酸領域Z'がポリA配列を含む、実施態様4に記載の方法。
[実施態様6]
第1のオリゴヌクレオチドが配列番号14で表されるオリゴヌクレオチドである実施態様1〜5の何れかに記載の方法。
[実施態様7]
第2のオリゴヌクレオチドが配列番号15で表されるオリゴヌクレオチドである実施態様1〜6の何れかに記載の方法。
[実施態様8]
ビーズは、直径が1〜10μmの磁性または非磁性ポリスチレン製ビーズである、実施態様1〜7の何れかに記載の方法。
[実施態様9]
核酸ハイブリダイゼーションプローブは、前記siRNAの前記一方の鎖の15mer以上の連続する部分に対して完全に相補的な配列を含む、実施態様1〜8の何れかに記載の方法。
[実施態様10]
第1及び第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方は標識物質により標識されており、第1及び第2のオリゴヌクレオチドの標識はビオチン化することにより行われる、実施態様1〜9の何れかに記載の方法。
[実施態様11]
第2の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体は、ストレプトアビジン-フィコエリスリン(SAPE)抱合体である、実施態様1〜10の何れかに記載の方法。
[実施態様12]
洗浄緩衝液は、界面活性剤及び/又は血清アルブミンを含む、実施態様1〜11の何れかに記載の方法。
[実施態様13]
第2の蛍光の強度は中央値蛍光強度である、実施態様1〜12の何れかに記載の方法。
[実施態様14]
沈殿と、第2の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体との接触工程は、界面活性剤及び/又は血清アルブミンを含む緩衝液中で行われる、実施態様1〜13の何れかに記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
洗浄緩衝液: 本発明の方法に使用する「洗浄緩衝液」は、0.01〜0.05%、好ましくは、0.02%のTween20等の非イオン性界面活性剤及び0.01〜1%、0.02〜0.5%、0.05〜0.2%、好ましくは、0.1%の血清アルブミン又はウシ血清アルブミンを含む。好ましくは、非イオン性界面活性剤はTween20である。更に好ましくは、「洗浄緩衝液」は、1×PBS、0.02%Tween20、及び0.1%BSAを含む。より更に好ましくは、「洗浄緩衝液」は、1×PBS、0.02%Tween20、1.5ppm ProClinTM300、及び0.1%BSAを含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
再懸濁したビーズを含むPCRプレートをフローサイトメーター(Luminex社製、Luminexシステム)にセットし、当該フローサイトメーターを用いてビーズ及びSAPE抱合体からの蛍光を検出した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
「siRNA溶液」: 測定対象のsiRNAを、以下の濃度でNuclease-Free Waterに溶解し、siRNA溶液を調製した: siLucについては0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、及び10fmol/μL; siGFPについては0.04、0.1、0.3、1、3、10、及び30fmol/μL; siGAPDHについては0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、及び0.5 fmol/μL。siRNAを含まないブランクサンプルも用意した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
「1×PBS-TP(0.1% BSA)」: 最終濃度が137 mM NaCl、2.68 mM KCl、8.1 mM Na2HPO4、1.47 mM KH2PO4、0.02% Tween20、1.5ppm ProClinTM300(Merck社、製品番号: 48912-U)、及び0.1% BSAとなるように、1×PBS-TP(0.1% BSA)を調製した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
再懸濁したビーズを含むPCRプレートを遮光下、25℃で5分間静置後、フローサイトメーター(Luminex社製、Luminexシステム)にセットし、当該フローサイトメーターを用いてビーズ及びSAPE抱合体からの蛍光を検出した。