(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知濃度のレセプターに対し、既知濃度の該レセプターに対するリガンドと測定対象物質とを競合的に溶液中において反応せしめた後、該レセプターと結合した該リガンドを物理的に除去する工程を経ることなく遊離リガンドを含む溶液を得、該溶液中における未結合状態のリガンド量を測定し、該未結合状態のリガンド量を測定対象物質のレセプターに対する結合能の指標とするレセプター結合能の測定方法であって、該未結合状態のリガンド量を１種類以上のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いて測定し、ここで、リガンドがエストロゲン、アンドロゲンまたはサイロイドホルモンからなる群から選択されるいずれかであり、レセプターが、エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプターまたはサイロイドホルモンレセプターからなる群から選択されることを特徴とするレセプター結合能の測定方法。
【請求項２】
該モノクローナル抗体もしくは該ポリクローナル抗体が、１％有機溶媒濃度中において６０％以上の活性が保持される抗体である請求項１記載のレセプター結合能の測定方法。
【請求項３】
該リガンドが標識、結合、加工、変性のいずれの処理も施されていないリガンドである請求項１記載のレセプター結合能の測定方法。
【請求項４】
該リガンドが該レセプターと反応した場合に、その５０％以上が該レセプターに結合しうるリガンド量である請求項１記載のレセプター結合能の測定方法。
【請求項５】
既知濃度のレセプターを含有する試薬、既知濃度の該レセプターに対するリガンドを含有する試薬、および１種類以上のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を含有する該リガンド量を測定するための試薬を含むことを特徴とし、ここで、リガンドがエストロゲン、アンドロゲンまたはサイロイドホルモンからなる群から選択されるいずれかであり、レセプターが、エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプターまたはサイロイドホルモンレセプターからなる群から選択されるものであるレセプター結合能測定用試薬。」
【請求項６】
該モノクローナル抗体もしくは該ポリクローナル抗体が、１％有機溶媒濃度中において６０％以上の活性が保持される抗体である請求項５記載のレセプター結合能測定用試薬。
【請求項７】
該リガンドが標識、結合、加工、変性のいずれの処理も施されていないリガンドである請求項６記載のレセプター結合能測定試薬。
【請求項８】
該リガンドが該レセプターと反応した場合に、その５０％以上が該レセプターに結合しうるリガンド量である請求項７記載のレセプター結合能測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体試料、海水、河川水、地下水等の水試料中におけるレセプター結合性物質あるいは化学物質のレセプター結合性を測定する方法、および該方法に用いられる測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内において生じる様々な生化学反応に関して、その反応を誘起する物質が関与していることが近年報告されてきている。これらの物質は該物質に対する生体内のレセプターと結合後、シグナル伝達物質の放出を誘起することによって反応が生じている。レセプターには、大きく分けて細胞膜上に存在するものと、細胞内もしくは核内に存在するものがある。
【０００３】
細胞膜上に存在するものとしては、アドレナリンレセプター、黄体形成ホルモンレセプター等のホルモンレセプターが挙げられ、その多くはリガンドの存在に伴うチロシンキナーゼ、アデニル酸シクラーゼ等を介したシグナルの伝達、増幅を通じて細胞内における制御を行う。また、核内、細胞内に存在するものの例としては、エストロジェンレセプター、レチノイドレセプターなどが挙げられる。また、トランスフェリンなど、血液中でキャリアとして働く様なレセプターも存在する。特に核内レセプターの作用機序は、まず核内レセプターとリガンドが結合することによって、レセプターの核酸結合領域が活性化され、核酸と結合し該領域の転写・翻訳を調節することによって生体内の様々な反応をコントロールしていると考えられている。
【０００４】
このように、物質とレセプターの結合については、生体内の様々な反応を示すモデルとして調査、研究されている。レセプターとは、ホルモン、生化学的メッセンジャー、ステロイド、薬物、薬物代謝物、ポリペプチド、蛋白質、ビタミン、アルカノイド、単糖、二糖または多糖に対して結合能を有するものであって、抗体を除く物質のことである。
【０００５】
現在ある物質のレセプターに対する結合能を判定するin vitroの方法としては、放射性同位元素を用いる方法（オボーン，Ｊ．Ｄ．ら、Biochemistry、第３２巻、第６２２９〜６２３６頁、１９９３年）、蛍光偏光消光法を用いる方法（ボルガー，Ｒ．ら、Environmental Health Perspectives、第１０６巻、第５５１〜５５７頁、１９９８年）、表面プラズモン共鳴を利用する方法（ワード，Ｌ，Ｄ．ら、Journal of Biological Chemistry、第２６９巻、第２３２８６〜２３２８９頁、  １９９４年）、マイクロカロリメーターを用いて熱力学的に測定する方法（ムーア，Ｊ．Ｌ．ら、Journal of Biological Chemistry、第２７１巻、第２１２７３〜２１２７８頁、１９９６年）等が挙げられる。
【０００６】
また、in vivoの方法としては、培養細胞を用いる方法（ソト，Ａ．Ｍ．ら、Environmental Health Perspectives、第１０３巻(suppl.)、第１１３〜１２２頁、１９９５年）、組換え酵母を用いる方法（アーノルド，Ｓ．Ｆ．ら、Enviromental Health Perspectives、第１０４巻、第５４４〜５４８頁、１９９６年)など、様々な方法が報告され、また実用化されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来報告されている、ボルガーらによる様な蛍光偏光消光法を用いる方法は、蛍光標識したトレーサーと測定しようとする物質を、レセプターに対して競合的に反応させ、レセプターと結合したトレーサーの蛍光が消光することによって物質量を測定する方法である。この方法では、蛍光標識したトレーサーを用いることに伴う反応性の低下に加え、試料中に含有される蛍光物質の影響あるいは濁度の影響を受けるという問題がある。
【０００８】
オボーンらによる放射性同位元素を用いる方法は、放射性同位元素で標識したトレーサーと測定しようとする物質を、レセプターに対して競合的に反応させ、レセプターと結合したトレーサーの放射性同位元素量を測定する方法である。この方法では、放射性同位元素を使用することに伴う設備上、作業上の問題があるため、特定の施設でしか用いることができないという問題がある。
【０００９】
また、ワードらによる表面プラズモン共鳴を利用する方法は、測定しようとする物質に対して、固定化したレセプターを用い、測定対象物とレセプターとの直接的な分子相互作用を解析する優れた方法である。しかしながら、多検体同時処理ができない、使用するセンサーチップが高価であるのに加え、特殊な装置を必要とする問題がある。
【００１０】
さらに、ムーアらによる熱力学的に測定する方法は、レセプターの固定化が不要であり、標識トレーサーも用いないことから非常に優れた方法であるが、同時多検体処理ができない、特殊な装置が必要であるなどの問題が指摘されている。
【００１１】
また、近年内分泌撹乱化学物質（ＥＤＣ）に関する広範囲なスクリーニングが必要とされており（遠山千春；ホルモンと臨床、第４６巻、第５１７〜５２８頁、１９９８年）、既存あるいは新規の数万種類の化学物質に対する結合能を調べる必要が生じている。上述したような従来の方法においては、同時多検体処理をすることが困難であるため、膨大な労力と時間が必要である。レセプターと化学物質との相互作用について、いわゆるハイスループットの概念に対応した測定手段は早急に望まれてきている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情に鑑み、レセプターに対する結合能を測定する方法において、レセプターを固定することなくかつ特殊な装置を用いず、同時多検体処理可能な方法および試薬の可能性について鋭意追求した結果、レセプターに対してリガンドと測定対象物質とを競合的に溶液中において反応せしめた後、レセプターと結合したリガンドを物理的に除去する工程を経ることなく溶液中における未結合状態のリガンド量を測定することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下のような構成から成る。
（１）既知濃度のレセプターに対し、既知濃度の該レセプターに対するリガンドと測定対象物質とを競合的に溶液中において反応せしめた後、該レセプターと結合した該リガンドを物理的に除去する工程を経ることなく該溶液中における未結合状態のリガンド量を測定し、該未結合状態のリガンド量を測定対象物質のレセプターに対する結合能の指標とすることをレセプター結合能の測定方法であって、該未結合状態のリガンド量を１種類以上のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を用いて測定することを特徴とするレセプター結合能の測定方法。
（２）該モノクローナル抗体もしくは該ポリクローナル抗体が、１％有機溶媒濃度中において６０％以上の活性が保持される抗体である（１）のレセプター結合能の測定方法。
（３）該リガンドが標識、結合、加工、変性のいずれの処理も施されていないリガンドである（１）のレセプター結合能の測定方法。
（４）該リガンドが該レセプターと反応した場合に、その５０％以上が該レセプターに結合しうるリガンド量である（１）のレセプター結合能の測定方法。
（５）該レセプターが、ホルモン、薬物およびその代謝物、ポリペプチド、蛋白質、糖類、生化学的メッセンジャー、ビタミンに対するレセプターおよびそれらのリガンド結合断片よりなる群から選ばれたものである（１）のレセプター結合能の測定方法。
（６）既知濃度のレセプターを含有する試薬、既知濃度の該レセプターに対するリガンドを含有する試薬、および１種類以上のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を含有する該リガンド量を測定するための試薬を含むことを特徴とするレセプター結合能測定用試薬。
（７）該モノクローナル抗体もしくは該ポリクローナル抗体が、１％有機溶媒濃度中において６０％以上の活性が保持される抗体である（６）のレセプター結合能測定用試薬。
（８）該リガンドが標識、結合、加工、変性のいずれの処理も施されていないリガンドである（６）のレセプター結合能測定試薬。
（９）該リガンドが該レセプターと反応した場合に、その５０％以上が該レセプターに結合しうるリガンド量である（６）のレセプター結合能測定試薬。
（１０）該レセプターが、ホルモン、薬物およびその代謝物、ポリペプチド、蛋白質、糖類、生化学的メッセンジャー、ビタミンに対するレセプターおよびそれらのリガンド結合断片よりなる群から選ばれたものである（６）のレセプター結合能測定試薬。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の概略は天然化合物あるいは人工的に合成された化合物のレセプターに対する結合能を判定する方法において、標識されていないリガンドとレセプター上の結合部位において競合的に反応させた後、該反応溶液中のリガンドの濃度を測定するものである。本発明においてレセプターとは、具体的には、ホルモン、薬物およびその代謝物、ポリペプチド、蛋白質、糖類、生化学的メッセンジャー、ビタミンに対するレセプターおよびそれらのリガンド結合断片等が挙げられ、いわゆる生体膜上のレセプター（黄体形成ホルモンレセプター、卵胞刺激ホルモンレセプター、ヒトコリオゴナドトロピンレセプター、甲状腺刺激ホルモンレセプター等）と核内および細胞質内レセプター（エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、ペルオキシソーム増殖活性化レセプター、グルココルチコイドレセプター、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、サイロイドレセプター、ユビキノンレセプター、ビタミンＤレセプター、ミネラルコルチコイドレセプター等）あるいは血清中に存在するキャリアーとしてのレセプター（サイログロブリン、トランスフェリンなど）を包括する。従って本発明におけるリガンドについても、これらレセプターに対応した黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒトコリオゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、ペルオキシソーム、グルココルチコイド、レチノイン酸、レチノイドＸ、サイロイド、ユビキノン、ビタミンＤ、ミネラルコルチコイド、鉄等を意味するものである。
【００１５】
レセプターへの測定対象物質とリガンドの結合比はその存在比および各々の結合定数によって定められる。従って、一定濃度のレセプターとリガンドが存在する場合、レセプターに結合するリガンドの比率は一定である。しかしながら、レセプターと結合能を有する物質が存在する場合、その存在量にしたがって、結合するリガンドの量は減少し、遊離状態のリガンドの量が増加する。このリガンドの濃度の変化を公知の方法を用いて測定することによって、間接的にレセプターに対する結合能の判定が可能となる。
【００１６】
本発明の重要な特徴は、レセプターに対する結合能を判定するために、そのレセプターに対し予め結合することが判明しているリガンドを添加し、レセプターの結合部位上で測定対象物質とリガンドを競合的に反応させた後、レセプターと結合したリガンドを物理的に除去する工程を経ることなく、その反応溶液のまま遊離状態のリガンドの量を測定することにある。この方法によると、従来のように、レセプターあるいはリガンドを不溶性担体に固定化する必要もなく、また、レセプターに対し競合的に反応させるリガンドは標識されないため、反応性の低下も生じない。しかもリガンドはレセプターに対して結合能を有するものであればいかなるものでもよく、経済的にかつ効率良く測定できるものを選択することが可能である。ここで、物理的に除去する工程とは、従来から行われているような、洗浄操作、フィルターによる濾過、あるいは磁気を用いた分離などの一般的な手法によるレセプターと結合したリガンドを分別する工程をいうものである。
【００１７】
近年、特に測定の要求度の高い内分泌撹乱化学物質をスクリーニングするためのレセプターとリガンドの組合わせとしては特に限定されるものではないが、好適な例としては、例えば、エストロジェンレセプターとエストラジオール、エストロン、エストリオール、あるいは甲状腺ホルモンレセプターとサイロキシン、トリヨードサイロニン等が挙げられる。なお、当然ながら、これら以外のレセプターとリガンドの組合せにおいても、本発明における測定方法を用いることが可能である。
【００１８】
上記リガンドは、標識、結合、加工、変性のいずれの処理も施されていないものを用いるのが好ましい。また、使用するレセプターの添加量としては、共存するリガンドの５０％以上を結合できる量が好適に用いられる。この濃度より少ない場合リガンドの濃度の変化は非常に少なくなるためレセプターに対する結合能を判定することが困難となる。
【００１９】
遊離のリガンドの濃度を測定する方法としては、既存の方法であれば特に限定されるものではないが、分光光学的方法または、蛍光・発光測定により測定されることが望ましい。分光光学的方法を用いて測定する場合、固定化した抗リガンド抗体に対して、酵素標識したリガンドを競合的に反応させることによって測定する方法が一般的に用いられる。標識に使用される酵素としては、パーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等を用いることができるが、好適にはパーオキシダーゼが使用される。また、蛍光・発光測定する場合は、酵素標識に代えて蛍光標識、発光標識等が使用される。蛍光標識としては、フルオレセイン、ローダミン等が挙げられる。発光標識としては、アクリジニウムエステル、エコーリンのような発光タンパク、ルシフェラーゼのような酵素が用いられる。
【００２０】
本発明において使用される抗体は、リガンドの測定が可能な抗体であればその由来、性状等は特に限定されるものではない。該抗体はモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体のいずれであってもよい。試料中に抗体に反応する物質が存在する場合、該物質の測定への影響を回避する目的で該物質に対する抗体を試薬中に添加することが望ましい。また、抗体を水不溶性担体に固相する際、配向性を高めるため使用する抗体に対する抗体を予め水不溶性担体に固相化する方法も用いられる。その他、プロテインＡまたはプロテインＧを予め固定化した後抗体を固相化する方法、ビオチン化した抗体をストレプトアビジンまたはアビジンを予め固定化した水不溶性単体に固相化するなど、公知の固相化方法を使用することが可能である。
【００２１】
また測定対象となる物質の中には水に対する溶解度が低いものも存在するため、試料を溶解するために有機溶媒が使用される。この場合、使用する抗体としては、有機溶媒１％濃度において６０％以上の抗体活性を保持するものが望ましい。また、使用する有機溶媒は特に限定されるものではないが、好適にはメタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、エタノール等を使用することができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例を用いて、本発明を詳細に説明する。なお、以下の実施例により、本発明は何ら限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  エストロジェンレセプター結合能の判定
試薬組成１
エストロジェンレセプター : 100nM  (10mMリン酸緩衝液；150mM NaCl，pH7.2)
17βエストラジオール： 33nM (10mMリン酸緩衝液；150mM NaCl，pH7.2)
試薬組成２
抗エストラジオール抗体固相プレート
ＨＲＰ標識エストラジオール
試料
ジエチルスチルベステロール(0，3.3,10,33,100,333,1000ng/ml)
【００２４】
測定方法
試料３０μlとエストロジェンレセプター溶液２０μlを混合後、17βエストラジオール溶液３０μlを添加し、３７℃にて１hrインキュベートを行う。インキュベート後、溶液５０μlを抗エストラジオール抗体固相プレートに分注を行う。同時にＨＲＰ（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）標識エストラジオール溶液を５０μl分注し、３７℃にて１hrインキュベートを行う。インキュベート後、０．１５ＭＮａＣｌ、 ０．０５％ Tween 20を含有する１０mMリン酸緩衝液にて、３回洗浄を行う。洗浄後、ＯＰＤ溶液（ｏ−フェニレンジアミン）を５０μl添加し、３７℃にて２０minインキュベートを行う。インキュベート後、１Ｎ硫酸１００μl添加し、４９０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００２５】
【表１】
0003649319.tif 000002
【００２６】
ジエチルスチルベステロール濃度に従って、吸光度の減少が認められることから、ジエチルスチルベステロールは、エストロジェンレセプターに結合能を有することを定量的に判定することが可能であることが確認された。
【００２７】
実施例２  エストロジェンレセプター結合能の判定
試薬組成１
エストロジェンレセプター : 100nM  (10mMリン酸緩衝液；150mM NaCl，pH7.2)
17βエストラジオール： 33nM (10mMリン酸緩衝液；150mM NaCl，pH7.2)
抗エストラジオール抗体固相プレートＡ
ＨＲＰ標識エストラジオール
試薬組成２
エストロジェンレセプター : 100nM (10mMリン酸緩衝液；150mM NaCl，pH7.2)
17βエストラジオール： 33nM (10mMリン酸緩衝液；150mM NaCl，pH7.2)
抗エストラジオール抗体固相プレートＢ
ＨＲＰ標識エストラジオール
試料
ジエチルスチルベステロール(０、1000ng/ml；ＰＢＳ調製、１％ＤＭＳＯ溶液調製)
測定方法
実施例１と同様にして測定を行った。
【００２８】
【表２】
0003649319.tif 000003
【００２９】
ジエチルスチルベステロール濃度に伴う吸光度変化は、使用する抗体によって変化することが確認された。有機溶媒存在下において反応性の低下が認められる抗体を用いた場合、吸光度変化が小さいため判定することが困難となる。
【００３０】
【発明の効果】
上述したように、本発明の測定方法は、溶液中でレセプターに対するリガンドと測定対象物質とを競合反応した後、該レセプターと結合した該リガンドを物理的に除去することなく、その反応溶液のまま未結合状態のリガンドを測定することにより、効率的にしかも精度よく、レセプター結合性物質をアッセイすることを可能とならしめるものである。