(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞の増殖を促進ための薬剤を調整するための配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号11、配列番号31およびGSD28（DRVYIHPI）からなるグループから選択される少なくとも一つを含む活性物質の使用。
【請求項２】
上記薬剤が腫瘍患者を治療するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記薬剤が腫瘍患者に対し、化学療法もしくは放射線療法処理を増強するために用いられることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
上記薬剤が移植治療するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
上記薬剤がマクロファージの活性を刺激するために用いられることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
相互参照
本出願は、1998年１月23日に提出された出願番号の指定される予定の米国出願の継続出願であり、1997年１月28日に提出された米国仮出願番号60/036,507号;1997年５月８日に提出された米国仮出願番号60/046,859号;1997年10月28日に提出された米国仮出願番号60/063,684号;1997年10月31日に提出された米国仮出願番号60/063,910号;1997年11月18日に提出された米国仮出願番号60/065,612号；および1997年11月26日に提出された米国仮出願番号60/066,593号の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、造血および間葉細胞の増殖および分化を増進する時の方法および使用のためのキットに関する。
発明の背景
骨髄は、造血系または広範な間葉組織のいずれかを再構築する能力のある多能性幹細胞を含む。造血および間葉幹細胞が広範な系列特異的細胞タイプを生ずる機構は、まったく類似しない。
a.造血系
造血系は、長期再集団化許容性を示す多能性の自己更新の造血幹細胞（HPC）を含めた、末端で分化したものから非常に初期の系列特異的細胞までに及ぶ多数の細胞世代から構成される。（Traycoffら、エックスペリメンタル・ヘマトロジー（Experimental Hematology）24巻:299−306頁、1996年）。HPCは、多能性系列特異的細胞（HLSC）に末端で分化する能力を保有する多能性系列特異的細胞である。造血は、継続プロセスであり、したがって、HPCは、すぐに赤血球、血小板、単核細胞、顆粒球およびリンパ球に分化できるHLSCの継続的源を提供するに違いないる（Prockop、サイエンス（Science）276巻:71−74頁、1997年）。HPCは、「自己更新」によって増殖させて、HPC型子孫細胞を生成するか、または付随する分化で増殖させて、HLSCを生成する。（Traycoffら、supra）。
HPC移植療法は、様々の悪性および遺伝性疾患で成功してきたが、高用量化学療法または放射線療法を継続中の患者のための骨髄造血支持体をも供する。（Emerson、ブラッド（Blood）87巻、3082−3088頁、1996年）。しかし、幹細胞移植は、数種の特徴によって限定されてきた。最初に、輸血後利益に達するのに十分な品質の幹細胞を要求すると、広範囲な効力のある骨髄収穫物または広範なフェレーシス手段のいずれかが必要になる（Emerson、supra）。次に、これらの条件下でさえ、限定された数の有用な細胞のみが得られる。最終的に、輸血後の成熟血液細胞再生は、ゆっくりであり、その結果１から３週の期間で直接的利益はほとんど見られない（Emerson、supra）。
比較的純粋な集団のHPCおよびHLSCを単離する技術と組合せた造血細胞のインビトロ培養技術の開発は、それらのex  vivo拡張を可能にした（AlcornおよびHolyoake、ブラッド・リビューズ（Blood Reviews）10巻:167−176頁、1996年、これは、ここに参照して組込まれる）。自己更新および分化を伴う増殖の両方による成功したHPCのex  vivo拡張は、自家移植に必要とされる白血球フェレーシス手段の回数および期間を減少させること、したがってアフェレーシス製品中に疾患が混入する危険性を減少させることのような多くの医療上の利点を約束する（AlcornおよびHolyoake、supra）。さらに、ex  vivo拡張は、それぞれ自家移植および成体の同種異型の移植に十分な末梢血および臍帯血中でHPC集団を不適切にする。最終的に、HPCのex  vivo拡張は、一般に遺伝子療法ベヒクルとしてのそれらの有用性を増加させる（AlcornおよびHolyoake、supra）。同等に、HPCのex  vivo拡張は、自家移植に続く偏性好中球減少症の期間を減少させる拡張集団の骨髄性前駆体を再注入すること、養子免疫療法プロトコールに使用するためのナチュラルキラー細胞の発生、後期移植関連血小板減少症を軽減する巨核球前駆体の発生、および遺伝子療法のための送出系のさらに充分な発生のような実質的な臨床上の利益を約束する（AlcornおよびHolyoake、supra）。
化学療法および／またはサイトカイン治療によって動員されるヒト骨髄、臍帯血および末梢血系列特異的細胞は、悪性疾患を治療する高用量療法の投与を伴う移植のためのHPCの有効な源であると見なされた。（Holyoakeら、ブラッド（Blood）87巻、4589−4595頁、1996年）。いかなる造血細胞の源でも、ほとんどの研究は、CD34のようなHPC−特異的表層抗原の点で選択された培養細胞集団を使用した。これらの細胞は、多くの技術によって容易に得ることができる（AlcornおよびHolyoake、supra）。ex  vivo拡張造血細胞を使用した数種の臨床試験の結果は、適切な条件下ex  vivoで培養されたかなり少数のHPCが、血液学上の再構築を開始する可能性があることを示唆する（Emerson、supra）。
ex  vivo培養物中のHPCの生存および増殖は、成長因子を共同作用する組合せを必要とする。使用されるサイトカイン／成長因子組合せおよび培養系の選択は、主として培養を開始するのに使用される細胞の発生運命を決定する（AlcornおよびHolyoake、supra）。in  vivoで、血液細胞生成は、隣接骨髄支質細胞によって生成される多様な細胞結合および分泌因子を伴う造血幹細胞の作用によって局所的に調節されると考えられる（AlcornおよびHolyoake、supra）。培養用培地に成長因子およびサイトカインを添加するのは、支質関連活性の不在を補足することが意図される。HPCの生成（様々な組み合わせで）を増加させることが示された成長因子およびサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−CSF）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）、幹細胞因子（SCF）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−CSF）、およびインターロイキン１、３、６および11（Takaku、ジェイ．キャンサー・レス．クリン．オンコロ．（J.Cancer Res.Clin.Oncol.）121巻:701−709頁、1995年;Holyoakeら、上記で検討された）が挙げられる。反対に、今日までのところ報告されたほとんどの拡張培養物中のマクロファージ阻害タンパク−１α（MIP−１α）、腫瘍壊死因子α（TNF−α）または形質転換成長因子β（TGFβ）の封入は、HPCおよびHLSC収量を減少させる結果になる（Emerson、supra）。
造血細胞のex  vivo培養に最適な条件を明示するのに多くの努力が注がれた。HPCのex  vivo増殖速度を増加させる改善法は、HPC移植の臨床上の利益を大いに増大させる。これは、全造血系を再構築する能力のあるHPCのより多量の供給を提供する増大した「自己更新」について、そしてより多量の系列特異的細胞の供給を提供する分化をともなう増殖についての両方について当てはまる。同様に、HPCのin  vivo増殖を増大させる方法は、骨髄中のHPC（およびHLSC）の局所濃度を迅速に増大させることによりHPC移植療法の利用性を増強させる。さらに、HPCおよびHLSCの分化を生じる方法は、細胞療法で使用するための特異的細胞型の集団を供するのに有用である。
哺乳類HPCのトランスフェクションが、達成された（Larochelleら、ネーチャー・メディシン（Nature Medicine）２巻、1329−1337頁、1996年）。したがって、HPCおよびHLSCの増殖を増大させる方法は、遺伝子療法で使用するための大きな集団の遺伝子導入細胞を迅速に供するのにも有用である。
b.間葉幹細胞
間葉幹細胞（MSC）は、ヒトを含めた多くの生物で示されるとおり、骨、軟骨、腱、筋肉、骨髄支質、脂肪および真皮のような様々の間葉組織に分化する能力を保持する多能性前駆細胞である（Bruderら、ジェイ．セルル．バイオケム．（J.Cellul.Biochem.）56巻、283−294頁（1994年））。間葉組織の形成は、生涯を通して継続するが、胚芽より成体でさらにいっそうゆっくりと進行するメッセンジェニック過程として知られる（Caplan、クリニックス・イン・プラスチック・サージェリー（Clinics in Plastic Surgery）21巻、429−435頁（1994年））。成体でのメッセンジェニック過程は、修復過程であるが、しかし胚芽発生の間に生じる同じ細胞現象を包含する（Caplan、1994年、上記で検討された）。修復過程の間中、化学親和力は、MSCを、それらが裂け目を補う多量の細胞に増殖する修復部位に運ぶ。その後、これらの細胞は、関わり合いを受け、そして特定の系列経路（分化）に入り、そこで、それらは増殖する能力を残す。結局、様々な経路での細胞は、末端で分化し（そしてもはや増殖できない）、そして組織特異的サイトカインおよび成長因子の局所濃度によって制御されたプロセスで、合せて適切な骨格組織を形成する（Caplan、1994年、supra）。
最近、MSC−基礎修復プロセスのための限定因子が、修復部位で適当な数の反応性MSCの欠乏であるという仮説がたてられた（Caplan、1994年、supra）。したがって、修復部位が系列特異的成長因子および分化分子への適切な露出を供するので、十分量のMSCを特定組織部位に供給することによって、修復プロセスが、制御できることが示唆された（Caplan、1994年、supra）。この結末に対して、いくつかの動物研究は、間葉組織と結合した様々の欠陥を修復するための自己MSCを用いる実現可能性を示した。
（検討のために、Caplanら、前十字靭帯（The Anterior Cruciate Ligament）：現在および未来の構想（Current and Future Concepts）、D.W.Jackson編、ラベンプレス社、ニューヨーク、405−417頁（1993年）参照）。最近の研究は、収集、培養でのex  vivo拡張、およびヒトでのMSCの静脈注入の実行可能性について示した（Lazarusら、ボーン・マロウ・トランスプランテーション（Bone Marrow Transplantation）、16巻、557−564頁（1995年）;CaplanおよびHaynesworth、米国特許番号第5,486,359号、その全体で参照してここに組込まれる）。さらに、動物起源のMSCは、レトロウイルスと共に遺伝子導入され、そしてインビトロおよびin  vivoの両方で高いレベルの遺伝子発現を達成した（Allayら、ブラッド（Blood）、82巻、477A（1993年））。したがって、このような技術によるMSCの増幅は、再構築療法のための期待できる道具のようであり、そして遺伝子療法に有用である可能性がある。
適切な量のMSCおよびMSC系列特異的細胞が、in  vivoで、特に順次および／または疾病に罹った患者で存在しない場合、MSC療法は、高密度の修復成分細胞を欠陥部位に送出する手段として役割を果たすことができる。高密度のMSCを欠陥部位に有効に送出するために、多数のMSCを迅速に生成する方法が必要である。MSCは、インビトロで多数の成長因子に露出されたが、しかし、血小板由来の成長因子（PDGF）のみが有糸分裂活性を示した（Caplanら、1994年、supra）。MSCのex  vivo増殖速度を増加させる方法は、MSC療法の有用性を大いに増加させる。同様に、MSCのin  vivo増殖速度を増加させる方法は、修復部位でMSCの局所濃度を迅速に増加させることによって、MSC療法の有用性を増強させる。
さらに、骨髄支質細胞、破骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を含むがそれに限定されないMSCの系列特異的子孫の増殖速度を増強する方法は、適切な修復部位で系列特異的細胞型の濃度を増加させることによって、MSC療法の治療上の有用性を増強する。
発明の概要
１つの局面で、本発明は、造血幹および系列特異的細胞の増殖および分化を、そして細胞をアンギオテンシノジェン、アンギオテンシンＩ（A I）、A I類似体、A Iフラグメントおよびそれらの類似体、アンギオテンシンII（A II）、A II類似体、A IIフラグメントまたはそれらの類似体、またはA II AT2タイプ２レセプター作動薬と、単独または他の成長因子およびサイトカインと組合せて接触させることによって、間葉幹および系列特異的細胞増殖を促進する方法を提供する。
本発明の別の局面で、改善細胞培養培地が、造血幹および系列特異的細胞の増殖および分化に、そして間葉幹および系列特異的細胞の増殖に供給され、ここで改善は、有効量のアンギオテンシノジェンの細胞培養培地に、A I、A I類似体、A Iフラグメントおよびそれらの類似体、A II、A II類似体、A IIフラグメントまたはそれらの類似体、またはA II AT2タイプ２レセプター作動薬を加えることを包含する。
別の局面では、本発明は、造血および間葉幹および系列特異的細胞の繁殖用のキットを提供し、ここでそのキットは、細胞を有効量のアンギオテンシノジェン、A I、A I類似体、A Iフラグメントおよびそれらの類似体、A II、A II類似体、A IIフラグメントまたはそれらの類似体、またはA II AT2タイプ２レセプター作動薬で包含し、細胞培養培地補足物として有効量の活性剤を使用するための指示する。好ましい具体例では、キットは、さらに細胞培養用培地を包含する。別の好ましい具体例では、キットは、さらに細胞を培養するための滅菌容器を包含する。
発明の詳細な説明
ここに定義されるとおり、語句「HPC」は、広範な分化造血細胞型を生じさせる能力のあるあらゆる造血多能性前駆細胞に該当する。この定義内の細胞型としては、それに限定されないが、CD34+骨髄単核細胞（BMMC）（Berardiら、ブラッド（Blood）86巻、2123−2129頁、1995年）、PBSC（Fritschら、ボーン・マロウ・トランスプランテーション（Bone Marrow Transplantation）、17巻、169−178頁（1996年）、玉石領域形成細胞（CAFC）（Lemieuxら、ブラッド（Blood）86巻、1339−1347頁、1995年）および５−FU BM細胞（AlconおよびHolyoake、ブラッド・レビューズ（Blood Reviews）、10巻:167−176頁、1996年）が挙げられる。ここに定義されるとおり、語句「HLSC」は、造血系列特異的細胞に該当し、そして十分に分化した造血細胞と同様に、細胞特異的分化経路にゆだねられるHPCの子孫を包含する。ここに定義されるとおり、間葉幹細胞（MSC）は、骨、軟骨、腱、筋肉、骨髄支質、脂肪および真皮のような様々の間葉組織に分化する能力を保持する多能性前駆細胞であり、それに限定されないが、CaplanおよびHaynesworth、米国特許番号第5,486,359号に記載されるもののような細胞が挙げられる。ここに定義されるとおり、「増殖」は、付随する分化を伴う細胞自己更新および細胞増幅の両方を包含する。ここに定義するとおり、「分化」は、特異的系列経路に入ることおよび分化細胞の機能の活性化を包含する。
DiZeregaに対する米国特許番号第5,015,629号（その全開示は、参照されここに組込まれる）には、創傷組織を癒す速度を増加させる方法が記述され、それにより上記増加に十分である量で、アンギオテンシンII（A II）のこのような組織に適用することを包含する。創傷組織にA IIを適用することは、明らかに創傷治癒の速度を増加させ、それによりさらに迅速な再上皮形成および組織修復にいたる。語句A IIは、ヒトに存在するオクタペプチド、および配列Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe［配列番号:1］を示す他の種に該当する。アンギオテンシンの生物学的形成が、血漿基質アンギオテンシノジェンでのレニンの作用によって開始される（Cloustonら、ゲノミックス（Genomics）２巻、240−248頁（1988年）;Kageyamaら、バイオケミストリー（Biochemistry）23巻、3603−3609頁;Ohkuboら、プロク．ナトル．カカデ．サイ．（Proc.Natl.Acad.Sci.）80巻、2196−2200頁（1983年）；おのおのの文献は、全体にここに組込まれる）。そのように形成された物質は、A IからＣ末端His−Leu残基を除去する酵素アンギオテンシナーゼ［配列番号:38］を変換することによってA IIに変換されるアンギオテンシンＩ（A I）と称されるデカペプチドである。A IIは、公知プレッサー剤であり、そして市販で入手できる。
研究は、A IIが、創傷修復に含まれる培養細胞中で有糸分裂誘発および走化性を増加させ、そして成長因子および細胞外マトリックスのそれらの放出を増加させることを示した（diZerega、米国特許番号第5,015,629号;Dzauら、J.Mol.Cell.Cardiol.、21巻、S7（補足III）1989年;Berkら、Hypertension、13巻、305−14頁（1989年）;Kawaharaら、BBRC150巻、52−９頁（1998年）;Naftilanら、J.Clin.Invest.83巻、1419−23頁（1989年）;Taubmanら、J.Biol.Chem.264巻、526−530頁（1989年）;Nakaharaら、BBRC184巻、811−８頁（1992年）;StoufferおよびOwens、Circ.Res.70巻、820頁（1992年）;Wolfら、Am.J.Pathol.140巻、95−107頁（1992年）;BellおよびMadri、Am.J.Pathol.137巻、７−12頁（1990年））。さらに、A IIは、ウサギの角膜眼およびニワトリの雛の漿尿膜モデルで脈管形成性があることが示された（Fernandezら、J.Lab.Clin.Med.105巻:141頁（1985年）;LeNobleら、Eur.J.Pharmacol.195巻:305−６頁（1991年））。したがって、A IIは、新生血管形成の増加、成長因子放出、再上皮形成および／または細胞外マトリックスの生成によって、創傷修復を促進する可能性がある。しかし、アンギオテンシノジェン、A I、A I類似体、A Iフラグメントおよびそれらの類似体、A II、A II類似体およびそれらのフラグメント、またはA IIレセプター作動薬が、造血および間葉幹および系列特異的細胞の増殖および分化を促進するのに有用であるかどうかについて、文献では知れられていない。
AT2受容体用に選択されたペプチド作動物質（A IIはAT1よりもAT2に対して100倍高い親和性を有する）が同定されてきている。このペプチドはｐ−アミノフェニルアラニン６−A II［すなわち（ｐ−NH2Phe）６−A II］であり、Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−Xaa−Pro−Phe−［配列番号36］において、Xaaはｐ−NH2−Pheである（Speth and Kim,BBRC169:997−1006（1990年））。このペプチドは、実験モデル（Catalioto,et al.,Eur.J.Pharmacolog 256:93−97（1994年）;Bryson,et al.,Eur.J.Pharmacolog.225:119−127（1992年））において、AT2に匹敵する結合特性を有していた。
A II受容体およびA II受容体作動物質の効果は、脈管損傷とその修復を扱った２つの実験モデルにおいて検討されており、これら実験は、共に、A II受容体のサブタイプ（AT1およびAT2）が創傷治癒において役割を担っていることを示唆した（Janiak et al.,Hypertension20:737−45（1992年）;Prescott et al.,Am.J.Pathol.139:1291−1296（1991年））;Kauffman et al.,Life Sci 49:223−28（1991年）;Visuanathan,et al.,Peptides 13:783−786（1992年）;Kimura,et al.,BBRC 187:1083−1090（1992年）。
多数の研究は、A II（１−７）（すなわちA II残基１−７）又は、A IIのその他のフラグメントに焦点をあて、これらの活性を評価していた。A II（１−７）は、A IIによって引用される範囲の全部ではなく一部を対象に引用していた（Pfeilschifter et al.,Eur J.Pharmacol.225:57−62（1992年）;Jaiswal et al.,hypertension 19（Supp.II）:II−49−II−55（1992年）;Edwards and Stack,J.Pharmacol Exper Ther 266:506−510（1993年）;Jaiswal et al.,J.Pharmacol.Exper.Ther.265:664−673（1991年）;Jaiswal,et al.,Hypertension 17:1115−1120（1991年）;Portsi,et al.,Br.J.Pharmacol.111:652−654（1994年）。
ここで定義するように、本発明に従って使用するAT2作動物質の好適なクラスは、A II、A II誘導体、又はこれの活性フラグメントから成り、この活性フラグメントは、A IIにおける６の位置にｐ−NH2−Pheを有する。ペプチド試薬に加えて、欠かすことのできないAT2作動物質活性を有するペプチド試薬（すなわちペプチド擬態物質）は、さらに本発明に従って使用されるよう意図されている。
本発明において特に興味のもたれる、活性を有するA II作動物質、A IIフラグメント及びこれらの誘導体は、式１において配列するR1−RR基のように少なくとも３つの連続するアミノ酸から構成されており、
R1−R2−R3−R4−R5−R6−R7−R8
ここでR1およびR2は共に以下の式で示す基
Ｘ−RA−RB−
を形成し、
ここでＸはＨまたは１個から３個のペプチド基であり、RAとRBの間の結合はアミノペプチダーゼＡによって断裂されやすい。
R3はVal、Ala、Leu、norLeu、Ile、Gly、Pro、Aib、Acpc及びTyrから構成される基より選択される。
R4はTyr、Tyr（PO3）２、Thr、Ser、homoSer及びazaTyrから構成される基より選択される。
R5はIle、Ala、Leu、norLeu、Val、及びGlyから構成される基より選択される。
R6はHis、Arg又は６−NH2−Pheであり、
R7はPro又はAlaであり、
R8はPhe、Phe（Br）、Ile、及びTyrから構成される基より選択され、R4を含有する配列は末端Tyr基より除外される。
本発明の実施時に有用なAT2作動物質の範疇に含まれる化合物には、R6がｐ−NH2−Pheであるとの制限を受けやすいA IIの誘導体が含まれる。
好適な実施の態様における１つのクラスにおいて、RAはAsp、Glu、Asn、Acpc（１−アミノシクロペンタンカルボキシ酸）、Ala、Me2Gly、Pro、Bet、Glu（NH2）、Gly、Asp（NH2）及びSarから適宜選択される。RBはAsp、Lys、Ala、Orn、Ser（Ac）、Sar、Ｄ−Arg及びＤ−Lysから適宜選択される。特に好適なRAとRBの組み合わせは、Asp−Arg、Asp−Lys、Glu−Arg及びGlu−Lysである。
このクラスにおいて特に好適な組み合わせは、以下のとおりである;A II、A III又はA II（２−８）、Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe［配列番号２］;A II（３−８）、すなわちdes1−A III又はA IVとして周知、Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe［配列番号３］;A II（１−７）、Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro［配列番号４］;A II（２−７）、Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro［配列番号５］;A II（３−７）、Val−Tyr−Ile−His−Pro［配列番号６］;A II（５−８）、Ile−His−Pro−Phe［配列番号７］;A II（１−６）、Asp−Arg−Val−Tyr−Ile−His−［配列番号８］;A II（１−５）、Asp−Arg−Val−Tyr−Ile［配列番号９］;A II（１−４）、Asp−Arg−Val−Tyr［配列番号10］；及びA II（１−３）、Asp−Arg−Val［配列番号11］。その他の好適な実施の態様には、Arg−norLeu−Tyr−Ile−His−Pro−Phe［配列番号12］及びArg−Val−Tyr−norLeu−His−Pro−Phe［配列番号13］が含まれる。さらにその他、本発明の目的に叶う実施の態様には、Asp−Arg−Pro−Tyr−Ile−His−Pro−Phe［配列番号31］がある。A II（６−８）、His−Pro−Phe［配列番号14］及びA II（４−８）、Tyr−Ile−PRO−Phe［配列番号15］も試験され、効果のないことが分った。
本発明の目的に叶う、特に興味のもたれる化合物としてのその他のクラスには、一般式II
R2−R3−R4−R5−R6−R7−R8
に示すクラスがあり、ここでR2はＨ、Arg、Lys、Ala、Orn、Ser（Ac）、Sar、Ｄ−Arg及びＤ−Lysから構成される基より選択され、
R3はVal、Ala、Leu、norLeu、Ile、Gly、Pro、Aib、Acpc及びTyrから構成される基より選択され、
R4はTyr、Tyr（PO3）２、Thr、Ser、homoSer及びazaTyrより構成される基より選択され、
R5はIle、Ala、Leu、norLeu、Val及びGlyから構成される基より選択され、
R6はHis、Arg又は６−NH2−Pheであり、
R7はPro又はAlaであって、
R8はPhe、Phe（Br）、Ile、及びTyrから構成される基より選択される。
一般式IIの化合物において、特に好適なサブクラスは式
R2−R3−Tyr−R5−His−Pro−Phe［配列番号16］
を有し、ここでR2、R3及びR5は既に定義したとおりである。特に好適なものは式Arg−Val−Tyr−Ile−His−Pro−Phe［配列番号２］のアンギオテンシンIIIであり、
その他の好適な化合物には、Arg−Val−Tyr−Gly−His−Pro−Phe［配列番号17］及びArg−Val−Tyr−Ala−His−Pro−Phe［配列番号18］の構造を有するペプチドが含まれる。A II（４−８）なるフラグメントは、反復試験において無効であるが、このような結果となる理由には、Ｎ−末端部においてチロシンが曝露されていることが挙げられる。
上記の式において、アミノ酸残基に対して標準的な３文字からなる略号が使われている。反対側に対する同一性が欠けている場合は、Ｌ−型アミノ酸が特に必要とされる。その他の残基は以下のように略号化される。
0003662029.tif 000002
A IIおよびそのアナログは、γ回転又はβ回転に適合するよう提唱されている（Regoli,et al.,Pharacological Reviews26:69（1974年）。一般には、R3、R5及びR7の位置における天然型側鎖は、原則的に受容体及び／又は活性にあずかるR4,R6及びR8の位置の基における互いの距離を維持することに関与している。R3,R5及びR8の位置における疎水性の側鎖は、ペプチドの全体の構成、及び／又は仮説上の疎水性ポケットの形成において重要な役割を担っている。
R2の位置上のアミノ酸における適正な側鎖は標的受容体に対する化合物の親和性に寄与することと、ペプチドの構成において重要な役割を果たすことの両者またはいずれか一方に関与している。この理由により、Arg及びLysは特にR2にとって好ましい。
本発明における目的のため、R3はR5（γ回転モデル）又はR6（β回転モデル）との直線的又は非直線的水素結合の形成にあずかっている。R3はβ非対象構造（可能性のある構造として提唱されている）において最初の回転に関わっている。一般式Ｉにおけるその他の位置とは対照的に、β分枝及びγ分枝はこの位置において同等に効果的である。さらには、一個の水素結合が比較的安定な構造を維持する上で有用となる。従って、R3はVal、Ala、Leu、norLeu、Ile、Gly、Pro、Aib、Acpc及びTyrから適宜選択される。
R4に関しては、構造解析によって、この位置における側鎖（R3及びR5における側鎖と同様に）受容体の占有及び刺激に必須と考えられている疎水性クラスターに寄与していることが示唆されている。このため、R4はTyr、Thr、Tyr（PO3）２、homoSer、Ser及びazaTyrから選択されることが好ましい。この位置において、Tyrは特に好ましいが、これは、Tyrがフェノール性ヒドロキシルから水素を受け取る能力を有する受容体部位との間で水素結合を形成するからである（Regoli,et al.,（1974）,supra）。
R5の位置においては、β脂肪族又は脂環式の鎖を伴うアミノ酸が特に好ましい。このために、R5の位置にはGlyが好ましい一方で、この位置におけるアミノ酸は、Ile、Ala、Leu、norLeu、Gly及びValから選択されることが好ましい。
アンギオテンシノーゲンA I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II誘導体、本発明に従って特に興味のもたれるフラグメント及びその誘導体において、R6はHis、Arg又は６−NH2−Pheである。ヒスチジンのイミダゾール環における独特な役割（生理的PHにおけるイオン化、供与体又は受容体として作用できる能力、芳香族としての特徴）は、R6としての特別なユーティリティーに関与していると考えられている。たとえば、構造モデルは、Hisが、R7の方向性に影響を及ぼすことによって、（βモデルにおける）水素結合又は非対象構造の第２回転において関わっているかのいずれかを示唆している。同様に、R8の方向性を最も適正なものとするためには、R7がProでなくてはならないと現在考えられている。R8の位置において、疎水性の環とアニオン性カルボキシル末端部は、誘導体が受容体へ結合する上で特に有用であることがわかっている。これにより、Tyr及び特にPheは、本発明の目的に適合している。
特に関心のもたれる誘導体には以下の表２に示すものがある。
0003662029.tif 000003
略式発明におけるポリペプチドは、固相合成に関してのJ.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,Pierce Chemical Co.,Reckford,III.（1984年）及びJ.Melenhofer,Hormonal Proteins and Peptides,Vol.,Academic Press,New York,（1973年）に含まれる汎用方法により合成され、溶液合成についてはE.Schroder and K.Lubke,The Peptides,Vol.1,Academic Press,New York,（1965年）により合成されるが、これに制約されない。現在執筆中の学術論文類の開示は参考文献として本発明に含まれる。
一般に、保護されたアミノ酸に連続的に添加して、ペプチド鎖を伸長させる上で３つの方法が関与している（米国特許第5,693,616号であり、その全体が参考文献として含まれる）。通常は、１級アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基並びにあらゆる反応性側鎖のいずれかが保護される。この保護アミノ酸が不揮発性固体指示相に結合されるか、又は溶液の形で利用され、配列上で次のアミノ酸もまた適宜保護され、アミド結合の形成に耐えられる条件下で添加される。すべての希望されるアミノ酸が適正な配列において結合された後、保護基及びあらゆる固体指示相が除去され、粗ペプチドが供給される。このペプチドが脱塩化されて精製され、好ましくはクロマトグラフィーによって最終産物が得られる。
好ましくは、ペプチドが標準的固相方法に従って合成され、アプライドバイオシステムズ・モデル430Aペプチドアナライザ（Applied Biosystems,Foster City,Calif）上で、製造所の指示に従って合成される。その他のペプチド又はペプチド擬態物質の合成法は、固相法又は液相法のいずれかによる方法であるが、本発明において周知である。
A IIはin vitroにおいて多数のタイプの細胞増殖を増大させることが示されてきたが、必ずしもすべてのタイプの細胞増殖を増大させてきたのではない。A IIが形質転換増殖因子β（TGFβ）（Gibbons et al.,J.Clin.Invest.90:456−461（1992年）の産生を介して細胞増殖を増大させたことを示す研究がある。よって、PDGFのみがMSCに対してマイトジェニックに作用するので、MSC増殖に対してA IIが及ぼす能力は期待されない。さらには、Emerson（supra）が、ほとんどの拡大培養にTGF−βを入れると、その結果としてHPC及びHLSC収量が減少し、A IIがTGF−βの作用を介してこのような条件下に利点をもたらすとは考えられない。A IIがHPC又はMSCのいずれかの分化に対して影響を及ぼすとの報告をした研究はない。
本発明における一つの局面には、アンギオテンシノーゲン、アンギオテンシンＩ（A I）、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、アンギオテンシンII（A II）、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体、又はA II AT2の２型受容体作動物質に曝露させることによってin vitro及びex vivoでHPC及びHLSCの増殖を増大させる方法が開示されている。HPC及びHLSCの分離、精製、ex  vivoでの生育及びin vivoでのモビライゼーションに関する実験条件が報告されている（Berardi et al.,Blood 86（６）:2123−2129、1995年;Fritsch et al.,Bone Marrow Transplantation 17:169−178,1996年;LaRochelle,et al.,Nature Medicine 12:1329−1337,1996年;Traycoff et al.,Experimental Hematology 24:299−306,1996年;Holyoake,et al.,Blood 87:4589−4595,1996年;Lemieux,et al.,Blood 86:1339−1347,1995年;Talmadge,et al.,Bone Marrow Transplantation 17:101−190,1996年;Bodine,et al.,Blood 88:89−97,1996年、以上はすべて参考文献として本発明に含まれる）。
本発明の１つの実施の態様において、HPCは骨髄、末梢血又は臍帯血から分離される。HPCはこの時点でこれらの試料として選択される。HPCを豊富に含む試料は、A I、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質の存在下において、適正な生育条件下で培養される。HPC増殖は、培養中、多様な時間点において評価される。
好ましい実施の態様において、HPC及びHLSCは、腸骨後方稜からの骨髄吸引物より単離される（Capian and Haynesworthらによる米国特許第5,486,359号）。CD34+HPCは、CD34に特異性を有するビオチニル化モノクローナル抗体（Becton Dickinson,CA,USAより入手）に付着させることによって、単離され、ストレプトアビジン親和性カラム（Ceprate SC;Cellpro,Bothell,WA,USA）を使って、そのカラムに吸引物を通過させ、続いて、本発明における標準的技術に従い、適正なカラムを使って洗浄およびストリッピングを行う。CD34+HPCは培養用の培地中に懸濁させ、好ましくは約0.1ng/mlから約1mg/mlの範囲のアンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II,A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質の存在下において培養される。細胞は８日から21日までの期間にわたって拡大培養され、分化を伴う細胞増殖は、位相差顕微鏡を使って標準的メチルセルロースコロニー形成アッセイ（Berardi,et al.,supra）により、この時間内における多様な時点で評価される。同様に、HPCの「自己再生」については、CD34+を指向する抗体への反応性によって定期的に評価される。
さらに好適な実施の態様において、アンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質の存在下において培養されたHPCは、自己由来移植に使用され、枯渇した造血系が再構築される。移植に先立ち、細胞を洗浄して、すべての培養液の痕跡物が除去され、適正な培地に再度懸濁されて、ペレット化され、数回洗浄される。最終洗浄後、細胞は0.7x106個/mlから50x106個/mlの範囲で適正な培地中に懸濁され、静脈内注入を介して患者へ再度輸血される。移植後、患者の末梢血試料はHPC、HLSC、さらに成熟化した血液細胞の数の増大を、標準的フローサイトメトリー及び細胞分取技術（Talmadge,et al.,supra）により多様な時点において評価される。
本発明におけるその他の目的において、アンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質に曝露することによるin vitro及びex vivoにおけるMSC及び系統特異性の間葉織細胞増殖の増大法が開示される。骨髄由来ストロマ細胞等、系統特異性間葉織細胞の分離、精製およびin vitro生育のための実験条件が報告されている（Johnson and Dorshikind、Blood 68（６）:1348−1354（1986年）であり、その全体が参考文献として含まれる）。その他の報告書では、系統特異性の間葉織細胞のin vitroにおける培養に向けた多様な条件を報告している（Bah,et al.,J.Cell Set.84:139−151（1986年）;Benayahu,et.a.,J.Cellular Physiology 140:1−７（1989年）であり、両者はその全体が本発明に参考文献として含まれる）。
本発明における１つの実施の態様において、MSCは腸骨後方稜及び／又は大腿骨頭部の海綿状骨から回収した骨髄吸引物から分離され、精製されて、適正な生育用培地に再度懸濁され、計数されて培養皿に撒くために適正な濃度に希釈される（Caplan and Haynesworth,米国特許第5,486,359号）。精製MSCは加湿された大気中で適正な生育培地及び生育条件において培養される。付着細胞は、好ましくは、アンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質が約0.1ng/mlから約1mg/mlの範囲で存在する条件において、加湿した大気中において37℃で生育培地中におかれる。細胞は２日から21日間のあいだの期間拡大培養され、この時間内の多様な時点において、細胞増殖が評価される。初代培養物がコンフルエントに近い状態になった時点で、細胞は回収され、患者へ再度輸血される。汚染物の存在について、顕微鏡による細胞の試験が行われる。細胞は洗浄されて培養液の残留物すべてを除去され、適正な培地中に再度懸濁されてペレット化され、数回洗浄される。最終洗浄後、細胞は0.7x106個/mlから50x106個/mlの範囲で適正な培地中に再度懸濁され、静脈内注入を介して患者へ輸血される。患者は、in vivoにおけるMSC増殖を、反復式骨髄吸引法及び生検の手段によって評価され、オリジナルの吸引物と生検と比較される。好適な実施の態様において、in vivoの増殖は、非増殖細胞中よりも増殖細胞中において高濃度で存在することが知られているタンパクに対する抗体、たとえば増殖細胞核抗原（PCNAまたはサイクリン）への反応性をみることによって評価される。このような抗体はzymed Laboratories（South San fransisco、California、USA）等の多数の入手元から入手できる。
好適な実施の態様において、分離されたMSCは、Dulbecco's培地MEM（DMEM−LG）（Gibco,Grand Island、NY、USA）中におかれる。この細胞は一連の段階を経て精製される。最初は、細胞が回収されて完全培地中に再度懸濁される。細胞は70％Percoll（Sigma Corporation,St.Louis,MO,USA）勾配を介して460xgで15分間遠心分離され、勾配中の最上層の25％が、完全培地30mlを含む試験管に移されて、細胞が遠心分離によって回収され、完全培地中に再度懸濁されて、計数され、100mmの培養皿に１枚あたり50x106個の脱核細胞が含まれるように撒ける状態まで希釈される。
さらに好適な実施の態様において、精製MSCは完全培地中で37℃にて加湿した大気中に95％空気及びCO2を含む条件で培養され、細胞は３日間接触されて、非付着細胞は培地換えにより除去される。付着細胞の細胞増殖と正常MSCの形態の存在について、位相差顕微鏡を使用し、連続する生育期間中の多様な時点において評価が行われる。４日ごとに副次的に培地換えが行われる。初代培養がコンフルエントに近づいた時点で、細胞は0.1mMEDTA（Gibco）含有0.25％トリプシンにて剥がされ、希釈されて、第２代細胞として再度おかれるか、患者への再輸血に使用される。好ましくは、細胞はTyrode's溶液（Gibco）を使い、培養液を含まない液にて洗浄される。最終洗浄後、細胞はTyrode's溶液中に再度懸濁され、37℃で１時間培養されて血清タンパクが封じられるようにする。Tyrode's溶液は除去され、細胞はTC199培地（Gibco）におかれ、１％血清アルブミンが添加されるのが好ましい。細胞はこの培地で多数回洗浄され、最終洗浄後、MSCはTC199培地に１％血清アルブミンを添加した液中へ再度懸濁される。続いて、MSCは15分かけてゆっくりと静脈内注入される。注入後８週間後まで、連続的な骨髄吸引物の評価が行われる。
好適な実施の態様において、in vivoにおけるアンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2・２型受容体作動物質の増殖効果の、MSC及び間葉織系統特異性の細胞の評価が、多様な組織の組織学的評価により行われる。好適な実施の態様において、MSC及び間葉織系統特異性の細胞のin vivo増殖は、非増殖細胞中よりも増殖細胞中において高濃度で存在することが知られているタンパクに対する抗体、たとえば増殖細胞核抗原（PSNAまたはサイクリン）への反応性をみることによって評価される。
本発明におけるさらなる目的において、HPC、HLSC分化に対してアンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質の及ぼす効果は、遺伝子発現、表現型、形態、又はその他の系統特異性細胞と分化を遂げつつある細胞とを鑑別するその他あらゆる方法における変化を検討することによって評価される。好適な実施の態様において、誘導又は活性化段階へのマクロファージ分化は、前述のように、アンギオテンシノーゲン、A I、A I誘導体、A Iフラグメント及びその誘導体、A II、A II誘導体、A IIフラグメント及びその誘導体及び／又はA II AT2の２型受容体作動物質へ曝露した後に評価される。マクロファージは、周知の方法のすべてにより、貧食能によって評価され、オプソニン化した酵母粒子を貧食するマクロファージの数、及び貧食したマクロファージ１個あたりの酵母粒子の数によって測定されるが、これに限定されるものではない（Rodgers and Xiong,Fundamendal and Applied Toxicology 33:100−108（1996年）。
別の望ましい実施の態様では、白血球の呼吸バースト作用が、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／または上記したようなA II  AT2タイプ２レセプター作用薬に接触させた後に評価された。白血球は、呼吸バースト作用に対して、呼吸バーストシステムを媒介として、過酸化水素を発生させる能力を含む（ただしそれに限定されない）技術において既知の何らかの方法で評価が行われた。（Rodgersら、Inernational  Journal  of  Immunopharmacology  10:111−120（1988）:Rodgers,In:Modern  Methods  in  Immunotoxicology（ed.G.Burleson）,Wiley  Liss  1:67−77（1995））
本発明の化合物によるマクロファージ活性化は、活性化されたマクロファージで作られたサイトカインを生成するためマクロファージ刺激し、Ｔ細胞へのマクロファージ表示を改善し、かつ哺乳動物において抗腫瘍免疫力を増大させて、ウイルスや細菌感染を治療するために用いることができる。
本発明の別の局面で、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬は、生体内でHPC、HLSC、MSCおよび間葉性直線（直系）特定細胞増殖を高めるために用いられている。HPC、HLSCP、MSCおよび間葉性直線（直系）特定細胞の増殖増大において使用するために、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬を、従来の製剤学上承認されているキャリヤー、佐剤、賦形剤を含むユニット処方用量における経口、非経口、吸入スプレー、直腸投与、または局所的投与を含む適切な方法で投与してもよい。本文で使用する非経口という用語は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、腱内、髄腔内、頭蓋内、胸部内、点滴技術または腹膜内投与を含む。
本発明のさらなる実施の態様において、生体内でのHPC、HLSC、MSCおよび間葉性直線（直系）特定細胞増殖をアンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬に接触させることで高める方法は、他の成長因子およびサイトカインの存在、不在のいずれかにおいて明らかにされている。そのような成長因子およびサイトカインの例としては、リンフォカイン、インターロイキン−1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11、顆粒性白血球コロニー刺激因子、顆粒性白血球／マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、表皮性成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板誘導成長因子、変形成長因子ベータおよび茎細胞因子を含むが、これに限定されるものではない。アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬は、固形（顆粒、粉末または座薬を含む）または液体（たとえば、溶液、懸濁液または乳濁液の形態で作られてもよい。本発明の化合物は、様々な溶液に適用させることができる。本発明に従った使用にふさわしい溶液は、無菌で、十分な量のペプチドが溶解しており、提案された適用に対して有害でないものである。この点に関して、本発明の化合物は非常に安定であるが、強酸および強塩基では加水分解する。本発明の化合物は有機溶媒およびpH5〜８の水性溶液に可溶である。
アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬は、殺菌のような従来の製剤学的操作に付されてもよいし、および／または防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、等のような従来からの補助剤を含んでいてもよい。
アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬は、単独活性薬剤として投与することができるが、一つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて使用することも可能である。配合剤として投与される場合、治療薬を、同時にまたは別々に投与する分離組成物として処方することも可能であるし、または治療薬を単独組成物として投与することも可能である。
投与に対して、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬を、通常、指示された投与経路に適切な一つまたは複数の補助剤と組み合わせる。化合物は、ラクトース、蔗糖、粉末澱粉、アルカノイック酸（alkanoic  acids）のセルロースエステル、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、燐酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニールピロリジン、および／またはポリビニールアルコールと混合してもよく、従来式の投与に従って錠剤またはカプセル剤にしてもよい。代替の方法として、本発明の化合物を、塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツオイル、綿実油、ごま油、トラガカントゴム、および／または様々な緩衝剤中に溶解してもよい。その他の補助剤および投与方法が、製剤学技術において知られている。キャリヤーまたは希釈剤は、単独または蜜蝋を混合したグリセリルモノステアリン酸またはグリセリルジステアリン酸のような遅延性物質、または当業者に既知の物質を含んでもよい。
局所投与にふさわしい処方には、皮膚浸透に適した液体または半液体調製剤（たとえば、塗布剤、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）、および目、耳または鼻に投与するのに適した点滴剤がある。
生体内で、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬と共に、HPC、HLSC、MSCおよび直線（直系）特定間葉性細胞の増殖または分化を促進するための投与計画は、傷害の種類、年齢、体重、性別、個人の医学的条件、状態の程度、投与経路、および使用する特殊化合物、等を含む様々な要素に基づいて行われる。したがって、投与計画は非常に広範囲なものとなりうるが、医者は標準的な方法を用いて、機械的に決定することも可能である。体重1kg当たり、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬0.1ng/kg〜1mg/kgの投与レベルは、本文に明記されたすべての使用方法に対して有効である。
治療計画は、治療を行う疾患により大きく異なり、傷害の種類、年齢、体重、性別、個人の医学的条件、状態の程度、投与経路、および使用する特殊化合物、等を含む様々な要素に基づく。たとえばアンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬は、ワンクールの放射線治療の前に、30日間を限度として腫瘍患者に投与する。治療では、上記した投与量を１日に１回から６回投与する。別の例では、血清瀉血（プラスマフェレーゼ）による提供用に造血直線（直系）特定細胞を起動させるために、治療では、１日１〜６回で30日までとする。
本発明の好ましい実施の態様では、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬を局所投与する。アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬の活性成分の好ましい局所投与量はおよそ0.1ng/ml〜1mg/mlで、一日２度投与するのが好ましい。局所投与では、活性成分は0.0001％〜10％w/wが含まれ、たとえば処方体重当たり１％〜２％であり、10％w/w含まれてもよいが、好ましくはせいぜい５％w/w、さらに好ましくは処方の0.1％〜１％である。
本発明のもう一つの局面において、改良された細胞培養基は、造血および間葉性茎および直線（直系）特定細胞の増殖および分化のために準備されており、そこで改善されたことは、細胞培養基に、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬の有効量が加えられたことである。本発明では、造血、間葉性茎および直線（直系）特定細胞の成長を援助するどのような細胞培養基でも使用が可能である。そのような細胞培養基には、Basal  Media  Eagle（基礎的培養基Eagle）、Dulbecco's  Modified  Eagle  Medium（dulbeccoの修正Eagle培養基）、Iscove's  Modified  Dulbecco's  Medium（Iscoveの修正Dulbecco培養基）、McCoy's  Medium（McCoyの培養基）、Minimum  Essential  Medium（最小限主要培養基）、Ｆ−10  Nutrient  Mixtures（Ｆ−10  栄養混合物）、Opti−MEM▲Ｒ▼Reduced−Serum（Opti−MEM▲Ｒ▼縮小血清培養基）、RPMII  Medium（RPMI培養基）、およびMacrophage−SFM  Medium（マクロファージ−SFM培養基）またはそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されるものではない。
改良された細胞培養基は、濃縮された（すなわち、10X）または濃縮されない形態で供給されてもよく、また液体、粉末または凍結乾燥のいずれかで供給されてもよい。細胞培養物は化学的に決定されてもよく、または血清補給物を含んでいてもどちらでもよい。培養基は、GIBCO  BRL（Gaitersburg,MD）およびSigma（St.Louis,MO）のような多くの販売元から市販されている。
さらなる局面において、本発明は、造血、間葉性茎および直線（直系）−特定細胞の増殖のための用具（キット）を用意している。この用具には、アンギオテンシノゲン、A I、A I類似物、A Iフラグメントおよびその類似物、A II、A II類似物、A IIフラグメントおよびその類似物および／またはA II  AT2タイプ２レセプター作用薬の有効量が含まれており、かつ細胞培養基として使用する場合の使用説明書が添付されている。
好ましい実施の態様において、この用具はさらに、細胞培養成長培養基を有している。本発明では造血、間葉性茎および直線（直系）−特定細胞の成長を援助するものであればどのような培養基を使ってもよい。このような細胞培養基の例は上記で挙げたものである。細胞培養基は濃縮（すなわち、10X）または非濃縮形態のいずれかで供給されてもよく、液体、粉末または凍結乾燥のいずれかであってもよい。細胞培養物は化学的に決定してもよく、または血清補給物を含んでいてもよい。
さらに好ましい実施の態様では、用具にはさらに殺菌容器が含まれており、これは、細胞培養フラスコ、回転瓶または遠心管のような密閉容器、または細胞培養皿またはマイクロ滴定皿（Nunc,Naperville,IL）のような非密閉容器のいずれかを内包することができる。
別の好ましい実施の態様では、用具はさらに、再組成細胞成長培養基内への封入のための抗生物質補助剤を含んでいる。好ましい抗生物質補助剤の例としては、actimonycin  Ｄ、Fungizone▲Ｒ▼、カナマイシン、ネオマイシン、nystarin、ペニシリン、ステレプトマイシンまたはそれらの組み合わせ（GIBCO）があるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、HPCおよびHLSCの増殖を高めるための方法を提供することにより、HPC移植を臨床的に大いに助けるものとなろう。これは、造血システム全体を再構成することができるHPCをより多く提供する増大した「自己再生力」についても、および十分に発達した、機能的な血液細胞をより早く再生するための、直線（直系）−特定細胞をより多く供給する分化を伴った増殖についても言えることである。同様に、生体内においてHPCの増殖を増大させる方法は、骨髄中においてHPC（およびHLSC）の局所濃度を急速に高めることで、HPC移植治療の効用を高め、その結果より速く機能血液細胞を生成することになるだろう。
同様に、MSCおよび間葉性直線（直系）−特定細胞の増殖を増大させる方法は、骨、軟骨、腱および靭帯のような骨格組織の修復におけるMSC治療の有効性大いに高めるだろう。数多くのMSCおよび間葉性直線（直系）−特定細胞をより速く増殖させることで、これらの細胞を高密度でより有効に損傷部位に届けることができ、かつ適切な修復部位において、茎および直線（直系）−特定細胞の局所濃度における生体内でのより速い拡充を可能なものとするだろう。
本発明の方法はまた、造血障害における遺伝子治療のための賦形剤としてのHPCおよびHLSCの潜在的有効性を高めるだけでなく、数多くのそのような細胞をトランスフェクションのために有効により多く供給することで、またトランスフェクションされたHPC、HLSC、MSCおよび造血直線（直系）特定細胞を急速に拡張させるためにより有効な手段を提供することで、骨格傷害における遺伝子治療に対しても賦形剤として、MSCおよび間葉性直径−特定細胞の潜在的有効性も高めるものである。
本発明は、例証だけを目的とする添付の実施例を参照することによりよりよく理解することができるであろう。本実施例は、本文書に付帯されている特許請求の範囲で定義されているとおり、本発明の範囲に限るものと理解されるべきではない。
実施例1.マクロファージの分化：食作用
常駐腹膜マクロファージはほとんど食作用行動は行わない。マクロファージを炎症剤または活性剤に接触させると、このマクロファージの機能を高めることになるだろう。常駐腹膜マクロファージを、C57B1/6のネズミ群またはSprague  Dawleyラット群から採取し、燐酸塩緩衝塩水（PBS）中に１×106細胞/mlの濃度で再懸濁した。五つの0.5ml細胞に等分したものを、35mmペトリ皿のカバーグラス上に配置した。定温培養前に、最終濃度が１〜1000ug/mlのPBS、A IIまたはA II類似物またはフラグメントのいずれかの0.5mlをそれぞれのカバーグラスに添加した。カバーグラスを入れた皿を37℃で４時間培養し、その後カバーグラスをPBSで３〜６回洗浄した。オプソニンを作用させた酵母菌粒子（Sigma  Chemical  Co.）（その代用物と同種のものから採取した成熟血清と共にオプソニンを作用させた酵母菌）をカバーグラスに添加し２時間培養した後、カバーグラスを再びPBSで洗浄し、ガラススライド上に転化した。酵母菌を摂取したマクロファージの数と、マクロファージ毎の摂取された酵母菌の数を顕微鏡で数えた。少なくとも、カバーグラス毎に100のマクロファージが数えられた。この研究で得られたデータを表３および４、図１および２にまとめた。表５は、これらの研究で用いたA II類似物およびフラグメントについて記述したものである。
10μg/mlまたはそれより大きなA IIに接触させることで腹膜マクロファージの食作用能力が甚だしく向上した。常駐個体群において、細胞の１％未満が食細胞である（観察細胞１個毎に酵母菌0.01）。A IIに接触させた後、平均でマクロファージ毎に酵母菌１個の高い濃度で25％以上の食細胞を増加させた（食菌できるマクロファージの数が25倍に増加、食菌された粒子の数が100倍に増加）。
表４に示したように、テストしたペプチド（GSD28を除く）のどの濃度も、ラットのマクロファージの食菌作用能力を高めた。しかし類似物のいずれも、A IIで観察した効果ほどの結果は出さなかった。これは、A IIおよび、より縮小した範囲で、A II類似物は顕在化したまたは活性化した状態までマクロファージ分化を刺激し、これがバクテリアおよび細胞のくずの摂食および浄化にまで至ったと推測される。
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実施例２  白血球分化：呼吸バースト
白血球の呼吸バースト（マクロファージおよび多形核好中球）は、バクテリアを殺すために使われる媒介システムの一つの成分（構成要素）である。食作用に関して、常駐マクロファージにおけるこの呼吸バースト作用は低い。分化により、顕現させた（炎症性）または活性化させた状態どちらに対しても、この機能作用は有意に高まった。呼吸バーストシステムを介して過酸化水素を生成する能力に対して、様々な濃度のA IIにハツカネズミまたはラットの腹膜マクロファージおよびヒトの腹膜血液単核細胞（PBMC）を生体内で接触させる効果を評価する研究が行われた。ヒトの研究については、５人のドナーを検査した。
ハツカネズミまたはラットの腹膜細胞は、牛血清アルブミン0.5を伴うコールドPBS  ５〜15mlで洗浄することで採取した。ヒトPBMCは、健常応募者から静脈穿刺により採取し、Ficoll  Hypaque密度遠心分離により腹膜血液から分離した。分離後、細胞を１×106で再懸濁し、受け皿毎に100μリットルの割合で96枚の受け皿に配置した。細胞を、A IIまたはA II類似物の様々な濃度と共に、37℃で４時間培養した。細胞に、過酸化水素用の蛍光プローブ、2,7ジクロロフルオレセインエステルを予備挿入した。2,7ジクロロフルオレセインエステルは、過酸化水素不在下では非蛍光性である。15分後、過酸化水素の生成を刺激するために、ホルボールミリスチン酸エステル（＋PMA）または（−PMA）10ng/mlを添加した。刺激の１時間後、生成された蛍光発光レベルを、Cytofluor  2350multilwell蛍光メーターで測定した。この研究から導かれた主な結果は図３〜４に示した。
PMAまたはペプチドの不在下では、過酸化水素の生成は全く観察されなかった。A IIに対する反応では、若干の変動が見られた（すなわち、この機能のレベルを高めるために必要なA IIの濃度）が、すべての研究において、A IIは、単独でおよびPMAによる刺激反応においてのどちらでも過酸化水素を生成する白血球の能力を高めた。さらに、PBMCの呼吸バースト作用に対するA IIの類似物（GSD22A、GSD24B、GSD28およびA II（１−７））の予備接触の効果を評価した（図５〜８）。すべての類似物では、呼吸バースト作用を増大させるためにはペプチドの濃度がさらにかなり高くなければならない。これらの類似物は100倍までの量が必要である。しかし呼吸バースト能力の増大がテストしたすべての類似物で観察された。類似物は、PMAの存在下および不在下のどちらでもその機能を促すことができた。これらのデータでは、A IIが、３種からの単核白血球／マクロファージの分化を促すことができたことが示されている。
実施例3.ヒトリンパ球の増殖反応
有糸分裂促進物質または抗原によるリンパ球の刺激に対して、これらの細胞は芽体発生および増殖を起こした。そのような刺激（物質）が無い場合、増殖はほとんど観察されない。短期間評価で細胞の増殖を測定する方法の一つは、新たに合成されたDNA中に混入されているヌクレオチドチミジンの量を量る方法である。ヨウシュウヤマゴボウ有糸分裂促進物質（"PWM"）の存在下および不在下でのヒトPBMCの増殖に対するA IIの効果を評価した。
ヒトPBMCを健常応募者から採取し、Ficoll  Hypaque（Sigma  Chemical,St.Louis）密度遠心分離で分離した。淡黄褐色の膜を除いた後、細胞を3X洗浄してFicoll  Hypaqueを取り除き、トリパンブルー（0.01％）内で計算を行い、牛の胎児血清10％と抗生物質を含むRPMI  1640中に、１×106細胞/mlの濃度で再懸濁を行った。細胞の100μリットル部分を各受け皿に加えた。その後は、FCS  10％および抗生物質を含むRPMI  1640中におけるA IIの様々な濃度（0.1〜最終濃度1000μg/ml）を、３枚づつにした様々な受け皿に添加した。適切な受け皿に対して、PWM（最終濃度20μg/ml）を添加した。これらの皿をCO25％で、37℃、48時間培養した。続いて、3H−チミジンの0.5μCiを各受け皿に添加し、37℃でさらに24時間培養した後、自動化multiwellサンプル採取器（Skatron）によりグラスファイバーフィルター上に採取した。これらのフィルターは乾燥させて、シンチレーション流体中に配置し、混入されているチミジン量をベータ計測器で測定した。結果は図９および表６に掲載している。
有糸分裂促進物質不在下では、A II接触後、混入チミジンの増加は認められなかった。しかし、分離した二つの実験では（二人の異なるドナーから採取した細胞）、A IIがPWMに対する反応において混入チミジン量を増加させることが証明された。データでは、A IIは造血直線（たとえばリンパ球）から採取した細胞の増殖を促進できることを証明している。
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実施例４  ラット間葉性茎細胞増殖
これらの研究は、A IIがMSCの増殖に対して有し得る効果を測定するために行った。骨髄細胞を雌のSprague  Dawleyラットの大腿骨および脛骨から、注射器と18径針を用いて、dulbecco's  Minimal  Essential  Medium−High  Glucose（"DMEM−HG"）により骨を洗うことで採取した。これらの細胞を、牛胎児血清（FCS）の選択ロットおよび抗生物質を含む（完全培養基）DMEM−HG内に５×103細胞/mm2の割合で24枚の受け皿内で、空気中にCO2を５％含む37℃の培養器で培養した。培養を始めてから24時間後、培養基および非付着性細胞を吸引して、新しい培養基を加えた。これらいくつかの受け皿のそれぞれに、A IIを伴った完全培養基（１〜100μg/ml）またはA IIの無い完全培養基を添加した。クローンからの細胞の移動およびそれらの増殖を顕微鏡検査で追求した。４日毎に古い培養基を取り除き、新しい培養基を培養物に加えた。
これらの実験から得られたデータを図10および11に掲載した。培養物にA IIを加えることで、MSCが元にあった部位（CFU）の数が有意に増加し、形成されたコロニーの大きさ（細胞の数）も増大した。これは、より小さな範囲であるが、それ自体の中でMSC成長を助ける血清が存在するだけで起こった。見て分かるように、二つの異なる血清ロットの存在下に検査を行ったすべての時点で、濃度依存方式において、MSCの数が増大している。これらのデータは、A IIはラットMSCの増殖を高めることができるという仮説を証拠だてるものである。
実施例５  マウス系に特異的な細胞に対するアンギオテンシンIIの効果
HPCをC57B1/6マウスから免疫磁気的なアフィニティクロマトグラフィーによって採取し、最適な増殖培地の半流動培養状態に置いた。培養開始後の様々な時間で、コロニー形成および形成コロニーのサイズ（コロニーあたりの細胞数）を顕微鏡で評価した。
雌性C57B1/6マウスをSimonsonから購入し、本研究における骨髄細胞の供給源として使用した。骨髄細胞を、未処理マウスから、または５−フルオロウラシル（５−FU）（3mg/マウス；約150mg/kg）を採取の48時間前に尾に注射したマウスから、２％ウシ胎児血清（FBS）を含有するpH7.4のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いて21ゲージ針で洗い流すことによってマウスの大腿骨および脛骨から採取した。流出液を遠心分離し、ペレットを、２％FBSを含有するPBSおよび５％正常ラット血清を含有するPBS中に４×107個/mlの有核細胞で再懸濁した。
免疫磁気標識を行うために必要な試薬をStem  Cell  Technologies,Inc.（Vancouver、BC）から購入した。下記のマウス系に特異的な細胞の表面抗原に対するビオチン標識モノクローナル抗体がHPC濃縮用カクテルに含まれ、これらを製造者の指示に従って使用した:CD5（Ly−１）、CD45−Ｒ（B220）、CD11b（Mac−１）、骨髄球様分化抗原（Gr−１）および赤血球様細胞（TER119）。10μｌの抗体カクテルを、２組の骨髄（正常および５−FU処理）のそれぞれに加え、混合して４℃で15分間インキュベーションした。次いで、細胞を、２％FBSを含有するPBS中に４×107細胞/mlで再懸濁した。次いで、抗体カクテルを洗い出し、100μｌの抗ビオチンテトラマーを1mlの細胞のそれぞれに加えた。懸濁物を混合し、４℃で15分間インキュベーションした。次いで、60μｌの磁気コロイドを1mlの細胞のそれぞれに加え、これらを混合し、４℃で15分間インキュベーションして免疫磁気的に標識した骨髄細胞を得た。
ステンレススチールのマトリックスを含有するカラムを、PBSでマトリックスを洗浄し、その後２％タンパク質を含有するPBSで洗浄することによって調製した。免疫磁気的に標識した骨髄細胞をカラムに負荷し、未標識細胞を含有する培地（濃縮HPC）を、0.2ml/分の流速での分画により流しながら集めた。培地をカラムの頂部に加えた。８〜10mlの濃縮HPCが集められるまで液切れしなかった。カラムに負荷した細胞の約２％が濃縮HPC画分に単離された。
濃縮されたHPC細胞の画分を、0.9％メチルセルロースをα最少必須培地（αMEM）（30％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブミン、10-4M  ２−メルカプトエタノール、2mM  Ｌ−グルタミン、およびコロニー刺激因子類を含有する２％馴化培地）中に含有する半流動培地に希釈した。馴化培地は、10μg/mlアメリカヤマゴボウマイトジェン（PWM）、10％FCSおよび抗生物質を含有するRPMI1640中で48時間インキュベーションした脾臓細胞の培養（１×106細胞/ml）から得られた上清であった。０〜100μg/mlの間の様々な濃度のA IIを、小容量で、マイクロタイターディッシュのウエルに対して、正常細胞に関して２×104細胞/mlおよび５−FU処理細胞に関して2.5×104細胞/mlの間に対して添加した。細胞を37℃および５％CO2で14日間インキュベーションした。14日後においてのみ、顕微鏡で細胞コロニーを、濃縮HPCを含有するウエルにおいて観察した。10μg/mlで処置した未処理（正常）マウスから得られた濃縮HPCでは顕微鏡下で18コロニーであり、100μg/mlのA IIでは顕微鏡下で10コロニーであった。細胞の顕微鏡下での評価を、インキュベーション開始後の様々な日数で行った。その結果を図12〜図17に要約して示す。
図12〜図14および図16は、コロニーあたり一定数以上の細胞を含有するコロニーの数をA II暴露の継続時間および濃度の関数として示す（図12〜図14は正常細胞に関し；図16は５−FU処理細胞に関する）。図15および図17は、正常マウスまたは５−FU処理マウスから得られた骨髄を様々な濃度のA IIとインキュベーションした後に見られるコロニーあたりの細胞数を時間の関数として示す。その結果は、HPCコロニーのサイズは、増大した濃度のA IIへの暴露に比例して増大すること、従って、A IIはHPC増殖を増大させることを明瞭に示している。
実施例６  ラット間葉幹細胞の増殖に対するA IIアナログおよびフラグメントの効果
これらの研究を、MSCの細胞培養においてA IIアナログおよびフラグメントを含むことによってこれらの細胞の増殖に対して得られる効果を明らかにするために行った。骨髄細胞を、雌性Sprague  Dawleyラットの大腿骨および脛骨からダルベッコ最少必須培地−高グルコース（「DMEM−HG」）を用いてシリンジおよび18ゲージ針で洗い流すことによって採取した。これらの細胞を24ウエルプレートにおいて、５×103細胞/mm2で、選択されたロットのウシ胎児血清（FCS）および抗生物質を含有するDMEM−HG（完全培地）中で、５％のCO2を空気中に含有する37℃のインキュベーターで培養した。培養開始の24時間後に、培地および非接着性細胞を吸引し、新しく調製した培地を添加した。これらのいくつかのウエルのそれぞれに、A IIアナログおよびフラグメント（表５を参照のこと）を含む（１〜100μg/ml）完全培地または含まない完全培地を添加した。クローンからの細胞の遊走およびそれらの増殖を顕微鏡によって調べた。４日毎に、古い培地を除き、新しく調製した培地を培養物に添加した。
A IIアナログまたはA IIフラグメントをこれらの培養に添加することによって、MSCの遊走元の部位数（CFU）および形成したコロニーのサイズ（細胞数）に対する著しい効果が認められた。これらの研究から得られた結果を図18〜図21に見ることができる。明らかなように、A IIアナログおよびフラグメントは、試験したすべての時間においてMSC数の増大を引き起こした。これらのデータは、A IIアナログおよびフラグメントはラットMSCの増殖を増大し得ることを示す。
実施例７  A IIの存在下におけるMSC系に特異的な細胞の増殖
骨髄から単離され、適切な条件下で増殖した間葉幹細胞は、骨、軟骨、筋肉および腱の生成に関与する細胞を含む複数の細胞タイプの特徴を発現し得る。骨形成細胞（骨組織を形成し得る細胞）は、それらをその骨形成分化の方向に向かわせる培地中で培養したときにアルカリホスファターゼ酵素を発現する。
雌性Sprague  Dawleyラットから得られた骨髄を、培地を用いて大腿骨を洗い流すことによって採取した。細胞を、直径が9cm2の培養ディッシュに入れ、一晩接着させ、次いで様々な濃度のA IIとともに抗生物質および10％ウシ胎児血清を含有するDMEM−HG培地に入れた。培養開始後の様々な時間で、細胞をタイロード（Tyrode）緩衝液で洗浄し、骨形成培地（10％ウシ胎児血清、100nMデキサメタゾンおよび0.05mMアスコルビン酸を含有するDMEM−HG）中に４日間置き、その後ウエルあたりのアルカリホスファターゼ活性のレベルを評価した。簡単に記載すると、ウエルをタイロード緩衝液で洗浄し、1mlのアルカリホスファターゼ基質溶液（1mM塩化マグネシウムおよび2.5mM p−二トロフェニルホスフェートを含有する50mMグリシン、pH10.5）を各ウエルに加えた。この水性基質を添加した15分後に、緩衝液を培養物から取り出し、1mlの1N水酸化ナトリウムと混合して反応を停止させた。次いで、得られる混合物の405nmでの吸光度を分光光度法によって測定した。アルカリホスファターゼ活性の値を、培養ディッシュあたりの吸光度値として表す。これらのデータを図22に示す。これは、A IIによって、骨形成分化を誘導するのに適切な培地中に置かれたときにアルカリホスファターゼを発現する細胞の増殖が促進され得ることを示す。
実施例８  マウス系に特異的な細胞に対するアンギオテンシンIIの効果
HPCをC56B1/6マウスから免疫磁気アフィニティクロマトグラフィーによって集め、コロニー刺激因子類の非存在下で最適な増殖培地の半流動培養状態に置いた。培養開始後の様々な時間で、コロニーの形成および形成コロニーのサイズ（コロニーあたりの細胞数）を顕微鏡下で評価した。
雌性C57B1/6マウスをSimonsonから購入して、本研究における骨髄細胞の供給源として使用した。骨髄細胞を、マウスの大腿骨および脛骨から、２％ウシ胎児血清（FBS）を含有するpH7.4のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いて21ゲージ針で洗い流すことによって採取した。流出液を遠心分離し、ペレットを、２％FBSを含有するPBSおよび５％正常ラット血清を含有するPBS中に４×107個/mlの有核細胞で再懸濁した。
免疫磁気標識を行うために必要な試薬をStem  Cell  Technologies,Inc.（Vancouver、BC）から購入した。下記のマウス系に特異的な細胞の表面抗原に対するビオチン標識モノクローナル抗体がHPC濃縮用カクテルに含まれ、これらを製造者の指示に従って使用した:CD5（Ly−１）、CD45−Ｒ（B220）、CD11b（Mac−１）、骨髄球様分化抗原（Gr−１）および赤血球様細胞（TER119）。10μｌの抗体カクテルを骨髄に加え、混合して４℃で15分間インキュベーションした。次いで、細胞を、２％FBSを含有するPBS中に４×107細胞/mlで再懸濁した。次いで、抗体カクテルを洗い出し、100μｌの抗ビオチンテトラマーを1mlの細胞のそれぞれに加えた。懸濁物を混合し、４℃で15分間インキュベーションした。次いで、60μｌの磁気コロイドを1mlの細胞のそれぞれに加え、これらを混合し、４℃で15分間インキュベーションして、免疫磁気的に標識した骨髄細胞を得た。
ステンレススチールのマトリックスを含有するカラムを、PBSでマトリックスを洗浄し、その後２％タンパク質を含有するPBSで洗浄することによって調製した。免疫磁気的に標識した骨髄細胞をカラムに負荷し、末標識細胞を含有する培地（濃縮HPC）を、0.2ml/分の流速での分画により流しながら集めた。培地をカラムの頂部に加えた。８〜10mlの濃縮HPCが集められるまで液切れしなかった。カラムに負荷した細胞の約２％が濃縮HPC画分に単離された。
濃縮されたHPC細胞画分を、0.9％メチルセルロースをα最少必須培地（αMEM）（30％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブミン、10-4M  ２−メルカプトエタノール、2mM  Ｌ−グルタミン、および２％馴化培地）中に含有する半流動培地に希釈した。馴化培地は、10μg/mlアメリカヤマゴボウマイトジェン（PWM）、10％FCSおよび抗生物質を含有するRPMI1640中で48時間インキュベーションした脾臓細胞の培養（１×106細胞/ml）から得られた上清であった。０〜100μg/mlの間の様々な濃度のA IIを、小容量で、ウエルあたり3,000個の細胞またはウエルあたり30,000個の細胞のいずれかを含むマイクロタイターディッシュのウエルに添加した。細胞を、37℃および５％CO2で14日間インキュベーションした。細胞の顕微鏡による評価を、インキュベーション開始後の様々な時間で行った。結果を図23〜図33に要約して示す。結果は、HPCコロニーのサイズは、増大した濃度のA II、A IIアナログおよびA IIフラグメントへの暴露に比例して増大すること、従って、A IIは、コロニー刺激因子類の非存在下でHPC増殖を増大させることを明瞭に示している
本発明は、明らかな改変および均等物が当業者には明らかであるので、示されそして説明された操作の厳密な細部、あるいは厳密な化合物、組成物、方法、手順または実施態様に限定されないことを理解しなければならない。従って、本発明は、貼付する請求の範囲の全体によってのみ限定されるものである。
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