【手続補正書】
【提出日】令和3年4月28日(2021.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２４】
有効成分が表８から選択される１種以上の物質を含有する，請求項１の細胞送達用キャリア。
【表８】
2021098668.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
特許文献１では，温度感受性ポリマー，ｐＨ応答性ポリマー，液晶ポリマー，およびポリマーゲルを含むナノ粒子のシステムが開示されている。特許文献２では，代謝型グルタミン酸５受容体アンタゴニストと速度制御ポリマーと，pH応答性ポリマーとを含むカプセル製剤が開示されている。特許文献３では，ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンメルカプトプロピオニル (イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマーが温度応答性を有し核酸の高い細胞への輸送能力を発揮しうることが示され，特許文献４では，刺激応答性ポリマーを固定化した，金属有機構造体-刺激応答性ポリマー複合体が示された。特許文献５では，有機ペルオキシ酸，多糖，粘土，コポリマーからなる複合体が示された。特許文献６ではｐＨ応答性ポリマーを含むリポソームからなる複合粒子が示されたが，これらの刺激応答性ポリマーだけの単独又は組合せだけでは，細胞内でリポソームを破壊するには有効であるが，細胞吸収性を高める目的では不充分であった。また，細胞外で刺激応答性ポリマーに刺激を与えて破壊した場合は，包接物が細胞外へ拡散してしまい，目的の細胞内へ効率的に輸送する事が困難でありリポソームカプセルを作る意味が薄れた。即ち，これらの刺激応答性ポリマーの使用は，細胞送達用キャリアの３）細胞内崩壊性を増強する事はできるが，１）抗酸化性，２）細胞内吸収性を高める事はできない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
しかし，以前よりアスコルビン酸グリセリドやAPPS（アスコルビン酸-2-リン酸-6-パルミチン酸）などの脂質を持たない水溶性の誘導体が，通常のアスコルビン酸より高濃度で皮膚細胞に吸収される事が報告されていた。これは，従来のビタミンC輸送チャンネルを介した細胞内輸送システムでは説明できなかった。近年APPSが，通常のアスコルビン酸に比較し，１０倍以上の細胞吸収性を有し，その吸収経路がアスコルビン酸輸送チャンネルを介さないことが報告された。この報告では，APPSが両親媒性であるため細胞膜であるリン脂質膜を直接通過する可能性を示したが，この説では水溶性のアスコルビン酸グリセリドやアスコルビン酸リン酸の細胞内高濃度化は説明できない（非特許文献３）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
α−トコフェロールは肝臓に高濃度で存在する。トコフェロール結合タンパクについては，主にその輸送タンパクなどが知られており，α-トコフェロール転移タンパク質結合体は内皮障壁を通過させてビタミンE送達を促進し，α-トコフェロール輸送タンパク質は，ＦＩＧＯ病期および５年生存率と相関するなど様々な生理作用と相関関係にある(非特許文献４)。さらに，α-トコフェロール転移タンパク質遺伝子はスクリーニングされその詳細が報告されている(非特許文献5)。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
レチノールにおいては，レチノール結合タンパク質が知られており，これは，血液中に存在するレチノールを特異的に結合して輸送するタンパク質と，各組織内にあってレチノールの細胞での動態を制御するタンパク質がある。輸送タンパク質は，肝臓で合成される分子量21kDaのタンパク質で，肝臓に蓄積されているビタミンA（Retinol）を結合・分泌して標的臓器（細胞）に輸送する働きがある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
ビタミンD結合タンパク質（ビタミンD：  (エルゴカルシフェロール)とD3(コレカルシフェロール)の総称）は，分子量約58kDaの糖タンパク質です。血清タンパク質であるアルブミンファミリーに属しており，アルブミンやα-フェトプロテインに類似した構造を有している。ビタミンD結合タンパク質は，ビタミンD輸送タンパク質として高濃度で血清中を循環しており，主に肝細胞で産生され，メガリンレセプターを介するエンドサイトーシスによりビタミンDを細胞内へ取り込む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
葉酸は，肝臓内に高濃度で存在し，体内の葉酸の約半分が蓄積されている。複数のグルタミン酸に結合した状態で存在するが，腸管でγ-グルタミルハイドラーゼにより，モノグルタメートへと変換される。小腸の近位部においてモノグルタメートの形で能動輸送され，門脈循環に取り込まれる。そこで肝臓でポリグルタメートになり，血中及び胆汁中に放出される。血漿中の葉酸の2/3がタンパク結合して輸送される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
リボフラビンは，肝臓，心臓に高濃度で存在し，脳内では低濃度で存在する。リボフラビンの輸送は，アルブミンやとイムノグロブリン類のタンパク質と結合し血中輸送されている。肝臓のような組織への取り込みは，生理的濃度では特別のタンパク質細胞送達用キャリアを介するが，それ以外はエンドサイトーシスにより取り込まれる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
コバラミン（ビタミンB12）は，主に肝臓に高濃度で存在する。コバラミンは，トランスコバラミンと呼ばれるタンパク質と結合し輸送される。食餌中のビタミンB12は，胃から分泌された内因子と結合して回腸から吸収され，吸収されたビタミンB12は，トランスコバラミンと結合して血液中を運搬される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
レチノール結合タンパク質（Retinol-binding protein:RBP）は肝臓で合成される分子量21kDaのタンパク質で，肝臓に蓄積されているビタミンA（Retinol）を結合・分泌して標的臓器（細胞）に輸送する働きにある1)。RBPの血漿半減期は短く（Rapid turnover protein），必須アミノ酸であるトリプトファン（食事から摂取し難い）を４分子含むので，タンパク栄養の指標として測定されている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上記１)の問題は，抗酸化作用を持つ両親媒精ビタミン誘導体を細胞送達用キャリアの表面の膜に取込むにことにより解決することができた。本発明者らは，以前の発明で，両親媒性アスコルビン酸誘導体を界面活性剤として使用することにより，細胞送達用キャリアの膜の一部又は総てを両親媒性アスコルビン酸誘導体で構成することに成功した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
さらに，本発明者らは，DDSの効果高めるために，様ざまな物質の細胞内取込み機構を検討した結果，エンドサイトーシスを利用することを思い付き，逆にエンドサイトーシスを誘導する物質を修飾することが，細胞送達用キャリアの取り込みに寄与するのではないかと考えた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
さらに，エンドサイトーシスを利用すれば，最後の問題である細胞吸収内で効率的に分解される問題が解決されることがわかった。すなわち，エンドサイトーシスを利用すれば，その飲作用により，細胞外液とともに細胞膜周囲の物質的を取り込むことができ，これにより細胞外液を満たした小胞(エンドソーム)を形成する。これは，全ての細胞で行われている一般的取り込み機構であり，取りこまれたエンドソームはライソソームによる分解を受ける。すなわち，細胞吸収内で効率的に分解されるのである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
そもそも，細胞はエンドサイトーシスにより細胞外からの物質などを絶え間なく取り込んでいるが，そのエンドサイトーシス活性が標準的な線維芽細胞などでさえも一分間に全体の1%程度の細胞膜がエンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれている。標準的なほ乳類の細胞一つあたりエンドソームが200個程度存在し，その合計の容積は細胞全体の1%程度をしめる。表面積で換算すると細胞膜の3%程度の限界膜がエンドソームを取り囲むこととなる。すなわち１時間で60%相当量の細胞膜がその3%程度しか表面積をもたないエンドソームへと次々流れ込んでいることになる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
この後，エンドソームは，リソソームと融合する。リソソーム（lysosome;ライソソーム）は，真核生物が持つ生体膜につつまれた構造体で内部に加水分解酵素を持ち，膜内に取り込まれた生体高分子はこれらの酵素により加水分解される。分解するべき物体を含んだエンドソームに融合した後のものは二次リソソーム（secondary lysosome）又はファゴリソソーム（phagolysosome）と称される。二次リソソームの一つは，このエンドサイトーシスに由来する。細菌等巨大な異物を取り込んだファゴソームや，ピノソームと呼ばれる細胞膜近辺のより微視的な分子を含んだ一重の生体膜からなる構造と，一次リソソームとが融合しファゴリソソーム（phagolysosome）となり，取り込んだ物を分解する。リソソームが含有する加水分解酵素群は酸性条件下で効率良く働く性質を持っており，リソソーム内部の水素イオン指数はプロトンポンプの働きによってpH５程度と酸性に保たれている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
エンドソームに取り込まれた，細胞送達用キャリア分子はリソソームで分解され一部は細胞内に蓄積すると考えるが，この時細胞内には，蓄積された未消化の多量の細胞送達用キャリアの構成物質も含まれる。この為に，オートファジーが活性化されると考えられる。つまりエンドサイトーシスによりエンドソームが活性化すると，エンドソーム系だけでなくオートファジーも活性化され，オートファゴソーム系の関連タンンパクも生合成も活性化すると考えられる。つまり本発明の目的の一つは，エンドソームとオートファゴソームの活性を担うマーカーを検出し，このマーカーを使用して，エンドソームとオートファゴソームを活性化する物質を探索し，最終的にそれを乳化物に応用するという事である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
即ち本発明では，オートファゴソーム,エンドソーム,リソソームの生合成に必要な淡白のうちいずれか１つ以上のタンパク合成の促進作用を有する物質をビタミン誘導体の中からスクリーニングすることにある。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
両親媒性抗酸化ビタミン誘導体により，その単独若しくは複合物の使用により有用なラメラ構造をもつ細胞送達用キャリアを形成しうること，およびこれらの抗酸化膜で抱接された物質が活性酸素から守られ，酸化し易い有効成分であっても，その安定性を維持しうることは，本発明者等が既に２００７年に発見し論文にしている。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
両親媒性抗酸化剤とは，アスコルビン酸やトコフェロール等の活性中心に，反対の極性を持つ修飾基で保護する事により，水溶性のアスコルビン酸を脂溶性に，脂溶性のトコフェロールを水溶性に近づけ，両親媒性を持たせた誘導体である。活性中心を修飾する為に抗酸化活性も低下している。活性酸素との反応速度をあえて低下させているのである。両親媒性の抗酸化ビタミン誘導体の活性酸素との反応速度の低下は，プロオキシダントの発生も低下させることが知られている。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
両親媒性抗酸化ビタミンを従来通りの方法で只添加するだけでは，酸化され易い有効成分の効率的な活性酸素の防御効果は発揮できず，乳化膜自体，若しくは乳化膜間に局所的に両親媒性抗酸化ビタミンが存在する事により初めて本発明の効果が効率的に発揮できるのである。これは，有効成分が存在する中心核に抗酸化ビタミン誘導体が存在するよりも，中心核の周囲に膜状に抗酸化ビタミン誘導体のバリアが存在する方が，外部からの活性酸素に対してより効果的に消去できる為であり，さらにその膜がラメラ構造を取る事により多層化すれば，幾重にも抗酸化バリアが張り巡らされる事により，有効成分が存在する中心核を守る構造がより強化されるためである。従って，乳化膜は，モノラメラである脂質２重膜及びそれ以上の多層ラメラ構造がより効果的となり，本名発明では，３重膜以上のラメラ構造が最も本発明の有効性を発揮するために適する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
【非特許文献１】Savini I，et al., Amino Acids 34，347-355 (2008).
【非特許文献２】石神 昭人，他， Vitarnin(sJapan)，88 (ll)，555-559 (2014).
【非特許文献３】Shibuya, S., et al., Nutrients 2017, 9, 645; doi:10.3390/nu9070645.
【非特許文献４】Heublein S，et al., J Cancer Res Clin Oncol. 2017年5月; 143(5):773-781.
【非特許文献５】Qu YH，Fu JC，Liu K，Zuo ZY，Jia HN，Ma Y，Luo HL. Int J Mol Sci. 2016 Jun 27;17(7):1016.
【非特許文献６】Peng J ,at al., Sci China Life Sci. 2014 Jan;57(1):59-68.
【非特許文献７】チョードリS ，et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2018 Oct 16;115(42):E9792-E9801.
【非特許文献８】Velikkakath AK, et al., Mol Biol Cell. 2012 Mar; 23(5):896-909.
【非特許文献９】Diao J ,et al., Nature. 2015 Apr 23;520(7548):563-6. doi: 10.1038/nature14147. Epub 2015 Feb 9.
【非特許文献１０】Antioxidants-carcinogenic and chemopreventive properties. Ito N, Hirose M. Adv Cancer Res. 1989;53:247-302. Review.
【非特許文献１１】Schwartz JL. J Nutr. 1996 Apr;126(4 Suppl):1221S-7S.
【非特許文献１２】J.E.ChungM.et al., Volume 9, Issues 1-2, 10 June 1997, Pages 37-48.
【非特許文献１３】Galovic Rengel R,et al., Eur J Pharm Sci. 2002 Jun;15(5):441-8.
【非特許文献１４】Filipovic-Grcic J, et al.,J Microencapsul. 2001 Jan-Feb;18(1):3-12.
【非特許文献１５】Takeuchi H, et al.,Pharm Res. 1996 Jun;13(6):896-901.
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
図１は，本発明の細胞送達用キャリアの効果のメカニズムを示す図である。A）の右上のアは，刺激応答性ポリマー含有分子である。中に有効成分（イの黒い▲）が抱接されている。アで長い尾のようなものが，刺激応答性ポリマーであり，それに結合した界面活性を有する脂質により細胞送達用キャリアの膜内に融合（接続）している。ウは，ビタミン誘導体などのオートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質であり，両親媒性のために，こちらも膜内に融合（接続）している。A)において，細胞膜表面のビタミンレセプターに結合する。B) ビタミン誘導体は，細胞表面でビタミンレセプターに認識され結合するが，分子形状が本来のビタミンと異なる為に，ビタミン輸送チャンネルで輸送されないため，細部膜表面に残りエンドサイトーシスされる。オは，細胞膜である。C)エンドソーム内に閉じ込まれた細胞送達用キャリアは，取り込み時間を見計らった外部刺激エにより，細胞表面の刺激応答性ポリマーの収縮により疎水性になる事から，膜の平行が崩れ容易に細胞送達用キャリアの膜が破壊され内容物がエンドソーム内に放出される。カは，消化酵素をもつリソソームである。D)リソソームはエンドソームと融合し，消化酵素をエンドソームに移動させ，E）においてエンドソーム内の分子を消化する。F)消化後エンドソームが破壊され，中の抱接成分（黒い▲）や一部未消化のビタミン誘導体（キ）が細胞内に放出されるようになる。未消化のビタミン誘導体は，オートファジー系を活性化させ，オートファゴソームで消化される。上記により，オートファジー関連遺伝子とリソソームの合成に関与するカテプシン合成遺伝子を同時に活性化すると考えられる。前述したようにオートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の一部はリソソーム形成にも関与する事が指摘され，本発明者等の上記の説明をより補足するものとなっている。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
本発明で使用できる，炭素が８個以上連続結合した炭化水素鎖を含む脂質としては，脂質が最も望ましく，さらに界面活性作用を持つ界面活性物質であってもどちらでも良い。炭素が８個以上連続結合した炭化水素鎖を含む脂質が細胞送達用キャリアの安定性をより高める。７以下の炭素では細胞送達用キャリアの安定性が低下し，炭素が３０以上でも同様に細胞送達用キャリアの安定性が低下する。さらに，好ましくは，脂質と界面活性作用を持つ物質の両者が同時に存在することが細胞送達用キャリアの安定性をより高めるために適している。すなわち，本発明の細胞送達用キャリアの主要部分は，脂質と界面活性作用を持つ物質によって構成され，さらに，この乳化膜に，脂質と界面活性作用を持つ物質と刺激応答性ポリマー含有分子が以下の図２又は図３のように膜の構成単位又は表面にイオン結合したものとして配置されることが最も望ましい。
請求項１３に示めされる，本発明の細胞輸送用キャリアは，オートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質と，刺激応答性ポリマー含有分子（ア）のどちらか１つ以上の物質が，脂質で主に構成された膜分子の一部を構成する，請求項１の細胞送達用キャリアであればよく，代表的な構造としては以下の図２の構造をもつものが使用できるがこれに限定されない。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
本発明の細胞送達用キャリアの代表的な構造例の１を図２に示した。
図の説明：刺激応答性ポリマー含有分子（ア）と，オートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質（イ），のどちらか１つ以上の物質が，脂質（ウ）で主に構成された膜分子の一部を構成する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
本発明の細胞送達用キャリアの代表的な構造例の２を図３に示した。
図３の説明：刺激応答性ポリマー含有分子（ア）が，脂質（イ）に，イオン結合している，本発明の細胞送達用キャリアである。（ウ）は，オートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質。
さらに，請求項１４に示される本発明には，刺激応答性ポリマー含有分子（ア）が，脂質（イ）に，イオン結合している，請求項１の細胞送達用キャリアを使用することもでき，その代表例を図３に示す。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
本発明における細胞送達用キャリアは，より細胞送達後の細胞の死滅の抑制効果に優れ，かつ，細胞内への送達効率に優れるという観点から，リン脂質でない脂質と膜融合性脂質とを，細胞内への送達効率に優れるモル比で，３：０．５〜３：２０のモル比で膜構成成分として含むことが好ましく，３：２〜３：１５のモル比で膜構成成分として含むことがより好ましく，３：５〜３：１０のモル比で膜構成成分として含むことが更に好ましい。
また，脂質として１，２-ジオレオイル-３-トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を，膜融合性脂質として１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を，前記のモル比で細胞送達用キャリアの膜構成成分として含むことが好ましい。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
刺激応答性ポリマー結合した脂質部分が細胞送達用キャリアの膜成分の界面活性を示す脂質の炭化水素叉は脂質の炭化水素部分と融合し，刺激応答性ポリマー部分は，細胞送達用キャリア外側の水溶媒部分に分散するため，あたかも刺激応答性ポリマーが細胞送達用キャリア膜から外側の溶媒側へ飛び出したような構造を取る。この状態を，刺激応答性ポリマー結合脂質により細胞送達用キャリア膜を刺激応答性ポリマーで修飾するという表現もできる。この場合，該脂質で修飾された刺激応答性ポリマー含有分子は，より細胞内での崩壊後の細胞の死滅の抑制効果に優れ，かつ，細胞内への送達効率に優れるという観点から，膜構成成分としての全脂質のうち，刺激応答性ポリマー含有分子は，０．０５〜４０モル％であることが好ましく，１．０〜２０モル％であることがより好ましく，２．０〜８．０モル％であることが更に好ましい。また，本発明における温度，pH，及び光の刺激応答性ポリマー含有分子は，膜融合性脂質と結合されることが好ましく，１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と結合することもできる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
本発明における温度刺激応答性ポリマー含有分子の水に対する下限臨界溶解温度は，体温に近い温度から製品流通時の夏場の車両輸送上の最高温度である７０℃までの温度（例えば，３５．０〜７０．０℃）の温度であることが好ましい。他方，本発明のおける温度応答性ポリマーは，下限臨界溶解温度が体温付近の温度であっても，できるだけ高い方が，細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすい。このように，細胞内への送達にも優れ，かつ，核酸の細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから，温度応答性ポリマーは，水に対する下限臨界溶解温度は，３７．０〜４２．０℃であることが好ましく，３７．５〜４１．０℃であることがより好ましく，３８．０〜４０．５℃であることが更に好ましい。なお，本発明において，温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度は，示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＤＳＣ）により測定する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
温度，pH，及び光の刺激応答性ポリマー含有分子としては，細胞内への送達にも優れ，かつ，細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから，特に，各種刺激応答性モノマーと，ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡ）などの他のモノマーとの共重合体を用いることもできる。重合体の中の，各種刺激応答性モノマーと他のモノマーのモル数であるが，各種刺激応答性モノマーが９０〜９９であることがより好ましく，他のモノマーは，１〜１０であることがより好ましい。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
例えば，温度応答性ポリマーとしては，細胞内への送達にも優れ，かつ，細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから，特に，Ｎ-イソプロピル（メタ）アクリルアミド（ＮＩＰＡＡ）と，ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡ）との共重合体を用いることもできる。重合体の中のＮＩＰＡＡとＤＭＡＰＡＡのモル数であるが，ＮＩＰＡＡが９０〜９９であることがより好ましく，ＤＭＡＰＡＡは，１〜１０であることがより好ましい。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
本発明における温度，pH，及び光の刺激応答性ポリマー含有分子の分子量は，特に限定されず，例えば，重量平均分子量が１０００〜１０００００であってもよいが，細胞内への送達にも優れ，かつ，細胞内への送達後の細胞死滅を抑制しやすいことから，重量平均分子量が２０００〜７００００であることが好ましい。なお，重量平均分子量は，ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定することができる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
細胞送達用キャリアの粒径は，特に限定されず，例えば，平均粒径０．０５〜１μｍのものを用いることができる。また，細胞送達用キャリアの平均粒径は，動的散乱法（ＤＬＳ）により測定する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
刺激応答性ポリマー含有分子が，脂肪酸に共有結合している場合の具体例としては，アルキル-ポリイソプロピルアクリルアミドなどが公知であり（非特許文献１２），刺激応答性ポリマー含有分子が，リポソームに共有結合している形態の場合は，ジオレオイルホスホエタノールアミン,メルカプトプロピオニル(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー（特許文献7）などで公知であり本発明には，これらのいずれのポリマーをも使用する事ができる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
このため，従来の温度刺激応答性ポリマー含有分子の下限臨界溶解温度は，体温に近い温度である３７〜４２℃の温度であることが好ましいとされてきた。しかし，本発明を含む製品が応用される医薬品，食品，化粧品を含む殆どの商品の流通温度の上限は，夏場には４５℃になることがあるため，下限臨界溶解温度を体温の３６〜４２℃に設定すると，細胞送達用キャリアが他の疎水性成分と結合し分離したり，容器がプラスチックの場合には付着して，有効成分が容器に残留する等の問題が発生した。このため本発明の下限臨界溶解温度は３５℃以上が適している。さらに下限臨界溶解温度が４５℃以上に設定すると人体適応箇所の温度を４５℃以上に設定する必要があるが，蒸しタオルの局所使用，局所摩擦による摩擦熱，加熱気体の利用，発熱デバイスなどの使用により，局所的に，短時間加熱する事により７０℃においても熱傷を最小限に抑制して副作用を残す事なく加熱する事ができることが判明した。７０℃以上だと不可逆的な熱傷を発生させることが多発したため，本発明の下限臨界溶解温度は，３５℃から７０℃以下にする事が望ましい。さらに好ましくは４５℃から６０℃にすることが望ましい。なお，本発明において，温度応答性ポリマーの水に対する下限臨界溶解温度は，示差走査熱量測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：ＤＳＣ）により測定する。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
本発明を実施するための最良の形態は，前記図１で示されるように，オートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質と，刺激応答性ポリマー含有分子のどちらか１つ以上の物質が，脂質で主に構成された膜分子の一部を構成する，細胞送達用キャリアである。更に，もう一つの本発明を実施するための最良の形態としては，前記図３で示される刺激応答性ポリマー含有分子が，脂質に，イオン結合している，細胞送達用キャリアが挙げられる。
本発明に包接できる有効成分としては、公知の成文リスト記載の有効成分を包接することができ、その具体例としては、ＩＳＢＮISBN:978-4840748315，ISBN:978-3-7692-7022-8，ISBN：1-882621-55-7，ISBN：978-4-8408-1492-8，ISBN：978-4-8408-1227-6，ISBN：978-4-8408-1464-5のいずれかの成分リストの掲載成分であればよい。
本発明の細胞送達用キャリアの具体的な用途としては，医薬品，医薬部外品，化粧品，サプリメント，動物医薬品，雑貨があげられる。
本発明に使用できる細胞送達用キャリアの製剤としては特に限定されないが、その剤形が，外用剤，口腔用剤，座薬，経口剤，ドリンク剤，パップ剤，パック剤，スプレー剤，注射剤，ドレッシング剤，液剤，軟膏剤，エアゾール剤，粉末状，打型剤，クリーム剤，外用散布剤，散剤，顆粒剤，錠剤，軟カプセル剤，丸剤，板状の剤型，トローチ剤，ペースト剤，固型剤，潤製剤，チック様製剤から選択される細胞送達用キャリアであれば流通剤型としてより適している。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
以下の，実験によりATG，CTS活性が，細胞送達率と相関関係にある事をしめす。
（本発明との比較実験）
脂質総量が２０ｍｇとなり，モル比率が，（脂質である１，２-ジオレオイル-３-トリメチルアンモニウムプロパン）：（ラメラ形成界面活性剤であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ  ５％)Cop.の合計重量）＝3：７の割合となるように，それぞれをクロロホルムに溶解した。さらに，蛍光色素であるローダミンＢ1mgを加えて溶解した。なお，本実験で使用したDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ  ５％)Cop.の，水に対する下限臨界溶解温度は４０℃であった。合計重量で添加した，ラメラ形成界面活性剤であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.のモル比は，６．５：０．５とした。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
このN-スクシンイミジルメルカプトプロピオン酸(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド５％)コポリマーと，ラメラ形成界面活性剤であり，エタノールアミン基を持つ脂質である１，２-ジオレオイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミンがモル比１：１でとなるようにジオキサンに溶解させ，室温で２４時間反応させた。反応後の溶液をエバポレーターでバキュームし，溶媒を飛ばすことによって，以下化学式１で示される温度刺激応答性ポリマー結合脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンメルカプトプロピオニル(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド５％)コポリマーを調製した。本発明者らはこの温度刺激応答性ポリマー結合脂質を略してDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ５％)Cop.と略す。叉は，以下DOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.と書かれた場合は，DOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ５％)Cop.を意味するものとする。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンメルカプトプロピオニル(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマーの略称は，DOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.で示す。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
【化１】
2021098668.tif 000002
化１は、本発明で使用できるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンメルカプトプロピオニル(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマーの化学式である。略称は，DOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.として以下表示する。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
上記実施例の第１モノマーであるＮ-イソプロピルアクリルアミドを，以下記載の別の第１モノマーに置き換えることにより，上記と同じ方法で脂質結合型の温度刺激応答性ポリマーを製造することができた。ところで，上記製法では第２モノマーの使用が記載されているが，第２モノマーは，使用された第１モノマーとは異なる物質を，同じ第１モノマーのグループの中から選択することができた。さらに，この第２モノマーは，添加しなくてもよく，その場合の配合率は，第２モノマーを減らした分，第１モノマーを増量すれば良い。前記の製造工程及び４０℃、湿度８０％、６ヶ月間におよぶ安定性試験の結果により分解率が１０％以下であった温度刺激応答性第１モノマーとしては以下の段落番号０１５４に示されるものが本発明で使用出来ることが判明した。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
（別の第一モノマー）
（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）アクリレート，（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート，（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート，（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）メタクリレート，（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート，（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）メタクリレート，１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン，１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼン，２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン，２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート，２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートＤＭＡＥＭＡ，２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール，２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス），２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール，２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレート，２−ヒドロキシブチルアクリレート，２−ヒドロキシブチルメタクリレート，２−ヒドロキシプロピルアクリレート，２−ヒドロキシプロピルメタクリレート，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン，３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド，N-アクリロイルアスパラギンアミド，N-アクリロイルグリシンアミド，N-アクリロイルグルタミンアミド，N-アセチルアクリルアミド，N-メチルアクリロイルアスパラギンアミド，Ｎ, Ｎ−ジメチルメタクリルアミド，Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−エチルメチルアミド，Ｎ，Ｎ−エチルメチルメタクリルアミド，Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル，Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド，Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド，Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミル酸，Ｎ，Ｎ−ジチオカルバメート，Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド，Ｎ，Ｎ−プロピルアクリルアミド，Ｎ，Ｎ−プロピルメタクリルアミド，Ｎ−アクリロイルピペリジン，Ｎ−アクリロイルモルホリン，Ｎ−アルキルアクリルアミド，Ｎ−アルキルメタアクリルアミド，Ｎ−アルキル置換アクリルアミド，Ｎ−アルキル置換メタクリルアミド，Ｎ−アレニルフタルイミド，Ｎ−イソプロピルアクリルアミド，Ｎ−イソプロピルアミド，Ｎ−イソプロピルブタ−２，３−ジエナミド，Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド，Ｎ−エチルアクリルアミド，Ｎ−エチルメタクリルアミド，Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド，Ｎ−エトキシエチルアミド，Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド，Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド，Ｎ−シクロプロピルアミド，Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド，Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド，Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド，Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド，Ｎ−ビニルアクリルアミド，Ｎ−ビニルアルキルアクリルアミド，Ｎ−ビニルメタアクリルアミド，N−プロピルアクリルアミド，Ｎ−メタクリロイルピペリジン，Ｎ−又はＮ，Ｎ−ジアルキル置換メタアクリルアミド���ｓ−ブチルアクリルアミド，ｔ−ブチルアクリルアミド，アクロイルグリシンアミド，アクロイルザルコシンアミド，アクロイルニペコタミド，アクロイルメチルウラシル，アセチルアクリルアミド，イソプロピルアクリルアミド，エチルイソプロピルアクリルアミド，エチレングリコール，エチレングリコールアレニルメチルエーテル，オキシエチレンアクリル酸エステル，オキシエチレンソルビタンラウレート，オキシエチレンメタアクリル酸エステル，オキシエチレンラウリルアミン，オリゴエチレングリコールアクリル酸エステル，ジイソプロピルアクリルアミド，ジエチルアクリルアミド，ジエチルアミノアクリレート，ジエチルアミノメタアクリレート，ジエチレングリコールアレニルメチルエーテル，ジブチルアクリルアミド，ジプロピルアクリルアミド，ジメチルアクリルアミド，ジメチルアミノアクリルアミド，ジメチルアミノアクリレート，ジメチルアミノプロピルアクリルアミド，ジメチルアミノプロピルメタアクリルアミド，ジメチルアミノメタクリルアミド，ジメチルアミノメタクリレート，ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート，プロピレングリコール，ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン，ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン，メチルアクリルアミド。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
メルカプトプロピオン酸を以下「MPA」と略す。上記実施例で製造し前記の製造工程及び４０℃、湿度８０％、６ヶ月間におよぶ安定性試験の結果により分解率が１０％以下であった本発明に使用できる完成した（温度）刺激応答性MPAポリマーを以下段落番号０１５５に示す。
（完成した（温度）刺激応答性MPAポリマー）
MPA(（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）アクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）メタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）メタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートＤＭＡＥＭＡ/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−ヒドロキシブチルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−ヒドロキシブチルメタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−ヒドロキシプロピルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(２−ヒドロキシプロピルメタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(N-アクリロイルアスパラギンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(N-アクリロイルグリシンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(N-アクリロイルグルタミンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(N-アセチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(N-メチルアクリロイルアスパラギンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ,Ｎ−ジメチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−メチ��ンビスアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−エチルメチルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−エチルメチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミル酸/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジチオカルバメート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−プロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ，Ｎ−プロピルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アクリロイルピペリジン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アクリロイルモルホリン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アルキルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アルキルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アルキル置換アクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アルキル置換メタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−アレニルフタルイミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−イソプロピルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−イソプロピルブタ−２，３−ジエナミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−エチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−エチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−エトキシエチルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−シクロプロピルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド/ジメチルアミノ���ロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−ビニルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−ビニルアルキルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−ビニルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(N−プロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−メタクリロイルピペリジン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(Ｎ−ジアルキルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ｓ−ブチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ｔ−ブチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(アクロイルグリシンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(アクロイルザルコシンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(アクロイルニペコタミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(アクロイルメチルウラシル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(アセチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(エチルイソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(エチレングリコール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(エチレングリコールアレニルメチルエーテル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(オキシエチレンアクリル酸エステル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(オキシエチレンソルビタンラウレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(オキシエチレンメタアクリル酸エステル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(オキシエチレンラウリルアミン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(オリゴエチレングリコールアクリル酸エステル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジイソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジエチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジエチルアミノアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジエチルアミノメタアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジエチレングリコールアレニルメチルエーテル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジブチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメ���ルアミノアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメチルアミノアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメチルアミノプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメチルアミノプロピルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメチルアミノメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ジメチルアミノメタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(プロピレングリコール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，MPA(メチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
さらに前記の製造工程及び４０℃、湿度８０％、６ヶ月間におよぶ安定性試験の結果により分解率が１０％以下であった本発明に使用できる完成した本発明の刺激応答性ポリマー結合脂質を以下段落番号０１５６に示す。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンメルカプトプロピオニルを以下「DOPEAMP」と略す。さらに，DMAPAAを「DMAPAA」と略す。
（完成した本発明の刺激応答性ポリマー結合脂質）
DOPEAMP(（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）アクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）メタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）メタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−ｎ−プロピル−２−オキサゾリン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートＤＭＡＥＭＡ/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−ヒドロキシ−３−フェノキシプロピルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−ヒドロキシブチルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−ヒドロキシブチルメタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−ヒドロキシプロピルアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(２−ヒドロキシプロピルメタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(N-アクリロイルアスパラギンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(N-アクリロイルグリシンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(N-アクリロイルグルタミンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(N-アセチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(N-メチルアクリロイルアスパラギンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ,Ｎ−ジメチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ-ジメチルアク���ルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−エチルメチルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−エチルメチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジエチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミル酸/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジチオカルバメート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−プロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ，Ｎ−プロピルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アクリロイルピペリジン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アクリロイルモルホリン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アルキルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アルキルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アルキル置換アクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アルキル置換メタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−アレニルフタルイミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−イソプロピルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−イソプロピルブタ−２，３−ジエナミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−エチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−エチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−エトキシエチルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプ���ピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−シクロプロピルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−ビニルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−ビニルアルキルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−ビニルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(N−プロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−メタクリロイルピペリジン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(Ｎ−ジアルキルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ｓ−ブチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ｔ−ブチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(アクロイルグリシンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(アクロイルザルコシンアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(アクロイルニペコタミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(アクロイルメチルウラシル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(アセチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(イソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(エチルイソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(エチレングリコール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(エチレングリコールアレニルメチルエーテル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(オキシエチレンアクリル酸エステル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(オキシエチレンソルビタンラウレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(オキシエチレンメタアクリル酸エステル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(オキシエチレンラウリルアミン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(オリゴエチレングリコールアクリル酸エステル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジイソプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジエチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジエチルアミノアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジエチルアミノメタアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジエチレングリコールアレニルメチルエーテル/ジメチルアミノプロピルアクリルアミ���)コポリマー，DOPEAMP(ジブチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアミノアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアミノアクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアミノプロピルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアミノプロピルメタアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアミノメタクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ジメチルアミノメタクリレート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(プロピレングリコール/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー，DOPEAMP(メチルアクリルアミド/ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)コポリマー。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
上記で示したジオレオイルホスファチジルエタノールアミンの代わりに以下に示めされるエタノールアミン基を持つ脂質を使って，４０℃、湿度８０％、６ヶ月間におよぶ安定性試験の結果により分解率が１０％以下であった本発明の刺激応答性ポリマー結合脂質に使用できるエタノールアミン基を持つ脂質を段落番号０１５７に示す。
（エタノールアミン基を持つ脂質）
２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインエタノールアミン，Ｎ−アシルアスパラギン酸エタノールアミン，Ｎ−アシルグルタミン酸エタノールアミン，Ｎ−アシルサルコシンエタノールアミン，Ｎ−アシルメチルアラニンエタノールアミン，Ｎ−アシルメチルタウリンエタノールアミン，N-ステアロイルジヒドロスフィンゴエタノールアミン，N-ステアロイルフィトスフィンゴエタノールアミン，アシル（C12,14）アスパラギン酸エタノールアミン，アシルＮ−メチルアミノ酸エタノールアミン，アシルアミノ酸エタノールアミン，アシル乳酸エタノールアミン，アセチルエチルカルボキシルメチルチアゾリジンカルボニルエタノールアミン，アミノ酢酸ベタインエタノールアミン，アルキル(アルケニル)オリゴグリコールエタノールアミン，アルキルフェノールポリグリコールエタノールアミン，アルコキシル化トリグリセリルエタノールアミン，イソテアリン酸フィトステリルエタノールアミン，カプロイルプロリンエタノールアミン，グリセロリン酸エタノールアミン，グルクロン酸エタノールアミン，ココイルアラニンエタノールアミン，ココイルグルタミン酸エタノールアミン，ココイルメチルタウリンエタノールアミン，コハク酸エタノールアミン，サーファクチンエタノールアミン，ジステアロイルグルタミン酸リシンエタノールアミン，ジホスファチジルグリセロールエタノールアミン，ジミリストイルグルタミン酸リシンエタノールアミン，ジラウロイルグルタミン酸リシンエタノールアミン，ジリノレオイルグルタミン酸リシンエタノールアミン，ステアロイルグルタミン酸ジオクチルドデシルエタノールアミン，ステアロイルグルタミン酸エタノールアミン，スピクリスポール酸エタノールアミン，スフィンゴエタノールアミン，セラミドホスホエタノールアミン，セラミドアミノエチルホスホエタノールアミン，セレブロシドエタノールアミン，パーム核油脂肪酸アミドプロピルベタインエタノールアミン，パーム脂肪酸グルタミン酸エタノールアミン，パルミトイルアスパラギン酸エタノールアミン，ビス（Ｎε-ラウロイル-Ｌ-リジン）セバコイルエタノールアミン， ヒドロキシステアリルフィトスフィンゴシンエタノールアミン，ピログルタミン酸イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリルエタノールアミン，ピログルタミン酸オレイン酸グリセリルエタノールアミン，ホスファチジルエタノールアミン，ポリオキシエチレンステアリルエタノールアミン，ポリオキシエチレンソルビタンステアリルエタノールアミン，ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル，ポリオキシエチレンメチルグルコースステアリルエタノールアミン，ポリオキシエチレンステアリルエタノールアミン，ポリオキシエチレンラウリルエタノールアミン，ミリストイルグルタミン酸エタノールアミン，ミリストイルメチルアミノプロピオン酸ヘキシルデシルエタノールアミン，ミリストイルメチルタウリンエタノールアミン，モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンエタノールアミン，ヤシ油アルキルベタインエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸Ｎ−メチルエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸アシルグリシンエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸アシルグルタミン酸エタノールアミン，ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸グリセリルエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸グルタミン酸エタノールアミン，ヤシ油脂肪酸サルコシンエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸メチルアラニンエタノールアミン，ヤシ油脂肪酸メチルタウリンエタノールアミン，ラウラミドプロピルベタインエタノールアミンラウリルアミノジ酢酸エタノールアミン，ラウリルジアミノエチルグリシンエタノールアミン，ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインエタノールアミン，ラウリン酸アミドプロピルベタイン，ラウレス酢酸エタノールアミン，ラウレス硫酸エタノールアミン，ラウロイルアスパラギン酸エタノールアミン，ラウロイルグルタミン酸ジヘキシルデシルエタノールアミン，ラウロイルグルタミン酸トリエタノールアミン，ラウロイルグルタミン酸メチルアラニンエタノールアミン，ラウロイルグルタミン酸エタノールアミン，ラウロイルグルタミン酸トリエタノールアミン，ラウロイルサルコシントリエタノールアミン，ラウロイルメチルアラニンエタノールアミン，ラウロイルメチルグリシンエタノールアミン，ラウロイルメチルタウリンエタノールアミン，ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸エタノールアミン，リゾホスファチジルエタノールアミン。
【手続補正４４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
（pH,光刺激感応性ポリマー結合脂質の製造）
上記のMPA誘導体を使用して，ラメラ構造形成脂質であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを修飾し，以下段落番号０１６０記載の刺激感応性ポリマー結合脂質を同様に製造した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンメルカプトプロピオニルを以下「DOPEAMP」と略す。これらのポリマーは、４０℃、湿度８０％、６ヶ月間におよぶ安定性試験の結果により分解率が１０％以下であった。
pH刺激応答性ポリマー：DOPEAMP（ポリグルコサミン），DOPEAMP（ポリ(エトキシエチルビニルエーテル))，DOPEAMP（アルキルアクリルアミド／ポリアクリル酸）コポリマー，DOPEAMP（ポリ(ビニルアルキルアクリルアミド))，DOPEAMP(ポリ（（ビニルオキシエトキシ）安息香酸），DOPEAMP(ポリ（（ビニルオキシエトキシ）ヘキサン酸）)，DOPEAMP(ポリ（（ビニロキシ）ヘキサン酸）)，DOPEAMP（ポリ(イソブチルビニルエーテル))，光刺激応答性ポリマー：DOPEAMP（ポリ(アルキルアクリルアミド))，DOPEAMP（ポリ(（4-フェニルアゾフェニル）アクリルアミド))，DOPEAMP（ポリ([（ピリジルアゾ）フェノキシ]ヘキサメタクリレート))，DOPEAMP（ポリ(ビニルアルキルアクリルアミド))，DOPEAMP（ポリ(（（ビニロキシ）エトキシ）アゾベンゼン)），DOPEAMP（ポリ(（エトキシ）エトキシエチルビニルエーテル)）
【手続補正４５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
（刺激応答性ポリマー結合脂質と，ATG,CTS活性を有するビタミン誘導体と，炭化水素からなるラメラ形成界面活性剤と，からなる３種混合細胞送達用キャリアの作成）
脂質総量が２０ｍｇとなり，モル比率が，ATG,CTS活性が高いビタミン誘導体であるVCIP（テトラヘキシルデカン酸アスコルビル）：ラメラ形成界面活性剤であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）：DOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ) Cop.）＝３：７の割合となるように，それぞれをクロロホルムに溶解した。なお，クロロホルムに溶解したＤＯＰＥのうち，ラメラ形成界面活性剤のジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と温度刺激応答性ポリマー結合脂質であるDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.とのモル比は，６．５：０．５とした。その溶液を，ナスフラスコに移動させ，エバポレーターで溶媒を飛ばし，リピッドフィルムを作製した。このリピッドフィルムに精製水を１ｍｌ加え，リピッドフィルムを水和させた後，ボルテックスで分散させた。その後，超音波槽で３０分ソニケーションを行い，リポソームのサイズを小さくしてから，エクストルーダーを用いて，２００ｎｍのフィルターを通して，リポソームのサイズを整えた。平均粒子径は１５２ｎｍであった。その後，ゲル濾過によりリポソームを分離させて精製し，ATG,CTS活性化物質と温度応答性ポリマーと炭化水素を含有した本発明の細胞送達用キャリアを作製した。この細胞送達用キャリアを染色法により透過型電子顕微鏡で観察すると多層ベシクル構造（ラメラ液晶構造）が確認でき，これらの細胞送達用キャリアがラメラ液晶構造を有することが確認された。
【手続補正４６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
（本発明との比較実験）
脂質総量が２０ｍｇとなり，モル比率が，（ATG,CTS活性が高いビタミン誘導体であるテトラヘキシルデカン酸アスコルビル,VCIP）:（脂質である１，２-ジオレオイル-３-トリメチルアンモニウムプロパン）：（ラメラ形成界面活性剤であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ５％)Cop.の合計重量）＝１：２：７の割合となるように，それぞれをクロロホルムに溶解した。さらに，これに蛍光色素であるローダミン(Carboxyrhodamine 110-PEG4-alkyne)1mgを加えて溶解した。なお，本実験で使用したDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ５％)Cop.の，水に対する下限臨界溶解温度は４０℃であった。合計重量で添加した，ラメラ形成界面活性剤であるジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.のモル比は，６．５：０．５とした。その溶液を，ナスフラスコに移動させ，エバポレーターで溶媒を飛ばし，リピッドフィルムを作製した。このリピッドフィルムにPBSを１ｍｌ加え，リピッドフィルムを水和させた後，ボルテックスで分散させた。その後，超音波槽で３０分ソニケーションを行い，リポソームのサイズを小さくしてから，エクストルーダーを用いて，２００ｎｍのフィルターを通して，リポソームのサイズを整えた。実施例と比較例の平均粒子径は１１４ｎｍ±１３ｎｍであった。別に，本発明の実施例だけは異なる大きなサイズのフィルターを用いて，平均粒子径が２５２ｎｍ，３１２ｎｍ，５７８ｎｍ，８１２ｎｍのものも作成した。その後，ゲル濾過によりリポソームを分離させて精製し，ATG,CTS活性化物質と温度応答性ポリマーと炭化水素を含有した本発明の細胞送達用キャリアを作製した。この細胞送達用キャリアを染色法により透過型電子顕微鏡で観察すると多層ベシクル構造（ラメラ液晶構造）が確認でき，これらの細胞送達用キャリアがラメラ液晶構造を有することが確認された。
【手続補正４７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
（温度応答性細胞送達用キャリアの安定性と取込み実験）試料A-１）両親媒性抗酸化ビタミン配合温度応答性ラメラ細胞送達用キャリア（本発明）卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール（INCI名 PEG-25 Phytostanol）０.１ｇとGOVC（２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸，グリセリン：カプリル酸：アスコルビン酸からなる基質を0.223:0.35:0.427の重量比で結合した両親媒性ビタミン誘導体）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。
【手続補正４８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
試料B-１）両親媒性の抗酸化ビタミンを構成する基質配合の温度応答性ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール１）卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.１ｇとカプリル酸0.035をクロロホルムに溶解し，エバポレーターで溶媒を除去してラメラ構造フィルムを形成させた。これにペプチド結合蛍光物質溶液（試料A-1と同じもの）1mLとアスコルビン酸0.043ｇとグリセリン0.022ｇとsiRNA溶液１ｍLを混合した。次に高速ミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径400nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングした。PD-10columnを用いてゲルろ過し細胞送達用キャリアを精製した。
【手続補正４９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
試料C-１)両親媒性の抗酸化ビタミン配合の非ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール２）卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.１ｇとGOVC０.１ｇにペプチド結合蛍光物質溶液（試料A-1と同じもの）を1mLとsiRNA溶液を１ｍL混合した。これらをラメラ構造フィルムの形成工程を経ないで，高速ミキサーで破砕撹拌し，その後超音波処理し，さらに孔径400nmのフィルターを通過させた。
【手続補正５０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
試料D-１)両親媒性の抗酸化ビタミン非配合の非ラメラ細胞送達用キャリアのコントロール卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.１ｇに，ペプチド結合蛍光物質溶液（試料A-1と同じもの）を1mLとsiRNA溶液を１ｍL混合した。これらをラメラ構造フィルムの形成工程を経ないで，高速ミキサーで破砕撹拌し，その後超音波処理し，さらに孔径400nmのフィルターを通過させた。
【手続補正５１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
（Franz cellを用いた皮膚透過性の比較）表皮皮膚モデルとしてLabCyte EPI-MODELを使用し，Franz Cellに人工皮膚をはさみ，37℃でインキュベートし作製したペプチド結合蛍光物質を含む上記で作成した本名発明のA-1，以下コントロールのB-１，C-1，D-1組成物液を1mLをドナーチャンバーへ投与し，投与後，48時間後，サンプリングポートのサンプリング試料及びペプチド結合蛍光物質抱接乳化組150μLに10％TritonX 10μLを加え試料溶液とした。試料溶液100μLを蛍光光度計infiniteM1000を用いて蛍光強度を測定し，以下の式から皮膚透過率を算出した。結果，本発明のA-1は４２％，以下コントロールのB-１は１９％，C-1は５％，D-1は４％であり，本発明の両親媒性抗酸化ビタミン配合ラメラ細胞送達用キャリアであるA-1の皮膚透過性の優位性が確認できた。
Permeation Rate(%)=(Fr/Fd)x100
（Fr：Fluourcence of sample from receptor，Fd：Fuluorescence of donor）
【手続補正５２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
（pH応答性細胞送達用キャリアの作製）試料A-２）両親媒性抗酸化ビタミン配合pH応答性ラメラ細胞送達用キャリア本発明）卵黄由来ホスファチジルコリン３ｇ，ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとコレステロール０.1５ｇ，PEG-25フィトスタノール（INCI名 PEG-25 Phytostanol）０.3ｇ，GOVC（２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸，グリセリン：カプリル酸：アスコルビン酸からなる基質を0.223:0.35:0.427の重量比で結合した両親媒性ビタミン誘導体）０.１ｇをクロロホルム１５０ｍLに溶解後，減圧下でクロロホルムを除去しフィルムを作製した。そこに0.5mMカルセインと9.0%(w/v)スクロースの混合溶液を１００mL加え，リピッドフィルムを剥がし超音波槽を用いて超音波で破砕後，孔径100nmフィルターでサイジングを行った。細胞送達用キャリア粒子の平均直径は８７ｎｍであった。電子顕微鏡観察によりラメラ構造が確認された。次にPD-10 columnでゲルろ過し，これをキトサン処理前液とした。次にこれを，キトサン溶液0.1(w/v)を1%(v/v)酢酸溶液に溶解させた液に滴下し４０℃で５時間反応後冷却した。これを，本発明のpH応答性細胞送達用キャリアとして，以下pH-GOVC-Chitoと略す。
【手続補正５３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
試料B-2）両親媒性の抗酸化ビタミンを構成する基質配合のpH応答性ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール１）卵黄由来ホスファチジルコリン３ｇ，ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとコレステロール０.1５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.3ｇとカプリル酸0.035をクロロホルム１５０ｍLに溶解エバポレーターによりクロロホルムを除去しフィルムを作製した。そこにアスコルビン酸0.04３ｇとグリセリン0.022ｇ，及び0.5mMカルセインと9.0%(w/v) スクロースの混合溶液を１００mL加え，リピッドフィルムを剥がし超音波槽を用いて超音波で破砕後，孔径100nmフィルターでサイジングを行った。次にPD-10 columnでゲルろ過し，これをキトサン溶液0.1(w/v)を1%(v/v)酢酸溶液に溶解させた液に滴下し４０℃で５時間反応後冷却した。
【手続補正５４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
試料C-2）両親媒性抗酸化ビタミン配合非ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール２）卵黄由来ホスファチジルコリン３ｇ，ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとコレステロール０.1５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.3ｇとGOCV０.１ｇ，及び0.5 mMカルセインと9.0%(w/v)スクロースの混合溶液を１００mL加え，高速ミキサーで破砕後，超音波処理し，孔径100nmフィルターを通過させた。これをキトサン溶液0.1(w/v)を1%(v/v)酢酸溶液に溶解させた液に滴下し４０℃で５時間反応後冷却した。
【手続補正５５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
試料D-2  両親媒性の抗酸化ビタミン非配合の非ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール３）卵黄由来ホスファチジルコリン３ｇ，ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとコレステロール０.1５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.3ｇ，及び0.5mMカルセインと9.0%(w/v)スクロースの混合溶液を１００mL加え，高速ミキサーで破砕後，超音波処理し，孔径100nmフィルターを通過させた。これをキトサン溶液0.1(w/v)を1%(v/v)酢酸溶液に溶解させた液に滴下し４０℃で５時間反応後冷却した。
【手続補正５６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
（pH反応性細胞送達用キャリアの皮膚透過率）表皮皮膚モデル（LabCyte EPI-MODEL 12）とレセプター内をPBSで満たしたFranz cellを使用し上部ドナーに本発明のA-2と以下コントロールのB-2，C-2，D-2の細胞送達用キャリア溶液を１mL添加して37℃,24時間培養後にPBSで満たされた下部レセプター部と上部ドナー部から試料を150μLずつ採取し10倍希釈したTriton X-100を20μL加え，その蛍光強度をInfiniteM1000を用いて測定した（Ex 495 nm, Em 515nm）。その値から以下式を用いて皮膚透過率を求めた。
Cumulative % dose applied / cm2＝(Fuluorcence of sample from receptor / Fuluorcence of donor) ×100% / 0.64 cm2
【手続補正５７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
（細胞内分布試験）HMV-II細胞をglass bottom dishに5×104cells/mLの濃度で2mLずつ播種し，24時間インキュベートした（37℃）。本発明のA-2とD-4を添加して2h培養後，PBSで2回洗浄し，70hインキュベートを行った。4% paraformaldehyde phosphate buffer solutionで20分固定化した後，再度PBSで2回洗浄し，共焦点レーザー顕微鏡で観察を行った。その結果，A-４に含有されていた蛍光色素のカルセインは，殆ど細胞内に取り込まれないことが判明した。これに対し本名発明のA-2では，カルセインは，細胞質と核に取り込まれ，特にカルセインは細胞核に顆粒状に集中していることが確認された。核のカルセイン蛍光強度は細胞質よりも低かった。
【手続補正５８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
試料A-１）ビタミン誘導体配合光応答性ラメラ細胞送達用キャリア（本発明）卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(FMA/SpMA)Copo.1ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール（INCI名 PEG-25 Phytostanol）０.１ｇとGOVC（２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸，グリセリン：カプリル酸：アスコルビン酸からなる基質を0.223:0.35:0.427の重量比で結合した両親媒性ビタミン誘導体）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに紫外線（352nm）を3分間照射し遮光した。以下作業は，暗室用赤色光源下で作業した。
【手続補正５９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
試料B-１）ビタミン誘導体でないビタミン配合の温度応答性ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール１）卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(FMA/SpMA)Copo.1ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.１ｇとカプリル酸0.035をクロロホルムに溶解し，エバポレーターで溶媒を除去してラメラ構造フィルムを形成させた。これに紫外線（352nm）を3分間照射し遮光した。以下作業は，暗室用赤色光源下で作業した。これにペプチド結合蛍光物質溶液（試料A-1と同じもの）1mLとアスコルビン酸0.043ｇとグリセリン0.022ｇとsiRNA溶液１ｍLを混合した。次に高速ミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径400nm フィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングした。PD-10 columnを用いてゲルろ過し細胞送達用キャリアを精製し遮光瓶に保存した。
【手続補正６０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
試料C-１)ビタミン誘導体配合の非ラメラ細胞送達用キャリア（コントロール２）卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(FMA/SpMA)Copo.1ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.１ｇとGOVC ０.１ｇにペプチド結合蛍光物質溶液（試料A-1と同じもの）を1mLとsiRNA溶液を１ｍL混合した。これに紫外線（352nm）を3分間照射し遮光した。以下作業は，暗室用赤色光源下で作業した。これらをラメラ構造フィルムの形成工程を経ないで，高速ミキサーで破砕撹拌し，その後超音波処理し，さらに孔径400nmのフィルターを通過させ遮光瓶に保存した。
【手続補正６１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
試料D-１)ビタミン誘導体非配合の非ラメラ細胞送達用キャリアのコントロール卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(FMA/SpMA)Copo.1ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール０.１ｇに，ペプチド結合蛍光物質溶液（試料A-1と同じもの）を1mLとsiRNA溶液を１ｍL混合した。これに紫外線（352 nm）を3分間照射し遮光した。以下作業は，暗室用赤色光源下で作業した。これらをラメラ構造フィルムの形成工程を経ないで，高速ミキサーで破砕撹拌し，その後超音波処理し，さらに孔径400nmのフィルターを通過させ遮光瓶に保存した。
【手続補正６２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
（皮膚組織透過性の比較）表皮皮膚モデルとしてLabCyte EPI-MODELを使用し，FranzCellに人工皮膚をはさみ，37℃でインキュベートし作製したペプチド結合蛍光物質を含む上記で作成した本名発明のA-1，以下コントロールのB-１，C-1，D-1組成物液1mLをドナーチャンバーへ投与し，遮光して３７℃で６時間インキュベートし，可視光（530nm）を３０分間照射し，引き続き４２時間インキュベートした。その後，サンプリングポートのサンプリング試料及びペプチド結合蛍光物質抱接乳化組150μLに10％TritonX10μLを加え試料溶液とした。試料溶液100μLを蛍光光度計infiniteM1000を用いて蛍光強度を測定し，以下の式から皮膚透過率を算出した。結果，本発明のA-1は２５％，以下コントロールのB-１は１５％，C-1は３％，D-1は２％であり，本発明の両親媒性抗酸化ビタミン配合ラメラ細胞送達用キャリアであるA-1の皮膚透過性の優位性が確認できた。
Permeation Rate(%)=(Fr/Fd)x100
（Fr：Fluourcence of sample from receptor，Fd：Fuluorescence of donor）
【手続補正６３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
上記で作成した，本名発明の温度刺激応答製ポリマー含有細胞送達用キャリアであるSGOVC-DDSとS-VCIP-DDS，及び，前記実施例で示したpH刺激応答性ポリマーを含有した本発明のpH-GOVC-Chito及び，前記実施例で示した光刺激応答性ポリマーを含有した本発明のDOPEMP(FMA/SpMA)Copoを使用して以下の処方を作成した。以下の製剤処方の単位は全て％重量で示す。以下の製剤処方において，S-GOVC-DDSとS-VCIP-DDSを同質量５０％：５０％で混合したものをS-GOVC-DDS/S-VCIP-DDSと記した。更に，S-GOVC-DDSとS-VCIP-DDSとpH-GOVC-ChitoとDOPEMP(FMA/SpMA)Copoを同質量２５％：２５％：２５％：２５％で混合したものをS-GOVC-DDS/S-VCIP-DDS/pH-GOVC-Chito/DOPEMP(FMA/SpMA)Copoと記した。
【手続補正６４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
（異なる温度応答性細胞送達用キャリア）
下限臨界溶解温度が，３７〜４２℃であるDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ) Cop.の体温変化型温度応答性細胞送達用キャリア（以下単に体温変化型という）と下限臨界溶解温度が，４５〜６０℃であるDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.の高温変化型温度応答性細胞送達用キャリア（以下単に高温変化型という）を使用して両親媒性抗酸化ビタミン配合温度応答性ラメラ細胞送達用キャリアの２つのキャリアの効果を比較した。
【手続補正６５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
キャリアの作成方法は、同じであり、即ち、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ) Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール（INCI名 PEG-25 Phytostanol）０.１ｇとGOVC（２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸，グリセリン：カプリル酸：アスコルビン酸からなる基質を0.223:0.35:0.427の重量比で結合した両親媒性ビタミン誘導体）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに0.2mg/mLの濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLと核酸としてルシフェラーゼ活性を抑制するタンパクを細胞内で生合成するmir-125a  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘを200nMの濃度でPBSでの希釈した溶液（以下単にsiRNA溶液と記す）１ｍL混合した。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径400nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングした。PD-10columnを用いてゲルろ過し細胞送達用キャリアを精製した。（皮膚組織透過性の比較）表皮皮膚モデルとしてLabCyte EPI-MODELを使用し，FranzCellに人工皮膚をはさみ，37℃でインキュベートし作製した蛍光物質を含む上記で作成した本発明の体温変化型と高温変化型のそれぞれのキャリアを１％重量含む組成物液1mLをドナーチャンバーへ投与し，遮光して体温モデルの３７℃と蒸しタオルモデルの４５℃でそれぞれ０．５時間インキュベートし，可視光（530nm）を３０分間照射し，引き続き４２時間インキュベートした。その後，サンプリングポートのサンプリング試料及びペプチド結合蛍光物質抱接乳化組150μLに10％TritonX 10μLを加え基準の試料溶液とした。試料溶液100 μLを蛍光光度計infiniteM1000を用いて蛍光強度を測定し，以下の式から皮膚透過率を算出した。その結果，３７℃インキュベーションにおける体温変化型は８％，高温変化型は４％であり、３７℃の体温モデル温度では、体温変化型が高温変化型の２倍高い蛍光強度を示した。一方４５℃インキュベーションにおける体温変化型は３％，高温変化型は９％であり、４５℃の蒸しタオルモデル温度では、高温変化型が体温変化型の３倍高い蛍光強度を示した。この結果は、蒸しタオルや赤外線、高周波、低周波などの光線療法デバイスなどを用いた高温環境では、４５℃以上の高温変化型キャリが人体変化型キャリアよりも高い薬剤輸送能力を発揮することが確認された。
【手続補正６６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
（異なるビタミン誘導体の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリア の異なるビタミン誘導体における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール（INCI名 PEG-25 Phytostanol）０.１ｇと異なるビタミンン誘導体０.１ｇを２００ mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに0.2mg/mL の濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つ、偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたビタミン誘導体のみ本発明に有効に使用できるビタミン誘導体として○グループとし、どちらか一方が確認できなかったものをＸグループとして以下の表にまとめた。
（○グループのビタミン誘導体）
【表１５】
2021098668.tif 000003
（Ｘグループのビタミン誘導体）
アスコルビン酸−２−硫酸Ｎａ，アスコルビン酸−２−硫酸Ｋ，アスコルビン酸−２−リン酸Ｎａ，アスコルビン酸−２−リン酸Ｍｇ，アスコルビン酸−２−リン酸−６−パルミチン酸Ｎａ，ステアリン酸アスコルビル、イソステアリルアスコルビルリン酸２Ｎａ、イソステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、イソパルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ、トコフェリルジメチルグリシン、トコフェリルジメチルグリシンＨＣｌ
【手続補正６７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６６】
（脂質の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリアの異なる脂質における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，PEG-25フィトスタノール（INCI名 PEG-25 Phytostanol）０.１ｇと脂質０．５ｇとGOVC（ビタミン誘導体である２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに0.2mg/mL の濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つび偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたもので、且つ、ビタミン誘導体の減衰率を１０％以下に抑制しビタミン誘導体を安定に保つことができた脂質を本発明に特に有用に使用できる脂質として以下に記載し、どちらか一方でも確認できなかったものを安定性に問題有として除外した。
（本発明に特に有用に使用できる脂質）
【表１６】
2021098668.tif 000004
【手続補正６８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
（界面活性作用を有する脂質の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリアの異なる界面活性作用を持つ脂質における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇ，界面活性作用を持つ脂質０.５ｇとGOVC（ビタミン誘導体である２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに0.2mg/mLの濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つび偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたもので、且つ、ビタミン誘導体の減衰率を１０％以下に抑制しビタミン誘導体を安定に保つことができたものを本発明に特に有用に使用できる界面活性を有する脂質として以下に記載し、どちらか一方でも確認できなかったものを安定性に問題有として除外した。
（本発明に特に有用に使用できる界面活性を有する脂質）
【表１７】
2021098668.tif 000005
【手続補正６９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
（刺激応答性物質の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリアの異なる刺激応答性物質における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇと異なる刺激応答性物質３ｇとコレステロール０.０５ｇとGOVC（ビタミン誘導体である２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに0.2mg/mLの濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つび偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたもので、且つ、ビタミン誘導体の減衰率を２０％以下に抑制しビタミン誘導体を安定に保つことができたものを本発明に特に有用に使用できる刺激応答性物質として以下に記載し、どちらか一方でも確認できなかったものを安定性に問題有として除外した。
（本発明に特に有用に使用できる刺激応答性物質）
【表１８】
2021098668.tif 000006
【手続補正７０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
（乳化安定剤の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリアの多価アルコール，合成酸化防止剤，紫外線吸収剤，防腐剤から選択される乳化安定剤における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇとＧＯＶＣ（ビタミン誘導体である２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに多価アルコール，合成酸化防止剤，紫外線吸収剤，防腐剤から選択される乳化安定剤０．５ｇと0.2mg/mLの濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つび偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたもので、且つ、ビタミン誘導体の減衰率を１０％以下に抑制しビタミン誘導体を安定に保つことができたものを本発明に特に有用に使用できる乳化安定剤として以下に記載し、どちらか一方でも確認できなかったものを安定性に問題有として除外した。
（本発明に特に有用に使用できる乳化安定剤）
【表１９】
2021098668.tif 000007
【手続補正７１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
（刺激応答性ポリマー内の異なる修飾鎖物質の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリアの刺激応答性ポリマー内の異なる修飾鎖物質における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ/修飾鎖物質)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇとＧＯＶＣ（ビタミン誘導体である２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸）０.１ｇを２００ mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに0.2mg/mLの濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つび偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたもので、且つ、ビタミン誘導体の減衰率を１０％以下に抑制しビタミン誘導体を安定に保つことができたものを本発明に特に有用に使用できる修飾鎖物質として以下に記載し、どちらか一方でも確認できなかったものを安定性に問題有として除外した。
（本発明に特に有用に使用できる修飾鎖物質）
【表２０】
2021098668.tif 000008
【手続補正７２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
（包接有効成分の安定性試験）
本発明の細胞送達用キャリアの異なる包接有効成分における安定性試験を行った。キャリアの作成方法は、卵黄由来ホスファチジルコリン１ｇとジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン0.8ｇとDOPEMP(ＮＩＰＡＡ/ＤＭＡＰＡＡ)Cop.３ｇとコレステロール０.０５ｇとＧＯＶＣ（ビタミン誘導体である２-グリセリル-３-カプリル酸アスコルビン酸）０.１ｇを２００mLクロロホルムに溶解後，エバポレーターで溶媒を除去しラメラ構造フィルムを形成させた。これに異なる有効成分０．５ｇと0.2mg/mL の濃度でPBSに溶かされたペプチド結合蛍光物質溶液（オボアルブミン：フルオレセインイソチオシアネート＝１：１(等モル)の混合水溶液）1mLをPBSで希釈した溶液１ｍLに混合した（以下単に蛍光溶液という）。次にミキサーでフィルムを破砕処理し，その後超音波処理し，さらに孔径１００nmフィルターを用いてナノオーダーのカプセルにサイジングし、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でカプセルの状態を観察し、キャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包していること、および偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認した。これを４０℃、湿度８０％の環境で６か月間保存した後、通常の光学顕微鏡と偏光顕微鏡でキャリアの状態を観察し、このとき、キャリアが破壊されず試験開始時と同様にキャリアが顕微鏡下で蛍光色素を内包し、且つび偏光顕微鏡下においてマルターゼクロス偏光が存在することを確認できたもので、且つ、ビタミン誘導体の減衰率を１０％以下に抑制しビタミン誘導体を安定に保つことができたものを本発明に特に有用に使用できる包接有効成分として以下に記載し、どちらか一方でも確認できなかったものを安定性に問題有として除外した。
（本発明に特に有用に使用できる包接有効成分）
【表２１】
2021098668.tif 000009
【手続補正７３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
（包接有効成分の安定性試験）
上記で作成した異なる有効成分を含む本発明の細胞送達用キャリアについて、皮膚科医師及び形成外科医師に依頼して有効性試験を実施したところ、複数の有効性が確認されたのでその具体的効果を次に示した。
（本発明の細胞送達用キャリアについての有効性）
【表２２】
2021098668.tif 000010
【手続補正７４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
本発明の細胞送達用キャリアの用途は，動物細胞，植物細胞，酵母，細菌，真菌，粘菌，マイコプラズマ，アメーバ等の全ての生物細胞に適用可能であり，医薬品，医薬部外品，化粧品，サプリメント，動物医薬品，肥料，農薬，培養液，雑貨等から選択され，細胞送達効率を高めることが有用な全ての製品に使用することができる。具体的な製剤としては，外用剤，口腔用剤，座薬，経口剤，ドリンク剤，パップ剤，パック剤，スプレー剤，注射剤，ドレッシング剤，液剤，軟膏剤，エアゾ ール剤，粉末状，打型剤，クリーム剤，外用散布剤，散剤，顆粒剤，錠剤，軟カプセル剤，丸剤，板状の剤型，トローチ剤，ペースト剤に応用できる。
【手続補正７５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
【図１】本発明の細胞送達用キャリアの効果を示す図である。A）の右上のアは，刺激応答性ポリマー含有分子である。中に有効成分（イの黒い▲）が抱接されている。アで長い尾のようなものが，刺激応答性ポリマーであり，それに結合した界面活性を有する脂質により細胞送達用キャリアの膜内に融合（接続）している。ウは，ビタミン誘導体などのオートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質であり，両親媒性のために，こちらも膜内に融合（接続）している。A)において，細胞膜表面のビタミンレセプターに結合する。B) ビタミン誘導体は，細胞表面でビタミンレセプターに認識され結合するが，分子形状が本来のビタミンと異なる為に，ビタミン輸送チャンネルで輸送されないため，細部膜表面に残りエンドサイトーシスされる。オは，細胞膜である。C)エンドソーム内に閉じ込まれた細胞送達用キャリアは，取り込み時間を見計らった外部刺激エにより，細胞表面の刺激応答性ポリマーの収縮により疎水性になる事から，膜の平行が崩れ容易に細胞送達用キャリアの膜が破壊され内容物がエンドソーム内に放出されるようになる。カは，消化酵素をもつリソソームである。D)リソソームはエンドソームと融合し，消化酵素をエンドソームに移動させ，E）においてエンドソーム内の分子を消化する。F)消化後エンドソームが破壊され，中の抱接成分（黒い▲）や一部未消化のビタミン誘導体（キ）が細胞内に放出される。未消化のビタミン誘導体は，オートファジー系を活性化させ，オートファゴソームで消化される。
【手続補正７６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
【図２】本発明の細胞送達用キャリアの代表的な構造例１である。刺激応答性ポリマー含有分子（ア）と，オートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質（イ），のどちらか１つ以上の物質が，脂質（ウ）で主に構成された膜分子の一部を構成する。
【手続補正７７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７６】
【図３】本発明の細胞送達用キャリアの代表例的な構造例２である。刺激応答性ポリマー含有分子（ア）が，脂質（イ）に，イオン結合している，本発明の細胞送達用キャリアである。（ウ）は，オートファジー関連遺伝子とカテプシン合成遺伝子の同時活性化物質。
【手続補正７８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2021098668.tif 000011
【手続補正７９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2021098668.tif 000012
【手続補正８０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2021098668.tif 000013