(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有するサーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨ。
（１）次の反応を触媒する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：７．５〜９．３
（５）さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【請求項２】
好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラスを培養し、該培養物から、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨを採取することを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨの製造法。
（１）次の反応を触媒する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：７．５〜９．３
（５）さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【請求項３】
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、下記理化学的性質を有するサーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させて、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることを特徴とするＤＮＡ一本鎖の製造法。
（１）次の反応を触媒する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：７．５〜９．３
（５）さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【請求項４】
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよびマンガンイオンの存在下に耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させ、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ一本鎖の製造法。
【請求項５】
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの存在下に、下記理化学的性質を有するサーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ一本鎖の製造法。
（１）次の反応を触媒する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：７．５〜９．３
（５）さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【請求項６】
耐熱性リボヌクレアーゼＨを高温にて作用させることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ一本鎖の製造法。
【請求項７】
耐熱性リボヌクレアーゼＨを５０〜８０℃にて作用させることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ一本鎖の製造法。
【請求項８】
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよびマンガンイオンの存在下に、下記理化学的性質を有するサーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨをｐＨ７．５〜９．３、高温にて作用させ、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることを特徴とするＤＮＡ一本鎖の製造法。
（１）次の反応を触媒する。ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）至適ｐＨ：７．５〜９．３
（５） さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は耐熱性に優れた新規なリボヌクレアーゼＨ、該リボヌクレアーゼＨを製造する方法および該リボヌクレアーゼＨを使用するＤＮＡ一本鎖の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から大腸菌のような中温性細菌およびステアロサーモフィラスのような中度高温菌由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、既に多くの研究がなされている。しかし、その熱安定性、精製工程、収率等は、必ずしも十分満足し得るものではなかった（特開平３−１４７７８５号公報、金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム・要旨集（１９９０）、６９頁など）。またサーマス・サーモフィルスからも耐熱性リボヌクレアーゼＨが見い出されている（特開平４−８２９４号公報、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｖｏｌ．１９，  Ｎｏ．１６，  ｐ．４４４３−４４４９）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
通常、リボヌクレアーゼＨは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断するという基質特異性を有し、ｃＤＮＡのクローニングの際の鋳型であるｍＲＮＡの除去、ｍＲＮＡのポリＡ領域の除去、ＲＮＡの断片化等の遺伝子工学の分野において、極めて利用価値の高い酵素である。従来のリボヌクレアーゼＨでは、耐熱性を要求される場合には、十分満足する結果が得られず、従来品に比べより耐熱性を向上させる酵素が得られれば、従来のリボヌクレアーゼＨでは利用できなかった条件下での利用が可能となるのみならず、その操作性の著しい向上が期待されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記観点より、従来のリボヌクレアーゼＨに比して耐熱性の向上されたリボヌクレアーゼＨの検索を鋭意検討し、本発明に至った。
【０００５】
すなわち本発明は、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨである。
（１）  次の反応を触媒する。
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせる。
（２）  分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）  熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）  至適ｐＨ：約７．５〜９．３
【０００６】
また本発明は、好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラスを培養し、該培養物から、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨを採取することを特徴とする耐熱性リボヌクレアーゼＨの製造法である。
（１）  次の反応を触媒する。
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）  分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）  熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）  至適ｐＨ：約７．５〜９．３
【０００７】
さらに本発明は、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、下記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させて、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることを特徴とするＤＮＡ一本鎖の製造法である。
（１）  次の反応を触媒する。
ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみに特異的かつエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じる。
（２）  分子量：８５，０００〜９５，０００
（３）  熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持する。
（４）  至適ｐＨ：約７．５〜９．３
【０００８】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、好熱性細菌が産生する耐熱性リボヌクレアーゼＨである。
【０００９】
また本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラスが産生するものであることが好ましい。サーマス・サーモフィルが産生する本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、さらにＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。従来から公知であるサーマス・サーモフィルス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、分子量が約２０Ｋであり、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しない。
【００１０】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを生産する菌株としては、サーマス・サーモフィラス、サーマス・アクアチカス、バチルス・ステアロサーモフィラスなどの超高熱性細菌に属する細菌が挙げられる。好ましくはサーマス・サーモフィラスが挙げられ、さらに好ましくはサーマス・サーモフィラスＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４）などが挙げられる。
【００１１】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを製造するに当たっては、例えばサーマス属に属する菌株を通常の方法で培養する。使用する培地組成は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用可能である。例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、デキストリン等が使用できる。窒素源としては、例えばポリペプトン、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、グルタミン酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物が使用できる。
【００１２】
培養は通常、振盪培養あるいは通気撹拌培養で行うことができる。培養温度は５０℃〜８０℃の範囲、好ましくは７５℃付近にて、培養ｐＨはｐＨ５〜１０の範囲、好ましくはｐＨ７〜９に制御することが好ましい。これらの条件以外の条件でも使用する菌株が生育可能であれば実施可能である。培養期間は、通常１〜３日間で生育菌体内に耐熱性リボヌクレアーゼＨが生成蓄積される。
【００１３】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを精製する方法は、一般に使用される酵素の精製法を用いれば良い。例えば菌体からの酵素の抽出には、超音波破砕、ガラスビーズ等を用いる機械的な破砕法や、界面活性剤、酵素等を用いる破砕法など、何れも使用することができる。この様にして抽出された抽出液については、公知の硫酸アンモニウム等による塩析法、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等による金属凝集法、更に、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）セファロースなどのイオン交換クロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００１４】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨを使用してＤＮＡ一本鎖を製造するには、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、好ましくは塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの存在下に耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせる。
酵素濃度は、０．０１〜２単位（Ｕ）／μｌであり、作用ｐＨは、７〜１０である。カリウムイオンとしては酢酸、硝酸などの有機酸または無機酸のカリウム塩が挙げられる。その濃度は、５〜５００ｍＭである。マグネシウムイオンとしては酢酸、硝酸などの有機酸または無機酸のマグネシウム塩が挙げられる。その濃度は、０．５〜１０ｍＭである。マンガンイオンとしては酢酸、硝酸などの有機酸または無機酸のマンガン塩が挙げられる。その濃度は、０．５〜１００ｍＭである。緩衝液としては、トリス緩衝液、トリシン緩衝液、ビシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳなどが挙げられる。
【００１５】
またＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料に、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの存在下に、高温度にて耐熱性リボヌクレアーゼＨを作用させ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド的に作用して、ＤＮＡ一本鎖を生じさせることが好ましい。特に耐熱性リボヌクレアーゼＨを５０〜８０℃にて作用させる。
【００１６】
本発明に使用するＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を含む試料とは、ＲＮＡとこのＲＮＡを鋳型に逆転写酵素により合成されたｃＤＮＡとの二本鎖、ＲＮＡにＤＮＡをハイブリダイズさせた二本鎖、ＤＮＡにＲＮＡをハイブリダイズさせた二本鎖など、どのような方法によって形成されたＲＮＡ／ＤＮＡの二本鎖でもよい。また使用されるＲＮＡ、ＤＮＡは生体細胞、組織から調製されたもの、酵素的に合成されたもの、化学的に合成されたもののいずれの組み合わせでもよい。
【００１７】
本発明の耐熱性リボヌクレアーゼＨのうち、サーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、リボヌクレアーゼＨ活性の他に、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。したがって、これらの三つの酵素作用を利用して、下記標的核酸配列の増幅法を実施することができる。
【００１８】
標的核酸配列の増幅法は、反応媒体中で実質的に一定の温度で標的核酸配列のコピー数を増加させる方法であって、下記工程を含む。
工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第一鋳型に、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズせしめ、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る；
工程２：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一鋳型ＲＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る；
工程３：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の標的核酸（ＤＮＡ）に対して相補的な核酸配列を有する第二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして上流に機能可能なプロモーター配列に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；
（ここで第一プライマー又は第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的又は相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる）
工程４：前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーを増加せしめ；
そして、
工程５：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程１から工程４を必要な回数繰り返す。
【００１９】
また別なる標的核酸配列の増幅法は、反応媒体中で実質的に一定の温度で標的核酸配列のコピー数を増加させる方法であって、下記工程を含む。
工程１’：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第一鋳型に、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズせしめ、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る；
工程２’：第一鋳型ＤＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る；
工程３’：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列（ＤＮＡ）を有する第二プライマーをハイブリダイズせしめ耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして標的核酸配列に上流にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成せしめた後、
工程４’：前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーを増加せしめ；
そして、
工程５’：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて、下記工程１〜工程４を必要な回数繰り返す。
工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第一鋳型に、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対して十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズせしめ、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る；
工程２：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一鋳型ＲＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る；
工程３：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の標的核酸（ＤＮＡ）に対して相補的な核酸配列を有する第二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして上流に機能可能なプロモーター配列に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；
（ここで第一プライマー又は第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的又は相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる）
工程４：前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列の多数のＲＮＡコピーを増加せしめる；
【００２０】
【発明の効果】
本発明の耐熱性リボヌクレア−ゼＨは、従来から知られている大腸菌のような中温性細菌およびステアロサ−モフィラスのような中度高温菌由来の耐熱性リボヌクレア−ゼＨが変性、失活する高い温度条件下でも変性、失活することがなく、ＲＮＡ／ＤＮＡバイブリッドに作用させることことが可能である。さらに耐熱性であることから、保存安定性も優れ、取扱いが容易になることが期待される。また、本発明のサーマス・サーモフィラス由来の耐熱性リボヌクレアーゼＨは、一種のタンパク質でありながら、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ−ゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）をも有するから、反応条件により容易に多種の酵素反応を同時に進め得ることが可能である。このような作用を利用して、新たな標的核酸の増幅が可能となる。
【００２１】
【実施例】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例中、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性は、以下の方法により測定した。
まず、下記組成を有する試薬Ａ，Ｂ，ＣおよびＤを調製した。
0003624960.tif 000002
【００２２】
＊    ［３Ｈ  ］  にてラベルされた基質ポリＡ／ポリｄＴの調製方法
ポリＡ（ファルマシア製：コード２７−４１１０−０１）１００ｍｇを１０ｍｌの滅菌水にて溶解した。ポリｄＴ（ファルマシア製：コード２７−７８３４−０１）５ユニットを２００μｌのＴＥバッファーにて溶解した。［３Ｈ  ］  ポリＡ（アマーシャム製：コードＴＲＫ．４８０  １０μＣｉ）を先に調製したポリＡ溶液５０μｌにて溶解した。５０サンプル分の基質調製のために、ここで調製した［３Ｈ  ］  ポリＡ＋ポリＡを５０万ｃｐｍ相当量を取り出し、先に調製したポリｄＴ溶液２０μｌ（１９ｐｍｏｌ／μｌ）と混合した。５倍濃度のアニーリングバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ［ｐＨ８．０］，５００ｍＭ  ＫＣｌ）２０μｌ、および滅菌水を加え１００μｌとした。この溶液を６５℃にて１０分間加熱後、室温にて冷却し基質溶液とした。
【００２３】
次いで試薬Ａ２．５μｌ、試薬Ｂ２μｌおよび滅菌水１９．５μｌをマイクロチューブに加え、撹拌後、酵素１μｌを加え、６０℃にて２０分間反応した。その後氷冷し、試薬Ｄ２５μｌおよび試薬Ｃ５０μｌを加えて撹拌した。更に１０分間氷冷した後、遠心分離（１２０００回転，１０分間）にて、酸不溶性画分を分離した。この上清の酸可溶性画分を５０μｌ採取し、液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、遊離［３Ｈ  ］  を測定した。酵素活性の１単位は、この条件下で１分間当り１μｍｏｌの酸可溶性物質を遊離する酵素量とした。
【００２４】
実施例１
（好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来のリボヌクレアーゼＨの調製）
ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．２％を含む培地（ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行った後、室温にて冷却した。そこへ好熱性細菌サーマス・サーモフィラスＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４）  を１白金耳接種し、７０℃にて２４時間振盪培養した。次に同組成の培地６Ｌを１０Ｌジャファ−メンタ−に移し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行い、放冷後これに上記記載したフラスコにて培養した培養液１００ｍｌを接種した。通気量２Ｌ／分、撹拌数４００回転／分、温度７０℃の条件にて１０時間培養した。
【００２５】
培養液６Ｌを遠心分離（８０００回転／分、１０分間）にて集菌し、１０ｍＭ２−メルカプロエタノール、５％  グリセロールを含むＫ−リン酸バッファーｐＨ７．５（以下バッファーＡとする）に懸濁した。超音波破砕機（海上電気製、１９ＫＨｚ）にて２０分間処理し、再度遠心分離し細胞残さを取り除いた上清を回収した。
【００２６】
上清液を硫酸アンモニウムによる塩析後、バッファーＡに対し透析した。この液をバッファーＡにて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。活性画分をバッファーＡに対し透析した。この液をバッファーＡにて平衡化したフォスフォセルロースＰ−１１（Ｗｈａｔｍａｎ社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。
活性画分をバッファーＡに対し透析した。更に、この液をバッファーＡにて平衡化したｎａｔｉｖｅＤＮＡセルロース（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０ＭＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。
活性画分を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  グリセロールに対し透析した。更に、この液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％  グリセロールに対し透析し酵素標品とした。
【００２７】
（１）分子量
上記酵素標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて既知の分子量マーカーと同時に泳動した。既知の分子量マーカーとの比較から、分子量は約８５，０００〜９５，０００と推定された（図１）。
【００２８】
（２）熱安定性
上記酵素標品をｐＨ８．０で６０℃〜９０℃で２時間処理後、その残存活性を測定した。熱処理後の残存活性は、７５℃にて２時間反応後においても、５０％以上認められた（図２）。
【００２９】
（３）至適ｐＨ
上記酵素標品ををｐＨ７．５〜ｐＨ９．５にて作用させ、その至適ｐＨを求めた。ｐＨの調製は試薬ＡのｐＨを変動させて行った。その結果、至適ｐＨはｐＨ７．５〜９．３付近であった（図３）。
【００３０】
（４）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性
本酵素はリボヌクレアーゼＨ活性以外に、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性も有しており、その活性１に対し、約５倍以上であった。ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の定義は、７０℃での活性測定条件下でｓｓＤＮＡ／プライマーを基質として、３０分間に１０ｎモルのｄＴＮＰを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を１単位とした。
【００３１】
（５）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）活性
本酵素はリボヌクレアーゼＨ活性以外に、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）活性も有しており、その活性はリボヌクレアーゼＨ１に対し、約０．１以下であった。ＲＮＡ依存ＤＮＡポリラーゼ（逆転写酵素）活性の定義は、７０℃での活性測定条件下でポリ（Ａ）オリゴ（ｄＴ）を基質として、３０分間に１０ｎモルのｄＴＴＰを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を１単位とした。
【００３２】
以上の結果から、本発明にて見いだされた好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来のリボヌクレアーゼＨは、著しく熱安定性が向上していることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来の新規リボヌクレアーゼＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真を示す。
【図２】好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来の新規リボヌクレアーゼＨの熱安定性を示す。
【図３】好熱性細菌サーマス・サーモフィラス由来の新規リボヌクレアーゼＨの至適ｐＨを示す。
【図１】
0003624960.tif 000003
【図２】
0003624960.tif 000004
【図３】
0003624960.tif 000005