(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のアミノ酸配列からなるヒト由来の新規なATP感受性カリウムチャネル蛋白質。
0003661953.tif 000002
【請求項２】
請求項１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるデオキシリボヌクレオチド。
【請求項３】
塩基配列が下記の式で表される請求項２記載のデオキシリボヌクレオチド。
0003661953.tif 000003
【請求項４】
請求項１のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするデオキシリボヌクレオチド。
【請求項５】
塩基配列の5'側末端及び3'側末端部に他の蛋白質またはポリペプチドをコードする塩基配列が結合され、カリウムチャネルの生物学的活性を有する蛋白質をコードする請求項２、または３記載のデオキシリボヌクレオチド。
【請求項６】
下記のアミノ酸配列からなるマウス由来の新規なATP感受性カリウムチャネル蛋白質。
0003661953.tif 000004
【請求項７】
請求項６のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるデオキシリボヌクレオチド。
【請求項８】
塩基配列が下記の式で表される請求項５記載のデオキシリボヌクレオチド。
0003661953.tif 000005
【請求項９】
請求項２、３、４、５、７または８記載のデオキシリボヌクレオチドをそれぞれプロモーターの下流に置いた発現プラスミド。
【請求項１０】
請求項９に記載のプラスミドで形質転換された生物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト及びマウス由来の膵β細胞やインスリン分泌細胞ラインに発現する新規の ATP感受性カリウムチャネル(βIR)の蛋白質及びそれをコードする遺伝子に関し、糖尿病等の診断薬、治療剤及びそれらの開発に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病の病因の多くは、膵β細胞のインスリン分泌障害に起因することが知られている。従って、インスリン分泌の分子機構の解明は、糖尿病の原因究明やその治療薬の開発に重要な役割を果たすと期待されるが、その詳細は未だ明らかにされていない。
【０００３】
種々の組織の細胞膜に存在する ATP感受性カリウムチャネル（ KATP チャネル）は、細胞内の代謝状態と膜電位を共役させることで、分泌や筋肉収縮などの細胞機能の主要な作用を示すことが明らかにされている。例えば、心筋細胞［Noma,A.,Nature,305:147,(1983) ］、膵β細胞〔Cook,D.L., Nature, 311: 271,(1984), Misler,S.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83: 7119,(1986) 〕、下垂体［Bernadi,H.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.,  90:1340,(1993)］、骨格筋［Spruce,A.E.,et al., Nature 316: 736,(1985)］などで KATP チャネルが確認されている。
【０００４】
特に膵β細胞において、グルコースの代謝と産生された ATPが KATP チャネルを閉鎖して脱分極することにより、カルシウムチャネルからのイオン流入を引き起こし、インスリンを分泌する。この様に、 KATP チャネルは、インスリン分泌の調節に主要な役割を果たしている。
【０００５】
KATP チャネルは電気生理学的に内向き整流を示すカリウムチャネルに属すし、それらのアミノ酸の同一性をもとに、5 種類のサブファミリーに分類されている(ROMK1,IRK1,GIRK1,  cKATP-1, uKATP-1)。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、膵β細胞における KATP チャネルの分子基盤は明らかにされていない。著者らの発見した種々の組織に遍在的に発現する uKATP-1 ［Inagaki,N.,  et al., J.Biol.Chem. 270: 5691,(1995)］は、膵β細胞を含む正常な組織で発現されているが、インスリン分泌細胞ラインでは発現されていない。
【０００７】
そこで、膵β細胞やインスリン分泌細胞ラインに特異的に発現されるカリウムチャネルを探索した。
【０００８】
膵β細胞に特異的に発現する新規のカリウムチャネルの詳細な蛋白質構造は未だ明かでなく、組織遍在性の新規のカリウムチャネル（ uKATP-1)やスルホニールウレア剤結合タンパク質などとの複合体形成の有無に関す情報も、まだ開示されてない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
新規の KATP チャネルを単離・同定、機能解析を行うためには、分子生物学的、細胞生物学的技術、電気生理学的技術などの高度の技術を要する。
発明者らは、これらの技術を駆使して、ヒト及びマウスの膵β細胞やインスリン分泌細胞系に特異的に発現するイソ型の新規の KATPチャネル（βIR）をコードするヒト及びマウスのゲノム遺伝子やcDNAを単離し、DNA配列とアミノ酸配列を決定した（図１、図２、図３、図４）。このβIRチャネル蛋白質をアフリカツメガエル卵母細胞の系と哺乳動物細胞の系で発現させた。電気生理学的解析の結果、βIRチャネルは内向き整流性を示すATP感受性カリウムチャネル蛋白質であることが証明された。
【００１０】
本発明の蛋白質は、哺乳動物の膵β細胞及びインスリン分泌細胞に特異的に発現される新規の ATP感受性カリウムチャネル（βIR）で、それらは種々の組織に遍在して発現される新規のATP 感受性カリウムチャネル uKATP-1 のイソ型である。
本発明は、これらの蛋白質のアミノ酸配列及びコードする DNA 配列の同定やこれらの配列を組み込んだプラスミド、さらに、このプラスミドを組み込んだ組換え体細胞（形質変換体）を包含する。
【００１１】
加えて、βIRの単離された遺伝子や蛋白質やその組換え体蛋白質、それらに対するアゴニストやアンタゴニストなどの物質及び診断薬、遺伝子治療薬を含めた薬剤設計を含むものである。
【００１２】
膵β細胞に特異的なヒト由来のhβIRとマウス由来のmβIRは３９０アミノ酸残基〔（開始コドンＡＴＧ）Ｍｅｔを含む〕で、分子量はそれぞれ４３，５１２ダルトンと４３，５５９ダルトンであり、アミノ酸配列で９６％の同一性を示す。さらに、ヒト及びマウスのβIRのアミノ酸はラットの uKATP-1 と約７１％の同一性を示し、他のカリウムチャネルの IRK1 、ROMK1 、GIRK1 、cKATP-1, とそれぞれ４６％、４１％、４２％、４４％の同一性であり、βIRが uKATP-1 と同じサブファミリーでイソ型であることを示した。
【００１３】
また、今日同定されている内向き整流カリウムチャネルの孔部分(H5領域)に保存されている Gly-Tyr-Gly モチーフ(アミノ酸 132-134)が、本発明のβIRと uKATP-1 では共通して Gly-Phe-Gly モチーフであることが確認された。
【００１４】
加えて、第二番目の膜透過の部位に、内向き整流カリウムチャネルの重要な決定因子であるアスパラギン(Asn) が、 uKATP-1 ではAsn-163 でβIRでは Asn-153である。βIRは uKATP-1 と高いホモロジーを示すが、細胞内のアミノ末端及びカルボキシル末端の領域と孔形成部分(H5)に類似性はない。
ヒト由来及びマウス由来のβIRの細胞内領域に潜在的な二つのcAMP依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位(Thr-224とSer-372)、五つのプロテインキナーゼC依存のリン酸化部位(Ser-3、Ser-37、Thr-336、Thr-345とSer-363)があり、かつ潜在的に三つのカゼインキナーゼII依存性のリン酸化部位(Thr-62、Thr-224とSer-354)がある。細胞外領域にいかなるN-結合のグリコシル化部位は存在しない。
【００１５】
RNAブロッチング研究でβIRのmRNAが膵β細胞やインスリン分泌細胞系で高頻度に発現されることが認められ、心臓や骨格筋や脳などの組織では低レベルの発現である。さらに、βIRチャネルの機能的な性質を特徴化するために、アフリカツメガエル卵母細胞でのhβIRとmβIRの発現を試みた。
ヒトとマウスでの in vitro合成のcRNAの発現は内向き整流カリウムチャネルの流入を、コントロールの水注入に比較して、重要に増加した。
【００１６】
この様に、βIRは uKATP-1と高いホモロージーがあり、そのmRNAは膵β細胞やインスリン分泌細胞系に顕著に発現されるため、βIRが膵β細胞の主要なATP感受性カリウムチャネルの可能性がある。本発明における研究で、糖尿病の治療薬として汎用されているスルホニールウレア剤でβIＲが阻害されることが見いだされ、膵β細胞におけるβIＲの重要さが確認されている。
【００１７】
具体的にβIRとスルホニール受容体をCOS-1細胞に共発現させた時、このチャネル(βIR)のATP感受性やスルホニール剤による活性阻害が証明された。
従って、βIRとスルホニール受容体はin vivoで複合体を形成して機能していることが示唆される。
【００１８】
本発明の新規なhβIRとmβIRのDNAは、cDNAライブラリーとゲノムライブラリーから得られた。 hβIRとmβIRのゲノム遺伝子はイントロンを含まないことを特徴とし、染色体 11p15.1に局在している。
hβIRやmβIRのゲノムDNAは、それらのcDNA及びそれらのフラグメントを用いてゲノムライブラリーをプローブすることによっても得ることできる。
【００１９】
単離したhβIRのDNAを、ヌクレオチドの欠失、挿入、置換によって変異体を作製することは公知技術を用いて容易である。
例えば、βIRの孔の部分の特徴的なモチーフを欠失するか、他のアミノ酸で置換することで、βIRの類似体を作製できる。モチーフ欠失の類似体は、スルホニールウレア剤と結合できてもチャネルの機能を有しない。スルホニールウレア剤過剰摂取の糖尿病患者にβIRの類似体を中和剤として投与できる可能性がある。また、βIRのモチーフ部位の置換で、より内向き整流の強力なカリウムチャネルを作製可能である。
【００２０】
βIRのアミノ酸配列が明らかにされたことで、より効果的で毒性のないβIR阻害剤の開発が容易になっている。本発明は、βIRに関する変異体やこれらに対するアゴニストやアンタゴニストの作製を含むものである。
さらに、hβIRのDNAおよびそのDNA変異体のアミノ末端やカルボキシル末端に相当する側に、他の蛋白質や合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を結合して融合蛋白質、即ちβIRの誘導体を作製することも公知技術により容易である。例えば、融合蛋白質が前駆体蛋白質として作製され、in vivo及びin vitroで開裂して機能する。融合蛋白質に本来の機能に加えて標的組織性や膜指向性をもたせることも可能である。この場合、融合蛋白質に糖結合性アミノ酸を含有させることで新たな糖鎖を形成させて、組織・膜指向性を腑活させることも含まれる。本発明に、βIRを含有する融合蛋白質の作製も含まれる。
【００２１】
βIRの変異体やその誘導体を作製することは、部位特異的突然変異技術を用いることでよくしられている技術である［Adelman et al., DNA, 2: 183,  (1983)］。
hβIRやmβIR、それらの変異体、それらの誘導体を大量生産するのに周知技術を用い、これらのDNAをコードしている複製可能な組換え体プラスミドを作り、さらに、この様なプラスミドで形質転換細胞を作製し、これらの宿種細胞を培養して物質を生産する。宿種細胞は細菌、酵母及び動物細胞を含む。
細菌などの原核生物がデオキシリボヌクレオチドのクローニングに適している。例えば、E.coliに由来するpBR322のプラスミドはアンピシリンやテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含有し、変換細胞を同定する容易な手段を与える。さらに、細菌のプラスミドは、それ自体の蛋白質の発現に用いられるプロモーターを含有する。原核生物に加えて、酵母などの真核生物も役立つ。
【００２２】
特に、酵母菌 sacchraomyces での発現にはプラスミド YRp7が共通に用いられる［Stinchomb et al., Nature, 289:39,(1979)］。
動物細胞も宿主として利用される。特に、脊椎動物細胞の培養が利用され易く常套手段になっている［krause and Paterson, Tissue Culture, Acadenic Press,(1973)］。細胞系として AtT-20、Hela Cells、Chinese Hamster Ovary(CHO)、COSM6、COS-7などがある。また、細胞系の発現プラスミドの制御機能としてもちいられるのが、ウイルスのPolyoma、Adenovirus2、Cytomagalovirus、Simian virus 40などのプロモーターである。動物細胞で利用性の高いプラスミドはpCMVである［Thomsen et al., Pro.Natl.Acad. Sci. U.S.A., 81: 659,(1984)］。
【００２３】
本発明のチャネル蛋白質やhβIRやmβIRのDNA配列は開始コドンATG で始まる。組換え体細胞を用いチェネル蛋白質を合成する場合、所望のDNAにATG を附加する必要もなく、取扱いが容易である。従って、大腸菌を用いた形質転換の原核生物で、βIRを発現させると、一般的にアミノ酸配列がMet で始まる蛋白質が生合成される。この蛋白質のN-末のMet は用途目的に応じて除去されてもよい。同様に、動物細胞の組換え体細胞でβIRを合成する場合にも、N-末にMet を含むβIR（１−３９０）またはＭｅｔが除去されたβIR（２−３９０）の蛋白質が生合成される。共に、用途目的に応じて有用である。
hβIR及びそれらのフラグメントを動物に免疫して抗体を得る。加えて、動物に免疫することで、所望の抗体を分泌する細胞からモノクローナル抗体を調製できる。
hβIRを大量に調製することが容易になり、それの分子的レベルでよりよく理解されてきた。それ故、hβIRやそれの変異体や類似体を開発することで、主に糖尿病疾患に関連する、研究試薬、診断薬や治療薬を開発できる。
【００２４】
特に、βIR蛋白質は、診断薬や治療薬に適した物質である、即ちβIRにアゴニスト的及びアンタゴニスト的に作用する物質の探索方法に用いることができる。例えば、動物細胞にβIR を発現させ、その活性の促進または阻害物質を分析・試験できる［Kayano、T. et al., J.Biol.Chem.,265:13276, (1990）、実施例４］。
【００２５】
さらに、βIRのDNA配列の情報が得られたことで、部分配列のデオキシリボヌクレオチドの調製が容易になった。これらの相対的に短いDNA配列は、選択されるべき遺伝子にハイブリダイズする能力を持つために、核酸のプローブとして利用される。ハイブリダイゼーションを調べるためのラベルには放射性物質や酵素を用いた発色法など公知技術として適切な指標手段がある。種々の組織の相補的DNA配列の検出に、プローブが有効である。
【００２６】
従って、βIRで作製したプローブで、種々の生物やそれらの組織細胞からハイブリダイズする核酸を得ることができる。得られた核酸は、βIRと同じかイソ型か類似体である。作製されたプローブは、患者の遺伝子診断に利用できる。プローブでハイブリダイズした患者のヌクレオチド配列を調べることで、疾患遺伝子の検出が可能である。
【００２７】
これまでに、カリウムチャネルのブロッカー剤(sulfonylurea)が、糖尿病の治療薬として使用されている。 hβIRやその変異体、誘導体、モノクローナル抗体、それらに関するアゴニストやアンタゴニストなどを製剤化することで、糖尿病の治療薬になり、またhβIR自体に機能不全がある場合、補充  療法で機能を補うことができる。
【００２８】
hβIRの遺伝子をベクターや幹細胞に組み込み、人体投与するこで遺伝子治療薬として用いることも期待される。
【００２９】
【実施例】
実施例1.
ヒト由来βIR-1のcDNAと遺伝子のクローニング
内向き整流カリウムチャネルをコードしている遺伝子はイントロンを欠損していることが知られているので、λFIXIIヒトゲノムライブラリーの7x105 プラークをスクリーンした。標準的なハイブリダイゼーションの条件下でプローブとして 32Pラベルしたラットの uKATP-1 全長のcDNAを用いた。
転写膜を42℃の 2xssc/0.1% SDSで 30分間洗浄処理した。
また、ヒト由来hβIRの32PラベルしたDNAフラグメントをプローブとして用いて、マウスのインスリン分泌細胞系のMIN6 cDNAライブラリーの 7x105のプラークを標準的なハイブリダイゼーションの条件下でスクリーンした。
転写膜の洗浄処理を50℃、0.1xSSC/0.1% SDSで、1時間行った。
ヒト及びマウス由来の二つのDNA鎖の配列は、適切な長さのDNA断片をM13mp18、mp19、pGEM3Zにサブクローニングした後に、ジデオキシヌクレオチド鎖のターミネーション法で決められた。
【００３０】
実施例2.
RNAブロッティング分析
種々の組織及び細胞株から抽出したRNAの20 ugを、下垂体と甲状腺から抽出した RNAの10μｇを、ホルムアルデヒドで変性して 1％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に転写した。 32Pでラベルした hβIRのDNAをプローブに用い、ハイブリダイゼーションを行った。
βIRのmRNAが膵β細胞とインスリン分泌細胞系であるMIN6及びHITT-15に極めて高いレベルで発現した(図  ５）。
【００３１】
実施例３．
PCR-SSCPとDNA配列
日本人の20人の正常人から採取したゲノムDNAのPCR-SSCP分析を行った。
六対のCy5-ラベルのオリゴヌクレオチドを、ヒト由来のhβIR-1遺伝子の蛋白質コード領域を増加させるのに用いた(図-6)。
PCR反応は10 ulの溶液で行われ、0.1ugのゲノムDNA、10 pmolのセンス、アンチセンス プライマー、10 mmol/1 KCl、20 mmol/1 Tris-HCl(pH 8.8)、2.0 mmol/MgCl2、6 mmol/1(NH4)2SO4、0.1% Triton X-100、0.01%牛血清アルブミン、200 umol/1 of each dNTPや 0.25UのPfuDNAポリメラーゼを含む。
最初の変性処理 94℃、3分間の後に、試料はGene Amp 9600 PCR系で40サイクルの増殖した。 94℃で15秒間の変性、65℃または60℃で15秒のアニーリング、72℃で30秒の伸長。反応液の試料を94℃、３分間で熱処理し、５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、自動シーケンサーでDNA配列を決定した。
【００３２】
実施例４．
電気生理学的解析
βIRとスルホニール受容体と COS-1細胞に共発現させ、電気生理学的解析を行った。 ATP濃度依存性にカリウムチャネル活性の抑制が認められた（図-7）。さらに、スルホニールウレア剤であるグリベンクラミド(glibencl amide)によってもカリウムチャネル活性の阻害が認められた（図-8）。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、膵β細胞に特異的に存在するATP感受性カリウムチャネルであるhβIRとmβIRのDNAおよびそれぞれによってコードされる蛋白質が提供され、それらを用いて公知の遺伝子工学技術により該蛋白質を量産することができ、研究試薬や糖尿病等の疾病の診断、治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図２のデオキシリボヌクレオチド配列に対応するアミノ配列を示す。
【図２】  実施例３で得られたヒト由来のβIRのデオキシリボヌクレオチド配列を示す。
【図３】  図４のデオキシリボヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を示す。
【図４】  マウス由来のmβIRのデオキシリボヌクレオチ配列を示す。
【図５】  実施例２におけるラットの種々の組織でのβIR mRNAのRNAのブロット分析
【図６】  実施例３においてヒト由来βIR遺伝子の亜領域を増幅するのに用いたPCRプライマーの配列。  全てのプライマー配列は5'から3'の方向に示される。
【図７】  実施例４におけるβIRチャネルのATP感受性を示す。
【図８】  実施例４におけるスルホニール剤(グリベンクラミド)によるβIRチャネル活性の阻害を示す。
【図１】
0003661953.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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