(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、オロチン酸およびイノシンから成る群から選択される少なくとも２種の遊離塩基；アデノシン、シチジン、グアノシン及びウリジンから成る群から選択される少なくとも１種のリボヌクレオシド並びに少なくとも２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシシチジン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシウリジンおよびチミジンから成る群から選択される２種の２′−デオキシヌクレオシドを含有し、実質的に鉄を含有しないことを特徴とする、ラクトバチルスおよび／またはビフィドバクテリア属に属する乳酸菌株を培養するための合成培地。
【請求項２】
更に、炭素源として、グルコース、フラクトース、ラクトース、サッカロースまたはそれらの混合物を含む、請求項１記載の培地。
【請求項３】
更に、緩衝剤として、ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、クエン酸水素２アンモニウム、ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3またはそれらの混合物を含む、請求項１または２記載の培地。
【請求項４】
更に、窒素源として、１種以上のアミノ酸、クエン酸水素２アンモニウムまたはそれらの任意の混合物を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の培地。
【請求項５】
更に、抗酸化剤として、アスコルビン酸、システイン、チオール化合物またはそれらの任意の混合物を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項６】
更に、微量要素として、Ｃｕ化合物、Ｚｎ化合物、Ｍｎ化合物、Ｍｇ化合物、Ｃｏ化合物またはそれらの任意の混合物を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の培地。
【請求項７】
更に、ビタミンとして、ニコチン酸、パントテネート、コバラミン、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキサル−ＨＣｌ、リボフラビン、ビオチン、葉酸またはそれらの任意の混合物を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の培地。
【請求項８】
前記ヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドを、０．１ｇ〜０．５ｇ／ｌ含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の培地。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の培地で、ラクトバチルスおよび／またはビフィドバクテリア属に属する乳酸菌を培養する、乳酸菌の製造方法。
【請求項１０】
ラクトバチルスおよび／またはビフィドバクテリア属に属する乳酸菌を、請求項１から８のいずれか１項に記載の培地で培養して、該培地中に生物活性分子を産出させる、生物活性分子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は特別のヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドを含有するビフィドバクテリア属またはラクトバチルス属の乳酸菌の培養に適する新規合成培地に関する。特に、本発明は生物活性分子または機能性代謝産物の単離のためにこの培地を使用することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラクトバチルス菌は天然に広く分布し、工業的発酵方法、例えば乳製品の製造に主として使用される。最近特別の菌株が宿主生物の健康状態の維持に正の効果を示すことが分かってから、その代謝の研究は非常に高まった。その複雑な栄養要求は、酵母エキスおよび各種起源のペプトンのような不確定かつ複雑な組成のマトリックスを含有する天然起源または合成生育培地により通例満たされている。
【０００３】
細菌細胞の栄養要求の研究、培地からその除去後または或る種の物質に対して栄養要求のある変異体の単離後、その効果を検知して特定成分の役割を確認するような異る目的に対しいくつかの半合成および完全に化学的に規定された乳酸菌培地が開発されている。規定された化学組成を有する生育培地も使用して、ヌクレオチドに対するラクトバチルス菌の要求度を決定しかつ異るＤＮＡ前駆体に関しその必須的または非必須的役割に属するかをみた。
【０００４】
過去数十年間に、生物学的試料のＤＮＡ残基の存在を測定するため試験生物としてホフ−ヨルゲンセンが最初に提案された（ホフ−ヨルゲンセン、「デオキシリボヌクレオシドおよびデオキシリボ核酸の微生物的研究」、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．５０（１９５２），４００〜４０３）菌株ラクトバチルス・ジョンソニＡＴＣＣ  １１５０６（以前はラクトバチルス・アシドフィルスＲ−２６として知られていた）に対し規定された培地により研究が行なわれた。この菌株はリボヌクレオチドレダクターゼ活性を機能的に欠くため生育培地に少なくとも１種のデオキシリボヌクレオシドの存在を必要とすることをイブスおよびイケダが「ライフ・オン・ザ・サルベジ・パス：ザ・デオキシヌクレオシド・キナーゼズ・オブ・ラクトバチルス・アシドフィラスＲ２６」，Ｐｒｏｇｒ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９８），２０７〜２５２に報告している。
【０００５】
さらに、ラクトバチルス・デルブレッキ亜種ラクティスＡＴＣＣ７８３０（以前にはＬ．ライヒマンニＡＴＣＣ７８３０として知られる）では、菌株Ｒ−２６に対比してデオキシリボヌクレオシドに対する要求はビタミンＢ１２により代替できることが示された。
【０００６】
後者の菌株をいくつかの実験に供し、ラクトバチルス菌のヌクレオチド要求度および培地をＤＮＡ分子で補充する効果を明らかにした（ジーナ＆ジーナ、Ｅｘｐｔｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３（１９５２），６７５〜６８０；オカザキ＆オカザキ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（１９５９），４３４〜４４５；ホフ−ヨルゲンセン、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３（１９５７），７８１〜７８５；マクナット、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２（１９５５），４６４〜４６８；ロブトラップ＆シュガー、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８２（１９６１），６２３〜６３１。
【０００７】
チミジンはしばしばラクトバチルス・アシドフィルスおよびＬ．ライヒマニィの生育の鍵因子として指摘された。さらに、その後の研究では、ウラシルの除去が乳酸菌のＲＮＡ合成および細胞分裂に深くかかわることが実証された。
【０００８】
シードラーらはＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３（１９５７），６７０〜６７５でウラシル、ビタミンＢ６、および酸加水分解カゼインが半規定培地でＬ．アシドフィルスの増殖に及ぼす酵母抽出物の明確な効果の再現能力を試験することによりホフ−ヨルゲンセンの培地が最適であることを報告した。
【０００９】
最近、イムバートおよびブロンデューは鉄のキレート化後生育するいくつかのラクトバチルス種の能力を試験する化学的に規定された培地をＣｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（１９９８），６４〜６６に開示し、さらにマンガンと鉄間の相互作用が試験された。キレートした鉄の補充はマンガンの存在で細菌の生育に影響を与えなかったが、一方好気培養後のＬ．アシドフィルスＡＴＣＣ４３５６Ｔに対し特にマンガンを除いた同じ培地にその添加後僅かにプラスの効果が観察された。
【００１０】
大部分の病原菌はその生育に鉄を必要とすることは既知である。これと対照的に、乳酸菌はこのような不可欠の鉄要求を示さないことで生存微生物のうちで一般に例外と見なされ、これは従って自然環境で病原体に対し生態学的利点を表わすと考えられる。
【００１１】
乳酸菌の平均金属含量を報告する刊行物はほとんど存在しない。一般に、ラクトバチルス種のうちに強い可変性が見出され、より低量が確証されるラクトバチルス・プランタルムと大腸菌細胞の鉄含量を比較することにより例証された（アルキバルドら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９（１９８３），２９〜３２）。
【００１２】
最近、ラクトバチルスおよびビフィドバクテリア属の特別の菌株が非常に注目されたが、これは宿主生物に有利な性質がこれらによるものであったからである。それまでこれらの菌株が報告された性質を示すことを単に知られていたが、この性質の理由は明らかにされなかった。
【００１３】
この点でＥＰ  ０５７７９０３号明細書は乳酸菌、特に摂取する場合ヘリコバクター・ピロリに感染した生物に有利な効果を現わすラクトバチルス菌株の使用を開示する。従って、ラクトバチルスは、ヘリコバクターが胃および／または腸粘膜構造にさらに生育しおよび／または粘着するのを防止しうる代謝化合物を生産できることが明らかである。代謝化合物を測定する見地から、乳酸菌が生産した化合物を単離できる培地を持つことが望ましい。
【００１４】
この化合物を単離するために、細菌細胞は培地で適度な程度まで培養する。しかし、乳酸菌の十分な生育を供する培地は通常規定されず、酵母抽出物およびペプトンのような複雑な基質を含み、これらから望ましい、未知の化合物は単離できない。
【００１５】
他方、これまで知られていた規定培地はある細菌菌株に対し通常特異的であり、さらに微生物の十分な生育を供しない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は新規な規定培地を供することで、この培地は複数の異る細菌菌株が十分に生育できるものである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
この課題は２種の遊離塩基、１種のリボヌクレオシドおよび２種の２′−デオキシヌクレオシドをそれぞれ微生物の生育を促進する十分量で含有することを特徴とする、炭素源、緩衝剤、窒素源、微量要素、抗酸化剤およびビタミンを含むラクトバチルスまたはビフィドバクテリア属に属する乳酸菌を培養する合成培地を供することにより解決された。
【００１８】
本発明に至る広汎な研究中、ラクトバチルス・ジョンソニィ用の化学的に規定された生育培地が開発され、これは驚くことに他のラクトバチルス菌および／またはビフィドバクテリアの培養にも同様に十分に適することが分かった。試験では、培地のヌクレオチド組成に特別の注意が払われ、数種のＤＮＡ前駆体起源はラクトバチルス／ビフィドバクテリアの生育を支持するその能力が試験された。
【００１９】
このためＬ．ジョンソニィ用の規定培地には遊離塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルおよびイノシン）、リボヌクレオシド（アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン）およびデオキシリボヌクレオシド（２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシシチジン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシウリジンおよびチミジン）を補充した。試験した異るラクトバチルスは５種のすべての遊離塩基、４種のすべてのリボヌクレオシドおよび５種のすべてのデオキシリボヌクレオシドが同時に存在する規定培地で生育する能力を示し、それにより実質的生育に対する最少要求は少なくとも２種の遊離塩基、１種のヌクレオシドおよび２種のデオキシリボヌクレオシドの組合せであることが分かった。
【００２０】
アデニンおよびグアニンの双方は前駆体としてイノシンにより代替でき、チアミンおよびシトシンに対する要求はウラシルを培地に補充することにより充足されることを示すことができた。イノシンおよびウラシルの存在はいくつかのラクトバチルス種の生育に有利であることが分かり、実質的にプリンおよびピリミジンを合成する能力のないことが新たに確証された。
【００２１】
上記最少所要化合物を補充した規定培地により最終細胞数を増加することができた。しかし最適結果は次のヌクレオチド誘導体、すなわちグアニン、チミン、シチジン、デオキシアデノシンおよびデオキシウリジンの組合せにより得られた。
【００２２】
この特別のレシピを使用してそのヌクレオチド組成の異る数種の規定レシピによりラクトバチルスの鉄要求も試験した。鉄化合物の除去後最少数の必要ヌクレオチド前駆体を供給する場合３７℃で１８時間培養後光学的濃度値にはほとんど差が認められなかった。
【００２３】
イノシンおよびウラシルが唯一のヌクレオチド源として供給される場合、鉄除去の一層強い効果が検知された。それ以上の研究により鉄除去のマイナス効果はウラシルをシトシンで代替後強調されることを示すことができた。従って、ラクトバチルス／ビフィドバクテリウムのピリミジンまたはプリンの代謝における鉄の推定役割が提案された。ラクトバチルス種、特にＬ．ジョンソニィは特別の環境條件下でのみ鉄を必要とすると結論される。今尚、少なくとも２種の遊離塩基、１種のリボヌクレオシドおよび２種のデオキシリボヌクレオチドをヌクレオチド前駆体として合成培地に補充すると、培地に鉄の添加を必要とせずに異るラクトバチルスおよびビフィドバクテリアの実質的生育を示すことができた。この特徴は、その生育に鉄を必要とする細菌によるカルチャーの汚染をそれにより排除できる事実のためむしろ有利であることを証明する。
【００２４】
培地の炭素源として、当業者に周知の、例えばフラクトース、ラクトース、サッカロースまたはその混合物の任意の起源は選択できる。特別の菌株の特異性に適応したｐＨ値を供するために、培地はＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、クエン酸水素２アンモニウム、ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3またはその混合物のような当業者が使用する任意種の緩衝剤を含有できる。
【００２５】
培地はさらに、好ましくは任意の天然アミノ酸またはクエン酸水素２アンモニウムまたはその混合物から選択できる窒素源を含有する。
【００２６】
生育に適する環境を供するために、培地はさらに抗酸化剤を含有する。例えば、アスコルビン酸、システイン、チオール化合物またはその混合物のような抗酸化剤は当業者に周知である。合成培地に含む異る化合物数を低減する目的に対してはシステインはそれだけで好ましい抗酸化剤である。
【００２７】
さらに、培地は微生物の生育に必要な微量要素を含有する。この微量要素は例えばＣｕ−，Ｚｎ−，Ｍｎ−，Ｍｇ−，Ｃｏ−化合物、またはその混合物である。培地の化合物量を低減する目的に対し例えば、クエン酸塩のような培地に添加する別の有機化合物から選択することが好ましく、またはＣｌ-などのようなマイナス荷電イオンでもよい。
【００２８】
培地は付加的にニコチン酸、パントテネート、コバラミン、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキサル−ＨＣｌ、リボフラビン、ビオチン、葉酸またはその混合物のような各種ビタミンを含有する。
【００２９】
当業者は自身の知識に基づいて、明記しなかったが、尚同じ目的に供する化合物を使用することは認識されるであろう。
培地に含むヌクレオチド前駆体の好ましい量は約０．５ｇ〜約０．３ｇ／ｌ、好ましくは約０．１ｇ／ｌの範囲であることが分かった。
【００３０】
その規定された組成のため本培地はラクトバチルスおよび／またはビフィドバクテリアがそれぞれ生産した生物活性分子および／または機能性代謝産物の同定および／または単離に対し使用できる。この点で細菌は培地に生育させる。この培地は適当な生育環境を供するので、高細胞数を達成でき、その結果実質量の生物活性分子／機能性代謝産物も生産できる。
【００３１】
微生物が分泌した代謝産物の単離に対し規定培養培地を高速で遠心分離して任意の細菌細胞からすべて取り出した。次に上澄を集め、さらに当業者に周知の技術により生物学的化合物の分析を行なった。
【００３２】
【実施例】
本発明は例として記載し、本発明を限定するものではない。
例
細菌菌株
試験では次の異る菌株を使用した。
【表１】
0003690958.tif 000002
微生物はＭＲＳ（ディフコ）ブロスまたは寒天に３７℃で増殖させた。各１８時間の２回の継代培養を試験実施前冷凍カルチャーにより行なった。
培地
規定培地（ＤＭ１）の組成は表２に示す。
【表２】
0003690958.tif 000003
上記培地は鉄を含まず、鉄は各回毎に新たに調製し、すぐに培地に添加した、滅菌蒸留水に溶解した硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ4７Ｈ2Ｏ）（０．０２ｇ／ｌ最終濃度）として補充した。滅菌は濾過−滅菌またはオートクレーブ処理（１２１℃）であった。各表示成分はシグマケミカルズより供給された。レシピに示したヌクレオチドはＬ．ジョンソニィの高度の生育を支持しうる最適組合せを表わす。
他のヌクレオチド誘導体を試験した。
遊離塩基：アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、
リボヌクレオシド：アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、および
デオキシリボヌクレオシド：２′−デオキシアデノシン、２′−デオキシグアノシン、２′−デオキシシチジン、２′−デオキシウリジン、チミジン、
これらは表２に示す同じ最終濃度の中性またはアルカリ性溶液として供給した。
【００３３】
生育細胞および光学的濃度測定
生育細胞数はＭＲＳ（ディフコ）寒天プレートで３７℃で４８時間嫌気培養後十進法計算により測定した。光学的濃度はＤｙｅ  ＵＮＩＣＡＭ  ＰＵ８６６０分光光度計を使用して５６０ｎｍで測定した。報告した生育結果は３回試験の平均である。
【００３４】
接種物の調製
試験した規定培地に、ＭＲＳカルチャーから１％接種し、２回洗浄し、最後に同量の滅菌蒸留水で再懸濁して培地を介して栄養素が移行するのを回避した。
培養パラメータ
チューブは３７℃で１８時間培養した。
【００３５】
上記培地は高生育量を達成する能力についてＬ．ジョンソニィに対する組成では最適であった。３７℃で１８時間培養後、平均１．８対数をすべての上記表示菌株に対し得た。
【００３６】
表２から推論できるように、培地は異るＤＮＡ誘導体の組合せを含有する（２種の遊離塩基、１種のリボヌクレオシドおよび２種の２′−デオキシリボヌクレオシド）。プリン前駆体としてイノシンおよび唯一の必須ピリミジン塩基としてウラシルを供するその他のヌクレオシドミックスを試験した。修正培地は１８時間の培養後１．５〜２対数範囲で増加する菌株の生育を支持した。
【００３７】
すべてのＤＮＡおよびＲＮＡ前駆体を省略すると、ほとんどすべての試験種はほとんど完全に生育阻害を生じた。但しＬ．カゼイ亜種カゼイ、Ｌ．カゼイ亜種パラカゼイおよびＬ．プランタルムはこの欠乏に影響を受けなかったが、これらは「ｄｅ−ｎｏｖｏ」合成によりプリンおよびピリミジンを合成できることを確認し、活性化リボース分子に直接ヌクレオチド環を形成させた。
【００３８】
他の試験菌株はＲＮＡおよびＤＮＡ合成に必須のヌクレオチドプールを合成するために少なくともイノシンおよびウラシルを必要とした。鉄の省略は表３から分かるように、この欠乏培地で生育する試験菌株の能力に影響を与えなかった。
【表３】
0003690958.tif 000004
【００３９】
異るヌクレオチド源を培地に添加して、ＤＭ１ヌクレオチド組成を代えた。５種の遊離塩基（アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル）、４種のリボヌクレオシド（アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジン）または５種の２′−デオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキシウリジン、チミジン）を供給し、相当する培地はＤＭ３，ＤＭ４およびＤＭ５とそれぞれ名づけた（表４）。
【表４】
0003690958.tif 000005
【００４０】
異るＤＮＡ誘導体に対する試験菌株の性能は５６０ｎｍで光学密度値を測定して決定した。表５は菌株を修正培地および硫酸第一鉄形の鉄を省略した培地で生育させた場合、双方が達成した最終生育収量を示す。結果はラクトバチルス菌が明白な鉄要求を欠くため強い除去効果を全く示さなかった。
【表５】
0003690958.tif 000006
予期したようにＬ．ジョンソニィＡＴＣＣ  １１５０６はこの培地で生育の発現はむしろ少なかったが、鉄の除去効果は僅かに認めることができた。
【００４１】
鉄欠乏はヌクレオチド源としてイノシンおよびウラシルの存在を特徴とするＤＭ２培地にも適用した（表４および６）。この場合、一層強い効果は特にＬ．ジョンソニィ、Ｌ．ガセリＬ．ガリナルム、およびＬ．ヘルベティカスに対し認められ、これらは硫酸第一鉄を欠くＤＭ２培地で培養後光学密度の有意な低減を示した。
【表６】
0003690958.tif 000007