(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式［１］又は［２］で示されるアンジオテンシン転換酵素（ACE）阻害剤および生理学的に許容可能なその塩。
［１］His−His−Leu
［２］His−Leu−Leu
【請求項２】
上記生理学的に許容可能な塩が塩酸塩、塩化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩からなる群より選択されたことを特徴とする請求項１記載のアンジオテンシン転換酵素（ACE）阻害剤。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、アンジオテンシン−Ｉ（angiotensin−Ｉ）をアンジオテンシン−IIに転換させるアンジオテンシン転換酵素（以下、ACEと称する）の活性を阻害するACE阻害剤に関するものであり、尚更詳細には安全性の高い食品由来のACE阻害剤に関する。
従来の技術
ACEが、アンジオテンシン−Ｉをアンジオテンシン−IIへ転換させる作用をする。アンジオテンシン−IIは、血圧を上昇させる作用を有し、本態性高血圧の主な原因になる。従って、血圧上昇を抑制する為、ACEの活性を阻害する物質に対する多様な研究が行なわれて来た。
既に開発されたACE阻害剤の例としては、カプトプリル（Captopril）と、Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−プロリンの如き、治療用血圧降下剤が合成されている。食品由来のものとしては、カゼイン（日本国特開昭62−270533号、特開昭64−5497号、特開昭64−83096号等）、および大豆タンパク質（日本国特開平３−167198号）の酵素加水分解によってACE阻害活性をもつペプチドが分離されている。
合成されたACE阻害剤等は、一般的に酵素阻害活性が高いが、大部分の場合、副作用等の安全性に問題を有している。反面、カゼインや大豆蛋白から得たACE阻害ペプチドの場合は、阻害活性は低いが、毒性が低く安全性が高いことを期待して開発されてきた。従って、最近では食品由来のACE阻害剤を分離した後、これを化学的に合成し大量生産しようとする研究が多く行なわれている。
食品蛋白質由来のACE阻害剤は、1979年Oshima等により初めて報告された（Oshima,G.,Shimabukuro,H.and Nagasawa,K.;Peptide inhibitors of angiotensin−I converting enzyme in digests of gelatin by bacterial collagenase.Biochem.Biophys.Acta.,556,128,1979）。
Oshima等は、Clostridium histolyticum由来のコラゲナーゼでゼラチンを24時間加水分解しアミノ酸３個乃至12個からなる９種のペプチドを分離した。この中、Ｃ−末端にAlanine−Hydroxyprolineの配列を有した６種のペプチドが比較的強力なACE阻害活性を示し（IC50＝8.3−37μＭ）、Ｃ−末端にProline−Ｘの配列を有したペプチドは相対的に低いACE阻害活性を示した（IC50＝123.4−146.5μＭ）。
その後、40余種のACE阻害ペプチドが報告されている。［Ariyoshi,Y.:Angiotensin converting enzyme inhibitors derived from food proteins.Trend in Food Science ＆ Techhnol.,May,139（1993）］
牛乳カゼイン酵素加水分解産物よりα−casein Bの23−34位置のアミノ酸配列に対応するPhenylalanine−Phenylalanine−Valine−Alanine−Proline−Phenylalanine−Proline−Glutamic acid−Valine−Phenylalanine−Glycine−Lycineのペプチドが同定され、Phenylalanine−Phenylalanine−Valine−Alanine−Prolineのペンタペプチド（IC50＝6.0μＭ）が同定され［Maruyama,S.and Suzuki,H.:A peptide inhibitor of angiotensin−I converting enzyme in the tryptichydrolysate of casein.Agric.Biol.Chem.46（５）,1393（1982）．］、β−caseinの177−183位置と相同のAlanine−Valine−Proline−Tyrosine−Proline−Glutamine−ArgenineのヘプタペプチドがACE阻害剤として同定された（Maruyame,S.Nakagomi,K.,Tomizuka,N.and Suzuki,H.:Angiotensin−I converting enzyme inhibitor derived from an enzymatic hydrolysate of casein.II.Isolation and bradykinin potentiating activity on the uterus and the ileum of rats.Agric.Biol.Chem,49（５）,1405（1985）．）。同定されたPhenylalanine−Phenylalanine−Valine−Alanine−Prolineのペンタペプチドに基づいてアミノ酸の配列を異にした一連のペプチドを合成した。即ち、Valine−Alanine−Proline,Phenylalanine−Valine−Alanine−Proline,Phenylalanine−Alanine−Prolineの３種の合成ペプチドのACE阻害活性は、母体のペンタペプチドと類似な水準の活性を示した［Kohmura,M.,Nio,N.and Aryoshi,Y.:Inhibition of angiotensin converting enzyme by syntheticpeptide fragments of various β−caseins.Agric.Biol.Chem,54（４）,1101（1990）］。
α−zeinの酵素加水分解物よりLeucine−Arginine−Proline等３種のACE阻害ペプチドが報告された［Miyoshi,S.,Kaneko,T.,Ishizawa,Y.,Fukui,F.,Tanaka,H.and Haruyama,S.:Structures and activity of angiotensin converting enzyme inhibitors in α−zein hydrolysate.Agric.Biol.Chem,55（５）,1221（1991）;Miyoshi,S.,Kaneko,T.,Ishizawa,Y.,Fukui,F.,Tanaka,H.and Maruyama,S.:Hypertensive activity of enzymatic α−zein hydolysate.Agric.Biol.Chem,55（５）,1407（1991）］。
乳酸菌飲料（sour milk）［Nakamuro,Y.Yamamoto,N.,Sakai,K.,Okubo,A.,Yamazaki,S.and Takano,T.:Purification and characterization of angiotensin−I converting enzyme inhibitors for sour milk.J.Dairy Sci.,78,777（1995）］、マグロ肉［Kohama,Y.,Matsumoto,S.,Oka,H.,Teramoto,T.,Okabe,M.and Mimura,T.:Isolation of angiotensin converting enzyme inhibitor from tuna muscle.Biochem.Biophys.Res.Comm,155（１）,332（1988）］、鰯肉［Matsuda,H.,Ishizaki,T.,Moritam H.,Nagaoka,T.,Osajima,K.and Osajima,N.:Digestion of peptides from sardine muscle that inhibit angiotensin−I converting enzyme by intestinal enzyme of pigs.日本農芸学会誌，66（11）,1645（1992）］、牡蠣蛋白質［Matsumoto,K.,Ogikubo,A.,Yoshino,T.,Matsui,T.and Osajima,Y.:Separation and purification of angiotensin−I converting enzyme inhibitory peptides in peptic hydrolyzate of oyster.日本食品工業学会誌，41（９）,589（1994）］、無花果乳液（Ficus carica）［Maruyama,S.,Miyoshi,S.and Tanaka,H.:Angietenain−I converting enzyme inhibitors derived from Ficus carica.Agric.Biol.Chem.,53（19）,2763（1989）］、米糠［村元學、河村幸雄：米蛋白質と米蛋白質由来の抗血圧上昇性ペプチド、食品工業、34（11）,18（1991）］、清酒およびその副産物［Saito,Y.,Nakamura,K.,Kawato,A.,and Imayasu,S.:Angiotensin−I converting enzyme inhibitor in sake and its by−product.日本農芸学会誌,66（７）］等の食品から由来したACE阻害ペプチドも報告された。
また、トリ−乃至ノナ−ペプチドであるACE阻害ペプチドが多数特許出願された（US 5449661,5071955,4692459,4585758,4512979,4191753,3832337;EP174162;日本国特開平８−225593、同平８−099994、同平６−340692、同平６−298794、同平６−279491、同平６−279490、同平６−277091、同平６−277090、同平６−277089、同平６−256387、同平６−220088、同平６−184191、同平６−166697、同平６−107686、同平６−049096、同平６−016568、同平５−306296、同平５−306295、同平５−294844、同平５−262790、同平５−097798、同平５−001095、同平４−341193、同平４−300894、同平４−282398、同平４−279597、同平４−264096、同平４−264095、同平４−247100、同平４−247099、同平４−247098、同平４−169598、同平３−063295、同平３−011097）。
【図面の簡単な説明】
図１は、味噌から本発明のペプチドを分離する過程中の３次クロマトグラフィーを行った結果を示すクロマトグラムであり、
図２は、味噌から本発明のペプチドを分離する過程中の４次クロマトグラフィーを行った結果をクロマドグラムである。
発明の詳細な説明
ここに活性が高く、安全性が優れ、大量生産に有利な新規のACE阻害ペプチドを探し出す為に多くの食品を研究した結果、所望の効果を示す２種のトリペプチドを味噌から発見し分離した。
従って、本発明の目的は高血圧制御に卓越な活性を表す新規のACE阻害剤を提供することにある。
また、本発明の目的は、人体に投与の際、安全で、構造が単純であり大量合成が容易な食品由来のACE阻害剤を提供することにある。
このような目的を達成する為に、本発明によれば、下記の構造式［１］又は［２］で示すアンジオテンシン転換酵素阻害剤及び生理学的に許容可能なこれらの塩が提供される。
［１］His−His−Leu
［２］His−Leu−Leu
本発明の内容をより詳細に説明すれば、次の如きである。
本発明による構造式［１］及び［２］のペプチドは、一般的なペプチド分離法により味噌より分離することができ、天然のペプチドであるので、Ｌ−型（Ｌ−form）である。更にこれらは一般的な公知の有機化学的ペプチド合成法に従い合成することも可能である。
本発明によるペプチドの生理学的に許容可能な塩をACE阻害剤として使用することができ、特に塩酸塩、塩化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩と、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メタンサルホン酸塩等の有機酸塩が望ましい。
本発明によるトリペプチド及び生理学的に許容可能なこれらの塩は、従来のACE阻害ペプチドと比較して同等か、それより高い活性を示し、また食品由来ペプチドであるので、安全である。さらに、構造が単純なので、大量生産が容易である。
以下、本発明を下記の実施例により更に詳細に説明する。これらの実施例は本発明の理解の為にのみ提供されるものであり、本発明の範囲がこれにより限定されるものではない。
（実施例）
A.  味噌からのHis−His−Leu及びHis−Leu−Leuの分離
先ず、味噌を凍結乾燥し粉末化した。味噌粉末300gを５リットル抽出槽に入れ、３リットルの水を加えた。混合物を30分間振盪抽出した後、3,000rpmにて遠心分離して上層液のみを回収した。上層液をトヨ４番（Toyo No.4）フィルターペーパーで濾過して濾過液を回収した。得られた濾過液を再度アミコン社（Amicon Co.Ltd.）のPM−10限外濾過膜を使用して限外濾過した。得られた濾過液を凍結乾燥して保管し、クロマトグラフィを順次行って目的ペプチドを分離した。
クロマトグラフィ条件
プレパラティブ高速液体クロマトグラフィモデルLC−20［Japan analytical institute社］を使用した。
１］一次クロマトグラフィ
−カラム:JAIGEL−ODS−Ａ−301カラム［Japan analytical institute社］
−移動相:2％〜60％のアセトニトリル、流速5ml/分
−214nm UV検出器
２］２次クロマトグラフィ
−カラム:JAIGEL−ES−502CPカラム
−移動相:pH4.2の緩衝液（0.1M sodium succinate buffer）、流速4ml/分
−214nm UV検出器
３］３次クロマトグラフィ
−カラム:JAIGEL−ODS−Ａ−301カラム
−移動相:0.05％トリフルオロ酢酸を含有した10％アセトニトリル；流速1ml/分
−214nm UV検出器
４］４次クロマトグラフィ
−カラム:JAIGEL−ES−502Nカラム
−移動相:pH7.5トリス−塩酸緩衝液（0.1M Tris−HCI buffer）；流速1ml/分
−214nm UV検出器
１次クロマトグラフィを上記条件１］の下で実施し合計７個の溶出分画を得た。クシマンとチェン［Cushman and Cheung Biochem,Pharmacol.,20 1637（1971）］の方法により各溶出分画のACE阻害活性を測定した。その結果、５番目の分画の阻害活性が一番高かった。従って、５番目の分画を上記条件２］の下で再度２次クロマトグラフィして合計５個の溶出分画に分け、上記の方法でACE阻害活性を測定した。その結果、３番目の分画の阻害活性が一番高かった。この分画を使用して上記条件３］の下で再度３次クロマトグラフィした。３次クロマトグラフィの結果を図１に示した。上記の方法にて分画し阻害活性を測定し一番高い活性を示す５番目の分画を使用し、上記条件４］の下で４次クロマトグラフィした。４次クロマトグラフィの結果を図２に示した。４次クロマトグラフィにより得られた分画A,Bを蛋白質配列分析器で分析し、本発明のトリペプチドである構造式［１］のHis−His−Leuと［２］のHis−Leu−Leuが含まれることを確認した。
B.  His−His−Leu及びHis−Leu−leuのACE阻害酵素活性測定
本発明のトリペプチドの存在下または不在下に、市販ACEとその基質（HHL）を反応させ、生成された馬尿酸（Hippuric acid）の量を測定（228nm）し、ACE活性の阻害度を評価した。IC50はACEの活性を50％阻害する濃度を窒素分析器で分析して求めた。His−His−LeuとHis−Leu−LeuのIC50は各々21.8μｇ蛋白質/ml,22.2μｇ蛋白質/mlであった。
【図１】
0003637066.tif 000002
【図２】
0003637066.tif 000003