(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノースとシクロデキストリン類を含有する有機溶媒の存在下にα−マンノシダーゼを作用させることを特徴とするシクロデキストリン類の水酸基にα結合で１個または数個のマンノシル基が結合しているマンノシル−シクロデキストリン類の製法。
【請求項２】
有機溶媒がメタノール，エタノール，アセトニトリル，ジメチルスルホキシドおよびジオキサンのうちのいずれかである請求項１記載のマンノシル−シクロデキストリン類の製法。
【請求項３】
有機溶媒を２〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度で用いる請求項１記載のマンノシル−シクロデキストリン類の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、シクロデキストリン類の水酸基にα結合でマンノシル基が結合したマンノシル−シクロデキストリン類の製造方法に関する。詳しくは、酵素反応を利用するマンノースとシクロデキストリン類からの効率的なマンノシル−シクロデキストリン類の製造方法に関する。
本発明により得られるマンノシル−シクロデキストリン類は、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く利用される。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
シクロデキストリン類（以下、ＣＤと略記する。）は、グルコースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−およびγ−ＣＤが良く知られている。さらに、最近ではＣＤの溶解度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグルコシル基やマルトシル基を結合させた分岐ＣＤが合成されている。
【０００３】
これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっているため、包接作用があり、各種油性物質等を取り込む性質を有している。
ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質をもっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く使用されている。
【０００４】
最近、医薬品工業の分野では、薬剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞，マクロファージに強い親和性を示すことが良く知られている。
【０００５】
以前、我々は上述した現状に鑑み、シクロデキストリンとα−マンノシル糖化合物を含有する溶液に、α−マンノシル基転移酵素を作用させることによって、ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤの開発に成功している。また、マルトオリゴ糖とα−マンノシル糖化合物を含有する溶液に、α−マンノシル基転移酵素およびシクロデキストリン合成酵素を作用させることによって、同様のマンノシル−ＣＤの開発に成功している。
【０００６】
しかし、これらマンノシル基転移酵素の転移反応およびシクロデキストリン合成酵素の作用を利用して直接マンノシル−ＣＤを合成する方法は、反応に用いる基質であるマンノシル糖化合物が高価であるために、コストの面に問題がある。また、マンノシル糖化合物は溶解度が低いものが多く、基質濃度が低く抑えられるため、転移効率が低い。その結果、収率，コストの面に問題がある。
したがって、本発明の目的はマンノシル−ＣＤをより効率的な方法で製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このような事情に鑑み、本発明者は鋭意努力を重ねた結果、有機溶媒の存在下に、高濃度のマンノースとＣＤを含有する溶液にα−マンノシダーゼを作用させると、縮合反応によってＣＤのグルコース残基に直接マンノシル基が結合したマンノシル−ＣＤを効率良く合成することを見出した。基質となるマンノースは比較的安価であり、高い溶解度を有する。その結果、収率，コストを格段に高めることが可能になった。また、基質濃度を高めることによって、α−マンノシダーゼの安定化、反応槽のコンパクト化も可能となった。したも、反応系の微生物汚染を軽減することができる。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明はマンノースとシクロデキストリン類を含有する有機溶媒の存在下にα−マンノシダーゼを作用させることを特徴とするシクロデキストリン類の水酸基にα結合で１個または数個のマンノシル基が結合しているマンノシル−シクロデキストリン類の製法を提供するものである。
【０００９】
本発明で得られるマンノシル−シクロデキストリン（分岐ＣＤと略記することがある。）は、ＣＤの水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤであり、ＣＤ１分子当たりマンノシル基１分子以上が結合している化合物をいう。これら分岐ＣＤの代表的な構造式を図１のＩ〜III に示す。
【００１０】
本発明の分岐ＣＤは、有機溶媒の存在下、高濃度のマンノースとＣＤとを含有する溶液に、α−マンノシダーゼを作用させることによって得られる。本発明において反応に供するＣＤは、α−ＣＤ，β−ＣＤおよびγ−ＣＤのいずれでもよく、これらの混合物であってもよい。また、グルコシル−ＣＤ，マルトシル−ＣＤ，ガラクトシル−ＣＤなど分岐側鎖を有するＣＤおよびその混合物や、前記のα−ＣＤなどのＣＤとの混合物であってもよい。
【００１１】
本発明に用いるα−マンノシダーゼとしては、マンノースとＣＤを含有する溶液に作用させたとき、マンノースとＣＤの縮合反応を触媒し、ＣＤの水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤを合成するものであれば、いずれも使用可能である。本発明に用いるα−マンノシダーゼは、自然界に広く分布しているものである。例えば、タチナタマメあるいはアーモンドなどの植物由来の酵素、サザエや肝臓（ウシ，ラット，ヒト）などの動物由来の酵素、さらにはアルスロバクター・オーレセンス，アスペルギルス・ニガーなどの微生物由来の酵素がよく知られている。本発明では植物由来の酵素が好適に用いられる。
【００１２】
次に、本発明で使用する有機溶媒としては、通常メタノール，エタノール，プロパノール，アセトン，ヘキサン，アセトニトリル，シクロヘキサン，ジメチルスルホキシド，ジオキサン，ジエチレングリコール，ジメチルホルムアミド，ピリジン，テトラヒドロフランなど様々なものが挙げられ、その種類は特に限定されない。これらの中で好ましいものはメタノール，エタノール，アセトニトリル，ジメチルスルホキシド，ジオキサンである。
また、その濃度については、基質の濃度を著しく低下させない範囲で使用することが好ましく、マンノースとＣＤの縮合反応を触媒するα−マンノシダーゼを失活させない濃度であれば、特に限定されるものではない。通常は２〜５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５〜２０％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。
【００１３】
本発明の反応系において、マンノースとＣＤを含む溶液（水溶液または懸濁液）は、ＣＤの濃度が通常５〜７０％（ｗ／ｗ），好ましくは２０〜５０％（ｗ／ｗ）であり、マンノースの濃度が通常２０〜８０％（ｗ／ｗ），好ましくは２５〜７０％（ｗ／ｗ）であることが適当である。また、ＣＤに対するマンノースの比率（重量）は、使用するＣＤの種類によって異なるが、０．２〜２０倍の範囲、好ましくは１〜１０倍の範囲とするのが適当である。
【００１４】
反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜７、温度は２５〜８５℃、好ましくは５０〜７０℃に調整して反応させることが適当である。また、使用酵素量は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が１時間〜２週間、好ましくは６時間〜１０日間で終了するような酵素量とすればよいが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
以上のような方法で反応させて得られた液を、高速液体クロマトグラフィーにかけて、ＣＤへの反応生成物を分画・分取した後、酵素分解法およびＦＡＢ−ＭＳによる分子量測定により構造解析を行なった結果、また既知のマンノシル−ＣＤとの高速液体クロマトグラフィーの溶出時間から、該反応生成物は図１のＩ〜III に示す構造式で表される分岐ＣＤであることを確認した。
【００１６】
【実施例】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）縮合反応
マンノース１００ｍｇおよびγ−ＣＤ１００ｍｇを、▲１▼１０％（ｖ／ｖ）のメタノール、▲２▼１０％（ｖ／ｖ）のエタノール、▲３▼１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル、▲４▼１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドまたは▲５▼１０％（ｖ／ｖ）のジオキサンを含む１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．２ｍｌに溶解させた後、タチナタマメのα−マンノシダーゼ（シグマ社製）を５単位加え、６０℃にて３日間反応させた。
【００１７】
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を高速液体クロマトグラフィーにかけて分析した。いずれの反応液も同様な溶出パターンを示し、それぞれ保持時間の一致する生成物Ａ，Ｂ，Ｃが生成した。一例として▲１▼の反応液のクロマトグラムを図２に示した。この生成物を調製用ＨＰＬＣで分取し、構造解析を行った。なお、比較例は有機溶媒を加えないこと以外は同様に処理した。
なお、ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
0003637086.tif 000002
【００１８】
また、酵素１単位は５ｍＭのｐ−ニトロフェニル  α−マンノシド（ｐＨ４．５）に４０℃で１０分間作用させたときに１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールが遊離する酵素量とした。
【００１９】
得られた反応生成物の収量および生成率を第１表に示す。なお、生成率は用いたＣＤあたりのモル百分率として示した。
表から明らかなように、いずれの有機溶媒の使用によっても縮合生成物の収量および生成率共に向上した。
【００２０】
【表１】
0003637086.tif 000003
【００２１】
上記で単離された反応生成物Ａ（図３）は、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１１３４であることがわかった。また、図４に示すように、このものはタチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に等モルのマンノースとα−ＣＤに分解された。さらに、13Ｃ−ＮＭＲ解析により、図５に示すように、α−ＣＤのグルコシル基の６位の水酸基にα結合でマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式Ｉ参照）であることが確認された。
【００２２】
また、反応生成物ＢおよびＣ（図６）はいずれも、ＦＡＢ−ＭＳ分析により分子量は１２９６であることがわかった。これらは、タチナタマメのα−マンノシダーゼにより完全に分解され、α−ＣＤと２倍モルのマンノースを生成した。さらに、高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを考慮して、反応生成物ＢおよびＣはα−ＣＤ１分子に対して２分子のマンノシル基が結合した化合物（図１の構造式IIとIII 参照）であることが確認された。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、α−マンノシダーゼの縮合反応を利用して、ＣＤ分子中の水酸基にα結合でマンノシル基が結合しているマンノシル−ＣＤを効率よく得ることができる。本発明の方法により得られるマンノシル−ＣＤは、医薬品分野のほか食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明により得られる分岐ＣＤの構造を示す。
【図２】  実施例１の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図３】  実施例１の反応生成物Ａの高速液体クロマトグラフである。
【図４】  実施例１の反応生成物Ａの酵素分解液の高速液体クロマトグラフである。
【図５】  実施例１の反応生成物Ａの13Ｃ−ＮＭＲ解析スペクトルである。
【図６】  実施例１の反応生成物ＢおよびＣの高速液体クロマトグラフである。
【図１】
0003637086.tif 000004
【図２】
0003637086.tif 000005
【図３】
0003637086.tif 000006
【図４】
0003637086.tif 000007
【図５】
0003637086.tif 000008
【図６】
0003637086.tif 000009