(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料としての炭酸カルシウムスラリーとｐＨ８〜１０の寒天培地とを混合して平板培養した後、寒天培地上に２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液、または２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液とグルコース溶液とを加え、赤色に染色されたコロニー数を計数することを特徴とする炭酸カルシウムスラリー中の細菌数測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、炭酸カルシウムスラリー、特に製紙工程で使用される炭酸カルシウムスラリー中の細菌数測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
炭酸カルシウムスラリーは主に製紙工業における塗工顔料として使用され、軽質炭酸カルシウムは通常６０％以上、重質炭酸カルシウムは７５％以上を含む高濃度スラリーの形態で市販されている。このような炭酸カルシウムスラリーは分散剤として少量の低分子ポリマーを含むため、保存中または輸送中に細菌が増殖し、異臭の発生、部分的な変色またはスライムの発生など、腐敗による障害が発生する場合がある。
【０００３】
このような微生物障害を防止するため、希釈した炭酸カルシウムスラリーを寒天培地に混合して培養した後、生成したコロニー数を計数する混釈法により生菌数を測定し、品質管理を行っている。しかし従来の混釈法では、炭酸カルシウムスラリーの希釈が高希釈の場合には、ペトリ皿を光にかざすことにより寒天平板培地内部に形成されたコロニーも残らず計数することができるが、炭酸カルシウムスラリーの希釈が低希釈の場合には、炭酸カルシウム粒子により寒天平板培地が白色地となるため、寒天平板培地に形成されたコロニー、特に寒天平板培地内部に形成されたコロニーを計数することが困難である。
【０００４】
炭酸カルシウムスラリー中の生菌数が少ない場合、例えば１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ（ｃｆｕ：ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）以下の場合は低希釈で計数する必要があるが、この場合は上記の理由で生菌数を測定することが困難である。またＤＮＡに特異的に反応して蛍光を発する蛍光染料、例えば４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、３，６−テトラメチルジアミノアクリジン（アクリジンオレンジ）などを用いてコロニーを染色する方法も考えられるが、この場合も寒天平板培地内部に形成されたコロニーを計数することはできない。
【０００５】
ところで、炭酸カルシウムスラリーは生菌数が少ない場合、例えば１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ以下の場合でも腐敗障害が発生する場合があるが、上記のように従来は低菌数試料の菌数測定が困難なため、十分な品質管理を行うことが困難であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、試料中の生菌数が多い場合はもちろん少ない場合でも、特別な測定器具を使用することなく簡単な操作で正確に生菌数を測定することができる炭酸カルシウムスラリー中の細菌数測定方法を提案することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、試料としての炭酸カルシウムスラリーとｐＨ８〜１０の寒天培地とを混合して平板培養した後、寒天培地上に２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液、または２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド溶液とグルコース溶液とを加え、赤色に染色されたコロニー数を計数することを特徴とする炭酸カルシウムスラリー中の細菌数測定方法である。
【０００８】
炭酸カルシウムスラリーはｐＨ９〜１０のアルカリ性であり、このため炭酸カルシウムスラリー中で増殖する菌のほとんどが、いわゆる好アルカリ性細菌である。そしてこれらの好アルカリ性細菌のほとんどがデヒドロゲナーゼ活性を有し、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドをホルマザンに還元する能力のあることがわかった。このため本発明では２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリドを用いて好アルカリ性細菌を赤色に染色することにより、低希釈の場合においても生菌数の正確な測定を可能にする。
【０００９】
本発明において試料となる炭酸カルシウムスラリーとしては、炭酸カルシウムが水などの分散媒に分散されたものであればどのようなスラリーでも使用でき、例えばスラリー中に分散剤、蛍光染料などが含まれていてもよい。また炭酸カルシウムは軽質のものでも重質のものでもよい。本発明の方法は炭酸カルシウムを高濃度に含有するスラリーに適用するのが好ましく、例えば軽質炭酸カルシウムを６０重量％以上含有するもの、重質炭酸カルシウムを７５重量％以上含有するものなどがあげられる。
【００１０】
このような炭酸カルシウムスラリーとしては製紙工程用の炭酸カルシウムスラリーがあげられ、本発明の方法に適している。また本発明の方法では、炭酸カルシウムスラリー中の細菌数が少なくて従来の方法では正確な測定ができない炭酸カルシウムスラリーについても正確な細菌数を測定することができ、例えば１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ以下の低菌数の炭酸カルシウムスラリーも試料として用いることができる。
【００１１】
本発明で使用する寒天培地としては、従来から細菌の培養に使用されている寒天培地が使用でき、例えばポリペプトン、酵母エキス、可溶性デンプンおよび食塩などを含む培地に、支持体としての寒天を添加した培地が使用できる。培地のｐＨは８〜１０、好ましくは９〜９．５である。
【００１２】
本発明の方法では、まず試料としての炭酸カルシウムスラリーとｐＨ８〜１０の寒天培地を混合し、平板培養する。この場合、炭酸カルシウムスラリーまたはその希釈液に寒天培地を加え、平板培養するのが好ましい。培養により寒天培地にコロニーが形成される。この場合、寒天層内部にもコロニーが形成されるが、このようなコロニーも後述の染色方法により染色させて計数することができる。なお寒天平板培地を形成した後、培地上に試料を塗布する方法では、試料中の水分が培地に取られて均一に塗布できないので好ましくない。
【００１３】
培養後は、寒天培地上に２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（以下、ＴＴＣという）溶液、またはＴＴＣ溶液とグルコース溶液とを加え、コロニーを染色する。この場合のＴＴＣの濃度は１０〜１０，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５００〜１，０００ｍｇ／ｌ、グルコースの濃度は０〜１０，０００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜１，０００ｍｇ／ｌとするのが望ましい。溶液の使用量は寒天平板上に行きわたるのに十分な量があればよい。例えば、直径１１ｃｍのペトリ皿の場合、通常１〜５ｍｌ、多くの場合は２〜３ｍｌで十分である。ＴＴＣ、グルコースを溶解する溶媒としては、蒸留水または純水が好ましいが、脱塩素水道水でもよい。この溶液は特に滅菌する必要はない。なおＴＴＣ溶液とグルコース溶液とを別々に添加する代わりに、予めＴＴＣとグルコースとの混合溶液を調製し、この混合溶液を添加することもできる。
【００１４】
染色は、ＴＴＣ溶液またはＴＴＣ溶液とグルコース溶液とを加えて、２５〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、１５分間〜２時間、好ましくは３０分間〜１時間保持して反応させることにより行うことができ、コロニーを赤く染色することができる。この場合、寒天培地の内部に形成されたコロニーも赤く染色することができるので、生成したコロニー数を目視により正確に計数することができる。
【００１５】
炭酸カルシウムスラリーの希釈倍率が小さい場合、培地は炭酸カルシウム粒子により白色地になるので、ペトリ皿を光にかざしても寒天内部に形成されたコロニーは計数できないが、上記のようにして染色することにより、培地が白色地の場合であっても白色地の中に赤色のコントラストを付けることによって、寒天内部のコロニーも正確に計数することができる。このため、炭酸カルシウムスラリー中の細菌数が１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ以下の低菌数の場合でも、細菌数を正確に測定することができる。
【００１６】
コロニーが赤色に染色される理由は、ＴＴＣが細菌のデヒドロゲナーゼ活性により還元され、赤色で不溶性のホルマザンが形成されるためである。この場合、炭酸カルシウム中に成長する細菌が全てデヒドロゲナーゼ活性を有していないと正確な菌数測定はできないが、後述の実施例からもわかるように、炭酸カルシウムスラリー中に成長するいわゆる好アルカリ性細菌は、いずれもデヒドロゲナーゼ活性を有していることが本発明者により明らかにされた。従って、前記のようにして染色することにより、炭酸カルシウムスラリー中の全細菌数を容易に測定することができる。
【００１７】
ＴＴＣは好アルカリ性細菌類にわずかな生育阻害性をもつため、染色は本発明のように培養後に行わないと正確な計数ができない。このため本発明では培養期間中は細菌とＴＴＣとを接触させないようにし、計数直前にその酵素活性だけを利用してコロニーの所在を識別できるようにしているので、正確な計数が可能である。
【００１８】
このように本発明では、１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ以下の低菌数の炭酸カルシウムスラリーであっても正確に細菌数を測定することができる。このため品質管理の質的向上のほかに、製品の保存中、あるいは輸送中にスラリーの腐敗初期段階を菌数測定により検出することができ、これにより障害発生前に殺菌剤添加などによって障害を防止することができる。また、炭酸カルシウムスラリーのような高アルカリ液に有効な殺菌剤を実験室でスクリーニングする場合、従来より正確な試験を行うこともできる。
【００１９】
【発明の効果】
以上の通り、本発明の方法は、炭酸カルシウムスラリーと寒天培地とを混合して平板培養した後、寒天培地上にＴＴＣ溶液またはＴＴＣ溶液とグルコース溶液とを加えて染色し、コロニーを計数しているので、炭酸カルシウムスラリー中の生菌数が多い場合はもちろん少ない場合でも、特別な測定器具を使用することなく、簡単な操作で正確に生菌数を測定することができる。
【００２０】
【実施例】
次の本発明の実施例について説明する。
実施例１
保存期間中に細菌が１．３×１０5ｃｆｕ／ｍｌまたは４．７×１０6ｃｆｕ／ｍｌにまで繁殖してしまった軽質炭酸カルシウムスラリー製品（７５％含有）であって、製品種も採取時期も異なる２種類を選び、滅菌水で１０倍に段階希釈した。これらの試料（試料Ａ，Ｂ）をデンプンＰＹ寒天培地（ポリペプトン１ｇ、酵母エキス１ｇ、可溶性デンプン１ｇ、食塩５ｇ、水道水１０００ｍｌ、ｐＨ９．０の寒天培地）と混合し、各５系列で平板培養（３０℃、３日間）を行った。
【００２１】
１枚に４０〜２００個の細菌コロニーが形成されたペトリ皿各１枚ずつを選び出し、染色しないでコロニー数を計数した。この場合、試料の希釈倍率が高いためスラリーの白色に妨害されず、寒天平板の内部に形成されたコロニーもペトリ皿を光にかざすことにより残らず計数することができた。次にＴＴＣ溶液（１００ｍｇ／ｌ）３ｍｌ、およびグルコース溶液（０．１％）１ｍｌを寒天培地の上に加え、３０℃の培養器で１時間反応させた。反応後、ＴＴＣが還元されて赤色に染色された細菌コロニー数を計数した。結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表１の結果から、炭酸カルシウムスラリーに生育する好アルカリ性細菌はいずれもデヒドロゲナーゼ活性を有し、ＴＴＣ還元能があることがわかる。
【００２４】
実施例２、比較例１
保存時間中に細菌数が４．７（±０．５）×１０5ｃｆｕ／ｍｌにまで繁殖してしまった、ある炭酸カルシウムスラリー（７５％含有）を試料として２種類の実験を行った。
対照系では、従来のように炭酸カルシウムスラリーを滅菌水で１０倍希釈段階を作り、前記デンプンＰＹ寒天培地を用いて３０℃で３日間平板培養した後、ペトリ皿を光にかざしてコロニー数を計数した（比較例１）。実施例の系では炭酸カルシウムスラリーの一部をとり、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）により滅菌した。この滅菌スラリー各１ｍｌを無菌的にペトリ皿に分注し、その上に各希釈段階試料１ｍｌ、および前記デンプンＰＹ寒天培地１０ｍｌを流込んで混合し、３０℃で３日間平板培養した。すなわち実施例の系では各ペトリ皿に無希釈のスラリー試料が余分に添加され、無希釈スラリーを植え込んだ場合と同じ条件になっていることになり、細菌数は滅菌水での各希釈段階に相当するだけが植え込まれたことになる。培養後、実施例の系では実施例１と同様にしてＴＴＣにより染色し、コロニー数を計数した。結果を表２に示す。
【００２５】
比較例２
実施例２で使用した炭酸カルシウムスラリーに微量の蛍光染料を添加した以外は実施例１と同様にして平板培養した。培養後のペトリ皿を暗室に持込み、紫外線ランプを用いて紫外線照射を行った。紫外線を吸収して黒っぽい斑点として検出されたコロニー数を計数した。結果を表３に示す。
【００２６】
比較例３
実施例２と同様にして平板培養した後、寒天培地の上に４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（以下、ＤＡＰＩという）溶液を加え、暗室中で紫外線照射を行った。ＤＡＰＩはＤＮＡに特異的に反応して蛍光を発する蛍光染料であり、コロニーを蛍光を発する斑点部分として識別することができる。結果を表３に示す。
【００２７】
比較例４
比較例３において、ＤＡＰＩの代わりに３，６−テトラメチルジアミノアクリジン（以下、アクリジンオレンジという）を用いた以外は同様にして行った。結果を表３に示す。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
【表３】
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【００３０】
表２、表３の結果では、各希釈段階の試料における細菌数は同じなので、同数レベルのコロニーが生成することが期待されるが、比較例１（目視で計数可能）に比べて比較例２〜４のコロニー数は明らかに低い計数値を示した。これは、いずれの方法も寒天層内部に形成されたコロニーを検出することができないためである。これに対して、実施例２と比較例１の結果に有意差は認められず、実施例２では寒天層内部に形成されたコロニーも計数することができることがわかる。
【００３１】
比較例５
実施例２において、希釈段階試料を添加しないで寒天平板培地を形成した。次に希釈段階試料を寒天平板培地表面に塗抹したが、培地に水分を取られて凝固し、均一に塗抹することが困難であった。
【００３２】
比較例６
前記デンプンＰＹ寒天培地成分にＴＴＣを１００ｍｇ／ｌとなるように加えて溶解した後、加熱して寒天を溶融し、次にオートクレーブにより１２１℃で１５分間滅菌した。しかし、滅菌後の培地は試験に供する前から赤味を帯び、培地として使用できなかった。これはＴＴＣがアルカリ性で加熱されたため、還元作用を受けて赤色のホルマザンを生成したためと考えられる。
【００３３】
比較例７
実施例２において、寒天培地に試料を植え込む際、除菌濾過したＴＴＣ溶液を培地に加えて平板培養した。しかし、添加したＴＴＣ濃度が１０ｍｇ／ｌでは着色が薄く、生長後のコロニーを識別しにくい場合があった。またＴＴＣ濃度が１００ｍｇ／ｌでは、細菌の成長を阻害し、コロニー数が少ない場合があった。
【００３４】
実施例３
製造直後に殺菌剤を添加して納入した軟質炭酸カルシウムスラリー（７５％含有）であっても、納入先でタンク保存中に短時間のうちに１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ以上の菌数を示すようになったことがある。細菌が検出されるようになるまでの期間がますます短くなってきたので、障害の発生が心配され、添加した殺菌剤が無効になったのではないか、殺菌剤添加量が不足しているのではないかなど、さまざまな可能性が考えられ、適切な対策を講じることができなかった。
【００３５】
この状況は、従来の菌数測定法で１×１０3ｃｆｕ／ｍｌ以下の細菌数が測定できないため、原因の解析ができなかったことによるが、本発明のＴＴＣ染色法を用いて以下の試料を試験したところ、表４に示す結果が得られた。
【表４】
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【００３６】
すなわち、新品のスラリーには納入時に細菌が検出されず、品質上の問題はないこと、製品受入れタンクの残存スラリーに細菌が増殖し始めていること、この旧スラリーと新スラリーがタンク内で混合されると、新品スラリーはタンクに受入れた直後から、細菌に汚染されてしまうことなどが判明した。
以上の測定結果に基づき、殺菌剤を受入れタンクにも定期的に添加する方法を採用したところ、短期間保存における菌数増加の問題はなくなり、腐敗を予防できるようになった。