(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＧ菌培養後の培養液よりＢＣＧ菌を除した残余の培養液を性質の異なるカラムを用い、前記残余の培養液を装填し、緩衝液により溶出して、順次複数箇に分画し、この中より単離すべき蛋白質を含む分画を選択し、この分画液を濃縮した後透析するカラム精製方法を、異なる性質のカラムを用い異なる成分を含有する緩衝液により前記同様のカラム精製方法を少なくとも２回行い、目的の蛋白質を精製する方法において、
出発物質としては前記ＢＣＧ菌は東京株を用いて培養液中にて８日間培養後、前記ＢＣＧ菌を集菌した残余の培養液（以下単に使用済み培養液と云う）とし、前記カラム精製方法の前処理として、前記使用済み培養液を４０乃至４５℃に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を除去し、次いで分子量５０００以下の蛋白質及び培養液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を濃縮し、次いで、この濃縮液に硫酸アンモニウム（以下単にＡＳ）を６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離により前記全蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給することを特徴とするＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法。
【請求項２】
前記カラム精製方法の２番目の段階のカラム精製方法において、カラムとして、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで平衡化して、カラム精製方法の前処理後の蛋白質を供給し、前記と同一の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第に高めながら濃度の低い方から順に供給し、溶出速度を０．５ｍｌ／分として、数区分に分画し、目的蛋白質を含む分画を選択し、
次いで、選択された分画蛋白質を濃縮し、次いで透析する過程において前記尿素を分離する方法であることを特徴とする請求項１記載のＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法。
【請求項３】
ａ．第１段階（前処理工程）
ＢＣＧ菌東京株を用いて培養液中にて８日間培養後、前記ＢＣＧ菌を集菌した残余の培養液（以下単に使用済み培養液と云う）を出発物質とし、この使用済み培養液を４０乃至４５℃に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を除去し、次いで分子量５０００以下の蛋白質及び培養液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を１／２００乃至１／３５０に濃縮し、
次いで、この濃縮液にＡＳを６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離により蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給する。
ｂ．カラム精製工程
第２段階
第１段階による蛋白質をフェニル・セファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径２５ｍｍ、容積８０ｍｌ）に装填し、ＡＳを含む１０ｍＭトリス塩酸（ＨＣｌ）緩衝液を、前記ＡＳ濃度を順に５００ｍＭのＡＳ含有のものから、全く含まないものまで段階的乃至連続的にＡＳ濃度を低めながら、全量で４５０乃至６００ｍｌ供給し、溶出液を順次１０ｍｌずつ分画する。
各分画より１０μｌずつサンプリングしたものにバイオ−ラッドプロテインアッセイ試薬５０μｌを混合し、吸光度を測定し、溶出パターンを求め、更に電気泳動により、目的の分子量の蛋白質が含まれる分画を選択し、この分画の溶出液を濃縮し、更に透析する。
第３段階
前記第２段階で濃縮した液を、３Ｍ尿素で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍｍ、容量７５ｍｌ）を用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に高めながら供給し、溶出速度を０．５ｍｌ／分として、溶出液を分画する。
次いで第２段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求めて、目的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質を濃縮・透析し、濃縮蛋白質液とする。
第４段階
前段階で得られた濃縮蛋白質液を１０％エチレングリコール（ＥＧ）及びＮａＣｌを含む５００ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ２００ＨＲカラムを用い、平衡化に用いたのと同じ緩衝液で溶出し、順次分画する。
次いで第３段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質を濃縮し、透析し濃縮蛋白質液とする。
第５段階
第４段階の濃縮蛋白質液を尿素を含まないＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）５００ｍｌで平衡化したものを用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）にＮａＣｌを５０ｍＭ乃至１００ｍＭまで連続的に濃度を上昇させた溶出液で溶出し、順次分画する。
次ぎに前段階と同様の方法により分画を選択し、濃縮及び透析し、目的の蛋白質を得る。
以上第１段階乃至第５段階よりなることを特徴とするＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液
より蛋白質を単離する方法。
【請求項４】
前記目的蛋白質はＭＰＢ６４であることを特徴とする請求項３記載の発明のＢＣＧ培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法。
【請求項５】
前記目的蛋白質はＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０であり、これらの内、２種以上の蛋白質を前記第２段階乃至第５段階において、同時間帯に並行して単離する方法であることを特徴とするＢＣＧ培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離することを特徴とする請求項３記載の発明のＢＣＧ培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はＢＣＧ菌培養液よりＢＣＧ菌が排出した蛋白質より有用な蛋白質を単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ＢＣＧ菌を５週間乃至１０週間の長期培養した少量の培養液より、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０を単離する方法は永井らによって、ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０、及びＤＥＡＥセファロースを用いて、単離する方法が１９８６年４月アメリカン・ソサイエティ・フォ・マイクロバイオロジィ発行、インフェクション・アンド・イムニテイ(American Society for Microbiology）、Vol.52,No.1  p293ー302に発表されている。
また遺伝子工学を用い前記のＭＰＢ６４蛋白質を製造する方法は、特開平１−２４７０９４号特許公開公報によって知られている。
【０００３】
然し乍ら、前者の方法は出発物質が長期培養の培養液であり、量も極めて少ない。また後者のものは、宿主にＭＰＢ６４遺伝子を組み込んで、宿主を培養した後、宿主よりＭＰＢ６４を取り出す方法であり、その操作は極めて煩瑣である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この発明はＢＣＧ菌を培養中に前記菌体が菌体外に排出する３００種類にも達する蛋白質の中より、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０などで代表される有用蛋白質を分離するための方法であり、大量のこれら蛋白質を能率よく単離する方法を市場に提供することであり、併せて、この単離した蛋白質を主剤とする遅延型過敏反応測定用試薬を市場に提供するためである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記の課題を達成するために、この方法発明はＢＣＧ菌培養後の培養液よりＢＣＧ菌を除した残余の培養液を性質の異なるカラムを用い、前記残余の培養液を装填し、緩衝液により溶出して、順次複数箇に分画し、この中より単離すべき蛋白質を含む分画を選択し、この分画液を濃縮した後透析するカラム精製方法を、異なる性質のカラムを用い異なる成分を含有する緩衝液により前記同様のカラム精製方法を少なくとも２回行い、目的の蛋白質を精製する方法において、
出発物質としては前記ＢＣＧ菌は東京株を用いて培養液中にて８日間培養後、前記ＢＣＧ菌を集菌した残余の培養液（以下単に使用済み培養液と云う）とし、前記カラム精製方法の前処理として、前記使用済み培養液を４０乃至４５℃に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を除去し、次いで分子量５０００以下の蛋白質及び培養液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を濃縮し、次いで、この濃縮液に硫酸アンモニウム（以下単にＡＳ）を６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離により前記全蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給することを特徴とするＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法とする。
【０００６】
前記の課題を達成するために、前記使用済み培養液より蛋白質を単離する方法の前記カラム精製方法の２番目の段階のカラム精製方法において、カラムとして、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで平衡化して、カラム精製方法の前処理後の蛋白質を供給し、前記と同一の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第に高めながら濃度の低い方から順に供給し、溶出速度を０．５ｍｌ／分として、数区分に分画し、目的蛋白質を含む分画を選択し、
次いで、選択された分画蛋白質を濃縮し、次いで透析する過程において前記尿素を分離する方法であることを特徴とすることが好ましい。
【０００７】
また前記の課題を達成するために、この方法発明は、
ａ．第１段階（前処理工程）
ＢＣＧ菌東京株を用いて培養液中にて８日間培養後、前記ＢＣＧ菌を集菌した残余の培養液（以下単に使用済み培養液と云う）を出発物質とし、この使用済み培養液を４０乃至４５℃に加温し、これを濾紙により、先ず残存ＢＣＧ東京菌を除去し、次いで分子量５０００以下の蛋白質及び培養液成分を濾別除去し、前記使用済み培養液を１／２００乃至１／３５０に濃縮し、
次いで、この濃縮液にＡＳを６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させ、遠心分離により蛋白質を分離し、この分離した蛋白質を次工程に供給する。
ｂ．カラム精製工程
【０００８】
第２段階
第１段階による蛋白質をフェニル・セファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径２５ｍｍ、容積８０ｍｌ）に装填し、ＡＳを含む１０ｍＭトリス塩酸（ＨＣｌ）緩衝液を、前記ＡＳ濃度を順に５００ｍＭのＡＳ含有のものから全く含まないものまで段階的乃至連続的に濃度を低めながら全量で４５０乃至６００ｍｌをＡＳ濃度の高い方から供給し、溶出液を順次１０ｍｌずつ分画する。
各分画より１０μｌずつサンプリングしたものにバイオ−ラッドプロテインアッセイ試薬５０μｌを混合し、吸光度を測定し、溶出パターンを求め、更に電気泳動により、目的の分子量の蛋白質が含まれる分画を選択し、この分画の溶出液を濃縮し、更に透析する。
【０００９】
第３段階
前記第２段階で濃縮した液を、３Ｍ尿素で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍｍ、容量７５ｍｌ）を用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に高めながら供給し、
溶出速度を０．５ｍｌ／分として、溶出液を分画する。
次いで第２段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質を濃縮し、濃縮蛋白質液とする。
【００１０】
第４段階
前段階で得られた濃縮蛋白質液を１０％エチレングリコール（ＥＧ）及びＮａＣｌを含む５００ｍｌの１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したセファクリルＳ２００ＨＲカラムを用い、平衡化に用いたのと同じ緩衝液で溶出し、順次分画する。
次いで第３段階と同様に吸光度を測定して溶出パターンを求め、目的の蛋白質を含む分画を選択し、次いで、選択された分画蛋白質を濃縮し、透析し濃縮蛋白質液とする。
【００１１】
第５段階
第４段階の濃縮蛋白質液を尿素を含まないＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）５００ｍｌで平衡化したものを用い、３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）にＮａＣｌを５０ｍＭ乃至１００ｍＭまで連続的に濃度を上昇させた溶出液で溶出し、順次分画する。
次に前段階と同様の方法により分画を選択し、濃縮及び透析し、目的の蛋白質を得る。
以上第１段階乃至第５段階よりなることを特徴とするＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法とする。
【００１２】
前記の課題を達成するために、前記ＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法の第１段階乃至第５段階の方法において、単離する前記目的蛋白質はＭＰＢ６４であることを特徴とする場合もある。
【００１３】
前記の課題を達成するために、前記ＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液より蛋白質を単離する方法の第１段階乃至第５段階の方法に於いて、単離する前記目的蛋白質はＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０であり、これらの内、少なくとも２種の蛋白質を前記第２段階乃至第５段階において、同時間帯に並行して単離する方法であることを特徴とする場合もある。
【００１４】
【発明の作用】
請求項１記載の方法発明に於いては、出発物質として、ＢＣＧ製剤を製造する時に産生されるＢＣＧ菌を培養した使用済みの培養液を用い、この中に前記ＢＣＧ菌より、その菌体外に排出された多種類の蛋白質中より目的の蛋白質を単離するに先立ち、この使用済み培養液を４０℃乃至４５℃に加温することによって、培養液の粘稠度が低下し、フィルターで濾過する場合に、流動性がよくなり、先ず残存するＢＣＧ菌が除かれ、次いで目的の蛋白質の分子量よりも小さい分子量の蛋白質及び培養液成分が短時間で濾過される作用がある。
【００１５】
請求項２記載の方法発明に於いては、請求項１記載の発明の作用のほか、カラム精製法の２番目において、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として、３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで平衡化して、カラム精製方法の前処理後の蛋白質を供給し、前記と同一の緩衝液にＮａＣｌを０乃至２００ｍＭ加えた緩衝液をＮａＣｌの含有濃度を連続的に次第に高めながら濃度の低い方から順に供給するから、蛋白質に結合もしくは取り込まれている不純物が尿素と結合して、除去される作用をなす。またこの段階の直後において、溶出液を透析することによって、前記尿素は溶出液から除去されて、単離した蛋白質を変化させたり、活性を弱める作用は殆ど起こさせない作用をなす。
【００１６】
請求項３記載の発明においては、前記請求項１及び２記載の発明の作用のほか、前述の第１段階乃至第５段階によって、使用済みの培養液より、目的とする蛋白質を純度高く少なくとも一種類、単離する作用をなす。
殊に第２段階に於いて、単離すべき蛋白質が２種以上あるときは、複数の分画をそれぞれ独立に選択し、その後の段階に於いては各分画毎に独立しての精製が可能となる作用をなす。
請求項４記載の発明においては、前記請求項３記載の作用のほか、目的蛋白質としてＭＰＢ６４を純度高く単離する作用をなす。
【００１７】
請求項５記載の発明においては、前記請求項３記載の作用のほか、目的蛋白質として、ＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０の内の少なくとも２種を第２段階に於いて、それぞれ独立して同時に分画され、その後それぞれの分画された蛋白質毎に同時平行して、それぞれ純度を高く単離する作用をなす。
【００１８】
【発明の実施の形態】
材料と方法
培養液：
ソートン（Sauton)合成培養液
使用菌：
日本ビーシージー製造株式会社製の種株たるマイコバクテリュウム・ボビスＢＣＧ東京（Mycobacterium  bovis  ＢＣＧ  Tokyo、以下単にＢＣＧ菌と云う)。
前記ＢＣＧ菌を、前記ソートン培地に移植し、通気しないで３７℃で表面培養した。８日目に培養した菌体をワクチン製造用として濾過により、集菌した後の使用済み培養液を集め、出発物質とした。
カラム：
ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ，セファクリルＳ２００ＨＲ，セファロースＣＬ−４Ｂ（スエーデン、ウプサラ、ファルマシアＬＫＢ社製）を用いた。
【００１９】
サンプル濃縮：
ミリポア・ペリコン・カセット・システム（Millipore  Pellicon  System）ＸＸ４２ＰＥＬ６０（米国，ＭＡ州，ベッドフォード，ミリポア社製)とアミコン(Amicon)ＹＭ−３メンブレン（membrane)(米国、ＭＡ州、アミコンInc.製)を用いた。
【００２０】
２次元電気泳動(以下単に２Ｄ−Ｅと云う)：
２Ｄ−Ｅとしてはミリポア・インベスティゲーター（Millipore  investigator)２−Ｄ電気泳動システムを用いた。
１次元目は５．５％塩基・酸基両性（アンフォライト）混合物を含む９．５Ｍ尿素を用いｐＩ３乃至１０の範囲，１８０００Ｖ/ｈｒで等電点電気泳動を行った。
２次元目は、１２．５％ポリアクリルアミド．ゲル（polyacrylamide  gel)を用い１６０００ｍＷでソディウム・ドデシル・サルフエート−ポリアクリルアミド・ゲル（Sodium  dodecyl  sulphate−polyacrylamide  gel)電気泳動(以下単にＳＤＳ−ＰＡＧＥと云う)を行った。
【００２１】
試薬:
ミリポア社製の２−Ｄ電気泳動システム用のものを使用した。ゲルは銀染色試薬(日本，東京，第一化学薬品株式会社製，)で染色した。分子量の測定は標準蛋白質(米国，ＣＡ州，リッチモンド，バイオラッド・ラボラトリー製)を用いた。
その他の試薬として、特に注意書きのない全ての試薬は和光純薬株式会社製のものを用いた。
【００２２】
実施の形態１
次ぎに請求項１乃至請求項５記載の方法発明を含む実施の形態を説明する。
第１段階（前処理）
先ず、前記出発物質たる使用済み培養液を８０乃至１００リッターを４０℃至４５℃に温めて、No.２の濾紙（日本，東京，東洋濾紙株式会社製）で濾過し、前記出発物質中に残存するＢＣＧ菌体を濾別し、続いて４０℃乃至４５℃状態のまま、ミリポア・ペリコン・カセット・装置に供給する。
このミリポア・ペリコン・カセットＰＬＣＣ００００５の装置のフィルターはグリセリンや他の培地成分のような分子量５０００以下の小さい分子を除くために用いる。
このようにして、最初の出発物質を３００乃至４００ｍｌに濃縮する。この濃縮は時間を節約するために数区分に分け複数箇の前記ミリポア・ペリコン・カセットＰＬＣＣ００００５を用いて行う場合もある。
【００２３】
前述の出発物質たる使用済み培養液は前述の通りの温度の範囲に加温されることにより、粘稠度が低下し、５０００以下の分子量の小さい分子のフィルターを通過するのを容易にし、通過時間を短縮するのに役立つ。
濃縮物は更にミリポア・メンブレン・ミリパック６０（０．２２μｍミリポアＣｏ．，製）で再び濾過し、完全にＢＣＧ菌体を除去する。
【００２４】
濃縮した培養濾液に硫酸アンモニウムを６０％飽和に加え、全蛋白質を沈殿させた。この沈殿物混合液をそのまゝ若しくは冷蔵庫で冷却保存した後、６０００ｒｐｍで遠心分離法により分離し、上清を除去する。
この濃縮物の２Ｄ−Ｅ（２次元電気泳動）を図１に示す。ＢＣＧ菌が分泌する蛋白質は等電点、及び分子量により多くの独立したスポットとして散らばっている。例えばＭＰＢ６４（２６ｋＤａ）を矢印で示す。
【００２５】
第２段階（フェニルセファロースによる蛋白質のアフィニティー[affinity]精製）
第１段階により得た全蛋白の沈殿物をフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムに装填する。
このカラムは硫酸アンモニウム（ＡＳ）濃度を５００ｍＭから全く含まないものまで順次５００ｍＭ  ＡＳ：１５０ｍｌ、２００ｍＭ  ＡＳ：５０ｍｌ、１００ｍＭ  ＡＳ：１５０ｍｌ、ＡＳ：なし１２０ｍｌ、と段階毎に減らした１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液を用い室温で溶出した。
【００２６】
而して、溶出液を１０ｍｌづつ分画する。各分画液より、１０μｌづつサンプルを採取し、これと５倍稀釈したバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）試薬（Protein Assay Bio-Rad）５０μｌを混合し、マイクロプレートリーダーで６００ｎｍの吸光度を測定する。その溶出パターンの例を図２に示す。
図２において、例えばＭＰＢ６４のピークは、既に発表されているので、ＭＰＢ６４を精製する場合、ＭＰＢ６４が含まれる分画の推定は、溶出パターン及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた分子量によるＭＰＢ６４の検出を行い、これらが含まれている分画を選択する。
第２段階においては、一つ以上の分画にわたり、目的の蛋白質があるときは、これら複数箇の分画を選択する。
【００２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの具体的な方法としては、グラジエントゲルとして１０乃至２０％ポリアクリルアミドゲルでマルチゲル・キット（日本，東京，第一化学薬品株式会社製）を用い４０ｍＡで、標準の蛋白質例えばＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０と一緒に銀染色試薬で蛋白質を染色して、標準の蛋白質と対応した蛋白質を含む分画を選択する。
目的の蛋白質例えばＭＰＢ６４を含む分画をアミコンＹＳ−３メンブレンを通して濃縮する。
【００２８】
濃縮物はスライド−Ａ−ライザー・カセット（米国，イリノイ州，ロックフォード，ピアス製）に入れ、ｐＨ７．５の１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で４℃で一昼夜透析する。
透析した原料はミリポア・ミレックスＧＶフィルター（０．２２μｍ）を通し、蛋白量はローリー法により定量した。
【００２９】
第３段階（尿素を含むＤＥＡＥ−セファロースカラムによる精製）  ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（直径１５ｍｍ、容積７５ｍｌ）を用い、これを３Ｍ尿素を含む３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｌで平衡化した。
第２段階からの濃縮物を前記ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムに供給し、前記平衡化に用いたのと同じ成分の緩衝液に濃度勾配をもったＮａＣｌ（０乃至２００ｍＭ）を加えて溶出する。
【００３０】
４℃で１分間に０．５ｍｌの溶出速度として、溶出液をそれぞれ５ｍｌの分画を４６乃至１００分画する。
この各分画を第２段階と同様の方法により、バイオラッド試薬を用い６００ｎｍの吸光度を測定する。その結果は図４に示す通りである。
また分画のサンプルは第２段階と同様ＳＤＳ−ＰＡＧＥで目的の蛋白質例えばＭＰＢ６４を検出し、これに対応する分画を選択し、第２段階と同様に濃縮、透析、及び濾過を行い、目的の濃縮物を得る。前述の透析の過程において、溶出時に添加した尿素成分は除去される。蛋白量も前記第３段階と同様の方法により定量する。
【００３１】
第４段階（セファクリルカラムによる精製）
セファクリルＳ２００ＨＲカラム（直径２５ｍｍ、容積４５０ｍｌ）を低温で１０％エチレングリコール及びＮａＣｌを含む５００ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化する。
第３段階で得た濃縮物を前記セファクリルＳ２００ＨＲカラムに供給し、前記平衡化に用いた同じ緩衝液で１分間に０．５ｍｌの溶出速度で溶出し、順次分画容器に５ｍｌずつ４６乃至１００に分画し、各分画からのサンプルを第２段階のバイオラッド試薬の代わりにＢＣＡ蛋白分析試薬（米国，イリノイ州，ロックフォード，ピアス社製）を用い、第３段階と同様の方法により、５６２ｎｍの吸光度測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥでによって、目的の蛋白質を検出し、此れに対応する分画を選択する（図４参照）。
【００３２】
このときのゲルの染色はＣＢＢで染色した後、より感度の高い銀染色することが好ましい。
目的の蛋白質を含む分画を集め、アミコンＹＭ−３メンブレンで濃縮し、４℃で１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で一昼夜透析する。更にこれを０．４５μｍのミリポアフィルターで濾過する。
回収した蛋白量はローリー法で評価する。
【００３３】
第５段階（尿素を含まないＤＥＡＥ−セファロースカラムによる精製）
精製の最終段階に於いては、尿素を含まない５０ｍＭのＮａＣｌを含む３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムに、段階４によって回収した蛋白質を供給し、４℃で５０乃至１００ｍＭの濃度勾配のＮａＣｌを含む５００ｍｌの３０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液で、１分間に０．５ｍｌの溶出速度で溶出し、順次５ｍｌずつ分４６乃至１００に画する（図５参照）。
【００３４】
目的の蛋白質の検出は第３段階と同様の方法で６００ｎｍの吸光度及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで行う。
前段階同様に目的の蛋白質を含む分画を集め、濃縮し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で透析し、ミリポアミレックス−ＧＶフィルター（０．２２μｍミリポアＣｏ．）で濾過する。
最終回収蛋白量はローリー法で測定する。
【００３５】
前述の実施の形態においては、主として、ＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０の単離に就いて説明したが、他の有用な蛋白質を同時に単離する方法も前記請求項１乃至請求項５の発明に含まれる。
これら数種の蛋白質を単離する場合は、第２段階で数種の蛋白質をそれぞれに分離した後の単離は各蛋白質毎に並行して、行なうことは勿論である。つまり、複数の蛋白質を同時並行的に精製することになる。
【００３６】
前記の第３段階及び第５段階において、溶出に使用する緩衝液の添加物の濃度は濃度勾配のあるものを説明したが４乃至１０段階に分けた段階的な添加物の濃度差のものを順次供給する方法もこの実施の形態に含まれる。
【００３７】
実施の形態２
実施の形態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの一種１５ｍｇに対し、リン酸緩衝液２ｍｌに溶解し、これに親水性軟膏０．５ｇ乃至１．５ｇ及びトラガカントゴム粉末少量（０．０２乃至０．０５ｇ）とを混合し、内径８ｍｍ乃至１１ｍｍの扁平容器に密封したもの。
前記の各成分、重量及び容量は一例であって限定的な意味はない。
【００３８】
実施の形態３
実施の形態１により精製されたＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの一種１５ｍｇに、リン酸緩衝液２ｍｌに溶解し、グリセリン１ｍｌ、及び／又はポリエチレングリコール１０％に混合し、皮膚に貼付してアレルギー反応をテストするパッチテスト（Patch・test）用絆創膏又はアルミニウム皿の中に濾紙が入れてある前記アルミニウム皿の中に、前記蛋白質を含浸した前記濾紙を皮膚に貼付して使用する所謂フインチャンバーに５乃至２０μｌ含浸させたものを、プラスチック容器又は気密性袋に密封したもの。
前記の蛋白質のうち、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０のそれぞれについて、前記と同様に密封したものを、キットにする場合もある。
【００３９】
【発明の効果】
請求項１記載の発明においては、ＢＣＧ菌培養後の使用済み培養液を出発物質としているから、ＢＣＧ菌を有効利用する場合は、産業廃棄物の有効利用であり、前記使用済み培養液を４０°乃至４５°に加温することによって、この使用済み培養液の粘稠が著しく低下するため、濾紙を通り易くなり、処理時間が短くなり、殊に使用済培養液に含まれる粘稠度の高いグリセロールが除去され、以後の取扱が容易になる。またこの程度の加温では蛋白質の力価の劣化を来さない。
【００４０】
請求項２記載の発明においては、ＤＥＡＥセフアロースＣＬ−６Ｂカラムを使用し、緩衝液として３Ｍ（モル）尿素を含む３０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で平衝化した後、同様の尿素を含む緩衝液にＮａＣｌを０から２００ｍＭまで濃度を次第に高めながら、濃度の低い方から順に供給して、目的の蛋白質を溶出することによって、蛋白質に結合若しくは取り囲まれている不純物が除去され、また、溶出中において、溶出液の中性を保持し、かつその直後の透析及び濾別により、前記尿素は精製蛋白質から除去され、蛋白質に尿素による非可逆的な変性をもたらす影響を最小限に抑制する。
【００４１】
請求項３記載の方法においては、前記請求項１及び請求項２記載の発明の効果の外、第２段階の方法を採用することにより、有用な蛋白質を一種又は二種以上の蛋白質に分画することができる。
更に、第３段階以降の方法により、それぞれの蛋白質の純度を向上させる効果を有する。
それぞれ単離された蛋白質は標準の蛋白質と比較して、同一のものと同定され純度も標準のものと同程度のものがそれぞれ得られる。
【００４２】
その他、前記に例示していないが、前記の使用済み培養液に含まれる他の防御抗原物質、ツベルクリン（tuberculn）、またミコバクテリア(mycobacteria)の共通抗原などを含む他のミコバクテリア抗原の精製にも適用し得る。
【００４３】
請求項４記載の発明においては、請求項１乃至請求項３の効果の外単離する蛋白質がＭＰＢ６４であるから、単離されたＭＰＢ６４は、他のＭＰＢ７０と組み合わせて、活動性結核の発病及びＢＣＧ陽性を区別して判断し得ることができる。
【００４４】
請求項５記載の発明においては、請求項１乃至請求項４記載の効果の外単離する蛋白質がＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの２種以上の蛋白質を第２段階乃至第５段階の方法により同時間帯に並行して行なう方法であるから、単一の出発物質から有効に２種以上の蛋白質を効率よく、それぞれ単離できる効果を有する。
【００４５】
前述の通りの構成、即ち、請求項５の方法で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの一種をリン酸緩衝液に溶解して、密封してある遅延型過敏反応測定用試薬においてはこの試薬を濾紙などに垂らして、絆創膏で検体の皮膚に貼付たり、前記試薬を皮内注射してその反応を調べることができる。
【００４６】
請求項５の方法で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの一種とリン酸緩衝液及び親水性軟膏剤とが混合して容器に密封しておくと、これを開封し、直ちに検体の皮膚に塗布することによって、その反応を調べることができる。
【００４７】
前述の通りの構成、即ち、請求項５の方法で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの一種１５ｍｇに対し、リン酸緩衝液２ｍｌの割合で溶解し、親水性軟膏剤１ｇ及びトラガカントゴム粉末０．０４ｇの割合で混合したものがパッチテスト用絆創膏に含浸させておくと、直ちに検体の皮膚に貼付ることによって、その反応を調べることができ、簡単に反応を調べることができる。
【００４８】
請求項５の方法で単離したＭＰＢ５９、ＭＰＢ６４、ＭＰＢ７０及びＭＰＢ８０のうちの一種を含浸させた濾紙をプラスチック容器、気密性袋の内の一種の容器に密封しておくと、これを開封し直ちに検体の皮膚に貼付ることによって、その反応を調べることができる。
【００４９】
単離したＭＰＢ６４とＭＰＢ７０を別々の試薬とし、それぞれ密封しておき、これら二種の試薬の組合せよりなる試薬であるから、これらを組み合わせて使用することによって、活動性結核または菌感染の有無が診断できる。
【００５０】
実験例１
実施の形態１の方法により、８日間ＢＣＧ菌を培養した直後の培養液１００リッターを用い、ＭＰＢ６４を単離した場合最終の第５段階において、単離したＭＰＢ６４を５ｍｇ得た。
而して、得られたＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＭＰＢ６４及び抗ＭＰＢ７０抗体を用いたイムノブロッテイング法で試験したところ、それぞれ標準ＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０と同じ反応を示した。
【００５１】
実験例２
また、実施の態様１によりＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０とをそれぞれ単離し、この二種の蛋白質を組み合わせて、それぞれ結核菌に感染させ発病させたモルモット及びＢＣＧ菌を接種したモルモットを用意して実験したところ、ＢＣＧ接種によりツベルクリン陽転したモルモットはＭＰＢ６４及びＭＰＢ７０に対して陽性の反応を示し、活動性結核であるものはＭＰＢ６４に対しては陽性であるが、ＭＰＢ７０に対しては陰性であった。
以上の結果から活動性結核かBCG陽転かが容易に判別できた。
実験例３
MPB５９はツベルクリン反応と同様の効果があり、MPB８０に付いては、これを含むアレルギーがあるか否かの判断に有効に使用し得るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】２Ｄ−Ｅ（２次元電気永動）による各種蛋白質の等電点、分子量の分布図である。
【図２】第２段階における各分画の蛋白量による吸光度分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を示すグラフ。
【図３】第３段階における各分画の蛋白量による吸光度分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を示すグラフ。
【図４】第４段階における各分画の蛋白量による吸光度分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を示すグラフ。
【図５】第５段階における各分画の蛋白量による吸光度分布及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された採取分画を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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