(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）多糖K5若しくはヘパラン硫酸のＮ−脱アセチル化、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸のＯ−脱硫酸化を行う段階と、
ｂ）段階ａ）から得られた生成物をＮ−硫酸化する段階と、
ｃ）C5エピメラーゼ酵素の存在下、１回以上のエピマー化処理を行う段階と、
ｄ）少なくとも幾つかの遊離水酸基を硫酸化する段階と
から成る、大腸菌からの多糖K5から、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸から出発して、ウロン酸全含有量に基づき50％よりも大きい含有量のＬ−イズロン酸を有する多糖類を調製する方法であって、
前記エピマー化段階は、HEPES、塩化カリウム及びEDTAによって構成されるpH7.4の伝統的緩衝液から成る反応媒体であって、その反応媒体へ、前記緩衝液の粘度を1.1〜3mm2/秒（1.1〜３センチストーク）の範囲の値へ増加させるのに適した量の１種以上の添加剤及びTRITON  Ｘ−100が添加された反応媒体の中で行い、しかも、前記１種以上の添加剤は、エチレングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及びホスファチジルコリンから成る群から選ぶことを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
添加剤は、15,000〜90,000の分子量を有するポリビニルピロリドンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
添加剤を、緩衝液25mlにつき0.5〜60mlの量で緩衝液へ添加する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
出発化合物を、反応媒体中に100ml当り５〜1000mgの量で溶解させる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
C5エピメラーゼを、反応媒体中に100ml当り21〜2000μｇの量で溶解させる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
エピマー化のための混合物は、C5エピメラーゼを、その混合物100ml当り1.5〜15,000μｇの量で含有する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
エピマー化反応は、恒温室中、30〜40℃の範囲の温度で行う、請求項１記載の方法。
【請求項８】
出発生成物は、25％〜100％Ｎ−硫酸化する、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
従来技術
グリコサミノグリカンは、例えば、腸粘膜、肺等、種々の起源（origin）を有する動物組織を抽出することによって得られる物質であり、詳しくは、イズロン酸を含有する多糖類に属する。ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸は、多糖類群に属する。
種々のグリコサミノグリカンは、種々の化学構造を有し、ウロン酸及びヘキソサミンの繰り返しによって構成される多糖類鎖によって形成される。特に、ヘパリン及びヘパラン硫酸の場合、ウロン酸はグルクロン酸又はイズロン酸によって形成され、ヘキソサミンの場合はグリコサミンによって形成される。
グリコサミンは、選択的にＮ−アセチル化され（ヘパラン硫酸）又は選択的にＮ−硫酸化され（ヘパリン）、かつ６−Ｏ硫酸化される。更に、硫酸基はグリコサミンの３の位置にも見いだすことができる。ウロン酸は２−Ｏ硫酸化される。
ヘパリンは、抗凝固薬（anticoagulant）及び抗血栓症薬（antithrombotic）として臨床実務において非常に重要である。
かかる治療上の用途の他に、他の幾つかの病理におけるヘパリン及びヘパラン硫酸の有用な利用、例えば、抗高脂血症機能、抗増殖機能、抗ウィルス機能、抗腫瘍機能及び抗血管形成機能に関する利用が期待される。
これらの新規な治療応用において、ヘパリン及びヘパラン硫酸を利用するためには、抽出法とは異なる方法、特に、異なる構造の調製を認めた一層柔軟性のある方法によって、これらの生成物又は同等の生成物を入手する必要がある。
また、動物組織からの抽出方法では、ウィールスを含んでいない生成物を入手することが保証されない。
抗凝固薬のグリコサミノグリカンの、生合成による製法は、特許出願WO  92/17507号明細書に記載されている。この方法では、次の反応シーケンス
−  Ｎ−脱アセチル化、
−  Ｎ−硫酸化、
−  Ｄ−グルクロン酸の少なくとも幾らかの残渣をＬ−イズロン酸の残渣に転化するためのエピマー化、及び
−  少なくとも幾らかの遊離水酸基の硫酸化
を受ける、大腸菌からの多糖類K5は、出発化合物として使用する。
この方法で重要な段階は、最大20％まで制限されるエピマー化によって構成される。このエピマー化は、HEPES、塩化カリウム、EDTA及びTRITON  Ｘ−100によって構成されるpH7.4までの伝統的反応媒体中の、Ｄ−グルクロニル−Ｌ−イズロニル−C5−エピメラーゼ酵素の存在下、室温で２日間行う。ウロン酸の３分の１まで制限されるエピマー化は、従来説明されてきた（M.フック（Hook）等：ザ・ジェイ・オブ・バイオケミ（The J.of Biol.Chem.）,249,12  3908〜3915,1974年６月25日）。しかも、このエピマー化度は、今まで克服できていないように思える。更に、この資料では、細胞雰囲気におけるエピマー化は、生合成方法に関するあらゆる要因が存在する条件での、ネズミの肥満細胞腫について記載されていることを考慮する必要がある。
しかし、既知の技術から得られるようなエピマー化度は、種々の治療処理のために要求される諸特性を有する生成物を得ることを可能にしない。
実際、イズロン酸はグルクロン酸に関する生成物に優れた適応性（flexibility,柔軟性）を与える［カズ（Casu）B.,ペチト（Petitou）M.,プロファゾリ（Provasoli）M.及びジネイ（Sinay）P.（1988），「配座適応性（Conformational flexibility）：イズロン酸含有グリコサミノグリカンの結合特性及び生物特性を説明するための新しい概念」，トレンド・バイオケミ科学（Trends Biochem.Sci.13,221〜225）。ヘパラン硫酸に比べてヘパリンの一層大きい抗凝固性と抗血栓症活性と、基礎線維母細胞成長要因（basic fibroblast growth factor）（bFGF）に関するものの他の活性とによって指摘されている通り、イズロン酸を高い率で含有する生成物は、グルクロン酸を含有するものと比べ一層活性であるという結果となり、しかも、イズロン酸は、活性点の極めて重要な部分であることが認識されている［マッカラナ（Maccarana）M.,カズ（Casu）B.及びリンダール（Lindahl）U.（1993），「基礎線維母細胞成長要因の結合のために必要なヘパリン／ヘパラン硫酸の最小シーケンス（Minimal sequence in Heparin/Heparan Sulfate Required for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor）」,J.バイオケミ（Biol.chem.）,268,23898〜23905］。
従って、工業的観点に従って受け入れられる収率と時間とを満たす、高いエピマー化度を有する生成物を得ることを可能にする方法を見いだす課題が存在する。
概要
ａ）多糖K5若しくはヘパラン硫酸のＮ−脱アセチル化、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸のＯ−脱硫酸化を行う段階と、
ｂ）段階ａ）から得られた生成物をＮ−硫酸化する段階と、
ｃ）Ｄ−グルクロニル−Ｌ−イズロニル−C5−エピメラーゼ酵素の存在下、１回以上のエピマー化処理を行う段階と、
ｄ）少なくとも幾つかの遊離水酸基を硫酸化する段階と
から成る方法であって、前記エピマー化段階は、HEPES、塩化カリウム及びEDTAによって形成されるpH7.4の伝統的緩衝液から成る反応媒体であって、その反応媒体へ、エチレングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及びホスファチジルコリンから成る群から選ばれた１種以上の添加剤及びTRITON  Ｘ−100が添加された反応媒体の中で行うことを特徴とする方法によって、大腸菌からの多糖K5から、又はヘパリン若しくはヘパラン硫酸から出発して、大きい含有量のイズロン酸を有する多糖類が得られることを、我々は見いだした。
本発明の方法によって、ウロン酸全含有量に基づき50％よりも大きい含有量のイズロン酸を有する多糖類が得られる。
発明の詳細な説明
本発明の方法と得られた多糖類との特徴及び利点は、次の詳細な説明の中にほとんど示される。
マンゾニ（Manzoni）M.,ベルゴミ（Bergomi）S.,カバゾニ（Cavazzoni）V.［ジャーナル・オブ・バイオアクティブ・アンド・コンパティブル・ポリマーズ（Journal of Bioactive and Compatible Polymers），第VIII巻,1993年７月,251〜257］に説明されている、大腸菌からの多糖K5は、本発明の方法のための出発物質として使用するのに特に適した物質である。
ヘパリン及びヘパラン硫酸は、プロセスの第１段階の操作条件の幾らかの変動はあるが、出発物質として使用することもできる。
出発物質は、2,000〜50,000以上の範囲に及ぶ分子量を持っていてもよい。
多糖K5を使用するとき、その構造は先ずＮ−脱アセチル化によって変性される。Ｎ−脱アセチル化は、ヒドラジンと硫酸ヒドラジンとの混合物で処理することによって、又は水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの塩基雰囲気中で処理することによって行う。
そこで、Ｎ−硫酸化は、トリエチルアミン−三酸化イオウ又はトリメチルアミン−三酸化イオウで処理することによって続けられる。種々に（例えば25％から100％まで）Ｎ−硫酸化された生成物は、かかる操作によって得ることができる。
Ｎ−脱アセチル化及びＮ−硫酸化は、既知の技術に従って、例えば、特許出願番号WO  92/17507明細書に従って行う。
ヘパリンを出発物質として使用するとき、先ずＯ−脱硫酸化を、次いで、Ｏ−脱硫酸化の間に硫酸基を失ったアミノ位置を再度硫酸化すべくＮ−硫酸化を行う。
ヘパラン硫酸を出発物質として使用するとき、Ｎ−脱アセチル化もＯ−脱硫酸化も結果としてのＮ−再硫酸化も行う。
上記の通り、多糖K5から又はヘパラン硫酸から得たＮ−硫酸化済み生成物は、グルクロン酸をイズロン酸に転化すべくエピマー化プロセスにかける。一方、ヘパリンから得た生成物は、イズロン酸からグルクロン酸を得るべく酵素で処理する。
エピマー化は、ウシの肝臓から抽出し、「J.B.C.255,3878〜3883（1980）」でA.マルムストレン（Malmstron）によって記載された方法を用いて精製したＤ−グルクロニル−Ｌ−イズロニル−C5−エピメラーゼ酵素（以下、単に、C5エピメラーゼという）の存在下で行う。
驚愕すべきことに、出願人は、伝統的反応媒体を適切な添加剤で変性することによって、非常に高度のエピマー化を得た。
本発明による反応媒体は、HEPES、塩化カリウム、EDTA及びTRITON  Ｘ−100によって構成されるpH7.4の緩衝液であり、エチレングリコール、グリセロール、ポリビニルピロリドン、特に15,000〜90,000の分子量を有するポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール及びホスファチジルコリンから成る群から選ばれた１種以上の添加剤を、緩衝液の粘度を1.1〜3mm2/s（１〜３センチストークス）の範囲の値に増加させるのに適した量で添加する。
特に、反応媒体は、pH7.4を有する次の緩衝液:HEPES0.04M、KCl0.4M、EDTA0.06Mから出発し、次いで、この緩衝液の25mlへ100〜1000μｌのTRITON  Ｘ−100と、0.5ml〜60mlの添加剤と、蒸留水を100mlになるまで添加して調製する。
エピマー化するための多糖は、５〜1000mgの量の前記反応媒体へ添加し、溶液Ａを得る。
C5エピメラーゼは、別個に、100ml当り21〜2000μｇの量の、前記と同じ反応媒体に溶解し、溶液Ｂを得る。
溶液Ｂは、混合物100ml当りC5エピメラーゼ1.5〜15.000μｇの含有量を得るような割合で溶液Ａへ添加し、エピマー化を行う。混合物は、撹拌を行って均一にし、次いで、恒温室中で30〜40℃の範囲の温度で90分〜15時間の範囲の時間の間加温する。
反応は、混合物を100℃で５分間加温して停止させる。生成物は、緩衝液として（NH4）HCO30.05Mを使用したDEAE−セファセル（Sephacel）カラムを通して精製し、生成物は（NH4）HCO32Mの緩衝液を用いて溶出する。
集めた画分はセファデックス（Sephadex）Ｇ−15カラムによって脱塩し、生成物を含有する画分は減圧下で凍結乾燥し、次いで、生成物は1H−NMRで分析する。
Ｄ−グルクロン酸とＬ−イズロン酸の含有量は、1H−NMRスペクトルによって計算する。得られた生成物は、溶液Ａに再溶解し、溶液Ｂで再処理し、更にエピマー化処理を行って、Ｌ−イズロン酸の含有量を増加させる。
抗凝固性と抗血栓症活性度を評価すべく、エピマー化済み生成物は、抗酸化剤としてピリジン−三酸化イオウを使用し、例えば、「第XIV回国際炭水化物シンポジウム（the XIV International Carbohydrate Symposium）（1988年８月14〜19日），ストックホルム」のアブストラクトでオガモ（Ogamo）等が説明した方法を用いてＯ−硫酸化を行う。本発明の方法によって得られた、例１、３、４、５、６、７及び９の生成物は、後で説明する通り、Ｏ−硫酸化を行い、優れた抗凝固性と抗血栓症活性度を示した。一方、既知の技術によって得られた、例２及び８の生成物は、非常に小さい活性度を示した。
得られた結果は、本発明による生成物は、抗凝固性と抗血栓症機能とによる臨床用途に適した特性を有する。従って、この生成物は、補助薬（adjuvant）物質及び添加剤（excipient）物質と混合した適切な薬剤組成物を調製するために使用し得る。
本発明による方法を説明すべく、次の例を公表する。
例１
HEPES0.04M、EDTA0.06M、KCl0.4Mを含有するpH7.4の緩衝液を調製し、TRITON  Ｘ−100  27μｌと、10％ポリビニルピロリドンK15水溶液9mlと、エチレングリコール1.62mlと全体積が18mlになるまでの水とを前記緩衝液4.5mlへ添加した。
この溶液は、1.41mm2/S（1.41センチストークス）の粘度を示した。この溶液に、100％Ｎ−脱アセチル化Ｎ−硫酸化済みK5の1mgを溶解し、溶液Ａを得た。
10％ポリビニルピロリドンK15の水溶液1.6mlと、エチレングリコール288μｌと、全体積が3.2mlになるまでの水とを、8.9μｇのC5エピメラーゼを含有したpH7.4の同一出発緩衝液0.8mlへ添加し、溶液Ｂを得た。
溶液Ａを1.6mlの溶液Ｂと混合し、その混合物を温室中37℃で４時間保持した。４時間後、溶液B1.6mlを添加し、次いで、その反応は一夜37℃に保持した。その反応は、100℃で５分間加熱することによって停止した。
生成物は、緩衝液として0.05M（NH4）HCO3を使用しながら、DEAE−セファセル・カラム（Sephacel column）（２×1.5cm）によって精製し、得られた生成物は、2M（NH4）HCO3を用いて溶出した。
生成物を含有する分画は、セファデックス（Sephadex）Ｇ−15カラム（0.3×5cm）で脱塩し、凍結乾燥した。
生成物は、1H−NMRで分析し、そのスペクトルを図１に示す。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、55であった。
例２（比較）
ポリビニルピロリドン及びエチレングリコールを添加しないという相違を持って、例１を繰り返した。使用した緩衝液は、水にほぼ等しい粘度、即ち約ゼロの粘度を有した。
得られた生成物に関する1H−NMRスペクトルは図２に示す。イズロン酸とグルクロン酸との総量に基づくＬ−イズロン酸の含有量は、18％に等しいことが分かった。
例３
Ｎ−脱アセチル化し50％Ｎ−硫酸化した多糖K5を出発物質として使用したという相違を持って、例１を繰り返した。
得られた生成物は1H−NMRで分析し、関連スペクトルを図３に示す。
Ｌ−イズロン酸の含有量は、Ｎ−硫酸化済みグリコサミンへの局部的な全ウロン酸に基づき51％に等しいことが分かった。
例４
EDTA0.06Mと、KCl0.4M（pH7.4）と、TRITON  Ｘ−100  30μｌと、10％ポリビニルピロリドンK15の水溶液10.6mlと、エチレングリコール0.85mlと、水4.42mlとを、HEPES0.04Mを含有する緩衝液5.3mlへ添加した。
この溶液は、1.2mm2/s（1.2センチストークス）の粘度を示した。
この溶液の9mlに、100％Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたK5の2mgを溶解し、溶液Ａを得た。
C5エピメラーゼ1.7μｇを同溶液の8mlに溶解し、溶液Ｂを得た。
生成物は、例１に記載の通りに精製した。
凍結乾燥した後、精製済み生成物は、溶液Ａの1mlに溶解し、次いでC5エピメラーゼ8.9μｇを含有する溶液Ｂの3.2mlと混合した。
この混合物は、一夜37℃に保持し、酵素は100℃で５分間加熱することによって不活性化した。生成物は、例１に記載の通りに精製し、図４に示す通り、1H−NMRで分析した。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、53であった。
例５
HEPES0.04M、EDTA0.06M、KCl0.4Mを含有するpH7.4の緩衝液を調製し、次いで、TRITON  Ｘ−100  22.8μｌと、100％Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたK5の1mgと、エチレングリコール40％を含有する、20％ポリビニルピロリドンK15の溶液4mlと、全体積が8mlになるまでの水とを、この溶液2mlへ添加した。HEPES0.01M、EDTA0.015M、KCl0.01M、TRITON  Ｘ−100  0.015％及びC5エピメラーゼ134.4μｇをこの溶液の6mlに添加した。
得られた溶液は、1.36mm2/s（1.36センチストークス）の粘度を示した。
この混合物は、37℃に１時間保持した。反応は100℃で５分間煮沸することによって停止した。
生成物は、例１に記載の通りに精製した。
凍結乾燥した後、生成物は、HEPES0.04M、EDTA0.06M及びKCl0.4Mの6.25mlを含有するpH7.4の緩衝液と、ポリビニルピロリドンK15  2.5gと、エチレングリコール2.5mlと、TRITON  Ｘ−100  71.2μｌと、全体積が25mlになるまでの水との中に溶解した。
HEPES0.01M、EDTA0.015M及びKCl0.1MのpH7.4の12ml（TRITON  Ｘ−100  0.015％を含有する）に溶解したC5エピメラーゼ1.9μｇを、得られた混合物12mlへ添加した。
混合物は、1.4mm2/s（1.4センチストークス）の粘度を示した。
この反応は、一夜37℃に保持した。反応の終りに、溶液を100℃で５分間加熱することによって酵素を不活性化した。生成物は、例１に記載の通りに精製し、1H−NMRスペクトルをとった（図５）。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、52であった。
例６
例５を繰り返した。但し、第一段階の反応は37℃で４時間保持した。
例１と同じ条件で精製し、凍結乾燥した後、生成物を水1mlに溶解し、次いで、HEPES0.04M、EDTA0.06M及びKCl0.4MのpH7.4の50mlを含有する緩衝液と、TRITON  Ｘ−100の283.5μｌと、10％ポリビニルピロリドンK15の100mlと、エチレングリコール20mlと、90％グリセロール2mlと、C5エピメラーゼ1.9μｇと、全体積が200mlになるまでの水とへ添加した。混合物は、1.41mm2/s（1.41センチストークス）の粘度を示した。
反応は37℃で４時間保持し、酵素は100℃、５分間で不活性化した。
生成物は、例１に記載の通りに精製し、1H−NMRスペクトルをとった（図６）。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、55であった。
例７
100％Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたK5の1.5mgを、HEPES0.04M、EDTA0.06M、KCl0.4MのpH7.4の7mlを含有する緩衝液と、TRITON  Ｘ−100の210μｌと、ポリビニルピロリドンK15の1.4gと、エチレングリコール2.8mlと、C5エピメラーゼ1.5mgと、全体積が28mlになるまでの水との中へ添加した。
溶液は、1.36mm2/s（1.36センチストークス）の粘度を示した。
反応は37℃で４時間保持し、酵素は100℃、５分間で不活性化した。
生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで凍結乾燥した。次いで、生成物は、C5エピメラーゼ1.3mgを含有する同じ溶液の24mlに溶解し、反応は37℃で４時間保持し、酵素は100℃、５分間で不活性化した。
生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで凍結乾燥した。次いで、生成物は、C5エピメラーゼ1mgを含有する同じ溶液の8.4mlに溶解し、反応は37℃で４時間保持した。
生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで1H−NMRスペクトルをとった（図７）。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、80であった。
例８（比較）
100％Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたK5の1mgを、HEPES0.04M、EDTA0.06M、KCl0.4MのpH7.4の3mlを含有する緩衝液と、TRITON  Ｘ−100の18μｌと、アセトン1.2mlと、C5エピメラーゼ1.9μｇと、全体積が12mlになるまでの水との中で溶解した。
溶液は、0.09mm2/s（0.09センチストーク）の粘度を示した。
反応は37℃で４時間保持した。
生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで1H−NMRスペクトルをとった（図８）。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、０であった。
例９
100％Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化されたK5の1mgを、HEPES0.04M、EDTA0.06M、KCl0.4MのpH7.4の2mlを含有する緩衝液と、TRITON  Ｘ−100の12μｌと、2.4％ポリビニルピロリドンK90の1.336mlと、C5エピメラーゼ304μｇと、全体積が8mlになるまでの水との中で溶解した。
溶液は、1.29mm2/s（1.29センチストークス）の粘度を示した。
反応は37℃で４時間保持し、酵素は100℃、５分間で不活性化し、次いで、溶液は、0.22μｍデバイスで濾過した。
C5エピメラーゼ304μｇを含有する同じ混合物8mlを、前記濾過済み溶液へ添加し、反応は37℃で４時間保持し、酵素は100℃、５分間で不活性化し、次いで、その溶液は0.22μｍデバイスで濾過した。
C5エピメラーゼ304μｇを含有する同じ混合物8mlを、この溶液へ添加し、反応は37℃で４時間保持し、酵素は100℃、５分間で不活性化し、次いで、その溶液は0.22μｍデバイスで濾過した。
生成物は、例１に記載の通りに精製し、次いで1H−NMRスペクトルをとった（図９）。
全ウロン酸で割ったＬ−イズロン酸の百分率は、59であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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