(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAポリメラーゼを含有する反応混合液において生じるDNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する方法であって、以下の式の化合物を該反応混合液に添加する工程を包含し：
0003616394.tif 000008
ここで：
R1、R2、およびR3は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であることはなく；そして
Ｘは以下からなる群より選択される部分であり：
0003616394.tif 000009
ここで、Ｘが（ｂ）であるとき：
R4はメチルおよび水素からなる群より選択され、そしてR1と結合した場合、ピロリジン環を形成し；
R5は、−CO2Hおよび−SO3Hからなる群より選択され；そして
ｎは０〜２の整数であり；
但しR1およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはなく；そしてここで該化合物がDNAポリメラーゼの停止の発生率を減少するに効果的な量で添加される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここでR1、R2、およびR3が、同じまたは異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であることはなく、そしてR1およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはない、方法。
【請求項３】
Ｘが−CH2CO2Hである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
R1、R2、およびR3がメチルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
R1、R2がメチルであり、そしてR3が水素である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
R1がメチルであり、そしてR2およびR3が水素である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｘが＝Ｏである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
R1、R2、およびR3がメチルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
R1およびR4がピロリジン環を形成し、R2およびR3がメチルであり、ｎが０であり、そしてR5が−CO2Hである、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
R1、R2、およびR3がメチルであり、そしてＸが−CH2SO3Hである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応混合液が、DNA配列決定の鎖終止法のための反応混合液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記DNA配列決定の鎖終止法が、ジデオキシDNA配列決定法である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記反応混合液がPCR反応混合液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応混合液が未精製のDNAを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記未精製のDNAが粗細胞溶解物である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ＤNA配列決定の鎖終止法において、DNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する方法であって、
ａ）水性溶液中で、DNA分子；該DNA分子を鋳型として使用することにより該DNA分子の部分に相補的な核酸を生成し得るDNAポリメラーゼ；デオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合物；鎖伸長インヒビター；および以下の式の化合物を組み合わせて、反応混合液を形成する工程：
0003616394.tif 000010
ここで：
R1、R2、およびR3は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であることはなく；そして
Ｘは以下からなる群より選択される部分であり：
0003616394.tif 000011
ここで、Ｘが（ｂ）であるとき：
R4はメチルおよび水素からなる群より選択され、そしてR1と結合した場合、ピロリジン環を形成し；
R5は、−CO2Hおよび−SO3Hからなる群より選択され；そして
ｎは０〜２の整数であり；
但しR1およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはなく、そしてここで該化合物は停止の発生率を減少するに効果的な量で添加される；および
ｂ）該反応混合液をインキュベートして、該DNA分子を鋳型として使用することにより該DNAポリメラーゼに多様な長さの核酸フラグメントを形成させる工程であって、ここで該核酸フラグメントは該DNA分子に相補的である、工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記鎖伸長インヒビターが2',3'−ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
請求項16に記載の方法であって、ここでR1、R2、およびR3が、同じまたは異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であることはなく、そしてR1、およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはない、方法。
【請求項１９】
Ｘが−CH2CO2Hである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
R1、R2、およびR3がメチルである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
Ｘが＝Ｏである、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
R1、R2、およびR3がメチルである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
R1およびR4がピロリジン環を形成し、R2およびR3がメチルであり、ｎが０であり、そしてR5が−CO2Hである、請求項18に記載の方法。
【請求項２４】
R2、R2、およびR3がメチルであり、そしてＸが−CH2SO3Hである、請求項18に記載の方法。
【請求項２５】
前記DNA分子が未精製のDNAである、請求項16に記載の方法。
【請求項２６】
請求項16に記載の方法であって、工程ａ）が前記DNA分子の第二の部分に相補的であるプライマーの添加をさらに包含し、DNA分子の該第二の部分がDNA分子の前記第一の部分の下流に位置し、ここで前記DNAポリメラーゼが該プライマーの3'末端を伸長し得、DNA分子の該第一の部分に相補的な核酸を生成する、方法。
【請求項２７】
DNA配列決定の鎖終止法によってDNAを配列決定するためのキットであって、１またはそれより多くのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有する容器、鎖伸長インヒビターを含有する容器、およびある量の以下の式の組成物を含有し：
0003616394.tif 000012
ここで：
R1、R2、およびR3は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であるということはなく；そして
Ｘは以下からなる群より選択される部分であり：
0003616394.tif 000013
ここで、Ｘが（ｂ）であるとき：
R4はメチルおよび水素からなる群より選択され、そしてR1と結合した場合、ピロリジン環を形成し；
R5は、−CO2Hおよび−SO3Hからなる群より選択され；そして
ｎは０〜２の整数であり；
但しR1およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはない、キット。
【請求項２８】
請求項27に記載のキットであって、ここでR1、R2、およびR3が、同じまたは異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であることはなく、そしてR1とR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはない、キット。
【請求項２９】
Ｘが−CH2CO2Hである、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
R1、R2、およびR3がメチルである、請求項29に記載のキット。
【請求項３１】
Ｘが＝Ｏである、請求項28に記載のキット。
【請求項３２】
R1、R2、およびR3がメチルである、請求項31に記載のキット。
【請求項３３】
R1およびR4がピロリジン環を形成し、R2およびR3がメチルであり、ｎが０であり、そしてR5が−CO2Hである、請求項28に記載のキット。
【請求項３４】
R1、R2、およびR3がメチルであり、そしてＸが−CH2SO3Hである、請求項28に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
本願発明は、国立衛生研究所（NIH）によって承認されたGrant（契約）番号GM12010のもとで、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の背景
本願発明は、主にDNA配列決定の方法における改良に関する。特に、本発明は主に、DNA配列決定の鎖終止法（chain termination method）において、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド、およびジメチルグリシンなどの窒素含有有機化合物を添加することによる、停止（stop）または休止（pause）の除去に関する。本発明はまた、これらの化合物を含有するDNA配列決定キットを提供する。本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などのDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順における改良を提供する。
効率的なDNA配列決定技術は、バイオテクノロジー産業の発達および基礎的な生物学的研究のために非常に重要である。DNA配列決定の効率および正確さの両方における改良が、DNA配列情報の要求に歩調を合わせるために必要とされている。例えば、ヒトゲノムプロジェクトは、DNA配列決定技術の効率、費用効果、および処理量の劇的な増加を目標としてきた。（Collins,F.,およびGalas,D.（1993）Science 262:43−46を参照のこと。）
今日、大部分のDNA配列決定は、DNA配列決定の鎖終止法によって行われる。最も一般的な鎖終止法は、Sangerのジデオキシヌクレオチドが介在する鎖終止法（Sangerら（1977）Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 74:5463−5467を参照のこと）の改変方法である。数千の研究室がこの技術を使用しており、ヒトゲノムプロジェクトのために自動化された配列決定を行っている研究所も含まれる。このDNA配列決定法に必要な試薬を含む市販のキットが入手可能であり、そして広く使用されている。
日常的に使用されてはいるが、Sangerの（ジデオキシ）配列決定技術は、問題および限界を有している。この方法の主な問題の１つは、DNA配列の決定を妨害するDNAポリメラーゼの停止または休止の発生率である。停止はGCリッチなDNAの領域、またはプライマーから特に離れた領域において主に問題である。さらに、停止は不純なDNA調製液においてより頻繁に生じる。このため、DNAがジデオキシ法によって配列決定され得る前に、DNA精製が一般的に必要とされる。
種々の方法が、ジデオキシ配列決定において停止を除去するために提案されてきた。例えば、研究者達は、反応温度を変えたり、種々のDNAポリメラーゼを使用したり、DNAポリメラーゼを安定化したり、およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで早めに停止したDNA分子を伸長したりして試みてきた（T.W.FawcetteおよびS.G.Bartlett（1990）BioTechniques 9:46−48;D.Pisa−WilliamsonおよびC.W.Fuller（1992）United States Biochemical Corp.Comments 19:29−36;J.Sambrook,E.F.FritschおよびT.Maniatis,編（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;およびF.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.SmithおよびK.Struhl,編（1989）Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley−Interscientific,John Wiley and Sons,New Yorkを参照のこと）。しかし、確かな方法は１つもない。DNA配列決定における停止の問題を除去することが依然として必要とされ、それゆえに、この重要なプロセスの効率および費用効果を改良することが必要とされている。
発明の要旨
本発明はDNAポリメラーゼを含有する反応混合液中で生じるDNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する方法を提供する。DNAポリメラーゼの停止の発生率は、本明細書中に記載されるような窒素含有有機分子を反応混合液に添加することにより減少する。本発明のこれらの組成物は、DNAポリメラーゼの停止の発生率を減少するのに効果的な量で反応混合液に添加される。DNA配列決定の鎖終止法において、この反応混合液は使用され得る。好ましくは、DNA配列決定の鎖終止法は、ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法である。反応混合液はまた、PCR反応混合液であり得る。配列決定されるDNAまたは増幅されるDNAは、精製され得るかまたは精製され得ない。未精製のDNAは、例えば、細胞の粗溶解物として存在し得る。
DNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する方法は、水溶液、DNA分子、１種類のDNAポリメラーゼまたは数種のDNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合液、鎖伸長インヒビター、および１つ以上の本発明の組成物を組み合わせて、反応混合液を形成し得る。DNAポリメラーゼは、DNA分子を鋳型として使用することによりDNA分子の部分に相補的な核酸を生成し得る。反応混合液はインキュベートされ、DNA分子を鋳型として使用することによりDNAポリメラーゼが種々の長さの核酸フラグメントを形成することが可能になる。形成された核酸フラグメントは、配列決定されるDNA分子に相補的である。
上記の方法のいくつかの改変方法において、核酸プライマーもまた、反応混合液に添加され得る。このプライマーは、DNA分子の１つの鎖の第一の部分から下流に位置するその鎖の第二の部分に相補的である。使用されるDNAポリメラーゼはプライマーの3'末端を伸長し得、DNA分子の第一の部分に相補的な核酸を生成する。
本発明は、鎖終止法によってDNA分子を配列決定するための改良方法を提供し、ここでDNA分子は、DNA分子を鋳型として使用することによりDNA分子の一部分に相補的な核酸を生成し得るDNAポリメラーゼ；デオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合液；および鎖伸長インヒビターと組み合わされ、反応混合液を形成する。この反応混合液はインキュベートされ、DNA分子を鋳型として使用することによりDNAポリメラーゼが種々の長さの核酸フラグメントを形成することが可能になり、ここで核酸フラグメントはDNA分子に相補的である。本発明の改良部分は、ある量の本明細書中に記載の１つ以上の窒素含有有機化合物を反応混合液に添加することである。
本発明はまた、鎖終止法によるDNA配列決定のためのキットを提供する。これらのキットは使用説明書、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む容器、鎖伸長インヒビターを含有する容器、およびある量の本発明の組成物を有する。キットはまた、他の成分も含み得る。好ましくは、キットはジデオキシDNA配列決定法によりDNA配列決定するためのものである。
【図面の簡単な説明】
図1A.ジデオキシDNA配列決定におけるDNAポリメラーゼの停止。２本鎖DNAのジデオキシDNA配列決定は、水をベタインの代わりに用いた以外は、本明細書の実施例１において記載されるように行った（結果は、水を使用した場合と使用しない場合で同一であった）。反応混合液は、実施例１に記載されるように、ポリアクリルアミド／尿素のDNAシークエンスゲルで分離した。DNAポリメラーゼの停止の位置を、矢印で示す。
図1B.ベタインによるジデオキシDNA配列決定におけるDNAポリメラーゼの停止の除去。ジデオキシDNA配列決定は、実施例１で記載されるようにベタインの存在下で行った。反応混合液は、実施例１に記載されるように、ポリアクリルアミド／尿素のDNシークエンスゲルで分離した。矢印は図1AのDNAポリメラーゼの停止に対応する位置を示す。
定義
本明細書で使用される用語「核酸」は、DNAまたはRNAのいずれかをいう。これは、プラスミド、DNAおよび／またはRNAの感染性高分子、非機能的DNAまたはRNA、染色体DNAまたはRNA、および（ポリメラーゼ連鎖反応によるなどの）インビトロで合成されたDNAまたはRNAを包含する。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、5'末端から3'末端へ読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の１本鎖高分子または２本鎖高分子をいう。
本明細書で使用される用語「DNA分子」は、任意の形態のDNA分子をいい、天然に存在するDNA分子、組換えDNA分子、または合成DNA分子を包含する。この用語は、プラスミド、細菌DNAおよびウイルスDNA、および染色体DNAを含む。この用語は、細胞溶解またはそれに続くDNA分子の操作によって生成されるDNAフラグメントを包含する。特定しない限り、１本鎖DNA配列の左側の端が5'末端である。
用語「上流」は、１本鎖DNA分子に関して使用される場合、DNA分子の参照領域の5'側に位置するそれらのDNA配列をいう。例えば、DNA分子の定義された部分から上流に位置するそれらの配列は、定義された部分の5'側に位置する配列である。同様に、用語「下流」は、１本鎖DNA分子に関して使用される場合、DNA分子の参照領域の3'側に位置するそれらのDNA配列をいう。
本明細書で使用される用語「相補的」は、２つの核酸配列の間の関係をいう。ある核酸配列が第二の核酸と２本鎖を形成し得るのであれば、その核酸配列は第二の核酸配列に相補的であり、ここで２本鎖の各残基は、グアノシン−シチジン（Ｇ−Ｃ）またはアデノシン−チミジン（Ａ−Ｔ）塩基対または等価な塩基対を形成する。等価な塩基対は、グアノシン、シチジン、アデノシン、またはチミジン以外のヌクレオシドアナログまたはヌクレオチドアナログを含み得、これらはDNA鋳型においてDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによって核酸へ組み込まれ得る。相補的なDNA配列は、DNA2重ヘリックスの通常の塩基対合の法則（Watson J.D.ら（1987）Molecular Biology of the Gene,第４版,Benjamin Cummings Publishing Company,Menlo Park,California,65−93頁を参照のこと）により公知の配列から予測され得る。相補的な核酸は、異なる大きさであり得る。例えば、小さな核酸は大きな核酸の一部分に相補的であり得る。
本明細書で使用される用語「DNA鋳型」または「鋳型」は、DNAまたはRNAポリメラーゼによって使用されるDNA分子またはDNA分子の一部分をいい、新しく合成される核酸の配列を決定する。（Watson,J.D.ら、上述  鋳型DNA分子におけるDNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼの作用の詳述な記載を参照のこと）。
DNAポリメラーゼに関して本明細書で使用される用語「複製」は、DNA分子を鋳型として使用してそのDNA分子の一部分に相補的な核酸を生成するプロセスをいう。
本明細書で使用される用語「精製DNA」または「精製DNA分子」は、RNAまたはタンパク質などの他の生物学的高分子または細胞性代謝物が混入していないDNAをいう。精製DNAは、タンパク質、他の細胞性核酸、および細胞性代謝物からの５％未満の混入を含む（重量基準）。用語「未精製DNA」または「未精製DNA分子」は、他の細胞性核酸、細胞性タンパク質、および細胞性代謝物からの５％以上の混入を有するDNA調製物をいう。未精製DNAは、LiClまたはポリエチレングリコールのいずれかと併用したエタノールを用いる沈澱のような、単一の精製工程を使用することにより得られ得る。用語「細胞溶解粗調製物」または「粗細胞溶解物」または「粗溶解物」は、未精製DNAの調製物をいい、ここでは細胞またはウイルス粒子は溶解されているが、DNAのさらなる精製は行われていない。
本発明のいくつかの化合物は、溶液のpHに依存して、正電荷または負電荷を有するか、あるいは正電荷および負電荷の両方を有して存在し得る。これらの化合物の種々の形態が、本発明に含まれることが理解される。
本明細書で使用される用語ベタインは、N,N,N−トリメチルグリシンをいう。
本明細書における全ての数の範囲は、それらの上限および下限を含むことが意図される。
詳細な説明
A. 概論
DNA分子の配列を決定する多くの異なる方法がある。現在、通常に使用される大部分の方法は、２つの一般的な方法のうちの１つの方法の改変である。１つの一般的なスキームは、特定の塩基と反応して、他の化学物質がリン酸ジエステル骨格をそれらの部分で切断することを可能にする化学試薬を使用する。第二の一般的な方法は、配列決定されるDNA分子に相補的なDNAフラグメントを生成するためにポリメラーゼ酵素を使用する。反応混合液中の少量の鎖伸長インヒビターの含有は、異なる大きさのDNAフラグメントの生成を引き起こす。化学的方法または鎖終止法のいずれかによって生成されるDNAフラグメントは、種々の方法によって分離および解析され得る。例えば、DNAフラグメントは、大きさに基づいてシークエンスゲルにおいて分離され得る。ゲル上の任意の位置に存在するバンドを試験することにより、DNA分子の配列が、対応する位置で決定され得る。例えば、バンドがＧのレーンのみの位置に存在するので、図1Aに表される配列の上部は３つの連続したＧヌクレオチドを含有する。
DNA配列決定の鎖終止法は、化学切断法よりも広く使用されている。デオキシヌクレオシド三リン酸は、DNA配列決定において用いられる最も一般的なチェーンターミネーターである。ジデオキシDNA配列決定の特定のプロトコルの例は、Sambrookら、上述を参照のこと。
広く使用されているのにも関わらず、ジデオキシ配列決定法に関する技術的な問題がある。主要な問題の１つは、DNA配列の決定を妨害するDNAポリメラーゼの停止または休止の発生率である。DNAポリメラーゼが特定の部位で停止した場合、バンドはシークエンスゲルの４つの全てのレーンに現れ、そしてその位置でのヌクレオチド残基は決定され得ない。
DNAポリメラーゼの停止は、いくつかの理由のために生じる。停止は、酵素がプライマーの3'末端からさらに長く伸長するような場合に、より頻繁に観察される。この現象は一度に配列決定され得るDNAフラグメントの長さを制限する。停止の発生率の減少は、より長い断片のDNA配列決定を可能にし、それゆえDNA配列決定をより効率的にする。
DNAポリメラーゼの停止はまた、DNA調製物に混入物が存在する場合、より頻繁に生じる。この現象のために、DNA調製物は配列決定の前に精製されなくてはならない。本発明の改良されたDNA配列決定法は、停止の発生率を減少し、それゆえ純度の低いDNAの調製物が、確実に配列決定されることを可能にする。また、この方法は、DNA配列決定の効率を増加し、そしてそのコストを減少する。
最後に、至適な条件下でさえ、DNAポリメラーゼの停止がしばしばDNAのGCリッチ領域において見られる。このことはDNA分子のある領域におけるDNAの配列情報を決定することを困難にする。プライマーの3'末端から離れたGCリッチ領域または至適に精製されていないDNA調製物においてDNA配列を決定しようとする場合に、もちろん、この問題は一層大きくなる。従って、本発明の改良された方法は、コストを減少してDNA配列決定の正確さおよび効率を増加する。
本発明の化合物によって引き起こされるDNAポリメラーゼの停止の発生率の減少はまた、DNA配列決定以外の手順における有用性も有する。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、インビトロ突然変異誘発、ニックトランスレーション、逆転写、および平滑末端化などの多くの一般的な実験技術は、DNAポリメラーゼを利用する。適切な濃度の本発明の化合物の添加は、潜在的にこれらの手順の効率またはスピードを増加する。
B. DNAポリメラーゼの停止の発生率を減少する化合物
本発明において使用される化合物は、およびDNA配列決定の鎖終止法において、およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順（例えば、PCR）において生じる停止の発生率を除去または減少し得る窒素含有有機分子である。これらの化合物は、以下の式によって表される：
0003616394.tif 000002
ここで：
R1、R2、R3は、同じまたは異なり得、そして水素、メチル、エチル、およびプロピルからなる群より独立して選択されるが、但しR1、R2、およびR3の２つより多くが水素であることはなく；そして
Ｘは以下からなる群より選択される部分である：
0003616394.tif 000003
ここで：
R4はメチル、水素からなる群より選択され、R1と結合した場合、ピロリジン環を形成し；
R5は、−CO2Hおよび−SO3Hからなる群より選択され；そして
ｎは０〜２の整数であり、
但し、R1およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはなく、そしてここで組成物は停止の発生率を減少するに効果的な量で添加される。
ピロリジン環がR1およびR4により形成される場合、以下の式IIの化合物が形成される。
0003616394.tif 000004
ある好ましい実施態様において、本発明の方法およびキットは式Ｉの化合物を使用し、ここでR1、R2、およびR3は同じかまたは異なり、そしてメチル、エチル、および水素からなる群より選択され（但しR1、R2およびR3の２つより多くが水素であることはない）、そしてR1およびR4がピロリジン環を形成する場合、R2およびR3の１つより多くが水素であることはない。
好ましい実施態様の別の群において、本発明の方法およびキットは、式Ｉの化合物を使用し、ここでＸは−CH2CO2Hである。この群内のさらに好ましい実施態様は、R1、R2、およびR3がメチルである化合物;R1、R2がメチルでありそしてR3が水素である化合物；またはR1がメチルであり、そしてR2およびR3が水素である化合物を使用する。
さらに好ましい実施態様において、本発明の方法およびキットは式Ｉの化合物を使用し、ここでＸは＝ＯでありそしてR1、R2、およびR3はメチルである。
さらにより好ましい実施態様において、本発明の方法およびキットは式Ｉの化合物を使用し、ここでR1およびR4がピロリジン環を形成し、R2およびR3はメチルであり、ｎは０であり、そしてR5は−CO2Hである（スタキドリン、式III）
0003616394.tif 000005
好ましい実施態様のさらに別の群において、本発明の方法およびキットは、R1、R2、およびR3がメチルであり、そしてＸが−CH2−SO3Hである化合物（スルホベタイン）を使用する。
一般的に、DNA配列決定における、およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順におけるDNAポリメラーゼの停止の発生率を除去または減少するために使用される化合物は、市販されている。例えば、ベタイン、ジメチルグリシン、サルコシン、およびトリメチルアミンＮ−オキシドは、全てSigma Chemical Company（St.Louis,Missouri,USA）から得られ得る。
これらの化合物はまた、当業者に公知の通常の方法によってもまた合成され得る。例えば、R4がＨであり、ｎが０であり、そしてR5が−CO2Hである式の化合物は、Lloydら（1992）J.Pharm.Pharmacol.44:507−511の方法により合成され得る。一般的に、クロロ酢酸エチルを加熱し、エタノール中で適切な第３アミンと還流させる。反応が完了すると、減圧下でエバポレートすることにより、エタノールを反応混合液から除去する。残渣を３〜６％w/v水性HCl中に溶解し、そして温めて還流させる。減圧下で溶液をエバポレートすることにより、所望の生成物が提供される。代表的に、これらの生成物はアセトニトリル／水混合液から再結晶され得る。
R4がＨまたはCH3であり、ｎが１であり、そしてR5がCO2Hである式Ｉの化合物は、Fiedorek,F.T.、米国特許第2,548,428号の方法により合成され得る。簡単には、βラクトンを第３アミンと反応させて、所望の化合物を提供する。
R4がＨであり、ｎが２であり、そしてR5が−CO2Hである式Ｉの化合物は、Aksnes,G.ら、J.Chem.Soc.London 1959:103−107の方法により合成され得る。簡単には、４−ブロモ酪酸（Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wisconsin,USA）を、メチルアルコールおよび触媒硫酸で処理することにより、メチルエステルに転化する。次いで、過剰のアルコール性第３アミンでメチルエステルを処理することにより、所望の化合物が提供される。
R4およびR1が一緒になってピロリジン環を形成し、R5がCO2Hである式Ｉの化合物は、Karerら（1925）Helv.Chim.Acta.8:364の一般的な方法により合成される。例えば、スタキドリンは、この手順に従ってプロリンのメチル化によって形成される。
Ｘが＝Ｏである式Ｉの化合物は、対応する第３アミンの酸化により合成される（March,J.（1992）Advanced Organic Chemistry,Reactions,Mechanisms and Structure,第４版,John Wiley and Sons,New York,1200−1201頁を参照のこと）。代表的には、酸化は過酸化水素を用いて行われるが、他の過酸類もまた使用され得る。
スルホベタインは、King,J.F.ら（1985）J.Phosphorus Sulfur 25:11−20の手順に従って合成され得る。R5が−SO3Hである式Ｉの他の化合物もまた、この手順の改変および当業者に公知の他の方法により合成され得る。
C. DNA配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順の改良方法
1. DNA配列決定の鎖終止法
本願発明は、鎖終止法によるDNA配列決定における改良を包含する。本明細書で使用される用語「DNA配列決定の鎖終止法」、「鎖終止法」、または「鎖終止DNA配列決定法」は、配列決定されるDNA分子の部分に相補的な核酸フラグメントを生成するためにDNAポリメラーゼを使用するDNA配列決定法をいう。一般的に、DNA分子の部分に相補的であるプライマーが使用される。プライマーは、DNAポリメラーゼにより、DNA分子の鋳型に沿って伸長される。この方法の原理は、少量の特定の鎖伸長インヒビターを反応混合液中に含むことにより、DNAポリメラーゼが極稀にインヒビターを取り込み、そして終止することである。一般的に、４つの反応混合液が調製され、それぞれ異なる鎖伸長インヒビターを有し、グアノシン残基、シトシン残基、アデノシン残基、またはチミジン残基で特異的に終止し得る。DNAポリメラーゼとインキュベートすることにより生成されるDNAフラグメントは、DNA分子の配列を決定するために分離され得、そして解析され得る。他の分離法または検出法も使用され得るが、代表的に、フラグメントはゲル電気泳動により分離され、そしてオートラジオグラフィーにより検出される。（DNA配列決定の鎖終止法のより詳細な記載についてはSangerら、上述およびSambrookら、上述を参照のこと）。この手順は自動化に準じ、そして種々の特定の方法が自動化の目的のために創作され、単一レーンの配列決定、レーザー検出、およびキャピラリー電気泳動を包含する。
本明細書で使用される用語「鎖伸長インヒビター」または「鎖終止インヒビター」は、DNAポリメラーゼ酵素による核酸鎖の伸長を終止させる化合物をいう。上記のように、これらの化合物は、DNA配列決定の鎖終止法において有用であり得る。
本明細書で使用される用語「休止」、「停止」、「DNAポリメラーゼ休止」または「DNAポリメラーゼ停止」は、鎖終止DNA配列決定法において、DNAポリメラーゼがDNAとインキュベートされる場合、特定のヌクレオチドでDNAポリメラーゼが停止するまたは機能しない現象をいう。これは、取り込まれる次の核酸が存在し、そして伸長が停止する明白な理由（ジデオキシヌクレオチドの取り込みなど）がなんら存在しないのにも関わらず、DNAポリメラーゼ分子が伸長できない現象である。DNAフラグメントがDNAシークエンスゲル上に並べられる場合、停止は、ゲルの４つの全てのレーンにおいて、DNAポリメラーゼが伸長困難性を有したフラグメント長に対応する位置でバンドとして現れ、そのため、その位置の核酸の正体が決定され得ない（例えば、図1A中の矢印を参照のこと）。
DNAの配列を決定するための種々の異なる鎖終止法がある。最も一般的に使用される方法は、ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法である。本明細書で使用される用語「ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法」または「ジデオキシDNA配列決定法」は、DNA配列決定の鎖終止法をいい、ここでは鎖伸長インヒビターは2'3'−ジデオキシヌクレオシドまたはそれらの誘導体である。代表的に2'3'−ジデオキシヌクレオシド三リン酸が使用される。種々の他の鎖伸長インヒビターもまた、使用され得る。例えば、アラビノヌクレオシド誘導体または3'O−メチルデオキシリボヌクレオチド誘導体が、鎖終止法において使用され得る（Sangerら、上述およびAxelrod,V.O.ら（1978）N.A.R.5:3549−3563を参照のこと）。
種々の異なる酵素が、配列決定されるDNA分子に相補的なDNAフラグメントを生成するために使用され得る。例えば、T7 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、およびDNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントは全て、DNA配列決定において使用される。RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素もまた、使用され得る。DNAポリメラーゼは、DNA配列決定において使用するための酵素を最適化するために、遺伝子学的にまたは物理的に改変され得る。
DNAポリメラーゼは、プライマー配列を必要とする。プライマー配列は、DNA分子の消化により生成され得るか、またはプライマー分子として外来的に添加され得る。本明細書で使用される用語「プライマー分子」、「プライマー」または「核酸プライマー」あるいは「DNAプライマー」は、配列決定されるDNA分子の一部分に相補的である１本鎖核酸分子をいう。プライマーはDNA分子にアニールさせられ、続くDNAポリメラーゼによるプライマーの3'末端の伸長が、配列決定されるDNA分子の部分に相補的な核酸配列を生成する。プライマーは、DNA配列決定の鎖終止法において、一般的に使用される。しかし、鎖終止法によるDNA配列決定のある改変において、プライマー配列は適切な酵素での消化により生成され得る（下記を参照のこと）。
別の実施態様において、DNA配列決定ベクターが、鎖終止法によるDNA配列決定を容易にするために使用され得る。種々のこのようなベクターが使用され得、M13、Bluescriptベクター（例えばpBS−KS+およびpBS−KS-）（Stratagene,San Diego,California,U.S.A.）、pUCベクター（例えば、pUC18およびpUC19）、およびpBR322ベクターを含む。配列決定されるDNA分子は、配列決定ベクターへ挿入される。プライマーは、配列決定ベクター中のDNAの領域に相補的であるように構築され得、プライマーの3'末端からの伸長が、配列決定されるDNA分子の一部分に相補的なDNAフラグメントを生成する。従って、配列決定ベクターが使用される場合、配列決定されるDNA分子はベクター中のインサートとして存在し得る。DNA配列決定ベクターの領域に相補的であるプライマーが使用され得、鎖伸長がプライマーの3'末端からDNAインサートの領域へ生じる。それゆえ、インサートのDNA配列の決定が可能になる。
配列決定のためのDNA調製物は、精製済または未精製のいずれかであり得る。未精製DNAは、粗細胞溶解物であり得る。DNAポリメラーゼの停止の発生率を除去または減少する本発明の化合物は、未精製DNA調製物（粗細胞溶解物を含む）のDNA配列決定における使用を可能にする。
DNA調製物は、１本鎖形態または２本鎖形態で存在し得る。例えば、直鎖状２本鎖DNAは、PCRにより生成され得る。このようなDNAが配列決定される場合、DNAポリメラーゼの停止の発生率は減少するか、または除去する。
DNA配列決定の鎖終止法において生成されるDNAフラグメントの混合物は、最も一般的には、ゲル電気泳動によって分離および解析される。DNAシークエンスゲルの例としては、本願における図の1Aおよび1Bを参照のこと。DNAフラグメントを分離するために有用な他の分離方法もまた使用され得る（Sambrookら、上述を参照のこと）。例えば、質量分析測定法が、DNAフラグメントの混合液を解析するために使用され得る（Jacobsonら、（1991）J.Genetic Analysis,Techniques and Applications 8:223−229を参照のこと）。
DNAフラグメントは標識済または無標識であり得る。例えば、無標識のDNAフラグメントは、自動化技術における紫外分光光度法により、またはゲル電気泳動後の銀染色により検出され得る。しかし、検出を容易にするために標識DNAフラグメントを生成することが、一般的に望ましい。例えば、放射性標識DNAフラグメントが生成され得る。それらは、例えば、放射性プライマーを使用することによって生成され得る。あるいは、DNAポリメラーゼとのインキュベートの間に、放射性ヌクレオチドが取り込まれる。放射性標識DNAフラグメントが生成される場合、それらは、ゲル電気泳動により分離され得、そしてオートラジオグラフィーにより可視化され得る（本願における図1Aおよび1Bを参照のこと）。種々の非放射性標識もまた使用され得、発蛍光団、化学発光剤、および検出可能な小分子（例えば、ビオチン）を含む。例えば、自動化塩基配列決定技術において、蛍光標識または比色標識は、キャピラリーチューブまたはシークエンスゲルを使用して、レーザー分光器により検出され得る。
非放射性標識は、間接的な手段により付着され得る。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合的に結合する。次いで、リガンドは、固有に検出可能であるか、またはシグナルシステム（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共有結合的に結合するかのいずれかである抗リガンド分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。多くのリガンドおよび抗リガンドが利用され得る。リガンドが天然の抗リガンドを有する場合（例えば、ビオチン、チロキシン、およびコルチゾール）、リガンドは標識された天然に存在する抗リガンドと共に使用され得る。あるいは、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物が、抗体と組み合わせて使用され得る。
DNA配列決定の鎖終止法の種々の改変がある。例えば、DNA配列決定は、手動により、半自動化手順により、または自動化DNA配列決定機器の使用により実施され得る。さらに、鎖終止DNA配列決定技術は、他の技術と組み合わせられ得る。例えば、「exometh」法においてDNA分子はエキソヌクレアーゼで処理され、多様な長さの１本鎖の5'伸長部を有する一連のDNA分子を生成する。次いで、これらのDNA分子は、外来のプライマーを添加しないでDNA配列決定の鎖終止法により直接配列決定され得る。（「exometh」改変によるDNA配列決定のより詳細な記載については、Sorge,J.A.ら（1989）Proc.Nat.Acad.Sci,USA 86:9208−9212を参照のこと）。鎖終止DNA配列決定法のこのような改変は、全て本発明に包含される。
本発明の化合物は、停止の発生率を除去または減少するために、DNAをDNAポリメラーゼとインキュベートする前またはその間に、反応混合液に添加され得る。DNA分子、DNAポリメラーゼ、鎖伸長インヒビター、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、プライマー、および本発明の化合物の添加の順番もまた多様であり得る。実施例４において示されるように、停止の発生率を減少または除去する化合物は、DNAポリメラーゼの通常のインキュベート時間の後においてでさえも添加され得、そしてインキュベートはDNAポリメラーゼの停止を取り除くために延長され得る。
2. ポリメラーゼ連鎖反応手順
本発明はまた、PCRなどの核酸増幅手順における改良を包含し、これはDNAポリメラーゼによる鎖伸長を包含する。
TaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ酵素を利用する種々の異なるPCR技術がある。PCR方法論の詳細な記載については、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications（Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.およびWhite,T.編）、Academic Press,San Diego（1990）を参照のこと。代表的なPCRプロトコルでは、標的核酸、２つのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマーの１つは各鎖にアニールする）、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および適切な塩を混合して、そして温度をサイクルさせることにより、プライマーを鋳型にアニールさせ、ポリメラーゼにプライマーを伸長させ、そして鋳型鎖を新しく合成された鎖から分離させる。温度サイクルを続けて行うことにより、プライマー間の領域の指数関数的増幅が可能になる。ポリメラーゼが、他のプライマーがアニールする位置まで少なくとも伸長させ得る限り、プライマーは、元の鋳型と新しく合成された核酸との両方にアニールし得る。この理由のために、PCRが産物を増幅する能力は、ポリメラーゼがアニールされたプライマーを伸長させる能力によって主に制限される。ポリメラーゼがアニールされたプライマーを伸長させる能力は、プライマー間の距離およびプライマー間の配列のヌクレオチド組成に依存する。本明細書中に記載される１つ以上の化合物の適切な量の添加は、この伸長を促進する。Taqポリメラーゼを使用するPCRプロトコルにおける鎖伸長に対するベタインの効果の実証については、本明細書中の実施例８および実施例９を参照のこと。ベタインに加えて本発明の他の化合物も、種々の異なるPCR方法における鎖伸長を改良するために、同様の方法で使用され得る。
本発明の化合物はまた、DNA配列決定およびポリメラーゼ連鎖反応以外の実験手順においても、DNAポリメラーゼの停止を減少することによいて有用性を有する。多くの一般的な実験技術（例えば、インビトロ変異誘発、ニックトランスレーション、逆転写および平滑末端化）がDNAポリメラーゼを利用する。これらの方法の記載については、Sambrookら（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版,1−３巻,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1989）を参照のこと。従って、本発明の化合物は、DNAポリメラーゼによる鎖伸長を含む種々の手順において有用である。
3. 停止の発生率を減少または除去する化合物の試験および最適化
DNA配列決定の鎖終止法およびDNAポリメラーゼを使用する他の実験手順における停止の発生率を除去または減少し得る化合物は、上記の通りである。これらの化合物は、DNAポリメラーゼの停止を除去または減少するそれらの相対的な能力について試験され得る。例えば、化合物は、本明細書中の実施例１において記載される手順によって試験され得る。簡単には、DNA配列決定は、選択された濃度の本発明の化合物の存在下または非存在下においてジデオキシ配列決定法により行われる。次いで、化合物の存在下および非存在下において得られるDNAシークエンスゲルが、DNAポリメラーゼの停止を除去するにおける化合物の有効性を測定するために比較される（例えば、図1Aおよび1Bを参照のこと）。各化合物の有効濃度は、この手順によって決定され得る。所定の化合物についての至適濃度は、チェインターミネーターDNA配列決定法の異なる改変法について変化し得る。これらの濃度は、異なる量の化合物を添加し、そして停止の発生率を測定することにより、実験に基づいて容易に測定され得る（例えば、本明細書中の実施例７を参照のこと）。
本発明はまた、鎖終止法によるDNA配列決定のための、DNAポリメラーゼの停止の発生率を除去または減少する量の本明細書中に記載される１つ以上の化合物を含有するキットを包含する。キットはさらに、使用説明書、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む容器、DNAポリメラーゼを含有する容器、および鎖伸長インヒビターを含有する容器を包含し得る。キット中の容器は種々の方法で組み合わされ得る。例えば、鎖伸長インヒビターは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合物と共に同じ容器中で組み合わされ得る。
本発明はまた、DNAポリメラーゼ連鎖反応のための、DNAポリメラーゼの停止の発生率を除去または減少する量の本明細書中に記載される１つ以上の化合物を含有するキットを包含する。キットはさらに、使用説明書、DNAポリメラーゼを含有する容器、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む容器を包含し得る。
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学的用語は、本発明の属する技術分野における当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものに類似したまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、ここでは好ましい方法および材料が記載されている。本明細書で以下に言及する全ての刊行物は、本明細書に参考として援用される。他で言及しない限り、本明細書中で使用または意図される技術は、当業者に周知の標準的な方法論である。材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するものではない。
実施例
実施例１ ベタインによるDNA配列決定のジデオキシ法における停止の除去
ベタインは、標準的なジデオキシ配列決定手順において通常見られる停止を除去する。
ベタイン一水和物をSigmaから得、5.5Mのストック溶液として−20℃で保存した。改変T7ポリメラーゼ（シークナーゼ2.0（Amersham,Arlington Heights,Illinois,U.S.A.））およびヌクレオチド混合物は、USBから購入した。35S−dATPは、Amershamから購入した。
一般的に、DNA配列決定は、Del Salら（1989）BioTechniques 7:514−519のプロトコルに従った。配列決定を、１ピコモル（pmol）のスーパーコイル２本鎖プラスミドDNA（製造業者の使用説明書に従ってQIAGEN tip−100カラムにかけることにより精製した）と２〜4pmolの種々のオリゴヌクレオチドプライマー（一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、このことは30ヌクレオチド以下のプライマーの不必要性を証明した）とを混合し、そして0.1NのNaOHを含む10μｌの容量に調整することにより、実施した。チューブを10分間68℃でインキュベートし、次いで、室温に移し、そして４μｌのTDMN（200mM NaCl,50mM DTT,120mM HCl,80mM MgCl2,280mM TES）を添加した。さらに室温で10分間インキュベートした後、２μｌのGTP標識混合液（7.5μM dCTP,7.5μM dGTP,7.5μM dTTP）および５μCiの35S−dATPを添加した。次いで、２μｌのシークナーゼ（冷却10mM Tris.Cl pH8.0,1mM EDTAで、1:8に希釈した）を添加した。この混合液を５分間室温でインキュベートし、次いで、3.5μｌを予め37℃に温めた４本のチューブ（それぞれ、3.5μｌの5.5Mベタインおよび2.5μｌの終止反応混合液（80μＭの各dNTP、８μＭの１種類のddNTP、50mM NaCl）を含む）に等分し、ベタインの最終濃度を約2Mとした。これを５分間37℃でインキュベートし、次いで、４μｌの停止溶液（80％の脱イオン化ホルムアミド,1×TBE,0.05％キシレンシアノール,0.05％ブロモフェノールブルー）で停止した。95℃で2.5分後、チューブを短時間氷上で冷却した。4.5μｌを６％のポリアクリルアミド（19:1 アクリルアミド：ビスアクリルアミド）/7M尿素/1×TBEゲルにロードし、種々の期間、35Wで泳動した。ゲルを12％メタノール/12％酢酸溶液で固定し、Whatmanペーパーにトランスファーして、そして乾燥した。一般的に、これをKodak XAR 5フィルムに一晩感光した。
2Mの濃度のベタインの添加は、DNA配列決定を上記のようなDel Salら、上述の方法の改変型を用いて実施した場合、事実上全ての停止を除去した。ベタインを用いない配列決定は、時折停止を導き、GCリッチ領域においておよび特にプライマーから離れた領域において生じる傾向がある（図1A）。17個のこのような停止の解析は、ピリミジン−グアニン−シトシンに類似する配列の中央の位置の後に停止が生じることを示し、試験した17個の停止のうちの11個は、このコンセンサスに一致しており、および残りの６個は１つの位置のみが異なっていた。GCGパッケージの一部分であるMFOLDプログラムによって決定されるような、１本鎖鋳型の潜在的な２次構造との明白な相関はなかった。ベタインの存在下（図1B）では、これらの停止の全てが消え、正各な配列が決定されることを可能にする。
実施例２ プライマーから離れた解読可能なDNA配列が、ベタインの存在下で得られる
ジデオキシ法によるDNA配列決定における停止の発生率は、プライマーから離れて位置するDNA領域において増加する。この現象は１つのプライマーから得られ得る有用なDNA配列を限定する。しかし、ジデオキシ配列決定反応混合液中に、ベタインが含まれると、プライマーから下流に離れるDNA領域における停止の発生率を減少する。このことにより、有用な配列情報が、別のプライマーを用いてさらに配列決定反応を行うことなく、DNAのこれらの領域において得られ得る。
DNA配列決定は、2Mベタインの存在下および非存在下で、実施例１に記載のように実施した。得られた配列決定反応物を、より長いDNAフラグメントを試験するためにゲルを12時間泳動した以外は、実施例１に記載のようにDNAシークエンスゲルに泳動した。これらのより長いDNAフラグメントは、ジデオキシDNA配列決定手順において通常得られるよりも、プライマーから離れたDNA領域の配列を明瞭に示した。ベタインの非存在下では、これらのゲルから、有用な配列情報はほとんど決定され得なかった。しかし、ベタインの存在下では、DNA配列は、プライマーの3'末端から少なくとも520ヌクレオチドまで解読され得た。それを越える配列は、ゲルの分離能のために、やや解読されにくくなる。
実施例３ ベタイン存在下での未精製DNA調製物からのDNA配列決定
DNAは、標準的なアルカリ溶解技術（Silhavyら（1984）Experiments With Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York 147−148）に一般的に従って調製し、次いでエタノール沈澱した。有機抽出、RNAse処理または他のさらなる精製技術は使用しなかった。pDSM3プラスミドを含有するXL1−blue細胞（Stratagene,San Diego,California）をDNAの供給源として使用した。次いで、DNAを実施例１に記載されるように配列決定した。予想された通り、ベタインの非存在下では多数の停止があった。しかし、ベタインを終止反応液に添加した場合、このDNAを配列決定したときに存在した停止が消滅した。
実施例４ ベタインで追跡することによるDNA配列決定の間の停止の除去
ベタインは、通常の終止反応の後に添加される場合、停止を除去し得る。DNA配列決定を、終止反応混合液にベタインを添加しなかったこと以外は、実施例１に記載されるように行った。37℃で５分間インキュベートした後、3.5μｌの5.5Mベタイン溶液かまたは3.5μｌの水のいずれかを添加した。次いで、さらに、５分間インキュベートを続け、そして実施例１に記載のように停止溶液で停止した。この時点でのベタインの添加は、ベタインの非存在下で見られた停止を大きく減少した。従って、シークエンスゲル上で停止を表すバンドは、停止したDNAポリメラーゼ複合体を表すようである。終止反応混合液と通常のインキュベートを行った後に添加したベタインは、停止したDNAポリメラーゼ複合体が伸長を再び始めることを可能にできる。このことは、ベタインが単にDNAポリメラーゼを安定化することによって作用するのであれば、この時点でのベタインの添加は何の効果も有さないので、ベタインが単にDNAポリメラーゼを安定化することによって作用するのではないことを示す。
実施例５ 改変されたジデオキシDNA配列決定手順における停止の発生率の除去または減少
実施例１のDNA配列決定手順を、ベタインが種々のジデオキシDNA配列決定プロトコルにおいて生じる停止を除去し得ることを示すために、改変した。ジデオキシDNA配列決定手順において、１本鎖DNA基質を置き換える効果または異なるDNAポリメラーゼを使用する効果を試験した。
ａ） １本鎖DNAの配列決定
１本鎖DNAを、通常の手順に従って、プラスミドpDSM6を含有するXL1−blue株から調製した。実施例１に記載される手順によって、１本鎖DNAを配列決定した場合、ベタインの非存在下において２本鎖の例においてよりも少ない停止が見られた。しかし、これらの停止もまた、ベタインによって除去された。
ｂ） Klenow DNAポリメラーゼ酵素を使用する配列決定
E.coli DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントを使用した以外は、本質的に実施例１に記載される手順によって、DNA配列決定を行った。7.5ユニットのKlenow酵素を使用し、伸長混合液を、GTP伸長混合物に加えて20μCiの35S−dATPおよび0.1μｌのDTTを含むように改変した。Klenow酵素の使用で異なる場所において停止が見られたが、シークナーゼを使用する手順について上述したのと同じように、一般的にベタインによって停止は除去された。
ｃ） Taqポリメラーゼ酵素を使用する配列決定
DNA配列決定を、Promega「fmolTMDNA Sequencing System」のプロトコルに従って行った（Promega Corporation,Madison,Wisconsin,USA）。プロトコルを以下に記載する。
（１）標識プライマーを停止する。
（２）４〜40fmolのDNA鋳型、５μｌの５×fmolシークエンス緩衝液（250mM Tris.Cl pH9.0,10mM MgCl2）、1.5pmolの標識プライマー、ベタイン、および水を、最終容量が16μｌになるように混合する（適切な濃度のベタイン（例えば、2M）を含有）。
（３）１μｌのシークエンス用のTaq DNAポリメラーゼ（5U/μｌ）を添加する。
（４）以下の表に従って、各dNTP/ddNTPのそれぞれに上記の４μｌを添加する：
0003616394.tif 000006
（５）１滴の鉱油で積層する。
（６）チューブを95℃に予備加熱したサーマルサイクラー中に置く。
（７）適切なサイクルプログラムを開始する（プライマーにより変わる、１つの例は、95℃で２分間、（95℃で30秒間、42℃で30秒間、70℃で60秒間）を30サイクル）。
（８）３μｌの停止溶液（10mM NaOH,95％ホルムアミド,0.05％ブロモフェノールブルー,0.05％キシレンシアノ−ル）を添加する。
（９）2.5分間95℃で加熱し、氷冷却し、そしてシークエンスゲルにロードする。
シークエンスゲルを泳動し、DNAポリメラーゼの停止の存在を、本明細書中の実施例１に記載するように決定した。反応混合液中に見られる停止の発生率は、ベタインの存在下で減少した。
実施例６ ジメチルグリシン、サルコシン（モノメチルグリシン）、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（TMANO）によるDNA配列決定の間の停止の除去
３つの別の化合物が、ジデオキシDNA配列決定手順において停止の発生率を減少することが示された。ジメチルグリシン、サルコシン（モノメチルグリシン）、およびトリメチルアミンＮ−オキシド（TMANO）（全てSigma Chemical Companyから）を、実施例１に記載のように、ジデオキシDNA配列決定法における停止を除去するこれらの能力について評価した。DNA配列決定は、他になければ実施例１に記載のように実施した。TMANOは、ベタインよりも良く停止を除去することが分かった。一方、ジメチルグリシンはいくらか効果が低かった。サルコシンは測定可能な効果を有したが、他の化合物ほど好ましくない。他の２つのＮ置換荷電化合物、テトラエチルアンモニウムクロリド（TEACl）およびテトラエチルアンモニウムアセテート（TEAAc）もまた、試験した。TEAClは、DNAポリメラーゼを阻害する。TEAAcはTEAClほどDNAポリメラーゼを阻害しなかったが、またシークエンスゲルにおいて見られる停止の数も減少しなかった。
実施例７ DNA合成のジデオキシ法において、停止を減少するのに効果的なベタイン、TMACO、サルコシン、およびジメチルグリシンの濃度範囲
TMANO、サルコシン、ジメチルグリシン、およびベタインの濃度範囲を、実施例１に記載の手順に従って決定した。
結果を以下の表にまとめる。
0003616394.tif 000007
実施例８ PCR増幅産物の最大サイズの増大
ベタインは、PCRにおける鎖伸長について、プライマー間の最大距離を伸長することが示された。PCRは、B.Krummel,Ph.D.Thesis,University of California,Berkeley,1990に記載されるようにT7 DNAで実施した。200μM dNTP、50mM KCl、10mM Tris−Cl pH8.3、2.5mM MgCl2、および0.01％ゼラチンの最終濃度を含有する200μｌの反応液中で、約50pmolの各プライマーを2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer,Norwalk,Connecticut,USA）および0.5μｇのファージT7 DNAと合わせた。94℃での１分ホットスタート後、94℃で90秒、37℃で１分、および72℃で20秒のサイクル時間でPCRを25サイクル行った。産物を沈澱させ、１％のアガロースゲルで泳動し、そしてエチジウム染色した後UVで可視化した。
2Mの濃度のベタインの添加は、約4000塩基対離れた２つのプライマーが、その間のDNA領域を増幅することを可能にした。このDNA領域は、ベタインの非存在下では、認められるほどに増幅されなかった。
実施例９ 問題となるDNA配列を含有する領域のPCR増幅
ベタインは、ベタインの非存在下で鎖伸長が妨げられてきたGCリッチなDNA領域にわたるPCRの鎖伸長を可能にすることが示された。PCRを、配列TGCの複数の繰り返しを含有するプラスミドで実施した。これによりDNAポリメラーゼの進行を阻害することを発明者らが示している（本明細書中の実施例１を参照のこと）。プライマーは500塩基対（PCRにより通常容易に増幅され得る距離）離れているだけであるが、標準的な反応条件ではいかなる増幅産物も生じなかった。ベタインを2Mの濃度で添加した場合、その間の領域が増幅された。
本明細書中の実施例および実施態様は、例証の目的のためのものにすぎず、それが考慮された種々の改変または変化が当業者に示唆され、そして本出願の意図および全体的な説明ならびに添付の請求の範囲内に含まれる。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それによって、参考として援用される。
【図１】
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