(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）樹枝状細胞前駆体を含む組織源を準備し、
（ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、インビトロ培養に適した細胞集団を得、
（ｃ）GM−CSFを含む培養培地中の基体上で、この細胞源を培養して、非付着性細胞および細胞集団を得、
（ｄ）この非付着性細胞および細胞集団を継代培養して増殖する樹枝状細胞前駆体を含む細胞凝集体を製造し、
（ｅ）この細胞凝集体を一回以上順次継代培養して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させることを特徴とする増殖している細胞培養物から樹枝状細胞の集団を製造する方法。
【請求項２】
上記組織源が血液または骨髄であり、GM−CSFが約１−1000U/mlの濃度で上記培地中に存在する請求項１の方法。
【請求項３】
上記組織源が骨髄である時、処理工程（ｂ）が、更に、補体を含む媒体中で樹枝状細胞前駆体上に存在しない抗原に対する特異抗体と、骨髄を接触することによって、樹枝状細胞前駆体上で発現されない抗原を発現する細胞を殺す工程を含む請求項２の方法。
【請求項４】
上記組織源が骨髄で、上記抗体が、I a抗原、Ｔ細胞上に存在する抗原および成熟樹枝状細胞上に存在する抗原からなる群から選ばれる一個以上の抗原に対するものである請求項３の方法。
【請求項５】
上記骨髄が、約500−1000U/mlの濃度のrGM−CSFで培養される請求項４の方法。
【請求項６】
I a−陰性骨髄非リンパ球が約５×105細胞/cm2の濃度で培養される請求項５の方法。
【請求項７】
抗−I a抗原抗体と抗−Ｔ細胞、Ｂ細胞および単核細胞抗体が、GKl.5抗−CD4、Ho2.2抗−CD8、B21−２抗−I a、およびRA3−3A1/6.1抗−B220/CD45Rからなる群から選ばれる請求項６の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）の細胞凝集体が１ないし５回連続して継代培養されている請求項３の方法。
【請求項９】
上記細胞凝集体が２ないし３回連続して継代培養されている請求項８の方法。
【請求項１０】
上記細胞凝集体が２回連続して継代培養されている請求項９の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約0.3ないし１日の後に、継代培養し、上記細胞凝集体を全て３ないし30日連続して継代培養する請求項３の方法。
【請求項１２】
上記細胞凝集体を全て10ないし20日連続して継代培養する請求項11の方法。
【請求項１３】
上記細胞凝集体を全て20日連続して継代培養する請求項12の方法。
【請求項１４】
上記細胞源が血液または骨髄で、工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約0.3ないし１日の後に、継代培養し、上記細胞凝集体を全て３ないし30日連続して継代培養する請求項３の方法。
【請求項１５】
工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約半日後に、継代培養し、上記細胞凝集体を20日後に二度連続して継代培養する請求項14の方法。
【請求項１６】
上記培養培地が、RPMI1640、DMEMおよびα−MEMからなる群から選ばれるものであり、かつ上記培養培地が血清で補足されている請求項３の方法。
【請求項１７】
牛胎児の血清が上記培養培地に約１〜15％の量で存在する請求項16の方法。
【請求項１８】
牛胎児の血清が上記培養培地に約10％の量で存在する請求項17の方法。
【請求項１９】
上記細胞源が血液で、培地中のGM−CSF濃度が約30−100U/mlである請求項14の方法。
【請求項２０】
上記細胞源が骨髄で、培地中のGM−CSF濃度が約500−1000U/mlである請求項14の方法。
【請求項２１】
（ａ）樹枝状細胞前駆体を含む組織源を準備し、
（ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、インビトロ培養に適した細胞集団を得、
（ｃ）GM−CSFを含む培養培地中の基体上で、この細胞源を培養して、非付着性細胞および細胞集団を得、
（ｄ）この非付着性細胞および細胞集団を継代培養して増殖する樹枝状細胞前駆体を含む細胞凝集体を製造し、
（ｅ）この細胞凝集体を一回以上順次継代培養して、樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、
（ｆ）この樹枝状細胞前駆体を、それらを成熟樹枝状細胞に熟成させるに充分な時間、培養し続けることを特徴とする増殖している細胞培養物から成熟樹枝状細胞の集団を製造する方法。
【請求項２２】
上記組織源が血液または骨髄であり、GM−CSFが約１−1000U/mlの濃度で上記培地中に存在する請求項21の方法。
【請求項２３】
上記組織源が骨髄である時、全処理段階で、補体を含む媒体中で樹枝状細胞前駆体上に存在しない抗原に対する特異抗体と、骨髄を接触することによって、樹枝状細胞前駆体上で発現されない抗原を発現する細胞を殺す工程を含む請求項21の方法。
【請求項２４】
上記組織源が骨髄で、上記抗体が、I a抗原、Ｔ細胞上に存在する抗原および成熟樹枝状細胞上に存在する抗原からなる群から選ばれる一個以上の抗原に対するものである請求項23の方法。
【請求項２５】
上記骨髄が、約500−1000U/mlの濃度のrGM−CSFで培養される請求項24の方法。
【請求項２６】
I a−陰性骨髄非リンパ球が細胞約５×105/cm2で培養される請求項25の方法。
【請求項２７】
抗−I a抗原抗体と抗−Ｔ細胞、Ｂ細胞および単核細胞抗体が、GK1.5抗−CD4、Ho2.2抗−CD8、B21−２抗−I a、およびRA3−3A1/6.1抗−B220/45Rからなる群から選ばれる請求項25の方法。
【請求項２８】
工程（ｅ）の細胞凝集体が１ないし５回連続して継代培養されている請求項21の方法。
【請求項２９】
上記細胞凝集体が２ないし３回連続して継代培養されている請求項28の方法。
【請求項３０】
上記細胞凝集体が２回連続して継代培養されている請求項29の方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を、約0.3ないし１日の後に、継代培養し、上記細胞凝集体を全て３ないし30日連続して継代培養する請求項21の方法。
【請求項３２】
上記細胞凝集体を全て10ないし20日連続して継代培養する請求項31の方法。
【請求項３３】
上記細胞凝集体を全て20日連続して継代培養する請求項32の方法。
【請求項３４】
上記細胞凝集体を１ないし５回連続して継代培養する請求項31の方法。
【請求項３５】
工程（ｃ）の非付着性細胞および細胞集団を約半日後に、継代培養し、上記細胞凝集体を20日後に二度連続して継代培養する請求項29の方法。
【請求項３６】
上記培養培地が、RPMI1640、DMEMおよびα−MEMからなる群から選ばれるものであり、かつ上記培養培地が血清で補足されている請求項21の方法。
【請求項３７】
牛胎児の血清が上記培養培地に約１〜15％の量で存在する請求項36の方法。
【請求項３８】
牛胎児の血清が上記培養培地に約10％の量で存在する請求項37の方法。
【請求項３９】
上記細胞源が血液で、培地中にGM−CSFが約30−100U/mlの濃度で存在する請求項21の方法。
【請求項４０】
上記細胞源が骨髄で、培地中にGM−CSFが約500−1000U/mlの濃度で存在する請求項21の方法。
【請求項４１】
抗原−活性化した樹枝状細胞の集団を含有した、ホストに抗原を付与するための組成物であって、上記の抗原−活性化した樹枝状細胞の集団が、抗原を請求項21、39または40のいずれかの方法で得た樹枝状細胞の集団に曝すことを含む方法によって製造されたものであることを特徴とするホストに抗原を付与するための組成物。
【請求項４２】
ホストが人間である請求項41の組成物。
【請求項４３】
請求項21、39または40のいずれかの方法で調製された樹枝状細胞の集団を含む組成物。
【請求項４４】
請求項21で調製された樹枝状細胞が抗原でパルスされ、樹枝状細胞が上記抗原を処理し、この樹枝状細胞で発現される変性された抗原を製造することを特徴とする抗原−活性化した樹枝状細胞の集団を含む組成物。
【請求項４５】
変性さるべき基体を、請求項21、39または40のいずれかの方法で得た樹枝状細胞の集団に曝し、この基体を樹枝状細胞で変性し、変性した抗原を製造することを特徴とする樹枝状細胞変性した抗原を含む組成物。
【請求項４６】
請求項44の組成物を含むことを特徴とする人間または動物の病気に対して免疫にする組成物。
【請求項４７】
人間または動物における抗原に対して免疫応答を誘発させるためのワクチン組成物で、請求項44の組成物を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項４８】
請求項45の組成物を含むことを特徴とする人間または動物の病気に対して免疫にする組成物。
【請求項４９】
人間または動物における抗原に対して免疫応答を誘発させるためのワクチン組成物で、請求項45の組成物を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項５０】
請求項44の組成物の治療効果のある量を含み、変性さるべき抗原が自己−蛋白質であることを特徴とする、治療の必要な人における自己免疫疾患を治療するための組成物。
【請求項５１】
請求項45の組成物の治療効果のある量を含み、変性さるべき物質が自己−蛋白質であることを特徴とする、治療の必要な人における自己免疫疾患を治療するための組成物。
【請求項５２】
自己免疫疾患が、多発硬化症、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎および若年糖尿病からなる群から選ばれる請求項51の組成物。
【請求項５３】
自己免疫疾患が、多発硬化症および若年糖尿病からなる群から選ばれる請求項51の組成物。
【請求項５４】
請求項１の方法で調製される樹枝状細胞前駆体。
【請求項５５】
組織源が血液または骨髄である請求項46による樹枝状細胞前駆体。
【請求項５６】
組織源が血液である請求項55による樹枝状細胞前駆体。
【請求項５７】
組織源が骨髄である請求項47による樹枝状細胞前駆体。
【請求項５８】
組織源が人間の血液で、培地中にGM−CSFが約400−800U/mlの濃度で存在する請求項２の方法。
【請求項５９】
TNF−α、Ｇ−CSF、IL−１およびIL−３からなる群から選ばれる一個以上のファクターが、培養培地中に存在する請求項58の方法。
【請求項６０】
組織源が人間の血液で、培地中にGM−CSFが約400−800U/mlの濃度で存在する請求項14の方法。
【請求項６１】
TNF−α、Ｇ−CSF、IL−１およびIL−３からなる群から選ばれる一個以上のファクターが、培養培地中に存在する請求項60の方法。
【請求項６２】
組織源が人間の血液で、培地中にGM−CSFが約400−800U/mlの濃度で存在する請求項22の方法。
【請求項６３】
TNF−α、Ｇ−CSF、IL−１およびIL−３からなる群から選ばれる一個以上のファクターが、培養培地中に存在する請求項62の方法。
【請求項６４】
上記細胞が人間の血液から得られ、約400−800U/mlの濃度のGM−CSFの存在下で培養される請求項56による樹枝状細胞前駆体。
【請求項６５】
抗原から抗原フラグメントを調製する方法で、請求項21に記載の方法で調製される樹枝状細胞および請求項１に記載の方法で調製される樹枝状細胞前駆体からなる群から選ばれる細胞と抗原を接触させ、該細胞が抗原をフラグメントに加工し、細胞表面に抗原フラグメントが存在するに充分な時間、該細胞と抗原を培養することを特徴とする抗原から抗原フラグメントを調製する方法。
【請求項６６】
樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体が血液または骨髄から得られたものである請求項65の方法。
【請求項６７】
樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体が血液から得られたものである請求項66の方法。
【請求項６８】
樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体が人間の血液から得られ、約400−800U/mlの濃度のGM−CSFの存在下で培養されたものである請求項67の方法。
【請求項６９】
抗原が樹枝状細胞前駆体により食作用を受ける請求項65の方法。
【請求項７０】
抗原がミコバクテリア抗原、バクテリア抗原およびウイルス抗原からなる群から選ばれる請求項69の方法。
【請求項７１】
抗原がミコバクテリア結核菌である請求項70の方法。
【請求項７２】
ミコバクテリア結核菌がBCGである請求項71の方法。
【請求項７３】
抗原−活性化した樹枝状細胞を含有した医薬組成物であって、上記の抗原−活性化した樹枝状細胞が、抗原を請求項21、39または40のいずれかの方法で得た樹枝状細胞の集団に曝すことを含む方法によって製造されたものであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７４】
請求項44の組成物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７５】
請求項45の組成物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項７６】
請求項44の組成物の治療効果のある量を含む医薬組成物であって、変性されるべき上記抗原が自己−蛋白質であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項７７】
請求項45の組成物の治療効果のある量を含む医薬組成物であって、変性されるべき上記物質が自己−蛋白質であることを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、国立保健研究所の支給するNIH交付金AI13013による米国政府の支援のもとに行われた。米国政府はこの発明にいくらかの権利を有する。本発明の達成は、交付金NB4370（オーストリア国立銀行）およびP8549（オーストリア科学財団）を通じてオーストリア政府によっても支援された。
この出願は、1992年４月１日に出願された米国特許出07/861,612の一部継続出願である1992年11月25日に出願された米国特許出願第07/981,357の一部継続出願である。
発明の技術分野
本発明は、免疫系の細胞の培養法に関する。更に詳しくは、樹枝状細胞前駆体の培養および樹枝状細胞を成熟させるためのインビトロでのその成熟のための方法が提供される。本発明は、Ｔ細胞依存株である樹枝状細胞で修飾された抗原、その製造法およびその免疫原としての使用にも関する。本発明の成熟樹枝状細胞を使用するワクチン、動物およびヒトの免疫法ならびに修飾された抗原も説明される。
発明の背景
免疫系は、現存の抗原に特定され種々のＴ−依存性の免疫応答を開始する樹枝状細胞の系を含む。樹枝状細胞は身体全部に種々の組織内に広く分布している。樹枝状細胞の分布は文献（１）に概説されている。樹枝状細胞は皮膚や気道のように身体表面に近いか、心臓や肝臓のような器官の細胞間部分にある非リンパ系器官中に見出される。樹枝状細胞は、多分サイトカイン顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下GM−CSFと略す）の支配下にあり、細胞の増殖を起こさない成熟過程を受けることができる（2,3）。最初に、樹枝状細胞および十中八九豊富な新しく合成されたMHCクラスII分子にある現存の抗原、つぎに強いアクセサリーおよび細胞−細胞間接着の機能が取得される（４−７）。樹枝状細胞は血液およびリンパ液を経てリンパ系器官に移動できる（８−10）。この場合、多分Ｔ−領域の「絡み合い」細胞として、抗原は再循環性プール中でＴ細胞に提供され得る（14）。しかし、上記に概説した種々の区画内での樹枝状細胞のプロジェニターについてはほとんど分かっていない。
強い免疫応答が続くような形での抗原の送出における樹枝状細胞の効力、即ち「免疫原性」は広く知られているが、この細胞の使用はどの器官にも極めて少ないという事実によって妨げられる。例えば、ヒトの血液では白血球の約0.1％が樹枝状細胞であり（25）、この時点まで成長に誘導されなかった。同様に、以前の研究（20,21）は培養中での骨髄からの多数の樹枝状細胞の成育を報告してはいない。ずっと最近の報告はGM−CSFで補われた髄培養物中での樹枝状細胞の成育を記載しているが、樹枝状細胞の起源または樹枝状細胞の濃厚な源泉としての増殖凝集体の使用についての証拠は見られない。Scheicherら:J.Immunol.Method.154:23−264（1992）。樹枝状細胞は、外来の抗原を免疫学的に活性なＴ細胞が認識すべきペプチドに加工できる（4,6,7,14）、すなわち樹枝状細胞は「抗原提示」の現象を達成するが、樹枝状細胞の少ないことが免疫原性ペプチドの同定へのその使用を妨げている。
脾臓（15）および求心性リンパ液（16,17）内の樹枝状細胞は、細胞周期内にはないが、増殖前駆体から発生する。結局、樹枝状細胞は骨髄（15,16,18,19）から発生するが、その少量の発生を記載した二つの報告（20,21）を除いて、培養物中にこの細胞を発生させるのは困難であった。骨髄前駆体細胞は報告されているが、培養物中でのその増殖を方向づける条件は報告されていない。Steinman,R.「樹枝状細胞およびその免疫原性における役割」、Ann.Rev.Immunol.,9:271−96（1991）。血液に比べて骨髄中で増殖する樹枝状細胞の同定は困難である。GM−CSFに応答して発育する多数の顆粒球があり、それが未熟樹枝状細胞培養物に溢れて、樹枝状細胞前駆体の成熟を阻害するからである。骨髄樹枝状細胞前駆体を豊富にするために細胞表面マーカーの使用が報告されているが、マーカーは多数の非樹枝状骨髄細胞によっても表現されるので、中程度の増加しか得られなかった。Bowers,W.E.およびGoodell、「樹枝状細胞個体発生」Res.Immunol.140:880−883（1989）。
比較的少数の樹枝状細胞が血液からも単離されている。Vakkila  J.ら「ヒトの末梢血から誘導された樹枝状細胞はインターロイキン１α、インターロイキン１βまたはインターロイキン６を産生しない」Scand.J.Immunol.31:345−352（1990）;Van  Voorhis  W.C.ら「ヒトの樹枝状細胞」J.Exp.Med.1172−1187（1982）。しかし、血液中の樹枝状細胞前駆体の存在は報告されていず、ごく最近1989年でも他の組織内での血液樹枝状細胞と成熟樹枝状細胞との関係は不確かである。さらに、樹枝状細胞は「希薄で単離が難しく、末梢組織中にDC（樹枝状細胞）を発生させることはまだ示されていないことが認められている。Mac  Pherson.G.G.「リンパ系樹枝状細胞：その生涯と免疫応答における役割」Res.Immunol.140:877−926（1989）。
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF）は、樹枝状細胞の成熟と機能を調節する因子である。Witmer−Packら、「顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子は、培養されたマウス上皮ランゲルハンス細胞の生存と機能に必須である」。J.Exp.Med.166:1484−1498（1987）。Heufler  C.ら、「顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子おおびインターロイキン１は、マウス上皮ランゲルハンス細胞の強力な免疫促進性樹枝状細胞への成熟を起こさせる」、J.Exp.Med.167:700−705（1988）。樹枝状細胞のインビトロでのGM−CSFで刺激された成熟は、樹枝状細胞の前駆体の培養物中のGM−CSFの存在が免疫学的に活性な細胞への成熟を起こさせることを示唆するが、強力な樹枝状細胞の成長という重要な目標はまだ解決されていない。
Ｔ−依存性の免疫応答は、Ｂ細胞による抗体の生産でのＴ−ヘルパー細胞の活性化によって特徴づけられる。Ｔ−依存性の免疫応答がＴ−非依存性の免疫応答より優れているところは、Ｔ−依存性の応答が記憶を持つこと、すなわち抗原が存在しないときでも細胞は抗体を速やかに生産して抗原へ応答する用意があり、従って免疫応答は「ブースト可能」であるということである。これに対し、Ｔ−非依存性の免疫応答は、比較的子供には少なく、Ｔ−非依存性の抗原が繰り返し投与された場合、ブースター応答を欠く。Ｔ細胞の免疫学的記憶は多分、免疫応答の最初の「一次」または「感作」リムの二つの結果を反映する：（ａ）抗原保有の樹枝状細胞に応答して成長する多数の抗原−特異性Ｔ細胞、および（ｂ）樹枝状細胞のプライミングの後に起こる個々のＴ細胞の機能の増進〔Inabaら、休止および感作Ｔリンパ球は成長とリンフォカイン放出のための明瞭な刺激（抗原提供細胞）の要件を示す;J.Exp.Med.160:868−876（1984）;InabaおよびSteinman、「樹枝状細胞によって開始される蛋白−特異性ヘルパーＴリンパ球の形成」、Science229:475−479（1985）;Inabaら、「混合白血球反応から単離された記憶Ｔリンパ球の性質」、Proc.Natl.Acad.Sci.82:7686−7690（1985）〕。
或る種類の抗原はＴ−細胞依存性の抗体応答を特徴的に誘発するが、他のものはＴ−細胞非依存性の応答を誘発する。例えば、一般に多糖はＴ−細胞非依存性の免疫応答を誘発する。記憶応答はなく、従って多糖類抗原によるその後の感染に対する保護もない。しかし、蛋白質は幼児でのＴ−細胞依存性の応答を誘発する。蛋白質に共有結合した多糖を含む接合ワクチンの成育は、多糖Ｔ−非依存性の応答をＴ−依存性の応答に変換する。残念ながら、そのＴ−細胞依存性を与える蛋白質の上の位置についてはほとんど分かっておらず、従ってもっと特異的な抗原の設計を妨げている。
上記のように、樹枝状細胞はＴ−依存性の応答の開始に重要な役割を演ずる。樹枝状細胞は、修飾された抗原が樹枝状細胞の表面に存在するときにＴ−細胞を活性化して抗体の最終的生産に関与することができるかたちで抗原と結合しそれを修飾する。例えば樹枝状細胞による抗原の修飾は、蛋白質を分断して特異的にＴ−細胞を活性化できる領域を持つペプチドを生産することを包含してもよい。
細胞が抗原を分断してペプチドにし、つぎにこのペプチドを主要組織適合複合体（MHC）の生成物と会合させる場合を、「抗原提示」という。MHCは、その生産物が種々の細胞の表面に表現される高度に多形性の遺伝子の領域である。MHC抗原は、移植片拒絶反応の主な決定因子である。二つの異なった種類のMHC遺伝子生成物、クラスＩおよびクラスIIのMHC分子、が同定されている。Ｔ細胞は、唯一つの特定のクラスＩおよびクラスIIのMHC分子に結合した外来の抗原を認識する。クラスＩおよびクラスIIのMHC分子との抗原会合のパターンで、どちらのＴ細胞が刺激されるかが決まる。例えば、余分な細胞状蛋白質から誘導されたペプチド断片は普通クラスIIのMHC分子に結合し、樹枝状細胞に内因的に転写された蛋白質は一般に新しく合成されたクラスＩのMHC分子と会合する。その結果、外因的および内因的に合成された蛋白質は、典型的に別々のＴ細胞集団によって認識される。
樹枝状細胞は、全動物の免疫応答に細胞を提示する特殊化された抗原である（14,31）。しかしここでも、免疫原ペプチドを同定し抽出するのに樹枝状細胞を使用する能力は細胞を提示するこれらの特殊化された抗原の数が少ないことによって妨げられる。
粒子の取り込みは単核および多形核の食細胞の特殊化された活性である。死滅細胞、免疫複合体および微生物はすべて貪欲に取り込まれる。ヒドロラーゼの多いリソソームとの融合の後、摂取された粒子は分解される（60,61）。この分解は透過できるアミノ酸（62,63）および糖の水準でなければならず、さもないと空胞化装置が不消化性の物質で膨潤する（64,65）。食細胞のそのようなクリアランスおよび消化の機能は、負傷の治療、組織の改造および宿主の防御に貢献する。
エンドサイトーシスのもう一つの結果である抗原提示細胞（APC）による抗原の処理は、食菌のスカベンジング作用とは多くの点で異なる。先ず、処理には少なくとも８〜18個のアミノ酸の長さのペプチドの生成が要り、スカベンジングはアミノ酸への消化を伴う（62,63）。第二に、提示にはクラスIIのMHC生成物へのペプチドの結合を要し（6,68）、スカベンジングはMHC生成物を必要としない。第三に、抗原提示は低容量で機能である。若干のＴ−Ｔハイブリッド（69,70）および一次Ｔ細胞集団（71）の刺激を成功させるには、僅か数百分子のリガンドを発生させるだけでよいからである。スカベンジングの間、食細胞は一時間あたり数十万個の蛋白質分子を除去し破壊する（63）。最後に、抗原提示はクラスIIのMHCに富むが食作用活性を少ししか示さない細胞、およびリソソーム、すなわち樹枝状細胞およびＢ細胞によって一番よく行われ、食細胞（マクロファージおよび好中球）はしばしば低水準のクラスIIおよび豊富なリソソームを有する。これらの知見は、樹枝状細胞およびＢ細胞のエンドサイトシス系内での抗原の特殊化の同定とともに、抗原提示のために必要な機械がスカベンジングに必要なそれと、定量的にも定性的にも異なるという示唆に導く（31）。
樹枝状細胞の場合、これらのAPCはその生涯の或る時点で食菌活性があるという徴候がある。Pughらはいくつかの求心性リンパ液樹枝状細胞においてフォイルゲン染色された封入を認め、他の細胞の食菌作用がリンパ液への侵入に先立って起こったと示唆した
（16）。Fossumは同種白血球を拒絶しているマウス中のＴ細胞領域の絡み合い樹枝状細胞中の食菌的包摂を記載している（71）。Reis  ｅ  Sousaら（74）は、新しく単離した上皮ランゲルハンス細胞は、未熟であるが増殖しない樹枝状細胞であるが、少量の或る種の粒子を取り込むことを見出した。しかし、粒子が増殖中の樹枝状細胞の培養物に投与されたとき、食菌作用の発生を示しまたは示唆した報告はない。
リンパ腫に対する活性免疫応答を誘発させるための哺乳類への病原性リンパ球でパルスされた樹枝状細胞の注入は、PCT特許出願WO91/13632の主題である。さらに、FrancotteおよびUrbain、Proc.Nat'1.Acad.Sci.,USA82:8149（1985）は、インビトロでウイルスでパルスされマウスに注入し戻したマウスの樹枝状細胞がウイルスへの一次応答および二次応答を増大させることを報告した。FrancotteおよびUrbainの報告も特許出願WO91/13632も、免疫応答を活性化するアジュバントとして樹枝状細胞を使用する実際的な方法を提示してはいない。これらの方法はどちらも大抵の治療法や免疫法には実用的でない細胞源である脾臓から得られた樹枝状細胞に頼っているからである。さらに、どちらの報告も臨床的に使用するのに充分な量の樹枝状細胞を得る方法を提供していない。
発明の要約
本発明は、増殖している細胞培養物から樹枝状細胞の集団を製造する方法を提供する。この方法は（ａ）樹枝状細胞前駆体から成る組織源を提供し、（ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、インビトロ培養に適した細胞集団を得、（ｃ）GM−CSF、またはGM−CSFの生物学的に活性な誘導体から成る培養培地中の基体上でこの組織源を培養して、増殖する非付着性細胞および細胞集合を得、（ｄ）この非付着性細胞および細胞集合を継代培養して増殖する樹枝状細胞前駆体から成る細胞集合体を製造し、（ｅ）この細胞集合体を一回以上順次継代培養して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させることから成る。
本発明はまた、増殖している細胞培養物からインビトロで成熟樹枝状細胞を製造する方法を提供する。この方法は（ａ）樹枝状細胞前駆体から成る組織源を提供し、（ｂ）（ａ）からの組織源を処理して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、インビトロ培養に適した細胞集団を得、（ｃ）GM−CSF、またはGM−CSFの生物学的に活性な誘導体から成る培養培地中の基体上でこの組織源を培養して、非付着性細胞および細胞集合を得、（ｄ）この非付着性細胞および細胞集合を継代培養して増殖する樹枝状細胞前駆体から成る細胞集合体を製造し、（ｅ）この細胞集合体を一回以上順次継代培養して樹枝状細胞前駆体の比率を増加させ、（ｆ）この樹枝状細胞前駆体を成熟させて成熟樹枝状細胞にするのに充分な期間、この樹枝状細胞前駆体の培養を継続することから成る。
非樹枝状前駆体の比率を減らすためには、非付着性細胞を得るために基体上で組織源を培養する前に、または培養の初期の間に、組織源を前処理してもよい。本発明の実施に好ましい組織源は、骨髄、特に血液である。
本発明はまた、増血を刺激する物質で個体を処理することによって組織源中に存在する樹枝状細胞の比率を増加させる方法を提供する。
骨髄が組織源として使用される場合、前処理過程は補体から成る培地中で樹枝状前駆体細胞に存在しない抗原に特異的な抗体と骨髄を接触させることによって樹枝状前駆体細胞上で表現されない抗原を表現するキリング細胞から成る。好ましくない非樹枝状細胞前駆体の除去は、好ましくない非樹枝状細胞またはその前駆体細胞を固体の支持体上に吸着させることによっても達成される。
本発明はまた、治療に使用でき、新しい治療用抗原の製造にも使用できる量で樹枝状細胞前駆体および樹枝状細胞を提供する。さらに、本発明の方法で調製された樹枝状細胞前駆体および樹枝状細胞も提供される。
本発明の別の実施態様は、抗原で活性化された樹枝状細胞が抗原に露出されＴ細胞への提示およびＴ細胞の活性化のために修飾された抗原を表現する本発明の方法によって調製された抗原で活性化された樹枝状細胞である。
本発明はまた、非修飾または野性の抗原の免疫原断片であり活性Ｔ細胞を分断する修飾抗原を生産するために樹枝状細胞で抗原が修飾される本発明の方法によって調製された樹枝状細胞の培養物に抗原を露出させることによって製造される新規な抗原を提供する。
この新しい抗原は、動物およびヒトを免疫して疾病を予防し治療するのに使用できる。
本発明はまた、増殖可能な前駆体細胞の集団から前駆体樹枝状細胞を提供し、樹枝状細胞前駆体が抗原を食菌して抗原を含む樹枝状細胞前駆体を得るのに充分な時間だけ、前駆体細胞を抗原と接触させ、抗原が処理され樹枝状細胞前駆体によって提示されるのに充分な条件と時間の間その抗原を含む樹枝状細胞前駆体を培養することから成る樹枝状細胞前駆体からの抗原の調製法を提供する。
食菌作用の結果として樹枝状細胞前駆体で処理された抗原は、単独または樹枝状細胞前駆体を含むアジュバントと組み合わせて、個体中での免疫応答を抗原に誘発させるのに使用される。
また、それらの個体の血液中の骨髄性樹枝状プロジェニター細胞の数を増加させる組成物および方法も提供される。
別の実施態様では、樹枝状細胞前駆体の収量が、充分な量のGM−CSFおよび他のサイトカイン中で前駆体を培養して、樹枝状細胞前駆体の増殖を促進することによって増加される。他のサイトカインには、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、TNF−α、インターロイキン−３、およびインターロイキン１α、インターロイキン−１β、インターロイキン６および幹細胞因子も包含するが、それらに限定されない。
別の実施態様では、本発明は個体が免疫応答をそれに発生させた蛋白質で本発明の樹枝状細胞をパルスさせ、関係する自己ペプチドまたは自己抗原を抽出することによって製造される自己ペプチド抗原を提供する。
本発明はまた、自己蛋白質への体制を誘導するために本発明の方法によって製造された自己ペプチドの治療上有効な量で個体を治療することによって自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
抗原が自己蛋白質であるか自己抗原であるような抗原で活性化された樹枝状細胞を治療の必要性によって個体に投与することから成る自己免疫疾病の治療も提供される。
若年性糖尿病、重症筋無力症、および多発性硬化症の群から選ばれる自己免疫疾患を治療するための本発明の組成物および方法の使用も提供される。
本発明はまた、病原論がアトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎に存在するような異常肥大のＴ細胞伝達の免疫応答を含む炎症性疾患の治療を提供する。
本発明はまた、本発明の方法によって調製された樹枝状細胞の培養物に抗原を露出させて、抗原で活性化された樹枝状細胞を製造し、ついで宿主をこの抗原で活性化された樹枝状細胞で接種することから成る宿主への抗原の提供法を提供する。
本発明はさらに、蛋白質、ウイルスおよび微生物の抗原を捕捉するためにその場で樹枝状細胞を増殖させ、つぎにインビトロまたはその場でＴ細胞に強力な方法でこれらの抗原を提示することから成るＴ細胞の活性化の方法を提供する。
本発明はさらに、MHCクラスＩおよびクラスII生成物を抗原ペプチドで提示するための成熟および前駆体樹枝状細胞の使用から成る方法を提供する。
本発明はまた、個体のMHC生成物に特異的な抗原ペプチドを作り、それによって個体内に免疫原応答を与えるのに使える特定の刺激性抗原を提示する細胞の数を増加させる方法を提供する。
また、結核を含むミコバクテリア、バクテリアおよびウイルスによって起こる疾病を含むがそれらに限定されない感染症を治療する組成物および方法も提供される。
その場での能動免疫および免疫療法のための伝播体として樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体を使用するための組成物および方法も提供される。
上記の抗原および抗原で活性化された樹枝状細胞のどれかから成るワクチンおよび本発明の組成物のどれかを投与することから成るヒトまたは動物の疾病を免疫する方法も提供される。
本発明の一つの目的は、樹枝状細胞が抗原と結合したときに免疫原またはアジュバントとしての使用に適する成熟樹枝状細胞に進化するように樹枝状細胞をインビトロで培養する方法を提供することである。
樹枝状細胞前駆体によって処理され提示されるべき抗原性物質を食菌できる樹枝状細胞前駆体を提供することも本発明の一つの目的である。
本発明のもう一つの目的は、疾病の治療または予防に有用な樹枝状細胞および樹枝状細胞前駆体の充分な量の便利で実用的な源泉を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、抗原に露出され、その表面に修飾された抗原を表現する本発明の樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体から成る新規な免疫原を提供することである。
本発明の別の目的は、樹枝状細胞前駆体または樹枝状細胞に露出されることによって修飾され、修飾された抗原はＴ−細胞依存性の抗原として有効であるような抗原を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、疾病の予防および治療のためにＴ−細胞依存性の抗原で個体を免疫する方法を提供することである。
図面の凡例
図１  樹枝状細胞「コロニー」を誘導するための工程図。
図２  増殖する凝集物から放出される樹枝状細胞のFACS分析。樹枝状細胞前駆体上で種々の細胞表面の決定基を認識する数種のmAb（23,24,28）が示されている。MHCクラスＩおよびクラスII生成物を除き、放出された細胞の表現型は均質である。一次mAbなしの染色はRB6およびRA3と同じである。図３  増殖する凝集物のパスツール・ピペッティングによって除去できる樹枝状細胞、および培養物中に自然に放出された樹枝状細胞のFACS分析。mAbは:M1/42抗MHCクラスＩ〔ATCC＃TIB126〕;NLDC145抗−絡合細胞（13）;M5/114抗−MHCクラスII〔ATCC＃TIB120〕;33D1抗−樹枝状細胞〔ATCC＃TIB227〕;B5−５抗−Thy−１。抗−MHC  mAbによる染色は双峰であるが、樹枝状細胞の放出細胞画分はMHCクラスＩおよびクラスIIの表現において最も豊富である。
図４  GM−CSFで刺激されたマウスの血液培養物から単離された集団のMLR刺激活性（本文参照）。
図５  GM−CSFの存在下に培養された骨髄内でのMLR刺激活性の進行性生育。
I a−陰性の前駆体、ＢおよびＴ細胞−減少の髄細胞は２日毎に培地の3/4を交換するGM−CSF中で培養された。各時点で、細胞は静かにピペッティングして除去した。照射の後、等級分けした髄細胞の投与を、３×105個の同種〔C57BL/6、左〕または同系〔BALB/C×DBA/2  F1〕Ｔ細胞に行い、MLR中で４日間培養した。3H−TdRの取り込みを80〜94時間目に測定した〔数値は標準誤差バーを持つ３組の平均値である〕。
図６  GM−CSFを追加した骨髄培養物中に生育するMLR刺激細胞の物理的性質（本文参照）。
A.  図５のものと類似の培養物を非付着性〔白〕および緩付着性〔黒〕の画分に分離した。後者は単分子層の上を静かにピペッティングすることによって除去できる細胞である。４日目の分離のためには緩付着性の細胞〔主に顆粒球〕を２日目に洗い流し、６日目の分離のためには顆粒球を２日目および４日目に洗い流した。細胞は照射され、図５におけるように同種Ｔ細胞に等級分けした投与で適用された。
B.  示された時点において、遊離の細胞および細胞凝集物を基質単分子層から除去し、1g沈降で分離した。凝集物は１日間培養して放出細胞を得た。これらの細胞および10mMのEDTAの存在で除去された強付着性細胞は照射してMLR刺激物質として試験した〔白四角〕。
図７  GN−CSFを追加した骨髄培養物内の凝集物からのI a−陽性の細胞の生育の細胞蛍光分析。
GM−CSFで刺激された骨髄培養物〔左、未画分〕を緩付着細胞凝集物〔中央〕および一夜の培養のあと凝集物から細胞〔右〕と比較した。細胞は４日目および６日目に取り出され、放出された細胞は５日目および７日目に分析した。細胞は非一次mAb〔no  lry〕またはmAbで顆粒球〔RB−６〕またはMHCクラスII生成物〔B21−２〕に染色し、つぎにFITC−マウス抗−ラットI gを行った。
図８  成長中の樹枝状細胞凝集物から放出されるI a−陽性の細胞の詳細な細胞蛍光分析による表現型の解析。汚染性のI a−陰性の顆粒球は低い前方光散乱に基づいてゲートアウトし、その結果図示のようにラットおよびハムスター抗−マウスmAb（7,17）を使ってより大きい細胞上での多くの表面抗原の表現を調べることができた。
図９  樹枝状細胞で制限された顆粒抗原2A1およびM342を持つ生育中の細胞の定量。
樹枝状細胞はM342および2A1（34）mAbのようなmAbと反応する細胞内顆粒を含む。マウスの髄からのI a−陰性の非リンパ球をGM−CSF中で培養し、緩付着顆粒球を２日目および４日目に洗い流した。２日目および４日目のデータはピペッティングで除去できた細胞を表し、３日目および５〜８日目のデータは単分子層から放出された細胞であった。示された各時点において、調製された染色されたサイトスピン中に少なくとも500個の細胞が数えられた〔本文参照〕。５×105個/cm2の細胞で開始し、２日毎に3/4容の新しい培地を添加した場合、総細胞およびI a+細胞の収量は、２日目で1.05×106および2.1×104、４日目で1.81×106および2.12×105、６日目で1.51×106および3.21×105であった。
図10  成長している樹枝状細胞のプロジェニター−後代の関係。成長している凝集物は４日目に骨髄培養物から分離し、0.1μCi/ml、３×105個／ウエルの細胞で、3H−TdRで12時間パルスした。すべてのウエルは新しい培地で置換し、１、２または３日の追跡で培養物に戻した。追跡中の放出細胞の収量は、それぞれウエル当たり2.0、2.9および3.0×105であった。I a+細胞の含有量は、パルスのあと28％、１日目、２日目および３日目でそれぞれ47％、55％および62％であった。データは、放射能で標識された細胞の百分率として表示され、線で埋めた部分は成熟樹枝状細胞の2A1顆粒細胞抗原を表現する細胞である。
図11  GM−CSFを追加した骨髄培養物中での樹枝状細胞の成長の提案経路図。増殖する凝集物は細胞ストローマに付着するか、それ自身付着性の前駆体から生成する。凝集物の周辺とそれから放出される細胞内で明白な樹枝状細胞の分化の間に、細胞過程、MHCクラスII、NLDC−145表面抗原、およびM342および2A1細胞内抗原〔本文参照〕の進行性増加およびプラスチックへの付着の進行性減少がある。
図12  ラテックスおよび炭素に露出された生育中の樹枝状細胞の差動−迅速染色。
A.  ２μのラテックス球に20時間露出したあとにサイトスピンされた生育中の樹枝状細胞の凝集物。凝集物中の多くの細胞は均一なラテックス粒子〔矢印〕で標識されている。
B.  Ａと同じ。ただし、培養物は１日追跡して成熟単一樹枝状細胞の製造を行った。放出された樹枝状細胞の多くは、透明な切断された中心球のまわりに配置された均一で半透明なラテックス球を含む〔矢印〕。
C.  ＡおよびＢと同じ。ただし、凝集物はコロイド状炭素でパルスし、つぎに炭素を含まない培地中で追跡した。凝集物から放出する成就樹枝状細胞のいくつかの中心球は、黒色の消化できない食菌トレーサー〔矢印〕の小さいが透明な切断されたエンドサイティック顆粒を含む。
D.  成熟樹枝状細胞を増殖する凝集物から製造したあと、炭素に露出させた。炭素の付着は明白ではない。
図13  抗酸菌および樹枝状細胞抗原のための二色標識を使用する生育中の樹枝状細胞へのBCGの取り込み。生育中の樹枝状細胞のクラスター〔GM−CSFで誘導された6d髄クラスター〕を、２時間BCGに露出した。単分子膜を洗浄し、GM−CSFで２時間培地中で追跡した。細胞を解離し、FITC−抗−Ｉ−Ａ  mAbで標識し、クラスIIに富んだ細胞を細胞選別で単離した〔培養物中の細胞の大部分は前記のようにクラスIIに富んでいた（16）〕。選別された細胞はサイトスピンし、オーラミン−ローダミンで染色して細胞に会合したBCGが目で見えるようにし、種々のmAbおよび免疫ペルオキシダーゼで二重標識した。各一対の左および右のパネルはそれぞれ位相差および抗酸染色の像である。左の矢印は右の桿菌の位置を示す。クラスIIの標識〔Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ、M5/114〕は、樹枝状細胞で制限されたNLDC−145抗体よりも良く細胞過程を概説する。
図14  樹枝状細胞中のBCGの電子顕微鏡観察。
図２に示したように、GM−CSFで刺激した６日目の骨髄に１日間加えた。洗浄してもう２日間培養したあと、放出された細胞を電子顕微鏡観察のために処理した。
A,B  多数の過程および僅かの食菌されたBCG〔矢印〕を持つ典型的な樹枝状細胞を示す低電力写真。
C,D  BCGに対する食胞膜、ならびにエンドサイティック空胞〔Ｅ〕、ゴルジ装置〔GA〕、および密なコアを持った小さい小胞〔＊〕を含む樹枝状細胞の中心球の細胞内器官を示す高電力写真。
図15  CFA感作/IFA感作Ｔ細胞への抗原提示。
完全〔CFA〕または不完全〔IFA〕フロイントアジュバントで感作された脚を排液するリンパ節から精製された。種々のAPCが表示されている。成熟樹枝状細胞は８日間の骨髄培養物であり、未熟樹枝状細胞は５〜６日間の培養物からのものである。
図16  その場での無垢なリンパ節Ｔ細胞への抗原提示。
骨髄樹枝状細胞の成長中の培養物を５〜６日目にBCGでパルスし、直後または２日間の追跡培養の後にＴ細胞の活性化に使用した。この集団を人口のアジュバントなしに無垢のマウスの脚に注射した。５日後に、排出するリンパ節を採りPPDまたはBSAの段階投与でインビトロで刺激し（樹枝状細胞はウシ胎仔血清で成長した）、BSAは非粒子抗原として働いた。データは５匹のマウスの群の平均値および標準誤差であり、それぞれ別々に検討された。BCGでパルスされた樹枝状細胞に露出されない対照のリンパ節は、PPDまたはBSAに応答しなかった（＜2000cpm）。
図17  その場での無垢な脾臓細胞への抗原提示。
骨髄樹枝状細胞の成長中の培養物を５〜６日目（未成熟）、７〜８日目（成熟）または５〜６日目にBCGでパルスし、つぎに２日間追跡した。各群の106個の細胞をマウスの群にi.v.で注射した。５ないし10日後、脾臓細胞を抗原としてのPPDまたはBSAの段階投与でインビトロで培養した。樹枝状細胞はFCS中で培養されたので、BSAの使用は、すべての樹枝状細胞集団がインビボで比較的免疫原性であることを確保するコントロールとして働く。感作されていない脾臓はBSAにもPPDにも応答しなかった。
図18A,BおよびＣ  実施例６に記載する方法によって製造されたヒト樹枝状細胞の混合白血球反応（MLR）分析。照射された細胞の段階投与（一連の３倍希釈で30ないし30,000）を、２×105個の補助細胞で排液されたＴ細胞に添加した。サイトカイン不在（×）、またGM−CSF（○）、GM−CSF＋IL−１α（●）、GM−CSF＋TNF−α（□）、GM−CSF＋TNF−α＋IL−１α（■）、GM−CSF＋IL−３（△）、およびGM−CSF＋IL−3IL−１（▲）の存在で培養された細胞のＴ細胞応答を５日目に3H−チミジンの16時間パルスで測定した。非樹枝状細胞の応答もＣに示す（◆）。三の異なった実験を示す。実験ＡおよびＢのための細胞を提供する患者は、Ｇ−CSFで前処理され、実験Ｃの患者はGM−CSFで前処理された。サイトカインは下記の濃度で使用した。rhuGM−CSF:400または800U/ml;rhuIL−１α、50LAF単位/ml（IL−１αは細胞の収集に先立つ最後の24時間の間だけ培養物中に存在する）;rhuTNF−α、50U/ml;およびrhuIL−３、100U/ml。Ｘ軸上の数値は樹枝状細胞の存在しないＸを除いて樹枝状細胞の数を表し、この数値は総細胞数に等しい。３回の培養物の標準偏差は平均値の10％未満であり、表示されていない。
発明の詳細な説明
本発明は、インビトロで成熟する増殖中の樹枝状細胞前駆体の培養物を製造して樹枝状細胞を成熟させる方法に関する。本発明の方法で製造される樹枝状細胞および樹枝状細胞前駆体は、疾病の予防および治療のための種々の免疫学的介入に適した量で製造できる。
樹枝状細胞前駆体および成熟樹枝状細胞の製造法のための出発物質は、本発明の方法で処理した時、前駆体細胞が樹枝状細胞にインビトロで増殖および成熟できる樹枝状細胞前駆体から成る組織源である。そのような前駆体細胞は非付着性であり、I a抗原、2A1およびM342抗原（34,44）およびNLDC145絡合細胞源抗原（13）のような成熟樹枝状細胞に見られるmAbマーカーでは標識されない。好ましくは、そのような組織源は脾臓、求心性リンパ液、骨髄および血液である。より好ましい組織源は骨髄および血液である。血液は入手し易く比較的大量に得ることができるので、前駆体細胞の好ましい組織源である。
ヒトを含む動物の樹枝状前駆体細胞の数を増加させるために、そのような個体を造血を刺激する物質で処理するのが好ましい。そのような物質にはＧ−CSFやGM−CSFがあり、また造血を促進する他の因子も含まれる。投与すべき造血因子の量は、その因子が投与される個体の細胞のディファレンシャルを監視することによって当業者が決定できる。典型的には、Ｇ−CSFおよびGM−CSFのような因子の投与量は、細胞毒性薬剤での治療から回復する個体の治療に使う投与量に類似したものである。好ましくは、組織源の取り出しの前に標準投与量で４ないし７日間投与して、樹枝状細胞前駆体の比率を増加させる（論説、Lancet、339:3月14日、1992、648〜649）。例えば、我々は１日あたり300マイクログラムのＧ−CSFの投与を５ないし13日間、400マイクログラムのGM−CSFの投与を４ないし19日間行うと、相当量の樹枝状細胞が得られる結果になることを確認した。
胎仔血または臍帯血は成長因子に富むが、前駆体樹枝状細胞を得るための血液の好ましい源泉でもある。
本発明の方法によれば、他の細胞の種類に対して樹枝状前駆体細胞の比率を増すように培養する前に、組織源を処理することができる。そのような前処理はまた、樹枝状前駆体細胞の増殖と競合するか、またはその増殖または生存を抑制する細胞を除去できる。前処理は、インビトロの培養により適する組織源を作るのにも使用できる。処理の方法は、多分個々の組織源によって組織特異的である。例えば、組織源として使用された場合、脾臓または骨髄は先ず単一細胞を得るように処理され、つぎに適当な細胞分離方法で他の種類の細胞から白血球を分離する。血液の処理は、毒性である赤血球（RBC）を含む他の細胞から白血球を分離する細胞分離技術を含む。RBCの除去は、当業者に公知の標準的な方法で達成できる。さらに、RBCを結合する抗−赤めモノクローナルVIE−64抗体のような抗毒素も、パンニング法を使用する除去のための基体へのRBCの結合を促進するのに使用できる。
本発明の好ましい方法によれば、骨髄を組織源として使用するとき、Ｂ細胞はGM−CSF中で骨髄を培養する前に除去される。Ｂ細胞およびプレＢ細胞はGM−CSFに応答して成長はしないけれども、それらは最初の髄の懸濁物の約50％を表し、それによって樹枝状細胞を迅速に数え上げるための抗−I aモノクローナル抗体による染色の利用を妨げる。さらに、顆粒球はGM−CSF応答性であり、GM−CSFの存在で容易に増殖する。そのようにして、Ｂ細胞および顆粒球は樹枝状細胞前駆体の存在を隠蔽する。Ｂ細胞は、マクロファージおよび顆粒球と樹枝状細胞を区別するのに有用なマーカーであるM342および2A1顆粒抗原を表現できる。さらに、顆粒球は培養物を過剰成長させ、役に立つGM−CSFと競合する傾向がある。本発明の最も好ましい方法は、培養中の最初の２〜４日の間に静かに洗浄することによって、骨髄培養物から非付着性の新しく生成した顆粒球を除去することである。
好ましくは、前駆体の増殖に競合し隠蔽する細胞の前処理の一つの形として、樹枝状細胞を殺す。そのような前処理は、補体を含む培地中の樹枝状前駆体細胞上に存在せず抗原に特異的な抗体に骨髄を接触させることによって、樹枝状前駆体細胞上で表現されない抗原を表現する細胞を殺すことから成る。本発明での使用に適した好ましくない細胞の除去のための別の形の前処理は、好ましく内細胞上に表現される抗原に特異的な抗体を使用して、固体の支持体上にその好ましくない前駆体細胞またはその前駆体を吸着させることである。種々の種類の固体支持体に細胞を吸着させるいくつかの方法が当業者に公知であり、本発明への使用に適している。例えば、ペトリ皿のようなプラスチックの表面を使って「パニング」することで好ましくない細胞を除去できる。別の適切な方法としては、磁気ヘッドの上に細胞を吸着させて磁力で分離させるか、または免疫ビーズの上に吸着させて重力で分離させる方法がある。樹枝状細胞前駆体の増加した量を含む非吸着細胞をつぎに、パニングを含む公知の方法で固体支持体から分離することができる。これらの前処理工程は二つの目的がある：培養物中の非樹枝状細胞の前駆体を破壊または復活させることと、培養物中でGM−CSFと競合する樹枝状細胞前駆体の比率を増加させることである。
さらに、I a−陽性の細胞、すなわちＢ細胞およびマクロファージは、好ましくは抗−I a抗体、好ましくはモノクローナル抗体、と補体の混合物の存在で細胞を培養することによって殺す。骨髄中にも存在する成熟樹枝状細胞は、骨髄からの細胞が抗−I a抗体の存在で培養された場合にも殺されるが、これらの成熟樹枝状細胞は血液および骨髄中に、これらの成熟樹枝状細胞の致死が樹枝状細胞前駆体の増殖および産出を有意に行わないほど少ない量で存在し、かつそれほど樹枝状細胞前駆体と違った抗原性マーカーを所有している。骨髄中にやはり存在し得るＴおよびＢ細胞ならびに単球は、ＴおよびＢ細胞抗原および単球に対し指向された抗体を包含させることによって殺すことができる。そのような抗原は、CD3、CD4、Ｂ細胞抗原B220、thy−１、CD8および単球抗原を含むが、それらに限定されない。骨髄からの残存生細胞はつぎに役500〜1000U/mlのGM−CSFを追加した培地中で培養し、下記のように培養する。CD4およびCD8は若い樹枝状細胞前駆体上に存在し得るので、これらの抗原に指向された抗体は樹枝状細胞前駆体の集団を壊滅させ得る。
血液を組織源として使用する場合、血液の白血球はその生存率を保つ従来法を使って取得することができる。本発明の好ましい方法によれば、ヘパリン（約100U/ml）または他の抗凝集剤を含む培地（好ましくはRPMI）で血液を希釈する。培地に対する血液の容積比は約１対１である。細胞はペレット化し、４℃で約1000rpm（150g）で培地中で血液を遠心分離することによって洗浄する。血小板および赤血球は、培地および塩化アンモニウムの混合物に細胞ペレットを懸濁させることによって壊滅させる。塩化アンモニウム（最終濃度0.839パーセント）に対する培地の混合比は、容積で約1:1が好ましい。細胞は遠心分離でペレット化し、培地−塩化アンモニウム混合物中でもう２回、または血小板および赤血球を実質的に含まない白血球の集団が得られるまで、洗浄する。
通常組織培養に使用されるどんな等張液も、血小板および赤血球から血液の白血球を分離するための培地として使用できる。そのような等張液の例は、燐酸で緩衝された食塩液、ハンクス平衡塩類溶液、または例えばRPMI1640を含む完全増殖培地である。RPMI160が好ましい。
組織源の処理によって得られた細胞を培養して、GM−CSFまたはGM−CSFに典型的な生物学的活性を保持するアミノ酸配列を持ったGM−CSF誘導体の蛋白質またはペプチドを追加した培養培地中の適切な基体上に一次培養物を生成する。適切な基体は細胞が付着するどんな細胞培養適合性の表面でもよい。好ましくは、基体は組織培養に使用されるように処理した市販のプラスチックである。例としては、種々のフラスコ、ローラーボトル、ペトリ皿および組織培養用につくられたマルチウエル・プレートがある。例えばコラーゲンまたはポリ−Ｌ−リジンのような物質、または細胞付着を促進する特定の細胞の種類に特異的な抗体で処理された表面も、それが下記のように細胞の示差的付着を許すならば使用することができる。細胞は好ましくは約7.5×105個/cm2の細胞の初期細胞密度でプレートする。この分量では表面は完全には細胞で覆われないが、大きい空白部（２〜３細胞経）はない。
非樹枝状細胞前駆体の比率を低下させるように処理された骨髄を培養する場合は、増殖する樹枝状細胞前駆体から成る凝集物が生成する。樹枝状細胞前駆体から成るI a−陰性の髄非リンパ球は好ましくは約106個／ウエル（５×105個細胞/cm2）という高い個数で培養される。樹枝状細胞前駆体の培養以外の目的で作られる液状の髄培養物は典型的にはこの分量の1/10で接種するが、生育中の樹枝状細胞の集団を同定し単離するのは困難である。
本発明の各段階における細胞の増殖培地は、前駆体樹枝状細胞の生存および増殖を許すものであるべきである。細胞培養に典型的に使用される増殖培地は、GM−CSFを追加した培地であればどんなものでも本発明の方法に従って使用できる。好ましい培地には、樹枝状前駆体細胞の増殖を促進するために血清おあたは一定のホルモンの組み合わせの適当量を追加したアミノ酸およびビタミンを添加したRPDI、DMEMおよびα−MEMがある。ホルモンを追加した無血清培地も樹枝状細胞前駆体の培養に適する。５％のウシ胎仔血清（FCS）およびGM−CSFを追加したRPMI1640が好ましい。細胞は、他の血清中で血清の他の濃度において増殖するように選定され採用されてもよい。ヒトの組織からの細胞も、FCSでなくヒトの血清を追加した培地で培養してもよい。培地は培養物のバクテリア感染を最少にするために抗生物質を含んでもよい。ペニシリン、ストレプトマイシンまたはゲンタマイシンまたはそれらを含む組み合わせが好ましい。細胞が培養される培地、または培地の一部は、GM−CSFを含む新鮮な栄養物を与えるために、定期的に補給されねばならない。
驚くべきことに、GM−CSFは前駆体樹枝状細胞のインビトロの増殖を促進することがわかった。細胞は、樹枝状細胞前駆体の生存と増殖を促進するのに充分な濃度のGM−CSFの存在で培養する。その分量は、GM−CSFに対する他の細胞（特にマクロファージおよび顆粒球）からの競合の量または細胞集団中のGM−CSFの不活性化剤の存在に左右される。好ましくは、細胞は約１ないし1000U/mlのGM−CSFの存在で培養する。もっと好ましくは、血液からの細胞は約30ないし100U/mlの濃度のGM−CSFの存在で培養される。この分量はマウスの血液から得た細胞による最大の応答に必要にして充分であることが分かった。最も好ましくは、細胞は約30U/mlの濃度のGM−CSFの存在で培養する。約400〜800U/mlの濃度のGM−CSFは血液からの増殖中のヒトの樹枝状細胞を培養するのに最適であることが分かった。利用できるGM−CSFと競合する多数の増殖中の顆粒球の存在のために、骨髄からの細胞は高濃度のGM−CSFを必要とし、そのため髄から得られる細胞の培養には約500〜1000U/mlの分量が好ましい。
マウスの骨髄の懸濁物をGM−CSFの存在で培養する場合は、三種の骨髄細胞の数が増加する。（１）好中球が優勢であるが培養物の表面には付着しない。好中球は独特の核構造を有し、RB−６抗原を表現し、MHCクラスII生成物を欠く。（２）マクロファージは培養容器に強固に付着し、かなりの水準のF4/80抗原を表現し、大部分はほとんどまたは全くMHCクラスIIを表現しない〔ただし、下記参照〕。
マウスまたはヒトの血液の白血球を30U/mlまたは400〜800U/mlで、それぞれ培養する場合は、培養物は多数の凝集物または細胞球を発生し、これから典型的な樹枝状細胞が最後に放出される。GM、CSFが存在しない場合は、コロニーは生育しない。特性的に大きい板状の突起または膜を伸ばす樹枝状細胞を最初に検出するのに細胞学的基準を使用してもよい（25〜27）。
GM−CSFは、天然の源泉から単離、組換えDNA技術で製造または化学合成で調製できる。ここで使用されるGM−CSFはいろんな方法でいろんな種から製造されるGM−CSFを含む。「GM−CSF」は、ここでは天然に存在する（天然の）GM−CSFのすべての生物活性なアナログ、フラグメントまたは誘導体として定義される。そのようなフラグメントまたは誘導体の形のGM−CSFは、樹枝状細胞前駆体の培養物中での増殖も促進しなければならない。さらに、生物学的活性を持つGM−CSFペプチドは、適当な細胞の種類にGM−CSFレセプターを結合させる能力によって同定される。
さらに樹枝状細胞の収量を増加させるためには、GM−CSFのほかに培養培地にさらにサイトカインを含ませるのが望ましい。そのようなサイトカインには顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−CSF）、単球−マクロファージコロニー−刺激因子（Ｍ−CSF）、インターロイキン１αおよび１β、３および６（それぞれIL−１α、IL−１β、IL−３およびIL−６）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、および幹細胞因子（SCF）がある。サイトカインは、樹枝状細胞前駆体の増殖または生存をよくすることによって培養物中に存在する樹枝状細胞の比率を増加するのに有効な量で使用される。サイトカインは下記の濃度で存在するのが好ましい:IL−１αおよびβ、１ないし100LAF単位/ml;TNF−α、５〜500U/ml;IL−３、25〜500U/ml;M−CSF、100〜1000U/ml;G−CSF、25〜300U/ml;SCF、10〜100ng/ml;およびIL−６、10〜100ng/ml。サイトカインのさらに好ましい濃度は:IL−１α、50LAF単位/ml;TNF−α、50U/ml、IL−３、100U/ml;M−CSF、300U/ml;およびＧ−CSF、100U/mlである。好ましいサイトカインは、ヒトの蛋白質である。最も好ましいサイトカインは、組換え技術（rhu）を使ってヒトの遺伝子から製造される。約10〜50U/mlからの濃度の（TNFα）が、樹枝状細胞の収量を数倍に増加させるのに使用できる。
組織源からの一次培養物は、湿度およびpHの標準組織培養条件で約37℃で非付着生の細胞の分離を許すのに充分な程度に、基体に細胞の集団が付着するまで培養される。血液中の樹枝状細胞前駆体は、単球と違って最初はプラスチックに付着性がないので、前駆体は一夜の培養のあと分離できる。単球および線維芽細胞は、付着性細胞の大部分をなすと考えられ、普通約６時間ないし約２時間以内に基体に付着する。好ましくは、非付着性の細胞は約８ないし16時間の間に付着性の細胞から分離される。最も好ましくは、非付着性の細胞は約12時間で分離される。付着性の細胞のかなりの量を除去しないどんな方法でも、非付着性の細胞からの付着性細胞の分離に使用できる。好ましくは、細胞は簡単な振盪またはピペッティングによって除去される。ピペッティングが最も好ましい。
この一次培養物からのヒトの血液から前駆体細胞を培養するために、樹枝状細胞前駆体ではない細胞を排除した細胞を、好ましくは約５×105個細胞/cm2の密度で基体上で培養する。毎日フィードして５日後に、細胞の凝集物（「ボール」ともいう）が現れる。これらの凝集物は次に下記のように処理してもよい。
一次培養物からの非付着性の細胞は、細胞の生存を許し培養物表面または表面上の強固に付着した細胞に緩く付着した増殖中の細胞のクラスターの時間的な増殖をもたらすのに充分な密度でそれを新しい培養フラスコに移すことによって継代培養する。これらのクラスターは、増殖する樹枝状細胞前駆体の病巣である。ここで使用される「培養フラスコ」という用語は、細胞の培養に適した容器をいう。一次培養物からのすべての非付着性細胞は、約２×105個/cm2ないし約５×105個/cm2の細胞の密度で継代培養するのが望ましい。約2.5×105個/cm2が好ましい。細胞は、培養皿の表面が非付着性の細胞の凝集物の固定されたマクロファージおよび線維芽細胞を含む強固に付着した細胞の単分子で覆われるのに充分な時間、培養する。この時点で、すべての非付着性細胞はウエルから除去され、細胞凝集物は継代培養から解除される。好ましくは、凝集物からの細胞は約10日後またはcm2当たりの凝集細胞の数が約３ないし４×105個に達したときに継代培養される。
凝集細胞を連続的に継代培養するには、凝集細胞を付着性細胞から除去し、凝集細胞を、好ましくは親培養物の表面積の約２ないし５倍の全表面上で継代培養する。より好ましくは、細胞を親培養物の表面積の約３倍の表面積上で継代培養する。樹枝状細胞に典型的な板状の突起を持つ細胞は、約４〜７日目に培養物中に現れる。培養の約４日目ないし７日目の間に、一定の表面積から回収できる単細胞の数は２倍になる。樹枝状細胞前駆体も成熟樹枝状細胞も凝集物中に存在する。
骨髄から樹枝状細胞を製造するには、好ましくは増殖中の成熟度の低い樹枝状細胞の特有の凝集物を培養の約４〜６日目より後にストローマから分離する。多数の樹枝状細胞が放出され、成熟樹枝状細胞の基本的な特徴を表すのはこの放出された集団である。骨髄は最初血液よりも高い比率の樹枝状細胞前駆体を含むので、骨髄から得られた細胞の約４〜６日間の培養だけで、血液から得られる細胞の約10〜25日間の培養で得られるのとほぼ同数の細胞を達成する。
樹枝状細胞の血液から誘導した集団をさらに増やすには、樹枝状細胞前駆体の連続的な増殖を与える間隔で数回連続的に細胞凝集物を継代培養する。好ましくは凝集物は、樹枝状細胞の形態を持つ細胞の大部分を培地中に放出する前に、例えば約３ないし30日間継代培養する。より好ましくは、細胞凝集物は約10ないし25日間、最も好ましくは20日間継代培養する。細胞を連続的に継代培養する回数は、必要な細胞数、細胞の生存率、および樹枝状細胞を放出する細胞凝集物を製造し続ける培養物の能力に左右される。好ましくは、細胞は約１ないし２ケ月の間、連続的に継代培養でき、そのあと約１回ないし５回日付着性の細胞が継代培養される。より好ましくは、２回ないし３回細胞を連続的に継代培養する。最も好ましくは、細胞を２回継代培養する。
好ましい方法によれば、一次およびその後の培養物の細胞を連続的に継代培養するには、増殖中の樹枝状細胞ならびに増殖中のマクロファージおよび線維芽細胞の単分子層中の若干の細胞の凝集物の大部分をピペッティングすることによって細胞を除去する。ピペッティングは通常、凝集物、特に成熟度の高い凝集物の周辺細胞を引き離す。培養期間中、例えば２週目に増殖中の樹枝状細胞の凝集物はより安定になり、1gの沈降による分離のために凝集物を除去することが可能である。
増殖中の培養物から成熟樹枝状細胞を単離するには別の方法が使える。一つは非付着性の細胞を除去し、1gの沈降によって基体に付着した細胞および単細胞から凝集物を分離するものである。つぎに、さらに１〜２日間の培養で凝集物から多数の樹枝状細胞を放出させ、一方文献記載の密なメトリザミド上での浮遊によって他の単細胞から成熟樹枝状細胞を分離できる（FreudentalおよびSteinman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:7698〜7702、1990）。もう一つの方法は、より簡単であるが本質的に過程の増殖段階を終了させるものであって、凝集物が非常に大きい場合すべての非付着性細胞を補集し、細胞を約20分間氷上に置き、ピペットで激しく再懸濁させて凝集物を解凝集し、メトリザミドカラム上に成熟樹枝状細胞を浮遊させるものである。
典型的には、５個の16mmのウエルの内容物を、15mlの円錐管内の50％FCS−RPMI1640の6mlのカラムに供給する（Sarstedt、62.553.002PS）。少なくとも20分後、加えた培地およびカラムの上部1mlを除く。RPMIを加え、凝集物を４゜で５分間1000rpmでペレット化し、細胞を継代培養のために新しい培地に静かに懸濁させる。
培養物中に存在する細胞を同定するのには種々の方法が使える。この方法には形態の解析、モノクローナル抗体による細胞の種類に特異的な抗原の検出、トリチウム標識チミジンオートラジオグラフィーを使用する増殖中の細胞の同定、混合白血球反応の分析および樹枝状細胞ホーミングの表示がある。
樹枝状細胞は、その星形の形状で検出されるほか、モノクローナル抗体を使用する特定の抗原の表現を検出することによっても同定できる。
一団のモノクローナル抗体が、GM−CSFで増大した培養物中の細胞を同定し特徴づけるのに使用できる。このモノクローナル抗体は別の文献に概論されている（23,24参考として添付）。
成熟樹枝状細胞の同定に適した特定のモノクローナル抗体は:1）MHCクラスＩ抗原に結合するもの（M1/42抗−MHCクラスＩ〔ATCC＃TIB126〕）;2）MHCクラスII抗原に結合するもの（B21−２抗−MHCクラスII〔ATCC＃TIB229〕;M5/114抗−MHCクラスII〔ATCC＃TIB120〕）;3）熱安定性抗原に結合するもの（M1/69抗−熱安定性抗原〔HSA、ATCC＃TIB125〕）;4）33D1抗−樹枝状細胞抗体〔ATCC＃TIB227〕;5）絡合細胞抗原に結合するもの（NLDC145抗−絡合細胞（13）；および６）成熟樹枝状細胞の核周部分の顆粒中の抗原の結合するもの（モノクローナル抗体2A1およびM342、（23）Aggerら）。本発明の樹枝状細胞で表現され、成熟樹枝状細胞の検出に使用できる他の抗原は、CD44（モノクローナル抗体2D2Cで同定）およびCD11b（モノクローナル抗体M1/70で同定）である。M1/69、M1/70、M1/42モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体、NY、Plenum1980、R.Kennettら編、185〜217頁に記載され、これは参考として添付してある。当業者は、成熟樹枝状細胞の同定に適した他の抗体も調製し特徴づけ得ることを認めるであろう。同様に、樹枝状前駆体細胞の製造は、樹枝状前駆体細胞に特異的な抗体の製造も促進する。
増殖中の細胞および後代を同定し表現するためには、培養物をトリチウム標識チミジンで標識して有系分裂のＳ期に細胞を同定することができる。有系分裂標識で細胞を標識するのに加えて、細胞は、成熟樹枝状細胞を伴ったマーカーが表現される場合に、モノクローナル抗体で共標識することもできる。樹枝状細胞前駆体の特有の表現型は安定であり、そのため例えばマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−CSF）中に保持された場合にでも、樹枝状細胞の後代はマクロファージにならない。
樹枝状細胞の成熟度のもう一つの指標は、混合白血球反応（MLR）中のＴ細胞の増殖を刺激する成熟樹枝状細胞の能力である。リンパ節に移行する樹枝状細胞の能力、すなわち樹枝状細胞のホーミングは、樹枝状細胞の成熟度のもう一つの指標であり、培養物中の細胞の成熟度を評価するのに使用できる。
本発明により樹枝状前駆体細胞を同定するのに明白になった基準は、他の器官内での樹枝状細胞の増殖中のプロジェニターの同定を可能にする。増殖中の前駆体が脾臓（15）および求心性リンパ液（16）中の樹枝状細胞の集団の急激な移動を生じさせることは公知である。〔Ｔ細胞以外の〕白血球の増殖が骨髄内で起こるが、樹枝状細胞にとっては、髄が血液および他の組織をプロジェニターでシードし、それがつぎにここに示すように強力に増殖する。本発明の方法によってさもなくば痕跡の樹枝状細胞を多数調製できるこよによって、樹枝状細胞の機能の以前は未検討であった他の領域がいまや解決できる。特に、増殖中の樹枝状細胞は、免疫源的形態に抗原を捕獲し保持し、インビボでの免疫性の発生のためのアジュバントとして働く能力を含めて、これらのAPCの作用の機構II関する分子的および臨床的研究を促進するであろう。
複雑な微生物および細胞の抗原へのＴ細胞の応答をその場で修飾するための構成蛋白質およびペプチドの使用への関心が増加している。典型的には、明礬のような人工のアジュバントが最大の免疫源的効果を得るのに必要である。樹枝状細胞とともに、ただし追加のアジュバントなしに投与した場合、免疫源性であることが公知のいくつかの抗原がある（１）。その場での樹枝状細胞の免疫源性は、例えば接触アレルゲン（45）、移植抗原（46〜49）、およびさらに最近は外来蛋白質（31,50,51）で示される。他の種類の抗原は微生物、腫瘍およびウイルスの抗原を含むが、これらに限定されない。感作されたＴ細胞は宿主APCでなく免疫樹枝状細胞の特定のMHCの種で提示される抗原だけを認識するように限定されるので、樹枝状細胞は直接APCとしてその場で作用する（14,31,50,51）。これらの知見は、樹枝状細胞が免疫源性の形でその場で蛋白質抗原を捕捉するときに有効であるというデータ（52〜54）と組み合わせて、これらのAPCが「自然界のアジュバント」であると考えることを可能にする。従って、本発明は臨床および治療の実践において可能性を示すその独特の抗原を活用するために、充分な量の樹枝状細胞前駆体を提供するのに適した補法および組成物を開示することによって樹枝状細胞の利用を可能にする。
樹枝状細胞は、複合抗原を処理して自己MHC生成物で提示されるそのペプチドにすることができる。我々の発明の好ましい実施態様の一つは、増殖中のプロジェニターからの生育における初期の段階で樹枝状細胞前駆体が粒子を嵌入させる樹枝状細胞の使用法である。我々は、骨髄懸濁物のGM−CSFによる刺激が増殖する樹枝状細胞前駆体のクラスターの生産をもたらすことを立証した。クラスター内で3H−チミジンでの標識をパルスする細胞は、樹枝状細胞の特徴的なマーカー、すなわちNLDC−145抗原および高水準のMHCクラスIIのような星形および抗原的な特徴を欠く。パルス追跡実験では、樹枝状細胞の特徴のすべてを持った3H−チミジン標識の後代が放出される。我々は凝集物内の細胞も食菌性であり、類似のパルス追跡プロトコルにおいて後代樹枝状細胞は食菌的な食事で明瞭に標識されることを見出した。粒子が結核を起こすようなBCG微生物である場合、樹枝状細胞を伴うミコバクテリア抗原はインビトロかつその場で強力にＴ細胞に提示される。
外来および自己抗原は、本発明の樹枝状細胞によって処理されてその免疫源的形態を保持する。抗原の免疫源的形態は、分断による抗原の処理を含み、Ｔ細胞によって認識されてそれを刺激することのできる抗原の形態を作る。個お増し▲９▼は、そのような外来または自己抗原は、樹枝状細胞によってペプチドに処理される蛋白質である。樹枝状細胞にょって生産される関係のペプチドは免疫源としての使用のため抽出および精製してもよい。
樹枝状細胞で処理されたペプチドは、樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体で処理された蛋白質に寛容性を導入するための寛容源としても使用できる。好ましくは、寛容源として使用する場合、樹枝状細胞上に存在するB7のような補助分子をブロックすることによってその補助機能を抑制することによって免疫応答を誘発する能力を低下させるように処理された樹枝状細胞上にその処理されたペプチドは存在する。
本発明の抗原で活性化された樹枝状細胞は、本発明の方法で調製された樹枝状細胞に、インビトロで、抗原を露出させることによって製造される。
樹枝状細胞は培養皿内にプレートされ、樹枝状細胞に抗原を結合させるのに充分な時間、充分な量の抗原に露出させる。樹枝状細胞に抗原を結合させるのに仏用な量および時間は、免疫アッセイまたは結合アッセイによって決定できる。当業者に公知の他の方法も樹枝状細胞上の抗原の存在を検出し、つぎにそれを抗原に露出させるのに使用できる。
理論に拘束されずに、現在の情報は樹枝状細胞の生育は下記の経路で進むことを示唆する〔図11〕。血液および髄の両方の樹枝状細胞前駆体は、MHCクラスII抗原ならびにＢおよびＴ細胞および単球マーカー〔B220、CD3、thy−１、CD4/8〕を欠き、前駆体は非付着性である。前駆体はストローマに付着し、クラスIIの陽性細胞の凝集物を生じる。多分、成長中の凝集物は遅い時期にも強固に付着した単分子層中に見出される強くクラスII−陽性の細胞のサブセットから発生する。しかし、これらの強固に付着したクラスIIに富む細胞は樹枝状細胞のMLR刺激活性を欠き、かなりの水準のFcγレセプターおよびF4/80抗原を表現できる。生育の最終段階は、緩やかに付着した凝集物が成熟した非増殖性の樹枝状細胞を放出するときである。後者は高水準のMHCクラスII〔図２〜３〕を持ち、脾臓から放出された多くの樹枝状細胞と全く同様にプラスチックに一時的に付着できる（25）。生育は凝集物内で起こるので、FcγレセプターおよびF4/80抗原のための細胞質染色の水準の低下、および樹枝状細胞に特徴的な顆粒〔M342、2A1〕および表面抗原〔33D1、NLDC145〕の増加があるようである。最後に、一次Ｔ−依存性免疫応答のための補助機能は、生育中の凝集物から細胞が放出されるに従って増加する。
成熟樹枝状細胞は、Ｔ細胞を種々の抗原に感作するのに有効であるが、食菌活性をほとんどまたは全く示さない。エンドサイトーシスが抗原の処理および提示に要求される程度において、どのように樹枝状細胞が粒子に付随するペプチドを提示するかは前もって明白ではなかった。我々の研究によれば、本発明の提供する樹枝状細胞に対するプロジェニターは、処理および提示のためのそのような粒子を嵌入できることが今や明白である。食菌によって嵌入できる粒子の種類は、バクテリア、ウイルス、ミコバクテリアまたは疾病を起こし得る他の感染剤を含む。従って、本発明の樹枝状細胞前駆体によって嵌入され処理されるすべての抗原性粒子は、本発明の一部として記載されている種々の免疫源、寛容源およびワクチンの製造にも適する。樹枝状細胞または樹枝状細胞前駆体による抗原の処理はつぎに提示されるフラグメントへの抗原の分断を含む。
樹枝状細胞前駆体による粒状物の食菌は、細胞が抗原を食菌、処理および提示するのに充分な時間、粒状物の存在で樹枝状細胞前駆体を培養することによって達成できる。好ましくは、粒子の存在における細胞の培養は、１ないし48時間行わねばならない。もっと好ましくは、粒状物の存在での細胞の培養は約20時間である。当業者は細胞が粒子を食菌するのに必要な時間が細胞の種類と食菌される粒子の性質に左右されることを認めるであろう。そのような食菌の程度を監視する方法は、当業者に公知である。
細胞は、細胞表面に抗原が嵌入され提示されるのに充分な時間抗原に露出されるべきである。細胞が処理された抗原を嵌入し提示するのに必要な時間は、抗原への露出についで洗浄時期があるパルス−追跡のプロトコールを使って決定される。一度細胞がその表面で処理された抗原を表現するのに必要な最短時間が決定されると、パルス−追跡プロトコールは免疫応答を誘発するために細胞と抗原を調製するのに使用できる。
食菌性の樹枝状前駆体細胞は、樹枝状前駆体細胞から成る細胞培養物をGM−CSFで刺激して、増殖中の樹枝状細胞の凝集物を誘導することによって得られる。これらの樹枝状前駆体細胞は上記の樹枝状細胞前駆体を含むどの源泉組織からも得ることができる。好ましくは、源泉組織は骨髄または血液培養物である。これらの凝集物内の細胞は明らかに食菌性である。生育中の培養物が粒子に露出され、洗浄され、２日間「追跡」されるとき、MHCクラスIIに富む樹枝状細胞は実質的に増加し、少なくとも50％はBCGミコバクテリアまたはラテックス粒子のような嵌入された粒子を含む。ミコバクテリアを含み、新しく生育した樹枝状細胞は、微生物のパルスに露出された成熟樹枝状細胞の相当する培養物よりも、感作されたＴ細胞に抗原を提示することにおいてもっと強力である。
BCGを含む樹枝状細胞を無垢なマウスの肉趾または血流に注射した場合、同様の状況が付随する。微生物を食菌したそれらの樹枝状細胞は、リンパ節および脾臓を排出することにおいてミコバクテリア抗原に最も強いTY細胞応答を誘発する。GM−CSFで誘発された生育中の樹枝状細胞は、−抗原の取り込みおよび細胞数の両方を増すことによって−その場での活性免疫へのこれらのAPCの使用を促進するであろう。樹枝状細胞による抗原の提示によるそのような強い免疫源性の応答の産出は、この細胞やこの系を固体内の免疫源性応答を産出するのに有用なアジュバントとして特に望ましいものとする。提示された抗原へのそのような免疫源性応答および抗体の生育は、ワクチンによるような進行中の感染の治療や将来の感染の予防に使用できる。固体内で治療的または予防的な免疫応答を作るための樹枝状細胞の使用は、例えば結核を起こすBCGミコバクテリアのような耐薬品性の微生物による感染の治療または予防に特に有用である。
摂取された粒子の免疫源性は、BCGミコバクテリアによって得られる（図12〜13）。BCGワクチンのどの接種物にも、生きた桿菌〔桿菌の約50％はコロニー生成単位として働く〕、死亡桿菌および多数のミコバクテリア蛋白質がある。BCGの食菌プールは樹枝状細胞によってＴ細胞に提示される。これはミコバクテリア抗原を、樹枝状細胞の生育する血清の一成分であるウシ血清アルブミン（BSA）と比較すれば明白である。すべてのAPC集団はBSAの提示において類似点があったが、ほとんどのBCGを食菌した樹枝状細胞はミコバクテリアのための最も有効なAPCであった（図12および13、◆）。従って、BCG粒子の取り込みは樹枝状細胞前駆体によるミコバクテリアの感作の大部分の原因となる。
従って、本発明のもう一つの実施態様は、例えばBCG抗原を含むミコバクテリア結核バクテリア抗原で樹枝状細胞前駆体をパルスして、耐薬品性の品種を含む結核用のより良い予防接種および治療用プロトコルの開発へのニードを与える重要な事柄であるミコバクテリアへの耐性を宿主に導入するものである（78）。
実際には、我々の発明によって微生物で生育中の樹枝状細胞を満たすことができるパルスおよび追跡プロトコルは、その後に起こる免疫刺激の二つの広い構成要素を可能にする。この要素はａ）抗原の捕捉と提示、この場合粒子の捕捉は未熟樹枝状細胞による、およびｂ）追跡器官中の強力アクセサリーまたは免疫刺激機能の発達である。この状況は、上皮ランゲルハンス細胞による可溶性蛋白質（4,6）および粒子（74）の取扱いに見られるものと類似している。APC機能のこの二つの広い要素の各々は多くの下位要素を伴う。例えば、未熟樹枝状細胞はより食菌性であるだけでなく、豊富なMHCクラスII分子および不変の鎖（6,7）および多数の酸性エンドサイトーシス的空胞（36）の活性生合成のような抗原提示に必要な他の特長も示す。
パルス追跡プロトコルを使用する抗原でのAPCチャージの能力は、樹枝状細胞の際立った特長である。マクロファージおよびＢ細胞についての以前の研究はＴ細胞のエピトープが短命であることを示唆していた（75）。ここと別の報告（6,14,71）に述べる結果は、免疫源性ペプチドが樹枝状細胞上でマウスに注射する前に少なくとも２日間生存することを示す。この存続能力によって樹枝状細胞が数日間にわたって排出するリンパ系組織中で移動しＴ細胞を感作することができるようになる（14,50,51）。
本発明の樹枝状細胞の重要な特長は、クラスＩおよびクラスIIの生成物上に微生物系その他の抗原を効率的に提示する能力である。BCGの場合、感作された細胞の大部分は、多分抗原の負荷がエンドサイトーシス的経路およびMHCクラスII生成物によって取り扱われるため、CD4＋Ｔ細胞である（76）。インフルエンザの場合は、CD8＋細胞障害Ｔリンパ球（CTL）を導入するクラスＩの経路が細胞質への抗原（感染ウイルス）の適当な送入を要求し、一方純粋にエンドサイトーシス的な経路はCD4＋ヘルパーだけへの提示のための非感染性ビリオンを送入する（77）。細胞の増殖が適用すべき遺伝子挿入（レトロウイルスベクトルによるような）の種々の方法を可能にするので、生育中の樹枝状細胞の培養物は、ペプチドでMHCクラスＩ生成物をチャージする機会を提供する。
本発明のこの別の実施態様によれば、増殖中の樹枝状細胞をベクトルとともに注射でき、これで樹枝状細胞による特定の蛋白質の表現が可能になる。これらの樹枝状細胞で表現されるウイルス系蛋白質はつぎにMHCクラスＩレセプターの細胞表面上で処理され、提示される。ウイルス抗原を提示する細胞または処理されたウイルス抗原自体はつぎにベクトルでコード付けされる蛋白質への免疫源性応答を作るための免疫源として使用できる。
ベクトルは、免疫応答が望まれる蛋白質に遺伝子をコードし表現する特定のDNA配列を含ませるように調製できる。好ましくは、樹枝状細胞を感染させるために、レトロウイルスベクトルが使用される。宿主細胞を感染させるためにレトロウイルスベクトルを使用することは、当業者に公知であり、1992年５月14非に公告されたWO92/07943およびRichard  C.Mulligan、「遺伝子伝達および遺伝子療法：原理、展望および見通し」、DNAレベルでのヒトの疾病のエノロジー、第12章、J.LinstenおよびA.Peterson、Rover  Press編、1991に記載されており、療法ともここに参照として添付されている。
生育中の樹枝状細胞をMHCクラスＩおよび／またはクラスII生成物のチャージに使用することによって、その場でのＴ細胞修飾のいくつかの望ましい要素が達成できる。未熟プロジェニトールによる抗原の取込みおよび提示は、個体のMHC生成物に適切なペプチドをAPCが仕立てることを可能にし、特定の刺激性APCの数を増加させる。これらの樹枝状細胞プロジェニター集団の性質は、その場での活性免役および免役療法のための伝播体として細胞を使うことへの要求の多くに適合する。
本発明は抗原で活性化さた樹枝状細胞で動物またはヒトを治療または免疫するのに使用するのに充分な量の樹枝状細胞を得る方法を初めて提供する。さらに、樹枝状細胞は、Ｔ細胞依存性の抗原として抗原をもっと有効にする形で抗原を修飾するのに充分な量で樹枝状細胞を得ることができる。
抗原で活性化した樹枝状細胞を治療剤または免疫源として使用するには、抗原で活性化した樹枝状細胞を、同系の動物またはヒトに免疫応答を誘発させるどんな方法ででも注射する。好ましくは、源泉組織を得たその同じ動物またはヒトに樹枝状細胞を注射し戻す。注射部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内または静脈内でもよい。動物またはヒトに注射し戻した抗原で活性化した樹枝状細胞の津量のために必要な数は、とりわけ個体の抗原および大きさに依存して変化する。その場での樹枝状細胞の機能の主な特長は、リンパ系組織のＴ−依存領域へ移動またはホーミングする能力であり、ここで樹枝状細胞は、循環する不活性のリンパ球のプールから必要な抗原−反応性Ｔ細胞を選別する最適の位置にあることになる。
個体内で免疫応答を刺激する好ましい方法によれば、その個体からの組織源は樹枝状細胞前駆体を提供するために同定される。血液を組織源として使用する場合は、好ましくは個体を先ずサイトカインで処理して造血を刺激する。樹枝状細胞前駆体集団の単離および拡大の後、細胞を抗原に接触させる。好ましくは、抗原との接触はインビトロで行う。細胞がその表面で抗原を処理し提示するのに充分な時間が経った後、細胞−抗原複合体を、免疫応答を誘発するのに充分な量、個体にもどす。好ましくは、１×106ないし10×106個の細胞提示抗原を個体に注射し戻す。
本発明の新規な抗原は、本発明の方法によって調製された樹枝状細胞と、修飾されるべき物質または他の抗原を結合させることによって調製される。樹枝状細胞は、知りまたは修飾された抗原によるＴ細胞の刺激を促進する形で抗原を処理し修飾する。そのような樹枝状細胞で修飾された抗原は、より特異的であり、修飾されたＴ−依存性の抗原よりも少ない好ましくないエピトープを持っているので、有利である。樹枝状細胞で修飾された抗原は標準の生化学的方法で精製することができる。例えば、主要組織適合複合体（MHC）の精製物に抗体を使用して、MHC−抗原性ペプチド複合体を選別し、つぎに処理された必要なペプチドを酸で溶出することが公知である〔Rudenskyら、Nature353:622〜７（1991）;Huntら、Science255:1261〜3992）、これらは参照としてここに添付している〕。
抗原で活性化された樹枝状細胞および樹枝状細胞で修飾された抗原は、いずれも抗原に対する免疫応答を誘発するのに使用できる。活性化された樹枝状細胞または修飾された抗原は、将来の感染を防ぐワクチンとして使用でき、または免疫系を活性化して進行中の疾病を治療することもできる。活性化された樹枝状細胞または修飾された抗原は、生理食塩水その他の注射できる液体とともにワクチンまたは医薬組成物として使うために配合することができる。本発明の修飾された抗原または抗原で活性化された樹枝状細胞から成るこのワクチンまたは医薬組成物は、免疫応答を誘発するのに充分な量投与される。好ましくは、約１ないし100マイクログラムの修飾された抗原、または樹枝状細胞に結合された場合その相当量を１回当たり投与しなければならない。
本発明はまた、自己免疫疾患の治療のための方法および組成物を提供する。そのような自己免疫疾患には、若年性糖尿病、多発性硬化症、重症筋無力症およびアトピー性皮膚炎があるが、これらに限定されない。理論に拘束されることなしに、自己免疫疾患は「自己蛋白質」すなわち個体中に存在または内因する自己抗原に向けられた免疫応答から来るものであると考えられる。自己免疫応答において、これらの「自己蛋白質」はＴ細胞に提示され、Ｔ細胞を「自己反応性」にする。本発明の方法によれば、樹枝状細胞は内因性の抗原によってパルスされて関係の「自己ペプチド」を作る。関係の自己ペプチドは各個体によって異なる。MHCが非常に多形性であり、個々のMHC分子が種々のペプチド画分を結合できるからである。「自己ペプチド」はつぎに競合のペプチドを設計するか、治療の必要のために個体の中の自己蛋白質に寛容性を誘発させるのに使用できる。
樹枝状細胞は今やここに同定された方法および原理によって前駆体から生育でき、また樹枝状細胞は抗原を修飾してキラーＴ細胞を生産できるので、本発明の組成物はキラーＴ細胞が耐性を付与するウイルスおよび腫瘍細胞に対するワクチンとして特に有用である。
実施例
実施例１ 血液からの樹枝状細胞前駆体を増殖することによるインビトロでのマウス樹枝状細胞の製造
材料
A.  マウス:BALB/C、BALB/C  ｘ  DBA/2  F1、BALB/C  ｘ  C57BL/6  F1、C57BL/6  ｘ  DBA/2  F1、及びC57BL/6の雄と雌で、生まれて６〜８週間のものを、Japan  SLC  Inc〔静岡、日本〕、Trudeau  Institute〔Saranac  Lake、NY〕、及びCharles  River  Wiga〔Sulzberg、FRG〕から購入した。rGM−CSFの４つの試料は、樹枝状細胞の収量が30〜100U/mlであるプラトーになるまでという同様の結果で評価された。これらの試料は、S.Gillis博士、Immunex  Corp、シアトルWA;Genetics  Institute〔mGM−CSFを用いて形質移入されたCOS細胞からの上澄;30U/ml以上で使用〕；及びT.Sudo博士〔発現ベクターを用いて形質移入されたCHO細胞からの上澄;pHSmGM−CSF（22）、及びE.Coli発現材料〕からのものであった。
B.  血液調製：血液は、心臓穿刺によって得るか、あるいは頸動脈から得た。この血液は、100U/mlのヘパリンを有するRPMI−1640に希釈するか、あるいは、この中に滴下させた〔約2ml/マウス〕。血液細胞を４゜にて1000rpmでペレット化し、RPMI1640で再懸濁させ、再び沈澱させた。このペレットを、１匹のマウスあたり1mlのRPMI1640中にて懸濁させ、蒸留水中の1.66％塩化アンモニウムの等体積と混合し、赤血球とした。室温で２分間後、この懸濁液を４゜にて1000rpmで回転させた。まだ赤血球を含有しているこのペレットを、0.5mlのRPMI及び0.5mlのNH4Cl中で２分間再び懸濁させ、RPMI中に希釈して、再び沈澱させた。更に２回洗浄した後、大部分の血小板及び赤血球が除去されて、白血球の集団が得られた。
C.  GM−CSFを用いて補足された血液からの樹枝状細胞の増殖凝集体
一般にCxD2  F1マウスからの白血球は、16mmの組織培地ウエル〔24個のウエル皿、Costar、＃25820〕内で、30U/mlで、しかも1.5x106細胞／ウエルのGM−CSFを用いて補足された培地（ウエルあたり1ml）において培養された。この培地は、５％のウシ胎児血清〔JRH  Biosciences、Lenexa、KA〕、50uMの２−ME、20ug/mlのゲンタマイシン、及び組換マウスGM−CSFを用いて補足されたRPMI1640であった。一晩の培養後、多くの単核細胞が付着し、非付着細胞を新たな16mmのウエルに移し替えた。この付着細胞は、樹枝状細胞コロニーには発育しなかったが、次の週の間には、この非付着集団は３つの変化を示した。第１には、リンパ球及び顆粒球のほとんどが死に、洗浄によって除去することができた。第２に、このウエルの表面は、マクロファージ及び線維芽細胞を含む、しっかりとした付着細胞の単層で覆われるようになった。第３に、この単層上の散乱部位に付加され、そこに小さな細胞凝集体が発育した。この培養物には、0.5〜0.75mlの培地を吸引し、GM−CSFを含む等体積の新たな培地を戻して添加することによって、GM−CSF（30u/ml）を６〜７日間、その後は３日ごとに与えた。この凝集体は、全体で大きく広がり続けた。第10日目には、細胞は、継代培養される準備ができた。残余の疎性細胞はいずれも、新たな培地及びGM−CSFの中に凝集体を移転させる前に洗い流すことができた。元のウエルについて約0.8〜１百万の移転された細胞は、３つの継代培養ウエルの中に分割された。
この凝集体のほとんどが、この最初の継代培養の間に分解される一方、残った付着単層のバルクは、元のウエルに付着した。転位により、この移転された凝集体における細胞のほとんどは、単一の細胞として、新しい培養ウエルに付着するが、２〜３日間すると再び凝集体が現れた。この凝集体は再び、付着間質細胞に付加したが、これらの付着細胞は、元の培養における密な単層よりも数が少なかった。次の４〜７日に渡って凝集体がウエルを満たした。これらのコロニーは、しばしば、元のウエルのものより大きいことがあり、樹枝状細胞を象徴する多くのシート状の突起で覆われていた。この時点では細胞の数を数えることはかなり困難であった。これは、この凝集体の多くが、しっかりと関連した細胞の核を含んでいるからであった。しかしながら、ウエルを再度覆うことが可能な数多くの単一細胞は、10日と17日の間の培養で約２倍に広がった。
この培養が過成長をもたらた場合には、樹枝状細胞の形態学を有した細胞のいくつかが放出された。より典型的には、この細胞が、過成長させることはなく、この凝集体を移転して、約20日間再び継代培養した。継代培養する前に、この凝集体は、1g沈澱によってフリーな細胞から精製することができた。このような分離は、長期間の培養を用いてより容易に実施されてきており、即ち、そのままの凝集体を単離することが、３対２対１週間の培養で、より容易であった。付加的な継代培養によれば、ウエルについて生産された凝集体の数は、次第に減少した。しかしながら、3H−TdRラベリング及びオートラジオグラフ法〔以下〕により確認されたように、成長細胞のコロニーが１〜２か月間に、継代培養において生成した。引き続いての２〜３週間の継代培養により、典型的な単一の樹枝状細胞が、ここで培地中に放出された。ビデオ記録を用いた直接観察により、これらの放出された細胞は、樹枝状細胞の活性運動性を有しており、大きなベール又はシート状の突起を連続して伸びたり縮んだりさせる。連続したGM−CSFの存在下では、フリーな樹枝状細胞、並びに広がったコロニーの両方が観察された。GM−CSFが存在しない場合には、フリーな樹枝状細胞しか放出されず、凝集体は本質的には分離沈降して、培地中に再生成されず、凝集体のコロニーは生成しなかった。継代培養についてのフリーな樹枝状細胞の収量は0.3〜2.5x105の範囲であった。
要するに、1.5x106細胞という最初の血液単核培養から、その樹枝状細胞を検出することは困難であったが、我々は、少なくとも３〜10x104の放出された樹枝状細胞を用いて３週間で５〜10の継代培養ごとに平均して得ると同時に、更に増殖可能な多くの凝集体も得た。それゆえ、成長細胞の凝集体が、GM−CSFを用いて補足されたマウス血液中において生成し、しかも、これらの凝集体が樹枝状細胞によって覆われており、その多くが、培地中で自然に放出可能であった。
D.  細胞凝集体の表現型及びそこから放出される樹枝状細胞
サイトスピン試料は、３〜10x104細胞を用いてShandon細胞遠心分離機内で製造された。このスライドは、アセトン内での固定化及び、mAbを用いて染色させる前に乾燥剤と共に貯蔵され、引き続いてパーオキシダーゼマウス  抗−ラットIg〔Boehringer  Mannheim  Biochemicals、＃605〜545〕又は、ラビット  抗−ハムスターIg〔Accurate  Chemical  ＆  Scientific  Corp、＃JZY−036−003〕を用いた。これらの試料を、ギムザを用いて染色し、明視野分析のためのパーマウントに取り付けた。細胞フルオログラフィー〔FACScan、Becton  Dickinson〕のために、細胞のアリコットを、最初のラット又はハムスターmAbを用いて染色し、引き続いてFITCマウス  抗−ラット  Ig〔Boehringer、＃605〜540〕又はバイオチン  ラビット  抗−ハムスターIg〔Accurate、JZY−066−003〕及びFITC−アビジンを用いた。
２〜３週間培養のサイトスピン試料を、mAbのパネル及び免疫パーオキシダーゼ法を用いて試験した。放出された細胞、及びこの凝集体の周囲から移転することが可能な細胞の多くは、それらの星状形状及び表現型において類似していた。これらの細胞のほとんどは、mAbを用いて強く染色され、MHCクラスII、CD45白血球の通常の抗原、CR3レセプターCD11b、及び熱安定性抗原（HSA）、及びCD44となった。mAbsを用いたFcレセプター〔2.4G2〕及びマクロファージF4/80抗原（MAC）への染色は、95％以上の細胞においては弱いか、あるいは検出することができなかった。これらの培養物は、稀なＢ細胞〔B220mAb、RA−３〕、Ｔ細胞〔thy−1mAb、B5−５〕、又は顆粒球〔GRAN、mAb  RB−６〕しか含んでいない。この凝集体の周囲にある細胞のいくつか、及びこの凝集体から放出された細胞の多くが、大きく樹枝状細胞に限定される２つのマーカーを用いて染色された。この指状突起細胞抗原〔mAb  NLDC145（13）、IDC〕は、胸腺上皮にも結合しているものであって、樹枝状プロファイルの多くを染色したが、その全てを染色しなかった。実際に、全ての樹枝状プロファイルは、リンパ組織にＴ領域を通った部分での、成熟した樹枝状細胞、Ｂリンパ球、並びに指状突起細胞の核周囲領域において、mAbs  2A1及びM342染色顆粒により染色された。多くの部位からのマクロファージ〔血液単細胞；腹腔マクロファージ；リンパ腺、胸腺、脾の部分におけるマクロファージ〕は、2A1又はM342−反応性顆粒を含まない。
細胞フルオログラフィーは、細胞表面での抗原の表現についての準定量的な情報を得るために使用された。mAbのパネルは、２つの集団に適用された。即ち、パスツールピペッティングによる凝集体から移転することができた細胞と、この凝集体を１日間継代培養された際に自然に放出された細胞である。これらの「移転された」及び「放出された」集団は、それらの樹枝状細胞及び表現型において同一であるが、以下に考慮されるいくつかの例外がある。この放出された細胞の表現型が図２に示されており、しかも、凝集された細胞と放出された細胞の間におけるいくつかの違いが図３に示されている。実際に、この凝集体中において及びこの凝集体から生成した樹枝状細胞の全ては、白血球の通常の〔cd45、mAb  M1/9.3〕及び熱安定性のある〔mAbs  M1/69及びJ11d〕抗原の高いレベルを示すと同様に、CD44及びCD11b〔mAb  M1/70〕の高いレベルをも示した。以下の抗原の低いレベルが、細胞表面上で検出された。樹枝状細胞抗原33D1、マクロファージマーカーF4/80、Fcγレセプター抗原2.4G2、p55  IL−２レセプターCD25抗原3C7、及びCD11cインテグリンN418〔図２〕。これらの抗原は、F4/80及び2.4G2のような抗原の多くが、免疫パーオキシダーゼ法を用いることにより弱いか、あるいは細胞質内に存在していなくても、FACSによって全ての細胞について示された。いくつかの抗原は存在していなかった。RB6顆粒球、RA3  Ｂ細胞、B5−５  thy−１、GK1.5  CD4、及びSER−４周縁ゾーンマクロファージ〔図２〕。
これらの培養における樹枝状細胞によるクラスＩ及びII  MHC生成物の発現は非常に高かったが、それにもかかわらず二頂であった〔図２及び図３〕。この凝集体から移転された樹枝状細胞のほとんどは、MHCクラスＩ及びIIのいくらか低いレベルを有している一方、この凝集体から放出された樹枝状細胞は、非常に高いレベルのMHC生成物を有していた。放出されて緩く付着した樹枝状細胞とは違った他のマーカーは、放出された集団においてより高いNLDC145であった〔図３、一番上のパネル〕。我々は、増殖凝集体から生じる細胞の表現型は、M1/70  CD11bマーカーがより強化されるという例外を除き、皮膚、脾臓及び胸腺（24、28）からの培養された樹枝状細胞において見られるものと非常に良く似ていると結論付けている。
E.  樹枝状細胞前駆体の成長を確認するための3H−TdR  オートラジオグラフィー
液体培養で２及び３週間後には、ウエルは、細胞の数多く広がった凝集体を含んでおり、しかも、いくつかの場合においては、既に非付着樹枝状細胞を多量に放出していた。培養物は、増殖細胞及びそれらの後代の表現型を同定するために3H−チミジンを用いてラベルされた。パルスラベルのために、3H−TdRを培養物に添加した〔6Ci/mM、1uCi/ml最終〕。２時間後、この培地を3H−TdRを含まない培地に置き換え、この培養物を、サイトスピン試料についての試料〔Shandon  Inc、Pittsburgh  PA、＃59900102〕のために、非付着性放出細胞と残余の付着凝集体に分離した。このサイトスピン細胞は、前述のようにmAb及び免疫パーオキシダーゼを用いて特定の抗原に対して染色された。そして、これらのスライドを、発色、ギムザを用いた染色、及びパーマウントに載せる前に、照射〔５日間〕のためにフォトグラフィック乳化液〔コダック  オートラジオグラフィー乳化液タイプNTB2  ＃165−4433〕の中に浸漬した。パルス追跡実験においては、細胞成育性を維持するために低投与量の3H−TdRを使用したが、細胞は、他の点では同様に取り扱った。このパルスは、0.1uCi/mlで２時間又は16時間与えられ、後者は、より高い初期ラベリング指数をもらたした。これらの細胞を洗浄し、収穫する前に１〜３日間追跡し、前述のような、免疫パーオキシダーゼ、オートラジオグラフィー、及びギムザ染色を用いて分析した。
２週間及び３週間の培養物を、3H−TdRに曝して、増殖活性を試験した。このラベルされた細胞を洗浄し、スライド上で回転させ、サイトスピンを、フォトグラフィック乳化液に浸漬して曝す前にmAb及び免疫パーオキシダーゼ法を用いて染色した。重要なマーカーは、mAbs  2A1及びNLDC−145であり、これらは、それぞれ、成熟した樹枝状細胞における細胞内顆粒及び細胞表面抗原であると認められる。
培養物を、3H−TdRの２時間パルスでラベルした時、凝集体におけるラベリング指数は非常に高く、凝集体におけるプロフィールの少なくとも10〜15％がＳ期にあることが明らかであった。対照的に、典型的な非付着樹枝状細胞を放出している培養物に3H−TdRを与えた場合には、この放出された分画は、稀なラベルされたプロフィールしか含まなかった。GM−CSFを除去した場合には、3H−TdRラベリングは１日のうちに起こった。実際に、凝集体における3H−TdRラベルされた細胞の全てが、成熟した樹枝状細胞、即ち、2A1及びNLDC145において見い出されたマーカーに対してmAbを用いてラベルされることはできなかった。抗−MHCクラスII  mAbを用いて染色されるレベルは、放出された樹枝状細胞集団においてよりも、Ｓ−期における細胞での方が少なかった〔図示されていない〕。
その後、凝集体におけるラベルされた細胞が、典型的な樹枝状細胞を生じさせていることを確かめるために、パルス追跡実験を行った。培養物をまず、低投与量の3H−TdRに、２時間あるいは16時間のいずれかで曝したが、後者は、凝集体における細胞を大きなパーセンテージでラベルするためである。これらのウエルを、ラジオラベルせずに洗浄し、その後、凝集体を取り除き、1g沈澱によってフリーな細胞から分離した。この凝集体を、ラジオラベルされていない新たな培地に移し替え、更に１〜３日間かけて培養すると、多くの樹枝状細胞が培地中に放出された。この「追跡された」培養物を調べた際、いくつかの発見が明らかであった。このラベリング指数は高く維持され、即ち、凝集体において増殖されている細胞の後代のほとんどが、培養物から失われていないものであった。第２に、粒子数は、元のパルスにおいて明らかであった数から数倍希釈された。第３に、成熟樹枝状細胞〔NLDC145、2A1顆粒抗原、高レベルのMHCクラスII〕のマーカーを表す細胞は、ここでもラジオラベルされた。従って、GM−CSFが培養されたマウス血液において誘導している細胞凝集体は、活動的に増殖し、しかも、2A1顆粒抗原、NLDC145マーカー、及び高レベルのMHCクラスIIを含む、成熟した樹枝状細胞についての典型的な細胞学的で抗原的な特徴を多く有している非増殖後代を放出していた。
F.  Ｔ細胞増殖応答に対する副細胞機能
MLR刺激活性を、GM−CSF処理された血液培養物においてモニターした。血液培養物からの細胞を、1500rads〔137Cs〕で曝し、分量を変えた投与量で、96の充分な、平底のマイクロテストウエルにおいて、3x105の精製された先天性又は他生Ｔ細胞に与えた。このＴ細胞は、ナイロンウール非付着性の、脾臓及びリンパ腺懸濁液であり、これを、残余のAPCを除去するために、J11d  mAbs及び補体を加えた抗−I aを用いて処理した。3H−TdR吸収は、72〜86時間で測定した〔6Ci/mM、4uCi/ml最終〕。
最初には、MLR刺激活性はほとんどないか、あるいは全くなかった〔図４、★〕。幾らかの刺激活性が、１日の培養において確認された〔図４、○〕。サイトスピン試料の試験から、これらの１日の非付着血液細胞が、I a−強化樹枝状細胞プロフィールを少量〔＜0.3％〕でしか含まないが、I a−強化樹枝状プロフィールの明らかな部分集合を含むことがわかった。７日目までに、増殖凝集体が単層上で最初に明らかであった時、取り出された凝集体の刺激活性は、更に増加していたが、７日の時点、及び引き続いての時間の点における細胞のほとんどが、MHCクラスII陽性であっても、特異活性の点では、典型的な樹枝状細胞よりもまだ100倍少なかった〔図４、△と●の比較〕。典型的な非付着樹枝状細胞が、凝集体から放出されるのがちょうど開始される時期である14日までに、この非付着集団は、かなりのMLR刺激活性を有していた〔図４、▽〕。３週間後、典型的な成熟した樹枝状細胞が強化され、これらは、実際に脾臓対部分に匹敵するほどに刺激をもたらした〔図４、◇と●の比較〕。この培養物における他の細胞、例えばこの凝集体から取り出されたものなどは、樹枝状細胞よりも約10倍活性が低かった〔図４、◆〕。我々は、増殖樹枝状細胞の凝集体は、MLR刺激活性を幾らか有しているが、これは、充分に強力で、１〜７日における出発培養物における集団よりも、細胞基準あたり約100〜300倍以上活性であるところの成熟した放出細胞であると結論付けている。７〜20日の培養の間に、全体の細胞数もまた、少なくとも５〜10倍に大きくなった。
G.  インビボにおける樹枝状細胞のホーミング活性
樹枝状細胞の第２の特異的な特徴は、周辺リンパ組織（８、10）のＴ領域に戻ろうとする能力である。樹枝状細胞又は他の細胞種を、カルボキシフルオレスセインを用いて氷で10分間、２〜10x106/mlでラベルし〔Molecular  Probes  Ｃ−1157;5％のFCSを用いたHanks平衡塩溶液（HBSS）において30uMの最終濃度〕、RPMI1640中で洗浄し、フートパッドの中にRPMI−1640を50uMの体積で注入した。１日後、ドレーン膝かがみ筋リンパ節を除去し、OCT培地内で冷凍し、低温槽内で分画〔10μ〕した。全ての結節をサンプリングするために、我々は一定間隔で重複した試料を採得した。この分画をマルチウエルスライド〔Carlson  Scientific  Microslides  ＃111006〕にプライムし、−20℃で貯蔵し、使用する前にデシケータ30'内で乾燥させ〔あるいは室温で一昼夜放置し〕、アセトン中で固定させ、パーオキシダーゼ共役ラビット抗−FITC抗体〔Dakopatts、P404〕を用いて染色した。リンパ節における樹枝状細胞が前述のようにＴ−依存領域にある（８）ことを確かめるために、我々は、適切なmAbをＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ又は樹枝状細胞に添加し、後者においては、クロモーゲン  キット〔Biomeda  Corp、Foster  City  CA＃s04〕を加えたアルカリ性ホスファターゼ共役マウス抗−ラットIg〔Boehringer  Mannheim、＃605−5357〕を用いて視覚化した。その後、我々は、"Endo  Blocker"〔Biomeda  Corp、＃M69〕を用い、引き続き前述のパーオキシダーゼ抗−FITCにより内因性パーオキシダーゼをブロック化した。
血液白血球は、フートパッドあたり106細胞の投与量で与えられた場合でも、リンパ組織に戻ることはなかった。我々が、血液からGM−CSFと共に生じてきた樹枝状細胞を試験した際、200,000細胞の注入に伴ってＴ領域への回帰が観察された。Ｔ領域への選択された局在化は、Ｂ細胞又はＴ細胞を染色するmAbを用いて試料を重複してラベリングすることにより確認された。従って、培養物において生成した樹枝状細胞は、この直系のキーとなる機能的特徴を有している。即ち、Ｔ−依存領域への回帰と強力な副活性である。
H.  血液から樹枝状細胞コロニーを発生させるための必要条件
樹枝状細胞コロニーを生じさせる血液細胞の表面表面型は、抗体及び補体を用いた出発集団を処理することによって評価された。33D1抗−樹枝状細胞、抗−MHCクラスII、又は抗thy−１のいずれかによる処理では、コロニー生成ユニットが取り除かれなかった〔図示されていない〕。代わりに、thy−1+又はI a+細胞の除去により、コロニー数が数倍に高められた。GM−CSF以外のCSF類もまた試験され、１〜３週間の培養を開始してか、あるいは２〜３週間たった凝集体を移し替えて隠された細胞を生成した。試験されたCSF類、即ちIL−３、Ｍ−CSF、Ｇ−CSF、SCFのいずれも、コロニー又は成熟した樹枝状細胞の生成を支持しなかった。従って、成長樹枝状コロニーは、GM−CSFに非常に依存している。樹枝状細胞系に対する増殖前駆体を同定するための努力において、我々は、いくつかの組織から培養物を作り出し、これらの組織は成熟した樹枝状細胞を欠き、違った成長ファクター、特にCSF類〔Ｍ−CSF、Ｇ−CSF、IL−３、GM−CSF、IL−１、及びCSF〕を用いて補足されている。樹枝状細胞前駆体は、新産の表皮からは観察されず、この表皮は、主にI aランゲルハンス細胞（29）を含んでいる。典型的な細胞コロニー又は多数の樹枝状細胞の同定を困難にすることがある、バルク骨髄培養物における顆粒球の過成長を避けるためには、２日及び４日で日付着性の増殖顆粒球を除去することが好ましい。マウス中に新種の典型的な樹枝状細胞を含んでいる（30）血液は、樹枝状細胞前駆体を得るのに非常に有用であることが確認された。成長細胞凝集体は、培養物中に約６日間後に現れ、これらはしばしば、樹枝状細胞の一般的でなく運動性のある突起を有したプロフィールで覆われていた。時間と共に、典型的な非付着性樹枝状細胞が放出された。後者は、前述の如く、培養されたマウス脾臓、マウス皮膚、幾つかの試料からのリンパ、及び人間の血液（25〜27）における樹枝状細胞の形態学及び運動を有していた。従って、増殖樹枝状細胞を同定するためには、適切な出発集団、好ましくは血液を用いて開始し、GM−CSFを用いて培養物を補足することが決定的であると思われる。
いかなる理論によっても結び付けられることを望まずに、我々は、培養物において見られた初期の凝集体がクローンを表していたものと考えている。なぜならば、４〜６の細胞の非常に小さなグループが初期、即ち５日に観察されたからである。我々は、この凝集体が、マーカーを用いて、CD44及びMHCクラスIIのようなポリモリフィック抗原を区別される系からの血液細胞と混合することによってクローナルであることを証明することを試みた。しかしながら、我々は、実験を完了させることができなかった。なぜならば、我々はマウス系が、コロニーを成長させる数及び速度の点で違っていることを見い出したからである。BALB/C及びDBA〔及びそれらから誘導されたF1系〕が最も活性であった。即ち、B6及びB10は数倍活性が低かった。しかもCBA/J、C3H/He及びA/Jのような系は、増殖した樹枝状細胞凝集体の低い源泉であった。
増殖樹枝状細胞の凝集体に対する前駆体は、典型的な単球又は樹枝状細胞ではなかった。というのは、成長した凝集体の数は、もし一つが付着によって単球を消耗させたり、あるいは抗体及び補体を用いてI a−陽性細胞を消耗させたとしても、実質的に増加することが可能だからである。理論によって束縛されるという期待なしに、我々は、血液が、増殖凝集体を形成するI a−陰性前駆体を含有するということを暫定的に結論付けている。この凝集体においては、樹枝状細胞が成熟し、しかも非増殖後代として放出される。
樹枝状細胞の凝集体の生成は、外因性のGM−CSFを必要とした。もし、この凝集体がマクロファージ又は顆粒球−限定されたCSF類〔Ｍ−CSF、Ｇ−CSF〕中に置かれると、増殖が引き起こされ、マクロファージも顆粒球もいずれも生成されなかった。なぜならば、この培養物は、樹枝状細胞凝集体の他にマクロファージや幾つかの間質細胞を含んでおり、他のサイトカインが生成され、これらが樹枝状細胞の生成に決定的なものである可能性があった。しかしながら、この凝集体における細胞はＭ−及びＧ−SCFに対する応答性を失っており、しかも、樹枝状細胞が成育の明らかな脊髄経路を表しているように思われる。恐らく、理論によって束縛されるという期待なしに、この経路は、一般的な前駆体から生成し、この前駆体においては、樹枝状細胞直系が、もはやマクロファージ及び顆粒球制限されたCSF類に対して応答することがない派生物である。
パルス及びパルス−追跡プロトコールを用いた3H−チミジンによるラベリングは、これらの液体培養物において起こっている前駆体−生成物の関係を確かめるのに重要であった。２時間のパルスにおいては、実際に、すべてのラベルされた細胞には、成熟した樹枝状細胞の２つの典型的なマーカー、即ち、NLDC−145指状突起のある細胞表面抗原（13）及び、最近に同定された2A1/M342顆粒細胞質抗原（34）が欠けていた。これらのmAbは、我々が単離された細胞〔血液、脾臓、腹膜マクロファージ〕としてか、あるいは分画〔胸腺皮質、脾臓赤色髄質、リンパ節髄質〕において調査した大部分のマクロファージ集団を染色しなかった。パルス追跡プロトコルにおいては、多数のラベルされた後代が凝集体から放出され、しかもこれらの放出された細胞は非付着性で、運動性があり、MLRにおいて強力に刺激性であった。オートラジオグラフィー及び免疫パーオキシダーゼラベリングを組み合わせた後、このラベルされた後代は、顆粒抗原、NLDC−145抗原、及び非常に高いレベルのMHCクラスIIを有していた。これらの細胞学的で抗原性マーカーのそれぞれは、樹枝状細胞に大きく限定される。
理論により束縛されるという期待なしに、我々は、典型的な非増殖樹枝状細胞に対する成熟は、凝集体の内部で起こっているものと考えている。この凝集体は、樹枝状細胞のシート状又は覆われた突起を有する細胞により覆われている。成熟した樹枝状細胞マーカー〔高いMHCクラスII、2A1陽性顆粒、NLDC抗原〕のマーカーを有する細胞はまた、細胞凝集体の周囲においても観察された。しかしながら、この凝集体をそのままの状態で、即ち、これらのもっと成熟した細胞を取り除かずに分離することは困難であった。樹枝状細胞が成熟して、凝集体が残る際の機構は明らかではなかった。成熟は古い培養物においても〔＞２週間〕、あるいは付着性の間質細胞を除去することにより高められた。増殖と成熟の両方は、培養物が非常に多くの線維芽細胞を含有する場合には、妨害された。
増殖凝集体において起こった機能的な成熟は衝突である。培養物において生じた樹枝状細胞は、強力なMLR刺激剤であった。100の樹枝状細胞は、100,000の血液白血球よりも多くの強力な初期MLRを誘導した。I a−陽性細胞あたりの刺激活性の増加は、凝集体が最初に現れた時と、典型的な樹枝状細胞が多数放出された時の間の、少なくとも2logsであった。この期間に渡り、細胞回収は５〜10倍に増加した。又、樹枝状細胞後代は、リンパ節のＴ細胞領域への正確な方法に回帰し、もう一つの機能的な性質は、血液細胞においては検出することができなかった〔データは示されていない〕。
実施例２ GM−CSFを用いて補足されたマウス骨髄培養物からの多数の樹枝状細胞の生成
材料
A.  マウス：雌BALB/C、雄DBA/2、及び、雌C57BL/6マウス、生まれて７週間のものを、Japan  SLC〔浜松、静岡、日本〕から購入した。BALB/C  ｘ  DBA/2  F1、生まれて７〜10週間で雄雌両方、をJapan  SLC及びTrudeau  Institute、Saranac  Lake、NYから購入した。
試薬：培養培地は、５％FCS、50μＭの２−メルカプトエタノール、及び20μg/mlのゲンタマイシンを用いて補足されたRPMI−1640〔Nissui、東京、日本;GIBCO、Grand  Island、NY〕であった。鼠rGM−CSF〔108U/mg蛋白質〕は、キリンビール株式会社〔前橋、群馬、日本〕により好意的に提供された。マウス白血球抗原に対するラット及びハムスターmAbsのパネルは、別に記載されている（23、24）。FITC−及び、パーオキシダーゼ−共役マウス抗−ラットIgGは、Boehringer  Mannheim〔インディアナポリス、IN〕から購入し、FITC−及び、パーオキシダーゼ−共役ヤギ抗−ハムスターIg〔γ及びＬ−鎖〕は、Jackson  Immunoresearch  Lab〔Westgrove、PA〕及びCaltag〔サンフランシスコ、CA〕からそれぞれ購入した。
B.  骨髄培養物：マウスの大腿部及び脛部から、ガーゼを用いて筋肉組織を全て取り除いた後、この骨を70％アルコールを含む60mmの皿に１分間置き、PBSを用いて２回洗浄し、RPMI−1640を含む新たな皿の中に移し替えた。この骨の両方の端部を皿の中で鋏を用いて切断し、その後、シリンジ及び25Gニードルで、2mlのRPMI−1640を用いて骨髄を洗い出した。この組織を懸濁させ、小さな片の骨及び残屑を除去するためにナイロンメッシュを通過させ、赤色細胞を塩化アンモニウムを用いて溶解させた。洗浄後、リンパ球及びI a−陽性細胞を37℃で60分間、mAbs及びラビット補体の混合物を用いて殺した。このmAbsは、GK1.5抗−CD4、HO2.2抗−CD8、B21−２抗−I a、及びRA3−3A1/6.1抗−B220/CD45Rであり、これらは全てATCC〔それぞれTIB207、150、229及び146〕から得られたものであった。7.5x105細胞を、500〜1000U/ml  rGM−CSFで補足された培地1mlにおいて、24のウエルプレート〔Nunc、Naperville、IL〕内に入れた。これらの培養物は、通常は２日ごとに、プレートをゆっくりと動かし、この培地の3/4を吸引し、GM−CSFを含む新たな培地を戻して添加することにより約２〜10日間与えられた。このような洗浄の目的は、強固に接着したマクロファージに緩やかに付着される樹枝状細胞を生成するクラスターを分離することなく、非付着性の顆粒球を除去するためであった。
成長樹枝状細胞を強化するために、我々は、実施例１のマウス血液細胞培養物について記載したものと同様の方法を用いた。簡単にいうと、付着された細胞の凝集体を、パスツールピペットを用いて分離し、50％FCS−RPMI1640の6mlカラムに適用した。この培養物における残余の顆粒球は、しばしば凝集体においてのものと同様であり、この工程で容易に解離された。分離された細胞の1g沈澱により、クラスターは管の底に移動し、単一の顆粒球が上部に残った。この凝集体を、GM−CSFを含む新たな培地にて、典型的には16mmのウエルにて１日間、２〜3x105/mlで継代培養した。一昼夜の培養を行った後、多数の典型的な樹枝状細胞が放出された。又、付着性マクロファージもこれらの培地内に広がったが、ほとんどは、培養表面にしっかりと付着したまま残った。
C.  樹枝状細胞前駆体及びI a−陽性の、骨髄非リンパ球の、細胞学的比較
骨髄の７日培養物における、放出された分画〔樹枝状細胞が豊富である；上部〕と付着性の分画〔マクロファージが豊富である；底部〕とを比較するために、I a−陰性の骨髄非付着細胞をGM−CSFにおいて培養した。２日及び４日には、非付着性細胞をゆっくりと洗浄し、６日には緩く付着した細胞凝集体を1g沈殿により分離した。培養物において１日後、この凝集体から放出された細胞を、ガラススライド上でサイトスパンし、パーオキシダーゼ抗−Igを加えた異なるmAbs及び、ギムザ及び非特異的エステラーゼを用いて染色した。元の培養物におけるしっかりと付着した細胞をEDTAで分離し、再度サイトスパンした。多くの樹枝状プロフィールが放出された分画〔ハンドレンズは、ギムザ染色における細胞の形状及び汚染顆粒球を検出するのに有用である〕内に存在している一方で、付着細胞は最も部分的に典型的な空胞マクロファージについてのものである。強力なMHCクラスII表現は、放出された細胞の全てに起こるが、幾つかの典型的な顆粒球について起こらなかった。しっかりと付着した細胞のサブセットしかクラスIIを示さなかった。ほとんどの放出された細胞は、2A1内細胞空胞抗原を示す一方、付着細胞は2A1弱性かあるいは陰性である。
D.  細胞表面及び細胞内抗原：細胞表面染色は、サイトフルオログラフィー〔FACScan;Becton  Dickinson、Mountain  View  CA〕を用いた。第１ラット又はハムスターmAbsを用いた染色の後、引き続いて実施例1Dにおいて述べたようにFITC−共役マウス抗−ラット又はヤギ抗−ハムスターIgにより行った。細胞表面（23、24）及び細胞内抗原（33、34）に対するmAbsのパネルを、サイトスピン試料について試験した。我々は、付着性及び非付着性集団の両方を研究し、前者は10mMのEDTAの存在下で分離した〔付着細胞をPBSを用いて２回洗浄し、EDTA−PBSを用いて１回洗浄し、その後、37℃で20分間、EDTA−PBSで培養した〕。このサイトスピンをアセトン内で固定し、mAbsを用いて染色し、引き続いてパーオキシダーゼ共役マウス抗−ラット又は抗−ハムスターIgにより行った。このパーオキシダーゼは、ジアミノベンジジンを用いて視覚化し、核をギムザを用いて対比染色した。
E.  細胞学的アッセイ：ギムザ染色は、サイトスピン試料を緩衝アセトンホルマリンの代わりにハンクス培地中の２％グルタールアルデヒドで固定化した以外は、標準的な方法（35）を用いて、非特異的エステラーゼ〔基質としてα−ナフチルアセテート〕染色の場合と同様にしてサイトスピン試料について行った。相対照観察は、通常は生きた細胞についてのものであり、100及び400xの最終倍率で倒立顕微鏡〔Nikon  Diaphot〕を用いて行った。透過電子顕微鏡法（36）及び3H−チミジンオートラジオグラフィーは、実施例1Eに記載される樹枝状細胞の成育について行った。
F.  混合白血球反応：骨髄培養物からの細胞を、15GyのＸ線照射に曝し、分量を変えた投与量で、96のウエル平底培養プレート内で４日間、3x105の同系又は同種異系Ｔ細胞に適用した。このＴ細胞は、脾臓及びリンパ腺懸濁液をナイロンウールを通して通過させ、その後、補体を加えたJ11d  mAbsを加えた抗−I aを用いて残余のAPCsを消耗することによって調製した。3H−チミジン吸収は、4uCi/ml〔222GBq/mmol;American  Radiolabeled  Chemicals,Inc、St.Louis,MO〕のパルスの後、60〜94時間で測定した。
G.  GM−CSFを用いて補足されたマウス骨髄からの増殖樹枝状細胞の凝集体
培養の前に、我々は、mAbsと、補体を加えたＢ細胞、Ｔ細胞、及びMHCクラスII抗原との混合物で骨髄懸濁液を処理した。Ｂ細胞及び顆粒球の数を減少させる骨髄細胞の、このような前処理は、骨髄中の成長樹枝状細胞を同定するのに必要である。なぜならば、Ｂ細胞及び顆粒球はまた、GM−CSF応答性であり、樹枝状細胞前駆体の存在を増殖してマスクするからである。
従って、２日及び４日の培養時に、我々は、形態学において典型的な顆粒球であり、しかもRB6抗原を表現するものであることが確認された、緩く付着した細胞を除去するために、ゆっくりとプレートを攪拌した〔以下を参照〕。これらの工程に伴い、我々は付着細胞の層に付着した４日目の細胞凝集体により確認した。この凝集体におけるプロフィールの幾つかは、樹枝状細胞の、隠された又はシート状の突起を有していた。この凝集体は、ゆっくりしたピペッティングによって取り出すことができ、しかも1g沈殿によって分離することができた。３時間のリプレーティング以内で、多くのスピニー付着細胞がクラスターから移出され、そして、新たな脾付着細胞が現れた（13）。もう１日の培養の後には、これらの付着細胞は表面が取れ、多くの典型的な樹枝状細胞が培養培地において浮かんで見えた。樹枝状細胞の最適収量は、この凝集体を６日目に収穫し、その後、一昼夜培養した時に得られた。樹枝状細胞を生成するための骨髄の容量は著しく、１週間で４つの主後脚骨から＞5x106である。
培養ウエルの表面に付着したものは、マクロファージの細胞学的な特徴を有した細胞であり、これらはまた、最初の一週間の培養の間に多数に拡がった。これらの細胞は、10mMのEDTAの存在下で37℃にて培養した後、ピペッティングによって取り出すことができた。
これらの培養物が、Ｍ−CSF中で保持された場合には、多数のマクロファージが育成され、プラスチックの表面にしっかりと付着していた。しかしながら、樹枝状細胞ではない凝集体又は樹枝状細胞の凝集体は明らかではなかった。Ｍ−CSFとGM−CSFとの混合物が適用された場合には、その後、付着性のマクロファージのコロニー並びに成長顆粒球と樹枝状細胞の凝集体が認められた。
H.  骨髄培養物中の強力なMLR刺激剤細胞の成育
マウス骨髄の懸濁液は、MLR刺激剤としては活性でなく（38）、検出可能な樹枝状細胞を含まないこと（30）が知られている。前述の細胞学的な観察が得られたことで、我々は、I a−陰性骨髄非リンパ球を６日間培養し、MLR刺激活性を１日毎の間隔でチェックした。これらの培養物がGM−CSFを用いて補足される限りは、強力なMLR刺激活性が発生した〔図５〕。この増加は、累進的であり、６日では、100しかない骨髄細胞、20以上の刺激指数を有するMLRsを誘導した。
MLR刺激活性の進行と、これらの突然発生培養物における樹枝状細胞の発現との相互関係を明らかにするために、我々は、まず最初に、これらの培養物を非付着性の分画と緩く付着性を有する分画とに分離した〔図6A〕。最初の４日間においては、主に顆粒球であった非付着性細胞は、プレートをゆっくりと攪拌して、細胞を収穫することにより得られた。この緩く付着した細胞は、４日目及びそれ以降の時間においては、予定樹枝状細胞前駆体及び樹枝状細胞の凝集体を含んでおり、しっかりと付着した間質細胞の表面上にピペッティングすることによって分離された。２日と４日の時点では、最も強力な刺激活性が付着分画にあった。６日までは、非付着性分画は非常に活性なものであった。しっかりとした付着性のマクロファージを試験した場合には、MLR刺激活性はなかった〔図6B、白い正方形〕。
上述の如く、GM−CSFの存在下では、これらの培養物は、４〜８日の間の培養で典型的な樹枝状細胞を放出する成長細胞の凝集体を生成した。これらの凝集体は、単層上をゆっくりとピペッティングすることによって単離することができ、引き続いて1g沈殿を行った。これらの凝集体を培養物に戻した場合には、樹枝状細胞が豊富である集団が放出され、これらの放出された細胞は、樹枝状細胞に特徴的である非常に強力なMLR刺激活性を有していることが明らかであった〔図6B〕。
I.  細胞表面マーカー−−サイトフルオログラフィー
サイトフルオログラフィーにより細胞の二つの集団は、非付着性の細胞又は容易に分離される細胞に簡単に区別された。一方の集団は、低い前方光拡散、高レベルのRB6抗原、及び低いレベルのMHCクラスIIを有していた。他方の集団は、より大きなものであり、相互表現型を有していた。この凝集された細胞は、MHCクラスII陽性細胞における分画されていない培養物に比べて豊富であり〔図８、左と中央を比較〕、しかも、樹枝状細胞の非常に豊富な集団を放出するために、凝集体を一昼夜培養した時、個々の細胞についてのMHCクラスIIのレベルが増加した〔図８、中央と右を比較〕。MHCクラスIIがより豊富であるRB6抗原陰性細胞は、４日の培養物に対して６日の培養物において見られた〔図８〕。これらの細胞はいずれも、Ｂ細胞のB220抗原又はマクロファージのSER−４抗原についてのmAbsとは反応しなかった〔図示されていない〕。
更に詳しいFACS研究を、凝集体から放出された細胞について行った。この顆粒球は、低い前方光散乱に基づいて追い出された。より大きな樹枝状細胞は、均一な高レベルのMHCクラスＩ及びII、並びにCD44及びCD11b〔Mac−1;M1/70〕を有していた。中間レベルの染色は、熱安定性のある抗原〔HSA;M1/69〕、CD45〔M1/9.3〕及びCD18〔2E6〕について確認された。低いレベルの染色は、低い親和性IL−２レセプター〔CD25、7D4〕、指状細胞抗原〔NLDC−145〕、Fcγレセプター〔2.4G2〕、樹枝状細胞抗原〔33D1〕、マクロファージ抗原〔F4/80〕及びCD11c  p150/90β２−インテグリン〔N418〕について明らかであった。幾つかの抗原は検出することができず、この中には、ファゴサイト〔SER−４マージナルゾーンマクロファージ、RB6顆粒球〕及びリンパ球〔RA3−6.1  Ｂリンパ球;thy−1,CD3,4,8  Ｔリンパ球〕マーカーが含まれる。この表現型は、脾臓及び表皮樹枝状細胞（24,27,28）において見られたものと多くの点で同様である。一つの例外は、CD11bの骨髄誘導細胞において高レベルである、脈管構造からの骨髄細胞の媒介移出を助けるインテグリンである。
J.  サイトスピン調合物
サイトスピンを、しっかりと付着した集団を有する放出された樹枝状細胞とさらに比較するために調製した。ギムザ染色により、凝集体から放出された細胞は、樹枝状細胞の典型的な星状形状を有している一方、この付着性細胞は、最も部分的な空胞マクロファージに対するものであった。多くの樹枝状細胞は、非特異的なエステラーゼ染色の核周囲スポットを有している一方、より付着性のある集団は、強化サイトプラスミックエステラーゼを有していた。
この放出された細胞は、典型的な顆粒球核による汚染を除いては、MHCクラスII生成物に対して、強力に染色した。この強力な付着細胞は、クラスII陽性細胞のサブ集団を含んでいた。最近では、抗原は、樹枝状細胞及びＢ細胞の細胞内空胞に主に位置しており、単核ファゴサイトではないと記載されてきている。この抗体はM342（34）及び2A1と名付けられている。樹枝状細胞の多くが強力な2A1染色を有しており、数値の小さい方がM342で示された。この付着細胞は弱性2A1を有する幾つかのプロフィールを有していた。
I a−陽性細胞及び顆粒状の細胞内抗原を示す細胞の成育を、サイトスピンについて定量化した〔図10〕。MHCクラスII抗原がまず示され、引き続いて2A1及びM342顆粒抗原が示された〔図10〕。８日までに、細胞の大部分が樹枝状であり、高レベルのMHCクラスII生成物及び2A1抗原を有していた。顆粒球が培養物から除去されない場合には、非付着細胞の収量はもっと大きくなるが、我々が検出したMHCクラスII陽性細胞の最も高いパーセンテージは30％であり、樹枝状細胞成長の部分であった凝集体を同定し、かつ単離することは困難であった。
このサイトスピンが、他の骨髄抗原についての染色された時には、放出された細胞が弱く染色し、時にはFcγレセプター〔2.4G2〕及びマクロファージ制限抗原〔F4/80〕についてのモノクロナールとの上記バックグラウンドを全く染色しなかった。しっかりした付着細胞のほとんどは、対照的に両方の抗原に対して強く染色した。このことは、低レベルの2.4G2及びF4/80が放出された樹枝状細胞の表皮において見られる一方、合成及び発現が恐らくは、表皮樹枝状細胞が培養物中に置かれた時に多く起こるような下方調整されたものである（27）ことを示している。
４日には、約30〜50,000のI a−陽性細胞が培養物中に浮かんでいる一方、６日及び８日の両方では、更に50〜100,000のI a−陽性細胞が収穫された。この定量的データは、各ウエルが１週間のうちに約200,000以上のI a−陽性細胞を生成したことを示していた。我々は、約20〜30ウエルの、２つの脛骨と２つの大腿骨から開始I a−陰性骨髄細胞を得たので、I a−陽性細胞の全体の収量が5x106以上であり、マウスの皮膚におけるランゲルハンス細胞の全体の算出数を越えている。
K.  3H−チミジンパルス追跡実験
これらの培養物における樹枝状細胞の増殖及び分化を証明するために、細胞のクラスターを４日で分離し、3H−チミジンの12時間パルスに曝し、オートラジオグラフィーにより、直後又は、3H−チミジンを含まない培地における１、２及び３日後の追跡を測定した。この凝集体における細胞の大部分は、最初にはラベルされており、凝集体から放出されたのほとんど全ての細胞がラベルされていた。追跡の間、放出された後代の増加したパーセンテージは、成熟した樹枝状細胞の2A1顆粒抗原を示した。
L.  電子顕微鏡法
放出された細胞は、細胞体の幾つかの方向から延びた多くの大きなベール又はラメリポディアを有していた。この細胞質は、多くのミトコンドリア、幾つかの電子密度の高い顆粒及びリポソームを有しているが、多嚢胞体の細胞学的な特徴を有した幾つかの電子光輝小胞ソームは有していなかった。樹枝状細胞から延びた多数の細胞突起が、我々の調合物の半−薄分画において明らかであった。
５日の培養物における、骨髄から誘導された樹枝状細胞は、多くのサイトラスミックベールを示している。核周囲領域の拡大図は、滑らかな細網及び空胞のプロフィールを示している。幾つかのリソソーム的又は食細胞的構造がある。
実施例３ インビボにおけるミコバクテリア抗原に対しマウスを増感させるマウス樹枝状細胞プロジェニター食作用粒子
材料及び方法
A.  マウス:BALB/C  ｘ  DBA/2  F1、C57BL/6  ｘ  DBA/2  F1、及びBALB/Cの雄及び雌を、Trudeau  Institute〔Saranac  Lake、NY〕及び、Japan  SLC〔浜松〕から購入し、生まれて６〜10週間のものを使用した。
B.  骨髄培養物：前記実施例２に記載したように、大腿部及び脛部から骨髄を洗浄し、0.83％の塩化アンモニウムを用いて赤血球を放血し、そして、５％のウシ胎児血清、20ug/mlのゲンタマイシン、及び1000U/mlの組換マウスGM−CSF〔キリンビール、前橋、群馬、日本;9.7x107U/mg〕を用いて補足されたRPMI−1640  1mlにおいて106細胞／ウエルで、24のウエルプレート〔Nunc、Naperville、IL及びCorning  ＃25820、Corning  NY〕内で培養した。２日において、0.75mlの培地と非付着細胞を除去し、新たな培地に置き換えた。４〜５日にこのような操作を繰り返し、それによって発育した顆粒球の大部分を除去し、散乱したマクロファージを含む間質に付着した増殖樹枝状細胞のクラスターを後に残した。その後、この培養培地を、〔以下に詳細に記載した〕BCGミコバクテリアの微粒子物で補足し、食作用が通常は５〜６日において20〜24時間進行するようにした。この時点で、培養物を、自由な疎性細胞及び粒子となるように濯ぎ、粒子吸収のために直ちに細胞を分析した。もしくは、洗浄された培養物中の細胞を分離し、３〜4x106細胞を、粒子を含まない、新たな、GM−CSF補足培地において、１日間又は２日間の「追跡」期間、60mmのペトリ皿に移し替えた。クラスIIが豊富で、成熟した樹枝状細胞が、実施例２に記載される追跡の間に発育し、これらを細胞選別〔以下〕により分離した。発育して成熟した樹枝状細胞の食細胞活性を比較するために、単一の非増殖性の成熟樹枝状細胞が豊富な７〜８日の骨髄培養物に、粒状物もまた投与した。
C.  粒状物:BCGミコバクテリア〔Trudeau  Institute,1.5〜2.5x108CFU/ml;協和製薬工業、東京〕を、直径16mmのウエルについて、約107の生きたBCGで投与した。吸収は、Ziehl  Neelsenよりももっと感度が良く、微生物の数を容易に数えられる、オーラミン−ローダミン法を用いて、引き続き行われる「耐酸性」染色で測定した。コロイダルカーボン〔ペリカンインキ、Hannover,ドイツ〕を1:2000の割合で希釈して添加した。このカーボンは、Diff−Quik（登録商標）〔Baxter  Healthcare  Corp,マイアミ、FL〕を用いて染色された試料における黒色顆粒占領として同定された。2uラテックス粒子〔0.5％v/v;Seradyn,インディアナポリス,IN〕の懸濁液を、培養物ウエルの表面がビーズで覆われる投与量である、50ul/ウエルで培養物に加えた。
D.  細胞選別による成熟した樹枝状細胞の分離
実施例２において先に記載したように、GM−CSF刺激骨髄培養物において生産される樹枝状細胞は、非常に高いレベルの表面MHCクラスII生成物〔ATCCからのモノクローナルB21−2,TIB227及びM5/114,TIB120〕並びに、中位のレベルの、モノクロナールNLDC−145により認められた樹枝状細胞制限抗原を示す。BCGを用いたパルスの直後、あるいは更に２日の「追跡」培養の後に、細胞を、バイオチンB21−２及びFITC−ストレプタビジン〔Tago,Burlingame,CA〕を用いて染色した。その後、クラスIIが豊富な細胞を、選別〔FACStar  Plus,Becton  Dickson,Mountainview,CA〕し、ガラススライド〔Shandon  Inst.Sewicky,CA〕上でサイトスパンした。この選別された細胞を、サイトスピン中の樹枝状細胞の星形形状の輪郭を出し、かつ内部移行したコロイダルカーボン又はラテックス球の核周囲蓄積質を含んだプロフィールの算出を可能とするDiff−Quik（登録商標）を用いて染色した。BCGを視覚化するために、サイトスピンを室温で10分間無水アセトン中で固定させ、M5/114抗−クラスII、NLDC−145抗−樹枝状細胞、又はRA3−6B2抗−B220又は抗−Ｂ細胞〔後者はコントロールとして〕を用い、引き続いてPOX共役マウス抗−ラットIg〔Boehringer  Mannheim,インディアナポリス,IN〕及び、ジアミノベンジジン四塩酸〔Polyscience  Inc,Warrington,PA〕を用いて染色した。その後、この調合物を、オーラミンローダミンを用いて耐酸性細菌に対して二重にラベルした。実際に、この調合物における全ての細胞は、NLDC−145及びMHCクラスII生成物が豊富であった。少なくとも400細胞においてのBCG細菌の数を算出した。
E.  電子顕微鏡観察：細胞関連BCGが全て内部移行されていることを証明するために、パルス追跡プロトコル〔上記〕において生産された樹枝状細胞を2.5％のグルタールアルデヒド内で固定し、実施例２に記載されるようなEMについて行った。
F.  インビトロにおける抗原提示
完全フロインド補助液〔CFA,SIGMA,St.Louis,MO;前部及び後部脚に25ul〕又は、コントロールとしてミコバクテリアを含まない不完全フロインド〔ICFA〕を用いて、マウスはプライムされた。７〜14日後、取り出したリンパ腺を、単一の細胞懸濁液の中に解離し、MHCクラスII、B220、及び熱安定性のある抗原〔M5/114抗−I a,RA3−6B2抗−B220、及びJ11d抗−HSA;TIB120、146、及び183、それぞれATCCからのもの〕についてのmABs及びウサギ補体を用いてAPCsを放血した。これらのAPC−放血され、プライムされたＴ細胞の3x105を、0.5％のマウス血清及び50uMの２−メルカプトエタノールを用いて補足されたRPMI−1640培地において、96のウエル平底マイクロテストウエル〔Corning  ＃25860〕で培養した。BCG−パルスされた骨髄又は脾臓APCsを、分量を変えた投与量で添加した。1uCiの3H−チミジン〔NEN,Boston,MA;20Ci/mmol;4uCi/ml〕吸収を、72〜88時間の時点でDNA合成をモニターするために添加した。示されているデータは、標準誤差が平均の15％未満である三組の平均値である。
G.  インビボにおける抗原提示
インビトロで抗原とパルスされたAPCsを、まだプライムされていないCxD2  F1マウスに対してインビボで投与した。放血したリンパ腺においてＴ細胞をプライムするために、2x105の樹枝状細胞を脚に注入し、リンパ腺細胞を５日後に準備した。脾臓においてＴ細胞をプライムするために、106細胞を脈間で注入し、脾細胞を５日又は10日後に準備した。Ｔ細胞プライムを測定するために、バルクリンパ腺又は脾細胞を上述のようにして培養し、プロテイン抗原の投与量を変えて試み、精製されたプロテイン誘導体〔PPD,Statenserum  Institute、コペンハーゲン、デンマーク、又は樋田一郎博士、日本BCG研究所、清瀬、東京〕又は、ウシ血清アルブミン〔シグマ〕及び3H−チミジンのいずれかを72〜88時間の時点で測定した。増殖細胞を特徴付けるために、この固体群を、3H−チミジン吸収を測定する前に、抗体及び補体を用いて処理した。
H.  成育する樹枝状細胞のクラスターの内部におけるラテックス粒子の食作用：パルス及びパルス追跡プロトコル
マウス骨髄又は血液がGM−CSFを用いて刺激される時、増殖細胞凝集物が現れ、これらは、多数の典型的な免疫刺激樹枝状細胞を生じさせる。以下に記載した実験について使用された骨髄においては、培養物においてGM−CSFによっても誘導される非付着顆粒球の大部分を洗浄除去することにより、増殖凝集物が最も良く同定される。凝集物が最初にかなり大きくなった時期〔５〜10細胞の大きさ〕である５〜６日においては、我々は、20〜22時間の時間をかけて違った粒子を適用した。
2uのラッテクス球を引き続いて投与し、重いレベリングが単層上に拡散したマクロファージに認められた。更に、幾つかのハッキリしたラベリングが、成育した樹枝状細胞凝集物の範囲内で起こった〔図12A〕。粒子に曝されてきた凝集物を、更に２日間再培養した。この時間の間、多数の細胞が懸濁液中に放出された。これらは主に、星状形状の特徴を有し、高レベルのMHCクラスII及びNLDC−145抗原を有する成熟した樹枝状細胞であった。この放出された細胞を光顕微鏡法により調査した際、多くがラテックス球を含んでおり、しばしば明らかな核周囲ゾーン又は中心球を取り囲んでいた〔図12B〕。又、我々は、同様の方法によりコロイダルカーボン吸収を研究した。凝集物をコロイドを用いてパルスし、かつ成熟した樹枝状細胞を追跡期間の間に形成させる際には、放出された細胞のいくつかは、小さいが、綺麗に切断されたカーボン沈澱物ではない中心球を有していた〔図12C〕。対照的に、ラテックス又はカーボンが成熟した樹枝状細胞に与えられた時には、吸収はほとんど起こらなかった〔図12D〕。
I.  樹枝状細胞を成育することによるBCGミコバクテリア吸収−−耐酸性染色
前述のラッテクス粒子を投与するためにプロトコルを用い、20〜22時間の期間に渡って、食細胞食として、生きたBCGミコバクテリアを投与した。細胞関連細菌は、感度の良い螢光耐酸性染色により視覚化した。20時間のパルスに伴って、成育した樹枝状細胞凝集物は多くの微生物を含んでいた。培養物からのより成熟した樹枝状細胞を分離するために、細胞を再懸濁し、高いレベルのMHCクラスII生成物を含む細胞を選別した。BCGパルスの直後には、約20％の選別された細胞が、耐酸性の細菌を含んでいた〔表１〕。MHCクラスII弱性細胞の大部分は、細胞選別の間に過度の付着性となるので、これ以上の研究は行わなかった。
その後、伴細胞培養物を、２日の追跡培養の後に調査した。なぜならば、多くの成熟した樹枝状細胞が追跡期間の間に形成され、I a−豊富な後代の数が４倍に増加したからである〔表１〕。
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BCGを含有する樹枝状細胞の定量的データ。マウス骨髄培養物を、GM−CSFを用いて５日間、16mmのウエルにおいて刺激し、洗浄し、20時間BCG微生物に曝した。この培養物を再び洗浄し、直ちに試験するか、あるいはプールして、更に２日の追跡培養のために60mmの皿に移し替えるかのいずれかとした。この培養物における樹枝状細胞は、螢光活性化された細胞選別機を用いてI a−豊富な細胞として選別され、その後、耐酸性細菌に染色を行うためにガラススライド上にサイトスパンされた。追跡期間の間、この培養物におけるI a−豊富な細胞のパーセンテージは２〜2.5倍に増加し、全体の細胞の数が２倍に増加し、その結果、I a−豊富な細胞の数において４〜５倍の増加が生じた。
BCGを含有する樹枝状細胞のパーセンテージはまた、50％にまで上昇した〔表１、図13〕。二重ラベリング実験からは、耐酸性細菌を含む細胞はMHCクラスII及び、樹枝状細胞制限NLDC145抗原を示すことが証明された。図13。なぜならば、MHCクラスII及びNLDC−145陽性細胞の全体の数が、ちょうど２日で４倍に増加し、これらのBCG−積載樹枝状細胞が、凝集物において成熟はしているが、食細胞性でないプロジェニターから誘導されたと思われるからである。
J.  BCGパルスAPCsの電子顕微鏡法
光学顕微鏡による細胞関連粒子の核周囲位置は、微生物が内部移行されたことを示していた。このことは、電子顕微鏡法により確かめられた。樹枝状細胞プロフィールの約50％が、内部移行されたBCGを含有していたが、プロフィールあたりの微生物の数は少なく、通常は１つかあるいは４つまでしかなかった、図14A,B。それぞれの微生物は、それ自身の空胞を占めているように思われた。ファゴソーム膜はほとんど細菌に似かよったものであるように思われた、図14C,D。
K.  プライムされたＴ細胞に対するミコバクテリア抗原のインビトロにおける提示
BCG微生物を用いてパルスされたか、あるいはパルス追跡された樹枝状細胞に存在する機能を試験するために、我々はまず、取り出されたマウスのリンパ腺から抗原応答性のあるＴ細胞を調製し、このリンパ腺には、CFA〔熱殺菌されたミコバクテリアを含む完全フロインド補助液〕又は、不完全フロインド補助液〔コントロールとしてIFA;方法を参照〕を注入しておいた。樹枝状細胞をIFA−プライムされたＴ細胞に添加した際、同質混合の白血球反応が観察された。このことから、APCsがBCGに曝されたか否かを比較することができた〔図15、右〕。しかしながら、樹枝状細胞がBCGと共にパルスされ、CFA−プライムされたＴ細胞に添加された時、強力な増殖応答が誘導された〔図15、左〕。樹枝状細胞が、１日のパルスの直後、あるいは更に２日の追跡期間の後に試験された場合には、追跡された個体群はもっと強力であった。〔図15、左；◆と▼を比較〕。100BCGのパルス追跡された樹枝状細胞だけはインビトロで、かなり大きなＴ細胞応答をもたらした〔図15、左◆〕。このBCGパルス−追跡個体群もまた、PPD又はBCGのいずれかに新たに曝された成熟した樹枝状細胞よりも、ミコバクテリア抗原に対する応答性を誘導するのが５〜10倍強力であった〔図15、左；◆と●、▲を比較〕。従って、食作用の程度は、パルス追跡個体群が最も活性のあるAPCsであり、かつ最も細胞内BCGを含んでいたので、提示の効率と関係しているように思われた〔表１〕。
L.  増感されていないマウスに対するミコバクテリア抗原のインビボにおける提示
BCG−パルスされた、及びBCG−パルスされ、かつ追跡されたAPCsの比較し得る個体群が、プライムされていないマウスに対するミコバクテリア抗原を提示する能力について試験された。フートパッドへの注入に引き続いて、PPDに対する強力な応答性が観察された〔図16〕。又、２日追跡後に試験した場合にも、樹枝状細胞が最も強力であり〔図16、◇と△の比較〕、この追跡期間により、樹枝状細胞の全体の収量が非常に増加した。
BCGパルス−追跡された樹枝状細胞の機能を示す増加した抗原が、BCGを有するAPCsの増加した数に関連しているか否かを試験するために、プライムされた個体群もまた、ウシ血清アルブミン〔BSA〕に対する応答性について試験した。というのは、樹枝状細胞がウシ胎児血清の存在下で成長したからであった。全ての樹枝状細胞個体群は、BCGへの露出の細部とは無関係に、BSAと同様にマウスにプライムされた。〔図16、黒く塗られた記号〕。このことは、それぞれの個体群が、溶解性プロテインを免疫化するのにかなり有効であったことを示している一方、BCGを食作用した樹枝状細胞が、ミコバクテリア抗原に対する応答性をもたらすのにより有用であったことを示している。
プライムされた細胞の表面マーカーは、3H−チミジン吸収を測定する前に、抗体及び個体群の補体媒介溶解によって試験した〔データは示されていない〕。この増殖細胞は、thy−１に対しては陽性であったが、MHCクラスII、熱安定性抗原、及びB220に対しては陰性であった。抗−CD4ハイブリドーマ培地上澄み液は、85％以上増殖を抑制し、即ちプライムされた細胞はヘルパー−タイプＴ細胞であった。
プライムはまた、BCG−パルスされた、及びBCG−パルス追跡された樹枝状細胞の静脈内注入の後に、脾臓Ｔ細胞を試験した時にも観察された〔図17〕。この細胞は、注入後、10日に対する５日の時点でより応答性があった〔図17AとＣを比較〕。又、BCGに曝した後、２日間培養された〔「追跡された」〕樹枝状細胞が、最も強力であった〔図12◆と▲を比較；しかし、全ての個体群はBSAと同様に脾臓細胞をもたらした〔図17B〕。我々は、樹枝状細胞祖先剤が捕捉し、しかもインビボで高い免疫原性である方法でミコバクテリア抗原を保持することを結論付けている。
実施例４
抗原は、免疫原として樹枝状細胞を活性化した。
実施例１に記載した方法に従って調製された樹枝状細胞は、24のウエルプラスチック培養プレートのウエルについて、約1x105細胞の濃度で載せられた。この細胞は、５％ウシ胎児血清及びGM−CSF（30U/ml）を含有しているRPMI1640内で培養される。抗原を樹枝状細胞培養物に添加し、この培養物を約４時間あるいは充分な時間で抗原と培養し、その結果、樹枝状細胞を、免疫学的に適切な形態で、あるいはＴ細胞により確認可能な形態で抗原を取り扱うことが可能となる。このような樹枝状細胞による抗原の取扱いには、樹枝状細胞を、１）得ること、２）プロセッシング、及び３）Ｔ細胞により確認可能な形態でＴ細胞に対する抗原を提示することを含む。樹枝状細胞に対する抗原の結合に引き続いて、細胞を培養物から集め、同系のマウスを免疫化するのに使用した。この活性化された樹枝状細胞は、抗原との免疫応答を誘導するのに充分な量で、マウスに皮下に注入する。
実施例５
実施例１に記載したようにして調製した樹枝状細胞を、蛋白質抗原で十分な時間パルスし、樹枝状細胞が、変性抗原を、獲得、加工し、該樹枝状細胞上に生じさせるようにする。その後、樹枝状細胞を、該変性抗原の抽出用に培養から集める。
変性抗原の抽出には、樹枝状細胞を洗浄剤で溶媒和し、MHC分子に結合した変性抗原を抽出する。変性抗原に結合したMHC分子は、MH2のようなMHC分子と結合する抗体で沈殿させて精製する。変性抗原は分析するために、該沈殿から抽出する。
実施例６ ヒト血液から樹枝状細胞の調製
A.  患者
コンソリデーション化学療法を受け（完全寛解で白血病／リンパ腫の15人、固形腫瘍の２人）、次いでＧ−CSF治療しているヒト患者からの血液で17の実験を実施した。３例は、化学療法（急性骨髄球性の白血病１人、固形腫瘍２人）し、BM−CSF治療した後の患者からの血液で実施した。これら３例の結果を、Ｇ−CSF治療した患者群からの２名、ＡおよびＢと、GM−CSF治療した患者群からの１名、Ｃ、で提示する。
B.  原理的説明
マウス血液に関する実施例１と骨髄に関する実施例２に記載される方法（J.Exp.Med.175:1157−1167,1992およびJ.Exp.Med.176:1693−1702,1992）の結果を、樹枝状細胞増殖と発育のいくつかの特色で確認した。（ａ）樹枝状細胞の先祖は成熟免疫制限性子孫および多くの他の細胞型（Ｂ細胞、単球細胞）の代表的なものであるMHCクラスIIの抗原を発現しない；（ｂ）樹枝状細胞の先祖は、増殖および成熟するのに、GM:CSFおよび該細胞で提供される他のシトキン類を、培養でまたは補体として必要とする；（ｃ）樹枝状細胞の増殖および発育における臨界的な工程は、標準細胞培養表面への接着がゆるい特有の凝集体に生ずる；（ｄ）これらの凝集体の出現をモニターすることによって、樹枝状細胞の世代に適切である多くの変量を評価できる。
（Ann.Rev.Immunol.9:271−296,1991）。
C.  実験記録
1.血液単核細胞を、標準的な濃厚媒体、ここではLympoprep（Nycomed,Oslo）中で沈降法で単離した。
2.単離した単核細胞は、樹枝状細胞の先祖でない細胞から完全に除いた。これらの不純物は、CD3およびHLA−DR抗原に対するモノクロナル抗体でコートし、親和性−精製したヤギの抗−マウスIgG（panning）でコートしたペトリ皿上で枯渇された。
3.培養媒体の1ml中の106の細胞を、直径16mmのプラスチック培養ウエル（Costar,Rochester,N.Y.）に入れた。この媒体は、50UMの２−メルカプトエタノール、10mMのグルタミン、50ug/mlのゲンタマイシン、〔加熱不活性化なしの〕臍帯血からの血清５％またはウシ胎児血清（不活性化した）５％およびヒト組み換え体GM−CSF400U/mlで補足されたRPMI−1640であった。その後、２日毎に、16日間、培養は、該媒体の0.3mlを除去し、シトキン類を補足した新鮮な媒体0.5mlで、これを置き換えることによって、栄養補給される。
細胞を下記の条件で培養した:1）付加的なシトキン類の存在なしで;2）GM−CSF、400または800U/ml;3）GM−CSF、400または800U/ml、パルスIL−１α、50LAF単位/ml（培養の最後の24時間）、４）GM−CSF、400または800U/ml、パルスTNFα、50U/ml;5）GM−CSF、400または800U/ml、パルスTNF−α、50U/ml、パルスIL−１α、50LAF単位/ml（培養の最後の24時間）、６）GM−CSF、400または800U/ml、パルスIL−３、100U/ml;7）GM−CSF、400または800U/ml、パルスIL−３、100U/ml、パルスIL−１α、50LAF単位/ml（最後の24時間）。
実験Ｃでは、濃厚なメトリツアミド（metrizamide）に沈めた非−樹枝状細胞をも試験した。
4.固有増殖する樹枝状細胞凝集体（以下ボールと称する）が５日目迄に現れた。相対比倒立顕微鏡（inverted phase contrast microscope）で試験して明らかとなる。これらのボールは、一週間（５−11日）の経過で大きく膨張した。いくつかのボールは、最初のウエル（工程３及び４）で現れたが、これらは非接着性ウエル（工程４）と同じ大きさにまで大きくならなかった。このウエルは、細胞密度が増すように、例えば、１ウエル分割を２−３ウエルに、継代培養する必要がある。
5.成育培養からの成熟樹枝状細胞を単離するために二つの異なる方法を用いた。一つの方法は、非接着性の細胞を除去し、1gの遠心沈降法でノンボールからボールを分離するものである。樹枝状細胞は、その後、付加的に１−２日間培養してボールから多数放出される。そして、成熟樹枝細胞を、公知の（Freudenthal and Steinman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:7698−7702,1990）濃厚なメトリツアミド上のフローテーションでノンボールから単離した。第二の方法は、簡単であるが、本質的にその処理の成長相を終止する。この第二の方法では、ボールが非常に大きい時、非接着性細胞を取り入れる。この細胞は、氷上に20分間残し、ボールを分離するようにピペットで激しく再浮遊させ、成熟樹枝状細胞をメトリツアミドコラム上に浮遊させた。
6.樹枝状細胞子孫の免疫刺激活性を証明するために、補助細胞−枯渇Ｔ細胞（混合白血球反応分析に対して200,000、MLR;酸化有系分裂誘発分析に対して150,000、OXMI）に、照射した細胞を段階的に投与（３倍の段階希釈で30−30,000）した。Ｔ細胞反応は、５日目（MLR）又は２日目（OXMI）に3H−チミジンの16hパルスで測定した。Ｔ細胞シミュレーション試験（酸化有系分裂誘発と混合白血球反応）を1mg/mlのインドメタシンの存在下で実施した。３つのMLR試験で得られたデータは図18A、ＢおよびＣに示される。
D.  結果
1.GM−CSFは本質的にシトキンである。Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、LF−３、またはシトキンでないものは、樹枝状細胞の発育を許さない。400−800U/mlでGM−CSFは、ドナーが血液中の骨髄性祖先の数を増すようにGM−CSFまたはＧ−CSFのいずれかで処理するか否かに関係なく、最適である。10−50U/mlでTNFαの添加は、通常、常ではなが、樹枝状細胞の収量を二倍に増加する（Caux et al.,「腫瘍壊死因子アルファは、インターロイイン−３および顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子−誘発した、ヒト造血CD34＋始原細胞の増殖に強く作用する」Blood2292−2298,1990）。図18A、ＢおよびＣに記載される典型的な試験結果から明らかなように、TNFα補足もまた、樹枝状細胞子孫の機能を十分改良する。数個の試験では、rhu  IL−１α（50LAF単位/ml）が、培養の最後の24時間の間に加えられた時、更に機能の増強することが立証された。固形腫瘍または白血病／リンパ腫をもった患者からの組織での実験では、樹枝状細胞の生成に関して比較できる結果が得られた。
2.血液60mlから出発し、GM−CSFだけの存在下で培養した後、代表的な成熟免疫刺激性樹枝状細胞の収量は、６−12×106個の細胞であった。これは全細胞の40−80％に相当する。この収量は、新鮮な血液60mlの成熟樹枝状細胞の収量（５％程度）より20倍以上大きい（Proc.Natl.Acad.Sci.87:7698−7702,1990）。
3.この方法で生成した樹枝状細胞の表現形は、細胞がHLA−DR、MHCクラスIIに対しては強く陽性であるが、CD1a、CD14およびＢ細胞マーカー類には陰性であることを含む。
4.この培養における顆粒球の発育は樹枝状細胞の純度を下げる。典型的には、これらの顆粒球ボールは接着性がより強く、上記実験記録の日２移転法で後に残せる。仮にこれらの接着性顆粒球コロニーが再び現れても、簡単な移転で、成長する樹枝状細胞を他のウエルに移すことができる。
実施例７
他の樹枝状細胞前駆体源を実施例６に記載の方法で試験した。
ａ）２人の患者用に、骨髄の少量の試料を準備した。上述の方法を適応した時、樹枝状細胞ボールと成熟免疫刺激性樹枝状細胞が大量に形成された。
ｂ）７人の正常なドナーからの血液を実施例６記載の方法を用いて評価した。ボールの数はたいしたものではなかった（２×106個の細胞のウエル当たり10−20）であったが、正常血液の使用は明らかに容易で、マウス血液や骨髄に比べて、前述（コメント５）したように顆粒球コロニーが形成されないという利点がある（J.Exp.Med.175:1157−1167,1992vs.J.Exp.Med.176:1693−1702,1992）。
ｃ）胎児又は臍帯血液も試験した。これは成人血液より非常に多量の祖先細胞を含むからである。CD34+祖先の数はなお小さい（約１％）ので、我々は、CD34+細胞を最初に精製しないという上記簡易法で試験した。DCボールは既に誘発された。ただし、毒性ある赤血球は枯渇させた。抗−赤血球性モノクロナルVIE−G4（Dr.W.Knapp,Viennaにより提供された）をパニング工程（工程２）に加え、パニング後Lymphoprep（工程１）に付加的なフローテーションを使用。臍帯血液からの樹枝状細胞の収量は、上記方法に記載されたものと大体対応するものである（１−５×106樹枝状細胞、メトリツアミドフローテーション工程なしに、40mlの臍帯血液から全細胞の20−40％に相当する）上記ボールはより接着性があり、樹枝状細胞を成人血液と対比してCD1aと表す。
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我々は本発明の多くの具体例を上に述べたが、基本的な構成を変化させて、本発明の方法及び組成物を利用する他の具体例を提供することも可能である。従って、本発明の範囲は、実施例として上に述べた特定の具体例によるのではなく、添付の請求の範囲によって規定されるものであることを認識されたい。
【図１】
0003649335.tif 000003
【図２】
0003649335.tif 000004
【図３】
0003649335.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0003649335.tif 000016
【図１５】
0003649335.tif 000017
【図１６】
0003649335.tif 000018
【図１７】
0003649335.tif 000019
【図１８Ａ】
0003649335.tif 000020
【図１８Ｂ】
0003649335.tif 000021
【図１８Ｃ】
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