(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する前記微生物の調製物とマレイン酸とを水性溶液中で混合し、酵素的異性化反応によりマレイン酸からフマル酸を製造するに際し、反応液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して反応させることを特徴とするフマル酸の製造法。
【請求項２】
Ｎ2、Ａｒ、Ｈｅより選ばれる１つ以上のガスで反応液をシールすることにより、反応液中の溶存酸素濃度を低下させることを特徴とする請求項１記載のフマル酸の製造法。
【請求項３】
反応液またはその原料に亜硫酸塩を添加することにより反応液中の溶存酸素濃度を低下させることを特徴とする請求項１記載のフマル酸の製造法。
【請求項４】
前記反応液またはその原料を脱気することによりマレイン酸を含有する水溶液中の溶存酸素濃度を低下させることを特徴とする請求項１記載のフマル酸の製造法。
【請求項５】
反応液中の溶存酸素濃度が０．５ｐｐｍ以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフマル酸の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マレイン酸から効率よくフマル酸を製造する方法に関する。フマル酸は、主にマレイン酸の異性化によって製造され、医薬、食品、工業原料として、広く利用されている。フマル酸からは、酵素法等により例えば食品、医薬、工業原料として有用なL-アスパラギン酸、L-リンゴ酸、L-アラニンが製造される。
【０００２】
【従来の技術】
マレイン酸を異性化してフマル酸を製造する方法としては、主に化学的方法が提案されているが（米国特許第2,816,923号、同第2,955,136号、同第2,332,992号）、反応平衡によりフマル酸への変換率が制約を受けること、この方法は高温反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣化が起こり、副生物を生成するため収率が低下するなどの問題点を有している。
【０００３】
一方、酵素法では、マレイン酸イソメラーゼがマレイン酸を異性化してフマル酸を生成することが、知られている（K.Otsuka Agric.Biol.Chem.,25,(9),p726(1961)）が、酵素学的性質について検討しているに過ぎず、産業上の応用の観点からの検討はほとんどなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、酵素法により、効率よく、かつ高収率でマレイン酸からフマル酸を製造することができる実用的な方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、効率よくフマル酸を製造する方法を確立すべく鋭意検討を行った結果、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する前記微生物の調製物とマレイン酸とを水性溶液中で混合し、酵素的異性化反応によりマレイン酸からフマル酸を製造するに際し、反応液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して反応させることにより、高収率でフマル酸を製造することができることを見いだし、本発明を完成するに到った。
【０００６】
すなわち本発明は、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する前記微生物の調製物とマレイン酸とを水性溶液中で混合し、酵素的異性化反応によりマレイン酸からフマル酸を製造するに際し、反応液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持して反応させることを特徴とするフマル酸の製造法である。
【０００７】
反応液中の溶存酸素濃度を低下させるには、Ｎ2、Ａｒ、Ｈｅより選ばれる１つ以上のガスで反応液をシールする方法、反応液またはその原料に亜硫酸塩を添加する方法、及び反応液またはその原料を脱気する方法が挙げられる。
【０００８】
また、本発明の方法において、反応液中の溶存酸素濃度は０．５ｐｐｍ以下であることが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を具体的に説明する。
本発明に用いられるマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物としては、本活性を有する微生物であれば特に限定されるものではないが、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍａｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が好適に用いられる。特にアルカリゲネス  フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（例えば、ＩＦＯ１２６６９、同ＩＦＯ  １３１１１、同ＩＡＭ  １４７３）、アルカリゲネス  ユウトロフス（ΛＩｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｌｅｓｃｅｎｓ）（例えばＡＴＣＣ  ２３７２８）、キサントモナス  マルトフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（例えばＡＴＣＣ  １３２７０）、バチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）〔例えば、同ＭＩ−１０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５１６０）〕、バチルス  ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｌｓ）〔例えば、同ＭＩ−１０３株（ＦＥＲＭＢＰ−５１６２）〕等が好適に用いられる。さらに、上記微生物の変異株もしくは遺伝子組換えによる改変株、上記微生物のマレイン酸イソメラーゼ遺伝子を他の微生物に導入することにより作製された微生物等を用いても何等差し支えない。
【００１０】
マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばマレイン酸、ブドウ糖、ショ糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、マレイン酸等の有機酸類、廃糖蜜等、好ましくはマレイン酸あるいはマレイン酸とその他の炭素源を混合して用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。更に、マレイン酸、マロン酸、タートロン酸、シトラコン酸、メサコン酸等をマレイン酸イソメラーゼの誘導物質として培地に添加してもよい。これらの誘導物質の添加濃度は、通常10〜200mM、好ましくは50〜100mMである。
【００１１】
培養条件は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下に、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても該微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【００１２】
かくして得られる培養物から遠心分離等により菌体を集めることにより、マレイン酸イソメラーゼを含有する菌体を取得することができる。
本発明において、マレイン酸のフマル酸への異性化反応には、上記菌体を培養した培養液から分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕物もしくは抽出物等の調製物も用いることができる。菌体は、例えば、リン酸緩衝液等の緩衝液（ｐＨ７）等で洗浄した後に使用してもよい。また、微生物菌体より得られる粗酵素標品を用いてもよく、更に精製した酵素標品を使用してもよい。更に、上記微生物菌体、その破砕物もしくは抽出物、または精製酵素を担体に固定化したものも使用することができる。本明細書にいう「マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の調製物」とは、これらのような、微生物菌体に由来しマレイン酸イソメラーゼ活性を有する画分を全て含むものとする。菌体を用いる場合、予め菌体を凍結したり、上記緩衝液中にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０等の界面活性剤を０．０１〜０．２％添加した液中で、１５〜４０℃の温度で、１０〜１２０分菌体を処理することにより菌体の透過性を高めてから使用することもできる。
【００１３】
本発明において、「マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する前記微生物の調製物とマレイン酸とを水性溶液中で混合する」とは、微生物菌体又はその調製物もしくはこれらを含有する水性溶液にマレイン酸又はマレイン酸を含む水性溶液を加えること、更には、固定化菌体又は固定化酵素を充填したカラムにマレイン酸を含有する水性溶液を通液することを含む。
【００１４】
微生物菌体からマレイン酸イソメラーゼを抽出、精製する方法は、公知の酵素の精製法のいずれの方法も適用できる。例えば、菌体の破壊法としては、超音波破砕、フレンチプレス、ホモジナイザー等を用いた機械的破壊法、リゾチームなどを用いた酵素的破壊法を用いることができる。このようにして得られた菌体破壊物の可溶性画分またはその分画物は、マレイン酸イソメラーゼの粗酵素画分として使用することができる。また、この粗酵素画分をさらに精製して得られる精製酵素を用いてもよい。粗酵素画分からのマレイン酸イソメラーゼの精製は、通常、（イ）沈澱法による分離、例えば硫安沈澱法、（ロ）クロマトグラフィーによる分離、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等、（ハ）電気泳動法による分離法、及びこれらの方法の任意の組み合わせによって、実施することができる。
【００１５】
本発明においては、マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその調製物をマレイン酸を含有する水性溶液に加え、酵素的異性化反応によりマレイン酸からフマル酸を製造するに際し、反応液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下、特に好ましくは０．５ｐｐｍ以下に維持して反応させることに特徴を有する。
【００１６】
ただし、溶存酸素レベルは瞬時４ｐｐｍを越えることがあっても、実質的に４ｐｐｍ以下を長時間維持すれば良い。例えば、撹拌を開始した直後や、マレイン酸含有水溶液を調製した直後に一時的に４ｐｐｍを越えた場合も、その後４ｐｐｍ以下に維持されれば良い。また、途中、撹拌数を上げたりしてごく短時間４ｐｐｍを越えた場合でも、全体の反応時間の大部分の時間４ｐｐｍ以下に維持されていれば良い。
【００１７】
反応液中の溶存酸素濃度を４ｐｐｍ以下に維持する方法として具体的には、例えば、Ｎ2、Ａｒ、Ｈｅより選ばれる１つ以上のガスで反応液をシールすること、反応液またはその原料に亜硫酸塩を添加すること、前記反応液またはその原料を脱気することが挙げられる。また、これらの手段を組み合わせてもよい。
【００１８】
Ｎ2、Ａｒ、Ｈｅより選択される１つ以上の気体とは、それぞれ単独の気体か、任意の２つ以上の気体の組み合わせを指す。これらの気体の雰囲気下でマレイン酸イソメラーゼ反応を行う方法としては、例えば、酵素反応中および／又は酵素反応に先立って、マレイン酸水溶液又は酵素反応液（以下、単に「反応液」という）に上記気体を連続的に吹き込む、反応液中に上記気体を吹き込んだ後密閉する、反応液を脱気した後密閉した反応槽に上記気体を導入する等の方法が行われる。本発明の方法では、反応液に接する気相が上記気体雰囲気であること、すなわち反応液が上記気体でシールされていればよく、必ずしも反応液又は反応槽内に上記気体を連続的に吹き込むことは必須ではない。また、反応液に接する気相は完全に上記気体で置換されることが好ましいが、気相の一部の置換であっても、置換による効果は期待できる。
【００１９】
本発明に用いる亜硫酸塩とは、亜硫酸の塩であれば良く、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素アンモニウム、亜硫酸カルシウム等の無機亜硫酸塩が好ましいが、本マレイン酸イソメラーゼ活性を阻害することが知られる水銀、銅との塩は用いられない。亜硫酸塩の濃度としては、１ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、好ましくは１０ｐｐｍ〜５００ｐｐｍが用いられる。
【００２０】
また、脱気により反応液又はその原料の溶存酸素濃度を低下させる方法としては、特に限定されないが、例えば、アスピレーターでの減圧下に５５℃程度に加熱する方法、超音波により振動を与えながら減圧下に液中の空気を追い出す方法などが行える。脱気は、反応に先だって反応液原料、例えばマレイン酸水溶液又は菌体もしくはその調製物を含む水溶液を脱気してもよいし、さらに反応中に反応液を脱気してもよい。
【００２１】
酵素反応は、ｐＨ５〜１０好ましくは６〜９で、２０〜５０℃、好ましくは２５〜３７℃の温度で、通常５〜１２０時間反応させる。本反応液には、必要に応じカルシウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩等の二価金属塩を添加することができる。また、反応液は緩衝剤や微量の有機溶媒等を含んでいてもよい。
【００２２】
反応に用いるマレイン酸を含有する水性溶液のマレイン酸濃度は１〜４０W/V％好ましくは１０〜３０W/V％であるが、例えば連続反応等においては、マレイン酸濃度が０．００１〜１％程度に維持される事もある。
【００２３】
反応に用いる菌体またはその調製物の添加量は、特に制限されるものではないが、菌体重量（湿菌体）として１〜３０％が好適に用いられる。
上記の方法で生成したフマル酸は、限外ろ過膜分離、遠心分離等により菌体及びその調製物と分離した後、硫酸等電点沈澱法等の公知の方法で沈澱させ、水洗、乾燥する事により、結晶として採取できる。
【００２４】
また、生成したフマル酸は、アスパルターゼ含有菌体たとえば、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＢ−４１株（FERM BP-1498）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） ATCC 11303等を作用させることによりL-アスパラギン酸を生成させることができるし、本反応系内に、アスパルターゼ含有菌を加えて反応させることにより、マレイン酸からL-アスパラギン酸を効率よく生成させることもできる。
【００２５】
さらに、生成したフマル酸は、フマラーゼ含有菌体たとえば、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＢ−４１株（FERM BP-1498）、E. coli ATCC11303等を作用させることによりL-リンゴ酸を生成させることができるし、本反応系内に、フマラーゼ含有菌を加えて反応させることにより、マレイン酸からL-リンゴ酸を効率よく生成させることもできる。
【００２６】
本発明において、「マレイン酸からフマル酸を製造する」とは、必ずしもフマル酸を蓄積することを意味するものではなく、上記のようにフマル酸を経由したマレイン酸からのL-アスパラギン酸やL-リンゴ酸の生成のように、少なくともマレイン酸からフマル酸への変換が起こっていればよいことを意味する。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
［実施例１］  Ｎ2雰囲気下でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
肉エキス：１０ｇ、ペプトン：１０ｇ，ＮａＣｌ：５ｇ，マレイン酸１０ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（苛性ソーダでｐＨ７．０に調整）からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
【００２８】
上記と同様の培地１０００ｍｌを３Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液３０ｍｌを接種し、これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回洗浄し、以下の反応に供試した。
【００２９】
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
予めＮ2ガスを３０分吹き込みながら撹拌し、Ｎ2置換した反応液〔マレイン酸１１６ｇ、５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにした）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した菌体（IFO 12669株）２０ｇを添加し、Ｎ2を0.02ｖｖｍの速度で気相に供給して撹拌し、３０℃で３６時間反応させた。反応中、溶存酸素濃度は０．５ｐｐｍ以下に維持された。反応終了後、遠心分離により上清液を回収し、得られた反応上清液を有機酸分析カラム（島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｈカラム）、ＵＶ検出器（２１０ｎｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー分析（島津社製、ＬＣ-５Ａ）に供した。その結果、６６ｇ／Ｌのフマル酸が生成していることを確認した。尚、生成フマル酸の定量は、ピメリン酸を内部標準物質として用いて行った。また、上記の反応上清液を、硫酸によりｐＨを３に下げることにより、フマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は６３ｇであった。
【００３０】
［実施例２］  Ａｒ雰囲気下でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
予めＡｒガスを３０分吹き込みながら撹拌し、Ａｒ置換した反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した菌体（IFO 12669株）２０ｇを添加し、Ａｒを0.02ｖｖｍの速度で気相に供給して撹拌し、シール中で３０℃で３６時間反応させた。反応中、溶存酸素濃度は０．５ｐｐｍ以下に維持された。フマル酸は、６５ｇ／Ｌ得られ、実施例１と同様にしてフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は６２．５ｇであった。
【００３１】
［実施例３］  Ｈｅ雰囲気下でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
予めＨｅガスを３０分吹き込みながら撹拌し、Ｈｅ置換した反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した菌体（IFO 12669株）２０ｇを添加し、Ｈｅを0.02ｖｖｍの速度で気相に供給して撹拌し、シール中で３０℃で３６時間反応させた。反応中、溶存酸素濃度は０．５ｐｐｍ以下に維持された。フマル酸は、６７ｇ／Ｌ得られ、実施例１と同様にしてフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は６３．５ｇであった。
【００３２】
［実施例４］  Ｎ2置換した反応液でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
予めＮ2ガスを３０分吹き込みながら撹拌し、Ｎ2置換した反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、実施例１で回収した菌体（IFO 12669株）２０ｇを添加して撹拌し、３０℃で３６時間反応させた。反応中、溶存酸素濃度はおよそ４ｐｐｍ以下に維持された。フマル酸は５２．４ｇ／Ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は４９．２ｇであった。
【００３３】
［実施例５］  亜硫酸ソーダを添加した反応液でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕に０．２ｇ／Ｌの亜硫酸ソーダを加え、３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、実施例１で回収した菌体（IFO 12669株）２０ｇを添加し、ジャーを密閉して撹拌し、３０℃で３６時間反応させた。反応中、溶存酸素濃度はおよそ３ｐｐｍ以下に維持された。フマル酸は５４．５ｇ／Ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は５１ｇであった。
【００３４】
［実施例６］  脱気した反応液でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を耐圧ビンに入れ、水流アスピレーターで吸引しながら、１５分間脱気した。静かに常圧に戻してから反応液を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、実施例１で回収した菌体（アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669菌株）20gを添加し、ジャーを密閉して撹拌し、３０℃で３６時間反応させた。反応中、溶存酸素濃度はおよそ４ｐｐｍ以下に維持された。フマル酸は５１．３ｇ／ｌ得られ、常法通り遠心分離後、硫酸によりｐＨを３に下げることによりフマル酸を沈澱させた。得られたフマル酸結晶は４８ｇであった。
【００３５】
［対照例］  通常空気下でのフマル酸生成
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）マレイン酸からのフマル酸生成
Ｎ2吹き込みを行わなかった反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ苛性ソーダ４００ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した菌体（IFO 12669株）２０ｇを添加し、Ｎ2シールせずに撹拌し、３０℃で３６時間反応させた。フマル酸は、４４ｇ／Ｌ得られ、実施例１と同様にしてフマル酸の結晶を得た。得られた結晶は４１ｇであった。
【００３６】
［参考例１］  アスパラギン酸の製造
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）フマル酸からのアスパラギン酸生成能を有する微生物の培養
尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、D-ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス１ｇ、カザミノ酸１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）からなる培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに、滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＢ−４１株（FERM BP-1498）を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した。
【００３７】
上記と同様の培地１０００ｍｌを２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液２０ｍｌと滅菌済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これを３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。得られた菌体から、夾雑するリンゴ酸副生活性を以下の方法で除いた。すなわち、アスパラギン酸：１００ｇ，アンモニア：１８０ｍｌ、塩化カルシウム：２．２ｇ，Ｔｗｅｅｎ２０：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりなる組成液に集菌体を懸濁し、４５℃，３時間振とうし、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体を回収した。
【００３８】
（３）マレイン酸とアンモニアからのアスパラギン酸生成
予めＮ2ガスを３０分吹き込みながら撹拌し、Ｎ2置換した反応液〔マレイン酸１１６ｇ，アンモニア１５３ｍｌ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、回収した両菌体（IFO 12669株２０ｇ、ＡＢ−４１株１２０ｇ）を添加し、Ｎ2を0.02ｖｖｍの速度で供給して撹拌し、シール中で３０℃で３６時間反応させた。反応終了後、遠心分離により上清液を回収し、得られた反応上清液を薄層クロマトグラフィー［展開溶媒  n-ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（容量比）、発色剤：ニンヒドリン試薬］に供した。その結果、１２８ｇ／ＬのL-アスパラギン酸が生成していることを確認した。このアスパラギン酸アンモニウム液に、硫酸を加えてｐＨを３にし、アスパラギン酸を沈澱させ、水洗後乾燥させ、アスパラギン酸結晶を得た。得られた結晶は１２５ｇであった。
【００３９】
［参考例２］  L-リンゴ酸酸の製造
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物の培養
アルカリゲネス  フェカリス IFO 12669株を、実施例１と同様に培養した。
（２）フマル酸からのL-リンゴ酸生成能を有する微生物の培養
尿素：４ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：１４ｇ，ＫＨ2ＰＯ4：０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4：０．５ｇ， ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：２０ｍｇ，ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ：２０ｍｇ、D-ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：１００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ及び蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）の培地１００ｍｌを５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、１５分間滅菌処理したものに滅菌済み５０％グルコース水溶液４ｍｌを加え、ブレビバクテリウム  フラバム  ＡＢ−４１菌株（FERM BP-1498）を植菌し、３３℃にて２４時間振とう培養した。
【００４０】
また、上記と同様の培地１０００ｍｌを２Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅菌処理したものに、上記振とう培養液２０ｍｌと滅菌済み５０％グルコース水溶液２００ｍｌを加え、これを３３℃にて２４時間培養した。得られた培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌した。本菌体は、夾雑するアスパルターゼ及びコハク酸副生活性を以下の方法で除いた。すなわち、フマル酸２ナトリウム：３２ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０：０．８ｇ（水で全量１Ｌとする）よりなる組成液に集菌体を懸濁し、４５℃，２時間振とうし、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して菌体を回収した。
【００４１】
（３）マレイン酸からのL-リンゴ酸生成
予めＮ2ガスを３０分吹き込みながら撹拌し、Ｎ2置換した反応液〔マレイン酸１１６ｇ，５Ｎ水酸化ナトリウム２００ｇ（水で全量を１０００ｍｌにする）〕を３Ｌ容のジャーファーメンターに移し、実施例１及び上記（１）で回収した両菌体（IFO 12669株２０ｇ、ＡＢ−４１株５０ｇ）を添加し、Ｎ2を0.02ｖｖｍの速度で供給して撹拌し、シール中で３０℃で３６時間反応させた。L-リンゴ酸は、１０４ｇ／Ｌ得られ、L-リンゴ酸ナトリウム液に、塩化カルシウムを加えてリンゴ酸カルシウムを沈澱させ、水洗後イオン交換樹脂でL-リンゴ酸を分離し、乾燥させることにより、L-リンゴ酸結晶を得た。得られた結晶は９０ｇであった。
【００４２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、酵素法により、効率よく、かつ高収率でマレイン酸からフマル酸を製造することができる。