(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：26に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＬ鎖を含んで成る診断用試薬。
【請求項２】
前記ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域がヒトCκ領域である、請求項１に記載の診断用試薬。
【請求項３】
ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：27に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＨ鎖を含んで成る診断用試薬。
【請求項４】
前記ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域がヒトCγ領域である、請求項３に記載の診断用試薬。
【請求項５】
（１）ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：26に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＬ鎖；並びに
（２）ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：27に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＨ鎖；
を有するキメラ抗体を含んで成る診断用試薬。
【請求項６】
前記ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域がヒトCκ領域であり、そして／又は前記ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域がヒトCγ領域である、請求項５に記載の診断用試薬。
【請求項７】
ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：26に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＬ鎖を含んで成るキメラ抗体を有効成分とするIL-6に起因する疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項８】
前記ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域がヒトCκ領域である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：27に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＨ鎖を含んで成るキメラ抗体を有効成分とするIL-6に起因する疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１０】
前記ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域がヒトCγ領域である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
（１）ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｌ鎖Ｖ領域が配列番号：26に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＬ鎖；並びに
（２）ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域と、ヒトIL-6レセプターに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域とを有し、該Ｈ鎖Ｖ領域が配列番号：27に示すアミノ酸配列を有することを特徴とするキメラＨ鎖；
を有するキメラ抗体を有効成分こするIL-6に起因する疾患の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項１２】
前記ヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域がヒトCκ領域であり、そして／又は前記ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域がヒトCγ領域である、請求項11に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ領域）、ヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト／マウスキメラ抗体、ヒトライト鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）Ｖ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体の使用に関する。本発明はさらに、上記の抗体又はその部分をコードするＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記ＤＮＡを含んで成るベクター、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は一連の細胞により生産される多機能サイトカインである。このものは免疫応答、急性期反応及び造血を調節し、そして宿主防御機構において中心的役割を演ずる。このものは広範な組織に作用して、標的細胞の性質に応じて成長誘導効果、成長阻害効果及び分化誘導効果を発揮する。ＩＬ−６に対する特異的レセプター（ＩＬ−６Ｒ）は、ＩＬ−６の多機能性に従ってリンパ系細胞及び非リンパ系細胞上で発現される。ＩＬ−６遺伝子の異常発現が種々の疾患、特に自己免疫疾患、メサンジウム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質細胞腫／骨髄腫の発病に関与することが示唆されている（Ｈｉｒａｎｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１１，４４３−４４９，１９９０の総説を参照のこと）。ヒト骨髄腫細胞はＩＬ−６を生産しそしてＩＬ−６Ｒを発現することが観察される。実験において、ＩＬ−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験管内での増殖を阻害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発癌においてオートクリン調節ループが機能していることが示された（Ｋａｗａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，８３，１９８８）。
【０００３】
ＩＬ−６Ｒは種々の動物細胞の表面に存在し、そしてＩＬ−６に特異的に結合し、そして細胞表面上のＩＬ−６Ｒ分子の数が報告されている（Ｔａｇａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，９６７，１９８７）。さらに、ヒトＩＬ−６ＲをコードするｃＤＮＡがクローン化され、そしてＩＬ−６Ｒの一次構造が報告されている（Ｙａｍａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，８２５，１９８８）。
マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そしてこの理由のため、ヒトにおけるそれらの療法的価値は制限される。ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短い。さらに、ヒト抗マウス抗体は、予定された効果を妨害するのみならず、患者における不都合なアレルギー応答の危険をもたらす免疫応答を惹起することなくして頻回投与することはできない。
【０００４】
これらの問題を解決するため、ヒト型化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの方法でヒト型化することができる。より簡単な方法は、可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に由来しそして定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法である。得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することを期待することができる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来する蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そしてそれ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免疫原性が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がなお生ずる可能性がある（ＬｏＢｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４２２０−４２２４，１９８９）。
【０００５】
マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させるものである。この方法においては、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して「再構成」（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト可変領域を作製する。次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はＣＤＲと極く一部のフレームワーク（ＦＲ）のみである。ＣＤＲは超可変蛋白質配列により構成されている。これらは種特異的配列を示さない。これらの理由のため、マウスＣＤＲを担持する再構成ヒト抗体はもはやヒトＣＤＲを含有する天然ヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。
【０００６】
前記のごとく、再構成ヒト抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製造方法であって任意の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在しない。従って、特定の抗原に対する十分に活性な再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が必要である。ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体、すなわちＰＭ１およびＭＴ１８は作製されており（特願平２−189420）、そして本発明者らはヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０、ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５を調製しているが、本発明者らはヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の作製を示唆する文献を知らない。
さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌードマウスに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体が注射された時腫瘍の増殖が顕著に阻害されることを、本発明者らは見出した。このことは、骨髄腫の治療のための療法剤として抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体が有用であることを示唆している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って本発明はヒトＩＬ−６Ｒに対する、免疫原性の低い抗体を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明はヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の過程で有用なヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発明はさらに、再構成ヒト抗体の部分、並びに再構成ヒト抗体及びその部分並びにキメラ抗体の製造のための発現系を提供する。
さらに具体的には、本発明は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びにヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ；並びにヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを提供する。
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（ＦＲ）、及び
（２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のＦＲ、及び
（２）ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ、
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＬ鎖；並びに
（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＨ鎖を提供する。
【００１２】
本発明はさらにまた、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供する。
【００１３】
本発明はまた、前記種々の抗体構成ポリペプチド、又はその部分をコードするＤＮＡに関する。
本発明はまた、上記ＤＮＡを含んで成るベクター、例えば発現ベクターに関する。
本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はさらにまた、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。
【００１４】
マウスＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
さらに詳しくは、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをクローン化するためには、遺伝子源として、ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製することが必要である。この様なハイブリドーマとして、特願平２−189420号明細書にはモノクローナル抗体ＰＭ１を生産するマウスハイブリドーマＰＭ１及び該抗体の性質が記載されている。本明細書の参考例２にハイブリドーマＰＭ１の作製方法を記載する。本発明者らは、それぞれがヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＡＵＫ１２−２０、ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５を作製している。これらのハイブリドーマの作製方法は本明細書の参考例３に記載されている。
【００１５】
マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする目的のＤＮＡをクローン化するためハイブリドーマ細胞を破壊し、そしてＣｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，５２９４，１９７７に記載されている常法により全ＲＮＡを得る。次に、この全ＲＮＡを用いて、Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４，１９８９に記載されている方法を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
【００１６】
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて前記ｃＤＮＡの有意義な部分の特異的増幅を行う。マウスモノクローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号：１〜１１に示す１１種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＫＶ）及び配列番号：１２に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＫＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００１７】
前記ＭＫＶプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズし、そして前記ＭＫＣプライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズする。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域の増幅のため、配列番号：１３〜２２に示す１０種のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ；ＭＨＶ）及び配列番号：２３に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ；ＭＨＣ）をそれぞれ５′−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用する。
【００１８】
なお、５′−末端プライマーはその５′−末端近傍に制限酵素ＳａｌＩ切断部位を提供する配列ＧＴＣＧＡＣを含有し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近傍に制限酵素Ｘｍａｌ切断部位を提供するヌクレオチド配列ＣＣＣＧＧＧを含有する。これらの制限酵素切断部位は可変領域をコードする目的のＤＮＡ断片をクローニングベクターにサブクローニングするために用いられる。
【００１９】
次に増幅生成物を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩで切断させて、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。他方、プラスミドｐＵＣ１９のごとき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素ＳａｌＩ及びＸｍａＩにより切断させ、このｐＵＣ１９に前記ＤＮＡ断片を連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコードするＤＮＡ断片を含むプラスミドを得る。
クローン化されたＤＮＡの配列決定は任意の常法に従って行うことができる。
目的とするＤＮＡのクローン化及びその配列決定を実施例１〜３に具体的に記載する。
【００２０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）
本発明はさらに、本発明の各Ｖ領域の超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供する。Ｌ鎖及びＨ鎖の各対のＶ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこの領域は同様の全般的構造を有しそして各領域は配列の比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、それらは３個の超可変領域又はＣＤＲにより連結されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  １９８３）。
【００２１】
前記４個のフレームワーク領域（ＦＲ）の多くの部分はβ−シート構造をとり、ＣＤＲはループを形成する。ＣＤＲはある場合にはβ−シート構造の一部分を形成することもある。ＣＤＲはＦＲによって非常に近い位置に保持され、そして他の領域のＣＤＲと共に抗原結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体の素材として有用なこれらのＣＤＲ、及びそれをコードするＤＮＡをも提供する。これらのＣＤＲ領域は、Ｖ領域の既知アミノ酸配列と照合することによって、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」の経験則から見出すことができ、実施例４において具体的に説明する。
【００２２】
キメラ抗体の作製
ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計するに先立って、使用するＣＤＲが実際に抗原結合領域を形成することを確かめる必要がある。この目的のため、キメラ抗体を作製した。さらに実施例１及び２に記載される４種類のモノクローナル抗体のクローン化されたＤＮＡのヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体のアミノ酸配列を相互に、及び既知のマウス及びヒトの抗体のＶ領域と比較した。４種類のモノクローナル抗体のそれぞれについて、１セットの典型的な機能的マウスＬ及びＨ鎖Ｖ領域がクローニングされた。しかしながら、４種類すべてのマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体は比較的異なるＶ領域を有していた。４種類の抗体は相互に単に微小な相違ではなかった。クローン化されたマウスＶ領域を用いて４種類のキメラ抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体を作製した。
【００２３】
キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、ＰＣＲ−クローン化ｃＤＮＡに見られるようなマウスリーダー配列及びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在するヒトＣ領域をコードする配列に連結することを含んで成る。前記４種類のモノクローナル抗体の内、モノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０からのキメラ抗体の作製を実施例５に記載する。
【００２４】
モノクローナル抗体ＰＭ−１からのキメラ抗体の作製を実施例６に記載する。マウスＰＭ−１κＬ鎖リーダー領域及びＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターにＰＣＲ法を用いてクローン化した。マウスＰＭ−１抗体（単に「ＰＭ−１抗体」又は「ＰＭ」という場合もある）のＨ鎖リーダー及びＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトγ−１Ｃ領域をコードするゲノムＤＮＡを含有する発現ベクターにＰＣＲ法を用いてサブクローン化した。
【００２５】
特に設計されたＰＣＲプライマーを用いて、マウスＰＭ−１抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡをそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配列を導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿入されるように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で適切に機能するようにした。次に、これらのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得たマウスＰＭ−１抗体のＶ領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するＨＣＭＶ発現ベクター（図１）に挿入した。これらのベクターは、種々の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現又は安定な発現のために適当である。
【００２６】
マウスＰＭ−１抗体中に存在するＶ領域と同じＶ領域を有するキメラＰＭ−1 抗体（バージョンａ）の作製に加えて、キメラＰＭ−１抗体の第二のバージョン（バージョンｂ）を作製した。キメラＰＭ−１抗体（バージョンｂ）においては、Ｌ鎖Ｖ領域中の位置１０７のアミノ酸がアスパラギンからリジンに変えられている。マウスＰＭ−１抗体からのＬ鎖Ｖ領域と他のマウスＬ鎖Ｖ領域との比較において、位置１０７におけるアルギニンの存在は異常であることが注目された。
【００２７】
マウスκＬ鎖Ｖ領域においては、位置１０７の最も典型的アミノ酸はリジンである。マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７に非典型的なアミノ酸であるアルギニンを有することの重要性を評価するため、位置１０７を典型的なアミノ酸であるリジンに変えた。この変更は、ＰＣＲ−変異誘発法（Ｍ．Ｋａｍｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８７）１７：５４０４）を用いてＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列中に必要な変更を行うことにより達成された。
【００２８】
キメラＰＭ−１抗体バージョン（ａ）はヒトＩＬ−６Ｒに結合する活性を示した。キメラＰＭ−１抗体バージョン（ｂ）もバージョン（ａ）と同様にヒトＩＬ−６Ｒに結合する。同様に、他の２種類のモノクローナル抗体ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５からキメラ抗体を作製した。４種類すべてのキメラ抗体はヒトＩＬ−６Ｒによく結合し、機能的測定において、正しいマウスＶ領域がクローン化されそして配列が決定されていたことが示された。
【００２９】
４種類のマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体から、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体の設計及び作製のための第一の候補としてマウスＰＭ−１抗体を選択した。マウスＰＭ−１抗体の選択は主として、ヌードマウスに移植されたヒト骨髄腫細胞に対するマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体及びキメラ抗体の効果を研究して得られた結果に基く。４種類のマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ抗体の内、ＰＭ−１抗体が最も強い抗腫瘍細胞活性を示した。又、キメラＰＭ−１抗体はキメラＡＵＫ１２−２０抗体よりも強い抗腫瘍活性を示した。
【００３０】
マウスモノクローナル抗体ＰＭ−１のＶ領域と既知のマウス及びヒトの抗体の
Ｖ領域との比較
マウスモノクローナル抗体のＣＤＲがヒトモノクローナル抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のＦＲとヒトモノクローナル抗体のＦＲとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域を、ＯＷＬ（ｏｒ  Ｌｅｅｄｓ）ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓに見出されるすべての既知マウス及びヒトのＶ領域と比較した。
【００３１】
マウス抗体のＶ領域に関しては、ＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域はマウス抗体ｍｕｓｉｇｋｃｋｏ（Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８７）２６２：１３５７９−１３５８３）のＬ鎖Ｖ領域と最も類似しており、９３．５％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が存在した。ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域はマウス抗体ｍｕｓｉｇｖｈｒ２（Ｆ．Ｊ．Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８７）１５：５４９６）のＨ鎖Ｖ領域に最も類似しており、８４．０％の同一性が存在した。マウスＰＭ−１抗体のＶ領域は既知マウスＶ領域に高比率の同一性を示し、マウスＰＭ−１抗体のＶ領域が典型的なマウスＶ領域であることが示される。このことはさらに、クローン化されたＤＮＡ配列が正しいという間接的な証明を与える。一般に、Ｈ鎖Ｖ領域間に比べてＬ鎖Ｖ領域間の方がより高い比率の同一性が存在する。これはおそらく、Ｈ鎖Ｖ領域に比べてＬ鎖Ｖ領域において一般的に観察されるより少ない量の多様性のためであろう。
【００３２】
ヒト抗体のＶ領域に関しては、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域は、ＲＥＩとも称されるヒト抗体ｋｌｈｕｒｅ（Ｗ．Ｐａｌｍら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７５）３５６：１６７−１９１）のＬ鎖Ｖ領域に最も類似しており、７２．２％の同一性が存在する。ＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒト抗体ｈｕｍｉｇｈｖａｐ (ＶＡＰ)(Ｈ．Ｗ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ (１９８７) ２３８：７９１−７９３）に最も類似しており、７１．８％の同一性が存在する。マウスＰＭ−１抗体からの再構成抗体をいかに設計するかを考えるためにヒトＶ領域との比較が最も重要である。ヒトＶ領域への同一性の比率はマウスＶ領域への同一性の比率より低い。これはマウスＰＭ−１抗体のＶ領域がマウスＶ領域に類似しており、そしてヒトＶ領域には類似していないことの間接的証明である。この証明にまた、ヒト患者における免疫原性の問題を解決するためにマウスＰＭ−１のＶ領域をヒト型化する（ｈｕｍａｎｉｚｅ）ことが最善であることを示す。
【００３３】
マウスＰＭ−１抗体のＶ領域をさらに、E.A. Kabatら、（1987）Sequences ofProteins of Immunological Interest, Forth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Officeにより定義される、ヒトＶ領域の異なるサブグループについてのコンセンサス配列と比較した。Ｖ領域のＦＲ間で比較を行った。その結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0003616087.tif 000002
【００３５】
マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧＩ）のコンセンサス配列からのＦＲに最も類似しており、７０．１％の同一性が存在する。マウスＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域のＦＲはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループII（ＨＳＧII）のコンセンサス配列からのＦＲに最も類似しており、５２．９％の同一性が存在する。これらの結果は、既知のヒト抗体との比較から得られた結果を支持している。ヒトＲＥＩ中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩに属し、そしてヒトＶＡＰ中のＨ鎖Ｖ領域はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIに属する。
【００３６】
ヒト抗体中のＶ領域とのこれらの比較から、再構成ヒトＰＭ−１抗体のＶ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域を選択することが可能である。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（ＨＳＧＩ）に属するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループII（ＨＳＧII）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのが最善であろう。
【００３７】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計における第一段階は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することであった。マウスＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のＦＲは、サブグループＩに属するヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のＦＲに最も類似していた（表１）。前記のごとく、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域と既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較において、それはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１構成員であるヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩに最も類似していた。従って、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計においてＲＥＩからのＦＲを使用した。また、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてＲＥＩのＦＲを使用した。
【００３８】
ＲＥＩに基くこれらのヒトＦＲ中には、もとのヒトＲＥＩに比べて５個の相違が存在する（ｋａｂａｔら、１９８７、によれば位置３９，７１，１０４，１０５及び１０７；表２を参照のこと）。ＦＲ４中の３個の変化（位置１０４，１０５及び１０７）は他のヒトκＬ鎖からのＪ領域に基いており、そしてそれ故にヒトからの逸脱を成すものではない（Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３２２：２１−２５）。位置３９及び７１における２個の変化はラットＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のＦＲ中に存在するアミノ酸にもどる変化であった（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。
【００３９】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つのバージョンを設計した。第一のバージョン（バージョン「ａ」）においては、ヒトＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に存在するＲＥＩに基くＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）と同一であり、そしてマウスＣＤＲはマウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同じであった。第二のバージョン（バージョン「ｂ」）はバージョン「ａ」に基き、ヒトＦＲ３中の位置７１におけるアミノ酸１個のみを異にする。Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１−９１７により定義されるように、残基７１はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分である。この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１ループの構造に直接影響すると予想され、そしてそれ故に抗体結合に大きく影響するであろう。
【００４０】
マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域において、位置７１はチロシンである。再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の設計に使用した修飾されたＲＥＩのＦＲにおいては位置７１はフェニルアラニンであった。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」においては、位置７１のフェニルアラニンがマウスＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中に見出されるようにチロシンに変えられている。表２は、マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中での使用のために修飾されたＲＥＩのＦＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）及び再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を示す。
【００４１】
【表２】
0003616087.tif 000003
【００４２】
注：ＲＥＩのＦＲは再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体中に見出されるものである（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。ＲＥＩのＦＲ中の５個の下線を付したアミノ酸はヒトＲＥＩのアミノ酸配列（Ｐｌａｍら、１９７５；０．Ｅｐｐら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７５）１４：４９４３−４９５２）から異なるアミノ酸である。マウスＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域中のＦＲはサブグループIIに属するヒトＨ鎖Ｖ領域に最も類似している（表１）。前記のごとく、マウスＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域と既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との比較において、これはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの１構成員であるヒトＨ鎖Ｖ領域ＶＡＰに最も類似していた。ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの他の構成員であるヒトＨ鎖Ｖ領域ＮＥＷを、再構成ヒトＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域の作製のための出発材料として、及び再構成ヒトＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用いた。
【００４３】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種類のバージョンを設計した。６種類のバージョンのすべてにおいて、ヒトＦＲは再構成Ｄ１．３中に存在するＮＥＷ
ＦＲに基いており、そしてマウスＣＤＲはマウスＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域中のＣＤＲと同じである。ヒトＦＲ中の７個のアミノ酸残基（位置１，２７，２８，２９，３０，４８及び７１；表３参照）は抗原結合に不都合な影響を与える可能性を有するものと同定されている。マウスＰＭ−１抗体のＶ領域のモデルにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域中の残基１はＣＤＲループの近くに位置する表面残基である。
【００４４】
残基２７，２８，２９、及び３０は、Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４：８７７−８８２により推定されるようにＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１の標準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分であり、そして／又はＨ鎖Ｖ領域の第一構造ループの部分を構成することがマウスＰＭ−１抗体Ｖ領域のモデルにおいて観察される（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７）。残基４８はマウスＰＭ−１抗体のＶ領域のモデルにおいて埋った（ｂｕｒｉｅｄ）残基として観察された。埋った（ｂｕｒｉｅｄ）残基の変化はＶ領域及びその抗原結合部位の全体構造を破壊する可能性がある。残基７１は、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）により予想されるようにＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲ２の標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）構造の部分である。再構成ヒトＰＭ−１抗体の６種類のバージョンはヒトＮＥＷのＦＲ中のこれら７つの位置のアミノ酸の変化の異る組合わせを含む（表３を参照のこと）。
【００４５】
【表３】
0003616087.tif 000004
【００４６】
注：ＮＥＷのＦＲには再構成ヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体の第一バージョン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）中に見出されるものである。
【００４７】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれの第一バージョンをコードするＤＮＡを新規なＰＣＲ利用法を用いて作製した。要約すれば、適当なヒトＦＲをすでに含有する再構成ヒトＶ領域をコードするプラスミドをＰＣＲプライマーを用いて修飾し、ヒトＶ領域中に存在するＣＤＲをマウスＰＭ−１抗体からのＣＤＲにより置換した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製のための出発材料は、再構成ヒトＤ１．３Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡであった。この再構成ヒトＤ１．３Ｌ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域ＲＥＩ中に存在するＦＲに基いて作製された。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製のための出発材料は再構成ヒトＤ１．３Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡであった。この再構成ヒトＤ１．３抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはヒトＨ鎖Ｖ領域ＮＥＷ（Ｗ．Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６）のＦＲをコードするＤＮＡに基いて作製された。
【００４８】
所望のヒトＦＲをコードするＤＮＡを含有する出発プラスミドＤＮＡを選択した後、マウスＤ１．３ＣＤＲに代るマウスＰＭ−１抗体ＣＤＲの置換を可能にするようにＰＣＲプライマーを設計しそして合成した。各再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域につき、３種類のプライマーはマウスＰＭ−１抗体ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含有し、そして２種類のプライマーは再構成ヒトＶ領域をコードする全体ＤＮＡ配列を挟むように設計されている。一連のＰＣＲ反応における５種類のＰＣＲプライマーの使用が、出発再構成ヒトＶ領域中に存在するヒトＦＲをコードするＤＮＡ及びマウスＰＭ−１抗体Ｖ領域中に存在するＣＤＲをコードするＤＮＡから成るＰＣＲ生成物をもたらした（実施例７、並びに図７及び図８を参照のこと）。ＰＣＲ生成物をクローン化し、そして配列決定して、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」の全体ＤＮＡ配列が正しいアミノ酸配列をコードしていることを確認した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の配列を配列番号５５に示す。
【００４９】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の他のバージョンをコードするＤＮＡは、公表されているＰＣＲ−変異誘発法（Ｋａｍｍａｎら、１９８９）にわずかな変更を加えた方法を用いて作製した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の設計に関して記載したように、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追加のバージョン（バージョン「ｂ」）をコードするＤＮＡを作製し、そして再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の５種類の追加のバージョン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」、及び「ｆ」をコードするＤＮＡを作製した。これらの追加のバージョンは、第一バージョンからの一連の微細な変化を含む。アミノ酸配列のこれらの微細な変化はＰＣＲ変異誘発を用いてＤＮＡ配列の微細な変更を行うことにより達成された。ＤＮＡ配列に必要な変化を導入するＰＣＲプライマーが設計された。一連のＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物をクローン化し、そして配列決定してＤＮＡ配列中の変化が計画通りに起っていることを確認した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｆ」の配列を配列番号５４に示す。
【００５０】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域の種々のバージョンのＤＮＡ配列を確認した後、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒトＣ領域をコードするＤＮＡをすでに含有する哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングした。すなわち、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列に連結し、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列に連結した。再構成ヒトＰＭ−１抗体のより高いレベルの発現を達成するため、図１に示すようなＨＣＭＶ発現ベクターを修飾して、ＨＣＭＶプロモーター・エンハンサー領域をヒトエロンゲーションファクター（ｈｕｍａｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ；ＨＥＦ−１α）プロモーター・エンハンサーにより置き換えた（図１５を参照のこと）。
【００５１】
次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）と、Ｈ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）〜（ｆ）のすべての組合せをヒトＩＬ−６Ｒへの結合について試験し、そしてその結果、実施例１１に詳細に記載するように、Ｌ鎖バージョン（ａ）とＨ鎖バージョン（ｆ）とを含んで成る再構成ヒト抗体がキメラＰＭ−１抗体（ａ）と同じレベルでＩＬ−６Ｒに結合する能力を示した。
【００５２】
発現のレベルを改良するための、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードする
ＤＮＡの変更
ＣＯＳ細胞中で生産される再構成ヒトＰＭ−１抗体の発現レベルの検討において、再構成ヒトＨ鎖の発現が常に、再構成ヒトＬ鎖又はキメラＬ鎖もしくはＨ鎖の発現レベルに比べて約１０分の１であることが明らかになった。低レベルの発現を生じさせる問題点は再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域にあるようであった。低レベルの発現が低レベルの転写の結果であるか否かを特定するため、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクターにより同時形質転換されたＣＯＳ細胞からＲＮＡを調製した。マウスＰＭ−１抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡのＰＣＲクローニングについて記載したようにして一本鎖ｃＤＮＡを合成した。再構成ヒトＬ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列の両端を挟むように設計されたＰＣＲプライマーを用いて、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域又は再構成Ｈ鎖Ｖ領域に対応する前記一本鎖ｃＤＮＡからＰＣＲ生成物を生成せしめた。
【００５３】
再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡについて、２種類のＰＣＲ生成物が存在し、一方は予想通り４０８bpの長さを有し、他方はより短い２９９bpのＰＣＲ生成物であった。正しいサイズのＰＣＲ生成物はＰＣＲ生成物の全生成量の約９０％を占め、そして短いＰＣＲ生成物は全生成量の約１０％を占めた。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域についてもやはり２種類のＰＣＲ生成物が存在し、一方は予想通り４４４bpの長さを有し、そして他方は３７０bpの長さの短いＰＣＲ生成物であった。しかしながらこの場合、正しくない短い方のＰＣＲ生成物がＰＣＲ生成物の全生成量の大部分、すなわち約９０％を占めた。正しいサイズのＰＣＲ生成物はＰＣＲ生成物の全生成量の約１０％に過ぎなかった。これらの結果は、再構成ヒトＶ領域をコードするＲＮＡの幾らかが欠失を含むことを示した。
【００５４】
どの配列が除去されたかを決定するため、短い方のＰＣＲ生成物をクローニングし、そして配列決定した。ＤＮＡ配列から、Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のいずれについてもＤＮＡの特定の部分が欠けていることが明らかになった。除去された配列を挟むＤＮＡ配列の検討により、これらの配列はスプライスドナー−アクセプター配列のコンセンサス配列（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ．Ｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）５０：３４９−３８３）に相当することが明らかとなった。再構成ヒトＨ鎖の低い発現レベルは、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域の設計が、どちらかと言えば効果的なスプライスドナー−アクセプター部位を不注意に形成させたためであると説明された。さらに、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域の設計はどちらかと言えば非効果的なスプライスドナー−アクセプター部位を不注意に形成させたようであった。これらのスプライスドナー−アクセプター部位を除去するため、ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれバージョン「ａ」及び「ｆ」をコードするＤＮＡ配列のわずかな変更を前記のＰＣＲ−変異誘発法を用いて行った。
【００５５】
低下した発現レベルの原因は、再構成ヒトＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域（配列番号：５４及び５５）の両者のリーダー配列をコードするＤＮＡ中のイントロンの存在であると考えられた。これらのイントロンはもともと、再構成ヒトＤ１．３抗体のＶ領域（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８）をコードするＤＮＡの作製において使用されたマウスμＨ鎖リーダー配列（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１４：２６８−２７０）をコードするＤＮＡに由来する。再構成ヒトＤ１．３抗体をコードするＤＮＡは、マウス免疫グロブリンプロモーターを用いる哺乳類細胞ベクターにおいて発現されたためマウスリーダーイントロンの存在が重要であった。
【００５６】
リーダーイントロンは免疫グロブリンプロモーターからの発現のためには重要であるが、しかしＨＣＭＶのごときウィルスプロモーターからの発現のためには重要でない（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６：６７１３−６７２４）配列を含有している。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖をコードするＤＮＡが免疫グロブリンプロモーター以外のプロモーターを用いるベクターにおいて発現される場合、リーダー配列中のイントロンは、再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡのＰＣＲ−クローニングにより除去された（実施例１２を参照のこと）。
【００５７】
低下した発現レベルの他の可能性のある原因は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤＮＡとの間のイントロン内の約１９０bpの非機能的ＤＮＡの存在であると考えられた。再構成ヒトＢＩ−８Ｈ鎖Ｖ領域（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２２−５２５）をコードするＤＮＡにもともと由来するＤＮＡ配列から再構成ヒトＰＭ−１Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを作製した。この最初の再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡはマウスＮＰのＨ鎖Ｖ領域（Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８３）２：１３７３−１３７８）をコードするＤＮＡから作製された。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと、発現ベクターに再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡを連結するためのＢａｍＨＩ部位との間のイントロン中に存在する約１９０bpのこのストレッチは、再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡのＰＣＲクローニングの過程で除去された。
【００５８】
発現レベルを改良するために変形された再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域の最終バージョンのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列番号：５７及び５６に示す。これらのＤＮＡ配列は、表２に示した再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」、並びに表３に示した再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」をコードする。ＨＥＦ−１α発現ベクター（図１５）に挿入された場合、これらのベクターはトランスフェクトされたＣＯＳ細胞中で約２μｇ／mlの抗体を一過性に生産する。より多量の再構成ヒトＰＭ−１抗体を安定的に生産させるため、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだ新しいＨＥＦ−１α発現ベクターを作製した（実施例１０及び図１１を参照のこと）。
【００５９】
欠陥のある（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ＳＶ４０プロモーターを連結したｄｈｆｒ遺伝子を、ヒトγ−１Ｈ鎖を発現するＨＣＭＶベクターについて記載したのと同様にして、ヒトγ−１Ｈ鎖を発現するＨＥＦ−１αベクターに導入した。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖を発現するＨＥＦ−１αベクター及び再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖を発現するＨＥＦ−１α−ｄｈｆｒベクターをＣＨＯ  ｄｈｆｒ（−）細胞に同時形質転換した。安定に形質転換されたＣＨＯ細胞系を、ヌクレオシドを含有せず１０％のＦＣＳ及び５００μｇ／mlのＧ４１８を含有するＡｌｐｈａ−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）中で選択した。遺伝子増幅工程に先立って、ＣＨＯ細胞系は１０μｇ／１０6 細胞／日までの再構成ヒトＰＭ−１抗体を生産することが観察された。
【００６０】
マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＶ領域と既知のヒト抗体のＶ領
域との比較
マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のカッパーＬ鎖（κＬ）Ｖ領域のＦＲとヒトκＬ鎖Ｖ領域のサブグループ（ＨＳＧ）Ｉ〜IVのＦＲとの相同性、及びマウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領域のＦＲとヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループ（ＨＳＧ）Ｉ〜III のＦＲとの相同性を表４に示す。
【００６１】
【表４】
0003616087.tif 000005
【００６２】
表４に示した様に、マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のカッパーＬ鎖（κＬ）Ｖ領域は、ヒトκＬ鎖Ｖ領域のサブグループ（ＨＳＧ）Ｉ〜IVとそれぞれ同程度（６４〜６８％）の相同性を示す。タンパクのＤａｔａ  ｂａｓｅ“ＬＥＥＤＳ”の検索より、ＨＳＧ−IVに属するヒト抗体Ｌｅｎ（Ｍ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５６，５０７−５５７，１９７５）のＬ鎖Ｖ領域が最も高い６８％の相同性を示す。一方、マウスモノクローナル抗体ＰＭ−１のヒト型化に用いられているヒト抗体ＲＥＩはＨＳＧ−Ｉに属し、マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖Ｖ領域とは、６２％の相同性を示す。またマウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖のｃａｎｏｎｉｃａｌ構造を調らべてみると（Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６：９０１〜９１７）、特にＬ鎖ＣＤＲ２（Ｌ２）がＬｅｎよりＲＥＩとよく一致する。
【００６３】
上記により、マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化に用いるヒト抗体は必ずしもＨＳＧ−IVに属する抗体から選ぶ必要もなく、マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化には、マウスモノクローナル抗体ＰＭ−１のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化の場合と同様にＲＥＩを用いる。
【００６４】
表４に示す様に、ＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループＩ（ＨＳＧ−Ｉ）と最も高い相同性を示す。また、Ｄａｔａ  ｂａｓｅ“ＬＥＥＤＳ”の検索により、やはりＨＳＧＩに属するヒト抗体ＨＡＸ（Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９，２４９６−２５０１，１９８７）がＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域に対して約６６％の相同性を示す。そこで再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計においては、ＨＳＧＩに属するヒト抗体ＨＡＸのＦＲ、及び同様にＨＳＧＩに属するＦＲを含有するヒト型化４２５抗体Ｈ鎖Ｖ領域（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  Ｃ．Ａ．，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，７７３−７８３，１９９１）のＦＲを用いる。ちなみに、ＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域はヒト型化４２５抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンａと約６４％の相同性を示す。
【００６５】
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計
前記の理由により再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域のＦＲとしてＲＥＩのＦＲを使用し、表５に示すように再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域を設計した。
【００６６】
【表５】
0003616087.tif 000006
【００６７】
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計
前記の理由により、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計に再構成ヒトＶH ａ４２５のＦＲを用いる。ところで、こうして設計した再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列はスプライス供与配列とよく一致する配列を有することが見出された。このことから、再構成ヒトＰＭ−１抗体の場合と同様に異常なスプライシングが再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体の発現においても起こる可能性がある。このため、ヌクレオチド配列を部分的に変更することにより、スプライス供与配列様の配列を除去した。この修正された配列をバージョンａと称する。
さらに、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンｂ〜ｄを設計した。バージョンａ〜ｄのアミノ酸配列を表６に示す。
【００６８】
【表６】
0003616087.tif 000007
【００６９】
注：ヒトサブグループＩＶH 領域（ＨＳＧＩ）において１種類の共通アミノ酸が特定できない位置はＸで示す。アンダーラインを付した２個のアミノ酸はＨＳＧＩコンセンサス配列中のアミノ酸と異る。ＲＶH ｂ，ＲＶH ｃ及びＲＶH ｄについてはＲＶH ａと異るアミノ酸残基のみが示してある。
さらに、ヒト抗体ＨＡＸ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３９，２４９６−２５０１，１９８７，ＳＬＥ患者由来Ｂ細胞由来のハイブリドーマ２１／２８細胞の産生する抗体；そのアミノ酸配列はこの文献中のＦｉｇ．６に記載されており、それをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列はＦｉｇ．４及び５に記載されている）のＦＲを用いて再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」〜「ｄ」を次の表７に示すように設計した。
【００７０】
【表７】
0003616087.tif 000008
【００７１】
注：ｓｌｅ１２２０Ｈａ中のアンダーラインを付した２個の残基はＨＡＸのＦＲからの変化を示す。ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ｓｌｅ１２２０Ｈｃ、及びｓｌｅ１２２０ＨｄについてはＨＡＸのＦＲ中のアミノ酸と異るＦＲ中のアミノ酸のみを示す。
ヒトＩＬ−６Ｒに対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、例えばＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞中で発現される。
【００７２】
これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ；ＨＣＭＶ）プロモーターを使用するのが好ましい。ＨＣＭＶプロモーターを含有する発現ベクターの例には、ＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 、ＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣK 、ＨＣＭＶ−１２ｈ−g γ1 、ＨＣＭＶ−１２κ−ｇκ等であって、ｐＳＶ２ｎｅｏに由来するもの（図１を参照のこと）が含まれる。
【００７３】
本発明のために有用なプロモーターの他の具体例はヒト・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）プロモーターである。このプロモーターを含有する発現ベクターにはＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１及びＨＥＦ−１２ｋ−ｇκ（図８及び図９）、並びにＨＥＦ−ＶH −ｇγ１及びＨＥＦ−ＶL −ｇκ（図１５）が含まれる。
宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現ベクターはさらにｄｈｆｒ遺伝子を含有することができる。ｄｈｆｒ遺伝子を含有する発現ベクターは例えばＤＨＦＲ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ1 （図１０）、ＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆ（図１１）等である。
【００７４】
要約すれば、本発明はまず、ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域、並びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを提供する。これらは、ヒトＩＬ−６Ｒに対するヒト／マウスキメラ抗体及び再構成ヒト抗体の作製のために有用である。モノクローナル抗体は、例えばＡＵＫ１２−２０、ＰＭ−１、ＡＵＫ６４−７、及びＡＵＫ１４６−１５である。Ｌ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２４，２６，２８又は３０に示すアミノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列番号：２５，２７，２９，又は３１に示すアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列番号：２４〜３１に示すヌクレオチド配列によりコードされている。
【００７５】
本発明はまた、
（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及びマウスＬ鎖Ｖ領域；並びに
（２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域：
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対するキメラ抗体に関する。マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域並びにこれらをコードするＤＮＡは前記の通りである。前記ヒトＬ鎖Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒトＣκ領域である。前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒトＣγ１領域である。
【００７６】
キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製造する。
【００７７】
あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。
【００７８】
本発明はさらに、
（Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＬ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖ＣＤＲを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を含んで成るＬ鎖；並びに
（Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び
（２）ヒトＨ鎖ＦＲ、及びヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖ＣＤＲを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を含んで成るＨ鎖；
を含んで成る、ヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供する。
【００７９】
好ましい態様においては、前記Ｌ鎖ＣＤＲは配列番号２４，２６，２８及び３０のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列の範囲が表９において定義されるアミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖ＣＤＲは配列番号２５，２７，２９及び３１に示されるアミノ酸配列であって該アミノ酸配列の範囲が表９において定義されるアミノ酸配列を有し；前記ヒトＬ鎖ＦＲがＲＥＩに由来するものであり；前記ヒトＨ鎖ＦＲはＮＥＷ又はＨＧＳＩコンセンサス配列又はＨＡＸに由来するものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域であり；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１である。
【００８０】
好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表２においてＲＶL ａとして示されるアミノ酸配列を有し、Ｈ鎖Ｖ領域は表３にＲＶH ａ、ＲＶH ｂ、ＲＶH ｃ、ＲＶH ｄ、ＲＶH ｅ又はＲＶH ｆとして示されるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列ＲＶH ｆが最も好ましい。
【００８１】
再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクター、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクター、及びエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗体を生産せしめる。
【００８２】
あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに導入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せしめる。
こうして生産されたキメラ抗体又は再構成ヒト抗体は、常法に従って、例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等により単離、精製することができる。
【００８３】
本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖はＨ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するために使用することができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又は再構成ヒトＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製するために用いることができる。
本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、マウスＨ鎖Ｖ領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本来、抗原であるヒトＩＬ−６Ｒと結合する領域であり、それ自体として、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として有用であると考えられる。
また、本発明のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲ及びＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲも、本来、抗原であるヒトＩＬ−６Ｒと結合する部分であり、それ自体として又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、診断薬等として有用であると考えられる。
【００８４】
本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＬ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。同様にマウスＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡはキメラＨ鎖をコードするＤＮＡ又は再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。
また、本発明のＬ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＬ鎖をコードするＤＮＡの作製のために有用である。同様に本発明のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲをコードするＤＮＡは再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及び再構成ヒトＨ鎖をコードするＤＮＡ作製のために有用である。
【実施例】
【００８５】
次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例１．ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコー
ドするＤＮＡのクローン化
ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローン化した。
【００８６】
１．全ＲＮＡの調製
ハイブリドーマＡＵＫ１２−２０からの全ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７９）により記載されている方法に従って調製した。すなわち、２．１×１０8 個のハイブリドーマＡＵＫ１２−２０の細胞を２０mlの４Ｍグアニジンチオシアネート（Ｆｕｌｋａ）中で完全にホモジナイズさせた。ホモジネートを遠心管中の５．３Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層し、次にこれをＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ４０ローター中で３１，０００rpm にて２０℃で２４時間遠心分離することによりＲＮＡを沈澱させた。
【００８７】
ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにより洗浄し、そして１mM  ＥＤＴＡ及び０．５％  ＳＤＳを含有する10mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）１５０μｌ中に溶解し、そしてそれにＰｒｏｔｅｎａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を０．５mg／mlとなるように添加した後、３７℃にて２０分間インキュベートした。混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをエタノールで沈澱させた。次に、ＲＮＡ沈澱物を１mM  ＥＤＴＡを含有する10mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）２００μｌに溶解した。
【００８８】
２．一本鎖ｃＤＮＡの合成
Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４（１９８９）により記載されている方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のようにして調製した全ＲＮＡの約５μｇを40mM  ＫＣｌ, 6mM ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレイトール、０．５mM  ｄＡＴＰ，０．５mM  ｄＧＴＰ，０．５mM  ｄＣＴＰ，０．５mM  ｄＴＴＰ，３５μＭ  ｏｌｉｇｏ  ｄＴプライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ），４８ユニットのＲＡＶ−２逆転写酵素（ＲＡＶ−２：Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ２；Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び２５ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）緩衝液１０μｌに溶解し、そしてこの反応混合物を３７℃にて６０分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法のために直接使用した。
【００８９】
３．抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＰＨＣ−２（Ｔｅｃｈｎｅ）を用いてＰＣＲ法を行った。
（１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅
ＰＣＲ法に使用するプライマーは、配列番号：１〜１１に示すＭＫＶ（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及び配列番号：１２に示すＭＫＣ（Ｍｏｕｓｅ  Ｋａｐｐａ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（マウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）であった。
【００９０】
まず、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）, ５０mM  ＫＣｌ  ０．１mM  ｄＡＴＰ，０．１mM  ｄＧＴＰ，０．１mM  ｄＣＴＰ，０．１mM  ｄＴＴＰ，１．５mM  ＭｇＣｌ2 ，２．５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ），０．２５μＭのそれぞれのＭＫＶプライマー、３μＭのＭＫＣプライマー及び一本鎖ｃＤＮＡ合成の反応混合物１μｌを含有するＰＣＲ溶液１００μｌを９４℃の初期温度にて１．５分間そして次に９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを２５回反復した後、反応混合物をさらに７２℃にて１０分間インキューベートした。
【００９１】
（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡの増幅
ＰＣＲのためのプライマーとして配列番号：１３〜２２に示すＭＨＶ（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ）プライマー１〜１０（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）、及び配列番号：２３に示すＭＨＣ（Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ）プライマー（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を使用した。前記３．（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅について記載したのと同じ方法により増幅を行った。
【００９２】
４．ＰＣＲ生成物の精製および断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．ＵＳ）を用いて精製し、そして１０mM  ＭｇＣｌ2 及び１５０mM  ＮａＣｌを含有する１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）中で１０ユニットの制限酵素ＳａｌＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて３７℃にて３時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。次に、ＤＮＡ沈澱物を１０ユニットの制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃にて２時間消化し、そして生ずるＤＮＡ断片を、低融点アガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国）を用いるアガロースゲル電気泳動により分離した。
【００９３】
約４５０bp長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM  ＥＤＴＡ及び２００mM  ＮａＣｌを含有する２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM  ＥＤＴＡを含有する１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解した。こうして、マウスカッパ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るＤＮＡ断片を得た。上記ＤＮＡ断片はいずれもその５′−末端にＳａｌＩ接着末端を有しそしてその３′−末端にＸｍａＩ接着末端を有する。
【００９４】
５．連結及び形質転換
上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含んで成るＳａｌＩ−ＸｍａＩＤＮＡ断片約０．３μｇを、プラスミドｐＵＣ１９をＳａｌＩ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクター約０．１μｇと、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４），１０mM  ＭｇＣｌ2 ，１０mMジチオスレイトール、１mMスペルミジン、１mM  ＡＴＰ，０．１μｇ／mlのウシ血清アルブミン及び２ユニットＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する反応混合物中で、１６℃にて１６時間反応させ連結した。
【００９５】
次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞２００μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置した。次いで８００μｌのＳＯＣ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を加え、３７℃にて１時間インキュベートした後、２×ＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
【００９６】
この形質転換体を、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地５ml中で３７℃にて一夜培養し、そしてこの培養物から、アルカリ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従ってプラスミドＤＮＡを調製した。
こうして得られた、ハイブリドーマＡＵＫ１２−２０に由来するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをｐ１２−ｋ２と命名した。
上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマＡＵＫ１２−２０に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＳａｌＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片から作成し、そしてｐ１２−ｈ２と命名した。
【００９７】
実施例２．マウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローン
化
実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリドーマＰＭ１，ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４６−１５に適用して下記のプラスミドを得た：
ハイブリドーマＰＭ１由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＰＭ−ｋ３；
ハイブリドーマＰＭ１由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＰＭ−ｈ１；
ハイブリドーマＡＵＫ６４−７由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ６４−ｋ４；
ハイブリドーマＡＵＫ６４−７由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ６４−ｈ２；
【００９８】
ハイブリドーマＡＵＫ１４６−１５由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドｐ１４６−ｋ３；及び
ハイブリドーマＡＵＫ１４６−１５由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドＰ１４６−ｈ１。
なお、上記プラスミドを含有する大腸菌株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｌｉｍｉｔｅｄに、ブダペスト条約に基づいて、１９９１年２月１１日に寄託され、そして表８に示す受託番号を有する。
【００９９】
【表８】
0003616087.tif 000009
【０１００】
実施例３．ＤＮＡの塩基配列の決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列を、ＳｅｑｕｅｎａｓｅTMＶｅｒｓｉｏｎ２．０キット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ、米国）を用いて決定した。
まず、前記のようにして得られたプラスミド約３μｇを０．２Ｎ  ＮａＯＨにより変性し、配列決定用プライマーとアニールさせ、そしてキット添付の処方に従って35Ｓ−ｄＡＴＰにより標識した。次に、標識されたＤＮＡを、８Ｍ尿素を含有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した後、ゲルを１０％メタノール及び１０％酢酸により固定し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけることにより塩基配列を決定した。
各プラスミドのｃＤＮＡコード領域の塩基配列を配列番号：２４〜３１に示す。
【０１０１】
実施例４．ＣＤＲの決定
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的良く保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の可変性は極めて高い（Kabat, E.A. ら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest 」US Dept. Health and Human Services, 1983）。
ヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域の上記のアミノ酸配列に基き、そしてＫａｂａｔらの報告に従ってＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体の各Ｖ領域のＣＤＲを表９に示す如く決定した。
【０１０２】
【表９】
0003616087.tif 000010
【０１０３】
実施例５．クローン化されたｃＤＮＡの発現の確認（１）
発現プラスミドの作製
ＰＣＲ法によりクローン化されたＡＵＫ１２−２０抗体のκＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードするｃＤＮＡからキメラＬ鎖／Ｈ鎖をコードするＤＮＡを作製した。マウスＡＵＫ１２−２０のＶ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサー及びプロモーターを含有する哺乳類細胞発現ベクター（ＨＣＭＶ発現ベクターと称する）（図１．実施例８）中でヒトＣ領域をコードするＤＮＡに容易に連結するためには、ＡＵＫ１２−２０抗体のＶ領域をコードするマウスｃＤＮＡ配列の５′−末端及び３′−末端に便利な制限酵素切断部位を導入することが必要であった。
【０１０４】
５′−末端及び３′−末端へのこれらの修飾はＰＣＲ法を用いて行った。２セットのＰＣＲプライマーを設計しそして合成した。マウスＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域の両方について、リーダー配列の始めをコードするＤＮＡにハイブリダイズし、効率的な翻訳のために必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ.,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０，１９８７）を維持しそしてＨＣＭＶ発現ベクターへのクローニングのためのＨｉｎｄIII 部位を形成するために、Ｌ鎖Ｖ領域後方プライマー（配列番号：３２）、及びＨ鎖Ｖ領域後方プライマー（配列番号：３３）を調製した。前方ＰＣＲ−プライマーは、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、Ｃ領域へのスプライシングのために必須のＤＮＡ配列を維持しそしてＨＣＭＶ発現ベクターでのヒトＣ領域への連結のためのＢａｍＨＩ部位を形成するように、Ｌ鎖Ｖ領域前方プライマー（配列番号３４）、及びＨ鎖Ｖ領域前方プライマー（配列番号３５）を調製した。
【０１０５】
ＰＣＲによる増幅に続き、ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、ヒトκ鎖又はγ−１鎖Ｃ領域ＤＮＡを含有するＨＣＭＶベクターにクローン化し、そして塩基配列を決定してＰＣＲ法による増幅中にエラーが生じなかったことを確認した。得られる発現ベクターをＨＣＭＶ−１２ｋ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１と称する。
ＨＣＭＶ発現ベクターの構造を図１に示す。プラスミドＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣκにおいて、ＶL 領域は任意のマウスＬ鎖Ｖ領域コード配列であることができる。この例において、ＡＵＫ１２−２０κＬ鎖Ｖ領域を挿入することによりＨＣＭＶ−１２ｋ−ｇｋを得た。プラスミドＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１において、ＶH 領域は任意のマウスＨ鎖Ｖ領域コード配列であることができる。この例においてはＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領域を挿入してＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１を得た。
【０１０６】
ＣＯＳ細胞での一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現
キメラＡＵＫ１２−２０抗体のＣＯＳ細胞での一過性発現を見るため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いる電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりＤＮＡをＣＯＳ細胞に導入した。すなわち、ＣＯＳ細胞を１×１０7 個／mlになるようにｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に懸濁し、この細胞浮遊液０．８mlにＤＮＡ（各プラスミドについ１０μｇ）を加えた。１，９００ボルト（Ｖ）、２５マイクロファラッド（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。
【０１０７】
室温にて１０分間の回復期間の後、エクレトロポレーションした細胞を、１０％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）８mlに加えた。７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、又は−２０℃にて長時間貯蔵した。
【０１０８】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるキメラ抗体の定量
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロックした後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止しそして４０５nmにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【０１０９】
ヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を確認するための酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地をＥＬＩＳＡにより測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のため、プレートをＭＴ１８マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコートした。１％  ＢＳＡでブロックした後、可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。
洗浄した後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈し、そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そして４０５nmにおける吸光度を測定した。
【０１１０】
この結果を図２に示した。キメラ抗体ＡＵＫ１２−２０をコードする遺伝子のＣＯＳ細胞へのトランスフェクションを実施した。このＣＯＳ細胞の培養上清サンプルは、ＩＬ−６Ｒに対する強い結合能を示し、図２に○（オープンサークル）で示す如く、サンプルの希釈度（抗体の濃度）依存的に４０５nmにおける吸光度が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒレセプターに対する抗体が含まれていることが確認された。
【０１１１】
ヒトＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害する能力の測定
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培養上清を測定して培地中に存在する抗体が、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との結合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化ＩＬ−６との競合的結合阻害能を調べた。プレートをＭＴ１８マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコートした。ブロッキングの後、可溶性組換ヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄した後、ＣＯＳ細胞からのサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化ＩＬ−６と共に各ウエルに加えた。
【０１１２】
洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そして吸光度を４０５nmにて測定した。精製マウスＡＵＫ１２−２０モノクローナル抗体を陽性対照として用いた。無関係の抗体を発現するＣＯＳ細胞からの培地を陰性対照として用いた。
【０１１３】
この結果を図３に示した。キメラ抗体ＡＵＫ１２−２０をコードする遺伝子でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の培養上清は、最高、及び２番目に高いサンプル濃度でＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害した。すなわち、図３に●で示す如く、サンプル希釈度（抗体の濃度）依存的に４０５nmにおける吸光度が変化し、サンプル中の抗体がＩＬ−６ＲとＩＬ−６の結合を阻害していることが認められた。これは陽性対照の吸光度の抗体濃度依存的変化（○）にほぼ一致することからも確認出来た。
なお、陰性対照（△）は阻害活性が全く認められなかった。
【０１１４】
実施例６．クローン化ｃＤＮＡの発現の確認（２）（キメラＰＭ−１抗体の作
製）
発現ベクターの作製
キメラＰＭ−１抗体を発現するベクターを作製するため、それぞれマウスＰＭ−１κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンｐＰＭ−ｋ３及びｐＰＭ−ｈ１をＰＣＲ法により変形し、そしてＨＣＭＶ発現ベクター（図１を参照のこと）に導入した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーｐｍｋ−ｓ（配列番号：３８）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライマーｐｍｈ−ｓ（配列番号：４０）を、リーダー配列の最初をコードするＤＮＡにハイブリダイズし且つＫｏｚａｋコンセンサス配列及びＨｉｎｄIII 制限部位を有するように設計した。Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーｐｍｋ−ａ（配列番号：３６）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーｐｍｈ−ａ（配列番号：３９）を、Ｊ領域の末端をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ制限部位を有するように設計した。
【０１１５】
κＬ鎖Ｖ領域のため、２種類の前方プライマーを合成した。ほとんどのκＬ鎖においては、位置１０７のリジンが保存されているが、マウスＰＭ−１κＬ鎖においては位置１０７がアスパラギンである。キメラＰＭ−１抗体の抗原結合活性に対するこの変化の効果を検討するため、前方プライマーｐｍｋ−ｂ（配列番号：３７）を、位置１０７がアスパラギンからリジンに変るように設計した。ＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ生成物を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＵＣ１９ベクター（Ｙａｎｉｓｈｅ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３：１０３−１０９）にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定の後、ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を切出し、そしてＨ鎖Ｖ領域については発現ベクターＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１にクローン化してＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１を得、そしてＬ鎖Ｖ領域についてはＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣκにクローン化してＨＣＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−ＰＭｋｂ−ｇｋを得た。
【０１１６】
ＣＯＳ細胞のトランスフェクション
キメラＰＭ−１抗体の一過性発現を観察するため、前記発現ベクターをＣＯＳ細胞において試験した。ＨＣＭＶ−ｐｍｈ−ｇγ１と、ＨＣＭＶ−ｐｍｋａ−ｇｋ又はＨＣＭＶ−ｐｍｋｂ−ｇｋのいずれかとを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ細胞に同時形質転換した。ＤＮＡ（プラスミド当り１０μｇ）を、ＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加え、１，９００Ｖ，２５μＦの容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％のγ−グロブリン不含有ウシ胎児血清を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）に加えた。７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃にて短期間貯蔵し、又は−２０℃にて長期間貯蔵した。
【０１１７】
キメラＰＭ−１抗体の発現及び分析
３日間の一過性発現の後、ＣＯＳ細胞からの培地を集め、そしてキメラＰＭ−１抗体について試験した。培地をまずＥＬＩＳＡにより分析して、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞によりヒト様抗体が生産されたか否かを決定した。このアッセイにおいて標準として既知量の精製ヒトＩｇＧを用いることにより、ＣＯＳ細胞からの培地中に存在するヒト様抗体（この場合、キメラＰＭ−１抗体）の量を推定することが可能である。ヒト抗体の検出のため、プレートをヤギ抗−ヒトＩｇＧ（全体分子、Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロッキングの後、ＣＯＳ細胞からのサンプルを段階希釈し、そして各ウェルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスフェターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そして４０５nmでの吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０１１８】
キメラＰＭ−１抗体をコードする遺伝子を担持するベクターによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの培地はヒト様抗体の発現について陽性であり、そしておよその量が上記のようにして測定された。
次に、キメラＰＭ−１抗体をコードする遺伝子を担持するベクターによりトランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの同じ培地をヒトＩＬ−６Ｒに結合する能力について測定した。抗原への結合の測定のため、プレートを、ヒトＩＬ−６Ｒに対する抗体であるＭＴ１８マウスモノクローナル抗体（参考例１）によりコートした。ブロッキングの後、可溶性ヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄した後、サンプルを段階希釈し、そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的；Ｓｉｇｍａ）を添加した。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そして４０５nmでの吸光度を測定した。この測定のために標準品は存在しなかった。
【０１１９】
２個のサンプルの内の１つは、マウスＰＭ−１抗体中に見られるＶ領域と同一のＶ領域を有するキメラ抗体（キメラＰＭ−１ａ抗体、図４）をコードする遺伝子によるトランスフェクトからのサンプルであった。他の１つのサンプルはＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７に前記のような１個のアミノ酸変化を有するキメラ抗体（キメラＰＭ−１ｂ抗体、図４）をコードする遺伝子によるトランスフェクションからのものであった。いずれのサンプルも、サンプルの希釈により減少するＩＬ−６Ｒに対する強い結合を示した。すなわち、作製されたキメラＰＭ−１抗体は機能的であり、そしてその抗原によく結合することができる。
【０１２０】
最も重要なことは、機能的キメラＰＭ−１抗体の証明は、正しいマウスＰＭ−１Ｖ領域がクローン化されそして配列決定されたことの直接の証拠である。Ｌ鎖Ｖ領域中の位置１０７にいずれのアミノ酸を有するキメラ抗体も抗原ＩＬ−６Ｒによく結合した。マウスＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置１０７は抗原結合のためにあまり重要ではなく、そしてこの位置におけるアスパラギン及びリジンのいずれも満足に機能するようである。マウスＰＭ−１抗体はそのＬ鎖Ｖ領域のこの位置にアスパラギンを有するので、キメラＰＭ−１抗体を用いるその後のすべての研究は、マウスＰＭ−１抗体に見出されるそれと同じバージョンａを用いて行った。
【０１２１】
より多量のＰＭ−１抗体を安定に生産するために、ｄｈｆｒ遺伝子を含有する新たなＨＣＭＶ発現ベクターを作製した。キメラＰＭ−１抗体のより高い発現レベルを達成するための第一段階は、ベクターＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 （図１）を変形して、このベクターが欠陥のある（ｃｒｉｐｐｌｅｄ）ＳＶ４０プロモーターエンハンサーにより発現されるｄｈｆｒ遺伝子を含有するようにすることであった。ＳＶ４０エンハンサー要素をｐＳＶ２−ｄｈｆｒベクター（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８１）１：８５４−８６４）から除去し、そしてＳＶ４０プロモーターによって発現されるｎｅｏ遺伝子の代りに「欠陥のある」ＳＶ４０プロモーターにより発現されるｄｈｆｒ遺伝子をＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 に挿入した。次に、この新しいＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 −ｄｈｆｒベクターにマウスＰＭ−１Ｖ領域を挿入した。この改良された発現ベクターの作製を実施例１０に詳細に記載する。
【０１２２】
ＣＨＯ  ｄｈｆｒ（−）細胞（Ｇ．Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：４２１６−４２２０）を２種類のプラスミドＤＮＡすなわちキメラＰＭ−１ａＬ鎖を発現するためのＨＣＭＶ−ＶL −ＨＣκベクター（ＨＣＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ）及びキメラＰＭ−１  Ｈ鎖を発現するためのＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ1 −ｄｈｆｒベクター（ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＰＭｈ−ｇγ１；実施例１０）により同時形質転換した。ＤＮＡ（各プラスミドにつき１０μｇ／ml）をＰＢＳ中１×１０7 細胞／mlの０．８mlのアリコートに加えた。１９００Ｖの電圧２５μＦの電気容量でパルスを与えた。
【０１２３】
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ヌクレオシド及び１０％  ＦＣＳを含有するＡｌｐｈａ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ培地（α−ＭＥＭ）１０mlに加えた。一夜のインキュベーションの後、培地を、ヌクレオシドを含有せず１０％  ＦＣＳ及び５００μｇ／mlのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ）を含有するα−ＭＥＭに変えて、ｄｈｆｒ+ 及びｎｅｏ+ 形質転換細胞の選択を行った。選択の後、選択されたクローンを用いて遺伝子増幅を行った。２×１０-8Ｍメソトレキセート（ＭＴＸ）中での１ラウンドの増幅の後、約３．９μｇ／１０6 細胞／日のキメラＰＭ−１ａの抗体を生産する細胞系（ＰＭ１ｋ３−７）を選択した。
【０１２４】
ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害するキメラ抗体の能力についてのＥ
ＬＩＳＡ測定
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞において又は安定なＣＨＯ細胞系において生産された抗体を測定して、それらが、ＩＬ−６Ｒへのビオチン化ＩＬ−６の結合と競争するか否かを決定した。プレートをマウス抗体ＭＴ１８によりコートした。ブロッキングの後、可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）を加えた。洗浄の後、ＣＯＳ細胞からのサンプルを段階希釈し、そしてビオチン化ＩＬ−６と一緒に各ウエルに加えた。洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンを加えた。インキュベーション及び洗浄後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止させ、そして４０５nmにおける吸光度を測定した。結果を図５に示す。
【０１２５】
実施例７．再構成ヒトＰＭ−１抗体の作製
より迅速に且つより効率的にＣＤＲ移植を達成するため、ＰＣＲによる逐次ＣＤＲ移植法を開発した。この方法はＰＣＲ変異誘発法（Ｋａｍｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１７：５４０４，１９８９）に基く。
ＣＤＲ移植のための選択されたヒトＦＲをコードするＤＮＡを含有する鋳型ＤＮＡを調製するために、適当な再構成ヒトＶ領域をコードするＤＮＡを便利なベクターに再クローニングする必要があった。プラスミドａｌｙｓ１１及びＦ１０のＤＮＡはそれぞれ再構成ヒトＤ１．３のＬ鎖及びＨ鎖をコードしており、ヒトＲＥＩからのＦＲをコードするＤＮＡ及びＮＥＷからのＦＲをコードするＤＮＡをそれぞれ含有する。
【０１２６】
再構成ヒトＤ１．３のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約５００bpのＮｃｏＩ−ＢａｍＨ１断片をａｌｙｓ１１から切り出し、そしてＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで開裂されたｐＢＲ３２７にサブクローニングしてプラスミドＶｌ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７を得た。このＶｌ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７からのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより開裂されたｐＵＣ１９に挿入してプラスミドＶｌ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９を得た。
【０１２７】
再構成ヒトＤ１．３のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約７００bpのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をＦ１０から切り出し、そしてＨｉｎｄIII −ＮｃｏＩアダプターを用いてｐＢＲ３２７のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、Ｖｈ−ｌｙｓ−ｐＢＲ３２７を得た。次に、このプラスミドからＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を切り出し、そしてＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより開裂されたｐＵＣ１９にサブクローニングしてＶｈ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９を得た。
【０１２８】
なお、プラスミドａｌｙｓ１１及び再構成ヒトＤ１．３のＬ鎖Ｖ領域ＦＲをコードするＤＮＡ配列はヒト型化ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ抗体（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８))のそれと同じである。鋳型として使用した、プラスミドＦ１０中の再構成ヒトＤ１．３のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列は、Ｖ．Ｖｅｒｈｏｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：１５３４−１５３６（１９８８）のＦｉｇ．２に記載されている。
【０１２９】
図６は、再構成ヒトＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域の第一バージョンをコードするＤＮＡの作製のために使用されたプライマー及びＰＣＲ反応を模式的に示す。後方プライマーＡ（ＡＰＣＲ１；配列番号：４１）及び前方プライマーＥ（ＡＰＣＲ４；配列番号：４２）は、このベクター上のＤＮＡ配列にハイブリダイズする。ＡＰＣＲ１及びＡＰＣＲ４はｐＵＣ１９ベクターのために特に設計されたが、ユニバーサルＭ１３配列プライマーを使用することもできる。
【０１３０】
ＣＤＲ１移植／変異誘発プライマーＢ（ｐｈｖ−１；配列番号：４３）、ＣＤＲ２移植プライマーＣ（ｐｈｖ−２；配列番号：４４）、及びＣＤＲ３移植プライマーＤ（ｐｈｖ−３；配列番号：４５）は４０〜６０bpの長さを有し、マウスＰＭ−１のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ及び該ＣＤＲをコードするＤＮＡを挟む鋳型ＤＮＡ中のヒトＦＲをコードするＤＮＡ配列から成る。第一のＰＣＲ反応において前方プライマーＡＰＣＲ４及び後方プライマーＤを用いた。マウスＰＭ−１のＣＤＲ３配列をコードするＤＮＡを含有する第一ＰＣＲ生成物を精製し、そして第二ＰＣＲ反応において後方プライマーとしてのプライマーＣと共に前方プライマーとして使用した。
【０１３１】
同様にして、マウスＰＭ−１のＣＤＲ２及びＣＤＲ３をコードするＤＮＡを含有する第二ＰＣＲ生成物、並びにマウスＰＭ−１の３個すべてのＣＤＲをコードするＤＮＡを含有する第三ＰＣＲ生成物をそれぞれ次のＰＣＲ段階のプライマーとして使用した。完全な再構成ヒトＰＭ−１  Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを有する第四ＰＣＲ生成物を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そしてさらに分析するためにｐＵＣ１９にサブクローニングした。
【０１３２】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製のために３種類の変異誘発プライマーｐｈｖ−１，ｐｈｖ−２及びｐｈｖ−３を合成した。これらは８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。変異誘発プライマーｐｈｖ−１は、マウスＰＭ−１抗体のＣＤＲ１の移植のためのみならずヒトＦＲ１中の位置２７及び３０におけるそれぞれのＳｅｒからＴｙｒへ、及びＳｅｒからＴｈｒへの変異のために設計された。各１００μｌのＰＣＲ反応物は典型的には１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM  ＫＣｌ，１．５mM  ＭｇＣｌ2 ，２５０μＭ  ｄＮＴＰ，５０ngの鋳型ＤＮＡ（Ｖｈ−ｌｙｓ−ｐＵＣ１９），２．５ｕのＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、及びプライマーを含有した。
【０１３３】
１μＭずつのｐｈｖ−３プライマー及びＡＰＣＲ４プライマーを含む第一のＰＣＲ反応を行い、９４℃にて１．５分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、３７℃にて１分間及び７２℃にて１分間の３０サイクルを反復した。アニーリング段階と合成段階の間の変温時間は２．５分間であった。最終サイクルの完了の後、７２℃にて１０分間の最終伸長反応を行った。５２３bpのＰＣＲ生成物を１．６％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そして次に第二のＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。
【０１３４】
第二のＰＣＲ反応において約１μｇの精製された第一ＰＣＲ生成物及び２５ｐｍｏｌｅの変異誘発プライマーｐｈｖ−２をプライマーとして使用した。ＰＣＲ条件は第一のＰＣＲ反応について記載したのと同じであった。同様にして、第二のＰＣＲ反応からの６６５bpのＰＣＲ生成物をプライマーｐｈｖ−１と共に第三のＰＣＲ反応において使用し、そして第三のＰＣＲ反応からの７３７bpのＰＣＲ生成物をプライマーＡＰＣＲ１と共に第四のＰＣＲ反応において使用した。第四のＰＣＲ反応からの１．１７２kbのＰＣＲ生成物を精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、そして次に再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域を含有する約７００bpの断片をｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。配列決定した４個のクローンの内２個が正しいアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有しており、そしてｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａと命名した。
【０１３５】
再構成ＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョンをコードするＤＮＡを作製するため５種類の変異誘発ＰＣＲプライマーを合成した。各ＰＣＲ反応は前記の反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。バージョン「ｂ」のため、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｍ４（Ｖａｌ−７１→Ａｒｇ−７１）（番号はＫａｂａｔらによる；表４参照）（配列番号：４６）及びＡＰＣＲ４を、鋳型ＤＮＡとしてのｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａと共に第一ＰＣＲ反応において使用した。この第１ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてプライマーＡＰＣＲ１と共に第二ＰＣＲ反応における前方プライマーとして使用した。第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を１．６％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そしてｐＵＣ１９にてサブクローニングしてｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを得た。
【０１３６】
同様にして、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｎｍ（Ａｓｐ−１→Ｇｌｎ−１）（配列番号：４７）及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン「ｃ」をコードするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ）を得、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｍ６（Ｉｌｅ−４８→Ｍｅｔ−４８）（配列番号：４８）及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン「ｄ」をコードするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ）を得、変異誘発プライマーｐｈｖ−ｎｍ及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｃを用いてバーション「ｅ」をコードするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ）を得、そして変異誘発プライマーｐｈｖ−ｍ７（Ｔｈｒ−２８→Ｓｅｒ−２８、及びＰｈｅ−２９→Ｉｌｅ−２９）（配列番号：４９）及び鋳型ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂを用いてバージョン「ｆ」をコードするＤＮＡ（ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ）を得た。再構成Ｈ鎖Ｖ領域バーション「ｆ」のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列番号５４に示す。
【０１３７】
図７は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョンをコードするＤＮＡの作製において使用したプライマー及びＰＣＲ反応を模式的に示す。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョンをコードするＤＮＡの作製のため、ＣＤＲ１移植プライマーｐｋｖ−１（配列番号：５０）、ＣＤＲ２移植プライマーｐｋｖ−２（配列番号：５１）及びＣＤＲ３移植プライマーｐｋｖ−３（配列番号：５２）を合成し、そして８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。前記のようにしてＰＣＲ反応を行った。第一ＰＣＲ反応物は1 μＭずつのｐｋｖ−３プライマー及びＡＰＣＲ４プライマーを含有した。第一ＰＣＲ反応からの３５０bpのＰＣＲ生成物を１．５％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そして第二ＰＣＲ反応における前方プライマーとして使用した。
【０１３８】
第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化し、そしてＣＤＲ３が移植されたＤＮＡを含有する５００bp断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。正しい配列を有するプラスミドＤＮＡを同定し、そして次のＰＣＲ反応における鋳型ＤＮＡとして使用した。第三ＰＣＲ反応において２５ｐｍｏｌｅの変異誘発プライマーｐｋｖ−２及びＡＰＣＲ４を使用した。第三ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてプライマーｐｋｖ−１と共に第四ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。同様にして、第四ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物をＡＰＣＲ１プライマーと共に第五ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。
【０１３９】
第五ＰＣＲ反応からの９７２bpのＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化し、そしてＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９にサブクローニングした。ＣＤＲ２領域において問題点が認識され、さらに２回のＰＣＲ反応が必要であった。第六ＰＣＲ反応及び第七ＰＣＲ反応において、ｐＵＣ１９ベクターにクローニングされた第五ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を鋳型ＤＮＡをして使用した。第六ＰＣＲ反応においてプライマーはｐｋｖ−２及びＡＰＣＲ４であった。第六ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてＡＰＣＲ１プライマーと共に第七ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。第七ＰＣＲ反応からのＰＣＲ精製物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化し、そして５００bp ＤＮＡ断片をＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９にサブクローニングした。配列決定した５個のクローンの内２個のクローンが正しいＤＮＡ配列を有していた。このクローンをｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａと称する。この配列を配列番号：５５に示す。
【０１４０】
再構成ヒトＰＭ−１  Ｌ鎖Ｖ領域の他のバージョンをコードするＤＮＡの作製のため、変異誘発プライマーｐｖｋ−ｍ１（配列番号：５３）を合成した。ＰＣＲ反応は本質的に前記の通りであった。第一ＰＣＲ反応において、変異誘発プライマーｐｋｖ−ｍ１（Ｐｈｅ−７１→Ｔｙｒ−７１）及びＡＰＣＲ４プライマーを鋳型ＤＮＡとしてのｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａと共に使用した。第一ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、そしてＡＰＣＲ１プライマーと共に第二ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。第二ＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化し、そしてＤＮＡ配列決定のためにｐＵＣ１９にサブクローニングした。このクローンをｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ｂと命名した。
【０１４１】
実施例８．遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で、発現させるためのヒトサ
イトメガロウイルス前期（ＨＣＭＶ）プロモーターを用いるベクタ
ーの作製（図１）
キメラＰＭ−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片及びキメラＰＭ−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ断片を、それぞれ、哺乳類細胞中でヒトκＬ鎖又はヒトγ−１Ｈ鎖を発現するように設計されたＨＣＭＶ発現ベクター（図１を参照のこと）ＨＣＭＶ−ＶL −ＫＣκ及びＨＣＭＶ−ＶH −ＨＣγ１にまず挿入した。該ＨＣＭＶ発現ベクターの作製のための詳細な記載は、Ｍａｅｄａら、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９９１）２：１２４−１３４；Ｃ．Ａ．Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ（１９９１）４：７７３−７８３に公表されている。両ベクターはｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｐ．Ｊ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ.,Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８２）１：３２７−３４１）に基礎を置き、そして免疫グロブリンＬ鎖又はＨ鎖の高レベルの転写のためにヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びエンハンサー（Ｍ．Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１−５３０）を含有する。
【０１４２】
Ｌ鎖発現ベクターはヒトＣκ領域（Ｔ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓら、Ｃａｒｒ．ＴＯＰ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１１４：１６６−１７１）をコードするゲノムＤＮＡを含有し、そしてＨ鎖発現ベクターはヒトＣγ１領域（Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ（１９８２）２９：６７１−６７９）をコードするゲノムＤＮＡを含有する。これらのＨＣＭＶ発現ベクターは多能であり、そして種々の哺乳類細胞タイプにおける一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現及び安定な発現のために使用することができる。
【０１４３】
実施例９．遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で発現させるためのヒトエロ
ンゲーションファクター１α（ＨＥＦ−１α）プロモーターを使用
するベクターの作製（図８及び図９）
ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・フアクター１α（ＨＥＦ−１α）は最も豊富な蛋白質の１つである。これはほとんどの細胞で発現される。ヒトＥＦ−１αプロモーター−エンハンサーの転写活性はＳＶ４０前期プロモーター−エンハンサーのそれに比べて約１００倍である（Ｄ．Ｗ．Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ（１９９０）９１：２１７−２２３；及びＴ．Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：５７９１−５７９８）。２．５kbのＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサー領域は、該遺伝子の５′−末端に接する約１．５kbのＤＮＡ、第一エクソン中の３３bp、第一イントロン中の９４３bp、及び第二エクソンの最初の部分の１０bpから成る。
【０１４４】
この後２．５kbのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴ（Ｄ．Ｗ．Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ（１９９０）９１：２１７−２２３；及びＴ．Ｕｅｔｓｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：５７９１−５７９８）から切り出し、そしてｐｄＫＣＲベクター（Ｍ．Ｔｓｕｃｈｉｙａら，Ｅｍｂｏ  Ｊ．（１９８７）６：６１１−６１６）、Ｋ．Ｏ′Ｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．３，１５２７−１５３１，（１９８１）、（Ｒ．Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖａｌ．８１，５０８６−５０９０（１９８４))にクローニングして、ＳＶ４０前期プロモーター−エンハンサーを含有する約３００bpのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片を置き換えてｐＴＥＦ−１を得た。
【０１４５】
ｐＴＥＦ−１をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼでフィルーインし、そしてＨｉｎｄIII リンカーに連結した。次に、この修飾されたｐＴＥＦ−１ベクターＤＮＡから約１．６kbのＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ断片を切り出した。
ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１をＥｃｏＲＩにより部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによりフィルーインし、そして自己連結することにより、実施例５において作製したＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１からプラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（ΔＥ２）を作製した。
【０１４６】
プラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（ΔＥ２）をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼでフィルーインし、そしてＨｉｎｄIII で消化した。ヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約７kbの断片を、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサーを含有する前記の１．６kb  ＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ断片に連結してＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１を得た。このベクター中のＨＥＦ−１αプロモーター・エンハンサー領域は、５′−領域に接する３８０bpのＤＮＡを除き、ｐＴＥＦ−１中のそれと同一であった。ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片として存在するこのＨ鎖Ｖ領域は、他のＨ鎖Ｖ領域と容易に交換することができる。
【０１４７】
再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ及びｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ（実施例７）から切り出し、そして前記のプラスミドＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入して、それぞれ発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ、及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆを得た。発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ、及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆ、並びにＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１は、それぞれ再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」及び「ｆ」、並びにマウスＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを有する。
【０１４８】
Ｌ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋを作製するため、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサー領域を含有する約３．０kbのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片をＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１ら切り出し、そして実施例５において作製したＨＣＭＶ−Ｌ鎖発現ベクターＨＣＭＶ−１２ｋ−ｇｋからの約７．７kbのＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片に連結してＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋを得た。Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１の場合と同様に、ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片として存在するＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋ中のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡは他のＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡと容易に交換することができる。なお、プラスミドＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１は、ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１（図８）のＥＦ１αプロモーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）によりＨＣＭＶ−ｐｍｈ−ｇγ１のＨＣＨＶプロモーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）を置き換えることにより作製したものである。
【０１４９】
再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片をｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ及びｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ｂ（実施例７）から切り出し、そしてＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入し、それぞれ発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及びＲＶ１−ＰＭ１ｂを得た。発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及びＲＶ１−ＰＭ１ｂ、並びにＨＥＦ−ＰＭK −ｇｋはそれぞれ再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域「ａ」及び「ｂ」、並びにマウスＰＭ−１  Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを有する。なお、プラスミドＨＥＦ−ＰＭK −ｇｋは、ＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋ（図９）のＥＦ１αプロモーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片) によりＨＣＭＶ−ｐｍｋａ−ｇｋのＨＣＭＶプロモーター領域（ＰｖｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片）を置き換えることにより作製したものである。
【０１５０】
実施例１０．遺伝子操作された抗体をＣＨＯ細胞中で高レベルで発現させるた
めの、欠陥ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー配列に連結され
たジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を用いる
ベクターの作製（図１０及び図１１）
ＳＶ４０前期プロモーターからエンハンサー配列を除去するため、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８１）１：８５４−８６４）（ＡＴＣＣ３３６９４）をＳｐｈＩ及びＰｖｕIIで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼでフィルーインし、そして自己連結してｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥを得た（図１０）。ＨＣＭＶプロモーター、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びヒトγ−１Ｃ領域をコードするＤＮＡを含有する約３．７kbのＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩによる部分消化によりＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１から切り出した。この断片を、ＥｃｏＲＩ−消化ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥに連結してＤＨＦＲ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ１を得た。
【０１５１】
ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハンサーを用いるＨ鎖発現ベクターに基いて類似のベクターを作製した（図１１を参照のこと）。ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１に由来する約３．７kbのＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ−消化ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ΔＥと連結してＤＨＦＲ−ΔＥ−１２ｈ−ｇγ１を得た。ＤＨＦＲ−ΔＥ−１２ｈ−ｇγ１中のｄｈｆｒ配列に続くＢａｍＨＩ部位を、ＢａｍＨＩによる部分消化、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼによるフィルーイン及び自己連結により除去した。ｄｈｆｒ  ｃＤＮＡを含有する約４kbのＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ断片をこの修飾されたＤＨＦＲ−ΔＥ−１２ｈ−ｇγ１から切り出し、そして実施例１２において作製したＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４からの約３kbのＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結してＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭｌｆを得た。
上記の改良されたプラスミドは本発明の再構成ヒトＰＭ−１抗体の製造のために使用することができる。
【０１５２】
実施例１１．再構成ヒトＰＭ−１抗体の種々のバージョンの発現及び分析
再構成ヒトＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各ＨＥＦ−１αベクターをＣＯＳ細胞に同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）した。標準対照としてキメラＰＭ−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各ＨＥＦ−１αベクターもＣＯＳ細胞に同時形質転換した。３日後，形質転換されたＣＯＳ細胞からの培地を集め、そしてＥＬＩＳＡにより（１）上清中に存在するヒトＩｇＧ抗体の量について、及び（２）ＩＬ−６Ｒに結合するそのＩｇＧの能力について分析した。次に、同じサンプルをさらに、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する該抗体の能力について試験した。
【０１５３】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖を発現する２種類のベクターの一方（ＲＶ１−ＰＭ１ａ又はＲＶ１−ＰＭ１ｂ）及びキメラＰＭ−１抗体Ｈ鎖を発現するベクター（ＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１）によりＣＯＳ細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの評価を行った。細胞をまた、キメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクター（ＨＣＭＶ−ＰＭｋａ−ｇｋ及びＨＣＭＶ−ＰＭｈ−ｇγ１）により同時形質転換した。未精製のＣＯＳ細胞上清を用いるデーターは、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合についての測定において、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖のバージョン「ａ」がキメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖と同等であることを示した。
【０１５４】
しかしながら、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖のバージョン「ｂ」はヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を実質的に保持しなかった。これらの結果から、ＦＲ３中の位置７１のフェニルアラニン（ＣＡＭＰＡＨＴＨ−１Ｈのために修飾されたヒトＲＥＩ中に存在する）からチロシン（天然ヒトＲＥＩ及びマウスＰＭ−１抗体中に存在する）への変化は機能的抗原結合部位の形成に対して非常に有害であることが結論された。
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の種々のバージョンを評価する次の実績において、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」を常に用いた。
【０１５５】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖の発現する６種類のベクターの１つ（ＲＶｈ−ＰＭ１ａ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｂ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｃ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｄ，ＲＶｈ−ＰＭ１ｅ又はＲＶｈ−ＰＭ１ｆ）及び再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖のバージョン「ａ」を発現するベクター（ＲＶ１−ＰＭ１ａ）によりＣＯＳ細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種類のバージョンを評価した。細胞を、キメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクター（ＨＥＦ−ＰＭｋ−ｇｋ及びＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１）によっても同時形質転換した。未精製のＣＯＳ細胞上清を用いた予備データーが示すところによれば、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合についての測定において、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖のバージョン「ａ」及び再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖のバージョン「ｆ」は、キメラＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖と同等であった。
【０１５６】
この予備データーを確認するため、キメラＰＭ−１抗体及び再構成ヒトＰＭ−１抗体をＣＯＳ細胞上清から濃縮そしてプロテインＡを用いて精製した。すなわち、ＣＯＳ細胞からの培地を１００ｋｄカットオフ限外濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮した。濃縮した培地をプロテインＡアガロース（ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳIIキット、ＢｉｏＲａｄ）を用いて精製した。要約すれば、濃縮された培地を、５ベッドボリウムの結合緩衝液により平衡化されたプロテインＡアガロースカラムに適用した。このカラムを１５ベッドボリウムの結合緩衝液で洗浄し、そして次に５ベッドボリウムの溶出緩衝液で溶出を行った。そしてマイクロコンセントレーター（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０，Ａｍｉｃｏｎ）を用いて溶出液を濃縮し、溶出緩衝液をＰＢＳに置換した。
【０１５７】
キメラＰＭ−１抗体、及び再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」と再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」又は「ｆ」とから成る再構成ヒトＰＭ−１抗体の精製されたサンプルの分析を行った。Ｌ鎖の「ａ」バージョン＋Ｈ鎖の「ｆ」バージョンが明らかに最良の再構成ヒトＰＭ−１抗体であった。このものは、キメラＰＭ−１抗体と同様にヒトＩＬ−６Ｒに結合する（図１３）。これはまた、マウス抗体及びキメラ抗体と同様に、ヒトＩＬ−６がヒトＩＬ−６Ｒに結合するのを阻害する（図１４）。
【０１５８】
実施例１２．発現レベルを改良するための再構成ヒトＰＭ−１Ｖ領域の修正
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域（配列番号：５４及び５５）のリーダー配列をコードするＤＮＡ配列内のイントロンを除去するため、Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲプライマーを用いて再クローニングした。Ｌ鎖及びＨ鎖の発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆをＣＯＳ細胞に同時形質転換した。４８時間後、全ＲＮＡを調製し（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８：５２９４−５２９９）、そしてマウス抗体Ｖ領域のＰＣＲクーロニングについて記載したようにして一本ｃＤＮＡ合成のために５μｇの全ＲＮＡを用いた。３種類のＰＣＲプライマーを設計し、そして合成した。ＬＥＶ−Ｐ１（配列番号：６０）及びＨＥＶ−Ｐ１（配列番号：５８）はスプライスドナー配列及びＢａｍＨＩ部位を含有し、そしてそれぞれＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための前方プライマーとして使用した。
【０１５９】
ＨＥＶ−Ｐ２（配列番号：５９）はＨｉｎｄIII 部位及びＡＴＧ開始コドンの前のＫｏｚａｋコンセンサス配列を含有し、そしてＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための後方プライマーとして使用した。１００μｌずつのＰＣＲ反応物は２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８），１０mM  ＫＣｌ，１０mM  （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ，２mM  ＭｇＳＯ4 ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１μｇのＢＳＡ，２５０μＭ  ｄＮＴＰ，２．５ｕのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ．Ｌａｂｓ，Ｕ．Ｋ．）、５０％の一本ｃＤＮＡ合成反応物並びに１００ｐｍｏｌｅずつの前方プライマー及び後方プライマーを含有した。
【０１６０】
各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１．５分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間のサイクル反応を３０回行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。Ｌ鎖Ｖ領域を含有する４０８bpのＰＣＲ生成物及びＨ鎖Ｖ領域を含有する４４４bpのＰＣＲ生成物を、２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化し、そしてｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、それぞれｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−３及びｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−３を得た。
【０１６１】
再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域のＤＮＡ配列は不適切なスプライスドナー部位及びアクセプター部位を含有することが明らかになった（配列番号：５４及び５５を参照のこと）。Ｌ鎖Ｖ領域内のこれらの部位は高頻度には使用されない（ｍＲＮＡの約１０％）が、Ｈ鎖Ｖ領域内のこれらの部位は高頻度で使用される（ｍＲＮＡの約９０％）。この異常なスプライシングが再構成ヒトＰＭ−１抗体の低レベルの発現をもたらした。Ｖ領域の異常なスプライシングを回避するため、スプライス−ドナー部位をＰＣＲ法により除去した。Ｈ鎖Ｖ領域について、後方プライマーＮＥＷ−ＳＰ１（配列番号：６１）及び前方プライマーＮＥＷ−ＳＰ２（配列番号６２）を合成した。このプライマーはＤＮＡ配列ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＡＧＡをＤＮＡ配列ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＧＣに変える。ＰＣＲ反応の条件はｃＤＮＡのクローニングについて前記した通りであったが、鋳型ＤＮＡは５０ngのｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−３であり、そしてプライマーはＨＥＶ−Ｐ２とＮＥＷ−ＳＰ２、又はＨＥＦ−Ｐ１とＮＥＷ−ＳＰ１のいずれかであった。
【０１６２】
２個のＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を２％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＰＣＲ連結反応において使用した。０．５μｇの第一ＰＣＲ生成物を含有する９８μｌのＰＣＲ反応物及び５ユニットのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを９４℃にて２分間、５０℃にて２分間及び７２℃にて５分間インキュベートし、そして次に１００ｐｍｏｌｅずつのＨＥＶ−Ｐ１プライマー及びＨＥＶ−Ｐ２プライマーを加えた。ＰＣＲチューブを３０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の２５サイクルのＰＣＲにかけ、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１６３】
同様にして、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のスプライス−ドナー領域をＰＣＲプライマーＲＥＩ−ＳＰ１（配列番号：６３）及びＲＥＩ−ＳＰ２（配列番号：６４）を用いて除去した。該プライマーはＤＮＡ配列ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＡＧＧをＤＮＡ配列ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＧＧに変える。両ＰＣＲ生成物、すなわちＬ鎖Ｖ領域についての４０８bpのＤＮＡ断片及びＨ鎖Ｖ領域についての４４４bpのＤＮＡ断片を２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、そして配列決定のためｐＵＣ１９にサブクローニングしてｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−４及びｐＵＣ−ＲＶｈ−ＲＭ１ｆ−４を得た。
【０１６４】
ＲＶｈ−ＰＭ１ｆのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片を、ｐＵＣ−ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ領域と置き換えることにより、ＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４を得た。再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のイントロンが除去されたバージョン「ａ」の配列を配列番号５７に示し、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のイントロンが除去されたバージョン「ｆ」の配列を配列番号５６に示す。
【０１６５】
実施例１３．再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ
の作製
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡの作製の工程を図１６に示す。鋳型となるヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩ部位を用いてｐＵＣ１９ベクターに組み込まれている。８個のＰＣＲプライマー（Ａ〜Ｈ）を準備し、第１のＰＣＲにより、Ｖ領域をコードする遺伝子を４つの領域に分けて増幅させる。プライマーＡ及びＨは、ｐＵＣ１９ベクター上のＤＮＡ配列と相補性を持つ。プライマーＢ，Ｃ及びＤは、それぞれ移植するＣＤＲ領域の遺伝子配列を有する４０〜６０bpのプライマーである。
【０１６６】
プライマーＥ，Ｆ及びＧは、それぞれプライマーＢ，Ｃ及びＤの５′側１５〜２０bpのＤＮＡ配列と相補性を持つ。４個の第１ＰＣＲは、それぞれプライマーＡとＥ、ＢとＦ、ＣとＧ、及びＤとＨを用いる。ＰＣＲ生成物Ａ−ＥはＦＲ１をコードし、Ｂ−ＦはＣＤＲ１とＦＲ２をコードする。Ａ−Ｅ断片の３′側とＢ−Ｆ断片の５′側は１５〜２０bpの相補性を持つので、後に、これら断片を連結することが可能となる。同様に、Ｂ−Ｆ断片は、ＣＤＲ２及びＦＲ３をコードするＣ−Ｇ断片とも相補性を持つ。そして、Ｃ−Ｇ断片はさらに、ＣＤＲ３とＦＲ４をコードするＤ−Ｈ断片とも相補性を持つ。こうしてこれら４種の断片は、互いの相補性により連結が可能となる。
【０１６７】
ＰＣＲ反応液中にてこれら４つの断片の連結反応を行った後、プライマーＡ及びＨを加える事により、正しく４つの断片が連結したものが、この第２のＰＣＲによって増幅してくる。こうして得られた第２のＰＣＲ生成物は、３つの移植されたＣＤＲを有し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩの消化後、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングする。
さらに具体的には、鋳型として再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするＤＮＡがプラスミドｐＵＣ１９に挿入されているプラスミドｐＵＣ−ＲＶ１−ＰＭ１ａ−４を用いた。
前記プライマーＡ〜Ｈは次の配列を有する。
【０１６８】
【表１０】
0003616087.tif 000011
【０１６９】
ＣＤＲ移植用の後方プライマー１２２０−Ｌ１，１２２０−Ｌ２及び１２２０−Ｌ３については、８Ｍ尿素を含む１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて精製後使用した。
１００μｌずつのＰＣＲ反応物は２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．８），１０mM  ＫＣｌ，１０mM   (ＮＨ4)2 ＳＯ4 ，２mM  ＭｇＳＯ4 ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１μｇのＢＳＡ，２５０μｍ  ｄＮＴＰ，５ｕのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ．Ｕ．Ｋ．），５０ngのｐＵＣ−ＲＶｌ−ＰＭ１ａ−４  ＤＮＡ、そして各１００ｐｍｏｌｅｓの前方及び後方プライマーを含有した。各ＰＣＲチューブは５０μｌの鉱油で覆い、そして９４℃にて１．５分間の最初の変性の後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応を３０サイクル行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１７０】
２５２bp（Ａ−Ｅ），９６bp（Ｂ−Ｆ），１３０bp（Ｃ−Ｇ）及び１２３bp（Ｄ−Ｈ）の各ＰＣＲ生成物を２．０％の低融点アガロース（ＦＭＣ，Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ）ゲルを用いて精製した。すなわち、各ＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切り取りそして６５℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容積の２mM  ＥＤＴＡ及び２００mMＮａＣｌを含有する２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）を加えた。この混合物をフェノール及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡ断片をエタノール沈澱により回収し、そして１mM  ＥＤＴＡを含有する１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）に溶解し、そしてＰＣＲ連結反応において使用した。
【０１７１】
次に、０．２μｇの各第１のＰＣＲ生成物及び５ユニットのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する９８μｌのＰＣＲ反応液を９４℃にて２分間、５０℃にて２分間及び７２℃にて５分間インキュベートし、連結反応を行った。そして次に、各１００ｐｍｏｌｅのＡ（ＲＥＶＥＲＳＥ）及びＨ（ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ）プライマーを加えて反応液を１００μｌとした後、これを５０μｌの鉱油でおおい、そして９４℃にて１分間、５０℃にて１分間及び７２℃にて１分間の反応を３０サイクル行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１７２】
マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＬ鎖のＣＤＲが移植されたＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有する５５８bpの第２ＰＣＲの生成物を２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化後、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、塩基配列を確認し、ｐＵＣ−ＲＶL −１２２０ａを得た。得られたＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列表７１に示す。
次いで、Ｌ鎖発現ベクターを構築するため、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＵＣ−ＲＶL −１２２０ａから切り出し、Ｌ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２κ−ｇκのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入し、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョンａの発現ベクターであるＲＶL −１２２０ａを得た。
【０１７３】
実施例１４．再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖の発現及び分析
ＣＯＳ細胞での一過性（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖を発現するベクターＲＶL −１２２０ａ及びキメラＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖を発現するベクター、ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１（実施例５）によりＣＯＳ細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖バージョン「ａ」の評価を行った。すなわち、ＣＯＳ細胞を１×１０7 個／mlになるようにｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に懸濁し、この細胞浮遊液０．８mlにＤＮＡ（各プラスミドについて１０μｇ）を加えた。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓａｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用い１，９００ボルト（Ｖ）、２５マイクロファラッド（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。
【０１７４】
室温にて１０分間の回復期間の後、エクレトロポレーションした細胞を、１０％のウシ胎児血清（γ−グロブリン不含）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）２０mlに加えた。７２時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、又は−２０℃にて長時間貯蔵した。
【０１７５】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるヒト様抗体の定量
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上清をＥＬＩＳＡにより測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認した。ヒト様抗体を検出するため、プレートをヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（Ｓｉｇｍａ）によりコートした。ブロックした後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈しそして各ウエルに加えた。
プレートのインキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的、Ｓｉｇｍａ）を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして４０５nmにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【０１７６】
ヒトＩＬ−６Ｒへの結合能を確認するための酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞からの上清をＥＬＩＳＡにより測定して、生産されたヒト様抗体が抗原ＩＬ−６Ｒに結合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のため、プレートをＭＴ１８マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコートした。１％  ＢＳＡでブロックした後、可溶性組換えヒトＩＬ−６Ｒ（ＳＲ３４４）をプレートに加えた。
プレートを洗浄した後、ＣＯＳ細胞からの培養上清を段階希釈し、そして該プレートの各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧをウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そして４０５nmにおける吸光度を測定した。
【０１７７】
この結果を図１７に示す。再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖バージョン「ａ」とキメラＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖の組み合せによるヒト様抗体は、キメラＡＵＫ１２−２０抗体と同様にヒトＩＬ−６Ｒに対する強い結合能を示し、サンプルの希釈度依存的に４０５nmにおける吸光度が変化し、サンプル中にＩＬ−６Ｒに対する抗体が含まれていることが確認された。また、この結果は、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖のバージョン「ａ」がキメラＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖と同様に抗原結合能を持つことを示している。
【０１７８】
実施例１５．ヒトサブグループＩ（ＨＳＧＩ）コンセンサス配列を用いた再構
成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖遺伝子の構築
実施例１３で示した方法と同様にして、ＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲをヒトサブグループＩのコンセンサス配列をＦＲとして有する再構成ヒトＶH ａ４２５（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，７７３−７８３，１９９１）に移植した。まず、再構成ヒトＶH ａ４２５（上記文献中、Ｆｉｇ３）をコードするＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片をプラスミドＨＣＭＶ−ＲＶHa−４２５−γ１から切り出し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングし、ｐＵＣ−ＲＶH −４２５ａを得た。
【０１７９】
これを鋳型ＤＮＡとして使用した。ＰＣＲに用いる８個のプライマー（Ａ１〜Ｈ１）を合成した。プライマー１２２０−Ｈ１は、ＣＤＲ１の移植及びＴｈｒ−２８からＳｅｒ−２８の変更を誘導する様にデザインし、プライマー１２２０−Ｈ３はＣＤＲ３の移植及びＳｅｒ−９４からＡｒｇ−９４への変異を誘導する様にデザインした。プライマー１２２０−Ｈ１，１２２０−Ｈ２及び１２２０−Ｈ３は、それぞれ８Ｍ尿素を含む１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて精製後、使用した。各プライマーのヌクレオチド配列は次の通りである。
【０１８０】
【表１１】
0003616087.tif 000012
【０１８１】
ＰＣＲの条件は、鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ−ＲＶH −４２５ａを使用し、Ｈ鎖ＣＤＲ移植用プライマーとして上記のものを使用した以外は実施例１３に記載したのと同じであった。Ａ１とＥ１、Ｂ１とＦ１、Ｃ１とＧ１、及びＤ１とＨ１のプライマー対を用いて第１ＰＣＲ反応を行い、それぞれ１８６bp（Ａ１−Ｅ１），７５bp（Ｂ１−Ｆ１），１７３bp（Ｃ１−Ｇ１）及び１０５bp（Ｄ１−Ｈ１）の各第１ＰＣＲ生成物を２．０％の低融点アガロースゲルにて精製し、次の第２ＰＣＲ連結反応において使用した。
【０１８２】
実施例１３にて示した条件に従い、各０．２μｇの上記第１ＰＣＲ生成物を用いて第２ＰＣＲ（ＰＣＲ連結反応を含む）を行い、マウスＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域ＣＤＲが移植されたヒトＨ鎖Ｖ領域を含有する４９５bpのＰＣＲ生成物を得、これを２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製した。そしてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化後、得られたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、塩基配列を確認して、ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａを得た。
【０１８３】
ところで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列を調らべた結果、スプライスの供与配列とよく一致する配列が見い出された。この事は、再構成ヒトＰＭ−１抗体の作成時に問題となった異常なスプライシングを引き起す可能性がある。そこで、この配列をＰＣＲ法により変異させた。変異誘導プライマーとして、ＳＧＩ−ＳＰ１（配列番号９７）及びＳＧＩ−ＳＰ２（配列番号９８）を合成した。このプライマーは、ＤＮＡ配列ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣをＤＮＡ配列ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣに変える。ＰＣＲ反応の条件は、前記条件と同様に行い、鋳型ＤＮＡは５０ngのｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａであり、そしてプライマーはＳＧＩ−ＳＰ１とＵＮＩＶＥＲＳＡＬ（配列番号８２）、またはＳＧＩ−ＳＰ２とＲＥＶＥＲＳＥ（配列番号８３）のいずれかであった。
【０１８４】
２個のＰＣＲ反応からのＰＣＲ生成物を２％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そしてＰＣＲ連結反応において使用した。各０．２μｇの第１ＰＣＲ生成物及び５ｕのＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する９８μｌのＰＣＲ反応液を９４℃にて２分間、５０℃にて２分間、及び７２℃にて５分間インキュベートし連結反応を行った。そして次に１００ｐｍｏｌｅずつのＵＮＩＶＥＲＳＡＬ及びＲＥＶＥＲＳＥプライマーを加え、５０μｌの鉱油でおおった後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間そして７２℃にて１分間の第２ＰＣＲを３０サイクル行い、そして次に７２℃にて１０分間インキュベートした。第２ＰＣＲで得られた４９５bpのＤＮＡ断片を２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製し、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩにより消化し、これをｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした後、塩基配列を確認して、ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａ−２を得た。
【０１８５】
次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を上記ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａ−２より切り出し、Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に導入し、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖のバージョンａの発現ベクターであるＲＶH −１２２０ａを得た。
【０１８６】
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョン（ｂ〜ｄ）をコードするＤＮＡを作成するために２組の変異誘発ＰＣＲプライマーを合成した。各ＰＣＲ反応は前記の反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。バージョン「ｂ」をコードするＤＮＡの作成のため、２種の第１ＰＣＲにおいて、ＵＮＩＶＥＲＳＡＬプライマー（配列番号８２）及び変異誘発プライマー１２２０Ｈ−ｍ１ａ（配列番号７８）、あるいは、ＲＥＶＥＲＳＥプライマー（配列番号８３）と変異誘発プライマー１２２０Ｈ−ｍ１ｂ（配列番号７９）の各ＰＣＲプライマー、並びに鋳型ＤＮＡとしてのｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａを用いた。それぞれ２０２bp及び３２３bpの第１ＰＣＲ生成物を２．０％低融点アガロースゲルを用いて精製後、前記の反応条件と同様に第２ＰＣＲ（ＰＣＲ連結反応を含む）を行い、４９５bpの生成物（バージョン「ｂ」）を得た。これをＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩにより消化し、そして、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｂを得た。
【０１８７】
同様にして、変異誘発プライマー１２２０Ｈ−ｍ２ａ（配列番号８０）、１２２０Ｈ−ｍ２ｂ（配列番号８１）及びこの生成物を鋳型ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ａを用いてＰＣＲ生成物（バージョン「ｃ」をコードするＤＮＡ）を得、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｃを得た。さらに、変異誘発プライマー１２２０Ｈ−ｍ１ａ（配列番号７８）、１２２０Ｈ−ｍ１ｂ（配列番号７９）及び鋳型としてのｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｃを用いてＰＣＲ生成物（バージョンｄ）を得、これをＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで消化してｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入することによりｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｄを得た。
【０１８８】
なお、プラスミドｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｂ中にコードされているの再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列番号８４に示し、ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｄ中にコードされている再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域バージョン「ｄ」のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列表８５に示す。
【０１８９】
次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖の各バージョンの発現ベクターを構築するために、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｂ，ｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｃ、及びｐＵＣ−ＲＶH −１２２０ｄより切り出し、Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入して、各バージョンの発現ベクターＲＶH −１２２０ｂ，ＲＶH −１２２０ｃ、及びＲＶH −１２２０ｄをそれぞれ得た。
【０１９０】
実施例１６．再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体の種々のバージョンの発現及び
分析
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖を発現する４種類のベクターの１つ（ＲＶH −１２２０ａ，ＲＶH −１２２０ｂ，ＲＶH −１２２０ｃ、またはＲＶH −１２２０ｄ）及び再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖を発現するベクターＲＶL −１２２０ａによりＣＯＳ細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の４種類のバージョンを評価した。
【０１９１】
比較のため、ＣＯＳ細胞をキメラＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクター（ＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１及びＨＥＦ−１２κ−ｇκ）によっても同時形質転換した。ヒトＩＬ−６Ｒへの結合についての測定において、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖と再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖のバージョン「ｂ」、あるいは再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖と再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖のバージョン「ｄ」との組み合せによる再構成ヒト１２−２０抗体は、キメラＡＵＫ１２−２０抗体と同等の結合活性を示した。これらの結果を図１８及び図１９に示す。
【０１９２】
実施例１７．ヒト抗体ＨＡＸを用いた再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖遺
伝子の構築
マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領域と最も相同性の高いヒト抗体は、タンパクデータベース“Ｌｅｅｄｓ”の検索により、ＨＡＸであった（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３９，２４９６−２５０１，１９８７，ＳＬＥ患者由来Ｂ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２１／２８の産生する抗体、遺伝子配列はＦｉｇ．４，５に、アミノ酸配列はＦｉｇ．６に記載）。再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計を、ＨＡＸ抗体のＦＲ領域とマウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領域のＣＤＲを用いて行った。
【０１９３】
マウスモノクローナル抗体ＡＵＫ１２−２０のＨ鎖Ｖ領域の第一バージョン（Ｓｌｅ１２２０Ｈａ）のＣＤＲを含む再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする全ＤＮＡは化学合成にて作成した。すなわち、全長４３９bpのＳｌｅ１２２０ＨａをコードするＤＮＡを各々２１bpの重複部位を有する９０〜９４bpの長さの６本のオリゴヌクレオチド（ｓｌｅ１２２０ｈ１〜６；それぞれ、配列番号８６〜９１）に分けて設計した。オリゴヌクレオチドの設計にあたり、２次構造の検索を行ない、構造上に問題のある部位に関して、アミノ酸置換がおきない様に、コドンの第３塩基を変換した。これらのオリゴヌクレオチドの相互関係及び２本鎖合成ＤＮＡの完成までの過程を図２０に示す。
【０１９４】
ＰＣＲ法を用いて図２０に示す反応を行う。すなわち６本の合成オリゴヌクレオチドを同一ＰＣＲ反応チューブに加え、第１のＰＣＲ反応を行う。これにより、２つのオリゴヌクレオチドのアニーリング伸長を行うことができ、さらに、４つのオリゴヌクレオチド、または、全長のオリゴヌクレオチドを得ることができる。次に、末端プライマーＡ（配列番号９２）及びＢ（配列番号９３）を加え、第２のＰＣＲ反応を行うことで、正しく全長を有するオリゴヌクレオチドのみを増幅することができる。得られた生成物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII により消化後、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングしてシークエンスを行う。
【０１９５】
具体的には、１００mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３），５０mM  ＫＣｌ，０．１mM  ｄＡＴＰ，０．１mM  ｄＧＴＰ，０．１mM  ｄＣＴＰ，０．１mM  ｄＴＴＰ，１．５mM  ＭｇＣｌ2 及び２．５ｕのＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）並びに各オリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌｅを含有する９８μｌの反応混合物を９４℃１．５分間の変性後、９４℃３分間、５０℃２分間、７２℃５分間の反応を３サイクル行い、次に７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０１９６】
反応液に５０μＭの末端プライマーＡおよびＢを１μｌずつ加え、８０μｌの鉱油で覆い、９４℃１．５分間の変性後、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間、７２℃１分間の反応を３０サイクル行い、続いて７２℃で１０分間インキュベートした。４３９bpのＰＣＲ生成物を１．５％の低融点アガロースゲルを用いて精製し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII により消化後、ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングして、塩基配列を確認した。得られたクローンをｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａとした。このプラスミド中にコードされている再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」のアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列番号９４に示す。
【０１９７】
次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０（ｓｌｅ１２２０Ｈａ）抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片をｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａより切出し、Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に導入し、ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａを得た。
【０１９８】
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョン（「ｂ」〜「ｄ」）を作成するため、２つの変異誘発プライマーｓｌｅ１２２０Ｈｍ１（配列番号９５）、及びｓｌｅ１２２０Ｈｍ２（配列番号９６）を合成した。各ＰＣＲ反応では、実施例１３で示されているＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ及び反応液組成を用いた。各ＰＣＲ反応では、バージョン「ｂ」及びバージョン「ｃ」については、鋳型としてのｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａ，５０ｐｍｏｌｅの変異誘発プライマーｓｌｅ１２２０Ｈｍ１またはｓｌｅ１２２０Ｈｍ２及び５０ｐｍｏｌｅの末端プライマーＢを含有する反応混合物を９４℃１．５分間の変性の後、９４℃１分、５０℃１分、７２℃１分の３０サイクルの反応にかけ、次に７２℃で１０分間インキュベートした。
【０１９９】
２３５bpまたは１７８bpの生成物を１．５％の低融点アガロースゲルを用いて精製し、第２のＰＣＲ反応のプライマーとして使用した。すなわち、５０ｐｍｏｌｅの末端プライマーＡと、０．２μｇのＰＣＲ生成物を加え、ｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａを鋳型として、第２ＰＣＲ反応を行い、４３９bpの生成物を１．５％低融点アガロースゲルで精製、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で消化後ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングして、それぞれ構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」又は「ｃ」をコードするプラスミドｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ又はｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｃを得た。
【０２００】
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｄ」をコードするＤＮＡは次の様にして作製した。鋳型としてのｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂを用いた。変異誘導プライマーｓｌｅ１２２０Ｈｍ２及び末端プライマーＢを５０ｐｍｏｌｅずつ用いて第１のＰＣＲ反応を３０サイクル行った。得られた１７８bpのＰＣＲ生成物を１．６％の低融点アガロースゲルにより精製し、第２のＰＣＲのプライマーとして用いた。このプライマーと５０ｐｍｏｌｅの末端プライマーＡを用いて第２のＰＣＲを行い、４３９bpのＤＮＡ断片を得た。これを、精製し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII にて消化後ｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングし、ヌクレオチド配列を確認し、ｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｄを得た。
【０２０１】
次いで、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖の各バージョンの発現ベクターを構築するため、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｃ、およびｐＵＣ−ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｄより切り出し、Ｈ鎖発現ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１のＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ部位に挿入して、各発現ベクター、ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ＲＶH −ｓｌｅ１２２０ＨｃおよびＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｄをそれぞれ得た。
【０２０２】
分  析
再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖を発現する４種類のベクターのうちの１つ（ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈａ，ＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｂ，ＲＶH −ｓｌｅ１２２０ＨｃまたはＲＶH −ｓｌｅ１２２０Ｈｄ）および、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖を発現するベクターＲＶL −１２２０ａを用いてＣＯＳ細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の４種類のバージョンを、ＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する能力について評価した。この結果を図２１〜２４に示す。なお、これらの結果は、生産された抗体をプロテインＡによって精製した後に得られたものである。
【０２０３】
上記のごとく、本発明によれば、キメラＬ鎖もしくは再構成Ｌ鎖又はキメラＨ鎖もしくは再構成Ｈ鎖のＶ領域、そして特にＦＲ中の１個又は複数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してもなおヒトＩＬ−６Ｒに結合する能力を維持している。従って本発明は、その本来の性質を維持している限り、１個又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている、キメラ抗体及び再構成ヒト抗体、キメラＬ鎖及び再構成Ｌ鎖、キメラＨ鎖及び再構成Ｈ鎖、再構成Ｌ鎖Ｖ領域、並びに再構成Ｈ鎖Ｖ領域、並びにこれらをコードするＤＮＡをも包含する。
【０２０４】
参考例
本発明において使用される出発ハイブリドーマは次の様にして作製された。
参考例１．ハイブリドーマ  ＭＴ１８の作製
ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表面にヒトＩＬ−６Ｒを発現するマウスＴ細胞を次の様にして作製した。すなわち、Ｙ．Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１４３，２９００−２９０６（１９８９）に開示されているプラスミドｐＺｉｐｎｅｏ  ＩＬ−６Ｒを常法に従ってマウスＴ細胞系ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ２１４）にトランスフェクトし、生ずる形質転換体を常法に従ってＧ４１８を用いてスクリーニングすることにより細胞あたり約３０，０００個のヒトＩＬ−６Ｒを発現する細胞株を得た。この細胞株をＣＴＢＣ３と称する。
【０２０５】
ＣＴＢＣ３細胞を常法に従ってＲＰＭＩ１６４０中で培養し、そして培養細胞をＰＢＳ緩衝液により４回洗浄し、そして１×１０7 個の細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内注射して免疫感作した。この免疫感作は１週間に１回６週間にわたって行った。
この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄腫Ｐ３Ｕ１細胞を融合せしめ、そして融合した細胞を次の様にしてスクリーニングした。ＩＬ−６Ｒ陰性ヒトＴ細胞系ＪＵＲＫＡＴ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８１６３）を、プラスミドｐＺｉｐｎｅｏ  ＩＬ−６Ｒにより同時トランスフェクトし、そして形質転換された細胞をスクリーニングして、細胞当り約１００，０００個のＩＬ−６Ｒを発現する細胞系を得た。この細胞系をＮＪＢＣ８と命名した。
【０２０６】
ＮＰ−４０で細胞溶解したＮＪＢＣ８を認識するがしかしＮＰ−４０で細胞溶解したＪＵＲＫＡＴを認識しない抗体を生産するハイブリドーマ細胞系をクローン化しそしてＭＴ１８と命名した。ハイブリドーマＭＴ１８は、工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約のもとに１９９０年７月１０日に微工研条寄第２９９９号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９９）として寄託された。
【０２０７】
参考例２．ハイブリドーマＰＭ１の作製
ヒトＩＬ−６Ｒに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトＩＬ−６Ｒを次の様にして抽出した。３×１０9 個のヒト骨髄腫細胞（ＩＬ−６Ｒ生産細胞）を１mlの１％ジギトニン、１０mMトリエタノールアミン緩衝液（pH７．４），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１mM  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド；和光純薬）中で溶解した。他方、参考例１において調製したハイブリドーマＭＴ１８により生産されたＭＴ１８抗体を、ブロムシアンで活性化されたセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に常法に従って結合させた。このＭＴ１８抗体結合セファロース４Ｂを前記の細胞溶解物を混合することにより、セファロース４Ｂ上のＭＴ１８抗体に前記可溶化したＩＬ−６Ｒを結合させた。セファロース４Ｂに非特異的に結合した物質を洗浄除去し、そしてＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＢにＭＴ１８抗体を介して結合したＩＬ−６Ｒを免疫原として使用した。
【０２０８】
前記の免疫原を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間に１回４週間にわたり腹腔内に免疫感作した。次に、この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１と融合せしめた。融合した細胞を次のようにしてスクリーニングした。まず、培養上清及び０．０１mlのＰｒｏｔｅｉｎＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を混合して上清中の免疫グロブリンをＰｒｏｔｅｉｎＧセファロースに吸着せしめた。他方、35Ｓ−メチオニンにより内部標識された１０11個のＵ２６６細胞を溶解し、そしてＭＴ１８結合セファロース４Ｂを用いてＩＬ−６Ｒをアフィニティ精製した。
【０２０９】
次に、35Ｓ−メチオニンで標識されたＩＬ−６Ｒを、免疫グロブリンが結合している上記のＰｒｏｔｅｉｎＧセファロースにより免疫沈降せしめ、そして沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。その結果、ＩＬ−６Ｒに特異的に結合する抗体を生産する１個のハイブリドーマクローンを単離し、そしてＰＭ１と命名した。ハイブリドーマＰＭ１は工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条約のもとに１９９０年７月１０日に、微工研条寄第２９９８号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２９９８）として寄託された。
【０２１０】
参考例３．ハイブリドーマＡＵＫ１２−２０，ＡＵＫ６４−７及びＡＵＫ１４
６−１５の作製
免疫原として可溶性ＩＬ−６Ｒ（ＳＲ  ３４４）を、Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｋ．らの、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８，６７３−６７６，１９９０、に記載されている方法に従って調製した。
すなわち、Ｎ−末端から３４５番目のコドンが終止コドンにより置換されているＩＬ−６ＲをコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３４４をＣＨＯ（５Ｅ２７）細胞にトランスフェクトし、そのトランスフェクトされた細胞を無血清培地（ＳＦ−０培地、三光純薬）中で培養し、そして得られる上清をＨＦ−Ｌａｂｌ系（東ソー）により濃縮しそしてＢｌｕｅ−５ＰＷカラム及びＰｈｅｎｙｌ−５ＰＷカラムにより精製した。精製された可溶性ＩＬ−６ＲはＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示した。
【０２１１】
雌性ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊマウス（日本クレア）に、１回の免疫原量を１０μｇ／マウスとしてＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（Ｂａｃｔｏ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｈ３７Ｒａ，Ｄｉｆｃｏ）と共に皮下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の２週間及び３週間後に、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント（Ｂａｃｔｏ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ，Ｄｉｆｃｏ）と共に同量の免疫原を第二回及び第三回追加免疫として皮下注射した。最終免疫感作（第四回注射）は第三回注射の１週間後に、アジュバントを使わないで尾静脈内に行った。
【０２１２】
免疫感作されたマウスから血清試料を採取し、希釈緩衝液により段階的に希釈し、そしてＧｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，１１７，５３−６０，１９８１、に記載されている方法に従ってＥＬＩＳＡ法により分析した。すなわち、ＳＲ３４４（０．１μｇ／ml）によりコートされたプレートを１％ＢＳＡによりブロックし、そして前記の希釈された試料をそれに加えた。ＳＲ３４４に結合したマウスＩｇＧをヤギの抗−マウスＩｇＧ／アルカリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（ＺＹＭＥＤ）及びアルカリホスファターゼ用基質（Ｓｉｇｍａ−１０４）を用いて測定した。
【０２１３】
血清中の抗−ＳＲ３４４抗体の増加を確認した後、最終免疫感作から３日後に、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓細胞を得た。脾臓細胞及び骨髄細胞株（Ｐ３Ｕ１）を２５：１の比率で混合し、ＰＥＧ１５００を用いて融合し、そして２０００個のウエル中で０．７〜１．１×１０6 細胞／ウエルの細胞濃度で培養した。ウエルからの上清を、ＳＲ３４４に結合するそれらの能力について（Ｒ３４４認識アッセイと称する第一次スクリーニング）、及びＳＲ３４４とＩＬ−６Ｒとの結合を阻害するそれらの能力について（１Ｌ−６／ｓ１Ｌ６Ｒ結合阻害アッセイ（ＲＢＩＡ）による）スクリーニングした。第一次スクリーニングが２４０個の陽性ウエルをもたらし、そして第二次スクリーニングが３６個の陽性ウエルをもたらした。
【０２１４】
上記のＳＲ３４４認識アッセイは次の様にして行った。ヤギの抗マウスＩｇ（Ｃａｐｐｅｌ）（１μｇ／ml）によりコートされたプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）を１％ＢＳＡによりブロックし、そして１００μｌ／ウエルのハイブリドーマ培養上清をそれに添加し、次に室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、２０ｎｇ／mlのＳＲ３４４をウエルに加え、そして室温にて１時間インキュベーションを行った。上清に由来する固定化された抗体により捕捉されたＳＲ３４４の量を、ラビット抗ＳＲ３４４ＩｇＧ（＃２，５μｇ／ml）、ヤギの抗ラビットＩｇＧ−アルカリホスファターゼ（Ａ／Ｐ）（１：３０００，Ｔａｇｏ）及び基質（１mg／ml，Ｓｉｇｍａ−１０４）の添加、並びにそれに続く４０５−６００nmでの吸光度の測定により定量した。
【０２１５】
前記のＲＢＩＡは次の様にして行った。ＭＴ１８抗体でコートしたプレートを１００ｎｇ／mlのＳＲ３４４（１００μｌ／ウエル）で満たし、そして室温にて１時間インキュベーョンを行った。プレートを洗浄した後、５０μｌ／ウエルのハイブリドーマ培養上清及び５０μｌ／ウエルのビオチン−ＩＬ−６結合体（２０ｎｇ／ml）をそれぞれのウエルに同時に加え、そしてウエルを室温にて１時間インキュベートした。ストレプトアビジン−Ａ／Ｐ（１：７０００，ＰＩＥＲＣＥ）及び対応する基質（Ｓｉｇｍａ−１０４）を添加し、４０５−６００nmでの吸光度を測定することにより、ＳＲ３４４に結合したビオチン−ＩＬ−６の量を測定した。
【０２１６】
最後に、限界希釈法を２回反復することにより陽性クローンを純化し、そしてＳＲ３４４とＩＬ−６との結合を阻害する３個のハイブリドーマクローン、すなわちＡＵＫ１２−２０，ＡＵＫ１４６−１５及びＡＵＫ６４−７；並びにＳＲ３４４とＩＬ−６との結合を阻害しないハイブリドーマクローンＡＵＫ１８１−６を得た。
【０２１７】
本発明はヒトＩＬ−６Ｒに対する再構成ヒト抗体を提供し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領域のＣＤＲがヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体のＣＤＲにより置き換えられている。この再構成ヒト抗体の大部分がヒト抗体に由来し、そしてＣＤＲは抗原性が低いから、本発明の再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そしてそれ故に療法用として期待される。
【０２１８】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図１は、本発明の抗体ペプチドの発現のために有用な、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示す。
【図２】図２は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する本発明のキメラ抗体ＡＵＫ１２−２０の能力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する本発明のキメラ抗体ＡＵＫ１２−２０の能力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒトＩＬ−６Ｒへの本発明のキメラ抗体ＰＭ１ａ及びＰＭ１ｂの結合についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−６ＲへのヒトＩＬ−６の結合を阻害する本発明のキメラ抗体ＰＭ１ａ及びＰＭ１ｂの能力を試験するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図６】図６は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグラムである。
【図７】図７は、再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグラムである。
【図８】図８は、Ｈ鎖の発現のために有用な、ヒト・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１α）プロモーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１の作製の過程を示す。
【図９】図９は、Ｌ鎖の発現のために有用な、ＨＥＦ−１αプロモーター／エンハンサー系を含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−１２ｋ−ｇｋの作製の過程を示す。
【図１０】図１０は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅のための欠陥ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー配列に連結されたジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）及びＨＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＤＨＦＲ−ＰＭｈ−ｇγ１の作製の過程を示す。
【図１１】図１１は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅のための欠陥ＳＶ４０−プロモーター／エンハンサー配列に連結されたｄｈｆｒ遺伝子及びＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆの作製の過程を示す。
【図１２】図１２は、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合についての再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」及び「ｂ」の能力を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ヒトＩＬ−６Ｒへの結合についての再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の能力を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構成ヒトＰＭ−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の能力を示すグラフである。
【図１５】図１５は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のために有用な、ヒトＥＦＩ−αプロモーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドＨＥＦ−ＶL −ｇｋ及びＨＥＦ−ＶH −ｇγ１を示す。
【図１６】図１６は、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするＤＮＡの作製の過程を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｌ鎖Ｖ領域の能力の確認のためのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。図中、標準ＡＵＫ１２−２０（キメラ）はキメラＡＵＫ１２−２０抗体をＣＨＯ細胞により大量に製造して精製したものについての結果を示す。
【図１８】図１８は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｂ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、ヒトＩＬ−６Ｒに結合する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｄ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体Ｈ鎖Ｖ領域の化学合成の過程を示す。
【図２１】図２１は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ａ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｂ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｃ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ヒトＩＬ−６ＲへのＩＬ−６の結合を阻害する再構成ヒトＡＵＫ１２−２０抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｄ」）の能力についてのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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