(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−バリン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物において、生育のためにリポ酸を要求し、かつ、配列番号１のヌクレオチド番号９９９〜１００７、又はヌクレオチド番号１０８１〜１１０４に相当する領域に変異を有することにより、Ｌ−バリンによるアテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを保持することを特徴とする微生物。
【請求項２】
さらに、Ｈ+−ＡＴＰａｓｅを欠損したことを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を発現し、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しない、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
前記ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが、配列番号１のヌクレオチド番号９５３〜１１６０の配列が除去されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
微生物がエシェリヒア・コリである請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
微生物が、エシェリヒア・コリＷ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５）／ｐＭＷｄＡＲ６又はエシェリヒア・コリＡＪ１２６３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２０９）／ｐＭＷｄＡＲ６である請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬ−バリン生産能を有する微生物を液体培地に培養し、培養液中にＬ−バリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−バリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＬ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物に関し、詳しくは、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能が増強された微生物に関する。
背景技術
従来、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンは、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア属に属するＬ−バリンもしくはＬ−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。従来の方法により、これらのアミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−バリン及びＬ−ロシインの需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的な製造法の開発が求められている。
ところで、エシェリヒア（Escherichia）属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子解析の進み方、遺伝子材料の豊富さ等から優れたＬ−バリン又はＬ−ロイシン生産菌として利用される可能性を有しているが、エシェリヒア属微生物によるこれらのアミノ酸生産の報告は少なく、Ｌ−分岐鎖アミノ酸ではＬ−イソロイシンの生産例が見られるのみである（特開平５−３０４９６９、特開平５−１３０８８２）。
発明の開示
本発明は、上記観点から、エシェリヒア属に属する微生物のＬ−バリン又はＬ−ロイシン生産能を向上させ、安価かつ効率的なＬ−バリン及びＬ−ロイシンの製造法を提供することを課題とする。
本発明者らは、エシェリヒア属に属する微生物の変異株によるＬ−バリン及びＬ−ロイシンの生産性について鋭意研究を重ねた結果、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異が、Ｌ−バリン又はＬ−ロイシン生産菌のこれらのアミノ酸生産能を高めることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち本願発明の第１の微生物は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物において、生育のためにリポ酸を要求することを特徴とする微生物である。本願発明の第２の微生物は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物において、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅを欠損したことを特徴とする微生物である。さらに本願発明の第３の微生物は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物において、生育のためにリポ酸を要求し、かつ、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅを欠損したことを特徴とする微生物である。
また本願発明は、上記微生物を液体培地に培養し、培養液中にＬ−バリンまたはＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−バリンまたはＬ−ロイシンの製造法を提供する。
尚、本明細書において、「Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損」とは、細胞がＨ+-ＡＴＰａｓｅ活性を実質的に発現しないことをいい、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅの８種類のサブユニットをコードするａｔｐオペロンの全体もしくは一部の欠失、または分断により遺伝子の発現が起こらない場合、及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ遺伝子から発現されるＨ+-ＡＴＰａｓｅタンパクがＨ+-ＡＴＰａｓｅ活性を有しないような１もしくは２以上のヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失を同遺伝子内に有する場合のいずれもが含まれる。また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとは、少なくともｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ及びｉｌｖＤの各遺伝子を有するものをいい、活性を持たないスレオニンデアミナーゼを発現するｉｌｖＡ遺伝子を有するもの、あるいは実質的にｉｌｖＡ遺伝子を有しないものも含む。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物であり、下記性質の何れかを有する微生物である。
▲１▼生育のためにリポ酸を要求する。
▲２▼Ｈ+-ＡＴＰａｓｅを欠損している。
▲３▼生育のためにリポ酸を要求し、かつＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損している。
本発明においては、上記▲１▼〜▲３▼のいずれかの性質を有するものであってもよいが、これらの内では▲３▼の性質を有するものが特に好ましい。
このような性質を有する微生物は、自然突然変異もしくは人為突然変異によって、生育のためにリポ酸を要求する変異（以下、「リポ酸要求性変異」という）又は／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損する変異（以下、「Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異」という）を付与したエシェリヒア属に属する微生物に、Ｌ−バリンもしくはＬ−ロイシン生産能を付与し、または上記変異株のＬ−バリンもしくはＬ−ロイシン生産能を増強することによって得られる。また、本発明の微生物は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物に、リポ酸要求性変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を導入することによっても得られる。
上記微生物の取得に用いられる微生物としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia） coli；以下、「E. coli」ともいう）等のエシェリヒア属に属する微生物であって病原性のない菌株が挙げられる。具体的な例としては、次のような菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリＫ−１２（ＡＴＣＣ１０７９８）
エシェリヒア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）
エシェリヒア・コリＷ１４８５（ＡＴＣＣ１２４３５）
このようなエシェリヒア属に属する微生物に、リポ酸要求性変異または／およびＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を導入するには、通常の変異処理法、例えばＸ線や紫外線の照射あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトローＮ−ニトロソグアニジン（以下、ＮＧと略す）、亜硝酸等の変異剤に接触せしめる等の方法が適用できる。また、エシェリヒア属に属する微生物への変異の導入は、他の遺伝的手法、例えば遺伝子組換え法、形質導入法、細胞融合法等によっても行うことができる。
変異株取得のためのより具体的な手段は、例えば次のようなものである。
リポ酸要求性変異株（以下、「リポ酸要求株」という）は、変異処理した菌体を寒天平板培地で培養し、リポ酸要求性となったコロニーを分離することによって得られる（A. A. Herbert and J. R. Guest: J. Gen. Microbiol., 53, 363-381（1968））。リポ酸要求株として具体的にはE. coli W1485lip2（ATCC25645）等が挙げられる。
Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株（以下、「Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株」という）は、変異処理した菌株の内、コハク酸を唯一の炭素源とする寒天平板培地で生育できず、グルコースを唯一の炭素源とする平板培地上で生育できる変異株を取得し、更にこの中よりＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損している株を取得することによって得られる。Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株として具体的には、E. coli AN718（E. coli Genetic Stock Center, Yale University、Department of Biology）等が挙げられる。
Ｈ+-ＡＴＰａｓｅは８種類のサブユニットが複雑に集合した分子量約５０万の膜結合性酵素であり、ＡＴＰを加水分解して生じる自由エネルギー変化によってＨ+を膜外に排出するポンプ機能と、細胞内呼吸により生じた膜内外のＨ+の濃度勾配を利用してＡＴＰを合成する機能とがある。またこの酵素は、膜内在性でＨ+輸送活性を持つＦ０画分と、膜表在性でＡＴＰの分解及び合成を触媒するＦ１画分に分けられ、Ｆ０はａ，ｂ，ｃの３種、Ｆ１はα、β、γ、δ、εの５種のサブユニットから構成されている。これらのどのサブユニットが変異した株でもＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株として使用することが出来る。また、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異は、変異サブユニットを発現するものでもよく、プロモーター部位の変異等によってＨ+-ＡＴＰａｓｅを構成するサブユニットが発現しなくなったものでもよい。
さらに、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株では酸化的リン酸化が行われず、エネルギー獲得は基質レベルのリン酸化で行われることから、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ阻害剤、ＴＣＡサイクル阻害剤、呼吸鎖阻害剤、脱共役剤等の各種薬剤を培養液に添加することによってもＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損と同様の効果が得られることが期待される。このようなＨ+-ＡＴＰａｓｅ阻害剤としてはジシクロヘキシルカルボジイミド、トリブチルスズ、オーロベルチン等が、ＴＣＡサイクル阻害剤としてはマロン酸、モノヨード酢酸、メチルバイオレット、２，４−ジニトロフェノール等が、電子伝達系阻害剤としてはテノイルトリフルオロアセトン，２−ｎ−ノニル−４−ヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド、アンチマイシン、脱共役剤としてはバリノマイシン、アテブリン、４，５，６，７−テトラフロロ−２−トリフルオロメチルベンゾイミダゾール等が例示される。これらの阻害剤は、単独で使用してもよく、２種以上の混合物として使用してもよい。
前記のようにして得られたリポ酸要求株を親株としてさらに変異処理を行い、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅを欠損した株を選択することによって、あるいはＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株を親株としてさらに変異処理を行い、リポ酸を要求するようになった株を選択することによって、リポ酸要求性変異及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を共に有する変異株（以下、「リポ酸要求−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株」という）が得られる。また、リポ酸要求性変異及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異をともに有する変異株は、これらの変異の一方を有する変異株に、形質導入、形質転換、細胞融合等によって他方の変異を導入することによっても得ることが出来る。
例えば、リポ酸要求株を親株として、その株にＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を形質導入することにより、リポ酸要求−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株が得られる。この場合、親株としては上記Ｗ１４８５ｌｉｐ２株が、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異の供与菌としては上記ＡＮ７１８株が挙げられる．また、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株を親株として、その株にリポ酸要求性変異を形質導入することによっても、リポ酸要求−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損株が得られる。
上記のようにして得られるリポ酸要求−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株としては、例えばE. coli AJ12631等が挙げられる。AJ12631株は、１９９１年７月２４日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-12381として寄託され、１９９５年８月２９日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-5209の受託番号が付与されている。
本発明の微生物は、エシェリヒア属に属する微生物のリポ酸要求性変異株もしくはＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株、またはリポ酸要求−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株に、Ｌ−バリンもしくはＬ−ロイシン生産能を付与し、または上記変異株のＬ−バリンもしくはＬ−ロイシン生産能を増強することにより得られる。また、本発明の微生物は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を有するエシェリヒア属に属する微生物に、リポ酸要求性変異または／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を導入することによっても得られる。さらに、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能が低い微生物であっても、リポ酸要求性変異又は／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を導入することによって、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を高めることができる。
〔１〕Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌は、エシェリヒア属に属する微生物のリポ酸要求性変異株もしくはＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株、またはリポ酸要求−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株に、Ｌ−バリン生産能を付与し、または前記各変異株のＬ−バリン生産能を増強することによって得られる。
Ｌ−バリンの生産能の付与または増強は、例えば、制御機構が実質的に解除されたＬ−バリン生合成系遺伝子をエシェリヒア属に属する微生物に導入することによって行われる。また、エシェリヒア属に属する微生物が保持するＬ−バリン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。
エシェリヒア属に属する微生物において、Ｌ−バリンの生合成の最終段階の反応は、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによってコードされる酵素群によって行われる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、ｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＥ、ｉｌｖＤ、ｉｌｖＡの各遺伝子を有しており、各々順に、アセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムIIの大サブユニット、小サブユニット、トランスアミナーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ及びスレオニンデアミナーゼをコードしている。これらの酵素のうち、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、トランスアミナーゼ及びジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ピルビン酸からL−バリンへの合成経路、及び２−ケト酪酸からＬ−イソロイシンへの合成経路を触媒し、スレオニンデアミナーゼはＬ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する。したがって、Ｌ−バリン合成系の反応を効率よく進行させるためには、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないオペロンを用いることが好ましい。このようなスレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとしては、スレオニンデアミナーゼ活性を失うような変異がｉｌｖＡに導入された、又はｉｌｖＡが破壊されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、あるいはｉｌｖＡが欠失したｉｌｖＧＭＥＤオペロンが挙げられる。
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい。
上記のような、スレオニンデアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを変異処理し、または遺伝子組換え技術を用いて改変することにより得られる。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとしては、エシェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、具体的にはナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. et. al., Escherichica coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C., 1208, table 1）にあげられるものが利用できる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡが取得される。
ただし、野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのＤＮＡ供与菌としてE. coliを用いる場合、K-12野生株はｉｌｖＧ遺伝子がフレームシフト変異をもっているために活性のあるアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムII（ＡＨＡＳII）が発現していない（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 922, 1991）。従ってK-12株をＤＮＡ供与菌とする場合には、ｉｌｖＧ遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸シンターゼIIの活性が回復するようにフレームが戻った変異株を調製してから同変異株をＤＮＡ供与菌として用いる必要がある。あるいはK-12株由来の株以外のE. coliをＤＮＡ供与菌としてｉｌｖＧ遺伝子のみを単離し、これをK-12株由来のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンに導入してもよい。すなわち、K-12株をＤＮＡ供与菌としてｉｌｖＭＥＤＡ部分を単離し、K-12株由来の株以外のE. coliをＤＮＡ供与菌としてｉｌｖＧ遺伝子のみを単離し、両者を連結して完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンとする。なお、アセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムII（ＡＨＡＳII）は大小２つのサブユニットにより構成されており、大サブユニットはｉｌｖＧ遺伝子にコードされている。小サブユニットはｉｌｖＭ遺伝子にコードされている。
アテニュエーションが解除されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを取得する方法は以下の通りである。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーターの位置および塩基配列はR. P. Lawtherらによって報告されている。（Nucleic Acids Res. 15, 2137 （1987））。
スレオニンデアミナーゼを発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを出発材料にして、アテニュエーターが除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを調製することにより、スレオニンデアミナーゼを発現せず、且つアテニュエーターが除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが得られる。
配列表の配列番号１として記載した塩基配列は、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの塩基配列のうち、プロモーター、アテニュエーター、及びｉｌｖＧ遺伝子コード領域を含む配列であり、アテニュエーションに必要な領域を含んでいる。また、ｉｌｖＧ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。966番目から971番目にいたるＤＮＡ配列はリーダーペプチド内に存在する２個のロイシン残基の連続部分をコードし、999番目から1007番目にいたるＤＮＡ配列はリーダーペプチド内に存在する３個のバリン残基の連続部分をコードし、1008番目から1016番目にいたるＤＮＡ配列はリーダーペプチド内に存在する３個のイソロイシン残基の連続部分をコードする。1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列はアテニュエーター内にあるロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成する部分をコードする。
細胞内にＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンが十分量存在すると、1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列より転写されるＲＮＡよりロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループが形成されるためＲＮＡポリメラーゼによる転写が終結してｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは発現しない。
細胞内に、例えばＬ−バリンが不足すると細胞内にＬ−バリンが結合したｔＲＮＡが不足し、リーダーペプチドをコードする領域内に存在するバリン残基の連続部分でリボゾームによる翻訳が停滞する。このため、ｍＲＮＡが新たな立体構造を形成するようになって、結果として1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列により転写されるＲＮＡにより形成されていたロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループが形成されなくなる。このためＲＮＡポリメラーゼによる転写が続行してｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは発現する。Ｌ−イソロイシン又はＬ−ロイシンが不足した場合も同様にしてｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは発現する。
したがって、Ｌ−バリンによるアテニュエーションに必要な領域を除去するためには、配列表の配列番号１に開示される配列の999番目から1007番目にいたるＤＮＡ配列、または1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列を除去すれば良い。同様に、後述のＬ−ロイシン生産菌の作製において、Ｌ−ロイシンによるアテニュエーションに必要な領域を除去するためには、配列表の配列番号１に開示される配列の966番目から971番目にいたるＤＮＡ配列、または1081番目から1104番目にいたるＤＮＡ配列を除去すれば良い。
ところで、アテニュエーションに必要な領域を除去するとは、アテニュエーションが起こらないように変異が導入されていることを意味する。したがって同変異はｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部を除去するものだけに限定されない。要するに、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成できなくなる変異であってもよい。また、Ｌ−バリン生産菌の作製においては、リーダーペプチド内にバリン残基の連続部分が含まれないようにする変異であってもよい。また、Ｌ−ロイシン生産菌の作製においては、リーダーペプチド内にロイシン残基の連続部分が含まれないようにする変異であってもよい。上記のいずれの場合もアテニュエーションは機能しなくなるからである。
すなわち、アテニュエーションに必要な領域を除去するとは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部、一部または近傍部分を除去するものの他に、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片を挿入することも含まれる。
（ｉ）野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡを取得するには、ｉｌｖＧＭ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子、ｉｌｖＤ遺伝子及びｉｌｖＡ遺伝子をおのおの取得し、これらを連結する方法が考えられる。ただし、Ｌ−バリン生産菌の取得においては、スレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子は必要ないので、ｉｌｖＧＭ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子及びｉｌｖＤ遺伝子を連結してｉｌｖＧＭＥＤを含有するＤＮＡを取得してもよい。
まず、E. coli、例えばE. coli K-12株、E. coli W3110株、E. coli MC1061株（以上の３株はｉｌｖＧがフレームシフトを起こしている）、E. coli MI162株（thr-10, car-94, λ-, relA1, ilvG603, thi-1）、E. coli B株（以上の２株は正常なｉｌｖＧを有している）を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、酵母エキス、ペプトン、トリプトン、又は肉エキスに塩化ナトリウム（NaCl）を加えた培地が用いられる。具体的にはＬ−ｂｒｏｔｈ（バクト・トリプトン１％、バクト・イースト・エキストラクト０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ブドウ糖０．１％、ｐＨ＝７．２）である。なお、培地の初発ｐＨは、６〜８に調製するのが適当である。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気かく拌深部培養、振とう培養または静置培養等により行う。なお、E. coli MI162株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC5919である。同株の詳しい性質は、Mol. Gen. Genet. 143, 243（1976）, J. Bacteriol., 149, 294（1982）に記載されている。
このようにして得られた培養物を、例えば3,000r.p.m.で５分間遠心分離してE. coliの菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta., 72, 619（1963））、K. S. Kirbyの方法（Biochem. J., 64, 405,（1956））等の方法により染色体DNAを得ることができる。
こうして得られた染色体ＤＮＡからｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを、温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと同一末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを、温度３０℃以上、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒア属の微生物、例えばE. coli MI262（leuB6, ilvI614, ilvH612, λ-, relA1, spoT1, ilvB619, ilvG603, ilvG605（am）, thi-1）のようなアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損変異株、E. coli AB2070株（proA2, trp-3, hisG4, ilvE12, metE46, thi-1, ara-9, lacY1 or lacZ4, galK2, malA1, mtl-1, rpsL8 or rpsL9, ton-1, tsx-3, λR, λ-, supE44）のようなトランスアミナーゼＢ欠損変異株、あるいはE. coli AB1280株（hisG1, ilvD16, metB1, argH1, thi-1, ara-13, lacY1 or lacZ4, gal-6, xyl-7, mtl-2, malA1, rpsL8, 9 or 17, tonA2, λR, λ-, supE44）のようなジヒドロキシ酸デヒドラターゼ欠損変異株を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は、D. M. Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol., Biol., 53, 159（1970））等により行うことができる。なお、E. coli MI262株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC5769である。同株の詳しい性質は、Mol. Gen. Genet., 156, 1（1977）に記載されている。E. coli AB2070株は、E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット州）より入手可能である。同株の索引番号はCGSC2070である。同株の詳しい性質は、J. Bacteriol., 109, 730（1972）に記載されている。
ところで、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列は明らかにされている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））ので、特定の制限酵素を選んで染色体ＤＮＡを消化することにより、目的とする遺伝子が存在するＤＮＡ断片を特定の長さのものとすることができる。同特定の長さを有するＤＮＡ断片だけをベクターＤＮＡに連結して組換えＤＮＡを作成し、同組換えＤＮＡを用いて染色体ＤＮＡライブラリーを作成する方が、より効率よく目的とする遺伝子が存在するＤＮＡ断片を取得することができる。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が増大した株あるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、トランスアミナーゼＢ活性が増大した株あるいはトランスアミナーゼＢ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＥ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中から、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性が増大した株あるいはジヒドロキシ酸デヒドラターゼ遺伝子欠損に起因する栄養要求性が相補された株を選択し、ｉｌｖＤ遺伝子を含む組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。
ｉｌｖＧＭ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＧＭ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調製してアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が増大していることを確認することにより達成できる。アセトヒドロキシ酸シンターゼの酵素活性測定法は、M. D. Feliceらの方法により行うことができる（Methods in Enzymology 166, 241）。
また、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損変異株はイソロイシン、ロイシン及びバリン要求性があるので、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損変異株を宿主に用いた場合は、バリンを含有しない最少培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
あるいは、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））。そこで、候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
上述した通り、E. coli K-12株のｉｌｖＧ遺伝子のオープン・リーディング・フレーム内部には変異が生じている。その結果フレームシフトが起き、さらに途中に終始コドンが出現するために翻訳が終了してしまう。すなわち、ｉｌｖＧ遺伝子の開始コドンのATG（１〜３番目）から数えて982〜984番目に終始コドンが出現している。したがって、同株より取得したｉｌｖＧＭ遺伝子を用いる場合には、サイト・ダイレクティッド・ミュータジェネシス法により変異部分を正常に戻す必要がある。たとえばエシェリヒア・コリＭＩ１６２株のｉｌｖＧ遺伝子（ilvG603）では、982〜984番目にある終始コドンTGAの前に、TGの２塩基対が挿入されて、フレームが正常に戻っている。その他についてはJ. Bacteriol. 149, 294（1982）のFig.2に詳しく記載されている。
ｉｌｖＥ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＥ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認する方法は以下の通りである。トランスアミナーゼＢ欠損変異株はイソロイシン要求性であるので、トランスアミナーゼＢ欠損変異株を宿主に用いた場合は、イソロイシンを含有しない最少培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＥ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
あるいはｉｌｖＥ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））。そこで、候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
ｉｌｖＤ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをもつ候補株が、ｉｌｖＤ遺伝子がクローニングされた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認する方法は以下の通りである。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ欠損変異株はイソロイシン、ロイシン、バリン要求性であるので、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ欠損変異株を宿主に用いた場合は、バリンを含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ｉｌｖＤ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
あるいはｉｌｖＥ遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列はR. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））。そこで、候補株から組換えＤＮＡを単離して、その塩基配列を解読して、同報告にある塩基配列と比較することによっても確認が行える。
上記菌株おのおのより、組換えＤＮＡを、例えばP. Guerryらの方法（J. Bacteriol., 116, 1064（1973））、D. B. Clewellの方法（J. Bacteriol., 110, 667（1972））などにより単離することができる。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン全長を得るには、ｉｌｖＧＭ遺伝子を有するＤＮＡ断片、ｉｌｖＥ遺伝子を有するＤＮＡ断片、及びｉｌｖＤ遺伝子を有するＤＮＡ断片を連結する。連結するときには、R. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン全塩基配列を参考にできる。
野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得は、染色体上に野生型ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを有する株から、斎藤、三浦の方法等により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; White, T. J. et al; Trends Genet. 5,185（1989）参照）により、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを増幅することによっても行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの一部領域だけを増はした場合には、該ＤＮＡ断片をプローブとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全領域を増幅した場合には、増幅されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽出することによってｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含有するＤＮＡ断片を回収できる。この場合においても、Ｌ−バリン生産菌の取得に際してはｉｌｖＡ遺伝子は必須ではないので、ｉｌｖＧＭＥＤ部分のみを増幅してもよい。
ＤＮＡプラスマーを作製するには、R. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））E. coliのｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン全塩基配列を参考にできる。
プラスマーＤＮＡの合成はホスホアミダイド法（Tetrahedron Letters, 22, 1859（1981）参照）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380B等）を用いて合成することができる。また、ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲ反応装置（パーキンエルマー社製ＤＮＡサーマルサイクラーPJ2000型等）を使用し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、供給者により指定された方法に従って行うことができる。
ＰＣＲ法により増幅されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンは、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導入することによって、ｉｌｖＡ遺伝子への変異の導入操作およびアテニュエーションに必要な領域の除去操作等がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと形質転換法、さらにｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの存在の確認方法は上述した方法と同じである。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの供与菌として、E. coli K-12株、E. coli W3110株、E. coli MC1061株等を使用した場合には、上述したようにｉｌｖＧ遺伝子のオープン・リーディング・フレーム内部にフレームシフト変異が存在しているので、この変異部分をサイト・ダイレクティッド・ミュータジェネシス法等により正常に戻す必要がある。E. coli MI162株（thr-10, car-94, λ-, relA1, ilvG603, thi-1）、E. coli B株等をＤＮＡ供与菌として場合には、ｉｌｖＧ遺伝子はそのまま使用することができる。
（ii）ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのアテニュエーションに必要な領域の除去
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンからアテニュエーションに必要な領域を除去する、すなわちｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンにアテニュエーションが起こらないような変異を導入するには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの５’上流域に存在するアテニュエーター全部、一部または近傍部分を除去するものの他に、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片を挿入するものも含まれる。なお、ここで「アテニュエーター」とは、ロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成する塩基配列である。たとえば配列表配列番号１に記載される塩基配列の1081番目から1104番目にいたる部分である。
アテニュエーターを除去するためにはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片を調製し、またｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも下流域のＤＮＡ断片を調製して両者を連結すればよい。例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片は、完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断することによって調製できる。あるいは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅してもよい。ＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、R. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））塩基配列、G. Coppolaらによってすでに報告されている（Gene 97, 21（1991））塩基配列を基にして化学合成してもよい。さらには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも上流域のＤＮＡ断片を化学合成してもよい。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうちアテニュエーター部よりも下流域のＤＮＡ断片を調製する方法も同様である。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを出発材料にして、アテニュエーターの一部または近傍部分が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを調製することによりｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが得られる場合がある。アテニュエーターの位置および塩基配列はR. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））ので、この配列を基にして除去するＤＮＡを決定する。
除去するＤＮＡは、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成するために必要なＤＮＡ部分か、同シュテム／ループの上流に位置する連続するバリン残基をコードする領域を含む適当なＤＮＡ部分か、あるいはその両方を含むＤＮＡ部分が好ましい。アテニュエーターの一部または近傍部分を除去するためにはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を調製し、またｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製して両者を連結すればよい。例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片は、完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断することによって調製できる。あるいは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅してもよい。ＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、R. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））塩基配列、G. Coppolaらによってすでに報告されている（Gene 97, 21（1991））塩基配列を基にして化学合成してもよい。さらには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を化学合成してもよい。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち除去されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製する方法も同様である。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを出発材料にして、アテニュエーター内部に新たなＤＮＡ断片が挿入されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを調製することによりｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが得られる場合がある。アテニュエーターの位置および塩基配列は、R. P. Lawtherら、あるいはG. Coppolaらによってすでに報告されているので、この配列を基にして挿入される新たなＤＮＡ断片の挿入位置および挿入されるＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。
挿入される新たなＤＮＡ断片は、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成するために必要なＤＮＡ部分か、あるいは同シュテム／ループの上流に位置する連続するバリン残基をコードするＤＮＡ部分に挿入されることが好ましい。挿入の結果、アテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成できなくなることがあり、このためアテニュエーターが機能しなくなることが期待されるからである。
挿入される新たなＤＮＡ断片の塩基配列は、挿入されたときにアテニュエーターがロー非依存型のターミネーター様シュテム／ループを形成しないように設計され、挿入されたときに同シュテム／ループの上流に連続するバリン残基が位置しないように設計されることが好ましい。
アテニュエーターの内部に新たなＤＮＡ断片を挿入するためには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を調製し、またｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製して、さらに挿入される新たなＤＮＡ断片を調製して３者を連結すればよい。例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片は、完全長のｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断することによって調製できる。あるいは、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅してもよい。ＰＣＲ法に用いるプライマーＤＮＡは、R. P. Lawtherらによってすでに報告されている（Nucleic Acids Res. 15, 2137（1987））塩基配列、G. Coppolaらによってすでに報告されている（Gene 97, 21（1991））塩基配列を基にして化学合成してもよい。さらには、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を化学合成してもよい。
ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を調製する方法も同様である。
挿入される新たなＤＮＡ断片は化学合成によって調製できる。
また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片、あるいはｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅する際に、プライマーＤＮＡに挿入される新たなＤＮＡ断片を連結しておくこともできる。例えば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも上流域のＤＮＡ断片を増幅するために用いる３’側ＤＮＡプライマーに、挿入される新たなＤＮＡ断片の片方の鎖を連結する。同様にしてｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンのうち新たなＤＮＡ断片が挿入されるＤＮＡ部分よりも下流域のＤＮＡ断片を増幅するために用いる５’側ＤＮＡプライマーに、挿入される新たなＤＮＡ断片の相補鎖を連結する。これらのプライマーを用いて増幅される２種のＤＮＡ断片を連結する。
（iii）スレオニンデアミナーゼの不活性化
取得したｉｌｖオペロンがｉｌｖＡ遺伝子を含んでいる場合には、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないように、ｉｌｖＡ遺伝子を除去し、あるいは発現されるスニオニンデアミナーゼが不活性化されるようにｉｌｖＡ遺伝子内部に変異、挿入、欠失等を起こさせるように、ｉｌｖＡ遺伝子を改変する。改変法としては、例えばｉｌｖＡ遺伝子内部に存在する制限酵素部位を切断し、切断点よりも下流のＤＮＡ断片を除去する方法が挙げられる。ｉｌｖＡ遺伝子を２箇所の制限酵素部位で切断し、再連結することによってＤＮＡ断片を切り出してもよい。また、前記制限酵素部位に合成ＤＮＡ等の他のＤＮＡ断片を挿入することによって、発現されるスレオニンデアミナーゼを不活性化することができる。制限酵素切断部位が粘着末端である場合には、この粘着末端を平滑化した後、末端同士を連結することによっても、発現されるスレオニンデアミナーゼを不活性化することができる。さらに、部位特異的変異導入等によってもスレオニンデアミナーゼを不活性化することができる。
以下、アテニュエーションが解除され、かつ、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンまたはｉｌｖＡを欠失したｉｌｖＧＭＥＤオペロンを、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンという。ここで、「Ａ*」は、ｉｌｖＡ遺伝子の欠失、または活性を有しないスレオニンデアミナーゼまたはその一部をコードするｉｌｖＡ遺伝子を表す。
（iv）エシェリヒア属に属する微生物への解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンの導入
上記のようにして得られる解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンを含むＤＮＡ断片を組換えＤＮＡとして、適当な宿主微生物に導入し、発現させることにより、ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンにコードされるバリン生合成系の酵素群の発現が増強された微生物を取得できる。宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えばエシェリヒア・コリがあげられる。
また、組換えＤＮＡから解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンを取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したものを使用してもよい。本発明において用いることのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
さらに、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンの発現を効率的に実施するために、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンの上流にｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等の微生物内で働く他のプロモーターを連結してもよく、ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロン固有のプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いてもよい。
また、上記のように、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンを含むＤＮＡ断片を自律複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドのような染色体外ＤＮＡとして宿主に保持させてもよいが、解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンを含むＤＮＡ断片を、トランスダクション、トランスポゾン（Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1,417（1983））、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.（1972））を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。宿主に導入する解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンの数は、１つでもよく、複数でもよい。
上記のようにして解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンを含むＤＮＡ断片を、リポ酸要求性の、又は／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損したエシェリヒア属に属する微生物に導入することにより、Ｌ−バリン生産菌が得られる。解除型ｉｌｖＧＭＥＤＡ*オペロンを含むＤＮＡ断片を導入したエシェリヒア属に属する微生物に、リポ酸要求性又は／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損を導入してもＬ−バリン生産菌は得られる。
〔２〕Ｌ−ロイシン生産菌
後記実施例に示すように、リポ酸要求性またはＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損したエシェリヒア属に属する微生物は、Ｌ−バリン生産性を向上させることができることが明らかとなった。このことは、リポ酸要求性変異により、あるいはＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異によって、細胞内の代謝の流れがＬ−バリン合成が進む方向に傾いた結果であることを示唆している。したがって、Ｌ−バリン生合成系の最終中間体から分岐する合成経路を有するＬ−ロイシン生合成も、リポ酸要求性変異又は／及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異によって促進されると考えられる。したがって、Ｌ−ロイシン生産能をリポ酸要求性変異株、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株、又はリポ酸要求性−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異をともに有する変異株に付与または増強すれば、Ｌ−ロイシン生産能を付与又は増強できることが期待される。
Ｌ−ロイシンの生産能の付与または増強は、例えば、上記Ｌ−バリン生産に必要な性質に加えて、制御機構が実質的に解除されたＬ−ロイシン生合成系遺伝子をエシェリヒア属に属する微生物に導入することによって行われる。また、エシェリヒア属に属する微生物が保持するＬ−ロイシン生合成系遺伝子の制御機構が実質的に解除されるような変異を導入してもよい。このような遺伝子として、例えば、Ｌ−ロイシンによる阻害が実質的に解除されたｌｅｕＡ遺伝子が挙げられる。
尚、本発明の微生物は、以上のようなＬ−バリン生産能あるいはＬ−ロイシン生産能に加えて、アミノ酸生産能の向上に有効な公知の性質、例えば各種栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、薬剤依存性等の性質あるいは遺伝子工学的手法により、アミノ酸の生合成を向上させる遺伝子が増幅されている特徴を併せ持っていてもよい。
＜２＞本発明のＬ−バリンまたはＬ−ロイシンの製造法
本発明によるＬ−バリンまたはＬ−ロイシンの製造は、本発明の微生物を液体培地で培養し、培養液中にＬ−バリンまたはＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、この培養液からＬ−バリンまたはＬ−ロイシンを採取することによって行うことができる。この際、Ｌ−バリンの製造には本発明のＬ−バリン生産菌を、Ｌ−ロイシンの製造には本発明のＬ−ロイシン生産菌を使用する。
本発明の製造法におけるＬ−バリン生産菌またはＬ−ロイシン生産菌の培養および培養液からのＬ−バリンまたはＬ−ロイシンの採取、精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐＨは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整することができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中に目的とするＬ−バリンまたはＬ−ロイシンが蓄積する。
培養終了後、培養液から菌体などの固形物を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮法、晶析法等によって目的とするＬ−バリンまたはＬ−ロイシンを採取、精製することが出来る。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＨＳＧＳＫを構築する手順を示す図である。
図２は、プラスミドｐｄＧＭ１を構築する手順を示す図である。
図３は、プラスミドｐＭＷＧＭＡ２を構築する手順を示す図である。
図４は、プラスミドｐＭＷＤ５を構築する手順を示す図である。
図５は、プラスミドｐＭＷｄＡＲ６を構築する手順を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施例を説明する。
実施例１ Ｌ−バリン生産菌の創製
１．解除型ｉｌｖＧＭＥＤオペロン発現プラスミドｐＭＷｄＡＲ６の構築
エシェリヒア・コリＭＩ１６２株より、染色体ＤＮＡを抽出した。該染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した。ｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片は４．８ｋｂの長さであることが判明している。そこで４．８ｋｂ前後の長さを有するＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片と、プラスミドベクターｐＢＲ３２２（宝酒造（株）より購入）をＨｉｎｄIIIで切断して得られるＤＮＡ断片とを連結した。
得られたＤＮＡ連結反応混合物を、アセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損株であるエシェリヒア・コリＭＩ２６２株に導入した。形質転換されてアセトヒドロキシ酸シンターゼ欠損の形質が相補された株を選択し、その株が保有するプラスミドを単離した。同プラスミドの構造を解析した結果、ｐＢＲ３２２のＨｉｎdIII部位にｉｌｖＧＭ遺伝子及びｉｌｖＥ遺伝子の５’末端側の一部を含む４．８ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されていた。同プラスミドをｐＢＲＧＭ７と命名した。
Gene 97, 21,（1991）、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 922,（1981）とJ. Bacteriol. 149, 294,（1982）に報告されているｉｌｖＧＭ遺伝子の塩基配列を参考にして、配列表配列番号３と配列番号４に記載した合成オリゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。両ＤＮＡをプライマーとして、ＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡの増幅を行った。増幅されるＤＮＡ断片は配列表配列番号１に記載される塩基配列のうち２５番目から９５２番目の配列を有するＤＮＡ断片である。同断片を断片（Ａ）とする。
同様にして、Gene 97, 21,（1991）、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 922,（1981）とJ. Bacteriol. 149, 294,（1982）に報告されている塩基配列を参考にして、配列表配列番号５と配列番号６に記載した合成オリゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。両ＤＮＡをプライマーとして、ＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法にてＤＮＡの増幅を行った。増幅されるＤＮＡ断片は配列表配列番号１に記載される塩基配列のうち1161番目から2421番目の配列を有するＤＮＡ断片である。同断片を断片（Ｂ）とする。
断片（Ａ）をＳｍａＩで消化して得られる大断片と、ベクターｐＵＣ１８（宝酒造）をＳｍａＩで消化して得られるＤＮＡ断片とを連結してプラスミドｐＵＣＡを作成した。断片（Ｂ）をＫｐｎＩで消化して得られる大断片と、ｐＨＳＧ３９９（宝酒造）をＨｉｎｃII及びＫｐｎＩで消化して得られる大断片とを連結してプラスミドｐＨＳＧＢを作成した。
プラスミドｐＵＣＡをＫｐｎＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにＰｓｔＩで消化し、最終的に断片（Ａ）を含むＤＮＡ断片を単離した。プラスミドｐＨＳＧＢをＨｉｎｄIIIで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（クレノーフラグメント）を用いて切断端を平滑末端化し、さらにＰｓｔＩで消化し、最終的に断片（Ｂ）を含むＤＮＡ断片を単離した。両ＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＨＳＧＳＫを作成した。
ｐＨＳＧＳＫに搭載される、断片（Ａ）及び断片（Ｂ）に由来するＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片を断片（Ｃ）と命名した。断片（Ｃ）は、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．８ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII断片をＳｍａＩとＫｐｎＩで切断して得られる断片に相当し、プロモーター、ＳＤ配列及びｉｌｖＧ遺伝子上流域を含むが、リーダー配列からアテニュエーター領域に至る配列約０．２ｋｂを欠いている。以上、ｐＨＳＧＳＫを構築する手順を図１にまとめた。
プラスミドｐＨＳＧＳＫをＳｍａＩとＫｐｎＩで消化することにより断片（Ｃ）を得、プラスミドｐＢＲＧＭ７をＳｍａＩとＫｐｎＩで消化することにより大ＤＮＡ断片を得、両者を連結した。得られたプラスミドをｐｄＧＭ１と命名した。ｐｄＧＭ１に搭載される、ｉｌｖＧＭ遺伝子を含む４．６ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII断片は、アテニュエーションに必要な領域を欠いている。アテニュエーションに必要な領域を欠いたｉｌｖＧＭ遺伝子を、本実施例及び図面において「ΔａｔｔＧＭ」と表現する。以上、ｐｄＧＭ１を構築する手順を図２にまとめた。
特開平２−４５８号公報に記載されているプラスミドｐＤＲＩＡ４は、エシェリヒア属細菌で自律複製可能でありかつブレビバクテリウム属細菌で自律複製可能なシャトルベクターｐＤＲ１１２０と、E. coli K-12由来のスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子及びｉｌｖＤ遺伝子の３’末端側の一部を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片とが結合されて調製される。なお同ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片は、特開平２−４５８号公報では、２．３ｋｂと記載されているが、現在では、２．７５ｋｂであることが判明している。プラスミドｐＤＲＩＡ４はブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２３５８（ＦＥＲＭ  Ｐ−９７６４）あるいはブレビバクテリウム・フラバムＡＪ１２３５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−９７６５）の染色体ＤＮＡ外に存在する。これらの株から常法によりプラスミドｐＤＲＩＡ４を調製できる。尚、ｐＤＲＩＡ４が有するｉｌｖＡ遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシンによるフィードバック阻害が解除されているが、本発明においてはこのフィードバック阻害の解除は必須ではない。
プラスミドｐＤＲＩＡ４上のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ ２．７５ｋｂのＤＮＡ断片中、Ｌ−イソロイシンによる阻害が実質的に解除されたスレオニンデアミナーゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を含むＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片を調製し、ベクターｐＭＷ１１９（ニッポンジーン社製）をＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩで切断して得られるＤＮＡ断片と連結した。こうして作製されたプラスミドをｐＭＷＡ１と命名した。
プラスミドｐＭＷＡ１をＨｉｎｄIIIで切断して得られるＤＮＡ断片と、プラスミドｐｄＧＭ１をＨｉｎｄIIIで切断して得られるｉｌｖＧＭ遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結した。プラスミド上に存在する制限酵素認識部位の位置を解析することによって、ｉｌｖＧＭ遺伝子の転写方向とｉｌｖＡ遺伝子の転写方向とが同方向となったものを選択し、これをプラスミドｐＭＷＧＭＡ２と命名した。ｐＭＷＧＭＡ２は、アテニュエーターを除去されたｉｌｖＧＭ遺伝子、ｉｌｖＥ遺伝子の５’末端側の一部、及びｉｌｖＤ遺伝子の３’末端側の一部を有している。以上、ｐＭＷＧＭＡ２を構築する手順を図３にまとめた。
エシェリヒア・コリＭＩ１６２株の染色体ＤＮＡを調製し、これをＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片混合物を調製した。一方、ベクターｐＵＣ１９（宝酒造社）をＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断してＤＮＡ断片を調製した。ＤＮＡ断片混合物とｐＵＣ１９が切断されて得られるＤＮＡ断片とを連結して、ＤＮＡ混合物を得た。同ＤＮＡ混合物を、トランスアミナーゼＢ欠損株であるＡＢ２０７０株（J. Bacteriol, 109, 703, 1972、エシェリヒア・コリ ジェネティックストックセンターから分譲。ＣＧＳＣ２０７０）に導入し、形質転換されて分岐鎖アミノ酸要求性が回復した株を選択した。同株よりプラスミドを調製したところ、プラスミドｐＵＣ１９がＳａｌＩ及びＰｓｔＩで切断して得られるＤＮＡ断片と、ｉｌｖＥ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片が連結されていた。このプラスミドをｐＵＣＥ１と命名した。ｐＵＣＥ１は、ｉｌｖＭ遺伝子の３’末端側の一部、ｉｌｖＥ遺伝子、及びｉｌｖＤ遺伝子の５’末端側の一部を有している。
ｐＭＷＧＭＡ２をＨｉｎｄIIIで部分消化してＤＮＡ断片混合物を調製した。一方、ｐＵＣＥ１をＨｉｎｄIIIで切断して、ｉｌｖＥ遺伝子の一部とｉｌｖＤ遺伝子の５’末端側の一部とを含む１．７ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を調製した。両者を連結して得られるＤＮＡ混合物を用いてジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ遺伝子産物）欠損株ＡＢ１２８０株を形質転換し、形質転換された株のうち分岐鎖アミノ酸要求性が消失したものを選択した。同形質転換株から、プラスミドを調製したところ、ｐＭＷＧＭＡ２がΔａｔｔＧＭとｉｌｖＡとの間に存在するＨｉｎｄIII部位でのみ切断されて得られるＤＮＡ断片と、ｐＵＣＥ１に由来するｉｌｖＥ遺伝子の一部とｉｌｖＤ遺伝子の一部とを含む１．７ｋｂのＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片が連結されており、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンが再生されていた。こうして得られるプラスミドをｐＭＷＤ５と命名した。以上、ｐＭＷＤ５を構築する手順を図４にまとめた。
以上の様にして得られたプラスミドｐＭＷＤ５は、ｐＭＷ１１９をベクターとしており、アテニュエーションに必要な領域が除去されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを搭載したプラスミドである。
次に、こうして得られたプラスミドｐＭＷＤ５をＳｎａＢＩで完全消化した後、ＡｃｃIIIで部分消化した。得られたＤＮＡ断片を再環化しｉｌｖＡ遺伝子のみが破壊されたプラスミドｐＭＷｄＡＲ６を得た（図５）。この様にして得られたプラスミドｐＭＷｄＡＲ６はアテニュエーションに必要な領域を欠き、且つｉｌｖＡ遺伝子が破壊されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを有するプラスミドである。
２．Ｌ−バリン生産菌の創製
上記のようにして得られたｉｌｖＧＭＥＤオペロン発現プラスミドｐＭＷｄＡＲ６を用いて、リポ酸要求性変異株E. coli W1485lip2（ATCC25645）、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株E. coli W1485atpA401、リポ酸要求性−Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株E. coli AJ12631（FERM P-12381）、及び野生株E. coli W1485（ATCC12435）をそれぞれ形質転換し、以下の形質転換株を得た。
１）E. coli W1485／ｐＭＷｄＡＲ６
２）E. coli W1485atpA401／ｐＭＷｄＡＲ６
３）E. coli W1485lip2／ｐＭＷｄＡＲ６
４）E. coli AJ12631／ｐＭＷｄＡＲ６
E. coli AJ12631は、E. coli W1485lip2（ATCC25645）に、E. coli AN718（CGSC6308）に由来するＨ+-ＡＴＰａｓｅのＦ１のαサブユニットに変異を有する変異遺伝子であるatpA401をP1kcファージ（IFO20008）によって形質導入することによって得られた株である（特開平５−１３７５６８参照）。Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を有する形質導入株の選択は、atpA401遺伝子の近傍に位置するbg1遺伝子をマーカーとして利用した。bg1遺伝子は、ホスホ−β−グルコシダーゼをコードしており、野生型bg1遺伝子（bg1-）を有するE. coliはサリシンを資化できないが、変異bg1遺伝子（bg1+）を有するE. coliはサリシンを唯一の炭素源として生育できるようになり、平板培地にブロモチムールブルー（BTB）を添加しておくとサリシン資化性株のコロニーは自ら生産した有機酸によって黄色に着色する。したがって、変異型bg1遺伝子（bg1+）とatpA401遺伝子を連鎖形質導入すれば、Ｈ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異株を効率よく選択することができる。まず、E. coli AN718からサリシン資化性（bg1+）株を分離し、続いてAN718（bg1+）株にP1kcを感染させ、得られた溶菌液を用いてE. coli W1485lip2の形質導入を行った。得られた形質導入株のリポ酸要求性及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ活性を調べ、リポ酸要求性及びＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異のいずれをも保持していることを確認した。
E. coli W1485atpA401は、同様にしてE. coli W1485にatpA401を形質導入して得られた株である。
実施例２ Ｌ−バリンの製造
実施例１で得られたＬ−バリン生産菌のＬ−バリン生産性を評価した。バクトトリプトン1％、酵母エキス0.5％、NaCl0.5％、寒天1.5％、アンピシリン100μg/mlからなる組成の培地に各形質転換株を塗布し、37℃で18ないし24時間培養後、その一部を白金耳で20mlの発酵培地（グルコース4％、硫酸アンモニウム1.6％、リン酸二水素カリウム0.1％、硫酸マグネシウム7水塩0.1％、硫酸第一鉄7水塩0.001％、硫酸マンガン5水塩0.001％、酵母エキス0.2％、バクトトリプトン0.2％、炭酸カルシウム3％、pH7.0）に接種して、37℃で24時間振盪培養した。リポ酸要求性株の培養にはリポ酸を1μg/Lとなるよう添加して培養した。
菌体を除去した培養上清中のＬ−バリン濃度を、陽イオンカラム（CPK08：旭化成（株）製）を用いた高速液体クロマトグラフィーにて測定した。結果を表１に示す。
0003709564.tif 000002
この結果から、リポ酸要求性変異及び／又はＨ+-ＡＴＰａｓｅ欠損変異を有するE. coliを宿主とし、この宿主細胞に、スレオニンデアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションに必要な領域を欠損したｉｌｖＧＭＥＤＡ+オペロンを含むＤＮＡ断片を導入して得られたE. coliは、Ｌ−バリン生産性が増強されていることが明らかである。また、宿主としてリポ酸要求性であり、かつＨ+-ＡＴＰａｓｅを欠損した株を用いると、Ｌ−バリン生産性を一層増強することができる。
産業上の利用可能性
本発明により、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシン生産菌のＬ−バリンまたはＬ−ロイシン生産能を増強することが可能となった。本発明の微生物を用いることにより、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンを効率よく製造することができる。
配列表
（1）一般情報
（i）出願人：味の素株式会社
（ii）発明の名称：L−バリン及びL−ロイシンの製造法
（iii）配列数：12
（iv）連絡先：
（A）宛名：
（B）番地：
（C）市：
（D）州：
（E）国：
（F）ZIP：
（v）コンピュータ読取り可能形式
（A）媒体：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC互換
（C）操作システム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウェア：FastSEQ Version 1.5
（vi）現行出願データ
（A）出願番号
（B）出願日
（C）分類
（viii）代理人／事務所情報
（A）名前：
（B）登録番号：
（C）整理番号：
（ix）通信情報
（A）電話番号：
（B）ファクシミリ番号：
（2）配列番号１の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：2841 base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：２本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：Genomic DNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（vi）起源：
（A）生物名：エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）
（B）株名：MI162
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：957..1055
（C）特徴を決定した方法：S
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：attenuator
（B）存在位置：1081..1104
（C）特徴を決定した方法：S
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：1195..2841
（C）特徴を決定した方法：S
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：Cleavage-site（SmaI）
（B）存在位置：52..57
（C）特徴を決定した方法：S
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：cleavage-site（KpnI）
（B）存在位置：2395..2400
（C）特徴を決定した方法：S
（xi）配列：SEQ ID NO:1:
0003709564.tif 000003
0003709564.tif 000004
0003709564.tif 000005
0003709564.tif 000006
0003709564.tif 000007
（2）配列番号２の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：548 amino acids
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：SEQ ID NO:2:
0003709564.tif 000008
0003709564.tif 000009
0003709564.tif 000010
（2）配列番号３の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：22 base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:3:
0003709564.tif 000011
（2）配列番号４の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：21 base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列：SEQ ID NO:4:
0003709564.tif 000012
（2）配列番号５の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：22 base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：NO
（xi）配列：SEQ ID NO:5:
0003709564.tif 000013
（2）配列番号６の配列の情報：
（i）配列の性質：
（A）配列の長さ：19 base pairs
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：NO
（iv）アンチセンス：YES
（xi）配列：SEQ ID NO:6:
0003709564.tif 000014
【図１】
0003709564.tif 000015
【図２】
0003709564.tif 000016
【図３】
0003709564.tif 000017
【図４】
0003709564.tif 000018
【図５】
0003709564.tif 000019