(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼ標識抗体および透析した血清を含有することを特徴とする水溶液。
【請求項２】
血清がヤギ、ロバ、ウシ、牛胎児、マウス、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ニワトリ、サル、ラット、モルモット、イヌおよびヒトよりなる群から選ばれる動物に由来する少なくとも１種の血清である請求項１に記載の水溶液。
【請求項３】
透析した血清がセロファン膜により透析した血清である請求項１に記載の水溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定法などに用いられるペルオキシダーゼ標識抗体を含有する水溶液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臨床検査や免疫学、生化学、分子生物学などの研究分野で、操作が簡便なことから免疫反応を利用した測定法が多用されている。そのうち、特に酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと表す）や化学発光免疫測定法（以下、ＣＬＩＡと表す）等が高感度化の観点から多用されている。該測定法には、通常、酵素標識された抗体が用いられている。標識する酵素の一つとしてペルオキシダーゼがよく用いられているが、ペルオキシダーゼ標識された抗体は特に低濃度では不安定であることが多く、保存中に劣化することが知られている。この問題を解決するために、いくつかの技術が知られている。例えば、マレイミドヒンジ法による標識化（酵素免疫測定法第３版９９ページ）、クエン酸緩衝液の使用（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｐ．２４２３，（１９８２））、標識抗体の凍結乾燥（米国特許第４２６５５２号公開公報）、アミノピリンの添加（特公平１−２９５５６６号公報）、アニリノナフタレンスルホン酸の添加（特公昭５８−５６６８号公報）、塩化カルシウムの添加（米国特許第４７８２０２３号）等の報告がなされている。その他、ペルオキシダーゼ標識された抗体が含まれている溶液中に、遊離したペルオキシダーゼを共存させる方法なども提案がなされている（特開平７−２２２６００号公報）。このようにペルオキシダーゼ標識された抗体の安定化には様々な工夫がなされてきたが、少なくとも半年から１年以上の安定性が求められる市販試薬としての使用に耐えるだけの保存性を有するものは少ない。また、凍結乾燥すれば安定性は保持されるが、使用する際に操作が煩雑になるといった別の問題が生じ、更なる改良が望まれていた。
【０００３】
また、先述の測定法では被測定物質に対する抗原もしくは抗体を担持させる固相が用いられているが、その固相に対して標識物質が非特異的に吸着してしまう可能性がある。そこで、標識物質を加える前に非特異的吸着防止剤を添加し、固相上の吸着点を覆うことが非特異的吸着を抑制する上で重要である。ＥＩＡ、ＣＬＩＡなどの免疫学的測定法を実施する際に用いる非特異的吸着防止剤は、抗原（もしくは抗体）に特異的でない抗体が固相に吸着したり、標識物質が固相に非特異的に吸着することを防止する作用を有するものである。従来、この非特異吸着防止剤には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や乳タンパク質などを適当な緩衝液に溶解したものがよく用いられていた。しかし、抗ビオチン標識抗体を固相に担持させ、該抗体を介したサンドイッチＥＩＡ法においては、その効果が十分でなかったり、逆にこれらの非特異吸着防止剤が非特異吸着を誘発する等の問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、長期間に亘り安定であり、非特異反応が抑制されそして測定再現性が良好である、ペルオキシダーゼ標識抗体を含む水溶液を提供することにある。本発明の他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、ペルオキシダーゼ標識抗体を含む水溶液中に透析処理を行なった動物血清を共存させることにより、水溶液中のペルオキシダーゼ標識抗体の安定性、非特異反応の抑制および測定再現性が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、ペルオキシダーゼ標識抗体および透析した血清を含有することを特徴とする水溶液である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるペルオキシダーゼ標識抗体とは、ペルオキシダーゼが化学的に結合した抗体を言う。ペルオキシダーゼ標識抗体は市販のものでも、ペルオキシダーゼと抗体から調製してもよく、特に限定されるものではない。ペルオキシダーゼを抗体に化学的に結合する場合には、例えば、過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法、マレイミド法等の公知の方法が使用できる。本発明で用いられるペルオキシダーゼは、その由来は動物・植物どちらでもよいが、好ましくは植物由来のものである。より好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略すこともある）である。本発明におけるペルオキシダーゼで標識される抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。サブタイプも特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤのいずれでもよい。さらに、抗体が認識する抗原の種類によって限定されるものでもない。抗体を取得する場合に用いる動物種も特に限定されるものではないが、ヤギ、ウサギ、マウスなど免疫学的測定において通常用いられるものが好ましい。
【０００８】
本発明においては、透析した血清が用いられる。透析は公知の方法が問題なく使用できるが、分画分子量５，０００〜５０，０００の透析膜例えばセロファン膜を用いることが好ましい。これより大きい分画分子量の透析膜を用いても小さい分画分子量の透析膜を用いても透析した血清を用いる効果が弱くなる。血清としては特に限定されないが、通常免疫測定に用いられる、例えばヤギ、ロバ、ウシ、牛胎児、マウス、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ニワトリ、サル、ラット、モルモット、イヌおよびヒトよりなる群から選ばれる動物に由来する少なくとも１種の血清を用いることが好ましい。かかる動物に由来する血清は、特に限定されずに使用できる。免疫反応に用いる抗体を取得した動物と同じ動物種の血清を用いることが好ましい。例えば、抗ビオチン抗体が担持された固相に、ビオチン標識した抗体、その抗体が認識する抗原、酵素標識した抗体からなる免疫複合体を固定する場合、抗ビオチン抗体を取得した動物種と同じ動物種の透析した血清を酵素標識した抗体を含む溶液に共存させることが好ましい。透析した血清の濃度は特に限定されるものではないが、好ましくは０．１〜５０ｖ／ｖ％で用いられる。それより濃度が薄いと、ペルオキシダーゼ標識抗体の保存性および非特異反応抑制の効果が少ない。それより濃度が高いと、溶液の粘性が高くなるなど測定誤差が生じやすくなり好ましくない。
【０００９】
本発明において用いられる透析および上記血清を希釈する緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、バルビタール緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グッド緩衝液などの一般的に用いられる緩衝液が使用できる。緩衝液の緩衝剤の濃度やｐＨは特に限定されないが、濃度が高すぎると反応系に影響を及ぼす可能性があり、低すぎると反応が不安定になりやすい。反応系には生体由来のタンパク質が存在するため、中性から弱アルカリ性が好ましく、ｐＨ７．０〜８．５の範囲とするのがもっとも良好である。本発明の溶液には、その他添加剤が存在してもよい。かかるその他の添加剤としては、例えば、塩化ナトリウムや塩化カリウム等の無機塩、アジ化ナトリウムやマイクロサイド等の防腐剤等が挙げられる。
【００１０】
【実施例】
本発明をさらに詳細に説明するために、以下実施例および比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるのものではない。
【００１１】
実施例１
１．透析ヤギ血清の調製
１０ｍＬの正常ヤギ血清を、分画分子量１２，０００〜１４，０００の透析チューブ（和光純薬工業社製）に充填し、０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略す）１，０００ｍＬに４℃で５時間浸漬した。この操作を３回行い、透析血清を調製した。続いて透析血清をＰＢＳで希釈し、５０ｖ／ｖ％透析ヤギ血清を調製した。
【００１２】
２．ビオチン標識梅毒トレポネーマ抗原溶液の調製
梅毒トレポネーマ抗原としては１５ｋＤａ（抗原Ａと略す），１７ｋＤａ（抗原Ｂと略す）（以上、ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社製）、４７ｋＤａ（抗原Ｃと略す）（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ社製）の３種を用いた。ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ナカライテスク社製）３．４ｍｇをＤＭＳＯ１００μＬに溶解した（ここで調製した溶液を、以下、ビオチン溶液と記す）。各抗原１ｍｇをそれぞれ５００μＬの１０ｍｍｏｌ／ＬＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した。これに、上記調製したビオチン溶液をそれぞれ７μＬ、６μＬまたは２μＬ加えてよく混和し、２５℃で４時間反応した。未反応のビオチンラベル化剤を除去するため、ＮＡＰ−５（ファルマシア社製）を用い、取扱説明書に従ってＰＢＳでゲルろ過を行なった。抗原Ａは１μｇ／ｍＬ、抗原Ｂは１．１μｇ／ｍＬ、抗原Ｃは３．１μｇ／ｍＬになるように、ゲルろ過で回収したビオチン標識抗原溶液をＰＢＳで希釈した。これに０．０９５ｗ／ｖ％となるようにアジ化ナトリウムを加えた。これをビオチン標識梅毒トレポネーマ抗原溶液（以下第１試薬と略す）とした。
【００１３】
３．ＨＲＰ標識抗体溶液の調製
５０ｖ／ｖ％透析ヤギ血清を用い、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体（サザンバイオテクノロジー社製）を６０ｎｇ／ｍＬに希釈し、０．０９５ｗ／ｖ％となるようにアジ化ナトリウムを加えた。これをＨＲＰ標識抗体溶液（以下第２試薬と略す）とした。
【００１４】
４．測定
まず、梅毒トレポネーマ抗体陽性血清５０μＬと第１試薬１０μＬを混合して希釈血清を調製し、４０℃で５分間インキュベーションした。一方で、抗ビオチン抗体担持反応剤（東洋紡績社製）を４０℃でインキュベーションした。なお、このインキュベーションは測光終了まで継続した。反応剤へＩＤ−１０００用ブロック液（東洋紡績社製）を５０μＬ滴下した。ついで、インキュベーションが終了した希釈血清を５０μＬ滴下し、さらに第２試薬を１０μＬ滴下した。２分後、ＩＤ−１０００用洗浄液（東洋紡績社製）２００μＬを１００μＬずつ滴下し、さらに１分後、ＩＤ−１０００用発色液（東洋紡績社製）を滴下した。発色液滴下から５．５〜７．５秒後の２秒間および４０．５〜４２．５秒後の２秒間に、固相表面へ波長６７０ｎｍのレーザー光を照射したときの反射強度を測定した。実際の測定にはＩＤ−１０００（東洋紡績社製）を用いた。第１試薬は１２℃に保存し、保存から０，１，６，１２ヶ月後に上記測定を行なった。表１に結果を示した。ここでは保存安定性開始時の測定値を１００としたときの相対値を表している。表１に示したように、保存期間中、活性がほぼ保たれていることがわかる。
【００１５】
【表１】
0003712963.tif 000002
【００１６】
比較例１
透析ヤギ血清の代わりに、透析を行なっていない正常ヤギ血清を同濃度で用いた以外は実施例１と同様の操作を行なった。表１に示したように、実施例１とは異なり、保存直後に活性が失われていることがわかる。
【００１７】
比較例２
第１試薬の作製において、透析ヤギ血清の代わりにＰＢＳを用いたこと以外は、実施例１と同様の操作を行なった。その結果を表１に示した。この結果からもわかるように、比較例１と同様に保存直後に活性が失われている。
【００１８】
実施例２
実施例１で梅毒トレポネーマ抗体陽性血清の代わりに、イムノティクルスオートＴＰ２（エイアンドティー社製）で陰性と判定された健常者血清１００検体を用いたこと以外は、実施例１と同様の操作を行なった。表２に示したように、１００検体全てが陰性となった。
【００１９】
【表２】
0003712963.tif 000003
【００２０】
比較例３
５０ｖ／ｖ％透析ヤギ血清の代わりに１ｗ／ｖ％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いた以外は実施例２と同様の操作を行なった。表２に示したように、１００検体中３検体が陽性と判定され、非特異反応が抑制されていないことがわかる。
【００２１】
実施例３および比較例４
実施例１および比較例３で調製した各第１試薬で、ＩＤ−１０００を使用して梅毒トレポネーマ抗体陽性血清を２０回繰り返し測定を行なった。表３に示したように、透析血清を用いた試薬の方がＢＳＡを用いた試薬よりも同時再現性が優れていることがわかる。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
【発明の効果】
本発明の水溶液を用いることにより、ペルオキシダーゼ標識抗体が長期間安定で、かつ非特異反応が抑制され測定再現性が良好な組成物が提供される。