(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルプレートに保持させた媒質液に分散浮遊している微小検体中から選びだした微小検体をマイクロピペットで吸引するマイクロマニピュレータであって、
前記セルプレートは、そのプレート本体に、多数の微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セルと、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セルが、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成され、各セルの上面開口部にはプレート本体に摺接された状態で水平方向にスライドして開閉される蓋体が配されると共に、各セル間には微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路が貫通形成され、
当該セルプレートの第一セルに貯留された媒質液に分散浮遊する微小検体中から選んだ微小検体にレーザ光を照射して当該微小検体をトラップするレーザトラッピング手段と、
当該レーザトラッピング手段により微小検体をトラップした状態で、セルプレートを移動させるか又はレーザ光を走査させて、当該微小検体を前記第一セルから前記誘導路を通って前記第二セルに移動させる検体分離手段と、
前記第二セルに移動した微小検体を、当該第二セル内に進退可能なマイクロピペットで吸引する検体吸引手段とを備えたことを特徴とするマイクロマニピュレータ。
【請求項２】
プレート本体に、微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セルと、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セルが、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成され、各セルの上面開口部にはプレート本体に摺接された状態で水平方向にスライドして開閉される蓋体が配されると共に、各セル間には微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路が貫通形成されていることを特徴とするマイクロマニピュレータ用セルプレート。
【請求項３】
前記誘導路の途中に、微小検体が浮遊していない媒質液を貯留する１以上のバッファセルが、その上面を開口して形成されてなる請求項２記載のマイクロマニピュレータ用セルプレート。
【請求項４】
前記誘導路は、その底面が倒立顕微鏡のカバーガラスとなる光学平面で形成されてなる請求項２又は３記載のマイクロマニピュレータ用セルプレート。
【請求項５】
前記プレート本体の表面に、前記各セルの上面開口部を閉鎖した前記各蓋体を前記各セルに貯留した媒質液中に浸漬させる凹部が形成されている請求項２記載のマイクロマニピュレータ用セルプレート。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡の視野下で媒質液に分散浮遊している微小検体から選び出した微小検体をマイクロピペットで吸引するマイクロマニピュレータとそれに使用するセルプレートに関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、微小検体となる大腸菌は遺伝子操作を行うために頻繁に使用されるが、この場合に、所定の媒質液中に分散させて遺伝子操作を行った後、媒質液中に分散する大腸菌を媒質液ごとマイクロピペット等で吸入し、これを培養槽に移植して培養し、大量のＤＮＡを複製させるようにしている。
しかし、媒質液中に分散している大腸菌は、個体差により、その全てが遺伝子操作されているわけではなく、これをマイクロピペットで吸入するときには同時に複数の大腸菌を吸入してしまうため、培養された大腸菌は遺伝子操作されたものとされないものが混合した状態になり、遺伝子操作されたものの収率が低い。
したがって、１個の大腸菌から培養することができればこれを純粋培養することができるので、その大腸菌が遺伝子操作されていれば、遺伝子操作された大腸菌だけを収率１００％で得ることが可能になる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、微生物や微粒子などの微小検体を光学顕微鏡の視野下で一つだけ取り出す場合に、その大きさがある程度大きければ問題ないが、大腸菌のようにあまりにも小さいと、レンズの光学的性質より視野が制限され、他の微小検体の混入がないことを顕微鏡で確認しながら取り出すことが極めて困難であった。
例えば、１００μｍの長さの微生物を取り出す場合、分解能１０μｍ，焦点深度３００μｍ，ＮＡ＝ 0.034, 視野径１０ｍｍのレンズを用いれば、直径２００μｍのマイクロピペットを使用することにより、他の微生物の混入がないことを顕微鏡で確認しながら取り出すことができるが、大腸菌のように１μｍ程度の長さしかない微生物は、光学レンズの限界である分解能0.26μｍ，ＮＡ＝1.3 (100倍の油浸対物レンズ) のレンズを用いたとしても、その焦点深度は0.2 μｍ，視野は２００μｍしかないので、マイクロピペット内に１ｍｍ3 の媒質液を吸い込むときに、他の微生物が混入していないことを顕微鏡で確認しながら吸い込むことはできない。
【０００４】
また、微小検体が顕微鏡で確認できる程度の大きさだとしても、マイクロピペットに吸い込む１ｍｍ3 の媒質液に多数の微生物や微粒子が存在する場合は、多数の個体を同時に吸い込んでしまったり、多数の個体がマイクロピペットの先端外側に付着して媒質液を滴下する際に混入する可能性があり、結局、媒質液を大量に吸い込んで複数の微生物を同時に取り出すことはできても、微生物や微粒子を１個だけ取り出すことは困難であり、このために、希釈作業を繰り返し行わなければならないという面倒があった。
【０００５】
さらに、媒質中の微小検体の存在密度が少なかったとしても、マイクロピペットは、大腸菌等のように動きが比較的速い（数μｍ〜数十μｍ／ｓ）ものについてはその動きに追従してマイクロピペットを操作すると、マイクロピペットで媒質液をかき回してしまい、取り出そうとする微生物自身がその流れにより押し流されるので、捕捉することができないという問題を生ずる。
【０００６】
このため、微小検体が分散された媒質液を流す検体送給チャンネル、微小検体が分散されない媒質液を流して前記検体送給チャンネルを流れる微小検体を一つだけ取り出す検体分離チャンネルを平行に形成すると共に、これら各チャンネルを接続チャンネルで連通させ、当該接続チャンネルをバブルバルブで断続することにより微小検体を一つだけ取り出すようにしたものが提案されている（ＵＳＰ５１００６２７）。
このバブルバルブは、気泡を含んだ媒質液を流すバブルチャンネルを、前記検体送給チャンネル及び検体分離チャンネルと並行に、前記接続チャンネルと交差するように形成し、当該バブルチャンネルと接続チャンネルとの交差点に媒質液を満たすことにより接続チャンネルを導通させ、気泡を位置させることにより遮断するようにしたものであるが、バブルチャンネルにより供給される媒質液と、検体送給チャンネル及び検体分離チャンネルに満たされている媒質液との圧力バランスをとることが極めて難しく、例えば、バブルチャンネルで気泡や媒質液を送給したときにその影響で他のチャンネル内の媒質液が流動してしまうため、他のチャンネルに影響を及ぼすことなく接続チャンネルのみを思い通りに断続制御することは極めて困難であり、実用的ではなかった。
【０００７】
そこで本発明は、一度に吸入する媒質液中に微小検体が１つしか存在しない状態を作り出して、その媒質液を吸い込むことにより、大腸菌のように動きの速い微生物でも顕微鏡で確認することなく１個だけ確実に分離して取り出すことができるようにすることを技術的課題としている。
【０００８】
この課題を解決するために、本発明に係るマイクロマニピュレータは、セルプレートに保持させた媒質液に分散浮遊している微小検体中から選びだした微小検体をマイクロピペットで吸引するマイクロマニピュレータであって、前記セルプレートは、そのプレート本体に、多数の微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セルと、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セルが、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成され、各セルの上面開口部にはプレート本体に摺接された状態で水平方向にスライドして開閉される蓋体が配されると共に、各セル間には微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路が貫通形成され、当該セルプレートの第一セルに貯留された媒質液に分散浮遊する微小検体中から選んだ微小検体にレーザ光を照射して当該微小検体をトラップするレーザトラッピング手段と、当該レーザトラッピング手段により微小検体をトラップした状態で、セルプレートを移動させるか又はレーザ光を走査させて、当該微小検体を前記第一セルから前記誘導路を通って前記第二セルに移動させる検体分離手段と、前記第二セルに移動した微小検体を、当該第二セル内に進退可能なマイクロピペットで吸引する検体吸引手段とを備えたことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係るセルプレートは、プレート本体に、微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セルと、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セルが、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成され、各セルの上面開口部にはプレート本体に摺接された状態で水平方向にスライドして開閉される蓋体が配されると共に、各セル間には微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路が貫通形成されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明によれば、微小検体の浮遊しない媒質液をセルプレートに形成された第二セル内に注入して貯留させた後、微小検体が分散浮遊する媒質液を第一セル内に注入して貯留させる。このとき、第一セルと第二セルの間には、微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路が貫通形成されて、各セル同士が連通されているので、微小検体が短時間のうちに第二セルへ移動することはない。
【００１１】
次いで、第一セルに貯留された媒質液に分散浮遊する多数の微小検体中の特定の微小検体にレーザ光を照射して当該微小検体をトラップし、次いで、これをトラップしたままの状態で、セルプレートを移動させるか、または、レーザ光を走査させて、当該微小検体を第一セルから誘導路を通って第二セルに強制的に移動させる。
このとき、レーザ光によりトラップされた１つの個体のみが第二セルに移動され、第二セル内には１つの微小検体しか存在しないことになるので、この第二セル内の媒質液をマイクロピペットで吸引すれば、微小検体が一つだけ確実に吸引されることになる。
【００１２】
なお、各セルの上面開口部にはプレート本体に摺接された状態で水平方向にスライドして開閉される蓋体が配されているので、微小検体が浮遊しない媒質液を第二セルに注入して貯留させた時点で当該第二セルの上面開口部を水平方向にスライドする蓋体で覆い、次いで、微小検体が分散浮遊する媒質液を第一セル内に注入して貯留させた時点で当該第一セルの上面開口部を水平方向にスライドする蓋体で覆えば、媒質液で満たされた第一セル及び第二セルと誘導路は密閉されて媒質液が蒸発しにくくなり、したがって、蒸発に起因して媒質液が各セル間を流動することがない。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて具体的に説明する。
図１は本発明に係るマイクロマニピュレータの一例を示すフローシート、図２はセルプレートの一例を示す斜視図、図３（ａ）〜（ｆ）はその操作手順を示す説明図である。
【００１４】
図中１は、セルプレート２に保持させた媒質液に分散浮遊している微生物 (微小検体) から選んだ一の微生物３を取り出すマイクロマニピュレータであって、前記セルプレート２が倒立顕微鏡４のステージ５上に置かれ、微生物３を吸引するマイクロピペット６がセルプレート２に対し進退可能に配設されている。このマイクロマニピュレータ１は、顕微鏡４の視野下で、媒質液に分散浮遊した微生物中から選んだ微生物３にレーザ光を照射してその照射位置にある微生物３をトラップするレーザトラッピング手段７と、微生物３をトラップした状態で、セルプレート２を移動させるか、又は、レーザ光を走査させて、当該微生物３を他の微生物から分離させる検体分離手段８と、分離された特定の微生物３をマイクロピペット６内に吸引する検体吸引手段９とを備えている。
【００１５】
媒質液を保持するセルプレート２は、倒立顕微鏡４のカバーガラスとなる０.１７ｍｍのプレート本体１０の上に、多数の微生物が分散浮遊している媒質液を貯留する第一セル１１Ａと、微生物が浮遊していない媒質液を貯留する第二セル１１Ｂが、その上面を開口して所定間隔離れて形成されると共に、各セル１１Ａ及び１１Ｂ間には微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路１２が貫通形成されて、各セル１１Ａ及び１１Ｂ同士が連通されている。
【００１６】
したがって、誘導路１２は、その底面が倒立顕微鏡４のカバーガラスとなる光学平面で形成されると共に、その途中には、微生物が浮遊しない媒質液を貯留するバッファセル１１Ｃがその上面を開口して形成され、これにより、誘導路１２が、第一セル１１Ａとバッファセル１１Ｃとを連通する第一の誘導路１２ａと、バッファセル１１Ｃと第二セル１１Ｂとを連通する第二の誘導路１２ｂとから形成される。
【００１７】
そして、前記各セル１１Ａ〜１１Ｃは、プレート本体１０の表面に形成された媒質液注入口となる大径の凹部１３Ａ〜１３Ｃ内に形成され、各セル１１Ａ〜１１Ｃの上面開口部には、凹部１３Ａ〜１３Ｃの底面に摺接された状態で水平方向にスライドして開閉される蓋体１４Ａ〜１４Ｃが配されている。
この場合に、凹部１３Ａ〜１３Ｃと各蓋体１４Ａ〜１４Ｃが互いに接する面は、光の波長オーダーの隙間で摺接するように光学研磨されている。これにより、蓋体１４Ａ〜１４Ｃをスライドさせても、誘導路１２内に流れを作らずに各セルを開閉することができる。
なお、大腸菌を分離するセルプレート２において、各凹部１３Ａ〜１３Ｃは直径９ｍｍ×深さ２ｍｍ程度、各セル１１Ａ〜１１Ｃは直径２ｍｍ×深さ１.８ｍｍ程度、セル１１Ａ，１１Ｃ間及びセル１１Ｃ，１１Ｂ間を連通する誘導路１２ａ及び１２ｂの長さは夫々約９ｍｍ程度、誘導路１２ａ，１２ｂの断面は縦横各０.１ｍｍ程度に形成されている。
【００１８】
倒立顕微鏡４は、ステージ移動装置１５によりＸ−Ｙ方向に移動可能に配設されたステージ５の下方に対物レンズ１６が配設されると共に、その光軸上にセルプレート２内を撮影するＣＣＤカメラ１７がセットされ、当該ＣＣＤカメラ１７で撮影された像がディスブレイ装置１８に表示される。
そして、前記レーザトラッピング手段７は、倒立型顕微鏡４の対物レンズ１６を透過するレーザ光により第一セル１１Ａ内の微生物３をトラップするようになされ、レーザ光源１９から出力されるレーザ光の光路中には、レーザ光の照射位置をＸ方向及びＹ方向に移動させるスキャニングミラー２０ｘ，２０ｙを有するスキャニング装置２１及びダイクロイックミラー２２が介装され、当該ダイクロイックミラー２２で反射された反射されたレーザ光が対物レンズ１６を透過し、第一セル１１Ａ内に集光されるように成されている。
なお、対物レンズ１６としては例えば倍率 100倍，ＮＡ＝1.30の液浸対物レンズが使用され、レーザ光源１９としては例えば半導体レーザが使用されている。
【００１９】
また、前記検体分離手段８では、前記レーザトラッピング手段７で特定の微生物３をトラップした状態で、ステージ移動装置１５によりセルプレート２を移動させたり、スキャニング装置２１によりレーザ光を走査することにより、当該微生物３を前記第一セル１１Ａから誘導路１２を通って第二セル１１Ｂに移動させて第一セル１１Ａ内の他の微生物から分離させるようになされている。
【００２０】
マイクロピペット６の検体吸引手段９は、例えば、弾性膜で形成されるダイアフラム等を変位させてピペット６内の容積を変化させることにより吸引／吐出したり、ピペット６内の温度を制御しその温度変化に基づく空気の体積変化を利用して吸引／吐出する等、任意の手段を採用することができる。
また、マイクロピペット６はロボットアーム（図示せず）の先端に取り付けられて、例えば培地を形成したマイクロプレート（図示せず）等との間を往復移動するように成され、吸引した微粒子や微生物を所定のマイクロプレート上に吐出するように成されている。
【００２１】
なお、３０は、マイクロマニピュレータ１を制御する制御装置であって、その入力側には、ＣＣＤカメラ１７，キーボード３１，マウス３２が接続され、その出力側には、ディスプレイ装置１８，レーザ光源１９の駆動装置３３，レーザスキャニング装置２１のドライバ３４，ステージ移動装置１５が接続されている。
【００２２】
以上が本発明装置の一例であって、次に、その作用について図３（ａ）〜（ｆ）を伴って説明する。
まず、セルプレート２をステージ５にセットし、図３（ａ）に示すように、微生物の存在しない清浄な媒質液を、第二セル１１Ｂが形成された凹部１３Ｂに注ぎ込み、蓋体１４Ｂが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ｂをスライドさせて第二セル１１Ｂの上面開口部を塞ぐ。なお、このとき、第二セル１１Ｂ内の媒質液は毛管現象により誘導路１２ｂ内を流れてバッファセル１１Ｃ内に流出する。
【００２３】
次いで、図３（ｂ）に示すように、微生物の存在しない清浄な媒質液を、バッファセル１１Ｃが形成された凹部１３Ｃに注ぎ込み、蓋体１４Ｃが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ｃをスライドさせてバッファセル１１Ｃの上面開口部を塞ぐ。なお、このとき、バッファセル１１Ｃ内の媒質液は毛管現象により誘導路１２ａ内を流れて第一セル１１Ａ内に流出する。
【００２４】
そして、図３（ｃ）に示すように、多数の微生物が分散浮遊する媒質液を、第一セル１１Ａが形成された凹部１３Ａに注ぎ込み、蓋体１４Ａが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ａをスライドさせて第一セル１１Ａの上面開口部を塞ぐ。
このとき、蓋体１４Ａと凹部１３Ａとの摺接面は光学研磨されているので、蓋体１４Ａをスライドすることによって、第一セル１１Ａ内の媒質液が誘導路１２ａ，１２ｂを通って、バッファセル１１Ｃや第二セル１１Ｂ内に流出することはない。
また、各セル１１Ａ〜１１Ｃの上面開口部は全て蓋体１４Ａ〜１４Ｃにより閉鎖されており、しかも各蓋体１４Ａ〜１４Ｃは媒質液に浸漬されているので、媒質液が蒸発したとしても、蓋体１４Ａ〜１４Ｃで塞がれた各セル１１Ａ〜１１Ｃの外側の凹部１３Ａ〜１３Ｃ内に貯留されている媒質液が蒸発することとなり、各セル１１Ａ〜１１Ｃ内にはその影響が及ばない。したがって、セル１１Ａ〜１１Ｃ内の媒質液は停止された状態に維持され、誘導路１２内に流れが形成されることもない。
【００２５】
この状態で、第一セル１１Ａ内をディスプレイ装置１４で観察しながら、任意の微生物３に対し、スキャニング装置２２によりレーザ光を照射すれば、図３（ｄ）に示すようにその位置で微生物３がトラップされる。
この状態で、図３（ｅ）に示すように、ステージ移動装置１５によりステージ５を移動させることにより、レーザ光でトラップした特定の微生物３を第一セル１１Ａから誘導路１２ａを通りバッファセル１１Ｃに移動し、さらに、誘導路１２ｂを通り第二セル１１Ｂまで移動する。
【００２６】
このとき、第一セル１１Ａと第二セル１１Ｂを連通する誘導路１２が、微生物の自由移動を阻止し得る程度に狭小に形成されているのて、第一セル１１Ａ内の他の微生物が誘導路１２を泳いで第二セル１１Ｂに達する確率は極めて低く、したがって、第二セル１１Ｂにはレーザ光でトラップした特別の微生物３のみが存在することになる。
【００２７】
また、本例では、誘導路１２の途中にバッファセル１１Ｃが形成されているので、万一、微生物が泳いで第一セル１１Ａから誘導路１２ａを通りバッファセル１１Ｃに達したとしても、再びバッファセル１１Ｃから誘導路１２ｂを通って第二セル１１Ｂに達することは皆無に等しく、したがって、第二セル１１Ｂ内には、レーザ光でトラップした特定の微生物３のみが存在し、他の微生物は存在しない。
【００２８】
そして最後に、図３（ｆ）に示すように、蓋体１４Ｂをスライドさせて第二セル１１Ｂの上面開口部を開放し、マイクロピペット６で第二セル１１Ｂ内の媒質液をすべて吸引すれば、その媒質液中にはレーザ光でトラップした微生物３しか存在しないので、マイクロピペット６として特に細いものを用いることなく、また、顕微鏡４で第二セル１１Ｂ内を確認することなく、一つの微生物を確実に吸引できる。
次いで、マイクロピペット６をロボットアーム（図示せず）などにより、培地を形成したマイクロプレート（図示せず）まで移動させて、マイクロプレート上に媒質液と共に微生物３を吐出する。これにより、例えば遺伝子操作した大腸菌を１個の菌から１００％の収率で純粋培養することがきる。
【００２９】
なお、バッファセル１１Ｃは、誘導路１２の途中に一つだけ形成する場合に限らず、必要に応じて任意の数だけ形成することができ、場合によっては、設けなくてもよい。
また、微小検体としては、大腸菌のような微生物に限らず、微粒子などであってもよい。
さらに、本例では、セルプレートに第一セル１１Ａと第二セル１１Ｂを一つずつ形成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、第二セル１１Ｂを複数形成して、夫々を誘導路１２を介して第一セル１１Ａと連通させるようにしてもよい。なお、この場合に、全ての第二セル１１Ｂに微生物の浮遊してない媒質液を注入して、夫々の上面開口部を蓋体１４Ｂで閉じた後、最後に、微生物の分散浮遊している媒質液を第一セル１１Ａに注入させて、その上面開口部を蓋体１４Ａで閉じればよい。
【００３０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、第一セルに貯留された媒質液に分散浮遊する多数の微小検体中の特定の微小検体にレーザ光を照射して当該微小検体をトラップし、次いで、これをトラップしたままの状態で、セルプレートを移動させたり、レーザ光を走査したりすることにより、当該微小検体を第一セルから誘導路を通って第二セルに強制的に移動させることにより、レーザ光によりトラップされた１つの個体のみを第二セルに移動させると、第二セル内には１つの微小検体しか存在しないので、この第二セル内の媒質液をマイクロピペットで吸引すれば、大腸菌のように動きの速い微生物でも、顕微鏡で確認することなく、これを１個だけ確実に分離して取り出すことができるという大変優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るマイクロマニピュレータ。
【図２】これに使用するセルプレート。
【図３】（ａ）〜（ｆ）は操作手順を示す説明図。
【符号の説明】
１・・・・・・・・・・マイクロマニピュレータ
２・・・・・・・・・・セルプレート
３・・・・・・・・・・特定の微生物 (微小検体)
６・・・・・・・・・・マイクロピペット
７・・・・・・・・・・レーザトラッピング手段
８・・・・・・・・・・分離手段
９・・・・・・・・・・吸引手段
１０・・・・・・・・・・プレート本体
１１Ａ・・・・・・・・・第一セル
１１Ｂ・・・・・・・・・第二セル
１１Ｃ・・・・・・・・・バッファセル
１２，１２ａ，１２ｂ・・誘導路
１３Ａ〜１３Ｃ・・・・・凹部
１４Ａ〜１４Ｃ・・・・・蓋体
【図１】
0003665681.tif 000002
【図２】
0003665681.tif 000003
【図３】
0003665681.tif 000004