(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢｅｎｖのポリペプチドの９〜１１個のアミノ酸を含んでなるＣＴＬ誘発ポリペプチドであって、下記の配列：
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；
を含んで成るＣＴＬ誘発ポリペプチド。
【請求項２】
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；
ＨＢｅｎｖ３３４−３４３（配列識別番号：１５）
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；または
ＨＢｅｎｖ３３５−３４４（配列識別番号：１６）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ；
である、請求項１記載のＣＴＬ誘発ポリペプチド。
【請求項３】
免疫原性リポタンパク質キャリヤーに接合された、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
リポソームを含んでなる製剤学的に許容されうる担体の中に懸濁された、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを有する宿主のＢ型肝炎感染症の処置または予防のための医薬組成物であって、医薬的に有効量のＣＴＬ誘発ポリペプチドを含んで成り、ここで前記ポリペプチドはＨＢｅｎｖのポリペプチドの８〜１３個のアミノ酸を含んでなるＣＴＬ誘発ポリペプチドであって、下記の配列：
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；
を含んで成る、医薬組成物。
【請求項６】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドが、
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；
ＨＢｅｎｖ３３４−３４３（配列識別番号：１５）
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；または
ＨＢｅｎｖ３３５−３４４（配列識別番号：１６）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ；
である、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
宿主が慢性Ｂ型肝炎の感染を有する、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドを予防的に投与する、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドをＨＢＶに対するＴヘルパーの応答を誘発する第２ペプチドとともに宿主に投与する、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドおよびＴヘルパー誘発ペプチドが連鎖されている、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプを有する宿主のＢ型肝炎感染症の処置または予防のための医薬組成物を製造する方法であって、医薬的に有効量のＣＴＬ誘発ポリペプチドを使用し、ここで前記ポリペプチドはＨＢｅｎｖのポリペプチドの８〜１３個のアミノ酸を含んでなるＣＴＬ誘発ポリペプチドであって、下記の配列：
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；
を含んで成る、方法。
【請求項１２】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドが、
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；
ＨＢｅｎｖ３３４−３４３（配列識別番号：１５）
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ；または
ＨＢｅｎｖ３３５−３４４（配列識別番号：１６）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ；
である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
宿主が急性Ｂ型肝炎の感染を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドを予防的に投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ＣＴＬ誘発ポリペプチドをＨＢＶに対するＴヘルパーの応答を誘発する第２ペプチドとともに宿主に投与する、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
ＣＴＬポリ誘発ペプチドおよびＴヘルパー誘発ペプチドが連鎖されている、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支持
米国政府は米国健康研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が授与した認可に従い本発明においてある種の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ウイルス、細胞内細菌および寄生体、および腫瘍細胞で感染した闘争細胞において必須の役割を演ずる。それらは直接の細胞障害性によりおよび他の免疫細胞、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、および他のＴ細胞に対する特異的および非特異的助けを提供することによってそれをなす。感染した細胞または腫瘍細胞はプロテアーゼを含む細胞内事象を通して抗原を処理する。処理された抗原は、細胞表面上でＨＬＡクラスＩ分子に結合したペプチドの形態で、ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターに提示される。ＭＨＣクラスＩ分子は、また、外因性ペプチドに結合しそしてそれらをＣＴＬに細胞内処理なしに提示することができる。
【０００３】
現在において、抗原性タンパク質の配列から、タンパク質が処理される方法およびペプチドのどの部分がＨＬＡクラスＩ分子と結合しそしてＣＴＬに提示されるかを予測することは困難である。結合のモチーフは、いくつかのＨＬＡクラスＩ分子について、これらの分子から溶離されたペプチドの配列分析に基づいて予測された（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０（１９９１））。さらに、処理されそしてＨＬＡクラスＩに実際に結合するペプチドのうちで、どれがＣＴＬ認識可能なエピトープを含有するかはまだ予測不可能である。
【０００４】
Ｂ型肝炎のウイルス（「ＨＢＶ」）は、現在世界中でほぼ２．５×１０８人の人々を感染している非溶解性ウイルスである。大人におけるＨＢＶ感染は、典型的には、大部分の場合において急性疾患に導き、そして大部分の患者において慢性疾患の状態に導く。この急性／慢性の比は、感染が出産時間に密接して起こるとき逆転する。慢性ＨＢＶ感染において肝細胞癌の出現率の増加が存在する。成人期においてＨＢＶで感染した個体の小さい百分率は、高い死亡率で強い免疫応答に関連する激症の肝炎を発生する。
【０００５】
ＨＢＶ感染のために有効な処置は存在しないが、ＨＢＶ感染を予防するワクチンが最近数年間に開発されてきている。ワクチンは慢性ＨＢＶ保菌者の血漿から精製されたＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を使用するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により生産されたＨＢｓＡｇを使用する。また、合成ＨＢｓＡｇペプチドに基づくワクチンが提案された。参照、例えば、米国特許第４，５５９，２３０号および米国特許第４，５９９，２３１号。しかしながら、抗ＨＢｓＡｇワクチンは免疫化個体のわずかに約９０％において保護を与える。免疫化されないか、あるいは免疫化されたが、保護されない個体は潜在的感染の有意な貯蔵所を提供する。
【０００６】
ＨＢＶ抗原に対する免疫性へのＣＴＬの寄与は評価することは困難であった。Ｃｈｉｓａｒｉら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ．６：３１（１９８９））は、ＨＢＶエンコーデ化抗原に対するＨＬＡ−クラスＩ制限、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の応答により仲介されることができる。クラスＩの主要な組織適合性（ＭＨＣ）制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答は、種々の他のウイルス、例えば、インフルエンザウイルスについて同定された。例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ  ４４：９５９（１９８６）は、細胞障害性Ｔリンパ球により認識されるインフルエンザウイルスの核タンパク質のエピトープを合成ペプチドにより定めることができることを報告した。ＨＢＶに対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を定めることを試みるとき、急性および慢性ＨＢＶの患者からの末梢血液のリンパ球は生体外でオートロガス肝細胞を殺すことができるが、細胞溶解性の特異性、そのＨＬＡ制限要素、および細胞の表現型は確立されなかった。参照、Ｍｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２７７３（１９８２）およびＭｏｎｄｅｌｌｉら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３３１（１９８７）。Ｍｏｒｉｙａｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：３６１−３６４（１９９０）は、ＨＢＶの主要なエンベロープ抗原が肝細胞表面において、エンベロープ特異的抗原によりおよびＭＨＣクラスＩ制限、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球により認識可能な形態で発現されることを報告した。
【０００７】
ＨＢＶで慢性的に感染した個体の大きい貯蔵所が存在するので、適当なＨＢＶ抗原に対して応答するこれらの個体の免疫応答を刺激し、これによりそれらの感染を排除することが望ましいであろう。また、急性期の感染に悩まされる個体における慢性ＨＢＶ感染に対する進化を防止することが望ましいであろう。さらに、現在承認されたＨＢＶワクチンは免疫化個体の抗体１０％において保護の免疫性を誘発しないので、例えば、ワクチンの免疫原性を増加または多様化することによって、いっそう有効な免疫性を誘発することが望ましいであろう。非常に驚くべきことには、本発明はこれらおよび他の関係する要求を満足する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、ＨＢＶ抗原に対するＭＨＣクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発するペプチドを提供する。問題のペプチドはＨＢＶエンベロープから誘導される。ある種の態様において、ＣＴＬ誘発ペプチドは、配列ＨＢｅｎｖ１８３−１９１  Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ（配列識別番号：１）；ＨＢｅｎｖ２４８−２５７  Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列識別番号：３）；ＨＢｅｎｖ２４９−２５７  Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列識別番号：４）；ＨＢｅｎｖ２４９−２５８  Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列識別番号：５）；ＨＢｅｎｖ２５０−２５８  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列識別番号：６）；ＨＢｅｎｖ２５１−２５９  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ（配列識別番号：７）；ＨＢｅｎｖ２５１−２６０  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ（配列識別番号：８）；ＨＢｅｎｖ２６０−２６９  Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列識別番号：９）；ＨＢｅｎｖ３３５−３４３  Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列識別番号：１０）；ＨＢｅｎｖ１５２−１６１  Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列識別番号：１１）；ＨＢｅｎｖ１７７−１８５  Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列識別番号：１２）；ＨＢｅｎｖ２０４−２１２  Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ（配列識別番号：１３）；またはＨＢｅｎｖ３７０−３７９  Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列識別番号：１４）を有する；か、あるいは前述の配列の１つに対して実質的に相同の配列を有するであろう。ペプチドは必要に応じてＮ−末端またはＣ−末端の一方または両方においてフランキングおよび／または修飾されることができる。その生物学的活性に実質的に悪影響を及ぼさないで、選択したペプチド内の非決定的残基において、保存的置換、欠失および付加をなすことができる。
【０００９】
種々のペプチドの態様において、ペプチドを各々それ自体に対して重合してより大きいホモポリマーを形成するか、あるいは異なるペプチドと重合してヘテロポリマーを形成することができることが理解されるであろう。ある場合において、ペプチドは組成物中で混合物として組み合わせられ、そして連鎖されないであろう。ペプチドは、また、Ｔリンパ球の応答を増強することができる脂質含有分子に接合するか、あるいは、例えば、Ｔヘルパー細胞の応答を誘発する異なるペプチドに接合することができる。
【００１０】
追加のペプチド、リポソーム、アジュバントおよび／または製剤学的に許容されうる担体と配合された本発明のペプチドからなる組成物が提供される。こうして、医薬組成物は、とくに感染が慢性または保菌の状態に進行するのを防止する努力において、急性ＨＢＶ感染を処置する方法において使用できる。慢性ＨＢＶ感染およびＨＢＶの保菌状態を処置する方法が、また、提供され、ここで医薬組成物を感染した個体にＨＢｃエピトープに対する免疫原的に有効な細胞障害性Ｔ細胞の応答を刺激するために十分な量で投与する。これらの感染を処置するために、ＨＢＶ抗原に対するＭＨＣクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発するペプチドを他のＨＢＶ抗原、例えば、ＨＢＶコアに対する免疫応答を誘発するその他のペプチドまたはタンパク質と組み合わせることが望ましい。慢性または保菌状態の感染を有する個体を処置するために、組成物を反復した投与で、必要に応じて、延長した期間にわたって投与して、ウイルスの感染および／または脱落を解決または緩和する。
【００１１】
ＨＢＶ感染、とくに慢性ＨＢＶ感染を予防するワクチン組成物が、また、提供される。ワクチン組成物は、免疫原的に有効量のＭＨＣクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発する前述のＨＢＶエンベロープペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２を含み、そして典型的にはさらにアジュバント、例えば、不完全フロインドアジュバントまたは水酸化アルミニウムを含むであろう。ＨＢＶに対する高められた防御を達成せしめるため、このワクチンはＨＢＶエンベロープ抗原に対する防御的抗体応答を誘発する成分を更に含んで成りうる。
【００１２】
なお他の態様において、本発明は診断法に関し、ここで本発明のペプチドを使用して、個体におけるＨＢＶエピトープ抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞の応答が可能であるリンパ球の存在を決定する。このような細胞の不存在は、問題の個体が慢性ＨＢＶ感染を発生することに対して感受性であるかどうかを決定する。典型的には、リンパ球は末梢血リンパ球であり、そして問題の個体は急性ＨＢＶ感染に悩まされる。
特定の態様の説明
本発明は、ＨＢＶ感染の処置、予防および診断のための組成物および方法において使用するＨＢＶエンベロープペプチドから誘導されたペプチドを提供する。これらのペプチドはＨＢＶ感染細胞に対するＭＨＣクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激する。刺激された細胞障害性Ｔリンパ球は感染細胞を殺すか、あるいはウイルスの複製を阻害し、こうして、慢性ＨＢＶ感染を包含する感染を妨害するか、あるいは実質的に予防することができる。細胞障害性Ｔ細胞の応答を誘発するとき有効であるペプチドは、また、Ｔ−ヘルパーの応答を誘発できる免疫原と組み合わせることができる。
【００１３】
本発明においてを使用するペプチドは、ＨＢｅｎｖ１８３−１９１（配列識別番号：１）、ＨＢｅｎｖ２４８−２６０（配列識別番号：２）、ＨＢｅｎｖ２６０−２６９（配列識別番号：９）、ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）、ＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）、ＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）、ＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１３）、およびＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）の領域から誘導され、ここで番号はＧａｌｉｂｅｒｔら、前掲、に従う。
【００１４】
本発明の「ペプチド」または「オリゴペプチド」を誘発するＨＢＶ細胞障害性Ｔリンパ球とは、ＨＢｃ配列から誘導された、少なくとも４つのＨＢＶアミノ酸配列の残基、好ましくは少なくとも６、より好ましくは８または９、時には１０〜１２残基、そして通常約５０より少ない残基、より通常抗体３５より少ない、好ましくは２５より少ない、例えば、８〜１７アミノ酸残基の鎖を意味する。細胞表面上のＭＨＣクラスＩの分子に結合した内因的に処理されたウイルスのペプチドと大きさが釣り合った、８〜１２アミノ酸残基の長さに本発明のペプチドを最適化することが望ましいことがある。参照、一般に、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：７０３−７０６（１９９１）；Ｖａｎ  Ｂｌｅｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：２１３−２１６（１９９０）；Ｒｏｔｚｓｃｈｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：２５２−２５４（１９９０）；およびＦａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−２９６（１９９１）、これらをここに引用によって加える。いっそう詳細に後述するように、通常ペプチドはここにおいて識別するＨＢＶ配列の隣接する残基の対応する部分に対して相同であり、そしてＣＴＬ誘発エピトープを含有するアミノ酸の少なくとも主要部分を有する。
【００１５】
ペプチドは、後述するように、「合成的に」に、あるいは換えＤＮＡ技術により製造することができる。ペプチドは好ましくは他の天然に見出されるＨＢＶタンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様においてペプチドは天然の断片またはペプチドに合成的に接合することができる。用語ペプチドはこの明細書においてポリペプチドと互換的に使用して、隣接するアミノ酸のアルファ−アミノ基とアルファ−カルボキシ基との間でペプチド結合により互いに接続した１系列のアミノ酸を表示するために使用する。ポリペプチドまたはペプチドは、種々の長さであり、それらの中性（非帯電）の形態であるか、あるいは塩である形態であることができ、そして修飾、例えば、グリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化を含まないか、あるいはこれらの修飾を含有することができ、修飾がここに記載するようにポリペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に暴露することができる。
【００１６】
望ましくは、ペプチドは大きいペプチドの生物学的活性の実質的にすべてをなお維持しながら、できだけ小さくされるであろう。生物学的活性とは、適当なＭＨＣ分子を結合しそしてＨＢＶ抗原または抗原模倣体に対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発する能力を意味する。細胞障害性Ｔリンパ球の応答とは、問題のＨＢＶ抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答を意味し、ここでＣＤ８＋、ＭＨＣクラスＩ制限Ｔリンパ球が活性化される。活性化されたＴリンパ球は、リンホカイン（例えば、ガンマインターフェロン）を分泌し、細胞を殺すか、あるいは殺さないで、感染したオートロガス細胞またはトランスフェクションされた細胞におけるウイルスの複製を阻害する生産物（例えば、セリンエステラーゼ）を遊離する。
【００１７】
用語「相同」、「実質的に相同」、および「実質的な相同性」は、ここにおいて使用するとき、１つの配列がアミノ酸の参照配列と比較して少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸の配列を意味する。配列の同一性または相同性の百分率は、参照配列の対応する部分に対して整列させたとき、互いに比較することによって計算される。
【００１８】
ヌクレオカプシド領域からの本発明のＣＴＬ誘発ＨＢＶペプチドの態様は、６〜３５アミノ酸からなり、そしてペプチド領域ＨＢｅｎｖ１８３−１９１（配列識別番号：１）からの少なくとも１つのＨＬＡ制限ＣＴＬエピトープ部位を含有する。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるＨＢｅｎｖ１８３−１９１領域の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ１８３−１９１は配列：
ＨＢｅｎｖ１８３−１９１（配列識別番号：１）
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ
を有する。このＨＢｅｎｖ１８３−１９１領域のペプチドの態様は、さらにここに記載するように、必要に応じて、Ｎ−末端およびＣ−末端の一方または両方において、ＨＢｃを包含するＨＢＶ配列からのアミノ酸、連鎖、他のＮ−末端およびＣ−末端の修飾を促進するために付加したアミノ酸によりフランキングおよび／または修飾し、担体に連鎖することができる。ペプチドＨＢｅｎｖ１８３−１９１は、少なくともＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２により仲介される細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発する。
【００１９】
本発明の他のＨＢｅｎｖペプチドの態様は、ＨＢｅｎｖ２４８−２６０の領域から製造される。この領域から誘導されたペプチドは少なくとも１つのＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの部位を含有し、そして典型的には少なくとも７アミノ酸、より通常９、１０または１１アミノ酸またはそれ以上であろう。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるＨＢｅｎｖ２４８−２６０領域の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ２４８−２６０は配列：
ＨＢｅｎｖ２４８−２６０（配列識別番号：２）
Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
を有する。
【００２０】
ＨＢｅｎｖ２４８−２６０領域からのペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００２１】
ＨＢｅｎｖ２４８−２６０の領域から製造される代表的なＣＴＬ誘発ペプチドは、次の９マーまたは１０マーのペプチドを包含する。
【００２２】
ＨＢｅｎｖ２４８−２５７（配列識別番号：３）
Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ；
ＨＢｅｎｖ２４９−２５７（配列識別番号：４）
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ；
ＨＢｅｎｖ２４９−２５８（配列識別番号：５）
Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ；
ＨＢｅｎｖ２５０−２５８（配列識別番号：６）
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ；
ＨＢｅｎｖ２５１−２５９（配列識別番号：７）
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ；
ＨＢｅｎｖ２５１−２６０（配列識別番号：８）
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ。
【００２３】
上のペプチドはＨＬＡ制限ＣＴＬ誘発エピトープを含有し、典型的には少なくともＨＬＡ−Ａ２制限されており、そして上のペプチドＩについて前述したように一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００２４】
他の態様において、本発明のペプチドは１０マーのＨＢｅｎｖ２６０−２６９、および少なくとも７の隣接するアミノ酸のＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの１または２以上の部位を含有するＨＢｅｎｖ２６０−２６９から誘導されたペプチドからなる。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるＨＢｅｎｖ２６０−２６９配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ２６０−２６９は配列：
ＨＢｅｎｖ２６０−２６９（配列識別番号：９）
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
を有する。
【００２５】
この領域から製造されたペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。ペプチドＨＢｅｎｖ２６０−２６９（配列識別番号：４）は、少なくともＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ２分子により仲介される細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発する。
【００２６】
本発明のなお他のＣＴＬ誘発ペプチドはＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）の領域からであり、そして少なくとも７つの隣接するアミノ酸の１または２以上のＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの部位を含有するＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるＨＢｅｎｖ３３５−３４３配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ３３５−３４３は配列：
ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００２７】
本発明のなお他のＣＴＬ誘発ペプチドはＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）の領域からであり、そして少なくとも７つの隣接するアミノ酸の１または２以上のＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの部位を含有するＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるＨＢｅｎｖ１５２−１６１配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ１５２−１６１は配列（ａｄｗサブタイプ）：
ＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００２８】
本発明の他のＣＴＬ誘発ペプチドはＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）の領域からであり、そして少なくとも７つの隣接するアミノ酸の１または２以上のＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの部位を含有するＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるＨＢｅｎｖ１７７−１８５配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ１７７−１８５は配列（ａｄｗサブタイプ）：
ＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００２９】
本発明の追加のＣＴＬ誘発ペプチドはＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１３）の領域からであり、そして少なくとも７つの隣接するアミノ酸の１または２以上のＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの部位を含有するＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１３）から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるＨＢｅｎｖ２０４−２１２配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ２０４−２１２は配列（ａｄｗサブタイプ）：
ＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１３）
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００３０】
本発明の追加のＣＴＬ誘発ペプチドはＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）の領域からであり、そして少なくとも７つの隣接するアミノ酸の１または２以上のＣＴＬ誘発ＨＬＡＣ−１制限エピトープの部位を含有するＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるＨＢｅｎｖ３７０−３７９配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでＨＢｅｎｖ３７０−３７９は配列（ａｄｗサブタイプ）：
ＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび／または修飾することができる。
【００３１】
前述したように、担体、支持体またはより大きいペプチドへのカップリングのために、ここに記載する理由で、あるいはペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質の変更などのために、追加のアミノ酸をオリゴペプチドまたはペプチドの末端に付加して、互いとの連鎖を容易にすることができる。アミノ酸、例えば、チロシン、システイン、リジン、グルタミンまたはアスパラギン酸などをペプチドまたはオリゴペプチドのＣ−末端またはＮ−末端に導入することができる。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチドの配列は、末端のＮＨ２のアシル化、例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸のアミド化、末端のカルボキシのアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどにより修飾することによって、天然の配列と異なるようにすることができる。ある場合において、これらの修飾は支持体または他の分子への連鎖のための部位を提供することができる。
【００３２】
理解されるように、本発明のＨＢＶペプチドまたは細胞障害性Ｔリンパ球刺激活性を有するそれらの類似体を必要に応じて修飾して、ある種の他の所望の属性、例えば、改良された薬理学的特性を提供するすると同時に、非修飾ペプチドの生物学的活性を増加するか、あるいは少なくとも実質的に保持することができる。例えば、ペプチドは、例えば、ここにおいて開示する配列から誘導されたペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、または両方へのアミノ酸の付加または欠失により、ペプチド配列中のアミノ酸の延長、減少または置換により修飾することができる。ペプチドを修飾してＣＴＬ誘発活性を実質的に増強し、こうして修飾されたペプチド類似体が野生型配列のペプチドより大きいＣＴＬ活性を有するようにすることができる。例えば、とくにＮ−末端の第２残基が疎水性でありそしてＨＬＡ制限分子への結合において関係がある場合、ペプチドのＮ−末端の疎水性を増加することが望ましいことがある。Ｎ−末端における疎水性を増加することによって、Ｔ細胞への提示効率を増加することができる。他の疾患に関連する抗原、とくに宿主が有意のＣＴＬ活性をもたないことがあるＣＴＬ誘発エピトープを含有するものから製造されたペプチドは、第２残基が通常疎水性であるペプチドのＮ−末端における疎水性残基を置換することによってＣＴＬ誘発性とすることができる。
【００３３】
本発明において使用するペプチドは、主題の化合物がＨＢＶの４つの主要なサブタイプに対する細胞障害性Ｔリンパ球の活性を提供することができるかぎり、ＨＢｅｎｖ１８３−１９１（配列識別番号：１）、ＨＢｅｎｖ２４８−２５７（配列識別番号：３）、ＨＢｅｎｖ２４９−２５７（配列識別番号：４）、ＨＢｅｎｖ２４９−２５８（配列識別番号：５）、ＨＢｅｎｖ２５０−２５８（配列識別番号：６）、ＨＢｅｎｖ２５１−２５９（配列識別番号：７）、ＨＢｅｎｖ２５１−２６０（配列識別番号：８）、ＨＢｅｎｖ２６０−２６９（配列識別番号：９）、ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）、ＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）、ＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）、ＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１３）、またはＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）と同一である必要はない。ＨＢＶの異なる株が存在するが、それらの各々は、「ａ」と表示される、少なくとも１つの共通のエンベロープの決定基を共有する。各株は、また、２つのエンベロープの決定基を有し、それらの１つは「ｄ」または「ｙ」であり、そして第２は「ｗ」または「ｒ」である。こうして、ウイルスの４つの可能なサブタイプが存在する：ａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒ、およびａｙｒ。ＨＢＶのクローニング、配列決定および発現は英国特許（ＧＢ）第２０３４３２３号、欧州特許（ＥＰ）第１３８２８号、米国特許第４，９３５，２３５号に記載されており、そしてＨＢＶエンベロープ領域の完全な配列は、また、Ｇａｌｉｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：６４６（１９７９）に記載されており、それらの各々をここに引用によって加える。アミノ酸配列は遺伝子バンク−７２データベースの中に２０の異なるＨＢＶ株について記載されており、７のａｄｗサブタイプ、５のａｙｗサブタイプ、７のａｄｒサブタイプ、および１株のａｙｒサブタイプを包含し、遺伝子バンクの配列をまたここに引用によって加える。
【００３４】
したがって、ペプチドを種々の変化、例えば、挿入、欠失、および置換に、保存的または非保存的に、付すことができ、ここでこのような変化はそれらの使用においてある種の利点を提供する。保存的置換とは、アミノ酸残基を生物学的および／または化学的に類似する他のもの、例えば、他について１つの疎水性残基、あるいは他について１つの極性残基と置換することを意味する。置換基は組み合わせ、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒを包含する。通常、ＨＢＶ細胞障害性Ｔリンパ球刺激エピトープを実質的に模擬することを意図する配列の部分は、ＨＢＶの少なくとも１つのサブタイプの配列と約２０％より多くは異ならないが、ただし例えば、連鎖またはカップリングを容易にするなどのために、ペプチドの物理的または化学的性質を変更する目的で、追加のアミノ酸をいずれかの末端に付加することができる。ペプチドの配列の領域がＨＢＶのサブタイプの間で多形性であることが発見された場合、１または２以上の特定のアミノ酸を変化させて異なるＨＢＶ株またはサブタイプの異なる細胞障害性Ｔリンパ球のエピトープをいっそう効率よく模擬することが望ましいことがある。
【００３５】
上に列挙した代表的なペプチドを包含する、本発明により識別されたペプチドの配列内に、ペプチドがそれらの生物学的活性、すなわち、ＨＢＶ感染細胞またはＨＢＶ抗原を発現する細胞に対するクラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激する能力を保持させる残基（または実質的に機能的に同等なもの）が存在する。これらの残基は単一のアミノ酸の置換、欠失、または挿入により同定することができる。さらに、残基の側鎖によりなされる寄与は、特定のアミノ酸（例えば、Ａｌａ）を使用する系統的走査によりプロービングすることができる。多数の置換に耐えるペプチドは、一般に、このような置換、例えば、小さい、比較的中性の分子、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または同様な残基を取り込んでいる。置換、付加または減法が可能である残基の数または種類は必須のエピトープの点の間の必要な間隔および探求するコンフォメーションおよび機能の属性（例えば、疎水性／親水性）に依存するであろう。必要に応じて、細胞障害性Ｔリンパ球に対して提示するためのそのＭＨＣ分子へのペプチド類似体の結合アフィニティーの増加は、また、このような変更により達成することができる。一般に、エピトープおよび／またはコンフォメーション的に重要な残基の間のスペーサーの置換、付加または欠失は、結合を崩壊するであろう立体的または電荷の妨害を回避するように選択されたアミノ酸または部分を使用するであろう。
【００３６】
多数の置換に耐えると同時に所望の生物学的活性を保持するペプチドは、また、Ｄ−アミノ酸含有ペプチドとして合成することができる。このようなペプチドは「インバーソ（ｉｎｖｅｒｓｏ）」または「レトロ−インバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」の形態として、すなわち、配列のＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸と置換するか、あるいはアミノ酸の配列を逆転しそしてＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸と置換することによって合成することができる。Ｄ−ペプチドはペプチダーゼに対して実質的にいっそう耐性であり、したがってそれらのＬ−ペプチドと比較して血清および組織においていっそう安定であるので、生理学的条件下のＤ−ペプチドの安定性は対応するＬ−ペプチドと比較してアフィニティーの差の補償を越えたことをすることができる。さらに、置換基を含むか、あるいは含まないＬ−アミノ酸含有ペプチドをＤ−アミノ酸でキャップして、抗原性ペプチドのエキソペプチダーゼを破壊を阻止することができる。
【００３７】
ここに記載する例示的ペプチドに加えて、本発明はＨＢＶに対するＭＨＣ制限細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発することができる前記ペプチド領域に関連する他のエピトープ領域を同定する方法を提供する。この方法は、感染したまたは未感染の個体から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を獲得し、そしてＨＢｅｎｖ１８３−１９１（配列識別番号：１）、ＨＢｅｎｖ２４８−２６０（配列識別番号：２）、ＨＢｅｎｖ２６０−２６９（配列識別番号：９）、ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）、ＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）、ＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）、ＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１３）、またはＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）のペプチドから誘導された合成ペプチドまたはポリペプチド断片で細胞を暴露（刺激）することからなる。各々が典型的には約８〜２０残基長さ、好ましくは９〜１２残基の、オーバーラップする合成ペプチドのプールをを使用して細胞を刺激することができる。細胞障害性Ｔリンパ球の活性を誘発する活性残基をプールから選択することができる。特定の細胞障害活性を誘発するペプチドの能力は、刺激したＰＢＬをそのＨＢＶサブゲノムの断片で感染またはトランスフェクションしたオートロガス標識化（例えば、51Ｃｒ）標的細胞（例えば、ＨＬＡ合致マクロファージ、Ｔ細胞、線維芽またはＢリンパ芽球細胞）とインキュベーションし、こうしてターゲッテッド抗原を細胞で内因的に合成し（あるいは細胞を問題のペプチドでパルスし）、そして標識の特定の解放を測定することによって決定する。
【００３８】
細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激するエピトープ領域を有するペプチドがいったん同定されると、応答のＭＨＣ制限要素を決定することができる。これは刺激したＰＢＬまたはその短期間の系統を問題のペプチドまたは適当な対照でパルスした既知のＨＬＡ型の（標識化）標的細胞のパネルとインキュベーションすることを包含する。ＣＴＬにより溶解されるパネルにおける細胞の１または２以上のＨＬＡアレルを溶解しない細胞と比較し、そして問題の抗原に対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答のための１または２以上のＨＬＡ制限要素を同定する。
【００３９】
Ｃａｒｂｏｎｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１７６７（１９８８）は、ペプチドによる刺激が対応する内因性タンパク質に対する低いアフィニティーで細胞障害性Ｔリンパ球を誘発でき、こうしてそれぞれのペプチドの刺激がペプチドを認識するが、天然の抗原ではない細胞障害性Ｔリンパ球を生ずることができることを報告した。刺激された細胞障害性Ｔリンパ球が天然のＨＢＶペプチドを認識できないことはＨＢＶペプチドの治療剤およびワクチン組成物の開発において望ましくないので、この潜在的制限を回避する方法を使用する。細胞障害性Ｔ細胞の順次の再刺激を本発明において使用して、合成ペプチドについてより高いアフィニティーを天然に処理された抗原についてを有するＴ細胞を同定しそして選択する。活性化したＰＢＬを再刺激することによって、短期間の細胞障害性Ｔリンパ球の系統を確立する。ペプチドで刺激された細胞をペプチドおよび組換え体または天然のＨＢＶ抗原、例えば、ＨＢｓＡｇで再刺激する。活性を有する細胞を、また、適当なＴ細胞のマイトジェン、例えば、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で刺激する。再刺激された細胞は、Ｔ細胞ヘルプ、およびＨＢＶ抗原の抗原非特異性源として照射された同種異系のＰＢＬを有する。天然のＨＢＶ抗原を認識する細胞障害性Ｔリンパ球の集団を選択的に拡張しかつ長期間の系統を確立するために、患者からのＰＢＬをまずペプチドおよび組換え体または天然のＨＢＶ抗原で刺激し、次いで対応するＨＢＶ抗原のポリペプチドを安定に発現するＨＬＡ合致Ｂリンパ芽球細胞で再刺激する。オートロガスおよび同種異系のＢリンパ芽球あるいは適当な抗原でトランスフェクションまたは感染させた他の細胞を使用して、内因的に合成された抗原を認識する能力について細胞系を再確証する。
【００４０】
１または２以上の患者またはＨＬＡ型において細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発することに寄与する本発明の異なるペプチドが同定されると、ある場合において組成物中で２またはそれ以上のペプチドを接合することが望ましいことがある。組成物中のペプチドは同一であるか、あるいは異なることができ、そして一緒になってそれらは患者の１または２以上のペプチドと同等であるか、あるいはそれらより大きい生物学的活性を提供すべきである。例えば、ここに記載する方法を使用して、２またはそれ以上のペプチドは特定の領域、例えば、ＨＢｅｎｖ２４８−２５７（配列識別番号：３）、ＨＢｅｎｖ２４９−２５７（配列識別番号：４）、ＨＢｅｎｖ２４９−２５８（配列識別番号：５）、ＨＢｅｎｖ２５０−２５８（配列識別番号：６）、ＨＢｅｎｖ２５１−２５９（配列識別番号：７）、および／またはＨＢｅｎｖ２５１−２６０（配列識別番号：８）ペプチドからの異なるか、あるいはオーバーラップする細胞障害性Ｔリンパ球のエピトープを定めることができ、これらのペプチドを「カクテル」で組み合わせて細胞障害性Ｔリンパ球の応答について増強された免疫原性を提供することができる。そのうえ、とくに第２または引き続くペプチドが最初のものと異なるＭＨＣ制限要素を有するとき、１つの領域のペプチドを、同一であるか、あるいは異なるＨＢＶタンパク質からの、他のＨＢＶ領域のペプチドと組み合わせることができる。他のＣＴＬ誘発ＨＢＶペプチドは同時継続米国出願第０７／９３５，８９８号に記載されており、これをここに引用によって加える。ペプチドのこの組成物は、多様な集団の間で本発明の治療、ワクチンまたは診断の方法および組成物により提供される免疫学的適用範囲を効果的に広げるために使用することができる。例えば、優勢な民族（コーカーサス人、アジア人およびアフリカの黒人）の間のＨＬＡアレレの異なる頻度を下表Ｉに示す。本発明の治療またはワクチンの組成物を配合して、集団の出来るだけ高い百分率に可能性治療または免疫性を提供することができる。
【００４１】
【表１】
0003616390.tif 000002
【００４２】
略語：ＥＵＣ、ヨーロッパ人のコーカーサス人；ＮＡＣ、北アフリカのコーカーサス人；      ＡＦＲ、アフリカの黒人；ＪＰＮ、日本人。
【００４３】
＊Ａ２８は２つのアレルＡｗ６８及びＡｗ６９を表す。
【００４４】
本発明のペプチドは連鎖を介して組み合わせてポリマー（マルチマー）を形成するか、あるいは連鎖なしに、混合物として、組成物中で配合することができる。同一ペプチドをそれ自体に連鎖し、これによりホモポリマーを形成する場合、複数の反復するエピトープ単位が提示される。ペプチドが異なる場合、例えば、カクテルが異なるＨＢＶサブタイプを表す場合、あるサブタイプ内で異なるエピトープ、異なるＨＬＡ制限特異性、Ｔヘルパーエピトープを含有するペプチド、反復する単位をもつヘテロポリマーが提供される。共有結合に加えて、分子間または構造内の結合を形成できる非共有結合の連鎖が含められる。
【００４５】
ホモポリマーまたはヘテロポリマーのための、あるいは担体へのカップリングのための連鎖は種々の方法で得ることができる。例えば、システイン残基をアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に付加することができ、ここでペプチドはシステイン残基のコントロールされた酸化を経て共有結合される。また、一方の官能基末端においてジサルファイド連鎖および他方においてペプチド連鎖を発生する多数のヘテロ官能剤、例えば、Ｎ−スクシジイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は有用である。この試薬は、それ自体および一方のタンパク質中のシステイン残基および他方におけるリジン上のアミノまたは他の遊離アミノ基を通してアミド連鎖の間でジサルファイド連鎖をつくる。種々のこのようなジサルファイド／アミド形成剤は既知である。参照、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１８５（１９８２）、これをここに引用によって加える。他の２官能性カップリング剤はジサルファイド連鎖よりむしろチオエーテルを形成する。それらのチオエーテル形成剤の多くは商業的に入手可能であり、そして６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルなどを包含する。カルボキシル基はそれらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせることによって活性化することができる。特定の好ましいカップリング剤は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）である。理解されるように、連鎖は記載するように、例えば、ＨＢＶ細胞障害性Ｔ細胞の決定基、ペプチド類似体，またはＴヘルパー決定基として機能する連鎖した基のいずれをも実質的に妨害すべきではない。
【００４６】
他の面において、本発明のペプチドはＨＢＶＴ−ヘルパー細胞のエピトープ、例えば、ＨＢＶへの細胞障害性Ｔ細胞の誘発において共同するＴ細胞を刺激するエピトープを提示する他のペプチドと組み合わせるか、あるいはカップリングすることができる。Ｔ−ヘルパー細胞は、例えば、Ｔ−ヘルパー１またはＴ−ヘルパー２表現型であることができる。ＨＢＶ配列からのＴ−ヘルパーのエピトープは、配列：Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（配列識別番号：１７）を有する、ＨＢｃ１−２０において同定された。他のＴ−ヘルパーのエピトープは、配列Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列識別番号：１８）を有する、領域ＨＢｃ５０−６０から、および配列Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列識別番号：１９）（ここでＩｌｅ116 はＨＢＶのａｄｗサブタイプにおけるＬｅｕである）を有するＨＢｃ１００−１１９、配列Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列識別番号：２０）を有するＨＢｃ１１７−１３１、および配列Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列識別番号：２１）を有するペプチドＨＢｃ１２０−１３９を包含する、ＨＢｃ１００−１３９の領域からのペプチドにより提供された。参照、Ｆｅｒｒａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：２１４−２２２（１９９１）、および米国特許第４，８８２，１４５号、各々をここに引用によって加える。
【００４７】
本発明のペプチドは広範な種類の方法で製造することができる。比較的短い長さを有するために、ペプチドは普通の技術に従い溶液中で、あるいは固体の支持体上で合成することができる。種々の自動合成装置は商業的に入手可能であり、そして既知のプロトコールに従い使用することができる。参照、例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）；Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：３４１−３４７（１９８６）；およびＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ．１−２８４（１９７９）、それらの各々をここに引用によって加える。
【００４８】
あるいは、組換えＤＮＡ技術を使用することができ、ここで問題のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主細胞の中に形質転換またはトランスフェクションし、そして発現のために適当な条件下に培養する。これらの手順は、例えば、一般に次の文献に記載されているように、一般にこの分野において知られている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８２）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９８７）、および米国特許第４，２３７，２２４号、米国特許第４，２７３，８７５号、米国特許第４，４３１，７３９号、米国特許第４，３６３，８７７号および米国特許第４，４２８，９４１号、それらの開示をここに引用によって加える。こうして、本発明の１または２以上のペプチド配列からなる融合タンパク質を使用してＨＢＶ細胞障害性Ｔリンパ球の決定基を提示することができる。例えば、細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激するためにここに記載するペプチド領域のエピトープをいっそう効果的に提示するように組換えＨＢｅｎｖアミノ酸配列が変更された、本発明の組換えエピトープのタンパク質が製造される。この手段により、いくつかのＴ細胞のエピトープを取り込んだポリペプチドを使用する。
【００４９】
ここにおける考えられる長さのペプチドのためのコーディング配列は化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法により合成することができるので、天然のペプチド配列をエンコードするものについて１または２以上の適当な塩基を単に置換することによって、修飾を行うことができる。次いでコーディング配列を適当なリンカーで準備し、そして普通にこの分野において入手可能な発現ベクターの中に結合し、そしてそれらのベクターを使用して適当に宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を生成することができる。ある数のこのようなベクターおよび適当に宿主系は現在入手可能である。融合タンパク質の発現のために、コーディング配列は作用可能に連鎖された開始コドンおよび停止コドン、プロモーターおよびターミネーターの領域および通常複製系を有して所望の細胞の宿主中の発現のための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列を所望のコーディング配列の挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミドの中に準備する。生ずる発現ベクターを適当な細菌宿主の中に形質転換する。酵母または哺乳動物細胞の宿主を、また、使用することができ、適当なベクターおよびコントロール配列を使用する。
【００５０】
本発明のペプチドおよびそれらの医薬組成物およびワクチン組成物は哺乳動物、とくにヒトに投与してＨＢＶ感染を処置および／または予防するために有用である。ペプチドはＨＢＶ感染細胞に対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を刺激するために使用するので、組成物は急性および／または慢性のＨＢＶ感染を処置または予防するために使用することができる。
【００５１】
医薬組成物のために、前述の本発明のペプチドはＨＢＶで既に感染した個体に投与されるであろう。感染の潜伏期または急性期における個体は免疫原性ペプチドで別々に処置するか、あるいは適当ならば、他の処置と組み合わせて処置することができる。治療の適用において、組成物は患者に収獲に対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発しかつその症状および／または合併症を治療するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は「治療的に有効な投与量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、ペプチドの組成、投与方法、処置する疾患の段階およびひどさ、患者の体重および健康の一般的状態、および主治医の判断に依存するが、患者から得られたＰＢＬ中のＨＢＶ特異的ＣＴＬ活性の測定により決定して、患者のＣＴＬの応答に依存して、７０ｋｇの患者について一般に約１μｇ〜約２，０００ｍｇのペプチドの範囲であり、約１０μｇ〜約１００ｍｇのペプチドの投与量をいっそう普通に使用され、次いで数週〜数カ月にわたって約１μｇ〜約１ｍｇのペプチドのブースター投与量を使用する。本発明のペプチドおよび組成物は一般に重大な疾患の状態、すなわち、生命を脅かすか、あるいは潜在的に生命を脅かす場合において使用することができることを留意しなくてはならない。このような場合において、外来の物質の最小化およびペプチドの比較的無毒の特質にかんがみて、実質的に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することができそして処置の医師は望ましいと感じることがある。
【００５２】
組成物の１回または多数回の投与は、処置の医師により選択される投与量のレベルおよびパターンで実施することができる。いずれの場合においても、製剤配合物は患者を効果的に処置するために十分な量の本発明の細胞障害性Ｔリンパ球刺激性ペプチドを提供すべきである。
【００５３】
治療の使用のために、投与はＨＢＶ感染の最初の徴候においてあるいは急性感染の場合において診断のすぐ後に開始し、そして少なくとも症状が実質的に消滅しそしてその後ある期間の間続けるべきである。よく確立された慢性の場合において、負荷投与および引き続く維持またはブースターの投与が要求される。急性の肝炎の処置の間のＨＢＶに対する有効な細胞障害性Ｔリンパ球の応答の誘発は、慢性肝炎、ＨＢＶ保菌の段階、および続く肝細胞の癌の引き続く発生の可能性を最小とするであろう。
【００５４】
本発明の組成物を使用する感染した個体の処置は、急性的に感染した個体における感染の消散を速めることができ、個体の約９０％は感染を自然に消散することができる。発生する慢性感染に対して感受性（または病気にかかりやすくなった）個体について、急性から慢性の感染への進化を防止する方法においてとくに有用である。感受性の個体が感染の前にまたはその間に同定された場合、例えば、ここに記載するように、組成物はそれらに対してターゲッティングされ、より大きい集団への投与の必要性を最小にすることができる。
【００５５】
ペプチド組成物は、また、慢性肝炎の処置のためにそして保菌者の免疫系を刺激してウイルス感染した細胞を実質的に減少するか、あるいはなお排除するために使用することができる。慢性肝炎を有する個体は、感染後約３〜６月にウイルスについて陽性と試験されるので、同定することができる。個体の感染の急性期の間の不適切な（またはふそんざいの）細胞障害性Ｔリンパ球の応答のために、個体が慢性ＨＢＶ感染を発生することがあるので、細胞障害性Ｔ細胞の応答を効果的に刺激するために十分な量の免疫保護ペプチドを投与の配合物およびモードにおいてを提供することが重要である。こうして、慢性肝炎の処置のために、代表的な投与量は７０ｋｇの患者について約１μｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約５μｇ〜１００ｍｇ／投与の範囲である。少なくとも臨床的症状または実験室のインジケーターがＨＢＶ感染が排除または実質的に消滅しめすまでそしてその後ある期間の間、投与を続けるべきである。免疫化投与および引き続く維持およびブースターの投与は、確立された間隔で、例えば、１〜４週間、感染を消散させるのに必要であるように、多分延長した期間、要求される。慢性および保菌のＨＢＶ感染の処置のために、また、ＣＴＬペプチドを他のＨＢＶ抗原に対する免疫応答を誘発する他のペプチドまたはタンパク質と組み合わせることが望ましいことがある。
【００５６】
治療的処置のための医薬組成物は、非経口的、局所的、経口的または局所の投与について意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。こうして、本発明は、許容できる担体、好ましい水性担体の中に溶解または懸濁した細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドの溶液からなる非経口的投与のための組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は普通の、よく知られた滅菌技術により滅菌することができるか、あるいは滅菌濾過することができる。生ずる水溶液はそれ自体使用のために包装するか、あるいは凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物を無菌の溶液と投与前に組み合わせる。組成物は必要に応じて生理学的溶液に近似させるために製剤学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含有することができる。
【００５７】
ある態様において、医薬組成物の中にＣＴＬを活性化する少なくとも１種の成分含めることが望ましいことがある。生体内でウイルスの抗原に対してＣＴＬを活性化することができる脂質、例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニル−セリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）が同定され、これは適当なペプチドに共有結合させるときウイルス特異的細胞障害性Ｔリンパ球を効果的に活性化することができる。参照、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１−５６４（１９８９）、ここに引用によって加える。本発明のペプチドを、例えば、Ｐ３ＣＳＳにカップリングし、そしてこのリポペプチドを個体に投与してＨＢＶに対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を特異的に活性化することができる。さらに、中性性抗体の誘発を、また、適当なエピトープ、例えば、ＨＢｓＡｇのエピトープを表示するペプチドに接合したＰ３ＣＳＳで活性化することができ、２つの組成物を組み合わせてＨＢＶ感染に対する体液および細胞仲介の両方の応答をいっそう効果的に誘発することができる。
【００５８】
製剤配合物中の本発明の細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドの濃度は、広く、すなわち、約１重量％より低い、通常１０重量％または少なくとも１０重量％から２０〜５０重量％またはそれ以上程度に高く変化することができ、そして主として流体体積、粘度などにより選択した投与の特定のモードに従い選択されるであろう。
【００５９】
こうして、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は２５０ｍｌの無菌のリンガー溶液、および１００ｍｇのペプチドを含有するように構成することができるであろう。非経口的に投与可能な化合物を製造する実際の方法は当業者に知られているか、あるいは当業者にとって明らかでありそして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルベニア州（１９８５）、これをここに引用によって加える。
【００６０】
本発明のペプチドは、また、ペプチドを特定の組織、例えば、リンパ系組織またはＨＢＶ感染肝細胞にターゲッティングするリポソームを介して投与することができる。リポソームは、また、ペプチド組成物の半減期を増加するために使用できる。本発明において有用なリポソームは、乳濁液、フォーム、ミセル、不溶性単層、脂質結晶、リン脂質分散液、層状層などを包含する。これらの調製物において、送り出すべきペプチドはリポソームの部分として、単独であるいは、例えば、リンパ系細胞の間で優勢な、レセプターに結合する分子、例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体と組み合わせるか、あるいは他の治療または免疫原性組成物と組み合わせて組み込まれる。こうして、本発明の所望のペプチドを充填したリポソームはリンパ系または肝細胞の部位に向けられることができ、ここでリポソームは次いで選択した治療／免疫原性ペプチド組成物を送り出す。本発明において使用するリポソームは標準の小胞形成脂質から形成され、脂質は一般に中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えば、コレステロールを包含する。脂質の選択は一般に、例えば、リポソームの大きさおよび血流中のリポソームの安定性の考察により案内される。リポソームを製造する種々の方法を利用可能であり、例えば、次の文献に記載されている：Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、米国特許第４，８３７，０２８号、および米国特許第５，０１９，３６９号、ここに引用によって加える。免疫細胞へターゲッティングするために、リポソームの中に組み込むべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面の決定基に対して特異的な抗体またはその断片を包含する。ペプチドを含有するリポソームの懸濁液は、静脈内、局所に、局所的などに投与することができ、ここで投与量は投与のモード、送り出されるペプチド、処置する疾患の状態などに従い変化する。
【００６１】
固体の組成物のために、普通の無毒の固体の担体を使用することができ、これらは、例えば、製剤学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを包含する。経口的投与のために、製剤学的に許容される無毒の組成物は任意の通常使用される賦形剤、例えば、前述の担体、および一般に１０〜９５％の活性成分、すなわち、本発明の１種または２種以上のペプチド、およびより好ましくは２５％〜７５％の濃度で組み込むことによって形成される。
【００６２】
エアゾールの投与のために、細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドは好ましくは微粉砕した形態で界面活性剤および噴射剤と一緒に供給される。ペプチドの典型的な百分率は０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％である。界面活性剤は、もちろん、無毒であり、そして好ましくは噴射剤の中に可溶性である。このような剤の代表例は、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、オステリン酸およびオレイン酸と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分的エステルである。混合エステル、例えば、混合または天然のグリセリドを使用することができる。界面活性剤は組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を構成することができる。組成物の残部は通常噴射剤である。また、担体、例えば、鼻内の送り出しのためにレシチンを必要に応じて含むことができる。
【００６３】
他の面において、本発明は活性成分として免疫原的に有効量のここに記載する細胞障害性Ｔリンパ球刺激ペプチドを含有するワクチンに関する。１種または２種以上のペプチドをヒトを包含する宿主の中にその自身の担体に連鎖させて、または活性ペプチド単位のホモポリマーまたはヘテロポリマーとして導入することができる。このようなポリマーは増加した免疫学的反応の利点を有しそして、異なるペプチドを使用してポリマーを構成する場合、ＨＢＶの異なる抗原決定基と反応する抗体および／または細胞障害性Ｔ細胞を誘発する能力を有する。有用な担体はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、チログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸、例えば、ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）などを包含する。ワクチンは、また、生理学的に耐性の（許容できる）希釈物、例えば、水、リン酸塩緩衝生理食塩水、または生理食塩水を含有し、そしてさらに典型的にはアジュバントを含む。アジュバント、例えば、不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、または明礬はこの分野においてよく知られている物質である。そして、前述したように、細胞障害性Ｔリンパ球の応答は本発明のペプチドを脂質、例えば、Ｐ３ＣＳＳに接合することによって活性化することができる。ここに記載するように注射、エアゾール、経口的、経皮的または他のルートを経てペプチド組成物で免疫化すると、宿主の免疫系はワクチンに対してＨＢＶに対して特異的な細胞障害性Ｔリンパ球を大量に生産することによって応答し、そして宿主はＨＢＶ感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、あるいは発生する慢性ＨＢＶ感染に対して耐性となる。
【００６４】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、ＨＢＶ感染に対して感受性であるか、あるいはそうでなければＨＢＶ感染の危険にある患者に投与して患者自身のの免疫応答能力を増強することができる。このような量を「免疫原的に有効量」と定義する。この場合において、正確な量は再び患者の健康状態および体重、投与のモード、配合物の特質などに依存するが、一般に約１．０μｇ〜約５００ｍｇ／７０ｋｇの患者、より普通には約５０μｇ〜約２００ｍｇ／７０ｋｇの患者の範囲である。ペプチドは適当なＨＬＡ型の個体に投与し、例えば、ＨＢｅｎｖ１８３−１９１（配列識別番号：１）、ＨＢｅｎｖ２４８−２６０（配列識別番号：２）、ＨＢｅｎｖ２６０−２６９（配列識別番号：９）、ＨＢｅｎｖ３３５−３４３（配列識別番号：１０）、ＨＢｅｎｖ１５２−１６１（配列識別番号：１１）、ＨＢｅｎｖ１７７−１８５（配列識別番号：１２）、ＨＢｅｎｖ２０４−２１２（配列識別番号：１２）、および／またはＨＢｅｎｖ３７０−３７９（配列識別番号：１４）の領域からのペプチドのワクチン組成物について、これらの少なくともＨＬＡ−Ａ２個体に投与されるであろう。
【００６５】
ある場合において、本発明のペプチドのワクチンをＨＢＶ、とくにＨＢＶエンベロープ抗原、例えば、組換えＨＢＶｅｎｖエンコーデッド抗原に対する中性性抗体の応答を誘発するワクチンまたはＨＢＶ感染個体から得られた精製した血漿調製物から製造したワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。種々のＨＢＶワクチン調製物が記載され、そしてそれらはＨＢｓＡｇおよびそのポリペプチド断片に主として基づく。本発明のペプチドを使用して配合することができるワクチンの例について、一般に参照、欧州特許（ＥＰ）第１５４，９０２号および欧州特許（ＥＰ）第２９１，５８６号、および米国特許第４，５６５，６９７号、米国特許第４，６２４，９１８号、米国特許第４，５９９，２３０号、米国特許第４，８０３，１６４号、米国特許第４，８８２，１４５号、米国特許第４，９７７，０９２号、米国特許第５，０１７，５５８号および米国特許第５，０１９，３８６号、各々をここに引用によって加える。ワクチンを組み合わせ、そして同時に、あるいは別々の調製物として投与することができる。
【００６６】
治療および免疫化の目的で、本発明のペプチドは、また、弱毒化ウイルス宿主、例えば、ワクシニアにより発現することができる。このアプローチは、本発明のＨＢＶペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクシニアウイルスを使用することを包含する。急性的または慢性的にＨＢＶ感染した宿主の中に、あるいは非感染宿主の中に導入するとき、組換えワクシニアワクチンはＨＢＶペプチドを発現し、これによりＨＢＶに対する宿主の細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアのベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号（ここに引用によって加える）に記載されている。他のベクターはＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターはＳｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１））（ここに引用によって加える）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用である広範な種類の他のベクター、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）のベクターなどはここにおける記載から当業者にとって明らかであろう。
【００６７】
請求の範囲の発明の組成物および方法は半ビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）治療のために使用することができる。半ビボ治療とは、治療および免疫原性の操作が体の外側で実施されることを意味する。例えば、リンパ球または他の標的細胞を患者から取り出し、そして高い投与量の主題のペプチドで処置し、患者により達成されるか、あるいは耐えられるレベルをかなり超える刺激濃度のペプチドを細胞の媒質の中に提供することができる。ＣＴＬを刺激する処置後、細胞を宿主に戻してＨＢＶ感染を処置する。また、宿主の細胞を、前述したように、ペプチドをエンコードする遺伝子を有するベクターに対して暴露することができる。ベクターでいったんトランスフェクションされると、細胞を生体外で増殖するか、あるいは患者に戻すことができる。生体外で増殖された細胞を、前以て決定した細胞密度に到達した後、患者に戻すことができる。
【００６８】
また、ペプチドは診断剤としての用途を見出すことができる。例えば、本発明のペプチドを使用してペプチドまたは関係するペプチドを使用して処置の養生法に対する特定の個体の感受性を決定することができ、こうして現存する処置のプロトコールを変更するか、あるいは影響を受けた個体について予後を決定するとき助けとなることができる。さらに、ペプチドは、また、どの個体が発生する慢性ＨＢＶ感染について実質的に危険であるかを予測するために使用することができる。
実施例Ｉ
ＣＴＬ特異的ＨＢｅｎｖエピトープの同定
この実施例は、ＨＢＶエピトープ抗原に対して特異的なＨＬＡ制限ＣＴＬ応答を誘発したＨＢｅｎｖペプチドの同定を記載する。
【００６９】
研究に含めたすべての患者はＨＬＡ−Ａ２陽性であった。１３人の患者（Ａ−１〜Ａ−１３；表ＩＩ）を急性肝炎のエピソードの間に研究し、６人（Ｃ−１〜Ｃ−６）はＨＢＶにより慢性的に感染しており、そして６人は非感染の健康なボランティア（Ｎ−１〜Ｎ−６）は正常の対照として働いた。患者および患者のＨＬＡハプロタイプを、ＨＬＡ型別トレー（Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ、シノガパーク、カリフォルニア州）を使用する微小細胞障害性試験においてＰＢＭＣにより決定し、表ＩＩに示す。
【００７０】
急性肝炎の診断は標準の診断基準に基づいた。診断のパラメーターは肝臓の損傷の臨床的（黄疸）および生化学的証拠（正常の上限より少なくとも２０倍大きいＡＬＴ活性）、ならびに肝炎デルタおよびＣ型肝炎のウイルスの感染の血清学的証拠の不存在（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ノースシカゴ、イリノイ州）における急性ＨＢＶ感染の血清学的証拠（ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＩｇＧ抗ＨＢｃ抗体の存在）を包含した。すべての患者は黄疸の発現後最初の４週の間に研究し、そのとき患者の血清はＨＢｓＡｇについて陽性でありそしてそれらのＡＬＴレベルは顕著に異常であった。１３人の患者のうちの１１人は引き続いて疾患から回復し、血清トランスアミナーゼの正常化およびＨＢｓＡｇのクリアランスは最初の診断の４月以内であった。１人の患者（Ａ−１１、表ＩＩ）は慢性の活性肝炎を発生しそして最初の診断後１３月にＨＢｓＡｇ陽性に止まった。１人の患者（Ａ−１０）は最初のクリニックの訪問後追跡を失った。慢性Ｂ型肝炎の患者は６カ月より長い間ＨＢｓＡｇに対して反復して血清学的に陽性であり、そして温和ないし中程度に増大した血清ＡＬＴ活性を表示した。正常の対照はＨＢＶ感染の臨床的歴史をもたず、そしてＨＢＶマーカーについて血清学的陰性であった。すべての患者および正常の対照はＨＩＶに対する抗体について血清学的に陰性であった。
【００７１】
【表２】
0003616390.tif 000003
【００７２】
患者および正常のドナーからのＰＢＭＣをフィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス）で分離し、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で３回洗浄し、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）（１０％の加熱不活性化ヒトＡＢ血清を含有する）（完全培地）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）の中に再懸濁させ、そして２４ウェルのプレート中で４×１０６細胞／ウェルでプレートした。特記しない限り、合成ペプチドを細胞培養物に１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。第３日に、ｒＩＬ２（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、ニューヨーク州ナトレイ）を１０Ｕ／ｍｌの最終濃度で補充した完全培地の１ｍｌを各ウェルに添加した。第７日に、培養物をペプチド、ｒＩＬ２および照射した（３０００ラド）オートロガスまたはＨＬＡ−Ａ２合致フィーダー細胞で再刺激し、そして培養したＰＢＭＣを第１４日にＣＴＬ活性について試験した。ペプチド特異的細胞障害性活性表示した選択した培養物を１μｇ／ｍｌのペプチド、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ２および１μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス）を含有する１ｍｌの完全培地中で１×１０６の照射（６０００ラド）同種異系のＰＢＭＣおよび１×１０５の照射（１８０００ラド）ＪＹ細胞（同種異系のＥＢＶ−Ｂ）形質転換細胞系、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７、Ｃｗ７）（１４）で毎週再刺激することによって拡張した。
【００７３】
細胞障害性アッセイのために、標的細胞はａ）１０μｇ／ｍｌにおいて合成ペプチドと一夜インキュベーションした同種異系ＰＨＡ刺激芽細胞または同種異系ＨＬＡ合致または不一致ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞系（Ｂ−ＬＣＬ）；ｂ）前述の安定なＢ−ＬＣＬトランスフェクション体；またはｃ）組換えワクシニアウイルスで感染したＢ−ＬＣＬ（後述する）から成っていた。Ｂ−ＬＣＬはアメリカン・ソサイアティ・フォー・ヒストコンパティビリティ・アンド・イムノジェネティックス（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）（マサチュセッツ州ボストン）から購入するか、あるいは同時継続米国出願第０７／９３５，８９８号に記載するようにわれわれの自身の患者および正常のドナーのプールから確立した。細胞をＬ−グルタミン（２ｍＭ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）、および１０％（ｖ／ｖ）の加熱不活性化ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を補充したＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）、１０％（ｖ／ｖ）の加熱不活性化ＦＣＳ、および１０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ２を補充したＲＰＭＩ１６４０中で中で末梢血ＰＢＭＣをＰＨＡで１μｇ／ｍｌにおいて刺激することによって、オートロガスＰＢＭＣ芽細胞の短期間の系統を生産した。室温において揺動プレート上で５０プラーク形成Ｕ／細胞において１×１０６細胞を感染させ、次いで１回洗浄し、そして３７℃において一夜インキュベーションすることによって、ワクシニア感染標的を調製した。
【００７４】
標的細胞を１００μＣｉの51Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）で１時間標識化し、そしてＨＢＳＳで３回洗浄した。標準の４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおいて５０００標的細胞／ウェルを含有するＵ字形の底の９６ウェルのプレートを使用して、細胞溶解活性を決定した。細胞障害性％を次の式から決定した：１００×［（実験の解放−自発的解放）／（最大の解放−自発的解放）］。最大の解放は洗浄剤（１％のトリトンＸ−１００、Ｓｉｇｍａ）で標的を溶解することによって決定した。自発的解放はすべてのアッセイにおいて最大の解放の２５％より低かった。
【００７５】
急性肝炎の２人のＨＬＡ−Ａ２陽性患者（Ａ−１およびＡ−３）をＨＢｓＡｇ３２９−３４８（ＡＳＡＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧ（配列識別番号：２２）に対するＣＴＬの応答の分析のために最初に選択し、この配列は２つのオーバーラップするＨＬＡ−Ａ２．１アレレ特異的結合モチーフを含有する（ＷＬＳＬＬＶＰＦＶおよびＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ）。これらの患者の１人（Ａ−３）は、また、ＨＬＡ−Ａ２．１アレレ特異的結合モチーフ（ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ）を表す１０残基のＨＢＶヌクレオカプシドのエピトープ（ＨＢｓＡｇ１８−２７）に対するＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬ応答を表示することが前の実験から知られていた。この患者はＨＢｓＡｇ３２９−３４８におけるモチーフの一方または両方に対する潜在的レスポンダーと考えられた。他の患者（Ａ−１）は、ＨＢｓＡｇ１８−２７に対するレスポンダーでないことが知られており、比較のために研究した。
【００７６】
ＨＢｓＡｇ３２９−３４８特異的ＣＴＬ系統を、両方の患者のＰＢＭＣから前述したようにペプチドで刺激することによって発生させた。刺激の２〜３週後、両方の患者はＨＢｓＡｇ３２９−３４８ペプチドで前パルスしたホモ接合体ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ＥＢＶ細胞系（ＪＹ）に対して強い細胞障害性応答を表示した。患者Ａ−１のＨＢｓＡｇ３２９−３４８特異的細胞系をクローニングのために選択した。
【００７７】
ＣＴＬ系統を本来９６ウェルのマイクロタイタープレート中で１、１０、および１００細胞／ウェルでクローニングし、次いで０．３または１細胞／ウェルでサブクローニングした。細胞をペプチド（１μｇ／ｍｌ）、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）、ｒＩＬ２（２０Ｕ／ｍｌ）、照射（６０００ラド）同種異系ＰＢＭＣ（１０５細胞／ウェル）、および照射（１８０００ラド）ＪＹ細胞（１０４細胞／ウェル）の存在下にプレートした。ＨＢＶ特異的クローンを２４ウェルのプレート中で前述したように再刺激したが、ただしペプチドを省略しそして、ＨＢＶの大きいエンベロープ抗原の安定な発現を付与するプラスミドでトランスフェクションした照射ＪＹ細胞（ＥＢＯ−ｐｒｅＳ１、参照１０）を１０５細胞／ウェルで添加した。
【００７８】
患者Ａ−１のＨＢｓＡｇ３２９−３４８特異的細胞系を使用して、４クローンを１細胞／ウェル（クローンＢ１３、Ｂ１６、Ｂ１７）または０．３細胞／ウェル（クローンＢ３）でプレートした細胞から誘導した。クローンＢ３をＨＬＡＣ−１アレレのレベルにおいてエフェクターと部分的に合致する同種異系標的細胞のパネルに対して試験した。ＨＬＡＣ−１において患者Ａ−１と部分的に合致する同種異系標的細胞を使用して、クローンＢ３の細胞溶解活性は、ペプチド中の２ＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフの存在のために、ＨＬＡ−Ａ２制限されることが発見された。患者Ａ−３から誘導されたＨＢｓＡｇ３２９−３４８特異的ポリクローナルＣＴＬ系統は、また、同一のステアリン酸マグネシウムにおいてＨＬＡ−Ａ２制限されると決定された。患者のＨＬＡ−Ａ２サブタイプは決定されたなかったので、ペプチドに対するＣＴＬの応答がＨＬＡ−Ａ２アレレによってのみ制限されるかどうか、あるいはそれが他のＨＬＡ−Ａ２サブタイプに同様によく拡張するかどうかは知られていない。
【００７９】
ＨＢｓＡｇ３２９−３４８内の最小の、最適なＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬエピトープを決定するために、ＨＢｓＡｇ３２９−３４８を補充したから誘導されたアミノ末端の切形およびオーバーラップする９マーおよび１０マーのパネルを生成して、２つのオーバーラップする理想的なＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフを含有する、この２０残基のペプチドの中に存在する１または２以上のＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬエピトープをマッピングした。患者Ａ−１からのＨＬＡ−Ａ２制限ＣＴＬクローンＢ１７、および患者Ａ−３からのポリクローナルＣＴＬ系統１Ｂ９を、前述の最初の細胞系およびＨＢｓＡｇ３２９−３４８の反復刺激により誘導し、エフェクター細胞として使用して、ＨＢｓＡｇ３２９−３４８に対するＣＴＬの応答の微細な特異性を確立した。ＨＬＡ−Ａ２．１陽性Ｂ細胞系（ＪＹ）をもとの２０マーと、あるいは切形ペプチドとインキュベーションすることによって、標的細胞を生産した。
【００８０】
第１図の結果が示すように、２つのＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフの最初のもの（ＨＢｓＡｇ３３５−３４３）のみがＣＴＬにより認識される。さらに、データが証明するように、このペプチド（ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ）はＨＢｓＡｇ３２９−３４８刺激ＣＴＬにより認識される最小の、最適なＨＬＡ−Ａ２制限エピトープである。なぜなら、ＨＢｓＡｇ３３５−３４３からの極端のアミノ末端または極端のカルボキシ末端の残基はＣＴＬによる認識を壊滅させるからである。
【００８１】
ペプチドを使用して患者Ａ−１からのＰＢＭＣにおけるＣＴＬの応答を刺激したとき、エフェクターレベルにおけるＨＢｓＡｇ３３５−３４３の優秀性は繰り返される。類別したＨＢｓＡｇ３２９−３４８サブユニットを表す合成ペプチドを１０μＭで使用して患者Ａ−１のＰＢＭＣを刺激した。刺激の週後、これらの系統の細胞障害性を１０μＭの同一ペプチドで前パルスしたＪＹ標的細胞および１０μＭのＨＢｓＡｇ３３５−３４３で前パルスしたＪＹ標的細胞に対して６０：１のＥ：Ｔで試験した。第２図に示す結果は、４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおける溶解％を表す。第２図において見ることができるように、ＨＢｓＡｇ３３５−３４３およびその拡張した変異型はＣＴＬの応答を誘発できることを証明したが、極端のアミノ末端およびカルボキシ末端のアミノ酸を省略すると、ＣＴＬの応答を刺激するペプチドの能力は完全に壊滅し、これによりＨＢｓＡｇ３３５−３４３がＨＢｓＡｇの３２９−３４８の間の最小の、最適なＨＬＡ−Ａ２制限エピトープであるという結論を強化する。
実施例ＩＩ
ＨＢＶｅｎｖにおける７つのＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフに対するＣＴＬの応答
第２位置にロイシンおよびカルボキシ末端としてバリンを含有する長さ９〜１０残基のペプチドとして定義された、７つの理想的なＨＬＡ−Ａ２．１アレレ特異的結合モチーフは、ＨＢＶエンベロープタンパク質のＨＢｓＡｇ領域に存在する（表ＩＩＩ）。実施例Ｉにおいて得られた結果に基づいて、これらの７つのエンベロープタンパク質、＋既知のＨＬＡ−Ａ２制限ＨＢＶヌクレオカプシドエピトープ（ＨＢｓＡｇ１８−２７）が、１２人の急性Ｂ型肝炎のＨＬＡ−Ａ２陽性患者においてＣＴＬの応答を刺激する能力を検査した。比較のために、６人の慢性肝炎のＨＬＡ−Ａ２陽性患者および６人の未感染の正常の対照をペプチドの同一パネルに対する応答性について試験した。
【００８２】
【表３】
0003616390.tif 000004
【００８３】
急性患者（Ａ−１〜Ａ−１２）、慢性患者（Ｃ−１〜Ｃ−６）、および正常の被検者（Ｎ−１〜Ｎ−６）からのＰＢＭＣを次の合成ペプチド：１＝ＨＢｃＡｇ１８−２７、２＝ＨＢｓＡｇ２０１−２１０、３＝ＨＢｓＡｇ２５１−２５９、４＝ＨＢｓＡｇ２６０−２６９、５＝ＨＢｃＡｇ３３５−３４３、６＝ＨＢｓＡｇ３３８−３４７、７＝ＨＢｓＡｇ３４８−３５７、８＝ＨＢｓＡｇ３７８−３８７、で実施例１に記載するように２週間刺激し、そして同一ペプチドで一夜前パルスしたＪＹ標的細胞に対する４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおいて試験した。ペプチドで前パルスしなかったＪＹ標的細胞による51Ｃｒ解放をペプチドで前パルスしたＪＹ標的細胞による51Ｃｒ解放から減ずることによって、ペプチド特異的細胞障害性を測定した。示す結果（第３図）は４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおける特異的溶解％を表す。
【００８４】
第３図理解できるように、急性肝炎の１２人のＨＬＡ−Ａ２陽性患者のうちの９人はパネルの中のペプチドの少なくとも１つに対して応答した。対照的に、６人のＨＬＡ−Ａ２陽性の未感染の正常の対照のいずれも同一の生体外の刺激後にペプチドのいずれに対しても応答せず、患者によるこれらのペプチドに対する応答性が対応するＨＢＶ誘導エピトープによる生体内の活性化を反映することを示唆する。
【００８５】
重要なことには、９人のレスポンダーのうちの８人はパネル内の多数のエピトープを認識し、急性肝炎の間のＨＢＶに対するＣＴＬの応答がポリクローナルおよび多重特異性の両方であることを示す。さらに、９人のレスポンダーの間で認識されたエピトープのスペクトルにおいて実質的な変動が存在し、ある種のエピトープは他よりもいっそう頻繁に認識された。例えば、ＨＢｓＡｇ１８−２７およびＨＢｓＡｇ３３５−３４３は、それぞれ、９人のレスポンダーのうちの７人および８人により個々に認識され、そして組み合わせたとき、それらはレスポンダーのすべての９人により認識された。対照的に、ＨＢｓＡｇ３４８−３５７、ＨＢｓＡｇ２５１−２５９およびＨＢｓＡｇ２６０−２６９は、それらを試験したレスポンダーの３／９、２／５および３／６のみにより認識された。
【００８６】
急性的に感染した患者において循環するヴィリオンＤＮＡのヌクレオチド配列の分析は、生体外のＣＴＬの拡張を刺激するために使用したプロトタイプのＨＢｓＡｇ３３５−３４３ペプチドの中に存在する正確なアミノ酸配列を発現するウイルスにより、ＣＴＬの非レスポンダーを包含する、すべての患者は感染することを示した。残基３３５−３４３は、伝子バンク−７２のデータベース、ならびにここにおける研究した１０人の患者において発表されているように、すべての４つのサブタイプから誘導されたすべての発表されたＨＢＶ配列の中に保存されることが知られているので、ＨＢｓＡｇ３３５−３４３はＨＢＶグループ特異的ＣＴＬエピトープであると結論することができる。しかしながら、同一のことはＨＢｓＡｇ３４８−３５７について真実ではない。なぜなら、生体外の刺激のために使用したプロトタイプの配列（ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶ）をエンコードするウイルスにより、１０人の患者のうちの７人のみが感染されることが発見されたからである。残りの３人の患者（Ａ−９、Ａ−１０、Ａ−１３）は、カルボキシ末端のバリンが位置３５７においてアラニンにより置換された変異型の配列を表示した。プロトタイプのウイルスにより感染された患者の間で、ちょうどＨＢｓＡｇ３３５−３４３についてのように、ＣＴＬのレスポンダーおよびＨＢｓＡｇ３４８−３５７に対する非レスポンダーが観察された。他方において、変異型ウイルスにより感染した３人の患者のいずれもプロトタイプのペプチドに対するＣＴＬの応答を表示しなかった。
【００８７】
すべての９人のレスポンダーは引き続いてＨＢｓＡｇ陰性となり、そしてレスポンダーの肝臓疾患は完全に消散したことは注目に値する。対照的に、ウイルスを除去することができなかった、慢性肝炎のすべての６人の患者は、また、これらのエピトープのいずれに対する末梢血ＣＴＬの応答を獲得することができなかった。急性的に感染した患者のうちの３人（Ａ−１０、Ａ−１１、Ａ−１２）は、また、これらのペプチドのいずれに対しても応答することができなかった。さらに、非レスポンダーの１人（Ａ−１１）は慢性の活性肝炎を発生し、そしてまだ彼の急性疾患後１３カ月ＨＢｓＡｇ陽性であった。これらの組み合わせたデータはＣＴＬの応答およびウイルスのクリアランスの間の関係を強く示唆する。しかしながら、非レスポンダーの患者Ａ−１２は疾患の発現後１〜４月の間にＨＢｓＡｇに陰性的に血清変換した。
【００８８】
表ＩＩおよび第３図に示すように、９人のレスポンダーのうちの４人はこの研究において使用したＪＹ標的細胞系（ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ７、Ｃｗ７）とＨＬＡ  Ａ２アレレのみを共有し、ペプチドのすべてに対する応答がこれらの個体においてＨＬＡ−Ａ２制限されることを証明した。残りのレスポンダーは、また、Ａ２に加えてＪＹ標的細胞の中に存在するＨＬＡ  Ｂ７および／またはＣｗ７アレレを共有するので、ありそうに思われないが、これらのアレレは、また、これらの患者におけるこれらのエピトープのための制限要素として働くことができる。
【００８９】
７つのＨＢＶエピトープのペプチドの異なる免疫原性についての分子の基礎は、それらの配列の比較から直ちに明らかではなかった。ホモ接合体ＨＬＡ−Ａ２．１陽性Ｂ細胞系（ＪＹ）への無関係のＨＬＡ−Ａ２制限ヌクレオカプシドのエピトープ（ＨＢｓＡｇ１８−２７）の結合と競合する７つのエピトープのペプチドの能力を決定することによって、ＨＬＡ−Ａ２．１に対するペプチドの相対的結合活性における潜在的差を検査した。
【００９０】
競合的結合の阻害アッセイは、エフェクター細胞源として患者Ａ−４からのＨＢｓＡｇ１８−２７特異的ＣＴＬクローンを使用した。ブロッキングペプチド（１、１０、１００μＭ）を51Ｃｒ標識化、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ＪＹ標的細胞とエフェクター細胞との混合物（Ｅ：Ｔ＝４０：１、３０００標的細胞／ウェル）に添加し、次いで４０分後に飽和より低い濃縮（０．０３μＭ）の標的ペプチド、ＨＢｓＡｇ18-27 を添加した。各ペプチドが４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおいて標的細胞の溶解をブロックする程度を計算することによって、各ペプチドの結合能力を評価した。
【００９１】
第４図に示すように、すべての４つの免疫原性ペプチドおよび３つの非免疫原性ペプチドのうちの２つをＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合したが、広く（１００倍より大きく）変動可能な効率はそれらの相対的免疫原性と相関関係をもたなかった。重要なことには、このアッセイにおいてＨＬＡ−Ａ２．１に結合しなかった唯一のペプチド（ＨＢｓＡｇ３３７−３４８）は非免疫原性であった。しかしながら、他の２つの免疫原性ペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ２．１の結合アフィニティーは免疫原性ペプチドのいくつかと同程度に高いか、あるいはそれより高かった。こうして、このクラスＩの分子に結合するペプチドの能力は免疫原性のために要求されるが、それはそれを保証しない。これが示唆するように、抗原のプロセシングのレベルにおける追加の因子およびＴ細胞のレパートリーは、ウイルスのタンパク質内のどのＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチドがＣＴＬの応答を誘発できるかの決定においてある役割を演ずることができる。
実施例ＩＩＩ
ペプチド特異的ＣＴＬを内因性ＨＢｅｎｖ抗原を認識する
ＨＢＶのａｙｗまたはａｄｗサブタイプのクローニングされたＨＢＶゲノムから誘導された大きい、中程度および主要なエンベロープのポリペプチドをエンコードする組換えワクシニアウイルスの２つのグループで感染した標的細胞を溶解するそれらの能力について測定することによって、内因的に合成される抗原を認識するＨＢｓＡｇ335-343 およびＨＢｓＡｇ348-357 特異的ＣＴＬの能力を検査した。
【００９２】
ＨＢＶの大きい、中程度および主要なエンベロープのポリペプチド（ａｄｗサブタイプ）を発現する組換えワクシニアウイルスおよび対応する対照の野生型ワクシニアを得た（Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：４９０（１９８３）；Ｃｈｅｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：３３７（１９８６）；ＣｈｅｎｇおよびＭｏｓｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１２８６（１９８７）、それらの各々をここに引用によって加える）。ＨＢＶのａｙｗサブタイプの同一の３つのＨＢＶエンベロープのポリペプチドを発現し組換えワクシニアウイルスの独立の系列を、次のようにして誘導した。ＨＢｓＡｇの発現のために、ＨＢＶ配列のヌクレオチド１４０９−２５１４を含有するＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ制限断片を、７．５Ｋの初期／後期のプロモーターから下流のワクシニアウイルスの発現ベクターの中にクローニングした。ワクシニアウイルスを発現するｐｒｅＳ１について、ヌクレオチド９３７−２５１４を含有するＢｇ１ＩＩ／ＳｐｈＩ断片を使用した。ｐｒｅＳ２コーディング配列をクローニングするために、まず、ヌクレオチド１２６７（例えば、ｐｒｅＳ２開始コドンから６塩基対上流）に開始しそして位置１２８０におけるＥｃｏＲＩ部位をスパンする、短いアダプターのオリゴヌクレオチドを合成した。ワクシニアウイルスの発現ベクターの中にこのオリゴヌクレオチドをクローニングした後、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ  ＨＢＶ断片（ヌクレオチド１２８０−２５１４）を中間の構成体の中に再クローニングすることによって、コーディング配列を完成させた。組換えワクシニアウイルスの発生は、Ｓｍｉｔｈら、前掲、に記載されているような標準の手順に従い実施した。Ｇｕｉｌｈｏｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０（１９９２）（ここに引用によって加える）に記載されているように、対応するＨＢＶ（ａｙｗサブタイプ）コーディング領域を含有する、ＥＢＶに基づく発現ベクターのパネルでＢ−ＬＣＬをトランスフェクションすることによって、ＨＢＶエンベロープタンパク質を発現する安定なトランスフェクション体（ａｙｗサブタイプ）を生成した。
【００９３】
それぞれ、ペプチド配列ＷＬＳＬＬＶＰＦＶおよびＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶで刺激することによって、ＨＢｓＡｇ335-343 特異的ＣＴＬ系統（患者Ａ−１）およびＨＢｓＡｇ348-357 特異的ＣＴＬ系統（患者Ａ−４）を発生させた。培地と、誘発ペプチドと、あるいは（ＨＢｓＡｇ348-357 の場合において）変異型ペプチド（ＧＬＳＰＴＶＷＬＳＡ）と前インキュベーションした、51Ｃｒ標識化ＪＹ標的細胞とＣＴＬをインキュベーションした。ａｙｗおよびａｄｗＨＢＶゲノムから誘導されたＨＢＶ主要な（Ｖ−ＨＢｓ）、中程度（Ｖ−ｐｒｅＳ２）、および大きい（Ｖ−ｐｒｅＳ１）エンベロープポリペプチドを発現する、６つの組換えワクシニアウイルスのパネルで感染した51Ｃｒ標識化ＪＹ標的細胞と、また、ＣＴＬをインキュベーションした。野生型ワクシニアウイルス（Ｖ−ｗｔ）を対照として使用した。ＨＢｓＡｇ335-343 特異的ＣＴＬ系統（右のパネル）をＥ：Ｔ＝４０：１において使用した。ＨＢｓＡｇ348-357特異的ＣＴＬ系統（左のパネル）をＥ：１において使用した。示す結果は４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおける溶解％を表す。
【００９４】
患者Ａ−１およびＡ−４からの両方のＨＢｓＡｇ335-343 およびＨＢｓＡｇ348-357 特異的ＣＴＬは、すべての３つのＨＢＶエンベロープタンパク質を合成する、組換えワクシニアウイルス感染標的細胞を溶解することができた（第５図）。これが示すように、これらの合成ペプチドの両方は、感染した細胞内の大きい、中程度および主要なＨＢＶエンベロープポリペプチドの内因性プロセシングにより発生するエピトープを表す。
【００９５】
重要なことには、ＨＢｓＡｇ335-343 特異的ＣＴＬは両方の組の組換えワクシニアウイルスにより感染した標的を等しい効率で溶解することができ、ＨＢｓＡｇ348-357 特異的ＣＴＬはａｙｗ感染標的細胞のパネルをａｄｗ標的よりも非常に効率よく溶解することができた。
【００９６】
上の実施例に記載する結果が例示するように、ヒトにおけるＨＢＶに対するＣＴＬ応答は非常に多価であり、多分この重大なウイルスの感染に対していっそう効率よい保護を与えるように思われる。さらに、データが示すように、ここにおいて使用するペプチドの刺激法は、多形性ＨＬＡクラスＩ位置によりそのまま制限された、多価の応答の同定および分析のために、効率よくかつ有効である。追加のＨＬＡアレル特異的結合モチーフは同定されるので、これらのモチーフを含有するＨＢＶ誘導ペプチドはＣＴＬ手順の生体外の刺激について使用することができる。
【００９７】
この明細書の中に述べたすべての刊行物、特許および特許出願をこの明細書の中に、各個々の刊行物、特許および特許出願が特定的にかつ個々にここに引用によって加えると示されているように、ここに引用によって加える。
【００９８】
以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更を行うことができる。したがって、本発明は添付する請求の範囲による以外限定されない。
【００９９】
配列のリスト
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：チサリ、フランシス  Ｖ．
（ｉｉ）発明の名称：Ｂ型肝炎のウイルスに対する細胞障害性Ｔリンパ球の応答を誘            発するペプチド
（ｉｉｉ）配列の数：２７
（ｉｖ）通信の住所：
（Ａ）受信人：タウンセンドおよびタウンセンド
（Ｂ）街路：ワン・マーケット・プラザ、ステウアート・ストリート・タワー
（Ｃ）市：サンフランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア州
（Ｅ）国：米国
（Ｆ）郵便番号：９４１０５
（ｖ）コンピューター読取り可能なフォーム：
（Ａ）媒質の型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  コンパティブル
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：パテント・イン・リリース＃１．０、バージョン＃１．２５
（ｖｉ）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）提出日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉｉ）代理人の情報：
（Ａ）名前：パルメリー、ステブン  Ｗ
（Ｂ）登録番号：３１，９９０
（Ｃ）参照／処理番号：１４７４０−４
（ｉｘ）電気通信の情報：
（Ａ）ＴＥＬ：２０６−４６７−９６００
（Ｂ）ＦＡＸ：４１５−５４３−５０４３
（２）配列識別番号：１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1               5
（２）配列識別番号：２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu
1               5                   10
（２）配列識別番号：３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：３
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu
1               5                   10
（２）配列識別番号：４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：４
Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu
1               5
（２）配列識別番号：５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：５
Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu
1               5                   10
（２）配列識別番号：６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：６
Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu
1               5
（２）配列識別番号：７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：７
Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
1               5
（２）配列識別番号：８についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：８
Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu
1               5                   10
（２）配列識別番号：９についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：９
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：１０についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１０
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1               5
（２）配列識別番号：１１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１１
Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：１２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１２
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu
1               5
（２）配列識別番号：１３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１３
Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu
1               5
（２）配列識別番号：１４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１４
Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu
1               5                   10
（２）配列識別番号：１５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１５
Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：１６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１６
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln
1               5                   10
（２）配列識別番号：１７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１７
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro
20
（２）配列識別番号：１８についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１８
Pro His His Tyr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
Met Tyr Leu Ala
20
（２）配列識別番号：１９についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：１９
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1               5                   10                  15
Ile Glu Tyr Leu
20
（２）配列識別番号：２０についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１５ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２０
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
1               5                   10                  15
（２）配列識別番号：２１についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２１
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Pro Ile
20
（２）配列識別番号：２２についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：２０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２２
Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln
1               5                   10                  15
Trp Phe Val Gly
20
（２）配列識別番号：２３についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２３
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：２４についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２４
Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：２５についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２５
Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：２６についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２６
Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
1               5                   10
（２）配列識別番号：２７についての情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：１０ミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｘｉ）配列の記載：配列識別番号：２７
Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
1               5                   10
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ＨＢｓＡｇ３３５−３４３、ＷＬＳＬＬＶＰＦＶがＣＴＬ刺激ＨＢｓＡｇ３２９−３４８により認識される最小最適ＣＴＬエピトープであることを示す。ＨＢｓＡｇ３２９−３４８の刺激により発生した、患者Ａ−１からのＣＴＬクローンおよび患者Ａ−３からのＣＴＬクローンド系統を、切形（上のパネル）またはＨＢｓＡｇ３２９−３４８をカバーするオーバーラッピング９マーまたは１０マー（下のパネル）で前パルスしたＪＹ標的細胞に対して試験した。
【図２】生体外ＣＴＬを誘発するのためのＨＢｓＡｇ３２９−３４８内の最適エピトープがＨＢｓＡｇ３３５−３４３であることをさらに確証する。
【図３】急性Ｂ型肝炎の感染、慢性Ｂ型肝炎の感染の患者、および正常の被検者におけるＨＢＶ特異的ＣＴＬの応答を示す。急性の患者（Ａ−１〜Ａ−１２）、慢性の患者（Ｃ−１〜Ｃ−６）、および正常の被検者（Ｎ−１〜Ｎ−６）からのＰＢＭＣは次の合成ペプチドを使用して刺激した：１−ＨＢｃＡｇ１８−２７、２＝ＨＢｓＡｇ２０１−２１０、３＝ＨＢｓＡｇ２５１−２５９、４＝ＨＢｓＡｇ２６０−２６９、５−ＨＢｃＡｇ３３５−３４３、６＝ＨＢｓＡｇ３３８−３４７、７＝ＨＢｓＡｇ３４８−３５７、８＝ＨＢｓＡｇ３７８−３８７。
【図４】ＨＬＡ−Ａ２．１競合結合阻害アッセイの結果を示し、４時間の51Ｃｒ解放アッセイにおけるＨＢｃＡｇ１８−１７特異的溶解の阻害％として表されている。
【図５】ＨＢｃＡｇ３３５−３４３およびＨＢｓＡｇ３４８−３５７に対するＣＴＬ応答が、それぞれ、グループ特異的およびサブタイプ特異的であること、および合成ペプチドが、また、感染細胞内の大きい、中程度および主要なＨＢＶエピトープのポリペプチドの内因性処理により発生するエピトープを含有することを図解する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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