(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)細胞増殖に好適な条件下で、所定の時間、３次元骨格上で細胞を培養し、接種された骨格上に細胞外マトリックスを分泌させて、コートされた骨格を作製し、
(b)該細胞を死滅させ、そして、
(c)該細胞及び細胞片を除去する
ことを含む、自然分泌細胞外マトリックスでコートされた３次元骨格を製造する方法。
【請求項２】
前記３次元骨格が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、サーマノクス、ニトロセルロース、コットン、ポリグリコール酸、腸線縫合糸材、セルロース、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸及びデキストランからなる群より選択される物質から作製される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記３次元骨格が約150μｍ〜約220μｍの孔隙を有する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記細胞外マトリックスが組織特異的細胞により分泌される請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞外マトリックスが、繊維芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、網膜細胞、内皮細胞、間質細胞からなる群より選択され細胞又はそれらの組み合わせにより分泌される請求項１記載の方法。
【請求項６】
(a)細胞増殖に好適な条件下で、所定の時間、３次元骨格上で細胞を培養し、接種された骨格上に細胞外マトリックスを分泌させて、コートされた骨格を作製し、
(b)該細胞を死滅させ、
(c)該細胞及び細胞片を除去し、そして、
(d)コートされた骨格上に堆積した細胞外マトリックスを回収する
ことを含む、自然分泌細胞外マトリックスを製造する方法。
【請求項７】
前記３次元骨格が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、サーマノクス、ニトロセルロース、コットン、ポリグリコール酸、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸及びデキストランからなる群より選択される物質から作製される請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記３次元骨格が約150μｍ〜約220μｍの孔隙を有する請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記自然分泌細胞外マトリックスが組織特異的細胞により分泌される請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記自然分泌細胞外マトリックスが、繊維芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、網膜細胞、内皮細胞、間質細胞からなる群より選択される細胞又はそれらの組み合わせにより分泌される請求項６記載の方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法により製造される、ヒトタンパク質で構成される自然分泌細胞外マトリックスでコートされた３次元骨格を含む組成物。
【請求項１２】
前記骨格が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、サーマノクス、ニトロセルロース、コットン、ポリグリコール酸、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸及びデキストランからなる群より選択される物質から作製される請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記３次元骨格が約150μｍ〜約220μｍの孔隙を有する請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
前記自然分泌細胞外マトリックスが組織特異的細胞により分泌される請求項１１記載の組成物。
【請求項１５】
前記自然分泌細胞外マトリックスが、繊維芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、網膜細胞、内皮細胞、間質細胞からなる群より選択される細胞又はそれらの組み合わせにより分泌される請求項１１記載の組成物。
【請求項１６】
ヒト自然分泌細胞外マトリックス及び医薬的に許容される担体を含む、組織欠損の治療のために注射することのできる自然分泌細胞外マトリックス組成物。
【請求項１７】
前記自然分泌細胞外マトリックスが、
(a)細胞増殖に好適な条件下で、所定の時間、３次元骨格上で細胞を培養し、接種された骨格上に細胞外マトリックスを分泌させて、コートされた骨格を作製し、
(b)該細胞を死滅させ、
(c)該細胞及び細胞片を除去し、
(d)コートされた骨格上に堆積した自然分泌細胞外マトリックスを回収し、そして、
(e)回収された細胞外マトリックスを医薬的に許容される担体を用いて加工する
ことによって製造される請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
別の組織又は細胞型により分泌された自然分泌細胞外マトリックスを(d)工程と(e)工程の間で混合して、コラーゲンＩ〜Ｖ型のそれぞれお互いの比率を調整する請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
前記骨格が、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、サーマノクス、ニトロセルロース、コットン、ポリグリコール酸、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、キトサン、ヒアルロン酸及びデキストランからなる群より選択される物質から作製される請求項１６記載の組成物。
【請求項２０】
前記３次元骨格が約150μｍ〜約220μｍの孔隙を有する請求項１６記載の組成物。
【請求項２１】
前記自然分泌細胞外マトリックスが組織特異的細胞により分泌される請求項１６記載の組成物。
【請求項２２】
前記自然分泌細胞外マトリックスが、繊維芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、軟骨細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、網膜細胞、内皮細胞、間質細胞からなる群より選択される細胞又はそれらの組み合わせにより分泌される請求項１６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本出願は、１９９５年６月６日に出願された米国特許出願第08/470,101号の一部継続出願であり、前記出願の全体は参考として本明細書中に含まれる。
１．序文
本発明は、しわ及び瘢痕などの軟組織及び皮膚欠損の治療及び修復のための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、注射することのできるヒト細胞外マトリックス成分の組成物並びにその調製方法及び使用方法に関する。注射することのできる該調製物は、in vitroで調製される３次元生体間質組織から得られる。
２．発明の背景
軟組織の増強及び修復のために注射することのできる材料を使用するという観念は、皮下注射針の発明の後すぐに開発された。パラフィン、ワセリン、植物油、ラノリン、みつろう及びシリコンなどの様々な製品が、軟組織及び皮膚欠損の修正のために人体中に注射されてきた。注射可能な液体シリコンは広く使用されてきたが、現在さらに綿密に追及されている皮膚潰瘍、再発性蜂巣炎及び小節などの長期に渡る副作用のため、注射可能なシリコンの使用は控えられている。さらに、ネバダ州では、ヒトに対して注射可能なシリコンを使用する行為は重罪である（Orange,Skin and News(1992)Vol.23,No.6,pg.1）。さらに最近では、軟組織増強のための注射可能な材料としてウシコラーゲンが広く使用されるようになってきている。コラーゲンは動物の体の主要な細胞外構造タンパク質である。少なくとも１４種の型の哺乳動物コラーゲンが文献に記載されている。それらに共通の特徴は、３本のポリペプチド鎖からなる三本鎖ヘリックスであり、これはα鎖と呼ばれる。全てのα鎖は同一の配座を有するが、アミノ酸の組成及び配列が異なる。この相違によりα鎖のそれぞれの型に別れるのであるが、しかし、全ての型は、アミノ酸配列において２つおきにグリシンを有する。２つおきに存在するこのグリシンによって、α鎖はヘリックス構造をとる。コラーゲンＩ型は、２つのα1鎖と１つのα2鎖とから構成され、皮膚、腱及び骨の主要な細胞外材料である。臨床医が「コラーゲン」と言うときは、普通はコラーゲンＩ型を意味する。コラーゲンＩ〜Ｖ型の詳細な一覧表及びそれらが見い出される組織については、後掲の表１を参照されたい。
コラーゲンは、皮膚、腱、軟骨、骨及び間隙などの硬結合組織又は軟結合組織を置換又は増強させるための移植材料として使用される。さらに、コラーゲンはその配置部位における細胞性内殖を助長することができるので、コラーゲン移植片はここ数年美容の目的に使用されている。初期のコラーゲン移植片は固体コラーゲン塊であることが多く、これは化学薬品、放射、或いは機械的特性を向上させ、免疫原性を減少させ及び／又は吸収に対する抵抗性を増強させる他の手段と架橋していた。利用されるコラーゲンは、架橋及び非架橋繊維性コラーゲン、ゼラチンその他、様々な形状であり、用途に応じて潤滑剤、骨原性因子その他、種々の他成分と組み合わせることもあった。固体架橋コラーゲン移植片の主要な欠点は、切開手段による外科的移植を必要とすることである。さらに、変形性及び柔軟性の欠落も、固体コラーゲン移植片の欠点である。
Oliverら,Clinical Orthopaedics & Related Research(1976)115:291-302;Br.J.Exp.Path.(1980)61:544-549;及びConn.Tissue Res.(1981)9:59-62には、皮膚をトリプシンで処理した後にアルデヒドで架橋することにより作製される移植片が記載されている。このようにして得られる固体コラーゲン移植片は、長い移植期間の後にも当初の量を維持することが報告された。このような固体移植片を持つ主要な問題は、それらを外科的に移植しなければならないということである。また、固体移植片は注射可能な移植片に比べて変形性が低い点、及び残存グルタルアルデヒドがin situで架橋反応を続けるため、柔軟性が失われるという点も欠点である。
Schechterら,Br.J.Plas.Surg.(1975)28:198-202では、架橋の後にＬアラニンに浸漬したグルタルアルデヒド架橋皮膚が開示されている。該文献によれば、皮膚をＬアラニンに曝すことにより、残存するアルデヒドの反応性基がブロックされ、これにより、そのような基によって生成される毒性分子の放出を防止できることが示される。
外科的に移植される固体コラーゲン材料に代わるものが米国特許第3,949,073号に開示されている。米国特許第3,949,073号には、ウシコラーゲンのアテロペプチド溶液の、軟組織を増強させる注射可能な移植片材料としての使用が記載されている。該特許によれば、ウシコラーゲンを移植前に再構成し、移植したときに組織の繊維状塊を形成させる。該特許では、増強部位において形成される繊維状塊の縮小を制御するために、不溶性ウシコラーゲン微小繊維の粒子を添加することが提案されている。該特許に記載されている材料の商業的態様は、少量の局所麻酔薬を含有する生理食塩水中の再構成アテロペプチドウシコラーゲンにより構成される。効力を有してはいるが、該移植片は移植後に容量が縮小する。これは主に、その液体成分が体に吸収されるからである。従って、容量一貫性が必須であれば、補充のための移植片材料をさらに１回若しくは複数回注射する必要がある。この特定の組成物には多くの一連の欠点がある。例えば、該コラーゲンはウシ由来のものであってヒト由来ではない。さらに、調製工程が長くて費用が高いだけでなく、微小繊維を添加する必要がある。
米国特許第4,424,208号には、架橋アテロペプチドウシコラーゲンの注射可能な分散剤、及び水性担体中の再構成アテロペプチドウシコラーゲン繊維が記載されており、これは米国特許第3,949,073号の材料に比べて容量一貫性が改良されている。
米国特許第4,582,640号では、米国特許第3,949,073号及び第4,424,208号に比べて改良された注射可能な移植片が開示されている。これは、改良された容量一貫性及び物理的変形に対する抵抗性、米国特許第4,424,208号の分散剤に比べて改良された注射可能性といった改良点を持ち、さらに、米国特許第4,424,208号のウシコラーゲンが２種の物理的形状のコラーゲンを含むのに対して、単一の物理的形状のコラーゲンのみを含んでいる。
米国特許第4,803,075号には、軟組織修復のために狭い径の針を通して注射できるようにするための潤滑剤を含有するウシコラーゲン組成物が記載されている。
上記の注射可能なコラーゲン移植片材料は利点を有し、全体的に有用であるにもかかわらず、該材料の製造及び注射に関連する問題がある。例えば、軟組織修復のためには、繊維性コラーゲンの懸濁液を使用することが多く、その組成物を微細ゲージのついた針を通して治療部位に注射する。注射可能な軟及び硬組成移植片組成物中の主要なマトリックス材料として繊維性コラーゲンを使用する場合には、幾つかの制限がある。ヒトに使用するのに適した繊維性コラーゲンを調製するには、比較的時間と費用がかかる。特に、アテロコラーゲンを製造するときに、混入物質及び潜在的な免疫原性物質を除去するのは、比較的複雑で費用のかかる操作である。さらに、繊維性コラーゲン組成物の持続性、形状保持性、凝集性、安定性、順応性、強固性及び侵入可能性は最適ではない。
コラーゲン移植片材料の製造及び注射に関連する問題に加え、上記の特許に係る注射可能な移植片の実際の使用に関する問題もまた多い。例えば、上記特許に係る注射可能物は異種の供給源からコラーゲンを得、通常はウシコラーゲンであるため、コラーゲンを改変してその免疫原性を減少させなければならない。改変したコラーゲンを用いたとしても、移植片材料はほとんど免疫原性を有したままであり、これに対し、元来すでにアレルギー性であるか、時間を経るごとにこのウシコラーゲンに対するアレルギー反応を発現する人もいる。これらのアレルギー反応のために、多くの人には上述の注射可能なコラーゲン移植片を使用できず、その他の人の場合にも年間３回のみの注射に限られる。重篤なアレルギー反応としてはリウマチ様関節炎の症状が挙げられる。一方、重篤度の低い反応としては注射部位における赤み及び膨張が挙げられ、これは不変の瘢痕となる可能性がある。これらの重篤な副作用があるため、上述のコラーゲン注射可能物は唇の増強には使用されなくなっている。さらに、異種コラーゲンの注射に関連する問題は手に負えないため、コラーゲンを注射するよりも、むしろ生物学的適合性を有するセラミックのマトリックスを、米国特許第5,204,382号に記載されたのと同様の結果を達成するために注射している。
まとめて言えば、持続性の欠落などの、軟組織の修復用の上述の注射可能な組成物の欠点、注射を繰り返し行う必要性及び有害な反応に関する深刻な懸念のために、軟組織増強のための新たな注射可能な材料が必要とされている。
３．発明の概要
本発明は、軟組織増強のための注射可能な材料並びにその使用方法及び製造方法に関し、先行技術である注射可能なウシコラーゲン及びシリコン等の他の注射可能な材料が有する欠点を克服するものである。本発明に従って使用される注射可能な材料は、自然分泌細胞外マトリックス調製物並びに自然分泌細胞外マトリックス由来の調製物を含む。これらの調製物は生物学的適合性及び生分解性を有し、結合組織の堆積、血管新生、再上皮形成及び繊維増殖を促進することができる。このことは、皮膚及び他の組織の欠損を修復するのに有用である。これらの細胞外マトリックス調製物は、欠損部位に注射することにより組織欠損の修復に用いてもよい。
本発明の注射可能な調製物は、皮膚欠損の修復に用いられていた従来の注射可能なコラーゲン調製物に比べて多くの利点を持つ。本発明の細胞外マトリックス調製物はヒトタンパク質のみを含有し、従って、外来タンパク質又はペプチドに起因する免疫応答、特に従来の注射可能なコラーゲン調製物に見い出されたウシコラーゲンに見られる型の免疫応答の危険性が減少する。さらに、本発明の注射された調製物はより長く持続し、たとえ複数回の注射が必要な場合でも、免疫原性が無いため、ウシコラーゲンを主成分とする調製物を用いるときのような「注射は年間３回以内」という規則に従わなくてもよい。本発明のもたらす他の利点は、天然細胞外マトリックスの調製物が、生理学的に正常な条件の組成物に酷似する細胞外マトリックスタンパク質の混合物を含むということであり、例えば、表皮細胞由来の細胞外マトリックス中にはコラーゲンI型及びIII型、ヒアルロン酸並びに種々のグリコサミノグリカン及び自然増殖因子が存在する。これらの細胞外マトリックスタンパク質の多くは広く研究されており、傷の治癒及び組織回復のためには重要であることが示されている。
本発明の他の態様では、前記調製物をin vitro組織培養のための高度に改良された系で使用することができる。本態様では、自然分泌細胞外マトリックスでコートされた３次元骨格を使用して、増殖のために支持体への付着を必要とするが従来の組織培養容器には付着しない細胞を培養することができる。コートされた骨格上での細胞の培養に加えて、該細胞により骨格上に分泌された細胞外マトリックスを回収し、これを用いて組織培養に使用するための容器をコートすることができる。基盤基質として作用する該細胞外マトリックスによれば、通常は従来の組織培養皿基盤基質に付着できない細胞を付着させ、続いて増殖させることができる。
本発明の更に別の態様は、特定の細胞の細胞性走性の能力を測定する新規方法である。該方法は、天然細胞外マトリックスでコートされた３次元骨格の一端に問題の細胞型を接種し、該細胞が前記骨格を横切った距離を経時的に測定することを含む。該細胞外マトリックスは細胞により骨格上に自然に分泌されるものであるので、体内で見られる細胞外マトリックスの優れたin vitro等価物である。このようなアッセイにより、例えば、単離した腫瘍細胞が転移性かどうか、又はある免疫細胞が骨格を横切って移動するかどうか若しくは更に走化性を有するかどうかをも知ることができ、従って、その細胞がこのような細胞性走性能力を有するかどうかを示すことができる。
３．１．定義及び略語
本明細書中で用いられる以下の用語の意味を示す。
接着層：
３次元骨格に直接付着した細胞、又はマトリックスに直接付着した細胞への付着により間接的に結合した細胞。
医薬的に許容される担体：
生理学的な等張性及びpHを有する水性溶媒であり、局所麻酔薬及び／又は液体潤滑剤などの他の要素を含んでいてもよい。
間質細胞：
疎繊維性結合組織中に見られる他の細胞及び／又は要素を持つ又は持たない繊維芽細胞であり、他の細胞及び／又は要素としては内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
３次元骨格：
以下の（ａ）及び（ｂ）を満たす材料及び／又は形で形成される３次元支持体。
（ａ）細胞が付着できる（又は、細胞が付着できるように改変可能である）。
（ｂ）細胞が複数の層で増殖できる。
この支持体に間質細胞を接種して生体間質マトリックスを形成する。
生体間質組織：
間質細胞を接種してある３次元骨格。集密であっても、準集密であっても、本発明の間質細胞は増殖及び分裂を続ける。in vitroで調製された生体間質組織は、本発明の注射可能な製剤に使用される細胞外マトリックスタンパク質の供給源である。
以下の略語の意味を示す。
ＥＤＴＡ            エチレンジアミン四酢酸
ＦＢＳ              ウシ胎児血清
ＨＢＳＳ            ハンクス平衡化塩溶液
ＨＳ                ウマ血清
ＭＥＭ              最小必須培地
ＰＢＳ              リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭＩ  １６４０  Roswell Park Memorial Institute Medium No.1640（GIBCO,Inc.,Grand Island,NY）
SEM               走査型電子顕微鏡
本発明は、以下の詳細な説明、特定の態様の実施例及び添付した図面を参照することにより、より完全に理解することができるが、これらは説明のみを目的とするものであり、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
図１：図１は、３次元マトリックスへの繊維芽細胞の付着及びメッシュの空隙を横切る細胞性突起の伸長を示す走査型電子顕微鏡写真である。繊維芽細胞は活発にマトリックスタンパク質を分泌しており、準集密の適切な段階にある。これは組織特異的細胞の接種の前に達成されなければならない。
図２Ａ−Ｄ：図２Ａ−Ｄは、in vitroで増殖させた皮膚組織から調製した細胞外マトリックスより単離されるコラーゲン（図２Ａ−Ｂ）、又は正常成人ヒト皮膚サンプルより単離されるコラーゲン（図２Ｃ−Ｄ）の透過型電子顕微鏡写真である。
５．発明の詳細な説明
本発明の一つの態様では、皮膚欠損の治療のための注射可能な細胞外マトリックス組成物の調製及び使用が含まれる。細胞外マトリックスタンパク質は、間質細胞を３次元骨格上で増殖させて重層細胞培養系とすることによりin vitroで調製された生体間質組織から得られる。従来の組織培養系では、細胞は単層で増殖していた。本発明に従って３次元骨格支持体上で増殖させた細胞は、重層で増殖し、細胞性マトリックスを形成する。このマトリックス系は、以前に記述されている単層組織細胞系に比べて、in vivoで見られる生理学的条件により近づいたものである。この３次元細胞培養系は、別の型の間質細胞の増殖及び幾つかの異なる間質組織の形成に適用することができ、該間質組織としては、限定するわけではないが、真皮、骨髄間質、グリア組織、軟骨を、少数ではあるが挙げることができる。
本発明によれば、前もって樹立した生体間質組織は、３次元骨格又は網状体上で増殖させた間質細胞を含む。該間質細胞は、ここでより完全に記載する更に別の細胞及び／又は要素を伴う又は伴わない細胞芽細胞を含むことができる。間質を構成する繊維芽細胞及び他の細胞及び／又は要素は、この起源が胎児でも成体でもよく、皮膚、肝臓、膵臓など、都合のよい供給源から得ることができる。このような組織及び／又は器官は適切なバイオプシーにより又は検屍において得ることができる。実際には、死体の器官を用いて間質細胞及び要素を豊富に供給してもよい。
いったん３次元骨格上に接種されると、間質細胞は該骨格上に増殖し、増殖因子、調節因子及び支持体上に堆積する細胞外マトリックスタンパク質を合成する。生体間質組織は、培養物の活発な増殖を長期間に渡って持続させる。増殖因子及び調節因子は培養物に添加することもできるが、それらは間質支持マトリックスにより合成されるので、添加は不要である。
自然分泌細胞外マトリックスは３次元骨格から回収され、さらに医薬的に許容される水性担体で加工され、生体材料を顔真皮などの組織へ正確に配置するためのシリンジに収納する。
本発明は、部分的に、ヒト間質細胞が生分解性又は非生分解性３次元支持骨格上で増殖する間に、該細胞は正常ヒト組織中で生成されるヒト細胞外マトリックスを合成して３次元支持骨格上に堆積させるという発見に基づいている。細胞外マトリックスは細胞により局所的に分泌され、細胞と組織とを結合させるだけでなく、接触する細胞の成長及び挙動に影響を与える。細胞外マトリックスは種々の繊維形成タンパク質を含んでおり、該タンパク質はグリコサミノグリカン鎖の網状組織で構成される水和ゲル中で絡み合っている。グリコサミノグリカンは負の電荷を持つ長い多糖鎖の不均一群であって、タンパク質と共有結合してプロテオグリカン分子を形成する（ヒアルロン酸を除く）。
繊維形成タンパク質には２つの機能型がある：主に構造的機能を有するもの（コラーゲン及びエラスチン）及び主に接触機能を有するもの（フィブロネクチン及びラミニンなど）である。繊維性コラーゲン（I型、II型及びIII型）はロープ様の三本鎖ヘリックス分子であり、細胞外スペースにおいて集合して長いケーブル様小繊維となる。そして、今度はそれらが集合して、高度な秩序を持つ種々の配列となる。IV型コラーゲン分子は集合してシート様の網目体となり、これは全ての基底膜の中心部を形成する。エラスチン分子は繊維及びシートの広い架橋網状組織を形成しており、これは伸びたり丸まったりすることができ、マトリックスに弾力性を与える。フィブロネクチン及びラミニンはマトリックス中の大型の接着性糖タンパク質の例である。フィブロネクチンは結合組織中に広く分布しているが、ラミニンは主に基底膜中に見出される。それらの多重結合ドメインによって、このようなタンパク質は細胞が細胞外マトリックスに接着され、組織化されるのを助長する。
例を挙げると、自然分泌ヒト皮膚細胞外マトリックスはI型及びIII型コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン、グリコサミノグリカン、酸性及び塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、ＫＧＦ、デコリン及び他の種々の分泌ヒト皮膚マトリックスタンパク質を含有する。自然分泌産物として、種々の細胞外マトリックスタンパク質が、in vivoで存在しているものと似た量及び比率で生成される。さらに、３次元での間質細胞の増殖は、単層系に比べてはるかに長い期間に渡って、培養物中の細胞の活発な増殖を持続させる。さらに、３次元系はin vitroでの培養物中の細胞の成熟、分化及び分離を支持し、in vivoに見出される対応物に類似の成熟組織の成分を形成させる。従って、培養物中の細胞によって作り出された細胞外マトリックスは、天然組織により類似している。
本出願人には、本発明が機能する機構を説明しなければならない義務も理由も無いが、３次元培養系において本質的な因子の幾つかは、３次元培養系の以下の特性によるかもしれない。
（ａ）３次元骨格は、タンパク質の付着のための、結果的には間質細胞の接着のためのより広い表面積を提供する。
（ｂ）該骨格は３次元なので、間質細胞は活発に増殖し続ける。これは、増殖して合流し、接触阻害を起こし、増殖及び分化を終了する単層培養物中の細胞とは対照的である。間質細胞の複製による増殖因子及び調節因子の合成は、部分的には、培養物中の細胞の増殖の刺激及び分化の調節を担っているかもしれない。
（ｃ）３次元骨格により、in vivoの対応組織中でのものにより類似した細胞性要素の空間的分布が実現される。
（ｄ）３次元系中の細胞増殖のための潜在的容量の増加により、in vivoで見出される天然の対応物に類似した局所的微環境を樹立することができる。
（ｅ）３次元マトリックスを用いる場合には、接着層中のマクロファージ、単球及び（恐らく）リンパ球などの遊走細胞の移動能が大きくなることにより、細胞−細胞相互作用が最大となる。
（ｆ）分化細胞の表現型の維持には、増殖／分化因子だけでなく、適切な細胞性相互作用も必要となることが認められている。本発明は間質組織微環境を効果的に作り直す。
以下のサブセクションでは、３次元間質支持体、培養系それ自体、及びその維持、並びに３次元培養物及び自然分泌細胞外マトリックスの種々の用途について、さらに詳細に記載する。ただ単に説明の便宜のために、発明の詳細な説明を(i)３次元間質細胞培養物の増殖、(ii)自然分泌ヒト細胞外マトリックスの単離、及び(iii)単離した細胞外マトリックスの、軟組織欠損の部位に注射するための調製物への製剤化の三節に分割する。
５．１．IN VITROでの生体間質組織の調製
間質組織の培養に使用する３次元支持体は、以下の（ａ）及び（ｂ）を満たす材料及び／又は形で出来ている。
（ａ）細胞が付着できる（又は、細胞が付着できるように改変可能である）。
（ｂ）細胞が複数の層で増殖できる。
生分解性又は非生分解性材料のような、幾つかの異なる材料を用いて該骨格を形成してもよい。例えば、非生分解性材料としては、ナイロン（ポリアミド）、ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル酸塩、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（PVC）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE;テフロン）、サーマノクス（TPX）などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、生分解性材料を使用してもよく、ニトロセルロース、コットン、ポリグリコール酸（PGA）、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、デキストラン、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。生分解性又は非生分解性のこれらの材料のいずれかを編み合わせてメッシュにし、３次元骨格を形成することができる。或いは、これらの材料を用いて、他の型の３次元骨格、例えば、コラーゲンスポンジなどのスポンジを形成することができる。
ナイロン、ポリスチレンなどのように、ある材料は細胞性付着しにくい基質である。このような材料を３次元支持骨格として用いる場合には、間質細胞を接種する前に該骨格を前処理して、間質細胞の該骨格への付着を増強したほうがよい。例えば、間質細胞の接種の前に、ナイロン骨格を0.1M酢酸で処理し、ポリリシン、FBS及び／又はナイロンをコートするためのコラーゲン中でインキュベートすることができる。ポリスチレンも同様に硫酸を用いて処理することができる。本発明に従って使用することのできる好適なナイロンメッシュはNitexであり、これは平均孔サイズが２１０μｍであり、平均ナイロン繊維直径が９０μｍであるナイロン濾過用メッシュ（#3-210/36,Tetko,Inc.,N.Y.）である。
以下に記載する他の細胞及び要素を伴う又は伴わない、成体又は胎児組織由来の繊維芽細胞を含む間質細胞を、該骨格に接種する。これらの繊維芽細胞は、バイオプシーにより又は、それが適当であれば、検屍により入手可能な皮膚、肝臓、膵臓などの器官由来のものであってもよい。実際には、繊維芽細胞は適当な死体の器官からの方がむしろ量的に都合よく得ることができる。好ましい態様においては、胎児繊維芽細胞は包皮から大量に得ることができる。
繊維芽細胞は、その供給源となる適当な器官又は組織を拡散することにより容易に単離することができる。これは、当業者に公知の技術を用いて容易に行うことができる。例えば、組織又は器官を機械的に拡散し、及び／又は、隣接する細胞間の結合を弱めることにより細胞を大幅に破壊することなく組織を分散させて個々の細胞の懸濁液とすることのできる消化酵素及び／又はキレート剤で処理することができる。酵素的解離は、組織を細かく切り、幾つかの消化酵素のいずれかを単独で又は組み合わせて用いて細かく切った組織を処理することにより行うことができる。これらの例としては、トリプシン、キモトリプシン、コラーゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、及び／又はディスパーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。機械的破壊は、僅かではあるが例を挙げると、グラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、受圧器、又はインソネーターの使用などの幾つかの方法によって行うことができるが、これらの方法に限定しない。組織拡散技術の検討のためには、Freshney,Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Techniques,2nd Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.9,pp.107-126を参照されたい。
いったん組織を個々の細胞の懸濁液にまで分解したら、該懸濁液をサブ集団に分画することができ、そのサブ集団から繊維芽細胞及び／又は他の間質細胞及び／又は要素を得ることができる。これもまた細胞分離の標準的な技術を用いて行うことができ、例えば、特定の細胞型のクローニング及び選択、対象としていない細胞の選択的破壊（陰性選択）、混合集団中での細胞凝集力の差異に基づく分離、凍結−解凍操作、混合集団中での細胞の接着特性の差異、濾過、従来の遠心およびゾーン遠心、遠心溶離（逆流遠心）、単位重力分離（unit gravity separation）、逆電流分布、電気泳動及び蛍光活性化細胞挿入が挙げられるが、これらに限定されない。クローン選択及び細胞分離技術の検討のためには、Freshney,Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Techniques,2nd Ed.,A.R.Liss,Inc.,New York,1987,Ch.11及びCh.12,pp.137-168を参照されたい。
繊維芽細胞の単離は、例えば、以下のように行うことができる。新鮮な組織サンプルを徹底的に洗浄し、ハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）中で細かく切ることにより血清を除去する。細かく切った組織は、新たに調製したトリプシン等の解離酵素の溶液中で、１〜１２時間インキュベートする。インキュベートの後に、解離した細胞を懸濁させ、遠心分離によりペレット化し、培養皿の上に撒く。他の細胞よりも先に、全ての繊維芽細胞が付着し、従って、適切な間質細胞を選択的に単離して増殖させることができる。次に、単離した繊維芽細胞を増殖させて密集させ、該密集培養物から取り出して３次元骨格上に接種することができる（Naughtonら,1987,J.Med.,18(3及び4):219-250を参照されたい。）。高濃度の間質細胞、例えば約１０6から５×１０7細胞／ml、を３次元骨格に接種すると、より短期間で３次元間質支持体を樹立できる。
繊維芽細胞に加えて、他の細胞も添加して、３次元間質細胞培養物を生産する細胞外マトリックスを形成することができる。例えば、疎繊維性結合組織中に見られる他の細胞を、繊維芽細胞と共に３次元支持骨格上に接種してもよい。このような細胞としては、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、形質細胞、マスト細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの間質細胞は、上述したような公知の方法を用いて、皮膚、肝臓などの適切な器官から容易に得ることができる。
本発明の一つの態様においては、培養すべき特定の組織に対して特殊化された間質細胞を繊維芽細胞間質に添加して、組織型特異的細胞外マトリックスを産生させることができる。例えば、皮膚繊維芽細胞を用いて、in vitroで皮膚特異的細胞外マトリックスを産生させるための３次元準集密間質を形成することができる。或いは、造血組織の間質細胞、例えば、限定するわけではないが、繊維芽内皮細胞、マクロファージ／単球、脂肪細胞及び網状細胞、を用いて、in vitroで骨髄特異的細胞外マトリックスを産生させるための３次元準集密間質を形成することができる（後述）。造血間質細胞は、骨髄懸濁液中で形成される「バフィーコート」（"buffy coat"）から、弱い力、例えば3000×ｇ、での遠心分離により容易に得ることができる。肝臓の間質細胞としては、繊維芽細胞、クップファー細胞、並びに血管及び胆管内皮細胞が挙げられる。同様にして、グリア細胞を用いて、神経学的細胞及び組織の増殖を支持することができる。この目的のためのグリア細胞は、胎児又は成体の脳をトリプシン処理又はコラーゲナーゼ消化することにより得ることができる。PontenとWestermark,1980,In Federof,S.Hertz,L.,編,「細胞神経生物学における進歩」（"Advances in Cellular Neurobiology"）,第１巻,New York,Academic Press,pp.209-227を参照されたい。
in vivoで使用する場合には、間質細胞を患者自身の細胞から得ることが好ましい。３次元間質支持骨格の存在下での細胞の増殖は、タンパク質、例えば、コラーゲン、弾性繊維、網状繊維、糖タンパク質；グリコサミノグリカン、例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、硫酸デルマタン、硫酸ケラタンなど；細胞性マトリックス、及び／又は他の材料を、該骨格に添加するか、又はこれらで該骨格支持体をコートすることによって、さらに増強することができる。
間質細胞の接種の後に、該３次元骨格を適当な栄養培地中において、細胞増殖に好ましい、すなわち有糸分裂つまり細胞分裂を促進する生理学的条件下でインキュベートする。RPMI 1640、フィッシャー培地、イスコフ培地、マッコイ培地などの、多くの市販の培地が使用に適している。３次元間質培養物は、増殖活性が最大となるように、インキュベーション期間中は培地中で懸濁するか又は浮遊させることが重要である。さらに、該培養物は、効力の無くなった培地を除去し、集団から外れた遊離細胞を除去し、そして新鮮な培地を加えるために、定期的に「フィード」（be "fed"）すべきである。
インキュベーション期間中では、間質細胞は、３次元骨格の空隙中に増殖し始める前に、該骨格に沿って線形的に及び該骨格を包むように増殖するであろう。該細胞は、細胞外マトリックスタンパク質が適切に堆積するように、適度に増殖させる。
骨格の空隙は、間質細胞が該空隙を横切って伸びることができるような適当な大きさであるべきである。該骨格を横切って伸びる、活発に増殖している間質細胞を維持すれば、間質細胞によって合成される増殖因子の産生が増強され、それによって、長期間の培養が支持される。例えば、もし前記空隙が小さすぎると、間質細胞は急激に集密状態に達するが、容易にはメッシュから抜け出せないかもしれない。トラップされた細胞は接触阻害を起こし、増殖を支持して長期培養を維持するのに必要な適当な因子を産生しなくなる可能性がある。もし前記空隙が大きすぎると、間質細胞が該空隙を横切って伸びることができない。これもまた、増殖を支持して長期培養を維持するのに必要な適当な因子の、間質細胞による産生を減少させるだろう。マトリックス型のメッシュを使用する場合には、本明細書中に例示するように、約１５０μｍ〜約２２０μｍの範囲の空隙が十分に機能するであろうことが見出された。しかし、３次元構造体及び骨格の複雑さによっては、他の大きさでも同じようにうまく機能するかもしれない。実際には、間質細胞が伸びて、複製を続け、そして長い期間に渡って増殖できる形及び構造であれば、いずれのものでも本発明にしたがって働くであろう。
骨格上に堆積した種々の型のコラーゲンの比率は、異なる組織特異的細胞を該骨格に接種することにより変化させることができる。例えば、造血細胞の場合には、マトリックスはコラーゲンIII型、IV型及びI型を、初期マトリックス中においておおよそ６：３：１の比で含むのが好ましい。皮膚の場合には、コラーゲンI型及びIII型は、好ましくは初期マトリックス中に堆積する。堆積するコラーゲン型の比率は、適切な細胞外マトリックスタンパク質を合成する繊維芽細胞を選択することにより、操作し又は増強することができる。これは、補体を活性化することができ、且つ特定のコラーゲン型を特定する適切なアイソタイプ又はサブクラスのモノクローナル抗体を用いて達成することができる。これらの抗体を補体と組み合わせて使用して、所望のコラーゲン型を発現する繊維芽細胞を消極的に選択することができる。或いは、骨格に接種する問質が、所望の適切なコラーゲン型を合成する細胞の混合物であってもよい。５つの型のコラーゲンの分布及び起源を表１に示す。
0003709487.tif 000002
従って、所望のコラーゲン型によって、適切な間質細胞（単数又は複数）を選択して、３次元骨格に接種することができる。
本発明の培養物を産生させる３次元細胞外マトリックスは、in vivoで遺伝子産物を導入するためのビヒクルを供給する。ある状況では、外来遺伝子産物、増殖因子、調節因子などを含有する細胞外マトリックスを調製することが望ましい。このような場合には、該細胞を遺伝子操作し、遺伝子産物、又は間質細胞により蓄積される細胞外マトリックス中に固定化される別の型の遺伝子産物を発現させる。例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて、対象の遺伝子を誘導プロモーターの制御下に置くことができる。該遺伝子を含有する組換えＤＮＡ構築物を用いて宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトすることができ、これをクローン化してから３次元培養系中でクローンが増加する。このような３次元培養物の使用には、幾つかの利点がある。第一に、該培養物は真核細胞を含むので、遺伝子産物が正確に発現され、培養物中で加工されて活性産物を形成する。第二に、トランスフェクトされた細胞の数を実質的に増加させ、臨床上有価で、適当で、有用な数とすることができる。本発明の３次元培養物によれば、トランスフェクトされた細胞の数の増加及びトランスフェクトされた細胞の増幅（細胞分裂による）が可能となる。
好ましくは、使用する発現制御要素は、培養物中で産物を過剰に合成できるように調節した遺伝子発現を可能にするものであるべきである。選択する転写プロモーターは、一般的に、そしてプロモーター要素に特異的に、培養する組織及び細胞の型に部分的に依存する。タンパク質を分泌することのできる細胞及び組織（例えば、豊富な粗面小胞体及びゴルジ複合体により特徴付けられるもの）が好ましい。
３次元培養物のインキュベーション中は、増殖細胞が骨格から遊離する。これらの遊離細胞は培養容器の壁に貼り付くことができ、そこで増殖し続け、集密の単層を形成することができる。これは、例えば、フィード中に遊離細胞を除去することにより、又は３次元骨格を新しい培養容器に移転することにより、防止又は最小に抑えるべきである。容器内に集密単層が存在すると、３次元骨格及び／又は培養物中の細胞の増殖が「遮断」（"shut down"）される。集密単層を除去するか、又は新たな容器に入った新鮮な培地に間質培養物を移転すると、３次元培養系の増殖活性は回復するだろう。このような除去又は移転は、間質単層の集密が２５％を超えたいずれの培養容器においても行うべきである。或いは、培養系を、遊離細胞が貼り付くのを防止するように配慮することができ、又は、定期的に培養物をフィードする代わりに、新鮮な培地が系中を継続的に流れるように培養系を構成することができる。流速は、３次元培養物中での増殖を最大にするように、そして、マトリックスから遊離した細胞が容器の壁に貼り付いて増殖して密集しないようにそれらを洗浄除去するように調整することができる。いずれの場合でも、遊離間質細胞を回収して、将来の使用に備えて低温保存することができる。
いったん３次元骨格上に接種すると、繊維芽細胞の接着はすぐに（例えば、１時間以内）見られ、繊維芽細胞は数日のうちに骨格空隙を横切って伸び始める。これらの繊維芽細胞は代謝活性を有しており、細胞外マトリックスを分泌し、活性な繊維芽細胞及びコラーゲンからなる皮膚等価物を急激に形成する。
図１は、繊維芽細胞が自然分泌コラーゲン管束の間の平行層中に並ぶ能力を示す。これらの繊維芽細胞は、急激な細胞分裂及びタンパク質分泌を示す。
５．２．骨格からの細胞外マトリックスの採取
細胞を骨格上に接種し、所望の量の細胞外マトリックスが３次元骨格上に分泌されるように、細胞増殖に好適な条件下で培養した後、細胞を死滅させ、自然分泌細胞外マトリックスをさらに処理する。
これはまず、細胞を死滅させ、死滅した細胞及び細胞片を３次元骨格から除去することを含む。この処理を行う方法は数種類ある。例えば、低温保存剤を用いずに、in vitroで調製した生体間質組織を液体窒素中でフラッシュ凍結することにより、細胞を死滅させることができる。細胞を死滅させる他の方法は、接種された３次元骨格を滅菌水に浸して、浸透圧への応答により細胞を破裂させることである。いったん細胞を死滅させると、例えば、細胞膜を破壊させて、EDTA、CHAPS又は双極性洗剤などの穏やかな洗浄リンス剤により細胞片を除去した後、DMSO、プロピレングリコール、ブタンジオール、ラフィノース、ポリビニルピロリドン、デキストラン又はスクロースなどの低温保護剤を用いて処理し、液体窒素中でガラス化することができる。或いは、骨格を酵素消化及び／又は、細胞膜を破壊して細胞成分を取り出すことのできる薬剤を用いる抽出に供することもできる。洗浄剤の例としては、非イオン性洗浄剤（例えば、トライトンＸ−100、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Rohm and Haas）；BRIJ-35、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Atlas Chemical Co.）、ツイーン20、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウリン酸エステル（polyethoxyethanol sorbitan monolaureate）（Rohm and Haas）、LUBROL-PX、又はポリエチレンラウリルエーテル（Rohm and Haas））；及びイオン性洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、分岐鎖又は無分岐鎖中に７〜２２個の炭素原子を含有するスルホン化アルカン及びスルホン化アルキルアレン）が挙げられる。酵素もまた使用することができ、例としては、ヌクレアーゼ（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼ）、ホスホリパーゼ及びリパーゼが挙げられる。穏やかな洗浄リンス剤を用いる利点は、高い抗原性を持つことが多い膜結合タンパク質を溶解するという点である。
いったん細胞を死滅させて細胞片を除去すると、自然分泌ヒト細胞外マトリックスの回収は、３次元骨格を構成する材料が生分解性か非生分解性かによって、種々の方法を用いて達成される。例えば、骨格が非生分解性材料によって構成されている場合には、３次元骨格を超音波処理及び／又は高圧水噴射及び／又は機械的スクレーピング及び／又は洗浄剤及び／若しくは酵素を用いる穏やかな処理に供して付着した細胞外マトリックスを骨格から除去することにより、細胞外マトリックスを非生分解性支持体から取り出すことができる。
細胞外マトリックスが生分解性３次元骨格上に堆積している場合には、細胞及び細胞片を死滅させて除去した後に、例えば、単に溶液中で骨格を分解することにより、すなわち、骨格を溶解して、従って細胞外マトリックスを遊離させることにより、細胞外マトリックスを回収することができる。さらに、生分解性支持体が、細胞外マトリックスそのもののように注射可能な材料で構成されている場合には、細胞外マトリックスでコートされた骨格全体を注射用シリンジ中に加工することができる。さらに、細胞外マトリックスが生分解性支持体上に堆積している場合には、該マトリックスが非生分解性支持体上に堆積している場合と同じ手法によって、すなわち、３次元骨格を超音波処理及び／又は高圧水噴射及び／又は機械的スクレーピング及び／又は洗浄剤及び／若しくは酵素を用いる穏やかな処理に供して付着した細胞外マトリックスを骨格から除去することにより、該マトリックスを取り出すことができる。これらの取り出し処理のうち、細胞により産生された自然分泌ヒト細胞外マトリックスにダメージを与える及び／又は変性させるようなものは一つも無い。
５．３．注射可能な調製物の調剤及び使用
自然分泌細胞外マトリックスを回収したら、さらに処理を行う。細胞外マトリックスをホモジナイズして、外科用針を通過することができるような微粒子とすることができる。ホモジナイゼーションは、例えば超音波処理として、当技術分野でよく知られている。さらに、細胞外マトリックスは、毒性を持つグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤を使用することなく、γ線照射により架橋させることができる。全ての細菌、真菌、及びウイルスは0.2 Mradで破壊されるので、γ線照射は、材料を滅菌するために20 Mradという最小値にすべきである。好ましくは、細胞外マトリックスを滅菌及び架橋させるために、0.25〜2 Mradで細胞外マトリックスを照射することができる。
さらに、コラーゲン及び他のタンパク質の量及び／又は比率の調整は、材料をシリンジ中に配置する前に、他の細胞型によって分泌された細胞外マトリックスを混合することにより行ってもよい。例えば、タンパク質及び薬剤のような生理活性物質を、組成物を注射した後のこれらの活性物質の放出又は制御放出のために、本発明の組成物中に取り込むことができる。生理活性物質の例としては、TGF-βなどの組織増殖因子その他、注射部位での治癒及び組織修復を促進するものが挙げられる。
自然分泌ヒト細胞外マトリックスの水性懸濁液の最終的な調剤には、典型的には、等浸透圧（すなわち、約0.1〜0.2）及び生理学的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ6.8〜7.5）への懸濁液のイオン強度の調整、並びに注射の際の局所的な痛みを低減するための、リドカイン等の局所麻酔薬の添加が含まれるだろう。最終的調剤にはまた、典型的には、マルトースなどの液体潤滑剤が含まれるが、これは体に許容されるものでなければならない。潤滑剤成分の例としては、グリセロール、グリコーゲン、マルトースなどが挙げられる。ポリエチレングリコール及びヒアルロン酸並びに非繊維性コラーゲン、好ましくはスクシニル化したコラーゲンなどの有機高分子ベースの物質もまた潤滑剤として作用することができる。これらの潤滑剤は、一般的には、注射可能性、侵入可能性及び注射部位に注入された生体適合性材料の分散を改良するために、及び組成物の粘度を改変することによりスパイキングの量を減らすために使用される。この最終的調剤は、定義によれば、医薬的に許容される担体中に加工された細胞外マトリックスである。
次いで、該マトリックスは、シリンジ中に該マトリックスを組織欠損部位に正確に配置するための他の注射装置の中に配置される。皮膚増強のための調剤の場合には、「注射可能な」という用語は、通常の圧力下、通常の条件下で実質的にスパイキングすることなく、２５程度のゲージの付いたシリンジから、製剤を投薬することができることを意味する。スパイキングは、組織への注射の場合よりもむしろ、シリンジから組成物がにじみ出る原因となる可能性がある。この正確な配置のためには、２７ゲージ（200μI.D.）又は３０ゲージ（150μI.D.）と同じくらい細い針が望ましい。このような針を通して押し出すことのできる最大の粒子サイズは、少なくとも以下の数値の複合関数となるだろう：粒子最大寸法、粒子縦横比（長さ：幅）、粒子の硬さ、粒子の面の粗度及び粒子に影響する関連因子：粒子接着、懸濁液体の粘弾特性、及び針を通過する速度。ニュートン液体中に懸濁された硬い球状ビーズが最も単純な場合であり、一方、粘弾性液体中の繊維性分岐粒子になると、より複雑になる傾向がある。
注射可能な自然分泌ヒト細胞外マトリックスの調製処理中の上述の工程は、無菌材を使用して無菌条件下で行うことが好ましい。医薬的に許容される担体中の処理された細胞外マトリックスは、軟組織を増強するために、又は先天性異常、後天性欠損若しくは美容的欠陥を修復若しくは修正するために皮内注射又は皮下注射することができる。このような病気の例としては、片側顔面小体症、頬及び頬骨形成不全、片側性乳房発育不全、漏斗胸、胸無発育（ポーランド異常）、及び口蓋裂修復又は粘膜下口蓋裂（咽頭後方移植片として）に続く口蓋帆咽頭不全などの先天性異常；陥凹瘢痕、皮下萎縮症（例えば、円板状エリテマトーデスに続くもの）、角膜損傷、unucleated eyeにおける眼球陥入（上側溝症候群もまた）、顔のアクネ点食、皮下萎縮症を伴う線形性硬皮性、サドル鼻（saddle-nose）変形、ロンベルク病及び片側性声帯麻痺などの後天性欠損（外傷後、術後、感染後）；眉をひそめたときの眉間のしわ、深い鼻唇のしわ、口周辺の平面的なしわ（circum-oral geographical wrinkles）、頬のくぼみ（sunken cheeks）及び乳房発育不全などの美容的欠陥が挙げられる。本発明の組成物は、体の括約筋の顕著な特徴となる組織などの内部組織を増強するために、これらの組織に注射することもできる。
本発明の様々な態様見本を以下の節に記載する。様々な系において使用する組織及び細胞の型に基づいて、本発明の３次元培養系を記載するが、これは記載のみを目的とするものであり、限定するためのものではない。これらの記載には、限定するわけではないが、骨髄、皮膚、上皮細胞、及び軟骨を特定的に含まれる。
しかし、３次元培養系が他の型の細胞及び組織について使用できることは明らかに理解される。本発明は、記載する各系について得られる特徴的データを実証する実施例によっても説明される。
実施例
６．実施例：３次元皮膚間質培養系
以下のサブセクションには、in vitroで異なる間質細胞を培養するための、本発明の３次元培養系が記載されている。簡単に言えば、繊維芽細胞の培養物を、予め滅菌しておいたナイロンメッシュ上で樹立した。インキュベーションを始めてから６〜９日以内に、接着繊維芽細胞がメッシュワーク空隙中に成長し始め、コラーゲン管束に平行に堆積し始めた。モノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光によれば、コラーゲンＩ型が最も多量に示され、これと共にIII型も幾らか示された。
６．１．皮膚繊維芽細胞の３次元間質の樹立
皮膚組織を細かく切り、トリプシンで２時間処理し、そして物理的方法で細胞を分離して懸濁液とすることにより、皮膚繊維芽細胞を単離した。繊維芽細胞は25ｃｍ2ファルコン組織培養皿中で集密となるまで増殖させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ)、ファンギゾーン（fungizone）、ゲンタマイシン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640（Sigma,MO）を用いてフィードした。繊維芽細胞を穏やかなトリプシン処理により取り出し、細胞をナイロン濾過メッシュ上に撒いた。該メッシュの繊維は直径約９０μｍであり、これを組み立てて２１０μｍのメッシュ空隙を有する四角形の編物にする（Tetko,Inc.,NY）。該メッシュは穏やかな酸洗浄で前処理し、ポリリシン及びＦＢＳ中でインキュベートした。繊維芽細胞の接着は３時間以内に見られ、最初の接種から５〜７日以内に繊維芽細胞がメッシュ空隙を横切って伸び始めた。これらの繊維芽細胞には代謝活性があり、細胞外マトリックスを分泌し、そして活性な繊維芽細胞及びコラーゲンからなる皮膚等価物を急激に形成した。図１は繊維芽細胞の付着及びメッシュ空隙を横切る細胞性突起の伸長を示す走査型電子顕微鏡写真である。
６．２．３次元骨髄間質培養物の樹立
インフォームドコンセントが得られた後に、血液学的に正常な成人志願者の後腸骨稜上の複数の部位から骨髄を吸引した。検体を、ヘパリン処理した試験管中に集めて８mlのRPMI 1640培地中で懸濁させた。該RPMI 1640培地には１０％ＦＢＳ及び５〜１０％ＨＳで馴化し、ヒドロコルチゾン、フンギゾーン、及びストレプトマイシンを補充した。細胞塊を拡散させ、有核細胞５×１０6個のアリコートに分割した。
以下の実施例で記載する全ての間質細胞培養物を支持する３次元骨格としては、ナイロン濾過スクリーン（#3-210/36,Tetko Inc.,NY）を用いた。直径約９０μｍの繊維により構成される該スクリーンを組み立てて、２１０μｍの篩空隙を有する四角形編物パターンとした。第６．１．節に記載のプロトコールを用いて間質細胞を接種した。間質要素の接着及びそれに続く増殖は、逆相対照顕微鏡及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いてモニタリングした。
６．３．３次元口粘膜上皮間質マトリックスの調製
口粘膜組織のサンプルを歯科の外科検体から得た。抗生物質（ＭＥＭ１００cc当たり、２mlの抗生物抗真菌溶液［GIBCO,Cat.#600-5240 AG］；及び0.01mlのゲンタマイシン溶液［GIBCO,Cat.#600-5710 AD］）を含有する新鮮ＭＥＭを用いて、組織を３回洗浄し、小片にまで切り、そして0.02％ＥＤＴＡ（w/v）を用いて洗浄した。0.25％トリプシン（Ca++又はMg++を含まないＰＢＳに溶けている）を加えた；２〜３秒後、組織片を取り出して新鮮なトリプシン（Ca++又はMg++を含まないＰＢＳに溶けている）中に配置し、4℃で一晩冷蔵した。組織を取り出して新鮮なトリプシン溶液中に配置し、細胞が単一細胞懸濁液を形成するのが見えるまで優しくかき回した。次いで、単一細胞懸濁液を、不活化した１０％ウシ胎児血清を含有するＭＥＭを用いて希釈し、１４００×ｇで７分間遠心分離した。上澄み液を静かに注ぎ出し、粘膜上皮細胞を含有するペレットを播種培地中に配置した。培地は、２％ウルトロセンＧ（Ultrosen G）を含むＤＭＥＭ、１×Ｌ−グルタミン、１×非必須アミノ酸、ペニシリン及びストレプトマイシンにより構成した。細胞を３次元骨格上に播種した。３次元間質培養物は、口繊維芽細胞及びナイロン濾過スクリーン（#3-210/36,Tetko Inc.,NY）の８mm×４５mm片を用いて作製した。該メッシュを0.1M酢酸中に30分間浸し、１０mMポリリシン懸濁液で１時間処理した。該メッシュを無菌ペトリ皿中に配置、ＤＭＥＭ完全培地中で、上述のようにして回収した１×１０6個の口繊維芽細胞を接種した。５％ＣＯ2での１〜２時間のインキュベーションの後、メッシュをコーニング２５ｃｍ2組織培養フラスコ中に配置し、５mlの培地を添加して浮遊させ、そして準集密として、３日おきにフィードした。培養物は、湿気環境下において、ＤＭＥＭ完全培地中、37℃、５％ＣＯ2において維持し、３日おきに新鮮な培地でフィードした。
６．４．３次元小管内皮間質細胞培養物の樹立
Larsonら,1987,Microvasc.Res.34:184の方法に従って脳から単離した小管（small vessel）内皮細胞を、Ｔ−７５組織培養フラスコを用いてin vitroで培養した。細胞は、ダルベッコ改良イーグル培地／Hams-F-12培地の組み合わせ（この溶液は１：１混合物として利用できる。）中で維持した。該培地には、熱不活性化した20％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グルタミン、及び抗生物質が補充されていた。細胞はフラスコ当たり１×１０6個の濃度で播種され、１週間以内に集密状態に達した。細胞は、さらに１週間継代し、そして記載したようにＦＣＳ、グルタミン、及び抗生物質を含有するＤＭＥＭ／Hams-F-12を用いてさらに１週間フィードした。細胞を継代するには、フラスコを５mlのＰＢＳ（Ca++又はMg++を含まない）で２回リンスし、３mlの0.05％トリプシン及び0.53mMＥＤＴＡを用いてトリプシン処理した。細胞をペレット化し、再懸濁し、トリパンブルー排除により生存について試験し、２５mlの前記ＤＭＥＭ／Hams-F-12補充培地を用いて播種及びフィードした。因子VIII関連抗原アッセイ（Grulnickら,1977,Ann.Int.Med.86:598-616）を用いて内皮細胞を積極的に同定し、銀染色を用いて小管内皮だけに特異的な接着結合複合体を同定した。
ナイロン濾過スクリーンメッシュ（#3-210/36,Tetko Inc.,NY）は、本質的に上述の記載に従って調製した。該メッシュを酢酸溶液（１mlの氷酢酸及び９９mlの蒸留H2O）中に30分間浸し、大量の蒸留水でリンスし、そしてオートクレーブで処理した。メッシュは８×８cmメッシュ当たり６mlのウシ胎児血清でコートし、一晩インキュベートした。該メッシュを３枚重ねて、この上に３×107個の小管内皮細胞（記載に従って培養したもの）を播種し、湿気環境において５％CO2の下、37℃で３時間インキュベートした。接種したメッシュは、完全な集密となるまで（約２週間）、３〜４日おきに10mlのＤＭＥＭ／Hams-F-12培地でフィードした。
６．５．３次元軟骨細胞間質細胞培養物の樹立
軟骨は、ヒト関節の関節表面から採集した。軟骨片は、コラーゲナーゼ（0.2％w/v）により、完全培地（１０％ウシ胎児血清、グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／mlアスコルビン酸塩及び３５μｇ／mlゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ）中、３７℃で２０時間消化した。遊離した軟骨細胞を遠心脱水して完全培地に再懸濁し、計数してＴ−１５０フラスコ当たり１×１０6個の細胞を撒いた。細胞は機械的操作で継代して（５〜７日おきに）集密にした。
ポリグリコール酸メッシュ（直径１mm×厚さ２mm）を、エチレンオキシド又は電子ビーム処理によって滅菌し、予め完全培地に一晩浸した。６ウエルプレート中において、該メッシュに、メッシュ当たり３〜４×１０6個の細胞を総量１０μｌで播種し、組織培養インキュベーター中、３７℃で３〜４時間インキュベートした。この時点で、1.5mlの培地を添加した。播種したメッシュを一晩インキュベートした。翌日、５mlの培地を添加した。培地は、集密になるまで１週間に３回替えた。
７．実施例：細胞外マトリックス組成物
幾つかの分析法を用いて細胞外マトリックスの特性決定を行い、マトリックスタンパク質の含有量を測定した。それぞれの数値は、少なくとも２回の測定の平均値である。該マトリックスはコラーゲンI型及びIII型、フィブロネクチン、テネイシン、硫酸化グリコサミノグリカン、デコリン並びに種々の他の分泌ヒト細胞外マトリックスタンパク質を含有していた。さらに、分泌マトリックスタンパク質は、３次元支持骨格全体に渡って見い出された。細胞外マトリックスは、合計292mg/ｃｍ2±0.06の量のタンパク質を含み；フィブロネクチンは3.4mg/ｃｍ2±1.2で存在し；そしてテネイシンは1.7mg/ｃｍ2±0.6であった。フィブロネクチン及びテネイシンは両方ともに、イムノブロット上で、予想どおりの分子量分布を示した。
７．１．細胞外マトリックスのコラーゲン含有量
細胞外マトリックスのコラーゲン含有量は、Sirius Redアッセイを用いて測定した。飽和ピクリン酸溶液中でのSirius Red F3BAの結合は、繊維性コラーゲンの堆積を見積るのに広く使用されている（Bedossaら,1989,Digestion 44(1):7-13;Finkelsteinら,1990,Br.J.Ophthalmol.74(5):280-282;Jamesら,1990,Liver 10(1):1-5）。Sirius Red結合のコラーゲンへの特異性は、大きくその組織学的染色としての用途を基礎としている。種々の度合いのコレスタティックフィブロシスのラット肝臓において、Sirius Red結合によって測定したコラーゲン含有量は、ヒドロキシプロリン含有量と強い相関を示した（Walshら,1992,Analyt.Biochem.203:187-190）。さらに、Sirius Redによる組織学的染色は複屈折性であり、コラーゲン鎖の配向に関係する指向性結合を示す。Sirius Redは、補体成分Ｃ１のような、コラーゲン様３重ヘリックスを含有する古典的コラーゲン以外のタンパク質に結合することが知られている。血清アルブミンへの僅かな結合も幾つか見い出されているが、ウシ血清アルブミン標準物を用いる対照実験においては、アッセイへの妨害は示されなかった。この妨害は、細胞外マトリックス中のコラーゲンシグナルの２％未満と概算され、Sirius Redアッセイを使用すればコラーゲン測定用の再現性のある手法を得ることになる。細胞外マトリックスは、0.61mg/ｃｍ2±0.09のコラーゲン含有物を含有していた。さらに、コラーゲンI型及びIII型は、イムノブロット上において、予想どおりの分子量分布を示した。
７．２．電子顕微鏡により可視化されたコラーゲン繊維
in vitroで増殖させた皮膚組織由来のコラーゲン及び正常成人ヒト皮膚サンプル由来のコラーゲンを処理し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により可視化した。簡単に言えば、それぞれのコラーゲンを秤量して無菌５０ml遠心管中に３０mlの0.05Mトリス緩衝液（pH8.0）と共に投入した。リストシェーカー上で２時間混合し、トリス緩衝液を除去して該試料を３０mlの新たな0.05Mトリス緩衝液と共にホモジナイゼーションシリンダーに投入した。該サンプルを緩衝液のみの中で３０秒間ホモジナイズし、次いで、米国特許第4,969,912号及び第5,332,802号に記載の分散剤を添加した後に３０秒間の破砕を２回行った。この機械的破壊処理の間は、温度を５〜１０℃に維持した。分散剤は0.05％（コラーゲンの湿重量）の濃度で添加した。ホモジナイズした調製物を3500rpmで６分間遠心分離して、分散したコラーゲン物質をまだ分散していない物質から分離した。分散していない残渣を、0.05％（コラーゲンの湿重量）の分散剤で再度処理し、３０秒間で２回ホモジナイズして破砕した。該分散物を再度遠心分離して、分散したコラーゲン物質を回収し、最初に回収したものに加えた。
コラーゲン分散物を１００ミクロンフィルターを通して濾過し、3500rpmで遠心分離して、ペレットを0.004Mリン酸緩衝液（pH7.4）を用いて３回洗浄した。最後の遠心分離を10,000rpmで行い、コラーゲンペレットを固めた。次いで、サンプルをＴＥＭ用に回収した。図２Ａ〜Ｄに示すように、in vitroで増殖させた皮膚組織から調製した細胞外マトリックス（図２Ａ〜Ｂ）、又は正常成人ヒト真皮から調製した細胞外マトリックス（図２Ｃ〜Ｄ）のどちらかから単離したコラーゲン繊維は、双方の調製物において、典型的なコラーゲンバンド及び通常の周期性を有する完全コラーゲン繊維である点で同一に見えた。
７．３．細胞外マトリックス中に存在するグリコサミノグリカン
グリコサミノグリカンは、生体中で種々の構造的及び機能的役割を果たすことが示されており、これが分泌された細胞外マトリックス中に存在することは重要である。表２は、細胞外マトリックス中に見い出されたグリコサミノグリカンの幾つかの例、並びに正常真皮におけるそれらの機能的重要性を示す。
0003709487.tif 000003
さらに、細胞外マトリックスは、合計2.8mg/ｃｍ2±0.1の硫酸化グリコサミノグリカンを含有することが見い出された。
７．４．細胞外マトリックス中に存在する増殖因子
細胞外マトリックスを産生して堆積させる細胞は、幾つかの異なる増殖因子もまた発現した。増殖因子は、細胞外マトリックスにおいて２つの理由で重要である。細胞外マトリックスの成長及び堆積の間、自然に撒かれた増殖因子は、細胞増殖及び活性を制御するのを補助する。さらに、増殖因子は細胞外マトリックスに付着したままである。マトリックスの堆積中に、種々の増殖因子の発現が測定されている。
増殖因子の発現は、全ＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって調べられている。簡単に言えば、ＲＮＡは、ＳＤＳ沈降及び有機溶媒分配操作によって、増殖細胞から抽出された。該ＲＮＡを、スーパースクリプト逆転写酵素及びランダムヘキサマープライマーを用いて転写した。逆転写の同じ１群を用いて、全ての増殖因子を検出した。ＰＣＲは、合計容量２０μｌのＲＮＡ２００ngに相当する４μｌの逆転写物を用いて、標準的な条件下で行った。
このアッセイに基づいて言えば、表３に示すように、酸性及び塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、及びＫＧＦ ｍＲＮＡ転写物が存在しており、その他、ＰＤＧＦ、アンフィレグリン、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦ、ＳＰＡＲＣ及びＶＥＧＦなども存在していた。これらの中で、ＰＤＧＦ及びＴＧＦ−β３は、培養物中での細胞増殖及びマトリックス堆積の調節に関与していると考えられ、一方、ＴＧＦ−β１、ＨＢＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ及びデコリンはマトリックス中に堆積する。アンフィレグリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２及びＩＬ−１は、これらの実験で用いた感度では発現されなかった。
0003709487.tif 000004
本明細書中に開示した特定の実施態様は本発明の幾つかの態様を説明するためのものであるので、これらの実施態様によって、本出願に記載し、請求の範囲とした発明がその範囲を限定されるものではない。いかなる均等な実施態様でも、本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書中に示し、記載したもの以外の本発明の種々の改変は、先行する記載物から当業者には明らかであろう。このような改変もまた、現行の請求の範囲の範囲内となるものである。
幾つかの参考文献が本明細書中に引用されているが、これらの全ての開示は、その全体が本明細書中に参考として取り込まれる。
【図１】
0003709487.tif 000005
【図２Ａ】
0003709487.tif 000006
【図２Ｂ】
0003709487.tif 000007
【図２Ｃ】
0003709487.tif 000008
【図２Ｄ】
0003709487.tif 000009