(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼのサブユニットをコードし、且つ以下の配列；
配列１
【化１】
0003664490.tif 000011
0003664490.tif 000012
0003664490.tif 000013
0003664490.tif 000014
0003664490.tif 000015
0003664490.tif 000016
0003664490.tif 000017
0003664490.tif 000018
0003664490.tif 000019
0003664490.tif 000020
0003664490.tif 000021
0003664490.tif 000022
配列２
【化２】
0003664490.tif 000023
0003664490.tif 000024
0003664490.tif 000025
0003664490.tif 000026
0003664490.tif 000027
0003664490.tif 000028
0003664490.tif 000029
0003664490.tif 000030
0003664490.tif 000031
0003664490.tif 000032
0003664490.tif 000033
配列３
【化３】
0003664490.tif 000034
0003664490.tif 000035
0003664490.tif 000036
0003664490.tif 000037
0003664490.tif 000038
0003664490.tif 000039
0003664490.tif 000040
又は、
配列４
【化４】
0003664490.tif 000041
0003664490.tif 000042
0003664490.tif 000043
0003664490.tif 000044
から選択されるか、又は上記の機能的誘導体であって、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼのサブユニット活性を示すタンパク質をコードし、且つ上記配列のいずれかにおいて１若しくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入及び／又は付加された核酸配列からなる、実質的に純粋なＤＮＡ分子。
【請求項２】
微生物から単離された、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
該微生物がアスペルギルス・フミガトゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）よりなる群から選択される、請求項２記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
該微生物がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項２記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
以下の；
制限地図１
【化５】
0003664490.tif 000045
制限地図２
【化６】
0003664490.tif 000046
制限地図３
【化７】
0003664490.tif 000047
及び
制限地図４
【化８】
0003664490.tif 000048
から選択される制限地図を有する請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
該ＤＮＡ分子が、そのＤＮＡが原核生物または真核生物細胞に導入された場合に発現され得るように調節配列に作動可能に連結している、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
請求項１のＤＮＡ分子によってコードされた、実質的に精製された蛋白質。
【請求項８】
以下の；
配列５
【化９】
0003664490.tif 000049
0003664490.tif 000050
0003664490.tif 000051
0003664490.tif 000052
配列６
【化１０】
0003664490.tif 000053
0003664490.tif 000054
0003664490.tif 000055
配列７
【化１１】
0003664490.tif 000056
0003664490.tif 000057
0003664490.tif 000058
又は
配列８
【化１２】
0003664490.tif 000059
0003664490.tif 000060
0003664490.tif 000061
0003664490.tif 000062
から選択されるか、又は上記の機能的誘導体であって、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼのサブユニット活性を示し、且つ上記配列のいずれかにおいて１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる前記機能的誘導体の配列から選択されるアミノ酸配列を有する、蛋白質。
【請求項９】
請求項１記載のＤＮＡ分子を含有する細胞。
【請求項１０】
請求項７記載の精製された蛋白質に対する抗体。
【請求項１１】
（ａ）２つの微生物を培養し、第１の微生物は無傷の請求項１に記載のＤＮＡ分子を担持し、第２の微生物はグルカンシンターゼ活性を示すタンパク質を発現しないように改変された請求項１に記載のＤＮＡ分子を担持し、
（ｂ）グルカンシンターゼに影響することが知られている化合物の定量可能な量と共に工程（ａ）の微生物のアリコートをインキュベートし、
（ｃ）テスト化合物と共に工程（ａ）の微生物のアリコートをインキュベートし；次いで、
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）の微生物におけるグルカンシンターゼ活性を測定することを特徴とする、グルカンシンターゼ活性を調節する化合物を選定する方法。
【請求項１２】
（ａ）３つの微生物を培養し、第１の微生物は無傷の請求項１に記載のＤＮＡ分子を担持し、第２の微生物はグルカンシンターゼ活性を示すタンパク質を発現しないように改変された請求項１に記載のＤＮＡ分子の形態を担持し、第３の微生物はグルカンシンターゼ活性を示すタンパク質を発現しないように改変された請求項１に記載のＤＮＡ分子の形態および少なくとも２コピーのＣＮＡ２  ＤＮＡおよび少なくとも２コピーのＣＮＢ２  ＤＮＡを担持し、
（ｂ）カルシニューリンに影響することが知られている化合物の定量可能な量と共に工程（ａ）の３つの微生物のアリコートをインキュベートし、
（ｃ）テスト化合物と共に該３つの微生物のアリコートをインキュベートし；次いで、
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）のアリコートの相対的増殖を測定することを特徴とする、カルシニューリンに影響する化合物を選定する方法。
【請求項１３】
（ａ）テスト化合物を、請求項１に記載のＤＮＡ分子によりコードされる１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを含有する溶液と混合して混合物を得
（ｂ）該混合物における１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット活性を測定し、次いで、
（ｃ）該混合物の１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット活性を標準と比較することを特徴とする、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット活性を調節する化合物を選定する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の概要
１，３−β−Ｄグルカンの生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を同定し、クローン化し、発現させ、細胞壁生合成に影響する化合物を含めた抗真菌性化合物につきスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで用いる。本発明は精製されたＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を使用するアッセイ、該ＤＮＡ分子によってコードされる蛋白質、該ＤＮＡ分子を発現する細胞および該分子の改変形を含む。
図面の簡単な記載
図１はプラスミドｐＦＦ１１９の制限地図である。
図２はプラスミドｐＦＦ３３４の制限地図である。
図３はｐＧＳ３の１１．０ｋｂ  ＥｃｏＲＩインサートの制限地図である。
図４はｐＧＳ６の１１．０ｋｂ  ＸｂａＩインサートの制限地図である。太線はｆｋｓＡ遺伝子の配列決定された部分を示す。ｐＧＳ１５のインサートおよび縮小された欠失誘導体（ｐＧＳ１７−ｐＧＳ２１）が示される。
図５はｆｋｓＡ遺伝子の一部のＤＮＡ配列および推定アミノ酸翻訳である。
図６はＦＫＳ１  ＤＮＡ配列である。
図７はＦＫＳ１  蛋白質のアミノ酸配列である。
図８はＦＫＳ２  ＤＮＡ配列である。
図９はＦＫＳ２  蛋白質のアミノ酸配列である。
図１０はｆｋｓＡのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
図１１はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）から単離されたＦＫＳ１相同体のＤＮＡ配列を示す。
図１２はガンジダ・アルビカンスのＦＫＳ１相同体のアミノ酸配列を示す。
図１３は酵母株の部分的リストである。
発明の背景
１，３−β−Ｄグルカンの生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を同定し、クローン化し、発現させ、細胞壁生合成に影響する化合物を含めた抗真菌性化合物をスクリーニングするｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで用いる。本発明は、精製されたＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を使用するアッセイ、該ＤＮＡ分子によってコードされる蛋白質、該ＤＮＡ分子を発現する細胞および該分子の改変形を含むが、それらに限定されるものではない。
本発明は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のいくつかの株の突然変異表現型を逆転させる遺伝子を含有する精製ＤＮＡ断片に指向される。該遺伝子は、ＦＫ５０６感受性遺伝子１については、ＦＫＳ１と呼ばれ、ＥＴＧ１（エキノカンジン（ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ）標的遺伝子１）としても公知である。エキノカンジンは、多くの真菌類において、１，３−β−Ｄ−グルカンの合成を阻害するアシル−置換環状ヘキサペプチドである。ＦＫＳ２はＦＫＳ１の相同体である。ＦＫＳ１はサッカロミセス・セレビシエのゲノムライブラリーからクローン化された。ＦＫＳ１の性質からして、それが１，３−β−Ｄグルカンシンターゼのサブユニットをコードしていることを示す。ＦＫＳ１またはその相同体によってコードされる蛋白質は、真菌類病についての薬物療法のための標的になり得る。本発明は、エキノカンジンの標的をもコードするＦＫＳ２、およびアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンスおよびクリプトコッカス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）のような病原体真菌類からの類似遺伝子のごとき相同体も含む。
本発明は、サッカロミセス・セレビシエの区分された突然変異体類の薬物関連表現型を逆転させる遺伝子よりなる。いくつかの突然変異株が真菌類細胞壁阻害剤の特別のクラスに対する感受性の変化によって同定され、一方、もう１つの突然変異株は免疫抑制化合物ＦＫ５０６およびサイクロスポリンＡに対して過剰感受性である。
新規治療剤化合物の作用様式を理解するには、生化学および遺伝学双方を含む種々の実験的アプローチを使用する。１のアプローチは、テスト化合物に対して感受性または抵抗性の生物を単離しようとすることである。そうすれば、かかる突然変異体は、薬物標的をコードする遺伝子を単離するのに使用できることがある。酵母生物学および突然変異体生物の関連分野のいくつかの一般的記載を以下に述べる。
ＦＫ５０６およびサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、Ｔ細胞活性化における中間のＣａ2+依存性ステップを阻害し、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を遮断する優れた免疫抑制剤である（総説については、Ｓｉｇａｌら、１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：５１９−５６０参照）。ＦＫ５０６はＦＫ５０６結合性蛋白質（ＦＫＢＰ）として公知の蛋白質の一群に結合し、一方、ＣｓＡはサイクロフィリン（cyclophilin）と呼ばれる別の蛋白質群のメンバーに結合する。得られた薬物−受容体複合体（ＦＫＢＰ−ＦＫ５０６またはサイクロフィリン−ＣｓＡ）はカルシニューリン、Ｃａ2+およびカルモジュリン依存性蛋白質ホスファターゼに結合してそれを阻害し、これは、カルシニューリンの阻害が免疫抑制のメカニズムであり得ることを示す（Ｌｉｕら、１９９１、Ｃｅｌｌ，６６：８０７−８１５）。
ＦＫ５０６およびＣｓＡは酵母および真菌類のある種の株の増殖を阻害する抗生物質でもある。これらの薬物の抗真菌特性およびＦＫＢＰ、サイクロフィリンおよびカルシニューリンの酵母および真菌類における存在は、これらの生物における薬物の作用様式の遺伝的調査に役立った。
ＦＫ５０６をスクリーニング剤として用いて、過剰感受性突然変異体を単離した。このスクリーニングで発見されたｆｋｓ１−１を用いてＦＫＳ１遺伝子をクローン化した。ＦＫＳ１の相同体（ＦＫＳ２）も発見され、クローン化された。この突然変異体の発見、その使用、およびＦＫＳ１、ＦＫＳ２およびこれらの遺伝子の相同体のクローニングを記載する実施例は後記にて示す。
ＣｓＡ過剰感受性突然変異体は報告されているが、ＦＫＳ１またはＦＫＳ２に対するその関係の有無は開示されていない（Ｋｏｓｅｒ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ、１０８：７３−８０）。
真菌類細胞壁は種々の細胞生命過程に関与する複雑な構造である。増殖性成長、形態形成、高分子の摂取および分泌ならびに浸透圧変化に対する保護は、細胞壁の組成および完全性の変化によって影響される。細胞壁合成、すなわち真菌類に必須であるが哺乳動物細胞には存在しないプロセス、の阻害を介して作用する抗真菌類化合物は、殺真菌類活性および低哺乳動物毒性の理想的な組合せを有すると予測される。
このタイプの化合物は臨床的使用に至っていないにも拘わらず、多くの研究者はかかる剤の同定に努めてきた。真菌類の壁は、多数のポリマー：キチン、α−およびβ−グルカン、マンノ蛋白質よりなり、これらは抗真菌類療法に対して全て標的となり得る。
β−グルカン阻害剤の主要なクラスは、アクレアチンＡ、エキノカンジンＡおよびニューモカンジンを含めたいくつかのリン脂質抗生物質からなる。これらの化合物は、全て、非極性脂肪酸側鎖を含有する環状ヘキサペプチドである。天然産物の殺真菌類活性は酵母以外にはほとんど無効である。エキノカンジンは、１，３−β−Ｄグルカンの全細胞合成を阻害するその能力によって殺真菌性であり、これは、細胞壁の完全性を破壊し、全酵母細胞の溶解を引き起こす。エキノカンジンは、グルコースの１，３−β−Ｄグルカンへの重合、すなわち、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガンタスおよびニューロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）のごときいくつかのタイプの真菌類からの混合膜画分によって触媒され得る反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する。
β−グルカン合成阻害剤の第２の構成群、パプラカンジンおよびケイチアカンジンは、芳香族環系に結合した配糖体成分および２つの長鎖脂肪酸を含有する。これらの化合物は、エキノカンジンと同一様式の作用を有する。天然産物の発見計画に加えて、化学的修飾による臨床的に有用なエキノカンジン、パプラカンジンまたはケイチアカンジン類の同定が試みられてきた。いずれは、これらのアナログが臨床的に使用されることとなろう。
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏらは、ニューモシスティス・カンジィ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｉｄｉｉ）、すなわち、米国におけるエイズ患者のニューモニア関連死亡の主要原因が、その嚢胞形態の壁におけるβ−グルカンであると報告している（Ｍａｔｓｕｍｏｙｏ  Ｙ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ，３６：２１Ｓ−２２Ｓ）。パプラカンジンおよびエキノカンジンのごときβ−グルカンの阻害剤は、従って、ニューモシスティス・カリニ感染治療に効果を有する。Ｓｃｈｍａｔｚらは、ニューモシスティス・カリニ肺炎のラット・モデルにおいて、Ｌ−６７１，３２９（エキノカンジン）およびＬ−６８７，７８１（パプラカンジン）は共に感染したラットの肺における嚢胞の数を減少させるのに効果的であったと報告している（Ｄ．Ｍ．Ｓｃｈｍａｔｚら、１９９０，ＰＮＡＳ，８７：５９５０−５９５４）。これらの結果は、β−グルカン合成はニューモシスティス・カリニ感染治療に有用な治療剤のための有効な標的であることを示唆する。
β−グルカン合成が変化したサッカロミセス・セレビシエの真実の薬物耐性株を単離する努力があった。単離された突然変異体はａｃｕｌ（Ｍａｓｏｎ，Ｍ．ら、１９８９，Ｙｅａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、１９８９年４月１５日〜４月２０日、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク、抄録＃１５４）；ａｃｒｌ／２／３／４（Ｆｏｎｔ  ｄｅ  Ｍｏｒａ，  Ｊ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｒ．，３５：１２  ２５９６−２６０１）；およびｐａｐｌ（Ｄｕｒａｎ，Ａ．ら、１９９２，Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔ．Ｇ．ＶｉｌｌａおよびＪ．Ａｂａｌｄｅ編）、Ｓｅｒｉｖｉｃｉｏ  ｄｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ、Ｓａｎｔｉａｇｏ大学、スペイン、２２１−２３２頁）を含む。これらの試みの欠点の１つは、サッカロミセス・セレビシエに対するアクレアチンおよびパプラカンジンの貧弱な能力であった。
今回の研究においては、より優れたエキノカンジン（Ｌ−７３３，５６０）を選択剤として使用し、グルカン合成が特異的に害された突然変異体を単離した。このスクリーニングで発見された最初の突然変異体（株Ｒ５６０−１Ｃ）を用いてＦＫＳ１遺伝子をクローン化した。Ｌ−７３３，５６０耐性株調査で同定された第２の突然変異体は、エキノカンジン耐性であって、キチンシンターゼ阻害剤ニッコマイシンＺにに対して超感受性であることが判明した。β−グルカンと同様にキチンは真菌類細胞壁の構造的完全性に必須の多糖である。ニッコマイシンＺは細胞増殖およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのキチンの重合を阻害する。第２の突然変異体を用いても、ＦＫＳ１遺伝子をクローン化した。
発明の詳細な記載
１，３−β−Ｄグルカンの生合成に関与する蛋白質をコードするＤＮＡ分子を同定し、クローン化し、発現させ、細胞壁生合成に影響する化合物を含めた、抗真菌類化合物をスクリーニングするアッセイで用いた。本発明は、精製されたＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を使用するアッセイ、該ＤＮＡ分子によってコードされた蛋白質、該ＤＮＡ分子を発現する細胞および該分子の改変形を含むが、これらに限定されない。
本発明は、ＥＴＧ１としても公知であるサッカロミセス・セレビシエＦＫ５０６感受性遺伝子１（ＦＫＳ１）をコードするＤＮＡ分子、および限定されるものではないがＦＫＳ２を含むＦＫＳ１の相同体の配列の単離、特性解析、発現に関する。ＦＫＳ１遺伝子はＦＫＳ１蛋白質を産生できるサッカロミセス・セレビシエ株から単離される。酵母のかかる株は当該分野でよく知られ、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビシエＷ３０３−１Ａ、Ｓ２２８Ｃ、ＧＲＦ８８、およびＹＦＫ００７を含む。
ＦＫＳ２遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエのゲノムＤＮＡのサザーンブロットにおいて、ＦＫＳ１ＤＮＡよりなるプローブにハイブリダイズするバンドとして見い出された。
これらの薬物に耐性または高感受性である個々の突然変異体を単離できるかは予測できないが、薬物高感受性または耐性の突然変異体の単離の技術は、ＭＹＧ（後掲）に記載されているごとく、栄養要求性、温度感受性、およびＵＶ感受性突然変異体の単離で用いられるものと同様である。ＦＫＳ１遺伝子またはＦＫＳ１の相同体は、（１）細胞を免疫抑制剤ＦＫ５０６、サイクロスポリンＡ、または他のカルシニューリン阻害剤に対して高感受性とする突然変異の相補（ｆｋｓ１−１）；（２）細胞をエキノカンジンに対して耐性とする突然変異の相補（ｆｋｓ１−２）；または（３）細胞をニッコマイシンＺに対して高感受性とする突然変異の相補（ｆｋｓ１−４）を含めた種々の方法によって染色体ＤＮＡライブラリーから単離できる（ＧＹＧ、後掲、１９５−２３０頁）。
ＦＫＳ１遺伝子またはその相同体は、ＤＮＡクローニングベクター中のＤＮＡ断片のライブラリーを調製し、ＦＫＳ１の存在について個々のクローンをスクリーニングすることによって、染色体ＤＮＡから単離することができる。例えば、プラスミドＹＣｐ５０における株ＧＲＦ８８からのサッカロミセス・セレビシエのゲノムＤＮＡのライブラリーは、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ１２３０１、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからＡＴＣＣ３７４１５として入手できる。
プラスミドライブラリーは、微生物の純粋な培養から染色体ＤＮＡを単離することによって調製できる。かかる微生物は、サッカロミセス・セレビシエ株Ｗ３０３−１Ａ、Ｓ２２８Ｃ、ＧＲＦ８８、およびＭＹ２１４６（ＹＦＫ００７）を含むが、それらに限定されない。染色体ＤＮＡを、例えば、Ｓａｕ３ＡＩが好ましいが、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＢｃｌＩ，ＢｇｌII、ＫｐｎＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、またはＸｈｏＩのごとき１種以上の制限エンドヌクレアーゼ酵素での部分消化によって断片化する。消化したＤＮＡ断片はサイズによって分離され、約２ないし１５ｋｂの長さのサイズ特異的断片としてクローニングベクターに挿入する。
本明細書で用いるクローニングベクターとは、一定の実験的ＤＮＡを取り込み、組み合わせたＤＮＡを、安定に存在でき、同ＤＮＡによって指示される蛋白質を発現できる宿主細胞中へ導入されるＤＮＡ配列と定義される。ベクターＤＮＡと組み合わせた外来性ＤＮＡは、組換え技術に由来する組換えＤＮＡ分子を構成する。クローニングベクターはプラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよびコスミドを含むが、それらに限定されない。
クローニングベクターをＳａｌＩのごとき制限エンドヌクレアーゼで切断し、ホスファターゼで処理し、ＤＮＡ断片を、Ｔ４リガーゼが好ましいＤＮＡリゼーゼで結ぶ。クローニングベクターを用いてＤＮＡの摂取能力がある宿主細胞を形質転換する。クローニングのための宿主細胞、ＤＮＡプロセッシング、および発現は、限定されるものではないが、細菌、酵母、真菌類、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含み、好ましい宿主はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。最も好ましい宿主は大腸菌Ｋ−１２株ＲＲ１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＤＨ１１Ｓ、またはＤＨ５ａである。約５×１０4個の独立したゲノムＤＮＡ断片をクローニングベクターに結び、これはライブラリーと呼ばれる。真実のライブラリーは、全ゲノムの代表を含有する可能性のあるものである。かかるライブラリーの例はＲｏｓｅ（ＧＹＧ、後掲）に記載されている。
形質転換手法において組換えＤＮＡ分子を摂取し安定に維持するようなコンピテント宿主細胞は、プラスミド選択的薬物を補足したＬＢ培地上で増殖する能力によって同定できる。アンピシリン遺伝子を含有するプラスミドベクターについては、アンピシリンが好ましい選択的薬物である。ライブラリーの十分な代表を得るためには、形質転換混合物を多くの寒天プレートの表面に延ばし、適当な条件下でインキュベートする。形質転換体細胞は、寒天プレートの表面から１０ｍｌのＬＢ培地が好ましい小容量のＬＢ培地に再懸濁できる。該細胞懸濁液を用いて、選択的薬物を補足した大容量のＬＢ液体を接種し、３７℃で一晩インキュベートする。次いで、プラスミドＤＮＡを、当該分野で公知の方法によって細胞から抽出する。
プラスミドライブラリーにおけるＦＫＳ１遺伝子またはその相同体を同定するスクリーニングを考えることができる。１の戦略は、株Ｔ５６０−１Ｃ（ＭＹ２１４０）のごときサッカロミセス・セレビシエのエキノカンジン耐性突然変異体の使用を要する。細胞をＤＮＡを摂取するようにコンピテントとし、次いで、ライブラリーＤＮＡで形質転換する。ＦＫＳ１遺伝子を担う形質転換体は、選択的エキノカンジンに対する耐性がプラスミド依存的に減少する。この予測は、株Ｔ５６０−１Ｃの遺伝的分析からの情報に基づいている。Ｒ５６０−１Ｃが野生型株と接合する場合、ヘテロ接合性二倍体は各親と比較して、エキノカンジン感受性は中間であり、これは、野生型遺伝子の単一コピーは突然変異体をエキノカンジンに対してより感受性にできる。
形質転換体混合物のアリコートを、形質転換体に対して選択的な培地上で平板培養する。インキュベーション増殖の後、コロニーを収集し、プールし、好ましくは、２５％グリセールを補足した培地中、−８０℃で凍結することによって保存する。１ミリリットル当たりのコロニー形成単位の数と定義される力価は当該分野で公知の方法によって測定される。
ＦＫＳ１遺伝子を含有する形質転換体の同定は、計数可能な数のコロニーが各プレートで増殖するように、プラスミド選択的培地を含有する寒天上にライブラリーを平板培養して達成できる。各コロニーの一部をレプリカ平板培養によって２つの寒天プレートに移し；最初のプレートは中程度の感受性で細胞を殺す濃度の選択的エキノカンジンを補足したプラスミド選択的培地を含有し、第２のものはプラスミド選択的培地のみを含有する。陽性クローンは、エキノカンジンを含まないプレート上では通常に増殖するが、エキノカンジンを含有するプレートでは増殖が少ないか、あるいは全く増殖しないコロニーと定義される。
エキノカンジン感受性表現型は、種々のテストによって検出できる。その１つにおいては、コロニーからの細胞を、異なる濃度の選択的エキノカンジンを含有するプレートの表面に直接斑点状に撒き；貧弱に増殖する細胞をインキュベーションの２日後に評価する。
第２のテストにおいては、各コロニーの一部を、最初のテストで用いたものの約２倍の濃度で選択的エキノカンジンを含有する寒天プレートにレプリカ平板培養することによって移す。陽性クローンはこれらのプレートで増殖しない。
第３のテストにおいては、個々のコロニーからの細胞をプラスミド選択的液体培地に接種し、飽和するまで増殖させる。飽和した培養のアリコートを用いて、選択的エキノカンジンで補足したまたは補足しない新鮮な液体培地に接種する。インキュベーションの後、６００ｎｍ波長での光学密度によって増殖を判定する。エキノカンジンの存在下で増殖しないコロニーを、エキノカンジン感受性に対して陽性とする。
もう１つのテストにおいて、可能なコロニーをブロスマイクロ希釈アッセイで検定し、その際、ある範囲の濃度の選択的エキノカンジンについてテストする。陽性クローンは元の耐性突然変異体よりも選択的エキノカンジンに対してより感受性である。
前記したごときテストを用いてゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングして、ＦＫＳ１遺伝子の機能的コピーを含有する組換えプラスミドを同定することができる。エキノカンジン感受性増加がＦＫＳ１のプラスミドをコードするコピーによるものか否かを判断するために、陽性クローンからプラスミドＤＮＡをキュアリングし、エキノカンジンに対する感受性の減少についてテストする。もしエキノカンジン耐性減少がプラスミドの存在によるものであれば、プラスミド喪失の結果この表現型は失われる。エキノカンジン感受性は種々の方法、好ましくはブロスマイクロ希釈アッセイによって測定できる。
エキノカンジン感受性増加がＦＫＳ１遺伝子を含有するプラスミドの存在によるものであるというより直接的証拠は、陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離することによって得ることができる。ＤＮＡを摂取する能力のある大腸菌細胞を該プラスミドで形質転換し、形質転換体を同定し、単離する。プラスミドＤＮＡを形質転換大腸菌から単離し、次いで、制限エンドヌクレアーゼで消化して適当なサイズの断片を得る。各断片のサイズは、ゲル電気泳動のごとき常法によって知ることができる。プラスミドを種々の酵素で消化することによって、切断の位置を示す地図が得られ；該地図はクローン化された断片ごとに別々で、特異的である。詳細な制限地図はゲノム内の特定の遺伝子を同定するのに十分である。エンドヌクレアーゼでの消化によって生成したクローン化遺伝子はアガロースゲルから精製し、当該分野で公知の方法によって配列決定に適したベクターに結ぶことができる。かかるベクターは、限定されるものではないが、ｐＢＲ３２２、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）、ｐＧＥＭ５Ｚｆ（＋）およびｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）を含み、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）およびｐＧＥＭ７Ｚｆ（−）が好ましい。二本鎖ＤＮＡを各プラスミドから調製し、配列決定のために用いる。
ＦＫＳ１遺伝子を含有するクローンを同定するための第２の戦略では、ＦＫ５０６高感受性突然変異を補足する能力を利用する。ＦＫ５０６高感受性突然変異株をライブラリーＤＮＡで形質転換する。ＦＫ５０６に対して高感受性でなくなった形質転換体は、高感受性突然変異の増殖に対しては阻害的であるが野生型株に対しては阻害的ではないレベルのＦＫ５０６の存在下で全ての形質転換体をインキュベートすることによって同定される。ＦＫＳ１遺伝子よりなるＤＮＡを含有する株のみが増殖する。同様の戦略は、サイクロスポリンその他の突然変異体が高感受性のカルシニューリン阻害剤を用いて達成できる。
ＦＫＳ１遺伝子を含有するクローンを同定するための第３の戦略は、ニッコマイシンＺに高感受性を与える突然異変体を補足する能力を利用する。ＭＳ１４のごときニッコマイシンＺ感受性突然変異体をライブラリーＤＮＡで形質転換する。ニッコマイシンＺに対する高感受性を失った形質転換体は、高感受性突然変異の増殖に対しては阻害的であるが野生型株に対しては阻害的ではないレベルのニッコマイシンＺの存在下で全ての形質転換体をインキュベートすることによって同定される。ＦＫＳ１遺伝子よりなるＤＮＡを含有する株のみが増殖する。
ＦＫＳ１の相同体であるＦＫＳ２遺伝子は、染色体ＤＮＡから単離できる。染色体ＤＮＡは標準的な方法を用い、サザーンハイブリダイゼーション分析からＦＫＳ２を含有することが知られている微生物の純粋培養から単離される。種々の酵素での消化によって染色体ＤＮＡを断片化する。ＦＫＳ２の単離は、ＦＫＳ１遺伝子のそれの一部と同様のヌクレオチド配列の領域を持つＤＮＡ分子よりなるプローブを用いて行うことができる。この断片の長さは、ＦＫＳ２含有生物からのＤＮＡのハイブリダイゼーションスクリーニングにおけるＦＫＳ２に対する特異性を付与するのに十分な位大きければよい。また、この断片はハイブリダイゼーションの特異性を達成するのに必要な最小長さよりも長くてもよい。好ましい断片は３．５ｋｂのＫｐｎＩＦＫＳ１断片または１０ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ  ＦＫＳ１断片である。
サッカロミセス・セレビシエのＦＫＳ１またはＦＫＳ２遺伝子を用いて、病原性真菌類において相同遺伝子を単離し、特性解析することができる。サザーンブロットハイブリダイゼーションは、ＦＫＳ１およびＦＫＳ２と密接に関連する遺伝子が病原性真菌類に存在することを示す。限定されるものではないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガタス、マグナポルサ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａ  ｇｒｉｓｅａ）およびウスティラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ）の株を含む病原性真菌類は、その細胞壁に１，３−β−Ｄグルカンを有するので、ＦＫＳ１またはＦＫＳ２の機能的相同体がこれらの真菌類の各々に存在するようである。また、ＦＫＳ１またはＦＫＳ２の機能的相同体はその細胞壁に１，３−β−Ｄグルカンを有する他の生物にも存在するようである。
ＦＫＳ１およびＦＫＳ２相同体は、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス・フミガタス、エイ・ニドゥランス（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、マグナポルサ・グリセアおよびウスティラゴ・マイディスから染色体ＤＮＡを単離することによって検出できる。染色体ＤＮＡの一部をＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII、ＣｌａＩ、およびＸｈｏＩのごとき多数の制限酵素で完全に切断する。ＤＮＡの消化された断片をゲル電気泳動によって分離する。次いで、該断片を、ナイロン膜が好ましい、ニトロセルロースまたはナイロン膜のごとき固体膜支持体に移す。次いで、ナイロンブロットを標識プローブとハイブリダイズさせる。選択すべき放射性同位体は32Ｐである。
ＤＮＡ断片は、（Ｒｉｇｂｙら、１９７７、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１１３：２３７−２５１に記載されているものののごとき）ニックトランスレーション法または（ＦｅｉｎｂｒｅｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８３、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２：６−１３に記載されているもののごとき）ランダム起点法によって放射性標識でき、ランダム起点法が好ましい。該ブロットを放射性標識断片と一晩ハイブリダイズするが、１．４ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ  ＦＫＳ１断片又は３．５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ  ＦＫＳ１断片または１．７ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＢｇｌII  ＦＫＳ２断片が好ましいプローブである。翌日、該ブロットを洗浄し、次いで、ＸＡＲ−５フィルムに暴露し、現像する。該ブロットを洗浄する条件は、高度に相同性の遺伝子のみがプローブとハイブリダイズし、オートラジオグラムに出現するようにする。プローブとハイブリダイズする消化された断片のサイズおよびパターンからゲノム地図を得る。各生物につき、該地図は染色体におけるＦＫＳ１またはＦＫＳ２相同体を特異的に同定するのに十分である。
限定されるものではないがｆｋｓ１−１またはＦＫＳ１の破壊もしくは欠失を含むＦＫＳ１遺伝子の突然変異は、グルカンシンターゼ阻害剤をスクリーニングするのに有用である。かかるスクリーニングは、グルカンシンターゼ阻害剤に対するＦＫＳ１野生型株と比較したかかる突然変異の感受性の変化に基づく。この差異を検出できるいずれの技術も使用できる。寒天プレート上での阻害ゾーンアッセイは特に有用である。
特異的アミノ酸をコードする各々のコドンに、実質的にかなりの数の縮重があるのは公知である。従って、本発明は、同一アミノ酸に終局翻訳されるようにコードする別のコドンを含有するＤＮＡ配列にも指向される。本明細書の目的では、１以上の置き換えられたコドンを担持する配列は縮重変異と呼ぶ。また、発現された蛋白質の最終的物理的特性を実質的に改変しないＤＮＡ配列または翻訳された蛋白質における突然変異も本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンに代えてのバリン、リシンに代えてのアルギニン、グルタミンに代えてのアスパラギンの置換は当該ポリペプチドの機能の変化を引き起こさないであろう。
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然に生じるペプチドの特性とは異なる特性を有するペプチドにつきコードするように改変できる。ＤＮＡ配列の改変方法は、部位特異的突然変異誘発を含むが、それらに限定されない。改変された特性は、限定されるものではないが、基質に対する酵素の親和性およびリガンドに対する受容体の親和性の変化を含む。
本明細書で用いる修飾されたＦＫＳ１  ＤＮＡまたは蛋白質の「機能的誘導体」とは、ＦＫＳ１  ＤＮＡまたは蛋白質の生物学的活性に実質的に同等である生物学的活性（機能的または構造的）を有する化合物である。「機能的誘導体」なる語は、「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「アナログ」、「相同体」または「化学的誘導体」を含ませる意図である。「断片」なる語は、ＦＫＳ１蛋白質のいずれのポリペプチドサブセットを意味する。「変異体」なる語は、全蛋白質またはその断片に、構造および機能が実質的に同様の分子を意味する。もし両分子が実質的に同様の構造を有するか、あるいはもし両分子が同様のの生物学的活性を有すれば、分子は修飾された蛋白質に「実質的に同等」である。従って、もし２の分子が実質的に同等の活性を有すれば、それらは、たとえ１の分子の構造が他で見い出されなくても、あるいは２つのアミノ酸配列が同一でなくても、それらは変異体であるとみなされる。
「アナログ」なる語は、全蛋白質またはその断片に機能が実質的に同等の分子をいう。
核酸に言及する場合、「実質的相同性」または「実質的に同等の」とは、最適に並べた時、または比較した時に、セグメントまたはその相補鎖が、ヌクレオチドの少なくとも７５％において、適当なヌクレオチドの挿入または欠失を許すならば同一であることを意味する。また、実質的相同性は、セグメントが鎖またはまたはその相補体にハイブリダイズする場合に存在する。
本出願で特許請求する核酸は、全細胞または細胞溶解物に、部分的に純粋なまたは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、それが環境の汚染物から精製された場合に実質的に純粋と考えられる。かくして、細胞から単離された核酸配列は、標準的な方法によって細胞成分から精製された場合に実質的に純粋と考えられ、他方、化学的に合成された核酸の配列はその化学的前駆体から精製された場合に実質的に純粋と考えられる。
本発明の核酸組成物は、合成によって、または各手法の組合せによって、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから誘導できる。
本発明の１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ・サブユニットをコードする天然または合成核酸は発現ベクターに取り入れることができる。通常、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ・サブユニットを取り入れる発現ベクターは宿主における複製に適する。許容される宿主の例は、限定されるものではないが、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。
本明細書で用いる「組換え発現ベクター」なる語句は、組換え発現ベクターを安定に担う適当な宿主生物の実質的に均質な培養を意味する。適当な宿主の例は、限定されるものではないが、細菌、酵母、真菌類、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞を含む。一般に、発現系の細胞は単一の祖先形質転換細胞の後代である。
本明細書に記載する方法により得られたクローン化１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットＤＮＡは、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節エレメントを含有する発現ベクターに分子をクローニングすることによって組換え的に発現でき、原核生物または真核生物宿所細胞に移入して、標準的な方法を用いて組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを産生できる。
発現ベクターは、適当な宿主において、遺伝子のクローン化コピーの転写およびそのｍＲＮＡの翻訳に要するＤＮＡ配列と本明細書では定義される。かかるベクターを用いて、細菌、藍藻門の藻類、植物細胞、昆虫細胞、真菌類および動物細胞のごとき種々の宿主において真核生物遺伝子を発現させることができる。
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母または細菌−動物細胞または細菌−真菌類または細菌−無脊椎動物細胞のごとき宿主細胞のＤＮＡシャトリングを可能とする。適当に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自己複製用の複製起点、選択マーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、および活性なプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、ＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼに指示するＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡが高頻度で開始されるようにするものである。発現ベクターは、限定されないが、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特に設計されたプラスミドまたはウイルスを含む。
種々の哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞で組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを発現させることができる。組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットに適し得る商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものではないが、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、およびλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）を含む。
種々の細菌発現ベクターを用いて細菌細胞で組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを発現させることができる。組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの発現に適する商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものではないが、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む。
種々の真菌類細胞発現ベクターを用いて、真菌類細胞で組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを発現させることができる。組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの発現に適する商業的に入手可能な真菌発現ベクターは、限定されるものではないが、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む。
種々の昆虫細胞発現ベクターを用いて、昆虫細胞で組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを発現させることができる。組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの発現に適する商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものではないが、ｐＢｌｕｅ  ＢａｃIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにｐＡｃＵＷ１およびｐＡＣ５Ｇ１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を含む。
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを、組換え宿主細胞での修飾された１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの発現で用いることができる。組換え宿主細胞は原核生物または真核生物であり得、限定されるものではないが、大腸菌のごとき細菌、酵母のごとき真菌類、限定されるものではないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類起源の細胞系を含む哺乳動物細胞、限定されるものではないがショウジョウバエおよびカイコ由来細胞を含む昆虫細胞を含む。適当であって商業的入手可能な哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものではないが、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ-）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３），Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）を含む。
限定されるものではないが、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含む多数の技法のうちのいずれかにより、発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に増殖させ、それらが１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを生産するか否かを判断するために個々に分析する。組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものではないが、抗−１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット抗体との免疫学的反応性を含むいくつかの手段によって行うことができる。
また、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットＤＮＡの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産された合成ｍＲＮＡまたは天然ｍＲＮＡを用いて行うことができる。合成ｍＲＮＡまたは１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを生産する細胞から単離したｍＲＮＡは、限定されるものではないが、麦芽エキスおよび網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系で効果的に翻訳させることができ、ならびに、限定されるものではないが、カエル卵母細胞へのマイクロインジョクション（カエル卵母細胞へのマイクロインジョクションが好ましい）を含む細胞ベースの系で効果的に翻訳させることができる。
ポリペプチドに言及する場合、「実質的な相同性」なる語は、問題とするポリペプチドまたは蛋白質が、問題とする天然に生じる蛋白質と少なくとも約３０％、通常は少なくとも約６５％の相同性を示すことをいう。
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットは適当な宿主細胞で発現でき、それを用いて１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットに影響する化合物を発見することができる。
また、本発明は、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を変調する化合物、即ち１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質の機能を変調する化合物をスクリーニングする方法に指向される。これらの活性を変調する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、または非蛋白質性有機分子であり得る。これらの化合物は、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、または１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質の機能を減少または減衰させることによって変調できる。１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、または１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質の機能を変調する化合物は、種々のアッセイによって検出できる。該アッセイは、発現または機能の変化があるか否かを判断する単純な「是／否」アッセイであり得る。該アッセイは、テスト化合物の発現または機能を、標準試料における発現または機能のレベルと比較することによって定量化できる。
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットＤＮＡ、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットに対する抗体、または１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質を含有するキットを調製できる。かかるキットは、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出し、あるいは試料中の１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質またはペプチド断片の存在を検出するのに使用される。かかる特性解析は、限定されるものではないが、法医学、分類学または疫学的研究を含む種々の目的で有用である。
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換え蛋白質および抗体は、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットＤＮＡ、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットＲＮＡまたは１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質をスクリーニングし、そのレベルを測定するのに使用できる。組換え蛋白質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの検出およびタイプ分けに適したキットの調製に役立つ。かかるキットは、少なくとも１つの容器を厳重に閉じ込めて保持する区画化された担体よりなる。該担体は、さらに、組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質または１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを検出するのに適した抗−修飾１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット抗体のごとき試薬よりなる。また、該担体は標識抗原または酵素基質等のごとき検出のための手段よりなり得る。
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット活性調節剤よりなる医薬上有用な組成物は、医薬上許容される担体を混合するような公知の方法に従って処方できる。かかる担体および処方の方法の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見い出すことができる。効果的な投与に適した医薬上許容される組成物を形成するには、かかる組成物は、有効量の蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは分子を含有するであろう。
本発明の治療組成物または診断組成物は、障害を治療または診断するのに有効な量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢のごとき種々の因子に依存する。他の因子としては投与様式を含む。
医薬組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内のごとき種々の経路によって個体に供される。
「化学誘導体」なる語は、通常は基礎分子には含まれない、さらなる化学的部位を含有する分子を記載する。かかる部位は基礎分子の溶解性、半減期、吸収等を改善する。または、該部位は基礎分子の望ましくない副作用を減衰させ、あるいは基礎分子の毒性を低下させる。かかる部位の例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのごとき種々のテキストに記載されている。
本明細書で記載する方法で同定される化合物は、適当な用量にて単独で使用できる。別法として、他の剤との共投与または逐次投与も望ましい。
また、本発明は、本発明の治療の新規方法で用いる適当な局所、経口、全身および非経口医薬処方を提供する目的を有する。有効成分として本発明で同定された化合物を含有する組成物は、投与用の通常のベヒクル中にて、種々の治療用量にて投与できる。例えば、該化合物は錠剤、（各々が適時放出および遅延放出処方を含む）カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のごとき経口投与形態にて、あるいは注射によって投与できる。同様に、それらは静脈内（ボーラスおよび注入双方）、腹腔内、皮下、吸蔵と共にまたはそれ以外の局所、または筋肉内形態（すべての形態は医薬分野の当業者に知られている）にて投与できる。
有利には、本発明の化合物は単一の日用量で投与できるか、あるいは毎日２、３または４回の分割用量にて合計日容量として投与できる。さらに、本発明の化合物は、当業者によく知られた経皮皮膚パッチの形態を用い、適当な鼻孔内ベヒクルの局所使用を介して、あるいは経皮経路を介して投与できる。経皮送達系の形態で投与するには、該投与は、勿論、投与計画中間欠的でなく連続的のものとなろう。
１以上の活性剤（ここに、該活性剤は別々の投与処方である）での組合せ治療には、該活性剤は同時に、あるいは各々を別のずらした時間に投与できる。
本発明の化合物を利用する投与方法は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療すべき疾患の重症度；投与経路；患者の腎臓および肝臓機能；使用するその特別の化合物を含めた種々の因子に応じて選択される。通常の技量の医者または獣医ならば、疾患の進行を防止し、逆行させまたは阻止するのに必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方できる。毒性なくして効果を生じる範囲内の薬物濃度を達成する最適な量は、標的部位に対する薬物の利用度の動態に基づいた方法を必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を含む。
サッカロミセス・セレビシエＭＹ２０９５（ＹＦＫ００７）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２１４０（Ｒ５６０−１Ｃ）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２１４７（ＹＦＫ５３２−７Ｃ）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２１４８（ＹＦＫ７９８）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２２５６（ＹＭＯ１４８、ＲＦＫ０９７８）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２２５７（ＹＦＫ１０８８−２３Ｂ）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２２５８（ＹＦＫ１０８８−１６Ｄ）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２２５９（ＹＦＫ１０８７−２０Ｂ）、サッカロミセス・セレビシエＭＹ２２６０（ＹＦＫ１０８７−２０Ａ）の生物学的に純粋な試料、並びにプラスミドｐＦＦ１１９およびｐＦＦ３３４のＤＮＡは、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。
以下の実施例は本発明をさらに明確とするために供するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
この実験で使用する培地の処方は以下のものを含むが、それに限定されない。
ａ．ＹＥＰＤ培地
バクト酵母エキス            １０ｇ
バクト−ペプトン            ２０ｇ
デキストロース              ２０ｇ
蒸留水を加えて１リットルとする。
オートクレーブによって滅菌する。
固形ＹＥＰＤ培地では、オートクレーブ処理の前にバクト−寒天を２％（２０グラム）まで添加する。
ｂ．ＹＰＡＤ培地
バクト酵母エキス            １０ｇ
バクト−ペプトン            ２０ｇ
デキストロース              ２０ｇ
硫酸アデニン                ６０−８０ｍｇ
蒸留水を加えて１リットルとする。
オートクレーブによって滅菌する。
固形ＹＰＡＤ培地では、オートクレーブ処理前にバクト−寒天を２％（２０グラム）まで添加する。
ｃ．ＹＰＡＤ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2
１部の滅菌した１Ｍ  ＣａＣｌ2を１００部のＹＰＡＤに希釈する。
ｄ．ＹＰＡＧ培地
デキストロースの代わりにグリセロール（２０ｇ／リットル）を含むＹＰＡＤ
ｅ．ＳＣ培地
アミノ酸無しのバクト酵母窒素ベース          ６．７ｇ
デキストロース                                ２０ｇ
完全なアミノ酸粉末                        ０．８７ｇ
蒸留水を加えて１リットルとする。
オートクレーブによって滅菌する。
固形ＳＣ培地では、オートクレーブ処理前にバクト−寒天を２％（２０グラム）まで添加する。
ｆ．完全アミノ酸粉末
０．８ｇ  アデニン
０．８    Ｌ−アルギニン
４．０    Ｌ−アスパラギン酸
０．８    Ｌ−ヒスチジン
１．２    Ｌ−イソロイシン
２．４    Ｌ−ロイシン
１．２    Ｌ−リシン
０．８    Ｌ−メチオニン
２．０    Ｌ−フェニルアラニン
８．０    Ｌ−スレオニン
０．８    Ｌ−トリプトファン
１．２    Ｌ−チロシン
０．８    ウラシル
６．０    Ｌ−バリン
乳鉢および乳棒で混合する。
ｇ．欠失粉末は完全アミノ酸粉末から１種以上の成分を省略することによって調製する。例えば、Ｔｒｐ欠失粉末はＬ−トリプトファンが添加されていない点を除き完全アミノ酸粉末に同じである。
ｈ．ＦＫ５０６を含有する固形ＳＣ培地は、予め５０−５２℃まで冷却した、オートクレーブ処理ＳＣ培地にＦＫ５０６を添加することによって調製する。該培地をペトリ皿に分注し、固化させる。Ｌ−７３３，５６０を含有する固形ＳＣ培地は同様に調製される。
ｉ．Ｔｒｐ欠失／デキストロース培地
０．８７ｇ    Ｔｒｐ欠失粉末
６．７ｇ      酵母窒素ベースｗ／ｏアミノ酸
２０ｇ        デキストロース
蒸留水を加えて１０００ｍｌとする。
５Ｍ  ＫＯＨでｐＨ５．８とする。
２０ｇ／ｌ寒天でＴｒｐ欠失プレートを作製する。
オートクレーブ処理によって滅菌する。
ｊ．ウラシル欠失／ソルビトール培地
０．８７ｇ    ウラシル欠失粉末
６．７ｇ      酵母窒素ベースｗ／ｏアミノ酸
２０ｇ        デキストロース
１８２ｇ      ソルビトール
蒸留水を加えて１０００ｍｌとする。
５Ｍ  ＫＯＨでｐＨ５．８とする。
２０ｇ／ｌ寒天でＴｒｐ欠失プレートを作製する。
オートクレーブ処理によって滅菌する。
ｋ．ウラシル欠失／ソルビトール寒天
オートクレーブ処理前に２０ｇ／ｌ寒天をウラシル欠失／ソルビトール培地に添加する。
ｌ．ウラシル欠失／ソルビトール軟寒天
オートクレーブ処理前に６ｇ／ｌ寒天をウラシル欠失／ソルビトール培地に添加する。
ｍ．Ｔｒｐ欠失／グリセロール
デキストロースを２０ｇ／ｌグリセロールで置き換える以外はｔｒｐ欠失／デキストロースに同じ。
ｎ．ＬＢ培地およびアンピシリンを含むＬＢ培地は実質的にＭａｎｉａｔｉｓ（後掲）に記載された方法に従って調製する。
株およびＤＮＡは標準的な手法（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９），Ｍａｎｉａｔｉｓという；及び“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓという）によって単離し、扱った。サッカロミセス・セレビシエに関する研究方法の多くは、Ｍ．Ｄ．Ｒｏｓｅ，  Ｆ．Ｗｉｎｓｔｏｎ及びＰ．Ｈｉｅｔｅｒ，  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９０），ＭＹＧという、及びＣ．Ｇｕｔｈｒｉｅ及びＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ編，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｃｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１），ＧＹＧという、に記載されている。
0003664490.tif 000002
さらなる株およびプラスミドは図に示す。
実施例２
液体ブロスマクイロ希釈アッセイ
ＦＫ５０６、Ｌ−７３３，５６０またはニッコマイシンＺのごとき化合物に対するサッカロミセス・セレビシエの特定株の感受性を定量するために、以下の手法を取った：
第１日：
ＳＣ培地または栄養要求性マーカー（例えば、ｕｒａ３、ｈｉｓ等）についての選択を要すれば特定の欠失粉末に置き換えたＳＣ培地に株を接種する。穏やかに撹拌しつつ一晩増殖させる。
第２日：
各一晩の株２０μＬを新鮮な培地２ｍｌに継代培養し；３０℃で４〜６時間インキュベートする。
滅菌平底９６−ウェル、１２カラムマイクロタイタープレートを、カラム２ないし１２中のＳＤまたはＳＤ欠失培地７５μＬに接種する。
注目する薬物を４×で溶解させ、所望の初期濃度とする。Ｌ−７３３，５６０については、滅菌ＳＤ中の６４μｇ／ｍｌ溶液を調製する。薬物懸濁液のアリコート７５μＬをカラム３に入れる。マルチチャンネルピペッターを用い、カラム３からの７５μＬをカラム４に入れ、ピペットで３回上げ下げして混合し、次いで、カラム４からの７５μＬをカラム５に入れる。カラム１２に達するまで系列希釈を反復し；混合後、７５μＬを捨てて廃棄する。
テストすべき各株を含む５ｍｌ滅菌試験管を標識する。適当な培地のアリコート２ｍｌを各試験管に入れる。株のＡ600を読み取り、最終ＯＤが０．００１４となるように培地を希釈する。例えば、もし株のＡ600が０．７０４１であれば、４μＬを培地２ｍｌに継代培養する。
接種物７５μＬをカラム２−１２に添加することによって、所与の列の各株を接種する。カラム１はブランクであるので、カラム１には添加しない。カラム２は薬物なしか、１００％増殖対照として供する。次いで、プレートを振盪することなく３０℃で一晩インキュベートする。
第３日：
インキュベーションの約２４時間後、プレートを温和に撹拌して細胞を懸濁させ、６００ｎｍ波長における吸光度を読み取る。いずれかの所与のウェルについての％対照増殖は、そのウェルについての吸光度値を同一列のカラム２の値で除することによって計算できる。これを各カラムについてなして、「パーセント対照増殖」−対−「薬物濃度」としてデータをプロットできる。得られた用量依存性曲線を用いて、各株の薬物感受性を比較することができる。
実施例３
ＹＦＫ１３２、ｆｋｓ１−１突然変異体の単離
サッカロミセス・セレビシエＹＦＫ１３２は、標準的なエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）突然変異誘発法（Ｓｈｅｒｍａｎら，  １９８６，「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）によってサッカロス・セレビシエ株ＹＦＫ００７（野生型；ＭＹ２０９５；ＡＴＣＣ７４０６０）から単離した。親株ＹＦＫ００７は約５０μｇ／ｍｌのＦＫ５０６に対して感受性であり、１００μｇ／ｍｌのＣｓＡに対しては非感受性である。突然変異体株ＹＦＫ１３２はＦＫ５０６に対して高感受性である。
ＹＦＫ００７を３０℃にてＹＥＰＤ２５ｍＬ中で一晩増殖させた。遠心することによって細胞を収穫し、０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）１０ｍｌに３×１０8細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。細胞懸濁液を１．２４×１０8細胞／ｍｌに希釈し、２の試料に分割した。
１方の試料にＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｍ０８８０）の０．５８８ｍｌを添加した。同一容量の蒸留水を対照としての第２の試料に添加した。処理した細胞懸濁液を２５℃でインキュベートした。種々の時点で試料を取り出し、５％チオ硫酸ナトリウム８ｍｌに添加して、突然変異誘発を停止した。停止した細胞を水に希釈し、ＹＥＰＤ寒天上で平板培養し、２５℃でインキュベートした。ＥＭＳ−処理したおよび未処理の培養を種々の希釈度にてＹＥＰＤプレートに広げ、コロニーを計数して突然変異誘発の後の細胞生存を測定した。
突然変異誘発したコロニーを含有するＹＥＰＤプレートを、ＦＫ５０６を０、１または１０μｇ／ｍｌを含有するＳＣ寒天上に平板培養し、２５℃でインキュベートした。約１，２００コロニーをスクリーニングした。ＳＣ培地＋ＦＫ５０６上で増殖しなかった３つの培養を同定し、さらに分析した。
ＹＦＫ１３２と命名する、ＦＫ５０６−高感受性表現型（０．１μｇ／ｍｌＦＫ５０６に感受性）を呈した、これらの培養のうちの１つは、１０μｇ／ｍｌＣｓＡに対して感受性であって、ゆっくりと増殖した。
実施例４
ＹＦＫ１３２、ｆｋｓ１−１突然変異体の戻し交配
ＹＦＫ１３２の表現型が単一の突然変異の結果であるか否かを判断するために、突然変異体と野生型株との間の交雑につき四倍体分析を行った。
ＹＦＫ１３２を野生型株ＹＦＫ００５に交配させ、得られた２倍体からの減数分裂セグレナントをＹＦＫ００７に２回戻し交配して株ＹＦＫ５３１−５Ａ、ＹＦＫ５３２−７ＣおよびＹＦＫ５３２−１０Ｂを得た。ＦＫ５０６高感受性で遅い増殖の表現型のＹＦＫ１３２が全ての交雑で共分離され、これは、これらの表現型は単一の遺伝子における突然変異の結果であることを示す。ＹＦＫ１３２はＹＦＫ００７のｆｋｓ１−１突然変異体である。
実施例５
ＹＦＫ１３２のエキノカンジン感受性のテスト
エキノカンジンＬ−６８８，７８６に対するＹＦＫ１３２の感受性はディスク−拡散アッセイで測定した。
ＹＦＫ１３２およびその親（ＹＦＫ００７）を液体ＳＣ培地２．５ｍｌで増殖させ、蒸留水で６．２５×１０7細胞／ｍｌまで希釈した。２％寒天（１３０ｍｌ）を含有する融解ＳＣ培地を、希釈した培養４ｍｌで接種し、２４５×２４５ｍｍバイトアッセイプレートに直ちに注いだ。培地が固形化した後、ＦＫ５０６（１、１０および５０μｇ）またはＬ−６８８，７８６（１、１０および５０μｇ）を含有する滅菌フィルターディスクを２８℃でインキュベートした。１８時間後、増殖阻止のゾーンを測定した。
以下の表に示すごとく、ＹＦＫ１３２はその親株（ＹＦＫ００７）よりもＬ−６８８，７８６に対してより感受性であった。
0003664490.tif 000003
実施例６
ｆｋｓ１−１の相補によるＦＫＳ１のクローニング
Ａ．一般的アプローチ
ＹＦＫ５３２−１０ＢのＦＫ５０６高感受性表現型（ＭＡＴａ、ａｄｅ２−１０１、ｈｉｓ３−Δ２００、ｌｅｕ２−Δ１、ｌｙｓ２−８０１、ｔｒｐ１−Δ１、ｕｒａ３−５２、ｆｋｓ１−１）の相補によって、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ遺伝子（ＦＫＳ１）をクローン化した。突然変異体表現型の相補による遺伝子クローニングに対する一般的手法はＭ．Ｄ．ＲｏｓｅおよびＪ．Ｒ．Ｂｒｏａｃｈによって概説されている（ＧＹＧ、１９５−２３０頁）。
ライブラリープラスミドＤＮＡは大腸菌ＡＴＣＣ３７４１５から得た。このライブラリーは、株ＧＲＦ８８からの酵母ゲノムＤＮＡの１０−ないし２０−ｋｂＳａｕ３ＡＩ部分消化断片を酵母シャトルベクターＹＣｐ５０に挿入することによってＭ．Ｄ．Ｒｏｓｅら（Ｇｅｎｅ，６０，２３７−２４３，１９８７）によって創製された。
Ｂ．エレクトロポレーション可能な細胞の調製
ＹＦＫ５３２−１０Ｂの細胞は、実質的にはＤ．Ｍ．ＢｅｃｋｅｒおよびＬ．Ｇｕａｒｅｎｔｅ（Ｇｕｔｈｒｉｅ及びＦｉｎｋ、前掲、１８２−１８７頁）によって記載されているごとくにエレクトロポレーションによる形質転換用に調製した。受容性細胞は、０．００４％アデニン硫酸を補足したＹＰＡＧ培地を含有する寒天プレート上で増殖させた。十分に増殖したパッチ（１ｍｍ×５ｍｍ）からの細胞を、２５０ｍｌの三角フラスコ中、ＹＰＡＤ−２５Ｃ培地（２５ｍＭ  ＣａＣｌ2を補足したＹＰＡＤ）５０ｍｌに接種し、回転振盪機（２２５ｒｐｍ、２″行程）にて３０℃でインキュベートした。培養を６００ｎｍで１．３の光学密度まで増殖させ、滅菌した５０ｍｌの使い捨てポリエチレン遠心チューブに移した。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ６０００冷却遠心機中、３５００ｒｐｍにおける４℃での５分間の遠心によって細胞を収穫した。全速回転して細胞ペレットを得、２５ｍｌ氷冷滅菌水で再懸濁させ、遠心によって収穫し、２５ｍｌの氷冷滅菌水で再度洗浄した。細胞ペレットを１０ｍｌの氷冷滅菌１Ｍソルビトールで再懸濁した。洗浄した細胞懸濁液を滅菌した１０ｍｌの使い捨てポリエチレン遠心チューブに移し、３５００ｒｐｍにおける４℃での１０分間の遠心によって細胞を収穫した。細胞ペレットを０．１ｍｌの氷冷滅菌１Ｍソルビトールで再懸濁した。
Ｃ．受容細胞のエレクトロポレーション
洗浄した細胞懸濁液の一部（５０μＬ）を滅菌したマイクロ遠心チューブに移した。ライブラリープラスミドＤＮＡ（バンクＡ）のアリコート（約５００ｎｇを含有する１μＬ）を細胞に添加し、温和に混合し、氷上で約５分間インキュベートした。細胞懸濁液を冷０．２ｃｍ滅菌エレクトロポレーション・キュベットに移し、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００オーム（プラス・コントローラーを備えたＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）にてパルスを与えた。直ちに、３ｍｌの氷冷滅菌１Ｍソルビトールを添加し、温和に混合した。
１５のアリコート（０．２ｍｌ）を滅菌培養チューブに移した。４６℃にて、軟（０．６％）寒天中に１ｍソルビトールを含有するウラシル欠失／ソルビトール軟寒天（３．５ｍｌ）を各チューブに添加して混合物を形成させ、同一のソルビトールを含有する培地で作成した２％寒天プレート上に各混合物を注ぎ、合計１５のプレートを得た。該手順を２１０のプレートが得られるまで反復した。
３０℃でプレートをインキュベートした。２４時間後、各プレートに、１μｇ／ｍｌのＦＫ５０６を含有するウラシル欠失／ソルビトール軟寒天（エタノール中のＦＫ５０６の５ｍｇ／ｍｌストック溶液を、予め５５℃まで冷却したオートクレーブ処理培地に添加した）３ｍｌを重ねた。該プレートを３０℃でさらに６日間インキュベートした。０．１μｇ／ｍｌのＦＫ５０６を補足したウラシル欠失培地を含有する寒天プレート上で単一のコロニーを画線培養することによって、形質転換コロニーからの細胞を精製した。
Ｄ．プラスミドｐＦＦ１１９の単離
精製した形質転換体のコロニーを１６ｍｍ培養チューブ中の１．５ｍｌウラシル欠失培地に接種し、チューブローラー中、３０℃で２日間インキュベートした。プラスミドＤＮＡは、方法１に従って、実質的にＪ．Ｎ．  Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  及びＤ．Ｒ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｇｕｔｈｒｉｅ及びＦｉｎｋ、前掲、３１９−３２９頁）によって記載されているごとくに調製し、コンピテント大腸菌株ＤＨ１１Ｓ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ５００手法（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用い、アンピシリン耐性大腸菌から調製した。得られたプラスミドはｐＦＦ１１９と命名した。
ｆｋｓ１−１を相補するｐＦＦ１１９の能力は、元の形質転換体中のプラスミドを自然にキュアリングさせることによって確認した。キュアリングはＦＫ５０６の高感受性表現型を回復させた。ｐＦＦ１１９での再形質転換はＦＫ５０６耐性を回復させた。
Ｅ．ｆｋｓ１−１を相補するＤＮＡの位置決め
ｐＦＦ１１９を制限エンドヌクレアーゼの種々の組合せで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。結果は、ｐＦＦ１１９が約１５ｋｂのＤＮＡのインサートを含有することを示した。
この１５ｋｂ領域内からの１１ｋｂ  ＳｐｈＩ断片をプラスミドＹＣｐｌａｃ３３［Ｒ．Ｄ．  Ｇｉｅｔｚ及びＡ．  Ｓｕｇｉｎｏ，Ｇｅｎｅ，７４：５２７−５３４（１９８８）］のＳｐｈＩ部位に両方の向きで移し、プラスミドｐＦＦ１３３およびｐＦＦ１３５を得た。また、これらのプラスミドはｆｋｓ１−１突然変異のＦＫ５０６高感受性表現型を相補することができる。
クローン化ＤＮＡのネストされたサブクローンは、ｐＦＦ１３３およびｐＦＦ１３５をＢａｍＨＩで線状化し、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、ＤＮＡリガーゼで該分子を再環化することによって作成した。２のサブクローン（ｐＦＦ１７２およびｐＦＦ１７３）のうち１つのみがｆｋｓ１−１を相補することができた。相補性ＤＮＡは、かくして、最初のＳｐｈＩ部位および第２のＢｇｌII部位の間の、最小６．０ｋｂおよび最大７．８ｋｂのＤＮＡを持つ領域に位置決めされた。
Ｅ．ｆｋｓ１−１を相補するＤＮＡのＦＫＳ１としての同定
ｆｋｓ１−１を相補するＤＮＡの挿入−欠失対立遺伝子は以下のようにして作成した。ｐＦＦ１３３の８．８ｋｂのＳｐｈＩ−ＰｓｔＩ断片を大腸菌ベクターｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のポリリンカーのＳｐｈＩおよびＰｓｔＩ部位の間に挿入してプラスミドｐＦＦ１７４を得た。プラスミドｐＪＪ２１５（Ｊ．Ｓ．  Ｊｏｎｅｓ及びＬ．Ｐｒａｋａｓｈ，  Ｙｅａｓｔ，６：３６３−３６６（１９９０））からの１．３ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ  ＨＩＳ３断片を平滑末端連結（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２．３．１０頁参照）によってプラスミドｐＦＦ１７４の２のＫｐｎＩ部位の間に挿入してプラスミドｐＦＦ１８６（センス向き）およびｐＦＦ１８７（アンチセンス向き）を得た。ＳｓｔＩ＋ＳｐｈＩでの消化によって６．６ｋｂ挿入−欠失断片を切り出し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。挿入−欠失突然変異を１工程遺伝子置換（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，ＧＹＧ，２８１−３０１頁参照）によって作成した。この破壊は、ＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＦＦ１７４からの８．８ｋｂのＳｐｈＩ−ＰｓｔＩ断片でプローブしたゲノムＤＮＡのサザーンブロットハイブリダイゼーション分析によって確認した。破壊されていない親は、該プローブにハイブリダイズする単一の９．８ｋｂゲノム断片を生じる。ＨＩＳ３がセンス向きに挿入された破壊突然変異体、例えば、ＹＦＦ２４０９は３．９−および３．７ｋｂ断片を与え、他方、アンチセンス破壊突然変異体、例えばＹＦＦ２４１１は４．９−および２．７−ｋｂ断片を与える。挿入−欠失対立遺伝子を持つ半数体株はｆｋｓ１−１突然変異体と実質的に同一の表現型を有し；それは、増殖が遅く、ＦＫ５０６に対して高感受性であって、Ｌ−７３３，５６０に対して高感受性である。挿入−欠失半数体をｆｋｓ１−１半数体と交雑させることによって作成した２倍体は増殖が遅く、ＦＫ５０６に対して高感受性であり、これは、挿入−欠失突然変異体はｆｋｓ１−１突然変異を相補しないことを示す。
これらの結果は、２つの対立遺伝子は同一遺伝子内にあり、ｐＦＦ１１９がＦＫＳ１遺伝子を担うことを示す。従って、挿入−欠失突然変異をｆｋｓ１−５：：ＨＩＳ３およびｆｋｓ１−６：：ＨＩＳ３という。
実施例７
サッカロミセス・セレビシエの他の株はＦＫＳ１の変異体を保有する。
サッカロミセス・セレビシエの種々の株から単離し、異なる制限酵素で消化したゲノムＤＮＡのサザーンハイブリダイゼーションは、いくつかの株が、ＧＲＦ８８における遺伝子についてのものとわずかに異なる制限地図を有するＦＫＳ１の変異体を有することを明らかとした。ＧＲＦ８８についてのものと同様の制限地図を持ち、ＦＫＳ１遺伝子を持つ株（Ｇ．Ｒ．  Ｆｉｎｋ）はＳＣ３４７（Ｊ．Ｈｏｐｐｅｒ）、Ｗ３０３−１Ｂ（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、Ｓ２８８Ｃ（Ｒ．Ｋ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ）１およびＡ３８４Ａ（Ｌ．Ｈａｒｔｗｅｌｌ）を含む。ＹＦＫ００７についてのものと同様のものを持つ株はＹＰＨ１（Ｐｈｉｌ  Ｈｉｅｔｅｒ）、ＹＦＫ００５、ＹＦＫ０９３、ＤＳ９４（Ｅ．Ｃｒａｉｇ）、およびＤＳ９５（Ｅ．Ｃｒａｉｇ）を含む。
実施例８
ＦＫＳ１  ＤＮＡとの交差−ハイブリダイゼーションによるＦＫＳ２の単離
ＦＫＳ１プローブと交差ハイブリダイズする２．５ｋｂＰｓｔＩゲノム断片を、サッカロセミス・セレビシエからのゲノムＤＮＡのサザーンブロットで検出した。この断片はゲノムのＦＫＳ１領域に由来するものではなかった。ゲノムＤＮＡをＢｇｌII＋ＰｓｔＩで消化した場合、該断片はサイズが１．７ｋｂであった。ゲノムＤＮＡを株ＹＦＫ００７から単離し、ＢｇｌII＋ＰｓｔＩで消化し、アガロースゲルで分画した。交差ハイブリダイズする断片を含有するゲルの領域を切り出し、ＱＩＡＥＸ抽出法（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を用いてＤＮＡを単離した。抽出したＤＮＡを、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のポリリンカー中のＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ部位間に挿入し、連結したＤＮＡをＤＨ１１Ｓ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体を、コロニーハイブリダイゼーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲）によって交差ハイブリダイズするＤＮＡの存在についてスクリーニングした。プラスミドＤＮＡを陽性クローンから単離し、ＫｐｎＩ＋ＰｓｔＩで消化した。ＫｐｎＩをＢｇｌIIの代わりに使用した。というのは、ＢｇｌII部位はベクターとの連結の間に失われるからである。ＦＫＳ１プローブと交差ハイブリダイズする１．７ｋｂ断片の存在は、サザーンブロットハイブリダイゼーション分析によって確認した。得られたプラスミドはｐＦＦ２５０と呼ばれる。
１．７ｋｂ断片を用いて、プラークハイブリダイゼーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲）によって、Ｓ２８８ＣからのゲノムＤＮＡのλライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号９５１９０１）をスクリーニングした。ＤＮＡを陽性クローンから単離し、種々の制限酵素で消化し、サザーンブロットハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイズする断片を分析した。ハイブリダイズする領域を担う１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部位に、両方向にて、クローン化してプラスミドｐＦＦ３３４およびｐＦＦ３３６を得た。
１．７ｋｂのＢｇｌII−ＰｓｔＩＤＮＡの挿入−欠失突然変異は、ｐＪＪ２４６（Ｊ．Ｓ．  Ｊｏｎｅｓら、前掲）からの０．８ｋｂ  ＰｓｔＩ  ＴＲＰ１断片を平滑末端連結によってＡｆｌIIおよびＢｂｓＩ部位の間に挿入することによって作成した。２．１ｋｂ破壊断片をＰｓｔＩ＋ＫｐｎＩで切り出した。ヘテロ接合ｆｋｓ１−５：：ＨＩＳ３／＋およびヘテロ接合ｔｒｐ１／ｔｒｐ１二倍体の染色体への１工程遺伝子置き換えによって、挿入−欠失突然変異を挿入した。Ｔｒｐ+形質転換体からのゲノムＤＮＡをＢｇｌII＋ＨｉｎｄIII＋ＰｓｔＩで消化した。破壊されなかった座は１．７ｋｂのハイブリダイズする断片を生じ、他方、挿入−欠失突然変異は１．４ｋｂおよび０．７ｋｂ断片を生じる。挿入−欠失突然変異の座においてヘテロ接合体である形質転換体を胞子形成させ、ＹＰＡＤについて細かく調べた。Ｔｒｐ+Ｈｉｓ-胞子は生きていた。しかしながら、Ｔｒｐ+ＨＩＳ+胞子は生きていなかった。挿入−欠失突然変異は、かくして、新しい座ＦＫＳ２を定義し、この座の挿入−欠失突然変異（ｆｋｓ２：ＴＲＰ１）は合成的にｆｋｓ１−５：：ＨＩＳ３で致死的である。これらの結果は、ＦＫＳ１およびＦＫＳ２の産物は重複する機能を有し、各々の機能が不活化された場合、遺伝子破壊またはＬ−７３３，５６０でのその遺伝子産物の阻害いずれかによりによって細胞が生存できないことを意味すると解釈される。
実施例９
ＦＫＳ１遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡライブラリーの構築
標準的な方法（ＲｏｓｅおよびＢｒｏａｃｈ，前掲）によって、ＦＫＳ１遺伝子を含有するゲノムＤＮＡライブラリーをプラスミドＹＥｐ２４において構築した。
高分子量ゲノムＤＮＡを酵母株ＹＦＫ０９３（ＭＹ２０８８、ＡＴＣＣ７４０５５）から調製し、Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、ショ糖勾配でサイズ分画した。ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰを用い、１０−１５ｋｂの範囲のＳａｕ３ＡＩ−消化ＤＮＡをＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウ断片で部分修飾した。
マルチコピーベクター（ＹＥｐ２４）をＳａｌＩで消化し、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを用いて、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で部分修飾した。修飾反応の後、ＤＮＡを１回フェノール抽出し、エタノール沈殿した。部分修飾したゲノム及びベクターＤＮＡを連結し、アンピシリン耐性について選択しつつＨＢ１０１細胞に形質転換した。
別々の形質転換によって生成したクローンをプールすることにより、２の独立したライブラリーを作成した。１のライブラリーは約３４１００の形質転換体を含有し、他方、第２のライブラリーは約１５０００の形質転換体を含有した。これらのライブラリーにおける組換えの頻度は、制限酵素消化によって〜９５％であると判断された。
実施例１０
Ｒ５６０−１Ｃ、すなわちＬ−７３３．５６０に耐性であるサッカロミセス・セレビシエの単離
Ｄ．Ｂｏｔｓｔｅｉｎ（１９８２，Ｃｅｌｌ，２８：１４５−１５４）から得られた酵母ゲノムライブラリーを用いるスフェロプラスト法（ＭＹＧ）によって、株Ｗ３０３−１Ａを形質転換した。ウラシル欠失培地で選択した形質転換体をプールし、−８０℃で２０％グリセロール中に保存した。力価（コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌ）を測定した後、ストックのアリコートを、プレート当たり約５×１０3ＣＦＵにて、０．５μｇ／ｍｌまたは１．２５μｇ／ｍｌにて半合成エキノカンジンＬ−７３３，５６０を含有するウラシル欠失培地上に延ばした。Ｌ−７３３，５６０のこの濃度は耐性クローンを選択するのに十分である。２７の薬物耐性コロニーを単離した。これらのクローンの耐性表現型を液体ＭＩＣアッセイで定量した。略言すると、Ｌ−７３３，５６０を、等容量の液体ウラシル欠失培地中の細胞懸濁液を添加した後に各列の濃度が２倍ずつ増加する１６ないし０．０３μｇ／ｍｌの範囲となるように、滅菌マイクロタイタープレートのウェルに系列希釈した。３０℃における２４時間後、プレートを６００ｎｍの波長にて分光光度計で読み取り、（薬物無しの対照ウェルに対する）各ウェルにおける対照増殖に対する百分率を計算した。得られた用量依存性曲線を用いて、親株に対する耐性を判断した。１のクローンは親株よりも１６−３２倍耐性であり；他のものは２ないし４倍耐性であった。最も耐性のクローンＲ５６０−１をさらに特性解析した。
この株はゲノムライブラリーから形質転換体として単離されたので、耐性はＲ５６０−１に含有されるプラスミドに存在する遺伝子によるものと予測された。これをテストするために、５−フルオロオロチン酸法（ＭＹＧ）での選択によって株からプラスミドをキュアリングした。プラスミドおよび存在するＵＲＡ３遺伝子の喪失は細胞を５−フルオロオロチン酸に耐性とし、ウラシル栄養要求性はウラシル欠失培地での非増殖によって確認した。驚くべきことに、キュアリングした誘導体（Ｒ５６０−１Ｃ）の薬物耐性はプラスミドの喪失によって変化しなかった。この結果は、Ｒ５６０−１Ｃは株Ｗ３０３−１Ａの自然発生エキノカンジン耐性突然変異体であることを示唆する。Ｒ５６０−１Ｃを、液体ＭＩＣアッセイにて、Ｌ−６８８，７８６、Ｌ−６４６，９９１（シロフンギン）およびＬ−６８７，７８１（パプラカンジン）のごとき他のβ−グルカンシンターゼ阻害剤で攻撃した。結果は、耐性表現型がＬ−７３３，５６０に特異的でないが、１，３−β−Ｄグルカンシンターゼの構造的に関連ないし非関連の阻害剤を含むことを示す。Ｒ５６０−１Ｃの表現型が単一の突然変異の結果であるか否かを判断するために、突然変異体および野生型株を交雑することによって形成された二倍体で四分子分析を行った。Ｒ５６０−１Ｃを野生型株Ｗ３０３−１Ｂに接合させ、胞子形成させ、詳細に調べ、Ｌ−７３３，５６０に対する感受性を液体ＭＩＣアッセイによって定量した。薬物耐性はこれらの四倍体内で２：２に分離し、これは、耐性が遺伝子１個のみにおける突然変異によることを示す。この突然変異をｆｋｓ１−２と呼ぶ。
実施例１１
Ｒ５６０−１Ｃにおけるｆｋｓ１−２突然変異の相補によるＦＫＳ１遺伝子のクローニング
Ｒ５６０−１Ｃの遺伝学的分析からの情報を用い、ｆｋｓ１−２の野生型対立遺伝子をクローン化するためのスクリーニングを工夫した。Ｒ５６０−１Ｃを野生型株Ｗ３０３−１Ｂに接合させた場合、ヘテロ接合性二倍体はＬ−７３３，５６０に対する感受性は中程度であり、これは、野生型ＦＫＳ１遺伝子の単一コピーは突然変異体をエキノカンジンに対してより感受性とするであろうことを示す。サッカロミセス・セレビシエＤＮＡのライブラリーをＲ５６０−１Ｃにクローニングすることによって、Ｌ−７３３，５６０に対するプラスミド依存性の中程度の感受性につき形質転換体をスクリーニングできる。ブロスマイクロ希釈およびレプリカ平板培養法により、４μｇ／ｍｌのＬ−７３３，５６０において、ヘテロ接合性二倍体とＲ５６０−１Ｃとが区別された。
実施例９のサッカロミセス・セレビシエの全ゲノムライブラリーを、スフェロプラスト法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，前掲）によってサッカロミセス・セレビシエＲ５６０−１Ｃに形質転換した。Ｕｒａ+クローンをウラシル欠失培地で選択し、プレートから掻き取り、プールし、２０％グリセロール中、−８０℃で凍結保存した。ライブラリーのアリコートを２００−３００ＣＦＵ／プレートにてウラシル欠失培地に平板培養した。３０℃における２４時間のインキュベーションの後、各プレート上のコロニーを、１）４μｇ／ｍｌＬ−７３３，５６０を補足したウラシル欠失培地；および２）ウラシル欠失培地プレートにレプリカ平板培養した。薬物補足プレートで貧弱に増殖し、および無薬物プレートで強力に増殖することによってクローンを同定した。３つのさらなるテストを用いて、いずれの可能なクローンが真に薬物耐性であるかを確立した。１のテストでは、推定クローンを、マイクロタイタープレート中の液体ウラシル欠失培地に接種し、３０℃で２４時間増殖させた。Ｄｙｎａｔｅｃｈ接種器を用い、各ウェルからの細胞を、１）４μｇ／ｍｌＬ−７３３，５６０を補足したウラシル欠失培地；および２）ウラシル欠失培地に接種した。増殖を分光光度法により定量し、薬物補足培地で貧弱に増殖するものを陽性に評点した。薬物耐性を見る第２のテストにおいて、４μｇ／ｍｌＬ−７３３，５６０を補足したウラシル欠失培地プレートにコロニーを直接パッチし、３０℃における２４時間後に貧弱に増殖するものを評点した。第３のアッセイにおいては、推定クローンをウラシル欠失培地プレートにパッチし、３０℃で２４時間増殖させ、次いで、１０μｇ／ｍｌＬ−７３３，５６０を補足したウラシル欠失培地にレプリカ平板培養した。増殖は３０℃における２４時間後に評点した。
９つの推定クローンが全てのアッセイで中程度の薬物耐性を示し陽性であった。１の株（Ｓ２７７）は野生型株とほとんど同程度にＬ−７３３，５６０に対して感受性であった。クローンＳ２７７の薬物感受性を定量するために、液体ＭＩＣアッセイを行った。薬物感受性クローン（Ｓ２７７）は突然変異体（Ｒ５６０−１Ｃ）よりもかなり感受性であり、野生型株（Ｗ３０３−１Ａ）とほとんど同程度に感受性であった。Ｓ２７７の中程度の薬物感受性が、それが含有するクローン化遺伝子によるものであることを証明するために、５−フルオロオロチン酸法によって該プラスミドを追い出した。ＭＩＣアッセイは、プラスミドの喪失の結果、Ｌ−７３３，５６０に対する中程度の感受性が逆転し、プラスミドを失ったクローンは元の耐性突然変異体（Ｒ５６０−１Ｃ）と同程度に薬物耐性となった。最後に、Ｓ２７７から単離したプラスミドＤＮＡでのＲ５６０−１Ｃの再形質転換により、Ｕｒａ+クローンが得られ、これはＬ−７３３，５６０に対する中程度の感受性において元の薬物感受性クローン（Ｓ２７７）と同一であった。
プラスミドＤＮＡを薬物感受性クローン（Ｓ２７７）から単離し、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載されている方法によって大腸菌に形質転換した。異なるサイズのインサートを持つ２のプラスミドを単離し、制限エンドヌクレアーゼマッピングによって解析した；１つ（ｐＪＡＭ５３）は１４ｋｂのインサートを有し、第２のものは（ｐＪＡＭ５４）は８ｋｂのインサートを有していた。制限マッピングは、ｐＪＡＭ５４におけるインサートがｐＪＡＭ５３の１４ｋｂ断片内に完全に含まれることを示した。両プラスミドは、それらを形質転換によって株Ｒ５６０−１Ｃに導入した場合、液体ＭＩＣアッセイで判断すると、Ｌ−７３３，５６０に対する中程度の感受性を付与する。
実施例１２
ｆｋｓ１−１突然変異体におけるカルシニューリンの過剰発現
カルシニューリン遺伝子を含有する個々のファージクローンを、ＰＣＲ（Ｆｏｏｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，３６０：６８２−６８４（１９９２））により酵母ゲノムＤＮＡから合成したプローブとのハイブリダイゼーションによって、λ−ＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号９４３９０１）における株Ｓ２８８Ｃの酵母ゲノムＤＮＡライブラリーから同定した。ＣＮＡ２およびＣＮＢ１遺伝子は、各々、単離されたファージクローン内の４．３ｋｂ  ＢｇｌIIおよび１．３ｋｂ  ＥｃｏＲＶ  ＤＮＡにマッピングされた。ＣＮＢ１断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（＋）のＳｍａＩ部位にｌａｃＺ向きに挿入し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、ＴＲＰ１−選択可能マルチコピー酵母シャトルベクターＹＥｐｌａｃ１１２（Ｇｉｅｔｓ及びＳｕｇｉｎｏ，１９８８，前掲）に移し、プラスミドＹＥｐ−Ｂを得た。ＣＮＡ２断片をＹＥｐ−ＢのＢａｍＨＩ部位に挿入してＹＥｐ−Ａ２−Ｂを得た。このプラスミドをエレクトロポレーションによってｆｋｓ１−１株ＹＦＫ５３１−５Ａに形質転換してＹＦＫ７９８を得た。
実施例１３
Ａ．グルカンシンターゼ阻害剤についてのスクリーニングのための、ｆｋｓ１−１突然変異株ＹＦＫ５３２−７Ｃの使用
株ＹＦＫ５３２−７Ｃ、ｆｋｓ１−１突然変異体は、株ＹＦＫ００７、ＦＫＳ１野生型株よりもＦＫ５０６およびＣｓＡ（公知のカルシニューリン阻害剤）に対して少なくとも１０００倍感受性である。ＹＦＫ００７およびＹＦＫ５３２−７Ｃはカルシニューリン阻害剤につきスクリーニングするのに使用できる。
また、株ＹＦＫ５３２−７Ｃは株ＹＦＫ００７よりも、エキノカンジンおよびパプラカンジンの両クラスのグルカンシンターゼ阻害剤に対して８−１０倍感受性である。従って、これらの株はグルカンシンターゼ阻害剤につきスクリーニングするのに使用できる。
カルシニューリン阻害剤を同定するためにカウンタースクリーニング株を工夫した。ｆｋｓ１−１突然変異体（株ＹＦＫ７９８）における酵母カルシニューリンの過剰発現はこれらの最も一般的なものを構成する。いずれの阻害剤標的化カルシニューリンも、ゾーン径の減少またはゾーン明確性の減少のいずれか（しばしば両者）を示す。グルカンシンターゼ阻害剤はいずれの効果も示さず、かくして、カルシニューリン阻害剤から区別できる。
グルカンシンターゼ阻害剤として陽性のものを知るために、カルシニューリン阻害剤について記載したのと同様に、株Ｒ５６０−１Ｃおよびその親Ｗ３０３−１Ａでのスクリーニングを工夫した。Ｒ５６０−１Ｃ−対−Ｗ３０３−１Ａについての、ゾーンの完全な喪失、またはサイズの顕著な減少はグルカンシンターゼ阻害性を示す。この株の対を用いた場合、カルシニューリン阻害剤ではゾーンは観察されない。
Ｂ．実験室手法の記載
最初のスクリーニングは、ＦＫＳ１野生型株（ＹＦＫ００７）のそれに対するｆｋｓ１−１酵母突然変異体（ＹＦＫ５３２−７Ｃ、ＦＫ５０６およびＣｓＡに対して高感受性）の感受性を比較する、２つのプレートのゾーンのサイズ差測定よりなる。２２０ｒｐｍで振盪しつつ、各株をＹＰＡＤ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2培地中、２８−３０℃で（中期または後期対数相まで）増殖させる。培養を水で１：１希釈し、希釈物のＯＤ値を（同様に１：１０に水中に希釈したＹＰＡＤ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2のブランクに対して）６００ｎｍで測定する。ＯＤ値に１０を乗じて培養のＯＤを見積もる。１．５％寒天を含有し、水浴で４５℃に平衡化したＹＰＡＤ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2培地の一部（１００ｍｌ）に、寒天中の最終細胞密度が０．０１５のＯＤ値となるように（すなわち、３×１０6ｃｆｕ／ｍｌ；試料計算は後記する）培養を接種する。接種した寒天を５００ｃｍ2Ｎｕｎｃプレートに注ぐ。寒天プレートが固形化してから、発酵エキスのごときテスト化合物を含有する試料の１０μＬアリコートを、水、１００％メタノールまたはエタノール、または５０％までのＤＭＳＯに溶解させ、１１×８のアレイにセットした２つのプレートの各メンバー上に置く。
該プレートを２８−３０℃で４８時間インキュベートする。ゾーンの直径を最外縁まで読み取り、ｍｍで記録する。ゾーンの明確性を、明瞭（表示無し）、ぼんやりした（ｈ）、非常にぼんやりした（ｖｈ）として記録する。非常にぼんやりしたゾーンは、アッセイ皿と暗色壁との間に置いた、上方からの光でプレートを見ることによって最も良く観察される。
標準
１．Ｌ−６７９，９３４（ＦＫ５０６）、メタノールに溶解させる。
２．Ｌ−６４４，５８８（サイクロスポリンＡ）（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ）は１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＣｒｅｍａｐｈｏｒベヒクル中にて販売されている。希釈は、各工程で激しく撹拌しつつ５０％メタノールまたは５０％エタノール中になすことができる。該ｃｒｅｍａｐｈｏｒはこれらの希釈においてもひどく濁ったままであるが、サイクロスポリンは生物学的に利用可能である。
３．Ｌ−７３３，５６０、メタノールに溶解させる。
４．Ｌ−６８７，７８１（ジヒドロキシパプラカンジン）、メタノールに溶解させる。
５．Ｌ−６３６，９４７（アクレアシン）、メタノールに溶解させる。全ての標準は−２０℃で保存する。
接種物希釈の試料計算
一晩の酵母培養は７ないし１０の範囲のＯＤ値を有するであろう（すなわち、１：１０希釈につき０．７ないし１．０）。８．９のＯＤを持つ培養を１：５９３に希釈して０．０１５のＯＤを持つ懸濁液を得る。従って、ＹＰＡＤ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2寒天の一部１００ｍｌに培養１６９ｍｌで接種する。
0003664490.tif 000004
0003664490.tif 000005
一次選択の結果
ＹＦＫ００７よりもＹＦＫ５３２−７Ｃの上で少なくとも２ｍｍ大きいゾーンは、カルシニューリンまたはグルカンシンターゼ阻害剤のいずれかの存在を示す。
ＹＦＫ５３２−７Ｃで観察されたものと比較してＹＦＫ７９８では減少し、ぼんやりとなるゾーンは、未知のものがカルシニューリン阻害剤であることを示す。
Ｗ３０３−１Ａと比較してＲ５６０−１Ｃで減少したゾーンは、グルカンシンターゼ阻害剤が存在することを示す。
実施例１４
グルカンシンターゼアッセイ
既知のようにして（Ｋａｎｇ及びＣａｂｉｂ，  ＰＮＡＳ，８３：５８−８−５８１２，１９８６）対数相まで増殖された突然変異体および野生型細胞から無細胞抽出物を調製した。ガラスビーズとホネジナイズした後、非破壊細胞および細胞夾雑物を低速遠心（５分間の１０００×ｇ）によって除去した。上清液体を１０００００×ｇで６０分間遠心し、ペレットを、０．０５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および１．０ｍＭ  ＰＭＳＦを含有する緩衝液（湿潤細胞１ｇ当たり）２．５ｍｌで洗浄した。洗浄したペレットを、５％グリセロールを含有する同緩衝液に再懸濁した。これを、キチンおよびグルカンシンターゼ酵素活性双方を含有するミクロソーム膜源として供した。合計容量６９μＬ中のＴＥＫ緩衝液（１２５ｍＭ  塩酸トリス、ｐＨ７．５、３１ｍＭ  ＫＦ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、２５％ＰＢＳ、ｐＨ７．０、３．３１μＭ  ＧＴＰ−γ−Ｓ、および０．２５％ＢＳＡを包含するカクテルＩ中の３５μｇ蛋白質を、合計容量１１μＬ中の４単位のα−アミラーゼ、２５μｇ  ＵＤＰ−グルコース、および１μＣｉのＵＤＰ−3Ｈ−グルコースを含むカクテルIIと混合することによって標準１，３−β−Ｄグルカンシンターゼ反応を開始した。３０℃における１５０分間のインキュベーションの後、ＵＤＰ−14Ｃ−グルコースのグルカンへの取り込みを、トリクロロ酢酸での沈殿後に測定した。
実施例１５
キチンシンターゼアッセイ
前記抽出物１２５μｇをトリプシン活性化し、０．５Ｍトリス、ｐＨ７．５、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、３２０μＭ  ＧｌｃＮＡｃ、14Ｃ−ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ基質ミックス、および０．８％ジギトニンを含む等容量（５０μＬ）のキチンシンターゼ反応カクテルと混合した。３０℃におけるインキュベーションの３０分後、取り込まれた14Ｃ−グルコースを１０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ワットマンのガラスマイクロファイバーＧＦ／Ａディスク上に収集し、計数した。
実施例１６
エキノカンジン−耐性突然変異体ＭＳ１０（ＭＹ２１１４）およびＭＳ１４（ＭＹ２１４５）の単離
ＭＳ１０およびＭＳ１４を２つの異なる手法でエキノカンジン耐性突然変異体として単離した。
第１の実験において、半合成エキノカンジンＬ−７３３，５６０の約４５μｇ（１．１２μｇ／ｍｌ溶液の４０ｍＬ）を、ＹＮＢＤ固形培地（ＹＮＢＤ培地はアミノ酸欠失を除きＳＣ培地と同じ）を含有する４つのプレートの各々の表面に延ばした。該溶液を風乾し、ＹＮＢＤブロス上で一晩新たに増殖させたサッカロミセス・セレビシエ株Ｘ２１８０−１Ａの１×１０6細胞を各プレート上に平板培養した。２８℃における４日間の増殖の後、Ｌ−７３３，５６０の存在下でも増殖できる３つのコロニーをエキノカンジン−耐性突然変異体として選別した。これらの突然変異体のうちの１つをＭＳ１４と命名した。
第２の実験は以下の修正をしつつ前記したごとくに行った：使用したＬ−７３３，５６０の濃度は約２２．５μｇ／プレートであった。融解し、次いで５０℃まで冷却したＹＮＢＤ培地２０ｍｌに阻害剤を添加した。４つのプレートを調製し；次いで、１×１０6細胞のサッカロミセス・セレビシエ株Ｘ２１８０−１Ａを各プレートの表面に広げた。２８℃における４日間の増殖の後、１２の耐性コロニーを単離した。これらの突然変異体のうちの１つをＭＳ１０と命名した。
これらの実験に基づくと、突然変異体ＭＳ１４の突然変異頻度は１．３×１０-6であり、他方、突然変異体ＭＳ１０の突然変異頻度は３×１０-6である。
実施例１７
ＭＳ１０およびＭＳ突然変異体の解析
ＭＳ１０およびＭＳ１４は、細胞壁、膜、ステロール、および蛋白質合成に影響する３０以上の阻害剤のパネルに対してテストした場合、多重薬物耐性は示さなかった。各ＭＳ１０およびＭＳ１４突然変異を担持する酵母株ＭＹ２１４４およびＭＹ２１４５の細胞をＹＰＡＤおよびＳＣ培地中で一晩増殖させた。一晩の培養から、細胞を同一培地中で１：１０希釈し、さらに４〜６時間増殖させた。薬物耐性／感受性テストは、固形ＹＰＡＤまたはＳＣ培地２０ｍｌおよび３×１０6細胞を含有するプレート上のディスク拡散アッセイによって行った。プレートに注ぐ前に５０℃まで冷却した予め融解させた培地に細胞を添加した。異なる薬物を含有する滅菌フィルターディスクをプレートの表面に置き、続いて２８℃で１〜２日間インキュベーションした。増殖阻止のゾーンのサイズを薬物耐性／感受性の相対的指標として測定した。ＭＳ１４はキチンシンターゼ阻害剤ニッコマイシンＺに対して高感受性であって、エキノカンジンＬ−７３３，５６０に対して耐性である。
ＭＳ１０およびＭＳ１４における突然変異の優性／劣性の関係は、ディスク拡散およびブロスマイクロ希釈アッセイ双方を用い、半数体および二倍体細胞の薬物耐性表現型を比較することによって判断した。これらのアッセイの結果は、ＭＳ１４細胞のニッコマイシンＺ−高感受性は劣性であり、他方、エキノカンジン耐性表現型は半優性であることを示す。対照的に、ＭＳ１０のエキノカンジン−耐性表現型は優性である。
以下の表におけるデータは、各突然変異体およびその親Ｘ２１８０−１Ａの増殖を阻止するのに必要な種々の薬物の最小濃度である。
0003664490.tif 000006
実施例１８
突然変異体グルカンおよびキチンシンターゼ酵素活性
細胞膜に関連する粗製酵素調製物を、グルカンおよびキチンシンターゼ活性につきテストした。Ｌ−７３３，５６０およびパプラカンジンに対する突然変異体１，３−β−Ｄグルカンシンターゼの感受性を、ニッコマイシンＺに対するキチンシンターゼの感受性と共にテストした。
これらの実験の結果は、ＭＳ１０およびＭＳ１４が、Ｌ−７３３，５６０に対しては高度に耐性であるが、パプラカンジンに対してはかろうじて耐性の劣る１，３−β−Ｄグルカンシンターゼと同等であることを明らかとした。キチンシンターゼはニッコマイシンＺに対する感受性により影響されない。以下の表のデータは、各々、１，３−β−Ｄグルカンシンターゼおよびキチンシンターゼアッセイにおける、グルカンシンターゼ阻害剤（Ｌ−７３３，５６０およびパプラカンジン）およびキチンシンターゼ阻害剤（ニッコマイシンＺ）についてのＩＣ50を示す。等量の膜蛋白質を各反応を開始させるのに使用した。
0003664490.tif 000007
実施例１９
ニッコマイシンＺ高感受性を相補する遺伝子のクローニング
遺伝的交雑を、ＭＳ１４（エキノカンジン−耐性およびニッコマイシンＺ−感受性）および野生型株ＧＧ１００−１４Ｄ（エキノカンジン−感受性およびニッコマイシンＺ−耐性）の間で実施した。得られた二倍体細胞を胞子形成させ、四倍体を詳細に比べ、続いて減数分裂分離体の表現型および薬物耐性分析を行った。結果は、エキノカンジン−耐性およびニッコマイシンＺ高感受性の２の表現型が共に分離することを示し、これは遺伝子一つのみが２つの表現型の原因であることを示唆する。
株Ｄ１−２２Ｃは前記交雑からの減数分裂分離体である。この株はエキノカンジン−耐性、ニッコマイシンＺ−高感受性であって、Ｕｒａ-である。株Ｄ１−２２Ｃからの細胞を、動原体をベースとしたベクターＹＣｐ５０（Ｍ．Ｒｏｓｅ、前掲）中に構築した酵母ＤＮＡゲノムライブラリーで形質転換した。これは、実施例６で使用したのと同一のＤＮＡライブラリーである。ウラシル−原栄養体およびニッコマイシンＺ−高感受性についての二重選択は、形質転換体をニッコマイシンＺ７５μｇ／ｍｌを含有するＵｒａ欠失プレート上で平板培養することによって行った。ウラシルの非存在下であってニッコマイシンＺの存在下で増殖できるコロニーのみが増殖する。従って、このアッセイは、ニッコマイシンＺ高感受性表現型を相補できるＤＮＡ断片を担持する組換えプラスミドを受容した形質転換体につき選択したこととなる。この方式によって単離したウラシル−原栄養体でニッコマイシンＺ−耐性のコロニー２０のうち、３つのクローンはエキノカンジンＬ−７３３，５６０に対しても感受性であった。それらの３つの形質転換体のうち１つは９−３Ｂと命名した株であり、相補する遺伝子をもつプラスミドを含有する。この株中のプラスミドをｐＭＳ１４と命名した。というのは、それは形質転換した突然変異体細胞（株Ｄ１−２２Ｃ）におけるＭＳ１４表現型を相補するからである。ｐＭＳ１４プラスミドを酵母細胞（クローン９−３Ｂ）からレスキューし、大腸菌で増殖させ、株Ｄ１−２２Ｃに再形質転換した。３つの形質転換体を、ブロスマイクロ希釈アッセイによって、Ｌ−７３３，５６０およびニッコマイシンＺに対する耐性／感受性につきテストした。テストした３つの形質転換体において、エキノカンジン耐性およびニッコマイシンＺ感受性は逆転した。
実施例２０
ＭＳ１０およびＭＳ１４における突然変異間の対立関係
ＭＳ１０をＧＧ１００−１４Ｄと交雑させることによって、ＭＳ１０からのエキノカンジン−耐性突然変異を担うウラシル栄養要求株を構築した。エキノカンジン−耐性減数分裂分離体を単一コピー組換えプラスミドｐＭＳ１４で形質転換し、形質転換体を、ブロスマイクロ希釈アッセイによってエキノカンジンに対する感受性につきテストした。テストしたすべての３つの形質転換体はＬ−７３３，５６０に対する感受性を示した。対照的に、対照プラスミドＹＣｐ５０で形質転換した突然変異体細胞はエキノカンジン−耐性のままであった。かくして、ＭＳ１４からの突然変異のエキノカンジン耐性およびニッコマイシン感受性表現型双方を相補する組換えプラスミドｐＭＳ１４は、ＭＳ１０のエキノカンジン耐性表現型を相補する。この結果は、２の突然変異が同一遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を表すことを示唆する。
実施例２１
Ａ．ｐＪＡＭ５４はＭＳ１０およびＭＳ１４からの突然変異を相補する。
ＭＳ１０またはＭＳ１４いずれかからの突然変異を含有する酵母細胞を、マルチコピープラスミドｐＪＡＭ５４（ＦＫＳ１を含有）で形質転換した。ｐＭＳ１４と同様に、ｐＪＡＭ５４は、ＭＳ１４からの突然変異によってもたらされたエキノカンジン耐性およびニッコマイシン感受性の２の表現型を相補した。また、ｐＪＡＭ５４は株ＭＳ１０のエキノカンジン耐性表現型を相補した。
Ｂ．ｐＭＳ１４およびｐＪＡＭ５４の間の交差−ハイブリダイゼーション
プラスミドｐＪＡＭ５４（ＦＫＳ１を含有するマルチコピープラスミド）および単一コピープラスミドｐＭＳ１４を制限酵素で消化し、ＦＫＳ１内部断片をハイブリダイゼーションプローブとして使用してサザーンハイブリダイゼーション分析によって分析した。サザーンおよび制限酵素分析は、ｐＪＡＭ５４およびｐＭＳ１４は共に同一の遺伝子、すなわちＦＫＳ１を含有することを示した。ＭＳ１０における突然変異は、従って、ｆｋｓ１−３といい、ＭＳ１４における突然変異はｆｋｓ１−４という。
実施例２２
クリプトコッカス・ネオフォルマンスからのＦＫＳ１およびＦＫＳ２相同体の単離
ＦＫＳ１相同体がＣ．  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓＢ−３５０２染色体に存在するか否かを判断するために、この株からの全ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化し、断片を０．８％アガロースゲル上で分離した。該ゲルを、サザーンの方法によってｐＪＡＭ５４からのＡｆｌII−ＸｈｏＩ断片でプローブし、高ストリンジェント条件下で洗浄した。長さが約１５ｋｂの断片がオートラジオグラムで見られた。この断片はＣ．  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓＢ−３５０２におけるＦＫＳ１相同体の全てまたは一部を恐らく含有する。
同様のサザーンブロットハイブリダイゼーション実験を、ＦＫＳ２断片をプローブとして行う。
実質的にＥｄｍａｎら（１９９０，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０（９）：４５３８−４５４４）の方法に従って、Ｃ．  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓＢ−３５０２からのポリ（Ａ）+ＲＮＡのファジミドｃＤＮＡライブラリーを構築する。大腸菌ＸＬ−１Ｂをファジミドライブラリーおよびヘルパーファージ（Ｒ４０８）で共感染させ、寒天プレート当たり約５００プラークが形成されるようにする。プラークをニトロセルロースに持ち上げ、ＦＫＳ１の断片をプローブとして標準的な方法によってプローブする。洗浄の後、フィルターをフイルムに暴露し、オートラジオグラムを用いて、ＦＫＳ１にハイブリダイズする特異的ファジミドクローンを同定する。次いで、プラスミドＤＮＡをｃＤＮＡトランスフェクト体から単離し、増殖させ、制限エンドヌクレアーゼでの消化によって分析する。
ＦＫＳ２を単離するために、同様の実験をＦＫＳ２プローブで行う。
実施例２３
ニューモシスティス・カリニからのＦＫＳ１およびＦＫＳ２相同体の単離
Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ−感染雄スプレイグ−ドーレイ・ラットからの全ラット肺をＢｒｉｎｋｍａｎｎホモゲナイザーでホモゲナイズし、ＤＮＡを文献記載のようにして単離した（Ｐ．Ａ．Ｌｉｂｅｒａｔｏｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３０（１１）：２９６８−２９７４）。精製したＤＮＡの２〜５μｇをＥｃｏＲＩのごとき制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片をアガロースゲル上で分離する。ＤＮＡをニトロセルロースのごとき固体支持体に移し、ＦＫＳ１に対する相同体を持つ断片につきサザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．１９７５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３−５１７）の方法によってプローブした。ストリンジェンシイを弱めブロットを洗浄することによって、弱い相同遺伝子を同定できる。
同様のサザーンブロットハイブリダイゼーション実験を、ＦＫＳ２断片をプローブとして行う。
ハイブリダイズする断片をサザーンブロットで可視化されるアガロースゲルの領域から、ミニ−ライブラリーを調製することによって、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉＦＫＳ１相同体をクローン化する。フェノール：ＣＨＣｌ3抽出して汚染物を除去した後、該ゲルのこの領域からのＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターに連結し、大腸菌に形質転換した。ミニ−ライブラリーを担持する大腸菌を寒天プレート上に広げ、ｉｎ  ｓｉｔｕコロニー溶解によってＦＫＳ１に相同のインサートにつきプローブする。個々の形質転換体からのＤＮＡをニトロセルロースに移し、放射能標識ＦＫＳ１  ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、洗浄し、フィルムに暴露させる。ＦＫＳ１に対する相同性を持つインサートを含有するコロニーをフィルム上で可視化し；次いで、プラスミドＤＮＡを陽性クローンから単離し、増殖させ、分析する。標準的な方法によるＤＮＡ配列分析を用いて、ＦＫＳ１に対する相同性の程度を確立し、機能的相同性をＦＫＳ１につき破壊されたサッカロミセス・セレビシエにおける発現によって証明することができる。
ＦＫＳ２相同体を単離するために、同様の実験をＦＫＳ２プローブで行う。
実施例２４
Ａ．ＦＫＳ１およびＦＫＳ２のアスペルギルス相同体のクローニング
当該分野で公知の方法（Ｔａｎｇら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１６６３−１６７１）によって、Ｇｌａｓｇｏｗ野生型としても公知のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣＡ４、およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＭＦ５６６８からゲノムＤＮＡを単離した。染色体ＤＮＡをいくつかの制限酵素で完全に切断し、消化したＤＮＡの断片を電気泳動によって分離した。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓＤＮＡを、ＢｉｏＲａｄ製Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  ＧＴ第四級アミン誘導ナイロン膜に移し、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓＤＮＡの断片をＮｙｔｒａｎナイロン膜（Ｓ＆Ｓ；  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，前掲）に移した。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓＤＮＡの二連ブロットを調製した。全てのブロットを、ランダムプライミング（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，前掲）によって放射能標識した32Ｐプローブとハイブリダイズさせた。Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓブロットについてのプローブは、ＦＫＳ１遺伝子を含有するｐＪＡＭ５４から単離した放射能標識した１．２５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片であった。また、１つのＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓブロットをこのプローブにハイブリダイズさせ、他のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓブロットを、ＦＫＳ２遺伝子の一部を含有するｐＦＦ２５０からの放射能標識した１．７ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片にハイブリダイズさせた。該ブロットをストリンジェントな条件下で一晩ハイブリダイズさせ、ストリンジェントな方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら，前掲）によって洗浄した。次いで、該ブロットをＸＡＲ−５フィルムに暴露し、常法（Ｌａｓｋｅｙ及びＭｉｌｌｓ（１９７７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，８２：３１４−３１６）によって現像した。両プローブはテストした各アスペルギルスＤＮＡの断片にハイブリダイズした。該ブロットは、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムＤＮＡがＦＫＳ１遺伝子からのサッカロミセス・セレビシエ１．２５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片およびＦＫＳ２遺伝子からの１．７ｋｂ  ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片の双方に対して相同であることを示す。また、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓＤＮＡはＦＫＳ１遺伝子からのサッカロミセス・セレビシエ１．２５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片に相同である。
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ相同体をクローン化するために、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムＤＮＡの２つのコスミドライブラリーをＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。コスミドベクターはＤＮＡをバクテリオファージλ粒子にパッケージするのに必要な「ｃｏｓ」配列を含有する修飾されたプラスミドである（Ｍａｎｉａｔｉｓら，前掲）。また、コスミドは複製起点を含有し、標準的な形質転換方法によって薬物耐性マーカーを大腸菌に導入でき、プラスミドとして増殖する。ｃｏｓ配列はベクターに連結された外来性ＤＮＡの３５−ないし４５−ｋｂ断片がλファージ粒子にパッケージされ、引き続いて大腸菌の感染に際して環化されるのを可能とする。２つの完全なコスミドライブラリーを、Ｂｒｏｄｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３１０５−３１０９）によるベクターＬＯＲＩＳＴ２およびｐＷＥ１５中で構築した。コスミドｐＷＥ１５はＣｏｌＥ１の複製起点を含有し、他方、ＬＯＲＩＳＴ２はバクテリオファージλの複製起点を含有する。１のベクターで不安定なＤＮＡ配列は、しばしば、他において安定である（Ｅｖａｎｓら，（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１５２巻：６０４−６１０）。コスミドライブラリーからのクローンをＮｙｔｒａｎ膜に移し、当該分野で公知の方法によってスクリーニングする（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。プローブは前記したＦＫＳ１およびＦＫＳ２遺伝子からの断片である。もしＦＫＳ１およびＦＫＳ２相同体がコスミドライブラリーに存在しないか、あるいは配列が不安定であれば、別のライブラリーをスクリーニングする。もし相同体が既に存在するライブラリーに存在しないか、あるいは遺伝子の一部のみが単離されれば、製造業者および当該分野の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）から得られるクローニングキットを用い、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムＳａｕ３ＡＩ部分ライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｍｂｄａ  Ｄａｓｈ中で構築する。
同様の方法を用いて、ＦＫＳ１およびＦＫＳ２のＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ相同体をクローン化する。
Ｂ．交差ハイブリダイゼーションによるサッカロミセス・セレビシエＦＫＳ１およびＦＫＳ２のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ相同体（ｆｋｓＡ）の単離
ｆｋｓＡはＦＫＳ１およびＦＳＫ２のアスペルギルス・ニデュランスについての表示である。ＤＮＡレベルの相同性がサッカロミセス・セレビシエＦＫＳ１およびＦＫＳ２遺伝子およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのゲノムＤＮＡの間で示された。この相同性はアスペルギルス相同体をクローン化する戦略の基礎をなす。
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅコスミドベクターｐＷＥ１５（Ｂｒｏｄｙら，１９９１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３１０５−３１０９）中に構築したＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムライブラリーはＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。このコスミドベクターは３０のマイクロタイタープレートに分割された大腸菌形質転換体を含有する２８３２の個々のコスミドよりなる。１４８８の形質転換体を、コロニーブロットとしてＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  ＧＴ第四級アミン誘導体ナイロン膜（ＢｉｏＲａｄ製）に移した。
マイクロタイタープレート（９６コロニー／プレート；１ブロット／プレート）のコロニーブロットは以下のごとくに作成した：個々のコスミドを、マイクロタイター皿中、ＬＢブロス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，前掲）中で一晩増殖させ、引き続いてアンピシリン１ｍｌ当たり５０μｇを含有するＬＢ寒天に接種した。増殖の７時間後、２のコロニーリフトを各プレートから作成し、フィルターを新しいプレートに移した。コロニーをさらに４時間増殖させ、フィルターに固定した。フィルターを０．５Ｎ  ＮａＯＨで処理し、１ＭトリスｐＨ７．５／７．５Ｍ  ＮａＣｌで中和し、１Ｍ  トリスｐＨ７．５／１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．２％ＳＤＳで洗浄し、１Ｍ  トリスｐＨ７．５／１．５Ｍ  ＮａＣｌで再度洗浄した。二連ブロットを、ｐＪＡＭ５４から単離した放射能標識した（32Ｐ）４．０ｋｂ  ＫｐｎＩ  ＦＫＳ１断片およびｐＦＦ２５０から単離した１．７ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片とハイブリダイズさせた。全ての32Ｐプローブはランダムプライミング（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，前掲）によって放射能標識した。ブロットは、製造業者ＢｉｏＲａｄによってＺｅｔａ膜につき推奨される条件を用いてハイブリダイズさせた。１のコロニーをまずＦＫＳ２プローブのみで検出した。このコスミドをｐＧＳ１と命名し、ＦＫＳ１およびＦＫＳ２遺伝子に対するハイブリダイゼーションを引き続いて精製コスミドＤＮＡでのＤＮＡスロットブロット分析によって確認した。コスミドＤＮＡをＬＢ培地で１０時間増殖させた培養から単離し、Ｑｉａｇｅｎプラスミドｍａｘｉキットで精製した。製造業者（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  およびＳｃｈｕｅｌｌ）の指示に従い、ＭｉｎｉｆｏｌｄIIスロットブロット装置を用い、各試料１．５μｇをＺｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ  ＧＴ第四級アミン誘導体化ナイロン膜（ＢｉｏＲａｄ）に適用することによって、二連ＤＮＡスロットブロットを調製した。試料はｐＧＳ１  ＤＮＡ、ベクターｐＷＥ１５  ＤＮＡ、およびハイブリダイズしないコスミドからのＤＮＡであった。スロットブロットをコロニーブロットについて前記したごとくにハイブリダイズさせた。ＦＫＳ１およびＦＫＳ２プローブは共にｐＧＳ１  ＤＮＡに特異的にハイブリダイズしたが、コスミドベクターｐＷＥ１５からのＤＮＡおよびハイブリダイズしないコロニーから単離したＤＮＡにはハイブリダイズしなかった。
コスミドｐＧＳ１のインサートは、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって〜３０ｋｂであると見積もられ、ＮｏｔＩまたはＥｃｏＲＩいずれかでの消化によってベクターから切り出された。ＦＫＳ２に対する相同性を持つｐＧＳ１からの特異的制限断片は、同一ハイブリダイゼーション条件を用い、サザーンブロットハイブリダイゼーションによって同定した。ＦＫＳ２にハイブリダイズした１１．０ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片をベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンして、サブクローンｐＧＳ３を構築した。制限地図は、制限エンドヌクレアーゼ消化および制限断片のアガロースゲル電気泳動によって決定し、図３に示す。ＦＫＳ２に相同なｐＧＳ３の領域はＦＫＳ２プローブへの制限断片のブロットのサザーンハイブリダイゼーションによって位置決定した。５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片はハイブリダイズする領域の内部にあり、以下の証拠に基づきｆｋｓＡに特異的であると判断された：左端に相当する１．７ｋｂ  ＰｓｔＩ断片および右端に相当する２．４ｋｂ  ＥｃｏＲＶ断片が、ＦＫＳ２にハイブリダイズすること。
いくつかのゲノムライブラリーは非隣接制限断片が連結されて得られた再配置された遺伝子またはＤＮＡを含有するので、サッカロミセス・セレビシエＦＫＳ２遺伝子および相同プローブでのサザーンブロットハイブリダイゼーションを行って、コスミドｐＧＳ１およびその誘導体ｐＧＳ３がＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムに関して共直線的であるか否かを判断した。相同プローブはｐＧＳ２から単離した５６８ｂｐ  ｆｋｓＡ特異的ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片であった。プラスミドｐＧＳ２は、ｐＧＳ１の６．０ｋｂ  ＳａｌＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングすることによって構築した。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムＤＮＡをＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ／ＳｓｔIIで消化した。ハイブリダイゼーションデータは、ゲノムＤＮＡの適当なサイズの制限断片が内部ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片のＥｃｏＲＶ部位に近い酵素で見い出されるが、このＥｃｏＲＶ部位よりも遠位の制限部位に対応するゲノムＤＮＡの制限断片は見い出されないことを示した。コスミドｐＧＳ１およびその誘導体ｐＧＳ３は図３に示したｐＧＳ３の制限地図の第２のＥｃｏＲＶ部位に対して左側のＥｃｏＲＩ部位からのＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムと共直線的であった。
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｆｋｓＡ遺伝子の全長を含有するコスミドクローンが単離されたことの確認のために、もう１つのライブラリーをスクリーニングした。ベクターｐＬＯＲＩＳＴ２（Ｂｒｏｄｙら，前掲）中に構築したＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓコスミドライブラリーは、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから得た。プローブをＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ内部５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片としたことを除き、該ライブラリーをｐＧＳ１の単離につき前記したのと全く同様にスクリーニングした。スクリーニングした２８８０のコスミドのうち、１つのコスミドクローンｐ１１Ｇ１２が該プローブに強くハイブリダイズした。精製したコスミドＤＮＡでのＤＮＡスロットブロット分析により、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ相同性プローブならびにＦＫＳ２プローブへのハイブリダイゼーションが確認された。相同プローブはｐＧＳ４から単離した５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片であった。プラスミドｐＧＳ４は、ｐＧＳ３の５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへサブクローニングすることによって構築した。ｐ１１Ｇ１２とＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムＤＮＡとの共直線性は、ＦＫＳ２プローブでのサザーンブロットハイブリダイゼーションによって決定した。テストした制限酵素はＥｃｏＲＶ−ＢｇｌII、ＥｃｏＲＶ−ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、およびＸｂａＩであった。ｐ１１Ｇ１２で得た制限断片はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓゲノムＤＮＡで得たものに対応した。このデータは、ｆｋｓＡに特異的な５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片の両側には、該ゲノムと共直線的な〜７．０ｋｂＤＮＡがあるのを示す。ＦＫＳ２にハイブリダイズし、該ゲノムと共直線的であるｐ１１Ｇ１２の１１．０ｋｂ  ＸｂａＩ断片を、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングしてｐＧＳ６を構築した。制限地図は、制限エンドヌクレアーゼ消化および制限断片のアガロースゲル電気泳動によって決定し、図４に示す。
ＤＮＡ配列は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ製「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ」キットを用い、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，７４；５４６３）の方法によるか、あるいは「Ｐｒｉｓｍ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ」と共にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定システムを用いて決定した。鋳型ＤＮＡは以下のプラスミド、ｐＧＳ４、ｐＧＳ７、ｐＧＳ６、ｐＧＳ１５、ｐＧＳ１６、ｐＧＳ１７、ｐＧＳ１８、ｐＧＳ１９、ｐＧＳ２０、およびｐＧＳ２１から得た。プラスミドｐＧＳ７は、ｐＧＳ６の１１．０ｋｂ  ＸｂａＩインサートをｐＢＲ３２２にサブクローニングすることによって構築した。ｐＧＳ６の３．６ｋｂ  ＫｐｎＩ断片および２．２ｋｂ  ＸｈｏＩ断片をｐＧＥＭ７にサブクローニングして、各々、ｐＧＳ１５およびｐＧＳ１６を構築した。Ｇｅｗａｉｎら（１９９２，Ｇｅｎｅ，１１９：１４９）が記載した方法を用い、Ｓａｕ３Ａ部分消化によってネストされた欠失のセットをｐＧＳ１５中に構築した。略言すれば、プラスミドｐＧＳ１５を、このベクターのマルチクローニング部位にあるＢａｍＨＩで直線化し、ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁した。反応混合物１５μｌ中の１μｇのアリコートを１×Ｓａｕ３Ａ緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中で部分消化に付した。酵素を貯蔵緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２００ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５０％グリセロール）中、０．７５単位／μｌに希釈し、貯蔵緩衝液中にさらに８回、順次２倍に希釈した。各希釈ならびに未希釈対照の１μｌを、１４μｌを含有する各試験管に添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する停止緩衝液３．４μｌの添加によって反応を停止し、６５℃で２０分間加熱した。ＤＮＡを電気泳動に付し、適当なサイズの断片をＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋプロトコルでゲル精製した。断片を定量し、５μｌの連結反応物当たりＤＮＡ２５ｎｇで再連結した。４つの最大断片を含有する連結物を沈殿させ、５μｌ反応物中、Ｃｓｐ４５１で消化した。Ｃｓｐ４５１部位はベクターのＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間にある。この消化は欠失を含有しない汚染断片を全て除去するのに必要であった。全てのＤＮＡ試料をＤＨ５ａ  ＦＩＱに形質転換し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって、適当な組換体を同定した。プラスミドｐＧＳ１７、ｐＧＳ１８、ｐＧＳ１９、ｐＧＳ２０およびｐＧＳ２１に含有された欠失物を図４に示す。
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合するＫＳおよびＳＫ配列決定プライマーを用い、ｐＧＳ４の５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩインサートの配列決定を開始した。ｆｓｋＡ配列を用いて、インサートの各鎖につき、当該配列をまたぐプライマーを設計した。ｐＧＳ４の５６８ｂｐインサートの配列の各末端に対するプライマーを作成し、ｐＧＳ７を鋳型としてｆｓｋＡ配列の延長に用いた。この情報を用いて、ｐＧＳ１５およびｐＧＳ１６を鋳型として用い、当該配列をまたぐプライマーを設計した。ネストされた欠失を含有するプラスミドｐＧＳ１７、ｐＧＳ１８、ｐＧＳ１９、ｐＧＳ２０、およびｐＧＳ２１につき、さらなる３′配列を得た。ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合するＳＰ６プライマーを用いて配列決定を開始し、プラスミドの配列が重複しない場合は、ｆｓｋＡ配列をベースとして配列を延長した。また、ｆｓｋＡをベースとするプライマーを用いて、ｐＧＳ６を鋳型として用い、対向鎖の配列を得た。配列を組み立て、ウィスコンシン大学の遺伝学コンピューターグループ（ＧＣＧ）配列分析ソフトウェアパッケージで分析した。
ｆｋｓＡの２５６５ヌクレオチドのＤＮＡ配列は、両鎖に基づく１６００ヌクレオチドの配列から決定した（図５）。８５５アミノ酸の推定開放読み枠は、サッカロミセス・セレビシエＦＫＳ１およびＦＫＳ２蛋白質に対して６７％の同一性を示すとされた。該アミノ酸配列をＧＡＰTM（ＧＣＧ）プログラムと比較した。ｆｋｓＡに相同なＦＫＳ２の領域はアミノ酸９４３からアミノ酸１７９９まで伸び、後者はカルボキシ末端に近い。ｆｋｓＡ推定開放読み枠の前半（アミノ酸１−４２７）はＦＫＳ２に最も相同で８２％の同一性を示し、一方、後半は５３％の同一性である。
ｆｋｓＡ遺伝子のｐＧＳ６上での位置は、配列情報および転写マッピングに基づいて決定できる。配列決定されたｆｋｓＡ遺伝子の一部は、図４の制限地図に示したごとく、ｐＧＳ６の第４のＰｓｔＩ部位の左側３１１ヌクレオチドから始まる。ｆｋｓＡ遺伝子産物およびサッカロミセスＦＫＳ１およびＦＫＳ２遺伝子産物の間の相同性に基づき、ｆｋｓＡの転写の方向は、図４に示したｐＧＳ６の制限地図で左から右であると推断できる。ｆｋｓＡ遺伝子につき、さらに、転写マッピングによってｐＧＳ６上で位置決めを行った。Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ（Ｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ−Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，１９８６）によって記載されているごとく当該分野で公知の方法を用いて、全Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓＲＮＡを単離した。該ＲＮＡを１．５％アガロース、２．２Ｍホルムアルデヒド、１×ＭＯＰＳ緩衝液での電気泳動に付し、Ｎｙｔｒａｎナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ）に移し、Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅのプロトコル（プロトコル番号６、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏ  Ｔｒａｃｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ）に従ってハイブリダイズさせた。ｐＧＳ４のｆｋｓＡ特異的５６８ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＶ断片のゲルブロットへのハイブリダイゼーションにより、単一の転写体が検出された。同一サイズの転写体が、ｐＧＳ６の２つの隣接ＰｓｔＩ断片、１．２ｋｂ  ＰｓｔＩ断片および０．７ｋｂ  ＰｓｔＩ断片によって検出されたが、１．２ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片の５’側にあるｐＧＳ３の１．４ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＳｐｅＩ断片では検出されなかった（該１．４ｂｐ  ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片は、ｐＧＳ３からの断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングすることによって構築されたｐＧＳ９から単離した）。これらのデータは、ｆｋｓＡ転写体は１．２ｋｂ  ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片内で始まることを示す。配列データは、ｆｋｓＡ遺伝子はｐＧＳ６のＥｃｏＲＶ部位を超えて伸びていることを示す。ｐＧＳ６の１．６ｋｂ  ＮｄｅＩ−ＮｈｅＩ断片は転写体を検出せず、これは転写体がＮｄｅＩ部位の前で終わることを示唆する。以上を要約すると、ｆｋｓＡ転写体は１．２ｋｂ  ＰｓｔＩ断片内で始まり、ｐＧＳ６のＥｃｏＲＶおよび第２のＮｄｅＩ部位の間で終わる。ｆｋｓＡ遺伝子の調節配列は１．２ｋｂ  ＰｓｔＩ断片の５’末端側に位置させることが可能である。
実施例２５
植物病原性真菌類からのＦＫＳ相同体の単離
Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａおよびＵｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓのごとき植物病原性真菌類からのＦＫＳ１およびＦＫＳ２相同体をクローン化するために、ＡｔｋｉｎｓおよびＬａｍｂｏｗｉｔｚ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，５：２２７２−２２７８）によって記載されている方法によって高分子量ゲノムＤＮＡを単離し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによって部分消化し、製造業者および当該分野で知られた方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）のクローニングキットを用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｍｂｄａ−Ｄａｓｈにクローン化した。該ライブラリーを、実質的に前記したごとくにＦＫＳ１およびＦＫＳ２からのプローブを用いてスクリーニングした。
実施例２６
Ａ．ｐｃｒ１（ｆｋｓ２−１）突然変異体の単離
標準的な手法を用い、（ＹＦＫ０９７８およびＹＭ０１４８としても公知の）Ｌ−７３３，５６０耐性突然変異体ＭＹ２２５６をＹＦＫ０９３１−０７Ｂ株から単離した。４種の類遺伝子性（ｆｋｓ１−１）親株（ＹＦＫ０９３１−０３Ｂ、ＹＦＫ０９３１−０７Ｂ、ＹＦＫ０９３１−１０Ｃ、およびＹＦＫ０９３２−０１Ｃ）を突然変異体探求で用いた。４種の株の遺伝子型は後記に表示する。該株はＡＲＳエレメントを含有するプラスミドｐＤＬ１、動原体およびＣＮＢ１、ＳＵＰ１１、およびＵＲＡ３遺伝子を含有する。
この突然変異体探求は、エキノカンジン耐性を付与するＦＫＳ２遺伝子における突然変異を同定するように設計した。略言すると、２８℃にて、ＹＰＡＤ１０Ｃａ培地（１０ｍＭ  ＣａＣｌ2を含有するＹＰＡＤ培地）５ｍｌ中で親株を一晩増殖させた。細胞をＹＰＡＤ１０Ｃａ中に１×１０3細胞／ｍｌに希釈し、培養のアリコート（０．２ｍｌ）を９６の個々のマイクロタイターウェルに分注した。培養を２８℃で飽和するまで増殖させた。５のウェルからの細胞を１：２０希釈し、６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ660）を測定して、各培養ごとの平均細胞密度を計算した（１  ＯＤ660＝３．３×１０7細胞／ｍｌ）。
各株の４０培養を、１μｇ／ｍｌのＬ−７３３，５６０を含有するＹＰＡＤ１０Ｃａ培地上で平板培養した。加えて、ＹＦＫ９３２−１ＣおよびＹＦＫ９３１−１０Ｃの２０ウェルを１：１０および１：１００希釈し、１μｇ／ｍｌＬ−７３３，５６０を含有するＹＰＡＤ１０Ｃａ培地上で平板培養した。プレートを２８℃でインキュベートした。２つのコロニーを各薬物プレートから拾い、−ＵｒａおよびＹＰＡＧ培地上でクローン的に精製し、２８℃で増殖させた。各プレートから２つの独立したクローンを、−ＵｒａおよびＹＰＡＤ１０Ｃａ培地のマスタープレートに拾い上げた。該マスタープレートを、標準的な欠失培地、ＹＰＡＤ１０Ｃａ培地、および１μｇ／ｍｌのＦＫ５２０、ＦＫ５０６、Ｌ−７３３，５６０、１０ｍｇ／ｍｌのサイクロスポリンＡ、または０．１μｇ／ｍｌラパマイシンのいずれかを含有するＹＰＡＤ１０Ｃａ培地にレプリカ平板培養した。該プレートを２８℃でインキュベートした。該マスターをＹＰＡＤ培地にレプリカ平板培養し、３７℃で該プレートをインキュベートすることによって温度感受性を測定した。該プレートを２日および３日後に評定した。
この実験から、Ｌ−７３３，５６０（１μｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＡＤ１０Ｃａ培地で増殖する１８の独立した突然変異体を、スクリーニングした約３．７×１０9細胞から同定した。これらのｐｃｒ（ニューモカンジン耐性）突然変異体はＬ−７３３，５６０に対して耐性であって、免疫抑制剤ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ＣｓＡ、およびラパマイシンに対しては感受性であった。また、突然変異体のうちの１つ（ＭＹ２２５６）は、３７℃における温度感受性表現型を保有した。ＭＹ２２５６およびその親株（ＹＦＫ０９３１−０７Ｂ）のＬ−７３３，５６０、ＦＫ５２０、ＦＫ５０６、ＣｓＡ、およびラパマイシンに対する感受性を測定し、結果を後記で示す。後記表に示すごとく、突然変異体はその親よりもＬ−７３３，５６０に対してかなり耐性である。ＭＹ２２５６およびＹＦＫ０９３１−０７Ｂはテストした免疫抑制剤に対して同様の感受性を示す。
混合した膜画分をＭＹ２２５６およびＹＦＫ０９３１−０７Ｂから調製し、標準的な手法を用い、Ｌ−７３３，５６０に対する１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ活性の感受性を、部分的精製膜調製物でアッセイした。ＹＦＫ０９３１−０７ＢおよびＭＹ２２５６からの１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ活性の特異的活性は、ｍｇ・時間当たりに取り込まれたＵＤＰ−Ｄ−［６−3Ｈ］グルコースの６０および４５ナノモルであった。突然変異体および親株からの酵素活性のＩＣ50は、各々、１６−２４μＭおよび０．２１μＭであり、これは、ＭＹ２２５６における１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ活性はＬ−７３３，５６０に対して耐性であることを示す。ＭＹ２２５６はさらに解析した。
実施例２７
ｐｃｒ１突然変異体の遺伝的解析
ＭＹ２２５６（ＭＡＴａ  ｆｋｓ１−１  ｐｃｒ１）を野生株ＹＦＫ０００５（ＭＡＴα  ＦＫＳ１＋ＰＣＲ１＋）と交雑させて株ＹＦＫ０９９６−１１Ｂを得た。ＹＦＫ０９９６−１１Ｂ（ＭＡＴａ  ｆｋｓ１−１  ｐｃｒ１）をＹＦＫ０６８８−１４Ｂ（ＭＡＴα  ｆｋｓ１−１  ＰＣＲ１＋）に接合させ、胞子形成させ、詳細に調べた。この交雑からの２９の四胞子および１２の三胞子の四倍体において、ｐｃｒ１表現型（Ｌ−７３３，５６０に対して耐性）は２r：２sに分離し、これは、ｐｃｒ１表現型は単一の突然変異の結果であることを示す。（ＹＦＫ１０８７−２０Ｂ、ＭＡＴα  ｆｋｓ１−１  ｐｃｒ１としても知られている）株ＭＹ２２５９および（ＹＦＫ１０８７−２０Ａ、ＭＡＴａ  ｆｋｓ１−１  ｐｃｒ１としても知られている）ＭＹ２２６０をこの交雑から得た。元のＭＹ２２５６突然変異体と同様に、ＭＹ２２５９およびＭＹ２２６０はｆｋｓ１−１およびｐｃｒ１突然変異を含有する。しかしながら、これらの株は元の突然変異体に存在するプラスミドｐＤＬ１を含有しない。
また、ＹＦＫ０９９６−１１Ｂ（ＭＡＴａ  ｆｋｓ１−１  ｐｃｒ１）をＹＦＫ０００５（ＭＡＴα  ＦＫＳ１  ＰＣＲ１）に交雑させた。この交雑において、ｐｃｒ１およびｆｋｓ１−１突然変異は独立して分離された。１６の四胞子および２０の三胞子四倍体において、１の親ジタイプ：１の非親ジタイプ：４のテトラタイプ四倍体の分離パターンを示し、これは２つの非連鎖遺伝子の証明である。また、この交雑は、ｐｃｒ１表現型はＦＫＳ１バックグラウンドで発現されることを示した。ＦＫＳ１ｐｃｒ１胞子はＬ−７３３，５６０およびカルシニューリン阻害剤ＦＫ５２０、ＦＫ５０６およびＣｓＡに対して耐性である。（ＹＦＫ１０８８−２３Ｂ、ＭＡＴａ  ＦＫＳ１＋ｐｃｒ１としても知られている）株ＭＹ２２５７、（ＹＦＫ１０８８−１６Ｄ、ＭＡＴα  ＦＫＳ１＋ｐｃｒ１としても知られている）ＭＹ２２５８、およびＹＦＫ１０８８−０２Ｄ（ＭＡＴａ  ＦＫＳ１＋ｐｃｒ１）がこの交雑から分離された。後記表に示すごとく、これらの分離体は野生型ＦＫＳ１バックグラウンドにｐｃｒ１突然変異を含有し、元の突然変異体に存在したプラスミドｐＤＬ１を欠く。
ｐｃｒ１突然変異がＦＫＳ２遺伝子にマップされるか否かを判断するために、ＹＦＫ１０８８−０２Ｄ（ＭＡＴａ  ｐｃｒ１）をＹＦＦ２７２０（ＭＡＴα  ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１）に交雑させた。この交雑からの３１の四胞子および６の三胞子四倍体において、すべての分離体は、Ｌ−７３３，５６０（ｐｃｒ１）およびトリプトファン栄養要求性（ｔｒｐ１）に対する耐性またはＬ−７３３，５６０およびトリプトファン原栄養体（ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１）に対する感受性の親表現型を示した。これらの結果は、ｐｃｒ１突然変異がＦＫＳ２遺伝子に密接にリンクしていることを示す。２つのさらなる交雑において、ＹＦＫ０９９６−２３Ｄ（ＭＡＴａ  ｐｃｒ１  ｃｎｂ１：：ＬＹＳ２）をＹＦＦ２７２０（ＭＡＴα  ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１）およびＹＦＦ２７２１（ＭＡＴα  ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１）に接合させた。テストした７８の四倍体において、ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１胞子は全てＬ−７３３，５６０に対して感受性であり、これは、ｐｃｒ１突然変異がＦＫＳ２遺伝子にマップされることを支持する。さらに、これらの交雑からのｃｎｂ１：：ＬＹＳ２胞子は全てＬ−７３３，５６０に対して感受性であった。これは、もし突然変異がカルシニューリンに制御されたＦＫＳ２遺伝子内にマップされるならばあり得ることである。
要約すると、ｐｃｒ１突然変異は、単一の遺伝子であり、ｆｋｓ１−１とは独立に分離し、ＦＫＳ１細胞で発現され、ＦＫＳ２遺伝子に密接にリンクしている。この理由で、ｐｃｒ１対立遺伝子はｆｋｓ２−１と改名された。
Ｂ．ｐｃｒ１（ｆｋｓ２−１）突然変異体の薬物耐性のレベルおよびスペクトルの定量
Ｌ−７３３，５６０、Ｌ−６３６，９４７（アクレアシン）およびＬ−６８７，７８１（ジヒドロパプロカンジン）に対するｐｃｒ１（ｆｋｓ２−１）ｆｋｓ１−１およびｐｃｒ１（ｆｋｓ２−１）ＦＫＳ１株の感受性をＭＩＣアッセイで測定した。略言すると、株を、液体ＹＰＡＤ培地５．０ｍｌ中、静止相まで増殖させた。ＭＹ２２５６予備培養を液体ＹＰＡＤ１０Ｃａ中で増殖させた。ＭＩＣアッセイは三連の平坦なウェルのマイクロタイタープレートで行った。マイクロタイタープレートの各ウェルにＹＰＡＤ培地１００μＬを満たした。最初のウェルに、ＹＰＡＤ培地中の薬物の４×溶液１００μＬを添加した。対照として供するために、ＹＰＡＤ１μＬ当たり１６０μＬ  ＤＭＳＯのストック溶液を作成した。溶媒の存在下であって薬物の不存在下で増殖させた株につき、この溶液１００μＬを、最初のウェルに添加した。薬物の２倍系列希釈を順次プレートに施した。
培養をＹＰＡＤ中、５×１０5細胞／ｍｌに希釈した（１  ＯＤ660＝３．３×１０7細胞／ｍｌ）。希釈した培養１００μＬを各ウェルに添加し、再懸濁し、２８℃でインキュベートした。４２時間後、培養を再懸濁し、ＳＬＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ３４０ＡＴＴＣマイクロタイタープレートリーダーで細胞密度を測定した。後記表に示すＭＩＣ濃度は、薬物の不存在下で増殖した株の１０％未満増殖となる薬物濃度を表す。
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実施例２８
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットｃＤＮＡの細菌発現ベクターへのクローニングおよび発現
組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを大腸菌のごとき細菌発現系で産生する。１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット発現カセットを大腸菌発現ベクターに移す；発現ベクターは限定されるものではないがｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む。該ｐＥＴベクターは、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット発現を密接に調節されたバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置く。誘導可能なｌａｃプロモーターによって駆動されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌宿主にこの構築体を移入した後、適当なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養に添加することによって１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの発現が誘導される。発現された１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットのレベルを本明細書に記載するアッセイによって測定する。
実施例２９
昆虫細胞における発現のための１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットｃＤＮＡのベクターへのクローニングおよび発現
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来するバクロウイルスベクターは、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＃１７１１）におけるｃＤＮＡの高レベルの発現を供するように設計する。以下の標準的な方法（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭａｘｂａｃＭａｎｕａｌ）によって、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットｃＤＮＡを発現する組換えバクロウイルスを産生する；ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含めた、種々のバクロウイルス移入ベクター中のポリヘドリン遺伝子に、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットｃＤＮＡ構築体を連結する。相同組換え、続いてのバクロウイルス移入ベクターおよび線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ（Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１８，５６６７（１９９０））のＳｆ９細胞への共トランスフェクションによって組換えバクロウイルスを作成する。組換えｐＡＣ３６０ウイルスは昆虫細胞における封入体の不存在によって同定し、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ  ＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ．１５５５）に基づいて同定する。プラーク精製に続き、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット発現を測定する。
真正な１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット受容体が感染細胞との関連で見い出される。活性な１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを低張または洗浄剤溶解によって昆虫細胞から抽出する。
別法として、下流に、誘導可能なメタロチオニンプロモーターの制御下にある修飾された受容体ＤＮＡを含有するベクター、およびＧ４１８耐性ネオマイシン遺伝子をコードするベクターでのＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞の共トランスフェクションによって、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットをショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２細胞で発現させる。Ｇ４１８の存在下での増殖により耐性細胞が得られ、これを誘導して、ＣｕＳｏ4の添加によって１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを発現させる。１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット調節剤の選定は、全細胞または膜調製物いずれかを用いたアッセイで達成される。
実施例３０
組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの精製
組換えにより産生された１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットは、限定されるものではないが抗体アフィニティークロマトグラフィーを含む種々の手法によって精製できる。
組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット抗体アフィニティーカラムは、抗−１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット抗体をＡｆｆｉｇｅｌ−１０（ＢｉｏＲａｄ）（抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化されたゲル支持体）に添加することによって作成する。次いで、抗体をスペーサーアームの部分でアミド結合を介してゲルにカップリングさせる。次いで、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で失活する。カラムを水、続いて０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非結合抗体または外来蛋白質を除去する。次いで、カラムを、洗剤のごとき適当な膜可溶化剤と共にリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、可溶化された１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。次いで、カラムを、光学密度がバックグラウンドに降下するまでリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し；次いで、蛋白質を、洗剤を補足した０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出させる。次いで、精製した１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット蛋白質をＰＢＳに対して透析する。
実施例３１
哺乳動物細胞系における１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットのクローニングおよび発現
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを哺乳動物発現ベクターにクローン化する。該哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞系を形質転換して、組換え哺乳動物細胞系を得る。組換え哺乳動物細胞系を、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットの発現が可能な条件下で培養する。組換え哺乳動物細胞系または該組換え哺乳動物細胞系から単離した膜をアッセイで用いて、組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットに結合する化合物を選定する。
実施例３２
スクリーニングアッセイ
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットをコードするＤＮＡを含有する組換え細胞、該組換え細胞に由来する膜、または該細胞もしくは膜に由来する組換え１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット調製物を用いて、１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット活性を調節する化合物を選定できる。かかる活性の調節はＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質またはその組合せのレベルで起こる。１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを調節する化合物を選定する１つの方法は、
（ａ）テスト化合物を１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニットを含有する溶液と混合して混合物を得；
（ｂ）該混合物中の１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼササブユニット活性を測定し；次いで、
（ｃ）混合物の１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼサブユニット活性を標準と比較する；
ことよりなる。
実施例３３
ＦＫＳ１のＤＮＡ配列
ＦＫＳ１のＤＮＡ配列を測定し、図６に示す。
実施例３４
ＦＫＳ１のアミノ酸配列
ＦＫＳ１のアミノ酸配列を決定し、図７に示す。
実施例３５
ＦＫＳ２のＤＮＡ配列
ＦＫＳ２のＤＮＡ配列を測定し、図８に示す。
実施例３６
ＦＫＳ２のアミノ酸配列
ＦＫＳ２のアミノ酸配列を決定し、図９に示す。
実施例３７
株Ｒ５６０−１Ｃにおけるｆｋｓ１−１突然変異を同定するために、（限定されるものではないがＫｐｎＩ、ＳｓｔＩ、ＢｇｌII、ＸｈｏＩを含めた）制限酵素での消化およびアガロースゲル電気泳動による精製によって、ＦＫＳ１暗号配列の一部を欠くギャップありプラスミドを、プラスミドｐＪＡＭ５４から調製した。標準的な方法を用い、このギャップありプラスミドをゲルから精製し、株Ｒ５６０−１Ｃに形質転換する。ウラシル欠失培地で選択した６０のＵｒａ+形質転換体を同一培地上にパッチし、３０℃で２４時間増殖させ、次いで、４μｇ／ｍｌＬ−７３３，５６０を補足したウラシル欠失培地にレプリカ平板培養し、３０℃で２日間インキュベートした。ウラシル非含有プレート上でのクローンの増殖は、１）このギャップありプラスミドは、株Ｒ５６０−１Ｃの染色体での相同組換えによりギャップの端部が修復され、２）ギャップはｆｋｓ１−２突然変異部分にわたることを示すであろう。対照的に、もしギャップがｆｋｓ１−２突然変異を含有しない染色体の領域にあるならば、修復されたプラスミドは無傷の野生型ＦＫＳ１遺伝子を担持し、形質転換体は部分的に薬物感受性であろう。ｐＪＡＭ５４のＫｐｎＩ−ギャップバージョンで形質転換した６０のクローンのうち５６が薬物耐性であった。これらのクローンからのプラスミドＤＮＡを単離し、大腸菌での増殖によって増幅し、ＦＫＳ１の染色体コピーにおいて挿入−欠失を持つ酵母株ＹＬＩＰ１３７に形質転換した。株ＹＬＩＰ１３７は実施例１に記載した株ＹＦＦ２４０９と表現型が類似しており、すなわち、ＹＬＩＰ１３７におけるＦＫＳ１の染色体コピーは機能的に不活化されている。ＦＫＳ１のプラスミド由来コピーはこれらの細胞において唯一のＦＫＳ１の機能的コピーであり；もしそれらがＬ−７３３，５６０に対して耐性であれば、それは該プラスミドがＦＫＳ１のｆｋｓ１−２突然変異体バージョンを担持することに帰する。ＹＬＩＰ１３７のＵｒａ+形質転換体をウラシル欠失培地で選択し、いくつかのクローンを液体ＭＩＣアッセイによってＬ−７３３，５６０に対する影響性につき分析した。全てのクローンは元のＲ５６０−１Ｃ突然変異体と同様に薬物に対して耐性であった。本発明者らは、ｆｋｓ１−２を担持する元のギャップ修復プラスミドをｐＪＡＭ６７と命名した。
プラスミドｐＪＡＭ６７からのＫｐｎＩ制限断片は長さが３．５ｋｂである。ｆｋｓ１−２突然変異を保有するより小さい断片を同定するために、プラスミドｐＪＡＭ５４中のＦＫＳ１遺伝子の断片をｐＪＡＭ６７（ｆｋｓ１−２）からの対応する断片で置き換え、新しい構築体をＹＬＩＰ１３７に形質転換し、液体ＭＩＣアッセイを用いて薬物耐性につきクローンをアッセイした。このようにして、ｆｋｓ１−２突然変異はｐＪＡＭ６７の０．８ｋｂ  ＳａｌＩ−ＮｃｏＩ断片内にあると判断された。この断片を、ＤＮＡ配列決定に適した大腸菌プラスミド（ｐＧＥＭ３（ｚ）ｆ）にサブクローン化した。
製造業者の仕様に従い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．からのモデルＸＸＸＸ自動ＤＮＡ配列決定機を用いて、約０．８ｋｂのＳａｌＩ−ＮｃｏＩ断片の配列を決定した。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎからのＧＣＧソフトウェアパッケージを用い、配列データを分析した。ｐＪＡＭ６７からのＳａｌＩ−ＮｃｏＩ断片（正確な長さ＝７１１ｂｐ）のＤＮＡ配列をＦＫＳ１のそれと比較して、ただ一つの変化が明らかとなった。ＦＫＳ１  ＳａｌＩ−ＮｃｏＩ断片のヌクレオチド４６９位において、塩基はＴ（チミジン）であるところ、ｆｋｓ１−２ＤＮＡ断片においては、対応する位置におけるヌクレオチド塩基はＡ（アデニン）である。蛋白質に翻訳された場合、この変化の結果、１８７７アミノ酸蛋白質一次配列のうち６３９位のフェニルアラニン（Ｆｋｓ１ｐ）がイソロイシン（Ｆｋｓ１−２ｐ）で置換される。この変化により、株Ｒ５６０−１Ｃおよびそれから得られる１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ双方のＬ−７３３，５６０耐性がもたらされるとの仮説が成立する。
実施例３８
カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２６１からの全ゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで完全に消化し、０．８％ゲルを用いるアガロースゲル電気泳動で分離した。該ゲルからのＤＮＡ断片の一部をニトロセルロースフィルターに移し、サザーンブロット（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前掲）によってサッカロミセス・セレビシエＦＫＳ１からの１．２５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片でプローブした。カンジダＤＮＡの約２ｋｂ断片は該プローブにハイブリダイズし、ゲルの残りの対応する領域からの断片を切り出し、標準的な方法によって精製し、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化したベクターｐＧＥＭ３（ｚ）ｆ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。連結混合物を大腸菌コンピテント細胞に形質転換し、プラスミド担持形質転換体をアンピシリンを含有する培地で選択し、プールした。２ｋｂのカンジダ・アルビカンスＦＫＳ１−相同ＤＮＡを持つプラスミドを担持するクローンを同定するために、プールした形質転換体のアリコートを選択培地上に広げ、コロニーをニトロセルロースに移し、標準的な方法によって溶解し、ｐＪＡＭ５４から単離した［32Ｐ］標識１．２５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片でプローブした。フィルターをストリンジェントな条件下で洗浄し、フィルムに暴露した。１９のコロニーがブロット上で陽性シグナルを示した。元のコロニーを源として用い、クローンであり得る各々からの細胞を液体培地で増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離した。このＤＮＡをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガースゲルで分離した断片を、サザーンブロットによって、ｐＪＡＭ５４からの放射能標識した１．２５ｋｂ  ＳａｌＩ−ＣｌａＩ断片でプローブした。１９のプラスミドのうち３つが、該プローブと強力にハイブリダイズする約２ｋｂの断片を含有した。カンジダ・アルビカンスＦＫＳ１相同体のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片を持つプラスミドをｐＧＪＳ１と命名した。ＦＫＳ１に相同なカンジダ遺伝子をＦＫＳ１ｃａｎと命名した。
標準的な方法を用いてｐＧＪＳ１からの約２ｋｂ断片のヌクレオチド配列を測定した。最初の２つの配列決定反応については、変性ｐＧＪＳ１  ＤＮＡをＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な「Ｔ７プライマー」および「ＳＰ６  プライマー」にアニールした。酵素「Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖ．２」を含めた全ての他の試薬はＵ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのものであり、製造業者の仕様に従って使用した。第１の反応からのＤＮＡ配列結果を用いて、これらの最初の反応からの配列の「末端」に相補的な１８−塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。これらのプライマーを反応の次の工程で用いた。該プロセスを、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）からのＧＣＧ分析プログラムを用い、隣接する蛋白質をコードする開放読み枠が個々の配列決定反応から得られるまで継続した。
カンジダ・アルビカンスＦＫＳ相同体（Ｆｋｓｃ１ｐ）の推定されるペプチド配列をカンジダ・アルビカンスからのＦｋｓ１ｐの蛋白質配列と比較した。Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐのプログラムを用いると、Ｆｋｓｃ１ｐのアミノ酸１ないし６８９はＦｋｓ１ｐの残基４６０−１１４７に相当した。２のペプチド配列は、この範囲にわたって相互に７９％同一であり８８％類似であった。これは非常に高度の相同性を構成し、２の蛋白質は機能が非常に似ているらしいことを示す。特に、エキノカンジン阻害剤（前掲）に罹患性の野生型に重要な残基として突然変異遺伝子ｆｋｓ１−２として同定された、Ｆｋｓ１ｐの６３９位のフェニルアラニンは、図ＣＤ１に示したＦｋｓｃ１ｐアミノ酸配列のフェニルアラニン１８０と同一であった。１）ＦＫＳ１ｃａｎはカンジダ・アルビカンス１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼのエキノカンジン−感受性サブユニットをコードし、２）Ｆｋｓｃ１ｐ蛋白質配列の残りはＦｋｓｌｐに対して同様の程度の相同性を示し、３）限定されるものではないがｆｋｓ１−２突然変異に類似するＦＫＳ１ｃａｎにおける突然変異の結果、エキノカンジン阻害に対する酵素活性（１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼを含有する突然変異体Ｆｋｓｃ１ｐサブユニット）および全細胞（突然変異体Ｆｋｓｃ１ｐを発現するカンジダ・アルビカンス細胞の罹患性が低いこととなると考えられる。
実施例３９
酵母キラートキシンに対する感受性についてのＦＫＳ１またはＦＫＳ２いずれかの機能的コピーの喪失の効果を評価した。トキシン罹患性テストは、テスト株がＭ1キラーウイルスを欠くことを必要とする。というのは、該ウイルスを含有する株はトキシン（Ｋ+）を生産し、その作用に対して免疫性（Ｉ+）であり、キラー耐性（Ｋｒｅ-）表現型と免疫（Ｉ+）表現型とは区別できないからである。ＦＫＳ１（ＹＬＩＰ１７９およびＹＬＩＰ１８３；ｆｋｓ１：：ＨＩＳ３）またはＦＫＳ２（ＹＬＩＰ１８６およびＹＬＩＰ１９０；ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１）のいずれかの挿入−欠失で構築された株はＫ+Ｉ+であり；従って、Ｍ1ウイルスは、Ｋｒｅ表現型をアッセイするには株から追い出されなければならない。ＹＬＩＰ１７９、ＹＬＩＰ１８３、ＹＬＩＰ１８６およびＹＬＩＰ１９０を３７℃で一晩増殖させた。翌日、一晩増殖のアリコートを新鮮な培地（１：１０００希釈）に移し、３７℃でインキュベーションを継続した。３継代後、培養からの細胞を寒天プレートに画線培養し、単一のコロニーを単離し、パッチアッセイでキラートキシンを生産しないことにつきテストした。該パッチアッセイは、１）キラートキシン過剰感受性株Ｓ６の１×１０5対数相細胞を、０．２５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ４．７および０．０３％メチレンブルー（ＹＰＡＤ  Ｃｉｔ  ＭＢ）を含有する融解ＹＰＡＤ寒天に添加し、２）プレートに注ぎ、接種した寒天を固化させ、３）テスト株のパッチをプレートの表面に適用し、４）２５℃で２４時間インキュベートし、パッチの回りが清浄化されているゾーンを探すことによって行った。ゾーンを生じない株は活性なトキシンを発現せず（Ｋ-）、免疫性ではなかった（Ｉ-）。この方法によってＭ１−キラーウイルスが追い出されたＹＬＩＰ１７９、ＹＬＩＰ１８３、ＹＬＩＰ１８６およびＹＬＩＰ１９０の誘導体を、パッチアッセイの修飾法によってキラートキシンに対する罹患性につきテストした。各テスト株を融解ＹＰＡＤ  Ｃｉｔ  ＭＢ寒天に接種し、スーパーキラー株（Ｋ１２）をパッチとして適用した。これらの条件下、テスト株がＫｒｅ-である場合は、細胞の周辺にでほとんどまたは全くゾーンがない。ｆｋｓ１：：ＨＩＳ３株およびｆｋｓ２：：ＴＲＰ１株に由来するＫ-Ｉ-単離体の全ては、株Ｋ１２によって産生されたトキシンに対して感受性であり；同一条件下で行ったいくつかの公知のＫｒｅ-株（Ｓ７０６、Ｓ７０８、およびＳ７２６；米国特許第５，１９４，６００号表ＩおよびVIに記載されている）での対照アッセイは、ほとんどまたは全くゾーンを示さなかった。従って、ＦＫＳ１またはＦＫＳ２いずれかの機能喪失突然変異の結果、米国特許第５，１９４，６００号に記載されているものとＫＲＥ遺伝子における機能的突然変異を喪失しているという点で表現型が区別される細胞が得られた。
実施例４０
１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼの阻害剤に対する２つの異なるｋｒｅ突然変異の罹患性を測定した。株Ｓ４４２（ＫＲＥ１  ＫＲＥ５）、Ｓ７０８（ｋｒｅ１−３）およびＳ７２６（ｋｒｅ５−１）を、静止相まで液体ＹＰＡＤ培地中で増殖させ、次いで、１ｍｌ当たり１×１０5細胞の最終濃度にて融解ＹＰＡＤ寒天に接種し、ペトリ皿に注いだ。薬物感受性をテストするために、ニューモカンジンＢ0、エキノカンジンＢ、ジヒドロパプラカンジン、およびＬ−７３３，５６０（１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼの４種の公知阻害剤）をプレートの表面に適用し、３９℃において２４時間増殖し、増殖阻止の各ゾーンの直径を測定した。このアッセイの方法は実質的に前記した通りであり、株Ｒ５６０−１Ｃ、Ｗ３０３−１Ａ、ＹＬＩＰ１７９（ｆｋｓ１：：ＨＩＳ３）およびＹＬＩＰ１８６（ｆｋｓ２：：ＴＲＰ１）を比較のために同一条件下でテストした。ゾーンの直径は、通常、阻害剤に対する罹患性の良好な指標であり、類遺伝子性の野生型株に対する耐性または高感受性を評価するのに使用できる。これらの基準を用いると、４種の１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ阻害剤に対する罹患性において、Ｒ５６０−１Ｃ細胞は耐性であり、ＹＬＩＰ１７９細胞は高感受性であり、ＹＬＩＰ１８６細胞は野生型株と同様であった。対照的に、ｋｒｅ突然変異体［Ｓ７０８（ｋｒｅ１−３）およびＳ７２６（ｋｒｅ５−１）］は、全ての４種の化合物に対する罹患性において、それらの野生型親株（Ｓ４４２）と同等であった。従って、これらの１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼ阻害剤に対する感受性についてｋｒｅ突然変異の影響はなく、他方、ＦＫＳ１の突然変異体対立遺伝の結果は、これらの化合物に対して耐性（ｆｋｓ１−２）または高感受性（ｆｋｓ１：：ＨＩＳ３）となった。この結果は、突然変異体／野生型株対の異なる罹患性に基づく１，３−β−Ｄ−グルカンシンターゼの阻害剤についての微生物アッセイが、これらのｋｒｅ突然変異体に対しては効果的でないが、これらのｆｋｓ１突然変異体に対しては効果的であり得ることを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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