(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４８０nm−９００nmの放出最大を有する燐光体の、および該燐光体により放出される放射を検出するための電荷結合素子(CCD)の、シンチレーションプロキシミティー試験における使用。
【請求項２】
シンチレーションプロキシミティー試験を多ウェルプレートのウェルで行う、請求項１記載の使用。
【請求項３】
電荷結合素子(CCD)を、多ウェルプレートの全てのウェルを同時にイメージするために使用する、請求項２記載の使用。
【請求項４】
燐光体が５００nm−７００nmの放出最大を有する、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
燐光体がランタニドまたはアクチニド部分である活性剤でドープ処理された無機宿主物質である、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
燐光体がランタニドまたはアクチニド部分の有機キレートである、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ランタニドまたはアクチニド部分が、テルビウム、ユーロピウム、エルビウム、スリウム、ホルミウム、ジスプロシウム、サマリウム、イッテルビウム、ルテシウム、ガドリニウム、ウラニウムおよびウラニルUO２３＋から選択される部分である、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
４８０nm−９００nmの放出最大を有する燐光体および該燐光体により放出される放射を検出するための電荷結合素子(CCD)を使用することを特徴とする、
液体媒体中に燐光体を含む固体表面を提供し、放射標識試薬が一方が固体表面に結合し、他方が液体媒体中である二つのフラクションに分かれ、固体表面に結合した放射標識試薬結合のフラクションを検出することによる、シンチレーションプロキシミティー試験を行う方法。
【請求項９】
シンチレーションプロキシミティー試験が多ウェルプレートのウェルで行われ、電荷結合素子(CCD)が多ウェルプレートの全てのウェルを同時にイメージするために使用される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
燐光体がユーロピウムの有機キレートまたはユーロピウムでドープ処理した無機宿主物質である、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、シンチレーションプロキシミティー試験、即ち、シンチレーションプロキシミティー原理が関与するアッセイまたは他の実験に関する。
【０００２】
現在のシンチレーションプロキシミティーアッセイ(SPA)法は、セリウムドープ処理したケイ酸イットリウム(Y2SiO5:Ce)(以後、単にケイ酸イットリウムまたはYSiと呼ぶ)またはPPOのような有機シンチラントを含むポリビニルトルエン(PVT)から製造されたシンチラントビーズの使用を含む。アッセイは、水性緩衝液中、低いエネルギー放射を発し、そのエネルギーが水性環境中に容易に分散する3H、125I、14C、35Sまたは33Pのような放射性同位体を使用して行う。例えば、3Hにより発せられる電子は、平均６KeVのエネルギーしか有さず、水中で非常に短いパス長(〜１μm)である。これらの同位体の一つで標識されている分子がビーズ表面に結合している場合、直接、または先にビーズに結合していた他の分子との相互作用を介して、発せられた放射がシンチラントを活性化し、光を産生する。ビーズに結合した標識分子の量と比例した、産生された光の量は、簡便には液体シンチレーション(LS)カウンターで測定できる。標識分子がビーズ表面に結合していない場合、その放射エネルギーはそれがビーズに届く前に周りの水性溶媒に吸収され、光は産生されない。従って、結合リガンドはシンチレーションシグナルを発するが、遊離リガンドは発せず、慣用の放射性リガンド結合アッセイの特徴である時間のかかる分離段階の必要性が除かれる。本アッセイに必要な操作は、数回の単純なピペット操作段階にまで減少され、良好な正確さおよび再現性を導く。
【０００３】
PCT WO91/08489(Packard Instrument Company Inc.)は、シンチレーションプロキシミティー放射免疫アッセイに使用する支持体を記載し、該支持体は、目的の反応物と選択的に結合できる抗原、抗体等の多数のリガンドがその表面に結合したシンチレーティング物質からなる。好ましくは、本支持体はオキサイド、カーボネートまたはクロライドのような無機セリウム塩で活性化されたケイ酸イットリウムを含む。
【０００４】
WO94/26413は、生存細胞または細胞の成分内の細胞性および生化学的過程の研究に関する。具体的に、シンチレーションプロキシミティー原理を使用した細胞性および生化学的過程の研究のための装置および方法が記載されている。
【０００５】
シンチレーションプロキシミティー形式の簡素性は、ロボットサンプルプロセッサーおよびマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターを使用したアッセイの殆ど完全な自動化を可能にする。結果として、SPA法は、高い処理量が可能であり、それは医薬−またはサンプル−スクリーニングアッセイで特に有益である。SPアッセイは、慣用的に９６ウェルマイクロタイタープレートで行われ、それは特に設計されたマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターで同時に６ウェル計数される。より高い処理量の探求は、カウンターの製造者に同時に１２ウェル計数できる、即ち、２倍の処理量の装置を製造させた。３８４ウェルプレートの出現も見られるが、現在まだ同時に１２ウェルしか計数できない。
【０００６】
SPAに付随する問題は、現在のSPAビーズタイプにより発せられる光を吸収する着色化合物がアッセイ培体中に存在することによりもたらされる、色消失である。色消失はシグナルを弱め、それによりシグナル対ノイズ比、従って感受性を減少させる。SPAアッセイによりスクリーニングされるサンプルの多くが着色され、これらの大半は色が黄色または茶色であり、可視スペクトルの青色領域の光を吸収する。PVT−およびY2SiO5:Ce−ベースのSPAビーズは青色領域の光を発し(最大放出は通常３５０nm−４５０nmの範囲である)、この効果に感受性である。
【０００７】
生物学的、および生物医学的科学における低から超低光レベルイメージング適応への使用に感受性の別の検出システムは、例えば、化学ルミネセンス、バイオルミネセンスおよび蛍光検出が関与するアッセイで使用されている、CCD(Charge Coupled Device；電荷結合素子)検出である。適応は、免疫アッセイ(Hooper et al., J. Biolum. Chemilum., 9, 113-122, (1994))、および核酸サンプルの電気泳動的分離に続くハイブリダイゼーションによる特異的蛍光色素標識核酸の分析(EP 214713, Astromed Ltd.)を含む。CCD法を使用した超低光イメージングは、定量的であり、速く、新しい世代のイメージング装置であり、検出器のCCDカメラは、同時にプレートの全体をイメージでき、マイクロタイターウェルプレートシンチレーションカウンターと比較して、サンプルの処理量増加に大きな可能性を有する。領域イメージング、即ちマイクロタイターウェルプレートの全てのウェルのCCDによる同時のイメージングは、９６、３８４、８６４またはそれ以上のウェルを含む高ウェル密度プレートと組合わせて使用するとき、測定をするのに必要な時間が慣用のシンチレーション計数法と比較して有意に減少されるため、非常に有利であると見なされる。
【０００８】
イメージング法、特に領域イメージングはまたオートラジオグラフィーの別法として、同位体標識物質にも適用される。この試みは、２−Dゲル電気泳動によるタンパク質の定量的分析(Patterson, et al., Biotechniques, 15(6), 1076, (1993))およびレセプター位置測定(Tang, et al., Biotechniques, 18(5), 886, (1995))のような適用に最も広く使用されている。放射感受性試薬(例えば、硫化ストロンチウム／サマリウム／セリウムまたはバリウムフルオロブロミド／ユーロピウム)で被覆したイメージングプレートを、放射標識サンプルに暴露し、イメージが、プレートのランタニド金属コーティング上の放射付随事象により形成される。暴露に続き、イメージをイメージングプレートリーダーの手段で読む。
【０００９】
PVT−ベースのマイクロスフェアを使用したSPA計数のCCD検出はまた報告されている(Englert, D., Society for Biomolecular Screening, Second Annual Conference October 14-17, (1996), pp209-221)。しかし、ビーズの低い光放出、システムの最適状態に及ばない検出能ならびに着色サンプルによる消失のために、SPAウェルからの光子計数は、利用可能な結果を得るのに十分なほど感受性ではなかった。慣用のシンチレーション計数のために、装置は色素消失を考慮に入れて補正できる。しかし、慣用のSPAビーズを通常のアッセイ条件下で使用したCCD検出の場合、１崩壊当りに検出される光子の数は、消失レベルの検出を可能にするには不十分であり、消失補正は不可能であった。今日まで、サンプル検出および測定が、本方法を使用して得られた作業アッセイの報告はない。
【００１０】
本発明は、現在のCCD−ベースの検出の低感受性および慣用のSPAビーズ法の色消失の二つの問題に打ち勝つことを探求する。本発明は、４８０nm−９００nmの放出最大を有する燐光体（蛍燐光体（phosphor）、以下同じ）の、および該燐光体により放出される放射を検出するための電荷結合素子の、シンチレーションプロキシミティー試験への用途を提供する。
【００１１】
シンチレーションプロキシミティー試験は、燐光体を担持する表面を放射性同位体を含む一定容積の液体と接触させる、試験である。放射性同位体の一部が表面に隣接して固定化される；残りの放射性同位体は液体中に分散または溶解したままである。電子または他の粒子の平均自由行程または放射性同位体の放射活性崩壊に由来する放射は、液体の容積に比して小さく、それにより表面に隣接して固定化された放射性同位体部分が表面が担持する燐光体を発光できるが、液体中に分散または溶解した放射性同位体部分は、表面が担持する燐光体を発光するには、一般的に表面から遠すぎる。
【００１２】
表面は、例えば、管壁または多ウェルまたはマイクロタイタープレートの壁のように；または特に、例えば糸またはビーズのように塊であり得る。燐光体は、予め形成された表面に適応されたコーティングとして存在し得る；または表面に分散され、または表面を構成し、またはまたは形作り得る。
【００１３】
試験は、化学的または生化学的アッセイ、例えば、免疫アッセイまたはイムノメトリックアッセイのような競合アッセイであり得る。または、試験は、燐光体を担持する表面と結合しているか、または結合するようになる生存細胞の研究に関与し得る。放射性同位体が固相と液相の間で分布される試験系が、原則として本発明の方法に適している。
【００１４】
放射性同位体は、遊離形でまたは、結合した形で、例えば、原子またはイオンとして存在し得る；これは、例えば、燐光体を担持する表面に接着した細胞により取りこまれる放射性同位体の追跡が望ましい場合、有用であり得る。または、放射性同位体は、アッセイ試薬の標識に使用し得る；これは、例えば、標識試薬が燐光体を担持した表面に固定化された他の試薬への結合に関して、非標識試薬と競合する場合、有用であり得る。
【００１５】
シンチレーションプロキシミティー試験は、定性的、またはより普通には定量的方法で行い得る。例えば、測定は、静止モードで、競合アッセイの結果が一定時間後または平衡で決定される場合のように、行い得る。あるいは、シンチレーションプロキシミティーアッセイは、動的モードで、細胞による放射標識がリアルタイムで追跡される場合のように行い得る。WO94/26413は、リアルタイムでの細胞性処置の研究のためのシンチレーティングマイクロタイタープレートおよび方法を記載する。シンチレーティングマイクロタイタープレートは、Amersham Lifescienceから、Cytostar-T(商標)の名前で販売されている。
【００１６】
液体は、一般に水性または他の液体である。放射性同位体は好ましくは水性媒体で２０００μmまでの平均自由行程を有する電子を放出するものである。これらは、3H、125I、14C、35S、45Ca、33Pおよび32Pのような生化学で通常使用される同位体を含むが、またこの範囲の電子を放出する55Fe、86Rb、109Cdおよ51Crのような他の放射性同位体を除外するものではない。
【００１７】
シンチレーションプロキシミティー試験は、好ましくは、例えば、マイクロタイタープレートのような多ウェルプレートのウェルで行う。燐光体はこのようなプレートのウェルに分配されたビーズとして提供される。または、燐光体は、プレートのプラスチックへの、結合剤との、直接挿入またはコーティングのいずれかによりプレートに取りこまれ得る。可能な結合剤の例は、tlcプレートの製造に使用されるような硫酸カルシウム、およびポリスチレンまたはα−メチルスチレンとビニルトルエンのコポリマーのような低融点プラスチックである。これらの装置は、プレートに存在する２４、９６または３８４ウェルを有し得るか、８６４、１５３６、２４００  ３４５６、または実際任意の所望の数のような高密度のウェルを有し得る。それらは、細胞−ベースのまたはリガンド結合アッセイを、CCDカメラベースのイメージャーにより行うために使用できる。燐光体は好ましくは５００nm−７００nmの、即ち、緑色または黄色または赤色のスペクトル内の放出最大を有する。燐光体は、低エネルギー電子または他の粒子により、または放射性同位体の放射性崩壊によりもたらされる放射により刺激される。これらの燐光体は、PVTベースSPAビーズまたはY2SiO5:Ceビーズよりも高い光アウトプットを有し、SPAアッセイが十分にイメージすることを可能にする。更に、マイクロタイターウェルプレートの全てのサンプルウェルは、CCD検出の手段により同時にイメージできる。長い波長の緑色または赤色放出は、スペクトルの青色領域で最大であった色消失問題を軽減する。
【００１８】
ある燐光体は、例えば、陰極線管法、ランプ燐光体およびX線燐光体における、産業的適応のために商業的に入手可能である。例えば、BlasseおよびGrabmaier, Luminescent Materials, Springer-Verlag, Berlin, (1994)および米国特許第5,435,937号参照。小燐光体粒子の電荷安定化懸濁液(例えば、イットリウム酸硫化物−Eu3+、イットリウム酸硫化物−Tb3+)および免疫反応性複合体を得るためのその抗体との結合が記載されている(Beverloo, et al., Cytometry, 13, 561-570 (1992))。燐光体複合体は、細胞への結合、続くUV光励起下での蛍光顕微鏡の使用による可視化により免疫細胞化学的適用に使用されていた。今日まで、しかしながら、このような燐光体は、放射活性トレーサー、特にSPAが関与する計数適用への使用に関して記載されていない。
【００１９】
使用し得る多くの適当な燐光体が存在する。幾つかは、活性剤でドープ処理された無機宿主物質からなる。このような宿主物質の例は、ケイ酸イットリウム、酸化イットリウム、イットリウム酸硫化物、イットリウムアルミニウムガリウムオキサイド(YAG)、イットリウムアルミニウムガーネット、ナトリウムイットリウムフロライド(NaYF4)、ランタンフルオリド、サンタン酸硫化物、イットリウムフルオリド(YF3)、没食子酸イットリウム、ガドリニウムフルオリド(GdF3)、バリウムイットリウムフルオリド(BaYF5またはBaY2F8)、ガドリニウム酸硫化物、ケイ酸亜鉛、硫化亜鉛およびバナジウム酸イットリウムである。活性剤は、一般にランタニドまたはアクチニド部分である。
【００２０】
他の燐光体は、ランタニドまたはアクチニド部分の有機キレートである。光放出は、ランタニドまたはアクチニドキレートと、例えば、イミドホスホランのようなルイス塩基エンハンサーと合わせるまたは混合することにより促進され得る。この種の燐光体の例は、EPA556005に記載されている。それらは、簡便にはポリスチレンまたは他の有機ポリマー中の溶液または分散として使用し得る。
【００２１】
ランタニドまたはアクチニド部分の同一性は、燐光体の放出波長により測定する。好ましい部分は、一般に、＋２または＋３イオンの形のテルビウム、ユーロピウム、エルビウム、スリウム、ホルミウム、ジスプロシウム、サマリウム、イッテルビウム、ルテシウム、ガドリニウム、ウラニウムおよびウラニルUO2から選択される部分である。
【００２２】
添付の図面を言及する。
図１はPVT SPAビーズを有する無機燐光体粒子、および比較のためのケイ酸イットリウム粒子のCCD検出シグナルを示す。
図２は、比較のためのPVT SPAビーズを有する有機キレートビーズのCCD検出シグナルを示す。
図３は、実施例２で使用した色素の吸収スペクトルを示す。
図４は、PVT SPA、ケイ酸イットリウム粒子、Y2O3:EuおよびYAG:Tb粒子の放出スペクトルを示す。
図５は、CCDイメージングシステムにより検出された逆転写シンチレーションプロキシミティーアッセイにおけるストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子の評価を示す。
図６は、ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズおよびCCDイメージングを使用したアウリントリカルボン酸によるHIV逆転写酵素の阻害を示す。
図７は、[35S]GTPγS G-タンパク質結合レセプターにおけるPST WGA被覆ビーズとChOA1レセプター／PIAアゴニスト由来のCCD検出シグナルと、PVT WGA被覆SPAビーズのシンチレーション計数シグナルの比較を示す。
図８は、CCDイメージングを使用したWGA−被覆ポリスチレンビーズへの[125I]EGF結合の阻害を示す。
図９は、PSTストレプトアビジン−被覆ビーズおよびストレプトアビジン−被覆燐光体粒子のCCDイメージングにより得た、およびPVTストレプトアビジン−被覆SPAビーズおよびシンチレーション計数により得たシグナル対ノイズ比の比較を示す。
図１０は、CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]チミジンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびCytostar-Tプレートの使用の比較を示す。
図１１は、CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]メチオニンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびCytostar-Tプレートの使用の比較を示す。
【００２３】
(実施例)
実施例１
ストレプトアビジン被覆燐光体粒子、ユーロピウムおよびテルビウムの有機キレートを含むストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズならびにストレプトアビジンSPAビーズに結合した[３H]ビオチン由来のCCD検出シグナルの比較
導入
無機燐光体Y2O3:Eu、Y2O2S:EuおよびYAG:Tbならびにトリス(２,２,６,６−テトラメチル−３,５−ヘプタンジオナート)テルビウムIII−ジフェニル−ホスホノイミド−トリフェニルホスホラン(以後、ALP-1と呼ぶ)またはトリス(ナフトイルトリフルオロアセトナート)ユーロピウムIII−(ジフェニル−ホスホンイミドトリフェニルホスホラン)１または２(以後、各々ALP-7またはALP-7-ジホスと呼ぶ)を含むポリスチレンから製造した有機キレートビーズを、ストレプトアビジンで表面被覆し、ストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエン(PVT)SPAビーズとストレプトアビジン被覆ケイ酸イットリウム粒子を、[３H]ビオチンアッセイで比較した。ストレプトアビジンのようなタンパク質および他の生物反応性種での粒子の共有結合的または物理的吸着によるコーティングは、当業者に既知の伝統的な方法で達成される。
【００２４】
材料および方法
実施例の実験に使用する無機燐光体は、既知の物質であり、シンチレーションプロキシミティーアッセイへの使用を容易にするために、修飾形で販売業者から得られる。有機キレートビーズは、当業者に既知の伝統的方法で製造されている。本実験で使用する粒子は、異なる試薬のCCD検出を例示するが、必ずしも該試薬の最良の調合物ではない。以下の実施例に使用するCCDイメージャーは、Molecular Devices Inc.により供給されるプロトタイプであり、Princeton Instruments Inc.により供給される液体窒素冷却CCDカメラを搭載する。開発中の別のCCDイメージャー検出システムは、異なるタイプの粒子およびプレートと増加された感受性で同等な相関的な反応をすると予期される。例えば、白壁マイクロタイタープレートの使用において、適当な帯域フィルターをプレートからの燐光の除去に使用した。
【００２５】
ビオチン結合アッセイ
ストレプトアビジン−被覆粒子およびPVT SPAビーズを、０.０１％w/vアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝食塩水pH７.４(以後、PBSアジド)に５mg／mlで懸濁させた。[３H]ビオチン(Amersham TRK753)の貯蔵は、５.１、１０.３および２０.７pmoleのビオチンを１００μlに含むようにPBSアジド中に作った。黒色マイクロタイタープレートのウェル中に、粒子懸濁液の１００μlサンプルをピペットで移動させた。粒子懸濁液を機械的に撹拌して、サンプルの均質性を確実にした。３種の[３H]ビオチン溶液各１００μlを異なる粒子を含むウェルに添加した。添加に続いて、プレートを密封し、次いでマイクロプレートシェーカーで６０分、室温でインキュベートした。SPAシグナルを、CCDカメライメージングシステムを使用して検出した。粒子への[３H]ビオチン粒子の非特異的結合を、大過剰の非標識ビオチンの存在下検出されるシグナルの測定により試験した。試験した全ての粒子に関して、[３H]ビオチンの非特異的結合は微々たるものであった(コントロールウェルのシグナルの３％を超えず、典型的に１％を超えなかった)。
【００２６】
結果
図１および２の結果は、５００μgのストレプトアビジン被覆燐光体粒子、ユーロピウムおよびテルビウムの有機キレートを含むポリスチレン粒子および慣用のSPA粒子に結合した３種のレベルの[３H]ビオチンを使用して発生したイメージャーシグナルを示す。
【００２７】
結論
実施例１のデータは、ストレプトアビジン被覆Y2O2S:Eu、Y2O3:EuおよびYAG:Tbに結合した[３H]ビオチンから発生したCCDイメージャーシグナルが、PVT SPAシグナルより少なくとも１０倍高かったことを証明する。ポリスチレン／ALP-7ジホスビーズは、PVT SPAビーズの約３倍のシグナルを発生させる。
【００２８】
実施例２
モデル[３H]ビオチン結合アッセイにおける黄色、オレンジ色および赤色色素の色消失効果
導入
着色化合物によるシグナル(計数)の消失は、慣用のシンチレーション計数では既知の現象である。シンチレーション物質の放出と着色物質の吸収スペクトルのスペクトル重複が、これが観察されるための必要条件である。色素は、SPAスクリーニングアッセイで通常遭遇するサンプル色の範囲をカバーするように選択される(参考として、図３の色素吸収スペクトルと図４のPVT SPA、ケイ酸イットリウム、Y2O3:EuおよびYAG:Tbの放出スペクトルを参照)。モデルアッセイは、CCDイメージャーによる、着色化合物存在下の、シグナル検出のための長波長放出粒子の使用の利点の一つを説明するために調整した。
【００２９】
[3H]ビオチン結合アッセイは、ケイ酸イットリウムおよびPVT SPAビーズと比較した、燐光体粒子Y2O2S:EuおよびYAG:Tbを使用して発生したイメージャーシグナルにおける着色化合物の効果の測定に使用した。更に、有機キレートポリスチレンビーズの相対的消失を、PVT SPAビーズと比較した。
【００３０】
材料および方法
ストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子、ポリスチレンを含む有機キレート、ケイ酸イットリウムおよびPVT SPAビーズを、５mg／mlでPBSアジドに懸濁させた。
アシッドイエロー(Sigma A-4520)を３６０μg／mlでPBSアジドに溶解した。
タートラジン(Sigma T-03888)を２１４μg／mlでPBSアジドに溶解した。
メチルオレンジ(Sigma M-3132)を１９６μg／mlでPBSアジドに溶解した。
ニュートラルレッド(Raymond and Lamb lot 5769)を２３４μg／mlでPBSアジドに溶解した。
[3H]ビオチン(Amersham TRK753)を１０７nMまでPBSアジドで希釈した。
【００３１】
アッセイプロトコール
各ビーズ懸濁液(５００μg)の１００μlアリコートを、適当な数の黒色マイクロプレートにピペットで移し、続いて１００μlの[3H]ビオチンのストックをピペットで移した。プレートを約３０分、環境温度でインキュベートし、ビオチンの粒子への結合を完了させた。４種の色素溶液の１０μlを、試験する粒子の各々のウェルに添加し、１０μlの緩衝液をコントロールウェルに添加した。プレートをマイクロプレートシェーカーで、６０分、室温でインキュベートした。SPAシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出した。
色素のウェル内濃度は、１cmパス長分光光度計で測定したとき、各色素の吸収最大波長で０.３から０.５の範囲の吸収となるレベルに設定した。
【００３２】
結果
第１表に示す結果は、ユーロピウム含有燐光体粒子または有機キレートビーズが、本実験で試験した色素によるシグナルの消失は示さなかったことを示す。PVT SPAビーズおよびケイ酸イットリウム粒子は、慣用のSPAアッセイで用いられるように、これらの色素によるシグナルの著しい消失を示す。テルビウム含有燐光体粒子および有機キレートビーズは、ニュートラルレッド色素により僅かな程度消失される。この後者の観察は、ニュートラルレッドの吸収スペクトルと、テルビウムの放出スペクトルの部分的重複により予期される。
【００３３】
第１表  黄色、オレンジ色および赤色色素による、無機燐光体、有機キレート粒子およびPVT SPAビーズおよびケイ酸イットリウムからのCCD検出シグナルの消失の比較
【表１】
0003719932.tif 000002
【００３４】
結論
本実験は、PVT SPAビーズまたはケイ酸イットリウムにおいてシンチラントの放出スペクトルと重複する吸収スペクトルを有する色素が、結合した放射性標識により放出されるとき、該種の放出光の消失をもたらすことができることを証明する。ユーロピウムまたはテルビウム含有燐光体粒子または重合物質内に包含された該物質の有機キレートのCCD検出シグナルは、これらの色素の存在下で有意に消失されなかった。
【００３５】
実施例３
無機燐光体粒子、ALP-7ジホスビーズおよびPVT SPAビーズならびにケイ酸イットリウム粒子に関する、タートラジンによるシグナル消失の濃度依存性の評価
導入
実験は、CCDイメージャーおよび慣用のシンチレーションカウンターにより検出されるものとして、調査中の異なる粒子由来のシグナルの濃度依存的消失の比較のために調整した。
【００３６】
材料および方法
ストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子、ALP-7-ジホス(ポリスチレン)ビーズ、PVT SPAビーズおよびケイ酸イットリウム粒子を、１０mg／mlでPBSアジドに懸濁させた。タートラジン(Sigma T-0388)をPBSアジドに1070Tg／mlで溶解させた。[3H]ビオチン(Amersham TRK 753)をPBSアジドで１０３nMまで希釈した。
【００３７】
アッセイプロトコール
粒子懸濁液の１００μlアリコートを、黒色マイクロタイタープレートの適当な数のウェルにピペットで移した。[3H]ビオチン(１０.３pmole)の貯蔵溶液１００μlを各ウェルに添加した。プレートを環境温度で６０分インキュベートし、ビオチンの粒子への結合を完了させた。タートラジン溶液(１、２、４または８μl)をプレートの適当なウェルにピペットで移し、PBSアジドを最終量２０８μl／ウェルとなるように添加した。トリプリケートのデータ点を、各々５.１、１０.２、２０.４および４０.８μg／mlのタートラジンを含むように調整した。プレートをマイクロプレートシェーカーで、６０分、室温でインキュベートした。SPAシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出した。次いで、プレートをWallac MicroBeta(商標)シンチレーションカウンターで計数した。
【００３８】
結果
本実施例の結果を第２表に示す。ケイ酸イットリウム粒子に関して、高いレベルのシグナル消失がCCD検出で(３３−５８％)およびまた慣用のSPA計数条件下で(５４−８２％)見られた。シグナルの消失の観察されたレベルは、存在するタートラジンの濃度と関連し、増加したレベルの消失が、添加したタートラジンの増加したレベルで観察された。無機燐光体粒子のCCD検出シグナルは、使用した色素の最高レベルで、シグナルの有意差のない消失を示した(１cmパス長分光光度計において波長最大でほぼ２の吸光度読取と同等)。PVT SPAビーズからのCCD検出シグナルの消失(２−１５％)は、ケイ酸イットリウムで観察されるものより明らかではないが、まだ有意である。存在するタートラジンの４つのレベルでのPVT SPAビーズの慣用のシンチレーション計数は、非常に高いシグナル消失(３７−８７％)を示し、慣用のSPAアッセイに関する色消失補正の必要性を例示する。ALP-7-ジホスポリスチレンビーズは、本実験でCCD検出シグナルの有意な消失を示さない(４％より大きくない)。
【００３９】
第２表  ４つの異なるレベルの色素でのタートラジンによるSPA粒子の放出の消失。CCD検出およびシンチレーションカウンターによる検出シグナルの消失の比較。
【表２】
0003719932.tif 000003
【表３】
0003719932.tif 000004
【００４０】
結論
色消失補正は、PVT SPAビーズまたはケイ酸イットリウム粒子を使用したSPAアッセイを十分に行うために必要である。ユーロピウムおよびテルビウムを含む無機燐光体または有機キレートビーズに関して、微々たるレベルの消失しか観察されない。これらの物質での色消失補正の必要性が、CCDイメージャーを用いた場合、従って除かれる。
【００４１】
実施例４
ストレプトアビジン被覆燐光体粒子を使用した逆転写酵素のアッセイ
導入
逆転写酵素SPAアッセイ(Amersham NK 8972)は、定量のためにストレプトアビジンPVT SPAビーズ上に捕獲されたビオチニル化DNA/RNAオリゴヌクレオチド酵素基質を使用する、相同アッセイシステムである。ストレプトアビジン−被覆Y2O3:EuおよびYAG:Tb粒子を、ストレプトアビジンPVT SPAビーズと本アッセイで比較した。
【００４２】
材料および方法
逆転写酵素アッセイ
ビオチニル化した、アニールの準備がされたプライマー／テンプレートを黒色マイクロプレートのウェルに添加した。この後、５０mMトリス／HCl  pH８.０、８０mM  KCl、１０mM  MgCl2、１０mM  DTTおよび０.０５％w/v  Nonidet P40で緩衝化したdATP、dCTP、dGTPおよびTTPの７５nM混合物中の[3H]TTP(Amersham TRK576)に続いた。反応を、０.０７５、０.１５または０.３単位のHIV逆転写酵素(Amersham T3610Y)の添加により開始した。プレートを３７℃で３０分インキュベートし、停止試薬の添加により終了させた。０.５mgの適当なストレプトアビジン−被覆燐光体またはPVT SPAビーズを添加し、プレートを室温で１０分インキュベートした。産生したシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出した。
【００４３】
結果
図５に図説する結果は、放射標識ヌクレオチドの取りこみが、使用した逆転写酵素の量に依存したことを示す。データは、各々Y2O3:EuおよびYAG:TbおよびPVT SPAビーズでの０.３単位のHIV逆転写酵素を使用した３０分のアッセイにおいて、３,２００、３,１００および３００の最大シグナルが観察されたことを示した。
【００４４】
結論
本実施例は、逆転写酵素SPAシステムで産生されたCCDイメージャーシグナルが、Y2O3:EuおよびYAG:Tbを使用してPVT SPAビーズよりも少なくとも１０倍高かったことを示す。
【００４５】
実施例５
ストレプトアビジン−被覆ポリスチレンビーズを使用した、アウリントリカルボン酸による逆転写酵素阻害のアッセイ
導入
逆転写酵素SPAアッセイ(Amersham NK8972)は、定量のためにストレプトアビジンPVT SPAビーズに捕獲されたビオチニル化DNA/RNAオリゴヌクレオチド酵素基質を使用する、相同アッセイシステムである。本アッセイにおいて、ユーロピウムを含むポリスチレン(PAT)から製造したストレプトアビジン−被覆有機キレートビーズを使用し、アウリントリカルボン酸による逆転写酵素の阻害を測定した。
【００４６】
材料および方法
逆転写酵素アッセイ
ビオチニル化した、アニールの準備がされたプライマー／テンプレートを白色マイクロプレートのウェルに添加した。この後、トリス／HCl  pH８.０、８０mM  KCl、１０mM  MgCl2、１０mM  DTTおよび０.０５％w/v  Nonidet P40で緩衝化したdATP、dCTP、dGTPおよびTTPの１２７nM混合物中の[3H]TTP(Amersham TRK576)に続いた。０.０５から１μMの間の濃度のアウリントリカルボン酸を添加し、０.０５単位のHIV逆転写酵素(Amersham T3610Y)の添加により開始した。プレートを３７℃で２０分インキュベートし、停止試薬の添加により終了させた。０.１mgのストレプトアビジン−被覆PSTビーズを添加し、プレートを一晩室温でインキュベートした。産生したシグナルをCCDイメージングシステムを使用して検出した。
【００４７】
結果
図６に図解する結果は、アウリントリカルボン酸による逆転写酵素活性の阻害を示す。データは、１μMの阻害剤で８５％阻害が達成できることを示し、０.２３μMのIC50値が決定された。これは、SPAアッセイで決定された０.１８μMの値と同等である。
【００４８】
結論
本実施例は、ポリスチレンユーロピウムビーズと逆転写酵素の既知の阻害剤が、CCDイメージングによる逆転写酵素SPAアッセイにおけるIC50値の決定に使用できることを示す。
【００４９】
実施例６
小麦胚芽凝集素(WGA)−被覆ポリスチレンビーズを使用したGTPγS G−プロテイン結合レセプターアッセイの評価
導入
GTPγS G−プロテイン結合レセプターSPAアッセイ(Amersham RPNQ0210)は、レセプターの結合に小麦胚芽凝集素(WGA)−被覆PVT SPAビーズを使用する相同アッセイシステムである。GTP−結合タンパク質(G−プロテイン)に結合するレセプターのアゴニスト誘導またはインバースアゴニスト誘導活性を、直接、添加した[35S]GTPγSおよびGDP存在下で定量できる。ユーロピウム含有ポリスチレン(PST)から製造した被覆有機キレートビーズを、従って、本アッセイで、WGA−被覆PVT SPAアッセイと比較した。
【００５０】
材料および方法
GTPγS G−プロテイン結合レセプターSPAアッセイ
３.７５μgのクローン化ラットアデノシンA1レセプター(BioSignal BSR-MA1R)、０.３７５mgの適当なWGA−被覆ビーズ、１０μMの(−)−N6−(２−フェニルイソプロピル−アデノシン)(PIA)アゴニスト、５μMのGDP、±１０μMのGTPγS(非特異的結合を測定するため)および０.２−０.４nMの[35S]GTPγSを白色マイクロプレートのウェルに、２０mM  HEPES、１００mM  NaCl、１０mM  MgCl2および１mM  EDTA  pH７.４を含むアッセイ緩衝液最終量５０μl中に添加した。プレートを室温で３０分インキュベートし、次いで１０分、１２００rpmおよび１５℃で遠心した。産生したシグナルは、CCDイメージングシステムを使用して検出した。
【００５１】
結果
図７に図解する結果は、WGA−被覆PSTイメージャービーズおよびPVT SPAビーズを使用したPIAアゴニストの存在下および非存在下のGTPγS G−プロテイン結合レセプターSPAアッセイにおいて産生されたシンチレーションカウンターおよびイメージャーシグナルを示す。データは、SPAアッセイで達成されるのと同等なシグナル対ノイズ比が達成できることを示す。
【００５２】
結論
本実施例は、ポリスチレンユーロピウムビーズが、小型化レセプターアッセイにおいて[35S]放射標識と共に使用でき、慣用のSPAで得られるのと同等なシグナル対ノイズ比を得ることを示す。
【００５３】
実施例７
ユーロピウムの有機キレートを含む小麦胚芽凝集素(WGA)−被覆有機ポリスチレンビーズを使用した、EGFレセプターに結合した表皮成長因子(EGF)のアッセイ
導入
A431ヒト細胞系で発現される[125I]EGF(Amersham IM196)とEGFレセプター(EGF-R)の相互作用は、レセプターがWGA−被覆PVT SPAビーズ上に捕獲された相同アッセイシステムで、SPAを使用して研究できる。本アッセイにおいて、ユーロピウムを含むポリスチレン(PST)から製造したWGA−被覆有機キレートビーズを使用し、非標識EGFによる[125I]EGF結合の阻害を測定した。
【００５４】
材料および方法
EGFレセプターアッセイ
２５μgのA431膜(自家調製物)を、０.２５mgのWGA−被覆PSTビーズと、２時間、室温で予備結合させた。次いで、これを白色マイクロプレートに移し、４００pMの[125I]EGF(Amersham IM196)を、２０mM  HEPES  pH７.５、２mM  CaCl2、０.１％(w/v)BSAフラクションVを含むアッセイ緩衝液に、０から１００nMの間の濃度のEGFと共に添加した。プレートを室温で３時間インキュベートし、産生したシグナルをCCDイメージングシステムを使用して測定した。
【００５５】
結果
図８に図解する結果は、WGA−被覆PSTビーズへの[125I]EGF結合の阻害を示す。データから、５nMのIC50値が決定され、これはSPAアッセイで決定された２nMの値と同等である。
【００５６】
結論
本実施例は、ポリスチレンユーロピウムビーズおよび非標識EGFが、CCDイメージングによる[125I]EGFレセプター結合アッセイにおけるIC50の測定に使用できることを示す。
【００５７】
実施例８
ストレプトアビジン−被覆有機ポリスチレンビーズおよびストレプトアビジン−被覆無機燐光体粒子を使用した、マイトージェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ酵素アッセイの評価
導入
マイトージェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼSPA[33P]アッセイ(Amersham RPNQ0220)は、[33P]標識ビオチニル化ミエリン塩基性タンパク質(bMBP)基質に結合するストレプトアビジン−被覆PVT SPAビーズを使用した相同アッセイシステムである。本アッセイにおいて、ユーロピウムを含むポリスチレン(PST)から製造したストレプトアビジン−被覆有機キレートビーズおよびユーロピウムでドープ処理した無機燐光体粒子を、本アッセイでストレプトアビジン−被覆PVT SPAビーズと比較した。
【００５８】
材料および方法
MAPキナーゼアッセイ
５０pmolのbMBP基質、２５pmolのATP、２５０nmol  MgCl2および５０mM  MOPSを含む反応緩衝液を、白色マイクロプレートのウェルに添加した。０.１μCiの[33P]ATP(BF1000)および０.０１μgから２μgのERK-1酵素を次いで添加した。プレートを３７℃で３０分インキュベートし、５０mM  ATPおよび０.２５mgの各ビーズタイプを含む停止緩衝液の添加により反応を停止させた。プレートを次いで１０分、８００pmで１５℃で遠心した。産生したシグナルをCCDイメージングを使用して検出した。
【００５９】
結果
図９に図説する結果は、ストレプトアビジン−被覆PSTおよび燐光体イメージャービーズおよびPVT SPAビーズを使用したMAPキナーゼ酵素アッセイで産生されるシグナル対ノイズ比を示す。データは、SPAアッセイで達成されるのと同等か、それより良好なシグナル対ノイズ比が本アッセイで達成できることを示す。
【００６０】
結論
本実施例は、両方の燐光体粒子およびポリスチレンユーロピウムビーズが、小型化酵素アッセイで[33P]放射標識と共に使用でき、慣用のSPAで得られるのと同等な、または良好なシグナル対ノイズ比を得ることを示す。
【００６１】
実施例９
CCDイメージングシステムを使用した、増殖している細胞における[14C]チミジンの取りこみの追跡における２％w/w  ALP-1およびCytostar-Tマイクロプレートの比較
導入
シンチラントALP-1をプレート基底に挿入するように製造した白色９６ウェルマイクロプレートを、Cytostar-T適応において評価した。２％w/w  ALP-1プレートを、接着性細胞を使用した[14C]チミジン取りこみにおいてCytostar-Tプレートと比較した。
【００６２】
材料および方法
慣用の細胞生育条件
V-79細胞(ECACC no.86041102)を慣用的に３７℃で、加湿した５％CO2インキュベーターで、１０％FBS(GIBCO/BRL 10099-117)、２mM  L−グルタミン(ICN/FLOW 16-801-49)、５０IU／mlペニシリンおよび２００μg／mlストレプトマイシン(ICN/FLOW／ 16-700-49)を添加したDMEM(ICN/FLOW 12-332-54)中で生育させた。慣用的植え継ぎに関して、細胞を１：２０から１：４０希釈で継代した。
【００６３】
チミジン取り込みアッセイ
V-79細胞を、１×１０4／ウェルで２％w/w  ALP-1およびCytostar-Tプレートに蒔き、２４時間、３７℃で５％CO2でインキュベートした。この最初のインキュベーションに続いて、０.５μCi[14C]チミジン(Amersham CFA532)を細胞に添加した。チミジン取り込みを、一定間隔でプレートを計数することにより２４時間にわたり追跡した。プレートを計数しないときは、３７℃で５％CO2でインキュベートした。産生されたシグナルを、CCDイメージングシステムを使用して計数した。
【００６４】
結果
図１０の結果は、V-79細胞による[14C]チミジン取りこみが、インキュベーションの時間に依存することを示した。５４３７および６９５３の最大[14C]チミジン取りこみが、各々２％w/w  ALP-1およびCytostar-Tプレートで２４時間後に観察された。
【００６５】
結論
本実験のデータは、２％w/w  ALP-1プレートを使用した[14C]チミジン取りこみアッセイで産生されるCCDイメージャーシグナルが、Cytostar-Tプレートと同等であったことを示す。
【００６６】
実施例１０
CCDイメージングシステムを使用した、増殖している細胞における[14C]メチオニンの取りこみの追跡における２％w/w  ALP-1およびCytostar-Tマイクロプレートの比較
導入
２％w/w  ALP-1プレートを、[14C]メチオニン取りこみにおいてCytostar-Tプレートと比較した。実施例９の方法および条件を本実験で使用した。
【００６７】
材料および方法
メチオニン取り込みアッセイ
V-79細胞を、５×１０3／ウェルで２％w/w  ALP-1およびCytostar-Tプレートに蒔き、２４時間、３７℃で５％CO2でインキュベートした。この最初のインキュベーションに続いて、培地をウェルから吸引し、細胞単層を１回滅菌リン酸緩衝化食塩水で洗浄した。０.５μCi[14C]メチオニンを含む２００μlのメチオニン枯渇DMEM(ICN/FLOW 16-422-49)を細胞に添加した。取り込みを、一定間隔でプレートを計数することにより２４時間にわたり追跡した。プレートを計数しないときは、３７℃で５％CO2でインキュベートした。産生されたシグナルを、CCDイメージングシステムを使用して計数した。
【００６８】
結果
図１１の結果は、[14C]メチオニン取りこみがインキュベーションの時間に依存し、１５８６５および１８４５５の最大取りこみシグナルが、各々２％w/w  ALP-1およびCytostar-Tプレートで２４時間後に観察されたことを示す。
【００６９】
結論
本実験において、結果は、２％w/w  ALP-1プレートを使用した[14C]メチオニン取りこみアッセイにおいて観察されるCCDイメージャーシグナルが、Cytostar-Tプレートと同等であったことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  PVT SPAビーズを有する無機燐光体粒子、および比較のためのケイ酸イットリウム粒子のCCD検出シグナルを示す。
【図２】  比較のためのPVT SPAビーズを有する有機キレートのCCD検出シグナルを示す。
【図３】  実施例２で使用した色素の吸収スペクトルを示す。
【図４】  PVT SPA、ケイ酸イットリウム粒子、Y2O3:EuおよびYAG:Tb粒子の放出スペクトルを示す。
【図５】  CCDイメージングシステムにより検出された逆転写シンチレーションプロキシミティーアッセイにおけるストレプトアビジン被覆無機燐光体粒子の評価を示す。
【図６】  ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズおよびCCDイメージングを使用したアウリントリカルボン酸によるHIV逆転写酵素の阻害を示す。
【図７】  [35S]GTPγS G-タンパク質結合レセプターにおけるPST WGA被覆ビーズとChOA1レセプター／PIAアゴニスト由来のCCD検出シグナルと、PVT WGA被覆SPAビーズのシンチレーション計数シグナルの比較を示す
【図８】  CCDイメージングを使用したWGA−被覆ポリスチレンビーズに結合した[125I]EGF結合の阻害を示す。
【図９】  PSTストレプトアビジン−被覆ビーズおよびストレプトアビジン−被覆燐光体粒子のCCDイメージングにより得た、およびPVTストレプトアビジン−被覆SPAビーズのシンチレーション計数により得たシグナル対ノイズ比の比較を示す。
【図１０】  CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]チミジンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびCytostar-Tプレートの使用の比較を示す。
【図１１】  CCDイメージングシステムを使用した、増殖細胞における[14C]メチオニンの取りこみの追跡に使用した、２％w/w ALP-1マイクロプレートおよびCytostar-Tプレートの使用の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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