(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤を含有する培地に被検微生物を接種、培養し、該薬剤の影響により形態の変化した被検微生物と正常な形態の被検微生物が共存する培地を得、該培地に形態の変化した該被検微生物のＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を添加し、ここで溶出したＡＴＰ及び該培地中のその他のＡＴＰを消去し、ついで該培地に残存する正常な形態の被検微生物のＡＴＰ量と、該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することを特徴とする微生物の薬剤感受性試験法。
【請求項２】
形態の変化した該被検微生物のＡＴＰ溶出剤が、キレート化剤、界面活性剤、アミン類からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の微生物の薬剤感受性試験法。
【請求項３】
次の（イ）〜（ニ）を含有する微生物の薬剤感受性試験用キット。
（イ）薬剤の影響により形態の変化した被検微生物のＡＴＰ溶出剤。
（ロ）ＡＴＰ消去剤。
（ハ）正常な形態の被検微生物のＡＴＰ抽出剤
（ニ）ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬。
【請求項４】
薬剤を含有する培地に被検微生物を接種、培養し、該薬剤の影響により形態の変化した被検微生物と正常な形態の被検微生物が共存する培地を得、該培地に形態の変化した該被検微生物のＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を添加し、ここで溶出したＡＴＰ及び該培地中のその他のＡＴＰを消去し、ついで該培地に残存する正常な形態の被検微生物のＡＴＰ量と、該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することを特徴とする微生物の最小発育阻止濃度測定法。
【請求項５】
形態の変化した該被検微生物のＡＴＰ溶出剤が、キレート化剤、界面活性剤、アミン類からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項４記載の微生物の最小発育阻止濃度測定法。
【請求項６】
次の（イ）〜（ニ）を含有する微生物の最小発育阻止濃度測定用キット。
（イ）薬剤の影響により形態の変化した被検微生物のＡＴＰ溶出剤。
（ロ）ＡＴＰ消去剤。
（ハ）正常な形態の被検微生物のＡＴＰ抽出剤
（ニ）ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、従来のＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法の改良に関し、特に微生物の薬剤に対する偽耐性に基づく誤判定を回避し、判定結果の信頼性の高い、微生物の薬剤感受性試験法及びそのキット、微生物の最小発育阻止濃度測定法及びそのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学療法に於ける薬剤感受性試験の最大の目的は、感染症の起因微生物（以下病原体ということがある）に有効な薬剤を迅速に判定し、的確な投薬を可能にすることにある。
一方、感染症の治療に際し、抗感染症剤を長期間にわたって大量に使い続けたために、病原体が薬剤耐性をつけてしまう場合がある。
この場合、感染症の治療を成功させるか否かはこうした病原体の性質、特に薬剤感受性あるいは薬剤耐性を見極めることが重要となる。
しかし、一般に薬剤感受性試験法として知られるディスク法、微量液体希釈法（液体培地希釈法）及び寒天平板希釈法（以下これらを総称して在来法という）は、判定結果の信頼性は高いが、培養に少なくとも１６〜２０時間を要するため、結果の判定は早くとも検査開始の翌日となる欠点を有する。
そこで、より迅速に判定可能な微生物の薬剤感受性試験法の出現が望まれている。
【０００３】
従来、より迅速に判定可能な微生物の薬剤感受性試験法として、薬剤を含有する培地で被検微生物を３〜５時間培養し、その被検微生物のＡＴＰ量と、該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することにより薬剤感受性を判定する方法（以下、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法という）が知られている。
この方法は、ＡＴＰ量の測定にルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬が利用され、微生物の検出限界が１０3ＣＦＵ／ｍｌと非常に高感度であり、培地への接種菌量が １０5ＣＦＵ／ｍｌである薬剤感受性試験においては接種直後より被検微生物の消長を観察することができ、しかも在来法より大幅な培養時間の短縮が可能となる利点を有する。（Ｈ．Ｈｏｊｅｒ，Ｌ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｓ．Ａｏｓｅｈｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｔｈｏｒｅ，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，Ｓｕｐｐｌ．，９，５８−６１，１９７６及びＡ．Ｔｈｏｒｅ，Ｌ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｈ．Ｈｏｊｅｒ，Ｓ．Ａｎｓｅｈｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｂｒｏｔｅ，Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｂ，８５，１６１−１６６，１９７７）。
【０００４】
しかし、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のグラム陰性桿菌を被検微生物として用い、β−ラクタム抗生物質に対する薬剤感受性試験をこのＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法で行うと、在来法では薬剤感受性の判定結果となる例も、この方法では全く反対の薬剤耐性、即ち偽耐性を示す例が数多く認められた（Ｖｅｌｌｅｎｄ，Ｈ．，Ｓ．Ａ．Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．Ｂａｒｚａ，Ｌ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｌ．Ｐｉｃｃｉｏｌｏ  ａｎｄ  Ｅ．Ｗ．Ｃｈａｐｐｅｌｌｅ．ＮＡＳＡ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ，１９７４）。
すなわち、従来のＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法においては、被検微生物の薬剤偽耐性に基づく誤判定を招来し、判定結果の信頼性を害なう大きな欠点を有していた。
【０００５】
従来のＡＴＰ法による薬剤感受性試験法において招来する偽耐性は、以下に述べるように被検微生物が薬剤の影響によりスフェロプラスト化およびフィラメント化といった形態の変化をおこしつつも、生存していることが原因と考えられてきた。
即ち、上記の偽耐性は微生物の細胞壁の合成阻害を作用機作とするβ−ラクタム抗生物質で特に数多く認められ、これら抗生物質の存在下で被検微生物を培養すると、被検微生物は初めのうちはスフェロプラスト化及びフィラメント化といった形態の変化を示し生存しているが、更に培養を続けると、ついに周囲との浸透圧差から溶菌、死滅してしまう。このようなことからＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法の判定所要時間である３〜５時間では被検微生物は形態変化をおこしつつ生存しているので耐性、一方、在来法の判定所要時間である１６〜２０時間では被検微生物は死滅してしまっており感受性、従って、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法では偽耐性が生じる。
これまでにＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法における偽耐性対策としては、培地を希釈したり、浸透圧の低い培地を用い、薬剤の影響によりフィラメント化及びスフェロプラスト化といった形態の変化した被検微生物を選択的に溶菌させる方法が知られている。（Ｐ．Ｆ．Ｗｈｅａｔ，Ｊ．Ｇ．Ｍ．Ｈａｓｔｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｐｅｎｃｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５，９５−９９，１９８８及びＥ．Ｇ．Ｈｏｒｎｓｔｅｎ，Ｌ．Ｅ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｈ．Ｅｌｗｉｎｇ，ａｎｄ  Ｉ．Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１２，１７１−１７５，１９８９）。
しかし、これらの試みは特定の微生物を対象とする場合は有効であるが、幅広い微生物を対象とする薬剤感受性試験の本来の目的を考えると不適当である。
【０００６】
一方また、ＡＴＰ法による微生物の最小発育阻止濃度測定法においても、同様に偽耐性に基づく誤判定を招来し、判定結果の信頼性を害なう大きな欠点を有していた。
【０００７】
また、近年薬剤による微生物の発育阻止効果が殺菌的に作用している薬剤の最小濃度、即ち最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定法や、微生物に薬剤を短時間接触し、薬剤がなくなった後も持続する増殖抑制効果（ポストアンティビオティック・イフェクト）（ＰＡＥ）の測定法においても、同様な欠点を有していた。
ＭＢＣの測定は、最小発育阻止濃度を測定するために薬剤を含有する培地で一晩培養した被検微生物を、再度薬剤非含有培地で培養し、その再増殖が認められない薬剤の最小濃度を求めることにより行う。
またＰＡＥの測定は、薬剤を含有する培地で２時間程度の短時間培養を行った後に薬剤非含有培地で１０００倍に希釈して再度培養し、被検微生物の再増殖が認められるまでの時間を求めることにより行う。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、幅広い菌種に適応可能で、被検微生物の薬剤偽耐性に基づく誤判定を回避し、判定結果の信頼性が高い、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法及び微生物の最小発育阻止濃度測定法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＥＤＴＡ（キレート化剤）、トリトンＸ−１００、ツイーン２０ 、ツイーン４０、アンヒト ール（界面活性剤）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、 ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エチルアミン、エタノールアミン（アミン類）が、薬剤の影響によりスフェロプラスト化及びフィラメント化といった形態の変化した被検微生物を選択的に溶菌し、ＡＴＰを溶出できることを発見した。
そして、ここで溶出したＡＴＰと培地中のその他のＡＴＰを消去した後、該培地に残存する被検微生物のＡＴＰ量と、薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することにより、微生物の薬剤の偽耐性に基づく誤判定を回避し、判定結果の信頼性の高い微生物の薬剤感受性試験法が得られることを発見し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、  薬剤を含有する培地に被検微生物を接種、培養し、該薬剤の影響により形態の変化した被検微生物と正常な形態の被検微生物が共存する培地を得、該培地に形態の変化した該被検微生物のＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を添加し、ここで溶出したＡＴＰ及び該培地中のその他のＡＴＰを消去し、ついで該培地に残存する正常な形態の被検微生物のＡＴＰ量と、該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することを特徴とする微生物の薬剤感受性試験法である。また本発明は、（イ）薬剤の影響により形態の変化した被検微生物のＡＴＰ溶出剤、（ロ）ＡＴＰ消去剤、（ハ）正常な形態の被検微生物のＡＴＰ抽出剤及び（ニ）ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を含有する微生物の薬剤感受性試験用キットである。また本発明は、薬剤を含有する培地に被検微生物を接種、培養し、該薬剤の影響により形態の変化した被検微生物と正常な形態の被検微生物が共存する培地を得、該培地に形態の変化した該被検微生物のＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を添加し、ここで溶出したＡＴＰ及び該培地中のその他のＡＴＰを消去し、ついで該培地に残存する正常な形態の被検微生物のＡＴＰ量と、該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することを特徴とする微生物の最小発育阻止濃度測定法である。また本発明は、（イ）薬剤の影響により形態の変化した被検微生物のＡＴＰ溶出剤、（ロ）ＡＴＰ消去剤、（ハ）正常な形態の被検微生物のＡＴＰ抽出剤及び（ニ）ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を含有する微生物の最小発育阻止濃度測定用キットである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、先ず薬剤を含有する培地に被検微生物を接種、培養する。
ここに用いられる薬剤としては、抗生物質、抗菌剤、抗真菌剤など、通常の微生物の薬剤感受性試験を目的とする任意の薬剤が挙げられる。
そして、これら被検微生物と薬剤の組み合わせによっては、在来法では当該薬剤に対し感受性と判定されるが、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法では反対の耐性（偽耐性）と判定され、判定結果が異なる場合がある。
本発明による微生物の薬剤感受性試験法は、このように在来法とＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法とで判定結果が異なる場合に多大な貢献をなす。
そして、特にβ−ラクタム抗生物質を用いた場合に本発明の効果が最も良好に反映されるので、本発明においては特にβ−ラクタム抗生物質が好ましい。
【００１２】
培地としては、被検微生物の生育増殖に好適な固体、液体あるいは半液体（ペースト）状の栄養培地が挙げられる。
培地は、天然、合成、あるいは半合成培地が挙げられる。
【００１３】
被検微生物の培養は、当該微生物の生育に好適な温度、時間、ｐＨとすることが好ましく、例えば、１５〜５０℃で、３０分〜３０日、ｐＨ４〜１０が好ましい。
【００１４】
本発明が適用される被検微生物としては、細菌、酵母菌、カビ、担子菌類など任意の微生物が挙げられる。
このうち在来法では感受性であると判定されるが、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法では耐性（偽耐性）と判定されることがしばしば見られる微生物、例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のグラム陰性桿菌を選択した場合に本発明の効果が良好に反映されるので、特に緑膿菌が好ましい。
【００１５】
緑膿菌は、敗血症、髄膜炎、気管支炎、肺炎、創傷感染症（広範熱傷の創感染、褥創感染）などの感染症を引き起こす原因微生物であることが知られ、この微生物の当該薬剤に対する感受性、あるいは耐性を迅速に把握することは、その感染症を治療をする上で極めて重要である。
【００１６】
このようにして、薬剤を含有する培地に被検微生物を接種して培養すると、該薬剤の影響により一部の被検微生物でフィラメント化及びスフェロプラスト化といった形態変化が認められる。
即ち、培地中に形態が変化した被検微生物と正常な形態の被検微生物が共存（共生）した状態となる。
【００１７】
次に、この培地に薬剤の影響により形態変化した被検微生物を選択的に溶菌し、培地中にＡＴＰを溶出するＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を添加し、溶出したＡＴＰ及び培地中のその他のＡＴＰを消去する。
【００１８】
本発明におけるＡＴＰ溶出剤としては、キレート化剤、界面活性剤、アミン類の少なくとも１種が挙げられる。
【００１９】
このうちキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン、４，５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタイプ化合物、それらの誘導体およびそれらの前駆体などの少なくとも１種が挙げられる。
これらは、０．５〜５０ｍＭの濃度範囲が好ましい。
【００２０】
また界面活性剤としては、トリトンＸ−１００、ツイーン２０、ツイーン４０等のノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤及びアンヒトール等のツビッターイオン界面活性剤などの少なくとも１種が挙げられる。
これらは、次の濃度範囲が好ましい。
トリトンＸ−１００（ノニオン界面活性剤）：０．０００５〜０．０５％
ツイーン２０（同上）：０．０１〜０．５％
ツイーン４０（同上）：０．０１〜０．５％
アンヒトール（ツビッターイオン界面活性剤）：０．００２〜０．２％
【００２１】
またアミン類としては、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エチルアミン、エタノールアミン等の類縁体および誘導体の少なくとも１種が挙げられる。
これらは、０．０１〜５％の濃度範囲が好ましい。
【００２２】
これらのＡＴＰ溶出剤は、培地、被検微生物および薬剤の種類によって適宜濃度を検討することによって、形態の変化した被検微生物を選択的に溶菌し、該微生物からＡＴＰを溶出させることができる。
【００２３】
ついでこの培地にＡＴＰ消去剤を添加し、被検微生物から溶出したＡＴＰ及び該培地中のそれ以外のＡＴＰを消去する。
【００２４】
ＡＴＰ消去剤としては、アデノシンヌクレオチドデアミナーゼ、ＡＴＰアーゼ、アデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシントリホスファターゼ等のＡＴＰを分解する任意の酵素が挙げられる。
これらは併用してもよい。
その添加量、消去の条件は、被検微生物から溶出したＡＴＰ及び該培地中のその他のＡＴＰを消去するのに充分であり、かつこの後につづく発光測定工程に悪影響を及ぼさない程度の添加量、温度及び時間条件を採用する。
例えば、アデノシンヌクレオチドデアミナーゼの場合、添加量としては０．０３〜３Ｕ／ｍｌ、１５〜５０℃、１〜６０分が好ましい。
【００２５】
ついで培地に残存する被検微生物のＡＴＰ量と、対照すなわち該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量とを比較することにより、微生物の薬剤感受性を判定することができる。
【００２６】
被検微生物のＡＴＰ量の測定は、被検微生物に従来公知のＡＴＰ抽出剤（界面活性剤、特に塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等の第４級アンモニウム塩）を作用させて、該被検微生物よりＡＴＰを抽出し、抽出されたＡＴＰ量を従来公知のＡＴＰの測定法により実施することができる。
【００２７】
ＡＴＰの測定法としては、（１）Ｍｇ2+、ルシフェリン（発光素）及びルシフェラーゼ（発光酵素）を組合わせたＡＴＰ測定用試薬（以下、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬という）を作用させ、放出された生物発光量を定量的に測定し、ＡＴＰ量を求める方法（メソッヅ・オブ・エンザイマテック・アナリシス、第７巻、第３５７頁、１９８５年参照）、（２）グルコースの存在下で被検液中のＡＴＰにヘキソースキナーゼを作用させてグルコース−６−リン酸を生成せしめ、このグルコース−６−リン酸にＮＡＤＰの存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成したＮＡＤＰＨを３４０ｎｍによる吸光度により測定する方法（同第７巻、第３４６頁、１９８５年参照）、（３）ヘキソキナーゼとピルベートキナーゼとを併用してＤ−グルコースからグルコース−６−リン酸を生成する反応を増幅し１−メトキシ−５−フェナジンメチルサルフェート及びイソルミノールを使用した発光によって定量する方法（特開昭６４−２３９００号参照）及び（４）定量すべきＡＴＰとアデノシントリフォスファターゼ（ＡＴＰａｓｅ）で代表されるＡＴＰ分解酵素によりＡＤＰとリン酸に分解し、この分解によって生成したリン酸をモリブデン酸と反応させてリンモリブデン酸を生成し、このリンモリブデン酸をアスコルビン酸と反応させ、還元されて生成するモリブデンブルーに由来する青色の度合を測定する方法（特開平４−３６０７００号参照）など、任意の手段が挙げられる。
そして、それらのうち、ＡＴＰにルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を作用させ、放出された生物発光量を定量的に測定し、ＡＴＰ量を求める方法が簡便、迅速に測定可能で、かつ測定値の精度と信頼性が高い結果が得られるので好ましい。
なお、上記発光反応を円滑に行うため、必要によりアルブミン、サイクロデキストリン、緩衝剤、キレート化剤等を加えてもよい。
【００２８】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬としては、発光にＡＴＰを必要とする系であればいかなるものも利用可能で、例えばホタル、ウミホタル、ラチア、発光ミミズ、ウミシイタケ等に由来するものが利用できるが、これらのうち好ましいのはホタル及びクローニングを行った微生物由来のものなどが挙げられる。
【００２９】
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を利用してＡＴＰを発光量として測定する試薬および発光量を測定する装置は市販されており、本発明を実施するに際してはこのような市販のキット及び装置を利用して被検微生物のＡＴＰを発光量として測定することができる。
【００３０】
以下にそのルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬（ＡＴＰ測定用試液）の一例を示す（ＢＵＮＳＥＫＩ  ＫＡＧＡＫＵ  Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１０，ｐｐ．８４５−８５１（１９５５）のｐ８４６参照）。
１０ｍＭ  硫酸マグネシウム（Ｍｇイオン）
０．３０ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン（発光素）
１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（安定剤）
１．０ｍＭ  ジチオスレイトール（安定剤）
０．５１ｍｇ／ｍｌ  ゲンジホタルルシフェラーゼ（発光酵素）
０．２％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（安定剤）
を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  緩衝液（ｐＨ７．８）
【００３１】
こうして、ＡＴＰ溶出剤と共にＡＴＰ消去剤を用い、薬剤の影響により形態変化した被検微生物のＡＴＰと培地中のその他のＡＴＰを消去した後に、残存する被検微生物よりＡＴＰを抽出してその量をルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を用いて測定し、得られたＡＴＰ量（発光量）と、対照すなわち該薬剤を含有しない培地で培養した被検微生物のＡＴＰ量（発光量）とを比較して、該薬剤に対する感受性を判定する。
対照と比較し、ＡＴＰ量の減少が著しいものを感受性、大差ない場合を耐性として判定する。
【００３２】
以下、実験例及び実施例を示して本発明をより具体的に説明する。
なお、以下に示す実験例及び実施例において使用する被検微生物、培地、薬剤の１例を以下に示す。
（１）培地：ミューラー・ヒントン培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ ディフコ社製））にＣａ2+およびＭｇ2+を添加してそれぞれ終濃度を５０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌに調整したカチオン・サプリメンテッド・ミューラー・ヒントン培地（Ｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ  Ｂｒｏｔｈ（ＣＳＭＨＢ））を調製した。
（２）被検微生物：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ ２７８５３を上記培地で一晩培養し、生理食塩水で５×１０6ＣＦＵ／ｍｌに調整した菌懸濁液を得た。
（３）薬剤：いずれも抗生物質として知られる化合物で、略号および一般名を示す。
ＦＯＭ：ホスホマイシン
ＡＳＰＣ：アスポキシシリン
ＰＩＰＣ：ピペラシリン
ＣＥＺ：セファゾリン
ＧＭ：ゲンタマイシン
ＴＯＢ：トブラマイシン
ＥＭ：エリスロマイシン
ＳＴ：スルファメトキサゾール・トリメトプリム
Ｓ／Ｃ：スルバクタム・セフォペラゾン
ＡＺＴ：アズトレオナム
Ｉ／Ｃ：イミペネム・シラスタチン
ＣＡＺ：セフタジジム
ＣＰ：クロラムフェニコール
【００３３】
【実験例１】
β−ラクタム抗生物質であるＰＩＰＣ（ピペラシリン）存在下で培養し、形態変化（フィラメント化）した被検微生物 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３からＡＴＰの溶出例
【００３４】
（実験方法）
被検微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３を抗生物質ＰＩＰＣを５μｇ／ｍｌで含有（最少発育阻止濃度（ＭＩＣ）の１．５倍の濃度）する５ｍｌの液体培地ＣＳＭＨＢに終濃度５×１０5ＣＦＵ／ｍｌで接種し、３７℃で３時間培養し、形態変化を生じた被検微生物を含有する「培養液ａ」を得た。
そこで得られた「培養液ａ」の光学顕微鏡写真（倍率１００）を図１に示す。
図１には、抗生物質ＰＩＰＣを含有する培地で３時間培養した被検微生物の形態が示される。抗生物質の影響によって形態が細長く変化（フィラメント化）した細胞が中央付近に観察される。
上記で得られた「培養液ａ」を１００μｌづつ５区分に分け、第１〜第４の各区分にそれぞれ２５ｍＭトリシン （ｐＨ７．７５）に溶解した下記Ａ〜ＤのＡＴＰ溶出剤を添加し、また第５区分には緩衝剤成分である２５ｍＭトリシン （ ｐＨ７．７５）のみを添加し、室温で３０分放置した。
【００３５】
（ＡＴＰ溶出剤の種類と濃度）
Ａ：５ｍＭ  ＥＤＴＡ（キレート化剤）
Ｂ：０．００５％  トリトンＸ−１００（ノニオン界面活性剤）
Ｃ：０．０２％  アンヒトール（ツビィターイオン界面活性剤）
Ｄ：０．２％    ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（アミン類）
【００３６】
次いで、５０μｌのルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬（商品名：ルシフェールＬＵプラス、キッコーマン（株）社製）を添加し、直後にルーマットＬＢ９５０１（ベルトールド社製）を用い積算時間３秒間で発光量を測定した。
上記発光量は、形態が変化した被検微生物が上記ＡＴＰ溶出剤の添加により溶出したＡＴＰと培養液中にもともと存在していたＡＴＰの和として測定できる。
測定結果を、第５区分のＡＴＰ溶出剤を含まない２５ｍＭトリシン （ｐＨ７．７５）の発光量を１００とした場合の相対比として、表１の培養液ａの列に示す。
表１の結果から、ＡＴＰ溶出剤を添加した第１〜４の区分のＡＴＰ濃度は、いずれもＡＴＰ溶出剤を添加しない第５区分のそれと比べ約２倍以上に増加していることから、形態が変化した被検微生物からＡＴＰが溶出しているのがわかる。
【００３７】
【比較例１】
一方、比較のため上記「抗生物質ＰＩＰＣを含有する５ｍｌの液体培地ＣＳＭＨＢ」を用いる代わりに、「抗生物質ＰＩＰＣを含有しない５ｍｌの液体培地ＣＳＭＨＢ」を用いる以外は全く同様にして、正常な形態の被検微生物を含有する対照の「培養液ｂ」を得た。
その顕微鏡写真（倍率１００）を図２に示す。
図２には、抗生物質ＰＩＰＣを含有しない対照の培地で３時間培養した被検微生物の形態が示される。抗生物質の影響をうけない、正常な形態の被検微生物（楕円形細胞が１つだけのもの、あるいは２つ連結したもの）が観察される。
次いで、上記と同様に「培養液ｂ」を１００μｌづつ５区分に分け、第１〜第４の各区分にそれぞれ２５ｍＭトリシン （ｐＨ７．７５）に溶解した前記Ａ〜ＤのＡＴＰ溶出剤を添加し、また第５区分には緩衝剤成分である２５ｍＭトリシン （ ｐＨ７．７５）を添加し、室温で３０分放置した。
そして対照の「培養液ｂ」の発光量を測定した。
その結果を同じく表１の培養液ｂの列に示す。
【００３８】
【表１】
0003636849.tif 000002
【００３９】
表１の結果から、薬剤を含有しない培地で培養し得られた対照の培養液ｂにおいては、ＡＴＰ溶出剤を添加した第１〜４区分のＡＴＰ濃度は、ＡＴＰ溶出剤を添加しない第５区分のそれと殆ど同一であることから、ＡＴＰ溶出剤の添加にも拘らず正常な被検微生物からのＡＴＰの溶出は生じていないことがわかる。
以上のことより、上記で示した４種類のＡＴＰ溶出剤はいずれも薬剤の影響により形態変化した被検微生物を選択的に溶菌し、ＡＴＰを溶出させる効果のあることが判る。
【００４０】
【実施例１】
（微生物の薬剤感受性試験用キットの調製例）
薬剤の影響により形態の変化した被検微生物のＡＴＰ溶出剤として、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ及び２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール  ０．５％とを含有するトリシン（緩衝剤）２５ｍＭ（ｐＨ７．７５）溶液と、ＡＴＰ消去剤としてアデノシンヌクレオチドデアミナーゼ０．３  Ｕ／ｍｌを含有するトリシン（緩衝剤）２５ｍＭ（ｐＨ７．７５）溶液とをそれぞれ調製した。
【００４２】
【実施例２】
（緑膿菌のβ−ラクタム抗生物質に対する薬剤感受性試験）
表２の「薬剤の種類の欄」に掲げるβ−ラクタム抗生物質を所定の濃度で添加した薬剤含有液体培地ＣＳＭＨＢを、９６ウエルマイクロタイタープレート（ダイナテック社製、白色）に１００μｌづつ分注した。
ついで、被検微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２７８５３の懸濁液を上記各ウエルに１０μｌずつ無菌的に接種（終濃度５×１０5ＣＦＵ／ｍｌ）し、このプレートを３７℃で３時間培養した。
ついで、以下の組成からなるＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を含有する試薬を５０μｌづつ添加し、薬剤の影響により形態変化した被検微生物を選択的に溶菌し、ＡＴＰを溶出させ、同時に溶出したＡＴＰと該培地中のその他のＡＴＰの消去を行った。
【００４３】
（ＡＴＰ溶出剤及びＡＴＰ消去剤を含有する試薬）
ＥＤＴＡ  ５ｍＭ（ＡＴＰ溶出剤）
２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール  ０．５％（同上）
アデノシンヌクレオチドデアミナーゼ  ０．３  Ｕ／ｍｌ（ＡＴＰ消去剤）
トリシン（緩衝剤）  ２５ｍＭ
ｐＨ      ７．７５
【００４４】
室温で３０分間放置した後、５０μｌのＡＴＰ抽出剤（０．２％塩化ベンザルコニウム）を添加した。
さらに５０μｌのルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬（２．５％のα−サイクロデキストリン溶液で溶解したルシフェールＬＵプラス、キッコーマン社製）を添加し、発光量をダイナテック社製のＭＬ３０００を用い、レートアッセイにより測定し、被検微生物のＡＴＰ量を測定した。
なお、上記α−サイクロデキストリンはＡＴＰ抽出剤の中和の為に用いた。
【００４５】
ついで上記被検微生物のＡＴＰ量の測定方法において、抗生物質含有ＣＳＭＨＢ培地に代えて、抗生物質非含有ＣＳＭＨＢ培地を用いる以外は全く同様にして対照の被検微生物のＡＴＰ量を測定した。
【００４６】
以下の方法により、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法の判定を行った。即ち、ＡＴＰインデックスを求め、以下の基準により感受性、耐性の判定を行った。
（感受性Ｓ、耐性Ｒの判定基準）
ＡＴＰインデックス＝（Ｘ／Ｙ）×１００
Ｘ＝抗生物質含有ＣＳＭＨＢの発光量
Ｙ＝抗生物質非含有ＣＳＭＨＢの発光量
ＡＴＰインデックス≦４０：感受性（Ｓ）
ＡＴＰインデックス＞４０：耐性（Ｒ）
【００４７】
【比較例１】
（従来のＡＴＰ法及び在来法による緑膿菌のβ−ラクタム抗生物質に対する感受性試験）
比較のため、被検微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ ２７８５３のβ−ラクタム抗生物質に対する感受性試験を従来のＡＴＰ法による薬剤感受性試験法（以下これを従来ＡＴＰ法ということがある）、在来法である微量液体希釈法により実施した。
その結果を表２に示す。
なお、従来ＡＴＰ法は、培養後直接５０μｌのＡＴＰ抽出剤を添加し、５０μｌのルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を添加して求めた発光量からＡＴＰインデックスを求め、判定した結果である。
また、在来法（微量液体希釈法）は日本化学療法学会が定める標準法に従って判定した結果である。
【００４８】
【表２】
0003636849.tif 000003
【００４９】
表２の結果から、従来ＡＴＰ法による緑膿菌の薬剤感受性試験は、ＣＥＺでのみ在来法と判定結果が一致した。しかし、その他の薬剤では在来法と逆の耐性すなわち偽耐性が確認され、判定結果の信頼性が欠けることが判る。
これに対し、本発明のＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法においては、ＣＥＺを含む全薬剤で在来法と完全に一致した。
即ち、本発明によれば、従来ＡＴＰ法の微生物の薬剤の偽耐性に基づく誤判定を回避し、判定結果の信頼性の高い、ＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法を提供できることが判る。
【００５０】
【実施例３】
（緑膿菌のβ−ラクタム抗生物質以外の抗生物質に対する薬剤感受性試験）
実施例２の緑膿菌のβ−ラクタム抗生物質に対する薬剤感受性試験において、薬剤の種類を表３に記載のβ−ラクタム抗生物質以外の抗生物質とする以外は全く同様にして、薬剤感受性試験を実施した。
【００５１】
【比較例（従来ＡＴＰ法、在来法）】
比較のため、緑膿菌のβ−ラクタム抗生物質以外の抗生物質に対する感受性試験を、従来ＡＴＰ法、在来法である微量液体希釈法により、上記比較例１と同様に実施した。
その結果を表３に示す。
本実施例、従来ＡＴＰ法、在来法による薬剤感受性試験の判定結果をまとめて表３に示す。
【００５２】
【表３】
0003636849.tif 000004
【００５３】
表３の結果から、β−ラクタム抗生物質以外の抗生物質ＦＯＭ（ホスホマイシン）の全濃度区分においては、在来法においては感受性の判定結果が得られるのに対し、従来ＡＴＰ法では、耐性の判定結果となり、またＳＴ（スルファネトキサゾール・トリメトプリム）の５０μｇ／ｍｌ濃度の区分においては、在来法においては耐性の判定結果が得られるのに対し、従来ＡＴＰ法においては感受性の判定結果となり、判定結果の信頼性が害なわれることが判る。これに対し本発明のＡＴＰ法による微生物の薬剤感受性試験法においては、いずれの区分も在来法と一致した。
また、従来ＡＴＰ法でも在来法と一致する結果が得られたその他の薬剤においても本発明のＡＴＰ法は変らず一致する結果を示した。
本発明によれば、緑膿菌のβ−ラクタム抗生物質以外の抗生物質に対する薬剤感受性試験においても微生物の薬剤の偽耐性に基づく誤判定を回避し、判定結果の信頼性の高い、微生物の薬剤感受性試験法を提供することができることが判る。以上の結果から、本発明の微生物の薬剤感受性試験法はβ−ラクタム抗生物質に限らず幅広い薬剤に適応できることが判る。
【００５４】
【実施例４】
（緑膿菌以外の被検微生物における薬剤感受性試験）
緑膿菌以外の微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２３およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９２１２を被検微生物とし、表４に記載の各種薬剤に対する感受性試験を従来ＡＴＰ法、本発明のＡＴＰ法による薬剤感受性試験法で行い、それぞれの結果を在来法（標準法）である微量液体希釈法と対比し、相関性を検討した。
実施例２と同様の方法により測定した。
各測定方法による判定結果を表４に示す。
【００５５】
【表４】
0003636849.tif 000005
【００５６】
表４の結果から、従来ＡＴＰ法においては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２を被検微生物とした際、β−ラクタム抗生物質（薬剤）であるＰＩＰＣ、ＡＺＴ、ＣＡＺにおいて偽耐性が確認された。
しかし、本発明によれば、その偽耐性が解消され、在来法との完全な相関が得られた。また、従来ＡＴＰ法と在来法とで、判定結果が一致するその他の微生物、薬剤を、本発明のＡＴＰ法による薬剤感受性試験に適用した場合、その判定結果は変らず在来法と一致することが判る。
即ち、本発明は緑膿菌に限らず幅広い菌種を被検微生物として、また薬剤に対して、判定結果の信頼性の高い微生物の薬剤感受性試験法を提供できることが判る。
【００５７】
【実施例５】
（微生物の最小発育阻止濃度測定用キット）
（イ）薬剤の影響により形態の変化した被検微生物のＡＴＰ溶出剤
ＥＤＴＡ  ５ｍＭ
２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール  ０．５％
（ロ）ＡＴＰ消去剤
アデノシンヌクレオチドデアミナーゼ  ０．３  Ｕ／ｍｌ
（イ）、（ロ）のいずれも緩衝液トリシン２５ｍＭ溶液（ｐＨ７．７５）として使用。
【００５８】
【実施例６】
（微生物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）測定）
被検微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ ２７８５３の表５に記載された薬剤に対する微生物の最小発育阻止濃度を本発明法で測定し、在来法（標準法）である微量液体希釈法および寒天平板希釈法との相関性を検討した。
表５に記載された薬剤の１００μｇ／ｍｌから０．１ μｇ／ｍｌまでの２倍希釈系列をＣＳＭＨＢで作製し９６ウエルマイクロタイタープレート（ダイナテック社製、白色）に１００μｌづつ分注した。
被検微生物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ ２７８５３の各薬剤の各濃度での感受性を実施例２に示す方法で判定した。
その結果感受性と判定された最も低い薬剤濃度を微生物の最小発育阻止濃度とした。
なお、在来法は、日本化学療法学会において定められた標準法に従って判定した。
その結果を表５に示す。
【００５９】
【表５】
0003636849.tif 000006
【００６０】
表５の結果から、本発明による微生物の最小発育阻止濃度は、在来法（微量液体希釈法、寒天平板希釈法）による測定値と、前後２段階の測定誤差範囲内で完全に一致した。
このことから、本発明によれば判定結果の信頼性の高い微生物の最小発育阻止濃度測定法を提供することができることが判る。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、従来ＡＴＰ法による微生物の薬剤の偽耐性に基づく誤判定を回避し、判定結果の信頼性の高い、微生物の薬剤感受性試験法及びそのキット、微生物の最小発育阻止濃度測定法及びそのキットを提供することができる。
また、本発明によれば、判定結果の信頼性の高い、薬剤の最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の測定法及び被検微生物に薬剤を短時間接触し、薬剤がなくなった後において持続する増殖抑制効果（ポストアンティビオティック・イフェクト）（ＰＡＥ）の測定法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図面代用写真（光学顕微鏡写真、倍率１００、抗生物質ＰＩＰＣを含有する培地で３時間培養した被検微生物の形態を示す。抗生物質の影響によって形態が細長く変化（フィラメント化）した細胞が中央付近に観察される。）
【図２】図面代用写真（光学顕微鏡写真、倍率１００、抗生物質ＰＩＰＣを含有しない対照の培地で３時間培養した被検微生物の形態を示す。抗生物質の影響をうけない、正常な形態の被検微生物細胞（楕円形細胞が１つだけのもの、あるいは２つ連結したもの）が観察される）。
【図１】
0003636849.tif 000007
【図２】
0003636849.tif 000008