(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコ免疫不全ウイルスの外被膜遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡであり、その塩
基配列が、
【化１】
0003656073.tif 000004
【化２】
0003656073.tif 000005
で示される全長配列の中で、ウイルスの感染に中心的な役割を果たす領域を発現
させる一部の長さを持つことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
ネコ免疫不全ウイルスの外被膜蛋白質であり、そのアミノ酸配列が、
【化３】
0003656073.tif 000006
【化４】
0003656073.tif 000007
で示される全長配列の中で、ウイルスの感染に中心的な役割を果たす領域である
一部の長さを持つ蛋白質、さらにそれに糖鎖が付加されたことを特徴とする蛋白
質。
【請求項３】
ネコ免疫不全ウイルスの外被膜遺伝子を含むＤＮＡであり、請求項２に記載さ
れたウイルスの感染に中心的な役割を果たす蛋白質の一部を発現し得るように構
築されたことを特徴とする発現用プラスミド、ファージあるいはウイルスのベク
ターＤＮＡ構造物。
【請求項４】
ネコ免疫不全ウイルス外被膜蛋白質の一部であり、ウイルスの感染に中心的な
役割を果たす請求項３の発現用ベクターＤＮＡを含む菌あるいは動物の細胞の培
養によって生産されたことを特徴とする蛋白質。
【請求項５】
生産された蛋白質が前記請求項２記載の蛋白質であることを特徴とする請求項
４記載の蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基配列が公知のものと異なっているネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ、ＦＩＶ）静岡株とそれらより作製されたワクチン、またそれらの外被膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ｅｎｖ）遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡ、それらのＤＮＡの遺伝子組み換えにより作製された発現ベクター、それらベクターを含む菌あるいは動物の細胞等を培養することにより得られる外被膜蛋白質、それらを用いて作製された遺伝子組み換え型ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在世界的な規模において、ヒト後天性免疫不全症候群（エイズ）が猛威をふるい、現代のペストと言われるほどの脅威となっている。この病気はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって伝染され、未だに有効な治療法やワクチンが開発されていない。一方、１９８６年アメリカ、カリフォルニア州ペタルマにおいて免疫不全症の病状を持ったネコからＨＩＶとよく似たウイルスがＰｅｄｅｒｓｅｎらにより発見されて（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５巻、ｐ７９０、１９８７）大きな話題となった。  
【０００３】
このウイルスはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）と命名され、それ以降日本も含めて世界中で多数の報告例を見るに至った。その後ネコ免疫不全ウイルスの全塩基配列が決定されて（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏ、Ｎ．Ａ．Ｓ．８６巻、ｐ５７４３、１９８９）ＨＩＶの遺伝子構成と良く類似していることが示された。また感染を受けたネコの病状の経過観察などから、この病気は基本的にはヒトのエイズに相当するものであることが判明し、ヒトエイズの動物実験モデルとして有用であると考えられている。
【０００４】
この免疫不全症候群に対する有効な予防対策となるワクチンの開発等に関してはどの様な状況であるかというと、ヒトの場合にはワクチンを作製しても逃避変異株がすぐ生ずるためにワクチンが効かなくなると考えられており、ワクチン開発の大きな障害となっている。また、ワクチンの有効性を確認するための適切で簡便な実験系が存在しない。
【０００５】
このような変異に関しての状況はネコの場合においても同様と考えられる実験成績がすでにＳｉｅｂｅｌｉｎｋらにより報告されているが（Ｊ．ｖｉｒｏｌ．、６７巻、ｐ２２０２、１９９３）、ネコの場合においては感染実験を簡単に行うことができるので試作されたワクチンが有効か否かを実験によって検証することが可能という非常に有利な側面を持っている。
【０００６】
試作ワクチンによるネコ免疫不全ウイルス感染に対する防御効果を調べた研究に関してはＹａｍａｍｏｔｏらにより報告されている（Ｊ．ｖｉｒｏｌ、６７巻、ｐ６０１、１９９３）。この報告によれば、ペタルマ株を使用して作製されたワクチンで免疫されたネコは、ペタルマ株のウイルスやウイルス感染の成立に直接関与していると考えられている外被膜蛋白質のアミノ酸配列の相違度が約１０％程度のウイルス株を感染させた場合、ペタルマ株ワクチンの投与により感染防御効果を示したという結果が得られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは同様にして作製したペタルマ株ワクチンが、アミノ酸配列の相違度において、約２０％異なった静岡株ウイルスの感染に対しては防御できないという実験結果を得ており、従って、新たなネコ免疫不全ウイルスワクチンの開発が望まれている。
【０００８】
上記したように、後天性免疫不全症候群のワクチンを使用する場合は、天然痘、麻疹等のように単一のウイルス株で作製されたワクチンでは不十分であると考えられた。ワクチンの作製法はむしろ現行のインフルエンザワクチンのように複数ウイルス株の混合されたものの方が適当であると思われる。この場合、混合されるべきウイルス株は感染に関与する外被膜蛋白質のアミノ酸配列の相違性が大きいものを含むほどより広範な有効性を持つものとなる。
【０００９】
これまで我が国において分離されたネコ免疫不全ウイルスの塩基配列に関しては槇らにより報告されたＴＭ２株の塩基配列しか決定されておらず（Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、１２３巻、ｐ２９、１９９２）、この株は上記した米国のペタルマ株に代表される欧米タイプの外被膜蛋白質アミノ酸配列とは２０％以上異なっている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは日本国内において分離された１０株近くのネコ免疫不全ウイルスの外被膜遺伝子塩基配列を決定して解析を行った。その結果ＴＭ２株、あるいはまたペタルマ株等の欧米タイプともアミノ酸配列が２０％以上異なるネコ免疫不全ウイルス株が存在することが明らかとなった。このような結果と前記した試験結果より我が国で有効なワクチンを作製しようとするならば静岡株、ペタルマ株、ＴＭ２株等を混合した多価ワクチンにすることが望ましい。
【００１１】
本発明のネコ後天性免疫不全症候群ウイルスワクチンを調製するに当たっては、先ず日本国内で分離された多数のネコ免疫不全ウイルス株の外被膜遺伝子の塩基配列を決定する必要がある。そのための手段としては、ＤＮＡを増幅する有力な方法であるポリメレース連鎖反応（ＰＣＲ）と自動塩基配列決定機が使用される。
【００１２】
本発明においては、先ず外被膜遺伝子の増幅が行われる。ネコ免疫不全ウイルスは、青森、静岡、仙台、福岡、旭川、横浜、名古屋、等の地域で飼育されているネコから分離した。ネコ免疫不全ウイルスのウイルス粒子に含まれている遺伝子は１本鎖ＲＮＡであるが、ウイルスが感染している細胞中で増殖する過程においては２本鎖ＤＮＡとなって染色体ＤＮＡに結合された状態になる。
【００１３】
これらのことはネコ免疫不全ウイルスが属するレトロウイルス科レンチウイルス亜科に共通する性質である。ネコ免疫不全ウイルスはＴリンパ球を加えれば培養することが可能である。また、このウイルスの感染を受けたネコから採取された血液中のＴリンパ球の染色体ＤＮＡにはウイルスの遺伝子が含まれている。本発明においてはこれらの染色体ＤＮＡ中に含まれたネコ免疫不全ウイルス遺伝子を利用して実験が行われる。
【００１４】
即ち、ネコ免疫不全ウイルスに感染したネコの血液よりＴリンパ球を遠心分離で沈澱として採取した後、細胞溶解用緩衝液（トリス塩酸（ｐＨ８．３）１０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2
２ｍＭ、ＮＰ４０  ０．４５％、ツイーン２０  ０．４５％、プロテネースＫ  ６０μｇ／ｍｌ）に分散して、インキュベートし、フェノール抽出、クロロフォルム抽出後、エタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈澱させ、少量の水を加えてＰＣＲ用のＤＮＡ溶液とする。インキュベートは５６℃で１時間が好ましい。
【００１５】
ネコ免疫不全ウイルスペタルマ株の外被膜遺伝子は２５６５塩基長であることがすでに明らかになっている（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６巻、ｐ５７４３、１９８９）。ＰＣＲは、外被膜遺伝子ＤＮＡを境界部分を互いに重複するような３つの領域に分けて行うのが好適である。ＰＣＲに必要な化学合成されたＤＮ
ＡプライマーのＤＮＡ５’末端側にはいずれも適当な制限酵素の切断認識配列を含ませてＰＣＲの後で塩基配列決定用のベクターに容易に結合できるようにするのがよい。増幅された遺伝子断片は１％の低融点アガロース電気泳動により精製することができる。
【００１６】
次に、このようにして得られた外被膜遺伝子の塩基配列が決定される。上記のようにして増幅されたネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ＤＮＡを切断認識配列に対応した制限酵素で切断して、同じ制限酵素で切断されたＭ１３ファージ２本鎖ＤＮＡにＴ４ＤＮＡライゲースで結合させ、カルシウムで処理された大腸菌ＪＭ１０９株にＤＮＡ感染させて、外被膜遺伝子ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡとして含むファージブラックを得る。このファージブラックを大腸菌に感染して増幅させ、１本鎖ＤＮＡを回収する。
【００１７】
またＴａｑポリメレースによるＤＮＡ誤合成の可能性を避けるため、ＰＣＲで増幅された同一遺伝子断片から得られた５個のファージ由来の１本鎖ＤＮＡを混合して塩基配列決定に用いるのがよい。以降の塩基配列の決定は、例えばアプライドバイオシステム社（ＡＢＩ）から市販されている塩基配列用のキット及び同社の自動塩基配列決定機３７３Ａを使用することで行われる。
【００１８】
このようにして得られた塩基配列が決定された外被膜遺伝子を用いてネコ免疫不全ウイルス不活化ワクチンの生産が行われる。ネコ免疫不全ウイルスは主としてネコのＴリンパ球の中で増殖する。ネコ免疫不全ウイルスを持続的に増殖しながら継代できるＴリンパ系細胞株を樹立するためには、例えばＨＩＶの場合には、米国のギャロのグループが樹立したＨＩＶ持続感染細胞ＭＯＬＴ−４が良く知られている（Ｐｏｐｏｖｉｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻、ｐ４９７、１９８４）。
【００１９】
ネコ免疫不全ウイルスに関しては、ペタルマ株ウイルスを持続的に産生するＦＬ−４細胞が報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．，３２巻、ｐ３６１、１９９１）。本発明においてはこれらと同様な手法を用いることで、静岡株等のＴリンパ球持続感染細胞系が樹立できる。これらを用いてワクチンを製造するには、上記のＹａｍａｍｏｔｏらによりすでに報告されている通り、ウイルス感染細胞そのものを使用する方法と、ウイルスを精製する方法を応用することができる。
【００２０】
前者は感染細胞をパラフォルムアルデヒド等で含まれているウイルスを固定不活化して適当なアジュバントを加えて作製する。後者は持続感染細胞を除去してウイルスを集めて不活化し、アジュバントを加えてワクチンとする。
【００２１】
別のワクチン製造法としては、遺伝子組み換え法を用いたコンポーネントワクチンの作製が挙げられる。外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要な働きを持つ領域を部分的に含む組み換え遺伝子発現用のベクターは既に公知となっている遺伝子組み換えの手法を用いて作製することが可能である。本発明においてもそのような手段を静岡株ウイルスの外被膜遺伝子の全部または感染に重要な部分の蛋白質を発現させることのできるベクターが調製される。
【００２２】
多価ワクチンの作製は、一種のワクチンを必要な種類だけ、例えば静岡株ワクチン、ペタルマ株ワクチン、ＴＭ２株ワクチンを調製し、これらを夫々等量ずつ混合することにより３価の多価ワクチンを調製することできる。
【００２３】
表１に本発明者らにより日本国内で分離され、外被膜遺伝子の塩基配列が決定された静岡株および公知となっている米国のペタルマ株、ディクソン株および唯一の全塩基配列が決定された日本国内分離株であるＴＭ２株、これら４種類の外被膜蛋白質のアミノ酸配列の相違度を示す。
【００２４】
表１より本発明におけるネコ免疫不全ウイルスの静岡株と公知のペタルマ株とは２０．３％、ＴＭ２株とは２０．０％、ディクソン株は２１．０％、また日本分離株と欧米分離株とでは全体として互いに約２０％近く異なっていることが明らかである。またこれ以外のデータでは、欧米株に類似したウイルスも数株分離されており、これらは輸入されたネコにより国内に持ち込まれたものと推定される。
【００２５】
【表１】
0003656073.tif 000002
【００２６】
これまでに日本国内で分離されて塩基配列が決定されたネコ免疫不全ウイルスとしては、槇らによるＴＭ１株、ＴＭ２株しかなく、これらは互いに極めて類似しているが、欧米タイプとは２０％以上異なっている（Ｒｉｇｂｙら，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７４巻、ｐ４２５、１９９３）。
【００２７】
このことから、欧米で分離された多数のネコ免疫不全ウイルスに関しては一つのグループを形成し、日本ではＴＭ２株タイプのネコ免疫不全ウイルスのみが流行しているのではないかと考えられていた。しかし、日本においてはＴＭ２株タイプだけではなく多様に変異したネコ免疫不全ウイルスが存在し、また欧米タイプのウイルス株も持ち込まれていることが明らかとなっている。
【００２８】
Ｙａｍａｍｏｔｏらはペタルマ株を用いた試作ワクチンの免疫により同一のペタルマ株や外被膜蛋白質のアミノ酸配列が１１％異なったディクソン株の感染を防御できたことを報告している（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７巻、ｐ６０１、１９９３）。本発明においては、例えばペタルマ株及び外ペタルマ株と外被膜蛋白質のアミノ酸配列が２０％異なる静岡株の試作ワクチンを作製し、これらのワクチンを用いてネコに夫々免疫しておき、攻撃ウイルスとして夫々にペタルマ株及び静岡株ウイルスを接種して防御効果を調べた。
【００２９】
防御効果の結果を表２に示した。ペタルマ株ワクチンで免疫されたネコはＹａｍａｍｏｔｏらの報告通り同じペタルマウイルスの感染を防御することはできたが、静岡株の感染は防御できないことが判った。
【００３０】
尚、本明細書および図面中において使用されているアミノ酸の略号は下記の意味を有する。
Ａ：アラニン
Ｃ：システイン
Ｄ：アスパラギン酸
Ｅ：グルタミン酸
Ｆ：フエニルアラニン
Ｇ：グリシン
Ｈ：ヒスチジン
Ｉ：イソロイシン
Ｋ：リジン
Ｌ：ロイシン
Ｍ：メチオニン
Ｎ：アスパラギン
Ｐ：プロリン
Ｑ：グルタミン
Ｒ：アルギニン
Ｓ：セリン
Ｔ：スレオニン
Ｖ：バリン
Ｗ：トリプトフアン
Ｙ：チロシン
【発明の効果】
【００３１】
本発明によりネコ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子ＲＮＡに対応する新規ＤＮＡ塩基配列が決定された。更に、同ＤＮＡを組み込んだベクターを用いて外被膜ペプチドを生産させ、これを用いてワクチンを製造することが可能となった。また、新規ネコ免疫不全ウイルス静岡株を培養により増殖させ、同株に対するワクチンが作製された。更にネコ免疫不全ウイルスＴＭ株、ペタルマ株のワクチンも作製され、これら３種のワクチンを混合することにより多価ワクチンが製造される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
実施例１
（１）外被膜遺伝子の増幅
ネコ免疫不全ウイルスの感染を受けたネコから採取された血液中のＴリンパ球を遠心分離で沈澱させて、細胞溶解用緩衝液（トリス塩酸（ｐＨ８．３）１０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2
２ｍＭ、ＮＰ４０  ０．４５％、ツイーン２０  ０．４５％、プロテネースＫ  ６０μｇ／ｍｌ）に分散して、５６℃で１時間インキュベートし、フェノール抽出、クロロフォルム抽出後、エタノールを加えて染色体ＤＮＡを沈澱させ、水５０μｌを加えてＰＣＲ用のＤＮＡ溶液とした。
【００３３】
ネコ免疫不全ウイルスペタルマ株の外被膜遺伝子は２５６５塩基長であることがすでに明らかになっている（Ｔａｌｂｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８６巻、ｐ５７４３、１９８９）。ＰＣＲを実施するに当たっては、これを境界部分を互いに重複するような３つの領域に分けて行った。
【００３４】
ＰＣＲに必要な化学合成されたＤＮＡプライマーは、ペタルマ株ウイルスにおける塩基番号では（１）５９０４〜５９２２（＋鎖）、６８５４〜６８７２（−鎖）、（２）６４９０〜６５１８（＋鎖）、７８４８〜７８６７（−鎖）、（３）７８０５〜７８２２（＋鎖）、８８２７〜８８４５（−鎖）であった。
【００３５】
これらプライマーＤＮＡの５’末端側にはいずれも適当な制限酵素の切断認識配列を含ませてＰＣＲの後で塩基配列決定用のベクターに容易に結合できるようにした。またそれらの塩基配列は以下の通りりである。
（１）ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴ  （＋鎖）
ＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣＡ    （−鎖）
（２）ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＧＡＡＧ
（＋鎖）
ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＣＡ
（−鎖）
（３）ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＴＴＧＴＡＣＡＴＴＴ            （＋鎖）
ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ      （−鎖）
【００３６】
ＰＣＲは５０μｌの反応溶液あたり、遺伝子ＤＮＡを５μｌ、２．７５ユニットのＴａｑポリメレース、各々２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ混合液を１μｌ、前記（１）〜（３）のプライマーのいずれかを＋鎖、−鎖それぞれ１μｌづつ加え、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分を１サイクルとして２７回繰り返して遺伝子断片を増幅させた。増幅された遺伝子断片は１％の低融点アガロースゲル電気泳動により精製した。
上記と同様の方法を用いて、ネコ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子を増幅し、精製した。
【００３７】
（２）外被膜遺伝子の塩基配列決定
上記（１）のようにして例えば、（２）のプライマーのペアを使用して増幅されたネコ免疫不全ウイルスの遺伝子ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法は次の通りである。０．５μｇの遺伝子断片を制限酵素のＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）で末端を切断しておき、同じ制限酵素で切断されたＭ１３ファージ２本鎖ＤＮＡ０．２μｇにＴ４ＤＮＡライゲース（宝酒造社製キット）で１４℃で２時間以上反応させて結合させ、カルシウムで処理した大腸菌ＪＭ１０９株にＤＮＡを感染させて、３７℃で一晩培養して外被膜遺伝子ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡとして含むファージプラックを得た。
【００３８】
このファージブラックを大腸菌ＪＭ１０９株菌液１ｍｌに感染させ、３７℃で６時間培養して増殖させた。大腸菌を１２０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で除去した上清に２５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、２．５Ｍ食塩水を１／１０量加えて２０℃で２０分間放置後、１５０００ｒｐｍ、５分の遠心分離でファージを沈澱させた。
【００３９】
ファージの沈澱を水に溶解させ、フェノール抽出後エタノールを加えて１本鎖ＤＮＡを回収した。また、ＴａｑポリメレースによるＤＮＡ誤合成を考慮して、ＰＣＲで増幅された同一遺伝子断片から得られた５個のファージ由来の１本鎖ＤＮＡを混合して塩基配列決定に用いた。
【００４０】
以降の塩基配列を決定する手段としては、アプライドバイオシステム社（ＡＢＩ）から市販されている塩基配列用のキットに記載された蛍光プライマー法に従った。この方法は塩基配列の決定に繁用されるＳａｎｇｅｒらによるジデオキシ法（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７４巻、ｐ５４６３、１９７７）を基本として、この方法で使用されるＭ１３プライマーをＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔを識別できるように蛍光標識させたものである。
【００４１】
標識されたＤＮＡを電気泳動にかけて塩基配列を決定する際にはＡＢＩの自動塩基配列決定機３７３Ａを使用して行った。
上記と同様の方法に従ってネコ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子の塩基配列が図１および図２に示すように決定された。
【００４２】
（３）ネコ免疫不全ウイルス不活化ワクチンの生産
静岡株ウイルスを持続的に増殖する感染細胞をＰＢＳ（０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水）で５×１０7 細胞／ｍｌとし、これに２．５％パラフォルムアルデヒドを等量加えて、４℃で２４時間振とうさせて、含まれているウイルスを固定不活化した。
【００４３】
これを３０００ｒｐｍ、１５分で細胞を沈澱させてパラフォルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳに再浮遊させて、この操作を３回繰り返してＰＢＳに５×１０7 ／ｍｌに浮遊させた。これにアジュバントとして５００μｇ／ｍｌのＡ−ＭＤＰ（ａｄｅｎｙｌ−ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｙｎｔｅｘ社製）（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、５巻、２２３、１９８７）を等量加えてワクチンを作製した。
実施例２
【００４４】
静岡株、ＴＭ株およびペタルマ株を含む多価ワクチンの作製
ネコ免疫不全ウイルス静岡株、ＴＭ２株およびペタルマ株単味のワクチンを個々に実施例１と同様にして作製した。これらを等量づつ混合して３価の多価ワクチンを調製した。また、別に３倍の濃度の単味ワクチンを作製して、これらを等量混合することで各株について単味の場合と同じ力価のワクチンを作製した。
実施例３
【００４５】
遺伝子組み替え法を用いたコンポーネントワクチンの作製
外被膜遺伝子の全部またはウイルスの感染に重要な働きを持つ領域を部分的に含む組み替え遺伝子発現用のベクターは既に公知となっている手法たとえばバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、酵母等を用いて容易に作製し得る。
【００４６】
本発明においては一例としてネコ免疫ウイルスの外被膜遺伝子を部分的に発現させることのできるカイコ−多角体病（バキュロ）ウイルス系（前田進、日本蚕糸学雑誌、５３巻、ｐ５４７、１９８４）における組み換えウイルスの作製法について記載する。
【００４７】
先ず、ネコ免疫不全ウイルス外被膜遺伝子を増幅するためのプライマーＤＮＡを合成する。この場合は外被膜蛋白質においてウイルスの感染に中心的な役割を果たす領域を発現させる。また、蛋白質を発現させることから、＋鎖プライマーは開始コドンＡＴＧ、−鎖プライマーは終了コドンのＴＡＧをアミノ酸の読み取り枠を合わせる配列で加え、発現ベクターに結合させるためにＢａｍＨＩ部分をも含ませる。これらの塩基配列および図１および図２における塩基番号を以下に示す。
【００４８】
＋鎖：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＣ        ＡＧＡ                                  （５５０〜５６９）
−鎖：ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＣＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＴ
（１８１７〜１８３６）
【００４９】
これらのプライマーを用いて、上記の実施例１（１）に記載した方法と全く同様にして外被膜遺伝子の断片（１２８７塩基長、４２９アミノ酸残基）を増幅した。これをＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）で切断し、図３に示すＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ、ＢａｍＨＩ部位に結合できる）で切断した多角体病ウイルスの発現ベクターｐＢＭ０５０にＴ４ＤＮＡライゲースで結合させ、カルシウムで処理した大腸菌ＪＭ１０５株に加えてクローニングを行った。
【００５０】
外被膜遺伝子断片を含むクローンＤＮＡ３μｇとカイコ多角体病ウイルスのゲノムＤＮＡ１５μｇ（モル比５０：１）とを混合して、リポフェクチンを２０μｇ／ｍｌに加えて、シャーレで培養したカイコの卵巣由来の細胞Ｂｍ−Ｎ４に共感染させて２７℃で培養してプラックを形成させた。
【００５１】
プラックを実体顕微鏡で観察すると、野性型ウイルスのプラックでは感染細胞の核内に多角体が観察されるのに対して、外被膜遺伝子を含むウイルスにより形成されたプラック
では核内から多角体が消失するので組み換え体ウイルスは容易に区別される。この組み換え体ウイルスを鈍化してＢｍ−Ｎ４細胞に感染させ外被膜蛋白質を得た。このものを用いて実施例１（３）記載の方法に従いコンポーネントワクチンを作製した。
試験例
【００５２】
ペタルマ株及びペタルマ株と外被膜蛋白質のアミノ酸配列が２０％異なる静岡株の試作ワクチンを実施例１（３）に記載した通りに作製した。これらのワクチンをネコに夫々３回接種することにより免疫しておき、攻撃ウイルスとして夫々にペタルマ株及び静岡株ウイルスを接種して防御効果を調べた。
【００５３】
また、対照としてはＰＢＳを投与した。表２のそれらの結果を示した。これによりペタルマ株ワクチンで免疫されたネコはＹａｍａｍｏｔｏらの報告通り同じペタルマウイルスの感染を防御することはできたが、静岡株の感染は防御できなかった。これに対して、静岡株で作製したワクチンを接種されたネコは両株のネコ免疫ウイルス感染を防御することができた。
【００５４】
【表２】
0003656073.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によりネコ免疫不全ウイルス静岡株の外被膜遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡ塩基配列が決定され、同ＤＮＡを組み込んだベクターを用いて外被膜ペプチドを生産させ、これを用いてワクチンを製造することができ、新たなネコ免疫不全ウイルスワクチンが得られる。また、新規ネコ免疫不全ウイルス静岡株を培養により増殖させ、同株に対するワクチンが作製でき、更にネコ免疫不全ウイルスＴＭ、ペタルマ株のワクチンも差製でき、これら３種のワクチンを混合することにより多価ワクチンが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ネコ免疫不全ウイルスの外被膜蛋白質遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列（１〜１５００）およびその配列から指定される外被膜蛋白質のアミノ酸配列を示すものである。
【図２】ネコ免疫不全ウイルスの外被膜蛋白質遺伝子ＲＮＡに対応するＤＮＡの塩基配列（１５０１〜２５７１）およびその配列から指定される外被膜蛋白質のアミノ酸配列を示すものである。
【図３】多角体病ウイルスの発現ベクターを示す地図である。
【図１】
0003656073.tif 000008
【図２】
0003656073.tif 000009
【図３】
0003656073.tif 000010
【配列表】
0003656073000001.xml