(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(-)-(S)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- カルボキシメチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸とウシ血清アルブミンとの結合物を抗原として用いることを特徴とする(-)-(S)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- メチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸を認識する抗体の産生方法。
【請求項２】
(-)-(S)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- カルボキシメチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸とウシ血清アルブミンとの結合物である抗原。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物の抗体およびその製造方法に関するものである。また本発明は、それらの抗体を利用したイムノアッセイ法、例えば、ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイ法、並びに抗原の製造に有用な中間体化合物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、フッ素含有ピリドンカルボン酸抗菌化合物の定量法としては、励起光を照射して生ずる蛍光を測定する方法（特開平5-203578号、Antimicrob. Agents Chemother. 33: pp.27-29, 1989年等を参照）、または高速液体クロマトグラフィによる方法（Antimicrob. Agents Chemother. 30: pp.325-327, 1986年; 及び特開昭64-13455号公報等を参照）が知られていた。
【０００３】
しかし、フッ素含有ピリドンカルボン酸抗菌化合物のイムノアッセイ法は未だ確立されておらず、抗体の産生法やイムノアッセイに用いる抗体についてもわずかな報告があるに過ぎなかった。レボフロキサシンの抗原性を調べる研究の一部として、レボフロキサシンとオバルブミンまたはモルモット血清アルブミンとの結合物を作製したとの報告があるが、抗原の製造方法の詳細は不明であり、開示された抗体もイムノアッセイのために使用できるものではなかった（Arzneim.-Forsch./Drug Res. 42(I), Nr. 3a 385-389, 1992年を参照) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する抗体およびその製造方法を提供することを目的としている。また、本発明の別の目的は、それらの抗体を利用したイムノアッセイ法、例えば、ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイ法を提供することにある。さらに本発明の目的は、上記の抗体の製造のために有用な抗原を提供することにある。
【０００５】
「ニューキノロン」と総称されるフッ素含有ピリドンカルボン酸抗菌化合物は強力な抗菌作用を有する化合物であり、各種感染症や化膿性疾患等の治療の目的で臨床的に使用されている。これらは、優れた臨床効果を挙げており、あるいは挙げることが期待されている。
フッ素含有ピリドンカルボン酸抗菌化合物の代表的化合物としては、例えば、レボフロキサシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ロメフロキサシン、(S)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(8- アミノ-6- アザスピロ[3.4] オクタン-6- イル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸 (DV-7751)、(-)-7-(7-(S)- アミノ-5- アザスピロ[2.4] ヘプタン-5- イル)-8-クロロ-6- フルオロ-1-[2-(S)-フルオロ-1-(R)- シクロプロピル]-4-オキソ-1,4- ジヒドロキノリン-7- カルボン酸 (DU-6859)、1-シクロプロピル-6- フルオロ-1,4- ジヒドロ-3- メトキシ-4- オキソ-7-(3-メチルピペラジニル)-3-キノリンカルボン酸 (AM-1155)、1-シクロプロピル-6- フルオロ-1,4- ジヒドロ-8- メトキシ-4- オキソ-7-(4-アミノメチルピペリジニル)-3-キノリンカルボン酸 (Q-35) 等を挙げることができる。
【０００６】
フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物の抗原性は極めて低く、これらの化合物自体を抗原として用いても、フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する抗体を効率良く製造することはできない。従って、フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する抗体を製造するための抗原としては、これらの化合物に蛋白を結合させたものを用いることが適当であると予想される。しかしながら、抗原性に影響を与える官能基、例えばピリジン骨格４位のケトン基や３位のカルボキシル基、あるいはフッ素原子等を損なわずに、フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物と蛋白とを結合させることが必要である。また、種々のフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物の測定に共通して使用可能な有用な抗体を産生する抗原が必要とされる場合もある。
【０００７】
本発明者は、レボフロキサシン[LVFX: (-)-(S)-9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-7-oxo-7H-pyrido[1,2,3-de][1,4]benzoxazine-6-carboxylic acid] の10位置換基である4-メチルピペラジンの4-メチル基を化学的に修飾し、この部位に血清アルブミンを結合させることによって上記の目的を達成できる優れた抗原を製造することに成功した。また、上記の抗原を用いることによりフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する有用な抗体を提供することができることを見いだし、該抗体を用いイムノアッセイ法によりフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を測定する方法を完成させた。本発明は上記の知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
従って本発明は、フッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物と蛋白との結合物である抗原、およびその凍結乾燥品を提供するものである。本発明の一態様によれば、オフロキサシンまたはレボフロキサシンの10位置換基である4-メチルピペラジニル基を4-カルボキシメチルピペラジニル基に変換した化合物を蛋白に結合させた抗原が提供される。また、これらの抗原を用いて動物を免疫することによりフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する抗体を産生する方法、および該方法により製造された抗体を提供するものである。さらに、これらの抗体を用いイムノアッセイ法によりフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を測定する方法を提供するものである。
【０００９】
本発明に従いフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する抗体を製造するために用いる抗原としては、オフロキサシンまたはレボフロキサシンの10位置換基である4-メチルピペラジニル基を4-カルボキシメチルピペラジニル基に変換した化合物（オフロキサシンの場合には、9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- カルボキシメチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸）をハプテンとして用い、このカルボキシルメチル基と蛋白等の担体とを結合させることにより製造された抗原を用いるのが適当である。担体として用いる蛋白は、一般に抗体産生に有用とされている種々の蛋白から適宜選択して使用すればよく、また、蛋白とハプテンとの結合はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、蛋白としてウシ血清アルブミンを用いることができ、蛋白とハプテンとの結合には、ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用した縮合反応や活性エステル法を利用することができるが、担体として用いる蛋白や蛋白とハプテンとの結合方法は上記の具体例に限定されることはない。
【００１０】
抗体の産生は、それ自体公知の方法で行うことができる。例えば、上記の抗原を適当なアジュバント、例えば、フロイントのアジュバントと混合してウサギ、ヤギ等の動物を免疫し、適宜追加免疫を行った後に血液を採取・分離して抗血清を得れば良い。また、モノクローナル抗体を製造するには、上記の免疫された動物から胸腺等の免疫細胞を分離し、当業者に周知の方法で適宜選択されたミエローマ細胞と細胞融合した後、融合細胞をクローニングすればよい。免疫すべき動物の種類、免疫スケジュール、担体蛋白、アジュバント等については種々の成書、例えば T.Chard  著、 北川、藤原、谷森訳「ラジオイムノアッセイ」（東京化学同人）を参考にすることができる。
【００１１】
一方、通常トレーサーと呼ばれる標識フッソ含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物は、放射性同位元素もしくは酵素で標識されたものを用いることができる。これらは、当業者に周知の種々の方法で製造し利用することができる。例えば、トリチウム標識したフッソ含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物、あるいはアルカリホスファターゼ (ALP)またはホースラディシュパーオキシダーゼ (HRP)等の酵素で標識したフッソ含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物をトレーサーとして用いることができる。これらは必要に応じて凍結乾燥品として保存でき、またキットの一部とすることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。
【００１２】
【実施例】
次の略号を使用する。
ＲＩＡ：ラジオ・イムノアッセイ
ＥＩＡ：エンザイム・イムノアッセイ
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＡＬＰ：アルカリフォスファターゼ(alkalinephosphatase)
ＣＤＩ：1,1 ´- カルボニルイミダゾール
ＨＯＳｕ：N-ヒドロキシスクシンイミド
ＰＢ  ：リン酸緩衝液
ＰＢＳ：0.01 Mリン酸緩衝生理食塩液(pH 7.4)
コーテイング緩衝液：0.1M炭酸緩衝液(pH 9.5)
洗浄緩衝液-1：0.05% Tween 20を含む50mMトリス塩酸緩衝液 (pH 7.4)
洗浄緩衝液-2：0.1% Tween 20 を含むブロックエース（大日本製薬製）10倍液
ＥＩＡ緩衝液：0.5 % ＢＳＡを含む50mMトリス塩酸緩衝液 (pH 7.4)
【００１３】
実施例１：免疫抗原の調製
1.1  (-)-(S)-9,10-ジフルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-7- オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸  BF2-キレート 40.0 g およびジメチルアセトアミド 200 ml に無水ピペラジン 12.0 g を攪拌下加え、内温20〜25℃で３時間反応させた。次いでトリエチルアミン 16 mlを氷冷攪拌下加え、さらにブロム酢酸エチル 24.0 g を滴下した。終了後20〜25℃で１時間反応させ、溶媒を減圧留去した。残渣を含水メタノール 1400 mlに溶解させ、トリエチルアミン 40 mlを加えて攪拌下３時間還流反応させた。溶媒を減圧留去し、残渣に水 1200 mlを加えクロロホルム 1200 mlで５回抽出した。クロロホルム層を合して濾過し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後溶媒を減圧留去して粗晶を得た。
【００１４】
上記の粗晶をシリカゲルカラムクロマトに付し、クロロホルム−メタノール (95:5) で溶出させ、濃縮残渣をエタノールから結晶化させて融点 188〜191 ℃の淡黄白色結晶状の (-)-(S)-9- フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- エトキシカルボニルメチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸 12.65 gを得た。融点 188〜191 ℃
上記の (4-エトキシカルボニルメチル-1- ピペラジニル) 体 23.9 g に濃塩酸 205 ml を加え、100 ℃の浴上で３時間攪拌して反応させた。室温に戻して濾過し、減圧で約 80 g まで濃縮し、これに水 410mlを加えて析出晶を濾取した。得られた結晶を水、80% エタノール、エタノール、エーテルの順に洗浄して乾燥し、淡黄色微粉末の(-)-(S)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- カルボキシメチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸塩酸塩 (DT-5334・HCl) 22.3 g を得た。融点 250〜252 ℃（分解）。化合物の構造は、元素分析およびＮＭＲによって確認した。
【００１５】
1.2 水溶性カルボジイミド法による合成
DT-5334・HCl 124 mgをＤＭＦ 5mlに溶解し、ＢＳＡ 500 mg の水- ＤＭＦ(1:1) 溶液 50 mlに氷冷下滴下した。４℃で３時間撹枠後、5 % 炭酸水素ナトリウム水溶液を滴下して析出物を溶解させた後、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩 5.39 g を加えて４℃で一夜攪拌下反応させた。反応後、蒸留水に対して透析したのち、凍結乾燥して DT-5334 -ＢＳＡ結合物（ロット１）を得た。
【００１６】
1.3 活性イミドエステル法による合成
DT-5334・HCl 441 mgをＤＭＦ 5 ml に溶解し、氷冷下ＣＤＩ 178 mg を加えて４℃で一夜攪拌下反応させた。反応後ＨＯＳｕ 126.5 mg を加え４℃で４時間攪拌下反応させた。この反応液をＢＳＡ 650 mg の水−ＤＭＦ(1:1) 溶液 100 ml に約１時間かけて氷冷下滴下したのち、４℃で一夜攪拌下反応させた。反応後、析出物を遠心分離 (1800×g, 4℃, 15分) し、上清を蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し DT-5334 -ＢＳＡ結合物（ロット２）を得た。
【００１７】
1.4  DT-5334 -ＢＳＡ結合物の薬物結合モル数
調製したDT-5334 - ＢＳＡ結合物についてアミノ酸分析法により薬物結合モル数を算出した。蛋白質ＢＳＡ 1モルに対する薬物の結合モル数はロット１およびロット２について、それぞれ 13.2 モルおよび 36.5 モルであった。なお、結合数の算出における対照アミノ酸としてグリシンおよびアラニンを使用し、その平均値を結合数とした。
【００１８】
実施例２：抗血清の作製
免疫抗原 1 mg あたり生理食塩水 0.5 ml およびフロイントのコンプリートアジュバント 0.5 ml を加えてホモジナイザーでエマルジョンとした。このエマルジョンを用いてウサギ（日本白色種、雌性、体重 2.5 kg 〜3 kg) 20匹を免疫した。免疫抗原は１回から６回目までロット１を、７回目以降ロット２を用い、抗原量は７回目まで１匹あたり 1 mg （結合物換算) 、８回目以降について 0.5 mg とした。免疫の間隔はおおむね２週間とし、腹部皮内（１〜２回目40個所）、臀部皮内（３回目40個所）、背部皮内（４〜５回目、40個所）および背部皮下（６〜13回目、 4個所）に投与した。途中で抗体の産生を確認したのち13回免疫の10日目に頚動脈より全採血した。採血した血液を遠心分離 (1600×g, 4℃、30分）し、得られた血清を -80℃で保存した。
【００１９】
実施例３：トリチウム標識抗原の製造
デスメチルレボフロキサシン [(-)-(S)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸] 3.5 mgをＤＭＦ 1 ml に溶解し、炭酸カリウム 11 mgを加えた。この溶液に、3H- ヨウ化メチル 1.85 GBq.のトルエン溶液を真空移動により加えて 37 ℃で一夜攪拌した。反応後、溶媒を減圧下留去し、残渣をＨＰＬＣ（ODS, eluent: 1% TEAOAc (pH 4)/CH3CN (85:15))で精製し、トリチウム標識レボフロキサシン (LVFX) 1.22 GBq. を得た。この化合物は標準品レボフロキサシンと比較したクロマトグラフィー(TLC) により同定された。比放射能は 2456.8 GBq (66.4 Ci)/mmolであった。
【００２０】
実施例４：ＲＩＡ系の確立
4.1 抗体価の測定
アッセイチューブに 0.5 %ＢＳＡを含むＰＢＳ 0.5 ml および 0.5 %ＢＳＡを含むＰＢＳ 0.1 ml で順次希釈した抗血清 0.1 ml およびトリチウム標識レボフロキサシン (3H-LVFX 、以下トレーサーと略す。約 1×104 dpm/tube) 0.1 mlを加え４℃で一夜インキュベートした。次にデキストラン炭末液（ＰＢＳ 100mlにデキストラン T-70 (Pharmacia) 100 mgを溶解後、活性炭 1 gを加えたもの) 1 mlを加え、４℃で30分インキュベートしたのち遠心分離 (1600×g, 4℃、15分）し、上清をバイアルにデカントしてシンチレーター (Atomlight:Du pont/NEN Research Product) 10mlを加えたのち、液体シンチレーションカウンター (Packard, 2500 型）で結合型の放射能 (Bo) を測定した。また、非特異的結合量 (N)を求めるために、抗血清の代わりに同一希釈率の正常ウサギ血清（ＮＲＳと略す）を用いて同様の操作を行なった。
【００２１】
抗血清の希釈率と、抗血清とトレーサーの特異的結合率（(Bo-N)/T、 T ：総放射能量）との関係を求めた。すべての動物について抗体の産生が認められ、中でも抗血清 R-3には、抗血清希釈率 20,000 倍において特異的結合率 40.01% と高い抗体価が認められた。好ましい抗血清として、希釈率 2,000倍における結合率が40% 以上の７種類の抗血清を選択し、結合率が40% 前後を示す希釈率を各抗血清の至適希釈率として設定した。
さらに上記のＲＩＡ系を用いて、各種のフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を測定する場合の測定感度を求めた。それぞれのフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物について上記の方法に準じて標準曲線を作成した。標準曲線の特性は、95% 信頼限界, IC90, およびIC50 (それぞれ、抗血清とトレーサーの結合を 90%又は50% 阻害するのに必要な化合物濃度）で示す（表１）。
【００２２】
【表１】
0003712133.tif 000002
1) DV-7751・1/2 H2O
2) DU-6859・3/2 H2O
3)(+)-(R)-9-フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(4- メチル-1- ピペラジニル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸
【００２３】
実施例５：エンザイム・イムノアッセイ
5.1 酵素標識抗原の調製
5.1.1  DT-5334−ＡＬＰ標識抗原
免疫抗原の調製に準じて、DT-5334 を用いてＡＬＰとの標識抗原を作製した。DT-5334・HCl 4.4 mgをＤＭＦ 0.5 ml に溶解し、氷冷下ＣＤＩ 17.8 mgを加えて４℃で一夜攪拌下反応させた。反応後、ＨＯＳｕ 12.7 mgを加え４℃で４時間攪拌下反応させた。この反応液をＡＬＰ 65 mgの水：ＤＭＦ (1:1) 10 ml溶液に約１時間かけて氷冷下滴下したのち、４℃で一夜攪拌下反応させた。反応後、析出物を遠心分離 (1800×g, 4℃, 15分) し、上清を蒸留水に対して透折したのち凍結乾燥して DT-5334−ＡＬＰ標識抗原を得た。
【００２４】
5.1.2 DV-7751a―ＡＬＰ標識抗原
グルタルアルデヒド法（一段法）により DV-7751a [(S)-9- フルオロ-2,3- ジヒドロ-3- メチル-10-(8- アミノ-6- アザスピロ[3.4] オクタン-6- イル)-7-オキソ-7H-ピリド[1,2,3-de][1,4] ベンゾキサジン-6- カルボン酸] を用いてＡＬＰとの標識抗原を作製した。DV-7751a 5 mg を 0.1 M PB (pH 6.8) 2 ml に加え、 0.1 M PB (pH 6.8) 0.2 ml に溶解したＡＬＰを加えた。さらに 1% グルタルデヒド 50 μl を加えて室温で２時間攪拌下反応させた。反応後蒸留水に対し透析したのち凍結乾燥してDV-7751a―ＡＬＰ標識抗原を得た。
【００２５】
5.2 標準曲線の作成
レボフロキサシンに対する標準曲線を作成し、DT-5334 −ＡＬＰ標識抗原および DV-7751a-ＡＬＰ標識抗原を用い、二種類の酵素標識抗原の性能を比較した。マイクロタイタープレートにコーテイング緩衝液で 20 μg/mlに調整したヤギ抗ウサギ IgGを 100μl 加え、４℃で一夜インキュベートしてプレートに固相した。プレートを洗浄緩衝液-1を用いて３回洗浄 (300 μl/ウェル）した。次に 1% ＢＳＡを含むＰＢＳを各ウェルに 300μl 加えてブロッキングした後、プレートを洗浄緩衝液-1で洗浄した。
【００２６】
その後、ＥＩＡ緩衝液で希釈した抗血清を加えて37℃で１時間インキュベートし、プレートを洗浄緩衝液-1で３回洗浄した。さらに、各ウェルにＥＩＡ緩衝液で希釈した酵素標識抗原50μl およびＥＩＡ緩衝液で系列希釈したＬＶＦＸ標隼溶液50μl を加えて 37 ℃で１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄緩衝液-1で３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質溶液（ジエタノールアミン緩衝液を蒸留水で５倍に希釈した後、p-ニトロフェニル・ホスフェートを加えたもの：以下基質と略す）100 μl を加え、DT-5334 −ＡＬＰ標識抗原については室温で２時間、DV-7751a一ＡＬＰ標識抗原については室温で30分インキュベートした後、1.6 M NaOH 25 μl を加えて反応を停止し、405 nmにおける吸光度を測定した。
２種類の標識抗原とも用量反応(dose responce) を示したが、特にDV-7751a―ＡＬＰ標識抗原は濃度範囲が3 ng/ml から10ng/ml であり、抗原として適当であることが確認された。
【００２７】
5.3 酵素標識抗原の調製法の検討
（一般法）
ＡＬＰ 1 mg を 1M ＰＢ (pH 6.8) 1 mlに溶解し、ＡＬＰ 1モルに対しそれぞれ 5倍、10倍、20倍および50倍モルの DV-7751a を加え、さらに1%グルタルアルデヒド50μl を加え室温で３時間反応させた。反応終了後、1M DL-リジン 100μl を加えて室温で１時間反応し、さらに蒸留水に対して透析した。透析後の凍結乾燥物を蒸留水 1mlに再溶解して４種類のDV-7751a―ＡＬＰ標識抗原を得た。
【００２８】
（二段法）
ＡＬＰ 1 mg を 1M ＰＢ (pH 6.8) 1 mlに溶解し、 1% グルタルアルデヒド 50 μl を加え室温で 16 時間反応させたのち蒸留水に対して透析した。透析後の凍結乾燥物を 1M ＰＢ (pH 6.8) 1 mlに再度溶解し、ＡＬＰ 1モルに対しそれぞれ 10 倍、20倍、50倍および 100倍モルの DV-7751a を加え、4 ℃で 16 時間反応させた後、蒸留水に対して透析した。透析後の凍結乾燥物を蒸留水 1mlに再溶解して４種類の DV-7751a ―ＡＬＰ標識抗原を得た。
【００２９】
5.4 調製法による酵素標識抗原の活性比較
マイクロタイタープレートに、コーティング緩衝液で 20 μg/mlに調製したヤギ抗ウサギIgG を 100μl 加え、室温で２時間インキュベートしてプレートに固相担体とした後、プレートを洗浄緩衝液-1で洗浄した。次に 1% ＢＳＡを含む 50 mMトリス塩酸緩衝液 (pH 7.4) 300 μl を各ウェルに加えて室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液-1で洗浄した。次にＥＩＡ緩衝液で系列希釈した抗ＬＶＦＸ血清を加えて室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液-1で３回洗浄した。さらに各ウェルにＥＩＡ緩衝液で50倍希釈した酵素標識抗原50μl およびＥＩＡ緩衝液50μl を加え、室温で２時間インキュベートした。その後プレートを洗浄緩衝液-1で３回洗浄し、基質を 100μl 加えて室温で30分間インキュベートした後、 1.6M 水酸化ナトリウム溶液 25 μl を加えて反応を停止し、 405 nm における吸光度を測定した。
【００３０】
一段法における吸光度はモル比20倍、抗血清希釈率 100倍において 2.338と最大を示し、二段法においてもモル比20倍、抗血清希釈率 100倍において0.878 と最大を示した。両法を比較すると、二段法に比べて一段法における吸光度が高値を示した。この結果によれば、DV-7751a―ＡＬＰ標識抗原の反応条件を一段法で実施し、ＡＬＰに対する薬物のモル比を20倍とすることが好適である。
以上の実施例を参考にすれば、当業者は本発明の抗体を用いて容易にラジオ・イムノアッセイまたエンザイム・イムノアッセイを行うことができ、種々のフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物の濃度を測定することができる。参考のため、以下に標準的な操作条件を示すが、本発明の測定方法はこれらの条件に限定されることはない。
【００３１】
0003712133.tif 000003
【００３２】
0003712133.tif 000004
【００３３】
0003712133.tif 000005
【００３４】
【発明の効果】
本発明により提供される抗体はフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物を認識する有用な抗体であり、該抗体を用いたイムノアッセイ法により、各種の試料、例えば生体試料中のフッ素含有ピリドンカルボン酸類抗菌化合物の濃度を高感度で測定することができるので有用である。