(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載したアミノ酸配列を有し、かつエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。  
【請求項２】
配列表の配列番号：２又は配列番号：４に記載したＤＮＡ配列を含有する、請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載したアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、もしくは置換されており、かつ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２記載のＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドが、ロドコッカス由来のものである、請求項１〜３いずれか記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載の組換えＤＮＡを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターで形質転換されてなる細胞。
【請求項９】
請求項８記載の細胞を培養し、該培養物からエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドの製造方法。  
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖脂質の構造や機能の解析等の糖鎖工学に有用なエンドグリコセラミダーゼを活性化する機能、すなわちエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。本発明は、また、該ＤＮＡを組込んだ組換えプラスミドを導入させた組換体を用いるエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドの工業的な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エンドグリコセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．１２３）はスフィンゴ糖脂質の糖鎖とセラミドの間のグリコシド結合を加水分解し完全な形の糖鎖とセラミドを遊離する酵素である。エンドグリコセラミダーゼは放線菌ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓより最初に発見された［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６１巻、第１４２７８〜１４２８２頁（１９８６）］。さらにこの放線菌ロドコッカスは基質特異性の異なる３種のエンドグリコセラミダーゼ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）を生産することが明らかとなっている［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６４巻、第１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）］。その後、ヒル由来のエンドグリコセラミダーゼ［バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１４１巻、第３４６〜３５２頁（１９８６）］等が知られている。これらの酵素は各種界面活性剤の存在下では糖脂質をよく分解することができるが、界面活性剤非存在下では分解が非常に遅い事が知られている。
【０００３】
一方、エンドグリコセラミダーゼを生産する放線菌ロドコッカスはエンドグリコセラミダーゼと同時にエンドグリコセラミダーゼを界面活性剤非存在下でも糖脂質を分解できるように分子種特異的に活性化するタンパク質性の２種のアクチベーターＩ及びアクチベーターＩＩを生産する。アクチベーターＩはエンドグリコセラミダーゼＩを活性化し、アクチベーターＩＩはエンドグリコセラミダーゼＩも活性化するがエンドグリコセラミダーゼＩに比較してエンドグリコセラミダーゼＩＩをより強く活性化し、さらにヒル由来のエンドグリコセラミダーゼ（セラミドグリカナーゼ）を活性化できることが示されている［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６６巻、第１２号、第７９１９〜７９２６頁（１９９１）］。
【０００４】
またアクチベーターＩＩは、分子量６９．２ｋＤａであるがトリプシン消化による徹底消化によって２７．９ｋＤａにまで分解され、その状態でも活性は完全に保持されていることが示されている［ザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１１０巻、第３２８〜３３２頁（１９９１）］。またアクチベーターＩＩ存在下では、エンドグリコセラミダーゼＩＩの至適ｐＨが中性側に移動しｐＨ７．５においても糖脂質を分解できるようになる。これらの事実は、アクチベーターＩＩの使用によってエンドグリコセラミダーゼＩＩをアクチベーターＩＩ非存在下では不可能であった生理的条件下（中性付近のｐＨ、界面活性剤非存在下）で生細胞に作用させる事が可能となることを示す。すなわち、アクチベーターＩＩを用いればエンドグリコセラミダーゼＩＩを用いて細胞内における糖脂質の機能を解析することが可能になる事が明らかにされている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし生細胞にエンドグリコセラミダーゼＩＩを作用させるには、多量の高純度のエンドグリコセラミダーゼＩＩとエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩが必要である。エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを生産菌ロドコッカスより製造するには培養に時間がかかり、また精製にも多くの段階を要し、多量の高純度のアクチベーターＩＩを得ることは非常に困難である。従ってより安価に高純度な酵素を製造する方法が求められている。
また、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのアミノ酸配列や遺伝子構造は不明であるため、遺伝子工学的にエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを製造することは困難である。
従って、本発明の第１の目的は、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。本発明の第２の目的は、これらのＤＮＡを組込んだ組換体を利用して、遺伝子工学的に高純度のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターを製造する方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、該製造方法により得られるポリペプチドを提供することにある。本発明の第４の目的は、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを提供することにある。本発明の第５の目的は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の状況に鑑み、本発明者らはエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを単離し、その塩基配列の解明するために鋭意研究を進めた結果、遂にエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するペプチドをコードするＤＮＡを単離することに成功し、その活性に関わる遺伝子構造の塩基配列を明らかにすることに成功した。さらにこのＤＮＡをプラスミドベクターに組込んで微生物で発現させることにも成功した。本発明はかかる事実に基づき、さらに研究を進めて完成するに至ったものである。
【０００７】
即ち、本発明の要旨は、
（１）  エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する単離されたＤＮＡ、
（２）  配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載したアミノ酸配列、又はその一部であって、かつ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する前記（１）記載のＤＮＡ、
（３）  配列表の配列番号：２又は配列番号：４に記載したＤＮＡ配列、又はその一部であって、かつ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する前記（１）又は（２）記載のＤＮＡ、
（４）  配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載したアミノ酸配列、又はその一部からなるアミノ酸配列において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、もしくは置換の少なくとも１つがなされており、かつ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（５）  前記（２）〜（４）いずれか記載のＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（６）  エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドが、ロドコッカス由来のものである、前記（１）〜（４）いずれか記載のＤＮＡ、
（７）  前記（１）〜（６）いずれか記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
（８）  前記（７）記載の組換えＤＮＡを含有するベクター、
（９）  前記（８）記載のベクターで形質転換されてなる細胞、
（１０）  前記（９）記載の細胞を培養し、該培養物からエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチドの製造方法、
（１１）  前記（１０）記載の方法により製造され得る、前記（１）〜（６）いずれか記載のＤＮＡによりコードされる、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又はその機能的に同等の活性を有するポリペプチド、
（１２）  前記（１）〜（６）いずれか記載のＤＮＡに特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、
（１３）  前記（１１）記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片、に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターとは界面活性剤非存在下でエンドグリコセラミダーゼを活性化するタンパク質を示す。
本明細書において、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性は以下のようにして測定することができる。
【０００９】
活性測定は、組換体大腸菌の細胞抽出液を用いて、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６６巻、第１２号、第７９１９〜７９２６頁（１９９１）に記載の方法で行うことができる。具体的には、４０ｎｍｏｌアシアロ−ＧＭ１、５μｇ牛血清アルブミン、０．３ミリユニットの精製エンドグリコセラミダーゼおよび適当量の粗抽出液（エンドグリコセラミダーゼアクチベータータンパク質）を０．８５％ＮａＣｌで等張化された２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４０μｌ中に含む標準試験混合液を調製する。次に、ザ
ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６４巻、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）に記載の方法に従って酵素活性を測定する。３７℃で６０分間インキュベートした後、カーボネート−シアナイド溶液（ｐＨ１１）を２５０μｌ添加して反応を止め、還元力をパーク（Ｐａｒｋ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）の方法［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第１８１巻、第１４９〜１５１頁（１９４９）］で評価する。対照実験としては、基質と粗抽出液（エンドグリコセラミダーゼアクチベータータンパク質）、または基質とエンドグリコセラミダーゼを別々にインキュベートする。両対照実験値の和を上記実験値から差し引く。エンドグリコセラミダーゼアクチベータータンパク質の１ユニットは、上記標準試験条件下で毎分１μｍｏｌのアシアロ−ＧＭ１の加水分解を増大させるエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩタンパク質の量と定義する。
【００１０】
本明細書において、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドとは、天然型のアミノ酸配列を有するエンドグリコセラミダーゼアクチベーターのみならず、前記のような方法によりエンドグリコセラミダーゼアクチベーターにより、エンドグリコセラミダーゼの活性化が認められる限り天然型のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味である。また、ここで言う天然型のアミノ酸配列を有するエンドグリコセラミダーゼアクチベーターとしては、例えばロドコッカス由来のものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものでなく、その他の放線菌類はもちろん、細菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物、昆虫等の生物体由来ものも含まれる。
【００１１】
本明細書において、機能的に同等の活性を有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。
天然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の多形や変異のほかに、生成後のタンパク質の生体内及び精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があっても、その機能については大きな違いが認められないものを機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。
【００１２】
人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合は更に多種多様の変異体を作製することが可能であるが、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有するポリペプチドと解釈される。例えば、大腸菌で発現されたタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパク質の種類によってはメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無はタンパク質の活性に影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、第１４３１頁（１９８４）］。
【００１３】
更に、遺伝子工学的にタンパク質の生産を行う際には、融合タンパク質として発現させることがしばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量を増加させる為に、目的のタンパク質のＮ末端に他のタンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的のタンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより、目的のタンパク質の精製を容易にすることなどが行われている。
【００１４】
また、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組合せ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、アミノ酸配列をコードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数存在することができる。遺伝子は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
【００１５】
更に、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが、使用している宿主中では使用頻度の低いものであった場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発現を図ることが行われている。このように特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製することが可能なことは言うまでもない。したがって、これらの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドであっても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされている限り、本発明に包含されるものである。
更に、目的のタンパク質のアミノ酸配列に１個若しくは複数個のアミノ酸残基を欠失、付加、挿入、若しくは置換の少なくとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、このようなポリペプチドをコードする遺伝子も、天然由来の単離されたものであれ人為的に作製されたものであれ、本発明に包含される。
【００１６】
一般に、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードするＤＮＡが相同性を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝子とハイブリダイズすることができ、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００１７】
以下に本発明のＤＮＡの単離およびその配列決定についてエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを例にして本発明を詳細に説明する。
まず、精製されたエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの部分アミノ酸配列に関する情報を得る。即ち、例えばザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー、第１１０巻、第３２８〜３３２頁（１９９１）に記載の方法で精製したエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを直接常法に従ってエドマン分解法［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２５６巻、第７９９０〜７９９７頁（１９８１）］に付しアミノ酸配列の分析を行う。また該アクチベーターに特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行い内部部分アミノ酸配列を決定してもよい。
【００１８】
これら部分アミノ酸配列の情報を基にエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子をクローニングするには、一般的にＰＣＲ法あるいはハイブリダイゼーション法を用いることができる。
【００１９】
次に、部分アミノ酸配列の情報をもとにサザンハイブリダイゼーション用のプローブとして、合成オリゴヌクレオチドをデザインする。ロドコッカス  ｓｐ．Ｍ−７７７のゲノムＤＮＡをＭｌｕＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ等の制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動［モレキュラー  クローニング
ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｔ．マニアティス（Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ）他著、第６章、第３〜２０頁、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行）で分離後、常法に従いナイロン膜にブロッティングする（モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第９章、第３４頁、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社、１９８９年発行）。
【００２０】
ハイブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行うことが出来る。例えば６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、８．７７ｇＮａＣｌ、及び４．４１ｇクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解したもの）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５℃でナイロン膜をブロッキングし、３２Ｐでラベルした各合成オリゴヌクレオチドを加えて６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、５５℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。検出されたバンドに相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出・精製した後通常用いられる方法によってプラスミドベクターに組み込むことができる。プラスミドベクターとしては例えば市販のｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ（全て宝酒造社製）などが挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。
【００２１】
次いで組換えプラスミドを宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換するが、宿主細胞としては、大腸菌等の細菌や放線菌等の原核細胞、酵母や動物、植物由来の真核細胞のいずれも使用することができる。
宿主細胞として大腸菌を使用する場合、大腸菌としては形質転換能を有し遺伝子の発現能に欠陥のないものであれば野生株、変異株何れも使用できる。導入の方法は通常用いられる方法、例えばモレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社、１９８９年発行、に記載の方法を用いることができる。
【００２２】
このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入した後、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１９の場合、アンピシリン耐性を有するコロニー、あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しかつ白色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導入されたコロニーを選別することができる。次に上記集団のなかから目的のＤＮＡ断片を含むベクターを有するコロニーを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコロニーハイブリダイゼーション（モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第１章、第９０〜１０４頁、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社、１９８９年発行）、プラークハイブリダイゼーション（モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第２章、第１０８〜１１７頁、コールド  スプリング  ハーバーラボラトリー社、１９８９年発行）を適宜用いればよい。また、ＰＣＲ法（モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第１４章、第１５〜１９頁、コールド  スプリング  ハーバー
ラボラトリー社、１９８９年発行）を用いることもできる。
【００２３】
目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選別できればこのベクターに挿入されている目的のＤＮＡ断片の塩基配列を通常の方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター法（モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、第１３章、第３〜１０頁、コールド  スプリングハーバー  ラボラトリー社、１９８９年発行）により決定する。決定された塩基配列を、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの部分アミノ酸配列、分子量などと比較することによって目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の構造及びエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの全アミノ酸配列を知ることができる。目的のＤＮＡ断片がエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の全長を含まない場合は、得られたＤＮＡ断片の一部をプローブとして用い、ロドコッカスｓｐ．Ｍ−７７７のゲノムＤＮＡを他の制限酵素で消化したものから同様にしてハイブリダイゼーション法等によって欠損している部分を得た後、つなぎ合わせ目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の全長を得ることができる。
【００２４】
得られたエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の全部または一部を適当なプラスミドベクターに挿入し、これで宿主細胞を形質転換する。次いで該形質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ活性を持つポリペプチドを生産させる。
例えば、宿主細胞として大腸菌を用い、プラスミドベクターとしてｐＥＴ２３ｂ［ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製］を用いた場合は、該形質転換体を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｌ培地（トリプトン０．１％、酵母エキス０．０５％、ＮａＣｌ０．１％、ｐＨ７．２）に、３７℃で一晩培養し、６００ｎｍにおける吸光度が約０．５程度になったときにＩＰＴＧを加えてさらに３７℃で一晩振盪培養を続ける。培養終了後、菌体を回収し超音波処理等により菌体を破砕し、遠心上清を得る。ついで下記のように通常のタンパク質精製法を用いて高純度のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを製造する。場合によっては該ポリペプチドを封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形で生産させることもできる。
【００２５】
発現の確認は例えばエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの活性を測定することにより行うことができる。活性測定は、例えば組換体が大腸菌の場合、細胞抽出液を用いて、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６６巻、第１２号、第７９１９〜７９２６頁（１９９１）に記載の方法で行うことができる。即ちエンドグリコセラミダーゼＩＩはその活性発現にトリトンＸ−１００のような界面活性剤を要求するので、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ活性は、粗抽出液の添加による界面活性剤の非存在下におけるエンドグリコセラミダーゼＩＩの活性の増大量を測定することにより評価することができる。
【００２６】
具体的には、４０ｎｍｏｌアシアロ−ＧＭ１（ヤトロン社製）、５μｇ牛血清アルブミン、０．３ミリユニットの精製エンドグリコセラミダーゼＩＩおよび適当量の粗抽出液（エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩタンパク質）を０．８５％ＮａＣｌで等張化された２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）４０μｌ中に含む標準試験混合液を調製する。ついで、ザ  ジャーナル  オブバイオロジカル  ケミストリー、第２６４巻、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）に記載の方法に従って酵素活性を測定する。３７℃で６０分間インキュベートした後、カーボネート−シアナイド溶液（ｐＨ１１）を２５０μｌ添加して反応を止め、還元力をパークとジョンソンの方法［ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第１８１巻、第１４９〜１５１頁（１９４９）］で評価する。対照実験としては、基質と粗抽出液（エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩタンパク質）、または基質とエンドグリコセラミダーゼを別々にインキュベートする。両対照実験値の和を上記実験値から差し引く。エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩタンパク質の１ユニットは、上記標準試験条件下で毎分１μｍｏｌのアシアロ−ＧＭ１の加水分解を増大させるエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩタンパク質の量と定義する。
【００２７】
また精製エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩをラットに免疫して得た抗血清を用いて免疫学的に発現を確認することもできる。
目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの発現が認められた場合はその発現の最適条件を検討する。
【００２８】
組換体の培養物からエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを精製するには通常のタンパク質精製法が利用できる。培養終了後遠心分離によって組換体を集め、これを超音波処理などによって破砕して、遠心分離等によって、細胞抽出液を得る。これを、塩析や、イオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィー等により精製することができる。用いる宿主−ベクター系によっては発現産物が組換体外に分泌される場合があるが、この場合は培地中から同様に精製を行えばよい。また、例えば宿主細胞が大腸菌の場合、発現産物が不溶性の封入体として形成される場合がある。この場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕して、遠心分離を行うことにより精製封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いられるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した後、透析法あるいは希釈法などを用いたリフォールディング操作を行うことによって活性を保持した目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ標品を得ることができる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ標品を得ることができる。
【００２９】
本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターをコードする遺伝子を利用し他の細胞由来の遺伝子またはｃＤＮＡから目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をハイブリダイゼーション法により得ることができる。その方法としては、例えば以下の方法が適用できる。
【００３０】
まず目的の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素により作製したｃＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ３２Ｐ等で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号：１あるいは配列番号：３に記載したアミノ酸配列、またはその一部をコードする遺伝子であればよく、例えば、配列表の配列番号：２あるいは配列番号：４に記載した遺伝子、またはその一部を使用することができる。）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリット形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には、目的のタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている。
【００３１】
得られた遺伝子は、例えば次のように塩基配列を決定し、得られた遺伝子が目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかを確認する。
塩基配列の決定は、ハイブリダイゼーションにより得られたクローンの場合、組換体が大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断片を取り出し、Ｍ１３ファージベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組換体がファージの場合も基本的に同様のステップにより塩基配列を決定することが出来る。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル［第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー社、１９８９年発行］等に記載されている。
【００３２】
得られた遺伝子が目的のエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーター遺伝子、例えば、配列表の配列番号：１又は配列番号：３に記載したアミノ酸配列と比較してその遺伝子構造及びアミノ酸配列を知ることができる。
【００３３】
得られた遺伝子がエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする領域の全てを含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーター遺伝子にハイブリダイズするエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドの全コード領域の塩基配列を決定することができる。
【００３４】
エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性又は機能的に同等の活性を持つポリペプチドを遺伝子工学的に得るには、まず得られたエンドグリコセラミダーゼアクチベーター遺伝子又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を適当な宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターに常法に従い接続して、それを宿主細胞に導入し組換体を作製する。この組換体を培養することにより、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を持つポリペプチドを生産させることが出来る。また、宿主として糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば大腸菌、枯草菌の様な原核生物、あるいは酵母、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能力を失った変異細胞を用いることによって糖鎖を持たないエンドグリコセラミダーゼアクチベーターポリペプチドを発現させることができる。
【００３５】
用いる発現系によっては、得られたエンドグリコセラミダーゼアクチベーター遺伝子又は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の一部が、細胞分泌用のシグナルペプチドをコードし、目的のポリペプチドが組換体外に分泌され、培養液中に蓄積される場合がある。この場合は、この培養液より回収することができる。また、組換体中に蓄積されている場合は、培養菌体を破砕する事で回収することができる。更に、組換体中で発現されたポリペプチドが不溶物（封入体）として蓄積される場合は、この不溶物を回収し、穏和な条件、例えば尿素などで可溶化した後に、変性剤を除くことによって活性を回復させることができる。発現は、上記のようにして、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を測定することにより確認できる。
【００３６】
組換体からのエンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドを精製するには、通常のクロマトグラフィーの手法を用いることができる。例えば、組換体外に分泌されている場合は、培養液の上清を、疎水、イオン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィーによって発現した目的のポリペプチドを得ることができる。また、組換体内に蓄積されている場合は、培養菌体を破砕し、目的のポリペプチドが可溶化していればその上清を、疎水、イオン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィーによって発現した目的のポリペプチドを得ることができる。発現産物が不溶物として蓄積されている場合は、細胞を破砕後、沈澱を回収し、尿素などの変性剤で可溶化する。その後、変性剤を除きリフォールディングさせた後、前述のようなクロマトグラフィーにより目的の活性を持ったポリペプチドを得ることができる。
【００３７】
本発明により、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターの一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターの遺伝子工学的な製造が可能となる。また、本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安価に高純度なエンドグリコセラミダーゼアクチベーター標品を得ることが可能となる。
また、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、常法により本発明のＤＮＡの検出や増幅等に有用である。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片は、常法により本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターの精製等において有用である。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１
エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ構造遺伝子のクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの抽出精製
エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの生産菌であるロドコッカス
ｓｐ．  Ｍ−７７７を、１．５％のマイコロジカルペプトン（オクソイド社製）、０．２％のＮａＣｌ、０．１％の酵母エキスからなる培地（ｐＨ７．０）３０ｍｌに接種し３日間、２８℃で振とう培養した。これを更に同じ培地９００ｍｌに接種し３日間、２８℃で振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め４．５ｍｌの緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した後、凍結、融解を行った。この菌体に４ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２．５ｍｌを加え、３０℃で１６時間保温した。これに抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、０．４ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ、ｐＨ７．５）１０ｍｌを加え５０℃で１６時間保温し、更に抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５％ＳＤＳ、０．２ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ、ｐＨ７．５）１０ｍｌを追加し８時間保温した。この後室温に戻し、等容量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を飽和したフェノール／クロロホルム溶液を加えて穏やかに回転攪拌を１６時間行い、３５００ｒｐｍで３０分間遠心した後上層を回収した。この溶液を緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に対して４℃で透析を行いゲノムＤＮＡ溶液を得た。
【００４０】
（２）エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの部分アミノ酸配列の決定
まずエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの２７．９ｋＤａトリプシン消化物をザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー、第１１０巻、第３２８〜３３２頁（１９９１）に記載の方法で精製した。まず精製エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ２７．９ｋＤａトリプシン消化物のＮ末端配列をエドマン分解法により決定した。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列ＡＣＴＮ（配列番号：５）が決定できた。
【００４１】
次に内部アミノ酸配列を以下のように決定した。
ピリジン４μｌ、４−ビニルピリジン１μｌ、トリブチルフォスフィン１μｌおよび蒸留水５μｌの入った試験管中に精製試料の入った小サンプル管を挿入し真空封管した。これを１００℃、５分間加熱することにより、試料中のシステイン残基を気相下でピリジルエチル化した。
この様にＳ−ピリジルエチル化した試料１ｎｍｏｌを４Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）５０μｌに溶解しリジルエンドペプチダーゼ（ピアース社製）を８ｐｍｏｌ添加し、３７℃で１６時間消化を行った。ついでμＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８  ＳＣ２．１／１０カラム（ファルマシア社製）を用いＳＭＡＲＴシステム（ファルマシア社製）によって０．０６５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む蒸留水から０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルへの濃度グラジエントの逆相クロマトグラフィーを行いペプチド断片の精製を行った。得られたペプチド断片をモデル４７７気相式ペプチドシークエンサー（アプライド  バイオシステム社製）を用いてエドマン分解法により分析し、内部部分アミノ酸配列ＡＣＴＩ（配列番号：６）を決定した。
【００４２】
（３）エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング
実施例１の（１）で調製したゲノムＤＮＡの２５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ（全て宝酒造社製）各１００ユニットで各々３７℃で６時間消化し、１００ユニットの酵素を追加してさらに１６時間反応させた。この反応液からＤＮＡ５μｇ相当について０．７％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、サザンブロット法（遺伝子研究法ＩＩ、第２１８〜２２１頁、東京化学同人発行）により、ナイロン膜［ハイボンドＮ＋  （Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋  ）  、アマシャム社製］にＤＮＡを転写した。このフィルターは同じものを２枚用意した。
【００４３】
ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例１の（２）で決定したＮ末端アミノ酸配列ＡＣＴＮ（配列番号：５）及び内部部分アミノ酸配列ＡＣＴＩ（配列番号：６）に基づきそれぞれオリゴヌクレオチドＡＣＴＮＨ（配列番号：７）、及びオリゴヌクレオチドＡＣＴＩＨ（配列番号：８）をデザインし、合成し、使用した。このときオリゴヌクレオチドの配列はロドコッカス属において既に塩基配列の決定されている各種タンパク質をコードする塩基配列からコドン使用頻度を算出し、使用頻度の高いコドンに基づきデザインした。
これらの合成オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌをメガラベル（ＭＥＧＡＲＡＢＥＬＴＭ、宝酒造社製）を用いて３２Ｐで標識した。
【００４４】
上記調製したフィルター２枚をそれぞれ６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、８．７７ｇＮａＣｌ、及び４．４１ｇクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％濃度で含む。）を含む溶液中、６５℃で３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブをそれぞれ０．５ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるように加え、５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次に６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で３０分間洗浄し、余分な水分を除いた後、イメージング  プレート（富士フィルム社製）に３時間あてＢＡＳ２０００イメージングアナライザー（富士フィルム社製）にて検出した。
【００４５】
その結果、オリゴヌクレオチドＡＣＴＮＨに対して、ＢａｍＨＩ消化物で約１０ｋｂｐ、ＰｓｔＩ消化物で約２．３ｋｂｐ、ＳａｌＩ消化物で約４５０ｂｐの位置にハイブリダイズするバンドを認めた。またオリゴヌクレオチドＡＣＴＩＨではＢａｍＨＩ消化物で約１０ｋｂｐ、ＰｓｔＩ消化物で約２．３ｋｂｐ、ＳａｌＩ消化物で約１ｋｂｐの位置にハイブリダイズするバンドを認めた。以後の実験は、取扱いの簡便さからＰｓｔＩ消化物について進めた。
【００４６】
制限酵素ＰｓｔＩで消化したゲノムＤＮＡ２０μｇの０．７％アガロースゲル電気泳動を行い、上述のハイブリダイゼーションで認められたバンドに相当する部分を切り出した。これをイージートラップ（ＥＡＳＹＴＲＡＰＴＭ、宝酒造社製）を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＰｓｔＩサイトに挿入した。
【００４７】
このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、直径８．５ｃｍの丸シャーレ５枚に、１枚当り２００〜１０００個のコロニーを形成させた。次に、これらのプレートより３００個のコロニーを選択し、培地プレート上においたナイロン膜（ハイボンドＮ＋  、アマシャム社製）上に写した。３７℃で３時間培養した後、このナイロン膜を０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、３ＭＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣでリンスした。このナイロン膜とプローブとしてオリゴヌクレオチドＡＣＴＮＨ（配列番号：７）を用い、前述と同じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、３個のポジティブシグナルが得られた。
それぞれの大腸菌ＪＭ１０９をＰ２３、Ｐ５４、Ｐ６２と命名した。アルカリ溶菌法により、得られたクローンのプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれｐＡＣＴＰ２３、ｐＡＣＴＰ５４、ｐＡＣＴＰ６２と命名した。これを数種類の制限酵素で消化し、電気泳動により切断パターンを解析した。その結果これらのプラスミドは同じインサートを持つことが明らかとなった。従って以降の実験にはｐＡＣＴＰ５４を用いることとした。
【００４８】
ｐＡＣＴＰ５４を制限酵素ＳａｌＩで消化した結果、約１ｋｂｐ、約４５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約１５０ｂｐの断片が得られそれぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４とした。これらの断片をアガロースゲル電気泳動後、ゲルより抽出精製しｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＳａｌＩサイトにサブクローニングし得られたプラスミドをそれぞれｐＡＣＴＳ１、ｐＡＣＴＳ２、ｐＡＣＴＳ３、ｐＡＣＴＳ４とした。これらのプラスミドをさらに適当な制限酵素（ＳｍａＩ、ＢａｌＩ、ＮａｅＩ等）で消化し、ＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、宝酒造社製）でセルフライゲーションを行って各種の欠失変異体を作製し、これらの変異欠失体及びｐＡＣＴＰ５４をそれぞれ末端からジデオキシ法によって塩基配列を決定した。
その結果、ｐＡＣＴＳ２上にはプローブとして用いたオリゴヌクレオチドＡＣＴＮＨがハイブリダイズする配列すなわちＮ末端アミノ酸配列ＡＣＴＮをコードする配列が存在し、またｐＡＣＴＳ１上にはプローブとして用いたオリゴヌクレオチドＡＣＴＩＨがハイブリダイズする配列すなわち内部アミノ酸配列ＡＣＴＩをコードする配列が存在し、また４個のＳａｌＩ断片はｐＡＣＴＰ５４上にＳ３、Ｓ２、Ｓ１、Ｓ４の順に並ぶことが明らかとなった（図１）。
【００４９】
これらの塩基配列をアミノ酸配列に翻訳した結果、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのアミノ酸配列の上流にシグナル様の配列が確認され、開始コドンが推定できた。また、このフレームの下流域には停止コドンは見いだされず精製エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの２７．９ｋＤａトリプシン消化物のＮ末端から４１７残基のアミノ酸（配列番号：９）をコードする事が明らかとなった。この４１７残基のアミノ酸配列は分子量４２ｋＤａに相当する。この４１７残基のアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列表の配列番号：１０に示す。従ってｐＡＣＴＰ５４はエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのＮ末端部分をコードする領域を含有し活性に必要な最小単位である分子量２７．９ｋＤａのエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩをコードする領域を包含していることが明らかとなった。
【００５０】
（４）エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのＣ末端領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング
エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の全長をカバーするために、ｐＡＣＴＰ５４では欠損していたＣ末端付近をコードするＤＮＡ断片を更に実施例１の（３）と同様にしてサザンハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。プローブは実施例１の（３）で得られた配列の中で最もＣ末端よりのＤＮＡ配列を含むｐＡＣＴＰ５４のＳｍａＩ／ＰｓｔＩ消化によって得られる約０．４ｋｂｐの断片を用いた。すなわちｐＡＣＴＰ５４を制限酵素ＳｍａＩ及びＰｓｔＩ（宝酒造社製）で消化し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、遊離する約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。
【００５１】
これをスピンバインド  シリーズ  ＩＩ（ＳｐｉｎＢｉｎｄＴＭ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ、宝酒造社製）を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をＢｃａＢＥＳＴＴＭ  ラベリング  キット（宝酒造社製）を用いて３２Ｐで標識した。実施例１の（１）で調製したゲノムＤＮＡ５０μｇを制限酵素ＭｌｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＡｐａＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ（全て宝酒造社製）の各１８０ユニットを用い各々３７℃で６時間消化した。この反応液からＤＮＡ１０μｇ相当を用い、実施例１の（３）と同様に調製したフィルターを６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、８．７７ｇＮａＣｌ、及び４．４１ｇクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解した物）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％濃度で含む）を含む溶液中、６８℃で３時間プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを０．１ｐｍｏｌ／ｍｌの濃度になるように加え、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００５２】
次に６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、７０℃で３０分間洗浄し、余分な水分を除いた後、イメージングプレート（富士フィルム社製）に１０分間当てた後、ＢＡＳ２０００イメージングアナライザー（富士フィルム社製）にて検出した。
その結果、ＭｌｕＩ消化物で約４ｋｂｐ、ＳａｃＩＩ消化物で約１．３ｋｂｐ、ＡｐａＩ消化物で約１ｋｂｐ、Ｅｃｏ５２Ｉ消化物で約０．６ｋｂｐの位置に、プローブとハイブリダイズするバンドを認めた。Ｅｃｏ５２Ｉ消化物はそのサイズからｐＡＣＴＰ５４では欠損していたＣ末端付近を完全にはカーバーしきれていないと考えられた。従って以降の実験には制限酵素ＭｌｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＡｐａＩの各消化物を用いた。
【００５３】
制限酵素ＭｌｕＩ、ＳａｃＩＩあるいはＡｐａＩで消化したゲノムＤＮＡ２０μｇをそれぞれ０．７％アガロースゲル電気泳動し、上述のハイブリダイゼーションで認められたバンドに相当する部分を切り出した。これらをイージートラップ（宝酒造社製）を用いて抽出精製を行い、得られたＭｌｕＩ断片をｐＵＣ１９Ｍ［ｐＵＣ１９Ｍは、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造社製）で消化した物にリン酸化ＭｌｕＩリンカー（宝酒造社製）を挿入し、ライゲーションすることによってｐＵＣ１９にＭｌｕＩサイトを持たせたプラスミドである］のＭｌｕＩサイトに、ＳａｃＩＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（ストラタジーン社製）のＳａｃＩＩサイトに、ＡｐａＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）のＡｐａＩサイトに、それぞれ挿入した。
これらのプラスミドを大腸菌ＨＢ１０１に形質転換して一晩培養し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ寒天培地を流した直径８．５ｃｍの丸シャーレ１０枚に、１枚当たり２００〜５００個のコロニーを形成させ、その内１０００コロニーを選択し同じ培地プレート上においたナイロン膜［ハイボンド−Ｎ＋  、アマシャム社製］上に写した。３７℃で１０時間保温した後、このナイロン膜を０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、３ＭＮａＣｌの溶液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×ＳＳＣでリンスした。このナイロン膜と前述と同じ様にｐＡＣＴＰ５４のＳｍａＩ／ＰｓｔＩ消化によって得られる約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を用い、前述と同じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、ＭｌｕＩ断片及びＳａｃＩＩ断片を含むコロニーからはポジティブシグナルは得られなかったがＡｐａＩ断片を含むコロニーからは２個のポジティブシグナルが得られた。
【００５４】
２個のポジティブシグナルが得られたコロニーから、アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製しｐＢＡｐ４２及びｐＢＡｐ６９と命名した。これらを数種類の制限酵素（ＡｐａＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、Ｅｃｏ１０９Ｉ、ＮａｅＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩＩ、ＭｌｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）で消化し、電気泳動により切断パターンを解析した。その結果ｐＢＡｐ４２とｐＢＡｐ６９は同じフラグメントが挿入されたものであることが判った。従って以降の解析はｐＢＡｐ４２を用いて行った。
【００５５】
次にｐＢＡｐ４２を数種類の制限酵素（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＡｃｃＩ、ＳｍａＩ）で消化しサブクローニングを行った。
これらのサブクローン及びｐＢＡｐ４２をそれぞれ末端からジデオキシ法によって塩基配列を決定しさらに得られた配列を基に合成した合成ＤＮＡプライマーを用いて塩基配列を決定した結果、ｐＡＣＴＰ５４のＳｍａＩ／ＰｓｔＩ消化によって得られる約０．４ｋｂｐの断片と同じ配列が見いだされた。
さらに、実施例１の（３）で決定したｐＡＣＴＰ５４の挿入断片中のＰｓｔＩ断片とｐＢＡｐ４２の挿入断片中のＡｐａＩ断片に渡って、１７４０ｂｐの読み取り枠（ＯＲＦ）が見いだされた。このＯＲＦは開始コドン（ＡＴＧ）で始まり終止コドン（ＴＧＡ）で終わり、翻訳されたアミノ酸配列中に実施例１の（２）で得られたアミノ酸配列ＡＣＴＮ及びＡＣＴＩに相当するアミノ酸配列が見いだされた。
【００５６】
以上の結果より、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。その結果を図１に示す。すなわち図１はｐＡＣＴＰ５４、ｐＢＡｐ４２の挿入断片の制限酵素地図と各挿入断片とエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ遺伝子の位置を示した図である。
エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号：２に示す。また、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの全アミノ酸配列を配列表の配列番号：１に示す。
【００５７】
実施例２
エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを発現するプラスミドの構築
エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの大腸菌での発現プラスミドの構築は実施例１で得られたｐＡＣＴＰ５４とｐＢＡｐ４２上に分割されて存在するエンドグリコセラミダーゼＩＩ構造遺伝子を取り出し、大腸菌での発現に適したプラスミドにつなぎ合わせ、組込むことにより行った。
【００５８】
（１）エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのＮ末端領域活性ポリペプチドを発現するプラスミドの構築
実施例１で得られたｐＡＣＴＰ５４を制限酵素ＳａｃＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動後、約６７０ｂｐのフラグメントをイージートラップ（宝酒造社製）で抽出精製し、ＤＮＡ  ブランテイング  キット（ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ、宝酒造社製）で平滑末端にした後、さらに制限酵素ＭｌｕＩで消化し、アガロースゲル電気泳動後、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製してＳａｃＩＩ−ＭｌｕＩ断片を得た。
【００５９】
次に、ｐＡＣＴＰ５４を制限酵素ＥｃｏＲＩ，ＭｌｕＩで消化しアガロースゲル電気泳動後、抽出精製して約８２０ｂｐのＭｌｕＩ−ＥｃｏＲＩ断片を得た。この２つのＤＮＡ断片をｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）のＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトにＤＮＡ  ライゲーション  キット（宝酒造社製）を用いて挿入した。このプラスミドをｐＴＡＣ１とした。さらに、このｐＴＡＣ１を制限酵素ＸｂａＩで消化し平滑末端化した後、ストップリンカー（配列番号：１１）を挿入した。このプラスミドをｐＴＡＣ２と命名した（図２）。
このｐＴＡＣ２には、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩをコードする遺伝子の上流にｌａｃＺα由来のペプチドを含む１３アミノ酸残基をコードする配列が含まれており、ｌａｃＺのＳＤ配列及びその開始コドンを利用してｌａｃＺαとの融合体としてのエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの誘導発現が期待される。このｐＴＡＣ２を大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、得られた組換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後挿入断片の塩基配列の確認を行った。ｐＴＡＣ２を導入した大腸菌ＪＭ１０９を、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴＡＣ２と表示する。
【００６０】
ｐＴＡＣ１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化し、平滑末端化し、アガロースゲル電気泳動後、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を抽出精製した。これをｐＥＴ２３ｂ（ノバジェン社製）のＨｉｎｃＩＩサイトと平滑末端化したＮｏｔＩサイトの間に挿入した。このプラスミドをｐＥＡＣ００１と命名した（図３）。
このｐＥＡＣ００１には、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩをコードする遺伝子の上流にＴ７・ＴａｇＴＭ（バクテリオファージＴ７のｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１残基アミノ酸配列、ノバジェン社製）及びクローニングサイト由来の１４アミノ酸残基をコードする配列が含まれており、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩをコードする遺伝子の下流にはＨｉｓ・ＴａｇＴＭ（６残基のヒスチジン残基、ノバジェン社製）がコードされており、成熟エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのＮ末端領域４１７残基との融合体としてのエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの誘導発現が期待される。このプラスミドを、大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、得られた組換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後、挿入断片の塩基配列の確認を行った。その結果、正しく構築されている事が確認されたプラスミドを発現用に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。ｐＥＡＣ００１を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００１と表示する。
【００６１】
ｐＥＡＣ００１を制限酵素ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、平滑末端にした後、セルフライゲーションした。このプラスミドをｐＥＡＣ１０１と命名した（図４）。
このプラスミドは、ｐＥＡＣ００１よりクローニングサイト由来の配列が９アミノ酸残基少ない、融合タンパク質部分の短い融合体としてのエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの誘導発現が期待される。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、得られた組換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後挿入断片の塩基配列の確認を行った。その結果、正しく構築されている事が確認されたプラスミドを発現用に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。プラスミドｐＥＡＣ１０１を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１（工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ  ＢＰ−５５３１として寄託されている。；本菌は当初はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１の名称（受託証）で寄託されたが、名称の誤記を訂正するため平成７年６月１５日付の微生物寄託証明書により名称が表記のとおり変更されている。）と表示する。
ｐＥＡＣ００１を制限酵素ＸｈｏＩで消化し平滑末端にした後、ＳｍａＩで消化しセルフライゲーションした。これによりｐＥＡＣ００１から成熟エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのＮ末端領域２７４残基を残し１４３残基を欠失させたプラスミドを構築した。このプラスミドをｐＥＡＣ００２と命名した（図５）。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、得られた組換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後挿入断片の塩基配列の確認を行った。正しく構築されている事が確認されたプラスミドを発現用に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。プラスミドｐＥＡＣ００２を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００２と表示する。
【００６２】
（２）シグナル配列を除くエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩポリペプチドを発現するプラスミドの構築
ｐＢＡｐ４２を制限酵素ＡｐａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルより抽出精製を行うことによって約１０００ｂｐのＢＡｐ４２−ＡｐａＩ断片を調製した。また実施例２で得られたｐＥＡＣ１０１を制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、ＤＮＡ  ブランティング  キット（宝酒造社製）で平滑末端にした物にリン酸化ＡｐａＩリンカー（宝酒造社製）を挿入し、ライゲーションすることによってｐＥＡＣ１０１に新たにＡｐａＩサイト導入した。このプラスミドを制限酵素ＡｐａＩで消化し、更に大腸菌由来アルカリフォスファターゼにより脱リン酸化を行った物にＢＡｐ４２−ＡｐａＩ断片をライゲイションすることによりｐＥＡＣ２０１を得た（図６）。
このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株へ導入し、得られた組換体からアルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後、挿入断片の塩基配列の確認を行った。その結果、正しく構築されている事が確認されたプラスミドを発現用に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。ｐＥＡＣ２０１を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ２０１と表示する。
【００６３】
実施例３
組換体エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの大腸菌における発現
（１）エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩ活性を有するポリペプチドの大腸菌における発現
実施例２で得られた大腸菌  Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴＡＣ２、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００２、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ２０１を、それぞれ１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地５ｍｌに接種して３７℃で一晩振とう培養し、その０．２％を新たに同培地５ｍｌに接種した。培養後の濁度（６６０ｎｍの吸光度）がおよそ０．５の段階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え１６時間振とう培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）０．５ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上清である大腸菌抽出液と沈殿に分画した。この抽出液及び沈殿をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、クマジーブリリアントブルーで染色した。
【００６４】
この結果、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴＡＣ２ではエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩは検出されず、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ２０１においては抽出液及び沈殿に、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００２においては沈殿にエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩと考えられるバンドが検出され、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを発現していることが確認できた。このときＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１が可溶性画分に最も多くエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩを産出していた。またＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ２０１による産物はロドコッカス  ｓｐ．  Ｍ−７７７により生産される天然のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩとほぼ同じ位置にバンドが見られた。
【００６５】
次にＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ２０１の菌体抽出液をジャーナル  オブ  バイオケミストリー、第１１０巻、第３２８〜３３２頁（１９９１）に記載の方法によりトリプシン消化を行った。この消化液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッテイングを行った。この膜をロドコッカス  ｓｐ．  Ｍ−７７７由来の精製エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの２７．９ｋＤａトリプシン消化物をラットに免疫して得た抗血清を用いて特異的に免疫染色した。その結果、トリプシン消化によって生じると考えられる約２８ｋＤａのバンドが検出された。
【００６６】
このことよりＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ００１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ２０１が可溶性画分に生産するエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの一部は天然と同じ立体構造を形成している物と正しい立体構造を形成していない物が混在していると考えられた。
【００６７】
（２）可溶性発現産物の精製
Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地５ｍｌに接種して３７℃で１６時間振とう培養し、これの０．６ｍｌを３００ｍｌの同じ培地に植菌して３７℃で振とう培養した。培養液の濁度（６６０ｎｍの吸光度）がおよそ０．５になった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、更に３７℃で一晩振とう培養した。
培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）１０ｍｌに懸濁し超音波処理を行い菌体を破砕した。これを遠心分離し沈殿を除いた上清に、１０ｍＭイミダゾール、１ＭＮａＣｌを含む４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）１０ｍｌを加え試料溶液とした。
【００６８】
この試料溶液からアフィニティークロマトグラフィーにより可溶性画分発現産物を精製した。まずＮｉ２＋を固定化したＨｉｓ・Ｂｉｎｄ金属キレーティング樹脂（ノバジェン社製）カラムを５ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で平衡化した。試料液をこのカラムに添加し６０ｍＭイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）でカラムを洗浄した後１Ｍイミダゾール、０．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で溶出した。この操作により１０ｍｌの精製可溶性発現産物が得られた。
【００６９】
（３）リフォールディングと組換体２７．９ｋＤａエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの生産
実施例３の（２）で得られたＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１の培養物からの精製可溶性発現産物１０ｍｌを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）９９０ｍｌ中に攪拌しながら滴下することにより希釈し、５℃で４日間攪拌を行う事によってリフォールディングを行った。
【００７０】
この溶液をＨｉｓ・Ｂｉｎｄ金属キレーティング樹脂カラムに添加し前と同様に洗浄、溶出する事によって濃縮を行った。この溶出液の緩衝液をＨｉ−Ｔｒａｐ  デザルティング  カラム（ファルマシア社製）を用い２ｍＭＣａＣｌ２  を含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に交換した。トリプシン２ｍｇを添加し３７℃で４時間消化した後、更にトリプシン２ｍｇを追加し３７℃で１６時間消化することによって２７．９ｋＤａエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩへの変換を行った。消化液を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）で平衡化した陰イオン交換樹脂Ｑカートリッジ（バイオラッド社製）に通過させ、更にアフィニティーカラムＰｒｏｔｒａｐＴＭ（宝酒造社製）に通過させることによりトリプシンを除き、限外濾過により４５μｌまで濃縮した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、分子量約２８，０００の単一バンドであった。またＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ピアース社製）によりタンパク質定量を行った結果、１１μｇ／μｌ（牛血清アルブミン換算）であった。
【００７１】
ザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー、第１１０巻、第３２８−３３２頁（１９９１）に記載の方法に基づきエンドグリコセラミダーゼＩＩに対する活性化作用を測定した結果、エンドグリコセラミダーゼＩＩ活性化作用が確認された。すなわち本発明の遺伝子をもつ大腸菌Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＡＣ１０１の培養液１リットルから約１．７ｍｇの組換体２７．９ｋＤａエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩが得られることがわかった。この分子量２７．９ｋＤａのエンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号：３に、その塩基配列を配列表の配列番号：４に示す。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によりエンドグリコセラミダーゼアクチベーターに必要なアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、これによりエンドグリコセラミダーゼアクチベーター遺伝子を提供することが可能となった。また、エンドグリコセラミダーゼアクチベーター活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供された。
本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターのＤＮＡ配列を利用すれば、本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターとは配列が異なるが同様の活性を持つと期待される類似のＤＮＡの探索も可能となる。また、本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターのＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列は本発明のエンドグリコセラミダーゼアクチベーターの抗体の作製にも有用である。
【００７３】
【配列表】
0003616203.tif 000002
0003616203.tif 000003
0003616203.tif 000004
【００７４】
0003616203.tif 000005
0003616203.tif 000006
【００７５】
0003616203.tif 000007
0003616203.tif 000008
【００７６】
0003616203.tif 000009
【００７７】
0003616203.tif 000010
【００７８】
0003616203.tif 000011
【００７９】
0003616203.tif 000012
【００８０】
0003616203.tif 000013
【００８１】
0003616203.tif 000014
0003616203.tif 000015
0003616203.tif 000016
【００８２】
0003616203.tif 000017
【００８３】
0003616203.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、エンドグリコセラミダーゼアクチベーターＩＩの構造遺伝子およびプローブ配列ＡＣＴＩＨおよびＡＣＴＮＨの概念図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＴＡＣ２の構築図を示す。
【図３】図３は、プラスミドｐＥＡＣ００１の構築図を示す。
【図４】図４は、プラスミドｐＥＡＣ１０１の構築図を示す。
【図５】図５は、プラスミドｐＥＡＣ００２の構築図を示す。
【図６】図６は、プラスミドｐＥＡＣ２０１の構築図を示す。
【図１】
0003616203.tif 000019
【図２】
0003616203.tif 000020
【図３】
0003616203.tif 000021
【図４】
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【図５】
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【図６】
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