(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の物理定数で特定される化合物。
１）  ＭＳ
１０８１（Ｍ＋Ｈ）+
２）  ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ-1
３３３２、２９２６、２８５４、１６６０、１５４９、１５３２、１４６４、１２５９、
１２４０、１０８１、１０６４、５５５
３）  ＵＶ λｍａｘ（メタノール）ｎｍ
２７４（２０００）、２８４（ｓｈ）
４）  融点
２７０℃（分解）
５）  ２０℃における［α］D
＋３．２°（ｃ＝０．１、ＤＭＳＯ）
６）  1Ｈ  ＮＭＲ  δＨ（ＤＭＳＯ−ｄ6）
０．８５、１．２５、１．４０、１．９０、２．０５、２．２５、３．３５、３．５０、
３．６０、３．７２、３．８５、３．９５、３．９８、４．１８、４．２１、４．３７、
４．５０、４．５５、４．６６、４．７５、４．８５、５．０７、５．５２、５．６８、
６．６７、７．１０、７．１２、７．１９、７．５５、７．６８、７．７９、８．１０、
８．３５、９．２０
【請求項２】
以下の物理定数で特定される化合物からなる抗カビ活性剤。
１）  ＭＳ
１０８１（Ｍ＋Ｈ）+
２）  ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ-1
３３３２、２９２６、２８５４、１６６０、１５４９、１５３２、１４６４、１２５９、
１２４０、１０８１、１０６４、５５５
３）  ＵＶ  λｍａｘ（メタノール）ｎｍ
２７４（２０００）、２８４（ｓｈ）
４）  融点
２７０℃（分解）
５）  ２０℃における［α］D
＋３．２°（ｃ＝０．１、ＤＭＳＯ）
６）  1Ｈ  ＮＭＲ  δＨ（ＤＭＳＯ−ｄ6）
０．８５、１．２５、１．４０、１．９０、２．０５、２．２５、３．３５、３．５０、
３．６０、３．７２、３．８５、３．９５、３．９８、４．１８、４．２１、４．３７、
４．５０、４．５５、４．６６、４．７５、４．８５、５．０７、５．５２、５．６８、
６．６７、７．１０、７．１２、７．１９、７．５５、７．６８、７．７９、８．１０、
８．３５、９．２０
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ラン藻由来の抗カビ活性剤およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ラン藻は生理活性物質の宝庫として注目され、さまざまな活性物質が単離されている。例えば、肝臓毒のマイクロシスチンや脱リン酸化酵素阻害活性物質のノジュラリンなどが現在までに単離されている。しかしながら、抗カビ活性を示す物質についてはいまだ十分な検討がなされていない。とくにラン藻の中でもネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ）などの陸生ラン藻を利用して抗カビ活性物質を得ることを試みた例は少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明者らは、陸生ラン藻を利用した簡便で効率のよい抗カビ活性物質の製造方法を提供することを目的として検討を進め、本発明に至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、陸生ラン藻をメタノール抽出し、酢酸エチル、ブタノールで溶媒分画を行ってブタノール画分を得る工程からなる抗カビ活性物質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法によって得られたブタノール画分からなる抗カビ活性剤にも関する。
【０００５】
本発明で用いる陸生ラン藻は、湿った土壌に塊状で生育する陸生のラン藻の中から選択する。例えば、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ  ｓｐ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｐ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ  ｓｐ、Ｃａｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ  ｓｐを挙げることができるがこれらに限定されるものではない。この中で好ましい陸生ラン藻は、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐである。
【０００６】
本発明で用いるメタノール、酢酸エチル、ブタノ−ルなどは、市販されているものをそのまま使用することができる。とくに精製する必要はない。メタノールによる抽出は当業者に周知の方法により行う。通常は、陸生ラン藻の重量の２倍程度のメタノールを用いて抽出するが、この量は制限的ではない。また、酢酸エチル、ブタノールによる溶媒分画も、当業者に周知の方法により行い、使用量は溶媒分画が効果的に行われる量であれば特に制限されない。
【０００７】
得られたブタノール画分は、そのままでも抗カビ活性を示すため、さらに精製することなく抗カビ剤として使用に供することができる。使用目的に応じてさらに強力な抗カビ活性画分を得たい場合には、当業者に既知の方法により精製することができる。例えば、ブタノール画分に酢酸エチルを加えて酢酸エチル不溶区を取得し、さらにこれにメタノールを加えてメタノール不溶区を得ることによって一段と抗カビ活性の高い画分を得ることができる。さらにこの画分をＨＰＬＣなどにより精製すれば一段と抗カビ活性の高い画分（物質）を得ることができる。例えば、陸生ラン藻としてネンジュモを用いて精製した場合には、以下の物理定数で特定される抗カビ活性物質を得ることができる。
【０００８】
ＭＳ  １０８１（Ｍ＋Ｈ）+
ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ-1  ３３３２、２９２６、２８５４、１６６０、１５４９、１５３２、１４６４、１２５９、１２４０、１０８１、１０６４、５５５
ＵＶ  λｍａｘ（メタノール）ｎｍ  ２７４（２０００）、２８４（ｓｈ）
融点  ２７０℃（分解）
２０℃における［α］D  ＋３．２°（ｃ＝０．１、ＤＭＳＯ）
1Ｈ  ＮＭＲ  δＨ（ＤＭＳＯ−ｄ6）  ０．８５、１．２５、１．４０、１．９０、２．０５、２．２５、３．３５、３．５０、３．６０、３．７２、３．８５、３．９５、３．９８、４．１８、４．２１、４．３７、４．５０、４．５５、４．６６、４．７５、４．８５、５．０７、５．５２、５．６８、６．６７、７．１０、７．１２、７．１９、７．５５、７．６８、７．７９、８．１０、８．３５、９．２０
本発明の抗カビ活性物質の製造方法は、操作が非常に簡便であり効率的である。また、使用する溶媒等も安価であることから極めて経済的である。さらに、この方法によれば、従来知られていなかった新しい抗カビ活性物質を容易に見いだすことができる。したがって、本発明は産業上きわめて有用であり、幅広く応用されることが期待される。
【０００９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術範囲はこれらの実施例によって何ら制限的に解釈されるものではない。
【００１０】
湿重量で６ｋｇのネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ ｃｏｍｍｕｎｅ）を２倍量のメタノールで抽出し、さらに酢酸エチル、ブタノールで溶媒分画を行った。ブタノール層の溶媒を留去したところ、Ａ．ｃａｎｄｉｄｕｓに対して胞子の発芽を抑制する活性を示す粗生成物が４２５ｍｇ得られた。この粗生成物を、メタノールー水溶媒により（メタノール濃度を１０％から１０％ずつ上昇させた）、ＹＭＣ・ＧＥＬ  ＯＤＳ−ＡＱ  １２０−Ｓ５０カラムを用いて精製し、８０−１００％メタノールで流出した画分を収集し、溶媒を留去した。得られた物質に酢酸エチルを加えて、酢酸エチル不溶区を得た。さらにこれにメタノールを加えてメタノール不溶区２５ｍｇを得た。得られた物質を、８５％メタノール溶媒によりＹＭＣ  ＡＱ−３１３カラム（６．０ｘ２５０ｍｍ：１．０ｍｌ／分：ＲＩ：５０℃）を用いてＨＰＬＣ分取した。図１に示すピーク１−４に相当する画分をそれぞれ取得し、溶媒を留去して画分１−４を得た。
【００１１】
得られた画分１−４について、以下に示す抗カビ活性試験を行った。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓの胞子を胞子発芽用培地（グルコース０．２％、イーストエクストラクト０．１％、ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ０．３７％、クエン酸０．１％）に懸濁し、被検物質（画分１−４）を初期濃度１０００μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにこれを順次胞子懸濁液にて希釈して被検物質の濃度が、５００μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、６３μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌとなる胞子懸濁液を調製した。これらを２７℃にて培養し、４８時間後胞子の発芽が認められるか否かを顕微鏡により観察した。結果は以下の表１に示すとおりであった。
【００１２】
【表１】
0003616656.tif 000002
また、上記の希釈法により画分１と既知の抗カビ活性物質シクロヘキシドとの活性の比較を行った結果、画分１はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃａｎｄｉｄｕｓの胞子発芽に対してシクロヘキシドよりも約２０倍強力な阻害活性を示すことが確認された。
【００１３】
画分１（１．８５ｍｇ）について、６０％メタノール、３５％水、５％クロロホルムの溶媒系にてＣｅｍｃｏｐａｃｋ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ５Ｃ１８を用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ２つのピークが重なって観測された。この２つの成分を分離して分析したところ、主成分である質量数１０８１（Ｍ＋Ｈ）＋の化合物１の他に、質量数１０６５（Ｍ＋Ｈ）＋の化合物２が含まれていることが判明した。化合物１および化合物２の同定データは以下のとおりである。なお、化合物１の１Ｈ  ＮＭＲは図２に示す通りであった。
【００１４】
［化合物１］
▲１▼  ＭＳ
１０８１（Ｍ＋Ｈ）＋
▲２▼  ＩＲ  νｍａｘ（ＫＢｒ）ｃｍ−１
３３３２、２９２６、２８５４、１６６０、１５４９、１５３２、
１４６４、１２５９、１２４０、１０８１、１０６４、５５５
▲３▼  ＵＶ  λｍａｘ（メタノール）ｎｍ
２７４（２０００）、２８４（ｓｈ）
▲４▼  融点
２７０℃（分解）
▲５▼  ２０℃における［α］Ｄ
＋３．２’（ｃ＝０．１、ＤＭＳＯ）
▲６▼  １Ｈ  ＮＭＲ  δＨ（ＤＭＳＯ−ｄ６：４０℃）
０．８５、１．２５、１．４０、１．９０、２．０５、２．２５、３．３５、３．５０、３．６０、３．７２、３．８５、３．９５、３．９８、４．１８、４．２１、４．３７、４．５０、４．５５、４．６６、４．７５、４．８５、５．０７、５．５２、５．６８、６．６７、７．１０、７．１２、７．１９、７．５５、７．６８、７．７９、８．１０、８．３５、９．２０
［化合物２］
▲１▼  ＭＳ
１０６５（Ｍ＋Ｈ）＋
これらの化合物のそれぞれに対して抗カビ活性試験を行ったところ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓおよびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍの胞子発芽を、化合物１は１．６μｇ／ｍｌで、化合物２は３．２μｇ／ｍｌで完全に阻害することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【図１】画分１−４を示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】化合物１の１Ｈ  ＮＭＲチャートである。
【図１】
0003616656.tif 000003
【図２】
0003616656.tif 000004