(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血に硫酸リチウムの水溶液を全血の体積の２０％以下、かつ、該硫酸リチウムの濃度が全血１ｍｌあたり１０〜２００μｍｏｌの濃度となるように混合し、次いで血球成分を濾別することを特徴とする、全血から血漿または血清試料の調製方法。
【請求項２】
請求項１において、該硫酸リチウムの水溶液の濃度が０．１〜５ｍｏｌ／ｌであることを特徴とする、全血から血漿または血清試料を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は全血から血漿または血清試料を調製する方法に関し、特にヘマトクリット値の高い全血から血球を破壊させることなく血漿や血清試料を高い分離率で取得しうる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の構成成分例えば代謝産物、蛋白質、脂質、電解質、酵素、抗原、抗体などの種類や濃度の測定は通常全血を遠心分離して得られる血漿または血清を検体として行われている。ところが、遠心分離は手間と時間がかかる。特に少数の検体を急いで処理したいときや、現場検査などには、電気を動力とし、遠心分離機を必要とする遠心法は不向きである。そこで、濾過により全血から血漿を分離する方法が検討されてきた。
【０００３】
この濾過方法には、ガラス繊維濾紙をカラムに充填し、カラムの一方から全血を注入し、他方から血漿や血清を得るいくつかの方法が公知化されている（特公昭４４−１４６７３号公報、特開平２−２０８５６５号公報、特開平４−２０８８５６号公報、特公平５−５２４６３号公報等）。
【０００４】
しかし、全血から濾過により自動分析等による測定に必要な量の血漿または血清を得る方法に関しては血糖など一部の項目を除いては、いまだ試行の段階にあり、広く実用化されるに至っていない。
【０００５】
その理由は、これまでの濾過方式では、主に下記３つの条件を満たしていない為であろうと考えられる。
【０００６】
１）自動分析に必要な十分な量の血漿を濾過によって得ることが難しい。
２）濾過により赤血球の破壊（溶血）が起こり易く、溶血により血漿（血清）中に放出されるヘモグロビン（Ｈｂ）の干渉を受け易い測定項目や、血球内の存在量が血漿（血清）中よりも多い、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｎａ、Ｋなどの測定が難しい。
３）濾過方式による場合、全血中で赤血球が占める割合いわゆるヘマトクリット値が高い検体（５０％以上）では、赤血球による濾過材料の目詰まりが起こってしまい、うまく濾過できない。
【０００７】
例えば、特公平６−６４０５４号公報では、特定の材料を用いて作ったガラス繊維濾紙による血漿濾過技術を開示しているが、取り出し得る血漿の量は用いるガラス繊維濾紙の体積の１／２以下に限定せざるを得ないとしている。この特許では、Ｈｃｔの上限は５０％であるとの前提の下に、ガラス繊維濾紙の空間を赤血球が充填し切った状態を想定し、この状態になるまでに濾過し得る血漿の量が最大ガラス繊維濾紙の体積の５０％であるとしているのである。しかし、日常臨床検査室で扱う全血検体としてＨｃｔ５５〜６０％のものが含まれていることも珍しくない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、全血から血漿を分離する際の大きな障害となる高ヘマトクリット検体、具体的には新生児や、脱水状態にある患者からの全血で記録されることのある、ヘマトクリット値が６０〜７０％の範囲の全血でも、濾過により確実に血漿分離ができる手段を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ガラス繊維を用いる血漿濾過において、分離回収される血漿量が、ガラス繊維濾紙の体積の１／２に限定されることなく、通常の臨床検査用自動分析装置による多項目測定に必要な１００μｌ以上の血漿（血清）をどんなヘマトクリット値からでも確実に分離回収する手段を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、従来カラム方式の濾過によっては実現が難しかった、臨床化学検査や免疫血清学検査の大部分の検査項目の測定に適合した、血球成分の破壊を伴わない、良質の血漿を得る手段を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
全血からの血漿分離技術の開発における問題点は、以下の３点に要約される。
（１）  血漿分離の過程で赤血球の破壊（溶血）を起こさせないこと。赤血球の破壊により、血球内成分、特にＨｂ、ＧＯＴ、ＬＤＨ、Ｋなど血漿中よりも血球内の存在量が血漿中よりも著しく多い成分の血漿中への放出が起こって誤差の原因となり、また、Ｈｂの血漿中への放出により光学的に測光の妨害となる。
（２）  ヘマトクリット値が高く（５０％以上）、赤血球の分離が難しく、且つ、より溶血を起こし易い検体についても確実に血漿分離ができること。ヘマトクリットが高くなると「血液の粘性が」急激に増加する結果濾過による分離が著しく難しくなる。
（３）  血漿分離の過程で組成の変化が起こらないこと。
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決して、高ヘマトクリット値の全血検体であっても溶血を起こさせることなく高い分離率で血漿を分離取得しうる手段を開発するべく鋭意検討の結果、全血検体にヘマトクリット値を低下させることのできる薬剤を特定濃度範囲内になるように添加してから血漿を分離することによりこの目的を達成することができた。
【００１３】
すなわち、本発明は、全血に無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の水溶液を全血の体積の２０％以下、かつ、該無機塩またはアミノ酸もしくはその塩の濃度が全血１ｍｌあたり１０〜２００μｍｏｌの濃度となるように混合し、次いで血球成分を濾別することを特徴とする、全血から血漿または血清試料の調製方法に関するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法が適用される全血検体は、ヘパリン、ＮａＦ、ＥＤＴＡ、モノヨード酢酸などの抗凝固剤や解糖阻止剤などの有無を問わない。本発明の方法が威力を発揮するのは高ヘマトクリット血液であり、ヘマトクリット値が５０〜７０％、特に５５〜７０％のものである。
【００１５】
硫酸リチウムは全血における血球と血漿の分離を促進してヘマトクリットを低下させる作用を有する（以下、「ＨＬ剤」と称することがある。）。
【００１８】
上記のＨＬ剤は水溶液として使用される。ＨＬ剤の濃度は０．１〜５ｍｏｌ／ｌ程度、好ましくは０．５〜３ｍｏｌ／ｌ程度、さらに好ましくは１〜２．５ｍｏｌ／ｌ程度が適当である。
【００１９】
ＨＬ剤水溶液にはＨＬ剤以外の成分も加えておくことができる。例えば、ＨＬ剤の乾燥防止を目的としてグリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を加えても良い。また、ｐＨを調節する目的で緩衝剤を加えても良い。さらに、分析の目的に応じ、濾過血漿中での被検物質の分離を容易にするために各種の化合物を加えることができる。ＨＤＬコレステロール測定の分画試薬であるデキストランやリンタングステン酸等、ＬＤＬコレステロールとの選択的な結合試薬がその例である。このような成分の他の例として、各種抗原や抗体（修飾を加えたものを含む）など血漿中の特定成分と反応性を有する化合物がある。
【００２０】
ＨＬ剤を全血に加えると赤血球膜の柔軟性が失われて変形しにくくなる。通常、全血を濾過しようとすると赤血球の見かけの大きさより十分に小さな空隙、例えば直径１〜２μｍのキャピラリーであっても通り抜けてしまうことが知られているが、ＨＬ剤を添加することにより赤血球の強度の変形はなくなるので、濾過が非常にし易くなる。
【００２１】
ＨＬ剤によるヘマトクリット低下効果は、ＨＬ剤を添加する全血中の血漿体積に対するＨＬ剤のモル濃度に比例する。一方、ＨＬ剤の濃度が２００ｍｍｏｌ／ｌ以上になると血球の破壊（溶血）が起こり易くなり赤血球の主成分であるヘモグロビンが血漿中に溶出してくる。そこで、ＨＬ剤の全血への添加量はＨＬ剤の濃度が全血１ｍｌあたり１０〜２００μｍｏｌ程度、好ましくは１０〜１００μｍｏｌ程度、更に好ましくは２０〜６０μｍｏｌ程度となるようにする。ＨＬ剤水溶液の添加量としては厳密な制限はないが、ＨＬ剤の添加量をあまり大きくすると全血の希釈率が大きくなりすぎて、秤量誤差を大きくするので好ましくない。また、希釈倍率が高くなると測定感度との関係で、測定時の精度や正確度が問題となる。そこで、ＨＬ剤水溶液の添加量は容積比で全血の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とする。添加量の下限はＨＬ剤水溶液におけるＨＬ剤の溶解度等に応じて決まり、通常１％以上である。このように、ＨＬ剤を少量添加するだけで濾過がしやすくなるので、測定法の感度や正確度への影響が少ない。そこで、ＨＬ剤水溶液の添加量は容積比で全血の２０％以下、好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下とする。添加量の下限はＨＬ剤水溶液におけるＨＬ剤の溶解度等に応じて定まり、通常１％以上である。
【００２２】
ＨＬ剤を加えると、ＨＬ剤は血漿に溶解して血漿の浸透圧を高める。ＨＬ剤の添加により血球内と血漿中での浸透圧の間にギャップが生ずる。この血球内外の浸透圧差を緩和させるような力が働く。すなわち、血球内の水を血漿中に排出し、血球内の浸透圧（すなわち溶質濃度）を高くし、血漿の浸透圧を下げて血球内外の圧力差をなくすような力が働く。その結果、血球の体積は減少し、血漿の体積が増加する。その結果として、ヘマトクリットが低下する。
【００２３】
ＨＬ剤の添加により赤血球の体積が減少し、血球膜の柔軟性も減少するので、多孔質膜などによる濾過材の濾過が非常にし易くなる。またフリーの血漿量が増えるので、濾過による血漿の回収率が向上する。
【００２４】
ＨＬ剤によるヘマトクリットの低下は、ＨＬ剤の濃度と共に上昇するが、血球膜は強度が弱いので、ある程度以上濃くなると血球は破壊、溶血し易くなる。ＨＬ剤の作用は主としてその浸透圧に由来するので、全血中（正確には血漿中）の溶質分子数に比例する。ＨＬ剤の添加量が多すぎると血球内外の浸透圧差が大きくなりすぎて、血球が破裂したり、血球膜の一部に穴があいて、血球内成分が血漿中に漏出する。
【００２５】
一般に血液検査は血漿中の成分濃度の測定を基本としている。赤血球が破壊したり血球膜の一部に穴があくと、赤血球内成分が血漿中に漏出してしまう。赤血球内には高濃度のＨｂ（ヘモグロビン）が詰まっているので、このような漏出が起こると血漿が赤くなる（溶血という）。赤血球の破壊は僅かであってもＨｂの漏出による血漿の着色は無視できず、項目によって測定値に強く影響する。例えば、健常者の血液検査において、全血球の０．１％が破壊したとすると、ＣＰＫ、ＡＬＰなど多くの酵素の測定値は正しく測れない。赤血球内には血漿中よりも濃度の高い成分（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋ）があるのでこれらの項目の測定についても溶血の影響を直接受ける。そこで、血漿の分離、回収に当たっては、溶血ができるだけ少ない条件で実施する必要がある。
【００２６】
健常者の全血中にはおよそ１５ｇ／ｄｌのヘモグロビン（Ｈｂ）が含まれている。Ｈｂが血漿（血清）中に漏洩（溶血）すると測定値に影響を与える。その程度は測定法、測定項目によって異なる。
【００２７】
例えば、血糖やコレステロールの測定については溶血の影響を受けにくく、１５０ｍｇ／ｄｌ程度のＨｂが血漿中に含まれていても（全体の１％が溶血したことに相当）正しく測定される。
【００２８】
一方、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋ等は溶血の影響を受け易く、特にＬＤＨやＫではＨｂが１５ｍｇ／ｄｌ（全体の０．１％の溶血に相当）であっても、測定値は臨床診断上有意な影響を受ける。
【００２９】
従って、血糖やコレステロールの測定のみを目的とする場合は、血漿分離法として不十分であっても良いが、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋ等を含めて正しく測ることを目的とする場合には、０．１％以上の溶血があってはならない。
【００３０】
健常者のＨｃｔは４０〜４５％であるが、日常の臨床検査では数％の頻度でＨｃｔが５５〜６０％を示す検体も扱う必要がある。この場合Ｈｂは２０〜２５ｇ／ｄｌとなるので、測定法のＨｂに対する許容範囲を１５ｍｇ／ｄｌとすると、これらの高Ｈｃｔ検体では０．０７％以下の溶血に抑える必要がある。
【００３１】
従来公知の無機塩やアミノ酸およびその塩またはレンチンなどの血球凝集素を乾燥状態で直接血液に溶解させたり、濾紙や多孔質材料に含浸、乾燥させておく方法においては、血液と乾燥固体が接触し、乾燥固体が血漿に溶解する初期の過程で局所的、一時的に溶血を起こし易い。従って、これらの方法で得た血漿は僅かながらＨｂの混入を伴っていることが多く、血糖やコレステロールの測定には問題がなくても、上記のＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、Ｋなどの測定には耐えないものであった。この傾向はＨｃｔの高い検体ではさらに顕著であった。
【００３２】
これに対して、上記化合物を適当な濃度の水溶液にしてから血液と接触させると局所的な濃度の上昇の程度も少なく、また血漿中の拡散も速やかに進行することから溶血は非常に起こりにくくなる。
【００３３】
全血の使用量は０．３〜３ｍｌ程度、通常０．５〜１．５ｍｌ程度でよい。全血とＨＬ剤水溶液の混合は単に数回振盪するだけでよい。ＨＬ剤の作用は殆ど瞬間的であって数秒のうちに平衡に達すると推定される。従って、混合に際しては温度や時間を特に調節する必要はない。
【００３４】
濾過材料は血球を分離しうる公知の濾過材料を用いることができる。このような濾過材料の例として、ガラス繊維濾紙、表面が親水化された弗素含有ポリマー、ポリスルホン等の血球分離能を有する微多孔性膜、ガラス繊維濾紙と微多孔性膜の積層体、ガラス繊維濾紙とセルロース濾紙の積層体、ガラス繊維濾紙とセルロース濾紙と微多孔性膜の積層体、特開昭６２−１３８７５６〜８号公報、特開平２−１０５０４３号公報、特開平３−１６６５１号公報等に記載された繊維質多孔性膜と非繊維質多孔性膜の積層体等がある。好ましいものはガラス繊維濾紙を用いたものであり、ガラス繊維濾紙と微多孔性膜の積層体、ガラス繊維濾紙とセルロース濾紙の積層体、ガラス繊維濾紙とセルロース濾紙と微多孔性膜の積層体、が特に好ましい。また、ポリスルホン微多孔性膜を用いたものも好ましい。最も好ましいものはガラス繊維濾紙とセルロース濾紙と微多孔性膜の積層体であり、この微多孔性膜にポリスルホン膜を用いたものがとりわけ好ましい。
【００３５】
ガラス繊維濾紙は密度が０．０２〜０．２程度、好ましくは０.０２〜０.１５程度、更に好ましくは０．０２〜０．０９程度で、保留粒子径が０．８〜９μｍ程度、特に１〜５μｍ程度のものが好ましい。ガラス繊維の表面を特開平２−２０８５６５、同４−２０８８５６号公報等に記載された様に、親水性高分子で処理することによって濾過をより速やかに円滑に行うことができる。また、ガラス繊維の表面をレクチンで処理することもできる。ガラス繊維濾紙は複数枚を積層して用いることができる。
【００３６】
表面を親水化されており血球分離能を有する微多孔性膜は、実質的に分析値に影響を与える程には溶血することなく、全血から血球と血漿を特異的に分離するものである。この微多孔性膜は孔径がガラス繊維濾紙の保留粒子径より小さくかつ０.５μｍ以上、好ましくは０.５〜８μｍ程度、より好ましくは０.５〜４.５μｍ程度、特に好ましくは０．５〜３μｍ程度のものが適当である。また、空隙率は高いものが好ましく、具体的には、空隙率が約４０％から約９５％、好ましくは約５０％から約９５％、さらに好ましくは約７０％から約９５％の範囲のものが適当である。微多孔性膜の例としてはポリスルホン膜、弗素含有ポリマー膜等がある。
【００３７】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜としては、特表昭６３−５０１５９４（ＷＯ  ８７／０２２６７）に記載のポリテトラフルオロエチレンのフィブリル（微細繊維）からなる微多孔性のマトリックス膜（微多孔性層）、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ(Ｗ.Ｌ.Ｇｏｒｅ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）、Ｚｉｔｅｘ(Ｎｏｒｔｏｎ社製）、ポアフロン(住友電工社製）などがある。その他に、ＵＳ ３２６８８７２（実施例３及び４）、ＵＳ ３２６０４１３（実施例３及び４）、特開昭５３−９２１９５（ＵＳ ４２０１５４８）等に記載のポリテトラフルオロエチレンの微多孔性膜、ＵＳ ３６４９５０５に記載のポリビニリデンフルオリドの微多孔性膜などがある。
【００３８】
これらの弗素含有ポリマーの微多孔性膜の作成に当たっては、１種もしくは２種以上の弗素含有ポリマーを混合しても良いし、弗素を含まない１種もしくは２種以上のポリマーや繊維と混合し、製膜したものであつても良い。
【００３９】
構造としては、延伸しないもの、１軸延伸したもの、２軸延伸したもの、１層構成の非ラミネートタイプ、２層構成のラミネートタイプ、例えば繊維等の他の膜構造物にラミネートした膜等がある。
【００４０】
フイブリル構造又は一軸延伸もしくは二軸延伸した非ラミネートタイプの微多孔性膜は、延伸により、空隙率が大きくかつ濾過長の短い微多孔膜が作られる。濾過長が短い微多孔膜では、血液中の有形成分（主として赤血球）による目詰りが生じがたく、かつ血球と血漿の分離に要する時間が短いので、定量分析精度が高くなるという特徴がある。
【００４１】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は特開昭５７−６６３５９(ＵＳ ４７８３３１５）に記載の物理的活性化処理(好ましくはグロー放電処理又はコロナ放電処理)を微多孔膜層の少なくとも片面に施すことにより微多孔性膜の表面を親水化して、隣接する微多孔性膜との部分接着に用いられる接着剤の接着力を強化することができる。
【００４２】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は、そのままでは、表面張力が低く乾式分析要素の血球濾過層として用いようとしても、水性液体試料ははじかれてしまって、膜の表面や内部に拡散、浸透しないことは、周知の事実である。本発明では、第１の手段として弗素含有ポリマーの微多孔性膜に親水性を付与し親水性を高める手段として、弗素含有ポリマーの微多孔性膜の外部表面及び内部の空隙の表面を実質的に親水化するに充分な量の界面活性剤を弗素含有ポリマーの微多孔性膜に含浸させることにより、前記の水性液体試料がはじかれる問題点を解決した。
【００４３】
水性液体試料がはじかれることなく膜の表面や内部に拡散、浸透、移送されるに充分な親水性を弗素含有ポリマーの微多孔性膜に付与するには、一般に、弗素含有ポリマーの微多孔性膜の空隙体積の約０．０１％から約１０％、好ましくは約０．１％から約５．０％、更に好ましくは０．１％から１％の界面活性剤で微多孔性膜の空隙の表面が被覆されることが必要である。例えば、厚さが５０μｍの弗素含有ポリマーの微多孔性膜の場合に、含浸される界面活性剤の量は、一般に０．０５ｇ／ｍ2から２．５ｇ／ｍ2の範囲であることが好ましい。弗素含有ポリマーの微多孔性膜に界面活性剤を含浸させる方法としては、界面活性剤の低沸点（沸点約５０℃から約１２０℃の範囲が好ましい）の有機溶媒（例、アルコール、エステル、ケトン）溶液に弗素含有ポリマーの微多孔性膜を浸漬し、溶液を微多孔性膜の内部空隙に実質的に充分に行きわたらせた後、微多孔性膜を溶液から静かに引き上げ、風(温風が好ましい)を送り乾燥させる方法が一般的である。
【００４４】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜を親水性化処理に用いられる界面活性剤としては、非イオン性（ノニオン性）、陰イオン性（アニオン性）、陽イオン性（カチオン性）、両性いずれの界面活性剤をも用いることができる。
【００４５】
これらの界面活性剤のうちでは、ノニオン性界面活性剤が、赤血球を溶血させる作用が比較的低いので、全血を検体とするための多層分析要素においては有利である。ノニオン性界面活性剤としては、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、アルキルポリエーテルアルコール、ポリエチレングリコールモノエステル、ポリエチレングリコールジエステル、高級アルコールエチレンオキシド付加物（縮合物）、多価アルコールエステルエチレンオキシド付加物（縮合物）、高級脂肪酸アルカノールアミドなどがある。
【００４６】
ノニオン性界面活性剤の具体例として、次のものがある。
アルキルフェノキシポリエトキシエタノールとしては、
イソオクチルフェノキシポリエトキシエタノール：
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：オキシエチレン単位平均９〜１０含有）
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５：オキシエチレン単位平均５含有）
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール：
（ＩＧＥＰＡＬ ＣＯ−６３０：オキシエチレン単位平均９含有）
（ＩＧＥＰＡＬ ＣＯ−７１０：オキシエチレン単位平均１０〜１１含有)
（ＬＥＮＥＸ６９８：オキシエチレン単位平均９含有）
アルキルポリエーテルアルコールとしては、
高級アルコールポリオキシエチレンエーテル：
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−６７：ＣＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｏ．５９０３０−１５−８）
【００４７】
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は、その多孔性空間に水不溶化した１種又は２種以上の水溶性高分子を設けることによって親水化したものであってもよい。水溶性高分子の例として、酸素を含む炭化水素にはポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、窒素を含むものにはポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、負電荷を有するものとしてポリアクリル酸、ポリメタアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸などをあげることが出来る。不溶化は熱処理、アセタール化処理、エステル化処理、重クロム酸カリによる化学反応、電離性放射線による架橋反応等によって行えばよい。詳細は、特公昭５６−２０９４号公報及び特公昭５６−１６１８７号公報に開示されている。
【００４８】
ポリスルホンの微多孔性膜は、ポリスルホンをジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンあるいはこれらの混合溶媒等に溶解して製膜原液を作製し、これを支持体上に、又は直接凝固液中に流延し洗浄、乾燥して行うことにより製造することができる。詳細は特開昭６２−２７００６号公報に開示されている。ポリスルホンの微多孔性膜は、そのほか特開昭５６−１２６４０号公報、特開昭５６−８６９４１号公報、特開昭５６−１５４０５１号公報等のも開示されており、それらも使用することができる。ポリスルホンの微多孔性膜も弗素含有ポリマーと同様界面活性剤を含有させ、あるいは水不溶化した水溶性高分子を設けることによって親水化することができる。
【００４９】
繊維質多孔性膜と非繊維質多孔性膜の積層体における非繊維多孔性膜としては、特公昭５３−２１６７７号、米国特許１,４２１,３４１号等に記載されたセルロースエステル類、例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテート／ブチレート、硝酸セルロースからなるブラッシュポリマー膜が好ましい。６−ナイロン、６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の微多孔性膜でもよい。その他、特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−９０８５９号等に記載された、ポリマー小粒子、ガラス粒子、けい藻土等が親水性または非吸水性ポリマーで結合された連続空隙をもつ多孔性膜も利用できる。
【００５０】
非繊維層多孔性膜の有効孔径は０．３〜１０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ、特に有効なのは１〜３μｍである。本発明で非繊維層多孔性膜の有効孔径は、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−７０に準拠した限界泡圧法（バブルポイント法）により測定した孔径で示す。非繊維層多孔性膜が相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターである場合、厚さ方向の液体通過経路は、膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっているのが普通で、液体通過経路の断面を円に近似したときの孔径は、自由表面の近くで最も小さくなっている。容積の通過経路における厚さ方向に関する最小孔径は、さらにフィルターの面方向について分布を持っており、その最大値が粒子に対する濾過性能を決定する。通常、それは限界泡圧法で測定される。
【００５１】
上に述べたように、相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターでは、厚さ方向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっている。本発明の分析要素の非繊維層多孔性膜としてこの種の膜を用いる場合には、出口側を、メンブランフィルターの光沢面とすることが好ましい。
【００５２】
繊維質多孔性層を構成する材料としては、濾紙、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えば、トリコット編）、ガラス繊維濾紙等を用いることができる。これらのうち織物、編物等が好ましい。織物等は特開昭５７−６６３５９号に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。
【００５３】
繊維質多孔性膜の空隙体積（単位面積当たり。以下同じ）は非繊維質多孔性層と同じでもよいし、異なってもよい。両者の空隙体積の関係を調整するには、両者の空隙率又は厚さを変えてもよいし、厚さと空隙率の両方を変えてもよい。
【００５４】
本発明で用いられる濾過材料が積層体である場合には特開昭６２−１３８７５６〜８号公報、特開平２−１０５０４３号公報、特開平３−１６６５１号公報等に開示された方法に従って各層を部分的に配置された接着剤で接着して一体化することができる。
【００５５】
本発明の濾過材料では、その表面のみで血球をトラップする訳ではなく、ガラス繊維濾紙の厚さ方向に浸透するに従って、初めは大きな血球成分、後には小さな血球成分と徐々に空隙構造にからめ、厚さ方向に全長にわたって血球を留め除去していく、いわゆる体積濾過作用によるものと理解される。
【００５６】
本発明になる方式においては、供給されるすなわち分離しようとする血液の量に応じて、濾過材料の密度、厚さおよび面積等を選択することができる。ガラス繊維濾紙を用いる場合には、分離回収される血漿または血清の量がガラス繊維濾紙の体積の１０％以上、好ましくは２０〜１００％程度、特に好ましくは３０〜７０％程度となるようにする。具体的には、目標とする血漿量の２倍程度の体積のガラス繊維濾紙を用いる。
【００５７】
濾過しようとする全血の供給量には特に制限はない。全血の量がガラス繊維濾紙の体積よりも小さくても血漿分離はうまくいくが、分離回収される血漿の全血に対する比（回収率）が低くなる。全血の量がガラス繊維濾紙の体積より大きい場合は、ガラス繊維濾紙の空隙を血球がほぼ充填し尽くしてしまうと、次いで、血球がガラス繊維濾紙から漏れだしてくる。この場合に、微多孔性膜が設置されていると、この膜により血球が止められるので、ガラス繊維濾紙のみを使用する場合より分離回収される血漿の量が増加する。なお、通常最適な全血の量はガラス繊維濾紙の体積を１とすると０．５〜１０、好ましくは０．７〜５、さらに好ましくは０．８〜３である。
【００５８】
濾過をする際には、血液供給側からの加圧あるいは反対側からの吸引を行って、濾過を促進することが好ましい。その際加圧あるいは減圧する体積を濾過材料の体積の２〜５倍とすることが好ましい。また、上記加圧、吸引をする時間に厳密な制限は無いが、溶血を防ぐためには６０秒以内として速やかに濾過を行うことが好ましい。例えば、１ｍｌの全血を濾過する場合には１〜６０秒、好ましくは２〜３０秒、更に好ましくは５〜２０秒の範囲で加圧もしくは吸引の後、速やかに大気圧に戻すことが好ましい。
【００５９】
このように、本発明になる方式では、分離回収する必要のある血漿量を予め設定しておき、これに対応するガラス繊維濾紙の体積を設定し、十分な量の血液を供給した後に加圧もしくは吸引し、必要量の血漿が得られた時点、あるいは予め設定した時間を超えた時点で大気圧に戻すことにより、分析に必要な量の血漿試料が得られる。濾過で得た血漿や血清は常法に従って分析が行われるが、本発明の方法は特に乾式分析素子を用いて複数項目を分析する場合に有効である。
【００６０】
【実施例】
実施例１
▲１▼  濾過ユニットの製作
図１に示す濾過ユニットを使用した。この濾過ユニット１はフィルターホルダー２とシリンジ３からなっている。フィルターホルダー２は外径２５ｍｍ内径２０ｍｍの短円筒状をしており、フィルターを収納するフィルターホルダー本体４と該本体４に螺着する蓋体５で構成されている。フィルターホルダー本体４は、下端が開放されていて内側にはフィルター収容部６が形成され、外周面下部には蓋体５を螺着させる螺子溝が刻まれている。一方、上面は閉止されていてその中央には検体吸入口７が突出形成されている。蓋体５の内周面上部には本体４の螺子溝と螺合する螺子溝が刻まれている。蓋体５の底面は中央部が下方に膨出していてその下端にはシリンジ３のノズル８を嵌込む吸引口９が空出形成されている。
【００６１】
上記のフィルターホルダーを倒置してそこに直径２０．１ｍｍの円板に打ち抜いたガラス繊維濾紙１０（ワットマン  ＧＦ／Ｄ）を２枚重ねてセットした。この濾紙は、坪量１２２．４ｇ／ｍ2、厚さ１．３ｍｍ、密度０．０９４ｇ／ｃｍ3であった。その上に厚さ１ｍｍのセルロース濾紙１１（Ｃｙｔｏｓｅｐ社  Ｃｙｔｏｓｅｐ、直径２０．１ｍｍ）を直径１３ｍｍの穴を有する直径２０．１ｍｍの両面テープ１２で固定した。その上に孔径２μｍ、厚さ０．１５ｍｍのポリスルフォン多孔質膜１３（富士写真フイルム製ＰＳ、直径２０．１ｍｍ）を重ね、更にその上に中心に直径８ｍｍの穴を有する直径２０．１ｍｍの粘着ビニールテープ１４を圧着した。
【００６２】
▲２▼  採血
男子健常者よりヘパリン添加全血５ｍｌを採血した。ヘマトクリットを測定したところ４４％であった。
【００６３】
▲３▼  ヘマトクリット低下試薬（ＨＬ試薬）溶液の調製
硫酸リチウム１水塩（Ｌｉ2ＳＯ4・Ｈ2Ｏ）を秤量、蒸留水に溶解して、濃度が２ｍｏｌ／ｌの水溶液を調製した。
【００６４】
▲４▼  ＨＬ試薬添加全血の調製
容量２ｍｌのサンプルチューブに▲３▼で調製したＨＬ試薬溶液３０μｌを秤取し、これにヘパリン全血１．５ｍｌを添加、混合した。ヘマトクリットを測ったところ３０％であった。
【００６５】
▲５▼  血漿濾過
▲４▼で調製した全血を▲１▼で製作した濾過ユニットに接続し、およそ６００μｌ／ｍｉｎの吸引速度で２０秒間吸引した。ポリスルフォン膜上に血漿が濾過分離された。
【００６６】
▲６▼  分離血漿の回収
濾過分離された血漿をマイクロピペットで吸引、秤取した。およそ３９５μｌの血漿を分離回収できた。溶血は全く認められなかった。ＬＤＨ活性を測定したところ、ＨＬ剤なしで遠心分離したコントロールで１７３ｕ／Ｌ、ＨＬ剤添加後本法により濾過回収した血漿で１７９であり、コントロールと殆ど同じレベルであった。
【００６７】
用いたガラス繊維濾紙の体積は６２８ｍｍ3なのでその1 ／２は３１４ｍｍ3（＝３１４μｌ）である。本発明方法によれば、容易に且つ、確実にガラス繊維濾紙の体積の１／２以上の血漿を分離回収できることが確かめられた。
【００６８】
比較例１
▲１▼  Ｌｉ2ＳＯ4含浸ガラス濾紙の調製
Ｌｉ2ＳＯ4の１ｍｏｌ／ｌ 水溶液１０ｍｌを調製し、直径５０ｍｍのシャーレに入れた。ワットマン社製ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｄを直径２０ｍｍの円板に打ち抜いた。ガラス繊維濾紙を水溶液に浸漬して、およそ１ｍｌ／ｃｍ2のＬｉ2ＳＯ4水溶液で湿潤させた後、室温にて放置、ついで６０℃で３時間加熱して乾燥させた。
【００６９】
▲２▼  濾過ユニットへの組み込み
実施例１と同様にして、内径２０ｍｍの濾過ホルダー中にＬｉ2ＳＯ4を含浸、乾燥したＧＦ／Ｄ２枚を設置し、更に実施例１と同様にして、濾過ユニットを完成させた。
【００７０】
▲３▼  全血の調製
健常者から真空採血管にて５ｍｌの全血を採取し、ヘパリン添加全血とした。その１．５ｍｌをサンプルチューブに入れた。
【００７１】
▲４▼  全血の吸引濾過
実施例１と同様にして、▲２▼で作製した濾過ユニットにより全血を吸引、濾過した。およそ２３０μｌの血漿を濾過回収できたが、溶血のため真赤になっていた。血漿中のＨｂの濃度は１５０〜２００ｍｇ／ｄｌに相当するレベルであった。
【００７２】
また分離血漿のＬＤＨ活性を測定したところ、３５０ＩＵ／Ｌであった。一方Ｌｉ2ＳＯ4を加えない全血について、ＬＤＨを測定したところ１９２ＩＵ／Ｌであった。
【００７３】
比較例２
実施例１の２ｍｏｌ／ｌ Ｌｉ2ＳＯ4水溶液に代えて生理食塩水を全血に加えて、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）の低下効果を調べた。ヘパリン添加全血１．５ｍｌに生理食塩水を加えて混和後ヘマトクリットを測定した。健常者の全血（Ｈｃｔ４４％）と高ヘマトクリット全血（５４％）の２レベルについて調べた。結果は表−１の通りであった。生理食塩水を用いた場合は赤血球の収縮などの作用は起こらないので、Ｈｃｔの低下の程度は単純希釈を想定して算出した値とほぼ一致した。これらの濃度ではＨｃｔの低下効果は見られないことが確かめられた。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
実施例２
健常女子より採血し、ヘパリン添加全血２０ｍｌを得た。このもののＨｃｔを測ったところ４１％であった。その１部を遠心分離して血漿を抜き取り高いＨｃｔ値の全血を調製した。また全血に血漿のみを添加して低いＨｃｔの全血を調製した。全部でＨｃｔの異なる検体５種類（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５）を調製した。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５の検体について、２ｍｏｌ／ｌのＬｉ2ＳＯ4を全血１ｍｌあたり５０μｌ添加した。実施例１と同じ濾過ユニットを用いて減圧濾過した。但し、全血を上部から導入し、下部吸引口に５ｍｌの注射筒をセットし、８００μｌの排気量で３０秒間かけて吸引した。ガラス繊維濾紙の体積は１８５ｍｍ3（＝１８５μｌ）であった。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
比較例３
同じ濾過ユニットを用い、同じ条件で全血にＬｉ2ＳＯ4を添加しないで血漿濾過を試みた。回収血漿量はヘマトクリットが高い程、ヘマトクリット低下剤の効果が顕著であった。４８％以下では１／４〜１／２．７程度であったが、５９％では１／７、６８％では殆ど血漿は回収できなかった。また溶血の程度も無添加の場合４８％以上で微溶血あるいは高強度の溶血が観測された。
【００７８】
実施例３
実施例１と同様の実験において、２ｍｏｌ／ｌのＬｉ2ＳＯ4水溶液１５μｌを全血１．５ｍｌに添加した後、実施例１と同じ方法により血漿濾過を行ったところ、溶血のない血漿を２２８μｌ回収できた。用いた全血のＨｃｔはＨＬ剤の添加前が４８％、添加後が４２％であった。
【００７９】
このようにして分離回収した血漿を検体として富士ドライケム５５００及び富士ドライケム８００（富士写真フイルム(株)製）を用いて血漿成分を測定した。この測定値から、ＨＬ剤を添加しない全血に同濃度のＬｉ2ＳＯ4を加えてから遠心分離して得た血漿を用いて作成した検量線を用いて、表３の結果を得た。コントロールとして、ＨＬ剤を添加しなかった全血を遠心分離して得た血漿を検体として用いて測定した。測定した２３項目全てについて、コントロールと同じレベルの正確度で測定されていることが確かめられた。
【００８０】
【表３】
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【００８１】
なお、ＨＬ剤添加前の全血を濾過したところ、溶血のない血漿を分離回収することはできなかった。
【００８２】
実施例４
全血を血球と血漿に分けてから両者を混合し、Ｈｃｔが２０％、４０％、４８％、６０％になるように調整した全血検体を調整した。これを用い、実施例３と同じように処理し、日立７１５０および富士ドライケム８００電解質測定機を用いて測定した。結果を図２に示す。
【００８３】
測定した全項目について、Ｈｃｔが２０〜６０％の範囲で測定結果のズレの程度は、コントロールに対して±１０％の範囲に入っていた。また、Ｈｃｔ４８％の値を基準とした時のズレの程度も一部の項目を除いて±５％に入っていた。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、全血からの血漿分離の効率を上げ、回収血漿量を増やすことができる。また、添加する試薬を適切に選択することにより、低いヘマトクリット値の全血から高いヘマトクリット値の全血まで、簡単な濾過操作により遠心分離血漿と同じレベルの精度、正確度での測定が可能な、成分的に偏りのない血漿が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の実施例で使用した濾過ユニットの断面図である。
【図２】  Ｈｃｔ値の異なる検体を用いて濾過し、分離した血漿を用いて測定したときの精度と正確度を示す。
【符号の説明】
１…濾過ユニット
２…フィルターホルダー
３…シリンジ
４…ホルダー本体
５…蓋体
６…フィルター収容部
７，９…血液出入口
８…ノズル
１０…ガラス繊維濾紙
１１…セルロール濾紙
１２…両面テープ
１３…ポリスルホン微多孔性膜
１４…流出面積規制部材
【図１】
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【図２】
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