(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記a）〜d）の段階からなることを特徴とするＤＮＡ試料中のシトシン塩基のメチル化度の相対的定量方法。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料が重亜硫酸塩溶液と化学反応し、その中で、５−メチルシトシンとシトシンが別々に反応し、反応後、二重鎖ＤＮＡ中で異なる塩基対として挙動する、
b）フルオレッセンスで標識されたdＣＴＰ誘導体が添加されて、ＤＮＡ試料が増幅され、c）増幅されたＤＮＡ試料が少なくとも一つの固定されたオリゴマーへハイブリッド形成され、及びd）ハイブリッド形成された増幅産物のフルオレッセンスが定量的に測定される。
【請求項２】
c）段階において、増幅されたＤＮＡ試料が、少なくとも一つの固定されたオリゴマーへハイブリッド形成され、それによって、固定されたオリゴマーが、各々相補的に少なくとも一つのプライマーに増幅段階で使用されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
c）段階において、増幅されたＤＮＡ試料が、少なくとも一つの固定されたオリゴマーへハイブリッド形成され、それによって、固定されたオリゴマーが各々同一の、少なくとも一つのプライマーに、増幅段階で使用されることを特徴とする請求項１の方法。
【請求項４】
b）段階で増幅のためにＰＣＲが使用されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
b）段階でフルオレッセンスで標識されたdＣＴＰ誘導体がＣy３−dＣＴＰまたはＣy５−dＣＴＰであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
フルオレッセンス色素Ｃy３及び／またはＣy５が標識として使用されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
オリゴマーのarrayがc）段階における増幅産物のハイブリッド形成のために、b）段階のプライマーに相補的に使用されることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
b）段階における複数個のＤＮＡ断片の増幅が同時に行われることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
d）段階で測定された値を他の類似の、処理されたＤＮＡ試料のフルオレッセンスと平衡させて、この方法により、異なる組織または異なる細胞試料の相対的メチル化度についての情報を得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＤＮＡ試料中のシトシン塩基のメチル化度の相対的定量方法に関する。
【０００２】
５−メチルシトシンはeukaryotischer細胞のＤＮＡ中の頻繁に修飾される共有結合の塩基である。これは例えば、転写の制御、ゲノム印刷及び腫瘍遺伝子において、ある役割を演じる。遺伝情報の構成部分としての５−メチルシトシンの同定は、それ故、非常に興味があるものである。５−メチルシトシンの位置は、シトシンと同じ塩基対の挙動を示すので、その配列からは同定できない。更に、ＰＣＲ増幅では５−メチルシトシンを含む新しい情報が完全に失われる。
【０００３】
この問題を解決する多数の方法が公知である。その大部分の方法はゲノムＤＮＡの化学反応または酵素処理によるもので、これらにより、シトシンは５−メチルシトシンと区別される。通常行われている方法はゲノムＤＮＡと重亜硫酸塩とを反応させる方法である。これによれば、アルカリ加水分解により２段階で、シトシン塩基がウラシルに変化する[Ｓhapiro、Ｒ．，Ｃohen、Ｂ．，Ｓervis、Ｒ．，Ｎature２２７、１０４７（１９７０）]。５−メチルシトシンはこの条件下に変化しないでそのままである。ＣからＵへの変化の結果、塩基配列が変化する。この変化から、配列により元の５−メチルシトシンが確認できる（これだけがＣ−シュプールの一群を供給する）。
【０００４】
更に５−メチルシトシンを立証する、公知の可能性についての概説としては、それに属する文献と共に以下の概説論文がある[Ｒein、Ｔ．，ＤeＰamphilis、Ｍ．Ｌ．，Ｚorbas、Ｈ．，Ｎucleic Ａcid Ｒes．２６、２２５５（１９９８）]。
【０００５】
ドイツ特許公報１９７５４４８２Ａ１からは断片のメチル化についての知見は得られない。むしろ、原因となる断片を配列するのに必ずしも必須ではない構成成分を有するモデルについての知見を、その特許公報から得る。
【０００６】
Ｐaul Ｃ．Ｌ らは[Ｂiotechniques（１９９６）２１(１)１２６〜３３：Ｃytosin methylation：quantitation automated genomic sequencing and ＧＥＮＥＳＣＡＮ analysis ]で、異なる標識を施したチミンとシトシン塩基を使用した配列法を記載している。しかしこれは、ゲノム配列でもなく、電気泳動法でもない。
【０００７】
Ｙurov、Ｙ．Ｂ．et al．は[Ｈuman Ｇenetics（１９９６）９７（３）３９０〜８：Ｈigh resolution multicolor fluorescence in suti hybridization using cyanine and fluorescein dyes：rapid chromosome identification by directly fluorescently labelled alphoid ＤＮA probes]で標識の対象としてＣｙ３及びＣｙ５−dＣＴＰを使用することに関して述べている。
【０００８】
米国特許公報第５８３７８３２号には、オリゴヌクレオチッドの配列及びそのＤＮＡ試料へのハイブリッド形成が記載されている。ＤＮＡのメチル化が検出されず、また、そこに記載されている複雑な増幅などの異なる断片のハイブリッド形成も不適当であるから、第一の相補的なオリゴヌクレオチッドに含まれ、それを以って、オリゴヌクレオチッドが特異的に断片と結合している。
【０００９】
現在はオリゴヌクレオチッド配列を製造できる、いくつかの方法が公知である。これらはおおまかに第３グループのgrobに区分される。
【００１０】
１）全てのオリゴマーは通常の方法で、比較的大量に、特殊な自動合成装置で、個々に、担体上にピペットで滴下する方法で製造される。その方法では、通常の自動の精密マイクロピペットロボットが使用される。この方法の利点は、通常の標準的方法及び装置を使用することにある。これにより、高品質の配列が非常に純粋なオリゴマーで製造でき、そのことは配列で高い検知感度と信頼性が獲得できるという非常にプラスの影響を与えた。この方法の大きな欠点は経費が莫大であり、従って、製品が高価であることである。
【００１１】
２）オリゴマーはピペット滴下により、ごく少量が直接基質上で合成される。どのラスター点でも、そこに予測されるオリゴマー鎖が核酸塩基の連続鎖からなっている。ピペット滴下には１）の方法に類似した、特殊なマイクロピペットロボット、または、例えば、個々の合成装置を経て配列点ヘ通じる溝を備えた装置が使用される。
【００１２】
オリゴマーは２）の方法のように、直接基質上で合成される。目的とする正常な核酸塩基の正常なラスター点への結合が、配列を目的とする、精密なピペット滴下に代わって、完全に平行な、半導体技術に由来するホトリソグラフィー技術によって行われる。この方法はある特定の波長の光でオリゴヌクレオチッド５’−ＯＨ保護基を除去できるということに基づいている。好適な位置に照射するという手段により、ヌクレオチッド末端を精確にラスター点に反応させることができる。その点に、次段階で新しいヌクレオチッド構成成分を結合させる。ヌクレオチッド構成成分の溶液を伴う配列表面の完全な網状化で、これまで光が照射された場所に核酸塩基が結合される。未だ光が照射されていない、全ての場所は変化しないままである。所定の場所に光を照射するモデルは、基質と光源の間にマイクロホトグラフィーの白黒マスクを設置し、全てのラスター部分を遮蔽して反応せないものである。
【００１３】
この方法は高い並行性のために迅速に、効率的に処理でき、ホトリソグラフィーを使用して高い精度を達成でき、高いラスター密度を得るのに好適である。
【００１４】
オリゴマー配列の製造における技術の現状の概観は、１９９９年１月に上梓された、Ｎature Ｇenetics の別冊（Ｎature Ｇenetics Ｓupplement、Ｖolume ２１、Ｊanuary １９９９）及びそこで引用された文献に記載されている。
【００１５】
オリゴマー配列及びホトリソグラフィーのマスクデザインに関する技術の現状は例えば、米国特許５，８３７，８３２、同５，８５６，１７４  ＷＯ９８／２７４３０及び米国特許５，８５６，１０１に記載されている。
【００１６】
ＤＮＡのＰＣＲによる増幅は従来の技術である。
【００１７】
本発明の課題は従来の技術の問題点を克服するもので、ゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化度の相対的定量方法を提供することにある。
【００１８】
この課題はＤＮＡ試料のシトシン塩基のメチル化度の相対的定量方法を任意に行うもので、具体的には以下の各段階で行う。
【００１９】
a）ゲノムＤＮＡ試料を試薬で化学反応させ、５−メチルシトシンとシトシンが別の反応をし、反応により二重鎖ＤＮＡ中に異なる塩基対の形成挙動が示され、
【００２０】
b）フルオレスセンスで標識したｄＣＴＰ誘導体を添加して、ＤＮＡ試料を増幅し、
【００２１】
c）増幅されたＤＮＡを一つまたは複数の固定されたオリゴマーにハイブリッド形成する際、固定されたオリゴマーは少なくとも一つの、増幅段階で使用されるプライマーに相補的であり、d）ハイブリッド形成された増幅産物のフルオレッセンスを計量すること。
【００２２】
本発明においては、a）で試薬として重亜硫酸塩を使用する。
【００２３】
更に、本発明においては、b）で増幅用にＰＣＲを使用する。
【００２４】
本発明においては、特にb）でフルオレスセンスで標識したｄＣＴＰ誘導体はＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰである。
【００２５】
本発明においては、特にフルオレスセンス色素をＣｙ３−ｄＣＴＰ及び／またはＣｙ５−ｄＣＴＰに標識として使用する。
【００２６】
本発明においては、更に、c）における増幅産物のハイブリッド形成のためにb）のプライマーに相補的なオリゴマーを使用する。
【００２７】
本発明においては、更に、b）において、複数のＤＮＡ断片の増幅が同時に行われる。
【００２８】
d）において計量された値を、他の類似の、処理されたＤＮＡ試料のフルオレッセンスと調整して、それにより、異なる組織または細胞試料の相対的メチル化度についての情報を得る。
【００２９】
本発明はＤＮＡ試料のシトシンのメチル化度の相対的定量方法を任意に行う方法である。ＤＮＡ試料は化学的に処理され、シトシン及びメチルシトシンが別々に反応し、ただ、メチルシトシンの位置が塩基対の挙動を維持する。続いてＤＮＡが増幅され、使用されるシトシン３リン酸がフルオレスセンス標識を有する。増幅産物はハイブリッド形成によって少なくとも一つの相補的なオリゴマーのプライマーに結合し、固相は幾倍にも成長する。特定の場所に固定されたフルオレスセンスは、他の類似の、処理された試料に比較して、当面の増幅されたＤＮＡ断片におけるシトシンのメチル化度を表す相対的数値の情報を与える。特に一つの試料の多くの異なる増幅産物のハイブリッド形成が、そのフルオレスセンスモデルが、ＤＮＡ試料におけるメチル化モデルについての情報を与えるところの一つのオリゴマー配列になる。次いで、異なる試料のモデルが調節される。
【００３０】
ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は従来の技術である。特に、本発明におけるフルオレスセンスにより標識化されたＰＣＲのヌクレオチッドがそれにあたる。従って、比較的高価なフルオレスセンスによる標識化を省いて多くのフルオーレを増幅産物に入れることが可能である。Ｃｙ５−dＣＴＰ（Ｃｙ５は市販のフルオレスセンス色素である）はファルマシア（Ｐharmacia）社から入手できる。
【００３１】
本発明はＤＮＡ試料のシトシンのメチル化度の相対的定量方法である。ゲノムＤＮＡ試料は、先ず、化学的に処理される。即ち、シトシンとメチルシトシンは別々に反応するが、ただ、メチルシトシンの位置はその塩基対の挙動を維持する。先ず、重亜硫酸塩溶液で処理し、最終的にはシトシン核酸塩基と反応し、次いで、アルカリ加水分解によりウラシルに転換する。５−メチルシトシンは同じ条件下で反応しない。ＣからＵヘの変換は、メチル化されていない位置で、塩基配列が変化する。それに続いて、ＤＮＡが増幅される。そのとき使用されるシトシン３リン酸はフルオレッセンス標識が付加されている。ここで、Ｃｙ５−ｄＣＴＰを使用するのが好ましい。ＣからＵヘの変換が為されない位置にのみ、ＰＣＲ中で、Ｃｙ５−Ｃ及びフルオレッセンス標識が組む込まれ得る。組み込まれたＣｙ５−Ｃの数は、増幅されたＤＮＡ断片におけるメチル化度に比例する。対向鎖にＣｙ５−Ｃｓが組み込まれている。そこでは、重亜硫酸塩で処理された鎖中にグアニンが存在する。この構成はフルオレッセンスの検出にとって障害となる。本発明においては、この問題は個々の重要な鎖のみが、溶液から固相へ結合させられることにより、回避される。加熱による変性の後、ハイブリッド形成により、少なくとも一つのプライマーに相補的で、且つ、固定されている一つのオリゴマーに結合させられる。そして固相は引き続き、数倍に成長する。固定されている場所におけるフルオレッセンスの数値を他の類似の、処理された試料に比較して、当面の増幅されたＤＮＡ中のシトシンメチル化度の相対的数値に関する情報が与えられる。一つの試料の多くの異なる増幅産物のハイブリッド形成が、そのフルオレッセンスモデルがＤＮＡ試料中のメチル化度のモデルについての情報を与えるところの、オリゴマー配列を形成させる。オリゴマー配列は別々に合成されるオリゴマーを担体に載せるか、またはリソグラフィー技術で製造される。ここで、担体はシラン化ガラスである。
【００３２】
異なる試料のフルオレッセンスモデルはデータバンクに預けられ、調節される。特に、一個人の組織及び複数の人の組織の相対的メチル化度についての情報を得るための方法として使用する。
【００３３】
以下に実施例により本発明を説明する。
【００３４】
実施例１：シトシンメチル化度の相対的定量方法の補正
下記の実施例は多数の薬剤抵抗（ＭＤＲ１）及び多数の抵抗たんぱく質（ＭＲＰ３）の各遺伝子の断片を例として引用した、増幅された核酸断片のシトシン塩基のメチル化度の相対的定量方法についてのものである。
【００３５】
先ず、最初に、ガラス基質が、従来の技術に従って、目的とするオリゴヌクレオチッドがこれに結合するように、化学的に処理される。基質上の異なるオリゴヌクレオチッドの調製により、他のヌクレオチッド配列が製造される。そのためには、官能基を含むアルキル鎖を有するシランで基質がシラン化される。
【００３６】
続いて、その表面に、二官能性連結剤、例えば、フェニレンジイソチオシアネートまたはアジピン酸−ジ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル）エステルが付加される。この連結剤は塩基性下で、オリゴヌクレオチッドを共有結合させる。この場合のオリゴヌクレオチッド配列は、下記の如くであり、増幅過程で使用される相補的なプライマーであり、自動ピペットまたはＳpottenにより基質上の一定の位置まで運ばれる。
ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＣＣ（ＭＲＰ３）、
ＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣＲＣＴＣＣＣＡ（ＭＲＰ３）及び
ＣＴＡＣＡＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡ（ＭＤＲ１）、
ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  Ｃ（ＭＤＲ１）。
【００３７】
核酸断片のシトシン塩基のメチル化度の相対的定量方法には、未知のメチル化試料が対比できるように二つのメチル化または非メチル化核酸断片（ＭＤＲ１またはＭＲＰ３のそれぞれ）が補正用に使用される。
【００３８】
実施例２
非メチル化試料の作製
非メチル化試料の場合は、制限酵素Ｍss１で切断されるゲノムＤＮＡ試料（１８ng）を嵌めこむ。最初に、２５ピコモルずつの下記の特殊なプライマーを下記の方法で４０サイクル以上で増幅させる。
ＣＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧ（ＭＤＲ１）、
ＴＧＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＣＡＴＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣ（ＭＤＲ１）、
９６．０℃、１０分；９６．０℃、３０秒；５８．０℃、１：１５分；７２．０℃、２分；７２．０℃、１５分。
【００３９】
第２の試料は同様に２５ピコモルずつの、下記の特殊なプライマーが下記の条件で４０サイクル以上で増幅される。
ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  ＣＣ（ＭＲＰ３）、
ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣ（ＭＲＰ３）。
９６．０℃、１０分；９６．０℃、１分；５５．０℃、４５秒；７２．０℃、１：１５分；７２．０℃以上で、１０分。
両増幅産物は重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）及びラジカル捕捉剤と高温下で化学反応する。重亜硫酸塩の反応は全ての非メチル化シトシン塩基をウラシルに変える。変化した増幅産物の精製には、これをＣ１８の固体相に結合させ、化学物質による洗浄により脱離させる。続いてＤＮＡが極性溶媒、例えば、アセトニトリルまたは水により、溶出される。重亜硫酸塩で処理された増幅産物のアルカリ加水分解により、直接、新たに、特殊な増幅過程の前に、フルオレスセンスで標識されたヌクレオチッドが組み込まれる。塩基対の長さ６３３bp（ＭＤＲ１）及び６４０bp（ＭＤＲ３）の断片が増幅されるが、これらは特定のＣy５−dＣＴＰの組込みにより、フルオレスセンスで標識されるものである。
【００４０】
両遺伝子（ＭＤＲ１）及び（ＭＤＲ３）の増幅は同様に、下記のプライマーの２５ピコモルずつが０．５〜０．７５ミリモルのＣy５−dＣＴＰとＰＣＲ中で下記の条件下で行われる。
ＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧ（ＭＤＲ１）、
ＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣ（ＭＤＲ１）、
ＡＡＣＴＣＣＣＣＡＡＴＡＣＴＡＣＡＡＣ（ＭＲＰ３）、
ＴＧＧＧＡＧＹＧＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴ（ＭＲＰ３）。
ＭＤＲ１：９６．０℃、２０分；９６．０℃、３０秒；５４．６℃、１：１５分；７２．０℃、２分；７２．０℃、１５分、で４０サイクル以上。ＭＲＰ３：９６．０℃、２０分；９６．０℃、３０秒；６１．７０℃、１：１５分；７２．０℃、２分；７２．０℃、１５分、で４０サイクル以上。
【００４１】
実施例３
メチル化測定試料の作製
ゲノムＤＮＡのメチル化のために、1μｇのＤＮＡを３７℃で１時間１ユニットのメチラーゼＳss１で培養した。次いで酵素が失活され、メチル化された試料はメチラーゼの作用で特異的に増幅される。
【００４２】
両増幅産物は重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩）及びラジカル捕捉剤と高温下で化学反応する。重亜硫酸塩の反応は、全ての非メチル化シトシン塩基をウラシルに変える。変化した増幅産物の精製には、これをＣ１８の固体相に結合させ、化学物質による洗浄により脱離させる。続いてＤＮＡが極性溶媒、例えば、アセトニトリルまたは水により、溶出される。重亜硫酸塩で処理された増幅産物のアルカリ加水分解により、直接、新たに、特殊な増幅過程の前に、フルオレスセンスで標識されたヌクレオチッドが組み込まれる。実施例２と同様に限定された断片が増幅される。
【００４３】
下記の特殊なプライマーの２５ピコモルずつが０．５〜０．７５ミリモルのＣy５−dＣＴＰとＰＣＲ中で反応する。
ＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧ（ＭＤＲ１）、
ＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＴＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣ（ＭＤＲ１）、
ＡＡＣＴＣＣＣＣＡＡＴＡＣＴＡＣＡＡＣ（ＭＲＰ３）、
ＴＧＧＧＡＧＹＧＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴ（ＭＲＰ３）
【００４４】
実施例４
増幅産物のハイブリッド形成
増幅産物は公知の方法でのハイブリッド形成より、対応するシトシンを含まないプライマーに相補的に表面結合するオリゴマーに固定され、固相は相補的な増幅産物を除去するために複数回洗浄される。
【００４５】
表面に結合した、この実施例では下記のような配列の、オリゴヌクレオチッド（オリゴマー配列）は、そのフルオレッセンスにより、６３５nmであることが証明される。
ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＡＴＡ  ＣＴＡ  ＣＡＡ  ＣＣ（ＭＲＰ３）、
ＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣＲＣＴＣＣＣＡ（ＭＲＰ３）及び
ＣＴＡＣＡＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡ（ＭＤＲ１）、
ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＣＴＡ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  Ｃ（ＭＤＲ１）。
それには市販のフルオレッセンススキャナ（例えば、ジェネピックス４０００、Ａxon Ｌaboratories製商品名）が使用される。
【００４６】
実施例５
評価
システムの補正の後、非メチル化またはメチル化された最初の供試試料により、その他の試料の評価も可能になる。異なる増幅産物のメチル化の間の本質的な差異は、非メチル化試料に対応するが、これまで行われたゲノムＤＮＡの増幅なしに、解明され、それで、個々の、評価対象の試料の増幅産物が、対比可能な濃度範囲内にある限り、配列の一定の場所が、相対的に、他の、明確に高められるか、または、低められたフルオレッセンス値を示すことが特に目立つ。
【００４７】
対比可能な濃度の問題は、概して、この方法で、唯、相対的、極限的差異が把握され（これは殆ど、完全なＣpＧ島のメチル化の場合に与えられるが）、他の色素を有するプライマーのフルオレッセンス標識により行われる（例えば、Ｃy３）。この場合、試料の評価は、精確に、同じもの、即ち、唯一Ｃy３がラベルされたプライマーで行われる。個々の増幅産物の６３５nm（Ｃy５）におけるシトシンのメチル化度の相対的定量が行われる前に、５３２nm（Ｃy３）における個々の場所への強さは、先ず、個々の増幅産物の濃度の調整に役立つ。Ｃy３値は、その際、補正ファクターとして使用される。フルオレッセンス定量値の評価方法は専門家が熟知している。