(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンを含有する溶液中での逆転写反応に供するためのRNA の45〜90℃の温度範囲での熱安定性の改良方法であって、
前記金属イオンは、マグネシウムイオン又はマンガンイオンであり、
前記溶液に、前記金属イオンに対して等モルを超えかつ２モル倍までの１種又は２種以上のデオキシヌクレオシド トリフォスフェートを含有させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記溶液がさらに１種又は２種以上の多価アルコールを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多価アルコールがグリセロールである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
金属イオンを含有する溶液中での逆転写反応に供するためのRNA の45〜90℃の温度範囲での熱安定性の改良方法であって、
前記金属イオンは、マグネシウムイオン又はマンガンイオンであり、
前記溶液に、前記金属イオンに対して等モル以上かつ２モル倍までの１種又は２種以上のデオキシヌクレオシド トリフォスフェート及びグリセロールを含有させることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記溶液がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、RNA の熱安定性の改良方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの遺伝子配列を解明するプロジェクトが進行されているが、その中で、遺伝子を鋳型としてmRNAを作成し、さらに、作成されたmRNAを鋳型として完全長cDNAを得ることが試みられている。一方、限られた条件下では、Superscript IIのような逆転写酵素（RNA 依存性DNA ポリメラーゼ）を用いることで、in vitroでmRNAからcDNAを得ることができることも知られている。
【０００３】
上記mRNAから完全長cDNAを得るために上記逆転写方法を利用することが考えられるが、従来の逆転写方法では、mRNAから完全長のcDNAを得ることができなかった。
本発明者の検討によれば、Superscript IIの至適温度である常温付近では、タンパク質の２次構造と同様に、長鎖のmRNAは１本のmRNAの鎖内で２次構造を形成してしまい、２次構造を形成している配列に対しては逆転写酵素が作用せず、その結果、mRNAの末端まで逆転写が行われないためである。
【０００４】
即ち、現在の技術的限界は、mRNAの安定な２次構造の為、反応が早期に終了し転写単位の5'末端まで到達する効率が非常に低いことである。この技術的な限界はライブラリーの品質に影響を与える。何故なら殆どのクローンが3'端のみを持ち、完全長を持たない為である。このステップを克服する為、今までにいくつかの試みがなされてきた。例えば、第一鎖の合成の前に、mRNAの２次構造を解く為に70℃の前処理をすることが挙げられる。また、mRNAの熱処理の代わりに水酸化メチル水銀で処理することも可能である。これらの方法は第一鎖合成の効率を上げるのに極めて効果的であるにも拘わらず、完全長cDNAを効率良く回収するには十分でなかった。特に数Kbp 以上の長いmRNAを逆転写する場合には、特に効率が悪い。
【０００５】
また、mRNAの２次構造が解ける温度条件で使用可能な耐熱性の逆転写酵素であるTth ポリメラーゼを用い、昇温下でmRNAを逆転写することも試みられた。しかるに、Tth ポリメラーゼの活性化に必要なマンガンイオンの存在下かつ昇温下では、mRNAが短時間の内に切断さてしまい、数Kbp 以上のcDNAを合成することはできなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明者らは、上記２次構造に起因する問題を解決して完全長cDNAを得るべく検討し、Superscript IIのような常温使用の酵素の耐熱性と熱活性化の方法を新たに開発した。その結果、mRNAが１本鎖の状態（２次構造を形成しない状態）にある比較的高い温度で逆転写を行うことができるようになった。
しかるに、比較的高い温度とすると、反応液中にマグネシウムイオンのような金属イオンが含まれる場合、前記マンガンイオンの場合と同様にmRNAが切断されてしまい完全長のcDNAを得ることができないことがさらに判明した。マグネシウムイオンは逆転写酵素Superscript IIの活性化に必須のイオンであり、Superscript IIによる逆転写のためには必須である。さらに、上記分解は、Superscript IIによる逆転写の緩衝剤として一般に使用されるトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔以下、トリスという〕の共存下では顕著であった。
【０００７】
そこで本発明の目的は、マグネシウムイオンのような逆転写酵素の活性化に必要な金属イオンを含有する反応液中、比較的高い温度下でも、RNA を安定に存在させることができる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、金属イオンを含有する溶液中でのRNA の熱安定性の改良方法であって、前記溶液に金属イオンに対するキレート剤を含有させることを特徴とする方法に関する。
本発明の好ましい態様の１つは、金属イオンを含有する溶液中でのRNA の熱安定性の改良方法であって、前記溶液に金属イオンに対するキレート剤と多価アルコールを含有させる方法である。この方法によれば、RNA の熱安定性がさらに高まる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下本発明について説明する。
本発明の方法は、マグネシウムイオンのような逆転写酵素の活性化に必要な金属イオンを含有する反応液に前記金属イオンに対するキレート剤を存在させることを特徴とする。
酵素は活性化のため金属イオンを必要とすることがあり、逆転写酵素であるSuperscript IIは、活性化のため、金属イオンとしてマグネシウムイオンを必要とする。ところが、マグネシウムイオンを含む溶液中、特にトリス(Tris)緩衝液中、比較的高い温度条件下で逆転写反応を行うと、mRNAの切断が進み、完全長のcDNAを得ることが困難である。
【００１０】
それに対して、本発明の方法では、金属イオンを含み逆転写酵素の活性は維持しながら、かつmRNAの切断を阻止できる方法として、金属イオンに対するキレート剤を存在させる。但し、逆転写酵素の活性化のための金属イオンを完全にキレートしてしまうと逆転写酵素が活性を示さなくなる。そこで、キレート力の比較的強い、例えばＥＤＴＡのような強いキレート剤を用いる場合には、金属イオンに対して当量未満のキレート剤を用いることが適当である。また、キレート力の比較的弱いキレート剤を用いる場合には、金属イオンに対してほぼ当モル量またはそれ以上、例えば、２モル倍までのキレート剤を用いることが適当である。但し、酵素活性に必要なマグネシウムやマンガン等の金属イオンの至適濃度を調節する為、比較的弱いキレート剤を用いることが好ましい。
【００１１】
キレート力の比較的弱いキレート剤としては、例えば、デオキシヌクレオシドトリフォスフェート(dNTP)を挙げることができる。キレート剤としてデオキシヌクレオシド トリフォスフェートを使用する場合は、金属イオンに対して当量を添加することが適当である。従って、キレート剤の添加量は、対象となる金属イオンに対するキレート力を考慮して、逆転写酵素活性は維持でき、かつmRNAの切断も阻止できる量を適宜決定できる。尚、デオキシヌクレオシド トリフォスフェートはdATP、dGTP、dCTP、dTTPのいずれか１種を使用しても或いは２種以上を併用してもよい。また、dATP、dGTP、dCTP、dTTPの４種を併用しても良い。
【００１２】
本発明の方法においては、上記のようなキレート剤に加えて、多価アルコールを補助剤として添加することでさらにRNA の安定性を向上させることができる。多価アルコールとしては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
【００１３】
以上は、逆転写酵素がSuperscript IIである場合について主に説明したが、他の金属イオンを必要とする逆転写酵素についても、同様にキレート剤を使用することで、逆転写酵素の活性を維持しつつRNA を熱安定化することができる。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明について詳細に説明する。
実施例１
金属イオン含有バッファーにおけるmRNAの安定性（dNTPの付加）
バッファー（50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2）に幾つかの添加剤を添加した場合のRNA の安定性について検討するため、65℃でT7 RNAポリメラーゼでin vitro転写されたRNA を用い、下記の組成のバッファー中でインキュベーションした。制限酵素Notlによる切断により直線状に開裂したpBluescript II SK をT7 RNAポリメラーゼでin vitro転写することによりRNA を調製した。この反応のプライマーにはpBluescript II SK の使用説明に書いてあるSKプライマーを用いた。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
インキュベーション後のRNA の切断を見る為に検体をSambrookらが記載しているRNA アガロースゲル泳動に供した（Molecular Cloning, The second edition pp 7.43-7.45）。ゲルはエチジウムプロマイドで染め、RNA の切断の程度の評価はリポゾームRNA のバンドの相対的強度を比較することにより評価した。アガロースゲル泳動の結果（レーン１〜７）を図１に示す。
【００１７】
レーン１に示すように、高濃度フリーのマグネシウムイオン（フリー Mg2+ ) の下、つまりRNA を50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2  15％(v/v) グリセロールでインキュベーションしたときには、グリセロールはRNA を切断から守るのに十分働かなかった。事実、切断の程度は50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2、グリセロール非存在下で処理したもの（レーン２）と同程度であった。
レーン３に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2, 2mM dNTPで処理してもRNA の切断を十分には防ぎ切れなかった。
一方、レーン４に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2, 3mM dNTP（NTP とＭｇ2+は同一モル濃度) の条件下ではRNA の切断を部分的に防止することができた。
さらに、レーン５に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2, 4mM dNTPの存在下、つまりＭｇ2+よりdNTPが 1mM多く含まれている条件下では、RNA は非常に安定であったが、逆転写酵素の活性はやや下がった。
そこで、レーン６に示すように、50mM Tris pH8.3, 3mM MgCl2, 3mM dNTP (NTP とＭｇ2+は同一モル濃度) に15％グリセロールを加えると、逆転写酵素活性は完全に保たれたままRNA も切断を受けなかった。
レーン６で使用した条件下ではRNA の安定性は、レーン７に示す滅菌水の安定性と殆ど変わらなかった。
【００１８】
以上のように、キレート剤としてdNTPを緩衝液中では、65℃という高温下でかつマグネシウムイオンの存在下においてもRNA の安定性が維持されている。
【００１９】
実施例2
逆転写酵素の耐熱化による逆転写効率の向上
上記レーン６で使用した新しい条件下において、逆転写活性を見る為、T7 RNAポリメラーゼでin vitro転写されたRNA を鋳型RNA として用い、それからcDNAを合成し、その産物に関して評価した。in vitroで転写されたRNA を鋳型にして変性ゲル電気泳動を用いると、逆転写反応の効率を各々の検体で比較でき、また、早期の逆転写の終結や反応効率の減少を示す非特異的転写の終結を評価できる。
【００２０】
コントロールとして、逆転写の標準バッファーの条件は次のものを用いた。
50mM Tris-HCl pH8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mMジチオスレイトール, 各dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0.75mM。
上記標準バッファーに 1μg 鋳型RNA, 400ngプライマー(20mer SK プライマー, CGCTCTAGAACTAGTGGATC),  とsuperscript II 200unitを20μl に調整する。0.2 μl の [α-P32]dGTP を逆転写産物標識の為に用いた。その他の全ての基質を入れる前に、RNA とプライマーの混合検体は65℃にインキュベートされた。その後の反応は42℃１時間で実行した。反応産物は変性アガロース電気泳動法に供され、完全長cDNAの回収率と、短い不完全伸長による産物との割合を調べる為にオートラジオグフィで電気泳動パターンを調べた。結果を図２のレーン１に示す。
尚、逆転写酵素superscript IIは、上記標準バッファー条件下では50℃以上の温度にすると失活した。
【００２１】
オリゴ糖類を添加すると酵素反応が安定化されることを示す為に、逆転写のバッファー条件を次のように設定した。
50mM Tris-HCl pH8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM  ジチオスレイトール, 各dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0.75mM,  20 ％(w/v) トレハロース、20％(v/v) グリセロール。
上記バッファーに 1μg 鋳型RNA, 400ngプライマー(20mer SK プライマー) と200unit のsuperscript IIを24μl の水溶液中で反応させた。0.2 μl の [α-P32]dGTP を逆転写産物標識の為に用いた。この条件下では逆転写酵素superscript IIは標準温度 (42℃) のコントロール反応より高い活性を有した。酵素活性はプライマーと鋳型RNA を37℃で２分間アニールした後、60℃で測定した。
【００２２】
反応産物は上記と同様に変性アガロース電気泳動法に供され、完全長cDNAの回収率と、短い不完全伸長による産物との割合を調べる為にオートラジオグフィで電気泳動パターンを調べた。結果を図２に示す。
レーン１に示すように、標準バッファー42℃での条件下では、途中の特異的な部分で逆転写が止まった産物や非特異的に逆転写が停止した産物がみられる。
レーン２に示すように、同じく42℃においては20％トレハロース20％グリセロールを加えてもこれらの途中で停止した産物は同様にみられた。
レーン３に示すように、60℃に温度を上げると、途中で合成反応が停止した産物は極めて少なくなり、完全長が合成されている。
レーン５に示すように、レーン３の条件にさらに0.125 μg/μl のＢＳＡを加えると、更に酵素活性が安定化した。しかし、20％トレハロース20％グリセロールを添加せず、ＢＳＡのみでは酵素の耐熱化は十分ではなかった。
レーン４に示すように、レーン３の条件にさらにtriton X100 を0.05％加えると、途中で停止した不完全逆転写反応物はさらに減少した。しかし、逆転写酵素全体の活性がやや低下した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１で得られたアガロースゲル泳動結果を示す図面に代わる写真。
【図２】  実施例２で得られたアガロースゲル泳動結果を示す図面に代わる写真。
【図１】
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【図２】
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