(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端と融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパク  質であって、前記カルボキシ末端部が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１６１番の配列を含んでなるハイブリッドタンパク質。
【請求項２】
アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端と融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパク  質であって、前記カルボキシ末端部の配列が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１５３番の配列であるハイブリッドタンパク質。
【請求項３】
アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ末端部が緑膿菌外膜タンパク質Ｆの全長を含んでなるハイブリッドタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質をコードしている核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸の発現を原核細胞又は真核細胞中で生じさせることを含んでなる請求項１〜３いずれか一項に記載のハイブリッドタンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、アミノ末端で、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ又はＯＭＰＦ）のカルボキシ末端部のカルボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩ又はＯＭＰＩ）を含んでなるハイブリッドタンパク質、並びにこのハイブリッドタンパク質のモノクローナル又はポリクローナル抗体に関する。ハイブリッドタンパク質並びにハイブリッドタンパク質の抗体の両方は、実験動物又はヒトへの緑膿菌の感染を防止することができる。
【０００２】
背景技術
緑膿菌は、日和見性グラム陰性病原体である。これは、とりわけ熱傷並びに移植又は癌患者を含む他の免疫日和見患者における院内感染の主要な経路である。したがって、緑膿菌は、ヒト用薬剤における「問題微生物」とみなされている。
いままで、緑膿菌に対するワクチンの開発に多くの努力がなされてきた。例えば、ＥＰ−０２９７２９１では、外膜タンパク質Ｆの完全アミノ酸配列だけでなく、ＯｐｒＦをコードするヌクレオチド配列も開示されている。ＥＰ−０３５７０２４では、外膜タンパク質Ｉの完全アミノ酸配列及びさらにはＯｐｒＩをコードするヌクレオチド配列が示されている。さらに、上記両方のタンパク質の場合、動物又はヒト発端者（ｐｒｏｂａｎｄ）に対して、緑膿菌に対する免疫保護を付与するのに有用なことがあることが示された。
しかしながら、致死緑膿菌感染に対するワクチン法は、依然として改良が必要とされている。
【０００３】
【発明の概要】
驚くべきことに、本発明者等は、ＯｐｒＩがそのＮ末端においてＯｐｒＦのＣ末端部と連結しているハイブリッドタンパク質が、ＯｐｒＩ若しくはＯｐｒＦを含んでなる融合タンパク質単独又は後者の融合タンパク質の混合物よりも顕著に免疫原性があることを見出した。
即ち、本発明は、アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ末端部が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１６１番配列を含んでなるハイブリッドタンパク質に関する。好ましい実施態様では、前記カルボキシ末端部の配列が配列番号４のアミノ酸配列の１〜１５３番の配列である。
【０００４】
さらに、本発明は、アミノ末端において、緑膿菌外膜タンパク質Ｆのカルボキシ末端部のカルボキシ末端に融合している緑膿菌外膜タンパク質Ｉを含んでなるハイブリッドタンパク質であって、前記カルボキシ末端部がＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ３及びＳＥＥ４からなる群から選択された少なくとも一種の表面露出Ｂ細胞エピトープを含んでなるハイブリッドタンパク質に関する。これらのＢ細胞エピトープは、ＯｐｒＦの以下のアミノ酸（ａａ）位置に位置している。ここで、ＳＥＥ１はａａ２１２〜２４０、ＳＥＥ２はａａ２４３〜２５６、ＳＥＥ３はａａ２８５〜２９８及びＳＥＥ４はａａ３３２〜３５０である（アミノ酸の位置は実施例１及びＨｕｇｈｅｓ等（１９９２）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０、第３４９７〜３５０３頁参照）。
本発明の別の実施態様では、上記ハイブリッドタンパク質の少なくとも一つを含んでなるワクチンが提供される。
【０００５】
さらに、本発明は、上記ハイブリッドタンパク質の一つ以上のモノクロ−ナル又はポリクロ−ナル抗体に関する。これらの抗体は、緑膿菌による感染に対する受動的防御を被験者に付与するためにワクチンに使用することもできる。
本発明のさらなる態様によれば、上記ハイブリッドタンパク質をコードする核酸が提供される。
さらに、本発明は、原核細胞又は真核細胞において本発明に係るハイブリッドタンパク質をコードしている上記核酸を発現させることを含んでなる上記ハイブリッドタンパク質の製造法に関する。
【０００６】
【発明の具体的説明】
本発明を、以下より詳細に説明する。
以下では、微生物源及びＤＮＡ源だけでなく以下の実施例で使用した方法及び例えば本発明を実施するのに有用とみなされる方法も示す。
【０００７】
アミノ酸配列等  ＯｐｒＦのカルボキシ末端部のアミノ酸配列は配列番号４に記載されている。上記ＳＥＥ１、ＳＥＥ２、ＳＥＥ３及びＳＥＥ４は、それぞれ、配列番号４のアミノ酸配列の２３〜５１番、５４〜６７番、９６〜１０９番、及び１４３〜１６１番の各配列に対応する。また、後記するＤ１（ａａ１９０〜２１３）は、配列番号４のアミノ酸配列の１〜２４番の配列に対応する。更にこれらアミノ酸配列をコードする塩基配列は配列番号３に記載されている。また、シグナル配列を含まないＯｐｒＩをコードする塩基配列及びそのアミノ酸配列は配列番号１及び２に記載されている。
【０００８】
微生物
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＳｃｈｅｍｅセログループＩ（ＡＴＣＣ３３３４８）を、Ａ．Ｂａｕｅｒｎｆｅｉｎｄ、Ｍａｘ．ｖｏｎ  Ｐｅｔｔｅｎｋｏｆｅｒ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ、ミュンヘン大学から入手した。バクテリアは、Ｆｉｎｋｅ，Ｍ．等（１９９０），Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５８、第２２４１〜２２４４頁に記載されているようにして成長させ且つ調製した。組換え体タンパク質の発現については、大腸菌Ｋ−１２Ｗ３１１０  ｌａｃｌＱＬ８を使用した。酵母におけるＯＰＲの発現については、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＨＴ３９３（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｐｒａ１，ｐｒｂ１，ｐｒｃ１，ｐｒｅ１，ｃｐｓ１）を使用した。
【０００９】
ＤＮＡ源
ＤＮＡ源として３種の組換えプラスミドを使用した。
ｐＦＳａｕｌ：アミノ酸位置５７〜３５０のタンパク質のＣ末端をコードしている緑膿菌外膜タンパク質Ｆ遺伝子の１．０ｋｂ  Ｓａｕ  ３Ａｌ断片を含んでいるｐＵＣ１９由来のプラスミド（Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｍ．等（１９８８）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０、第１５５〜１６２頁）。
ｐｌＴａｑ１：完全ＯｐｒＩ遺伝子を有する６２６ｂｐＴａｑｌ断片を含むｐＵＣ１９由来プラスミド（Ｄｕｃｈｅｎｅ，Ｍ．等（１９８９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１、第４１３０〜４１３７頁）。
ｐＧＥＸ−２ａ：ベクターｐＴＲＣから得たポリリンカーを導入することにより変更したベクターｐＧＥＸ−２Ｔ由来の発現ベクター。
ベクターｐＧＥＸ−２ａはｔａｃプロモーターを含み、その後に２６ｋＤａ日本住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、トロンビンの開裂部位及びｐＴＲＣ特異的ポリリンカー領域が続いている。
【００１０】
合成ペプチドに対して誘発した抗血清の特徴付け
ＯｐｒＦから得たアミノ酸領域１９０〜２１３（Ｄ１）、２１２〜２４０（Ｄ２、ＳＥＥ１）、２３９〜２５０（Ｄ３）、２８４〜３１６（Ｄ４）及び３３２〜３５０（Ｄ５、ＳＥＥ４）を表す合成ペプチドを、Ｒｏｕｓｓｉｌｈｏｎ，Ｃ．Ｅ．等（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５、第１４９〜１５４頁に記載のようにして合成した。ウサギを、リンパ節付近の異なる８箇所に、完全フロイントアジュバントにＫＬＨ複合ペプチド２００μｇを添加したもので皮下免疫し、２週間後、不完全フロイントアジュバントに複合体４００μｇを添加したもので再免疫した。これらの動物に、最初の免疫から６週間後及び９週間後の２回、複合体１５０μｇ及び１００μｇを静脈内にブースター注射した。ペプチドに対する抗体価を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５（ＰＢＳ）にペプチドを１ｍｌあたり５ｎｇ添加した溶液を室温で一晩塗布したプレートについて、ＥＬＩＳＡにより測定した。プレートを、０．０５Ｍクエン酸及び０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で３回洗浄した後、シリカゲルで３日間乾燥した。ウサギ血清を１：１６０に希釈し、大腸菌タンパク質で飽和した。組換えＧＳＴ融合タンパク質を用いたウエスタンブロッティング解析及び完全な緑膿菌セログループ１１（ＡＴＣＣ３３３５８）に対する免疫螢光測定を、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら（１９８４）Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎ．１、第３〜８頁およびＳｃｈｎｏｒｒ，Ｊ．Ｂ．ら（１９９１）、Ｖａｃｃｉｎｅ９、第６７５〜６８１頁に報告されている方法により実施した。
【００１１】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質としてのＯｐｒＦ及びＯｐｒＩの発現
ＯｐｒＦ遺伝子の塩基５６８〜５９４番に相当する５´端にＳａｃｌ制限部位を有するオリゴヌクレオチドｐ１（５´−ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＧＡＣ−３´）及びＯｐｒＦ遺伝子の塩基１０２８〜１０５３番に相補的な５´端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するｐ２（５´−ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＣＧＧ−３´）並びにプラスミドｐＦＳａｕｌ１０ｎｇを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｇｅｎ−Ａｍｐ  Ｋｉｔによりポリメラーゼ連鎖反応を行って５００ｂｐ断片を得た。増幅断片をＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターｐＧＥＸ−２ａに導入して、アミノ酸１９０〜３５０のポリンＯｐｒＦのＣ末端をコードするプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦを得た。ＯｐｒＩ遺伝子のコード領域の塩基６１〜８７に相当する５´端のＮｃｏｌ制限部位を有するｐ３（５´−ＣＧＴ  ＡＣＣ  ＡＴＧＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＧＡＡＧＣＴ−３´）及びＯｐｒＩ遺伝子のコード領域の塩基２３１〜２５５に相補の５´端にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するｐ４（５´−ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣ  Ｃ−３´）並びにプラスミドＤＮＡ  ｐｌＴａｑ１  １０ｎｇをポリメラーゼ連鎖反応に使用して２１５ｂｐ断片を増幅した後、制限酵素Ｎｃｏｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理して、発現ベクターｐＧＥＸ−２ａの対応部位に導入して、ＯｐｒＩのアミノ酸２１〜８３をコードしているプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＩを得た。
【００１２】
ＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ−及びＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブッリド遺伝子の構築
オリゴヌクレオチドｐ１（上記参照）及びｐ５（５´−ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＧ  ＡＣＧ  ＧＴＴ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＧＣＧ−３´）（ＯｐｒＦ遺伝子の塩基１００３〜１０２６に相補）並びにプラスミドｐＦＳａｕ１  １０ｎｇを使用して４７０ｂｐＯｐｒＦ断片を増幅した。第２ポリメラーゼ連鎖反応を、プラスミドｐｌＴａｑ１  １０ｎｇ並びにオリゴヌクレオチドｐ４（上記参照）及びｐ６（５´−ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＡＴＣ  ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＧＣＴ−３´）（上記ヌクレオチドの１〜３０番はＯｐｒＦ遺伝子の塩基９９７〜１０２６に相当し、上記ヌクレオチドの３１〜５７番はＯｐｒＩコード領域の塩基６１〜８７に相当する）を用いて実施した。これにより、２４０ｂｐ断片が得られた。
【００１３】
得られたＤＮＡ断片並びにオリゴヌクレオチドｐ１及びｐ４の両方１５０ｎｇを用いて、Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．等（１９８９）、Ｇｅｎｅ  ７７、第６１〜６８頁に記載されているような第三ポリメラーゼ連鎖反応を行った。得られた６６０ｂｐ断片を、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターｐＧＥＸ−２ａに導入して、ＯｐｒＦのアミノ酸１９０〜３４２及びＯｐｒＩのアミノ酸２１〜８３をコードしているプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩを得た。オリゴヌクレオチドｐ３及びＯｐｒＩ遺伝子から得たコード領域の塩基２２３〜２４９に相補の５´端にＳａｃＩ制限部位を有するｐ７（５´−ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＴＣＡＧ  ＣＡＴ  ＧＣＧ−３´）及びプラスミドｐｌＴａｑ１  １０ｎｇを使用して２１０ｂｐ断片を増幅し、それを制限酵素ＮｃｏＩ及びＳＡｃＩを用いてベクターｐＧＥＸ２ａに導入した。得られたプラスミドを酵素ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して、対応の酵素を用いて、プラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦの消化により得た４９０ｂｐ断片を導入した。プラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦは、ＯｐｒＩから得たアミノ酸２１〜８３及びＯｐｒＦから得たアミノ酸１９０〜３５０をコードしており、これらはＳａｃＩクローニング部位に導入された２アミノ酸リンカーにより分離されている。
【００１４】
大腸菌における組換えタンパク質の発現及び精製
４種のプラスミドｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ、ｐＧＥＸ−Ｏｐｒｌ、ｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒｌ及びｐＧＥＸ−Ｏｐｒｌ−ＯｐｒＦを用いて、大腸菌Ｋ−１２株Ｗ３１１０ｌａｃＩＱＬ８を形質転換した。大規模抗原産生のために、プラスミドを入れた５リットルバクテリア培養をＯＤ６６０＝１まで成長させ、緑膿菌特異的組換え抗原の発現を、イソプロピルチオガラクトシドにより誘発させた。細胞の分裂後、４種の異なるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質が水溶液に溶解することが分かった。したがって、４種の融合タンパク質を、非変性条件下で粗バクテリア溶解産物からアフィニティークロマトグラフィーにより純度約８０％に精製できた。
【００１５】
活性免疫及び保護実験
４グループ（Ａ〜Ｄ）の６８匹雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０〜１２週齢）の各々に、抗原：ＧＳＴ（Ａ）、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ＋ＧＳＴ−ＯｐｒＩ（Ｂ）、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ（Ｃ）又はＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ（Ｄ）１００μｇをアジュバント“ＡＢＭ２  ｃｏｍｐｌｅｔｅ”（Ｓｅｂａｋ、Ａｉｄｅｎｂａｃｈ）１００μｌに懸濁したものを０日目に投与した。等量の抗原をＡｌ（ＯＨ）３  １００μｌに懸濁したものを、１４日目、２８日目及び４２日目にブースター注射した。４９日目に、尾部静脈から放血して血清を採取し、各グループからのマウス７〜１０匹のプール血清における抗体価を測定した。４日後、全ての動物に、免疫抑制処理を施した。免疫抑制のために、マウスに、体重１ｇ当たりシクロホスファミド（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ国ハイデルベルグ）１５０μｇをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．２５ｍｌを添加したものを、５３日目、５５日目、５７日目の３回注射した。５８日目に、各抗原グループを、４つのサブグル−プＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ（各サブグル−プに１６〜１７匹の動物）に分けた。グループＡ〜Ｄのマウスには、腹腔内に、５×１０１（サブグル−プＩ）、５×１０２（サブグル−プＩＩ），５×１０３（サブグル−プＩＩＩ）又は５×１０４（サブグル−プＩＶ）ＣＦＵの緑膿菌セログループ１を投与した。１５匹のさらなる非免疫マウスに、バクテリア抗原投与なしで免疫抑制のみを行った。この対照グループを使用して、白血球減少症の状態の確認及び非特異的感染の排除を行った。全ての生存動物を、感染後１０日間監視した。
【００１６】
酵母における組換えＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの発現及び精製
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける緑膿菌外膜タンパク質の発現のために、酵母／大腸菌シャトルベクターｐＹｅｐｓｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，Ｃ．等（１９８７）ＥＭＢＯ．Ｊ．６、第２２９〜２３４頁）を使用した。このプラスミドは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓキラートキシンのシグナル配列に融合したポリペプチドを発現する。
ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質をコードするｐＧＥＸ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩから得たＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を分離し、ｐＹｅｐｓｅｃ１にクローニングし、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した（ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ−ｌが得られる）。ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を、結さつ前にクレノー酵素により平滑末端とし、一方、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は処理しなかった。酵母中で発現させた可溶性ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質を、エピトープＤ１に対するモノクローナル抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＭＡｂを、製造業者の教示にしたがってＢｒＣＮ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ドイツ国フライブルグ）に連結した。ＰＢＳに添加した酵母エキスをカラムにロードし、非特異的結合物質を０．５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭグリシンｐＨ９．０緩衝液で溶出させた。ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦハイブリッドタンパク質の溶出を、０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ１１．０で実施した。カラムを、０．１ＭグリシンンｐＨ２．５で洗浄後ＰＢＳで洗浄することにより再生した。
【００１７】
特異的免疫グロブリンの産生及び受動免疫
ウサギを、０日目、１４日目及び２８日目に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞抽出物から分離した精製組換えＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ（又は対照としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ単独からの細胞抽出物）１００μｇを不完全フロイントアジュバントに乳化したもので３回免疫した。３８日目に、血液試料を得て、４℃で一晩凝固させた。血清を除去し、遠心分離し、−２０℃で保存した。３０匹の雌ＳＣＩＤマウス（１８〜２０ｇ、Ｂｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ社、デンマーク）のグループでは、このグループの全ての動物に、ウサギ抗ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ血清０．５ｍｌ又はウサギ抗酵母血清０．５ｍｌを投与した。さらなる対照として、一グループの動物に、通常生理食塩溶液０．５ｍｌを投与した。さらなる一グループの動物に、緑膿菌のセログループ１の熱不活性化細胞に対するウサギ血清０．５ｍｌを注射した。３時間後、グループ１〜６の動物を、５つのサブグル−プ（ａ〜ｅ）に分割し、緑膿菌セログループＩ懸濁液（ムチンにそれぞれ１０１，１０２，１０３，１０４，１０５ＣＦＵ／ｍｌ懸濁）を投与した。生存動物を、１週間観察した。ムチン（Ｓｉｇｍａ社、ドイツ国Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）５ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁し、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘブレンダーで１０分間処理し、ふるいを通過させ、１２０℃で１５分間オートクレーブ処理した。使用直前に、溶液を無菌１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に調整した。
【００１８】
【実施例】
実施例１ ＯｐｒＦのエピトープマッピング
Ｏｐｒを主成分とする緑膿菌ワクチンの合理的選択基準としてＢ細胞エピトープを表すＯｐｒＦのアミノ酸配列部を同定するために、ＯｐｒＦのアミノ酸５８〜３５０を表す組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体を調製した。ＭＡｂｓの結合を、大腸菌において発現したＯｐｒＦの一連の組換えサブ断片を用いて分析した。ＭＡｂｓは、次の５つの異なる領域を識別した：ａａ１９０〜２１３（Ｄ１）、ａａ２１２〜２４０（Ｄ２、ＳＥＥ１）、ａａ２３９〜２５０（Ｄ３）、ａａ２８４〜３１６（Ｄ４）及びａａ３３２〜３５０（Ｄ５、ＳＥＥ４）。したがって、ａａ１９０とａａ３５０との間のＯｐｒＦのＣ末端部は、ＯｐｒＦのＢ細胞エピトープのほとんどをカバーしていると思われた。エピトープをさらに分析するために、上記で定義したアミノ酸部に関連した合成ペプチドを調製し、ＫＬＨに複合化した。これらのペプチドに対するポリクローナル抗血清を、ウサギにおいて生じさせた。結果は表１に示される通りであった。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
表１は、ペプチドＤ１〜Ｄ５が対応のポリクローナル抗血清により認識されたことを示している。ペプチドＤ１、Ｄ２、Ｄ４及びＤ５はモノクローナル抗体と反応し、ペプチドＤ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５も、組換えＯｐｒＦに対して生じさせたポリクローナル抗体により認識され、したがって、これらの５エピトープはＢ細胞由来であることが確認された。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５に対して生じさせた抗血清はウエスタンブロット分析においてＯｐｒＦを認識したが、生存緑膿菌細胞は、Ｄ２及びＤ５に対して生じさせた抗血清とともにインキュベーションした後のみに陽性蛍光を示した。したがって、これらの２種のエピトープは、表面露出していると思われる。
【００２１】
合成ペプチドのいずれとも反応しなかったがＧＳＴ−ＯｐｒＦ及びさらには組換えサブ断片を認識して２つの追加のエピトープＤ６及びＤ７を生じるさらなるＭＡｂｓが確認された。これらのエピトープＤ６及びＤ７は、それぞれアミノ酸残基２４０〜３１６及び１９０〜２５０に相当する。したがって、ＯｐｒＦのアミノ酸１９０〜アミノ酸３５０の領域は重要な抗原領域を含むと考えられ、本発明者等は、これらのエピトープを担持する組換えタンパク質が動物モデルにおける保護を付与することができるかどうかを確認することにした。
【００２２】
実施例２ ＯｐｒＩのエピトープマッピング
未変性ＯｐｒＩに対して生じさせたＭＡｂｓ  ２Ａ１、６Ａ４及び５Ｂ４を用いて、緑膿菌感染に対して防御能を示し、Ｎ末端に位置したエピトープを認識した二種の異なるエピトープを特徴付けした（Ｆｉｎｋｅ，Ｍ．等（１９９１）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９、第１２５１〜１２５４頁）。続いて行った研究によって、もしアミノ酸２１〜アミノ酸８３のアミノ酸配列全体が発現されるならば、２Ａ１のみが結合することが分かった。したがって、サブユニットワクチンの手段として組換えＯｐｒＩ抗原を構築するために、完全なアミノ酸領域２１〜８３が最も適当な抗原であると考えられた。
【００２３】
実施例３ 大腸菌におけるＯｐｒの発現
緑膿菌感染に対するワクチンにおける緑膿菌の単一外膜タンパク質の効力は、２種の異なるＯｐｒの融合エピトープの共発現により向上する可能性がある。４種の異なるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を、大腸菌中で大量に発現させた：ＧＳＴ−ＯｐｒＦ（ａａ１９０−３５０）、ＧＳＴ−ＯｐｒＩ（ａａ２１−８３）、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ（ａａ１９０−３４２）−ＯｐｒＩ（ａａ２１−８３）及びＧＳＴ−ＯｐｒＩ（ａａ２１−８３）−ＯｐｒＦ（ａａ１９０−３５０）（図１）。組換えタンパク質を、免疫グルタチオンを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより約８０％に精製できた。ＯｐｒＩ特異的ＭＡｂ  ６Ａ４及び２Ａ１並びにエピトープＤ１、Ｄ２、Ｄ４、Ｄ５、Ｄ５、Ｄ６及びＤ７に対する異なるＯｐｒＦ特異的ＭＡｂを有する４種の組換え生成物をウエスタンブロット解析したところ、ＭＡｂ特異的エピトープが組換え融合タンパク質により発現されたことが分かった。
【００２４】
実施例４ 大腸菌由来融合タンパク質による活性免疫
マウスを、２週間間隔で４回、組換えＧＳＴ結合融合タンパク質又はＧＳＴのみをアジュバント“ＡＢＭ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ”に懸濁したもので免疫した。マウス８〜１０匹のプール血清からの各抗体価を、ＥＬＩＳＡだけでなく、緑膿菌に対する結合活性用ウエスタンブロッティング及びペプチドＤ１〜Ｄ５に対するＥＬＩＳＡにより分析した。
【００２５】
図２は、緑膿菌に対する特異的抗体価が、全ての免疫グループにおいて、血清希釈１：１５６２５以下で得られたことを示している。緑膿菌ポリペプチドを用いた血清のウエスタンブロット分析により、全ての免疫グループ由来の血清によるＯｐｒＩ並びにＯｐｒＦの特異的染色が示された。ＧＳＴ免疫対照グループでは、ＯｐｒＩ又はＯｐｒＦの染色は観察されなかった。ペプチドＤ１〜Ｄ５に対する血清のさらなる分析（図３）から、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−Ｏｐｒｌで免疫された動物だけでなくＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦで免疫された動物でも、ペプチドＤ５及びＤ４が優勢であった。外膜融合タンパク質に対して誘発した抗体が緑膿菌感染からマウスを保護できるかどうかを試験するために、マウスに、免疫抑制用シクロホスファミドを３回投与した。非免疫対照動物１５匹の末梢血試料において測定した白血球数は、平均レベル４００／μｌ未満に低下した。１日後、動物に、５×１０１、５×１０２、５×１０３又は５×１０４ＣＦＵの緑膿菌セログループ１を抗原投与した。動物の生存を、１週間記録した。図４及び表２に、４種の異なる抗原投与後の動物の生存率と、プロビット回帰分析により算出した各ワクチンについてのＬＤ５０値とを示した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
ＧＳＴのみ又はＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦで免疫したグループについては、ＬＤ５０計算値は１．５８及び２．６５と低かった。ＧＳＴ−ＯｐｒＩとＧＳＴ−ＯｐｒＦとの混合物の同時ワクチン接種では、ＬＤ５０値が８３．３ＣＦＵに増加した。しかしながら、この差は、統計的に有意ではないことが分かった。これに対して、ハイブリッドＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩのワクチン接種後では、ＬＤ５０の計算値が、１５４０ＣＦＵの方向に大きくシフトした（ｐ≦０．００１）。ＧＳＴ免疫対照と比較して、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩグループについて計算された防御値は９６２であった。これらの結果は、同一に計画した二回目の実験で確認された（ｐ≦０．００１）。
【００２８】
比例リスクモデルによるデータの解析と、異種のワクチン製剤によりリスク比の減少計算値を、上記表２に示した。ＧＳＴ−ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩのワクチン接種により、リスク比が、ＧＳＴ免疫対照と比較して、０．３まで非常に有意（ｐ≦０．０００１）に減少した。抗原投与量が５×１０３ＣＦＵの場合でさえ、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＯｐｒＦ＋ＧＳＴ−ＯｐｒＩ、ＧＳＴ−ＯｐｒＩ−ＯｐｒＦ免疫グループ並びに投与１及び２（５×１０１及び５×１０２）に対して、リスク比が０．６９に有意（ｐ≦０．００１９）に減少した。
【００２９】
実施例５ 酵母におけるＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの発現
追加の融合成分のないＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質の発現については、代替宿主としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを選択し、プラスミドとしてｐＹｅｐｓｅｃ１を選択する。ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ−Ｉ（図１）に含有されているＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは少量でしか発現されなかった。ＯｐｒＩだけでなくＯｐｒＦもペリプラズム空間を介してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅにおいて移出されたので、本発明者等は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける移出を真似することを試みた。このために、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩハイブリッドタンパク質を、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓのキラートキシン（ｋｔ）の分泌シグナル配列に融合させた。ｐＹｅｐｓｅｃ１−Ｆ−Ｉ（図１）によりコードされているトリパータイトハイブリッドタンパク質ｋｔ．ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、ここでは以下のポリペプチドストレッチから構成されている：まず酵母分泌シグナル配列の１６アミノ酸があり、続いてＤＮＡリンカーによりコードされた９アミノ酸があり、その後アミノ酸１９０〜３４２のＯｐｒＦ特異的ポリペプチドストレッチ及びアミノ酸２１〜８３を含むＯｐｒＩペプチドが続いている。ＯｐｒＦ特異的ポリペプチドは、可能なグリコシル化部位アスパラギン−Ｘ−トレオニン（表１参照）を２回担持している。これらのグリコシル化部位は、もし融合タンパク質が分泌経路に入ったならば認識可能でなければならない。キラートキシンリーダー配列へ融合すると、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩは、ＵＡＳＧＡＬ／ＣＹＣ１プロモーターの誘発条件下で発現したとき、酵母細胞抽出物においてウエスタンブロット解析により検出されたが、培養ブロスには、分泌抗原は検出されなかった。
【００３０】
酵母において発現したＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ融合タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて鮮明なバンドとして移動しなかったが、不均一な分布を示し、いくつかのスミアバンドに現れた。このことは、Ｎ−グリコシル化による翻訳後変更を示している。組換え緑膿菌抗原をエンドグリコシダーゼＦとともにインキュベーションするとより低分子量の鮮明なバンドが現れ、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩがキラートキシンリーダー配列に融合したときに分泌経路に入ったことと、２つのグリコシル化可能性部位のうちの少なくとも一つがグリコシル化されたことを示している。
【００３１】
実施例６ 酵母由来ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩの抗体による受動的免疫
組換えシュードモナス抗原を、酵母細胞抽出物の上清から、エピトープＤ１に対する抗ＯｐｒＦマウスモノクローナル抗体を用いて、アンモニウム塩析出及びイムノアフィニティークロマトグラフィーにより濃縮した。次に、ウサギを、抗原で３回免疫し、動物から血清を採取した。免疫前血清は緑膿菌ＯｐｒＦ又はＯｐｒＩのいずれとも反応性を示さなかったが、免疫ウサギから得た血清は、緑膿菌の３種の異なるＡＴＣＣ菌株から得た外膜タンパク質ＯｐｒＦ及びＯｐｒＩと特異的に反応しただけでなく、試験した緑膿菌の３種の異なる臨床分離物とも特異的に反応した。これらの血清の防御能を、ＳＣＩＤマウスにおいて、緑膿菌の致死抗原投与に対する防御について試験した。結果は表３に示される通りであった。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
表３に示すように、対照抗酵母血清を注射したマウスは、抗原投与量５×１０１（表３、グル−プ１）でさえ、感染に対しては防御されなかった。一方、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ特異的ウサギ血清を投与したマウスは、５×１０２ＣＦＵの緑膿菌の抗原投与に対して十分に防御され（表３、グループ３）、５×１０３ＣＦＵの抗原投与後に４０％の生存が観察された。さらなる対照として、抗原菌株緑膿菌セログループ１のＬＰＳに対して誘発させたウサギ血清による防御を試験した。投与量５×１０３以下で、ＬＰＳ特異的血清で防御された動物の１００％が生存した（表３、グループ５）。これよりも１０倍高い抗原投与量５×１０４では、このグループにおいては生存は観察できなかった。
【００３４】
統計的解析を使用して、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ特異的血清、ＬＰＳ特異的血清及び抗酵母対照グループの緑膿菌感染に対する防御のための防御投与量を比較した。その結果、抗酵母血清と比較して、ＯｐｒＦ−ＯｐｒＩ血清の効力が８５倍増加したことが分かった（ｐ≦０．００２、表３、グル−プ３参照）。これに対して、ＬＰＳ特異的血清については、効力の計算値が抗酵母血清（ｐ≦０．００１）よりも３２５倍高かった。
【００３５】
【配列表】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】緑膿菌の外膜タンパク質の構築組換え融合タンパク質の概略を示した図である。大腸菌Ｋ１２における発現では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコードするベクターｐＧＥＸ−２ａを使用した。
【図２】表記のＧＳＴ結合組換え外膜タンパク質ワクチン又はＧＳＴ単独で免疫したマウスの血清における緑膿菌に対する抗体価の測定を示した図である。ＥＬＩＳＡ測定は、音波処理緑膿菌セログループ１２を塗布したプレートを用いて実施した。
【図３】ＯｐｒＦのＢ細胞エピトープを表す表１に示す合成ペプチドＤ１〜Ｄ５に対するＥＬＩＳＡによる抗体測定の結果を示した図である。マウスを、表記の組換え融合タンパク質又はＧＳＴ単独で４回免疫した。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃマウスを表記ワクチン又はＧＳＴ単独で免疫後、緑膿菌セログループ１の５、５０、５００又は５０００コロニー形成単位を腹腔内抗原投与した後の生存率を示した図である。棒グラフは、抗原投与１回当たりの生存率（ｎ＝１６〜１７）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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