(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモンおよびアスパラギンを含んでなる、医薬製剤。
【請求項２】
アスパラギンを含有する成長ホルモンの緩衝化水性溶液の形態である、請求の範囲第１項記載の医薬組成物。
【請求項３】
pHが２〜８の範囲内の値に調節されている請求の範囲第１又は２項記載の医薬組成物。
【請求項４】
アスパラギンの濃度が100mMまでである、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
更に塩およびサッカリドを含んでなる、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、成長ホルモンを含んでなる安定化医薬製剤、該製剤の製法、および成長ホルモンの製剤を安定化させるためのアスパラギンの使用に関する。
発明の背景
ヒトおよび普通の家畜からの成長ホルモン（GH）は、合成されおよび下垂体の前方ロープ（lope）から分泌される、約191個のアミノ酸から成る蛋白質である。ヒト成長ホルモンは191個のアミノ酸から成る。
成長ホルモンは、身体の成長の調節におけるのみならず、蛋白質、炭水化物および脂質の代謝の調節において関与する重要なホルモンである。
成長ホルモンによって影響される器官系には、骨格、結合組織、筋肉および内部器官、例えば肝臓、腸管および腎臓が含まれる。
例えばヒト成長ホルモン（hGH）およびMet−hGHを工業的規模で生産せしめる成長ホルモン遺伝子の組換え工学およびクローン化の開発までヒト成長ホルモンはヒトの死体の下垂体から抽出により得ることができた。成長ホルモンの非常に限られた供給は、成長ホルモンの使用が短い身長（成長ホルモンの欠損症、通常の短い身長およびターナー（Turner）症候群による）、成人における成長ホルモン欠損症、不妊症、熱傷の治療、創傷治癒、ジストロフィー、骨接合、骨粗しょう症、広汎性胃出血および偽関節の治療に特に提案されてきたけれども、その使用を小人症の治療に対し、子供および青春期における縦の成長促進に制限した。
更に、成長ホルモンは家畜の成長速度を高めるため、またはヒトの消費のため虐殺されるべき動物において脂肪の割合を減少させるため提案されてきている。
成長ホルモンの医薬製剤は、不安定の傾向にある。分解生成物、例えば脱アミド化スルホキシル化生成物およびダイマー又はポリマー形は、特に成長ホルモンの溶液内で発生する。
hGHの顕著な分解反応は、１）種々の量のＬ−asp−hGH,L−iso−asp−hGH,D−asp−hGHおよびＤ−iso−asp−hGH（文献１−３）を形成するため直接加水分解により又は環式スクシンイミド中間体を介した脱アミド化、２）14位および15位におけるメチオニン残基の酸化（文献４−９）および３）ペプチド結合の開裂である。
脱アミド化が、特に149位のAsnで起こる。
hGHは、14位および125位において、特に溶液中で比較的容易に酸化される（４−８）。
スルホキシドを形成する溶液中のhGHの酸化は、調製中溶解した酸素に通常起因する。蒸留水中の酸素の溶解性は約200μＭである（９）。4IU/mlを含んでなる製剤中のhGHの濃度は、60nM hGHに相当する1.3mg/mlであるので、酸素は通常の保存状態で、hGHの酸化に対し化学量論的量の約3000倍過剰で存在するであろう。製剤をタッピング（tapping）しそして包装する前に緩衝剤の脱ガスにより問題を解決する試みは実行可能でない。
今日、これらの分解生成物は毒性があるか又は変成された生物学的活性又はレセプター結合特性を有しているとは考えられていない、しかし、スルホキシドの配座安定性は天然hGHに比較して減少しているという結果に対し示唆が存する。
hGHを含んでなる安定な、溶解された製剤の開発に対し、スルホキシドの形成速度および酸化を制御する手段を知ることは重要である。
分解の動力学は、温度、pHおよびhGH製剤中の種々の添加剤および補助剤に依存する。
不安定のため、成長ホルモンは、今日凍結乾燥されそして分解を最少にするため使用に対しそれが再構成されるまで４℃で凍結乾燥された形で保存される。
hGHを含んでなる凍結乾燥医薬製剤は、今日患者によって再構成されそして冷蔵庫内で低温度で、しばしば約４℃で、14日までの使用期間中溶液として保存され、この期間幾分の分解は起こるであろう。
更に、凍結乾燥された成長ホルモンの再構成プロセスは患者に困難性を与える傾向にある。
従って、現在では使用前にできるだけ遅く成長ホルモンを再構成しそして保存しそして製剤を凍結乾燥された状態で船積みすることが好まれる。製造者から薬局までのチェーンは、２年までの長期保存期間を許容する制御された低温度、例えば４℃で製剤を取り扱いがちである。
しかし、自己投薬のためのペンシステムの拡張された使用および拡張された使用分野は、十分な冷却が常に利用できないという条件下末端使用者にとって長期間安定である製剤を要求する。
好ましくは、製剤は凍結乾燥された状態で約１カ月そしてカートリッジの使用の目的期間ペン装置内で再構成される状態で更に１カ月間末端使用者にとって安定であるべきである。
従って、成長ホルモンのより安定な製剤凍結乾燥された状態で比較的高温で長期間そして更に長期間比較的高温で溶液中で安定であることが要求される。このような安定化は、診療所から個人の家まで成長ホルモンの投与が移動する場合極めて重要であり、最適保存は前述の如く利用できないであろう。
更に、ペン装置の使用に対し成長ホルモンの投与のパターンのシフトは、患者により行われるべき取扱いを促進するため成長ホルモンを含んでなる安定な溶解製剤を要求する。成長ホルモンを含んでなる安定な溶解製剤は患者によって使用されるペン装置に適合するカートリッジの形態で直ちに使用できるように製造でき、そして該患者は製剤の再構成を避けるであろうし、そして従って凍結乾燥製剤、再構成のための適当なビヒクル並びに必要な熟練および製剤の殺菌再構成のための殺菌装置を手に入れる必要がないであろう。
安全な理由のため、製剤の使用直前に凍結乾燥された製剤の再構成を避けることが望ましいであろう。
更に、成長ホルモン製剤の製造において凍結乾燥工程を避けることが有利である。凍結乾燥は時間がかかりそして費用のかかるプロセスでありそして凍結乾燥機の制限された能力のため製造における「障害」がしばしば存する。
従って、溶解されたhGH製剤が保存期間および１カ月までの使用期間中安定であることを確保するため分解プロセスの速度を減少する必要がある。
hGHを安定化するこれまでの試みは、ダイマーの形成を防止するのに十分には成功しなかった。ダイマー形成に関連した問題は、例えばベッカーa.w.Biotechnology and Applied Biochemistry9,478（1987）に記載されている。
国際公開公報WO87/09614およびオーストラリア特許出願30771/89は、ヒト成長ホルモングリシンおよびマニトールを含む安全な医薬製剤を開示する。このような製剤は通常の加工中および凍結乾燥状態での保存中並びに再構成後使用期間中改善された安定性を示す。
公開されたヨーロッパ特許出願303746は、動物成長ホルモンが種々の安定剤で安定化され不溶部分の減少せしめられた形成および水性環境下可溶性活性の維持を与えることを開示しており、そしてそのような安定剤にはポリオール、アミノ酸、生理的pHで荷電した側鎖を有するアミノ酸のポリマーおよび塩素塩が含まれる。ポリオールは非還元糖、糖アルコール、糖酸、ペンタエリトリトール、ラクトース、水溶性デキストランおよびフィコール（Ficoll）から選ばれ；アミノ酸はグリシン、サルコシン、リシン又はそれらの塩、セリン、アルギニン、又はそれらの塩、ベタイン、N,N−ジメチル−グリシン、アスパラギン酸又はその塩、グルタミン酸又はその塩から成る群から選ばれ；生理学的pHで荷電した側鎖を有するアミノ酸のポリマーは、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチンおよびそれらの塩から選ばれ；塩素誘導体は、塩化コリン、コリンクエン酸二水素塩、コリン二酒石酸塩、コリン二炭酸塩、三コリンクエン酸塩、コリンアスコルビン酸塩、コリンホウ酸塩、コリングルコン酸塩、コリンホスフェート、ジ（コリン）ノスルフェートおよびジコリンムケートから成る群から選ばれる。
発明の簡単な記載
今や驚くべきことに次の内容が見出された：すなわち、添加剤又は緩衝化物質としてアスパラギンを含んでなるヒト成長ホルモン製剤がペプチド結合の脱アミド化、酸化および開裂に対して極めて高い安定性を示す。生成物の安定性は、凍結乾燥された状態で又は溶解され又は再溶解された製剤の形態でその保存および船積みを許容する。
本発明の製剤は、通常のビヒクル例えば蒸留水又は注射用水を用い後に再構成されるべき凍結乾燥粉末の形で、又は成長ホルモンを含んでなる溶液の形であってよい。そのようなビヒクルは、通常の防腐剤、例えばｍ−クレゾールおよびベンジルアルコールを含むことができる。
本発明の好ましい態様は、アスパラギン緩衝剤で緩衝化された成長ホルモンの緩衝化水性溶液の形でアスパラギンを含んでなるヒト成長ホルモンの医薬製剤の形である。そのような製剤は直ちに使用できる形でありそして相当な分解なしで水性溶液として保存されそして船積みできる。
安定性の理由のため、溶液のpHは、２〜８の範囲の値に好ましく調節される。pH5〜８を有する製剤はより好ましくそしてpH6〜7.5を有する製剤は最も好ましい。
安定化効果を得るため、アスパラギンが100mMまでの濃度で好ましく加えられる。アスパラギンの濃度は好ましくは２〜20mMの範囲であり、最も好ましくは２〜10mMである。
本発明の医薬製剤は、凍結乾燥された製剤の形であってもよい。
本発明の医薬製剤は更に、その加工性例えば凍結乾燥を促進するため、塩およびサッカリドを含むことができる。好都合には、マニトールが凍結乾燥に対し増量剤として用いられる。
更に、本発明の別の面は成長ホルモンの安定化製剤の製造のためのアスパラギンの使用に関する。
本発明に関連して、「成長ホルモン」は如何なる起源例えば鳥、牛、馬、ヒト、羊、豚、サケ、マスからの成長ホルモン又はマグロ成長ホルモンであってよく、好ましくは牛、ヒト又は豚成長ホルモンであり、ヒト成長ホルモンが最も好ましい。本発明に従って用いられる成長ホルモンは、例えば下垂体を常法で抽出することにより、天然源から単離される天然成長ホルモンであり、又は例えばE.B.ヤンセンおよびS.タールソン、Biotech and Biolng.36,１−11（1990）で記載される如く、組換え工学により生産される成長ホルモンであってよい。「成長ホルモン」は成長ホルモンの先端を切った形であってよく、ここにおいて１個又はそれ以上のアミノ酸残基は欠損している；その類似体であってよく、ここにおいて天然分子中の１個又はそれ以上のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基により、好ましくは天然に生ずるアミノ酸残基により置換されている、但し置換が不都合な作用例えば抗原性又は減少せしめられた作用を有しない場合に限る；又はその誘導体、例えば、Met−hGH,Met−Glu−Ala−Glu−hGH又はAla−Glu−hGHの如きＮ−又はＣ−末端拡大を有する形である。好ましい成長ホルモンはhGHである。
本発明に関連して、「高い安定性」は製剤がホスフェート緩衝剤を含んでなる通常の製剤よりもより安定である場合に得られる。
医薬製剤の追加の構成を指称するため用いられる語句「塩」は通常のそのような塩、例えば有機酸例えばクエン酸、酒石酸又は酢酸のアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩、例えばクエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム又は酢酸ナトリウム、又は鉱酸例えば塩酸のアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩、例えば塩化ナトリウムを含んでなる。
「サッカリド」は、医薬製剤に対して通常用いられる単糖、二糖、又は糖アルコールであってよく、例えばラクトースおよびマニトールである。
本発明の製剤によって用いられる溶剤は、水、アルコール例えばエチル、ｎ−プロピル又はイソプロピル、ブチルアルコール又はこれらの混合物であってよい。溶剤は保存剤例えばｍ−クレゾール又はベンジルアルコールを含んでなることができる。
発明の詳細な記載
本発明を説明する以下の実施例により更に詳しく説明する。実施例は請求の範囲により規定される本発明の範囲を制限するものと解してはならない。
実験部
実施例
脱アミド化の減少
脱アミド化の速度を、同じpHおよびpH7.3で8mMホスフェート緩衝剤と比較して10mM  Asnの存在下、pH6.5で6IU hGHを含んでなるhGH製剤に対して25℃で測定した。
hGH製剤を、0.9％（v/v）のベンジルアルコールを含有する10mlの脱イオン水に13.2mgのアスパラギンを溶解して得られた10mMのアスパラギン溶液の10mlに20mgのhGHを溶解し次いで0.1N塩酸を加え言及されたpHとすることによって調製した。
以下の表に示されるhGH製剤を25℃で保存し次いで14日および30日後IE−HPLCによりデスアミド含量に対し分析した。
結果を下記の表に示す。
0003662580.tif 000002
出発物質中のデスアミド−hGHの含量は2.1％であった。
前記表から明らかなように、hGHの脱アミド化は、pH6.5のホスフェート緩衝剤と比較してアスパラギンを加えることにより約25％だけ減少する。
Asp又はGluの添加は、pH6.5のホスフェートと比較して脱アミド化の速度を増加する。
上記結果は、次の内容を示している：すなわち、脱アミド化の速度は、pHを低下し次いで100mMまで、好ましくは約5mMの低濃度でアスパラギンを加えることにより減少する。
防腐剤としてのｍ−クレゾール又はベンジルアルコールの使用は脱アミド化の速度に影響しないように思われる。
開裂形成（ペプチド結合の加水分解）は、ホスフェートと比較してpH6.5のアスパラギンによって減少する。
文献
１）  Y.−C.J.ワングおよびM.A.ハンソン.Parenteral Formulations of Proteins and Peptides:Stability and Stabilizers.J.Parenteral Science and Technology 42（Suppl.）（1988）53−525.
２）  M.C.マニング,K.パテル,R.T.ボーシカルト.Stability of Protein Pharmaceuticals.Pharmaceutical Research 6（11）（1989）903−918.
３）  B.A.ヤーンソン,J.M.シロカワ,W.S.ハンコック,M.W.スペルマン,L.J.Basa and D.W.Asward.J.Biol.Chem.264,1462−71（1989）．
４）  L.C.テー等.,J.Biol.Chem.,262,785−794（1987）．
５）  G.W.ベッカー等.,Biotech.Appl.Biochem.,10,326−337（1988）．
６）  R.A.ホウテン等.,Arch.Biochem.Biophys.,178,350−355（1977）．
７）  R.M.リジン等.,Anal.Biochem.,167,199−209（1987）．
８）  P.ゲルフォース等.,Acta Paediatr.Scand（Suppl）,370,93−100（1990）．
９）  M.J.クラウマン,Pharm.Res.,7（３）289−292（1990）．