(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子をイオン化する方法であって：
ａ）絶対０度より高く、かつイオン化又は分子間の衝突により前記分子が断片化する温度よりも低い温度を維持する温度浴として機能するのに十分な体積を有し、前記低い温度で前記分子を内包してイオン化を行うための０．３７Ｋの液体ヘリウムを調製する工程；
ｂ）前記低い温度を維持したまま、前記分子及びプロトンを前記０．３７Ｋの液体ヘリウム中に導入し、前記分子を当該液体ヘリウム内でイオン化する工程；
ｃ）前記イオン化された分子を断片化することなく、前記液体ヘリウムを取り除く工程；
の工程を含む、前記方法。
【請求項２】
前記０．３７Ｋの液体ヘリウムが初期に少なくとも１０，０００個のヘリウム原子を含む液滴からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン化された分子がその後質量分析に使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）少なくとも１０，０００個のヘリウム原子を含むヘリウムのクラスターを形成し、そしてその温度を０．３７Ｋまで低下する工程；
（ｂ）前記クラスターにプロトンを導入する工程；
（ｃ）前記分子が維持される周囲圧力を、常圧から０．１３３３Ｐａより低い圧力まで低下する工程；
（ｄ）前記分子をプロトン化されたヘリウムのクラスター中に導入し、これによって分子をプロトン化する工程；
（ｅ）液滴からヘリウムを除去して、残った断片化されていないプロトン化された分子を得る工程；及び
（ｆ）断片化されていない前記分子を分析のために質量分析計及び検出器に導入する工程；
の工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分析が質量測定を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分析が制御された断片化及び検出を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
分子のプロトン化を、その断片化を伴なわずに請求項４に記載の方法によって行う装置であって：
（ａ）少なくとも１０，０００個のヘリウム原子のヘリウムのクラスターを形成する手段及びこれを０．３７Ｋまで冷却する手段；
（ｂ）プロトンを形成する手段及びプロトンを前記ヘリウムのクラスターに導入する手段；
（ｃ）前記分子が維持される周囲圧力を、常圧から０．１３３３Ｐａまで低下する手段；
（ｄ）前記分子をプロトン化されたヘリウムのクラスター中に導入し、これによって前記分子をプロトン化する手段；
（ｅ）液滴からヘリウムを除去して、残った断片化されていないプロトン化された分子を得る手段；及び
（ｆ）断片化されていない前記分子を、分析のために質量分析計及び検出器に導入する手段；を含む、前記装置。
【請求項８】
前記分析が質量測定を含む、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記分析が制御された断片化及び検出を含む、請求項７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、質量分析、並びに処理量を増加し、そしてそれによって得られる結果の質を向上するための方法及び装置に関し、そして特に分析される対象の化合物の、前駆体のイオン化、特にプロトン化に関する。
【０００２】
【従来の技術】
基本的な質量分析法において、分子は、それを断片化するために充分なエネルギーを持つ電子ビームにより衝撃される。生成した正の断片（カチオン及びラジカルカチオン）は、真空中の磁界を通って加速され、そして質量−電荷比に基づいて分類される。質量分析計で生成されるイオンの大部分は、単位正電荷を保有するために、ｍ／ｅの値は断片の分子量と等価である。質量分析の情報の分析は、本来の分子を得る逆向きの作業である断片の再構成を含む。分子をイオン化する現実の方法が、分子の断片化を起こすために、断片を構成することなしに直接本来の分子を得ることは可能ではなかった。
【０００３】
操作において、非常に低い濃度の試料分子を、これらが高エネルギー電子ビームによって衝撃される高真空のイオン化室に流すことが可能である。生成された分子の断片及び正のイオンは、荷電されたアレイを通って加速されて分析管に入る。荷電された分子の経路は、適用される磁界によって曲げられる。低い質量（低い運動量）を有するイオンは偏向され、そして分析器の壁に衝突し、そして高い運動量のイオンは、充分に偏向されず、そしてまた分析器の壁に衝突する。然しながら、適当な質量−電荷比を有するイオンは、分析器の通路に従い、スリットを通って出て、そしてコレクターと衝突して、電流を発生し、これを増幅し、そして検出する。磁界の強度を変化することによって、分析される質量−電荷比を連続的に変化させることができる。
【０００４】
質量分析計の出力は、質量−荷電比（ｍ／ｅ）に対する相対強度のプロットとして示され、スペクトル中の最も強いピークが基本ピークとして確認され、そして他の全てはそれに対する相対的な強度である。ピークそれ自体は、通常縦の線として示される。
【０００５】
断片化は予測可能であり、そして形成されるイオンは、分子が形成することができる最も安定なカチオン及びラジカルカチオンを反映する。スペクトル中に観察される最も高い分子量のピークは、典型的には母体分子から電子を差し引いたものを示し、そして分子イオン（Ｍ＋）と呼ばれる。断片は、それらの質量−電荷比、又は更に好ましくは失われた質量によって確認される。
【０００６】
化合物及び分子特性を確認する、特に薬物のスクリーニングへの適用において使用される通常の質量分析法は、クロマトグラフィーによる分離後の検出器として使用される質量分析計を伴なう、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）である。このような方法において、試料は逆相ＨＰＬＣカラムに注入され、そしてエレクトロスプレーイオン化／イオントラップ質量分析計の供給源に、溶媒で溶出される。供給源は、液体排出物をエアゾールに転換し、そしてエアゾール中の溶質をイオン化する。脱溶媒されたイオンは、質量分析計の分析計に取り込まれ、そしてトラップに収集される。一旦トラップが満たされたならば、その電圧が変化され、質量に依存した様式で順番に出て、そして検出器を打つ。工程を既知の質量のイオンで較正することによって、試料の未知の質量を測定することができる（ＬＣ／ＭＳ）。
【０００７】
更に、特定のイオンを、トラップ中で他のイオンから単離し、そして衝突誘導解離によって断片化し、そして断片の質量を測定することができる（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）。例えば、ペプチドにおいて、殆んどの断片化はペプチド結合において起こるものであり、そして断片のパターンは、ペプチド配列の情報を含み、これはタンパク質の同定に使用することができる。
【０００８】
ＬＣ／ＭＳは価値のある分析手段であるが、ある種の欠点がある。従って、例えば、ＬＣ／ＭＳは、母体イオンを常には生成せず、そして従って、これは分子構造を指定するために非常な努力を必要とすることがあり得る。更に標準液は、成分のパーセント（モル）を与える必要がある。更に質量分析前にクロマトグラフィーによる分離が必要である。最後に小さな溶媒分子から大きなタンパク質までの広い範囲を含むイオン化を得る困難さがある。
【０００９】
好ましい産物が存在するかどうかを決定するだけではなく、製造される量を決定するために、迅速なスクリーニング用のパイロット反応を得ることが非常に好ましいが、しかししばしば困難である。高い処理量のスクリーニングが使用されている分野において、アッセイを迅速に行うことは、ＬＣ／ＭＳの主要事項である分離を行う必要性を除去することによって行われる。更に、薬物物質及び薬物産物を分析するために、不純物を更に容易に特定しなければならず、そして更に不純物の定量も標準液を必要とせずに行わなければならない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
いかなる新規なイオン化の方法も、有用であるためには、以下の二つの見掛け上の基本的な制限を克服しなければならない：
（１）分子が、溶液中又はプラズマのいずれかから電荷を獲得する能力は、溶媒又はガスのプロトン親和力と比較した、中性分子のプロトン親和力（ＰＡ）に依存する。言い換えれば、分子が高いＰＡを有しない場合、これは電荷を獲得しないものであり、そして検出されないものである。これは、異なった分子に対して異なった水準の反応に導き、そして測定は矛盾したものとなる。
【００１１】
（２）イオン化中に、そして中性のガス分子の衝突から与えられるエネルギーの量は、断片化の機会を増加し、付随する分子の再構成及び母体分子の決定における困難さの増加を伴なう。
【００１２】
これらの制限の主たる原因は、生成したイオンが、一時的に高圧の環境にあることである。結果として、加熱及び電荷の交換又はイオン分子の反応の機会に導く衝突が存在する。低圧でイオン化を行って、他のガス分子との衝突の数を制限することによって、この問題を回避することは可能であると考えることができるが、プロトンの添加又は除去（化学イオン化）又は電子の除去（電子衝撃イオン化）は、それ自体充分に発熱性であり、共有結合を解離することを惹き起こし、そして高圧イオン化の供給源における中性のガスとの衝突は、イオンからそれが断片化される前にエネルギーを除去することを可能にする。従って電荷の交換又はイオン分子の反応を伴なわないイオン化に対する理想的な圧力はない。
【００１３】
従って、本発明の目的は、質量分析のような分子の分析に対する分子のイオン化のための、しかし電荷の交換又はイオン分子反応を最小化した或いはそれを伴なわない方法及び装置を提供することである。
【００１４】
本発明の更にもう一つの目的は、質量分析計による異なった分子の測定値間の一貫性を向上させる手段を提供することである。
本発明のなおもう一つの目的は、分子がイオン化又は衝突によって断片化しないような手段を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
一般的に本発明は、質量分析によって全体の分子を分析するための前記方法を、通常イオン化又は衝突から得られる分子の断片化を伴なわずに行う方法及び装置を含む。本発明によれば、分子は、断片化衝突が最小化される充分に冷却された環境中でイオン化され、そしてここにおいて温度浴のような熱交換の手段が、イオン化によって発生される熱を、それにより分子の断片化が起こる前に除去する。
【００１６】
本発明の非常に大いに好ましい態様において、絶対０度の僅か上に冷却された液体ヘリウムの液滴が、イオン化のための環境として使用される。液体ヘリウムの液滴は、分子に衝突の起こらない環境を提供し、そして同時にイオン化中に発生する内部エネルギーを除去するために非常に効率のよい方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法によって使用される装置（ヘリウム液滴式質量分析計−ＨＤＭＳ）は：
ａ）絶対０度近辺の温度のヘリウムの液滴を製造するためのヘリウム液滴又はクラスター源；
ｂ）分子をプロトン化して、質量分析を可能にするためのイオンを供給するためのプロトン源；
ｃ）分子のプロトン化又はイオン化のための常圧（ＡＰ）源；
ｄ）過剰の液体ヘリウムの脱溶媒又は除去のための手段；及び
ｅ）完全にプロトン化された分子の分析及び検出のための選択手段及び検出手段、又は正確な質量を測定するための選択手段及び検出手段、或いは構造分析のために、完全にプロトン化された分子の制御された断片化を得るための選択手段及び検出手段を伴なう質量分析計のような分析手段；
の要素を含む。
【００１８】
本発明のこれらの及び他の目的、特徴及び利益は、以下の説明及び図面から更に明白となるものである。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明による絶対０度近辺のヘリウム液滴中に隔離された分子のイオン化の利益は、分子が断片化されないものであることである。これは、試料中のそれぞれの質量に対して一つのピークのみが存在するものであることを意味する。ＬＣ−ＭＳの場合、これは成分のいずれもが同一質量（即ち異性体）を有しない限り、成分をＬＣによって分離する必要がないものであることを意味する。これは、伝統的に相当な時間を質量分析計に入る前に成分をカラムで分離するために単純に待っていたために、分析速度を大幅に増加する。
【００２０】
イオン化中に競合がないことは、全ての分子（ヘリウムを除く）が、同様な効率でイオン化されるものであることを意味し、従って、一定の質量に対して測定される強度は、試料中のそのモルパーセントに直接相関する。これは、各種の反応因子を決定するための参照物質及び標準液を製造する必要を排除する。
【００２１】
本発明の方法及び装置は、現在の分析技術に対して、即ち、標準液を必要とせずに組成のパーセント（モル）を与えることによって、そして質量分析の前のクロマトグラフィーによる分離の必要性を回避することによって、いくつかの有意な利益を提供する。
【００２２】
装置
本発明のＨＤＭＳは、図１ａ−ｆに示すように、好ましくは６個の機能単位を含む：
（１）ヘリウムクラスター源１
（２）プロトン源２
（３）ＡＰ源３
（４）捕獲セル部位４
（５）脱溶媒域５及び
（６）質量分析計及び検出器、それぞれ６及び７。
【００２３】
各部位は、それぞれの部位の操作上の工程の以下の説明を伴なって、図２ａ−ｅに更に特定的に示される。
ヘリウムクラスター源１：
図２ａに更に詳細に示すように、超純粋なヘリウムは、加圧下で５μｍのノズル１１を通して１．３３３×１０−３Ｐａ（１０-5トール）圧力の真空室１２中で膨張させられる。ヘリウムが膨張すると、冷却され、均質に核化し、そして少なくとも約１０，０００個、そして好ましくは約１００，０００ないし１，０００，０００個のヘリウム原子を含む液滴又はクラスター１０を形成する。液滴又はクラスターの温度は、最初は２０°Ｋより低いノズル（クライオポンプで冷却）と同じである。液体ヘリウムの液滴は、これらが０．３７°Ｋの温度に達するまで蒸発（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって冷却される。この温度で、ヘリウム液滴には、表面張力に打ち勝ち、そしてただ一個のヘリウム原子をも蒸発させるための充分な内部エネルギーがもはやなくなる。この時点までに、ヘリウム液滴１０は、室１２を出て、これは５０，０００及び５００，０００個の間のヘリウム原子を有する。この種類のヘリウムビームを形成する技術は、例えばＫ．Ｎａｕｔａａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１１１，３４２６（１９９９）に記載されている。ヘリウム液滴の冷却能力は、ヘリウム原子の数に関係する。液滴中の１，０００個のヘリウム原子毎に、約１ｅＶの冷却能力がある（９６．２７ｋＪ／モル（２３ｋｃａｌ／モル）又は８０５５ｃｍ-1）。
【００２４】
プロトン化領域２：
図２ｂに示すように、ヘリウム液滴１０は、スキマー（ｓｋｉｍｍｅｒ）を通ってプロトン化領域２に通過する。別個の室２ａにおいて、水素（Ｈ2）をＨ+に自動イオン化するために、５００ワット、２．４５ＧＨｚのマイクロ波源を使用する。この既知の方法は、約１００ｍＡのプロトンの連続した流れ２ｂを製造する。プロトンは、この高圧領域（１３．３３−１３３３Ｐａ（１−１００ミリトール））からスキマーを通って抽出される。プロトンを約１ｅＶの運動エネルギーまで減速した後、プロトンビームは液体ヘリウム液滴のビーム１０と交差する。プロトンがヘリウム液滴と衝突した時、これは急速に吸収される。プロトンの溶媒和において放出されるエネルギーの量は、プロトンの運動エネルギー（約１ｅＶ）及びＨｅＨ+の形成熱（１．５４ｅＶ）の合計である。ヘリウム液滴に与えられた２．５４ｅＶのエネルギーは、２５４０個のヘリウム原子の蒸発によって散逸される。１００ｍＡのプロトンの流れは、ヘリウムクラスタービームに、ヘリウム液滴当たり約１個のプロトンの効率で与えられる。
【００２５】
ＡＰ源３：
図２ｃに示すように、ＡＰ源３中のＨＰＬＣの排出物３ａの一部分２ａは、ヘリウムの流れ中で霧化され、そしてガスとして一連のスキマー３’を通して運ばれる。スキマーは、圧力を常圧（１０１３００Ｐａ（７６０トール））から０．１３３３Ｐａ（１０-3トール）より低い圧力まで、そして好ましくは１．３３３×１０−３Ｐａ（１０-5トール）（又は最初の流れの約１０ｐｐｂ）まで減少させる。中性の排出物の分子３ｂは、スキマーを通って、捕獲セル４に入る。
【００２６】
捕獲セル４：
図２ｄにおいて、中性の排出物の分子の流れ３ｂは、ＡＰ源３を出て、ビーム４ｂを形成し、これはプロトン化されたヘリウム液滴のビーム４ａと交差する。プロトン化されたヘリウム液滴は、中性分子を捕獲しながら、大きい経路を掃討する。１．３３３×１０−３Ｐａ（１０-5トール）のバックグラウンド圧力において、ヘリウム液滴は、液滴当たり平均１個の中性分子を捕獲する。中性分子が吸収された場合、ヘリウムは液滴から蒸発して、溶媒和熱及び中性分子の内部熱を散逸する。
【００２７】
本発明に必要な分子の大きさ及び熱の散逸の例として、特定の分子、最悪の場合の例として、０．５４８３ｋＪｍｏｌ-1 Ｋ-1（０．１３１ｋｃａｌ ｍｏｌ-1 Ｋ-1）（２９８ケルビンにおいて１．６６ｅＶの内部エネルギー）の異常に高い熱量量を持ち、これは捕獲された場合１６６０個のヘリウム原子を散逸する、バックミンスターフラーレン（Ｃ60）と比較して、一連の図３ａ−ｄを示す。中性分子はヘリウムより実質的に高い分極性を有するため、これはプロトンに引き寄せられる。中性分子及びプロトンが複合体を形成した場合、放出されたエネルギーは、液滴のヘリウムを蒸発させる。Ｃ60Ｈ+を形成するために散逸されるエネルギーは、ヘリウム及びＣ60間のプロトン親和力の差と等しい。Ｃ60のプロトン親和力は、８２８．８ｋＪ／モル（１９８ｋｃａｌ／モル）であり、そしてヘリウムのプロトン親和力は、１４８．６ｋＪ／モル（３５．５ｋｃａｌ／モル）である。この差は、６８０．２ｋＪ／モル（１６２．５ｋｃａｌ／モル）であり、これは７．０５ｅＶ又は７０５０個のヘリウム原子に換算される。この点について、大きな分子においてすら、蒸発される全体のヘリウムは、最初の５０，０００ないし５００，０００個の原子からの１１，１９０個のみの原子であり、又は多くとも継続した冷却剤としてのヘリウム原子の２３％のみの損失である。
【００２８】
本発明によれば、少なくとも数個のヘリウム原子がプロトン化後もあって、複合体が０．３７°Ｋにとどまることを確実にしなければならない。上記の例を分析することによって、本発明によって、最大の分子を効果的にイオン化することができることを推定することが可能である。ヘリウム及び殆んどの他の中性分子のプロトン親和力の差は、殆んど１０ｅＶを超えず、そしてプロトンの運動エネルギーは、１ｅＶである。５０，０００個の原子のヘリウム液滴において、液滴に残存する熱容量は、従って３９ｅＶである。中性分子の熱容量が分子量によって概略計算されると仮定した場合（０．００２３ｅＶ／ダルトン）、残存する３９ｅＶは、１６．９ｋＤａの質量の分子を冷却することが可能である。然しながら、これは最小の液滴に関してのみである。供給源を更に冷却することによるように、より大きい液滴が製造される場合、２００ｋＤａを超える分子を効果的にイオン化し、ＤＮＡからタンパク質及び抗体までの範囲に及ぶ生物学的分析への適用に使用する適用を伴なうことができる。
【００２９】
脱溶媒セル５：
図２ｄにおいて、ヘリウム液滴ビーム４ｃは、スキマー４’を通過した後、捕獲セル４の末端で、プロトン化された種からヘリウムを除去するために脱溶媒セル５を通過する。これは、冷却されたヘリウムの雲（０．１３３３Ｐａ（１０-3トール））５ａとの衝突によって達成される。然しながら液滴が相対的に遅い速度で移動するために、バックグラウンドのヘリウムとの衝突は、有意な内部エネルギーを誘導しないものであり、これによって準安定性イオンは、検出されるまでそのままでいる。
【００３０】
質量分析計６／検出器７：
図２ｅにおいて、プロトン化された分子のイオン１００は、スキマー５’を通過した後、質量分析計６の超高真空領域６ａ（１．３３３×１０−５Ｐａ（１０-7トール））に入り、四極子検出器７ａによって、得られる単一の分子のピーク８を伴なって検出される。
【００３１】
上記の説明及び図面に示された態様は、単に本発明の例示であり、そして構造、工程及び物質に対するもののような変更及び改変は、特許請求の範囲に定義される通りの本発明の範囲から逸脱することなく行うことができることは了解される。従って、例えば、別の検出方法が、四極子飛行時間式質量分析計（ＱＴＯＦ）又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）がプロトン化された分子の正確な質量を測定して、その化学量論を得るために、使用されるものである。質量分析計は、制御された断片化のための環境を得て、完全にプロトン化された分子の化学構造の決定を援助するために、更に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａ−ｆは、本発明の方法の工程及びそのような工程を行う部位的要素を略図的に示す。
【図２】図２ａ−ｅは、ヘリウム液滴又はクラスター源、プロトン源、ＡＰ源、脱溶媒及び検出器を伴なう質量分析計のそれぞれの部位を示す。
【図３】図３ａ−ｄは、バックミンスターフラーレン分子（Ｃ６０）と比較した液体ヘリウムの温度浴の特性を示す。
【図１】
0003616047.tif 000002
【図２】
0003616047.tif 000003
【図３】
0003616047.tif 000004