(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の成分を酸化酵素を用いて定量する際に、Ｃ６〜１８アルキルスルフォン酸塩及びＣ３〜１２アルキルナフタレンスルフォン酸塩を共存させ、酵素反応が行なわれる系中の該アルキルスルフォン酸塩及び該アルキルナフタレンスルフォン酸塩のそれぞれの濃度が０．０１％〜０．１％であり、酵素活性を低下させずに該反応が行なわれることを特徴とする試料中の成分の定量法。
【請求項２】
試料中の定量すべき成分が１，５−アンヒドログルシトールである請求項１記載の定量法。
【請求項３】
試料が血液由来の試料である請求項１又は２記載の定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、定量しようとする試料が仮にヘモグロビンを含んでいる場合があっても、試料中のヘモグロビンによる測定の干渉を抑え、試料中の特定の成分、例えば１，５−アンヒドログルシトール（以下１，５ＡＧと略す。）等を酵素反応を利用して精度良く定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中には、時としてヘモグロビンが含まれている場合がある。その場合、成分を酵素反応を利用して分析する際に試料中のヘモグロビンが成分の測定結果に影響を与える。かかる場合目的成分の定量に先だってヘモグロビンを分解あるいは当該定量に影響しない物質に変換するか、あるいは影響のでない測定波長領域で定量を行なう必要がある。
【０００３】
試料中のヘモグロビンを消去する方法としては、（ａ）イオン交換カラムを用いてヘモグロビンを吸着除去する方法（特開昭６３−１８５３０７号公報、特開昭６４−６７５６号公報）、( ｂ) 酸化剤を用いて酸化ヘモグロビン（メトヘモグロビン）とする方法がある。又、特定波長領域を用いる方法としては、（ｃ）発色定量する際の発色基質に長波長高感度の基質を用いて試料の使用量を下げて影響を少なくする方法等が考案されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
（ａ）のカラムを用いる方法は、用手法で操作が煩雑であり、（ｂ）の方法は発色基質をも酸化する場合があり発色を抑えることが難しい。又、（ｃ）の方法により高感度で長波長の発色基質によって影響を回避しようとしても完全に影響が回避されていないため、必ずしも  満足できる結果は得られない。
例えば、１，５ＡＧは糖尿病の診断マーカーとして知られている。１，５ＡＧの定量法としては該物質に酸化酵素を作用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られている（特公平３−２４２００号公報）。しかしながら、血液等のヘモグロビンを含有する試料を用いた時に、正確な測定値が得られない場合が多い。
従って、多数の試料を自動分析装置を用いて分析する場合等に、その中にヘモグロビンを含む試料が存在していても、該試料中のヘモグロビンの影響を回避し、全ての試料について目的の成分を正確に定量できる方法の開発が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、測定系にアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を共存させることによって、目的成分を酸化酵素により酸化し同時に過酸化水素を生成せしめ、試料中のヘモグロビンの影響を回避してヘモグロビンを含む試料であっても含まない試料であってもいずれも正確に目的成分を定量することができることを見出し本発明を完成した。
【０００６】
すなわち本発明は、
（１）試料中の成分を酸化酵素を用いて定量する際にアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を共存させることを特徴とする試料中の成分の定量法、
（２）試料中の定量すべき成分が１，５ＡＧである上記（１）記載の定量法、
（３）試料が血液由来の試料である上記（１）又は（２）記載の定量法、に関するものである。
【０００７】
本発明によれば、ヘモグロビンを含有している試料中の成分の測定値がヘモグロビンの含有量依存的に下がる影響が回避され、ヘモグロビンの影響を受けない測定が可能である。
よって、本発明によれば自動分析装置等を用いて多数の試料の分析を行なう場合、多数の試料中にヘモグロビンを含む試料が存在していても、該試料についても、目的とする試料中の成分の定量を正確に行なうことができ、更に、測定系にアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を共存させても、ヘモグロビンを含まない試料の正確な定量に実質的な悪影響を及ぼさない。従って、本発明によれば、ヘモグロビンを含む試料と含まない試料を区別しなくても、全ての試料について成分の正確な定量が可能となるため、多数の試料の分析を同一の方法（本発明の方法）により簡単に正確に行なうことができる。
【０００８】
本発明において使用されるアルキルスルフォン酸塩あるいはアルキルナフタレンスルフォン酸塩は一般的には陰イオン界面活性剤で分類される化合物で蛋白質の変性剤として用いられている。したがって、使用量が多すぎると試薬として用いる酵素蛋白をも変性し酵素活性を低下させる危険性があり、少なすぎると十分な効果が出ず、使用量はそれぞれ、通常、酸化酵素による反応が行なわれる系中の濃度が０．００５％〜０．５％、好ましくは０．０１％〜０．１％となる量である。
アルキルスルフォン酸塩のアルキルとしては、Ｃ６〜１８の長鎖アルキルが好ましく、特にＣ１０〜１８の長鎖アルキルが好ましい。アルキルナフタレンスルフォン酸塩のアルキルとしてはＣ３〜１２のアルキルが好ましく、特にＣ４〜８のアルキルが好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。たとえば、アルキルスルフォン酸ナトリウムとして、ラテムルＰＳ（花王（株））、ニッコールＯＳ−１４（日光ケミカルズ（株））、ＩＰＣ−ＡＩＫＳ−６〜１３（東京化成工業（株））などが市販されており、又、アルキルナフタレンスルフォン酸ナトリウムとしてペレックスＮＢペースト、ペレックスＮＢ−Ｌ（花王（株））などが市販されている。
【０００９】
本発明は特に目的の成分を分析する際に用いられる酸化酵素が生成する過酸化水素をペルオキシダーゼと発色基質によって色素として検出する場合に適用できる。試料としては各種体液等が挙げられ、特に血液由来の試料である血清、血漿や尿が挙げられる。試料中の定量すべき成分としては、たとえばグルコース、クレアチニン、コレステロール、グリセロール、リン脂質、中性脂肪、遊離脂肪酸、シアル酸、尿素窒素、尿酸、１，５ＡＧの定量、等が挙げられる。特に、本発明は、目的成分が微量で高感度な検出を必要とする１，５ＡＧの定量等に適用すると効果が著しい。
【００１０】
使用する酸化酵素は、定量すべき成分を酸化する能力を有する酵素であり、公知の酸化酵素を使用することができる。試料中の例えば上記成分を酸化酵素を用いて定量する方法は公知であり、本発明の定量法はこの公知の方法に準じて行なうことができる。
酵素反応は、試薬を試料に添加し、通常１５〜５０℃で１分〜３０分、好ましくは３分〜１０分反応させることでなされる。
【００１１】
つぎに試料中の１，５ＡＧの定量を例に挙げて説明する。先ず試料中のグルコースを消去し、次いで１，５ＡＧに１，５ＡＧ酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素と発色基質とをペルオキシダーゼの存在下に反応させ、生成する色素の可視部の吸収を測定することにより、１，５ＡＧを定量することができる。
【００１２】
発色基質はペルオキシダーゼの存在下に酸化されて発色する化合物であれば何れも用いることができる。例えば２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもしくはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカップリング系が使用できる。具体的には４−アミノアンチピリンとフェノール類、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジンあるいはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）等の組み合わせによるいわゆるトリンダー系発色剤などがある。
【００１３】
また高感度基質と呼ばれているＮ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）、Ｎ−（メチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、ビス〔４−（３−スルホプロピルエチルアミノ）フェニル〕メタン二ナトリウム塩（Ｂｉｓ−ＡＬＰＳ）、ビス〔２，６−ジメチル−４−（３−スルホプロピルプロピルアミノ）フェニル〕メタン二ナトリウム塩（Ｂｉｓ−ＭＡＰＳ）等が使用可能である。使用する発色基質の量は生成する過酸化水素に対して好ましくは１〜１００倍モル量である。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例及び比較例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例及び比較例において使用したアルキルスルフォン酸塩は、アルキルの平均炭素数が１６のアルキルスルフォン酸ナトリウム塩（商品名ラテムルＰＳ：花王（株））であり、又、アルキルナフタレンスルフォン酸塩はアルキルの炭素数が４のアルキルナフタレンスルフォン酸ナトリウム塩（商品名ペレックスＮＢ−Ｌ：花王（株））である。
【００１５】
実施例１
クレアチニン測定用に以下の第一、第二試薬を調製した。
第一試薬
クレアチナーゼ                    ６０Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ            １０Ｕ／ｍＬ
ＴＯＯＳ                            １．５ｍＭ
アルキルスルフォン酸塩              ０．０５％
アルキルナフタレンスルフォン酸塩    ０．０５％
リン酸緩衝液                          ２５ｍＭ（ｐＨ７．８）
界面活性剤                            ０．１％
第二試薬
４−アミノアンチピリン              ８．０ｍＭ
クレアチニダーゼ                １２０Ｕ／ｍＬ
ＨＲＰ                            ４０Ｕ／ｍＬ
リン酸緩衝液                          ２５ｍＭ（ｐＨ７．８）
【００１６】
上記試薬を用いて、以下のパラメーターにて日立７１５０型自動分析装置を用いてクレアチニン濃度を測定した。
試料                    １０μｌ
第一試薬              ３００μｌ
第二試薬              １００μｌ
温度                    ３７℃
検量線              ０、１０μｇ／ｍｌ
測定波長            ５７０／７００ｎｍ
吸光度差              １０〜５ｍｉｎ
試料として
クレアチニン          １．０ｍｇ／ｄＬ
を含有する血清試料にヘモグロビン溶液を９：１で混合し、ヘモグロビン０〜５００ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／ｄＬ毎）を含有する試料を用いて、クレアチニン濃度を測定した。
【００１７】
その結果以下のようにヘモグロビンの影響はほとんどなかった。
0003690754.tif 000002
【００１８】
実施例２
１，５ＡＧの測定用に以下の第一、第二試薬を調製した。
第一試薬
４−アミノアンチピリン              １．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2                           ７．５ｍＭ
ＫＣｌ                                ８０ｍＭ
ＡＴＰ                                  ５ｍＭ
Ｄ−キシロース                      ０．３μｇ／ｍＬ
ＨＲＰ                              ４Ｕ／ｍＬ
グルコキナーゼ                      １Ｕ／ｍＬ
ピルベートキナーゼ                  ３Ｕ／ｍＬ
ホスフォエノールピルビン酸              ２ｍＭ
アルキルスルフォン酸塩              ０．０５％
アルキルナフタレンスルフォン酸塩    ０．０５％
ＨＥＰＥＳ緩衝液                      ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）
界面活性剤                            ０．１％
第二試薬
ＴＯＯＳ                            ４．５ｍＭ
ピラノースオキシダーゼ          １００Ｕ／ｍＬ
ＨＥＰＥＳ緩衝液                      ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）
【００１９】
上記試薬を用いて、以下のパラメーターにて日立７１５０型自動分析装置を用いて１，５ＡＧ濃度を測定した。
試料                    １０μｌ
第一試薬              ２６０μｌ
第二試薬              １３０μｌ
温度                    ３７℃
検量線              ０、５０μｇ／ｍｌ
測定波長            ５７０／７００ｎｍ
吸光度差              １０〜５ｍｉｎ
試料として
１，５ＡＧ          ２２．２μｇ／ｍｌ
グルコース            １００ｍｇ／Ｌ
を含有する血清試料にヘモグロビン溶液を９：１で混合し、ヘモグロビン０〜５００ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／ｄＬ毎）を含有する試料を用いて、１，５ＡＧ濃度を測定した。
【００２０】
その結果以下のようにヘモグロビンの影響はほとんどなかった。
0003690754.tif 000003
【００２１】
実施例３
１，５ＡＧの測定用に以下の第一、第二試薬を調製した。
第一試薬
ＤＡ−６７                        ０．０５ｍＭ
ＭｇＣｌ2                           ７．５ｍＭ
ＫＣｌ                                ８０ｍＭ
ＡＴＰ                                  ５ｍＭ
Ｄ−ガラクトース                        ２μｇ／ｍＬ
グルコキナーゼ                      １Ｕ／ｍＬ
ピルベートキナーゼ                  ３Ｕ／ｍＬ
ホスフォエノールピルビン酸              ２ｍＭ
アルキルスルフォン酸塩              ０．０５％
アルキルナフタレンスルフォン酸塩    ０．０５％
界面活性剤                            ０．１％
ＨＥＰＥＳ緩衝液                      ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）
第二試薬
ピラノースオキシダーゼ          １００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ                    ５Ｕ／ｍＬ
ＨＥＰＥＳ緩衝液                      ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）
【００２２】
上記試薬を用いて、実施例２のパラメーターで測定波長を６６０／７５０ｎｍにかえて同様に日立７１５０型自動分析装置を用いて１，５ＡＧ濃度を測定した。
試料として
１，５ＡＧ          ３５．２ｍｇ／Ｌ
グルコース              ８５ｍｇ／ｄＬ
を含有する血清試料にヘモグロビン溶液を９：１で混合し、ヘモグロビン０〜５００ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／ｄＬ毎）を含有する試料を用いて、１，５ＡＧ濃度を測定した。
【００２３】
その結果以下のようにヘモグロビンの影響はほとんどなかった。
0003690754.tif 000004
【００２４】
実施例４
１，５ＡＧの測定用に以下の第一、第二試薬を調製した。
第一試薬
ＭＣＤＰ                          ０．０５ｍＭ
ＭｇＣｌ2                           ７．５ｍＭ
ＫＣｌ                                ５０ｍＭ
ＡＴＰ                                  ５ｍＭ
ＮＡＤ                                  １ｍＭ
ピルビン酸                            １０ｍＭ
Ｄ−キシロース                      ０．４μｇ／ｍＬ
グルコキナーゼ                    １０Ｕ／ｍＬ
グルコース６リン酸脱水素酵素      １２Ｕ／ｍＬ
乳酸脱水素酵素                      ２Ｕ／ｍＬ
アルキルスルフォン酸塩              ０．０３％
アルキルナフタレンスルフォン酸塩    ０．０３％
界面活性剤                            ０．１％
ＨＥＰＥＳ緩衝液                      ５０ｍＭ（ｐＨ７．５）
第二試薬
ペルオキシダーゼ                  １０Ｕ／ｍＬ
ピラノースオキシダーゼ            ８０Ｕ／ｍＬ
ＨＥＰＥＳ緩衝液                      ５０ｍＭ（ｐＨ７．５）
【００２５】
上記試薬を用いて、実施例３と同様のパラメーターにて１，５ＡＧ濃度を測定した。
試料として
１，５ＡＧ            ５．２ｍｇ／Ｌ
グルコース            １４８ｍｇ／ｄＬ
を含有する血清試料にヘモグロビン溶液を９：１で混合し、ヘモグロビン０〜５００ｍｇ／ｄＬ（１００ｍｇ／ｄＬ毎）を含有する試料を用いて、１，５ＡＧ濃度を測定した。
【００２６】
その結果以下のようにヘモグロビンの影響はほとんどなかった。
0003690754.tif 000005
【００２７】
比較例１
実施例１の第一試薬からアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を除いた試薬を用いて実施例１と同様に同試料にヘモグロビンを添加して測定した。
0003690754.tif 000006
以上のようにヘモグロビンの影響を受け正確な測定が出来なかった。
【００２８】
比較例２
実施例２の第一試薬からアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を除いた試薬を用いて実施例２と同様に同試料を測定した。
0003690754.tif 000007
以上のようにヘモグロビンの影響を受け正確な測定が出来なかった。
【００２９】
比較例３
実施例３の第一試薬からアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を除いた試薬を用いて実施例３と同様に同試料を測定した。
0003690754.tif 000008
以上のようにヘモグロビンの影響を受け正確な測定が出来なかった。
【００３０】
比較例４
実施例４の第一試薬からアルキルスルフォン酸塩及びアルキルナフタレンスルフォン酸塩を除いた試薬を用いて実施例４と同様に同試料を測定した。
0003690754.tif 000009
以上のようにヘモグロビンの影響を受け正確な測定が出来なかった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、ヘモグロビンの影響を受ける事のない、１，５−アンヒドログルシトールを初めとする各種試料中成分の酸化酵素を利用した定量法が提供される。