(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子−８のN末端側２３番目から４６番目のアミノ酸配列に特異的に反応し、かつ線維芽細胞増殖因子−８の活性を阻害するモノクローナル抗体。
【請求項２】
線維芽細胞増殖因子−８がヒト由来である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
IgG1サブクラスに属するモノクローナル抗体である、請求項１または２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマKM1334（FERM BP-5451）。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、乳癌の診断薬。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、乳癌の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、線維芽細胞増殖因子−８によって増殖するヒト腫瘍細胞の病態解析および治療に有用であり、線維芽細胞増殖因子−８に特異的に反応し、かつ中和活性を有する、すなわち、線維芽細胞増殖因子−８活性を阻害するモノクローナル抗体を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
アンドロジェン誘導増殖因子（ＡＩＧＦ）は、１９９２年、性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株ＳＣ−３〔Shionogi Carcinoma-3：J.Steroid Biochem.27, 459(1987) 〕の培養上清中より単離された因子である。ＡＩＧＦは、アンドロジェン刺激により誘導産生され、オートクライン的にＳＣ−３細胞を増殖させる増殖因子である［Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.89, 8928ー8932, (1992)］。遺伝子クローニングの結果、ＦＧＦファミリーとアミノ酸レベルで３０〜４０％のホモロジーがあることが示され、線維芽細胞増殖因子−８（以下、ＦＧＦ−８と略す。）と命名された。その後、マウスＦＧＦ−８をプローブとしてヒト胎盤ゲノムライブラリーよりヒトＦＧＦ−８がクローン化され、マウスＦＧＦ−８と塩基レベルで８５％、アミノ酸レベルで１００％一致することが示された［FEBS Letters, 363, 226(1995)］。従来より、前立腺癌や乳癌など性ホルモン依存的増殖を示す腫瘍においては、性ホルモン誘導性の増殖因子がオートクライン的に作用していると推測されてきたが、ＦＧＦ−８の単離およびクローニングは、マウスの系ではあるが、初めてそのメカニズムを実証するものであった。ヒトにおいても同様のメカニズムでＦＧＦ−８が発癌や腫瘍の増殖に関与していることが推察されるが、これまでのところ明確な証拠は得られていない。しかし、前立腺癌や乳癌のいくつかのヒト腫瘍細胞株でＦＧＦ−８のメッセンジャーＲＮＡの発現が認められること、さらにＣＨＯ細胞で発現させたＦＧＦ−８をこれらの細胞株や繊維芽細胞の細胞株の培養系に添加すると増殖の促進が認められることから［FEBS Letters, 363, 226(1995)］、ＦＧＦ−８が性ホルモン依存性腫瘍にオートクラインあるいはパラクライン的に作用する増殖因子の一つである可能性は十分にあると思われる。
【０００３】
したがってＦＧＦ−８に対する抗体は、上記に示した腫瘍細胞におけるＦＧＦ−８の役割や生物学的機能の解析、さらには前立腺癌および乳癌等の免疫学的検出による診断に有効である。さらに中和活性を有する抗体であれば、ＦＧＦ−８の生物活性を研究するうえで役立つと考えられ、また、前述の癌治療に有効であるとも考えられる。
【０００４】
これまでのところＦＧＦ−８に対するモノクローナル抗体は取得されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前立腺癌や乳癌などのホルモン依存性腫瘍の増殖因子である可能性があるＦＧＦ−８に特異的に反応し、さらにＦＧＦ−８の活性を阻害する性質を有するモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＦＧＦ−８の部分ペプチドを免疫原に用いてハイブリドーマを作製し、該ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を確立し、該ハイブリドーマを培地中に培養するか動物に投与して腹水癌化し、培養上清または腹水を採取することによりモノクローナル抗体を得た。これを用いてウエスタンブロッティングを行い、該モノクローナル抗体がＦＧＦ−８蛋白に反応することを見い出し、さらに性ホルモン依存的増殖を示すマウス乳癌細胞株ＳＣ−３の培養液中に該モノクローナル抗体を添加し、該モノクローナル抗体がＦＧＦ−８活性を阻害すること、すなわち、ＦＧＦ−８に対する中和活性を見いだした。
【０００７】
本発明は、ＦＧＦ−８に特異的に反応し、かつ、ＦＧＦ−８活性を阻害するモノクローナル抗体に関する。
本発明のＦＧＦ−８に特異的に反応するモノクローナル抗体（以下、抗ＦＧＦ−８と称す）の具体例としては、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１３３４が生産する抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４をあげることができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
（１）抗原の調製
抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、ＦＧＦ−８を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはＦＧＦ−８をコードするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、ＦＧＦ−８をコードするｃＤＮＡの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合蛋白として発現、精製された蛋白質、さらには、ペプチド合成機を用いて合成されたＦＧＦ−８の部分ペプチド等を用いることができる。
【０００９】
抗原として用いるペプチドは免疫原性を高めるために、架橋剤を用いてキャリアタンパクと結合させる。キャリアタンパクとしてはキーホールリンペットヘモシアニン（以下ＫＬＨと略す。）、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す。）あるいはサイログロブリン（以下ＴＨＹと略す。）などがある。架橋剤としてはグルタールアルデヒドやN-（m-マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド（以下ＭＢＳと略す。）などがある。
【００１０】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウスまたはラットに、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年〕などで調べる。免疫に用いたペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
【００１１】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ−１(Current Topics in Microbiology and Immunology-1) 、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ（European J. Immunology）6, 511-519 (1976) 〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー（Nature）276, 269-270  (1978)〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J. Immunology ）123 ，1548-1550  (1979) 〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔ネイチャー（Nature）256, 495-497 (1975) 〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI-1640 培地にグルタミン（1.5mM ）、２−メルカプトエタノール（5 ×10-5Ｍ）、ジェンタマイシン（10μg/ml）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を10％加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（15μg/ml）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日2 ×107 個以上の細胞数を確保する。
【００１２】
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム1.83g 、リン酸一カリウム0.21g 、食塩7.65g 、蒸留水１リットル、pH7.2 ）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、洗浄用培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／108 抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に洗浄用培地１〜２ｍｌを数回加え、全量が５０ｍｌになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、ＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（10-4Ｍ）、チミジン（1.5 ×10-5Ｍ）およびアミノプテリン（4 ×10-7Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％CO2 インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば（５）に述べる酵素免疫測定法あるいはＦＡＣＳ（Fluorescence-Activated Cell Sorting の略）などを用いて、ＦＧＦ−８部分ペプチドに特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００１３】
（５）抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体の選択
抗体を測定する酵素免疫測定法としてはサンドイッチ法、イムノエンザイムメトリック法、酵素標識第２抗体を用いた固相法、固相化第２抗体を用いた方法、酵素・抗酵素抗体を用いた固相法などがある〔蛋白質核酸酵素  別冊No.31 P.23 (1987) 〕。以下に、酵素標識第２抗体を用いた固相法で行う方法について述べる。
【００１４】
抗原ペプチドは、架橋剤を用いて、免疫に使用したものとは異なるキャリアタンパクと結合させておく。コントロールペプチドとしては、ヒトＦＧＦ−８部分ペプチドおよび該部分ペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するペプチドをキャリアタンパクと結合させて用いる。上記ペプチドを１〜５０μｇ／ｍｌ、１０〜１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩放置してプレートコートする。ＢＳＡ溶液などでブロッキング後、ハイブリドーマ培養上清もしくは（６）で得られる精製抗体を第一抗体として５０〜１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温で２時間または４℃で一晩反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた溶液（以下Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと称す）で洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温１〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、ヒトＦＧＦ−８部分ペプチドに特異的に反応するウェルを抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体として選択する。
【００１５】
（６）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、３〜１０日飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2 ×107 〜5 ×106 細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（3,000rpm、５分）して固形分を除去後、40〜50％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲルろ過カラムに通塔し、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットもしくはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行う。蛋白量は、ローリー法もしくは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
【００１６】
（７）モノクローナル抗体の特異性の確認（ウエスタンブロッティング）
（５）で選択された抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体がＦＧＦ−８タンパクに反応するか否かを、ウエスタンブロッティングにて調べる。マウス乳癌細胞株ＳＣ−３のテストステロン刺激時の培養液もしくはその培養液中のＦＧＦ−８蛋白あるいはＣＨＯ細胞発現ＦＧＦ−８蛋白を精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画後、ニトロセルロース膜あるいはＰＶＤＦ膜にブロッティングする。ＢＳＡ溶液でブロッキング後、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体の培養上清もしくは精製抗体１〜１０μｇ／ｍｌを室温で２時間または４℃で一晩反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗マウスイムノグロブリン抗体もしくは抗ラットイムノグロブリン抗体１〜５０μｇ／ｍｌを５０〜１００μｌ／ウェルずつ分注し、室温1〜２時間反応させる。よく洗浄した後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体がＦＧＦ−８蛋白の分子量に一致するバンドに反応することを確認する。
【００１７】
（８）モノクローナル抗体によるＦＧＦ−８活性の阻害
（５）で選択された抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体がＦＧＦ−８活性を阻害できるか否かを、ターゲット細胞にマウス乳癌細胞株ＳＣ−３もしくはヒト前立腺癌または乳癌の細胞株を用いた増殖阻害アッセイにて調べる。方法としては、ターゲット細胞をＦＧＦ−８（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）あるいはテストステロンを含む培地にて培養する際、培養上清もしくは精製した抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体の最終濃度が0.1 〜１００μｇ／ｍｌになるように段階希釈して培地中に添加する。24〜72時間培養後、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチル−２−チアゾニル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド］溶液もしくはセルカウンティングキットなどを用いて生細胞数を測定し、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体によりＦＧＦ−８活性が阻害されることを確認する。
【００１８】
【実施例】
実施例１
（１）免疫原の調製
ヒトＦＧＦ−８のＮ末端より２３残基から４６残基までの部分アミノ酸配列にキャリア蛋白との結合のためにＣ末端にＣｙｓを付加してペプチド合成を行った（配列番号１）。ペプチド合成には、他種品目同時固層法自動ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８（島津製作所社製）を用いた。免疫原性を高める目的で、合成ペプチドとＫＬＨ（カルビオケム社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍｌに調整し、ＫＬＨ溶液の1/10容量の２５ｍｇ／ｍｌＭＢＳ（ナカライテスク社）を滴下して３０分間撹拌反応させた。あらかじめＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラムなどのゲルろ過カラムでフリーのＭＢＳを除き、ＫＬＨ−ＭＢＳコンジュゲート２．５ｍｇを得た。さらに、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ＰＨ７．０）に溶解したペプチド１ｍｇと混合し、室温で３時間、攪拌反応した。反応後、ＰＢＳ−０．５ＭＮａＣｌで透析したものを免疫原とした。
【００１９】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例１（１）に示した方法により調製したペプチド−ＫＬＨコンジュゲート１００μｇをアルミニウムゲル２ｍｇおよび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×109 細胞とともに５週令雌マウス（Balb/c）に投与し、２週間後より１００μｇのペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを１週間に１回、計４回投与した。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を実施例１（３）に述べる酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1,200rpm、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
【００２０】
（３）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原としては、配列番号１に示すヒトＦＧＦ−８部分ペプチドを以下の方法でサイログロブリン（以下、ＴＨＹと略す。）と架橋したコンジュゲートを用いた。すなわち、ペプチド１ｍｇを0.1 Ｍ酢酸アンモニウムバッファーに溶解し、あらかじめ同バッファーに溶解しておいたＴＨＹ５ｍｇを加えながら、１ｍｌにメスアップした。さらに、攪拌しながら、0.02Ｍグルタールアルデヒド５４０μｌを滴下し、室温で５時間攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで一晩透析したものを抗原として用いた。対照抗原には配列番号２に示すペプチドを先に述べた方法でＴＨＹと架橋したコンジュゲートを用いた。９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社）に、調製した１０μｇ／ｍｌのコンジュゲートを, ５０μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、残っている活性基をブロックするために、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μｌ／ウェルで加え、室温１時間反応させた。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、ハイブリドーマの培養上清もしくは被免疫マウス抗血清を５０μｌ／ウェルで分注し２時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ダコ社）を５０μｌ／ウェルで加えて室温、１時間反応させ、ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［2,2-アジノビス（3-エチルベンゾチアゾール-6-スルホン酸）アンモニウム］を用いて発色させＯＤ４１５ｎｍの吸光度（ＮＪ２００１;日本インターメッド社）を測定した。
【００２１】
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を正常培地で培養し、細胞融合時に２×107 個以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
【００２２】
（５）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウス脾細胞と実施例１（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（1,200rpm、５分）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を０．２〜１ｍｌ／108 個マウス脾細胞の割合で加え、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が50mlになるようにした。遠心分離（900rpm、５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでＨＡＴ培地100ml 中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベーター中、３７℃で10〜14日間培養した。この培養上清を実施例１（３）に記載した酵素免疫測定法を用いて、ＦＧＦ−８ペプチドに特異的に反応するウェルを選んだ。さらにＨＴ培地と正常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株を確立した。当該ハイブリドーマ株の具体例としては、図１に示したようにモノクローナル抗体ＫＭ１３３４が挙げられる。ハイブリドーマＫＭ１３３４は、平成８年３月７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にFERM BP-5451として寄託されている。なお、抗体クラスはサブクラスタイピングキットを用いた酵素免疫測定法によりＩｇＧ１と決定された。
【００２３】
（６）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb/c）に実施例１（３）で得られたハイブリドーマ株を５〜20×106 細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠心分離（3,000rpm、５分）して固形分を除去した後、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Labpratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
【００２４】
実施例２
（１）ウエスタンブロッティングによるモノクローナル抗体の特異性の検討
マウス乳癌細胞株ＳＣ−３のテストステロン刺激時の培養液より精製したＦＧＦ−８蛋白を0.1 μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分画後、常法によりＰＶＤＦ膜にブロッティングした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４（１０μｇ／ｍｌ）およびコントロール抗体として正常ラット血清（×５００）を、室温で２時間または４℃で一晩反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社）を室温で１時間反応させた。ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、ＥＣＬ（アマシャム社製）試薬を 1分間反応させ、余分な試薬を除去した後、フィルムを１０秒〜２分間程度感光させて検出した。図２に示すようにＫＭ１３３４はＦＧＦ−８に反応した。ＦＧＦ−８の理論値は２２Ｋダルトンだが、糖鎖等の付加により３０Ｋダルトン前後のバンドとして認められた。
【００２５】
（２）モノクローナル抗体によるＦＧＦ−８活性阻害の検討
抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体がＦＧＦ−８活性を阻害できるか否かを、ターゲット細胞にマウス乳癌細胞株ＳＣ−３を用いた増殖阻害アッセイにて調べた。ＦＧＦ−８（50ng/ml ）、テストステロン（10nM；ナカライテスク社製）あるいは塩基性線維芽細胞増殖因子（以下、ｂＦＧＦと略す）（1ng/ml；Pepro Tech Inc. 製）を含む培地でＳＣ−３を培養した。この際に、抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体であるＫＭ１３３４を最終濃度０．１〜１００μｇ／ｍｌになるように段階希釈して培地中に添加した。コントロール抗体としては、精製マウスＩｇＧ（シグマ社製）を用いた。７２時間培養後、ＭＴＴ法で生細胞数を測定した。すなわち、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチル−２−チアゾニル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド］−ＰＢＳ溶液を１０μｌ／ウェルで加えて、３７℃で４〜５時間インキュベートした後、0.04N ＨＣｌ−イソプロパノールを１５０μｌ／ウェルで加え、さらに３７℃で１〜２時間振とうして生成した色素を可溶化し、ＯＤ５４０ｎｍにて吸光度を測定した。ＦＧＦ−８、ｂＦＧＦ、およびテストステロンに対する活性阻害の結果を、図３、図４および図５に示す。図３に示すようにＫＭ１３３４は濃度依存的にＦＧＦ−８によるＳＣ−３細胞の増殖を阻害したが、図４に示すように、ＫＭ１３３４は濃度依存的にｂＦＧＦによるＳＣ−３細胞の増殖を阻害しなかった。したがってＫＭ１３３４はＦＧＦ−８活性を特異的に阻害することが示された。さらに、図５において、ＫＭ１３３４は、テストステロンによるＳＣ−３細胞の増殖を部分的には阻害したが、抗体濃度１００μｇ／ｍｌにおいて、完全には阻害されなかった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によれば、ＦＧＦ−８と特異的に反応し、且つＦＧＦ−８の活性を阻害するモノクローナル抗体を提供することができる。本発明のモノクローナル抗体は、腫瘍細胞におけるＦＧＦ−８の役割や生物学的機能の解析、さらには前立腺癌および乳癌等の免疫学的検出による診断に有用である。
【００２７】
【配列表】
配列番号：1
配列の長さ：25
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：GlnValThrValGlnSerSerProAsnPheThrGlnHisValArgGluGlnSerLeuValThrAspGlnLeuCys
【００２８】
配列番号：2
配列の長さ：15
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：CysAlaThrAlaAlaAspGlnGluLysAsnProGluGlyAspGly
【図面の簡単な説明】
【図１】  抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４の酵素免疫測定法における抗原に対する結合反応性を示す。■はＴＨＹ−ＦＧＦ−８ペプチド抗原を、□はＴＨＹ−１５６３９ペプチド抗原に対する結合反応性をそれぞれ示している。
【図２】  抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４のウエスタンブロッティングにおける精製ＦＧＦ−８タンパクとの反応性を示す。
【図３】  抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４のＦＧＦ−８に対する活性阻害を示す。図中、ｇｒｏｗｔｈ０％の線は増殖因子も抗体も加えなかった時の値を示す。点線はコントロール抗体である精製マウスＩｇＧ、実線は抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４の活性阻害をそれぞれ示す。
【図４】  抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４のｂＦＧＦに対する活性阻害を示す。図中、ｇｒｏｗｔｈ０％の線は増殖因子も抗体も加えなかった時の値を示す。点線はコントロール抗体である精製マウスＩｇＧ、実線は抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４の活性阻害をそれぞれ示す。
【図５】  抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４のテストステロンに対する活性阻害を示す。図中、ｇｒｏｗｔｈ０％の線は増殖因子も抗体も加えなかった時の値を示す。点線はコントロール抗体である精製マウスＩｇＧ、実線は抗ＦＧＦ−８モノクローナル抗体ＫＭ１３３４の活性阻害をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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