(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の開口を有する円板を回転させ前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点画像を得る共焦点顕微鏡において、
光源と、
入力光を前記試料に集光し前記試料からの戻り光を出射する対物レンズと、
前記開口を通過した前記光源の出力光を前記対物レンズに入射し、前記対物レンズからの戻り光を再び前記開口に通過させ出力する共焦点スキャナと、
前記試料が設置されるステージと、
このステージの位置を移動させる駆動手段と、
前記共焦点スキャナの出力光を撮影する撮影手段と、
前記駆動手段を制御して前記ステージを移動させると共に前記撮影手段からの共焦点画像を取り込む制御手段と
を備え前記撮影手段の受光面の一部に設定されたグレーレベル検出用領域内の複数の画素から得られるグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知することにより前記試料の上下端面を自動的に検出することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【請求項２】
前記撮影手段の受光面の一部に設定されたグレーレベル検出用領域内の複数の画素から得られるグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知することにより前記試料側面端を自動的に検出することを特徴とする特許請求の
範囲請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項３】
前記試料からの戻り光が反射光であることを特徴とする
特許請求の範囲請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【請求項４】
前記試料からの戻り光が蛍光であることを特徴とする
特許請求の範囲請求項１記載の共焦点顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点顕微鏡に関し、特に試料の上下端面を自動的に検出することが可能な共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の共焦点顕微鏡は複数の開口を有する円板を回転させ開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点画像を得るものである。
【０００３】
図５はこのような従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成ブロック図である。図５において１はレーザ光源等の光源、２は共焦点スキャナ、３は光学顕微鏡、４は対物レンズ、５は試料、６はステージ、７はＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ等の撮影手段、８は制御手段、９はステージ６を上下に移動させる駆動手段である。
【０００４】
光源１からの出力光は光ファイバ等を介して共焦点スキャナ２に入射され、共焦点スキャナ２からの出力光は光学顕微鏡の対物レンズ４を介して試料５に照射される。
【０００５】
試料５からの反射光や蛍光等の戻り光は再び対物レンズ４を介して共焦点スキャナ２を介して撮影手段７に入射され、撮影手段７の出力信号は制御手段８に接続される。
【０００６】
また、制御手段８の制御信号は駆動手段９に接続され、駆動手段９は試料５が設置されたステージ６を上下に駆動する。
【０００７】
ここで、図５に示す従来例を説明する。共焦点スキャナ２内部には複数の開口を有する円板が回転しており、光源１からの出力光は前記複数の開口を通過して対物レンズ４により試料５上に集光される。
【０００８】
試料５からの反射光や蛍光等は戻り光として対物レンズ４を介して共焦点スキャナ２に入射され先に通過した前記複数の開口のうち同一の開口を通過して撮影手段７に入射される。
【０００９】
即ち、同一開口を通過した光を撮影するので撮影手段７で得られる画像は光軸方向に分解能を持った画像となり、さらに、前記開口を回転させて試料５全体を走査しているので試料５のスライス画像である共焦点画像を得ることができる。
【００１０】
そこで、制御手段８は駆動手段９を制御して試料５が設置されたステージ６を図６中”イ”に示す光軸方向（上下方向）に移動させ複数枚の共焦点画像を得て、これらの複数枚の共焦点画像を画像処理して試料５の３次元画像を得る。
【００１１】
図６は上述の光軸方向の走査を説明する説明図である。図６において５は図５と同一符号を付してある。
【００１２】
制御手段８は駆動手段９を制御して共焦点画像の走査面を図６中”イ”に示す試料５の上端面に移動させると共に撮影手段７からの出力信号を取り込み、図６中”イ”に示す試料５の上端面の共焦点画像を得る。
【００１３】
次に、制御手段８は駆動手段９を制御して共焦点画像の走査面を図６中”ロ”に示す面に移動させると共に撮影手段７からの出力信号を取り込み、図６中”ロ”に示す面の共焦点画像を得る。
【００１４】
同様にして、制御手段８は駆動手段９を制御して共焦点画像の走査面が図６中”ハ”に示す試料５の下端面に移動してくるまで走査面を順次移動させると共に撮影手段７からの出力信号を順次取り込みそれぞれの面の共焦点画像を得て行く。
【００１５】
そして、全ての共焦点画像の取り込みを終了すると制御手段８は得られた複数枚の共焦点画像を画像処理して試料５の３次元画像を得る。
【００１６】
この結果、光学顕微鏡３に共焦点スキャナ２を取り付けると共に試料５が設置されたステージ６を光軸方向に移動させ、得られた複数の共焦点画像を画像処理することにより、試料５の３次元画像を得ることが可能になる。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、図５に示す共焦点顕微鏡では図６中”イ”及び”ハ”に示す試料５の上下端面は操作者が目視によりステージ６を動かして決定していた。
【００１８】
一方、共焦点顕微鏡は光軸方向の焦点深度が浅い、言い換えれば、焦点面以外の部分の像は見えないので前記焦点面が試料５の位置からずれている場合には試料５の上下端面を決定する以前に試料５自体を見つけることが困難であると言った問題点があった。
【００１９】
さらに、画像処理をしないと肉眼では確認できないような暗い試料の場合も試料自体を見つけることが困難であると言った問題点があった。
従って本発明が解決しようとする課題は、試料の上下端面を自動的に検出することが可能な共焦点顕微鏡を実現することにある。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
このような課題を達成するために、本発明の第１では、
複数の開口を有する円板を回転させ前記開口を通過した光を集光して試料を走査することにより共焦点画像を得る共焦点顕微鏡において、
光源と、
入力光を前記試料に集光し前記試料からの戻り光を出射する対物レンズと、
前記開口を通過した前記光源の出力光を前記対物レンズに入射し、前記対物レンズからの戻り光を再び前記開口に通過させ出力する共焦点スキャナと、
前記試料が設置されるステージと、
このステージの位置を移動させる駆動手段と、
前記共焦点スキャナの出力光を撮影する撮影手段と、
前記駆動手段を制御して前記ステージを移動させると共に前記撮影手段からの共焦点画像を取り込む制御手段と
を備え前記撮影手段の受光面の一部に設定されたグレーレベル検出用領域内の複数の画素から得られるグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知することにより前記試料の上下端面を自動的に検出することを特徴とするものである。
【００２１】
このような課題を達成するために、本発明の第２では、
本発明の第１において、
前記撮影手段の受光面の一部に設定されたグレーレベル検出用領域内の複数の画素から得られるグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知することにより前記試料側面端を自動的に検出することを特徴とするものである。
【００２２】
このような課題を達成するために、本発明の第３では、
本発明の第１において、
前記試料からの戻り光が反射光であることを特徴とするものである。
【００２３】
このような課題を達成するために、本発明の第４では、
本発明の第１において、
前記試料からの戻り光が蛍光であることを特徴とするものである。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下本発明を図面を用いて詳細に説明する。図１は本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成ブロック図である。
【００２５】
図１において１〜７及び９は図５と同一符号を付してあり、８ａは制御手段である。また、接続関係についても図５と同様である。
【００２６】
ここで、図１に示す実施例の動作を図２、図３及び図４を用いて説明する。図２は撮影手段７の受光面の詳細を示す平面図、図３は検出信号及びその微分信号を示す特性曲線図、図４は制御手段８ａの動作を説明するフロー図である。
【００２７】
図２中”イ”は撮影手段７の受光面全体であり、制御手段８ａは受光面の任意の一部分に図２中”ロ”に示すようなグレーレベル検出用領域を設定する。
【００２８】
試料５の上限端面を自動的に検出する場合、制御手段８ａは前記グレーレベル検出用領域内の複数の画素の平均値、最大値や中央値等をグレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”として適宜求める。
【００２９】
例えば、図３（Ａ）は前記グレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”の一例を示す特性曲線図であり、図３中”イ”及び”ロ”の位置は試料５の上端面及”Ｚｓ”び下端面”Ｚｅ”を示している。また、図３中”ハ”及び”ニ”はステージ６の機械的な上側移動限界”Ｚｕ”及び下側移動限界”Ｚｂ”である。
【００３０】
図３（Ａ）から分かるようにグレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”は試料５が存在しない部分では図３中”ホ”に示すようなバックグラウンド信号レベルであり、図３中”イ”に示す試料５の上端面”Ｚｓ”になると急激に信号レベルが上昇し、一方、図３中”ロ”に示す試料５の下端面”Ｚｅ”になると信号レベルが急激に下降する。
【００３１】
また、グレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”の微分信号”ΔＩ／Δｚ”は図３（Ｂ）に示すようになり、図３中”イ”及び”ロ”に示す試料５の上端面”Ｚｓ”及び下端面”Ｚｅ”において信号レベルが急激に変動する。
【００３２】
従って、制御手段８ａは図３（Ｂ）に示す信号レベルの変動を検知することにより試料５の上下端面位置を以下に示す手順で決定する。
【００３３】
先ず第１に、図４（ａ）に示すように制御手段８ａは試料の上下端面での変動を識別するしきい値”Ｔ”を設定し、図４（ｂ）に示すように駆動手段９を制御してステージ６の位置を上側移動限界”Ｚｕ”に移動させる。
【００３４】
図４（ｃ）に示すように制御手段８ａはグレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”を取り込み、図４（ｄ）に示すように制御手段８ａは駆動手段９を制御してステージ６の位置をスライス間隔分”Δｚ”だけ移動させる。
【００３５】
そして、図４（ｅ）に示すように制御手段８ａは前記移動後の位置が下限である”Ｚｂ”に達したかどうかを判断し、もし、前記移動後の位置が既に”Ｚｂ”に達していれば図４（ｆ）に示すように必要なエラー処理を行う。
【００３６】
もし、前記移動後の位置が”Ｚｂ”に達していなければ図４（ｇ）に示すように制御手段８ａはグレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”を取り込むと共に先に取り込んだグレーレベル信号との差分”ΔＩ”を演算する。
【００３７】
次に、図４（ｈ）に示すように制御手段８ａは”ΔＩ／Δｚ”を演算して、先に設定されたしきい値”Ｔ”以上かどうかを判断する。
【００３８】
もし、”ΔＩ／Δｚ＜Ｔ”であれば制御手段８ａは図４（ｃ）の処理に戻り、”ΔＩ／Δｚ≧Ｔ”であれば制御手段８ａは図４（ｉ）に示すように現在位置を上端面”Ｚｓ”と決定して現在位置を記憶する。
【００３９】
同様にして、図４（ｊ）に示すように制御手段８ａはグレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”を取り込み、図４（ｋ）に示すように制御手段８ａは駆動手段９を制御してステージ６の位置をスライス間隔分”Δｚ”だけ移動させる。
【００４０】
そして、図４（ｌ）に示すように制御手段８ａは前記移動後の位置が下限である”Ｚｂ”に達しているかどうかを判断し、もし、前記移動後の位置が既に”Ｚｂ”に達していれば図４（ｆ）に示すように必要なエラー処理を行う。
【００４１】
もし、前記移動後の位置が”Ｚｂ”に達していなければ図４（ｍ）に示すように制御手段８ａはグレーレベル信号”Ｉ（ｚ）”を取り込むと共に先に取り込んだグレーレベル信号との差分”ΔＩ”を演算する。
【００４２】
次に、図４（ｎ）に示すように制御手段８ａは”−ΔＩ／Δｚ”を演算して、先に設定されたしきい値”Ｔ”以上かどうかを判断する。
【００４３】
もし、”−ΔＩ／Δｚ＜Ｔ”であれば制御手段８ａは図４（ｊ）の処理に戻り、”−ΔＩ／Δｚ≧Ｔ”であれば制御手段８ａは図４（ｏ）に示すように現在位置を下端面”Ｚｅ”と決定して現在位置を記憶する。
【００４４】
この結果、受光面の一部に設定されたグレーレベル検出用領域からのグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知することにより、試料５の上端面”Ｚｓ”及び下端面”Ｚｅ”を自動的に検出することが可能になる。
【００４５】
また、画像処理をしないと肉眼では確認できないような暗い試料であっても試料の上下端面を自動的に検出することができる。
【００４６】
なお、図２におけるグレーレベル検出用領域は撮影手段７の受光面の任意の一部分に設定されるが、あくまでも制御手段８ａの処理上の設定であり、撮影手段７に特殊な設定がなされる訳ではない。
【００４７】
また、図４に示すフロー図ではステージ６を図３中”ハ”に示す上側移動限界”Ｚｕ”から図３中”ニ”に示す下側移動限界”Ｚｂ”に向かって移動させたが、逆方向に移動させても勿論構わない。
【００４８】
また、図１に示す実施例ではステージ６を光軸方向にのみ移動させているが、さらに、光軸に垂直な平面上を移動させることにより試料の中心位置等の決定をすることも可能である。
【００４９】
即ち、光軸方向にステージ６を移動させると共にその時点で光軸に垂直な平面上を移動させて、その時のグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知すれば、試料の上下端面のみならず試料の側面の端が検出できるので、試料の光軸に垂直な平面上での位置関係も得ることができる。
【００５０】
また、光源１としてはレーザ光源を例示したが白色光源、ＬＥＤ、輝線スペクトルや連続スペクトルを有するランプ光源等であっても構わない。
【００５１】
また、撮影手段７としてはＣＣＤカメラを例示したがＳＩＴ（Silicom Intensified Target）カメラやＰＣＤ（Plasma Charge-couped Device）カメラ等であっても構わない。
【００５２】
【発明の効果】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。受
受光面の一部に設定されたグレーレベル検出用領域内の複数の画素から得られるグレーレベル信号の微分信号の変動部分を検知することにより、試料の上端面及び下端面を自動的に検出することが可能な共焦点顕微鏡が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成ブロック図である。
【図２】撮影手段の受光面の詳細を示す平面図である。
【図３】検出信号及びその微分信号を示す特性曲線図である。
【図４】制御手段の動作を説明するフロー図である。
【図５】このような従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成ブロック図である。
【図６】光軸方向の走査を説明する説明図である。
【符号の説明】
１  光源
２  共焦点スキャナ
３  光学顕微鏡
４  対物レンズ
５  試料
６  ステージ
７  撮影手段
８，８ａ  制御手段
９  駆動手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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