(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタにおけるECF18Rを結合し得るE.coliによる腸コロニー形成に耐性であるブタを同定するための方法であって、該方法が以下：
a.遺伝子多型性が、該ブタからの生物学的サンプルにおいて存在するかどうかを決定する工程であって、該ブタのα（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１における307位における窒素塩基がアデニンである、工程；および
b.該ブタが該FUT1多型性についてホモ接合体である場合に、該ブタが耐性であると推定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
ブタにおけるECF18Rを結合し得る微生物によって生じる腸障害に対して耐性であるブタを同定するための方法であって、該方法が以下：
a.  該ブタからの生物学的サンプルにおいて、該ブタのα（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１における307位の唯一の窒素塩基がアデニンであるかどうかを決定する工程；および
b.  307位の該唯一の窒素塩基がアデニンである場合に、該ブタが耐性であると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
ブタにおけるECF18Rを結合し得る微生物によって生じる疾患に耐性であるブタを育種するための方法であって、該方法が以下：
a.  E.coli関連腸疾患に耐性であるブタであるとそれらを同定する、α（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１において遺伝子多型性についてホモ接合性である育種のためのブタを選択する工程であって、該ブタのα（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１における307位における窒素塩基がアデニンである工程；および
b.  該選択したブタを育種する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記E.coliがF18株である、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
ブタのα（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１をコードする、単離されたDNA分子であって、該α（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１における307位における窒素塩基がアデニンである、DNA分子。
【請求項６】
以下の配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有する、単離されたDNA分子：
0003637420.tif 000009
。
【請求項７】
ヌクレオチド307位においてグアニンの代わりにアデニンが存在する、請求項６に記載の単離されたDNA分子。
【請求項８】
請求項６または７に記載のヌクレオチド配列に相捕的である、単離されたDNA分子。
【請求項９】
ヌクレオチド857位において、グアニンの代わりにアデニンを有する、請求項６に記載の単離されたDNA分子。
【請求項１０】
ヌクレオチド229位においてチミンを有する、請求項６に記載の単離されたDNA分子。
【請求項１１】
請求項５または６に記載のDNA分子によってコードされるポリペプチドであって、該分子がα（1,2）フコシルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項5,6または８に記載の単離されたDNA分子の一部分であって、該一部分が、307位を含有する、DNA分子の一部分。
【請求項１３】
E.coli  F18関連疾患を有するブタを処置するための薬物を開発するための、ブタα（1,2）フコシルトランスフェラーゼのヌクレオチド多型性の使用であって、ここで、
該開発が、E.coli  F18の正常レセプターを阻害する分子を産生するように、該ヌクレオチド多型性を変異させることによって達成される、使用。
【請求項１４】
請求項５〜10および12のいずれか１項に記載されるDNA分子を含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項14に記載のベクターによって形質転換された、細胞。
【請求項１６】
請求項14に記載のベクターによって形質転換された、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項14に記載のベクターを動物細胞に導入する工程を包含する、非ヒトトランスジェニック動物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
イー・コリ（E.coli）関連疾患、特に、フィムブリエF18を有するイー・コリ細菌株に関連する腸疾患に対して遺伝学的に耐性のブタを同定するための組成物および非侵襲性の方法を提供する。ブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ（FUT1）遺伝子におけるDNA多型性は、耐性のブタと感受性のブタを区別し、ブタ育種家に有用な診断試験を提供することが同定された。
ブタの飼育における主要な問題は、病気させないでそれらを維持することである。離乳後の腸疾患が特に問題である。限定数の血清型の毒性エシェリキア・コリ（Escherichia（E.）coli）株は、ブタにおける浮腫疾患および離乳後の下痢の病原体であり、世界中のブタ飼育農家において、特に４ないし12週齢の子豚の間で、深刻な経済的損失を引き起こす。浮腫疾患の典型的な臨床上の徴候は、失調症、痙攣および麻痺のような神経学的サインである。死体解剖にて、浮腫は、典型的に、まぶたおよび額、胃壁ならびに結腸間膜のような独特な部位に存在する。該疾患は、エンテロ細胞（腸内細胞）の主要な形態学的変化をもたらすことなく小腸表面にコロニーを形成するイー・コリによって、各々、生産されるシガ様毒素II変異型およびエンテロトキシンLT、STa、STbによって引き起こされる。特定の型の細菌イー・コリ株、F18、F4およびK88は、この点に関して、主要な致命的な元凶である。「ブタの浮腫疾患は、全身性の管損傷によって特徴付けられるエンテロトキセミアである。後者は、特定のイー・コリ株によって生産されるシガ様毒素II変異型という毒素によって引き起こされる。」（Bertschingerら、1993）。イー・コリは、それらの線毛の型によって識別される。関連する一連の接着性フィムブリエを例えば、K88またはF18と称する（Vogeliら、1997）。
全てのブタがイー・コリ感染で死ぬわけではない。コロニー形成は、例えば、K88またはF18と称する細菌のフィムブリエによって媒介されるエンテロ細胞への細菌の接着に依存する。接着に対して感受性、すなわち、フィムブリエを結合するためのブタにおけるレセプターの発現は、宿主によって遺伝学的に制御されていることが示され、それは、優性の特性として、F18の場合、感受性対立遺伝子であるＢおよび耐性対立遺伝子のｂによって受け継がれる（Vogeliら、1996;Meijerinkら、1997）。該イー・コリF18レセプター（ECF18R）の遺伝子座は、染色体６上のハロセン（HAL）連鎖群のＳ遺伝子座および他の遺伝子座へのその密接な遺伝子連鎖に基づいて、ブタ染色体６（SSC6）に位置決定された。K88イー・コリのレセプターは、染色体13上にある。
耐性のメカニズムは、耐性動物における腸の縁がイー・コリによってコロニー形成されない、すなわち、細菌が耐性のブタの腸壁に接着しないというようである。腸の刷子縁膜における糖タンパク質レセプターは、いくつかのイー・コリに関連する接着および非接着表現型の間の相違の原因であり、それにより、宿主ブタの遺伝子型が耐性を決定することが示された。フィムブリエを有する細菌もまた研究された（WO9413811）。
F18イー・コリ関連疾患に対して耐性であるブタを同定する現行の方法は、１）屠殺してブタから腸試料を収集し、顕微鏡接着試験を行うこと、２）毒性のイー・コリで動物を試験すること（「コロニー形成試験」）または３）Ａ−Ｏ（Ｓ）血液型システムの血液型分類を行うことのいずれかである。最初の２つの方法は、育種用家畜として有用な耐性動物を同定するために実用的なものではない。血液型分類法は耐性動物を同定するけれども、該試験は、感受性の動物が感受性に関してホモ接合体であるかまたはヘテロ接合体であるかを決定できない。これらの対立遺伝子（遺伝子の状態）に関して、動物の遺伝子型の知見は、好結果の飼育プログラムを発展させるために不可欠である。育種プログラムの目的は、離乳後に家畜の多くを殺すF18イー・コリ関連疾患に対して耐性のブタを生産することである。
１の出版物において、著者らは、ブタにおける浮腫疾患に関して、「適当な遺伝子マーカーの探求が進行中である・・・」と述べ（Bertschingerら、1993、87ページ）、WalterおよびSellwood（1982）による：
耐性のブタを育種することは、有効な予防ができない疾患を防止する魅力的な方法である。この解決法の成否は、ブタ集団における耐性をコードする遺伝子の普及率、耐性のブタを検出する改善された方法、および耐性と同時に選択される反対の遺伝子特性の不在に依存するであろう。
という記載を引用した。
遺伝子「マーカー」座は、関連する遺伝子座に近接であるが、必ずしもその遺伝子座そのものではないコーディングまたは非コーディング遺伝子座である。検出可能な表現型は、連続または不連続の特性、例えば、制限長フラグメント多型性、生産特性、細菌接着特性、比色または酵素反応および抗生物質耐性を包含する。Ｓ遺伝子座は、ＡおよびＯ血液型抗原の発現を制御する。Ｓ遺伝子座で劣性のホモ接合体のブタは、ＡまたはＯ血液型抗原のいずれをも発現しない。同様の状態がヒトに存在し、ヒト血液型Ｈをコードするアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における変異が原因である（Keiiyら、1994;またWO9628967も参照）。ブタのブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、近年、配列決定された（Cohneyら、1996）。該遺伝子は、まさしく、ブタにおいてＳ遺伝子座に存在する遺伝子のようである。
血液型ＨおよびSe遺伝子座は、遺伝学的および物理的にヒト染色体19q13.3に位置決定された。該領域は、進化論的に保存され、ブタにおける遺伝子のHAL連鎖群に対して相同の遺伝子を含有する。血液型Ｈをコードする遺伝子はFUT1と呼ばれ、一方、Se遺伝子はFUT2遺伝子と等価である。FUT1は赤血球細胞系統においてＨ抗原発現を決定し、一方、FUT2は分泌性上皮および唾液においてＨ抗原の発現を調節する。FUT1遺伝子の保存は、ラットおよびウサギのような下等哺乳動物において示され、mRNA発現は、ウサギ脳組織およびラット結腸において示された。これらの種の全てにおいて、２つの型のアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ヒトFUT1およびFUT2遺伝子に構造的に非常に類似するが、特に、FUT1相同遺伝子は種特異的発現パターンを示すことが報告された。ヒトにおいて、FUT1遺伝子は、赤血球細胞の前駆体におけるＨ抗原の合成の原因である。しかしながら、ブタにおいて、赤血球は、ヒトLewis抗原の場合のように、受動的に血清由来のＨ様抗原を吸着する。ブタにおいて、全てのＨ様抗原は、外分泌を行う分泌組織に関連し、FUT2（分泌型）遺伝子の発現は、他の動物種の分泌組織に見出される。したがって、抗ヒト血液型ＨおよびＡ抗体と交差反応するブタＡ−Ｏ血液型決定基の発現は、FUT2遺伝子により影響を及ぼされるかもしれない。
血液型およびイー・コリブタ疾患についてのさらなる情報は、血液型抗原の炭水化物構造がいくつかの病原性微生物の宿主組織への接着を媒介すること、例えば、ヘリノバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）はLewisb血液型抗原に接着し、尿路感染症を引き起こすイー・コリは血液型Ｐ物質に接着することを包含する。したがって、血液型特異的炭水化物構造の形成の原因であるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、宿主による細菌のコロニー形成の制御に関する遺伝子の候補である。これらの遺伝子の局在性は、ブタの小腸におけるF18陽性イー・コリの接着／非接着の原因となる遺伝子座と同じ染色体領域にある。ブタは、離乳後、すなわち、F18イー・コリによって引き起こされる疾患に罹患しやすくなる時期まで、血液型抗原ＡおよびＯを発現しない。
ブタにおけるイー・コリ関連腸疾患のための診断および治療の新規な方法が必要とされる。遺伝子変異の検出は、いくつかのブタの障害（悪性低体温症）の診断試験として提案された（Fujiiら、1991;米国特許第5,358,648号）が、診断用の多型性マーカーは報告されなかった。イー・コリのコロニー形成に対する耐性を発達させるためのワクチンは記載されたが（米国特許第5,552,144号;WO8604604）、生ワクチンを経口的に生まれたばかりのブタに投与するのは困難であるため、また、規定の制限のため、イー・コリ疾患を防止するための好ましい方法ではないようである。抗生物質は治療に有用であるが、予防では成功しない。
発明の概要
本発明の組成物および非侵襲性の方法は、イー・コリ関連疾患に感受性のブタの検出および排除を提供する。イー・コリF18による腸内コロニー形成に対して耐性のブタを同定するための非侵襲性の方法は、以下の工程：ブタ由来の生物学的試料中、コロニー形成に対する耐性に関連する遺伝的多型性が存在するかどうかを決定し；ブタが多型性１に関してホモ接合体である場合、ブタは耐性であると推断する工程を包含する。（１多型性とは、変異のため集団的に存在するヌクレオチド配列における変化のことである）
より詳細には、該方法は、ブタ由来の生物学的試料中、ブタのアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における位置307の窒素塩基がアデニンであるかグアニンであるかを決定し；位置307の唯一の窒素塩基がアデニンである場合、ブタを耐性として同定することである。
生物学的試料中で多型性が存在するかどうかを決定するために、制限フラグメント長多型性を分子量によってそれらを分離するゲル上で分析する。制限エンドヌクレアーゼは、特異的部位で核酸分子を再現可能に切断し、切断の位置によって種々の分子量の核酸フラグメントを生じる酵素である。
本発明は、また、イー・コリ関連腸疾患に対して耐性のブタとして同定するアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子における遺伝的多型性を有する飼育用ブタを選択し、選択したブタを飼育することによって、イー・コリ関連疾患に対して耐性のあるブタを育種する方法に関する。
本発明の態様は、ブタにおけるアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子に関して多型性であり、特に図１記載の配列であるDNA分子である。本発明の他の態様は、図１記載の配列に相捕的なヌクレオチド配列を有する分子である。
本発明の態様は、位置307においてグアニンの代わりにアデニンを有する単離DNA分子である。該分子は、また、位置857においてグアニンの代わりにアデニンを結合していてもよい。本発明の他の単離DNA分子は、図１に配列のヌクレオチド位置229に変異を有する分子である（ここに、コドンCTTはTTTに変化し、アミノ酸ロイシンのかわりにフェニルアラニンをコードする）。ヌクレオチド位置714の変異は、GAT→GACであるが、コードされる生産物にアミノ酸置換を伴わない。
本発明のDNA分子によってコードされ、アルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドもまた、本発明の態様である。
ブタにおいてイー・コリF18レセプターを検出するための分子アッセイは、（ａ）ブタの有核細胞からDNAを単離し；（ｂ）プライマーとしてブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のDNA配列に相捕的なオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）においてDNAを増幅し；（ｃ）少なくとも１つの制限酵素、例えば、Cfo Iで制限酵素消化を行い；（ｄ）得られたフラグメントをゲル電気泳動により分離し；（ｅ）フラグメントの各数および長さをゲル上で決定し；（ｆ）FUT1のフラグメントの数および長さから、ブタの細胞中にどのF18レセプター遺伝子型が存在するか決定することである。DNAバンドは比較的低濃度のアガロースゲル上を移動することができるので、短鎖フラグメントよりもむしろ、本明細書に開示される長鎖増幅フラグメントを制限酵素フラグメント長多型性分析（RFLP）に使用することは、あまり費用がかからない。また、フラグメントのいくつかを生産するために、たった１つの制限酵素が可変診断部位に隣接する一定の制限部位に必要とされる。
イー・コリF18レセプターに関連する多型性を検出するためのキットは、耐性のブタと感受性のブタを区別するブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のDNA配列に相捕的な別々の容器中のオリゴヌクレオチドを使用する。該試験は、何れの歳のブタでも行うことができる。
また、多型性は、イー・コリ関連疾患に罹患したブタを治療するための薬剤の開発に有用である。ブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼの変異型は、正常な酵素を妨げ、F18の腸内レセプターの生産を妨げる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のブタα１→２フコシルトランスフェラーゼ多型性のヌクレオチド配列（FUT1）（下段）および予測されるアミノ酸配列（上段）を１文字アミノ酸表記を用いて示す。アミノ酸配列の下の実線の二重線（＝）は、推定の膜貫通領域であり；アミノ酸配列の下の点線は、３つの可能性のあるＮ結合グリコシル化部位を示す。
□は、耐性のブタにおいてグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に置換されている場所である。
＊は終止コドンを示す。
アミノ酸残基の略号は、次の通りである。A,Ala;C,Cys;D,Asp;E,Glu;F,Phe;G,Gly;H,His;I,Ile;K,Lys;L,Leu;M,Met;N,Asn;P,Pro;Q,Gln;R,Arg;S,Ser;T,Thr;V,Val;W,Trp;およびY,Tyr。
好ましい具体例の記載
イー・コリ関連疾患に対するブタの耐性に関連するDNA多型性の分子分析は、飼育用の耐性ブタを選択するための診断アッセイを容易にした。耐性のブタは、本発明の多型性マーカーによって同定されるように、イー・コリF18レセプター遺伝子座にて感受性のブタと異なる。
本発明は、高レベルの感度および特異性で、F18イー・コリ感染に関連する疾患に遺伝学的に感受性のブタと耐性のブタを区別するための非侵襲性の方法および組成物を提供する。ブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ（FUT1）遺伝子におけるDNA多型性は、耐性のブタと感受性のブタを区別するものとして同定された。多型性は、新規な対立遺伝子を導くヌクレオチド配列における変異（変化）によって生じた。対立遺伝子は、遺伝子の状態である。集団において、おそらく先祖のDNA分子における変異によって引き起こされた窒素塩基置換によって異なる遺伝子の多くの対立遺伝子が存在し得る。１以上の対立遺伝子の１集団内における共存（ときどき、「変異型」という）は、遺伝学的多型性と呼ばれる。そこに１以上の対立遺伝子が明らかに集団の安定な構成要素として存在し得る遺伝子座は、多型性遺伝子座である。通常、多型性遺伝子座の１つは低い頻度で集団内に存在する。
生物学的試料、好ましくは血液から決定する場合、耐性のブタは、それらのゲノムにおいて、ヌクレオチド配列の位置307（図１参照）にて検出される唯一の塩基がアデニンであるが、ホモ接合体の感受性のブタにおける同じ位置の塩基はグアニンである多型性を有する。ヘテロ接合体のブタは、両方の型のDNAを示し、感受性であろう。多型性は、ブタ遺伝子配列の変異型である（Cohneyら、1996）。
遺伝子連鎖分析をブタのファミリーにおいて行い、異系交配したブタにおいてFUT1における多型性と疾患耐性の間の遺伝学的関連を決定した。本発明によると、多型性は、アルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ１遺伝子（FUT1）において見出された。単一のヌクレオチド塩基置換を位置307に有する多型性を用いて、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子とＳ−システム、ECF18R遺伝子座およびHAL連鎖群の他の遺伝子座の間の密接な連鎖を確立した。
FUT1の変異とECF18Rの密接な連鎖の検出により、イー・コリF18接着耐性、ヘテロ接合体（キャリアー）およびホモ接合体の感受性のブタの同定のための分子試験が発展した。該診断試験は、高い感度および特異性で、浮腫疾患および離乳後の下痢に感受性のブタを同定する。本発明の多型性の発生率は、ブタの品種の間で異なる。Vogeliら（1997）は、お互いに無関係の群由来の５種類のブタの品種におけるM307対立遺伝子の頻度を提示した。本発明の多型性についての診断試験の有効性は、それらのブタ群由来のECF18R感受性対立遺伝子を有効に排除する機会を有し、それにより、浮腫疾患および離乳後の下痢を引き起こすイー・コリF18細菌性接着のための先行条件を排除する品種を提供する。
本発明は、さらに、bp307で種々の多型性を示すアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１の配列の変異型であるヌクレオチド配列およびアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子における多型性を同定するための診断的な分子に基づくキットを包含する。
イー・コリF18レセプター遺伝子座（ECF18R）についての候補遺伝子を得るために、アルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT1およびFUT2（Meijerinkら、1997）を用いて、その遺伝子を含有する５つのコスミドおよび１つのゲノムクローンをブタゲノムライブラリーから単離した。蛍光in situハイブリダイゼーションによるマッピングは、これらの全てのクローンをブタ染色体６のバンドq11（SSC6q11）に位置決定した。コスミドの配列分析は、（ａ）ヒトFUT1配列に対し82.3％同一である、1098塩基対の長さのオープン・リーディング・フレーム（ORF）、および（ｂ）ヒトFUT2配列に対し85％同一である、1023塩基対の長さの第２のORFという特徴を決定した。したがって、FUT1およびFUT2遺伝子座は、ヒト血液型Ｈおよび分泌型遺伝子座のブタ等価物であるようである。F18フィムブリエを有するイー・コリ（ECF18R）による接着およびコロニー形成に感受性または耐性のいずれかのブタにおける２つのORFの直接配列決定は、FUT1ORFの塩基対307（M307）および塩基対857（M857）にて２つの多型性を示した。ヌクレオチド位置は、ATG（メチオニンをコードする）から数えられた。221種の子孫を有するLandraceファミリーの34種の交配におけるこれらの変異の分析は、小腸におけるイー・コリF18接着およびコロニー形成に対する耐性および感受性を制御する遺伝子座（ECF18R）、および血液型インヒビターＳの遺伝子座との密接な連鎖を示した。したがって、M307変異は、イー・コリF18接着耐性動物のマーカーに援助される選択のための良好なマーカーである。ヌクレオチド位置229における別の変異は、ロイシンをコードするコドン（CTT）がTTT（フェニルアラニンをコードする）に変化した多型性を導くことが見出された。位置714での変異（GAT→GAC）（アスパラギン酸をコードする）は、アミノ酸置換を生じなかった。感受性のブタと耐性のブタを区別する多型性は、FUT2において同定されなかった。
実施例
以下の実施例は本発明の具体例を提供する。
実施例1:耐性のブタについてのアッセイ
本発明の多型性は、PCR−RFLP試験を用いて容易に同定される。ブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ１の160bpフラグメントを用いた試験の１具体例は、PCRを用いて、以下のプライマー;5'CCAACGCCTCCGATTCCTGT3'および5'GTGCATGGCAGGCTGGATGA3'で増幅した。該具体的の好ましいPCR条件は、以下の時間および温度での25サイクルである:94℃、30秒;60℃、45秒;72℃、90秒。耐性のブタ由来の増幅DNAは制限酵素Hgalによって消化されたが、制限酵素HinP Iによって消化されなかった。ホモ接合体感受性のブタ由来の増幅DNAは、制限酵素HinP Iによって消化された。ヘテロ接合体感受性のブタ由来の増幅DNAは、両方の酵素によって部分的に消化された。
別法では、標準的手法にしたがって、DNAをブタの有核細胞から単離した。異なるECF18R遺伝子型（Bb,bb）の動物におけるブタFUT1およびFUT2配列ならびにそれらのフランキング領域の直接配列決定により、FUT1 ORFの位置307および857にて２つのＧ→Ａ転位（各々、M307およびM857という）を同定した。M307転位は、Cfo Iの１つの制限部位を削除する。ブタ有核細胞から単離したDNAの増幅は、標準的な手法にしたがって、プライマーP6およびP11を用いて行った（95℃で３分、次いで、95℃で30秒、56℃で30秒および72℃で30秒を30サイクル、次いで、72℃で７分の最終的な伸長反応）後、Cfo I消化を行い、３％アガロースゲル上で分離した結果、制限酵素断片長多型性（RFLP）を得た。ホモ接合体M307AA動物は、２つのバンドを示した。ホモ接合体M307GG動物は、93、241および87bpフラグメントを示した。ヘテロ接合体動物は、４つのフラグメント全てを示した。
実施例2:F18イー・コリに対して耐性のブタの検出におけるアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼを用いるアッセイの感度および特異性
研究は、疾患耐性とFUT1遺伝子の位置307における多型性との関連を決定するために行った。183匹の離乳したブタ（歳２−６月の範囲）を６つの異なる飼育群から得た。これらの群のたった１つが、該研究を始める前に耐性の動物を含むことが知られており、該群は、ブタストレス症候群の高い発病率を有することが知られている。他の５つの群は、ブタストレス症候群の形跡がなく、疾患耐性の発生率は知られていなかった。各群由来のブタを無作為に選択し、人道的に安楽死させ、脾臓および小腸の試料を取り出した。DNAを脾臓組織から抽出し、実施例１に記載のPCR−RFLPアッセイにおいて使用した。粘膜表面を腸から削り取ることによって腸細胞を精製し、低張性のEDTA溶液中で細胞を溶菌し、遠心分離によって洗浄した。精製した腸細胞刷子縁をF18イー・コリと共にインキュベートした。該混合物を位相差顕微鏡によって調べた。該アッセイは、ブタが感受性であるか（腸試料が接着細菌を有した）、または耐性であるか（腸試料が接着細菌を有さなかった）を決定した。多型性についてのPCR−RFLPアッセイは、53匹の耐性のブタのうち53匹および130匹の感受性のブタのうち128匹において細菌−腸細胞結合アッセイに相関した。細菌−腸細胞結合アッセイを用いて感受性であると決定された２匹のブタは、PCR−RFLPアッセイを用いて耐性であると不正確に予測された。試験された６つの群のうち２つは耐性のブタを含んだが、１つの群だけがブタストレス症候群を有し、PCR−RELPアッセイはブタストレス症候群を有さない動物において疾患耐性の動物を同定できることを明らかにした。
実施例3:染色体（SSC6）上でのFUT1の局在性
プライマーP7およびP10を用いてブタゲノムDNAから得られたFUT1ヌクレオチドプロープでコスミドライブラリーをスクリーニングした後、コスミドETHs1、−s2、−s3、−s4および−s6を同定し、FISHおよびDISC−PCRによってバンドq11における染色体６に位置決定した。
実施例4:ブタFUT1 ORFの同定
サザンブロット分析の場合、Ksp I、EcoR IおよびKsp I/EcoR Iコスミド消化物と放射能標識したブタFUT1フラグメントP6−P11およびP7−P10がハイブリダイズして、ETHs2、−s4および−s6について同一のオートラジオグラフィーシグナルを示し、一方、コスミドETHs1および−s3からは異なるシグナルが得られた。コスミドETHs2 Ksp Iから、サブクローン940bpおよび6.2kbの長さが単離され、それは、サザンブロットにおいてハイブリダイズするKsp Iフラグメントの見積もりの長さに相当した。２つのサブクローンの配列決定の結果を合わせると1501bp配列になり、それはゲノムPCR産物の直接配列決定の結果と一致した。1501bp配列は、82.3％のヌクレオチドおよび80.8％のアミノ酸同一性でヒトFUT1 ORFに相当する1098bpのオープン・リーディング・フレーム（ORF）を含有する。ORFは、ポリペプチドをコードする。
実施例5:ブタFUT2および偽遺伝子FUTPの同定
ETHs1は、FUT1配列にハイブリダイズする１つのDNAフラグメント（2.7kb）を有するが、ETHs3は２つ（2.7kbおよび8.2kb）を有する。ETHs1および−s3の2.7kb EcoR Iフラグメントのサブクローニングおよび部分的配列決定により、これらの２つのフラグメントが同一であることを確認した。該配列は、ヒトFUT2に非常に類似するが、NH2−および−COOH末端領域において数個の変化を示す。これらの変化は、保存ORFと矛盾するフレームシフトを導くので、2.7kbフラグメントから得られる配列は偽遺伝子（FUT2P）を示すという仮説が成り立つ。ETHs3 BamH I消化物のサブクローニング後、8.2kb EcoR Iフラグメントに含有されるハイブリダイズする配列を同定した。得られたサブクローンの配列は、1023bp ORFを示し、ヒトFUT2配列に対してヌクレオチドレベルで85％およびアミノ酸レベルで83％同一である。NH2−および−COOH末端領域における多くの相違が、ブタFUT2配列と2.7kbフラグメント由来のFUT2P配列の間に観察された。予測アミノ酸配列は、ブタ分泌型酵素の部分的に決定されたアミノ酸配列に相当する（ThurinおよびBlaszczyk−Thurin、1995）。得られたブタFUT1、FUT2およびFUTP配列をGenBankに提出し、各々、受託番号U70883、U70881およびU70882を得た。FUT1およびFUT2遺伝子は、非常に相同性の配列を有する。これは、例えば、プライマー開発において考慮されなければならない。さらに、FUT1およびFUT2酵素活性は、さらなる研究において区別されなければならない。
実施例6:M307およびM857変異の同定およびM307のキャラクタリゼーション
標準的手法にしたがって、ブタの有核細胞からDNAを単離した。異なるECF18R遺伝子型（Bb、bb）の動物におけるブタFUT1およびFUT2配列ならびにそれらのフランキング領域の直接配列決定は、FUT1 ORFの位置307および857にて２つのＧ→Ａ転位（各々、M307およびM857という）を同定した。M307転位は、酵素Cfo Iの１つの制限部位を削除する。ブタの有核細胞から単離したDNAの増幅は、標準的な手法にしたがって、プライマーP6およびp11を用いて行った（95℃で３分、次いで、95℃で30秒、56℃で30秒および72℃で30秒を30サイクル、次いで、72℃で７分の最終的な伸長反応）後、Cfo I消化を行い、３％アガロースゲル上で分離した結果、制限酵素断片長多型性（RFLP）を得た。ホモ接合体M307AA動物は、２つのバンド（93−および328−bpフラグメント）を示した。ホモ接合体M307GG動物は、87−、93−および241bpフラグメントを示した。ヘテロ接合体動物は、４つのフラグメント全てを示した。
実施例7:変異M857のキャラクタリゼーション
M857変異は、１つのAci I部位を削除する転位である。２つの付加的なAci I部位を位置866および872で不正対合するように、プライマーPBESTを設計した。プライマーP7およびPBESTを用いるPCR（95℃で３分、次いで、95℃で30秒、56℃で30秒および72℃で30秒を30サイクル、次いで、72℃で最終的な伸長反応を７分）、次いで、Aci I消化を行い、３％アガロースゲル上でPCR−RFLP分析を行った。ホモ接合体M857AA動物は、174bpフラグメントを示したが、M857GGの増幅産物は、136−および38−bpフラグメントを示した。
実施例8:FUT1遺伝子の遺伝子マッピング
Landraceブタファミリーにおいて、M307とHAL連鎖群（Ｓ、ECF18R、RYR1、GP1、PGD）の遺伝子座との間の組換えは、組換え率（fraction）θ＜0.04を示した（表２）。全組換え率についてのロッドスコアＺは、24.5〜50.6であり、これらの遺伝子座間の連鎖の強力な証拠を示す。これらのデータは、FUT1によりどちらも影響を及ぼされるＳおよびECF18Rにきわめて近接して、HAL連鎖群にFUT1遺伝子を遺伝マッピングさせる。実験的Landraceファミリーにおいて、対立遺伝子関連がECF18RとRYR1の間に見出された。RYR1における位置1843の過剰な遺伝子型RYR1TT（ハロセン感受性遺伝子型）は、浮腫疾患および離乳後の下痢に対して耐性のブタ（遺伝子型ECF18Rb/b）の間で観察された（表３）。該対立遺伝子関連は、連鎖不均衡、すなわち、観察されたハプロタイプ頻度の対立遺伝子の独立の組み合わせ下で予想されるハプロタイプ頻度からのずれの結果である。したがって、連鎖不均衡は、連鎖した遺伝子座に属する対立遺伝子の無作為でない関連を示す。しかしながら、低組換え率のため、他より有意に良いと決定できた遺伝子座規則はなかった。
実施例9:M307AとECF18RbおよびM307GとECF18RBとの関連
Landrace（SL）およびLarge White（LW）親ブタにおいて、ECF18Rb（浮腫および離乳後の下痢耐性対立遺伝子）は、M307Aに100％関連し、ECF18RB（浮腫および離乳後の下痢感受性対立遺伝子）はM307Gに100％関連する（ここに、Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン）。SLブタにおいて、88％（30/34）のSSが各々、全てのECF18RbおよびM307Aハプロタイプの原因であった。Larg WhiteブタおけるSS−ECF18RbハプロタイプおよびSS−M307Aハプロタイプの両方についての対応する値は、82％（9/11）であった。実験的SLファミリーにおいて、FUT1遺伝子座でのM857A対立遺伝子の出現率は低く、LWブタにおいては存在さえしなかった。したがって、有意な配偶子の関連は、M857の対立遺伝子およびフランキング遺伝子の対立遺伝子との間では観察されなかった。位置FUT1 307およびFUT1 857でのＧ→Ａ転位は、Duroc、HampshireおよびPietrainブタにおいても種々の頻度で見出され、それらの転位は他のブタ品種においても起こるようであった。
実施例10:FUT1遺伝子型の分布
表４は、ECF18R型の間のヌクレオチド位置307におけるFUT1遺伝子型の分布が、２つの独立した仮説の下に予測された比率と有意に異なったことを示す。119匹の浮腫疾患および離乳後の下痢に耐性のECF18Rb/b動物のうち118匹がDNAに基づく試験において、遺伝子型M307A/Aを有すると決定された。１匹の耐性動物は、遺伝子型M307A/Gを有した。131匹の感受性のブタのうち130匹がM307A/GまたはM307G/Gであった。
イー・コリ接着に対して感受性の１匹の動物が、DNA試験によってホモ接合体M307A/Aであることが示された。該実施例および実施例２由来のデータは、過去の研究と一緒に、FUT1遺伝子がブタにおけるＳ遺伝子座およびECF18遺伝子座に存在する遺伝子であることを示唆した。該実施例および実施例２において４匹の動物が該ハプロタイプを否定するが、これらの動物は疾患耐性／感受性に関して不正確に表現されたようである。
実施例11:アルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼにおけるアミノ酸交換
アルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子１のbp＋307およびbp＋857でのＧ→Ａ変化は、各々、コード産物に機能的な結果を有し得るアラニン（中性−非極性）の代わりにスレオニン（中性−極性）、およびアルギニン（塩基性）のかわりにグルタミン（中性−極性）の予測アミノ酸置換を生じる。bp229のＣ→Ｔ変化は、フェニルアラニン（中性−非極性）の代わりにロイシン（中性−非極性）のアミノ酸置換を生じる。
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方法
1.プライマー
ヒトFUT1遺伝子由来のプライマーをゲノムDNA由来のそのブタ相対物の増幅に用いた。得られたブタ配列から、特異的プラマーを設計し、さらなる増幅および配列決定反応に用いた（表１）。
2.ブタゲノムライブラリーのスクリーニング
ブタゲノムライブラリーをプライマーP7およびP10で得られたブタFUT1プローブまたはブタFUT1 cDNAのいずれかを用いてスクリーニングした。Super Cos I（Stratagene,La Jolla,Ca,USA）において構築されたブタゲノムライブラリーを、プライマーP7およびP10を用いてブタゲノムDNAから得られたα32P dATP標識した（Prime It II,Stratagene）FUT1プローブを用いてスクリーニングした。42℃で15時間のレプリカフィルターのハイブリダイゼーション（50％ホルムアミド、6XSSC、5xデンハート、0.5％SDS、0.1mg/mlサケ精液）および65℃で30分間の２度の洗浄（1xSSC、0.1％SDS）の後、Ｘ線フィルムに曝露（15時間、−80℃）後、陽性コロニーを同定した。
3.ブタ中期染色体のin situハイブリダイゼーション
コスミドクローンETHs1、ETHs2、ETHs3、ETHs4およびETHs6をブタ中期上で、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）（Solinas Toldoら、1993）または直接的in situ染色体PCT（DISC PCR）に付した。中期染色体は、ハイブリダイゼーション前にＱバンド染色し、写真に撮った。ビオチン−16−dUTPを用いるランダムプライミングによって、プローブを標識した。アビジン−FITCおよびビオチン化抗アビジンを用いて、シグナル検出および増幅を行った。染色体は、4,6−ジアミジノ−２−フェニルインドールで対比染色し、コスミドの相対位置をSolinas Toldo,1993に記載のように決定した。
4.サブクローニング
プローブ陽性ゲノムコロニーの酵素消化物をアガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上に転写し、プローブ陽性バンドをFUT1配列決定のためにプラスミド中でサブクローン化した。該方法から得られたFUT1の配列を図１に示す。
全コスミドのKsp I−、EcoR I−およびKsp I/EcoR I消化物を0.8％アガロースゲル上で分離し、Hybond Nナイロン膜上に転写した（Meijerinkら、1997）。該ブロットをα32P dATP標識したブタFUT1 PCR産物（プライマーP6−P11およびP7−P10）でハイブリダイズした。オートラジオグラフィーのシグナルに基づいて、ETHs1、−s2および−s3をpBluescript SK−（Stratagene）中のさらなるサブクローニングに付し、FUT配列をサブクローンから決定した。コスミドETHs2および−s3から得られた２つのFUT−様オープン・リーディング・フレーム（ORF）の配列（FUT1およびFUT2）をPCR産物の直接配列決定によって、ECF18R陽性（BB/Bb）および陰性（bb）動物において比較した。
5.ポリメラーゼ連鎖反応および直接配列決定
Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminatorキット（Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT,USA）および10ピコモルのプライマーを用いて、最初の変性95℃で５分、次いで、95℃で30秒、50℃で15秒および60℃４分を25サイクルからなる温度プログラムでサイクル配列決定を行った。ブタアルファ（1,2）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の増幅および配列決定に用いられたプライマーを表１に列記する。付加的なプライマーは、FUT1、FUT2およびFUT2偽遺伝子の高い類似性のため、プライマーの交差アニーリングの可能性を考慮して設計された。試料は、373A ABIシークエンサー（Applied Biosystems Inc.）上で分析し、GCGパッケージ（Devereux,1984）を用いて配列分析を行った。
6.有益な子孫の生産
単一ヌクレオチド多型性を４匹の雄ブタと16匹の雌ブタから生まれた221匹のLandraceブタおよび無関係のブタとの間の９種の交配から生まれた29匹のLarge Whiteブタにおいて分析した。ECF18レセプターをコードするブタ遺伝子と選択された多型性遺伝子座間の連鎖の試験のための大量の有益な子孫を生産するために、型B/bxb/bの有益なLandrace交配のみが行われた。
7.コロニー形成試験
Bertschingerらの1993年の研究において、前記のLandraceブタはまた、コロニー形成試験において、ECF18感受性についても試験された。このため、離乳後短時間にブタに血清型O139:K12（Ｂ）:H1:F18のイー・コリ株124/76の細菌を接種した（Rippingerら、1995）。細菌の糞流出を毎日モニターした。コロニー形成の範囲は、２つの最も高い糞のスコアの平均として算出した。6.7対数コロニー形成単位（CFU）/g以上に相当する平均の糞スコア3.5を有するブタは、コロニー形成に対して感受性であるとみなされた。この限定は、該値以下では死亡率を欠くこと、および完全に耐性の同腹子から得られたスコアに基づく。
8.ヌクレオチド多型性の連鎖分析
単一ヌクレオチド多型性の結果を、
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ら（1996）によって記載されたイン・ビトロ接着アッセイにおいて同定されたECF18Rに関する印刷されたデータおよび
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ら（1996）によって公表されたようなGPI−、PGD−、α−１−Ｂ−グリコプロテイン−（A1BG）、リアノジンレセプター（RYR1）、EAH−およびＳ−遺伝子座に関する印刷されたデータと比較した。ペアの連鎖分析および組換え率の計算は、CRI−MAPバージョン2.4プログラムを用いて行った（Greenら、1990）。多点連鎖分析は、前記の遺伝子座の地図への連続的挿入によって行った。ハプロタイプ頻度は、Landraceファミリーにおける親動物、および子孫の情報からECF18Rに関するハプロタイプであった８匹の親Large White動物から算出した。ECF18RとFUT1（FUT1/M307）における変異（多型性）のテトラコリック相関は、全てのLandraceおよびKarge White子孫において算出された。
9.サザンブロッット分析
酵素Ksp I、EcoR IおよびKsp I/EcoR Iでの消化および0.8％アガロース上での分離後、コスミドETHs1、ETHs2およびETHs3のサザンブロット分析を行った。α32PdATP標識した5'FUT1フラグメント（プライマーP6−P11）でのハイブリダイゼーションの結果、Ksp I消化およびKsp I/EcoR I消化の両方において同一のハイブリダイズ940bpバンドを生じる。しかしながら、3'FUT1フラグメント（プライマーP7−P10）（表１）でのハイブリダイゼーションは、6.2kb  Ksp Iバンドおよび1.1kb  Ksp I/EcoR Iバンドを示す。5'および3'FUT1フラグメントの両方が同じ4.6kbEcoR Iフラグメントにハイブリダイズする。これは、コスミドETHs2に含有されるFUT1遺伝子におけるKsp I部位の存在を示す。3'FUT1フラグメントのクロスハイブリダイゼーションは、2.7kbおよび8.2kbバンドを検出し、その結果、FUT2偽遺伝子（不完全ORF）およびFUT2遺伝子配列を各々、同定する。
10.制限フラグメント多型性
ブタFUT1遺伝子における（Ａ）M307GからＡおよび（Ｂ）N857GからＡへの変異の検出は、種々の制限酵素を用いる制限長多型性分析によって達成された。Cfo I（Ａ）およびAci I（Ｂ）を用いる増幅FUT1フラグメントの消化により、制限フラグメント多型性が生じる。フラグメントの長さは塩基対で示される。（Ａ）M307A/A遺伝子型は、328および93bpの制限フラグメントを生じるが、M307G/G遺伝子型は93、241および87bpのフラグメントを生じ、ヘテロ接合体M307A/G遺伝子型は４つのフラグメント全てを示す。
（Ｂ）M857A/A遺伝子型の消化は、174bpフラグメントを生じるが、M857G/G遺伝子型においては136および38bpフラグメントを生じ、M857A/G遺伝子型においては３つのフラグメント全てを生じる。
11.ブタの供給源
Swiss Landrace実験的集団のデータは、チューリッヒ大学の獣医細菌学研究所（Institute of Veterinary Bacteriology,University of Zurich）で確立された２つの血統から由来した。Large White、Swiss Landrace、Duroc、HampshireおよびPietrain品種の全ての他のブタは、スイスの異なる飼育群から由来した。他のブタは、米国中西部の農場から無作為に入手された。
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【図１】
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