(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌中でポリエステルバイオポリマーを構築する方法であって、
Ｃ４基質を重合し得るポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする遺伝子の発現のために、細菌を選択する工程、
該細菌に、該ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする単離された構造遺伝子を、該細菌中での該遺伝子の発現のための調節配列と組み合わせて導入する工程、
および
発現した該ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ酵素がポリヒドロキシブチレートを合成するために適切な基質を提供する工程を包含する方法であって、
但し、前記単離された構造遺伝子は、
【化１】
0003703983.tif 000049
のヌクレオチド配列を有する遺伝子であり、また前記調節配列は該構造遺伝子が単離された種とは異なる種由来であるか、または該構造遺伝子が単離された種と同一の種の異なる遺伝子由来であり、且つ該構造遺伝子が該調節配列の制御下にあって、該構造遺伝子は、該構造遺伝子の天然のプロモーターと結合していないことを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、トランスジェニック生物、特にトランスジェニック植物における生分解性プラスチックの製造方法、および新規なポリエステルバイオポリマーに関する。Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ、海軍研究機関、および国立科学基金からの助成金の規定により、米国政府は本発明に権利を有する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌による合成は、これまで長い間、多くのより複雑なバイオポリマーを産生する手段でしかなかった。最近になってようやく、これらのバイオポリマーの合成経路が確かめられた。これら経路に関係する様々な酵素および補助因子の単離に多くの努力が払われた。これらの発現の調節は主として経験上のものであった。即ち、栄養分濃度や酸素のようなその他の因子のレベルを変化させて、ポリマーの産生および組成が測定された。
【０００３】
これらの複雑なバイオポリマーの産生を制御し、それを特定の様式に改変するため、これらの合成に必要な化学反応工程を調べる以下の系を設計することが必要である；これらの化学反応工程に寄与するタンパク質を単離し、特徴付けること；これらのタンパク質をコードする遺伝子を単離し、配列決定し、クローニングすること；およびこれらの遺伝子の発現割合および発現レベルを調節するメカニズムを同定し、特徴付け、利用すること。
【０００４】
商業上有用な複雑なバイオポリマーであるポリヒドロキシブチレートは、多数の細菌が産生する細胞間保持物質である。ポリ−β−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）はＤ（−）−３−ヒドロキシブチレートの重合したエステルであり、１９２５年にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍで最初に発見された。この独特のポリエステルは、その化学的性質および物理的性質の両者のために、さらに進んだ研究の対象として注目されるバイオポリマーになった。ＰＨＢは生分解性／熱可塑性材料として、ある種の抗生物質の有機合成のためのキラル中心として、およびドラッグデリバリーと骨の置換のためのマトリックスとしての用途を含む、様々な応用が可能である。このポリマーはインビボの体内で、ヒト血液の正常な構成成分であるヒドロキシブチレートに分解される。
【０００５】
Ｃ2生合成中間体のアセチルＣｏＡからの疎水性結晶性ＰＨＢ粒子の酵素的合成は、多数の細菌で研究されてきた。アセチルＣｏＡからＰＨＢへの変換には、βケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼの３つの酵素が関与する。
【０００６】
チオラーゼは炭素−炭素結合の合成および開裂を触媒する遍在性酵素であり、従って細胞内代謝において中心的役割を占める。テルペノイド、ステロイド、マクロライドおよび他の生合成経路と、脂肪酸の分解とには、異なるチオラーゼ酵素が関与する。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａでは、２つのアセチルＣｏＡ基が縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成するのをβケトチオラーゼが触媒する。次にアセトアセチルＣｏＡはＮＡＤＰ特異的レダクターゼで還元されて、ＰＨＢポリメラーゼの基質であるＤ（−）−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが形成される。
【０００７】
βケトチオラーゼ（アセチル−ＣｏＡ−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）は、Ａ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ（ＳｅｎｉｏｒおよびＤａｗｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１３４、２２５−２３８（１９７３））、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（ＯｅｄｉｎｇおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、１３４、２３９−２４８（１９７３））、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＢｅｒｎｔおよびＳｃｈｌｅｇｅｌ、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０３、２１−３０（１９７５））およびＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１６、２１−２７（１９７８））で研究された。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子のクローニングおよび発現は米国特許出願第０６７，６９５号に記載されている。次にこの遺伝子は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＮｏｃａｒｄｉａを含む他の細菌種からレダクターゼ遺伝子を単離するためのハイブリダイズ用プローブとして用いられた。
【０００８】
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａでＰＨＢ生合成に関与するレダクターゼはヒドロキシブチリル−ＣｏＡのＤ（−）異性体に立体特異的であり、補助因子としてもっぱらＮＡＤＰ（Ｈ）を利用する。最もよく特徴付けられたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、Ｓａｉｔｏら、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１４、２１１−２１７（１９７７）およびＴｏｍｉｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏ１ｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、３５３、Ｄ．Ｌｅｎｎｏｎら編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｈｏｌｌａｎｄ、１９８３）により記載されたＺｏｏｇｌｏｅａ由来のものである。このＮＡＤＰ特異的な分子量９２，０００の酵素はＦｕｋｕｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９１７、３６５−３７１（１９８７）により、少量ではあるが均一にまで精製された。米国特許出願第０６７，６９５号に記載されたように、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のβケトチオラーゼ酵素は今日ではクローニングされ、発現され、その精製物は均一にまで精製されている。クローニングされた遺伝子は、Ａｌｃａ１ｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＮｏｃａｒｄｉａを含む他の細菌種から相当するβケトチオラーゼを同定および単離するのに用いられた。
【０００９】
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのＰＨＢポリメラーゼはＤ−β−ヒドロキシブチリルＣｏＡに対して立体特異的である。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓは他の基質、例えばＤ−β−ヒドロキシバレリルＣｏＡを使用し得る。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの培地にプロピオネートを添加すると、Ｃ5とＣ4ユニットのＰＨＢ／ＨＶコポリマーへの取り込みが起こるからである。ＧｒｉｅｂｅｌおよびＭｅｒｒｉｃｋ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１０８、７８２−７８９（１９７１）はＢ．  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの天然のＰＨＢ粒子からＰＨＢポリメラーゼを分離したが、その過程で酵素活性はすべて消失した。彼らは２つのタンパク質分画の１つへＰＨＢ粒子を添加することによってのみ、活性を再構築し得た。より最近、Ｆｕｋｕｉら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１０、１４９−１５６（１９７６）およびＴｏｍｉｔａら（１９８３）はＺ．ｒａｍｉｇｅｒａにこの酵素を発見し、粒子に結合しないＰＨＢポリメラーゼに部分精製した。クローニングし、発現させ、新規なポリマーの合成にその産生物を用いる方法は米国特許出願第０６７，６９５号に記載されている。
【００１０】
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓを含む細菌により産生されるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）貯蔵ポリマーの全範囲が見いだされている。ＰＨＡポリマーは、側鎖の長さに変異を有する（ＣＨ3〜ＣＨ8Ｈ17）βヒドロキシアルカノエートのＤ−異性体のヘテロポマーである。例えば、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓは５−クロロペンタン酸の存在下で生育させると、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレートおよび５−ヒドロキシバレレートをポリマーに取り込む。
【００１１】
このポリマーは古典的な発酵法で非常に高収量が得られること、および１０，０００よりも大きい分子量のＰＨＡおよびＰＨＢは多くの応用に有用であるという事実から、新規なＰＨＢ様バイオポリマーを開発して応用分野を改善、または新たに作り出すこと望まれている。
【００１２】
ＰＨＢ以外のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓの単一培養による産生は、ｄｅＳｍｅｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４、８７０−８７８（１９８３）により報告されている。両方の細菌で、ポリマーは制御された発酵により産生した。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓはグルコースとプロピオネート下で生育させるとＰＨＢ−ＰＨＶのヘテロポリマーを産生し、ＰＨＶ含有量は約３０％に達する。Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓはオクタン下で生育させるとポリ−β−ヒドロキシオクタノエートを産生する。Ｎｏｃａｒｄｉａはｎ−ブタン下で生育させるとＰＨＢ−ＰＨ−２−ブテノエートのコポリマーを産生することが報告されている。選択された基質を用いる制御発酵により得られる３−ヒドロキシブチレートポリマーの最終組成の決定もまた、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，４７７，６５４号に記載されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
基質特異性に関して異なる様々な酵素の利用を可能にし、これらの酵素をコードする遺伝子を他の宿主、特に植物で発現させる方法により、現在利用可能な石油由来のプラスチックス、特にポリプロピレンの経済的な生体分解性代替物を提供することが可能となる。
【００１４】
従って、本発明の目的は、複合バイオポリマー、特にＰＨＢ、ＰＨＡおよび類似ポリマーの合成方法に用いられる酵素をさらに提供することである。
【００１５】
本発明の目的はさらに、これらのポリマー合成タンパク質をコードする他の遺伝子を単離し、配列決定し、クローニングすること、およびこれらの遺伝子の発現速度と発現レベルを調節する手段である。
【００１６】
本発明の他の目的は、ポリヒドロキシブチレートおよびポリヒドロキシアルカノエートを合成するタンパク質をコードする遺伝子から発現する、精製されたタンパク質を提供することである。
【００１７】
本発明の目的はさらに、これらのタンパク質および調節配列を用いて、ポリエステル骨格を有する新規なバイオポリマーを創製する方法を提供することである。
【００１８】
さらに本発明の目的は、細菌および植物細胞を製造に用い、生体分解性ポリヒドロキシアルカノエートおよび新規な関連ポリマーの経済的な供給源を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生物中でポリエステルバイオポリマーを構築する方法に関し、この方法は、ポリヒドロキシブチレートの合成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現のために、生物を選択する工程、この生物に、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする単離された構造遺伝子を上記生物中の上記遺伝子の発現の調節配列と組み合わせて導入する工程、および発現した上記酵素がポリヒドロキシブチレートを合成するために適切な基質を提供する工程を包含し：ここで、上記単離された構造遺伝子は、
【００２０】
【化２】
0003703983.tif 000002
【００２１】
のヌクレオチド配列を有する遺伝子、および、このヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群から選択され、このハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣＰ（１×ＳＳＣＰは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１０ｎＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4を含む)、５×デンハート液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ超音波処理変性サケＤＮＡを含む溶液中で約１６から１８時間の期間、６５℃の温度で実施される。
【００２２】
本発明の方法は、上記酵素をそれらの基質特異性に基づいて選択する工程をさらに包含し得る。
【００２３】
本発明の方法は、上記酵素をコードする遺伝子を改変することによりこの酵素の基質特異性を変化させる工程をさらに包含し得る。
【００２４】
本発明の方法は、特定のインデューサーに反応して、ポリマーの合成に必要な酵素をコードする遺伝子の発現を制御する調節配列を発現ベクターに提供する工程をさらに包含し得る。上記ポリマー合成の特定のインデューサーは、温度変化および特定の基質からなる群から選択され得る。
【００２５】
上記遺伝子は、Ｚｏｏｇｌｏｅａ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、ＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓおよびＰｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍからなる群から選択される細菌に由来し得る。
【００２６】
本発明の方法は、ポリマー合成に必要な酵素の少なくとも１つが欠損した細菌生物中で前記遺伝子を発現させる工程をさらに包含し得る。
【００２７】
本発明の方法は、上記遺伝子を植物中で発現させる工程をさらに包含し得る。
【００２８】
上記遺伝子は、ヒドロキシアシルＣｏＡ基質のＤ異性体に立体特異的な酵素をコードし得る。
【００２９】
本発明は、１つの局面で、ポリヒドロキシブチレートまたはそのコポリマーを合成するための生物に関し、この生物は、ポリヒドロキシブチレートの合成に必要な酵素をコードする遺伝子、および適切な基質と反応してポリヒドロキシブチレートまたはそのコポリマーを合成し得るこの生物中の、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼをコードする単離された構造遺伝子の発現のための調節配列と組み合わせて上記遺伝子を発現する。
【００３０】
好ましくは、上記生物は、細菌または植物である。
【００３１】
好ましくは、上記基質は、アセトアセチル誘導体、オレフィン、エステル、アルコール、ジオール、エポキシド、Ｄ−ヒドロキシブチリルＣｏＡ、Ｄ−βヒドロキシバレリルＣｏＡ、分岐βヒドロキシアシルＣｏＡ、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡのアシルＣｏＡモノマー類似体、４−ヒドロキシブチルＣｏＡ、アシルチオエステルＣｏＡ、３ヒドロキシ−４−ペンテノイル−ＣｏＡおよびこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
【００３２】
上記生物は、ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼタンパク質を発現し得る。
【００３３】
上記生物は、上記ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓプラスミドおよび植物ＤＮＡウイルスからなる群から選択されるベクターを用いて導入された、植物であり得る。
【００３４】
上記生物は、上記ポリヒドロキシブチレートポリメラーゼ遺伝子が、細胞質、ミトコンドリア、またはクロロプラスト中に導入された、植物であり得る。
【００３５】
本発明は、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）およびポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ポリエステル合成の遺伝子および酵素を、原核細胞および真核細胞、特に植物で分子レベルで操作することにより、バイオポリマー合成を制御し改変する方法に関する。
【００３６】
ＰＨＢおよびＰＨＡポリマーの産生に関与する遺伝子の単離、特徴付け、および発現が例示されている。Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ株Ｉ−１６−Ｍ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ由来のＰＨＢおよびＰＨＡ合成経路の酵素（β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼあるいはＰＨＡポリメラーゼ）をコードする遺伝子が、ＰＨＢを産生しない生物であるＥ．ｃｏ１ｉで確認または単離され、発現された。
【００３７】
細菌細胞を用いた好ましい実施態様では、窒素またはリン酸制限条件下でＰＨＢを乾燥細胞重量の７０％から８０％まで蓄積する能力のあるＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにより産生される。他の実施例では、ＰＨＢ、ＰＨＡおよび新規ポリマーの発現および合成のために、遺伝子が植物細胞に導入される。ポリマーの特定の改変には、ポリマー鎮の長さの変化、およびポリマーに異なるモノマーを組み入れて物理的性質の異なるコポリマーを製造することが含まれる。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下の方法は、βケトチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢポリメラーゼ、およびＰＨＡポリメラーゼをコードする遺伝子とそれらの発現産物とを単離し、その発現を調節する配列を同定し特徴付け、そしてポリマー産生に対する培養条件および使用基質の影響を調べるために用いられた。ＰＨＢおよびＰＨＡ様バイオポリマーを製造する系を構築する技法もまた開示されている。これらの酵素を細菌または植物細胞で組み合わせ、適当な酸素および温度の制御培養条件下に適当な基質を用いることにより、様々なポリマーを作成できる。これらの発現を調節する酵素またはヌクレオチド配列もまた、発現量を変え、または基質特異性を変えて得られるポリマーをさらに変化させるために改変することが可能である。その効果は、完全細胞を用いては通常利用できなかった基質が、単離された酵素を用いることにより製造可能であることである。
【００３９】
方法、遺伝子、およびこれらの発現産物およびポリマー合成は以下の実施例に詳細が記載されているが、それに限定されない。
【００４０】
【実施例】
培地および培養条件
ＰＨＢ生合成経路の遺伝学的研究のために、まず初めにＺｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ株Ｉ−１６Ｍ（ＡＴＣＣ１９６２３）を用いた。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａＤＮＡは２００ｍｌの対数増殖期中期の培養物から、以下のように精製した。細胞を遠心して集め、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１、ＰＨ８．２で洗浄し、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣ１に再懸濁した。次に１０ｍｌの２４％  ｗ／ｖポリエチレングリコール８０００および２ｍｌの２５ｍｇ／ｍｌリゾチームを加え、次に３７℃で３０分インキュベートして、細胞をスフェロプラストにした。スフェロプラストを遠心して集め、５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ８．０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、３００μ１の１０％  ｗ／ｖＳＤＳを添加し、５５℃で１０分間インキュベートして細胞を溶解した。１０ｍｌのＴＥをさらに添加し、細胞溶解物をＲＮＡｓｅ（５０μｇ／ｍｌ）およびプロテイナーゼＫ（３０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。次にＤＮＡをＣｓＣ１密度勾配遠心により精製した。
【００４１】
Ｅ．ｃｏ１ｉ株はＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地（ＮａＣ１、１０ｇ／ｌ；トリプトン、１０ｇ／１；イースト抽出物、１０ｇ／１）または２ＸＴＹ培地（ＮａＣｌ、５ｇ／１；トリプトン、１６ｇ／１：イースト抽出物、１０ｇ／１）に生育させた。組換えプラスミドを含有するＥ．ｃｏ１ｉによる、ＰＨＢまたはＰＨＡの産生には（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を０．０４％に減少させ変更した最小培地を用いた。
【００４２】
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株はトリプチカーゼソイブロス（ＴＳＢ、ＢＢＬ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ、  Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉ１１ｅ、  Ｍｄ）または０．３９ｇ／１  ＭｇＳＯ4：０．４５ｇ／１  Ｋ2ＳＯ4；１２ｍｌ１．１ｍ  Ｈ3ＰＯ4；１５ｍｇ／１  ＦｅＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ；２４ｍｌ痕跡元素（２０ｍｇ／１  ＣｕＳＯ4５Ｈ2Ｏ；  １００ｍｇ／１  ＺｎＳＯ4６Ｈ2Ｏ；１００ｍｇ／１  ＭｎＳＯ4４Ｈ2Ｏ；  ２．６ｇ／１  ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ）を含有する限定最小培地に生育させた。ｐＨはＮａＯＨで６．８に調整し、培地はオートクレーブで滅菌した。窒素源としてＮＨ4Ｃｌを最終濃度０．１％または０．０１％になるように添加し、フルクトースを最終濃度０．５〜１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加した。
【００４３】
プラスミドＤＮＡの調製は、Ｉｓｈ−ＨｏｒｏｗｉｃｚおよびＢｕｒｋｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、９．２９８９−２９９８（１９８１）の記載に従いＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、７．１５１３−１５２３（１９７９）の方法で行った。λ  ＤＮＡはＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏ１ｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  １９８２）に記載の標準的方法で調製した。ＤＮＡ配列はＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９クローニングベクターを（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ３３、１０３−１０９（１９８５））用いてＳａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、５４６３−５４６７（１９７７）のジデオキシ鎖終結法により分析した。α−［35Ｓ］−ｄＡＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片はＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。配列データはＶＡＸシステムでコンパイルし分析した。
【００４４】
ランダムなＺ．ｒａｍｉｇｅｒａクロモソームＤＮＡ断片の組換えライブラリーを、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８−７８２（１９８３）の記載に従いλｇｔ１１発現ベクターに構築した。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ  ＤＮＡはＡｎｄｅｒｓｏｎ、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、９、３０１５−３０２６（１９８１）の教示に従いまずＥｃｏＲＩメチラーゼを用いてメチル化し、次にＭｇ2+の存在下にＤＮＡｓｅ  １で部分消化した。部分消化したＤＮＡ断片の末端をクレノウポリメラーゼで修復し、ＥｃｏＲＩリンカーを添加し、過剰量のＥｃｏＲＩでＤＮＡを完全に消化した。２−８  ｋｂの断片を１．５％アガロースゲルでサイズ選別し、電気溶出により精製し、ＥｃｏＲＩ消化されたホスファターゼ処理λｇｔ１１のＤＮＡにライゲートした。ライゲーションは２μｇのλｇｔ１１  ＤＮＡおよび１μｇの断片化クロモソームＤＮＡを用い全量１０μｌで、４℃で１８時間行った。完全なライゲーション反応物はインビトロでＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）の記載に従い、Ｅ．ｃｏ１ｉ株ＢＨＢ２６８８およびＢＨＢ２６９０、ＨｏｈｎおよびＭｕｒｒａｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、  ＵＳＡ、７４、３２５９−３２６３（１９７７）から調製したλ抽出物を用いてパッケージした。パッケージしたファージはＥ．ｃｏ１ｉ  Ｙ１０８８を用いてプレートにまき増幅させた。
【００４５】
λｇｔ１１発現ライブラリーのスクリーニングは、ウサギ抗チオラーゼ抗体を用いてＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２、７７８−７８２（１９８３）に記載の変法により行った。
【００４６】
制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ１はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手し、製造業者の指示した条件下で用いた。子牛腸アルカリホスファターゼはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。プラスミドの精製、Ｅ．ｃｏ１ｉの形質転換等を含む全ての慣例的ＤＮＡ操作は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）の記載した方法で行った。クロモソームＤＮＡはＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株から精製し、ＴＳＢ中で後期対数相まで生育させた。制限酵素消化ＤＮＡ試料のアガロースゲルからニトロセルロースフィルターへの転写、32Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いたプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションはＰｅｏｐｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、  ２６２、９７−１０２（１９８７）に記載されている。制限酵素分析のためのＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの組換え株からの迅速なプラスミドの単離は、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７．１５１３−１５２３（１９７９）のアルカリ抽出法で行った。
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓへの接合伝達
広宿主プラスミドｐＬＡＦＲ３またはｐＬＡＦＲ３の組換え誘導体のＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓへの接合移入は、Ｅａｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６９、４５１８−４５２４（１９８７）に記載の方法により行った。但しこの場合、受容細胞Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓはソニケートせず、また接合移入体は窒素源として０．０１％  ＮＨ4Ｃｌ、炭素源として１％（ｗ／ｖ）フルクトース、および１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ無機塩寒天プレートで選択した。
【００４７】
Ｔｎ５変異誘発のために、自然ストレプトマイシン耐性株のＡ．  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  １１５９９（１５９９  Ｓ１）を用いた。唯一のドナーとしてＥ．  ｃｏ１ｉ  ＭＭ２９４Ａ（ｐＲＫ６０２）を用いて、上記の様にｐＲＫ６０２（Ｔｎ５）の移入を行った。Ｔｎ５を含有するＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株はストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）上での生育によって選択した。
Ｚ．ｒａｍｉｅｒａチオラーゼ遺伝子の同定
チオラーゼ抗血清は精製されたチオラーゼタンパク質を用いて標準方法により、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白色ウサギの雌を用いて調製した。抗体力価はＡｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｓｃａｎｄ．２６、５０７−５１５（１９４９）のオクタロニー二重拡散アッセイで評価した。精製抗体は血清から、Ｂｉｇｈｅｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０、１３５３−１３５７（１９８３）に従いプロテインＡアガロースのクロマトグラフィーで調製した。約４×１０4個の組換えファージをＥ．ｃｏ１ｉ  Ｙ１０９０に吸着させて１５cmのＬＢアガープレートにまき、４２℃で３時間インキュベートした。次にプレートを、予め１０ｍＭ  ＩＰＴＧで飽和させたニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｌｌ、ＢＡ８５）の上に載せ、３７℃でさらに４時間インキュベートした。フィルターを取り除き、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＨ７．９、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０分間洗浄し、２０％  ｖ／ｖ牛胎児血清を添加したＴＢＳＴ中で３０分間インキュベートして、ＴＢＳＴですすいだ。第一抗体は精製した抗チオラーゼ抗体（１０μｌ）を添加したＴＢＳＴの１０ｍｌ中でこのフィルターを、室温で１時間インキュベートすることにより結合させた。次にフィルターを、ＴＢＳＴを各５分間ずつ３回替えて洗浄した。結合した第一抗体はビオチン−アビシン  ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ発色剤（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）を用いて検出した。
【００４８】
タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動により、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２２、６８０−６８５（１９７０）の方法で分離し、Ｂｕｒｎｅｔｔｉ、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２、１９５−２０３（１９８１）の記載に準じてニトセルロースフィルター（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ  ＢＡ８５）に電気泳動により移した。３０Ｖで一晩移した後、フィルターをＴＢＳ（ツイン２０を含有しないＴＢＳＴ）ですすぎ、５％ウシ血清アルブミンを添加したＴＢＳ中でインキュベートした。次に、抗チオラーゼ血清と反応するタンパク質を、フィルターを１００ｍｌの１％ゼラチン入りＴＢＳに２ｍｌの抗チオラーゼ血清を添加したものと共に１−２時間インキュベートすることにより検出した。結合した第一抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体およびホースラディッシュペルオキシダーゼ発色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ．  ＣＡ）を用いて検出した。
【００４９】
アガロースゲルから分離したＤＮＡ断片を用い、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、  ９８、５０３−５１７（１９７５）の開発した方法に基づくＳｍｉｔｈおよびＳｕｍｍｅｒｓ、  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９、１２３−１２９（１９８０）のサンドイッチブロット法によりＤＮＡプロットを調製した。フィルターは、Ｒｉｇｂｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、  １１３、２３７−２５１（１９７７）のニックトランスレーション法により［α−32Ｐ］ｄＡＴＰで高比活性（０．１〜１×１０8ｃｐｍ／μｇＤＮＡ）にラベルしたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、シールされたポリテン（ｐｏｌｙｔｈｅｎｅ）バッグ中で６５℃にて行った。プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション液は５×ＳＳＣＰ（１×ＳＳＣＰは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4を含有）、５×デンハー液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ超音波処理変性サケＤＮＡを含有した。フィルターを８〜１８時間プレハイダリダイズさせ、フィルター当り１０7ｃｐｍのラベル化ＤＮＡプローブを用いて１６〜１８時間バイブリダイズさせた。
【００５０】
溶原性λｇｔ１１組換えクローンはＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ、  Ｓｃｉｅｎｃｅ、  ２２２、７７８−７８２（１９８３）に記載のようにＥ．ｃｏ１ｉ  Ｙ１０８９で調製した。λファージにコードされるタンパク質の調製および分析のために、溶原菌をＬＢ（１００ｍｌ）で３０℃にて、０．５  ＯＤ600に達するまで生育させた。プロファージは４５℃で２０分間インキュベートして誘導し、ＩＰＴＧを５ｍＭになるように添加して、誘導された溶原菌を３７℃で１時間インキュベートした。細胞を集め、アッセイ緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  βメルカプトエタノール、５％（ｖ／ｖ）グリセロール）に再懸濁し、超音波処理により溶菌させ、遠心により細胞残渣をペレット化して、細胞抽出物を−２０℃で貯蔵した。細菌溶解物のタンパク質濃度は、Ｍ．Ｍ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８−２５４（１９７６）の方法により標準としてウシ血清アルブミンを用いてアッセイした。チオラーゼ酵素のアッセイはＮｉｓｈｉｍｕｒａら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．１１６、２１−２７（１９７８）の記載に従い行った。
【００５１】
ＤＮＡ断片はＭベクターｍｐ１０およびｍｐ１１にクローン化し、Ｓａｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０、１４１−１５８（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、５４６３−５４６７（１９７７）のジデオキシ鎖終結法により配列決定した。Ｍ１３配列決定用プライマーおよび他の試薬はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．  から購入した。Ｇ／Ｃに富む領域はＭｉｌｌｓおよびＫｒａｍｅｒ、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６．２２３２−２２３５（１９７９）に記載のように、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰを用いて再度配列決定した。コンピューターを用いた配列解析はＮｕＣ１ｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０、１４１−１５８（１９８４）のＳｔａｄｅｎプログラムを用いて行った。
【００５２】
精製された目的のＤＮＡ１μｇから、約２×１０5個の組換え体が得られ、これをＥ．ｃｏ１ｉ  Ｙ１０８８で増幅させた。合計１０5個の増幅ファージを、精製したウサギ抗チオラーゼ抗体を用いてスクリーニングした。最初のスクリーニングで１０個の潜在的陽性クローンが確認された（ＬＤＢＫ１−ＬＤＢＫ１０）。制限酵素分解による分析により、ＬＤＢＫ２−１０のクローンは同一であることが示された。クローンＬＤＢＫ１およびＬＤＢＫ２を以下の研究のために選択した。ＬＤＢＫ１は３．６ｋｂおよび０．７５ｋｂの２個のＥｃｏＲＩ断片を含む挿入物を有する。ＬＤＢＫ２は１．６５ｋｂおよび１．０８ｋｂの３個のＥｃｏＲＩ断片を含む挿入物を有する。
【００５３】
ＬＤＢＫ１およびＬＤＢＫ２の挿入配列にコードされるタンパク質は、チオラーゼ酵素活性およびウサギ抗チオラーゼ血清との交叉反応について分析した。ＬＤＢＫ１およびＬＤＢＫ２ファージＤＮＡを含む溶原性株Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８９を調製した。各クローンからいくつかの溶原菌が得られ、その内の２つ、Ｙ１０８９／ＬＤＢＫ１およびＹ１０８９／ＬＤＢＫ２を以下の研究に用いた。λｇｔ１１ベクターであるＢＮＮ９７／λｇｔ１１の溶原菌をコントロールとして用いた。チオラーゼ酵素アッセイの結果は、Ｙ１０８９／ＬＤＢＫ１由来のタンパク質はチオラーゼ活性をかなり含有していることを明確に示した。さらに、チオラーゼ活性はＩＰＴＧ添加により、５倍より多くまでも誘導可能である。このことはチオラーゼをコードする配列の発現はλｇｔ１１ベクターに含まれるｌａｃプロモーターの転写制御下に置かれていることを示す。Ｙ１０８９／ＬＤＢＫ２もＢＮＮ９７／λｇｔ１１も、そのタンパク質溶菌物は、ＩＰＴＧで誘導した場合でさえも、有意なチオラーゼ活性を示さない。
【００５４】
ウサギ抗チオラーゼ抗体に対し最初に陽性反応を生じたタンパク質のサイズは、ウエスタンブロット実験により調べた。タンパク質溶菌物はＳＤＳポリアクリルアミトゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースフィルターに写し、ウサギ抗チオラーゼ血清でスクリーニングした。結果は、Ｙ１０８９／ＬＤＢＫ１のＩＰＴＧ誘導およびＩＰＴＧ非誘導溶菌物の両者に、免疫反応陽性の４０，０００ダルトンタンパク質が示された。
【００５５】
ＬＤＢＫ１挿入物の制限酵素地図を作成した。完全なチオラーゼ遺伝子領域を含有する大きな３．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片は、操作を容易とするためプラスミドベクターｐＵＣ８にサブクローンした。得られたサブクローンの一つであるｐＵＣＤＫＢ１の制限酵素分析から、ＬＤＢＫ１のこの断片の制限地図を確立した。ｐＵＣＤＢＫ１のＤＮＡは32Ｐで高比活性にラベル化し、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａクロモソームＤＮＡをｐＵＣＤＢＫ１の制限酵素地画に用いたのと同じ酵素で消化したものを含むニトロセルロースフィルターにハイブリダイズさせた。サザンハイブリダイゼーション実験により、５．４ｋｂゲノム断片はｐＵＣＤＢＫ１からの１．４５ｋｂ  ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ断片および１．０５ｋｂＳａｌＩ断片の両方にハイブリダイズすることが確認された。サザンハイブリダイゼーション実験に基づき、クローン化されたｐＵＣＤＢＫ１挿入物はＺ．ｒａｍｉｇｅｒａゲノムに唯１つだけ示される。
【００５６】
ｐＵＣＤＢＫ１挿入物のＤＮＡ配列分析は、Ｍ１３／サンガ−ジデオキシ鎖終結法を用いて行った。遺伝子をコードする領域を位置付けるため、６個のリーディングフレームの全てについて、各々のＤＮＡ配列をアミノ酸配列のＮＨ2末端との相同性についてスキャンした。これらの手法を用いることにより、１．４５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片内の遺伝子コーディング領域を同定した。遺伝子のプラス鎖の完全ヌクレオチド配列を図１および配列表の配列番号１に示す。ＥｃｏＲＩ部位から２９０ｂｐ下流には、ＤＮＡ配列をＮＨ2末端アミノ酸配列と比較して帰属されたチオラーゼ構造遺伝子の開始点がある。このＮＨ2末端配列は、−８９位からヌクレオチド１１７４位の終止コドン（ＴＡＧ）まで伸びる単一の長いオープンリーディングフレーム内にある。セリンに始まり２５残基伸びる部分は実験的に決定したＮＨ2末端配列であり、これはＤＮＡ配列の解読による２位から２６位の残基と同一である。次に、ＤＮＡ配列を解読して残余の残基２７位から３９１位（ヌクレオチド７９位から１１７３位）までのアミノ酸配列を推定した。このようにして、ヌクレオチド１位から１１７４位（上記リーディングフレーム内）のＤＮＡ配列はアミノ酸３９１個の算出分子量４０，５９８のポリペプチドをコードする(配列番号２)。この値はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定した分子量４２，０００と非常によく一致する。
【００５７】
他の２つの証拠から、この翻訳産物はチオラーゼの正しいアミノ酸配列であることが確認される。まず、活性部位ペプチドと推定されるアミノ酸配列（ＮＨ2−Ｇ１ｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ）を検索すると８４位−９２位残基に存在した。さらに、翻訳産物から推定されるアミノ酸組成は実験的に得られたものと非常によく一致している。１．４６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片のＧ／Ｃ含有量は６６．２％と高い。分けて考えると、５’−フランキング２９０ｂｐのＧ／Ｃ含有量は５７．４％であり、構造遺伝子領域では６８．４％である。アミノ酸配列から、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａチオラーゼが５個のシステイン残基を有することが確認される。Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ活性部位のシステインは残基Ｃｙｓ−８９である、他の分子内または分子間ジスルフィド結合に関与するシステインはＣｙｓ−１２５、Ｃｙｓ−３２３、Ｃｙｓ−３７７およびＣｙｓ−３８７である。ＮＨ2末端配列の分析は、１位がセリンであることを示した。
【００５８】
ＡＴＧ開始コドンから７ヌクレオチド上流にはＥ．ｃｏｌｉ配列との相同性から確認される、可能なリボソーム結合部位５’−ＣＴＧＡＧＧＡ−３’がある。ある種の細菌の遺伝子で翻訳開始可能な、２つのＧＴＧを含む他の開始コドンが、さらに上流に存在する。５’−フランキング領域を、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターエレメントの”−１０”および”−３５”との相同性について調べることにより残基−１２２位から−１１６位に可能な”−３５”領域が、また−１００位から−９５位に対応する”−１０”領域である５’−ＴＡＴＡＡＴ−３’が確認された。ポリ（Ｔ）トラクトもまた−２５５位から−２６６位に存在する。Ｎ−ホルミルメチオニン残基の除去のみがチオラーゼの翻訳後プロセシングであることが明かである。なぜなら、他の開始コドンであるＡＴＣまたはＧＴＧはフレームからはずれているか、または構造遺伝子の開始前にインフレームの終止コドンがあるからである。
【００５９】
ｐＵＣＤＢＫ１の１．５Ｋｂ  ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片は完全なＺ．ｒａｍｉｇｅｒａのチオラーゼ構造遺伝子に加えて２８３ｂｐの５’−フランキングＤＮＡを含んでいる。このＤＮＡ断片がｔａｃプロモーターのベクターｐＫＫ２２３−３（またはその誘導体）内に挿入された一連のプラスミド構築物を作成した。ｐＺＴ３の作成のために、ｐＵＣＫＢＫ１をＳａｌＩで開裂させ、クレノウポリメラーゼで平滑末端にし、ＥｃｏＲＩリンカーを付加する。ＥｃｏＲＩで消化した後、１．５Ｋｂ断片をアガロースゲルから精製して、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ｔａｃプロモーターに対して正しい方向に挿入された遺伝子を有する組換えクローンは、制限酵素分析の後Ｅ．ｃｏ１ｉ  ＪＭ１０５を形質転換することにより確認した。
【００６０】
次に、チオラーゼ遺伝子の５’末端に隣接する２８３ｂｐの配列が欠失した一連のクローンを構築した。ｐＵＣＤＢＫ１  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理した。ＳａｌＩ消化の後、断片の末端をクレノウで修復し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加した。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで開裂させ、１．２−１．４ｋｂの正しいサイズ範囲内の断片をアガロースゲルから精製して、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ部位にライゲートした。目的のクローンを制限酵素地図により同定し、５’−欠失の程度をＤＮＡ配列決定により測定した。これらの一連のクローン、ｐＺＴ３．１−ｐＺＴ３．５の内、最も欠失の長いクローンは残った５’−フランキングＤＮＡが８４ｂｐであった。従って続くＢａｌ３１欠失を以下のように行った：ｐＺＴ３．５  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に消化し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼで処理した；クレノウポリメラーゼで末端を修復して、ＥｃｏＲＩリンカーを付加し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化した後、チオラーゼのＮＨ2末端領域に相当する断片をアガロースゲルから溶出して、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化したＭ１３ｍｐ  １１  ＤＮＡにライゲートし、Ｅ．ｃｏ１ｉ  ＪＭ１０１上にプレートした；５０個の形質転換体から一本鎖ＤＮＡを調製し、５’−欠失の程度をＴ−トラッキングで分析した；目的のクローンからインビトロで二本鎖ＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ挿入物を制限酵素消化およびアガロースゲルからの溶出により回収した。
【００６１】
完全なチオラーゼ遺伝子を再構築するために、ｐＫＫ２２３−３からｔａｃプロモーター上流のＢａｍＨＩ部位を欠失させた誘導体ベクター（ｐＫＫ２２６）に、ｐＺＴ３．５からの２９０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をライゲートした；このＣ末端ベクターを次に、目的のＢａｌ３１が欠失したＮＨ2末端を再構築するために用いた；クローンｐＺＴ３．５．１およびｐＺＴ３．５．２を以下の研究に用いた。
【００６２】
チオラーゼのＡＴＧ翻訳開始コドンに隣接した２８３ｂｐのＤＮＡの配列欠失の効果は、プラスミドｐＺＴ３．１−ｐＺＴ３．５．２の産生するチオラーゼ活性レベルを分析することにより測定した。各プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５培養物の１００ｍｌをＩＰＴＧと共に１５時間、インキュベートし、チオラーゼレベルをアッセイした。これらの結果のうち最も注目すべきことは、クローンｐＺＴ３．３−ｐＺＴ３．５．２を用いて得られるチオラーゼの発現レベルは非常に高く、ｐＺＴ３．５で最大の１７８Ｕ／ｍｇが得られたことである。これは完全な２８３ｂｐの５’フランキングＤＮＡを含むプラスミドｐＺＴ３に比較して、５．９倍の増加を示している。このデータは、−８４（ｐＺＴ３．５）と−１６８（ｐＺＴ３．２）との間に位置するチオラーゼ５’フランキング配列が、チオラーゼ遺伝子のｔａｃプロモーターからの発現を強く阻害することを示す。これらの配列の位置は−８４（ｐＺＴ３．５）および−１２４（ｐＺＴ３．４）の間に限定し得る。なぜならば、この領域を欠失させると、ｔａｃ−誘起のチオラーゼ発現が最大レベルとなるためである。さらに−３７（ｐＺＴ３．５．１）まで、および−２６（ｐＺＴ３．５．２）までの欠失は、チオラーゼの発現レベルを増加せず、実際僅かに減少が観察された。この一連のクローンの誘導のタイムコースはｐＺＴ３と同じキネティックスに従い、欠失によってそれとわかるほど影響されないことは注目に値する。
【００６３】
チオラーゼプロモーターが領域−８４（ｐＺＴ３．５）から−１２４（ｐＺＴ３．４）に存在するか否かを決定するために、ＢｅｒｋおよびＳｈａｒｐ、Ｃｅｌｌ  １２、７２１−７３２（１９７７）の方法に従いＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ  ＲＮＡについてＳ１ヌクレオチド保護実験を行った。全ＲＮＡを１００ｍｌの対数増殖期中期の培養物から、Ｈｉｎｎｅｎｂｕｓｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８、５２３８−５２４７（１９８３）の熱フェノール／ガラスビーズ抽出法により単離した。５’−32Ｐラベル化ＤＮＡプローブは以下のように調製した：１０μｇのプラスミドｐＺＴ３．１ＤＮＡをＡｖａＩで完全に消化し、続いてＣＩＰで処理した；ＡｖａＩ制限酵素断片の５’末端を、[γ−32Ｐ］−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベル化した；ＥｃｏＲＩ消化の後、ＤＮＡを８％アクリルアミドゲルで分離して、32Ｐラベル化した２８０ｂｐのプローブ断片を溶出し、工クノール沈澱により回収した。プローブ（１０，０００ｃｐｍ）および１１μｇＲＮＡをプールし、凍結乾燥し、１０μｇハイブリダイゼーション緩衝液（４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４；１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；  ０．４Ｍ  ＮａＣｌ；  ８０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）に再懸濁して、９０℃で１０分間変性させ、５５℃で一晩アニールさせた。２０００単位のＳ１ヌクレアーゼを含有する２３５μｌの氷冷Ｓ１ヌクレアーゼ緩衝液（０．２５Ｍ  ＮａＣｌ：  ３０ｍＭ  ＮａＯＡｃ；  １ｍＭ  ＺｎＳＯ4；  ２００μｇ一本鎖子牛胸腺ＤＮＡ）を添加した後、３７℃で３０分間インキュベートした。反応混合物をフェノール−クロロホルムで１回抽出し、０．２Ｍ  ＮａＯＡｃおよび１０μｇイーストｔＲＮＡキャリアーの存在下でエタノール沈澱を行った。得られた断片を６％（ｗ／ｖ）アクリルアミド、７Ｍ尿素のＤＮＡ配列決定ゲルで分析した。サイズ標準としてマキサムギルバートのＧおよびＣ配列決定反応を、５０，０００ｃｐｍの５’−32Ｐ−ラベル化プローブＤＮＡで行った。結果は、保護された断片を明確に示し、そしてＲＮＡ開始部位が、−８６位または−８７位のＣまたはＴ残基に位置することを明かに示した。コントロールは、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ  ＲＮＡの非存在下でプローブは完全に分解されることを示し、このことはチオラーゼのプロモーター領域が約１０ｂｐ（−９６）および３５ｂｐ（−１２１）上流に存在することを実証する。チオラーゼの５’非翻訳領域の長さは８６ｂｐである。
【００６４】
誘導実験の結果から、チオラーゼ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉにおいて可溶性で触媒活性な形態で高レベルで発現し得ることを明確に示した。Ｓ１ヌクレアーゼの実験で、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのチオラーゼ遺伝子の転写開始部位をヌクレオチド−８６／−８７位に位置付けてきた。
【００６５】
チオラーゼプロモーターの”−３５”領域が認識され、ＲＮＡポリメラーゼを結合することが示されているけれども、転写開始速度を決定するのは”−１０”領域である。例えばｐＺＴ３の場合、ベクターおよび挿入プロモーターの両方にＲＮＡポリメラーゼ分子が同時に結合することにより、ｔａｃプロモーターから速やかに転写が開始される結果となり、次にこのｔａｃプロモーターがＺｏｏｇｌｏｅａプロモーターに結合したポリメラーゼ分子の存在により阻害されるのであろう。２つのプロモーターが接近している程、ポリメラーゼの両者への同時の結合チャンスは少なくなり、同時に阻害が低くなる。従って、これにより、酵素の発現速度を制御する１つの手段が提示される。
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａレダクターゼ遺伝子の確認
チオラーゼ遺伝子のプロモーター領域を確認し、チオラーゼＴＡＧ終止コドンの下流に、可能なターミネーター配列が存在しないことを確認した後、クローンｐＵＣＤＢＫ１に存在する残余の２ｋｂのＺｏｏｇｌｏｅａＤＮＡを配列決定して、レダクターゼ遺伝子について調べた。完全なｐＵＣＤＢＫ１挿入またはその断片を含有する一連の発現プラスミド（ｐＺＴ１〜ｐＺＴ３）を、Ｅ．ｃｏｌｉｔａｃプロモーターベクターｐＫＫ２２３．３中に構築した。各プラスミドはｔａｃプロモーターに対して発現のために正しい方向に位置するチオラーゼ遺伝子を有する。ｔａｃプロモーターはチオラーゼの発現を指令するのではなく、オペロン様タイプの機構の２．３ｋｂ下流に位置する任意の遺伝子の発現を指令すると予想するのが理にかなっている。クローンｐＺＴ１は、ｐＵＣＤＢＫ１の完全な３．８ｋｂＥｃｏＲＩ  Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ  ＤＮＡ挿入を、ベクターｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより構築した。続いて、ｐＺＴ２をｐＺＴ１から、８５０ｂｐ  ＳｍａＩ断片を欠失させる直接的な方法で派生させた。ｐＺＴ３はチオラーゼプロモーターの確認についての記載のようにして構築する。一連のｔａｃプロモーター誘導実験は、各々の組換えクローンｐＺＴ１、ｐＺＴ２およびｐＺＴ３で行った。ベクターｐＫＫ２２３−３をコントロールとして用いた。
【００６６】
各々のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を生育させ、イソプロピル−β−Ｄ−カラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度２ｍＭとなるように添加することにより誘導させた。１５時間誘導を行った後、１０ｍｌの培地を収穫し、超音波で溶菌させた。次に各クローンから細胞溶解物を、酵素アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの両者で分析した。どちらの細胞溶解物からもＰＨＢポリメラーゼ活性は検出されなかった。３つの組換えプラスミドｐＺＴ１、ｐＺＴ２およびｐＺＴ３の各々は、チオラーゼ活性を相当なレベルで示した。さらに、ｐＺＴ１およびｐＺＴ２からの細胞溶解物は、ＮＡＤＰＨを補助因子とするＡｃＡｃ−ＣｏＡレダクターゼ活性を比較的高レベルで有する。ＮＡＤＰＨを補助因子として用いる場合は、どの細胞溶解物にもレダクターゼ活性が検出されない。コントロールのｐＫＫ２２３−３はチオラーゼ活性もレダクターゼ活性も有さない。ｐＺＴ１およびｐＺＴ２の細胞溶解物は実際に、正しいレダクターゼを含有するということを確認するために、この細胞溶解物もまたＤ（−）β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの酸化についてアッセイした。どちらの場合にも、ＮＡＤＰを電子受容体として用いて酵素活性が観察された。
【００６７】
上記細胞溶解物の各々はＳＤＳ−ＰＡＧＥでも分析した。結果は、ｐＺＴ１、ｐＺＴ２およびｐＺＴ３の細胞溶解物タンパク質中に４２，０００ダルトン付近のチオラーゼタンパク質が存在することを示す。このタンパク質はコントロールであるｐＫＫ２２３−３の細胞溶解物には存在しない。ｐＺＴ１およびｐＺＴ２の細胞溶解物は、ｐＺＴ３またはコントロールには存在しない小さな２５，０００ダルトンタンパク質も有し、このタンパク質はＡｃＡｃＣｏＡレダクターゼに相当する。結果は、ＡｃＡｃ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子はチオラーゼ遺伝子の下流に位置することを示す。この酵素の完全な構造遺伝子はｐＵＣＤＢＫ１のチオラーゼの３’末端と下流の最初のＳｍａＩ部位との間に位置するにちがいない。レダクターゼ遺伝子の転写開始部位の確認と過剰発現
ｐＵＣＤＢＫ１の最初のＳａｌＩ部位の２．３ｋｂ下流に位置する、２３３９ｂｐの完全ヌクレオチド配列を図２および配列表の配列番号３に示す。チオラーゼ遺伝子のコドン使用情報を標準として用いて配列データのコンピューター分析を行い、３つのオープンリーディングフレームを同定した。ｐＺＴ１およびｐＺＴ２の誘導された細胞溶解物中に存在する２５，０００ダルトンのバンドを、次に調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて電気溶出し、Ｎ末端タンパク質配列のデータを得た。このデータを用いて対応する遺伝子の転写開始部位を確立した。実験で決定したＮ末端の５個のアミノ酸は、最初のオープンリーディングフレームのＤＮＡ配列から推定される２位〜６位の残基と一致する。このリーディングフレームの翻訳により、分子量２５，０００のポリペプチドが推定される(配列番号４)。ヌクレオチド３７位のＡＴＧに始まりＴＧＡ終止コドンヌクレオチドに終わる最初のオープンリーディングフレームの翻訳産物を図２および配列表の配列番号４に示す。これはアセトアセチルＣｏＡレダクターゼタンパク質の推定される一次アミノ酸配列である。
【００６８】
クローンｐＺＴ１およびｐＺＴ２のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子はＥ．ｃｏｌｉで、納得できるほど高レベルで発現可能である。しかし、両方の場合共、ｔａｃプロモーターからのレダクターゼ遺伝子の発現は、チオラーゼ構造遺伝子および５’フランキング配列の存在のために至適ではない。より単純なアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ過剰産生ベクターとしてｐＺＲ１４を構築した。ｐＵＣＤＢＫ１  ＤＮＡをＳａｌＩとＳｍａＩとで完全に消化し、ＳａｌＩ末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で修復した。ＥｃｏＲＩリンカーを付加しＥｃｏＲＩで消化した後、断片をアガロースゲル電気泳動で分離した。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ構造遺伝子に、５’末端の３６ｂｐフランキングおよび３’末端の２６６ｂｐフランキングを加えたものに相当する１．０５ｋｂ断片を精製し、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ部位にライゲートした。次に、このｐＺＲ１４が、レダクターゼ遺伝子が正しい方向に入った正しい制限酵素地図を有することを確認した。ｐＺＲ１４の誘導実験をｐＺＴ１、ｐＺＴ２およびｐＺＴ３についての記載と同様にして行った。アセトアセチルＣｏＡレダクターゼが発現した。
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓでのチオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子の確認
Ｚｏｏｇｌｏｅａから最初の２つのＰＨＢ遺伝子を単離した方法を適用し、Ｚｏｏｇｌｏｅａチオラーゼ遺伝子領域を相同な配列の位置を決めるハイブリダイゼーション用プローブとして用いて、他のＰＨＢ産生種であるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓから遺伝子を同定し、単離し、特徴付けた。
【００６９】
次に、ｐＵＣ８にクローン化された（クローンｐＡｅＴ３）Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＤＮＡの２ｋｂ  ＰｓｔＩ断片の配列を分析して、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６ゲノム中の対応するチオラーゼ遺伝子領域を同定した。ｐＡｅＴ３の下流の配列もまた、ＺｏｏｇｌｏｅａクローンｐＵＣＤＢＫ１のＮＡＤＰ−関与レダクターゼ遺伝子領域と相同である。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓチオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子の配列を図３および図４(図４は図３に示す配列の続きの配列を示している)、ならびに配列表の配列番号５に、そしてそれらの推定されるアミノ酸配列を配列表の配列番号６および７にそれぞれ示す。
【００７０】
チオラーゼおよびレダクターゼ遺伝子をｐＡｅＴ３からｐＫＫ２２３．３にクローニングすることにより、各々の酵素の発現が得られる。ＺｏｏｇｌｏｅａとＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓとでチオラーゼタンパク質配列を比較することにより、２つのタンパク質が活性部位Ｃｙｓ−８９を含め６３％について相同であることが確立された。
【００７１】
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓおよびＺｏｏｇｌｏｅａチオラーゼ遺伝子領域は両方とも、ＮｏｃａｒｄｉａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓＤＮＡを相同な遺伝子についてスクリーニングするための、ハイブリダイゼーション用プローブとして用いた。チオラーゼ、レダクターゼおよび他の合成酵素の遺伝子を、相同な配列を有する上記以外の他の種から、同定する手法は当業者に周知である。
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのＰＨＢポリメラーゼ遺伝子の確認
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ由来のＰＨＢポリメラーゼは、Ｄ（−）−ヒドロキシルブチル−ＣｏＡを利用し、これらを鋳型に依存しないヘッドトゥーテイル縮合反応によるオキソエステル結合で重合し、直鎖状のポリマーを得る。これらのポリマーは、最大で１０，０００個のモノマーユニットを含み得、１×１０6以上の分子量となり得る。このポリマーは迅速に不溶性となり、細胞中で独立した顆粒として蓄積される。
【００７２】
広域宿主プラスミドｐＲＫ２９０の誘導体を基にした接合移入システムは、Ｄｉｔｔａらの、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７、７３４７−７３５１（１９８０）に記載され、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓについてＰＨＢポリメラーゼ遺伝子を単離するために、ＰＨＢ陰性変異体の単離、特徴付けおよび補完性に関連して、トランスポゾン変異誘発および相補性分析が使用し得る。Ｓｃｈｌｅｇｅｌらの、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１、２８３−２９４（１９７０）に記載されている様に、スダンブラック染色がＰＨＢ陰性変異体の検出に用いられる。生育させ、収穫し、そしてＰＨＢを放出させるために細胞を溶解することにより、変異体の補完性をスクリーニングし、次いでこれを精製し、その存在および分子量分布を測定し得る。溶解液中のチオラーゼ、リダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼの活性もまた試験される。
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢポリメラーゼ遺伝子の確認
これらの技術はまた、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６のポリ（β）−ヒドロキシブチレート−陰性変異体の補完性を用いて、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６中にＰＨＢポリメラーゼ遺伝子（ｐｈｂＣ）クローニング、配列決定、および発現させることにも応用される。ＰＨＢの生合成経路の３つの酵素をコードしている遺伝子は、ｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢと統合されていることが結果から示された。Ｅ．ｃｏｌｉ中で３つ全ての遺伝子を発現させたところ、この細菌では顕著なレベル（乾燥細胞の５０％）のＰＨＢ産生があった。ｐｈｂＣは、典型的な膜タンパク質とは異なる親水性の特性の、Ｍｒ＝６３，９００のポリペプチドをコードしており、このことは、ＰＨＢの生合成には恐らく膜複合体が含まれないことを示している。
【００７３】
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６の誘導体（１１５９９  Ｓ１、表１）のＰＨＢ−陰性変異体の構築、特徴付けおよび相補性のための方針をＰＨＢポリメラーゼをコードする遺伝子（複数の遺伝子の場合も）の確認および単離に用いた。トランスポゾン変異誘発を用いたことにより、全ての興味ある株へのＴｎ５挿入のクロモソーム中での位置決めにＤＮＡハイブリダイゼーション分析の使用が可能となった。窒素を制限した最少寒天プレートで生育させた時の、不透明なコロニー（ｏｐａｑｕｅ  ｃｏｌｏｎｙ）表現型により、３２個の潜在的なＰＨＢ陰性変異体が確認された。３つのクラスに属するだけなのに、Ｔｎ５のＤＮＡプローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションで３２もの変異体が見つかったのは、これがＰＨＢ−欠損株を濃縮するために用いられる方法であるため、驚くことではない。次に、各クラスからの代表、即ち、ＰＨＢ  ＃２、ＰＨＢ  ＃３およびＰＨＢ  ＃１９を分析するためにさらに詳細なＤＮＡハイブリダイゼーション実験を行った。これらの実験により、ＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３株の場合不透明な表現型を引き起こすＴｎ５挿入はクロモソーム中、図３および図４に示した様に、ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子からそれぞれ約１．２ｋｂおよび１．６ｋｂ上流に位置していると結論される。ＰＨＢ  ＃１９株の場合、Ｔｎ５挿入はＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓクロモソームの他の場所に位置している。
【００７４】
ｐｈｂＣの、単離および特徴付けに用いた実験方法および実験材料は以下の通りである。この実験方法および実験材料は、ｐｈｂＡおよびｐｈｂＢ遺伝子の単離に関して記述したものと類似である。
【００７５】
細菌株およびプラスミドは表１に示してある。培地および培養条件は上述の通りである。
【００７６】
【表１】
0003703983.tif 000003
【００７７】
ＤＮＡの操作方法は上述したのと類似である。制限エンドヌクレアーゼのＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ１は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手し製造者の指示に従い使用した。ウシの腸のアルカリフォスファターゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。常法のＤＮＡ操作方法は、プラスミドの精製、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換、その他を含め全て、Ｍａｎｉａｔｉｓらの記載した方法を用いて行った。クロモソームＤＮＡは前述した様に、ＴＢＳ中で対数増殖期後期まで生育させたＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株から精製した。アガロースゲルからニトロセルロースフィルターへの制限酵素消化されたＤＮＡ試料の転写、プリハイブリダイゼーションおよび32Ｐ−標識ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションは前述した通りである。制限酵素分析用の、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのリコンビナント株からのプラスミドの迅速な単離は、アルカリ抽出法で行った。
Ａ．ｅｕｔｒｏｈｕｓ中への接合
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中への、広域宿主プラスミドｐＬＡＦＲ３あるいはｐＬＡＦＲ３のリコンビナント誘導体の接合移入は、前述したのと同じ方法を用いて行った。しかしこの場合、受容細胞であるＡ．ｅｕｔｒｏｈｕｓ細胞は超音波処理せず、そして接合移入体（Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ）は、０．０１％のＮＨ4Ｃｌを窒素源、１％（ｗ／ｖ）のフルクトースを炭素源として１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含んだＡ．ｅｕｔｒｏｈｕｓ無機質寒天プレート上で選択した。
【００７８】
Ｔｎ５変異誘発用には、１１５９９（１５９９  Ｓ１）のＡ．ｅｕｔｒｏｈｕｓストレプトマイシン自然耐性株を用いた。ｐＲＫ６０２（Ｔｎ５）の移入は、上述の様にＥ．ｃｏｌｉのＭＭ２９４Ａ（ｐＲＫ６０２）を唯一のドナーとして用いて行った。Ｔｎ５を含んだＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株は、ストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）上で生育させることにより選択した。
ＰＨＢ−欠損変異体の増幅および確認
Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢ−欠損株を確認するための増幅およびスクリーニングの方法は、ＳｃｈｌｅｇｅｌおよびＯｅｄｉｎｇの、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ、Ｖｉｅｎｎａ、２２３−２３１（１９７１）に記載されているものを使用した。約１０5個のＫａｎr接合移入体（Ｔｎ５挿入変異体）のプールを、０．０１％のＮＨ4Ｃｌ、１％のフルクトースおよび１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだ１０ｍｌの無機質培地に接種し、そして３０℃で１８時間培養した。この培養物を次に１００ｍｌの同じ培地に接種し、３０℃で３０時間培養した。ＰＨＢ−欠損変異株を増幅するために、この培養物から１０9の細胞を含んだ一部を、密度平衡遠心分離によりショ糖の段階グラジエントで分画し、そして０．０１％のＮＨ4Ｃｌ、１％のフルクトースおよび１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだ無機塩寒天プレート上に蒔いた。３０℃で４から５日間生育させた後、不透明な（ＰＨＢ−欠損）および白（ＰＨＢ−含有）のコロニーが容易に区別できた。不透明なおよび白の両方のコロニーにより産生されたＰＨＢのレベルを定量することにより、不透明なコロニーはＰＨＢ−欠損で、白コロニーはＰＨＢを含有することが確認された。
タンパク質の分析
β−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰＨ−関与のアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼおよびＰＨＢ−ポリメラーゼのアッセイを行うために、１００ｍｌのＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株の培養物を３０℃で４０時間ＴＢＳ中で生育させた。Ｔｎ５変異体株用には１００μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを加え、そしてｐＬＡＦＲ３あるいはその誘導体を含んだ株用には１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加えた。遠心分離で細胞を回収し、２ｍｌの細胞溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０；５ｍＭのβ−メルカプトエタノール；５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２ｍＭのフェニル−メチル−スルフォニル−フルオライド；１０％ｖ／ｖのグリセリン）に再懸濁し、そして超音波処理で細胞溶解した。細胞溶解液の一部を遠心分離して細胞残渣デブリスを除去し、β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼのアッセイ用とした。β−ケトチオラーゼ活性は、ＤａｖｉｓらのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、８２−８９（１９８７）に記載された様に、ＮＡＤＰＨを補助因子として、アセトアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡのチオリシスの速度の測定により決定された。ＰＨＢポリメラーゼアッセイは粗細胞溶解液を用いて行い、そして、ＦｕｋｕｉらのＡｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１１０、１４９−１５６（１９７６）に記載された様に、Ｄ−3Ｈ−ヒドロキシブチル−ＣｏＡ（約２μＣｉ／μｍｏｌの放射比活性）の取り込みレベルを測定した。タンパク質濃度は、ＢｒａｄｆｏｒｄのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８−２５４（１９７６）の方法により、Ｂｉｏｒａｄのアッセイ溶液および標準物としてウシ血清アルブミンを用いて決定された。Ｅ．ｃｏｌｉのｍａｘｉ−ｃｅｌｌ標識実験は、ＳａｎｃａｒらのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３７、６９２−６９３（１９７９）に記載された様に行った。
ＰＢＨの精製および定量
異なった株のＰＨＢレベルを調べるために、粗細胞溶解液の１００μｌを５％の次亜塩素酸ナトリウム１．２ｍｌにて３７℃にて１時間処理した。不溶のＰＨＢを次に、１０分間微量遠心管で遠心分離し回収し、１ｍｌのＨ2Ｏ、１ｍｌのアセトン、１ｍｌのエタノールで連続して洗浄し、減圧下で乾燥した。次にＰＨＢ濃度は、ＬａｗおよびＳｌｅｐｅｃｋｙのＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８２、３３−３６（１９６１）に記載されている様に分光光度計で標準曲線を用いて定量し、ｍｇ  ＰＨＢ／ｍｇタンパク質で表した。
プラスミドの構築および相補正分析
プラスミドｐＬＡ２９、ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐＬＡ４２は、ｐＡｅＴ２９の制限酵素断片を広域宿主ベクターｐＬＡＦＲ３に挿入するクローニングで構築し、ＰＨＢ−陰性のＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株を相補性分析した。ｐＬＡＦＲ３はｐＬＡＦＲ１の誘導体で、ＦｒｉｅｄｍａｎのＧｅｎｅ  １８、２８９−２９６（１９８２）に記載され、ＥｃｏＲＩ部位へ挿入されたｐＵＣ８ポリリンカークローニング部位を有する。ｐＡｅＴ９の異なった断片をｐＬＡＦＲ３ヘクローニングした。ｐＬＡ２９は、ｐＡｅＴ２９からの１５ｋｂのＥｃｏＲＩ部位挿入体全体をｐＬＡＦＲ３のＥｃｏＲＩ部位へつなげることで構築した。ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐＬＡ４２を構築するため、先ずｐＵＣ１８へ対応する断片をクローニングし、プラスミドｐＡｅＴ４０、ｐＡｅＴ４１およびｐＡｅＴ４２を生成した。次にこの断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによる消化でｐＵＣ１８から切り出し、アガロースゲル電気泳動で精製し、そしてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＬＡＦＲ３につなげた。ｐＡｅＴ４０を構築するため、ｐＡｅＴ２９のＤＮＡをＮｄｅＩで完全に消化しＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いて結合性末端を埋めた。アガロースゲル上で断片を分画した後、目的の７ｋｂ断片を電気溶出で精製し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位につなげ、そして次にＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５α細胞を形質転換した後に制限酵素分析によりリコンビナントプラスミドｐＡｅＴ４０を確認した。ＮｄｅＩ部位の一つがこの酵素の構造遺伝子の中にあるために、この構築によりアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ活性は除去される。ｐＡｅＴ４１の構築は、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ消化されたｐＡｅＴ２９のＤＮＡをアガロースゲルで分画し、そして５ｋｂのＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を精製し、ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したｐＵＣ１８につなぎ、正しいプラスミドを得た。β−ケトチオラーゼおよびアセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼの構造遺伝子を有する２．３ｋｂのＰｓｔＩ断片の欠損は、ｐＡｅＴ４１のＤＮＡをＰｓｔＩにより部分消化し、そして再びつなぐことにより行い、ｐＡｅＴ４２を構築した。
Ｔｎ５挿入物のハイブリダイゼー−ションによるマッピング
１０5個のＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  １１５９９  Ｓ１のＴｎ５挿入変異体のライブラリーを構築し、そして３２個の潜在的にＰＨＢ−陰性のコロニーを、前述の様に窒素制限最少プレート上での不透明なコロニー表現型で確認した。これらはさらにＳｏｕｔｈｅｒｎ  ＤＮＡハイブリダイゼーション分析により特徴付けられた。ＤＮＡハイブリダイゼーション実験は、制限酵素消化された各株からのクロモソームＤＮＡを、それぞれＴｎ５  ＤＮＡプローブ〈プラスミドｐＲＫ６０２）と、でＡ．ｅｕｔｒｏｈｕｓのｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子座（図３）を含んだ２つのプラスミドｐＡｅＴ１０およびｐＡｅＴ２９とを用いて分析して行った。
【００７９】
３２個の「不透明な」株は、たった三つの明確な変異体タイプの雑多なコピーを表している。これらの三つの明確な変異体タイプは、株ＰＨＢ  ＃２、ＰＨＢ＃３およびＰＨＢ  ＃１９で表される。株ＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３では、トランスポゾンＴｎ５はそれぞれ２．３ｋｂおよび０．６ｋｂのクロモソームのＰｓｔＩ断片に挿入された。これらのクロモソームのＰｓｔＩ断片の両方は、ｐＡｅＴ２９にクローニングされた１５ｋｂのＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＤＮＡ上に位置付されたが、ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ構造遺伝子上にはなかった。株ＰＨＢ  ＃１９は、ＰｓｔＩ断片にＴｎ５を挿入したが、ｐＡｅＴ２９プラスミド上にはなかった。
【００８０】
さらに詳細なＤＮＡハイブリダイゼーション実験を、ＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３からのクロモソームＤＮＡに対して行い、これらの変異体のそれぞれでのＴｎ５挿入部位の位置決めをした。これらの株のそれぞれ、および野生株Ｈ１６およびＰＨＢ  ＃１９からのクロモソームＤＮＡをＳａｌＩ、ＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ニトロセルロースフィルターの両面へ転写し、そしてＴｎ５  ＤＮＡ（ｐＲＫ６０２）プローブおよびｐＡｅＴ２９  ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせて、ＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３株中でのＴｎ５挿入の位置をマッピングした。
【００８１】
野生株Ｈ１６および、各変異株ＰＨＢ  ＃２、ＰＨＢ  ＃３およびＰＨＢ  ＃１９の生化学分析の結果を表２に示した。各株の定常相の培養物を１００ｍｌを回収し、細胞溶解し、そしてＰＨＢ含量およびβ−ケトチオラーゼ、ＮＡＤＰ特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼおよびＰＨＢポリメラーゼ活性に関してアッセイした。これらの生育条件下では、野生株Ｈ１６は有意なレベルのＰＨＢ（１．３ｍｇＰＨＢ／ｍｇタンパク質、表２）を産生し、三つの酵素活性全てが高いレベルであった。変異株ＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３は、ＰＨＢを実質的に産生せず、そしてＰＨＢ  ＃１９株は野生株のレベルのたった５％しか産生しなかった（表２）。ＰＨＢポリメラーゼ活性はこれら三つの変異株全てで検出されなかったが、しかしＰＨＢ  ＃１９株の細胞溶解液中にＰＨＢが存在していることは、酵素活性がアッセイの検出レベルよりも恐らく低いが、酵素が存在していることを示している。三つの変異体全てのβ−ケトチオラーゼ活性は、野生株Ｈ１６の４５％（ＰＨＢ  ＃２）から３８％（ＰＨＢ  ＃１９）のオーダーに減少していた。同様に、ＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ活性は、野生株の５０％付近であった。ＰＨＢ−ポリメラーゼ遺伝子はｐｈｂＡ−ｐｈｂＢから上流に位置し、後者の遺伝子の発現はＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３株の場合上流に挿入されたＴｎ５に影響されることがこれらのデータから結論される。
【００８２】
Ａ．ｅｕｔｒｏｈｕｓを挿入したｐＡｅＴ２９の断片を含んだ一連のプラスミドを、広域宿主ベクターｐＬＡＦＲ３中で構築して、ＰＨＢ−陰性変異体の相補性分析を行った。
【００８３】
各リコンビナントプラスミドｐＬＡ２９、ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐＬＡ４２は、連結により各Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株に導入され、そして得られた連結体は、白（ＰＨＢプラス）の表現型の復活に関して窒素制限プレート上で分析された。プラスミドｐＬＡ２９、ｐＬＡ４０、ｐＬＡ４１およびｐＬＡ４２は、それぞれＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３株のクロモソーム中にＴｎ５が挿入されたｐｈｂＡ−ｐｈｂＢから上流の領域を含み、これらの二つの株のそれぞれの変異を相補し、白いコロニーの表現型を復活している。４つのリコンビナントプラスミド全てはまた、変異株ＰＨＢ  ＃１９に対して野生株コロニーの表現型を復活した。この株の場合、Ｔｎ５挿入体は各プラスミドに含まれているＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのクロモソーム領域の外側に位置した。ベクターｐＬＡＦＲ３を用いた対照実験では、三つの変異株のそれぞれに導入すると不透明なコロニー表現型が得られた。
【００８４】
各相補株の生化学分析は、変異株の特徴付けに関して記述したように行い、そしてこれらの結果もまた表２に示してある。各変異株にｐＬＡ２９を導入すると、ＰＨＢポリメラーゼ活性およびＰＨＢ生合成が復活した（表２）。さらに、約３から５倍のレベルのβ−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ活性が観察された。プラスミドｐＬＡ４０およびｐＬＡ４１はまた、ＰＨＢ−ポリメラーゼおよびＰＨＢ産生をＰＨＢ  ＃２（表２）、ＰＨＢ  ＃３およびＰＨＢ  ＃１９に復活させたが、ｐＬＡ４０の場合には、ｐｈｂＢ遺伝子はこのプラスミドの構築中に破壊された。最後に、プラスミドｐＬＡ４２は、三つの変異株全てにＰＨＢポリメラーゼ活性およびＰＨＢ産生を復活したが、ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子は欠損していた。このプラスミドを含んだ株の場合、β−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ活性は、野生株と同じレベルで残っていた（表２）。
【００８５】
【表２】
0003703983.tif 000004
【００８６】
上述の様に、プラスミドｐＡｅＴ２９上に位置するｐｈｂＡ−ｐｈｂＢは、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉ中で発現した。ＰＨＢ  ＃２およびＰＨＢ  ＃３株での、ｐｈｂＣ遺伝子がｐｈｂＡ−ｐｈｂＢから上流に確認されたことと、チオラーゼおよびリダクターゼ活性の減少の観察とから、これら三つの遺伝子全てはｐｈｂＣから上流に位置する単一のプロモーターから発現されていることが示された。このことから、プラスミドｐＡｅＴ４１およびｐＡｅＴ４２を含んだＥ．ｃｏｌｉ株の培養物を、細胞が静止期相に達するまで窒素制限条件下で生育させ、その時点で細胞を回収し、分析した。ｐＵＣ１８を含んだＥ．ｃｏｌｉを対照として用いた。β−ケトチオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ、ＰＨＢポリメラーゼおよび濃度のアッセイの結果は表３に示されており、ｐＡｅＴ４１を含んだＥ．ｃｏｌｉの細胞溶解液は、各酵素活性およびＰＨＢ産生が顕著なレベルであることを示している。
【００８７】
上述のＥ．ｃｏｌｉ株のＭａｘｉ−ｃｅｌｌ分析を、プラスミドｐＡｅＴ４１およびｐＡｅＴ４２にコードされたポリペプチドの分子量の決定に用いた。このプラスミドは、ｐＵＣ８ベクターのｌａｃＺプロモーターからのＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子を発現していたので、プラスミドｐＡｅＴ１０もこの分析に含められた。プラスミドｐＡｅＴ１０およびｐＡｅＴ４１を含んだ試料中で、付加的なタンパク質バンドがそれぞれＭｒ  ４０，０００およびＭｒ  ２６，０００に存在した。これらのプラスミドの両方は、β−ケトチオラーゼ（Ｍｒ  ４１，０００）およびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｍｒ  ２６，０００）をコードするｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子を発現している。これら２つのタンパク質のいづれも、ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子を含まないプラスミドｐＡｅＴ４２を含んだ細胞の抽出液中には存在しなかった。ベクターｐＵＣ８を用いた対照実験では、Ｍｒ  ４１，０００あるいはＭｒ  ２６，０００にはシグナルを与えなかった。プラスミドｐＡｅＴ４１およびｐＡｅＴ４２の両者は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＰＨＢポリメラーゼ遺伝子（ｐｈｂＣ）を発現し、そしてこれらのプラスミドを含んだ細胞の抽出物を含んだ試料中には、Ｍr５８，０００のシグナルが明瞭に現れた。さらに、このタンパク質は、ｐｈｂＣ遺伝子を含まないプラスミドｐＡｅＴ１０を含んだ細胞からの抽出液を含んだ試料中には存在せず、そしてｐＵＣ８を含んだ細胞の対照試料にも存在しない。Ｍｒ  ３０，０００付近の付加的なバンドは、全ての試料中に存在し、そしてｐＵＣ８を含んだ細胞抽出液の対照実験でもまた見いだされ、それ故これはベクターのタンパク質であろうと思われる。これらのデータからＥ．ｃｏｌｉで発現されているｐｈｂＣ遺伝子は約Ｍr５８，０００のポリペプチドをコードしていると考えられる。
【００８８】
【表３】
0003703983.tif 000005
【００８９】
ｐｈｂＣのヌクレオチド配列分析
プラスミドｐＡｅＴ４２中にクローニングされたＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓクロモソームＤＮＡの２ｋｂのＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片は、ｐｈｂＣおよび恐らく調節配列の完全な構造遺伝子を含んでいる。この断片は、上述のジデオキシ配列決定方法を用いて、ＤＮＡ鎖の両方から何回も配列決定された。単一の長いオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８２０からヌクレオチド２６０８のＴＧＡ停止コドンまで延びている。潜在的な翻訳開始コドンは、位置８４２（ＡＴＧ）、１０６７（ＡＴＧ）および１０９７（ＡＴＧ）に存在する。これらの潜在的な開始部位から翻訳すると、それぞれＭｒ  ６３，９４０、Ｍｒ  ５５，５１３およびＭｒ  ５４，４８３のタンパク質が生成される。位置８４２のＡＴＧからの翻訳生成物と、位置１０６７のＡＴＧからの翻訳生成物および以下に記述するＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の生成物との間のアミノ酸配列に顕著に相同性があることは、恐らく最初のＡＴＧ（位置８４２）が正しいことを示している。図５および配列表の配列番号８は、ＳｍａＩ部位から下流に位置するｐｈｂＡ遺伝子の最初の３０のヌクレオチドまでの、この領域の全部のヌクレオチド配列を表している。位置８４２のＡＴＧから位置２６０９のＴＧＡまでの、このオープンリーディングフレームの翻訳生成物もまた示してある。プラスミドｐＡｅＴ４２のｐｈｂＣ遺伝子にコードされたＰＨＢポリメラーゼは、Ｍｒ＝６３，９４０の５８９アミノ酸のポリペプチドである(配列番号９)。ｐｈｂＡ遺伝子産生物のＮ−末端の１０個のアミノ酸もまた図５に示されている。図５に示されたヌクレオチド配列の付加的な特徴には、ＳｍａＩ部位から上流で始まり、位置７６のＴＧＡ停止コドンで終わる、オープンリーディングフレームのＣ−末端が含まれる。ｐｈｂＣのＴＧＡ停止コドン（位置２６０９）から８５ｂｐ下流の位置にｐｈｂＡ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドン（位置２９６９）がある。これらのデータから、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢ生合成経路の三つの酵素は、図５に示した様にｐｈｂＣ−ｐｈｂＡ−ｐｈｂＢとして統合された三つの遺伝子にコードされていることは明白である。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉ中でｐｈｂＣのみを発現させると、ＰＨＢあるいは顕著なレベルのＰＨＢポリメラーゼ活性のいづれも産生されない（プラスミドｐＡｅＴ４２）。Ｅ．ｃｏｌｉはＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＡ−ｐｈｂＢ遺伝子が存在しないと、ＰＨＢポリメラーゼを基質としてＤ−（−）−ヒドロキシルブチリル−ＣｏＡを合成できない様である。ｐＡｅＴ４２の挿入体はｐｈｂＣ用のプロモーターおよび構造遺伝子を含んでいるので（プラスミドｐＬＡ４２はＰＨＢ−陰性変異株の全て相補する、表２）、Ｅ．ｃｏｌｉ中では使用できる基質がない場合に、ＰＨＢポリメラーゼは活性がないか分解されると考えられる。
【００９１】
ＰＨＢポリメラーゼをコードする、プラスミドｐＬＡ４２中にＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓクロモソームＤＮＡを挿入した核酸配列は、Ｍｒ  ６３，９４０の単一のポリペプチド（図４）を予測させる。ＰＨＢポリメラーゼは以前には精製および特徴付されていないが、Ｅ．ｃｏｌｉのｍａｘｉ−ｃｅｌｌ実験の結果はこのペプチドがＭｒ＝５８，０００であることを示し、遺伝子配列から予想されるのと良く一致している。
【００９２】
何年もの間、（Ｄ）−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの重合は、膜に結合したポリメラーゼが関与し、サイトプラズムの水性の環境と疎水性の結晶性ＰＨＢ顆粒との間に一種のバリアーを形成する、と提唱されていた。ＰＨＢポリメラーゼポリペプチドの親水性の性質は、典型的な膜貫通構造を示唆しない。さらに、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｓの天然のＰＨＢ顆粒のＮＭＲによる研究では、高度に結晶性で固体の状態とは逆で、これらの顆粒は流動性の状態であることが示された。これらのデータを合わせると、ＰＨＢの生合成には複雑な膜に結合した重合系を全く必要としないという考えに保証を与える。文献で提案されたＰＨＢポリメラーゼ用の機構には二つの部分的反応が含まれる。最初のアシル−Ｓ−酵素中間体の形成の次に、第二の反応でプライマー受容体への転移が起こる。ＰＨＢポリメラーゼの予測される一次構造には５つのシステイン残基Ｃｙｓ246、Ｃｙｓ319、Ｃｙｓ382、Ｃｙｓ438およびＣｙｓ459がある。
Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ  ＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の確認
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ中でのポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）ポリエステルの生合成に関与する遺伝子もまた以下の様に単離された。
【００９３】
１９８３年にｄｅ  ＳｍｅｔらはＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５４、８７０−８７８で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ  ＴＦ４−１Ｌ（ＡＴＣＣ  ２９３４７）により産生されるポリマーであるポリ−β−ヒドロキシオクタノエートを確認した。引き続きの研究で、Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓは、使用する炭素源に依存して一連のＰＨＡバイオポリマーを産生し得ることが示された。炭素源は、例えば、ｎ−アルカンおよび１−アルケン（Ｌａｇｅｖｅｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４、２９２４−２９３２（１９８８））、あるいは脂肪酸（Ｂｒａｎｄｌら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４、１９７７−１９８２（１９８８）である。この経路は、アルカン／アルケンの脂肪酸への変換を含む様であり、次にこの脂肪酸がβ−酸化経路に入り、β−ヒドロキシアセチル−ＣｏＡのＤ異性体の形成が起こり、ＰＨＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込まれる。１）チオラーゼ／リダクターゼ酵素を有さない、あるいは２）ＰＨＡポリメラーゼはβ−ヒドロキシルブチレートを基質として使用できないことから、Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓは、β−ヒドロキシルブチレートの取り込みを示していない。Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼに使用される広い範囲の基質により、この酵素をコードする遺伝子は、ポリエステルのバイオポリマー工学において特別の興味をもたれている。
【００９４】
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａのβ−ケトチオラーゼ遺伝子をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用い、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのβ−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼを単離するために用いたアプローチを、上述の通り行い、Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子を単離した。Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓクロモソームＤＮＡのサザンＤＮＡハイブリダイゼーションにより、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢポリメラーゼ遺伝子（ｐｈｂＣ）に高い相同性を示す６ｋｂのＥｃｏＲ１制限酵素断片が確認された。この６ｋｂのＥｃｏＲ１制限酵素断片は、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドベクターであるｐＵＣ１８中に標準的な方法でクローニングされ、プラスミドｐＰＯ２３を得た。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣ遺伝子にハイブリダイゼーションする領域は、図６に示した様に位置づけされた。完全な６ｋｂの断片のヌクレオチド配列分析により、三つの潜在的なタンパク質コード領域（図６に示されたオープンリーディングフレームＯＲＦ１、ＯＲＦ２およびＯＲＦ３）が確認された(配列番号１０)。ＯＲＦ１は、ヌクレオチド５５４のＡＴＧ開始コドンから始まりヌクレオチド２２３１のＴＧＡ停止コドンで終わる（図７、図８および図９。図８に示される配列は図７に示される配列の、そして図９に示される配列は、図８に示される配列の続きの配列をそれぞれ示す）。このオープンリーディングフレームは、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣ遺伝子とハイブリダイゼーションするｐＰＯ２３挿入領域に含まれている。
【００９５】
ＯＲＦ１は、Ｍr＝６２，３００ダルトンの５５９アミノ酸のポリペプチドをコードしている(配列番号１１)。ＯＲＦ１を翻訳して推定したタンパク質の配列と、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢポリメラーゼとを、プログラムＡＬＩＧＮを用いて比較し、二つのタンパク質の間に５２％の同一性のあることが判明した。ＯＲＦ３は、位置２２９７のＡＴＧから始まり、位置３１４６のＴＡＡで終わり、そしてＭr＝６４，４００ダルトンの５７７アミノ酸のタンパク質をコードしている(配列番号１３)。ＯＲＦ１およびＯＲＦ３の推定されたポリペプチド産生物は、ｐｈｂＣ遺伝子産物と４０％および４２％の絶対同一性があった。単離され試験し得た全てのＰＨＡ陰性株はＯＲＦ１で相補され、この遺伝子が通常に発現されるＰＨＡポリメラーゼをコードしていることが確認された。ＯＲＦ３はまた、ＰＨＡポリメラーゼをコードしていると信じられている。しかし、遺伝子発現試験はＯＲＦ３が通常は発現されないことを示している。
【００９６】
ＯＲＦ２は、位置２２９７のＡＴＧから始まり位置３１４６のＴＡＡで終わり、そしてＭr＝３１，４００ダルトンの２８３アミノ酸のタンパク質をコードしている(配列番号１２)。この遺伝子は、ＰＨＡデポリメラーゼをコードしていると考えられる。
ＰＨＢ、ＰＨＡおよび類似ポリマーの合成
以上により、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢ生合成遺伝子をＥ．ｃｏｌｉへ導入することにより、新しいＰＨＢ産生株を構築することか可能で、乾燥細胞重量の５０％までのＰＨＢの蓄積が得られることが確立された。新しいあるいは改良されたポリエステル産生株の構築が、多くのシステムで、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓからのＰＨＢ生合成遺伝子、あるいはＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓからのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子およびＯＲＦ２およびＯＲＦ３のいづれかにより現在可能となった。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのβ−ケトチオラーゼおよびＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ中のＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子を、広域宿主発現ベクターｐＮＭ１８５（Ｍｅｒｍｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６７、４４７−４５４（１９８６）、あるいはｐＥＲＤ２０／ｐＥＲＤ２１（Ｒａｍｏｓら、ＦＥＢＳ  ＬＥＴＴＥＲＳ  ２２６、２４１−２４６（１９８６）の中で、ｘｙｌＳプロモーターの制御下で発現するプラスミドが構築し得る。あるいは、広域宿主ｔａｃプロモーター発現ベクターｐＭＭＢ２４／ｐＭＭＢ２２（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎら、Ｇｅｎｅ  ２６、２７３−２８２（１９８３））による。これらと同じベクターが、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのＰＨＢポリメラーゼ遺伝子あるいはプラスミドｐＰＯ２３にクローニングされた三つのＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ遺伝子の発現に使用し得る（図６）。
【００９７】
二つのプラスミドｐＬＡＰ１およびｐＬＡＰ２が構築され、これらはＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子およびＯＲＦ２（ｐＬＡＰ１）あるいはＰＨＡポリメラーゼ遺伝子およびＯＲＦ２プラスＯＲＦ３（ｐＬＡＰ２）をＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのｐｈｂＣプロモーターの制御下で発現するはずである（図５）。
【００９８】
これらのプラスミドを構築するため、ｐｈｂＣプロモーターを含んだプラスミドｐＡｅＴ４２中のＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ挿入体の最初の８１０ヌクレオチドを含んだ、８１０ｂｐのＳｍａＩ−ＢｓｔＢ  １制限酵素断片をＥ．ｃｏｌｉベクターｐＵＣ１９中の唯一のＳｍａＩ部位につなげ、プラスミドｐＡｅＴＢ１を得た。Ｆｓｐ１消化したｐＰＯ２３のＤＮＡの端から１７０ｂｐ上流までエクソヌクレアーゼＢａｌ３１を用いて除去し、Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのＰＨＡポリメラーゼ遺伝子プロモーターを除去し、そして引続きＣｌａ１で消化することによりＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子プラスＯＲＦ２を回収し、そしてこの断片をＳｍａＩ／Ｃｌａ１消化したｐＢＬＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ  ９２０３７）にクローニングした。ｐＰＯＢ１０の挿入は、ＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子のＡＴＧ開始コドン（ヌクレオチド５３５、図７）からすぐ上流の１９ｂｐを含むことで、完全なＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子およびＯＲＦ２であることを確認した。構造遺伝子とＯＲＦ２は次に、２．６ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ１断片上に回収され得、そしてＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したｐＡｅＴＢ１につなげ、プラスミドｐＡｅＰ１を得た。ｐｈｂＣプロモーター−ＰＨＡポリメラーゼ構造遺伝子−ＯＲＦ２構築物を含んだｐＡｅＰ１の完全な挿入体を、次に３．４のＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に切り取り、そして広域宿主ベクターｐＬＡＦＲ３のポリリンカー領域にクローニングし、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ株中にとりこんだ。ｐＡｅＰ２を構築するために、ｐＰＯＢ１０からの２．６ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｃｌａ１断片と、ＯＲＦ３を含んだｐＰＯ２３からの２．５ｋｂのＣｌａ１−Ｘｈｏ１断片とを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化したｐＡｅＴＢ１とつなげ、ｐＡｅＰ２を得た。もう一度、ｐｈｂＣ−ＰＨＡポリメラーゼ−ＯＲＦ２−ＯＲＦ３構築物を、５．９ｋｂのＥｃｏＲ１−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り取り、そしてｐＬＡＲＦ３のポリリンカー領域ヘクローニングし、ｐＬＡＰ２を得た。ｐＬＡＰ１は、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中のＰＨＡポリメラーゼおよびＯＲＦ２の両方を発現するはずであり、そしてｐＬＡＰ２はそれに加えてＯＲＦ３を発現するはずである。もしこれらの遺伝子が発現されないなら、β−ケトチオラーゼおよびＮＡＤＰ−特異的アセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子用に上述した、広い宿主領域を有する発現ベクターに挿入し得る。
【００９９】
ＰＨＢポリメラーゼおよびＰＨＡポリメラーゼ遺伝子は、細菌および植物システム中では、ＰＨＡポリマーの産生の役に立たないことを証明しなければならない。しかし、クローニングされ特徴付けられた遺伝子は、さらに二つのポリメラーゼの融合による構築あるいは化学的変異誘発により改変し得る。機能的なポリメラーゼ酵素は次に、表現型による外観あるいは増大した密度によりポリマーの蓄積が検出できる適切な生物体中で選択できる。これは、酵素の特異性を変える、新規のポリメラーゼを創製するための直線的なアプローチである。
酵素の発現レベルの変化によるポリマー合成の改変
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｎ．ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ、およびＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓで示した様に、一連の生物体からのポリマー遺伝子および遺伝子産生物の単離および特徴付けの後、遺伝子産生物の発現を制御する手段が確立し得る。Ｚｏｏｇｌｏｅａのチオラーゼ遺伝子の過剰生産は、Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａの転写開始部位およびプロモーターを定義するために使用する実験で示された。過剰産生は酵素を均一まで精製することを可能にし、そして分析および基質特異性の比較のための試薬に用い得る量を与える。加えて、精製された酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのポリマー合成用の立体特異的基質の合成に使用し得る。さらに、ポリマーの過剰生産に対応する転写調節機構が一連の環境条件下で解明されたなら、既知のポリマーおよび新規のポリマーの酵素的合成用のｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムが開発され、新しい物質が提供される。この新しい物質は、次にこのポリマーの最適の利用がなされる様に、化学組成、分子量およびレオロジー特性に関して分析される。
【０１００】
Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＺ．ｒａｍｉｇｅｒａチオラーゼの過剰生産システムは、合成されたｔａｃプロモーターを用いて構築され、一連のチオラーゼ発現プラスミドを生成し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中に導入された最適の構築体が総可溶性細胞タンパク質の約２０−３０％のチオラーゼを与える。この方法は試薬に用い得る量のチオラーゼを与え、平均１５０ｍｇの純粋なチオラーゼが１Ｌの培養物から得られる。
【０１０１】
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの遺伝子調節が起こると予想される本質的に二つの条件がある；栄養制限条件下で炭素が不足した細胞に引続いて炭素源を与え、次いで栄養制限条件下で生育した細胞が大量のＰＨＢを蓄積させ、そして栄養制限条件を取り去ると、ＰＨＢの分解が起こる。
【０１０２】
ポリマーの生合成遺伝子の転写調節は、以下の様に決定される。種々の条件下で生育した培養物を、酵素アッセイ（チオラーゼ、リダクターゼおよびシンセターゼ）およびＲＮＡ精製の両方ために回収する。ＲＮＡ試料をクローニングされた遺伝子をプローブとして、一連のノーザンハイブリダイゼーション実験で分析する。有用なＲＮＡハイブリダイゼーションの方法論には、ＲＮＡのグリオキシル化（ＭｃＭａｓｔｅｒおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、４８３５（１９７７））；ホルムアルデヒド／アガロースゲル電気泳動（ＬｅｈｒａｃｈらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １６、４７４３（１９７７））；ニトロセルロースあるいはナイロンフィルターへの移動（ＴｈｏｍａｓのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、５２０１（１９８０））；およびニックトランスレーションにより32Ｐで標識したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション（ＲｉｇｂｙらのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １１３、２３７（１９７７））が含まれる。ＤＮＡプローブは、クローンｐＵＣＤＢＫ１（Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａ）；およびｐＡｅＴ３（Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）から調製した。これらの実験の結果の一つとして、遺伝子のオペロンの統合およびｍＲＮＡの長さの確定ができた。
【０１０３】
それぞれの生合成酵素のレベルを操作し、そしてポリマー合成におけるその効果をモニターした。速度制限酵素（あるいは複数の場合も有り得る）を過剰産生することで経路の流量を増大させるためには、生合成経路中の速度制限酵素（あるいは複数の場合も有り得る）を確認することが必要である；各酵素の過剰生産の効果は、異なるモノマーユニットの取り込み、即ちブチレートで生育させたＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにより産生されたコポリマー中のＰＨＢ：ＰＨＶの比率に影響する；そして一つの種からの遺伝子を他の種の中で発現させ、例えば、Ｚｏｏｇｌｏｅａの遺伝子をＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓで、およびその逆に、および他の生物体からの他の単離および特徴付けられた不均一な遺伝子を、例えばＮｏｃａｒｄｉａおよびＰ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓをＺｏｏｇｌｏｅａおよびＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ中で発現させる。
【０１０４】
複数の宿主生物体中でポリマー生合成遺伝子を過剰生産させるためには、これらの細菌中で機能する広域宿主発現ベクターを使用しなければならない。一つの例として、遺伝子投与量による酵素の過剰生産を行った。例えば、プロモーター領域を含んだ完全なｐＵＣＤＢＫ１挿入体は、ベクターｐＳＵＰ１０４（Ａ．Ｐｏｂｌｅｒ編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、（Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ  １９８３）中にＳｉｍｏｎらが記載）ヘクローニングし得、そしてＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ  Ｉ−１６−Ｍを形質転換するのに使用し得る。各酵素の過剰生産の度合は酵素アッセイでモニターされ得る。同様のアプローチが、いかなる数の他の遺伝子にも行い得る；例えば、チオラーゼ；チオラーゼおよびリダクターゼ；リダクターゼ；リダクターゼおよびシンセターゼ、その他。第二に、遺伝子は、高効率のプロモーター、即ちｔａｃ（ＧｉｌｌらのＪ．Ｂａｃｔ．１６７、６１１−６１５（１９８６）およびｔｏｌ（ＭｅｒｍｏｄらのＪ．Ｂａｃｔ．  １６７、４４７−４５４（１９８６）の転写調節下に置き得る。この場合構築物は、対応した遺伝子を欠損した変異体へ連節される。ポリマーの生合成遺伝子あるいは目的の遺伝子の発現は、次に過剰生産のレベルを酵素アッセイを用いてモニターし定量することで、厳密に調節し得る。各構築物を試験するので、ポリマー合成の効果、即ち合成の速度およびレベルをルーチン的にモニターすることができる。
得られる基質あるいは酵素の特異性を変えることによるポリマー合成の改変
異なった細菌によって産生されたＰＨＢあるいはＰＨＡの分子量を決定する因子は、種々の細菌により産生されたポリマーの分子量分布を分析することで解明できる。多くのＰＨＢ−生産微生物が、Ｄ（−）−ヒドロキシルブチレート以外のモノマーをポリマー鎖に組み込む能力にはほとんど疑問はない。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓにより産生されたＰＨＢ−ＰＨＶコポリマーの場合、プロピオネートが先ずプロピオニル−ＣｏＡに変換され、次にこれがβ−ケトチオラーゼの基質として働くと提案されている。過剰生産システムから得られる高い収量の純粋な酵素が、三つのＰＨＢ−生合成酵素のそれぞれが利用し得る代わりの基質の範囲を決定するために必要であり、そして得られる基質が厳格に制御し得るｉｎ  ｖｉｔｒｏシステム中で、種々のタイプのＰＨＢ−様の新ポリマーが合成され得る。
【０１０５】
チオラーゼおよびリダクターゼ酵素は、ＰＨＢおよびＰＨＢ−様のポリマーの生合成の本質的な部分であるが、生成される新しいタイプのポリマーを最終的に決定するのはＰＨＢポリメラーゼである。このことは、その多くは細胞中に入らず、そのため発酵工程によるＰＨＢへの取り込みを試験できない基質についても、全部の範囲の基質を試験することが、酵素を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムの開発により、容易となった。
【０１０６】
一つ以上のリダクターゼ酵素の過剰産生および精製により、酵素の反応速度および特異性を比較する手段が提供された。Ｚｏｏｇｌｏｅａのリダクターゼは、ＮＡＤＰ−特異的であると報告されているが、Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの酵素は明かにＮＡＤあるいはＮＡＤＰのいづれかを使用する。この酵素の立体特異性は、この酵素をＰＨＢポリメラーゼの研究用のＤ−基質の合成用の有用な試薬として得る。アセトアセチル誘導体の内試験されるものは、ＣｏＡのオキソエステルおよびオキソパンテテインピヴァロエート（ＯＰＰ）およびそのメチレン誘導体である。このメチレンアナログのオキソエステルではなくケトンがＺｏｏｇｌｏｅａのチオラーゼにより分解される。
【０１０７】
種々のより長い鎖のアルキル誘導体が、特にＣ5からＣ8の直鎖の３−オキソチオールエステル、オキソエステルおよびメチレンケトン、もまたＰＨＢポリメラーゼの基質として有用であり得、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ中のＣ5−Ｃ8−β−ヒドロキシアルカノエートが存在すれば、オレフィン、アルコールおよびエポキシドも基質として有用であり得る。
【０１０８】
Ｚ．ｒａｍｉｇｅｒａの粗抽出物中の、Ｌ−ヒドロキシルブチリルＣｏＡではなくＤ−β−ヒドロキシルブチリルＣｏＡはＰＨＢポリメラーゼの基質である。他のＤ−ヒドロキシルアシルＣｏＡ種も代わりの基質あるいはＤ−β−ヒドロキシバレリルＣｏＡ（ＨＶ−ＣｏＡ）の様な共基質として利用できると予測されている。［２−3Ｈ］ＨＢ−ＣｏＡおよびβ−［３−14Ｃ］−ＨＶ−ＣｏＡは、それぞれ酵素的あるいは化学的合成により簡単に調製でき、そして基質として使用し得、そして沈澱したあるいはゲル濾過で分離したポリマー中の3Ｈおよび14Ｃ含量あるいは比率をモニターし得る。ブロックコポリマー領域、例えば（ＨＢ）500（ＨＶ）1000（ＨＢ）500'は、例えば、ＨＢ−ｏｘｏ−ＣｏＡおよびＨＶ−Ｓ−ＣｏＡモノマーの様な基質の比率および延長期での脱離基を慎重に制御することで構築し得ると予測できる。
【０１０９】
分岐したβ−ヒドロキシアシルＣｏＡ類を含んだ付加的な他の基質も試験し得る。この様な化合物は通常細胞中へ輸送されないので、全細胞中では試験は行えない。他の基質は、正常な［14Ｃ］−ＰＨＢ形成の阻害に関して、先ず可溶性の［14Ｃ］−ＨＢＣｏＡを不溶性のポリマーに取り込ませることで、次いで共重合の共基質として、そして最後にホモポリマー化で、試験され得る。代わりの基質は、ＨＢ−ＣｏＡ’に対するＫm、Ｖmax、および、キャリブレートされたゲル濾過実験で決定されるポリマーサイズで試験される。
連続してＰＨＢを産生する方法
ＰＨＢは、栄養制限条件下、通常は窒素制限条件（例えば、０．１％窒素、種に依存する）で生育させると、細菌中で産生され貯蔵され、酸素、リン酸あるいは他の非−炭素栄養源を制限してもまたＰＨＢ合成および貯蔵は誘起される。例えば、窒素固定細菌Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉは、酸素制限下、グルコース／アンモニウム塩で生育すると、乾燥細胞重量の７０％までをＰＨＢとして蓄積する。利用可能な酸素を増大させるとＰＨＢ合成が減少し、そして二つの生合成酵素のレベルの減少を伴う。酵素レベルの減少は遺伝子レベルで働いている調節機構（あるいは複数の場合も有り得る）を反映する。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓの生育の窒素制限は、乾燥細胞重量の８０％までのＰＨＢ収量を与える。同様に、ＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．も窒素制限下でＰＨＢ産生を増大させる。
【０１１０】
非制限条件下では、通常はＰＨＢを産生する生物体中のＰＨＢは、分解酵素により迅速に分解する。制限条件下の生育で蓄積されたＰＨＢは非制限条件下では分解されないので、この分解酵素が不活性な様にあるいは欠失している様に、これらの生物体を変異することができる。これらの細菌を生育させるために、ＰＨＢは培地中に排出されても良い。あるいは、ＰＨＢを代謝（生合成および分解）しない必須酵素を生物体へ導入し、その生物体に制限条件下で大量のＰＨＢを蓄積させ、そして条件が非制限に変化したときに、生物体が培地中へＰＨＢ放出するようにし得る。
【０１１１】
制限および非制限条件をくりかえすことで、最大量のＰＨＢを蓄積することができ（ポリマー含量の関数として増殖する細菌の吸光度に基づき）、細菌の複製を促進する非制限条件へ変化させることで、蓄積されたポリマーを培地中へ放出させる。細菌を破壊することなくポリマーを含んだ培地を連続除去することで、生物体は通常の発酵システムで培養できる。
植物中での発現、および、ＰＨＢおよびＰＨＡポリマーの産生
上述の様に細菌発現システムを用いて、チオラーゼ、リダクターゼ、および／あるいはＰＨＢ用のポリメラーゼ、あるいはＰＨＡをコードしている遺伝子は、種々の種の植物中で発現され得、所望するポリマー性の産生物を産生する。この様なシステムの利点は、石油に基づくプラスティックヘの依存の減少、および種々の土壌の上で生育可能な植物用の経済的に有用な作物の創製、等で即座に明白となる。
【０１１２】
植物の遺伝子工学用の第一に要求されることは、外来ＤＮＡを植物組織へ運搬するシステムである。現時点で最も一般的なベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘起（Ｔｉ）プラスミドであり、感染によりＤＮＡを運搬する。カリフラワーモザイクウイルスあるいはＧｅｍｉｎｉウイルスベクターを基にしたベクターの様な、植物ＤＮＡウイルスもまたベクターとして使用し得る。植物細胞へ直接遺伝子を転移する多くの方法があり、プロトプラストによる化学的に刺激されたＤＮＡの取り込み、エレクトロポーレーション、無処理の植物細胞のエレクトロインジェクション、リポソームを介したプロトプラストの形質転換、および植物への直接注入によるＤＮＡ形質転換、が含まれる。化学的に刺激した取り込みは、プロトプラストをドナーおよびキャリアーＤＮＡを１３％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールの存在下で４０ｍＭのＣａＣｌ2中でインキュベートすることが必要である。ポスト−インキュベーションを行い、ＣａＣｌ2濃度を徐々に上昇させると共にＰＥＧ濃度を徐々に低くする。エレクトロポーレーションは、高い電圧の電気パルスを用い、細胞膜を可逆的に透過性とし、ＤＮＡを含む大きな分子の取り込みを容易にする。電気注入および直接注入は、最初にプロトプラストの形成を行う必要がないという利点を有する。これらの方法は、当業者には既知である。例えば、Ｃ．Ｐ．ＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎおよびＳ．Ｌ．Ｆｕｌｌｅｒによる総説、”Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ”、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、  Ｐ．Ｗ．Ｊ．Ｒｉｇｂｙ編集ｖｏｌ．６、１０４−１７１（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．  １９８７）を参照。
【０１１３】
遺伝子は、サイトプラズム、ミトコンドリア、あるいはクロロプラストヘ、直接あるいはターゲッティング用配列のいづれかを用いて、導入し得る。ベクターおよびターゲッティング用配列および植物用のプロモーターは、当業者に既知であり、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８００  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ  ０８８５４−９９３２およびＳｔｒａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡから市販されている。
【０１１４】
有用な炭素基質を産生する全てのタイプの植物は、ポリマー産生のために改良し得る。植物中でのポリマーの産生に関して用いる場合、用語「ポリマー」は、ＰＨＢ、ＰＨＡ、および開示したポリメラーゼを使用して脂肪酸から合成される炭素を基にした新規のポリマーを含む。もしも植物が適切な脂肪酸を形成しない場合、チオラーゼおよびリダクターゼ遺伝子を一つあるいはそれ以上のポリメラーゼと共に植物に導入し得る。Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのポリメラーゼは、Ｃ４およびＣ５基質を重合する。Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓのポリメラーゼは、Ｃ６からＣ１８の脂肪酸の様に、より長い基質に働き、短い鎖の脂肪酸には働かない。好ましくは変異誘発により、グリセリンエステルおよび脂肪酸分解経路をブロックして植物が適切な基質を形成する様に改変し得る。
【０１１５】
遺伝子は、全てのタイプの植物へ導入し得る。広く生育され、これらの遺伝的システムは良く特徴付けられているために、トウモロコシ、小麦および米の様な、穀物植物が好ましい。他の有用な農耕用の植物には、タバコおよび高脂肪種子植物、特に荒れ他あるいは無機塩を含んだ土壌で生育するこれらの変種が含まれる。
【０１１６】
これらの遺伝子は、また、植物細胞培養システムヘも導入でき、これらの多くは当業者に既知である。種々の穀物および他の農耕用の作物の培養は、Ｄ．Ａ．Ｅｖａｎｓ、Ｗ．Ｒ．ＳｈａｒｐおよびＰ．Ｖ．Ａｍｍｉｒａｔｏ編集のＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖｏｌ．４（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．ＮＹ  １９８６）に詳細に記載されている。多くの遺伝子研究が行われた植物システムの特別な例は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａである。細菌中での産生に関して記述したように、細胞培養中でのポリマー産生は、クローニングされた遺伝子の導入のみならず、基質および条件の変化により操作できる。
【０１１７】
本発明の、炭素−炭素骨格を有するポリヒドロキシブチレートおよびポリヒドロキシブチレート−様のポリマーを、上述の詳細な記述に従ったリコンビナント技術を用いて作る方法、および得られるポリマー、の改変および変更は当業者には明白である。この様な変更および改変は添付した請求項の範囲内にあるものと見なされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ由来のチオラーゼの遺伝子配列を示す図である。転写開始部位（太い矢印）の上流（−１００から−９５、および−１２２から−１１６）で、Ｅ．ｃｏ１ｉ”−１０”および”−３５”コンセンサス領域と相同な位置にある配列を下線で示す。リポソーム結合部位と考えられる部位を下線で示す（−１１から−８）。
【図２】クローンｐＵＣＤＢＫ１のチオラーゼ遺伝子の下流にある、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼをコードするＺ．ｒａｍｉｇｅｒａ  ＤＮＡの２．３ｋｂの完全なヌクレオチド配列を示す図である。初めのＳａｌＩ部位から次のＳｍａＩ部位まで伸びる２０９４ｂｐの配列が示されている。ヌクレオチド３７のＡＴＧからヌクレオチド７６０のＴＧＡ終止コドンまで伸びるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ構造遺伝子の翻訳産物も示す。四角で囲んだアミノ酸残基２位から６位は、精製タンパク質のエドマン分解で得られる配列と同一である。可能なリボソーム結合部位を下線で示し、可能なターミネーターは矢印で示す。ＳａｌＩおよびＳｍａＩの制限酵素部位が示されている。
【図３】プラスミドｐＡｅＴ３にクローニングされたＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＤＮＡの、相当する２ｋｂ断片のヌクレオチド配列の一部を示す図である。図４と合わせてこの２ｋｂ断片の全体を示し、ヌクレオチド４０〜１２１９および１２９６〜２０３４に伸びるＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓチオラーゼとアセトアセチルＣｏＡリダクターゼ遺伝子との転写産物を示す。図４と合わせて過剰産生ベクターｐＡＴおよびｐＡＲの構築に用いた制限エンドヌクレアーゼ開裂部位もまた示される。Ｐｓｔ１＝Ｐｓｔ１；Ａｖａ＝２およびＤｄｅ＝Ｄｄｅ１。
【図４】プラスミドｐＡｅＴ３にクローニングされたＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓＤＮＡの、相当する２ｋｂ断片のヌクレオチド配列の一部を示す図である。図３に示す配列の続きの配列を示す図である。
【図５】Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  Ｈ１６のＰＨＢポリメラーゼ（ｐｈｂＣ）遺伝子座のヌクレオチド配列を示す図である。オープンリーディングフレーム８４２位から２６０８位の転写産物で、推定するＰＨＢポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。ｐｈｂＡ遺伝子の最初の７２個のヌクレオチドの転写産物も示す。ヘアピン構造を形成可能な配列（２６６０位）を矢印で示す。
【図６】Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ  ＰＨＡポリメラーゼ遺伝子の可能なコーディング領域、オープンリーディングフレームＯＲＦ１、ＯＲＦ２、およびＯＲＦ３を示す図である。ＯＲＦ１は開始コドンＡＴＧのヌクレオチド５５４に始まって終止コドンＴＧＡのヌクレオチド２２３１に終わり、アミノ酸５５９個からなるＭｒ＝６２，３００ダルトンのポリペプチドをコードする。ＯＲＦ２は開始コドンＡＴＧのヌクレオチド２２９７に始まってＴＡＡのヌクレオチド３１４６に終わり、アミノ酸２８３個からなるＭｒ＝３１，４００ダルトンのタンパク質をコードする。ＯＲＦ３はＡＴＧのヌクレオチド３２１７に始まってＴＧＡのヌクレオチド４９４８に終わり、アミノ酸５５７個からなるＭｒ＝６４，４００ダルトンのタンパク質をコードする。
【図７】Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ  ｐｈｂＣ遺伝子を含有する６ｋｂ断片の完全なヌクレオチド配列分析の一部を示す図である。図８および図９と合わせてこの６ｋｂ断片の全部の配列を示す。
【図８】Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ  ｐｈｂＣ遺伝子を含有する６ｋｂ断片の完全なヌクレオチド配列分析の一部を示す図である。図７に示す配列の続きの配列を示す図である。
【図９】Ｐ．ｏｌｅｏｖａｒａｎｓ  ｐｈｂＣ遺伝子を含有する６ｋｂ断片の完全なヌクレオチド配列分析の一部を示す図である。図８に示す配列の続きの配列を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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