(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも５００ＭＰａの引張り強度を持つ無機質の材料から成る均一な多孔性基質からなる支持体を準備する工程と、
（ｂ）植物生細胞の培養体を前記基質の孔に導入する工程と、
（ｃ）細胞の生存力を維持するゾル又はコロイド懸濁液で、前記植物生細胞を導入した基質をコートすることによって前記植物生細胞を捕捉する工程と、
（ｄ）基質内に捕捉された前記植物生細胞を揮発性ＳｉＯ2、または有機的に修飾したＳｉＯ2前駆物質で飽和させた搬送ガスを含む反応ガスで固定化する工程と
から成る植物生細胞の二次代謝産物の生産方法。
【請求項２】
固定化工程（ｄ）で使用される搬送ガスが、Ｓｉ(ＯＲ)4、ＳｉＨx(ＯＲ)4-x、および／または、ＳｉＸX(ＯＲ)4-xで飽和されており、ここに、ｘ＝１、２、Ｒはアルキルまたはアリル、Ｘはハロゲン化物またはアルキルである、請求項１に記載の生産方法。
【請求項３】
固定化工程（ｄ）が、多孔性支持体の孔中に捕捉された前記植物生細胞の表面において実行され、かつ、その後、同細胞が蒸気相の水によって処理される、請求項１に記載の生産方法。
【請求項４】
植物生細胞の培養体が、生物集塊を育成するのに好適な科学的、生理的条件の下に維持された植物組織から発生したものである、請求項１から３のいずれか１つに記載の生産方法。
【請求項５】
導入工程（ｂ）が、多孔性無機質支持体を振とうしながら細胞懸濁液中に投じ、同細胞懸濁液を、前記支持体を通して濾過せしめ、磁場ないし電場のような外部駆動力によって細胞を移動せしめ、かつ、多孔性支持体中に生殖性侵入を自発的に導入せしめることを含む物理的方法から成る、請求項１に記載の生産方法。
【請求項６】
前記支持体を形成する基質が、多孔性ガラス、セラミック、クレーなどの無機質である、請求項１に記載の生産方法。
【請求項７】
前記支持体を形成する基質が、無機繊維の織物または凝集体である、請求項１に記載の生産方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに１つに記載の二次代謝産物の生産方法のその場（in situ）応用に用いられる静止相の植物細胞の培養体を維持するための物品で、
同物品は細胞を捕捉し、かつ、その細胞を生存的条件に維持する、実質的に均一に分布する孔を有する無機質材料の多孔性基質から形成される支持体から成り、前記基質が少なくとも５００ＭＰａの最終引張り強度を有し、その剛性を高める為にＳｉＯ2前駆体のゲル溶液で含浸されており、前記支持体が、ガラス、セラミック、織物、ないしガラス繊維、または同様の無機質材料の多孔性基質から成る少なくとも１個の円盤状要素であって、同円盤状要素が植物生細胞の固定化と二次代謝産物の生産のための反応ガスが供給される密閉反応器中に配置されていることを特徴とする静止相の植物細胞の培養体を維持するための物品。
【発明の詳細な説明】
本発明は、多孔性の無機基質において、植物生細胞の二次代謝産物を連続的に、ないし、不連続的に生産する製法に関する。
本発明はさらに、植物細胞を、捕捉・固定するのに好適な物品に関する。すなわち、それによって、二次代謝産物生産のために、それら植物細胞の生存を維持する条件に捕捉・固定するのに好適な物品に関する。
工業規模での二次代謝産物は、本発明の応用分野の主なものではあるが、唯一のものではない。なぜなら、本発明の方法、および、それによる固定化は、以下に詳述するように、固定化植物細胞を用いる、他の等価的な分野のいずれにおいても、用いて有益なものとなり得るからである。
もっとも一般的に使用される固定基質は、FEBS Lett.103:93-97(1979)および122:312-316 (1980),Plant Cell Rep.5:302-305 (1986)およびAppl.Microbiol.Biotechnol.30:475-481(1989)に記載してあるように、カルシウム・イオンと架橋反応させた、藻類のアルギン酸ポリサッカライドである。その他の方法としては、Biotechnol.Bioeng.33:293-299(1989),5:660-667 (1990),Appl.Microbiol.Biotechnol.33:36-42(1990),37:397-403(1991)および35:382-392(1991)に記載してあるように、ポリウレタン気泡による捕捉がある。
非植物細胞の場合には、多孔性・非晶質、ゾル・ゲル由来シリカを、生細胞捕捉のために使用することが記載されている。すなわち、J.Biotechnol.30:197 (1993),J.Ceram.Soc.Jpn.100:426(1992),Biochim.Biophys.Acta 276:323(1972),Chemistry of Materials 6:1605-1613(1994)、および、Angew.Chem.Int.Engl.34:301-303(1995)の報告の通りである。この後者の方は、植物の高等細胞に応用するには現実に好適な方法とは考えられない。なぜなら、細菌や、酵母細胞の固定化に関して報告されている実験条件では、植物細胞は重篤な毒作用を受けるからである。植物細胞の固定化に用いられ、かつ、その特許が請求されている方法に関しては、いくつかの問題が必然的に伴う。先ず第一に、表面への簡単な接着に基づく方法は、正当な意味で固定化とは考えられない。なぜなら、細胞の生殖や、生物集団の増加は、必然的に、細胞が溶液中に放出される原因になるからである。
ポリウレタン・フォーム基質は、固定化細胞への、および、固定化細胞からの輸送に重大な制限を加える恐れがある。この支持基質の一つの重大な欠点は、機械的剛性が脆いことである。そのため、実際の工業生産用の長期の使用には適用できそうにない。
アルギン酸ビーズへの固定化は、細胞と、ゲル基質との直接の接触を許すので、そのため、細胞は、必然的に、高濃度の各種イオンや有機化合物にさらされるので、否定的な生理作用の原因となる。
したがって、本発明の主な目的は、植物細胞を固定化する、特定の方法によって前記の欠点を克服することであって、その方法とは、植物細胞の生存性を維持し、かつ、細胞が基質から放出されるのを防止しながら、固定化相と、培養液の間の輸送を自由に保ちつつ、植物細胞を固定化する方法である。
本発明のもう一つの目的は、標準条件で繰り返し実行しても、定常な結果を与える方法を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、生産中の応力に耐え、張力を分かちあうことができるほどの十分な剛性を持った支持基質を提供することである。
さらにもう一つの目的は、固定化物品、または、基質を提供することである。すなわち、それらの物品または基質は、開放孔を通じて有機質や養分の自由な交換を許しながら、細胞間接触を増大させ、したがって、それによって細胞間通信の可能性を確保するものである。
本発明のさらにもう一つの目的は、工業規模の装置や、関係生産設備によって実行可能な製法を提供することである。
上記の目的は、以下の諸工程から成る製法によって達成される、すなわち、
（ａ）少なくとも500MPaの引張り強度を持つ無機質の材料から成る均一な多孔性基質の支持体を準備する工程と、
（ｂ）植物生細胞の培養体を前記基質の孔に導入する工程と、
（ｃ）細胞の生存力を維持するゾルまたはコロイド懸濁液で、前記植物生細胞を導入した基質をコートすることによって前記植生物細胞を捕促する工程と、
（ｄ）基質内に捕促された前記植物生細胞を揮発性SiO2、または有機的に修飾したSiO2前駆物質で飽和させた搬送ガスを含む反応ガスで固定化する工程。
このように、植物細胞を非活性の支持体に固定化する培養システムの使用は、それによって、その細胞の環境を簡単に操作することができ、しかも、特定の二次的代謝産物の収量を、液体に懸濁させた細胞が生成するものよりも増大させる手段となることが現在では認められている。
本発明によって実現される植物細胞の固定化法は、二次代謝産物の生産における広範囲な応用をカバーする。というのは、この製法は、一つの植物種には限定されないし、また、基質の機械的剛性と、前駆物質由来のシリカを沈着させた多孔質とがあいまって、この固定化生物系が、大規模な産業用バイオリアクターの異質相の生産にも応用可能となっているからである。
本発明の申請者は、驚くべきことに、次の事実を発見した。そして、これが、本発明の主眼点の一つでもある。それは、植物細胞を、その生存性を維持しながら、固定することが可能である、ということである。
基質は、グラス・ファイバーからなる線維体であっても、多孔性ガラス、セラミック、クレー、または、同様の無機材料であってもよい。
さらに好ましくは、この基質は、無機線維から成る織物、ないし、凝集体であって、SiO2前駆物質、または、同様の物質のゲル性養液を染ませて、その剛性を高めたものであってもよい。例えば、100-700mg/cm2の線維密度を持つ通常のガラス線維体を、Si(OEt)4および、CH3SiH(OEt)2のゲル性溶液に漬けたものであってもよい。この濡れた材料を15日間放置し、非晶性シリカを表面に沈着させる。このようにして得られた剛性の高い織物を切断して、様々の大きさの小片にしてもよい。
一般に、このガラス線維体は、直径30から10μmの線維で構成されていることが好ましい。その織り目は、工程（b）に従って植物細胞を導入するのに相応しいものとする。線維基質の剛性と機械的応力を増すために用いられるSi(OEt)4および、CH3SiH(OEt)2の濃度は、公称SiO2の10から100g/cm3の範囲にある。溶媒は、下記のものの中から一種以上が選ばれるのが好ましい。すなわち、エタノール、メタノール、ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルマミドである。溶液は、Si-OR基の加水分解を確保するのに十分なH2O濃度を含み、かつ、公称1x10-1から1x10-5MのH+濃度で酸性化される。工程(a)に好適な粘度は、0.2から100Pasの範囲にあることが好ましい。操作は、類縁体Si(OR)4,SiHx(OR)4-x、および、SiXx(OR)4-xのゲル性溶液を用いて行なった。ただし、ここに、x=1，2、R=アルキルないしアリル基、X=ハロゲン化物、または、アルキル基であり、これは同一結果をもたらす。前記類縁体をあらかじめ重合させて得たシリコン誘導体は、同一結果をもたらす。
同じ大きさのガラス線維体の小片を集めて堆積物とし、工程（a）の後に自ら自然に実行させてもよい。
工程(b)による細胞の導入は、単純に、ガラス線維体の小片を、生細胞懸濁液の中に投じて振とうすることで実行される。この懸濁液を、適当な支持体の上に取り付けた、同じガラス線維体に濾過しても同一結果が得られるであろう。
コロイド性SiO2-ゾル懸濁液で処理すると、工程（c）に従って、ガラス線維体の空間内に細胞の第一次の捕捉が実行されるが、この工程は、pH4.0-6.5で緩衝させたコロイド性SiO2懸濁液を用いて実行する。この操作は、水酸化アルミニウム、または、その他の含水酸化物のゾル性懸濁液を用いて実行されるが、同じ結果をもたらす。線維体の線維密度によって、工程（c）で述べたように、様々な抽出速度が必要とされる。線維密度が最低の場合には、最高の抽出速度が用いられる。このゾルないしコロイド懸濁液中のハイドロキッド、すなわち、含水酸化物の量は、5から200g/dm3の範囲にあり、コロイド粒子は、10と1000nmの間に含まれる直径を持つと考えられる。
細胞捕捉の実行は、工程（d）で行なわれる。Si(OR)4、SiHx(OR)4-x、および／または、SiXx(OR)4-xの選択は、SiO2様沈着物の接着性、その剛性、および、その全体多孔性に影響を及ぼす。この工程は、気相中で行なわれ、酸化シリコン類縁体を、細胞表面と、ガラス線維体の水酸基に定着させる。Si(OR)4、SiHx(OR)4-x、および／または、SiXx(OR)4-x溶液、または、その混合液としては、各種の成分濃度が示される。モル比で表わせば、Si(OR)4/SiHx(OR)4-xでは0.1/1から1/0.01まで、SiHx(OR)4-x/SiXx(OR)4-xでは0.01/2から1/0.1まで、Si(OR)4/SiXx(OR)4-xでは1/0.01から0.01/1まで、である。化学的類縁体SiHR(OR)2であって、ここに、Rはアルキルまたはアリルであるそのような類縁体も、溶液として、または、Si(OR)4との混合液として用いられる。その際、SiHR(OR)2/Si(OR)4の比は、0.01/2と1/0.03の間にある。
前記成分の溶液ないし混合液を用いて、搬送ガス流において、適当な蒸気圧が得られるようにする。前記溶液ないし混合液は、恒温油浴中において、20℃と120℃の間に得られる一定温度で保存される。本発明に用いられる搬送ガスは、空気、窒素、アルゴン、もしくは、ヘリウムである。このガスの全体流量は、ガラス線維体の幾何学的表面の1平方センチメートルについて、0.2から80cm3/分の間にあることが好ましい。蒸気相水による処理を、不活性ガスを、10と70℃の間で恒温に保持した蒸留水中にバブルして、不活性ガス流中において実行する。全体流量は、ガラス線維体の幾何学的表面の1平方センチメートルについて、0.01から10cm3/分の範囲にある。
本発明の特徴および利点は、二つの実施例を記述することでさらに明らかにされるであろう。以下に、この実施例を、付属の図を参照しながら例示するが、この例示は、非限定的な意味においてのみなされる。
第1図は、本発明によるガラス線維体の顕微鏡写真であって、工程（a）によってコートし、安定化した後のものである。
第2図は、工程（b）による線維体中の細胞の顕微鏡写真である。
第3図は、工程（d）で用いられたガラス反応器の線描画である。
第4図は、工程（d）によって、線維体に固定化された細胞の顕微鏡写真である。
実施例1
網目25x25μmの織り目を持つ、通常のガラス線維体を、約25mm直径の円盤にカットした。このものに、蒸気を2時間流して、加水した。公称SiO2、濃度=100g/dm3を含む1/1 Si(OEt)4/CH3SiH(OEt)2エタノール溶液を、正規組成H2O，OR/H2O=0.5モル比で加水し、粘度=100Pasになるまで放置した。
この溶液に浸した円盤を、1mm/sの速度で引き出した。この材料は、40℃で15日間定着を実行すると、ガラス線維が、Si-Hや、Si-CH3半量体を依然として保持している、非晶質で、かつ、多孔性のSiO2様物質にコートされていることを示す。コートされた線維の形態を、第1図の走査電子顕微鏡写真で示す。
Coronilla vaginalis L. (1991年葉から出発した細胞系種39 RAR、和名オウゴンハギ）を、3% (w/v)の蔗糖、1.3mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、0.25mg/lのカイネチン、および、0.25mg/lのナフタレン酢酸を添加した、ガンボルグの基礎成長B5培養液中で育成した。pHは滅菌前に5.7に調節した。2週間おきに、細胞を新鮮な培養液に移動し、12時間光照射時には、回転振とう器（110rpm）上で25℃に維持した。この細胞懸濁液を、滅菌円盤を浸透するのに用いた。操作は、滅菌状態において行なった。すなわち、円盤一つ一つを、細胞培養液で満たしたペトリ皿に投じて、90rpmの回転振とう器上で三日間放置した。この間12時間を光照射時間とした。線維体に捕捉された細胞を、走査電子顕微鏡にて観察した。その様子を第2図に示す。
それぞれの円盤について、その表面を洗浄し、捕捉されていない細胞負荷をすべて取り除いた。この円盤を、滅菌したSiO2ゾル懸濁液に漬けた。粒子径40nmの、このコロイド懸濁液を、アルカリリン酸塩でpH5.7に緩衝させ、蒸留水で希釈し、公称SiO2、濃度20g/dm3とした。
この円盤を、1mm/s-1の速度で引き出し、ラックに載せ、第3図に示すガラス反応器に入れた。この反応器には、85℃の恒温に維持されたモル比80/20の溶液Si(OEt)4およびCH3SiH(OEt)2で飽和された空気から成るガス流が供給される。全体ガス流量は、円盤の幾何学的表面の125cm2当たり15ml/分であった。処理を3分間持続し、次に、同じ全体ガス流量を用いて、蒸気で飽和させた空気で2分間円盤を処理した。これは、70℃の恒温に維持した水に空気をバブルして行なった。ガラス線維円盤中の細胞を、走査電子顕微鏡で観察してみると、第4図に示すように、SiO2様堆積物によって固定されているようであった。個々の円盤を、ホルモンを含まないB5培養液中で、25℃で、12時間の光照射時間を設けて、回転振とう器上に維持した。
細胞の生存持続性は、植物ミトコンドリアが、テトラゾリウム塩（TTC）を還元して、赤色のフォルムアザンを与える能力のあることに基づいて定量した。この赤色フォルムアザンは、485nmの吸収分光光度計によって簡単に検出することができる。TTC（0.5% w/v）を、pH7のリン酸ナトリウム・バッファーに溶解した。このTTC溶液を、それぞれの円盤に加え、振とうせずに、暗黒中で、23℃で、24時間インキュベートした。赤色フォルムアザンを、固定化細胞から、5mlの95％エタノールで15分間抽出した。成長ホルモンを添加した固相のB5培地上で、2本の伸長円盤を培養して、細胞の生存性をさらにテストした。微少カルスの誘発をもって、細胞培養体の生存性を示すインディケーターとした。
固定化の維持は、10個の円盤を、25℃で、12時間の光照射時間を設けて、回転振とう器上で飼育したとき、その培養液中に見られる浮遊細胞の出現をどの程度コントロールできるかでテストした。テストは、14日おきに、溶液を直接顕微鏡観察することによって行なった。または、ホルモンを添加した溶液に21日間の熟成期間を与えて行なった。
6ヶ月の期間にわたって、固定化細胞による溶液の汚染をチェックしたが、まったく認められなかった。
固定化細胞は、クマリン化合物のような二次的代謝産物を生成する。なぜなら、固定化細胞が維持される培養液を蛍光分析してみると、蛍光化合物の存在が認められ、その濃度は、4ヶ月の観察期間に増加していたからである。
実施例2
Coronilla viminalis Salisb.（1991年葉から出発した細胞系種7 CFR、和名オウゴンハギ）を、3%（w/v）の蔗糖、1.3mg/lの2,4-ジクロロフェノキシ酢酸、0.25mg/lのカイネチン、および、0.25mg/lのナフタレン酢酸を添加した、MS培養液中で育成した。pHは滅菌前に5.7に調節した。
細胞は、2週間おきに、新鮮な培養液に移し、12時間光照射時には、回転振とう器（110rpm）上で25℃に維持した。この細胞懸濁液を、実施例1で使用した方法にしたがって得た滅菌円盤を浸透するのに用いた。
細胞を、実施例1で使用した方法に従って捕捉し、固定化した。個々の円盤を、ホルモンを含まないMS培養液中で、25℃で、12時間の光照射時間を設けて、回転振とう器上に維持した。
細胞の生存性は、TTC還元と、伸長円盤を、成長ホルモンを添加したMS固相培地で培養した時に見られる微少カルスによってテストした。
円盤から、培養液中への細胞の放出は、6ヶ月の期間に渡って認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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