【手続補正書】
【提出日】令和2年12月2日(2020.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）変異体であって、
i)  配列番号１で示されるアミノ酸配列、
ii)  配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１９６位、２２８位、６００位、２６７位、２７６位、５５位、２３０位、２３５位、２３９位、４３５位、５８７位、５８８位、及び５９１位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
iii)  配列番号１、３、６若しくは４０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
iv)  配列番号１、３、若しくは６で示されるアミノ酸配列と７０％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、かつ、相同性領域のアミノ酸配列が配列番号１で示されるアミノ酸配列における相同性領域と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
配列番号１のアミノ酸配列における１９６位、２２８位、６００位、２６７位、２７６位、５５位、２３０位、２３５位、２３９位、４３５位、５８７位、５８８位、及び／又は５９１位に対応する位置に１以上のアミノ酸置換を有し、当該置換を有しない未改変のFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼと比較して、保存安定性が向上しているFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項２】
FAD-GDHにおいて、
配列番号１のアミノ酸配列における１９６位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、若しくはアルギニンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２２８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、若しくはシステインに置換されている、配列番号１のアミノ酸配列における６００位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはグルタミンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２７６位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン若しくはチロシンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における５５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン若しくはシステインに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２３０位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アルギニン、リシン、若しくはヒスチジンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２３５位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、セリン若しくはグリシンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２３９位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、セリン若しくはグリシンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における４３５位に対応する位置のアミノ酸がセリン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における５８７位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸若しくはグルタミン酸に置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における５８８位に対応する位置のアミノ酸がセリン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンに置換されている、及び/又は
配列番号１のアミノ酸配列における５９１位に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンに置換されている、
FAD-GDH変異体であって、当該置換を有しない未改変のFAD-GDHと比較して、保存安定性が向上している、請求項１に記載のFAD-GDH変異体。
【請求項３】
FAD-GDHにおいて、
配列番号１のアミノ酸配列における１９６位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、メチオニン、若しくはアラニンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２２８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン、若しくはヒスチジンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における６００位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２６７位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２７６位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における５５位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２３０位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２３５位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２３９位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における４３５位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における５８７位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における５８８位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、及び/又は
配列番号１のアミノ酸配列における５９１位に対応する位置のアミノ酸がリシンに置換されている、
FAD-GDH変異体であって、当該置換を有しない未改変のFAD-GDHと比較して、保存安定性が向上している、請求項１又は２に記載のFAD-GDH変異体。
【請求項４】
さらに、
配列番号１のアミノ酸配列における１９２位に対応する位置のアミノ酸がプロリンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２１２位に対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２１８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換されている、
配列番号１のアミノ酸配列における２２６位に対応する位置のアミノ酸がトレオニンに置換されている、及び／又は
配列番号１のアミノ酸配列における２３２位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体。
【請求項５】
i)配列番号１のアミノ酸配列における１９６位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン若しくはアスパラギンに置換され、かつ配列番号１のアミノ酸配列における２２８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン若しくはヒスチジンに置換されている変異体、
ii)配列番号１のアミノ酸配列における１９２位に対応する位置のアミノ酸がプロリンに置換され、かつ、配列番号１のアミノ酸配列における１９６位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン若しくはアスパラギンに置換されている変異体、iii) 配列番号１のアミノ酸配列における２２６位に対応する位置のアミノ酸がトレオニンに置換され、かつ配列番号１のアミノ酸配列における２２８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン若しくはヒスチジンに置換されている変異体、
iv) 配列番号１のアミノ酸配列における２３０位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２３２位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２３５位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、かつ配列番号１のアミノ酸配列における２３９位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている変異体、
v)配列番号１のアミノ酸配列における１９２位に対応する位置のアミノ酸がプロリンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における１９６位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２１２位に対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２１８位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２２６位に対応する位置のアミノ酸がトレオニンに置換され、かつ配列番号１のアミノ酸配列における２２８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている192P/196N/212L/218H/226T/228N変異体、
vi) 前記v)の変異体において、さらに、配列番号１のアミノ酸配列における２３０位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２３２位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２３５位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、配列番号１のアミノ酸配列における２３９位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている192P/196N/212L/218H/226T/228N/230Q/232A/235A/239A変異体、及び
vii) 前記vi)の変異体において、さらに配列番号４０のアミノ酸配列を有するM3変異体、からなる群より選択され、当該置換を有しないFAD-GDHと比較して、保存安定性が向上している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体。
【請求項６】
加温前の未置換のFAD-GDHの酵素活性を100%としたときの、20-40℃でpH 7.4にて加温した未置換のFAD-GDHの残存活性(%)と、加温前のFAD-GDH変異体の酵素活性を100%としたときの、20-40℃でpH 7.4にて加温したFAD-GDH変異体の残存活性(%)とを比較して、
(a)１週間加温した後の残存活性(%)が１％以上向上している、
(b)２週間加温した後の残存活性(%)が３％以上向上している、
(c)３週間加温した後の残存活性(%)が３％以上向上している、又は
(d)４日間加温した後の残存活性(%)が１％以上向上している、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体をコードするFAD-GDH遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のFAD-GDH遺伝子を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
【請求項１０】
以下の工程を含むFAD-GDHを製造する方法：
請求項９に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からFAD-GDHを単離する工程。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体を含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体を含むグルコースセンサー。
【請求項１３】
請求項１２に記載のグルコースセンサーを有する持続血糖測定デバイス。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体を含む電極。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のFAD-GDH変異体、請求項１１に記載のキット、請求項１２に記載のセンサー、若しくは請求項１３に記載のデバイス又は請求項１４に記載の電極を用いるグルコース測定方法。
【請求項１６】
20〜40℃で、１日〜２週間の連続測定を行う、請求項１５に記載の方法。