(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子含有液を流すシースフローセルと、シースフローセルを流れる各粒子から少なくとも２種類の信号を光学的に検出してそれぞれ第１および第２アナログ信号に変換する第１および第２検出器と、第１および第２アナログ信号をそれぞれデジタル信号に変換する第１および第２Ａ／Ｄ変換部と、第１および第２デジタル信号を遅延時間調整可能にそれぞれ遅延させる第１および第２遅延部と、遅延した第１および第２デジタル信号の位相差を検出する位相差検出部と、検出された位相差が略最小になるように第１および第２遅延部を制御する制御部と、略最小位相差の第１および第２デジタル信号に基づいて特徴パラメータを演算するパラメータ演算部と、演算結果を出力する出力部とを備えたフローサイトメータ。
【請求項２】
第１および第２遅延部が、それぞれ複数段のシフトレジスタとセレクタから構成され、シフトレジスタの各段からの出力をセレクタで選択することにより遅延時間を調整する請求項１記載のフローサイトメータ。
【請求項３】
位相差検出部は、第１および第２デジタル信号が所定値以上であることを示す第１および第２論理信号を生成する信号弁別部と、第１および第２論理信号の排他的論理和を位相差として演算する位相差演算部とを備える請求項１記載のフローサイトメータ。
【請求項４】
第１および第２遅延部はそれぞれ複数段のシフトレジスタとシフトレジスタの各段からの出力を選択するセレクタから構成され、位相差検出部は第１および第２デジタル信号が所定値以上であることを示す第１および第２論理信号を生成する信号弁別部と、第１および第２論理信号の排他的論理和を位相差として演算する位相差演算部を備え、制御部は前記位相差に基づいてセレクタを制御して前記位相差を略最小にする請求項１記載のフローサイトメータ。
【請求項５】
第１および第２デジタル信号に含まれる高周波ノイズを低減させるフィルタをさらに備える請求項１記載のフローサイトメータ。
【請求項６】
フィルタは、フィルタリングの程度を変化することができる可変フィルタである請求項５記載のフローサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞や血球等の粒子を分析するためのフローサイトメータに関し、特に個々の粒子ごとに得られる複数の光検出信号を処理して各々の粒子の特徴パラメータを求めるために、ディジタル信号処理回路を用いたフローサイトメータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞や血球などの粒子を分析するための測定装置として、従来からフローサイトメータが利用されている。一般的なフローサイトメータでは、細胞や血球の種類を判別するために前もって適当な染色を施し、その粒子懸濁液を細いガラス管（シースフローセル）に導き、その懸濁液の流れに対してレーザ光を照射する。粒子がそのレーザ光照射エリアを通過するごとに、その粒子による散乱光や蛍光が検出される。散乱光や蛍光は、フォトダイオードやフォトマルチプライヤチューブによって光電変換され、粒子１個１個について複数の電気信号が得られる。
【０００３】
一般的に、前方散乱光信号、側方散乱光信号、赤蛍光信号、緑蛍光信号というような電気信号がよく利用される。これらの電気信号の波形を処理することによって、その信号パルスの振幅、面積、幅などの種々の特徴パラメータが求められる。さらに、個々の粒子について求められた複数の特徴パラメータを用いて統計解析することにより、測定した試料中に含まれる粒子の種類や比率が求められる。上記のように一般的なフローサイトメータでは、光検出部から散乱光や蛍光といった複数の種類の電気信号を得ている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、このようなフローサイトメータで検出される光信号は、その強度の違いに応じて、フォトダイオードやフォトマルチプライヤなどの光電変換素子が使い分けられるのが一般的である。また、これらの光電変換素子によって生成される検出信号の大きさやノイズレベル等の違いによって、信号増幅器のゲイン（段数）や周波数特性を異なった設定にするのが一般的である。
【０００５】
その結果として、ある１個の粒子に対する複数の光検出信号の間で時間的なずれが生じることがある。複数の検出信号間で時間的なずれがある場合、従来のアナログ信号処理では、それらの検出信号から明確に１個の粒子に対応した信号パルスの面積や幅を正確に求めることが難しい。特に、２個の粒子が近接して検出部を通過する場合には、近接した検出信号がどちらの粒子に対応するものであるのか明確に特定できず、信頼性の低いパラメータが算出されることになる。
【０００６】
また、蛍光等の微弱な光の検出信号は高周波ノイズのために一般的にＳ／Ｎ比が低く、その高周波ノイズを低減するために、従来ではアナログ回路によるフィルタを設けるのが一般的であった。ところが、このアナログ回路によるフィルタは、その位相特性が良くないため、検出信号の波形を大きく歪ませてしまう。歪んだ波形からは、正確にその信号パルスの面積や幅といったパラメータを求めることができない。
【０００７】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、複数の光検出信号に対する信号処理を、従来のアナログ信号処理による方法ではなく、ディジタル信号処理による方法で実現し、上記のような従来のアナログ信号処理での欠点を解消したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この発明は、粒子含有液を流すシースフローセルと、シースフローセルを流れる各粒子から少なくとも２種類の信号を光学的に検出してそれぞれ第１および第２アナログ信号に変換する第１および第２検出器と、第１および第２アナログ信号をそれぞれデジタル信号に変換する第１および第２Ａ／Ｄ変換部と、第１および第２デジタル信号を遅延時間調整可能にそれぞれ遅延させる第１および第２遅延部と、遅延した第１および第２デジタル信号の位相差を検出する位相差検出部と、検出された位相差が略最小になるように第１および第２遅延部を制御する制御部と、略最小位相差の第１および第２デジタル信号に基づいて特徴パラメータを演算するパラメータ演算部と、演算結果を出力する出力部とを備えたフローサイトメータを提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
この発明のシースフローセルは、細胞や血球などの粒子に染色を施し、シースフローセルに導いて各粒子にレーザ光を照射し、各粒子から散乱光や蛍光などの２種類以上の光を検出するようにしたものであればよく、これには公知のものを使用することができる。
【００１０】
各粒子から光学的に検出する少なくとも２種類の信号とは、例えば、１つの粒子から得られる前方散乱光，側方散乱光，蛍光，側方蛍光などをいう。
また、粒子からその信号を光学的に検出してアナログ信号に変換する検出器には、フォトダイオード，フォトトランジスタ，フォトマルチプライヤチューブのような光電変換素子を用いることができる。
【００１１】
Ａ／Ｄ変換部には、市販のＡ／Ｄ変換器を用いることができるが、処理速度の速いものを使用することが好ましい。
遅延部は、例えば、複数段のシフトレジスタと、シフトレジスタの各段からの出力を選択するセレクタとを組合せて構成してもよい。
【００１２】
位相差検出部は、第１および第２デジタル信号の波形についてそれぞれが所定のスレシホールドレベル以上であることを示す第１および第２論理信号を生成する信号弁別部と、第１および第２論理信号の排他的論理和を位相差、つまり、時間ずれとして演算する位相差演算部から構成することができる。
遅延部と位相差検出部がこのように構成される場合、制御部は、演算された位相差に基づいてセレクタを制御して前記位相差を縮小することができる。
【００１３】
このフローサイトメータは、第１および第２デジタル信号に含まれる高周波ノイズを低減されるためのフィルタをさらに備えることが好ましい。
また、その場合、フィルタのフィルタリングの程度をフィルタへの入力信号に応じて制御するようにしてもよい。
【００１４】
【実施例】
以下、図面に示す実施例に基づいてこの発明を詳述する。これによってこの発明が限定されるものではない。
図１に、この発明の実施例に係るフローサイトメータのブロック図を示す。光学系１００では、血球や細胞を含む懸濁液に対して適当な染色を施こし、それをシースフローセル１に導き、シース液流によって細く絞られた懸濁液流に対してレーザ光源２からコンデンサレンズ５を介してレーザ光を照射する。
【００１５】
この実施例では、レーザ光照射エリアを横切っていく粒子１個１個の前方散乱光、側方蛍光をそれぞれ集光レンズ６，７を介して捉え、それぞれフォトダイオード３とフォトマルチプライヤチューブ４とで光電変換する。フォトダイオード３とフォトマルチプライヤチューブ４から得られたそれぞれの検出信号Ａ，Ｂは、信号処理系２００によって波形処理される。
信号処理系２００では、粒子１個１個に対応する各検出信号波形の高さ、面積、幅といった特徴パラメータを算出する。
【００１６】
信号処理系２００では、従来のアナログ回路による信号処理ではなく、ディジタル回路による信号処理を行う。数十ＭＨｚの周期で各検出信号Ａ，Ｂのレベルをサンプリングし、高速のＡ／Ｄコンバータ８ａ，８ｂを用いて波形サンプリングデータに変換する。
【００１７】
次に波形スムージング用フィルタ９ａ，９ｂによって、信号波形の高周波ノイズ成分を低減する。図３は、波形スムージング用フィルタの簡単な例を示すものであり、この例では、隣り合う波形サンプリングデータの平均値をリアルタイムに次々に算出する。この処理によって平均法１段による波形データが得られ、高周波ノイズ成分が低減された滑らかな波形になる。
さらに、この平均法１段による波形データの隣り合うデータの平均値を次々に算出することにより、平均法２段による波形データが得られ、高周波ノイズ成分がさらに低減された波形になる。
【００１８】
この実施例では、このような平均法によるスムージング処理の処理段数を、各検出信号に含まれるノイズ成分の違いによって、ＣＰＵ１３によって設定できるようにしている。
【００１９】
高周波ノイズ成分が低減された検出信号Ａ，Ｂは、次に遅延部１０の遅延回路１０ａ，１０ｂに入力される。遅延回路１０ａ，１０ｂは、それぞれ図４に示すようにファーストイン・ファーストアウト型のシフトレジスタ（７段）１０１とセレクタ１０２から構成される。シフトレジスタ１０１はレジスタＲ１〜Ｒ７からなり、検出信号Ａ，Ｂ間のタイミング（位相）ずれを補正するためのものである。この実施例では、波形データが通過するシフトレジスタの段数を、ＣＰＵ１３からの指令により条件設定部１１を介してセレクタ１０２で設定、変更できるようにしている。つまり、レジスタＲ１〜Ｒ７の出力をセレクタ１０２により選択できるようにしている。
【００２０】
従って、フィルタ９ａ，９ｂでスムージング処理された各検出信号Ａ，Ｂは、クロック周期毎に次々にレジスタＲ１〜Ｒ７に入力される。最初に入力された検出信号の波形データは、“レジスタの数×クロック周期”の時間が経過した時、最後のレジスタＲ７から出力される。
【００２１】
つまり、どの位置のシフトレジスタからの出力を選択するかを、セレクタ１０２で各信号チャネル毎に設定にすることにより、各検出信号間の時間的なずれ（位相差）を補正することができる。そして、その位相差は、信号弁別部１７と位相差演算部１２を備える位相差検出部２０において検出されるようになっている。
【００２２】
この実施例のフローサイトメータでは、実際の被験粒子を測定する前に、あらかじめ規定の調整用粒子を測定することによって、図５のフローチャートに示す手順で個々の粒子に対応して得られる複数の検出信号間の時間的なずれを自動補正しておくようにしている。
ここで、規定の調整用粒子とは、実際の被験粒子に対応するサイズや特徴を有する市販の粒子、例えばラテックス蛍光粒子である。
【００２３】
図５に示すように、最初に、各検出信号Ａ，Ｂに対応するシフトレジスタ（図４）の段数ＳＡ，ＳＢを全て同じ値Ｓ０に設定しておく（ステップＳ１）。一方、信号弁別部１７では、それぞれ図２に示すように、検出信号Ａ，Ｂを論理信号Ｘ，Ｙに変換する。つまり、調整用粒子を測定した時に得られる検出信号の内の１つの検出信号Ａを基準とし、その信号レベルが規定のスレシホールドレベルａ以上であることを示すロジック信号をＸとし、検出信号Ｂのレベルが規定のスレシホールドレベルｂ以上であることを示す論理信号をＹとする。
【００２４】
そして、位相差演算部１２は、これらの論理信号ＸとＹの排他的論理和、すなわち（（Ｘ＝０かつＹ＝１）又は（Ｘ＝１かつＹ＝０））である期間の長さを、例えば１００個の粒子数を検知するまで積算し、その値を位相差（時間ずれ）Ｔとする。ここでは、粒子１００個についての測定を１回として複数回の測定をくり返し行い、第ｎ回目の測定で得られる位相差をＴnとしている。
【００２５】
そこで、まず、ｎ＝１に設定して１００個の粒子について１回目の測定を行い（ステップＳ２），Ｔ1を算出する（ステップＳ１，Ｓ２）。
次に、検出信号Ｂに対するシフトレジスタの段数ＳＢを（Ｓ０＋１）に設定し（ステップ３）、次の粒子１００個について（（Ｘ＝０かつＹ＝１）又は（Ｘ＝１かつＹ＝０））である期間の長さＴ2を算出する（ステップＳ４，Ｓ５）。
【００２６】
ここで、Ｔ2＜Ｔ1であれば（ステップＳ６）、信号Ｂに対応するシフトレジスタの段数ＳＢをさらにプラス１した値に再設定し、次の粒子１００個について（（Ｘ＝０かつＹ＝１）又は（Ｘ＝１かつＹ＝０））である期間の長さＴ3を算出する。Ｔ3＜Ｔ2であれば（ステップＳ６）、信号Ｂに対応するシフトレジスタの段数ＳＢをさらにプラス１した値に再設定しＴ4を算出する。
【００２７】
ステップＳ７〜ステップＳ１０の処理を繰り返すことによって、Ｔn≧Ｔn-1となるｎの値を見つける（ステップＳ１０）。それによって、そのｎの値に基づいて検出信号Ｂに対応するシフトレジスタの段数ＳＢを決定すれば（ステップＳ１１）、検出信号Ａ，Ｂ間のタイミングずれが最も小さくなる。
【００２８】
一方、ステップＳ６の比較において、Ｔ1＝Ｔ2であれば（ステップＳ１２），ルーチンはステップＳ１１へ進む。また、ステップＳ６，Ｓ１２の比較において、Ｔ2＞Ｔ1であれば、信号Ｂに対応するシフトレジスタの段数ＳＢを（Ｓ０−１）に設定し直し（ステップＳ１３）、次の粒子１００個について（（Ｘ＝０かつＹ＝１）又は（Ｘ＝１かつＹ＝０））である期間の合計値Ｔ3を算出する（ステップＳ１４，Ｓ１５）。Ｔ3＞Ｔ2であれば（ステップＳ１６）、信号Ｂに対応するシフトレジスタの段数ＳＢをさらにマイナス１した値に再設定した上でＴ4を算出する。
【００２９】
ステップＳ１４〜ステップＳ１７の処理を繰り返すことによって、Ｔn≦Ｔn-1になるｎの値を見つける。そのｎの値によって、検出信号Ｂに対応するシフトレジスタの段数ＳＢを決定すれば（ステップＳ１８）、検出信号Ａ，Ｂ間のタイミングずれが最も小さくなる。
【００３０】
なお、検出信号が３つ以上ある場合は、基準となる１つの検出信号を決め、その基準信号と他の検出信号の内の１つを組み合わせ、それぞれ上記と同様の処理をすればよい。
上記のような自動補正処理は、規定の調整用粒子を所定数（例えば１００個）ずつ連続して複数回測定する間に完了させることができる。
【００３１】
このようにして補正処理が終了すると、実際に計測すべき被験粒子（細胞や血球など）を含む試料液をシースフローセル１に導く。そしてフォトダイオード３とフォトマルチプライヤチューブ４とによってそれぞれ得られた検出信号Ａ，Ｂは、遅延部１０で各検出信号間のタイミング（位相）ずれが最小になるように補正され、それらの波形データは、粒子の特徴パラメータを算出するためのパラメータ演算部１８に渡される。
【００３２】
パラメータ演算部１８は、各検出信号Ａ，Ｂの波形データから、その波形の高さ、幅、面積というような特徴パラメータを算出する。
検出信号Ａ，Ｂごとに実時間で算出された特徴パラメータは、メモリ１４に次々に記録され、ＣＰＵ１３を介して出力部１６から出力されるようになっている。なお、条件設定部１１は、ＣＰＵ１３がフィルタ９ａ，９ｂ，遅延部１０，位相差検出部２０へ指令する各種指令条件を保持するためのものである。
【００３３】
【発明の効果】
この発明によれば、各粒子の特徴を表す複数の種類の光検出信号間の時間的なずれをなくすことができるので、
１）１個の粒子に対応した検出信号の時間的な範囲をより正確に特定でき、その検出信号パルスの高さや面積や幅というような特徴パラメータをより正確に求めることができる。
２）２個の粒子が近接して光検出部を通過するような場合でも、それぞれの粒子について特徴パラメータをより正確に求めることができる。
【００３４】
検出信号に含まれる高周波ノイズ信号を低減するためフィルターを備えれば、波形のスムージング処理をディジタル処理で実現し、そのスムージングの度合いを、各々の信号チャネルごとに設定、変更できるので、
１）測定対象や測定項目等が異なる場合でも、それぞれの信号チャネルごとに最適な波形スムージング度合いに容易に設定、変更することができる。
２）信号波形を大きく歪ませることなくノイジーな波形をなめらかにすることができ、検出信号パルスから特徴パラメータをより精度よく求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施例の構成を示すブロック図である。
【図２】実施例の出力波形を示すタイムチャートである。
【図３】実施例の要部構成の詳細ブロック図である。
【図４】実施例の要部構成の詳細ブロック図である。
【図５】実施例の動作を示すフローチャートである。
【符号の説明】
１  シースフローセル
２  レーザ光源
３  フォトダイオード
４  フォトマルチプライヤチューブ
５  コンデンサレンズ
６  集光レンズ
７  集光レンズ
８ａ  Ａ／Ｄコンバータ
８ｂ  Ａ／Ｄコンバータ
９ａ  フィルタ
９ｂ  フィルタ
１０  遅延部
１０ａ  遅延回路
１０ｂ  遅延回路
１１  条件設定部
１２  位相差演算部
１３  ＣＰＵ
１４  メモリ
１６  出力部
１７  信号弁別部
１８  パラメータ演算部
２０  位相差検出部
１００  光学系
２００  信号処理系
【図１】
0003690960.tif 000002
【図２】
0003690960.tif 000003
【図３】
0003690960.tif 000004
【図４】
0003690960.tif 000005
【図５】
0003690960.tif 000006