(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨膜を有する軟骨から得られる軟骨細胞を軟骨膜と共に培養することを特徴とするヒト軟骨細胞の製法。
【請求項２】
該軟骨が、耳介軟骨であることを特徴とする請求項１に記載の製法。
【請求項３】
培養細胞を単層的または重層的に１回または２回以上播種して培養し、軟骨細胞塊を得ることを特徴とする請求項１乃至２記載の製法。
【請求項４】
請求項１乃至３に記載の製法により得られる正常ヒト軟骨細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の正常ヒト軟骨細胞単独または該軟骨細胞と包埋材料とからなる軟骨治療材。
【請求項６】
該包埋材料が、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アルギン酸、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカンまたはヒトの真皮の一種又は二種以上から選ばれる請求項５に記載の軟骨治療材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、正常ヒト軟骨細胞の製法およびかかる製法により得られる正常ヒト軟骨細胞に関する。また、本発明は、かくして得られた正常ヒト軟骨細胞を用いた軟骨治療材に関する。
【０００２】
【従来の技術】
軟骨細胞は組織中では基質の中に細胞が包埋された状態で存在しており、酵素、例えばコラゲナーゼで軟骨を処理して、基質成分から軟骨細胞を単離することができる。この単離した軟骨細胞を利用して、軟骨に関わる疾患の治療に対し、移植治療、特に軟骨細胞の自家移植が考えられてきた。ヒト以外の動物、例えばウサギ、ウシ等の如く多量の細胞が得られる場合については、この方法による移植治療が可能であることが実験的に確認されている（例えば、Bentry, et al., Nature 230: 385-388(1971), Green, Clin. Orthop. 124:237-250(1977), Wakitani et al., J. Bone and Joint Surgery 71B: 74-80(1989), Paige et al., Plastic and Reconstructive Surgery 96:1390-1398(1995), Paige et al., Plastic and Reconstructive Surgery 97:168-178(1996)） 。
【０００３】
これまで、ヒトにおいても関節軟骨、耳介軟骨および肋軟骨等の軟骨細胞の培養が試みられてきた（Aulthouse et al., In Vitro Cellular & Developmental Biology 25: 659-668(1989), Brrittberg et al., The New England Journal of Medicine 331: 889-895(1994), Ting et al., Annals of Plastic Surgery 40: 413-421(1998), Rodriguez et al., Plastic and Reconstructive Surgery 103:1111-1119(1999)）。
【０００４】
しかしながら、ヒトではわずかの量の軟骨しか採取できないため、培養開始時に僅かな数の軟骨細胞しか用いることができない上に、ヒト軟骨細胞は従来の培養法では増殖が著しく少なく、更に増殖すると軟骨細胞から繊維芽細胞に形質を変えてしまうために移植治療の実用に供することは極めて困難であった。即ち、ヒトにおいては、移植のために大量の正常な軟骨細胞が必要であるにもかかわらず、充分な量の軟骨細胞を得ることができないという問題があった。
【０００５】
この問題を解決するために、本発明者はヒト軟骨細胞を軟骨細胞増殖能を支持するフィーダー細胞として軟骨形成期の軟骨周辺細胞と共培養することにより迅速且つ大量にヒト軟骨細胞を培養することを提案した（WO  02／12451(2002)）。しかし、ヒト以外の動物のフィーダー細胞を使用することは、細菌や不測のウイルスによる感染の問題があり、それを防ぐために煩雑な処理が必要であった。
【０００６】
【非特許文献１】
Bentry, et al., Nature 230: 385-388(1971)
【非特許文献２】
Green, Clin. Orthop. 124:237-250(1977)
【非特許文献３】
Wakitani et al., J. Bone and Joint Surgery 71B: 74-80(1989)
【非特許文献４】
Paige et al., Plastic and Reconstructive Surgery 96:1390-1398(1995)
【非特許文献５】
Paige et al., Plastic and Reconstructive Surgery 97:168-178(1996)
【非特許文献６】
Aulthouse et al., In Vitro Cellular & Developmental Biology 25: 659-668(1989)
【非特許文献７】
Brrittberg et al., The New England Journal of Medicine 331: 889-895(1994)
【非特許文献８】
Ting et al., Annals of Plastic Surgery 40: 413-421(1998)
【非特許文献９】
Rodriguez et al., Plastic and Reconstructive Surgery 103:1111-1119(1999)
【０００７】
【特許文献１】
WO  02／12451(2002)
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトの軟骨細胞を、細菌・ウイルスによる感染の恐れがなく、しかも、迅速かつ大量に正常な軟骨細胞またはその細胞塊を得る方法を提供することを目的とする。また、本発明は、かくして得られた正常ヒト軟骨細胞またはその細胞塊を用いた軟骨治療材を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、軟骨膜を有する軟骨から得られる軟骨細胞を軟骨膜と共に培養することを特徴とするヒト軟骨細胞の製法であり、特に、該軟骨が、耳介軟骨であるヒト耳介軟骨細胞の製法であると共にかかる製法により得られる正常ヒト軟骨細胞、就中、ヒト耳介軟骨細胞である。
【００１０】
本発明は、上記製法において、培養細胞を単層的または重層的に１回または２回以上播種して培養し、軟骨細胞塊を得ることを特徴とするヒト軟骨細胞、就中、ヒト耳介軟骨細胞の製法である。
【００１１】
更に、本発明は、上記製法により得られる正常ヒト軟骨細胞単独または該軟骨細胞と包埋材料とからなる軟骨治療材であり、該包埋材料が、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、アルギン酸、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカンまたはヒトの真皮の一種又は二種以上から選ばれる軟骨治療材である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、先に提案したフィーダー細胞を用いる方法（WO  02／12451(2002)）を更に改良し、耳介軟骨等の軟骨細胞を、フィーダー細胞を用いることなく、より簡便に培養し増殖させる方法を見出した。従来は、軟骨細胞の培養・増殖にはフィーダー細胞が必要であると考えられていたが、本発明者は、フィーダー細胞を用いずとも、軟骨細胞の培養・増殖が可能であることを見出した。かくして、本発明の方法は、フィーダー細胞を用いる場合の煩雑な操作を回避でき簡便化できるとともに、フィーダー細胞からの感染等の危険も回避でき、ヒトへの自家移植に最適で安全なものと言える。
【００１３】
また、かかる方法で増殖させたヒト軟骨細胞を更に重層培養して軟骨塊とし、これを支持物質無しで移植治療に用いることが可能であることも見出した。
【００１４】
本発明で用いるヒト軟骨が耳介軟骨である場合は、美容的配慮から耳介後部基部より僅かな皮膚切開で少量（１×１平方センチ程度）の軟骨組織を採取することが好ましい。この時の採取軟骨組織は片面に軟骨膜が付着していることが好ましい。この操作により、軟骨採取部位は残されたもう片面の軟骨膜より軟骨が素早く再生され治癒全体も早く行われる結果となる。
【００１５】
次に必要な移植用細胞を得るため、採取された軟骨膜付き耳介軟骨を細かく切断し(dice)、単層培養を開始する。この時に使用する培地には軟骨細胞の増殖に必要なサイトカインを添加することが好ましい。この単層培養だけでも移植可能であるが、更に、この単層培養で増殖した細胞を用いて数回に渡り重層培養を行うことにより、ピンセット等の器具で取り扱える程度の物理的強度を有し、且つ生体に移植した時に分散・吸収されない組織を得ることができる。重層の播種回数は、所望する組織の大きさによって異なるが、一般的には３〜４回が好ましい。
【００１６】
この組織は、注射筒等に入れ、注射針を付けてから軟骨欠損部位に注入して鼻の変形、隆鼻、顔面骨変形、顔面骨欠損、頤形成、頭蓋骨変形、頭蓋部欠損、変形性関節症、小耳症、その他軟骨欠損を伴う疾患や軟骨欠損部の治療・修復に供することができる。この時に、この軟骨組織にキャリアーとしてコラーゲン、ポリグリコール酸（PGA ; polygycolic acid）、ポリ乳酸(polylactic acid)、アルギン酸塩(Alginate)、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸―ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン(proteoglycans)、グリコサミノグリカン(glucosaminoglycan)を混合して用いても良い。なお、本発明の製法により得られる軟骨細胞はキャリアー無しでも実用に供することが出来る。
【００１７】
ヒト軟骨細胞
本発明の軟骨細胞の製法は、軟骨膜が付着した状態のヒト軟骨組織、例えば耳介軟骨、肋軟骨、関節軟骨、椎間軟骨および気管軟骨の軟骨細胞の培養に用いることができるが、特に耳介軟骨の軟骨細胞の培養・増殖に適している。
【００１８】
本発明の製法に供される軟骨細胞は、公知の方法により軟骨膜を付着させたヒト軟骨組織から得ることができる。一般的には摘出した軟骨組織をメス等を用いて細切してコラゲナーゼで処理し、培養・増殖させることが好ましい。
（１）摘出した軟骨組織を抗生物質（例えばペニシリン、カナマイシン）や抗真菌剤（例えばアムホテリシンＢ）にて一晩約４℃で静置して除菌し、次にメス等を用いて軟骨組織を細切する。
（２）細切した軟骨組織をII型コラゲナーゼを含む培地に移し、一晩約４℃で静置する。さらに、３７℃にして４時間振とうする。
（３）次に、処理した組織を遠心して、この沈澱物を培養に供する。
【００１９】
この方法により、１平方センチのヒト耳介軟骨組織から継代１代目で３〜５×１０6細胞個の軟骨細胞を得ることができる。また、本発明の培養方法において、公知の増殖因子、特に軟骨の増殖を刺激するもの、例えばFGF（例えばbFGF）、IGF（例えばIGF-1）および骨形成因子９(BMP9)から適宜選択し、或いは組合わせて使用することができる。
【００２０】
ヒト軟骨細胞培養方法
ヒト軟骨細胞の培養は、軟骨細胞の培養に適した公知の培地を用いることができる。また、培地にはウシ胎仔血清(FBS)又はヒト血清、ヒドロコルチゾン(Hydrocortisone)の他に、ヒトbFGF、ヒトIGF-1等の増殖因子を適宜添加する(Cuevasら、Biochem. Biophy. Res. Commun.156,611-18,1988 ; Froger-Gaillardら、Endocrinol.124,2365-72)。そのような培地の例として、DME(H)培地に、FBS（好ましくは１０％程度）、ヒトbFGF（好ましくは10ng/ml程度）、ヒドロコルチゾン（好ましくは40ng/ml）、ヒトIGF-1（好ましくは5ng/ml）を添加した培地を挙げることができる。なお、患者由来自家血清を用いることもでき、かくすることにより、より安全を図ることができる。
【００２１】
１）初代培養
培地を入れたフラスコに軟骨細胞を播種し、軟骨細胞の培養に適した条件（例えば３７℃、１０％CO2条件下）にて炭酸ガス培養器中で培養する。培養は、増殖した細胞が単層で密集的(confluent)になるまで行う（通常１０〜１４日間）
２）継代培養
継代培養は初代培養と同じ培地で行うことができる（通常、１継代７日間）。初代培養で得られた細胞を継代した場合、耳介軟骨ではP0（初代培養）→P４において細胞数が１０００倍程度増加する。さらに多数の軟骨細胞を所望する場合には継代回数を適宜増加させることができる。
３）重層培養
継代培養により得られたヒト軟骨細胞を重層的に１回または２回以上、好ましくは３〜４回播種して培養することによって、ゲル状の軟骨細胞塊を得ることができる。得られた軟骨細胞塊中において、ヒト軟骨細胞はアグリカン等を含む軟骨基質で囲まれており、軟骨細胞同士がアグリカン等の基質を介して結合してゲル状の細胞塊を形成する。
【００２２】
軟骨治療材
本発明により得られた前記の継代培養または重層培養したヒト軟骨細胞または細胞塊をそのまま又は生体材料に包埋し、これを軟骨治療材として移植に供することができる。ヒト軟骨細胞または細胞塊を包埋するキャリアーの例としてコラーゲン、ポリグリコール酸（PGA ; polygycolic acid）、ポリ乳酸(polylactic acid)、アルギン酸塩(Alginate)、ポリエチレンオキシド、フィブリン接着剤、ポリ乳酸―ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン(proteoglycans)、グリコサミノグリカン(glucosaminoglycan)が混合して用いても良い。なお、包埋するキャリアーを用いない方がキャリヤーの吸収反応による軟骨細胞の吸収がなく好ましい場合もある。
【００２３】
また、当該軟骨治療材は、軟骨細胞を包埋するキャリアーを適宜選択し、組合わせることにより、軟骨ばかりか内軟骨性骨化を誘導することができる。そのような内軟骨性骨化を誘導し得るキャリアーとしては例えばヒト真皮が挙げられるが、さらに骨形成を促進する成長因子、例えば骨形成因子(BMP)を用いて骨化を促進させることができる。
【００２４】
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されることはない。
【００２５】
実施例１  軟骨細胞培養
培地組成：DME(H)培地に10％FBS、 10ng/mlヒトFGF（科研製薬）、および40ng/ml Hydrocortisone(Sigma)、および5ng/mlヒトIGF-1(GIBCO)を添加した。
採取軟骨：ヒト耳介後部基部軟骨から約１×１平方センチの片面に軟骨膜の付着した軟骨を採取した。
【００２６】
(a)軟骨細胞画分
上記に得た、軟骨片をペニシリンＧ(800u/ml)およびカナマイシン(1mg/ml)およびファンギーソン(2.5ug/ml)で除菌し、次にメスで細切した後、03%コラゲナーゼtypeII(Worthington Biochemical )を含むF-12培地中で４℃で一晩静置した。翌日３７℃で４時間振とうした後、遠心し、その沈殿物を培養開始の細胞画分とした。
【００２７】
(b)初代培養
上記細胞画分を上記培地を用いて底面積７５cm2のフラスコに播種した。このフラスコをCO2 Incubator中でCO2濃度を１０％に設定して培養した。培地は週２回交換した。その結果、軟骨細胞は、１０〜１４日間の培養により単層で集蜜的になった。得られた細胞を次の継代培養に使用した。
【００２８】
なお、FBSに代えて、患者の自家血を3000rpmで10分間遠心分離して得られる自家血清を用いても同様の結果が得られることが確認された。
【００２９】
(c)継代培養
継代培養は初代培養の細胞１×１０6個を底面積１７５ｃｍ2フラスコに播種して、初代培養と同じ条件で行った。７日間の培養により単層で集蜜的になり、得られた細胞を次の継代培養に使用した。その結果、４継代で細胞数が初代の１０００倍程度増加した。
【００３０】
(d)重層培養
継代培養において得られた軟骨細胞を１×１０6個/cm2の密度で３回播種し重層させ重層培養を実施した。２週間の培養後、シート状のゲル塊が形成された（図１）。このゲル状の軟骨細胞塊についてヘマトキシリンーエオジン(H.E)染色したところ、細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合していることが示された（図２）。また、軟骨組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行ったところ、細胞外基質に染色を呈し、当該細胞外基質が軟骨に特異的な基質であることが示された（図３）。
【００３１】
実施例２  軟骨細胞の移植
先ず継代培養または重層培養のフラスコから培地を除去した後、細胞をセル・リフターで集め、この集まった細胞を注射等に吸引して採取した。この採取した注射筒にある軟骨細胞をヌードマウスの軟骨欠損部位に注射針を用いて注入した。この移植６月後に移植部位から一部採取して組織学的に検討し生着したことを確認した。即ち、採取した組織をヘマトキシリンーエオジン(H.E)染色したところ、細胞が重層化して細胞同士が基質を介して結合しているが示された（図４）。また、軟骨組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行ったところ、細胞外基質に染色を呈し、当該細胞外基質が軟骨に特異的な基質であることが示された（図５）。さらに、トルイジン・ブルー染色でメタクロマジーが示され、軟骨のマーカーであるアグリカンの存在を示唆された（図６）。以上から、移植した軟骨細胞は軟骨組織を形成していたことが示された。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば、ヒトの軟骨細胞を、細菌・ウイルスによる感染の恐れがなく、しかも、迅速かつ大量に正常な軟骨細胞またはその細胞塊を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】継代培養において得られた軟骨細胞を２週間の重層培養後に得られた、シート状のゲル塊を示す写真。
【図２】図1のゲル状の軟骨細胞塊についてヘマトキシリンーエオジンで染色した結果を示す写真。
【図３】軟骨組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行った結果を示す写真。
【図４】移植部位から一部採取して、ヘマトキシリンーエオジン(H.E)染色した結果を示す写真。
【図５】移植部位から一部採取して、軟骨組織の分子マーカーであるII型コラーゲンについて免疫染色を行った結果を示す写真。
【図６】移植部位から一部採取して、トルイジン・ブルー染色を行った結果を示す写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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