(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イ．糖結合性部位を有するタンパク質と、一般式ＳＧＲ−Ｘ−Ｙで表わされる光反応性化合物〔式中、ＳＧＲは前記タンパク質が結合する糖を表わし、Ｘは、前記糖が酸化処理または還元処理により解離されるときに、特定の蛍光色素が結合するような原子団（Ｘ’）を発現する官能基を表わし、Ｙは、光照射により光反応して、前記タンパク質の表面に結合するような原子団（Ｙ’）を発現する官能基を表わす〕とを光反応させることにより、前記タンパク質の糖結合性部位に糖（ＳＧＲ）が結合し且つその近傍のタンパク質表面に原子団（Ｙ’）が結合した修飾タンパク質を生成する工程、
ロ．工程イで得られた修飾タンパク質を酸化処理または還元処理することにより、糖（ＳＧＲ）が解離され蛍光色素結合性原子団（Ｘ’）が発現した修飾タンパク質を生成する工程、および
ハ．工程ロで得られた修飾タンパク質に蛍光色素を反応させることにより、糖結合性部位の近傍に蛍光色素が結合した修飾タンパク質を生成する工程、
を含むことを特徴とする蛍光性糖センサーに用いられるタンパク質を製造する方法。
【請求項２】
糖結合性部位を有するタンパク質が、レクチンまたは糖認識性抗体である請求項１の蛍光性糖センサー用タンパク質の製造方法。
【請求項３】
Ｘが、グルコシル基またはジスルフィド基であり、それぞれ、酸化処理または還元処理により糖が解離されるとＸ’としてケトンまたはチオールを発現する請求項１または請求項２の蛍光性糖センサー用タンパク質の製造方法。
【請求項４】
Ｙが、フェニルアジド基、トリフルオロメチルアゾ基またはベンゾフェノン基である請求項１〜請求項３のいずれかの蛍光性糖センサー用タンパク質の製造方法。
【請求項５】
糖結合性部位を有するタンパク質がレクチンであり、Ｘがグルコシル基であり酸化処理により糖が解離されるとケトンを発現し、また、Ｙがフェニルアジド基であり光照射に光反応してＹ’としてナイトレンを発現する請求項１の蛍光性糖センサー用タンパク質の製造方法。
【請求項６】
レクチンが、コンカナバリンＡである請求項５の蛍光性糖センサー用タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のいずれかの方法で製造され、糖結合性部位の近傍に蛍光色素が結合されていることを特徴とする蛍光性糖センサーに用いられるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖を検出する技術分野に属し、特に、糖の存在を蛍光変化により検出するのに用いることのできる新規な蛍光性物質とその製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖は、生体に必須の有機化合物の一つであり、情報伝達、エネルギー代謝、構造体形成などにおいて重要な役割を果たしている。したがって、糖濃度を測定することは、疾病の予防や診断などにおいて重要である。
【０００３】
現在実用に供されている糖類の検出手段としては、酵素を用いるグルコースセンサーがよく知られている。これは、酵素（グルコースオキシダーゼ）を用いてグルコースを分解し、その際生じる過酸化水素を適当な手段（たとえば、電気的手段）で測定することによりグルコースの濃度を求めるものである。この方法は確立された技術ではあるが、用いる酵素は生体由来であるので、不可逆的に経時変質し、再使用することはできない。
【０００４】
最近、安定なセンサーとして化学合成によって得られる物を用いる糖類の検出手段も幾つか提案されているが、特定の糖類を識別し且つそれを物理シグナルとして読み出させるようにした技術として確立されたものは少ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、糖の存在を蛍光という光シグナルで読み出すことのできる糖類の新規な検出手段を確立することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、自然界に存在し糖類を認識する優れたホスト分子であるタンパク質群に注目し、これらのタンパク質の糖認識部位（糖結合性部位）の近傍に確実に蛍光色素を導入する手法を案出することによって、上記の目的を達成する新しいタイプの蛍光性糖センサー用物質を導き出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、イ．糖結合性部位を有するタンパク質と、一般式ＳＧＲ−Ｘ−Ｙで表わされる光反応性化合物〔式中、ＳＧＲは前記タンパク質が結合する糖を表わし、Ｘは、前記糖が酸化処理または還元処理により解離されるときに、特定の蛍光色素が結合するような原子団（Ｘ’）を発現する官能基を表わし、Ｙは、光照射により光反応して、前記タンパク質の表面に結合するような原子団（Ｙ’）を発現する官能基を表わす〕とを光反応させることにより、前記タンパク質の糖結合性部位に糖（ＳＧＲ）が結合し且つその近傍のタンパク質表面に原子団（Ｙ’）が結合した修飾タンパク質を生成する工程、ロ．工程イで得られた修飾タンパク質を酸化処理または還元処理することにより、糖（ＳＧＲ）が解離され蛍光色素結合性原子団（Ｘ’）が発現した修飾タンパク質を生成する工程、および、ハ．工程ロで得られた修飾タンパク質に蛍光色素を反応させることにより、糖結合性部位の近傍に蛍光色素が結合した修飾タンパク質を生成する工程を含むことを特徴とする蛍光性糖センサーに用いられるタンパク質を製造する方法を提供するものである。
【０００８】
本発明の蛍光性糖センサー用タンパク質における糖結合性部位を有するタンパク質は、一般に、レクチンまたは糖認識性抗体である。
【０００９】
本発明の蛍光性糖センサー用タンパク質の好ましい態様においては、Ｘは、グルコシル基またはジスルフィド基であり、それぞれ、酸化処理または還元処理により糖が解離されるとＸ’としてケトンまたはチオールを発現するものであり、さらに、Ｙは、フェニルアジド基、トリフルオロメチルアゾ基またはベンゾフェノン基である。そして、本発明の蛍光性糖センサー用タンパク質の特に好ましい態様においては、糖結合性部位を有するタンパク質はレクチンであり、Ｘはグルコシル基であり酸化処理により糖が解離されるとケトンを発現し、また、Ｙはフェニルアジド基であり光照射に光反応してＹ’としてナイトレンを発現するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、別の視点から、上記のごとき方法によって製造され、糖結合性部位の近傍に蛍光色素が結合されていることを特徴とする蛍光性糖センサーに用いられるタンパク質も提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
蛍光性物質が糖センサーとして機能するためには、糖との相互作用が蛍光シグナルとして反映されるように、該物質内において糖に結合する部位と蛍光色素の存する部位とが至近距離になければならない。本発明においては、糖結合性タンパク質の糖結合性部位の近傍に蛍光プローブ（蛍光色素）を修飾するために、光アフィニティ−ラベルを利用した。
【００１２】
すなわち、糖に光反応性官能基をつけた化合物（前記一般式ＳＧＲ−Ｘ−Ｙで表わされる光反応性化合物）と糖結合性タンパク質とを光反応させる。これによって、該タンパク質の糖結合性部位に糖が結合し且つその近傍に光反応生成物の残りの部分が結合する。このようにして、タンパク質をその糖結合性部位特異的にラベル化することができる。
【００１３】
その後、糖鎖部分（タンパク質の糖結合性部分に結合した糖）を酸化または還元して化学的に破壊、解離させて、蛍光色素が特異的に反応（結合）するような原子団を発現させ、この原子団に蛍光色素を反応、結合させることにより蛍光色素修飾タンパク質を調製することができる。得られた蛍光色素修飾タンパク質は、糖の濃度変化に応じて蛍光の強さが変化し、糖センサーとして機能することが確認されている。
【００１４】
本発明の原理は、糖を認識し糖に結合し得るタンパク質であればいずれにも適用されて蛍光性糖センサーを調製することができるが、原料としての入手やセンサーとしての調製が容易であるなどの実用上好ましいタンパク質はレクチンおよび糖認識性抗体であり、その中でもレクチンが特に好ましい。
【００１５】
本発明に従って蛍光性糖センサーを調製するための糖認識性抗体としては、抗原である特定の糖を認識しその糖と結合し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびそれらのフラグメントのいずれも適用可能であり、また、特定のクラスの免疫グロブリンに限定されない。これらの糖認識性抗体は、生体から単離されるか、あるいは、周知の方法に従って作製することによって容易に入手することができる。
【００１６】
本発明に従い蛍光性糖センサー用タンパク質を調製するのに特に適している糖結合性部位を有するタンパク質はレクチンである。よく知られているように、レクチンは免疫学的産物ではない糖結合性タンパク質であり、糖に対する結合特異性に基づいて各種のレクチンが存在する。本発明に従えば、特定の糖に対して結合特異性を有するレクチンを用い、該糖に光反応性の官能基をつけた光反応性化合物をレクチンと反応させ、既述の工程に従い蛍光色素修飾レクチンを調製することにより、その糖の定量および定性分析ができる蛍光センサーが得られる。たとえば、レクチンとしてコンカナバリンＡを用いるとマンノースやグルコース系の糖の濃度に依存して蛍光が変化するレクチン型蛍光性バイオセンサーが得られる。
【００１７】
以下、糖結合性部位を有するタンパク質（糖結合性タンパク質）として主にレクチンを用いる場合に沿って、本発明の実施の形態をさらに説明するが、本発明は、糖認識性抗体のような他の糖結合性タンパク質を用いる場合においても同様に実施され得ることは当業者であれば明かであろう。
【００１８】
図１は、糖結合性タンパク質としてコンカナバリンＡ（conA）を用いて本発明の蛍光性糖センサー用タンパク質を調製する工程を示すものである。
本発明に従い蛍光性糖センサーを調製するには、先ず、糖結合性タンパク質と、一般式ＳＧＲ−Ｘ−Ｙで表わされる光反応性化合物とを光反応させる。ここで、Ｘは、糖（ＳＧＲ）と光反応性官能基を含む部位（Ｙ）を連結するとともに、糖が酸化または還元処理により破壊、解離されると蛍光が結合するような原子団（Ｘ’）を発現し得る官能基である。Ｘとして一般に用いられるのはグルコシル基（−Ｏ−）またはジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）である。グリコシル基は酸化処理で糖が解離されるとケトン（ＣＨＯ）を発現し、一方、ジスルフィド基は還元処理で糖が解離されるとチオール（ＳＨ）を発現する。
【００１９】
また、光反応性官能基を含む部位（Ｙ）として最も一般的に用いられるのは、フェニルアジド基、トリフルオロメチルアゾ基、ベンゾフェノン基などであり、これらは光照射により光反応し、光反応後にタンパク質の表面に結合する原子団（Ｙ’）を発現する。
【００２０】
例えば、図１に示す例においては、糖結合性タンパク質であるコンカナバリンＡ（conA）に、光反応性化合物としてＡＰＭ（アジドフェニルマンノピラノシド）とを光反応させる（工程イ）。このＡＰＭは、マンノピラノシド（糖）とフェニルアジド基（Ｙ）とをグリコシル基（Ｘ）が連結する構造を成し、conAに接触するとその糖（マンノピラノシド）がconAの糖結合性部位に結合し、その後、光照射により光反応すると、アジド基（−Ｎ３）の一部が窒素ガスとして脱離しＮを含むナイトレンという反応性の高い原子団が形成（発現）してconAの糖結合性部位の近傍の表面に結合する〔図１の（２）の拡大図参照〕。
【００２１】
次に、このようにして得られたＡＰＭ修飾conAを過ヨウ素酸酸化して（工程ロ）、糖骨格を分解、脱離させるとconAの糖結合性部位の活性が再生されるとともに、糖骨格が存在していた部分（すなわち、糖結合性部位の近傍）にアルデヒド基が発現する〔図１の（３）参照〕。
【００２２】
アルデヒドはヒドラジン基に特異的に結合することができる。したがって、工程ロで得られた酸化型ＡＰＭ修飾conAにヒドラジン型蛍光色素を反応させる（工程ハ）ことにより、conAの糖結合性部位の近傍に部位特異的な蛍光色素修飾が行われた蛍光色素修飾conAを得ることができる〔図１の（４）参照〕。図２には、アルデヒド基に特異的に反応して結合するヒドラジン型蛍光色素の例を示す。
【００２３】
糖結合性タンパク質に結合させる光反応性化合物において糖（ＳＧＲ）と光反応性部位（Ｙ）とを連結する基として図１に示すようなグリコシル基の代わりに、ジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）が用いられた場合には、酸化処理ではなく還元処理により糖骨格が分解、脱離され、その糖骨格部分にチオール（−ＳＨ）が形成（発現）され、このチオール基に対して特異的に結合するマレイミド型蛍光色素や活性ハロゲン型蛍光色素を用いることにより、同様に糖結合性部位の近傍に部位特異的な蛍光色素修飾が行われた色素修飾タンパク質を得ることができる。
【００２４】
以上のようにして調製した本発明の蛍光色素修飾タンパク質は、用いたタンパク質が特異的に結合する糖類の濃度に依存して蛍光が変化（蛍光強度が増大または減少）するので糖の定量および定性分析を行うセンサーとして有用である。糖の分析は、一般に、目的の糖を含有する水溶液中に蛍光色素修飾タンパク質を溶かした状態で行われるが、本発明に従う蛍光色素修飾タンパク質から成る糖センサーは、適当なポリマー等により担持された膜状物として目的の糖類の溶液に浸漬されて蛍光測度を行うようにすることも可能である。
【００２５】
【実施例】
以下に、本発明の特徴をさらに明かにするため実施例を示すが、本発明はこの実施例によって制限されるものではない。
この実施例は、図１に示す工程に従い、糖結合性タンパク質としてコンカナバリンＡ（conA）を用いて、糖センサーとして蛍光色素修飾conAを調製する場合の例である。
【００２６】
ＡＰＭ（ｐ−アジドフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド）の合成
窒素気流下、ペンタ−O−アセチル−α，β−Ｄ−マンノース３．０ｇ（７．７ｍｍｏｌ）とｐ−ニトロフェノール１．０７ｇ（７．７ｍｍｏｌ）を乾燥塩化メチレン１６ｍｌに溶解し、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏを加えて反応を開始した。室温で３日間攪拌し、Ｔ．Ｌ．Ｃ．（ＳｉＯ２，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２０：１）で変化がなくなったのを確認して、５％ＮａＨＣＯ３水溶液３０ｍｌを加えて、反応を終了した。有機相を５％ＮａＨＣＯ３水溶液で２回、蒸留水で１回順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。精製はカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＣＨＣｌ３，径７ｃｍ×長１２ｃｍ）によって行い、白色結晶としてｐ−ニトロフェニル−２，３，４，６−テトラ−O−アセチル−α−マンノピラノシド２．２４ｇ（収率６２％）を得た。
【００２７】
上記のようにして得られた化合物１．７ｇ（３．６２ｍｍｏｌ）を単蒸留ＭｅＯＨ  １００ｍｌに溶解し、４．５Ｎ  ＮａＯＭｅ０．８ｍｌ（３．６ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（ＳｉＯ２，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５：１）で確認後、酢酸０．２２ｇ（３．６ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止した。溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝５：１、半径３．５ｃｍ×長７ｃｍ）によって精製した。白色固体としてｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド０．７ｇ（収率６４％）を得た。
【００２８】
上記のようにして得られたｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド０．２ｇ（０．６６ｍｍｏｌ）を窒素気流下ＭｅＯＨ６ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ−Ｃ１５０ｍｇを加えた。系をゆっくりと水素置換して、室温で３０分攪拌した。ＴＬＣ（ＳｉＯ２，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝４：１）で原料消失及び精製物のニンヒドリン発色を確認後、反応を停止した。Ｐｄ−Ｃをろ別し、濾液を減圧留去して、無色油状残渣を得た。
【００２９】
この無色油状残渣を０．４Ｎ  ＨＣｌ５ｍｌ（２ｍｍｏｌ）に溶解し、氷冷した。氷冷下、この溶液に、ＮａＮＯ２０．０５ｇ（０．７３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を１．３ｍｌの蒸留水に溶解した冷水溶液を徐々に加えた。その後、尿素水溶液を加え、ヨウ素カリウムデンプン紙が青色に呈色しなくなったのを確認し、ＮａＮ３水溶液（０．０６ｇ、０．９２ｍｍｏｌ／１ｍｌ）を徐々に加えた。氷冷下、２０分攪拌後、反応を停止した。反応混合物をゲルカラムクロマトグラフィー（ＬＨ−２０、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：１、径３ｃｍ×長２０ｃｍ）により脱塩した。その後、カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝４：１、径４ｃｍ×長１０ｃｍ）で精製して、黄色固体１２０ｍｇ（収率６１％）を得た。同定は、ＩＲ及び１Ｈ−ＮＭＲにより行った。
ＩＲ（ｎｅａｔ）νＤ−Ｈ３３００，νＮ３２１００／ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４，２５℃，ＴＭＳ，δ／ｐｐｍ）、３．５８（ｍ，１Ｈ，Ｈ５）、３．７２（ｍ，３Ｈ，Ｈ４，Ｈ６）、３．８８（ｄｄ，Ｊ＝４．０，１２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３）、３．９９（ｄｄ，Ｊ＝４．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ２）、５．４２（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４）、６．９８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，Aromatic）、７．１５（ｄ，J＝８．８Ｈｚ，２Ｈ，Aromatic）
【００３０】
ＡＰＭの光アフィニティーラベル化（工程イ）
以下の操作は、全て遮光下で行った。精製コンカナバリンＡ（Sigma社製、TypeV1）５０ｍｇ（４．９×１０−７ｍｏｌ，Ｍｗ＝１０２，０００として）を、氷浴下、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍｌに溶解した。ＡＰＭ５．５ｍｇ（１．８５×１０−５ｍｏｌ、糖結合部位に対して１０ｅｑ）を１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１ｍＭＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌに溶解し、コンカナバリンＡ水溶液に加えた。非特異的修飾を防ぐためのラジカル補足剤として、ヒドロキノン１０ｍｇを固体を加え溶解させた。混合溶液３ｍｌを脱気セルに移し、Freeze pump & thaw法により脱気を２回行った。氷浴下、混合液を１５分静置した後、攪拌しながら、ＵＶランプ（Spectronics社製、２０W）を用いて、液面より３ｃｍの距離から１５分間光照射を行った。光照射終了後、得られる茶色溶液は直ちにゲルクロマトグラフィーによる精製に供した。
【００３１】
すなわち、光反応後得られた茶色溶液を、４℃下、Bio gel  Ｐ‐３０ゲルカラム（直径２ｃｍ×長さ４０ｃｍ）〔溶解液：１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）〕に展開させ、６ｍｌづつフラクションコレクターによって分画した。それぞれの分画成分について、２２０ｎｍ、２８０ｎｍの吸光度を測定し、フラクションカーブを得た。蛋白成分を回収して、Amicon限外ろ過装置（Membrane type ＹＭ１０）によって濃縮した。
【００３２】
以上のようにしてBio gel P-30精製より得られたＡＰＭ修飾conAは、ｐH５．０の条件下、ダイマー状態で存在し、ジ修飾体、モノ修飾体、非修飾体の３成分の混合物として存在している。そこで、このＡＰＭ修飾conA混合物を、４℃において、Sepadex G-100ゲルカラム（直径２ｃｍ×長さ４０ｃｍ）上に展開させ、６ｍｌづつ分画した。分画３０まで、Ａ液〔１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２７００ｍｌ〕のみで溶出させ、その後、Ａ液からＢ液〔１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２８０ｍＭグルコース  ７００ｍｌ〕へグラジエントをかけながら溶出させた。各画分について、２２０、２８０、３３０ｎｍの吸光度を測定し、フラクションカーブを得た。フラクションカーブから３成分の存在が確認された。第１流出成分（分画８〜１８）であるジ修飾体を分取し、Amicon限外ろ過装置（Membrane type YM10）によって濃縮した。
【００３３】
ＡＰＭ修飾conAの糖骨格の切断−酸化型ＡＰＭ修飾conAの調製（工程ロ）
工程イにより得られたＡＰＭ‐修飾conAのジ修飾体について以下のように過ヨウ素酸酸化を行い、糖結合活性の再生を行った：Sephadex G-100で精製したＡＰＭ修飾conA（ジ修飾体）をAmicon濃縮装置を用いて、１００ｍM酢酸緩衝液（ｐH４．４）で緩衝液を置換した。４℃に冷却したＡＰＭ修飾conA溶液（１．１４×１０−５Ｍ）７．３ｍｌに対して、ＮａＩＯ４（１．７７ｍｇ、８．３ｍｍｏｌ）の１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）１．０ｍｌを加えて、反応を開始した。遮光下、４℃で静置した。ＮａＩＯ４の消費量を、２２０ｎｍのＮａＩＯ４由来の吸収の変化を追跡し、反応追跡を行った。各時間ごとに、系から１００μｌを取り出し、蒸留水で３ｍｌで希釈して、吸収スペクトル測定を行い、２２０ｎｍの吸光度を決定した。２５時間経過後、過ヨウ素酸ナトリウムの消費量が飽和に達したので、エチレングリコール２００μｌを加え反応を停止した。１時間、４℃以下で静置後、ゲルカラムクロマトグラフィー〔Bio Gel P-30、長さ２０ｃｍ×直径２ｃｍ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）〕で精製を行った。収量：８．０６×１０−８ｍｏｌ（収率９７％）。
【００３４】
ヒドラジン型蛍光色素修飾conAの調製（工程ハ）
工程ロで得られた酸化型ＡＰＭ修飾conAに、図２に示すヒドラジン型蛍光色素のうちクマリンヒドラジンおよびフルオレセインヒドラジンを修飾することにより、糖結合性部位の近傍に部位特異的な蛍光色素修飾が行われたconAを調製した。
【００３５】
すなわち、氷浴下、酸化型ＡＰＭ修飾conA水溶液１８００μlに、全体で２ｍMになるようにヒドラジン型蛍光色素をＤＭＳＯ溶液（２００μｌ）として加えた。遮光、４℃下において、混合液を２４時間静置した。反応終了後、ゲルカラムクロマトグラフィー（Bio Gel P-30、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）、直径２ｃｍ×長さ２３ｃｍ）による精製を行った。蛍光色素修飾conAを分取し、適当な濃度までAmicon濃縮装置を用いて濃縮して、ストック溶液とした。
【００３６】
反応収率：７４％（ε２８０ｎｍ＝１１６ｍＭ−１・ｃｍ−１より）、色素修飾率０．４２個／モノマー（ε２８０ｎｍ＝１１６ｍＭ−１・ｃｍ−１及びε４３５ｎｍ＝４６ｍＭ−１・ｃｍ−１より算出）。
【００３７】
蛍光スペクトル測定
以上のようにして得られた蛍光色素修飾conAについて糖の存在下における蛍光スペクトルを測定した。
測定は、２μMの蛍光色素修飾conAの水溶液２ｍｌを蛍光セルに入れ、２０℃下、１Mの糖ストック溶液を適量ずつ加えながら行った。
【００３８】
図３は、蛍光色素としてクマリンヒドラジンを用いた場合のα−MManP（α−メチルマンノピラノシド）の蛍光スペクトル変化を示す。また、図４は蛍光色素としてフルオレセインヒドラジンを用いた場合のβ−MGluP（β−メチルグルコピラノシド）の蛍光スペクトル変化を示す。
【００３９】
クマリンヒドラジン色素で修飾された場合は、糖濃度の増加に応じて蛍光強度が減少し、一方、フルオレセインヒドラジン色素で修飾された場合には、糖濃度の増加に応じて蛍光強度が増加しており、いずれも、本発明によって得られる蛍光色素修飾conAが糖のセンサーとして好適であることを明示している。
【００４０】
【発明の効果】
本発明に従えば、レクチンまたは糖認識性抗体のような糖結合性タンパク質から、その糖結合性部位の近傍に部位特異的に蛍光色素が修飾された糖センサーとして好適な蛍光性タンパク質を簡単に調製することができる。本発明に従えば、用いるタンパク質の糖に対する結合特異性に応じて各種の糖類の分析に利用できる多様な蛍光性糖センサーを得ることができる。本発明の蛍光性タンパク質から成る糖センサーは、きわめて安定であり再使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】コンカナバリンAを用いて本発明の蛍光性糖センサー用タンパク質を調製する工程を概示する。
【図２】本発明において用いられるヒドラジン型蛍光色素の１例の化学構造式を示す。
【図３】蛍光色素としてクマリンヒドラジンを用いた蛍光色素修飾コンカナバリンAの蛍光スペクトル強度の糖濃度依存性の１例を示す。
【図４】蛍光色素としてフルオレセインヒドラジンを用いた蛍光色素修飾コンカナバリンAの蛍光スペクトル強度の糖濃度依存性の１例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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