(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気条件下により配列の発現を促進でき、嫌気性条件により誘導される活性を有するプロモーター配列を含んでなるDNA構築物であって、プロモーター配列がヒンジ領域を規定するアミノ酸鎖により結合された第一および第二タンパク質をコードするDNA配列に作動可能に結合されていることを特徴とするDNA構築物を含む弱毒化細菌と、薬学上許容されるキャリアとを含んでなるワクチン組成物であって、第一タンパク質が破傷風菌毒素Ｃ断片を含んでなる抗原配列であり、第二タンパク質が抗原決定基であるワクチン組成物。
【請求項２】
プロモーターが嫌気性条件で配列の発現を促進しうるnirBプロモーターまたはその一部もしくは誘導体である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ヒンジ領域がプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
第二タンパク質が、病原微生物の抗原決定基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
抗原決定基が、ウイルス、細菌、真菌、酵母または寄生虫から誘導される、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
抗原配列がSchistosoma mansoniのP28から誘導される、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
抗原配列がヒトパピローマウイルス（HPV）から誘導される、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
抗原配列が単純ヘルペスから誘導される、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
抗原配列が口蹄疫ウイルス（FMDV）から誘導される、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
弱毒化細菌がサルモネラ（Salmonella）属から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明はDNA構築物、その構築物を含有した複製性発現ベクター、その構築物を含有した弱毒化細菌、およびその細菌を含有したワクチンに関する。
近年、細菌の芳香族生合成経路の遺伝子における不可逆変異の導入により弱毒化されたSalmonellaの株に基づく経口サルモネラ生ワクチンの新世代が現れた。このような株は例えばEP−Ａ−0322237で開示されている。上記経口サルモネラ生ワクチンはヒトおよび動物でサルモネラ症用のワクチンとして有望であり、それらは免疫系への異種抗原送達用のキャリアとしても有効に使用できる。混合サルモネラワクチンはウイルス、細菌および寄生虫からの抗原を送達して、組換え抗原に対する分泌、体液性および細胞性免疫応答を生じさせるために用いられてきた。混合サルモネラワクチンは、単一用量経口マルチワクチン送達系としての大きな可能性を示している（C.Hormaeche et al,FEMS Symposium,No.63,Plenum,New York,pp.71−83,1992）。
混合サルモネラワクチンの開発には克服すべき問題がある。主要な考慮事項は、免疫応答を誘発する上で十分であるような高レベルの組換え抗原の発現をサルモネラワクチンで得ることである。しかしながら、外来抗原の未調節の高レベル発現は毒性であって、細胞生存力に影響を与え（I.Charles and G.Dougan,TIBTECH,8,pp.117−21,1990）、ワクチンを無効にするか、または組換えDNAの喪失を起こす。この問題についてのいくつかの可能な解決策、例えば必須遺伝子である“オン−オフ”（on−off）プロモーターを有したプラスミドからの発現、またはサルモネラ染色体中への外来遺伝子の組込みが記載されていた。
上記問題を克服する別の手段は、インビボで誘導しうるプロモーターを用いることであり、このようなプロモーターの１つはE.coli亜硝酸レダクターゼプロモーターnirBであり、これは嫌気生活下で誘導され、Clostridium tetaniの破傷風菌毒素断片Ｃ（TetC）生産のためのバイオテクノロジーで用いられている（M.D.Oxer et al,Nucl.Ac.Res.,19,pp.2889−92,1991）。nirBプロモーターからTetCを発現する構築物（pTETnir15）を保有したAro Salmonellaがマウスにおいて非常に高い抗破傷風菌抗体応答を示すことは、本出願の発明者らにより既に見い出されている（S.N.Chatfield et al,Bio/Technology,Vol.10,pp.888−92,1992）。このChatfield et alによる論文は本出願の優先日後に公表された。
しかしながら、我々はnirBからSchistosomamansoni単独のP28抗原を発現させようと試みたとき、得られた構築物が免疫原性でないことも見い出した。
破傷風菌トキソイドは、化学的にカップリングされたゲストエピトープ用のアジュバントとしてよく用いられている（D.A.Herrington et al,Nature,328,pp.257−9,1987）。SalmonellaにおけるTetCの強い免疫原性は、ゲストペプチドまたはタンパク質の免疫応答を促進する上でこの特徴を活用できることを我々に示唆した。しかしながら、２つのタンパク質を一緒に融合させると、個別成分の性質をもはや留めていない、不正確に折りたたまれたキメラタンパク質がしばしば生ずる。例えば、Vibrio cholerae（CT−Ｂ）およびE.coli（LT−Ｂ）腸毒素のＢサブユニットは強力な粘膜免疫原であるが、これらサブユニットとの遺伝子融合体はキャリアの構造および性質と、ひいてはそれらの免疫原性も変えることがある（M.Sandkvist et al,J.Bacteriol.,169,pp.4570−6,1987,Clements,1990 and M.Lipscombe et al,Mol.Microbiol.,5,pp.1385,1990参照）。更に、細菌で発現される多くの異種遺伝子は可溶性の、適正に折りたたまれた、または活性な形では生産されず、不溶性の凝集物として蓄積する傾向がある（C.Schein et al,Bio/Technology,6,pp.291−4,1988;R.Halenbeck et al,Bio/Technology,7,pp.710−5,1989）。
上記問題を克服することが本発明の目的である。
我々は、組換え抗原、特に融合タンパク質の効率的発現が、誘導性プロモーター（例えばnirB）を用いて、融合タンパク質の２つの抗原成分間に可動性ヒンジ領域を組込むことにより、細菌（例えばsalmonellae）で行えることをここに発見した。得られた組換え抗原は、良好な免疫原性を有することが示された。タンパク質の高発現は、また、そのタンパク質をコードする遺伝子が破傷風菌毒素Ｃ断片の遺伝子に結合されたときに得られることが、意外にもわかった。
したがって、第一の態様において、本発明は、ヒンジ領域で結合された第一および第二タンパク質をコードするDNA配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなるDNA構築物であって、プロモーター配列が周辺環境の変化に応答して誘導される活性を有することを特徴とする構築物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、結合された第一および第二タンパク質をコードするDNA配列に作動可能に結合されたプロモーター配列を含んでなり、その第一異種タンパク質が破傷風菌毒素断片Ｃまたはその１以上のエピトープを含んだ抗原配列である、DNA構築物を提供する。
別の態様において、本発明は前記のようなDNA構築物を含有する、細菌での使用に適する、複製性発現ベクターを提供する。
もう１つの面において、本発明は好ましくは実質上純粋な形をした融合タンパク質、（例えば、ヒンジ領域により）結合された第一および第二タンパク質を含んでなる融合タンパク質を提供し、その融合タンパク質は前記のような複製性発現ベクターで発現される。
別の態様において、本発明は弱毒化された細菌を前記のようなDNA構築物で形質転換することからなる、弱毒化細菌の生産法を提供する。
本発明は、前記のような弱毒化細菌または融合タンパク質と薬学上許容されるキャリアを含んでなるワクチン組成物も提供する。
第一および第二タンパク質は好ましくは異種タンパク質であり、特にポリペプチド免疫原であって、例えばそれらはウイルス、細菌、真菌、酵素または寄生虫から誘導される抗原配列である。特に、第一の上記タンパク質は破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んだ抗原配列であることが好ましい。
第二タンパク質は病原生物の抗原決定基であることが好ましい。例えば、抗原決定基はウイルス、細菌、真菌、酵素または寄生虫から誘導される抗原配列である。
第一および／または第二異種タンパク質に関するウイルス抗原配列の例は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）のタイプ、例えばHIV−１またはHIV−２、HIV、例えばHIV−１または−２からのCD4レセプター結合部位、肝炎ＡまたはＢウイルス、ヒトライノウイルス、例えば２型または14型、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス２型または３型、口蹄疫ウイルス（FMDV）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパピローマウイルス（HPV）、例えば16型パピローマウイルス、そのE7タンパク質、E7タンパク質またはそのエピトープを含む断片、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）から誘導される配列である。細菌から誘導される抗原の例はBordetella pertussis（例えば、P69タンパク質および繊維状赤血球凝集素（FHA）抗原）、Vibrio cholerae、Bacillus anthracisおよびE.coli抗原、例えばE.coli熱不安定毒素Ｂサブユニット（LT−Ｂ）、E.coliK88抗原および腸毒性E.coli抗原から誘導されるものである。抗原の他の例には、細胞表面抗原CD4、Schistosoma mansoni P28グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗原（P28抗原）、ならびに吸虫類、マイコプラズマ、回虫、条虫類、Chlamydia trachomatisおよびマラリア寄生虫、例えばplasmodiumまたはbabesia属の寄生虫（例えばplasmodium falciparum）の抗原、ならびに上記抗原由来の免疫原性エピトープをコードするペプチドが挙げられる。
具体的な抗原には全鎖長Schistosoma mansoni P28、（ＢおよびＴ細胞エピトープを双方とも含有した）免疫原性P28aa115−131ペプチドのオリゴマー（例えば、２、４および８マー）、ヒトパピローマウイルスE7タンパク質、単純ヘルペス抗原、口蹄疫ウイルス抗原およびサル免疫不全ウイルス抗原がある。
プロモーター配列は周辺環境の変化に応答して誘導され活性を有したものであり、このようなプロモーター配列の例は嫌気性条件により誘導される活性を有したものである。このようなプロモーター配列の具体例は、例えば国際特許出願PCT/GB92/00387で記載されたnirBプロモーターである。nirBプロモーターはE.coliから単離されたが、それは亜硝酸レダクターゼ遺伝子nirB（Jayaraman et al,J.Mol.Biol.,196,781−788,1987）およびnirD、nirC、cysG（Peakman et al,Eur.J.Biochem.,191,315−323,1990）を含めたオペロンの発現を指示する。それは亜硝酸と環境の酸素圧の変化の双方により調節され、酸素を除去したとき活性になる（Cole,Biochem.Biophys.Acta.,162,356−368,1968）。嫌気生活への応答は、多くの嫌気性呼吸遺伝子に共通したメカニズムで、転写アクチベーターとして作用するタンパク質FNRを介して媒介される。欠失および変異分析により、嫌気生活に唯一応答するプロモーターの一部が単離され、他の嫌気性調節プロモーターとの比較により共通FNR結合部位が確認されている（Bell et al,Nucl.Acids Res.,17,3865−3874,1989;jayaraman et al,Nucl,Acids Res.,17,135−145,1989）。推定FNR結合部位と−10相同領域との距離は重要であることも示された（Bell et al,Molec.Microbiol.,4,1753−1763,1990）。したがって、嫌気生活に唯一応答するnirBプロモーターのその部分だけを用いることが好ましい。ここで用いられるnirBプロモーターについて言及するときは、嫌気性条件下でコード配列の発現を促進できるそのプロモーター自体あるいはその一部または誘導体を言うものとする。nirBプロモーターを含有した好ましい配列は
0003633933.tif 000002
である。
ヒンジ領域は、ドメイン間で空間および時間の双方を分離して、第一および第二タンパク質双方の独立した折りたたみを促進しうるように設計された領域である。
ヒンジ領域とは、典型的には高割合のプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸をコードする配列である。ヒンジ領域は完全にプロリンおよび／またはグリシンアミノ酸から構成してもよい。ヒンジ領域は１以上のグリシン−プロリンジペプチド単位を含んでいてもよい。
ヒンジ領域は、例えば約15以内のアミノ酸、例えば少くとも４つ、好ましくは６〜14のアミノ酸を含み、アミノ酸の数は第一および第二タンパク質間に可動性を付与しうるような数である。
一態様において、ヒンジ領域は抗体免疫グロブリンのヒンジドメインに実質上相当しうる。IgG抗体のヒンジ領域は特にプロリンに富み（T.E.Michaelson et al,J.Biol.Chem.,252,883−9,1977）、これは抗原結合および尾部ドメイン間に可動性接合を与えると考えられる。
以下の理論に拘束されるわけではないが、プロリンは、このアミノ酸に特徴的な環構造がプロリン残基を隣接アミノ酸と連結しているペプチド結合周囲で回転を妨げることから、ヒンジの堅い部分を形成すると考えられる。この性質はプロリンおよび隣接残基がα−ヘリックスまたはβ鎖の定序構造をとらないようにしていると考えられる。可動性は、非常に限定された立体的要求しかしない最も簡単なアミノ酸、すなわちグリシンにより付与されると考えられる。グリシンはヒンジにおいて可動性のひじ部分（elbow）として機能すると考えられる。他のアミノ酸、特にかさ高い（bulky）鎖がないもの、例えばアラニン、セリン、アスパラギンおよびトレオニンもグリシンの代わりに用いてよい。
１つの好ましい態様において、ヒンジ領域は下記配列を有した４以上のアミノ酸の鎖である：
−〔Ｘ〕ｐ−Pro−〔Ｙ〕ｑ−Pro−〔Ｚ〕ｒ−
（上記式中、Proはプロリンであり、ＸおよびＹは各々グリシンまたはかさ高くない（non−bulky）側鎖を有したアミノ酸であり、Ｚはいずれかのアミノ酸であり、ｐは正の整数であり、ｑは０〜10の正の整数であり、ｒは０または０より大きい正の整数である）。
ヒンジ領域は第一および第二タンパク質双方にとり異種の別な領域であっても、あるいは第一タンパク質のカルボキシ末端部分または第二タンパク質のアミノ末端部分により規定してもよい。
E.coli（H.Grosjean et al,Gene,18,199−209,1982）およびSalmonellaで稀にしか利用されないコドンもヒンジをコードするために選択され、稀なコドン自体はメッセンジャーRNAの翻訳時にリボソームの停止を起こして、ポリペプチドドメインの正確な折りたたみを行わせると考えられる（I.J.Purvis et al,j.Mol.Biol.,193,413−7,1987）。更に、可能であるならば、得られた融合体で翻訳されるときに、かさ高いまたは荷電した側基をコードしないクローニング領域について制限酵素が選択される。
最も好ましい面において、本発明はヒンジ領域で結合された第一のおよび第二ポリペプチド免疫原をコードするDNA配列に作動可能に結合されたnirBプロモーターを含んでなり、第一ポリペプチド免疫原が破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んでいるDNA分子を提供する。
本発明のもう１つの好ましい面では、ヒンジ領域で結合された第一および第二ポリペプチド免疫原をコードするDNA配列に作動可能に結合されたnirBプロモーター配列を含む、細菌での使用に適する、複製性発現ベクターであって、第一ポリペプチド免疫原が破傷風菌毒素断片Ｃまたはそのエピトープを含んでいるもの、が提供される。
抗原をコードする第二配列にヒンジ領域を介して結合された破傷風菌毒素断片Ｃ（TetC）をコードするDNA配列を提供することにより、細菌細胞中におけるその配列の発現は断片Ｃおよびヒンジ領域が存在しない構築物と比較して高められることがわかった。例えば、S.mansoniの全鎖長P28タンパク質の発現レベルは、TetCとの融合体として発現されたときに、P28タンパク質がnirBプロモーターから単独で発現されるときよりも大きかった。S.mansoniの全鎖長P28タンパク質およびそのタンデムエピトープとのTetC融合体はすべて可溶性であり、E.coliおよびS.typhimuriumの双方で発現された。加えて、TetC−P28融合タンパク質はグルタチオンアガロースマトリックスでアフィニティ精製することができ、このことはP28がその天然基質となおも結合しうるコンホメーションをとるように正確に折りたたまれたことを示唆している。
ヒンジ領域で結合された第一および第二異種タンパク質の適切な発現はインビボで得ることができる。異種タンパク質は弱毒化細菌で発現させることができ、そのためこれはワクチンとして使用できる。
弱毒化細菌はSalmonella、Bordetella、Vibrio、Haemophilus、NeisseriaおよびYersinia属から選択される。一方、弱毒化細菌は腸毒性Escherichia coliの弱毒株であってもよい。特に、下記種、即ちS.typhi−ヒトチフス菌の原因;S.typhimurium−いくつかの動物種でサルモネラ症の原因;S.enteritidis−ヒトで食中毒の原因;S.choleraesuis−ブタでサルモネラ症の原因;Bordetella pertussis−百日咳の原因;Haemophilus influenzae−髄膜炎の原因;Neisseria gonorrhoeae−淋病の原因;Yersinia−食中毒の原因が挙げられる。
細菌の弱毒化は、細菌の芳香族アミノ酸生合成経路における遺伝子の非復帰変異に関するものでもよい。芳香族アミノ酸生合成経路の分岐点化合物であるコリスミン酸の合成に関与する遺伝子が少なくとも存在している。これらのうちいくつか、例えばaroA（５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ）、aroC（コリスミン酸シンターゼ）、aroD（３−ジヒドロキナ酸デヒドラクターゼ）およびaroE（シキミ酸デヒドロゲナーゼ）は、細菌ゲノム上の広い異なる位置に存在している。したがって、変異はaroA、aroC、aroDまたはaroE遺伝子にあってもよい。
しかしながら、好ましくは、弱毒化細菌はその芳香族アミノ酸生合成経路における２つの異なる遺伝子の各々で非復帰変異を有している。このような細菌はEP−Ａ−0322237で開示されている。適切な二重aro変異体はaroA  aroC、aroA  aroDおよびaroA  aroEである。しかしながら、aroA、aroC、aroDまたはaroE遺伝子の他の組合せで変異を有する他の細菌も有用である。Salmonella二重aro変異体、例えばS.typhiまたはS.typhimuriumの二重aro変異体、特にaroA  aroC、aroA  aroDおよびaroA  aroE変異体が特に好ましい。一方、弱毒化細菌は１以上の他の遺伝子の調節に係わる遺伝子に不可逆変異を有していてもよい（EP−Ａ−0400958）。好ましくは、変異は調節に係わるompR遺伝子または他の遺伝子に存在する。調節に係わり、しかも環境刺激に応答することが知られた他の遺伝子も多数ある（Ronson et al,Cell,49,579−581）。
このタイプの弱毒化細菌は、第二遺伝子に第二の変異を有していてもよい。好ましくは、第二遺伝子は必須生合成経路に係わる酵素をコードする遺伝子、特に芳香族化合物の生合成経路に係わる前コリスミン酸経路に係わる遺伝子である。したがって、第二の変異はaroA、aroCまたはaroD遺伝子にあることが好ましい。
他のタイプの弱毒化細菌は、環境ストレスに応答して生産されるタンパク質をコードする、またはそれをコードするDNAの発現を調節する細菌のDNAで非復帰変異の存在により弱毒化が起きた細菌である。このような細菌はWO91/15572で開示されている。非復帰変異には欠失、挿入、逆位または置換がある。欠失変異はトランスポゾンを用いて行えばよい。
本発明によるDNA構築物を含んだ弱毒化細菌は、ワクチンとして用いることができる。細菌により発現された（好ましくは実質上純粋形の）融合タンパク質もワクチンの製造に使用できる。例えば、精製TetC−P28融合タンパク質はそれ自体で免疫原性であることがわかった。したがって、別の面において、本発明は薬学上許容されるキャリアまたは稀釈剤と、活性成分として前記のような弱毒化細菌または融合タンパク質を含んでなるワクチン組成物を提供する。
ワクチンは１種以上の適切なアジュバントを含んでいてもよい。
ワクチンは凍結乾燥形、例えばカプセル形、で患者への経口投与用に提供されることが有利である。このようなカプセルは、例えばEudragit″Ｓ″,Eudragit″Ｌ″、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含んだ腸溶性コーティングで提供してもよい。これらのカプセルはそのままで用いてもよく、一方凍結乾燥物質は投与前に例えば懸濁液として再調製してもよい。再調製は、生物の生存を保証しうる適切なpHの緩衝液で行われることが有利である。弱毒化細菌およびワクチンを胃酸性から保護するためには、炭酸水素ナトリウム調製物がワクチンの各投与前に投与されることが有利である。一方、ワクチンは非経口投与、鼻内投与または乳内投与用に製造してもよい。
本発明のDNA構築物を含んだ弱毒化細菌は宿主、特にヒト宿主の、おそらく動物宿主であっても、予防処置に用いてよい。したがって、微生物、特に病原体に起因する感染は、本発明による弱毒化細菌の有効量を投与することにより防止される。その後に、細菌は微生物に対する抗体を生じさせうる異種タンパク質を発現する。用いられる投与量は、宿主の大きさおよび重量、処分されるワクチンのタイプと、異種タンパク質の性質を含めた様々な因子に依存している。
本発明による弱毒化細菌は、弱毒化される細菌を前記のようなDNA構築物で形質転換することにより生産してもよい。いずれかの適切な形質転換技術、例えばエレクトロポレーションが用いられる。こうして、細菌にとり異種のタンパク質を発現できる弱毒化細菌が得られる。弱毒化細菌の培養物も好気性条件下で増殖させてよい。こうして、十分量の細菌が、異種タンパク質の最少発現を行うワクチンとしての処方用に生産される。
DNA構築物は、ヒンジ領域により結合された破傷風菌毒素Ｃ断片またはそのエピトープおよび第二異種タンパク質をコードするDNA配列に作動可能に結合されたnirBプロモーターを含んでなる複製性発現ベクターであってもよい。nirBプロモーターは、タンパク質の発現をコントロールする現存プロモーターの代わりに、異種タンパク質（例えば、破傷風菌毒素Ｃ断片）の発現をコードする遺伝子を既に組み込んだ発現ベクターに挿入される。次いで、ヒンジ領域と、第二異種タンパク質（例えば、抗原配列）をコードする遺伝子が挿入される。発現ベクターは、勿論、そのベクターが挿入される弱毒化細菌と適合できねばならない。
発現ベクターには、nirBプロモーターの他に転写終結部位と翻訳開始および停止コドンを含んだ、適切な転写および翻訳コントロール要素も設定される。適切なリボソーム結合部位も設定される。ベクターは典型的には複製起点と、所望であれば選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、を含む。ベクターはプラスミドであってもよい。
本発明は下記例と添付図面を参照して説明され、それらによっては制限されるものではない：
図１は、本発明の一態様による、中間プラスミドpTECH1の構築の概略図である。
図２は第二中間プラスミドpTECH2の構築の概略図である。
図３は、出発物質として図２の中間プラスミドを用いた本発明のプラスミドの構築の概略図である。図３において、Ｂ＝BamH I、Ｅ＝EcoR V、Ｈ＝Hind III、Ｘ＝Xba I、Ｓ＝Spe I
図４は反復エピトープ（レピトープ）を含んだプラスミドの構築の概略図である。
図５は、SL3261、SL3261（pTETnir15）、SL3261（pTECH2）、SL3261（pTECH2−モノマー）、SL3261（pTECH2−ダイマー）、SL3261（pTECH2−テトラマー）、SL3261（pTECH2−オタクマー）およびSL3261（pTECH1−P28）で静脈内接種されたマウスにおいて、ELISAにより検出されるような組換えS.mansoniタンパク質P28に対する抗体応答について示している。図５において、結果は免疫後に間隔をおいた個々のマウスのODとして表示されている。
図６は、図５のように接種されたマウスでELISAにより検出されるようなTetCに対する抗体応答について示している。
図７は、SL3261、SL3261（pTECH2）、SL3261（pTECH2−モノマー）、SL3261（pTECH2−ダイマー）、SL3261（pTECH2−テトラマー）およびSL3261（pTECH2−オクタマー）で静脈内接種されたマウスにおいて、ELISAにより検出されるようなオボアルブミンとカップリングされたP28タンパク質のペプチド115−131に対する抗体応答について示している。
図８は、SL3261（pTECH1−P28）で経口接種されたマウスからELISAにより検出されるようなTetCに対する抗体応答について示している。
図９は、図８のように接種されたマウスでELISAにより検出されるような組換えP28に対する抗体応答について示している。
図10は、pTECH2中間プラスミドからの様々な構築物の作製について概略している。
図11は、pTECH2を用いて作製された三部分（tripartite）タンパク質構造体（“ヘテロマー”）の構造について概略している。
図12は、ベクターpTECH1（配列NO:17）のDNA配列について示している。
図13は、ベクターpTECH2（配列NO:18）のDNA配列について示している。
図14は、ベクターpTECH2上の制限部位について概略している。
例１
pTECH1の作製
nirBプロモーターおよびTetC遺伝子、並びにヒンジ領域をコードし、かつ、第二またはゲストタンパク質をコードする遺伝子の挿入を行える制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだDNA配列を組み込んだプラスミド、pTECH1の作製法が図１で示されている。図１で示された出発物質、発現プラスミドpTETnir15は、lac I遺伝子およびtacプロモーターを含むEcoR I−Apa I領域（1354bp）を下記対のオリゴ１および2:
0003633933.tif 000003
で置き換えることにより、pTETtac115（Makoff et al,Nucl.Acids Res.,17,10191−10202,1989）から構築した。
そのオリゴヌクレオチドはPharmacia Gene Assemblerで合成し、得られたプラスミドを配列決定により確認した（Makoff et al,Bio/Technology,7,1043−1046,1989）。
次いでpTETnir15プラスミドは、断片Ｃ融合タンパク質の発現を指示するように、異種DNAの挿入部位として適したポリリンカー領域を組み込んだ新規pTECH1プラスミドの構築に用いた。pTETnir15は断片Ｃの発現を指示する既知pAT153ベースのプラスミドである。しかしながら、TetC遺伝子の３′末端に存在する天然の好都合な制限部位はない。したがって、ヒンジ領域により先行される標的部位は、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いて、“アド−オン”（add−on）アダプター配列（表１）で調製されたプライマーによりTetCコード領域の３′末端に導入した（K.Mullis et al,Cold Spring Harbor Sym.Quant.Biol.,51,263−273,1986）。したがって、pTETnir15はSac IIおよびBamH I部位をカバーする領域に相当するプライマーを用いたPCR反応で鋳型として用いた。この増幅におけるアンチセンスプライマーは38塩基の５′アダプター配列で調製した。そのアンチセンスプライマーは、新たなXba I、Spe IおよびBamH I部位をコードする配列をPCR産物中に組み込めるように設計した。加えて、プロリンを含めた追加の余分なアミノ酸をコードするDNA配列を組み込み（ヒンジ領域）、翻訳停止コドンシグナルを断片Ｃオープン読取枠と同枠で組み込んだ。
PCR産物をゲル精製し、Sac IIおよびBamH Iで切断し、Sac IIおよびBamH Iで既に切断された残留2.8kbベクターpTETnir15中に組み込んでクローニングした。形質転換コロニーから精製されたpTECH1と呼ばれるプラスミドは図１で示されている。異種配列、例えばSchistosoma mansoni P28グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（P28）をコードする配列を既知方法に従いXba I、Spe IおよびBamH I部位に組み込んでクローニングした。
例２
pTECH2の構築
pTECH1の有用性を更に改善するために、短いリンカー配列がpTECH1のXba IおよびBamH I部位間に導入され、オリゴヌクレオチドの方向性クローニングを行わせ、かつ、多重タンデムエピトープ（“レピトープ”）の構築を促進させた（図２）。BamH I、EcoR V、Hind III、Spe Iの制限酵素標的部位とその後に翻訳停止コドンを有した２つの相補性オリゴヌクレオチドを合成した（表１）。そのオリゴヌクレオチドをXba IおよびBamH I付着末端で調製した。しかしながら、BamH I標的配列は誤対合を含めて設計されており、クローニング特にpTECH1におけるこの制限部位は壊される。このバージョンのベクターはpTECH2と命名した。
例３
pTECH1−P28の構築
P28遺伝子発現カセットは、鋳型としてpUC19−P28DNA（Dr.R.Pierce,Pasteur Institute,Lilleの好意による）を用いて、PCRにより作製した。オリゴヌクレオチドプライマーは、開始コドンで始まり停止コドンで終わる全鎖長P28遺伝子を増幅させるように設計した。加えて、センスおよびアンチセンスプライマーを各々Xba IおよびBamH Iの制限部位で調製した。生成物をゲル精製し、Xba IおよびBamH Iで切断し、次いで既にこれらの酵素で切断され、ゲル精製されたpTECH1中に組み込んでクローニングした。
TetC−P28融合タンパク質の発現
TetC−P28融合タンパク質の発現は、その構築物を有する細菌細胞のSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより評価した。融合タンパク質は可溶性のままであり、TetCおよびP28双方に対する抗血清と交差反応し、そして全鎖長融合体について予想分子量80kDalであることがわかった。
融合タンパク質は、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより判断したところ、E.coli（TG2）およびS.typhimurium（SL5338、SL3261）を含めたいくつかの異なる遺伝的バックグラウンドで安定的に発現された。TetC−ヒンジタンパク質だけと同時移動し、かつ、抗TetC血清ともっぱら交差反応する50kDalの小さなバンドがウエスタンブロットで視認できることに興味がもたれた。ヒンジ領域でのコドン選択は準最適であるように設計されているため、まれなコドンは翻訳中に停止を起こして、時々翻訳の不完全終結を導き、こうしてこのバンドの説明がつけられる。
TetC−P28融合体のアフィニティ精製
グルタチオンはP28、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの天然基質である。グルタチオンを結合させる上で関与するアミノ酸残基は、ポリペプチドの一次構造で空間的に離れており、三次構造でグルタチオン結合ポケットを形成するために一つにまとめられると考えられる（P.Reinemer et al,EMBO J.,8,1997−2005,1991）。融合体のP28成分がグルタチオンを結合できるコンホメーションをとるように正確に折りたたまれているかどうかを判断するために、グルタチオン−アガロースマトリックスでアフィニティ精製されうるその能力について試験した。得られた結果（示さず）は、TetC−P28が実際にマトリックスと結合できること、および融合体が遊離グルタチオンと競合的に溶出されることから、結合が可逆性であることを明らかにした。
例４
pTECH2−P28（aa115−131）ペプチド融合体の構築
aa115−131ペプチドをコードする相補性オリゴヌクレオチドはE.coliで最適な発現のためにコドン選択して設計した（H.Grosjean et al,idem）。そのオリゴヌクレオチドをアニーリングで形成されたBgl IIおよびSpe I付着末端で調製し、BamH IおよびSpe Iで既に切断されたpTECH2中に組み込んでクローニングした（図３）。
エピトープの反復タンデムコピー（レピトープ）を下記手段によりpTECH2で構築した。組換え融合ベクターをXba IおよびSpe Iで切断し、各切断物に、ベクター内の他の箇所で唯一切断する第二の制限酵素、例えばアンピシリン耐性遺伝子内でもっぱら切断を行うPst Iを加えた（図４）。エピトープ配列を含むDNA断片は二重切断物の各々から精製して、混合し、その後に結合させることができる。Xba Iはその標的配列を開裂させて、Spe I突出部と適合する５′−CTAG突出部を形成する。結合により、これら双方の酵素の認識配列は壊れる。こうすると、Xba I−Spe I制限部位は唯一のままであり、操作はエピトープの４または８タンデムコピーを発現する組換え融合ベクターを構築するために簡単かつ有効に繰返すことができる（図４）。類似方法は神経ペプチド生産用のマルチマー融合タンパク質の形成で他者により用いられていた（T.Kempe et al,Gene,39,239−45,1985）。
TetC−ペプチド融合タンパク質の発現
モノマー、ダイマー、テトラマーおよびオクタマータンデムペプチド反復体としてのTetC−ペプチド融合体の発現は、その構築物を有する細菌株のSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより評価した。融合タンパク質は可溶性のままであり、TetCおよびP28に対する双方の抗血清と交差反応し、しかも予想分子量を示す（図５）。更に、融合タンパク質は、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより判断したところ、E.coli（TG2）およびS.typhimurium（SL5338、SL3261）を含めたいくつかの異なる遺伝的バックグラウンドで発現される。抗P28抗体でプローブ処理したウエスタンブロットでみられるもっと低い分子量の弱いバンドの出現で示されるように、もっと多数のコピーからなるレピトープの分解もいくらか存在することがわかった。バンドの大きさは、それらがTetCに対して少ないコピー数の融合体からなることを示唆していた。上記TetC−P28融合体の場合のように、TetC−ペプチド融合体の発現レベルはpTECH2からTetC単独の場合よりも少なく、発現レベルはコピー数増加に従い次第に減少した。
例５
免疫学的研究
インビボにおけるプラスミド構築物の安定性およびマウスの免疫処置
BALB/cマウスに、S.typhimurium SL3261および異なる構築物を有するSL3261を約106cfu静脈内または５×109経口で与えた。１〜８日目（エピトープ融合体）および１〜11日目（ベクター、オクタマーおよびP28融合体）に行われた肝臓、脾臓および（経口接種マウスでは）リンパ節のホモジネートにおける生存カウント数はアンピシリン含有および非含有培地で類似していたが、これはプラスミドが組織で増殖中に失われなかったことを示している。
静脈内免疫されたマウスの抗体応答
TetC−P28融合体に対する抗体応答
尾採血を各群マウス８匹の動物から３〜６週目に毎週行った。図５は、TetC−P28融合体を発現するサルモネラで免疫されたマウスにおいて、組換えP28に対する抗体応対が３週目までに現れて、４週目以後6/6マウスで陽性であったことを示している。抗P28抗体は、SL3261、SL3261−pTETnir15またはpTECH2で免疫されたマウスの血清で検出されなかった。
TetCを単独でまたはTetC−P28融合体として発現するサルモネラで（サルモネラ単独ではなく）免疫されたすべてのマウスは、TetCに対する抗体を早くも３週目には出現させた（図６）。
TetC−ペプチド融合体に対する抗体応答
aa115−131ペプチドの多重コピーに融合されたTetCを発現するサルモネラで免疫されたマウスから上記のように採血し、血清をオボアルブミンに化学的に結合された合成115−131ペプチドおよび組換えP28に対するELISAにより試験した。図７は、ペプチドに対する抗体応答が早くも３週目に検出され、その後増加し、応答が多くのペプチドコピー数を含む融合体ほど強かったことを示している。オクタマー融合体が陽性のマウス４〜５匹で最良の応答を示した。抗体応答はSL3261、pTECH2またはモノマーエピトープ融合体で免疫されたマウスでオボアルブミン−モノマーまたは組換えP28に対して検出されなかった。
抗エピトープ血清の一部はELISAで全鎖長P28タンパク質を認識した（図５）。ダイマー融合体で注射されたマウス１匹は５週目に陽性であり、テトラマー融合体で注射されたもう１匹のマウスは３週目に陽性であった。その後オクタマー融合体で注射された少くとも２匹のマウスの血清は、４〜６週目に一貫してP28を認識した。
要約すると、レピトープに対する抗体応答は、コピー数増加で劇的に改善され、テトラマーおよびオクタマーレピトープ融合体が最も強力であった。モノマー融合体に対する抗体応答は検出されなかった。
異なる融合体で免疫されたマウスのTetCに対する抗体応答
TetCに対する抗体応答はすべてのグループで同一というわけではなく、TetCへのＣ末端融合体の付加は明らかに応答を変えた。図６は、ベクターpTECH2（TetC−ヒンジ単独）で示されたTetCに対する抗体応答が親ベクターpTETnir15に対するTetC応答よりも有意に低かったことを示している。意外にも、大きさを増した融合体のTetCへの付加はTetCに対する応答を劇的に回復させる。最大融合体、pTECH1の全鎖長P28に対する抗TetC応答は、（試験条件下で）親プラスミドから得られたTetCに対する応答と類似していた。非組換えSL3261で注射されたマウスの血清は、試験期間中いかなるときもTetCと反応しなかった。
経口免疫されたマウスの抗体応答
マウス10匹の群を、SL3261単独あるいはpTECH1またはpTECH1−P28を有するSL3261約５×109cfuで、胃管栄養チューブから0.2ml胃内に与えて、経口免疫した。３〜10週目に採取した血液は、組換えサルモネラを受容したほとんどのマウスが早くも３週目にTetCに対する抗体を生産することを示した（図８）。TetC−P28融合体で免疫されたマウスはP28に対する抗体を生産し、これは８週目までに約半数のマウスで検出できたが、その後減少した（図９）。
精製融合タンパク質で免疫されたマウスの抗体応答
マウスを水酸化アルミニウムに吸着されたアフィニティ精製TetC−P28融合タンパク質で皮下免疫した。コントロールは市販の破傷風菌トキソイドのみを受容した。予備結果では、融合タンパク質を受容した動物がTetCおよびP28双方に対する抗体応答を起こすことを示している（データ示さず）。抗P28抗体は破傷風菌トキソイドを与えたマウスで検出されなかった。
TetCおよびP28に対するＴ細胞応答
マウスをSL3261、SL3261（pTETnir15）およびSL3261（pTECH1−P28）約106cfuで静脈内免疫した。６月後に、IL−2/IL−４生産としてのＴ細胞応答を、下記の物質および方法と題されたセクションで記載されるように、サルモネラ全細胞可溶性抽出物、TetC、組換えP28および全成虫抗原に対して測定した。表２は、双方のグループからの細胞が水酸化ナトリウム処理サルモネラ抽出物およびTetCに対するIL−2/IL−４応答を生じたことを示している。しかしながら、TetC−P28融合体を発現するサルモネラで免疫されたマウスからの細胞も、組換えP28および全虫抽出物の双方に応答した。
このように、サルモネラ送達系はP28に対する体液性および細胞性（Ｔ細胞）双方の免疫応答を引き出した。
組換え抗原を発現するサルモネラはすべてマウス組織と親株で生き残っていて、プラスミドはインビボで失われていなかった。
より高分子量の融合体（全鎖長P28およびオクタマー）を発現する構築物が最も免疫原性であるとわかった。免疫応答は、更なるＴ細胞ヘルパーエピトープを提供するキャリアTetCにより促進されたことがある（Francis et al,Nature,330,168−170,1987）。４週目までに、pTECH1−P28を有する細胞で免疫されたすべてのマウスは、静脈内免疫後に、TetCと更に全鎖長P28タンパク質との双方に対して応答した。経口で免疫されたマウスもTetCおよびP28に応答したが、すべてのマウスがP28に応答したわけではない。P28に対する応答は追加免疫により改善するのが好ましい。コドン最適化ヒンジ領域、コドン最適化P28および全鎖長P28の多重コピーからなる改良構築物は現在作製中である。
エピトープに対する抗体応答はコピー数を増加させると劇的に改善し、テトラマーおよびオクタマー“レピトープ”融合体が最大の効力を示した。
例６
pTECH2中HPVE7タンパク質のクローニング
全鎖長HPV16型E7タンパク質遺伝子を、ベクターヒンジ領域のBamH I部位でその遺伝子の枠内挿入（frame insertion）によりプラスミドpTECH2中に組み込んでクローニングした。
E7遺伝子はプラスミドpGEX16E7（S.A.Comerford et al,J.Virology,65,4681−90,1991）から得た。その遺伝子はこのプラスミドにおいて２つの制限部位、即ち３′BamHI部位および５′EcoR I部位と隣接している。pGEX16E7  DNAをEcoR Iで切断し、Sequenase（USBからのDNAポリメラーゼ）を用いた補充反応により平滑末端化した。次いでそれをBamH Iで切断して、0.3kbp全鎖長E7遺伝子を放出させた。
ゲル精製遺伝子をBamH I−EcoR V二重切断pTECH2に結合させ、この結合混合物を用いてコンピテントE.coli HB101細菌を形質転換した。
組換えコロニーは、プローブとしてHPV16  E7タンパク質に対する２種のモノクローナル抗体、即ち6Dおよび4F（R.W.Tindle et al,J.Gen.Vir.,71,1347−54,1990）を用いて、コロニーブロッティングにより選択した。これらコロニーのうち一方、即ちpTE79は次の分析のために選択した。
好気性および嫌気性双方の条件下で増殖させたpTE79形質転換E.coliからタンパク質抽出物を調製し、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッテイングにより分析した。嫌気性条件下の増殖で約60kDalの組換え分子を発現させたが、これはモノクローナル抗体6Dおよび4Fと、破傷風菌断片Ｃに対するウサギポリクローナル血清と反応した。
例７
pTECH2−gDの構築
単純ヘルペスウイルス１型（HSV1）からの免疫学上重要な抗原は、gD1と呼ばれる糖タンパク質Ｄである（R.J.Watson et al,Science,218,381−383,1982）。トランスメンブランおよび細胞質ドメインaa26−340を欠く末端が切り取られた（truncated）gD1遺伝子カセットをPCRにより合成した。用いられたPCRプライマーは表３で示されている。フォワードプライマーは成熟タンパク質のＮ末端をコードするように設計し、リバースプライマーはトランスメンブランドメインのすぐ５′側のアミノ酸をコードしていた。加えて、プライマーを各々BamH IおよびSpe I制限部位で調製した。PCR反応用の鋳型はプラスミドpRWFG（pBR322中におけるPatton株からのHSV1  gD  BamH I−Ｊクローン;Dr.T.Minson,Cambridge Universityの好意による）であった。増幅産物をBamH IおよびSpe Iで切断し、各酵素で既に切断されたpTECH2中に組み込んでクローニングした。
TetC−gD1融合タンパク質の発現は、構築物を有した細菌株のSDS−PAGEおよびウエスタンブロッテイングにより評価した。ウエスタンブロットでは、抗TetCポリクローナル血清または成熟gDのアミノ酸11−19に対するモノクローナル抗体（LP16と呼ぶ、Dr.T.Minson,Cambridgeから入手）でプローブ処理した。融合タンパク質は、大きさが50kDalまで下がる低分子量バンドと一緒に、ウエスタンブロットで視認しうる85kDalバンドとして発現される。低分子量バンドはgDのタンパク質開裂産物に相当するか、またはリボソーム中止によるgDのコード領域内における未成熟翻訳終結の産物を表す。融合タンパク質は、サルモネラ株SL5338およびSL3261で発現される。
例８
pTECH2−FMDV/SIVレピトープの構築
口蹄疫ウイルス（FMDV;血清型A12）ウイルスタンパク質１（VP1;aa136−159）からのペプチド、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）エンベロープタンパク質（gp120;aa171−190）からのV2ループをpTECH2中に組み込んでクローニングした（M.P.Broekhuijsen et al,J,J.Gen.Virol.,68,3137−45,1987;K.A.Kent et al,AIDS Res.and Human Retro.,8,1147−1151,1992）。
そのペプチドをコードする相補性オリゴヌクレオチドは、E.coliで最適発現のためにコドン選択して設計した（H.Grosjean et al,Gene,18,199−209,1982）。そのオリゴヌクレオチドは表３で示されている。オリゴヌクレオチドをアニーリングで形成されたBgl IIおよびSpe I付着末端で調製し、BamH IおよびSpe Iで既に切断されたpTECH2中に組み込んでクローニングした（図３）。これらペプチドのダイマー、テトラマーおよびオクタマー融合体を既に記載されたように構築した。
TetC−融合体の発現は、TetCに対するポリクローナル血清とFMDVまたはSIVエピトープに対するモノクローナル抗体でSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティングにより評価した。FMDVおよびSIVレピトープ構築物は、SL5338およびSL3261双方でTetC融合タンパク質を発現した。
例９
pTECH2−gp120−P28ペプチドヘテロマーの構築
TetCの単一分子から２タイプ以上のエピトープを送達する可能性を探るために、融合体をP28およびSIVレピトープで作成し、三部分タンパク質を作製した。この形の構築は、異なるレピトープを含んだベクターモジュールの集合を許容するベクターのモジュラー（Modular）性質により促進された。これらの“ヘテロマー”はP28およびSIVレピトープのタンデムダイマーまたはテトラマーを発現する。TetC−レピトープＡ−レピトープＢ融合体におけるその発現レベル、安定性および免疫原性についての特定レピトープの位置効果を調べるために、逆の組合せ、即ちTetC−レピトープＢ−レピトープＡも、図11で示されたように構築した。こうして構築された“ヘテロマー”はTetC−P28ダイマー−SIVダイマー、TetC−SIVダイマー−P28ダイマー、TetC−P28テトラマー−SIVテトラマーおよびTetC−SIVテトラマー−P28テトラマーである。
三部分融合体の発現は、上記のような抗体試薬を用いて、SDS−PAGEおよびウエスタンブロッテイングにより評価した。これらのヘテロマー構築物はすべてSalmonella株SL5338およびSL3261で発現されたが、興味あることには、発現レベルおよび安定性は逆になったものよりも一方のダイマー−ダイマーおよびテトラマー−テトラマー組合せ（TetC−gp120−P28）の方が大きい。
例10
物質および方法
プラスミド、オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ鎖反応
プラスミドpTETnir15はnirBプロモーターのコントロール下で破傷風菌毒素からの断片Ｃの発現を指示する（Chatfield et al,idem;Oxer et al,idem）。TetC−ヒンジ融合ベクターpTECH1はMullis et al,1986で記載されたポリメラーゼ鎖反応（PCR）によりpTETnir15から構築した。PCRはPyrococcus furiosusからの高正確性（fidelity）熱安定性DNAポリメラーゼを用いて行ったが、これは関連３′−５′エキソヌクレアーゼ校正活性を有している（K.S.Lundberg et al,Gene,108,1−6,1991）。増幅反応は製造業者（Stratagene）の指示に従い行った。
細菌株
用いられた細菌株はE.coli TG2（recA）（J.Sambrook et al,Molecular cloning:a laboratory manual,Cold Spring Harbor,New York,1989）、S.typhimurium SL5338（galE  r-m+）（A Brown et al,J.Infect.Dis.,155,86−92,1987）およびSL3261（aroA）（S.K.Hoiseth et al,Nature,291,238−9,1981）であった。細菌は、適切ならばアンピシリン（50μg/ml）を含有させて、ＬまたはYTブロスとＬ寒天で培養させた。E.coliで生産されたプラスミドDNAは、SL3261  aroA（r+m）ワクチン中へのエレクトロポレーション効力を増加させるために、SL5338中への形質転換によって最初に修正した。エレクトロポレーションの場合、中間対数期に増殖した細胞を回収し、初期培養容量の半分の氷冷水、1/10容量の氷冷グリセロール（10％）で洗浄し、最後に細胞を氷冷グリセロール（10％）中1010細胞/mlの濃度まで再懸濁させた。前冷却キュベットに細胞60μｌおよびプラスミドDNA100ngの混合物を加えた。細胞はInvitrogenからのPoratorを用いてパルス処理した（セッティング：電圧＝1750μＶ、静電容量＝40μＦ、抵抗＝500）。20mMグルコースで補充された前加温Ｌブロスを直ちに加え、細胞を静かに振盪しながら37℃で１〜1.5時間増殖させた。次いで細胞をアンピシリン含有Ｌ寒天プレート上におき、37℃で16時間インキュベートした。
SDS−PAGEおよびウエスタンブロッテイング
TetC融合体の発現はSDS−PAGEおよびウエスタンブロッテイングにより試験した。中間対数期に増殖した抗生物質選択された細胞を遠心により回収し、タンパク質を10％SDS−PAGEにより分別した。タンパク質をエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜に移し、TetCまたは全鎖長P28タンパク質に対するポリクローナルウサギ抗血清と反応させた。次いでブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギIg（Dako,UK）でプローブ処理し、４−クロロ−１−ナフトールで発色させた。
グルタチオン−アガロースアフィニティ精製
TetC全鎖長P28遺伝子融合体を発現する細菌細胞を対数期まで増殖させ、氷冷し、2500×ｇで15分間、４℃で遠心により回収した。細胞を原容量の1/15の氷冷リン酸緩衝液（PBS）に再懸濁し、MSE Soniprepで超音波処理により溶解させた。不溶性物質を遠心除去し、上澄に前膨脹グルタチオン−アガロースビーズ（Sigma,UK）の50％スラリーを1/6容量で加えた。静かに室温で１時間混合した後、ビーズを1000×ｇで10秒間の遠心により集めた。上澄を捨て、ビーズを20倍容量の冷PBS−0.5％トリトンＸ−100に再懸濁し、ビーズを再び遠心により集めた。洗浄工程を更に３回繰り返した。融合タンパク質は、pH8.0の5.0mM還元グルタチオン（Sigma）含有50mMトリス−HClを１倍容量で加えることにより溶出させた。静かに10分間混合した後、ビーズを前のようにペレット化し、上澄を除去した。溶出工程を更に５回繰返し、上澄分画をSDS−PAGEで分析した。
動物
雌性BALB/cマウスはHarlan Olac UK Blackthorn,Bicester,UKから購入し、少くとも８週齢のときに用いた。
接種および器官ホモジネートの生存数カウント
細菌を必要とされる100μg/mlアンピシリンで補充されたトリプシン大豆ブロス（Oxoid）中で増殖させた。静脈内接種の場合は、静置培養物をPBSで希釈し、動物に側尾血管から0.2mlで約106cfu与えた。経口接種の場合には、細菌を振盪一夜培養物中で増殖させ、遠心により濃縮し、動物に0.2mlで約５×109cfuを胃管栄養チューブから胃内に与えた。接種物の用量はトリプシン大豆寒天上の生存数カウントによりチェックした。器官ホモゲネートの生存数カウントのために、マウス３匹の群を時間をおいて殺し、肝臓および脾臓と（経口接種マウスの場合には）腸間膜リンパ節のプールをColworth stomacher（C.E.Hormaeche,Immunology,37,311−318,1979）において蒸留水10ml中で別々にホモゲナイズし、生存数カウントを100μg/mlアンピシリンで補充されたトリプシン大豆寒天上で行った。
抗体応答の測定
抗体を固相免疫アッセイで測定した。96ウェル平底プレートをpH9.6の0.1M炭酸緩衝液100μｌ中TetC0.1μｇ（Dr.N.Fairweather,the Wellcome Foundation,Beckenham,UKの好意による）または組換えP28  １μｇ（Dr.R.Pierce,Pasteur Institute,Litte,Franceの好意による）でコーティングした。４℃で一晩インキュベート後、プレートを37℃で１時間インキュベートした。非特異的結合部位の遮断は、pH7.0のPBS中２％カゼイン（BDH,Poole,UK）200μｌと37℃で１時間インキュベートすることにより行った。プレートを半自動式ELISA洗浄機（Titertek,Flow/ICN、Herts,UK）によりPBS中0.05％Tween 20（Sigma）で３回洗浄した。２％カゼインで1:20希釈された接種マウスの血清100μｌを各ウェルに加え、プレートを37℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、製造業者の指示に従いPBS中２％カゼインで希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Dako,Bucks,UK）100μｌを各ウェルに加え、37℃で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、更に３回の洗浄をPBS単独で行った。プレートは、pH5.0のリン酸／クエン酸緩衝液および0.02％過酸化水素を用い、製造業者の指示に従い3,3′,3,3′−テトラメチルベンジジン二塩酸塩（Sigma）を用いて発色させた。プレートを37℃で10〜15分間インキュベートし、その後反応を3M  H2SO4（BDH）25μｌで停止させた。プレートをELISAリーダーにより450nmで読み取った。
Ｔ細胞応答の測定
６月前に予防接種されたマウスから脾臓を無菌的に摘出し、単一細胞懸濁物をプラスチックプランジャーによりステンレススチールシーブに通して脾臓をすりつぶすことにより調製した。細胞をRPMI1640培地（Flow/ICN）中300×ｇで１回洗浄し、Gey′ｓ溶液中でインキュベートして、赤血球を溶解させた。白血球を上記のように更に２回洗浄し、完全培地、即ち100U/mlペニシリンＧ（Flow/ICN）、100μg/mlストレプトマイシン（Flow/ICN）、２×10-5M  β−メルカプトエタノール（Sigma）、1mM  Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（HEPES）（Flow/ICN）および10％熱不活化新生牛血清（Northumbria Biolabs,Northumberland,UK）で補充されたRPMI1640に再懸濁した。Ｔ細胞の単離のためには、脾臓細胞を上記のように処理し、赤血球の溶解後に白血球を加温（37℃）RPMI1640に再懸濁し、Wigzellガラスビーズカラムに通した（H.Wigzell et al,Scand.J.Immunol.,1,75−87,1972）。
細胞を関連抗原の存在下で96ウェルプレートに最終容量200μｌの完全培地中２×106/mlでいれた。これらは20μg/ml最終濃度でVillarreal et al（Microbial Pathogenesis,13,305−315,1992）に記載されたように調製されたS.typhimurium C5のアルカリ処理全細胞可溶性抽出物;10μg/mlのTetC;50μg/mlの組換えSchistosoma mansoni P28;20μg/mlのS.mansoni全成虫抽出物（Dr.D.Dunne,Cambridge Universityの好意による）であった。細胞を湿度95％、５％CO2、37℃雰囲気でインキュベートした。
SL3261（pTECH1−P28）で免疫された動物のＴ細胞用のフィーダー細胞は、上記のように調製された同系BALB/cナイーブ（naive）脾臓から得た。pTETnir15で免疫されたマウスの場合、フィーダー細胞は同様に免疫された動物から得た。赤血球溶解とRPMI1640で２回の洗浄後に、細胞を2000radでＸ線照射し、更に２回洗浄した。これらの抗原供与細胞を完全培地に再懸濁して、Ｔ細胞と最終比率1:1にした。
IL−２生産およびアッセイ
Ｔ細胞懸濁物を上記のようにプレート培養した。２日後に、上澄50μｌを回収し、培地50μｌ中１×104細胞／ウェルのCTLL−２（IL−２依存性）に加えた。CTLL−２細胞をDr.J.Ellis,University College,London,UKから得て、上記のように補充されたRPMI1640で維持し、牛胎児血清の代わりに新生牛血清を用いた。20時間後、PBS中濃度5mg/mlのMTT20μｌを加えた。MTT形質転換を他で示されたように測定した（Tada et al,J.Immunol.Method,93,157−165,1986）。結果は、630nmの参照フィルターを用いて、570nmで３回の光学密度読取りの平均として表示した。有意性は学生用（Student′ｓ）ｔ検定により調べた。
細菌サンプル寄託
Salmonella typhimurium株SL3261−pTECH1、SL3261−pTECH1−P28、SL3261−pTECH2、SL3261−pTECH2−P28オクタマーおよびPTE79は、the National Collection of Type Cultures,61 Colindale Avenue,London,NW9 5HT,UKに、1993年７月15日付で、各々寄託番号NCTC 12831、NCTC 12833、12832、12834および12837として寄託した。
0003633933.tif 000004
0003633933.tif 000005
0003633933.tif 000006
（１）一般的情報
（ｉ）出願人
（Ａ）名称：メデファホールディングスBV
（Ｂ）通り：チャーチルラーン223
（Ｃ）市：アムステルダム
（Ｄ）国：オランダ国
（Ｅ）郵便番号（ZIP）:1078ED
（ii）発明の名称：ワクチン
（iii）配列の数:20
（iv）コンピューターの読み取り可能な形式
（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM  PC互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MSDOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release＃1.0 Version＃1.25（EPO）
（vi）先の出願のデータ
（Ａ）出願番号:GB  9216317.9
（Ｂ）出願日:1992年７月31日
（vi）先の出願のデータ
（Ａ）出願番号:GB  9306398.0
（Ｂ）出願日:1993年３月26日
（２）配列情報No:1:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:68塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（vi）起源：
（Ａ）生物名：大腸菌
（ix）配列の特徴：
（Ａ）NAME/KEY:プロモーター
（Ｂ）存在位置:1..61
（xi）配列:No:1:
0003633933.tif 000007
（２）配列情報No:2:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:68塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:2:
0003633933.tif 000008
（２）配列情報No:3:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:60塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:3:
0003633933.tif 000009
（２）配列情報No:4:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:21塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:4:
0003633933.tif 000010
（２）配列情報No:5:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:64塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:YES
（xi）配列:No:5:
0003633933.tif 000011
（２）配列情報No:6:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:33塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:6:
0003633933.tif 000012
（２）配列情報No:7:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:29塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:7:
0003633933.tif 000013
（２）配列情報No:8:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:31塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:8:
0003633933.tif 000014
（２）配列情報No:9:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:78塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:9:
0003633933.tif 000015
（２）配列情報No:10:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:78塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:10:
0003633933.tif 000016
（２）配列情報No:11:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:66塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:11:
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（２）配列情報No:12:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:66塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:12:
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（２）配列情報No:13:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:13:
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（２）配列情報No:14:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:30塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:14:
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（２）配列情報No:15:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:57塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:15:
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（２）配列情報No:16:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:57塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:16:
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（２）配列情報No:17:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:3754塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:17:
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（２）配列情報No:18:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:3769塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（xi）配列:No:18:
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（２）配列情報No:19:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:38塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）配列の種類:DNA（Genomic）
（iii）ハイポセティカル:NO
（iii）アンチセンス:NO
（ｖ）フラグメント型：中間部フラグメント
（xi）配列:No:19:
0003633933.tif 000029
（２）配列情報No:20:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ:14アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ｖ）フラグメント型：中間フラグメント
（xi）配列:No:20:
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図６】
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0003633933.tif 000040
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【図７】
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0003633933.tif 000043
【図９】
0003633933.tif 000044
【図１０】
0003633933.tif 000045
【図１１】
0003633933.tif 000046
【図１２】
0003633933.tif 000047
0003633933.tif 000048
0003633933.tif 000049
【図１３】
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0003633933.tif 000051
0003633933.tif 000052
【図１４】
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