(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト核酸試料からヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子を得、その上流のプロモーター領域に存在する２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定することを特徴とする精神分裂病の発症危険度及び／又は重症化因子の検出方法。
【請求項２】
前記ヒト核酸試料がヒト血液から抽出したＤＮＡである、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
ヒト核酸試料から得られたヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の上流領域を増幅し、増幅されたＤＮＡの２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定する、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号６に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるアンチセンスプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅を行う請求項１〜３何れか一項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記センスプライマーと、前記アンチセンスプライマーとを用いて増幅されたＤＮＡ断片が８０〜２００塩基対である請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
配列番号３に示す塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマー対。
【請求項７】
請求項６記載のプライマー対を用いた請求項１〜５何れか一項に記載の検出方法。
【請求項８】
配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号６に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるアンチセンスプライマーとを含むことを特徴とするヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の上流領域に存在する２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定するためのキット。
【請求項９】
前記センスプライマーが配列番号３に示す塩基配列からなり、前記アンチセンスプライマーが配列番号４に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
下記一般式（１）
５’Ｘ（ＧＴ）ｎＹ３’      （１）
(式中、Ｘは配列番号１に示す塩基配列であり、Ｙは配列番号２に示す塩基配列であり、ｎは１〜１００の整数である）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と、これと機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載の組換えベクターを用いた、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の転写促進物質及び／又は抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体２Ａサブユニット（ＮＲ２Ａ）遺伝子の調節領域及びその検出方法に関し、より詳細には、ヒトＮＲ２Ａ遺伝子上流に存在する２塩基（ＧＴ）ｎ／（ＣＡ）ｎ反復配列の繰返し数を測定することを特徴とする精神分裂病の発症危険度及び／又は重症化因子の検出方法及びそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
精神分裂病は、複雑な遺伝的背景を有する一般的且つ重篤な精神的疾患である。薬理学的又は他の生物学的研究によって種々の発症機構の仮説や原因となる遺伝子の候補が提唱されているが、精神分裂病の正確な病因については未だ明らかではない(Gainetdinov R.R. et al. Trends Neurosci. 24, 527-533 (2001)及びGlenthoj B.Y. & Hemmingsen R. Acta Psychiatr Scand Suppl. 395, 105-112  (1999)参照)。
【０００３】
これまで、精神分裂病の罹患しやすさと関連する遺伝子多型としては、ドーパミンＤ３受容体の９番目のセリン／グリシンの多型が報告されている（Williams J. et al., Mol. Psychiatry, 1998, 3, 141-149）。しかしながら、上記一塩基多型では、罹患危険率が１．１５倍上昇するという弱い効果しかもたないことと、細胞実験レベルでの病態への関与が不明であることが問題である。
【０００４】
また、カテコールアミンの生合成経路の律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子の第一イントロン内に存在するマイクロサテライトＤＮＡの特定の対立遺伝子が精神分裂病と関連していることが報告されている（特表平１１−５０４８０９号公報参照）。該特定の対立遺伝子は、精神分裂病の１つの決定因子と考えられるが、極めて頻度が低いため、その他の重要な危険因子についても検討する必要がある。
【０００５】
さらに、精神分裂病では、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の機能低下を示唆する間接証拠があり、「ＮＭＤＡ受容体機能低下説」が唱えられている。これは、フェンシクリジン（ＰＣＰ）やケタミン等のＮＭＤＡ受容体複合体の非競合型アンタゴニストを正常人に投与した場合に、精神分裂病の臨床的特徴と極めて類似した行動及び認識の欠如が認められることに基づいている。これらの症状は、正常な機能の過剰やひずみとして概念化され、典型的には、幻覚や妄想を含む陽性症状(Positive symptoms)と、正常な機能の減少や欠損を反映すると考えられている感情鈍麻や自閉性等からなる陰性症状(Negative symptoms)を含んでいる。ＮＭＤＡ受容体のアンタゴニスト（拮抗薬）は精神分裂病患者の症状を悪化させることもできる(Javitt D.C. & Zukin SR. Am.J. Psychiatr. 148, 1301-1308 (1991)及びMalhotra A.K. et al. Neuropsychopharmacology 17, 141-150 (1997)参照)。
【０００６】
ヒトＮＭＤＡ受容体複合体は、陽イオンチャンネル型の受容体であって、活性化されるとナトリウム、カリウムイオンだけでなくカルシウムイオンに対しても高い透過性を示す。この受容体複合体を構成するサブユニットには、ＮＲ１、ＮＲ２Ａ、ＮＲ２Ｂ、ＮＲ２Ｃ、ＮＲ２Ｄ、ＮＲ３Ａ及びＮＲ３Ｂという７種類が存在し、ＮＲ１と４種類のＮＲ２サブユニット及び２種類のＮＲ３サブユニットの何れか１つとでヘテロダイマーを形成する(Dingledine R. et al. Pharmacol. Rev. 51, 7-61 (1991)参照)。ＮＲ２Ａサブユニットは思春期以降に発現し、成人期を通じて安定して維持される(Watanabe M. et al. Neuroreport 3, 1138-1140 (1992)参照)。精神分裂病の患者の４分の３は１６〜２５歳の間に発病し、上述したＮＭＤＡ受容体複合体の非競合型アンタゴニストは、思春期以前の個体には精神異常の特徴を誘導しない(Baldridge E. B. & Bessen H.A. Emerg. Med. Clin. North Am. 8, 541-550 (1990)及びReich D.L. & Silvag G. Can. J. Anaesth. 36, 186-197 (1989)参照)。
【０００７】
しかし、このように精神分裂病との関連性が示唆されるヒトＮＭＤＡ受容体については、これまで具体的な分子異常は同定されておらず、特にＮＲ２Ａサブユニットは精神分裂病の病態生理学にとって重要な候補であるだけでなく、分子的レベルでの解析が必要とされている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＭＤＡ受容体の遺伝子構造を解析することにより、精神分裂病との関連性を解明することを目的とする。また、その結果得られた知見に基づいて、精神分裂病の診断に有用な方法やその方法に使用するプライマー及びキットを提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、このような遺伝子の解析に基づいて、精神分裂病の新規な治療薬をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
精神分裂病は思春期以降に発病することから、本発明者等はＮＭＤＡ受容体のうち思春期以降に発現する２Ａサブユニットに注目し、このＮＲ２Ａ遺伝子の構造を詳細に研究した。その結果ＮＲ２Ａ遺伝子上流のプロモーター領域に存在するマイクロサテライト反復配列（２塩基（ＧＴ）ｎ／（ＣＡ）ｎ反復配列）が多型性を有し、このマイクロサテライト反復配列多型の種類と、精神分裂病の罹患しやすさ、及び／又は症状の重症化との間に顕著な相関関係があることを見出すことによって本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の視点において、ヒト核酸試料からヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子を得、その上流のプロモーター領域に存在する２塩基（ＧＴ）ｎ／（ＣＡ）ｎ反復配列の繰返し数を測定することを特徴とする精神分裂病の発症危険度及び/又は重症化因子の検出方法が提供される。
【００１２】
前記検出方法の好ましい実施形態において、ヒト核酸試料がヒト血液から抽出したＤＮＡであることを特徴とする。
【００１３】
更に好ましい実施形態において、前記検出方法は、ヒト核酸試料から得られたヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の上流領域を増幅し、増幅されたＤＮＡの２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定することを特徴とする。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、前記ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の上流領域の増幅が、配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号６に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるアンチセンスプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応により増幅を行うことを特徴とする。
【００１５】
更に別の好ましい実施形態において、前記センスプライマーと、前記アンチセンスプライマーとを用いて増幅されたＤＮＡ断片は８０〜２００塩基対であることを特徴とする。
【００１６】
本発明の第２の視点において、配列番号３に示す塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーとからなるプライマー対が提供される。このプライマー対は、前記精神分裂病の発症危険度、及び/又は重症化因子の検出に用いることができる。
【００１７】
本発明の第３の視点において、配列番号５に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号６に示す塩基配列のうち連続する１８〜２５の塩基配列からなるアンチセンスプライマーとを含むことを特徴とする、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の上流領域に存在する２塩基（ＧＴ）ｎ／（ＣＡ）ｎ反復配列の繰返し数を測定するためのキットが提供される。
【００１８】
好ましい実施形態において、前記キットに含まれるセンスプライマーが配列番号３に示す塩基配列からなり、アンチセンスプライマーが配列番号４に示す塩基配列からなることを特徴とする。
【００１９】
本発明の第４の視点において、下記一般式（１）
５’Ｘ（ＧＴ）ｎＹ３’      （１）
(式中、Ｘは配列番号１に示す塩基配列であり、Ｙは配列番号２に示す塩基配列であり、ｎは１〜１００の整数である）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片と、これと機能的に連結されたレポーター遺伝子とを含むことを特徴とする組換えベクターが提供される。この組換えベクターを用いて、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子の転写促進物質及び／又は抑制物質をスクリーニングすることができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本明細書において使用する「対立遺伝子」(allele)とは、特定の遺伝形質に関する２つ或はそれ以上の遺伝子の択一的な型の一つ一つの遺伝子型のことをいう。被験者が２つの同一の対立遺伝子を持つ場合には「ホモ接合性」(homozygous)と呼ばれ、２つの異なる対立遺伝子を持つ場合には「ヘテロ接合性」(heterozygous)と呼ばれる。また、「遺伝子型」(genotype)とは、着目する遺伝子座の対立遺伝子の組合せをいう。対立遺伝子型及び遺伝子型の統計的解析には、例えばモンテカルロ法（ＣＬＵＭＰプログラム、Sham P.C. & Curtis P. Ann. Hum. Genet. 59, 97-105 (1995)参照）を用いて行うことができ、ＣＬＵＭＰプログラムは、http://linkage.rockefeller.edu/.から入手できる。
【００２１】
「連鎖不平衡」(linkage disequilibrium)とは、２つの対立遺伝子が所定の母集団において非独立的に遺伝することが認められるような場合をいう。２つの対立遺伝子が独立して遺伝する場合の予想される頻度は、第１の対立遺伝子の頻度と第２の対立遺伝子の頻度との積となるが、このような場合を「連鎖平衡」(linkage equilibrium)という。「ハプロタイプ」(haplotype)とは、２以上の対立遺伝子が一緒に遺伝する（連鎖不平衡）一組の対立遺伝子のことをいう。連鎖不平衡の強さを調べるにはハプロタイプの構築、頻度の推定が必要である。連鎖不平衡係数Ｄ(disequilibrium coefficient)は、Ｄ＝ｈ−ｐ１ｐ２で表され、ｈはハプロタイプの頻度、ｐ１、ｐ２は２つの遺伝子座における２つの対立遺伝子の頻度である。Ｄは正の値になったときに連鎖不平衡が強いということができる。  Hardy-Weinberg平衡、２つの遺伝子座の連鎖不平衡及びハプロタイプ頻度の推定は、Arlequinソフトウエア(Schneider等)を用いて行うことができ、http://anthropologie.unige.ch/arlequin/methods.htmlから入手することができる。
【００２２】
「多型」(polymorphism)とは、遺伝子又はその一部において２以上の型が存在することをいう。多型部位は一塩基対の場合（ＳＮＰ）も、或は一定の長さの塩基対の場合もある。「マイクロサテライト」(microsatellite)とは、ゲノム上で比較的豊富に存在する１〜６塩基程度の反復配列をいう。ヒトゲノムには多くの場所に分散して２塩基の反復配列(ＧＴ)ｎ／（ＣＡ）ｎの存在が知られており、個体によってこの反復回数に相違が見られるケース（多型）が多く観察されている。これらのマイクロサテライト反復配列は、遺伝子の転写活性を調節する機能的役割を有することも報告されている。
【００２３】
（ＮＲ２Ａ遺伝子上流に存在するマイクロサテライト反復配列を含むＤＮＡ断片）
本発明に係るマイクロサテライト反復配列を含むＤＮＡ断片は、ヒト１６番染色体(16p13.3)におけるＮＲ２Ａ遺伝子上流のプロモーター領域に存在する。図１はこのＮＲ２Ａ遺伝子の構造とマイクロサテライト反復配列及びその他の一塩基多型の存在する位置を示したものである。このマイクロサテライト反復配列（ＧＴ）ｎの繰返し数は、本発明者等の調べた被験者集団においては、１１〜３９回の範囲内で変動し、最も高頻度で見出される対立遺伝子は２４回の繰返し数を有していた。本明細書の以下の実施例において詳細に説明するように、（ＧＴ）ｎの繰返し数が２５回以上の対立遺伝子を有する被験者は精神分裂病に罹患しやすく、及び／又は症状の重症化を示す。また、上記繰返し数が増加するに従って、ＮＭＤＡ受容体遺伝子の転写活性が低下することが、この２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮＡ断片と機能的に結合したレポーター遺伝子の発現量を測定することによって示された。これらの結果は、精神分裂病の診断や治療或は新規な治療薬の開発においても、上記２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮＡ断片の有用性を示すものである。
【００２４】
これらのＤＮＡ断片としては、例えば、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子上流に存在する２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮＡ断片であって、下記一般式（１）
５’Ｘ（ＧＴ）ｎＹ３’      （１）
（式中、Ｘは配列番号１に示す塩基配列であり、Ｙは配列番号２に示す塩基配列であり、ｎは１〜１００の整数である）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片がある。上記一般式（１）において、配列番号１に示した塩基配列Ｘは、２塩基ＧＴ反復配列の上流の単一なゲノム塩基配列であり、配列番号２に示した塩基配列Ｙは、２塩基ＧＴ反復配列の下流の単一なゲノム塩基配列である。配列Ｙは、ヒトＮＭＤＡ受容体遺伝子のプロモーター配列と転写開始部位（ｍＲＮＡの５’末端に対応する配列）を含む。（ＧＴ）ｎが２５回以上繰返す反復配列は精神分裂病患者において多く認められることから病気との関連性が示唆される。このＤＮＡ断片の下流に種々のレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子や緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子等を連結し、脳由来の培養細胞に導入することにより、これらのレポーター遺伝子の発現産物（例えば、蛍光強度）に基づいて、精神分裂病と関連性の高いＮＲ２Ａ遺伝子の発現調節機構を容易に解析することができる。
【００２５】
上記レポーター遺伝子を含むベクターは、当業者において公知のものの中から適宜選択して使用することができる。例えば、真核細胞のプロモーター配列とエンハンサー配列を除去したプラスミドに組換えホタルルシフェラーゼ遺伝子とポリアデニル化部位等を備えたベクターが市販されている（プロメガ社製、ルシフェラーゼレポーターベクター等）。これらのベクターのマルチクローニング部位に上記一般式（１）で表された塩基配列からなるＤＮＡ断片を挿入することによって、ＮＲ２Ａ遺伝子の発現に関わる制御因子の機能を迅速且つ簡単に解析することができる。これらの組換えベクターをトランスフェクトした細胞では、レポーター遺伝子上流に適切な方向性で挿入したＮＲ２Ａ遺伝子のプロモーター活性を、発現させたレポーター遺伝子産物の量（例えばルシフェラーゼの酵素活性量）として測定することができる。
【００２６】
このプロモーター活性の評価は、精神分裂病の診断や治療の方針を作成するにあたり、或は新規な医薬品の開発にとって極めて重要な手がかりとなる。例えば、試験管内の培養細胞系において、該ＤＮＡ断片に含まれるＮＲ２Ａ受容体遺伝子の発現調節領域に働いてその転写を促進又は抑制するような物質（薬剤）のスクリーニングが可能となる。これによって精神分裂病の新規な治療薬を探索することができる可能性がある。
【００２７】
具体的なスクリーニング方法としては、（ａ）候補化合物の存在下で培養した脳由来の細胞に、上記一般式（１）で表された塩基配列からなるＤＮＡをルシフェラーゼ遺伝子と機能的に結合させた組換えベクターで形質転換し、一定時間培養後に該形質転換細胞の蛍光強度を検出する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で検出された蛍光強度を、前記候補化合物非存在下での蛍光強度と比較して、その蛍光強度を増強したり低下させたりする候補化合物を選択する工程、を含む。前記候補化合物としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸又はその誘導体、合成又は天然化合物などが挙げられるがこれらに限定されない。上記培養細胞の種類や培養方法、或はレポーター遺伝子の種類やそれに対応した検出方法等は当業者において容易に最適化することができる。
【００２８】
（２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数の測定方法、その方法に用いるプライマー対及びキット）
以下の実施例において詳細に説明するように、本発明は、ヒトＮＲ２Ａ遺伝子上流のプロモーター領域に存在する２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数と精神分裂病との関連性に関する知見に基づいて、精神分裂病の発症危険度（罹患しやすさ）及び／又は症状の重症化因子を検出する方法、その方法に用いるプライマー対及びキットを提供する。
【００２９】
一つの実施形態において、上記精神分裂病の発症危険度及び／又は症状の重症化因子の検出方法は、（ａ）被験者から核酸を含む試料を取得する工程、（ｂ）該試料中におけるヒトＮＭＤＡ受容体２Ａサブユニット（ＮＲ２Ａ）遺伝子の上流領域を増幅する工程、及び（ｃ）該上流領域に存在する２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定する工程を含み、該２塩基ＧＴ反復配列が、少なくとも一方の対立遺伝子において２５回以上繰り返すと、被験者が精神分裂病に罹患しやすく、及び／又は症状が重症化しやすいことを示唆する。
【００３０】
本発明の検出方法は、被験者のゲノムＤＮＡを含む核酸試料を用いて行う。これらの試料は被験者の組織、細胞、血液等を含む。特に、簡単な採血によって容易に得られる血液細胞（例えば静脈血から得られる白血球）が好ましい。その他、繊維芽細胞、上皮細胞、ケラチノサイトなどのような他の細胞も使用できる。更に、毛髪や皮膚等の乾燥試料を用いて行うこともできる。
【００３１】
本発明の検出方法によれば、被験者からの核酸試料はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や連結酵素連鎖反応（ＬＣＲ）等の適当な方法により増幅される。ＤＮＡを増幅するための種々の方法は当業者に公知であり、例えば、所望のＤＮＡ断片をクローン化したり、ＰＣＲ、ＬＣＲ、鎖置換増殖方法(Walker G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 392-396 (1992))、転写反応に基づいた増殖方法（ Kwoh D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, 1173-1177 (1989))、自己持続複製反応(Guatelli J. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1874-1878 (1990))、Ｑ−βレプリカーゼシステム(Lizardi P. et al. Bio/Technology 6, 1197-1202 (1988))、核酸配列に基づいた増殖反応（ＮＡＳＢＡ）(Lewis R. Genetic Engineering News 12, 1 (1992))、修復連鎖反応（ＲＣＫ）等により行うことができるがこれらに限定されない。
【００３２】
増殖反応産物は、種々の方法により検出することができ、例えば、塩基配列の決定、一本鎖立体配置の解析、分子量の測定、及び制限酵素切断後の分子量測定等が含まれる。これらの２以上の技術を組合せて行う事もまた可能である。分子量の測定は最も簡便な方法として特に好ましく、当業者に公知の種々の方法がある。例えば、ポリアクリルアミド電気泳動やキャピラリー電気泳動、或は質量分析法(WO 94/16101, Cohen et al. Adv. Chromatogr. 36, 127-162 (1996), Griffin et al. Appl. Biochem. Biotechnol. 38, 147-159 (1993))によっても行うことができる。
【００３３】
一本鎖立体配置多型（ＳＳＣＰ）による検出技術もまた、アクリルアミドゲル等に基づく分離方法であるが、非変性条件下で行われる。好適なキャピラリー電気泳動によって行うこともできる。この技術は、種々のＤＮＡ断片をそれらの立体配置（コンフォメーション）に従って識別し得る(Orita et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86, (1989), Cotton Mutat. Res. 285, 125-144 (1993), Hayashi Genet. Anal. Tech. Appl. 9, 73-79 (1992))。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、以下の配列番号３及び配列番号４に示した塩基配列のプライマー対を用いるＰＣＲ法により、２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮＡ断片を増幅する。
5'-ATTCTGGCTCCCTGAGATCAGAG-3'（配列番号３）
5'-GCTGGGTACAGTTATCCCCCT-3'（配列番号４）
このプライマー対はそれぞれ２３塩基及び２１塩基の一本鎖ＤＮＡであって、本発明に係る２塩基ＧＴ反復配列の上流及び下流領域と特異的に結合し、その結果、約１３０塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。増幅されたＤＮＡ断片は塩基配列の決定又はＤＮＡ分子量の解析の何れの方法によっても２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数を測定することができる。増幅されたＤＮＡ断片の長さはプライマー対の設計によって任意の長さにすることができるが、ＤＮＡ断片の長さがあまりに短いと塩基配列の決定が難しく、又その長さがあまり長いと分子量の解析が困難となる。増幅反応は、当業者にとって公知の技術である４種類のデオキシヌクレオチドリン酸（ｄＮＴＰｓ）及びＴａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００３５】
ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅は、２ヶ所以上のゲノム領域を同時に増幅する複合増幅(multiplex amplification)を含む。例えば、ＰＣＲ産物の大きさが異なるようにプライマーを設計することによってＤＮＡ断片を同時に増幅し、及び解析することは当業者にとって公知である。或は、異なるＤＮＡ断片を増幅する際に、異なった標識（例えば蛍光波長の異なる色素）を持ったプライマーを用いることでもそれぞれを別々に検出することができる。その他、当業者において公知の技術を用いて２ヶ所以上のゲノム領域を同時に増幅することができる。
【００３６】
本発明の特に好ましい態様において、増幅されたＤＮＡ断片は、その長さを測定することによって検出され得る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、このような方法として当業者において周知であり、電気泳動用のゲルはポリアクリルアミドゲルの他にも適当なものを選択して使用することができる。アクリルアミドを使用する場合は、変性条件で3〜8％、好ましくは4-5％濃度のゲルが使用できる。その他、高性能ポリマーで作成されたキャピラリー電気泳動装置を用いることも可能である。適切な分子量マーカーを使用することによって、このような電気泳動の結果からそのＤＮＡ断片の大きさを正確に測定することは当業者において容易に行うことができる。
【００３７】
質量分析法は、増幅されたＤＮＡ断片の分子量を検出する方法であり、大量の試料を高速で処理できる方法として、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ  (matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight/mass spectrometry)がある。増幅されたＤＮＡ断片から塩、緩衝液、界面活性剤、タンパク質等の不純物を除去した後、ＭＡＬＤＩプレートへスポットして質量分析される。即ち、ＤＮＡ断片はレーザー光照射によりイオン化される。電荷を帯びた産物は質量分析機内に作られた電場内へ遊離し加速される。加速された電荷分子は真空空間を飛行し、測定板へと到達する。計測されるのはレーザー光照射から測定板までの飛行時間(time of flight)であり、この飛行時間は定められた電場空間、飛行空間においては荷電分子の質量／電荷により一義的に決まる。
【００３８】
本発明に係るＮＲ２Ａ遺伝子の上流領域に存在する２塩基ＧＴ反復配列を含むＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー対は、２塩基ＧＴ反復配列の両端の単一な塩基配列部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー対を公知の方法で化学合成して用いることができる。これらの各プライマーは、２５〜２５００塩基対離れた領域においてハイブリダイズすることができるが、増幅産物の塩基配列の決定又は分子量の解析を容易にするため、増幅産物の大きさが１００〜５００塩基対であることが好ましい。より好ましくは、増幅産物の大きさは８０〜２００塩基対である。配列番号５に示した塩基配列は、２塩基ＧＴ反復配列の５’上流領域の塩基配列であり、この配列の中から連続する１０〜３０塩基の任意の一本鎖のＤＮＡ配列を選択してセンスプライマーとすることができる。配列番号６に示した塩基配列は、２塩基ＧＴ反復配列の３’下流領域の塩基配列であり、この配列の中から連続する１０〜３０塩基の任意の一本鎖のＤＮＡ配列を選択してアンチセンスプライマーを合成することができる。これらのオリゴヌクレオチドプライマーの長さは１０〜３０塩基の範囲内であれば良いが、好ましくは１８〜２５塩基のものを、更に好ましくは配列番号３及び配列番号４に示したそれぞれ２３塩基及び２１塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。これらのプライマーは増幅されたＤＮＡ断片の検出を容易にするために標識することができる。標識としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光色素、ストレプトアビジン、アビジン、磁気ビーズ、抗原及び抗体等が用いられる。
【００３９】
ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ａサブユニット遺伝子上流に存在する２塩基（ＧＴ）ｎ／（ＣＡ）ｎ反復配列の繰返し数を測定するためのキットには、これらのプライマー対を含むことができる。これらのプライマー対のほかに当業者にとって公知の他の構成試薬、例えば、ＤＮＡの抽出や精製用の試薬を含んでいても良い。その他、４種類のデオキシヌクレオチドリン酸（ｄＮＴＰｓ）やＴａｑポリメラーゼ等の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等も含まれ得る。
【００４０】
（２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数と精神分裂病との関連性）
精神分裂病患者及び対照被験者の各対立遺伝子について測定された２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数の結果から、この２塩基ＧＴが２５回以上繰り返すと、精神分裂病に罹患しやすいことが分かる。例えば、図２は、本発明の実施例において解析された精神分裂病患者と対照者における（ＧＴ）ｎの対立遺伝子の分布を表すが、被験者対立遺伝子の中で最も頻度が高いのは２４回の繰返しであること及び２５回以上の繰返しを有する対立遺伝子は、対象者よりも精神分裂病患者に多いことが理解される。
【００４１】
本発明の検出方法を用いた精神分裂病の診断は、１つの対立遺伝子型だけでも、または複数の対立遺伝子からなる遺伝子型を調べることによってもできる。例えば、（ＧＴ）ｎの繰返し数の測定や、この繰返し数が一定の範囲内にあるものをグループとして同定することもできる。（ＧＴ）ｎの繰返し数は一定の範囲にわたって分布するため、多くの種類の対立遺伝子が存在することになるが、これらをその繰返し数が２５回以上のＬ型と、２４回以下のＳ型に分類することによって、便宜上２つの対立遺伝子として解析することができ、更に連鎖不平衡やハプロタイプの解析を行うために適している。このような２つの対立遺伝子型に分類することが遺伝学的に妥当であることは後述する実施例において詳細に示される。実施例に示した表２はこのような分類に従って行った症例対照法の結果を示す。表２に示したデータに基づいて説明すると、遺伝子型がＬ／Ｌというタイプの個人は、健常人対照群では１０％の頻度であるが、精神分裂病の患者では１９％の頻度で存在することから、Ｌ／Ｌという遺伝子型を有する個人は他の遺伝子型に比べて精神分裂病の発症の可能性が約１.９倍高いということができる。
【００４２】
本発明に係るマイクロサテライト反復配列の多型と精神分裂病患者の症状の重症度については、本発明の方法により測定された精神分裂病患者の２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数と、臨床的な症状を観察することによって明らかにすることができる。臨床的症状の観察は、精神科の医師により、米国精神医学会の精神疾患の診断・統計マニュアル第４版（ＤＳＭ−IV）に基づいて診断され、例えば、ＰＡＮＳＳ法を用いて行うことができる。
【００４３】
また、本発明の検出方法は、他の任意の測定方法と組合せて診断の正確性を向上することができる。他の方法は、遺伝子検査であっても血清タンパク質の検査であっても何れでも良い。例えば、同じＮＲ２Ａ遺伝子の近傍に存在する一塩基多型との組合せでもよいし、他の遺伝子（ＮＭＤＡ受容体遺伝子であるか否かを問わない）であっても良い。或は、血清中の神経伝達物質の濃度測定と組み合わせることもできる。
【００４４】
（薬理遺伝学）
また、すでに精神分裂病を発症している患者にとっては、その病因を解析することにより、適切な治療方針の可能性を見出すことができ、個人の遺伝的背景に基づいた薬理遺伝学を可能とする。例えば、本発明に係るマイクロサテライト反復配列についてＬ／Ｌ型の遺伝子型を有する精神分裂病患者または患者グループは、ＮＭＤＡ受容体の機能低下が病因となっている可能性があり、また、他の遺伝子型の患者に比べて症状が重症化しやすいことを予見でき、これらの知見に基づいて適切な治療薬や治療方針を計画することができる。例えば、神経伝達物質の１つであるグリシンは、アロステリック様の作用でＮＭＤＡ受容体を活性化し、精神分裂病のある種の陰性症状を改善することが知られている。本発明の方法により、精神分裂病の病因としてＮＭＤＡ受容体の機能の低下を検出することができれば、ＮＭＤＡ受容体を活性化することによる治療方法等が考えられ得る。
【００４５】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４６】
[実施例１]  被験者
精神分裂病の診断は、米国精神医学会の精神疾患の診断・統計マニュアル第４版（ＤＳＭ−IV）に基づいた。少なくとも２人の経験豊かな精神科医が診察を行って、一致した結果を基に患者と診断した。血縁関係のない精神分裂症の患者は、175人の男性（平均年齢44.9±12.4）と128人の女性（平均年齢46.2±13.9）から構成された。対照被験者は、精神病でないことが文書で証明された病院のスタッフ、及び精神科医の簡単な面接によって精神医学的に問題の無いことが示された企業勤務者から集められ、121人の男性（平均年齢42.9±8.8）と184人の女性（平均年齢42.7±15.1）を含んだ。家系に基づいた関連性の検討を行うため、49人の精神分裂病患者とその両親を別に収集した。すべての被験者は日本中部に在住した。本発明における遺伝子解析は、理化学研究所と東京医科歯科大学の倫理委員会によって許可されたものであり、すべての被験者はインフォームドコンセントを与えた。
【００４７】
[実施例２]  ＮＲ２Ａ遺伝子の構造と多型の解析
ＮＲ２ＡｃＤＮＡの５’末端を決定するためにMarathon-Ready cDNA kit (クロンテック社、Palo Alto, California)と、ＮＲ２ＡｃＤＮＡに特異的な２種類のプライマーＧＳＰ１： 5'-TCATCTCCAGGGCTGATGGCTGCGG-3'（配列番号７）及びＧＳＰ２：5'-ATTCTCAGCGCTCACCCGGTCCCAT-3' （配列番号８）とを用いてｃＤＮＡの５’末端の高速増幅(ＲＡＣＥ)を行い、５’−ＲＡＣＥ断片をクローニング及び塩基配列を決定した。さらに、26人の精神分裂病患者のＮＭＤＡ、ＮＲ２Ａサブユニット遺伝子のすべてのエクソン、スプライシングの境界領域及び５’上流領域をＰＣＲ直接塩基配列決定(PCR-direct sequencing)することによってＤＮＡ多型のスクリーニングを行った。プロモーター上流領域に存在する（ＧＴ）ｎ反復配列は、ＰＣＲ産物をＴＡベクター（インビトロジェン社、Carlsbad, California）にクローン化し、それらの塩基配列を決定した。
【００４８】
マイクロサテライト反復配列多型を含むゲノムＤＮＡ断片を増幅するために、非標識の上流プライマー：5'-ATTCTGGCTCCCTGAGATCAGAG-3'（配列番号３）と蛍光標識した下流プライマー：5'-GCTGGGTACAGTTATCCCCCT-3'（配列番号４）とを用いた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）を用いて、初期変性を９４℃で１分間行ったあと、９４℃で１５秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で４５秒間のサイクルを４０回、最後に７２℃で２分間の伸長反応を１回行った。ＰＣＲ産物はジーンスキャン（GeneScan）ソフトウエアを搭載したＡＢＩ３７００ＤＮＡシーケンサー（ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いて塩基配列を決定した。-1245位のＣからＴへの一塩基多型、1275位のＧからＡへの一塩基多型、及びイントロン１０の101位のＣからＴへの一塩基多型は、ＰＣＲに基づいた制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ)によって解析した。
【００４９】
その結果、ＮＲ２ＡｃＤＮＡの５’末端は、これまで報告されていた塩基配列（GenBank Acc. No. NM_000833.2）よりも１３５塩基対(bp)長いことを見出した。ＮＲ２Ａ遺伝子のゲノム構造はｃＤＮＡの塩基配列と、GenBankに登録された対応するゲノム領域を含むＢＡＣ(bacterial artificial chromosome)クローンの塩基配列とを比較して決定した。これらのＢＡＣクローンの登録番号はAC007596（エクソン１〜３を含む）、AC026423（エクソン４を含む）及びAC006531（エクソン５〜１４を含む）である。ＮＲ２Ａゲノム遺伝子は、図１に示したように１４個のエクソンからなり、ヒト１６番染色体の16p13.3に少なくとも１３１キロ塩基対(kb)にわたって存在する。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）はエクソン３にあり、終止コドンはエクソン１４にある。このＮＲ２Ａゲノムの遺伝子構造に基づいて、血縁関係のない２６人の精神分裂病患者のＮＭＤＡ、ＮＲ２Ａサブユニット遺伝子のすべてのエクソン、スプライシングの境界領域及び第１エクソンの上流1094塩基対までの領域について変異のスクリーニングを行った。その結果、以下の５ヶ所の多型部位が認められた：-1245位のＣからＴへの一塩基多型（-1245C>T）、５’調節領域の（ＧＴ）ｎの反復配列、-351位のＧからＡへの一塩基多型(-351G>A)、1275位のＧからＡへの一塩基多型(1275G>A)、及びイントロン１０の101位のＣからＴへの一塩基多型(IVS10+101C>T)である（塩基配列の番号は翻訳開始コドンのＡを＋１とし、イントロン部分は除いて計数した。但し、５’調節領域の（ＧＴ）ｎの反復回数はｎ＝２６とした。図１参照）。（ＧＴ）ｎの３’末端は-679位に位置した。調べた試料の中で、（ＧＴ）ｎの反復回数は１１個から３９個であった。-351位のＧからＡへの一塩基多型は、２６人の患者のうち１人のヘテロ対立遺伝子に存在する稀な多型であった。
【００５０】
[実施例３]  マイクロサテライト反復配列多型及びＳＮＰｓの遺伝子型と精神分裂病との相関性の統計的解析
-351G>Aを除き、すべての塩基配列の変異を日本人の精神分裂病患者303人と対照者305人の試料について分類した。-1245C>T、1275G>A、及びIVS10+101C>Tの一塩基多型についての遺伝子型及び対立遺伝子型を比較したが、精神分裂病と対照群とで有意な差は認められなかった（それぞれ、Ｐ＝0．36、0．73及び0．97）。すべての遺伝子型分布は、Hardy-Weinberg平衡の範囲内であった。これらの一塩基多型の間の連鎖不平衡解析の結果は、1275G>AとIVS10+101C>Tとの間には強い連鎖不平衡（精神病患者について：Ｄ＝0．036、Ｄ’（標準化したＤ）＝0．708、Ｐ＜0．00001；対照者について：Ｄ＝0．038、Ｄ’＝0．702、Ｐ＝0．00001）を示したが、-1245C>Tと1275G>A（Ｐ＞0．05）及び-1245C>TとIVS10+101C>T（Ｐ＞0．05）との間には連鎖不平衡は認められなかった。
【００５１】
【表１】
ＮＲ２Ａ遺伝子内に存在する一塩基多型の分布
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【００５２】
ヒトＮＲ２Ａ遺伝子の５’上流調節領域に存在するマイクロサテライト反復配列の対立遺伝子型(allele)及び遺伝子型(genotype)の比較は、モンテカルロ法により、ＣＬＵＭＰのプログラムを用いて行った。その結果、これらの対立遺伝子型と精神分裂病との間に顕著な相関（Ｐ＝0．0178）が認められた。
【００５３】
精神分裂病患者及び対照正常人の５’上流のプロモーター領域における２塩基ＧＴ反復配列の繰返し数の分布を図２に示した。繰返し数が２４回よりも多い対立遺伝子の頻度は、対照群よりも精神分裂病患者の方が大きいことから、このマイクロサテライト対立遺伝子をその長さによって２つのクラスに分類した。すなわち、その繰返し数が２５回以上のＬ型と、その繰返し数が２４回以下のＳ型である（図２参照）。Ｌ型とＳ型の対立遺伝子は、それぞれ-1245Ｃと-1245Ｔの一塩基多型と連結していた（精神分裂病患者についてＤ（Ｄ’）＝0．011（0．500）、Ｐ＝0．015；対照者についてＤ（Ｄ’）＝0．011（0．778）、Ｐ＝0．004）。これらの結果は、マイクロサテライト反復配列について上記Ｌ型及びＳ型という２種類の対立遺伝子への分類が遺伝学的に妥当であることを示し、このことは更に後述する機能的解析によっても支持される。
【００５４】
Ｌ型及びＳ型の２種類の対立遺伝子の分類に従って行った症例対照法の結果を表２に示した。その結果、この２種類の対立遺伝子に関する遺伝子型の分布は、精神分裂病の患者と対照群とで著しく異なっていた（CLUMP P=0.0035）。精神分裂病患者の試料の遺伝子型は、Ｌ／Ｌ型（Ｐ＝0．004、χ２＝8．42、ｄｆ＝１、オッズ比＝1．98、95％信頼区間＝1．24〜3．11）、及び（Ｌ／Ｌ＋Ｌ／Ｓ）型（Ｐ＝0．007、χ２＝7．22、ｄｆ＝１、オッズ比＝1．55、95％信頼区間＝1．12〜2．13）の数が著しく多く、Cochran-Armitage直線性傾向テストの結果、少なくとも１つのＬ型の対立遺伝子の存在によって、精神分裂病の危険性が著しく増加することが分かった（Ｐ＝0．003、χ２＝9．07、ｄｆ＝２）。更に、精神分裂病患者におけるＬ型の対立遺伝子の頻度は、対照群のそれと明らかに異なった（Ｐ＝0．0004、及びBonferroni相関後のＰ＝0．0008、χ２＝12．5、ｄｆ＝１、オッズ比＝1．54、95％信頼区間＝1．21〜1．95）（表２参照）。
【００５５】
【表２】
マイクロサテライト反復配列の遺伝子型及び対立遺伝子型の分布
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【００５６】
-1245C>Tの一塩基多型と（ＧＴ）ｎの２種類の対立遺伝子によって規定されるハプロタイプの分布は、精神分裂病と対照群とで著しく異なった（ＣＬＵＭＰ通常のカイ二乗Ｐ＝0．0016）。-1245ＣとＬ型の（ＧＴ）ｎからなるハプロタイプは精神分裂病において過度に存在していた（Ｐ＝0．001、χ２＝10．2、ｄｆ＝１）。このことは、マイクロサテライト反復配列の周辺のゲノム領域が精神分裂病の素因を与えることが確認された。
【００５７】
被験者である日本人集団は均一であると考えられるが、内在的な層別化のために症例対照法の結果に問題があり擬陽性の結果が得られる恐れもある。そこで、これを検証するため49の精神分裂病家系（精神分裂病患者とその両親）を用いて系統不平衡テスト（ＰＤＴ、Martin E.R. et al. Am. J. Hum. Genet. 67, 147-154 (2000)参照）を行い、その結果を下記表３に示した。ＰＤＴを行うためのソフトウエアはhttp://wwwchg.mc.duke.edu.から入手した。系統不平衡テスト（ＰＤＴ：pedigree disequilibrium test）は、多くの対立遺伝子の分析から生ずる統計的数値の上昇を、包括値(global score)を計算することにより是正することができる。この包括値を求めた結果、マイクロサテライト反復配列多型は全体として精神分裂病と関連していることが分かった（Ｐ＝0．026、χ２＝24．6、ｄｆ＝13）。表３に示したように、Ｌ型に分類される（ＧＴ）２５と（ＧＴ）２７の２つの対立遺伝子は、両親から患者である子孫に過度に伝達され、統計的な有意性（Ｐ＝0．003）と傾向（Ｐ＝0．070）を示した。
【００５８】
【表３】
マイクロサテライト反復配列の系統不平衡テスト（ＰＤＴ）結果
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【００５９】
[実施例４]  プロモーター活性の測定のためのルシフェラーゼアッセイ
上記マイクロサテライト反復配列はＮＲ２Ａ遺伝子の上流の発現調節領域に存在していたため、この２塩基（ＧＴ）ｎがプロモーター活性に及ぼす影響を、試験管内におけるレポーターアッセイシステムを用いて検討した。
（ＧＴ）ｎの繰返しが１２、２４及び３９であるホモ接合体ＤＮＡから、以下のプライマー対を用いて２塩基（ＧＴ）ｎを含むプロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅した。
【００６０】
5'-ATTCTGGCTCCCTGAGATCAGAG-3'（配列番号３）
5'-AAGCCCTAGGAGCTCCCCTCCA-3'（配列番号９）
【００６１】
増幅したそれぞれのＤＮＡ断片は、エンハンサーのないｐＧＬ３−ｂａｓｉｃプラスミド（プロメガ社、Madison, Wisconsin）に結合した。マイクロサテライト反復配列のない組換え体も同時に構築した。ヒト神経芽細胞腫細胞を２４穴プレートにそれぞれ１×１０５個ずつプレーティングし、１０％牛胎児血清添加したダルベッコ最小必須培地（シグマ社製、St. Louis, Missouri）で増殖させた。この培養細胞に、各プロモーター断片を持ったｐＧＬ３−ｂａｓｉｃプラスミド１μｇを、内部標準として用いたｐＲＬ−ＴＫプラスミド０．１μｇと共にLipofectAMINE 2000（Invitrogen社製）を用いて共形質転換（co-transfection）した。４８時間後、細胞を収集し、溶解してPicagene Dual Seapansy kit reagents (Toyo B-Net社製)とLumat LB 9507蛍光光度計（Berthold Direct, Chicago,
Illinois）を用いて蛍光強度を測定した。
【００６２】
その結果を図３に示した。図３の横軸に示した繰返し数の（ＧＴ）ｎ反復配列を含むプロモーターの転写活性を、レポーター遺伝子の発現産物であるルシフェラーゼ活性を指標として縦軸にプロットした。レポーター遺伝子の転写活性は、（ＧＴ）ｎの長さが長くなるに従って抑制されていることが分かった。最も一般的な繰返し回数である２４回の反復回数を有するプラスミドのプロモーター活性は、（ＧＴ）ｎ繰返し配列を持たない組換え体の約半分であった。（ＧＴ）３９の組換え体の活性は（ＧＴ）ｎ繰返し配列を持たない組換え体の活性の約３９％であった。
【００６３】
[実施例５]  ＭＫ８０１結合アッセイ
脳内において、ＮＭＤＡ受容体は皮質層で最も大量に発現されており、皮質層における受容体調節不全が精神分裂病の病理と関係づけられている。従って、遺伝子型の決定された死後脳の皮質層におけるＮＭＤＡ受容体の結合部位の数を、トリチウム標識したＭＫ８０１リガンドを用いて調べた。ＭＫ８０１（(+)-5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cycloheptane-5,10-imine）はＮＭＤＡ受容体のチャンネル孔に結合する非競合的なアンタゴニストであって高い親和性を有する。脳の解剖は、Toru等の方法(Toru M et al. Acta. Psychiatr. Scand. 78, 121-137 (1988))に従って行った。トリチウム標識したＭＫ８０１結合実験はKornhuber等の方法の変法により行った。即ち、神経細胞膜の標品(0.2 mg/ml)を1 mlのアッセイバッファー中で、3 nM [3H]MK801 (Perkin Elmer, Boston, MA), 10μM glycine (シグマ社)及び10μMの非標識ＭＫ８０１と共に３０℃、１５時間インキュベートした。その後、反応液をワットマンＧＦ／Ｂ濾紙（ケント社、UK）で濾過することによってインキュベートを停止した。
【００６４】
その結果を図４に示した。図４に示したように、２つのＬ型対立遺伝子を有する被験者（Ｌ／Ｌ）は、Ｓ型のホモ接合性対立遺伝子を有する被験者（Ｓ／Ｓ）に比べて、図中の（ａ）前頭皮質、（ｂ）頭頂皮質、（ｃ）側頭皮質、及び（ｄ）後頭皮質における[3H]MK801への特異的結合が１１％〜５％減少していた。全皮質層のデータをまとめると、図４（ｅ）に示したようにＬ／Ｌ遺伝子型の被験者試料はＳ／Ｓ遺伝子型の被験者試料よりも著しく結合部位が少なかった。
【００６５】
[実施例６]精神分裂病の臨床症状と（ＧＴ）ｎの長さとの相関
本発明者等は次に、（ＧＴ）ｎの繰返し数によって規定される遺伝子型と精神分裂病の臨床的表現型との関係について調べた。精神分裂病の症状の重症度を評価するために、患者の遺伝子型を知らない２人の精神科医の一致した診断によるＰＡＮＳＳ法を用いた。その結果を図５に示した。図５に示したように、より長い繰返し数を有するホモ接合性の対立遺伝子を持つ被験者は、陽性及び陰性症状共に大きなスコアを示した。（ＧＴ）２３／（ＧＴ）２３、（ＧＴ）２４／（ＧＴ）２４、及び（ＧＴ）２５／（ＧＴ）２５のホモ接合性の対立遺伝子を持った患者は、（ＧＴ）２２／（ＧＴ）２２のホモ接合性の対立遺伝子を持った患者に比べて、それぞれ50％、69％及び106％の陽性症状の増加を示した。（ＧＴ）ｎの長さと陽性症状の相関係数（ｒ）は0．986（Ｐ＝0．007）であった。同様に、（ＧＴ）ｎの繰返し数と陰性症状の重症度とのあいだにも正の相関性が認められた（ｒ＝0．882、Ｐ＝0．05）。
【００６６】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、ヒトＮＲ２Ａ遺伝子のプロモーター領域にある２塩基（ＧＴ）ｎ／（ＣＡ）ｎ反復配列の繰返し数を調べることにより、被験者が精神分裂病に罹患しやすく、及び／又は症状が重症化しやすいか否かが示される。この方法は精神分裂病の診断や治療薬の選択等、個人の遺伝的素因に基づいた医療の提供を可能とする。また、本発明の一般式（１）で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片は、精神分裂病患者におけるＮＲ２Ａ遺伝子の発現調節機構の研究や、ＮＲ２Ａ遺伝子の発現調節に効果のある薬剤のスクリーニングに有用である。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＭＤＡ受容体のＮＲ２Ａサブユニット遺伝子の構造と多型部位を示した図である。塩基配列の位置は、翻訳開始コドンのＡを＋１として計数し、表示した。箱型はエクソンを表示し、内部の数字はエクソンの大きさ（塩基対）を示す。水平方向の矢印は、該当領域の塩基配列がGenBankに登録されているＢＡＣクローンの番号を示す。
【図２】精神分裂病患者と対照者における（ＧＴ）ｎの対立遺伝子の分布を表す。対立遺伝子の大きさ（横軸）はＧＴ反復配列の繰返し数を示す。
【図３】（ＧＴ）ｎのプロモーター活性に及ぼす影響を示す。ルシフェラーゼ活性（縦軸）は、２４回の繰返し数を有する組換え体の蛍光強度に対する相対値で示す。それぞれの値は、４回の独立した形質転換実験（３重測定）の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図４】死後脳の大脳皮質におけるトリチウム標識ＭＫ８０１の結合を表す。結合部位の数は、Ｓ／Ｓ遺伝子型（５人の精神分裂病患者及び７人の正常人）及びＬ／Ｌ遺伝子型（１人の精神分裂病患者及び１人の正常人）の個人の（ａ）前頭部、（ｂ）頭頂部、（ｃ）側頭部、（ｄ）後頭部及び（ｅ）全体の皮質について測定した。結合部位の数は、それぞれの部位について１４人の被験者平均値に対する百分率（％）で表した。Ｐ＝0．0054
【図５】症状の重症度とＧＴ反復配列の長さの関係を表す。データ（縦軸）は、ＰＡＮＳＳ法による陽性及び陰性度の平均値±ＳＥＭを表す。診断された患者の数は、（ＧＴ）２２／（ＧＴ）２２遺伝子型については１人、（ＧＴ）２３／（ＧＴ）２３遺伝子型については２人、（ＧＴ）２４／（ＧＴ）２４遺伝子型については５人、及び（ＧＴ）２５／（ＧＴ）２５遺伝子型については５人である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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