(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）親ポリヌクレオチド変種よりも多くの組換えポリヌクレオチドを親ポリヌクレオチド変種間の組換えにより発生させることができる十分な相違を有する親ヌクレオチド変種の第１のプールおよび第２のプールをインキュベートすることであって、インキュベートが、第１のプール内のいずれかのポリヌクレオチド変種に由来する鎖が、第２プール内のいずれかのポリヌクレオチドに由来する鎖とアニールして、ヘテロ二本鎖を含むアニールしたポリヌクレオチドを発生させることができる条件下で行われること、
（ｂ）ヘテロ二本鎖を親ポリヌクレオチド変種または組換えポリヌクレオチド変種に転換するためにヘテロ二本鎖をＤＮＡ修復システムに曝すこと、および
（ｃ）望みの機能的特性をもつ組換えポリヌクレオチド変種を選別または選択することを含む、
望みの特性の獲得に向かってポリヌクレオチドを進化させる方法。
【請求項２】
ヘテロ二本鎖がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ修復システムに曝される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヘテロ二本鎖を細胞に導入することによってヘテロ二本鎖をｉｎ  ｖｉｖｏで細胞のＤＮＡ修復システムに曝す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アニールしたポリヌクレオチドがさらにホモ二本鎖を含み、導入するすることにおいてホモ二本鎖を受ける細胞に対してヘテロ二本鎖を受ける細胞を選択する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）親ポリヌクレオチド変種よりも多くの組換えポリヌクレオチドを親ポリヌクレオチド変種間の組換えにより発生させることができる十分な相違を有する親ヌクレオチド変種の集団を、ヘテロ二本鎖を含むアニールしたポリヌクレオチドを発生する条件下でインキュベートすること、
（ｂ）ヘテロ二本鎖を親ポリヌクレオチド変種または組換えポリヌクレオチド変種に転換するためにヘテロ二本鎖をＤＮＡ修復システムにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝すこと、および  （ｃ）望みの機能的特性をもつ組換えポリヌクレオチド変種を選別または選択することを含む、
望みの特性の獲得に向かってポリヌクレオチドを進化させる方法。
【請求項６】
ＤＮＡ修復システムが細胞抽出物に含まれるＤＮＡ修復システムである請求項２または５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５の（ｂ）の産物を細胞に導入することをさらに有する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記導入することが改質された親ホモ二本鎖に対してヘテロ二本鎖を選択する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）親ポリヌクレオチド変種よりも多くの組換えポリヌクレオチドを親ポリヌクレオチド変種間の組換えにより発生させることができる十分な相違を有する親ヌクレオチド変種の集団を、ヘテロ二本鎖を含むアニールしたポリヌクレオチドを発生する条件下でインキュベートすること、
（ｂ）アニールしたポリヌクレオチドを、ＤＮＡ修復システムを有する細胞に導入し、そして、ホモ二本鎖を受ける細胞に対して、ヘテロ二本鎖を受ける細胞を選択し、かつヘテロ二本鎖を親ポリヌクレオチド変種または組換えポリヌクレオチド変種に転換する条件下で細胞を増殖させること、および
（ｃ）望みの機能的特性をもつ組換えポリヌクレオチド変種を選別または選択することを含む、
望みの特性の獲得に向かってポリヌクレオチドを進化させる方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド変種が、ある遺伝子の対立のまたは同族の変種、またはエラープローンＰＣＲによって生成された突然変異体またはカセット式変異の誘発により生成された突然変異体を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が細菌細胞である請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１ポリヌクレオチド変種が第１ベクターの成分として提供され、第２ポリヌクレオチド変種が第２ベクターの成分として与えられ、方法がさらに第１および第２ベクターを、第１および第２ポリヌクレオチド変種が反対側末端で生じる線形化された形に変換することを含み、それによってインキュベート段階で第１線形化ベクターの一本鎖形が互いに再アニールされ、線形第１ベクターを形成し、第２線形化ベクターの一本鎖形が互いに再アニールされ、線形第２ベクターを形成し、第１および第２ベクターの一本鎖線形化された形が互いにアニールされ、各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を形成し、前記導入することが線形第１および第２ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖又はこれから誘導された組換えポリヌクレオチドを受ける細胞を選択する請求項４、８、９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
第１および第２ベクターがＰＣＲにより線形化された形に変換される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１および第２ベクターが第１および第２制限酵素での消化により線形化された形に変換される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドの集団が、二本鎖形で与えられる第１および第２ポリヌクレオチドを含み、さらに第１および第２ベクターの成分として第１および第２ポリヌクレオチドを取り込むことを含み、それによって第１および第２ポリヌクレオチドは第１および第２ベクターの反対側の末端を占め、それによってインキュベートすることで第１線形化ベクターの一本鎖形が互いに再アニールされて線形第１ベクター形成し、第２線形化ベクターの一本鎖形が互いに再アニールされて線形第２ベクターを形成し、第１および第２ベクターの一本鎖線形化された形が互いにアニールされ、各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を形成し、導入することが線形第１および第２ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖又はこれから誘導された組換えポリヌクレオチドを受ける細胞を選択する請求項４、８、９または１０に記載の方法。
【請求項１６】
導入することの前に共有結合で閉じた環状ヘテロ二本鎖を形成するためにヘテロ二本鎖中のニックを封じることをさらに含む請求項４、８、９または１０に記載の方法。
【請求項１７】
ポリヌクレオチド変種の集団が二本鎖形で与えられ、さらにアニールされる前に二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに変換することを含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項１８】
変換することにおいて、第１ポリヌクレオチド変種の第１鎖、および第２ポリヌクレオチド変種の第２鎖を増幅するために、第１および第２二本鎖ポリヌクレオチド変種の非対称増幅を行うことを含み、それによって第１および第２鎖が、インキュベートされるときにアニールされてヘテロ二本鎖を形成する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１および第２二本鎖ポリヌクレオチド変種がベクターなしの形で与えられ、さらにベクターにヘテロ二本鎖を取り込むことを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１および第２ポリヌクレオチドが染色体ＤＮＡ由来である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）〜（ｃ）が繰り返えされることを更に含み、後続する繰り返し周期におけるインキュベートすることが先行する繰り返し周期で得られた組換え変種に対して行われる請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２２】
ポリヌクレオチド変種がポリペプチドを符号化する請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２３】
ポリヌクレオチド変種の集団が少なくとも２０の変種を含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド変種の集団が少なくとも長さ１０ｋｂである請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチド変種の集団が天然変種を含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドの集団が変異原ＰＣＲにより生成された変種を含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２７】
ポリヌクレチド変種の集団が部位指向変異形成により生成された変種を含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２８】
変種ポリヌクレオチドの集団を少なくとも部分的に脱メチル化することをさらに含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも部分的に脱メチル化することが変種ポリヌクレオチドの集団のＰＣＲ増幅により実行される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも部分的に脱メチルする段階が宿主細胞での変種ポリヌクレオチドの集団の増幅により実行される請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞がメチラーゼ酵素を符号化する遺伝子に欠陥がある請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ポリヌクレオチド変種の集団は二本鎖ポリヌクレオチドであり、各ポリヌクレオチドの唯一の鎖は少なくとも部分的に脱メチル化されている請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
変種ポリヌクレオチド変種の集団が互いに少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも５つのポリヌクレオチドを含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項３４】
選別した組換え変種を分離することをさらに含む請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項３５】
組換え蛋白質を生成するために選別した組換え変種を発現することをさらに含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
薬剤組成物を形成するために組換え蛋白質を担体と調合することをさらに含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ポリヌクレオチド変種がプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、およびフィターゼからなる群から選ばれた酵素を符号化する請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項３８】
ポリヌクレオチド変種がインシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、黄体形成ホルモン、じゅう毛性性腺刺激ホルモン、視床上部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、レラクシン、インターフェロン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびプロラクチンからなる群から選ばれたポリペプチドを符号化する請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項３９】
ポリヌクレオチド変種が代謝経路を形成する複数の酵素を符号化する請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項４０】
ポリヌクレオチド変種が鎖状体形である請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも２つのポリヌクレオチド変種は０．１〜２５％の範囲で異なる変種である請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項４２】
機能的特性は酵素特性である請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチド変種が鎖状体形であり、機能的特性は酵素特性である請求項１、５、９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は１９９７年１２月８日に提出された、米国特許第６０／０６７９０８号から優先権を得、あらゆる目的で参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は遺伝学、さらに詳細には、望みの特性を取得するためにポリヌクレオチドを強制的に分子進化させる技術分野に存する。
【０００３】
（背景）
合理的設計および有向進化を含む、種々の手法が、蛋白質機能を最適化するために使用されてきた（１、２）。所与の最適化問題に対する手法の選択は、部分的に、配列、構造および機能の間の関係の理解の程度に依存する。合理的再設計は一般に構造と機能の関係についての広範な知識を必要とする。有向進化は構造と機能の関係に関する特定の知識をほとんどまたは全く必要としない。むしろ、その本質的特徴は最適化すべき機能を評価する手段である。有向進化は、突然変異体分子のライブラリの生成と、それに続く望みの機能に対する選択または選別を含む。望みのその特性または１組の特性に関して改善を示す遺伝子生成物は選択または選別で同定される。有益な突然変異を集積するために、これらの生成物を符号化する遺伝子をこのプロセスの追加の周期にかけることができる。この進化は、どこまで進歩することを望むか、および各世代で典型的に観察される突然変異の効果に応じて、少数又は多数の世代を要することがある。このような手法は、新規の機能性核酸（３、４）、ペプチドおよびその他の小分子（３）、抗体（３）、並びに酵素およびその他の蛋白質（５、６、７）を作成するために使用されてきた。これらの手順は機能評価において不正確さおよび雑音に対してかなり寛容である（７）。
【０００４】
いくつかの刊行物で有向進化における遺伝子組換えの役割を論じている（国際公開９７／０７２０５号、国際公開９８／４２７２７号、米国特許第５８０７７２３号、米国特許第５，７２１，３６７号、米国特許第５，７７６，７４４号および国際公開９８／４１６４５号、米国特許第５，８１１，２３８号、国際公開９８／４１６２２号、国際公開９８／４１６２３号、および米国特許第５，０９３，２５７号を参照）。
【０００５】
組換え法のＰＣＲに基づく群は、ＤＮＡシャフリング［５，６］、捩れ延長プロセス［８９，９０］およびランダム・プライミング組換え［８７］からなる。このような方法は一般に集合／組換え段階中に有意量のＤＮＡを合成し、続いて最終生成物を増幅するものであり、遺伝子サイズの増大につれて増幅効率が低下する。
【０００６】
相同組換え用の活性システムを有する酵母細胞がｉｎ  ｖｉｖｏ組換えに使用されてきた。ベクターで形質転換され、部分的に挿入断片と重複する細胞は相同性の領域で挿入断片を接合し、機能的な、共有結合で閉じたプラスミドを復元する［９１］。この方法は組替えのいかなる段階でもＰＣＲ増幅を必要とせず、従ってこの方法に固有のサイズの問題がない。しかし、１つの組換え事象で導入されるクロスオーバの数は多数の挿入断片を含む１つの細胞の形質転換の効率によって制限される。他のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法はタンデム配向における同じプラスミドでクローン化された２つの親遺伝子間の組替えを伴うものである。１つの方法ではキメラ遺伝子を生成するために細菌細胞の相同組換え機構を利用する［９２］。タンデムの第１遺伝子は標的蛋白質のＮ末端部分を提供し、第２遺伝子はＣ末端部分を提供する。しかし、１つのクロスオーバだけがこの手法で発生する。別のｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法ではベクターにおける基質の同じタンデム組織化を使用する［９３］。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞への形質転換の前に、プラスミドは親配列間のエンドヌクレアーゼ消化で線形化される。組換えは二本鎖切断修復を司る酵素によりｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。線状分子の末端は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、続いて相補的一本鎖３’末端がアニールされ二本鎖プラスミドが復元される［９４］。この方法は環状プラスミドにおけるタンデム組換えと同様な利点および欠点を有する。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は望みの特性獲得に向けてポリヌクレオチドを進化させるための方法を提供する。この方法はヘテロ二本鎖を含むアニールしたポリヌクレオチドを生成する条件下で親ポリヌクレオチド変種の集団をインキュベートすることを含んでいる。ヘテロ二本鎖は次いで細胞ＤＮＡ修復システムに曝されて親ヌクレオチド変種または組換えポリヌクレオチド変種に変換される。得られたポリヌクレオチドは次いで望みの特性に関して選別または選択される。
【０００８】
ある方法では、ヘテロ二本鎖はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ修復システムに曝される。適当な修復システムは細胞抽出物の形で調製できる。
【０００９】
他の方法では、ヘテロ二本鎖を含むアニーリングの生成物が宿主細胞に導入される。したがってヘテロ二本鎖は宿主細胞のＤＮＡ修復システムにｉｎ  ｖｉｖｏで曝される。
【００１０】
いくつかの方法では、アニールした生成物を宿主細胞に導入するとホモ二本鎖を含む形質転換細胞に対してヘテロ二本鎖が選択される。これは、例えば、第１ベクターの成分として第１ポリヌクレオチド変種を提供することにより達成でき、第２ポリヌクレオチド変種は第２ベクターの成分として提供される。第１および第２ベクターは、第１および第２ポリヌクレオチド変種が反対側の末端に生じる、線形化された形に変換される。インキュベート段階で、第１線形化ベクターの一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第１ベクターを形成し、第２線形化ベクターの一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第２ベクターを形成し、第１および第２ベクターの一本鎖線形化された形は互いにアニールされ、各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を形成する。したがって生成物を細胞に導入すると線状の第１および第２ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖が選択される。任意選択で、上記の方法で、第１および第２ベクターをＰＣＲにより線形化された形に変換することができる。また別法として、第１および第２ベクターを第１および第２制限酵素による消化で線形化された形に変換することができる。
【００１１】
ある方法では、ポリヌクレオチド変種は二本鎖形で与えられ、アニーリング段階の前に一本鎖形に変換される。任意選択で、このような変換は第１ポリヌクレオチド変種の第１鎖、および第２ポリヌクレオチド変種の第２鎖を増幅するために第１および第２二本鎖ポリヌクレオチド変種の非対称増幅を行うことによる。第１および第２鎖はヘテロ二本鎖を形成するためにインキュベート段階でアニールする。
【００１２】
ある方法では、第１および第２ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの集団が二本鎖形で与えられ、この方法はさらに第１および第２ベクターの成分として第１および第２ポリヌクレオチドを取込むことを含む。ここで第１および第２ポリヌクレオチドは第１および第２ベクターの反対側の末端を占める。インキュベート段階で、第１線形化ベクターの一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第１ベクターを形成し、第２線形化ベクターの一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第２ベクターを形成し、第１および第２ベクターの一本鎖線形化された形は互いにアニールされて各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を形成する。導入段階で、線形第１および第２ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖を含む形質転換細胞が選択される。
【００１３】
ある方法では、第１および第２ポリヌクレオチドは染色体ＤＮＡから得られる。ある方法では、ポリヌクレオチド変種はポリペプチドの変種を符号化する。ある方法では、ポリヌクレチオド変種の集団が少なくとも２０の変種を含む。ある方法では、ポリヌクレオチド変種の集団が少なくとも長さ１０ｋｂである。
【００１４】
ある方法では、ポリヌクレオチド変種は天然変種を含む。他の方法では、ポリヌクレオチド変種は変異原性ＰＣＲまたはカセット変異誘発で発生した変種を含む。ある方法では、ヘテロ二本鎖が導入される宿主細胞が細菌細胞である。ある方法では、異なるポリヌクレオチド変種の集団が互いに少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも５個のポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
ある方法はさらに異なるポリヌクレオチドを少なくとも部分的に脱メチル化する段階を含む。脱メチル化はＰＣＲ増幅によってまたは変種をメチル化欠損宿主細胞中を通過させることによって達成できる。
【００１６】
ある方法はヘテロ二本鎖をＤＮＡ修復システムに曝す前にヘテロ二本鎖中の１つ以上のニックを封じる追加の段階を含む。ニックはＤＮＡリガーゼによる処理で封じることができる。
【００１７】
ある方法はさらに選別した組換えポリヌクレオチド変種を分離する段階を含む。ある方法では、ポリヌクレオチド変種はその変種によって産生が触媒される組換え蛋白質または二次代謝産物を産生するものが選別される。
【００１８】
ある方法では、組換え蛋白質または二次代謝産物は担体と調合されて薬剤組成物を形成する。
【００１９】
ある方法では、ポリヌクレオチド変種は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、カチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびフィターゼからなる群から選ばれた酵素を符号化する。他の方法では、ポリヌクレオチド変種は、インシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、上皮小体ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、黄体形成ホルモン、胎盤性性腺刺激ホルモン、視床上部（ｈｙｐｅｒｔｈａｌｍｉｃ）放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、レラクシン、インターフェロン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、およびプロラクチンからなる群から選ばれたポリペプチドを符号化する。
【００２０】
ある方法では、変種ポリヌクレオチドの集団中の各ポリヌクレオチドは代謝経路を形成する複数の酵素を符号化する。
【００２１】
（定義）
選別とは、一般に、まず物理的に細胞を分離し、次いでどの細胞が望みの特性を有するか、有しないかを決定する二段階過程である。選択は選別の１つの形であって、同定および物理的分離が、ある遺伝的環境では細胞に生存する標識を発現することを可能にするが、他の細胞は死滅する（逆もまた同じ）選択標識の発現により同時に達成される。選別構成要素の例にはルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよび緑蛍光蛋白質が含まれる。選択標識には薬剤および毒物耐性遺伝子が含まれる。自然選択は自然進化の過程で生じ得るが、この方法では選択は人により行われる。
【００２２】
外因性ＤＮＡセグメントとは、細胞にとって外来（または異種）または細胞に同種であるが宿主細胞核酸内のその要素が通常見られない位置にあるものである。外因性ＤＮＡセグメントは発現されると外因性ポリペプチドをもたらす。
【００２３】
遺伝子という用語は、生物学的機能に関連したＤＮＡの何らかのセグメントを指すために広く使用される。したがって、遺伝子は配列の符号化および／またはその発現に必要な規制配列を含む。遺伝子は例えば、他の蛋白質に対する認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントをも含む。
【００２４】
「野性型」という用語は、核酸断片がいかなる突然変異も含まないことを意味する。「野性型」蛋白質は、蛋白質が自然に見られる活性の水準で活性であり、典型的には自然に見られるアミノ酸配列を含む。一面では、用語「野性型」または「親配列」を本発明の操作前の出発配列または基準配列を示す。
【００２５】
「実質的に純粋」とは、目的種が存在する支配的種であることを（すなわち、モル数に基いて、組成物中の他のいかなる高分子種よりも豊富である）、好ましくは実質的に精製された分画が、目的種が存在する全高分子種の少なくとも約５０％（モル数に基づいて）を含む組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は組成物に存在する全高分子種の約８０〜９０％以上を含むことになる。最も好ましくは、目的種が本質的に均一になる（汚染種が慣用の検出法で組成物中に検出できない）まで精製され、組成物は本質的に単一高分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ドルトン以下）、および元素イオン種は高分子種と見なされない。
【００２６】
パーセント配列同一性は、比較ウィンドウ中で２つの最適に整列した配列を比較し、両方の配列で同じ核酸塩基が位置の数を求めて一致する位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウの位置の全数で割って計算する。比較ウィンドウを整列するための配列の最適整列はアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＲ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのコンピュータ化実施により行うことができる。
【００２７】
自然発生という用語は、人により人工的に作られるものから区別して自然に見ることができる対象を記述するために使用される。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、自然の起源から分離でき、実験室で人により意図的に修飾されなかったポリペプチドまたはポリヌクレオチドは自然発生である。一般に、自然発生の語は、種にとって典型的である、非病理的（病気でない）個体に存在するような対象を指す。
【００２８】
核酸は別の核酸配列と機能的関係に置かれると、動作可能に結合される。例えば、プロモータまたはエンハンサは、符号化配列の転写を増大させる場合、符号化する配列に動作可能に結合される。動作可能に結合されるとは、結合されるＤＮＡ配列が通常は隣接し、２つの蛋白質符号化領域を接合する必要がある所では隣接し、読取り枠にあることを意味する。しかし、エンハンサは一般にプロモータから数キロ塩基だけ離れているときに機能し、イントロン配列が可変長のことがあるので、ある種のポリヌクレオチド要素は動作可能に結合されるが隣接してはいない。
【００２９】
例えば、配位子と受容体との間の特異的結合親和性とは、少なくとも、１×１０6Ｍ-1の結合親和性を意味する。
【００３０】
ここでは「同族」という用語は、進化的および機能的に種の間で関係付けられる遺伝子配列を指す。例えば、これだけには限らないが、ヒト・ゲノムでは、ヒトＣＤ４遺伝子はマウスＣＤ４遺伝子と同族遺伝子である。これら２つの遺伝子の配列および構造が、それらが高度に同質であり、両方の遺伝子がＭＨＣクラスＩＩ制限抗原認識によりＴ細胞活性化の信号化で機能する蛋白質を符号化することを示すからである。
【００３１】
「ヘテロ二本鎖」という用語は、異なる親二本鎖分子から誘導される相補的一本鎖間の塩基対により生じた対合ＤＮＡを指し、「ホモ二本鎖」という用語は、同じ親二本鎖分子から誘導された相補的一本鎖間の塩基対により生じた二本鎖ＤＮＡを指す。
【００３２】
二本鎖ＤＮＡ中の「ニック」という用語は、１つの鎖上の２つの隣接ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合の欠如を指す。二本鎖ＤＮＡ中の「ギャップ」という用語は、二本鎖の１つの鎖の１つ以上のヌクレオチドの欠如を指す。二本鎖ＤＮＡ中の「ループ」という用語は、１つの鎖中の１つ以上の不対ヌクレオチドを指す。
【００３３】
突然変異体または変種配列とは、１つ以上の位置で野性型または基準配列と異なる野性型または基準配列からの実質的変化を示す配列である。
【００３４】
（詳細な説明）
Ｉ．一般
本発明は、ポリヌクレオチドを望みの特性の獲得に向かって進化させる方法を提供する。この方法のための基質は互いに類似の領域を含むが、また相違する点または領域をも有する少なくとも二種のポリヌクレオチド変種の配列である。基質は類似の領域でｉｎ  ｖｉｔｒｏでアニールされる。アニールは最初の基質を再生でき、または成分鎖が異なる親を起源とするヘテロ二本鎖を形成できる。アニールの生成物はＤＮＡ修復酵素、および任意選択で不適正対形成を修復する複製システムに曝される。被曝は、アニール生成物が宿主細胞に形質転換され、宿主ＤＮＡ修復システムに曝されるときと同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。別法として、被曝は、アニールした生成物が機能性ＤＮＡ修復システムを含む細胞抽出物に曝されるときと同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともできる。ヘテロ二本鎖をＤＮＡ修復システムに曝すと、ＤＮＡ不適正によりヘテロ二本鎖のバルツ部分でＤＮＡが修復される。修復過程は鎖間の相違の比相互交換を促進する相同性組換えとは異なる。ＤＮＡ修復過程は典型的にはヘテロ二本鎖分子の両方の成分鎖に生じ、ある特別な不適正で鎖が修復されるように典型的にランダムである。生じる集団はこのように親鎖間の相違点の本質的にランダムな再組合せを含む組換えポリヌクレオチドを含むことができる。組換えポリヌクレオチドの集団は次いで望みの特性を獲得するために選別される。特性は、蛋白質に結合するＤＮＡ分子の能力のような、本質的にポリヌクレオチドの特性とすることができ、ｍＲＮＡまたは蛋白質のような、その発現生成物の特性とすることもできる。
【００３５】
ＩＩ．シャフリングのための基質
シャフリングのための基質は基準ポリヌクレオチドと、ある領域では相似性を示し、他の領域又または点では相違している基準ポリヌクレオチドの変種である。相似性の領域は安定なヘテロ二本鎖が形成されるようなポリヌクレオチドのアニーリングを支持するために十分であるべきである。変種形はしばしば互いに実質的配列同一性を示す（例えば、少なくとも５０％、７５％、９０％または９９％）。組換えが、出発物質にあるよりももっと多様な生成物を生じることができるのに充分な基質間相違があるべきである。したがって、少なくとも少なくとも２つの位置で異なる少なくとも２つの基質がなければならない。相違の程度は組換えられる基質の長さおよび進化すべき機能的変化の程度に依存する。０．１〜２５％の間の位置の相違が典型的である。非常に密接に関連した遺伝子からの突然変異の組換えまたはより遠い関係の遺伝子もしくは遺伝子の組みからの配列の全切片さえも進化の速度および望む新しい特性の取得を強化できる。キメラまたはモザイク遺伝子を作る組換えは２つ以上の親の望ましい特徴を単一遺伝子または遺伝子の組に組合わせ、親には見られなかった新規な機能的特徴を作るために有用である。組合わされるべき異なる基質の数は２から１０、１００、１０００、さらに１０5、１０7または１０9以上の構成要素までサイズが広く変化する。
【００３６】
突然変異を有する特異的核酸配列の最初の小さい集団は多くの異なる方法で作られる。突然変異は誤りがちなＰＣＲで作られてもよい。誤りがちなＰＣＲは長い配列にランダムにわたって点突然変異の低水準を導入する低忠実度重合条件を用いる。選択的に、突然変異はオリゴヌクレオチド指向突然変異形成によりテンプレートポリヌクレオチドに導入できる。オリゴヌクレオチド指向突然変異形成では、ポリヌクレオチドの短い配列が制限酵素消化を用いてポリヌクレオチドから除去され、種々の塩基が本来の配列から変えられた、合成ポリヌクレオチドで置換される。ポリヌクレオチド配列も化学的突然変異形成により変えることができる。化学的突然変異原は、例えば、酸性亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはぎ酸を含む。ヌクレオチド前駆体の同族である他の作用物質はニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、またはアクリジンを含む。一般に、これらの作用物質は、それによって配列を突然変異するヌクレオチド前駆体の代りにＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンおよび同類のような挿入剤も使用できる。ポリヌクレオチド配列のランダム突然変異形成はＸ線または紫外線による照射でも達成される。一般に、そのように突然変異されたプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片はＥ．ｃｏｌｉに導入され、突然変異体プラスミドのプールまたはライブラリとして普及される。
【００３７】
選択的に、特異的核酸の小さい混合集団は同じ遺伝子または異なる関連種と同じ遺伝子（すなわち、同族遺伝子）の異なる対立遺伝子の形で見出すことができる。選択的に、基質は免疫グロブリン遺伝子のような、非対立遺伝子を除き関連できる。相違は先行する組換えまたはシャフリングの結果でもある。相違は代替のコドン使用で天然蛋白質を符号化する再合成遺伝子も生じる。
【００３８】
出発基質は進化すべき配列の変種形を符号化する。ある方法では、基質は新しいまたは改良した特性の進化が望ましい蛋白質の変種形を符号化する。他の方法では、基質は多重遺伝子経路を構成する複数の遺伝子の変種形を符号化できる。このような方法では、変化は１つまたはある数の成分遺伝子で生じることができる。他の方法では、基質はＤＮＡまたはＲＮＡ結合配列として進化すべき変種セグメントを含むことができる。出発基質が符号化配列を含む方法では、発現に必要なプロモータおよびポリアデニル化配列のような、ある本質的規制配列が基質の成分としても存在してよい。選択的に、このような規制配列は基質をクローン化するために使用されるベクターの成分として提供される。
【００３９】
出発基質は約５０、２５０、１０００、１０，０００、１００，０００、１０6またはそれ以上の塩基からの長さで変化できる。出発基質は、二本鎖または一本鎖形とすることができる。出発基質はＤＮＡまたはＲＮＡおよびその同族であることができる。ＤＮＡならば、出発基質はゲノムまたはｃＤＮＡである。基質がＲＮＡならば、基質は典型的にヘテロ二本鎖形成の前にｃＤＮＡに逆転写される。基質はクローン化断片、化学合成断片またはＰＣＲ増幅生成物として提供できる。基質は染色体、プラスミドまたはウイルス源から誘導できる。ある方法では、基質は鎖状体形である。
【００４０】
ＩＩＩ．ヘテロ二本鎖を発生する手順
ヘテロ二本鎖はＤＮＡ基質を変性し、アニーリング条件下でインキュベートすることにより、二本鎖ＤＮＡ基質から発生される。ヘテロ二本鎖形成のためのハイブリッド形成条件は配列依存性で、異なる環境では異なる。より長い配列は高温で特異的にハイブリッド形成する。一般に、ハイブリッド形成条件は定義されたイオン強度およびｐＨで特異的配列に対する熱融解温度（Ｔｍ）以下の約２５℃であるように選ばれる。Ｔｍは（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度で）標的配列の相補的なプローブの５０％が標的配列に平衡状態でハイブリッド形成する温度である。
【００４１】
二本鎖基質の変性および再生のための模範的条件は次の通りである。等モル濃度（約１．０〜５．０ｎＭ）の基質が１×ＳＳＰＥ緩衝液（１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）に混合される。９６℃で１０分間加熱後、反応混合物は直ちに０℃で５分間冷却される。混合物は次いで６８℃で２〜６時間インキュベートされる。変性および再アニーリングはＮａＯＨのような変性剤の添加および除去でも行われる。過程は変性段階が短い配列に対して省略されることを除き、一本鎖ＤＮＡ基質に対してと同じである。
【００４２】
ヘテロ二本鎖形成のための基質の適当な設計により、改質した親ホモ二本鎖と比較してヘテロ二本鎖に対する選択を達成することができる。ホモ二本鎖は単に親基質を再構築し、引き続く選別段階で組換え生成物を有効に希釈するだけである。一般に、選択はヘテロ二本鎖が開いた環で形成されるように基質を設計して達成されるが、ホモ二本鎖は線状分子として形成される。引き続く形質転換段階は環状ヘテロ二本鎖に対して実質的濃縮（例えば、１００倍）を生じる。
【００４３】
図１は別々のベクターの２つの基質配列がプライマ（Ｐ１、Ｐ２およびＰ３、Ｐ４）の２つの異なる組を用いてＰＣＲ増幅される方法を示す。典型的に、第１および第２基質は同じベクターの別々のコピーに挿入される。プライマの２つの異なる対が２つのベクターの異なる点で増幅を開始する。図１はＰ１／Ｐ２プライマ対がベクターの基質との２つの境界の１つで増幅を開始し、Ｐ１／Ｐ２プライマ対は第２ベクターの他の境界で複製を開始する配列を示す。各プライマ対の２つのプライマは環状プラスミドの回りの反対方向に増幅を開始する。この増幅で発生した増幅生成物は、第１および第２基質がベクターの反対末端で生じる、二本鎖線形化ベクター分子である。増幅生成物は混合され、変成され、アニールされる。混合および変性はいずれかの順序で行われる。再アニーリングは２つの線状ホモ二本鎖、およびＰＣＲ増幅の開始点で各鎖に１個のニックを含む開いた環状ヘテロ二本鎖を発生する。増幅生成物の宿主細胞への導入では、ホモ二本鎖よりもヘテロ二本鎖を選択する。ヘテロ二本鎖はホモ二本鎖より遥かに効率的に形質転換するからである。
【００４４】
増幅が基質とベクターの残余の間の界面で開始されることは上記の案で本質的でない。むしろ、増幅は、増幅がベクター間の異なる点で開始される基質を有する２つのベクター上のいずれかの点で開始される。一般の場合に、このような増幅は、第１および第２基質がそれぞれベクターの残余に対して異なる位置を占める２つの線形化ベクターを発生する。ニックがプラスミドと基質の界面におけるよりもむしろベクター成分内で生じることを除き、変性および再アニーリングは図１に示されるものと同様なヘテロ二本鎖を発生する。ベクターの基質成分の外側の増幅の開始は、ベクターが有する基質に特異的なプライマを設計するために必要でない利点を有する。
【００４５】
図１は２つの基質を示すが、上記のスキームはある数の基質に拡張される。例えば、基質を有するベクターの最初の集団は２つのプールに誘導される。１つのプールは１組のプライマからＰＣＲ増幅され、他のプールは別からである。増幅生成物は以前に変性され、アニールされる。ヘテロ二本鎖は、第１のプールのある基質からの１つの鎖および第２のプールのある基質からの１つの鎖を含んで形成できる。選択的に、ベクターの多重コピーにクローン化された３個以上の基質が異なる点で出発する各ベクターの増幅により増幅を受ける。各基質では、この過程は隣接ベクターＤＮＡが基質の２つの側にいかに分けられるかで変化する増幅生成物を発生する。例えば、１つの増幅生成物は基質の１つの側にベクターの大部分を有し、別の増幅生成物は基質の他の側にベクターの大部分を有し、追加の増幅生成物は基質に隣接するベクター配列の等しい区分を有する。配列アニーリング段階で、基質の鎖はある他の基質の鎖と環状ヘテロ二本鎖を形成するが、同じ基質の鎖が線状ホモ二本鎖を形成するためだけに互いに再アニールできる。さらに追加の変化では、多重基質は図１の案の多重反復を行うことにより行うことができる。第１反復の後、ベクターの組換えポリヌクレオチドはベクターの追加のコピーに取込まれる第３基質によりヘテロ二本鎖形成を受ける。組換えポリヌクレオチドを有するベクターおよび第３基質を有するベクターは異なるプライマ対から別々にＰＣＲ増幅される。増幅生成物は次いで変成され、アニールされる。過程は追加の基質による組み替えを可能にするために追加の回数繰り返すことができる。
【００４６】
ヘテロ二本鎖形成のための代替方法が図２に示される。ここで、第１および第２基質はベクターの別のコピーに取込まれる。２つのコピーは次いでそれぞれ異なる制限酵素で消化される。図２は、制限酵素が基質とベクターの間の反対境界で切断するが、必要である全ては異なる場所で切断する２つの異なる制限酵素を使用することである。消化は第１および第２基質を有する線形化第１および第２ベクター、残余ベクター配列に関して異なる位置を占める第１および第２基質を発生する。変性および再アニーリングは開いた環状ヘテロ二本鎖および線状ホモ二本鎖を発生する。この方法は、図１に関して記載されたものに類似の戦略を用いる２個以上の基質間の組換えに拡張できる。１つの変化では、基質の２個のプールが形成され、各々は別々にベクターにクローン化される。２個のプールは次いで異なる酵素に鋭敏であり、アニーリングは２つの基質のように進行する。別の変化では、３個以上の基質がベクターの３個以上のコピーにクローン化され、３個以上の生じる分子が３個以上の酵素で切断し、３個以上の部位で切断する。これはベクター中の基質部分に隣接するベクター配列の区分と異なる３個の異なる線形化ベクターを発生する。選択的に、ある数の基質が、各回で新鮮な基質との組換えアニーリングの１回により反復様式で対として組換えられる。
【００４７】
他の変形では、ヘテロ二本鎖はベクターの無い形で基質分子から形成され、ヘテロ二本鎖は続いてベクターにクローン化される。このようなことは図３に示したように第１および第２基質の非対称増幅により達成できる。非対称または単一プライマＰＣＲは二本鎖の１つの鎖のみを増幅する。プライマの適当な選択により、反対の鎖は２個の異なる基質から増幅できる。再アニーリング増幅生成物に関して、ヘテロ二本鎖は２個の基質の反対鎖から形成される。１つの鎖のみが各基質から増幅されるので、再アニーリングはホモ二本鎖を改良しない（少量の非増幅基質以外）。過程は図１に関して記載されたものに対する類似の戦略を用いてある数の基質の組み替えを可能にするために拡張できる。例えば、基質は２個のプールに分割でき、各プールは、互いにではなく、１つのプールの増幅生成物が他のプールの増幅生成物とのみアニールできるような、同じ非対称増幅を受ける。選択的に、シャフリングは反復様式で対として進行し、そこでは第１および第２基質のヘテロ二本鎖から形成された組換え体が続いて第３基質とのヘテロ二本鎖形成を受ける。点突然変異もＰＣＲ増幅中に望む水準で導入できる。
【００４８】
図４はホモ二本鎖に関してヘテロ二本鎖の選択の別の接近を示す。第１および第２基質は別々のベクターからのＰＣＲ増幅により分離される。基質は変成され、ヘテロ二本鎖および再構築ホモ二本鎖の両方を形成してアニールすることを可能にする。アニーリングの生成物は制限酵素ＸおよびＹで消化される。Ｘは第１基質の部位を有するが、第２基質には有せず、Ｙはその逆である。酵素Ｘは第１基質から再構築ホモ二本鎖を切断し、酵素Ｙは第２基質から再構築ホモ二本鎖を切断する。いずれの酵素もヘテロ二本鎖を切断しない。ヘテロ二本鎖は、第１および第２基質の両方に近接した部位を有する酵素ＡおよびＢによる追加の開裂、およびＡおよびＢによる消化から生じる末端と両立する相補末端を有するベクターへの生成物の結合によるホモ二本鎖の制限断片から有効に分離できる。ＡおよびＢで切断したヘテロ二本鎖だけがベクターと結合できる。選択的に、ヘテロ二本鎖はゲル上のサイズ選択によりホモ二本鎖の制限断片から分離できる。上記過程はＮ酵素によるヘテロ二本鎖とホモ二本鎖の混合物の開裂でＮ基質に一般化でき、その各々は異なる基質を切断し、他の基質を切断しない。ヘテロ二本鎖は方向性クローン化で形成できる。ヘテロ二本鎖形成のための２つの基質は染色体ＤＮＡのＰＣＲ増幅で得ることができ、線状ベクターの反対末端に接続する。方向性クローン化は２つの異なる酵素でベクターを消化すること、およびベクターを切断するために使用した２つの酵素だけの相補末端とそれぞれ両立する第１および第２基質を消化し、適応することで達成できる。第１および第２基質はこのように線形化ベクター断片の反対末端で結合できる。この案は図１に記載されるものに類似の原理を用いてある数の基質に拡張できる。例えば、基質はベクターへの結合の前に２つのプールへ分割できる。選択的に、第１および第２基質のヘテロ二本鎖形成により形成された組換え生成物は続いて第３基質とのヘテロ二本鎖形成を受ける。
【００４９】
ＩＶ．ベクターおよび形質転換
一般に、基質はヘテロ二本鎖形成段階の前後のいずれかにベクターに取込まれる。遺伝子工学で典型的に使用される種々のクローン化ベクターが適当である。
【００５０】
細胞宿主の種類に依存して、問題のＤＮＡセグメントを含むベクターは標準法で宿主細胞に移される。例えば、塩化カルシウム形質転換は一般に原核細胞に使用されるが、リン酸カルシウム処理がある。リポフェクション、またはエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用されてもよい。ほ乳類細胞を形質転換するために使用される他の方法はポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションおよびバイオリシチックスの使用を含む（一般に、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、参照）。ウイルス・ベクターもｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージされ、感染で導入される。ベクターの選択は宿主細胞に依存する。一般に、適当なベクターは望む宿主細胞に認識される複製の起源、シャッフルされる基質内の遺伝子の発現を支持する意図した宿主細胞および／または規制配列で発現できる選択メーカーを有する。
【００５１】
Ｖ．宿主細胞の種類
一般に、ＤＮＡ修復および細胞に導入されるヘテロ二本鎖の複製を支持するある種類の細胞が使用できる。特に関心のある細胞は、細菌、特にＥ．ｃｏｌｉ（１６、１７）のような、遺伝子工学で通常使用される標準細胞種である。適当なＥ．ｃｏｌｉ系統は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ、ｍｕｔＬ、ｄａｍ’、および／またはｒｅｃＡ+、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１０−Ｇｏｌｄ（［Ｔｅｒ’Δ（ｍｃｒＡ）１８３Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３ｅｎｄＡｌ  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−ｌ  ｒｅｃＡｌ  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡｌ  ｌａｃ  Ｈｔｅ］［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃ’ＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｒ’）Ａｍｖ  Ｃａｍ’］）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１  ｍｕｔＳ［遺伝子型：ｌａｃＺ５３、ｍｕｔＳ２０１：：Ｔｎ５、ｔｈｙＡ３６、ｒｈａ−５、ｍｅｔＢｌ、ｄｅｏＣ、ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）］（２０、２４、２８〜４２）を含む。好ましいＥ．ｃｏｌｉ系統はＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０［遺伝子型：ｒｐｓｌ、（Ｓｔｒ’）、ｔｈｒ、ｌｅｕ、ｅｎｄａ、ｔｈｉ−ｌ、ｌａｃｙ、ｇａｌｋ、ｇａｌｔ、ａｒａ  ｔｏｎａ、ｔｓｘ、ｄａｍ、ｄｃｍ、ｓｕｐＥ４４、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、［Ｆ、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ-Ｂ-ｌａｃＩ’ＺΔＭ１５］であり、それは正常な細胞不適正修復システムを有する（１７）。この系統種は小さい鎖特異的選好でヘテロ二本鎖における不適正および不同を修復する。さらに、この系統はｄａｍ’およびｄｃｍ’であるから、系統から分離されたプラスミドは非メチル化であり、従ってＤＮＡ二本鎖形成／不適正修復の追加の回に特に従う（以下参照）。他の適当な細菌細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａのようなグラム陰性およびグラム陽性を含む。
【００５２】
真核生物も不適正修復を行うことができる（４３〜４８）。原核細胞および真核細胞の両方の不適正修復システムはＤＮＡ複製中の遺伝的忠実性の維持に重要な役割を演じると考えられる。原核細胞、特にｍｕｔＳおよびｍｕｔＬにおいて不適正修復に重要な役割を演じる遺伝子のあるものは遺伝子組換えの結果で、真核細胞に同族体を有し、ゲノム安定性を有する。野性型または突然変異体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはＣＯＳ−１サル細胞（５７）を有するように、ヘテロ二本鎖（４９〜５６）の不適正修復を行うことを示した。酵母の好ましい系統はＰｉｃｃｈｉａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓである。ほ乳類細胞はショートパッチ機構（３８、５８〜６３）によりＧ−ＴからＧ−Ｃ塩基対に修復する能力を有することを示した。ほ乳類細胞（例えば、マウス、ハムスター、霊長類、ヒト）両方の細胞系統および一次培養物も使用できる。このような細胞は、胎児幹細胞、接合体、線維芽細胞、リンパ球、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、腎臓、肝臓、筋肉、および皮膚細胞を含む、幹細胞を含む。関心のある他の真核細胞はトウモロコシ、コメ、コムギ、ワタ、ダイズ、サトウキビ、タバコ、およびシロイヌナズナのような植物細胞；魚、海藻、かび（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、昆虫（例えば、ｂａｃｕｌｏ  ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎ．Ｙ．、（１９８７）参照）を含み、それはここで参考文献に取り込まれる。
【００５３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで修復は広い種類の原核細胞および真核細胞で生じる。ほ乳類細胞の使用は、基質がほ乳類細胞でのみ発現される、またはほ乳類細胞での使用を意図するポリペプチドを符号化するある応用で有利である。しかし、細菌および酵母細胞はこれらの系統で到達できる高い形質転換頻度による大きいライブラリを選別するために有利である。
【００５４】
Ｖ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ修復システム
宿主細胞にアニール生成物を導入する代替として、アニールした生成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ修復システムに曝されることができる。ＤＮＡ修復システムは修復コンピテントＥ．ｃｏｌｉ酵母またはいずれかの他の細胞からの抽出物として得られる（６４〜６７）。修復コンピテント細胞は適当な緩衝液中に溶菌され、ヌクレオチドで補足される。ＤＮＡはこの細胞抽出物中でインキュベートされ、複製のためのコンピテント細胞に形質転換される。
【００５５】
ＶＩ．選別および選択
宿主細胞へのアニール生成物の導入後、宿主細胞は、発現されるポリヌクレオチドにより符号化された遺伝子に対して、生じる修復および複製を可能にするために典型的におよび選択的に培養される。組換えポリヌクレオチドは、上記のヘテロ二本鎖法、または下記の他のシャフリング法を用いる組み替えの追加の回を受ける。しかし、１回かまたは数回の組換え後に、組換えポリヌクレオチドは望みの特性に対して選別または選択を受ける。ある例では、選別または選択はＤＮＡ修復に用いられる同じ宿主細胞で行われる。他の例では、組換えポリヌクレオチド、その発現生成物または発現生成物により生じた二次代謝物はこのような細胞から分離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選別される。他の例では、組換えポリヌクレオチドは、組換えが生じる宿主細胞から分離され、他の宿主細胞中で選別され、選択される。例えば、ある方法では、細菌宿主細胞中で生じるが、真核細胞中の組換えポリヌクレオチドの発現生成物を選別するＤＮＡ修復を可能にすることは有利である。選別または選択を生き残る組換えポリヌクレオチドはそれ自体でしばしば有用な生成物である。他の例ではこのような組換えポリヌクレオチドは互いにまたは他の基質と追加の組替えを受ける。このような組替えは上記のヘテロ二本鎖法またはいずれかの他のシャフリング法で行うことができる。組替えの追加の回は反復を基に選別または選択の追加の回が続く。選択的に、選択の厳密さは各回で増加する。
【００５６】
選別または選択の性質は取得することを求める望みの特性に依存する。酵素の望ましい特性は高い触媒活性、薬剤への耐性を与える能力、高い安定性、広い（または狭い）範囲の基質を受容する能力、または有機溶媒のような非自然環境で機能する能力を含む。蛋白質の他の望ましい特性は選ばれた標的、選択容量、与えられた標的への免疫応答を発生する能力、免疫原性の欠如および病因性微生物に対する毒性を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド配列の望ましい特性は、与えられた蛋白質標的に特異的に結合する能力、および動作可能に結合した符号化配列の発現を制御する能力を含む。薬剤耐性のような、上記特性のあるものは、薬剤上での平板培養により選択できる。発現に対する制御配列の影響など他の特性は制御配列に結合したレポーター遺伝子の発現生成物の外見を検出することにより選別できる。分泌される発現蛋白質の容量など他の特性は蛋白質に対する標識抗体を使って、ＦＡＣTMによって選別できる。免疫原性またはその欠如のような、他の特性は個別細胞または細胞のプールからの蛋白質を分離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、および実験動物で分析することにより、選別できる。
【００５７】
ＶＩＩ．変種
１．脱メチル化
大部分の細胞種は細胞種間で異なるメチル化のパターンで、ある方法でＤＮＡをメチル化する。メチル化の部位は５−メチルシトシン（ｍ5Ｃ）、Ｎ４−メチルシトシン（Ｍ4Ｃ）、Ｎ6−メチルアデニン（ｍ6Ａ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍ5Ｃ）および５−ヒドロキシメチルウラシル（ｈｍ5Ｕ）を含む。Ｅ．ｃｏｌｉでは、メチル化はＤａｍおよびＤｃｍ酵素で行われる。ｄａｍ遺伝子で指定されるメチラーゼは配列ＧＡＴＣのアデニン残基のＮ６−位をメチル化し、ｄｃｍ遺伝子で指定されるメチラーゼは配列ＣＣＷＧＧの内部シトシン残基のＣ５位をメチル化する。植物および動物からのＤＮＡはしばしばＣＧまたはＣＮＧ配列がメチル化されることを意味するＣＧメチル化を受ける。メチル化の細胞修復の可能性のある効果は参考文献１８〜２０で論じられる。
【００５８】
ある方法では、ヘテロ二本鎖形成のためのＤＮＡ基質は一方または両方の鎖、好ましくは後者を少なくとも部分的に脱メチル化される。基質ＤＮＡの脱メチル化はヘテロ二本鎖の有効でランダムな修復を促進する。ｄａｍメチル化された１つの鎖および非メチル化の１つの鎖で形成されたヘテロ二本鎖では、修復は修正のためのテンプレートとして役立つメチル化鎖により、非メチル化鎖に偏る。いずれの鎖もメチル化されないと、不適正修復は起こるが、重要でない鎖の優先を示す（２３、２４）。
【００５９】
脱メチル化は種々の方法で行うことができる。ある方法では、基質ＤＮＡはＰＣＲ増幅で脱メチル化される。ある例では、ＤＮＡ脱メチル化は上記のヘテロ二本鎖形成手順のＰＣＲ段階の１つで達成される。  他の方法では、追加のＰＣＲ段階が脱メチル化を生じるために行われる。他の方法では、脱メチル化はメチル化欠損宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｄａｍ’ｄｃｍ’系統）による基質ＤＮＡ通過で生じる。他の方法では、脱メチル化酵素を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで脱メチル化される。脱メチル化ＤＮＡは上記の同じ手順を用いるヘテロ二本鎖形成のために使用される。ヘテロ二本鎖は続いて非メチル化ヘテロ二本鎖の分解を防ぐためにＤＮＡ修復に熟練しているが制限酵素欠損細胞に導入される。
【００６０】
２．シーリング・ニック
上記のヘテロ二本鎖形成のためのいくつかの方法は各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を生じる。これらのニックは宿主細胞にヘテロ二本鎖を導入する前に封じることができる。シーリングは標準結合条件下でＤＮＡリガーゼによる処理で得ることができる。結合はＤＮＡの二重ヘリックスの１つの鎖中のニックにより分離された２つの隣接塩基を結合するリン酸ジエステル結合を形成する。ニックを封じると宿主細胞へのヘテロ二本鎖の導入後組替えの頻度が増加する。
【００６１】
３．増幅への誤差傾向ＰＣＲ付随物
上記方式のいくつかはＰＣＲ増幅段階を含む。選択的に、このような段階は基質間の追加の相違を誘起する変異原条件下で行うことができる。
【００６２】
ＶＩＩＩ．他のシャフリング方法
上記のヘテロ二本鎖形成の方法は他のシャフリング法と共に使用できる。例えば、ヘテロ二本鎖シャフリング、選別または選択の一周期を行い、別の方法でシャフリングの周期が続き、選別または選択の追加の周期が続く。他のシャフリング方式は国際公開９５／２２６２５号：米国特許第５，６０５，７９３号：米国特許第５，８１１，２３８号；国際公開９６／１９２５６号；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０、１５１０（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ他、Ｇｅｎｅ、１６４、４９〜５３（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、５４９〜５５３（１９９５）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１、１０７４７〜１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０、３８９〜３９１（１９９４）；Ｃｒａｍｅｒｉ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２（１）：１〜３（１９９６）；Ｃｒａｍｅｒｉ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４、３１５〜３１９（１９９６）；国際公開９８／４２７２７号；国際公開９８／４１６２２号；国際公開９８／０５７６４号；国際公開９８／４２７２８号；国際公開９８／２７２３０号（それぞれあらゆる目的でその全体を参照によって組み込む）に記載される。
【００６３】
ＩＸ．蛋白質同族
分離された蛋白質も誘導体化合物の開発のためのリード化合物として役立つ。誘導体化合物はアミノ酸の化学修飾または化学構造によるアミノ酸の置換を含む。同族はリード蛋白質と実質的に同じ方法で示される主要官能基を可能にする安定化電子配置および分子立体配座を有する。特に、非消化性化合物はポリペプチド結合領域に一致する空間的電子特性を有するが、典型的にはポリペプチドよりはるかに小さい分子であり、しばしば約２ＣＨＤ以下および好ましくは約１ＣＨＤ以下の分子量を有する。このような非消化性化合物の同定は自己無動着場（ＣＳＦ）分析、配位相互作用（ＣＨＩ）分析、および基準モード動的分析のようないくつかの標準法によって行うことができる。これらの技術を実施するためのコンピュータ・プログラムは既に入手可能である。Ｒｅｉｎ他、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ（Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）参照。
【００６４】
ＩＸ．薬剤組成物
上記方法で発生した発現生成物により触媒される、ポリヌクレオチド、その発現生成物、および二次代謝物は薬剤組成物として選択的に製剤される。このような組成物は１つ以上の活性剤および薬学的に受容可能な担体を含む。種々の水系担体、例えば水、緩衝液、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒト・アルブミン溶液および同類を使用できる。これらの溶液は滅菌され、一般に粒状物が無い。組成物は、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤、および同類、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、のような生理的条件に近づくために必要な薬学的に受容可能な補助物質を含み、選ばれた投与の特別なモードに従って、ナトリウムは流体体積、粘度、などに主として基づいて選ばれる。
【００６５】
（実施例）
実施例１．Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  Ｌｕｐｉｎｉ  ＦｌａａおよびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  Ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ＦｌａＡの組換えからの新規なＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  Ｆｌａａ遺伝子
細菌鞭毛は鞭毛モータ（６８）による螺旋フィラメント、近位フックおよび基底小体を有する。この基本設計はＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍで広範に試験され、多くの他の細菌並びにある古細菌に広く適用される。長い螺旋フィラメントはフラゲリン・サブユニットから組み立てられた重合体で、その分子量範囲は細菌種（６９）に依存して、２０，０００と６５，０００の間にある。プレーンと複合と名づけられた、二種の繊毛フィラメントは、その電子顕微鏡的に決定された表面構造（７０）により識別された。プレーン・フィラメントは弱い螺旋の線のある滑らかな表面を有するが、複合フィラメントは交代する畝と溝の人目に付く螺旋パターンを示す。複合繊毛フィラメントのこれらの特性は、粘性媒体中（７１〜７３）で有効に細菌を推進することを可能にする、脆いおよび（含意で）硬い構造に対応すると考えられる。プレーン・フィラメントの繊毛は時計方向と反時計方向回転（６８）の間で交代できるが、複合フィラメントの全ての既知の繊毛は間欠停止で時計方向のみに回転する（７４）。この後者の航法パターンは細菌および古細菌を通じて見られるので、複合繊毛は古代、基本的運動性設計（６９）の共通の背景を反映することが示唆される。
【００６６】
人目に付く螺旋帯で支配されるそのフィラメントの微細構造およびその脆性でプレーン細菌繊毛と異なり、フィラメントも熱分解に対して耐性である（７２）。Ｓｃｈｍｉｔｔ他（７５）は、バクテリオファージ７−７−１は特にＲ．ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３の繊毛に特異的に吸着し、その宿主の増殖感染のための運動性を必要とする。Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉおよびＲ．ｌｕｐｉｎｉからの繊毛は全く同様であるが、バクテリオファージ７−７−１はＲ．ｍｅｌｉｌｏｔｉに感染しない。現在まで複合繊毛は三種の土壌細菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓ（７３）、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（７６）、およびＲ．ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３（７０、７２）のみで観察された。Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３は５〜１０個の周毛的に挿入された複合繊毛を有し、それは高分解能電子顕微鏡および光回折で最初に分離され、分析された（７０）。
【００６７】
Ｍｕｒａｙａｍａ他（７７）はさらに、複合繊毛中の高い疎水性アミノ酸残基の含量が複合繊毛の異常な特性に対する主な理由の１つであることを発見した。単位長さ当たりの質量の測定および電子顕微鏡写真からの三次元再構築を得ることにより、Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ他（７３、７８）はＲ．ｌｕｐｉｎｉの複合繊毛は機能性２量対からなることを示唆した。図６は推論したＲ．ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３ＦｌａＡのアミノ酸配列と推論したＲ．ｍｅｌｉｌｏｔｉＦｌａＡのアミノ酸配列の比較を示す。完全な一致は垂直線で示され、保存的交換はコロンで示される。全体の同一性は５６％である。Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ  ｆｌａＡおよびＲ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ｆｌａＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏヘテロ二本鎖形成を受け、新規なＦｌａＡ分子および構造を作るためにｉｎ  ｖｉｖｏ修復が続いた。
【００６８】
Ａ．方法
Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３  ｆｌａＡ遺伝子を含むｐＲＬ２０およびＲ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ｆｌａＡ遺伝子を含むｐＲＭ４０が図６Ａおよび６Ｂに示される。これらのプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０から分離された（ｄａｍおよびｄｃｍ型メチル化なし）。
約３．０ｐｇの非メチル化ｐＲＬ２０およびｐＲＭ４０ＤＮＡはそれぞれＢａｍ  ＨＩおよびＥｃｏＲＩで３７℃で１時間消化された。アガロース・ゲル分離後、線形化ＤＮＡはＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）で精製された。
等モル濃度の（２．５ｎＭ）の線形化非メチル化ｐＲＬ２０およびｐＲＭ４０は１×ＳＳＰＥ緩衝液（１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）に混合された。９６℃で１０分間加熱後、反応混合物は直ちに０℃で５分間冷却された。混合物は形成するヘテロ二本鎖に対して６８℃で２時間インキュベートされた。
【００６９】
１ミクロリットルの反応混合物が、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１ｍｕｔＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０およびＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテント細胞を形質転換するために使用された。全体の形質転換効率は閉じた、共有結合および環状ｐＵＣ１９プラスミドによる対象形質転換のものよりも１０〜２００倍低かったが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９コンピテント細胞による形質転換効率はＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０のものより約７倍高く、Ｅ．ｃｏｌｉＥＳ１３０１ｍｕｔＳのものより１０倍高い。
【００７０】
２つのクローンがＥ．ｃｏｌｉＳＣＳ１１０形質転換体から、および２つがＥ．ｃｏｌｉＥＳ１３０１ｍｕｔＳ形質転換体からランダムで選択され、プラスミドＤＮＡが追加のＤＮＡ配列分析のためにこれらの４個のクローンから分離された。
【００７１】
Ｂ．結果
図７は（ａ）ＳＣＳ０１の配列（クローン＃１Ｅ．ｃｏｌｉＳＣＳ１１０形質転換ライブラリから）、（ｂ）ＳＣＳ０２の配列（クローン＃２Ｅ．ｃｏｌｉＳＣＳ１１０形質転換ライブラリから）、（ｃ）ＥＳ０１の配列（クローン＃１Ｅ．ｃｏｌｉＥＳ１３０１形質転換ライブラリから）、および（ｄ）ＥＳ０２の配列（クローン＃２Ｅ．ｃｏｌｉＥＳ１３０１形質転換ライブラリから）を示す。全ての４個の配列は野性型Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ  ｆｌａＡおよびＲ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ｆｌａＡ配列と異なった。クローンＳＣＳ０２、ＥＳ０１およびＥＳ０２は全て完全な開放読取り枠を含むが、ＳＣＳ０１は切断された。図８は、組換えが主にループ領域（不適正領域）で生じたことを示す。Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ｆｌａＡおよびＲ．ｌｕｐｉｎｉ  ｆｌａＡから発生したｆｌａＡ突然変異体ライブラリはＥ．ｃｏｌｉＳＣＳ１１０、ＥＳ１３０１、ＸＬ１０−ＧｏｌｄおよびＪＭ１０９、並びに機能性ＦｌａＡ組換え体に対して選別された形質転換体に形質転換できる。
【００７２】
実施例２．強化した特異的活性の変種のためのＥＣＢデアシラーゼの有向進化
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓは多くの重要な二次代謝物（多くの抗生物質を含む）並びに大量の酵素を生じるその能力により最も重要な工業微生物の中にある。ここに記載した接近は天然Ｓｔｏｐｔｏｍｙｃｅｓ酵素の有向進化、代謝経路における遺伝子のあるものまたは全部、並びにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓで発現される他の異種酵素で使用できる。
【００７３】
新しい抗かび剤は、日和見感染を受ける、免疫易感染ＡＩＤＳ、臓器移植および癌化学療法患者の数の大量の増加により緊急に必要である。ある種のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにより作られるリポペプチド、Ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ（ＥＣＢ）は可能性のある抗かび剤として広範に研究された。有意に毒性を減じた種々の抗かび剤が、Ａ．ｎｉｄｕｒａｎｓ  ｅｃｈｉｎｏｃａｄｉｎ  Ｂのリノル酸側鎖を異なるアリール側鎖で置換することにより生じた（７９〜８３）。化学的アシル化のための環状ヘキサペプチドＥＣＢ核前駆体がＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓＥＣＢデアシラーゼを用いるＥＣＢの酵素的加水分解により得られる。そのままの核へのＥＣＢの変換を最大にするために、この反応はＥＣＢ基質を可溶にするために混合性誘起溶媒の少量とｐＨ５．５で行われる。生成物環状ヘキサペプチド核はＥＣＢを完全に脱アシル化するために必要な長期インキュベート中にｐＨ５．５以上で不安定である（８４）。しかし、ＥＣＢデアシラーゼの最適ｐＨは８．０〜８．５であり、その活性はｐＨ５．５でおよび２．５％以上のエタノールの存在で低下する（８４）。ＥＣＢ核の生産を改善するために、これらの過程関連条件下でＥＣＢデアシラーゼの活性を増加することが必要である。
【００７４】
ＥＣＢデアシラーゼに関して知られたことは比較的少ない。酵素はヘテロ２量体であり、その２個のサブユニットは単一前駆体蛋白質の処理で誘導される（８３）。１９．９ｋＤα−サブユニットは１５アミノ酸スペーサ・ペプチドにより６０．４ｋＤβ−サブユニットから分離され、天然生物のシグナル・ペプチドおよび別のスペーサ・ペプチドと共に除去される。ポリペプチドも発現され、組換えＥＣＢデアシラーゼによるＥＣＢの大規模転換のために使用される微生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓの機能性酵素に処理される。酵素の三次元構造は決定されず、その配列は、ＥＣＢデアシラーゼをエンジニアリングする合理的努力に導くのに十分な信頼性のある構造モデルが構築することが困難である、ペニシリン・アシラーゼのような他の可能性のある関連酵素に対して低い類似性を示す。本発明者等は従ってこの重要な活性を改良するために有向進化（８５）を使用することを決定した。
【００７５】
変異原性ＰＣＲおよび２．４ｋｂＥＣＢデアシラーゼ遺伝子（７３％Ｇ＋Ｃ）のランダムプライミング組換えに適当なプロトコルは最近記載された（８６）。ここで、本発明者等はさらに強化した特異的活性の新しいＥＣＢデアシラーゼを発生するためにヘテロ二本鎖組換えの使用を説明する。
【００７６】
この場合に、ｐＨ５．５でおよび１０％ＭｅＯＨの存在で高い特異的活性を示す、２つのＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓＥＣＢデアシラーゼ突然変異体、Ｍ７−２およびＭ１６はｉｎ  ｖｉｔｒｏヘテロ二本鎖形成およびｉｎ  ｖｉｖｏ不適正修復の技術を用いて組換えられた。
【００７７】
図１２はＭ７−２およびＭ１６デアシラーゼ突然変異体に対する遺伝子を含むプラスミドｐＭ７−２およびｐＭ１６の物理的マップを示す。突然変異体Ｍ７−２はプラスミドｐＳＨＰ１５０−２*から発現された、野性型ＥＣＢデアシラーゼ遺伝子を含む全Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞で直接行われた変異原性ＰＣＲにより得られた。ｐＭ７−２を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓは野性型ＥＣＢデアシラーゼ（８６）を発現する細胞の特異的活性を１．５倍示す。クローンｐＭ１６は記載（８６、８７）されたようにランダムプライミング組換え技術を用いて得られた。野性型ＥＣＢデアシラーゼ・クローンの特異的活性の２．４倍を示す。
【００７８】
Ａ．方法：
Ｍ７−２およびＭ１６プラスミドＤＮＡ（ｐＭ７−２およびｐＭ１６）（図９）はＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０（別々の反応で）から精製された。約５．０μｇの非メチル化Ｍ７−２およびＭ１６ＤＮＡは３７℃で１時間それぞれＸｈｏ１およびＰｓｈＡ１で消化された（図１０）。アガロース・ゲル分離後、線形化ＤＮＡはＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて精製された。
等モル濃度（２．０ｎＭ）の線形化非メチル化ｐＭ７−２およびｐＭ１６ＤＮＡは１×ＳＳＰＥ緩衝液（１×ＳＳＰＥ；１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）中に混合された。９６℃で１０分間加熱後、反応混合物は直ちに０℃で５分間冷却される。混合物はヘテロ二本鎖の形成を促進するために６８℃で３時間インキュベートされた。
【００７９】
１ミクロリットルの反応混合物が５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１ｍｕｔＳ、ＳＣＳ１１０およびＪＭ１０９コンピテント細胞を形質転換するために使用された。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１ｍｕｔＳからの全形質転換体はプールされ、Ｅ．ｃｏｌｉＳＣＳ１１０はプールされた。プラスミド・プールは各プール・ライブラリから分離され、このプールはデアシラーゼ活性選別のための突然変異体ライブラリを形成するためにＳ．ｌｏｖｉｄａｎｓＴＫ２３原形質体を形質転換するために使用された。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓＴＫ２３ライブラリからの形質転換はそのプレート試験でｉｎ  ｓｉｔｕでＥＣＢデアシラーゼ活性に対して選別された。形質転換原形質体は２４時間３０℃でＲ２ＹＥ寒天プレート上で再生し、４８時間チオストレプトンの存在で展開させた。コロニーが適当なサイズに成長すると、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に０．５ｍｇ／ｍｌＥＣＢを含む６ｍｌの０．７％アガロース溶液がそれぞれＲ２ＹＥ寒天プレート上に注がれ、３０℃で１８〜２４時間展開することを可能にした。野性型プラスミドｐＳＨＰ１５０−２*を含む対照コロニーのものより大きい清澄帯で囲まれたコロニーは追加のキャラクタリゼーションのために選択された。
【００８０】
選択された形質転換体はチオストレプトンを含む２０ｍｌ培地中に接種され、３０℃で４８時間好気的に成長させられ、その点でそれらはＨＰＬＣを用いてＥＣＢデアシラーゼ活性を分析された。１００μＬの全ブロスが１０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨおよび２００μｇ／ｍｌのＥＣＢ基質を含む０．１ＭＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０℃で３０分間反応に使用された。反応は２．５体積のメタノール添加で停止され、２０μｌの各試料は、５０：５０のＡ：Ｂ（Ａ＝９３％アセトニトリル、０．１％リン酸；Ｂ＝７０％アセトニトリル、０．１％リン酸）で開始し、３０：７０のＡ：Ｂで２．２ｍｌ／分の流速で２２分で終結する線形アセトニトリル勾配を用いて室温で１００×４．６ｍｍポリヒドロキシエチルアスパルトアミド・カラム（ＰｏｌｙＬＣ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ．ＵＳＡ）上のＨＰＬＣで分析された。ＥＣＢおよびＥＣＢ核ピークの面積が計算され、ＥＣＢデアシラーゼ活性を評価するためにｐＩＪ７０２*を含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓの試料培養物からの対応するピークの面積から差し引かれた。
【００８１】
陽性突然変異体の２．０ｍｌの前培養物が５０ｍｌ培地に接種されるために使用され、３０℃で９６時間成長を可能にされた。上澄みはさらに１０ｋＤの分子量カットオフでＡｍｉｃｏｎろ過ユニット（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてその原体積の１／３０まで濃縮された。生じる酵素試料は同体積の５０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．０）緩衝液で希釈され、Ｈｉ−Ｔｒａｐイオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）にかけられた。結合緩衝液は５０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．０）であり、溶出緩衝液は１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．０）であった。０から１．０Ｍ  ＮａＣｌまでの線形勾配が２．７ｍｌ／分の流速で８カラム体積で適用された。０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出するＥＣＢデアシラーゼ分画は濃縮され、緩衝液はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニットを用いる５０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．０）で交換された。酵素純度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色剤を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥで検証され、濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて決定された。
【００８２】
修正ＨＰＬＣ試験がＥＣＢ基質（８４）上のＥＣＢデアシラーゼ突然変異体の活性を決定するために使用された。４μｇの各精製ＥＣＢデアシラーゼ突然変異体が１０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨおよび異なる濃度のＥＣＢ基質を含む０．１Ｍ  ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０℃で３０分間活性試験反応に対して使用された。試験は重複で行われた。反応は２．５体積のメタノールを加えて停止され、ＨＰＬＣ試験が上記のように行われた。吸収値は記録され、初期比は時間伸展曲線の最少二乗回帰で計算され、それからＫｍおよびｋｃａｔが計算された。
【００８３】
ｐＨの関数としての活性は３０℃で異なるｐＨ値：５、５．５および６（０．１Ｍアセテート緩衝液）；７、７．５、８および８．５（０．１Ｍリン酸緩衝液）；９および１０（０．１Ｍ炭酸緩衝液）でＨＰＬＣ試験を用いて精製したＥＣＢデアシラーゼに対して測定された。精製ＥＣＢデアシラーゼの安定性は１０％メタノールを含む０．１Ｍ  ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）中３０℃で決定された。試料は異なる時間間隔で引き出され、残留活性は上記のＨＰＬＣ試験で同じ緩衝液で測定された。
【００８４】
Ｂ．結果
図１１は、突然変異体Ｍ７−２およびＭ１６遺伝子へこのヘテロ二本鎖修復法を適用の１回の後、約５００の原形質転換体からの１つの突然変異体（Ｍ１５）が野性型の特異的活性の３．１倍を有することが分かった。野性型および進化したＭ１５ＥＣＢデアシラーゼは精製され、ＥＣＢの脱アシル化のためのその動力学パラメータはＨＰＬＣで決定された。進化したデアシラーゼＭ１５は２０５％まで増加した触媒速度定数、ｋcatを有する。Ｍ２０の触媒有効性（ｋcat／Ｋm）は野性型酵素にわたって２．９の係数で強化される。
【００８５】
５〜１０の異なるｐＨ値で野性型およびＭ１５による脱アシル化の初期速度は２００μｇ／ｍｌのＥＣＢで決定された。組換えＭ１５はｐＨ５〜８で野性型より活性である。この試験の酵素活性のｐＨ依存性は強くないが、野性型と比較して、低いｐＨに最適で１．０〜１．５単位の一定のシフトがある。
【００８６】
精製したＥＣＢデアシラーゼ突然変異体Ｍ１５の脱アシル化の時間経過は０．１Ｍ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）中３０℃で測定された。野性型と突然変異体Ｍ１５の間で安定性の有意差は観察されなかった。
【００８７】
野性型ＥＣＢデアシラーゼ配列に関するＤＮＡ突然変異および進化した変種ｍ７−２、Ｍ１６およびＭ１５中のアミノ酸置換の位置が図１２に要約される。
【００８８】
ヘテロ二本鎖組換え法は新規な子孫を作るために親配列を組換えることができる。Ｍ７−２およびＭ１６遺伝子の組換えはＭ１５を生じ、その活性はその親のいずれよりも高い（図１３）。Ｍ１５の６個の塩基置換で、５個（α５０、α１７１、β５７、β１２９およびβ３４０の位置で）はＭ７−２から継承し、他の１つ（β３０）はＭ１６から来た。
【００８９】
この接近はＤＮＡ組換えの現存の方法へ代替を提供し、特に大きい遺伝子または完全なオペロンの組み替えに有用である。この方法はその特性を改良するためおよび構造−機能関係を研究するために組換え蛋白質を作るために使用できる。
【００９０】
実施例３．新規な熱安定性Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ変種
この実施例はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅの熱安定性を改良するために２つの異なる配列からの配列情報を組合わせてｉｎ  ｖｉｖｏ修復が続く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏヘテロ二本鎖形成の使用を示す。
【００９１】
遺伝子ＲＣ１およびＲＣ２は熱安定性Ｂ．ｓｕｂｌｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ変種（８８）を符号化する。Ａｓｎ２１８／Ｓｅｒ（Ｎ２１８Ｓ）およびＡｓｎ１８１／Ａｓｐ（Ｎ１８１ＩＤ）アミノ酸置換を生じる、ＲＣ１の１１０７およびＲＣ２の９９５の塩基位置における突然変異（図１４）はｓｕｂｌｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ熱安定性の向上をもたらし；類似および非類似の両方の残りの突然変異は熱安定性に検出可能な効果を有しない。６５℃で、単一変種Ｎ１８１ＤおよびＮ２１８Ｓは野性ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅよりそれぞれ約３倍および２倍長い半減期を有し、両方の突然変異体を含む変種は８倍長い半減期を有する（８８）。ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ変種の集団における異なる半減期は従ってそれによって配列情報が組合わされる効率を評価するために使用される。特に、これら２つの突然変異（熱安定性に影響する点突然変異の欠如で）の間の組替えは、集団の２５％が二重突然変異体の熱安定性を示すライブラリを発生するはずである。同様に、Ｎ１８１ＤおよびＮ２１８Ｓが等しい頻度で除かれると、集団の２５％が野性型様安定性を示すはずである。本発明者等は診断方法として組換え集団の分画を用いた。
【００９２】
Ａ．方法
この実施例の基礎となる戦略は図１５に示される。
【００９３】
ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ突然変異遺伝子ＲＣ１およびＲＣ２（図１４）は、ｓｕｂｔｉｌｉｔｉｎ  Ｅプロ配列の４５ｎｔ、完全成熟配列および停止コドン後の１１３ｎｔを含む９８６ｂｐ断片である。遺伝子はそれぞれｐＢＥ３−１およびｐＢＥ３−２を生じる、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓシャトル・ベクターｐＢＥ３中のＢａｍ  ＨＩとＮｄｅ１の間でクローン化された。プラスミドＤＮＡｐＢＥ３−１およびｐＢＥ３−２はＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０から分離された。
【００９４】
約５．０μｇの非メチル化ｐＢＥ３−１およびｐＢＥ３−２ＤＮＡは３７℃で１時間それぞれＢａｍ  ＨＩおよびＮｄｅ  Ｉと共に消化された。アガロース・ゲル分離後、等モル濃度（２．０ｎＭ）の線形化非メチル化ｐＢＥ３−１およびｐＢＥ３−２が１×ＳＳＰＥ緩衝液（１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）に混合された。９６℃で１０分間加熱後、反応混合物は直ちに０℃で５分間冷却された。混合物は形成するヘテロ二本鎖に対して６８℃で２時間インキュベートされた。
【００９５】
１ミクロリットルの反応混合物が５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１ｍｕｔＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０およびＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞を形質転換するために使用された。
【００９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞による形質転換効率はＥ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０のものより約１０倍高く、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１  ｍｕｔＳのものより１５倍高かった。しかし全ての場合に、形質転換効率は閉じた、共有結合および環状制御ｐＵＣ１９プラスミドによる形質転換のものより１０〜２５０倍低かった。
【００９７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０突然変異体ライブラリからの５個のクローンおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１  ｍｕｔＳライブラリからの５個がランダムに選ばれ、プラスミドＤＮＡが追加のＤＮＡ配列分析のためにＱＩＡｐｒｅｐスピン・プラスミド・ミニプレプキットを用いて分離された。
【００９８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１突然変異ライブラリからの約２，０００個のランダム・クローンがプールされ、全プラスミドＤＮＡがＱＩＡＧＥＮ−１００カラムを用いて分離され、０．５〜４．０μｇの分離したプラスミドが既に述べたように（８８）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ４２８を形質転換するために使用された。
【００９９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ４２８ライブラリからの約４００個の形質転換体が選別を受けた。選別は既に記載した（８８）試験を用いて、こはく酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド上で行われた。プラスミド・ライブラリを含むＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ４２８はカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）板を含むＬＢ板上で成長した。３７℃で１８時間後、単一コロニーはウェル当たり２００μｌＳＧ／カナマイシン培地を含む９６ウェル板に採られた。これらの板は細胞を飽和まで成長させるため振とうしながら３７℃で２４時間インキュベートされた。細胞は遠心沈澱され、上澄みは熱安定性試験のために試料採取された。
【０１００】
９６ウェル試験板の二同形培養は１０μｌの上澄みをレプリカ板に移すことで各成長板に対して用意された。ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ活性は次いで１００μｌの活性試験溶液（０．２ｍＭこはく酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０、３７℃）を加えて測定された。反応速度はＴｈｅｒｍｏＭａｘマイクロプレート・リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）中で１．０分にわたって４０５ｎｍで測定された。室温で測定された活性は活性クローン（野性型のものの１０％以下の活性のクローンは不活性として記録された）の分率を計算するために使用された。初期活性（Ａi）は各ウェルへ予め温めた（３７℃）試験溶液（０．２ｍＭ  こはく酸−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０）の１００μｌを直ちに加えることにより１０分間６５℃で１つの試験板をインキュベート後に測定された。残留活性（Ａｒ）は、４０分間培養した後測定された。
【０１０１】
Ｂ．結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏヘテロ二本鎖形成およびｉｎ  ｖｉｖｏ修復は上記のように行われた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０突然変異体ライブラリからの５個のクローンおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＥＳ１３０１ｍｕｔＳライブラリからの５個がランダムで選択され、配列された。図１４は、１０個のクローンからの４個が親遺伝子と異なることを示した。生じる遺伝子中の親ＲＣ１またはＲＣ２からの特別な点突然変異の発生の頻度は０％〜５０％の範囲で、ヘテロ二本鎖中の１０点突然変異が強い鎖特異性選好なしで修復された。
【０１０２】
１０個の突然変異のいずれもｄｅｍ部位内に位置しないので、不適正修復は一般にＥ．ｃｏｌｉ  ｌｏｎｇ−ｐａｔｃｈ不適正修復システムにより行われると思われる。システムは、修復される鎖を決定するための主要機構としてＧＡＴＣ配列におけるアデニンのＮ６−メチル化の状態を用いる鎖特異性方式で異なる不適正を修復する。１つだけのＤＮＡ鎖上のＧＡＴＣ配列でメチル化したヘテロ二本鎖で、修正用テンプレートとして役立つメチル化鎖で、修復は非メチル化鎖に高度に偏ることを示した。いずれの鎖もメチル化されないならば、不適正修復が生じるが、小さい鎖選好性を示した（２３、２４）。これらの結果は、二本鎖の有効でランダムな修復を促進するために組換えられるＤＮＡを脱メチル化することは好ましいことを示す。
【０１０３】
６５℃でのｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ熱不活化の速度はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＢ４２８ライブラリからの４００個のランダム・クローンを分析することにより評価された。９６ウェル板から得られた熱安定性は下降順でプロットされて、図１６に示される。約１２．９％のクローンはＮ１８１ＤおよびＮ２１８Ｓ二重突然変異による突然変異体に匹敵する熱安定性を示した。この速度はこれら２つの標識のランダム組換えに対して期待されるものの半分だけであるので、ヘテロ二本鎖内の９９５および１１０７位における２つの不適正はより低い位置のランダムさで修復された。
【０１０４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＣＳ１１０ヘテロ二本鎖ライブラリからの選別された４００個の形質転換体中の最高熱安定性を示すクローンの配列分析はＮ１８１ＤおよびＮ２１８Ｓの両方の突然変異の存在を確認した。選別されたＢ．ｓｕｂｌｉｌｉｓ  ＤＢ４２８ライブラリからの４００個の形質転換体のうち、約９１％のクローンはＮ１８１Ｄ−および／またはＮ２１８Ｓ−型酵素安定性を発現したが、形質転換体の約８．０％は野性型だけのｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｅ安定性を示した。
【０１０５】
１．０％以下の不活性クローンが発見され、組換え過程でほとんど新しい点突然変異が導入されなかったことを示した。これは、新しい点突然変異が１０個の配列化遺伝子中に確認されないという事実に一致する（図１４）。点突然変異はｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化応用のあるものに有用な相違を提供するが、それらは特に突然変異速度が高いとき、有益な突然変異の組換えに対して疑問でもある。
【０１０６】
実施例４．ヘテロ二本鎖組換えのための最適化条件
本発明者等は、ヘテロ二本鎖組換えの効率が遺伝子から遺伝子へかなり異なることが分かった［１７、５７］。この実施例では、本発明者等は組換え効率を改良する種々のパラメータを研究し最適化する。この実施例で用いられたＤＮＡ基質はＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑蛍光蛋白質の部位指向性突然変異体であった。ＧＦＰ突然変異体はその蛍光を廃止する配列に沿って異なる位置で導入された停止コドンを有した。蛍光野性型蛋白質は２つ以上の突然変異間の組換えでのみ回復できる。蛍光コロニーの分画は組換え効率の尺度として使用された。
【０１０７】
Ａ．方法
約２〜４μｇの各親プラスミドは１つの組換え実験に使用された。１つの親プラスミドはＰｓｔＩエンドヌクレアーゼで消化され、別の親はＥｃｏＲＩで消化された。線形化プラスミドは共に混合され、２０×ＳＳＰＥ緩衝液は最終濃度１×（１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）まで加えられた。反応混合物は９６℃で４分間加熱され、直ちに氷上に４分間移され、インキュベートが６８℃で２時間続けられた。
【０１０８】
標的遺伝子はｐＧＦＰプラスミドのベクター配列に対応するプライマによるＰＣＲ反応で増幅された。前進プライマ；５’−ＣＣＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧ−３’、逆プライマ５’−ＣＧＧＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧ−３’、ＰＣＲ生成物は共に混合されＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて精製された。精製した生成物は２０×ＳＳＰＥ緩衝液と混合され、上記のように対合された。アニール生成物はエタノールで沈澱され、またはＱｉａｇｅｎカラムで精製され、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ酵素で消化された。消化生成物はＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＧＦＰベクターに結合された。
【０１０９】
ｄＵＴＰは最終濃度２００μＭ、４０μＭ、８μＭ、１．６μＭ、０．３２μＭでＰＣＲ反応に加えられた。ＰＣＲ反応とそれに続くクローン化手順は上記と同様に行った。
【０１１０】
組換えプラスミドは修飾化学形質転換法でＸＬ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ系統に形質転換された。細胞はＬＢ寒天板含有アンピシリン上に塗布され、３７℃で一夜成長され、蛍光が発生するまで室温または４℃でのインキュベートが続いた。
【０１１１】
Ｂ．結果
１．組換え効率への結合の効果
組換え効率へのＤＮＡヘテロ二本鎖中の破断の効果を試験するために２つの実験が行われた。１つの実験では、ヘテロ二本鎖プラスミドは全ての現存の一本鎖破断を閉じるためにＤＮＡリガーゼで処理され、非結合試料と同じ条件で形質転換された（表１参照）。結合試料は非結合試料より組換え効率で７倍までの改良を示す。
【０１１２】
別の実験では、ｄＵＴＰは宿主細胞中のウラシルＮ−グリコシダーゼによる修復でＤＮＡに追加の破断を導入するＰＣＲ反応に加えられた。表２はｄＵＭＰ取込みが組替えを抑制し、抑制の程度がｄＵＴＰ濃度の増加で増加することを示す。
【０１１３】
２．ヘテロ二本鎖形成に対するプラスミド・サイズの影響
プラスミド・サイズは組換え効率に影響する重要な因子である。２つのプラスミドｐＧＦＰ（３．３ｋｂ）およびＢａｃｉｌｌｕｓシャトル・ベクターｐＣＴＩ（約９ｋｂ）が伝統的ヘテロ二本鎖プロトコルに続く環状ヘテロ二本鎖様プラスミドの準備で使用された。この実験の目的のために（二本鎖形成へのプラスミド・サイズの効果を研究するために）両方の親が同じ配列を有した。ｐＧＦＰが環状プラスミドの３０〜４０％を形成すると、シャトル・ベクターはこの形の１０％以下を生じた。
【０１１４】
プラスミド・サイズの増加はそれぞれの近傍で末端の濃度を減少し、一本鎖である非常に長い（＞０．８ｋｂ）末端のアニーリングをより困難にする。この困難は図３に示される手順で避けられ、そこではヘテロ二本鎖形成はベクターの無い形の基質間で生じ、ヘテロ二本鎖は続いてベクターに挿入される。
【０１１５】
３．組換えの効率対突然変異間の距離
一連のＧＦＰ変種は組換えの効率への突然変異間の距離の効果を研究するために対で組換えられた。親遺伝子はＰＣＲで増幅され、アニールされ、ｐＧＦＰベクターに結合された。ヘテロ二本鎖はＸＬ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ系統に形質転換された。
【０１１６】
表３の最初の３列は三種の独立の実験の結果を示し、突然変異間の距離への組換え効率の依存性を示す。期待したように組み替えは非常に近い突然変異では少なく、効果的でなくなる。
【０１１７】
しかし、ｌｏｎｇ−ｐａｔｃｈ修復が２７ｂｐだけ離れた突然変異を組換えることができたことは顕著である。
【０１１８】
表３の最後の行は１つの一重および１つの二重突然変異体の間の組換えを示す。野性型ＧＦＰは９９ｂｐだけの距離で生じる各個別クロスオーバによる二重クロスオーバの事象でのみ回復でき、多重で、近い間隔の突然変異を組換えるこの方法の能力を示す。
【０１１９】
４．ヘテロ二本鎖調製からの親二本鎖の除去
ベクターの無い形の基質のアニーリングはベクターの成分としての基質のアニーリングに関してサイズの利益を提供するが、宿主への形質転換により単にホモ二本鎖に関してヘテロ二本鎖に対する選択を可能にしない。既に増幅され、精製された遺伝子断片の適当な量で播種した各親に対する１つだけのプライマによる非対称ＰＣＲ反応が１００周期継続し、別の鎖より１つの鎖の１００倍の過剰を保証する。これらの非対称反応の生成物は混合され、共にアニールされ、少量の非組換え二本鎖のみを生じる。表３の最後の列はこれらの富化ヘテロ二本鎖から得られた組換え効率を示す。最初の三列と第四列との比較は親鎖の非対称合成により達成された改良を示す。
【０１２０】
上記の発明は明確さと理解の目的で詳細に説明したが、発明の真の範囲から逸脱せずに形態および細部に種々の変更を加えることができることが、この開示を読めば当分野の技術者には明らかであろう。本出願に引用した全ての刊行物および特許文書は、個々の各刊行物および特許文書が個別に表されるのと同程度にあらゆる目的でその全体が参照により取り込まれる。
【０１２１】
参考文献
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２３．Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，Ｍ．１９８８．「ＤＮＡ不適正のメチル指向修復（Ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ．）」ｐ．９１〜１１３，Ｉｎ  Ｋ．Ｂ．Ｌｏｗ（ｅｄ．）「遺伝物質の組換え（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．
２４．Ｆｉｓｈｅｌ，Ｒ．Ａ．，Ｓｉｅｇｅｌ，Ｅ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｒ．１９８６．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける遺伝子変換。共修復によるヘテロ対立不適正ヌクレオチドの解決（Ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏａｌｌｅｌｉｃ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｃｏ−ｒｅｐａｉｒ．）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １８８：１４７〜１５７．
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２６．Ｒａｄｍａｎ，Ｍ．，Ｒ．Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｂ．Ｗ．Ｇｌｉｃｋｍａｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，１９８０．「ＤＮＡメチル化、不適正修正および遺伝子安定性（ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．）」ｐ．１２１〜１３０，Ｉｎ  Ｍ．Ａｌａｃｅｖｉｃ（ｅｄ．）「環境変異原性の過程（Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．）」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．
２７．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．１９８９．「分子クローン化：実験室手引き（Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．）」２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
２８．Ａｌｌｅｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍａｋｈｏｖ．Ａ．，Ｇｒｉｌｌｅｙ．Ｍ．，Ｔａｙｌｏｒ．Ｊ．，Ｔｈｒｅｓｈｅｒ，Ｒ．，Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．「ｍｕｔＳは転座機構によるヘテロ二本鎖ループ形成を媒介する（ＭｕｔＳ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｌｏｏｐ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．）」１９９７，ＥＭＰＯ  Ｊ．  １６：４４６７〜４４７６．
３０．Ｔｓａｉ−Ｗｕ，Ｊ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｕ，Ａ．Ｌ．１９９４．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔＹ依存性不適正修復はＤＮＡポリメラーゼＩおよび文字下位修復経路を含む（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｕｔＹ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ａ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅｐａｉｒ  ｔｒａｃｔ．）」Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．  ２４４：４４４〜４５０．
３１．Ｗｏｒｔｈ．Ｌ．Ｊｒ．，Ｃｌａｒｋ．Ｓ．，Ｒａｄｍａｎ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｍｏｄｒｉｃｈ．Ｐ，１９９４．「不適正修復蛋白質ＭｕｔＳおよびＭｕｔＬは発散したＤＮＡ間のＲｅｃＡ触媒鎖移動を阻害する（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＭｕｔＳ  ａｎｄ  ＭｕｔＬ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＲｅｃＡ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｅｖｅｒｇｅｄ  ＤＮＡｓ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３２３８〜３２４１．
３２．Ｆｏｘ．Ｍ．Ｓ．，Ｒａｄｉｃｅｌｌａ．Ｊ．Ｐ．ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏ．Ｋ．１９９４．「塩基対不適正修復のある特徴および遺伝子組換え体の形成における役割（Ｓｏｍｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ．）」Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２５３〜２６０．
３３．Ｒａｄｉｃｅｌｌａ．Ｊ．Ｐ．，Ｃｌａｒｋ．Ｅ．Ａ．．Ｃｈｅｎ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆｏｘ，Ｍ．Ｓ．１９９３．「局在化修復イベントのパッチ長さ：ｍｕｔ  Ｙ依存ミスマッチ修復におけるＤＮＡポリメラーゼＩの役割（Ｐａｔｃｈ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｅｖｅｎｔｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｉｎ  ｍｕｔ  Ｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ．）」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：７７３２〜７７３６．
３４．Ｋｒａｃｚｋｉｅｗｉｃｚ−Ｄｏｗｊａｔ，Ａ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｌ．Ｒ．１９９０．「ヘテロ二本鎖ＤＮＡのＲｅｃＢ−ｒｅｃＣ依存処理はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの隣接遺伝子の組み換えを刺激する（ＲｅｃＢ−ｒｅｃＣ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｇｅｎｅ）」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：１７２〜１７８．
３５．Ｒａｄｍａｎ．Ｍ．１９８９．「ミスマッチ修復および遺伝子組み換えの忠実度（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．）」Ｇｅｎｏｍｅ  ３１；６８〜７３．
３６．Ｒａｐｏｓａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｆｏｘ，Ｍ．Ｓ．１９８７．「Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける塩基対ミスマッチおよび異種修復の若干の特徴（Ｓｏｍｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｙ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）」Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１７：３８１〜３９０．
３７．Ｊｏｎｅｓ．Ｍ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒａｄｍａｎ．Ｍ．１９８７．「Ｅ．ｃｏｌｉにおけるミスマッチ修復および組み換え（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」Ｃｅｌｌ  ５０；６２１〜６２６．
３８．Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｆ．，Ｍａｅｎｈａｕｔ−Ｍｉｃｈｅｌ，Ｇ．ａｎｄ  Ｒａｄｍａｎ，Ｍ．１９８７．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉミスマッチ修復におけるＧＡＴＣ配列、ＤＮＡニックおよびＭｕｔＨ機能（ＧＡＴＣ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＤＮＡ  ｎｉｃｋｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＭｕｔＨ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ．）」ＥＭＢＯＪ．６：１１２１〜１１２７
３９．Ｇｌａｚｅｒ．Ｐ．Ｍ．，Ｓａｒｋａｒ．Ｓ．Ｎ，．Ｃｈｉｓｈｏｌｍ．Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｗ．Ｃ．１９８７．「ヒト細胞抽出物中に検出されたＤＮＡミスマッチ修復（ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ．）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７；２１８〜２２４
４０．Ｌａｅｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ．Ｆ．，Ｍａｅｎｈａｕｔ−Ｍｉｃｈｅｌ，Ｇ．ａｎｄ  Ｒａｄｍａｎ  Ｍ．１９８６．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるＧＡＴＣ配列およびミスマッチ修復（ＧＡＴＣ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）」ＥＭＢＯＪ．５；２００９〜２０１３．
４１．Ｂａｕｅｒ，Ｊ．，Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，Ｒ．１９８１．「バクテリオファージＴ７ヘテロ二本鎖ＤＮＡの非対称修復（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ．）」Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８１：５４１〜５４７．
４２．Ｗｉｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｅｓｅｌｓｏｎ．Ｍ．１９７５．「ヘテロ二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ修復（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：２２０２〜２２０６．
４３．Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ．Ｄ．Ｔ．ａｎｄ  Ｐｅｔｅｓ．Ｔ．Ｄ．１９９７．「ＤＮＡループの修復はＤＮＡミスマッチおよびヌクレオチド除去修復蛋白を要する（Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｌｏｏｐｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ＤＮＡ−ｍｉｓｍａｔｃｈ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）」Ｎａｔｕｒｅ  ３８７；９２９〜３１．
４４．Ｌｅｕｎｇ．Ｗ．，Ｍａｌｋｏｖａ．Ａ．ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ．Ｊ．Ｅ，１９９７．「線状二本鎖ＤＮＡによる遺伝子ターゲッティングはしばしば優先的ミスマッチ矯正を受ける一本鎖の同化によって起こる（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｒ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｏｃｃｕｒｓ  ｂｙ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｔｏ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４；６８５１〜６８５６．
４５．Ｈｕｎｔｅｒ．Ｎ．ａｎｄ  Ｂｏｒｔｓ．Ｒ．Ｈ．１９９７．「Ｍｌｈｌは減数分裂中の乗り換えを促進できる点でミスマッチ修復蛋白の内でもユニークである（Ｍｌｈｌ  ｉｓ  ｕｎｉｑｕｅ  ａｍｏｎｇ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｉｔｓ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｏｖｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｅｉｏｓｉｓ．）」Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：０８９０〜９３６９．
４６．Ａｌａｎｉ．Ｅ，．Ｌｅｅ．Ｓ．，Ｋａｎｅ．Ｍ．Ｆ．．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ．Ｊ．ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．１９９７．「誤対合塩基認識蛋白Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＳＨ２．はＤＮＡのホリデイ接合部も認識する（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＳＨ２．ａ  ｍｉｓｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｅ  ｒｅｃｏｎｇｎｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．ａｌｓｏ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＤＮＡ．）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６５：２８９〜３０１．
４７．Ｖａｒｌｅｔ  Ｉ．，Ｃａｎａｒｄ  Ｂ．，Ｂｒｏｏｋｓ．Ｐ．，Ｃｅｒｏｖｉｃ，  Ｇ．ａｎｄ  Ｒａｄｍａｎ．Ｍ．１９９６．「Ｘｅｎｏｐｕｓ卵抽出物におけるミスマッチ修復：ＤＮＡ鎖の破断は除去点ではなく信号として働く（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｅｇｇ  ｅｘｔｒａｃｔｓ：ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ａｃｔ  ａｓ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｐｏｉｎｔｓ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０１５６〜１０１６１．
４８．Ｎｉｃｏｌａｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．１９９４．「菌類における減数分裂遺伝子変換の極性：対照的な見方（Ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｉｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ｆｕｎｇｉ：ｃｏｎｓｔｒａｓｔｉｎｇ  ｖｉｅｗｓ．）」Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２４２〜５２．
４９．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｋ．．Ｊ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ．ａｎｄ  Ｒ，Ｄ．Ｋｏｌｏｄｎｅｒ．１９８９．「ヘテロ二本鎖プラスミドＤＮＡによるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換に続くミスマッチ修復の特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｗｉｔｈ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３７１３〜３７１７．
５０．Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．，Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ．ａｎｄ  Ｓ．Ｆｏｇｅｌ．１９８９．「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるヘテロ二本鎖ＤＮＡ矯正はミスマッチ特異的であり機能的ＰＭＳ遺伝子を必要とする（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｉｓ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＰＭＳ  ｇｅｎｅｓ）」  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４４３２〜４４４０．
５１．Ｂａｙｎｔｏｎ，Ｋ．，Ｂｒｅｓｓｏｎ−Ｒｏｙ，Ａ．ａｎｄ  Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．Ｐ．１９９８．「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける損傷寛容経路の分析：翻訳合成におけるＲｅｖ３  ＤＮＡポリメラーゼの要件（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ａ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｒｅｖ３  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８；９６０〜９６６．
５２．Ａｌａｎｉ．Ｅ．，Ｒｅｅｎａｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ，Ｒ．Ｄ．１９９４．「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるミスマッチ修復と遺伝子組み換えの相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．）」Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３７：１９〜３９．
５４．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｋ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ．Ｍ．Ｓ．，Ｆｏｇｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ．Ｒ．Ｄ．１９８７．「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅにおける遺伝子転換におけるヘテロ二本鎖矯正の役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ．）」Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：３６２〜３６４．
５５．Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｋ．ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ．Ｒ，Ｄ．１９８６．「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの形質転換後のヘテロ二本鎖プラスミドＤＮＡの修復（Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：３４０１〜３４０９．
５６．Ｗｈｉｔｅ．Ｊ．Ｈ．，Ｌｕｓｎａｋ．Ｋ．ａｎｄ  Ｆｏｇｅｌ，Ｓ．１９８５．「酵母におけるミスマッチ特異的な減数分裂後の分離頻度はヘテロ二本鎖組換え中間体を示唆する（Ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｓｔ−ｍｅｉｏｔｉｃ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ．）」Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３５０〜３５２．
５７．Ａｂａｓｔａｄｏ．Ｊ．−Ｐ．，Ｂ．Ｃａｍｉ．Ｔ．Ｈ．Ｄｉｎｈ．Ｊ．Ｉｇｏｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ．１９８４．「Ｅ．ｃｏｌｉおよびＣｏｓ−１サル細胞における複雑なヘテロ二本鎖の処理（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｓ−１  ｍｏｎｋｅｙ  ｃｅｌｌｓ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５７９２〜５７９６．
５８．Ｂｒｏｗｎ．Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｊｉｒｉｃｎｙ．１９８７．「特異的ミスマッチ修復イベントが哺乳類の細胞を５−メチルシトシンの欠損から保護する（Ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｅｖｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ．）」Ｃｅｌｌ  ５０：９４５〜９５０．
５９．Ｓｉｂｇｈａｔ−Ｕｌｌａｈ．ａｎｄ  Ｒ−Ｓ．Ｄａｙ．１９９３．「ヒトＧ；Ｔミスマッチ修復活性のＤＮＡ基質配列の特異性（ＤＮＡ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｇ；Ｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１；１２８１〜１２８７．
６０．Ｍｉｌｌｅｒ．Ｅ．Ｍ．，Ｈｏｕｇｈ．Ｈ．Ｌ．．Ｃｈｏ．Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ．Ｊ．Ａ．１９９７．「チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞の相同的組み換え中間体における効率の良いニック指向機構および効率の劣るミスマッチ特異的機構によるミスマッチ修復（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｉｃｋ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ，ａｎｄ  ｌｅｓｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．）」Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４７；７４３〜７５３．
６１．Ｄｅｎｇ，Ｗ．Ｐ．ａｎｄ  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ．Ｊ．Ａ．１９９４．「哺乳類の細胞における染色体外組み換えのヘテロ二本鎖ＤＮＡ中間体のミスマッチ修復（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｅｓ．）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：４００〜４０６．
６２．Ｔｈｏｍａｓ．Ｄ．Ｃ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ．Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．１９９１．「ヒトＨｅＬａ細胞抽出物におけるヘテロ二本鎖修復（Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨｅＬａ  ｃｅｌｌｓ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３７４４〜５１．
６３．Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｔｈｏｍａｓ．Ｋ．ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ，１９８５．「培養哺乳類細胞核に注入されたプラスミド・ヘテロ二本鎖中のミスマッチ塩基の効率的矯正（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｉ．）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：７０〜７４．
６４．Ｆａｎｇ，Ｗ．．Ｗｕ，Ｊ．Ｙ．ａｎｄ  Ｓｕ．Ｍ．Ｊ．１９９７．「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの細胞抽出物中の小型ミスマッチ異種配列のメチル指向修復（Ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２７１４〜２２７２０．
６５．Ｓｍｉｔｈ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｄｒｉｃｈ．Ｐ．１９９７．「ＰＣＲ産物からのポリメラーゼで産生された突然変異配列の除去（Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４；６８４７〜５０．
６６．Ｓｕ，Ｓ．Ｓ．，Ｇｒｉｌｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｈｒｅｓｈｅｒ，Ｒ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．１９８９．「ＤＮＡ合成が制限された条件下でギャップ形成はメチル指向ミスマッチ矯正に関連する（Ｇａｐ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．）」Ｇｅｎｏｍｅ  ３１：１０４〜１１．
６７．Ｍｕｓｔｅｒ−Ｎａｓｓａｌ．Ｃ．ａｎｄ  Ｋｏｌｏｄｎｅｒ．Ｒ．１９８６．「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞を含まない抽出物を触媒とするミスマッチ矯正（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７６１８〜７６２２．
６８．Ｍａｃｎａｂ．Ｒ．Ｍ．１９９２．「細菌鞭毛の遺伝と生物発生（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａ．）」Ａｎｎｕｌ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２６：１３１〜１５８．
６９．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ  Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ｊ．１９９３．「細菌鞭毛繊維とその成分フラジェリン（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎｓ．）」Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：４５１〜４７２．
７０．Ｓｃｈｍｉｔｔ．Ｒ．，Ｒａｓｋａｌ．  Ａ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ．Ｆ．１９７４．「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓの普通鞭毛と複合鞭毛：微細構造と組成の分析（Ｐｌａｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｏｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．）」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１７；８４４〜８５７．
７１．Ｇｏｅｔｚ．Ｒ．，Ｌｉｍｍｅｒ，Ｎ．．Ｏｂｅｒ．Ｋ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔ．Ｒ．１９８２．「複合鞭毛をもつＲｈｉｚｏｂｉｕｍ２菌株の運動性と走化性（Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａ．）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２８：７８９〜７９８．
７２．Ｓｃｈｍｉｔｔ．Ｒ．．Ｂａｍｂｅｒｇｅｒｌ．．Ａｃｋｅｒ  Ｇ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ．Ｆ．１９７４．「Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３の複合鞭毛の微細構造分析（Ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａ  ｏｆ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３．）」Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１００：１４５〜１６２．
７３．Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ．Ｓ．．ＤｅＲｏｓｉｅｒ．Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｃｎａｂ．Ｒ．Ｍ．１９８７．「Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉの複合鞭毛繊維の３次元構造およびその普通鞭毛の構造との関係（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：６０３〜６２０．
７４．Ｇｏｔｚ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｒ．１９８７．「Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍａｌｉｌｏｔｉは右向きの鞭毛らせんの一方向の断続的回転によって遊泳する（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍａｌｉｌｏｔｉ  ｓｗｉｍｓ  ｂｙ  ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｒｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｇｈｔ−ｈａｎｄｅｄ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｈｅｌｉｃｅｓ．）」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３１４６〜３１５０．
７５．Ｌｏｔｚ，Ｗ．，Ａｃｋｅｒ，Ｇ，ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｒ．１９７７．「バクテリオファージ７−７−１はＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３の複合鞭毛に吸着する（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ７−７−１  ａｄｓｏｒｂｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａ  ｏｆ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３．）」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３４：９〜１７．
７６．Ｋｒｕｐｓｋｉ．Ｇ．，Ｇｏｌｔｚ，Ｆ．，Ｏｂｅｒ，Ｋ．．Ｐｌｅｉｃｒ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔ．Ｒ．１９８５．「Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉの複合鞭毛繊維の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ．）」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６２：３６１〜３６６．
７７．Ｍａｒｕｙａｍａ．Ｍ．，Ｌｏｄｄｅｒｓｔａｅｄｔ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔ．Ｒ．１９７８．「Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３から単離した複合鞭毛の精製と生化学的諸特性（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｌａｇｅｌｌａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｕｐｉｎｉ  Ｈ１３−３．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５３５：１１０〜１２４．
７８．Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，ＤｅＲｏｓｉｅｒ．Ｄ．Ｊ．．Ａｉｚａｗａ，Ｓ：−Ｉ．ａｎｄ  Ｍａｃｎａｂ．Ｒ．Ｍ．１９８６．「フラジェリン・サブユニットの対による摂動。普通鞭毛繊維と複合鞭毛繊維の違いの構造的基礎（Ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｌａｉｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．）」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９０：５６９〜５７６．
７９．Ｇｏｒｄｅｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｚｅｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｆ．，Ｔｈａｋｋａｒ，Ａ．Ｌ．ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ．Ｌ．Ｃ．１９８４．「ＬＹ１２１０１９のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ抗カンジダ活性と毒性（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉ−Ｃａｎｄｉｄａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＬＹ１２１０１９．）」Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３７：１０５４〜１０６５．
８０．Ｄｅｂｏｎｏ，Ｍ．，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｋ．Ｅ．，Ｋｒｉｓｔ，Ｈ．Ａ．，Ｗｉｎｄ，Ｊ．Ａ．，Ｃｒｏｕｓｅ，Ｇ．Ｄ．，Ｔａｏ．Ｅ．Ｖ．，Ｖｉｃｅｎｚｉ，Ｊ．Ｔ．，Ｃｏｕｎｔｅｒ．Ｆ．Ｔ．，Ｏｔｔ，Ｊ．Ｌ．．Ｏｓｅ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ  Ｏｍｕｒａ，Ｓ．１９８９．「エキノカンジンＢペプチドの酵素的脱アシル化および化学的再アシル化によるエキノカンジンＢの新規類似体の合成：抗菌剤シロフンジンの合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｗ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅａｃｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔ  ｃｉｌｏｆｕｎｇｉｎ（ＬＹ１２１０１９）．）」Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４２（３）：３８９〜３９７．
８１．Ｄｅｂｏｎｏ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｏｒｄｅｅ，Ｒ．Ｓ．１９９４．「菌類の細胞壁の発達を阻害する抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４８：４７１〜４９７．
８２．Ｄｅｂｏｎｏ．Ｍ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｗ．Ｗ．，Ｌａｇｒａｎｄｅｕｒ，Ｌ．，Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｊ．，Ｎｉｓｓｅｎ．Ｊ．Ｓ．，Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｋ．Ｋ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｍ．Ｊ．，Ｚｗｅｉｆｅｌ．Ｍ．Ｊ．，Ｚｅｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｒｄｅｅ，Ｒ．Ｓ．．Ｔａｎｇ．Ｊ．ａｎｄ  Ｐａｔｔ，Ｔ．Ｒ．１９９５．「抗菌性リポペプチド、エキノカンジンＢ（ＥＣＢ）の半合成的化学修飾：ＥＣＢのポリアリル化アシル類似体の親油性パラメータおよび幾何パラメータの構造活性研究（Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ（ＥＣＢ）：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｒｙｌａｔｅｄ  ａｃｙｌ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ＥＣＢ．）」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８（１７）：３２７１〜３２８１．
８３．Ｙｅｈ，Ｗ．Ｋ．１９９７．「製剤用酵素技術の発展：ケース・スタディー（Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．）」Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（５−６）：３３４〜３４３．
８４．Ｂｏｅｃｋ，Ｌ．Ｄ．．Ｆｕｋｕｄａ．Ｄ．．Ａｂｂｏｔｔ．Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｄｅｂｏｎｏ．１９８９．「Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓによるエキノカンジンＢの脱アシル化（Ｄｅａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｃｈｉｎｏｃａｎｄｉｎ  Ｂ  ｂｙ  Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ．）」Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４２（３）：３８２〜３８８
８５．Ａｍｏｌｄ．Ｆ．Ｈ．１９９８．「有向進化による設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．）」Ａｃｃｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３１：１２５〜１３１．
８６．Ｓｈａｏ．Ｚ．，Ｃａｌｌａｈａｎ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｍｏｌｄ．Ｆ．Ｈ．１９９８．「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓにおけるＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ  ｕｔａｈｅｓｉｓ  ＥＣＢデアシラーゼの有向酵素進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ  ＥＣＢ  ｄｅａｃｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．）」Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ．
８７．Ｓｈａｏ．Ｚ．．Ｚｈａｏ．Ｈ．．Ｇｉｖｅｒ．Ｌ．ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ．Ｆ．Ｈ．１９９８．「ランダム・プライミングｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換え：有向進化のための有効なツール（Ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６（２）：６８１〜６８３．
８８．Ｚｈａｏ．Ｈ．ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ．ＦＨ，１９９７．「同種遺伝子のランダム組み換えによって区別される機能的および非機能的突然変異（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７９９７〜８０００．
８９．Ｚｈａｏ．Ｈ．，Ｇｉｖｅｒ．Ｌ．．Ｓｈａｏ，Ｚ．，Ａｆｆｈｏｌｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｆ．Ｈ．１９９８．「ねじれ延長法（ＳｔＥＰ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えによる分子進化（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ（ＳｔＥＰ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．）」Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８〜２６１．
９０．Ｊｕｄｏ．Ｍ．Ｓ．Ｂ．，Ｗｅｄｅｌ．Ａ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ．Ｃ．１９９８．「ＰＣＲを介する組み換えの刺激と抑制（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：１８１９〜１８２５．
９１．Ｏｋｋｅｌｓ，Ｊ．Ｓ．１９９７．「ポリペプチド変種の調製方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ．）」ＰＣＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ９７／０７２０５．
９２．Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｌ．１９９２．「ｉｎ  ｖｉｖｏ同種組み換えによって生成されたハイブリッド原核ポリペプチド（Ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．）」Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，０９３，２５７．
９３．Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ．Ｃ．１９８３．「Ｅ．ｃｏｌｉにおける関連するクローン化遺伝子間の組み換えによるハイブリッド蛋白の遺伝子符号化の形成（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ．）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：５６６１〜５６６９．
９４．Ｍａｒｙｏｎ．Ｅ．ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ．Ｄ．１９９１．「Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌｅａｖｉｓ卵母細胞に注入したＤＮＡからの組み換え中間体の特徴付け：同種組み換えの非保存的機構の証拠（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌｅａｖｉｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：３２７８〜３２８７．
【図面の簡単な説明】
【図１】  標的配列およびベクターを増幅するそれぞれの異なる配列に対する１組のプライマによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたヘテロ二本鎖形成の過程を示す図である。
【図２】  標的配列およびベクターを線形化する制限酵素を用いたヘテロ二本鎖形成の過程を示す図である。
【図３】  標的配列およびベクターを増幅するそれぞれの異なる配列に対する１組のプライマによる非対称または単一プライマ・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたヘテロ二本鎖形成過程を示す図である。
【図４】  ホモ二本鎖を除去するために独特の制限酵素（ＸおよびＹ）を用いたヘテロ二本鎖組換えを示す図である。
【図５】  Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＲ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）からのＦｌａＡのアミノ酸配列を示す図である。
【図６】  ｐＲＬ２０およびｐＲＭ４０を線形化するために利用される独特の制限部位の配置を示す図である。
【図７Ａ】〜
【図７Ｄ】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏヘテロ二本鎖形成およびそれに続くｉｎ  ｖｉｖｏ修復（（ａ）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、（ｂ）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、（ｃ）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、（ｄ）はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）で作成された４種のモザイクｆｌａＡ遺伝子のＤＮＡ配列を示す図である。
【図８】  ヘテロ二本鎖修復過程で両方の親遺伝子からの配列情報を含むモザイクｆｌａＡ遺伝子がどのようにして作成されたかを示す図である。
【図９Ａ】  強化された特異的活性を有するＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ  ＥＣＢデアシラーゼ突然変異体の物理マップを示す図である（突然変異体７−２に対するｐＭ７−２）
【図９Ｂ】  強化された特異的活性を有するＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ  ＥＣＢデアシラーゼ突然変異体の物理マップを示す図である（突然変異体１６に対するｐＭ１６）。
【図１０】  突然変異体７−２および突然変異体１６において突然変異を組換えてより強化された特異的活性を有するＥＣＢデアシラーゼ組換え体を得るために実施例２で使用される過程を示す図である。
【図１１】  野性型ＥＣＢデアシラーゼおよび改良突然変異体７−２、突然変異体１６および組換え突然変異体１５の特異的活性を示す図である。
【図１２】  突然変異体７−２および突然変異体１６の親配列に対して組換えＥＣＢデアシラーゼ突然変異体１５におけるＤＮＡ塩基の変化およびアミノ酸の置換の位置を示す図である。
【図１３Ａ】〜
【図１３Ｅ】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏヘテロ二本鎖形成とそれに続くｉｎ  ｖｉｖｏ修復（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）によって作成されたＡ．ｕｔａｈｅｎｓｉｓ  ＥＣＢデアシラーゼ遺伝子突然変異体Ｍ−１５遺伝子のＤＮＡ配列を示す図である。
【図１４】  ＲＣ１およびＲＣ２において突然変異体を組換えて熱安定性スブチリシンＥを得るために実施例３で使用される過程を示す図である。
【図１５】  ＲＣ１およびＲＣ２並びに実施例３に示した二本鎖形成の反応生成物の形質転換体からランダムに採られた１０個のクローンの配列を示す図である。ｘはＲＣ１とＲＣ２の間で異なる塩基位置に対応する。９９５における突然変異は１８１におけるアミノ酸置換に対応するが、１１０７における突然変異はスブチリシン蛋白質配列の２１８におけるアミノ酸置換に対応する。
【図１６】  ヘテロ二本鎖形成および修復により作成されたライブラリからの４００個のクローンを初期活性（Ａi）および残留活性（Ａr）について選別した結果を示す図である。比Ａi／Ａrは酵素の熱安定性を評価するために使用された。活性変種からのデータは降順に分類し、プロットしてある。約１２．９％のクローンがＮ１８１ＤおよびＮ２１８Ｓ突然変異を含む二重突然変異体に対応する表現型を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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