(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェネチルアルコールと乳糖又は乳糖含有物との混合物に、エシエリキア・コリ（Escherichia coli）由来のβ−ガラクトシダーゼ又はエシエリキア・コリ菌体を作用させることを特徴とするフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、生産効率に優れたフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
バラ油の主成分であるフェネチルアルコールは、バラ香をもつ香料として、化粧品産業等で広く利用されている。しかし、フェネチルアルコールは揮発性が高く、また、水に難溶性であることから、これらの欠点を解決するため、いくつかの配糖体が合成されている。フェネチルアルコール配糖体は、化学的手法及び酵素的手法の双方により合成することができ、化学的手法としては、例えば、公知のKoenigs-Knorr 反応を用いることにより、フェネチルアルコール配糖体を合成することが報告されている〔ケミセ・デリシテ（Chem.ber．），34,957(1901)〕。また、酵素的手法としては、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）由来のβ−ガラクトシダーゼを用いてフェネチルアルコール配糖体を合成することが報告されている〔バイオテクノロジー・レターズ（Biotechnol. Lett. ）13,863(1991)〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらのうち、化学的手法は工程数が多く、高価な試薬を使用するためにコスト高になる等の問題点があった。また、アスペルギルス・オリーゼ由来のβ−ガラクトシダーゼを用いた酵素的手法は、特に高価な試薬は必要とはしないものの、生産効率が悪く、配糖体を工業的に製造するのは難しいという問題点があった。
本発明は、生産効率のよいフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造方法を提供することを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、エシエリキア・コリ由来のβ−ガラクトシダーゼ又はエシエリキア・コリ菌体を用いることにより、フェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを安価に、しかも収率良く合成することができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、フェネチルアルコールと乳糖又は乳糖含有物との混合物に、エシエリキア・コリ（Escherichia coli）由来のβ−ガラクトシダーゼ又はエシエリキア・コリ菌体を作用させることを特徴とするフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの製造方法を要旨とするものである。
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるエシエリキア・コリ由来のβ−ガラクトシダーゼとしては、市販のものを用いることができるし、エシエリキア・コリ菌体から精製したものを用いることもできる。また、これらのβ−ガラクトシダーゼは、そのままの形で使用してもよいし、各種の固定化法により固定化したものも使用することができる。さらには、脂質等で修飾した修飾酵素として使用することも可能である。
【０００６】
また、本発明に用いられるエシエリキア・コリ菌体としては、β−ガラクトシダーゼ活性を有する菌体であればいかなるものでもよく、例えば、野生型菌体は勿論のこと、自然的並びに人為的変異型菌体、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を組み入れた組換え菌体等が挙げられる。このような菌体としては、例えば、エシエリキア・コリ  Ｎ４８３０−１／ｐＳＩ１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３９０７）、エシエリキア・コリ  Ｃ６００等が挙げられる。
【０００７】
これらの菌体は一般に乳糖を含む培地で培養することにより、β−ガラクトシダーゼ活性の高い菌体を得ることができる。また、炭素源としてグルコース、ショ糖、廃糖蜜等を用い、菌体を充分増殖させた後に乳糖を添加し、さらに培養を続け、β−ガラクトシダーゼを充分誘導させた後に、菌体を遠心、濾過等の通常用いられる方法により回収すれば、さらにβ−ガラクトシダーゼ活性の高い菌体を得ることができる。
【０００８】
培養に用いる窒素源としては、例えば、ペプトン、カゼイン、コーンステイプリカー、肉エキス、酵母エキス等の有機窒素源や、硫安、塩化アンモニウム、尿素等の無機窒素源を用いることができる。さらに、β−ガラクトシダーゼの生産性を上げるために、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド等の誘導物質を添加してもよい。
【０００９】
本発明においては、このようにして得られた菌体を、遠心、濾過等の方法により回収し、洗浄したものをそのまま反応に用いることもできるし、さらにはこれらの菌体を各種の固定化法により固定化したものも使用することができる。
【００１０】
本発明において、反応時のフェネチルアルコールの濃度としては、０．１〜１０重量％が適当であり、１〜５重量％が好ましい。このとき、フェネチルアルコールの溶解性を上げる目的でアセトン等の水混和性の有機溶媒を適当量添加することも可能である。また、乳糖の濃度としては、１〜５０重量％が適当であり、１０〜４０重量％が好ましい。
【００１１】
また、反応時のｐＨとしては、６〜９が適当であり、６〜８が好ましく、反応温度としては、３０〜５５℃の範囲が適当であり、３０〜４０℃が好ましい。さらに、反応時間としては、使用する酵素量あるいは菌体量により適宜選べばよいが、目的とするフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの生成量が最大になるような時間を選べばよい。
【００１２】
このような方法によって製造したフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドは、シリカゲルクロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等の通常の分離方法で分離することができる。
【００１３】
本発明の方法により製造したフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドは、水溶解性及び保存安定性に優れているため、例えば、徐放性の香料として、香水、オーデコロン、シャンプー、リンス、石鹸、整髪料、洗口剤、制汗剤、マッサージ粉末等の化粧料、清涼飲料、菓子、冷菓、乳製品、酒類、肉、歯磨粉、煙草等の食品、台所用、住居用、風呂用等の芳香剤、紙おむつ、生理用ナプキン等の吸収性物品、入浴剤、洗剤等に使用することができる。
【００１４】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１、比較例１
フェネチルアルコール２ｇ（和光純薬工業社製、特級試薬）及び乳糖２０ｇを、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ミリリットルに溶解し、これにエシエリキア・コリ由来のβ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＨ−２０１、東洋紡社製：実施例１）又はアスペルギルス・オリーゼ由来のβ−ガラクトシダーゼ（スミラクトＧＬＬ、新日本化学社製：比較例１）を２０００ユニット加えて、４０℃で２７時間反応させた。
【００１５】
反応液中のフェネチルアルコール及びフェネチルアルコール配糖体の生成量を高速液体カラムクロマトグラフィー（カラム：島津製作所製Shim-pack ＣＬＣ−ＯＤＳ、溶出溶媒：４０容量％メタノール水溶液、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）で経時的に測定した。
その結果を図１に示す。図１は、エシエリキア・コリ及びアスペルギルス・オリーゼ由来のβ−ガラクトシダーゼによるフェネチルアルコールに対する糖転移率を示す図であり、縦軸に糖転移率を、横軸に反応時間を示した。
図１から明らかなように、アスペルギルス・オリーゼ由来のβ−ガラクトシダーゼを用いると、糖転移率は１０％程度であるのに対して、エシエリキア・コリ由来のβ−ガラクトシダーゼを用いると、３０％程度まで糖転移率が向上する。
【００１６】
次に、それぞれの反応液において、反応液中の未反応原料を等容のクロロホルムで３回抽出して除去した。抽出後の水層を減圧して、水層に含まれているクロロホルムを除去した後、この水溶液をダイアイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）カラム（７０ミリリットル）に通液し、フェネチルアルコール配糖体を吸着させた。このカラムを１リットルの蒸留水で水洗した後、水−メタノールのグラジエントによりフェネチルアルコール配糖体を溶出させた。得られた溶出液を減圧濃縮し、エシエリキア・コリ由来のβ−ガラクトシダーゼを用いた反応液から１．３５ｇ（最終収率２９．０％）のフェネチルアルコール配糖体を、アスペルギルス・オリーゼ由来のβ−ガラクトシダーゼを用いた反応液から０．２８ｇ（最終収率６．０％）のフェネチルアルコール配糖体を、それぞれ得た。
【００１７】
得られたフェネチルアルコール配糖体の13Ｃ−ＮＭＲ、ＵＶスペクトル、融点を測定したところ、両者共に次のような結果が得られた。
（１）13Ｃ−ＮＭＲ
重水中でバリアン社製のVXR-300 を用いて測定した。その結果、38.1,63.8,71.5,73.5,73.6,75.6,77.9,105.7,129.4,131.5,131.9,141.6ppm にシグナルが観察された。
（２）ＵＶスペクトル
日立製作所製の分光光度計（U-3210）を用いて測定した。その結果、λmax は水中で207nm であった。
（３）融点
89℃であった。
【００１８】
また、得られたそれぞれのフェネチルアルコール配糖体をアスペルギルス・オリーゼ由来のβ−ガラクトシダーゼで加水分解すると、フェネチルアルコールとＤ−ガラクトースが生成した。
【００１９】
以上の結果から、上記で得られたそれぞれのフェネチルアルコール配糖体の構造は、両者共にフェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドであることが判明した。
【００２０】
実施例２
エシエリキア・コリ  Ｎ４８３０−１／ｐＳＩ１０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１３９０７）１白金耳をＬＢ培地〔トリプトン（ディフコ社製）１重量％、イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５重量％、ＮａＣｌ１重量％〕２０リットルに植菌し、３７℃で５時間培養した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製、特級試薬）を１ｍＭとなるように加えて、さらに３７℃で８時間培養した。得られた培養液を通常の方法で遠心分離して湿菌体を得た。
フェネチルアルコール１０ｇ（和光純薬工業社製、特級試薬）及び乳糖１００ｇを、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ミリリットルに溶解し、これに上記のようにして得られたエシエリキア・コリ  Ｎ４８３０−１／ｐＳＩ１０の湿菌体５０ｇを加えて、４０℃で８時間反応させた。得られた反応物を遠心して、菌体を除去した後、上澄みを実施例１と同様にして精製し、５．１１ｇのフェネチルアルコール配糖体を得た。このときの最終収率は１０．０％であった。
次に、実施例１と同様にして、このフェネチルアルコール配糖体の構造等を確認したところ、実施例１と全く同じものであることがわかった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、フェネチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エシエリキア・コリ及びアスペルギルス・オリゼ由来のβ−ガラクトシダーゼによるフェネチルアルコールに対する糖転移率を示す図である。
【図１】
0003690612.tif 000002