(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のジアセチルポリアミンをイムノアッセイにより測定する方法において、測定に供するサンプルとして一級アミンを修飾できる酵素を用いて処理したサンプルを使用することを特徴とする、ジアセチルポリアミンの測定法。
【請求項２】
ジアセチルポリアミンがジアセチルスペルミンおよび／またはジアセチルスペルミジンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
一級アミンを修飾できる酵素がアミンオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
一級アミンを修飾できる酵素が動物血清由来のアミンオキシダーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
サンプルを動物血清とインキュベーションする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも、抗ジアセチルポリアミン抗体と一級アミンを修飾できる酵素を構成試薬として含有する、請求項１記載の方法を実施するためのキット。
【請求項７】
一級アミンを修飾できる酵素がアミンオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼおよび／またはデヒドロゲナーゼである、請求項６記載のキット。
【請求項８】
一級アミンを修飾できる酵素が動物血清由来のアミンオキシダーゼである、請求項６記載のキット。
【請求項９】
酵素が精製酵素の形態で供給される、請求項６記載のキット。
【請求項１０】
酵素が動物血清の形態で供給される、請求項６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、試料中のジアセチルポリアミンをイムノアッセイにより測定する方法および該方法に使用するキットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
癌患者の尿サンプル中のポリアミン濃度は健常者の尿サンプル中の当該濃度より高値を示すことから、ポリアミンが癌の診断用マーカーとして期待されていたが、偽陽性、偽陰性共に多く観察され、ポリアミンが癌の診断用マーカーとして臨床検査上採用されるには至っていない。
しかし最近、ジアセチルスペルミン、ジアセチルスペルミジンなどのポリアミンのジアセチル体（ジアセチルポリアミン）が、癌の診断、治療効果の判定及びマーカーとして有用であることが報告されている（J. Cancer Res. Clin. Oncol., 121:317-319(1995)、 J. Cancer Res. Clin. Oncol., 123:539-545(1997))。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来、ポリアミン、ジアセチルポリアミンなどのポリアミン類の測定は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法が主流であるものの、多数の検体サンプルを短時間で処理できない、測定機器のメンテナンス及び精度管理が煩雑であるなどのＨＰＬＣ法に共通する問題を有し、必ずしも満足し得る方法ではなかった。
【０００４】
このようなＨＰＬＣ法に代わり、イムノアッセイも種々検討されてきたが、尿サンプル中には測定目的のジアセチルポリアミンと構造類似の夾雑物質が多数存在し、ジアセチルポリアミンのみに特異的な抗体を通常の免疫手法で取得することは困難なことであった。このため、イムノアッセイに使用する抗体は、アフィニティ精製により基質特異性を改善してからでないと使用することができず（生化学、６９巻，７号，８９８頁（１９９７年）、J. Biochem., 121 1134-1138(1997)）、このようなアフィニティ精製の手間等が臨床検査で実際に使用する際のネックとなっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ジアセチルポリアミンをイムノアッセイにて測定する場合、交差反応性が問題となるポリアミン及びモノアセチルポリアミンをアミンオキシダーゼ等の酵素により一級のアミノ基を修飾することで交差反応性を減少させることができ、もって目的とするジアセチルポリアミンを特異的に、かつ感度よく測定できることを知見し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、サンプル中のジアセチルポリアミンをイムノアッセイにより測定する方法において、測定に供するサンプルを一級アミンを修飾できる酵素を用いて処理することを特徴とする、ジアセチルポリアミンの測定法及びそれに使用するキットに関するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明方法で使用するサンプルは、ジアセチルポリアミン、特にジアセチルスペルミンおよび／またはジアセチルスペルミジンを含有するものであれば特に制限されない。そのようなサンプルを具体的に例示すれば、尿、血清等を例示することができ、特に尿サンプルが使用に好適である。
【０００７】
本発明では、このようなイムノアッセイに使用するサンプルを一級アミンを修飾できる酵素を用いて処理することを特徴としている。
一級アミンを修飾できる酵素としては、ジアセチルポリアミンと構造類似の夾雑物質、特にポリアミン及びモノアセチルポリアミン中の一級アミンを修飾（たとえば、酸化、アミノ基転移、脱水素など）できる酵素であれば特に限定されない。そのような酵素を具体的に例示すれば、アミンオキシダーゼ、アミノトランスフェラーゼまたはデヒドロゲナーゼを単独または組み合わせて使用すればよい。
【０００８】
酵素の使用形態としては、精製酵素、粗精製酵素、未精製酵素などいずれの形態であってもよい。たとえば、酵素としてアミンオキシダーゼを利用する場合には、動物血清、特にウシ血清からの調製品またはウシ血清そのものを使用することができる。
酵素処理は、サンプル中に酵素を添加して、必要により撹拌しながら１０〜４０℃で１０分〜４時間程度インキュベーションすることにより行うことができる。なお、上記酵素処理はイムノアッセイ前に行うのが好ましいが、イムノアッセイと同時に行っても構わない。
【０００９】
酵素処理されたサンプル中のジアセチルポリアミンのイムノアッセイによる測定は、公知の方法またはそれに準じて行うことができる。すなわち、使用する抗体としては、遊離のジアセチルポリアミンに結合し、それらを測定できるものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれの抗体であってもよい。特に、本発明においてはサンプルの酵素処理を特徴としており、ジアセチルポリアミンのみに特異的な抗体を使用する必要はなく、ジアセチルポリアミンと構造類似の夾雑物質（たとえば、ポリアミン、モノアセチルポリアミンなど）と多少の交差反応性を有する抗体であっても本発明で使用可能である。そのような抗体の調製は既に報告されており、その公知の方法に準じて、またはそれを改良して行うことができる（生化学、６９巻，７号，８９８頁（１９９７年）、J. Biochem., 121 1134-1138(1997)）。
【００１０】
使用する抗体は、抗体そのものでもよいが、活性フラグメントを使用することもできる。活性フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどの各種フラグメントで、測定上の機能が失われていないものであればよい。
これら活性フラグメントの調製は、精製抗体に対してパパイン、ペプシン、トリプシン処理などの公知の方法を適用することで行うことができる（例えば、「免疫生化学研究法（続生化学実験講座５）」、日本生化学会編、８９頁（１９８６年）参照）。
【００１１】
このようにして調製された抗体またはその活性フラグメントは、必要により選択した測定方法に適した形態に修飾し、本発明に使用する。
抗体の修飾は、それぞれ常法に従って行うことができる。例えば、固相化抗体を調製する場合、使用できる担体の材質としては、抗体との結合性の高いものであれば特に制限されず、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレンなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げられ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したものであってもかまわない。
【００１２】
担体の形状としては、マイクロタイタープレート、ディスクなどの平板状、ビーズなどの粒子状、試験管、チューブなどの管状、その他繊維状、膜状などが例示され、測定法に応じて適宜選択することができる。
固相担体への抗体の固定化は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法（例えば「固定化酵素」千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講談社発行参照）を用いて行えばよい。
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するために、ＢＳＡ、糖、スキムミルクなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
【００１３】
また、標識化抗体または標識化抗原を調製する場合、使用する標識体としては、放射性同位体（32Ｐ、3 Ｈ、14Ｃ、125 Ｉなど）、酵素（β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、補酵素・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘムなど）、蛍光色素（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体など）、金属粒子（金、銀、白金など）などを使用することができる。
抗体または抗原の標識化は、選択した標識剤に適した公知の方法（例えば「続生化学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、（１９８６年発行）第１０２〜１１２頁参照）に従って行えばよい。また、アビジン−ビオチン等を介して抗体または抗原を標識することもできる。
【００１４】
イムノアッセイで採用する測定手順としては、競合法、凝集法など公知の手順のいずれであってもよい。採用した測定手順の具体的な操作法に関しては、たとえば下記の文献を参照することができる。
(a) 入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談社、昭和５４年５月１日発行）
(b) 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）医学書院、１９８２年１２月１５日発行）
(c) 臨床病理  臨時増刊  特集第５３号「臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、１９８３年発行）
(d) 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、１９８６年１０月９日発行）
【００１５】
(e) 特公平６−４３９９８号公報、特開昭５５−１５１００号公報、特開昭５２−１４８６２０号公報及び特開昭５４−９１２９６号公報
(f) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」(Immunochemical techniques (Part A))
(g) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」(Immunochemical techniques (Part B))
(h) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」(Immunochemical techniques (Part C))
(i) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」(Immunochemical techniques (Part D:Selected Immunoassay)）
(j) 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」(Immunochemical techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))
［（ｆ）〜（ｊ）はアカデミックプレス社発行］
【００１６】
このような公知の測定手順の中から競合法を例に挙げて具体的に説明すれば、固相化抗ジアセチルポリアミン抗体に対し、酵素処理したサンプル中の遊離のジアセチルポリアミンと一定濃度の標識化ジアセチルポリアミンとを競合反応させ、固相と液相を分離（ＢＦ分離）後、いずれか一方の相の標識量を測定することで、サンプル中の遊離のジアセチルポリアミンを検出または定量することができる。
【００１７】
本発明のキットは、少なくとも、抗ジアセチルポリアミン抗体と一級アミンを修飾できる酵素を構成試薬として含有する。
上記競合法を例に挙げ、実施するためのキットの構成試薬を具体的に説明すれば、たとえば次のものが例示される。
▲１▼固相化抗ジアセチルポリアミン抗体
▲２▼標識化ジアセチルポリアミン
▲３▼一級アミンを修飾できる酵素
【００１８】
この構成試薬において、標識として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる場合には、たとえば次の構成をとり得る。
▲１▼固相化抗ジアセチルポリアミン抗体
▲２▼西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化ジアセチルポリアミン
▲３▼一級アミンを修飾できる酵素
また、上記試薬の他に、必要により、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル希釈用試薬などの各試薬から状況に応じ適宜選択し、測定のための構成試薬とすることもできる。なお、一級アミンを修飾できる酵素はサンプル希釈用試薬の中に含有させることも可能である。
【００１９】
【発明の効果】
本発明者は、数十匹以上のマウスに免疫を行い、ジアセチルスペルミンに対する抗血清の特異性を検定したが、ジアセチルスペルミンに対する反応性を１とした場合、Ｎ1 −アセチルスペルミジンに対する交差反応性が３００分の１より低い特異性を有する抗血清を調製することはできなかった。これは、ジアセチルスペルミンとＮ1 −アセチルスペルミジンは構造類似の化合物であり、しかも低分子量の化合物であることから、ジアセチルスペルミンのみに特異性を有する抗体を免疫化学的な手法で取得するには限界があると考えられる。
【００２０】
したがって、このような特異性の低い抗体を使用した場合、たとえば、イムノアッセイで使用する抗ジアセチルスペルミン抗体のＮ1 −アセチルスペルミジンに対する交差反応性がジアセチルスペルミンの３００分の１程度であっても、健常人の尿中には、ジアセチルスペルミンの約３０倍のＮ1 −アセチルスペルミジンが存在するため、測定値の約１０％がＮ1 −アセチルスペルミジンに由来するものとなり、ジアセチルスペルミンの測定法としては好ましいことではない。
しかしながら、酵素によりＮ1 −アセチルスペルミジンを修飾すれば、抗体との交差反応性は１０００分の１以下にすることも可能であり、抗体をアフィニティ精製することなしに、十分な特異性を持つ測定系を提供することが初めて可能となったのである。
【００２１】
同様に、ジアセチルスペルミジンに対する抗体ではＮ8 −アセチルスペルミジンに対する交差反応性が２０分の１あった。健常人の尿中には、ジアセチルスペルミジンのおよそ８倍のＮ8 −アセチルスペルミジンが存在するため、測定値の約４０％がＮ8 −アセチルスペルミジンに由来するものとなり好ましくなかったが、酵素によりＮ8 −アセチルスペルミジンを修飾すれば、抗体との交差反応性は１００分の１以下にすることも可能であり、抗体をアフィニティ精製することなしに、十分な特異性を持つ測定系を提供することが初めて可能となった。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、これにより本発明は何等限定されるものではない。
実施例１
＜方法＞
（１）抗ジアセチルスペルミン抗体および抗ジアセチルスペルミジン抗体の調製
ＳＡＴＡ（N-succinimidyl-S-acetylthioacetate）とヒドロキシルアミンによりスルフヒドリル基を導入したＢＳＡと、ＥＭＣＳ（N-（ε-maleimidocaproyloxy)succinimide）によりマレイミド基を導入したモノアセチルスペルミンをコンジュゲートしたものを免疫原として使用し、常法によりマウスに免疫した。この方法でコンジュゲートすると、モノアセチルスペルミンの一級アミノ基の部分が酸アミド結合となり、構造的にジアセチル体に近似する。２週間おきに４〜６回追加免疫を行い、摘出したマウスの脾細胞とミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）を細胞融合し、得られたハイブリドーマよりジアセチルスペルミンを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ９Ｇ９を選出した。
また、モノアセチルスペルミンの代わりに、Ｎ8 −アセチルスペルミジンを用いて免疫源を作製し、ジアセチルスペルミジンを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１Ｄ８を選出した。
得られたハイブリドーマから常法によりモノクローナル抗体を産生させ、各種クロマトグラフィー法で精製し、以下の実験に供した。
【００２３】
（２）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミン及び西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミジンの調製
上記の免疫原の調製法と同様の方法で西洋ワサビペルオキシダーゼとモノアセチルスペルミンあるいはＮ8 −アセチルスペルミジンをコンジュゲートし、以下の実験に供した。
（３）一級アミン修飾用酵素溶液の調製
夾雑する交差反応性物質を修飾する酵素として、ウシ血清アミンオキシダーゼを利用することとし、ウシ血清９容量に対し、１Ｍトリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）１容量を加え、一級アミン修飾用酵素溶液とした。また、本溶液にウシ血清アミンオキシダーゼの阻害剤であるセミカルバジドを１０ｍＭになるように加えて本酵素を失活させたもの（対照実験用失活酵素溶液）を対照実験用として用い、以下の実験に供した。
【００２４】
（４）抗体の固相化とブロッキング
９Ｇ９抗体溶液あるいは１Ｄ８抗体溶液（１０μｇ／ｍｌ：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で調製）を９６穴プレート（NUNC Immuno module C8 Maxisorp）に１００μｌ／ウエル分注し、４℃で一晩反応させた。抗体液を吸引除去後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄し、ブロッキング溶液（５％シュクロース−０．５％スキムミルク（Ｄｉｆｃｏ））を３００μｌ／ウエル分注し、室温で１時間インキュベート後、ブロッキング溶液を除去し、乾燥させて以下の実験に供した。
【００２５】
（５）測定手順
上記（４）で調製した抗体固相化プレートに、測定用サンプルを５０μｌ／ウエル分注する。次に上記（３）で調製した一級アミン修飾用酵素溶液あるいは対照実験用失活酵素溶液に、９Ｇ９抗体固相化プレートについては（２）で調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを４０ｎｇ／ｍｌ、１Ｄ８抗体固相化プレートについては（２）で調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを４００ｎｇ／ｍｌになるように加えた溶液を１００μｌ／ウエル分注して、撹拌しながら室温で２時間反応させる。反応後リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にてウエルを洗浄し、ＴＭＢＺ（3,3',5,5',-Tetramethyl-benzidine）溶液を１００μｌ／ウエル分注して発色させる。最後に、１Ｎ硫酸を１００μｌ／ウエル分注して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【００２６】
＜結果＞
（１）反応曲線
上記測定手順に従い、各種ポリアミン溶液を用いて反応曲線を作成した。９Ｇ９固相化プレートについての結果は図１に、１Ｄ８固相化プレートについての結果は図３に示す。また、対照実験としてウシ血清アミンオキシダーゼを失活させた対照実験用失活酵素溶液を用いて作成したそれぞれの反応曲線を図２と図４に示す。なお、略号は以下の通りである。
ＤＡＳＰＭ：ジアセチルスペルミン
ＡｃＳＰＭ：アセチルスペルミン
ＡｃＰＵＴ：アセチルプトレッシン
Ｎ１ＳＰＤ：Ｎ1 −アセチルスペルミジン
Ｎ８ＳＰＤ：Ｎ8 −アセチルスペルミジン
ＳＰＭ    ：スペルミン
【００２７】
（２）交差反応性
図１から図２の結果より、ジアセチルスペルミンに対する反応性を１００％とした場合の各種ポリアミンの交差反応性と特異性改善倍率を表１に示す。この結果から、ウシ血清アミンオキシダーゼで処理することによりジアセチルスペルミン以外のポリアミン類の抗体との交差反応性が低下し、特異性の高いジアセチルスペルミンの測定系を提供できることが明きらかとなった。
同様に図３から図４の結果より、ジアセチルスペルミジンに対する反応性を１００％とした場合の各種ポリアミンの交差反応性と特異性改善倍率を表２に示す。この結果から、ウシ血清アミンオキシダーゼで処理することによりジアセチルスペルミジン以外のポリアミン類の抗体との交差反応性が低下し、特異性の高いジアセチルスペルミジンの測定系を提供できることが明きらかとなった。
なお、特異性改善倍率は以下のように計算した。
特異性改善倍率＝Ａ／Ｂ
Ａ：セミカルバジド非存在下での交差反応性の逆数
Ｂ：セミカルバジド存在下での交差反応性の逆数
【００２８】
【表１】
0003709078.tif 000002
DASPM ：ジアセチルスペルミン
AcSPM ：アセチルスペルミン
N1SPD ：Ｎ１アセチルスペルミジン
N8SPD ：Ｎ８アセチルスペルミジン
SPM   ：スペルミン
【表２】
0003709078.tif 000003
DASPD ：ジアセチルスペルミジン
AcPUT ：アセチルプトレッシン
N8SPD ：Ｎ８アセチルスペルミジン
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性がある酵素溶液と９Ｇ９固相化プレートおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対する反応曲線を示したものである。
【図２】図２は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性がない酵素溶液と９Ｇ９固相化プレートおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化モノアセチルスペルミンを用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対する反応曲線を示したものである。
【図３】図３は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性がある酵素溶液と１Ｄ８固相化プレートおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対する反応曲線を示したものである。
【図４】図４は、ウシ血清アミンオキシダーゼの活性がない酵素溶液と１Ｄ８固相化プレートおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化Ｎ8 −アセチルスペルミジンを用いて行ったイムノアッセイにおける各種ポリアミンに対する反応曲線を示したものである。
【図１】
0003709078.tif 000004
【図２】
0003709078.tif 000005
【図３】
0003709078.tif 000006
【図４】
0003709078.tif 000007