(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光能力を有する甲虫類からの抽出物をクロマトグラフ処理工程を含む精製工程により精製して得られる蛋白質であって、SDS-PAGEでの分子量が40,000、反応至適pHがpH７〜９、反応至適温度が35〜70℃である、オキシルシフェリンとD-システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。
【請求項２】
発光能力を有する甲虫類由来であり、遺伝子組み換えの手法を用いて生産させた蛋白質であって、SDS-PAGEでの分子量が40,000、反応至適pHがpH７〜９、反応至適温度が35〜70℃である、オキシルシフェリンとD-システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。
【請求項３】
発光能力を有する甲虫類が、ホタルであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項４】
発光能力を有する甲虫類が、北米産ホタルであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項５】
発光能力を有する甲虫類が、日本産ホタルであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項６】
発光能力を有する甲虫類が、ゲンジボタルであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質。
【請求項７】
発光能力を有する甲虫類が、ヘイケボタルであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ルシフェリンの再生に係わる蛋白質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物発光は、酵素ルシフェラーゼが発光基質であるルシフェリンの酸化を触媒する反応であり、反応生成物としてオキシルシフェリンを生成する。
このオキシルシフェリンは、ルシフェラーゼの反応を阻害する物質として知られており、そのためルシフェリン−ルシフェラーゼ反応は反応直後のフラッシュ発光の後、急激に発光が減少することが知られている。
【０００３】
従来、オキシルシフェリンに作用し、発光基質であるルシフェリンを再生させる蛋白質は、単離、精製されてないのが実状である。
このような蛋白質を見出し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光持続性の向上が期待でき、また使用するルシフェラーゼ、ルシフェリンの使用量の軽減等につながる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、オキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、上記課題について鋭意検討した結果、甲虫類生体内にオキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質が存在することを見出し、該蛋白質を単離、精製することに成功した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）オキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。
（２）発光能力を有する生体からの抽出物をクロマトグラフ処理工程を含む精製工程により精製して得られる、オキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質。
【０００７】
（３）発光能力を有する生体が、甲虫類であることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
（４）発光能力を有する生体が、ホタルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
（５）発光能力を有する生体が、北米産ホタルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
【０００８】
（６）発光能力を有する生体が、日本産ホタルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
（７）発光能力を有する生体が、ゲンジボタルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
（８）発光能力を有する生体が、ヘイケボタルであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本蛋白質を製造する方法としては、如何なる方法でもよく、例えば、以下の方法が挙げられる。
本蛋白質の製造のもととなるものは、本蛋白質を含有するものであれば如何なるものでも良く、例えば、ホタルをはじめとする甲虫類及び一般に市販されているホタルの粗酵素抽出液、さらには遺伝子組み換えの手法を用いて生産させた組み換え体等が挙げられる。
【００１０】
次いで、本蛋白質を含有するものを、緩衝液中で粉砕、溶菌もしくは溶解させる。
緩衝液としては、本蛋白質を失活させるものでなければ、如何なるものでも良く、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液等が挙げられる。
【００１１】
粉砕方法としては、乳鉢及び乳棒を用いる方法、ホモゲナイザー、ワーニングブレンダー、フレンチプレス等を用いる方法、溶菌方法としては、リゾチーム処理を施す方法等が挙げられる。
【００１２】
次いで、粉砕物、溶菌物及び溶解物等より、通常の遠心分離あるいは濾過処理により残さを除去して、粗酵素液を得るか、これに必要により硫安沈澱法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱法等を適宜選択して実施することにより粗酵素粉末を得る。
【００１３】
上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさらに精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、蔗糖密度勾配遠心等の沈降法、等電点の違いによる分離法、アフィニティクロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択して実施することにより、精製された蛋白質標品を得ることが出来る。
【００１４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕
２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液に、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウムを添加し、さらにグリセロールを１０％（Ｗ／Ｖ）となる如く添加して得た緩衝液Ａ（ｐＨ７．０）２００ｍｌを用い、ホタル発光器抽出物（firefly lantern extract；ＳＩＧＭＡ社製）４ｇを溶解させた。
【００１５】
このようにして得た溶液を、常法により硫酸アンモニウムを用いて塩析し、４０〜６０％飽和で生成した沈澱を２０ｍｌの緩衝液Ａに溶解させた。
次いで、この溶液を、緩衝液Ａで平衡化したウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ３４（ＩＢＦ社製）カラム中に通過させてゲル濾過クロマトグラフィーを行い活性画分を得た。
【００１６】
このようにして得られた画分を、５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液に１ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭエチレンジアミン４酢酸２ナトリウムを添加し、更に５％（Ｗ／Ｖ）グリセロール及び１ｍＭ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ｂ（ｐＨ６．５）で透析した。
【００１７】
得られた溶液を、緩衝液Ｂで平衡化させたＳ−セファロース  ＦＦ（S-Sepharose FF；ファルマシア  バイオテク社製）カラムに吸着させ、１〜１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行い、活性画分を得た。
【００１８】
このようにして得られた活性画分を、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｂと同じ組成のｐＨ８．０の溶液）で透析後、緩衝液Ｃで平衡化させたイオン交換ＨＰＬＣカラム（東ソー社製、TSKgel SuperQ-5PW）に吸着させ、１〜１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行い、活性画分を得た。
【００１９】
このようにして得られた活性画分を、緩衝液Ａで平衡化させたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（東ソー社製、TSKgel G3000SWXL）に通過させて、純化させることに成功した。
なお、ゲル濾過の通過画分を、Laemmli 法 (Laemmli, U.K.: Nature, 227, 680, (1970))により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、本純化蛋白質の分子量は、約40,000であった。
【００２０】
さらに本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適温度は、夫々ｐＨ７〜８及び温度３５〜５０℃であった。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後においても、８０％以上の残存活性を保持していた。
【００２１】
〔実施例２〕
緩衝液Ａ１５mlに、ゲンジボタル（西武百貨店より購入）の発光器 200 匹分を添加し、ヒスコトロン〔（株）日音医理科機器製作所製〕を用いて破砕したものを、12,000 r.p.m.で２０分間遠心処理し、上清１４mlを得た。
このようにして得た粗酵素溶液を常法により硫酸アンモニウムを用いて塩析し、３０〜６０％飽和で生成した沈澱を、12,000 r.p.m.で１０分間遠心分離処理し、その沈澱を２０ ml の緩衝液Ａに溶解させて溶液を得た。
【００２２】
次いで、この溶液を、緩衝液Ａで平衡化したウルトロゲル（Ultrogel）ＡｃＡ３４（ＩＢＦ社製）カラム中に通過させてゲル濾過クロマトグラフィーを行い活性画分を得た。このようにして得られた画分を、緩衝液Ｂ（ｐＨ６．５）で透析後、緩衝液Ｂで平衡化させたＳ−セファロース  ＦＦ（S-Sepharose FF；ファルマシア  バイオテク社製）カラムに吸着させ、１〜１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行い、活性画分を得た。
【００２３】
このようにして得られた活性画分を、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｂと同じ組成のｐＨ８．０の溶液）で透析後、緩衝液Ｃで平衡化させたイオン交換ＨＰＬＣカラム（東ソー社製、TSKgel SuperQ-5PW）に吸着させ、１〜１００ｍＭまで塩化ナトリウムによるリニアグラジエント溶出を行い、活性画分を得た。
【００２４】
このようにして得られた活性画分を、緩衝液Ａで平衡化させたゲル濾過ＨＰＬＣカラム（東ソー社製、TSKgel G3000SWXL）に通過させて、純化させることに成功した。
なお、本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適温度は、夫々ｐＨ７〜８及び温度３５〜５０℃であった。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後においても、８０％以上の残存活性を保持していた。
【００２５】
〔実施例３〕
緩衝液Ａ１５mlに、ヘイケボタル（西武百貨店より購入）の発光器 300匹分を添加し、ヒスコトロン〔（株）日音医理科機器製作所製〕を用いて破砕したものを、12,000 r.p.m.で２０分間遠心処理し、上清１３mlを得た。
このようにして得られた粗酵素液は、実施例２と同様の操作により純化させることに成功した。
【００２６】
なお、本蛋白質の反応至適ｐＨ、反応至適温度は、夫々ｐＨ８〜９及び温度５０〜７０℃であった。また、本蛋白質は、５０℃、３０分の熱処理後においても、８０％以上の残存活性を、６０℃、３０分の熱処理後においても６０％以上の残存活性を保持していた。
【００２７】
〔実施例４〕
実施例１により精製した蛋白質のルシフェリン−ルシフェラーゼ反応に及ぼす影響を調べた。０．５μｇ／ｍｌ アメリカボタルルシフェラーゼ １０μｌ、1 ｍＭ ルシフェリン ４０μｌ、１０ｍＭ Ｄ−システイン ４０μｌ、活性測定用緩衝液［２５ｍＭグリシルグリシン＋５．４ｍＭ硫酸マグネシウム、（ｐＨ７．８）］３００μｌを加えたものに、実施例１により精製した蛋白質１０ μｌを添加した。この溶液中に、１０ｍＭＡＴＰを１００μｌ注入し、発光量を１０秒間隔で１分間測定した結果を表１に示した。なお、蛋白質の代わりに活性測定用緩衝液１０μｌを添加したものを、コントロールとし、比較した。その結果、本蛋白質を添加することにより、発光持続性が向上することが判明した。
【００２８】
【表１】
0003636867.tif 000002
【００２９】
なお、実施例２及び３により精製した蛋白質においても、同様の効果が確認できた。
活性測定法
活性測定用緩衝液［２５ｍＭグリシルグリシン＋５．４ｍＭ硫酸マグネシウム、（ｐＨ７．８）］８．５ｍｌに、０．０１ｍＭ Ｄ−システイン１ｍｌ及び１ｍＭオキシルシフェリン０．５ｍｌを添加し、基質混合液を作成した。
【００３０】
上記混合液１００μｌに、測定サンプル１０μｌを加え、３７℃で４時間反応させた。この反応液１０μｌを活性測定用緩衝液２００μｌに添加した後、ＡＴＰ、ルシフェラーゼ混合液（１０ｍＭＡＴＰ溶液に、ルシフェラーゼを０．５ｍｇ／ｍｌとなるよう添加した溶液）を１００μｌ注入し、発光量を５秒間積算した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、オキシルシフェリンとＤ−システインに作用してルシフェリンを再生する能力を有する蛋白質が提供され、該蛋白質をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系に添加すれば、発光を持続させることができ、また使用するルシフェラーゼ及びルシフェリンの使用量が軽減される。